ΑΝΟΣΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΡΕΠΕΡΤΟΡΙΟΥ ΤΟΥ Τ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ-ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Α ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΝΤΕΛΗΣ ΖΕΜΠΕΚΑΚΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ. Διατριβής: 4107 ΑΝΟΣΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΡΕΠΕΡΤΟΡΙΟΥ ΤΟΥ Τ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΣΤΑΛΙΚΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2018

2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ-ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Α ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΝΤΕΛΗΣ ΖΕΜΠΕΚΑΚΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ. Διατριβής: 4107 ΑΝΟΣΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΡΕΠΕΡΤΟΡΙΟΥ ΤΟΥ Τ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΣΤΑΛΙΚΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2018

4 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΑΡΙΑ ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ( ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ) ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΜΑΓΚΛΑΒΕΡΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ ΙΩΑΝΝΑ ΧΟΥΒΑΡΔΑ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΑΡΙΑ ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, ΑΝΑΠΛ.ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ) ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΜΑΓΚΛΑΒΕΡΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ ΙΩΑΝΝΑ ΧΟΥΒΑΡΔΑ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ ΓΑΡΥΠΙΔΟΥ ΒΑΣΙΛΕΙΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ -ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ΚΟΛΕΤΣΑ ΤΡΙΑΝΤΑΦΥΛΛΙΑ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΕΛΙΣΑΒΕΤ ΓΕΩΡΓΙΟΥ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ ΧΑΤΖΗΔΗΜΗΤΡΙΟΥ, ΕΡΕΥΝΗΤΡΙΑ Β, ΕΚΕΤΑ «Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» Νόμος 5343/32, άρθρο 202, παρ. 2 και ν. 1268/82 άρθρο 50 ~ 2 ~

5 AΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΣΤΕΡΙΟΣ Ι. ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΜΕΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ ΚΑΡΒΟΥΝΗΣ ~ 3 ~

6

7 Στην οικογένειά μου! Σε αυτήν που με δημιούργησε και σε αυτήν που δημιούργησα. ~ 5 ~

8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ... 9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΒΑΣΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑΣ Δομή του Τ κυτταρικού υποδοχέα Γενετικοί τόποι του Τ κυτταρικού υποδοχέα Μηχανισμοί δημιουργίας ποικιλότητας των υποδοχέων ΤΗΣ προσαρμοστικής ανοσίας. 22 Συνδυαστική ποικιλότητα και ανασυνδυασμός V(D)J Συνδετική ποικιλότητα Διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων Φάση διαφοροποίησης ανεξάρτητη από το αντιγόνο Φάση διαφοροποίησης εξαρτώμενη από το αντιγόνο Επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων στο θύμο αδένα Υποκατηγορίες Τ λεμφοκυττάρων CD4+ Τ λεμφοκύτταρα CD8+ Τ λεμφοκύτταρα ΛΕΜΦΟΫΠΕΡΠΛΑΣΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ T-LGL λεμφοϋπερπλασίες και σύνδρομα μυελικής ανεπάρκειας: ποια είναι η ακριβής συσχέτιση; T-LGL λεμφοϋπερπλασίες και μεταμόσχευση αλλογενών αιμοποιητικών κυττάρων ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΡΕΠΕΡΤΟΡΙΟΥ ΤΟΥ Τ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΜΕ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗΣ ΕΠΟΜΕΝΗΣ ΓΕΝΙΑΣ (NEXT GENERATION SEQUENCING- NGS) ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ NGS ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΡΩΤΟΤΥΠΙΑ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΡΟΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ in vitro ανάλυση In silico (βιοπληροφορική ανάλυση) Αποτελεσματα ~ 7 ~

10 1. Αποτελέσματα της ερευνητικής δραστηριότητας για προτυποποίηση της μεθόδουngs ανάλυσης Αποτελέσματα της ερευνητικής δραστηριότητας για την προτυποποίηση in silico βιοπληροφορικής ανάλυσης ΑΝΟΣΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΡΕΠΕΡΤΟΡΙΟΥ ΤΩΝ Τ-LGL ΛΕΜΦΟΫΠΕΡΠΛΑΣΙΩΝ ΣΕ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΕΣ ΟΝΤΟΤΗΤΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ομάδα μελέτης Πειραματική μεθοδολογία Αποτελέσματα ανάλυσης ανά κλινική οντότητα ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ~ 8 ~

11 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ TR: T receptor Τ υποδοχέας MAP κινάσες: Mitogen activated protein κινάσες NF-κB: Nuclear factor κb NF-AT: Nuclear factor of activated T-cells AP-1: Activator Protein 1 RSS: Recombination Signal Sequence CDR: Complementarity Determining Region P nucleotides: Palindromic nucleotides TdΤ: Terminal deoxynucleotidyl transferase IFN-γ: Ιντερφερόνη γ LTα: Λεμφοτοξίνη α IL: Ιντερλευκίνη TGF-β: Transforming Growth Factor-β Τ- ΧΛΥΝ: Τ Χρόνια Λεμφοϋπερπλαστικά Νοσήματα TNF: Tumor Necrosis Factor Allo-HCT: allo Hematopoietic cell transplantation - μεταμόσχευση αλλογενών αιμοποιητικών κυττάρων T-LGL: T Large Granular Lymphocyte - Τ μεγάλο λεμφοκύτταρο με κοκκία NGS: Next Generation Sequencing- Αλληλούχηση επόμενης γενιά Real time PCR: Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο MHC: Major Histocompatibility complex Μείζον Σύμπλεγμα Ιστοσυμβατότητας ~ 9 ~

12 DN: Double Negative Διπλά Αρνητικά DP: Double Positive Διπλά θετικά SP: Single Positive Μονά Θετικά Th : T helper Τ βοηθητικά Treg: T regulatory Τ ρυθμιστικά CIN: Chronic Idiopathic Neutropenia Χρόνια Ιδιοπαθής Ουδετεροπενία PCR: Polymerase Chain Reaction Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης ~ 10 ~

13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Γυρίζοντας πίσω το χρόνο και αναπολώντας τα γεγονότα που διαδραματίστηκαν τα τελευταία 15 χρόνια στη ζωή μου, συνειδητοποιώ πόσα πολλά και ετερόκλητα πράγματα μπορεί να πετύχει ο άνθρωπος αν έχει θέληση και κυρίως συμπαράσταση από το οικείο περιβάλλον του. Οικογένεια και σπουδές εξελίσσονταν ταυτόχρονα και (τις περισσότερες φορές) αρμονικά επιδεικνύοντας μία απίστευτη ισορροπία που πήγαζε από την αγάπη και την υποστήριξη που απλόχερα όλα αυτά τα χρόνια οι "δικοί" μου άνθρωποι μου πρόσφεραν. Θα ήθελα, λοιπόν, από καρδιάς να ευχαριστήσω τους γονείς μου, Αθανάσιο και Στυλιανή, που παρ' όλες τις αρχικές τους αντιρρήσεις για τα μεγάλα "ανοίγματα" που επιχειρώ στη ζωή μου, είναι πάντα εκεί σιωπηλοί συμπαραστάτες και συνοδοιπόροι. Τον Παναγιώτη που πριν από 18 χρόνια που με γνώρισε ως "φοιτήτρια" (και ακόμα τον ίδιο τίτλο φέρω) πήρε το "ρίσκο" να ξεκινήσουμε την κοινή μας ζωή και με απέραντη υπομονή και επιμονή όλα αυτά τα χρόνια συνεχίζει να υπομένει αγόγγυστα της ανασφάλειες και τα άγχη μου. Τις κόρες μου, Αθανασία και Κατερίνα που μόλις 8 και 3 χρονών αντίστοιχα, δεν ξεχνούν να μου υπενθυμίζουν ότι "δεν οδεύω ορθώς" (όπως χαρακτηριστικά λέει η Αθανασία), υποδεικνύοντας μου τί είναι σημαντικό και τί πραγματικά αξίζει. Εξίσου τυχερή στάθηκα και στην επαγγελματική μου ζωή, αφού τις περισσότερες φορές περιστοιχιζόμουν από ανθρώπους που ανιδιοτελώς μου πρόσφεραν γνώσεις και εναύσματα για να συνεχίσω να προσπαθώ και να εξελίσσομαι. Μέσα σε αυτό το πλαίσιο θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Κώστα Σταματόπουλο, ο οποίος αρχικά ως Υπεύθυνος του Εργαστηρίου Μοριακής Βιολογίας της Αιματολογικής Κλινικής και Μονάδας Μεταμόσχευσης Αιμοποιητικών Κυττάρων του Γ.Ν.Θ. "Γ. Παπανικολάου" και τα τελευταία τέσσερα χρόνια ως Διευθυντής του Ινστιτούτου Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών (ΙΝΕΒ) του Εθνικού Κέντρου Έρευνας & Τεχνολογικής Ανάπτυξης (ΕΚΕΤΑ) στη Θεσσαλονίκη μου αφιέρωσε προσωπικό του χρόνο προκειμένου να μου μεταδώσει απλόχερα τις γνώσεις του στο πεδίο της μοριακής βιολογίας και της ανοσογενετικής. Τον ευχαριστώ ειλικρινά που όλα αυτά τα χρόνια με τον τρόπο του και τις αντιδράσεις του με "πείσμωνε" για να μην σταματήσω να προσπαθώ. ~ 11 ~

14 Η διδακτορική μου διατριβή εκπονήθηκε στο Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών (ΙΝΕΒ) του Εθνικού Κέντρου Έρευνας & Τεχνολογικής Ανάπτυξης (ΕΚΕΤΑ). Θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Αναστασία Χατζηδημητρίου (Ερευνήτρια), η οποία με στήριξε και με στηρίζει σε όλες τις φάσεις εκπόνησης της διδακτορικής μου διατριβής και με τιμά με την συνεργασία και την φιλία της. Ένα μεγάλο ευχαριστώ χρωστώ και στην φίλη και συνάδελφο Μαρία Καρυπίδου (Βιολόγο) για τη συμπαράσταση, την ειλικρίνεια και τις άπειρες ώρες που περάσαμε μαζί στο εργαστήριο. Η διδακτορική μου διατριβή δε θα μπορούσε να είχε ολοκληρωθεί χωρίς την συνεισφορά της ομάδας Πληροφορικής της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Θα ήθελα θερμά να ευχαριστήσω τον Αθανάσιο Γκούφα (μεταπτυχιακό φοιτητή) και τον Χρήστο Μαραμή (μεταδιδακτορικό ερευνητή) για τη στενή συνεργασία και κυρίως τους επιβλέποντες του παραπάνω εγχειρήματος, τον κ. Νικόλαο Μαγκλαβέρα (Καθηγητή) και την κ. Ιωάννα Χουβαρδά (Επίκουρη Καθηγήτρια). Στενή συνεργασία μέσα στο παραπάνω πλαίσιο αναπτύχθηκε με την κ.ελένη Παπαδάκη (Καθηγήτρια Αιματολογίας). Οι γνώσεις της σχετικά με την οντότητα της Χρόνιας Ιδιοπαθούς Ουδετεροπενίας αλλά και η διάθεση των δειγμάτων προς ανάλυση ήταν πολύτιμη και γι αυτό της οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ. Τις κ.κ. Βασιλεία Γαρυπίδου (Καθηγήτρια Παθολογίας - Αιματολογίας), Ελισάβετ Γεωργίου (Επίκουρη Καθηγήτρια Βιολογικής Χημείας) και Τριανταφυλλιά Κολέτσα (Επίκουρη Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής), μέλη της επταμελούς εξεταστικής μου επιτροπής, τις γνώρισα πριν από τρείς εβδομάδες. Στο σύντομο αυτό χρονικό διάστημα της συναναστροφής μας, η στάση τους και η συμπεριφορά τους ήταν καθοριστική στην ομαλή διεξαγωγή της διαδικασίας και ειλικρινά τις οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ. ~ 12 ~

15 Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ στην επιβλέπουσα μου, την κ. Παπαϊωάννου Μαρία (Αιματολόγο- Αναπληρώτρια Καθηγήτρια της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ) για τη συμπαράσταση της σε όλα τα επίπεδα, τις πολλές ώρες συζητήσεων προσπαθώντας να τοποθετήσουμε τα "πράγματα" στη σωστή τους διάσταση και πάνω από όλα για τη συνέπεια της, κρατώντας την υπόσχεση που μου είχε δώσει πριν από 11 χρόνια (ούσα προπτυχιακή φοιτήτρια στο Βιολογικό τμήμα) ότι θα εκπονήσω μαζί της τη Δ.Δ. μου. Την ευχαριστώ από καρδιάς που με συνόδευσε σε αυτό το μαγευτικό "ταξίδι". Θεσσαλονίκη, Ιούνιος 2018 ~ 13 ~

16

17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ~ 15 ~

18

19 ΒΑΣΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑΣ Το ανοσοποιητικό σύστημα εξελίχθηκε για να προστατεύει τον οργανισμό από παθογόνους παράγοντες. Κάθε άνοση απάντηση περιλαμβάνει αναγνώριση του παθογόνου ή άλλου δυνητικά επιβλαβούς υλικού και αντίδραση εναντίον του, με σκοπό την εξάλειψή του. Γενικά, οι διάφοροι τύποι άνοσης απάντησης διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: έμφυτες (innate) και προσαρμοστικές (adaptive). Τα δύο κύρια χαρακτηριστικά της προσαρμοστικής άνοσης απάντησης είναι η εξειδίκευση σε συγκεκριμένο ερέθισμα και η μνήμη που προσδίδει στο ανοσοποιητικό σύστημα την ικανότητα ν αντιδρά πολύ πιο γρήγορα και αποτελεσματικά σε επόμενη επαφή μ ένα συγκεκριμένο αντιγόνο. Η προσαρμοστική άνοση απάντηση διακρίνεται σε χυμική (Β λεμφοκύτταρα) και κυτταρική (Τ λεμφοκύτταρα). Τα Τ λεμφοκύτταρα αρχικά παράγονται στο μυελό τον οστών και, κατά την εμβρυική και νεογνική ζωή, μεταναστεύουν στο θύμο αδένα όπου συμβαίνει η διαφοροποίηση τους σε ώριμα Τ λεμφοκύτταρα τα οποία στη συνέχεια μεταναστεύουν στον περιφερικό λεμφικό ιστό, στο αίμα και στη λέμφο. (1) Το πλέον εντυπωσιακό χαρακτηριστικό του ανοσοποιητικού συστήματος των σπονδυλωτών είναι η ικανότητα αναγνώρισης εκατομμυρίων διαφορετικών αντιγόνων μέσω των ειδικών αντιγονικών υποδοχέων των Β και Τ λεμφοκυττάρων [ανοσοσφαιρίνες και Τ κυτταρικοί υποδοχείς (TR), αντιστοίχως]. Τα λεμφοκύτταρα έχουν την ικανότητα να δημιουργούν τεράστια ποικιλότητα αντιγονικών υποδοχέων (>10 12 ). Το μεγαλύτερο μέρος αυτής της ποικιλότητας δημιουργείται κατά την ανάπτυξη των λεμφοκυττάρων μέσω μιας διεργασίας που καλείται ανασυνδυασμός V(D)J και αφορά σε τυχαία αναδιάταξη του γενετικού υλικού των Τ λεμφοκυττάρων, η οποία αντικατοπτρίζει και τη διαφορετική ειδικότητα του υποδοχέα σε κάθε Τ λεμφοκύτταρο. (1,2) Ενώ τα Β λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν τα αντιγόνα μέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα, στα Τ λεμφοκύτταρα πρέπει να προηγηθεί η επεξεργασία και η παρουσίαση του αντιγόνου σε κατάλληλη μορφή από κάποιο αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο (μακροφάγο, δενδριτικό, Β λεμφοκύτταρο). (3,4) ~ 17 ~

