ΕΡΓΑΣΗΡΙΑΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ ΓΙΑ ΣΙ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕ ΠΑΡΑΜΕΣΡΟΤ ΚΑΙ ΣΗ ΛΕΓΕΩΝΕΛΛΑ

Transcript

1 ΕΡΓΑΣΗΡΙΑΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ ΓΙΑ ΣΙ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕ ΠΑΡΑΜΕΣΡΟΤ ΚΑΙ ΣΗ ΛΕΓΕΩΝΕΛΛΑ Κατςιαφλάκα Άννα Ιατρόσ Βιοπαθολόγοσ, Msc ςτη Δημόςια Τγεία Σεχνική υπεφθυνοσ Μικροβιολογικοφ Σομζα ΠΕΔΤ Θεςςαλίασ

2 Νομοθεςία-Μικροβιολογικζσ αναλφςεισ Πόςιμο νερό (ΚΤΑ Τ2/2600/2001) ΟΜΧ, T. coliforms, E. coli, Enterococci spp., C. perfrigens (επιφανειακά) Νερά γεϊτρηςησ, πηγάδια, πηγζσ ΟΜΧ, T. coliforms, E. coli, Enterococci spp., C. (ΚΤΑ Τ2/2600/2001) perfrigens (επιφανειακά) Ακτζσ κολφμβηςησ (ΤΑ 2006/7/ΕΚ) E. coli, Enterococci spp. Επιφανειακά νερά (ΤΑ 2006/7/ΕΚ) Εμφιαλωμζνα νερά (νομοθεςία ανάλογα με το δείγμα) Νερά αναψυχήσ (ΤΔ Γ1/443/1973, ΔΤΓ2/οικ.90361/ ) Δίκτυο νοςοκομείων (ΚΤΑ Τ2/2600/2001, ΔΤΓ2/οικ.90361/ ) E. coli, Enterococci spp. ΟΜΧ, T. coliforms, E. coli, Enterococci spp., P. aeruginosa, C. perfrigens ΟΜΧ, T. coliforms, E. coli Enterococci spp., P. aeruginosa, S. aureus, Legionella spp.: Όταν ζητηιοφν ΟΜΧ, T. coliforms, E. coli, Enterococci spp. P. aeruginosa, Legionella spp.: Όταν ζητηιοφν

3 Ειδικζσ περιπτώςεισ επιπλζον. Cryptosporidium spp. Giardia spp. Salmonella spp. Shigella spp. Campylobacter spp. Ιοί

4

5 Ολική Μεςόφιλη Χλωρίδα (Μζθοδοσ ενςωμάτωςησ ΕΛΟΤ ΕΝ ISO 6222:2000) Τεχνικθ ενςωμάτωςησ διαδοχικών αραιώςεων Θρεπτικό υλικό Water Plate Count Agar Επϊαςη Πόςιμα: 36±2 C για 44±4h & 22±2 C για 68±4h Φυςικά μεταλλικά:36±2 C για 24±2h Κολυμβθτικζσ δεξαμενζσ: 36±2 C για 21±3h Αξιολόγηςη Καταμζτρθςθ όλων των αποικιών

6 Ολικά κολοβακτηριοειδή (Μζθοδοσ διήθηςησ μεμβρανών ΕΛΟΤ ΕΝ ISO :2000) Όγκοσ διθιηςησ 100ml Θρεπτικό υλικό/επϊαςη Lactose TTC agar ςτουσ 36±2 C για 21±3h Αξιολόγηςη Κίτρινεσ ι κιτρινο-πορτοκαλί αποικίεσ με ανάπτυξθ κίτρινου χρώματοσ κάτω από μεμβράνθ Επιβεβαιωτικζσ α/α ςε Tryptone Soya Agar ςτουσ 36±2 C για 21±3h Οξειδάςθ αρνθτικζσ

