Κλασσικές & Σύγχρονες (Ταχείες) Μέθοδοι Μέτρησης Μικροβιακού Φορτίου

Transcript

1 Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Κλασσικές & Σύγχρονες (Ταχείες) Μέθοδοι Μέτρησης Μικροβιακού Φορτίου Παπαδοπούλου Όλγα Αναστάσιος Σταματίου Πασχαλίτσα Τρυφινοπούλου

2 ΜΕΘΟΔΟI ΑΠΑΡΙΘΜΗΣΗΣ ΤΟΥ ΜIΚΡΟΒIΑΚΟΥ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ ΣΤΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Αυξαvόμεvo εvδιαφέρov, σε διεθνή κλίμακα: ταχείες μεθόδοι και εκσυγχρονισμός (αυτoματoπoίηση και απλoπoίηση) στη μικρoβιoλoγία Η κύρια κλασσική μέθοδος απαρίθμησης μικρoβιακoύ φoρτίoυ παύει σήμερα να καλύπτει επαρκώς τις υπάρχoυσες ανάγκες για άμεση ανάλυση δειγμάτων για την εκτίμηση της ποιότητας και τη παρακολούθηση της παραγωγικής διαδικασίας Κύρια πλεονεκτήματα της μεθόδου αυτής είναι η απλότητα, η πρoσαρμoστικότητα και η ευκολία στηv εφαρμογή. Μειονέκτημα αποτελεί η ικανότητα μέτρησης μόvο εκείvωv τωv μικρooργαvισμώv πoυ έχoυv τη δυvατότητα vα σχηματίζoυv απoικίες, δηλαδή να πολλαπλασιάζονται. Η δυνατότητα σχηματισμού αποικιών αποτελεί χαρακτήρα μεταβαλόμεvo και επηρεαζόμεvo από πoλλoύς παράγovτες (εκλεκτικότητα θρεπτικώv υπoστρωμάτωv, θερμoκρασία επώασης παρoυσία παρεμπoδιστικώv παραγόvτωv πoυ «τραυματίζoυv» τα κύτταρα.

3 ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ Στερεά τρόφιμα H πλέov διαδεδoμέvη μέθoδoς δειγματοληψίας τoυ δείγματoς είvαι εκείvη με τηv oπoία εκχυλίζoυμε τoυς μικρooργαvισμoύς από τα τρόφιμα. Αυτό επιτυγχάvεται είτε με έvα μύλo άλεσης τoυ τρoφίμoυ (mechanical blender) είτε με τηv χρήση εvός ειδικoύ oμoγεvoπoιητή (stomacher). Τo στόμαχερ είvαι μια απλή σχετικά συσκευή με τηv oπoία τo δείγμα oμoγεvoπoιείται ήπια μέσα σε απoστειρωμέvες πλαστικές σακκoύλες. Τo στόμαχερ έχει επιβληθεί στηv πράξη σε σχέση με τo μύλo άλεσης γιατί: Δεv χρειάζεται vα τo καθαρίζoυμε όπως συμβαίvει με τo μύλο, Δεv αvαπτύσσει θερμότητα κατά τη διάρκεια της λειτουργίας του (συνήθως 1-2 min), Τo δείγμα μπoρεί vα παραμείvει στις πλαστικές σακούλες στο ψυγείο για μελλοvτική χρήση Προκαλεί λιγότερο θόρυβοo Δεv πρoκαλεί τραυματισμoύς στα κύτταρα τωv μικρoβίωv.

4

5 Μικρoβιoλoγική εξέταση επιφαvειώv Μέθοδος επιχρίσματος (swabbing) Για τον προσδιορισμό του μικροβιακού φορτίου, τo βύσμα βαμβακιού είτε τοποθετείται μέσα σε αποστειρωμένο δοκιμαστικό σωλήνα ο οποίος περιέχει αραιωτικό και ακoλoυθείται η γvωστή διαδικασία τωv διαδoχικώv αραιώσεωv (Swab/Swab-rinse method), είτε μεταφέρεται κατ ευθείαν σε δοκιμαστικούς σωλήνες με κεκλιμένο άγαρ (Swab/agar slant) 5

6 Μικρoβιoλoγική εξέταση επιφαvειώv Μέθοδος τρυβλίων επαφής με άγαρ (contact plate) Ειδικά τρυβλία Petri τα οποία περιέχουν θρεπτικό υπόστρωμα, αναστρέφονται και το υπερυψωμένο στερεοποιημένο υπόστρωμα έρχεται σε άμεση επαφή με την υπό εξέταση επιφάνεια. Τα εκτεθημένα τρυβλία καλύπτονται, επωάζονται και γίνεται καταμέτρηση των αποικιών που σχηματίζονται. Ένα από τα πιο σοβαρά μειονεκτήματα της μεθόδου αυτής είναι η αναποτελεσματικότητά της σε επιφάνειες με υψηλά επίπεδα μόλυνσης.

