ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΑΜΙΝΟΠΕΠΤΙΔΑΣΗΣ ΟΞΥΓΑΛΑΚΤΙΚΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Str. thermophillus ΜΕ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ME ΥΠΕΡΥΨΗΛΗ ΠΙΕΣΗ

Transcript

1 ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΑΜΙΝΟΠΕΠΤΙΔΑΣΗΣ ΟΞΥΓΑΛΑΚΤΙΚΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Str. thermophillus ΜΕ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ME ΥΠΕΡΥΨΗΛΗ ΠΙΕΣΗ Μ.Γιαννόγλου, Ζ.Αλεξανδράκης, Γ.Κατσαρός, Π.Ταούκης Εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο Φ.Σταύρος, Γ.Νούνεσης Εργαστήριο Βιομοριακής Φυσικής, Ινστιτούτο Ραδιοϊσοτόπων και Ραδιοδιαγνωστικών Προϊόντων, ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείμενο της παρούσας έρευνας αποτέλεσε η μελέτη της κινητικής απενεργοποίησης-ενεργοποίησης της αμινοπεπτιδάσης PepX προερχόμενη από την οξυγαλακτική καλλιέργεια του μικροοργανισμού Str. thermophillus, με εφαρμογή Υπερυψηλής Υδροστατικής πίεσης (ΥΠ). Πραγματοποιήθηκε απομόνωση και καθαρισμός της PepX με χρήση χρωματογραφίας ανιοντανταλλαγής, χρωματογραφίας μοριακής διήθησης και χρωματογραφίας υδροξυ-απατίτη. Το εύρος των πιέσεων που εφαρμόστηκε για τη μελέτη της αμινοπεπτιδάσης κυμάνθηκε από 1-45 MPa σε συνδυασμό με ήπιες θερμοκρασίες από 2-4 o C και παρατηρήθηκε τόσο απενεργοποίηση σε υψηλές πιέσεις και θερμοκρασίες, όσο και ενεργοποίηση σε ήπιες συνθήκες επεξεργασίας. Μετά τη μελέτη με ΥΠ τόσο του μη απομονωμένου όσο και του καθαρού ενζύμου ακολούθησαν πειράματα της μεταβολής της δομής του καθαρού ενζύμου επεξεργασμένου σε διάφορους συνδυασμούς πίεσης και θερμοκρασίας. Μελετήθηκε με χρήση φασματοσκοπίας κυκλικού διχροϊσμού η μεταβολή στη δομή ενζύμου επεξεργασμένου σε διάφορους συνδυασμούς πίεσης και θερμοκρασίας, καθώς και σε ατμοσφαιρική πίεση και διάφορες θερμοκρασίες. Τα ληφθέντα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τη δομή του ανεπεξέργαστου ενζύμου. Μικρές μεταβολές στη δευτεροταγή δομή του ενζύμου παρατηρήθηκαν για επεξεργασία στα 2 MPa ενώ σημαντικές μεταβολές στη δομή της PepX για επεξεργασία στα 45MPa. Όσον αφορά την τριτοταγή δομή του ενζύμου τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντικές μεταβολές στη δομή για συνθήκες επεξεργασίας υψηλότερες των 1MPa. Τα αποτελέσματα της έρευνας συμβάλλουν στην μελέτη του μηχανισμού αδρανοποίησης του συγκεκριμένου ενζύμου με βάση τις μεταβολές που προκαλούνται στη δομή του σε διάφορες συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας ως συνάρτηση του χρόνου. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ωρίμανση του τυριού περιλαμβάνει σύνθετες μικροβιολογικές και βιοχημικές αλλαγές με τα πρωτεολυτικά ένζυμα να παίζουν πρωτεύοντα ρόλο κατά την διάρκειά της (Kalit et al., 25). Τα πρωτεολυτικά ένζυμα είτε υπάρχουν στο γάλα, είτε συνήθως προέρχονται από οξυγαλακτικές καλλιέργειες που χρησιμοποιούνται κατά την τυροκόμηση. Ένα μεγάλο μέρος των ενζύμων αυτών είναι θερμοάντοχα ή διατηρούν σημαντικό μέρος της ενεργότητας, παρά τη θερμική επεξεργασία που υφίσταται το γάλα πριν (παστερίωση) ή και κατά τη διάρκεια της τυροκόμησης, και συμβάλλουν καθοριστικά στην ωρίμανση του τυριού (Moatsou et al., 22).

