ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΣΤΡΟΦΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ (γονίδιο φαινότυπος) Πρόσθεση εξωγενών γονιδίων (διαγονιδιακά) Τροποποίηση ενδογενών γονιδίων Αφαίρεση γονιδίων (knockout) ΥΠΟΘΕΣΗ Στοχευμένη μεταλλαξογένεση γονιδίων Ελεγχόμενη έκφραση γονιδίων (conditional) ΠΡΟΣΘΙΑ ΓΕΝΕΤΙΚΗ (φαινότυπος γονίδιο) Τυχαία μεταλλαξογένεση ΧΩΡΙΣ ΥΠΟΘΕΣΗ Ε Ντούνη
ΙΑΓΟΝΙ ΙΑΚΑ ΖΩΑ-TRANSGENIC ANIMALS Ηδιαδικασίακατάτηνοποίαπροστίθεταιέναεξωγενέςγονίδιο στο γονιδίωμα ενός οργανισμού και το γονίδιο αυτό μεταφέρεται στους απογόνους.
Τεχνικές διαγένεσης σε ζώα 1. DNA microinjection 2. DNA transfer via a transposon 3. DNA transfer via a lentiviral vector 4. DNA transfer via sperm 5. DNA transfer via ES cells 6. DNA transfer via cloning ιαγονιδιακά ποντίκια ιαγονιδιακά κτηνοτροφικά ζώα
ημιουργία διαγονιδιακών ζώων Τεχνική μικροένεσης DNA σε προπυρήνες γονιμοποιημένων ωαρίων Με χρήση λεντιιών
Α) γονιδιωματική περιοχή ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΔΙΑΓΟΝΙΔΙΟΥ Υποκινητής 3 UTR Β) cdna Υποκινητής cdna 3 UTR
ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗΣ Χρησιμοποιείται οποιοδήποτε κλωνοποιημένο τμήμα DNA (γενομικό, cdna) Απαραίτητη είναι η ύπαρξη τουλάχιστον ενός εσωνίου στην κατασκευή Aφαιρούνται οι προκαρυωτικές αλληλουχίες των πλασμιδίων φορέων ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ DNA Απομόνωση κλώνου που περιέχει την γονιδιακή κατασκευή Πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσες Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Πέψη με β αγαράση Απομόνωση DNA από κολώνα Ποσοτική εκτίμηση Συγκέντρωση DNA: 4-6 ng/ml ( ~ 500 αντίγραφα)
Δημιουργία διαγονιδικών ζώων με μικροένεση Γιατί; Μελέτη της υπερέκφρασης μιας πρωτεΐνης Πως; Ενσωμάτωση του διαγονιδίου : τυχαία στο γονιδίωμα Έκφραση: (υποκινητής) Ιστοειδική Εκτοπική
Tg : διαγονιδιακό ποντίκι Founder : ιδρυτής σειράς concatemers Ενσωμάτωση του διαγονιδίου : τυχαία σε μία ή > θέσεις Αριθμός αντιγράφων : ένα ή περισσότερα Μωσαϊκισμός : 30-40% των ιδρυτών
H έκφραση ενός διαγονιδίου εξαρτάται από: 1. Τον υποκινητή, δηλ. αν είναι ισχυρος ή ιστοειδικός 2. Την θέση ενσωμάτωσης, που είναι πάντα τυχαία ευχρωματίνη ετεροχρωματίνη έκφραση έκφραση BAC κλώνοι ή Αλληλουχίες «θέσης ελέγχου περιοχών» (Locus Control region, LCR) Επιτρέπουν έκφραση του διαγονιδίου: 1. ανεξάρτητη της θέσης ενσωμάτωσης 2. ανάλογη του αριθμού των αντιγράφων
Ποσοστά επιβίωσης στα διάφορα στάδια Μετά από μικροένεση: 75% Μετά την εμφύτευση: 20% Ποσοστό διαγονιδιακών: 25% 200 αυγά 150 αυγά 30 ποντίκια 7 διαγονιδιακά Τεχνικές ταυτοποίησης διαγονιδιακών ποντικών Υβριδοποίηση A B C Southern blot Φυσιολογικό HL-60 E1334 E1335 E1322 Slot blot mu p55υ hu p75υ PCR Φυσιολογικό E1334 E1335 E1322
Παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεϊνών από κτηνοτροφικά ζώα 1. Επιλογή υποκινητών γονιδίων που εκφράζονται σε κύτταρα του μαστικού αδένα π.χ. καζεΐνη, β-γαλακτοσφαιρίνη 2. Προετοιμασία διαγονιδιακής κατασκευής 3. Εισαγωγή διαγονιδίου στον προπυρήνα γονιμοποιημένου ωαρίου με μικροένεση 4. Εμφύτευση σε θετή μητέρα 5. Ταυτοποίηση διαγονιδιακών απογόνων με PCR 6. Συλλογή γάλακτος 7. Απομόνωση και καθαρισμός φαρμακευτικής πρωτεΐνης απότογάλα
Πλεονεκτήματα τεχνικής μικροένεσης εν υπάρχει περιορισμός στο μέγεθος του διαγονιδίου (μπορεί να χρησιμοποιηθούν κλώνοι BACs μεγέθους 200kb). Η έκφραση του διαγονιδίου παραμένει συνήθως σταθερή και δεν μειώνεται από επιγενετικούς μηχανισμούς. εν εμφανίζονται προβλήματα που σχετίζονται με τοξικότητα, ενεργοποίηση του ανοσολογικού συστήματος με φλεγμονώδεις αντιδράσεις.