20 Δομή του Τ κυτταρικού υποδοχέα Ο Τ κυτταρικός υποδοχέας (TR) είναι ετεροδιμερές, αποτελούμενος από αβ ή γδ αλυσίδες οι οποίες κωδικοποιούνται από V(D)J γονίδια και σταθερή περιοχή. Οι αλυσίδες αποτελούνται από ένα Ν-τελικό εξωκυττάριο τμήμα, ένα συνδετικό πεπτίδιο, ένα διαμεμβρανικό τμήμα και ένα C-τελικό κυτταροπλασματικό άκρο. Κατάλοιπα κυστεϊνης κοντά στο διαμεμβρανικό τμήμα κάθε αλυσίδας διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό δισουλφυδριλικών δεσμών ανάμεσα στις α-β και γ-δ αλυσίδες. (1,3) Κάθε αλυσίδα συνδέεται με τη λιπιδική διπλοστοιβάδα με μια υδρόφοβη διαμεμβρανική περιοχή, της οποίας χαρακτηριστικό είναι η παρουσία ηλεκτροθετικών αμινοξέων. Ενώ η παρουσία τέτοιων αμινοξέων στις διαμεμβρανικές περιοχές συνήθως δρα αποσταθεροποιητικά, στη συγκεκριμένη περίπτωση αυτά τα φορτισμένα κατάλοιπα παίζουν σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση και σταθεροποίηση του συμπλόκου TR-CD3. Το πρωτεϊνικό σύμπλοκο CD3 εμφανίζει κυτταροπλασματικές προεξοχές που προάγουν την αλληλεπίδραση του με πρωτεΐνες μεταβίβασης σήματος και δρα επικουρικά στην ενεργοποίηση του Τ κυτταρικού υποδοχέα, ο οποίος στερείται ανάλογου κυτταροπλασματικού τμήματος και συνεπώς δε μπορεί να μεταβιβάσει στο κύτταρο το σήμα ενεργοποίησης του Τ κυτταρικού υποδοχέα. Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες του CD3 φέρουν όξινα κατάλοιπα, σχηματίζοντας ιοντικούς δεσμούς με τα βασικά αμινοξέα στη διαμεμβρανική περιοχή του Τ κυτταρικού υποδοχέα. Η βιοσύνθεση και συναρμολόγηση του συμπλόκου TR-CD3 είναι μεγάλης σημασίας για το Τ λεμφοκύτταρο. Σε περιπτώσεις λάθος συναρμολόγησης, το σύμπλοκο TR-CD3 δεν μπορεί να εκφραστεί σωστά στην κυτταρική επιφάνεια και συνεπώς το Τ λεμφοκύτταρο δεν μπορεί ν αναγνωρίσει τα αντιγόνα. Στην ενεργοποίηση του συμπλόκου TR-CD3 κύριο ρόλο διαδραματίζουν οι κυτταροπλασματικές κινάσες p56lck και η p59fyn οι οποίες είναι υπεύθυνες για τη μεταβίβαση σήματος. Κύριο ρόλο επίσης διαδραματίζουν οι κινάσες ασβεστίου και οι MAP κινάσες. Στην παραπάνω διαδικασία συμμετέχουν πολλά μόρια που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση μονοπατιών, των οποίων η συνεργατική δράση έχει ως αποτέλεσμα ~ 18 ~

21 αλλαγές σε επίπεδο έκφρασης, φωσφορυλίωσης και αναδιαμόρφωσης μορίων προκαλώντας διαφορετικά πρότυπα ενεργοποίησης των ΜΑΡΚ κινασών και μετατόπιση διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων (NF-κB, NF-AT και AP-1)(5,6) στον πυρήνα. Γενετικοί τόποι του Τ κυτταρικού υποδοχέα Ο γενετικός τόπος του Τ κυτταρικού υποδοχέα περιλαμβάνει ομάδες γονιδίων (V-D- J-C). Για τη συναρμολόγηση των κωδικοποιητικών αλληλουχιών της μεταβλητής περιοχής του TR επιλέγεται τυχαία ένα γονίδιο από την κάθε ομάδα. Εκτός από τις ομάδες γονιδίων, οι συγκεκριμένοι γενετικοί τόποι περιλαμβάνουν και πλήθος ρυθμιστικών γονιδίων που καθορίζουν τη μεταγραφή ή την αποσιώπηση, όπως οι αλληλουχίες-οδηγοί (leader sequences, L) πριν από κάθε γονίδιο V. (7 9) Πιο συγκεκριμένα ο γενετικός τόπος της β αλυσίδας του Τ κυτταρικού υποδοχέα εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 7. Αποτελείται από γονίδια ανά απλοειδές γονιδίωμα, από τα οποία τα είναι λειτουργικά. Οργανώνεται σε δύο συστοιχίες γονιδιακών TRBD-J-C τμημάτων ως εξής: 1. ένα γονίδιο TRBD1, έξι γονίδια TRBJ και το γονίδιο TRBC1 και 2. ένα γονίδιο TRBD2, οκτώ γονίδια TRBJ και το γονίδιο TRBC2 (3,7 9)(Εικόνα 1) ~ 19 ~

22 Εικόνα 1 : Ο γενετικός τόπος TRB. (IMGT Web resources; Η 5-3 πολικότητα των γονιδίων TRBV παίζει καθοριστικό ρόλο στον τύπο της αναδιάταξης. Όλα τα γονίδια TRBV ανασυνδυάζονται με απαλοιφή (deletion) του DNA που παρεμβάλλεται ανάμεσα στα γονίδια TRBV και TRBJ, εκτός από το γονίδιο TRBV30 το οποίο ανασυνδυάζεται με αναστροφή (inversion), επειδή έχει αντίστροφη πολικότητα σε σχέση με τα γονίδια TRBJ-TRBC. Επίσης ένα γονίδιο TRBV περιλαμβάνει ρυθμιστικές αλληλουχίες και μια αλληλουχία-οδηγό (leader sequence) στο 5 άκρο της, ενώ στο 3 άκρο περιλαμβάνει την αλληλουχία-σήμα του ανασυνδυασμού (recombination signal sequence, RSS). Οι RSS αποτελούνται από ένα καλά διατηρημένο παλίνδρομο επτανουκλεοτίδιο (heptamer) (5 -CACTGTG-3 ), ένα καλά διατηρημένο εννεανουκλεοτίδιο (nonamer) (5 -ACAAAAACC-3 ), πλούσιο σε Α ή Τ και ανάμεσα τους μια διαστηματική αλληλουχία (spacer region) μήκους 12 ή 23 νουκλεοτιδίων με διατηρημένο μήκος αλλά χωρίς συντηρημένη αλληλουχία. Στις ρυθμιστικές αλληλουχίες περιλαμβάνεται η αλληλουχία ΤΑΤΑ (ΤΑΤΑ box) πλούσια σε αδενίνη και θυμίνη. Η αλληλουχία-σήμα του ανασυνδυασμού (RSS) στο 3 άκρο κάθε γονιδίου TRBV αποτελείται από ένα 7μερές κι ένα 9μερές που χωρίζονται από μια διαστηματική περιοχή (spacer) μήκους 12 bp. Σύμφωνα με τον κανόνα 12-23, ένα γονίδιο μπορεί να συνδεθεί μόνο με ένα άλλο γονίδιο που έχει ~ 20 ~

23 RSS με spacer 23 bp. Έτσι διασφαλίζεται η σύνδεση των γονιδίων TRBV μόνο με τα γονίδια TRBJ και όχι με τις σταθερές περιοχές TRBC.(10 13) (Εικόνα 2) Όπως προαναφέρθηκε, αναδιατάξεις μεταξύ των V(D)J γονιδίων προσδίδουν στον TR ετερογένεια και ειδικότητα για τα αντιγόνα. Το σημείο πρόσδεσης του αντιγόνου είναι οι υπερμεταβλητές περιοχές οι οποίες καθορίζουν την εξειδίκευση του υποδοχέα και γι αυτό καλούνται περιοχές καθορισμού της συμπληρωματικότητας (complementarity determining regions, CDRs: CDR1, CDR2, CDR3). Οι δομές αυτές αναγνωρίζουν πεπτιδικά αντιγόνα και οι αλληλουχίες των μοναδικών αντιγονοειδικών περιοχών (συγκεκριμένα, της περιοχής CDR3) μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως μοριακοί δείκτες των λεμφοκυτταρικών κλώνων. (14,15) Εικόνα 2: Σχηματική απεικόνιση του κανόνα Ανασυνδυασμός γίνεται μόνο μεταξύ ενός γονιδίου, του οποίου η RSS έχει spacer μήκους 12 bp με ένα γονίδιο με spacer μήκους 23 bp. ~ 21 ~

24 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΤΗΣ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ Κύριο χαρακτηριστικό του ανοσοποιητικού συστήματος των σπονδυλωτών είναι η ικανότητα αναγνώρισης εκατομμυρίων διαφορετικών παθογόνων μέσω των αντιγονοειδικών υποδοχέων των Τ λεμφοκυττάρων. Για τη δημιουργία αυτής της τεράστιας ποικιλότητας υπεύθυνοι είναι τρεις ειδικοί μηχανισμοί: 1.Συνδυαστική ποικιλότητα 2.Ανασυνδυασμός V(D)J 3.Συνδετική ποικιλότητα Συνδυαστική ποικιλότητα και ανασυνδυασμός V(D)J Τα Τ λεμφοκύτταρα αναπτύσσονται από αρχέγονα μητρικά κύτταρα του μυελού των οστών. Ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση τους συμβαίνει στο θύμο αδένα κατά την πρώιμη φάση της οντογένεσης των Τ λεμφοκυττάρων και περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια κατά ιεραρχική σειρά: 1. πρώτα συμβαίνουν αναδιατάξεις των β, γ, και δ γονιδίων. Τα κύτταρα στα οποία συμβαίνουν επιτυχημένες αναδιατάξεις των γ και δ γονιδίων, παράγουν ένα λειτουργικό γδ υποδοχέα μέσω του οποίου μεταβιβάζονται σήματα για την περαιτέρω ανάπτυξη και διαφοροποίησή του προς την γδ σειρά. 2. σε θυμοκύτταρα στα οποία έχει συμβεί παραγωγική αναδιάταξη των γονιδίων της β αλυσίδας, η β αλυσίδα συνδέεται μ ένα υποκατάστατο πεπτίδιο της α αλυσίδας (ptα). Αυτά τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται γρήγορα, εκφράζουν CD4 και CD8 κι έπειτα αναδιατάσσουν τα γονίδια της α αλυσίδας. ~ 22 ~

25 Τα γονίδια της β αλυσίδας ανασυνδυάζονται πρώτα. Αρχικά ανασυνδυάζεται ένα γονίδιο D (TRBD) μ ένα γονίδιο J (TRBJ) και, στη συνέχεια, ένα γονίδιο V ανασυνδυάζεται με το σύμπλοκο DJ. Ακολουθεί μεταγραφή του γενετικού συμπλόκου TR VDJ, επεξεργασία και συρραφή του προ-mrna (RNA splicing), μετάφραση του ώριμου mrna σε πολυπεπτιδική αλυσίδα στα ριβοσωμάτια και μετα-μεταφραστική τροποποίηση των αντίστοιχων πεπτιδίων (κυρίως με γλυκοζυλίωση στο ενδοπλασματικό δίκτυο). Kάθε γονίδιο V φέρει στο 5 άκρο του ένα μικρό εξόνιο, την αλληλουχία-οδηγό (leader). Αυτό συνθέτει ένα μικρό πεπτίδιο-οδηγό ή πεπτίδιο-σήμα (signal ή leader L peptide). Το πεπτίδιο-οδηγός τελικά αφαιρείται από μια πεπτιδάση μετά την είσοδο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας στο ενδοπλασματικό δίκτυο. (10 12,16)(Εικόνα 3) Εικόνα 3: Σχηματική απεικόνιση της σύνθεσης της β και α αλυσίδας του Τ κυτταρικού υποδοχέα. (Προσαρμογή από IMGT Web resources; Τελικά, με την έκφραση ενός λειτουργικού αβ TR υποδοχέα ικανού ν αναγνωρίζει MHC μόρια, το θυμοκύτταρο είναι έτοιμο να υποβληθεί σε επιλογή. ~ 23 ~