2 Η εμφάνιση των πεπτιδίων και των αμινοξέων ως αποτέλεσμα της πρωτεόλυσης της καζεΐνης παίζει σημαντικό ρόλο στην δημιουργία της χαρακτηριστικής γεύσης και υφής των τυριών. Κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης του τυριού, η παρουσία των πεπτιδασών (ενδογενών και μικροβιακής προέλευσης) θεωρείται καθοριστική. Τα ένζυμα που προέρχονται από οξυγαλακτικές καλλιέργειες χωρίζονται σε 3 ομάδες: πρωτεάσες μεμβράνης, ενδοκυτταρικές πρωτεάσες και γλυκολυτικά ένζυμα. Η ωρίμανση του τυριού επιταχύνεται όσο μεγαλύτερη είναι η δραστικότητα των πρωτεολυτικών ενζύμων μετά το πέρας της τυροκόμησης. Η επεξεργασία με Υπερυψηλή Υδροστατική Πίεση (ΥΠ) προκαλεί εξειδικευμένη μετουσίωση πρωτεϊνών και ενεργοποίηση / απενεργοποίηση ενζύμων (Katsaros et al., 21). Η συστηματική μελέτη της επίδρασης των παραμέτρων επεξεργασίας ΥΥΠ (χρόνος-πίεση-θερμοκρασία) στους ανωτέρω παράγοντες επιτρέπει να καθοριστούν οι βέλτιστες συνθήκες επεξεργασίας για την επιτάχυνση της ωρίμανσης του τελικού προϊόντος. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο προσδιορισμός της κινητικής ενεργοποίησης - απενεργοποίησης με ΥΠ της αμινοπεπτιδάσης PepX προερχόμενη από την οξυγαλακτική καλλιέργεια του μικροοργανισμού Str. thermophillus. Εξετάστηκε η αμινοπεπτιδάση με τη μεγαλύτερη δραστικότητα (PepX), η οποία ελευθερώθηκε με σπάσιμο των κυττάρων του Str. thermophillus, απομονώθηκε και καθαρίστηκε με χρήση χρωματογραφίας ανιοντανταλλαγής και χρωματογραφίας μοριακής διήθησης. Μελετήθηκαν οι δομικές μεταβολές του καθαρού ενζύμου μετά από επεξεργασία με ΥΠ με χρήση φασματοσκοπίας κυκλικού διχροϊσμού. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η ανάπτυξη του μικροοργανισμού Str. thermophillus (ACA-DC 22) πραγματοποιήθηκε σε κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα Μ-17 Broth (1.1529, Merck, Germany). Το σπάσιμο των κυττάρων για την απελευθέρωση των ενζύμων πραγματοποιήθηκε σε Tris HCl (ph=7), με χρήση συσκευής υπερήχων (Sonics & Materials inc., Newtown, USA,VC75). Μετά από μία σειρά φυγοκεντρήσεων και υπερδιηθήσεων η αμινοπεπτιδάση PepX απομονώθηκε και καθαρίστηκε με καταβύθιση των πρωτεϊνών παρουσία θειικού αμμωνίου σε εύρος κορεσμού από 3 έως 7%, χρωματογραφίας ανιοντανταλλαγής (UNOsphereQ, Biorad), χρωματογραφία μοριακής διήθησης (Sephacryl S-2 High Resolution) και χρωματογραφία υδροξυ-απατίτη (Biogel HT). Όλα τα ληφθέντα κλάσματα αναλύθηκαν για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της PepX και το πρωτεϊνικό περιεχόμενο. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά σύμφωνα τη μέθοδο Bradford (Bradford et al., 1985). Η καθαρότητα του ενζυμικού διαλύματος ελέγχθηκε με χρήση SDS-Page και IEF ηλεκτροφόρηση. Για τα πειράματα της κινητικής απενεργοποίησης/ενεργοποίησης των ενζύμων με ΥΠ χρησιμοποιήθηκε η μονάδα εργαστηριακής κλίμακας Food Pressure Unit LO1, (Resato International BV, Roden, Holland), η οποία παρέχει την δυνατότητα µέγιστης πίεσης και θερµοκρασίας λειτουργίας 1 MPa και 1 C αντίστοιχα, σε ένα σύστηµα έξι µικροθαλάµων χωρητικότητας 45 ml ο καθένας. Ως μέσο μεταφοράς της πίεσης στα κύτταρα και κατά συνέπεια και στα προαναφερθέντα ένζυμα χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα (phosphate buffer, ph=7), καθώς και γάλα πρόβειο.

