Μοριακή Διαγνωστική. Διδακτικές διαφάνειες επιπλέον συγγράμματος. Κλινική Χημεία ΣΤ Εξάμηνο - Παραδόσεις

Transcript

1 Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Τμήματα Βιολογίας Σ.Θ.Ε. Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας Μοριακή Διαγνωστική Διδακτικές διαφάνειες επιπλέον συγγράμματος Κλινική Χημεία ΣΤ Εξάμηνο - Παραδόσεις Μαργαρίτης Αυγέρης

2 Μοριακή Διαγνωστική

3 Μοριακή Διαγνωστική Η Μοριακή Διαγνωστική (Molecular Diagnosis) αποτελεί έναν από τους νεότερους και πλέον αναπτυσσόμενους κλάδους της Κλινικής Βιοχημείας (Clinical Biochemistry) και της Εργαστηριακής Ιατρικής (Laboratory Medicine), η οποία εκμεταλλεύεται: α. την σημαντική πρόοδο της μοριακής βιολογίας και γενετικής των ανθρώπινων ασθενειών β. τις ταχύτατες εξελίξεις στην τεχνολογία ανάλυσης των βιομορίων και τις βιοτεχνολογικές εφαρμογές επιχειρεί: α. την διάγνωση και διαφοροδιάγνωση (diagnosis/diaforodiagnosis) β. την πρόγνωση (prognosis) γ. πρόβλεψη ανταπόκρισης στην θεραπεία (prediction of therapeutic response) δ. παρακολούθηση της πορείας των ασθενών (monitoring)

4 Μοριακή Διαγνωστική Οι περισσότερο συνήθεις εφαρμογές της Μοριακής Διαγνωστικής αφορούν: α. Ανίχνευση και ταυτοποίηση παθογόνων μικροοργανισμών και ιών σε δείγματα βιολογικών υγρών β. Ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με γενετικές ασθένειες, όπως την κυστική ίνωση, μυϊκή δυστροφία, θαλασσαιμίες κ.α. γ. Ανίχνευση και προσδιορισμός γονιδιακής έκφρασης (gene expression) ή/και επέκτασης (gene amplification) ή/και γενικότερων μεταβολών του αριθμού των αντιγράφων ενός γονιδίου (copy-number alterations: amplifications, deletions, gene fusions) για έγκαιρη διάγνωση, πρόγνωση και θεραπεία νεοπλασιών δ. Ανάλυση DNA και νουκλεϊκών οξέων για Ιατροδικαστικούς σκοπούς

5 Ιδιότητες Γενετικού Υλικού (DNA) 1. Καθολικό μόριο Απαντάται σε όλους τους οργανισμούς από τον άνθρωπο μέχρι τους ιούς Αντιγράφεται και εκφράζεται με τον ίδιο τρόπο σε όλους τους οργανισμούς 2. Ρυθμιστικό μόριο Ελέγχει την παραγωγή όλων των πρωτεϊνών ενός οργανισμού, ελέγχοντας τις ιδιότητές του 3. Σταθερότητα Αντιγράφεται και εκφράζεται πιστά Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί 4. Μοναδικότητα (DNA fingerprint) Η αλληλουχία των αζωτούχων βάσεων είναι μοναδική για κάθε οργανισμό

6 Μεθοδολογίες Ανάλυσης DNA Α. Παλιότερες μεθοδολογίες Διασταυρώσεις, Καρυώτυπος, Χαρτογράφηση, Southern blot, RFLPs Β. Νεότερες Μεθοδολογίες 1. Μοριακή Κλωνοποίηση (Molecular cloning) Μεταφορά γενετικού υλικού (γονιδίων) σε ένα οργανισμό και έλεγχο των ιδιοτήτων τους 2. Αλληλούχηση (Sequencing) Αποκάλυψη της αλληλουχίας των αζωτούχων βάσεων 3. DNA μικροσυστοιχίες (DNA microarrays) Ταυτόχρονος έλεγχος παρουσίας και έκφρασης μεγάλου αριθμού γονιδίων 4. PCR (Polymerase Chain Reaction) Επιλεκτική ανίχνευση συγκεκριμένων γονιδίων 5. Real Time PCR Ποσοτική ανίχνευση

7 Πριν την PCR Ο έλεγχος του DNA απαιτεί τον αρχικό πολλαπλασιασμό του: 1. Απομόνωση του DNA που επιθυμούμε να ελέγξουμε. 2. Κλωνοποίηση σε βακτηριακά πλασμίδια 3. Μετασχηματισμός των βακτηρίων 4. Ανάπτυξή τους σε τρυβλία 5. Επιλογή των επιθυμητών βακτηριακών κλώνων 6. Απομόνωση του βακτηριακού γενετικού υλικού, το οποίο φέρει το υπό έλεγχο DNA 7. Ανάλυση

8 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR) In vitro ταχύτατη, πιστή και ελεγχόμενη αντιγραφή του DNA Το 1983 ο Kary Mullis αναπτύσσει την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR) Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985 Dec 20; 230 (4732) : (Βραβείο Nobel 1993) Αρχή της PCR In vitro ενίσχυση (πολλαπλασιασμός) συγκεκριμένου τμήματος DNA, με την χρήση: α. Υποστρώματος DNA β. DNA πολυμεράσης γ. μείγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) γ. πρωταρχικών τμημάτων εκκινητών της αντίδρασης δ. κατάλληλων μεταβολών της αντίδρασης

