ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ»

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Μέγεθος: px
Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ»"

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ» ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΒΙΒΑΣΗΣ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΣΕ ΠΑΙΔΙΑ ΜΕ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΑΥΞΗΣΗΣ ΕΙΡΗΝΗ ΚΩΣΤΟΠΟΥΛΟΥ Παιδίατρος ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2013

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Ε. ΓΚΡΕΚΑ-ΣΠΗΛΙΩΤΗ Καθηγήτρια Παιδιατρικής-Ενδοκρινολογίας Υπεύθυνη της Μονάδας Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας και Διαβήτη της Παιδιατρικής Κλινικής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. ΘΕΟΔΩΡΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΙΔΗΣ Καθηγητής Παθολογίας-Ενδοκρινολογίας Παθολογικής Κλινικής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΚΑΡΑΜΑΝΟΣ Καθηγητής Βιοχημείας και Οργανικής Βιοχημικής Ανάλυσης Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Ε. ΓΚΡΕΚΑ-ΣΠΗΛΙΩΤΗ Καθηγήτρια Παιδιατρικής-Ενδοκρινολογίας Υπεύθυνη της Μονάδας Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας και Διαβήτη της Παιδιατρικής Κλινικής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών. ΘΕΟΔΩΡΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΙΔΗΣ Καθηγητής Παθολογίας-Ενδοκρινολογίας Παθολογικής Κλινικής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΚΑΡΑΜΑΝΟΣ Καθηγητής Βιοχημείας και Οργανικής Βιοχημικής Ανάλυσης Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών ΚΥΡΙΑΚΟΣ ΚΥΠΡΑΙΟΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακολογίας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΕΛΕΝΗ ΠΑΠΑΔΑΚΗ-ΠΕΤΡΟΥ Kαθηγήτρια Ανατομικής-Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΔΙΟΝΥΣΙΟΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ Επίκουρος Καθηγητής Μακροσκοπικής-Μικροσκοπικής Ανατομικής με εξειδίκευση στο Μυοσκελετικό Σύστημα Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΔΙΟΝΥΣΙΟΣ ΧΡΥΣΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Παιδιατρικής, Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας - Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών 2

3 Στους γονείς μου, Παναγιώτη και Σοφία 3

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Ερευνητικό Εργαστήριο της Μονάδας Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας και Διαβήτη της Παιδιατρικής Κλινικής της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών, με υπεύθυνη Εργαστηρίου την Καθηγήτρια Βασιλική Ε. Γκρέκα-Σπηλιώτη. Επιθυμώ να ευχαριστήσω θερμά όλους εκείνους που συνέβαλαν στην ολοκλήρωσή της. Πρωτίστως, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στην καθηγήτριά μου και επιβλέπουσα της διδακτορικής μου διατριβής Καθηγήτρια Βασιλική Ε. Γκρέκα- Σπηλιώτη, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε κατά την ανάθεση της συγκεκριμένης ερευνητικής εργασίας. Η ερευνητική αυτή δουλειά υπήρξε το έναυσμα ώστε να γνωρίσω και να εργασθώ σε ένα άκρως ενδιαφέρον ερευνητικό περιβάλλον, που αποτέλεσε την αφετηρία για τη γενικότερη ερευνητική μου δραστηριότητα. Επίσης, την ευχαριστώ θερμά για τη συνεχή καθοδήγηση, την υποστήριξη και αμέριστη συμπαράσταση καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής αυτής διατριβής, από τη στιγμή της ανάθεσης έως την τελική διόρθωση του εκπονήματος. Οι συμβουλές της υπήρξαν πάντα γόνιμες και εποικοδομητικές και η συμβολή της πολύτιμη στην επίλυση κάθε ανακύπτοντος ζητήματος. Η ίδια υπήρξε πάντοτε για εμένα πρότυπο ιατρού, καθηγήτριας και ερευνήτριας, με έκδηλα τα στοιχεία της ανθρωπιάς και του επαγγελματισμού, η δε συνεργασία μας υπήρξε πρότυπο διαπροσωπικής κι επαγγελματικής σχέσης. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τους κ.κ. Θ. Αλεξανδρίδη, Καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, Ν. Καραμάνο, Καθηγητή του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών, Κ. Κυπραίο, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, Ε. Παπαδάκη, Καθηγήτρια του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, Δ. Παπαχρήστου, Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών και Δ. Χρύση, Αναπληρωτή καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την ευγένεια και την προθυμία να συμμετάσχουν στην ερευνητική αυτή προσπάθεια ως μέλη της Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής. Η συμμετοχή τους αποτελεί ιδιαίτερη τιμή για εμένα. Ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω την κα Andrea Paola Rojas Gil, Μοριακή Βιολόγο του Ερευνητικού Εργαστηρίου της Μονάδας Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας και Διαβήτη, για την καθοδήγηση, τις εύστοχες υποδείξεις και τη βοήθειά της στην επεξεργασία κι ερμηνεία των ερευνητικών ευρημάτων. Ευχαριστώ την κα Αλεξία Καρβέλα, Μεταδιδακτορική Μοριακή Βιοχημικό του εργαστηρίου όπου πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα της παρούσας εργασίας, για τη διδασκαλία των εργαστηριακών τεχνικών και τη σημαντική καθοδήγηση και συμβολή της στη διεκπεραίωση του ερευνητικού μου έργου. Ευχαριστώ επίσης όλα τα μέλη του εργαστηρίου που εργάστηκαν συγχρόνως στον ίδιο χώρο για την ευγένεια και τη συναδελφικότητα που επέδειξαν, παρέχοντας ένα ευχάριστο και αξιοπρεπές περιβάλλον συνεργασίας. 4

5 Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω θερμά την οικογένειά μου, και ιδιαιτέρως τους γονείς μου, για την ενθάρρυνση και τη διακριτική, αλλά ουσιαστική υποστήριξή τους, όχι μόνο κατά τη διάρκεια της υλοποίησης της παρούσας εργασίας, αλλά σε όλα τα στάδια της ζωής μου και της επαγγελματικής μου πορείας. 5

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ. 10 SUMMARY...12 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 : Η ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ Η ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΕΚΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΑΠΟ ΤΗΝ ΥΠΟΦΥΣΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΡΥΘΜΙΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΕΚΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΣΩΜΑΤΙΚΗ ΑΥΞΗΣΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΥΔΑΤΑΝΘΡΑΚΩΝ, ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪ- ΝΩΝ, ΤΩΝ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΩΝ ΡΥΘΜΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΡΟΠΟΙ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ Ο ΙΝΣΟΥΛΙΝΟΜΟΡΦΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ Ι Ο ΙΝΣΟΥΛΙΝΟΜΟΡΦΟΣ ΑΥΞΗΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ ΙΙ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΑΥΞΗΣΗΣ ΑΙΤΙΑ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ..43 6

7 1.12 ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΟΝΤΟΤΗΤΕΣ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΑΥΞΗΣΗΣ ΚΛΑΣΣΙΚΗ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΙΚΗ ΔΥΣΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗ ΙΔΙΟΠΑΘΕΣ ΚΟΝΤΟ ΑΝΑΣΤΗΜΑ ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΑΝΤΙΣΤΑΣΗΣ ΣΤΗΝ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ ΣΥΝΔΡΟΜΟ LARON ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΤΟΥ STAT5b ΔΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΣΤΟΝ ΑΞΟΝΑ IGF-I ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΒΙΟΑΝΕΝΕΡΓΗ ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ (BIOINACTIVE GΗ) ΔΙΑΤΑΡΑΧΗ ΣΤΗ ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ (GROWTH HORMONE TRANSDUCTION DEFECT / GHTD) ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ GHTD Η ΔΙΑΤΑΡΑΓΜΕΝΗ ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΟΙ ΠΡΟΕΚΤΑΣΕΙΣ ΤΗΣ ΣΤΙΣ ΕΝΔΟΚΥΤΤΑΡΙΕΣ ΔΙΕΡΓΑΣΙΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΚΡΙΣΗΣ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΟΝΤΟΤΗΤΩΝ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑΣ ΑΥΞΗΣΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΗ ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΩΡΗ ΕΚΚΡΙΣΗ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΔΙΕΓΕΡΣΗΣ IGF-I (IGF-I GENERATION TEST)...64 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 : Ο ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ Η ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΗΣ GH (GHR) ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ GHR Η ΔΕΣΜΕΥΤΙΚΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ ΤΗΣ GH ΣΥΝΘΕΣΗ, ΩΡΙΜΑΝΣΗ ΚΑΙ ΕΝΔΟΚΥΤΤΩΣΗ ΤΟΥ GHR ΑΠΟΔΟΜΗΣΗ ΤΟΥ GHR ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΗΣ ΟΥΒΙΚΟΥΙΤΙΝΗΣ ΟΥΒΙΚΟΥΙΤΙΝΥΛΙΩΣΗ Η ΑΝΑΚΥΚΛΩΣΗ ΤΟΥ GHR Ο ΔΙΜΕΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ GHR..75 7

8 2.7 ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΩΣ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΣΤΗΝ GH ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΑ ΑΠΟ ΤΗΝ GH ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ JAK/STAT ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ Ras/Raf/MEK/ERK (Ή ΤΗΣ MAPK ΚΙΝΑΣΗΣ) ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ PI3K/Akt ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΗΣ PHOSPHOLIPASE C (PLC)/PKC/Ca ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ IRS (INSULIN RECEPTOR SUBSTRATES) ΚΑΙ Η PI3 ΚΙΝΑΣΗ..88 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 : ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ ΤΗΣ GH ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ GHR Η ΟΥΒΙΚΟΥΙΤΙΝΥΛΙΩΣΗ ΩΣ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΟΥ GHR H ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ GHR ΔΡΑΣΕΙΣ ΤΩΝ ΑΡΝΗΤΙΚΩΝ ΡΥΘΜΙΣΤΩΝ Η ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ SOCS ΤΡΟΠΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ SOCS Η ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΤΗΣ ΑΥΞΗΤΙΚΗΣ ΟΡΜΟΝΗΣ ΚΑΙ ΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ SOCS ΦΩΣΦΑΤΑΣΕΣ SIGNAL REGULATORY PROTEIN (SIRP) ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΟΙ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΩΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ STAT (PIAS) Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ β-transducing REPEAT-CONTAINING PROTEIN Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ p Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ STAT3 ΣΤΗ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ ΚΑΙ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ GH 107 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 : ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΟΥ EGF/EGFR Η ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ GH ΜΕ ΤΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΟΥ EGF/EGFR ΑΡΝΗΤΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΑΞΟΝΑ EGF/EGFR AΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ

9 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΣΚΟΠΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 : ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ GHTD ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΛΗΨΗ ΚΑΙ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ ΕΠΑΓΩΓΕΣ ΜΕ GH ΚΑΙ EGF ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΣΥΓΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ RNA ΚΑΙ REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟ RNA (INTERFERENCE RNA CIS).146 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 : ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Α ΜΕΡΟΣ) ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ ΤΗΣ GH ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΕ 200 ng/ml hgh, ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΚΑΙ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥ ΡΥΘΜΙΣΤΗ CIS ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΕ 200 ng/ml hgh ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΕΝΤΟΠΙΣΗΣ ΤΩΝ ΑΡΝΗΤΙΚΩΝ ΡΥΘΜΙΣΤΩΝ CIS ΚΑΙ p21 ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΑΓΩΓΕΣ ΜΕ 200 ng/ml hgh ΚΑΙ 1000 ng/ml hgh (B ΜΕΡΟΣ) ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΤΩΝ ΑΡΝΗΤΙΚΩΝ ΡΥΘΜΙΣΤΩΝ ΤΟΥ ΣΕ ΒΑΣΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΜΗ ΕΠΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΑΓΩΓΗ ΜΕ 200mg/dl hgh (15 min), ΠΡΙΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ sirna CIS (Γ ΜΕΡΟΣ) ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΙΚΟΥ ΜΟΝΟΠΑΤΙΟΥ ΤΗΣ GH ΚΑΙ ΤΩΝ ΑΡΝΗΤΙΚΩΝ ΡΥΘΜΙΣΤΩΝ ΤΟΥ, ΣΕ ΒΑΣΙΚΗ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΜΗ ΕΠΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΠΑΓΩΓΕΣ ΓΙΑ 15min ΜΕ: 200mg/dl hgh (GH200), 1000mg/dl hgh (GH1000) ΚΑΙ 15nM EGF (EGF) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 : ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ..193 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ.207 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΗ.231 9

10 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η Αυξητική ορμόνη παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγεννητική κατά μήκος αύξηση, στη σκελετική ανάπτυξη, στο μεταβολισμό πρωτεϊνών, λιπών και υδατανθράκων, στην οστική ανακύκλωση και την ανοσιακή λειτουργία. Διαταραχή στην έκκριση ή στη δράση της ορμόνης στα παιδιά προκαλεί, μεταξύ άλλων, ανεπάρκεια αύξησης. Έχουν περιγραφεί αρκετές κλινικές οντότητες ανεπάρκειας αύξησης, που οφείλονται κυρίως σε διαταραχές στην υποφυσιακή έκκριση GH, στην 24ωρη αυθόρμητη έκκριση της GH, στον αριθμό ή τη λειτουργία των υποδοχέων GHR, στη μετά τον υποδοχέα μεταβίβαση του σήματος της GH και στη σύνθεση ή δράση του IGF-I. Η παρούσα μελέτη εξέτασε έναν ασθενή με Διαταραχή στη Μεταγωγή του Σήματος της GH (Growth Hormone Transduction Defect/GHTD). Η οντότητα αυτή χαρακτηρίζεται από σοβαρό κοντό ανάστημα με φυσιολογικές δοκιμασίες φαρμακολογικής πρόκλησης, φυσιολογικές τιμές 24ωρης έκκρισης GH, χαμηλά επίπεδα IGF-I, διαταραχή στη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα STAT3 και υπερέκφραση του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου p21. Επιπλέον, οι ασθενείς με GHTD παρουσιάζουν σημαντικά αυξημένα επίπεδα IGF-I μετά από επαγωγή με hgh κατά τo IGF-I generation test και σημαντική αναπλήρωση αύξησης μετά από θεραπεία με hgh. Επίσης, χαρακτηρίζονται από απουσία μεταλλάξεων στην πρωτεΐνη STAT3, στον υποδοχέα GHR και στο γονίδιο GH1. Χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών από ούλα του προς μελέτη ασθενή κι ενός μάρτυρα. Μελετήθηκαν σηματοδοτικά μόρια του μεταγωγικού μονοπατιού της GH και του μονοπατιού αρνητικής ρύθμισης, και διερευνήθηκε ο ρόλος της πρωτεΐνης CIS στην παθολογική μεταβίβαση του σήματος της GH στον ασθενή, καθώς και η επίδραση της καταστολής του γονιδίου CIS στη σηματοδότηση της GH. Επίσης, διερευνήθηκε η πιθανή διασυνομιλία ανάμεσα στα σηματοδοτικά μονοπάτια της GH και του EGF, καθώς και ο ρόλος της διασυνομιλίας αυτής στην αποκατάσταση της φυσιολογικής σηματοδότησης της GH και, κατ επέκταση, στην κλινική ανταπόκριση μετά από θεραπεία με εξωγενώς χορηγούμενη ανθρώπινη βιοσυνθετική ορμόνη, παιδιών με GHTD. Η πρωτεϊνική έκφραση των μελετηθέντων πρωτεϊνών μελετήθηκε με ανοσοαποτύπωση κατά Western, η κυτταρική εντόπισή τους με ανοσοφθορισμό και η διαντίδραση ορισμένων από τις πρωτεΐνες με ανοσοσυγκατακρήμνιση. Τα ευρήματα της εργασίας στοιχειοθετούν την αρχική υπόθεση ότι η διαταραγμένη μεταβίβαση του σήματος της GH στα παιδιά με GHTD διαμεσολαβείται μέσω της υπερέκφρασης της ουβικουιτινυλιωμένης μορφής της πρωτεΐνης CIS, η οποίθα προκαλεί ραγδαία και εκσεσημασμένη μεταφορά του GHR στο πρωτεάσωμα για αποδόμηση. Τα αποτελέσματα επίσης έδειξαν ότι η αποκατάσταση της φυσιολογικής σηματοδότησης της GH μετά τη σίγαση του γονιδίου CIS περιλαμβάνει την επαναφορά του GHR στην κυτταροπλασματική μεμβράνη για φυσιολογική ενεργοποίηση από την GH, καθώς και την ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του EGFR. Επιπροσθέτως, υπάρχει έντονη διασυνομιλία μεταξύ των σηματοδοτικών μονοπατιών της GH και του EGF κατά τη χορήγηση εξωγενούς hgh στα παιδιά με 10

11 GHTD, με αποτέλεσμα την επιτάχυνση της αύξησης που παρατηρείται στα παιδιά αυτά μετά από θεραπεία με hgh. 11

12 SUMMARY Growth Hormone (GH) plays an important role in postnatal linear growth, skeletal development, protein, lipid and carbohydrate metabolism, bone turnover and immune function. Defects in the GH secretion and function in children can cause growth retardation. Several clinical entities of growth retardation have been described, including defects in pituitary GH secretion, spontaneous 24h GH secretion, GH receptor number or function, post-receptor signaling and IGF-I synthesis or function. In this study, one patient with Growth Hormone Transduction Defect (GHTD) was studied. GHTD is characterized by severe short stature with normal provoked and spontaneous GH secretion, low IGF-I concentrations, impaired phosphorylation of the transcriptional factor STAT3 and overexpression of the cyclin-dependent kinase inhibitor, p21. Furthermore, GHTD patients have significantly increased IGF-I concentrations after induction with hgh during the IGF-I generation test, and significant catch-up growth after hgh therapy. No mutations were found in STAT3, GHR and GH1 gene in the GHTD patients. Primary fibroblast cultures were established from gingival biopsies obtained from the GHTD patient and one control. The GH signaling molecules and the negative regulators of GH were studied, as well as the role of protein CIS in the impaired GH signaling and the effect of CIS silencing on GH signaling. Furthermore, the possible crosstalk between the GH and EGF signaling cascades was examined, as well as its role in the restoration of the impaired GH signaling and the clinical response after therapy with exogenous hgh. The protein expression of the studied molecules was studied by Western Immunoblotting, their cellular localization by Immunofluoresence and the proteinprotein interactions by Co-immunoprecipitation. The results of this study support the hypothesis that impaired GH signaling in GHTD children is mediated by the overexpression of ubiquitinated CIS, which causes rapid and excessive translocation of the GHR to the proteasomes for degradation. The results also showed that the restoration of physiological GH signaling after the silencing of CIS involves the restoration of the GHR to the plasma membrane for normal activation by GH, as well as the activation of the EGFR pathway. In addition, there is vigorous crosstalking between the GH and EGF signaling pathways during exogenous hgh treatment in the GHTD children, resulting in the accelerated growth seen in these children after hgh therapy. 12

13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 1 : Η Αυξητική Ορμόνη 1.1 Εισαγωγικά για την Αυξητική Ορμόνη To ενδοκρινικό σύστημα είναι υπεύθυνο για τη διατήρηση της ομοιοστασίας όλου του οργανισμού στα θηλαστικά. Οι ορμόνες συντίθενται σε ειδικούς αδένες κι εκκρίνονται κατόπιν στην κυκλοφορία ώστε να δράσουν σε ιστούς-στόχους. Η φυσιολογική απόκριση στα ενδοκρινικά μονοπάτια, κι επομένως η αποτελεσματικότητα του ενδοκρινικού συστήματος, επάγεται από την πρόσδεση μίας ορμόνης στον υποδοχέα της. Αυτή η διαντίδραση πυροδοτεί μία ελεγχόμενη ακολουθία ενδοκυττάριων γεγονότων, που καταλήγει σε συγκεκριμένες φαινοτυπικές μεταβολές. Οι ενδοκρινικές διαταραχές μπορεί να οφείλονται είτε σε διαταραχή στη σύνθεση ή έκκριση ορμονών στους ενδοκρινείς αδένες είτε σε διαταραχή στην απαντητικότητα των ιστών-στόχων. Η Αυξητική Ορμόνη (Growth Hormone GH) αποτελεί ένα πρότυπο μοντέλου για τη μελέτη του μηχανισμού δράσης των ορμονών. Πρόκειται για μία ορμόνη με πολλαπλές φυσιολογικές δράσεις και οι κύριοι μηχανισμοί ρύθμισης της έκκρισης, της σηματοδότησης και της καταστολής της σηματοδότησης αυτής έχουν σε μεγάλο βαθμό διαλευκανθεί. Διάφορες διαταραχές έχουν συσχετισθεί είτε με αυξημένη είτε με μειωμένη έκκριση GH, καθώς και με τροποποιημένη απαντητικότητα στην ορμόνη. Ανασυνδυασμένη ανθρώπειος GH (hgh) χρησιμοποιείται ευρέως στα παιδιά για τη θεραπεία διαταραχών αύξησης. Η πλειοτροπία των δράσεων της GH, η διαντίδρασή της με άλλα ορμονικά μονοπάτια και η προοπτική της φαρμακολογικής χορήγησής της, καθιστούν τη μελέτη των μηχανισμών που ρυθμίζουν την ευαισθησία στην ορμόνη αυτή δικαιολογημένη. 1.2 Η δομή της Αυξητικής Ορμόνης H Αυξητική Ορμόνη (GH) είναι ένα πολυπεπτίδιο που αποτελείται από 191 αμινοξέα στον άνθρωπο, με μοριακό βάρος (ΜΒ) 22kDa και το οποίο προάγει την αύξηση, τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση κυττάρων και ιστών. Ονομάζεται επίσης σωματοτροπίνη ή σωματοτρόπος ορμόνη και πρόκειται για μία ορμόνη με πολλές λειτουργίες. Σε αντίθεση με τις άλλες υποφυσιακές ορμόνες οι οποίες επιδρούν σε ένα συγκεκριμένο όργανο-στόχο, η GH επιδρά σε αρκετούς ιστούς. Εκκρίνεται από τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, είναι η αφθονότερη ορμόνη του πρόσθιου λοβού και ασκεί τη δράση της μέσω εξειδικευμένων υποδοχέων που βρίσκονται στην κυτταρική επιφάνεια των ιστών-στόχων (Growth Hormone Receptor/GHR). (1) 13

14 Εικόνα 1. Τρισδιάστατη απεικόνιση του μορίου της GH και του συμπλέγματος GH-GHR. Η GH εκκρίνεται ως μονή πολυπεπτιδική αλυσίδα και τα 191 αμινοξέα της σχηματίζουν τέσσερις έλικες που της επιτρέπουν την πρόσδεση στους υποδοχείς της. Οι έλικες αυτές ακολουθούν το πρότυπο «άνω-άνω-κάτω-κάτω». (2) Δύο ισχυροί ενδομοριακοί δισουλφιδικοί δεσμοί εξασφαλίζουν τη δομική συνέχεια του μορίου. Ο ένας συνδέει τα αμινοξέα 53 και 165, ενώ ο άλλος συνδέει τα αμινοξέα 182 και 189. (Cys 53-Cys 165, Cys 182-Cys 189). Αυτό είναι παρόμοιο και σε άλλα μέλη της οικογένειας Helix Bundle Peptide (HBP), όπως είναι η προλακτίνη, το πλακουντιακό γαλακτογόνο, η ιντερλευκίνη 2 έως 7, η ιντερλευκίνη 9, η ιντερλευκίνη 11 έως 13 και διάφοροι άλλοι αυξητικοί παράγοντες (3). Η κύρια κυκλοφορούσα μορφή της GH είναι μια πρωτεΐνη 22kDa. Εναλλακτικό μάτισμα μπορεί να οδηγήσει στο σχηματισμό μίας εναλλακτικής μορφής 20 kda, από την οποία απουσιάζουν οι περιοχές αμινοξέων (4). Δύο άλλες μορφές, επίσης, 27 kda και 17 kda κυκλοφορούν στο πλάσμα, όμως η σημασία τους στη φυσιολογία δεν είναι γνωστή. (5) Εικόνα 2. Το μόριο της αυξητικής ορμόνης. Οι δισουλφιδικοί δεσμοί απεικονίζονται με μωβ χρώμα. 14

