ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Μελέτη υβριδικών μαγνητικών νανοσωματιδίων για την ελεγχόμενη χορήγηση αντικαρκινικών ουσιών Αναγνώστου Ελένη-Χριστίνα ΒΙΟΛΟΓΟΣ Πάτρα, 2012 1

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Αναγνώστου Ελένη-Χριστίνα ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Αναπλ. Καθηγητής Κ. Αυγουστάκης Λέκτορας Α. Μπακανδρίτσος Αναπλ. Καθηγήτρια E. Παπαδημητρίου 2

Το πόνημά μου αυτό ειναι αφιερωμένο στους γονείς μου 3

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε κατά τα έτη 2010-2012 στο τμήμα Επιστήμης των Υλικών. Πρώτα απ όλα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Κωνσταντίνο Αυγουστάκη Αναπληρωτή Καθηγητή Φαρμακευτικής Τεχνολογίας ο οποίος μου έδωσε την ευκαιρία να εργαστώ πάνω σε ένα νέο για εμένα επιστημονικό πεδίο, αυτό της νανοτεχνολογίας. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στο λέκτορα κ. Αριστείδη Μπακανδρίτσο, ο οποίος ήταν πάντα δίπλα μου καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της μεταπτυχιακής μου έρευνας. Οι συμβουλές και η καθοδήγησή του διαδραμάτησαν καταλυτικό ρόλο για την ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τις μεταπτυχιακές φοιτήτριες με τις οποίες δούλεψα κατά διαστήματα στον ίδιο χώρο Δήμητρα Τζαβάρα και Έφη Βούλγαρη καθώς επίσης και τον φοιτητή Αργύρη Κολοκυθά-Ντούκα για τη διαμόρφωση ενός ευχάριστου και θετικού κλίματος στα πλαίσια του εγαστηρίου. Τέλος, οφείλω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στους γονείς μου για την υλική και ηθική στήριξή τους όλο αυτό το διάστημα. 4

Πίνακας συντομογραφιών DOX: Doxorubicin, Δοξορουβικίνη PBS: Phosphate buffered saline, Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών NaCl: Sodium chloride, Χλωριούχο νατριο DLS: Dynamic light scattering, Δυναμική σκέδαση φωτός PEG: Polyethylene glycol, Πολυαιθυλενογλυκόλη MLV: Multilamellar vesicles, Πολυστοιβαδιακά σωματίδια LUV: Large unilamellar vesicles, Μεγάλα μονοστοιβαδιακά σωματίδια SUV: Small unilamellar vesicles, Μικρά μονοστοιβαδιακά σωματίδια HPMA: N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide, Ν-(2-υδροξυπροπυλο) μεθυλακρυλαμίδιο FITC: Fluorescein isothiocyanate, Ισοθειοκυανική φλουοροσκείνη EPR: Enhanced permeability and retention effect, Φαινόμενο ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης PLGA: Poly (lactic-co-glycolic acid), Πολυ (γαλακτικό-συν-γλυκολικό οξύ) MPS: Mononuclear phagocyte system, Μονοπυρηνικό σύστημα φαγοκυττάρων Spions: Superparamagnetic iron oxide nanoparticles, Υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια σιδήρου MNPs: Magnetic nanoparticles, Μαγνητικά νανοσωματίδια Tween 80: Polysorbate 80, Πολυσορβικό 80 MRI: Magnetic resonance imaging, Μαγνητική τομογραφία NMR: Nuclear magnetic resonance, Πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός IMS: Ion mobility spectrometry, Φασματομετρία κινητικότητας ιόντων FACS: Fluorescence-activated cell sorting, Κυτταρομετρία ροής διαλογής κυττάρων MDT: Magnetic drug targeting, Μαγνητική στόχευση φαρμάκων FDA: Food and drug administration, Οργανισμός τροφίμων και φαρμάκων των ΗΠΑ 5

Περίληψη Στο τομέα της νανοϊατρικής ένας από τους σημαντικότερους στόχους είναι η ανάπτυξη φαρμακευτικών νανοφορέων που θα μεταφέρουν και θα αποδεσμεύουν εκλεκτικά το φάρμακο στον πάσχοντα ιστό. Η χορήγηση δοξορουβικίνης (Dox), για παράδειγμα, εμφανίζει σημαντικά προβλήματα έλλειψης εκλεκτικότητας και συστημικής τοξικότητας. Μία πιθανή προσέγγιση για την περισσότερο εκλεκτική χορήγηση της Dox στους καρκινικούς όγκους είναι η χορήγηση της μετά τον εγκλεισμό της σε μαγνητικά στοχευόμενους νανοφορείς. Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ειδίκευσης ήταν η μελέτη μαγνητικών νανοφορέων με βάση συμπολυμερή πολύ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολύ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(maa-g-egma) με διαφορετικά χαρακτηριστικά πολυμερικού κελύφους και ο προσδιορισμός εκείνων των χαρακτηριστικών που προσδίδουν στους νανοφορείς βέλτιστη συμπεριφορά. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η σταθερότητα των μαγνητικών νανοφορέων με διαφορετικό μήκος αλυσίδων πολύ(αιθυλενογλυκόλης) και διαφορετική πυκνότητα αρνητικού φορτίου σε διάφορα μέσα όπως υδατικά διαλύματα χλωριούχου νατρίου (ΝαCl), ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS), δοξορουβικίνης καθώς επίσης και σε υδατικά διαλύματα διαφόρων τιμών ph. Μελετήθηκε επίσης η φόρτωση του φαρμάκου σε αυτούς καθώς επίσης και η αποδέσμευση του από τους συγκεκριμένους νανοφορείς σε διάφορα μέσα (νερό, υδατικό διάλυμα PBS και διάλυμα αλβουμίνης σε PBS). Οι νανοφορείς παρασκευάστηκαν μέσω πρόσδεσης του συμπολυμερούς πολυ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολυ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(maa-g-egma) στην επιφάνεια νανοκρυσταλλιτών Fe 2 O 3 κατά τη διάρκεια ανάπτυξής τους. Η μελέτη της σταθερότητας έγινε με τη μέθοδο της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Η μελέτη της φόρτωσης και της αποδέσμευσης του φαρμάκου στους και από τους νανοφορείς έγινε με τη μέθοδο της φασματοφωτομετρίας φθορισμού. Στο πρώτο κεφάλαιο παρουσιάζονται συνοπτικά τα διάφορα είδη νανοφορέων, οι ιδιότητες καθώς και οι εφαρμογές αυτών. Γίνεται επίσης μια σύντομη βιβλιογραφική ανασκόπηση σε ότι αφορά τη φόρτωση και αποδέσμευση φαρμάκων από νανοφορείς. Το δεύτερο κεφάλαιο είναι αφιερωμένο στις τεχνικές και τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν στα πλάισια της συγκεκριμένης εργασίας καθώς επίσης και των πειραματικών διαδικασιών.τέλος, το τρίτο κεφάλαιο αφορά στην παράθεση και τον σχολιασμό των αποτελεσμάτων,τα οποία μπορούν να συνοψιστούν στα εξής συμπεράσματα: Οι μαγνητικοί νανοφορείς με βάση συμπολυμερή πολύ(μεθακρυλικού οξέος)-gπολύ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(maa-g-egma) έχουν ικανοποιητικά 6

χαρακτηριστικά μεγέθους και ζ δυναμικού για παρατεταμένη παραμονή στην κυκλοφορία μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, γεγονός που αποτελεί προϋπόθεση για την εφαρμογή τους ως συστήματα εκλεκτικής μεταφοράς (στόχευσης) αντικαρκινικών φαρμάκων. Οι υψηλές τιμές φόρτωσης της δοξορουβικίνης στους νανοφορείς με υψηλή πυκνότητα ανιονικών φορτίων, λόγω ισχυρότερων ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων με το θετικά φορτισμένο φάρμακο αποτελεί σημαντικό πλεονέκτημα των νανοφορέων αυτών σαν συστήματα χορήγησης δοξορουβικίνης. Η αύξηση του ρυθμού αποδέσμευσης της δοξορουβικίνης από τους νανοφορείς σε διαλύματα αλβουμίνης με ελάττωση του ph είναι σημαντική καθώς παρέχει τη δυνατότητα μιας σχετικά εκλεκτικής διάθεσης του φαρμάκου στους καρκινικούς όγκους όπου επικρατούν συνθήκες χαμηλότερου από το το φυσιολογικό ph. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα που λήφθηκαν δικαιολογούν την περαιτέρω μελέτη των μαγνητικών νανοφορέων δοξορουμπικίνης για την καταλληλότητά τους ως φορείς στοχευμένης χορήγησης του φαρμάκου σε καρκινικούς όγκους. 7

Abstract In the field of nanomedicine, one of the most important targets is the development of functional nanoassemblies which will deliver and release selectively the drug to the suffering tissue. For example, the administration of doxorubicin (Dox) displays lack of selectivity and systemic toxicity issues. A possible approach towards a more selective delivery of Dox to the target tissue is its encapsulation at magnetically targeted nanoparticles. The present postgraduate thesis aim was the study of magnetic nanocarriers based on copolymers of poly(methacrylic acid)- graft -poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(maa -g- EGMA)) with different structural characteristics and the determination of those characteristics, that impart to the nanocarriers the optimal performance. Specifically, the stability of magnetic nanoparticles, with different chain length of poly(ethyleneglycol) and different density of negative charges, was studied at various media such as NaCl, ph and Dox concentration. The drug loading in the nanocarriers was also studied, as well as its release by the specific nanocarriers at various media (distilled water, PBS and albumin solution in PBS). The nanoparticles were prepared via a self-assembly process of the polymers [poly(methacrylic acid)-graft-poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(maa-g-egma)] on the surface of the growing iron oxide nanocrystallites. The stability studies were performed with the use of DLS technique. The study of the drug loading and release from the nanoparticles was followed using the fluorescence spectroscopy. In the first chapter, the various types of nanoparticles, their properties, as well as their applications are presented briefly. Additionally, a short literature review with regard to the loading and release of drugs from nanoparticles is presented. The second chapter refers to the techniques and methods that were utilized in the context of the present thesis, as well as to the experimental procedures. Finally, in the third chapter the experimental results are presented and discussed. Based on the results of this study: The magnetic nanocarriers based on copolymers poly(methacrylic acid)- graft - poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(maa -g- EGMA)) have satisfying characteristics of size and z potential for long blood residence time after an intravenous injection, which is a prerequisite for their application as controlled (targeted) delivery systems for anticancer drugs. 8

The high values of doxorubicin loading without stability loss is an important advantage. The increase in the release rate of doxorubicin by the nanocarriers in albumin solutions with low ph (5-6) is important, since it facilitates a relatively selective release of the drug in cancer tumors which display lower ph than that of the normal tissues. In conclusion, the results of the research justify the further in-vitro study of the suitability of the magnetic doxorubicin nanocarriers as selective delivery systems of the drug to the cancer tumors. 9

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο :ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... σελ.13 1. ΓΕΝΙΚΑ... σελ.13 2. ΕΙΔΗ ΝΑΝΟΦΟΡΕΩΝ... σελ.13 2.1 Λιπιδικοί νανοφορείς (λιποσώματα)... σελ.13 2.1.1 Ταξινόμηση των λιποσωμάτων... σελ.14 2.1.2 Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος... σελ.14 α. MLV s-multilamellarvesicles (μεγάλα πολυστοιβαδιακά σωματίδια)... σελ.14 β. LUV s και IUV s- LargeunilamellarvesiclesandIntermediateunilamellarvesicles (μεγάλα και μεσαίου μεγέθους μονοστοιβαδιακά σωματίδια)... σελ.14 γ. SUV s-smallunilamellarvesicles (μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα)... σελ.15 2.1.3 Ταξινόμηση με βάση τη σύσταση και τις εφαρμογές... σελ.15 α. Συμβατικά λιποσώματα... σελ.15 β. Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας... σελ.15 γ. Ανοσολιποσώματα... σελ.16 δ. Κατιονικά λιποσώματα... σελ.16 ε. Λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη... σελ.16 2.2 Συζευγμένα με φάρμακο πολυμερή... σελ.16 2.3 Πολυμερικά νανοσωματίδια... σελ.17 2.4 Πολυμερικά μικκύλια... σελ.19 2.5 Δενδριμερή... σελ.19 2.6 Ιικά νανοσωματίδια... σελ.20 2.7 Νανοσωλήνες άνθρακα... σελ.20 2.8 Νανοσφαίρες... σελ.21 2.9 Νανοκάψουλες... σελ.22 3. ΦΥΣΙΚΗ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ... σελ.22 10

3.1 Φυσική στόχευση... σελ.23 3.2 Μοριακή στόχευση... σελ.24 4. ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΦΑΡΜΑΚΩΝ. σελ.25 5. ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΝΑ ΞΕΠΕΡΑΣΟΥΝ ΤΗΝ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΑ ΦΑΡΜΑΚΑ... σελ.26 6. ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ... σελ.28 6.1 Μέγεθος σωματιδίων... σελ.28 6.2 Τοξικότητα και βιοσυμβατότητα των σωματιδίων... σελ.29 6.3 Επιφανειακό φορτίο... σελ.32 6.4 Ικανότητα προσρόφησης πρωτεινών... σελ.34 7. ΧΡΟΝΟΣ ΕΚΚΑΘΑΡΙΣΗΣ (CLEARANCETIME)... σελ.34 8. ΦΟΡΤΩΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΦΑΡΜΑΚΟΥ... σελ.35 9. ΦΟΡΤΩΣΗ ΦΑΡΜΑΚΟΥ... σελ.36 10. ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΦΑΡΜΑΚΟΥ... σελ.36 11. ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗΣ... σελ38 12. ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗΣ... σελ.38 13. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΩΝ... σελ.41 14. ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗ ΧΡΟΝΙΚΑ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ... σελ.42 15. ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΣΕ ΟΤΙ ΑΦΟΡΑ ΤΗΝ ΚΑΤΑΝΟΜΗ... σελ.44 16. ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΜΑΓΝΗΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΓΙΑ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΑΡΜΑΚΟΥ... σελ.45 17. ΕΙΔΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ... σελ.47 17.1 Πολυμερική επίστρωση... σελ.48 18. ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΥΒΡΙΔΙΚΩΝ ΝΑΝΟΔΟΜΩΝ... σελ.48 19. ΒΙΟΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΜΑΓΝΗΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ... σελ.49 20. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΥΠΕΡΠΑΡΑΜΑΓΝΗΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ... σελ.50 20.1 Invitro χρήση των SPIONs... σελ.50 11

20.2 In vivo εφαρμογές των SPIONs... σελ.51 20.2.1 Μαγνητική τομογραφία (Magnetic resonance imaging)... σελ.51 20.2.2 Μαγνητική στόχευση φαρμάκων (MDT)... σελ.52 20.2.3 Υπερθερμία με μαγνητικά ρευστά... σελ.54 21. ΤΑ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΡΗΣΗ... σελ.56 22. ΔΟΞΟΡΟΥΒΙΚΙΝΗ... σελ.56 22.1 Εισαγωγή... σελ.56 22.2 Κλινικές χρήσεις... σελ.58 22.3 Μηχανισμοί δράσης... σελ.58 22.3.1. Παραγωγή ελευθέρων ριζών... σελ.58 22.3.2. Αναστολή της τοποϊσομεράσης ΙΙ... σελ.59 22.3.3. Απόπτωση... σελ.60 22.3.4. Αναστολή Πρωτεασώματος... σελ.61 22.3.5. Παρεμβολή στο DNA... σελ.62 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο : ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ... σελ.63 1. ΔΥΝΑΜΙΚΗ ΣΚΕΔΑΣΗΣ ΦΩΤΟΣ... σελ.63 2. ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΦΩΤΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ... σελ.64 2.1 Αρχή λειτουργίας φασματοσκοπίας φωτοφωταύγειας (PL)... σελ.64 2.2 Οργανολογία φασματοσκοπίας φωτοφωταύγειας... σελ.65 2.3 Εφαρμογές της φασματοσκοπίας φωτοφωταύγειας... σελ.66 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο : ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... σελ.67 1. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ... σελ.67 1.1 Υλικά και ουσίες... σελ.67 1.2 Όργανα και συσκευές... σελ.67 2. ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ... σελ.68 2.1 Χαρακτηρισμός νανοσωματιδίων... σελ.68 12

2.1.1 Προσδιορισμός μεγέθους νανοσωματιδίων... σελ.68 2.2 Προσδιορισμός ζ-δυναμικού νανοσωματιδίων... σελ.68 3. ΜΕΛΕΤΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ... σελ.68 3.1 Σταθερότητα των νανοσωματιδίων σε υδατικά διαλύματα NaCl... σελ.68 3.2 Σταθερότητα των νανοσωματιδίων σε υδατικό διάλυμα PBS... σελ.69 3.3 Σταθερότητα των νανοσωματιδίων σε υδατικά διαλύματα διαφόρων τιμών ph... σελ.69 3.4 Σταθερότητα των φορτωμένων με δοξορουβικίνη νανοσωματιδίων σε υδατικά διαλύματα NaCl... σελ.69 3.5 Επίδραση της παρουσίας της δοξορουβικίνης στα χαρακτηριστικά των νανοφορέων σελ.70 4. ΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ... σελ.70 5. ΦΟΡΤΩΣΗ ΔΟΞΟΡΟΥΒΙΚΙΝΗΣ... σελ.70 6. ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΔΟΞΟΡΟΥΒΙΚΙΝΗΣ... σελ.71 6.1 Αποδέσμευση σε Η 2 Ο... σελ.71 6.2 Αποδέσμευση σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS)... σελ.72 6.3 Αποδέσμευση σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 7.4... σελ.73 6.4 Αποδέσμευση σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 6.06... σελ.73 6.5 Αποδέσμευση σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 5.22... σελ.74 7. ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΚΑΜΠΥΛΩΝ... σελ.75 7.1 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης δοξορουβικίνης σε νερό... σελ.75 7.2 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης δοξορουβικίνης σε PBS... σελ.76 7.3 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης δοξορουβικίνης σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 7.4... σελ.77 7.4 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης δοξορουβικίνης σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 6.06... σελ.77 7.5 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης δοξορουβικίνης σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 5.22... σελ.78 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο : ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ... σελ.80 1. ΔΟΜΗ ΝΑΝΟΦΟΡΕΩΝ... σελ.80 13

1.1 Δομικός χαρακτηρισμός του υβριδικού συστήματος μέσω σκέδασης νετρονίων σε μικρές γωνίες (SANSPOL) και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης (TEM)... σελ.81 2. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ... σελ.84 2.1 Προσδιορισμός μεγέθους και ζ-δυναμικού νανοσωματιδίων... σελ.84 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ... σελ.84 3.1 Σταθερότητα των νανοσωματιδίων σε υδατικά διαλύματα NaCl... σελ.85 3.2 Σταθερότητα των νανοσωματιδίων σε υδατικά διαλύματα διαφόρων τιμών ph... σελ.89 3.3 Σταθερότητα των φορτωμένων με δοξορουβικίνη νανοσωματιδίων σε υδατικά διαλύματα NaCl... σελ.91 3.4 Επίδραση της παρουσίας δοξορουβικίνης στα χαρακτηριστικά των νανοφορέων... σελ.93 3.5 Σταθερότητα των νανοσωματιδίων σε υδατικό διάλυμα PBS... σελ.94 4. ΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ... σελ.97 5. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΦΟΡΤΩΣΗΣ ΔΟΞΟΡΟΥΒΙΚΙΝΗΣ... σελ.101 6. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗΣ ΔΟΞΟΡΟΥΒΙΚΙΝΗΣ... σελ.104 6.1 Μελέτη της αποδέσμευσης δοξορουβικίνης σε PBS... σελ.104 6.2 Μελέτη της αποδέσμευσης δοξορουβικίνης σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 7.4... σελ.106 6.3 Συγκριτική μελέτη της αποδέσμευσης δοξορουβικίνης από το νανοφορέα Mag102-6 σε διαλύματα αλβουμίνης σε PBS σε τιμές ph 7.4, 6.06 και 5.22... σελ.107 7. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... σελ.109 8. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... σελ.110 14

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 0 ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΓΕΝΙΚΑ Οι νανοεπιστήμες και η νανοτεχνολογία διαδραματίζουν σήμερα σημαντικό ρόλο στο τομέα της ιατρικής και της φαρμακευτικής τεχνολογίας, όπως για παράδειγμα σε ότι αφορά την ανίχνευση νόσων και την ελεγχόμενη χορήγηση φαρμάκων. Οι δυνατότητες των νανοϋλικών έχουν προσελκύσει τεράστιο ενδιαφέρον. Το ενδιαφέρον γύρω από τα νανοσωματίδια εστιάζεται στο μέγεθος τους και στη μεγάλη ελεύθερη επιφάνεια η οποία μπορεί να τροποποιηθεί [1]. Επιπλέον, τα νανοσωματίδια μπορούν να έχουν εύκολα πρόσβαση σε διάφορες περιοχές του σώματος και να αλληλεπιδρούν με βιολογικά συστήματα σχεδόν σε μοριακό επίπεδο. Καθώς η γνώση για τις διάφορες πολυλειτουργικές και υβριδικές νανοδομές εμπλουτίζεται και εξελίσεται, νέες προκλήσεις που πρέπει να αντιμετωπιστούν ανακύπτουν. Έτσι, ενώ σχεδιάζονται υβριδικές νανοδομές, η προσοχή πρέπει να στραφεί σε ορισμένα χαρακτηριστικά που είναι απαραίτητα για την αποτελεσματική στόχευση. Αυτά περιλαμβάνουν (i) κάθαρση από την κυκλοφορία, (ii) την μεταφορά του συστήματος φάρμακο-νανοφορέας και την αποδέσμευση του φαρμάκου στη θέση-στόχο, και (iii) την αποτελεσματική αποβολή του νανοφορέα από το σώμα. 2. ΕΙΔΗ ΝΑΝΟΦΟΡΕΩΝ Κατά τη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών, πολλά είδη νανοφορέων έχουν μελετηθεί σε ότι αφορά τη χρήση τους σε θεραπευτικές εφαρμογές όπως είναι τα λιποσώματα, τα συζευγμένα με φάρμακο πολυμερή, τα πολυμερικά μικύλλια, τα δενδριμερή, τα nanoshells, τα νανοσωματίδια βασισμένα σε νουκλεικό οξύ (nucleic acid-based nanoparticles) κ.ά. Οι δύο κυρίαρχες τάξεις των νανοσωματιδίων,τα λιποσώματα και τα πολυμερή, αντιπροσωπεύουν πάνω από το 80% των διαθέσιμων νανοσωματιδίων στην κλινική χρήση. 15

2.1 Λιπιδικοί νανοφορείς (λιποσώματα) Τα λιποσωμικά συστήματα μεταφοράς φαρμάκων έχουν γνωρίσει ευρεία ανάπτυξη με διάφορα λιποσωμικά φάρμακα να βρίσκονται σε κλινικές δοκιμές ή να κυκλοφορούν ήδη στην αγορά.τα λιποσώματα (σχήμα 1) είναι κυστίδια που αποτελούνται κυρίως από φωσφολιπίδια, τα οποία σχηματίζουν διπλοστοιβάδες συγκροτώντας μακρομοριακές δομές γνωστές ως πολυστοιβαδικά κυστίδια (MLV) [2]. Η βιοσυμβατή και βιοδιασπώμενη σύνθεσή τους, καθώς και η μοναδική ικανότητά τους να εγκλωβίζουν τόσο υδρόφιλα όσο και υδρόφοβα φάρμακα, τα καθιστούν άριστους θεραπευτικούς φορείς. Τα λιποσώματα μπορεί επίσης να είναι επικαλυμμένα με βιοσυμβατά πολυμερή, όπως η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) για να παρατείνουν το χρόνο παραμονής τους στην κυκλοφορία του αίματος [3]. Η πολυμερική επικάλυψη των λιποσωμάτων μπορεί επίσης να σχεδιαστεί ώστε να εκφράζει λειτουργικές ομάδες, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη σύζευξη ενός προσδέτη στόχευσης. Σχήμα 1: Λιποσώματα [4] 2.1.1 Ταξινόμηση των λιποσωμάτων Τα λιποσώματα ταξινομούνται σε διαφορετικές κατηγορίες ανάλογα με το μέγεθος,τη σύσταση και τις εφαρμογές τους, τη μέθοδο παρασκευής κ.ά. 2.1.2 Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος α.mlv s-multilamellar vesicles (μεγάλα πολυστοιβαδιακά σωματίδια) Αποτελούνται από ένα μεγάλο αριθμό παράλληλων, ομόκεντρων φωσφολιπιδικών διπλοστοιβάδων. Η κυριότερη μέθοδος παρασκευής τους είναι αυτή της ενυδάτωσης λεπτού λιπιδικού υμενίου. Τα λιποσώματα αυτά έχουν μεγάλες και ετερογενείς διαμέτρους (1-10 μm), 16