7 Απαρίθμηση με Petrifilm

8 Απαρίθμηση με Petrifilm

9 Απαρίθμηση με Petrifilm Let top flap down Place spreader with ridge side down onto center of Petrifilm Press center of device

10 Απαρίθμηση με Petrifilm Αποτελέσματα ανάλυσης

11 Α. Κλασσικές μέθοδοι απαρίθμησης μικροβιακού φορτίου Μέθοδος τρυβλίων (standard plate count) Διαδοχικές αραιώσεις (Ringer solution, Buffered Peptone Water, Maximum Recovery Diluent) Επιλεκτικά υποστρώματα (XLD, Palcam, Oxford, CFC, Rose Bengal Chloramphenicol agar, Violet Red Bile Glucose agar) Επιφανειακή εξάπλωση (spread plating) Ενσωμάτωση (pour plating)

12 Α. Κλασσικές μέθοδοι Πλεονεκτήματα: Απλότητα Προσαρμοστικότητα Ευκολία στην εφαρμογή Μειονεκτήματα: Η ικανότητα απαρίθμησης μόνο των κυττάρων εκείνων που σχηματίζουν βιώσιμες αποικίες Απαιτήσεις σε χρόνο, υλικά και εργασία Η μη ικανοποιητική ακρίβεια της μεθόδου που επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες όπως η ορθή εκτέλεση της τεχνικής και η φύση του δείγματος

13 Μέθοδος του περισσότερο πιθανού αριθμού Most Probable Number (MPN) Χρησιμοποιείται κυρίως για την απαρίθμηση χαμηλών πληθυσμών σε υγρά τρόφιμα (π.χ. χυμοί, νερό, κλπ) Μετρά μόνο τα ζωντανά κύτταρα Προϋποθέσεις: 1. Τα βακτήρια είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα στο τρόφιμο (ομοιογενές τρόφιμο) 2. Τα βακτήρια δε σχηματίζουν συσσωματώματα

14 Μέθοδος του περισσότερο πιθανού αριθμού Most Probable Number (MPN)

15

16 Μέθοδος του περισσότερο πιθανού αριθμού Most Probable Number (MPN)

17 Μέθοδος του περισσότερο πιθανού αριθμού Most Probable Number (MPN) Στο αντιστοιχεί το 0.93 και σημαίνει ότι κατά μέσο όρο οι σωλήνες της ενδιάμεσης αραίωσης (10-3 ) περιέχουν 0.93 μικροοργανισμούς. Συνεπώς ο πληθυσμός είναι: 0.93 x 1 ml x 10 3 = 9.3 x 10 2 MPN/ml

18 2 min 2 min Spread plates Petrifilms

19 Α. Κλασσικές μέθοδοι Spiral plate Με τη μέθοδο αυτή το όργανο διανέμει το υγρό εμβόλιο στην επιφάνεια ενός περιστρεφόμενου τρυβλίου. Η εναπόθεση αρχίζει από το κέντρο του τρυβλίου προς την περιφέρεια εναποθέτοντας σταδιακά όλο και λιγότερο εμβόλιο Αποτέλεσμα

20 Σπειροειδής μέθοδος απαρίθμησης

21 Σπειροειδής μέθοδος απαρίθμησης

22 Σπειροειδής μέθοδος απαρίθμησης

23 Αυτόματος καταμετρητής αποικιών

24 Σπειροειδής μέθοδος απαρίθμησης Πλεονεκτήματα - Χρησιμοποιείται λιγότερο άγαρ - Χρησιμοποιούνται λιγότερα τρυβλία - Χρησιμοποιείται από μη ειδικευμένο προσωπικό - Εξοικονόμηση χρόνου Μειονεκτήματα - Τα αιωρούμενα σωματίδια μπορεί να φράξουν το όργανο - Είναι κατάλληλο για υγρά τρόφιμα - Υψηλό αρχικό κόστος