15 Οι πρώτες κλινικές παρατηρήσεις που συνέδεσαν τον αδένα της υπόφυσης με μια διαταραχή έγιναν το 1886 από τον Pierre Marie, ο οποίος διαπίστωσε την ύπαρξη μεγεθυμένων πρόσθιων λοβών υπόφυσης σε ασθενείς με ακρομεγαλία. Η απομόνωση μιας πρωτεΐνης με προαγωγικές της αύξησης δράσεις έγινε το 1945 από βόειες υποφύσεις και ονομάστηκε σωματοτροπίνη ή αυξητική ορμόνη. (6,7) Αν και απελευθερώνεται στη συστηματική κυκλοφορία και η δράση της σε κύτταρα στόχους διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα GHR, το είδος των αντιδράσεων που επάγονται εξαρτάται από τον ιστό-στόχο, την ηλικία του ατόμου και τη συνεχή ή κατά ώσεις παρουσία της GH. (8) Η GH ακολουθεί ένα κιρκαδικό κύκλο κι εκκρίνεται σε 6-12 φάσεις κατά τη διάρκεια της ημέρας. Υπό συνθήκες φυσιολογικού βραδινού ύπνου και φυσιολογικών συνηθειών κατά τη διάρκεια της ημέρας, μία μέγιστη ώση έκκρισης αυξητικής ορμόνης συμβαίνει σύντομα μετά την έναρξη του ύπνου, κατά το πρώτο επεισόδιο του ύπνου βραδέων κυμάτων (SWS), στα στάδια ΙΙΙ-ΙV. (9,10) 1.3 Το γονίδιο της Αυξητικής Ορμόνης Το γονίδιο της GH ανήκει σε μια μεγάλη οικογένεια γονιδίων που περιλαμβάνει τα γονίδια για την GH, την προλακτίνη και τα πλακουντιακά γαλακτογόνα. Στα περισσότερα θηλαστικά, η GH κωδικοποιείται από ένα μονήρες γονίδιο, αν και στα ανθρωποειδή έχει γίνει διπλασιασμός με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός συμπλέγματος γονιδίων που έχουν μία κονή γονιδιακή τοποθεσία. To γονίδιο που κωδικοποιεί την υποφυσιακή GH (GH1) έχει μήκος περίπου 3Kb κι εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 17 (17q23), όπου βρίσκεται το σύμπλεγμα των 5 σχετιζόμενων γονιδίων. To σύμπλεγμα γονιδίων της ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης περιλαμβάνει τα γονίδια που κωδικοποιούν το πλακουντιακό γαλακτογόνο (PL: placental lactogen) ή χοριονική σωματοτροπίνη (CS: chorionic somatomammotropin), την πλακουντιακή αυξητική ορμόνη (ή GH-V: Growth hormone variant) και την κανονική αυξητική ορμόνη (GH-N: Growth hormone normal). Το σύμπλεγμα περιλαμβάνει 5 γονίδια, τρία PL και δύο GH γονίδια, τα οποία προέρχονται από ένα κοινό πρόγονο μετά από γεγονότα ανασυνδυασμού επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών. Όλο το σύμπλεγμα έχει μήκος 66kb στο χρωμόσωμα 17 (q22-q24). (11) Έχει γίνει αλληλούχιση όλης της ομάδας των γονιδίων. (12) Τα PL και GH-V γονίδια εκφράζονται αποκλειστικά στον πλακούντα, ενώ το γονίδιο GH-N εκφράζεται αποκλειστικά στην υπόφυση. H αλληλουχία των αμινοξέων των GH-V και GH-N διαφέρουν σε 15 θέσεις, από τις οποίες οι 13 βρίσκονται στην ώριμη πρωτεΐνη. (13-15) Το γονίδιο GH-N κωδικοποιεί δύο mrnas που έχουν υποστεί εναλλακτικό μάτισμα και τα οποία μεταφράζονται σε πρωτεΐνες GH με MB 22kD και 20kD. Και τα πέντε γονίδια έχουν περισσότερο από 92% ομολογία νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. (16) 15

16 Εικόνα 3. Το γονίδιο της αυξητικής ορμόνης Οι πρωτεΐνες PL και GH-V προσδένονται στους υποδοχείς τους σε πολλούς ιστούς κι έχουν βιολογικές δράσεις σε ιστούς όπως το ήπαρ, τα οστά, τα κύτταρα του αίματος και ο πλακούντας. Ως απάντηση στις πλακουντιακές ορμόνες η αύξηση του IGF-I πιθανώς προάγει την αύξηση των μητρικών ιστών, όπως είναι η μήτρα, ο μαστός και ο θυρεοειδής αδένας. Επίσης, δράσεις στην καρδιά και στο νεφρό μπορεί να αυξήσουν την καρδιακή παροχή και το μητρικό όγκο αίματος. Υπάρχουν αρκετές ενδείξεις για το ρόλο των PL και GH-V στη μεταβολική προσαρμογή της εγκύου. Οι δράσεις τους συνεισφέρουν στη μεταγευματική υπεργλυκαιμία και υπερινσουλιναιμία της εγκύου στα μέσα και στο τελευταίο τρίμηνο της εγκυμοσύνης, καθώς και στην αυξημένη κινητοποίηση και χρησιμοποίηση των μητρικών ελεύθερων λιπαρών οξέων για ενέργεια, αφήνοντας διαθέσιμη τη μητρική γλυκόζη για το έμβρυο. (17,18) Διαταραχές στα επίπεδα των PL και GH-V έχουν συσχετισθεί με διάφορες παθολογικές καταστάσεις της εγκυμοσύνης, μεταξύ των οποίων είναι η προεκλαμψία, o διαβήτης της κύησης και η ενδομήτρια καθυστέρηση αύξησης (IUGR). (19-22) Αν και τα γονίδια PL και GH-V έχουν σημαντική ομολογία με το γονίδιο GH-N, οι παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση των πλακουντιακών γονιδίων είναι διαφορετικοί από αυτούς που ρυθμίζουν την υποφυσιακή αυξητική ορμόνη. Έχει αποδειχθεί ότι η πρωτεΐνη GH-N έχει περιορισμένο ρόλο στην εμβρυική γραμμική αύξηση. Ασθενείς με μεμονωμένη ανεπάρκεια GH, υποφυσιακή απλασία ή ανεγκεφαλία παρουσιάζουν ελάχιστη έως μέτρια μείωση στο μήκος γέννησης. (23) Επιπρόσθετα, η ανεπάρκεια της GH σε πειραματόζωα έχει μικρή ή καθόλου επίδραση στην εμβρυική ανάπτυξη. Αντίστροφα, η περίσσεια της GH δε συνοδεύεται από μεγαλύτερη εμβρυική αύξηση. Αν και η GH-N έχει περιορισμένη δράση στην κατά μήκος αύξηση του εμβρύου, φαίνεται πως έχει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό και στην ανάπτυξη του εμβρύου. Για παράδειγμα, η κλινική εμπειρία συσχετίζει τη GH-N με τον περιγεννητικό μεταβολισμό των υδατανθράκων. 16

17 1.4 Έκκριση της Αυξητικής Ορμόνης από την υπόφυση O πρόσθιος λοβός της υπόφυσης περιλαμβάνει διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους που είναι υπεύθυνοι για την έκκριση των υποφυσιακών ορμονών. Τα σωματοτρόπα κύτταρα είναι υπεύθυνα για την έκκριση της αυξητικής ορμόνης (GH), τα θυρεοτρόπα για την έκκριση της θυρεοειδοτρόπου ορμόνης (TSH), τα κορτικοτρόπα για την έκκριση της φλοιοεπινεφριδιοτρόπου ορμόνης (ACTH), τα γοναδοτρόπα για την έκκριση της ωχρινοποιητικής ορμόνης (LH) και της θυλακιοτρόπου ορμόνης (FSH), και τα λακτοτρόπα για την έκκριση της προλακτίνης (PRL). Η ACTH προκύπτει από τη διάσπαση ενός μεγαλύτερου πεπτιδίου που παράγεται στην υπόφυση, της προοπιομελανοκορτίνης (POMC). Άλλα προϊόντα διάσπασης της POMC είναι τα κλάσματα της μελανινοτρόπου ορμόνης (α-msh, β-msh, γ-msh), η β-λιποτροπίνη και η β-ενδορφίνη. Εικόνα 4. Yποφυσιακές ορμόνες Η έκκριση των ορμονών αυτών βρίσκεται υπό τον άμεσο έλεγχο του υποθαλάμου και μεσολαβητές είναι ποικίλες υποθαλαμικές ορμόνες που είτε διεγείρουν είτε καταστέλλουν την έκκριση των υποφυσιακών ορμονών. Η έκκριση των υποθαλαμικών ορμονών επηρεάζεται από πολλούς χυμικούς παράγοντες και παράγοντες του κεντρικού νευρικού συστήματος. Οι υποφυσιακές ορμόνες, από τη στιγμή που απελευθερώνονται στο πλάσμα, ασκούν τις δράσεις τους σε διάφορα όργανα-στόχους, είτε σε ένα συγκεκριμένο ενδοκρινή αδένα (π.χ. θυρεοειδή αδένα) είτε σε τελικά όργανα. Λόγω της πολυπλοκότητας αυτού του υποθαλαμουποφυσιακού άξονα, πολλοί παθογενετικοί μηχανισμοί μπορούν να λειτουργήσουν σε κάθε επίπεδο, καταλήγοντας σε μία ετερογενή ομάδα διαταραχών με παρόμοια συμπτώματα με αυτά της υποφυσιακής ανεπάρκειας. Η ανεπάρκεια των υποφυσιακών ορμονών ACTH, FSH, LH, GH, PRL και/ή TSH συνυπάρχει στη συνδυασμένη ανεπάρκεια υποφυσιακών ορμονών (Combined Pituitary Hormone Deficiency/CPHD). Aν και οι περισσότερες περιπτώσεις CPHD είναι σποραδικές, υπάρχουν στον άνθρωπο περιπτώσεις που οφείλονται σε μεταλλάξεις στις περιοχές POU1F1 (PIT1) ή PROP1. Ο ΡΙΤ1, το πρωτεϊνικό παράγωγο του γονιδίου ΡΟU1F1, προσδένεται και ενεργοποιεί τους υποκινητές των 17

18 γονιδίων GH1 και PRL ώστε να αυξήσει το ρυθμό μεταγραφής τους. Ο ΡΙΤ1 είναι απαραίτητος για τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιαμό των κυττάρων της πρόσθιας υπόφυσης, που εκκρίνουν GH (σωματοτρόπα κύτταρα). Έχουν αναφερθεί τουλάχιστον 8 διαφορετικές μεταλλάξεις του γονιδίου POU1F1 σε άτομα με οικογενή CPHD. 1.5 Ρύθμιση της έκφρασης της Αυξητικής Ορμόνης Στον άνθρωπο, τα επίπεδα της GH είναι υψηλά κατά τις δύο πρώτες εβδομάδες μετά τη γέννηση, μειώνονται σταδιακά, και παραμένουν χαμηλά κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας. Αμέσως πριν την εφηβεία, τα επίπεδα GH αρχίζουν να αυξάνονται, φτάνουν το μέγιστο κατά την εφηβεία και μειώνονται σταδιακά με την πρόοδο της ηλικίας. (24,25 ) Κατά την εφηβεία, συμβαίνουν σημαντικές αλλαγές σε επίπεδο φύλου, που καθορίζουν τα διαφορετικά μοντέλα σωματικής αύξησης στο άρρεν και θήλυ φύλο (αύξηση οστών και μυών, κατανομή λίπους κλπ). Οι άρρενες αρουραίοι παρουσιάζουν «εκρήξεις» έκκρισης GH με μεσοδιαστήματα 3-4 ωρών, με χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα επίπεδα μεταξύ των εκκρίσεων. Στα θήλεα, η έκκριση είναι επίσης κατά ώσεις, αλλά οι μέγιστες τιμές είναι χαμηλότερες και τα βασικά επίπεδα είναι υψηλότερα από αυτά που ανευρίσκονται στα άρρενα, με αποτέλεσμα η έκκριση να είναι σχεδόν συνεχής. (26,27) Εικόνα 5. Μοντέλο έκκρισης αυξητικής ορμόνης στα δύο φύλα στον αρουραίο Η GH εκκρίνεται κατά ώσεις από τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, υπό τη ρύθμιση ενός σύνθετου νευροενδοκρινικού συστήματος που περιλαμβάνει δύο υποθαλαμικές ορμόνες από τη μέση προεξοχή. Η πρώτη, ο εκλυτικός παράγων της GH, GHRH, διεγείρει την απελευθέρωση της GH και τον πολλαπλασιαμό των σωματοτρόπων κυττάρων. Η δεύτερη, η σωματοστατίνη αναστέλλει τη βασική και τη μέσω GHRH απελευθέρωση της GH. H επίδραση των ορμονών αυτών ρυθμίζεται από άλλους υποθαλαμικούς παράγοντες, από νευροδιαβιβαστές και από κυκλοφορούσες ορμόνες που δρουν απευθείας στην υπόφυση. 18

19 1.5.1 Παράγοντες που ρυθμίζουν τη σύνθεση και απελευθέρωση της Αυξητικής Ορμόνης Α) Υποφυσιοτρόπες ορμόνες α) Εκλυτικός Παράγων της GH (Growth Hormone Releasing Factor-GHRH) O εκλυτικός παράγων της GH (GHRH: Growth Hormone Releasing Hormone), επίσης γνωστός ως GHRF (Growth Hormone Releasing Factor), είναι ένα υποθαλαμικό πεπτίδιο που αποτελείται από 44 αμινοξέα και το οποίο διεγείρει την απελευθέρωση και τη σύνθεση της GH από την υπόφυση. O GHRH εκκρίνεται από τις νευροεκκριτικές απολήξεις των νευρώνων του τοξοειδούς πυρήνα και απελευθερώνεται από νευροεκκριτικές απολήξεις της μέσης προεξοχής. (28) Μέσω του υποθάλαμο-υποφυσιακού πυλαίου συστήματος μεταφέρεται στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, όπου διεγείρει την έκκριση της GH ενεργοποιώντας τον υποδοχέα GHRH- R. Εικόνα 6. Οδός μεταφοράς του GHRH Η μείωση στο ρυθμό αύξησης νεαρών αρουραίων μετά την καταστροφή του υποθαλάμου τους ήταν η πρώτη απόδειξη νευροενδοκρινούς ελέγχου της έκκρισης της GH. Ο GHRH συντίθεται ως πρόδρομο μόριο 107/108 αμινοξέων στον άνθρωπο και με την επίδραση πεπτιδασών μετατρέπεται σε GHRH(1-44)NH 2. H in vivo ορμόνη υπάρχει ως η αμιδική μορφή 44 αμινοξέων σε όλα τα είδη. Στον άνθρωπο, υπάρχει επίσης μία άλλη μορφή, η [GHRH(1-40)OH]. H αλληλουχία αμινοξέων του GHRH δεν είναι καλά συντηρημένη στα θηλαστικά. Ο GHRH απελευθερώνεται κατά ώσεις, προκαλώντας κατά ώσεις απελευθέρωση της GH. Εκφράζεται κυρίως στον τοξοειδή πυρήνα του υποθαλάμου, αλλά και σε άλλους ιστούς, όπως το έντερο, ο πλακούντας, οι γονάδες και το ανοσοποιητικό σύστημα. 19

20 Η πρόσδεση του GHRH στον υποδοχέα GHRH-R προκαλεί αυξημένη παραγωγή GH κυρίως μέσω του μονοπατιού της κυκλικής μονοφωσφορικής αδενοσίνης (c- AMP), αλλά και μέσω του μονοπατιού της φωσφολιπάσης C (μονοπάτι IP3/DAG) και άλλων λιγότερο σημαντικών μονοπατιών. Το εξαρτώμενο από τη c-amp μονοπάτι πυροδοτείται από την πρόσδεση του GHRH στον υποδοχέα του, ο υποδοχέας υφίσταται δομικές αλλαγές και ενεργοποιεί την Gsα υπομονάδα του στενά συνδεόμενου G-πρωτεϊνικού συμπλέγματος στην ενδοκυττάρια πλευρά του υποδοχέα. Αποτέλεσμα είναι η ενεργοποίηση της προσδεδεμένης στη μεμβράνη αδενυλικής κυκλάσης και η αύξηση του ενδοκυττάριου camp. To camp συνδέεται με τις ρυθμιστικές υπομονάδες της πρωτεϊνικής κινάσης Α (ΡΚΑ) και τις ενεργοποιεί, επιτρέποντας στις ελεύθερες καταλυτικές υπομονάδες να μεταφερθούν στον πυρήνα και να φωσφορυλιώσουν το μεταγραφικό παράγοντα CREB (camp response element binding protein). O φωσφορυλιωμένος CREB προάγει τη μεταγραφή της GH συνδεόμενος με CREs (camp-response elements) στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου της GH. Επίσης, ο GHRH αυξάνει τη μεταγραφή του γονιδίου του GHRH- R, προκαλώντας θετική ανατροφοδότηση. Στο μονοπάτι της φωσφολιπάσης C, o GHRH ενεργοποιεί τη φωσφολιπάση C μέσω του βγ-συμπλέγματος των ετεροτριμερικών G-πρωτεϊνών. Η ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C οδηγεί στην παραγωγή διακυλγλυκερόλης (DAG) και τριφωσφωρικής ινοσιτόλης (IP3). Η ενεργοποίηση της ΙΡ3 προκαλεί απελευθέρωση του ενδοκυττάριου Ca +2 από το ενδοπλασματικό δίκτυο, αυξάνοντας τη συγκέντρωση του κυτταροπλασματικού Ca +2, με τελική κατάληξη την απελευθέρωση εκκριτικών κυστιδίων που περιλαμβάνουν προσχηματισμένη αυξητική ορμόνη. Εικόνα 7. Η σηματοδότηση του GHRH 20

21 Ο GHRH πρωτοεμφανίζεται στον ανθρώπινο υποθάλαμο μεταξύ της 18 ης και 29 ης εβδομάδας κύησης και η περίοδος αυτή αντιστοιχεί στην έναρξη παραγωγής της αυξητικής ορμόνης στα έμβρυα. Μελέτες σε ποντίκια έδειξαν ότι ο υποδοχέας του GHRH δεν απαιτείται για τον αρχικό πολλαπλασιασμό των αρχέγονων κυττάρων από τα οποία θα προέλθουν τα σωματοτρόπα και λακτοτρόπα κύτταρα. Κατά τη διαφοροποίηση και μεταφορά τους στην «caudomedial ζώνη», ωστόσο, τα κύτταρα αυτά δέχονται ενεργοποίηση μέσω του GHRH από τον υποθάλαμο. Για τη σωστή σηματοδότηση του GHRH, χρειάζεται ο υποδοχέας GHRH-R για τον πολλαπλασιασμό των σωματοτρόπων κυττάρων. β) Σωματοστατίνη H σωματοστατίνη, γνωστή και ως ανασταλτική ορμόνη της GH (Growth hormoneinhibiting hormone/ghih) ή ως ανασταλτικός παράγων της απελευθέρωσης σωματοτροπίνης (Somatotropin release-inhibiting hormone/srif), είναι άλλη μία πεπτιδική ορμόνη, 14 ή 28 αμινοξέων. Ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά σε υποθαλαμικά εκχυλίσματα το 1973 (29) και, κατόπιν, βρέθηκε ότι η σωματοστατίνη εκκρίνεται από πολλούς ιστούς, μεταξύ των οποίων το πάγκρεας, ο εντερικός σωλήνας και περιοχές του κεντρικού νευρικού συστήματος εκτός του υποθαλάμου. Ρυθμίζει το ενδοκρινικό σύστημα, επηρεάζει τη νευροδιαβίβαση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και αναστέλλει την έκκριση πολλών ορμονών. Βασική της λειτουργία είναι η καταστολή της έκκρισης, αλλά όχι της σύνθεσης της GH από τα σωματοτρόπα κύτταρα. Παράγεται από νευροενδοκρινικούς νευρώνες του περικοιλιακού πυρήνα του υποθαλάμου, οι οποίοι καταλήγουν στη μέση προεξοχή, όπου η σωματοστατίνη απελευθερώνεται από νευροεκκριτικές απολήξεις στο υποθάλαμο-υποφυσιακό σύστημα. Ακολούθως, καταλήγει στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης κι αναστέλλει την έκκριση της GH. Εικόνα 8. Χημική δομή της σωματοστατίνης Η σωματοστατίνη δρα με ενδοκρινή και παρακρινή τρόπο. Συντίθεται ως ένα πρόδρομο μόριο 116 αμινοξέων, την προπροσωματοστατίνη, από την οποία προκύπτει η προσωματοστατίνη, στην οποία δρουν ενδοπεπτιδάσες που σχηματίζουν τις δύο μορφές που εκκρίνονται από τον υποθάλαμο, τη SRIH-14 και SRIH-28. Οι 21

22 δύο μορφές παράγονται σε διαφορετικές αναλογίες από νευρώνες κι εκκριτικά κύτταρα κατά τη διαδικασία διαφοροποίησης. Η σωματοστατίνη SRIH-28 έχει τις μεγαλύτερες ανασταλτικές επιδράσεις (10πλάσιες) στην έκκριση της GH. Στον άνθρωπο, υπάρχει ένα μόνο γονίδιο που κωδικοποιεί τη σωματοστατίνη. (30,31) Σε αντίθεση με τον GHRH, η σωματοστατίνη κατανέμεται ευρέως στο Κεντρικό και Περιφερικό Νευρικό σύστημα και η αλληλουχία του γονιδίου της έχει συντηρηθεί στα θηλαστικά. Εικόνα 9. Η σωματοστατίνη και οι πρόδρομες μορφές της Έχουν κλωνοποιηθεί στα θηλαστικά 5 υπότυποι υποδοχέα της σωματοστατίνης, μέσω των οποίων διαμεσολαβούνται οι διαφορετικές βιολογικές της δράσεις. (1) Όλοι οι υποδοχείς είναι μέλη της υπεροικογένειας των συνδεόμενων με G-πρωτεΐνες υποδοχέων. Καθένας από τους υποδοχείς ενεργοποιεί διαφορετικούς σηματοδοτικούς μηχανισμούς εντός των κυττάρων, όλοι όμως αναστέλλουν την αδενυλική κυκλάση. Ο υποδοχέας της σωματοστατίνης κωδικοποιείται από 5 γονίδια (sstr 1-5). Το κύριο εξ αυτών που επηρεάζει την έκκριση της αυξητικής ορμόνης από τα σωματοτρόπα κύτταρα είναι το sstr 2. H μεταγωγή του σήματος περιλαμβάνει την εξαρτώμενη από G-πρωτεΐνες μείωση των τασεοευαίσθητων καναλιών Ca +2 (L- και T-τύπους) και αύξηση των καναλιών Κ +. Η σωματοστατίνη (SRIH), αναστέλλει την έκκριση της GH με τρόπο ανεξάρτητο από τον GHRH, αλλά με άμεση παρεμπόδιση της δράσης του GHRH. Aν και ο ακριβής μηχανισμός δεν είναι γνωστός, η σωματοστατίνη φαίνεται πως αποτρέπει την ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης. Δεν είναι γνωστό αν επηρεάζει τη σύνθεση της GH άμεσα, όμως μπορεί να το κάνει τροποποιώντας την ενδοκυττάρια συγκέντρωση camp, σε αντίθεση με τη δράση του GHRH. γ) Γκρελίνη H γκρελίνη είναι ένα πεπτίδιο που αποτελείται από 28 αμινοξέα. Είναι το πρώτο φυσικό πεπτίδιο το οποίο περιέχει μια υδροξυλική ομάδα στο αμινοξύ σερίνη-που βρίσκεται στην τρίτη θέση- και η οποία ακετυλιώνεται από το n-οκτανοϊκό οξύ. (32) 22

23 Εικόνα 10. Η χημική δομή της γκρελίνης Απομονώθηκε για πρώτη φορά από το στομάχι αρουραίου, όπου παράγεται από έναν συγκεκριμένο τύπο ενδοκρινικών κυττάρων του γαστρικού βλεννογόνου. (33) Παράγεται επιπλέον σε ιστούς όπως ο γαστρεντερικός σωλήνας, οι ωοθήκες, οι όρχεις, οι νεφροί, τα επινεφρίδια, ο πλακούντας και το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα. Μετά την παραγωγή της εμφανίζει σημαντική συγκέντρωση στο πλάσμα. Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκκριση της γκρελίνης ακολουθεί κιρκαδικό ρυθμό και χαρακτηρίζεται από νυκτερινή αύξηση των επιπέδων της ορμόνης. (34) Οι ορμόνες GHRH και σωματοστατίνη ελέγχουν, όπως έχει ήδη αναφερθεί, την έκκριση της αυξητικής ορμόνης. Για την προαγωγή της έκκρισης της GH αναπτύχθηκαν συνθετικές ουσίες, τα ευοδωτικά πεπτίδια της έκκρισης της GH (Growth Hormone Secretagogues/GHSs), τα οποία συνδέονται με δικούς τους υποδοχείς στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. (35) Η γκρελίνη αποδείχθηκε ότι είναι ο φυσικός συνδέτης του GHSR (Growth Hormone Secretagogue Receptor), συμμετέχοντας με τον τρόπο αυτό στη ρύθμιση της παραγωγής GH από την υπόφυση. (36) Η γκρελίνη θεωρείται σημαντικός ρυθμιστής του μεταβολισμού της ενέργειας και της έκκρισης GH. (37-39) Η έκκριση της γκρελίνης διεγείρεται από τη νηστεία και προάγει την έκκριση της αυξητικής ορμόνης από τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. Η γκρελίνη διεγείρει την έκκριση της αυξητικής ορμόνης άμεσα, δρώντας στον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης, και πιθανώς έμμεσα, προάγοντας την έκκριση του GHRH και αναστέλλοντας της έκκριση της σωματοστατίνης. 23