7 E. coli (Μζθοδοσ διήθηςησ μεμβρανών ΕΛΟΤ ΕΝ ISO :2000) Όγκοσ διθιηςησ 100ml Θρεπτικό υλικό/επϊαςη Lactose TTC agar ςτουσ 44±0.5 C για 21±3h Αξιολόγηςη Επιβεβαιωτικζσ Κίτρινεσ ι κιτρινο-πορτοκαλί αποικίεσ με ανάπτυξθ κίτρινου χρώματοσ κάτω από μεμβράνθ α/α ςε Tryptone Soya Agar ςτουσ 36±2 C για 21±3h Οξειδάςθ αρνθτικζσ Έλεγχοσ για παραγωγι ινδόλθσ και παρουςία β-γλυκουρονιδάςθσ

8 Enterococci spp. (Μζθοδοσ διήθηςησ μεμβρανών ΕΛΟΤ ΕΝ ISO :2001 ) Όγκοσ διθιηςησ 100ml Θρεπτικό υλικό/επϊαςη Slanetz & Bartley ςτουσ 36±2 C για 44±4h Αξιολόγηςη Κόκκινεσ, βυςςινί, ροη αποικίεσ Επιβεβαιωτικζσ Μεταφορά μεμβράνθσ ςε Bile-Esculin-Azide agar και επώαςθ (44±0.5 C για 2h) Καςτανοκίτρινεσ ωσ μαφρεσ αποικίεσ

9 Clostridium perfrigens (Μζθοδοσ διήθηςησ μεμβρανών ΚΥΑ Υ2/2600/2001) Όγκοσ διθιηςησ 50 θ 100ml Θρεπτικό υλικό/επϊαςη m-cp agar ςτουσ 44±1 C για 21±3h αναεροβίωσ Αξιολόγηςη Κίτρινεσ αποικίεσ Επιβεβαιωτικζσ Ροη ι κόκκινεσ αποικίεσ μετά τθν ζκκεςθ ςε ατμοφσ υδροξειδίου του αμμωνίου

10 Pseudomonas aeruginosa (Μζθοδοσ διήθηςησ μεμβρανών ΕΛΟΤ ΕΝ ISO 16266:2009 ) Όγκοσ διθιηςησ 100 θ 250ml Θρεπτικό υλικό/επϊαςη Pseudomonas agar base+supl. CN ςτουσ 36±2 C για 44±4h Αξιολόγηςη Πράςινεσ, φκορίηουςεσ, καςτανζρυκρεσ αποικίεσ Επιβεβαιωτικζσ α/α ςε Nutrient agar & επώαςθ ςτουσ 36±2 C για 21±3h Acetamide Broth+Nessler King s B medium-επϊαςη ωσ και 5 ημζρεσ

11 Legionella spp. (Μζθοδοσ διήθηςησ μεμβρανών ISO 11731:1998) Όγκοσ δείγματοσ 500ml Επεξεργαςία υμπφκνωςθ και διαίρεςθ ςε 4 μζρθ του αρχικοφ δείγματοσ Θρ. Τλικό/Επϊαςη GVPC ςτουσ 36±1 C για 10d Αξιολόγηςη Γκρι αποικίεσ Επιβεβαιωτικζσ α/α ςε BCYE & BCY agar 36±1 C για 48h Latex agglutination test

12 Legionella spp.

13 Cryptosporidium spp.-giardia spp. (US EPA Method 1623) Όγκοσ δείγματοσ lt υλλογή δείγματοσ: - Επιφανειακά φδατα 10lt - Πόςιμο 100lt Συλλογθ με προςαρμογθ φίλτρου ςτη βρφςη υμπφκνωςη δείγματοσ με φίλτρο Ζκλουςη φίλτρου ςε τελικό όγκο ml Φυγοκζντρηςη δείγματοσ Immunomagnetic Separation (IMS) beads Fluorescein isothiocyanate (FITC) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining Differential interference contrast (DIC) microscopy