26 Συνδετική ποικιλότητα Σε κάθε αναδιάταξη η περιοχή CDR3 περιλαμβάνει τη συμβολή των γονιδίων V(D)J. Όμως οι διαφορετικές αμινοξικές αλληλουχίες των περιοχών CDR3 είναι περισσότερες από αυτές που μπορεί να κωδικοποιηθούν από τα τμήματα V, J και D της γαμετικής σειράς. Οι μηχανισμοί δημιουργίας της συνδετικής ποικιλότητας (ποικιλότητα στο σημείο συμβολής των γονιδιακών τμημάτων V(D)J) οφείλονται κυρίως στην προσθαφαίρεση νουκλεοτιδίων στις συμβολές των αναδιατασσόμενων γονιδίων μέσω των παρακάτω μηχανισμών: 1. ενεργοποίηση της καταλυτικής δράσης του συμπλόκου DNA-PKcs, το οποίο φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Artemis. Η πρωτεΐνη Artemis εντοπίζει τη δομή φουρκέτας στα κωδικοποιητικά άκρα και πραγματοποιεί εκτομή σ ένα από τα συμμετέχοντα νουκλεοτίδια. Αν η εκτομή δεν γίνει στην κορυφή της φουρκέτας θα προκύψουν παλίνδρομα νουκλεοτίδια, γνωστά ως P νουκλεοτίδια (palindromic nucleotides). 2. καταλυτική δράση του ενζύμου τελική δεοξυνουκλεοτιδική τρανσφεράση (Tdt). Το ένζυμο αυτό καταλύει την προσθήκη νουκλεοτιδίων σε μονόκλωνες αλυσίδες χωρίς ν απαιτεί την παρουσία εκμαγείου. Tα νουκλεοτίδια που προστίθενται από την Tdt είναι γνωστά ως Ν νουκλεοτίδια (non-templated nucleotides). 3. δράση άλλων ενζύμων και συγκεκριμένα εξω-νουκλεασών οι οποίες αφαιρούν νουκλεοτίδια πριν την ένωση των γονιδιακών τμημάτων. (11,17,18) Οι γονιδιακές αναδιατάξεις των αντιγονικών υποδοχέων εξαιτίας των παραπάνω μηχανισμών είναι χαρακτηριστικές και μοναδικές των ξεχωριστών κλώνων λεμφοκυττάρων. Χάρη στη μοναδικότητά τους, αποτελούν ένα είδος «μοριακής ταυτότητας» των κλώνων. (14,19,20) ~ 24 ~

27 ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Τα Τ λεμφοκύτταρα αναπτύσσονται από αρχέγονα, αιμοποιητικά, πολυδύναμα κύτταρα τα οποία μεταναστεύουν από το μυελό των οστών στο θύμο αδένα, όπου διαφοροποιούνται και ωριμάζουν. Τα διαδοχικά στάδια ωρίμανσης των Τ λεμφοκυττάρων διακρίνονται με βάση την έκφραση διαφορετικών μεμβρανικών πρωτεϊνών, χαρακτηριστικών για κάθε στάδιο, γνωστών ως δείκτες επιφανείας (CD4, CD8 κ.α.). Η ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων διακρίνεται σε δύο φάσεις: 1. ανεξάρτητη από το αντιγόνο, που εξελίσσεται στο θύμο αδένα 2. εξαρτώμενη από το αντιγόνο, που διαδραματίζεται στα δευτερογενή λεμφικά όργανα. (21 26) Φάση διαφοροποίησης ανεξάρτητη από το αντιγόνο Η ανεξάρτητη από το αντιγόνο διαφοροποίηση των Τ λεμφοκυττάρων συμβαίνει στο θύμο αδένα και είναι πολυσταδιακή διαδικασία η οποία ολοκληρώνεται με ιεραρχική σειρά και σκοπό έχει τη δημιουργία ώριμων, «παρθένων» Τ λεμφοκυττάρων (naive, virgin Τ cells). Τα προγονικά, ανώριμα Τ λεμφοκύτταρα εισέρχονται στο φλοιό του θύμου, όπου αρχίζει ο ανασυνδυασμός των γονιδίων του T κυτταρικού υποδοχέα (προ-τ-λεμφοκύτταρα). Όπως προαναφέρθηκε, κάθε κύτταρο φέρει στο γονιδίωμα του αλληλόμορφα για τους γενετικούς τόπους της δ, γ, β και α αλυσίδας του Τ κυτταρικού υποδοχέα. Ωστόσο κάθε Τ λεμφοκύτταρο εκφράζει μόνο έναν λειτουργικό Τ κυτταρικό υποδοχέα. Το φαινόμενο αυτό καλείται αποκλεισμός αλληλομόρφου (allelic exclusion), ρυθμίζεται στο επίπεδο του ανασυνδυασμού και της έκφρασης των γονιδίων του Τ κυτταρικού υποδοχέα και είναι σημαντικό για τη ρύθμιση της άνοσης απάντησης. Η παραπάνω διαδικασία ~ 25 ~

28 επιτυγχάνεται με την παύση των περαιτέρω ανασυνδυασμών, μόλις εκφραστεί λειτουργικός αντιγονικός υποδοχέας στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων. Σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της διαφοροποίησης και ωρίμανσης των Τ λεμφοκυττάρων παίζει το μικροπεριβάλλον του θύμου αδένα. Σε όλα τα στάδια της διαφοροποίησης τους στο θύμο, τα Τ λεμφοκύτταρα έρχονται σε στενή επαφή με τα κύτταρα του στρώματος του θύμου (συνδετικός ιστός, φλοιώδες και μυελικό επιθήλιο) αλλά και διαπλεκόμενα δενδριτικά κύτταρα που παίζουν το ρόλο αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων. (21,22,25,27) Τα στρωματικά κύτταρα του θύμου ΟP9 εκφράζουν το δείκτη Delta-like 1, ο οποίος είναι ο προσδέτης για τον Notch υποδοχέα. Η ενεργοποίηση της σηματοδότησης μέσω του Notch1 υποδοχέα είναι σημαντική για την διαφοροποίηση των "παρθένων" σε ώριμα Τ λεμφοκύτταρα. Η διαδικασία διαφοροποίησης των Τ λεμφοκυττάρων διακρίνεται σε στάδια ανάλογα με την έκφραση των δεικτών επιφανείας CD44 (υποδοχέας υαλουρονικού οξέος ο οποίος συμμετέχει στην ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων, στην αιμοποίηση και στη μετάσταση των όγκων) και CD25 (α αλυσίδα του υποδοχέα της IL-2) στην κυτταρική μεμβράνη των CD4-CD8- (Double Negative) θυμοκυττάρων. Ανάλογα με την έκφραση των δεικτών επιφάνειας, τα Τ λεμφοκύτταρα διακρίνονται σε υποσύνολα χαρακτηριστικά για τα διάφορα στάδια διαφοροποίησης τους. Το υποσύνολο DN1 περιλαμβάνει κύτταρα με χαρακτηριστικά CD44+CD25-. Οι αναδιατάξεις των γονιδίων του Τ κυτταρικού υποδοχέα γίνονται ιεραρχικά. Αναδιατάξεις αρχίζουν στα γονίδια που κωδικοποιούν την δ και γ αλυσίδα του Τ κυτταρικού υποδοχέα σε κύτταρα με χαρακτηριστικά CD44+ CD25+ (DN2) και ολοκληρώνεται στα κύτταρα με χαρακτηριστικά CD44- CD25+ (DN3), τα οποία διαφοροποιούνται στην Τ λεμφική σειρά. Εάν και οι δύο αναδιατάξεις είναι επιτυχημένες και συντεθεί γ και δ αλυσίδα, τότε το κύτταρο θα εκφράσει λειτουργικό TRγδ στην κυτταρική επιφάνεια και θα αναστείλει τις περαιτέρω αναδιατάξεις των γονιδίων που κωδικοποιούν την β και α αλυσίδα (αποκλεισμός αλληλομόρφου). Σε διαφορετική περίπτωση, το κύτταρο προχωρεί στην αναδιάταξη ~ 26 ~

29 των γονιδίων της β αλυσίδας. Η επιτυχημένη αναδιάταξη των γονιδίων της β αλυσίδας επάγει την έκφραση του προ-tr (pre-tr) και την περαιτέρω διαφοροποίηση των DN3 σε CD4+CD8+ (Double Positive) θυμοκύτταρα. Προκειμένου να ολοκληρωθεί η διαφοροποίηση του Τ λεμφοκυττάρου συμβαίνει αναδιάταξη των γονιδίων που κωδικοποιούν την α αλυσίδα του Τ κυτταρικού υποδοχέα. Τελικά, τα Τ κύτταρα εκφράζουν έναν λειτουργικό αβ Τ κυτταρικό υποδοχέα και υπόκεινται σε θετική ή αρνητική επιλογή. (5,21,25 27)(Εικόνα 4) Εικόνα 4: Διαφορική έκφραση επιφανειακών δεικτών σηματοδοτεί τα διαφορετικά στάδια διαφοροποίησης των Τ λεμφοκυττάρων. Συντομογραφίες: DN: Double Negative, DP: Double Positive, SP: Single Positive. ~ 27 ~

30 Τ λεμφοκύτταρα τα οποία κατά την ανάπτυξή τους στο θύμο παρουσιάζουν υποδοχείς με δυνητικά επικίνδυνη ειδικότητα (π.χ. έντονη αυτοαντιδραστικότητα) εξαλείφονται με κυτταρικό θάνατο στα πλαίσια διεργασιών επιλογής των Τ λεμφοκυτταρικών κλώνων. Οι τύποι επιλογής των Τ λεμφοκυττάρων είναι δυο: 1. θετική επιλογή, που εξασφαλίζει ότι όλα τα ώριμα Τ λεμφοκύτταρα είναι ικανά ν αναγνωρίζουν τα μόρια του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC-major histocompatibility complex) του οργανισμού και 2. αρνητική επιλογή, κατά την οποία εξαλείφονται τα Τ αυτοαντιδραστικά Τ λεμφοκύτταρα εξασφαλίζοντας έτσι την ανοχή έναντι των αυτοαντιγόνων. Η θετική και η αρνητική επιλογή των Τ λεμφοκυττάρων είναι γνωστές ως κεντρική ανοχή (central self-tolerance). Επιπρόσθετοι ειδικοί ρυθμιστικοί μηχανισμοί γνωστοί ως περιφερική ανοχή (peripheral self-tolerance) μπορεί να ενεργοποιηθούν από συγκεκριμένες υποομάδες Τ λεμφοκυττάρων (Τ ρυθμιστικά λεμφοκύτταρα) όταν κάποιο από τα αυτοαντιδραστικά κύτταρα διαφύγει από τους μηχανισμούς της αρνητικής επιλογής.(21,23) Φάση διαφοροποίησης εξαρτώμενη από το αντιγόνο Τα παρθένα Τ λεμφοκύτταρα που έρχονται σ επαφή με το αντιγόνο σταματούν να μεταναστεύουν και πολλαπλασιάζονται στα δευτερογενή λεμφικά όργανα. Μετά την ενεργοποίηση του Τ λεμφοκυττάρου, ξεκινά η διαίρεσή του: τελικά από το αρχικό Τ λεμφοκύτταρο δημιουργείται ένας κλώνος περίπου 1000 θυγατρικών κυττάρων πανομοιότυπης ειδικότητας (κλωνική έκπτυξη, clonal expansion). Τα κύτταρα αυτά στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε δραστικά, ικανά να καταστρέψουν τα μολυσμένα κύτταρα ή να ενεργοποιήσουν άλλα κύτταρα του ανοσολογικού συστήματος. ~ 28 ~

31 Μερικά από τα αντιγόνο-ειδικά κύτταρα που αναπτύσσονται από την κλωνική έκπτυξη των παρθένων Τ λεμφοκυττάρων, γνωστά ως μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα (memory T cells), παραμένουν και μετά την απομάκρυνση του αντιγόνου εξασφαλίζοντας ταχεία και αποτελεσματική απόκριση σε δεύτερη συνάντηση με το ίδιο παθογόνο.(28,29) ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΟ ΘΥΜΟ ΑΔΕΝΑ Αφού εκφραστούν στη κυτταρική επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων τα μόρια TR, CD4 και CD8, θα ακολουθήσει η επιλογή εκείνων των κυττάρων που θ αποτελέσουν το ρεπερτόριο των ώριμων Τ λεμφοκυττάρων στην περιφέρεια. Τα Τ λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν μόνο πεπτιδικά αντιγόνα τα οποία παρουσιάζονται από τα MHC μόρια της επιφανείας των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων. Τα MHC μόρια είναι μεμβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες διακρίνονται σε δύο τάξεις, I (MHC I) και II (MHC II): 1.Τα MHC μόρια τάξης Ι μεσολαβούν στην παρουσίαση αντιγονικών πεπτιδίων στα CD8 Τ λεμφοκύτταρα. 2.Τα MHC μόρια τάξης ΙΙ μεσολαβούν στην παρουσίαση αντιγονικών πεπτιδίων στα CD4 Τ λεμφοκύτταρα. Η σύνδεση TR-MHC διευκολύνει την ωρίμανση, επιβίωση, διαφοροποίηση ή το θάνατο των Τ-λεμφοκυττάρων. Έτσι, η επιλογή των αβ CD4 + CD8 + Τ-λεμφοκυττάρων στο θύμο υποδιαρείται σε δύο φάσεις, γνωστές ως θετική επιλογή (positive selection) και αρνητική επιλογή (negative selection).(30) ~ 29 ~

32 ΥΠΟΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ CD4+ Τ λεμφοκύτταρα Τα Τ βοηθητικά κύτταρα (Τhelper cells) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. Συμμετέχουν στην ενεργοποίηση των Β λεμφοκυττάρων και την ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των κυτταροτοξικών CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Εκφράζουν το δείκτη επιφανείας CD4 παράλληλα με το σύμπλοκο TR/CD3. Τα CD4 Τ λεμφοκύτταρα διακρίνονται σε τέσσερα υποσύνολα: Th1, Th2, Th17 και Treg, τα οποία επιτελούν διαφορετικές λειτουργίες και ελέγχονται από διαφορετικούς μεταγραφικούς παράγοντες. (31,32) Πιο συγκεκριμένα: 1. Τα Th1 κύτταρα συμμετέχουν στις άνοσες απαντήσεις εναντίον ενδοκυττάριων παθογόνων κι επάγουν την εκδήλωση κάποιων αυτοάνοσων ασθενειών. Παράγουν IFNγ, λεμφοτοξίνη α (LΤα) και IL Τα Th2 κύτταρα αναγνωρίζουν εξωκυττάρια παράσιτα και συμμετέχουν σε αλλεργικές αντιδράσεις και στο άσθμα. Παράγουν IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13 και IL- 25. (33,34) 3. Ο υποπληθυσμός Th17 χαρακτηρίζεται από παραγωγή IL-17, IL-21 και IL-22. Σχετίζεται με αυτοάνοση ιστική βλάβη π.χ. ρευματοειδή αρθρίτιδα και ειδικές αλλεργικές αντιδράσεις. Ο TGF-β (Τransforming Growth Factor- β) και οι ιντερλευκίνες IL-23 και IL-17 αποτελούν τους κύριους παράγοντες που οδηγούν στην παραγωγή νέων δραστικών Th17 κυττάρων. (35,36) 4. Τα Τregs καταστέλουν την ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος και βοηθούν στην ομοιόσταση της άνοσης απάντησης καθώς και στην ανοχή σε αυτοαντιγόνα. Διακρίνονται στα φυσικώς παραγόμενα Τregs (natural Treg, ntreg), που απαιτούν άμεση κυτταρική επαφή προκειμένου να δράσουν, και στα ~ 30 ~