24 Εικόνα 11. Προαγωγή της έκκρισης GH από την γκρελίνη O υποδοχέας GHSR εκφράζεται σε πολλούς υποθαλαμικούς και θαλαμικούς πυρήνες, στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου, στη μέλαινα ουσία του εγκεφάλου και στον προσωπικό πυρήνα του στελέχους, υποδηλώνοντας ένα πιθανό κεντρικό ρόλο της γκρελίνης. Η γκρελίνη, εκτός από τη ρύθμιση της έκκρισης της αυξητικής ορμόνης, αποτελεί βασικό ρυθμιστή της όρεξης, δίνοντας το ερέθισμα για πρόσληψη τροφής. Οι επιδράσεις της γκρελίνης στην πρόσληψη τροφής φαίνεται ότι διαμεσολαβούνται από το Νευροπεπτίδιο Υ (ΝΡΥ), κυρίως όμως από το υποθαλαμικό νευροπεπτίδιο AGRP (Agouti-related peptide). (40) Αποτελεί επίσης ενδογενή ανταγωνιστή της λεπτίνης. Τα επίπεδα της γκρελίνης είναι αυξημένα προγευματικά κι ελαττωμένα μεταγευματικά. (41) Επιπρόσθετα, έχει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, αναβολικές δράσεις όπως η εναπόθεση λίπους, η αύξηση της γλυκόζης, αλλά και αυξάνει τη γαστρική λειτουργία, την εξωκρινή κι ενδοκρινή παγκρεατική έκκριση και την καρδιακή παροχή. (Εικόνα 12). Το mrna και το πεπτίδιο της γκρελίνης έχουν ανιχνευθεί στην υπόφυση του αρουραίου και του ανθρώπου, υποδηλώνοντας ότι η γκρελίνη συντίθεται εντός της υπόφυσης, όπου μπορεί να επηρεάζει την απελευθέρωση της GH με αυτοκρινή ή παρακρινή τρόπο. Έχει επίσης αναφερθεί ότι η γκρελίνη εκφράζεται σε σωματοτρόπα, λακτοτρόπα και θυρεοτρόπα κύτταρα της υπόφυσης. (42) Ο υποδοχέας της αποτελείται από 7 διαμεμβρανικά τμήματα. Η μεταγωγή του σήματος περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης C (μέσω πρωτεΐνης G), τη δημιουργία φωσφορικής ινοσιτόλης και διακυλγλυκερόλης και αυξημένη ενδοκυττάρια συγκέντρωση Ca

25 Εικόνα 12. Δράσεις της γκρελίνης δ) Γοναδοτρόπος ορμόνη (Gonadotropin-Releasing Hormone/GnRH) Στα ανώτερα σπονδυλωτά, η GnRH δε διεγείρει την έκκριση της GH. Ωστόσο, σε ορισμένα είδη και σε συγκεκριμένες φάσεις ανάπτυξης, η GnRH διεγείρει την έκκριση της GH, όπως σε νεογέννητα ποντίκια και ψάρια. Η GnRH δρα μέσω της cgmp, υπάρχουν όμως ενδείξεις δράσης της μέσω του οξειδίου του αζώτου (ΝΟ). (43) ε) Κορτικοτροπίνη (Corticotropin-Releasing Hormone /CRH) Η CRH μέσω της σωματοστατίνης καταστέλλει την έκκριση της αυξητικής ορμόνης. (44) Σε ορισμένα είδη των κατώτερων σπονδυλωτών, η CRH διεγείρει την έκκριση της GH. (45) Β) ΡΙΤ-1 (Pituitary-specific positive transcription factor 1) Ο ΡΙΤ-1 είναι μέλος της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων που περιέχουν την περιοχή ΡΟU και πρωτοαναγνωρίστηκε ως παράγων ειδικός για τα υποφυσιακά κύτταρα που συνδέεται με στοιχεία απαραίτητα για την έκφραση των γονιδίων της GH, της Προλακτίνης και της Θυρεοτροπίνης. Στα θηλαστικά, η ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου της GH επιτυγχάνεται μέσω της διαντίδρασης του μεταγραφικού παράγοντα PIT-1 με δύο περιοχές σύνδεσης στο εγγύς τμήμα του υποκινητή. (46) Ο ΡΙΤ-1 προκαλεί ενεργοποίηση του υποκινητή της GH μέσω αύξησης των ενδοκυττάριων επιπέδων camp. Υπάρχουν γενετικές αποδείξεις για το ρόλο του ΡΙΤ-1 στον πολλαπλασιασμό των υποφυσιακών κυττάρων, καθώς διάφορες μεταλλάξεις του ΡΙΤ-1 οδηγούν σε υποϋποφυσισμό σε ποντίκια και ανθρώπους. Mεταλλάξεις του PIT-1 προκαλούν συνδυασμένη υποφυσιακή ανεπάρκεια (Combined Pituitary Hormone Deficiency/CPHD), που περιλαμβάνει ανεπάρκεια των GH, TSH και PRL, ενώ οι ACTH, FSH και LH παράγονται φυσιολογικά. Ο ΡΙΤ-1 είναι μία πρωτεΐνη 291 αμινοξέων με μια αμινοτελική περιοχή διασταυρούμενης 25

26 ενεργοποίησης και μία ΡΟU περιοχή πρόσδεσης στο DNA. Η περιοχή ΡΟU διακρίνεται σε δύο καλά συντηρημένες περιοχές, οι οποίες διαχωρίζονται από μία λιγότερο συντηρημένη περιοχή σύνδεσης. Οι περιοχές αυτές είναι το C-τελικό ήμισυ, η POU-homeobox περιοχή, που κωδικοποιεί μία περιοχή με χαμηλή συγγένεια πρόσδεσης στο DNA, και το Ν-τελικό ήμισυ, η POU-ειδική περιοχή, η οποία προσδίδει υψηλή συγγένεια στην περιοχή POU και συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών. Η παρατήρηση ότι ποντίκια με έλλειψη του ΡΙΤ-1 δεν έχουν κύτταρα που παράγουν Προλακτίνη ή TSHβ, όπως και κύτταρα που παράγουν GH, υποδηλώνει ότι ο ΡΙΤ-1 μπορεί να ρυθμίζει άλλους υποδοχείς στα λακτοτρόπα και θυρεοτρόπα κύτταρα, ο ρόλος των οποίων στον πολλαπλασιασμό είναι παρόμοιος με αυτόν του GHRH-R στα σωματοτρόπα κύτταρα. Ο ΡΙΤ-1 είναι ένας από τους πιο ειδικά εκφραζόμενους γνωστούς μεταγραφικούς παράγοντες, που περιορίζεται στα σωματοτρόπα, λακτοτρόπα και θυρεοτρόπα κύτταρα. Ωστόσο, αυτό το μοντέλο έκφρασης υποδηλώνει ότι η πρωτεΐνη ΡΙΤ-1 δεν αρκεί για τη σύνθεση της GH, γιατί η GH δεν εκφράζεται στα λακτοτρόπα ή θυρεοτρόπα κύτταρα, αν και εκφράζουν ΡΙΤ-1. Είτε επιπρόσθετοι αναγκαίοι παράγοντες απουσιάζουν σε αυτούς τους κυτταρικούς τύπους είτε συμβαίνει καταστολή της σύνθεσης της GH στα λακτοτρόπα και θυρεοτρόπα κύτταρα. Ακόμα και στα σωματοτρόπα κύτταρα, η λειτουργία του ΡΙΤ-1 από μόνη της δεν είναι αρκετή για την έκφραση της GH. Απαραίτητο για την έκφραση του γονιδίου PIT-1 είναι το γονίδιο PROP-1, το οποίο εδράζεται στο χρωμόσωμα 5q και κωδικοποιεί μεταγραφικούς παράγοντες απαραίτητους για την εμβρυική ανάπτυξη της υπόφυσης. Έχουν περιγραφεί 13 διαφορετικές μεταλλάξεις του PROP-1, οι οποίες αποτελούν την πιο κοινή γενετική αιτία CHPD. Όλες οι μεταλλάξεις αφορούν την περιοχή πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα στο DNA και προκαλούν ανεπάρκεια των GH, PRL, TSH και των γοναδοτροπινών. Γ) Περιφερικές ορμόνες και νευροπεπτίδια που επηρεάζουν άμεσα την έκκριση της GH i) Τριιωδοθυρονίνη (Τ3) : Η τριιωδοθυρονίνη είναι απολύτως απαραίτητη για τη φυσιολογική αύξηση και ανάπτυξη πολλών ιστών. (47,48) Το νευρικό σύστημα είναι ιδιαιτέρως ευαίσθητο σε αυτή την ορμονική δράση. Έχει βρεθεί σε κύτταρα υποφυσιακού όγκου στους αρουραίους η ενεργοποίηση από την τριιωδοθυρονίνη της μεταγραφής του γονιδίου της GH. (49) Επιπλέον, η τριιωδοθυρονίνη σε υποφυσιακή κυτταρική σειρά σε αρουραίους διεγείρει άμεσα τη μετάφραση παραγόντων οι οποίοι με τη σειρά τους διεγείρουν το ρυθμό σύνθεσης της αυξητικής ορμόνης στο επίπεδο της μετάφρασης. (50) ii) Γλυκοκορτικοειδή : Τα γλυκοκορτικοειδή ρυθμίζουν τη σύνθεση και την έκκριση της GH επηρεάζοντας την υποθαλαμική, αλλά και την υποφυσιακή λειτουργία. 26

27 Αφ ενός καταστέλλουν την υποθαλαμική έκφραση της GHRH, αφετέρου ενισχύουν την υποφυσιακή απαντητικότητα στην GHRH. Τα επίπεδα του mrna του υποδοχέα GHRH-R έχει βρεθεί in vitro σε κύτταρα υπόφυσης αρουραίου ότι διεγείρονται άμεσα από τα γλυκοκορτικοειδή, αποτελώντας την πιθανή εξήγηση της αυξημένης υποφυσιακής απαντητικότητας στην GHRH. (51) iii) Λεπτίνη : Η λεπτίνη αποτελεί μέρος των ομοιοστατικών μηχανισμών που ρυθμίζουν την ενεργειακή ισορροπία του σώματος. Εκτός από τις υποθαλαμικές της δράσεις, η λεπτίνη διεγείρει άμεσα την υποφυσιακή έκκριση της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) και της αυξητικής ορμόνης (GH), διευκολύνοντας αναπαραγωγικές, αυξητικές και αναβολικές δράσεις κατά τη διάρκεια ενεργειακής αφθονίας. Έχει αποδειχθεί in vivo ότι η λεπτίνη αυξάνει την έκκριση της GHRH και μειώνει την έκκριση της σωματοστατίνης, συγχρόνως με τη διέγερση της έκκρισης της GH. (52) Είναι επιβεβαιωμένη η ύπαρξη υποδοχέων λεπτίνης στα σωματοτρόπα κύτταρα. Η σηματοδοτική δράση της λεπτίνης φαίνεται ότι γίνεται κυρίως διαμέσου JAK2 και STAT. Επίσης, η λεπτίνη αυξάνει την παραγωγή ΝΟ από τα κύτταρα της υπόφυσης, αλλά και τη μέσω ΝΟ έκκριση της GH. iv) Αντιπονεκτίνη : Η αντιπονεκτίνη είναι η λιποκίνη που παράγεται σε μεγαλύτερη ποσότητα. Έχει ινσουλινοευαισθητοποιό, αντιαθηρωματογόνο, αντιφλεγμονώδη, αντιαγγειογόνο και αντιογκογόνο δράση. (53) Η αντιπονεκτίνη φαίνεται να επηρεάζει in vitro την έκκριση της GH στον αρουραίο. Βραχυπρόθεσμη έκθεση της υπόφυσης σε αντιπονεκτίνη για 4 ώρες ελαττώνει την απελευθέρωση της GH παρουσία ή απουσία GHRH. Αντιθέτως, μετά από 24ωρη έκθεση σε αντιπονεκτίνη παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του υποδοχέα του εκλυτικού παράγοντα GHRH και αυξημένη απελευθέρωση GH σε υψηλές δόσεις. H παχυσαρκία έχει συνδεθεί με χαμηλά επίπεδα GH και διαταραχή στην παλμική έκκρισή της, με αποτέλεσμα τη σχετική ανεπάρκεια της GH. H αντιπονεκτίνη επάγει την αύξηση του ενδοκυττάριου Ca +2 μέσω εισροής του εξωκυττάριου Ca +2 και απελευθέρωσης των ενδοκυττάριων αποθηκών Ca +2, προκαλώντας τελικά την έκκριση της GH. Θεωρείται ότι η αντιπονεκτίνη ρυθμίζει άμεσα την έκκριση της GH από τα σωματοτρόπα κύτταρα συνδεόμενη σε οποιονδήποτε από τους υποδοχείς της (AdipoR1, AdipoR2) και αυτό γίνεται μέσω μίας παρόμοιας διεργασίας με αυτήν που παρατηρείται μετά από τη διέγερση της GH από την GHRH. (54) v) Ρεζιστίνη : Πρόκειται για μία ακόμη ορμόνη που παράγεται από το λιπώδη ιστό. Η ρεζιστίνη διεγείρει την απελευθέρωση της GH από τα σωματοτρόφα κύτταρα αρουραίου, με μηχανισμό εξαρτώμενο από πρωτεΐνη G. (55) vi) Ορεξίνες : Υπάρχουν άμεσες επιδράσεις της ορεξίνης Α και της ορεξίνης Β στην απελευθέρωση GH σε μηρυκαστικά. (56,57) vii) Oπιοειδή : Μετά την απομόνωση και αναγνώριση των ενδογενών οπιοειδών πεπτιδίων από τους Hughes και συν. το 1975, έχει βρεθεί ότι η χορήγηση φυσικών 27

28 και συνθετικών αναλόγων ενδογενών οπιοειδών αυξάνει τα επίπεδα της κυκλοφορούσας στο πλάσμα αυξητικής ορμόνης σε αρκετά είδη θηλαστικών. (58,59) Μία πρόσφατη μελέτη επιβεβαιώνει ότι και στον άνθρωπο τα οπιοειδή αυξάνουν την έκκριση της αυξητικής ορμόνης. (60) Επιπλέον, το μονοπάτι των οπιοειδών έχει συσχετισθεί με την αυξημένη απελευθέρωση GH κατά τη διάρκεια της αύξησης. (61) viii) Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Peptide (PACAP)-Υποφυσιακό Πεπτίδιο ενεργοποιόν την αδενυλική κυκλάση : To PACAP είναι μία πρωτεΐνη που κωδικοποιείται στον άνθρωπο από το γονίδιο ADCYAP1. Πρόκειται για έναν εν δυνάμει διεγέρτη της έκκρισης της GH και έχει προταθεί ως προγονικός εκλυτικός παράγων της GH. Εκτός από τη δράση του ως υποφυσιοτρόπος ορμόνη, το PACAP δρα και ως νευροδιαβιβαστής και νευρορυθμιστής. Το πολυπεπτίδιο αυτό ενεργοποιεί την αδενυλική κυκλάση και αυξάνει τα επίπεδα της camp στα κύτταρα-στόχος. Στα θηλαστικά, τα PACAP 27 και PACAP 38 διεγείρουν την έκκριση της GH in vitro και in vivo. Επιπροσθέτως, το PACAP αυξάνει τη σύνθεση της GH, όπως προκύπτει από τα αυξημένα επίπεδα mrna GH. Εικόνα 13. Μηχανισμός δράσης του PACAP ix) Θυρεοτρόπος ορμόνη (TRH) : To τριπεπτίδιο TRH μπορεί να επαγάγει την έκκριση της GH σε πολλά ζωικά είδη υπό ορισμένες φυσιολογικές συνθήκες. Έχει προταθεί ότι η απελευθέρωση της GH από τα κύτταρα του πρόσθιου λοβού της υπόφυσης προκαλείται από την TRH μέσω μηχανισμού που εξαρτάται από το Ca και όχι από τη c-amp. (62) 28

29 x) Νευροπεπτίδιο Υ : Διεγείρει άμεσα την έκκριση της GH από τα σωματοτρόπα σε ορισμένα είδη ψαριών και ζώων. (63) Σε υποφυσιακά κύτταρα χοίρου καταστέλλει την απόκριση σε πρόκληση με GHRH. (64) xi) Γαλανίνη : Η γαλανίνη είναι ένα πεπτίδιο 30 αμινοξέων στον άνθρωπο που απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1983 (65). Είναι παρούσα στο γαστρεντερικό σωλήνα και ευρέως στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα, όπου συμμετέχει σε πολλές εγκεφαλικές λειτουργίες. Οι μετασυναπτικές δράσεις της είναι συνήθως ανασταλτικές και διαμεσολαβούνται από τρεις διαφορετικούς υποδοχείς. (66) Όσον αφορά στην ανασταλτική επίδραση της γαλανίνης στην απελευθέρωση της GH, είναι πιθανό ότι η γαλανίνη επιδρά στο ρυθμιστικό σύστημα του υποθαλάμου. (67) Σύμφωνα με περισσότερο πρόσφατες μελέτες, η γαλανίνη μπορεί να διεγείρει απευθείας την απελευθέρωση της GH. Για παράδειγμα, όταν χορηγείται στην περιφέρεια, διεγείρει την έκκριση της GH (68). Είναι πιθανό ότι η γαλανίνη είναι το υποκατάστατο του πεπτιδίου GALP (Galanin-related peptide), το οποίο όχι μόνο διεγείρει την απελευθέρωση της GH, αλλά και εκφράζεται σε μεγάλη εγγύτητα ως προς τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης. (69) xii) ΝΟ : Το οξείδιο του αζώτου διεγείρει την έκκριση της GH σε πειράματα in vitro. Έχει απομονωθεί η συνθάση του ΝΟ σε υποφυσιακά κύτταρα. Το ΝΟ έχει προταθεί ως ο πρωταρχικός παράγοντας έκκρισης της GH κατά την άσκηση. Δ) Νευρομεταβιβαστές - Ακετυλοχολίνη : Χολινεργικά μονοπάτια έχει βρεθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της έκκρισης της GH και πιστεύεται ότι δρουν μέσω απόσυρσης της σωματοστατίνης από τον υποθάλαμο. Η χορήγηση χολινεργικών αγωνιστών κατά τη διενέργεια κλινικών πειραμάτων προκάλεσε διπλασιασμό της ημερήσιας έκκρισης GH σε υγιείς άνδρες, ενώ η χορήγηση φαρμάκων που μπλοκάρουν τους μουσκαρινικούς υποδοχείς μειώνει την έκκριση GH κατά τη διάρκεια του ύπνου και την αναστέλλει μετά από χορήγηση GHRH. (70) - Ντοπαμίνη : Αυξάνει την έκκριση GH σε φυσιολογικά άτομα μέσω αναστολής της έκκρισης της σωματοστατίνης. Επίσης, έχει βρεθεί ότι διεγείρει την απελευθέρωση in vitro της GH στα χρυσόψαρα. (71) - Κατεχολαμίνες (α αδρενεργικά μονοπάτια, β αδρενεργικά μονοπάτια): Τα μονοπάτια των κατεχολαμινών στο ΚΝΣ φαίνεται να είναι θεμελιώδους σημασίας για τη διατήρηση της παλμικής έκκρισης της GH. (72) Οι α 1 αγωνιστές δε φαίνεται να επιδρούν στη βασική έκκριση GH στον άνθρωπο, ενώ οι α 2 αγωνιστές, όπως είναι η κλονιδίνη, προκαλούν έκκριση GH στον άνθρωπο και σε πειραματικά ζώα. Οι β- αδρενεργικοί υποδοχείς ασκούν ανασταλτική δράση στην έκκριση GH, μέσω μειωμένης έκκρισης GHRH. H νοραδρεναλίνη δρα εκτός του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και μειώνει τα επίπεδα της GH στον ορό του χρυσόψαρου, πιθανώς επηρεάζοντας άμεσα τα σωματοτρόπα κύτταρα. (73) Επίσης, η νοραδρεναλίνη μπορεί 29

30 να δράσει μέσω α2-αδρενεργικών υποδοχέων και καταστέλλει τη βασική, αλλά και τη μέσω ντοπαμίνης και GnRH έκκριση της GH στο χρυσόψαρο. - Σεροτονίνη: Διεγείρει την έκκριση GH σε πειραματικά ζώα, πιθανώς μέσω απελευθέρωσης GHRH. Στον άνθρωπο, η χορήγηση της πρόδρομης σεροτονινεργικής ουσίας 5-υδροξυτρυπτοφάνης αυξάνει τα επίπεδα της GH. Έχει βρεθεί επίσης ότι η σεροτονίνη καταστέλλει τη διεγειρόμενη από GnRH απελευθέρωση GH στα χρυσόψαρα. - Ισταμίνη : Έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την αυθόρμητη έκκριση GH. - Αμινοξέα : Η ενδοφλέβια χορήγηση ορισμένων αμινοξέων είναι γνωστό ότι προκαλεί σημαντική απελευθέρωση GH. Για παράδειγμα, αύξηση της αργινίνης ορού κατά 52% αυξάνει σημαντικά τα επίπεδα GH στον άνθρωπο. Ομοίως, η ορνιθίνη χορηγούμενη ενδοφλέβια προκαλεί πενταπλάσια αύξηση της GH σε 45 λεπτά. (74) Η γλυκίνη από του στόματος, όπως και η γλουταμίνη σε πολύ χαμηλή δόση από του στόματος αυξάνουν τα επίπεδα της GH, ενώ το γ-αμινοβουτυρικό οξύ, ο ισχυρότερος ανασταλτικός νευροδιαβιβαστής του εγκεφάλου, προκαλεί αύξηση της GH στην ηρεμία, αλλά αναστολή της στην άσκηση. (75) Ε) Ανασταλτικά νευροπεπτίδια, πρωτεΐνες και ορμόνες α) GH : Η GH ασκεί αρνητική ρύθμιση στην ίδια της την έκκριση, μειώνοντας την παραγωγή του GHRH και του υποδοχέα του (GHRHR) και αυξάνοντας τη δραστηριότητα της σωματοστατίνης. (76,77) Η GH φαίνεται ότι δρα στους νευρώνες του Νευροπεπτιδίου Υ (NPY) στον τοξοειδή πυρήνα του υποθαλάμου και σε νευρώνες της σωματοστατίνης στον περικοιλιακό πυρήνα μέσω του υποδοχέα της (GHR). Η ενεργοποίηση αυτών των νευρώνων προκαλεί την απελευθέρωση της σωματοστατίνης και αναστέλλει την έκκριση της GH. (78) β) IGF-I : Στον άνθρωπο έχει βρεθεί ότι η συστηματική χορήγηση IGF-I καταστέλλει την έκκριση της GH. (79) Έχει προταθεί ότι ο IGF-I καταστέλλει την έκκριση της GH δρώντας τόσο στον υποθάλαμο όσο και στην υπόφυση. Δεν έχει ακόμα διαλευκανθεί όμως αν η αναστολή της GH γίνεται μέσω αρνητικής ανατροφοδότησης στην υπόφυση ή μέσω τροποποίησης της απελευθέρωσης σωματοστατίνης στον υποθάλαμο. Έχει επίσης δειχθεί η άμεση ανασταλτική δράση του στα σωματοτρόπα κύτταρα. (80) Επιπλέον, παράγοντες όπως η υπεργλυκαιμία και τα υψηλά επίπεδα ελεύθερων λιπαρών οξέων μειώνουν τα επίπεδα της GH. (81) γ) Κορτιστατίνη (CST): Πρόκειται για ένα κυκλικό πεπτίδιο με λειτουργικές ομοιότητες με τη σωματοστατίνη, το οποίο προσδένεται στους υπότυπους 1-5 του υποδοχέα της σωματοστατίνης με παρόμοια συγγένεια, αλλά μπορεί να προσδεθεί και σε άλλους υποδοχείς. Είναι προφανές ότι η κορτιστατίνη αναστέλλει την απελευθέρωση GH. (82,83) 30