χαμηλή ικανοτητα εγκλωβισμού όγκου ανά μόριο λιπιδίου και παρουσιάζουν πολλαπλά εσωτερικά διαμερίσματα. β.luv s και IUV s- Large unilamellar vesicles and Intermediate unilamellar vesicles (μεγάλα και μεσαίου μεγέθους μονοστοιβαδιακά σωματίδια) Έχουν διάμετρο της τάξης των 1000 nm και είναι μονοστοιβαδιακά. Ανάλογα με το επιθυμητό μέγεθος μπορούν να παρασκευασθούν με διάφορες μεθόδους, όπως είναι η απομάκρυνση απορρυπαντικού, η μηχανική διασπορά και τα διφασικά συστήματα. Θεωρούνται κατάλληλα για τον εγκλωβισμό υδατοδιαλυτών υλικών. γ.suv s-small unilamellar vesicles (μικρά μονοστοιβαδιακά λιποσώματα) Αποτελούνται μόνο από μια διπλοστοιβάδα και έχουν διάμετρο 20-100 nm. Οι μέθοδοι παρασκευής τους είναι η κατεργασία με υπέρηχους και η μέθοδος διαδοχικών κύκλων ψύξηςαπόψυξης. Σχήμα 2: Ονοματολογία λιποσωμάτων, δομή και μέγεθος [5] 2.1.3 Ταξινόμηση με βάση τη σύσταση και τις εφαρμογές α. Συμβατικά λιποσώματα Αποτελούνται μόνο από φωσφολιπίδια (ουδέτερα ή/και αρνητικά φορτισμένα) ή/και χοληστερόλη. Διαφέρουν ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες και χαρακτηρίζονται από σχετικά μικρό χρόνο κυκλοφορίας στο αίμα. β. Λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας Το πιο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό τους είναι ότι έχουν την ικανότητα να βγαίνουν εκτός κυκλοφορίας σε περιοχές όπου η διαπερατότητα του αγγειακόυ τοιχώματος είναι αυξημένη. Ο 17

πιο δημοφιλής τρόπος παραγωγής τους είναι η ομοιοπολική σύνδεση του πολυμερούς πολυαιθυλενογλυκόλης στην εξωτερική επφάνεια. γ. Ανοσολιποσώματα Διαθέτουν ειδικά αντισώματα ή κλάσματα αντισωμάτων (Fab ή αντισώματα μονής αλυσίδας) στην επιφάνειά τους προκειμένου να ενισχύσουν τη στόχευσή τους σε συγκεκριμένα κύτταρα στα οποία υπερεκφράζονται υποδοχείς των αντισωμάτων. δ. Κατιονικά λιποσώματα Πρόκειται για συστήματα μεταφοράς γενετικού υλικού. Τα κατιονικά λιπιδικά συστατικά τους αλληλεπιδρούν με και εξουδετερώνουν- το αρνητικά φορτισμένο DNA, συμπυκνώνοντάς το σε μια πιο συμπαγή δομή. Τα σύμπλοκα λιπιδίου-dna παρέχουν προστασία και επάγουν την κυτταρική διείσδυση και έκφραση του συμπυκνωμένου πλασμιδίου. ε. Λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη Διευκολύνουν την ενδοκυτταρική μεταφορά εγκλωβισμένων φαρμάκων μέσω σύντηξης με τη μεμβράνη των κυττάρων στόχων [2]. 2.2 Συζευγμένα με φάρμακο πολυμερή Ένα άλλο είδος νανοσωματιδίων μεταφοράς φαρμάκου, τα συζευγμένα με φάρμακο πολυμερή, έχουν επίσης μελετηθεί εκτενώς [6]. Μικρομοριακοί θεραπευτικοί παράγοντες και οι πρωτεΐνες συνήθως έχουν δύο μη επιθυμητές ιδιότητες: μικρό χρόνο κυκλοφορίας στο αίμα, γεγονός που οδηγεί στην ανάγκη για συχνή χορήγηση και μη ειδική στόχευση, με αποτέλεσμα την εκδήλωση ανεπιθύμητων παρενεργειών. Η σύζευξη των φαρμάκων στους πολυμερικούς νανοφορείς μπορεί να μειώσει αυτές τις ανεπιθύμητες δυσμενείς επιπτώσεις. Η σύζευξη του πολυμερούς με το φάρμακο όχι μόνο παρατείνει τον in vivo χρόνο κυκλοφορίας από μερικά λεπτά έως αρκετές ώρες, αλλά επίσης μειώνει την κυτταρική πρόσληψη κατά μήκος της ενδοκυτταρικής πορείας. Αυτά τα χαρακτηριστικά βοηθούν την παθητική μεταφορά των φαρμάκων σε ιστούς με διαπ ερατά αιμοφόρα αγγεία, όπως είναι για παράδειγμα οι όγκοι [7,8]. Οι μεγάλες προκλήσεις των περισσότερων συζευγμένων με φάρμακο πολυμερών περιλαμβάνουν τη τοξικότητα, την ανοσογονικότητα, τη μη ειδική βιοκατανομή, την in vivo αστάθεια, τη χαμηλή ικανότητα μεταφοράς φαρμάκου, την ταχεία αποδέσμευση του φαρμάκου καθώς επίσης και προκλήσεις που σχετίζονται με τη σύνθεση τους. Η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) (σχήμα 3), η οποία εισήχθη για πρώτη φορά στην κλινική χρήση στις αρχές του 1990, 18

ενισχύει τη σταθερότητα παρουσία πλάσματος και τη διαλυτότητα του φαρμάκου μειώνοντας παράλληλα την ανοσογονικότητα του φαρμάκου [9].Υπάρχουν αυτή τη στιγμή έξι παραδείγματα των συζευγμάτων PEG-φάρμακο που βρίσκονται σε κλινική χρήση (Πίνακας 1). Εκτός από το PEG, άλλα γραμμικά πολυμερή όπως το πολυγλουταμινικό οξύ και το Ν - (2-υδροξυπροπυλο) μεθυλακρυλαμίδιο (HPMA) έχουν αξιοποιηθεί ως πολυμερικοί φορείς μεταφοράς φαρμάκων. Πίνακας 1. PEG-drug conjugates in clinical practice. HGF: hepatocyte growth factor. [10] Composition Trade name Company Indication PEG-adenosine Adagen Enzon Severe combined immunodefi deaminase ciency (SCID) disease associated with adenosine deaminase defi ciency PEG-anti-VEGF Macugen OSIPharmaceuticals Wet form of macular degeneration aptamer PEG- α -IFN 2a Pegasys Nektar,Hoffmann- Hepatitis B and C LaRoche PEG-G-CSF Neulasta Amgen Neutropenia associated with cancer chemotherapy PEG-HGF Somavert Nektar, Pfi zer Acromegaly PEG- L -asparaginase Oncaspar Enzon Acute lymphoblastic leukemia Σχήμα 3: ο χημικός τύπος της πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG). [11] 19

2.3 Πολυμερικά νανοσωματίδια Τα βιοδιασπώμενα πολυμερικά νανοσωματίδια (σχήμα 4) είναι ακόμη μια κατηγορία νανοφορέων η οποία έχει μελετηθεί εκτενώς ως φορείς φαρμάκων [12]. Γενικά σχηματίζονται μέσω της αυτο-οργάνωσης συμπολυμερών που αποτελούνται από δύο ή περισσότερες συστάδες πολυμερών με διαφορετικό βαθμό υδροφοβικότητας. Αυτά τα συμπολυμερή αυθόρμητα οργανώνονται σε μια δομή πυρήνα-κελύφους σε υδάτινο περιβάλλον. Συγκεκριμένα, τα υδρόφοβα τμήματα αποτελούν τον πυρήνα για να ελαχιστοποίησουν την έκθεση τους σε υδατικά περιβάλλοντα, ενώ τα υδρόφιλα τμήματα αποτελούν το κέλυφος για τη σταθεροποίηση του πυρήνα [13]. Αυτή η δομή πυρήνα - κελύφους παρέχει έναν ιδανικό σύστημα μεταφοράς φαρμάκου. Ο υδρόφοβος πυρήνας του είναι ικανός να μεταφέρει φάρμακο με ποικίλη ικανότητα φόρτωσης (5-25% κατά βάρος). Το υδρόφιλο κέλυφος, παρέχει όχι μόνο στερική προστασία αλλά και λειτουργικές ομάδες για τις περαιτέρω τροποποιήσεις της επιφάνειας των σωματιδίων. Πολυμερικά νανοσωματίδια έχουν διαμορθωθεί για να ενσωματώνουν είτε υδρόφιλα είτε υδρόφοβα μικρά μόρια φαρμάκων, καθώς επίσης και μακρομόρια όπως οι πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα [14,15]. Η αποδέσμευση των εγκλωβισμένων φαρμάκων πραγματοποιείται με ελεγχόμενο ρυθμό με τρόπο που εξαρτάται από τον χρόνο ή το περιβάλλον. Επιπλέον, ο ρυθμός αποδέσμευσης του φαρμάκου μπορεί να ελεγχθεί με την τροποποίηση των πλευρικών αλυσίδων του πολυμερούς [16-18]. Σε γενικές γραμμές, αυτά τα βιοδιασπώμενα πολυμερικά συστήματα μπορούν να παρέχουν επίπεδα φαρμάκου στο βέλτιστο εύρος σε σχέση με άλλες μεθόδους χορήγησης φαρμάκων, αυξάνοντας έτσι την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου, μεγιστοποιώντας τη συμμόρφωση του ασθενούς και ενισχύοντας παράλληλα την ικανότητα χρήσης εξαιρετικά τοξικών, ελάχιστα διαλυτών ή σχετικά ασταθών φαρμάκων. Σχήμα 4: Πολυμερικά νανοσωματίδια [11] 20

2.4 Πολυμερικά μικκύλια Οι λειτουργικές ιδιότητες των μικκυλίων βασίζονται στα αμφίφιλα συμπολυμερή, που οργανώνονται με τέτοιο τρόπο ώστε να σχηματίσουν δομές πυρήνα / κελύφους σε υδατικά μέσα (σχήμα 5). Η υδρόφοβη περιοχή του πυρήνα χρησιμεύει ως δεξαμενή για υδρόφοβα φάρμακα, ενώ η υδρόφιλη περιοχή του κελύφους σταθεροποιεί τον υδρόφοβο πυρήνα κάνοντας τα πολυμερή υδατοδιαλυτά, καθιστώντας το σωματίδιο ένα κατάλληλο υποψήφιο για ενδοφλέβια χορήγηση [19]. Το φάρμακο μπορεί να φορτωθεί σε ένα πολυμερικό μικύλλιο με δύο τρόπους: φυσική ενθυλάκωση [20] ή με χημική ομοιοπολική σύνδεση [21]. Πολυλειτουργικά πολυμερικά μικκύλια που περιέχουν προσδέτες στόχευσης, θεραπευτικούς παράγοντες και παράγοντες απεικόνισης αναπτύσσονται με έντονους ρυθμούς [22] και φαίνεται πως θα γίνουν η επικρατούσα τάση μεταξύ των διαφόρων μοντέλων των μικυλλιακών σχηματισμών στο εγγύς μέλλον. Σχημα 5: Πολυμερικά μικκύλια [23] 2.5 Δενδριμερή Ένα δενδριμερές είναι ένα συνθετικό πολυμερικό μακρομόριο με διαστάσεις νανομέτρων, που αποτελείται από πολλαπλά, ιδιαίτερα διακλαδισμένα μονομερή που «αναδύονται» ακτινωτά από το κεντρικό πυρήνα (σχήμα 6). Ιδιότητες που συνδέονται με αυτά τα δενδριμερή όπως το μέγεθός τους, η λειτουργικότητα της τροποποιήσιμης επιφάνειας, η διαλυτότητα στο νερό και η διαθέσιμη εσωτερική κοιλότητα τα καθιστούν ελκυστικά για την μεταφορά φαρμάκων [24]. Τα χαρακτηριστικά της εύκολα τροποποιήσιμης επιφάνειας των δενδριμερών, τους επιτρέπει να είναι ταυτόχρονα συζευγμένα με διάφορα μόρια όπως σκιαγραφικά μέσα απεικόνισης, με προσδέτες στόχευσης ή με φάρμακα, αποδίδοντας ένα πολυλειτουργικό σύστημα μεταφοράς φαρμάκων [24]. 21

Σχήμα 6: δενδριμερές [25] 2.6 Ιικά νανοσωματίδια Μια ποικιλία ιών έχει αναπτυχθεί για να χρησιμοποιηθεί σε εφαρμογές στη βιοϊατρική και τη νανοτεχνολογία που περιλαμβάνουν τη στόχευση των ιστών και την μεταφορά των φαρμάκων (σχήμα 7). Ένας αριθμός μορίων και πεπτιδίων στόχευσης μπορεί να εκφράζεται σε βιολογικά λειτουργική μορφή στην επιφάνεια του καψιδίου των ιών χρησιμοποιώντας χημικά ή γενετικά μέσα. Ως εκ τούτου, αρκετοί προσδέτες ή αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων της τρανσφερίνης και του φολικού οξέος, έχουν συζευφθεί με ιούς με σκοπό την ειδική στόχευση όγκων in vivo [26]. Εκτός από αυτή τη τεχνητή στόχευση, ένα υποσύνολο ιών, όπως ο κυνοειδής παρβοϊός, έχουν φυσική συγγένεια με τους υποδοχείς, όπως με τους υποδοχείς τρανσφερίνης σε μια ποικιλία καρκινικών κυττάρων [27]. Σχήμα 7: Ιικά νανοσωματίδια [25] 2.7 Νανοσωλήνες άνθρακα Οι νανοσωλήνες άνθρακα είναι κύλινδροι άνθρακα, που αποτελούνται από δακτυλίους βενζολίου (σχήμα 8) και που έχουν εφαρμοστεί στον τομέα της βιολογίας ως αισθητήρες για την ανίχνευση του DNA και πρωτεΐνών, ως διαγνωστικές συσκευές για τη διάκριση των 22

διαφορετικών πρωτεϊνών από δείγματα ορού, και ως φορείς για τη μεταφορά εμβολίων ή πρωτεΐνών [28]. Οι νανοσωλήνες άνθρακα είναι αδιάλυτοι σε όλους τους διαλύτες, δημιουργώντας κάποιους προβληματισμούς σε ότι αφορά την υγεία και τα προβλήματα τοξικότητας που μπορούν να προκαλέσουν. Ωστόσο, η χημική τροποποίηση των νανοσωλήνων άνθρακα μπορεί να τους καταστήσει υδατοδιαλυτούς και να τροποποιηθούν έτσι ώστε να μπορούν να συνδεθούν με μια ευρεία ποικιλία ενεργών μορίων, όπως πεπτίδια, πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα, και θεραπευτικούς παράγοντες [29]. Αντιμυκητιακοί παράγοντες (αμφοτερικίνη Β) ή αντικαρκινικά φάρμακα (μεθοτρεξάτη) έχουν ομοιοπολικά συνδεθεί με νανοσωλήνες άνθρακα και με ένα φθορίζοντα παράγοντα (FITC). Σε μια in vitro μελέτη, τα φάρμακα που δεσμεύτηκαν στους νανοσωλήνες άνθρακα έδειξαν να εσωτερικεύονται πιο αποτελεσματικά εντός των κυττάρων σε σύγκριση με τα ελεύθερα φάρμακα και να έχουν ισχυρή αντιμυκητιακή δράση [30,31]. Οι πολλαπλές ομοιοπολικές τροποποιήσεις στο πλευρικό τοίχωμα ή στις άκρες των νανοσωλήνων άνθρακα τους επιτρέπει να μεταφέρουν πολλά μόρια ταυτόχρονα, στρατηγική η οποία παρέχει ένα θεμελιώδες πλεονέκτημα στη θεραπεία του καρκίνου. Σχήμα 8: Φουλερένια και νανοσωλήνες [32,33] 2.8 Νανοσφαίρες Τα νανοσωματίδια αυτά είναι σφαιρικές δομές που αποτελούνται από ένα σύστημα μήτρας στην οποία το φάρμακο κατανέμεται κατά τον εγκλωβισμό, τη σύνδεση, ή την ενθυλάκωση του. Η επιφάνεια της σφαίρας μπορεί να τροποποιηθεί με την προσθήκη πολυμερών και βιολογικών υλικών όπως προσδέτες. Αντισώματα μπορούν επίσης να συνδεθούν για στόχευση [34]. 23

2.9 Νανοκάψουλες Αυτά τα σωματίδια είναι κυστικά συστήματα με μια κεντρική κοιλότητα ή πυρήνα στον οποίο εγκλείεται το φάρμακο. Ο πυρήνας περιβάλλεται από μια εξωτερική πολυμερική μεμβράνη στην επιφάνεια της οποίας δεσμεύονται προσδέτες στόχευσης ή αντισώματα. Το υλικό του πυρήνα μπορεί να είναι στερεό, υγρό ή αέριο, και το περιβάλλον του πυρήνα μπορεί να είναι υδατικό ή λιπαρό [34]. 3. ΦΥΣΙΚΗ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΣΤΟΧΕΥΣΗ Η στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων εκλεκτικά στον πάσχοντα ιστό, γενικά επιτυγχάνεται μέσω δύο κύριων προσεγγίσεων: της φυσικής (παθητικής) και της μοριακής (ενεργούς) στόχευσης ή και μέσω του συνδυασμού αυτών. Σχήμα 9: Σχηματική απεικόνιση του μηχανισμού φυσικής στόχευσης (μέσω του φαινομένου EPR) και της μοριακής μέσω της πρόσδεσης προσδετών στην επιφάνεια των νανοφορέων [35]. 24

3.1 Φυσική στόχευση Η φυσική στόχευση εκμεταλλεύεται τα μοναδικά παθοφυσιολογικά χαρακτηριστικά των αγγείων των όγκων που επιτρέπουν στα μακρομόρια, συμπεριλαμβανομένων των νανοσωματιδίων, να συσσωρεύονται στην περιοχή του όγκου [36]. Τα ταχέως αναπτυσσόμενα καρκινικά κύτταρα απαιτούν την πρόσληψη νέων αγγείων (νεοαγγείωση) ή την εκτροπή των ήδη υπαρχόντων αγγείων κοντά στη μάζα του όγκου για να τους προμηθεύουν με οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά [37]. Η προκύπτουσα δυσαναλογία των ρυθμιστών της αγγειογέννεσης όπως είναι οι αυξητικοί παράγοντες και οι μεταλλοπρωτεινάσες της μήτρας, κάνει τα αγγεία των όγκων να αποδιοργανώνονται έντονα και να διαστέλλονται παρουσιάζοντας διευρυμένα κενά μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων και μειωμένη λεμφική παροχέτευση [37]. Αυτά τα χαρακτηριστικά ονομάζονται φαινόμενο ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης (EPR), το οποίο αποτελεί ένα σημαντικό μηχανισμό με τον οποίο μακρομόρια, συμπεριλαμβανομένων των νανοσωματιδίων, με μοριακό βάρος άνω των 50 kda, επιλεκτικά μπορούν να συσσωρεύονται εντός του όγκου. Πολύ σημαντικό για την ικανοποιητική συγκέντρωση των νανοφορέων στον στόχο μέσω του EPR είναι η παρατεταμένη κυκλοφορία τους στο αίμα, ώστε σταδιακά να επιτευχθεί αυξημένη στατιστικά ποσότητα των νανοφορέων μέσω της διάχυσης από τα υψηλής διαπερατότητας αιμοφόρα αγγεία του όγκου. Έχει βρεθεί ότι τα μακρομόρια παραμένουν σε υψηλά επίπεδα στην κυκλοφορία του αίματος, φαινόμενο που ισχύει για τις περισσότερες πρωτεΐνες του πλάσματος και τα βιοσυμβατά συνθετικά πολυμερή ή τα συζευγματά τους [38-41]. Εδώ, μακρομόρια ορίζονται αυτά των άνω των 40 kda. Το φαινόμενο ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης για τα μακρομόρια έχει παρατηρειθεί σε αρκετούς στερεούς όγκους του ανθρώπου, όπως το ηπάτωμα, ο καρκίνος του νεφρού, ο καρκίνος του πνεύμονα, και ο όγκος του εγκεφάλου [42,43]. Με βάση αυτό το φαινόμενο έχουν γίνει πολλές προσπάθειες στοχευμένης μεταφοράς και αποδέσμευσης φαρμάκων στην περιοχή του όγκου [44,45]. Έτσι είναι δυνατόν να επιτευχθούν τοπικές συγκεντρώσεις φαρμάκων εως και 10-50 φορές μεγαλύτερες στην περιοχή του όγκου συγκριτικά με τους φυσιολογικούς ιστούς, σε ένα διάστημα 1-2 ημερών. Νεότερα πολυμερικά σύμπλοκα, μικύλλια ή λιποσωμικά φάρμακα αντικαρκινικών παραγόντων βασίζονται στο φαινόμενο EPR. Όμως μελέτες έχουν δείξει ότι το φαινόμενο EPR δεν είναι εφαρμόσιμο σε χαμηλού μοριακού βάρους φάρμακα εξαιτίας της γρήγορης διάχυσής τους στην κυκλοφορία του αίματος, ακολουθούμενη από νεφρική κάθαρση [44]. Αποτελέσματα ερευνών με λιποσώματα διαφορετικών μέσων μεγεθών, δείχνουν ότι το όριο μεγέθους των σωματιδίων που 25

διεισδύουν στους όγκους είναι περίπου 400 nm, ενώ άλλες έρευνες δείχνουν ότι σωματίδια με διαμέτρους μικρότερες των 200 nm είναι πιο αποτελεσματικα [35]. Παρόλο όμως που η φυσική στόχευση αποτελεί τη βάση για την κλινική θεραπεία, ταυτόχρονα παρουσιάζει αρκετούς περιορισμούς. Η στόχευση των κυττάρων μέσα σε ένα όγκο δεν είναι πάντα εφικτή εξαιτίας της μη αποτελεσματικής διάχυσης μερικών φαρμάκων και της τυχαίας φύσης αυτής της προσέγγισης. Ο περιορισμός αυτός βέβαια είναι κοινός με τη συμβατική θεραπεία. Επιπλέον η φυσική στόχευση περιορίζεται επειδή δεν παρουσιάζουν όλοι οι όγκοι το φαινόμενο EPR και επειδή η διαπερατότητα των αιμοφόρων αγγείων δεν είναι η ίδια σε όλη την έκταση του όγκου. 3.2 Μοριακή στόχευση Η μοριακή στόχευση έχει μελετηθεί συστηματικά τα τελευταία χρόνια. Έχει υπάρξει αυξανόμενο ενδιαφέρον για την εφαρμογή της μοριακής στόχευσης και της διαμόρφωσης βιοτροποποιημένων νανοσωματίδιων στόχευσης. Τα στοχευμένα νανοσωματίδια, σε σύγκριση με τα μη- στοχευμένα, έχουν πολλά πλεονεκτήματα όπως είναι: η δυνατότητα καταμερισμού των περισσότερων από τα νανοσωματιδία εντός του ιστού-στόχου αυξάνοντας την πρόσληψη στα κύτταρα-στόχους, η υψηλότερη θεραπευτική αποτελεσματικότητα και η μικρότερη τοξικότητα. Η πιο σημαντική επίδραση των τροποποιημένων νανοσωματιδίων με προσδέτες στόχευσης είναι η αύξηση της ενδοκυτταρικής πρόσληψης από τα κύτταρα-στόχους. Οι Kim et al. έδειξαν ότι τα στοχευμένα με φολικό οξύ πολυμερικά νανοσωματίδια είχαν πάνω από 6,7 φορές μεγαλύτερη κυτταρική πρόσληψη από τα μη στοχευμένα νανοσωματίδια [46]. Σε μια άλλη μελέτη, έχει δειχθεί ότι με τη διαφοροποίηση της πυκνότητας του προσδέτη στόχευσης στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων (0-10%), τα στοχευμένα νανοσωματίδια είχαν πάνω από επτά φορές μεγαλύτερη ενδοκυτταρική πρόσληψη σε σχέση με τα μη στοχευμένα νανοσωματιδία μετά από δύο ώρες επώασης [47]. Επιπλέον η συγκέντρωση των στοχευμένων νανοσωματιδίων σε όγκους είναι υψηλότερη σε σύγκριση με εκείνη των μη στοχευμένων νανοσωματιδίων [47]. Η συσσώρευση των στοχευμένων νανοσωματιδίων στον όγκο εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τα χαρακτηριστικά των προσδετών στόχευσης και των νανοσωματιδίων. Πρόσφατα ανεπτυγμένα συζεύγματα ενεργούς στόχευσης φαρμάκων χρησιμοποιούν μια τριμερή δομή που αποτελείται από ένα προσδέτη ή αντίσωμα ως ομάδα στόχευσης, ένα πολυμερές ή ένα λιπίδιο ως μεταφορέα, και ένα ενεργό χημειοθεραπευτικό φάρμακο.στην ιδανική περίπτωση, τα αντιγόνα και οι υποδοχείς της επιφάνειας του κυττάρου θα πρέπει να έχουν διάφορες ιδιότητες που να τα καθιστούν ιδιαίτερα κατάλληλους στόχους [48]. Πρώτον, 26