33 επαγόμενα Τregs (induced Treg, itreg), τα οποία με τη βοήθεια των κυτταροκινών επάγουν την καταστολή. (37) CD8+ Τ λεμφοκύτταρα Τα Τ κυτταροτοξικά κύτταρα (Τc cells) έχουν κυτταροτοξική και φαγοκυτταρική δράση εναντίον ιών και άλλων παθογόνων μικροοργανισμών κι επάγουν το θάνατο των μολυσμένων σωματικών κυττάρων ή των νεοπλασματικών κυττάρων. Τα υψηλά επίπεδα IFN-γ, η οποία εκκρίνεται από τα CD8 Τ λεμφοκύτταρα εμποδίζει την αντιγραφή των ιών, προκαλεί αυξημένη έκφραση των μορίων MHC τάξης Ι και ενεργοποιεί τα μακροφάγα. (38) ~ 31 ~

34 ΛΕΜΦΟΫΠΕΡΠΛΑΣΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ Οι λεμφοϋπερπλασίες CD3 + CD8 + CD57 + μεγάλων Τ λεμφοκυττάρων με κοκκία (T-LGL) μπορεί να είναι είτε ιδιοπαθείς είτε να αναπτύσσονται στο πλαίσιο ιογενών λοιμώξεων, αυτοάνοσων διαταραχών, μετά μεταμόσχευση οργάνων ή μεταμόσχευση αλλογενών αιμοποιητικών κυττάρων, καθώς επίσης και σε ασθενείς μετά τη λήψη anti-cd20 μονοκλωνικού αντισώματος για τη θεραπεία Β λεμφώματος. (39 47) Διακρίνονται σε αντιδραστικές και μονοκλωνικές, παροδικές (<6 μηνών) και χρόνιες (>6 μηνών). (48 51) Υπάρχει σημαντική επικάλυψη ως προς το φάσμα των κλινικών εκδηλώσεων και των εργαστηριακών ευρημάτων μεταξύ των μονοκλωνικών (όπως η T-LGL λευχαιμία) και των αντιδραστικών λεμφοϋπερπλασιών από κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα που, όπως προαναφέρθηκε, συνυπάρχουν με διάφορες κλινικές καταστάσεις. Ιδιαίτερη υποκατηγορία των χρόνιων λεμφοϋπερπλασιών των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων, είναι η λευχαιμία από μεγάλα κοκκιώδη Τ λεμφοκύτταρα (T-LGL λευχαιμία). Η LGL λευχαιμία διακρίνεται στην CD3+ LGL λευχαιμία, στην οποία τα κύτταρα εκφράζουν και ανασυνδυάζουν τα γονίδια του Τ κυτταρικού υποδοχέα, και στην CD3- (ΝΚ)-LGL λευχαιμία όπου τα νεοπλασματικά κύτταρα δεν φέρουν κλωνική αναδιάταξη των γονιδίων του Τ κυτταρικού υποδοχέα, ενώ εκφράζουν το δείκτη CD56. H T-LGL λευχαιμία με φαινότυπο CD8 + CD4 - οφείλεται σε έκπτυξη κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων τα οποία υπόκεινται σε έντονη αντιγονική διέγερση και χαρακτηρίζονται από διαταραχές στο μηχανισμό της απόπτωσης.(52) Η T-LGL λευχαιμία εκδηλώνεται σε μεγάλο εύρος ηλικιών (από 4 έως 88 έτη) με μέση ηλικία τα 55 έτη, προσβάλλει εξίσου τα δύο φύλα και έχει ήπια κλινική πορεία. Η κλινική εικόνα περιλαμβάνει σπληνομεγαλία, ηπατομεγαλία, σπάνια διηθήσεις του δέρματος και λεμφαδενοπάθεια. Το 1/3 των ασθενών εμφανίζει ρευματοειδή αρθρίτιδα, ενώ σε κάποιους ασθενείς συνυπάρχει αρθρίτιδα, σπληνομεγαλία και ~ 32 ~

35 ουδετεροπενία, κλινική κατάσταση γνωστή ως σύνδρομο Felty. (53,54) Η νόσος συνήθως έχει χρόνια πορεία και οι ασθενείς παραμένουν ασυμπτωματικοί για πάνω από 5 έτη με διάμεση επιβίωση που ανέρχεται στα 10 έτη. Τα αίτια που οδηγούν στην εκδήλωση της Τ-LGL λευχαιμίας παραμένουν υπο διευκρίνηση. Υπάρχουν ενδείξεις ότι χρόνια επίμονη αντιγονική διέγερση ή κάποια διαταραχή στο μηχανισμό της απόπτωσης των T-LGL κυττάρων π.χ λόγω μετάλλαξης στο γονίδιο STAT3 μπορεί να οδηγήσει στην εκδήλωση της νόσου. (49,54 60) Επιπλέον, υποστηρίζεται η υπόθεση ότι μια λοίμωξη από ρετροϊούς μπορεί να παίζει ρόλο στην εκδήλωση της νόσου, γεγονός που επιβεβαιώνεται από την ανεύρεση αντισωμάτων εναντίον πρωτεϊνών του ιού HTLV (Human T cell Lymphotropic Virus). (61,62) Απορρύθμιση κάποιων ενδοκυττάριων σηματοδοτικών μονοπατιών, π.χ. Fas/FasL, P13K και MAPK/ERK, σχετίζονται επίσης με την αντίσταση στην απόπτωση που εμφανίζουν τα λευχαιμικά LGL κύτταρα.(63) T-LGL λεμφοϋπερπλασίες και σύνδρομα μυελικής ανεπάρκειας: ποια είναι η ακριβής συσχέτιση; Οι T-LGL λεμφοϋπερπλασίες εμφανίζουν επικάλυψη με άλλα σύνδρομα μυελικής ανεπάρκειας (μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα, απλαστική αναιμία, παροξυσμική νυκτερινή αιμοσφαιρινουρία) στα οποία έχει επίσης αναφερθεί παρουσία αυτοάνοσων ολιγο/μονοκλωνικών πληθυσμών κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων. Οι κυτταροπενίες φαίνεται ότι εκδηλώνονται λόγω καταστροφής των αιμοποιητικών στελεχιαίων κυττάρων από τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα μέσω έκκρισης λεμφοκινών (π.χ. IFNα, ο ΤΝF και η IL2) ή/και αυξημένη καταστροφή τους στην περιφέρεια π.χ. με αυτοάνοσο μηχανισμό. (15,49,54,56,64,65) Χρόνια ιδιοπαθής ουδετεροπενία Στα σύνδρομα μυελικής ανεπάρκειας συγκαταλέγεται και η χρόνια ιδιοπαθής ουδετεροπενία (Chronic Idiopathic Neutropenia, CIN) η οποία είναι επίκτητη διαταραχή της κοκκιοποίησης που χαρακτηρίζεται από παρατεταμένη ουδετεροπενία, ήπια και ασυμπτωματική κλινική πορεία (66 68) και προσβάλλει ~ 33 ~

36 κυρίως γυναίκες μέσης ηλικίας με τύπο HLA-DRB1*1302.(69) Η ανεπάρκεια της αιμοποίησης στην CIN φαίνεται ότι οφείλεται κυρίως στην επαγόμενη μέσω της έκφρασης του αντιγόνου Fas απόπτωση των CD34+/CD33+ αιμοποιητικών προγονικών προβαθμίδων και δευτερογενώς στις αυξημένες συγκεντρώσεις προφλεγμονωδών και προ-αποπτωτικών κυτταροκινών μακροφαγικής στρωματικής προέλευσης στο μυελό των οστών. Ως κύριος παθογενετικός μηχανισμός αναφέρεται επίσης ο αυξημένος αριθμός διεγερμένων Τ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα και στον μυελό των οστών των ασθενών, υποστηρίζοντας αίτια παθογένεσης ανοσολογικής αρχής. (70 72) H CIN παρουσιάζει σημαντική κλινική αλληλοεπικάλυψη με άλλες διαταραχές που έχουν ως αποτέλεσμα την εκδήλωση ουδετεροπενίας και σχετίζονται με χρόνιες κλωνικές εκπτύξεις των CD8+ Τ λεμφοκυττάρων, π.χ. T-LGL λευχαιμία και το σύνδρομο Felty (FS), καθώς επίσης και σύνδρομα μυελικής ανεπάρκειας. Ωστόσο, ενώ οι μεταλλάξεις του γονιδίου STAT3 είναι ιδιαίτερα συχνές στην Τ-LGL λευχαιμία και το σύνδρομο Felty και λιγότερο συχνά αναφέρονται στα σύνδρομα μυελικής ανεπάρκειας, είναι ιδιαίτερα σπάνιες στη CIN, υποδηλώνοντας έτσι ένα διακριτό παθογενετικό μηχανισμό. (60,73,74) Προηγούμενες ανοσογενετικές μελέτες της ομάδας μας σε δείγματα ασθενών με CIN πρόσφεραν ενδείξεις επιλογής από αντιγόνο στη διαμόρφωση του ρεπερτορίου των Τ λεμφοκυττάρων. Ειδικότερα, αναλύσεις βασιζόμενες στη μεθοδολογία της κυτταρομετρίας ροής και κλασικής υποκλωνοποίησης και αλληλούχησης κατά Sanger αποκάλυψαν την ύπαρξη κλωνικών εκπτύξεων των Τ κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα και στο μυελό των ασθενών με CIN, με διακριτά πρότυπα κλωνικότητας μεταξύ των υποπληθυσμών των Τ λεμφοκυττάρων. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ολιγοκλωνικό / μονοκλωνικό πρότυπο στα CD8+κύτταρα, ενώ ο υποπληθυσμός των CD4+ κυττάρων εμφάνισε ένα πολυκλωνικό πρότυπο.(75) Επιπλέον, αναφέρθηκε έντονη επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου των γονιδίων της β αλυσίδας του Τ κυτταρικού υποδοχέα, υποδηλώνοντας επιλογή από περιορισμένο φάσμα αντιγονικών στοιχείων.(76) ~ 34 ~

37 Ωστόσο, λόγω των εγγενών περιορισμών της αλληλούχησης χαμηλής απόδοσης (κατά Sanger) δεν ήταν δυνατό να συναχθούν οριστικά συμπεράσματα. T-LGL λεμφοϋπερπλασίες και μεταμόσχευση αλλογενών αιμοποιητικών κυττάρων Οι T-LGL νεοπλασματικές λεμφοϋπερπλασίες πρέπει να διαφοροδιαγνωσθούν από αντιδραστικές καταστάσεις που σχετίζονται με υπερπλασία, παροδική ή μόνιμη, των «φυσιολογικών» CD8+ κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων. Οι καταστάσεις αυτές συνήθως συνυπάρχουν με αυτοάνοσες διαταραχές και, δυνητικά, μπορεί να δώσουν γένεση σε Τ-LGL λευχαιμία. Σε αυτό το πλαίσιο, είναι συχνή η έκπτυξη κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων μετά από μεταμόσχευση αλλογενών αιμοποιητικών κυττάρων (allo-hct), βασική θεραπευτική επιλογή σε αιματολογικές κακοήθειες, σύνδρομα ανεπάρκειας του μυελού και κληρονομικά νοσήματα, ιδίως του ανοσοποιητικού συστήματος. Η εμφάνιση πολυ- ή μονοκλωνικών εκπτύξεων T- LGL κυττάρων σε ασθενείς μετά από allo-hct μπορεί είτε να είναι ασυμπτωματική (77) είτε να συνοδεύεται από κυτταροπενίες και αυτοάνοσες εκδηλώσεις.(39) Η ισχυρή συσχέτιση με ιογενείς λοιμώξεις σε πολλές από αυτές τις περιπτώσεις εμπλέκει χρόνια αντιγονική διέγερση στην παθογένεση της οντότητας. Στην περίπτωση αυτή, η συνολική ανοσοκαταστολή των ασθενών μετά τη μεταμόσχευση φαίνεται να επιτρέπει την ανάπτυξη ενός Τ-LGL κλώνου, ο οποίος, κανονικά, θα βρισκόταν υπό τον έλεγχο του ανοσοποιητικού συστήματος.(39,40,78) Αυτού του είδους οι εκπτύξεις των αντιδραστικών Τ-LGL κυττάρων συνήθως είναι πολυκλωνικές. ~ 35 ~

38 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΡΕΠΕΡΤΟΡΙΟΥ ΤΟΥ Τ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΜΕ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗΣ ΕΠΟΜΕΝΗΣ ΓΕΝΙΑΣ (NEXT GENERATION SEQUENCING- NGS) Την τελευταία δεκαετία, η αλληλούχηση του DNA έχει σημειώσει τεράστια πρόοδο με την ανάπτυξη των αλληλουχητών νέας γενιάς (next generation sequencing, NGS). Με τη μεθοδολογία NGS είναι εφικτή η αλληλούχηση εκατομμυρίων μορίων DNA ταυτόχρονα, σε αντίθεση με τις μεθόδους της κλασικής υποκλωνοποίησης που εφαρμόζονταν ευρέως επί δύο δεκαετίες. Οι μέθοδοι NGS εφαρμόζονται τα τελευταία 5 χρόνια και στο πεδίο της ανοσογενετικής σε μελέτες ρεπερτορίου των γονιδίων IG/TR σε ευρύ φάσμα φυσιολογικών και παθολογικών καταστάσεων. Πολλές διαφορετικές μεθοδολογικές προσεγγίσεις NGS έχουν αναπτυχθεί με την εφαρμογή τεχνολογιών αλληλούχησης που χαρακτηρίζονται από διαφορετική ταχύτητα, ικανότητα επικάλυψης του στόχου και ανάλυση τμημάτων διαφορετικού μήκους. Η πλατφόρμα 454/Roche χρησιμοποιεί τεχνολογία Pyrosequencing, η οποία συνδυάζει την απλή προσθήκη νουκλεοτιδίων με ανίχνευση χημειοφωτάγειας σε προϊον PCR σε μορφή γαλακτώματος (Emulsion PCR). Έχει τη δυνατότητα ανάλυσης κλασμάτων DNA μεγέθους 700 bp με βάθος της τάξης των 150,000 διαβασμάτων σε κάθε πείραμα. Η πλατφόρμα Illumina/Solexa βασίζεται στην αλληλούχηση μέσω σύνθεσης με τη μεθοδολογία SBS (Sequence by Synthesis) και, στη συνέχεια, κλωνική επαύξηση του δείγματος (Bridge amplification). Έχει τη δυνατότητα ανάλυσης τμημάτων μεγέθους 600 bp με αντίστοιχο βάθος της τάξης εκατομμυρίων διαβασμάτων σε κάθε πείραμα. Τέλος, η τεχνολογία Ion Torrent/Life Technologies έχει τη δυνατότητα να αναλύσει ένα δισεκατομμύριο αλληλουχίες μήκους έως 200 bp ανά πείραμα. (79) ~ 36 ~