31 ΣΤ) Φυσιολογικές και μη καταστάσεις που επηρεάζουν την έκκριση της GH i) Ηλικία: Η γήρανση συνδυάζεται με μείωση στην έκκριση της GH, γεγονός που συσχετίζεται με μεταβολές στη σύνθεση του σώματος, αλλά και στη φυσική και ψυχολογική λειτουργία. Παρόμοιες μεταβολές παρατηρούνται σε νεώτερους ενήλικες με ανεπάρκεια αυξητικής ορμόνης και περιλαμβάνουν μείωση της άλιπης μάζας σώματος και της μυικής ισχύος, αύξηση του λιπώδη ιστού, κυρίως του σπλαχνικού, και αθηρογόνες μεταβολές στο λιπιδαιμικό προφίλ. Η μνήμη και η γνωστική λειτουργία σταδιακά επιδεινώνονται με την ηλικία, ενώ η οστική πυκνότητα ελαττώνεται. Επίσης, ο βαθύς ύπνος βραδέων κυμάτων μειώνεται σημαντικά με την ηλικία, όπως και η έκκριση της GH κατά τη διάρκεια της νύχτας. Οι μεταβολές αυτές παρουσιάζουν συσχέτιση, ωστόσο δεν είναι βέβαιο ότι υπάρχει αιτιολογική σύνδεση μεταξύ τους. Τα επίπεδα της GH φτάνουν σε plateau στη νεαρή ενήλικο ζωή και στη συνέχεια ελαττώνονται προοδευτικά, με ταυτόχρονη μείωση της μυικής μάζας και της αερόβιας ικανότητας και αύξηση του κοιλιακού λίπους. Μετά την τρίτη δεκαετία ζωής, η GH ελαττώνεται κατά 15% για κάθε δεκαετία ενήλικης ζωής. Η μείωση στην έκκριση της GH είναι αποτέλεσμα μείωσης του εύρους των ώσεων GH κι ελάχιστα της παλμικής συχνότητας. ii) Άσκηση : Η άσκηση αποτελεί σημαντικό διεγέρτη έκκρισης της GH. Η έντονη άσκηση στα παιδιά διεγείρει άμεσα την έκκριση GH. Στους ηλικιωμένους η τακτική άσκηση αυξάνει την άλιπη μάζα σώματος, τη μυική δύναμη και την αερόβια ικανότητα. Η απόκριση της GH στην άσκηση μειώνεται με τη γήρανση. Το εύρημα αυτό οδήγησε στην υπόθεση ότι κάποιες από τις δράσεις της άσκησης διαμεσολαβούνται από την GH ή τον IGF-I. H βελτιστοποίηση της έκκρισης της GH επέρχεται κυρίως όταν η διάρκεια της άσκησης είναι μεγαλύτερη από 10 λεπτά, όταν επαναλαμβάνεται πολλές φορές μέσα στην ίδια μέρα και όταν η ένταση της άσκησης είναι μεγαλύτερη από το γαλακτικό κατώφλι. (84) iii) Ύπνος : Για περισσότερο από 30 χρόνια υπήρχε η παρατήρηση ότι η GH εκκρίνεται περισσότερο κατά τη διάρκεια του βαθέως ύπνου βραδέων κυμάτων (Slow wavw sleep/sws). Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η έκκριση της GH κατά την έναρξη του ύπνου ρυθμίζεται πρωτίστως από τη διέγερση της GHRH, κατά τη διάρκεια μιας περιόδου σχετικής απόσυρσης της σωματοστατίνης και αυξημένων επιπέδων κυκλοφορούσας γκρελίνης. Φαρμακολογικές παρεμβάσεις που αυξάνουν τη διάρκεια και/ή την ένταση του SWS αυξάνουν επίσης το ρυθμό της απελευθέρωσης της GH. Επειδή η φυσιολογική αρνητική ανατροφοδότηση που ασκεί η GH στην κεντρική GHRH είναι μη λειτουργική σε ασθενείς με ανεπάρκεια GH, είναι πιθανό ότι τα ελαττωμένα επίπεδα ενέργειας και η κόπωση που συχνά αναφέρεται από αυτούς τους ασθενείς αντανακλούν εν μέρει την τροποποίηση στη ρύθμιση ύπνουαφύπνισης. (85) Ο βραδέων κυμάτων ύπνος ελαττώνεται με την ηλικία. Ωστόσο, στις περισσότερες μελέτες η χορήγηση GH ή GHRH σε ηλικιωμένους δε βελτίωσε τον SWS, γεγονός 31

32 που υποδηλώνει ότι η εξαρτώμενη από την ηλικία μείωση της GH δεν προκαλεί μειωμένο SWS, αν και το αντίστροφο μπορεί να είναι αλήθεια. iv) Παχυσαρκία : Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι κατά τη διάρκεια της προεφηβικής ηλικίας τα παχύσαρκα παιδιά παρουσιάζουν μεγαλύτερη ταχύτητα αύξησης και προχωρημένη οστική ηλικία συγκρινόμενα με λεπτόσωμα. Ωστόσο, αυτό το προεφηβικό πλεονέκτημα στην αύξηση τείνει να μειωθεί βαθμιαία κατά την εφηβεία, στην οποία τα παχύσαρκα παιδιά παρουσιάζουν μειωμένη αυξητική έκρηξη συγκρινόμενα με λεπτόσωμα. Η έκκριση της GH στα παχύσαρκα παιδιά είναι ελαττωμένη, υποδηλώνοντας ότι η μεγαλύτερη αύξηση που παρατηρείται είναι ανεξάρτητη από την GH. Παράγοντες στους οποίους έχει αποδοθεί η επιταχυνόμενη αύξηση στα παχύσαρκα παιδιά είναι τα αυξημένα επίπεδα λεπτίνης και ινσουλίνης, τα επινεφριδιακά ανδρογόνα, ο IGF-I, η IGFBP-1 και GHBPs. (86) Τα παχύσαρκα παιδιά σε σύγκριση με παιδιά κανονικού βάρους παρουσιάζουν μειωμένο χρόνο ημιζωής της GH, μειωμένα επεισόδια έκκρισης GH και μειωμένο ημερήσιο ρυθμό παραγωγής GH. Όλες αυτές οι διαφοροποιήσεις παρουσιάζουν θετική συσχέτιση με το βαθμό του υπερβάλλοντος βάρους. (87) Ωστόσο, η ποσότητα της GH που απελευθερώνεται ανά ώση και η διάρκεια των εκκριτικών επεισοδίων είναι συγκρίσιμα σε παχύσαρκα και λεπτόσωμα παιδιά. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η σημαντική μείωση της αυθόρμητης και μετά από πρόκληση έκκρισης της GH. H διαταραγμένη έκκριση της GH, ωστόσο, δε συνδυάζεται με μείωση του κυκλοφορούντος IGF-I, και αυτό ίσως εξηγεί τη φυσιολογική αύξηση στα παχύσαρκα παιδιά. 1.6 Μηχανισμοί σηματοδότησης κατά την έκκριση της Αυξητικής Ορμόνης α) Αδενυλική κυκλάση/camp/πρωτεϊνική Κινάση Α και Φωσφολιπάση C-IP3- Πρωτεϊνική Κινάση C: Τα σωματοτρόπα κύτταρα, υπό την επίδραση της GHRH, εκπολώνουν το δυναμικό της κυτταρικής μεμβράνης και διεγείρουν την εισροή Ca +2 μέσω διαμεμβρανικών καναλιών Ca +2, οδηγώντας σε αυξήσεις του ελεύθερου ενδοκυττάριου Ca +2. Η αύξηση αυτή προκύπτει από την εισροή Ca +2 μέσω τασεοευαίσθητων καναλιών Ca +2, αλλά και από την υδρόλυση της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης από τη φωσφολιπάση C, που οδηγεί στην κινητοποίηση ενδοκυττάριων αποθηκών Ca +2. β) ΝΟ: Υπάρχουν ενδείξεις υπέρ της διαμεσολάβησης του ΝΟ και της cgmp στην έκκριση GH από εκκριταγωγά. In vivo, η έγχυση της πρόδρομης του ΝΟ ουσίας, L- αργινίνης, αύξησε ήπια τις κυκλοφορούσες συγκεντρώσεις της GH και την απόκριση στην GHRH. Επιπλέον, ένας αναστολέας της σύνθεσης ΝΟ, ο Nx-nitro-L-arginine methyl ester (NAME), κατέστειλε τη μέσω GHRH έκκριση GH. (88) Έχει επίσης αποδειχθεί η ύπαρξη δραστηριότητας γουανυλικής κυκλάσης στα σωματοτρόπα 32

33 κύτταρα και η παρουσία αυξημένων κυτταρικών συγκεντρώσεων cgmp μετά από in vitro έγχυση GHRH. (89) γ) Κυτταρικός μηχανισμός έκκρισης GH: Στο παρελθόν, επικρατούσε η αντίληψη ότι εκκριτικά κυστίδια της GH που βρίσκονται σε επαφή με τη μεμβράνη ενσωματώνονται σε αυτή, απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους και κατόπιν απομακρύνονται με τη διαδικασία της ενδοκύττωσης. Πρόσφατα, ο μηχανισμός της κυτταρικής έκκρισης έχει διαλευκανθεί από μελέτες που αποκάλυψαν την ύπαρξη μιας καινούριας κυτταρικής δομής, που ονομάζεται porosome. Τα porosomes είναι κυπελλοειδούς ή κωνικής διαμόρφωσης υπερμοριακές λιποπρωτεϊνικές δομές που εντοπίζονται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη εκκριτικών κυττάρων κι έχουν διάμετρο ανοίγματος nm. Τα σωματοτρόπα αποτελούν παράδειγμα κυττάρων που φέρουν porosomes. Οι δομές αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο στην προσωρινή αγκυροβόληση εκκριτικών κυστιδίων τα οποία συντήκονται με τα porosomes αυξάνοντας κατά 20-40% τη διάμετρό τους. (90-95) Εικόνα 14. Κυτταρικός μηχανισμός έκκρισης GH Στα σωματοτρόφα κύτταρα τα εκκριτικά κυστίδια που περιέχουν GH μεταφέρονται στην πλασματική μεμβράνη κατά μήκος μικροσωληνίσκων. Στη διαδικασία αυτή συμμετέχουν μοριακές κινητικές μηχανές που ανήκουν στην οικογένεια των κινεσινών, με κατανάλωση μορίων ATP. (96) Τα κυστίδια συνδεόμενα με την κυτταρική μεμβράνη προσδένονται προσωρινά στα porosomes και απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους προς το εξωτερικό του κυττάρου κατά τη διάρκεια της κυτταρικής έκκρισης. (97) Για πρώτη φορά τα porosomes είχαν περιγραφεί σε κύτταρα της εξωκρινούς μοίρας του παγκρέατος και κατόπιν στα σωματοτρόφα κύτταρα της υπόφυσης. (98) 1.7 Βιολογικές δράσεις της Αυξητικής Ορμόνης Η κύρια βιολογική δράση της GH είναι η ρύθμιση της κατά μήκος αύξησης των οστών μετά τη γέννηση. (99,100) Η GH προάγει την αύξηση μέσω πολλαπλών επιδράσεων στον κυτταρικό μεταβολισμό και στη διαφοροποίηση. Επίσης, ρυθμίζει το μεταβολισμό των υδατανθράκων, των λιπιδίων, των πρωτεϊνών, του αζώτου και 33

34 των μετάλλων ( ) και διεγείρει τη σύνθεση DNA, τη διαφοροποίηση και τη μιτογένεση σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. ( ) Η GH είναι επίσης σημαντική για τη διατήρηση του ανοσοποιητικού συστήματος (108,109) την ανάπτυξη της καρδιάς και την υπερτροφία (110) και έχει βρεθεί ότι δρα στον εγκέφαλο ρυθμίζοντας το συναίσθημα, τη συμπεριφορά και την απάντηση στο στρες. (111) Είναι ασαφές ποιες από αυτές τις δράσεις σχετίζονται με τη σωματική αύξηση και ποιες αποτελούν δράσεις ανεξάρτητες από την αύξηση Σωματική αύξηση H GH, όπως έχει ήδη αναφερθεί, προάγει τη μετά τη γέννηση κατά μήκος αύξηση του σώματος και των οστών και τη διαφοροποίηση των μυοκυττάρων, των οστικών κυττάρων και των χονδροκυττάρων. Η χόνδρινη ουσία των οστών αυξάνει παράλληλα με τη σωματική αύξηση και σταδιακά οστεοποιείται μέχρι τη σύγκλειση των επιφύσεων. Επειδή προάγει τη σκελετική, σπλαχνική και οργανική αύξηση αποκαλείται επίσης «αναβολική ορμόνη». Η απάντηση των ιστών του σώματος στην αυξητική ορμόνη είναι μία αναλογική και ισορροπημένη αύξηση του μεγέθους τους. Η αύξηση των οστών προκαλεί γραμμική αύξηση, ενώ ταυτόχρονα αναπτύσσονται το δέρμα και τα εξαρτήματα, καθώς και οι σκελετικοί μύες. Οι άνθρωποι που πρόκειται να γίνουν ψηλοί εκκρίνουν GH σε υψηλότερες συγκεντρώσεις από τους υπόλοιπους, με αποτέλεσμα μεγαλύτερο ρυθμό αύξησης. Μία ενδεχόμενη συγγενής διαταραχή στη σύνθεση κι έκκριση της GH καταλήγει σε νανισμό, ενώ η υπερέκκριση προκαλεί γιγαντισμό αν συμβεί προεφηβικά και ακρομεγαλία αν συμβεί μετά την εφηβεία. (112,113) Τα άτομα με ακρομεγαλία παρουσιάζουν μεγάλα άκρα και γνάθους, υπερτροφία της καρδιάς και υπέρταση. Μεταβολικά, αυτοί οι ασθενείς αναπτύσσουν σοβαρή ινσουλινοαντίσταση με συμπτώματα σακχαρώδη διαβήτη. Απώλεια της έκκρισης GH σε νεαρούς ενήλικες ή σε παιδιά οδηγεί σε σημαντικά μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης με διαταραχές σε ορισμένες μεταβολικές λειτουργίες που οδηγούν σε αυξημένο σωματικό λίπος και μειωμένη μυική δύναμη. (114) Ρύθμιση του μεταβολισμού των υδατανθράκων, των πρωτεϊνών, των λιπιδίων και των ηλεκτρολυτών Οι αλλαγές που η GH επάγει στο μεταβολισμό της γλυκόζης και των λιπιδίων απεικονίζονται στην εικόνα

35 Εικόνα 15. Μεταβολικές δράσεις της GH Η GH διεγείρει τη λιπόλυση και, άρα, την παραγωγή ελεύθερων λιπαρών οξέων και γλυκερόλης, και αυξάνει την οξείδωση των λιπιδίων. Επίσης, αναστέλλει την ινσουλινοεπαγώμενη καταστολή της ηπατικής γλυκονεογένεσης και την αποθήκευση του γλυκογόνου στο ήπαρ και στους μυς. Αυξάνει, επομένως, τα κυκλοφορούντα επίπεδα της γλυκόζης και της ινσουλίνης και καταστέλλει την οξείδωση της γλυκόζης. ( ) Κατά συνέπεια, έχει υπεργλυκαιμική, ακόμα και διαβητογόνο δράση σε ορισμένες περιπτώσεις. Αυτές οι μεταβολικές αλλαγές παρατηρούνται σε ασθενείς με ακρομεγαλία, προδιαθέτοντάς τους σε σακχαρώδη διαβήτη. Αντιθέτως, η έλλειψη GH σχετίζεται με αυξημένη μάζα λιπώδους ιστού και μειωμένη άλιπη μάζα σώματος. Η αύξηση στο λιπώδη ιστό που διαπιστώνεται σε αυτά τα άτομα, συμβάλλει στην εμφάνιση ινσουλινοαντίστασης και υπερινσουλιναιμίας. (118) Ωστόσο, δεν έχει ακόμα διαλευκανθεί αν η αντίσταση στην ινσουλίνη σχετίζεται με τα μειωμένα επίπεδα GH. Η οξεία χορήγηση GΗ σε ενήλικες με έλλειψη GH προκαλεί μείωση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη και αύξηση στις συγκεντρώσεις γλυκόζης και ινσουλίνης στο πλάσμα. Η χρόνια χορήγηση GH αυξάνει την άλιπη μάζα σώματος και μειώνει τη λιπώδη μάζα, βελτιώνοντας την ινσουλινοευαισθησία (119). Η GΗ επίσης προάγει την κατακράτηση αζώτου, νατρίου, καλίου και φωσφόρου, ρυθμίζοντας με τον τρόπο αυτό το μεταβολισμό των μετάλλων και την ισορροπία των ηλεκτρολυτών. (120) Μοντέλα ζώων παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τις μεταβολικές δράσεις της GH. Διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν GH έχουν αυξημένο ρυθμό αύξησης και επίπεδα IGF-Ι, καθώς και μειωμένη λιπώδη μάζα. Σε αυτά τα ζώα είναι παρούσες επίσης ανωμαλίες όπως επηρεασμένη καρδιακή λειτουργία, υπέρταση, ανοσολογικές διαταραχές και αρθριτικές διαταραχές. Μεταβολικά, αυτά τα ζώα αναπτύσσουν σοβαρή ινσουλινοαντίσταση με υψηλά επίπεδα γλυκόζης και ινσουλίνης. (121) To προσδόκιμο επιβίωσης παρουσιάζει αρνητική συσχέτιση με τα κυκλοφορούντα επίπεδα GH. Ποντίκια που υπερεκφράζουν GH δε ζουν τόσο πολύ όσο τα φυσιολογικά αδέρφια τους, εμφανίζοντας συμπτώματα πρόωρης γήρανσης. (122) Είναι ενδιαφέρον ότι τα υψηλά επίπεδα ινσουλίνης και η κακή γλυκαιμική ρύθμιση αποτελούν παράγοντες κινδύνου για διάφορες νόσους που συνδέονται με την ηλικία στον άνθρωπο. (123) Οξειδωτικές διεργασίες είναι περισσότερο ενεργείς στα GH διαγονιδιακά ποντίκια, λόγω μειωμένης 35

36 δραστηριότητας ορισμένων αντιοξειδωτικών ενζύμων. (124) Αυτό θα μπορούσε να επηρεάζει αρνητικά τη διάρκεια ζωής των ποντικιών αυτών, καθότι είναι γνωστό ότι η οξειδωτική βλάβη παίζει καθοριστικό ρόλο στην κυτταρική γήρανση. (125) Έχει βρεθεί ότι η απαλοιφή του γονιδίου του IGF-Ι στο ήπαρ στα ποντίκια συνεπάγεται υψηλά επίπεδα GH και ινσουλίνης, (126) υπερπλασία των νησιδίων του παγκρέατος και ινσουλινοαντίσταση στο ήπαρ, στους μυς και στο λιπώδη ιστό. (127) Η αναστολή της δράσης της GH μετά από διασταύρωση των ποντικιών αυτών με διαγονιδιακά ποντίκια που παρουσιάζουν ανταγωνιστική δράση στην GH, βελτιώνει την ινσουλινοευαισθησία στο ήπαρ. Αυτή η παρατήρηση υποδηλώνει ότι η αύξηση των επιπέδων της GH στα ποντίκια με την απαλειφή του IGF-Ι γονιδίου παίζει μείζονα ρόλο στην ινσουλινοαντίσταση, (128) καθώς και ότι ο IGF-Ι αντιμάχεται τις διαβητογόνους δράσεις της GH. Η αυξητική ορμόνη έχει εντονότατη αναβολική δράση στο μεταβολισμό των πρωτεϊνών. Επάγει την πρωτεϊνοσύνεση σε πλήθος ιστών, όπως είναι οι μύες, τα ερυθρά αιμοσφαίρια, το ήπαρ και το δέρμα. Αυτό επιτυγχάνεται κυρίως μέσω της διευκόλυνσης της εισόδου των αμινοξέων εντός των κυττάρων, αλλά και μέσω διέγερσης του σχηματισμού RNA κι ενεργοποίησης των ριβοσωμάτων. Επιπλέον, η GH προκαλεί αυξημένη σύνθεση κολλαγόνου και χόνδρων Ρύθμιση γονιδίων Η ρύθμιση της μεταγραφής είναι από τις σπουδαιότερες δράσεις της GH στους ιστούς-στόχους. Αρκετά γονίδια έχει βρεθεί ότι ενεργοποιούνται από την GH. Aπό τα πρώτα που αναφέρθηκαν είναι ο Ιnsulin-like Growth Factor I (IGF-I). (129,130) Η σχέση ανάμεσα στην επαγώμενη από την GH ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου του IGF-Ι και της σωματικής αύξησης είναι αποδεδειγμένη. Οι μεταγραφικές δράσεις της GH ασκούνται από αρκετούς μεταγραφικούς παράγοντες. Mεταγραφικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην επαγώμενη από την GH έκφραση του IGF-I είναι ο HNF-1α και ο STAT5. (131,132) Ωστόσο, τα μονοπάτια που εμπλέκονται μπορεί να διαφέρουν στους διάφορους κυτταρικούς τύπους, δεδομένου ότι αναστολείς της ΡΙ3 κινάσης είτε αναστέλλουν είτε προάγουν την επαγώμενη από την GH μεταγραφή του IGF-I στα ηπατοκύτταρα και στα μυικά σωληνάρια, αντίστοιχα. (133,134) Η ανακάλυψη ότι ο Signal Transducer and Activator of Transcription 5 (STAT5) ενεργοποιείται από την GH μέσω της φωσφορυλίωσης του GHR, (135) αποτέλεσε σημαντική αφετηρία για την κατανόηση των μηχανισμών της μεταγραφικής ρύθμισης της GH. Απαλειφή του γονιδίου του STAT5b στα ποντίκια συνεπάγεται μείωση κατά 27% στο ρυθμό ανάπτυξης στα άρρενα και απώλεια του διμορφισμού των φύλων στην ανάπτυξη (136). Αυτά τα αποτελέσματα συνδέουν το μεταγραφικό παράγοντα STAT5 με τις δράσεις της GH. O SΤΑΤ5b προσδένεται στον υποκινητή και ρυθμίζει τη μεταγραφή του ηπατικού πυρηνικού παράγοντα 6 (hepatic nuclear factor 6/HNF-6), o oποίος ενεργοποιεί άλλα γονίδια που ρυθμίζονται από την GH. (137,138) O STAT5b μπορεί να αναστείλει τη μεταγραφή και τη δραστηριότητα του Peroxisome Proliferator-Activated Receptor alpha (PPARα), με πιθανή κατάληξη την επαγωγή 36

37 λιπογενών δράσεων στο ήπαρ. (139,140,141) Άλλα γονίδια σημαντικά για τη δράση της GH που ρυθμίζονται τουλάχιστον εν μέρει από την πρωτεΐνη STAT5 είναι: οι καταστολείς της σηματοδότησης των κυττοκινών (SOCS-1, -2, -3 και CIS) στο ήπαρ, ( ) o αναστολέας της πρωτεάσης της σερίνης (Spi) 2.1, (146,147) η υπομονάδα acid labile (ALS) του συμπλέγματος IGFBP-3, (148) η ινσουλίνη (σε κύτταρα ινσουλινώματος αρουραίων) (149) και ένας αριθμός γονιδίων του ηπατικού χρωμοσώματος Ρ450 που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των ενδογενών στεροειδών. (150,151) Η ενεργοποιούμενη από την GH έκφραση του γονιδίου c-fos διαμεσολαβείται εν μέρει από τα μονοπάτια STAT1/3 και ERK1/2. (152) Πρόσθετοι μεταγραφικοί παράγοντες που ενεργοποιούνται από την GH είναι οι : α, β, δ ισομορφές της οικογένειας C/EBP, HNF-1α, IRF-1, mttf1, c-jun και c-fos, Foxm1b, Runx2, Hoxa1, ear-2, TAFII Αυξητική ορμόνη και καρκίνος Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι εκτός από τις δράσεις της στην αύξηση και στο μεταβολισμό, η GH εμπλέκεται στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου. Η υπερέκφραση της GH έχει συσχετισθεί με καρκίνο σε μοντέλα ζώων, αλλά και στον άνθρωπο. Πράγματι, ασθενείς με ακρομεγαλία παρουσιάζουν αυξημένη επίπτωση καρκίνου. ( ) Αντιθέτως, η απουσία ή τα χαμηλά επίπεδα GH έχουν συσχετισθεί με μειωμένη τάση ανάπτυξης κακοηθειών. (156,157) Η αυξημένη τάση των διαγονιδιακών ποντικιών που υπερεκφράζουν GH να αναπτύξουν καρκίνο ήπατος θα μπορούσε να αποδοθεί σε αυξημένα επίπεδα κυκλοφορούντος IGF-Ι. Ωστόσο, ο IGF- Ι επάγει μεταβολικές δράσεις και μόνο μικρή αύξηση της σύνθεσης DNA στο ήπαρ. ( ) Επιπλέον, διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν IGF-Ι δεν παρουσιάζουν τις ηπατικές ιστοπαθολογικές μεταβολές που παρατηρούνται στο ήπαρ διαγονιδιακών ποντικιών που υπερεκφράζουν GH. (161) Ακόμα και όταν ενεργοποιούνται αντιαποπτωτικά μονοπάτια σε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν GH, το κύριο σηματοδοτικό μονοπάτι της GH, αυτό των JAK2/STAT5, είναι απευαισθητοποιημένο στο ήπαρ. (162,163) Αυτό υποδηλώνει ότι αυτό το μονοπάτι δεν εμπλέκεται στην πολλαπλασιαστική δράση της υπερεκφραζόμενης GH. Mια πιθανή εξήγηση είναι ο ρυθμιστικός ρόλος της GH στη δράση ηπατικών μιτογόνων, όπως ο EGF. Έχει περιγραφεί ότι η GH ρυθμίζει την έκφραση του EGFR. (164) Επίσης, η ποσότητα του EGFR βρέθηκε αυξημένη σε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερέκφραζαν GH. (165) 1.8 Τρόποι δράσης της Αυξητικής Ορμόνης Η αυξητική ορμόνη προάγει τη σύνθεση κι έκκριση αυξητικών παραγόντων, οι πιο σημαντικοί από τους οποίους είναι οι σωματομεδίνες ή ινσουλινόμορφοι αυξητικοί 37