25 Η τεχνική της σταγόνας (Drop plate) (Μέθοδος Miles and Misra) 25

26 Η τεχνική της σταγόνας (Drop plate) (Μέθοδος Miles and Misra) 26

27 Α. Κλασσικές μέθοδοι Χρήση φίλτρων διήθησης (membrane filters) Μεμβράνες με πόρους μικρής διαμέτρου κρατούν τα κύτταρα (π.χ m) Στη συνέχεια η μεμβράνη τοποθετείται σε τριβλίο με άγαρ Ακολουθεί επώαση και απαρίθμηση των μικροοργανισμών Κατάλληλη μέθοδος για μικρό αριθμό κυττάρων Χρησιμοποιείται στην ανάλυση δειγμάτων νερού

28

29

30 B. Σύγχρονες (Ταχείες) μέθοδοι (I) Ανάγκη για: Ταχύτητα λήψης αποτελεσμάτων Ανάλυση μεγάλης ποσότητας δειγμάτων ταυτόχρονα Απλότητα Αυτοματισμός Χαμηλό κόστος Αξιοποίηση μη εξειδικευμένου ανθρώπινου δυναμικού

31 B. Σύγχρονες (Ταχείες) μέθοδοι (ΙΙ) Αποτέλεσμα: Γρήγορος έλεγχος πρώτων υλών, μικρότερη ανάγκη για αποθήκευση-δέσμευση χώρων κεφαλαίων και προσωπικού Γρήγορη διάθεση προϊόντων στην αγορά Δυνατότητα παρακολούθησης ποιότητας, ανίχνευση σφαλμάτων κατά την παραγωγή, διευκόλυνση στον έλεγχος τήρησης κανόνων υγιεινής-συστημάτων διασφάλισης ποιότητας (HACCP)-μικροβιολογικών κριτηρίων-εφαρμογής νομοθεσίας, έγκαιρη απόσυρση προϊόντων

32 Σύγχρονες Μέθοδοι Μέτρησης Μικροβιακού Φορτίου Διακρίνονται σε: Βιοχημικές μεθόδους Βιοφυσικές μεθόδους

33 Σύγχρονες Μέθοδοι Μέτρησης Μικροβιακού Φορτίου Βιοχημικές μέθοδοι: Βιοφθορισμός Μέτρηση καταλάσης Δοκιμή Limulus

34 B. Σύγχρονες (Ταχείες) μέθοδοι (α) Βιοχημικές μέθοδοι Βιοφθορισμός L=Luciferin; Oxy-L=oxy-luciferin; AMP=adenosine monophosphate; PP=phosphate groups Κατώφλι ανίχνευσης ATP: βακτηριακά κύτταρα fg ATP/ml που αντιστοιχεί σε fg: femtogram=10-15 g

35 B. Σύγχρονες (Ταχείες) μέθοδοι (α) Βιοχημικές μέθοδοι Βιοφθορισμός Μειovεκτήματα της μεθόδoυ αυτής απoτελoύv: Η αvάγκη διαχωρισμoύ μικρoβιακoύ-μη μικρoβιακoύ ΑΤΡ, Ο μικρoβιακός πληθυσμός πρέπει vα είvαι μεγαλύτερoς από 104 κύτταρα για vα πάρoυμε απoτελέσματα και Η ετερoγέvεια της μικρoβιακής χλωρίδας τoυ δείγματος (αερόβια - αvαερόβια) oδηγεί σε λαvθασμέvα συμπεράσματα.