3 Η δραστικότητα των πεπτιδασών μετρήθηκε με χρήση κατάλληλων υποστρωμάτων (Bachem, UK). Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε με βάση τη μέθοδο Mierau et al. (1996) και Vesanto et al. (1995) με χρήση φασματοφωτομέτρου (SPECTRAmax 25 Microplate Spectrophotometer, Molecular devices, U.S.A.). Η δευτεροταγής και η τριτοταγής δομή της καθαρής PepX προσδιορίστηκε με χρήση φασματοσκοπίας κυκλικού διχροϊσμού (CD). Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων με κυκλικό διχροϊσμό χρησιμοποιήθηκε το φασματοπολωσίμετρο JASCO-715 με σύστημα Peltier για τον έλεγχο της θερμοκρασίας. Για την λήψη των φασμάτων CD στη περιοχή nm (far UV) και στην περιοχή nm (near UV) χρησιμοποιήθηκαν κυψελίδες (Quartz SUPRASIL, Hellma) με μήκη διαδρομής 1 και 1 mm αντίστοιχα. Σε κάθε φάσμα αφαιρέθηκε το φάσμα του ρυθμιστικού διαλύματος. Για την ανάλυση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα ORIGIN 8. (OriginLab Corporation, USA) και για τον υπολογισμό των επιμέρους κλασμάτων της δευτεροταγούς δομής χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα CDNN (Institut für Biotechnologie, Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Το μεγαλύτερο ποσοστό της αμινοπεπτιδάσης PepX ανιχνεύτηκε στο ίζημα κορεσμένου διαλύματος ammonium sulphate για κορεσμό 3-7%. Με χρήση χρωματογραφίας FPLC-ανιοντοανταλλαγής παρατηρήθηκε ότι η έκλουση της πεπτιδάσης με τη μέγιστη ενεργότητα πραγματοποιήθηκε σε συγκέντρωση.18 Μ NaCl (Εικόνα 1). Το ένζυμο καθαρίστηκε περαιτέρω με χρήση χρωματογραφίας μοριακής διήθησης (Εικόνα 2). Μόνο μία κορυφή για την PepX ανιχνεύτηκε μετά από εφαρμογή χρωματογραφίας υδροξυ-απατίτη η έκλουση της οποίας πραγματοποιήθηκε σε συγκέντρωση.19 M Phosphate (Εικόνα 3).,3,25 Anion-exchange chromatography Elution profile NaCl (M) PepN activity PepX activity,6, E 28,2,15,1,4,3,2 Phosphate (M) 15 1 DE 41 / Dt (min -1 ) 5, t (min) Εικόνα 1. Χρωματογραφία ανιοντοανταλλαγής της PepX

4 3 25 Gel Filtration Chromatography Elution pofile PepX activity E ΔΕ 41 /Δt (min -1 ) t (min) Εικόνα 2. Χρωματογραφία μοριακής διήθησης της PepX 1, Hydroxyapatite Chromatography,6 3,8,5 25 Absorbance (28nm),6,4 Elution profile Phosphate (M) PepX activity,4,3,2 Phosphate (M) Spec. Activity (U),2, t (min) Εικόνα 3. Χρωματογραφία υδροξυ-απατίτη της PepX Η καθαρή PepX προσδιορίστηκε ως μια μονομερήs πρωτεΐνη με σχετική μοριακή μάζα 86 kda και ισοηλεκτρικό σημείο 5,2 (Εικόνα 4).