πρέπει να εκφράζονται αποκλειστικά στα κύτταρα του όγκου και να μην εκφράζονται στα φυσιολογικά κύτταρα. Δεύτερον, θα πρέπει να εκφράζονται ομοιογενώς σε όλα τα καρκινικά κύτταρα που αποτελούν στόχο. Τέλος, τα αντιγόνα και οι υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας δεν θα πρέπει να αποβάλλονται στην κυκλοφορία του αίματος. Μόλις οι νανοφορείς αναγνωριστούν και προσδεθούν στην επιφάνεια των κυττάρων στόχων (μέσω αλληλεπιδράσεων προσδέτη υποδοχέα) τότε, ανάλογα με τον προσδέτη που φέρουν, είτε θα παραγματοποιηθεί ενδοκυττάρωση του νανοφορέα, είτε αυτός θα παραμείνει προσκολλημένος στην επιφάνεια του κυττάρου. Η πρώτη περίπτωση κρίνεται αναγκαία όταν χρειάζεται να γίνει η αποδέσμευση του φαρμάκου εντός του κυττάρου. Ενώ αντίθετα η δεύτερη περίπτωση πλεονεκτεί σε συμπαγείς όγκους, στους οποίους η αποδέσμευση του φαρμάκου στην επιφάνεια μπορεί να σκοτώσει και τα γειτονικά κύτταρα, τα οποία πιθανώς να μην εκφράζουν τον υποδοχέα με τον οποίο θα μπορούσε να προσδεθεί ο νανοφορέας [35]. Το εαν τα στοχευμένα συζευγματα μπορούν να εσωτερικευθούν μετά τη δέσμευση στα κύτταραστόχους είναι ένα σημαντικό κριτήριο κατά την επιλογή των κατάλληλων προσδετών στόχευσης. Η εσωτερίκευση όπως προαναφέρεται συμβαίνει συνήθως μέσω μεσολαβούμενης από υποδοχέα ενδοκύτωσης. Η θεραπευτική αυτή προσέγγισή ωστόσο συνοδεύεται και από μειονεκτήματα όπως είναι: α. το ιδιαίτερα υψηλό της κόστος, αφού σχετίζεται με εξατομικευμένη μοριακή ανάλυση του πάσχοντα ιστού του ασθενούς και β. η πιθανή επαγωγή αποκρίσεων του ανοσοποιητικού συστήματος από τους παράγοντες στόχευσης. Δηλαδή έχει παρατηρηθεί ότι όταν οι νανοφορείς εκφράζουν στην επιφάνεια τους μόρια κατάλληλα για στόχευση, τότε μειώνεται ο χρόνος κυκλοφορίας τους στο αίμα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα οι νανοφορείς να μην προλαβαίνουν να συγκεντρωθούν και να αποδεσμεύσουν το φάρμακο εκλεκτικά [49,50]. Η σημασία αυτού γίνεται ακόμη περισσότερο αντιληπτή λαμβάνοντας υπόψη πως η διαδικασία της μοριακής στόχευσης προϋποθέτει τη συγκέντρωση των νανοφορέων μέσω του φαινομένου EPR στους συμπαγείς όγκους. 4. ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΦΑΡΜΑΚΩΝ Ο καρκίνος οφείλεται στη συσσώρευση μεταλλαγών που ολοένα και περισσότερο εμφανίζονται στους ανθρώπινους πληθυσμούς. Πρόκειται για μία ασθένεια που προσβάλλει τους ανθρώπους με ταχύτατο ρυθμό και οι θεραπευτικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την καταπολέμηση της εμφανίζουν αρκετούς περιορισμούς. Τα τελευταία είκοσι χρόνια, έχουν ανακαλυφθεί και κατανοηθεί σε μεγάλο βαθμό οι μοριακοί μηχανισμοί που αφορούν στην 27

καρκινογένεση και την παθοφυσιολογία του καρκίνου. Αρκετοί από αυτούς τους μηχανισμούς έχουν αποτελέσει την κινητήρια δύναμη για το σχεδιασμό και την ανακάλυψη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων, με αποτελεσματικότερες ιδιότητες στην καταπολέμηση του καρκίνου [51]. Ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα της θεραπείας του καρκίνου αποτελεί η εμφάνιση ανθεκτικότητας των καρκινικών κυττάρων έναντι της δράσης των χημειοθεραπευτικών παραγόντων. Οι μηχανισμοί ανθεκτικότητας οφείλονται στην απώλεια των κυτταρικών υποδοχέων ή διαμεταβιβαστών του φαρμάκου στο κύτταρο, στο μεταβολισμό του φαρμάκου ή σε μεταλλαγή του στόχου δράσης του φαρμάκου. Σε μερικές περιπτώσεις, η χρήση περισσοτέρων του ενός φαρμάκων, που εμφανίζουν διαφορετικούς μηχανισμούς εισόδου στο κύτταρο και διαφορετικούς κυτταρικούς στόχους οδηγεί σε αποτελεσματικότερη θεραπεία του καρκινικού όγκου. Ωστόσο, τα κύτταρα έχουν αναπτύξει μηχανισμούς ανθεκτικότητας που παρέχουν προστασία σε φάρμακα με διαφορετική δομή και λειτουργία. Το φαινόμενο της ανθεκτικότητας σε περισσότερα του ενός φαρμάκων, προκύπτει ως αποτέλεσμα αλλαγών που περιορίζουν την επίδραση των φαρμάκων στα κύτταρα εξαιτίας της περιορισμένης πρόσληψης τους, της αυξημένης απέκκρισης τους ή επηρεάζοντας λιπίδια της μεμβράνης [51]. Οι αλλαγές αυτές (α) μπλοκάρουν τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση), ο οποίος ενεργοποιείται από τη δράση των περισσοτέρων φαρμάκων, (β) ενεργοποιούν μηχανισμούς αποτοξικοποίησης του φαρμάκου και επιδιόρθωσης βλαβών του γενετικού υλικού και (γ) επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο και τα σημεία ελέγχου του, καθιστώντας τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά στην κυτταροτοξική δράση των φαρμάκων [51]. 5. ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΝΑ ΞΕΠΕΡΑΣΟΥΝ ΤΗΝ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Γίνεται λοιπόν αντιληπτό ότι η ανοχή στα φάρμακα έχει αναδειχθεί ως ένα σημαντικό εμπόδιο που περιορίζει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα των χημειοθεραπευτικών παραγόντων. Μεταξύ των διαφόρων μηχανισμών που σχετίζονται με την ανοχή στα φάρμακα, ο ρόλος της P-γλυκοπρωτεΐνης είναι ο πιο γνωστός και ο πιο εκτενώς αναφερόμενος [52]. Έχει προταθεί ότι τα νανοσωματίδια μπορεί να είναι σε θέση να παρακάμψουν τη μεσολαβούμενη από την Ρ-γλυκοπρωτεϊνη αντίσταση. Ένας πιθανός μηχανισμός είναι ότι τα νανοσωματίδια μπορούν να αποφύγουν την αναγνώριση από την P-γλυκοπρωτεΐνη με το να εγκλωβίζονται σε 28

ένα ενδόσωμα όταν εισέρχονται στο κύτταρο, οδηγώντας σε υψηλές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις του φαρμάκου (σχήμα 10). Οι στρατηγικές στόχευσης, ιδιαίτερα εκείνες που χρησιμοποιούν υποδοχέα- προσδέτες στόχευσης, μπορεί να έχουν ιδιαίτερες δυνατότητες για την υπερνίκηση της ανοχής στα φάρμακα, επειδή αυτοί οι προσδέτες συνήθως εσωτερικεύονται μέσω μεσολαβούμενης από υποδοχέα ενδοκύτωσης. Πράγματι, σε μια μελέτη, ένα ph-αποκρυνόμενο πολυμερικό μικκύλιο που περιέχει δοξορουβικίνη [53] και ένα σύζευγμα τρανσφερίνης με φορτωμένα με πακλιταξέλη νανοσωματίδια [54] παρουσίασαν μεγαλύτερη ανασταλτική δραστηριότητα κατά της ανοχής στο φάρμακο στα MCF-7 κύτταρα και/ή σε ξενομοσχεύματα από τα δικά τους αντίστοιχα μη στοχευμένα ελεύθερα φάρμακα. Σχήμα 10: Εσωτερίκευση των νανοσωματιδίων μέσω μεσολαβούμενης από υποδοχέα ενδοκύτωσης. Όγκο-ειδικοί προσδέτες ή αντισώματα στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων δεσμεύονται στους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, γεγονός που ενεργοποιεί την εσωτερίκευση των νανοσωματιδίων μέσα στο κύτταρο μέσω ενδοσώματος. Καθώς η τιμή του ph στο εσωτερικό του ενδοσώματος γίνεται όξινη, το φάρμακο αποδεσμεύεται από τα νανοσωματίδια και πηγαίνει στο κυτταρόπλασμα. Νανοσωματίδια φορτωμένα με φάρμακο παρακάμπτουν την P- γλυκοπρωτεΐνη χωρίς να αναγνωρίζονται όταν το φάρμακο εισέρχεται στα κύτταρα, οδηγώντας σε υψηλές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις [55]. 29

6. ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ 6.1. Μέγεθος σωματιδίων Το μέγεθος των σωματιδίων συνήθως αναφέρεται στη συνολική διάμετρο αυτών. Το μέγεθος των σωματιδίων και η κατανομή του μεγέθους είναι τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά των νανοσωματιδιακών συστημάτων. Τα χαρακτηριστικά αυτά επηρεάζουν την in vivo κατανομή, την τοξικότητα και την ικανότητα στόχευσης των συστημάτων αυτών. Επιπλέον, μπορούν να επηρεάσουν τη φόρτωση και την αποδέσμευση των φαρμάκων καθώς επίσης και τη σταθερότητα των νανοσωματιδίων. Η αποδέσμευση του φαρμάκου επηρεάζεται από το μέγεθος των σωματιδίων. Μικρότερα σωματίδια έχουν μεγαλύτερη επιφάνεια, κι ως εκ τούτου, το μεγαλύτερο μέρος του φαρμάκου θα είναι συνδεδεμένο σε ή κοντά στην επιφάνεια των σωματιδίων, οδηγώντας έτσι σε ταχεία αποδέσμευση του φαρμάκου. Ενώ, τα μεγαλύτερα σωματίδια έχουν μεγάλους πυρήνες που επιτρέπουν περισσότερο φάρμακο να ενκαψακιωθεί και να διαχυθεί αργά [56]. Μικρότερα σωματίδια έχουν επίσης μεγαλύτερο κίνδυνο συσσωμάτωσης κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης και της μεταφοράς τους. Είναι πάντα μια πρόκληση ο σχηματισμός νανοσωματιδίων με το μικρότερο δυνατό μέγεθος, αλλά με τη μέγιστη σταθερότητα. Η αποικοδόμηση του πολυμερούς μπορεί επίσης να επηρεαστεί από το μέγεθος των σωματιδίων. Για παράδειγμα, το ποσοστό της αποικοδόμησης του PLGA πολυμερούς βρέθηκε να αυξάνεται με αύξηση του μεγέθους των σωματιδίων in vitro [57]. Θεωρήθηκε ότι στα μικρότερα σωματίδια, τα προϊόντα της αποικοδόμησης του PLGA μπορούν να διαχέονται από τα σωματίδια εύκολα, ενώ σε μεγάλα σωματίδια, τα προϊόντα της αποικοδόμησης είναι πιο πιθανό να παραμείνουν εντός της πολυμερικής μήτρας για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα προκαλώντας αυτοκαταλυτική (autocatalytic) αποικοδόμηση του πολυμερούς [58]. Δεδομένου ότι η μικρότερη διάμετρος των τριχοειδών αγγείων στο σώμα είναι 4 μm [59], τα μεγαλύτερα σωματίδια θα πρέπει να «συλλαμβάνονται» και να κρατώνται στους πνεύμονες [60]. Σωματίδια με μεγαλύτερη μεγέθη ή / και συσσωματώματα των μικρών σωματιδίων μπορούν να παγιδευτούν έτσι, προκαλώντας εμβολή εντός του τριχοειδούς στρώματος των πνευμόνων [61]. Η συσσωμάτωση των νανοσωματιδίων μειώνει το επιφανειακό τους φορτίο, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε καθίζηση η οποία με τη σειρά της θα μπορούσε να αποδειχθεί επικίνδυνη αν αυτά τα σωματίδια ενεχύονταν ενδοφλεβίως. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να γνωρίζουμε το επιφανειακό φορτίο και το μέγεθος των σωματιδίων στο αίμα [62]. Τα περισσότερα χορηγούμενα ενδοφλεβίως νανοσωματίδια αναγνωρίζονται ως ''ξένο σώμα'' από το ανοσοποιητικό σύστημα και αποβάλλονται αμέσως μέσω των μακροφάγων του 30

μονοπυρηνικού συστήματος φαγοκυττάρων (MPS) [63]. Σωματίδια μικρότερα από 4 μm συλλαμβάνονται μέσω των κυττάρων του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος, κυρίως στο ήπαρ (60-90%) και στο σπλήνα (3-10%) [61,63]. Αν και είναι πιο πιθανό ότι τα μικρά σωματίδια μέχρι και 100 nm φαγοκυτταρώνονται μέσω των κυττάρων του ήπατος (τα ανοίγματα στο ενδοθήλιο των αιμοφόρων αγγείων του ήπατος είναι μεταξύ 100 και 150 nm), υπάρχει μια τάση για σωματίδια μεγαλύτερα από 200 nm να φιλτράρονται από τους φλεβικούς κόλπους του σπλήνα [64]. Εάν σωματίδια μεταξύ 30 και 100 nm χορηγούνται ενδοφλεβίως, το ήπαρ αποβάλλει τα μεγαλύτερα σωματίδια ταχύτερα από την κυκλοφορία του αίματος σε σύγκριση με τα μικρότερα. Έτσι, όσο μεγαλύτερα είναι τα σωματίδια,τόσο μικρότερη είναι η περίοδος ημιζωής τους στο πλάσμα [65]. Ανάλογα με το μέγεθος των σωματιδίων, η πρόσληψη μπορεί να υποδιαιρεθεί στην κυτταροφαγία (όλα τα μεγέθη) και στην πινοκύττωση (σωματίδια μικρότερα των 150 nm) [63,66]. Μεγάλα σωματίδια αφαιρούνται μόνο από κύτταρα που μπορούν να φαγοκυτταρώνουν ενώ μικρότερα σωματίδια μπορούν να απομακρυνθούν από όλους τους τύπους κυττάρων μέσω της πινοκύττωσης (όλα τα κύτταρα είναι σε θέση να πινοκυτταρώνουν). Η φαγοκυττωτική δραστηριότητα αυξάνεται με το μέγεθος των σωματιδίων [66]. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, σωματίδια με μέγεθος μεγαλύτερο από 10 nm δεν μπορούν να διεισδύσουν στο ενδοθήλιο [67]. Ωστόσο, το εμπόδιο αυτό της διαπερατότητας μπορεί να μειωθεί κάτω από παθολογικές καταστάσεις, όπως φλεγμονή. Εκεί, το όριο διείσδυσης μπορεί να αυξηθεί για να δεχθεί σωματίδια μεγέθους 700 nm [64]. Αυτό μπορεί επίσης να επιτυγχάνεται προσωρινά με τη βοήθεια της φαρμακευτικής αγωγής, τους ανοσοποιητικούς ρυθμιστές,τη θερμότητα ή την ακτινοβολία [67]. Εν κατακλείδι, η πρόσληψη των νανοσωματιδίων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το μέγεθος των σωματιδίων, όπως έχει αποδειχθεί in vitro [66,69] και in vivo [66, 70]. 6.2 Τοξικότητα και βιοσυμβατότητα των σωματιδίων Ένα επίσης πολύ σημαντικό θέμα είναι η τοξικότητα και ο μεταβολισμός των νανοσωματιδίων in vivo. Η ενδεχόμενη τοξικότητα των νανοσωματιδίων είναι ο κυριότερος παράγοντας που καθορίζει εάν και πότε αυτά θα εισαχθούν στις κλινικές δοκιμές για ανθρώπους. Όλες οι φαρμακευτικές ουσίες που προορίζονται για χρήση σε ανθρώπους και ζώα απαιτούν εκτεταμένες δοκιμές για την εμφάνιση τοξικών παρενεργειών. Εκτός από την οξεία τοξικότητα και η τοξικότητα των προϊόντων αποικοδόμησης πρέπει να ληφθεί σοβαρά υπόψη. Μια πρώτη ένδειξη για την τοξικότητα μπορεί να προέρθει από τη μελέτη ιστών από 31

κυτταροκαλλιέργειες μετά από επώαση με νανοσωματίδια [71,72]. Ωστόσο, η κυτταροτοξικότητα είναι συνήθως πολύ υψηλότερη in vitro σε σύγκριση με την in vivo. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι προϊόντα αποικοδόμησης υπεύθυνα για την τοξικότητα αποβάλλονται συνεχώς από το σημείο εφαρμογής in vivo. Ως εκ τούτου, οι δοκιμές τοξικότητας που διεξάγονται in vitro δύναται να έχουν περιορισμένη εφαρμογή [66]. Εάν εναιωρήματα που περιέχουν νανοσωματίδια χρησιμοποιούνται in vivo, αυτά θα πρέπει να είναι υδρόφιλα και το ph τους πρέπει να είναι κοντά στο 7,4 [67]. Επιπλέον, θα πρέπει να είναι αποικοδομήσιμα και να αποβάλλονται από το σώμα χωρίς να αφήνουν κατάλοιπα, αλλιώς μπορεί να συσσωρευτούν σε ορισμένα τμήματα των κυττάρων, όπως λιποσώματα, ή σε ιστούς από το σύστημα φαγοκυττάρωσης (MPS) [66]. In vivo μελέτες με υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια σιδήρου (Spion) βασισμένα σε σωματίδια των 100-1000 nm είτε με δεξτράνη είτε με ανυδρογλυκόζη είτε με ανθρακική επίστρωση, έδειξαν εξαιρετική βιοσυμβατότητα (ακόμα και σε κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους) [73,74]. Παρακάτω γίνεται μια προσπάθεια ανάλυσης της λογικής γύρω από την ανάπτυξη διαφόρων επιστρώσεων και προσδετών που έχουν κατά καιρούς χρησιμοποιηθεί στην ανάπτυξη μαγνητικών νανοσωματιδίων (ειδικότερα MNPs) για βιοϊατρικές εφαρμογές. Η χρησιμοποίηση διαφόρων περιβλημάτων γύρω από τον πυρήνα των MNPs έχει τρεις κυρίως βασικούς σκοπούς: να τα κάνει βιοσυμβατά μειώνοντας την τοξικότητά τους για τα κύτταρα και κατά συνέπεια για τον οργανισμό, να τροποποιήσει τον βαθμό πρόσληψής τους από τα κύτταρα και τέλος να ελαχιστοποιήσει την πρόσληψή τους από το ενδοθηλιακό σύστημα του οργανισμού και τα μακροφάγα. Ειδικά σε ότι αφορά στα οξείδια του Fe οι Pisanic et al. [76] μελέτησαν την άμεση κυτταροτοξικότητά τους σε κύτταρα φαιοχρωμοκυττώματος (PC12), αλλά και την επίδραση των νανοσωματιδίων στην δυνατότητά των κυττάρων να απαντούν σε φυσιολογικά ερεθίσματα, όπως η παραγωγή νέων νευριτών μετά από έκθεση σε NGF (nerve growth factor), μια πρωτεΐνη υπεύθυνη για την διαφοροποίηση και την επιβίωση των νευρικών κυττάρων. Η μελέτη συγκεντρώσεων Fe 2 O 3 από 0,15 έως 15 mm είχε ως αποτέλεσμα την δοσοεξαρτώμενη μείωση της βιωσιμότητας και της ικανότητας των κυττάρων PC12 για σχηματισμό νευριτών ειδικά σε συγκεντρώσεις 15 mm. H συνήθης συγκέντρωση ιόντων Fe +3, όπου εμφανίζονται τα πρώτα κυτταροτοξικά φαινόμενα είναι τα 4 mm [77]. Ο σχηματισμός ελευθέρων ριζών μέσω των αντιδράσεων Fenton και/ή Haber-Weiss που παρατηρούνται σε πολύ υψηλές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις Fe θεωρείται υπεύθυνος για την τοξικότητα αυτή [78]. Εκτός από την βιοσυμβατότητα, που είναι και ο κύριος σκοπός που εξυπηρετούν, τα περιβλήματα επηρεάζουν την λιποδιαλυτότητα ή το ηλεκτρικό φορτίο των MNPs με αποτέλεσμα 32

να τροποποιούν την είσοδό τους στα κύτταρα. Ένα από τα πιο γνωστά πολυμερή που χρησιμοποιούνται για τον σκοπό αυτό είναι η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) η οποία επιτρέπει την διάλυση των MNPs τόσο σε πολικά όσο και σε μη πολικά διαλύματα, ενώ επίσης προσδίδει και υψηλή διαλυτότητα στις κυτταρικές μεμβράνες [79,80]. Επίσης η επικάλυψη με PEG εμποδίζει την προσρόφηση πρωτεϊνών πάνω στα MNPs και έτσι αποφεύγεται η πρόσληψή τους από τα κύτταρα του δικτυενδοθηλιακού συστήματος. Ιδιαίτερα μελετημένες για την εφαρμογή τους στα MNPs είναι και οι επικαλύψεις με δεξτράνη και με αμινοσιλάνιο. [81]. Μια από τις βασικές διαφορές της δεξτράνης από το αμινοσιλάνιο είναι ότι η πρώτη είναι αρνητικά φορτισμένη, ενώ το δεύτερο προσδίδει στα MNPs ισχυρά θετικό φορτίο που τους επιτρέπει να αλληλεπιδρούν με ηλεκτροστατικές δυνάμεις με την αρνητικά φορτισμένη κυτταρική μεμβράνη. Η προσθήκη κατάλληλου προσδέτη πάνω στα MNPs έχει ως αποτέλεσμα την εκλεκτική είσοδό τους στα κύτταρα μέσω ενδοκυττάρωσης με την μεσολάβηση υποδοχέα [82]. Για τον σκοπό αυτό έχουν χρησιμοποιηθεί διάφοροι προσδέτες και κυρίως μονοκλωνικά αντισώματα (Mabs) [83,84]. Πέραν όμως των μονοκλωνικών αντισωμάτων, των οποίων το μέγεθος και η ανοσογονικότητά τους έχει ως αποτέλεσμα να διαχέονται με δυσκολία μέσω βιολογικών φραγμών, ως προσδέτες έχουν χρησιμοποιηθεί και μόρια μικρού μοριακού βάρους. Αυτά συνήθως ενώνονται με διάφορους υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης, οι οποίοι υπερεκφράζονται εν γένει από τα καρκινικά κύτταρα με αποτέλεσμα η πρόσληψή τους από αυτά να είναι αρκετές τάξεις μεγαλύτερη από αυτή των φυσιολογικών κυττάρων. Τέτοιο παράδειγμα αποτελεί και ο υποδοχέας του φυλλικού οξέος [85]. Επιπλέον, το φυλλικό οξύ είναι σταθερό μόριο, με μικρή ανοσογονικότητα, του οποίου ο υποδοχέας έχει φανεί ότι ενδοκυτταρώνει με αποτελεσματικότητα μόρια συνδεδεμένα με φυλλικό [86,87]. Χαρακτηριστικές είναι δύο εργασίες των Yong Zhang et al. [75] και Nathan Kohler et al. [88], στις οποίες η πρόσληψη των MNPs με φυλλικό οξύ ήταν από 10 έως 20 φορές υψηλότερη για τα καρκινικά κύτταρα (επρόκειτο για δύο καρκινικές σειρές του μαστού MCF7 και BT20). Η φαγοκυττάρωση των MNPs γίνεται από κύτταρα με φαγοκυτταρικές ιδιότητες, όπως τα κύτταρα του δικτυενδοθηλιακού συστήματος. Τα MNPs υφίστανται οψωνοποίηση από πρωτεΐνες του πλάσματος και με μεσολάβηση του συμπληρώματος φαγοκυτταρώνονται. Η επικάλυψη των MNPs με PEG έχει ως σκοπό την αποφυγή της φαγοκυττάρωσης των σωματιδίων από μη καρκινικά κύτταρα μέσω του μηχανισμού αυτού. 33

Σχήμα 11: Σχηματικό διάγραμμα της πρόσληψης μαγνητικών νανοσωματιδίων με τροποποιημένη την επιφάνειά τους (PEG, φυλλικό οξύ) από το κύτταρο [89]. 6.3 Επιφανειακό φορτίο Όταν τα νανοσωματίδια χορηγούνται ενδοφλεβίως, αναγνωρίζονται εύκολα από το ανοσοποιητικό σύστημα του σώματος, και στη συνέχεια απομακρύνονται από την κυκλοφορία από τα φαγοκύτταρα [90]. Εκτός από το μέγεθος των νανοσωματιδίων, η υδροφοβικότητα της επιφάνειάς τους καθορίζει το ποσό των προσροφημένων συστατικών του αίματος, κυρίως πρωτεΐνών (opsonins). Αυτό με τη σειρά του επηρεάζει την in vivo τύχη των νανοσωματιδίων [90,91]. Η δέσμευση των οψονινών πάνω στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων, διαδικασία η οποία ονομάζεται οψονοποίηση δρα ως γέφυρα μεταξύ των νανοσωματιδίων και των φαγοκυττάρων. Η ένωση ενός φαρμάκου με τους συμβατικούς φορείς οδηγεί σε τροποποίηση του προφίλ βιοκατανομής του φαρμάκου. Πράγματι, στη κυκλοφορία του αίματος, η επιφάνεια των μη τροποποιημένων νανοσωματιδίων (συμβατικά νανοσωματίδια) οψονοποιείται γρήγορα και εκκαθαρίζονται μαζικά από το μακροφάγα του μονοπυρηνικού συστήματος φαγοκυττάρων [92]. Έτσι, για να αυξηθεί η πιθανότητα της επιτυχίας στη στόχευση φαρμάκων με τη χρήση νανοσωματιδίων, είναι αναγκαία η ελαχιστοποίηση της οψονοποίησης και η παράταση της κυκλοφορίας των νανοσωματιδίων in vivo. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με (α) επίστρωση της επιφάνειας των νανοσωματιδίων με υδρόφιλα πολυμερή / επιφανειοδραστικές ουσίες, (β) σύνθεση των νανοσωματιδίων με βιοδιασπώμενα συμπολυμερή με υδρόφιλα τμήματα, όπως πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG), οξείδιο του πολυαιθυλενίου, polyoxamer, poloxamine και πολυσορβικό 80 (Tween 80). 34