38 παράγοντες IGF (IGF-I, IGF-II). Οι παράγοντες αυτοί μοιάζουν δομικά με την προϊνσουλίνη. Σημαντικότερoς εξ αυτών είναι ο IGF-I. Έχει βρεθεί σε ηπατοκύτταρα ότι τα κύρια σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται από την GH έχουν ως κατάληξη την έκφραση του mrna του IGF-I και την έκκρισή του. Εκτός από την άμεση δράση της σε διάφορους ιστούς και όργανα, η GH ασκεί πολλές από τις δράσεις της μέσω του ΙGF-Ι. O IGF-Ι παράγεται σε πολλούς ιστούς, κυρίως στο ήπαρ, και δρα μέσω του δικού του υποδοχέα, προάγοντας τον πολλαπλασιασμό και την ωρίμανση πολλών ιστών, όπως τα οστά, οι χόνδροι και οι σκελετικοί μύες. (166) Εικόνα 16. Άμεση κι έμμεση δράση της GH Σχηματικά, οι δράσεις της GH αποδίδονται παρακάτω: ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ (ΑΜΕΣΗ ΔΡΑΣΗ) ΗΠΑΡ - Πρωτεϊνική σύνθεση - Γλυκονεογένεση - Σύνθεση mrna IGF- I - Χρησιμοποίηση γλυκόζης ΜΥΕΣ - Πρόσληψη αμινοξέων - Πρωτεϊνική σύνθεση - Άλιπη σωματική μάζα - Mείωση πρόσληψης γλυκόζης ΛΙΠΩΔΗΣ ΙΣΤΟΣ - Λιπόλυση - Παραγωγή ελεύθερων λιπαρών οξέων 38

39 ΑΥΞΗΤΙΚΗ ΟΡΜΟΝΗ (ΕΜΜΕΣΗ ΔΡΑΣΗ) ΗΠΑΡ IGF-I ΗΠΑΡ - Σύνθεση DNA/RNA - Πρωτεϊνική σύνθεση - Αύξηση - Κολλαγόνο AΛΛΟΙ ΙΣΤΟΙ (Οστά, καρδιά, ενδοκρινή/εξωκρινή όργανα) - Σύνθεση DNA/RNA - Πρωτεϊνική σύνθεση - Υπερτροφία και υπερπλασία κυττάρων Ο ινσουλινόμορφος Αυξητικός Παράγων Ι (IGF-I) Ο IGF-I ονομάζεται επίσης σωματομεδίνη C και είναι σημαντικός ρυθμιστής της σωματικής αύξησης και πρωταρχικός μεσολαβητής των δράσεων της αυξητικής ορμόνης. Παίζει σημαντικό ρόλο στη γραμμική αύξηση, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στη διαφοροποίηση και στην απόπτωση. Έχει μοριακό βάρος daltons και αποτελείται από 70 αμινοξέα σε μία μονή αλυσίδα με τρεις ενδομοριακές δισουλφιδικές γέφυρες. Εικόνα 17. Τρισδιάστατη απεικόνιση του μορίου του IGF-I Ο IGF-I παράγεται κυρίως στο ήπαρ ως ορμόνη με ενδοκρινή δράση, καθώς και στους ιστούς-στόχους με παρακρινή/αυτοκρινή δράση. Η παραγωγή του διεγείρεται 39

40 από την αυξητική ορμόνη και μπορεί να παρεμποδισθεί από τον υποσιτισμό, τη μειωμένη ευαισθησία στην αυξητική ορμόνη, την έλλειψη των υποδοχέων της αυξητικής ορμόνης ή από διαταραχές στο σηματοδοτικό μονοπάτι μετά τον υποδοχέα. Περίπου το 98% του IGF-I είναι προσδεδεμένο σε μία από τις 6 συνδετικές πρωτεΐνες (IGF-BP). H IGFBP-3 είναι η αφθονότερη δεσμευτική πρωτεΐνη και καταλαμβάνει το 80% της συνολικής πρόσδεσης του IGF-I. O IGF-I προσδένεται στην IGFBP-3 με αναλογία 1:1. Στην κυκλοφορία, o IGF-I είναι παρών ως συμπλέγματα των 150kDa, που αποτελούνται από τον IGF-I, την IGFBP-3 ή -5 και μία γλυκοπρωτεΐνη 85kDa, την acid-labile subunit (ALS). Η παρουσία της ALS μετά τη γέννηση συνδυάζεται με αυξημένη απόκριση στην GH, λόγω αύξησης της έκκρισης της GH και των ηπατικών υποδοχέων GHR. H πρωταρχική δράση του IGF-I διαμεσολαβείται από την πρόσδεσή του στον ειδικό υποδοχέα του, τον Insulin-like Growth Factor I Receptor/IGF-IR, ο οποίος είναι παρών σε πολλούς κυτταρικούς τύπους σε πολλούς ιστούς. Η πρόσδεση στον IGF-IR, έναν υποδοχέα με δράση τυροσιν-κινάσης, πυροδοτεί την ενδοκυττάρια σηματοδότηση. Ο IGF-I είναι ισχυρός φυσικός ενεργοποιητής του σηματοδοτικού μονοπατιού της AKT, δηλαδή ενός διεγέρτη της κυτταρικής αύξησης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, αλλά κι ενός εν δυνάμει αναστολέα του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Εικόνα 18. Ο υποδοχέας IGF-IR Αρκετές μελέτες έχουν αποδείξει την έκφραση και την κατανομή των υποδοχέων της GH και του IGF-I στον εγκέφαλο. Αν και η υπόφυση θεωρείται η αποκλειστική πηγή της GH στο αίμα και ο παραγώμενος στο ήπαρ IGF-I αποτελεί τη μεγαλύτερη ποσότητα του κυκλοφορούντος IGF-I, έχει προταθεί από μελέτες η τοπική παραγωγή τόσο της GH όσο και του IGF-I σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου. Ποντίκια με απαλοιφή του γονιδίου του IGF-Ι φτάνουν το 40% της αύξησης που παρατηρείται στα ποντίκια του «άγριου τύπου», (167,168) ενώ ποντίκια με διαταραχή στον υποδοχέα του IGF-I (IGF-IR) πεθαίνουν στη γέννηση έχοντας κατά 55% μειωμένο βάρος. (169) Η ηπατική παραγωγή του IGF-Ι, που βρίσκεται υπό τον έλεγχο της GH, είναι κατεξοχήν υπεύθυνη για τα κυκλοφορούντα επίπεδα του IGF-Ι. (170) H απαλοιφή του γονιδίου του IGF-Ι στο ήπαρ μειώνει τα κυκλοφορούντα επίπεδα του IGF-Ι κατά 65%, αλλά δεν επηρεάζει την αύξηση. (171) Περαιτέρω μείωση στο 15% των φυσιολογικών επιπέδων μπορεί να επιτευχθεί με απαλοιφή της υπομονάδας Acid 40

41 Labile Subunit (ALS), οδηγώντας σε σημαντική μείωση του μήκους του σώματος. (172) Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι μία ελάχιστη συγκέντρωση κυκλοφορούντος IGF-Ι απαιτείται για την αύξηση και ότι ο εξωηπατικός IGF-Ι, που επίσης παράγεται ως απάντηση στην GH, συνεισφέρει σημαντικά στη σωματική αύξηση. (173) Η GH ορμόνη επομένως, δρα άμεσα και έμμεσα, μέσω τοπικά ή συστηματικά παραγόμενου IGF-I. Δεδομένου ότι τα επίπεδα του IGF-I στο αίμα δεν παρουσιάζουν μεγάλες διακυμάνσεις κατά τη διάρκεια της ημέρας για το ίδιο άτομο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δοκιμασία ελέγχου για την ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης ή για την περίσσεια αυξητικής ορμόνης στην ακρομεγαλία και στο γιγαντισμό. Η ερμηνεία των επιπέδων του IGF-I περιπλέκεται από το μεγάλο εύρος των φυσιολογικών τιμών και από τις παραλλαγές λόγω ηλικίας, φύλου και σταδίου ήβης. Κλινικά σημαντικές καταστάσεις μπορεί να συγκαλυφθούν από το μεγάλο εύρος των φυσιολογικών τιμών. Εικόνα 19. Οι άξονες GH IGF-I Ο ινσουλινόμορφος Αυξητικός Παράγων ΙΙ (IGF-ΙI) Ο IGF-II είναι ένα πολυπεπτίδιο 7500 dalton με 75% ομολογία με τον IGF-I και όπως και ο IGF-I παράγεται σε πολλούς ιστούς. Ο IGF-II έχει μεγαλύτερη ομοιότητα με την ινσουλίνη στον τρόπο δράσης του κι έχει επιπλέον ρυθμιστικές της αύξησης δράσεις, αλλά και μιτογόνο δραστηριότητα. Τα επίπεδά του εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό, αλλά όχι απόλυτα, από την αυξητική ορμόνη και θεωρείται μείζων αυξητικός παράγων κατά την εμβρυική ζωή, σε αντίθεση με τον IGF-I που είναι μείζων αυξητικός παράγων κατά την ενήλικο ζωή. 41

42 1.9 Aνεπάρκεια αύξησης Η ανεπάρκεια αύξησης είναι ο όρος που περιγράφει μικρότερη ταχύτητα ανάπτυξης από την αναμενόμενη για την ηλικία. Η ταχύτητα ανάπτυξης είναι ο ρυθμός με τον οποίο ψηλώνει ένα παιδί από την ηλικία των 4 ετών έως την έναρξη της εφηβείας (φυσιολογικά: 5-7 εκατοστά/έτος). Το κοντό ανάστημα μπορεί να αποτελεί τη φυσιολογική έκφραση του γενετικού δυναμικού και στην περίπτωση αυτή η ταχύτητα ανάπτυξης είναι φυσιολογική, ή μπορεί να είναι το αποτέλεσμα κάποιας κατάστασης που προκαλεί ανεπάρκεια αύξησης, με ταχύτητα ανάπτυξης μικρότερη από τη φυσιολογική. Ένα παιδί θεωρείται κοντό αν το ύψος του είναι κάτω από την 3 η εκατοστιαία θέση ή, εναλλακτικά, αν το ύψος του βρίσκεται περισσότερο από 2 σταθερές αποκλίσεις υπό του μέσου ύψους παιδιών ίδιας ηλικίας, φύλου, φυλής και κοινωνικοοικονομικής κατάστασης. Πολλά από τα παιδιά με κοντό ανάστημα έχουν φυσιολογική ταχύτητα ανάπτυξης. Σε αυτά συμπεριλαμβάνονται παιδιά με οικογενές κοντό ανάστημα ή ιδιοσυστασιακή καθυστέρηση της ήβης και της αύξησης. Προκειμένου να διατηρηθεί η ίδια εκατοστιαία θέση στην καμπύλη ανάπτυξης, η ταχύτητα ανάπτυξης πρέπει να βρίσκεται τουλάχιστον στην 25 η εκατοστιαία θέση. Από όλα τα παιδιά με κοντό ανάστημα, μόνο μερικά έχουν σαφή και θεραπεύσιμη διάγνωση. Τα περισσότερα από αυτά τα παιδιά έχουν χαμηλή ταχύτητα ανάπτυξης. Τα αίτια του κοντού αναστήματος είναι τα ακόλουθα: AITIA KONTOY ΑΝΑΣΤΗΜΑΤΟΣ Οικογενές κοντό ανάστημα Ανεπάρκεια αντίσταση GH, IGF-I Ιδιοσυστασιακή ήβης και ανάπτυξης καθυστέρηση Υποθυρεοειδισμός, πρώιμη ήβη, Σ.Δ., σ. Cushing Ιδιοπαθές (μη οικογενές) κοντό ανάστημα SGA, IUGR Ψυχοκοινωνικός νανισμός Χρόνιες νόσοι (ΦΝΕ, Δυσαπορρόφηση, Ηπατική ανεπάρκεια, Άσθμα, ΚΙ, ΧΝΑ, ΒΠΔ, Συγ. κυανωτικές καρδιοπάθειες, αιμολ. αναιμία, λοιμώξεις) Μεταβολικές διαταραχές (γλυκογονιάσεις, λιπιδώσεις, φαινυλκετονουρία) Χρόνιος υποσιτισμός Σκελετικές δυσπλασίες (αχονδροπλασία, υποχονδροπλασία, ατελής οστεογένεση) Σύνδρομα (Turner, Down, Noonan, Prader-Willi, Laurence-Moon-Biedl, Russel-Silver, Bloom, Williams, Rubinstein-Taybi) 42

43 1.10 Αίτια ανεπάρκειας Αυξητικής Ορμόνης Η ανεπάρκεια αυξητικής ορμόνης περιγράφει την κατάσταση στην οποία η υπόφυση αδυνατεί να παράξει ή να απελευθερώσει την ορμόνη σε ικανοποιητικές ποσότητες. Λαμβάνοντας υπόψη τις πολλαπλές δράσεις της αυξητικής ορμόνης σε όλο τον οργανισμό, η έλλειψή της έχει πολλαπλές συνέπειες, όπως είναι η αδυναμία δημιουργίας αρκετών νέων πρωτεϊνών, απαραίτητων για τη μυική ανάπτυξη, η αδυναμία διέγερσης της παραγωγής ορμονών, όπως ο ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγων Ι και η αδυναμία φυσιολογικής ανάπτυξης και ωρίμανσης. Τα αίτια ανεπάρκειας της Αυξητικής Ορμόνης διακρίνονται σε συγγενή κι επίκτητα Κλινικές εκδηλώσεις ανεπάρκειας της Αυξητικής Ορμόνης Η ανεπαρκής έκκριση της αυξητικής ορμόνης προκαλεί τον υποφυσιακό νανισμό, που χαρακτηρίζεται από πολύ χαμηλό ανάστημα. Ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης μπορεί να εμφανιστεί σε κάθε ηλικία, είναι όμως μεγαλύτερες οι επιπτώσεις κατά τη διάρκεια της σωματικής αύξησης, λόγω του τελικού κοντού αναστήματος και της καθυστέρησης της οστικής ηλικίας. Επιπρόσθετα, στις πολύ νεαρές ηλικίες η ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης μπορεί να προκαλέσει σοβαρά υπογλυκαιμικά επεισόδια. 43

44 Mεγάλα ποσά GH χρειάζονται κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας για τη διατήρηση της φυσιολογικής αύξησης. Νεογνά με ανεπάρκεια GH έχουν συνήθως φυσιολογικό μήκος και βάρος. Μερικά μπορεί να έχουν μικρό πέος ή υπογλυκαιμία νηστείας, καθώς και χαμηλή κατά μήκος αύξηση, η οποία επιβραδύνεται με την πρόοδο της ηλικίας. Στην περίπτωση της μεμονωμένης ανεπάρκειας GH (Isolated Growth Hormone Deficiency/IGHD), η σκελετική ωρίμανση είναι συνήθως καθυστερημένη συγκριτικά με την καθυστέρηση του ύψους. Τα χαρακτηριστικά είναι συνήθως αρμονικά, αν και συχνά συνυπάρχουν κεντρική παχυσαρκία ή πλαδαρότητα, νεότερη εμφάνιση προσώπου από την αναμενόμενη για τη χρονολογική ηλικία, καθυστερημένη εμφάνιση μόνιμων οδόντων και υψίσυχνη φωνή. Ο μυικός όγκος είναι μειωμένος, η δε ευφυία βρίσκεται στις περισσότερες περιπτώσεις εντός των φυσιολογικών πλαισίων. Μπορεί επίσης να υπάρχει καθυστέρηση ήβης, αλλά η γονιμότητα δεν επηρεάζεται. Στην ενήλικο ζωή μπορεί να βρεθούν μεταβολές του δέρματος παρόμοιες με αυτές που συναντώνται σε πρόωρη γήρανση. Στις περιπτώσεις της συνδυασμένης ανεπάρκειας της GH (Combined Growth Hormone Deficiency/CGHD) είναι δυνατόν να συνυπάρχουν λαγόχειλο ή λυκόστομα, υποπλασία του οπτικού νεύρου και καθυστερημένη σεξουαλική ωρίμανση στην εφηβεία. Οι περισσότερες περιπτώσεις ανεπάρκειας GH είναι σποραδικές. Μπορεί να οφείλονται σε εγκεφαλικές διαταραχές, όπως εγκεφαλικό οίδημα, χρωμοσωμικές ανωμαλίες, ιστιοκύττωση, λοιμώξεις, ακτινοβολία, τραύματα της κεφαλής ή όγκους στον υποθάλαμο ή στην υπόφυση. Η Μαγνητική Τομογραφία ανιχνεύει υποθαλαμικές ή υποφυσιακές ανωμαλίες σε ποσοστό 12% των ασθενών με IGHD. H έναρξη και η εξέλιξη της ανεπάρκειας της αυξητικής ορμόνης εξαρτάται από την αιτία. Σε παιδιά με συγγενή ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης η ανεπάρκεια της κατά μήκος αύξησης συνήθως εμφανίζεται κατά το πρώτο ή δεύτερο έτος της ζωής, αλλά η πάθηση διαγιγνώσκεται αργότερα στις περισσότερες περιπτώσεις. Όταν η ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης είναι επίκτητη και παρουσιάζεται αργά κατά την παιδική ηλικία, η διάγνωση τίθεται αργότερα. Σε κάθε περίπτωση, υπάρχει πολύ αργός ρυθμός αύξησης. Αν και το κοντό ανάστημα, η καθυστερημένη ταχύτητα αύξησης και η καθυστερημένη σκελετική ωρίμανση είναι όλα ευρήματα της ανεπάρκειας της GH, κανένα από αυτά δεν είναι ειδικό της διαταραχής αυτής. Οι ασθενείς πρέπει να ελέγχονται για άλλες συστηματικές νόσους πριν την πραγματοποίηση προκλητών δοκιμασιών για ανεπάρκεια GH. Επίσης, πρέπει να γίνεται έλεγχος για συνυπάρχουσες ανεπάρκειες των LH, FSH, TSH, ACTH, ώστε ο προγραμματισμός της θεραπείας να είναι ο κατάλληλος. Είναι διαθέσιμη ανασυνδυασμένη GH που χορηγείται υποδόρια. Σε παιδιά με IGHD ή CGHD η χορήγηση ανασυνδυασμένης GH ως θεραπεία υποκατάστασης είναι καλό να αρχίζει το συντομότερο από τη στιγμή της διάγνωσης. Η κλινική ανταπόκριση εξαρτάται από τη διαταραχή καθεαυτή, τη σοβαρότητα της κατάστασης και την ηλικία έναρξης της θεραπείας, από την ανταπόκριση άλλων πιθανών ανεπαρκειών στη θεραπεία, όπως είναι η ανεπάρκεια θυρεοειδικών ορμονών, και από την ανάπτυξη πιθανών επιπλοκών, όπως αντι-gh αντισώματα. Ο χαρακτηρισμός της 44

45 οικογενούς IGHD σε μοριακό γενετικό επίπεδο είναι σημαντικός για διάφορους λόγους. Η αναγνώριση της εμπλεκόμενης γονιδιακής περιοχής υποδεικνύει την πιθανή σοβαρότητα της καθυστέρησης της αύξησης, αλλά και την καταλληλότητα διάφορων θεραπευτικών επιλογών. Μπορεί επίσης να έχει προγνωστική αξία για τη σοβαρότητα της καθυστέρησης της αύξησης και την πιθανότητα ανάπτυξης αντισωμάτων αντι-gh μετά από θεραπεία με GH. (174) 1.12 Κλινικές οντότητες ανεπάρκειας αύξησης Διαταραχές στην υποφυσιακή έκκριση GH, στον αριθμό ή τη λειτουργία των υποδοχέων GHR, στη μετά τον υποδοχέα μεταγωγή του σήματος ή στη σύνθεση του του IGF-I, συνήθως καταλήγουν σε μειωμένη γραμμική αύξηση Κλασσική ανεπάρκεια Αυξητικής Ορμόνης Στην κλασσική ανεπάρκεια της GH η υπόφυση περιέχει επαρκείς ποσότητες της ορμόνης, ωστόσο η ανεπάρκεια προκαλείται από την ανεπαρκή διέγερση της απελευθέρωσης της αυξητικής ορμόνης, λόγω ανεπάρκειας του παράγοντα απελευθέρωσης της αυξητικής ορμόνης (GHRH). Τα παιδιά με GHD έχουν μειωμένο ρυθμό αύξησης και καθυστερημένη οστική ηλικία. Η κλασσική ανεπάρκεια της GH χαρακτηρίζεται από σοβαρό κοντό ανάστημα με χαμηλές συγκεντρώσεις GH (< 10 ng/ml) μετά από φαρμακολογική πρόκληση με παράγοντες όπως είναι η κλονιδίνη, η L-Dopa, η ινσουλίνη και η γλυκαγόνη. Τα επίπεδα IGF-I είναι χαμηλά και αποκαθίστανται μετά από εξωγενή χορήγηση GH κατά το IGF-I generation test. Σοβαρό κοντό ανάστημα ρυθμός αύξησης κ.φ. βάρος σώματος Καθυστερημένη οστική ηλικία IGF-I Φαρμακολογική πρόκληση: GH<10ng/ml (x2) IGF-I generation test: αποκατάσταση IGF-I Εικόνα 20. Τα χαρακτηριστικά της κλασσικής ανεπάρκειας της GH (GHD). Δίδυμα αδέρφια. Ασθενής με κλασσική ανεπάρκεια GH (αριστερά) 45

46 Νευροεκκριτική δυσλειτουργία της Αυξητικής Ορμόνης (Growth Hormone Neurosecretory Dysfunction / GHND) Η Νευροεκκριτική Δυσλειτουργία της Αυξητικής Ορμόνης (GHND) περιγράφηκε από τη Spiliotis και συν. το Χαρακτηρίζεται από σοβαρό κοντό ανάστημα με ύψος περισσότερο από δύο σταθερές αποκλίσεις κάτω από το μέσο όρο, παθολογική ταχύτητα αύξησης, σοβαρή καθυστέρηση της οστικής ηλικίας (2 ή περισσότερα έτη), φυσιολογικές συγκεντρώσεις GH μετά από φαρμακολογική πρόκληση (μέγιστη τιμή μεγαλύτερη από 10 ng/ml), χαμηλές συγκεντρώσεις IGF-I και παθολογικούς ρυθμούς 24ωρης αυθόρμητης έκκρισης GH. Στους ασθενείς αυτούς παρατηρείται μείωση του αριθμού και του εύρους των εκκριτικών αιχμών της GH στο 24ωρο, καθώς και μείωση της συνολικής ποσότητας της GH στο 24ωρο, συγκριτικά με τα φυσιολογικά άτομα. Η ακριβής διαταραχή στην GHND δεν έχει προσδιορισθεί. Πρόκειται πιθανώς για διαταραχή στη νευρορρύθμιση της υπόφυσης από τον υποθάλαμο ή από τα ανώτερα εγκεφαλικά κέντρα. Πιθανολογούνται γενετικές διαταραχές που επηρεάζουν την έκκριση νευροδιαβιβαστών, οι οποίοι ελέγχουν την έκκριση του GHRH και της σωματοστατίνης. Όπως συμβαίνει και με τα παιδιά με την κλασσική ανεπάρκεια GH, τα παιδιά με GHND αυξάνουν την ταχύτητα αύξησής τους μετά την εξωγενή χορήγηση βιοσυνθετικής ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης, (hgh), παρουσιάζοντας αξιοσημείωτη αναπλήρωση της αύξησης μέχρι να φτάσουν το ύψος του ενήλικα. ( ) Σοβαρό κοντό ανάστημα ρυθμός αύξησης κ.φ. βάρος σώματος Καθυστερημένη οστική ηλικία IGF-I Φαρμακολογική πρόκληση: κ.φ. (GH>10ng/ml) τιμή 24ωρης έκκρισης GH IGF-I generation test: Αυξημένη ανταπόκριση ( %) Εικόνα 21. Τα χαρακτηριστικά της νευροεκκριτικής δυσλειτουργίας της GH (GHND)- Ασθενής με GHND 46

47 Ιδιοπαθές κοντό ανάστημα Στην κατηγορία του ιδιοπαθούς κοντού αναστήματος εντάσσονται παιδιά με αδιευκρίνιστης αιτιολογίας κοντό ανάστημα. O όρος ιδιοπαθές κοντό ανάστημα (Ιdiopathic Short Stature/ISS) αναφέρεται σε ένα μεγάλο εύρος κοντών παιδιών με οικογενές κοντό ανάστημα, με καθυστέρηση στην αύξηση ή που είναι κοντά για το προβλεπόμενο ύψος με βάση το ύψος των γονέων. Μερικά από αυτά μπορεί να έχουν κάποια μη αναγνωρισμένη ενδοκρινολογική διαταραχή. (178) To ιδιοπαθές κοντό ανάστημα στα παιδιά χαρακτηρίζεται από φυσιολογική ή καθυστερημένη ταχύτητα αύξησης, ύψος περισσότερο από δύο σταθερές αποκλίσεις κάτω του μέσου όρου, φυσιολογικό βάρος γέννησης, απουσία ενδοκρινικών διαταραχών και μη αποδεδειγμένη φυσική ή ψυχολογική νόσο. (179) Όταν η ταχύτητα αύξησης είναι καθυστερημένη, ωστόσο, είναι σημαντικό να αποκλεισθεί η ανεπάρκεια αυξητικής ορμόνης προτού διαγνωσθεί το ιδιοπαθές κοντό ανάστημα. Και τούτο διότι η GH είναι κρίσιμη όχι μόνο για τη σκελετική αύξηση, αλλά και για την ομοιοστασία των πρωτεϊνών, λιπιδίων και υδατανθράκων, όπως και για την ισορροπία ύδατος-ηλεκτρολυτών, επομένως η ανεπάρκειά της μπορεί να προκαλέσει μεταβολικά προβλήματα. (180) Η διαγνωστική κατηγορία του ιδιοπαθούς κοντού αναστήματος αντιπροσωπεύει μία ετερογενή ομάδα γενετικών διαταραχών. Υποψήφια γονίδια προς μελέτη είναι τα GH1, GHR, JAK2, STAT5b, IGF-I, IGFR και άλλα γονίδια του σηματοδοτικού μονοπατιού της GH. (181) Εικόνα 22. Ιδιοπαθές κοντό ανάστημα Σύνδρομο Αντίστασης στην Αυξητική Ορμόνη (Growth Hormone Insensitivity Syndrome / GHIS) Το σύνδρομο αντίστασης στην GH (GHIS) είναι μία άλλη αιτία σοβαρού κοντού αναστήματος με καθυστέρηση στην ταχύτητα αύξησης, που μπορεί να θεωρηθεί λαθεμένα ιδιοπαθές κοντό ανάστημα. Στο σύνδρομο αυτό, υπάρχουν φυσιολογικές ή αυξημένες συγκεντρώσεις GH στον ορό λόγω διαταραχής στον υποδοχέα της GH (GHR) ή στο ενδοκυττάριο μονοπάτι μετά το επίπεδο του υποδοχέα. Η εξωγενώς χορηγούμενη GH αποτυγχάνει να αυξήσει τις παθολογικά χαμηλές συγκεντρώσεις του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα Ι (IGF-I), όπως επίσης δεν είναι ικανή να 47