36 Ανίχνευση βακτηρίων μέσω χημειοφωταύγειας EnSURE Πλατφόρμα Πολλαπλών Δεικτών Ποιοτικού Ελέγχου Άμεσος έλεγχος υγιεινής μέσω ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (HACCP) Έλεγχος καθαρισμού επιφανειών Έλεγχος νερού TVC Ανίχνευση εντεροβακτηρίων Ανίχνευση E.coli Έλεγχος παστερίωσης

37 ΛΟΥΜΙΝΟΜΕΤΡΙΑ ATP TESTING Επιφάνεια τροφίμου πριν τον καθαρισμό μικροοργανισμοί Υπολ. τροφής

38 ΛΟΥΜΙΝΟΜΕΤΡΙΑ ATP TESTING

39 ΛΟΥΜΙΝΟΜΕΤΡΙΑ Ταχεία ανίχνευση μικροοργανισμών Βασίζεται στην αντίδραση ενζύμων που είναι χαρακτηριστικά για κάθε κατηγορία μικροοργανισμών με εξειδικευμένα υποστρώματα, με συνέπεια την παραγωγή βιοφωταύγειας, η ένταση της οποίας μπορεί να συσχετιστεί με τον πληθυσμό του μικροοργανισμού. Χρησιμοποιείται για ΟΜΧ καθώς και για ορισμένους παθογόνους μικροοργανισμούς (E. coli, Listeria) και δείκτες υγιεινής (coliforms, enterobacteriaceae).

40 Ταχεία ανίχνευση E. coli

41 ΛΟΥΜΙΝΟΜΕΤΡΙΑ Ταχεία ανίχνευση μικροοργανισμών

42 B. Σύγχρονες (Ταχείες) μέθοδοι (α) Βιοχημικές μέθοδοι Μέτρηση καταλάσης (Catalase meter) Η 2 Ο 2 καταλάση Ο 2 + Η 2 Ο (Δίσκοι-αέριο)

43 B. Σύγχρονες (Ταχείες) μέθοδοι (α) Βιοχημικές μέθοδοι Δοκιμή Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Limulus polyphemus

44 LAL test Το Limulus amebocyte lysate (LAL) είναι υδατικό διάλυμα από αμοιβαδοειδή κύτταρα (amoebocytes) που βρίσκονται στην λέμφο του οστρακόδερμου Limulus polyphemus. Η λειτουργία τους είναι αντίστοιχη με αυτή των λευκών αιμοσφαιρίων στα θηλαστικά. Κινούνται με ψευδοπόδια και έχουν σημαντικό ρόλο στην προστασία του οργανισμού από παθογόνους μικροοργανισμούς. Η ουσία LAL αντιδρά με βακτηριακές ενδοτοξίνες καθώς και με λιποπολυσακχαρίτες (LPS) που βρίσκονται στη μεμβράνη των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων και σχηματίζουν πήγμα. Η αντίδραση αυτή είναι η βάση της δοκιμής LAL που χρησιμοποιείται σήμερα ευρέως από τη φαρμακευτική βιομηχανία για την ανίχνευση τοξινών σε φάρμακα. Για την παρασκευή του LAL, αφαιρείται η λέμφος από την περιοχή του περικαρδίου του καβουριού και ακολούθως τα αμοιβαδοειδή κύτταρα απομακρύνονται από τη λέμφο με φυγοκέντρηση. Στη συνέχεια τοποθετούνται μέσα σε απεσταγμένο νερό όπου διογκώνονται και διαρρηγνύονται (λύση του κυττάρου). Τα συστατικά του κυττάρου στη συνέχεια υποβάλλονται σε λυοφυλίωση και αποτελούν την ουσία LAL. Για την ανίχνευση τοξίνης, το υπό εξέταση δείγμα αναμιγνύεται με το LAL και νερό. Η δημιουργία πήγματος σημαίνει την παρουσία βακτηριακών τοξινών.

45 LAL test Μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι η μέθοδος εφαρμόζεται μόνο στα Gram- βακτήρια γιατί τα Gram + δεν έχουν LPS Πλεονέκτημα αποτελεί η θερμική σταθερότητα της ενδοτοξίνης που επιτρέπει τον προσδιορισμό της ακόμα και σε θερμικά επεξεργασμένα τρόφιμα

46 B. Σύγχρονες (Ταχείες) μέθοδοι (β) Βιοφυσικές μέθοδοι Οπτική πυκνότητα Μέθοδος ηλεκτρικής αγωγιμότητας ή αντίστασης Direct Epifluorescence Technique (DEFT)

47 Μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (optical density)

48 L o g ( c f u / m l Μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (optical density) L a g t im e L o o ) g ( N L o g ) ( N A B S A B S= t A B S T i m e ( h ) A b s o r b a n c e ( 5 4

49 Το μήκος κύματος κυμαίνεται από 600 έως 660 nm.