Μειονεκτήματα τεχνικής μικροένεσης Η τυχαία ενσωμάτωση μπορεί να δημιουργήσει προβλήματα (καταστροφή ενδογενών γονιδίων, νεοπλασίες) Χαμηλή αποτελεσματικότητα ~4% σε ποντίκια ~1% σε κτηνοτροφικά ζώα (30.000$ διαγονιδιακός χοίρος, 300.000$ διαγονιδιακή αγελάδα) Τεχνικές δυσκολίες: Το κυτταρόπλασμα των χοίρων και των βοοειδών είναι αδιαφανές σε αντίθεση με αυτό των τρωκτικών, κάτι που καθιστά τον εντοπισμό των προπυρήνων δύσκολο.
ημιουργία διαγονιδιακών ζώων Τεχνική μικροένεσης DNA σε προπυρήνες γονιμοποιημένων ωαρίων Με χρήση λεντιιών: ανήκουν στους ρετροϊούς και ενσωματώνονται στο γονιδίωμα των κυττάρων στόχων
ΡΕΤΡΟΙΟΙ Αποτελείται από: Ένα εξωτερικό φάκελο που προέρχεται από την κυτταρική μεμβράνη του κυττάρου ξενιστή Αρκετά αντίγραφα μιας πρωτεΐνης φακέλου που βρίσκεται στην λιπιδική διπλοστιβάδα του φακέλου Ένα καψίδιο; Ένα πρωτεινικό κέλυφος που περιβάλει: δύο μόρια RNA και το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase) Το γονιδίωμα των ρετροιών περιβάλλεται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες ("R") που επιτρέπουν ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή λειτουργούν ως ενισχυτής
ημιουργία διαγονιδιακών ζώων με λεντιιούς ημιουργία ανασυνδυασμένου λεντιικού φορέα που φέρει το διαγονίδιο
Σύγκριση των δύο τεχνικών Σε πολλά ζώα τα ωάρια είναι αδιαφανή οπότε δεν ενδείκνυται η μικροένεση. Επειδή η διαφανής ζώνη αποτελεί φυσικό εμπόδιο για την λεντιική μόλυνση, ο ανασυνδυασμένος ιός ενίεται μεταξύ της κυτταρικής μεμβράνης και της διαφανούς ζώνης.
Σύγκριση των δύο τεχνικών στον χοίρο Λεντιιοί: υψηλότερα ποσοστά στον αριθμό των διαγονιδιακών χοίρων ανά αριθμό ενεθέντων εμβρύων. υψηλότερα ποσοστά στον αριθμό των διαγονιδιακών χοίρων που εκφράζουν το διαγονιδίο
Σύγκριση των δύο τεχνικών
Μειονεκτήματα χρήσης λεντιιών Μειωμένη ικανότητα μεταφοράς μεγάλης ποσότητας γενετικού υλικού (< 8 kb). Η ενσωμάτωση του ιού όπως και στην μέθοδο μικροένεσης είναι τυχαία. Άρα πάντα υπάρχει η πιθανότητα αλλαγής στην έκφρασης ενδογενών γονιδίων (ανάπτυξη κακοήθειας). Παύση έκφρασης διαγονιδίου από επιγενετικούς μηχανισμούς. Προβλήματα που σχετίζονται με τοξικότητα, έντονη ενεργοποίηση του ανοσολογικού συστήματος με φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Παθογονικότητα ιού: εξακολουθεί να υπάρχει ο κίνδυνος ο ιός να αρχίσει να αναπαράγεται Όχι καλά αποσαφηνισμένη η χρονική διάρκεια παραμονής του γενετικού υλικού στον ιστό-κύτταρο στόχο και ακόλουθη μείωση της αρχικής δραστικότητας. Πρακτικά προβλήματα (οικονομικά, προβλήματα ασφάλειας).