48 αυξήσει τη μειωμένη ταχύτητα αύξησης στα παιδιά με σύνδρομο αντίστασης στην GH. H πλειονότητα των ασθενών με σύνδρομο αντίστασης στην GH έχει χαμηλές συγκεντρώσεις της προσδενόμενης στην GH πρωτεΐνης (GHBP), λόγω μεταλλάξεων ή απαλοιφών στο γονίδιο του GHR ( ) αν και μεταλλάξεις σε αυτό το γονίδιο μπορεί να βρεθούν και σε ασθενείς με το σύνδρομο που έχουν φυσιολογικά ή αυξημένα επίπεδα GHBP. ( ) Έχει βρεθεί ένας ασθενής με σύνδρομο GHIS και μετάλλαξη στο γονίδιο της πρωτεΐνης STAT5b, (192) το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγώμενη από την GH ενεργοποίηση του IGF-I. (193,194) Παιδιά με GHIS έχουν τα εξής χαρακτηριστικά: Σοβαρό κοντό ανάστημα (ύψος < 3 η % θέση) Χαμηλό IGF-I Φυσιολογική τιμή GH (ΦΤ: 10 ng/ml) μετά από φαρμακολογική πρόκληση Φυσιολογική 24ωρη έκκριση της GH Μειωμένη ανταπόκριση IGF-I μετά από 4 ημέρες χορήγησης hgh (IGF-I Generation Test: < 30 % αύξηση) Οι ασθενείς με GHIS έχουν τα ίδια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά με τους ασθενείς με κλασσική ανεπάρκεια της GH, αν και τείνουν να έχουν δυσμορφικά χαρακτηριστικά, όπως είναι αραιά μαλλιά, προέχον μέτωπο, μικρό πιγούνι. Άλλα χαρακτηριστικά που έχουν περιγραφεί είναι μπλε σκληροί χιτώνες των οφθαλμών, μικρό πέος, νεογνική υπογλυκαιμία. Η καθυστέρηση αύξησης είναι εμφανής ήδη από τη γέννηση, γεγονός που αποδεικνύει ότι ο IGF-I είναι απαραίτητος και για την ενδομήτρια αύξηση. Μελέτες έχουν δείξει ότι περίπου 25% των παιδιών με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα (ISS) έχουν πρωτοπαθή ανεπάρκεια IGF (IGFD), δηλαδή χαμηλές συγκεντρώσεις IGF-I στο αίμα, με φυσιολογική έκκριση GH. H πρωτοπαθής ανεπάρκεια IGF (IGFD) μπορεί να οφείλεται σε 3 κατηγορίες μοριακών διαταραχών: 1) Μειωμένη ευαισθησία στην GH λόγω μεταλλάξεων στο γονίδιο του GHR (κλασικό σύνδρομο Laron), 2) γονιδιακές διαταραχές που αφορούν την Janus kinase-2 (JAK-2) ή τον STAT5b του σηματοδοτικού μονοπατιού της GH και 3) μεταλλάξεις στο γονίδιο του IGF-I. Μεταλλάξεις στο γονίδιο του GHR μπορούν να προκαλέσουν ιδιοπαθές κοντό ανάστημα (ISS), επηρεάζοντας τη λειτουργία του υποδοχέα GHR. Στο ένα άκρο, οι μεταλλάξεις που αναστέλλουν πλήρως τη λειτουργία του GHR σχετίζονται με πλήρες σύνδρομο αντίστασης στην GH, ή σύνδρομο Laron, ενώ έχει υποτεθεί ότι λιγότερο διασπαστικές μεταλλάξεις θα μπορούσαν να προκαλέσουν μερικό σύνδρομο αντίστασης στην GH. (195) Τα περισσότερα παιδιά με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα ανταποκρίνονται στη θεραπεία με GH με αύξηση στο ρυθμό αύξησής τους, αλλά η ανταπόκριση αυτή είναι μικρότερη από αυτή που παρατηρείται σε ασθενείς με ανεπάρκεια GH που θεραπεύονται με GH, υποδηλώνοντας πως οι ασθενείς με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα παρουσιάζουν μερική αντίσταση στην GH. Oι ετερόζυγες μεταλλάξεις του γονιδίου του GHR δεν είναι συχνή αιτία ιδιοπαθούς κοντού αναστήματος. Μεταλλάξεις στο 48

49 γονίδιο GHR ήταν παρούσες σε ποσοστό περίπου 30% των ατόμων που επιλέχθηκαν για κοντό ανάστημα (ύψος 2 SD) με χαμηλά επίπεδα GHBP ή IGF-I και χαμηλό ρυθμό αύξησης, ενώ σε κοντά παιδιά με επαρκή επίπεδα GH ήταν παρούσες σε ποσοστό 2%. Μία ταξινόμηση της αντίστασης της GH είναι η ακόλουθη: Α) Πρωτοπαθής (π.χ. Σ. Laron, κληρονομικές και/ή συγγενείς διαταραχές) - Διαταραχές του GHR (ποιοτικές και ποσοτικές) - Διαταραχές της μεταβίβασης του σήματος της GH (μετά το επίπεδο του υποδοχέα) - Πρωτοπαθείς διαταραχές της σύνθεσης ή έκκρισης του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα) Β) Δευτεροπαθής (επίκτητες καταστάσεις) - Κυκλοφορούντα αντισώματα έναντι της GH που αναστέλλουν τη δράση της GH - Aντισώματα έναντι του GHR - Δευτεροπαθείς διαταραχές της σύνθεσης του IGF-I - Yποσιτισμός - Ηπατική νόσος Σύνδρομο Laron Το Σ. Laron είναι μια οικογενής διαταραχή με αυτοσωματική μορφή κληρονομικότητας. To 1966 στο Ισραήλ ο Zvi Laron και οι συνεργάτες του ανέφεραν μία γενετική μορφή νανισμού σε 3 αδέρφια εβραϊκής καταγωγής, με κλινικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά ανεπάρκειας αυξητικής ορμόνης (GHD), αλλά με «αφύσικα υψηλές συγκεντρώσεις ανοσοαντιδρώσας αυξητικής ορμόνης ορού». Η υποκείμενη διαταραχή θεωρήθηκε αρχικά ότι ήταν ενδογενής διαταραχή στη σύνθεση της αυξητικής ορμόνης με αποτέλεσμα ανοσολογικά ανιχνεύσιμη αλλά μεταβολικά ανενεργή GH. Μέσα σε 2 χρόνια, αναγνωρίσθηκαν 19 επιπλέον Ισραηλινοί ασθενείς με Ασιατική Εβραϊκή καταγωγή. Στην πορεία αναγνωρίσθηκαν διεθνώς περισσότεροι από 250 ασθενείς, από τους οποίους η συντριπτική πλειοψηφία είχε Εβραϊκές ή Μεσογειακές ρίζες. Στο σύνδρομο Laron η αντίσταση στην αυξητική ορμόνη οφείλεται συνήθως σε μεταλλάξεις στο εξωκυττάριο τμήμα του υποδοχέα της αυξητικής ορμόνης, το οποίο έχει πανομοιότυπη αλληλουχία με την Growth Hormone-Binding Protein (GHBP). Στοιχεία από τη μελέτη οικογενειών με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα φανερώνουν ότι οι μεταλλάξεις στο εξωκυττάριο ή ενδοκυττάριο τμήμα του υποδοχέα GHR έχουν ένα εύρος φαινοτύπων, υποστηρίζοντας την άποψη ότι η έκφραση των ετερόζυγων μεταλλάξεων ως μερικό σύνδρομο αντίστασης στην GH εξαρτάται από το γενετικό υπόβαθρο του κάθε ατόμου. Έχουν επίσης περιγραφεί μεταλλάξεις που καταλήγουν σε παθολογικό διμερισμό του GHR ή διαταραγμένη μεταβίβαση του σήματος GH-GHR. 49

50 Σοβαρό κοντό ανάστημα ρυθμός αύξησης κ.φ. βάρος σώματος GH: κ.φ. ή IGF-I Φαρμακολογική πρόκληση:κ.φ. (GH>10ng/ml) κ.φ. τιμή 24ωρης έκκρισης GH IGF-I generation test: <30% ανταπόκριση Εικόνα 23. Τα χαρακτηριστικά του σ. Laron Ασθενής με σ. Laron Στις περιπτώσεις αυτές, τα κυκλοφορούντα επίπεδα του IGF-I είναι πολύ χαμηλά και δεν υπάρχει αρνητική ανατροφοδότηση σε επίπεδο υπόφυσης. Επομένως, υψηλά επίπεδα GH εκκρίνονται από την υπόφυση, υποδηλώνοντας μία κατάσταση μειωμένης ευαισθησίας. Επιπλέον, η GH δεν ανευρίσκεται στο αίμα συνδεόμενη με την GH δεσμευτική πρωτεΐνη (GH-binding protein), καθότι αυτή προέρχεται από την αποκοπή του εξωκυττάριου τμήματος του υποδοχέα από την κυτταρική επιφάνεια. Ωστόσο, η συγγενώς μειωμένη ευαισθησία στην GH μπορεί να εμφανισθεί με ένα ευρύ φάσμα φαινοτύπων. Ένας ηπιότερος φαινότυπος έχει συσχετισθεί με την εισαγωγή ενός ψευδο-εξονίου ανάμεσα στα εξόνια 6 και 7, που μειώνει την έκφραση του GHR στην κυτταρική επιφάνεια. Σε ένα άλλο παράδειγμα με ήπιο φαινότυπο, μία μετάλλαξη στο εξόνιο 9 προκαλεί σοβαρή βράχυνση του ενδοκυττάριου τμήματος του υποδοχέα και απώλεια των περιοχών σύνδεσης των JAK2 και STAT5. Η εξωγενής χορήγηση GH δεν επιταχύνει την αύξηση ούτε αυξάνει τα επίπεδα του IGF-I ή της δεσμευτικής πρωτεΐνης-3 του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα (IGFBP-3). Μόνο σε ένα μικρό ποσοστό κοντών παιδιών υπάρχουν αναγνωρισμένες γενετικές διαταραχές που συμβάλλουν στην ανεπάρκεια της αύξησής τους. Μεταλλάξεις στα γονίδια ΡΙΤ-1, (196) GHRH (197) GH, (198) GHR, (182) και IGF-I (199) σπάνια είναι η αιτία του κοντού αναστήματος Μετάλλαξη του STAT5b Το σηματοδοτικό μονοπάτι JAK2/STAT5 θεωρείται το πιο σημαντικό όσον αφορά στις επαγωγικές της αύξησης δράσεις της GH. Ενώ έχουν αναγνωριστεί αρκετές εκατοντάδες 50

51 ασθενών με μεταλλάξεις στο γονίδιο του GHR, μόνο 1 άτομο με μετάλλαξη στον STAT5b και 2 ασθενείς με μετάλλαξη στο γονίδιο του IGF-I έχουν αναγνωρισθεί έως τώρα. Ο ασθενής με μετάλλαξη στην πρωτεΐνη STAT5b είχε φυσιολογικά επίπεδα GHBP, σε αντίθεση με τους ασθενείς με το κλασσικό σύνδρομο Laron, επομένως η διαταραχή ήταν περιφερικότερα της εξωκυττάριας περιοχής του υποδοχέα της αυξητικής ορμόνης. Μεταλλάξεις στη διαμεμβρανική ή ενδοκυτταροπλασματική περιοχή του υποδοχέα της αυξητικής ορμόνης έχουν αναγνωρισθεί σε μια υποομάδα ασθενών με σύνδρομο Laron, αλλά δεν ήταν παρούσες στον ασθενή αυτόν. Ο συνδυασμός αυξημένων επιπέδων αυξητικής ορμόνης και χαμηλών επιπέδων IGF-I στον ασθενή θα μπορούσε να οφείλεται σε διαταραχή του γονιδίου του IGF-I, αλλά δε θα μπορούσε να εξηγήσει τα χαμηλά επίπεδα του ALS (acidlabile subunit) και της IGF-binding protein 3. Επιπλέον, δε διαπιστώθηκε τέτοια μετάλλαξη. Αντιθέτως, διαπιστώθηκε ομόζυγος μετάλλαξη στο γονίδιο του STAT5b. Οι γονείς του ασθενή δεν είχαν ανεπάρκεια αύξησης, ήταν πρώτα ξαδέλφια και ήταν φορείς της ίδιας μετάλλαξης. Σοβαρό κοντό ανάστημα ρυθμός αύξησης κ.φ. βάρος σώματος GH: κ.φ. ή IGF-I Φαρμακολογική πρόκληση:κ.φ. (GH>10ng/ml) κ.φ. τιμή 24ωρης έκκρισης GH IGF-I generation test: <30% ανταπόκριση Εικόνα 24. Τα χαρακτηριστικά της μετάλλαξης του μεταγραφικού παράγοντα STAT5b. Ασθενής με τη μετάλλαξη (δεξιά) Πολύ σημαντική στην ερμηνεία αυτών των ευρημάτων είναι η παρατήρηση ότι τα χαρακτηριστικά της αύξησης ενός ασθενή με ομόζυγη μετάλλαξη του STAT5b είναι πανομοιότυπα με αυτά που παρατηρούνται σε ασθενείς με ομόζυγες μεταλλάξεις στον GHR. Συγκεκριμένα, ο ασθενής με μετάλλαξη της ενδοκυτταροπλασματικής πρωτεΐνης STAT5b, η οποία αναστέλλει την ενδοκυττάρια σηματοδότηση που προάγει τις φυσιολογικές δράσεις της αυξητικής ορμόνης, έχει ως προεξάρχον χαρακτηριστικό την έντονη ανεπάρκεια αύξησης, με ύψος στη χρονολογική ηλικία των 16,5 ετών που αντιστοιχεί σε παιδί 6,5 ετών (-7,5 SD). Ο φαινότυπος αυτός θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα διάφορων διαταραχών στο σύστημα της αυξητικής 51

52 ορμόνης, όπως: μετάλλαξη στον υποδοχέα Growth Hormone-releasing hormone receptor (GHRH-R), μετάλλαξη στην GH, στον ΡΙΤ-1. Το εύρημα όμως των αυξημένων επιπέδων GH στον ορό σε συνδυασμό με χαμηλά επίπεδα IGF-I, επιβεβαιώνει την ύπαρξη αντίστασης στην αυξητική ορμόνη στον ασθενή αυτό. Επομένως, αυτός ο ασθενής είχε, εξαιρετικά χαμηλό IGF-I κι ελάχιστη απόκριση του άξονα του IGF-I στη χορήγηση GH. Θα μπορούσε να συμπεράνει κανείς από τις παρατηρήσεις αυτές ότι, τουλάχιστον στους ανθρώπους, η επίδραση της GH και του GHR στην αύξηση διαμεσολαβείται κυρίως, αν όχι αποκλειστικά, από το μονοπάτι JAK-2/STAT5b/IGF-I. Παρά την ύπαρξη μεγαλύτερης από 90% ομολογίας μεταξύ των STAT5a και STAT5b, μελέτες σε ζώα έχουν δείξει ότι οι δύο ισομορφές έχουν διακριτούς ρόλους και διαφορετικούς στα διάφορα είδη ζώων. Ο κρίσιμος ρόλος του STAT5b στην αύξηση περιγράφηκε για πρώτη φορά σε μελέτες σε knockout ποντίκια. Βρέθηκε ότι μόνο τα αρσενικά ποντίκια με ανεπάρκεια του STAT5b είχαν ανεπάρκεια αύξησης. Είναι ξεκάθαρο ότι ούτε ο STAT5a ούτε τα υπόλοιπα STATs μπορούν να υποκαταστήσουν την πρωτεΐνη STAT5b στην προαγωγή της κατά μήκος αύξησης. Ενδιαφέρουσα παράμετρος στην περίπτωση του ασθενή αυτού είναι η ύπαρξη ιστορικού επηρεασμένης ανοσολογικής λειτουργίας. Αυτό το εύρημα είναι συμβατό με την υπόθεση ότι η πρωτεΐνη STAT5b είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και την απόκριση ανοσορυθμιστών, όπως είναι η ιντερφερόνη, η ιντερλευκίνη-2 και η ιντερλευκίνη-3. Η αναγνώριση συγκεκριμένων μοριακών γενετικών διαταραχών ανοίγει το δρόμο για νέες θεραπείες στοχευμένες προς συγκεκριμένες λειτουργικές ανωμαλίες εντός των κυττάρων. (200) Διαταραχές στον άξονα IGF-I στον άνθρωπο Έχουν αναγνωρισθεί διαταραχές στον IGF-I και στον υποδοχέα του. Έχει αναφερθεί μία περίπτωση παιδιού με απαλοιφή των εξονίων 4 και 5 στο γονίδιο IGF-I, σε συνδυασμό με απουσία κυκλοφορούντος IGF-I. Το παιδί είχε μικροκεφαλία, επηρεασμένη ακοή και σοβαρό κοντό ανάστημα. Έχει βρεθεί ένας ενήλικας με ιδιαιτέρως κοντό ανάστημα και παρόμοιο φαινότυπο και σημειακή μετάλλαξη του γονιδίου IGF-I. Eτερόζυγες μεταλλάξεις στον υποδοχέα του IGF-I έχουν συσχετισθεί με ενδομήτρια καθυστέρηση αύξησης. Διαταραχές στις συνδετικές πρωτεΐνες του IGF-I μπορούν να προκαλέσουν παθολογικό φαινότυπο ως προς την αύξηση. Για παράδειγμα, ο χρόνος ημίσειας ζωής του IGF-I θα μπορούσε να μειωθεί απουσία σταθερού IGF-I, IGFBP-3 (IGF binding protein) και ALS (acid-labile subunit). Μεταλλάξεις στο ALS έχουν περιγραφεί σε παιδιά με μέτριο κοντό ανάστημα στην εφηβεία, καθυστέρηση ήβης και, σε ορισμένες περιπτώσεις, σε παιδιά που έχουν επιτύχει φυσιολογικό ανάστημα στην ενήλικη ζωή. Τέλος, το σύνδρομο «3Μ», μία αυτοσωματική υπολειπόμενη διαταραχή, οφείλεται σε μετάλλαξη στην κουλλίνη 7 (cullin 7). Η κουλλίνη 7 οποία αποτελεί μέρος της οδού του συμπλέγματος της Ε3 λιγάσης, επομένως η μετάλλαξη 52

53 αυτή μπορεί να έχει επιπτώσεις στην κάθαρση του GHR και ενδεχομένως άλλων σηματοδοτικών μορίων Bιοανενεργή Αυξητική Ορμόνη (Bioinactive GH) Υπάρχει μια αναφορά από τον Lewis και συν. για δυσλειτουργική μορφή της GH, δηλαδή, ενώ οι μέγιστες συγκεντρώσεις της GH στον ορό ήταν >10ng/ml μετά από φαρμακολογική πρόκληση, αναγνωρίστηκαν μεταλλάξεις στο γονίδιο GH1. Συγκεκριμένα, 5 ετερόζυγες μεταλλάξεις αναγνωρίστηκαν σε 4 ασθενείς. Τα στοιχεία αυτά υποστηρίζουν την υπόθεση ότι το κοντό ανάστημα αυτών των ασθενών είναι αποτέλεσμα έκκρισης ενός αναλόγου GH που οδηγεί σε διαφορετική ενεργοποίηση των μονοπατιών ERK και STAT5. Αυτό είναι ένα ασύνηθες αποτέλεσμα δράσης ενός μεταλλαγμένου αγωνιστή του υποδοχέα. Οι ασθενείς με ανεπάρκεια GH με μεταλλάξεις περικοπής ή ομόζυγες απαλοιφές στο γονίδιο GH1 είναι σε αυξημένο κίνδυνο να αναπτύξουν αντι-gh αντισώματα μετά από θεραπεία με GH. Αντιθέτως, δεν υπάρχουν αναφορές για ανάπτυξη αλλοαντισωμάτων σε ασθενείς με παρανοηματικές μεταλλάξεις ή αντικατάσταση ενός ζεύγους βάσης ανάμεσα σε περιοχές ματίσματος. Ο Κowarski και συν. ήταν οι πρώτοι που συσχέτισαν το κοντό ανάστημα με βιοανενεργή GH. Η βιοανενεργή GH κλινικά χαρακτηρίζεται από φυσιολογική ή ελαφρώς αυξημένη έκκριση GH, παθολογικά χαμηλά επίπεδα IGF-I και φυσιολογική αναπλήρωση αύξησης μετά από θεραπεία υποκατάστασης με GH. Eπιπρόσθετες περιπτώσεις βιοανενεργής GH περιέγραψαν ο Takahashi και συν., οι οποίοι ανέφεραν 2 παρανοηματικές μεταλλάξεις (R77C και D112G) στο γονίδιο GH1, που κατέληξαν στο σύνδρομο του Kowarski σε 2 Ιάπωνες ασθενείς. Ωστόσο, οι μεταλλάξεις αυτές είχαν βρεθεί μόνο σε ετερόζυγο μορφή. Δομικά, η ανθρώπινη GH περιέχει 4 αντιπαράλληλες έλικες, που διαχωρίζονται από συνδεόμενες αγκύλες, και 4 περιοχές κυστεΐνης στις περιοχές 53, 165, 182 και 189. Έχει βρεθεί ότι οι 4 αυτές περιοχές κυστεΐνης είναι συντηρημένες στα μόρια GH διαφορετικών σπονδυλόζωων. Αυτό ίσως είναι ενδεικτικό της σπουδαιότητάς τους για τη βιολογική δράση της πρωτεΐνης. Οι 4 περιοχές κυστεΐνης σχηματίζουν 2 δισουλφιδικές γέφυρες: μία μεταξύ της κυστεΐνης-53 και της κυστεΐνης-165, που καταλήγει σε μία μεγάλη αγκύλη, και μία μεταξύ κυστεΐνης-182 και κυστεΐνης-189, που σχηματίζει μια μικρή αγκύλη. Μελέτες έχουν δείξει ότι η ακεραιότητα της μικρής αγκύλης (από την κυστεΐνη 182 έως την κυστεΐνη 189) δεν είναι απαραίτητη για την έκκριση και τη βιολογική δράση της GH. Ωστόσο, δραστική μείωση της έκκρισης της GH παρατηρήθηκε όταν η δισουλφιδική γέφυρα κυστεΐνη-53 έως κυστεΐνη-165 διαταράχθηκε λόγω μετάλλαξης, σε ασθενή από τη Σερβία με σοβαρό κοντό ανάστημα. Η αλληλούχιση του GH1 γονιδίου ανέδειξε μία μετάλλαξη που αφορά την αντικατάσταση της κυστεΐνης στο αμινοξύ 53 από σερίνη. Ο ασθενής ήταν ομόζυγος για τη μετάλλαξη. (201) Η κλινική εκτίμηση, η φυσιολογική αλληλούχιση του GHR και το γεγονός ότι η θεραπεία με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη GH είχε ως αποτέλεσμα την αποκατάσταση της φυσιολογικής αύξησης στον ασθενή, απέκλεισε πιθανή διαταραχή στον GHR ή στον 53