9 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR) Η PCR αντίδραση χαρακτηρίζεται από τρία θερμοκρασιακά στάδια. 1. Στάδιο αποδιάταξης: Επώαση της αντίδρασης στους 95 ο C για την αποδιάταξη των δυο αλυσίδων του dsdna 2. Στάδιο υβριδοποίησης των εκκινητών: Επώαση στους ο C για την επιλεκτική υβριδοποίηση των εκκινητών στο ssdna Στάδιο το οποίο ελέγχει την εξειδίκευση της αντίδρασης Η εξειδίκευση της αντίδρασης ελέγχεται από την σύνθεση και χρήση κατάλληλων εκκινητών και την σωστή υβριδοποίησή τους στο στάδιο αυτό 3. Στάδιο ενίσχυσης των εκκινητών: Επώαση της αντίδρασης στους 72 o C για την δράση της Taq πολυμεράσης

10 Αυξημένη θερμοκρασία αύξηση ειδικότητας (αλλά μείωση απόδοσης) Μειωμένη θερμοκρασία μείωση ειδικότητας (αλλά αύξηση απόδοσης Θερμοκρασιακά Στάδια PCR Αρχική Αποδιάταξη Αποδιάταξη Ενίσχυση Τελική Ενίσχυση Υβριδοποίηση εκκινητών Απόδοση PCR: ελέγχεται από όλα τα στάδια αποδιάταξη, υβριδοποίηση και ενίσχυση (αλλά και από αντιδραστήρια) Ειδικότητα PCR: ελέγχεται από υβριδοποίηση εκκινητών (αλλά και συγκέντρωση MgCl 2 )

11 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR) Για PCR αντιδράσεις απόδοσης 100%: Η ποσότητα του τελικό επιθυμητού προϊόντος είναι: (2 n-2 ) * x όπου n, ο αριθμός των κύκλων της αντίδρασης και x, ο αριθμός των υπό ενίσχυση DNA τμημάτων στο αρχικό δείγμα Απλούστερα: 2 n * x

12 Καμπύλη PCR

13 Απόδοση PCR E n : απόδοση από κλίση καμπύλης φθορισμού E ds : απόδοση από κλίση καμπύλης αναφοράς Robert Brankatschk et al. Appl. Environ. Microbiol. 2012;78: Απόδοση PCR: E = [10 (-1/slope) -1] * 100% Amplification factor: 10 (-1/slope)

14 Απόδοση PCR Η απόδοση της PCR αντίδρασης επηρεάζεται: A.Αρνητικά 1. Ηπαρίνη αναστολέας αντίδρασης PCR, χρησιμοποιείται ως αντιπηκτικό κατά την συλλογή αίματος. Προτείνεται η χρήση EDTA. 2. Ιοντικά απορρυπαντικά (SDS) - αναστολέας αντίδρασης PCR. Απαιτείται η απομάκρυνση από το δείγμα (εκχύλιση με φαινόλη κατακρήμνιση με αιθανόλη 3. Μη ιοντικά απορρυπαντικά σε συγκεντρώσεις >5% 4. DΝases και πρωτεϊνικών αναστολέων δείγματος αντιμετωπίζεται με κατάλληλη απομόνωση νουκλεϊκών οξέων Β. Θετικά 1.Φορμαμίδιο 5% 2.Γλυκερόλη (10-15%) 3.PEG (Polyethylene glycol 5-15%)

15 Ανίχνευση προϊόντων PCR 1. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης - βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr) O πλέον συνήθης τρόπος ανίχνευσης των προϊόντων της PCR αντίδρασης πραγματοποιείται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσία βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr), το οποίο φθορίζει κάτω από UV ακτινοβολία Αρχή 300bp 200bp 100bp 229bp 1. Τα ενισχυόμενο DNA τμήμα κινείται προς τον θετικό πόλο αντίστροφος ανάλογα του μεγέθους τους 2. Με την βοήθεια δείκτη μοριακών βαρών, προσδιορίζεται το μέγεθος του ενισχυόμενου τμήματος

16 Ανίχνευση προϊόντων PCR 2. Αυτοραδιογραφία για ραδιοσημασμένα προϊόντα ή με χρήση ραδιοσημασμένων ανιχνευτών (probes) 3. Χρήση βιοτινυλιωμένων εκκινητών στρεπταβιδίνης συνήθως υπάρχει αντίδραση αλκαλικής φωσφατάσης ή υπεροξειδάσης (προσαρτημένες στην στρεπταβιδίνη) 4. HPLC ανίχνευση