39 ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ NGS Μεγάλη επιστημονική πρόκληση αποτελεί η προτυποποίηση των διαδικασιών ανάλυσης των δεδομένων που προκύπτουν από την εφαρμογή των μεθοδολογιών NGS. Η διαχείριση αυτών των δεδομένων απαιτεί μεγάλες υπολογιστικές δυνατότητες καθώς ο όγκος και η πολυπλοκότητά τους υπερβαίνουν κατά πολλές τάξεις μεγέθους τα διαθέσιμα αποτελέσματα από αναλύσεις κλασικής υποκλωνοποίησης. Αναγκαία είναι επίσης και η δημιουργία αλγορίθμων για την αναγνώριση και επιδιόρθωση των λαθών που συστηματικά εισάγονται σε συγκεκριμένες θέσεις εξαιτίας της πειραματικής μεθοδολογίας αλλά ποικίλουν ανάλογα με την πειραματική πλατφόρμα. Τέτοια λάθη μπορεί να οφείλονται είτε στην αρχική προετοιμασία του δείγματος και της βιβλιοθήκης (PCR errors), είτε σε αυτή καθαυτή την αλληλούχηση (Sequencing errors). Η αναγνώριση των λαθών, αλλά και η επιδιόρθωσή τους συγκεντρώνει το μεγαλύτερο βιοπληροφορικό ενδιαφέρον ώστε να αποφευχθεί η εξαγωγή εσφαλμένων συμπερασμάτων. Για όλους αυτούς τους λόγους, απαιτείται η δημιουργία μιας προτυποποιημένης, ολοκληρωμένης βιοπληροφορικής διαδικασίας, ειδικά σχεδιασμένης για ανοσογενετικά δεδομένα επεξεργασμένα από το International immunogenetics system, IMGT, διεθνή βάση αναφοράς για την Ανοσογενετική. Η βιοπληροφορική προσέγγιση επίσης πρέπει να έχει ως σκοπό την ενσωμάτωση σε ένα διαθέσιμο βιοπληροφορικό πλαίσιο πρότυπων δομικών στοιχείων διαχείρισης και επεξεργασίας πληροφορίας ώστε να υποστηριχθεί η διεξαγωγή ανοσογενετικών αναλύσεων με χρήση αναφορών του IMGT. (80) ~ 37 ~

40

41 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ~ 39 ~

42

43 ΣΚΟΠΟΣ ΚΑΙ ΠΡΩΤΟΤΥΠΙΑ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Η μοριακή ανάλυση του ρεπερτορίου του Τ κυτταρικού υποδοχέα στη μελέτη αιματολογικών νοσημάτων με άνοση παθογένεια είναι πολύ διαδεδομένη, ιδίως στα πλαίσια της ανίχνευσης κλωνικότητας. Η έννοια της ολιγοκλωνικότητας στο πλαίσιο των κυτταρικών ανοσοαποκρίσεων βασίζεται στην παρουσία ανοσοκυρίαρχων (immunodominant) Τ κυτταρικών κλώνων στους υπό ανάλυση κυτταρικούς υποπληθυσμούς. Ιδιαίτερα για την αιματολογία, η μοριακή ανάλυση του ρεπερτορίου του Τ κυτταρικού υποδοχέα και η ανίχνευση του κυρίαρχου κλωνοτύπου μπορεί να εφαρμοστεί ως διαγνωστικό εργαλείο, προσφέροντας νέες προοπτικές έρευνας σε πλήθος αιματολογικών νοσημάτων. (81,82) Η έλευση των προηγμένων τεχνολογιών αλληλούχησης νέας γενιάς προσφέρει τέτοιο βάθος ανάλυσης ώστε μπορεί να οδηγήσει σε αναθεώρηση των αντιλήψεών μας σχετικά με την έννοια της κλωνικότητας και τη σύσταση των άνοσων ρεπερτορίων, υπερκεράζοντας τις εγγενείς αδυναμίες της αλληλούχησης κατά Sanger. Ωστόσο, οι σχετικές δημοσιευμένες μελέτες δεν απάντησαν οριστικά στις πειραματικές και βιοπληροφορικές προκλήσεις, υπογραμμίζοντας την επιτακτική ανάγκη μεθοδολογικών βελτιώσεων στην προαναλυτική, αναλυτική και μετααναλυτική διαδικασία. Η παρούσα μελέτη σκοπό έχει την κατανόηση της παθογένειας των T-LGL λεμφοϋπερπλασιών μέσω της ενδελεχούς μελέτης του ρεπερτορίου του Τ κυτταρικού υποδοχέα με τεχνολογία NGS. Με το σκεπτικό που αναπτύχθηκε στην προηγούμενη παράγραφο, η διατριβή επικεντρώθηκε επίσης και στην προτυποποίηση της πειραματικής διαδικασίας (in vitro) και την πρόταση βιοπληροφορικών αλγορίθμων (in silico) ειδικά σχεδιασμένων για ανοσογενετικά δεδομένα. Βασικός σκοπός του εγχειρήματος ήταν να διασφαλιστεί αξιοπιστία και επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων σε μελέτες του ρεπερτορίου των Τ λεμφοκυττάρων, με σημαντικές προεκτάσεις για τη μελέτη μεγάλου εύρους παθολογικών καταστάσεων και νέες προοπτικές στην ανοσογενετική ανάλυση. ~ 41 ~

44 1. ΠΡΟΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. in vitro ανάλυση Στις πειραματικές διαδικασίες που αφορούσαν την προτυποποίηση της πειραματικής μεθοδολογίας χρησιμοποιήθηκαν τα δείγματα τεσσάρων ασθενών με χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία, στους οποίους πραγματοποιήθηκε ενίσχυση των αναδιατάξεων της β αλυσίδας του TR. Επιπρόσθετα χρησιμοποιήθηκαν εσωτερικά controls τα οποία αφορούσαν: i) πολλαπλά δείγματα του ίδιου ασθενούς στο ίδιο χρονικό στιγμιότυπο (replicate samples). ii) πολλαπλές αντιδράσεις RT-PCR από το ίδιο δείγμα RNA (replicate PCRs). Πραγματοποιήθηκε λήψη αίματος και ακολούθησε απομόνωση: i) μονοπύρηνων κυττάρων ή ii) του υποπληθυσμού CD8+ T λεμφοκυττάρων με αρνητική επιλογή και χρήση κατάλληλων μονοκλωνικών αντισωμάτων. Η απομόνωση RNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δύο διαφορετικών πειραματικών τεχνικών: i) μέθοδος του 4Μ θειοκυανικού γουανιδινίου ii) κατάλληλες στήλες απομόνωσης RNA (QiAmp RNA blood mini kit, Qiagen) Χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το RNA πραγματοποιήθηκε σύνθεση cdna με τη μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής (reverse transcription, RT) χρησιμοποιώντας ως εκκινητές εξανουκλεοτίδια τυχαίας αλληλουχίας (random hexamers) και ~ 42 ~

45 διαφορετικές συγκεντρώσεις RNA ως υπόστρωμα. Ακολούθησε ενίσχυση αναδιατάξεων TRBV-TRBD-TRBJ σύμφωνα με το πρωτόκολλο Biomed-2. (83) Τα προϊόντα PCR που προέκυψαν από την ενίσχυση των αναδιατάξεων TRBV/TRBD/TRBJ υποβλήθηκαν σε καθαρισμό με δύο διαφορετικά πρωτόκολλα (PureLink PCR Purification Kit, Invitrogen και QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen). Τα «καθαρισμένα» προϊόντα PCR χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα για την δημιουργία βιβλιοθήκης NGS με πρωτόκολλο συμβατό με την πλατφόρμα Illumina / Solexa. Εφαρμόστηκαν τρία διαφορετικά πρωτόκολλα προετοιμασίας της βιβλιοθήκης συμβατά με την πλατφόρμα της Illumina. 1. Illumina (TruSeq DNA LT (FC )(84) 2. Kapa Biosystems, Kapa HTP library preparation kit, Illumina Platforms, KRO426-v4.15 (85) 3. NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (#E7370, New England Biolabs)(86) (Εικόνα 5) Εικόνα 5: Σχηματική απεικόνιση διαφορετικών πειραματικών προσεγγίσεων ανά στάδιο δημιουργίας της βιβλιοθήκης. Πραγματοποιήθηκε εφαρμογή και συγκριτική ανάλυση όλων των παραπάνω διαδικασίων προκειμένου να επιλεγούν αυτά που εξασφαλίζουν τη βέλτιστη ποιότητα της βιβλιοθήκης. ~ 43 ~

46 Τα παραπάνω πρωτόκολλα προετοιμασίας της βιβλιοθήλης ακολουθούν τα ίδια βήματα. Ως αρχικό υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκαν κλάσματα DNA (προϊόντα PCR ή fragmented DNA ). Η διαδικασία περιλαμβάνει ενζυμική επιδιόρθωση των άκρων των τμημάτων, πρόσθεση Α-ουράς, ενζυμική προσθήκη των adaptors και των αλληλουχιών που χρησιμοποιούνται για την διάκριση των δειγμάτων (indexes) και τελική ενίσχυση όλων των κλασμάτων που φέρουν στα άκρα τους adaptorsindexes. Οι διαφορές των παραπάνω πρωτοκόλλων αφορούν στις εξής παραμέτρους: 1. συγκέντρωση του αρχικού υποστρώματος για τη δημιουργία της βιβλιοθήκης NGS Τα πρωτόκολλα της Kapa Biosystems και της NEB απαιτούν μικρή συγκέντρωση δείγματος (10 ng- 5μg) σε αντίθεση με το πρωτόκολλο της Illumina (1μg). 2. δομή των adaptors Tα πρωτόκολλα της Illumina και της Kapa Biosystems χρησιμοποιούν ως adaptors δίκλωνα κλάσματα DNA σε αντίθεση με το πρωτόκολλο της ΝΕΒ, το οποίο χρησιμοποιεί adaptors με δομή φουρκέτας, επιτυγχάνοντας έτσι πιο αποτελεσματική πρόσδεσή τους στο αρχικό υπόστρωμα. 3. ποσότητα μαγνητικών σφαιριδίων (beads) Τα μαγνητικά σφαιρίδια χρησιμοποιούνται για τον καθαρισμό των προϊόντων που προκύπτουν από τα ενδιάμεσα στάδια επεξεργασίας του δείγματος και σκοπό έχουν την απομάκρυνση τμημάτων DNA μη ειδικού μεγέθους. Τα πρωτόκολλα της Kapa Biosystems και της NEB προτείνουν οι ποσότητες των μαγνητικών σφαιριδίων αλλά και των adaptors να είναι ανάλογες της συγκέντρωσης αλλά και του αρχικού μήκους του υποστρώματος, σε αντίθεση με το πρωτόκολλο της Illumina το οποίο χρησιμοποιεί συγκεκριμένες ποσότητες των παραπάνω αντιδραστηρίων ανεξαρτήτως μήκους αλλά και συγκέντρωσης υποστρώματος. ~ 44 ~

47 Για την τελική επικύρωση των βιβλιοθηκών εφαρμόστηκαν δύο διαφορετικά ανεξάρτητα πρωτόκολλα: i) φωτομέτρηση με Qubit και απεικόνιση της βιβλιοθήκης με bioanalyzer ii) Real time PCR (KAPA SYBR FAST Universal qpcr Kit, KAPABIOSYSTEMS) Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις ενός βακτηριοφάγου, γνωστής αλληλουχίας (phix) που χρησιμοποιείται για να αυξήσει την ποικιλότητα της βιβλιοθήκης αλλά και ως αλληλουχία αναφοράς προκειμένου να εξαχθούν συμπεράσματα για την ποιότητα των αλληλουχιών. Η τελική συγκέντρωση της βιβλιοθήκης που χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα πειράματα αλληλούχησης ήταν 2nΜ. Προκειμένου να διερευνήσουμε κατά πόσο μπορεί να επηρεάσει το ρεπερτόριο του Τ κυτταρικού υποδοχέα η αρχική ποσότητα των κυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν πολλαπλά δείγματα του ίδιου ασθενούς τα οποία περιείχαν από 5 εκ. έως και 18 εκ. κύτταρα, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την αρχική εκχύλιση του RNA και διαφορετικές συγκεντρώσεις RNA για τη σύνθεση του cdna (από 1 έως 5,8 μg RNA). 2. In silico (βιοπληροφορική ανάλυση) Η βιοπληροφορική ανάλυση ανοσογενετικών δεδομένων που προκύπτουν από την εφαρμογή μεθόδων αλληλούχησης μεγάλης κλίμακας πρέπει να περιλαμβάνει: (i) ποιοτικά φίλτρα, με βάση τα οποία αλληλουχίες σε μορφή fastaq με συνολικά πολύ χαμηλή ποιότητα καθώς επίσης και αλληλουχίες που είναι μόνο μια φορά διαβασμένες να απορρίπτονται από τον αλγόριθμο. (ii) σύνθεση των paired-end αλληλουχιών: τα δύο fastq αρχεία που προκύπτουν μετά το πέρας της διαδικασίας της αλληλούχησης πρέπει να συνεννώνονται έτσι ώστε να προκύψει μια «συμβολοσειρά» για την κάθε αλληλουχία. Σε αυτό το στάδιο αναπτύχθηκε ειδικός αλγόριθμος που επιτυγχάνει τη συνένωση των αλληλουχιών χωρίς αλληλουχία αναφοράς και ολοκληρώνει το φιλτράρισμα και τη ~ 45 ~