54 IGF-I, αποδεικνύοντας την παρουσία ανενεργής GH. Πριν τη θεραπεία υποκατάστασης, η συγκέντρωση της GH σε βασικό επίπεδο ήταν αρκετά υψηλή, οι μέγιστες τιμές GH μετά από δοκιμασία πρόκλησης ήταν υψηλές, τα βασικά επίπεδα IGF-I ήταν χαμηλά, ενώ η συγκέντρωση της IGFBP-3 ήταν ανεξήγητα στα χαμηλότερα φυσιολογικά επίπεδα και η GHBP σε φυσιολογικά επίπεδα. Μετά το IGF-I generation test ωστόσο, ο ασθενής παρουσίαζε φυσιολογική απόκριση ως προς την IGF-I και IGFBP Διαταραχή στη Μεταγωγή του Σήματος της Αυξητικής Ορμόνης (Growth Hormone Transduction Defect / GHTD) Έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία αρκετές περιπτώσεις παιδιών με κοντό ανάστημα που οφείλονται σε μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη STAT5, ωστόσο λίγες μελέτες έχουν γίνει πάνω στη STAT3, που είναι επίσης ένας σημαντικός μεσολαβητής της ενδοκυττάριας σηματοδότησης της GH. Οι Rojas Gil και συν., (202) μελέτησαν τη λειτουργικότητα του SΤΑΤ3 σε ασθενείς με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα και διαπίστωσαν μειωμένη ενεργοποίηση του STAT3 σε καλλιέργειες ινοβλαστών 4 παιδιών με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα μετά από επαγωγή με 200 ng/ml GH, συγκριτικά με καλλιέργειες ινοβλαστών μαρτύρων. Επίσης, διαπιστώθηκε υπερέκφραση του αρνητικού ρυθμιστή της GH, CIS, υπερέκφραση του αρνητικού ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου p21 και αυξημένη δραστηριότητα πρωτεασώματος. Η οντότητα αυτή έχει χαρακτηριστεί ως Growth Hormone Transduction Defect (GHTD). Στο παρελθόν είχαν περιγραφεί άλλες 6 περιπτώσεις παιδιών με GHTD από το ίδιο εργαστήριο. Συγκεκριμένα, τα παιδιά αυτά παρουσίαζαν σοβαρή ανεπάρκεια αύξησης, (ύψος >- 3,5 SD), φυσιολογική έκκριση GH μετά από πρόκληση, αλλά και χωρίς πρόκληση, χαμηλά επίπεδα IGF-I, αλλά σημαντικά αυξημένα επίπεδα IGF-I μετά από επαγωγή με hgh κατά τη δοκιμασία IGF-I (IGF-I generation test). Tα παιδιά αυτά παρουσίαζαν σημαντική αναπλήρωση της αύξησης μετά από εξωγενή χορήγηση GH, παρά τη διαταραγμένη φωσφορυλίωση του STAT3 και την υπερέκφραση του αρνητικού ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου p21. Το σύνδρομο GHIS και η βιοανενεργός GH αποκλείσθηκαν μετά από αλληλούχιση των γονιδίων GHR και GH- 1. Δε διαπιστώθηκαν ανωμαλίες σε κανένα από τα 10 εξόνια του γονιδίου GHR ή τα πέντε εξόνια και τις περιοχές ματίσματος του γονιδίου GH-1, σε κανέναν από τους ασθενείς. Το γεγονός αυτό ενισχύει την υπόθεση πως μία νέα μοριακή διαταραχή είναι υπεύθυνη για την ανεπαρκή αύξηση των παιδιών αυτών. 54

55 Εικόνα 25. Ασθενής με διαταραχή στη μεταγωγή του σήματος της GH (GHTD) Παθοφυσιολογία της GHTD - Η διαταραγμένη αρνητική ρύθμιση του μονοπατιού της GH και οι προεκτάσεις της στις ενδοκυττάριες διεργασίες Η αναγνώριση της κλινικής οντότητας Growth Hormone Transduction Defect (GHTD) έγινε μετά από τη μελέτη αρχικά τεσσάρων και στη συνέχεια 10 συνολικά παιδιών με σοβαρή ανεπάρκεια αύξησης, (ύψος >-3,5 SD), φυσιολογική έκκριση GH μετά από φαρμακολογική πρόκληση, αλλά και χωρίς πρόκληση, χαμηλά επίπεδα IGF-I, αλλά σημαντικά αυξημένα επίπεδα IGF-I μετά από επαγωγή με hgh κατά τη δοκιμασία IGF-I (IGF-I generation test). Tα παιδιά αυτά παρουσίαζαν σημαντική αναπλήρωση της αύξησης μετά από εξωγενή χορήγηση GH. Αρχικά, μελετήθηκε η ταχύτητα ανάπτυξης ινοβλαστών από βιοψίες ούλων ασθενών με GHTD και μαρτύρων. Οι μάρτυρες παρουσίαζαν παραγωγή ινοβλαστών μετά από 2-3 εβδομάδες επώασης της βιοψίας στους 37 C και σε θρεπτικό υλικό, χωρίς προσθήκη GH (Α). Η παραγωγή ινοβλαστών δεν ήταν εφικτή στους ασθενείς μετά από το ίδιο χρονικό διάστημα (Β), παρά μόνο μετά από προσθήκη 5 mg/ml GH στο θρεπτικό υλικό. Η ταχύτητα ανάπτυξης των ινοβλαστών μελετήθηκε με καμπύλες αύξησης σε βασική κατάσταση και μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh. 55

56 % of Cells Fold increase of original cell number Fold increase of original cell number Growth Curve without GH Growth Curve with 200ng/ml GH Days C S Days 2 Εικόνα 26. Καμπύλες αύξησης ινοβλαστών σε μάρτυρες 0 και ασθενείς με GHTD, χωρίς προσθήκη GH και μετά από προσθήκη 200ng/ml GH. Στη βασική κατάσταση η ταχύτητα ανάπτυξης στους ινοβλάστες των ασθενών ήταν εξαιρετικά χαμηλή, ενώ μετά από επαγωγή με 200 ng/ml hgh υπολειπόταν σημαντικά συγκριτικά με τους μάρτυρες. Μετά από ανάλυση FACS, βρέθηκε ότι το μεγαλύτερο (περίπου 95%) ποσοστό των κυττάρων των ασθενών βρισκόταν στη φάση G 0 /G 1 του κυτταρικού κύκλου. C S FACS C -GH S -GH C + 200ng GH S + 200ng GH C + S ng 1000ng GH GH G0/G1 S G2/M Εικόνα 27. Ανάλυση FACS. Ποσοστό κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου σε ασθενείς και μάρτυρες. Επειδή για τη μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από τη φάση G 1 στη φάση S είναι απαραίτητη η δράση κυκλινών, όπως των Cyclin A, Cyclin D και CDT1, μελετήθηκε η πρωτεϊνική τους έκφραση με ανοσοαποτύπωση κατά Western. Εικόνα 28. Μειωμένη πρωτεϊνική έκφραση των cyclin A, cyclin D και CDT1 στους ασθενείς με GHTD, συγκριτικά με τους μάρτυρες. Διαπιστώθηκε ότι η πρωτεϊνική έκφραση των συγκεκριμένων κυκλινών ήταν εξαιρετικά μικρή σε σχέση με την αντίστοιχη των μαρτύρων. Μετά από το εύρημα αυτό και δεδομένου ότι η πρωτεΐνη p21 είναι αναστολέας των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών, μελετήθηκε η πρωτεϊνική έκφρασή της και βρέθηκε ότι στους ασθενείς υπήρχε υπερέκφρασή της. 56

57 Εικόνα 29. Υπερέκφραση της p21 στους ασθενείς με GHTD, συγκριτικά με τους μάρτυρες. Το σύνδρομο GHIS και η βιοανενεργός GH αποκλείσθηκαν μετά από αλληλούχιση των γονιδίων GHR και GH1. Δε διαπιστώθηκαν ανωμαλίες σε κανένα από τα 10 εξόνια του γονιδίου GHR ή τα πέντε εξόνια και τις περιοχές ματίσματος του γονιδίου GH1, σε κανέναν από τους ασθενείς. Το γεγονός αυτό ενίσχυε την υπόθεση πως μία νέα μοριακή διαταραχή ήταν υπεύθυνη για την ανεπαρκή αύξηση των παιδιών αυτών. Καλλιεργήθηκαν ινοβλάστες από βιοψίες ούλων των 4 παιδιών με το ιδιοπαθές κοντό ανάστημα και 3 μαρτύρων. Ελέγχθηκε η έκφραση του GHR σε μεταγραφικό, μεταμεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο, μελετώντας το mrna και την παραγόμενη πρωτεΐνη. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ ασθενών και μαρτύρων σε επίπεδο mrna και στις ποσότητες του GHR μετά από ανοσοκατακρήμνιση με ένα αντι-ghr IgG αντίσωμα. Μετά από καλλιέργεια των ινοβλαστών με hgh (200ng/ml) για 5 και 15 λεπτά, διαπιστώθηκε μείωση στα επίπεδα GHR στους ινοβλάστες των ασθενών και των μαρτύρων. (441) Ακολούθησε μελέτη του ενδοκυττάριου μονοπατιού της GH. H ενεργοποίηση των JAK2 και STAT5b ήταν παρόμοια στους ασθενείς και στους μάρτυρες. Σε αντίθεση με τη φυσιολογική ενεργοποίηση των JAK2 και STAT5 μετά την προσθήκη 200 ng/ml hgh στο θρεπτικό υλικό για 30 λεπτά, η επαγώμενη από την hgh τυροσινφωσφορυλίωση του STAT3 είτε ήταν απούσα είτε σημαντικά μειωμένη στις καλλιέργειες ινοβλαστών των ασθενών, συγκριτικά με τις καλλιέργειες των μαρτύρων. (202) A1 A2 A3 A4 M1 M2 M ptyrstat3 STAT3 ACTIN Εικόνα 30. Οι ασθενείς με GHTD (Α) δεν μπορούν να φωσφορυλιώσουν τη STAT3 μετά από 30 λεπτά επαγωγής των ινοβλαστών τους με 200ng/ml GH, σε αντίθεση με τους μάρτυρες (Μ). Από κλινικά στοιχεία είναι προφανές ότι οι ασθενείς ανταποκρίνονται σε φαρμακολογικές δόσεις GH με αύξηση της ταχύτητας ανάπτυξής τους. Λαμβάνοντας αυτό υπόψιν, χρησιμοποιήθηκαν μεγαλύτερες δόσεις GH στις κυτταρικές 57

58 καλλιέργειες των ασθενών, ώστε να εκτιμηθεί αν αυτές οι μεγαλύτερες δόσεις είναι ικανές να ξεπεράσουν το εμπόδιο στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3. Στους μάρτυρες, δεν παρατηρήθηκε αύξηση στη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 όταν προστέθηκε στο θρεπτικό υλικό hgh σε δόσεις 200 ng/ml και 500 ng/ml, ενώ μετά από προσθήκη hgh σε δόση 1000 ng/ml υπήρχε σχεδόν πλήρης καταστολή της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης STAT3. Αντιθέτως, οι ινοβλάστες των ασθενών παρουσίαζαν πολύ χαμηλή ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3 μετά από προσθήκη hgh σε δόσεις μέχρι 500 ng/ml. Ωστόσο, υπήρχε μέτρια αύξηση στη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 σε όλους τους ινοβλάστες των ασθενών μετά από προσθήκη hgh σε δόση 1000 ng/ml. Α1 Α2 Α3 Α4 Μ ng hgh pstat3 Aktin Εικόνα 31. Η φωσφορυλίωση της STAT3 στους ασθενείς με GHTD (A) επιτεύχθηκε μετά από επαγωγή με υψηλή δόση GH, ενώ στο μάρτυρα (Μ) η φωσφορυλίωση είναι μεγαλύτερη στις μικρότερες δόσεις. H επιβεβαίωση της δυσλειτουργίας της πρωτεΐνης STAT3 έγινε μελετώντας την ενεργοποίησή της σε απόκριση σε ένα άλλο ερέθισμα, την ιντερφερόνη-β. Η ιντερφερόνη-β είναι γνωστό ότι χρησιμοποιεί επίσης το μονοπάτι σηματοδότησης JAK-STAT. (442) Καλλιεργώντας τους ινοβλάστες των μαρτύρων για 30 λεπτά παρουσία διάφορων συγκεντρώσεων ιντερφερόνης-β ( U/ml) η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3 αυξανόταν σταδιακά με την αύξηση της δόσης σε σχέση με την ενεργοποίησή της παρουσία συγκέντρωσης ιντερφερόνης-β 10 U/ml. Mετά από επαγωγή με 100 U/ml ιντερφερόνης-β, η τυροσιν-φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 ήταν μειωμένη στις καλλιέργειες ινοβλαστών και των τεσσάρων ασθενών, σε σχέση με τους ινοβλάστες των μαρτύρων. Αντιθέτως, δεν υπήρχε εμφανής τυροσινφωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 σε χαμηλές δόσεις ιντερφερόνης-β (0, 0.1 και 10 U/ml) στις καλλιέργειες ινοβλαστών των ασθενών και ήταν μόλις ανιχνεύσιμη στις δόσεις 100 και 1000 U/ml. Στους ασθενείς αυτούς έγινε έλεγχος για πιθανές μεταλλάξεις στο γονίδιο STAT3, χωρίς να ανευρεθεί καμία. Στους ινοβλάστες δέκα ασθενών με GHTD παρατηρήθηκε υπερέκφραση της πρωτεΐνης CIS (32kDa) και της ουβικουιτινυλιωμένης μορφής της, ucis, (37kDa), σε βασικό επίπεδο και μετά από επαγωγή με 200 μg/l hgh για 30 λεπτά, τόσο σε επίπεδο mrna όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Αντιθέτως, στους ινοβλάστες των πέντε μαρτύρων που χρησιμοποιήθηκαν, τα επίπεδα CIS και ucis ήταν χαμηλότερα κι εμφανίστηκαν 15 λεπτά μετά την επαγωγή με hgh, αντικατοπτρίζοντας τη 58

59 φυσιολογική αρνητική ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού της GH. Στους ινοβλάστες των μαρτύρων, η μέγιστη ενεργοποίηση της JAK2 ήταν εμφανής 5 λεπτά μετά την επαγωγή με hgh, ενώ στους ινοβλάστες των ασθενών η ενεργοποίηση ήταν καθυστερημένη κι έφτανε το μέγιστο στα 30 λεπτά. Η ενεργοποίηση του STAT5 στις ίδιες συνθήκες ήταν επίσης καθυστερημένη, φτάνοντας στο μέγιστο σε 60 λεπτά στους ασθενείς, ενώ στους μάρτυρες σε 15 λεπτά. Η πρωτεΐνη STAT3 δεν ενεργοποιούνταν στους ασθενείς ποτέ, ενώ στους μάρτυρες παρουσίαζε τη μέγιστη ενεργοποίηση σε 15 λεπτά. Ασθενής Μάρτυρας 0 pstat3 hgh 200ng/ml pstat3 Η ουβικουιτίνη παρουσίαζε στο βασικό επίπεδο υπερέκφραση στους ινοβλάστες του ασθενή και εντόπιση πυρηνική και κυτταροπλασματική. Μετά από επαγωγή με 200 μg/l hgh, τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης της ουβικουιτίνης δε μεταβάλλονταν, αλλά η κυτταρική εντόπιση μετατρεπόταν σε κυρίως κυτταροπλασματική με περιπυρηνική άθροιση, σε αντίθεση με τους μάρτυρες, που εμφάνιζαν κυρίως πυρηνική έκφραση. Ασθενής Μάρτυρας 0 Ub hgh 200ng/ml Ub Προκειμένου να διαπιστωθεί η σχέση μεταξύ της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης CIS με τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος και την αποδόμηση του GHR, μελετήθηκαν οι διαφορές στη δραστηριότητα του πρωτεασώματος ανάμεσα σε έναν ασθενή και ένα μάρτυρα. Οι ινοβλάστες του ασθενή εμφάνιζαν στη βασική κατάσταση περισσότερο από 50% αύξηση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος συγκρινόμενοι με τους ινοβλάστες του μάρτυρα. Η επαγωγή με 200 ng/ml και 1000 ng/ml hgh προκάλεσε ελάχιστη μείωση στη δραστηριότητα του πρωτεασώματος μόνο στους ινοβλάστες του μάρτυρα. Η χορήγηση όμως του περισσότερο ειδικού αναστολέα του πρωτεασώματος λακτασυστίνη (15μΜ), προκάλεσε μείωση της δραστηριότητας του πρωτεασώματος στους ινοβλάστες του ασθενή και του μάρτυρα. 59

60 Εικόνα 32. Δραστηριότητα του πρωτεασώματος σε ινοβλάστες ενός ασθενή με GHTD (μαύρα κουτιά) κι ενός μάρτυρα (άσπρα κουτιά). 0 hgh200μg/l hgh1000μg/l Lact 1mM Lact 5μΜ Lac15μΜ Επιπλέον, στους ινοβλάστες των μαρτύρων ο GHR παρουσίαζε πυρηνική και κυτταροπλασματική εντόπιση σε βασικό επίπεδο σε αντίθεση με τους ινοβλάστες των ασθενών που η εντόπισή του ήταν κυρίως κυτταροπλασματική, κοντά στον πυρήνα. Η επαγωγή με 200 ng/ml hgh δεν προκαλούσε μεταβολές στην εντόπιση του GHR στους ασθενείς. Ασθενής Μάρτυρας 0 GHR hgh 200ng/ml GHR H επαγωγή με λακτασυστίνη ή με λακτασυστίνη και 200ng/ml hgh τροποποίησε την εντόπιση του GHR στους ινοβλάστες των ασθενών σε κυρίως μεμβρανική, ενώ στους ινοβλάστες των μαρτύρων υπήρχε μόνο κυτταροπλασματική άθροιση. Ασθενής Μάρτυρας 0 15μΜ Lactacystin 200 ng/ml hgh/15μμ Lactacystin Μετά από επαγωγή με τον αναστολέα του πρωτεασώματος MG132 και hgh, αποκαταστάθηκε η φυσιολογική κινητική της ενεργοποίησης των JAK2, STAT5 και STAT3 στους ινοβλάστες των ασθενών, ενώ στους ινοβλάστες των μαρτύρων διαταράχθηκε η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών αυτών. 60

61 Κατά την ανάλυση του ρυθμού κυτταρικής αύξησης, οι ινοβλάστες του ασθενή πολλαπλασιάζονταν με βραδύτερο ρυθμό από τους ινοβλάστες των μαρτύρων. Η προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων GH ( ng/ml) αύξανε το ρυθμό αύξησης των ινοβλαστών των ασθενών και των μαρτύρων, σε κάθε όμως περίπτωση ο ρυθμός αύξησης των ινοβλαστών των ασθενών παρέμενε μικρότερος. Ο μεγαλύτερος ρυθμός αύξησης για τους ινοβλάστες των μαρτύρων επιτεύχθηκε μετά από προσθήκη 200 ng/ml hgh, ενώ για τους ινοβλάστες των ασθενών μετά από προσθήκη 500 ng/ml hgh. H προσθήκη 1000 ng/ml hgh προκάλεσε μικρή μείωση στο ρυθμό αύξησης των ινοβλαστών ασθενών και μαρτύρων. Οι ινοβλάστες των ασθενών παρουσίασαν μεγαλύτερο χρόνο διπλασιασμού του πληθυσμού τους συγκριτικά με τους ινοβλάστες του μάρτυρα. Οι ινοβλάστες των ασθενών είχαν μικρότερο βαθμό σύνδεσης βρωμοουριδίνης (BrdU) στο DNA συγκριτικά με τους ινοβλάστες των μαρτύρων. Σε όλες τις καλλιέργειες ινοβλαστών των ασθενών παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή στην αύξηση, που εκφραζόταν με το ποσοστό των κυττάρων που συνέθεταν DNA. H προσθήκη διαφόρων δόσεων hgh αύξησε το ποσοστό των κυττάρων που συνέθεταν DNA με την ίδια κινητική στους ινοβλάστες των ασθενών και των μαρτύρων, αν και οι διαφορές στους ινοβλάστες των ασθενών και των μαρτύρων παρέμεναν. Η μειωμένη σύνδεση Βρωμοουριδίνης, που αντιπροσωπεύει άμεσα τα κύτταρα που βρίσκονται στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, υποδηλώνει διαταραχή στη μετάβαση των ινοβλαστών του ασθενή από τη φάση G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Με ανάλυση FACS βρέθηκε ότι το 69% των ινοβλαστών των μαρτύρων και το 93% των ινοβλαστών των ασθενών παρέμενε στη φάση G0/G1 του κυτταρικού κύκλου. Η προσθήκη hgh σε συγκεντρώσεις 200 ng/ml και 1000 ng/ml μείωσε το ποσοστό των ινοβλαστών των ασθενών στη φάση G0/G1 από 93% σε 80% και 72%, αντίστοιχα, ενώ το ποσοστό των ινοβλαστών των μαρτύρων παρέμεινε περίπου το ίδιο. Επιπλέον, στους ινοβλάστες των ασθενών βρέθηκε χαμηλή έκφραση των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου και συγκεκριμένα των κυκλινών Α, D και της πρωτεΐνης CDT1, μετά από χορήγηση 200 ng/ml hgh, συγκριτικά με τους ινοβλάστες των ινοβλαστών των μαρτύρων. Επομένως, η λειτουργική διαταραχή στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3 στο σηματοδοτικό μονοπάτι της GH στους ινοβλάστες των ασθενών σχετίζεται με καθήλωση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G0/G1, γεγονός που αντικατοπτρίζεται επίσης από τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης p21 και τη μειωμένη έκφραση της κυκλίνης Α, της κυκλίνης D και του CDT1. 61

62 Ασθενής Μάρτυρας 0 p21 hgh 200μg/L p21 Είναι αξιοσημείωτο ότι η διαταραγμένη ενεργοποίηση της πρωτεΐνης STAT3 στους ινοβλάστες των ασθενών αποκαθίσταται μετά από έκθεση των ινοβλαστών σε υψηλές συγκεντρώσεις hgh. Επιπλέον, η χορήγηση εξωγενούς hgh στους ασθενείς κατά την 5ήμερη διενέργεια δοκιμασίας IGF-I αύξησε τις χαμηλές συγκεντρώσεις IGF-I σε φυσιολογικά επίπεδα. Αντιστοίχως, η ταχύτητα αύξησης των παιδιών αυξήθηκε σημαντικά μετά από 4 έτη θεραπείας με hgh. Μία πιθανή εξήγηση της ικανότητας των υψηλών συγκεντρώσεων hgh να αυξήσουν τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης STAT3 στους ινοβλάστες των ασθενών είναι η επαγωγή εναλλακτικών μονοπατιών που εμπλέκουν τις πρωτεΐνες JAK1, JAK3 ή EGFR. (297,400,441) 1.13 Μέθοδοι διάκρισης κλινικών οντοτήτων ανεπάρκειας αύξησης Η διάγνωση της ανεπάρκειας της GH κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας, με πρώτο σημείο την ανεπάρκεια της αύξησης, είναι ιδιαιτέρως σημαντική για τη μελλοντική ευεξία του ατόμου, καθώς εκτός από το κοντό ανάστημα, η αθεράπευτη ανεπάρκεια GH μπορεί να προκαλέσει επίσης προβλήματα, όπως η υπερχοληστερολαιμία, η παχυσαρκία, η μυική αδυναμία και η επηρεασμένη ποιότητα ζωής στην ενήλικο ζωή Φαρμακολογική πρόκληση Αυξητικής ορμόνης Στην κλινική άσκηση ρουτίνας η εκτίμηση της έκκρισης της GH πραγματοποιείται πρωτίστως με φαρμακολογική πρόκληση της απελευθέρωσης της GH. Η φαρμακολογική πρόκληση από μόνη της μπορεί, ωστόσο, σε κάποιες περιπτώσεις να είναι παραπλανητική και η διάγνωση της ανεπάρκειας της GH μπορεί να χαθεί. Οι προκλητές δοκιμασίες περιλαμβάνουν άσκηση, χορήγηση L-Dopa, αργινίνης, κλονιδίνης, γλυκαγόνης, ινσουλίνης και προπρανολόλης. Η ανεπαρκής απόκριση της GH (<7-10 ng/ml) διαφέρει στην κάθε δοκιμασία. 62

63 Εικόνα 33. Η δοκιμασία πρόκλησης της GH ωρη έκκριση Αυξητικής Ορμόνης Ο υπολογισμός της αυθόρμητης 24ωρης έκκρισης της GH μπορεί να είναι βοηθητικός αρκετά συχνά στη διάγνωση της ανεπάρκειας της GH αν η ανεπάρκεια της αύξησης επιμένει παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων IGF-I στον ορό και φυσιολογικών συγκεντρώσεων GH μετά από φαρμακολογική πρόκληση. ( ,203,204) Αυτά σε συνδυασμό στοιχειοθετούν την οντότητα Growth Hormone Neurosecretory Defect (GHND). Εικόνα 34. Τα μοντέλα 24ωρης έκκρισης GH στις οντότητες GHD, GHND και σε μάρτυρες Είναι σημαντικό να λαμβάνεται υπόψη ότι οι ρυθμοί έκκρισης της GH ποικίλλουν με βάση το Δείκτη Μάζας Σώματος και ότι οι ημερήσιοι ρυθμοί έκκρισης GH σε παχύσαρκους άνδρες είναι ελαττωμένοι στο ένα τέταρτο των αντίστοιχων για φυσιολογικό βάρος σώματος. Ωστόσο, παρά τα σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκκρισης GH, τα παχύσαρκα παιδιά έχουν φυσιολογική αύξηση με φυσιολογικά 63

