Молекулска и атомска спектроскопија Флуоресцентна спектроскопија Оддел IV. Спектрохемиски анализи Поглавје 23Г. Молекулска луминисцентна спектроскопија (стр. 616-625) Ског, Вест, Холер, Крауч, Аналитичка хемија Поглавје 10. Спектроскопски методи на анализа 10Е Молекулска фотолуминисцентна спектроскопија Харви, Модерна аналитичка хемија (стр. 423-434) Предавање 6б, Инструментални аналитички методи (А), M. Стефова, 2016 http://hemija.pmf.ukim.edu.mk/subjects/view/212 Флуоресценција = фотолуминисцентен процес атоми или молекули се ексцитираат со апсорпција на електромагнетно зрачење, а потоа ексцитираниот вид се релаксира со враќање во основната состојба оддавајќи го вишокот енергија во вид на фотони. ГОЛЕМА ОСЕТЛИВОСТ! 1-1000 пати поголема од онаа на апсорпционата спектроскопија СПЕЦИФИЧНОСТ при контролирани услови може да бидат детектирани и поедини молекули од даден вид ГОЛЕМ ЛИНЕАРЕН ОПСЕГ на концентрации НО, РЕЛАТИВНО Е МАЛ БРОЈОТ НА ХЕМИСКИ СИСТЕМИ КОИ ПОКАЖУВААТ ЗАБЕЛЕЖИТЕЛНА ФЛУОРЕСЦЕНЦИЈА! Сепак, вреди! 1
Што се случува? се предизвикува ЕКСЦИТАЦИЈА со определена λ т.н. ексцитациона λ се мери ЕМИСИЈА на подолга λ т.н. емисиона или флуоресцентна λ На пр. редуцирана форма на коензимот никотинамид аденин динуклеотид (NADH) апсорбира на 340 nm. Молекулите покажуваат флуоресценција со емисионен максимум на 465 nm. Флуоресцентната емисија се мери под прав агол во однос на упадниот зрак за да се избегне мерење на упадното зрачење (инструмент за флуоресценција). Настанатата краткотрајна емисија = флуоресценција, додека подолготрајна луминисценција = фосфоресценција. Што се случува по апсорпција? Како молекулата се ослободува од вишокот енергија добиен со апсорпција? Два најважни механизми за релаксација: релаксација без зрачење релаксација со зрачење - флуоресценција 2
вибрациона релаксација, 10-11 s интерна конверзија меѓусистемски премин (Харви) флуоресценција 10-5 -10-10 s ексцитациона λ < флуоресцентна λ, т.е. ексцитациона Е > флуоресцентна Е Стоксово поместување, резонантни линии Ексцитационен-флуоресцентен спектар апсорпциониот, или ексцитационен спектар, и флуоресцентниот спектар огледални слики со преклопување блиску до почетниот премин (0-то вибрационо ниво на E1 до 0-тото вибрационо ниво на E0). - исклучоци од ова правило на слика и лик во огледало се појавуваат особено ако ексцитираните и основните состојби имаат различни молекулски геометрии или кога различните флуоресцентни ленти потекнуваат од различни делови на молекулата. 3
Концентрација моќност на флуоресценција? F = K(P 0 P) F моќност на флуоресценција (P 0 P) моќност на апсорбираното зрачење K константа која зависи од геометријата и ефикасноста на флуоресценција Ефикасност на флуоресценцијата или квантна ефикасност = број на флуоресцентни фотони/апсорбирани фотони При ниска концентрација: F = K P 0 c P 0 = const F = K c со пораст на концентрацијата и при А > 0,05 нарушена линеарност Ефект на примарен апсорпционен внатрешен филтер Ефект на самогаснење (self quenching) Концентрација интензитет на флуоресценција? 4
Инструменти за мерење на флуоресценција Hg, Xe или Hg-Xe лампа, ласер F зависи од моќноста зрачењето од изворот! Колку и какви селектори на λ? - двата филтри флуорометар - двата монохроматори спектрофлуорометар - хибрид = ексцитационен филтер + емисионен монохроматор Инструменти за мерење на флуоресценција а) флуорометар б) спектрофлуорометар 5