5 E D C B A 116, 86 kda 66,2 Εικόνα 4. SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση της PepX; στήλη A, MW standards; στήλη B, MW της PepX μετά από επεξεργασία με ammonium sulphate; στήλη C, MW της PepX μετά από χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής; στήλη D, MW της PepX μετά από χρωματογραφία μοριακής διήθησης; στήλη E, MW της PepX μετά από χρωματογραφία υδροξυ-απατίτη 45, 35, 25, 18,4 14,4 Για τη μελέτη της συγκεκριμένης πρωτεάσης έγινε χρήση πιέσεων από 1-45MPa σε συνδυασμό με θερμοκρασίες από 2 4 C και παρατηρήθηκε τόσο απενεργοποίηση σε υψηλές πιέσεις και θερμοκρασίες, όσο και ενεργοποίηση σε ήπιες (ως 2 MPa) συνθήκες επεξεργασίας. Προσδιορίστηκε η σταθερά του ρυθμού απενεργοποίησης/ενεργοποίησης τόσο για το καθαρό ένζυμο όσο και για το μη καθαρό σε κάθε εξεταζόμενη συνθήκη επεξεργασίας. Παρακάτω απεικονίζεται η μεταβολή της δραστικότητας της μη απομονωμένης (a) και της καθαρής (b) αμινοπεπτιδάσης PepX για επεξεργασία σε πιέσεις 1-45 MPa σε θερμοκρασία 2 C. Παρατηρήθηκε ότι το καθαρό ένζυμο ήταν πιο ανθεκτικό στην πίεση συγκριτικά με το μη καθαρό. (a) (b) Εικόνα 5. Mεταβολή της δραστικότητας της μη απομονωμένης (a) και της καθαρής (b) αμινοπεπτιδάσης PepX για επεξεργασία σε ΥΠ 1-45 MPa σε θερμοκρασία 2 C.

6 Στη συνέχεια εξετάστηκαν οι δομικές μεταβολές της καθαρής PepX μετά από επεξεργασία με ΥΠ με εφαρμογή φασματοσκοπίας κυκλικού διχροϊσμού στην άπω υπεριώδη περιοχή nm καθώς και στην εγγύς υπεριώδη περιοχή (26 36 nm). Οι μεταβολές στη δευτεροταγή και τριτοταγή δομή της PepX φαίνονται στις εικόνες 6 και 7 αντίστοιχα. 3 MRE(deg*cm 2 /dmol) untreated 2MPa, 2 o C, 15min, A/Ao =119,8% 45MPa, 2 o C, 15min, A/Ao =4,8% wavelength(nm) Εικόνα 6: Εφαρμογή φασματοσκοπίας κυκλικού διχροϊσμού στην άπω υπεριώδη περιοχή nm για την καθαρή ανεπεξέργαστη και επεξεργασμένη PepX στα 2 και 45 MPa στους 2 C για 15 min θ (mdeg) 3,5 3, 2,5 2, 1,5 1,,5 -,5-1, 1MPa, 15min, 2 o C 2MPa, 15min, 2 o C 3MPa, 15min, 2 o C 45MPa, 15min, 2 o C wavelength (nm) Εικόνα 7: Εφαρμογή φασματοσκοπίας κυκλικού διχροϊσμού στην εγγύς υπεριώδη περιοχή (26 36 nm) για την PepX επεξεργασμένη σε πιέσεις 1-45 MPa στους 2 C για 15 min Μικρές μεταβολές στη δευτεροταγή δομή του ενζύμου παρατηρήθηκαν για επεξεργασία στα 2 MPa ενώ σημαντικές μεταβολές στη δομή της PepX για