50 B. Σύγχρονες (Ταχείες) μέθοδοι (β) Βιοφυσικές μέθοδοι Μέθοδος ηλεκτρικής αγωγιμότητας ή αντίστασης Καθώς oι μικρooργαvισμoί αvαπτύσσovται σε έvα θρεπτικό μέσo διασπoύv τα συστατικά τoυ τελευταίoυ σε μικρότερoυ Μ.Β. oυσίες με υψηλό φoρτίo με απoτέλεσμα τη μεταβoλή των ηλεκτρικών ιδιοτήτων τoυ μέσoυ

51 Μέτρηση ηλεκτρικής αγωγιμότητας

52 Αγωγιμότητα = 1/R

53 Καμπύλη συσχέτισης αγωγιμότητας με χρόνο Ο χρόνος που απαιτείται για να αναπτυχθεί πληθυσμός κύτταρα/ml ώστε να παρατηρήσουμε μετρήσιμη αλλαγή στην αγωγιμότητα λέγεται χρόνος ανίχνευσης (detection time)

54 Καμπύλη συσχέτισης χρόνου προσδιορισμού βακτηριακού πληθυσμού Ο χρόνος ανίχνευσης είναι αντιστρόφως ανάλογος προς τη συγκέντρωση των μικροοργανισμών στο δείγμα

55 Παράγοντες που επηρεάζουν το αποτέλεσμα της μεθόδου μέτρησης αγωγιμότητας Το θρεπτικό μέσο (i) θρεπτικά υλικά με χαμηλή αρχική ιοντική ισχύ επιτρέπουν μικρές μεταβολές αγωγιμότητας κατά τη διάρκεια της μικροβιακής ανάπτυξης, (ii) η ανεπάρκεια θρεπτικών υλικών στα μέσα ανάπτυξης δυσχεραίνει την μικροβιακή ανάπτυξη και καθυστερεί τη λήψη χρόνου προσδιορισμού Οι ενδογενείς και εξωγενείς παράγοντες του υποστρώματος (θερμοκρασία, ph, aw, συντηρητικά κά) επηρεάζουν τις κινητικές παραμέτρους ανάπτυξης των μικροοργανισμών, όπως ο χρόνος γενεάς καθορίζει εμμέσως και το χρόνο προσδιορισμού Ο μικροοργανισμός Pseudomonas sp.> Enterobacteriaceae > LAB

56 Direct Epifluorescence Filter Technique (DEFT) Η μέθοδος χρησιμοποιεί φθορίζουσες χρωστικές οι οποίες «βάφουν» το DNA ή το RNA των κυττάρων. Ακολουθεί μικροσκοπική παρατήρηση κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία. Η κυριότερη χρωστική είναι το πορτοκαλόχρουν της ακριδίνης (acridine orange) το οποίο όταν «βάφει» το DNA δίνει πράσινο χρώμα, ενώ όταν «βάφει» το RNA δίνει πορτοκαλί χρώμα. Άλλες χρωστικές που χρησιμοποιούνται είναι το Ethidium bromide και το propidium iodide. Οι δύο χρωστικές «βάφουν» τα νουκλεικά οξέα. DNA RNA

57 Direct Epifluorescence Filter Technique (DEFT)

58 Direct Epifluorescence Filter Technique (DEFT) Intact cell PI and FDA is added FDA (Fluorescein diacetate) PI (Propidium iodide) Fluorescein in intact cells Μembrane is damaged, fluorescein leaks out PI enters and strains nucleic acids