Τεχνικές διαγένεσης σε κτηνοτροφικά ζώα 1. DNA microinjection 2. DNA transfer via a transposon 3. DNA transfer via a lentiviral vector 4. DNA transfer via sperm 5. DNA transfer via ES cells 6. DNA transfer via cloning
Σταθμοί στην διαγένεση και κλωνοποίηση κτηνοτροφικών ζώων
Παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεΐνών από γάλα διαγονιδιακών ζώων Ε Ντούνη
Παραδείγματα διαγονιδιακών ζώων Παραγωγή αντιθρομβίνης-α από διαγονιδιακές αίγες (θρόμβωση) Παραγωγή λακτοφερίνης σε αγελάδες (αντιβακτηριδιακές ιδιότητες) Παραγωγή ενζύμου αναστολέα της C1-εστεράσης (οιδήματα) Παραγωγή αντισωμάτων από αγελάδες (ανοσοανεπάρκειες) Παραγωγή λυσοζύμης σε αυγά (λοιμώξεις) ημιουργία χοίρων που απελευθερώνουν λιγότερο φωσφόρο στο περιβάλλον ημιουργία διαγονιδιακών ψαριών για γρηγορότερη ανάπτυξη και αύξηση βάρους
Παραγωγή α-αντιθρομβίνης από διαγονιδιακές αίγες Πλεονεκτήματα Μεγάλη παραγωγή = 90.000 δείγματα αίματος ιαγονιδιακά=2-10γρ πρωτεΐνης ανά λίτρο Βακτήρια ή κυτταρικές σειρές= 0.2γρ πρωτεΐνης ανά λίτρο καλλιέργειας Κόστος Καθαρισμός Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις Μειονεκτήματα Κόστος παραγωγής διαγονιδιακών ζώων Ευζωία των διαγονιδιακών ζώων Μετάδοση ασθενειών Αναπαραγωγή με φυσικό πληθυσμό
Εφαρμογές τεχνολογίας διαγονιδιακών συστημάτων Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης in vivo ημιουργία πειραματικών μοντέλων ασθενειών του ανθρώπου Ανάλυση των μοριακών, κυτταρικών μηχανισμών που εμπλέκονται στην επαγωγή του φαινοτύπου οκιμές νέων φαρμακευτικών ουσιών στα μοντέλα ασθενειών ημιουργία οργανισμών με νέα βελτιωμένα χαρακτηριστικά χρήσιμα στην ιατρική (π.χ. παραγωγή ινσουλίνης), στην κτηνοτροφία και στην γεωργία Γονιδιακή θεραπεία Ξενομεταμοσχεύσεις
Προβληματισμοί Μετάδοση ασθενειών στον άνθρωπο μέσω ξενομεταμοσχεύσεων (πχ. νόσοςτωντρελώναγελάδων) Ευζωίας των διαγονιδιακών ζώων λόγω εκδήλωσης κληρονομήσιμης ασθένειας Αναπαραγωγή με φυσικούς πληθυσμούς Ασφάλεια καταναλωτών Ο άνθρωπος επεμβαίνει στη φύση προς ίδιον όφελος
Ευζωία Animal welfare Καταστροφή εμβρύων Η γενετική τροποποίηση δεν θα πρέπει να επιβαρύνει την υγεία και ευζωία των ζώων Έγκριση πειραματισμού και συνθηκών διαβίωσης από αρμόδιες αρχές Η βιοτεχνολογία μπορεί να οφελήσει τα ζώα: Ανθεκτικότητα σε ασθένειες Απαλλαγή από χαρακτηριστικά που συχνά προκαλούν τραυματισμούς (πχ κέρατα) Εάν αναπαράγονται πιο αποτελεσματικά σε σχέση με το επιλεκτικό ζευγάρωμα
Λειτουργική ανάλυση διαγονιδιακών ζώων 1. Ανάλυση της έκφρασης σε επίπεδο RNA RT-PCR, Northern blot, In situ εντοπισμός της έκφρασης σε ιστούς 2. Αναλυση της έκφρασης σε επίπεδο πρωτεΐνης Western blot Ανοσοϊστοχημεία Κυτταρομετρία ροής ELISA σε ορό Λειτουργικές δοκιμές 3. Φαινοτυπική ανάλυση Κλινικά συμπτώματα (βάρος) Βιωσιμότητα Ιστοπαθολογία