17 Άλλες θερμοάντοχες DNA πολυμεράσες: Pfu (Pyrococcus furiosus) ανώτερη θερμοαντοχή, 3 5 εξωνουκλεολυτική δράση (proofreading) Tth (Thermus thermophilus) θερμοάντοχη, προσθήκη τροποποιημένων dntps, RT θραύσμα Stoffel (πιο σταθερό σε υψηλές θερμοκρασίες, μεγαλύτερο εύρος Mg 2+, κατάλληλο για υποστρώματα με μεγάλο ποσοστό G-C). Αντιδραστήρια PCR αντίδρασης 1. DNA πολυμεράση χρήση DNA-εξαρτώμενης DNA πολυμεράσης για ενίσχυση της DNA μήτρας Η πλέον χρησιμοποιούμενη: Taq polymerase του βακτηρίου Thermus aquaticus, το οποίο επιβιώνει σε θερμές πηγές. Εμφανίζει βέλτιστη θερμοκρασία στους 72 o C, κάνοντάς την ιδανική για την PCR Ανασυνδυασμένες μορφές της Taq α. AmpliTaq, η οποία εκφράζεται στην E. coli και εμφανίζει μεγαλύτερη επαναληπτικότητα β. HotStar Taq, ανασυνδυασμένη Taq πολυμεράση, η οποία βρίσκεται σε ανενεργή μορφή μέσω πρόσδεσης μονοκλωνικού αντισώματος. Απαιτεί την θέρμανσή της (~95 o C) για την ενεργοποίησή της (αποδιάταξη Ab). Θεωρείται πολύ περισσότερο ειδική μορφή της Taq

18 Αντιδραστήρια PCR αντίδρασης 2. Μείγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) Ισομοριακό μείγμα datp, dttp, dgtp, dctp σε συγκέντρωση μμ. Ανάλογα με την ανίχνευση του PCR προϊόντος μπορεί να είναι: α. μη ραδιοσημασμένα β. ραδιοσημασμένα γ. βιοτινυλιωμένα δ. διδεοξυριβονουκλεοτίδια (για αλληλούχηση του PCR προϊόντος) 3. Ιόντα μαγνησίου (Mg 2+ ) MgCl 2 χρησιμοποιείται ως δότης, σε συγκέντρωση 1-1,5 mm α. Τα Mg 2+ είναι απαραίτητος συμπαράγοντας της Taq β. σχηματίζουν σύμπλοκα με τα dntps και διευκολύνουν την ενσωμάτωσή τους στην νέα αλυσίδα γ. επηρεάζουν υβριδοποίηση εκκινητών δ. αυξάνουν την Tm του δίκλωνου DNA Ρυθμιστές της ειδικότητας της PCR αντίδρασης

19 Αντιδραστήρια PCR αντίδρασης Εκκινητές (PCR primers) Οι εκκινητές αποτελούν τα πρωταρχικά τμήματα, τα οποία ενισχύονται από την PCR πολυμεράση. Είναι ιδιαίτερα σημαντικοί γιατί: 1. Τα 5 -άκρα τους οριοθετούν το προϊόν της PCR αντίδρασης 2. Ελέγχουν την ειδικότητα της PCR αντίδρασης 3. Επηρεάζουν την απόδοση της αντίδρασης 4. Ελέγχουν την θερμοκρασία υβριδοποίησης της αντίδρασης Ο εκκινητής συμπληρωματικός της 3-5 αλυσίδας καλείται πρόσθιος (forward/f), ενώ ο συμπληρωματικός της 5-3 καλείται ανάστροφός (reverse/r)

20 Αντιδραστήρια PCR αντίδρασης Έλεγχος ειδικότητας (specificity) PCR αντίδρασης Ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο για την ειδικότητα της PCR αντίδρασης διαθέτει το 3 -άκρο των εκκινητών, αφού αυτό ενισχύεται από την DNA πολυμεράση Ένας ΜΗ ΕΙΔΙΚΟΣ εκκινητής με συμπληρωματικό 3 -άκρο θα επιτρέψει την παραγωγή παραπροϊόντων

21 Χαρακτηριστικά Σχεδιασμού PCR εκκινητών Βασικοί κανόνες για το σχεδιασμό PCR primers: 1. Μήκος: bases 2. Θερμοκρασία τήξης εκκινητή (T m ): o C (ιδανικά o C) Τm: η θερμοκρασία όπου το 50% του εκκινητή βρίσκεται σε μονόκλωνη κατάσταση γενικά Tm= (A+T)*2 + (G + C) *4 o C (για εκκινητές <25 bases) 3. Θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητή (T a ): T a = T m έως (T m -5 o C) T a = 0.3 x Tm (εκκινητή) Tm (προϊόντος) GC Περιεχόμενο: 40-60% 5. GC Clamp: 3G s C s στις 5 τελευταίες βάσεις του 3 άκρου του εκκινητή 6. Αποφυγή δευτεροταγών δομών: Αποφυγή hairpins, Self-dimers, Cross-dimers 7. Επαναλήψεις: Αποφυγή επανάληψης δι-νουκλεοτιδίων ή ίδιας βάσης (π.χ. ΑΤΑΤΑΤΑΤΑΤ ή AGCGGGGGATGGGG 8. Αποφυγή συμπληρωματικότητας με άλλα υποστρώματα της αντίδρασης Έλεγχος με BLAST