Το δυναμικό ζήτα του νανοσωματιδίων συνήθως χρησιμοποιείται για να χαρακτηρίσει το επιφανειακό φορτίο των νανοσωματιδίων [93].Εκφράζει το ηλεκτρικό δυναμικό των σωματιδίων και επηρεάζεται από τη σύνθεση του σωματιδίου και το μέσο στο οποίο είναι διεσπαρμένο (το νανοσωματίδιο). Νανοσωματίδια με ζήτα δυναμικό πάνω από (+ / -) 30 mv έχουν δείξει ότι είναι σταθερά σε εναιώρημα, καθώς το επιφανειακό φορτίο εμποδίζει την συσσωμάτωση των σωματιδίων. Το ζήτα δυναμικό μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για να διαπιστωθεί αν ένα φορτισμένο υλικό είναι ενκαψακιωμένο στο κέντρο της νανοκάψουλας ή προσροφημένο στην επιφάνεια. Το δυναμικό ζήτα εξαρτάται απο τη συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών του διαλυτού μέσου in vitro και επιπλέον από την προσρόφηση των πρωτεΐνών του πλάσματος in vivo [94]. Εάν το δυναμικό ζήτα είναι χαμηλότερο από μια δεδομένη κρίσιμη τιμή του συστήματος σωματιδίων, συμβαίνει συσσωμάτωση και καθίζηση των σωματιδίων. Το επιφανειακό φορτίο διαδραματίζει επίσης σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της ενδοκύττωσης. Ωστόσο, ο δείκτης ενδοκύτωσης in vitro είναι ελάχιστος με ένα δυναμικό ζήτα κοντά στο μηδέν [95]. Αντίθετα, η φαγοκυττάρωση αυξάνεται με ένα υψηλότερο επειφανειακό φορτίο ανεξάρτητα από το αν το φορτίο είναι αρνητικό ή θετικό [63]. Όσο υψηλότερο είναι το επιφανειακό φορτίο, τόσο μικρότερος είναι ο χρόνος παραμονής των νανοσωματιδίων στο κυκλοφορικό σύστημα [65]. 6.4 Ικανότητα προσρόφησης πρωτεινών Εάν τα νανοσωματίδια χορηγούνται με ενδοφλέβια ένεση, συμβαίνει άμεση αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες του πλάσματος. Η προσρόφηση των πρωτεϊνών στην επιφάνεια των σωματιδίων ονομάζεται οψονοποίηση [96]. Το ποσό των προσροφημένων πρωτεϊνών βασίζεται στο μέγεθος των νανοσωματιδίων καθώς επίσης στο φορτίο και την υδροφοβικότητα της επιφάνειας τους. Με αύξηση του μεγέθους, του φορτίου και της υδροφοβικότητας των σωματιδίων, η ικανότητα προσρόφησης των πρωτεϊνών αυξάνετα [63]. Επίσης οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις έχουν μία επίδραση στην πρωτεϊνική προσρόφηση [97], έτσι ώστε αφυδάτωση των υδρόφοβων περιοχών οδηγεί σε αύξηση της εντροπίας, η οποία με τη σειρά της διευκολύνει την προσρόφηση πρωτεινών [98]. Τα συστατικά των προσροφημένων πρωτεϊνών διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην βιοκατανομή, την αποικοδόμηση και την αποβολή των νανοσωματιδίων [63,99-100]. Πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη φαγοκυττάρωση ονομάζονται οψονίνες (π.χ. ανοσοσφαιρίνηg (IgG), φιμπρονεκτίνη) [59,101], ενώ εκείνες που αναστέλλουν τη φαγοκυττάρωση καλούνται δυσοψονίνες [96]. 35

Η προσρόφηση των διαφόρων πρωτεϊνών στα συστήματα των νανοσωματιδίων έχει ερευνηθεί in vitro και in vivo [96,102,103]. Οι οψονίνες και οι δυσοψονίνες καθώς και άλλες ανενεργές πρωτεΐνες του πλάσματος του αίματος είναι υπεύθυνες για τη γενική συμπεριφορά των νανοσωματιδίων in vivo. 7. ΧΡΟΝΟΣ ΕΚΚΑΘΑΡΙΣΗΣ (CLEARANCE TIME) Μία βασική παράμετρος για την βιωσιμότητα των μαγνητικών νανοσωματιδίων, είναι ο μέγιστος χρόνος που μπορούν να διατηρήσουν τις ιδιότητες τους υπό φυσιολογικές συνθήκες in vivo. Με το που εισέρχονται τα νανοσωματίδια στην ροή του αίματος (συνήθως με ενδοφλέβια ένεση), πολύ γρήγορα καλύπτονται από συστατικά της κυκλοφορίας, όπως πρωτεΐνες πλάσματος, με μια διαδικασία που ονομάζεται οψονοποίηση. Η οψονοποίηση καθιστά τα νανοσωματίδια αναγνωρίσιμα από τον κύριο μηχανισμό άμυνας του οργανισμού, το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα (RES). Tο σύστημα RES αποτελείται από φαγοκύτταρα, τα οποία «καταπίνουν» τον ξένο παράγοντα που μπορεί να συνιστά κίνδυνο και τον διαλύουν, και συσχετίζονται κυρίως με το ήπαρ, την σπλήνα και τους λεμφαδένες. Η οψονοποίηση και η φαγοκυττάρωση απεικονίζονται στο σχήμα 12. Σχήμα 12: Οψονοποίηση και φαγοκυττάρωση [11] 36

Ο ρυθμός εκκαθάρισης των νανοσωματιδίων εξαρτάται από: το μέγεθος του νανοσωματιδίου, το φορτίο, την υδροφοβικότητα της επιφάνειας, τον αριθμό και το είδος των λειτουργικών ομάδων της επιφάνειας. Γενικά, όσο πιο έντονα κατιονικό είναι ένα νανοσωματίδιο, τόσο πιο τοξικό είναι για τον οργανισμό. Οι υδρόφιλες επιφάνειες, δηλαδή οι υδρόφιλες επικαλύψεις όπως η δεξτράνη, το PEG, το οξείδιο του πολυαιθυλενίου PEO κ.α., παρέχουν ένα δυναμικό «νέφος» υδρόφιλων και ουδέτερων αλυσίδων στην επιφάνεια του νανοσωματιδίου το οποίο απωθεί τις πρωτεΐνες του πλάσματος και εμποδίζει την γρήγορη εκκαθάριση από το κυκλοφορικό σύστημα [11]. 8. ΦΟΡΤΩΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΦΑΡΜΑΚΟΥ Η αποτελεσματικότητα της φόρτωσης και της αποδέσμευσης των φαρμάκων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη δυνατότητα σχεδίασης ενός βιοσυμβατού κολλοειδούς νανοφορέα που θα επιτρέπει υψηλή φόρτωση των μορίων των φαρμάκων χωρίς πρόωρη αποδέσμευση του φαρμάκου πριν αυτό να φτάσει στον προορισμό του. Έτσι, ο φορέας πρέπει να έχει καλές ιδιότητες βιοσυμβατότητας με υψηλή ικανότητα ενθυλάκωσης και θα πρέπει να παρουσιάζει ελεγχόμενη αποδέσμευση των μορίων του φαρμάκου σε συγκεκριμένη θέση. Γενικά, όταν το φάρμακο χορηγηθεί, δεν θα έχει καμία προτίμηση σε κάποια θέση και ως εκ τούτου μπορεί να διανεμεθεί σε όλα τα όργανα, γεγονός που σε πολλές περιπτώσεις είναι ανεπιθύμητο εξαιτίας του τοξικού χαρακτήρα του φαρμάκου. 9. ΦΟΡΤΩΣΗ ΦΑΡΜΑΚΟΥ Στην ιδανική περίπτωση, ένα επιτυχημένο σύστημα νανοσωματιδίων θα πρέπει να έχει υψηλή ικανότητα φόρτωσης φαρμάκου. Σε ότι αφορά τη φόρτωση του φαρμάκου, αυτή επιτυγχάνεται είτε με ομοιοπολικό δεσμό είτε με εγκλωβισμό του φαρμάκου σε ένα στρώμα του πολυμερούς [104]. Η ομοιοπολική σύνδεση μπορεί να είναι πολύ ισχυρή για να διασπαστεί από κυτταρικά ένζυμα [105]. Η φόρτωση των φαρμάκων και η αποτελεσματικότητα εγκλωβισμού τους εξαρτώνται πολύ από τη διαλυτότητα της στερεάς κατάστασης του φαρμάκου στο υλικό της μήτρας ή στο πολυμερές, η οποία σχετίζεται με τη σύνθεση του πολυμερούς, το μοριακό βάρος, την αλληλεπίδραση του φαρμάκου με το πολυμερές και τη παρουσία τελικών λειτουργικών ομάδων ( π.χ. εστέρων ή καρβοξυλομάδων) [106]. Η ομάδα PEG δεν έχει καμία ή έχει μικρή επίδραση στη φόρτωση του φαρμάκου [107]. Για τα μικρά μόρια, μελέτες δείχνουν ότι η χρήση ιονικής 37

αλληλεπίδρασης μεταξύ του φαρμάκου και του υλικού της μήτρας μπορεί να είναι ένας πολύ αποτελεσματικός τρόπος για την αύξηση της φόρτωσης των φαρμάκων [108]. 10. ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΦΑΡΜΑΚΟΥ Για την ανάπτυξη ενός επιτυχημένου συστήματος νανοσωματιδίων, τόσο η αποδέσμευση του φαρμάκου όσο και η βιοαποικοδόμηση του πολυμερούς είναι και οι δύο σημαντικοί παράγοντες που πρέπει να λαμβάνονται υπόψιν. Γενικά, ο ρυθμός αποδέσμευσης του φαρμάκου εξαρτάται από: 1. τη διαλυτότητα του φαρμάκου, 2. την εκρόφηση του προσροφημένου φαρμάκου, 3. τη διάχυση του φαρμάκου μέσω της μήτρας του νανοσωματιδίου, 4. τη διάβρωση της μήτρας των νανοσωματιδίων, και 5. το συνδυασμό της διάβρωσης και της διαδικασίας της διάχυσης. Έτσι η διαλυτότητα, η διάχυση και η βιοαποικοδόμηση των υλικών της μήτρας διέπουν τη διαδικασία αποδέσμευσης. Εάν η διάχυση του φαρμάκου είναι ταχύτερη από τη διάβρωση της μήτρας, ο μηχανισμός αποδέσμευσης ελέγχεται σε μεγάλο βαθμό από μια διαδικασία διάχυσης. Η ταχεία αρχική αποδέσμευση ή «έκρηξη» ( burst ) οφείλεται κυρίως στην ασθενή δέσμευση του φαρμάκου ή στην προσρόφηση του φαρμάκου στη μεγάλη επιφάνεια των νανοσωματιδίων [109]. Είναι προφανές ότι η μέθοδος εγκλωβισμού, έχει επίδραση στο προφίλ της αποδέσμευσης. Εάν το φάρμακο είναι φορτωμένο με τη μέθοδο του εγκλωβισμού, το σύστημα έχει ένα σχετικώς μικρό burst effect και καλύτερα χαρακτηριστικά αποδέσμευσης [110]. Εάν το νανοσωματίδιο είναι επικαλυμμένο με πολυμερές, η αποδέσμευση στη συνέχεια ελέγχεται από τη διάχυση του φαρμάκου από τον πυρήνα σε ολόκληρη την πολυμερική μεμβράνη. Η επίστρωση της μεμβράνης ενεργεί ως εμπόδιο στην αποδέσμευση κι ως εκ τούτου, η διαλυτότητα και η διάχυση του φαρμάκου στη πολυμερική μεμβράνη γίνεται καθοριστικός παράγοντας στην αποδέσμευση του φαρμάκου. Επιπλέον ο ρυθμός αποδέσμευσης μπορεί επίσης να επηρεάζεται από ιοντικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ του φαρμάκου και της προσθήκης των βοηθητικών συστατικών. Όταν το φάρμακο εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση με τα βοηθητικά συστατικά για το σχηματισμό ενός λιγότερου υδατοδιαλυτού συμπλέγματος, τότε η αποδέσμευση του φαρμάκου μπορεί να είναι πολύ αργή με σχεδόν μηδενισμό του burst release [108]. Σε μια μελέτη [207], οι Gautier et al. μελέτησαν την αποδέσμευση της Dox από επικαλυμμένα με PEG Spions (η Dox είχε φορτωθεί στα Spions με τη μορφή συμπλέγματος Dοx-Fe 2+ ). Σε ph 7.4, η κινητική που παρατηρήθηκε ήταν προοδευτική, χωρίς την εμφάνιση burst effect. Η Dox αποδεσμευόταν συνεχώς κατά τη διάρκεια 2 ωρών και στη συνέχεια 38

έφθανε σε ένα πλατώ που ισοδυναμούσε με ~70% του φορτωμένου φαρμάκου. Τα αποτελέσματα έδειχναν ότι το στρώμα PEG δεν εμπόδιζε το φάρμακο να αποδεσμευτεί, αλλά καθυστερούσε το φαινόμενο αυτό σε φυσιολογικό ph. Σε ph 4, η αποδέσμευση επιταγχυνόταν σημαντικά με το 85% του φαρμάκου να αποδεσμεύεται σε 1 ώρα και σχεδόν ολοκληρωτική αποδέσμευση μέσα σε 2 ώρες. H υπόθεση που έκαναν ήταν ότι το φαινόμενο της αποδέσμευσης ήταν ακόμη πιο γρήγορο, επειδή το σύμπλεγμα Dοx-Fe 2+ δεν ήταν σταθερό σε ph 4 [111]. Ο χρόνος της αποδέσμευσης στη συνέχεια εξαρτώταν από το χρόνο που απαιτούταν για τη σταθεροποίηση του όξινου ph κοντά στην επιφάνεια του Spion μετά τη διάχυση μέσα από το στρώμα του PEG. Σύμφωνα με τη μελέτη, η κινητική σε ph 7.4 φαίνεται να προσαρμόζεται στη μαγνητική στόχευση των φαρμάκων. Το πιο όξινο ph του καρκινικού ιστού [112,113] θα πρέπει να διεγείρει την αποδέσμεσυση της συμπλοκοποιημένης Dox, αλλά και της εγκλωβισμένης Dox, η οποία θα μεταφέρει στη συνέχεια ένα θετικό φορτίο στο μόριο του σακχάρου. Σύμφωνα με τις πειραματικές συνθήκες της συγκεκριμένης μελέτης, η εμφάνιση ενός πλατώ δείχνει ότι μόνο ένα μέρος της φορτωμένης Dox αποδεσμεύεται σιγά-σιγά από τα Spion. Αυτό το είδος των αποτελεσμάτων περιγράφονται στην βιβλιογραφία για τα επικαλυμμένα Spion. Σε ph 7.4, το 33% της προσροφημένης Dox αποδεσμευέται μέσα σε 24 ώρες από τα επικαλυμμένα με PEG Spion [114] και 31% σε 48 ώρες από επικαλυμμένο με Ν-ισοπροπυλακρυλαμίδιο (NIPAAP), ακρυλικό οξύ (AA) και PEGMA Spion συζευγμένο στη συνέχεια με φολλικό οξύ [115]. Η υπόθεσή που έκαναν ήταν ότι η αποδέσμευση ελέγχεται από τη διάχυση του φαρμάκου μέσω του πολυμερούς. Στην περίπτωση αυτή, η αναλογία όγκου δότη / δέκτη είναι καθοριστική για τη τιμή του πλατώ, και θα πρέπει να εκτοπίζεται αν ο όγκος του δέκτη ήταν μεγαλύτερος. Ωστόσο, αυτή δεν είναι η μόνη εξήγηση, δεδομένου ότι η ιοντική ισχύς του μέσου αποδέσμευσης μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο στο ποσοστό της ανταλλαγής ιόντων στην επιφάνεια του Spion, όπως περιγράφεται στη βιβλιογραφία [116]. Σε μια άλλη μελέτη, οι Akbarzadeh et al. [117] απέδωσαν το γεγονός της μείωσης του ποσοστού αποδέσμευσης της Dox από υβριδικά μαγνητικά νανοσωματίδια (με την αύξηση της τιμής του ph) στο ότι η ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση υπήρχε στο ουδέτερο περιβάλλον και εξαφανίστηκε στο όξινο (η τιμή pka της αμινομάδας στην δοξορουβικίνη ήταν περίπου 8,2.). 11. ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗΣ Η τεχνολογία ελεγχόμενης χορήγησης φαρμάκων αποτελεί ένα ταχέως αναπτυσσόμενο πεδίο. Τέτοια συστήματα μεταφοράς φαρμάκων προσφέρουν πολλά 39

πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τις συμβατικές φαρμακομορφές όπως είναι η βελτίωση του θεραπευτικού αποτελέσματος, η μείωση της τοξικότητας καθώς και η βελτιωμένη συμμόρφωση του ασθενούς. Όλα τα συστήματα ελεγχόμενης αποδέσμευσης αποσκοπούν στη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας με φάρμακα [118]. Αυτή η βελτίωση μπορεί να λάβει τη μορφή της μείωσης των παρενεργειών, της μείωσης του αριθμού των χορηγήσεων του φαρμάκου που απαιτούνται κατά τη διάρκεια της θεραπείας ή της εξάλειψης της ανάγκης για εξειδικευμένη χορήγηση (π.χ. επαναλαμβανόμενες ενέσεις). Σε ότι αφορά τον έλεγχο της αποδέσμευσης του φαρμάκου δύο τύποι μπορούν να επιτευχθούν, ο έλεγχος του χρόνου και ο έλεγχος της κατανομής. 12. ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗΣ Στο χρονικό έλεγχο, τα συστήματα χορήγησης φαρμάκων στοχεύουν στην αποδέσμευση του φαρμάκου κατά τη διάρκεια μιας παρατεταμένης περιόδου ή σε μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Η ελεγχόμενη αποδέσμευση κατά τη διάρκεια μιας παρατεταμένης περιόδου είναι ιδιαίτερα επωφελής όταν χρησιμοποιούνται φάρμακα τα οποία μεταβολίζονται γρήγορα και αποβάλλονται από το σώμα μετά τη χορήγηση. Ένα παράδειγμα αυτού του όφελους απεικονίζεται στο σχήμα 13 στο οποίο η συγκέντρωση του φαρμάκου στη θέση δράσης μέσα στο σώμα συγκρίνεται μετά από την άμεση αποδέσμευση από 4 ενέσεις χορηγούμενες σε 6 ωριαία χρονικά διαστήματα και μετά από παρατεταμένη αποδέσμευση από ένα σύστημα ελεγχόμενης αποδέσμευσης. Οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου μπορεί να κυμαίνονται ευρέως κατά την περίοδο 24 ωρών, όταν το φάρμακο χορηγείται με ένεση εφόδου, και μόνο για ένα μέρος της διάρκειας της θεραπείας είναι η συγκέντρωση του φαρμάκου στο θεραπευτικό παράθυρο (δηλαδή, η συγκέντρωση του φαρμάκου που παράγει ευεργετικά αποτελέσματα, χωρίς επιβλαβείς παρενέργειες). Με τα συστήματα ελεγχόμενης αποδέσμευσης, ο ρυθμός της αποδέσμευσης του φαρμάκου αντιστοιχεί με το ρυθμό της αποβολής του φαρμάκου, και, ως εκ τούτου, η συγκέντρωση του φαρμάκου είναι εντός του θεραπευτικού παραθύρου σχεδόν καθ όλη τη διάρκεια της 24 ώρης θεραπείας. Κλινικά, ο χρονικός έλεγχος μπορεί να παράγει μια σημαντική βελτίωση της φαρμακευτικής θεραπείας. Για παράδειγμα, όταν ένα οπιοειδές παυσίπονο χορηγείται σε ένα ασθενή με καρκίνο τελικού σταδίου, κάθε φορά που η συγκέντρωση του φαρμάκου είναι κάτω από τις θεραπευτικές συγκεντρώσεις ο ασθενής πονάει. Ένα σύστημα χρονικά ελεγχόμενης αποδέσμευσης θα διασφαλίσει ότι θα προέλθει από το φάρμακο το μέγιστο δυνατό όφελος. Ο έλεγχος της κατανομής, έχει ως στόχο 40

συστήματα χορήγησης φαρμάκων να στραφούν προς την αποδέσμευση του φαρμάκου στην ακριβή θέση δράσης τους μέσα στο σώμα. Το πλεονέκτημα αυτού του τύπου ελέγχου απεικονίζεται στο σχήμα 14, στο οποίο συγκρίνονται οι συγκεντρώσεις του φαρμάκου στο επιθυμητό σημείο της δράσης του και η πρόκληση παρενεργειών. Υπάρχουν δύο περιπτώσεις όπου ο έλεγχος της κατανομής μπορεί να είναι οφέλιμος. Η πρώτη είναι όταν η φυσική κατανομή προκαλεί τα μόρια των φαρμάκων να συναντήσουν τους ιστούς και να προκαλέσουν σημαντικές παρενέργειες που απαγορεύουν την περαιτέρω θεραπεία. Αυτή η κατάσταση είναι συχνά η αιτία της αποτυχίας της χημειοθεραπείας όταν ο θάνατος των κυττάρων του μυελού των οστών εμποδίζει τον ασθενή να υποβληθεί σε μια πλήρη θεραπεία. Η δεύτερη περίπτωση είναι όταν η φυσική κατανομή του φαρμάκου δεν επιτρέπει στα μόρια των φαρμάκων να φθάσουν στη θέση δράσης τους. Για παράδειγμα, ένα φαρμακευτικό μόριο που δρα σε ένα υποδοχέα στον εγκέφαλο δεν θα είναι ενεργό, αν κατανέμεται από το αίμα του ασθενούς αλλά δεν μπορεί να διαπεράσει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό [119]. Ένας μεγάλος αριθμός των κατηγοριών των φαρμάκων μπορούν να επωφεληθούν από τη χρονικά και χωρικά ελεγχόμενη αποδέσμευση. Αυτές οι κατηγορίες περιλαμβάνουν χημειοθεραπευτικά φάρμακα, ανοσοκατασταλτικά, αντιφλεγμονώδη φάρμακα, αντιβιοτικά, ανταγωνιστές των οπιοειδών, στεροειδή, ορμόνες, αναισθητικά. Πρόσφατα, η ανάγκη ανάπτυξης νέων στρατηγικών ελεγχόμενης αποδέσμευσης έχει ενταθεί από τις προόδους στο σχεδιασμό πεπτιδικών φαρμάκων και την ανάδειξη της γονιδιακής θεραπείας. Αυτοί οι βιοτεχνολογικοί παράγοντες μπορεί να κυριαρχήσουν στην επόμενη γενιά των φαρμάκων. Ωστόσο, η κλινική επιτυχία τους μπορεί να εξαρτάται από το σχεδιασμό των συσκευών ελεγχόμενης αποδέσμευσης οι οποίες θα διασφαλίζουν ότι τα φάρμακα φτάνουν στα κύτταραστόχους τους ακριβώς στον απαιτούμενο χρόνο. 41

Σχήμα 13: Συγκεντρώσεις του φαρμάκου στη θέση της θεραπευτικής δράσης μετά την μεταφορά από μια συμβατική ένεση (λεπτή γραμμή) και από ένα χρονικά ελεγχόμενο σύστημα αποδέσμευσης (έντονη γραμμή). [120] Σχήμα 14. Η χορήγηση φαρμάκων από ένα ιδανικό σύστημα ελεγχόμενης αποδέσμευσης σε ότι αφορά την κατανομή. Έντονη γραμμή: συγκεντρώσεις του φαρμάκου στη θέση της θεραπευτικής δράσης. Λεπτή γραμμή: επίπεδα στα οποία εμφανίζονται παρενέργειες [120]. 42

13. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗΣ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΩΝ Ένα ευρύ φάσμα μηχανισμών έχει αναπτυχθεί ώστε να επιτευχθεί τόσο ελεγχόμενη αποδέσμευση σε ότι αφορά την κατανομή όσο και χρονικά ελεγχόμενη αποδέσμευση των φαρμάκων. Για παράδειγμα, ένα φάρμακο που πρόκειται να αποδεσμευτεί για μεγάλο χρονικό διάστημα στο στομάχι του ασθενούς, όπου το ph είναι όξινο και οι συνθήκες του περιβάλλοντος δεν είναι σταθερές, θα απαιτήσει πολύ διαφορετικό σύστημα αποδέσμευσης από εκείνο που θα απαιτήσει ένα φάρμακο που πρόκειται να μεταφερθεί με παλμικό τρόπο στο αίμα. Μία σημαντική παράμετρος στο σχεδιασμό πολυμερών για κάθε μηχανισμό ελεγχόμενης αποδέσμευσης είναι η «μοίρα» του πολυμερούς μετά την αποδέσμευση του φαρμάκου. Πολυμερή που φυσιολογικά αποβάλλονται από το σώμα είναι επιθυμητά για πολλές εφαρμογές ελεγχόμενης αποδέσμευσης [121,122]. Αυτά τα πολυμερή μπορεί να αποβάλλονται απευθείας μέσω των νεφρών ή μπορεί να βιοδιασπώνται σε μικρότερα μόρια τα οποία στη συνέχεια αποβάλλονται. Μη διασπώμενα πολυμερή είναι αποδεκτά σε εφαρμογές στις οποίες το σύστημα μεταφοράς μπορεί να ανακτηθεί μετά την αποδέσμευση του φαρμάκου (π.χ., την αφαίρεση του επιθέματος) ή για στοματικές εφαρμογές στις οποίες το πολυμερές περνά μέσα από το γαστρεντερικό σωλήνα. Από την άποψη της χημείας των πολυμερών, είναι σημαντικό να εκτιμήσουμε ότι οι διαφορετικοί μηχανισμοί ελεγχόμενης αποδέσμευσης απαιτούν πολυμερή με μια ποικιλία φυσικοχημικών ιδιοτήτων. 14. ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗ ΧΡΟΝΙΚΑ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ Τα περισσότερα μόρια των φαρμάκων πρέπει να διαλυθούν στο υδατικό περιβάλλον του ασθενούς και ελεύθερα να διαχυθούν εντός του μέσου πριν να μπορέσουν να δράσουν στους υποδοχείς που αποτελούν το στόχο τους. Πολυμερικά συστήματα που επιτυγχάνουν χρονικά ελεγχόμενη αποδέσμευση προστατεύουν τα μόρια του φαρμάκου από αυτό το υδατικό περιβάλλον για προγραμματισμένες εκ των προτέρων χρονικές περιόδους. Η προστασία αυτή μπορεί να συνεπάγεται καθυστέρηση της διάλυσης των μορίων των φαρμάκων, αναστέλλοντας τη διάχυση του φαρμάκου από το φορέα ή ελέγχοντας τη ροή των διαλυμάτων των φαρμάκων [123]. Οι μηχανισμοί αυτοί φαίνονται στο σχήμα 15. Πολυμερή που χρησιμοποιούνται για την καθυστέρηση της διάλυσης των φαρμάκων έχουν ως στόχο να επιβραδύνουν το ρυθμό με τον οποίο τα μόρια των φαρμάκων εκτίθενται στο νερό του υδάτινου περιβάλλοντος γύρω από το 43