48 διόρθωση των αλληλουχιών με βάση τα πιθανά λάθη και την ποιότητα του κάθε νουκλεοτιδίου. (iii) προετοιμασία των συντεθειμένων αλληλουχιών για το εργαλείο IMGT/HighV- QUEST, προκειμένου να γίνει η αναγνώριση των γονιδίων και των αναδιατάξεων. Το αρχείο εξόδου φιλτράρεται περαιτέρω προκειμένου να διατηρηθούν οι αλληλουχίες με τις εξής ιδιότητες: 1. αναγνωρίζονται τα V-D-J γονιδία και η CDR3 αμινοξική αλληλουχία, 2. είναι παραγωγικές: δηλαδή η κωδικοποιητική περιοχή δεν περιέχει κωδικόνια τερματισμού (stop codons) και το CDR3 είναι εντός πλαισίου ανάγνωσης (in-frame junction). (iv) ομαδοποίηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων, η οποία περιλαμβάνει την ανεύρεση των αναδιατάξεων με το ίδιο TRBV γονίδιο και ταυτόσημη αμινοξική αλληλουχία στην περιοχή CDR3 (κλωνότυπος), την ανάλυση του ρεπερτορίου TRBV/ TRBJ γονιδίων με βάση τους κλωνοτύπους, τη σύγκριση αποτελεσμάτων μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων και την ανεύρεση κλωνοτύπων κοινών μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων (δημόσιοι κλωνότυποι) (87) Σε αυτό το στάδιο επίσης αξιολογήθηκαν εργαλεία που αναπτύχθηκαν από τη συνεργαζόμενη ομάδα βιοπληροφορικής του ΙΝΕΒ ΕΚΕΤΑ και του Εργαστηρίου Ιατρικής Πληροφορικής του ΑΠΘ και σκοπό είχαν τη σύγκριση δεδομένων που προέκυψαν από την εφαρμογή της κλασικής υποκλωνοποίησης και αλληλούχησης κατά Sanger και από τις μεθόδους αλληλούχησης NGS. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε και συγκριτική ανάλυση του ίδιου συνόλου αλληλουχίων που προκύπτει από την παραπάνω ανάλυση έναντι των διαθέσιμων εργαλείων Decombinator (88) και MiTCR, τα οποία αναλύουν επίσης ανοσογενετικά δεδομένα. (89) ~ 46 ~

49 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Αποτελέσματα της ερευνητικής δραστηριότητας για προτυποποίηση της μεθόδουngs ανάλυσης Κατά τη διάρκεια του ελέγχου των προϊόντων της τελικής βιβλιοθήκης παρατηρήθηκαν διαφορές ως προς το μέγεθος αλλά και την ύπαρξη μη ειδικών κλασμάτων, ανάλογα με το πρωτόκολλο καθαρισμού που εφαρμόστηκε. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιώντας το gel extraction kit, το μέγεθος του PCR προϊόντος είναι καλά καθορισμένo (εικ.6α). Το μειονέκτημα αυτού του πρωτοκόλλου είναι το γεγονός ότι η τελική συγκέντρωση του προϊόντος είναι μικρή. Χρησιμοποιώντας το PCR purification kit η τελική συγκέντρωση του ειδικού προϊόντος είναι μεγαλύτερη, αλλά ταυτόχρονα υπάρχουν και μη ειδικά προϊόντα τα οποία δυνητικά επηρεάζουν το τελικό αποτέλεσμα. (εικ. 6β). ~ 47 ~

50 Εικόνα 6α. Εικόνα 6β. Εικόνα 6 α - β : Μέγεθος βιβλιοθήκης χρησιμοποιώντας ως υποστρώματα προϊόντα PCR τα οποία καθαρίστηκαν με Gel extraction kit και PCR Purification kit, αντιστοίχως. ~ 48 ~

51 Διατηρώντας σταθερή την τελική συγκέντρωση της βιβλιοθήκης, πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση με διαφορετικές συγκεντρώσεις phix και παρατηρήθηκαν διαφορές στην πυκνότητα των clusters (σύνολο αλληλουχιών που προέρχονται από την αντιγραφή μιας αλληλουχίας). Συγκεντρωτικά τα αποτελέσματα φαίνονται παρακάτω (πίνακας 1): PhiX clusters [Density(K/MM2)] clusters που περνούν τα ποιοτικά φίλτρα NO 986 +/ / % 978 +/ ,34 +/- 14,65 10% / /- 13,29 5% 559 +/ ,5 +/- 1,41 Πίνακας 1: Οι διαφορετικές συγκεντρώσεις του PhiX επηρεάζουν την συνολική ποιότητα των αποτελεσμάτων, η οποία αντικατοπτρίζεται στο συνολικό αριθμό των clusters που πληρούν τα ποιοτικά κριτήρια. Στην πλατφόρμα αλληλούχησης της Illumina, η πυκνότητα των clusters που δημιουργήθηκαν πάνω στο Flow cell κατά τη διάρκεια του πειράματος είναι καίριας σημασίας επειδή σχετίζεται με τις εξής παραμέτρους: i) ποιότητα του πειράματος ii) αριθμός των αλληλουχιών που περνούν τα ποιοτικά φίλτρα iii) Q30 score iv) τελικό μέγεθος των παραγόμενων αποτελεσμάτων (total data output).(90) Αναφορικά με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα παραπάνω πειράματα, παρατηρούμε ότι η καλύτερη απόδοση της πειραματικής διαδικασίας, η οποία αντικατοπτρίζεται στην ποιότητα των παραγόμενων αλληλουχιών, παρατηρήθηκε σε συγκέντρωση phix 5%. Σε αυτή τη συγκέντρωση το 92,5 % των συνολικών αλληλουχιών περνούν με επιτυχία τα ποιοτικά φίλτρα. Στις υπόλοιπες περιπτώσεις το ποσοστό αποτυχίας κυμαίνεται μεταξύ 45-70%. ~ 49 ~

52 Τέλος, πραγματοποιήθηκαν τρία διαφορετικά πειράματα αλληλούχησης χρησιμοποιώντας το ίδιο kit προετοιμασίας του αλληλουχητή (MiSeq Run, multiplexed 2x250bp version 2) και σε καθένα από αυτά αλληλουχήθηκαν οι βιβλιοθήκες που είχαν προετοιμαστεί με τα τρία διαφορετικά πρωτόκολλα που προαναφέρθηκαν. Συνοπτικά τα αποτελέσματα φαίνονται παρακάτω (πίνακας 2). KIT %>=Q30 OUTPUT (G) Illumina (TruSeq DNA LT) Kapa Biosystems, Kapa HTP library preparation kit NEBNext Ultra Library Prep Kit for Illumina Πίνακας 2: Συγκεντρωτικός πίνακας ποιοτικών χαρακτηριστικών των αποτελεσμάτων που προκύπτουν από την εφαρμογή διαφορετικών πρωτοκόλλων δημιουργίας της βιβλιοθήκης. Το υψηλό ποσοστό των αλληλουχιών με ποιοτικό σκορ >30 (2η στήλη) και μεγαλύτερο μέγεθος δεδομένων (3η στήλη) υποδεικνύουν το βέλτιστο πρωτόκολλο δημιουργίας της βιβλιοθήκης. Επισημαίνεται ότι τα παραπάνω πειράματα πραγματοποιήθηκαν διαδοχικά, κρατώντας σταθερή την συγκέντρωση της βιβλιοθήκης και προσπαθώντας να βελτιστοποιηθεί η ποιότητα αλλά και ο αριθμός των παραγόμενων αλληλουχιών. Στο παραπάνω πίνακα φαίνονται συγκεντρωτικά αποτελέσματα που αφορούν το ποσοστό των αλληλουχιών των οποίων η ποιότητα ήταν ίση ή μεγαλύτερη από Q30 (η ποιότητα του κάθε νουκλεοτιδίου συμβολίζεται με κλίμακα αριθμών με το ποιοτικότερο νουκλεοτίδιο να έχει Qscore=40) και το συνολικό μέγεθος των παραγόμενων αποτελεσμάτων. Λαμβάνοντας υπόψη τις συστάσεις της Illumina σχετικά με την αξιολόγηση της πειραματικής διαδικασίας, ένα πείραμα αλληλούχησης θεωρείται πετυχημένο όταν το 75% των τελικών δεδομένων χαρακτηρίζεται από ποιοτικό σκορ μεγαλύτερο του Q30 (>=Q30).(91) Η ανάλυση που ακολούθησε αφορούσε μόνο στους κύριους κλωνοτύπους και έδειξε ότι αυτοί αντιπροσωπεύονταν σε παραπλήσια συχνότητα (εικόνα 7) στα πολλαπλά δείγματα του ίδιου ασθενούς, ένδειξη ότι το εφαρμοζόμενο πρωτόκολλο είναι αξιόπιστο για την ανάλυση ρεπερτορίου. ~ 50 ~

53 Εικόνα 7. Συγκριτική ανάλυση των κύριων κλωνοτύπων σε πολλαπλά δείγματα του ίδιου ασθενούς επιβεβαιώνει παρόμοια συχνότητα των ίδιων πέντε κύριων κλωνοτύπων. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν χρησιμοποιήθηκε το ίδιο αρχικό δείγμα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις RNA για τη σύνθεση του cdna (1 έως 5,8 μg RNA). (Εικόνα 8) Εικόνα 8. Χρησιμοποιώντας διαφορετικές ποσότητες RNA για τη σύνθεση cdna παρατηρήθηκε ότι η συχνότητα των κύριων κλωνοτύπων ήταν παρόμοια. Τέλος, προκειμένου να διερευνηθεί η επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων σε διαφορετικά μηχανήματα, χρησιμοποιήθηκε το ίδιο προϊόν PCR σε διαφορετικά ΜiSeq μηχανήματα. Παρατηρήθηκε επαναληψιμότητα τόσο ως προς το ρεπερτόριo των γονιδίων TRBV όσο και ως προς τους κύριους κλωνότυπους. (Εικόνα 9α-β ) ~ 51 ~

54 Εικόνα 9α. Εικόνα 9β Εικόνα 9α-β: Αναλύοντας το ίδιο υπόστρωμα σε διαφορετικά μηχανήματα MiSeq παρατηρήθηκε ότι η συχνότητα των TRBV γονιδίων (Εικόνα 9α) και των κύριων κλωνοτύπων (Εικόνα 9β) είναι παρόμοια. ~ 52 ~

55 Συμπερασματικά, όσον αφορά τα επιμέρους βήματα της πειραματικής διαδικασίας παρατηρήθηκε ότι: o αρχικός αριθμός των κυττάρων από 5 έως 18 εκατομμύρια είναι επαρκής για την αντιπροσωπευτική απεικόνιση του ρεπερτορίου. o διαφορετικές συγκεντρώσεις RNA για τη σύνθεση του cdna (1 έως 5,8 μg RNA) εξασφάλισαν επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. o στο στάδιο της εκχύλισης του RNA, η εφαρμογή δύο διαφορετικών πρωτοκόλλων (4Μ γουανιδινίου και χρήση στηλών) δεν επηρέασε την τελική ποιότητα και συγκέντρωση του RNA. Συνεπώς, και τα δύο εναλλακτικά πρωτόκολλα μπορεί να χρησιμοποιηθούν. o ο «καθαρισμός» των προϊόντων PCR με gel extraction kit υπερτερεί σε σχέση με το PCR purification kit. Το τελικό προϊόν στην πρώτη περίπτωση είναι απαλλαγμένο από μικρά, μη ειδικά προϊόντα, που δυνητικά επηρεάζουν την τελική πειραματική διαδικασία. o για τη ποσοτικοποίηση της βιβλιοθήκης προτείνεται συνδυασμός εφαρμογής του bioanalyzer και της Real time PCR. o το πρωτόκολλο δημιουργίας της βιβλιοθήκης που πληροί όλα τα ποιοτικά κριτήρια είναι εκείνο που πραγματοποιήθηκε με τα αντιδραστήρια της NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina και αυτό υιοθετήθηκε στην επεξεργασία όλων των δειγμάτων που αναλύθηκαν από τις διαφορετικές κλινικές οντότητες που μελετήθηκαν. ~ 53 ~

56 2. Αποτελέσματα της ερευνητικής δραστηριότητας για την προτυποποίηση in silico βιοπληροφορικής ανάλυσης Η βιοπληροφορική επεξεργασία των δεδομένων και τα αποτελέσματα που προέκυψαν από αυτή πραγματοποιήθηκε με βάση κάποια κριτήρια και παραμέτρους. Συνοπτικά οι παράμετροι και τα κριτήρια αφορούν : 1. Total reads of raw data: το πλήθος των raw αλληλουχιών (αποτελούν δεδομένα της πειραματικής διαδικασίας και μπορεί να χρησιμοποιηθούν για στατιστική ανάλυση) Not Null CDR3/V: Οι αλληλουχίες που είχαν κενό το πεδίο της ανάλυσης του CDR3 ή/και του ΤRBV γονιδίου εξαιρέθηκαν από την ανάλυση ( κριτήριο) Filtered out: Το πλήθος των αλληλουχιών που απορρίφθηκαν σε κάθε στάδιο (αποτελούν δεδομένα της πειραματικής διαδικασίας και η χρήση τους εξυπηρετεί μόνο στατιστικά αποτελέσματα) Identity>95%: Το ποσοστό ταυτότητας του TRBV γονιδίου με τη βλαστική σειρά (παράμετρος, διαφοροποιείται ανάλογα με το αντικείμενο μελέτης) CDR3 landmarks C-F: Οι αλληλουχίες των οποίων το CDR3 αρχίζει και τερματίζεται με τα δύο αμινοξέα - landmarks (κριτήριο, όλες οι αλληλουχιες CDR3 οφείλουν να χαρακτηρίζονται από τα παραπάνω landmarks) Not Containing X,#,*: Εξαιρέθηκαν όλες οι μη παραγωγικές αναδιατάξεις (κριτήριο, έτσι εξαιρούνται οι μη παραγωγικές αναδιατάξεις) Functional TRBV: Το TRBV γονίδιο πρέπει να είναι λειτουργικό (εξαιρούνται οι αναδιατάξεις που χρησιμοποιούν ψευδογονίδια) (κριτήριο) Total filter out: Σύνολο αλληλουχιών που απορρίφθηκαν (αριθμητικά δεδομένα του πειράματος). ~ 54 ~