7 επεξεργασία στα 45MPa. Όσον αφορά την τριτοταγή δομή του ενζύμου τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντικές μεταβολές στη δομή για συνθήκες επεξεργασίας υψηλότερες των 1MPa. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Το εύρος των πιέσεων που εφαρμόστηκε για την απενεργοποίηση/ενεργοποίηση της μη απομονωμένης PepX κυμάνθηκε από 1-45 MPa σε συνδυασμό με ήπιες θερμοκρασίες από 2-4 o C και παρατηρήθηκε τόσο απενεργοποίηση σε υψηλές πιέσεις και θερμοκρασίες, όσο και ενεργοποίηση σε ήπιες συνθήκες επεξεργασίας. Με χρήση χρωματογραφίας ανιοντανταλλαγής, χρωματογραφίας μοριακής διήθησης και χρωματογραφίας υδροξυ-απατίτη καθαρίστηκε και απομονώθηκε η PepX. Το καθαρό ένζυμο προσδιορίστηκε ως μια διμερής πρωτεΐνη με σχετική μοριακή μάζα 86kDa και ισοηλεκτρικό σημείο 5,2. Η επεξεργασία με ΥΠ του καθαρού ενζύμου έδωσε παρόμοια αποτελέσματα όσον αφορά τις συνθήκες ενεργοποίησης / απενεργοποίησης του ενζύμου μόνο που το καθαρό ένζυμο εμφανίστηκε πιο ανθεκτικό κατά την επεξεργασία με ΥΠ. Στη συνέχεια μελετήθηκαν οι δομικές μεταβολές του καθαρού ενζύμου μετά από επεξεργασία με ΥΠ με τη φασματοσκοπία του κυκλικού διχροϊσμού. Μικρές μεταβολές στη δευτεροταγή δομή του ενζύμου παρατηρήθηκαν για επεξεργασία στα 2 MPa ενώ σημαντικές μεταβολές στη δομή της PepX για επεξεργασία στα 45 MPa. Όσον αφορά την τριτοταγή δομή του ενζύμου τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντικές μεταβολές στη δομή για συνθήκες επεξεργασίας υψηλότερες των 1 MPa. Τα αποτελέσματα της έρευνας συμβάλλουν στη μελέτη του μηχανισμού αδρανοποίησης του συγκεκριμένου ενζύμου με βάση τις μεταβολές που προκαλούνται στη δομή του σε διάφορες συνθήκες πίεσης και θερμοκρασίας ως συνάρτηση του χρόνου. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Bradford M. (1976). "Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal. Biochem. 72: , [2] Kalit S, Havranek JL, Kaps M, Perko B, Cubric VC. 25. Proteolysis and the optimal ripening time of Tounj cheese. Int J Dairy Technol [3] Katsaros G.I., Giannoglou M.N., Taoukis P.S. (29). Kinetic Study of the Combined Effect of High Hydrostatic Pressure and Temperature on the Activity of L. bulgaricus Aminopeptidases. Journal of Food Science 74 (5), Ε219-Ε225 [4] Mierau, I., E. R. Kunji, K. J. Leenhouts, M. A. Hellendoorn, A. J. Haandrikman, B. Poolman, W. N. Konings, G. Venema, and J. Kok Multiple-peptidase mutants of Lactococcus lactis are severely impaired in their ability to grow in milk. J. Bacteriol. 178: [5] Moatsou G, Massouras T, Kandarakis I and Anifantakis E. 22. Evolution of proteolysis during the ripening of traditional Feta cheese. Le Lait 82: [6] Vesanto, E., K. Savijoki, T. Rantanen, J. L. Steele, and A. Palva An X- prolyl dipeptidyl aminopeptidase (pepx) gene from Lactobacillus helveticus. Microbiol. 141: