ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ»

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ» ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΒΙΒΑΣΗΣ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΣΕ ΠΑΙΔΙΑ ΜΕ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΑΥΞΗΣΗΣ ΕΙΡΗΝΗ ΚΩΣΤΟΠΟΥΛΟΥ Παιδίατρος ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2013

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Ε. ΓΚΡΕΚΑ-ΣΠΗΛΙΩΤΗ Καθηγήτρια Παιδιατρικής-Ενδοκρινολογίας Υπεύθυνη της Μονάδας Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας και Διαβήτη της Παιδιατρικής Κλινικής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. ΘΕΟΔΩΡΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΙΔΗΣ Καθηγητής Παθολογίας-Ενδοκρινολογίας Παθολογικής Κλινικής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΚΑΡΑΜΑΝΟΣ Καθηγητής Βιοχημείας και Οργανικής Βιοχημικής Ανάλυσης Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Ε. ΓΚΡΕΚΑ-ΣΠΗΛΙΩΤΗ Καθηγήτρια Παιδιατρικής-Ενδοκρινολογίας Υπεύθυνη της Μονάδας Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας και Διαβήτη της Παιδιατρικής Κλινικής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. ΘΕΟΔΩΡΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΙΔΗΣ Καθηγητής Παθολογίας-Ενδοκρινολογίας Παθολογικής Κλινικής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΚΑΡΑΜΑΝΟΣ Καθηγητής Βιοχημείας και Οργανικής Βιοχημικής Ανάλυσης Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών ΚΥΡΙΑΚΟΣ ΚΥΠΡΑΙΟΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακολογίας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΕΛΕΝΗ ΠΑΠΑΔΑΚΗ-ΠΕΤΡΟΥ Kαθηγήτρια Ανατομικής-Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΔΙΟΝΥΣΙΟΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ Επίκουρος Καθηγητής Μακροσκοπικής-Μικροσκοπικής Ανατομικής με εξειδίκευση στο Μυοσκελετικό Σύστημα Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΔΙΟΝΥΣΙΟΣ ΧΡΥΣΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Παιδιατρικής, Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας - Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 2

3 Στους γονείς μου, Παναγιώτη και Σοφία 3

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Ερευνητικό Εργαστήριο της Μονάδας Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας και Διαβήτη της Παιδιατρικής Κλινικής της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών, με υπεύθυνη Εργαστηρίου την Καθηγήτρια Βασιλική Ε. Γκρέκα-Σπηλιώτη. Επιθυμώ να ευχαριστήσω θερμά όλους εκείνους που συνέβαλαν στην ολοκλήρωσή της. Πρωτίστως, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στην καθηγήτριά μου και επιβλέπουσα της διδακτορικής μου διατριβής Καθηγήτρια Βασιλική Ε. Γκρέκα- Σπηλιώτη, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε κατά την ανάθεση της συγκεκριμένης ερευνητικής εργασίας. Η ερευνητική αυτή δουλειά υπήρξε το έναυσμα ώστε να γνωρίσω και να εργασθώ σε ένα άκρως ενδιαφέρον ερευνητικό περιβάλλον, που αποτέλεσε την αφετηρία για τη γενικότερη ερευνητική μου δραστηριότητα. Επίσης, την ευχαριστώ θερμά για τη συνεχή καθοδήγηση, την υποστήριξη και αμέριστη συμπαράσταση καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής αυτής διατριβής, από τη στιγμή της ανάθεσης έως την τελική διόρθωση του εκπονήματος. Οι συμβουλές της υπήρξαν πάντα γόνιμες και εποικοδομητικές και η συμβολή της πολύτιμη στην επίλυση κάθε ανακύπτοντος ζητήματος. Η ίδια υπήρξε πάντοτε για εμένα πρότυπο ιατρού, καθηγήτριας και ερευνήτριας, με έκδηλα τα στοιχεία της ανθρωπιάς και του επαγγελματισμού, η δε συνεργασία μας υπήρξε πρότυπο διαπροσωπικής κι επαγγελματικής σχέσης. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τους κ.κ. Θ. Αλεξανδρίδη, Καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, Ν. Καραμάνο, Καθηγητή του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών, Κ. Κυπραίο, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, Ε. Παπαδάκη, Καθηγήτρια του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, Δ. Παπαχρήστου, Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών και Δ. Χρύση, Αναπληρωτή καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την ευγένεια και την προθυμία να συμμετάσχουν στην ερευνητική αυτή προσπάθεια ως μέλη της Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής. Η συμμετοχή τους αποτελεί ιδιαίτερη τιμή για εμένα. Ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω την κα Andrea Paola Rojas Gil, Μοριακή Βιολόγο του Ερευνητικού Εργαστηρίου της Μονάδας Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας και Διαβήτη, για την καθοδήγηση, τις εύστοχες υποδείξεις και τη βοήθειά της στην επεξεργασία κι ερμηνεία των ερευνητικών ευρημάτων. Ευχαριστώ την κα Αλεξία Καρβέλα, Μεταδιδακτορική Μοριακή Βιοχημικό του εργαστηρίου όπου πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα της παρούσας εργασίας, για τη διδασκαλία των εργαστηριακών τεχνικών και τη σημαντική καθοδήγηση και συμβολή της στη διεκπεραίωση του ερευνητικού μου έργου. Ευχαριστώ επίσης όλα τα μέλη του εργαστηρίου που εργάστηκαν συγχρόνως στον ίδιο χώρο για την ευγένεια και τη συναδελφικότητα που επέδειξαν, παρέχοντας ένα ευχάριστο και αξιοπρεπές περιβάλλον συνεργασίας. 4

5 Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω θερμά την οικογένειά μου, και ιδιαιτέρως τους γονείς μου, για την ενθάρρυνση και τη διακριτική, αλλά ουσιαστική υποστήριξή τους, όχι μόνο κατά τη διάρκεια της υλοποίησης της παρούσας εργασίας, αλλά σε όλα τα στάδια της ζωής μου και της επαγγελματικής μου πορείας. 5

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ. 10 SUMMARY...12 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 : Η ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ Η ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΕΚΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΑΠΟ ΤΗΝ ΥΠΟΦΥΣΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΡΥΘΜΙΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΕΚΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΣΩΜΑΤΙΚΗ ΑΥΞΗΣΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΥΔΑΤΑΝΘΡΑΚΩΝ, ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪ- ΝΩΝ, ΤΩΝ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΩΝ ΡΥΘΜΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΡΟΠΟΙ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ Ο ΙΝΣΟΥΛΙΝΟΜΟΡΦΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ Ι Ο ΙΝΣΟΥΛΙΝΟΜΟΡΦΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ ΙΙ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΑΥΞΗΣΗΣ ΑΙΤΙΑ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ..43 6

7 1.12 ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΟΝΤΟΤΗΤΕΣ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΑΥΞΗΣΗΣ ΚΛΑΣΣΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΙΚΗ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗ ΙΔΙΟΠΑΘΕΣ ΚΟΝΤΟ ΑΝΑΣΤΗΜΑ ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΑΝΤΙΣΤΑΣΗΣ ΣΤΗΝ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ ΣΥΝΔΡΟΜΟ LARON ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΤΟΥ STAT5b ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΣΤΟΝ ΑΞΟΝΑ IGF-I ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΒΙΟΑΝΕΝΕΡΓΗ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ (BIOINACTIVE GΗ) ΔΙΑΤΑΡΑΧΗ ΣΤΗ ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ (GROWTH HORMONE TRANSDUCTION DEFECT / GHTD) ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ GHTD Η ΔΙΑΤΑΡΑΓΜΕΝΗ ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΟΙ ΠΡΟΕΚΤΑΣΕΙΣ ΤΗΣ ΣΤΙΣ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΕΣ ΔΙΕΡΓΑΣΙΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΚΡΙΣΗΣ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΟΝΤΟΤΗΤΩΝ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΑΥΞΗΣΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΗ ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΩΡΗ ΕΚΚΡΙΣΗ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ IGF-I (IGF-I GENERATION TEST)...64 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 : Ο ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ Η ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ GH (GHR) ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ GHR Η ΔΕΣΜΕΥΤΙΚΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ ΤΗΣ GH ΣΥΝΘΕΣΗ, ΩΡΙΜΑΝΣΗ ΚΑΙ ΕΝΔΟΚΥΤΤΩΣΗ ΤΟΥ GHR ΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΤΟΥ GHR ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΗΣ ΟΥΒΙΚΟΥΙΤΙΝΗΣ ΟΥΒΙΚΟΥΙΤΙΝΥΛΙΩΣΗ Η ΑΝΑΚΥΚΛΩΣΗ ΤΟΥ GHR Ο ΔΙΜΕΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ GHR..75 7

8 2.7 ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΩΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΣΤΗΝ GH ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΑ ΑΠΟ ΤΗΝ GH ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ JAK/STAT ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ Ras/Raf/MEK/ERK (Ή ΤΗΣ MAPK ΚΙΝΑΣΗΣ) ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ PI3K/Akt ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΗΣ PHOSPHOLIPASE C (PLC)/PKC/Ca ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ IRS (INSULIN RECEPTOR SUBSTRATES) ΚΑΙ Η PI3 ΚΙΝΑΣΗ..88 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 : ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ ΤΗΣ GH ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ GHR Η ΟΥΒΙΚΟΥΙΤΙΝΥΛΙΩΣΗ ΩΣ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΟΥ GHR H ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ GHR ΔΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ ΑΡΝΗΤΙΚΩΝ ΡΥΘΜΙΣΤΩΝ Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ SOCS ΤΡΟΠΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ SOCS Η ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΚΑΙ ΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ SOCS ΦΩΣΦΑΤΑΣΕΣ SIGNAL REGULATORY PROTEIN (SIRP) ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΟΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΩΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ STAT (PIAS) Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ β-transducing REPEAT-CONTAINING PROTEIN Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ p Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ STAT3 ΣΤΗ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΚΑΙ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ GH 107 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 : ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΟΥ EGF/EGFR Η ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ GH ΜΕ ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΟΥ EGF/EGFR ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΑΞΟΝΑ EGF/EGFR AΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ

9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΣΚΟΠΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 : ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ GHTD ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΛΗΨΗ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ ΕΠΑΓΩΓΕΣ ΜΕ GH ΚΑΙ EGF ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΣΥΓΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ RNA ΚΑΙ REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟ RNA (INTERFERENCE RNA CIS).146 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 : ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Α ΜΕΡΟΣ) ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ ΤΗΣ GH ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΕ 200 ng/ml hgh, ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΚΑΙ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥ ΡΥΘΜΙΣΤΗ CIS ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΕ 200 ng/ml hgh ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΕΝΤΟΠΙΣΗΣ ΤΩΝ ΑΡΝΗΤΙΚΩΝ ΡΥΘΜΙΣΤΩΝ CIS ΚΑΙ p21 ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΑΓΩΓΕΣ ΜΕ 200 ng/ml hgh ΚΑΙ 1000 ng/ml hgh (B ΜΕΡΟΣ) ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΤΩΝ ΑΡΝΗΤΙΚΩΝ ΡΥΘΜΙΣΤΩΝ ΤΟΥ ΣΕ ΒΑΣΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΜΗ ΕΠΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΕ 200mg/dl hgh (15 min), ΠΡΙΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ sirna CIS (Γ ΜΕΡΟΣ) ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΤΩΝ ΑΡΝΗΤΙΚΩΝ ΡΥΘΜΙΣΤΩΝ ΤΟΥ, ΣΕ ΒΑΣΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΜΗ ΕΠΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΑΓΩΓΕΣ ΓΙΑ 15min ΜΕ: 200mg/dl hgh (GH200), 1000mg/dl hgh (GH1000) ΚΑΙ 15nM EGF (EGF) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 : ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ..193 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ.207 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΗ.231 9

10 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η Αυξητική ορμόνη παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγεννητική κατά μήκος αύξηση, στη σκελετική ανάπτυξη, στο μεταβολισμό πρωτεϊνών, λιπών και υδατανθράκων, στην οστική ανακύκλωση και την ανοσιακή λειτουργία. Διαταραχή στην έκκριση ή στη δράση της ορμόνης στα παιδιά προκαλεί, μεταξύ άλλων, ανεπάρκεια αύξησης. Έχουν περιγραφεί αρκετές κλινικές οντότητες ανεπάρκειας αύξησης, που οφείλονται κυρίως σε διαταραχές στην υποφυσιακή έκκριση GH, στην 24ωρη αυθόρμητη έκκριση της GH, στον αριθμό ή τη λειτουργία των υποδοχέων GHR, στη μετά τον υποδοχέα μεταβίβαση του σήματος της GH και στη σύνθεση ή δράση του IGF-I. Η παρούσα μελέτη εξέτασε έναν ασθενή με Διαταραχή στη Μεταγωγή του Σήματος της GH (Growth Hormone Transduction Defect/GHTD). Η οντότητα αυτή χαρακτηρίζεται από σοβαρό κοντό ανάστημα με φυσιολογικές δοκιμασίες φαρμακολογικής πρόκλησης, φυσιολογικές τιμές 24ωρης έκκρισης GH, χαμηλά επίπεδα IGF-I, διαταραχή στη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα STAT3 και υπερέκφραση του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου p21. Επιπλέον, οι ασθενείς με GHTD παρουσιάζουν σημαντικά αυξημένα επίπεδα IGF-I μετά από επαγωγή με hgh κατά τo IGF-I generation test και σημαντική αναπλήρωση αύξησης μετά από θεραπεία με hgh. Επίσης, χαρακτηρίζονται από απουσία μεταλλάξεων στην πρωτεΐνη STAT3, στον υποδοχέα GHR και στο γονίδιο GH1. Χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών από ούλα του προς μελέτη ασθενή κι ενός μάρτυρα. Μελετήθηκαν σηματοδοτικά μόρια του μεταγωγικού μονοπατιού της GH και του μονοπατιού αρνητικής ρύθμισης, και διερευνήθηκε ο ρόλος της πρωτεΐνης CIS στην παθολογική μεταβίβαση του σήματος της GH στον ασθενή, καθώς και η επίδραση της καταστολής του γονιδίου CIS στη σηματοδότηση της GH. Επίσης, διερευνήθηκε η πιθανή διασυνομιλία ανάμεσα στα σηματοδοτικά μονοπάτια της GH και του EGF, καθώς και ο ρόλος της διασυνομιλίας αυτής στην αποκατάσταση της φυσιολογικής σηματοδότησης της GH και, κατ επέκταση, στην κλινική ανταπόκριση μετά από θεραπεία με εξωγενώς χορηγούμενη ανθρώπινη βιοσυνθετική ορμόνη, παιδιών με GHTD. Η πρωτεϊνική έκφραση των μελετηθέντων πρωτεϊνών μελετήθηκε με ανοσοαποτύπωση κατά Western, η κυτταρική εντόπισή τους με ανοσοφθορισμό και η διαντίδραση ορισμένων από τις πρωτεΐνες με ανοσοσυγκατακρήμνιση. Τα ευρήματα της εργασίας στοιχειοθετούν την αρχική υπόθεση ότι η διαταραγμένη μεταβίβαση του σήματος της GH στα παιδιά με GHTD διαμεσολαβείται μέσω της υπερέκφρασης της ουβικουιτινυλιωμένης μορφής της πρωτεΐνης CIS, η οποίθα προκαλεί ραγδαία και εκσεσημασμένη μεταφορά του GHR στο πρωτεάσωμα για αποδόμηση. Τα αποτελέσματα επίσης έδειξαν ότι η αποκατάσταση της φυσιολογικής σηματοδότησης της GH μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS περιλαμβάνει την επαναφορά του GHR στην κυτταροπλασματική μεμβράνη για φυσιολογική ενεργοποίηση από την GH, καθώς και την ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του EGFR. Επιπροσθέτως, υπάρχει έντονη διασυνομιλία μεταξύ των σηματοδοτικών μονοπατιών της GH και του EGF κατά τη χορήγηση εξωγενούς hgh στα παιδιά με 10

11 GHTD, με αποτέλεσμα την επιτάχυνση της αύξησης που παρατηρείται στα παιδιά αυτά μετά από θεραπεία με hgh. 11

12 SUMMARY Growth Hormone (GH) plays an important role in postnatal linear growth, skeletal development, protein, lipid and carbohydrate metabolism, bone turnover and immune function. Defects in the GH secretion and function in children can cause growth retardation. Several clinical entities of growth retardation have been described, including defects in pituitary GH secretion, spontaneous 24h GH secretion, GH receptor number or function, post-receptor signaling and IGF-I synthesis or function. In this study, one patient with Growth Hormone Transduction Defect (GHTD) was studied. GHTD is characterized by severe short stature with normal provoked and spontaneous GH secretion, low IGF-I concentrations, impaired phosphorylation of the transcriptional factor STAT3 and overexpression of the cyclin-dependent kinase inhibitor, p21. Furthermore, GHTD patients have significantly increased IGF-I concentrations after induction with hgh during the IGF-I generation test, and significant catch-up growth after hgh therapy. No mutations were found in STAT3, GHR and GH1 gene in the GHTD patients. Primary fibroblast cultures were established from gingival biopsies obtained from the GHTD patient and one control. The GH signaling molecules and the negative regulators of GH were studied, as well as the role of protein CIS in the impaired GH signaling and the effect of CIS silencing on GH signaling. Furthermore, the possible crosstalk between the GH and EGF signaling cascades was examined, as well as its role in the restoration of the impaired GH signaling and the clinical response after therapy with exogenous hgh. The protein expression of the studied molecules was studied by Western Immunoblotting, their cellular localization by Immunofluoresence and the proteinprotein interactions by Co-immunoprecipitation. The results of this study support the hypothesis that impaired GH signaling in GHTD children is mediated by the overexpression of ubiquitinated CIS, which causes rapid and excessive translocation of the GHR to the proteasomes for degradation. The results also showed that the restoration of physiological GH signaling after the silencing of CIS involves the restoration of the GHR to the plasma membrane for normal activation by GH, as well as the activation of the EGFR pathway. In addition, there is vigorous crosstalking between the GH and EGF signaling pathways during exogenous hgh treatment in the GHTD children, resulting in the accelerated growth seen in these children after hgh therapy. 12

13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 1 : Η Αυξητική Ορμόνη 1.1 Εισαγωγικά για την Αυξητική Ορμόνη To ενδοκρινικό σύστημα είναι υπεύθυνο για τη διατήρηση της ομοιοστασίας όλου του οργανισμού στα θηλαστικά. Οι ορμόνες συντίθενται σε ειδικούς αδένες κι εκκρίνονται κατόπιν στην κυκλοφορία ώστε να δράσουν σε ιστούς-στόχους. Η φυσιολογική απόκριση στα ενδοκρινικά μονοπάτια, κι επομένως η αποτελεσματικότητα του ενδοκρινικού συστήματος, επάγεται από την πρόσδεση μίας ορμόνης στον υποδοχέα της. Αυτή η διαντίδραση πυροδοτεί μία ελεγχόμενη ακολουθία ενδοκυττάριων γεγονότων, που καταλήγει σε συγκεκριμένες φαινοτυπικές μεταβολές. Οι ενδοκρινικές διαταραχές μπορεί να οφείλονται είτε σε διαταραχή στη σύνθεση ή έκκριση ορμονών στους ενδοκρινείς αδένες είτε σε διαταραχή στην απαντητικότητα των ιστών-στόχων. Η Αυξητική Ορμόνη (Growth Hormone GH) αποτελεί ένα πρότυπο μοντέλου για τη μελέτη του μηχανισμού δράσης των ορμονών. Πρόκειται για μία ορμόνη με πολλαπλές φυσιολογικές δράσεις και οι κύριοι μηχανισμοί ρύθμισης της έκκρισης, της σηματοδότησης και της καταστολής της σηματοδότησης αυτής έχουν σε μεγάλο βαθμό διαλευκανθεί. Διάφορες διαταραχές έχουν συσχετισθεί είτε με αυξημένη είτε με μειωμένη έκκριση GH, καθώς και με τροποποιημένη απαντητικότητα στην ορμόνη. Ανασυνδυασμένη ανθρώπειος GH (hgh) χρησιμοποιείται ευρέως στα παιδιά για τη θεραπεία διαταραχών αύξησης. Η πλειοτροπία των δράσεων της GH, η διαντίδρασή της με άλλα ορμονικά μονοπάτια και η προοπτική της φαρμακολογικής χορήγησής της, καθιστούν τη μελέτη των μηχανισμών που ρυθμίζουν την ευαισθησία στην ορμόνη αυτή δικαιολογημένη. 1.2 Η δομή της Αυξητικής Ορμόνης H Αυξητική Ορμόνη (GH) είναι ένα πολυπεπτίδιο που αποτελείται από 191 αμινοξέα στον άνθρωπο, με μοριακό βάρος (ΜΒ) 22kDa και το οποίο προάγει την αύξηση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση κυττάρων και ιστών. Ονομάζεται επίσης σωματοτροπίνη ή σωματοτρόπος ορμόνη και πρόκειται για μία ορμόνη με πολλές λειτουργίες. Σε αντίθεση με τις άλλες υποφυσιακές ορμόνες οι οποίες επιδρούν σε ένα συγκεκριμένο όργανο-στόχο, η GH επιδρά σε αρκετούς ιστούς. Εκκρίνεται από τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, είναι η αφθονότερη ορμόνη του πρόσθιου λοβού και ασκεί τη δράση της μέσω εξειδικευμένων υποδοχέων που βρίσκονται στην κυτταρική επιφάνεια των ιστών-στόχων (Growth Hormone Receptor/GHR). (1) 13

14 Εικόνα 1. Τρισδιάστατη απεικόνιση του μορίου της GH και του συμπλέγματος GH-GHR. Η GH εκκρίνεται ως μονή πολυπεπτιδική αλυσίδα και τα 191 αμινοξέα της σχηματίζουν τέσσερις έλικες που της επιτρέπουν την πρόσδεση στους υποδοχείς της. Οι έλικες αυτές ακολουθούν το πρότυπο «άνω-άνω-κάτω-κάτω». (2) Δύο ισχυροί ενδομοριακοί δισουλφιδικοί δεσμοί εξασφαλίζουν τη δομική συνέχεια του μορίου. Ο ένας συνδέει τα αμινοξέα 53 και 165, ενώ ο άλλος συνδέει τα αμινοξέα 182 και 189. (Cys 53-Cys 165, Cys 182-Cys 189). Αυτό είναι παρόμοιο και σε άλλα μέλη της οικογένειας Helix Bundle Peptide (HBP), όπως είναι η προλακτίνη, το πλακουντιακό γαλακτογόνο, η ιντερλευκίνη 2 έως 7, η ιντερλευκίνη 9, η ιντερλευκίνη 11 έως 13 και διάφοροι άλλοι αυξητικοί παράγοντες (3). Η κύρια κυκλοφορούσα μορφή της GH είναι μια πρωτεΐνη 22kDa. Εναλλακτικό μάτισμα μπορεί να οδηγήσει στο σχηματισμό μίας εναλλακτικής μορφής 20 kda, από την οποία απουσιάζουν οι περιοχές αμινοξέων (4). Δύο άλλες μορφές, επίσης, 27 kda και 17 kda κυκλοφορούν στο πλάσμα, όμως η σημασία τους στη φυσιολογία δεν είναι γνωστή. (5) Εικόνα 2. Το μόριο της αυξητικής ορμόνης. Οι δισουλφιδικοί δεσμοί απεικονίζονται με μωβ χρώμα. 14

15 Οι πρώτες κλινικές παρατηρήσεις που συνέδεσαν τον αδένα της υπόφυσης με μια διαταραχή έγιναν το 1886 από τον Pierre Marie, ο οποίος διαπίστωσε την ύπαρξη μεγεθυμένων πρόσθιων λοβών υπόφυσης σε ασθενείς με ακρομεγαλία. Η απομόνωση μιας πρωτεΐνης με προαγωγικές της αύξησης δράσεις έγινε το 1945 από βόειες υποφύσεις και ονομάστηκε σωματοτροπίνη ή αυξητική ορμόνη. (6,7) Αν και απελευθερώνεται στη συστηματική κυκλοφορία και η δράση της σε κύτταρα στόχους διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα GHR, το είδος των αντιδράσεων που επάγονται εξαρτάται από τον ιστό-στόχο, την ηλικία του ατόμου και τη συνεχή ή κατά ώσεις παρουσία της GH. (8) Η GH ακολουθεί ένα κιρκαδικό κύκλο κι εκκρίνεται σε 6-12 φάσεις κατά τη διάρκεια της ημέρας. Υπό συνθήκες φυσιολογικού βραδινού ύπνου και φυσιολογικών συνηθειών κατά τη διάρκεια της ημέρας, μία μέγιστη ώση έκκρισης αυξητικής ορμόνης συμβαίνει σύντομα μετά την έναρξη του ύπνου, κατά το πρώτο επεισόδιο του ύπνου βραδέων κυμάτων (SWS), στα στάδια ΙΙΙ-ΙV. (9,10) 1.3 Το γονίδιο της Αυξητικής Ορμόνης Το γονίδιο της GH ανήκει σε μια μεγάλη οικογένεια γονιδίων που περιλαμβάνει τα γονίδια για την GH, την προλακτίνη και τα πλακουντιακά γαλακτογόνα. Στα περισσότερα θηλαστικά, η GH κωδικοποιείται από ένα μονήρες γονίδιο, αν και στα ανθρωποειδή έχει γίνει διπλασιασμός με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός συμπλέγματος γονιδίων που έχουν μία κονή γονιδιακή τοποθεσία. To γονίδιο που κωδικοποιεί την υποφυσιακή GH (GH1) έχει μήκος περίπου 3Kb κι εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 17 (17q23), όπου βρίσκεται το σύμπλεγμα των 5 σχετιζόμενων γονιδίων. To σύμπλεγμα γονιδίων της ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης περιλαμβάνει τα γονίδια που κωδικοποιούν το πλακουντιακό γαλακτογόνο (PL: placental lactogen) ή χοριονική σωματοτροπίνη (CS: chorionic somatomammotropin), την πλακουντιακή αυξητική ορμόνη (ή GH-V: Growth hormone variant) και την κανονική αυξητική ορμόνη (GH-N: Growth hormone normal). Το σύμπλεγμα περιλαμβάνει 5 γονίδια, τρία PL και δύο GH γονίδια, τα οποία προέρχονται από ένα κοινό πρόγονο μετά από γεγονότα ανασυνδυασμού επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών. Όλο το σύμπλεγμα έχει μήκος 66kb στο χρωμόσωμα 17 (q22-q24). (11) Έχει γίνει αλληλούχιση όλης της ομάδας των γονιδίων. (12) Τα PL και GH-V γονίδια εκφράζονται αποκλειστικά στον πλακούντα, ενώ το γονίδιο GH-N εκφράζεται αποκλειστικά στην υπόφυση. H αλληλουχία των αμινοξέων των GH-V και GH-N διαφέρουν σε 15 θέσεις, από τις οποίες οι 13 βρίσκονται στην ώριμη πρωτεΐνη. (13-15) Το γονίδιο GH-N κωδικοποιεί δύο mrnas που έχουν υποστεί εναλλακτικό μάτισμα και τα οποία μεταφράζονται σε πρωτεΐνες GH με MB 22kD και 20kD. Και τα πέντε γονίδια έχουν περισσότερο από 92% ομολογία νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. (16) 15

16 Εικόνα 3. Το γονίδιο της αυξητικής ορμόνης Οι πρωτεΐνες PL και GH-V προσδένονται στους υποδοχείς τους σε πολλούς ιστούς κι έχουν βιολογικές δράσεις σε ιστούς όπως το ήπαρ, τα οστά, τα κύτταρα του αίματος και ο πλακούντας. Ως απάντηση στις πλακουντιακές ορμόνες η αύξηση του IGF-I πιθανώς προάγει την αύξηση των μητρικών ιστών, όπως είναι η μήτρα, ο μαστός και ο θυρεοειδής αδένας. Επίσης, δράσεις στην καρδιά και στο νεφρό μπορεί να αυξήσουν την καρδιακή παροχή και το μητρικό όγκο αίματος. Υπάρχουν αρκετές ενδείξεις για το ρόλο των PL και GH-V στη μεταβολική προσαρμογή της εγκύου. Οι δράσεις τους συνεισφέρουν στη μεταγευματική υπεργλυκαιμία και υπερινσουλιναιμία της εγκύου στα μέσα και στο τελευταίο τρίμηνο της εγκυμοσύνης, καθώς και στην αυξημένη κινητοποίηση και χρησιμοποίηση των μητρικών ελεύθερων λιπαρών οξέων για ενέργεια, αφήνοντας διαθέσιμη τη μητρική γλυκόζη για το έμβρυο. (17,18) Διαταραχές στα επίπεδα των PL και GH-V έχουν συσχετισθεί με διάφορες παθολογικές καταστάσεις της εγκυμοσύνης, μεταξύ των οποίων είναι η προεκλαμψία, o διαβήτης της κύησης και η ενδομήτρια καθυστέρηση αύξησης (IUGR). (19-22) Αν και τα γονίδια PL και GH-V έχουν σημαντική ομολογία με το γονίδιο GH-N, οι παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση των πλακουντιακών γονιδίων είναι διαφορετικοί από αυτούς που ρυθμίζουν την υποφυσιακή αυξητική ορμόνη. Έχει αποδειχθεί ότι η πρωτεΐνη GH-N έχει περιορισμένο ρόλο στην εμβρυική γραμμική αύξηση. Ασθενείς με μεμονωμένη ανεπάρκεια GH, υποφυσιακή απλασία ή ανεγκεφαλία παρουσιάζουν ελάχιστη έως μέτρια μείωση στο μήκος γέννησης. (23) Επιπρόσθετα, η ανεπάρκεια της GH σε πειραματόζωα έχει μικρή ή καθόλου επίδραση στην εμβρυική ανάπτυξη. Αντίστροφα, η περίσσεια της GH δε συνοδεύεται από μεγαλύτερη εμβρυική αύξηση. Αν και η GH-N έχει περιορισμένη δράση στην κατά μήκος αύξηση του εμβρύου, φαίνεται πως έχει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό και στην ανάπτυξη του εμβρύου. Για παράδειγμα, η κλινική εμπειρία συσχετίζει τη GH-N με τον περιγεννητικό μεταβολισμό των υδατανθράκων. 16

17 1.4 Έκκριση της Αυξητικής Ορμόνης από την υπόφυση O πρόσθιος λοβός της υπόφυσης περιλαμβάνει διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους που είναι υπεύθυνοι για την έκκριση των υποφυσιακών ορμονών. Τα σωματοτρόπα κύτταρα είναι υπεύθυνα για την έκκριση της αυξητικής ορμόνης (GH), τα θυρεοτρόπα για την έκκριση της θυρεοειδοτρόπου ορμόνης (TSH), τα κορτικοτρόπα για την έκκριση της φλοιοεπινεφριδιοτρόπου ορμόνης (ACTH), τα γοναδοτρόπα για την έκκριση της ωχρινοποιητικής ορμόνης (LH) και της θυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH), και τα λακτοτρόπα για την έκκριση της προλακτίνης (PRL). Η ACTH προκύπτει από τη διάσπαση ενός μεγαλύτερου πεπτιδίου που παράγεται στην υπόφυση, της προοπιομελανοκορτίνης (POMC). Άλλα προϊόντα διάσπασης της POMC είναι τα κλάσματα της μελανινοτρόπου ορμόνης (α-msh, β-msh, γ-msh), η β-λιποτροπίνη και η β-ενδορφίνη. Εικόνα 4. Yποφυσιακές ορμόνες Η έκκριση των ορμονών αυτών βρίσκεται υπό τον άμεσο έλεγχο του υποθαλάμου και μεσολαβητές είναι ποικίλες υποθαλαμικές ορμόνες που είτε διεγείρουν είτε καταστέλλουν την έκκριση των υποφυσιακών ορμονών. Η έκκριση των υποθαλαμικών ορμονών επηρεάζεται από πολλούς χυμικούς παράγοντες και παράγοντες του κεντρικού νευρικού συστήματος. Οι υποφυσιακές ορμόνες, από τη στιγμή που απελευθερώνονται στο πλάσμα, ασκούν τις δράσεις τους σε διάφορα όργανα-στόχους, είτε σε ένα συγκεκριμένο ενδοκρινή αδένα (π.χ. θυρεοειδή αδένα) είτε σε τελικά όργανα. Λόγω της πολυπλοκότητας αυτού του υποθαλαμουποφυσιακού άξονα, πολλοί παθογενετικοί μηχανισμοί μπορούν να λειτουργήσουν σε κάθε επίπεδο, καταλήγοντας σε μία ετερογενή ομάδα διαταραχών με παρόμοια συμπτώματα με αυτά της υποφυσιακής ανεπάρκειας. Η ανεπάρκεια των υποφυσιακών ορμονών ACTH, FSH, LH, GH, PRL και/ή TSH συνυπάρχει στη συνδυασμένη ανεπάρκεια υποφυσιακών ορμονών (Combined Pituitary Hormone Deficiency/CPHD). Aν και οι περισσότερες περιπτώσεις CPHD είναι σποραδικές, υπάρχουν στον άνθρωπο περιπτώσεις που οφείλονται σε μεταλλάξεις στις περιοχές POU1F1 (PIT1) ή PROP1. Ο ΡΙΤ1, το πρωτεϊνικό παράγωγο του γονιδίου ΡΟU1F1, προσδένεται και ενεργοποιεί τους υποκινητές των 17

18 γονιδίων GH1 και PRL ώστε να αυξήσει το ρυθμό μεταγραφής τους. Ο ΡΙΤ1 είναι απαραίτητος για τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιαμό των κυττάρων της πρόσθιας υπόφυσης, που εκκρίνουν GH (σωματοτρόπα κύτταρα). Έχουν αναφερθεί τουλάχιστον 8 διαφορετικές μεταλλάξεις του γονιδίου POU1F1 σε άτομα με οικογενή CPHD. 1.5 Ρύθμιση της έκφρασης της Αυξητικής Ορμόνης Στον άνθρωπο, τα επίπεδα της GH είναι υψηλά κατά τις δύο πρώτες εβδομάδες μετά τη γέννηση, μειώνονται σταδιακά, και παραμένουν χαμηλά κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας. Αμέσως πριν την εφηβεία, τα επίπεδα GH αρχίζουν να αυξάνονται, φτάνουν το μέγιστο κατά την εφηβεία και μειώνονται σταδιακά με την πρόοδο της ηλικίας. (24,25 ) Κατά την εφηβεία, συμβαίνουν σημαντικές αλλαγές σε επίπεδο φύλου, που καθορίζουν τα διαφορετικά μοντέλα σωματικής αύξησης στο άρρεν και θήλυ φύλο (αύξηση οστών και μυών, κατανομή λίπους κλπ). Οι άρρενες αρουραίοι παρουσιάζουν «εκρήξεις» έκκρισης GH με μεσοδιαστήματα 3-4 ωρών, με χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα μεταξύ των εκκρίσεων. Στα θήλεα, η έκκριση είναι επίσης κατά ώσεις, αλλά οι μέγιστες τιμές είναι χαμηλότερες και τα βασικά επίπεδα είναι υψηλότερα από αυτά που ανευρίσκονται στα άρρενα, με αποτέλεσμα η έκκριση να είναι σχεδόν συνεχής. (26,27) Εικόνα 5. Μοντέλο έκκρισης αυξητικής ορμόνης στα δύο φύλα στον αρουραίο Η GH εκκρίνεται κατά ώσεις από τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, υπό τη ρύθμιση ενός σύνθετου νευροενδοκρινικού συστήματος που περιλαμβάνει δύο υποθαλαμικές ορμόνες από τη μέση προεξοχή. Η πρώτη, ο εκλυτικός παράγων της GH, GHRH, διεγείρει την απελευθέρωση της GH και τον πολλαπλασιαμό των σωματοτρόπων κυττάρων. Η δεύτερη, η σωματοστατίνη αναστέλλει τη βασική και τη μέσω GHRH απελευθέρωση της GH. H επίδραση των ορμονών αυτών ρυθμίζεται από άλλους υποθαλαμικούς παράγοντες, από νευροδιαβιβαστές και από κυκλοφορούσες ορμόνες που δρουν απευθείας στην υπόφυση. 18

19 1.5.1 Παράγοντες που ρυθμίζουν τη σύνθεση και απελευθέρωση της Αυξητικής Ορμόνης Α) Υποφυσιοτρόπες ορμόνες α) Εκλυτικός Παράγων της GH (Growth Hormone Releasing Factor-GHRH) O εκλυτικός παράγων της GH (GHRH: Growth Hormone Releasing Hormone), επίσης γνωστός ως GHRF (Growth Hormone Releasing Factor), είναι ένα υποθαλαμικό πεπτίδιο που αποτελείται από 44 αμινοξέα και το οποίο διεγείρει την απελευθέρωση και τη σύνθεση της GH από την υπόφυση. O GHRH εκκρίνεται από τις νευροεκκριτικές απολήξεις των νευρώνων του τοξοειδούς πυρήνα και απελευθερώνεται από νευροεκκριτικές απολήξεις της μέσης προεξοχής. (28) Μέσω του υποθάλαμο-υποφυσιακού πυλαίου συστήματος μεταφέρεται στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, όπου διεγείρει την έκκριση της GH ενεργοποιώντας τον υποδοχέα GHRH- R. Εικόνα 6. Οδός μεταφοράς του GHRH Η μείωση στο ρυθμό αύξησης νεαρών αρουραίων μετά την καταστροφή του υποθαλάμου τους ήταν η πρώτη απόδειξη νευροενδοκρινούς ελέγχου της έκκρισης της GH. Ο GHRH συντίθεται ως πρόδρομο μόριο 107/108 αμινοξέων στον άνθρωπο και με την επίδραση πεπτιδασών μετατρέπεται σε GHRH(1-44)NH 2. H in vivo ορμόνη υπάρχει ως η αμιδική μορφή 44 αμινοξέων σε όλα τα είδη. Στον άνθρωπο, υπάρχει επίσης μία άλλη μορφή, η [GHRH(1-40)OH]. H αλληλουχία αμινοξέων του GHRH δεν είναι καλά συντηρημένη στα θηλαστικά. Ο GHRH απελευθερώνεται κατά ώσεις, προκαλώντας κατά ώσεις απελευθέρωση της GH. Εκφράζεται κυρίως στον τοξοειδή πυρήνα του υποθαλάμου, αλλά και σε άλλους ιστούς, όπως το έντερο, ο πλακούντας, οι γονάδες και το ανοσοποιητικό σύστημα. 19

20 Η πρόσδεση του GHRH στον υποδοχέα GHRH-R προκαλεί αυξημένη παραγωγή GH κυρίως μέσω του μονοπατιού της κυκλικής μονοφωσφορικής αδενοσίνης (c- AMP), αλλά και μέσω του μονοπατιού της φωσφολιπάσης C (μονοπάτι IP3/DAG) και άλλων λιγότερο σημαντικών μονοπατιών. Το εξαρτώμενο από τη c-amp μονοπάτι πυροδοτείται από την πρόσδεση του GHRH στον υποδοχέα του, ο υποδοχέας υφίσταται δομικές αλλαγές και ενεργοποιεί την Gsα υπομονάδα του στενά συνδεόμενου G-πρωτεϊνικού συμπλέγματος στην ενδοκυττάρια πλευρά του υποδοχέα. Αποτέλεσμα είναι η ενεργοποίηση της προσδεδεμένης στη μεμβράνη αδενυλικής κυκλάσης και η αύξηση του ενδοκυττάριου camp. To camp συνδέεται με τις ρυθμιστικές υπομονάδες της πρωτεϊνικής κινάσης Α (ΡΚΑ) και τις ενεργοποιεί, επιτρέποντας στις ελεύθερες καταλυτικές υπομονάδες να μεταφερθούν στον πυρήνα και να φωσφορυλιώσουν το μεταγραφικό παράγοντα CREB (camp response element binding protein). O φωσφορυλιωμένος CREB προάγει τη μεταγραφή της GH συνδεόμενος με CREs (camp-response elements) στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου της GH. Επίσης, ο GHRH αυξάνει τη μεταγραφή του γονιδίου του GHRH- R, προκαλώντας θετική ανατροφοδότηση. Στο μονοπάτι της φωσφολιπάσης C, o GHRH ενεργοποιεί τη φωσφολιπάση C μέσω του βγ-συμπλέγματος των ετεροτριμερικών G-πρωτεϊνών. Η ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C οδηγεί στην παραγωγή διακυλγλυκερόλης (DAG) και τριφωσφωρικής ινοσιτόλης (IP3). Η ενεργοποίηση της ΙΡ3 προκαλεί απελευθέρωση του ενδοκυττάριου Ca +2 από το ενδοπλασματικό δίκτυο, αυξάνοντας τη συγκέντρωση του κυτταροπλασματικού Ca +2, με τελική κατάληξη την απελευθέρωση εκκριτικών κυστιδίων που περιλαμβάνουν προσχηματισμένη αυξητική ορμόνη. Εικόνα 7. Η σηματοδότηση του GHRH 20

21 Ο GHRH πρωτοεμφανίζεται στον ανθρώπινο υποθάλαμο μεταξύ της 18 ης και 29 ης εβδομάδας κύησης και η περίοδος αυτή αντιστοιχεί στην έναρξη παραγωγής της αυξητικής ορμόνης στα έμβρυα. Μελέτες σε ποντίκια έδειξαν ότι ο υποδοχέας του GHRH δεν απαιτείται για τον αρχικό πολλαπλασιασμό των αρχέγονων κυττάρων από τα οποία θα προέλθουν τα σωματοτρόπα και λακτοτρόπα κύτταρα. Κατά τη διαφοροποίηση και μεταφορά τους στην «caudomedial ζώνη», ωστόσο, τα κύτταρα αυτά δέχονται ενεργοποίηση μέσω του GHRH από τον υποθάλαμο. Για τη σωστή σηματοδότηση του GHRH, χρειάζεται ο υποδοχέας GHRH-R για τον πολλαπλασιασμό των σωματοτρόπων κυττάρων. β) Σωματοστατίνη H σωματοστατίνη, γνωστή και ως ανασταλτική ορμόνη της GH (Growth hormoneinhibiting hormone/ghih) ή ως ανασταλτικός παράγων της απελευθέρωσης σωματοτροπίνης (Somatotropin release-inhibiting hormone/srif), είναι άλλη μία πεπτιδική ορμόνη, 14 ή 28 αμινοξέων. Ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά σε υποθαλαμικά εκχυλίσματα το 1973 (29) και, κατόπιν, βρέθηκε ότι η σωματοστατίνη εκκρίνεται από πολλούς ιστούς, μεταξύ των οποίων το πάγκρεας, ο εντερικός σωλήνας και περιοχές του κεντρικού νευρικού συστήματος εκτός του υποθαλάμου. Ρυθμίζει το ενδοκρινικό σύστημα, επηρεάζει τη νευροδιαβίβαση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και αναστέλλει την έκκριση πολλών ορμονών. Βασική της λειτουργία είναι η καταστολή της έκκρισης, αλλά όχι της σύνθεσης της GH από τα σωματοτρόπα κύτταρα. Παράγεται από νευροενδοκρινικούς νευρώνες του περικοιλιακού πυρήνα του υποθαλάμου, οι οποίοι καταλήγουν στη μέση προεξοχή, όπου η σωματοστατίνη απελευθερώνεται από νευροεκκριτικές απολήξεις στο υποθάλαμο-υποφυσιακό σύστημα. Ακολούθως, καταλήγει στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης κι αναστέλλει την έκκριση της GH. Εικόνα 8. Χημική δομή της σωματοστατίνης Η σωματοστατίνη δρα με ενδοκρινή και παρακρινή τρόπο. Συντίθεται ως ένα πρόδρομο μόριο 116 αμινοξέων, την προπροσωματοστατίνη, από την οποία προκύπτει η προσωματοστατίνη, στην οποία δρουν ενδοπεπτιδάσες που σχηματίζουν τις δύο μορφές που εκκρίνονται από τον υποθάλαμο, τη SRIH-14 και SRIH-28. Οι 21

22 δύο μορφές παράγονται σε διαφορετικές αναλογίες από νευρώνες κι εκκριτικά κύτταρα κατά τη διαδικασία διαφοροποίησης. Η σωματοστατίνη SRIH-28 έχει τις μεγαλύτερες ανασταλτικές επιδράσεις (10πλάσιες) στην έκκριση της GH. Στον άνθρωπο, υπάρχει ένα μόνο γονίδιο που κωδικοποιεί τη σωματοστατίνη. (30,31) Σε αντίθεση με τον GHRH, η σωματοστατίνη κατανέμεται ευρέως στο Κεντρικό και Περιφερικό Νευρικό σύστημα και η αλληλουχία του γονιδίου της έχει συντηρηθεί στα θηλαστικά. Εικόνα 9. Η σωματοστατίνη και οι πρόδρομες μορφές της Έχουν κλωνοποιηθεί στα θηλαστικά 5 υπότυποι υποδοχέα της σωματοστατίνης, μέσω των οποίων διαμεσολαβούνται οι διαφορετικές βιολογικές της δράσεις. (1) Όλοι οι υποδοχείς είναι μέλη της υπεροικογένειας των συνδεόμενων με G-πρωτεΐνες υποδοχέων. Καθένας από τους υποδοχείς ενεργοποιεί διαφορετικούς σηματοδοτικούς μηχανισμούς εντός των κυττάρων, όλοι όμως αναστέλλουν την αδενυλική κυκλάση. Ο υποδοχέας της σωματοστατίνης κωδικοποιείται από 5 γονίδια (sstr 1-5). Το κύριο εξ αυτών που επηρεάζει την έκκριση της αυξητικής ορμόνης από τα σωματοτρόπα κύτταρα είναι το sstr 2. H μεταγωγή του σήματος περιλαμβάνει την εξαρτώμενη από G-πρωτεΐνες μείωση των τασεοευαίσθητων καναλιών Ca +2 (L- και T-τύπους) και αύξηση των καναλιών Κ +. Η σωματοστατίνη (SRIH), αναστέλλει την έκκριση της GH με τρόπο ανεξάρτητο από τον GHRH, αλλά με άμεση παρεμπόδιση της δράσης του GHRH. Aν και ο ακριβής μηχανισμός δεν είναι γνωστός, η σωματοστατίνη φαίνεται πως αποτρέπει την ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης. Δεν είναι γνωστό αν επηρεάζει τη σύνθεση της GH άμεσα, όμως μπορεί να το κάνει τροποποιώντας την ενδοκυττάρια συγκέντρωση camp, σε αντίθεση με τη δράση του GHRH. γ) Γκρελίνη H γκρελίνη είναι ένα πεπτίδιο που αποτελείται από 28 αμινοξέα. Είναι το πρώτο φυσικό πεπτίδιο το οποίο περιέχει μια υδροξυλική ομάδα στο αμινοξύ σερίνη-που βρίσκεται στην τρίτη θέση- και η οποία ακετυλιώνεται από το n-οκτανοϊκό οξύ. (32) 22

23 Εικόνα 10. Η χημική δομή της γκρελίνης Απομονώθηκε για πρώτη φορά από το στομάχι αρουραίου, όπου παράγεται από έναν συγκεκριμένο τύπο ενδοκρινικών κυττάρων του γαστρικού βλεννογόνου. (33) Παράγεται επιπλέον σε ιστούς όπως ο γαστρεντερικός σωλήνας, οι ωοθήκες, οι όρχεις, οι νεφροί, τα επινεφρίδια, ο πλακούντας και το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα. Μετά την παραγωγή της εμφανίζει σημαντική συγκέντρωση στο πλάσμα. Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκκριση της γκρελίνης ακολουθεί κιρκαδικό ρυθμό και χαρακτηρίζεται από νυκτερινή αύξηση των επιπέδων της ορμόνης. (34) Οι ορμόνες GHRH και σωματοστατίνη ελέγχουν, όπως έχει ήδη αναφερθεί, την έκκριση της αυξητικής ορμόνης. Για την προαγωγή της έκκρισης της GH αναπτύχθηκαν συνθετικές ουσίες, τα ευοδωτικά πεπτίδια της έκκρισης της GH (Growth Hormone Secretagogues/GHSs), τα οποία συνδέονται με δικούς τους υποδοχείς στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. (35) Η γκρελίνη αποδείχθηκε ότι είναι ο φυσικός συνδέτης του GHSR (Growth Hormone Secretagogue Receptor), συμμετέχοντας με τον τρόπο αυτό στη ρύθμιση της παραγωγής GH από την υπόφυση. (36) Η γκρελίνη θεωρείται σημαντικός ρυθμιστής του μεταβολισμού της ενέργειας και της έκκρισης GH. (37-39) Η έκκριση της γκρελίνης διεγείρεται από τη νηστεία και προάγει την έκκριση της αυξητικής ορμόνης από τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. Η γκρελίνη διεγείρει την έκκριση της αυξητικής ορμόνης άμεσα, δρώντας στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, και πιθανώς έμμεσα, προάγοντας την έκκριση του GHRH και αναστέλλοντας της έκκριση της σωματοστατίνης. 23

24 Εικόνα 11. Προαγωγή της έκκρισης GH από την γκρελίνη O υποδοχέας GHSR εκφράζεται σε πολλούς υποθαλαμικούς και θαλαμικούς πυρήνες, στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου, στη μέλαινα ουσία του εγκεφάλου και στον προσωπικό πυρήνα του στελέχους, υποδηλώνοντας ένα πιθανό κεντρικό ρόλο της γκρελίνης. Η γκρελίνη, εκτός από τη ρύθμιση της έκκρισης της αυξητικής ορμόνης, αποτελεί βασικό ρυθμιστή της όρεξης, δίνοντας το ερέθισμα για πρόσληψη τροφής. Οι επιδράσεις της γκρελίνης στην πρόσληψη τροφής φαίνεται ότι διαμεσολαβούνται από το Νευροπεπτίδιο Υ (ΝΡΥ), κυρίως όμως από το υποθαλαμικό νευροπεπτίδιο AGRP (Agouti-related peptide). (40) Αποτελεί επίσης ενδογενή ανταγωνιστή της λεπτίνης. Τα επίπεδα της γκρελίνης είναι αυξημένα προγευματικά κι ελαττωμένα μεταγευματικά. (41) Επιπρόσθετα, έχει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, αναβολικές δράσεις όπως η εναπόθεση λίπους, η αύξηση της γλυκόζης, αλλά και αυξάνει τη γαστρική λειτουργία, την εξωκρινή κι ενδοκρινή παγκρεατική έκκριση και την καρδιακή παροχή. (Εικόνα 12). Το mrna και το πεπτίδιο της γκρελίνης έχουν ανιχνευθεί στην υπόφυση του αρουραίου και του ανθρώπου, υποδηλώνοντας ότι η γκρελίνη συντίθεται εντός της υπόφυσης, όπου μπορεί να επηρεάζει την απελευθέρωση της GH με αυτοκρινή ή παρακρινή τρόπο. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η γκρελίνη εκφράζεται σε σωματοτρόπα, λακτοτρόπα και θυρεοτρόπα κύτταρα της υπόφυσης. (42) Ο υποδοχέας της αποτελείται από 7 διαμεμβρανικά τμήματα. Η μεταγωγή του σήματος περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C (μέσω πρωτεΐνης G), τη δημιουργία φωσφορικής ινοσιτόλης και διακυλγλυκερόλης και αυξημένη ενδοκυττάρια συγκέντρωση Ca

25 Εικόνα 12. Δράσεις της γκρελίνης δ) Γοναδοτρόπος ορμόνη (Gonadotropin-Releasing Hormone/GnRH) Στα ανώτερα σπονδυλωτά, η GnRH δε διεγείρει την έκκριση της GH. Ωστόσο, σε ορισμένα είδη και σε συγκεκριμένες φάσεις ανάπτυξης, η GnRH διεγείρει την έκκριση της GH, όπως σε νεογέννητα ποντίκια και ψάρια. Η GnRH δρα μέσω της cgmp, υπάρχουν όμως ενδείξεις δράσης της μέσω του οξειδίου του αζώτου (ΝΟ). (43) ε) Κορτικοτροπίνη (Corticotropin-Releasing Hormone /CRH) Η CRH μέσω της σωματοστατίνης καταστέλλει την έκκριση της αυξητικής ορμόνης. (44) Σε ορισμένα είδη των κατώτερων σπονδυλωτών, η CRH διεγείρει την έκκριση της GH. (45) Β) ΡΙΤ-1 (Pituitary-specific positive transcription factor 1) Ο ΡΙΤ-1 είναι μέλος της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων που περιέχουν την περιοχή ΡΟU και πρωτοαναγνωρίστηκε ως παράγων ειδικός για τα υποφυσιακά κύτταρα που συνδέεται με στοιχεία απαραίτητα για την έκφραση των γονιδίων της GH, της Προλακτίνης και της Θυρεοτροπίνης. Στα θηλαστικά, η ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου της GH επιτυγχάνεται μέσω της διαντίδρασης του μεταγραφικού παράγοντα PIT-1 με δύο περιοχές σύνδεσης στο εγγύς τμήμα του υποκινητή. (46) Ο ΡΙΤ-1 προκαλεί ενεργοποίηση του υποκινητή της GH μέσω αύξησης των ενδοκυττάριων επιπέδων camp. Υπάρχουν γενετικές αποδείξεις για το ρόλο του ΡΙΤ-1 στον πολλαπλασιασμό των υποφυσιακών κυττάρων, καθώς διάφορες μεταλλάξεις του ΡΙΤ-1 οδηγούν σε υποϋποφυσισμό σε ποντίκια και ανθρώπους. Mεταλλάξεις του PIT-1 προκαλούν συνδυασμένη υποφυσιακή ανεπάρκεια (Combined Pituitary Hormone Deficiency/CPHD), που περιλαμβάνει ανεπάρκεια των GH, TSH και PRL, ενώ οι ACTH, FSH και LH παράγονται φυσιολογικά. Ο ΡΙΤ-1 είναι μία πρωτεΐνη 291 αμινοξέων με μια αμινοτελική περιοχή διασταυρούμενης 25

26 ενεργοποίησης και μία ΡΟU περιοχή πρόσδεσης στο DNA. Η περιοχή ΡΟU διακρίνεται σε δύο καλά συντηρημένες περιοχές, οι οποίες διαχωρίζονται από μία λιγότερο συντηρημένη περιοχή σύνδεσης. Οι περιοχές αυτές είναι το C-τελικό ήμισυ, η POU-homeobox περιοχή, που κωδικοποιεί μία περιοχή με χαμηλή συγγένεια πρόσδεσης στο DNA, και το Ν-τελικό ήμισυ, η POU-ειδική περιοχή, η οποία προσδίδει υψηλή συγγένεια στην περιοχή POU και συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών. Η παρατήρηση ότι ποντίκια με έλλειψη του ΡΙΤ-1 δεν έχουν κύτταρα που παράγουν Προλακτίνη ή TSHβ, όπως και κύτταρα που παράγουν GH, υποδηλώνει ότι ο ΡΙΤ-1 μπορεί να ρυθμίζει άλλους υποδοχείς στα λακτοτρόπα και θυρεοτρόπα κύτταρα, ο ρόλος των οποίων στον πολλαπλασιασμό είναι παρόμοιος με αυτόν του GHRH-R στα σωματοτρόπα κύτταρα. Ο ΡΙΤ-1 είναι ένας από τους πιο ειδικά εκφραζόμενους γνωστούς μεταγραφικούς παράγοντες, που περιορίζεται στα σωματοτρόπα, λακτοτρόπα και θυρεοτρόπα κύτταρα. Ωστόσο, αυτό το μοντέλο έκφρασης υποδηλώνει ότι η πρωτεΐνη ΡΙΤ-1 δεν αρκεί για τη σύνθεση της GH, γιατί η GH δεν εκφράζεται στα λακτοτρόπα ή θυρεοτρόπα κύτταρα, αν και εκφράζουν ΡΙΤ-1. Είτε επιπρόσθετοι αναγκαίοι παράγοντες απουσιάζουν σε αυτούς τους κυτταρικούς τύπους είτε συμβαίνει καταστολή της σύνθεσης της GH στα λακτοτρόπα και θυρεοτρόπα κύτταρα. Ακόμα και στα σωματοτρόπα κύτταρα, η λειτουργία του ΡΙΤ-1 από μόνη της δεν είναι αρκετή για την έκφραση της GH. Απαραίτητο για την έκφραση του γονιδίου PIT-1 είναι το γονίδιο PROP-1, το οποίο εδράζεται στο χρωμόσωμα 5q και κωδικοποιεί μεταγραφικούς παράγοντες απαραίτητους για την εμβρυική ανάπτυξη της υπόφυσης. Έχουν περιγραφεί 13 διαφορετικές μεταλλάξεις του PROP-1, οι οποίες αποτελούν την πιο κοινή γενετική αιτία CHPD. Όλες οι μεταλλάξεις αφορούν την περιοχή πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα στο DNA και προκαλούν ανεπάρκεια των GH, PRL, TSH και των γοναδοτροπινών. Γ) Περιφερικές ορμόνες και νευροπεπτίδια που επηρεάζουν άμεσα την έκκριση της GH i) Τριιωδοθυρονίνη (Τ3) : Η τριιωδοθυρονίνη είναι απολύτως απαραίτητη για τη φυσιολογική αύξηση και ανάπτυξη πολλών ιστών. (47,48) Το νευρικό σύστημα είναι ιδιαιτέρως ευαίσθητο σε αυτή την ορμονική δράση. Έχει βρεθεί σε κύτταρα υποφυσιακού όγκου στους αρουραίους η ενεργοποίηση από την τριιωδοθυρονίνη της μεταγραφής του γονιδίου της GH. (49) Επιπλέον, η τριιωδοθυρονίνη σε υποφυσιακή κυτταρική σειρά σε αρουραίους διεγείρει άμεσα τη μετάφραση παραγόντων οι οποίοι με τη σειρά τους διεγείρουν το ρυθμό σύνθεσης της αυξητικής ορμόνης στο επίπεδο της μετάφρασης. (50) ii) Γλυκοκορτικοειδή : Τα γλυκοκορτικοειδή ρυθμίζουν τη σύνθεση και την έκκριση της GH επηρεάζοντας την υποθαλαμική, αλλά και την υποφυσιακή λειτουργία. 26

27 Αφ ενός καταστέλλουν την υποθαλαμική έκφραση της GHRH, αφετέρου ενισχύουν την υποφυσιακή απαντητικότητα στην GHRH. Τα επίπεδα του mrna του υποδοχέα GHRH-R έχει βρεθεί in vitro σε κύτταρα υπόφυσης αρουραίου ότι διεγείρονται άμεσα από τα γλυκοκορτικοειδή, αποτελώντας την πιθανή εξήγηση της αυξημένης υποφυσιακής απαντητικότητας στην GHRH. (51) iii) Λεπτίνη : Η λεπτίνη αποτελεί μέρος των ομοιοστατικών μηχανισμών που ρυθμίζουν την ενεργειακή ισορροπία του σώματος. Εκτός από τις υποθαλαμικές της δράσεις, η λεπτίνη διεγείρει άμεσα την υποφυσιακή έκκριση της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) και της αυξητικής ορμόνης (GH), διευκολύνοντας αναπαραγωγικές, αυξητικές και αναβολικές δράσεις κατά τη διάρκεια ενεργειακής αφθονίας. Έχει αποδειχθεί in vivo ότι η λεπτίνη αυξάνει την έκκριση της GHRH και μειώνει την έκκριση της σωματοστατίνης, συγχρόνως με τη διέγερση της έκκρισης της GH. (52) Είναι επιβεβαιωμένη η ύπαρξη υποδοχέων λεπτίνης στα σωματοτρόπα κύτταρα. Η σηματοδοτική δράση της λεπτίνης φαίνεται ότι γίνεται κυρίως διαμέσου JAK2 και STAT. Επίσης, η λεπτίνη αυξάνει την παραγωγή ΝΟ από τα κύτταρα της υπόφυσης, αλλά και τη μέσω ΝΟ έκκριση της GH. iv) Αντιπονεκτίνη : Η αντιπονεκτίνη είναι η λιποκίνη που παράγεται σε μεγαλύτερη ποσότητα. Έχει ινσουλινοευαισθητοποιό, αντιαθηρωματογόνο, αντιφλεγμονώδη, αντιαγγειογόνο και αντιογκογόνο δράση. (53) Η αντιπονεκτίνη φαίνεται να επηρεάζει in vitro την έκκριση της GH στον αρουραίο. Βραχυπρόθεσμη έκθεση της υπόφυσης σε αντιπονεκτίνη για 4 ώρες ελαττώνει την απελευθέρωση της GH παρουσία ή απουσία GHRH. Αντιθέτως, μετά από 24ωρη έκθεση σε αντιπονεκτίνη παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του υποδοχέα του εκλυτικού παράγοντα GHRH και αυξημένη απελευθέρωση GH σε υψηλές δόσεις. H παχυσαρκία έχει συνδεθεί με χαμηλά επίπεδα GH και διαταραχή στην παλμική έκκρισή της, με αποτέλεσμα τη σχετική ανεπάρκεια της GH. H αντιπονεκτίνη επάγει την αύξηση του ενδοκυττάριου Ca +2 μέσω εισροής του εξωκυττάριου Ca +2 και απελευθέρωσης των ενδοκυττάριων αποθηκών Ca +2, προκαλώντας τελικά την έκκριση της GH. Θεωρείται ότι η αντιπονεκτίνη ρυθμίζει άμεσα την έκκριση της GH από τα σωματοτρόπα κύτταρα συνδεόμενη σε οποιονδήποτε από τους υποδοχείς της (AdipoR1, AdipoR2) και αυτό γίνεται μέσω μίας παρόμοιας διεργασίας με αυτήν που παρατηρείται μετά από τη διέγερση της GH από την GHRH. (54) v) Ρεζιστίνη : Πρόκειται για μία ακόμη ορμόνη που παράγεται από το λιπώδη ιστό. Η ρεζιστίνη διεγείρει την απελευθέρωση της GH από τα σωματοτρόφα κύτταρα αρουραίου, με μηχανισμό εξαρτώμενο από πρωτεΐνη G. (55) vi) Ορεξίνες : Υπάρχουν άμεσες επιδράσεις της ορεξίνης Α και της ορεξίνης Β στην απελευθέρωση GH σε μηρυκαστικά. (56,57) vii) Oπιοειδή : Μετά την απομόνωση και αναγνώριση των ενδογενών οπιοειδών πεπτιδίων από τους Hughes και συν. το 1975, έχει βρεθεί ότι η χορήγηση φυσικών 27

28 και συνθετικών αναλόγων ενδογενών οπιοειδών αυξάνει τα επίπεδα της κυκλοφορούσας στο πλάσμα αυξητικής ορμόνης σε αρκετά είδη θηλαστικών. (58,59) Μία πρόσφατη μελέτη επιβεβαιώνει ότι και στον άνθρωπο τα οπιοειδή αυξάνουν την έκκριση της αυξητικής ορμόνης. (60) Επιπλέον, το μονοπάτι των οπιοειδών έχει συσχετισθεί με την αυξημένη απελευθέρωση GH κατά τη διάρκεια της αύξησης. (61) viii) Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Peptide (PACAP)-Υποφυσιακό Πεπτίδιο ενεργοποιόν την αδενυλική κυκλάση : To PACAP είναι μία πρωτεΐνη που κωδικοποιείται στον άνθρωπο από το γονίδιο ADCYAP1. Πρόκειται για έναν εν δυνάμει διεγέρτη της έκκρισης της GH και έχει προταθεί ως προγονικός εκλυτικός παράγων της GH. Εκτός από τη δράση του ως υποφυσιοτρόπος ορμόνη, το PACAP δρα και ως νευροδιαβιβαστής και νευρορυθμιστής. Το πολυπεπτίδιο αυτό ενεργοποιεί την αδενυλική κυκλάση και αυξάνει τα επίπεδα της camp στα κύτταρα-στόχος. Στα θηλαστικά, τα PACAP 27 και PACAP 38 διεγείρουν την έκκριση της GH in vitro και in vivo. Επιπροσθέτως, το PACAP αυξάνει τη σύνθεση της GH, όπως προκύπτει από τα αυξημένα επίπεδα mrna GH. Εικόνα 13. Μηχανισμός δράσης του PACAP ix) Θυρεοτρόπος ορμόνη (TRH) : To τριπεπτίδιο TRH μπορεί να επαγάγει την έκκριση της GH σε πολλά ζωικά είδη υπό ορισμένες φυσιολογικές συνθήκες. Έχει προταθεί ότι η απελευθέρωση της GH από τα κύτταρα του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης προκαλείται από την TRH μέσω μηχανισμού που εξαρτάται από το Ca και όχι από τη c-amp. (62) 28

29 x) Νευροπεπτίδιο Υ : Διεγείρει άμεσα την έκκριση της GH από τα σωματοτρόπα σε ορισμένα είδη ψαριών και ζώων. (63) Σε υποφυσιακά κύτταρα χοίρου καταστέλλει την απόκριση σε πρόκληση με GHRH. (64) xi) Γαλανίνη : Η γαλανίνη είναι ένα πεπτίδιο 30 αμινοξέων στον άνθρωπο που απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1983 (65). Είναι παρούσα στο γαστρεντερικό σωλήνα και ευρέως στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα, όπου συμμετέχει σε πολλές εγκεφαλικές λειτουργίες. Οι μετασυναπτικές δράσεις της είναι συνήθως ανασταλτικές και διαμεσολαβούνται από τρεις διαφορετικούς υποδοχείς. (66) Όσον αφορά στην ανασταλτική επίδραση της γαλανίνης στην απελευθέρωση της GH, είναι πιθανό ότι η γαλανίνη επιδρά στο ρυθμιστικό σύστημα του υποθαλάμου. (67) Σύμφωνα με περισσότερο πρόσφατες μελέτες, η γαλανίνη μπορεί να διεγείρει απευθείας την απελευθέρωση της GH. Για παράδειγμα, όταν χορηγείται στην περιφέρεια, διεγείρει την έκκριση της GH (68). Είναι πιθανό ότι η γαλανίνη είναι το υποκατάστατο του πεπτιδίου GALP (Galanin-related peptide), το οποίο όχι μόνο διεγείρει την απελευθέρωση της GH, αλλά και εκφράζεται σε μεγάλη εγγύτητα ως προς τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. (69) xii) ΝΟ : Το οξείδιο του αζώτου διεγείρει την έκκριση της GH σε πειράματα in vitro. Έχει απομονωθεί η συνθάση του ΝΟ σε υποφυσιακά κύτταρα. Το ΝΟ έχει προταθεί ως ο πρωταρχικός παράγοντας έκκρισης της GH κατά την άσκηση. Δ) Νευρομεταβιβαστές - Ακετυλοχολίνη : Χολινεργικά μονοπάτια έχει βρεθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της έκκρισης της GH και πιστεύεται ότι δρουν μέσω απόσυρσης της σωματοστατίνης από τον υποθάλαμο. Η χορήγηση χολινεργικών αγωνιστών κατά τη διενέργεια κλινικών πειραμάτων προκάλεσε διπλασιασμό της ημερήσιας έκκρισης GH σε υγιείς άνδρες, ενώ η χορήγηση φαρμάκων που μπλοκάρουν τους μουσκαρινικούς υποδοχείς μειώνει την έκκριση GH κατά τη διάρκεια του ύπνου και την αναστέλλει μετά από χορήγηση GHRH. (70) - Ντοπαμίνη : Αυξάνει την έκκριση GH σε φυσιολογικά άτομα μέσω αναστολής της έκκρισης της σωματοστατίνης. Επίσης, έχει βρεθεί ότι διεγείρει την απελευθέρωση in vitro της GH στα χρυσόψαρα. (71) - Κατεχολαμίνες (α αδρενεργικά μονοπάτια, β αδρενεργικά μονοπάτια): Τα μονοπάτια των κατεχολαμινών στο ΚΝΣ φαίνεται να είναι θεμελιώδους σημασίας για τη διατήρηση της παλμικής έκκρισης της GH. (72) Οι α 1 αγωνιστές δε φαίνεται να επιδρούν στη βασική έκκριση GH στον άνθρωπο, ενώ οι α 2 αγωνιστές, όπως είναι η κλονιδίνη, προκαλούν έκκριση GH στον άνθρωπο και σε πειραματικά ζώα. Οι β- αδρενεργικοί υποδοχείς ασκούν ανασταλτική δράση στην έκκριση GH, μέσω μειωμένης έκκρισης GHRH. H νοραδρεναλίνη δρα εκτός του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και μειώνει τα επίπεδα της GH στον ορό του χρυσόψαρου, πιθανώς επηρεάζοντας άμεσα τα σωματοτρόπα κύτταρα. (73) Επίσης, η νοραδρεναλίνη μπορεί 29

30 να δράσει μέσω α2-αδρενεργικών υποδοχέων και καταστέλλει τη βασική, αλλά και τη μέσω ντοπαμίνης και GnRH έκκριση της GH στο χρυσόψαρο. - Σεροτονίνη: Διεγείρει την έκκριση GH σε πειραματικά ζώα, πιθανώς μέσω απελευθέρωσης GHRH. Στον άνθρωπο, η χορήγηση της πρόδρομης σεροτονινεργικής ουσίας 5-υδροξυτρυπτοφάνης αυξάνει τα επίπεδα της GH. Έχει βρεθεί επίσης ότι η σεροτονίνη καταστέλλει τη διεγειρόμενη από GnRH απελευθέρωση GH στα χρυσόψαρα. - Ισταμίνη : Έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την αυθόρμητη έκκριση GH. - Αμινοξέα : Η ενδοφλέβια χορήγηση ορισμένων αμινοξέων είναι γνωστό ότι προκαλεί σημαντική απελευθέρωση GH. Για παράδειγμα, αύξηση της αργινίνης ορού κατά 52% αυξάνει σημαντικά τα επίπεδα GH στον άνθρωπο. Ομοίως, η ορνιθίνη χορηγούμενη ενδοφλέβια προκαλεί πενταπλάσια αύξηση της GH σε 45 λεπτά. (74) Η γλυκίνη από του στόματος, όπως και η γλουταμίνη σε πολύ χαμηλή δόση από του στόματος αυξάνουν τα επίπεδα της GH, ενώ το γ-αμινοβουτυρικό οξύ, ο ισχυρότερος ανασταλτικός νευροδιαβιβαστής του εγκεφάλου, προκαλεί αύξηση της GH στην ηρεμία, αλλά αναστολή της στην άσκηση. (75) Ε) Ανασταλτικά νευροπεπτίδια, πρωτεΐνες και ορμόνες α) GH : Η GH ασκεί αρνητική ρύθμιση στην ίδια της την έκκριση, μειώνοντας την παραγωγή του GHRH και του υποδοχέα του (GHRHR) και αυξάνοντας τη δραστηριότητα της σωματοστατίνης. (76,77) Η GH φαίνεται ότι δρα στους νευρώνες του Νευροπεπτιδίου Υ (NPY) στον τοξοειδή πυρήνα του υποθαλάμου και σε νευρώνες της σωματοστατίνης στον περικοιλιακό πυρήνα μέσω του υποδοχέα της (GHR). Η ενεργοποίηση αυτών των νευρώνων προκαλεί την απελευθέρωση της σωματοστατίνης και αναστέλλει την έκκριση της GH. (78) β) IGF-I : Στον άνθρωπο έχει βρεθεί ότι η συστηματική χορήγηση IGF-I καταστέλλει την έκκριση της GH. (79) Έχει προταθεί ότι ο IGF-I καταστέλλει την έκκριση της GH δρώντας τόσο στον υποθάλαμο όσο και στην υπόφυση. Δεν έχει ακόμα διαλευκανθεί όμως αν η αναστολή της GH γίνεται μέσω αρνητικής ανατροφοδότησης στην υπόφυση ή μέσω τροποποίησης της απελευθέρωσης σωματοστατίνης στον υποθάλαμο. Έχει επίσης δειχθεί η άμεση ανασταλτική δράση του στα σωματοτρόπα κύτταρα. (80) Επιπλέον, παράγοντες όπως η υπεργλυκαιμία και τα υψηλά επίπεδα ελεύθερων λιπαρών οξέων μειώνουν τα επίπεδα της GH. (81) γ) Κορτιστατίνη (CST): Πρόκειται για ένα κυκλικό πεπτίδιο με λειτουργικές ομοιότητες με τη σωματοστατίνη, το οποίο προσδένεται στους υπότυπους 1-5 του υποδοχέα της σωματοστατίνης με παρόμοια συγγένεια, αλλά μπορεί να προσδεθεί και σε άλλους υποδοχείς. Είναι προφανές ότι η κορτιστατίνη αναστέλλει την απελευθέρωση GH. (82,83) 30

31 ΣΤ) Φυσιολογικές και μη καταστάσεις που επηρεάζουν την έκκριση της GH i) Ηλικία: Η γήρανση συνδυάζεται με μείωση στην έκκριση της GH, γεγονός που συσχετίζεται με μεταβολές στη σύνθεση του σώματος, αλλά και στη φυσική και ψυχολογική λειτουργία. Παρόμοιες μεταβολές παρατηρούνται σε νεώτερους ενήλικες με ανεπάρκεια αυξητικής ορμόνης και περιλαμβάνουν μείωση της άλιπης μάζας σώματος και της μυικής ισχύος, αύξηση του λιπώδη ιστού, κυρίως του σπλαχνικού, και αθηρογόνες μεταβολές στο λιπιδαιμικό προφίλ. Η μνήμη και η γνωστική λειτουργία σταδιακά επιδεινώνονται με την ηλικία, ενώ η οστική πυκνότητα ελαττώνεται. Επίσης, ο βαθύς ύπνος βραδέων κυμάτων μειώνεται σημαντικά με την ηλικία, όπως και η έκκριση της GH κατά τη διάρκεια της νύχτας. Οι μεταβολές αυτές παρουσιάζουν συσχέτιση, ωστόσο δεν είναι βέβαιο ότι υπάρχει αιτιολογική σύνδεση μεταξύ τους. Τα επίπεδα της GH φτάνουν σε plateau στη νεαρή ενήλικο ζωή και στη συνέχεια ελαττώνονται προοδευτικά, με ταυτόχρονη μείωση της μυικής μάζας και της αερόβιας ικανότητας και αύξηση του κοιλιακού λίπους. Μετά την τρίτη δεκαετία ζωής, η GH ελαττώνεται κατά 15% για κάθε δεκαετία ενήλικης ζωής. Η μείωση στην έκκριση της GH είναι αποτέλεσμα μείωσης του εύρους των ώσεων GH κι ελάχιστα της παλμικής συχνότητας. ii) Άσκηση : Η άσκηση αποτελεί σημαντικό διεγέρτη έκκρισης της GH. Η έντονη άσκηση στα παιδιά διεγείρει άμεσα την έκκριση GH. Στους ηλικιωμένους η τακτική άσκηση αυξάνει την άλιπη μάζα σώματος, τη μυική δύναμη και την αερόβια ικανότητα. Η απόκριση της GH στην άσκηση μειώνεται με τη γήρανση. Το εύρημα αυτό οδήγησε στην υπόθεση ότι κάποιες από τις δράσεις της άσκησης διαμεσολαβούνται από την GH ή τον IGF-I. H βελτιστοποίηση της έκκρισης της GH επέρχεται κυρίως όταν η διάρκεια της άσκησης είναι μεγαλύτερη από 10 λεπτά, όταν επαναλαμβάνεται πολλές φορές μέσα στην ίδια μέρα και όταν η ένταση της άσκησης είναι μεγαλύτερη από το γαλακτικό κατώφλι. (84) iii) Ύπνος : Για περισσότερο από 30 χρόνια υπήρχε η παρατήρηση ότι η GH εκκρίνεται περισσότερο κατά τη διάρκεια του βαθέως ύπνου βραδέων κυμάτων (Slow wavw sleep/sws). Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η έκκριση της GH κατά την έναρξη του ύπνου ρυθμίζεται πρωτίστως από τη διέγερση της GHRH, κατά τη διάρκεια μιας περιόδου σχετικής απόσυρσης της σωματοστατίνης και αυξημένων επιπέδων κυκλοφορούσας γκρελίνης. Φαρμακολογικές παρεμβάσεις που αυξάνουν τη διάρκεια και/ή την ένταση του SWS αυξάνουν επίσης το ρυθμό της απελευθέρωσης της GH. Επειδή η φυσιολογική αρνητική ανατροφοδότηση που ασκεί η GH στην κεντρική GHRH είναι μη λειτουργική σε ασθενείς με ανεπάρκεια GH, είναι πιθανό ότι τα ελαττωμένα επίπεδα ενέργειας και η κόπωση που συχνά αναφέρεται από αυτούς τους ασθενείς αντανακλούν εν μέρει την τροποποίηση στη ρύθμιση ύπνουαφύπνισης. (85) Ο βραδέων κυμάτων ύπνος ελαττώνεται με την ηλικία. Ωστόσο, στις περισσότερες μελέτες η χορήγηση GH ή GHRH σε ηλικιωμένους δε βελτίωσε τον SWS, γεγονός 31

32 που υποδηλώνει ότι η εξαρτώμενη από την ηλικία μείωση της GH δεν προκαλεί μειωμένο SWS, αν και το αντίστροφο μπορεί να είναι αλήθεια. iv) Παχυσαρκία : Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι κατά τη διάρκεια της προεφηβικής ηλικίας τα παχύσαρκα παιδιά παρουσιάζουν μεγαλύτερη ταχύτητα αύξησης και προχωρημένη οστική ηλικία συγκρινόμενα με λεπτόσωμα. Ωστόσο, αυτό το προεφηβικό πλεονέκτημα στην αύξηση τείνει να μειωθεί βαθμιαία κατά την εφηβεία, στην οποία τα παχύσαρκα παιδιά παρουσιάζουν μειωμένη αυξητική έκρηξη συγκρινόμενα με λεπτόσωμα. Η έκκριση της GH στα παχύσαρκα παιδιά είναι ελαττωμένη, υποδηλώνοντας ότι η μεγαλύτερη αύξηση που παρατηρείται είναι ανεξάρτητη από την GH. Παράγοντες στους οποίους έχει αποδοθεί η επιταχυνόμενη αύξηση στα παχύσαρκα παιδιά είναι τα αυξημένα επίπεδα λεπτίνης και ινσουλίνης, τα επινεφριδιακά ανδρογόνα, ο IGF-I, η IGFBP-1 και GHBPs. (86) Τα παχύσαρκα παιδιά σε σύγκριση με παιδιά κανονικού βάρους παρουσιάζουν μειωμένο χρόνο ημιζωής της GH, μειωμένα επεισόδια έκκρισης GH και μειωμένο ημερήσιο ρυθμό παραγωγής GH. Όλες αυτές οι διαφοροποιήσεις παρουσιάζουν θετική συσχέτιση με το βαθμό του υπερβάλλοντος βάρους. (87) Ωστόσο, η ποσότητα της GH που απελευθερώνεται ανά ώση και η διάρκεια των εκκριτικών επεισοδίων είναι συγκρίσιμα σε παχύσαρκα και λεπτόσωμα παιδιά. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η σημαντική μείωση της αυθόρμητης και μετά από πρόκληση έκκρισης της GH. H διαταραγμένη έκκριση της GH, ωστόσο, δε συνδυάζεται με μείωση του κυκλοφορούντος IGF-I, και αυτό ίσως εξηγεί τη φυσιολογική αύξηση στα παχύσαρκα παιδιά. 1.6 Μηχανισμοί σηματοδότησης κατά την έκκριση της Αυξητικής Ορμόνης α) Αδενυλική κυκλάση/camp/πρωτεϊνική Κινάση Α και Φωσφολιπάση C-IP3- Πρωτεϊνική Κινάση C: Τα σωματοτρόπα κύτταρα, υπό την επίδραση της GHRH, εκπολώνουν το δυναμικό της κυτταρικής μεμβράνης και διεγείρουν την εισροή Ca +2 μέσω διαμεμβρανικών καναλιών Ca +2, οδηγώντας σε αυξήσεις του ελεύθερου ενδοκυττάριου Ca +2. Η αύξηση αυτή προκύπτει από την εισροή Ca +2 μέσω τασεοευαίσθητων καναλιών Ca +2, αλλά και από την υδρόλυση της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης από τη φωσφολιπάση C, που οδηγεί στην κινητοποίηση ενδοκυττάριων αποθηκών Ca +2. β) ΝΟ: Υπάρχουν ενδείξεις υπέρ της διαμεσολάβησης του ΝΟ και της cgmp στην έκκριση GH από εκκριταγωγά. In vivo, η έγχυση της πρόδρομης του ΝΟ ουσίας, L- αργινίνης, αύξησε ήπια τις κυκλοφορούσες συγκεντρώσεις της GH και την απόκριση στην GHRH. Επιπλέον, ένας αναστολέας της σύνθεσης ΝΟ, ο Nx-nitro-L-arginine methyl ester (NAME), κατέστειλε τη μέσω GHRH έκκριση GH. (88) Έχει επίσης αποδειχθεί η ύπαρξη δραστηριότητας γουανυλικής κυκλάσης στα σωματοτρόπα 32

33 κύτταρα και η παρουσία αυξημένων κυτταρικών συγκεντρώσεων cgmp μετά από in vitro έγχυση GHRH. (89) γ) Κυτταρικός μηχανισμός έκκρισης GH: Στο παρελθόν, επικρατούσε η αντίληψη ότι εκκριτικά κυστίδια της GH που βρίσκονται σε επαφή με τη μεμβράνη ενσωματώνονται σε αυτή, απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους και κατόπιν απομακρύνονται με τη διαδικασία της ενδοκύττωσης. Πρόσφατα, ο μηχανισμός της κυτταρικής έκκρισης έχει διαλευκανθεί από μελέτες που αποκάλυψαν την ύπαρξη μιας καινούριας κυτταρικής δομής, που ονομάζεται porosome. Τα porosomes είναι κυπελλοειδούς ή κωνικής διαμόρφωσης υπερμοριακές λιποπρωτεϊνικές δομές που εντοπίζονται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη εκκριτικών κυττάρων κι έχουν διάμετρο ανοίγματος nm. Τα σωματοτρόπα αποτελούν παράδειγμα κυττάρων που φέρουν porosomes. Οι δομές αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο στην προσωρινή αγκυροβόληση εκκριτικών κυστιδίων τα οποία συντήκονται με τα porosomes αυξάνοντας κατά 20-40% τη διάμετρό τους. (90-95) Εικόνα 14. Κυτταρικός μηχανισμός έκκρισης GH Στα σωματοτρόφα κύτταρα τα εκκριτικά κυστίδια που περιέχουν GH μεταφέρονται στην πλασματική μεμβράνη κατά μήκος μικροσωληνίσκων. Στη διαδικασία αυτή συμμετέχουν μοριακές κινητικές μηχανές που ανήκουν στην οικογένεια των κινεσινών, με κατανάλωση μορίων ATP. (96) Τα κυστίδια συνδεόμενα με την κυτταρική μεμβράνη προσδένονται προσωρινά στα porosomes και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους προς το εξωτερικό του κυττάρου κατά τη διάρκεια της κυτταρικής έκκρισης. (97) Για πρώτη φορά τα porosomes είχαν περιγραφεί σε κύτταρα της εξωκρινούς μοίρας του παγκρέατος και κατόπιν στα σωματοτρόφα κύτταρα της υπόφυσης. (98) 1.7 Βιολογικές δράσεις της Αυξητικής Ορμόνης Η κύρια βιολογική δράση της GH είναι η ρύθμιση της κατά μήκος αύξησης των οστών μετά τη γέννηση. (99,100) Η GH προάγει την αύξηση μέσω πολλαπλών επιδράσεων στον κυτταρικό μεταβολισμό και στη διαφοροποίηση. Επίσης, ρυθμίζει το μεταβολισμό των υδατανθράκων, των λιπιδίων, των πρωτεϊνών, του αζώτου και 33

34 των μετάλλων ( ) και διεγείρει τη σύνθεση DNA, τη διαφοροποίηση και τη μιτογένεση σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. ( ) Η GH είναι επίσης σημαντική για τη διατήρηση του ανοσοποιητικού συστήματος (108,109) την ανάπτυξη της καρδιάς και την υπερτροφία (110) και έχει βρεθεί ότι δρα στον εγκέφαλο ρυθμίζοντας το συναίσθημα, τη συμπεριφορά και την απάντηση στο στρες. (111) Είναι ασαφές ποιες από αυτές τις δράσεις σχετίζονται με τη σωματική αύξηση και ποιες αποτελούν δράσεις ανεξάρτητες από την αύξηση Σωματική αύξηση H GH, όπως έχει ήδη αναφερθεί, προάγει τη μετά τη γέννηση κατά μήκος αύξηση του σώματος και των οστών και τη διαφοροποίηση των μυοκυττάρων, των οστικών κυττάρων και των χονδροκυττάρων. Η χόνδρινη ουσία των οστών αυξάνει παράλληλα με τη σωματική αύξηση και σταδιακά οστεοποιείται μέχρι τη σύγκλειση των επιφύσεων. Επειδή προάγει τη σκελετική, σπλαχνική και οργανική αύξηση αποκαλείται επίσης «αναβολική ορμόνη». Η απάντηση των ιστών του σώματος στην αυξητική ορμόνη είναι μία αναλογική και ισορροπημένη αύξηση του μεγέθους τους. Η αύξηση των οστών προκαλεί γραμμική αύξηση, ενώ ταυτόχρονα αναπτύσσονται το δέρμα και τα εξαρτήματα, καθώς και οι σκελετικοί μύες. Οι άνθρωποι που πρόκειται να γίνουν ψηλοί εκκρίνουν GH σε υψηλότερες συγκεντρώσεις από τους υπόλοιπους, με αποτέλεσμα μεγαλύτερο ρυθμό αύξησης. Μία ενδεχόμενη συγγενής διαταραχή στη σύνθεση κι έκκριση της GH καταλήγει σε νανισμό, ενώ η υπερέκκριση προκαλεί γιγαντισμό αν συμβεί προεφηβικά και ακρομεγαλία αν συμβεί μετά την εφηβεία. (112,113) Τα άτομα με ακρομεγαλία παρουσιάζουν μεγάλα άκρα και γνάθους, υπερτροφία της καρδιάς και υπέρταση. Μεταβολικά, αυτοί οι ασθενείς αναπτύσσουν σοβαρή ινσουλινοαντίσταση με συμπτώματα σακχαρώδη διαβήτη. Απώλεια της έκκρισης GH σε νεαρούς ενήλικες ή σε παιδιά οδηγεί σε σημαντικά μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης με διαταραχές σε ορισμένες μεταβολικές λειτουργίες που οδηγούν σε αυξημένο σωματικό λίπος και μειωμένη μυική δύναμη. (114) Ρύθμιση του μεταβολισμού των υδατανθράκων, των πρωτεϊνών, των λιπιδίων και των ηλεκτρολυτών Οι αλλαγές που η GH επάγει στο μεταβολισμό της γλυκόζης και των λιπιδίων απεικονίζονται στην εικόνα

35 Εικόνα 15. Μεταβολικές δράσεις της GH Η GH διεγείρει τη λιπόλυση και, άρα, την παραγωγή ελεύθερων λιπαρών οξέων και γλυκερόλης, και αυξάνει την οξείδωση των λιπιδίων. Επίσης, αναστέλλει την ινσουλινοεπαγώμενη καταστολή της ηπατικής γλυκονεογένεσης και την αποθήκευση του γλυκογόνου στο ήπαρ και στους μυς. Αυξάνει, επομένως, τα κυκλοφορούντα επίπεδα της γλυκόζης και της ινσουλίνης και καταστέλλει την οξείδωση της γλυκόζης. ( ) Κατά συνέπεια, έχει υπεργλυκαιμική, ακόμα και διαβητογόνο δράση σε ορισμένες περιπτώσεις. Αυτές οι μεταβολικές αλλαγές παρατηρούνται σε ασθενείς με ακρομεγαλία, προδιαθέτοντάς τους σε σακχαρώδη διαβήτη. Αντιθέτως, η έλλειψη GH σχετίζεται με αυξημένη μάζα λιπώδους ιστού και μειωμένη άλιπη μάζα σώματος. Η αύξηση στο λιπώδη ιστό που διαπιστώνεται σε αυτά τα άτομα, συμβάλλει στην εμφάνιση ινσουλινοαντίστασης και υπερινσουλιναιμίας. (118) Ωστόσο, δεν έχει ακόμα διαλευκανθεί αν η αντίσταση στην ινσουλίνη σχετίζεται με τα μειωμένα επίπεδα GH. Η οξεία χορήγηση GΗ σε ενήλικες με έλλειψη GH προκαλεί μείωση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη και αύξηση στις συγκεντρώσεις γλυκόζης και ινσουλίνης στο πλάσμα. Η χρόνια χορήγηση GH αυξάνει την άλιπη μάζα σώματος και μειώνει τη λιπώδη μάζα, βελτιώνοντας την ινσουλινοευαισθησία (119). Η GΗ επίσης προάγει την κατακράτηση αζώτου, νατρίου, καλίου και φωσφόρου, ρυθμίζοντας με τον τρόπο αυτό το μεταβολισμό των μετάλλων και την ισορροπία των ηλεκτρολυτών. (120) Μοντέλα ζώων παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τις μεταβολικές δράσεις της GH. Διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν GH έχουν αυξημένο ρυθμό αύξησης και επίπεδα IGF-Ι, καθώς και μειωμένη λιπώδη μάζα. Σε αυτά τα ζώα είναι παρούσες επίσης ανωμαλίες όπως επηρεασμένη καρδιακή λειτουργία, υπέρταση, ανοσολογικές διαταραχές και αρθριτικές διαταραχές. Μεταβολικά, αυτά τα ζώα αναπτύσσουν σοβαρή ινσουλινοαντίσταση με υψηλά επίπεδα γλυκόζης και ινσουλίνης. (121) To προσδόκιμο επιβίωσης παρουσιάζει αρνητική συσχέτιση με τα κυκλοφορούντα επίπεδα GH. Ποντίκια που υπερεκφράζουν GH δε ζουν τόσο πολύ όσο τα φυσιολογικά αδέρφια τους, εμφανίζοντας συμπτώματα πρόωρης γήρανσης. (122) Είναι ενδιαφέρον ότι τα υψηλά επίπεδα ινσουλίνης και η κακή γλυκαιμική ρύθμιση αποτελούν παράγοντες κινδύνου για διάφορες νόσους που συνδέονται με την ηλικία στον άνθρωπο. (123) Οξειδωτικές διεργασίες είναι περισσότερο ενεργείς στα GH διαγονιδιακά ποντίκια, λόγω μειωμένης 35

36 δραστηριότητας ορισμένων αντιοξειδωτικών ενζύμων. (124) Αυτό θα μπορούσε να επηρεάζει αρνητικά τη διάρκεια ζωής των ποντικιών αυτών, καθότι είναι γνωστό ότι η οξειδωτική βλάβη παίζει καθοριστικό ρόλο στην κυτταρική γήρανση. (125) Έχει βρεθεί ότι η απαλοιφή του γονιδίου του IGF-Ι στο ήπαρ στα ποντίκια συνεπάγεται υψηλά επίπεδα GH και ινσουλίνης, (126) υπερπλασία των νησιδίων του παγκρέατος και ινσουλινοαντίσταση στο ήπαρ, στους μυς και στο λιπώδη ιστό. (127) Η αναστολή της δράσης της GH μετά από διασταύρωση των ποντικιών αυτών με διαγονιδιακά ποντίκια που παρουσιάζουν ανταγωνιστική δράση στην GH, βελτιώνει την ινσουλινοευαισθησία στο ήπαρ. Αυτή η παρατήρηση υποδηλώνει ότι η αύξηση των επιπέδων της GH στα ποντίκια με την απαλειφή του IGF-Ι γονιδίου παίζει μείζονα ρόλο στην ινσουλινοαντίσταση, (128) καθώς και ότι ο IGF-Ι αντιμάχεται τις διαβητογόνους δράσεις της GH. Η αυξητική ορμόνη έχει εντονότατη αναβολική δράση στο μεταβολισμό των πρωτεϊνών. Επάγει την πρωτεϊνοσύνεση σε πλήθος ιστών, όπως είναι οι μύες, τα ερυθρά αιμοσφαίρια, το ήπαρ και το δέρμα. Αυτό επιτυγχάνεται κυρίως μέσω της διευκόλυνσης της εισόδου των αμινοξέων εντός των κυττάρων, αλλά και μέσω διέγερσης του σχηματισμού RNA κι ενεργοποίησης των ριβοσωμάτων. Επιπλέον, η GH προκαλεί αυξημένη σύνθεση κολλαγόνου και χόνδρων Ρύθμιση γονιδίων Η ρύθμιση της μεταγραφής είναι από τις σπουδαιότερες δράσεις της GH στους ιστούς-στόχους. Αρκετά γονίδια έχει βρεθεί ότι ενεργοποιούνται από την GH. Aπό τα πρώτα που αναφέρθηκαν είναι ο Ιnsulin-like Growth Factor I (IGF-I). (129,130) Η σχέση ανάμεσα στην επαγώμενη από την GH ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου του IGF-Ι και της σωματικής αύξησης είναι αποδεδειγμένη. Οι μεταγραφικές δράσεις της GH ασκούνται από αρκετούς μεταγραφικούς παράγοντες. Mεταγραφικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην επαγώμενη από την GH έκφραση του IGF-I είναι ο HNF-1α και ο STAT5. (131,132) Ωστόσο, τα μονοπάτια που εμπλέκονται μπορεί να διαφέρουν στους διάφορους κυτταρικούς τύπους, δεδομένου ότι αναστολείς της ΡΙ3 κινάσης είτε αναστέλλουν είτε προάγουν την επαγώμενη από την GH μεταγραφή του IGF-I στα ηπατοκύτταρα και στα μυικά σωληνάρια, αντίστοιχα. (133,134) Η ανακάλυψη ότι ο Signal Transducer and Activator of Transcription 5 (STAT5) ενεργοποιείται από την GH μέσω της φωσφορυλίωσης του GHR, (135) αποτέλεσε σημαντική αφετηρία για την κατανόηση των μηχανισμών της μεταγραφικής ρύθμισης της GH. Απαλειφή του γονιδίου του STAT5b στα ποντίκια συνεπάγεται μείωση κατά 27% στο ρυθμό ανάπτυξης στα άρρενα και απώλεια του διμορφισμού των φύλων στην ανάπτυξη (136). Αυτά τα αποτελέσματα συνδέουν το μεταγραφικό παράγοντα STAT5 με τις δράσεις της GH. O SΤΑΤ5b προσδένεται στον υποκινητή και ρυθμίζει τη μεταγραφή του ηπατικού πυρηνικού παράγοντα 6 (hepatic nuclear factor 6/HNF-6), o oποίος ενεργοποιεί άλλα γονίδια που ρυθμίζονται από την GH. (137,138) O STAT5b μπορεί να αναστείλει τη μεταγραφή και τη δραστηριότητα του Peroxisome Proliferator-Activated Receptor alpha (PPARα), με πιθανή κατάληξη την επαγωγή 36

37 λιπογενών δράσεων στο ήπαρ. (139,140,141) Άλλα γονίδια σημαντικά για τη δράση της GH που ρυθμίζονται τουλάχιστον εν μέρει από την πρωτεΐνη STAT5 είναι: οι καταστολείς της σηματοδότησης των κυττοκινών (SOCS-1, -2, -3 και CIS) στο ήπαρ, ( ) o αναστολέας της πρωτεάσης της σερίνης (Spi) 2.1, (146,147) η υπομονάδα acid labile (ALS) του συμπλέγματος IGFBP-3, (148) η ινσουλίνη (σε κύτταρα ινσουλινώματος αρουραίων) (149) και ένας αριθμός γονιδίων του ηπατικού χρωμοσώματος Ρ450 που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των ενδογενών στεροειδών. (150,151) Η ενεργοποιούμενη από την GH έκφραση του γονιδίου c-fos διαμεσολαβείται εν μέρει από τα μονοπάτια STAT1/3 και ERK1/2. (152) Πρόσθετοι μεταγραφικοί παράγοντες που ενεργοποιούνται από την GH είναι οι : α, β, δ ισομορφές της οικογένειας C/EBP, HNF-1α, IRF-1, mttf1, c-jun και c-fos, Foxm1b, Runx2, Hoxa1, ear-2, TAFII Αυξητική ορμόνη και καρκίνος Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι εκτός από τις δράσεις της στην αύξηση και στο μεταβολισμό, η GH εμπλέκεται στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Η υπερέκφραση της GH έχει συσχετισθεί με καρκίνο σε μοντέλα ζώων, αλλά και στον άνθρωπο. Πράγματι, ασθενείς με ακρομεγαλία παρουσιάζουν αυξημένη επίπτωση καρκίνου. ( ) Αντιθέτως, η απουσία ή τα χαμηλά επίπεδα GH έχουν συσχετισθεί με μειωμένη τάση ανάπτυξης κακοηθειών. (156,157) Η αυξημένη τάση των διαγονιδιακών ποντικιών που υπερεκφράζουν GH να αναπτύξουν καρκίνο ήπατος θα μπορούσε να αποδοθεί σε αυξημένα επίπεδα κυκλοφορούντος IGF-Ι. Ωστόσο, ο IGF- Ι επάγει μεταβολικές δράσεις και μόνο μικρή αύξηση της σύνθεσης DNA στο ήπαρ. ( ) Επιπλέον, διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν IGF-Ι δεν παρουσιάζουν τις ηπατικές ιστοπαθολογικές μεταβολές που παρατηρούνται στο ήπαρ διαγονιδιακών ποντικιών που υπερεκφράζουν GH. (161) Ακόμα και όταν ενεργοποιούνται αντιαποπτωτικά μονοπάτια σε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν GH, το κύριο σηματοδοτικό μονοπάτι της GH, αυτό των JAK2/STAT5, είναι απευαισθητοποιημένο στο ήπαρ. (162,163) Αυτό υποδηλώνει ότι αυτό το μονοπάτι δεν εμπλέκεται στην πολλαπλασιαστική δράση της υπερεκφραζόμενης GH. Mια πιθανή εξήγηση είναι ο ρυθμιστικός ρόλος της GH στη δράση ηπατικών μιτογόνων, όπως ο EGF. Έχει περιγραφεί ότι η GH ρυθμίζει την έκφραση του EGFR. (164) Επίσης, η ποσότητα του EGFR βρέθηκε αυξημένη σε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερέκφραζαν GH. (165) 1.8 Τρόποι δράσης της Αυξητικής Ορμόνης Η αυξητική ορμόνη προάγει τη σύνθεση κι έκκριση αυξητικών παραγόντων, οι πιο σημαντικοί από τους οποίους είναι οι σωματομεδίνες ή ινσουλινόμορφοι αυξητικοί 37

38 παράγοντες IGF (IGF-I, IGF-II). Οι παράγοντες αυτοί μοιάζουν δομικά με την προϊνσουλίνη. Σημαντικότερoς εξ αυτών είναι ο IGF-I. Έχει βρεθεί σε ηπατοκύτταρα ότι τα κύρια σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται από την GH έχουν ως κατάληξη την έκφραση του mrna του IGF-I και την έκκρισή του. Εκτός από την άμεση δράση της σε διάφορους ιστούς και όργανα, η GH ασκεί πολλές από τις δράσεις της μέσω του ΙGF-Ι. O IGF-Ι παράγεται σε πολλούς ιστούς, κυρίως στο ήπαρ, και δρα μέσω του δικού του υποδοχέα, προάγοντας τον πολλαπλασιασμό και την ωρίμανση πολλών ιστών, όπως τα οστά, οι χόνδροι και οι σκελετικοί μύες. (166) Εικόνα 16. Άμεση κι έμμεση δράση της GH Σχηματικά, οι δράσεις της GH αποδίδονται παρακάτω: ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ (ΑΜΕΣΗ ΔΡΑΣΗ) ΗΠΑΡ - Πρωτεϊνική σύνθεση - Γλυκονεογένεση - Σύνθεση mrna IGF- I - Χρησιμοποίηση γλυκόζης ΜΥΕΣ - Πρόσληψη αμινοξέων - Πρωτεϊνική σύνθεση - Άλιπη σωματική μάζα - Mείωση πρόσληψης γλυκόζης ΛΙΠΩΔΗΣ ΙΣΤΟΣ - Λιπόλυση - Παραγωγή ελεύθερων λιπαρών οξέων 38

39 ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ (ΕΜΜΕΣΗ ΔΡΑΣΗ) ΗΠΑΡ IGF-I ΗΠΑΡ - Σύνθεση DNA/RNA - Πρωτεϊνική σύνθεση - Αύξηση - Κολλαγόνο AΛΛΟΙ ΙΣΤΟΙ (Οστά, καρδιά, ενδοκρινή/εξωκρινή όργανα) - Σύνθεση DNA/RNA - Πρωτεϊνική σύνθεση - Υπερτροφία και υπερπλασία κυττάρων Ο ινσουλινόμορφος Αυξητικός Παράγων Ι (IGF-I) Ο IGF-I ονομάζεται επίσης σωματομεδίνη C και είναι σημαντικός ρυθμιστής της σωματικής αύξησης και πρωταρχικός μεσολαβητής των δράσεων της αυξητικής ορμόνης. Παίζει σημαντικό ρόλο στη γραμμική αύξηση, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στη διαφοροποίηση και στην απόπτωση. Έχει μοριακό βάρος daltons και αποτελείται από 70 αμινοξέα σε μία μονή αλυσίδα με τρεις ενδομοριακές δισουλφιδικές γέφυρες. Εικόνα 17. Τρισδιάστατη απεικόνιση του μορίου του IGF-I Ο IGF-I παράγεται κυρίως στο ήπαρ ως ορμόνη με ενδοκρινή δράση, καθώς και στους ιστούς-στόχους με παρακρινή/αυτοκρινή δράση. Η παραγωγή του διεγείρεται 39

40 από την αυξητική ορμόνη και μπορεί να παρεμποδισθεί από τον υποσιτισμό, τη μειωμένη ευαισθησία στην αυξητική ορμόνη, την έλλειψη των υποδοχέων της αυξητικής ορμόνης ή από διαταραχές στο σηματοδοτικό μονοπάτι μετά τον υποδοχέα. Περίπου το 98% του IGF-I είναι προσδεδεμένο σε μία από τις 6 συνδετικές πρωτεΐνες (IGF-BP). H IGFBP-3 είναι η αφθονότερη δεσμευτική πρωτεΐνη και καταλαμβάνει το 80% της συνολικής πρόσδεσης του IGF-I. O IGF-I προσδένεται στην IGFBP-3 με αναλογία 1:1. Στην κυκλοφορία, o IGF-I είναι παρών ως συμπλέγματα των 150kDa, που αποτελούνται από τον IGF-I, την IGFBP-3 ή -5 και μία γλυκοπρωτεΐνη 85kDa, την acid-labile subunit (ALS). Η παρουσία της ALS μετά τη γέννηση συνδυάζεται με αυξημένη απόκριση στην GH, λόγω αύξησης της έκκρισης της GH και των ηπατικών υποδοχέων GHR. H πρωταρχική δράση του IGF-I διαμεσολαβείται από την πρόσδεσή του στον ειδικό υποδοχέα του, τον Insulin-like Growth Factor I Receptor/IGF-IR, ο οποίος είναι παρών σε πολλούς κυτταρικούς τύπους σε πολλούς ιστούς. Η πρόσδεση στον IGF-IR, έναν υποδοχέα με δράση τυροσιν-κινάσης, πυροδοτεί την ενδοκυττάρια σηματοδότηση. Ο IGF-I είναι ισχυρός φυσικός ενεργοποιητής του σηματοδοτικού μονοπατιού της AKT, δηλαδή ενός διεγέρτη της κυτταρικής αύξησης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αλλά κι ενός εν δυνάμει αναστολέα του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Εικόνα 18. Ο υποδοχέας IGF-IR Αρκετές μελέτες έχουν αποδείξει την έκφραση και την κατανομή των υποδοχέων της GH και του IGF-I στον εγκέφαλο. Αν και η υπόφυση θεωρείται η αποκλειστική πηγή της GH στο αίμα και ο παραγώμενος στο ήπαρ IGF-I αποτελεί τη μεγαλύτερη ποσότητα του κυκλοφορούντος IGF-I, έχει προταθεί από μελέτες η τοπική παραγωγή τόσο της GH όσο και του IGF-I σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου. Ποντίκια με απαλοιφή του γονιδίου του IGF-Ι φτάνουν το 40% της αύξησης που παρατηρείται στα ποντίκια του «άγριου τύπου», (167,168) ενώ ποντίκια με διαταραχή στον υποδοχέα του IGF-I (IGF-IR) πεθαίνουν στη γέννηση έχοντας κατά 55% μειωμένο βάρος. (169) Η ηπατική παραγωγή του IGF-Ι, που βρίσκεται υπό τον έλεγχο της GH, είναι κατεξοχήν υπεύθυνη για τα κυκλοφορούντα επίπεδα του IGF-Ι. (170) H απαλοιφή του γονιδίου του IGF-Ι στο ήπαρ μειώνει τα κυκλοφορούντα επίπεδα του IGF-Ι κατά 65%, αλλά δεν επηρεάζει την αύξηση. (171) Περαιτέρω μείωση στο 15% των φυσιολογικών επιπέδων μπορεί να επιτευχθεί με απαλοιφή της υπομονάδας Acid 40

41 Labile Subunit (ALS), οδηγώντας σε σημαντική μείωση του μήκους του σώματος. (172) Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι μία ελάχιστη συγκέντρωση κυκλοφορούντος IGF-Ι απαιτείται για την αύξηση και ότι ο εξωηπατικός IGF-Ι, που επίσης παράγεται ως απάντηση στην GH, συνεισφέρει σημαντικά στη σωματική αύξηση. (173) Η GH ορμόνη επομένως, δρα άμεσα και έμμεσα, μέσω τοπικά ή συστηματικά παραγόμενου IGF-I. Δεδομένου ότι τα επίπεδα του IGF-I στο αίμα δεν παρουσιάζουν μεγάλες διακυμάνσεις κατά τη διάρκεια της ημέρας για το ίδιο άτομο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δοκιμασία ελέγχου για την ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης ή για την περίσσεια αυξητικής ορμόνης στην ακρομεγαλία και στο γιγαντισμό. Η ερμηνεία των επιπέδων του IGF-I περιπλέκεται από το μεγάλο εύρος των φυσιολογικών τιμών και από τις παραλλαγές λόγω ηλικίας, φύλου και σταδίου ήβης. Κλινικά σημαντικές καταστάσεις μπορεί να συγκαλυφθούν από το μεγάλο εύρος των φυσιολογικών τιμών. Εικόνα 19. Οι άξονες GH IGF-I Ο ινσουλινόμορφος Αυξητικός Παράγων ΙΙ (IGF-ΙI) Ο IGF-II είναι ένα πολυπεπτίδιο 7500 dalton με 75% ομολογία με τον IGF-I και όπως και ο IGF-I παράγεται σε πολλούς ιστούς. Ο IGF-II έχει μεγαλύτερη ομοιότητα με την ινσουλίνη στον τρόπο δράσης του κι έχει επιπλέον ρυθμιστικές της αύξησης δράσεις, αλλά και μιτογόνο δραστηριότητα. Τα επίπεδά του εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό, αλλά όχι απόλυτα, από την αυξητική ορμόνη και θεωρείται μείζων αυξητικός παράγων κατά την εμβρυική ζωή, σε αντίθεση με τον IGF-I που είναι μείζων αυξητικός παράγων κατά την ενήλικο ζωή. 41

42 1.9 Aνεπάρκεια αύξησης Η ανεπάρκεια αύξησης είναι ο όρος που περιγράφει μικρότερη ταχύτητα ανάπτυξης από την αναμενόμενη για την ηλικία. Η ταχύτητα ανάπτυξης είναι ο ρυθμός με τον οποίο ψηλώνει ένα παιδί από την ηλικία των 4 ετών έως την έναρξη της εφηβείας (φυσιολογικά: 5-7 εκατοστά/έτος). Το κοντό ανάστημα μπορεί να αποτελεί τη φυσιολογική έκφραση του γενετικού δυναμικού και στην περίπτωση αυτή η ταχύτητα ανάπτυξης είναι φυσιολογική, ή μπορεί να είναι το αποτέλεσμα κάποιας κατάστασης που προκαλεί ανεπάρκεια αύξησης, με ταχύτητα ανάπτυξης μικρότερη από τη φυσιολογική. Ένα παιδί θεωρείται κοντό αν το ύψος του είναι κάτω από την 3 η εκατοστιαία θέση ή, εναλλακτικά, αν το ύψος του βρίσκεται περισσότερο από 2 σταθερές αποκλίσεις υπό του μέσου ύψους παιδιών ίδιας ηλικίας, φύλου, φυλής και κοινωνικοοικονομικής κατάστασης. Πολλά από τα παιδιά με κοντό ανάστημα έχουν φυσιολογική ταχύτητα ανάπτυξης. Σε αυτά συμπεριλαμβάνονται παιδιά με οικογενές κοντό ανάστημα ή ιδιοσυστασιακή καθυστέρηση της ήβης και της αύξησης. Προκειμένου να διατηρηθεί η ίδια εκατοστιαία θέση στην καμπύλη ανάπτυξης, η ταχύτητα ανάπτυξης πρέπει να βρίσκεται τουλάχιστον στην 25 η εκατοστιαία θέση. Από όλα τα παιδιά με κοντό ανάστημα, μόνο μερικά έχουν σαφή και θεραπεύσιμη διάγνωση. Τα περισσότερα από αυτά τα παιδιά έχουν χαμηλή ταχύτητα ανάπτυξης. Τα αίτια του κοντού αναστήματος είναι τα ακόλουθα: AITIA KONTOY ΑΝΑΣΤΗΜΑΤΟΣ Οικογενές κοντό ανάστημα Ανεπάρκεια αντίσταση GH, IGF-I Ιδιοσυστασιακή ήβης και ανάπτυξης καθυστέρηση Υποθυρεοειδισμός, πρώιμη ήβη, Σ.Δ., σ. Cushing Ιδιοπαθές (μη οικογενές) κοντό ανάστημα SGA, IUGR Ψυχοκοινωνικός νανισμός Χρόνιες νόσοι (ΦΝΕ, Δυσαπορρόφηση, Ηπατική ανεπάρκεια, Άσθμα, ΚΙ, ΧΝΑ, ΒΠΔ, Συγ. κυανωτικές καρδιοπάθειες, αιμολ. αναιμία, λοιμώξεις) Μεταβολικές διαταραχές (γλυκογονιάσεις, λιπιδώσεις, φαινυλκετονουρία) Χρόνιος υποσιτισμός Σκελετικές δυσπλασίες (αχονδροπλασία, υποχονδροπλασία, ατελής οστεογένεση) Σύνδρομα (Turner, Down, Noonan, Prader-Willi, Laurence-Moon-Biedl, Russel-Silver, Bloom, Williams, Rubinstein-Taybi) 42

43 1.10 Αίτια ανεπάρκειας Αυξητικής Ορμόνης Η ανεπάρκεια αυξητικής ορμόνης περιγράφει την κατάσταση στην οποία η υπόφυση αδυνατεί να παράξει ή να απελευθερώσει την ορμόνη σε ικανοποιητικές ποσότητες. Λαμβάνοντας υπόψη τις πολλαπλές δράσεις της αυξητικής ορμόνης σε όλο τον οργανισμό, η έλλειψή της έχει πολλαπλές συνέπειες, όπως είναι η αδυναμία δημιουργίας αρκετών νέων πρωτεϊνών, απαραίτητων για τη μυική ανάπτυξη, η αδυναμία διέγερσης της παραγωγής ορμονών, όπως ο ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγων Ι και η αδυναμία φυσιολογικής ανάπτυξης και ωρίμανσης. Τα αίτια ανεπάρκειας της Αυξητικής Ορμόνης διακρίνονται σε συγγενή κι επίκτητα Κλινικές εκδηλώσεις ανεπάρκειας της Αυξητικής Ορμόνης Η ανεπαρκής έκκριση της αυξητικής ορμόνης προκαλεί τον υποφυσιακό νανισμό, που χαρακτηρίζεται από πολύ χαμηλό ανάστημα. Ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης μπορεί να εμφανιστεί σε κάθε ηλικία, είναι όμως μεγαλύτερες οι επιπτώσεις κατά τη διάρκεια της σωματικής αύξησης, λόγω του τελικού κοντού αναστήματος και της καθυστέρησης της οστικής ηλικίας. Επιπρόσθετα, στις πολύ νεαρές ηλικίες η ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης μπορεί να προκαλέσει σοβαρά υπογλυκαιμικά επεισόδια. 43

44 Mεγάλα ποσά GH χρειάζονται κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας για τη διατήρηση της φυσιολογικής αύξησης. Νεογνά με ανεπάρκεια GH έχουν συνήθως φυσιολογικό μήκος και βάρος. Μερικά μπορεί να έχουν μικρό πέος ή υπογλυκαιμία νηστείας, καθώς και χαμηλή κατά μήκος αύξηση, η οποία επιβραδύνεται με την πρόοδο της ηλικίας. Στην περίπτωση της μεμονωμένης ανεπάρκειας GH (Isolated Growth Hormone Deficiency/IGHD), η σκελετική ωρίμανση είναι συνήθως καθυστερημένη συγκριτικά με την καθυστέρηση του ύψους. Τα χαρακτηριστικά είναι συνήθως αρμονικά, αν και συχνά συνυπάρχουν κεντρική παχυσαρκία ή πλαδαρότητα, νεότερη εμφάνιση προσώπου από την αναμενόμενη για τη χρονολογική ηλικία, καθυστερημένη εμφάνιση μόνιμων οδόντων και υψίσυχνη φωνή. Ο μυικός όγκος είναι μειωμένος, η δε ευφυία βρίσκεται στις περισσότερες περιπτώσεις εντός των φυσιολογικών πλαισίων. Μπορεί επίσης να υπάρχει καθυστέρηση ήβης, αλλά η γονιμότητα δεν επηρεάζεται. Στην ενήλικο ζωή μπορεί να βρεθούν μεταβολές του δέρματος παρόμοιες με αυτές που συναντώνται σε πρόωρη γήρανση. Στις περιπτώσεις της συνδυασμένης ανεπάρκειας της GH (Combined Growth Hormone Deficiency/CGHD) είναι δυνατόν να συνυπάρχουν λαγόχειλο ή λυκόστομα, υποπλασία του οπτικού νεύρου και καθυστερημένη σεξουαλική ωρίμανση στην εφηβεία. Οι περισσότερες περιπτώσεις ανεπάρκειας GH είναι σποραδικές. Μπορεί να οφείλονται σε εγκεφαλικές διαταραχές, όπως εγκεφαλικό οίδημα, χρωμοσωμικές ανωμαλίες, ιστιοκύττωση, λοιμώξεις, ακτινοβολία, τραύματα της κεφαλής ή όγκους στον υποθάλαμο ή στην υπόφυση. Η Μαγνητική Τομογραφία ανιχνεύει υποθαλαμικές ή υποφυσιακές ανωμαλίες σε ποσοστό 12% των ασθενών με IGHD. H έναρξη και η εξέλιξη της ανεπάρκειας της αυξητικής ορμόνης εξαρτάται από την αιτία. Σε παιδιά με συγγενή ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης η ανεπάρκεια της κατά μήκος αύξησης συνήθως εμφανίζεται κατά το πρώτο ή δεύτερο έτος της ζωής, αλλά η πάθηση διαγιγνώσκεται αργότερα στις περισσότερες περιπτώσεις. Όταν η ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης είναι επίκτητη και παρουσιάζεται αργά κατά την παιδική ηλικία, η διάγνωση τίθεται αργότερα. Σε κάθε περίπτωση, υπάρχει πολύ αργός ρυθμός αύξησης. Αν και το κοντό ανάστημα, η καθυστερημένη ταχύτητα αύξησης και η καθυστερημένη σκελετική ωρίμανση είναι όλα ευρήματα της ανεπάρκειας της GH, κανένα από αυτά δεν είναι ειδικό της διαταραχής αυτής. Οι ασθενείς πρέπει να ελέγχονται για άλλες συστηματικές νόσους πριν την πραγματοποίηση προκλητών δοκιμασιών για ανεπάρκεια GH. Επίσης, πρέπει να γίνεται έλεγχος για συνυπάρχουσες ανεπάρκειες των LH, FSH, TSH, ACTH, ώστε ο προγραμματισμός της θεραπείας να είναι ο κατάλληλος. Είναι διαθέσιμη ανασυνδυασμένη GH που χορηγείται υποδόρια. Σε παιδιά με IGHD ή CGHD η χορήγηση ανασυνδυασμένης GH ως θεραπεία υποκατάστασης είναι καλό να αρχίζει το συντομότερο από τη στιγμή της διάγνωσης. Η κλινική ανταπόκριση εξαρτάται από τη διαταραχή καθεαυτή, τη σοβαρότητα της κατάστασης και την ηλικία έναρξης της θεραπείας, από την ανταπόκριση άλλων πιθανών ανεπαρκειών στη θεραπεία, όπως είναι η ανεπάρκεια θυρεοειδικών ορμονών, και από την ανάπτυξη πιθανών επιπλοκών, όπως αντι-gh αντισώματα. Ο χαρακτηρισμός της 44

45 οικογενούς IGHD σε μοριακό γενετικό επίπεδο είναι σημαντικός για διάφορους λόγους. Η αναγνώριση της εμπλεκόμενης γονιδιακής περιοχής υποδεικνύει την πιθανή σοβαρότητα της καθυστέρησης της αύξησης, αλλά και την καταλληλότητα διάφορων θεραπευτικών επιλογών. Μπορεί επίσης να έχει προγνωστική αξία για τη σοβαρότητα της καθυστέρησης της αύξησης και την πιθανότητα ανάπτυξης αντισωμάτων αντι-gh μετά από θεραπεία με GH. (174) 1.12 Κλινικές οντότητες ανεπάρκειας αύξησης Διαταραχές στην υποφυσιακή έκκριση GH, στον αριθμό ή τη λειτουργία των υποδοχέων GHR, στη μετά τον υποδοχέα μεταγωγή του σήματος ή στη σύνθεση του του IGF-I, συνήθως καταλήγουν σε μειωμένη γραμμική αύξηση Κλασσική ανεπάρκεια Αυξητικής Ορμόνης Στην κλασσική ανεπάρκεια της GH η υπόφυση περιέχει επαρκείς ποσότητες της ορμόνης, ωστόσο η ανεπάρκεια προκαλείται από την ανεπαρκή διέγερση της απελευθέρωσης της αυξητικής ορμόνης, λόγω ανεπάρκειας του παράγοντα απελευθέρωσης της αυξητικής ορμόνης (GHRH). Τα παιδιά με GHD έχουν μειωμένο ρυθμό αύξησης και καθυστερημένη οστική ηλικία. Η κλασσική ανεπάρκεια της GH χαρακτηρίζεται από σοβαρό κοντό ανάστημα με χαμηλές συγκεντρώσεις GH (< 10 ng/ml) μετά από φαρμακολογική πρόκληση με παράγοντες όπως είναι η κλονιδίνη, η L-Dopa, η ινσουλίνη και η γλυκαγόνη. Τα επίπεδα IGF-I είναι χαμηλά και αποκαθίστανται μετά από εξωγενή χορήγηση GH κατά το IGF-I generation test. Σοβαρό κοντό ανάστημα ρυθμός αύξησης κ.φ. βάρος σώματος Καθυστερημένη οστική ηλικία IGF-I Φαρμακολογική πρόκληση: GH<10ng/ml (x2) IGF-I generation test: αποκατάσταση IGF-I Εικόνα 20. Τα χαρακτηριστικά της κλασσικής ανεπάρκειας της GH (GHD). Δίδυμα αδέρφια. Ασθενής με κλασσική ανεπάρκεια GH (αριστερά) 45

46 Νευροεκκριτική δυσλειτουργία της Αυξητικής Ορμόνης (Growth Hormone Neurosecretory Dysfunction / GHND) Η Νευροεκκριτική Δυσλειτουργία της Αυξητικής Ορμόνης (GHND) περιγράφηκε από τη Spiliotis και συν. το Χαρακτηρίζεται από σοβαρό κοντό ανάστημα με ύψος περισσότερο από δύο σταθερές αποκλίσεις κάτω από το μέσο όρο, παθολογική ταχύτητα αύξησης, σοβαρή καθυστέρηση της οστικής ηλικίας (2 ή περισσότερα έτη), φυσιολογικές συγκεντρώσεις GH μετά από φαρμακολογική πρόκληση (μέγιστη τιμή μεγαλύτερη από 10 ng/ml), χαμηλές συγκεντρώσεις IGF-I και παθολογικούς ρυθμούς 24ωρης αυθόρμητης έκκρισης GH. Στους ασθενείς αυτούς παρατηρείται μείωση του αριθμού και του εύρους των εκκριτικών αιχμών της GH στο 24ωρο, καθώς και μείωση της συνολικής ποσότητας της GH στο 24ωρο, συγκριτικά με τα φυσιολογικά άτομα. Η ακριβής διαταραχή στην GHND δεν έχει προσδιορισθεί. Πρόκειται πιθανώς για διαταραχή στη νευρορρύθμιση της υπόφυσης από τον υποθάλαμο ή από τα ανώτερα εγκεφαλικά κέντρα. Πιθανολογούνται γενετικές διαταραχές που επηρεάζουν την έκκριση νευροδιαβιβαστών, οι οποίοι ελέγχουν την έκκριση του GHRH και της σωματοστατίνης. Όπως συμβαίνει και με τα παιδιά με την κλασσική ανεπάρκεια GH, τα παιδιά με GHND αυξάνουν την ταχύτητα αύξησής τους μετά την εξωγενή χορήγηση βιοσυνθετικής ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης, (hgh), παρουσιάζοντας αξιοσημείωτη αναπλήρωση της αύξησης μέχρι να φτάσουν το ύψος του ενήλικα. ( ) Σοβαρό κοντό ανάστημα ρυθμός αύξησης κ.φ. βάρος σώματος Καθυστερημένη οστική ηλικία IGF-I Φαρμακολογική πρόκληση: κ.φ. (GH>10ng/ml) τιμή 24ωρης έκκρισης GH IGF-I generation test: Αυξημένη ανταπόκριση ( %) Εικόνα 21. Τα χαρακτηριστικά της νευροεκκριτικής δυσλειτουργίας της GH (GHND)- Ασθενής με GHND 46

47 Ιδιοπαθές κοντό ανάστημα Στην κατηγορία του ιδιοπαθούς κοντού αναστήματος εντάσσονται παιδιά με αδιευκρίνιστης αιτιολογίας κοντό ανάστημα. O όρος ιδιοπαθές κοντό ανάστημα (Ιdiopathic Short Stature/ISS) αναφέρεται σε ένα μεγάλο εύρος κοντών παιδιών με οικογενές κοντό ανάστημα, με καθυστέρηση στην αύξηση ή που είναι κοντά για το προβλεπόμενο ύψος με βάση το ύψος των γονέων. Μερικά από αυτά μπορεί να έχουν κάποια μη αναγνωρισμένη ενδοκρινολογική διαταραχή. (178) To ιδιοπαθές κοντό ανάστημα στα παιδιά χαρακτηρίζεται από φυσιολογική ή καθυστερημένη ταχύτητα αύξησης, ύψος περισσότερο από δύο σταθερές αποκλίσεις κάτω του μέσου όρου, φυσιολογικό βάρος γέννησης, απουσία ενδοκρινικών διαταραχών και μη αποδεδειγμένη φυσική ή ψυχολογική νόσο. (179) Όταν η ταχύτητα αύξησης είναι καθυστερημένη, ωστόσο, είναι σημαντικό να αποκλεισθεί η ανεπάρκεια αυξητικής ορμόνης προτού διαγνωσθεί το ιδιοπαθές κοντό ανάστημα. Και τούτο διότι η GH είναι κρίσιμη όχι μόνο για τη σκελετική αύξηση, αλλά και για την ομοιοστασία των πρωτεϊνών, λιπιδίων και υδατανθράκων, όπως και για την ισορροπία ύδατος-ηλεκτρολυτών, επομένως η ανεπάρκειά της μπορεί να προκαλέσει μεταβολικά προβλήματα. (180) Η διαγνωστική κατηγορία του ιδιοπαθούς κοντού αναστήματος αντιπροσωπεύει μία ετερογενή ομάδα γενετικών διαταραχών. Υποψήφια γονίδια προς μελέτη είναι τα GH1, GHR, JAK2, STAT5b, IGF-I, IGFR και άλλα γονίδια του σηματοδοτικού μονοπατιού της GH. (181) Εικόνα 22. Ιδιοπαθές κοντό ανάστημα Σύνδρομο Αντίστασης στην Αυξητική Ορμόνη (Growth Hormone Insensitivity Syndrome / GHIS) Το σύνδρομο αντίστασης στην GH (GHIS) είναι μία άλλη αιτία σοβαρού κοντού αναστήματος με καθυστέρηση στην ταχύτητα αύξησης, που μπορεί να θεωρηθεί λαθεμένα ιδιοπαθές κοντό ανάστημα. Στο σύνδρομο αυτό, υπάρχουν φυσιολογικές ή αυξημένες συγκεντρώσεις GH στον ορό λόγω διαταραχής στον υποδοχέα της GH (GHR) ή στο ενδοκυττάριο μονοπάτι μετά το επίπεδο του υποδοχέα. Η εξωγενώς χορηγούμενη GH αποτυγχάνει να αυξήσει τις παθολογικά χαμηλές συγκεντρώσεις του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα Ι (IGF-I), όπως επίσης δεν είναι ικανή να 47

48 αυξήσει τη μειωμένη ταχύτητα αύξησης στα παιδιά με σύνδρομο αντίστασης στην GH. H πλειονότητα των ασθενών με σύνδρομο αντίστασης στην GH έχει χαμηλές συγκεντρώσεις της προσδενόμενης στην GH πρωτεΐνης (GHBP), λόγω μεταλλάξεων ή απαλοιφών στο γονίδιο του GHR ( ) αν και μεταλλάξεις σε αυτό το γονίδιο μπορεί να βρεθούν και σε ασθενείς με το σύνδρομο που έχουν φυσιολογικά ή αυξημένα επίπεδα GHBP. ( ) Έχει βρεθεί ένας ασθενής με σύνδρομο GHIS και μετάλλαξη στο γονίδιο της πρωτεΐνης STAT5b, (192) το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγώμενη από την GH ενεργοποίηση του IGF-I. (193,194) Παιδιά με GHIS έχουν τα εξής χαρακτηριστικά: Σοβαρό κοντό ανάστημα (ύψος < 3 η % θέση) Χαμηλό IGF-I Φυσιολογική τιμή GH (ΦΤ: 10 ng/ml) μετά από φαρμακολογική πρόκληση Φυσιολογική 24ωρη έκκριση της GH Μειωμένη ανταπόκριση IGF-I μετά από 4 ημέρες χορήγησης hgh (IGF-I Generation Test: < 30 % αύξηση) Οι ασθενείς με GHIS έχουν τα ίδια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά με τους ασθενείς με κλασσική ανεπάρκεια της GH, αν και τείνουν να έχουν δυσμορφικά χαρακτηριστικά, όπως είναι αραιά μαλλιά, προέχον μέτωπο, μικρό πιγούνι. Άλλα χαρακτηριστικά που έχουν περιγραφεί είναι μπλε σκληροί χιτώνες των οφθαλμών, μικρό πέος, νεογνική υπογλυκαιμία. Η καθυστέρηση αύξησης είναι εμφανής ήδη από τη γέννηση, γεγονός που αποδεικνύει ότι ο IGF-I είναι απαραίτητος και για την ενδομήτρια αύξηση. Μελέτες έχουν δείξει ότι περίπου 25% των παιδιών με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα (ISS) έχουν πρωτοπαθή ανεπάρκεια IGF (IGFD), δηλαδή χαμηλές συγκεντρώσεις IGF-I στο αίμα, με φυσιολογική έκκριση GH. H πρωτοπαθής ανεπάρκεια IGF (IGFD) μπορεί να οφείλεται σε 3 κατηγορίες μοριακών διαταραχών: 1) Μειωμένη ευαισθησία στην GH λόγω μεταλλάξεων στο γονίδιο του GHR (κλασικό σύνδρομο Laron), 2) γονιδιακές διαταραχές που αφορούν την Janus kinase-2 (JAK-2) ή τον STAT5b του σηματοδοτικού μονοπατιού της GH και 3) μεταλλάξεις στο γονίδιο του IGF-I. Μεταλλάξεις στο γονίδιο του GHR μπορούν να προκαλέσουν ιδιοπαθές κοντό ανάστημα (ISS), επηρεάζοντας τη λειτουργία του υποδοχέα GHR. Στο ένα άκρο, οι μεταλλάξεις που αναστέλλουν πλήρως τη λειτουργία του GHR σχετίζονται με πλήρες σύνδρομο αντίστασης στην GH, ή σύνδρομο Laron, ενώ έχει υποτεθεί ότι λιγότερο διασπαστικές μεταλλάξεις θα μπορούσαν να προκαλέσουν μερικό σύνδρομο αντίστασης στην GH. (195) Τα περισσότερα παιδιά με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα ανταποκρίνονται στη θεραπεία με GH με αύξηση στο ρυθμό αύξησής τους, αλλά η ανταπόκριση αυτή είναι μικρότερη από αυτή που παρατηρείται σε ασθενείς με ανεπάρκεια GH που θεραπεύονται με GH, υποδηλώνοντας πως οι ασθενείς με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα παρουσιάζουν μερική αντίσταση στην GH. Oι ετερόζυγες μεταλλάξεις του γονιδίου του GHR δεν είναι συχνή αιτία ιδιοπαθούς κοντού αναστήματος. Μεταλλάξεις στο 48

49 γονίδιο GHR ήταν παρούσες σε ποσοστό περίπου 30% των ατόμων που επιλέχθηκαν για κοντό ανάστημα (ύψος 2 SD) με χαμηλά επίπεδα GHBP ή IGF-I και χαμηλό ρυθμό αύξησης, ενώ σε κοντά παιδιά με επαρκή επίπεδα GH ήταν παρούσες σε ποσοστό 2%. Μία ταξινόμηση της αντίστασης της GH είναι η ακόλουθη: Α) Πρωτοπαθής (π.χ. Σ. Laron, κληρονομικές και/ή συγγενείς διαταραχές) - Διαταραχές του GHR (ποιοτικές και ποσοτικές) - Διαταραχές της μεταβίβασης του σήματος της GH (μετά το επίπεδο του υποδοχέα) - Πρωτοπαθείς διαταραχές της σύνθεσης ή έκκρισης του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα) Β) Δευτεροπαθής (επίκτητες καταστάσεις) - Κυκλοφορούντα αντισώματα έναντι της GH που αναστέλλουν τη δράση της GH - Aντισώματα έναντι του GHR - Δευτεροπαθείς διαταραχές της σύνθεσης του IGF-I - Yποσιτισμός - Ηπατική νόσος Σύνδρομο Laron Το Σ. Laron είναι μια οικογενής διαταραχή με αυτοσωματική μορφή κληρονομικότητας. To 1966 στο Ισραήλ ο Zvi Laron και οι συνεργάτες του ανέφεραν μία γενετική μορφή νανισμού σε 3 αδέρφια εβραϊκής καταγωγής, με κλινικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά ανεπάρκειας αυξητικής ορμόνης (GHD), αλλά με «αφύσικα υψηλές συγκεντρώσεις ανοσοαντιδρώσας αυξητικής ορμόνης ορού». Η υποκείμενη διαταραχή θεωρήθηκε αρχικά ότι ήταν ενδογενής διαταραχή στη σύνθεση της αυξητικής ορμόνης με αποτέλεσμα ανοσολογικά ανιχνεύσιμη αλλά μεταβολικά ανενεργή GH. Μέσα σε 2 χρόνια, αναγνωρίσθηκαν 19 επιπλέον Ισραηλινοί ασθενείς με Ασιατική Εβραϊκή καταγωγή. Στην πορεία αναγνωρίσθηκαν διεθνώς περισσότεροι από 250 ασθενείς, από τους οποίους η συντριπτική πλειοψηφία είχε Εβραϊκές ή Μεσογειακές ρίζες. Στο σύνδρομο Laron η αντίσταση στην αυξητική ορμόνη οφείλεται συνήθως σε μεταλλάξεις στο εξωκυττάριο τμήμα του υποδοχέα της αυξητικής ορμόνης, το οποίο έχει πανομοιότυπη αλληλουχία με την Growth Hormone-Binding Protein (GHBP). Στοιχεία από τη μελέτη οικογενειών με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα φανερώνουν ότι οι μεταλλάξεις στο εξωκυττάριο ή ενδοκυττάριο τμήμα του υποδοχέα GHR έχουν ένα εύρος φαινοτύπων, υποστηρίζοντας την άποψη ότι η έκφραση των ετερόζυγων μεταλλάξεων ως μερικό σύνδρομο αντίστασης στην GH εξαρτάται από το γενετικό υπόβαθρο του κάθε ατόμου. Έχουν επίσης περιγραφεί μεταλλάξεις που καταλήγουν σε παθολογικό διμερισμό του GHR ή διαταραγμένη μεταβίβαση του σήματος GH-GHR. 49

50 Σοβαρό κοντό ανάστημα ρυθμός αύξησης κ.φ. βάρος σώματος GH: κ.φ. ή IGF-I Φαρμακολογική πρόκληση:κ.φ. (GH>10ng/ml) κ.φ. τιμή 24ωρης έκκρισης GH IGF-I generation test: <30% ανταπόκριση Εικόνα 23. Τα χαρακτηριστικά του σ. Laron Ασθενής με σ. Laron Στις περιπτώσεις αυτές, τα κυκλοφορούντα επίπεδα του IGF-I είναι πολύ χαμηλά και δεν υπάρχει αρνητική ανατροφοδότηση σε επίπεδο υπόφυσης. Επομένως, υψηλά επίπεδα GH εκκρίνονται από την υπόφυση, υποδηλώνοντας μία κατάσταση μειωμένης ευαισθησίας. Επιπλέον, η GH δεν ανευρίσκεται στο αίμα συνδεόμενη με την GH δεσμευτική πρωτεΐνη (GH-binding protein), καθότι αυτή προέρχεται από την αποκοπή του εξωκυττάριου τμήματος του υποδοχέα από την κυτταρική επιφάνεια. Ωστόσο, η συγγενώς μειωμένη ευαισθησία στην GH μπορεί να εμφανισθεί με ένα ευρύ φάσμα φαινοτύπων. Ένας ηπιότερος φαινότυπος έχει συσχετισθεί με την εισαγωγή ενός ψευδο-εξονίου ανάμεσα στα εξόνια 6 και 7, που μειώνει την έκφραση του GHR στην κυτταρική επιφάνεια. Σε ένα άλλο παράδειγμα με ήπιο φαινότυπο, μία μετάλλαξη στο εξόνιο 9 προκαλεί σοβαρή βράχυνση του ενδοκυττάριου τμήματος του υποδοχέα και απώλεια των περιοχών σύνδεσης των JAK2 και STAT5. Η εξωγενής χορήγηση GH δεν επιταχύνει την αύξηση ούτε αυξάνει τα επίπεδα του IGF-I ή της δεσμευτικής πρωτεΐνης-3 του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα (IGFBP-3). Μόνο σε ένα μικρό ποσοστό κοντών παιδιών υπάρχουν αναγνωρισμένες γενετικές διαταραχές που συμβάλλουν στην ανεπάρκεια της αύξησής τους. Μεταλλάξεις στα γονίδια ΡΙΤ-1, (196) GHRH (197) GH, (198) GHR, (182) και IGF-I (199) σπάνια είναι η αιτία του κοντού αναστήματος Μετάλλαξη του STAT5b Το σηματοδοτικό μονοπάτι JAK2/STAT5 θεωρείται το πιο σημαντικό όσον αφορά στις επαγωγικές της αύξησης δράσεις της GH. Ενώ έχουν αναγνωριστεί αρκετές εκατοντάδες 50

51 ασθενών με μεταλλάξεις στο γονίδιο του GHR, μόνο 1 άτομο με μετάλλαξη στον STAT5b και 2 ασθενείς με μετάλλαξη στο γονίδιο του IGF-I έχουν αναγνωρισθεί έως τώρα. Ο ασθενής με μετάλλαξη στην πρωτεΐνη STAT5b είχε φυσιολογικά επίπεδα GHBP, σε αντίθεση με τους ασθενείς με το κλασσικό σύνδρομο Laron, επομένως η διαταραχή ήταν περιφερικότερα της εξωκυττάριας περιοχής του υποδοχέα της αυξητικής ορμόνης. Μεταλλάξεις στη διαμεμβρανική ή ενδοκυτταροπλασματική περιοχή του υποδοχέα της αυξητικής ορμόνης έχουν αναγνωρισθεί σε μια υποομάδα ασθενών με σύνδρομο Laron, αλλά δεν ήταν παρούσες στον ασθενή αυτόν. Ο συνδυασμός αυξημένων επιπέδων αυξητικής ορμόνης και χαμηλών επιπέδων IGF-I στον ασθενή θα μπορούσε να οφείλεται σε διαταραχή του γονιδίου του IGF-I, αλλά δε θα μπορούσε να εξηγήσει τα χαμηλά επίπεδα του ALS (acidlabile subunit) και της IGF-binding protein 3. Επιπλέον, δε διαπιστώθηκε τέτοια μετάλλαξη. Αντιθέτως, διαπιστώθηκε ομόζυγος μετάλλαξη στο γονίδιο του STAT5b. Οι γονείς του ασθενή δεν είχαν ανεπάρκεια αύξησης, ήταν πρώτα ξαδέλφια και ήταν φορείς της ίδιας μετάλλαξης. Σοβαρό κοντό ανάστημα ρυθμός αύξησης κ.φ. βάρος σώματος GH: κ.φ. ή IGF-I Φαρμακολογική πρόκληση:κ.φ. (GH>10ng/ml) κ.φ. τιμή 24ωρης έκκρισης GH IGF-I generation test: <30% ανταπόκριση Εικόνα 24. Τα χαρακτηριστικά της μετάλλαξης του μεταγραφικού παράγοντα STAT5b. Ασθενής με τη μετάλλαξη (δεξιά) Πολύ σημαντική στην ερμηνεία αυτών των ευρημάτων είναι η παρατήρηση ότι τα χαρακτηριστικά της αύξησης ενός ασθενή με ομόζυγη μετάλλαξη του STAT5b είναι πανομοιότυπα με αυτά που παρατηρούνται σε ασθενείς με ομόζυγες μεταλλάξεις στον GHR. Συγκεκριμένα, ο ασθενής με μετάλλαξη της ενδοκυτταροπλασματικής πρωτεΐνης STAT5b, η οποία αναστέλλει την ενδοκυττάρια σηματοδότηση που προάγει τις φυσιολογικές δράσεις της αυξητικής ορμόνης, έχει ως προεξάρχον χαρακτηριστικό την έντονη ανεπάρκεια αύξησης, με ύψος στη χρονολογική ηλικία των 16,5 ετών που αντιστοιχεί σε παιδί 6,5 ετών (-7,5 SD). Ο φαινότυπος αυτός θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα διάφορων διαταραχών στο σύστημα της αυξητικής 51

52 ορμόνης, όπως: μετάλλαξη στον υποδοχέα Growth Hormone-releasing hormone receptor (GHRH-R), μετάλλαξη στην GH, στον ΡΙΤ-1. Το εύρημα όμως των αυξημένων επιπέδων GH στον ορό σε συνδυασμό με χαμηλά επίπεδα IGF-I, επιβεβαιώνει την ύπαρξη αντίστασης στην αυξητική ορμόνη στον ασθενή αυτό. Επομένως, αυτός ο ασθενής είχε, εξαιρετικά χαμηλό IGF-I κι ελάχιστη απόκριση του άξονα του IGF-I στη χορήγηση GH. Θα μπορούσε να συμπεράνει κανείς από τις παρατηρήσεις αυτές ότι, τουλάχιστον στους ανθρώπους, η επίδραση της GH και του GHR στην αύξηση διαμεσολαβείται κυρίως, αν όχι αποκλειστικά, από το μονοπάτι JAK-2/STAT5b/IGF-I. Παρά την ύπαρξη μεγαλύτερης από 90% ομολογίας μεταξύ των STAT5a και STAT5b, μελέτες σε ζώα έχουν δείξει ότι οι δύο ισομορφές έχουν διακριτούς ρόλους και διαφορετικούς στα διάφορα είδη ζώων. Ο κρίσιμος ρόλος του STAT5b στην αύξηση περιγράφηκε για πρώτη φορά σε μελέτες σε knockout ποντίκια. Βρέθηκε ότι μόνο τα αρσενικά ποντίκια με ανεπάρκεια του STAT5b είχαν ανεπάρκεια αύξησης. Είναι ξεκάθαρο ότι ούτε ο STAT5a ούτε τα υπόλοιπα STATs μπορούν να υποκαταστήσουν την πρωτεΐνη STAT5b στην προαγωγή της κατά μήκος αύξησης. Ενδιαφέρουσα παράμετρος στην περίπτωση του ασθενή αυτού είναι η ύπαρξη ιστορικού επηρεασμένης ανοσολογικής λειτουργίας. Αυτό το εύρημα είναι συμβατό με την υπόθεση ότι η πρωτεΐνη STAT5b είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και την απόκριση ανοσορυθμιστών, όπως είναι η ιντερφερόνη, η ιντερλευκίνη-2 και η ιντερλευκίνη-3. Η αναγνώριση συγκεκριμένων μοριακών γενετικών διαταραχών ανοίγει το δρόμο για νέες θεραπείες στοχευμένες προς συγκεκριμένες λειτουργικές ανωμαλίες εντός των κυττάρων. (200) Διαταραχές στον άξονα IGF-I στον άνθρωπο Έχουν αναγνωρισθεί διαταραχές στον IGF-I και στον υποδοχέα του. Έχει αναφερθεί μία περίπτωση παιδιού με απαλοιφή των εξονίων 4 και 5 στο γονίδιο IGF-I, σε συνδυασμό με απουσία κυκλοφορούντος IGF-I. Το παιδί είχε μικροκεφαλία, επηρεασμένη ακοή και σοβαρό κοντό ανάστημα. Έχει βρεθεί ένας ενήλικας με ιδιαιτέρως κοντό ανάστημα και παρόμοιο φαινότυπο και σημειακή μετάλλαξη του γονιδίου IGF-I. Eτερόζυγες μεταλλάξεις στον υποδοχέα του IGF-I έχουν συσχετισθεί με ενδομήτρια καθυστέρηση αύξησης. Διαταραχές στις συνδετικές πρωτεΐνες του IGF-I μπορούν να προκαλέσουν παθολογικό φαινότυπο ως προς την αύξηση. Για παράδειγμα, ο χρόνος ημίσειας ζωής του IGF-I θα μπορούσε να μειωθεί απουσία σταθερού IGF-I, IGFBP-3 (IGF binding protein) και ALS (acid-labile subunit). Μεταλλάξεις στο ALS έχουν περιγραφεί σε παιδιά με μέτριο κοντό ανάστημα στην εφηβεία, καθυστέρηση ήβης και, σε ορισμένες περιπτώσεις, σε παιδιά που έχουν επιτύχει φυσιολογικό ανάστημα στην ενήλικη ζωή. Τέλος, το σύνδρομο «3Μ», μία αυτοσωματική υπολειπόμενη διαταραχή, οφείλεται σε μετάλλαξη στην κουλλίνη 7 (cullin 7). Η κουλλίνη 7 οποία αποτελεί μέρος της οδού του συμπλέγματος της Ε3 λιγάσης, επομένως η μετάλλαξη 52

53 αυτή μπορεί να έχει επιπτώσεις στην κάθαρση του GHR και ενδεχομένως άλλων σηματοδοτικών μορίων Bιοανενεργή Αυξητική Ορμόνη (Bioinactive GH) Υπάρχει μια αναφορά από τον Lewis και συν. για δυσλειτουργική μορφή της GH, δηλαδή, ενώ οι μέγιστες συγκεντρώσεις της GH στον ορό ήταν >10ng/ml μετά από φαρμακολογική πρόκληση, αναγνωρίστηκαν μεταλλάξεις στο γονίδιο GH1. Συγκεκριμένα, 5 ετερόζυγες μεταλλάξεις αναγνωρίστηκαν σε 4 ασθενείς. Τα στοιχεία αυτά υποστηρίζουν την υπόθεση ότι το κοντό ανάστημα αυτών των ασθενών είναι αποτέλεσμα έκκρισης ενός αναλόγου GH που οδηγεί σε διαφορετική ενεργοποίηση των μονοπατιών ERK και STAT5. Αυτό είναι ένα ασύνηθες αποτέλεσμα δράσης ενός μεταλλαγμένου αγωνιστή του υποδοχέα. Οι ασθενείς με ανεπάρκεια GH με μεταλλάξεις περικοπής ή ομόζυγες απαλοιφές στο γονίδιο GH1 είναι σε αυξημένο κίνδυνο να αναπτύξουν αντι-gh αντισώματα μετά από θεραπεία με GH. Αντιθέτως, δεν υπάρχουν αναφορές για ανάπτυξη αλλοαντισωμάτων σε ασθενείς με παρανοηματικές μεταλλάξεις ή αντικατάσταση ενός ζεύγους βάσης ανάμεσα σε περιοχές ματίσματος. Ο Κowarski και συν. ήταν οι πρώτοι που συσχέτισαν το κοντό ανάστημα με βιοανενεργή GH. Η βιοανενεργή GH κλινικά χαρακτηρίζεται από φυσιολογική ή ελαφρώς αυξημένη έκκριση GH, παθολογικά χαμηλά επίπεδα IGF-I και φυσιολογική αναπλήρωση αύξησης μετά από θεραπεία υποκατάστασης με GH. Eπιπρόσθετες περιπτώσεις βιοανενεργής GH περιέγραψαν ο Takahashi και συν., οι οποίοι ανέφεραν 2 παρανοηματικές μεταλλάξεις (R77C και D112G) στο γονίδιο GH1, που κατέληξαν στο σύνδρομο του Kowarski σε 2 Ιάπωνες ασθενείς. Ωστόσο, οι μεταλλάξεις αυτές είχαν βρεθεί μόνο σε ετερόζυγο μορφή. Δομικά, η ανθρώπινη GH περιέχει 4 αντιπαράλληλες έλικες, που διαχωρίζονται από συνδεόμενες αγκύλες, και 4 περιοχές κυστεΐνης στις περιοχές 53, 165, 182 και 189. Έχει βρεθεί ότι οι 4 αυτές περιοχές κυστεΐνης είναι συντηρημένες στα μόρια GH διαφορετικών σπονδυλόζωων. Αυτό ίσως είναι ενδεικτικό της σπουδαιότητάς τους για τη βιολογική δράση της πρωτεΐνης. Οι 4 περιοχές κυστεΐνης σχηματίζουν 2 δισουλφιδικές γέφυρες: μία μεταξύ της κυστεΐνης-53 και της κυστεΐνης-165, που καταλήγει σε μία μεγάλη αγκύλη, και μία μεταξύ κυστεΐνης-182 και κυστεΐνης-189, που σχηματίζει μια μικρή αγκύλη. Μελέτες έχουν δείξει ότι η ακεραιότητα της μικρής αγκύλης (από την κυστεΐνη 182 έως την κυστεΐνη 189) δεν είναι απαραίτητη για την έκκριση και τη βιολογική δράση της GH. Ωστόσο, δραστική μείωση της έκκρισης της GH παρατηρήθηκε όταν η δισουλφιδική γέφυρα κυστεΐνη-53 έως κυστεΐνη-165 διαταράχθηκε λόγω μετάλλαξης, σε ασθενή από τη Σερβία με σοβαρό κοντό ανάστημα. Η αλληλούχιση του GH1 γονιδίου ανέδειξε μία μετάλλαξη που αφορά την αντικατάσταση της κυστεΐνης στο αμινοξύ 53 από σερίνη. Ο ασθενής ήταν ομόζυγος για τη μετάλλαξη. (201) Η κλινική εκτίμηση, η φυσιολογική αλληλούχιση του GHR και το γεγονός ότι η θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη GH είχε ως αποτέλεσμα την αποκατάσταση της φυσιολογικής αύξησης στον ασθενή, απέκλεισε πιθανή διαταραχή στον GHR ή στον 53

54 IGF-I, αποδεικνύοντας την παρουσία ανενεργής GH. Πριν τη θεραπεία υποκατάστασης, η συγκέντρωση της GH σε βασικό επίπεδο ήταν αρκετά υψηλή, οι μέγιστες τιμές GH μετά από δοκιμασία πρόκλησης ήταν υψηλές, τα βασικά επίπεδα IGF-I ήταν χαμηλά, ενώ η συγκέντρωση της IGFBP-3 ήταν ανεξήγητα στα χαμηλότερα φυσιολογικά επίπεδα και η GHBP σε φυσιολογικά επίπεδα. Μετά το IGF-I generation test ωστόσο, ο ασθενής παρουσίαζε φυσιολογική απόκριση ως προς την IGF-I και IGFBP Διαταραχή στη Μεταγωγή του Σήματος της Αυξητικής Ορμόνης (Growth Hormone Transduction Defect / GHTD) Έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία αρκετές περιπτώσεις παιδιών με κοντό ανάστημα που οφείλονται σε μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη STAT5, ωστόσο λίγες μελέτες έχουν γίνει πάνω στη STAT3, που είναι επίσης ένας σημαντικός μεσολαβητής της ενδοκυττάριας σηματοδότησης της GH. Οι Rojas Gil και συν., (202) μελέτησαν τη λειτουργικότητα του SΤΑΤ3 σε ασθενείς με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα και διαπίστωσαν μειωμένη ενεργοποίηση του STAT3 σε καλλιέργειες ινοβλαστών 4 παιδιών με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα μετά από επαγωγή με 200 ng/ml GH, συγκριτικά με καλλιέργειες ινοβλαστών μαρτύρων. Επίσης, διαπιστώθηκε υπερέκφραση του αρνητικού ρυθμιστή της GH, CIS, υπερέκφραση του αρνητικού ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου p21 και αυξημένη δραστηριότητα πρωτεασώματος. Η οντότητα αυτή έχει χαρακτηριστεί ως Growth Hormone Transduction Defect (GHTD). Στο παρελθόν είχαν περιγραφεί άλλες 6 περιπτώσεις παιδιών με GHTD από το ίδιο εργαστήριο. Συγκεκριμένα, τα παιδιά αυτά παρουσίαζαν σοβαρή ανεπάρκεια αύξησης, (ύψος >- 3,5 SD), φυσιολογική έκκριση GH μετά από πρόκληση, αλλά και χωρίς πρόκληση, χαμηλά επίπεδα IGF-I, αλλά σημαντικά αυξημένα επίπεδα IGF-I μετά από επαγωγή με hgh κατά τη δοκιμασία IGF-I (IGF-I generation test). Tα παιδιά αυτά παρουσίαζαν σημαντική αναπλήρωση της αύξησης μετά από εξωγενή χορήγηση GH, παρά τη διαταραγμένη φωσφορυλίωση του STAT3 και την υπερέκφραση του αρνητικού ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου p21. Το σύνδρομο GHIS και η βιοανενεργός GH αποκλείσθηκαν μετά από αλληλούχιση των γονιδίων GHR και GH- 1. Δε διαπιστώθηκαν ανωμαλίες σε κανένα από τα 10 εξόνια του γονιδίου GHR ή τα πέντε εξόνια και τις περιοχές ματίσματος του γονιδίου GH-1, σε κανέναν από τους ασθενείς. Το γεγονός αυτό ενισχύει την υπόθεση πως μία νέα μοριακή διαταραχή είναι υπεύθυνη για την ανεπαρκή αύξηση των παιδιών αυτών. 54

55 Εικόνα 25. Ασθενής με διαταραχή στη μεταγωγή του σήματος της GH (GHTD) Παθοφυσιολογία της GHTD - Η διαταραγμένη αρνητική ρύθμιση του μονοπατιού της GH και οι προεκτάσεις της στις ενδοκυττάριες διεργασίες Η αναγνώριση της κλινικής οντότητας Growth Hormone Transduction Defect (GHTD) έγινε μετά από τη μελέτη αρχικά τεσσάρων και στη συνέχεια 10 συνολικά παιδιών με σοβαρή ανεπάρκεια αύξησης, (ύψος >-3,5 SD), φυσιολογική έκκριση GH μετά από φαρμακολογική πρόκληση, αλλά και χωρίς πρόκληση, χαμηλά επίπεδα IGF-I, αλλά σημαντικά αυξημένα επίπεδα IGF-I μετά από επαγωγή με hgh κατά τη δοκιμασία IGF-I (IGF-I generation test). Tα παιδιά αυτά παρουσίαζαν σημαντική αναπλήρωση της αύξησης μετά από εξωγενή χορήγηση GH. Αρχικά, μελετήθηκε η ταχύτητα ανάπτυξης ινοβλαστών από βιοψίες ούλων ασθενών με GHTD και μαρτύρων. Οι μάρτυρες παρουσίαζαν παραγωγή ινοβλαστών μετά από 2-3 εβδομάδες επώασης της βιοψίας στους 37 C και σε θρεπτικό υλικό, χωρίς προσθήκη GH (Α). Η παραγωγή ινοβλαστών δεν ήταν εφικτή στους ασθενείς μετά από το ίδιο χρονικό διάστημα (Β), παρά μόνο μετά από προσθήκη 5 mg/ml GH στο θρεπτικό υλικό. Η ταχύτητα ανάπτυξης των ινοβλαστών μελετήθηκε με καμπύλες αύξησης σε βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh. 55

56 % of Cells Fold increase of original cell number Fold increase of original cell number Growth Curve without GH Growth Curve with 200ng/ml GH Days C S Days 2 Εικόνα 26. Καμπύλες αύξησης ινοβλαστών σε μάρτυρες 0 και ασθενείς με GHTD, χωρίς προσθήκη GH και μετά από προσθήκη 200ng/ml GH. Στη βασική κατάσταση η ταχύτητα ανάπτυξης στους ινοβλάστες των ασθενών ήταν εξαιρετικά χαμηλή, ενώ μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh υπολειπόταν σημαντικά συγκριτικά με τους μάρτυρες. Μετά από ανάλυση FACS, βρέθηκε ότι το μεγαλύτερο (περίπου 95%) ποσοστό των κυττάρων των ασθενών βρισκόταν στη φάση G 0 /G 1 του κυτταρικού κύκλου. C S FACS C -GH S -GH C + 200ng GH S + 200ng GH C + S ng 1000ng GH GH G0/G1 S G2/M Εικόνα 27. Ανάλυση FACS. Ποσοστό κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου σε ασθενείς και μάρτυρες. Επειδή για τη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από τη φάση G 1 στη φάση S είναι απαραίτητη η δράση κυκλινών, όπως των Cyclin A, Cyclin D και CDT1, μελετήθηκε η πρωτεϊνική τους έκφραση με ανοσοαποτύπωση κατά Western. Εικόνα 28. Μειωμένη πρωτεϊνική έκφραση των cyclin A, cyclin D και CDT1 στους ασθενείς με GHTD, συγκριτικά με τους μάρτυρες. Διαπιστώθηκε ότι η πρωτεϊνική έκφραση των συγκεκριμένων κυκλινών ήταν εξαιρετικά μικρή σε σχέση με την αντίστοιχη των μαρτύρων. Μετά από το εύρημα αυτό και δεδομένου ότι η πρωτεΐνη p21 είναι αναστολέας των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών, μελετήθηκε η πρωτεϊνική έκφρασή της και βρέθηκε ότι στους ασθενείς υπήρχε υπερέκφρασή της. 56

57 Εικόνα 29. Υπερέκφραση της p21 στους ασθενείς με GHTD, συγκριτικά με τους μάρτυρες. Το σύνδρομο GHIS και η βιοανενεργός GH αποκλείσθηκαν μετά από αλληλούχιση των γονιδίων GHR και GH1. Δε διαπιστώθηκαν ανωμαλίες σε κανένα από τα 10 εξόνια του γονιδίου GHR ή τα πέντε εξόνια και τις περιοχές ματίσματος του γονιδίου GH1, σε κανέναν από τους ασθενείς. Το γεγονός αυτό ενίσχυε την υπόθεση πως μία νέα μοριακή διαταραχή ήταν υπεύθυνη για την ανεπαρκή αύξηση των παιδιών αυτών. Καλλιεργήθηκαν ινοβλάστες από βιοψίες ούλων των 4 παιδιών με το ιδιοπαθές κοντό ανάστημα και 3 μαρτύρων. Ελέγχθηκε η έκφραση του GHR σε μεταγραφικό, μεταμεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο, μελετώντας το mrna και την παραγόμενη πρωτεΐνη. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ ασθενών και μαρτύρων σε επίπεδο mrna και στις ποσότητες του GHR μετά από ανοσοκατακρήμνιση με ένα αντι-ghr IgG αντίσωμα. Μετά από καλλιέργεια των ινοβλαστών με hgh (200ng/ml) για 5 και 15 λεπτά, διαπιστώθηκε μείωση στα επίπεδα GHR στους ινοβλάστες των ασθενών και των μαρτύρων. (441) Ακολούθησε μελέτη του ενδοκυττάριου μονοπατιού της GH. H ενεργοποίηση των JAK2 και STAT5b ήταν παρόμοια στους ασθενείς και στους μάρτυρες. Σε αντίθεση με τη φυσιολογική ενεργοποίηση των JAK2 και STAT5 μετά την προσθήκη 200 ng/ml hgh στο θρεπτικό υλικό για 30 λεπτά, η επαγώμενη από την hgh τυροσινφωσφορυλίωση του STAT3 είτε ήταν απούσα είτε σημαντικά μειωμένη στις καλλιέργειες ινοβλαστών των ασθενών, συγκριτικά με τις καλλιέργειες των μαρτύρων. (202) A1 A2 A3 A4 M1 M2 M ptyrstat3 STAT3 ACTIN Εικόνα 30. Οι ασθενείς με GHTD (Α) δεν μπορούν να φωσφορυλιώσουν τη STAT3 μετά από 30 λεπτά επαγωγής των ινοβλαστών τους με 200ng/ml GH, σε αντίθεση με τους μάρτυρες (Μ). Από κλινικά στοιχεία είναι προφανές ότι οι ασθενείς ανταποκρίνονται σε φαρμακολογικές δόσεις GH με αύξηση της ταχύτητας ανάπτυξής τους. Λαμβάνοντας αυτό υπόψιν, χρησιμοποιήθηκαν μεγαλύτερες δόσεις GH στις κυτταρικές 57

58 καλλιέργειες των ασθενών, ώστε να εκτιμηθεί αν αυτές οι μεγαλύτερες δόσεις είναι ικανές να ξεπεράσουν το εμπόδιο στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3. Στους μάρτυρες, δεν παρατηρήθηκε αύξηση στη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 όταν προστέθηκε στο θρεπτικό υλικό hgh σε δόσεις 200 ng/ml και 500 ng/ml, ενώ μετά από προσθήκη hgh σε δόση 1000 ng/ml υπήρχε σχεδόν πλήρης καταστολή της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης STAT3. Αντιθέτως, οι ινοβλάστες των ασθενών παρουσίαζαν πολύ χαμηλή ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3 μετά από προσθήκη hgh σε δόσεις μέχρι 500 ng/ml. Ωστόσο, υπήρχε μέτρια αύξηση στη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 σε όλους τους ινοβλάστες των ασθενών μετά από προσθήκη hgh σε δόση 1000 ng/ml. Α1 Α2 Α3 Α4 Μ ng hgh pstat3 Aktin Εικόνα 31. Η φωσφορυλίωση της STAT3 στους ασθενείς με GHTD (A) επιτεύχθηκε μετά από επαγωγή με υψηλή δόση GH, ενώ στο μάρτυρα (Μ) η φωσφορυλίωση είναι μεγαλύτερη στις μικρότερες δόσεις. H επιβεβαίωση της δυσλειτουργίας της πρωτεΐνης STAT3 έγινε μελετώντας την ενεργοποίησή της σε απόκριση σε ένα άλλο ερέθισμα, την ιντερφερόνη-β. Η ιντερφερόνη-β είναι γνωστό ότι χρησιμοποιεί επίσης το μονοπάτι σηματοδότησης JAK-STAT. (442) Καλλιεργώντας τους ινοβλάστες των μαρτύρων για 30 λεπτά παρουσία διάφορων συγκεντρώσεων ιντερφερόνης-β ( U/ml) η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3 αυξανόταν σταδιακά με την αύξηση της δόσης σε σχέση με την ενεργοποίησή της παρουσία συγκέντρωσης ιντερφερόνης-β 10 U/ml. Mετά από επαγωγή με 100 U/ml ιντερφερόνης-β, η τυροσιν-φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 ήταν μειωμένη στις καλλιέργειες ινοβλαστών και των τεσσάρων ασθενών, σε σχέση με τους ινοβλάστες των μαρτύρων. Αντιθέτως, δεν υπήρχε εμφανής τυροσινφωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 σε χαμηλές δόσεις ιντερφερόνης-β (0, 0.1 και 10 U/ml) στις καλλιέργειες ινοβλαστών των ασθενών και ήταν μόλις ανιχνεύσιμη στις δόσεις 100 και 1000 U/ml. Στους ασθενείς αυτούς έγινε έλεγχος για πιθανές μεταλλάξεις στο γονίδιο STAT3, χωρίς να ανευρεθεί καμία. Στους ινοβλάστες δέκα ασθενών με GHTD παρατηρήθηκε υπερέκφραση της πρωτεΐνης CIS (32kDa) και της ουβικουιτινυλιωμένης μορφής της, ucis, (37kDa), σε βασικό επίπεδο και μετά από επαγωγή με 200 μg/l hgh για 30 λεπτά, τόσο σε επίπεδο mrna όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Αντιθέτως, στους ινοβλάστες των πέντε μαρτύρων που χρησιμοποιήθηκαν, τα επίπεδα CIS και ucis ήταν χαμηλότερα κι εμφανίστηκαν 15 λεπτά μετά την επαγωγή με hgh, αντικατοπτρίζοντας τη 58

59 φυσιολογική αρνητική ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού της GH. Στους ινοβλάστες των μαρτύρων, η μέγιστη ενεργοποίηση της JAK2 ήταν εμφανής 5 λεπτά μετά την επαγωγή με hgh, ενώ στους ινοβλάστες των ασθενών η ενεργοποίηση ήταν καθυστερημένη κι έφτανε το μέγιστο στα 30 λεπτά. Η ενεργοποίηση του STAT5 στις ίδιες συνθήκες ήταν επίσης καθυστερημένη, φτάνοντας στο μέγιστο σε 60 λεπτά στους ασθενείς, ενώ στους μάρτυρες σε 15 λεπτά. Η πρωτεΐνη STAT3 δεν ενεργοποιούνταν στους ασθενείς ποτέ, ενώ στους μάρτυρες παρουσίαζε τη μέγιστη ενεργοποίηση σε 15 λεπτά. Ασθενής Μάρτυρας 0 pstat3 hgh 200ng/ml pstat3 Η ουβικουιτίνη παρουσίαζε στο βασικό επίπεδο υπερέκφραση στους ινοβλάστες του ασθενή και εντόπιση πυρηνική και κυτταροπλασματική. Μετά από επαγωγή με 200 μg/l hgh, τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης της ουβικουιτίνης δε μεταβάλλονταν, αλλά η κυτταρική εντόπιση μετατρεπόταν σε κυρίως κυτταροπλασματική με περιπυρηνική άθροιση, σε αντίθεση με τους μάρτυρες, που εμφάνιζαν κυρίως πυρηνική έκφραση. Ασθενής Μάρτυρας 0 Ub hgh 200ng/ml Ub Προκειμένου να διαπιστωθεί η σχέση μεταξύ της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης CIS με τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος και την αποδόμηση του GHR, μελετήθηκαν οι διαφορές στη δραστηριότητα του πρωτεασώματος ανάμεσα σε έναν ασθενή και ένα μάρτυρα. Οι ινοβλάστες του ασθενή εμφάνιζαν στη βασική κατάσταση περισσότερο από 50% αύξηση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος συγκρινόμενοι με τους ινοβλάστες του μάρτυρα. Η επαγωγή με 200 ng/ml και 1000 ng/ml hgh προκάλεσε ελάχιστη μείωση στη δραστηριότητα του πρωτεασώματος μόνο στους ινοβλάστες του μάρτυρα. Η χορήγηση όμως του περισσότερο ειδικού αναστολέα του πρωτεασώματος λακτασυστίνη (15μΜ), προκάλεσε μείωση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος στους ινοβλάστες του ασθενή και του μάρτυρα. 59

60 Εικόνα 32. Δραστηριότητα του πρωτεασώματος σε ινοβλάστες ενός ασθενή με GHTD (μαύρα κουτιά) κι ενός μάρτυρα (άσπρα κουτιά). 0 hgh200μg/l hgh1000μg/l Lact 1mM Lact 5μΜ Lac15μΜ Επιπλέον, στους ινοβλάστες των μαρτύρων ο GHR παρουσίαζε πυρηνική και κυτταροπλασματική εντόπιση σε βασικό επίπεδο σε αντίθεση με τους ινοβλάστες των ασθενών που η εντόπισή του ήταν κυρίως κυτταροπλασματική, κοντά στον πυρήνα. Η επαγωγή με 200 ng/ml hgh δεν προκαλούσε μεταβολές στην εντόπιση του GHR στους ασθενείς. Ασθενής Μάρτυρας 0 GHR hgh 200ng/ml GHR H επαγωγή με λακτασυστίνη ή με λακτασυστίνη και 200ng/ml hgh τροποποίησε την εντόπιση του GHR στους ινοβλάστες των ασθενών σε κυρίως μεμβρανική, ενώ στους ινοβλάστες των μαρτύρων υπήρχε μόνο κυτταροπλασματική άθροιση. Ασθενής Μάρτυρας 0 15μΜ Lactacystin 200 ng/ml hgh/15μμ Lactacystin Μετά από επαγωγή με τον αναστολέα του πρωτεασώματος MG132 και hgh, αποκαταστάθηκε η φυσιολογική κινητική της ενεργοποίησης των JAK2, STAT5 και STAT3 στους ινοβλάστες των ασθενών, ενώ στους ινοβλάστες των μαρτύρων διαταράχθηκε η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών αυτών. 60

61 Κατά την ανάλυση του ρυθμού κυτταρικής αύξησης, οι ινοβλάστες του ασθενή πολλαπλασιάζονταν με βραδύτερο ρυθμό από τους ινοβλάστες των μαρτύρων. Η προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων GH ( ng/ml) αύξανε το ρυθμό αύξησης των ινοβλαστών των ασθενών και των μαρτύρων, σε κάθε όμως περίπτωση ο ρυθμός αύξησης των ινοβλαστών των ασθενών παρέμενε μικρότερος. Ο μεγαλύτερος ρυθμός αύξησης για τους ινοβλάστες των μαρτύρων επιτεύχθηκε μετά από προσθήκη 200 ng/ml hgh, ενώ για τους ινοβλάστες των ασθενών μετά από προσθήκη 500 ng/ml hgh. H προσθήκη 1000 ng/ml hgh προκάλεσε μικρή μείωση στο ρυθμό αύξησης των ινοβλαστών ασθενών και μαρτύρων. Οι ινοβλάστες των ασθενών παρουσίασαν μεγαλύτερο χρόνο διπλασιασμού του πληθυσμού τους συγκριτικά με τους ινοβλάστες του μάρτυρα. Οι ινοβλάστες των ασθενών είχαν μικρότερο βαθμό σύνδεσης βρωμοουριδίνης (BrdU) στο DNA συγκριτικά με τους ινοβλάστες των μαρτύρων. Σε όλες τις καλλιέργειες ινοβλαστών των ασθενών παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή στην αύξηση, που εκφραζόταν με το ποσοστό των κυττάρων που συνέθεταν DNA. H προσθήκη διαφόρων δόσεων hgh αύξησε το ποσοστό των κυττάρων που συνέθεταν DNA με την ίδια κινητική στους ινοβλάστες των ασθενών και των μαρτύρων, αν και οι διαφορές στους ινοβλάστες των ασθενών και των μαρτύρων παρέμεναν. Η μειωμένη σύνδεση Βρωμοουριδίνης, που αντιπροσωπεύει άμεσα τα κύτταρα που βρίσκονται στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, υποδηλώνει διαταραχή στη μετάβαση των ινοβλαστών του ασθενή από τη φάση G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Με ανάλυση FACS βρέθηκε ότι το 69% των ινοβλαστών των μαρτύρων και το 93% των ινοβλαστών των ασθενών παρέμενε στη φάση G0/G1 του κυτταρικού κύκλου. Η προσθήκη hgh σε συγκεντρώσεις 200 ng/ml και 1000 ng/ml μείωσε το ποσοστό των ινοβλαστών των ασθενών στη φάση G0/G1 από 93% σε 80% και 72%, αντίστοιχα, ενώ το ποσοστό των ινοβλαστών των μαρτύρων παρέμεινε περίπου το ίδιο. Επιπλέον, στους ινοβλάστες των ασθενών βρέθηκε χαμηλή έκφραση των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου και συγκεκριμένα των κυκλινών Α, D και της πρωτεΐνης CDT1, μετά από χορήγηση 200 ng/ml hgh, συγκριτικά με τους ινοβλάστες των ινοβλαστών των μαρτύρων. Επομένως, η λειτουργική διαταραχή στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3 στο σηματοδοτικό μονοπάτι της GH στους ινοβλάστες των ασθενών σχετίζεται με καθήλωση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G0/G1, γεγονός που αντικατοπτρίζεται επίσης από τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης p21 και τη μειωμένη έκφραση της κυκλίνης Α, της κυκλίνης D και του CDT1. 61

62 Ασθενής Μάρτυρας 0 p21 hgh 200μg/L p21 Είναι αξιοσημείωτο ότι η διαταραγμένη ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3 στους ινοβλάστες των ασθενών αποκαθίσταται μετά από έκθεση των ινοβλαστών σε υψηλές συγκεντρώσεις hgh. Επιπλέον, η χορήγηση εξωγενούς hgh στους ασθενείς κατά την 5ήμερη διενέργεια δοκιμασίας IGF-I αύξησε τις χαμηλές συγκεντρώσεις IGF-I σε φυσιολογικά επίπεδα. Αντιστοίχως, η ταχύτητα αύξησης των παιδιών αυξήθηκε σημαντικά μετά από 4 έτη θεραπείας με hgh. Μία πιθανή εξήγηση της ικανότητας των υψηλών συγκεντρώσεων hgh να αυξήσουν τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 στους ινοβλάστες των ασθενών είναι η επαγωγή εναλλακτικών μονοπατιών που εμπλέκουν τις πρωτεΐνες JAK1, JAK3 ή EGFR. (297,400,441) 1.13 Μέθοδοι διάκρισης κλινικών οντοτήτων ανεπάρκειας αύξησης Η διάγνωση της ανεπάρκειας της GH κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας, με πρώτο σημείο την ανεπάρκεια της αύξησης, είναι ιδιαιτέρως σημαντική για τη μελλοντική ευεξία του ατόμου, καθώς εκτός από το κοντό ανάστημα, η αθεράπευτη ανεπάρκεια GH μπορεί να προκαλέσει επίσης προβλήματα, όπως η υπερχοληστερολαιμία, η παχυσαρκία, η μυική αδυναμία και η επηρεασμένη ποιότητα ζωής στην ενήλικο ζωή Φαρμακολογική πρόκληση Αυξητικής ορμόνης Στην κλινική άσκηση ρουτίνας η εκτίμηση της έκκρισης της GH πραγματοποιείται πρωτίστως με φαρμακολογική πρόκληση της απελευθέρωσης της GH. Η φαρμακολογική πρόκληση από μόνη της μπορεί, ωστόσο, σε κάποιες περιπτώσεις να είναι παραπλανητική και η διάγνωση της ανεπάρκειας της GH μπορεί να χαθεί. Οι προκλητές δοκιμασίες περιλαμβάνουν άσκηση, χορήγηση L-Dopa, αργινίνης, κλονιδίνης, γλυκαγόνης, ινσουλίνης και προπρανολόλης. Η ανεπαρκής απόκριση της GH (<7-10 ng/ml) διαφέρει στην κάθε δοκιμασία. 62

63 Εικόνα 33. Η δοκιμασία πρόκλησης της GH ωρη έκκριση Αυξητικής Ορμόνης Ο υπολογισμός της αυθόρμητης 24ωρης έκκρισης της GH μπορεί να είναι βοηθητικός αρκετά συχνά στη διάγνωση της ανεπάρκειας της GH αν η ανεπάρκεια της αύξησης επιμένει παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων IGF-I στον ορό και φυσιολογικών συγκεντρώσεων GH μετά από φαρμακολογική πρόκληση. ( ,203,204) Αυτά σε συνδυασμό στοιχειοθετούν την οντότητα Growth Hormone Neurosecretory Defect (GHND). Εικόνα 34. Τα μοντέλα 24ωρης έκκρισης GH στις οντότητες GHD, GHND και σε μάρτυρες Είναι σημαντικό να λαμβάνεται υπόψη ότι οι ρυθμοί έκκρισης της GH ποικίλλουν με βάση το Δείκτη Μάζας Σώματος και ότι οι ημερήσιοι ρυθμοί έκκρισης GH σε παχύσαρκους άνδρες είναι ελαττωμένοι στο ένα τέταρτο των αντίστοιχων για φυσιολογικό βάρος σώματος. Ωστόσο, παρά τα σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκκρισης GH, τα παχύσαρκα παιδιά έχουν φυσιολογική αύξηση με φυσιολογικά 63

64 επίπεδα ελεύθερου IGF-I και GHBP. (205,206) Επομένως, κάθε παχύσαρκο παιδί με ανεπάρκεια αύξησης και χαμηλές συγκεντρώσεις IGF-I, παρά τη φυσιολογική απόκριση της GH στη φαρμακολογική πρόκληση, χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Ο προσδιορισμός της 24ωρης έκκρισης της GH είναι σχετικά δύσκολος και ακριβός, δεδομένου ότι προϋποθέτει οργανωμένη ενδονοσοκομειακή παιδιατρική ενδοκρινολογική μονάδα. Συγκεκριμένα, το παιδί πρέπει να εισαχθεί στο νοσοκομείο το προηγούμενο βράδυ από την έναρξη της δοκιμασίας, ώστε να εγκλιματισθεί στο νοσοκομειακό περιβάλλον. Στόχος είναι τη νύχτα της 24ωρης καταμέτρησης το παιδί να έχει φυσιολογικό και συνεχή ύπνο, με φυσιολογικής διάρκειας στάδια ΙΙΙ-ΙV του ύπνου, προκειμένου να επιτευχθούν οι μέγιστες φυσιολογικές νυχτερινές αιχμές GH. To παιδί επίσης πρέπει να βρίσκεται σε φυσιολογική δραστηριότητα κατά την ημέρα της εξέτασης ώστε να επιτευχθούν οι αιχμές της GH που σχετίζονται με τη δραστηριότητα. Ωστόσο, τα αποτελέσματα που προκύπτουν είναι συχνά αμφιλεγόμενα Δοκιμασία διέγερσης IGF-I (IGF-I Generation test) Επειδή τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της 24ωρης έκκρισης GH είναι, όπως ήδη αναφέρθηκε, αμφιλεγόμενα, στην κλινική πράξη προτιμάται μία ευκολότερη μέθοδος ελέγχου της GH που θα μπορούσε επίσης να αντικατοπτρίζει την παθολογική 24ωρη αυθόρμητη έκκριση της GH. Πρόκειται για τη δοκιμασία διέγερσης IGF-I (IGF-I generation test). Το IGF-I generation test έχει χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση της αντίστασης στην GH (GH insensitivity/ghi), με κύρια μορφή το σύνδρομο Laron, μία διαταραχή με χαμηλές συγκεντρώσεις IGF-I, στην οποία οι συγκεντρώσεις αυτές δεν αυξάνουν σημαντικά μετά τη χορήγηση βιοσυνθετικής ανθρώπινης GH (hgh). ( ) Πρόκειται για μία δοκιμασία ανεκτίμητης αξίας για τη διάγνωση της GHI, με υψηλή επαναληψιμότητα σε παιδιά κι ενήλικες. (214) Το IGF-I generation test έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση της σχέσης ανάμεσα στην απόκριση στη δοκιμασία και στην απόκριση κατά τη διάρκεια της θεραπείας με hgh σε παιδιά με ανεπάρκεια GH που διαγνώσθηκαν με φαρμακολογική πρόκληση. Πρώτος ο Rudman (215) μελέτησε την απόκριση του IGF-I μετά από θεραπευτική χορήγηση hgh για 10 ημέρες σε ασθενείς με ανεπάρκεια GH και διαπίστωσε τεράστια αύξηση του IGF-I μετά από λίγες μέρες θεραπείας με hgh. Ορισμένοι άλλοι συγγραφείς έχουν επίσης αναφέρει μια παρόμοια απόκριση του IGF-I στην ίδια κατηγορία παιδιών μετά από χορήγηση hgh για μερικές μέρες. ( ) Έχει επίσης αναφερθεί ότι η αυξημένη απόκριση των IGF-I και IGFBP-3 κατά τη διάρκεια 5ήμερων IGF-I και IGFBP-3 δοκιμασιών είναι διαγνωστική για παιδιά με ανεπάρκεια GH και Μείζονα Θαλασσαιμία. (219) Άλλες μελέτες έχουν φανερώσει την ύπαρξη θετικής σχέσης μεταξύ της απόκρισης του IGF-I και της αύξησης μετά από θεραπεία σε παιδιά με ανεπάρκεια GH. (220) Η ομάδα της BE Spiliotis πραγματοποίησε IGF-I generation test σε παιδιά με ανεπάρκεια GH είτε λόγω κλασσικής ανεπάρκειας GH είτε λόγω GHND. Kατά το IGF-I generation test πραγματοποιήθηκαν αιμοληψίες καθημερινά για 5 ημέρες στις 64

65 09.00 π.μ. και χορηγήθηκε ανθρώπινη GH (Genotropin) καθημερινά για 4 ημέρες υποδόρια σε δόση 0.03 mg/kg/ημέρα αμέσως μετά την πρώτη αιμοληψία. Και οι δύο κατηγορίες παιδιών είχαν σημαντικά χαμηλότερες συγκεντρώσεις IGF-I στη βασική κατάσταση, όμως παρουσίαζαν μεγαλύτερη αύξηση στις τιμές του IGF-I κατά τη διάρκεια του IGF-I generation test συγκρινόμενες με τους φυσιολογικού και κοντού αναστήματος μάρτυρες. Μια πιθανή υπόθεση που θα μπορούσε να εξηγεί την ιδιαιτέρως αυξημένη απόκριση του IGF-I στα παιδιά με ανεπάρκεια της GH είναι η επίδραση της hgh στην αυξημένη ποσότητα μη κατειλημμένων υποδοχέων GH (priming effect). Είναι αξιοσημείωτο ότι οι μέγιστες συγκεντρώσεις IGF-I σημειώθηκαν στις περισσότερες περιπτώσεις των μαρτύρων φυσιολογικού αναστήματος τις ημέρες 4-5 της δοκιμασίας, ενώ στα παιδιά με ανεπάρκεια αύξησης τις ημέρες 3-4. Γι αυτό, είναι σημαντική η μέτρηση των συγκεντρώσεων IGF-I καθημερινά κατά τις 5 ημέρες της δοκιμασίας ώστε να διαπιστωθεί η μέγιστη απόκριση του IGF-I σε όλα τα παιδιά. (221) Εικόνα 35. Η δοκιμασία διέγερσης IGF-I σε μάρτυρες με κοντό ανάστημα, παιδιά με κλασσική ανεπάρκεια GH (GHD1), νευροεκκριτική δυσλειτουργία GH (GHD2) και μάρτυρες φυσιολογικού αναστήματος. Επομένως, το IGF-I generation test είναι εύκολο να πραγματοποιηθεί χωρίς εισαγωγή στο νοσοκομείο, μπορεί να διακρίνει το σύνδρομο μειωμένης ευαισθησίας στην GH (GHIS) από την ανεπάρκεια GH (GHD, GHND) και, άρα, μπορεί να αναγνωρίσει τα παιδιά με ανεπάρκεια GH που μπορούν να επωφεληθούν από τη θεραπεία με hgh. Επιπρόσθετα, η δοκιμασία αυτή λόγω της δυνατότητας που παρέχει για έμμεση διάγνωση των ασθενών με παθολογικές 24ωρες συγκεντρώσεις GH (φυσιολογική δοκιμασία φαρμακολογικής πρόκλησης), ίσως θα μπορούσε να υποκαταστήσει τη δοκιμασία 24ωρης καταμέτρησης των συγκεντρώσεων GH. 65

66 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 : Ο υποδοχέας της Αυξητικής Ορμόνης 2.1 Η δομή του υποδοχέα της GH (GHR) Ο GHR είναι μια μονή διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που αποτελείται από μία εξωκυττάρια περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη και μία ενδοκυττάρια περιοχή σηματοδότησης. Ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων κυτταροκινών Τάξης 1, στην οποία επίσης ανήκουν οι υποδοχείς της ερυθροποιητίνης (ΕΡΟ), των IL-2 έως IL-8, της IL-11 και IL-12, της θρομβοποιητίνης, του ανασταλτικού παράγοντα της λευχαιμίας (LIF), του granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) και του granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). (222,223) Τα κοινά χαρακτηριστικά αυτής της οικογένειας υποδοχέων περιλαμβάνουν την ύπαρξη περιοχών κυστεΐνης και του μοτίβου WSXWS στο εξωκυττάριο τμήμα, καθώς και την ύπαρξη του στοιχείου Box 1, που είναι πλούσιο σε προλίνη κι εμπλέκεται στη σύνδεση με τις Janus κινάσες, στο κυτταροπλασματικό τμήμα. Ο υποδοχέας GHR περιλαμβάνει σχετικά μεγάλες κυτταροπλασματικές περιοχές. (224) Είναι ευρέως κατανεμημένος σε όλα τα κύτταρα του ανθρώπινου σώματος, αλλά εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ και ακολούθως στο λίπος και στο μυ. Εικόνα 36. Ο υποδοχέας GHR Από τους υποδοχείς κυτταροκινών, ο GHR μοιάζει δομικά περισσότερο από οποιονδήποτε άλλον με τον υποδοχέα προλακτίνης. Η ομοιότητα στην αλληλουχία μεταξύ των δύο υποδοχέων είναι λιγότερο από 30%, όμως οι κρυσταλλικές μορφές και τα συνολικά δομικά χαρακτηριστικά των συμπλεγμάτων GH-GHR (εξωκυττάριο τμήμα) και GH-PRLR (εξωκυττάριο τμήμα) παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα. (225) Αν 66

67 και η GH μπορεί να προσδεθεί στον υποδοχέα της προλακτίνης, το αντίστροφο δε συμβαίνει. H ύπαρξη του GHR αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τους Tsushima και Friesen το 1973, (226) ενώ η αλληλούχιση και κλωνοποίηση του γονιδίου από ήπαρ κουνελιού έγινε το (227) To γονίδιο που κωδικοποιεί τον ανθρώπινο GHR βρίσκεται σε ένα μονό αντίγραφο στο χρωμόσωμα 5p13-p12. (228) Περιλαμβάνει περίπου 90 kb και περιέχει εννέα κωδικοποιά εξόνια (εξόνια 2-10). (229) To γονίδιο του GHR κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη 620 αμινοξέων. Η εξωκυττάρια περιοχή, δηλαδή η περιοχή πρόσδεσης της ορμόνης και του διμερισμού του υποδοχέα, περιλαμβάνει 250 αμινοξέα, ενώ η ενδοκυττάρια περιοχή περιλαμβάνει περίπου 350 αμινοξέα και η μονή διαμεμβρανική έλικα περιλαμβάνει 24 αμινοξέα. (230) O GHR περιέχει πέντε περιοχές γλυκοζυλίωσης, όπου προσδένεται ασπαραγίνη, (231,232) και είκοσι τρεις περιοχές ουβικουιτινυλίωσης, όπου προσδένεται λυσίνη. Αυτές οι μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις αυξάνουν το μοριακό βάρος του GHR από το αναμενόμενο των 70 kda σε kda. Μετά την πρόσδεση της GH, ο GHR πυροδοτεί τη μεταγωγή του σήματος με τελική κατάληξη την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε αναβολικές διεργασίες, όπως είναι η πρωτεϊνοσύνθεση, η αποδόμηση των λιπιδίων, η ανοσιακή λειτουργία, η μυική μάζα, η οστική ανακύκλωση και η ανάπτυξη των οδόντων. Μεταλλάξεις του GHR στον άνθρωπο προκαλούν, όπως έχει ήδη αναφερθεί, το σύνδρομο Laron, το οποίο χαρακτηρίζεται από κοντό ανάστημα και άλλα χαρακτηριστικά που ανευρίσκονται σε διάφορα σύνδρομα ανεπάρκειας GH. (182) Ανάλογα με τον τύπο των μεταλλάξεων, επηρεάζεται είτε ο σχηματισμός του συμπλέγματος GH/GHR είτε η διεργασία του διμερισμού. Σε αυτούς τους ασθενείς παρατηρούνται σοβαρή αντίσταση στην GH, που χαρακτηρίζεται από πολύ υψηλές συγκεντρώσεις GH και πολύ χαμηλά επίπεδα IGF-Ι και IGFBP3. GHR knockout ποντίκια είναι βιώσιμα, με ένα σχεδόν φυσιολογικό μέγεθος κατά τη γέννηση. (233) Ο ρυθμός αύξησης φθίνει κατά τη μεταγεννητική ζωή, καταλήγοντας σε μείωση κατά 50% περίπου στο βάρος σώματος στην ενήλικη ζωή. Όπως συμβαίνει στο σύνδρομο Laron στον άνθρωπο, τα κυκλοφορούντα επίπεδα του IGF-Ι και της IGFBP-3 είναι εξαιρετικά χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα. (234) Τα ποντίκια αυτά επίσης παρουσιάζουν μείωση στην άλιπη μάζα σώματος, αύξηση στο λιπώδη ιστό και μειωμένη οστική ανακύκλωση και πυκνότητα σε μέταλλα. Τα ποντίκια αυτά όμως ζουν πολύ περισσότερο από τους μάρτυρες. 2.2 Γονιδιακή έκφραση του GHR Ο πρώτος ιστός που αναγνωρίσθηκε να αποκρίνεται στην GH είναι το ήπαρ λόγω του μεγάλου αριθμού των υποδοχέων των ηπατικών κυττάρων. (235) Με τη χρήση περισσότερο ευαίσθητων τεχνικών, έχει ποσοτικοποιηθεί ο αριθμός των GHR σε εξωηπατικούς ιστούς, όπως είναι οι μύες, τα οστά, ο νεφρός, ο μαζικός αδένας, ο λιπώδης ιστός και τα εμβρυονικά αρχέγονα κύτταρα. (236) Ο GHR έχει επίσης βρεθεί στον εγκέφαλο και το ανοσοποιητικό σύστημα του ανθρώπου. 67

68 Υπάρχουν πολλοί παράγοντες που επηρεάζουν την έκφραση του GHR είτε στο μεταγραφικό επίπεδο είτε στο επίπεδο της μετάφρασης. Τέτοιοι είναι: η κατάσταση της διατροφής, το αναπτυξιακό στάδιο, η κατάσταση του ενδοκρινικού συστήματος και διάφοροι μηχανισμοί ελέγχου των κυττάρων/ιστών. Η έκφραση του GHR αυξάνεται ανάλογα με την ηλικία και γίνεται μέγιστη στην εφηβεία. Πιο αναλυτικά, παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση του GHR είναι: Παράγων Επίδραση στην έκφραση του GHR Διατροφή Σύστημα Βιβλιογραφία Υποσιτισμός και νηστεία GHR (mrna) Ηπατοκύτταρα αρουραίου 237, 238, 239 Έλλειψη γλυκόζης GHR (mrna) Ηπατοκύτταρα χοίρου 240 Ενδοκρινικό σύστημα Χρόνια GH GHR (πρόσδεση) Ήπαρ αρουραίου, χοίρου, προβάτου 241, 242 Υποφυσεκτομή GHR (αριθμός) Ήπαρ κουνελιού 243 Οξεία GH GHR (πρόσδεση) Ήπαρ αρουραίου 244 Υπερέκφραση GH GHR (πρόσδεση) Ήπαρ διαγονιδιακών ποντικιών 245 Εγκυμοσύνη GHR (mrna+πρόσδεση) Ήπαρ ποντικιού 246 Οιστρογόνα GHR (mrna) Ήπαρ αρουραίου Δεξαμεθαζόνη GHR (mrna) Ήπαρ αρουραίου Ινσουλίνη - GHR (mrna+πρωτεΐνη) Ηπατοκύτταρα ανθρώπου 248,

69 - GHR (επιφάνεια) - GHR (πρόσδεση) Πίνακας 1. Ρύθμιση της έκφρασης του GHR 2.3 Η δεσμευτική πρωτεΐνη της GH Πολλές μεμβρανικές πρωτεΐνες υπόκεινται σε πρωτεόλυση κοντά στην περιοχή εισόδου τους στη μεμβράνη, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση των εξωκυττάριων περιοχών τους στον περικυτταρικό χώρο, διαδικασία γνωστή ως shedding. ( ) Tέτοιες πρωτεΐνες είναι μόρια κυτταρικής προσκόλλησης, λευκοκυτταρικά αντιγόνα, υποδοχείς και οι συνδέτες τους, εκτοένζυμα, ιικές μεμβρανικές πρωτεΐνες και διάφορες άλλες πρωτεΐνες. (253) O GHR είναι κυρίαρχο μέλος αυτής της τάξης των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών και παράγει σημαντικές ποσότητες από την εξωκυττάρια περιοχή του, γνωστή ως GHBP (Growth Hormone Binding Protein), η οποία μπορεί να μετρηθεί στην κυκλοφορία. (254) Τουλάχιστον το 50% της κυκλοφορούσας GH βρίσκεται συνδεδεμένο με αυτή τη δεσμευτική πρωτεΐνη υψηλής συγγένειας, (255,256) η οποία είναι η διαλυτή μορφή της εξωκυττάριας περιοχής του GHR. H GHBP είναι παρούσα στην κυκλοφορία πολλών ειδών. H βιολογική της σημασία, αν και δεν έχει κατανοηθεί πλήρως, υπογραμμίζεται από τα εξής γεγονότα: 1) Έχει συντηρηθεί εξελικτικά στα σπονδυλωτά και 2) παράγεται με δύο διαφορετικούς μηχανισμούς: Στα τρωκτικά και κάποια ακόμα είδη, η GHBP είναι προϊόν εναλλακτικού ματίσματος του mrna του GHR. Η κυτταροπλασματική και διαμεμβρανική περιοχή αντικαθίστανται από μία βραχεία υδρόφιλη ουρά. Αντιθέτως, η GHBP στον άνθρωπο και στο κουνέλι προκύπτει από ρυθμιζόμενη πρωτεόλυση του συνολικού μορίου του GHR και απομάκρυνση της εξωκυττάριας περιοχής με τη μορφή της GHBP. (257) Το ήπαρ είναι σημαντική πηγή της πρωτεΐνης GHBP. Έχει πλέον αναγνωρισθεί η πρωτεάση που είναι υπεύθυνη για την πρωτεόλυση του GHR και άρα την παραγωγή GHBP. Συγκεκριμένα, υπάρχει η υπόθεση ότι στην πρωτεόλυση του GHR μπορεί να εμπλέκεται το ένζυμο TACE (tumor necrosis factorα-converting enzyme), επίσης γνωστό ως ADAM 17, και σε μικρότερο βαθμό το παρόμοιο δομικά ADAM 10. (258,259) Το ένζυμο ΤΑCE ανήκει στις metzincins, μια μεγάλη οικογένεια μεταλλοπρωτεασών και δεν έχει ειδικότητα για κάποια γραμμική αλληλουχία αμινοξέων. Πολλά υποστρώματα του ενζύμου που έχουν μελετηθεί δεν παρουσιάζουν κοινή αλληλουχία. Σε ινοβλάστες από knockout ποντίκια για το TACE που διαμολύνθηκαν με GHR κουνελιού, απέτυχε η γένεση GHBP. Η διαμόλυνση των κυττάρων αυτών με cdna του ενζύμου TACE αποκατέστησε την ικανότητά τους να παράγουν GHBP και το εναπομείναν μόριο του GHR. (259) Έχει βρεθεί ότι αναστολείς της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) αναστέλλουν πλήρως το shedding του GHBP, ενώ οι αναστολείς της ΜΕΚ ασκούν μερική ανασταλτική δράση. (260) Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι το μονοπάτι της PKC είναι σημαντικό για την ενεργοποίηση του ενζύμου TACE και ότι το μονοπάτι ERK- 69

70 MΑΡK παίζει επίσης ένα μικρότερο ρόλο. Είναι επίσης ενδιαφέρον ότι η ίδια η GH έχει επίδραση στην πρωτεόλυση του GHR. Η πρόσδεση της GH στον GHR επάγει το διμερισμό του GHR και ο διμερισμένος GHR είναι πολύ πιο ανθεκτικός στην πρωτεόλυση από το μονομερές GHR. (261) Συνοψίζοντας, το ένζυμο TACE, που ενεργοποιείται από εξαρτώμενους από την PKC και τη MAPK μηχανισμούς, κόβει το μονομερές GHR σε μία επί του παρόντος άγνωστη περιοχή. Αυτό καταλήγει στο σχηματισμό διαλυτής GHBP κι ενός εναπομείναντος μορίου GHR, που περιλαμβάνει τη διαμεμβρανική και ενδοκυττάρια περιοχή. Η GHBP διαχέεται στον περικυτταρικό χώρο και φτάνει στη συστηματική κυκλοφορία. Η κατάληξη του εναπομείναντος μορίου GHR δεν έχει ακόμα διευκρινισθεί πλήρως. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το εναπομείναν τμήμα του GHR υπόκειται σε δεύτερο κόψιμο, πιθανώς ενδομεμβρανικά, από μία ενζυματική δραστηριότητα παρόμοια με αυτή της γ-σεκρετάσης, (262) όμοια με αυτή κατά το κόψιμο της πρόδρομης πρωτεΐνης του αμυλοειδούς που ενέχεται στη νόσο Alzheimer. (263) Τα κύτταρα απευαισθητοποιούνται στην GH μετά την πρωτεόλυση. Αντιστρόφως, ο επαγώμενος από την GH διμερισμός του GHR μειώνει την ευαισθησία του υποδοχέα στην πρωτεόλυση. Εκτός από αυτές τις επιδράσεις της πρωτεόλυσης στην κυτταρική ευαισθησία στην GH, ο ρόλος της GHBP στη φυσιολογία της GH δεν είναι ακόμα σαφής. Σε διαφορετικά μοντέλα η GHBP μπορεί είτε να επαγάγει είτε να αναστείλει τη δράση της GH. (254) Σε αντίθεση με τη στοιχειομετρία 1:2 GH:GHR στην κυτταρική επιφάνεια, το μεγαλύτερο μέρος της συνδεδεμένης με την GHBP GH υπάρχει σε στοιχειομετρία 1:1 (GH:GHBP). Aυτό έχει οδηγήσει στην υπόθεση ότι μέρος του ρόλου της GHBP είναι να δρα ως αποθήκη της GH και να τη μεταφέρει αποτελεσματικά από την κυκλοφορία στον GHR της κυτταρικής επιφανείας. (264) Στην κυκλοφορία, η GH που είναι συνδεδεμένη με την GHBP έχει παρατεταμένο χρόνο ημιζωής συγκριτικά με την ελεύθερη GH, πιθανώς λόγω αδυναμίας πρόσβασης της GH σε περιοχές αποδόμησης. (265) Δεδομένης της κατά ώσεις μεταφοράς της GH στην κυκλοφορία, ένας πιθανός ρόλος της GHBP είναι η σταθεροποίηση της βιοδιαθεσιμότητας της GH. (266) Στον άνθρωπο, τα επίπεδα GHBP αυξάνονται σταθερά κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας, μεταβάλλονται λίγο μέχρι μετά την ενηλικίωση και μειώνονται μετά την ηλικία των 60 ετών. (267) Παιδιά με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα έχουν χαμηλότερα επίπεδα GHBP από τους μάρτυρες, (268) γεγονός που ίσως αντανακλά μία κατάσταση ήπιας αντίστασης στην GH. Στο σύνδρομο Laron ο GHR και η GHBP υπάρχουν συνήθως σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Η GHBP είναι επίσης χαμηλή στο σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1 και αυξάνεται μετά τη θεραπεία με ινσουλίνη. (269) H GHBP είναι χαμηλή σε καταστάσεις κακής διατροφής, αλλά όχι στην παχυσαρκία. (270) Ο ρόλος σε αυτές τις καταστάσεις είναι ακόμα άγνωστος. Επομένως, η δραστηριότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών έχει τρεις τουλάχιστον συνέπειες στη δράση της GH. Πρώτον, το κόψιμο του GHR προκαλεί απώλεια των λειτουργικών GHR από την κυτταρική επιφάνεια. Αυτή είναι μια μορφή αρνητικής ρύθμισης του υποδοχέα. (260) Η αρνητική ρύθμιση είναι πιθανώς απαραίτητη για να αποφευχθεί η υπερδιέγερση του συστήματος. Δεύτερον, σχηματίζονται δύο άμεσα 70

71 προϊόντα: η GHBP και ο εναπομείνας GHR. Η GHBP έχει σύνθετη δράση, που περιλαμβάνει αναστολή της πρόσδεσης της GH στους υποδοχείς GHR μέσω ανταγωνισμού με το συνδέτη (271) και αναστολή της σηματοδότησης του GHR μέσω σχηματισμού μη παραγωγικών ετεροδιμερών GHR/GHBP. In vivo, η GHBP έχει επίσης ενισχυτική επίδραση στη δράση της GH μέσω παράτασης του χρόνου ημιζωής και της βιοδιαθεσιμότητας της GH. (272,273) Τρίτον, το εναπομείναν τμήμα του GHR είναι πιθανώς σημαντικός ρυθμιστής της δράσης της GH μέσω αδιευκρίνιστων ενδοκυττάριων μηχανισμών. Συμβαίνουν περαιτέρω πρωτεολυτικές διεργασίες του εναπομείνατος GHR (274) και ορισμένα από τα προϊόντα μπορεί να έχουν διάφορες βιολογικές δράσεις. Τέλος, διάφορες μελέτες αποκαλύπτουν ότι η GHBP έχει θετικές επιδράσεις στη δράση της GH, αναστέλλοντας τη νεφρική κάθαρση της GH. 2.4 Σύνθεση, ωρίμανση και ενδοκύττωση του GHR Μετά τη σύνθεσή του στο ενδοπλασματικό δίκτυο, το πρόδρομο μόριο του GHR μεταφέρεται στο σύστημα Golgi. Στο σύστημα Golgi ο υποδοχέας υφίσταται ωρίμανση που χαρακτηρίζεται από αλλαγές στο μοντέλο γλυκοζυλίωσης, με αποτέλεσμα ο ώριμος γλυκοζυλιωμένος GHR να στερείται των πλούσιων σε μαννόζη υδατανθράκων. Τα επίπεδα του GHR στην κυτταρική επιφάνεια αντανακλούν μία ισορροπία μεταξύ δύο διαδικασιών: την ενδοκύττωση/αποδόμηση του υποδοχέα και τη μεταφορά των νεοσχηματισμένων υποδοχέων στην πλασματική μεμβράνη. Η ενδοκύττωση και αποδόμηση συμβαίνουν συνεχώς, ακόμα και απουσία διέγερσης από την GH, ενώ παρουσία GH η αποδόμηση του υποδοχέα επιταχύνεται. (275,276) Τα δεδομένα δείχνουν ότι η JAK2 συνδεόμενη με τον GHR επάγει μια εξαρτώμενη από τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος πρωτεόλυση του GHR κι επιτρέπει τη μετατροπή του πρόδρομου υποδοχέα σε ώριμο. (277) Η ενδοκύττωση είναι η διεργασία με την οποία τα κύτταρα εσωτερικοποιούν εξωκυττάρια μακρομόρια ή πρωτεΐνες. Υπάρχουν περιοχές της κυτταροπλασματικής μεμβράνης που η εσωτερική της πλευρά καλύπτεται από πλέγμα που σχηματίζει η πρωτεΐνη κλαθρίνη. Οι περιοχές αυτές ονομάζονται βοθρία ή καλυμμένα κοιλώματα κλαθρίνης και σε αυτές βρίσκονται οι υποδοχείς GHR. Μετά την πρόσδεση της GH σχηματίζονται κυστίδια καλυμμένα με πλέγμα κλαθρίνης. Η κλαθρίνη στη συνέχεια απομακρύνεται με τη δράση ενζύμων κι επανέρχεται στα βοθρία, ενώ τα κυστίδια μεταφέρονται στα ενδοσώματα. Έχει επιβεβαιωθεί ότι η εσωτερικοποίηση του GHR είναι εξαρτώμενη από την ουβικουιτίνη και αυξάνεται μετά την πρόσδεση της GH. (278) Μια συγκεκριμένη περιοχή στην κυτταροπλασματική περιοχή είναι σημαντική για την εσωτερικοποίηση του GHR. O GHR δεν έχει ενδογενή δραστικότητα κινάσης. H εσωτερικοποίηση του GHR προϋποθέτει την επιστράτευση του συστήματος σύνδεσης της ουβικουιτίνης στο μοτίβο του μηχανισμού ουβικουιτινυλίωσης του GHR, αλλά όχι τη σύνδεση της ουβικουιτίνης στον GHR. 71

72 2.5 Αποδόμηση του GHR - Το σύστημα της ουβικουιτίνης Αρχικά, είχε βρεθεί ότι η ΑΤΡ-εξαρτώμενη σύνδεση της ουβικουιτίνης με παθολογικές κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες διαμεσολαβεί την αποδόμησή τους. Πλέον, η ουβικουιτινυλίωση θεωρείται ότι συμμετέχει σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, όπως η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η διαφοροποίηση και η ανάπτυξη, η απόκριση στο stress, η επιδιόρθωση του DNA, η μεταγραφή γονιδίων, η ανοσοαπόκριση, η ρύθμιση υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας και καναλιών ιόντων, η απώλεια μυικής μάζας και η απόπτωση. Η ουβικουιτίνη είναι μια μικρή ρυθμιστική πρωτεΐνη που έχει βρεθεί στους περισσότερους ιστούς των ευκαρυωτικών οργανισμών. Αναγνωρίσθηκε το 1975 ως μια πρωτεΐνη 8,5 kda που αποτελείται από 76 αμινοξέα. Κωδικοποιείται από τέσσερα διαφορετικά γονίδια. Ο ρόλος της είναι να κατευθύνει πρωτεΐνες σε κυτταρικά διαμερίσματα, όπως είναι το πρωτεάσωμα, το οποίο καταστρέφει και ανακυκλώνει πρωτεΐνες. Η ουβικουιτίνη συνδέεται με πρωτεΐνες και τις μαρκάρει ώστε να καταστραφούν. Σε άλλες περιπτώσεις, μπορεί να τις κατευθύνει σε άλλες εντοπίσεις στο κύτταρο, όπου ρυθμίζουν άλλες πρωτεΐνες και κυτταρικούς μηχανισμούς Ουβικουιτινυλίωση Η ουβικουιτινυλίωση είναι μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση που καταλήγει στην πρόσδεση της ουβικουιτίνης σε περιοχές λυσίνης πρωτεϊνών-στόχων. Η διαδικασία αυτή είναι το αποτέλεσμα της διαδοχικής δράσης τριών ενζύμων: Του ενζύμου που ενεργοποιεί την ουβικουιτίνη (Ε1), του ενζύμου πρόσδεσης της ουβικουιτίνης (E2) και της λιγάσης της ουβικουιτίνης (Ε3), τα οποία στις περισσότερες περιπτώσεις αποτελούν ένα πρωτεϊνικό σύμπλεγμα. Αρχικά, σε ένα βήμα που προϋποθέτει την παρουσία ΑΤΡ, το ενεργοποιό της ουβικουιτίνης ένζυμο Ε1 σχηματίζει έναν υψηλής ενέργειας θειολικό εστέρα μεταξύ της δραστικής του περιοχής κυστεΐνης και της C-τελικής περιοχής γλυκίνης της ουβικουιτίνης. Στη συνέχεια, ένα συζευκτικό της ουβικουιτίνης ένζυμο, το Ε2, υποδέχεται την ενεργοποιημένη από το Ε1 ουβικουιτίνη και σχηματίζει ένα Ε2-S-Ub ενδιάμεσο, το οποίο περιλαμβάνει τη δραστική περιοχή κυστεΐνης του Ε2. Η τελική σύζευξη της ουβικουιτίνης στο υπόστρωμα μπορεί να διαμεσολαβηθεί άμεσα από το Ε2, συνήθως όμως είναι απαραίτητη επιπροσθέτως μια πρωτεϊνική λιγάση της ουβικουιτίνης (Ε3). Το σύμπλοκο της ουβικουιτίνης προσδένεται μέσω της C-τελικής γλυκίνης στην ε-αμινομάδα μιας περιοχής λυσίνης ή, σε μερικές περιπτώσεις, στην α- αμινομάδα της Ν-τελικής περιοχής του υποστρώματος. 72

73 Εικόνα 37. Το σύστημα ουβικουιτινυλίωσης Ένα υπόστρωμα μπορεί να τροποποιηθεί με μονοουβικουιτινυλίωση, ωστόσο, δεδομένου ότι η ουβικουιτίνη περιέχει 7 περιοχές λυσίνης, είναι δυνατόν να σχηματισθούν αλυσίδες πολυουβικουιτίνης. Γενικά, υποστρώματα με αλυσίδες των 4 ή περισσότερων μορίων ουβικουιτίνης, μαρκάρονται περισσότερο αποτελεσματικά για αποδόμηση από μία μεγάλη κυτταροπλασματική πρωτεάση, το πρωτεάσωμα 26S. Σε αντίθεση με το υπόστρωμα, τα μόρια ουβικουιτίνης δεν αποδομούνται, αλλά ανακυκλώνονται. Σημαντικό ρόλο στη διάρκεια και την ένταση των γεγονότων που ελέγχονται από ουβικουιτινυλίωση, αλλά και στην ομοιοστασία της ουβικουιτίνης, παίζουν ένζυμα αποουβικουιτινυλίωσης (DUBs). Η Ε3 λιγάση είναι που κυρίως καθορίζει την ειδικότητα του συστήματος της ουβικουιτίνης. Έως τώρα, στο γονιδίωμα των θηλαστικών έχουν βρεθεί μόνο δύο ισομορφές του ενζύμου Ε1 (Ε1a και E1b), σε αντίθεση με περισσότερες από 20 πρωτεΐνες Ε2 και περίπου 500 λιγάσες ουβικουιτίνης Ε3. Τα ένζυμα Ε3 διακρίνονται σε 3 κατηγορίες: 1) Αυτά που περιλαμβάνουν την περιοχή HECT, 2) Αυτά που περιλαμβάνουν την περιοχή RING-finger και 3) Αυτά που περιλαμβάνουν την περιοχή U-box Η ανακύκλωση του GHR Yπάρχουν χαρακτηριστικά που καθιστούν τη μεταβίβαση του σήματος μέσω GHR μοναδική, συγκρινόμενη με άλλων υποδοχέων: Κατ αρχάς, η ενδοκύττωση του GHR και ο χρόνος παραμονής του στην κυτταρική επιφάνεια δεν εξαρτάται από την παρουσία συνδέτη. Μετά την «άφιξη» στην κυτταρική επιφάνεια από το ενδοπλασματικό δίκτυο/σύμπλεγμα Golgi, ο GHR μεταφέρεται με οχήματα μεταφοράς στα λυσοσώματα για αποδόμηση. Επιπλέον, η ενδοκύττωση του GHR εξαρτάται από την ύπαρξη ενεργού συστήματος ουβικουιτίνης. Γενετικά και μοριακά πειράματα έχουν δείξει ότι τα μόρια του GHR συσσωρεύονται στην κυτταρική μεμβράνη αν το σύστημα της ουβικουιτίνης ανασταλεί. Επιπροσθέτως, η ουβικουιτινυλίωση του GHR συμπίπτει με την επιστράτευση βοθρίων κλαθρίνης. Είναι χαρακτηριστικό ότι δεν απαιτείται η ουβικουιτινυλίωση του GHR καθεαυτή, καθότι η αντικατάσταση όλων των περιοχών λυσίνης από 73

74 αργινίνες στην κυτταροπλασματική ουρά του GHR, δεν αναστέλλει την εσωτερικοποίηση/ενδοκυττάρωση. Σε μελέτες έχει αναγνωριστεί ως στόχος του συστήματος της ουβικουιτίνης στην κυτταροπλασματική ουρά του GHR μια αλληλουχία 10 αμινοξέων, η αλληλουχία DSWVEFIELD. Πρόκειται για το UbE μοτίβο για την εξαρτώμενη από ουβικουιτινυλίωση ενδοκύττωση. Το μοτίβο αυτό είναι επίσης απαραίτητο για τη μεταφορά του GHR στα MVBs (multivesicular bodies) για λυσοσωμιακή αποδόμηση. Εκτός από το σύστημα της ουβικουιτίνης, η υπομονάδα 26S του πρωτεασώματος εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση του GHR. Το πρωτεάσωμα 26S είναι ένα πολυκαταλυτικό ενζυμικό σύμπλεγμα που βρίσκεται στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα όλων των ευκαρυωτικών κυττάρων, το οποίο είναι υπεύθυνο για την αποδόμηση ουβικουιτινυλιωμένων πρωτεϊνών. Το πρωτεάσωμα αποτελείται από έναν πυρήνα 20S που σχετίζεται με ένα ή δύο ρυθμιστικά τμήματα 19S. H υπομονάδα 19S μπορεί να προσδεθεί στην αλυσίδα πολυουβικουιτίνης και την αποκόπτει από την πρωτεΐνη-στόχο. Η πρωτεΐνη-στόχος τότε ξετυλίγεται και αποδομείται στον πρωτεολυτικό πυρήνα, σχηματίζοντας πεπτίδια των 3-25 αμινοξέων σε μήκος. Oι αναστολείς του πρωτεασώματος αναστέλλουν τόσο την εσωτερικοποίηση του GHR όσο και τη μεταφορά από τα ενδοσώματα στα λυσοσώματα. Το ανασταλτικό αποτέλεσμα χάνεται όταν ο GHR «κόβεται» μετά το αμινοξύ 369, υποδηλώνοντας ότι είτε ο GHR είτε κάποια συνδεόμενη πρωτεΐνη πρέπει να αποδομηθούν στο πρωτεάσωμα πριν μπορέσει να γίνει η εσωτερικοποίηση. Προκύπτει λοιπόν ότι το σύστημα ουβικουιτίνης ρυθμίζει την ανακύκλωση του GHR μέσω δύο διαφορετικών γεγονότων: την εσωτερικοποίηση από την πλασματική μεμβράνη και τη μεταφορά από τα ενδοσώματα στα λυσοσώματα. Εικόνα 38. Η ανακύκλωση του υποδοχέα GHR Η GH ενεργοποιεί την τυροσιν-κινάση JAK2 μέσω ενός μοτίβου πλούσιου σε προλίνη (box 1) και πυροδοτεί την ενεργοποίηση των STATs. Οι σχετιζόμενες με το box 1 δραστηριότητες στον GHR δεν επιφέρουν ούτε την ενδοκύττωσή του ούτε την αποδόμησή του. Αντιθέτως, η ευαισθησία στην GH ρυθμίζεται από το μηχανισμό 74

75 ουβικουιτινυλίωσης, μέσω της εξαρτώμενης από την ουβικουιτίνη ενδοκύττωσης. Μετάλλαξη σε αυτό το μηχανισμό προκαλεί σημαντική μείωση της ενδοκύττωσης και της λυσοσωματικής αποδόμησης, καθιστώντας τα κύτταρα ευαίσθητα στην GH. Με τον τρόπο αυτό τα κύτταρα μπορούν να αντιδράσουν γρήγορα στο στρες και σε μεταβαλλόμενες αυξητικές καταστάσεις και δίνονται νέες θεραπευτικές δυνατότητες για τη ρύθμιση της ευαισθησίας στην GH χωρίς να υπάρχει παρέμβαση στις ευαίσθητες ορμονικές ισορροπίες των GH, IGF-I και της ινσουλίνης. 2.6 Ο διμερισμός του GHR Σύμφωνα με αρχικές δομικές μελέτες, ο επαγώμενος από την GH διμερισμός του GHR υπήρξε για καιρό το αποδεκτό μοντέλο ενεργοποίησης. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, η πρόσδεση της GH στην εξωκυττάρια περιοχή του GHR στα κύτταρα-στόχους, προάγει τον ομοδιμερισμό του υποδοχέα, με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός τριμερούς συμπλέγματος (GH-GHR 2 ). (279,280) Σύμφωνα με τις ίδιες ή σύγχρονες μελέτες, ανάλογα GH που δεν έχουν την ικανότητα να προάγουν το διμερισμό του GHR είναι ανενεργά, (281) η διαταραχή της περιοχής 2 στο μόριο της GH προκαλεί ανταγωνιστική δράση in vivo (282) και in vitro και η χρήση μονοκλονικών αντισωμάτων που παρεμποδίζουν το διμερισμό του GHR ανταγωνίζεται τον εξαρτώμενο από την GH κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η απουσία του ενδοκυττάριου τμήματος από τον GHR καταλήγει στο σχηματισμό ανενεργών διμερών. (283) Ωστόσο, μονοκλονικά αντισώματα που κατευθύνονται προς το εξωκυττάριο τμήμα του υποδοχέα και έχουν την ικανότητα να προάγουν το διμερισμό, αποτυγχάνουν να προκαλέσουν μεταβίβαση του σήματος, (285) γεγονός που υποδηλώνει ότι ο διμερισμός από μόνος του δεν επαρκεί ώστε να πυροδοτήσει τη σηματοδότηση και ότι οι δομικές αλλαγές που επάγονται από την GH είναι επίσης σημαντικές. Κρυσταλλογραφική ανάλυση έχει δείξει ότι ένα μόριο GH, προσδένεται σε δύο μόρια GHR, μέσω δύο περιοχών πρόσδεσης στον GHR (μία υψηλής συγγένειας περιοχή ή περιοχή 1, και μία μικρότερης συγγένειας περιοχή ή περιοχή 2). Σύμφωνα με το αρχικό μοντέλο, η GH προσδένεται σε ένα μόριο GHR μέσω της περιοχής 1 και κατόπιν σε ένα δεύτερο μόριο μέσω της περιοχής 2. (2,285,286) Η πρόσδεση στο δεύτερο μόριο GHR είναι εφικτή μόνο αν έχει προηγηθεί η πρόσδεση στο πρώτο μόριο. (286) Εικόνα 39. Η ενεργοποίηση της JAK2 από το τριμερές GH-GHR2 75

76 To τριμερές αυτό σύμπλεγμα μεταξύ των δύο μορίων GHR και GH σταθεροποιείται από την άμεση διαντίδραση μεταξύ των δύο παραμεμβρανικών περιοχών. Ο διμερισμός προκαλεί μία δομική αλλαγή που πυροδοτεί τον καταρράκτη αντιδράσεων της σηματοδότησης. Συγκεκριμένα, η πρόσδεση της GH σε δύο υποδοχείς GHR αυξάνει τη συγγένεια κάθε υποδοχέα με την JAK2. Με τον τρόπο αυτό, τα δύο συνδεόμενα με τους υποδοχείς GHR μόρια JAK2 έρχονται σε στενή επαφή, διευκολύνοντας τη διασταυρούμενη φωσφορυλίωση περιοχών τυροσίνης στην περιοχή κινάσης των JAK2. (287) Ακολούθως, τα ενεργοποιημένα μόρια JAK2 φωσφορυλιώνουν περιοχές τυροσίνης στον GHR και σε σηματοδοτικά μόρια. Ένας μίσχος περίπου 10 αμινοξέων διαχωρίζει την περιοχή διμερισμού από την κυτταρική μεμβράνη. Σύμφωνα όμως με ένα νεότερο μοντέλο διμερισμού, προσχηματισμένα διμερή GHR προϋπάρχουν της πρόσδεσης της GH. Oι υποδοχείς GHR σχηματίζουν διμερή αμέσως μετά τη σύνθεσή τους στο ενδοπλασματικό δίκτυο, τα οποία παραμένουν στην κυτταρική επιφάνεια. (288,289) H ασύμμετρη πρόσδεση της GH στις περιοχές πρόσδεσης των υποδοχέων του προσχηματισμένου διμερούς, προκαλεί σχετική περιστροφή των ενδοκυττάριων περιοχών των GHR. Επειδή η κυτταροπλασματική περιοχή καθενός υποδοχέα θεωρείται ότι συνδέεται με ένα μόριο JAK2, η περιστροφή αυτή φέρνει τα δύο μόρια JAK2 σε εγγύτητα, ικανή να επιτρέψει σε κάθε μόριο JAK2 να φωσφορυλιώσει την περιοχή τυροσίνης της περιοχής κινάσης του άλλου μορίου JAK2. (290) Η πτύχωση του υποδοχέα συμβαίνει πολύ γρήγορα, πιθανώς κατά τη διάρκεια και αμέσως μετά την ολοκλήρωση της μετάφρασης. Ο επακόλουθος διμερισμός είναι πιο αργός και συμβαίνει στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο, ανεξάρτητα από την πρόσδεση της GH στην κυτταρική επιφάνεια. Εικόνα 40. Η διαδοχική πρόσδεση της GH στο προσχηματισμένο διμερές GHR και η έναρξη της σηματοδότησης Οποιοσδήποτε παράγοντας διακόπτει τη συνοχή του συμπλέγματος GH-GHR 2 μπορεί να μπλοκάρει τη λειτουργία της ορμόνης. Για παράδειγμα, η αλλαγή μιας απλής γλυκίνης στη θέση 120 σε αργινίνη θα παρεμποδίσει την πρόσδεση του υποδοχέα στη δεύτερη περιοχή πρόσδεσης της αυξητικής ορμόνης. 76

77 Εικόνα 41. Ο διμερισμός του υποδοχέα GHR Η μεγάλη πλάγια αλυσίδα της αργινίνης στη θέση 120 δεν μπορεί να καταληφθεί όταν ο δεύτερος υποδοχέας συνδέεται, γιατί δεν «ταιριάζει» με την τρυπτοφάνη στη θέση 104 του υποδοχέα (απεικονίζεται ως πράσινες σφαίρες). Επομένως, η τροποποιημένη ορμόνη δε σχηματίζει ενεργό σύμπλεγμα με ένα δεύτερο υποδοχέα και καταστέλλει την αύξηση. Ο ανεξαρτήτως από την πρόσδεση συνδέτη διμερισμός του GHR δεν είναι μόνο ένα πλεονέκτημα για τη μεταβίβαση του σήματος, αλλά είναι επιπλέον απαραίτητη συνθήκη για την εξαρτώμενη από το σύστημα ουβικουιτίνης ενδοκύττωση του GHR. Έχει βρεθεί σε κυτταρική σειρά πνεύμονα από Κινέζικα χάμστερ, στα οποία χρησιμοποιήθηκε ένα ένζυμο που ενεργοποιεί την ουβικουιτίνη, ότι τα μονομερή του GHR εσωτερικοποιούνταν ραγδαία και ανεξάρτητα από το ενεργοποιημένο σύστημα ουβικουιτίνης. Προφανώς, το σύστημα της ουβικουιτίνης αναγνωρίζει μόνο διμερή του υποδοχέα GHR. Η ενδοκυττάρια περιοχή του υποδοχέα δε φαίνεται να συμμετέχει στο διμερισμό του GHR, καθώς η εξάλειψη του 97% της περιοχής αυτής σε ένα μόριο GHR δεν επηρεάζει τον ετεροδιμερισμό του με ένα πλήρες μόριο GHR. Ομοίως, έγινε μετάλλαξη αμινοξέων της διαμεμβρανικής περιοχής του GHR σε περιοχές αλανίνης και δεν επηρεάστηκε ο διμερισμός του GHR. Έχει προταθεί από δεδομένα κρυσταλλογραφίας ότι αμινοξέα της υποπεριοχής 2 του εξωκυττάριου τμήματος του GHR παίζουν καθοριστικό ρόλο στο διμερισμό. Ωστόσο, μεταλλάξεις αυτών των αμινοξέων δεν επηρεάζουν το διμερισμό του GHR, πιθανώς γιατί μονές μεταλλάξεις δεν είναι ικανές να διαταράξουν την εκσεσημασμένη διαντίδραση μεταξύ των υποδοχέων GHR. Αντιθέτως, η αντικατάσταση ολόκληρου του εξωκυττάριου τμήματος του GHR με τμήμα της πρωτεΐνης που βρίσκεται σε επαφή με τον υποδοχέα του LDL, οδήγησε σε χιμαιρικά μονομερή. Πιθανότατα, το εξωκυττάριο τμήμα του GHR απαιτείται μόνο για την αρχική σύνδεση των υποδοχέων GHR, καθώς η πέψη με πρωτεάσες του εξωκυττάριου τμήματος υποδοχέων GHR που εντοπίζονται στην κυτταρική μεβράνη, ήδη διμερισμένων, δε διαταράσσει το διμερισμό των συνδεόμενων με τη μεμβράνη εναπομεινασών πρωτεϊνών. Αν οι υποδοχείς βρεθούν σε στενή επαφή, ο διμερισμός πιθανώς διατηρείται μέσω των ασθενώς διαντιδρώντων διαμεμβρανικών τμημάτων των υποδοχέων. 77

78 Αν και ο GHR διμερίζεται απουσία της GH, τα σηματοδοτικά μονοπάτια ενεργοποιούνται μόνο μετά την πρόσδεση της GH. Η ενεργοποίηση μετά την πρόσδεση της GH πιθανότατα προϋποθέτει μία δομική αλλαγή στον GHR, που οδηγεί στην ενεργοποίηση της JAK2 τυροσιν-κινάσης στην ενδοκυττάρια πλευρά. Μεταλλάξεις στην υποπεριοχή 2 παρεμποδίζουν αυτή την εξαρτώμενη από την GH δομική αναδιοργάνωση. Επειδή η GH προσδένεται διαδοχικά στα δύο μόρια GHR, η παρουσία προσχηματισμένων διμερών προσφέρει το πλεονέκτημα γρήγορης σηματοδότησης, δεδομένου ότι δε χάνεται χρόνος για την «επιστράτευση» δεύτερου μορίου GHR. Συμπερασματικά, ο αριθμός των λειτουργικών GHR στην κυτταρική επιφάνεια εξαρτάται από την ισορροπία ανάμεσα στη σύνθεση και την αποδόμηση. Η λειτουργικότητα επιτυγχάνεται μόνο αν οι υποδοχείς βρίσκονται με τη μορφή διμερών στην κυτταρική επιφάνεια, και μόνο τα διμερή παρέχουν το ειδικό «εισιτήριο» ώστε να ενδοκυττωθούν από το σύστημα της ουβικουιτίνης. (291) 2.7 Ενεργοποίηση κυτταροπλασματικών κινασών ως απάντηση στην GH O GHR δεν έχει ενδογενή ενζυμική δραστικότητα και επιστρατεύει κυτταροπλασματικές τυροσιν-κινάσες για τη διαδικασία της μεταγωγής του σήματος. Η πιο σημαντική τυροσιν-κινάση μέσω της οποίας διαμεσολαβούνται οι δράσεις της GH είναι η JAK2. H ενεργοποίηση της JAK2 καταλήγει στην ενεργοποίηση διάφορων τυροσιν-κινασών που δε βρίσκονται σε επαφή με τον υποδοχέα και οι οποίες μπορούν να επάγουν διαφορετικά, αλλά σε πολλές περιπτώσεις αλληλοσυνδεόμενα, σηματοδοτικά μονοπάτια. Η JAK2 συνδέεται με τον GHR μέσω του Box1, που βρίσκεται εγγύς της διαμεμβρανικής περιοχής. Η σπουδαιότητα της JAK2 αποδεικνύεται μετά από μετάλλαξη του Box1 ή απαλοιφή της JAK2. Και στις δύο περιπτώσεις ο GHR είναι ανενεργός. Αρχικά υπήρχε η άποψη ότι η πρόσδεση της GH στον GHR και ο διμερισμός του GHR επιστρατεύουν πρωτεΐνες JAK2 προς τον υποδοχέα. Ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι η JAK2 είναι σε μόνιμη σύνδεση με τους υποδοχείς και είναι πολύ πιθανό ότι η πρόσδεση του συνδέτη σταθεροποιεί το προσχηματισμένο σύμπλεγμα υποδοχέα- JAK2. Η JAK2 εκτός από το ρόλο που έχει στη σηματοδότηση της GH, εξασφαλίζει την επάρκεια του GHR στην κυτταρική επιφάνεια επηρεάζοντας τη σταθερότητά του (292,293). Έχει ήδη αναφερθεί ότι η επάρκεια του GHR στην κυτταρική επιφάνεια είναι καθοριστικός παράγων της κυτταρικής ευαισθησίας στην GH. H διαθεσιμότητα του GHR στην κυτταρική επιφάνεια εξαρτάται από την αρνητική ρύθμιση, καθώς και από την πρωτεόλυση και το shedding του εγγύς τμήματος της εξωκυττάριας περιοχής (294). H GH επάγει δομικές αλλαγές στον GHR που καταλήγουν σε φωσφορυλίωση και καταλυτική ενεργοποίηση της περιοχής κινάσης της JAK2. (295) H μέγιστη φωσφορυλίωση της JAK2 προϋποθέτει την παρουσία τουλάχιστον του ενός τρίτου της κυτταροπλασματικής ουράς του GHR. Όταν η JAK2 ενεργοποιείται, 78

79 φωσφορυλιώνει τον GHR σε πολλαπλές περιοχές τυροσίνης. Φωσφορυλιωμένα συμπλέγματα των GHR-JAK2 παρέχουν πολλαπλές περιοχές πρόσδεσης για σηματοδοτικά μόρια που περιέχουν SH2 ή μοτίβα πρόσδεσης φωσφοτυροσίνης (PTB). H JAK2 ανήκει στην οικογένεια των Janus Associated Kinases που περιλαμβάνει επίσης τις JAK1, JAK3 και Tyk2. Η GH έχει επίσης την ικανότητα να επάγει τη φωσφορυλίωση των JAK1 και JAK3, αλλά σε πολύ μικρότερα επίπεδα ενεργοποίησης σε σχέση με την JAK2. Aν και δεν έχει αποδειχθεί ότι η GH ενεργοποιεί την Tyk2, έχει ανιχνευθεί επαφή του Tyk2 με τον υποδοχέα σε ανθρώπινα ηπατικά κύτταρα, επομένως ίσως η GH χρησιμοποιεί αυτή την κινάση. Η GH επιστρατεύει, μέσω ενεργοποίησης της JAK2, άλλες τυροσιν-κινάσες εκτός του υποδοχέα, όπως είναι οι c-src, c-fyn και FAK. Αν και ο ακριβής ρόλος της ενεργοποίησης αυτών των πρωτεϊνών από την GH δεν είναι ξεκάθαρος, κάποιες μελέτες υποδηλώνουν ότι άλλες πρωτεΐνες εξαρτώμενες από την GH, όπως οι FAK, p130cas και c-cbl μπορούν να δράσουν ως υποκατάστατα για τη c-src. H ενεργοποίηση της FAK επάγει αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού ακτίνης. 2.8 Σηματοδοτικά μονοπάτια εξαρτώμενα από την GH Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η πρόσδεση της αυξητικής ορμόνης στον υποδοχέα της οδηγεί στην ενεργοποίηση και αυτοφωσφορυλίωση των συνδεόμενων με τον υποδοχέα κυτταροπλασματικών τυροσιν-κινασών Janus kinases-2 (JAK-2). H ενεργοποίηση των JAK-2 προάγει την τυροσιν-φωσφορυλίωση του GHR και άλλων πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα τη φωσφορυλίωση των Signal Transducers and Activators of Transcription (STATs) και άλλων μονοπατιών, όπως της ERK κινάσης (Extracellular Signal Regulated-kinase), της MAP κινάσης (Mitogen-activated Protein Kinase) και της PI3 κινάσης (Phosphoinisitol 3 Kinase). (296,297) To μονοπάτι JAK/STAT Το μονοπάτι JAK/STAT αποτελεί πρότυπο σηματοδοτικό μηχανισμό για κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες στα θηλαστικά και, από μηχανιστικής άποψης, είναι ένα σχετικά απλό μονοπάτι.. Η πρόσδεση της GH στον υποδοχέα της φέρνει δύο μόρια JAK2 σε εγγύτητα, επιτρέποντας τη διασταυρούμενη φωσφορυλίωσή τους. Οι ενεργοποιημένες JAK2 φωσφορυλιώνουν στη συνέχεια τους υποδοχείς GHR κι επιπρόσθετους στόχους, όπως είναι οι πρωτεΐνες STAT. Σύντομα μετά τη φωσφορυλίωση του συμπλέγματος GHR/JAK2, οι πρωτεΐνες STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription), που είναι δυνητικά μεταγραφικοί παράγοντες, επιστρατεύονται στο ενεργοποιημένο σύμπλεγμα. Οι πρωτεΐνες STAT των θηλαστικών διατηρούν μία συντηρημένη περιοχή τυροσίνης κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο, που είναι η περιοχή που φωσφορυλιώνεται από την JAK2. 79

80 Μετά τη φωσφορυλίωσή τους οι πρωτεΐνες STAT αποσυνδέονται από τον υποδοχέα, ομοδιμερίζονται ή ετεροδιμερίζονται δια μέσου της περιοχής SH2 κάθε μορίου STAT και μεταναστεύουν στον πυρήνα, όπου προσδένονται σε ειδικά στοιχεία απόκρισης του DNA (DNA response elements). Kατά συνέπεια, ρυθμίζουν τη μεταγραφή γονιδίων. ( ) Εικόνα 42. Το μονοπάτι JAK/STAT Η είσοδος των φωσφορυλιωμένων STAT στον πυρήνα γίνεται μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από την ιμπορτίνη-α5 και μέσω του πυρηνικού μονοπατιού Ran. Με τον τρόπο αυτό, το μονοπάτι JAK/STAT αποτελεί έναν άμεσο μηχανισμό μετατροπής ενός εξωκυττάριου σήματος σε μεταφραστική απόκριση. Η ενεργοποίηση της JAK2 διεγείρει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την κυτταρική μετανάστευση και την απόπτωση. Αυτά τα κυτταρικά γεγονότα είναι κρίσιμα για την αιμοποίηση, την ανοσιακή ανάπτυξη, την ανάπτυξη του μαζικού αδένα, τη λιπογένεση, τη σεξουαλική διαφοροποίηση και άλλες διεργασίες. Είναι προφανές ότι μεταλλάξεις που μειώνουν τη δραστηριότητα του μονοπατιού JAK/STAT επηρεάζουν τις προαναφερόμενες διεργασίες. (303) Αντιθέτως, μεταλλάξεις που ενεργοποιούν συνεχόμενα ή αποτυγχάνουν να ρυθμίσουν σωστά τη σηματοδότηση μέσω JAK, προκαλούν φλεγμονώδη νόσο, ερυθροκυττάρωση, γιγαντισμό και λευχαιμίες. Οι πρωτεΐνες STAT παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. (304) Πρόκειται για τη μόνη γνωστή έως τώρα οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων που η δραστηριότητά τους ρυθμίζεται από τυροσινφωσφορυλίωση. Έως τώρα, έχουν αναγνωριστεί στα θηλαστικά επτά πρωτεΐνες STAT (STAT1-STAT5a, STAT5b και STAT6). Oι δύο ισομορφές STAT5 κωδικοποιούνται από δύο διαφορετικά γονίδια, τα οποία έχουν περίπου 95% ομολογία στην κωδικοποιούσα αλληλουχία τους. Οι δύο αυτές ισομορφές έχουν τόσο αλληλοκαλυπτόμενες όσο και διακριτές λειτουργίες στη μεταβίβαση του σήματος της GH. Εκτός από τις πρωτεΐνες STAT5a και STAT5b, η GH μπορεί να ενεργοποιήσει επίσης τις πρωτεΐνες STAT1 και STAT3. Οι πρωτεΐνες STAT περιλαμβάνουν 6 καλά συντηρημένες περιοχές: την αμινοτελική περιοχή, μία coiled-coil περιοχή, την περιοχή πρόσδεσης στο DNA, τη συνδετική περιοχή, μία περιοχή SH2 και την περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής 80

81 (που εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης). Η παρουσία μίας τυροσίνης στο καρβοξυτελικό άκρο, που είναι το υπόστρωμα για τις JAK κινάσες, έχει συντηρηθεί κατά την εξέλιξη. Οι πρωτεΐνες STAT προσδένονται στους υποδοχείς κυτταροκινών μέσω της περιοχής SH2. Όλες οι δομικές περιοχές στις πρωτεΐνες STAT είναι σημαντικές για τη μεταγραφική τους δραστηριότητα. Η περιοχή SH2 και το αμινοτελικό άκρο (περιοχές 1-120) είναι κρίσιμα για τη σταθερότητα της διαντίδρασης STAT-DNA. Η coiled-coil περιοχή σχηματίζει μία υδρόφιλη επιφάνεια πρόσδεσης για ενδεχόμενες πρωτεϊνικές διαντιδράσεις. Η απομάκρυνση των 50 καρβοξυτελικών περιοχών επιτρέπει το διμερισμό και την πρόσδεση στο DNA, αλλά δεν επιτυγχάνεται η ενεργοποίηση της μεταγραφής. Οι περιοχές SH2, η αμινοτελική περιοχή και η coil-coiled περιοχή συνεισφέρουν στην πρόσδεση στο DNA. H καρβοξυτελική περιοχή έχει ιδιότητες διασταυρούμενης ενεργοποίησης. Εικόνα 43. Η χημική δομή των STAT Η γονιδιακή στόχευση στα ποντίκια έχει διαλευκάνει το μοριακό ρόλο κάθε μέλους της οικογένειας των STAT πρωτεϊνών. Η ανάλυση knockout ποντικιών δείχνει ότι η πρωτεΐνη STAΤ5b εμπλέκεται άμεσα στην κατά μήκος αύξηση και στις φυλετικά διαφορετικές αποκρίσεις στην GH ως προς την έκφραση ηπατικών γονιδίων. Η απουσία της πρωτεΐνης SΤAT5b σε ποντίκια συνεπάγεται μείωση κατά 27% της σωματικής αύξησης στα άρρενα, αυξημένα επίπεδα GH στο πλάσμα, μειωμένα κυκλοφορούντα επίπεδα IGF-Ι και παχυσαρκία. Παρατηρείται επίσης απώλεια των εξαρτώμενων από το φύλο αποκρίσεων στην GH. H έκφραση ειδικών για τα άρρενα ηπατικών γονιδίων, όπως η πρωτεΐνη MUP (major urinary protein), ήταν μειωμένη στα ίδια επίπεδα με αυτά των θηλέων άγριου τύπου, ενώ τα επίπεδα έκφρασης επικρατών γονιδίων ήταν υψηλότερα από τα αντίστοιχα των θηλέων άγριου τύπου. Επιπλέον, η πρωτεΐνη STAT5b είναι απαραίτητη για την εξαρτώμενη από την GH ηπατική έκφραση των IGF-Ι, IGFBP3, ALS, SOCS1, SOCS2, SOCS3 και CIS, όπως και για τη διέγερση της λιπόλυσης στο λιπώδη ιστό. 81

82 Ο φαινότυπος των ποντικιών STAT5a-/- περιλαμβάνει διαταραγμένη ανάπτυξη του μαζικού αδένα και της γαλακτογένεσης, χωρίς διαταραχή στη σωματική αύξηση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η πρωτεΐνη STAT5a είναι απαραίτητη για τη λειτουργία της προλακτίνης, αλλά όχι για τη δράση της GH. Φαίνεται πως υπάρχει συνεργασία των πρωτεϊνών STAT5a και STAT5b στην εξαρτώμενη από την GH έκφραση του ALS. Tα ποντίκια με απουσία των γονιδίων STAT5a/b (double knockouts) παρουσιάζουν επιπρόσθετους φαινότυπους, όπως μη γονιμότητα στα θήλεα και πιο έντονη διαταραχή στην αύξηση. Παρά τη μεγάλη ομολογία των δύο ισομορφών της πρωτεΐνης STAT5, έχουν εντελώς διακριτό ρόλο. Έχει αναφερθεί ότι η έκφραση της πρωτεΐνης STAT5b είναι δεκαπλάσια από αυτή της πρωτεΐνης STAT5a στο ήπαρ και πολύ μεγαλύτερη στα άρρενα συγκριτικά με τα θήλεα. Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών STAT από την GH μπορεί να εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Για παράδειγμα, η GH δεν μπορεί να διεγείρει τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών STAT1 και STAT3 στα ΙΜ-9 λεμφοκύτταρα, παρά την ικανότητα της IFN-γ να ενεργοποιεί αυτές τις STAT πρωτεΐνες στην ίδια κυτταρική σειρά. Στην κυτταρική σειρά 3T3-F442A των ινοβλαστών η GH ρυθμίζει την έκφραση του c-fos μέσω της ενεργοποίησης των πρωτεϊνών STAT1 και STAT3. Αυτή η εξειδίκευση ίσως οφείλεται στη διαντίδραση των πρωτεϊνών STAT με άλλους ειδικούς για τον κάθε ιστό μεταγραφικούς παράγοντες για τη ρύθμιση σύνθετων response elements ενός συγκεκριμένου γονιδίου. Παράγων STAT που απουσιάζει STAT1 STAT2 STAT3 Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά ποντικιών Μειωμένη απόκριση στις ιντερφερόνες, επομένως μειωμένος έλεγχος αύξησης και ευαλωτότητα σε όγκους Μειωμένη απόκριση σε ιντερφερόνες Eμβρυικός θάνατος: μειωμένη απόκριση σε παθογόνα και πολλαπλές διαταραχές στους ιστούς, όπως στην κυτταρική επιβίωση STAT4 Μειωμένη κυτταρική διαφοροποίηση των ΤΗ1 κυττάρων που προκαλείται από απώλεια της απαντητικότητας στην IL-12 STAT5a Μειωμένη ανάπτυξη του μαζικού αδένα λόγω απώλειας της απαντητικότητας στην PRL (προλακτίνη). STAT5b Μειωμένη αύξηση λόγω τροποποιημένης απαντητικότητας στην GH STAT6 Μειωμένη κυτταρική διαφοροποίηση των ΤΗ2 κυττάρων που προκαλείται από απώλεια της απαντητικότητας στην IL-4 Πίνακας 2. Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά ποντικιών στα οποία απουσιάζουν ειδικές STAT πρωτεΐνες 82

83 Έχει βρεθεί ότι η GH ενεργοποιεί διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια εκτός του STAT. Ο ακριβής ρόλος και η συμμετοχή του καθενός από αυτά τα μονοπάτια στις φυσιολογικές δράσεις της GH δεν είναι πλήρως γνωστά, δεδομένου ότι πολλά από αυτά τα μονοπάτια ενεργοποιούνται επίσης από διάφορους αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα στοιχεία προκύπτουν από in vitro συστήματα. Μερικά από τα ενεργοποιούμενα από την GH μονοπάτια φαίνονται στην εικόνα. Εικόνα 44. Τα κύρια σηματοδοτικά μονοπάτια της GH Η συμμετοχή καθενός από αυτά τα μονοπάτια στις φυσιολογικές δράσεις της GH παραμένει ασαφής, γιατί μπορεί να ενεργοποιηθούν και από άλλους αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες. (305) Το μονοπάτι Ras/Raf/MEK/ERK (ή της ΜΑΡΚ κινάσης) Το μονοπάτι της mitogen-activated protein kinase (ΜΑΡΚ) είναι παρόν σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς κι ελέγχει σημαντικές κυτταρικές διεργασίες, όπως είναι ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η κυτταρική επιβίωση, η νευρολογική λειτουργία, η ανοσιακή απόκριση και η απόπτωση. Tο μονοπάτι αυτό μεταφέρει σήματα από τους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας σε μεταγραφικούς παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων. 83

84 Εικόνα 45. Οι δράσεις του μονοπατιού Ras/Raf/MEK/ERK Το μονοπάτι της ΜΑΡ κινάσης περιλαμβάνει ενεργοποίηση πρωτεϊνικών σεριν- /θρεονιν- κινασών, οι οποίες είναι ιδιαιτέρως συντηρημένες κατά την εξέλιξη. Δύο συστατικά του μονοπατιού αυτού, τα Ras και Raf, είναι πρωτοογκογονίδια. Το μονοπάτι ενεργοποιείται από διάφορους αυξητικούς παράγοντες, παράγοντες διαφοροποίησης, ορμόνες και ουσίες που προάγουν την ογκογένεση. Σημαντικός παράγοντας ενεργοποίησης του μονοπατιού είναι η πρόσδεση της GH στον υποδοχέα της GHR. Τα περισσότερα ερεθίσματα, όπως και η GH, ενεργοποιούν τις πρωτεΐνες Ras επάγοντας την ανταλλαγή GDP με GTP. Η πρωτεΐνη SOS (Son of sevenless homologes), είναι παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων (GTP exchange factor). Δεσμεύεται στην πρωτεΐνη Ras επιβάλλοντας την απομάκρυνση της GDP (ανενεργός) και τη δέσμευση GTP (ενεργός). Εικόνα 46. Το μονοπάτι της ΜΑΡΚ κινάσης Η πρόσδεση της GH στον υποδοχέα της, μετά την ενεργοποίηση της JAK2, ενεργοποιεί τις MAPK (Mitogen activated protein kinases) μέσω των συνδεόμενων με την JAK2 πρωτεϊνών Shc (Src homology 2 domain containing transforming protein 1) και Grb2 (Growth factor receptor-boound protein 2). Συγκεκριμένα, η GH 84

85 διεγείρει το σύμπλεγμα Shc-Grb2-SOS το οποίο ενεργοποιεί την πρωτεΐνη Ras. Αυτό προϋποθέτει, όπως ήδη αναφέρθηκε, την επιστράτευση παραγόντων που ανταλλάσσουν το GDP με GTP στην κυτταρική μεμβράνη όπου βρίσκεται η Ras. (306) Η πρωτεΐνη Ras έχει βρεθεί ότι μπορεί να προσδεθεί στην πρωτεΐνη Raf με μεγάλη συγγένεια. (307) Για να πυροδοτηθεί όμως η καταλυτική δραστηριότητα της Raf, η πρωτεΐνη Ras πρέπει να είναι κατάλληλα τοποθετημένη στην κυτταρική μεμβράνη. Τα γεγονότα αυτά καταλήγουν στην ενεργοποίηση της MAP/ERK κινάσης (ΜΕΚ) και της ERK1 και -2 (extracellular signal regulated kinase). ( ) Εικόνα 47. Τρισδιάστατη απεικόνιση του ενεργοποιημένου μονοπατιού της ΜΑΡΚ κινάσης Η GH έχει βρεθεί ότι επάγει άμεσα τη φωσφορυλίωση των ERK 1/2 κατά χρονοεξαρτώμενο και δοσοεξαρτώμενο τρόπο στα ηπατοκύτταρα ψαριών. (311) Μία ακόμα ενδιαφέρουσα πορεία της επαγώμενης από την GH ενεργοποίησης της ERK είναι η μέσω JAK2 τυροσιν-φωσφορυλίωση του EGFR. O Yamauchi και συν. έδειξαν ότι η επαγώμενη από την GH φωσφορυλίωση του EGFR, πιθανώς στην περιοχή Υ1068, επιτρέπει τη σύνδεση του Grb2 στην περιοχή αυτή και πυροδοτεί την επαγώμενη από την GH ενεργοποίηση της ERK. (312) Σε ορισμένα κύτταρα, όπως είναι η κυτταρική σειρά 3Τ3-F442A από έμβρυα ποντικιού που μοιάζουν με ινοβλάστες, η GH αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό που επάγεται από τον EGF. Σε αυτά τα κύτταρα η GH προκαλεί απευαισθητοποίηση της επαγώμενης από τον EGF ενεργοποίησης του ΕrbB-2, μέσω της ενεργοποίησης του ERK. (313) Επιπροσθέτως, σε προλιποκύτταρα επίμυ έχει βρεθεί ότι η GH και ο EGF συνεργούν ειδικά για την ενεργοποίηση της ERK. Η περιοχή συνέργειάς τους είναι το επίπεδο ενεργοποίησης της MEK και όχι κάποιο επίπεδο νωρίτερα στον καταρράκτη των αντιδράσεων. Επίσης, μετά από συνεργική δράση της GH και του EGF, αποφωσφορυλιώνεται η πρωτεΐνη KSR (Kinase Suppressor of Ras) σε μία κρίσιμη περιοχή σερίνης, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των MEK-ERK. H KSR είναι μια 85

86 πρωτεΐνη που διευκολύνει τη φωσφορυλίωση της ΜΕΚ από τη Raf. Με τον τρόπο αυτό η GH ευαισθητοποιεί τα κύτταρα αυτά στην EGF-επαγώμενη ενεργοποίηση της ERK. (314) Εκτός από το ρόλο της ERK στον πολλαπλασιασμό, η ενεργοποίησή της έχει συσχετισθεί με την ενεργοποίηση του ογκογονιδίου c-fos που διεγείρεται από την GH. (315) Eπίσης, η πλήρης ενεργοποίηση της επαγώμενης από την GH σηματοδότησης του STAT5 μπορεί να εξαρτάται από την ενεργοποίηση της ERK. (316) Άλλες ΜΑΡ κινάσες όπως η JNK και η p38, έχει βρεθεί ότι ενεργοποιούνται ως απάντηση στην GH. Η p38 επιτρέπει τη μιτογένεση και την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού. ( ) Το μονοπάτι PI3K/Akt Η σεριν-/θρεονιν- κινάση Akt, γνωστή επίσης και ως πρωτεϊνική κινάση Β/ΡΚΒ, έχει κρίσιμο ρυθμιστικό ρόλο σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες, όπως η εξέλιξη του καρκίνου και ο μεταβολισμός της ινσουλίνης. Το μονοπάτι της Akt ενεργοποιείται από διάφορα ερεθίσματα, σημαντικό εκ των οποίων είναι η πρόσδεση της GΗ στον υποδοχέα της GHR. Αποτέλεσμα είναι η παραγωγή 3,4,5 τριφωσφορικής φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης από την 3,4 διφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη μέσω δράσης της κινάσης της φωσφοϊνοσιτίδης 3 (Phosphoinositide 3-kinase/PΙ3Κ). Τα λιπίδια αυτά λειτουργούν ως σημεία πρόσδεσης στην κυτταρική μεμβράνη πρωτεϊνών όπως η Akt. Εικόνα 48. Το μονοπάτι PI3K/Akt Υπάρχουν τρεις ισομορφές της Akt (Akt1, Akt2, Akt3). Η Akt ρυθμίζει την κυτταρική αύξηση μέσω της δράσης της στο σύμπλεγμα TSC1/TSC2 και στα μονοπάτια mtor. Ρυθμίζει επίσης τον κυτταρικό κύκλο και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω της άμεσης δράσης της στους αναστολείς των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών p21 και p27 και της έμμεσης δράσης της στα επίπεδα 86

87 της κυκλίνης D και της p53. Επιπλέον, αποτελεί μείζονα ρυθμιστή της κυτταρικής επιβίωσης μέσω άμεσης αναστολής προαποπτωτικών σημάτων. Αρνητικός ρυθμιστής της PI3K, αυτού του κύριου ρυθμιστή της κυτταρικής αύξησης, του μεταβολισμού και της επιβίωσης, είναι η πρωτεΐνη PTEN. Η πρωτεΐνη αυτή είναι γνωστή και για την ογκοκατασταλτική της δράση. (319) Τα μονοπάτια Ras/Raf/MEK/ERK και Ras/PI3K/PTEN/Akt διαντιδρούν μεταξύ τους ρυθμίζοντας την αύξηση και σε κάποιες περιπτώσεις την ογκογένεση. Για παράδειγμα, σε ορισμένα κύτταρα, η μετάλλαξη της PTEN μπορεί να καταστείλει το μονοπάτι Ras/Raf/MEK/ERK, λόγω της ικανότητας του ενεργοποιημένου Akt να φωσφορυλιώνει και να απενεργοποιεί διάφορα Rafs. Αν και τα δύο αυτά μονοπάτια θεωρείται ότι έχουν αντιαποπτωτικές δράσεις και ότι προκαλούν αντίσταση σε φάρμακα, σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές παρουσιάζουν ειδικές δράσεις. Επιπλέον, τα δύο μονοπάτια αλληλεπιδρούν με το μονοπάτι p53. (321) Έχει βρεθεί σε ηπατοκύτταρα ότι τα σηματοδοτικά μονοπάτια ERK, PI3K/Akt και JAK2/STAT5 διαμεσολαβούν την εξαρτώμενη από την GH έκφραση του mrna του IGF-I και την έκκριση του IGF-I To μονοπάτι της Phospholipase C (PLC)/PKC/Ca +2 Η φωσφολιπάση C (PLC) καταλύει την υδρόλυση της 4,5 διφωσφορικής φωσφατιδυλινοσιτόλης σε 1,4,5 τριφωσφορική ινοσιτόλη (IP3) και διακυλογλυκερόλη (DAG), που δρουν ως δεύτερα σηματοδοτικά μόρια. Η ΙΡ3 αυξάνει τα ενδοκυττάρια επίπεδα Ca +2, ενώ η DAG ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση C (PKC). Εικόνα 49. Το μονοπάτι της φωσφολιπάσης C H φωσφολιπάση C έχει βρεθεί ότι φωσφορυλιώνεται ως απάντηση στην GH μέσω άμεσης πρόσδεσης στο σύμπλεγμα GHR/JAK2. Η ενεργοποίηση μονοπατιών από τη φωσφολιπάση C φαίνεται ότι εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Για παράδειγμα, η GH επάγει την παραγωγή της DAG και της ΙΡ3 στα κύτταρα του εγγύς νεφρικού σωληναρίου, (321) ενώ επάγει μόνο την παραγωγή της DAG στα κύτταρα των β- νησιδίων του παγκρέατος. (322) 87

88 Τα κύτταρα χρησιμοποιούν δύο μηχανισμούς για να αυξήσουν την ενδοκυττάρια συγκέντρωση ασβεστίου: την απελευθέρωση ασβεστίου από ενδοκυττάριες αποθήκες και την είσοδο ασβεστίου από τον εξωκυττάριο χώρο μέσω δυναμο-εξαρτώμενων καναλιών ασβεστίου. Έχει δειχθεί ότι η GH χρησιμοποιεί και τους δύο μηχανισμούς για να αυξήσει τη συγκέντρωση του ενδοκυττάριου ασβεστίου σε διάφορες κυτταρικές σειρές. (323) Tο μονοπάτι IRS (Insulin Receptor Substrates) και η ΡΙ3 κινάση Τα μόρια IRS είναι μεγάλες κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες που λειτουργούν ως πρωτεΐνες πρόσδεσης και συμμετέχουν στη σηματοδότηση της ινσουλίνης, της ιντερλευκίνης-4 και άλλων κυτταροκινών και πεπτιδικών ορμονών. Έχουν καθοριστικό ρόλο στη μεταβίβαση σημάτων στα ενδοκυττάρια μονοπάτια των PI3K/Akt και ERK/MAPΚ. Το μονοπάτι των υποκαταστάτων υποδοχέων ινσουλίνης IRS αποτελεί ένα ακόμα μονοπάτι μέσω του οποίου η GH ασκεί τις δράσεις της. Η GH και η ινσουλίνη έχουν μερικές κοινές κυτταρικές δράσεις, όπως η ενεργοποίηση της μεταφοράς γλυκόζης, η πρωτεϊνοσύνθεση, η διακίνηση αμινοξέων, η λιπογένεση, η γονιδιακή ρύθμιση, η διαφοροποίηση, η μιτογένεση, η αναστολή της απόπτωσης και η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού. Είναι αναμενόμενο λοιπόν ότι η GH και η ινσουλίνη μοιράζονται ορισμένα σηματοδοτικά μονοπάτια. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, η GH έχει την ικανότητα να διεγείρει την τυροσινφωσφορυλίωση των IRS-1 και IRS-2. Δεν έχει διερευνηθεί το αν συμβαίνει το ίδιο με τα υποκατάστατα υποδοχέων ινσουλίνης IRS- 3 και IRS-4. Η GH αυξάνει επίσης τη σχετιζόμενη με τα IRS-1 και IRS-2 (324, 325) δραστηριότητα της PI3K. Εικόνα 50. Η διέγερση των IRS από την GH και τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται 88

89 Οι πρωτεΐνες IRS-1, -2 και -3 συνδέονται με την JAK2 μέσω ενός μορίου πρόσδεσης (Grb2 ή CrkII) και φωσφορυλιώνονται από την GH. H φωσφορυλίωση των IRS δημιουργεί περιοχές πρόσδεσης για άλλα σηματοδοτικά μόρια που περιέχουν την περιοχή SH2, όπως είναι η ΡΙ3 κινάση και η SHP2. Μερικά από αυτά τα σηματοδοτικά μόρια ενεργοποιούνται ή φωσφορυλιώνονται από την GH. H PI3 κινάση φωσφορυλιώνει λιπίδια ινοσιτόλης δημιουργώντας πολυφωσφοϊνοσιτίδες, οι οποίες εμπλέκονται στη μεταβίβαση του σήματος. Έχει βρεθεί ο ρόλος της GH σε διαδικασίες που διαμεσολαβούνται από την ΡΙ3 κινάση, όπως η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, ο κυτταρικός μεταβολισμός, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η κυτταρική επιβίωση. 89

90 Κεφάλαιο 3 : Αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH Η ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών της GH είναι ταχεία και παροδική. Η μέγιστη επαγωγή της τυροσιν-φωσφορυλίωσης της JAK2 επιτυγχάνεται λίγα λεπτά μετά τη διέγερση από την GH. In vitro, η φάση ενεργοποίησης ακολουθείται από μία περίοδο απευαισθητοποίησης, κατά την οποία δεν μπορεί να επιτευχθεί η μέγιστη ενεργοποίηση της σηματοδότησης της GH. Yπάρχουν διάφορα επίπεδα στα οποία μπορεί να επιτευχθεί η αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης που διαμεσολαβείται από τον GHR: στη διακίνηση του υποδοχέα (εσωτερικοποίηση/ ανακύκλωση/ αποδόμηση), στην πρωτεόλυσή του, στην απενεργοποίηση θετικών ρυθμιστών της αποφωσφορυλίωσης, στην αποδόμηση ενδιάμεσων σηματοδοτικών μορίων, στη δράση των αρνητικών ρυθμιστών και, ίσως, και σε άλλους μηχανισμούς. (326,327) 3.1 Αρνητική ρύθμιση του GHR Έχει ήδη αναφερθεί ότι η ρύθμιση του αριθμού των ενεργών υποδοχέων GHR στις κυτταρικές μεμβράνες είναι βασικός μηχανισμός για τον έλεγχο της ευαισθησίας της GH. Η απομάκρυνση των υποδοχέων κυτταρικής επιφανείας είναι ένα αρχικό βήμα για τη λήξη της GH-εξαρτώμενης σηματοδότησης. Αυτό διαμεσολαβείται μέσω εσωτερικοποίησης/ενδοκύττωσης (328). Η συγκέντρωση του υποδοχέα GHR ρυθμίζεται σε πολλά επίπεδα από τη μεταγραφή ως την πρωτεϊνική σύνθεση και μεταφορά στην κυτταρική μεμβράνη. Σχεδόν όλοι οι νεοσυντιθέμενοι υποδοχείς GHR μετατρέπονται στην ώριμη μορφή τους και κατευθύνονται προς την κυτταροπλασματική μεβράνη. Ένα μικρό ποσοστό μπορεί επίσης να κατευθυνθεί προς τα λυσοσώματα. Σε κατάσταση σταθερότητας, η ανακύκλωση του GHR είναι ραγδαία. Ο χρόνος ημιζωής του GHR είναι λεπτά. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, στην κυτταροπλασματική μεμβράνη οι υποδοχείς μπορεί να ενδοκυττωθούν, να μεταφερθούν στα ενδοσώματα, όπου μπορούν να ανακυκλωθούν προς τη μεμβράνη ή να στοχοποιηθούν για αποδόμηση στα λυσοσώματα μέσω του συστήματος της ουβικουιτίνης. Ένα μέρος των υποδοχέων GHR της κυτταροπλασματικής μεμβράνης μπορεί να κοπεί από μεταλλοπρωτεάσες σχηματίζοντας την πρωτεΐνη GHBP. Η απόκριση στην GH είναι σε πολλές περιπτώσεις φυλο-εξαρτώμενη και υπόκειται σε νευροενδοκρινικό έλεγχο. Σε μοντέλο αρουραίων, η GH στο άρρεν φύλο εκκρίνεται σε τακτικές ώσεις κάθε 3,5-4 ώρες, ενώ στο θήλυ φύλο το προφίλ της GH είναι περισσότερο συνεχές. Αυτές οι διαφορές στα δύο φύλα καθορίζουν τη φυλοεξαρτώμενη έκφραση μεγάλου αριθμού παραγώγων ηπατικών γονιδίων, όπως είναι πρωτεΐνες πλάσματος, ένζυμα στεροειδών, υποδοχείς και άλλα σηματοδοτικά μόρια. 90

91 Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση ηπατικών γονιδίων στο άρρεν φύλο προϋποθέτει STAT5b και όχι STAT5a. To STAT5b ενεργοποιείται επανειλημμένα από κάθε ώση GΗ στο πλάσμα στους άρρενες αρουραίους, ενώ στους θήλεις, το συνεχές προφίλ της GH ρυθμίζει αρνητικά την GHR-JAK2-STAT5b σηματοδότηση, ώστε γίνεται πολύ γρηγορότερα η απενεργοποίηση του συμπλέγματος GHR-JAK2 μέσω μιας εξαρτώμενης από το πρωτεάσωμα διαδικασίας. Αυτή η αρνητική ρύθμιση σχετίζεται με την GH-επαγώμενη εσωτερικοποίηση του GHR και αποδόμηση μέσω του πρωτεασώματος και προϋποθέτει αυτούσιο το σύστημα ουβικουιτινυλίωσης Η ουβικουιτινυλίωση ως ρυθμιστικό σύστημα του GHR Ως κύριο ρυθμιστικό σύστημα του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα, το σύστημα της ουβικουιτίνης είναι αναμενόμενο να συμμετέχει στη διακίνηση διάφορων μεμβρανικών πρωτεϊνών σε ενδοκυττάριες τοποθεσίες. Η αποδόμηση των πρωτεϊνών από το μονοπάτι ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος προϋποθέτει δύο βήματα: 1) την ουβικουιτινυλίωση, δηλαδή την πρόσδεση της ουβικουιτίνης στην πρωτεΐνη και 2) την αποδόμηση της ουβικουιτινυλιωμένης πρωτεΐνης από το σύμπλεγμα 26S του πρωτεασώματος, με την απελευθέρωση της ουβικουιτίνης, η οποία μπορεί πλέον να ξαναχρησιμοποιηθεί. Μια σημαντική ρυθμιστική παράμετρος των μεμβρανικών πρωτεϊνών είναι ο χρόνος παραμονής τους στην κυτταρική επιφάνεια. Ο αριθμός συγκεκριμένων πρωτεϊνών στην κυτταρική επιφάνεια ρυθμίζεται από την έκφρασή τους (γονιδιακή έκφραση, σταθερότητα mrna, ρυθμό μετάφρασης). Ωστόσο, από τη στιγμή που μια μεμβρανική πρωτεΐνη έχει συντεθεί και μεταφερθεί στον αυλό του ενδοπλασματικού δικτύου, η παρουσία της στην κυτταρική επιφάνεια εξαρτάται από παράγοντες που διαφέρουν για κάθε πρωτεΐνη: το χρόνο, την αποτελεσματικότητα πολυμερισμού και τον ποιοτικό έλεγχο στο ενδοπλασματικό δίκτυο, το ρυθμό μεταφοράς από το ενδοπλασματικό δίκτυο στην κυτταρική μεμβράνη, το ρυθμό ενδοκύττωσης, την πρωτεόλυση στην κυτταρική επιφάνεια, την ικανότητα ανακύκλωσης στην ενδοκυττάρια πορεία και τη δραστηριότητα του λυσοσώματος. Η διαθεσιμότητα του υποδοχέα της αυξητικής ορμόνης (GHR) στην κυτταρική μεμβράνη ρυθμίζεται σε διάφορες περιοχές μέσα στο κύτταρο: α) Η ποσότητα των πρωτεϊνών που συντίθενται στο ενδοπλασματικό δίκτυο ρυθμίζεται από τη μεταγραφή γονιδίων. Επιπλέον, το σύστημα ποιοτικού ελέγχου του ενδοπλασματικού δικτύου ρυθμίζει την έξοδο των κατάλληλα πτυχωμένων πρωτεϊνών από αυτό, β) Στο σωμάτιο Golgi, οι πρωτεΐνες μπορούν είτε να κατευθυνθούν απευθείας στα λυσοσώματα είτε να μεταφερθούν στην κυτταρική επιφάνεια, γ) Στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, ο μηχανισμός ενδοκύττωσης μπορεί να επιλέξει πρωτεΐνες για ενδοκύττωση μέσω των βοθρίων κλαθρίνης ή οι πρωτεΐνες μπορεί να υποβληθούν σε πρωτεόλυση. δ) Στα ενδοσώματα, οι πρωτεΐνες είτε ανακυκλώνονται ξανά προς την κυτταροπλασματική μεμβράνη είτε μαρκάρονται στο λυσόσωμα για αποδόμηση. Σε καθεμιά από αυτές τις κυτταρικές τοποθεσίες, το σύστημα 91

92 ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος μπορεί να ρυθμίζει με ειδικό τρόπο τα επίπεδα πρωτεϊνών με διάφορους μηχανισμούς H εσωτερικοποίηση του υποδοχέα GHR Oι Cheung και συν. ήταν οι πρώτοι που απέδειξαν την ουβικουιτινυλίωση του GHR το Έως τότε, ήταν ήδη γνωστό ότι ο GHR εισέρχεται εντός του κυττάρου στα λιποκύτταρα. Η πρόσδεση της GH αυξάνει την ουβικουιτινυλίωση του GHR και το ρυθμό εσωτερικοποίησής του. Και τα δύο αυτά αποτελέσματα προϋποθέτουν ένα ακέραιο σύστημα ουβικουιτίνης και δεν μπορούν να επέλθουν σε κύτταρα στα οποία απουσιάζει το ενεργοποιητικό της ουβικουιτίνης ένζυμο Ε1. Η εξαρτώμενη από την ουβικουιτίνη ενδοκύττωση του GHR εξαρτάται από το μοτίβο UbE του GHR, το οποίο περιλαμβάνει τη φαινυλαλανίνη 346. Παρά τα ευρήματα αυτά, φαίνεται ότι η διαδικασία της εσωτερικοποίησης μπορεί να εξελιχθεί και χωρίς την ουβικουιτινυλίωση του GHR. Αυτό προκύπτει από μελέτες με μεταλλάξεις που δείχνουν ότι η ενδοκύττωση του GHR δεν επηρεαζόταν από αντικατάσταση των περιοχών λυσίνης με αργινίνη στην κυτταροπλασματική περιοχή του GHR. Είναι ωστόσο ενδιαφέρον ότι είναι απαραίτητο ένα ακέραιο σύστημα ουβικουιτίνης για εσωτερικοποίηση τέτοιων τροποποιημένων μορφών GHR. Η κατατμημένη μορφή του GHR που περιλαμβάνει τις περιοχές μπορεί να εσωτερικοποιηθεί ανεξάρτητα από την ουβικουιτινυλίωση. Στην περίπτωση αυτή δρα ένας διαφορετικός μηχανισμός που χρησιμοποιεί ένα μοτίβο δύο μορίων λευκίνης του υποδοχέα. Η σημασία αυτού του μηχανισμού δεν είναι ξεκάθαρη, καθώς αυτές οι μορφές του υποδοχέα δεν έχουν δυνατότητα σηματοδότησης. Η αναστολή του πρωτεασώματος έχει ως αποτέλεσμα επίσης την αναστολή της εξαρτώμενης από την GH εσωτερικοποίησης και αποδόμησης του GHR, αλλά μόνο της πλήρους μορφής του GHR. Οι μορφές του GHR που στερούνται των περιοχών της ενδοκυττάριας περιοχής εσωτερικοποιούνται και ανακυκλώνονται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, παρά την αναστολή του πρωτεασώματος. Μία πολύ ισχυρή ένδειξη ότι το σύστημα ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση του GHR προκύπτει από το γεγονός ότι η αναστολή του πρωτεασώματος παρατείνει τη φωσφορυλίωση του GHR και την ενεργοποίηση των JAK2/STAT5. Η εσωτερικοποίηση καθεαυτή δεν αρκεί για την αρνητική ρύθμιση του υποδοχέα GHR, δεδομένου ότι το σύμπλεγμα GHR/JAK2 είναι ακόμα ενεργό στα ενδοσώματα. Οι συνδεόμενες με τον GHR πρωτεΐνες μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην εσωτερικοποίηση του υποδοχέα. Η τελική απενεργοποίηση του GHR επιτυγχάνεται με την αποδόμηση του GHR στα λυσοσώματα και/ή στο πρωτεάσωμα. Το σύστημα της ουβικουιτίνης είναι απαραίτητο για τη μη λυσοσωματική αποδόμηση κυτταροπλασματικών και πυρηνικών πρωτεϊνών στο πρωτεάσωμα. Ωστόσο, έχει βρεθεί ότι το σύστημα αυτό είναι επίσης απαραίτητο για την επαγώμενη από το συνδέτη εσωτερικοποίηση του GHR, επομένως διαμεσολαβεί έμμεσα την αποδόμησή του στα λυσοσώματα. (344) 92

93 3.2 Δράσεις των αρνητικών ρυθμιστών Η οικογένεια πρωτεϊνών SOCS Ένας επιπρόσθετος μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης της GH σηματοδότησης, που ενεργοποιείται αυτόματα στα ηπατοκύτταρα περίπου 40 λεπτά μετά την εμφάνιση μιας GH ώσης, προϋποθέτει νέα πρωτεϊνική σύνθεση. Αυτό το μονοπάτι περιλαμβάνει γονίδια «άμεσης» απόκρισης που τα προϊόντα τους ρυθμίζουν αρνητικά τη σηματοδότηση προς το STAT5b από το σύμπλεγμα GHR-JAK2, παρεμποδίζοντας την ενεργοποίηση επιπρόσθετων STAT5b μορίων. Πρόδρομος για αυτό το μηχανισμό αρνητικής σηματοδότησης υπήρξε η ανακάλυψη ότι οι πρωτεΐνες SOCS και CIS, που αναστέλλουν τη σηματοδότηση από τους υποδοχείς κυτταροκινών μέσω JAK2, είναι πρώιμα γονιδιακά προϊόντα που επάγονται από κυτταροκίνες, μέσω ενός επαγώμενου από τις STAT μεταγραφικού μηχανισμού. ( ) H οικογένεια πρωτεϊνών SOCS αποτελεί μια οικογένεια αναστολέων της σηματοδότησης κυτταροκινών και ορμονών, που μπορεί να επαχθεί ταχέως μετά την έναρξη της σηματοδότησης από το σύμπλεγμα ενός υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας με την JAK2. Οι πρωτεΐνες SOCS αναγνωρίσθηκαν το 1997 από τρεις διαφορετικές ερευνητικές ομάδες. Η οικογένεια SOCS περιλαμβάνει τουλάχιστον οκτώ πρωτεΐνες: τη Cytokine-inducible SH2-containing protein, CIS, και τις πρωτεΐνες SOCS-1 έως SOCS-7, που έχουν παρόμοια αρχιτεκτονική. Όλα τα μέλη της έχουν μία μεταβλητή αμινοτελική περιοχή, μία κεντρική περιοχή SH2 (Src-homology 2) που επιτρέπει την πρόσδεσή τους σε περιοχές φωσφοτυροσίνης στις πρωτεΐνες-στόχους και ένα συντηρημένο καρβοξυτελικό μοτίβο, το SOCS box, που μπορεί να μαρκάρει τις πρωτεΐνες αυτές για αποδόμηση στο πρωτεάσωμα. (332) Εικόνα 51. Η δομή των πρωτεϊνών SOCS Έχει προταθεί ότι κάποια ζεύγη των πρωτεϊνών αυτών παρουσιάζουν στενότερη συσχέτιση μεταξύ τους παρά με άλλα μέλη της οικογένειας. Οι πρωτεΐνες SOCS-1 και SOCS-3 έχουν μεγάλη ομολογία στην αλληλουχία τους, η πρωτεΐνη SOCS-2 παρουσιάζει κατά 35% ομοιότητα αμινοξέων με την πρωτεΐνη CIS, οι πρωτεΐνες SOCS-4 και SOCS-5 έχουν επίσης σημαντικό βαθμό ομολογίας, όπως και οι 93

94 πρωτεΐνες SOCS-6 και SOCS-7. Εκτός από την περιοχή SH2 και το SOCS box, οι πρωτεΐνες SOCS-1 και SOCS-3 περιλαμβάνουν μία περιοχή kinase inhibitory region (KIR) στο αμινοτελικό άκρο, η οποία δεν έχει περιγραφεί για άλλα μέλη της οικογένειας. Το SOCS box έχει επίσης αναγνωριστεί σε άλλες πρωτεΐνες στις οποίες απουσιάζει η περιοχή SH2, αλλά υπάρχουν άλλες περιοχές που διαμεσολαβούν τις διαντιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (επαναλήψεις αγκυρίνης, επαναλήψεις WD40 ή SPRY περιοχές). Σε γενικές γραμμές, οι πρωτεΐνες SOCS βρίσκονται σε χαμηλά επίπεδα, ωστόσο η έκφρασή τους επάγεται ταχέως μετά τη διέγερση που προκαλούν διάφορες κυτταροκίνες ή αυξητικοί παράγοντες. Η έκφραση του mrna των πρωτεΐνών SOCS εξαρτάται από τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών STAT, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι πρωτεΐνες SOCS ρυθμίζουν τη δράση των κυτταροκινών μέσω αρνητικής ρύθμισης. Έχει βρεθεί ότι οι πρωτεΐνες SOCS κυρίως στοχεύουν το μονοπάτι JAK/STAT, επομένως ρυθμίζουν τη δράση πολλών κυτταροκινών. Οι δράσεις των SOCS μπορούν να αναδειχθούν αν μειωθεί η φωσφορυλίωση των JAK και STAT, ο διμερισμός των STAT, η μεταφορά στον πυρήνα και η μεταγραφική δραστηριότητα των STAT. Στον πίνακα 2 φαίνονται οι κυτταροκίνες και οι αυξητικοί παράγοντες των οποίων η σηματοδότηση αναστέλλεται από τις πρωτεΐνες SOCS. Μέλος οικογένειας SOCS CIS SOCS1 SOCS2 SOCS3 SOCS4 SOCS5 SOCS6 SOCS7 Παράγοντας που αναστέλλεται GH, PRL, EPO, IL-2, IL-3 GH, PRL, ινσουλίνη, λεπτίνη, EPO, TPO, TSLP, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IFNα/β, IFNγ, LIF, TNFα, IGF1 GH, PRL, IGF-1, IL-6, LIF GH, PRL, ινσουλίνη, λεπτίνη, ΕPO, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, IL-11, IFNα/β, IFNγ, LIF, IGF-1 EGF IL-4, IL-6, LIF, EGF Άγνωστο PRL, GH, λεπτίνη Πίνακας 3. Παράγοντες που αναστέλλονται από τα μέλη της οικογένειας SOCS 94

95 Τρόπος δράσης των πρωτεϊνών SOCS Διάφοροι μηχανισμοί μπορούν να εξηγήσουν τον τρόπο δράσης των SOCS πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες SOCS μπορούν να δράσουν ως: α) αναστολείς των πρωτεϊνών JAK, β) ανταγωνιστές πρόσδεσης σε θετικούς ρυθμιστές και γ) μέρος των συμπλεγμάτων λιγάσης της ουβικουιτίνης ώστε να προωθηθεί η διαδικασία της αποδόμησης. Ένα κοινό χαρακτηριστικό όλων των SOCS/CIS πρωτεϊνών είναι η κεντρική SH2 περιοχή, που επιτρέπει στις πρωτεΐνες αυτές να προσδένονται σε σηματοδοτικά μόρια που είναι φωσφορυλιωμένα σε περιοχές τυροσίνης. Στην περίπτωση της SOCS-1, η JAK2 έχει αναγνωρισθεί ως ο πρωταρχικός στόχος. (333) Η πρωτεΐνη SOCS-1, μέσω της SH2 περιοχής της, προσδένεται στο εσωτερικό της αγκύλης ενεργοποίησης της JAK2 (στην τυροσίνη 1007), με αποτέλεσμα τη μειωμένη φωσφορυλίωση των JAK2 και STAT5. Έχει βρεθεί ότι είναι απαραίτητη η περιοχή KIR για τη δράση της πρωτεΐνης SOCS-1 στην κινάση JAK2. Έχει προταθεί πως μετά την πρόσδεση της SOCS-1 στη φωσφορυλιωμένη JAK2, αναστέλλεται η δραστηριότητα της JAK2 μέσω της περιοχής KIR και άρα η πρόσβαση σε άλλα υποστρώματα της JAK2. Έχει βρεθεί ότι η SOCS-1 μπορεί να προσδεθεί σε κυτταροπλασματικές περιοχές του καρβοξυτελικού άκρου του GHR, ακόμα και απουσία τυροσιν-φωσφορυλίωσης. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η SOCS-1 μπορεί να συνδέεται με μη διεγερμένα μόρια υποδοχέα, αυξάνοντας με αυτό τον τρόπο τη συγγένειά της με το σύμπλεγμα υποδοχέα-κινάσης. (333) Η πρωτεΐνη SOCS-3 κυρίως προσδένεται στον ενεργοποιημένο υποδοχέα κυτταροκινών, επομένως εμποδίζει την πρόσδεση των STAT πρωτεϊνών, αλλά μπορεί επίσης να προσδεθεί στις πρωτεΐνες JAK. Όπως και η SOCS-1, η SOCS-3 αναστέλλει τη δραστηριότητα κινάσης της JAK2 μέσω της περιοχής KIR. Εικόνα 52. Μηχανισμός δράσης των πρωτεϊνών SOCS1/3 και CIS H πρωτεΐνη CIS συνδέεται μέσω της περιοχής SH2 στον ενεργοποιημένο υποδοχέα κυτταροκινών, και συγκεκριμένα στις περιοχές πρόσδεσης των πρωτεϊνών STAT. Πιστεύεται ότι η πρωτεΐνη CIS αναστέλλει τη σηματοδότηση καλύπτοντας 95

96 ανταγωνιστικά τις περιοχές του ενεργοποιημένου υποδοχέα όπου προσδένονται οι πρωτεΐνες STAT. Επιπρόσθετα, έχει βρεθεί ότι η πρωτεΐνη CIS αναστέλλει τη μεταβίβαση του σήματος από τον GHR στο STAT5b μέσω ενός εξαρτώμενου από το πρωτεάσωμα μηχανισμού. Ευρήματα από μελέτες υποδηλώνουν ότι ο αναστολέας CIS και το πρωτεάσωμα ρυθμίζουν την εσωτερικοποίηση του GHR και ότι η CISεξαρτώμενη εσωτερικοποίηση του υποδοχέα είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη λήξη της GHR σηματοδότησης. (334) Σύμφωνα με μία πρόσφατη βιβλιογραφική αναφορά, η πρωτεΐνη CIS έχει επιπλέον δράσεις που αφορούν στην καθήλωση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 και στην κυτταρική απόπτωση. Ποντίκια στα οποία απουσιάζει η έκφραση της CIS εμφανίζουν ενεργοποίηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μειωμένη κυτταρική απόπτωση στα δενδριτικά τους κύτταρα. (446) O μηχανισμός δράσης της πρωτεΐνης SOCS2 δεν είναι ακόμα γνωστός. Ωστόσο, έχει προταθεί ότι είναι ο ίδιος με το μηχανισμό δράσης της πρωτεΐνης CIS (πρόσδεση στον ενεργοποιημένο υποδοχέα κυτταροκινών και παρεμπόδιση της πρόσδεσης της πρωτεΐνης STAT5). Οι πρωτεΐνες CIS και SOCS-2 θεωρούνται ασθενέστεροι αναστολείς από τις SOCS-1 και SOCS-3 σε παρόμοια πρωτεϊνικά επίπεδα. H SOCS-2 μπορεί επίσης να έχει αρνητικές επιδράσεις σε κυτταροκίνες, ειδικά στην GH. Οι δράσεις των SOCS-4, SOCS-5, SOCS-6 και SOCS-7 παραμένουν λιγότερο γνωστές. Έχει βρεθεί ότι η SH2 περιοχή των SOCS-6 και SOCS-7 είναι ειδική για τα IRS-4 και IRS-2, που σημαίνει ότι ρυθμίζει τη σηματοδότηση του IGF-I, καθώς και για την υπομονάδα p85 της PI3Κ. Επιπλέον, η SOCS-6 είναι πιθανό ότι ρυθμίζει τη σηματοδότηση της ινσουλίνης σε ινσουλινοευαίσθητους ιστούς, όπως ο εγκέφαλος. Επίσης, η SOCS-6 προσδένεται στο σύμπλεγμα elongin B/C μέσω του SOCS box, δρώντας επομένως ως Ε3 λιγάση της ουβικουιτίνης που μαρκάρει πρωτεΐνες-στόχους για ουβικουιτινυλίωση και αποδόμηση στο πρωτεάσωμα. Έχει περιγραφεί ένα άλλο μοντέλο του μηχανισμού δράσης των πρωτεϊνών SOCS, που αναφέρεται στην περιοχή SOCS box. Η απουσία του SOCS box δεν επηρεάζει την ικανότητα πρόσδεσης των SOCS-1 και SOCS-3, ούτε την ανασταλτική τους δράση. Ωστόσο, μελέτες έχουν δείξει ότι μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών περιλαμβάνει το ονομαζόμενο SOCS box μοτίβο, προφανώς γιατί έχει σημαντικό λειτουργικό ρόλο. Επιπλέον, ποντίκια στα οποία απουσιάζει το SOCS box μοτίβο της πρωτεΐνης SOCS- 1 έχουν παρόμοιο φαινότυπο με τα ποντίκια στα οποία απουσιάζουν και τα δύο γονίδια SOCS-1 (SOCS-1-/-), γεγονός που υποδηλώνει ότι το SOCS box είναι πράγματι απαραίτητο για την πλήρη δραστηριότητα του SOCS-1. Οι ίδιες οι πρωτεΐνες SOCS μπορούν να στοχευθούν για ουβικουιτινυλίωση και αποδόμηση στο πρωτεάσωμα. Υπάρχουν αμφισβητούμενα αποτελέσματα σχετικά με το μηχανισμό που ρυθμίζει τη σταθερότητα των πρωτεϊνών CIS, SOCS-1 και SOCS- 3. Φαίνεται πως το σύμπλεγμα Elongin BC μπορεί να έχει διπλή δράση. Μπορεί να προαγάγει την αποδόμηση των πρωτεϊνών SOCS, όπως έχει βρεθεί για τις πρωτεΐνες CIS, SOCS-1 και SOCS-3, ενώ σε άλλα κυτταρικά συστήματα μπορεί να σταθεροποιήσει τις SOCS-1 και SOCS-3. Δεν μπορεί επί του παρόντος να προταθεί ένα γενικό μοντέλο για τη δράση των πρωτεϊνών SOCS. Φαίνεται πως ο μηχανισμός μέσω του οποίου κάθε μέλος της 96

97 οικογένειας ασκεί την ανασταλτική του δράση είναι ειδικός για κάθε κυτταρικό τύπο κι εξαρτάται από τις εμπλεκόμενες κυτταροκίνες. Αυτό μπορεί να εξηγείται από την παρουσία μη αναγνωρισμένων συνοδευτικών μορίων των πρωτεϊνών SOCS Η σηματοδότηση της αυξητικής ορμόνης και οι πρωτεΐνες SOCS Η GH επάγει την έκφραση των πρωτεϊνών SOCS με διαφορετική κινητική σε κυτταρικές σειρές ινοβλαστών, σε διάφορους ιστούς σε υποφυσιεκτομηθέντα ζώα και στα ηπατοκύτταρα. Στα ηπατοκύτταρα, η σηματοδότηση μέσω του υποδοχέα της GH, GHR, χαρακτηρίζεται, όπως έχει ήδη αναφερθεί, από την ενεργοποίηση πολλαπλών ενδοκυττάριων σηματοδοτικών μονοπατιών, μεταξύ των οποίων είναι αυτό των STAT, της MAP κινάσης, της PI3K και της πρωτεϊνικής κινάσης C. Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών STAT πραγματοποιείται μέσω μιας GH-επαγώμενης αντίδρασης τυροσιν-φωσφορυλίωσης, η οποία καταλύεται από τη συνδεόμενη με τον GHR τυροσιν-κινάση JAK2. Στο ήπαρ, που είναι σημαντικός ιστός-στόχος της GH, δύο στενά σχετιζόμενες πρωτεΐνες STAT, η STAT5a και η STAT5b, προσδένονται σε τυροσιν-φωσφορυλιωμένες περιοχές του GHR, γεγονός που επιτρέπει την άμεση τυροσιν-φωσφορυλίωση των STAT in vivo ως απάντηση σε φυσιολογικά επίπεδα της κυκλοφορούσας GH. Αυτό οδηγεί σε διμερισμό των ενεργοποιημένων STAT και μεταφορά τους στον πυρήνα, όπου προσδένονται σε στοιχεία απόκρισης (response elements) του DNA γονιδίων-στόχων και διεγείρουν τη γονιδιακή μεταγραφή. Οι πρωτεΐνες STAT1 και STAT3 ενεργοποιούν το γονίδιο c-fos, ενώ η STAT5 ενεργοποιεί γονίδια μέσω του GHRE (GH response element). Έχουν περιγραφεί διάφορα μεταγραφικά κύματα, με μεταγραφικούς παράγοντες τους Fos, Jun, EGR (early growth response protein) 1 και 2, KLF (Kruppel-like factor) 4 και ΧΒΡ (Χ boxbinding protein) 1 αρχικά, και τους ATF (activating transcription factor) 3 και GADD45-γ (growth arrest and DNA damage inducible gene 45-γ), στη συνέχεια. Οι μεταγραφικοί αυτοί παράγοντες πυροδοτούν μονοπάτια που ρυθμίζουν την ανοσοαπόκριση, το μεταβολισμό των υδατανθράκων και λιπιδίων και την παραγωγή του IGF-I. Αντίθετα, η διέγερση από την GH των STAT1 και STAT3 απαιτεί υψηλές συγκεντρώσεις GH και αφορά άμεσες διαντιδράσεις μεταξύ της JAK2 και των STAT, χωρίς να χρειάζονται οι ειδικές περιοχές φωσφοτυροσίνης της κυτταροπλασματικής περιοχής του GHR για να δράσουν ως περιοχές πρόσδεσης για την ενεργοποίηση του STAT5. Oι πρωτεΐνες SOCS/CIS έχουν αναγνωριστεί ως σημαντικοί αναστολείς της σηματοδότησης μέσω των υποδοχέων κυτταροκινών σε πολλούς ιστούς και κυτταρικούς τύπους. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεΐνες SOCS/CIS μπορούν να αναστείλουν τη σηματοδότηση της GH με πολλαπλούς μηχανισμούς. Έχει ήδη αναφερθεί ότι τέτοιοι μηχανισμοί είναι η άμεση αναστολή της JAK2, (στην περίπτωση της SOCS-1), η αναστολή της JAK2 με τρόπο που εξαρτάται από τις εγγύς μεμβρανικές περιοχές φωσφοτυροσίνης του GHR (στην περίπτωση της SOCS-3), και 97

98 η αναστολή της σηματοδότησης GHR-JAK2 μέσω άπω-μεμβρανικών περιοχών φωσφοτυροσίνης του GHR, (στην περίπτωση των CIS και SOCS-2). Εικόνα 53. Μηχανισμός δράσης των CIS, SOCS-1 και SOCS-3 H αναστολή της GH σηματοδότησης προς το STAT5b αφορά 2 μηχανισμούς: 1) Μία αρχική αναστολή της εξαρτώμενης από τον GHR ενεργοποίησης του STAT5b μέσω ανταγωνισμού ανάμεσα στη CIS και του STAT5b ως προς τις ίδιες ή αλληλοεπικαλυπτόμενες περιοχές φωσφοτυροσίνης στην κυτταροπλασματική ουρά του GHR, 2) Mία χρονοεξαρτώμενη, διαμεσολαβούμενη από το πρωτεάσωμα αναστολή, που αφορά την αποδόμηση της CIS, σε συνδυασμό με αποδόμηση του συμπλέγματος GHR-JAK2. Η υπόθεση αυτή επιβεβαιώνεται από το εύρημα ότι η GH διεγείρει μια χρονοεξαρτώμενη αποδόμηση της πρωτεΐνης CIS, η οποία αναστέλλεται από τον αναστολέα του πρωτεασώματος MG-132. Επιπλέον στοιχείο για τον προτεινόμενο ρόλο της CIS στην ενεργοποίηση της αποδόμησης του GHR που εξαρτάται από το πρωτεάσωμα, είναι το εύρημα ότι ο GHR υπόκειται σε αρνητική ρύθμιση μέσω της εσωτερικοποίησης του υποδοχέα, που εξαρτάται από το πρωτεάσωμα κι επάγεται από το συνδέτη. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η εσωτερικοποίηση του υποδοχέα δεν προϋποθέτει την ουβικουιτινυλίωση του υποδοχέα. Πιθανώς, η πρωτεΐνη CIS που συνδέεται στον υποδοχέα GHR δρα ως στόχος για ουβικουιτινυλίωση. Έχει αναφερθεί ότι το SOCS box δεσμεύει τις elongins B και C. Το δημιουργούμενο σύμπλεγμα δεσμεύει την elongin A ώστε να σχηματισθεί ένα ενεργό σύμπλεγμα μεταγραφικής επιμήκυνσης. Η elongin A αλληλεπιδρά με την elongin C. Είτε μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης της elongin B είτε μέσω της προκαλούμενης από την κουλίνη-2 ουβικουιτινυλίωσης των υποστρωμάτων, η JAK2 και οι σχετικές πρωτεΐνες SOCS μπορούν να καταστραφούν. (335,336) 98

99 Εικόνα 54. Σχηματική απεικόνιση των δύο τρόπων καταστροφής των SOCS και της JAK2 Γενικά, η έκφραση των CIS και SOCS3 επάγεται αμέσως μετά τη διέγερση με GH, αλλά παροδικά, ενώ η έκφραση της πρωτεΐνης SOCS2 αυξάνει σταδιακά και φτάνει στο μέγιστο 24 ώρες αργότερα. H SOCS3 προσδένεται στις φωσφορυλιωμένες περιοχές Y487 και Y332 του υποδοχέα GHR, ενώ η SOCS2 στην περιοχή Υ595. Φαίνεται επιπλέον ότι η SOCS1 προσδένεται επίσης στον GHR, αλλά σε αυτή την περίπτωση δεν απαιτείται ενεργοποίηση του υποδοχέα. Η ανασταλτική δράση της πρωτεΐνης CIS φαίνεται ότι είναι χρονοεξαρτώμενη και αφορά άμεση πρόσδεση στον GHR και επαγωγή της εξαρτώμενης από το πρωτεάσωμα αποδόμησης του GΗR. Οι συγκεκριμένες θέσεις στον GHR που απαιτούνται για τη διαντίδραση με την πρωτεΐνη CIS δεν έχουν ακόμα χαρτογραφηθεί. (337) Είναι αξιοσημείωτο ότι η υπερέκφραση της CIS σε διαγονιδιακά ποντίκια καταλήγει σε φαινότυπο παρόμοιο με αυτόν που ανευρίσκεται σε ποντίκια στα οποία απουσιάζει η πρωτεΐνη STAT5b. Aυτό υποδηλώνει ότι η CIS ίσως είναι σημαντικός παράγοντας για την αρνητική ρύθμιση της εξαρτώμενης από την GH σηματοδότησης. Ο φαινότυπος των ποντικιών στα οποία απουσιάζει η πρωτεΐνη SOCS2 (SOCS2-/-) προσδίδει στη SOCS2 σημαντικό ρόλο στην αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH. Tα SOCS2-/- ποντίκια είναι κατά 30-40% μεγαλύτερα από τα φυσιολογικά. Η αύξηση του βάρους οφείλεται σε αύξηση στο μέγεθος των οστών και σε ανάλογη αύξηση των περισσότερων οργάνων. Παρόμοιοι φαινότυποι έχουν βρεθεί επίσης σε ζώα που υπερεκφράζουν την GH, σε ασθενείς με μεγαλακρία και στην περίπτωση μίας μετάλλαξης στα ποντίκια που προκαλεί αύξηση στην μεταγεννητική ανάπτυξη κατά 40-50%. Στα τελευταία ποντίκια έχει βρεθεί μία μετάλλαξη στο χρωμόσωμα 10 που καταλήγει στην απενεργοποίηση της περιοχής SOCS2. Επιπρόσθετες μελέτες έχουν δείξει ότι, πράγματι, η πρωτεΐνη SOCS2 είναι απαραίτητη για την αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH. Για παράδειγμα, η SOCS2 παρεμποδίζει την εξαρτώμενη από την GH αναστολή της διαφοροποίησης των αρχέγονων νευρικών κυττάρων. Κατά συνέπεια, τα ποντίκια SOCS2-/- έχουν λιγότερους νευρώνες στον αναπτυσσόμενο φλοιό, ενώ η υπερέκφραση της SOCS2 προκαλεί αυξημένη νευρωνική διαφοροποίηση. Έχει επίσης βρεθεί ότι η ανασταλτική δράση των οιστρογόνων στη σηματοδότηση της GH διαμεσολαβείται μέσω της πρωτεΐνης SOCS2. Τα οιστρογόνα αυξάνουν το mrna της SOCS2, η οποία 99

100 καταστέλλει την εξαρτώμενη από την GH φωσφορυλίωση της JAK2. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι ο άξονας GH/IGF-1 είναι κύριος στόχος των δράσεων της SOCS2. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί μέσω των οποίων καθεμιά από τις πρωτεΐνες SOCS, και ιδιαίτερα η SOCS2, ασκούν την αρνητική τους δράση στη σηματοδότηση της GH δεν είναι πλήρως διευκρινισμένοι Φωσφατάσες Η ενεργοποίηση των εξαρτώμενων από την GH σηματοδοτικών μονοπατιών βασίζεται στην πρωτεϊνική φωσφορυλίωση περιοχών τυροσίνης, σερίνης ή θρεονίνης. Η ενεργοποίηση του GHR από την GH κινητοποιεί διάφορα αρνητικά ρυθμιστικά μονοπάτια σημαντικά για τον τερματισμό της GH σηματοδότησης. Ένας προφανής μηχανισμός για την απενεργοποίηση αυτής της διαδικασίας είναι η δράση φωσφατασών. Η δραστηριότητα των φωσφατασών είναι σημαντικός ρυθμιστής της σηματοδότησης της GH, τόσο σε επίπεδο υποδοχέα όσο και σε επίπεδο σηματοδοτικών μορίων. Διάφορες μελέτες έχουν αναγνωρίσει τρεις διαφορετικές φωσφατάσες που εμπλέκονται στην αρνητική ρύθμιση των δράσεων της GH: 1) την SHP (1 και 2), επίσης γνωστή ως ΡΤΡ-1, 2) την ΡΤΡ1Β και 3) την ΡΤΡ-Η1. Οι τυροσιν-φωσφατάσες SHP-1 και SHP-2, οι οποίες προσδένονται σε φωσφορυλιωμένες τυροσινικές περιοχές στον GHR, στην JAK2 και στον STAT5b μέσω των περιοχών τους SH2, καταλύουν την αποφωσφορυλίωση αυτών των σηματοδοτικών μορίων και προκαλούν την απενεργοποίησή τους. Οι SHP-1 και SHP-2 είναι οι δύο καλύτερα χαρακτηρισμένες φωσφατάσες που εμπλέκονται στη σηματοδότηση της GH. (338) Πρόκειται για τυροσιν-φωσφατάσες που περιέχουν την Src-homology domain 2/ SH2. Η GH μπορεί να ενεργοποιήσει την SHP1 και να επαγάγει τη μεταφορά της στον πυρήνα όπου προσδένεται στη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη STAT5b. Η ενζυμική δραστηριότητα της SHP-1 περιορίζει επίσης το βαθμό και τη διάρκεια της ενεργοποίησης της JAK2 μετά από διέγερση από GH. Αντιθέτως, η SHP-2 δρα και ως θετικός και ως αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης της GH, ανάλογα με τη συγκέντρωσή της τοπικά και με τον κυτταρικό τύπο. Η SHP-2 επιστρατεύεται στο σύμπλεγμα που επάγεται από την GH και το οποίο περιλαμβάνει τα GHR, JAK2 και SIRP (signal-regulatory protein) α. Η ενεργοποίηση από την GH επάγει την πρόσδεση της SHP-2 στην Grb2. Η περιοχή SH2 της SHP-2 συνδέεται ειδικά με τη φωσφορυλιωμένη τυροσίνη 595 του ανθρώπινου GHR και μετάλλαξη αυτής της περιοχής πρόσδεσης παρατείνει τη σηματοδότηση της GH. Αντιθέτως, η έκφραση καταλυτικά ανενεργού SHP-2 μειώνει τη μεταγραφική δραστηριότητα που ακολουθεί την ενεργοποίηση του GHR. (339) Ο ίδιος ο GHR αποφωσφορυλιώνεται από πρωτεϊνικές τυροσιν-φωσφατάσες (ΡΤΡs), όπως είναι οι PTP-1B, T cell PTP και PTP-H1. Η JAK2 επίσης είναι ένα φυσιολογικό υποκατάστατο της PTP-1B κατά τρόπο ανεξάρτητο από την GH. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες STAT3, STAT5a και STAT5b αποφωσφορυλιώνονται από την ΡΤΡ-1Β. H αποφωσφορυλίωση των πρωτεϊνών STAT μέσω των ΡΤΡ στον πυρήνα είναι 100

101 σημαντικό σήμα για μεταφορά των μορίων αυτών πίσω στο κυτταρόπλασμα. Η φωσφατάση TC45 είναι μία πυρηνική μορφή της TC-PTP που αποφωσφορυλιώνει τις πρωτεΐνες STAT1 και STAT5. Σε κύτταρα που το γονίδιο TC-PTP έχει εξαλειφθεί, η πυρηνική αποφωσφορυλίωση των ενεργοποιημένων από την GH STAT1 και STAT3, επηρεάζεται, όχι όμως και των STAT5 και STAΤ6. (340) Πράγματι, έχει βρεθεί ότι η προεπώαση με Vanadate, που είναι ένας γενικός αναστολέας των τυροσιν-φωσφατασών, παρατείνει την εξαρτώμενη από την GH φωσφορυλίωση των JAK2 και STAT5. Θεωρώντας πως το μονοπάτι GHR/JAK2/STAT5 είναι το κύριο σηματοδοτικό μονοπάτι της GH, η δράση των φωσφατασών αυτών των τριών πρωτεϊνών είναι κρίσιμη για την κυτταρική απόκριση Signal Regulatory Protein (SIRP) Οι πρωτεΐνες SIRP αποτελούν μια οικογένεια διαμεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνών η πλειοψηφία των οποίων περιλαμβάνει μία κυτταροπλασματική περιοχή πλούσια σε προλίνη και τέσσερις κυτταροπλασματικές τυροσίνες, οι οποίες, όταν φωσφορυλιωθούν, προσδένονται στις τυροσιν-φωσφατάσες SHP. Οι πρωτεΐνες SIRP διακρίνονται στις SIRP-α και SIRP-β, οι οποίες παρουσιάζουν ομολογία κατά 90% στην εξωκυττάρια περιοχή. Η SIRP προσδένεται άμεσα στην JAK2 ως απόκριση στην GH, χωρίς να προηγηθεί τυροσυλ-φωσφορυλίωση, αν και η ίδια είναι ιδιαιτέρως φωσφορυλιωμένη σε μόρια τυροσίνης. H φωσφορυλιωμένη SIRP επιστρατεύει ένα ή περισσότερα μόρια τυροσιν-φωσφατάσης SHP-2, τα οποία αποφωσφορυλιώνουν τη SIRP και πιθανώς, την JAK2. Επομένως, η SIRP είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της δράσης της GH. (341,342) H υπερέκφραση της SIRP-α ρυθμίζει αρνητικά την ενεργοποιούμενη από την GH σηματοδότηση αναστέλλοντας τη φωσφορυλίωση των JAK2, STAT5b, STAT3, ERK1 και ERK2. Ο ακριβής μηχανισμός μέσω του οποίου η SIRP-α ρυθμίζει αρνητικά τη σηματοδότηση της GH δεν είναι σαφής. Μπορεί να αφορά πρόσδεση στην SHP-1, μία πρωτεϊνική τυροσιν-φωσφατάση που είναι γνωστό ότι δρα στην JAK2 και STAT5. Εναλλακτικά, μπορεί να ανταγωνίζεται τον GHR για την πρόσδεση θετικών ρυθμιστών, όπως είναι οι πρωτεΐνες SHP-2 ή JAK Πρωτεϊνικοί Αναστολείς των Eνεργοποιημένων STAT (Protein Inhibitors of Activated STATs/PIAS) Oι πρωτεΐνες PIAS έχουν αναγνωρισθεί ως αρνητικοί ρυθμιστές της σηματοδότησης κυτταροκινών λόγω της ικανότητάς τους να αναστέλλουν τη δράση των μεταγραφικών παραγόντων STAT. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι οι PIAS μπορούν να δράσουν ως συρρυθμιστές σε άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια, όπως αυτά των στεροειδών ορμονών και της p53. Πιο πρόσφατα στοιχεία υποδηλώνουν ότι οι PIAS μπορούν να δράσουν ως Ε3 λιγάσες διεγείροντας την πρόσδεση ρυθμιστών που μοιάζουν με την ουβικουιτίνη (SUMO) σε πρωτεΐνες-στόχους. Οι πρωτεΐνες (PIAS) 101

102 έχουν ως κοινή δομή το αμινοτελικό μοτίβο διαντίδρασης με πυρηνικό υποδοχέα και την περιοχή πρόσδεσης ψευδαργύρου RING (real interesting new gene)-like. (343) Έχουν αναγνωρισθεί 6 PIAS: oι PIAS1, PIAS3, PIAS3β, PIASxα, PIASxβ και PIASy, που μπορούν να διαντιδρούν με διαφορετικούς μεταγραφικούς παράγοντες και άλλες πρωτεΐνες. Αρκετοί νέοι μεταγραφικοί παράγοντες που ενεργοποιούνται από την GH έχουν αναγνωρισθεί πρόσφατα ως πιθανοί στόχοι της δράσης των PIAS. Επομένως, είναι πιθανός ο ρυθμιστικός ρόλος της οικογένειας αυτής σε συγκεκριμένες δράσεις της GH. Εικόνα 55. Τα σημαντικότερα μονοπάτια αρνητικής ρύθμισης της GH Η πρωτεΐνη β-transducing repeat-containing protein/β-trcp Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι φυσιολογικές δράσεις της αυξητικής ορμόνης είναι ευρείες και περιλαμβάνουν τη ρύθμιση του μεταβολισμού και τη σωματική αύξηση. Για το λόγο αυτό η απαντητικότητα των κυττάρων στην αυξητική ορμόνη υπόκειται σε στενή ρύθμιση. Όλα τα κύτταρα του ανθρώπινου οργανισμού έχουν υποδοχείς της αυξητικής ορμόνης. Η ενδοκύττωση και η αποδόμηση των υποδοχέων εξαρτώνται από το σύστημα της ουβικουιτίνης, το οποίο αποτελεί το μείζον σηματοδοτικό μονοπάτι για μη λυσοσωματική αποδόμηση. (344) Το εξαρτώμενο από την ουβικουιτίνη μοτίβο ενδοκύττωσης (UbE), που βρίσκεται στην κυτταροπλασματική ουρά του GHR, είναι απαραίτητο για την ενδοκύττωση και την αποδόμηση του υποδοχέα. Η πρωτεΐνη β-trcp (β-transducing repeat-containing protein) είναι σημαντικός παράγων που επιστρατεύεται στο μοτίβο UbE της ουβικουιτίνης κι επομένως διαμεσολαβεί την ενδοκύττωση και αποδόμηση του GHR. (345) Η β-trcp είναι η υπομονάδα F-box αναγνώρισης του υποστρώματος μιας Ε3 λιγάσης που βασίζεται στην κουλλίνη, της SCF. Φαίνεται ότι η β-trcp επιστρατεύει το μηχανισμό ουβικουιτινυλίωσης. Η διαντίδραση της β-trcp είναι το πρώτο βήμα για την ενδοκύττωση του GHR μέσω μιας διεργασίας εξαρτώμενης από την κλαθρίνη. Για να 102

103 εμπλακεί ο μηχανισμός ουβικουιτινυλίωσης σε αυτή τη διεργασία, ο GHR πρέπει να διμεριστεί. (346) Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η β-trcp περιέχει πράγματι μια περιοχή διμερισμού που είναι απαραίτητη για τη δράση της ως Ε3. Επομένως, χρήζει διερεύνησης το αν ο διμερισμός της β-τrcp προκαλεί την αναγκαιότητα για διμερισμό του GHR. H ουβικουιτινυλίωση ενός παράγοντα από τη β-trcp έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή του από το πρωτεάσωμα. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η απόφαση για αποδόμηση του στόχου δεν εξαρτάται από τη δράση της β-trcp, αλλά από τη δραστηριότητα μιας ή δύο κινασών που φωσφορυλιώνουν περιοχές σερίνης στο μοτίβο αποδόμησης. Υπάρχουν δύο ισομορφές, η β-trcp1, που βρίσκεται κυρίως στον πυρήνα, και η β- TrCP2, που βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα. (347) Παρά τη διαφορετική εντόπισή τους μέσα στο κύτταρο, οι δύο ισομορφές μπορούν να αναλάβουν η μία το ρόλο της άλλης αν κάποια από τις δύο υποστεί γονιδιακή σίγαση. Δεδομένου ότι δε χρειάζεται πιθανώς καμία τροποποίηση για την πρόσδεση της β-trcp στον GHR, οι δύο πρωτεΐνες μπορούν να ρυθμίζουν η μία τη δραστηριότητα της άλλης. Οι λιγάσες αυτές έχουν αμφισήμαντο ρόλο στην κυτταρική διαίρεση και σε διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια απαραίτητα στην ογκογένεση. Τα μοτίβα τους που προσδένονται στα υποστρώματα αποτελούνται από επτά περιοχές WD40 σε σχήμα προπέλλας με μία κεντρική κοιλότητα. Η γονιδιακή σίγαση της β-trcp αναστέλλει την πρόσληψη και αποδόμηση της GH στον ίδιο βαθμό με τη σίγαση της βαριάς αλυσίδας της κλαθρίνης. Επίσης, αυξημένη κυτταρική β-trcp επιφέρει μεγαλύτερη ενδοκύττωση/αποδόμηση του GHR, ενώ αυξημένα επίπεδα GHR μπορεί να δεσμεύσουν την ελεύθερη β-trcp, επηρεάζοντας τις άλλες της δράσεις. (348) Θεωρείται πολύ πιθανό ότι τα επίπεδα της ελεύθερης κυτταροπλασματικής συγκέντρωσης της β-trcp καθορίζουν την επαγωγή της ενδοκύττωσης του GHR. Η ενδοκύττωση του GHR δεν προϋποθέτει την ουβικουιτινυλίωσή του. Έτσι, η πρόσδεση μιας SCF E3 λιγάσης που χρησιμοποιεί τη β-trcp, δε μαρκάρει τον GHR για ουβικουιτινυλίωση, αλλά πρέπει να στοχεύει κάποιον άλλο παράγοντα στο σύμπλεγμα GHR-ουβικουιτίνης. Αυτή είναι η πρώτη παρατήρηση σύμφωνα με την οποία μία SCF E3 λιγάση εμπλέκεται άμεσα στην ενδοκύττωση ενός υποδοχέα των κυτταροκινών, χωρίς να μαρκάρει τον ίδιο τον υποδοχέα, αλλά μάλλον κάποιον άλλο παράγοντα στο σύμπλεγμα ουβικουιτινυλίωσης του GHR. Επίσης, η σημαντική μείωση των κυτταρικών επιπέδων και των δύο ισομορφών του β-trcp μετά από σίγαση του γονιδίου τους είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της αποδόμησης του GHR. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις κυτταροπλασματικής β-trcp, τα κύτταρα είναι πιο ευαίσθητα στην GH. Έχει αναφερθεί ότι η ρυθμιζόμενη διαδικασία ενδοκύττωσης εξασφαλίζει ότι οι υποδοχείς GHR διατηρούνται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη στα σωστά επίπεδα ώστε τα κύτταρα να παρουσιάζουν την κατάλληλη ευαισθησία στην GH. Η πρόσδεση της JAK2 στον GHR επιβραδύνει την ενδοκύττωση του υποδοχέα. (349) Μετά το ερέθισμα της GH, η JAK2 απελευθερώνεται, επιτρέποντας την πιο αποτελεσματική πρόσδεση της β-trcp στον υποδοχέα. Με τον τρόπο αυτό, η πρόσδεση της GH επιταχύνει την ενδοκύττωση του GHR. Επομένως, η κυτταρική συγκέντρωση της ελεύθερης JAK2 103

104 είναι ένας επιπλέον παράγοντας που παίζει ρόλο στη ρύθμιση της βασικής ενδοκύττωσης/αποδόμησης του GHR. Στα περισσότερα υποστρώματά της η πρωτεΐνη β-trcp αναγνωρίζει την αλληλουχία DSGFSX. O GHR, εκτός από το μοτίβο UbE, περιλαμβάνει μία διατηρημένη αλληλουχία που αντιστοιχεί στην αλληλουχία DSGFSX. Η β-trcp συμμετέχει στην αποδόμηση και των υποδοχέων της προλακτίνης, (350) της ερυθροποιητίνης (351) και της ιντερφερόνης IFNA. (352) Η β-trcp δρα επομένως ως αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης αυτών των υποδοχέων. Μετά την πρόσδεση των συνδετών τους, το μοτίβο DSGFSX φωσφορυλιώνεται και κατόπιν η Ε3 λιγάση ουβικουιτινυλιώνει λυσίνες στην ουρά των υποδοχέων, γεγονός που οδηγεί στην καταστροφή των υποδοχέων. Είναι ενδιαφέρον ότι η πρόσδεση της β-trcp στο μοτίβο UbE είναι σημαντική και για τη βασική, αλλά και για την επαγώμενη από την GH ενδοκύττωση. (278) Αυτό το σενάριο διαφέρει από τον τρόπο αποδόμησης του GHR. Επιπρόσθετα, πρόσφατη μελέτη ανέδειξε ότι η β-τrcp εμπλέκεται στην αποδόμηση του υποδοχέα EGFR. O EGFR και ο GHR χρησιμοποιούν την ίδια οδό μεταφοράς προς τα λυσοσώματα, η οποία περιλαμβάνει τα συμπλέγματα ESCRT-I, -II, -III, όπως θα αναφερθεί στη συνέχεια. H πρωτεΐνη β-trcp παρεμβαίνει στη διαδικασία πολυουβικουιτινυλίωσης κατά την οποία μαρκάρεται ο υποδοχέας EGFR ώστε να μεταφερθεί στο λυσόσωμα μέσω των συμπλεγμάτων ESCRT και να αποδομηθεί. (353) H β-trcp παίζει σημαντικό ρόλο επίσης στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Ως απάντηση στο στρες αποτρέπει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέχρι την ολοκλήρωση της επιδιόρθωσης του DNA. Συγχρόνως, παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάφραση πρωτεϊνών, στην κυτταρική αύξηση κι επιβίωση. Μετά τη δράση μιτογόνων, η β-trcp προκαλεί αποδόμηση ενός αναστολέα της μετάφρασης. Παράλληλα, είναι μεσολαβητής της αποδόμησης μιας προαγωγικής της απόπτωσης πρωτεΐνης, της BimEL, σε συνεργασία με το μονοπάτι ERK-RSK. Προάγει με τον τρόπο αυτό την κυτταρική επιβίωση μετά από διέγερση με μιτογόνα. (354) Η αποδόμηση της BimEL επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να διαφύγουν της απόπτωσης που επάγεται από τη χημειοθεραπεία. Συγχρόνως, σε συνεργασία με το μονοπάτι PI3K-S6K, η β-trcp διαμεσολαβεί την πρωτεϊνοσύνθεση και, άρα, την κυτταρική αύξηση. (355) Παρά την ευρεία γκάμα υποστρωμάτων, η πρωτεΐνη β-trcp θεωρείται ογκογονίδιο. Αυτό αντικατοπτρίζεται από την αυξημένη έκφρασή της σε διάφορους καρκίνους, ενώ σπάνια βρίσκονται μεταλλάξεις σε ανθρώπινους όγκους και πρωτοπαθείς καρκίνους. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, στο οποίο υπάρχει συνεχής ενεργοποίηση του NFκB και υψηλά επίπεδα β-trcp. (356) Η πρωτεΐνη p21 Η πρωτεΐνη p21, γνωστή και ως WAF1, είναι αναστολέας των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών. Προσδένεται στα συμπλέγματα κυκλίνης-cdk (cyclin-dependent kinase)-2 ή CDK-4 κυρίως, μέσω μίας περιοχής με συντηρημένη αλληλουχία στην αμινοτελική της περιοχή και αναστέλλει τη δραστηριότητά τους. Οι καρβοξυτελικές περιοχές 104

105 ποικίλλουν σε μήκος και λειτουργία. (357,358) Επομένως, η p21 λειτουργεί ως ρυθμιστής της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου στη φάση S. Η ανακάλυψη αυτή έγινε στις αρχές της δεκαετίας του 1990 και αποκάλυψε πώς τα κύτταρα σταματούν να διαιρούνται μετά την έκθεσή τους σε καταστροφικούς παράγοντες, όπως η ακτινοβολία. H έκφραση του γονιδίου της p21 ελέγχεται στενά από την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53, μέσω της οποίας διαμεσολαβείται η καθήλωση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G 1 ως απάντηση σε διάφορα ερεθίσματα κυτταρικού στρες. Η καθήλωση του κυτταρικού κύκλου επιτρέπει στα κύτταρα να επιδιορθώσουν βλάβες του DNA και κατόπιν να συνεχίσουν την κυτταρική διαίρεση. Από τη μία πλευρά, η δράση της ως αναστολέα του κυτταρικού πολλαπλασιασμού προσδίδει στην p21 ογκοκατασταλτικές ιδιότητες. Από την άλλη πλευρά, η ικανότητα της p21 να επάγει την καθήλωση του κυτταρικού κύκλου μετά από στρες μπορεί να προστατεύει τα κύτταρα από την απόπτωση. Η αντιαποπτωτική δραστηριότητα της p21 μπορεί να συμβάλει στην εν δυνάμει δράση της ως ογκογονίδιο. Επομένως, η πρωτεΐνη αυτή χαρακτηρίζεται από «ανταγωνιστικό δυαδισμό» ως προς τη δράση της. Ορισμένες φορές, η p21 εκφράζεται χωρίς να έχει επαχθεί από την p53 και η έκφρασή της εξαρτάται από δύο παράγοντες: 1) Το υπάρχον ερέθισμα, 2) τον κυτταρικό τύπο. Τα μεγαλύτερα επίπεδα της p21 είναι παρόντα σε ιστούς με υψηλό ρυθμό ανακύκλωσης, όπως το δέρμα και ο γαστρεντερικός σωλήνας. (359) Η έκφραση της p21 μπορεί επίσης να ρυθμιστεί μετα-μεταφραστικά τόσο από την εξαρτώμενη όσο και από τη μη εξαρτώμενη από την ουβικουιτίνη πρωτεασωμική αποδόμηση. (360,361) Η καθήλωση του κυτταρικού κύκλου από την p21 μπορεί να προαγάγει την κυτταρική διαφοροποίηση. Εικόνα 56. Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου Επιπλέον από την καθήλωση του κυτταρικού κύκλου και, άρα, την καταστολή του πολλαπλασιασμού, η πρωτεΐνη p21 συμμετέχει στην κυτταρική γήρανση. Μπορεί επίσης να διαντιδρά με το πυρηνικό αντιγόνο κυτταρικού πολλαπλασιασμού, PCNA (Proliferating cell nuclear antigen), το οποίο προάγει τη δράση της DNA πολυμεράσης, και παίζει ρυθμιστικό ρόλο στο διπλασιασμό και την επιδιόρθωση του DNA στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Ωστόσο, οι δράσεις της p21 στη ρύθμιση της σύνθεσης του DNA παραμένουν αμφιλεγόμενες. Σε διαφορετικές μελέτες η p21 105

106 έχει προταθεί ως απαραίτητη, (362,363) μη απαραίτητη (364,365) ή ανασταλτική (366) της επιδιόρθωσης του DNA. Η πρωτεΐνη p21 έχει αναφερθεί ότι μπορεί να κοπεί από κασπάσες, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της CDK2 και την έναρξη της απόπτωσης μετά την ενεργοποίηση των κασπασών. Ωστόσο, η p21 μπορεί να αναστείλει την απόπτωση και δεν επάγει τον κυτταρικό θάνατο από μόνη της. (367) Η p21 μπορεί να επαχθεί ως αποτέλεσμα βλάβης του DNA ή έκφρασης ογκογονιδίων, διεγείροντας μη αναστρέψιμη καθήλωση του κυτταρικού κύκλου (π.χ. γήρανση), εμποδίζοντας την αύξηση υποφυσιακών όγκων. (368,369) Η p21 μπορεί να μεσολαβήσει είτε στην καταστολή είτε στην προαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ανάλογα με την ενδοκυττάρια εντόπιση της πρωτεΐνης. (370) Η ενδοπυρηνική p21 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό ασταθών ή ανευπλοειδικών κυττάρων. (371) Η κυτταροπλασματική εντόπιση της p21 συνεπάγεται αντίσταση στην απόπτωση. Ωστόσο, υπάρχουν αρκετές αναφορές για προαγωγικές της απόπτωσης δράσεις της p21 υπό συγκεκριμένες συνθήκες και σε συγκεκριμένα συστήματα. Ως απάντηση στην ακτινοβολία και στη χημειοθεραπεία, η πρωτεΐνη p53 σταθεροποιείται και διαμεσολαβεί την απόπτωση και την καθήλωση του κυτταρικού κύκλου. Οι μηχανισμοί της εξαρτώμενης από την p53 απόπτωσης δεν είναι πλήρως διευκρινισμένοι, όμως η εξαρτώμενη από την p53 καθήλωση του κυτταρικού κύκλου γίνεται μέσω της p21. Δεν είναι γνωστός ο τρόπος με τον οποίο ένα κύτταρο επιλέγει ανάμεσα στην απόπτωση και την καθήλωση του κυτταρικού κύκλου μετά τη βλάβη του DNA, αλλά συχνά υψηλά επίπεδα της έκφρασης της p21 διαμεσολαβούν την καθήλωση του κυτταρικού κύκλου και προστατεύουν από την απόπτωση. Διαταραχή στην εξαρτώμενη από την p53 επαγωγή της p21 ή το κόψιμο της p21 από κασπάσες καταλήγουν σε αυξημένη απόπτωση που εξαρτάται από την p53. Εικόνα 57. Τα δύο εναλλακτικά μονοπάτια μετά τη βλάβη του DNA Ένας πιθανός μηχανισμός μέσω του οποίου η p21 αποτρέπει την απόπτωση είναι η καθήλωση του κυτταρικού κύκλου, συνήθως στις φάσεις G 2 -M, που επιτρέπει την επιδιόρθωση ή παρεμποδίζει τη βλάβη του DNA. Ένας άλλος μηχανισμός σχετίζεται με την ικανότητα της p21 να προσδένεται και να απενεργοποιεί τα συμπλέγματα κυκλίνης Α/Cdk2. Το κόψιμο της p21 από την κασπάση-3 αποτελεί σημαντικό 106

107 μηχανισμό για την ενεργοποίηση της κυκλίνης Α/Cdk2 και για κυτταρικό θάνατο. Έχουν αναφερθεί και πιο άμεσοι μηχανισμοί μέσω των οποίων η p21 μπορεί να αναστείλει τον κυτταρικό θάνατο. Τέτοιοι είναι η αναστολή του κοψίματος της p21 από τις κασπάσες, (372) η διαντίδραση της p21 με την προκασπάση-3 και η σταθεροποίηση του αναστολέα της απόπτωσης c-iap1. (373) Όπως έχει αναφερθεί, η πρωτεΐνη p21, ως αναστολέας του πολλαπλασιασμού παίζει σημαντικό ρόλο στην αναστολή της ανάπτυξης των όγκων. Ο καρκίνος αναπτύσσεται όταν διαταράσσεται η ισορροπία ανάμεσα στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τον κυτταρικό θάνατο. Ποντίκια που δεν εκφράζουν την p21 είναι περισσότερο επιρρεπή στην επαγόμενη ογκογένεση. Επίσης, η p21 συνεργάζεται με άλλους καταστολείς όγκου προστατεύοντας τα ποντίκια από την εξέλιξη των όγκων, αν και η δράση της είναι πολύ πιο ασθενής από τη δράση της p53. Τόσο στην υποφυσιακή υποπλασία όσο και στα αδενώματα της υπόφυσης έχει παρατηρηθεί επαγωγή της p21, η οποία συμβάλλει στον περιορισμό της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. (374,375) Επιπλέον, στον καρκίνο του μαστού έχει βρεθεί πως ο HER-2 (Ηuman Epidermal Growth Factor Receptor 2), που αποτελεί κακό προγνωστικό παράγοντα, μπορεί να επηρεάζει τη μεταφορά του p21 από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, με αποτέλεσμα την απώλεια των ογκοκατασταλτικών του λειτουργιών. (376) Ωστόσο, όπως αναφέρθηκε προηγούμενα, αρκετές μελέτες αναφέρουν ότι η p21, εκτός από αναστολέας του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, δρα και ως αναστολέας της εξαρτώμενης από την p53 απόπτωσης σε διάφορα συστήματα. Τα αντικαρκινικά φάρμακα σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα μέσω της εξαρτώμενης ή της μη εξαρτώμενης από την p53 απόπτωσης. Η p21 προστατεύει τα κύτταρα από την απόπτωση. Επειδή η απουσία της p21 συνήθως αυξάνει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στην απόπτωση, μικρά μόρια που παρεμποδίζουν την έκφραση της p21 μπορούν να βελτιώσουν τη δράση των αντικαρκινικών φαρμάκων. Συμπερασματικά, η p21 μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη ενός όγκου στον οργανισμό, ταυτοχρόνως όμως η αναστολή της δράσης της μπορεί να είναι ευεργετική κατά τη διάρκεια χημειοθεραπείας. (377) 3.3 Ο ρόλος της STAT3 στη σηματοδότηση και δράση της GH Η ικανότητα ενός κυττάρου να αποκρίνεται στην GH είναι αυστηρά ρυθμιζόμενη. Το μέγεθος και η διάρκεια του σήματος είναι ελεγχόμενα κι επηρεάζονται από το ενδοκυττάριο περιβάλλον. Υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί διασυνομιλίας με σηματοδοτικά μονοπάτια που μπορούν να επηρεάσουν αρνητικά τις αποκρίσεις στην GH. Η διαταραχή στην αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH μπορεί να προκαλέσει μη ελεγχόμενες αντιδράσεις στην ορμόνη, επηρεάζοντας την ομοιόσταση και οδηγώντας σε διάφορες παθοφυσιολογικές επιπλοκές. Μέχρι σήμερα, δεν έχουν αναπτυχθεί μοντέλα knockout για STAT3, καθώς δεν είναι συμβατά με τη ζωή κατά την εμβρυική φάση ανάπτυξης. Έχει βρεθεί παρ όλα αυτά 107

108 ότι η πρωτεΐνη STAT3 αυξάνει τη γονιδιακή έκφραση αναστολέων της απόπτωσης (Bcl-xL, Mcl-1 και survivine), ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου (cyclin D1, c-myc) και ενεργοποιητών της αγγειογένεσης (αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγων). (438) Είναι γνωστό ότι η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών STAT, συμπεριλαμβανομένης της STAT3, πυροδοτεί την αποδέσμευση του μεταγραφικού παράγοντα από τον υποδοχέα της GH, την έναρξη του ομο- ή ετεροδιμερισμού του μεταγραφικού παράγοντα και τη μετατροπή του συμπλόκου αυτού σε μία υψηλής συγγένειας με το DNA πρωτεΐνης. Επομένως, η ενεργοποίηση του STAT3 και η επακόλουθη απενεργοποίηση/αναστολή του είναι κρίσιμες για τη βιολογική δράση της GH. Μερικοί ασθενείς με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα παρουσιάζουν μείωση στο πυρηνικό, ολικό και φωσφορυλιωμένο STAT3. Δεν μπορεί να αποδειχθεί με βεβαιότητα αν το εύρημα αυτό σχετίζεται με την ανεπάρκεια αύξησης που παρατηρείται σε αυτούς τους ασθενείς. Έχει αναφερθεί ότι οι πρωτεΐνες STAT είναι δυναμικές πρωτεΐνες που μεταφέρονται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα ακόμα και απουσία φωσφορυλίωσης. Αυτός ο μηχανισμός ανταλλαγής διατηρεί τις πρωτεΐνες STAT διαθέσιμες για φωσφορυλίωση ως απόκριση στη διέγερση με (439, 440) GH. Οι μεταβολές στην ποσότητα της φωσφορυλιωμένης STAT3 (pstat3) στον πυρήνα μπορεί να οφείλονται σε μεταβολή στο ρυθμό με τον οποίο η pstat3 εξέρχεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Υπάρχουν διάφοροι πιθανοί μηχανισμοί που συμμετέχουν σε αυτή τη διαδικασία. Μπορεί να υπάρχει διαταραχή στη δραστηριότητα της πρωτεΐνης CRM1, μιας πρωτεΐνης υπεύθυνης για την έξοδο των πρωτεϊνών STAT από τον πυρήνα. Επίσης, μπορεί να υπάρχει μειωμένη δραστηριότητα της ιμπορτίνης-α3, που συμμετέχει στην είσοδο της STAT3 στον πυρήνα. Επιπλέον, μπορεί να εμπλέκεται μια μεταβολή στη δραστηριότητα πυρηνικών φωσφατασών, καθώς η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών STAT καθορίζει το χρόνο παραμονής αυτών των μορίων στον πυρήνα. Υπάρχει η υπόθεση ότι τα χαμηλότερα επίπεδα pstat3 που παρατηρούνται σε ορισμένους ασθενείς με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα συγκριτικά με τους μάρτυρες, ίσως έχουν ως αποτέλεσμα αλλεπάλληλους γύρους κυτταροπλασματικής αναφωσφορυλίωσης, με στόχο να διατηρηθούν μόρια μεταγραφικά ενεργά στον πυρήνα, σε μια προσπάθεια αντιρρόπησης της πιθανής απορρύθμισης της μετάβασης της pstat3 στον πυρήνα. Επομένως, διαταραχές στη σηματοδότηση του STAT3 μπορεί να είναι παρούσες σε ορισμένους ασθενείς με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα. 108

109 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 : Το μονοπάτι του EGF/EGFR Το μονοπάτι του υποδοχέα του Επιδερμικού Αυξητικού Παράγοντα (EGF/EGFR) είναι ένα από τα πιο σημαντικά μονοπάτια που ρυθμίζουν την αύξηση, την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση στα κύτταρα θηλαστικών. (378) Εκτός όμως από το ρόλο του στην ανάπτυξη, τη ρύθμιση του φυσιολογικού κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής συμπεριφοράς, ο EGF είναι κρίσιμος και για τη γένεση κι εξέλιξη των καρκίνων. ( ) Εικόνα 58. Οι κύριες δράσεις του μονοπατιού EGF/EGFR Ο υποδοχέας του EGF, EGFR, που είναι επίσης γνωστός ως ErbB-1, είναι μέλος της οικογένειας υποδοχέων ErbB (ErbB-1--4), που έχουν ενδογενή δραστικότητα τυροσιν-κινάσης (Receptor Tyrosine Kinases/RTKs). Χαρακτηρίζεται δομικά από την παρουσία μιας εξωκυττάριας περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη, ένα διαμεμβρανικό πέρασμα και μια κυτταροπλασματική ουρά που περιλαμβάνει μια περιοχή τυροσινκινάσης και μερικές περιοχές φωσφορυλίωσης. (382) Εικόνα 59. Η δομή του EGFR και οι πιθανές μεταλλάξεις του 109

110 Ο EGF προκαλεί διμερισμό των εξωκυττάριων περιοχών του EGFR με στοιχειομετρία 2:2 EGF/EGFR. Αυτό επιτυγχάνεται με τις δραματικές δομικές ανακατατάξεις που προκαλεί κάθε μόριο EGF στην εξωκυττάρια περιοχή ενός μονομερούς EGFR, ώστε τα μονομερή αποκτούν τέτοια δομή που επιτρέπει το διμερισμό. Η επίδραση της κυτταροπλασματικής περιοχής του υποδοχέα στις μεταβολές αυτές είναι άγνωστη. Είναι ενδιαφέρουσα η υπόθεση ότι μεταβολές στην κυτταροπλασματική περιοχή του EGFR, που είναι ανεξάρτητες από τον EGF και οφείλονται είτε στην αυτοφωσφορυλίωσή του είτε σε μη εξαρτώμενη από φωσφορυλίωση μεταβολή στη σύνδεσή του με άλλες πρωτεΐνες, θα μπορούσαν να επηρεάσουν την κινητική της διαντίδρασης του EGF με το εξωκυττάριο τμήμα του EGFR. Πράγματι, έχει βρεθεί ότι η αναστρέψιμη διαντίδραση της κυτταροπλασματικής περιοχής του EGFR με φωσφορυλιωμένες μεμβρανικές πρωτεΐνες μπορεί να επηρεάσει το βαθμό συγγένειας με τον οποίο ο EGF προσδένεται στην εξωκυττάρια περιοχή του υποδοχέα. (383) Μία μελέτη αναφέρει ότι η υψηλή συγγένεια πρόσδεσης του ΕGF στον EGFR μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι τα διμερή EGFR, στα οποία έχουν προσδεθεί τα μόρια του EGF, προσδένονται σε μία επιπρόσθετη εξωτερική περιοχή. Ίσως οι επαγώμενες από την GH μεταβολές στη συγγένεια πρόσδεσης του EGF θα μπορούσαν να αντικατοπτρίζουν επαγώμενες από την GH και εξαρτώμενες από την ERK μεταβολές στη σύνδεση του EGFR με μία τέτοια εξωτερική περιοχή. (384) Η πρόσδεση του EGF είτε σε ομοδιμερή EGFR είτε σε ετεροδιμερή EGFR-ErbB-2 ενεργοποιεί τη δραστηριότητα τυροσιν-κινάσης και τη φωσφορυλίωση πολλαπλών περιοχών τυροσίνης, (385,386) πυροδοτώντας διάφορα ενδοκυττάρια μονοπάτια. (387) Η φωσφορυλίωση του EGFR προκαλεί επιστράτευση ενός αριθμού σηματοδοτικών πρωτεϊνών, όπως είναι οι πρωτεΐνες Grb-2, SHC, PTP-1B και η PLCγ. Τα ενδοκυττάρια μονοπάτια που πυροδοτούνται είναι τα Ras/RAF/MEK/ERK (p44/p42 MAPK), p38 MAPK, PKC, PI3K/AKT και το μονοπάτι STAT. (388,389) Εικόνα 60. Τα τρία κύρια ενδοκυττάρια μονοπάτια κατά τη σηματοδότηση του EGF Μετά την πρόσδεση του EGF, ο EGFR υπόκειται σε εσωτερικοποίηση και συμμετέχει σε σηματοδοτικά μονοπάτια που μπορεί να οδηγήσουν στην αρνητική ρύθμιση και την αποδόμηση του υποδοχέα. Υπάρχουν επαρκή στοιχεία που 110

111 υποστηρίζουν ότι η σηματοδότηση του EGFR μπορεί να ξεκινήσει όχι μόνο από τον EGFR της κυτταρικής επιφανείας, αλλά και από υποδοχείς μετά την ενδοκύττωσή τους. (390) 4.1 Η αλληλεπίδραση της GH με το μονοπάτι του EGF/EGFR Ο EGFR είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που προσδένει τον EGF στο εξωκυττάριο τμήμα του και πυροδοτεί τη σηματοδότηση μέσω ενδογενούς δραστηριότητας τυροσιν-κινάσης του κυτταροπλασματικού του τμήματος. Εκτός από καθοριστικό μόριο για την έναρξη δράσης του EGF, ο ΕGFR συμμετέχει στη σηματοδότηση που επάγεται από άλλα ερεθίσματα. Δηλαδή, ο EGFR ενεργοποιείται μετά από την πρόσδεση σε αυτόν του συγκεκριμένου συνδέτη EGF, αλλά μπορεί να ενεργοποιηθεί και από άλλους αυξητικούς παράγοντες, όπως είναι η αυξητική ορμόνη. (391) Εικόνα 61. Η ενεργοποίηση του EGFR από την GH Σε ορισμένες περιπτώσεις, κάποιο ερέθισμα προκαλεί απελευθέρωση διαλυτών συνδετών του EGFR, που μπορούν να ενεργοποιήσουν τον EGFR μετά την πρόσδεσή τους σε αυτόν, στο ίδιο ή σε γειτονικά κύτταρα, ενεργοποιώντας τη δραστηριότητα κινάσης. ( ) Αυτό ονομάζεται διασταυρούμενη ενεργοποίηση. Ένα άλλο είδος διασυνομιλίας είναι η χρησιμοποίηση του EGFR στη σηματοδότηση από άλλο ερέθισμα, χωρίς ενεργοποίηση της δραστηριότητας κινάσης του EGFR, φαινόμενο που εξηγείται από τη διαντίδραση ανάμεσα στη σηματοδότηση της GH και του EGFR. Η θεραπεία με GH προκαλεί τυροσιν-φωσφορυλίωση του EGFR, χωρίς να απαιτείται ακέραιη η περιοχή της κινάσης του EGFR. (396,397) Aποτέλεσμα είναι η δράση του EGFR ως μόριο προσκόλλησης της πρωτεΐνης Grb-2, ώστε να ενισχυθεί η επαγώμενη από την GH ενεργοποίηση του μονοπατιού ERK. Ενώ η επαγώμενη από την GH μεταγραφή γονιδίων όπως του IGF-1, του c-fos, του αναστολέα της πρωτεάσης της σερίνης και των ενζύμων του ηπατικού κυτοχρώματος Ρ450, σχετίζεται με την απευθείας ενεργοποίηση κάποιων από αυτά τα μονοπάτια από την GH, πολλές δράσεις της GH πιθανώς επηρεάζονται από τη διαντίδραση της GH με τα σηματοδοτικά μονοπάτια άλλων αυξητικών παραγόντων. (398,399) Όπως υποδηλώνουν μελέτες σε προλιποκύτταρα 3Τ3-F442A, υπάρχει διασυνομιλία μεταξύ του υποδοχέα GHR και των σηματοδοτικών μονοπατιών του EGFR. 111

112 Επομένως, η GH, εκτός από τυροσιν-φωσφορυλίωση του EGFR, προκαλεί ΕRKεξαρτώμενη φωσφορυλίωση του υποδοχέα. Το αρχικό βήμα στη σηματοδότηση του EGF είναι η ειδική του διαντίδραση με τον EGFR της κυτταρικής επιφανείας. Χρησιμοποιώντας τα προλιποκύτταρα 3T3-F442A, έχει βρεθεί διαντίδραση μεταξύ της σηματοδότησης της GH και του EGF. (396,397,400) Επειδή διαθέτουν υποδοχείς και για τους δύο συνδέτες, τα προλιποκύτταρα αυτά αποτελούν ένα χρήσιμο σύστημα μελέτης τέτοιων διαντιδράσεων χωρίς να είναι απαραίτητη η υπερέκφραση οποιουδήποτε συστατικού. Εκτός από την τυροσιν-φωσφορυλίωση, έχει παρατηρηθεί ότι μετά από θεραπεία των προλιποκυττάρων 3Τ3-F442A με GH προκαλείται θρεονιν-φωσφορυλίωση του EGFR. Aυτή η επαγώμενη από την GH φωσφορυλίωση του EGFR αναστέλλεται με προθεραπεία με αναστολείς της ΜΑΡ κινάσης (ΜΕΚ) 1, επομένως στοιχειoθετείται η εμπλοκή του μονοπατιού ERK. Είναι ενδιαφέρον ότι η συγχορήγηση GH και EGF μείωσε σημαντικά την επαγώμενη από τον EGF αποδόμηση και την αρνητική ρύθμιση του EGFR. Αυτές οι δράσεις της GH αναστέλλονται μετά από αναστολή του ΜΕΚ1. Αντιθέτως, ο ρυθμός εσωτερικοποίησης του σημασμένου με ραδιενεργό ιώδιο EGF (Ι 125 -ΕGF) μέσα σε 10 λεπτά μετά την αρχική πρόσδεση δεν επηρεαζόταν από την GH. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την ύπαρξη ERK-εξαρτώμενων δράσεων της GH στην επαγώμενη από τον EGF σηματοδότηση του EGFR, μετά από το επίπεδο της ενδοκύττωσης. Έχει επίσης βρεθεί ότι η προθεραπεία με GH προκάλεσε παροδική, αλλά σημαντική μείωση της πρόσδεσης Ι 125 -EGF. Πειράματα έδειξαν ότι η μειωμένη πρόσδεση οφείλεται πρωτίστως σε μειωμένη συγγένεια, παρά σε μεταβολή του αριθμού των δεσμευτικών περιοχών του EGFR. H επίδραση της GH στην πρόσδεση του EGF ήταν εξαρτώμενη από τη συγκέντρωσή της και σχετιζόταν προσωρινά με την επαγώμενη από την GH ενεργοποίηση του ERK. Η αναστολή της ενεργοποίησης του ΜΕΚ, αλλά όχι της ενεργοποίησης της πρωτεϊνικής κινάσης C, εμπόδιζε τις δράσεις της GH στην πρόσδεση του EGF. Συμπερασματικά, τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η GH μπορεί να ρυθμίζει τόσο την πρόσδεση του EGF όσο και τη μετά την πρόσδεση σηματοδότηση του EGFR, με έναν εξαρτώμενο από τον ΜΕΚ1/ΕRK τρόπο. Εικόνα 62. Η διασυνομιλία μεταξύ GHR και EGFR. Η GH προκαλεί τυροσιν-φωσφορυλίωση (Yp) και σεριν-/θρεονιν-φωσφορυλίωση του ErbB2 (S/Tp). H πρώτη θεωρείται ότι συμβάλλει στην GH-επαγώμενη ενεργοποίηση του ERK, ενώ η δεύτερη απευαισθητοποιεί τον ErbB2 στην EGF-επαγώμενη ενεργοποίηση. 112

113 Επομένως, στα προλιποκύτταρα 3T3-F442A η GH προάγει τόσο την τυροσινφωσφορυλίωση όσο και τη θρεονιν-φωσφορυλίωση του EGFR και η αναστολή του MEK1/ERK μονοπατιού αναστέλλει την επαγώμενη από την GH θρεονινφωσφορυλίωση, αλλά όχι την τυροσιν-φωσφορυλίωση. (397,400) Μία από τις πρώτες ενδείξεις αλληλεπίδρασης GH και EGFR ήταν η παρατήρηση ότι η έλλειψη GH σε μεταλλαγμένα ποντίκια, όπως και η υποφυσεκτομή, συνοδεύονται από μειωμένη έκφραση του EGFR στο ήπαρ. Επιπλέον, η χορήγηση GH σε αυτά τα ποντίκια προκαλούσε επαγωγή του υποδοχέα EGFR, προσεγγίζοντας τα επίπεδά του στα φυσιολογικά ποντίκια. (401) 4.2 Αρνητική ρύθμιση του άξονα EGF/EGFR Ο EGFR ελέγχει πολλαπλές φυσιολογικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως είναι ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση, η διαφοροποίηση και η επιβίωση. Επίσης, η διαταραγμένη σηματοδότηση μέσω του EGFR έχει συσχετισθεί με ανθρώπινους καρκίνους. Για όλους αυτούς τους λόγους, ο EGFR υπόκειται σε διάφορες ρυθμιστικές διεργασίες. H σηματοδότηση του EGFR ξεκινά με την ενεργοποίηση της δραστηριότητας τυροσιν-κινάσης του ίδιου του υποδοχέα. Οι ενεργοποιημένοι EGFR στοχεύονται αμέσως από ανασταλτικούς μηχανισμούς που δεν απαιτούν de novo πρωτεϊνική σύνθεση. Τέτοιοι είναι η αποφωσφορυλίωση από πρωτεϊνικές τυροσιν-φωσφατάσες (Protein Tyrosine Phosphatases/PTPs) (402,403) και η ενδοκύττωση. (404,405) Η ισορροπία ανάμεσα στη συνεχιζόμενη δραστηριότητα κινάσης του EGFR και στη λειτουργία των PTP είναι καθοριστικής σημασίας για τη συνολική φωσφορυλίωση του EGFR και τη δυνατότητα σηματοδότησής του. Η απουσία δραστηριότητας των PTP (406) και η αδυναμία αρνητικής ρύθμισης του υποδοχέα, (407) ίσως είναι ευνοϊκή για την ογκογόνο δραστηριότητα του EGFR. Οι Mattila και συν. έδειξαν ότι η ιντεγκρίνη α 1 β 1, που προσδένεται στο κολλαγόνο, λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης του EGFR, μέσω της ενεργοποίησης μιας τυροσιν-φωσφατάσης της TC-PTP. (408) Επιπλέον, μετά από την πρόσδεση του συνδέτη, ο ενεργοποιημένος EGFR υφίσταται ενδοκύττωση, είτε εξαρτώμενη από την κλαθρίνη είτε όχι, και αποδομείται στο λυσόσωμα, διακόπτοντας τη σηματοδότηση. Τα ενδοσώματα παραλαμβάνουν το «φορτίο» τους από την κυτταροπλασματική μεμβράνη και το ανακυκλώνουν είτε πίσω στη μεμβράνη είτε το επιλέγουν για αποδόμηση στα λυσοσώματα. Οι EGFR ανακυκλώνονται μεταξύ κυτταροπλασματικής μεμβράνης και των Multivesicular Bodies (MVBs) μέχρι να ενεργοποιηθούν. Το σύστημα μεταφοράς-επιλογής δρα μέσω διαχωρισμού των «φορτίων» σε ενδοαυλικά κυστίδια και εξαρτάται από λιγάσες της ουβικουιτίνης που κάνουν την επιλογή. Η πρωτεΐνη c-cbl επιστρατεύεται κυρίως ως Ε3-λιγάση σε περιοχές φωσφορυλιωμένων τυροσινών του υποδοχέα, τον οποίο μαρκάρει για μεταφορά στα MVBs. Στα MVBs γίνεται δεύτερη επιλογή μέσω ουβικουιτινυλίωσης για αποδόμηση στο λυσόσωμα και είναι καθοριστική για τον EGFR, γιατί εμποδίζει την αδιάκοπη ανακύκλωσή του μεταξύ ενδοσωμάτων και 113

114 κυτταροπλασματικής μεμβράνης κι επιτρέπει τον ακριβή του έλεγχο μειώνοντας το χρόνο ημιζωής του. Το σύστημα επιλογής αποτελείται από 3 πρωτεϊνικά συμπλέγματα, τα ESCRT-I, -II, -III. Στην πορεία του προς το λυσόσωμα, ο υποδοχέας εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των σηματοδοτικών του μονοπατιών. Επομένως, η ενδοκύττωση αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή της σηματοδότησης του EGFR. Η πρωτεΐνη β-trcp εμπλέκεται στην πολυουβικουιτινυλίωση κατά τη μεταφορά του EGFR στα MVBs και κατόπιν κατά τη μεταφορά του στο λυσόσωμα για αποδόμηση. Αποτελεί συνεπώς αρνητικό ρυθμιστή του υποδοχέα. Επιπρόσθετη αρνητική ρύθμιση του EGFR προκύπτει από την de novo έκφραση αναστολέων του EGFR, που κωδικοποιούνται από γονίδια των οποίων η μεταγραφή ενεργοποιείται από τη σηματοδότηση του EGFR. Τέτοιοι αναστολείς είναι οι IFI (Inducible feedback inhibitors). Έχουν αναγνωρισθεί τέσσερις έως τώρα στα θηλαστικά: η πρωτεΐνη LRIG1 (leukine-rich and immunoglobulin-like domains protein 1), (409) η SOCS-4, η SOCS-5 και η RALT (Receptor-associated late transducer). (410) Εικόνα 63. Οι IFIs Οι αναστολείς LRIG1, SOCS-4 και SOCS-5 μάλλον προάγουν την εξαρτώμενη από το συνδέτη αποδόμηση του EGFR. Συγκεκριμένα, ο LRIG ρυθμίζει την έκφραση του EGFR με τρεις μηχανισμούς. α) Προσδένεται σε υποδοχείς EGFR στους οποίους δεν είναι προσδεδεμένος ο συνδέτης. Οι υποδοχείς ακολούθως αποδομούνται με έναν μηχανισμό που δεν έχει ακόμα διαλευκανθεί. β) Ο LRIG1 προσδένεται στον ενεργοποιημένο EGFR (παρουσία του συνδέτη), με αποτέλεσμα την τυροσινφωσφορυλίωση μιας Cbl που είναι συνδεδεμένη με το LRIG1. Η Cbl στη συνέχεια διαμεσολαβεί την ουβικουιτινυλίωση του EGFR. γ) Η εξωκυττάρια περιοχή του LRIG1 απελευθερώνεται στον εξωκυττάριο χώρο μετά από δράση του ενζύμου ADAM, όπου δρα ως ανταγωνιστικός αναστολέας του EGF. Οι πρωτεΐνες SOCS-4 και SOCS-5 προσδένονται στον EGFR κι επιφέρουν την αποδόμησή του μέσω της ουβικουιτινυλίωσής του από μία άγνωστη έως τώρα Ε3 λιγάση. Ο αναστολέας RALT αναστέλλει την καταλυτική δράση του EGFR ανεξάρτητα από το συνδέτη. Η μεταγραφική ενεργοποίηση των γονιδίων των IFIs είναι παροδική, με αποτέλεσμα η έκφρασή τους να περιορίζεται σε λίγες ώρες, διάρκεια που μάλλον συμπίπτει με την G 1 φάση του κυτταρικού κύκλου στα κύτταρα που πολλαπλασιάζονται υπό την επίδραση του EGF. Και οι τέσσερις πρωτεΐνες υφίστανται αποδόμηση που εξαρτάται από το πρωτεάσωμα. 114

115 Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεΐνες SOCS ρυθμίζουν την έκφραση του EGFR. (411,412) H σηματοδότηση του EGF καθορίζει σε μεγάλο βαθμό τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων και λόγω της εν δυνάμει ογκογονικότητάς του ο υποδοχέας του, EGFR, είναι από τα καλύτερα χαρακτηρισμένα υποστρώματα των SH2 διαντιδράσεων. (413) Η σηματοδότηση του EGFR διαμεσολαβείται είτε από την άμεση πρόσδεση των πρωτεϊνών STAΤ και τη διασταυρούμενη ενεργοποίησή τους είτε από τις πρωτεΐνες Grb2 και Shc, οι οποίες συνδέονται στα μονοπάτια Ras-MAPK και Ras-PI3K-AKT/PKB. Επιπρόσθετες πρωτεΐνες με περιοχή SH2 συμβάλλουν στην αρνητική ρύθμιση του EGFR, όπως είναι η φωσφατάση SHP1 και η λιγάση της ουβικουιτίνης Cbl. Εικόνα 64. Α) Η δράση του LRIG1, B)Η δράση των SOCS-4 και SOCS-5 Η πρωτεΐνη SOCS-2 έχει αναφερθεί ότι είναι αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης του μεταγραφικού παράγοντα STAT5b που ξεκινά από τον EGFR, χωρίς να απαιτείται αποδόμηση, (414) ενώ οι SOCS-1 και SOCS-3 έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζουν αρνητικά τη σηματοδότηση STAT1-EGFR. Οι ανθρώπινες SOCS-4 και SOCS-5 παρουσιάζουν ομοιότητα αλληλουχίας με την SH2 κατά 90%. Έχει βρεθεί ότι η επαγώμενη από τον EGF έκφραση των SOCS-4 και SOCS-5 μειώνει τη σηματοδότηση της STAT3 ως αποτέλεσμα της αυξημένης αποδόμησης του EGFR. (415) Η ανάπτυξη αρκετών συμπαγών όγκων συσχετίζεται με την υπερέκφραση του EGFR, η οποία επίσης συνοδεύεται από κακή πρόγνωση των ασθενών. Για το λόγο αυτό, ο EGFR αποτελεί θεραπευτικό στόχο μονοκλονικών αντισωμάτων, π.χ. cetuximab, τα οποία αναστέλλουν την ενεργοποίηση του υποδοχέα. Πράγματι, τέτοια αντισώματα έχουν αποδειχθεί πολύ σημαντικά για τη θεραπεία συμπαγών όγκων, ιδιαίτερα σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία. (416) Εκτός από την πρόσδεση στον υποδοχέα, υπάρχουν αναφορές ότι τα μονοκλονικά αντισώματα προάγουν την εσωτερικοποίηση και αποδόμηση του υποδοχέα στα λυσοσώματα. Ο βαθμός αυτής της αρνητικής ρύθμισης του EGFR έχει βρεθεί ότι εξαρτάται από το μέγεθος των συμπλεγμάτων του υποδοχέα που σχηματίζονται στην κυτταρική επιφάνεια. (417) 115

116 4.3 Aυξητικοί παράγοντες και καρκίνος Η GH, εκτός από τις επιδράσεις της στην αύξηση και στο μεταβολισμό, συμμετέχει και στην ογκογένεση, όπως και στην εξέλιξη του καρκίνου. Η υπερέκφραση της GH έχει συσχετιστεί με καρκίνο σε μοντέλα ζώων, αλλά και στον άνθρωπο. Πράγματι, σε ασθενείς με ακρομεγαλία περίπου 15% των θανάτων οφείλονται σε κακοήθεια, ειδικά του παχέως εντέρου, πιθανώς λόγω αυξημένων επιπέδων IGF-I. (418) Επίσης, αδενώματα του παχέως εντέρου συμβαίνουν πιο συχνά στους ασθενείς αυτούς, συμπεριφέρονται πιο επιθετικά κι έχουν μεγαλύτερη τάση για εξαλλαγή. Η μη ελεγχόμενη νόσος συσχετίζεται με αυξημένη επίπτωση νεοπλασμάτων, τα οποία είναι συνήθως επιθετικά. Αν τα επίπεδα της GH μετά τη θεραπεία βρίσκονται υπό έλεγχο, τόσο η συνολική θνησιμότητα όσο και η οφειλόμενη σε καρκίνο δε διαφέρουν από του φυσιολογικού πληθυσμού. Στοιχεία που προσδίδουν στην GH ρόλο ως προς την καρκινογένεση προκύπτουν από δεδομένα αύξησης φυσιολογικών παιδιών. Μία αναδρομική μελέτη του 1946 από το Ηνωμένο Βασίλειο ανέφερε την ύπαρξη σημαντικά μεγαλύτερου κινδύνου για καρκίνο του μαστού σε γυναίκες που ήταν ψηλές στην ηλικία των 7 ετών. (419) Επίσης, γυναίκες που ψήλωσαν γρήγορα στην εφηβεία είχαν περίπου 30% αυξημένο κίνδυνο για προεμμηνοπαυσιακό καρκίνο μαστού και 40% αυξημένο κίνδυνο για μετεμμηνοπαυσιακό καρκίνο μαστού. Σε μια άλλη αναδρομική μελέτη από γυναίκες από τη Δανία βρέθηκε ότι το μεγάλο βάρος γέννησης, το υψηλό ανάστημα στην ηλικία των 14 ετών, ο χαμηλός δείκτης μάζας σώματος στην ηλικία των 14 ετών και η μέγιστη αύξηση σε πρώιμο στάδιο ήταν ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του μαστού. (420) Αν και υπάρχουν αρκετά στοιχεία που συσχετίζουν το μεγαλύτερο ανάστημα στην παιδική ηλικία και στην ενήλικο ζωή με αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο, οι εμπλεκόμενοι μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς και μπορεί να περιλαμβάνουν την έκθεση σε στεροειδή του φύλου, την αυξημένη πρόσληψη θερμίδων και τον αυξημένο συνολικό αριθμό κυττάρων. Αν και όλες αυτές οι πιθανότητες μπορεί να διαμεσολαβούνται από τον IGF-I, δεν έχει βρεθεί αιτιολογική σύνδεση ανάμεσα στον άξονα GH/IGF-I και στον κίνδυνο για καρκίνο στις μελέτες αυτές. Επιπλέον, διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν GH, είναι περισσότερο επιρρεπή στην ανάπτυξη καρκίνου. Σε προχωρημένη ηλικία δε, παρουσιάζουν αυξημένη πιθανότητα να αναπτύξουν ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. (421) Αντιθέτως, η απουσία ή τα χαμηλά επίπεδα GH συσχετίζονται με μειωμένη τάση για ανάπτυξη κακοηθειών είτε αυθορμήτως (422) είτε μετά από χορήγηση καρκινογόνων. (423) Η αυξημένη επίπτωση ηπατοκυτταρικού καρκίνου στα διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν GH, θα μπορούσε να αποδοθεί στα υψηλά επίπεδα κυκλοφορούντος IGF-I. Ωστόσο, έχει περιγραφεί ότι το IGF-I επάγει ποικίλες μεταβολικές δράσεις στο ήπαρ, αλλά μικρή αύξηση στη σύνθεση του DNA. (424) Επίσης, η πρόσδεση του IGF-I στα ηπατοκύτταρα είναι ελάχιστα ανιχνεύσιμη, (425) ενώ διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν IGF-I δεν παρουσιάζουν τις ιστοπαθολογικές μεταβολές που παρατηρούνται στο ήπαρ των διαγονιδιακών ποντικιών που υπερεκφράζουν GH. 116

117 Υπάρχουν αρκετές αναφορές για τη σύνδεση του IGF-I με την ανάπτυξη του καρκίνου. Η πρώτη έμμεση αναφορά έγινε πριν από 50 χρόνια όταν παρατηρήθηκε ότι γυναίκες με καρκίνο μαστού που είχαν υποβληθεί σε υποφυσεκτομή είχαν καλύτερη πρόγνωση. Πιο άμεση ένδειξη αποτελεί η παρατήρηση ότι άτομα με υψηλότερα επίπεδα IGF-I και χαμηλότερα επίπεδα IGFBP-3, εντός των φυσιολογικών ορίων, έχουν αυξημένο κίνδυνο για πολλούς από τους κοινούς καρκίνους, όπως του παχέως εντέρου, του στήθους, του πνεύμονα και του προστάτη. (426,427) Βέβαια, ίσως τα υψηλά επίπεδα IGF-I να μην είναι η γενεσιουργός αιτία του καρκίνου, αλλά το αποτέλεσμα κάποιας άλλης διεργασίας. Ο IGF-I έχει επιδράσεις σε καθένα από τα στάδια ανάπτυξης του καρκίνου: στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην απόπτωση, στην αγγειογένεση και στη μετάσταση, στην ανάπτυξη αντίστασης σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. (428) Πρόκειται για έναν εν δυνάμει πολλαπλασιαστικό παράγοντα που επηρεάζει σχεδόν κάθε κυτταρικό τύπο, δράση που διαμεσολαβείται κυρίως μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού της ΜΑΡ κινάσης. Εκτός από τις πολλαπλασιαστικές του δράσεις, ο IGF-I είναι επίσης ισχυρός αντιαποπτωτικός παράγων και αυτή του η δράση διαμεσολαβείται κυρίως μέσω του μονοπατιού της PI3 κινάσης. (429) Έχει βρεθεί από αρκετά πειράματα ότι ο άξονας GH/IGF-I όχι μόνο επηρεάζει την πολλαπλασιαστική συμπεριφορά του καρκίνου του μαστού, αλλά επίσης διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων του μαστού. (430) Λαμβάνοντας υπόψην την αναβολική και μιτογόνο δράση της GH και την αντιαποπτωτική δράση του IGF-I, η θεραπευτική χρήση της GH έχει προκαλέσει έντονο ενδιαφέρον. Δεδομένου ότι και οι δύο ορμόνες μπορούν να προκαλέσουν πολλαπλασιασμό σε φυσιολογικά και κακοήθη κύτταρα, η πιθανότητα η θεραπεία με GH να επάγει καρκίνο, να αυξάνει τον κίνδυνο υποτροπής ενός όγκου σε ασθενείς που έχουν θεραπευτεί για κακοήθεια ή να αυξάνει τον κίνδυνο καρκίνου σε ασθενείς με προδιάθεση, έχει δημιουργήσει προβληματισμό. Ωστόσο, μια σειρά από μελέτες έχουν δείξει ότι δεν υπάρχει αυξημένος κίνδυνος για ανάπτυξη λευχαιμίας σε άτομα στα οποία χορηγήθηκε GH, εκτός αν υπάρχει υποκείμενη προδιάθεση. Ακόμα και σε παιδιά με προηγούμενη διάγνωση καρκίνου, η επακόλουθη χορήγηση GH δεν αυξάνει τον κίνδυνο υποτροπής. Ωστόσο, η βραχυπρόθεσμη παρακολούθηση ασθενών μετά από χορήγηση υποφυσιακής GH ανέδειξε αυξημένη επίπτωση καρκίνου παχέως εντέρου. Επιπλέον, η παρακολούθηση ογκολογικών ασθενών έχει αποκαλύψει αύξηση σε δεύτερα νεοπλάσματα σε αυτούς που έλαβαν GH. (431) Ο EGF και ο υποδοχέας του, EGFR, έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται στην παθογένεση και στην εξέλιξη διαφόρων τύπων καρκίνου. (432) Αυξημένα επίπεδα EGFR έχουν αναγνωρισθεί ως κοινό χαρακτηριστικό πολλών καρκινικών τύπων και φαίνεται ότι προάγουν την αύξηση συμπαγών όγκων. Από το 1985 ως το 2000 πραγματοποιήθηκαν περισσότερες από 200 μελέτες που αφορούσαν περισσότερους από ασθενείς και οι οποίες ανέδειξαν ότι 10 κυτταρικοί τύποι εκφράζουν τον EGFR σε υψηλά επίπεδα. Ο EGFR βρέθηκε ότι δρα ως ισχυρός προγνωστικός παράγοντας για τους καρκίνους της κεφαλής και του τραχήλου, των ωοθηκών, του τραχήλου της μήτρας, της ουροδόχου κύστεως και του οισοφάγου. Σε όλους αυτούς τους καρκίνους, η αυξημένη έκφραση του EGFR συσχετιζόταν με μειωμένη ελεύθερη 117

118 υποτροπής περίοδο ή μειωμένη ολική επιβίωση στο 70% των μελετών. Ωστόσο, ακόμα και σε καρκινικούς τύπους που δεν ανιχνεύθηκε η προγνωστική σπουδαιότητα του EGFR, η αντι-egfr θεραπεία μπορεί να είναι ωφέλιμη. (433) O υποδοχέας του EGF (Epidermal Growth Factor Receptor/EGFR), ένας μεσολαβητής του signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκίνους, όπως είναι το καρκίνωμα της κεφαλής και του τραχήλου. Μελέτες έχουν αναδείξει ρόλο του STAT3 ως ογκογονίδιο. (434,435) Θεραπείες, όπως μονοκλονικά αντισώματα και αναστολείς της τυροσιν-κινάσης που στοχεύουν τον EGFR, έχουν περιορισμένη αντιογκογόνο δράση, που μπορεί εν μέρει να εξηγηθεί από τη συνεχή ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3, παρά την αναστολή του EGFR. H ενεργοποίηση του STAT3 επάγει έκφραση γονιδίων-στόχων στο καρκίνωμα της κεφαλής και του τραχήλου, όπως είναι το γονίδιο του Bcl-XL, το οποίο είναι μεσολαβητής της αντιαποπτωτικής δραστηριότητας. Η υπερέκφραση του EGFR έχει ανευρεθεί σε διάφορες κακοήθειες, στις οποίες τα επίπεδα του EGFR συσχετίζονται με μειωμένη επιβίωση των ασθενών. (436) H συνδυασμένη στόχευση του σηματοδοτικού άξονα των EGFR-STAT3-Bcl-XL αποτελεί μία πιθανή μελλοντική θεραπεία για καρκίνους όπως ο καρκίνος της κεφαλής και του τραχήλου. (437) Η ενεργοποίηση του STAT3 έχει συσχετισθεί με θετική ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και ενισχύεται σε καρκινικά κύτταρα. Το STAT3 επίσης παίζει σημαντικό ρόλο στη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, μέσω θετικής ρύθμισης των κυκλινών Α και D και της κυκλινοεξαρτώμενης κινάσης 25 (cdk25), και μέσω ταυτόχρονης αρνητικής ρύθμισης του αναστολέα των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών ρ21. Είναι γνωστή η σχέση ανάμεσα στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και τα υψηλά επίπεδα GH. Μία πιθανή εξήγηση θα μπορούσε να είναι ο ρυθμιστικός ρόλος της GH σε μιτογόνα του ήπατος, όπως είναι ο EGF. Η GH, όπως έχει ήδη αναφερθεί, ρυθμίζει την ηπατική έκκριση του EGFR. 118

119 Κεφάλαιο 5 : ΣΚΟΠΟΣ Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η περαιτέρω διαλεύκανση της παθολογικής ενδοκυττάριας σηματοδότησης της GH και της αρνητικής ρύθμισής της από τις πρωτεΐνες p21, CIS, ucis και β-trcp, στη Διαταραχή της Μεταβίβασης του Σήματος της GH (GHTD). Επιπλέον, επιχειρήθηκε η διευκρίνιση του μηχανισμού της αποκατάστασης της παραγωγής του IGF-I και της σωματικής αύξησης των παιδιών με GHTD μετά από θεραπεία με hgh. 119

120 Κεφάλαιο 6 : ΑΣΘΕΝΕΙΣ - ΜΕΘΟΔΟΙ 6.1 Ασθενείς με GHTD Α) Περιγραφή των προς μελέτη ασθενών (A μέρος πειραμάτων) Για το Α μέρος πειραμάτων μελετήθηκαν 10 ασθενείς με διαταραχή Growth Hormone Transduction Defect (GHTD) και 5 μάρτυρες. Οι ασθενείς παρακολουθούνταν στα Εξωτερικά Ιατρεία του Τμήματος Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας και Διαβήτη του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Εξασφαλίσθηκε γραπτή έγκριση των παιδιών και των γονέων τους. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Οι σωματομετρικές μετρήσεις, τα κλινικά χαρακτηριστικά και οι εργαστηριακές παράμετροι των ασθενών και των μαρτύρων ήταν τα ακόλουθα: 5 Μάρτυρες 10 Ασθενείς Ηλικία 8-11 ετών 8-11 ετών Ύψος +1SD - +2SD -3SD - -4SD BMI (%) 50-75% (Φ.Τ. <85%) 55-80% (Φ.Τ. <85%) Οστική ηλικία 7-10,5 ετών 5-8 ετών Στάδιο εφηβείας Tanner I Tanner I Βάρος γέννησης AGA AGA IGF-I ng/ml ng/ml (Φ.Τ ) Τιμές GH μετά από φαρμακολογική πρόκληση (κλονιδίνη, L-DOPA) - 11,5-20,2 ng/ml (Φ.Τ. >10 ng/ml) Τιμές 24ωρης έκκρισης GH Ανταπόκριση IGF-I στο IGF-I generation test - 3,8-4,4 ng/ml (Φ.Τ. 3,5-5,2) % (Φ.Τ. ~100%) Πίνακας 4. Χαρακτηριστικά των προς μελέτη ασθενών 120

121 Β) Περιγραφή του προς μελέτη ασθενή με GHTD (Β και Γ μέρος πειραμάτων) Για το Β και Γ μέρος πειραμάτων μελετήθηκαν επιλεκτικά ένας ασθενής με GHTD κι ένας μάρτυρας. Ο ασθενής παρουσίαζε τα κάτωθι χαρακτηριστικά κατά την περίοδο της πρώτης επίσκεψής του στα Εξωτερικά Ιατρεία της Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας: Σωματομετρικές μετρήσεις, κλινικά χαρακτηριστικά και εργαστηριακές παράμετροι του προς μελέτη ασθενή με GHTD Ηλικία Ύψος Βάρος σώματος Οστική ηλικία Στάδιο εφηβείας Βάρος γέννησης IGF-I Τιμές GH μετά από φαρμακολογική πρόκληση Τιμές 24ωρης έκκρισης GH Ανταπόκριση IGF-I στο IGF-I generation test Απόκριση μετά από εξωγενή χορήγηση ανθρώπινης βιοσυνθετικής hgh 8 6/12 ετών 119,4cm (<3 η % θέση, > -3,5 SD) 22,5kg (5 η -10 η % θέση) 6 6/12 ετών Εφήβαιο: Tanner I, όρχεις: 2,5ml άμφω 2950g (AGA) 100 ng/ml κ.φ. κ.φ. 370% αύξηση Σημαντική αναπλήρωση της αύξησης, επίτευξη φυσιολογικού τελικού αναστήματος (25 η -50 η % θέση) Πίνακας 5. Χαρακτηριστικά του προς μελέτη ασθενή 121

122 Ο ασθενής παρουσίαζε ανεπάρκεια αύξησης από την ηλικία των 5 ετών. Η έναρξη της θεραπείας με ανθρώπινη βιοσυνθετική hgh έγινε σε ηλικία περίπου 9,5 ετών. Ακολούθησε σημαντική αναπλήρωση της αύξησης. Εικόνα 65. Καμπύλες ανάπτυξης του ασθενή με GHTD Τα αποτελέσματα της διπλής δοκιμασίας πρόκλησης GH μετά από χορήγηση κλονιδίνης και L-DOPA καταγράφονται στον παρακάτω πίνακα. 1 η Δοκιμασία πρόκλησης GH GH: ng/ml 2 η Δοκιμασία πρόκλησης GH GH: ng/ml t=0 0,2 t=0 3,1 t=15 3,1 t=15 t=30 11,8 t=30 3,0 t=60 3,9 t=60 4,3 t=90 2,2 t=90 7,1 t=120 3,1 t=120 8,4 Πίνακας 6. Δοκιμασία προκλητών εξετάσεων 122

123 Οι τιμές των IGF-I και IGF-BP3 κατά τη δοκιμασία διέγερσης IGF-I καταγράφονται στον παρακάτω πίνακα. IGF-I generation test 1 η ημέρα 2 η ημέρα 3 η ημέρα 4 η ημέρα 5 η ημέρα IGF-I (ng/ml) IGFBP -3 (mg/l) IGF-I (ng/ml) IGFBP -3 (mg/l) IGF-I (ng/ml) IGFB P-3 (mg/l) IGF-I (ng/ml) IGFBP -3 (mg/l) IGF-I (ng/ml) IGFBP -3 (mg/l) 90 2, , ,4 81 3, ,35 Πίνακας 7. Δοκιμασία διέγερσης IGF-I. Τιμές IGF-I και IGFBP-3 μετά από 4 ημέρες χορήγησης GH Ήδη παλαιότερα είχε αποκλεισθεί στον ασθενή το Σύνδρομο Αντίστασης στην GH (GHIS) και η βιοανενεργή GH με αλληλούχιση των γονιδίων GHR και GH-1, κατά την οποία δε διαπιστώθηκαν ανωμαλίες σε κανένα από τα 10 εξόνια του γονιδίου GHR και σε κανένα από τα πέντε εξόνια και τις περιοχές ματίσματος του γονιδίου GH-1. Τα πειράματα της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκαν όταν ο ασθενής βρισκόταν σε ηλικία ετών και τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν ελήφθησαν κατά τη διάρκεια αυτής της ηλικιακής περιόδου. Ο μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε είχε φυσιολογικό ύψος και βάρος σώματος και η ηλικία του ήταν παρόμοια με του ασθενή. 6.2 Μεθοδολογία Λήψη και διαχείριση καλλιεργειών ινοβλαστών Πραγματοποιήθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες από ινοβλάστες ούλων του ασθενή με GHTD κι ενός μάρτυρα. Οι βιοψίες ούλων ελήφθησαν από Οδοντίατρο και τοποθετήθηκαν σε σωλήνες falcon των 15 ml, εντός των οποίων υπήρχαν 5ml θρεπτικού υλικού DMEM (Doulbeccos Modified Eagle Medium Gibco), εμπλουτισμένου με 10% FCS (Fetal calf serum Gibco) και 2% αντιβιοτικά στρεπτομυκίνη-πενικιλλίνη (Seromed-Biochrom, 10,000u, 10,000mg/ml A2212). Εικόνα 66. Σωλήνας falcon 15 ml με θρεπτικό υλικό και βιοψία ούλων 123

124 Τα ιστοτεμάχια μεταφέρθηκαν σε τρυβλία διαμέτρου 35x10mm και τεμαχίστηκαν με αποστειρωμένο νυστέρι στα μικρότερα δυνατά κομμάτια, με στόχο την επιτυχή προσκόλληση του ιστού στον πυθμένα του τρυβλίου. Εικόνα 67. Τρυβλίο petri Κατόπιν, προστέθηκαν 5 ml πλήρους θρεπτικού υλικού ανά τρυβλίο και ανθρώπινη βιοσυνθετική αυξητική ορμόνη (Genotropin, Pharmacia 5,3mg) σε τελική συγκέντρωση 4μg/ml/τρυβλίο, σύμφωνα με το πρωτόκολλο, και τα τρυβλία μεταφέρθηκαν σε επωαστικό θάλαμο, σε σταθερές συνθήκες, ατμόσφαιρα 5% CO 2 και θερμοκρασία 37 C. Η όλη διαδικασία πραγματοποιήθηκε υπό πλήρως άσηπτες συνθήκες. Τα τρυβλία παρέμειναν στον επωαστικό θάλαμο για τρεις εβδομάδες, προκειμένου να εξαχθούν οι ινοβλάστες από τα ιστοτεμάχια. Εικόνα 68. a) Ιστοτεμάχιο βιοψίας ούλων στο πρώτο στάδιο επεξεργασίας της, b) 1 εβδομάδα αργότερα εξέρχονται τα πρώτα κερατινοκύτταρα, c) 3 εβδομάδες αργότερα έχουν ήδη εξέλθει ινοβλάστες, d) Καλλιέργεια ινοβλαστών απομακρυσμένη από τη βιοψία. Για τις πρώτες 5 ημέρες το θρεπτικό υλικό δεν ανανεωνόταν, κατόπιν γινόταν ανανέωση έως ότου οι ινοβλάστες καταλάβουν το 80-90% του πυθμένα του τρυβλίου. Στο σημείο αυτό ξεκινούσε η ανακαλλιέργεια των ινοβλαστών. Η διαδικασία της ανακαλλιέργειας είναι η εξής: Α) Αφαιρείται το θρεπτικό υλικό από το τρυβλίο με τη χρήση αντλίας και ακολουθεί ξέπλυμα των κυττάρων με τη χρήση του αποστειρωμένου διαλύματος PBS (Phosphate Buffer Saline) σε αραίωση 1x από 10x. Β) Προστίθεται 0,5 ml θρυψίνης (Seromed-Biochrom) σε κάθε τρυβλίο και το τρυβλίο μεταφέρεται στον επωαστικό θάλαμο για περίπου 2 λεπτά. Η θρυψίνη είναι μία παγκρεατική πρωτεάση της σερίνης κι έχει την ιδιότητα να αποκολλά τα κύτταρα 124

125 από τον πυθμένα του τρυβλίου. Στη συνέχεια, η θρυψίνη απομακρύνεται στο μεγαλύτερο βαθμό της και το τρυβλίο τοποθετείται στον επωαστικό θάλαμο για 10 επιπλέον λεπτά, ώστε να δράσει η υπολειπόμενη θρυψίνη. Στο τέλος του χρονικού αυτού διαστήματος οι ινοβλάστες έχουν αποκολληθεί κι έχουν αποκτήσει σφαιρική μορφή, ενώ όταν ήταν προσκολλημένοι στον πυθμένα του τρυβλίου είχαν επιμήκη μορφολογία. Γ) Κατόπιν, 4 ml πλήρους θρεπτικού υλικού προστίθενται σε κάθε τρυβλίο, τα κύτταρα αναδιαλύονται και 2 ml από το εναιώρημα αυτό μεταφέρονται σε νέο μεγαλύτερο τρυβλίο. Στο νέο τρυβλίο προστίθενται 8 ml πλήρους θρεπτικού υλικού, έως συνολικό όγκο 10 ml. Το θρεπτικό υλικό των καλλιεργειών ινοβλαστών ανανεώνεται ανά 2-3 ημέρες, ώστε να απομακρύνονται η υπολειπόμενη θρυψίνη που είναι τοξική για τα κύτταρα, τα νεκρά κύτταρα και οι τοξίνες. H διαδικασία της ανακαλλιέργειας επαναλαμβάνεται έως 6 φορές, καθώς μετά το πέρας αυτών τα κύτταρα είναι πλέον γερασμένα και η συμπεριφορά τους σε πειράματα απρόβλεπτη. Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τις κυτταρoκαλλιέργειες είναι: 1) DMEM, GIBCO, 1x, Invitrogen, ) Pen Strep, GIBCO, Invitrogen, ) Fungizone, Amphotericin B, GIBCO, Invitrogen, ) Fetal Bovine Serum (FBS), GIBCO, Invitrogen, ) 5% Trypsin, Trypsin-EDTA 10x, GIBCO, Invitrogen, ) Trypsin 1x : Για την παρασκευή 50ml Trypsin 1x χρησιμοποιήθηκαν 5ml Trypsin 10x και 45ml PBS 1x. 7) PBS 10x : Για την παρασκευή 500ml χρησιμοποιήθηκαν 1 gr KCl, 40gr NaCl, 7,2gr Na 2 HPO4, 1,2gr KH 2 PO4 και έως συμπληρώσεως όγκου 500ml απιονισμένο Η2Ο (dη 2 Ο). Ρύθμιση του ph στην τιμή 7,4 και προσθήκη δις απεσταγμένου νερού έως την ποσότητα όγκου των 500 ml. 8) PBS 1x : Για την παρασκευή 1000ml χρησιμοποιήθηκαν 100ml PBS 10x και 900ml απιονισμένου Η2Ο (dη2ο). 9) Πλήρες θρεπτικό υλικό : Σε 500ml DMEM 1x προστέθηκαν 10ml Pen Strep, 1,5 ml Fungizone και 50ml FBS. 10) Θρεπτικό υλικό starvation : Σε 500ml DMEM 1x προστέθηκαν 10ml Pen Strep και 1,5 ml Fungizone Επαγωγές με GH και EGF Μετά τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών σε βαθμό κάλυψης του πυθμένα του τρυβλίου κατά 80-90%, ξεκινά η επαγωγή τους, σύμφωνα με το αντίστοιχο πρωτόκολλο. Η διαδικασία της επαγωγής περιλαμβάνει τα εξής : Απομάκρυνση του θρεπτικού υλικού από το τρυβλίο με τη χρήση αντλίας. 125

126 Έκπλυση των ινοβλαστών με αποστειρωμένο διάλυμα PBS 1x τρεις φορές, με σκοπό την απομάκρυνση των αυξητικών παραγόντων και της περίσσειας θρεπτικού υλικού. Προσθήκη θρεπτικού υλικού νηστείας (starvation), το οποίο παραμένει για 24 ώρες. Με τη χρήση του θρεπτικού υλικού νηστείας εξασφαλίζεται η αξιολόγηση αποκλειστικά της δράσης του προς μελέτη αυξητικού παράγοντα με τον οποίο επάγονται οι ινοβλάστες και όχι των αυξητικών παραγόντων που περιέχονται στο πλήρες θρεπτικό υλικό. Επίσης, κατά τη διάρκεια των 24 ωρών επιτυγχάνεται συγχρονισμός των κυτταρικών διαιρέσεων. Προσθήκη hgh ή EGF στο θρεπτικό υλικό starvation: α) Αυξητική ορμόνη (Genotropin 5,3mg, Somatropin Human, recombinant, Pfizer). Σε δοσολογία 200 ng/ml είτε 1000 ng/ml και χρόνο επαγωγής 15 λεπτά. β) EGF, Human Recombinant Protein, Chemicon International, GF144. Σε συγκέντρωση 50nM και χρόνο επαγωγής 15 λεπτά. Μετά παρέλευση 15 λεπτών, αφαίρεση του θρεπτικού υλικού και α) 3 εκπλύσεις με PBS 1x, «ξύσιμο» (scrapping) των κυττάρων και λύση τους ώστε να χρησιμοποιηθούν σε Western Immunoblotting ή Ανοσοκατακρήμνιση, ή β) 3 εκπλύσεις με PBS 1x και έναρξη ανοσοφθορισμού Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Immunoblotting) Η ανοσοαποτύπωση κατά Western είναι μία από τις καλύτερες μεθόδους ανίχνευσης συγκεκριμένων πρωτεϊνών ενός σύνθετου μίγματος, που συνδυάζει την υψηλή αναλυτική ικανότητα της ηλεκτροφόρησης σε γέλη ακρυλαμιδίου, την ειδικότητα των αντισωμάτων και την ευαισθησία των ενζυματικών μεθόδων. Ο όρος ηλεκτροφόρηση αναφέρεται στο φαινόμενο μετανάστευσης ηλεκτρικά φορτισμένων σωματιδίων-ιόντων με την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Με τον τρόπο αυτό, οι πρωτεΐνες που υπόκεινται σε ηλεκτροφόρηση, λόγω των διαφορετικών φορτίων και μοριακών τους βαρών, διαχωρίζονται επιτυχώς. Η μέθοδος περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια : α) Εκχύλιση πρωτεϊνών από ινοβλάστες του ασθενή με GHTD και του μάρτυρα. Τα κύτταρα λύθηκαν με 50μl SDS Sample Buffer και 2,5μl β-μερκαπτοαιθανόλη. To SDS Sample Buffer που χρησιμοποιήθηκε περιέχει το ανιοντικό αποδιατακτικό παράγοντα SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), ο οποίος δεσμεύεται στις πρωτεΐνες, διασπά τους δισουλφιδικούς δεσμούς, απελευθερώνει τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες και συνδέεται με αυτές ανάλογα με το Μοριακό Βάρος τους, εξουδετερώνοντας το φορτίο των πρωτεϊνών και καθιστώντας τις αρνητικές. Η β-μερκαπτοαιθανόλη διασπά τους δισουλφιδικούς δεσμούς (S-S) των πρωτεϊνών. Ακολούθησε βρασμός των θραυσμάτων κυττάρων στους 100 C για 5 λεπτά, ώστε να είναι εφικτή η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών. 126

127 β) Διαχωρισμός των πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε γέλη πολυακρυλαμίδης παρουσία SDS κατά Laemmli (SDS PAGE ηλεκτροφόρηση). Στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση ως μέσο διαχωρισμού χρησιμοποιείται το ακρυλαμίδιο. Το πήκτωμα (gel) δημιουργείται από τον πολυμερισμό μονομερών ακρυλαμιδίου, με αποτέλεσμα το σχηματισμό αλυσίδων πολυακρυλαμιδίου. Ο πολυμερισμός οφείλεται στην καταλυτική δράση των ελευθέρων ριζών. Στις αλυσίδες πολυακρυλαμιδίου ενσωματώνονται μόρια ΝΝ-μεθυλεν-bis-ακρυλαμιδίου (bis), σχηματίζοντας πλέγμα. Η κατάλυση συμβαίνει με τη χρήση της βάσης TEMED (NNN Ν - τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνης), με τη βοήθεια ελευθέρων ριζών που δημιουργούνται με υπερθειικά ιόντα (S 2 O 3 2 -), χάρη στην παρουσία ενός δεύτερου καταλύτη, του υπερθειικού άλατος του αμμωνίου (Ammonium Persulfate/APS). Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης βάσει του μοριακού τους βάρους, καθώς όλες οι πρωτεΐνες έχουν κοινό ανιοντικό φορτίο. Εικόνα 69. Η συσκευή ηλεκτροφόρησης Οι πρωτεΐνες κατά την ηλεκτροφόρηση μετακινούνται προς την άνοδο περνώντας από τους πόρους δύο συνεχόμενων πηκτωμάτων, στα οποία διακρίνεται η γέλη ακρυλαμίδης. Πρόκειται για το ανώτερο ή πήκτωμα πακεταρίσματος (stacking gel) και το κατώτερο ή πήκτωμα διαχωρισμού (separating gel). Στο stacking gel το ποσοστό ακρυλαμίδης είναι σταθερό (4%) και ανεξάρτητο από το μέγεθος των υπό ανάλυση πρωτεϊνών, ενώ στο separating gel το ποσοστό της ακρυλαμίδης εξαρτάται από το μοριακό βάρος των διαχωριζόμενων πρωτεϊνών. Το πήκτωμα πακεταρίσματος συσσωρεύει τις πρωτεΐνες, ώστε να εισέλθουν ταυτόχρονα στο πήκτωμα διαχωρισμού. Όταν τοποθετηθεί το πήκτωμα πακεταρίσματος πάνω από το πήκτωμα διαχωρισμού, προτού ακόμα πήξει, βυθίζεται στο πρώτο μία οδοντωτή μήτρα, η οποία δημιουργεί τα φρεάτια στα οποία θα φορτωθούν τα πρωτεϊνικά δείγματα. Μετά από περίπου 30 λεπτά, το πήκτωμα σταθεροποιείται (πήζει). Ακολουθεί η συναρμολόγηση της συσκευής ηλεκτροφόρησης και το δοχείο γεμίζει με το ρυθμιστικό διάλυμα Running Buffer. 127

128 Εικόνα 70. Το πήκτωμα πακεταρίσματος (πράσινο χρώμα) και το πήκτωμα διαχωρισμού (γκρι χρώμα), δια μέσου των οποίων μετακινούνται οι πρωτεΐνες και διαχωρίζονται σύμφωνα με το ΜΒ. Στα πειράματα της παρούσας εργασίας η επιθυμητή συγκέντρωση πολυακρυλαμιδίου ήταν 10% για τις πρωτεΐνες μεγαλύτερου μοριακού βάρους (pstat3, pegfr, EGFR, GHR, β-trcp) και 12% για τις πρωτεΐνες μικρότερου μοριακού βάρους (p21, CIS, Ub). Η σύσταση των δύο πηκτωμάτων παρατίθεται στους κάτωθι πίνακες. Πήκτωμα πακεταρίσματος 4% - δόση για πάχος 1,5mm Απιονισμένο Η 2 Ο 3,075ml 0,5Μ Tris-HCl ph:6,8 1,25ml 20% (w/v) SDS 0,025ml Acrylamide/Bis-Acrylamide (30% / 0,8% w/v) 0,67ml 10% (w/v) ammonium persulfate - APS 0,025ml TEMED 0,010ml Πίνακας 8. Υλικά για την παρασκευή πηκτώματος πακεταρίσματος 4% κατά την ανοσοαποτύπωση κατά Western. Πήκτωμα διαχωρισμού δόση για πάχος 1,5mm Συγκέντρωση πηκτής 7% 10% 12% 15% Απιονισμένο Η 2 Ο 5,1ml 4,1ml 3,4ml 2,4ml 1,5Μ Tris-HCl ph:8,8 2,5ml 2,5ml 2,5ml 2,5ml 128

129 20% (w/v) SDS 0,05ml 0,05ml 0,05ml 0,05ml Acrylamide/Bis- Acrylamide (30% / 0,8% w/v) 10% (w/v) ammonium persulfate APS 2,3ml 3,3ml 4,0ml 5,0ml 0,05ml 0,05ml 0,05ml 0,05ml TEMED 0,010ml 0,010ml 0,010ml 0,010ml Πίνακας 9. Υλικά για την παρασκευή πηκτώματος διαχωρισμού των πρωτεϊνών κατά την ανοσοαποτύπωση κατά Western. Η συγκέντρωση της πηκτής συσχετίζεται με το Μοριακό Βάρος των διαχωριζόμενων πρωτεϊνών. Συγκέντρωση πηκτής Εύρος ΜΒ σε kd 7% % % Πίνακας 10. Συσχέτιση συγκέντρωσης ακρυλαμιδίου των πηκτών διαχωρισμού και του Μοριακού Βάρους (ΜΒ) των διαχωριζόμενων πρωτεϊνών κατά την ανοσοαποτύπωση κατά Western. Τα απαραίτητα υλικά για την παρασκευή των ρυθμιστικών και άλλων διαλυμάτων είναι τα ακόλουθα: Running Buffer 10x, 1000ml Tris-Base Glycine SDS dh 2 O 30g 144g 5g Έως τα 1000ml Transfer Buffer 10x, 1000ml Tris-Base Glycine dh2o 30g 144g Έως τα 1000ml 129

130 TBS 10x, ph 7.5, 1000ml Tris-Base 60,55g NaCl 87,66g dh2o Έως τα 1000ml TBS-Tween 1x, 1000ml TBS 10x Tween 20 dh2o 100ml 1ml 900ml Ponceau 10x Ponceau Trichloroacetic acid Sulfosalicylic acid 2g 30g 30g Πίνακας 11. Ρυθμιστικά και άλλα διαλύματα για την ανοσοαποτύπωση κατά Western. Τα πρωτεϊνικά δείγματα φορτώθηκαν στην επιθυμητή ποσότητα στα κελιά της πηκτής. Η κατάλληλη ποσότητα του πρωτεϊνικού περιεχομένου σε κάθε δείγμα προσδιορίσθηκε με ηλεκτροφόρηση, βαφή με Cοomassie Blue και διορθώθηκε με πυκνομέτρηση της τουμπουλίνης. Ταυτόχρονα φορτώθηκε 1 δείγμα μάρτυρα (ladder: Benchmarck Prestained), ο οποίος αφού ηλεκτροφορηθεί αποδίδει πρωτεϊνικές μπάντες με γνωστά μοριακά βάρη. Στη συνέχεια εφαρμόστηκε τάση ρεύματος 80V για το χρονικό διάστημα που οι πρωτεΐνες βρίσκονταν στο πήκτωμα πακεταρίσματος και 120V για το χρονικό διάστημα που βρίσκονταν στο πήκτωμα διαχωρισμού. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιήθηκε ως ρυθμιστικό διάλυμα το Running Buffer 1x. Ο μέσος όρος της διάρκειας της ηλεκτροφόρησης στα πειράματα της εργασίας αυτής ήταν περίπου 3 ώρες (2,5-3,5 ώρες). γ) Μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, οι πρωτεΐνες που διαχωρίστηκαν στο πήκτωμα καθηλώθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με ηλεκτρομεταφορά με τη διαδικασία του transfer (μεταφοράς), κατά την οποία εφαρμόζεται ρεύμα σταθερής έντασης 300mA. Συγκεκριμένα, μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, αφαιρέθηκαν τα πηκτώματα από τη συσκευή και απορρίφθηκε το πήκτωμα πακεταρίσματος. Στη συνέχεια, στην κασετίνα μεταφοράς τοποθετήθηκαν τα παρακάτω, με την ακόλουθη σειρά: ένα σφουγγαράκι, 3 διηθητικά χαρτιά, το πήκτωμα διαχωρισμού, η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, 3 διηθητικά χαρτιά και ένα επιπλέον σφουγγαράκι. Το πήκτωμα 130

131 τοποθετήθηκε προς τη μεριά του αρνητικού πόλου και η μεμβράνη προς το θετικό πόλο. Εικόνα 71. Περιεχόμενα κασετίνας μεταφοράς Η συσκευή γεμίζει με το ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς, τοποθετείται σε αυτή ένας αναδευτήρας και μία παγοθήκη και όλο το σύστημα μεταφέρεται σε ψυχόμενο δωμάτιο ή περιβάλλεται από πάγο. Κατόπιν, το σύστημα συνδέεται με τροφοδοτικό σε ένταση ρεύματος 300mA. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αυτής, οι πρωτεΐνες μετακινούνται προς την άνοδο και επικάθονται στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ως ακριβές αντίγραφο αποτύπωμα του πηκτώματος. Εικόνα 72. Διαδικασία ηλεκτρομεταφοράς των πρωτεϊνικών μπαντών από το πήκτωμα στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης 131

132 Εικόνα 73. Κατά την ηλεκτρομεταφορά οι πρωτεϊνικές μπάντες μεταφέρονται από το πήκτωμα στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ως ακριβές αποτύπωμα Η διάρκεια της μεταφοράς για τα πειράματα της εργασίας ήταν 1h 15min για συγκέντρωση 10% της γέλης ακρυλαμίδης και 1h για συγκέντρωση 12% της γέλης ακρυλαμίδης. δ) Επώαση με αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών-στόχος. Η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης επωάστηκε με διάλυμα μπλοκαρίσματος (blocking) των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων για 1 ώρα. Το διάλυμα μπλοκαρίσματος παρασκευάζεται από άπαχο γάλα σε μορφή σκόνης, διαλυμένο σε TBS-Tween 1x. Ακολούθησε υβριδοποίηση των μεμβρανών με ειδικά πρωτογενή αντισώματα (πίνακας 12) για 1 24ωρο, σε κινούμενη επιφάνεια και σε θερμοκρασία δωματίου. Τα πρωτογενή αντισώματα ήταν αραιωμένα σε διάλυμα μπλοκαρίσματος, παρουσία αζιδίου του νατρίου (Sodium Azide) 20%, το οποίο εμποδίζει την ανάπτυξη μικροοργανισμών κατά τη διάρκεια της επώασης. Για την παρασκευή 15ml πρωτογενούς αντισώματος χρησιμοποιήθηκαν 15ml TBS-Tween και 15μl Sodium Azide, στα οποία έγινε η διάλυση του πρωτογενούς αντισώματος σύμφωνα με την επιθυμητή συγκέντρωση. Μετά από ολονύκτια επώαση και 3 5λεπτες πλύσεις με TBS-Tween, ακολούθησε επώαση διάρκειας 1 ώρας με τα δευτερογενή αντισώματα σε κινούμενη επιφάνεια και σε θερμοκρασία δωματίου. Το δευτερογενές αντίσωμα είναι ειδικό για το πρωτογενές αντίσωμα με το οποίο έγινε η πρώτη επώαση και περιλαμβάνει το ένζυμο υπεροξειδάση (Horse Raddish Hyperoxidase). Η αραίωση των δευτερογενών αντισωμάτων έγινε με διάλυμα μπλοκαρίσματος χωρίς την προσθήκη αζιδίου του νατρίου 20%, καθότι αυτό καταστρέφει το ένζυμο της υπεροξειδάσης. Για την παρασκευή 15ml δευτερογενούς αντισώματος χρησιμοποιήθηκαν 15ml TBS-Tween, στα οποία έγινε η διάλυση του δευτερογενούς αντισώματος σύμφωνα με την επιθυμητή συγκέντρωση. Ακολούθησαν 3 10λεπτες εκπλύσεις με TBS-Tween. 132

133 Διάλυμα blocking 10%, 50ml Άπαχο γάλα TBS Tween Sodium Azide 20%* 5ml 45ml 50μl * Η προσθήκη Sodium Azide 20% γινόταν μόνο κατά την παρασκευή του πρωτογενούς αντισώματος. Πίνακας 12. Παρασκευή διαλύματος blocking για την επώαση της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης κατά την ανοσοαποτύπωση κατά Western και την παρασκευή των αντισωμάτων. Tα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν, τα δευτερογενή αντισώματα και οι συγκεντρώσεις τους ήταν: 1 ο αντίσωμα 2 ο αντίσωμα STAT3 (K-15)-(Santa Cruz, s.c. 483) (1:500) pstat3 (Y705),-(Cell Signalling, #4113S) (1:250) Goat anti-rabbit IgG-FITC, sc-2012, Santa Cruz (1:1000) Goat anti-mouse IgG HRP conjugate (Upstate, ) & Anti-mouse IgG HRPlinked Ab, Cell Signalling, #7076 (1:250) EGFR (Upstate, ) (1:500) Goat anti-rabbit, sc-2012, Santa Cruz (1:500) pegfr (Tyr 1173)-(Santa Cruz, s.c ) Goat anti-rabbit, sc-2012, Santa Cruz (1:250) (1:200) CIS (H-80)-(Santa Cruz, s.c ) (1: ) GHR (Novus Biologicals, NBP ) (1:500) β-trcp (H-85)-(Santa Cruz, s.c ) (1: ) p21 (Novus Biologicals, NBP ) (1:500) β-τουμπουλίνη (Millipore, ) (1:500) Goat anti-rabbit, sc-2012, Santa Cruz (1:1000) Goat anti-rabbit, sc-2012, Santa Cruz (1:500) Goat anti-rabbit, sc-2012, Santa Cruz (1:1000) Anti-chicken polyclonal, Novus Biologicals (1:2000) Goat anti-mouse IgG HRP conjugate (Upstate, ) & Anti-mouse IgG HRPlinked Ab, Cell Signalling, #7076 (1:500) Πίνακας 13. Τα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην ανοσοαποτύπωση κατά Western και οι συγκεντρώσεις τους. 133

134 ε) Ανίχνευση του εκπεμπόμενου σήματος με τη μέθοδο της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας. Εν συνεχεία, γίνεται ανίχνευση σήματος σε φωτογραφικό φιλμ με τη χρήση αντιδραστηρίου ECL (H 2 O 2 και luminol) (GE Healthcare Biosciences AB, Sweden). Η ανίχνευση βασίζεται στο φαινόμενο της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας. Συγκεκριμένα, το δευτερογενές αντίσωμα φέρει προσδεμένο το ένζυμο της υπεροξειδάσης, το οποίο με την επίδραση διαλύματος H 2 O 2 σε αλκαλικό περιβάλλον καταλύει την οξείδωση του luminol. Η μέγιστη εκπομπή φωτονίων λαμβάνει χώρα σε μήκος κύματος 428nm και παρουσιάζει μέγιστη τιμή 5-20 λεπτά μετά την προσθήκη των αντιδραστηρίων. Η ανίχνευση επιτυγχάνεται με έκθεση σε φωτογραφικό φιλμ, ευαίσθητο στο μπλε φως. Ο χρόνος έκθεσης του φιλμ εξαρτάται από την ένταση και την ποιότητα του σήματος. Εικόνα 74. Η ανίχνευση των πρωτεϊνικών μπαντών με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας Εικόνα 75. Η κατακόρυφη στήλη στις επιμέρους εικόνες Α και Β αποτελεί το μάρτυρα, δηλαδή κάθε μπάντα της στήλης έχει γνωστό ΜΒ. Επομένως, μπορεί να εκτιμηθεί η έκφραση της προς μελέτη πρωτεΐνης (σκούρες μαύρες μπάντες) σε κάθε περίπτωση, σύμφωνα με το ΜΒ της, το οποίο είναι γνωστό. Μετά την ολοκλήρωση της μεθόδου, το τελευταίο στάδιο είναι η ποσοτικοποίηση των εμφανιζόμενων μπαντών, οι οποίες αντιστοιχούν στις πρωτεΐνες ενδιαφέροντος. 134

135 Αυτό επιτυγχάνεται με επεξεργασία των σκανναρισμένων φιλμ με το ηλεκτρονικό πρόγραμμα scion image (version ; Scion Corporation). Με τη βοήθεια του προγράμματος αυτού γίνεται πυκνομέτρηση των μπαντών που προκύπτουν και σύγκριση της πρωτεϊνικής έκφρασης της προς μελέτη πρωτεΐνης με την πρωτεϊνική έκφραση της β-τουμπουλίνης. Η β-τουμπουλίνη είναι δομικό στοιχείο του κυτταροσκελετού και θεωρείται ότι έχει αμετάβλητη από τις συνθήκες έκφραση, επομένως λειτουργεί ως εσωτερικός μάρτυρας της πρωτεϊνικής έκφρασης. Εφαρμόσθηκε ο τύπος: (Εμβαδό πρωτεΐνης / Εμβαδό πρωτεΐνης β- tubulin) x100. Τα υπολογιζόμενα νούμερα μεταφέρθηκαν σε πρόγραμμα excel και σε γραφικές παραστάσεις Ανοσοφθορισμός (Immunofluoresence) Ο ανοσοφθορισμός είναι η μέθοδος κατά την οποία χρησιμοποιούνται φθορίζοντα αντισώματα για την ανίχνευση και εντόπιση συγκεκριμένου αντιγόνου σε ιστούς ή κύτταρα. Πρόκειται επομένως για μία αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος, κατά την οποία τα αντισώματα είναι μαρκαρισμένα με μία φθορίζουσα ουσία και το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος γίνεται ορατό στο μικροσκόπιο φθορισμού. Με τη μέθοδο αυτή μελετάται η ύπαρξη συγκεκριμένης πρωτεΐνης, η ποσότητά της και η τοποθεσία της εντός του κυττάρου. Για το σκοπό αυτό καλλιεργούνται κύτταρα, τα οποία μονιμοποιούνται πάνω σε καλυπτρίδες, χωρίς να υφίστανται λύση. Φθορισμός ονομάζεται η εκπομπή φωτός συγκεκριμένου μήκους κύματος από μια ουσία η οποία ακτινοβολείται από φως μικρότερου μήκους κύματος. Εκμετάλλευση της ιδιότητας αυτής γίνεται στο μικροσκόπιο φθορισμού. Συγκεκριμένα, κατά το φθορισμό, υπεριώδες φως πέφτει πάνω στα ηλεκτρόνια των ατόμων του φθοριοχρώματος, της φθορίζουσας δηλαδή ουσίας που χρησιμοποιείται για τη σήμανση αντισωμάτων και η οποία απορροφά ακτίνες υπεριώδους και απελευθερώνει φθορίζον φως κατά τη διέγερση των ηλεκτρονίων της. Μέρος της αρχικής διεγείρουσας ενέργειας καταναλώνεται με αποτέλεσμα το φθοριόχρωμα να εκπέμπει φως μικρότερης ενέργειας (μεγαλύτερου μήκους κύματος) από τη διεγείρουσα ακτινοβολία. Εικόνα 76. Μικροσκόπιο φθορισμού. Η υπεριώδης ακτινοβολία που εκπέμπεται διεγείρει τα ηλεκτρόνια του φθοριοχρώματος του αντισώματος, το οποίο εκπέμπει ορατό φως. 135

136 Στα πειράματα της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκε άμεσος ανοσοφθορισμός, κατά τον οποίο ανιχνεύθηκαν αντιγόνα σε μονιμοποιημένα κύτταρα σε καλυπτρίδες. Συγκεκριμένα, το πειραματικό πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε είναι το ακόλουθο: Πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες ινοβλαστών πάνω σε καλυπτρίδες, σε τρυβλία των 60mm 2. Μετά την κάλυψη του 80% της επιφάνειας κάθε καλυπτρίδας, έγινε προσθήκη διαλύματος νηστείας (starvation) για 24h. Ακολούθησαν επαγωγές κάποιων καλυπτρίδων με 200ng/ml hgh για 15min, άλλων καλυπτρίδων με 1000ng/ml hgh για 15min και άλλων με 50ng/ml EGF για 15min, ενώ υπήρχαν και καλυπτρίδες στις οποίες δεν έγινε επαγωγή. Μετά την ολoκλήρωση των επαγωγών έγινε αφαίρεση του θρεπτικού υλικού (starvation) και ακολούθησαν 3 5λεπτες εκπλύσεις με 3ml PBS σε κινούμενη επιφάνεια. Μετά την 3η έκπλυση έγινε αφαίρεση του PBS και προσθήκη 50μl παραφορμαλδεΰδης 4% σε κάθε καλυπτρίδα για 7min. H παραφορμαλδεΰδη προκαλεί μονιμοποίηση των κυττάρων. Ακολούθησαν 3 5λεπτες εκπλύσεις με 3ml PBS σε κινούμενη επιφάνεια κι έγινε προσθήκη 50μl Triton-X 100 0,1% για 5min. To Triton-X είναι απορρυπαντικό και καθιστά την κυτταρική μεμβράνη διαπερατή, ώστε η επακόλουθη είσοδος των αντισωμάτων να είναι εφικτή. Ακολούθησαν 3 επιπλέον 5λεπτες εκπλύσεις με 3ml PBS σε κινούμενη επιφάνεια και αμέσως μετά επώαση με 3ml διάλυμα μπλοκαρίσματος (blocking) BSA 1% για 1h σε κινούμενη επιφάνεια. Το blocking δεσμεύει τις μη ειδικές θέσεις πρόσδεσης των αντισωμάτων. Ακολούθησε υβριδοποίηση των κυττάρων με τα ειδικά πρωτογενή αντισώματα (50μl/καλυπτρίδα) στους 4 ο C για όλη τη νύχτα, σε απόλυτο σκοτάδι. Μετά την επώαση ακολούθησαν 3 5λεπτες εκπλύσεις με 3ml blocking BSA σε κινούμενη επιφάνεια κι επώαση με το εκάστοτε δευτερογενές αντίσωμα σε συγκέντρωση 1:100 (50μl/καλυπτρίδα) για 1h σε απόλυτο σκοτάδι. Ακολούθησε 1 5λεπτη έκπλυση με 3ml blocking BSA και 2 5λεπτες εκπλύσεις με 3ml PBS-Tween σε κινούμενη επιφάνεια. Οι καλυπτρίδες μεταφέρθηκαν ανάποδα σε αντικειμενοφόρους πλάκες στις οποίες είχε προηγουμένως τοποθετηθεί 3μl χρωστική Dapi, η οποία βάφει τους πυρήνες των κυττάρων. Εικόνα 77. Αντικειμενοφόρος πλάκα πάνω στην οποία μεταφέρθηκε η καλυπτρίδα με τα μονιμοποιημένα κύτταρα. 136

137 Ακολούθησε μικροσκόπηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. Α) Β) Εικόνα 78. Μικροσκόπιο φθορισμού Διαλύματα και ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν: BSA blocking, 5ml PBS 1x FCS BSA Παραφολμαδεϋδη 4%, 50ml Παραφολμαδεϋδη PBS 1x TRITON-X 100 0,1%, 50ml TRITON-X 100 PBS 1x PBS-Tween, 50ml PBS 1x Tween 20 4,5ml 0,5ml 15gr 2gr 50ml 5μl 50ml 50ml 50μl Πρώτα αντισώματα 50μl σε συγκέντρωση 1:50 1μl πρώτο αντίσωμα σε 49μl BSA blocking Πρώτα αντισώματα 50μl σε συγκέντρωση 1:20 2,5μl πρώτο αντίσωμα σε 47,5μl BSA blocking Δεύτερα αντισώματα 50μl σε συγκέντρωση 1:100 0,5μl φθορίζον δεύτερο αντίσωμα σε 49,5μl BSA blocking Πίνακας 14. Υλικά ανοσοφθορισμού. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 1:50 είναι: EGFR, pegfr, STAT3, CIS, p21, Ub. Σε συγκέντρωση 1:20 χρησιμοποιήθηκαν τα αντισώματα pstat3, GHR, β-trcp. 137

138 1 ο αντίσωμα 2 ο αντίσωμα STAT3 (K-15) - Santa Cruz, s.c. 483 (1:50) pstat3 (Tyr 705) - Santa Cruz, s.c (1:20) EGFR (528) - Santa Cruz, s.c.-120 (1:50) pegfr (Tyr 1173) - Santa Cruz, s.c (1:50) CIS (H-80) - Santa Cruz, s.c (1:50) GHR - Novus Biologicals, NBP (1:20) β-trcp (H-85) - Santa Cruz, s.c (1:20) p21 (187) - Santa Cruz, s.c.-817 (1:50) Ub (FL-76), Santa Cruz, s.c (1:50) Goat anti-rabbit IgG-FITC, sc-2012, Santa Cruz (1:100) Donkey anti-goat IgG-FITC, sc-2024, Santa Cruz (1:100) Goat anti-mouse IgG-FITC, sc-2010, Santa Cruz (1:100) Goat anti-rabbit IgG-FITC, sc-2012, Santa Cruz (1:100) Goat anti-rabbit IgG-FITC, sc-2012, Santa Cruz Donkey anti-goat IgG-FITC, sc-2024, Santa Cruz (1:100) Goat anti-rabbit IgG-FITC, sc-2012, Santa Cruz (1:100) Goat anti-mouse IgG-FITC, sc-2010, Santa Cruz (1:100) Goat anti-rabbit IgG-FITC, sc-2012, Santa Cruz (1:100) Πίνακας 15. Τα πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στον απλό ανοσοφθορισμό και οι συγκεντρώσεις τους. Εκτός από τον άμεσο απλό ανοσοφθορισμό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα με άμεσο διπλό ανοσοφθορισμό. Στο διπλό ανοσοφθορισμό, δηλαδή στον ανοσοφθορισμό στον οποίο χρησιμοποιείται διπλή φθορίζουσα χρώση, γίνεται ταυτόχρονα χρήση δύο αντισωμάτων σημασμένων με διαφορετικά φθοριοχρώματα για την ανίχνευση δύο διαφορετικών αντιγόνων στο ίδιο υπόστρωμα, εν προκειμένω, στους ίδιους ινοβλάστες. Με τον τρόπο αυτό γίνεται σύγκριση στο βαθμό έκφρασης της κάθε πρωτεΐνης και διαπιστώνεται ο πιθανός συνεντοπισμός των δύο πρωτεϊνών. 138

139 488 nm 550 nm 520 nm Πρωτεΐνη Α: FITC (πράσινο) 620 nm Πρωτεΐνη Β: TRITC (κόκκινο) 488 nm Κατάσταση διέγερσης 520 nm Βασική κατάσταση 550 nm 620 nm Κατάσταση διέγερσης Βασική κατάσταση Εικόνα 79. Οι πρωτεΐνες Α και Β συνεντοπίζονται (κίτρινο). Αυτό είναι μια καλή ένδειξη για αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών. Στο διπλό ανοσοφθορισμό, τα 2α αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι : Δευτερογενή αντισώματα κατά το διπλό ανοσοφθορισμό Donkey anti-goat, Alexa Fluor 488, Invitrogen, A κόκκινο Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488, Invitrogen, A κόκκινο Goat anti-rabbit, Alexa Fluor 488, Invitrogen, A κόκκινο Donkey anti-goat, Alexa Fluor 488, Invitrogen, Α πράσινο Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488, Invitrogen, A πράσινο Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 488, Invitrogen, Α πράσινο Πίνακας 16. Τα δευτερογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν κατά το διπλό ανοσοφθορισμό και το χρώμα που εκπέμπουν Ανοσοκατακρήμνιση (Ιmmunoprecipitation) και Ανοσοσυγκατακρήμνιση (Complex immunoprecipitation) Η ανοσοκατακρήμιση είναι η μέθοδος με την οποία ένα πρωτεϊνικό αντιγόνο κατακρημνίζεται από ένα διάλυμα με τη χρήση ενός αντισώματος ειδικού για το συγκεκριμένο αντιγόνο. Στην απλή ανοσοκατακρήμνιση το αντίσωμα που χρησιμοποιείται είναι ειδικό για μια γνωστή πρωτεΐνη και απομονώνει τη 139

140 συγκεκριμένη πρωτεΐνη από ένα διάλυμα που περιέχει πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες. Η ανοσοσυγκατακρήμνιση των πρωτεϊνών είναι μια μέθοδος που στόχο έχει την ανίχνευση πρωτεϊνών που βρίσκονται σε αλληλεπίδραση ή ανίχνευση ολόκληρων πρωτεϊνικών συμπλόκων. Η ανοσοσυγκατακρήμνιση βοηθά στην εξακρίβωση αν δύο πρωτεΐνες διαντιδρούν ή όχι in vitro. Στην περίπτωση αυτή επιλέγεται ένα αντίσωμα που μαρκάρει μια γνωστή πρωτεΐνη, η οποία θεωρείται ότι είναι μέλος ενός μεγαλύτερου συμπλέγματος πρωτεϊνών. Μαρκάροντας, επομένως, τη γνωστή πρωτεΐνη με το ειδικό της αντίσωμα, είναι εφικτό να εξαχθεί από το διάλυμα ολόκληρο το πρωτεϊνικό σύμπλεγμα και συνεπώς να αναγνωρισθούν άγνωστα μέλη του συμπλέγματος. Εικόνα 80. Η διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης. 1) Προστίθεται το κατάλληλο αντίσωμα, 2) Το αντίσωμα προσδένεται στην πρωτεΐνη ενδιαφέροντος, 3)Προστίθενται τα σφαιρίδια της πρωτεΐνης Α που καθιστούν το ανοσοσύμπλεγμα αδιάλυτο, 4) Φυγοκέντρηση. Το ανοσοσύμπλεγμα καθιζάνει και το υπερκείμενο απορρίπτεται. Συγκεκριμένα, το αντίσωμα αναγνωρίζει τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη μέσα σε ένα πρωτεϊνικό εκχύλισμα και αυτή συμπαρασύρει προς το αντίσωμα όλες εκείνες τις πρωτεΐνες με τις οποίες αλληλεπιδρά είτε άμεσα είτε έμμεσα μέσω άλλων πρωτεϊνών. Σε μία επακόλουθη επομένως φυγοκέντρηση, στο ανοσοΐζημα εμφανίζεται εκτός από την πρωτεΐνη-στόχο και μια πληθώρα άλλων πρωτεϊνών. Αν το ανοσοσύμπλοκο αυτό στη συνέχεια θερμανθεί ώστε να διαταραχθούν οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, σε μια επακόλουθη ηλεκτροφόρηση και Western Blot ανάλυση θα αποκαλυφθούν οι πρωτεΐνες που συμπαρασύρθηκαν μαζί με την πρωτεΐνη-στόχο, με τη χρήση αντισωμάτων ειδικών για τις πρωτεΐνες αυτές. Πρόκειται δηλαδή για μία τεχνική που ανιχνεύει διαντιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Απαραίτητη προϋπόθεση για να εξαχθεί το σύμπλοκο από το διάλυμα, να γίνει δηλαδή το λεγόμενο pull down, είναι το να βρίσκονται οι πρωτεΐνες στενά συνδεδεμένες μεταξύ τους. Τα κύτταρα λύονται σε συνθήκες μη αποδιάταξης, ώστε οι πρωτεΐνες που βρίσκονται σε φυσική επαφή να παραμένουν συνδεδεμένες. Η πρωτεΐνη συνδέεται με το Fc τμήμα του αντισώματος. Στη συνέχεια γίνεται δέσμευση του αντισώματος με τα σφαιρίδια πρωτεΐνης Α (αγαρόζης), η οποία 140

141 επιτυγχάνεται με επώαση καθ όλη την διάρκεια της νύχτας (overnight) στους 4 ο C. Η πρωτεΐνη Α (αγαρόζη) σταθεροποιεί τα σύμπλοκα πρωτεΐνης-αντισώματος. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν στη μέθοδο είναι: 1. 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) 2. 1x Cell Lysis Buffer 3. RIPA Buffer 4. Protein A Agarose Beads Lysis buffer (100ml) 150mM NaCl : 0,8766gr 0,5% NP-40 : 50μl 5mM EDTA : 0,1461gr 20mM Tris-HCl : 0,2423gr Ρύθμιση του ph: 7,6 RIPA Buffer Lysis Buffer 0,1% Cocktail Inhibitors 0,1% DTT 1mM (5μl DTT 0,1M μl dh 2 O 0,2% PMSF 500mM 2,5% Doc 10% Καλλιεργήθηκαν ινοβλάστες σε τρυβλία, στα οποία έγιναν επαγωγές για 15 λεπτά είτε με 200 ng/ml GH είτε με 1000ng/ml GH είτε με 50nM EGF είτε δεν έγιναν επαγωγές. Κατόπιν ετέθη θρεπτικό υλικό νηστείας. Μετά την απομάκρυνσή του, ακολούθησαν 3 εκπλύσεις με PBS 1x και κατόπιν τα κύτταρα επωάστηκαν με 150λ RIPA buffer σε πάγο, για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, το εναιώρημα συγκεντρώθηκε σε eppendorf με τη χρήση αποστειρωμένης ξύστρας και φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στους 4 C σε μέγιστη ταχύτητα. Το υπερκείμενο διάλυμα αποθηκεύτηκε. Η συνέχεια της πειραματικής διαδικασίας περιλάμβανε: Προσθήκη σε ένα eppendorf 5 μl αντισώματος σε 10 μl από κάθε πρωτεϊνικό δείγμα, τοποθέτηση σε περιστρεφόμενη ρόδα και επώαση στους 4 ο C για 8 ώρες. 141

142 Προσθήκη 25 μl σφαιριδίων (beads) Agarose A και συμπλήρωση με RIPA buffer έως τα 500 μl. Επώαση καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ο C. Την επόμενη μέρα φυγοκέντρηση των eppendorfs για 1 λεπτό. Απομάκρυνση του υπερκείμενου και 3 εκπλύσεις με 500 μl lysis buffer, φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 1 λεπτό στις στροφές/λεπτό σε ψυχόμενη φυγόκεντρο. Με τον τρόπο αυτό το σύμπλοκο σφαιρίδια-πρωτεΐνη-αντίσωμα κατακρημνίζεται στον πυθμένα του eppendorf και στη συνέχεια το υπερκείμενο αφαιρείται. Επαναδιάλυση του ιζήματος σε 500μl RIPA buffer και νέα φυγοκέντρηση. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται 3 φορές. Μετά την τελευταία έκπλυση, αναδιάλυση του ιζήματος με 50 μl Sample Buffer + 2% Μερκαπτοαιθανόλη). Χρησιμοποίηση των δειγμάτων σε Western Immunoblotting Απομόνωση RNA και Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Απομόνωση ολικού mrna Η απομόνωση RNA έγινε από ινοβλάστες που είχαν προηγουμένως συλλεχθεί από τις πρωτογενείς καλλιέργειες και πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του RNA extraction Sigma Kit. Η διαδικασία περιλάμβανε: Λύση των ινοβλαστών με τη χρήση 250μl Solution Buffer και 2,5μl β- μερκαπτοαιθανόλη ανά δείγμα, καλή ανάδευση σε vortex και φυγοκέντρηση για λίγα δευτερόλεπτα, ώστε να σπάσουν οι μεμβράνες των κυττάρων και να απελευθερωθεί το ολικό RNA. Μεταφορά των δειγμάτων σε κολώνα με ειδικό φίλτρο (κολώνα χρώματος μπλε) (εικόνα 81) και φυγοκέντρηση για 2 λεπτά, ώστε να απομακρυνθούν τα κυτταρικά θραύσματα και να αποδεκατισθεί το DNA. Απομάκρυνση του φίλτρου. Προσθήκη σε κάθε δείγμα 250μl 70% αιθανόλης και καλή ανάδευση. Μεταφορά των δειγμάτων σε νέες κολώνες δέσμευσης του RNA (κολώνες χρώματος κόκκινου) (εικόνα 81) και φυγοκέντρηση για λίγα δευτερόλεπτα. Πρόσδεση του RNA στο φίλτρο της νέας κολώνας. Προσθήκη 250μl Wash Solution Buffer 1 και φυγοκέντρηση. Απομάκρυνση του εκχυλίσματος και προσθήκη 80μl DNAse (10μl DNAse και 70μl DNAse Buffer) στη μεμβράνη του φίλτρου για 15 λεπτά, ώστε να δράσουν οι ενδονουκλεάσες. 142

143 Εικόνα 81. Απομόνωση ολικού mrna με τη χρήση του RNA Extraction Sigma Kit. Προσθήκη 250μl Wash Solution Buffer 1 και φυγοκέντρηση. Απομάκρυνση του εκχυλίσματος και προσθήκη 500μl Wash Solution Buffer 2. Φυγοκέντρηση για λίγα δευτερόλεπτα. Νέα πλύση με 500μl Wash Solution Buffer 2 και φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 2 λεπτά. Απομάκρυνση του εκχυλίσματος και προσθήκη 50μl Elution Buffer. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό. Στα 50μl εναπομείναντος εκχυλίσματος περιέχεται το ολικό RNA. RT-PCR Πρόκειται για μία μέθοδο ανίχνευσης επιπέδων έκφρασης RNA, μέσω δημιουργίας cdna μεταγράφων από το RNA ενδιαφέροντος, με τη χρήση του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση. Ακολούθως, το νεοσυντιθέμενο cdna πολλαπλασιάζεται με τη μέθοδο της PCR. Το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση απαιτεί δίκωνο DNA για την παραγωγή cdna. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιούνται ειδικοί εκκινητές, οι οποίοι υβριδοποιούνται με το συμπληρωματικό κομμάτι mrna υπό κατάλληλες συνθήκες. Στη συνέχεια, το cdna πολλαπλασιάζεται με τη χρήση της DNA πολυμεράσης και των κατάλληλων εκκινητών. Η DNA πολυμεράση προάγει την προσθήκη νουκλεοτιδίων dntps σε εκμαγείο του DΝA που προϋπάρχει. Συγκεκριμένα, η δημιουργία του cdna έγινε με την ακόλουθη διαδικασία: Σε PCR eppendorfs τοποθετημένων σε πάγο έγινε προσθήκη 8λ 5x First strand buffer, 5λ 0,1Μ DTT, 1λ 25 mm dntp mix, 0,25λ τυχαίων εκκινητών (3μg/λ), 0,25λ RNasin Ribonuclease inhibitor (30U/λ), RNA, ώστε σε τελικό όγκο 50λ η συγκέντρωση να είναι 1μg, και depc H 2 0 μέχρι συμπλήρωσης όγκου 40λ. Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της εταιρείας INVITROGEN (SuperScript III One-Step RT- PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase). Ακολούθησε επώαση των δειγμάτων στους 70 C για 3 λεπτά και μεταφορά σε πάγο ξανά. Στη συνέχεια, έγινε 143

144 προσθήκη 7λ depc H 2 0, 2λ 5x First Strand Buffer και 1λ Superscript Reverse Transcriptase (200U/λ) σε κάθε eppendorf. Ακολούθησε επώαση στους 37 C για 60min και στους 70 C για 1min. To παραγώμενο cdna αποθηκεύτηκε στους -20 C. PCR ανάλυση Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μία τεχνική απομόνωσης και πολλαπλασιασμού μιας DNA αλληλουχίας μέσω ενζυμικής αναπαραγωγής του, χωρίς τη χρήση ζωντανών μικροοργανισμών. Τα τμήματα του DNA μπορούν να κλωνοποιηθούν σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα. Με την PCR, μία συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος με γνωστή αλληλουχία πολλαπλασιάζεται. Η αλληλουχία του γονιδίου είναι απαραίτητη για το σχεδιασμό των συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων, που καθένα είναι συμπληρωματικό με μία από τις αλυσίδες του δίκλωνου DNA. Τα ολιγονουκλεοτίδια, που θα χρησιμοποιηθούν ως εκκινητές, πρέπει να είναι ικανά να δεσμεύονται σε θέσεις αντίθετες από την αλληλουχία που πρόκειται να ενισχυθεί, δηλαδή καθορίζουν τα άκρα του προς μελέτη DNA τμήματος. Η τεχνική της PCR βασίζεται στον επαναλαμβανόμενο κύκλο τριών αντιδράσεων, οι οποίες διαφέρουν ως προς τη θερμοκρασία και το χρόνο. Στον πρώτο κύκλο, γίνεται αποδιάταξη του DNA, άρα απομάκρυνση των συμπληρωματικών κλώνων του DNA, με αύξηση της θερμοκρασίας αντίδρασης στους C. Στο δεύτερο στάδιο γίνεται υβριδισμός των εκκινητών με την προς μελέτη αλληλουχία, σε θερμοκρασίες C. Οι εκκινητές είναι συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια μήκους βάσεων και καθορίζουν την αλληλουχία του DNA που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί. Τα ολιγονουκλεοτίδια αυτά αποτελούνται από μη συμπληρωματικές βάσεις, ώστε να αποφεύγεται ο υβριδισμός μεταξύ τους, αλλά και με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες του DNA. Στο τρίτο και τελευταίο στάδιο γίνεται η σύνθεση των συμπληρωματικών κλώνων του DNA με επέκταση του 3 ου άκρου των εκκινητών με τη χρήση της Taq πολυμεράσης, σε θερμοκρασία 72 C. Η Taq πολυμεράση προέρχεται από το βακτήριο Thermus aquaticus, το οποίο είναι ανθεκτικό σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες. Τα προαναφερόμενα στάδια επαναλαμβάνονται πολλές φορές (30-40 κύκλοι) και καταλήγουν στη δημιουργία περισσότερων από 1 δισεκατομμύριο κλώνους του αρχικού τμήματος DNA. Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο του επιπέδου έκφρασης του γονιδίου CIS ήταν οι ακόλουθες: ΓΟΝΙΔΙΟ PCR Buffer dntps Sense Primer Antisense Primer MgCl 2 DMSO Taqpolymerase H 2 O cdna CIS 5λ 0,4λ 0,5λ 0,5λ 1,5λ 0,5λ 0,5λ 36,1λ 5λ Οι PCR αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε θερμικό κυκλοποιητή (RTC-2000 Peltier Thermal Cycler) σύμφωνα με το παρακάτω πρόγραμμα: 95 C για 1 λεπτό (αρχική αποδιάταξη) 94 C για 30 δευτερόλεπτα (αποδιάταξη) 144

145 56 C για 45 δευτερόλεπτα (υβριδοποίηση των εκκινητών) 72 C για 1 λεπτό (επιμήκυνση αλυσίδας) 35 κύκλοι επανάληψη των βημάτων 2 έως 4 72 C για 20 λεπτά (συμπλήρωση μονόκλωνων άκρων) και 4 C (ολοκλήρωση της διαδικασίας) ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Ο διαχωρισμός των τμημάτων του DNA που προκύπτουν από την PCR γίνεται σε πηκτή αγαρόζης ή ακρυλαμιδίου. Τα τμήματα DNA γίνονται ορατά με τη χρήση του βρωμιούχου αιθιδίου, ενώ το μήκος κάθε προϊόντος συγκρίνεται ταυτόχρονα με το μήκος γνωστού μάρτυρα (DAN ladder), που ηλεκτροφορείται ταυτόχρονα. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Σε μία κωνική φιάλη προστίθενται 1,4gr αγαρόζης (INVITROGEN) και 140ml διαλύματος TBE 1x (TBE 10x: Σε αρχική ποσότητα απιονισμένου νερού προστίθενται 108gr Trizma Base, 55gr βορικό οξύ, 5,845gr EDTA και ακολουθεί ογκομέτρηση σε τελικό όγκο 1 λίτρο). Η φιάλη τοποθετήθηκε σε φούρνο μικροκυμάτων για περίπου 1 λεπτό στη μέγιστη θερμοκρασία, έως ότου διαλυθεί η αγαρόζη. Όταν η θερμοκρασία του διαλύματος κατέβει στους C, προστίθενται μερικές σταγόνες πυκνού διαλύματος βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr), το οποίο συμπλέκεται με τις βάσεις του DNA και φωσφορίζει όταν αυτό εκτεθεί σε U.V., σηματοδοτώντας τα δείγματα στην πηκτή αγαρόζης. Στη συνέχεια, το διάλυμα εισάγεται σε καλούπι ηλεκτροφόρησης, μετά από την τοποθέτηση της κατάλληλης μήτρας στη συσκευή, ώστε να σχηματισθούν τα φρεάτια όπου θα εισαχθούν τα δείγματα. Αφού πολυμερισθεί το πήκτωμα, η μήτρα απομακρύνεται και στη συσκευή προστίθεται ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ 1x, τόσο ώστε να καλύπτεται πλήρως η επιφάνεια της πηκτής. Στα σωληνάρια eppendorfs που περιέχουν 50λ τελικού προϊόντος PCR, γίνεται προσθήκη 12λ loading buffer. Το loading buffer περιέχει: 0,25w/v bromphenol blue, 0,25w/v xylene cyanole FF, 40%w/v sucrose, 0,1M EDTA, 0,5%w/v SDS. Στη συνέχεια, τα δείγματα εισάγονται στο πήκτωμα και ηλεκτροφορούνται, με σταθερή τάση στη συσκευή 100Volt. H πηκτή αγαρόζης τοποθετείται με κατεύθυνση από τον αρνητικό προς το θετικό πόλο, σύμφωνα με την πορεία κίνησης του DNA, ενώ το βρωμιούχο αιθίδιο κινείται από το θετικό προς τον αρνητικό πόλο. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωμα παρατηρείται κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία. Η ταυτοποίηση του μεγέθους του προίόντος της PCR γίνεται σε σύγκριση με μάρτυρα. Συγκεκριμένα, o μάρτυρας που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο 1kb DNA ladder, INVITROGEN. Για την ποσοτικοποίηση (densitometry) των σημάτων της RT-PCR έγινε ανάλυση των εικόνων με το πρόγραμμα Image-Pro plus. 145

146 6.2.7 Επεμβατικό RNA (Interference RNA CIS) Το επεμβατικό RNA είναι ένας μηχανισμός ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης, κατά τον οποίο το RNA καταστέλλει την έκφραση συμπληρωματικών προς αυτό γονιδίων. (Νόμπελ Ιατρικής 2006 για τους Fire και Mello). Η διαδικασία ξεκινά με την αναγνώριση μιας διπλής αλυσίδας RNA από μία ενδονουκλεάση (Dicer), η οποία διασπά τη διπλή αλυσίδα RNA (dsrna) σε κοντά θραύσματα διπλής αλυσίδας (short interference RNA/siRNA), μήκους νουκλεοτιδίων. Η αρχική διπλή αλυσίδα RNA μπορεί να προέρχεται από ενδογενή γονίδια (στην περίπτωση που το επεμβατικό RNA είναι ενδογενής μηχανισμός ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης), από τεχνητά εισερχόμενα πλασμίδια ή από μεγαλύτερες αλυσίδες εξωγενούς RNA που προσλαμβάνεται από το κύτταρο. Τα sirna θραύσματα δημιουργούνται με αποκοπές στα 3 άκρα του μεγαλύτερου δίκλωνου RNA. Το ίδιο ένζυμο, dicer, που διασπά το dsrna καταλύει τη διάσπαση αυτή. Εναλλακτικά, κύτταρα μπορεί να διαμολυνθούν απευθείας με συνθετικό sirna. Εικόνα 82. Η διαδικασία του επεμβατικού RNA Στη δεύτερη φάση, μία μονή αλυσίδα του sirna, που ονομάζεται οδηγός ή αντινοηματική αλυσίδα, έρχεται σε επαφή με πρωτεΐνες προς σχηματισμό ενός επαγώμενου από το RNA συμπλέγματος σίγασης (RNA induced silencing complex/risc). Ακολουθεί ξεδίπλωμα (unwinding) της διπλής αλυσίδας του sirna από τη δραστηριότητα ελικάσης του RISC. Η νοηματική αλυσίδα του sirna απομακρύνεται και η οδηγός αλυσίδα από το σύμπλεγμα υβριδοποιείται με μία συμπληρωματική αλληλουχία του πλήρους μήκους mrna-στόχος. Μία ενδονουκλεάση (Slicer) στο εσωτερικό του RISC αποδομεί το mrna-στόχος. Τα sirna, επομένως, προσδένονται στο mrna του γονιδίου ενδιαφέροντος σε συγκεκριμένες αλληλουχίες και προάγουν την αποδόμησή του. Με τον τρόπο αυτό, παρεμποδίζουν την παραγωγή συγκεκριμένων πρωτεϊνών. Η διαδικασία του επεμβατικού RNA είναι επίσης γνωστή ως σίγαση sirna (sirna silencing). 146

147 Πειραματικό πρωτόκολλο: 1) Έγχυση 2 x 10 5 κυττάρων σε τρυβλίο (35x10mm) με 2ml θρεπτικού υλικού χωρίς αντιβιοτικό. 2) Επώαση των κυττάρων στους 37 ο C σε επωαστή CO 2 μέχρι πληρότητας 60-80% των κυττάρων. Αυτό επιτυγχάνεται συνήθως σε ώρες. 3) -Παρασκευή του Διαλύματος Α : Για κάθε διαμόλυνση, έγινε διάλυση 6μl sirna duplex σε 100μl sirna Transfection Medium (sc:36868). - Παρασκευή του Διαλύματος Β : Για κάθε διαμόλυνση, έγινε διάλυση 6μl sirna Transfection Reagent σε 100μl sirna Transfection Medium. 4) Προσθήκη του Διαλύματος Α απευθείας στο Διάλυμα Β με τη χρήση πιπέττας. Ανάδευση του τελικού διαλύματος με την πιπέττα και επώαση για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 5) Έκπλυση των κυττάρων με 2ml sirna Transfection Medium. Αναρρόφηση του sirna Transfection Medium. 6) Για κάθε διαμόλυνση, προσθήκη 0,8ml sirna Transfection Medium σε κάθε σωληνίσκο με το τελικό διάλυμα (Διάλυμα Α και Διάλυμα Β). Ήπια ανάδευση και εφαρμογή στα κύτταρα. 7) Επώαση των κυττάρων για 5-7 ώρες στους 37 ο C σε επωαστή CO 2. 8) Προσθήκη 1ml θρεπτικού υλικού με διπλάσια περιεκτικότητα ορού και αντιβιοτικών, χωρίς απομάκρυνση του μίγματος της διαμόλυνσης. 9) Επώαση των κυττάρων για ακόμη ώρες. 10) Αναρρόφηση του θρεπτικού υλικού και αντικατάσταση με θρεπτικό υλικό 1x. 11) Επώαση των κυττάρων για ώρες στους 37 ο C σε επωαστή CO 2. 12) Πραγματοποίηση Western Immunoblotting ή ανοσοφθορισμού. Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τη διαμόλυνση είναι: CIS sirna, sc-43685, Santa Cruz Biotechnology sirna diluents, RNA-ase free H 2 0, Santa Cruz Biotechnology sirna transfection Reagent, sc-29528, Santa Cruz Biotechnology 147

148 pjak2/tubulin Κεφάλαιο 7 : ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 7.1 (Α μέρος) Μελέτη της κινητικής πρωτεϊνών του σηματοδοτικού μονοπατιού της GH μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh, της πρωτεϊνικής και γονιδιακής έκφρασης του αρνητικού ρυθμιστή CIS μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh και της κυτταρικής εντόπισης των αρνητικών ρυθμιστών CIS και p21 μετά από επαγωγές με 200 ng/ml hgh και 1000 ng/ml hgh. Μελετήθηκε με Western Immunoblotting η πρωτεϊνική έκφραση των πρωτεϊνών pjak2, pstat5b και pstat3 σε βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh για 5, 10, 15, 30, 40 και 60 λεπτά. 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 C0 C5 C10 C15 C30 C40 C60 P0 P5 P10 P15 P30 P40 P60 Εικόνα: Μπάντες φιλμ και αποτελέσματα των densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για την pjak2 στους μάρτυρες και στους ασθενείς. Η μέγιστη φωσφορυλίωση της JAK2 παρατηρείται μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh για 5 λεπτά στους μάρτυρες, ενώ στους ασθενείς μετά από επαγωγή για 30 λεπτά. 148

149 pstat5b/tubulin 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 C0 C5 C15 C30 C60 P0 P5 P15 P30 P60 Εικόνα: Μπάντες φιλμ και αποτελέσματα των densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για την pstat5b στους μάρτυρες και στους ασθενείς. Η μέγιστη φωσφορυλίωση της STAT5b παρατηρείται μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh για 15 λεπτά στους μάρτυρες, ενώ στους ασθενείς μετά από επαγωγή για 60 λεπτά. 149

150 CIS (32kDa)/Tubulin Ub CIS (37 kda)/ Tubulin pstat3/tubulin C0 C5 C15 C30 C60 P0 P5 P15 P30 P60 Εικόνα: Μπάντες φιλμ και αποτελέσματα των densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για την pstat3 στους μάρτυρες και στους ασθενείς. Η μέγιστη φωσφορυλίωση της STAT3 παρατηρείται μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh για 15 λεπτά στους μάρτυρες, ενώ στους ασθενείς δεν είναι εφικτή η φωσφορυλίωση της STAT3. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης CIS και της ουβικουιτινυλιωμένης της μορφής, ucis, με Western Immunoblotting (A), καθώς και η γονιδιακή έκφραση της πρωτεΐνης CIS με RT-PCR (B). ucis CIS 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 C0 C30 P0 P30 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 C0 C30 P0 P30 Εικόνα: Μπάντες φιλμ και αποτελέσματα των densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για τις CIS και ucis στους μάρτυρες και στους ασθενείς. 150

151 CIS/Actin 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 C0 C30 P0 P30 Εικόνα: Μπάντες και αποτελέσματα των densitometries της RT-PCR για τη CIS στους μάρτυρες και στους ασθενείς. Διαπιστώνεται αυξημένη πρωτεϊνική έκφραση των πρωτεϊνών CIS και ucis και αυξημένη γονιδιακή έκφραση της CIS στους ασθενείς συγκριτικά με τους μάρτυρες. Κατόπιν, μελετήθηκαν με ανοσοφθορισμό οι πρωτεΐνες pstat3, p21, Ub, CIS και GHR σε βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh. pstat3 p21 M0 A0 M0 A0 M GH200 A GH200 Εικόνες: Ανοσοφθορισμός για τις πρωτεΐνες pstat3 και p21 στους μάρτυρες και στους ασθενείς (0, GH200). M GH200 A GH200 Επιβεβαιώθηκε η ήδη περιγεγραμμένη στο παρελθόν αδυναμία φωσφορυλίωσης της pstat3 και η υπερέκφραση της p21 στους ασθενείς με GHTD. Επιπλέον όμως, διαπιστώθηκε υπερέκφραση των Ub και CIS στον ασθενή στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh. Ο GHR, μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh 151

152 στους ασθενείς, παρουσιάζει κυτταροπλασματική εντόπιση και όχι μεμβρανική, όπως παρατηρείται στους μάρτυρες. Ub CIS GHR M0 A0 M0 A0 M0 A0 M GH200 A GH200 M GH200 A GH200 M GH200 A GH200 Εικόνες: Ανοσοφθορισμός για τις πρωτεΐνες Ub, CIS και GHR στους μάρτυρες και στους ασθενείς (0, GH200) Λόγω της περιγεγραμμένης στο παρελθόν επιτυχούς φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης STAT3 στους ασθενείς μετά από επαγωγή με 1000 ng/ml hgh, μελετήθηκε η έκφραση και η κυτταρική τοποθεσία των αρνητικών ρυθμιστών CIS και p21 στην επαγωγή αυτή, συγκριτικά με τη βασική κατάσταση και την επαγωγή με 200 ng/ml hgh. Aσθενείς CIS Aσθενείς p21 0 GH200 0 GH200 0, GH200: Υπερέκφραση CIS GH1000: CIS 0, GH200: Υπερέκφραση p21 GH1000: p21 + πυρηνικής εντόπισης GH1000 GH1000 EGF Εικόνες: Ανοσοφθορισμός για τις πρωτεΐνες CIS και p21 στους μάρτυρες και στους ασθενείς (0, GH200, GH1000). Μετά από επαγωγή με 1000 ng/ml hgh, παρατηρείται μείωση της έκφρασης και της κυτταροπλασματικής εντόπισης της πρωτεΐνης CIS (λευκό βέλος) και αύξηση της κυτταροπλασματικής εντόπισης της p21 (λευκό βέλος). 152

153 7.2 (Β μέρος) Πρωτεϊνική έκφραση και κυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών του σηματοδοτικού μονοπατιού της GH και των αρνητικών ρυθμιστών του σε βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με 200mg/dl hgh (15 min), πριν και μετά από τη διαδικασία sirna CIS. 1. Πρωτεΐνη pstat3 Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα Η πρωτεΐνη STAT3 παρουσιάζει αύξηση της φωσφορυλίωσής της μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, συγκριτικά με τη βασική κατάσταση μη επαγωγής. Μετά από σίγαση του γονιδίου CIS, η φωσφορυλίωση της STAT3 μειώνεται τόσο στη βασική κατάσταση όσο και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. M0 M200 M0si M200si A0 A200 A0si A200si pstat3 Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για την pstat3 στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, 0 sicis, GH200 sicis) Μπάντες των φιλμ Ινοβλάστες ασθενή Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 είναι σχεδόν ανύπαρκτη στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. Μετά από τη σίγαση του γονιδίου CIS, η φωσφορυλίωση αυξάνεται σημαντικά κυρίως στη βασική κατάσταση μη επαγωγής, αλλά και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 είναι μεγαλύτερη στο μάρτυρα σε σύγκριση με τον ασθενή, στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, η φωσφορυλίωση της STAT3 είναι πολύ μεγαλύτερη στον ασθενή στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. 153

154 Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Η φωσφορυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης STAT3 εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη, ήδη από τη βασική κατάσταση, κυρίως όμως μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. Μ pstat3 dapi Μ pstat3 0 0 SiCIS 0 0 SiCIS GH200 GH200 sicis GH200 GH200 SiCIS Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi - pstat3 Μετά από τη σίγαση του γονιδίου CIS, η pstat3 ελαττώνεται, ειδικά μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, χωρίς να μεταβάλλεται η εντόπισή της. Ινοβλάστες ασθενή Η πρωτεΐνη STAT3 φωσφορυλιώνεται μετά από τη σίγαση του γονιδίου CIS, τόσο στη βασική κατάσταση όσο και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. A pstat3 dapi A pstat3 0 0 SiCIS 0 0 sicis GH200 GH200 sicis GH 200 GH 200 sicis Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi - pstat3 Η κυτταρική εντόπιση της pstat3 μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS είναι κυτταροπλασματική και μεμβρανική (λευκά βέλη). Μετά από σίγαση του γονιδίου CIS και επαγωγή με 200ng/ml hgh, επικρατεί η κυτταροπλασματική, και ιδιαιτέρως η περιπυρηνική, εντόπιση (λευκό βέλος). 154

155 2. Πρωτεΐνη CIS Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα Η πρωτεϊνική έκφραση της ουβικουιτινυλιωμένης μορφής της πρωτεΐνης CIS μηδενίζεται μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS. M0 M200 M0si M200si A0 A200 A0si A200si ucis Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για την ucis στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, 0 sicis, GH200 sicis) Μπάντες των φιλμ Ινοβλάστες ασθενή H πρωτεϊνική έκφραση της ουβικουιτινυλιωμένης μορφής της πρωτεΐνης CIS, μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, μηδενίζεται στη βασική κατάσταση κι ελαττώνεται σημαντικά μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. Η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης ucis είναι μεγαλύτερη στον ασθενή συγκριτικά με το μάρτυρα. Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Η εξαφάνιση της πρωτεΐνης CIS μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, επιβεβαιώνει την επιτυχία της μεθόδου σίγασης. 155

156 Μ CIS dapi M CIS 0 0 SiCIS 0 0 sicis GH200 GH200 sicis GH 200 GH 200 sicis Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi - CIS Η κυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης CIS, χωρίς σίγαση του γονιδίου CIS, είναι κυρίως πυρηνική και κυτταροπλασματική (λευκά βέλη). Ινοβλάστες ασθενή Ομοίως, στον ασθενή η πρωτεΐνη CIS μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS ελαττώνεται σημαντικά στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, επιβεβαιώνοντας την επιτυχία της μεθόδου. A CIS dapi A CIS 0 0 SiCIS 0 0 sicis GH200 GH200 sicis GH200 GH200 sicis Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi - CIS Η κυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης CIS, χωρίς σίγαση του γονιδίου CIS, είναι κυρίως πυρηνική και λιγότερο κυτταροπλασματική. Στον ασθενή, στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, η συγκέντρωση της πρωτεΐνης CIS είναι σαφώς μεγαλύτερη συγκριτικά με το μάρτυρα και υπάρχει σημαντική επικράτηση της πυρηνικής εντόπισης (λευκά βέλη) σε σχέση με την κυτταροπλασματική. 156

157 CIS A0 A GH200 M0 M GH200 Εικόνα: Σύγκριση των εικόνων ανοσοφθορισμού για τη CIS στον ασθενή και στο μάρτυρα (0, GH200). 3. Πρωτεΐνη GHR Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα Η πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα GHR είναι παρόμοια στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. Μετά από σίγαση του γονιδίου CIS, η πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα GHR αυξάνεται, τόσο στη βασική κατάσταση όσο και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. M0 M200 M0si M200si A0 A200 A0si A200si GHR Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για τον GHR στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, 0 sicis, GH200 sicis) Μπάντες των φιλμ Ινοβλάστες ασθενή Η πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα GHR ελαττώνεται σε μικρό βαθμό μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, η πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα GHR αυξάνεται στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. 157

158 Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Στη βασική κατάσταση μη επαγωγής, ο υποδοχέας GHR βρίσκεται κυτταροπλασματικά, ιδιαίτερα περιπυρηνικά (λευκό βέλος). Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, η συγκέντρωση του υποδοχέα αυξάνεται, η εντόπισή του όμως παραμένει η ίδια (λευκό βέλος). Μ GHR dapi M GHR 0 0 SiCIS 0 0 SiCIS GH200 GH200 sicis GH200 GH200 SiCIS Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi - GHR Μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, η εντόπιση του υποδοχέα GHR είναι κυτταροπλασματική και μεμβρανική (λευκό βέλος). Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, η συγκέντρωση του υποδοχέα αυξάνεται και η εντόπισή του δε μεταβάλλεται (λευκό βέλος). Ινοβλάστες ασθενή Στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, η εντόπιση του υποδοχέα GHR είναι κυτταροπλασματική, και ιδιαιτέρως περιπυρηνική (λευκά βέλη). Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, τόσο στη βασική κατάσταση όσο και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, ο υποδοχέας εντοπίζεται στον πυρήνα, στο κυτταρόπλασμα, αλλά και στην κυτταρική μεμβράνη (λευκά βέλη), όπου είναι λειτουργικός. A GHR dapi Α GHR 0 0 SiCIS 0 0 SiCIS GH200 GH200 sicis GH200 GH200 SiCIS Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi - GHR 158

159 4. Πρωτεΐνη EGFR Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Στη βασική κατάσταση, ο υποδοχέας EGFR εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, και κυρίως περιπυρηνικά (λευκό βέλος). Μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, ο υποδοχέας εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη (λευκά βέλη). Μ EGFR dapi M EGFR 0 0 SiCIS 0 0 SiCIS GH200 GH200 sicis GH200 GH200 SiCIS Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi - EGFR Μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh και σίγαση του γονιδίου CIS, η συγκέντρωση του υποδοχέα EGFR αυξάνεται και διατηρεί την επικρατούσα κυτταροπλασματική, αλλά και μεμβρανική του εντόπιση (λευκό βέλος). Ινοβλάστες ασθενή Στη βασική κατάσταση μη επαγωγής, η εντόπιση του υποδοχέα EGFR είναι κυρίως κυτταροπλασματική και λιγότερο μεμβρανική (λευκά βέλη). Μετά από σίγαση του γονιδίου CIS, η εντόπιση δε μεταβάλλεται. A EGFR dapi A EGFR 0 0 SiCIS 0 0 SiCIS GH200 GH200 sicis GH200 GH200 SiCIS Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi - EGFR Μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, η συγκέντρωση του υποδοχέα EGFR είναι μεγαλύτερη από αυτή στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και η εντόπισή του είναι κυρίως κυτταροπλασματική και λιγότερο μεμβρανική. Μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh και σίγαση του γονιδίου CIS, η συγκέντρωση του υποδοχέα αυξάνεται 159

160 σημαντικά και η εντόπισή του παραμένει κυρίως κυτταροπλασματική, αλλά είναι εμφανής και η μεμβρανική εντόπιση. 5. Πρωτεΐνη pegfr Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα Η πρωτεϊνική έκφραση της φωσφορυλιωμένης μορφής του υποδοχέα EGFR αυξάνεται μετά από σίγαση του γονιδίου CIS, στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. M0 M200 M0si M200si A0 A200 A0si A200si pegfr Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για τον pegfr στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, 0 sicis, GH200 sicis) Μπάντες των φιλμ Ινοβλάστες ασθενή Η πρωτεϊνική έκφραση της φωσφορυλιωμένης μορφής του υποδοχέα EGFR αυξάνεται μετά από σίγαση του γονιδίου CIS, στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. Στον ασθενή, ο pegfr έχει μεγαλύτερη πρωτεϊνική συγκέντρωση συγκριτικά με το μάρτυρα σε κάθε περίπτωση. Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα H κυτταρική εντόπιση του φωσφορυλιωμένου υποδοχέα EGFR (pegfr) είναι κυτταροπλασματική, ιδιαίτερα περιπυρηνική (λευκά βέλη), και λιγότερο μεμβρανική, στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. 160

161 Μ pegfr dapi M pegfr 0 0 SiCIS 0 0 sicis GH200 GH200 sicis GH 200 GH 200 sicis Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi pegfr Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, στην κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, η κυτταρική εντόπιση του pegfr δε μεταβλήθηκε. Ινοβλάστες ασθενή Η φωσφορυλιωμένη μορφή του υποδοχέα EGFR έχει κυτταροπλασματική εντόπιση, με επικράτηση της περιπυρηνικής, τόσο στην κατάσταση μη επαγωγής όσο και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. A pegfr dapi A pegfr 0 0 SiCIS 0 0 SiCIS GH200 GH200 sicis GH 200 GH 200 sicis Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi - pegfr Στη βασική κατάσταση μη επαγωγής, μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, ο pegfr δεν παρουσιάζει αύξηση στη συγκέντρωσή του, η εντόπισή του όμως μετατρέπεται από κυτταροπλασματική σε κυτταροπλασματική και μεμβρανική (λευκό βέλος). Μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh και σίγαση του γονιδίου CIS, η συγκέντρωση του υποδοχέα αυξάνεται και η εντόπισή του, εκτός από κυτταροπλασματική, γίνεται σε σημαντικό βαθμό και μεμβρανική (λευκά βέλη). 6. Πρωτεΐνη β-trcp Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα Η πρωτεϊνική συγκέντρωση της πρωτεΐνης β-trcp μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh ελαττώνεται σε σχέση με τη βασική κατάσταση μη επαγωγής. Μετά τη σίγαση 161

162 του γονιδίου CIS, τόσο στην κατάσταση μη επαγωγής όσο και μετά την επαγωγή με 200ng/ml hgh, η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης παρουσιάζει αύξηση. M0 M200 M0si M200si A0 A200 A0si A200si β-trcp Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για τη β-trcp στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, 0 sicis, GH200 sicis) Μπάντες των φιλμ Ινοβλάστες ασθενή Μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, η πρωτεϊνική συγκέντρωση της πρωτεΐνης β- TrCP ελαττώνεται σε μικρό βαθμό συγκριτικά με τη βασική κατάσταση. Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης β-trcp αυξάνεται. Η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης β-trcp είναι μικρότερη στον ασθενή σε σύγκριση με το μάρτυρα, σε κάθε περίπτωση, δηλαδή στη βασική κατάσταση, με ή χωρίς σίγαση του γονιδίου CIS, αλλά και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, με ή χωρίς σίγαση του γονιδίου CIS. Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Η κυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης β-trcp στην κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh είναι κυρίως πυρηνική και λιγότερο κυτταροπλασματική και μεμβρανική. Μ β-trcp dapi M β-trcp 0 0 SiCIS 0 0 SiCIS GH200 GH200 sicis GH 200 GH 200 sicis Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi β-trcp 162

163 Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, τόσο στη βασική κατάσταση όσο και μετά την επαγωγή, η συγκέντρωση της β-trcp αυξάνεται, όπως και η κυτταροπλασματική και μεμβρανική εντόπισή της (λευκά βέλη). Ινοβλάστες ασθενή Στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, η συγκέντρωση της πρωτεΐνης είναι περίπου η ίδια και η εντόπισή της είναι κυρίως πυρηνική και λιγότερο κυτταροπλασματική και μεμβρανική. A β-trcp dapi A β-trcp 0 0 SiCIS 0 0 SiCIS GH200 GH200 sicis GH 200 GH 200 sicis Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi β-trcp Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, η μεμβρανική εντόπιση της β-trcp αυξάνεται (λευκά βέλη). Συγκρίνοντας τους ινοβλάστες του ασθενή και του μάρτυρα, προκύπτει ότι η συγκέντρωση της β-trcp είναι μικρότερη στον ασθενή στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή, τόσο χωρίς σίγαση του γονιδίου CIS όσο και μετά από σίγαση. Επίσης, μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με GH, η μεμβρανική εντόπιση της β-trcp αυξάνεται, τόσο στο μάρτυρα όσο και στον ασθενή. 7. Πρωτεΐνη p21 Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα Η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης p21 στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, ελαττώνεται ελάχιστα μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS. 163

164 M0 M200 M0si M200si A0 A200 A0si A200si p21 Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για την p21 στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, 0 sicis, GH200 sicis) Μπάντες των φιλμ Ινοβλάστες ασθενή Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης p21 μειώνεται σημαντικά. Συγκρίνοντας τον ασθενή με το μάρτυρα, χωρίς σίγαση του γονιδίου CIS η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης p21 είναι μεγαλύτερη στον ασθενή και στις δύο περιπτώσεις, ενώ μετά τη σίγαση του γονιδίου, η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης p21 είναι μεγαλύτερη στο μάρτυρα, σε κάθε περίπτωση. Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Η κυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης p21 στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, είναι κυρίως κυτταροπλασματική, ιδιαιτέρως περιπυρηνική (λευκά βέλη). Πρόκειται για την εντόπιση της πρωτεΐνης που της προσδίδει αντιαποπτωτική δράση. Μ p21 dapi M p SiCIS 0 0 SiCIS GH200 GH200 sicis GH 200 GH 200 sicis Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi p21 Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, η εντόπιση της πρωτεΐνης γίνεται κυρίως πυρηνική, εντόπιση στην οποία η πρωτεΐνη p21 δρα ως αναστολέας του κυτταρικού κύκλου. 164

165 Ινοβλάστες ασθενή Στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, η κυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης p21 είναι κυρίως πυρηνική. A p21 dapi A p SiCIS 0 0 SiCIS GH200 GH200 sicis GH 200 GH 200 sicis Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, sicis, GH200 sicis): dapi p21 Μετά από σίγαση του γονιδίου CIS, η εντόπισή της στο κυτταρόπλασμα (λευκά βέλη) αυξάνεται σημαντικά και στις δύο περιπτώσεις. 165

166 7.3 (Γ Μέρος) Πρωτεϊνική έκφραση και κυτταρική εντόπιση πρωτεϊνών του σηματοδοτικού μονοπατιού της GH και των αρνητικών ρυθμιστών του, σε βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγές για 15min με: 200mg/dl hgh (GH200), 1000mg/dl hgh (GH1000) και 15nM EGF (EGF). 1. Πρωτεΐνη STAT3 Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα H ποσότητα της πρωτεΐνης STAT3 αυξάνεται μετά από επαγωγή με GH200, GH1000 και EGF συγκριτικά με τη βασική κατάσταση μη επαγωγής. Η μεγαλύτερη αύξηση παρατηρείται μετά από τις επαγωγές με GH200 και EGF. M STAT3 dapi Μ STAT3 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi STAT3 Η κυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης είναι κυρίως στον πυρήνα και λιγότερο στο κυτταρόπλασμα. Ινοβλάστες ασθενή Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης STAT3 είναι μεγαλύτερη μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, αν συγκριθεί με τη βασική κατάσταση μη επαγωγής και την επαγωγή με GH200, με μια μικρή υπερίσχυση στην επαγωγή EGF. Στις επαγωγές της μέγιστης συγκέντρωσης, η πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, ιδιαιτέρως περιπυρηνικά, και στην κυτταρική μεμβράνη (λευκά βέλη). Αντιθέτως, στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με GH200, η κύρια εντόπιση της πρωτεΐνης είναι πυρηνική (λευκά βέλη) και λιγότερο κυτταροπλασματική. 166

167 A STAT3 dapi Α STAT3 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi STAT3 Συγκρίνοντας τις εικόνες ανοσοφθορισμού στους ινοβλάστες του μάρτυρα και του ασθενή, διαπιστώνεται μεγαλύτερη συγκέντρωση της πρωτεΐνης STAT3 στον ασθενή από ό,τι στο μάρτυρα, ήδη από τη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από τις επαγωγές με GH200, GH1000 και EGF. 2. Φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη STAT3 (pstat3) Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα H φωσφορυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης STAT3, pstat3, παρουσιάζει τη μέγιστη συγκέντρωσή της μετά από επαγωγή με GH200 και μετά από επαγωγή με EGF. Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF pstat3 Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για την pstat3 στο μάρτυρα (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ H συγκέντρωση της pstat3 μετά από επαγωγή με GH1000 είναι ιδιαιτέρως χαμηλή, συγκρίσιμη με αυτή χωρίς επαγωγή και σημαντικά μικρότερη από τις συγκεντρώσεις της μετά από επαγωγή με GH200 και EGF. 167

168 Ινοβλάστες ασθενή H φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 πραγματοποιείται σε πολύ μεγάλο βαθμό μετά από επαγωγή με GH1000 και σε λίγο μικρότερο βαθμό μετά από επαγωγή με EGF. A0 A200 A1000 AEGF pstat3 Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για την pstat3 στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ Στην περίπτωση της επαγωγής με GH200, η φωσφορυλίωση είναι αμελητέα, όπως και στη βασική κατάσταση μη επαγωγής. Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 είναι εντονότερη μετά από επαγωγή με GH200 και μετά από επαγωγή με EGF. Στις επαγωγές αυτές η pstat3 εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα κυρίως, αλλά και στον πυρήνα (λευκά βέλη). Μετά από επαγωγή με GH1000 η κυτταρική ποσότητα της πρωτεΐνης είναι μικρότερη συγκριτικά με τις άλλες επαγωγές και η εντόπισή της είναι περισσότερο πυρηνική και λιγότερο κυτταροπλασματική. M pstat3 dapi M pstat3 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi pstat3 168

169 Ινοβλάστες ασθενή Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 είναι εντονότερη μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF. Η κυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης σε αυτές τις επαγωγές είναι κυρίως κυτταροπλασματική και μεμβρανική (λευκά βέλη). Στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με GH200, η εντόπιση της pstat3 είναι κυτταροπλασματική (λευκά βέλη). A pstat3 dapi Α pstat3 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi pstat3 3. Πρωτεΐνη CIS Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα Η ουβικουιτινυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης CIS (ucis) παρουσιάζει μεγαλύτερη πρωτεϊνική έκφραση μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, συγκριτικά με την επαγωγή με GH200 και ακόμα περισσότερο αν συγκριθεί με τη βασική κατάσταση. Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF ucis Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για την ucis στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ 169

170 Ινοβλάστες ασθενή Η μέγιστη πρωτεϊνική έκφραση της ουβικουιτινυλιωμένης μορφής της πρωτεΐνης CIS (ucis) διαπιστώνεται στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με GH200. Στις δύο αυτές περιπτώσεις, η πρωτεϊνική έκφραση είναι μεγαλύτερη όχι μόνο αν συγκριθεί με τις επαγωγές GH1000 και EGF στους ινοβλάστες του ασθενή, αλλά και συγκριτικά με την κατάσταση μη επαγωγής και την επαγωγή με GH200 στους ινοβλάστες του μάρτυρα. Η ucis παρουσιάζει την ίδια περίπου πρωτεϊνική έκφραση στους ινοβλάστες του μάρτυρα και του ασθενή μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF. Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Μελετήθηκε η ενδοκυττάρια συγκέντρωση και η κυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης CIS συνολικά και όχι μόνο της ucis, δεδομένης της απουσίας αντισώματος ucis για ανοσοφθορισμό. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης CIS είναι μεγαλύτερη κυρίως μετά από επαγωγή με EGF, αλλά και μετά από επαγωγή με GH1000, σε σχέση με τη βασική κατάσταση μη επαγωγής και την επαγωγή με GH200. M CIS dapi Μ CIS 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi CIS Η κυτταρική εντόπιση στις επαγωγές με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση (GH1000 και EGF) είναι κυρίως πυρηνική, όμως τόσο η πυρηνική όσο και η κυτταροπλασματική (λευκά βέλη) εντόπιση της πρωτεΐνης CIS στις επαγωγές αυτές είναι εντονότερες από τις αντίστοιχες στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με GH200. Ινοβλάστες ασθενή Η ενδοκυττάρια συγκέντρωση της πρωτεΐνης CIS είναι εμφανώς μεγαλύτερη στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με GH200. Στις περιπτώσεις αυτές, η εντόπιση της πρωτεΐνης είναι πυρηνική και κυτταροπλασματική (λευκά βέλη). 170

171 A CIS dapi Α CIS 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi CIS Μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, η συγκέντρωση της πρωτεΐνης CIS είναι ελαττωμένη συγκρινόμενη με την κατάσταση μη επαγωγής και την επαγωγή με GH200. Επίσης, η κυτταρική εντόπιση της CIS μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF είναι κυρίως στον πυρήνα, ενώ η κυτταροπλασματική είναι ελάχιστη. 4. Πρωτεΐνη GHR Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα Η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης GHR είναι παρόμοια μετά από επαγωγή με GH200, μετά από επαγωγή με EGF και στη βασική κατάσταση, ενώ είναι παρόμοια στη βασική κατάσταση. Μετά από επαγωγή με GH1000, η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης μειώνεται. Μ0 Μ200Μ100ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF GHR Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για τoν GHR στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ 171

172 Ινοβλάστες ασθενή Mετά από επαγωγή με GH200 η πρωτεϊνική έκφραση της GHR μειώνεται συγκριτικά με τη βασική κατάσταση, όπως και μετά από επαγωγή με EGF. Μετά από επαγωγή με GH1000, όταν δηλαδή επιτυγχάνεται η μέγιστη φωσφορυλίωση της STAT3, η πρωτεϊνική συγκέντρωση της GHR παρουσιάζει αύξηση. Από τη σύγκριση της πρωτεϊνικής έκφρασης της GHR στους ινοβλάστες του μάρτυρα και του ασθενή προκύπτει ότι η βασική πρωτεϊνική έκφραση του GHR είναι παρόμοια στα δύο παιδιά, μετά από επαγωγή με GH200 μεγαλύτερη πρωτεϊνική έκφραση διαπιστώνεται στο μάρτυρα, ενώ μετά από επαγωγή με GH1000 μεγαλύτερη πρωτεϊνική έκφραση διαπιστώνεται στον ασθενή. Στις επαγωγές, επομένως, που η φωσφορυλίωση του STAT3 προσμαρτυρά ενεργοποίηση του μονοπατιού της αυξητικής ορμόνης, πράγματι διαπιστώνεται η μέγιστη πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα της αυξητικής ορμόνης (GHR). Μετά από επαγωγή με EGF, η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης GHR που παρατηρείται είναι στα ίδια επίπεδα στο μάρτυρα και στον ασθενή, και δε διαφέρει από τα αντίστοιχα επίπεδα στην κατάσταση μη επαγωγής. Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Η μέγιστη συγκέντρωση του υποδοχέα GHR διαπιστώνεται μετά από επαγωγή με GH200, με εντόπιση κυτταροπλασματική και μεμβρανική (λευκά βέλη) στην επαγωγή αυτή. Μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF ο GHR εντοπίζεται κυρίως κυτταροπλασματικά (περιπυρηνικά). M GHR dapi Μ GHR 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi GHR EGF Ινοβλάστες ασθενή Η εντόπιση της πρωτεΐνης GHR μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, είναι κυρίως μεμβρανική (λευκά βέλη), αλλά και κυτταροπλασματική. 172

173 A GHR dapi Α GHR 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi GHR Μετά από επαγωγή με GH200, η εντόπιση του υποδοχέα GHR είναι κυρίως κυτταροπλασματική (λευκό βέλος) και λιγότερο μεμβρανική. EGF 5. Πρωτεΐνη EGFR Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα H πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα EGFR είναι αυξημένη μετά από επαγωγή με GH200 και μετά από επαγωγή με EGF, ενώ αυξάνεται ελάχιστα μετά από επαγωγή με GH1000 σε σχέση με τη βασική κατάσταση μη επαγωγής. Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF EGFR Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για τoν EGFR στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ Ινοβλάστες ασθενή Η πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα EGFR αυξάνεται μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF συγκριτικά με τη βασική κατάσταση μη επαγωγής. Μετά από επαγωγή με GH200, η έκφραση του υποδοχέα δεν παρουσιάζει αύξηση. Μετά από σύγκριση των ινοβλαστών του μάρτυρα και του ασθενή προκύπτει ότι μετά από επαγωγή με GH200 η πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα είναι μεγαλύτερη 173

174 στο μάρτυρα, ενώ μετά την επαγωγή με GH1000 η πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα είναι μεγαλύτερη στον ασθενή. Δηλαδή, ο υποδοχέας εκφράζεται πρωτεϊνικά σε κάθε παιδί περισσότερο στην επαγωγή που το μονοπάτι της αυξητικής ορμόνης είναι λειτουργικό (μέγιστη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3). Μετά από επαγωγή με EGF, η πρωτεϊνική έκφραση του EGFR είναι περίπου ίση στο μάρτυρα και στον ασθενή. Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Ο υποδοχέας EGFR βρίσκεται σε μεγαλύτερη ποσότητα μετά από επαγωγή με GH200 και μετά από επαγωγή με EGF. Η εντόπισή του στις δύο αυτές περιπτώσεις είναι κυτταροπλασματική και, κυρίως, μεμβρανική (λευκά βέλη). Μετά από επαγωγή με GH1000, η ποσότητα του EGFR είναι συγκρίσιμη με αυτή της βασικής κατάστασης και η εντόπισή του είναι κυρίως κυτταροπλασματική. M EGFR dapi M/EGFR 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi EGFR Είναι χαρακτηριστικό ότι η ενδοκυττάρια εντόπιση του EGFR μετά από επαγωγή με EGF παρουσιάζει κοκκιώδη μορφή. Ινοβλάστες ασθενή Mετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, ο EGFR παρουσιάζει μεγαλύτερη έκφραση συγκριτικά με τη βασική κατάσταση μη επαγωγής και την επαγωγή με GH200. Η εντόπισή του μετά από επαγωγή με GH1000 είναι κυτταροπλασματική και μεμβρανική (λευκά βέλη), ενώ μετά από επαγωγή με EGF η εντόπιση του EGFR είναι μεμβρανική (λευκά βέλη) κι εντόνως κυτταροπλασματική, ιδιαιτέρως περιπυρηνική. Η εμφάνιση του EGFR είναι επίσης κοκκιώδης στον ασθενή μετά από επαγωγή με EGF. EGF 174

175 A EGFR dapi Α EGFR 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi GHR EGF 6. Φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη EGFR (pegfr) Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα Η μεγαλύτερη πρωτεϊνική έκφραση του φωσφορυλιωμένου EGFR παρατηρείται μετά από επαγωγή με EGF. Μετά από επαγωγή με GH200 η πρωτεϊνική έκφραση του EGFR είναι μεγαλύτερη σε σχέση με την αντίστοιχη μετά από επαγωγή με GH1000. Η ελάχιστη πρωτεϊνική έκφραση του pegfr παρατηρείται στην κατάσταση μη επαγωγής. Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF pegfr Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για τoν pegfr στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ Ινοβλάστες ασθενή Η πρωτεϊνική έκφραση του pegfr είναι αυξημένη μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, στις περιπτώσεις δηλαδή που παρατηρείται η μεγαλύτερη φωσφορυλίωση του STAT3. 175

176 Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Η φωσφορυλιωμένη μορφή του υποδοχέα EGFR είναι μεγαλύτερη μετά από επαγωγή με GH200 και μετά από επαγωγή με EGF, δηλαδή στις επαγωγές που η πρωτεΐνη STAT3 φωσφορυλιώνεται περισσότερο. H παρατήρηση αυτή είναι σύμφωνη με την πρωτεϊνική έκφραση του pegfr. Η εντόπιση του pegfr μετά από επαγωγή με GH200 είναι πυρηνική (λευκό βέλος) κυρίως, και σε μικρότερο βαθμό κυτταροπλασματική και μεμβρανική. Μετά από επαγωγή με EGF, η εντόπιση είναι κυρίως κυτταροπλασματική και μεμβρανική (λευκό βέλος), με εμφανή την κοκκιώδη μορφή. M pegfr dapi Μ pegfr 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi pegfr Μετά από επαγωγή με GH1000 ο φωσφορυλιωμένος EGFR εντοπίζεται εξίσου στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα (λευκό βέλος). Ινοβλάστες ασθενή Η φωσφορυλίωση του EGFR είναι μεγαλύτερη μετά από επαγωγή με GH200, GH1000 και EGF, συγκριτικά με τη βασική κατάσταση μη επαγωγής. Μετά από επαγωγή με EGF η φωσφορυλίωση είναι λίγο μεγαλύτερη από ό,τι μετά τις επαγωγές με GH. A pegfr dapi A pegfr 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi pegfr 176

177 H εντόπιση του pegfr είναι κυρίως πυρηνική και λιγότερο κυτταροπλασματική και μεμβρανική σε όλες τις επαγωγές και στη βασική κατάσταση. Ωστόσο, μετά από επαγωγή με EGF, η μεμβρανική και κυτταροπλασματική εντόπιση (λευκά βέλη) είναι σαφώς περισσότερες από ό,τι στις επαγωγές με GH. Μετά από επαγωγή με GH1000, η μεμβρανική και κυτταροπλασματική εντόπιση (λευκά βέλη) είναι περισσότερη συγκριτικά με την επαγωγή GH200. Η κοκκιώδης μορφολογία είναι διακριτή μετά από επαγωγή με EGF. Η ποσότητα του pegfr είναι μεγαλύτερη στον ασθενή σε σύγκριση με το μάρτυρα, σε κάθε περίπτωση επαγωγής. 7. Πρωτεΐνη ουβικουιτίνη (Ub) Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα H ποσότητα της ουβικουιτίνης αυξάνεται σε σχέση με τη βασική κατάσταση μετά από επαγωγή με GH1000 και πολύ περισσότερο μετά από επαγωγή με EGF. Μετά από επαγωγή με GH200 δεν παρατηρείται μεταβολή της ποσότητας της ουβικουιτίνης σε σχέση με την κατάσταση της μη επαγωγής. M Ub dapi M Ub 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi Ub Η εντόπιση της ουβικουιτίνης είναι κυρίως πυρηνική κι ελάχιστα κυτταροπλασματική. Ινοβλάστες ασθενή Η ποσότητα της ουβικουιτίνης είναι μεγαλύτερη στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με GH200. Η λιγότερη ποσότητα της πρωτεΐνης διαπιστώνεται μετά από επαγωγή με GH

178 A Ub dapi A Ub 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi Ub Η εντόπιση της ουβικουιτίνης στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με GH200 είναι κυρίως πυρηνική (λευκά βέλη) και λιγότερο κυτταροπλασματική και μεμβρανική (λευκά βέλη). Μετά από επαγωγή με GH1000 και EGF, η κυρίως πυρηνική εντόπιση της πρωτεΐνης παραμένει. Από τη σύγκριση των ινοβλαστών του μάρτυρα και του ασθενή προκύπτει ότι στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με GH200, η ποσότητα της ουβικουιτίνης είναι μεγαλύτερη στον ασθενή, με περισσότερη εντόπιση στο κυτταρόπλασμα σε σχέση με το μάρτυρα. Στις επαγωγές GH1000 και EGF, η ποσότητα της πρωτεΐνης είναι μεγαλύτερη στο μάρτυρα, με εντόπιση περισσότερο πυρηνική και λιγότερο κυτταροπλασματική σε σχέση με τον ασθενή. 8. Πρωτεΐνη β-trcp Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα H πρωτεϊνική έκφραση της β-trcp αυξάνεται μετά από επαγωγή με GH200, GH1000 και EGF συγκριτικά με τη βασική κατάσταση μη επαγωγής. Εμφανίζεται δε λίγο μεγαλύτερη μετά από επαγωγή με GH200 και μετά από επαγωγή με EGF, στις επαγωγές δηλαδή που επιτυγχάνεται η μέγιστη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3. 178

179 Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF β-trcp Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για τη β-trcp στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ Ινοβλάστες ασθενή H μέγιστη πρωτεϊνική έκφραση της β-trcp διαπιστώνεται μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, επίσης στις επαγωγές μέγιστης φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης STAT3. Μετά από επαγωγή με GH200, δεν αυξάνεται η πρωτεϊνική έκφραση της β-trcp σε σχέση με τη βασική κατάσταση. Τόσο στην κατάσταση μη επαγωγής όσο και μετά από κάθε επαγωγή, η πρωτεϊνική έκφραση της β-trcp είναι μεγαλύτερη στον ασθενή συγκριτικά με το μάρτυρα. Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Η έκφραση της πρωτεΐνης β-trcp φαίνεται μεγαλύτερη στις επαγωγές σε σχέση με τη βασική κατάσταση. Το εύρημα αυτό είναι συμβατό με την πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης. M β-trcp dapi M btrcp 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi β-trcp EGF Η εντόπιση της β-trcp στην επαγωγή GH200 είναι κυρίως κυτταροπλασματική και πυρηνική (λευκό βέλος), στην επαγωγή EGF κυρίως μεμβρανική (λευκά βέλη), ενώ στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με GH1000, η εντόπιση της πρωτεΐνης 179

180 είναι κυρίως πυρηνική (λευκά βέλη) και λιγότερο κυτταροπλασματική και μεμβρανική. Ινοβλάστες ασθενή Η έκφραση της πρωτεΐνης β-trcp είναι μεγαλύτερη μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, όπως ακριβώς συμβαίνει και με την πρωτεϊνική έκφρασή της. Μετά από επαγωγή με GH200, δεν αυξάνεται η έκφραση της πρωτεΐνης σε σχέση με τη βασική κατάσταση, εύρημα επίσης συμβατό με το αποτέλεσμα της Western Immunoblotting. A β-trcp dapi A βtrcp 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi β-trcp H εντόπιση της πρωτεΐνης είναι κυρίως πυρηνική (λευκά βέλη) και λιγότερο κυτταροπλασματική και μεμβρανική, τόσο στη βασική κατάσταση όσο και σε κάθε περίπτωση επαγωγής. Μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, τόσο η πυρηνική όσο και κυτταροπλασματική εντόπιση είναι αυξημένες. 9. Πρωτεΐνη p21 Western Immunoblotting Ινοβλάστες μάρτυρα H πρωτεϊνική έκφραση της p21 παρατηρείται αυξημένη μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, κι ελαφρώς μειωμένη μετά από επαγωγή με GH200, σε σχέση με τη βασική κατάσταση. 180

181 Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF p21 Tubulin Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για τoν EGFR στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ Ινοβλάστες ασθενή Η πρωτεϊνική έκφραση της p21 είναι μέγιστη στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με GH200, ενώ ελάχιστη πρωτεϊνική έκφραση παρατηρείται μετά από επαγωγή με GH1000. Ανοσοφθορισμός Ινοβλάστες μάρτυρα Η ποσότητα της πρωτεΐνης p21 είναι μεγαλύτερη μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF, με εντόπιση κυρίως πυρηνική και λιγότερο κυτταροπλασματική (λευκά βέλη). Η κυτταροπλασματική εντόπιση, ωστόσο, είναι περισσότερη μετά από επαγωγή με EGF από ό,τι μετά από επαγωγή με GH1000. M p21 dapi M p21 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi p21 Στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με GH200, η εντόπιση της πρωτεΐνης p21 είναι περισσότερο πυρηνική και λιγότερο κυτταροπλασματική. Μετά από επαγωγή με GH1000, αυξάνεται σημαντικά η πυρηνική εντόπιση της πρωτεΐνης, ενώ μετά από επαγωγή με EGF, αυξάνεται και η κυτταροπλασματική και η πυρηνική εντόπιση συγκριτικά με τη βασική κατάσταση και την επαγωγή GH

182 Ινοβλάστες ασθενή Μετά από επαγωγή με GH1000, παρατηρείται μείωση της πυρηνικής έκφρασης της πρωτεΐνης p21, αλλά σημαντική αύξηση της κυτταροπλασματικής (λευκά βέλη) έκφρασής της συγκριτικά με τη βασική κατάσταση και τις επαγωγές GH200 και EGF. A p21 dapi A p21 0 GH200 0 GH200 GH1000 EGF GH1000 EGF Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi p21 Συγκρίνοντας το μάρτυρα και τον ασθενή προκύπτει ότι στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με GH200 η πυρηνική έκφραση της πρωτεΐνης p21 είναι μεγαλύτερη στον ασθενή σε σχέση με το μάρτυρα. Μετά από επαγωγή με GH1000, η πυρηνική έκφραση της πρωτεΐνης είναι μεγαλύτερη στο μάρτυρα, ενώ στον ασθενή επικρατεί η κυτταροπλασματική. Μετά από επαγωγή με EGF, η κυτταροπλασματική εντόπιση της πρωτεΐνης p21 είναι μεγαλύτερη στο μάρτυρα. ΑΝΟΣΟΣΥΓΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΕΙΣ ΚΑΙ ΔΙΠΛΟΙ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΙ 1α. Ανοσοσυγκατακρήμνιση EGFR/β-TrCP Έγινε κατακρήμνιση της πρωτεΐνης β-trcp και αναζητήθηκε αν βρίσκεται σε φυσική σύνδεση μαζί της η πρωτεΐνη EGFR. Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF EGFR/β-TrCP Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για τoν EGFRβ-TrCP στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ 182

183 Διαπιστώθηκε ότι οι δύο πρωτεΐνες βρίσκονται σε φυσική σύνδεση περισσότερο μετά από επαγωγή με GH200 και μετά από επαγωγή με EGF στο μάρτυρα, ενώ στον ασθενή περισσότερο μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF. Δηλαδή, στις επαγωγές της μέγιστης φωσφορυλίωσης του STAT3 για κάθε παιδί. 1β. Διπλός ανοσοφθορισμός EGFR/β-TrCP Ελέγχθηκε η κοινή ενδοκυττάρια εντόπιση των πρωτεϊνών EGFR και β-trcp, η οποία είναι ενδεικτική αλλά όχι αποδεικτική της αλληλεπίδρασης μεταξύ τους. Με κόκκινο χρώμα αποδίδεται η μία πρωτεΐνη και με πράσινο χρώμα η άλλη, ανάλογα με το χρώμα του αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε σε κάθε περίπτωση. Τα δύο αντισώματα εφαρμόστηκαν στα ίδια κύτταρα, άλλοτε του μάρτυρα και άλλοτε του ασθενή και με καφέ απόχρωση αποδίδεται η κοινή κυτταρική εντόπιση των δύο πρωτεϊνών, όταν ο βαθμός έκφρασής τους είναι ο ίδιος. Ινοβλάστες μάρτυρα Ο κυτταροπλασματικός και μεμβρανικός συνεντοπισμός (λευκά βέλη) των πρωτεϊνών EGFR και β-trcp είναι μεγαλύτεροι, όπως αποδεικνύεται από την καφέ απόχρωση, μετά από επαγωγή με GH200 και μετά από επαγωγή με EGF, στις επαγωγές δηλαδή που και η πρωτεϊνική έκφραση των δύο πρωτεϊνών είναι μεγαλύτερη και η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 μέγιστη. EGFR-βΤrCP EGFR-βTrCP M0 dapi M0 EGFR M0 βtrcp M0 EGFR-βTrCP Μ GH1000 dapi Μ GH1000 EGFR Μ GH1000 btrcp Μ GH1000 EGFR-bTrCP M GH200 dapi M GH200 EGFR M GH200 βtrcp M GH200 EGFR-βTrCP Μ EGF dapi Μ EGF EGFR Μ EGF btrcp Μ EGF EGFR-bTrCP Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi EGFR β-trcp- συγχώνευση Ινοβλάστες ασθενή Οι πρωτεΐνες EGFR και β-trcp συνυπάρχουν κυτταροπλασματικά και μεμβρανικά κυρίως στις επαγωγές GH1000 και EGF (λευκά βέλη), δηλαδή στις επαγωγές που η πρωτεϊνική έκφραση των δύο πρωτεινών είναι μέγιστη, όπως και η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3. 183

184 EGFR-bTrCP EGFR-bTrCP Α0 dapi Α0 EGFR Α0 btrcp Α0 EGFR-bTrCP Α GH1000 dapi Α GH1000 EGFR Α GH1000 btrcp Α GH1000 EGFR-bTrCP Α GH200 dapi Α GH200 EGFR Α GH200 btrcp Α GH200 EGFR-bTrCP Α EGF dapi Α EGF EGFR Α EGF btrcp Α EGF EGFR-bTrCP Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi EGFR β-trcp- συγχώνευση 2α. Ανοσοσυγκατακρήμνιση STAT3/EGFR Έγινε κατακρήμνιση της πρωτεΐνης EGFR και αναζητήθηκε πιθανή φυσική σύνδεσή της με την πρωτεΐνη STAT3. Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF STAT3/EGFR Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για STAT3- EGFR στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ Διαπιστώθηκε φυσική σύνδεση, επομένως αλληλεπίδραση, των δύο πρωτεϊνών κυρίως μετά από τις δύο επαγωγές με GH στο μάρτυρα, ενώ στον ασθενή κυρίως μετά από επαγωγή με GH

185 2β. Διπλός ανοσοφθορισμός STAT3/EGFR: Ελέγχθηκε η κοινή ενδοκυττάρια εντόπιση των πρωτεϊνών STAT3 και EGFR. Ινοβλάστες μάρτυρα EGFR-STAT3 Μ 0 dapi Μ 0 EGFR Μ 0 STAT3 Μ 0 EGFR-STAT3 Μ GH200 dapi Μ GH200 EGFR Μ GH200 STAT3 Μ GH200 EGFR-STAT3 Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi EGFR - STAT3- συγχώνευση Διαπιστώθηκε συνύπαρξη των πρωτεϊνών στο κυτταρόπλασμα (λευκά βέλη) σε μικρό βαθμό μετά από κάθε επαγωγή. Ινοβλάστες ασθενή Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi EGFR - STAT3- συγχώνευση Διαπιστώθηκε η συνύπαρξη των πρωτεϊνών στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη, κυρίως μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF (λευκά βέλη). Η συνύπαρξη στους ινοβλάστες του ασθενή είναι περισσότερο εμφανής από αυτή στους ινοβλάστες του μάρτυρα. 3α. Ανοσοσυγκατακρήμνιση pstat3/cis Έγινε κατακρήμνιση της πρωτεΐνης CIS και αναζητήθηκε πιθανή φυσική σύνδεσή της με την πρωτεΐνη pstat3. 185

186 Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF pstat3/cis Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για pstat3-cis στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ Διαπιστώθηκε φυσική σύνδεση ανάμεσα στις δύο πρωτεΐνες, η οποία στο μάρτυρα είναι μεγαλύτερη κυρίως μετά από επαγωγή με GH200 και λιγότερο μετά από επαγωγή με EGF. Μετά από επαγωγή με GH1000 στο μάρτυρα η φυσική σύνδεση ανάμεσα στις δύο πρωτεΐνες υπάρχει, αλλά είναι μικρού βαθμού. Στον ασθενή, η φυσική σύνδεση είναι παρούσα μόνο μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF και είναι σημαντικού βαθμού. 3β. Διπλός ανοσοφθορισμός pstat3/cis Ελέγχθηκε η κοινή ενδοκυττάρια εντόπιση των πρωτεϊνών pstat3 και CIS. Ινοβλάστες μάρτυρα CIS-pSTAT3 CIS-pSTAT3 Μ0 dapi Μ0 CIS Μ0 pstat3 Μ0 CIS-pSTAT3 Μ GH1000 dapi Μ GH1000 CIS Μ GH1000 pstat3 Μ GH1000 CIS-pSTAT3 Μ GH200 dapi Μ GH200 CIS Μ GH200 pstat3 Μ GH200 CIS-pSTAT3 Μ EGF dapi Μ EGF CIS Μ EGF pstat3 Μ EGF CIS-pSTAT3 Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi CIS pstat3- συγχώνευση Η κοινή εντόπιση των δύο πρωτεϊνών είναι κυτταροπλασματική και μεμβρανική και παρατηρείται περισσότερο μετά από τις επαγωγές GH200 και EGF (λευκά βέλη) και λιγότερο μετά από επαγωγή με GH1000. Η παρατήρηση αυτή είναι σε συμφωνία με το αποτέλεσμα της ανοσοκατακρήμνισης για τα δύο μόρια. 186

187 Ινοβλάστες ασθενή Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi CIS pstat3- συγχώνευση Η κοινή εντόπιση των δύο πρωτεϊνών είναι κυτταροπλασματική και μεμβρανική και παρατηρείται κυρίως μετά από τις επαγωγές GH1000 και EGF (λευκά βέλη). To αποτέλεσμα της ανοσοκατακρήμνισης για τις δύο πρωτεΐνες είναι σύμφωνο με την παρατήρηση αυτή. 4α. Ανοσοσυγκατακρήμνιση EGFR/GHR Έγινε κατακρήμνιση της πρωτεΐνης GHR και αναζητήθηκε πιθανή φυσική σύνδεσή της με την πρωτεΐνη EGFR. Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF GHR/EGFR Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για GHR-EGFR στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ Οι δύο υποδοχείς βρίσκονται σε φυσική σύνδεση στο μάρτυρα και στον ασθενή, στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από όλες τις επαγωγές. Στο μάρτυρα, η μέγιστη φυσική σύνδεση ανάμεσα στους δύο υποδοχείς διαπιστώνεται μετά από επαγωγή με GΗ1000, ενώ μετά από επαγωγή με GH200 η φυσική σύνδεση είναι αυξημένη συγκριτικά με την κατάσταση μη επαγωγής. Στον ασθενή, η μέγιστη φυσική σύνδεση διαπιστώνεται μετά από επαγωγή με GH

188 4β. Διπλός ανοσοφθορισμός EGFR/GHR Ελέγχθηκε η κοινή ενδοκυττάρια εντόπιση των υποδοχέων EGFR και GHR. Η μεμβρανική εντόπιση των υποδοχέων είναι αυτή που τους καθιστά λειτουργικούς. Ινοβλάστες μάρτυρα EGFR-GHR Μ GH1000 dapi Μ GH1000 EGFR Μ GH1000 GHR Μ GH1000 EGFR-GHR Μ EGF dapi Μ EGF EGFR Μ EGF GHR Μ EGF EGFR-GHR Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi GHR EGFR - συγχώνευση Οι δύο υποδοχείς συνυπάρχουν κυρίως μεμβρανικά στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και μετά από επαγωγή με GH200 (λευκά βέλη). Μετά από επαγωγή με GH1000 οι υποδοχείς παρουσιάζουν κοινή εντόπιση σε μικρό βαθμό, κυρίως κυτταροπλασματικά. Μετά από επαγωγή με EGF η κοινή εντόπιση των δύο πρωτεϊνών είναι έντονη, κυρίως κυτταροπλασματικά (λευκό βέλος) και λιγότερο μεμβρανικά. Ινοβλάστες ασθενή EGFR-GHR Α GH1000 dapi Α GH1000 EGFR Α GH1000 GHR Α GH1000 EGFR-GHR Ινοβλάστες ασθενή (Α Εικόνα: Aσθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi GHR EGFR - συγχώνευση Α EGF dapi Α EGF EGFR Α EGF GHR Α EGF EGFR-GHR Οι δύο υποδοχείς συνυπάρχουν στη βασική κατάσταση μη επαγωγής και σε όλες τις επαγωγές. Η μέγιστη συνύπαρξή τους παρατηρείται μετά από επαγωγή με GH1000 και μετά από επαγωγή με EGF. Σε αυτές τις επαγωγές, η συνύπαρξη είναι κυρίως μεμβρανική (λευκά βέλη) και λιγότερο κυτταροπλασματική. Στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με GH200, η συνύπαρξη των δύο πρωτεϊνών είναι περισσότερο κυτταροπλασματική (λευκά βέλη) και λιγότερο μεμβρανική. Συγκρίνοντας το μάρτυρα και τον ασθενή προκύπτει ότι στο μάρτυρα ήδη από τη βασική κατάσταση οι δύο υποδοχείς βρίσκονται στην κυτταρική μεμβράνη, σε 188

189 μεγαλύτερο βαθμό από ό,τι στον ασθενή. Μετά από επαγωγή με GH200, ο μεμβρανικός συνεντοπισμός των υποδοχέων είναι μεγαλύτερος στο μάρτυρα, γεγονός που πιθανώς εξηγεί τη λειτουργικότητα του μονοπατιού της αυξητικής ορμόνης στην επαγωγή αυτή. Αντίστροφα, μετά από επαγωγή με GH1000, ο μεμβρανικός συνεντοπισμός των υποδοχέων είναι σημαντικά μεγαλύτερος στον ασθενή σε σχέση με το μάρτυρα, εύρημα που πιθανώς ερμηνεύει τη λειτουργικότητα του μονοπατιού στον ασθενή στην επαγωγή αυτή. Μετά από επαγωγή με EGF, η μεμβρανική συνύπαρξη των υποδοχέων είναι σαφώς μεγαλύτερη στον ασθενή σε σχέση με το μάρτυρα. 5α. Ανοσοσυγκατακρήμνιση ucis/egfr Έγινε κατακρήμνιση της πρωτεΐνης EGFR και αναζητήθηκε πιθανή φυσική σύνδεσή της με την ουβικουιτινυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης CIS (ucis). Μ0 Μ200 Μ1000 ΜEGF A0 A200 A1000 AEGF ucis/egfr Εικόνα: Αποτελέσματα densitometries της ανοσοαποτύπωσης κατά Western για ucis-egfr στο μάρτυρα και στον ασθενή (0, GH200, GH1000, EGF) Μπάντες των φιλμ Οι δύο πρωτεΐνες βρίσκονται σε φυσική σύνδεση κυρίως μετά από επαγωγή με EGF στον ασθενή και στο μάρτυρα, όπως είναι αναμενόμενο. Επιπλέον, στο μάρτυρα παρατηρείται σημαντικού βαθμού φυσική σύνδεση μεταξύ των πρωτεϊνών στην επαγωγή GH1000, που το μονοπάτι της GH δεν είναι λειτουργικό, ενώ στον ασθενή παρατηρείται σημαντική φυσική σύνδεση μετά από επαγωγή με GH200, στην οποία επίσης δεν είναι λειτουργικό το μονοπάτι της GH. Στις επαγωγές με GH που η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 είναι η μέγιστη για κάθε παιδί, δηλαδή GH200 για το μάρτυρα και GH1000 για τον ασθενή, η φυσική σύνδεση των πρωτεϊνών ucis και EGFR είναι η μικρότερη δυνατή. 189

190 5β. Διπλός ανοσοφθορισμός EGFR/CIS Ελέγχθηκε η κοινή ενδοκυττάρια εντόπιση των πρωτεϊνών EGFR και CIS. Ινοβλάστες μάρτυρα Μ EGFR-CIS EGFR-CIS 0 dapi 0 EGFR 0 CIS 0 EGFR-CIS GH1000 dapi GH1000 EGFR GH1000 CIS GH1000 EGFR-CIS GH200 dapi GH200 EGFR GH200 CIS GH200 EGFR-CIS EGF dapi EGF EGFR EGF CIS EGF EGFR-CIS Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi EGFR CIS - συγχώνευση Οι πρωτεΐνες EGFR και CIS συνυπάρχουν κυρίως στο κυτταρόπλασμα και λιγότερο στην κυτταρική μεμβράνη μετά από επαγωγή με GH1000 και, ιδιαίτερα, μετά από επαγωγή με EGF (λευκά βέλη). Μετά από επαγωγή με GH200, η κυτταροπλασματική και μεμβρανική συνύπαρξή τους είναι λιγότερο εμφανής. Ινοβλάστες ασθενή EGFR-CIS EGFR-CIS Α0 dapi Α0 EGFR Α0 CIS Α0 EGFR-CIS Α GH1000 dapi Α GH1000 EGFR Α GH1000 CIS Α GH1000 EGFR-CIS Α GH200 dapi Α GH200 EGFR Α GH200 CIS Α GH200 EGFR-CIS Α EGF dapi Α EGF EGFR Α EGF CIS Α EGF EGFR-CIS Εικόνα: Aσθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi EGFR CIS - συγχώνευση Η μέγιστη συνύπαρξη των πρωτεϊνών EGFR και CIS παρατηρείται μετά από επαγωγή με GH200 και EGF και αφορά το κυτταρόπλασμα και την κυτταρική μεμβράνη (λευκά βέλη). Είναι χαρακτηριστικό ότι μετά από την επαγωγή με GH200, που από τις δύο επαγωγές με GH είναι η επαγωγή της μέγιστης συνύπαρξης των δύο πρωτεϊνών, το μονοπάτι της αυξητικής ορμόνης είναι ανενεργό. Αντιθέτως, μετά από επαγωγή με GH1000, που η συνύπαρξη, άρα, πιθανώς, και η αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών, είναι μικρή, το μονοπάτι της αυξητικής ορμόνης είναι λειτουργικό, όπως αποδεικνύει η φωσφορυλίωση του STAT3. Ίσως η μειωμένη αποδόμηση του υποδοχέα EGFR μέσω της πρωτεΐνης CIS να είναι η εξήγηση της επιτυχημένης φωσφορυλίωσης του STAT3. 190

191 6. Διπλός ανοσοφθορισμός β-trcp/ghr Ελέγχθηκε η κοινή ενδοκυττάρια εντόπιση των πρωτεϊνών β-trcp και GHR. Ινοβλάστες μάρτυρα β-trcp-ghr β-trcp-ghr Μ0 dapi Μ0 β-trcp Μ0 GHR Μ0 β-trcp -GHR Μ GH1000 dapi Μ GH1000 β-trcp Μ GH1000 GHR ΜGH1000 β-trcp -GHR Μ GH200 dapi Μ GH200 β-trcp Μ GH200 GHR Μ GH200 β-trcp-ghr Μ EGF dapi Μ EGF β-trcp Μ EGF GHR Μ EGF β-trcp -GHR Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi β-trcp - GHR συγχώνευση Οι πρωτεΐνες συνυπάρχουν στο κυτταρόπλασμα, ιδιαίτερα περιπυρηνικά, και στην κυτταρική μεμβράνη, στη βασική κατάσταση και στις επαγωγές GH1000 και EGF (λευκά βέλη). Στην επαγωγή GH200, η συνύπαρξή τους είναι κυρίως περιπυρηνική και λιγότερο έντονη. Ινοβλάστες ασθενή Εικόνα: Aσθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi β-trcp - GHR - συγχώνευση Οι πρωτεΐνες β-trcp και GHR παρουσιάζουν κοινή εντόπιση στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη, ιδιαίτερα μετά από τις επαγωγές GH200 και EGF (λευκά βέλη), και λιγότερο στη βασική κατάσταση. Μετά από επαγωγή με GH1000, οι πρωτεΐνες παρουσιάζουν τη μικρότερη συνύπαρξή τους και η κοινή εντόπισή τους είναι κυρίως ο πυρήνας και λιγότερο το κυτταρόπλασμα. 191

192 7. Διπλός ανοσοφθορισμός EGFR/pSTAT3 Ελέγχθηκε η κοινή ενδοκυττάρια εντόπιση των πρωτεϊνών EGFR και pstat3. Ινοβλάστες μάρτυρα Εικόνα: Μάρτυρας (0, GH200, GH1000, EGF): dapi EGFR pstat3 - συγχώνευση Οι πρωτεΐνες EGFR και pstat3 συνυπάρχουν στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη στις επαγωγές GH200 και EGF (λευκά βέλη). Στη βασική κατάσταση μη επαγωγής συνυπάρχουν σε μικρό βαθμό, κυρίως στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα. Η συνύπαρξη των πρωτεϊνών είναι σχεδόν ανύπαρκτη μετά από επαγωγή με GH1000. Ινοβλάστες ασθενή EGFR-pSTAT3 Α GH1000 dapi Α GH1000 EGFR Α GH1000 pstat3 Α GH1000 EGFR-pSTAT3 Α EGF dapi Α EGF EGFR Α EGF pstat3 Α EGF EGFR-pSTAT3 Εικόνα: Ασθενής (0, GH200, GH1000, EGF): dapi EGFR pstat3 - συγχώνευση Οι πρωτεΐνες EGFR και pstat3 συνυπάρχουν σε πολύ μικρό βαθμό στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με GH200, στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη. Μετά από επαγωγή με GH1000, η συνύπαρξη είναι μεγαλύτερη, επίσης στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη, ενώ ο μέγιστος βαθμός συνύπαρξης παρατηρείται μετά από επαγωγή με EGF, στις ίδιες κυτταρικές εντοπίσεις (λευκά βέλη). 192

193 Κεφάλαιο 8 : Συζήτηση Α1) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΜΕΙΩΜΕΝΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ CIS ΣΤΟ ΜΕΤΑΓΩΓΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΣΤΟΥΣ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥΣ ΡΥΘΜΙΣΤΕΣ ΤΟΥ, ΣΕ ΠΑΙΔΙΑ ΜΕ GHTD. Η Διαταραχή στη Μεταβίβαση του Σήματος της Αυξητικής Ορμόνης (GHTD) περιγράφτηκε για πρώτη φορά από την ομάδα του εργαστηρίου μας το Η ομάδα αυτή πραγματοποίησε βασική έρευνα με σκοπό την κατανόηση των ενδοκυττάριων μηχανισμών σηματοδότησης της αυξητικής ορμόνης στη συγκεκριμένη κλινική οντότητα και τη σύγκριση των μηχανισμών αυτών με τους αντίστοιχους φυσιολογικούς. Τα χαρακτηριστικά της οντότητας GHTD σε ενδοκυττάριο επίπεδο, όπως περιγράφτηκαν από τους Spiliotis και συν. (202), είναι η μειωμένη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 και η υπερέκφραση της πρωτεΐνης p21, ήδη από τη βασική κατάσταση. Λόγω των πολύ σημαντικών δράσεων της αυξητικής ορμόνης, ενός από τους κυριότερους αυξητικούς παράγοντες του ανθρώπινου οργανισμού, μεταξύ των οποίων είναι η σωματική αύξηση και ο μεταβολισμός, η απαντητικότητα των κυττάρων σε αυτή υπόκειται σε αυστηρή ρύθμιση. Πολύ σύντομα μετά την έναρξη της μεταβίβασης του σήματος της GH, ενεργοποιούνται οι μηχανισμοί ελέγχου της διαδικασίας αυτής. Η αρνητική ρύθμιση του υποδοχέα της αυξητικής ορμόνης είναι ένας ειδικός μηχανισμός που περιορίζει δυνητικά την εκσεσημασμένη κυτταρική απόκριση στην αυξητική ορμόνη. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η αρνητική αυτή ρύθμιση επιτυγχάνεται, μεταξύ άλλων, μέσω της εσωτερικοποίησης του GHR και της αποδόμησής του από διάφορα πρωτεολυτικά συστήματα, ειδικότερα από μονοπάτια εξαρτώμενα από την ουβικουιτίνη. (328) Η πρωτεΐνη CIS έχει αναγνωρισθεί ως μία Ε3 λιγάση της ουβικουιτίνης. (334) Έχει δειχθεί ότι η εξαρτώμενη από τη CIS εσωτερικοποίηση του GHR είναι προαπαιτούμενη για την εξαρτώμενη από το πρωτεάσωμα αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH. Σύμφωνα με μελέτες, η υπερέκφραση της πρωτεΐνης CIS έχει συσχετισθεί με αντίσταση στην GH μετά το επίπεδο του υποδοχέα της σε λιποβαρή για την ηλικία κύησης (Small for Gestational Age/SGA) ποντίκια με διαταραχή στη σηματοδότηση JAK/STAT5. (445) Άλλες μελέτες σε διαγονιδιακά ποντίκια επίσης επιβεβαίωσαν ότι η υπερέκφραση της CIS προκαλεί σοβαρή ανεπάρκεια της σωματικής αύξησης. Στη σειρά πειραμάτων που πραγματοποιήθηκε σε ινοβλάστες 10 ασθενών με τη διαταραχή GHTD, αποδείχθηκε κατ αρχάς η ήδη περιγεγραμμένη στο παρελθόν υπερέκφραση της πρωτεΐνης p21 και η διαταραγμένη ενεργοποίηση του μονοπατιού 193

194 JAK/STAT μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh. Στην παρούσα διατριβή αποδείχθηκε επιπλέον η υπερέκφραση του αρνητικού ρυθμιστή της σηματοδότησης της GH, CIS, και της ουβικουιτινυλιωμένης του μορφής, ucis. Διαπιστώθηκε δε μειωμένη πρωτεϊνική έκφραση του υποδοχέα GHR, με επικράτηση της κυτταροπλασματικής και όχι της μεμβρανικής εντόπισής του. Όλα τα παραπάνω πιθανώς συμβάλλουν στην ανεπάρκεια αύξησης που παρατηρείται στους GHTD ασθενείς. Στο δεύτερο μέρος πειραμάτων της εργασίας αυτής έγινε επεξεργασία των ινοβλαστών με sirna CIS, ώστε να ελαττωθεί η γονιδιακή έκφραση της πρωτεΐνης CIS. Αποτέλεσμα ήταν η αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης του υποδοχέα GHR και η ελάττωση της υπερβολικής αποδόμησής του, ώστε κατέστη εφικτή η μετατόπισή του στην κυτταρική μεμβράνη όπου είναι λειτουργικός. (328) Ταυτόχρονα, αποκαταστάθηκε η φυσιολογική ενεργοποίηση (φωσφορυλίωση) της STAΤ3 και η εντόπισή της σε κυτταροπλασματική και μεμβρανική εντόπιση, όπου είναι δυνατή η πρόσδεσή της στον υποδοχέα GHR. Όπως έχει αναφερθεί, η GH προάγει την αύξηση ευνοώντας την κυτταρική επιβίωση και η διέγερση του υποδοχέα της, GHR, μεταβιβάζει ένα αντιαποπτωτικό σήμα. Η δράση αυτή φαίνεται να διαμεσολαβείται από την ενεργοποίηση της PI3 κινάσης, με την επακόλουθη φωσφορυλίωση των AKT/PKB. Η φωσφορυλίωση της p21 από τις AKT/PKB σταθεροποιεί την κυτταροπλασματική p21 και προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, προστατεύοντας τα κύτταρα από την απόπτωση. Υπάρχει αναφορά για πρόσδεση της p21 στην πρωτεΐνη STAT3 και αναστολή της ικανότητάς της να ενεργοποιεί τη μεταγραφή. (443) Η ομάδα του εργαστηρίου μας που χαρακτήρισε την οντότητα GHTD διαπίστωσε στα πρώτα πειράματα ότι οι ινοβλάστες των παιδιών με GHTD παρουσιάζουν καθήλωση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G 0 /G 1 και υπερέκφραση της p21 σε πυρηνική θέση. Στα πειράματα της παρούσας εργασίας βρέθηκε ότι όταν η έκφραση της πρωτεΐνης CIS ελαττωνόταν μετά από τη σίγαση του γονιδίου της, η πρωτεϊνική έκφραση της p21 στον GHTD ασθενή ελαττωνόταν σημαντικά, ενώ στο μάρτυρα ήταν οριακά εμφανής η μείωση αυτή. Η έκφραση των CIS και p21 συνεπώς, παρουσιάζει εμφανή συσχέτιση, ιδιαιτέρως στον ασθενή. Είναι άγνωστο αν η συσχέτιση αυτή οφείλεται σε κοινή γονιδιακή ρύθμιση των CIS και p21 (η γονιδιακή έκφραση της CIS διεγείρει τη γονιδιακή έκφραση της p21) ή σε αλληλεπίδραση στην αρνητική τους ρύθμιση (η αυξημένη έκφραση της CIS αναστέλλει την αρνητική ρύθμιση της p21). Πρόσφατη μελέτη συνδέει την πρωτεΐνη CIS με τον κυτταρικό κύκλο. Συγκεκριμένα, αναφέρεται ενεργοποίηση του κυτταρικού κύκλου και μείωση της κυτταρικής απόπτωσης απουσία της πρωτεΐνης CIS σε δενδριτικά κύτταρα ποντικιού. (446) Είναι πιθανή η επίδραση της CIS σε κινάσες του κυτταρικού κύκλου μέσω της p21 ή άλλου αναστολέα κινασών και στην περίπτωση αυτή. Εκτός από τη μείωση της πρωτεϊνικής έκφρασης της p21 μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS στον ασθενή, μειώθηκε συγχρόνως η πυρηνική υπερέκφρασή της και αυξήθηκε η κυτταροπλασματική της έκφραση. Το γονίδιο p21, ως γονίδιο-στόχος της p53, κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη που ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο και τη σύνθεση του DNA. Η ενδοκυττάρια εντόπιση της πρωτεΐνης p21 καθορίζει τις άλλοτε θετικές και 194

195 άλλοτε αρνητικές δράσεις της στον κυτταρικό κύκλο. Όταν η p21 εντοπίζεται στον πυρήνα αναστέλλει τη δραστηριότητα των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών CDK1 και CDK2 και εμποδίζει τη μετάβαση από τη φάση G 1 στη φάση S ή από τη φάση G 2 στη φάση M του κυτταρικού κύκλου. Αντιθέτως, η κυτταροπλασματική εντόπιση της p21 ενισχύει την αντιαποπτωτική της δράση. (371) Επομένως, η σίγαση του γονιδίου CIS, μειώνοντας την πυρηνική εντόπιση της p21 στον ασθενή, αίρει την καθήλωση του κυτταρικού κύκλου και αυξάνει την προαγωγική του πολλαπλασιασμού και αντιαποπτωτική δράση της p21. Φαίνεται επομένως ότι η απαλοιφή της δράσης της μίας πρωτεΐνης (CIS) προκαλεί αντιδραστική αύξηση της αντίθετης δράσης της άλλης. Η μείωση βέβαια της πρωτεϊνικής έκφρασης της p21 καθιστά την αντιαποπτωτική της δράση ελεγχόμενη. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με την προαναφερόμενη βιβλιογραφική αναφορά σύμφωνα με την οποία, απουσία της πρωτεΐνης CIS, ενεργοποιείται ο κυτταρικός κύκλος και μειώνεται η κυτταρική απόπτωση σε δενδριτικά κύτταρα ποντικιού. (446) Συμπερασματικά, στον ασθενή, μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS χάνεται η υπερβολική δράση δύο σημαντικών αρνητικών ρυθμιστών της σηματοδότησης της GH και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Συγκεκριμένα, υπάρχει απώλεια της δράσης της πρωτεΐνης CIS και της προαγωγικής του πολλαπλασιασμού δράσης της p21, η οποία ωστόσο ελαττώνεται ως προς την ποσότητα. Αντιθέτως, στο μάρτυρα, η σίγαση του γονιδίου CIS προκάλεσε καθήλωση του κυτταρικού κύκλου, λόγω αύξησης της πυρηνικής εντόπισης της πρωτεΐνης p21. Δηλαδή, υπό φυσιολογικές συνθήκες, όταν δεν είναι δυνατή η αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH από το ρυθμιστή CIS, αναλαμβάνει η p21 τη διακοπή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Φαίνεται επομένως ότι στο μάρτυρα η απαλοιφή της αρνητικής ρύθμισης της σηματοδότησης της GH από τη CIS, μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS, προκαλεί αντιρρόπηση από την κατασταλτική για τον κυτταρικό κύκλο δράση της p21. Η πρωτεΐνη β-trcp αποτελεί έναν επιπλέον αρνητικό ρυθμιστή της σηματοδότησης της GH, μέσω της ενδοκύττωσης και αποδόμησης του GHR. (345) Η πρωτεϊνική έκφραση της πρωτεΐνης β-trcp βρέθηκε μειωμένη στον ασθενή σε σύγκριση με το μάρτυρα, τόσο στη βασική κατάσταση όσο και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. Αν ληφθεί υπόψη η υπερέκφραση του αρνητικού ρυθμιστή CIS στον ασθενή, προκύπτει αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση της πρωτεΐνης CIS και στην έκφραση της πρωτεΐνης β-trcp. Μετά τη διαδικασία της σίγασης της πρωτεΐνης CIS με τη χρήση sirna CIS, η πρωτεϊνική έκφραση και η μεμβρανική εντόπιση της πρωτεΐνης β-trcp αυξήθηκε στο μάρτυρα και στον ασθενή. Δεδομένου ότι μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS αυξάνεται η πρωτεϊνική έκφραση και η μεμβρανική εντόπιση του υποδοχέα GHR, στου οποίου την αρνητική ρύθμιση συμμετέχει η β- TrCP, το εύρημα αυτό είναι μάλλον αναμενόμενο. Η αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης και της μεμβρανικής εντόπισης της β-trcp μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS ήταν μικρότερη στον ασθενή, πιθανώς λόγω της αρχικής υπερέκφρασης της πρωτεΐνης CIS και, άρα, των μεγαλύτερων επιπέδων της μετά το sirna CIS. 195

196 Α2) Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΜΕΙΩΜΕΝΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ CIS ΣΤΟΝ ΥΠΟΔΟΧΕΑ EGFR. ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΔΙΑΣΥΝΟΜΙΛΙΑΣ ΤΩΝ ΜΟΝΟΠΑΤΙΩΝ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΤΟΥ EGF. Ο Yamauchi και συν. απέδειξαν την ύπαρξη διασυνομιλίας μεταξύ του μεταγωγικού μονοπατιού της GH και της οδού μεταγωγής του σήματος του EGF. Συγκεκριμένα, έδειξαν ότι η ενεργοποιημένη από την GH JAK2 μπορεί να προκαλέσει τυροσινφωσφορυλίωση του EGFR, ανεξάρτητα από την ενδογενή δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης του EGFR. (396,397) Ακολούθως, ο EGFR παρέχει θέση πρόσδεσης στην Grb2, ενεργοποιώντας τη MAP κινάση. Επιπλέον, έχει περιγραφεί η θρεονινφωσφορυλίωση του EGFR από την GH στα προλιποκύτταρα 3Τ3-F442A, μέσω του μονοπατιού MEK/ERK. (400) Με αφορμή αυτές τις παρατηρήσεις μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία η ποσοτική έκφραση και η κυτταρική τοποθεσία του EGFR, σε μια προσπάθεια να βρεθεί η επίδραση της πρωτεΐνης CIS στην πιθανή διασυνομιλία ανάμεσα στα σηματοδοτικά μονοπάτια των GH και EGF. Η μελέτη της έκφρασης των υποδοχέων GHR και EGFR ενίσχυσε την αρχική μας υπόθεση για την ύπαρξη αλληλεπίδρασης ανάμεσα στους δύο υποδοχείς στο μάρτυρα και στον ασθενή. Η αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης και της μεμβρανικής εντόπισης του EGFR και της ενεργοποιημένης μορφής του στο μάρτυρα, μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh, αν και σε μικρό βαθμό, αποτελούν ισχυρή ένδειξη ότι ο EGFR ενεργοποιείται κατά τη σηματοδότηση της GH. Στην επαγωγή αυτή, ο GHR καταλαμβάνει μεμβρανική εντόπιση και ενεργοποιείται η φυσιολογική σηματοδότηση της GH. Επομένως, φαίνεται ότι οι δύο υποδοχείς (EGFR και GHR) έχουν κοινή τοποθεσία και, πιθανώς, συνεργάζονται υπό φυσιολογικές συνθήκες κατά την επιτυχή μεταβίβαση του σήματος της GH. Ομοίως, στον ασθενή, μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh, παρά την αδυναμία σηματοδότησης της GH, η έκφραση και η μεμβρανική εντόπιση του EGFR και του pegfr αυξάνονται σε μικρό βαθμό. Η σίγαση του γονιδίου CIS με τη χρήση sirna CIS μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh στο μάρτυρα και στον ασθενή, αυξάνει την έκφραση του EGFR και τη μεμβρανική του εντόπιση, κυρίως όμως στον ασθενή. Αν και δεν είναι γνωστή από τη βιβλιογραφία η αρνητική ρύθμιση του EGFR από την πρωτεΐνη CIS, αυτή είναι μια ένδειξη ότι κάτι τέτοιο είναι πιθανό. Μια άλλη πιθανή εξήγηση της αυξημένης μεμβρανικής έκφρασης του EGFR μετά από τη σίγαση του γονιδίου CIS, είναι ότι η αυξημένη έκφραση του GHR προκαλεί μείωση της αποδόμησης του EGFR. Σύμφωνα με μία σχετική βιβλιογραφική αναφορά, η GH μειώνει την επαγώμενη από τον EGF αποδόμηση του EGFR. (400) Συμπεραίνουμε επομένως ότι οι υποδοχείς GHR και EGFR και τα σηματοδοτικά τους μονοπάτια διασυνομιλούν σε μικρό βαθμό μετά από διέγερση με GH τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες (μάρτυρας), όσο και στην περίπτωση του ασθενή με GHTD. Η διασυνομιλία όμως αυτή δεν επαρκεί από μόνη της για την επιτυχημένη μεταγωγή του σήματος της GH, όπως φαίνεται στην περίπτωση του ασθενή, πιθανώς επειδή ο υποδοχέας GHR δε βρίσκεται στη λειτουργική του θέση. Μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS όμως, η διασυνομιλία αυτή γίνεται εντονότερη, ιδιαίτερα στην περίπτωση του ασθενή, πιθανώς λόγω της 196

197 αυξημένης μεμβρανικής εντόπισης των δύο υποδοχέων. Πρόκειται για μία διασυνομιλία που, στον ασθενή κυρίως, ευοδώνεται όταν τα επίπεδα της πρωτεΐνης CIS είναι ελαττωμένα και παρεμποδίζεται όταν η πρωτεΐνη CIS υπερεκφράζεται. Συνοψίζοντας, στους ινοβλάστες του ασθενή, η μείωση της γονιδιακής έκφρασης της πρωτεΐνης CIS μετά τη σίγαση του γονιδίου της, προκάλεσε ενεργοποίηση του άξονα JAK/STAT, με φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3, αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης και της μεμβρανικής εντόπισης του GHR, αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης και της μεμβρανικής εντόπισης του EGFR και της φωσφορυλιωμένης μορφής του (pegfr), αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης και της κυτταροπλασματικής και μεμβρανικής εντόπισης της β-trcp, και μείωση της πρωτεϊνικής έκφρασης της p21 με ταυτόχρονη σταθεροποίηση της κυτταροπλασματικής εντόπισής της. Τα ευρήματα αυτά στοιχειοθετούν τη θεωρία μας σύμφωνα με την οποία αφενός η υπερέκφραση της πρωτεΐνης CIS αποτελεί τη βασική αιτία της διαταραγμένης μεταβίβασης του σήματος της GH στα παιδιά με GHTD, αφετέρου η αποκατάσταση της φυσιολογικής σηματοδότησης της GH μετά την άρση της δράσης της CIS, περιλαμβάνει εκτός από τον GHR, και τη συμμετοχή του υποδοχέα EGFR. Επιπροσθέτως, η υπερέκφραση των αρνητικών ρυθμιστών CIS και p21 στον ασθενή, συνοδεύεται από μειωμένη έκφραση του αρνητικού ρυθμιστή β-trcp. Αυτό ενδεχομένως αποτελεί αντιρροπιστικό μηχανισμό, ώστε να είναι εφικτή η σηματοδότηση της GH παρά την καταστολή της από τις πρωτεΐνες CIS και p21. B1) ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΏΝ ΔΟΣΕΩΝ GΗ (GH200, GH1000) ΣΤΟ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΣΤΟΥΣ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥΣ ΡΥΘΜΙΣΤΕΣ ΤΟΥ Σύμφωνα με την περιγραφή της οντότητας GHTD από τους Spiliotis και συν., στα απαραίτητα κριτήρια ένταξης παιδιών με ανεπάρκεια αύξησης στη συγκεκριμένη κλινική οντότητα συμπεριλαμβάνονται η αυξημένη απόκρισή του IGF-I τους μετά από 4 ημέρες χορήγησης hgh κατά το IGF-I generation test και η κλινική ανταπόκρισή τους μετά από εξωγενή χορήγηση ανθρώπινης βιοσυνθετικής αυξητικής ορμόνης. Προηγούμενα πειράματα των Spiliotis και συν. έδειξαν ότι η σηματοδότηση της GH είναι εφικτή στο μάρτυρα μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, ενώ στον ασθενή μόνο μετά από επαγωγή με πενταπλάσια δόση hgh, δηλαδή 1000ng/ml hgh. Στην πενταπλάσια δόση, η φωσφορυλίωση της STAT3 στο μάρτυρα είναι σχεδόν ανύπαρκτη. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν από τα πειράματα της συγκεκριμένης εργασίας, στα οποία η πρωτεϊνική έκφραση της pstat3 και η κυτταροπλασματική εντόπισή της αυξάνονται στο μάρτυρα μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, ενώ στον ασθενή μετά από επαγωγή με 1000ng/ml hgh. Φαίνεται, επομένως, ότι στον ασθενή η αδυναμία ενδοκυττάριας σηματοδότησης της GH μέσω του μονοπατιού JAK/STAT3 δεν είναι αμετάκλητο φαινόμενο, αλλά μπορεί να αποκατασταθεί με μεγαλύτερη δόση hgh. 197

198 Δεδομένου ότι οι ασθενείς με GHTD παρουσίαζαν ανεπάρκεια αύξησης η οποία αποκαταστάθηκε μετά από πολλά χρόνια χορήγησης ανθρώπινης βιοσυνθετικής hgh, (με τις ίδιες φαρμακολογικές δόσεις hgh που χορηγούνται σε παιδιά με κλασσική ανεπάρκεια αυξητικής ορμόνης), θεωρούμε ότι η επαγωγή των ινοβλαστών των ασθενών με πενταπλάσια δόση hgh in vitro αντιστοιχεί στα επίπεδα GH μετά από τη θεραπευτική χορήγηση hgh in vivo. Και στις δύο περιπτώσεις η σηματοδότηση της GH είναι επιτυχής. Στα πειράματα της παρούσας εργασίας, επιβεβαιώθηκε η υπερέκφραση της ουβικουιτινυλιωμένης πρωτεΐνης CIS (ucis) στους ινοβλάστες του ασθενή, στη βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, κι αυτό θεωρείται η γενεσιουργός αιτία της ανεπαρκούς σηματοδότησης της GH στην επαγωγή με τη χαμηλή δόση hgh. Η ελαττωμένη πρωτεϊνική έκφραση της ucis μετά από επαγωγή με 1000ng/ml hgh, θεωρούμε ότι ερμηνεύει την αποκατάσταση της φυσιολογικής φωσφορυλίωσης της STAΤ3 στην επαγωγή αυτή, λόγω της παραμονής του υποδοχέα GHR στην κυτταρική μεμβράνη και της μειωμένης αποδόμησής του. Αντιθέτως, στους ινοβλάστες του μάρτυρα, η ελαττωμένη πρωτεϊνική έκφραση της ucis στην επαγωγή GH200 επιτρέπει τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3, ενώ μετά από επαγωγή με 1000ng/ml hgh, η ucis αυξάνεται, ασκώντας την απαραίτητη αρνητική ρύθμιση του μονοπατιού, με αποτέλεσμα η σηματοδότηση της GH να μην είναι αποτελεσματική. Η έκφραση της συνολικής πρωτεΐνης CIS και ο βαθμός κυτταροπλασματικής εντόπισής της, όπως προκύπτουν από πειράματα ανοσοφθορισμού, είναι αυξημένα στον ασθενή και στο μάρτυρα στις ίδιες επαγωγές που είναι αυξημένη η πρωτεϊνική έκφραση της ucis. Επομένως, όχι μόνο η αυξημένη συγκέντρωση των CIS και ucis, αλλά και η κυτταροπλασματική εντόπιση της πρωτεΐνης CIS στις προαναφερόμενες επαγωγές, έχουν ως αποτέλεσμα τη δράση της ως αρνητικού ρυθμιστή της σηματοδότησης της GH. H αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH από την πρωτεΐνη CIS στις επαγωγές GH200 στο μάρτυρα και GH1000 στον ασθενή, επιβεβαιώνεται από την αυξημένη αλληλεπίδραση και το συνεντοπισμό των πρωτεϊνών CIS και pstat3 στις ίδιες επαγωγές. Εκτός από τη φωσφορυλιωμένη μορφή της STAT3 (pstat3), τα πειράματα της παρούσας εργασίας έδειξαν ότι και η μη φωσφορυλιωμένη μορφή, δηλαδή η πρωτεΐνη STAT3, παρουσιάζει μεγαλύτερη πρωτεϊνική έκφραση στην επαγωγή GH200 για το μάρτυρα και στην επαγωγή GH1000 για τον ασθενή. Μάλιστα, στον ασθενή, στην επαγωγή της μέγιστης πρωτεϊνικής έκφρασης, GH1000, η εντόπιση της STAT3 είναι κυρίως κυτταροπλασματική, άρα περισσότερο διαθέσιμη προς φωσφορυλίωση. Η STAT3, όπως όλη η οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων STAT, επιστρατεύεται στο ενεργοποιημένο σύμπλεγμα GHR/JAK2, το οποίο βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα προτού μεταφερθεί στον πυρήνα. Συνεπώς, η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού JAK/STAT προϋποθέτει την κυτταροπλασματική εντόπιση των STAT. (298) Γενικότερα όμως, η STAT3 παρουσιάζει μεγαλύτερη έκφραση στον ασθενή από ό,τι στο μάρτυρα τόσο στη βασική κατάσταση όσο και σε κάθε επαγωγή με GH. 198

199 Όσον αφορά στον υποδοχέα GHR, τα συγκεκριμένα πειράματα ανέδειξαν την αύξηση της πρωτεϊνικής του έκφρασης και της μεμβρανικής εντόπισής του στην επαγωγή που επιτυγχάνεται η ενεργοποίηση της STAT3 και, άρα, η σηματοδότηση της GH (επαγωγή GH200 για το μάρτυρα και GH1000 για τον ασθενή). Επομένως, τόσο η συγκέντρωση όσο και η εντόπιση του GHR τον καθιστούν διαθέσιμο για ενεργοποίηση από την GH στις προαναφερόμενες επαγωγές και αυτό προφανώς εξηγεί την ενεργοποίηση του μονοπατιού JAK2/STAT3. Είναι σημαντική η επισήμανση ότι στις επαγωγές αυτές ο αρνητικός ρυθμιστής CIS είναι μειωμένος, επομένως η εσωτερικοποίηση και η αποδόμηση του GHR είναι επίσης ελαττωμένες. Η πρωτεΐνη p21 παρουσιάζει το ίδιο μοντέλο πρωτεϊνικής έκφρασης με τον αρνητικό ρυθμιστή CIS, στο μάρτυρα και στον ασθενή. Συγκεκριμένα, παρουσιάζει τη μέγιστη έκφρασή της στις επαγωγές που δεν επιτυγχάνεται η φωσφορυλίωση της pstat3 (GH1000 για το μάρτυρα και GH200 για τον ασθενή) και τη μικρότερη στις επαγωγές που η μεταγωγή του σήματος της GH είναι εφικτή (GH200 για το μάρτυρα και GH1000 για τον ασθενή). Στον ασθενή, παρουσιάζει αυξημένη πρωτεϊνική έκφραση ήδη από τη βασική κατάσταση, όπως και η πρωτεΐνη CIS. Όσον αφορά στην κυτταρική εντόπιση της p21, η πυρηνική εντόπιση, που έχει ανασταλτική δράση στον κυτταρικό κύκλο, (370) αυξάνεται στο μάρτυρα στην επαγωγή GH1000, ενώ στον ασθενή στη βασική κατάσταση και στην επαγωγή GH200. Το γεγονός αυτό καθιστά την p21 συνυπεύθυνη, μαζί με την πρωτεΐνη CIS, για την παρεμπόδιση της σηματοδότησης της GH στην επαγωγή GH200 στον ασθενή και στην επαγωγή GH1000 μάρτυρα. Σημαντική θέση στην πολύπλοκη ρύθμιση του μεταγωγικού μονοπατιού της GH καταλαμβάνει η εσωτερικοποίηση και η εξαρτώμενη από την ουβικουιτίνη αποδόμηση του GHR. Και οι δύο αυτές διαδικασίες προϋποθέτουν το μοτίβο ενδοκύττωσης UbE που βρίσκεται στην κυτταροπλασματική ουρά του GHR. Ένας από τους παράγοντες που επιστρατεύονται στο μοτίβο UbE είναι η πρωτεΐνη β-trcp, η οποία αποτελεί την F-box υπομονάδα μιας Ε3 λιγάσης. Εκτός όμως από αρνητικός ρυθμιστής του GHR, η β-trcp συμμετέχει στους μηχανισμούς ελέγχου του μονοπατιού EGF/EGFR. (353) Προς επιβεβαίωση των παραπάνω, η β-trcp παρουσίασε αυξημένη πρωτεϊνική έκφραση στις επαγωγές GH200 στο μάρτυρα και GH1000 στον ασθενή, στις επαγωγές δηλαδή που παρατηρείται ταυτόχρονη έκφραση των δύο υποδοχέων και το μονοπάτι της GH είναι λειτουργικό. Και στις δύο περιπτώσεις, η αύξηση της β-trcp μπορεί να οφείλεται είτε στην αύξηση της συγκέντρωσης του EGFR είτε στην αύξηση του GHR είτε στην αύξηση και των δύο. Η β-trcp βρέθηκε επίσης αυξημένη στην επαγωγή GH1000 στο μάρτυρα, στην οποία η πρωτεϊνική έκφραση του GHR είναι μειωμένη, ενώ του EGFR είναι αυξημένη σε σχέση με τη βασική κατάσταση. Πιθανώς, στην επαγωγή αυτή η β-trcp αναλαμβάνει την αρνητική ρύθμιση του EGFR. Ο διπλός ανοσοφθορισμός και η ανοσοσυγκατακρήμνιση των πρωτεϊνών β-trcp και EGFR ανέδειξαν ότι οι δύο πρωτεΐνες βρίσκονται στη μέγιστη φυσική σύνδεση μεταξύ τους, άμεση ή έμμεση, όταν το μονοπάτι της GH είναι ενεργό, δηλαδή στις επαγωγές GH200 στο μάρτυρα και GH1000 στον ασθενή. Πρόκειται για τις επαγωγές 199

200 στις οποίες οι υποδοχείς GHR και EGFR παρουσιάζουν μεμβρανική έκφραση, ως αποτέλεσμα της μείωσης της πρωτεΐνης CIS. Η εξασθένιση της δράσης της CIS φαίνεται ότι συνεπάγεται την ανάληψη από τη β-trcp της αρνητικής ρύθμισης της ενεργοποιημένης μεταγωγικής οδού της GH. Η αντιστρόφως ανάλογη σχέση των πρωτεϊνών CIS και β-trcp θα μπορούσε επίσης να εξηγήσει τη μεγαλύτερη πρωτεϊνική έκφραση της β-trcp στο μάρτυρα στη βασική κατάσταση και σε κάθε επαγωγή, συγκριτικά με τον ασθενή, δεδομένου ότι η πρωτεϊνική έκφραση της CIS στον ασθενή είναι μεγαλύτερη συγκριτικά με το μάρτυρα σε κάθε περίπτωση. Η αλληλεπίδραση των β-trcp και EGFR στη μεμβράνη, αλλά κυρίως στο κυτταρόπλασμα, κατά την επιτυχή σηματοδότηση της GH επιβεβαιώνει επίσης τη συμμετοχή του EGFR στη φυσιολογική σηματοδότηση της GH και την αρνητική ρύθμιση που η β-trcp ασκεί άμεσα ή έμμεσα στον υποδοχέα. Είτε δηλαδή η β-τrcp συνδέεται απευθείας με τον EGFR είτε συνδέεται με τον GHR που είναι συνδεδεμένος με τον EGFR, αποτέλεσμα είναι η μεταφορά του EGFR στο κυτταρόπλασμα και η αποδόμησή του. Ο διπλός ανοσοφθορισμός για τις πρωτεΐνες β-trcp και GHR ανέδειξε την κυτταροπλασματική συνύπαρξη των πρωτεϊνών στις επαγωγές GH200 για το μάρτυρα και GH1000 για τον ασθενή, με τη μεμβρανική συνύπαρξή τους να είναι ελάχιστη. Μετά από αυτές τις επαγωγές, ο GHR φαίνεται ότι απομακρύνεται από την κυτταρική μεμβράνη, όπου αρχικά βρίσκεται, με τη δράση της β-trcp. Δεδομένου ότι το μονοπάτι JAK/STAT είναι λειτουργικό στις επαγωγές αυτές, φαίνεται ότι η β- TrCP κινητοποιείται δευτερευόντως ώστε να αποτρέψει τη συνεχή ενεργοποίηση του μονοπατιού. Στις εν λόγω επαγωγές, όπως έχει ήδη αναφερθεί, ενεργοποιείται και ο υποδοχέας EGFR, ενώ οι άλλοι δύο αρνητικοί ρυθμιστές, CIS και p21, είναι ελαττωμένοι. Συμπερασματικά, υπό φυσιολογικές συνθήκες μη ανεπάρκειας αύξησης, η σηματοδότηση της GH in vitro επιτυγχάνεται μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh, με φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα STAT3. Στην επαγωγή αυτή, εκτός από τη φωσφορυλιωμένη μορφή της STAT3, και η μη φωσφορυλιωμένη μορφή παρουσιάζει αυξημένη πρωτεϊνική έκφραση, ενώ η έκφραση του αρνητικού ρυθμιστή CIS, της ουβικουιτινυλιωμένης του μορφής, ucis, και η συνολική έκφραση της ουβικουιτίνης είναι αισθητά ελαττωμένες. Ως αποτέλεσμα, δεν υπάρχει υπερβολική μετατόπιση του υποδοχέα GHR στο πρωτεάσωμα προς αποδόμηση, αλλά παραμένει στην κυτταρική μεμβράνη, επιτρέποντας τη μεταγωγή του σήματος της GH. Στην ίδια επαγωγή, η συγκέντρωση της πρωτεΐνης p21 είναι ελαττωμένη, γεγονός που ευνοεί τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ενώ η β-trcp είναι ιδιαιτέρως αυξημένη, πιθανώς επειδή αυτή κυρίως αναλαμβάνει την αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH δεδομένης της χαμηλής συγκέντρωσης των CIS και p21. Η αύξηση της πρωτεϊνικής συγκέντρωσης και της μεμβρανικής εντόπισης του υποδοχέα EGFR, καθώς και της φωσφορυλιωμένης (ενεργού) μορφής του στην εν λόγω επαγωγή (GH200), αποτελεί ένα επιπλέον ισχυρό επιχείρημα για την εμπλοκή του EGFR στην επιτυχή σηματοδότηση της GH υπό φυσιολογικές συνθήκες. Η συμπεριφορά των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στο μεταγωγικό μονοπάτι της GH ή στην αρνητική ρύθμισή του βρέθηκε να είναι η ίδια στους ινοβλάστες του ασθενή 200

201 μετά από επαγωγή με 1000ng/ml hgh με αυτή που παρατηρήθηκε στους ινοβλάστες του μάρτυρα μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh. Κατά απόλυτη αντιστοιχία με τα προαναφερθέντα για το μάρτυρα, στον ασθενή με GHTD στην επαγωγή GΗ1000 διαπιστώθηκε αυξημένη διαθεσιμότητα της πρωτεΐνης STAT3 στην κυτταρική μεμβράνη και κατά συνέπεια αυξημένη φωσφορυλίωσή της, μείωση της πρωτεΐνης CIS, της ucis και της ολικής ουβικουιτίνης, μείωση της p21 με ταυτόχρονη αύξηση της κυτταροπλασματικής, άρα προαγωγικής του κυτταρικού κύκλου, εντόπισής της και αύξηση της συγκέντρωσης και της μεμβρανικής εντόπισης των υποδοχέων GHR και EGFR (συμπεριλαμβανομένης της φωσφορυλιωμένης μορφής pegfr). Επιπλέον, στην επαγωγή αυτή, η αυξημένη πρωτεϊνική έκφραση της β-trcp φανερώνει το σημαντικό της ρόλο στην καταστολή του ενεργοποιημένου μονοπατιού της GH, μέσω της αρνητικής ρύθμισης των ταυτοχρόνως ενεργοποιημένων υποδοχέων GHR και EGFR. Φαίνεται ότι η δράση της αυτή επιτυγχάνεται καλύτερα όταν η εντόπιση της πρωτεΐνης είναι κυτταροπλασματική. Είναι επομένως προφανές ότι οι ίδιοι ενδοκυττάριοι μηχανισμοί που επιτρέπουν τη σηματοδότηση της GH και που ρυθμίζουν την αρνητική ρύθμισή της κινητοποιούνται και στα δύο παιδιά, σε διαφορετική όμως επαγωγή. Β2) ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΔΟΣΕΩΝ ΤΗΣ GH ΣΤΟΝ ΥΠΟΔΟΧΕΑ EGFR. ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΔΙΑΣΥΝΟΜΙΛΙΑΣ ΤΩΝ ΜΟΝΟΠΑΤΙΩΝ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΤΟΥ EGF. Ο υποδοχέας EGFR ενεργοποιείται με τυροσιν-φωσφορυλίωση μετά από κυτταρική διέγερση με τον αυξητικό παράγοντα EGF. (376) Συνεπώς, είναι αναμενόμενη η παρατηρούμενη αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης και της μεμβρανικής εντόπισης του EGFR και του pegfr μετά από επαγωγή με EGF, στο μάρτυρα και στον ασθενή. Στα πειράματα της εργασίας αυτής όμως, διαπιστώθηκε επιπλέον ότι η πρωτεϊνική έκφραση του EGFR και η μεμβρανική του εντόπιση, καθώς και η συγκέντρωση του pegfr, είναι αυξημένες μετά από επαγωγή με GH200 στο μάρτυρα και με GH1000 στον ασθενή, στις επαγωγές δηλαδή που η σηματοδότηση της GH είναι επιτυχής. Στις επαγωγές αυτές, η μικρού βαθμού φυσική σύνδεση και ο περιορισμένος συνεντοπισμός των ucis και EGFR θα μπορούσαν να εξηγήσουν την αυξημένη διαθεσιμότητα του υποδοχέα. Η διαντίδραση των υποδοχέων GHR και EGFR και ο μεμβρανικός συνεντοπισμός τους ήταν αυξημένα στις εν λόγω επαγωγές. Το εύρημα αυτό συνηγορεί υπέρ της συμμετοχής του EGFR στην επιτυχή σηματοδότηση που ενεργοποιείται από την GH. Είναι πιθανή η μέσω του ενεργοποιημένου EGFR φωσφορυλίωση της STAT3. Ενδεικτική της συμμετοχής αυτής είναι επιπλέον η φυσική σύνδεση και ο μεμβρανικός/κυτταροπλασματικός συνεντοπισμός των πρωτεϊνών STAT3 και EGFR, καθώς και ο μεμβρανικός/κυτταροπλασματικός συνεντοπισμός των pstat3 και EGFR, στις εν λόγω επαγωγές. Δεδομένου ότι στις επαγωγές αυτές η συγκέντρωση του GHR είναι η μέγιστη, με σημαντικού βαθμού μεμβρανική εντόπιση, είναι πιθανό ότι οι δύο υποδοχείς συνεργάζονται για τη μεταβίβαση του σήματος της GH, τόσο 201

202 υπό φυσιολογικές συνθήκες (μάρτυρας) όσο και στον ασθενή με GHTD. Απαραίτητη προϋπόθεση είναι η μεμβρανική εντόπιση και των δύο υποδοχέων. Είναι γνωστή από τη βιβλιογραφία η τυροσιν-φωσφορυλίωση του EGFR μετά από επαγωγή με hgh, η οποία είναι ανεξάρτητη από την ενδογενή δράση κινάσης του EGFR. (397) Στις επαγωγές που ο pegfr εντοπίζεται μεμβρανικά, χωρίς την ταυτόχρονη μεμβρανική εντόπιση του GHR (GH1000 στο μάρτυρα και GH200 στον ασθενή), η σηματοδότηση που ενεργοποιείται από την GH δεν είναι επιτυχής. Η πρωτεϊνική έκφραση του pegfr μετά από επαγωγή με 200ng/ml hgh στο μάρτυρα και στον ασθενή είναι περίπου η ίδια. Αν θεωρήσουμε ότι ο EGFR συμμετέχει πράγματι στη σηματοδότηση της GH, γεννάται το ερώτημα γιατί στη συγκεκριμένη επαγωγή είναι δυνατή η σηματοδότηση της GH στο μάρτυρα, αλλά όχι στον ασθενή. Το ερώτημα αυτό θα μπορούσε να απαντηθεί λαμβάνοντας υπόψη ότι στον ασθενή, μετά από επαγωγή με GH200, η πρωτεϊνική έκφραση του αρνητικού ρυθμιστή CIS είναι μεγαλύτερη από αυτή του μάρτυρα, με αποτέλεσμα ο GHR να μεταφέρεται προς αποδόμηση και να μην είναι επαρκώς διαθέσιμος στην κυτταρική μεμβράνη. Ένας από τους βασικότερους στόχους της εκπόνησης αυτής της διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση πιθανής μεγαλύτερης διασυνομιλίας ανάμεσα στα σηματοδοτικά μονοπάτια της GH και του EGF στους GHTD ασθενείς. Κάνοντας μία σύνοψη, οι επαγωγές με GH (χαμηλή και πενταπλάσια δόση) και EGF και τα πειράματα της ανοσοσυγκατακρήμνισης και των διπλών ανοσοφθορισμών στο τρίτο μέρος των πειραμάτων, ανέδειξαν, μεταξύ άλλων, τη σημαντική συμμετοχή του EGFR κατά τη φυσιολογική σηματοδότηση της GH. Οι ενδείξεις που συνηγορούν υπέρ της συμμετοχής του EGFR στη σηματοδότηση της GH είναι: α) Η αύξηση της πρωτεϊνικής έκφρασης του EGFR, της ενεργοποιημένης μορφής του (pegfr) και της μεμβρανικής (λειτουργικής) εντόπισής του στις «λειτουργικές επαγωγές» (GH200 για το μάρτυρα και GH1000 για τον ασθενή). β) Η φυσική σύνδεση και ο κυτταρικός συνεντοπισμός των πρωτεϊνών EGFR-STAT3 στο κυτταρόπλασμα και στη μεμβράνη στις επαγωγές GH200 για το μάρτυρα και GH1000 για τον ασθενή. Το εύρημα αυτό ενισχύει την υπόθεση ότι ο EGFR ενεργοποιεί το μονοπάτι της STAT3 στις επαγωγές με GH. Άρα, οι υποδοχείς GHR και EGFR ενεργοποιούνται συγχρόνως. Στην περίπτωση της επαγωγής GH1000 στο μάρτυρα, παρά την ενεργοποίηση του EGFR, η σηματοδότηση της GH δεν είναι, ως γνωστό, εφικτή. Προφανώς, η αυξημένη έκφραση της CIS στην επαγωγή αυτή, και άρα η αρνητική ρύθμιση του GHR, είναι η αιτία του φαινομένου αυτού. Επειδή ο GHR στην επαγωγή GH1000 στο μάρτυρα δε βρίσκεται σε σημαντικό βαθμό στην κυτταρική μεμβράνη, η ενεργοποίηση του EGFR φαίνεται ότι δεν προϋποθέτει τη μεμβρανική εντόπιση του GHR. γ) Ο μεμβρανικός και κυτταροπλασματικός συνεντοπισμός των EGFR και pstat3 στις επαγωγές GH200 στο μάρτυρα και GH1000 στον ασθενή. δ) Η φυσική σύνδεση και ο κυτταροπλασματικός και μεμβρανικός συνεντοπισμός των πρωτεϊνών EGFR-β-ΤrCP στις επαγωγές που το μονοπάτι της GH είναι ενεργό (GH200 για το μάρτυρα και GH1000 για τον ασθενή). Το εύρημα αυτό αφενός επιβεβαιώνει τη συμμετοχή της β-trcp στην αρνητική ρύθμιση του υποδοχέα EGFR 202

203 (είτε με άμεση σύνδεση μαζί του είτε με έμμεση σύνδεση μέσω του GHR) και αφετέρου αποδεικνύει ότι, εφόσον η αρνητική αυτή ρύθμιση είναι μεγάλη στις επαγωγές που το μονοπάτι της GH είναι λειτουργικό, ο EGFR είναι ενεργοποιημένος στις επαγωγές αυτές. Το ίδιο συμπέρασμα προκύπτει ακόμα και αν η β-trcp δεν είναι απευθείας συνδεδεμένη με τον EGFR, αλλά με τον GHR κι αυτός με τον EGFR. ε) Η φυσική σύνδεση και ο μεμβρανικός συνεντοπισμός των υποδοχέων GHR-EGFR στις επαγωγές που το μονοπάτι της GH είναι λειτουργικό (GH200 για το μάρτυρα και GH1000 για τον ασθενή). Αξίζει να σημειωθεί ότι η αλληλεπίδραση των υποδοχέων είναι σημαντική στο μάρτυρα στην επαγωγή GH1000, ωστόσο η εντόπισή τους δεν είναι μεμβρανική λόγω των αυξημένων επιπέδων των CIS και ucis, και αυτός είναι πιθανώς ο λόγος που δε γίνεται η μεταβίβαση του σήματος της GH. Επομένως, προκύπτει ως συμπέρασμα ότι δεν είναι υποχρεωτική η μεμβρανική εντόπιση των υποδοχέων για να επιτευχθεί η αλληλεπίδρασή τους και ότι η αλληλεπίδραση των υποδοχέων δε συνεπάγεται απαραιτήτως την ενεργοποίησή τους και την επιτυχή σηματοδότηση της GH. στ) Η σε πολύ μικρό βαθμό φυσική σύνδεση των πρωτεϊνών ucis-egfr στο κυτταρόπλασμα και στη μεμβράνη στις επαγωγές GH που επιτυγχάνεται η μεταγωγή του σήματος της GH (GH200 για το μάρτυρα και GH1000 για τον ασθενή), παρά την αυξημένη ποσότητα του EGFR στις ίδιες επαγωγές. Στις επαγωγές αυτές, εκτός από την υποτιθέμενη μειωμένη αρνητική ρύθμιση της CIS στον EGFR, η μεταφορά και του GHR στο πρωτεάσωμα προς αποδόμηση είναι ελάχιστη, λόγω των χαμηλών επιπέδων της ucis. Ολοκληρώνοντας, η μελέτη αυτή καταδεικνύει τις πρωτεΐνες CIS και β-trcp ως αρνητικούς ρυθμιστές του μονοπατιού EGF/EGFR υπό φυσιολογικές συνθήκες (μάρτυρας). Αντιθέτως, στον ασθενή, η αρνητική ρύθμιση του άξονα EGF/EGFR φαίνεται να επιτελείται από τις πρωτεΐνες CIS, β-trcp, αλλά και p21, όπως καταδεικνύει η πυρηνική εντόπιση της πρωτεΐνης. Γ) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ EGF ΣΤΑ ΜΟΡΙΑ ΤΩΝ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΩΝ ΜΟΝΟΠΑΤΙΩΝ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΤΟΥ EGF ΚΑΙ ΣΤΟΥΣ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥΣ ΡΥΘΜΙΣΤΕΣ ΤΟΥΣ. Ενδιαφέροντα είναι τα ευρήματα των πειραμάτων της παρούσας εργασίας σχετικά με τις ενδοκυττάριες αντιδράσεις που συμβαίνουν μετά από επαγωγή των ινοβλαστών με EGF. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η ενεργοποίηση του υποδοχέα EGFR από τον EGF υπό φυσιολογικές συνθήκες, πυροδοτεί, μεταξύ άλλων, την ενεργοποίηση της STAT3. (388,389) Αυτό εξηγεί το γεγονός ότι στο μάρτυρα και στον ασθενή, μετά από επαγωγή των ινοβλαστών με EGF, αυξάνεται η συγκέντρωση και η μεμβρανική εντόπιση της πρωτεΐνης STAT3, ώστε να μπορεί να φωσφορυλιωθεί και να ολοκληρωθεί η σηματοδότηση του EGF. Το φαινόμενο αυτό είναι εντονότερο στην περίπτωση του ασθενή, δηλαδή η μεταγωγική οδός μέσω της πρωτεΐνης STAT3 είναι περισσότερο ευαίσθητη στη διέγερση με EGF και ενεργοποιείται σε εντονότερο βαθμό από ό,τι σε φυσιολογικές συνθήκες. Άρα, το μονοπάτι που εμπλέκει το μεταγραφικό παράγοντα STAΤ3 φαίνεται ότι είναι περισσότερο «έτοιμο» για 203

204 ενεργοποίηση στον ασθενή μετά από επαγωγή με EGF. Πράγματι, η φωσφορυλιωμένη μορφή της STAT3 μετά από επαγωγή με EGF είναι περισσότερη στον ασθενή συγκριτικά με το μάρτυρα. Στην ίδια επαγωγή αυξάνεται επίσης ο μεμβρανικός/κυτταροπλασματικός συνεντοπισμός των EGFR και pstat3, περισσότερο όμως στον ασθενή. Στην επαγωγή EGF, επίσης, ο ασθενής και ο μάρτυρας παρουσιάζουν παρόμοια επίπεδα του αρνητικού ρυθμιστή της σηματοδότησης της GH, ucis, ο οποίος δρα ως ανασταλτικός μηχανισμός του ενεργοποιημένου μονοπατιού EGF/EGFR. Αυτή είναι μια πρώτη ένδειξη ότι η πρωτεΐνη CIS αναστέλλει άμεσα το σηματοδοτικό μονοπάτι του EGF. Ενισχυτική του ίδιου συμπεράσματος είναι η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών ucis και EGFR, καθώς και ο μεμβρανικός/κυτταροπλασματικός συνεντοπισμός των CIS και EGFR, στην επαγωγή EGF. Η πρωτεΐνη CIS είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι ρυθμίζει αρνητικά τον υποδοχέα GHR και τη σηματοδότηση της GH (337), προκύπτει όμως από την παρούσα εργασία ότι αποτελεί πιθανώς αρνητικό ρυθμιστή και του υποδοχέα EGFR. Μία επιπλέον ένδειξη της αρνητικής ρύθμισης που ασκεί ο αναστολέας CIS στον EGFR είναι η φυσική σύνδεση και ο συνεντοπισμός των πρωτεϊνών CIS και pstat3 στο κυτταρόπλασμα και στη μεμβράνη μετά από επαγωγή με EGF, ιδιαιτέρως στον ασθενή. Φαίνεται ότι η πρωτεΐνη CIS κινητοποιείται με σκοπό την καταστολή του ενεργοποιημένου, όπως αποδεικνύει η pstat3, μονοπατιού του EGF. Η αύξηση της κυτταροπλασματικής εντόπισης της p21 μετά από επαγωγή με EGF στο μάρτυρα, προσδίδει στην πρωτεΐνη προαγωγική του κυτταρικού κύκλου δράση. Αντιθέτως, η πυρηνική εντόπιση της p21 στην ίδια επαγωγή στον ασθενή, συνεπάγεται καταστολή του κυτταρικού κύκλου και, άρα, συμμετοχή της πρωτεΐνης στην αρνητική ρύθμιση του μονοπατιού του EGF. Στην αρνητική ρύθμιση του EGFR φαίνεται ότι συμβάλλει, όπως έχει ήδη αναφερθεί, και η πρωτεΐνη β-trcp. Αυτό προκύπτει από την αυξημένη συγκέντρωσή της μετά από επαγωγή με EGF, κυρίως στο μάρτυρα, αλλά και από την αυξημένη φυσική σύνδεση και το μεμβρανικό/κυτταροπλασματικό συνεντοπισμό των β-trcp και EGFR στην ίδια επαγωγή. Μετά από επαγωγή με EGF, αυξάνεται επίσης η μεμβρανική εντόπιση του GHR σε σύγκριση με τη βασική κατάσταση, ιδιαιτέρως στον ασθενή. Η μεμβρανική εντόπιση του GHR πιθανώς οφείλεται στη μειωμένη εσωτερικοποίηση του GHR από την πρωτεΐνη CIS, η οποία πιθανώς «καταναλώνεται» στην αρνητική ρύθμιση του αυξημένου EGFR. Αποδεικνύεται επομένως ότι, σε αντίθεση με τη διαταραχή στο μεταγωγικό μονοπάτι GH/GHR, το μονοπάτι EGF/EGFR είναι φυσιολογικό στον ασθενή με GHTD. Και τούτο διότι η πρωτεϊνική έκφραση και η μεμβρανική εντόπιση του υποδοχέα και της φωσφορυλιωμένης του μορφής δε διαφέρουν στο μάρτυρα και στον ασθενή μετά από επαγωγή με EGF. Είναι χαρακτηριστικό ότι η πρωτεϊνική έκφραση και η μεμβρανική εντόπιση του φωσφορυλιωμένου EGFR είναι απολύτως συγκρίσιμες στις επαγωγές GH1000 και EGF στον ασθενή. Άρα, στον ασθενή, η ενεργοποίηση του EGFR κατά τη φυσιολογική μεταγωγή του σήματος της GH είναι τόσο έντονη όσο όταν το ερέθισμα 204

205 είναι ο EGF. Αντιθέτως, στο μάρτυρα η μεμβρανική εντόπιση του EGFR και η ενεργοποίησή του μετά από επαγωγή με GH200 είναι σαφώς μεγαλύτερες από ό,τι στη βασική κατάσταση ή την επαγωγή GH1000, αλλά όχι τόσο μεγάλες όσο μετά από επαγωγή EGF. Επομένως, τόσο ο EGFR όσο και ο GHR ενεργοποιούνται σε μεγαλύτερο βαθμό στη «λειτουργική» επαγωγή GH1000 στον ασθενή από ό,τι στην αντίστοιχη «λειτουργική» επαγωγή GH200 στο μάρτυρα. Συμπεράσματα Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφηκε ο ρόλος της υπερέκφρασης του αρνητικού ρυθμιστή CIS στη διαταραγμένη μεταβίβαση του σήματος της GH στους GHTD ασθενείς και οι μοριακοί μηχανισμοί που λαμβάνουν χώρα μετά την άρση της επίδρασης του ρυθμιστή αυτού, με αποτέλεσμα την αποκατάσταση της φυσιολογικής σηματοδότησης. Επίσης, δόθηκε περισσότερο φως στο ρόλο άλλων ρυθμιστικών μονοπατιών στη διαταραχή αυτή και στο πώς αυτά διαφοροποιούνται από τη φυσιολογική κατάσταση. Τέλος, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής συμβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση της φυσιολογικής σηματοδότησης της GH και του EGF, στην εξακρίβωση της φυσιολογικής διασυνομιλίας ανάμεσα στα σηματοδοτικά τους μονοπάτια, καθώς και των μεταβολών που παρουσιάζει η διασυνομιλία αυτή σε ασθενή με GHTD. Αποδείχθηκε ποικιλοτρόπως η διασυνομιλία των GHR και EGFR και των σηματοδοτικών τους μονοπατιών κατά την επιτυχημένη σηματοδότηση της GH, όπως και κατά την επιτυχή σηματοδότηση του EGF, με υπεροχή στον ασθενή σε κάθε περίπτωση. Απαραίτητη προϋπόθεση για την επιτυχή διασυνομιλία των δύο υποδοχέων είναι η εντόπισή τους στην κυτταροπλασματική μεμβράνη. Η ανακάλυψη ότι υπό φυσιολογικές συνθήκες, αλλά και στη διαταραχή GHTD, εκτυλίσσονται οι ίδιες ενδοκυττάριες διεργασίες είτε ερέθισμα αποτελεί η GH (στην κατάλληλη δόση ανάλογα με την περίπτωση) είτε ο EGF, αποδεικνύει ότι οι μεταγωγικές οδοί της GH και του EGF χρησιμοποιούν κοινά σηματοδοτικά μόρια σε μεγάλο βαθμό. Λαμβάνοντας υπόψη ότι όλοι οι ασθενείς με τη διαταραχή GHTD που έχουν περιγραφεί παρουσιάζουν τα ίδια κλινικά χαρακτηριστικά και την ίδια ενδοκυττάρια συμπεριφορά ως προς τη σηματοδότηση της GH (διαταραγμένη φωσφορυλίωση της STAT3, υπερέκφραση της CIS, ucis και της p21, αυξημένη δράση του πρωτεασώματος), φαίνεται λογικό ότι τα νέα συμπεράσματα που προκύπτουν από την παρούσα εργασία αφορούν γενικώς την οντότητα GHTD. Με τον τρόπο αυτό, προσεγγίζεται καλύτερα και αποσαφηνίζεται η διαταραχή GHTD, προσφέρεται μια πιθανή ερμηνεία της διαταραγμένης μεταβίβασης του σήματος της GH στα παιδιά με GHTD, αλλά και γίνεται προσπάθεια να εξηγηθεί ο μηχανισμός μέσω του οποίου υπερνικάται η διαταραγμένη μεταβίβαση στα παιδιά αυτά μετά από θεραπεία με εξωγενώς χορηγούμενη ανθρώπινη βιοσυνθετική GH. Επιπλέον όμως, η αναγνώριση των παιδιών με GHTD και η διάκρισή τους από τα παιδιά με Σύνδρομο Αντίστασης στην GH (GHIS) είναι απαραίτητη για την 205

206 πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας της θεραπείας με ανθρώπινη βιοσυνθετική GH και, άρα, την επιλογή των πρώτων έναντι των δεύτερων για πιθανή χορήγηση θεραπείας. Η διαλεύκανση του μοριακού μηχανισμού δράσης της GH και του ελέγχου της σηματοδότησής της, αλλά και η ανίχνευση των διαταραχών στον άξονα GH-IGF-Ι, μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για νέες, ενδεχομένως περισσότερο εξειδικευμένες, θεραπευτικές προσεγγίσεις στο μέλλον. Ωστόσο, είναι ενδιαφέρον το εύρημα ότι όλα τα παιδιά με τη διαταραχή GHTD που έχουν περιγραφεί στο παρελθόν είχαν ένα γονέα με κοντό ανάστημα και διαταραγμένη ενεργοποίηση της STAT3, ενώ από το οικογενειακό ιστορικό του γονέα αυτού προέκυψε σε κάθε περίπτωση ότι δεν υπήρχε αναφορά κρούσματος καρκίνου για τρεις γενεές. Χρήζει περαιτέρω διερεύνησης η υπόθεση ότι η υπερέκφραση των αρνητικών ρυθμιστών CIS και p21 έχει προστατευτικό ρόλο ως προς την ανάπτυξη καρκίνου στα παιδιά με GHTD και στις οικογένειές τους. ΠΙΘΑΝΟΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΚΑΜΨΗΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΑΡΑΓΜΕΝΗΣ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ ΤΗΣ GH ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΞΩΓΕΝΩΣ ΧΟΡΗΓΟΥΜΕΝΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΤΙΚΗ GH, ΣΕ ΠΑΙΔΙΑ ΜΕ GHTD. GHR GH GHR EGFR E G F E G F EGFR Κυτταρική μεμβράνη JAK2 JAK2 Τυροσινφωσφορυλίωση Ενεργοποίηση S T A T 3 S T A T 3 Πυρήνας S T A T 3 S T A T 3 S R E 206

207 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ (1) Tannenbaum, G.S. Neuroendocrine control of growth hormone secretion, 1991; Acta Paediatr. Scand. Suppl. 372, (2) De Vos AM, Ultsch M, Kossiakoff AA. Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: Crystal structure of the complex, Science 1992; 255(5042): (3) Horseman N, Nelson D, Li-Yuan Yu-Lee. Transcriptional Regulation by the Helix Bundle Peptide Hormones: Growth Hormone, Prolactin and Hematopoietic Cytokines. Endocrine Reviews 1994; 15: (4) Lewis UJ, Singh RN, Tutwiler GF, Sigel MB, VanderLaan EF, VanderLaan WP. Human growth hormone: a complex of proteins. Recent Prog Horm Res 1980; 36: (5) Lewis UJ, Sinha YN, Lewis GP, Structure and properties of members of the hgh family: a review. Endocr J 2000; 47:S1-8. (6) Li CH. The isolation of pituitary growth hormone, Science 1944; 99: (7) Li CH, Simpson ME. Isolation and properties of the anterior hypophyseal growth hormone, J Biol Chem 1945; 159: (8) Iwona Pilecka, Andrew Whatmore, Rob Hooft van Huijsduijnen, Benoit Destenaves, Peter Clayton. Trends in Endocrinology & Metabolism 2007; 18 (1): (9) Van Coevorden A, Mockel J, Laurent E, Kerkhofs M, L'Hermite-Balériaux M, Decoster C, Neve P, Van Cauter E. Neuroendocrine rhythms and sleep in aging men. Am J Physiol 1991; 260:F (10) Van Cauter E, Plat L, Copinschi G. Interrelations between sleep and the somatotropic axis. Sleep 1998; 21: (11) George DL, Phillips JA, Francke U, Seeburg PH. The genes for growth hormone and chorionic somatomammotropin are on the long arm of human chromosome 17 in region q21 to qter. Hum Genet. 1981; 57: (12) Chen EY, Liao Y-C, Smith DH, Barrera-Saldana HA, Gelinas RE, Seeburg PH, The human growth hormone locus: nucleotide sequence, biology, and evolution. Genomics 1989; 4: (13) MacLeod JN, Lee AK, Liebhaber SA, Cooke NE. Developmental control and alternative splicing of the placentally expressed transcripts from the human growth hormone gene cluster. J Biol Chem. 1992; 267: (14) Seeburg PH. The human growth hormone gene family: nucleotide sequences show recent divergence and predict a new polypeptide hormone. DNA 1982; 1: (15) Hirt H, Kimelman J, Birnbaum MJ, Chen E, Seeburg P, Eberhardt N, Barta A. The human growth hormone gene locus: structure, evolution, and allelic variations. DNA 1987; 6: (16) Miller WL, Eberhardt NL. Structure and evolution of the growth hormone gene family. Endocr Rev 1983; 4: (17) Freemark M, Driscoll P, Maaskant R, Petryk A, Kelly PA. Ontogenesis of prolactin receptors in the human fetus in early gestation. Implications for tissue differentiation and development. J Clin Invest. 1997; 99: (18) Weinhaus AJ, Stout LE, Sorenson RL. Glucokinase, hexokinase, glucose transporter 2, and glucose metabolism in islets during pregnancy and prolactin-treated islets in vitro: mechanisms for long term up-regulation of islets. Endocrinology 1996; 137: (19) McIntyre HD, Serek R, Crane DI, Veveris-Lowe T, Parry A, Johnson S, Leung KC, Ho KK, Bouqoussa M, Hennen G, Igout A, Chan FY, Cowley D, Cotterill A, Barnard R. Placental growth hormone (GH), GH-binding protein, and insulin-like growth factor axis in normal, growth-retarded, and diabetic pregnancies: correlations with fetal growth. J Clin Endocrinol Metab; 2000; 85: (20) Leger J, Noel M, Limal JM, Czernichow P. Growth factors and intrauterine growth retardation. II. Serum growth hormone, insulin-like growth factor (IGF) I, and IGF-binding 207

208 protein 3 levels in children with intrauterine growth retardation compared with normal control subjects: prospective study from birth to two years of age. Study Group of IUGR. Pediatr Res. 1996; 40: (21) Mittal P, Espinoza J, Hassan S, Kusanovic JP, Edwin SS, Nien JK, Gotsch F, Than NG, Erez O, Mazaki-Tovi S, Romero R. Placental growth hormone is increased in the maternal and fetal serum of patients with preeclampsia. J Matern Fetal Neonatal Med. 2007; 20: (22) Alsat E, Guibourdenche J, Couturier A, Evain-Brion D. Physiological role of human placental growth hormone. Mol Cell Endocrinol. 1998; 140: (23) Gluckman PD, Gunn AJ, Wray A,Cutfield WS, Chatelain PG, Guilbaud O, Ambler GR, Wilton P, Albertsson-Wikland K. Congenital idiopathic growth hormone deficiency associated with prenatal and early postnatal growth failure. The International Board of the Kabi Pharmacia International Growth Study. J Pediatr. 1992; 121: (24) Gillies G. Somatostatin: the neuroendocrine story. Trends Pharmacol Sci 1997; 18: (25) Mauras N, Blizzard RM, Link K, Johnson ML, Rogol AD, Veldhuis JD. Augmentation of growth hormone secretion during puberty: evidence for a pulse amplitude-modulated phenomenon. J Clin Endocrinol Metab 1987; 64: (26) Eden S. Age- and sex-related differences in episodic growth hormone secretion in the rat. Endocrinology 1979; 105:555-60, (27) Clark RG, Carlsson LM, Robinson IC. Growth hormone secretory profiles in conscious female rats. J Endocrinol 1987; 114: (28) Frohman LA, Kineman RD. Growth hormone-releasing hormone: discovery, regulation, and actions. Comprehensive Physiology, 2011; (29) Brazeau P, Vale W, Burgus R, Ling N, Butcher M, Rivier J, Guillemin R. Hypothalamic polypeptide that inhibits the secretion of immunoreactive pituitary growth hormone. Science 1973; 179: (30) Shen LP, Pictet RL, Rutter WJ. "Human somatostatin I: sequence of the cdna". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1982; 79 (15): (31) Shen LP, Rutter WJ. "Sequence of the human somatostatin I gene". Science 1984; 224 (4645): (32) Βednarek MA, Feighner SD, Pong SS, McKee KK, Hreniuk DL, Silva MV, Warren VA, Howard AD, Van Der Ploeg LH, Heck JV. Structure-function studies on the new growth hormone-releasing peptide, ghrelin: minimal sequence of ghrelin necessary for activation of growth hormone secretagogue receptor 1a. J Med Chem 2000; 43(23): (33) Kojima M, Hosoda H, Date Y, Nakazato M, Matsuo H, Kangawa K. Ghrelin is a growthhormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature, 1999; 402: (34) Ghizzoni L, Vottero A, Mastorakos G, Folli F, Ziveri M, Bernasconi S. Spontaneous 24- hour ghrelin secretion in short-normal prepubertal children. Horm Res 2002; 58(2):152. (35) Casanueva FF, Dieguez C. Growth hormone secretagogues: Physiological role and clinical utility. Trends Endocrinol Metab 1999; 10:30-8. (36) Wren AM, Small CJ, Ward HL, Murphy KG, Dakin CL, Taheri S, Kennedy AR, Roberts GH, Morgan DGA, Ghatei MA, Bloom SR. The novel hypothalamic peptide ghrelin stimulates food intake and growth hormone secretion. Endocrinology 2000; 141: (37) Kamegai J, Tamura H, Shimizu T, Ishii S, Sugihara H, Wakabayashi I. Chronic central infusion of ghrelin increases hypothalamic neuropeptide Y and agouti-related protein mrna levels and body weight in rats. Diabetes 2001; 50: (38) Shintani M, Ogawa Y, Ebihara K, Aizawa-Abe M, Miyanaga F, Takaya K, Hayashi T, Inoue G, Hosoda K, Kojima M, Kangawa K, Nakao K. Ghrelin, an endogenous growth hormone secretagogue, is a novel orexigenic peptide that antagonizes leptin action through the activation of hypothalamic neuropeptide Y/Y1 receptor pathway. Diabetes 2001; 50: (39) Nakazato M, Murakami N, Date Y, Kojima M, Matsuo H, Kangawa K, Matsukura S. A role for ghrelin in the central regulation of feeding. Nature 2001; 409:

209 (40) Kamegai J, Tamura H, Shimizu T, Ishii S, Sugihara H, Wakabayashi I. Central effect of ghrelin, an endogenous growth hormone secretagogue, on hypothalamic peptide gene expression. Endocrinology 2000: 141: (41) Naoki Hattori. Expression, regulation and biological actions of growth hormone (GH) and ghrelin in the immune system. Growth Hormone IGF Research 2009; 19(3): (42) Caminos JE, Nogueiras R, Blanco M, Seoane LM, Bravo S, Alvarez CV, Garcı a-caballero T, Casanueva FF, Die guez C. Cellular distribution and regulation of ghrelin messenger ribonucleic acid in the rat pituitary gland. Endocrinology 2003; 144: (43) Uretsky AD, Weiss BL, Yunker WK, Chang JP. Nitric oxide produced by a novel nitric oxide synthase isoform is necessary for gonadotropin-releasing hormone-induced growth hormone secretion via a cgmp-dependent mechanism. J Neuroendocrinol 2003; 15: (44) Chrousos GP. The role of stress and the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in the pathogenesis of the metabolic syndrome: neuro-endocrine and target tissue-related causes. International journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity 2000; 24(2):S50-5. (45) Rousseau K, Le Belle N, Marchelidon J, Dufour S. Evidence that corticotrophin releasing hormone acts as a growth hormone-releasing factor in a primitive teleost, the European eel (Anguilla anguilla). J Neuroendocrinol 1999; 11: (46) Argenton F, Vianello S, Bernardini S, Jacquemin P, Martial J, Belayew A, Colombo L, Bortolussi M. The transcriptional regulation of the growth hormone gene is conserved in vertebrate revolution, Biochemical and Biophysical Research Communications 1993; 192(3) (47) Wright ML, Sicbaldi EM, Loveridge KM, Pike PA, Majerowski MA. Cell population kinetics in tadpole limb epidermis during thyroxine-induced, spontaneous, and prolactininhibited metamorphosis. Gen. Comp. Endocrinol. 1981; 43: (48) Kumegawa, M., E. Ikeda, S. Hosoda, and T. Takuma. In vitro effects of thyroxine and insulin on myoblasts from chick embryo skeletal muscle. Dev. Biol. 1980; 79: (49) Christofer K. Glass, Rodrigo Franco, Cary Weinberger, Vivian R. Albert, Ronald M. Evans, Michael G. Rosenfeld. A c-erb-a binding site in rat growth hormone gene mediates trans-activation by thyroid hormone, Nature 1987; 329(6141): (50) Herbert H. Samuels, Lawrence E. Shapiro, Thyroid hormone stimulates de novo growth hormone synthesis in cultured GH1 cells: Evidence for the accumulation of a rate limiting RNA species in the induction process, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1976; 73(10): (51) Teresa L. Miller, Kelly E. Mayo, Glucocorticoids Regulate Pituitary Growth Hormone- Releasing Hormone Receptor Messenger Ribonucleic Acid Expression, Endocrinology 1997; 138: (52) Hajime Watanobe, Satoshi Habu, Leptin regulates Growth Hormone-Releasing Factor, Somatostatin, and α-melanocyte-stimulating Hormone but not Neuropeptide Y Release in rat hypothalamus in vivo: Relation with Growth Hormone Secretion, The journal of neuroscience, 2002; 22(14): (53) Rodriguez-Pacheco F, Martinez-Fuentes AJ, Tovar S, Pinilla L, Tena-Sempere M, Dieguez C, Castaño JP, Malagon MM. Regulation of pituitary cell function by adiponectin. Endocrinology 2007; 148(1): (54) Steyn FJ, Boehme F, Vargas E, Wang K, Parkington HC, Rao JR, Chen C. Adiponectin regulates growth hormone secretion via adiponectin receptor mediated Ca +2 signalling in rat somatotrophs in vitro. Journal of Neuroendocrinology 2009; 21(8): (55) Rodrı guez-pacheco F, Va zquez-martı nez R, Martı nez-fuentes AJ, Pulido MR, Gahete MD, Vaudry H, Gracia-Navarro F, Die guez C, Castan o JP, Malago n MM. Resistin regulates pituitary somatotrope cell function through the activation of multiple signaling pathways. Endocrinology 2009; 150: (56) Xu R, Wang Q, Yan M, Hernandez M, Gong C, Boon WC, Murata Y, Ueta Y, Chen C. Orexin A augments voltage-gated Ca +2 currents and synergistically increases growth hormone 209

210 (GH) secretion with GH-releasing hormone in primary cultured ovine somatotropes. Endocrinology 2002; 143: (57) Molik E, Zieba DA, Misztal T, Romanowicz K, Wszola M, Wierzchos E, Nowakowski M. The role of orexin A in the control of prolactin and growth hormone secretions in sheep-in vitro study. J Physiol Pharmacol 2008; 59(9): (58) Bruni JF, Van Vugt D, Marshall S, Meites J. Effects of naloxone, morphine, and methionine enkephalin on serum prolactin, luteinizing hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone, and growth hormone. Life Sci. 1977; 21:461. (59) Armstrong JD, Spears JW. Changes in growth hormone and luteinizing hormone following acute or chronic administration of an opioid agonist, FK33-824, in wethers. J. h i m. Sci. 1991; 69:774. (60) Cassidy Vuong, Stan H. M. Van Uum, Laura E. O'Dell, Kabirullah Lutfy, Theodore C. Friedman. The Effects of Opioids and Opioid Analogs on Animal and Human Endocrine Systems. Endocrine Reviews 2010; 31(1): (61) Thompson DL, Weltman JY, Rogol AD, Metzger DL, Veldhuis JD, Weltman A. Cholinergic and opioid involvement in release of growth hormone during exercise and recovery. Journal of Applied Physiology 1993; 75(2): (62) Szabo M. TRH and GRF stimulate release of growth hormone through different mechanisms, Am J Physiol. 1986; 250(5 Pt 1): (63) Estienne MJ, Barb CR. The control of adenohypophysial hormone secretion by amino acids and peptides in swine. Domest Anim Endocrinol 2005; 29: (64) Barb CR, Barrett JB. Neuropeptide Y modulates growth hormone but not luteinizing hormone secretion from prepuberal gilt anterior pituitary cells in culture. Domest Anim Endocrinol 2005; 29: (65) Tatemoto K, Rokaeus A, Jornvall H, McDonald TJ, Mutt V. Galanin-a novel biologically active peptide from porcine intestine. FEBS Lett 1983; 164: (66) Smith KE, Walker MW, Artymyshyn R, Borowsky B, Tamm JA, Yao WJ, Vaysse PJ, Branchek TA, Gerald C, Jones KA. Cloned human and rat galanin GALR3 receptors. Pharmacology and activation of G-protein inwardly rectifying K+ channels. J. Biol. Chem. 1998; 273(36): (67) Ottlecz A, Snyder GD, McCann SM, Regulatory role of galanin in control of hypothalamicanterior pituitary function, Proc Natl Acad Sci U S A. 1988; 85(24): (68) Baranowska-Bik A, Baranowska B, Wolin ska-witort E, Chmielowska. M, Martyn ska L, Bik W. Galanin modulates pituitary hormones release, Neuro Endocrinol Lett 2005; 26: (69) Rich N, Reyes P, Reap L, Goswami R, Fraley GS. Sex differences in the effect of prepubertal GALP infusion on growth, metabolism and LH secretion. Physiol Behav 2007; 92: (70) Wehrenberg WB, Wiviott SD, Voltz DM, Giustina A. Pyridostigmine mediated growth hormone release: evidence for somatostatin involvement. Endocrinology 1992; 130: (71) Lee EK, Chan VC, Chang JP, Yunker WK, Wong AO. Norepinephrine regulation of growth hormone release from goldfish pituitary cells. Involvement of alpha2 adrenoreceptor and interactions with dopamine and salmon gonadotropin-releasing hormone. J Neuroendocrinol 2000; 12: (72) Sibilia V, Guidobono F, Pecile A, Pagani F, Villa I, Netti C. Involvement of the catecholaminergic system in the inhibitory effect of brain histamine on growth hormone secretion, Agents and actions, 1993; 38(3-4), (73) Chang JP, Marchant TA, Cook AF, Nahorniak CS, Peter RE. Influences of Catecholamines on Growth Hormone Release in Female Goldfish, Carassius auratus, Neuroendocrinology 1985; 40: (74) Mathieni G. Growth hormone secretion by arginine stimulus: the effect of both low doses and oral arginine. Boll Soc It Sper Biol. 1980; 56:

211 (75) Rigamonti AE, Muller EE. Gamma-hydroxybutyric acid and growth hormone secretion studies in rats and dogs. Alcohol. 2000; 20(3): (76) Nass R, Gilrain J, Anderson S, Gaylinn B, Dalkin A, Day R, Peruggia M, Thorner MO. High plasma growth hormone (GH) levels inhibit expression of GH secretagogue receptor messenger ribonucleic acid levels in the rat pituitary. Endocrinology 2000; 141: (77) Τannenbaum GS, Evidence for autoregulation of growth hormone secretion via the central nervous system. Endocrinology 1980; 107: (78) Shiro Minami, Jun Kamegai, Hitoshi Sugihara, Nobuchika Suzuki, Ichiji Wakabayashi. Growth Hormone Inhibits Its Own Secretion by Acting on the Hypothalamus through Its Receptors on Neuropeptide Y Neurons in the Arcuate Nucleus and Somatostatin Neurons in the Periventricular Nucleus, Endocr J 1998; 45:S (79) Chapman IM, Hartman ML, Pieper KS, Skiles EH, Pezzoli SS, Hintz RL, Thorner MO. Recovery of growth hormone release from suppression by exogenous insulin-like growth factor I (IGF-I): evidence for a suppressive action of free rather than bound IGF-I. J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: (80) Yamashita S, Melmed S. Insulin-like growth factor I action on rat anterior pituitary cells: suppression of growth hormone secretion and messenger ribonucleic acid levels. Endocrinology 1986; 118: (81) Gillies G, Somatostatin: the neuroendocrine story. Trends Pharmacol Sci 1997; 18: (82) Gahete MD, Dura n-prado M, Luque RM, Martı nez-fuentes AJ, Va zquez-martı nez R, Malago n MM, Castan o JP. Are somatostatin and cortistatin two siblings in regulating endocrine secretions? In vitro work ahead. Mol Cell Endocrinol 2008; 286: (83) Baranowska B, Bik W, Baranowska-Bik A, Wolinska-Witort E, Chmielowska M, Martynska L. Cortistatin and pituitary hormone secretion in rat. J Physiol Pharmacol 2009; 60: (84) Godfrey RJ, Madgwick Z, Whyte GP. The exercise-induced growth hormone response in athletes. Sports Medicine, 2003; 33(8): (85) Van Cauter E, Latta F, Nedeltcheva A, Spiegel K, Leproult R, Vandenbril C, Weiss R, Mockel J, Leqros JJ, Copinschi G. Reciprocal interactions between the GH axis and sleep, Growth Horm IGF Res. 2004; 14(A):S (86) Marcovecchio ML, Chiarelli F. Obesity and growth during childhood and puberty, World Rev Nutr Diet 2013; 106: (87) Veldhuis JD, Iranmanesh A, Ho KKY, Waters MJ, Johnson ML, Lizarralde G. Dual defects in pulsatile growth hormone secretion and clearance subserve the hyposomatotropism of obesity in man. J Clin Endocrinol Metab 1991; 72: (88) Valverde I, Penalva A, Ghigo E, Casanueva FF, Diequez C. Involvement in nitric oxide in the regulation of growth hormone secretion in dogs. Neuroendocrinology 2001; 74: (89) Kostic TS, Andric SA, Stojilkovic SS. Spontaneous and receptorcontrolled soluble guanylyl cyclase activity in anterior pituitary cells. Mol Endocrinol 2001; 155: (90) Jena BP. Fusion pore or porosome: structure and dynamics. J Endocrinol 2003; 176: (91) Jena BP. Understanding membrane fusion combining experimental and simulation studies. Methods Cell Biol 2008; 90: (92) Jena BP. Porosome: the secretory portal in cells. Biochemistry 2009; 48: (93) Jena BP. Secretory vesicles transiently dock and fuse at the porosome to discharge contents during cell secretion. Cell Biol Int 2009; 34:3 12. (94) Jena BP. Membrane fusion: role of SNAREs and calcium. Protein Pept Lett 2009; 16: (95) Jena BP. Role of SNAREs in membrane fusion. Adv Exp Med Biol 2011; 713: (96) von Delius M, Leigh DA. Walking molecules. Chem Soc Rev 2011; 40: (97) Cho WJ, Lee JS, Jena BP. Conformation states of the neuronal Porosome complex. Cell Biol. Int. 2010; 34:

212 (98) Schneider SW, Sritharan KC, Geibel JP, Oberleithner H, Jena BP. Surface dynamics in living acinar cells imaged by atomic force microscopy: identification of plasma membrane structures involved in exocytosis. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: (99) Isaksson OG, Jansson JO, Gause IA. Growth hormone stimulates longitudinal bone gowth directly. Science 1982; 216: (100) Isgaard J, Nilsson A, Lindahl A, Jansson JO, Isaksson OG. Effects of local administration of GH and IGF-1 on longitudinal bone growth in rats. Am J Physiol 1986; 250:E (101) Davidson MB. Effect of growth hormone on carbohydrate and lipid metabolism. Endocr Rev 1987; 8: (102) Kostyo JL. Rapid effects of gowth hormone on aminoacid transport and protein synthesis. Ann N Y Acad Sci 1968; 148: (103) Kostyo JL, Nutting DF. Growth hormone and protein metabolism, In: Sawyer WH, Knobil E (eds) Handbook of physiology. American Physiology Society, Washington DC, 1974; (104) Madsen K, Friberg U, Roos P, Eden S, Isaksson O. Growth hormone stimulates the proliferation of cultured chondrocytes from rabbit ear and rat rib growth cartilage. Nature 1983; 304: (105) Billestrup N, Nielsen JH. The stimulatory effect of growth hormone, prolactin and placental lactogen on beta-cell proliferation is not mediated by insulin-like growth factor-i. Endocrinology 1991; 129: (106) Barnard R, Ng KW, Martin TJ, Waters MJ. Growth Hormone receptors in clonal osteoblastlike cells mediate a mitogenic response to GH endocrinology 1991; 128: (107) Slootweg MC, Swolin D, Netelenbos JC, Isaksson OG, Ohlsson C. Estrogen enhances growth hormone receptor expression and growth hormone action in rat osteosarcoma cella and human osteoblast-like cells. J Endocrinol 1997; 155: (108) Chen HT, Schuler LA, Schultz RD. Growth Hormone receptor and regulation of gene expression in fetal lymphoid cells. Mol Cell Endocrinol 1998; 137:21-9. (109) Jeay S, Sonenshein GE, Postel-Vinay MC, Kelly PA, Baixeras E. Growth hormone can act as a cytokine controlling survival and proliferation of immune cells: new insights into signaling pathways. Mol Cell Endocrinol 2002; 188:1-7. (110) Lombardi G, Colao A, Ferone D, Marzullo P, Orio F, Longobardi S, Merola B. Effect of growth hormone on cardiac function, Horm. Res. 1997; 48(4): (111) Yoshizato H, Fujikawa T, Soya H, Tanaka M, Nakashima K. The growth hormone gene is expressed in the lateral hypothalamus: enhancement by GH-releasing hormone and repression by restraint stress. Endocrinology 1998; 139: (112) Colao A, Merola B, Ferone D, Lombardi G, Acromegaly. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: (113) Isaksson OG, Lindahl A, Nilsson A, Isgaard J. Mechanism of the stimulatory effect of growth hormone on longitudinal bone growth. Endocr Rev 1987; 8: (114) Bierich JR. Growth hormone therapy in short children without classical growth hormone deficiency. J Endocrinol Invest 1989; 12: (115) Holt RI, Simpson HL, Sonksen PH. The role of the growth hormone-insulin-like growth factor axis in glucose homeostasis. Diabet Med 2003; 20:3-15. (116) Moller N, Gjedsted J, Gormsen L, Fuglsang J, Djurhuus C. Effects of growth hormone on lipid metabolism in humans. Growth Horm IGF Res 2003; 13:S (117) Svensson J, Bengtsson BA. Growth hormone replacement therapy and insulin sensitivity. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88: (118) Christ ER, Carroll PV, Russell-Jones DL, Sonksen PH. The consequences of growth hormone deficiency in adulthood, and the effects of growth hormone replacement. Schweiz Med Wochenschr 1997; 127: (119) Holt RI, Simpson HL, Sonksen PH. The role of the growth hormone-insulin-like growth factor axis in glucose homeostasis. Diabet Med 2003; 20:

213 (120) Strobl JS, Thomas MJ. Human growth hormone. Pharmacol Rev 1994; 46:1-34. (121) Bartke A, Chandrashekar V, Bailey B, Zaczek D. Consequences of growth hormone overexpression and GH resistance. Neuropeptides 2002; 36: (122) Wolf E, Kahnt E, Ehrlein J, Ehrlein J, Hermanns W, Brem G, Wanke R. Effects of long-term elevated serum levels of growth hormone on life expectancy of mice: lessons from transgenic animal models. The GH-transgenic mouse as an experimental model for growth research: clinical and pathological studies. Mech Ageing Dev 1993; 68(1-3): (123) Facchini FS, Hua N, Abbasi F, reaven GM. Insulin resistance as a predictor of age-related diseases. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: (124) Hauck SJ, Bartke A. Free radical defenses in the liver and kidney of human growth hormone transgenic mice: possible mechanisms of early mortality. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2001; 56:B (125) Droge W. Oxidative stress and aging. Adv Exp Med Biol 2003; 543: (126) Yakar S, Liu JL, Fernandez AM, Wu Y, Schally AV, Frystyk J, Chernausek S, Mejia W, Roith DL. Liver-specific IGF-I gene deletion leads to muscle insulin insensitivity. Diabetes 2001; 50(5): (127) Haluzik M, Yakar S, Gavrilova O, Setser J, Boisclair Y, LeRoith D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-I gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex: relative roles of growth hormone and IGF-I in insulin resistance. Diabetes 2003; 52: (128) Yakar S, Setser J, Zhao H, Stannard B, Haluzik M, Glatt V, Bouxsein ML, Kopchick JJ, LeRoith D. Inhibition of growth hormone action improves insulin sensitivity in liver IGF-Ideficient mice. J Clin Invest 2004; 113: (129) Doglio A, Dani C, Fredrikson G, Grimaldi P, Ailhaud G. Acute regulation of insulin-like growth factor I gene expression by growth hormone during adipose cell differentiation. EMBO J. 1987; (6): (130) Bichell DP, Kikuchi K, Rotwein P. Growth hormone rapidly activates insulin-like growth factor I gene transcription in vivo. Mol. Endocrinol. 1992; 6: (131) Meton I, Boot EP, Sussenbach JS, Steenbergh PH. Growth hormone induces insulin-like growth factor-i gene transcription by a synergistic action of STAT5 and HNF-1α. FEBS Lett. 1990; 444, (132) Davey, H. W., Xie, T., McLachlan, M. J., Wilkins, R. J., Waxman, D. J., Grattan, D. R. STAT5b is required for GH-induced liver IGF-I gene expression. Endocrinology 2001; 142, (133) Shoba, L. N., Newman, M., Liu, W., Lowe, W. L., Jr. LY , an inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, inhibits GH-mediated expression of the IGF-I gene in rat hepatocytes. Endocrinology 2001; 142, (134) Sadowski, C. L., Wheeler, T. T., Wang, L. H., Sadowski, H. B. GH regulation of IGF-I and suppressor of cytokine signaling gene expression in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology 2001; 142, (135) Wood TJ, Sliva D, Lobie PE, Pircher TJ, Gouilleux F, Wakao H, Gustafsson J, Groner B, Norstedt G, Haldosen LA. Mediation of growth hormone-dependent transcriptional activation by mammary gland factor/stat 5. J Biol Chem 1995; 270: (136) Udy GB, Towers RP, Snell RG. Requirement of STAT5b for sexual dimorphism of body growth rates and liver gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: (137) Lahuna O, Rastegar M, Maiter D, Thissen JP, Lemaigre FP, Rousseau GG. Involvement of STAT5/signal transducer and activator of transcription 5 and HNF-4/hepatocyte nuclear factor 4 in the transcriptional control of the HNF6 gene by growth hormone. Mol Endocrinol 2000; 14: (138) Lahuna O, Fernandez L, Karlsson H, Maiter D, Lemaigre F, Rousseau G, Gustafsson J, Mode A. Expression of hepatocyte nuclear factor 6 in rat liver is sex-dependent and regulated by growth hormone. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:

214 (139) Flores-Morales A, Stahlberg N, Tollet-Egnell P, Lundeberg J, Malek R, Quackenbush J, Lee N, Norstedt G. Microarray analysis of the in vivo effects of hypophysectomy and growth hormone treatment on gene expression in the rat. Endocrinology 2001; 142: (140) Zhou YC, Waxman DJ. STAT5b down-regulates peroxisome proliferator-activated receptor alpha transcription by inhibition of lignad-independent activation function region-1 transactivation domain. J Biol Chem 1999; 274: (141) Carlsson L, Linden D, Jalouli M, Oscarsson J. Effects of fatty acids and growth hormone on liver fatty acid binding protein and PPAR alpha in rat liver. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001; 281:E (142) Adams TE, Hansen JA, Starr R, Nicola NA, Hilton DJ, Billestrup N. Growth hormone preferentially induces the rapid, transient expression of SOCS-3, a novel inhibitor of cytokine receptor signaling. J. Biol. Chem. 1998; 273, (143) Davey HW, McLachlan MJ, Wilkins RJ, Hilton DJ, Adams TE. STAT5b mediates the GHinduced expression of SOCS-2 and SOCS-3 mrna in the liver. Mol. Cell. Endocrinol. 1999; 158: (144) Ram PA, Waxman DJ. SOCS/CIS protein inhibiton of growth hormone-stimulated STAT5 signaling by multiple mechanisms. J. Niol. Chem. 1999; 274: (145) Tollet-Egnell P, Flores-Morales A, Stavreus-Evers A, Sahlin L, Norstedt G. Growth hormone regulation of SOCS-2, SOCS-3 and CIS messenger ribonucleic acid expression in the rat. Endocrinology 1999; 140: (146) LeCam A, Pages G, Auberger P, LeCa G, Leopold P, Benarous R, Glaichenhaus N. Study of a growth hormone-regulated protein secreted by rat hepatocytes: cdna cloning, anti-protease activity and regulation of its synthesis by various hormones. EMBO J. 1987; 6: (147) Bergad PL, Shih HM, Towle HC, Schwarzenberg SJ, Berry SA. Growth hormone induction of hepatic serine protease inhibitor 2.1 transcription is mediated by a STAT5-related factor binding synergistically to two gamma-activated sites. J. Biol. Chem. 1995; 270: (148) Οoi GT, Cohen FJ, Tseng LY, Rechler MM, Boisclair YR. Growth hormone stimulates transcription of the gene encoding the acid-labile subunit/als of the circulating insulin-like growth factor-binding protein complex and ALS promoter activity in rat liver. Mol. Endocrinol. 1997; 11: (149) Galsgaard ED, Gouilleux F, Gronwer B, Serup P, Nielsen JH, Billestrup N. Identification of a growth hormone-responsive STAT5-binding element in the rat insulin 1 gene. Mol. Endocrinol. 1996; 10: (150) Waxman DJ. Regulation of liver-specific steroid metabolizing cytochromes P450: cholesterol 7 alpha hydroxylase, bile acid 6 beta-hydroxylase, and growth hormone-responsive steroid hormone hydroxylases. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1992; 43: (151) Waxman DJ, Ram PA, Park SH, Choi HK. Intermittent plasma growth hormone triggers tyrosine phosphorylation and nuclear translocation of a liver-expressed, STAT 5-related DNA binding protein. Proposed role as an intracellular regulator of male-specific liver gene transcription. J. Biol. Chem. 1995; 270: (152) Ηοdge C, Liao J, Stofega M, Guan K, Carter-Su C, Schwartz J. Growth hormone stimulates phosphorylation and activation of elk-1 and expression of c-fos, egr-1, and jun B through activation of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Biol. Chem. 1998; 273: (153) Webb SM, Casanueva F, Wass JA. Oncological complications of excess GH in acromegaly. Pituitary 2002; 5: (154) Jenkins PJ. Acromegaly and cancer. Hormone Research 2004; 62: (155) Siegel G, Tomer Y. Is there an association between acromegaly and thyroid carcinoma? A critical review of the literature. Endocrine Research 2005; 31: (156) Anisimov VN. Mutant and genetically modified mice as models for studying the relationship between aging and carcinogenesis. Mechanisms of Ageing and Development 2001; 12(2):

215 (157) Ikeno Y, Bronson RT, Hubbard GB, Lee S, Bartke A, Delayed occurrence of fatal neoplastic diseases in ames dwarf mice: correlation to extended longevity. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences 2003; 58: (158) Hartmann H, Schmitz F, Christ B, Jungermann K, Creutzfeldt W, Metabolic actions of insulin-like growth factor-i in cultured hepatocytes from adult rats. Hepatology 1990; 12: (159) Kimura M, Ogihara M. Effects of insulin-like growth factor I and II on DNA synthesis and proliferation in primary cultures of adult rat hepatocytes. European Journal of Pharmacology 1998; 354: (160) Grunnet N, Peng X, Tygstrup N. Growth factors and gene expression in cultured rat hepatocytes. Journal of Hepatology 1999; 31: (161) Bartke A. Can growth hormone (GH) accelerate aging? Evidence from GH-transgenic mice. Neuroendocrinology 2003; 78: (162) González L, Miquet JG, Sotelo AI, Bartke A, Turyn D. Cytokine-inducible SH2 protein upregulation is associated with desensitization of GH signaling in GHRH-transgenic mice. Endocrinology 2002; 143: (163) Miquet JG, Sotelo AI, Bartke A, Turyn D. Desensitization of the JAK2/STAT5 GH signaling pathway associated with increased CIS protein content in liver of pregnant miceamerican Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 2005; 289: (164) Jansson JO, Ekberg S, Hoath SB, Beamer WG, Frohman LA. Growth hormone enhances hepatic epidermal growth factor receptor concentration in mice. Journal of Clinical Investigation 1988; 82: (165) Miquet JG, González L, Matos MN, Hansen C, Louis A, Bartke A, Turyn D, Sotelo AI. Transgenic mice overexpressing GH exhibit hepatic upregulation of GH-signaling mediators involved in cell proliferation. Journal of Endocrinology 2008; 198: (166) Annie M. Procter, John A. Phillips III, David N. Cooper, Hum Genet. The molecular genetics of growth hormone deficiency 1998; 103: (167) Powell-Braxton L, Hollingshead P, Giltinan D, Pitts-Meek S, Stewart T. Inactivation of the IGF-I gene in mice results in perinatal lethality. Ann N Y Acad Sci 1993; 692: (168) Powell-Braxton L, Hollingshead P, Warburton C, Dowd M, Pitts-Meek S, Dalton D, Gillett N, Stewart TA. IGF-I is required for normal embryonic growth in mice. Genes Dev 1993; 7: (169) Liu JP, Baker J, Perkins AS, Robertson EJ, Efstratiadis A. Mice carrying null mutations of the genes encoding insulin-like growth factor I (IGF-I) and type I IGF receptor, Cell 1993; 75: (170) Sjogren K, Liu JL, Blad K, Skrtic S, Vidal O, Wallenius V, LeRoith D, Törnell J, Isaksson OG, Jansson JO, Ohlsson C. Liver-derived insulin-like growth factor I is the principal source of IGF-I in blood but is not required for postnatal body growth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96: (171) Yakar S, Liu JL, Stannard B, Andrew Butler, Domenici Accili, Brian Sauer, Derek LeRoith. Normal growth and development in the absence of hepatic insulin-like growth factor I. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96: (172) Haluzik M, Yakar S, Gavrilova O, Setser J, Boisclair Y, LeRoith D. Insulin resistance in the liver-specific IGF-I gene-deleted mouse is abrogated by deletion of the acid-labile subunit of the IGF-binding protein-3 complex:relative roles of growth hormone and IGF-I in insulin resistance. Diabetes 2003; 52: (173) Ιsaksson O, Ohlsson C, Sjogren K, Wallenius K, Jansson JO. The somatomedin hypothesis revisited in a transgenic model. Growth Horm IGF Res 2001; 11:S (174) Procter AM, Phillips III JA, Cooper DN. The molecular genetics of growth hormone deficiency. Hum Genet 1998; 103: (175) Spiliotis BE, August GP, Hung W, Sonis W, Mendelson W, Bercu BB. Growth hormone neurosecretory dysfunction. A treatable cause of short stature. JAMA 1984; (4) 251:

216 (176) Bercu BB, Schulman D, Root AW, Spiliotis BE Growth hormone (GH) provocative testing frequently does not reflect endogenous GH secretion. J Clin Endocrin Metab 1986; 63: (177) Zadik Z, Zung A, Sarel R, Cooper M. Evolving growth hormone deficiency in children with subnormal secretion of growth hormone. J Pediatr 1997; 130: (178) Attie KM, Carlsson LMS, Rundle AC, Sherman BM. Evidence for partial growth hormone insensitivity among patients with idiopathic short stature. J Pediatr 1995; 127: (179) Ranke MB, Towards a consensus on the definition of idiopathic short stature, Hormone Res 1996; 45: (180) Carter-Su C. Molecular mechanism of growth hormone action. Annu Rev Physiol 1996; 58: (181) Rosenfeld RG, Hwa V. Toward a Molecular Basis for Idiopathic Short Stature, The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 2004; 89(3): (182) Rosenfeld RG, Rosebloom AL, Guevara Aguirre J. Growth hormone (GH) insensitivity due to primary GH receptor deficiency. Endocrin 1994; 15: (183) Woods KA, Dastot F, Preece MA, Clark AJ, Postel-Vinay MC, Chatelain PG, Ranke MB, Rosenfeld RG, Amselem S, Savage MO. Phenotype: genotype relationships in growth hormone insensitivity syndrome. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: (184) Wojcik J, Berg MA, Esposito N, Geffner ME, Sakati N, Reiter EO. Dower S, Francke U, Postel-Vinay MC, Finidori J. Four continuous amino acid substitutions identified in patients with Laron syndrome differently affect the binding affinity and intracellular trafficking of the growth hormone receptor, J Clin Endocrinol Metab 1998; 83, (185) Burren CP, Woods KA, Rose SJ, Tauber M, Price DA, Heinrich U, Gilli G, Razzaghy-Azar M, Al-Ashwal A, Crock PA, Rochiccioli P, Yordam N, Ranke MB, Chatelain PG, Preece MA, Rosenfeld RG, Savage MO. Clinical and endocrine characteristics in atypical and classical growth hormone insensitivity syndrome. Hormone Res 2001; 55: (186) Amit T, Youdim MB, Hochberg Z. Clinical review 112: does serum growth hormone (GH) binding protein reflect human GH receptor function? J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: (187) Duquesnoy P, Sobrier ML, Duriez B, Dastot F, Buchanan CR, Savage MO, Preece MA, Craescu CT, Blouquit Y, Goossens M. A single amino acid substitution in the exoplasmic domain of the human growth hormone (GH) receptor confers familial GH resistance (Laron syndrome) with positive GH-binding activity by abolishing receptor homodimerization. EMBO J 1994; 13: (188) Woods KA, Fraser NC, Postel-Vinay MC, Savage MO, Clark AJ. A homozygous splice site mutation affecting the intracellular domain of the growth hormone (GH) receptor resulting in Laron syndrome with elevated GH-binding protein, J Clin Endocrinol Metab 1996; 81: (189) Iida K, Takahashi Y, Kaji H, Takahashi MO, Okimura Y, Nose O, Abe H, Chihara K. Functional characterization of truncated growth hormone (GH) receptor (1 277) causing partial GH insensitivity syndrome with high GH-binding protein. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: (190) Ayling RM, Ross R, Towner P, Von Laue S, Finidori J, Moutoussamy S, Buchanan CR, Clayton PE, Norman MR. A dominant-negative mutation of the growth hormone receptor causes familial short stature. Nat Genet 1997; 16: (191) Freeth JS, Silva CM, Whatmore AJ, Clayton PE. Activation of the signal transducers and activators of transcription signaling pathway by growth hormone (GH) in skin fibroblasts from normal and GH binding protein-positive Laron syndrome children, Endocrinology 1998; 139: (192) Kofoed EM, Hwa V, Little B, Woods KA, Buckway CK, Tsubaki J, Pratt KL, Bezrodnik L, Jasper H, Tepper A, Heinrich J, Rosenfeld RG. Growth hormone insensitivity associated with a STAT5b mutation. N Engl J Med 2003; 349:

217 (193) Udy GB, Towers RP, Snell RG, Wilkins RJ, Park SH, Ram PA, Waxman DJ, Davey HW. Requirement of STAT5b for sexual dimorphism of body growth rates and liver gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: (194) Teglund S, McKay C, Schuetz E, van Deursen JM, Stravopodis D, Wang D, Brown M, Bodner S, Grosveld G, Ihle JN. Stat5a and Stat5b proteins have essential and nonessential, or redundant, roles in cytokine responses, Cell 1998; 93: (195) Audrey D. Goddard, Patrick Dowd, Steven Chernaasek, Mitchell Geffner, Joseph Gertner, Raymond Hintz, Nancy Hopwood, Selna Kaplan, Leslie Plotnick, Alan Rogol, Robert Rosenfield, Paul Saenger, Nellie Mouras, Richard Hershkopf, Morris Angulo, Kenneth Attie. Partial growth-hormone insensitivity: The role of growth hormone mutations in idiopathic short stature, J Pediatr 1997; 131: (196) Pfaffie RW, Parks JS, Brown MR, Heimann G. Pit-1 and pituitary function. J Pediatr Endocrinol 1993; 6: (197) Wajnrajch MP, Gertner JM, Harbison MD, Chua SCJ, Leibel RL. Nonsense mutation in the human growth hormone-releasing hormone receptor causes growth failure analogous to the little (lit) mouse. Nature Genetics 1996; 12: (198) Perez-Jurado LA, Argente J. Molecular basis of familial growth hormone deficiency. Horm Res 1994; 42: (199) Woods KA, Camacho-Hubner C, Savage MO, Clark AJL. Intrauterine growth retardation and postnatal growth failure associated with deletion of the insulin-like growth factor I gene. N Engl J Med 1996; 335: (200) Erica A, Eugster MD, Ora Hirsch Pescovitz MD. New Revelations about the Role of STATs in Stature, N. Engl J Med 2003; 349:12. (201) Besson A., Salemi S., Deladoëy J., Vuissoz JM, Eblé A, Bidlingmaier M, Bürgi S, Honegger U, Flück C, Mullis PE. Short Stature Caused by a Biologically Inactive Mutant Growth Hormone GH-C53S). 2005; 90(5):2493. (202) Rojas-Gil AP, Ziros PG, Diaz L, Kletsas D, Basdra EK, Alexandrides TK, Zadik Z, Frank SJ, Papathanassopoulou V, Beratis NG, Papavassiliou AG, Spiliotis BE: Growth hormone/jak- STAT axis signal-transduction defect. FEBS J 2006; 273: (203) Hindmarsh P, Smith PJ, Brook CG, Matthews DR. The relationship between height velocity and growth hormone secretion in short pre-pubertal children. Clin Endocrinol 1987; 27: (204) Saggese G, Meossi C, Cesaretti G, Bottone E. Physiological assessment of growth hormone secretion in the diagnosis of children with short stature. Pediatrician 1987; 14: (205) Ballerini MG, Ropelato MG, Domene HM, Pennisi P, Heinrich JJ, Jasper HG. Differential impact of simple childhood obesity on the components of the growth hormone-insulin-like growth factor (IGF)-IGF binding proteins axis. J Pediatr Endocrinol Metab 2004; 17: (206) Di Somma C, Savastano S, Rota F, et al, Appropriate use of stimulation tests and insulinlike growth factor-i in obesity. J Endocrinol Invest 2008; 31(9): (207) Laron Z, Pertzelan A, Karp M, Kowaldo-Silbergeld A, Daughaday WH. Administration of growth hormone to patients with familial dwarfism with high plasma immunoreactive growth hormone: measurement of sulfation factor, metabolic and linear growth responses. J Clin Endocrinol Metab 1971; 33: (208) Hayek A, Peake GT. Growth and somatomedin-c responses to growth hormone in dwarfed children. J Pediatr 1981; 99: (209) Savage MO, Blum WF, Ranke MB, Postel-Vinay MC, Cotterill AM, Hall K, Chatelain PG, Preece MA, Rosenfeld RG. Clinical features and endocrine status in patients with growth hormone insensitivity (Laron syndrome). J Clin Endocrinol Metab 1993; 77: (210) Blum WF, Cotterill AM, Postel-Vinay MC, et al, Improvement of diagnostic criteria in growth hormone insensitivity syndrome: solutions and pitfalls. Pharmacia Study Group on Insulin-like Growth Factor I Treatment in Growth Hormone Insensitivity Syndromes. Acta Paediatr Suppl 1994; 399:

218 (211) Cotterill AM, Camacho-Hubner C, Woods K, Martinelli C, Duquesnoy P, Savage MO. The insulin-like growth factor I generation test in the investigation of short stature. Acta Paediatr 1994; 399: (212) Thalange NK, Price DA, Gill MS, Whatmore AJ, Addison GM, Clayton PE. Insulin-like growth factor binding protein-3 generation: an index of growth hormone insensitivity. Pediatr Res 1996; 39: (213) Rosenfeld RG, Buckway C, Selva K, et al, Insulin-like growth factor (IGF) parameters and tools for efficacy: The IGF-I generation test in children. Horm Res 2004; 62(1): (214) Selva KA, Buckway CK, Sexton G, Pratt KL, Tjoeng E, Guevara-Aguirre J., Rosenfeld RG. Reproducibility in patterns of IGF generation with special reference to idiopathic short stature. Horm Res 2003; 60: (215) Rudman D, Kutner MH, Blackston RD, Cushman RA, Patterson JH. Children with normalvariant short stature: treatment with human growth hormone for six months. N Engl J Med 1981; 305(3): (216) Rosenfeld RG, Kemp SF, Hintz RL. Constancy of somatomedin response to growth hormone treatment of hypopituitary dwarfism, and lack of correlation with growth rate. J Clin Endocrinol Metab 1981; 53: (217) Van Vliet G, Styne DM, Kaplan SL, Grumbach MM. Growth hormone treatment for short stature. N Engl J Med 1983; 309: (218) Buckway CK, Guevara-Aguirre J, Pratt KL, Burren CP, Rosenfeld RG. The IGF-I generation test revisited: a marker of GH sensitivity. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: (219) Chrysis DC, Alexandrides TK, Koromantzou E, Georgopoulos N, Vassilakos P, Kiess W, Kratsch J, Beratis NG, Spiliotis BE. Novel application of IGF-I and IGFBP-3 generation tests in the diagnosis of growth hormone axis disturbances in children with beta-thalassaemia. Clin Endocrinol 2001; 54: (220) Schwarze CP, Wollmann HA, Binder G, Ranke MB. Short-term increments of insulin-like growth factor I (IGF-I) and IGF-binding protein-3 predict the growth response to growth hormone (GH) therapy in GH-sensitive children. Acta Paediatr Suppl 1999; 88: (221) Spiliotis BE, Alexandrides TK, Karystianos C, Vassilakos P, Zadik Z, Nikolakopoulou NM, Nikiforidis G, Beratis NG. The insulin-like growth factor-i (IGF-I) generation test as an indicator of growth hormone status, Hormones 2009; 8(2): (222) Cosman D. The hematopoietin receptor superfamily. Cytokine 2003; 5: (223) Βazan JF. A novel family of growth factor receptors: A common binding domain in the growth hormone, prolactin, erythropoietin and IL-6 receptors, and the p75 IL-2 receptor β- chain. Biochemical and Biophysical Research Communications 1989; 164(2): (224) Frank SJ, Messina JL. Growth hormone receptor. In: Oppenheim JJ, Feldman M, eds. Cytokine reference on-line. London: Academic Press, Harcourt 2002; (225) Somers W, Ultsch M, De Vos AM, Kossiakoff AA. The X-ray structure of a growth hormone-prolactin receptor complex. Nature 1994; 372: (226) Tsusima T, Friesen HG. Radioreceptor assay for growth hormone. J Biol Chem 1973; 278: (227) Leung DW, Spencer SA, Cachianes G, Hammonds RG, Collins C, Henzel WJ, Barnard R, Waters MJ, Wood WI. Growth hormone receptor and serum binding protein: purification, cloning and expression. Nature 1987; 330: (228) Barton DE, Foellmer BE, Wood WI, Francke U. Chromosome mapping of the growth hormone receptor gene in man and mouse. Cytogenet. Cell Genet. 1998; 50: (229) Schwartzbauer G, Menon R. Regulation of growth hormone receptor gene expression. Mol Genet Metab. 1998; 63(4): (230) Leung DW, Spencer SA, Cachianes G, Hammonds RG, Collins C, Henzel WJ, Barnard R, Waters MJ, Wood WI. Growth hormone receptor and serum binding protein: purification, cloning and expression. Nature 1987;330:

219 (231) Harding PA, Wang XZ, Kelder B, Souza S, Okada S, Kopchick JJ. In vitro mutagenesis of growth hormone receptor Asn-linked glycosylation sites. Mol Cell Endocrinol 1994; 106: (232) Haldosen LA, Gustafsson JA. Detection of glycosylated growth hormone-binding proteins in rat serum. Mol Cell Endocrinol 1990; 68: (233) Zhou Y, Xu BC, Maheshwari HG, Reed M, Lozykowski M, Okada S, Cataldo L, Coschigamo K, Wagner TE, Baumann G, Kopchick JJ. A mammalian model for Laron syndrome produced by targeted disruption of the mouse growth hormone receptor/binding protein gene (the Laron mouse). Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: (234) Coshigano KT, Clemmons D, Bellush LL, Kopchick JJ. Assessment of growth parameters and life span of GHR/BP gene-disrupted mice. Endocrinology 2000; 141: (235) Posner BI, Kelly PA, Shiu RP, Friesen HG. Studies of insulin, growth hormone and prolactin binding: tissue distribution, species variation and characterization. Endocrinology 1974; 95: (236) Kelly PA, Djiane J, Postel-Vinay MC, Edery M. The prolactin/growth hormone receptor family. Endocr Rev 1991; 12: (237) Bornfeldt KE, Arnqvist HJ, Enberg B, Mathews LS, Norstedt G. Regulation of insulin-like growth factor-i and growth hormone receptor gene expression by diabetes and nutritional state in rat tissues, J Endocrinol 1989; 122: (238) Straus DS, Takemoto CD. Effect of fasting on insulin-like growth factor-i and growth hormone receptor mrna levels and IGF-I gene transcription in rat liver. Mol Endocrinol 1990; 4: (239) Mertinez V, Balbin M, Ordonez FA. Hepatic expression of growth hormone receptor/binding protein and insulin-like growth factor I genes in uremic rats. Influence of nutritional deficit. Growth Horm IGF Res 1999; 9:61-8. (240) Brameld JM, Gilmour RS, Buttery PJ. Glucose and amino acids interact with hormones to control expression of insulin-like growth factor-i and growth hormone receptor mrna in cultured pig hepatocytes. J Nutr 1999; 129: (241) Chung CS, Etherton TD. Characterization of porcine growth hormone binding to porcine liver microsomes: chronic administration of GH induces GH binding, Endocrinology 1986; 119: (242) Gluckman PD, Breier BH, Sauerwein H. Regulation of the cell surface growth hormone receptor. Acta Paediatr Scand Suppl 1990; 366:73-8. (243) Posner BI, Patel B, Vezinhet A, Charrier J. Pituitary-dependent growth hormone receptors in rabbit and sheep liver. Endocrinology 1980; 107: (244) Maiter D, Underwood LE, Maes M, Ketelslegers JM. Acute down-regulation of the somatogenic receptors in rat liver by a single injection of growth hormone. Endocrinology 1988; 122: (245) Chen NY, Chen WY, Kopchick JJ, 1997, Liver and kidney growth hormone receptors are regulated differently in diabetic GH and GH antagonist transgenic mice. Endocrinology 138: (246) Camarillo IG, Thordarson G, Ilkbahar YN, Talamantes F. Development of a homologous radioimmunoassay for mouse growth hormone receptor. Endocrinology 1998; 139: (247) Bennett PA, Levy A, Carmignac DF, Robinson IC, Lightman Sl. Differential regulation of the growth hormone receptor gene: effects of dexamethasone and estradiol. Endocrinology 1996; 137: (248) Leung KC, Doyle N, Ballesteros M, Waters MJ, Ho KK. Insulin regulation of human hepatic growth hormone receptors: divergent effects on biosynthesis and surface translocation. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: (249) Ji S, Guan R, Frank SJ, Messina JL. Insulin inhibits growth hormone signaling via the growth hormone receptor/jak2?stat5b pathway. J Biol Chem 1999; 274:

220 (250) Ehlers MR, Riordan JF. Membrane proteins with soluble counterparts: role of proteolysis in the release of transmembrane proteins. Biochemistry 1991; 30: (251) Hooper NM, Karran EH & Turner AJ 1997 Membrane protein secretases. Biochemical Journal 1996; 321: (252) Mullberg J, Althoff K, Jostock T, Rose-John S. The importance of shedding of membrane proteins for cytokine biology. European Cytokine Network 2000; 11: (253) Hooper NM, Karran EH, Turner AJ. Membrane protein secretases. Biochemical Journal 1997; 321: (254) Baumann G. Growth hormone binding protein. Journal of Pediatric Endocrinology and Metabolism 2001; 14: (255) Baummann G. Growth hormone binding protein. The soluble growth hormone receptor. Minerva Endocrinol 2002; 27: (256) Baumann G, Amburn K, Shaw MA, 1988, The circulating growth hormone-binding protein complex: a major constituent of plasma GH in man. Endocrinology 122: (257) Dastot F, Duquesnoy P, Sobrier ML, Goosens M, Amselem S. Evolutionary divergence of the truncated growth hormone receptor isoform in its ability to generate a soluble growth hormone binding protein. Mol Cell Endocrinol 1998; 137: (258) Alele J, Jiang J, Goldsmith JF, Yang X, Maheshwari HG, Black RA, Baumann 5964 G, Frank SJ. Blockade of growth hormone receptor shedding by a metalloprotease inhibitor. Endocrinology 1998; 139: (259) Zhang Y, Jiang J, Black RA, Baumann G, Frank SJ. TACE is a growth hormone binding protein sheddase: the metalloprotease TACE/ADAM-17 is critical for (PMA-induced) growth hormone receptor proteolysis and GHBP generation. Endocrinology 2000; 141: (260) Guan R, Zhang Y, Jiang J, Baumann CA, Black RA, Baumann G, Frank SJ. Phorbol esterand growth factor-induced growth hormone (GH) receptor proteolysis and GH-binding protein shedding: relationship to GH receptor down-regulation. Endocrinology 2001; (261) Zhang Y, Guan R, Jiang J, Kopchick JJ, Black RA, Baumann G, Frank SJ. Growth hormone (GH)-induced dimerization inhibits phorbol ester-stimulated GH receptor proteolysis. Journal of Biological Chemistry 2001; 276: (262) Cowan J, Guan R, Jiang J, Wolfe MS, Frank SJ. GH receptor is a target for both metalloprotease-mediated and gamma secretase cleavage. Program of the 84th Annual Meeting of the Endocrine Society, San Francisco, CA, USA, 2002, p (263) Esler WP, Wolfe MS. A portrait of Alzheimer secretases new features and familiar faces. Science 2001; 293: (264) Βaumann G, Lowman HB, Mercado M, Wells JA. The stoichiometry of growth hormonebinding protein complexes in human plasma: comparison with cell surface receptors. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1994; 78: (265) Clark RG, Mortensen DL, Carlsson, LM, Spencer SA, McKay P, Mulkerrin M, Moore J, Cunningham BC. Recombitant human growth-binding protein enhances the growth-promoting activity of human GH in the rat. Endocrinology 1996; 137: (266) Veldhuis JD, Johnson ML, Fant LM, Mercado M, Baumann G. Influence of high affinity GHBP on plasma profiles of free and bound GH and on the apparent half life of GH. J. Clin. Invest. 1993; 91: (267) Maheshwari H, Sharma L, Baumann G. Decline of plasma growth hormone binding protein in old age. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996; 81: (268) Carlsson LM, Attie KM, Compton PG, Vitangcol RV, Merimee TJ. The National Cooperative Growth Study. Reduced concentration of serum growth hormone-binding protein in children with idiopathic short stature. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1994; 78: (269) Μenon RK, Arslanian S, May B, Cutfield WS, Sperling MA. Diminished growth hormonebinding protein in children with insulin-dependent diabetes mellitus. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1992; 74,

221 (270) Hochberg Z, Nertz P, Colin V, Ish-Shalom S, Yeshurun D, Youdim MBH, Amit T. The distal axis of growth hormone in nutritional disorders: GH-binding protein, insulin-like growth factor-i and IGF-I receptors in obesity and anorexia nervosa. Metabolism 1992; 41: (271) Mannor DA, Winer LM, Shaw MA. Baumann G. Plasma growth hormone (GH)-binding proteins: effect on GH binding to receptors and GH action. J. Clin. Endocrinol. Metab. 1991; 73: (272) Baumann G, Amburn KD, Buchanan TA. The effect of circulating growth hormone-binding protein on metabolic clearance, distribution, and degradation of human growth hormone. J Clin. Endocrinol. Metab. 1987; 64: (273) Clark RG, Mortensen DL, Carlsson LM, Spencer SA, McKay P, Mulkerrin M, Moore J, Cunningham BC. Recombinant human growth hormone (GH)-binding protein enhances the growth-promoting activity of human GH in the rat. Endocrinology 1996; 137: (274) Cowan J, Guan R, Jiang J, Wolfe MS, Frank SJ. GH receptor is a target for both metalloprotease-mediated and gamma-secretase cleavage. Program of the 84th Annual Meeting of the Endocrine Society, San Francisco, CA, USA, 2002, p (275) Gorin E, Goodman HM. Turnover of growth hormone receptors in rat adipocytes. Endocrinology 1985; 116: (276) Putters J, da Silva Almeida AC, van Kerkhof P, van Rossum AG, Gracanin A, Strous GJ. Jak2 is a negative regulator of ubiquitin-dependent endocytosis of the growth hormone receptor. 2011; PLoS One 6(2):e (277) Loesch K, Deng L, Wang X, He K, Jiang J, Frank S. Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Growth Hormone Receptor in Janus Kinase 2-Deficient Cells, (Endocrinology 2007; 148: (278) Govers R, van Kerkhof P, Schwartz AL, Strous GJ. Identification of a novel ubiquitin conjugation motif, required for ligand-induced internalization of the growth hormone receptor. Embo J 1999; 16: (279) Cunningham BC, Ultsch M, de Vos AM, Mulkerrin MG, Clauser KR, Wells JA. Dimerization of the extracellular domain of the human growth hormone receptor by a single hormone molecule. Science 1991; 254: (280) de Vos AM, Ultch M., Kossiakoff AA. Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the comlex. Science 1992; 255: ). (281) Cunningham BC, Wells JA. Rational design of receptor-specific variants of human growth hormone. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: (282) Chen WY, Wight DC, Wagner TE, Kopchick JJ. Expression of a mutated bovine growth hormone gene suppresses growth of transgenic mice, Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: (283) Ross RJ, Esposito N, Shen XY, Von Laue S, Chew SL, Dobson PR, Postel-Vinay MC, Finidori J. A short isoform of the human growth receptor functions as a dominant negative inhibitor of the full-length receptor and generates large amounts of binding protein. Mol Endocrinol 1997; 11: (284) Rowlinson SW, Behncken SN, Rowland JE, Clarkson RW, Strasburger CJ, Wu Z, Baumbach W, Waters MJ. Activation of chimeric and full-length growth hormone receptors by growth hormone receptor monoclonal antibodies. A specific conformational change may be required for full-length receptor signaling, J Biol Chem 1998; 273: (285) Cunningham B, Ultsch M, De Vos A, Mulkerrin M, Clauser K, Wells J. Dimerization of the extracellular domain of the human growth hormone receptor by a single hormone molecule. Science 1991; 245: (286) Fuh G, Cunningham BC, Fukunaga R, Nagata S, Goeddel DV, Wells JA. Rational design of potent antagonists to the human growth hormone receptor. Science 1992; 256: (287) Herrington J, Carter-Su C. Signaling pathways activated by the growth hormone receptor, Trends Endocrinol Metab. 2001; 12(6): (288) Ross RJ, Leung KC, Maamra M, Bennett W, Doyle N, Waters MJ, Ho KK. Binding and functional studies with the growth hormone receptor antagonist, B2036-PEG, reveal effects of 221

222 pegylation and evidence that it binds to a receptor dimer. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: (289) Gent J, van Kerkhof P, Roza M, Bu G, Strous GJ. Ligand-independent growth hormone receptor dimerization occurs in the endoplasmic reticulum and is required for ubiquitin systemdependent endocytosis. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: (290) Nathan J. Lanning, Christin Carter-Su. Recent advances in growth hormone signaling, Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders 2006; 7(4), (291) Strous GJ, Gent J. Dimerization, ubiquitylation and endocytosis go together in GHR function, FEBS Letters 529, 2002; (292) He K, Loesch K, Cowan JW, Li X, Deng L, Wang X, Jiang J, Frank SJ. JAK2 enhances the stability of the mature GH receptor. Endocrinology 2005; 145: (293) He K, Wang X, Jiang J, Guan R, Bernstein KE, Sayeski PP, Frank SJ. Janus kinase 2 determinants for growth hormone receptor association, surface assembly, and signaling. Mol Endocrinol 2003; 17: (294) Loesch K, Deng L, Wang X, He K, Jiang J, Frank SJ. Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Growth Hormone Receptor in Janus Kinase 2-Deficient Cells. Endocrinology 2007; 148: (295) Argetsinger LS, Campbell GS, Yang X, Witthuhn BA, Silvennoinen O, Ihle JN & Carter-Su C. Identification of JAK2 as a growth hormone receptor-associated tyrosine kinase, Cell 1993; 74, (296) Kim S, Loesch K, Wang X, Jiang J, Mei L, Cunnick JM, Wu J,. Frank SJ. A Role for Grb2- Associated Binder-1 in Growth Hormone Signaling, Endocrinology 143(12): (297) Smit LS, Meyer DJ, Billestrup N, Norstedt G, Schwartz J, Carter-Su C. The role of the growth hormone (GH) receptor and JAK1 and JAK2 kinases in the activation of Stats 1, 3, and 5 by GH. Mol Endocrinol 1996; 10: (298) Campbell G, Meyer D, Raz R, Levy D, Schwartz J, Carter-Su C. Activation of acute phase response factor (APRF)/Stat3 transcription factor by growth hormone. J Biol Chem 1995; 270: (299) Wood TJ, Sliva D, Lobie PE, Pircher TJ, Gouilleux F, Wakao H, Gustafsson JA, Groner B, Norstedt G, Haldosιn LA. Mediation of growth hormone-dependent transcriptional activation by mammary gland factor/stat 5. J Biol Chem 1995; 270: (300) Meyer D, Campbell G, Cochran B, Argetsinger L, Larner A, Finbloom D, Carter-Su C, Schwartz J. Growth hormone induces a DNA binding factor related to the interferon-stimulated 91-kDa transcription factor. J Biol Chem 1994; 269: (301) Rosenfeld R, Belgorosky A, Camacho-Hόbner C, Savage M, Wit J, Hwa V. Defects in growth hormone receptor signaling. Trends Endocrinol Metab 2007; 18: (302) Herrington J, Smit LS, Schwartz J & Carter-Su C. The role of STAT proteins in growth hormone signaling. Oncogene 2000; 19: (303) O'She JJ, Gadina M, Schreiber RD. Cytokine signaling in 2002: new surprises in the Jak/Stat pathway. Cell 2002; 109: (304) Bromberg JF. Activation of STAT proteins and growth control, Bioessays 2001; 23: (305) Finidori J, Kelly P. Cytokine receptor signalling through two novel families of transducer molecules: Janus kinases, and signal transducers and activators of transcription. J Endocrinol 1995; 147: (306) Walter Kolch. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions, Biochem. J. 2000; 351: (307) Moodie SA, Wolfman A. The 3Rs of life : Ras, Raf and growth regulation. Trends Genet. 1994; 10: (308) Αnderson, NG. Growth hormone activates mitogen-activated protein kinase and S6 kinase and promotes intacellular tyrosine phosphorylation in 3T3-F442A preadipocytes. Biochem. J. 1992; 284,

223 (309) Campbell GS, Pang L, Miyasaka T, Saltiel AR, Carter-Su C. Stimulation by growth hormone of MAP kinase activity in 3T3-F442A fibroblasts. J. Biol. Chem. 1992; 267: (310) VanderKuur JA, Butch ER, Waters SB, Pessin JE, Guan KL, Carter-Su C. Signaling molecules involved in coupling growth hormone receptor to mitogen-activated protein kinase activation. Endocrinology 1997; 138: (311) Reindl KM, Kittilson JD, Bergan HE, Sheridan MA. Growth hormone-stimulated insulinlike growth factor-1 expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hepatocytes is mediated by ERK, PI3K-AKT and JAK-STAT, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2011; 301: (312) Yamauchi T, Ueki K, Tobe K, Tamemoto H, Sekine N, Wada M, Honjo M, Takahashi M, Takahashi T, Hirai H, Tushima T, Akanuma Y, Fujita T, Komuro I, Yazaki Y, Kadowaki T. Tyrosine phosphorylation of the EGF receptor by the kinase Jak2 is induced by growth hormone, Nature. 1997; 390(6655):91-6. (313) Kim SO, Houtman J, Jiang J, Ruppert JM, Bertics PJ, Frank SJ. Growth hormone-induced alteration in ErbB-2 phosphorylation status in 3T3-F442A fibroblasts. J. Biol. Chem. 1999; 274: (314) Li X, Huang Y, Jiang J, Frank SJ. Synergy in ERK activation by cytokine receptors and tyrosine kinase growth factor receptors. Cell Signal. 2011; 23(2): (315) Hodge C, Liao J, Stofega M, Guan K, Carter-Su C, Schwartz J. Growth hormone stimulates phosphorylation and activation of elk-1 and expression of c-fos, egr-1, and junb through activation of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2. J. Biol. Chem. 1998; 273: (316) Pircher TJ, Peterson H, Gustafsson JA, Haldosen LA. Extracellular signal-regulated kinase/erk interacts with signal transducer and activator of transcription 5a/STAT5a. Mol. Endocrinol. 1999; 13: (317) Goh EL, Zhu T, Yakar S, LeRoith D, Lobie PE. CrkII participation in the cellular effects of growth hormone and insulin-like growth factor-1. Phosphatidylinositol-3 kinase dependent and independent effects. J. Biol. Chem. 2000; 275: (318) Zhu T, Lobie PE. Janus kinase 2-dependent activation of p38 mitogen-activated protein kinase by growth hormone. Resultant transcriptional activation of ATF-2 and CHOP, cytoskeletal re-organization and mitogenesis. J. Biol. Chem. 2000; 275: (319) Carracedo A, Pandolfi PP. The PTEN-PI3K pathway: of feedbacks and cross-talks. Oncogene 2008; 27(41): (320) McCubrey JA, Steelman LS, Chappell WH, Abrams SL, Wong EWT, Chang F, Lehmann B, Terrian DM, Milella M, Tafuri A, Stivala F, Libra M, Basecke J, Evangelisti C, Martelli AM, Franklin RA. Roles of the raf/mek/erk pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochem Biophys Acta. 2007; 1773(8): (321) Rogers SA, Hammerman MR. Insulin-like growth factor II stimulates production of inositol trisphosphate in proximal tubular basolateral membranes from canine kidney. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: (322) Sjoholm A, Zhang Q, Welsh N, Hansson A, Larsson O, Tally M, Berggren PO. Rapid Ca +2 influx and diacylglycerol synthesis in growth hormone-mediated islet beta-cell mitogenesis. J Biol Chem 2000; 275: (323) Boquet G, Barakat L, Paly J, Djiane J, Dufy B. Involvement of both calcium influx and calcium mobilization in growth hormone-induced Ca +2 increases in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Endocrinol 1997; 131: (324) Sun XJ, Rothenberg P, Kahn CR, Backer JM, Araki E, Wilden PA, Cahill DA, Goldstein BJ, White MF. Structure of the insulin receptor substrate IRS-1 defines a unique signal transduction protein. Nature 1991; 352: (325) Sun XJ, Wang LM, Zhang Y, Yenush L, Myers Jr MG, Glasheen E, Lane WS, Pierce JH, White MF. Role of IRS-2 in insulin and cytokine signalling. Nature 1995; 377:

224 (326) Flores-Morales A, Greenhalgh CJ, Norstedt G, Rico-Bautista E: Negative regulation of growth hormone receptor signalling. Mol Endocrinol 2006; 20: (327) Yang N, Wang X, Jiang J, Frank SJ. Role of the growth hormone (GH) receptor transmembrane domain in receptor predimerization and GH-induced activation. Mol Endocrinol 2007; 21: (328) Leung DW, Spencer SA, Cachlanes G, Hammonds RG, Collins C, Henzel WJ, Barnard R, Waters MJ, Wood WI. Growth hormone receptor amd serum binding protein: purification, cloning and expression. Nature 1987; 330: (329) Endo TA, Masuhara M, Yokouchi M, Suzuki R, Sakamoto H, Mitsui K, Matsumoto A, Tanimura S, Ohtsubo M, Misawa H, Miyazaki T, Leonor N, Taniguchi T, Fujita T, Kanakura Y, Komiya S, Yoshimura A. Nature 1997; 387; (330) Naka T, Narazaki M, Hirata M, Matsumoto T, Minamoto S, Aono A, Nishimoto N, Kajita T, Taga T, Yoshizaki K, Akira S, Kishimoto T. Nature 1997; 387: (331) Starr R, Willson TA, Viney EM, Murray LJ, Rayner JR, Jenkins BJ, Gonda TJ, Alexander WS, Metcalf D, Nicola NA, Hilton DJ. Nature 1997; 387: (332) Zhang JG, Farley A, Nicholson SE, Willson TA, Zugaro LM, Simpson RJ, Moritz RL, Cary D, Richardson R, Hausmann G, Kile BJ, Kent SB, Alexander WS, Metcalf D, Hilton DJ, Nicola NA, Baca M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: (333) Ram PA, Waxman DJ, SOCS/CIS Protein Inhibition of Growth Hormone-stimulated STAT5 Signaling by Multiple Mechanisms. J Biol Chem. 1999; 274(50): (334) Landsman T, Waxman DJ. Role of the cytokine-induced SH2-containing protein CIS in growth hormone receptor internalization, J Biol Chem. 2005; 280(45): (335) Gonzalez L, Miquet GJ, Sotelo IA, Bartke A, Turyn D. Cytokine-Inducible SH2 Protein Up-Regulation Is Associated with Desensitization of GH Signalling in GHRH-Transgenic Mice. Endocrinology 2002; 143(2):386. (336) Waxman DJ, Landsman T. Role of the Cytokine-induced SH2 Domain-containing Protein CIS in Growth Hormone Receptor Internalization. The Journal of Biological Chemistry 2005; 280(45): (337) Ram PA, Waxman DJ. Role of the Cytokine-inducible SH2 Protein CIS in Desensitization of STAT5b Signaling by Continuous Growth Hormone, J Biol Chem. 2000: 275(50): (338) Hackett RH, Wang YD, Sweitzer S, Feldman G,. Wood W.I, Larner AC. Mapping of a cytoplasmic domain of the human growth hormone receptor that regulates rates of inactivation of JΑΚ2 and Stat proteins. J. Biol. Chem. 1997; 272: (339) Kim SO, Jiang J, Yi W, Feng GS, Frank SJ. Involvement of the Src homology 2-containing tyrosine phosphatase SHP-2 in growth hormone signaling. J. Biol. Chem. 1998; 273: (340) Gu F, Dubé N, Kim JW, Cheng A, Ibarra-Sanchez Mde J, Tremblay ML, Boisclair YR. Protein tyrosine phosphatase 1B attenuates growth hormone-mediated JAK2-STAT signaling, Mol Cell Biol. 2003; 23(11): (341) Carter-Su C, Rui L, Stofega MR. SH2-B and SIRP: JAK2 binding proteins that modulate the actions of growth hormone. Recent Progress in Hormone Research 2000; 55: (342) Stofega MR, Argetsinger LS, Wang H, Ullrich A, Carter-Su C. Negative regulation of growth hormone receptor/jak2 signaling by signal regulatory protein alpha, J Biol Chem. 2000; 275(36): (343) Palvimo JJ. PIAS proteins as regulators of small ubiquitin-related modifier (SUMO) modifications and transcription, Biochem Soc Trans. 2007; 35(6): (344) Strous GJ, van Kerkhof P, Govers R, Ciechanover A, Schwartz AL. The ubiquitin conjugation system is required for ligand-induced endocytosis and degradation of the growth hormone receptor, EMBO J 1996; 15: (345) da Silva Almeida AC, Strous GJ, van Rossum AG. β-trcp Controls GH Receptor Degradation via Two Different Motifs. Mol Endocrinol 2012; 26:

225 (346) Gent J, van Kerkhof P, Roza M, Bu G, Strous GJ. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002; 99: (347) Suzuki H, Chiba T, Kobayashi M, Takeuchi M, Suzuki T, Ichiyama A, Ikenoue T, Omata M, Furuichi K, Tanaka K. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 256: (348) van Kerkhof P, Putters J, Strous GJ. The Ubiquitin Ligase SCF(βTrCP) Regulates the Degradation of the Growth Hormone Receptor. J Biol Chem. 2007; 282(28): (349) Putters J, da Silva Almeida AC, van Kerkhof P, van Rossum AG, Gracanin A, Strous GJ. Jak2 is a negative regulator of ubiquitin-dependent endocytosis of the growth hormone receptor. PLoS One 2011; 6:e (350) Li Y, Kumar KG, Tang W, Spiegelman VS, Fuchs SY. Negative regulation of prolactin receptor stability and signaling mediated by SCF (β-trcp) E3 ubiquitin ligase. Mol Cell Biol 2004; 24: (351) Meyer L, Deau B, Forejtnı kova H, Dume nil D, Margottin-Goguet F, Lacombe C, Mayeux P, Verdier F. β-trcp mediates ubiquitination and degradation of the erythropoietin receptor and controls cell proliferation. Blood 2007; 109: (352) Kumar KG, Tang W, Ravindranath AK, Clark WA, Croze E, Fuchs SY. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-α receptor. EMBO J 2003; 22: (353) Van Kerkhof P, Westgeest M, Hassink G, Strous GJ. SCF TrCP acts in endosomal sorting of the GH receptor. Experimental Cell Research 2011; 317 ( ). (354) Dehan E, Bassermann F, Guardavaccaro D, Vasiliver-Shamis G, Cohen M, Lowes KN, Dustin M, Huang DCS, Taunton J, Pagano M. β-trcp- and Rsk1/2-mediated degradation of BimEL inhibits apoptosis. Molecular Cell 2009; 33(1): (355) Dorrello NV, Peschiaroli A, Guardavaccaro D, Colburn NH, Sherman NE, Pagano M. S6K1- and btrcp-mediated degradation of PDCD4 promotes protein translation and cell growth. Science 2006; 314: (356) Putters J, Slotman JA, Gerlach JP, Strous GJ. Specifity, location and function of βtrcp isoforms and their splice variants. Cellular Signaling 2011; 23: (357) Lee MH, Reynisdottir I, Massagué J. Cloning of p57kip2, a cyclin-dependent kinase inhibitor with unique domain structure and tissue distribution. Genes Dev. 1995; 9: (358) Luo Y, Hurwitz J, Massagué J. Cell-cycle inhibition by independent CDK and PCNA binding domains in p21. Nature 1995; 375: (359) Gartel AL, Serfas MS, Gartel M, Goufman E, Wu GS, el-deiry WS, Tyner AL. p21 (WAF1/CIP1) expression is induced in newly nondividing cells in diverse epithelia and during differentiation of the Caco-2 intestinal cell line. Exp. Cell Res. 1996; 227: (360) Sheaff RJ, Singer JD, Swanger J, Smitherman M, Roberts JM, Clurman BE. Proteasomal turnover of p21cip1 does not require p21cip1 ubiquitination. Mol. Cell 2000; 5: (361) Touitou R, Richardson J, Bose S, Nakanishi M, Rivett J, Allday M. J. A degradation signal located in the C-terminus of p21waf1/cip1 is a binding site for the C8α subunit of the 20S proteasome. EMBO J 2001; 20: (362) McDonald ER, Wu GS, Waldman T, El-Deiry WS. Repair defect in p21 WAF1/CIP1 / human cancer cells. Cancer Res 1996; 56: (363) Sheikh MS, Chen YQ, Smith ML, Fornace AJ. Role of p21waf1/cip1/sdi1 in cell death and DNA repair as studied using a tetracycline-inducible system in p53-deficient cells. Oncogene, 1997; 14: (364) Li R, Waga S, Hannon G, Beach D, Stillman B. Differential effects by the p21 CDK inhibitor on PCNA dependent DNA replication and repair. Nature 1994; 371: (365) Adimoolam S, Lin CX, Ford JM. The p53-regulated cyclin-dependent kinase inhibitor, p21 (cip1, waf1, sdi1), is not required for global genomic and transcription-coupled nucleotide excision repair of UV-induced DNA photoproducts. J Biol Chem. 2001; 276: (366) Cooper MP, Balajee AS, Bohr VA. The C-terminal domain of p21 inhibits nucleotide excision repair in vitro and in vivo. Mol Biol Cell 1999; 10:

226 (367) Almond JB, Cohen GM. The proteasome: a novel target for cancer chemotherapy. Leukemia 2002; 1 (4): (368) Vera Chesnokova, Svetlana Zonis, Kalman Kovacs, Anat Ben-Shlomo, Kolja Wawrowsky, Serguei Bannykh, Shlomo Melmeda. p21cip1 restrains pituitary tumor growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105(45): (369) Mooi WJ, Peeper DSOncogene-induced cell senescence halting on the road to cancer. N Engl J Med 2006; 355: (370) Sherr CJ, Roberts JM. CDK inhibitors: Positive and negative regulators of G1-phase progression. Genes Dev 1999; 13: (371) Barboza JA, Liu G, Ju Z, El-Naggar AK, Lozano G. p21 delays tumor onset by preservation of chromosomal stability. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: (372) Xu SQ, El-Deiry WS. p21(waf1/cip1) inhibits initiator caspase cleavage by TRAIL death receptor DR4. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 269: (373) Steinman RA, Johnson DE. p21waf1 prevents down-modulation of the apoptotic inhibitor protein c-iap1 and inhibits leukemic apoptosis. Mol. Med. 2000; 6: (374) Chesnokova V, Zonis S, Rubinek T, Yu R, Ben-Shlomo A, Kovacs K, Wawrowsky K, Melmed S. Senescence mediates pituitary hypoplasia and restrains pituitary tumor growth. Cancer Res 2007; 67: (375) Uccella S, Tibiletti MG, Bernasconi B, Finzi G, Oldrini R, Capella C. Aneuploidy, centrosome alteration and securing overexpression as features of pituitary somatotroph and lactotroph adenomas. Anal Quant Cytol Histol 2005; 27: (376) Winters ZE, Leek RD, Bradburn MJ, Norbury CJ, Harris AL. Cytoplasmic p21waf1/cip1 Expression is Correlated With HER-2/ neu in Breast Cancer and is an Independent Predictor of Prognosis. Breast Cancer Research. 2003; 5(6). (377) Gartel AL, Tyner AL. The role of the Cyclin-dependent Kinase Inhibitor p21 in apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics 2002; 1: (378) Kanae Oda, Yukiko Matsuoka, Akira Funahashi, and Hiroaki Kitano. A comprehensive pathway map of epidermal growth factor receptor signaling. Molecular Systems Biology 2005; 1: (379) Shilo BZ. Signaling by the Drosophila epidermal growth factor receptor pathway during development. Exp Cell Res 2003; 284: (380) Holbro T, Civenni G, Hynes NE. The ErbB receptors and their role in cancer progression. Exp Cell Res 2003; 284: (381) Mendelsohn J, Baselga J. Status of epidermal growth factor receptor antagonists in the biology and treatment of cancer. J Clin Oncol 2003; 21: (382) Jorissen RN, Walker F, Pouliot N, Garrett TP, Ward CW, Burgess AW. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling. Exp Cell Res 2003; 284: (383) Walker F, Burgess AW. Reconstitution of the high affinity epidermal growth factor receptor on cell-free membranes after transmodulation by platelet-derived growth factor. J Biol Chem 1991; 266: (384) Huang Y, Chang Y, Wang X, J Jiang J, Frank SJ. Growth Hormone Alters Epidermal Growth Factor Receptor Binding Affinity via Activation of Extracellular Signal-Regulated Kinases in 3T3-F442A Cells. Endocrinology 2004; 145(7): (385) Boeri Erba E, Bergatto E, Cabodi S, Silengo L, Tarone G, Defilippi P, Jensen ON. Systematic analysis of the epidermal growth factor receptor by mass spectrometry reveals stimulation-dependent multisite phosphorylation. Molecular and Cellular Proteomics 2005; 4: (386) Wu SL, Kim J, Bandle RW, Liotta L, Petricoin E, Karger BL. Dynamic profiling of the posttranslational modifications and interaction partners of epidermal growth factor receptor signaling after stimulation by epidermal growth factor using Extended Range Proteomic Analysis (ERPA). Molecular and Cellular Proteomics 2006; 9:

227 (387) Jorissen RN, Walker F, Pouliot N, Garrett TP, Ward CW, Burgess AW. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling. Exp Cell Res 2003; 284: (388) Henson ES, Gibson SB. Surviving cell death through epidermal growth factor (EGF) signal transduction pathways: implications for cancer therapy. Cellular Signalling 2006; 18: (389) Normanno N, De Luca A, Bianco C, Strizzi L, Mancino M, Maiello MR, Carotenuto A, De Feo G, Caponigro F, Salomon DS. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene 2006; 366:2 16. (390) Wiley HS. Trafficking of the ErbB receptors and its influence on signaling. Exp Cell Res 2003; 284: (391) Gonza lez L, Dı az ME, Miquet JG, Sotelo AI, Ferna ndez D, Dominici FP, Bartke A, Turyn D. GH modulates hepatic epidermal growth factor signaling in the mouse, Journal of Endocrinology 2010; 204: (392) Eguchi S, Dempsey PJ, Frank GD, Motley ED, Inagami T. Activation of MAPKs by angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Metalloprotease-dependent EGF receptor activation is required for activation of ERK and p38 MAPK but not for JNK. J Biol Chem 2001; 276: (393) Pierce KL, Tohgo A, Ahn S, Field ME, Luttrell LM, Lefkowitz RJ. Epidermal growth factor (EGF) receptor-dependent ERK activation by G protein-coupled receptors: a coculture system for identifying intermediates upstream and downstream of heparin-binding EGF shedding. J Biol Chem 2001; 276: (394) McCole DF, Keely SJ, Coffey RJ, Barrett KE. Transactivation of the epidermal growth factor receptor in colonic epithelial cells by carbachol requires extracellular release of transforming growth factor-. J Biol Chem 2002; 277: (395) Buteau J, Foisy S, Joly E, Prentki M. Glucagon-like peptide 1 induces pancreatic ß-cell proliferation via transactivation of the epidermal growth factor receptor. Diabetes 2003; 52: (396) Yamauchi T, Ueki K, Tobe K, Tamemoto H, Sekine N, Wada M, Honjo M, Takahashi M, Takahashi T, Hirai H, Tushima T, Akanuma Y, Fujita T, Komuro I, Yazaki Y, Kadowaki T. Tyrosine phosphorylation of the EGF receptor by the kinase Jak2 is induced by growth hormone. Nature 1997; 390: (397) Kim SO, Houtman JC, Jiang J, Ruppert JM, Bertics PJ, Frank SJ. Growth hormone-induced alteration in ErbB-2 phosphorylation status in 3T3 F442A fibroblasts. J Biol Chem 1999; 274: (398) Woelfle J, Billiard J, Rotwein P. Acute control of insulin-like growth factor-1 gene transcription by growth hormone through STAT5B. J Biol Chem 2003; 278: (399) Bergad PL, Shih HM, Towle HC, Schwarzenberg SJ, Berry SA. Growth hormone induction of hepatic serine protease inhibitor 2.1 transcription is mediated by a Stat5-related factor binding synergistically to two -activated sites. J Biol Chem 1995; 270: (400) Huang Y, Kim SO, Jiang J, Frank SJ. Growth hormone-induced phosphorylation of EGF receptor in 3T3 F442A cells: modulation of EGF-induced trafficking and signaling. J Biol Chem 2003; 278: (401) Johansson S, Husman B, Norstedt G & Andersson G. Growth hormone regulates the rodent hepatic epidermal growth factor receptor at a pretranslational level. Journal of Molecular Endocrinology 1989; 3: (402) Xu Y, Tan LJ, Grachtchouk V, Voorhees JJ, Fisher GJ. Receptortype protein-tyrosine phosphatase-kappa regulates epidermal growth factor receptor function. J. Biol. Chem. 2005; 280: (403) Tarcic G, Boguslavsky SK, Wakim J, Kiuchi T, Liu A, Reinitz F, Nathanson D, Takahashi T, Mischel PS, Ng T, Yarden Y. An unbiased screen identifies DEP-1 tumor suppressor as a phosphatase controlling EGFR endocytosis. Curr. Biol. 2009; 19:

228 (404) Sorkin A, Goh LK. Endocytosis and intracellular trafficking of ErbBs, Exp. Cell Res. 2009; 315: (405) Madshus IH, Stang E. Internalization and intracellular sorting of the EGF receptor: a model for understanding the mechanisms of receptor trafficking. J. Cell Sci. 2009; 122: (406) Sun T, Aceto N, Meerbrey KL, Kessler JD, Zhou C, Migliaccio I, Nguyen DX, Pavlova NN, Botero M, Huang J, Bernardi RJ, Schmitt E, Hu G, Li MZ, Dephoure N, Gygi SP, Rao M, Creighton CJ, Hilsenbeck SG, Shaw CA, Muzny D, Gibbs RA, Wheeler DA, Osborne CK, Schiff R, Bentires-Alj M, Elledge SJ, Westbrook TF. Activation of multiple proto-oncogenic tyrosine kinases in breast cancer via loss of the PTPN12 phosphatase. Cell (2011); 144: (407) Marmor MD, Yarden Y. Role of protein ubiquitylation in regulating endocytosis of receptor tyrosine kinases. Oncogene 2004; 23: (408) Elina Mattila, Teijo Pellinen, Jonna Nevo, Karoliina Vuoriluoto, Antti Arjonen, Johanna Ivaska. Negative regulation of EGFR signalling through integrin-α1β1-mediated activation of protein tyrosine phosphatase TCPTP, Nat Cell Biol. 2005; 7(1): (409) Gur G, Rubin C, Katz M, Amit I, Citri A, Nilsson J, Amariglio N, Henriksson R, Rechavi G, Hedman H, Wides R, Yarden Y. LRIG1 restricts growth factor signaling by enhancing receptor ubiquitylation and degradation. EMBO J. 2004; 23: (410) Xu D, Makkinje A, Kyriakis JM, Gene 33 is an endogenous inhibitor of epidermal growth factor receptor signaling and mediates dexamethasone-induced suppression of EGF function. J. Biol. Chem. 2005; 280: (411) Goldshmit Y, Walters CE, Scott HJ, Greenhalgh CJ, Turnley AM. SOCS2 induces neurite outgrowth by regulation of epidermal growth factor receptor activation. J. Biol. Chem. 2004; 279: (412) Kario E, Marmor M, Adamsky K, Citri A, Amit I, Amariglio N, Rechavi G, Yarden Y. Suppressors of cytokine signaling 4 and 5 regulate epidermal growth factor receptor signaling. J. Biol. Chem. 2005; 280: (413) Citri A, Yarden Y. EGF-ERBB signalling: towards the systems level. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006; 7: (414) Goldshmit Y, Walters CE, Scott HJ, Greenhalgh CJ, Tumley AM. SOCS2 induces neurite outgrowth by regulation of epidermal growth factor receptor activation, J Biol Chem. 2004; 279(16): (415) Nicholson SE, Metcalf D, Sprigg NS, Columbus R, Walker F, Silva A, Cary D, Willson TA, Zhang JG, Hilton DJ. Suppressor of cytokine signaling (SOCS)-5 is a potential negative regulator of epidermal growth factor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: (416) Roovers RC, Laeremans T, Huang L, De Taeye S, Verkleij AJ, Revets H, de Haard HJ, van Bergen en Henegouwen PM. Efficient inhibition of EGFR signaling and of tumour growth by antagonistic anti-efgr Nanobodies. Cancer Immunol Immunother. 2007; 56(3): (417) Oliveira S, Schiffelers RM, van der Veeken J, van der Meel R, Vongpromek R, van Bergen En Henegouwen PM, Storm G, Roovers RC. Downregulation of EGFR by a novel multivalent nanobody-liposome platform, J Control Release. 2010; 145(2): (418) Webb SM, Casanueva F, Wass JA. Oncological complications of excess GH in acromegaly. Pituitary. 2002; 5(1):21-5. (419) De Stavola BL, dos Santos Silva I, McCormack V, Hardy RJ, Kuh DJ, Wadsworth ME. Childhood growth and breast cancer. American Journal of Epidemiology 2004; 159: (420) Ahlgren M, Melbye M, Wohlfahrt J, Sorensen TI Growth patterns and the risk of breast cancer in women. New England Journal of Medicine, 2004; 351: (421) Snibson KJ. Hepatocellular kinetics and the expression of growth hormone (GH) in the livers and liver tumours of GH-transgenic mice. Tissue & Cell 2002; 34: (422) Anisimov VN. Mutant and genetically modified mice as models for studying the relationship between aging and carcinogenesis. Mechanisms of Ageing and Development 2001; 122:

229 (423) Pollak M, Blouin M-J, Zhang J-C, Kopchick JJ. Reduced mammary gland carcinogenesis in transgenic mice expressing a growth hormone antagonist. British Journal of Cancer 2001; 85(3): (424) Hartmann H, Schmitz F, Christ B, Jungermann K, Creutzfeldt W. Metabolic actions of insulin-like growth factor-i in cultured hepatocytes from adult rats. Hepatology 1990; 12: (425) Santos A, Yusta B, Fernandez-Moreno MD, Blazquez E. Expression of insulin-like growth factor-i (IGF-I) receptor gene in rat brain and liver during development and in regenerating adult rat liver. Molecular and Cellular Endocrinology 1994; 101: (426) Ma J, Pollak M, Giovannucci E, Chan JM, Tao Y, Hennekens CH, Stampfer MJ. Prospective study of colorectal cancer risk in men and plasma levels of insulin like growth factor (IGF)-1 and IGF binding protein-3. Journal of the National Cancer Institute 1999; 91: (427) Manousos O, Souglakos J, Bosetti C, Tzonou A, Chatzidakis V, Trichopoulos D, Adami HO, Mantzoros C. IGF-I and IGF-II in relation to colorectal cancer. International Journal of Cancer 1999; 83: (428) Laban C, Bustin SA, Jenkins PJ. The GH-IGF-I axis and breast cancer, Trends in Endocrinology and Metabolism 2002; 14:28 34). (429) Jenkins PJ, Mukherjee A, Shalet SM. Does growth hormone cause cancer? Clinical Endocrinology 2006; 64: (430) Ng ST, Zhou J, Adesanya OO, Wang J, LeRoith D, Bondy CA. Growth hormone treatment induces mammary gland hyperplasia in aging primates. Nat Med 1997; 3: (431) Ogilvy-Stuart AL, Gleeson H. Cancer risk following growth hormone use in childhood: implications for current practice. Drug Saf. 2004; 27(6): (432) Ito Y, Takeda T, Sakon M, Tsujimoto M, Higashiyama S, Noda K, Miyoshi E, Monden M, Matsuura N. Expression and clinical significance of erb-b receptor family in hepatocellular carcinoma. British Journal of Cancer 2001; 84: ). (433) Nicholson RI, Gee JMW, Harper ME. EGFR and cancer prognosis. European Journal of Cancer 2001; 37(4):9-15. (434) Bromberg JF, Horvath CM, Besser D, Lathem WW, Darnell JE Jr. STAT3 activation is required for cellular transformation by v-src. Mol Cell Biol 1998; 18: (435) Turkson J, Bowman T, Garcia R, Caldenhoven E, De Groot RP, Jove R. STAT3 activation by Src induces specific gene regulation and is required for cell transformation. Mol Cell Biol 1998; 18: (436) Rubin Grandis J, Melhem MF, Gooding WE, Day R, Holst VA, Wagener MM, Drenning SD, Tweardy DJ. Levels of TGF-alpha and EGFR protein in head and neck squamous cell carcinoma and patient survival. J Natl Cancer Inst 1998; 90: (437) Boehmn AL, Sen M, Seethala R, Gooding WE, Freilino M, Man Yan Wong S, Wang S, Johnson DE, Grandis JR. Activator of Transcription-3, and Bcl-XL enhances antitumor effects in squamous cell carcinoma of the head and neck. Mol Pharmacol 2008; 73: (438) Amin HM, McDonnell TJ, Ma Y, Lin Q, Fujio Y, Kunisada K, Leventaki V, Das P, Rassidakis GZ, Cutler C, Medeiros LJ, Lai R. Selective inhibition of STAT3 induces apoptosis and G(1) cell cycle arrest in ALK-positive anaplastic large cell lymphoma. Oncogene 2004; 23: (439) Liu L, McBride K, Reich N. STAT3 nuclear import is independent of tyrosine phosphorylation and mediated by importin-a3. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: (440) Reich NC, Liu L. Tracking STAT nuclear traffic. Nat Rev Immunol 2006; 6: (441) Jiang J, Liang L, Kim S-O, Zhang Y, Mandler R, Frank SJ. Growth hormone-dependent tyrosine phosphorylation of a GH receptor-associated high molecular weight protein immunologically related to JAK, Bioch Biophys Res Commun 1998; 253:

230 (442) Yang CH, Murti A, Pfeffer LM. STAT3 complements defects in an interferon-resistant cell line: evidence for an essential role for STAT3 in interferon signaling and biological activities. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: (443) Sirotkin VA, Makarevitch VA, Kwon BH, Kotwica J. Involvement of MAP kinase in the mediation of GH action on ovarian granulose cells. Molecular and Cellular Endocrinology 2003; 205(1-2): (444) Costoya JA, Finidori J, Moutoussamy S, Senaris R, Devesa J, Activation of growth hormone receptor delivers an antiapoptotic signal: evidence for a role of Akt in this pathway. Endocrinology 1999; 12: (445) Huang Y. Du M, Zhuang S, Shen Z, Li Y. Impaired growth hormone receptor signaling during non-catch-up growth in rats born small for gestational age. Horm Res Paediatr. 2010;74(2): (446) Alam Miah Μ, Yoon CH, Kim J, Jang J,Seong YR, Bae YS. CISH is induced during DC development and regulates DC-mediated CTL activation. Eur. J. Immunol. 2012; 42:

231 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΗ Abstract Children with growth hormone transduction defect (GHTD) have impaired growth and signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) activation. Here, we examine the etiology of GHTD. Control (Cf) and GHTD (Pf) children's fibroblasts were induced with hgh, MG132, lactacystin or silence RNA/CIS (sicis). Western immunoblotting (WI) examined protein expression. Immunofluorescent microscopy (IF) examined cellular localization. The results were: (i) Pf showed retarded activation of pjak2 and pstat-5 and increased ubiquitinated CIS (UbCIS) by WI. (ii) After MG132, Pf showed normal activation of pjak2, pstat5 and pstat3. (iii) IF showed membrane (ML) and cytoplasmic localization (CL) of the GHR in Cf while the Pf showed only CL. In Pf, induction with lactacystin or sicis changed the localization of the GHR to ML. In GHTD, abnormal GH signalling may be caused by over-expression of CIS, which may increase degradation of GHR, thus reducing membrane GHR availability, delaying activation of pjak2 and pstat5 and reducing activation of pstat3. Introduction Growth hormone (GH) plays an important role in postnatal linear growth, skeletal development, protein and lipid metabolism, bone turnover and immune function. Defects in pituitary GH secretion, GH receptor (GHR) number or function, postreceptor signalling or insulinlike growth factor (IGF-I) synthesis, usually result in reduced proportionate linear growth. In the last few years, several new defects in the GH IGF-I axis have been identified. Our group has described a new disorder, growth hormone transduction defect, (GHTD), in four children with severe growth impairment, (height: > 3.5 SD), normal provoked and spontaneous GH secretion, low IGF-I concentrations but significantly increased IGF-I concentrations after induction with hgh during the IGF- I generation test, who have significant catch-up growth after hgh therapy despite impaired phosphorylation of STAT-3 and over-expression of cyclin-dependent kinase inhibitor p21/ waf1/cip1 (p21). GHTD has since been diagnosed in our laboratory in 231