σύστημα χορήγησης φαρμάκων. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με μία πολυμερική επίστρωση ή με μήτρα που διαλύεται με βραδύτερο ρυθμό σε σχέση με το φάρμακο. Στην ελεγχόμενη με διάχυση αποδέσμευση (diffusion-controlled release), η διάχυση των μορίων των φαρμάκων μέσα σε ένα υδατικό διάλυμα αναστέλλεται από την αδιάλυτη πολυμερική μήτρα στην οποία τα μόρια των φαρμάκων πρέπει να ταξιδεύουν μέσω ελικοειδών μονοπατιών για να βγούν από τη μήτρα. Πολυμερικές αλυσίδες όπως αυτές σε ένα διασταυρώμενο υδροπήκτωμα αποτελούν το φραγμό διάχυσης. Το εμπόδιο στη διάχυση μπορεί να μειωθεί με τη διόγκωση του υδροπηκτώματος, για παράδειγμα, που δημιουργεί κενά στη δομή της γέλης. Πολυμερή που χρησιμοποιούνται για την ελεγχόμενη με διάχυση αποδέσμευση μπορούν να κατασκευαστούν είτε ως μήτρες στις οποίες το φάρμακο είναι ομοιόμορφα κατανεμημένο ή ως ρυθμοπεριοριστικές μεμβράνες που προστατεύουν την δεξαμενή του φαρμάκου από το περιβάλλον. Οι συσκευές που ελέγχουν τη ροή των διαλυμάτων των φαρμάκων μερικές φορές χρησιμοποιούν τη διαβάθμιση της οσμωτικής πίεσης για τη δημιουργία συμπιεσμένων θαλάμων που περιέχουν υδατικά διαλύματα του φαρμάκου. Πολλές συσκευές χρονικά ελεγχόμενης αποδέσμευσης χρησιμοποιούν τους παραπάνω μηχανισμούς για να παρέχουν διαρκή αποδέσμευση του φαρμάκου σε σταθερό ρυθμό. Μια άλλη μορφή της χρονικά ελεγχόμενης αποδέσμευσης αναφέρεται στη μεταφορά των φαρμάκων κατά την οποία το φάρμακο αποδεσμεύεται με παλμικό τρόπο μόνο όταν απαιτείται από το σώμα [124]. Πολλές εργασίες σε αυτόν τον τομέα έχουν ως τελικό στόχο τη μεταφορά της ινσουλίνης σε διαβητικούς. Οι ανάγκες σε ινσουλίνη κυμαίνονται καθ όλη τη διάρκεια της ημέρας λόγω της πρόσληψης τροφής από τον ασθενή και την αλλαγή δραστηριότητας των επίπεδων γλυκόζης στο αίμα. Τωρινά σκευάσματα ινσουλίνης απαιτούν επαναλαμβανόμενες ενέσεις καθημερινά και προσεκτικό έλεγχο της πρόσληψης γλυκόζης. Η αποκρινόμενη μεταφορά φαρμάκων ελπίζει να φέρει την επανάσταση στη θεραπεία με ινσουλίνη με το σχεδιασμό συστημάτων που αποδεσμεύουν ινσουλίνη σε απόκριση της αύξησης των επιπέδων γλυκόζης στο αίμα. Σε γενικές γραμμές, τα αποκρινόμενα συστήματα μεταφοράς φαρμάκων έχουν δύο συστατικά: έναν αισθητήρα που ανιχνεύει την περιβαλλοντική παράμετρο που διεγείρει την αποδέσμευση του φαρμάκου και μια συσκευή μεταφοράς που αποδεσμεύει το φάρμακο. Για τη θεραπεία του διαβήτη, τα αποκρινόμενα συστήματα μεταφοράς φαρμάκων που έχουν προταθεί χρησιμοποιούν το ένζυμο οξειδάση της γλυκόζης ως αισθητήρα [125]. Όταν τα επίπεδα σακχάρων στο αίμα αυξηθούν, η οξειδάση της γλυκόζης μετατρέπει τη γλυκόζη σε γλυκονικό οξύ με αποτέλεσμα να μειωθεί το ph. Αυτή η μείωση του ph στη συνέχεια, χρησιμοποιείται ως το σήμα για την αποδέσμευση της ινσουλίνης. Η αποδέσμευση 44

επιτυγχάνεται από ph-ευαίσθητα πολυμερή που είτε διογκώνονται είτε διασπώνται σε όξινα περιβάλλονται [126]. Η ιδέα της μεταφοράς φαρμάκων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για οποιαδήποτε φαρμακευτική θεραπεία στην οποία ένας αισθητήρας και μια συσκευή μεταφοράς μπορούν να συνδυαστούν. Σήματα που έχουν χρησιμοποιηθεί για να προκαλέσουν αποδέσμευση του φαρμάκου έχουν αναθεωρηθεί από τον Langer [127] και περιλαμβάνουν τα εξής: μαγνητικά σήματα στα οποία μαγνητικά σφαιρίδια κατανέμονται εντός πολυμερικής μήτρας και προκαλούν μια αναδιάταξη της μήτρας όταν ένα μαγνητικό πεδίο εφαρμόζεται, ηλεκτρικά σήματα στα οποία το μέγεθος των πόρων, η διαπερατότητα, και άλλοι παράγοντες ελέγχονται από την ηλεκτρικά διεγερμένη διόγκωση του πολυμερούς, υπερηχητικά σήματα στα οποία η ένταση, η συχνότητα και η διάρκεια της αύξησης των υπερήχων αποδεσμεύουν τόσο μη διασπώμενα όσο και βιοδιασπώμενα πολυμερικά συστήματα, συστήματα ph (ph systems) στα οποία ιονιζόμενες ομάδες εντός του πηκτώματος ελέγχουν τις αλληλεπιδράσεις των πολυμερικών αλυσίδων και συστήματα θερμοκρασίας (temperature systems) στα οποία θερμοευαίσθητα υδροπηκτώματα διογκώνονται και καταρρέουν σε απόκριση των διακυμάνσεων της θερμοκρασίας. Σχήμα 15: Παραδείγματα μηχανισμών χρονικά ελεγχόμενης αποδέσμευσης [120]. 45

15. ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΗ ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΣΕ ΟΤΙ ΑΦΟΡΑ ΤΗΝ ΚΑΤΑΝΟΜΗ Η απλούστερη μέθοδος για την επίτευξη του ελέγχου της κατανομής είναι να εμφυτευτεί το σύστημα χορήγησης φαρμάκων άμεσα στην θέση-στόχο. Αυτή η μέθοδος έχει επιτυχώς περιγραφεί στην μεταφορά των χημειοθεραπευτικών παραγόντων σε κακοήθη γλοιώματα χρησιμοποιώντας πολυ (ανυδρίτες) από τους Brem et al. [128]. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, πολυμερικοί δίσκοι οι οποίοι περιείχαν καρμουστίνη εμφυτεύτηκαν σε κοιλότητες που δημιουργήθηκαν μετά από χειρουργική αφαίρεση του όγκου. Για την πλειονότητα των ασθενειών που απαιτούν ελεγχόμενη σε ότι αφορά την κατανομή αποδέσμευση των φαρμάκων, πρέπει να χρησιμοποιηθεί ένας μηχανισμός στόχευσης που να επιτρέπει στο σύστημα μεταφοράς να βρει τον επιθυμητό στόχο [129]. Πολυμερή χρησιμοποιούνται σε δύο τύπους συστημάτων μεταφοράς για αυτές τις εφαρμογές, κολλοειδείς φορείς και συζεύγματα πολυμερούς-φαρμάκου. Στα κολλοειδή σκευάσματα, το πολυμερές εγκλωβίζει το φάρμακο εντός μικρο-ή νανοσωματιδίων [130]. Στα συζεύγματα πολυμερούς-φαρμάκου, το φάρμακο είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένο με το πολυμερές. Σε αυτές τις μορφές ελεγχόμενης σε ότι αφορά την κατανομή αποδέσμευση, το πολυμερές δρα ως φορέας, αλλά δεν είναι υπεύθυνο για τη στόχευση της συσκευής μεταφοράς [131]. Βιολογικά μόρια, όπως ανοσοσφαιρίνες και υδατάνθρακες συχνά χρησιμοποιούνται ως ομάδες στόχευσης. Ωστόσο, υπάρχουν αρκετά παραδείγματα στόχευσης στα οποία ο έλεγχος της κατανομής είναι μια εγγενής ιδιότητα του πολυμερικού φορέα. Πολυμερικές επιφανειοδραστικές ουσίες όπως τα συμπολυμερή πολυ (αιθυλενο γλυκόλης) και πολυ (προπυλενοξειδίου), που αναφέρονται επίσης ως pluronics, μεταβάλλουν την κατανομή των κολλοειδών φορέων στο σώμα [132]. Η αλλαγή στην κατανομή εξαρτάται από την ικανότητα των πολυμερικών επιφανειοδραστικών ουσιών να αλλάζουν την πρωτεϊνική προσρόφηση στις επιφάνειες των σωματιδίων. 16. ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΜΑΓΝΗΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΓΙΑ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΑΡΜΑΚΟΥ Σε ότι αφορά την παραγωγή μαγνητικών νανοσωματιδίων για βιοϊατρικές εφαρμογές, ίσως η σημαντικότερη διαδικασία είναι εκείνη της επένδυσης επικάλυψης του μαγνητικού πυρήνα του νανοσωματιδίου με κάποιο βιοσυμβατό υλικό, φυσικό (όπως οι πρωτεΐνες) ή συνθετικό (όπως η δεξτράνη). Βέβαια το ότι το υλικό που θα επιλεγεί ως επένδυση μπορεί να είναι βιοσυμβατό, δεν σημαίνει κατ ανάγκη ότι και το τελικό νανοσωματίδιο που θα προκύψει θα 46

είναι βιοσυμβατό. Οι ενώσεις αυτές «τυλίγονται» γύρω από τον μαγνητικό πυρήνα και δημιουργούν ένα επιπλέον στρώμα. Γενικώς οι επικαλύψεις προσφέρουν τα εξής πλεονεκτήματα: 1. Ενίσχυση αντοχής στην οξείδωση. 2. Κολλοειδή σταθερότητα υπό φυσιολογικές συνθήκες. 3. Αντίσταση στη φαγοκυττάρωση. 4. Μηχανική σταθερότητα. 5. Βιοσυμβατότητα. Η δυνατότητα της τροποποίησης είναι η πλέον κρίσιμη όταν θέλουμε ένα σωματίδιο να καταστεί πολυλειτουργικό. Η πολυλειτουργικότητα έχει να κάνει με την ικανότητα του υλικού που έχει χρησιμοποιηθεί ως επικάλυψη να ενώνεται, με χημικό ή ηλεκτροστατικό τρόπο, με πολλά διαφορετικά μόρια ταυτόχρονα, ώστε κάθε ένα από αυτά τα μόρια να επιτελεί αυτόνομα και ανεξάρτητα από τα υπόλοιπα την κάθε φορά επιθυμητή λειτουργία [11]. Τα οξείδια του σιδήρου με δομή πυρήνα / κελύφους είναι τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα ως πηγές των μαγνητικών υλικών [135]. Τα οξείδια του σιδήρου έχουν πολλά κρυσταλλικά πολύμορφα γνωστά ως α-fe 2 O 3 (αιματίτης), β-fe 2 O 3, γ-fe 2 O 3 (μαγγεμίτης), ε-fe 2 O 3, Fe 3 O 4 (μαγνητίτης) και κάποια άλλα ακόμη [134]. Παρ'όλα αυτά, μόνο ο μαγγεμίτης και ο μαγνητίτης βρέθηκαν να έχουν το μεγαλύτερο ενδιαφέρον σε ότι αφορά τις βιοεφαρμογές [135]. Σε ορισμένες μελέτες, καθαρά μέταλλα, όπως ο Fe και το Co επιλέχθηκαν ως μαγνητικά υλικά, επειδή έχουν πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με τα οξείδια του σιδήρου όπως π.χ., καλύτερες μαγνητικές ιδιότητες και υψηλή μαγνήτιση κορεσμού [136]. Ωστόσο, ο Fe και το Co έχουν χειρότερη οξειδωτική σταθερότητα, χειρότερη συμβατότητα σε μη υδατικά συστήματα και τοξικότητα σε σχέση με τα οξείδια του σιδήρου. Η τροποποίηση των μαγνητικών νανοσωματιδίων (MNPs) με αμινομάδες, διοξείδιο του πυριτίου, πολυμερή, διάφορες επιφανειοδραστικές ουσίες ή άλλες οργανικές ενώσεις (βλ. Σχήμα.16) παρέχεται συνήθως προκειμένου να επιτευχθούν καλύτερες φυσικοχημικές ιδιότητες. Επιπλέον,η δομή πυρήνα/κελύφους των MNPs παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα όπως αυτά της καλής διασποράς, της υψηλής σταθερότητας έναντι της οξείδωσης και της αξιόλογης ποσότητας φαρμάκου που μπορεί να φορτωθεί στο πολυμερικό κέλυφος [137]. 47

Ακόμη, πολλές λειτουργικές ομάδες από πολυμερή που βρίσκονται στην επιφάνεια των σωματιδίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω τροποποίηση με σκοπό τη λήψη ποικίλων ιδιοτήτων [138]. Είναι ευνοικό το γεγονός ότι τα MNPs διατηρούν επαρκή υδροφιλικότητα και με την προσθήκη επίστρωσης δεν υπερβαίνουν τα 100 nm σε μέγεθος αποφεύγοντας τη ταχεία εκκαθάριση από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα [139]. Έχει βρεθεί επίσης ότι η τροποποίηση της επιφάνειας διαδραματίζει το βασικό ρόλο σε ότι αφορά την τοξικότητα των νανοσωματιδίων. Σχήμα 16: Διαδικασίες προετοιμασίας μαγνητικών σωματιδίων για την παράδοση φαρμάκων [140]. 17. ΕΙΔΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ Τα τελευταία χρόνια έχουν χρησιμοποιηθεί πάρα πολλές ενώσεις ως υλικά επικάλυψης. Ο χρυσός είναι μια πολύ δημοφιλής επικάλυψη, καθώς προσφέρει αξιοσημείωτη αντίσταση στην διάβρωση και στην οξείδωση. Εντούτοις η βιοσυμβατότητα του δεν είναι η επιθυμητή, αφού ο Au δεν υπάρχει υπό φυσιολογικές συνθήκες στον οργανισμό, οπότε θεωρείται ξένο σώμα και μπορεί να προκαλέσει ανοσολογική αντίδραση. Οι πολυσακχαρίτες, δηλαδή μεγάλα μόρια υδατανθράκων αλυσιδωτής ή διακλαδωμένης μορφής, είναι εξαιρετικά βιοσυμβατοί, όμως είναι δομικά ασταθείς ενώσεις και μπορούν να διαλυθούν σε όξινα περιβάλλοντα. Ένα άλλο 48

είδος επικάλυψης, είναι η επικάλυψη με βάση το πυρίτιο. Αυτές οι επικαλύψεις χρησιμοποιούνται για την προστασία των νανοσωματιδίων από την λυσοσωμική ενζυμική πέψη, βελτιώνοντας ταυτόχρονα τις μηχανικές ιδιότητες και την χημική σταθερότητα. Επειδή όμως οι επικαλύψεις αυτές είναι συνήθως πορώδεις, τα συστατικά που μπορεί να βρίσκονται στο εσωτερικό τους ενδέχεται να διαλυθούν ή να οξειδωθούν. Ωστόσο, η επίστρωση μπορεί να οδηγήσει σε τροποποίηση της φόρτωσης και της αποδέσμευσης των φαρμάκων γεγονός που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη [141]. 17.1. Πολυμερική επίστρωση Η επίστρωση των MNPs με πολυμερή που χρησιμοποιούνται για μεταφορά φαρμάκων είναι ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος τρόπος για την επίλυση του προβλήματος της σταθερότητας των νανοσωματιδίων από την οξείδωση, όπως αποδεικνύεται σε πολλά παρακάτω παραδείγματα [142]. Οι Reshmi et al. αναφέρουν τη μέθοδο με την οποία προετοίμασαν σύνθετα κολλοειδή νανοσωματίδια δομής πυρήνα/κελύφους, αποτελούμενα από μαγνητικό πυρήνα (ξεκινώντας από καρβονύλιο σιδήρου) και βιοδιασπώμενο πολυμερικό κέλυφος [143]. Το πολυμερικό περίβλημα θα μπορούσε να μεταφέρει το φάρμακο και να το απελευθερώσει κατά τη διάρκεια της βιοαποικοδόμησης του [144]. Τα MNPs τείνουν να συσσωματωθούν λόγω των ισχυρών μαγνητικών έλξεων διπόλουδιπόλου μεταξύ των σωματιδίων. Για να αποφευχθεί αυτό το φαινόμενο, οι επιφάνειες των MNPs επικαλύπτονται με υδρόφιλα πολυμερή, όπως το άμυλο ή η δεξτράνη και η χιτοζάνη [145]. Αξίζει να σημειωθεί ότι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο πολυμερές που λειτουργεί ως επικάλυψη είναι το PEG. Η σύνδεση του PEG προάγει τη διαλυτότητα στο νερό, μειώνει την τοξικότητα και αυξάνει την in vivo ημιζωή των μικρών μορίων φαρμάκων. 18. ΣΤΑΘΕΡΟΠΟΙΗΣΗ ΥΒΡΙΔΙΚΩΝ ΝΑΝΟΔΟΜΩΝ Η κολλοειδής σταθεροποίηση των νανοσωματιδίων σε υδάτινο και φυσιολογικό μέσο είναι ζωτικής σημασίας για τις θεραπευτικές εφαρμογές τους και μπορεί να επιτευχθεί είτε με φόρτιση της επιφάνειας είτε με τη σύζευξή τους με μακρομόρια. Το επιφανειακό φορτίο μπορεί να παρακολουθείται και να εξασφαλίζεται με τα κατάλληλα μέσα, όπως η αλλαγή του ph του μέσου ή με την τροποποίηση λειτουργικών ομάδων. Η στερική σταθεροποίηση μπορεί να επιτευχθεί με την σύνδεση μακρομορίων, όπως είναι πολλές επιφανειοδραστικές ουσίες [146] ή 49

πολυμερή στην επιφάνεια των σωματιδίων. Η στερική σταθεροποίηση είναι όντως λιγότερο ευαίσθητη στην ιοντική ισχύ του μέσου και μπορεί να επιτευχθεί εύκολα και σε πολικό και σε μηπολικό μέσο. Τα νανοσωματίδια οξειδίου μπορούν να σταθεροποιηθούν είτε κατά τη διάρκεια της σύνθεσης τους ή σε μια μετα-συνθετική διαδικασία. Η in situ τροποποίηση κατά τη διάρκεια της σύνθεσης έχει πολλά πλεονεκτήματα, όπως τη μειωμένη συσσωμάτωση [147]. Αυτά τα βιοσυμβατά στρώματα σταθεροποιούν τα νανοσωματίδια και παρέχουν προσιτή επιφάνεια για τη σύζευξη άλλων επιθυμητών μορίων. 19. ΒΙΟΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΜΑΓΝΗΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ Η αποτελεσματική χρήση των MNPs στις βιοϊατρικές εφαρμογές, όπως η στοχευμένη μεταφορά φαρμάκων εξαρτάται από έναν αριθμό παραγόντων που σχετίζονται με το μέγεθος και το μαγνητισμό των βιοσυμβατών νανοσωματιδίων. Παράμετροι όπως οι φυσικοχημικές ιδιότητες των φορτωμένων με φάρμακο MNPs, η ένταση του πεδίου, το βάθος του ιστούστόχου, ο ρυθμός της ροής του αίματος, και η αγγειακή παροχή, παίζουν ρόλο στον καθορισμό της αποτελεσματικότητας της χορήγησης φαρμάκων [148]. Η αύξηση της μαγνήτισης είναι επωφελής για τη διευκόλυνση του χειρισμού συστημάτων μεταφοράς φαμάκων [149]. Τα νανοσωματίδια πρέπει να είναι μικρά, ώστε να μπορούν να είναι υπερπαραμαγνητικά, προκειμένου να αποφύγουν τη συσσωμάτωση μετά τη διακοπή του μαγνητικού πεδίου και να παραμείνουν στην κυκλοφορία χωρίς να απομακρυνθούν από τα φυσικά «φίλτρα» του σώματος όπως το ήπαρ ή το ανοσοποιητικό σύστημα [150]. Τα υπερπαραμαγνητικά νανοσυστήματα προτιμώνται λόγω της ικανότητάς τους να μαγνητίζονται μετά την έκθεση τους σε ένα μαγνητικό πεδίο, αλλά δεν έχουν μόνιμη μαγνήτιση αν το πεδίο απενεργοποιηθεί. Ο υπερπαραμαγνητισμός προκαλείται από θερμικές επιδράσεις στο υλικό. Στα υπερπαραμαγνητικά σωματίδια, οι θερμικές διακυμάνσεις είναι αρκετά ισχυρές για να απομαγνητίσουν αυθόρμητα μια κεκορεσμένη οργάνωση, ως εκ τούτου αυτά τα σωματίδια έχουν μηδενικό συνεκτικό πεδίο και δεν έχουν υστέρηση. (Σχήμα 17). 50

Σχήμα 17: Χαρακτηριστικά μαγνήτισης υπερπαραμαγνητικών (συνεχής γραμμή), παραμαγνητικών (γραμμή με τελείες) και σιδηρομαγνητικών (διακεκομμένη γραμμή) σωματιδίων [140]. 20. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΥΠΕΡΠΑΡΑΜΑΓΝΗΤΙΚΩΝ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ Μπορούμε να ταξινομήσουμε τις βιοϊατρικές εφαρμογές σύμφωνα με διάφορες παραμέτρους. Καταρχήν αν εφαρμόζονται in vivo ή in vitro. Σε ότι αφορά τις in vivo εφαρμογές αυτές μπορούν να διαχωριστούν περαιτέρω σε θεραπευτικές, όπως είναι η υπερθερμία και η μεταφορά φαρμάκων και σε διαγνωστικές (κυρίως ως γραφικά μέσα στην MRI). Σε ότι αφορά τις in vitro εφαρμογές, αυτές κυρίως χρησιμοποιούνται για διαγνωστικούς σκοπούς (κυρίως για τον διαχωρισμό ομάδων κυττάρων). Ο αριθμός των εφαρμογών με χρήση των Spion έχει αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια [67,151-152]. Στον τομέα της κλινικής ιατρικής, τα Spion χρησιμοποιούνται στη γονιδιακή μεταφορά, τη μαγνητική τομογραφία (MRI), την υπερθερμία και την ακτινοθεραπεία. Επιπλέον, τα Spion χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό των κυττάρων, των πρωτεΐνών, των μορίων DNA / RNA, των βακτηρίων, των ιών και βιομορίων [154]. Η in vivo αποικοδόμηση των Spion εξαρτάται από το υλικό του πυρήνα καθώς και από την επικάλυψη. Υλικά όπως οξείδιο του σιδήρου, η αλβουμίνη, η δεξτράνη, η χιτοζάνη μπορούν να αποικοδομούνται, ενώ υλικά όπως η αιθυλοκυτταρίνη, το πολυστυρένιο, το διοξείδιο του πυριτίου και άλλα δεν είναι αποικοδομήσιμα [67]. Τα τελευταία χρόνια, νανοσωματίδια που αποτελούνται από πυρήνα οξειδίου του σιδήρου προτιμώνται λόγω των καλών μαγνητικών ιδιοτήτων τους και της χαμηλής τοξικότητας για τον οργανισμό [67]. 51

Στις περισσότερες των περιπτώσεων τα νανοσωματίδια μπορούν να διακριθούν σε τρεις ομάδες: (i) μη τροποποιημένα, χωρίς επικάλυψη Spion με μέγιστη ευελιξία που αργότερα μπορούν να τροποποιηθούν, (ii) Spion με μια ειδική χημική τροποποίηση της επιφάνειας, όπως δεξτράνης, καρβοξυλο- ή αμινο- ομάδες επιτρέποντας τη τροποποίηση με άλλα μόρια, και (iii) Spion με συγκεκριμένες ουσίες, όπου τα δεσμευμένα μόρια μπορεί να είναι φαρμακευτικές ουσίες, αντισώματα κ.α. Πολλές δυνατότητες για τη χρήση των Spion in vitro και in vivo περιγράφονται παρακάτω. 20.1 In vitro χρήση των SPIONs Τα Spion έχουν αποδειχθεί πολύ χρήσιμα εργαλεία για τεχνικές μαγνητικού διαχωρισμού σε κλινική χρήση και έχουν αντικαταστήσει άλλες τεχνολογίες διαχωρισμού. Αυτό ισχύει π.χ. για τον ανοσομαγνητικό διαχωρισμό των κυττάρων και καθαρισμό [153]. Επιπλέον, χρησιμοποιούνται στο τομέα της μοριακής βιολογίας, όπου έχουν αποδειχθεί χρήσιμα για την απομόνωση, τον καθαρισμό, την υβριδοποίηση, τη σύνθεση και ως δείκτες για τα μόρια DNA / RNA. Η απομόνωση και η ανίχνευση μικροοργανισμών είναι εύκολα δυνατή με τη χρήση Spion [151,155], καθώς και η αποτελεσματική μεταφορά νουκλεοτιδικών ή γονιδιακών ακολουθιών σε κύτταρα [156]. Στην ιατρική και κλινική διάγνωση, η αλληλεπίδραση αντιγόνων και αντισωμάτων χρησιμοποιείται συνήθως για τη μέτρηση των συγκεντρώσεων των βιολογικών δεικτών. Η χρήση των Spion ως στερεές φάσεις για αυτές τις τεχνικές διαχωρισμού έχει απλουστεύσει αυτό το πεδίο της κλινικής χημείας μέσω της ανάπτυξης πιο ευαίσθητων, πολύ αποτελεσματικών και αυτοματοποιημένων ανοσολογικών τεχνικών [157]. Τα Spion απέδειξαν επίσης την αποτελεσματικότητά τους ως μη-ιικοί φορείς γονιδίων που διευκολύνουν την εισαγωγή πλασμιδίων στον πυρήνα σε σύγκριση με άλλες συνήθως διαθέσιμες τεχνολογίες. Όπως και στο διαχωρισμό των κυττάρων, η εφαρμογή μαγνητικού πεδίου επιτρέπει τη μεταφορά των γονιδίων επιλεκτικά στα επιθυμητά τοπικά κύτταρα μέσα σε κυτταροκαλλιέργειες [156]. 20.2. In vivo εφαρμογές των SPIONs 20.2.1 Μαγνητική τομογραφία (Magnetic resonance imaging) 52

Η κλινική διάγνωση με μαγνητική τομογραφία έχει γίνει μια δημοφιλής μη επεμβατική μέθοδος για τη διάγνωση [67]. Η ανάπτυξη της μαγνητικής τομογραφίας για την απεικονιστική διάγνωση διαφόρων ασθενειών είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη μιας νέας κατηγορίας σκιαγραφικών μέσων. Αυτά τα φάρμακα χορηγούνται στον ασθενή έτσι ώστε να αυξηθεί η αντίθεση ανάμεσα στον φυσιολογικό και τον παθολογικό ιστό και να γίνει αντιληπτή η λειτουργία ενός οργάνου ή η ροή του αίματος [158]. Τα περισσότερα σκιαγραφικά μέσα που έχουν χρησιμοποιηθεί μέχρι σήμερα είναι παραμαγνητικά, όπως για παράδειγμα το γαδολίνιο. Εμπορικά διαθέσιμα προϊόντα οξειδίων του Fe, κυρίως μαγκεμίτη γ-fe 2 O 3, έχουν χρησιμοποιηθεί ως σκιαγραφικά μέσα για την διάγνωση όγκων και παθολογικών εστιών στο ήπαρ, όπου τα μαγνητικά νανοσωματίδια συσσωρεύονται σε μεγαλύτερες ποσότητες λόγω της διαφορετικής σύστασης του ιστού και των διαδικασιών πρόσληψης με ενδοκυττάρωση [158]. Ειδικά σε ότι αφορά την ανίχνευση πρωτοπαθών και μεταστατικών όγκων του εγκεφάλου, φλεγμονής και ισχαιμίας παρουσιάζεται μεγάλη αύξηση της ευαισθησίας της τεχνικής. Για το σκοπό αυτό επίσης πρωτεΐνες όπως η τρανσφερίνη, πεπτίδια όπως η tat πρωτεΐνη του HIV και ολιγονουκλεοτίδια διαφόρων αλληλουχιών έχουν προστεθεί σε νανοσωματίδια οξειδίων του Fe, έτσι ώστε αυτά να αποκτήσουν ειδικά χαρακτηριστικά ως απεικονιστικοί παράγοντες. Τα πρώτα επικαλυμένα με δεξτράνη Spion είχαν ήδη κατωχυρωθεί επίσημα πριν από 15 χρόνια ως σκιαγραφικά μέσα για τη μαγνητική τομογραφία του ήπατος στην Ευρώπη [159]. Η αποτελεσματικότητα των Spions ως σκιαγραφικά μέσα σε διάφορους ιστούς εξαρτάται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες του, όπως το μέγεθος, το φορτίο και την επίστρωση [65], και μπορεί να αυξηθεί μέσω μετατροπών της επιφάνειας από βιολογικά δραστικές ουσίες (αντισώματα, συνδέτες του υποδοχέα, πολυσακχαρίτες, πρωτεΐνες, κλπ.) [67]. Η υδροδυναμική διάμετρος του Spion που χρησιμοποιείται στη μαγνητική τομογραφία κυμαίνεται μεταξύ 20 και 3500 nm, αν και τα ενδοφλβίως χορηγούμενα σωματίδια είναι σχετικά μικρά και κυμαίνονται μεταξύ 20 και 150 nm με επικάλυψη, ή 5-15 nm χωρίς επικάλυψη [160,161]. Οι επιστρώσεις συνήθως είναι φτιαγμένες από παράγωγα της δεξτράνης και πολυ (αιθυλενογλυκόλη) [160], αλλά και από άμυλο, αλβουμίνη, διοξείδιο του πυριτίου, κλπ. [161]. Δεδομένου ότι τα περισσότερα από τα σωματίδια προσλαμβάνονται από τα κύτταρα του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος, η κατανομή τους είναι πιο εύκολο να γίνει ορατή στο ήπαρ, το σπλήνα, το μυελό των οστών [161] και τους λεμφαδένες. Spion έχουν επίσης προοριστεί για χρήση σε συνδυασμό με συστήματα μεταφοράς για μεταφορά φαρμάκων, ενώ την ίδια στιγμή είναι και σκιαγραφικοί παράγοντες [162]. Με τον τρόπο αυτό, η κινητική του φαρμακευτικού παράγοντα θα μπορούσε να παρακολουθηθεί μέσω της μαγνητικής τομογραφίας. Επιπλέον, η 53

κατανομή των μαγνήτη [163]. σωματιδίων μπορεί να επηρεαστεί, μέσω της εφαρμογής ενός εξωτερικού 20.2.2 Μαγνητική στόχευση φαρμάκων (MDT) Ένα από τα σημαντικά προβλήματα όσον αφορά τη φαρμακοθεραπεία είναι η μεταφορά των φαρμάκων σε μια συγκεκριμένη θέση και η διατήρηση σε αυτή τη θέση για επιθυμητό χρονικό διάστημα. Η συνολική συγκέντρωση των φαρμάκων θα μπορούσε να μειωθεί δραστικά και οι παρενέργειες θα μπορούσαν να αποφευχθούν. Χρησιμοποιώντας ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο, τροποποιημένα με φάρμακα Spion θα μπορούσαν να μεταφερθούν σε συγκεκριμένες θέσεις [73]. Η μέθοδος της MDT δεν εξαρτάται μόνο από τις φυσικές ιδιότητες, τη συγκέντρωση και το ποσό των εφαρμοζώμενων σωματιδίων, αλλά επίσης από το είδος της δέσμευσης των φαρμάκων. Επιπλέον, η γεωμετρία, το μέγεθος και η διάρκεια εφαρμογής του εξωτερικού μαγνήτη και η πορεία των ενεχυμένων Spion, καθώς και η αγγειακή προσφορά των ιστών -στόχων θα επηρεάσουν τη δράση τους. Οι φυσιολογικοί παράμετροι του ασθενούς, όπως το σωματικό βάρος, ο όγκος του αίματος, η περιφερική αντίσταση του κυκλοφορικού συστήματος και η λειτουργία των οργάνων θα επηρεάσει επίσης την αποτελεσματικότητα του εξωτερικού μαγνήτη εκτός από τη δυνατότητα της τοποθέτησης του μαγνήτη σε στενή γειτνίαση με την περιοχή [67]. Η MDT, ωστόσο, εξαρτάται από αυτό το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο που με τους περισσότερους εμπορικά διαθέσιμους μαγνήτες επιτυγχάνεται βάθος διείσδυσης λίγων χιλιοστών στον ιστό. Και in vivo τα Spion εφαρμόστηκαν επιτυχώς ενδοφλεβίως και συσσωρεύτηκαν σε συγκεκριμένες θέσεις μέσω εξωτερικών μαγνητών [163]. Αυτό είναι ιδιαίτερα ελκυστικό για χρήση στη θεραπεία του καρκίνου, όπου η χημειοθεραπεία ή η ακτινοθεραπεία παρουσιάζουν σοβαρές παρενέργειες ενώ έχουν μόνο ένα μικρό θεραπευτικό περιθώριο. Διαφορετικές μέθοδοι εξετάστηκαν όπως τα θερμοευαίσθητα και ph-ευαίσθητα λιποσώματα που περιέχουν εγκλωβισμένους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ή ειδικά αντισώματα όγκου [163]. Η MDT με Spion έχει επίσης χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στη γονιδιακή θεραπεία [160]. Η αποδοτικότητα της διαμόλυνσης των χρησιμοποιούμενων ευρέως ιικών φορέων θα μπορούσε να αυξηθεί μέχρι και 100 φορές μέσω της σύζευξης των φορέων αυτών με το Spion και την εφαρμογή ενός εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Η διάρκεια της μεταφοράς γονιδίων θα μπορούσε να μειωθεί σε λίγα λεπτά. Οι περισσότεροι από τους συγγραφείς που χρησιμοποιούν μαγνητοδιαμόλυνση (magnetotransfection) ανέφεραν 2-10 φορές μεγαλύτερη συσσώρευση σωματιδίων και την ίδια στιγμή, μια σημαντική οπισθοδρόμηση των όγκων σε σύγκριση με 54

ομάδες ελέγχου. Μετά την αφαίρεση του εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, τα περισσότερα από τα σωματίδια μπορούσαν να βρεθούν στο ήπαρ [67,73,163]. Σχήμα 18: Η βασική ιδέα της μαγνητικής στόχευσης [164]. 20.2.3 Υπερθερμία με μαγνητικά ρευστά Η υπερθερμία είναι μια θεραπευτική διαδικασία, η οποία χρησιμοποιείται για την άνοδο της θερμοκρασίας μιας περιοχής του σώματος. Η λογική της θεραπείας αυτής βασίζεται στο γεγονός ότι σε θερμοκρασίες πάνω από 41-42 ο C τα καρκινικά κύτταρα πεθαίνουν, καθώς αυτά παρουσιάζουν ελλείψεις σε βασικούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης βλαβών στις πρωτεΐνες και το DNA τους. Η υπερθερμία έχει στην περίπτωση αυτή την λογική της συμπληρωματικής θεραπείας και συνήθως εφαρμόζεται σε συνδυασμό με άλλες θεραπείες κατά του καρκίνου. Τα μαγνητικά υλικά μπορούν να θερμανθούν υπό την επίδραση ενός εξωτερικού εναλλασσόμενου πεδίου, λόγω διαφόρων διαδικασιών απώλειας ενέργειας οι οποίες συμβαίνουν κατά την αντιστροφή της μαγνήτισης. Πρώτοι οι Freeman et al. σε μια εργασία τους το 1960 πρότειναν την χρησιμοποίηση σωματιδίων Fe, τα οποία συγκεντρώνονταν σε ένα συγκεκριμένο σημείο του σώματος με την μεσολάβηση μαγνητικού πεδίου [165]. Η διαδικασία με την οποία γίνεται η στόχευση των 55

φαρμάκων είναι ένας συνεχής ανταγωνισμός ανάμεσα στις δυνάμεις της ροής του αίματος και την δύναμη του εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου. Όταν οι μαγνητικές δυνάμεις υπερνικούν την γραμμική ροή του αίματος στις αρτηρίες (10 cm s -1 ) ή τα τριχοειδή (0.05 cm s -1 ), τα μαγνητικά σωματίδια κατακρατούνται στον στόχο και μπορούν να ενδοκυτταρωθούν από τα ενδοθηλιακά κύτταρα του στόχου [166]. Για αυτή την εφαρμογή η χρησιμοποίηση των νανοσωματιδίων ευνοεί την μεταφορά μέσα από τα τριχοειδή αγγεία χωρίς να υπάρχει κίνδυνος εμβολισμού, λόγω του μεγέθους τους. Τα υπερπαραμαγνητικά σωματίδια που εκτίθενται σε εναλλασσόμενο μαγνητικό πεδίο μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επαγωγή θερμότητας [167]. Μέσω της ταλάντωσης της μαγνητικής ροπής μέσα στα σωματίδια, η ενέργεια του μαγνητικού πεδίου υπό μορφή θερμότητας απελευθερώνεται στο περιβάλλον του ιστού [67]. Τα Spion έχουν πολύ υψηλότερο ρυθμό ειδικής απορρόφησης σε σύγκριση με μεγαλύτερα μαγνητικά σωματίδια και ως εκ τούτου, προορίζονται για χρήση στην υπερθερμία, όπου ο ιστός θερμαίνεται έως 41-46 ο C [168]. Εάν η θερμοκρασία υπερβαίνει τους 56 ο C, το αποτέλεσμα είναι νέκρωση, πήξη ή απανθράκωση του ιστού, μία διαδικασία που ονομάζεται ''Thermoablation» [167,169]. Για προφανείς λόγους η thermoablation έχει περιορισμένη αξία σε κλινικές εφαρμογές. Σε αντίθεση, η υπερθερμία είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για τη θεραπεία του καρκίνου, αφού τα κύτταρα του όγκου είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε υψηλές θερμοκρασίες [170]. Εάν τα καρκινικά κύτταρα θερμαίνονται μέχρι και 41-45 ο C, η βλάβη των φυσιολογικών ιστών είναι αναστρέψιμη, ενώ τα καρκινικά κύτταρα καταστρέφονται μη αναστρέψιμα. Αυτό μπορεί να είναι ένα πλεονέκτημα όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με θεραπείες όπως ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Είναι ενδιαφέρον, ότι η υπερθερμία φαίνεται να προκαλεί τροποποιήσεις των μορίων των υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας, και ως εκ τούτου, τα κύτταρα του όγκου αναγνωρίζονται από το ανοσοποιητικό σύστημα (κύτταρα φονιάδες) πιο εύκολα [171]. Οι συμβατικές θεραπείες με υπερθερμία συμπεριλαμβάνουν μικροκυμάτα, υπέρηχους, ραδιοσυχνότητες και υπέρυθρες ακτίνες, και έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί με επιτυχία. Ωστόσο, το μειονέκτημά τους βασίζεται στην αδυναμία τους να προκαλέσουν επιλεκτικά θερμότητα σε συγκεκριμένους ιστούς όγκων, την αναστολή της θερμικής αγωγιμότητας μέσω λιγότερο θερμικά αγώγιμων ιστών, όπως τους λιπαρούς ιστούς και τα κρανιακά οστά και την κατανομή της θερμοκρασίας ανομοιογενώς. Έχει δειχθεί ότι η θέση των σωματιδίων στο εσωτερικό του κυττάρου (ενδοκυττάρια, διάμεσα,δεσμευμένα στη μεμβράνη) ήταν πολύ σημαντική όσον αφορά την αποτελεσματικότητα της επαγωγής υπερθερμίας. Ενδοκυτταρικώς επαγόμενη υπερθερμία αύξησε την αποτελεσματικότητα των σωματιδίων και επέτρεψε τη μείωση της δόσης τους [168]. Ακόμη και 56

μετά τη μίτωση, το 50% των σωματιδίων ήταν ακόμη παρόν μέσα στα καρκινικά κύτταρα. Αυτό αποτελεί πλεονέκτημα σε περίπτωση που εφαρμόζεται επαναλαμβανόμενη υπερθερμία. Αυτό σημαίνει ότι τα Spion θα πρέπει να αποικοδομούνται αργά από τα κύτταρα για αυτόν τον τύπο της εφαρμογής, δεδομένου ότι οι αλλαγές στις φυσικές ιδιότητες των κυττάρων θα μειώσει δραστικά την απορροφούσα θερμική ενέργεια. Spion τροποποιημένα με αντισώματα έναντι επιφανειακών υποδοχέων μπορούν να συνδεθούν με την κυτταρική μεμβράνη. Επί του παρόντος, διεξάγονται κλινικές δοκιμές σε ασθενείς που πάσχουν απο καρκίνο του προστάτη και του εγκεφάλου χρησιμοποιώντας τοπική μαγνητική υπερθερμία σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία [167]. Εκτός από τη θεραπεία του καρκίνου, η τοπική μαγνητική υπερθερμία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την πήξη του αίματος στα μικρά αγγεία [67], για την επιλεκτική αύξηση της θερμοκρασίας σε μολυσμένα με ιό κύτταρα (π.χ. HIV μετά τη σύνδεση των CD4 γλυκοπρωτεΐνών στα Spion) και ως μηχανισμός μεταφοράς φαρμάκων, όπου οι ουσίες συνδέονται σε μαγνητικές μικροσφαίρες ή σε Spion [172]. Περιληπτικά, η εφαρμογή των Spion για την τοπική μαγνητική υπερθερμία είναι ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για τη μελλοντική θεραπεία. 21. ΤΑ ΝΑΝΟΣΩΜΑΤΙΔΙΑ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΡΗΣΗ Παρά την εκτεταμένη έρευνα και ανάπτυξη, μόνο λίγα νανοσωματιδία μεταφοράς φαρμάκων επί του παρόντος είναι εγκεκριμένα από την FDA και διαθέσιμα για τη θεραπεία του καρκίνου. Τα λιποσωμικά αντικαρκινικά φάρμακα ήταν τα πρώτα που εγκρήθηκαν για τη θεραπεία του καρκίνου. Δυο εμπορικά λιποσωμικά σκευάσματα είναι διαθέσιμα στις Ηνωμένες Πολιτείες. Αυτά είναι η πεγκυλιωμένη λιποσωμική δοξορουβικίνη (Doxil στις ΗΠΑ και Caelyx εκτός των ΗΠΑ) και η λιποσωμική δαουνορουβικίνη (daunorubicin) (DaunoXome). Ένα τρίτο λιποσομικό σκεύασμα εγκεκριμένο στην Ευρώπη είναι η μη πεγκυλιωμένη λιποσωμική δοξορουβικίνη (Myocet) [173]. 22. ΔΟΞΟΡΟΥΒΙΚΙΝΗ 22.1 Εισαγωγή Η Δοξορουβικίνη (Doxorubicin, CAS No: 25316 40 9) ανήκει στην κατηγορία των αντιβιοτικών ανθρακυκλίνης και είναι ένας αντινεοπλασματικός παράγοντας που 57

χρησιμοποιείται για τη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου (σχήμα 19). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιείται ευρέως στη θεραπεία ορισμένων μορφών λευχαιμίας, του λεμφώματος Hodgkin, καθώς επίσης και στη θεραπεία καρκίνων της ουροδόχου κύστεως, του στήθους, του στομάχου, των πνευμόνων, των ωοθηκών, του θυρεοειδούς και άλλων. Σχήμα 19: Η χημική δομή της δοξορουβικίνης [174]. Η δοξορουβικίνη αποτελείται από δύο κυρίως μέρη: Μια αδιάλυτη στο νερό τετρακυκλική αγλυκόνη (δακτύλιοι Α-Δ) και ένα υδατοδιαλυτό, σάκχαρο daunosamine [175]. Η συστηματική της ονοματολογία είναι (8S,10S)-10-(4-amino-5-hydroxy-6-methyl- tetrahydro-2h-pyran-2-yloxy)-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1-methoxy-7,8,9,10- tetrahydrotetracene-5,12-dione hydrochloride, ενώ συναντάται και με τα εξής συνώνυμα: Doxorubicin HCl, Adriamycin, Adriblastin, 14-Hydroxydaunomycin, 14-Hydroxydaunorubicine, DOXO, Adriamycin semiquinone, ADM, ADR κλπ. Η δοξορουβικίνη είναι μια κόκκινη κρυσταλλική σκόνη, που αποσυντίθεται στους 205 ο C. Έχει μοριακό τύπο, C 27 H 29 O 11 N.HCl και μοριακό βάρος 579.98 g/mol. Είναι διαλυτή στο νερό και σε υδατικά διαλύματα αλκοόλης, λιγότερο διαλυτή σε άνυδρη μεθανόλη και τελείως αδιάλυτη σε μη πολικούς οργανικούς διαλύτες. Τα διαλύματα της δοξορουβικίνης έχουν πορτοκαλοκίτρινο χρώμα σε όξινο ph, πορτοκαλοκόκκινο χρώμα σε ουδέτερο ph και μπλε ιώδες σε ph με τιμές μεγαλύτερες του 9 [174]. 58

Η δοξορουβικίνη, αποτελείται από μια αγλυκόνη που περιλαμβάνει ένα τετρακυκλικό δακτύλιο (εικόνα 1.1.1: δακτύλιοι Α-Δ) με παρακείμενες ομάδες κινόνης και υδροκινόνης (δακτύλιοι Γ και Β αντίστοιχα). Επίσης περιλαμβάνει μια μεθόξυ ομάδα στον άνθρακα 4, και μια μικρή πλευρική αλυσίδα στον άνθρακα 9 με ένα καρβονύλιο στον άνθρακα 13. Επίσης ένα σάκχαρο daunosamine σύνδέεται με γλυκοσιδικό δεσμό στον άνθρακα 7 του δακτυλίου Α [176]. 22.2 Κλινικές χρήσεις Η Dox χρησιμοποιείται ευρέως στη θεραπεία ορισμένων μορφών λευχαιμίας, του λεμφώματος Hodgkin, καθώς επίσης και στη θεραπεία καρκίνων της ουροδόχου κύστεως, του στήθους, του στομάχου, των πνευμόνων, των ωοθηκών, του θυρεοειδούς και άλλων. Οι πιο συνηθισμένες θεραπευτικές αγωγές που περιλαμβάνουν την Dox και χρησιμοποιούνται σήμερα είναι οι CA (Cyclophosphamide, Adriamycin), TAC (Taxotere, CA), ABVD (Adriamycine, Bleomycin, Vinblastine, Dacarbazine), CHOP (Cyclophosphamide, Adriamycin, Vincristine, Prednisone) και η FAC (5-Fluorouracil, Adriamycin, Cyclophosphamide). Το φάρμακο χορηγείται με ένεση και μπορεί να πωλείται κάτω από τις εμπορικές ονομασίες Adriamycin PFS, Adriamycin RDF, Rubex ή Doxil. Το Doxil είναι μια μορφή του φαρμάκου, η οποία περικλείεται σε λιποσώματα και πλεονεκτεί ως προς τις άλλες στο ότι μειώνεται η καρδιοτοξικότητα. Το Doxil χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών ή για τη θεραπεια του Σαρκώματος του Kaposi. 22.3 Μηχανισμοί δράσης 22.3.1. Παραγωγή ελευθέρων ριζών Η δοξορουβικίνη έχει την ικανότητα να προκαλεί το σχηματισμό μεγάλου αριθμού ελευθέρων ριζών με δύο τρόπους: Σύμφωνα με τον πρώτο τρόπο, οι δακτύλιοι Β και Γ, παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, όσον αφορά στην ικανότητα της δοξορουβικίνης να παράγει ελεύθερες ρίζες. Ο δακτύλιος Γ είναι μια ομάδα κινόνης, η οποία μετατρέπεται σε ελεύθερη ρίζα ημικινόνης μετά από αναγωγή ενός ηλεκτρονίου. Ο δακτύλιος Β είναι μια υδροκινόνη, η οποία επίσης μπορεί να αναχθεί σε ρίζα ημικινόνης. Κάτω από ανοξικές συνθήκες αυτές οι ρίζες είναι σχετικά σταθερές, αλλά παρουσία οξυγόνου, δίνουν το ασύζευκτο ηλεκτρόνιό τους στο τελευταίο, με αποτέλεσμα την παραγωγή ελεύθερης ρίζας οξυγόνου. Στο σχηματισμό των ανηγμένων ριζών ημικινόνης συμμετέχουν οι κατάλληλες φλαβοπρωτεΐνες οι οποίες δέχονται ηλεκτρόνια από το NADH ή το 59

NADPH και τα δίνουν στη δοξορουβικίνη. Η αναγωγή του οξυγόνου σε ρίζα υπεροξειδίου έχει ως αποτέλεσμα τον επανασχηματισμό του μορίου της δοξορουβικίνης. Ο οξειδοαναγωγικός αυτός κύκλος μπορεί να επαναληφθεί, με αποτέλεσμα την παραγωγή ενός μεγάλου αριθμού ριζών υπεροξειδίου από ένα και μόνο μόριο δοξορουβικίνης. O οξειδοαναγωγικός κύκλος της δοξορουβικίνης (και συνεπώς η παραγωγή ελευθέρων ριζών) μπορεί να πραγματοποιηθεί στο κυτταρόπλασμα, στα μιτοχόνδρια, στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στον πυρήνα. Το τελευταίο ίσως και να εξηγεί ένα τρόπο πρόκλησης βλαβών στο γενετικό υλικό: Η δοξορουβικίνη προσδένεται επιλεκτικά στο DNA όπου και ενεργοποιείται μεταβολικά προκαλώντας βλάβες με τη μεσολάβηση των ελευθέρων ριζών που παράγονται. Σύμφωνα με το δεύτερο τρόπο, η δοξορουβικίνη έχει την ιδιότητα να δημιουργεί σύμπλοκα με ιόντα σιδήρου (Dox-Fe 3+ ). Το σύμπλοκο αυτό μπορεί να επάγει την παραγωγή ελευθέρων ριζών. Τα σύμπλοκα Dox-Fe προσδένονται ισχυρά στο DNA και επιπλέον διατηρούν την ιδιότητά τους να παράγουν ελεύθερες ρίζες. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ελευθέρων ριζών πολύ κοντά στο DNA. Οι ελεύθερες ρίζες δρουν πάνω στο γενετικό υλικό προκαλώντας ρήγματα στις αλυσίδες του DNA [175]. 22.3.2. Αναστολή της τοποϊσομεράσης ΙΙ Ένα βασικό πρόβλημα στην αντιγραφή του DNA είναι η ύπαρξη των υπερελίκων. Η κίνηση της διχάλας αντιγραφής δημιουργεί υπερέλικες στη μη αντιγραφόμενη περιοχή του DNA μπροστά από τη διχάλα. Υπολογίζεται ότι για κάθε 10 ζευγάρια βάσεων που πολυμερίζονται στη διχάλα αντιγραφής, θα πρέπει το γονικό δίκλωνο μόριο να κάνει μια περιστροφή γύρω από τον άξονά του για να μην υπερελικωθεί. Στο επίπεδο του χρωμοσώματος αυτό σημαίνει ότι το χρωμόσωμα θα πρέπει να περιστρέφεται αστραπιαία δεδομένου ότι η αντιγραφή είναι μια πολύ γρήγορη διαδικασία. Κάτι τέτοιο όμως δεν συμβαίνει διότι δεν το επιτρέπει η όλη τοπολογία των χρωμοσωμάτων και επιπροσθέτως απαιτούνται μεγάλα ποσά ενέργειας [177]. Οι τοποϊσομεράσες, είναι μια κατηγορία πρωτεϊνών, οι οποίες τροποποιούν την τοπολογία του DNA χωρίς να μεταβάλουν τη δομή και την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων [178]. Η τοποϊσομεράση Ι χαρακτηρίζεται από την ικανότητά της να προκαλεί ρήγματα στον ένα κλώνο του DNA ανακουφίζοντας το μόριο από τις τάσεις που δημιουργούνται εξαιτίας της υπερελίκωσης. Στη συνέχεια λειτουργεί ως λιγάση και επαναδημιουργεί το φωσφοδιεστερικό δεσμό. Η τοποϊσομεράση ΙΙ χαρακτηρίζεται από την ικανότητα να προκαλεί ρήγματα και στους 60

δύο κλώνους ενός μορίου DNA, να περνά τμήμα του μορίου DNA μέσα από το πρώτο και στη συνέχεια να επανενώνει τα δύο άκρα του μορίου [177]. Η δοξορουβικίνη (και γενικά οι ανθρακυκλίνες) δρουν στο μόριο της τοποϊσομεράσης ΙΙ και σταθεροποιούν μια ενδιάμεση κατάσταση, κατά την οποία οι δύο κλώνοι του DNA είναι κομμένοι και ομοιοπολικά συνδεδεμένοι με περιοχές τυροσίνης στο μόριο της τοποϊσομεράσης ΙΙ, εμποδίζοντας με αυτό τον τρόπο την επανένωση των δύο κλώνων. Η δομή της δοξορουβικίνης, έχει σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό και τη σταθερότητα του τριμερούς συμπλόκου δοξορουβικίνη DNA τοποϊσομεράση ΙΙ. Το επίπεδο σύστημα δακτυλίων είναι σημαντικό για την παρεμβολή στο DNA, καθώς οι δακτύλιοι Β και Γ συμπλέκονται με τα γειτονικά ζεύγη βάσεων και ο δακτύλιος Δ διέρχεται του σημείου παρεμβολής. Οι περιοχές του μορίου που δεν συμμετέχουν στην παρεμβολή (ο δακτύλιος Α και το σάκχαρο), φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση του συμπλόκου. Συγκεκριμένα, το σάκχαρο daunosamine εντοπίζεται στη μικρή αύλακα του DNA και είναι ένας καθοριστικός παράγοντας για την ενεργότητα των ανθρακυκλινών ως αναστολείς της τοποϊσομεράσης ΙΙ. Επιπλέον έχει αναφερθεί ότι η δοξορουβικίνη αναστέλει και την τοποϊσομεράση Ι. Παρόλα αυτά έχει βρεθεί ότι ο θάνατος των κυττάρων είναι σχετικά ανεξάρτητος από τη συγκέντρωση της τοποϊσομεράσης Ι στο κύτταρο, κάτι που υποδηλώνει ότι η αναστολή της τοποϊσόμερασης Ι από τη δοξορουβικίνη είναι ένας δευτερεύοντας μηχανισμός δράσης της ένωσης. Τη βλάβη που προκαλείται στο DNA ως αποτέλεσμα της αναστολής της τοποϊσομεράσης ΙΙ, ακολουθεί διακοπή της αύξησης στη φάση G1 και G2 του κυτταρικού κύκλου και τέλος ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος. Αξίζει να σημειωθεί ότι κάποια καρκινικά κύτταρα μπορεί να γίνουν ανθεκτικά στη δράση της δοξορουβικίνης λόγω μεταβολής στη λειτουργία του γονιδίου ή της πρωτεΐνης της τοποϊσομεράσης ΙΙ [178]. 22.3.3. Απόπτωση Η απόπτωση είναι μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου η οποία ρυθμίζεται από φυσιολογικούς και γενετικούς παράγοντες. Κατά την διάρκεια αυτής της διαδικασίας, η χρωματίνη στον πυρήνα συμπυκνώνεται και προσκολλάται στην πυρηνική μεμβράνη. Το κύτταρο και το κυτταρόπλασμα συρρικνώνονται και στη συνέχεια τεμαχίζονται. Επίσης τεμαχίζεται και ο πυρήνας, αλλά τα υπόλοιπα κυτταρικά οργανίδια παραμένουν άθικτα μέχρι το τελευταίο στάδιο της απόπτωσης. Τα τεμάχια που κυττάρου, τα οποία καλούνται και αποπτωτικά σωμάτια, περικλείονται από την κυτταρική μεμβράνη, έτσι ώστε τα περιεχόμενα 61

του κυττάρου να μην διαχυθούν στο περιβάλλον του κυττάρου. Τα αποπτωτικά σωμάτια απομακρύνονται με κυτταροφαγία. Ένα χαρακτηριστικό της απόπτωσης είναι ότι δεν προκαλεί φλεγμονή στους γύρω ιστούς. Τα τελικά μόρια τελεστές της απόπτωσης που είναι κοινοί σε όλα τα κύτταρα είναι οι κασπάσες και οι DNAάσες. Οι πρώτες προκαλούν πρωτεόλυση και οι τελευταίες θρυμματισμό του DNA [176]. Πολλά αντικαρκινικά φάρμακα δρουν προκαλώντας απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα. Αυτό συμβαίνει μέσω δύο κυρίως οδών: 1. Οδός ανεξάρτητη από τους υποδοχείς θανάτου (DR-independent pathway intrinsic pathway) 2. Οδός εξαρτωμένη από τους υποδοχείς θανάτου (DR-dependent pathway extrinsic pathway) 22.3.4. Αναστολή Πρωτεασώματος Το πρωτεάσωμα είναι ένα σύμπλοκο από κυτταροπλασματικές και πυρηνικές πρωτεάσες, οι οποίες συμμετέχουν σε μηχανισμούς αποικοδόμησης πρωτεϊνών που δεν αποικοδομούνται στα λυσοσώματα. Το 26S πρωτεάσωμα (που αποτελείται από έναν 20S πυρήνα και δύο 19S καλύμματα), έχει σημαντικό ρόλο στο ρυθμό ανακύκλωσης των κυτταροπλασματικών και πυρηνικών πρωτεϊνών, καθώς επίσης και στην αποικοδόμηση ρυθμιστικών πρωτεϊνών που ελέγχουν την ανάπτυξη των κυττάρων και το μεταβολισμό τους [178]. Το πρωτεάσωμα εντοπίζεται τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα και τελευταία έχει δειχθεί ιδιαίτερο ενδιαφέρον στο ρόλο που έχουν στη μεταφορά της δοξορουβικίνης στον πυρήνα. Αυτό συμβαίνει ως εξής: Αρχικά η δοξορουβικίνη εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα με παθητική διάχυση. Εκεί έχει υψηλή χημική συγγένεια με την υπομονάδα 20S του πρωτεασώματος με την οποία και συνδέεται, σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο.το σύμπλοκο που σχηματίζεται μετατοπίζεται στον πυρήνα μέσω των πυρηνικών πόρων και με μια διαδικασία που απαιτεί ενέργεια από το ATP. Στον πυρήνα η δοξορουβικίνη έχει υψηλότερη χημική συγγένεια με το DNA σε σχέση με το πρωτεάσωμα. Έτσι αποσυνδέεται από το πρωτεάσωμα και παρεμβάλλεται στο DNA προκαλώντας αναστολή της σύνθεσής του. Επιπλέον, όταν η δοξορουβικίνη είναι συνδεδεμένη στο πρωτεάσωμα, αυτό παρουσιάζει μικρή ικανότητα πρωτεϊνόλυσης. Αυτή η αναστολή του πρωτεασώματος, έχει ως αποτέλεσμα τη 62

μη αποικοδόμηση ρυθμιστικών αλλά και μεταλλαγμένων πρωτεϊνών και ως εκ τούτου επαγωγή της απόπτωσης [179]. Σε μετασχηματισμένα κύτταρα και διαιρούμενους ιστούς, παρατηρείται μια συσσώρευση του πρωτεασώματος στον πυρήνα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ελάττωση της συγκέντρωσής του στο κυτταρόπλασμα και συνεπώς μειωμένη μεταφορά της δοξορουβικίνης στον πυρήνα. Το γεγονός αυτό ίσως να εξηγεί και το λόγο που παρατηρείται μείωση της κυτταροτοξικότητας της δοξορουβικίνης σε κύτταρα με αυξημένες πυρηνικές συγκεντρώσεις του πρωτεασώματος [178]. 22.3.5. Παρεμβολή στο DNA Η δοξορουβικίνη αφού περάσει στον πυρήνα του κυττάρου προσδένεται με υψηλή χημική συγγένεια στο DNA. Αυτό συμβαίνει μέσω παρεμβολής της, μεταξύ των βάσεων του τελευταίου. Η δοξορουβικίνη παρεμβάλλεται μεταξύ της κυτοσίνης και της αμινομάδας των αλληλουχιών 5 -CGN-3. Για την παρεμβολή είναι απαραίτητη η εξωκυκλική N2 αμίνη της γουανίνης και η αμίνη που βρίσκεται στον άνθρακα 3 του σακχάρου daunosamine. Η δοξορουβικίνη συνδέεται στον άνθρακα με ένα ομοιοπολικό δεσμό (δεσμός N-C-N) μεταξύ της 3 αμινομάδας της daunosamine και της Ν2 αμίνης της γουανίνης. Η περιοχή daunosamine προεξέχει στη μικρή αύλακα του DNA, ενώ ο κεντρικός άνθρακας του N-C-N δεσμού προέρχεται από τη φορμαλδεϋδη, η οποία αντιδρά με τη αμινομάδα της δοξορουβικίνης σχηματίζοντας μια ενεργή βάση Schiff. Το σύμπλοκο DNA δοξορουβικίνη σταθεροποιείται περαιτέρω με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ της δοξορουβικίνης και του δεύτερου κλώνου του DNA [180]. Η φορμαλδεΰδη που συμμετέχει στην παρεμβολή της δοξορουβικίνης στο DNA μπορεί να παράγεται από την ίδια την δοξορουβικίνη. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι αντιδράσεις παραγωγής ελευθέρων ριζών στις οποίες διαμεσολαβούν ιόντα σιδήρου, έχουν ως αποτέλεσμα και την παραγωγή φορμαλδεΰδης από διάφορες κυτταρικές πηγές άνθρακα όπως είναι τα λιπίδια [178]. 63

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 0 : ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ 1. ΔΥΝΑΜΙΚΗ ΣΚΕΔΑΣΗΣ ΦΩΤΟΣ Μια από τις πιο δημοφιλείς τεχνικές σήμερα για την μέτρηση του μεγέθους κολλοειδών νανοσωματιδίων είναι η δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS), καθώς μπορεί να μετρηθεί το μέγεθος σωματιδίων, σε διασπορά, ταχύτατα και απαιτώντας ελάχιστη προετοιμασία δείγματος. Η DLS ανιχνεύει τη συχνότητα του τρεμοπαίγματος του μοτίβου που καταγράφεται στον ανιχνευτή από τη σκέδαση του φωτός στα σωματίδια (σχήμα 20.α) [181]. Η ενισχυτική και καταστρεπτική συμβολή του φωτός από τη σκέδαση (σχήμα 20.β) είναι υπεύθυνη για την εμφάνιση σκοτεινών και φωτεινών περιοχών σε αυτό το μοτίβο. Η συχνότητα αυτή είναι ανάλογη της θερμικής κίνησης Brown των σωματιδίων, η οποία με τη σειρά της εξαρτάται από το μέγεθος των σωματιδίων (όσο μικρότερα τα σωματίδια τόσο γρηγορότερη είναι η κίνηση Brown) και από το ιξώδες του διαλύτη. Το ιξώδες ενός υγρού συσχετίζεται άμεσα με την θερμοκρασία του, άρα για μετρηθεί η κινητικότητα των σωματιδίων μέσα σε ένα διάλυμα είναι απαραίτητο οι μετρήσεις να διεξάγονται κάτω από μια γνωστή και σταθερή θερμοκρασία. Η ανάλυση της χρονικής εξάρτησης της διακύμανσης/συσχέτισης του μοτίβου τρεμοπαίγματος μπορεί επομένως να αποδώσει το συντελεστή διάχυσης των σωματιδίων μέσω του οποίου, χρησιμοποιώντας την εξίσωση Stokes-Einstein (εξισώση 1.8, D=kT/6πηr, όπου k: η σταθερά Boltzmann, T: η απόλυτη θερμοκρασία, η: το ιξώδες του διαλύτη και r: η υδροδυναμική ακτίνα του σωματιδίου), και γνωρίζοντας το ιξώδες του μέσου, μπορεί να υπολογιστεί η υδροδυναμική διάμετρος των σωματιδίων. Η διάμετρος που μετριέται μέσω της τεχνικής DLS ονομάζεται υδροδυναμική διάμετρος και είναι η διάμετρος μιας ιδεατής σφαίρας που έχει τον ίδιο συντελεστή διάχυσης με το σωματίδιο. 64

Σχήμα 20: α) Σχηματική αναπαράσταση ενός μοτίβου τρεμοπαίγματος, β) Το παρατηρηθέν σήμα εξαρτάται από την συμβολή των φάσεων του σκεδαζόμενου φωτός που προσπίπτει στον ανιχνευτή. β1) δύο ακτίνες συμβάλουν και ακυρώνονται μεταξύ τους με συνέπεια να ανιχνεύεται μειωμένη ένταση (σκοτεινή περιοχή). β2), δύο ακτίνες συμβάλουν ενισχυτικά με συνέπεια να ανιχνεύεται αυξημένη ένταση (φωτεινή περιοχή) [181]. Σχήμα 21: Σχηματική απεικόνιση ενός συστήματος δυναμικής σκέδασης φωτός [181]. Ένα τυπικό σύστημα δυναμικής σκέδασης φωτός αποτελείται από έξι κύρια τμήματα (σχήμα 21). Την πηγή φωτός (laser), η ακτίνα της οποίας θα περάσει μέσα από την κυψελίδα με το δείγμα, την κυψελίδα με το δείγμα και τον ανιχνευτή για να μετρηθεί η σκεδαζόμενη ακτινοβολία. Επίσης μία ψηφιακή πλατφόρμα επεξεργάζεται το σήμα της έντασης της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας και το μοτίβο τρεμοπαίγματος. Τέλος η πληροφορία αυτή περνά σε 65

ένα ηλεκτρονικό υπολογιστή όπου με το κατάλληλο λογισμικό, αναλύονται τα δεδομένα και δίνονται πληροφορίες για το μέγεθος των σωματιδίων. 2. ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΦΩΤΟΦΩΤΑΥΓΕΙΑΣ 2.1 Αρχή λειτουργίας φασματοσκοπίας φωτοφωταύγειας (PL) Η φασματοσκοπία φωτοφωταύγειας είναι μια μη καταστρεπτική μέθοδος ανίχνευσης της ηλεκτρονικής δομής των υλικών. Φως κατευθύνεται σε ένα δείγμα, όπου απορροφάται και προσδίδει περίσσεια ενέργεια μέσα στο υλικό σε μια διαδικασία που ονομάζεται φωτο-διέγερση. Ένας τρόπος με τον οποίο η πλεονάζουσα ενέργεια μπορεί να διαχέεται από το δείγμα είναι μέσω της εκπομπής φωτός, ή φωταύγεια. Στην περίπτωση της φωτο-διέγερσης, η φωταύγεια ονομάζεται φωτοφωταύγεια. Η φωτο-διέγερση είναι η αιτία που τα ηλεκτρόνια μέσα σε ένα υλικό προχωρούν σε επιτρεπόμενες διεγερμένες καταστάσεις. Όταν αυτά τα ηλεκτρόνια επιστρέφουν στις καταστάσεις ισορροπίας τους, η περίσσεια ενέργεια απελευθερώνεται και μπορεί να περιλαμβάνει την εκπομπή φωτός ή όχι. Η ενέργεια του εκπεμπόμενου φωτός (φωτοφωταύγεια) σχετίζεται με τη διαφορά στα επίπεδα ενέργειας μεταξύ των δύο καταστάσεων των ηλεκτρονίων που εμπλέκονται στη μετάβαση μεταξύ της διεγερμένης κατάστασης και της κατάστασης ισορροπίας [182]. Ένα απλουστευμένο μοντέλο για τη φωτοφωταύγεια σε ένα ημιαγωγό περιλαμβάνει τρία στάδια: διέγερση, χαλάρωση και επανασύνδεση. Προσπίπτοντα φωτόνια αντλούν ηλεκτρόνια κατόπιν απορρόφησης από τη ζώνη σθένους στην ζώνη αγωγιμότητας, αφήνωντας πίσω μια οπή. Το ηλεκτρόνιο και η οπή χαλαρώνουν σε μια μικρότερη ενέργεια εντός της δομής των ζωνών εως ότου φτάσουν στα άκρα των ζωνών. Η αποβολή ενέργειας λαμβάνει χώρα με διεργασίες που δεν ακτινοβολούν με φωτόνια, σε ατέλειες, προσμίξεις ή άλλους φορείς φορτίου. Το ενεργειακό χάσμα είναι πολύ μεγάλο για τέτοιες διεργασίες, έτσι ώστε η επανασύνδεση με εκπομπή φωτονίου να είναι πιο πιθανή. Σε ένα συμπαγές υλικό η ενέργεια επανασύνδεσης ουσιαστικά είναι ίση με το ενεργειακό χάσμα μείον την ενέργεια του σχηματισμού εξιτονίου λόγω της αλληλεπίδρασης Coulomb μεταξύ ηλεκτρονίου και οπής [183]. 66

2.2 Οργανολογία φασματοσκοπίας φωτοφωταύγειας Η περισσότερο χρησιμοποιούμενη πηγή στα φθορισμόμετρα φίλτρου είναι η λυχνία ατμών υδραργύρου χαμηλής πίεσης με παράθυρο χαλαζία. Η πηγή αυτή παράγει χρήσιμες γραμμές διέγερσης φθορισμού στα 254, 302, 313, 546, 578, 691 και 773 nm. Μεμονωμένες γραμμές μπορούν να επιλεγούν με κατάλληλα φίλτρα απορρόφησης ή συμβολής. Επείδή στις περισσότερες φθορίζουσες ενώσεις μπορεί να παραχθεί φθορισμός με διέγερση σε διάφορα μήκη κύματος, τουλάχιστόν μια από τις γραμμές του υδραργύρου θα είναι κατάλληλη. Στα φασματοφθορισόμετρα, όπου απαιτείται συνεχής ακτινοβολία, χρησιμοποιείται λυχνία εκκένωσης που περιέχει αέριο ξένο σε υψηλή πίεση και λειτουργεί σε ισχύ 75-450 W. Οι λυχνίες αυτές απαιτούν τροφοδοτικά ικανά να παράγουν ρεύματα 5-20 Α σε τάση λειτουργίας 15-30 V. Το φάσμα της λυχνίας εκκένωσης ξένου είναι συνεχές στην περιοχή 300 ως 1300 nm και προσεγγίζει τα χαρακτηριστικά του φάσματος του μέλανος σώματος. Από τις αρχές της δεκαετίας του 1970 άρχισε η χρησιμοποίηση διαφόρων τύπων λέιζερ ως πηγών δίεγερσης για πειράματα φωταύγειας. Τα περισσότερα εμπορικά φασματοφθορισμόμετρα χρησιμοποιούν λυχνίες επειδή είναι φθηνότερες και πιο απλές στη χρήση. Ωστόσο, οι πηγές λέιζερ προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα όπως για παράδειγμα ο υψηλός βαθμός μονοχρωματικότητας που οδηγεί σε περιορισμό των παρεμποδίσεων από άλλες φθορίζουσες ενώσεις. Για την επιλογή του μήκους κύματος της ακτινοβολίας διέγερσης και της ακτινοβολίας εκπομπής φθορισμού έχουν χρησιμοποιηθεί φίλτρα απορρόφησης και φίλτρα συμβολής. Πολλά φασματοφθορισμόμετρα είναι εφοδιασμένα με έναν τουλάχιστον και μερικές φορές με δυο μονοχρωμάτορες φράγματος [184]. 2.3 Εφαρμογές της φασματοσκοπίας φωτοφωταύγειας Οι μέθοδοι φθορισμού και φωσφορισμού μπορούν να χρησιμοποιηθούν για μετρήσεις χαμηλότερων συγκεντρώσεων απ ότι οι φασματοφωτομετρικές μέθοδοι, που βασίζονται σε μετρήσεις απορρόφησης και είναι κατά μια εως τρεις τάξεις μεγέθους από τις πιο ευαίσθητες αναλυτικές τεχνικές. Η φασματοσκοπία φωτοφωταύγειας μπορεί να μας δώσει πληροφορίες σχετικά με την ηλεκτρονική δομή και τις ιδιότητες ενός υπό εξέταση υλικού. Αυτό είναι δυνατό και για άλλα ηλεκτρονικά υλικά, όπως για παράδειγμα οι υπεραγωγοί. Επιπλέον η χρήση της τεχνικής αυτής σε χαμηλές θερμοκρασίες μπορεί να δώσει επιπλέον πληροφορίες αναφορικά με τη βασική γνώση μας για τέτοια σύνθετα συστήματα, όπως για παράδειγμα την ενέργεια 67

σύνδεσης εξιτονίου. Οι μετρήσεις φωτοφωταύγειας είναι όμως και ιδιαιτέρως χρήσιμες για τον οπτικοηλεκτρονικό χαρακτηρισμό ενός νανοδομημένου ημιαγωγού, σχετικά με τις ιδιότητες εκπομπής του και την πιθανότητα να έχει πρακτική εφαρμογή σε μια διάταξη τεχνολογικού ενδιαφέροντος. [183,185, 186]. 68

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο : ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ 1.1 Υλικά και ουσίες Όλες οι ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού καθαρότητας ενώ χρησιμοποιήθηκε απιονισμένο και απεσταγμένο νερό σε όλες τις διαδικασίες. Οι ουσίες και οι ενώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: 1. Doxorubicin των 50 mg: EBEWE Pharma (σε όλα τα πειράματα με δοξορουβικίνη, το διάλυμα του φαρμάκου που χρησιμοποιήσαμε είχε συγκέντρωση 200 ppm) 2. Νανοφορείς: Mag102-6 (c= 0,2643 % w/v), Mag10-1 (c= 0,162% w/v), Mag102-2 (c= 0,25% w/v), MagPC (c= 0,21% w/v) 3. NaCl: lach:ner 4. αλβουμίνη: Alfa Aesar 5. HCL (37%): Carlo ERBA 6. ανθρώπινο πλάσμα 7. KH2PO4: SIGMA-ALDRICH 8. KCL: SIGMA-ALDRICH 9. Na2HPO4: MERCK KGaA 1.2 Όργανα και συσκευές Κατά την εκτέλεση του πειραματικού μέρους χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα όργανα και συσκευές: 1. Συσκευή μέτρησης μεγέθου και ζ-δυναμικού, Nano z-sizer, Malvern Instruments 2. Φυγόκεντρος: BIOFUGE pico Heraeus 3. Φθορισμόμετρο: F-2500 Fluorescence Spectrophotometer, HITACHI 69

4. Ζυγός Ακριβείας: KERN and Sohn GmbH 5. Πεχάμετρο: Consort C931 6. Αναδευτήρας: VELP SCIENTIFICA 2. ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ 2.1 Χαρακτηρισμός νανοσωματιδίων 2.1.1 Προσδιορισμός μεγέθους νανοσωματιδίων Το μέσο μέγεθος των νανοσωματίδιων προσδιορίστηκε με την μέθοδο της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS), χρησιμοποιώντας τη συσκευή Malvern nano z-sizer. Συγκεκριμένα 20 μl από καθένα από τα τέσσερα δείγματα νανοσωματιδίων (Mag102-6, Mag10-1, Mag102-2, MagPC) αραιώθηκε σε 600 μl dh 2 O. Η νανοσωματιδιακή διασπορά μετρήθηκε αμέσως και προσδιορίστηκαν οι μέσοι διάμετροι. Για κάθε δείγμα νανοσωματιδίων έγιναν τρεις μετρήσεις και λήφθηκε η μέση τιμή. 2.2 Προσδιορισμός ζ-δυναμικού νανοσωματιδίων Για την μέτρηση του δυναμικού ζ των νανοσωματιδίων χρησιμοποιήθηκε η ίδια μέθοδος και η ίδια συσκευή. Οι μετρήσεις έγιναν με την αραίωση 20 μl από καθένα από τα τέσσερα δείγματα νανοσωματιδίων (Mag102-6, Mag10-1, Mag102-2, MagPC) σε 600 μl dh 2 O. Για κάθε νανοφορέα έγιναν τρεις μετρήσεις και λήφθηκε η μέση τιμή. 3. ΜΕΛΕΤΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑΣ Η σταθερότητα των νανοσωματιδίων μελετήθηκε σε υδατικά διαλύματα χλωριούχου νατρίου (ΝαCl), ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS), καθώς επίσης και σε υδατικά διαλύματα διαφόρων τιμών ph. Επίσης μελετήθηκε η σταθερότητα των φορτωμένων με δοξορουβικίνη νανοφορέων σε υδατικά διαλύματα NaCl και η επίδραση της παρουσίας του φαρμάκου στα χαρακτηριστικά (μέγεθος και ζ δυναμικό) των νανοφορέων. Η μελέτη της σταθερότητας και της επίδρασης του φαρμάκου έγινε με τη μέθοδο της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) χρησιμοποιώντας τη συσκευή Malvern nano z-sizer. 70