57 Total filter in: σύνολο αλληλουχιών μετά το φιλτράρισμα. Στις συγκεκριμένες αλληλουχίες θα εφαρμοστούν στην συνέχεια οι αλγόριθμοι προκειμένου να ολοκληρωθεί η ανάλυση τόσο ανά δείγμα όσο και μεταξύ των δειγμάτων. (αριθμητικά δεδομένα του πειράματος)(92) Τελικά, το ίδιο σύνολο δεδομένων αναλύθηκε σε τρία διαφορετικά εργαλεία/πλατφόρμες ευθυγράμμισης/εξαγωγής CDR3 από δεδομένα αλληλούχησης υψηλής απόδοσης: IMGT High V-Quest, Decombinator και ΜiTCR. Τα τρία εργαλεία έτρεξαν με βάση τις αντίστοιχες παραμέτρους και τελικά προέκυψαν συγκρίσιμα αποτελέσματα μεταξύ IMGT και MiTCR. Αντίθετα, τα αποτελέσματα από το εργαλείο Decombinator είχαν αρκετές αναντιστοιχίες.(89)(93) Επισημαίνεται ότι και τα τρία εργαλεία ανάλυσης χρησιμοποιούν μόνο παραγωγικές αναδιατάξεις προκειμένου να υπολογίσουν το σύνολο των κλωνοτύπων. Πιο συγκεκριμένα, προέκυψαν κλωνότυποι με βάση το MiTCR και με βάση το IMGT. Η μικρή αυτή διαφορά έγκειται στο γεγονός ότι, σύμφωνα με το MiTCR, κλωνότυπος είναι η νουκλεοτιδική αλληλουχία του CDR3 χωρίς να λαμβάνεται υπόψη το αντίστοιχο γονίδιο. Αντίθετα, σύμφωνα με το IMGT, κλωνότυπος είναι η αλληλουχία που χρησιμοποιεί το ίδιο TRBV γονίδιο και κωδικοποιεί την ίδια αμινοξική αλληλουχία CDR3. Παρουσιάζει ενδιαφέρον να γνωρίζουμε αν αναδιατάξεις που χρησιμοποιούν διαφορετικά γονίδια TRBV μπορεί να κωδικοποιούν το ίδιο CDR3. Τυπικά, οι σχετικές αλληλουχίες αντιστοιχούν σε διαφορετικούς κλωνοτύπους και έτσι πρέπει να αξιολογούνται. Ωστόσο, δεν πρέπει να παραβλέπεται το γεγονός ότι σε αρκετές περιπτώσεις, εξαιτίας εγγενών αδυναμιών της πειραματικής διαδικασίας, η αναγνώριση των γονιδίων TRBV δεν είναι εφικτή. Σε αυτή την περίπτωση το IMGT αποδίδει όλα τα πιθανά γονίδια που αντιστοιχούν στο γνωστό τμήμα της αλληλουχίας με την ένδειξη or ενώ αντίθετα το MiTCR ομαδοποιεί τις συγκεκριμένες αλληλουχίες αυτές στο γονίδιο που χρησιμοποείται από τον επικρατή κλωνότυπο. Ασφαλώς, αυτό αποτελεί αυθαιρεσία του αλγορίθμου, επειδή μπορεί να οδηγήσει σε ψευδή εντύπωση επιλεκτικότητας (restriction) του ~ 55 ~

58 ρεπερτορίου. Παρόλ αυτά, συγκρίνοντας τους 30 επικρατέστερους κλωνοτύπους υπήρχε απόλυτη ταύτιση μεταξύ των δύο εργαλείων. Στην περίπτωση χρήσης του Decombinator, οι κλωνότυποι ήταν πολύ λιγότεροι (14146 vs και 28546). Aυτό οφείλεται στο γεγονός ότι το παραπάνω εργαλείο κάνει χρήση κάποιων μικρών σε μήκος αλληλουχιών τις οποίες ονομάζει tag, θεωρεί ότι είναι μοναδικές για κάθε γονίδιο και με βάση αυτές αναγνωρίζει τα γονίδια ανά αλληλουχία. Αποτέλεσμα της παραπάνω διαδικασίας είναι να μην αναγνωρίζονται όλα τα γονίδια και συνεπώς να εξαιρούνται οι συγκεκριμένες αλληλουχίες από την τελική ανάλυση, χάνοντας έτσι πληροφορίες που αφορούν στο συνολικό Τ ρεπερτόριο. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα συνάγεται ότι το εργαλείο IMGT High V- Quest αποτελεί την πιο ασφαλή επιλογή για την ανάλυση και το χαρακτηρισμό αλληλουχιών που προέρχονται από την ανοσογενετική ανάλυση του Τ κυτταρικού υποδοχέα. ~ 56 ~

59 2.ΑΝΟΣΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΡΕΠΕΡΤΟΡΙΟΥ ΤΩΝ Τ-LGL ΛΕΜΦΟΫΠΕΡΠΛΑΣΙΩΝ ΣΕ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΕΣ ΟΝΤΟΤΗΤΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. Ομάδα μελέτης Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν δείγματα ασθενών από διαφορετικές κλινικές οντότητες που χαρακτηρίζονται από υπερπλασίες κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων. Πιο συγκεκριμένα: 1. Δυο συγγενείς ασθενείς (ασθενής 1: πατέρας ασθενής 2: υιός) με οικογενή T-LGL λευχαιμία. Ο Ασθενής 1 εμφάνισε θρομβοπενία, σπληνομεγαλία, αντιπυρηνικά αντισώματα (+) σε ηλικία 55 ετών (1999). Ανταποκρίθηκε μερικώς σε θεραπεία με κορτικοειδή. Το 2002 υποβλήθηκε σε σπληνεκτομή (αρχική ιστολογική εξέταση σπληνός «χωρίς ειδικά ευρήματα»). Μετά τη σπληνεκτομή παρέμεινε ήπια ουδετεροπενία έως το χρόνο δειγματοληψίας, η οποία επέμεινε έως τον τελευταίο έλεγχο. Ο Ασθενής 2 εκδήλωσε παγκυτταροπενία από 17 ετών (1993), χωρίς προφανή αιτιολογία. Το 2002 η παγκυτταροπενία παρέμενε, διαπιστώθηκε σπληνομεγαλία και ο ασθενής υποβλήθηκε σε σπληνεκτομή η οποία οδήγησε σε παροδική αποκατάσταση των αιματολογικών παραμέτρων. Ωστόσο, παρέμεινε θρομβοπενία από το 2003 έως το χρόνο της δειγματοληψίας. Ο λεπτομερής εργαστηριακός έλεγχος των δύο ασθενών απέδωσε εντυπωσιακά παρόμοια αποτελέσματα σε σειρά εξετάσεων. Πιο συγκεκριμένα, η κυτταρομετρία ροής ανέδειξε αναστροφή λόγου CD4/CD8, αύξηση CD3+CD8+CD57+ κυττάρων (πατέρας>30%, υιός: 18-22%) θετικά αντιπολυμορφοπυρηνικά αντισώματα (δοκιμασίες GIFT, GAT) αρνητικός έλεγχος για μεταλλάξεις του γονιδίου της ελαστάσης. Τα αποτελέσματα της οστεομυελικής βιοψίας αναφέρουν υπερκυτταρικό μυελό με αξιόλογη υπερπλασία και των τριών αιμοποιητικών σειρών με δυσπλαστικές αλλοιώσεις (αυτοάνοσου τύπου περιφερική καταστροφή;), ενώ η βιοψία σπληνός ανέδειξε: (i) λευκός πολφός: υπερπλασία Β ζώνης (μανδύας/ ~ 57 ~

60 οριακή ζώνη, CD20+CD3-), υπερπλασία T ζώνης (CD20-CD3+, CD4+>CD8+) (ii) ερυθρός πολφός: μέτριας έκτασης CD3+CD20-Τ λεμφοκυτταρική διήθηση (CD8+>CD4+) σπληνικών χορδών και κολποειδών. 2. Δείγματα ενός ασθενούς με Ph + οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία που ανέπτυξε T-LGL λευχαιμία από τα κύτταρα του δότη μετά από μεταμόσχευση αλλογενών αιμοποιητικών κυττάρων (allo-hct). Πιο συγκεκριμένα, αναλύθηκαν το δείγμα του δότη (#4) και 3 δείγματα του ασθενούς, +6 μήνες (#5), +3 έτη (#6) και +10 έτη (#7) μετά την allo-hct, πάντοτε σε πλήρη ύφεση από τη νόσο και σε κατάσταση πλήρους χίμαιρας του δότη. Η αρχική διερεύνηση είχε πραγματοποιηθεί λόγω εμμένουσας ουδετεροπενίας μετά από χορήγηση Rituximab εξαιτίας ΕΒV λοίμωξης, οπότε και διαπιστώθηκε ολιγοκλωνική έκπτυξη Τ-LGL (τα δύο πρώτα στιγμιότυπα), η οποία εξελίχθηκε σε συμπτωματική T- LGL λευχαιμία (επανειλημμένα επεισόδια αυτοάνοσης αιμολυτικής αναιμίας, ουδετεροπενίας μετά τα +5 έτη από την allo-hct) σε λεμφοκύτταρα του δότη. 3. Ασθενείς με Χρόνια Ιδιοπαθή Ουδετεροπενία. Στη μελέτη συμπεριλήφθησαν 13 καλά χαρακτηρισμένες περιπτώσεις CIN (8 γυναίκες, 5 άνδρες) με διάμεση ηλικία 48 έτη (εύρος, 27-70). Οι CIN ασθενείς είχαν αριθμό ουδετεροφίλων <1.8 x10 9 /l (διάμεση τιμή 1.3 ± 0.3 x 10 9 /l, εύρος x 10 9 /l) διάρκειας τουλάχιστον 12 μηνών (διάμεση διάρκεια 100 μήνες, εύρος μήνες). Η λήψη αναλυτικού ιστορικού, η κλινική εξέταση και η διενέργεια εργαστηριακών εξετάσεων δεν αποκάλυψαν κάποια υποκείμενη αιτία ουδετεροπενίας. ~ 58 ~

61 2. Πειραματική μεθοδολογία Χρησιμοποιώντας ως αρχικό υπόστρωμα γενωμικό DNA (gdna) ή/και cdna, εφαρμόστηκε η προτυποποιημένη πειραματική διαδικασία που περιγράφηκε λεπτομερώς στην προηγούμενη ενότητα. Η βιοπληροφορική επεξεργασία πραγματοποιήθηκε με τον αλγόριθμο που αναπτύχθηκε ειδικά για NGS ανοσογενετική ανάλυση. (92) 3. Αποτελέσματα ανάλυσης ανά κλινική οντότητα Οικογενής T-LGL λευχαιμία Συνολικά αναλύθηκαν παραγωγικές TRBV-TRBD-TRBJ αναδιατάξεις ( αλληλουχίες /δείγμα). Τα κύρια ευρήματα στην περίπτωση της οικογενούς T-LGL λευχαιμίας συνοψίζονται ως εξής: έντονη επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου των γονιδίων TRBV (Εικόνα 10) ύπαρξη εκπτυγμένων κλωνοτύπων (Εικόνα 11) παραμονή αλλά, παράλληλα, και διαχρονική διακύμανση στη συχνότητα των εκπτυγμένων κλωνοτύπων (clonal drift) στα δείγματα του υιού (Εικόνα 12) παρουσία κοινών («δημόσιων») κλωνοτύπων στα δείγματα πατέρα και υιού. ~ 59 ~

62 Εικόνα 10: Επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου των TRBV γονιδίων. Εννέα γονίδια αντιπροσωπεύουν το 40% του συνολικού TRBV ρεπερτορίου. Εικόνα 11: Οι δέκα συχνότεροι κλωνότυποι/ ανά δείγμα. Με γκρι χρώμα το πολυκλωνικό ρεπερτόριο. Εικόνα 12: Παραμονή κύριων κλωνοτύπων διαχρονικά στα δείγματα του υιού (clonal drift). Με γκρι χρώμα το πολυκλωνικό ρεπερτόριο. Επισημαίνεται ότι τα παραπάνω δείγματα είχαν υποβληθεί σε ανοσογενετική τους ανάλυση με μεθόδους κλασικής υποκλωνοποίησης και αλληλούχησης κατά Sanger(94)(95) με συγκρίσιμα αποτελέσματα. Ωστόσο, η μεθοδολογία NGS απέδωσε πληρέστερη εικόνα του ρεπερτορίου του Τ κυτταρικού υποδοχέα, επαληθεύοντας την ύπαρξη πολλαπλών κύριων εκπτυγμένων κλωνοτύπων σε κάθε ασθενή μέσα σε πολυκλωνικό υπόστρωμα. ~ 60 ~

63 T-LGL λευχαιμία στα κύτταρα του δότη μετά από μεταμόσχευση αλλογενών αιμοποιητικών κυττάρων Συνολικά αναλύθηκαν παραγωγικές αναδιατάξεις TRBV-TRBD-TRBJ ( αλληλουχίες /δείγμα). Τα κύρια ευρήματα στην περίπτωση της T-LGL λευχαιμίας από κύτταρα του δότη συνοψίζονται ως εξής: ο ανοσοκυρίαρχος κλωνοτύπος ανιχνεύθηκε στο πολυκλωνικό ρεπερτόριο του δότη στη συνέχεια εκπτύχθηκε στον λήπτη, παραμένοντας διαχρονικά και συνυπάρχοντας με κάποιους άλλους εκπτυγμένους κλωνότυπους. (Εικόνα 13) Εικόνα 13: Παρουσία κοινών κλωνοτύπων στο δείγμα του δότη και στα διαχρονικά δείγματα του ασθενούς. Τα ίδια χρώματα υποδηλώνουν κοινό κλωνότυπο. Με γκρι χρώμα το πολυκλωνικό ρεπερτόριο. ~ 61 ~

64 Η αναζήτηση κοινών ("δημόσιων") κλωνοτύπων ανέδειξε 1013 τέτοιους κλωνοτύπους, από τους οποίους οι 37 ήταν κοινοί και στα τέσσερα δείγματα. Οι 6 από τους 37 εμφανίζονταν και στα τέσσερα δείγματα με ποσοστό πάνω από 0,01%.(Εικόνα 14) Εικόνα 14. Παρουσία κοινών κλωνοτύπων στο σύνολο των δειγμάτων με συχνότητα μεγαλύτερη του 0.01%. Τέλος, αναλύοντας τους κοινούς κλωνοτύπους, βρέθηκε ότι 79/1013 κωδικοποιούν την ίδια CDR3 περιοχή σε αμινοξικό επίπεδο αλλά χρησιμοποιώντας διαφορετικό TRBV γονίδιο. ~ 62 ~