14 Salmonella spp.-shigella spp. (Μζθοδοσ διήθηςησ μεμβρανών ISO 19250:2010) Όγκοσ δείγματοσ 1lt-Ποιοτικι μζκοδοσ Θρεπτικό υλικό/επϊαςη Αξιολόγηςη Buffered Peptone Water ςτουσ 36±2 C για 18±2h Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichement Broth ςτουσ 41±0.5 C για 21±3h XLD, BGA 36±2 C για 21±3h Salmonella spp.: XLD-μαφρεσ/BGA-ροη Shigella spp: XLD-διαφανείσ Επιβεβαιωτικζσ α/α ςε Nutrient agar & επώαςθ ςτουσ 36±2 C για 21±3h Οξειδάςθ/Βιοχθμικζσ δοκιμαςίεσ

15 Campylobacter spp. (Μζθοδοσ διήθηςησ μεμβρανών ISO 17995:2005) Όγκοσ δείγματοσ 1lt-Ποιοτικι μζκοδοσ Θρεπτικό υλικό/επϊαςη Αξιολόγηςη Preston Broth & Bolton Broth ςτουσ 36±1 C για 44±4h ςε μικροαερόφιλεσ ςυνκικεσ nccda ςτουσ 41±0.5 C για 44±4h ςε μικροαερόφιλεσ ςυνκικεσ Ύποπτεσ αποικίεσ Επιβεβαιωτικζσ α/α ςε μθ εκλεκτικό κρ. υλικό & επώαςθ ςτουσ 41.5±0.5 C για 21±3h ςε αερόβιεσ και μικροαερόφιλεσ ςυνκικεσ Ανάπτυξθ μόνο ςε μικροαερόφιλεσ ςυνκθκεσ Gram/Βιοχθμικζσ δοκιμαςίεσ

16 Ιοί: Μοριακή ανίχνευςη Hepatitis A Virus Norovirus Rotavirus Adenoviruses Enteroviruses Αρχή μεθόδων: υμπφκνωςθ δείγματοσ Extraction ιικοφ DNA από το ςυμπυκνωμζνο δείγμα Π.Ε.Δ.Τ. Θεςςαλίασ: Ανίχνευςθ ςε κλινικά δείγματα Υπό ανάπτυξθ για νερά

17 ΔΕΙΚΣΗ ΟΓΚΟ ΔΕΙΓΜΑΣΟ ΑΠΟΣΕΛΕΜΑ Ε. Ολικι μεςόφιλθ χλωρίδα 2ml 24,48 ι 72h Ολικά κολοβακτθριοειδι 100ml 1-2d E. coli 100ml 3d Enterococci spp. 100ml 2d Clostridium perfringens 50 ι 100ml 2d Pseudomonas aeruginosa 100 ι 250ml Εωσ και 5d Legionella spp. 500ml 12d Cryptosporidium spp., Giardia spp. Salmonella spp. Shigella spp. υμπεραςματικά 10 ι 100lt 2d Campylobacter spp. 1lt 6d Ιοί Είδοσ δείγματοσ 2d 1lt 5d

18 υμπεραςματικά ΕΙΔΟ ΔΕΙΓΜΑΣΟ ΑΠΑΙΣΟΤΜΕΝΟ ΧΡΟΝΟ Πόςιμο νερό 3-4d Νερά γεϊτρηςησ, πηγάδια, πηγζσ 3-4d Ακτζσ κολφμβηςησ 3-4d Επιφανειακά νερά 3-4d Εμφιαλωμζνα νερά 5-6d Νερά αναψυχήσ 3-4d 5-6d αν ηθτθκεί P. aeruginosa 12d αν ηθτθκεί Legionella Δίκτυο νοςοκομείων 3-4d 5-6d αν ηθτθκεί P. aeruginosa 12d αν ηθτθκεί Legionella

19 υμπεραςματικά

20

21