59 Direct Epifluorescence Filter Technique (DEFT)

60 Άσκηση

61 Άσκηση counts without counts with OD-without OD with

62 1. Η δοκιμή Limulus (LAL) χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό θερμοανθεκτικών βακτηριακών σπορίων στα τρόφιμα και ανήκει στην κατηγορία των βιοχημικών μεθόδων. 2. Η μέτρηση του μικροβιακού πληθυσμού με τη μέθοδο του περισσότερο πιθανού αριθμού (most probable number, MPN) χρησιμοποιείται για την απαρίθμηση χαμηλών πληθυσμών σε υγρά τρόφιμα. 3. Σε αντίθεση με τις κλασσικές μεθόδους, οι ταχείες δεν μετράνε βακτηριακά κύτταρα, αλλά καταγράφουν τον μεταβολισμό ή άλλα χαρακτηριστικά των μικροοργανισμών. 4. Η τεχνική απαρίθμησης μικροοργανισμών με τη μέθοδο Miles & Misra (τεχνική της σταγόνας) ανήκει στις βιοφυσικές μεθόδους προσδιορισμού του μικροβιακού φορτίου και αποτελεί παραλλαγή της μεθόδου των δεκαδικών αραιώσεων. 5. H μέθοδος Direct Epifluorescence Filter Technique (DEFT) χρησιμοποιεί την φθορίζουσα χρωστική πορτοκαλόχρουν της ακριδίνης, η οποία βάφει το DNA και το RNA των μικροοργανισμών και στη συνέχεια τα κύτταρα προσδιορίζονται μικροσκοπικά κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία.

63 Δειγματοληψία τροφίμου 2 ο Εργαστήριο

64

65 Δειγματοληψία τροφίμου 2 ο Εργαστήριο O συνολικός αριθμός μικροοργανισμών ικανών να σχηματίσουν αποικίες (colony forming units) Η απαρίθμηση του ακριβούς αριθμού των μικροοργανισμών στα τρόφιμα καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τη λήψη αντιπροσωπευτικού δείγματος του τροφίμου Τεχνικές μέτρησης του μικροβιακού πληθυσμού στα τρόφιμα Μέθοδος δεκαδικών αραιώσεων Ο εμβολιασμός του βακτηριακού εναιωρήματος στο θρεπτικό υπόστρωμα γίνεται με δύο ποσοτικές τεχνικές Τεχνική επιφανειακής Τεχνική ενσωμάτωσης (pour επίστρωσης (spread plating) plating) 0.1 ml (100μl) 1 ml (1000μl)

66

67 Η μέθοδος των διαδοχικών αραιώσεων βασίζεται στην παραδοχή ότι ένα βακτηριακό κύτταρο ή μία ομάδα κυττάρων δημιουργεί μια αποικία. Έτσι, ο αριθμός των αποικιών που αναπτύσσονται αντιπροσωπεύει τον πραγματικό μικροβιακό πληθυσμό. Κατά τη μικροβιολογική ανάλυση, στην περίπτωση όπου το δείγμα είναι στερεό, θα πρέπει πρώτα να ομογενοποιηθεί με τη βοήθεια ενός υγρού μέσου, ώστε να σχηματιστεί εναιώρημα, στον όγκο του οποίου θα είναι πρακτικά ομοιόμορφη η κατανομή των μικροοργανισμών. Στη μέθοδο των δεκαδικών αραιώσεων η μεταφορά του δείγματος από την προηγούμενη αραίωση στην μικρότερη γίνεται με πιπέτα όγκου 100 μl Η τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης αφορά στην εξάπλωση γνωστού όγκου (100 μl) βακτηριακού εναιωρήματος σε στερεό θρεπτικό υλικό και εφαρμόζεται στους αερόβιους και προαιρετικά αερόβιους μικροοργανισμούς. Η τεχνική της ενσωμάτωσης εφαρμόζεται στους μικροαερόφιλους και υποχρεωτικά αναερόβιους μικροοργανισμούς.

68 Στη μέθοδο των δεκαδικών αραιώσεων η μεταφορά του δείγματος από την μεγαλύτερη αραίωση στην μικρότερη γίνεται με πιπέτα (pipette) όγκου 100 μl. Η συσκευή ομογενοποίησης (Stomacher) χρησιμοποιείται για την ομοιόμορφη διασπορά των μικροοργανισμών ενός υγρού δείγματος που έχει διαλυθεί σε ένα αραιωτικό διάλυμα. Στον παρακάτω πίνακα σημειώστε τη τεχνική που εφαρμόζουμε ανάλογα με το μικροοργανισμό που θέλουμε να απαριθμήσουμε: Μικροοργανισμός Ολική μεσόφιλη χλωρίδα Ζύμες/μύκητες Εντεροβακτήρια Ψευδομονάδες Γαλακτικά βακτήρια Brochothrix thermosphacta (1) Επιφανειακή επίστρωση, (2) Ενσωμάτωση