65 Χρόνια Ιδιοπαθής Ουδετεροπενία Στους ασθενείς με Χρόνια Ιδιοπαθή Ουδετεροπενία, συνολικά μελετήθηκαν αλληλουχίες οι οποίες πληρούσαν τα ποιοτικά κριτήρια. Σε περαιτέρω βιοπληροφορική επεξεργασία υποβλήθηκαν μόνο παραγωγικές αναδιατάξεις TRBV- TRBD-TRBJ (85,2% του συνόλου 256,151 αλληλουχίες/ δείγμα). Η ανάλυση του ρεπερτορίου πραγματοποιήθηκε με βάση τους κλωνοτύπους και όχι τον αρχικό αριθμό των αναδιατάξεων. Ο συνολικός αριθμός των αναδιατάξεων αντιστοιχούσε σε κλωνοτύπους. Ως εκπτυγμένοι κλωνότυποι αναφέρθηκαν εκείνοι που αντιστοιχούσαν σε 3 τουλάχιστον ταυτόσημες αναδιατάξεις (ίδιο TRBV γονίδιο και ταυτόσημη αμινοξική αλληλουχία CDR3). Η σχετική συχνότητα κάθε κλωνοτύπου / δείγμα ορίστηκε ως ο αριθμός των αναδιατάξεων που αντιστοιχούν σε έναν κλωνότυπο δια του συνολικού αριθμού παραγωγικών αναδιατάξεων για το συγκεκριμένο δείγμα. Οι κλωνοτύποι που αντιπροσωπεύονται από μία μόνο αναδιάταξη αναφέρονται εφεξής ως μονήρεις (singletons). Ο αριθμός των διαφορετικών κλωνοτύπων / δείγμα κυμαινόταν από με διάμεση τιμή διακεκριμένων κλωνοτύπων / δείγματος. Από αυτούς, οι 4453 (εύρος: ) ήταν εκπτυγμένοι κλωνότυπους, ενώ οι 6392 (εύρος: ) μονήρεις. Στο σύνολο των ασθενών, μεταξύ των 46 λειτουργικών TRBV γονιδίων που αναγνωρίστηκαν πιο συχνά ήταν τα: TRBV29-1 (9.9%), TRBV19 (6.1%), TRBV12-3 (5.6%), TRBV6-5 (5.1%), TRBV27 (5%) και TRBV6-1 (4.4%), τα οποία αθροιστικά αντιστοιχούσαν στο 36.1% του TRBV ρεπερτορίου. Το TRBV29-1 γονίδιο επικρατούσε σε 6/13 περιπτώσεις CIN (Εικόνα 15). ~ 63 ~

66 Εικόνα 15. Ρεπερτόριο TRBV γονιδίων. Ανάλυση των TRBV γονιδίων στην ομάδα των ασθενών και σύγκριση με το ρεπερτόριο τριών υγιών μαρτύρων (γυναίκες παρόμοιας ηλικίας). Τα πρώτα 8 TRBV γονίδια στον άξονα χ είναι τα πιο συχνά στην ομαδα των ασθενών. Τα δύο τελευταία TRBV γονίδια (TRBV30 και TRBV7-9) προστέθηκαν προκειμένου να τονίσουν τις διαφορές στο ρεπερτόριο μεταξύ των CIN ασθενών και των υγιών μαρτύρων. Οι συχνότητες των γονιδίων που εμφάνιζαν στατιστικά σημαντικές διαφορές με τιμές p<0.05 και p<0.01 σημειώνονται με [*] και [***], αντιστοίχως. Επιλεκτικότητα των TRBV γονιδίων παρατηρήθηκε και στα δείγματα των υγιών μαρτύρων. Πιο συγκεκριμένα, τα έξι πιο συχνά TRBV γονίδια (TRBV27, TRBV12-3, TRBV6-5, TRBV28, TRBV7-9 και TRBV19) συνολικά αποτελούσαν το 30.9% του συνολικού ρεπερτορίου. Στατιστικά σημαντικές διαφορές όσον αφορά τη συχνότητα των γονιδίων μεταξύ των ασθενών με CIN και των υγιών μαρτύρων (p<0.05) διαπιστώθηκαν για τα παρακάτω γονίδια: TRBV7-9, TRBV19, TRBV30 και TRBV29-1 (Εικόνα 15). Επισημαίνεται, ωστόσο, ότι το μικρό μέγεθος του δείγματος δυσχεραίνει την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. ~ 64 ~

67 Όσον αφορά το ρεπερτόριο των TRBJ γονιδίων, από το σύνολο των 13 λειτουργικών γονιδίων, πιο συχνά ήταν τα TRBJ1-2 (20.1%), TRBJ2-7 (19.3%), TRBJ2-2 (16.9%) και TRBJ1-5 (14.6%). Τα 5 συχνότερα γονίδια TRBJ συνολικά αντιπροσώπευαν το 70.9% όλων των παραγωγικών κλωνοτύπων αλλά με διαφορετικό πρότυπο έκφρασης ανά ασθενή (Πίνακας 3). J-GENE CIN 16 CIN 30 CIN 34 CIN 20 CIN 32 CIN 25 CIN 23 CIN 26 CIN 10 CIN 12 CIN 21 CIN 38 CIN 40 MEAN TRBJ1-1 12, , , , , , , , , , , , , , TRBJ1-2 23, ,311 14, , , , , , , , , , , ,10852 TRBJ1-3 6, , ,9938 4, , , , , , , , , , , TRBJ1-4 3, , , , , , , , , , , , , , TRBJ1-5 9, , , , , , , , , , , , , ,64386 TRBJ1-6 4, , , , , , , , , , , , , , TRBJ2-1 0, , , , , , , , , , , TRBJ2-2 2, , , , , , , , , , , , , ,87004 TRBJ TRBJ , , ,00287 TRBJ , , , , TRBJ2-6 6, , , , , , , , , , , , , , TRBJ2-7 30, , , , , , , , , , , , , ,29418 Πίνακας 3: Ρεπερτόριο TRBJ γονιδίων στο σύνολο των CIN ασθενών. Επιλεκτικότητα TRBJ γονιδίων, διαφορετική ανά ασθενή. TRBD γονίδια αναγνωρίστηκαν σε / αναδιατάξεις, με υψηλότερη συχνότητα του TRBD1 έναντι του TRBD2 γονιδίου [68.1% και 31.9%, αντιστοίχως), γεγονός που πιθανόν αποδίδεται στο φαινόμενο της "εγγύς αποτελεσματικότητας" (proximal efficiency) κατά τη διάρκεια του ανασυνδυασμού. (96,97). Επιπλέον, το μήκος της CDR3 περιοχής ακολουθούσε κανονική κατανομή, με μέσο μήκος τα 13 αμινοξέα (εύρος, 7-20) Προκειμένου να εξαγάγουμε συμπεράσματα όσον αφορά την επιλεκτικότητα συγκεκριμένων TRBV γονιδίων ανάλογα με το μήκος της περιοχής CDR3, κατατάξαμε τους κλωνότυπους σε δύο ομάδες: (i) κλωνότυποι με μήκος CDR3 μεταξύ αμινοξέων και (ii) κλωνότυποι με μήκος CDR3 μεταξύ 8-11 αμινοξέων. Η παραπάνω ανάλυσε ανέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0.05) στη συχνότητα (i) των TRBD1, TRBJ1-1 και TRBJ1-2 γονιδίων, που ήταν υψηλότερη στην ομάδα των κλωνοτύπων με μήκος CDR3 μεταξύ αμινοξέων και, (ii) των TRBV29-1, TRBD2 και TRBJ1-3 γονιδίων, που ήταν υψηλότερη στην ομάδα των κλωνοτύπων με μήκος CDR3 μεταξύ 8-11 αμινοξέων. ~ 65 ~

68 Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε ότι η παρατηρούμενη επιλεκτικότητα του TRBV ρεπερτορίου δεν οφείλεται σε επιλεκτικότητα των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν κατά την πειραματική διαδικασία αλλά σχετίζεται με την οντότητα υπό μελέτη, συγκρίναμε τα αποτελέσματα από τους ασθενείς με CIN με τα αποτελέσματα από 7 ασθενείς με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (CLL), τα οποία προέκυψαν χρησιμοποιώντας την ίδια πειραματική διαδικασία και αναλύθηκαν με την ίδια βιοπληροφορική προσέγγιση.(92,98) Η συχνότητα των γονιδίων TRBV διέφερε μεταξύ των δύο οντοτήτων. Πιο συγκεκριμένα, τα γονίδια TRBV6-1 και TRBV6-4 υπερεκφράζονταν στα CD8 + T λεμφοκύτταρα της CIN έναντι της CLL (4.4% έναντι 1.6%, p= % έναντι 0.8%, p=0.001, αντιστοίχως), ενώ το αντίθετο παρατηρήθηκε για το γονίδιο TRBV12-3 (5.6% έναντι 9.5%, p=0.009) (Εικόνα 16). Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι οι παρατηρούμενες "ασυμμετρίες" όσον αφορά στην έκφραση συγκεκριμένων TRBV γονιδίων αντικατοπτρίζουν βασικές διαφορές ως προς τις οντότητες/ ασθένειες υπό μελέτη και δεν είναι αποτέλεσμα της πειραματικής διαδικασίας (amplification artifacts). Εικόνα 16: Σύγκριση του ρεπερτορίου των TRBV γονιδίων ασθενών με CIN έναντι ασθενών με CLL. ~ 66 ~

69 Όσον αφορά την κλωνικότητα των δειγμάτων, όλες οι περιπτώσεις CIN έφεραν εκπτυγμένους κλωνότυπους, με τη συχνότητα του ανοσοκυρίαρχου κλωνοτύπου να κυμαίνεται μεταξύ 5.5 και 23.2% του συνολικού ρεπερτορίου του κάθε δείγματος (διάμεση τιμή=11.7%), αντιστοιχώντας σε ολιγοκλωνικό ρεπερτόριο (Εικόνα 17). Επιπλέον, συγκρίνοντας τη συχνότητα των 10 πιο εκπτυγμένων κλωνοτύπων ανά δείγμα βρέθηκε ότι το ρεπερτόριο των δειγμάτων CIN ήταν σαφώς πιο ολιγοκλωνικό συγκριτικά με το αντίστοιχο των υγιών μαρτύρων [37.4% έναντι 11.3%; p=0.013), Εικόνα 17]. Εικόνα 17: Ανάλυση κλωνικότητας των CIN δειγμάτων έναντι υγιών μαρτύρων. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει ένα δείγμα. Το κάθε διαφορετικό μοτίβο / γραμμή αντικατοπτρίζει την συχνότητα των 10 πιο εκπτυγμένων κλωνοτύπων ανά δείγμα. Το μονόχρωμο μοτίβο (άσπρο) αντιπροσωπεύει το πολυκλωνικό υπόστρωμα, δηλαδή το άθροισμα των συχνοτήτων όλων των υπολοίπων κλωνοτύπων. Το ρεπερτόριο των CIN CD8+ T- λεμφοκυττάρων είναι σημαντικά πιο ολιγοκλωνικό από το αντίστοιχο των υγιών μαρτύρων. ~ 67 ~

70 Η ανάλυση των κλωνοτύπων όλων των CIN δειγμάτων ανέδειξε ότι 4554/140,984 (3.2%) κλωνότυποι εμφανίζονταν σε δύο τουλάχιστον ασθενείς και γι αυτό χαρακτηρίστηκαν ως "δημόσιοι" ("public clonotypes"). Στην πλειονότητά τους (3630/4554, 79.7%) μοιραζόταν μεταξύ δύο ασθενών και μόνο λίγοι μεταξύ 3 ή 4 CIN ασθενών (12.8% and 7.6%, αντιστοίχως). Παρόμοια αποτελέσματα προέκυψαν όταν επαναλάβαμε την ανάλυση αποκλείοντας τους μονήρεις κλωνοτύπους. (Πίνακας 4). Αριθμός ασθενών Αριθμός κλωνοτύπων Συχνότητα(%) , , , , , , , , , , , ,18 Σύνολο 4554 Πίνακας 4α: "Δημόσιοι" κλωνότυποι μεταξύ των CIN ασθενών (συμπεριλαμβανομένων των μονήρων αλληλουχιών). Αριθμός ασθενών Αριθμός κλωνοτύπων Συχνότητα(%) , , , , , , , , , , ,43 Σύνολο 937 Πίνακας 4β: "Δημόσιοι" κλωνότυποι μεταξύ των CIN ασθενών (εξαιρώντας τις μονήρεις αλληλουχίες). ~ 68 ~

71 Στις περισσότερες περιπτώσεις CIN, οι "δημόσιοι κλωνότυποι" εμφανίζονταν σε χαμηλή συχνότητα. Γι αυτό, η ανάλυση επαναλήφθηκε αξιολογώντας μόνο κλωνότυπους με συχνότητα μεγαλύτερη του 0,1%: βρέθηκε ένας κλωνότυπος κοινός μεταξύ 4 ασθενών και 7 κλωνότυποι κοινοί σε ζεύγη ασθενών. Επιπρόσθετη βιοπληροφορική ανάλυση ανέδειξε ότι η αμινοξική αλληλουχία ενός συγκεκριμένου κλωνοτύπου μπορεί να κωδικοποιείται από διαφορετικές νουκλεοτιδικές αλληλουχίες, φαινόμενο γνωστό ως "συγκλίνων ανασυνδυασμός" ("convergent recombination"), ενισχύοντας επιπλέον την εμπλοκή αντιγονικής επιλογής στην παθογένεση της CIN.(20,99) (Εικόνα 18) Εικόνα 18: Το φαινόμενο του "Convergent recombination" στη CIN. Η βιοπληροφορική ανάλυση των 10 πιο εκπτυγμένων κλωνοτύπων ανά δείγμα ανέδειξε ότι η ίδια αμινοξική αλληλουχία μπορεί να κωδικοποιείται από πλήθος διαφορετικών νουκλεοτιδικών αλληλουχιών. Ο άξονας "samples" αντιπροσωπεύει τα 13 CIN δείγματα που αναλύθηκαν. Στον άξονα "clonotypes" κάθε στήλη αντιπροσωπεύει έναν από τους δέκα πιο συχνούς κλωνοτύπους ανά δείγμα. Τέλος, στον άξονα "Num of nucleotides" φαίνεται ο αριθμός των διαφορετικών νουκλεοτιδικών αλληλουχιών που κωδικοποιούν τον κάθε κλωνότυπο με χρωματικό κώδικα. ~ 69 ~