22 RT-PCR Διπλή αντίδραση: 1. In vitro αντίστροφη μεταγραφή RNA σε cdna 2. Αντίδραση PCR Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής καταλύεται από RNA-εξαρτώμενη DNA πολυμεράση γνωστή ως αντίστροφη μεταγραφάση Οι συνηθέστερες αντίστροφες μεταγραφάσες 1. MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) - 37 o C εφαρμογή σε αντίστροφη μεταγραφή μεγάλων υποστρωμάτων (mrnas) έως 7 Kb. Δεν έχει ενεργότητα 3-5 εξωνουκλεάσης και ασθενής ενεργότητα RNase H 2. AMV (Avian Myeloblastosis Virus) - 42 o C Διαθέτει ενεργότητα RNase H, και είναι σταθερή σε o C 3. Superscript II (42 o C) και ΙΙΙ (50 o C) (genetically engineered MMLV enzymes) για μειωμένη ενεργότητα RNase H, μεγαλύτερη απόδοση αντίδρασης Εφαρμογή: Έλεγχος γονιδιακής έκφρασης

23 Εκκινητές της αντίδρασης RT (Reverse transcription primers) RT εκκινητές A. Μη ειδικοί 1. Oligo-dT primer: ~18 bases Τ Υβριδοποιείται στη poly(a) ουρά των mrna Δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε προκαρυωτικά mrna (λόγω απουσίας poly(a) ουράς) Χαμηλή απόδοση σε >4Κb 2. Random primers: random 6-mers Υβριδοποιούνται τυχαία σε κάθε συμπληρωματικό υπόστρωμα Β. Ειδικοί 3. Gene-specific RT primer: Υβριδοποιείται σε συγκεκριμένο/α συμπληρωματικό υπόστρωμα προσφέροντας τόσο εξειδίκευση και ευαισθησία

24 Αποφυγή ενίσχυσης genomic DNA 1. Χρήση DNase I Προτείνετε η αρχική χρήση DΝase I στο RNA υπόστρωμα για την αποφυγή ενίσχυσης gdna κατά την PCR αντίδραση 2. Χρήση PCR εκκινητών σε διαφορετικά εξώνια

25 Nested PCR Πραγματοποιείται χρήση 2 ζευγαριών εκκινητών σε διαφορετικές PCR αντιδράσεις (συνήθως όχι ταυτόχρονα) α. ενός εξωτερικού 1 ου ζεύγους για λίγους κύκλους (10-18 κύκλους) επιτρέπει τον πολλαπλασιασμό ενός ειδικού αρχικού υποστρώματος β. ενός εσωτερικού 2 ου ζεύγους για μεγαλύτερο αριθμό κύκλων (25-35 κύκλοι) χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα τον ενισχυμένο ειδικό προϊόν της 1 ης αντίδρασης Στόχος αύξηση ευαισθησίας αντίδρασης για αραιά υποστρώματα

26 Πολλαπλή PCR (multiplex PCR) Η πολλαπλή PCR δίνει την δυνατότητα ταυτόχρονης ενίσχυσης πολλών διαφορετικών DNA τμημάτων σε μία PCR αντίδραση Διαφέρει από συμβατική singleplex PCR περιλαμβάνοντας περισσότερα του ενός ζεύγη PCR εκκινητών στο ίδιο μείγμα επιτρέποντας την ταυτόχρονη ενίσχυση περισσότερων τμημάτων Προϋποθέσεις 1. Πολύ καλή ειδικότητα των εκκινητών 2. Παρόμοια Tm και Τα 3. Διαφορετικά μεγέθη ενισχυόμενου προϊόντος για διάκριση σε ηλεκτροφόρηση αγαρόζης Εφαρμογές: Γενετικές ασθένειες, μικροβιολογικός έλεγχος

27 Συμβατική PCR Ημιποσοτική Ανάλυση Συμβατική PCR Ανάλυση τελικού σημείου (end-point PCR detection) Ημι-ποσοτική PCR Ανάλυση τελικού σημείου σε κύκλο που δεν έχει προηγηθεί plateu H PCR αντίδραση τερματίζεται πριν την φάση plateu εκθετική φάση με στόχο η κάθε αντίδραση να φέρει διαφορετική ποσότητα (copies) του προς ενίσχυση DNA τμήματος ΕΞΑΙΤΙΑΣ της διαφορετικής ποσότητας στο αρχικό δείγμα

28 Ποσοτική PCR (quantitative PCR/qPCR) Ποσοτική Συναγωνιστική PCR (Quantitative Competitive PCR) Πραγματοποιείται με ταυτόχρονη ενίσχυση ενός συναγωνιστή (competitor DNA) γνωστής συγκέντρωσης, μαζί με το προς προσδιορισμό DNA. Τα δυο αυτά τμήματα ενισχύονται από το ίδιο ζεύγος PCR εκκινητών. Διακρίνονται μεταξύ τους: 1. Συνήθως από διαφορετικό μήκος 2. Δράση ενζύμων περιορισμού Ποσοτικοποίηση Με χρήση σημασμένου ανιχνευτή (probe) κατασκευάζεται καμπύλη αναφοράς με βάση την ποσότητα του συναγωνιστή, επιτρέποντας την ποσοτικοποίηση Ευαισθησία: moles (pmoles)

29 Real-Time qpcr

30 Ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (Real-Time quantitative PCR/qPCR) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Real-Time quantitative PCR / qpcr) Αποτελεί την πλέον καθιερωμένη και ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδο ποσοτικής PCR 1. Χαρακτηρίζεται από την μέτρηση της συγκέντρωσης των προϊόντων της PCR αντίδρασης κατά την πραγματική διάρκεια (real-time) αυτής, και συγκεκριμένα στο τέλος κάθε κύκλου αυτής 2. Η μέτρηση της συγκέντρωσης των προϊόντων της αντίδρασης πραγματοποιείται μέσω φθορισμογόνων μορίων 3. Πλεονεκτήματα: ταχύτητα, ευαισθησία απουσία χειρισμού αντίδρασης μετά το τέλος αυτής (π.χ. ηλεκτροφόρηση)

31 Real-Time quantitative PCR Οι συνηθέστερες μέθοδοι φθορισμομετρικού προσδιορισμού των PCR προϊόντων: A. ειδικοί DNA-ανιχνευτές (probes) Χρήση φθορισμογόνων DNA ανιχνευτών (fluorescent DNA probes) ή όπως είναι περισσότεροι γνωστοί TaqMan probes Στην συγκεκριμένη τεχνική γίνεται χρήση: 1. Ειδικού ζεύγους PCR εκκινητών (forward & reverse) 2. Ειδικού DNA ανιχνευτή (probe) διπλά σημασμένου α. στο 5 -άκρο με φθορισμογόνο μόριο (fluorophore) και β. στο 3 -άκρο με μόριο αποσβέστη (quencer) 3. του φαινομένου FRET εξωνουκλεολυτικής δράσης της Taq πολυμεράσης

32 Φθορισμογόνοι DNA ανιχνευτές (fluorescent DNA probes) Η επιτυχής υβριδοποίηση των εκκινητών και του διπλά σημασμένου ανιχνευτή (probe) επιτρέπει: 1. την ενίσχυση του PCR προϊόντος κατά την 5-3 ενίσχυση των εκκινητών 2. τον κατακερματισμό του probe από την 5-3 εξωνουκλεολυτική δράση της πολυμεράσης 3. Απομάκρυνση της χρωστικής από τον αποσβέστη, και απόσβεση του φαινομένου FRET 4. Μέτρηση της έντασης του φθορισμού από το μόριο της χρωστικής, η οποία αυξάνει ανάλογα με την συσσώρευση των προϊόντων της PCR. Yuan CC et al. Clin Chem 2000, 46(1): Πλεονέκτημα η υψηλή ειδικότητα της αντίδρασης από την χρήση PCR εκκινητών αλλά και του ειδικού ανιχνευτή χρήση διαφορετικών χρωστικών για ταυτόχρονη ανίχνευση διαφορετικών προϊόντων

33 Μη ειδικές φθορισμογόνες χρωστικές (fluorescent dyes) Β. μη-ειδικές φθορισμογόνες χρωστικές Η πλέον χρησιμοποιούμενη μη-ειδική χρωστική φθορισμού στην PCR πραγματικού χρόνου είναι η SYBG Green I Στην συγκεκριμένη τεχνική γίνεται χρήση: 1. Ειδικού ζεύγους PCR εκκινητών (forward & reverse) 2. ΔΕΝ χρησιμοποιείται ειδικός ανιχνευτής 3. μη-ειδικής ως προς το PCR προϊόν χρωστικής φθορισμού (SYBR Green I) 4. Ενσωμάτωσης της μη-ειδικής χρωστικής στο δίκλωνο PCR προϊόν και εκπομπή φθορισμού

34 Καμπύλη τήξης PCR προϊόντων (melting curve analysis) Ενίσχυση μόνο του ειδικού προϊόντος Ενίσχυση και μη-ειδικών προϊόντων

35 Καμπύλες φθορισμού qpcr σήμα υποβάθρου, b ΔRn = Rn b, Rn = ένταση φθορισμού χρωστικής / ένταση φθορισμού χρωστικής ROX b = ένταση σήματος υποβάθρου

36 Προσδιορισμός C T - Ποσοτικοποίηση Η ποσοτικοποίηση επιτυγχάνεται από το προσδιορισμό της τιμής Ct (Threshold cycle) για κάθε δείγμα, η οποία ορίζεται ως o αριθμός των απαιτούμενων κύκλων για να ξεπεράσει ο ειδικός φθορισμός της PCR αντίδρασης τον φθορισμό κατωφλίου (Threshold). O φθορισμός κατωφλίου (Threshold) καθορίζεται από το σήμα του υποβάθρου (baseline) και πρέπει να βρίσκεται μέσα στην γραμμική φάση της καμπύλης Threshold

37 Απόλυτη ποσοτικοποίηση (Absolute quantification) Κατά την απόλυτη ποσοτικοποίηση (absolute quantification): προσδιορίζεται ο απόλυτος αριθμός των μορίων της αλληλουχίας στόχου σε ένα δείγμα, μέσω: α. προτύπων δειγμάτων γνωστής συγκέντρωσης, και β. κατασκευής καμπύλης αναφοράς Απαιτεί την παρόμοια απόδοση PCR αντίδρασης μεταξύ των αγνώστων δειγμάτων και των πρότυπων δειγμάτων

38 Σχετική ποσοτικοποίηση (Relative quantification) C T δείγμα C T βαθμονομητής ΔC T = C T βαθμονομητής - C T δείγμα Για αντιδράσεις απόδοσης eff δείγμ. ~ eff βαθμ. ~100% Χ δείγμ / X βαθμ. = 2 -ΔCT ή Χ δείγμ = 2 -ΔCT * X βαθμ. ή για X βαθμ. = 1 αυθαίρετη μονάδα τότε Χ δείγμ = 2 -ΔCT (arbitrary units)

39 Σχετική ποσοτικοποίηση (Relative quantification) Ειδικά για μεθοδολογίες προσδιορισμού γονιδιακής έκφρασης απαιτείται η κανονικοποίηση των γονιδίων ελέγχου (gene of interest) ως προς γονίδια αναφοράς (housekeeping genes) Τα γονίδια αναφοράς (housekeeping genes) εμφανίζουν σταθερή και μη ρυθμιζόμενη έκφραση μεταξύ διαφορετικών κυτταρικών τύπων και παθολογικών καταστάσεων Η κανονικοποίηση αυτή επιτρέπει την διόρθωση τυχαίων ή/και συστηματικών σφαλμάτων: α. τόσο κατά την πραγματοποίηση της PCR αντίδρασης β. όσο και σφαλμάτων, διαφορετικών αποδόσεων των προηγούμενων βημάτων της μεθοδολογίας, όπως της απομόνωσης του RNA και της αντίστροφης μεταγραφής Οπότε πλέον χρησιμοποιείται ο τύπος της σχετικής ποσοτικοποίησης: Όπου ΔΔCT = ΔCT δείγμ. - ΔCT βαθμ. ΔCT = CΤ target gene CT housekeep. 2 -ΔΔCT

40 Χημική μέθοδος αλληλούχησης Maxam-Gilbert sequencing Η χημική μέθοδος αλληλούχησης αναπτύχθηκε από τους Allan Maxam and Walter Gilbert το 1977 (PNAS 1977 Feb; 74(2): ). Αρχή της μεθόδου 1. Η χημική μέθοδος αλληλούχησης Maxam-Gilbert στηρίζεται στο γεγονός ότι η επίδραση κατάλληλων χημικών αντιδραστηρίων κόβει μονόκλωνα DNA μόρια (ssdna) σε συγκεκριμένες θέσεις με βάση την αλληλουχία τους. 2. Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των τμημάτων πέψης σε κατάλληλο πήκτωμα μας επιτρέπει την αλληλούχηση του μονόκλωνου DNA υποστρώματος

41 Χημική μέθοδος αλληλούχησης Maxam-Gilbert sequencing Βασικά σημεία μεθόδου: 1. Δημιουργία μονόκλωνου DNA (ssdna) 2. Ιχνηθέτηση ssdna στο 5 -ακρο με ραδιενεργό φωσφόρο ( 32 P), με την χρήση πολυνουκλεοτιδικής κινάσης 3. Κατάλληλη (ήπια) κατεργασία των ssdna με χημικές ενώσεις, η οποία τροποποιεί και κόβει το ssdna σε συγκεκριμένη αζωτούχο βάση ανά αλυσίδα. 4. Δημιουργία σειράς θραυσμάτων/χημική επίδραση εξαρτώμενα από την παρουσία της συγκεκριμένης βάσης 5. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός και ανίχνευση με αυτοραδιογραφία ( 32 P)

42 Χημικές Επιδράσεις Χημική μέθοδος αλληλούχησης Maxam-Gilbert sequencing HCOOH (μυρμηκικό οξύ): G + A DMS (διμεθυλοθεϊικό οξύ): G H 2 N-NH 2 (υδραζίνη): C + T H 2 N-NH 2 & 5M NaCl: C Τα 32 P-5 -τμήματα που δημιουργούνται διαχωρίζονται με βάση το μέγεθός τους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα, δίνοντας μια σειρά ραδιενεργών ζωνών, η οποία προδίδει την αλληλουχία. Αναγνώριση αλληλουχίας: 5 προς 3 άκρο Μειονέκτημα μεθόδου: α. τοξικότητα β. αστάθεια χημικών αντιδραστηρίων Απόδοση: έως 250 βάσεις

43 Χημική μέθοδος αλληλούχησης Maxam-Gilbert sequencing Maxam and Gilbert (PNAS 1977 Feb; 74(2): )

44 Ενζυμική μέθοδος αλληλούχησης Sanger sequencing Η χημική μέθοδος αλληλούχησης αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger το 1977 (PNAS 1977 Dec; 74(12): ). Αρχή της μεθόδου 1. Η ενζυμική μέθοδος αλληλούχησης Sanger sequencing στηρίζεται στη in vitro σύνθεση DNA παρουσία αλυσο-τερματικών τριφωσφορικών διδεοξυριβονουκλεοτιδίων (ddntps), η προσθήκη των οποίων οδηγεί στον τερματισμό της αντίδρασης πολυμερισμού ανάλογα με το ddntp. 2. Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των τμημάτων σε κατάλληλο πήκτωμα μας επιτρέπει την αλληλούχηση του μονόκλωνου DNA υποστρώματος

45 Ενζυμική μέθοδος αλληλούχησης Sanger sequencing Βασικά σημεία μεθόδου: 1. Δημιουργία μονόκλωνου DNA (ssdna) 2. In vitro σύνθεση συμπληρωματικής αλυσίδας παρουσία α. dntps (datp, dctp, dttp & dgtp) β. συγκεκριμένου ddntp γ. σημασμένου εκκινητή (ραδιοσημασμένος ή φθοριοσήμανση) διαφορετικά σήμανση με 35 S των dntps 3. Η απουσία 3 -ΟΗ από τα ddntps οδηγεί στον τερματισμό της αντίδρασης πολυμερισμού μετά την προσθήκη του ddntp 4. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός και ανίχνευση τμημάτων

46 Ενζυμική μέθοδος αλληλούχησης Sanger sequencing Για την εύρεση της αλληλουχίας in vitro σύνθεση επαναλαμβάνετε 4 φορές παρουσία διαφορετικού ddntp σε συγκέντρωση (αναλογία ddntp:dntp) ώστε η αντίδραση να τερματίζεται σε όλα τα δυνατά σημεία Τα σημασμένα τμήματα που δημιουργούνται διαχωρίζονται με βάση το μέγεθός τους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, δίνοντας μια σειρά ραδιενεργών ζωνών, η οποία προδίδει την αλληλουχία. Αναγνώριση αλληλουχίας: 5 προς 3 άκρο Απόδοση: έως >500 βάσεις Η αυτοματοποίηση της μεθόδου στηρίζεται: 1. Χρήση σημασμένων ddntps με διαφορετική φθορίζουσα χρωστική εύκολη και ειδική διάκρισή τους από ανιχνευτή φθορισμού 2. Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (capillary electrophoresis) για διαχωρισμό σε ένα κανάλι 3. Μονή αντίδραση πολυμερισμού

47 Μέθοδος πυροφωσφορικού Pyrosequencing Η μέθοδος του πυροφωσφορικού περιεγράφηκε για πρώτη φορά από τους Bertil Pettersson, Mathias Uhlen και Pal Nyren (Anal Biochem 1993; 208(1): ) Αρχή μεθόδου 1. Η μέθοδος στηρίζεται στην απελευθέρωση πυροφωσφορικού (PPi) μετά την προσθήκη ενός dntp στην νέα αλυσίδα 2. Το PPi χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα για την παραγωγή ATP και την εκπομπή χημειοφωταύγειας 3. Η ένταση του φωτός που παράγεται είναι ανάλογη του ATP και ανιχνεύεται από κατάλληλο ανιχνευτή

48 Μέθοδος πυροφωσφορικού Pyrosequencing Βασικά σημεία μεθόδου: 1. Κατά την in vitro σύνθεση της αλυσίδας προστίθεται ένα μόνο dntp 2. To συμπληρωματικό dntp προστίθεται στην αλυσίδα και απελευθερώνεται μόριο πυροφωσφορικού (PPi). 3. To PPi μετατρέπεται σε ATP από την ATP θειολάση και παρουσία APS (adenosine 5 phosphosulfate). 4. Το ATP χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα σε αντίδραση χημειοφωταύγειας, παρουσία ενζύμου λουσιφεράσης και υποστρώματος λουσιφερίνης 5. Μέτρηση εκπεμπόμενου φωτός 6. Τα μη συμπληρωματικά dntp δεν προστίθενται και δεν πραγματοποιείται η αντίδραση χημειοφωταύγειας. 7. Τα dntps που δεν συνδέθηκαν (συμπληρωματικά και μη) αποικοδομούνται από νουκλεοτιδάση, πριν προστεθεί το επόμενο. Πλεονεκτήματα α. Δεν απαιτεί ηλεκτροφόρηση ή άλλο διαχωρισμό β. Ταχύτητα γ. Αυτοματοποίηση δ. Ευρεία χρήση για έλεγχο μεθυλίωσης του DNA (DNA methylation)

49 Μέθοδοι CSGE και DGGE Mέθοδος CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis) 1. Πολλαπλασιασμός του DNA τμήματος ενδιαφέροντος με PCR 2. Αποδιάταξη αλυσίδων με θέρμανση 3. Αναδιάταξη αλυσίδων α. Δημιουργία αποκλειστικά ομοδιμερών (απουσία μεταλλάξεων) β. δημιουργία ομοδιμερών (i. φυσιολογικών και ii. μεταλλαγμένων αλληλομόρφων), και ετεροδιμερών με διαφορετικό ηλεκτροφορητικό πρότυπο σε πήκτωμα αγαρόζης Mέθοδος DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis) 1. Πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση των δίκλωνων PCR προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης παρουσία κλίσης (βαθμίδωσης) αποδιατακτικού μέσου (ουρία ή φορμαμίδιο) 2. Η παρουσία μεταλλάξεων αλλάζει το σημείο αποδιάταξης του προϊόντος και κατ επέκταση τον ηλεκτροφορητικό του διαχωρισμό