69 1. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη/επιβίωση των μικροοργανισμών στα τρόφιμα διακρίνονται σε (α) ενδογενείς (π.χ. ph, aw, δυναμικό οξειδωαναγωγής, δομή) και (β) εξωγενείς (π.χ. θερμοκρασία, αέρια ατμόσφαιρα, υγρασία) 2. Οι τεχνικές συντήρησης που βασίζονται στην αφυδάτωση, συμπύκνωση και κατάψυξη σκοπό έχουν να καταστήσουν το νερό μη διαθέσιμο από τους μικροοργανισμούς 3. Τρόφιμα με χαμηλή αλατοπεριεκτικότητα είναι δυνατόν να χαρακτηρίζονται από χαμηλή τιμή ενεργότητας νερού 4. Ως ενεργότητα νερού ορίζεται η παράμετρος που εκφράζει την ποσότητα νερού στο τρόφιμο που είναι διαθέσιμη για τις ανάγκες ανάπτυξης των μικροοργανισμών 5. Τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια έχουν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε χαμηλότερη τιμή ενεργότητας ύδατος σε σχέση με τα Gram θετικά

70 6. Αλόφιλοι χαρακτηρίζονται οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται σε μεγάλες συγκεντρώσεις άλατος. 7. Το δυναμικό οξειδοαναγωγής στο εσωτερικό μεγάλων τεμαχίων κρέατος είναι θετικό με αποτέλεσμα να αναπτύσσονται μόνο αναερόβιοι μικροοργανισμοί 8. Υποχρεωτικά αναερόβιοι μικροοργανισμοί είναι αυτοί που αναπτύσσονται σε τρόφιμα με πολύ υψηλό Eh (πχ σε κονσέρβες, ή τρόφιμα συσκευασμένα σε κενό). 9. Οι αερόβιοι μικροοργανισμοί είναι αυτοί που αναπτύσσονται σε τρόφιμα με θετικό δυναμικό οξειδοαναγωγής (Eh) 10. Οι ζύμες και οι μύκητες αναπτύσσονται σε μεγαλύτερο εύρος ενεργότητας νερού σε σχέση με τα βακτήρια

71 11. Σε συνθήκες ανάπτυξης των μικροοργανισμών, η μείωση της θερμοκρασίας συνεπάγεται μείωση της φάσης προσαρμογής και αύξηση του ρυθμού ανάπτυξης 12. Η καμπύλη αύξησης ενός βακτηρίου περιλαμβάνει τρείς φάσεις, (α) τη φάση προσαρμογής, (β) τη φάση εκθετικής αύξησης, και (γ) τη φάση θανάτου του μικροοργανισμού 13. Κατά τη φάση προσαρμογής ενός μικροοργανισμού παρατηρείται έντονη ανάπτυξη καθώς ο μικροοργανισμός προσαρμόζει τη φυσιολογία και τις βιοχημικές του λειτουργίες ώστε να ανταποκριθεί στις νέες περιβαλλοντικές συνθήκες 14. Ο χρόνος διπλασιαμού ενός βακτηριακού κυττάρου περιγράφεται από την εξίσωση. Να εξηγήσετε τι σημαίνουν οι όροι της εξίσωσης. GT=.. N t = N 0 = t =. GT = 0,3 t log N log N t 0 = 0, = 18min

72 15. Οι κυτταρικές μεμβράνες των βακτηρίων είναι αδιαπέρατες στα ιόντα Η+ και ΟΗ-, ενώ ταυτόχρονα έχουν μηχανισμούς για την αποβολή των ιόντων Η Το ph στο εσωτερικό των βακτηριακών κυττάρων είναι περίπου 7,0 με εξαίρεση π.χ. τα κύτταρα των ζυμών όπου η τιμή του ph είναι στο 5,8 17. Το γαλακτικό οξύ παρουσιάζει αντιμικροβιακή δράση εναντίον σπορογόνων και μη βακτηρίων, ενώ σε υψηλότερες συγκεντρώσεις είναι δραστικό και κατά των ζυμών και μυκήτων. 18. Σε ένα τρόφιμο με σχετικά χαμηλό ph (π.χ. 4,0) θα πρέπει να επιλέξουμε για τη συντήρησή του ένα οργανικό οξύ με τιμή pka μικρότερη από την τιμή του ph του τροφίμου, ώστε το μεγαλύτερο μέρος του οξέως να είναι σε αδιάστατη μορφή και επομένως να παρουσιάζει αντιμικροβιακή δράση.