Примена Кои супстанци флуоресцираат? Структура флуоресценција Најинтензивна и најкорисна флуоресцентна емисија - соединенија со ароматични прстени, а помал е бројот на алифатични и алициклични карбонилни соединенија како и некои системи со конјугирани двојни врски кои исто така флуоресцираат. Повеќето несупституирани ароматични јаглеводороди флуоресцираат во раствор при што ефикасноста се зголемува со зголемување на бројот на прстени и со степенот на кондензираност. Наједноставните хетероциклкични соединенија (пирол, фуран, тиофен и пиридин) не флуоресцираат, додека кондензираните молекули кои ги содржат овие хетеропрстени (хинолин, изохинолин, индол и сл.) обично покажуваат молекулска флуоресценција. Супституцијата во ароматичниот прстен предизвикува поместувања на λ на апсорпција и соодветни промени на флуоресцентните ленти. Примена Кои супстанци флуоресцираат? Структура флуоресценција Големо влијание на ефикасноста на флуоресценцијата има: ригидноста (крутоста) на структурата - флуоресценцијата е особено фаворизирана во крути молекули. На пр. ефикасноста на флуоресценцијата кај флуорен е скоро 1, додека кај бифенил е околу 0,2 (спореди ги структурите). температурата - со пораст на температурата се намалува ефикасноста на флуоресценцијата бидејќи притоа се зголемува фреквенцијата на судири со што се зголемува веројатноста за релаксација со судири. типот на растворувачот - намалување на вискозноста на р-рувачот предизвикува намалена ефикасност на флуоресценцијата. Што ако аналитот не флуоресцира? Дериватизација = вметнување на флуоресцирачка група! Пр. Јонски маркер/позиционер за Ca 2+ или Na + во нервно ткиво, чиј емисион спектар се менува при врзување со некој од овие јони боја = Fura-2 6
Примена Квалитативна анализа? Не е техника за идентификација и структурна анализа! Пр. протечени отпадни масла Квантитативна анализа? ДА!!! Флуоресцентните методи се 10 до 1000 пати поосетливи од методите засновани на апсорпција, нивната осетливост може да се зголеми со: зголемување на интензитетот на ексцитационото зрачење (P 0 ) од кој директно зависи интензитетот на зрачењето добиено со флуоресценција (види ја равенката: од што зависи F?) засилување на сигналот од детекторот. Овие можности не постојат кај апсорпционите техники бидејќи во апсорбанцата всушност фигурира однос P 0 /P (A=log(P 0 /P) и со зголемување на P 0 пропорционално ќе се зголеми и P, што нема да доведе до зголемување на осетливоста. Примена Органски и биохемиски аналити Примената на флуорометријата за решавање на проблеми од органската и биохемиска анализа е импресивна: ароматични полициклични јаглеводороди, аминокиселини, протеини, коензими, витамини, нуклеински киселини, итн. Флуорометриски може да се определат и многу медицински супстанци (пеницилин, адреналин, алкилморфин, фенобарбитал, прокаин, резерпин, активни компоненти од лековитите растенија како што се хлорофил, алкалоиди, стероиди, флавоноиди итн.) анализа на прехранбени продукти, лекови, клинички примероци и природни производи, при што осетливоста и селективноста ја прават оваа метода извонредно погодна за овие анализи техника за детекција во течна хроматографија и електрофореза Неоргански видови: директни методи: аналит + флуоресцирачки комплекс индиректни методи: гасење (quenching) на флуоресценција при р-ја: аналит + флуоресцирачки реагенс 7
Молекулска фосфоресцентна спектроскопија Фосфоресценција појава слична на флуоресценција Разлика - времетраењето, но тоа потекнува од разлика во електронските спински состојби: - обични молекули во основна состојба синглетна - слободни радикали во основна состојба дублетна - ексцитирана состојба синглетна или триплетна Флуоресценција 10-5 s 10-4 -10 4 s Фосфоресценција Фосфоресценција: -Помалку веројатен премин со промена на спинска состојба триплет синглет - Мала ефикасност - се зголемува со Т и со атсорпција на пробата на цврста површина или молекулски јами (циклодекстрини) - Инструменти флуорометар + фосфороскоп Хемилуминисцентни методи: Реакции кои продуцираат светлина Хемилуминисценција продукт на хемиска реакција електронски ексцитирани молекули емитираат зрачење Се среќаваат во биолошки системи биолуминисценција! Пр. светулки, морска темјанушка, некои медузи, бактерии Предност: едноставна опрема нема извор (пробата свети!) инструмент = реакционен сад + фотомултипликатор Висока осетливост ppm-ppb определување на гасови (NO 2, O 3, SO x ) неоргански видови (H 2 O 2, метали...) имунолошки техники испитувања на DNA последователни реакции на полимерази (PCR) 8