50 Μέθοδοι SSCP και RFLP Mέθοδος SSCP 1. Πολλαπλασιασμός του DNA τμήματος ενδιαφέροντος με PCR 2. Αποδιάταξη αλυσίδων με επίδραση φορμαμιδίου σε υψηλή θερμοκρασία 3. Ηλεκτροφόρηση μονόκλωνου DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 4. Παρουσία μεταλλάξεων οδηγεί στην ανάπτυξη συγκεκριμένων δευτεροταγών δομών του ssdna και διαφορετικό ηλεκτροφορητικό πρότυπο σε σχέση με το φυσιολογικό (wt) αλληλόμορφο Mέθοδος RFLP Η μέθοδος βασίζεται στην παρουσία ή απουσία μιας θέσης περιορισμού για μια περιοριστική ενδονουκλεάση από την παρουσία μιας μετάλλαξης ή ενός πολυμορφισμού 1. Πολλαπλασιασμός του DNA τμήματος ενδιαφέροντος με PCR 2. Πέψη PCR προϊόντος με περιοριστική ενδονουκλεάση κατάλληλη για την υπό μελέτη μετάλλαξη ή πολυμορφισμό 3. Διαχωρισμός των τμημάτων σε πήτωμα αγαρόζης ή πολυακρυλαμίδης Μειονέκτημα Απαίτηση για ένζυμα περιορισμού τα οποία δρουν στην υπό μελέτη θέση μετάλλαξης ή πολυμορφισμού

51 The Human Genome Project (HGP) Το πρόγραμμα του ανθρωπίνου γονιδιώματος (The Human genome project) α. είναι το μεγαλύτερο διεθνές ερευνητικό πρόγραμμα που ξεκίνησε 1/10/1990. β. διεθνές ερευνητικό πρόγραμμα με ειρηνικούς σκοπούς. Από αρκετούς ιστορικούς των επιστημών χαρακτηρίζεται ως «αντισταθμιστικό του 1 ου διεθνούς προγράμματος Manhattan», το οποίο οδήγησε και στην δημιουργία της ατομικής βόμβας το 1945 (1 η πειραματική έκρηξη: έρημη κοιλάδα Alamogorno του Νέου Μεξικού στις ). γ. Κύριος στόχος ήταν η αποκρυπτογράφηση του ανθρώπινου γονιδιώματος. δ. απώτερο στόχο την αύξηση του προσδόκιμου επιβίωσης και τη βελτίωση της ποιότητας ζωής του ανθρώπου καθώς και την προστασία του περιβάλλοντος αφού ο στόχος ήταν η επέκτασή του σε όλους τους οργανισμούς.

52 Ιστορική Αναδρομή HGP 1977 Πρόταση για απόπειρα έναρξης αποκρυπτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος με στόχο να τελειώσει το έτος 2300! 1984 Πρόταση για απόπειρα αποκρυπτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος με στόχο να τελειώσει το έτος Θεωρητική έναρξη HGP υπό την επίβλεψη του ΝΙΗ των ΗΠΑ Διεθνοποίηση του προγράμματος- Ευρωπαϊκή συμμετοχή: 20 Ινστιτούτα από ΗΠΑ, Καναδά, Γερμανία, Γαλλία, Μεγάλη Βρετανία, Ιαπωνία και Κίνα. (1/10/1990, επίσημη έναρξη). Επικεφαλής ήταν ο James Watson μέχρι το 1992 και ο Francis Collins στη συνέχεια Συνθήκη της Bermuda- πολιτική κοινοποίησης αποτελεσμάτων Ίδρυση της ιδιωτικής εταιρείας Celera Genomics (Craig Venter) 1999 Ολοκλήρωση της αποκρυπτογράφησης του πρώτου ανθρώπινου χρωμοσώματος (Chr 22) Ανακοίνωση αποτελεσμάτων HGP

53 Δημοσίευση αποτελεσμάτων

54 Ηierarchical shotgun sequencing από HGSC Lander ES et al 2001, Nature 409(6822):

55 whole genome shotgun sequencing Στην στρατηγική του whole genome shotgun sequencing από Celera Genomics α. το σύνολο του γονιδιώματος κόβεται σε εκατοντάδες χιλιάδες τυχαία μικρά κομμάτια DNA τα οποία και υποβάλλονται σε sequencing β. στην συνέχεια πραγματοποιείται επανασύνδεση των τμημάτων DNA με την βοήθεια pattern-recognition softwares Το whole genome shotgun sequencing δεν απαιτεί την γνώση της ακριβούς θέσης των μικρών τμημάτων DNA αλλά είναι ιδιαίτερα απαιτητικό σε επίπεδο επανασύνδεσης μέσω pattern-recognition softwares Βοηθήθηκε σημαντικά από τα μέχρι τότε δημοσιευμένα data/sequences του HGSC.