3.1 Σταθερότητα των νανοσωματιδίων σε υδατικά διαλύματα NaCl Σε 9 κυψελίδες οι οποίες περιείχαν 600 μl NaCl στις εξής συγκεντρώσεις : 0.005 Μ, 0.01 Μ, 0.026 Μ, 0.05 Μ, 0.1 Μ, 0.4 Μ, 0.8 Μ, 1 Μ, 2 Μ, αραιώθηκε μικρή ποσότητα νανοσωματιδίων. Πιο συγκεκριμένα 20 μl από το νανοφορέα Mag102-6, 34 μl από τον Mag10-1, 21 μl από τον Mag102-2 και 25 μl από τον MagPC. Τα δείγματα παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για 24 h και στη συνέχεια μετρήθηκε το μέγεθος και το ζ δυναμικό αυτών. Η ίδια ακριβώς διαδικασία ακολουθήθηκε για τον προσδιορισμό της σταθερότητας σε υδατικά διαλύματα NaCl και των τεσσάρων νανοφορέων. 3.2 Σταθερότητα των νανοσωματιδίων σε υδατικό διάλυμα PBS Για τη διεξαγωγή του συγκεκριμένου πειράματος ορισμένη ποσότητα εκ των τεσσάρων νανοφορέων διαλύθηκε σε 600 μl υδατικού διαλύματος PBS (οι ποσότητες των νανοφορέων που χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή του συγκεκριμένου πειράματος ήταν ακριβώς ίδιες με τις ποσότητες που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη σταθερότητας σε υδατικά διαλύματα NaCl). Τα δείγματα παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για 24 h και στη συνέχεια μετρήθηκε το μέγεθος και το ζ δυναμικό αυτών. 3.3 Σταθερότητα των νανοσωματιδίων σε υδατικά διαλύματα διαφόρων τιμών ph Σε 17 κυψελίδες οι οποίες περιείχαν 600 μl υδατικού διαλύματος με τις εξής τιμές ph: 2.5, 3.0, 3.5, 3.8, 4.1, 4.2, 4.5, 4.8, 5.5, 6.1, 6.5, 7.1, 8, 8.3, 9.7, 10 και 10.5 αραιώθηκε μικρή ποσότητα νανοσωματιδίων (20 μl Mag102-6, 34 μl Mag10-1, 21 μl Mag102-2). Τα δείγματα παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για 24 h και στη συνέχεια μετρήθηκε το μέγεθος και το ζ δυναμικό αυτών. Η ίδια ακριβώς διαδικασία ακολουθήθηκε για τον προσδιορισμό της σταθερότητας σε υδατικά διαλύματα διαφόρων τιμών ph και των τριών νανοφορέων με τη διαφορά ότι για τον προσδιορισμό της σταθερότητας του νανοφορέα Mag102-2 χρησιμοποιήσαμε υδατικά διαλύματα τεσσάρων μόνο τιμών ph για να εξακριβώσουμε τη συμπεριφορά αυτού του δείγματος σε μια συγκεκριμένη μόνο περιοχή της κλίμακας ph (3.5-4.8). 3.4 Σταθερότητα των φορτωμένων με δοξορουβικίνη νανοσωματιδίων σε υδατικά διαλύματα NaCl Στο συγκεκριμένο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν δύο εκ των τεσσάρων νανοφορέων, συγκεκριμένα ο Μag102-6 και ο Μag 10-1. Σε 5 κυψελίδες οι οποίες περιείχαν 895 μl NaCl στις 71

εξής συγκεντρώσεις : 0.1 Μ, 0.12 Μ, 0.15 Μ, 0.8 Μ, 1 Μ, προστέθηκαν 45 μl Μαg102-6 /κυψελίδα και 260 μl φαρμάκου/κυψελίδα. Σε 5 ακόμη κυψελίδες οι οποίες περιείχαν 1026 μl NaCl στις ίδιες συγκεντρώσεις προστέθηκαν 74 μl Mag10-1/κυψελίδα και 100 μl φαρμάκου/κυψελίδα. Τα δείγματα παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για 24 h υπό ανάδευση και στη συνέχεια μετρήθηκε το μέγεθος και το ζ δυναμικό τους. 3.5 Επίδραση της παρουσίας της δοξορουβικίνης στα χαρακτηριστικά των νανοφορέων Για τη μελέτη της επίδρασης της παρουσίας του φαρμάκου στα χαρακτηριστικά (μέγεθος και ζ δυναμικό) των νανοφορέων, έλαβε χώρα η ακόλουθη πειραματική διαδικασία: σε 10 κυψελίδες τοποθετήθηκε συγκεκριμένη ποσότητα νανοφορέα/κυψελίδα (45 μl Mag102-6, 74 μl Mag10-1, 48 μl Mag102-2) και διάφοροι όγκοι φαρμάκου. Στη συνέχεια προστέθηκε νερό, ουτως ώστε ο τελικός όγκος του διαλύματος σε κάθε κυψελίδα να είναι 1200 μl. Τα μg του φαρμάκου προς τα μg του νανοφορέα ήταν σε κάθε κυψελίδα τα ακόλουθα: 0.03, 0.06, 0.1, 0.13, 0.16, 0.23, 0.3, 0.36, 0.43 και 0.5. Τα δείγματα παρέμειναν για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανάδευση και στη συνέχεια μετρήθηκε το μέγεθος και το ζ δυναμικό αυτών. Η ίδια ακριβώς διαδικασία ακολουθήθηκε για τον προσδιορισμό της επίδρασης του φαρμάκου και των τριών νανοφορέων. 4. ΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Για τη μελέτη της τυχόν προσρόφησης πρωτεινών πλάσματος από τους νανοφορείς σχεδιάστηκε το ακόλουθο πείραμα: σε 4 κυψελίδες οι οποίες περιείχαν 600 μl πλάσματος προστέθηκαν στην πρώτη κυψελίδα 40 μl Mag102-6, στη δεύτερη 42 μl Mag102-2, στη τρίτη 48 μl MagPC και στη τέταρτη 68 μl Mag10-1. Τα δείγματα αναδεύονταν ήπια για 24 h. Στη συνέχεια τοποθετήθηκε από ένας μαγνήτης δίπλα στη κάθε κυψελίδα οι οποίες παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για 24 h. Μετά το πέρας των 24 ωρών - οι νανοφορείς είχαν συσσωρευθεί στο τοίχωμα της κυψελίδας-, αφαιρέθηκε το υπερκείμενο από κάθε κυψελίδα και στη συνέχεια αφαιρέθηκαν και οι μαγνήτες και προστέθηκαν 600 μl dh 2 O/κυψελίδα. Τα δείγματα ανακινήθηκαν ελαφρώς για 1 h ώστε να εκπλυθούν χαλαρά προσδεδεμένα (μακρο)μόρια από την επιφάνεια των νανοφορέων και επανατοποθετήθηκε από ένας μαγνήτης δίπλα στη κάθε κυψελίδα οι οποίες παρέμειναν για ακόμη 24 h σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, αφαιρέθηκε ξανά το υπερκείμενο και οι μαγνήτες. Προστέθηκαν 600 μl dh 2 O/κυψελίδα και ακολούθησε ήπια 72

ανακίνηση. Το μέγεθος και το ζ δυναμικό των δειγμάτων μετρήθηκε με τη μέθοδο της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS), χρησιμοποιώντας τη συσκευή Malvern nano z-sizer. 5. ΦΟΡΤΩΣΗ ΔΟΞΟΡΟΥΒΙΚΙΝΗΣ Σε 10 κυψελίδες βάλαμε 45.5 μl Μag 102-6/κυψελίδα, τους εξής όγκους φαρμάκου: 20 μl, 40 μl, 60 μl, 80 μl, 100 μl, 140 μl, 180 μl, 220 μl, 260 μl, 300 μl και προσθέσαμε τόσα μl H 2 O ούτως ώστε ο τελικός όγκος σε κάθε κυψελίδα να είναι 1200 μl. Τα δείγματα παρέμειναν υπό ήπια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες. Στη συνέχεια, δίπλα από κάθε κυψελίδα, τοποθετήσαμε ένα μαγνήτη. Οι κυψελίδες έμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για ακόμη 24 ώρες. Μετά το πέρας των 24 ωρών, μεταφέραμε 800 μl από την κάθε κυψελίδα σε 10 eppedorfs. Στα 3 πρώτα eppedorfs (αυτά τα οποία περιείχαν 20, 40 και 60 μl Dox), προσθέσαμε 125 μl HCL (37%) και 75 μl H 2 O. Το HCL, προστέθηκε σε όλα τα πειράματα φόρτωσης για να αυξήσουμε την υδροφιλικότητα του φαρμάκου μέσω της πρωτονίωσης της αμινομάδας αυτού και έτσι να διευκολύνουμε τη διάλυσή του καθώς επίσης και για να διαλυθούν τυχόν νανοφορείς που είχαν παραμείνει στο διάλυμα. Από τα eppedorfs τα οποία περιείχαν 80 και 100 μl Dox, μεταφέραμε 400 μl σε 2 άλλα eppedorfs αφου πρώτα είχαμε βάλει (στα eppedorfs) 475 μl H 2 O και 125 μl HCL. Από τα eppedorfs τα οποία περιείχαν 140 και 180 μl Dox, μεταφέραμε 200 μl σε 2 νέα eppedorfs αφου πρώτα είχαμε βάλει 675 μl H 2 O και 125 μl HCL. Τέλος, από τα eppedorfs τα οποία περιείχαν 220, 260 και 300 μl Dox, μεταφέραμε 100 μl σε 3 άλλα eppedorfs αφου πρώτα είχαμε βάλει 775 μl H 2 O και 125 μl HCL. Η διαδικασία αυτή των αραιώσεων ακολουθήθηκε για να λάβουμε μετρήσεις εντός του εύρους της πρότυπης καμπύλης της δοξορουβικίνης σε νερό που είχαμε κατασκευάσει (σχήμα 1). Τα δείγματα παρέμειναν στους 37 o C για 2.5 ώρες, ώστε να επιδράσει το HCL. Οι μετρήσεις έγιναν σε φθορισμόμετρο. Ακολουθήσαμε την ίδια ακριβώς διαδικασία και για τους τρεις νανοφορείς με τη διαφορά ότι για κάθε νανοφορέα προσθέταμε διαφορετικό όγκο. Για τον υπολογισμό της % φόρτωσης, χρησιμοποιήσαμε το λόγο των μg του φαρμάκου που απορροφήθηκαν από το νανοφορέα * 100 προς τα μg του φαρμάκου που απορροφήθηκαν από το νανοφορέα + τα μg του κάθε φορά νανοφορέα. 73

6. ΑΠΟΔΕΣΜΕΥΣΗ ΔΟΞΟΡΟΥΒΙΚΙΝΗΣ 6.1 Αποδέσμευση σε Η 2 Ο Αρχικά έγινε η φόρτωση των νανοφορέων. Σε 3 κυψελίδες βάλαμε 45 μl Mag 102-6/ κυψελίδα, 180 μl Dox/κυψελίδα και τόσο νερό ωστέ να έχουμε τελικό όγκο μεσα στην κάθε κυψελίδα 1200 μl. Τα δείγματα παρέμειναν υπό ήπια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες. Στη συνέχεια, δίπλα στην κάθε κυψελίδα τοποθετήθηκε μαγνήτης και παρέμειναν ως έχει για ακόμη 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως, μεταφέραμε το περιεχόμενο της κάθε κυψελίδας σε 3 eppedorfs, από όπου προσδιορίστηκε η φόρτωση. Κατόπιν προστέθηκαν 1200 μl H 2 O/κυψελίδα και τις τοποθετήσαμε στους 37 o C υπό ήπια ανάδευση για να ξεκινήσει η διαδικασία της αποδέσμευσης. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα αφαιρούταν το μέσο διασποράς (1200 μl) και συμπληρωνόταν νέα ποσότητα για την αποφυγή του κορεσμού του μέσου διασποράς με φάρμακο. Στον όγκο που αφαιρούταν, κάθε φορά προσδιοριζόταν και η ποσότητα της Dox που είχε αποδεσμευτεί. 6.2 Αποδέσμευση σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) Ακολουθώντας την προηγούμενη διαδικασία προσδιορίστηκε η αποδέσμευση του φαρμάκου αυτή τη φορά σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ως μέσο αποδεύσμευσης. Η διαδικασία επαναλήφθηκε επτά ακόμη φορές. Το πείραμα έγινε και για τους τρεις νανοφορείς, αλλάζοντας κάθε φορά τον αρχικό όγκο του φαρμάκου που προστίθετο και την αρχική αραίωση. 6.3 Αποδέσμευση σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 7.4 Ακολουθώντας την ίδια διαδικασία προσδιορίστηκε η απελευθέρωση του φαρμάκου αυτή τη φορά σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών που περιείχε 3 % w/v αλβουμίνη ως μέσο αποδεύσμευσης. Σε αυτήν την περίπτωση, για τον προσδιορισμό της δοξορουβικίνης σε αλβουμίνη δε χρησιμοποιήθηκε HCl καθώς αυτό καταβυθίζει την πρωτεΐνη και για το λόγο αυτό κατασκευάσθηκαν νέες πρότυπες καμπύλες. 74

Emission 6.4 Αποδέσμευση σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 6. 6.5 Αποδέσμευση σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 5.2 Ακολουθώντας την ίδια διαδικασία που περιγράφηκε και στην παράγραφο 6.3. προσδιορίστηκε η απελευθέρωση του φαρμάκου αυτή τη φορά σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών που περιείχε 3 % w/v αλβουμίνη ως μέσο αποδεύσμευσης, όπου το ph ρυθμίστηκε στο 6 ή 5.2. 7. ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΚΑΜΠΥΛΩΝ 7.1 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης δοξορουβικίνης σε νερό Για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης παρασκευάστηκαν διαλύματα Dox τελικού όγκου 1000 μl με τις ακόλουθες συγκεντρώσεις φαρμάκου : 1. 0 ppm Dox, 2. 0.1 ppm Dox, 3. 0.25 ppm Dox, 4. 0.5 ppm Dox, 5. 1 ppm Dox, 6. 2 ppm Dox, 7. 3 ppm Dox, 8. 4 ppm Dox, 9. 5 ppm Dox, 10. 6 ppm Dox, 11. 8 ppm Dox. Σε όλα τα διαλύματα προσθέσαμε 125 μl HCL- για να διαλυθεί καλύτερα η δοξορουβικίνη στο νερό-. Η μέτρηση των δειγμάτων έγινε μετά από 2.5 ώρες σε φθορισμόμετρο. Η διαδικασία επαναλήφθηκε τρεις φορές. Ο φθορισμός για την κατασκευή της συγκεκριμένης πρότυπης καμπύλης μετρήθηκε στα 555 nm. 800 600 400 Adj. R-Square: 0.99399 200 0-200 0 2 ppm Dox Σχήμα 1: πρότυπη καμπύλη δοξορουβικίνης σε νερό. 75

Emission 7.2 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης δοξορουβικίνης σε PBS Ακολουθήσαμε την ίδια διαδικασία με αυτή που περιγράφεται στην υποενότητα 7.1 με τη διαφορά ότι αυτή τη φορά ο διαλύτης ήταν το PBS αντί του νερού. Ο φθορισμός για την κατασκευή της συγκεκριμένης πρότυπης καμπύλης μετρήθηκε στα 555 nm. 800 600 =8405.377+367.605*x Adj. R-Square: 0.99308 400 200 0-200 0 2 ppm Dox Σχήμα 2: πρότυπη καμπύλη δοξορουβικίνης σε PBS 7.3 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης δοξορουβικίνης σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 7.4 Ομοίως, η κατασκευή της πρότυπης καμπύλης του φαρμάκου σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS, έγινε όπως στην υποενότητα 7.1 με τη διαφορά ότι αυτή τη φορά ο διαλύτης ήταν το διάλυμα αλβουμίνης σε PBS αντί του νερού. Επίσης, αυτή τη φορά δεν προσθέσαμε καθόλου HCL γιατί καταβυθίζει την αλβουμίνη. Ο φθορισμός για την κατασκευή της συγκεκριμένης πρότυπης καμπύλης μετρήθηκε στα 590 nm. 76

Emission 1200 1000 800 =98.81778+82.58141*x Adj. R-Square=0.99644 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 ppm Dox Σχήμα 3: πρότυπη καμπύλη δοξορουβικίνης σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 7.4 7.4 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης δοξορουβικίνης σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 6 Ομοίως, η κατασκευή της πρότυπης καμπύλης του φαρμάκου σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS με ph 6, έγινε όπως στην υποενότητα 7.3 αφού πρώτα είχε ρυθμιστεί το διάλυμα της αλβουμίνης σε PBS στη τιμή ph 6. Η μέτρηση της πρότυπης καμπύλης έγινε τρεις φορές. Η πρώτη μέτρηση έλαβε χώρα αμέσως μετά την προσθήκη του φαρμάκου στα διαλύματα της αλβουμίνης στο PBS (Σχήμα 4), η δεύτερη μετά από 6 ώρες και η τρίτη μετά από 24 ώρες. Αυτό έγινε για να μελετηθεί η σταθερότητα του φαρμάκου στο συγκεκριμένο διάλυμα με τη συγκεκριμένη τιμή ph. Ο φθορισμός για την κατασκευή της συγκεκριμένης πρότυπης καμπύλης μετρήθηκε στα 590 nm. 77

Emission Emission 1400 1200 1000 ψ=74.4751+119.417χ Adj. R-Square: 0.98531 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 ppm Dox Σχήμα 4: πρότυπη καμπύλη δοξορουβικίνης σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS με ph 6. 7.5 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης δοξορουβικίνης σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS σε ph 5.2 Ομοίως, η κατασκευή της πρότυπης καμπύλης του φαρμάκου σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS με ph 5.2, έγινε όπως στην υποενότητα 6.4 αφού πρώτα είχε ρυθμιστεί το διάλυμα της αλβουμίνης σε PBS στη τιμή ph 5.2. Ο φθορισμός για την κατασκευή της συγκεκριμένης πρότυπης καμπύλης μετρήθηκε στα 590 nm. 1400 1200 1000 ψ=30.81537+122.665χ Adj. R-Square: 0.99426 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 10 ppm Dox Σχήμα 5: πρότυπη καμπύλη δοξορουβικίνης σε διάλυμα αλβουμίνης σε PBS με ph 5.2 78

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 0 : ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΔΟΜΗ ΝΑΝΟΦΟΡΕΩΝ Οι υβριδικοί μαγνητικοί νανομεταφορείς φαρμάκων που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία έχουν σχήμα πυρήνα-κελύφους και παρασκευάστηκαν μέσω μιας διαδικασίας αυτοοργάνωσης του πολυ (μεθακρυλικού οξέος)- graft- πολυ (μεθακρυλική αιθυλενογλυκόλη) (p (MAA-g-EGMA)) πάνω σε νανοκρυστάλλους οξειδίων σιδήρου. Αυτό το συμπολυμερές εμβολιασμού - το οποίο και απεικονίζεται στο σχήμα 1- λειτουργεί ως στεφάνη για τα MNPs. Τα τμήματα μεθακρυλικού οξέος (MAA) πλαισιώνουν επιλεκτικά την περιοχή γύρω από τους μαγνητικούς νανοκρυσταλλίτες, ενώ οι πλευρικές αλυσίδες πολυ (αιθυλενογλυκόλης) διατάσσονται ως προεξοχές προς το υδατικό περιβάλλον. Με τον τρόπο αυτό, οι πολλές αλυσίδες PEG που συνδέονται με τον πολυμερικό σκελετό σχηματίζουν ένα μοτίβο που μοιάζει με τη δομή πρωτεογλυκανών [187,188]. Επιπλέον, η επιλογή του πολυμερούς οδηγεί σε συναρμολόγηση νανοφορέων με υψηλή πυκνότητα PEG, [189,190], η οποία πιστεύεται ότι συμβάλλει στην αύξηση του χρόνου παραμονής των νανοφορέων στο αίμα [191,192]. Σχήμα 1: Μοριακή δομή του διακλαδισμένου με PEG συμπολυμερούς πολυ (μεθακρυλικού οξέος) - graft- πολυ (μεθακρυλική αιθυλενογλυκόλη). [193] 79

Για τη συγκεκριμένη εργασία, συντέθηκαν διαφορετικοί τύποι MagP(MAA-g-EGMA) με ποικίλο μήκος και πυκνότητα των αλυσίδων PEG. (Πίνακας 1) Πίνακας 1: Δομικά χαρακτηριστικά των υπό μελέτη νανοφορέων Polymer Number of monomers (p) Density of chains n:m Mw (g/mol) Number of monomers (n) Number of monomers (m) %n Solid content mass (%) Mol anionic sites (gr PCE) Mag102-6 102 6:1 67000 76.8 12.8 12.4 22.8 1.1 10-3 Mag10-1 10 1:1 47000 86 71 19.74 9 1.8 10-3 Mag102-2 102 2:1 78000 32.4 16.2 4.48 48 4.2 10-4 1.1 Δομικός χαρακτηρισμός του υβριδικού συστήματος μέσω σκέδασης νετρονίων σε μικρές γωνίες (SANSPOL) και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης (TEM) Σε μια εργασία [193], μελετήθηκε η συνολική δομική οργάνωση των υβριδικών μαγνητικών νανοφορέων (εσωτερικό κέλυφος και εξωτερικό πολυμερικό κέλυφος) οι οποίοι παρασκευάστηκαν μέσω μιας διαδικασίας αυτο-οργάνωσης του πολυ (μεθακρυλικού οξέος)- graft- πολυ (μεθακρυλική αιθυλενογλυκόλη) (p (MAA-g-EGMA)) πάνω σε νανοκρυστάλλους οξειδίων σιδήρου με τη μέθοδο της σκέδασης νετρονίων σε μικρές γωνίες (SANSPOL). Τα πειράματα SANS έδωσαν πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με τα μεγέθη των σωματιδίων και την εσωτερική οργάνωση των νανοφορέων. Χρησιμοποιούνται τα συγκεκριμένα αποτελέσματα αυτής της εργασίας διότι οι νανοφορείς που μελετήθηκαν σε αυτή παρουσίαζουν παρόμοια δομικά χαρακτηριστικά με τους νανοφορείς που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία, μόνο που στην παρούσα εργασία κάθε κολοειδές αποτελείται από περισσότερους από έναν πυρήνες και τα πολυμερή έχουν γεφυρωτικό ρόλο μεταξύ των νανοκρυσταλλιτών σε κάθε κολλοειδές, ενώ οι αλυσίδες PEG εξακολουθούν να δημιουργούν ένα εξωτερικό προστατευτικό φλοιό. Με τη σκέδαση νετρονίων σε μικρές γωνίες, η διάμετρος του πυρήνα εκτιμήθηκε σε 12.4 nm ± 0,2, ενώ το εσωτερικό κέλυφος είχε πάχος 6,7 ± 0,3 nm και το δεύτερο κέλυφος (το εξωτερικό στρώμα), που αποτελείται από 90% ν / ν νερό, είχε πάχος 11 ± 2 nm. Η προκύπτουσα διάμετρος του υβριδικού κολλοειδούς, με βάση αυτό το μοντέλο, εκτιμάται σε 48 ± 2 nm. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από το TEM δίνουν μια μέση τιμή 13,5 nm για τη διάμετρο των Mions, ενώ από μετρήσεις DLS, η διάμετρος του κολλοειδούς εκτιμήθηκε σε ~ 41 nm (σχήμα 3), έτσι τα αποτελέσματα του SANS επιβεβαιώνουν αρκετά καλά τις άλλες τεχνικές. 80

Οι Εικόνες 1α και β είναι αντιπροσωπευτικές εικόνες ΤΕΜ για τα υβρίδια MagP(MAA-g-EGMA)3 και 1 αντίστοιχα. Και τα τρία υβρίδια εμφανίζουν παρόμοια χαρακτηριστικά στις εικόνες ΤΕΜ. Δεν εμφανίστηκαν συσσωματώματα ή κολλοειδή αποτελούμενα από περισσότερους του ενός νανοκρυσταλλίτες (clustered). Αυτή η παρατήρηση οδηγεί στο συμπέρασμα ότι στην περίπτωση των πολυ-πύρηνων κολλοειδών οι νανοκρυσταλλίτες συγκρατούνται μαζί μέσω αλυσίδων πολυμερούς σε μια διαμόρφωση γεφύρωσης. Η κρυσταλλική φύση των Mions ήταν προφανής από την εμφάνιση των ατομικών επιπέδων στην εικόνα υψηλότερης ανάλυσης ΤΕΜ που φαίνεται στην εικόνα 1γ. Με βάση τα κατά προσέγγιση κλάσματα όγκου των υλικών που καταλαμβάνει κάθε κέλυφος, τα υβρίδια που ελήφθησαν μπορούν να περιγραφούν στο Σχήμα 2. [193] Σχήμα 2: Το εκτιμώμενο μοντέλο του κολλοειδούς MagP (PMAA-g-EGMA)3 βασισμένο στα αποτελέσματα που προέκυψαν από το SANS.[193] 81

Σχήμα 3: Η κατανομή του υδροδυναμικού μεγέθους των υβριδικών κολλοειδών [193]. Εικόνα 1. a) και b) εικόνες TEM των υβριδίων MagP(MAA-g-EGMA)3 και 1 αντίστοιχα. c) Υψηλής ανάλυσης εικόνα που δείχνει ότι ακόμη και τα μικρότερα σωματίδια είναι κρυσταλλικά [193]. 82