64 επίπεδα ελεύθερου IGF-I και GHBP. (205,206) Επομένως, κάθε παχύσαρκο παιδί με ανεπάρκεια αύξησης και χαμηλές συγκεντρώσεις IGF-I, παρά τη φυσιολογική απόκριση της GH στη φαρμακολογική πρόκληση, χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Ο προσδιορισμός της 24ωρης έκκρισης της GH είναι σχετικά δύσκολος και ακριβός, δεδομένου ότι προϋποθέτει οργανωμένη ενδονοσοκομειακή παιδιατρική ενδοκρινολογική μονάδα. Συγκεκριμένα, το παιδί πρέπει να εισαχθεί στο νοσοκομείο το προηγούμενο βράδυ από την έναρξη της δοκιμασίας, ώστε να εγκλιματισθεί στο νοσοκομειακό περιβάλλον. Στόχος είναι τη νύχτα της 24ωρης καταμέτρησης το παιδί να έχει φυσιολογικό και συνεχή ύπνο, με φυσιολογικής διάρκειας στάδια ΙΙΙ-ΙV του ύπνου, προκειμένου να επιτευχθούν οι μέγιστες φυσιολογικές νυχτερινές αιχμές GH. To παιδί επίσης πρέπει να βρίσκεται σε φυσιολογική δραστηριότητα κατά την ημέρα της εξέτασης ώστε να επιτευχθούν οι αιχμές της GH που σχετίζονται με τη δραστηριότητα. Ωστόσο, τα αποτελέσματα που προκύπτουν είναι συχνά αμφιλεγόμενα Δοκιμασία διέγερσης IGF-I (IGF-I Generation test) Επειδή τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της 24ωρης έκκρισης GH είναι, όπως ήδη αναφέρθηκε, αμφιλεγόμενα, στην κλινική πράξη προτιμάται μία ευκολότερη μέθοδος ελέγχου της GH που θα μπορούσε επίσης να αντικατοπτρίζει την παθολογική 24ωρη αυθόρμητη έκκριση της GH. Πρόκειται για τη δοκιμασία διέγερσης IGF-I (IGF-I generation test). Το IGF-I generation test έχει χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση της αντίστασης στην GH (GH insensitivity/ghi), με κύρια μορφή το σύνδρομο Laron, μία διαταραχή με χαμηλές συγκεντρώσεις IGF-I, στην οποία οι συγκεντρώσεις αυτές δεν αυξάνουν σημαντικά μετά τη χορήγηση βιοσυνθετικής ανθρώπινης GH (hgh). ( ) Πρόκειται για μία δοκιμασία ανεκτίμητης αξίας για τη διάγνωση της GHI, με υψηλή επαναληψιμότητα σε παιδιά κι ενήλικες. (214) Το IGF-I generation test έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση της σχέσης ανάμεσα στην απόκριση στη δοκιμασία και στην απόκριση κατά τη διάρκεια της θεραπείας με hgh σε παιδιά με ανεπάρκεια GH που διαγνώσθηκαν με φαρμακολογική πρόκληση. Πρώτος ο Rudman (215) μελέτησε την απόκριση του IGF-I μετά από θεραπευτική χορήγηση hgh για 10 ημέρες σε ασθενείς με ανεπάρκεια GH και διαπίστωσε τεράστια αύξηση του IGF-I μετά από λίγες μέρες θεραπείας με hgh. Ορισμένοι άλλοι συγγραφείς έχουν επίσης αναφέρει μια παρόμοια απόκριση του IGF-I στην ίδια κατηγορία παιδιών μετά από χορήγηση hgh για μερικές μέρες. ( ) Έχει επίσης αναφερθεί ότι η αυξημένη απόκριση των IGF-I και IGFBP-3 κατά τη διάρκεια 5ήμερων IGF-I και IGFBP-3 δοκιμασιών είναι διαγνωστική για παιδιά με ανεπάρκεια GH και Μείζονα Θαλασσαιμία. (219) Άλλες μελέτες έχουν φανερώσει την ύπαρξη θετικής σχέσης μεταξύ της απόκρισης του IGF-I και της αύξησης μετά από θεραπεία σε παιδιά με ανεπάρκεια GH. (220) Η ομάδα της BE Spiliotis πραγματοποίησε IGF-I generation test σε παιδιά με ανεπάρκεια GH είτε λόγω κλασσικής ανεπάρκειας GH είτε λόγω GHND. Kατά το IGF-I generation test πραγματοποιήθηκαν αιμοληψίες καθημερινά για 5 ημέρες στις 64

65 09.00 π.μ. και χορηγήθηκε ανθρώπινη GH (Genotropin) καθημερινά για 4 ημέρες υποδόρια σε δόση 0.03 mg/kg/ημέρα αμέσως μετά την πρώτη αιμοληψία. Και οι δύο κατηγορίες παιδιών είχαν σημαντικά χαμηλότερες συγκεντρώσεις IGF-I στη βασική κατάσταση, όμως παρουσίαζαν μεγαλύτερη αύξηση στις τιμές του IGF-I κατά τη διάρκεια του IGF-I generation test συγκρινόμενες με τους φυσιολογικού και κοντού αναστήματος μάρτυρες. Μια πιθανή υπόθεση που θα μπορούσε να εξηγεί την ιδιαιτέρως αυξημένη απόκριση του IGF-I στα παιδιά με ανεπάρκεια της GH είναι η επίδραση της hgh στην αυξημένη ποσότητα μη κατειλημμένων υποδοχέων GH (priming effect). Είναι αξιοσημείωτο ότι οι μέγιστες συγκεντρώσεις IGF-I σημειώθηκαν στις περισσότερες περιπτώσεις των μαρτύρων φυσιολογικού αναστήματος τις ημέρες 4-5 της δοκιμασίας, ενώ στα παιδιά με ανεπάρκεια αύξησης τις ημέρες 3-4. Γι αυτό, είναι σημαντική η μέτρηση των συγκεντρώσεων IGF-I καθημερινά κατά τις 5 ημέρες της δοκιμασίας ώστε να διαπιστωθεί η μέγιστη απόκριση του IGF-I σε όλα τα παιδιά. (221) Εικόνα 35. Η δοκιμασία διέγερσης IGF-I σε μάρτυρες με κοντό ανάστημα, παιδιά με κλασσική ανεπάρκεια GH (GHD1), νευροεκκριτική δυσλειτουργία GH (GHD2) και μάρτυρες φυσιολογικού αναστήματος. Επομένως, το IGF-I generation test είναι εύκολο να πραγματοποιηθεί χωρίς εισαγωγή στο νοσοκομείο, μπορεί να διακρίνει το σύνδρομο μειωμένης ευαισθησίας στην GH (GHIS) από την ανεπάρκεια GH (GHD, GHND) και, άρα, μπορεί να αναγνωρίσει τα παιδιά με ανεπάρκεια GH που μπορούν να επωφεληθούν από τη θεραπεία με hgh. Επιπρόσθετα, η δοκιμασία αυτή λόγω της δυνατότητας που παρέχει για έμμεση διάγνωση των ασθενών με παθολογικές 24ωρες συγκεντρώσεις GH (φυσιολογική δοκιμασία φαρμακολογικής πρόκλησης), ίσως θα μπορούσε να υποκαταστήσει τη δοκιμασία 24ωρης καταμέτρησης των συγκεντρώσεων GH. 65

66 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 : Ο υποδοχέας της Αυξητικής Ορμόνης 2.1 Η δομή του υποδοχέα της GH (GHR) Ο GHR είναι μια μονή διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που αποτελείται από μία εξωκυττάρια περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη και μία ενδοκυττάρια περιοχή σηματοδότησης. Ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων κυτταροκινών Τάξης 1, στην οποία επίσης ανήκουν οι υποδοχείς της ερυθροποιητίνης (ΕΡΟ), των IL-2 έως IL-8, της IL-11 και IL-12, της θρομβοποιητίνης, του ανασταλτικού παράγοντα της λευχαιμίας (LIF), του granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) και του granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). (222,223) Τα κοινά χαρακτηριστικά αυτής της οικογένειας υποδοχέων περιλαμβάνουν την ύπαρξη περιοχών κυστεΐνης και του μοτίβου WSXWS στο εξωκυττάριο τμήμα, καθώς και την ύπαρξη του στοιχείου Box 1, που είναι πλούσιο σε προλίνη κι εμπλέκεται στη σύνδεση με τις Janus κινάσες, στο κυτταροπλασματικό τμήμα. Ο υποδοχέας GHR περιλαμβάνει σχετικά μεγάλες κυτταροπλασματικές περιοχές. (224) Είναι ευρέως κατανεμημένος σε όλα τα κύτταρα του ανθρώπινου σώματος, αλλά εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ και ακολούθως στο λίπος και στο μυ. Εικόνα 36. Ο υποδοχέας GHR Από τους υποδοχείς κυτταροκινών, ο GHR μοιάζει δομικά περισσότερο από οποιονδήποτε άλλον με τον υποδοχέα προλακτίνης. Η ομοιότητα στην αλληλουχία μεταξύ των δύο υποδοχέων είναι λιγότερο από 30%, όμως οι κρυσταλλικές μορφές και τα συνολικά δομικά χαρακτηριστικά των συμπλεγμάτων GH-GHR (εξωκυττάριο τμήμα) και GH-PRLR (εξωκυττάριο τμήμα) παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα. (225) Αν 66

67 και η GH μπορεί να προσδεθεί στον υποδοχέα της προλακτίνης, το αντίστροφο δε συμβαίνει. H ύπαρξη του GHR αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τους Tsushima και Friesen το 1973, (226) ενώ η αλληλούχιση και κλωνοποίηση του γονιδίου από ήπαρ κουνελιού έγινε το (227) To γονίδιο που κωδικοποιεί τον ανθρώπινο GHR βρίσκεται σε ένα μονό αντίγραφο στο χρωμόσωμα 5p13-p12. (228) Περιλαμβάνει περίπου 90 kb και περιέχει εννέα κωδικοποιά εξόνια (εξόνια 2-10). (229) To γονίδιο του GHR κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη 620 αμινοξέων. Η εξωκυττάρια περιοχή, δηλαδή η περιοχή πρόσδεσης της ορμόνης και του διμερισμού του υποδοχέα, περιλαμβάνει 250 αμινοξέα, ενώ η ενδοκυττάρια περιοχή περιλαμβάνει περίπου 350 αμινοξέα και η μονή διαμεμβρανική έλικα περιλαμβάνει 24 αμινοξέα. (230) O GHR περιέχει πέντε περιοχές γλυκοζυλίωσης, όπου προσδένεται ασπαραγίνη, (231,232) και είκοσι τρεις περιοχές ουβικουιτινυλίωσης, όπου προσδένεται λυσίνη. Αυτές οι μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις αυξάνουν το μοριακό βάρος του GHR από το αναμενόμενο των 70 kda σε kda. Μετά την πρόσδεση της GH, ο GHR πυροδοτεί τη μεταγωγή του σήματος με τελική κατάληξη την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε αναβολικές διεργασίες, όπως είναι η πρωτεϊνοσύνθεση, η αποδόμηση των λιπιδίων, η ανοσιακή λειτουργία, η μυική μάζα, η οστική ανακύκλωση και η ανάπτυξη των οδόντων. Μεταλλάξεις του GHR στον άνθρωπο προκαλούν, όπως έχει ήδη αναφερθεί, το σύνδρομο Laron, το οποίο χαρακτηρίζεται από κοντό ανάστημα και άλλα χαρακτηριστικά που ανευρίσκονται σε διάφορα σύνδρομα ανεπάρκειας GH. (182) Ανάλογα με τον τύπο των μεταλλάξεων, επηρεάζεται είτε ο σχηματισμός του συμπλέγματος GH/GHR είτε η διεργασία του διμερισμού. Σε αυτούς τους ασθενείς παρατηρούνται σοβαρή αντίσταση στην GH, που χαρακτηρίζεται από πολύ υψηλές συγκεντρώσεις GH και πολύ χαμηλά επίπεδα IGF-Ι και IGFBP3. GHR knockout ποντίκια είναι βιώσιμα, με ένα σχεδόν φυσιολογικό μέγεθος κατά τη γέννηση. (233) Ο ρυθμός αύξησης φθίνει κατά τη μεταγεννητική ζωή, καταλήγοντας σε μείωση κατά 50% περίπου στο βάρος σώματος στην ενήλικη ζωή. Όπως συμβαίνει στο σύνδρομο Laron στον άνθρωπο, τα κυκλοφορούντα επίπεδα του IGF-Ι και της IGFBP-3 είναι εξαιρετικά χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα. (234) Τα ποντίκια αυτά επίσης παρουσιάζουν μείωση στην άλιπη μάζα σώματος, αύξηση στο λιπώδη ιστό και μειωμένη οστική ανακύκλωση και πυκνότητα σε μέταλλα. Τα ποντίκια αυτά όμως ζουν πολύ περισσότερο από τους μάρτυρες. 2.2 Γονιδιακή έκφραση του GHR Ο πρώτος ιστός που αναγνωρίσθηκε να αποκρίνεται στην GH είναι το ήπαρ λόγω του μεγάλου αριθμού των υποδοχέων των ηπατικών κυττάρων. (235) Με τη χρήση περισσότερο ευαίσθητων τεχνικών, έχει ποσοτικοποιηθεί ο αριθμός των GHR σε εξωηπατικούς ιστούς, όπως είναι οι μύες, τα οστά, ο νεφρός, ο μαζικός αδένας, ο λιπώδης ιστός και τα εμβρυονικά αρχέγονα κύτταρα. (236) Ο GHR έχει επίσης βρεθεί στον εγκέφαλο και το ανοσοποιητικό σύστημα του ανθρώπου. 67

68 Υπάρχουν πολλοί παράγοντες που επηρεάζουν την έκφραση του GHR είτε στο μεταγραφικό επίπεδο είτε στο επίπεδο της μετάφρασης. Τέτοιοι είναι: η κατάσταση της διατροφής, το αναπτυξιακό στάδιο, η κατάσταση του ενδοκρινικού συστήματος και διάφοροι μηχανισμοί ελέγχου των κυττάρων/ιστών. Η έκφραση του GHR αυξάνεται ανάλογα με την ηλικία και γίνεται μέγιστη στην εφηβεία. Πιο αναλυτικά, παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση του GHR είναι: Παράγων Επίδραση στην έκφραση του GHR Διατροφή Σύστημα Βιβλιογραφία Υποσιτισμός και νηστεία GHR (mrna) Ηπατοκύτταρα αρουραίου 237, 238, 239 Έλλειψη γλυκόζης GHR (mrna) Ηπατοκύτταρα χοίρου 240 Ενδοκρινικό σύστημα Χρόνια GH GHR (πρόσδεση) Ήπαρ αρουραίου, χοίρου, προβάτου 241, 242 Υποφυσεκτομή GHR (αριθμός) Ήπαρ κουνελιού 243 Οξεία GH GHR (πρόσδεση) Ήπαρ αρουραίου 244 Υπερέκφραση GH GHR (πρόσδεση) Ήπαρ διαγονιδιακών ποντικιών 245 Εγκυμοσύνη GHR (mrna+πρόσδεση) Ήπαρ ποντικιού 246 Οιστρογόνα GHR (mrna) Ήπαρ αρουραίου Δεξαμεθαζόνη GHR (mrna) Ήπαρ αρουραίου Ινσουλίνη - GHR (mrna+πρωτεΐνη) Ηπατοκύτταρα ανθρώπου 248,

69 - GHR (επιφάνεια) - GHR (πρόσδεση) Πίνακας 1. Ρύθμιση της έκφρασης του GHR 2.3 Η δεσμευτική πρωτεΐνη της GH Πολλές μεμβρανικές πρωτεΐνες υπόκεινται σε πρωτεόλυση κοντά στην περιοχή εισόδου τους στη μεμβράνη, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση των εξωκυττάριων περιοχών τους στον περικυτταρικό χώρο, διαδικασία γνωστή ως shedding. ( ) Tέτοιες πρωτεΐνες είναι μόρια κυτταρικής προσκόλλησης, λευκοκυτταρικά αντιγόνα, υποδοχείς και οι συνδέτες τους, εκτοένζυμα, ιικές μεμβρανικές πρωτεΐνες και διάφορες άλλες πρωτεΐνες. (253) O GHR είναι κυρίαρχο μέλος αυτής της τάξης των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών και παράγει σημαντικές ποσότητες από την εξωκυττάρια περιοχή του, γνωστή ως GHBP (Growth Hormone Binding Protein), η οποία μπορεί να μετρηθεί στην κυκλοφορία. (254) Τουλάχιστον το 50% της κυκλοφορούσας GH βρίσκεται συνδεδεμένο με αυτή τη δεσμευτική πρωτεΐνη υψηλής συγγένειας, (255,256) η οποία είναι η διαλυτή μορφή της εξωκυττάριας περιοχής του GHR. H GHBP είναι παρούσα στην κυκλοφορία πολλών ειδών. H βιολογική της σημασία, αν και δεν έχει κατανοηθεί πλήρως, υπογραμμίζεται από τα εξής γεγονότα: 1) Έχει συντηρηθεί εξελικτικά στα σπονδυλωτά και 2) παράγεται με δύο διαφορετικούς μηχανισμούς: Στα τρωκτικά και κάποια ακόμα είδη, η GHBP είναι προϊόν εναλλακτικού ματίσματος του mrna του GHR. Η κυτταροπλασματική και διαμεμβρανική περιοχή αντικαθίστανται από μία βραχεία υδρόφιλη ουρά. Αντιθέτως, η GHBP στον άνθρωπο και στο κουνέλι προκύπτει από ρυθμιζόμενη πρωτεόλυση του συνολικού μορίου του GHR και απομάκρυνση της εξωκυττάριας περιοχής με τη μορφή της GHBP. (257) Το ήπαρ είναι σημαντική πηγή της πρωτεΐνης GHBP. Έχει πλέον αναγνωρισθεί η πρωτεάση που είναι υπεύθυνη για την πρωτεόλυση του GHR και άρα την παραγωγή GHBP. Συγκεκριμένα, υπάρχει η υπόθεση ότι στην πρωτεόλυση του GHR μπορεί να εμπλέκεται το ένζυμο TACE (tumor necrosis factorα-converting enzyme), επίσης γνωστό ως ADAM 17, και σε μικρότερο βαθμό το παρόμοιο δομικά ADAM 10. (258,259) Το ένζυμο ΤΑCE ανήκει στις metzincins, μια μεγάλη οικογένεια μεταλλοπρωτεασών και δεν έχει ειδικότητα για κάποια γραμμική αλληλουχία αμινοξέων. Πολλά υποστρώματα του ενζύμου που έχουν μελετηθεί δεν παρουσιάζουν κοινή αλληλουχία. Σε ινοβλάστες από knockout ποντίκια για το TACE που διαμολύνθηκαν με GHR κουνελιού, απέτυχε η γένεση GHBP. Η διαμόλυνση των κυττάρων αυτών με cdna του ενζύμου TACE αποκατέστησε την ικανότητά τους να παράγουν GHBP και το εναπομείναν μόριο του GHR. (259) Έχει βρεθεί ότι αναστολείς της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) αναστέλλουν πλήρως το shedding του GHBP, ενώ οι αναστολείς της ΜΕΚ ασκούν μερική ανασταλτική δράση. (260) Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι το μονοπάτι της PKC είναι σημαντικό για την ενεργοποίηση του ενζύμου TACE και ότι το μονοπάτι ERK- 69

70 MΑΡK παίζει επίσης ένα μικρότερο ρόλο. Είναι επίσης ενδιαφέρον ότι η ίδια η GH έχει επίδραση στην πρωτεόλυση του GHR. Η πρόσδεση της GH στον GHR επάγει το διμερισμό του GHR και ο διμερισμένος GHR είναι πολύ πιο ανθεκτικός στην πρωτεόλυση από το μονομερές GHR. (261) Συνοψίζοντας, το ένζυμο TACE, που ενεργοποιείται από εξαρτώμενους από την PKC και τη MAPK μηχανισμούς, κόβει το μονομερές GHR σε μία επί του παρόντος άγνωστη περιοχή. Αυτό καταλήγει στο σχηματισμό διαλυτής GHBP κι ενός εναπομείναντος μορίου GHR, που περιλαμβάνει τη διαμεμβρανική και ενδοκυττάρια περιοχή. Η GHBP διαχέεται στον περικυτταρικό χώρο και φτάνει στη συστηματική κυκλοφορία. Η κατάληξη του εναπομείναντος μορίου GHR δεν έχει ακόμα διευκρινισθεί πλήρως. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το εναπομείναν τμήμα του GHR υπόκειται σε δεύτερο κόψιμο, πιθανώς ενδομεμβρανικά, από μία ενζυματική δραστηριότητα παρόμοια με αυτή της γ-σεκρετάσης, (262) όμοια με αυτή κατά το κόψιμο της πρόδρομης πρωτεΐνης του αμυλοειδούς που ενέχεται στη νόσο Alzheimer. (263) Τα κύτταρα απευαισθητοποιούνται στην GH μετά την πρωτεόλυση. Αντιστρόφως, ο επαγώμενος από την GH διμερισμός του GHR μειώνει την ευαισθησία του υποδοχέα στην πρωτεόλυση. Εκτός από αυτές τις επιδράσεις της πρωτεόλυσης στην κυτταρική ευαισθησία στην GH, ο ρόλος της GHBP στη φυσιολογία της GH δεν είναι ακόμα σαφής. Σε διαφορετικά μοντέλα η GHBP μπορεί είτε να επαγάγει είτε να αναστείλει τη δράση της GH. (254) Σε αντίθεση με τη στοιχειομετρία 1:2 GH:GHR στην κυτταρική επιφάνεια, το μεγαλύτερο μέρος της συνδεδεμένης με την GHBP GH υπάρχει σε στοιχειομετρία 1:1 (GH:GHBP). Aυτό έχει οδηγήσει στην υπόθεση ότι μέρος του ρόλου της GHBP είναι να δρα ως αποθήκη της GH και να τη μεταφέρει αποτελεσματικά από την κυκλοφορία στον GHR της κυτταρικής επιφανείας. (264) Στην κυκλοφορία, η GH που είναι συνδεδεμένη με την GHBP έχει παρατεταμένο χρόνο ημιζωής συγκριτικά με την ελεύθερη GH, πιθανώς λόγω αδυναμίας πρόσβασης της GH σε περιοχές αποδόμησης. (265) Δεδομένης της κατά ώσεις μεταφοράς της GH στην κυκλοφορία, ένας πιθανός ρόλος της GHBP είναι η σταθεροποίηση της βιοδιαθεσιμότητας της GH. (266) Στον άνθρωπο, τα επίπεδα GHBP αυξάνονται σταθερά κατά τη διάρκεια της παιδικής ηλικίας, μεταβάλλονται λίγο μέχρι μετά την ενηλικίωση και μειώνονται μετά την ηλικία των 60 ετών. (267) Παιδιά με ιδιοπαθές κοντό ανάστημα έχουν χαμηλότερα επίπεδα GHBP από τους μάρτυρες, (268) γεγονός που ίσως αντανακλά μία κατάσταση ήπιας αντίστασης στην GH. Στο σύνδρομο Laron ο GHR και η GHBP υπάρχουν συνήθως σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Η GHBP είναι επίσης χαμηλή στο σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1 και αυξάνεται μετά τη θεραπεία με ινσουλίνη. (269) H GHBP είναι χαμηλή σε καταστάσεις κακής διατροφής, αλλά όχι στην παχυσαρκία. (270) Ο ρόλος σε αυτές τις καταστάσεις είναι ακόμα άγνωστος. Επομένως, η δραστηριότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών έχει τρεις τουλάχιστον συνέπειες στη δράση της GH. Πρώτον, το κόψιμο του GHR προκαλεί απώλεια των λειτουργικών GHR από την κυτταρική επιφάνεια. Αυτή είναι μια μορφή αρνητικής ρύθμισης του υποδοχέα. (260) Η αρνητική ρύθμιση είναι πιθανώς απαραίτητη για να αποφευχθεί η υπερδιέγερση του συστήματος. Δεύτερον, σχηματίζονται δύο άμεσα 70

71 προϊόντα: η GHBP και ο εναπομείνας GHR. Η GHBP έχει σύνθετη δράση, που περιλαμβάνει αναστολή της πρόσδεσης της GH στους υποδοχείς GHR μέσω ανταγωνισμού με το συνδέτη (271) και αναστολή της σηματοδότησης του GHR μέσω σχηματισμού μη παραγωγικών ετεροδιμερών GHR/GHBP. In vivo, η GHBP έχει επίσης ενισχυτική επίδραση στη δράση της GH μέσω παράτασης του χρόνου ημιζωής και της βιοδιαθεσιμότητας της GH. (272,273) Τρίτον, το εναπομείναν τμήμα του GHR είναι πιθανώς σημαντικός ρυθμιστής της δράσης της GH μέσω αδιευκρίνιστων ενδοκυττάριων μηχανισμών. Συμβαίνουν περαιτέρω πρωτεολυτικές διεργασίες του εναπομείνατος GHR (274) και ορισμένα από τα προϊόντα μπορεί να έχουν διάφορες βιολογικές δράσεις. Τέλος, διάφορες μελέτες αποκαλύπτουν ότι η GHBP έχει θετικές επιδράσεις στη δράση της GH, αναστέλλοντας τη νεφρική κάθαρση της GH. 2.4 Σύνθεση, ωρίμανση και ενδοκύττωση του GHR Μετά τη σύνθεσή του στο ενδοπλασματικό δίκτυο, το πρόδρομο μόριο του GHR μεταφέρεται στο σύστημα Golgi. Στο σύστημα Golgi ο υποδοχέας υφίσταται ωρίμανση που χαρακτηρίζεται από αλλαγές στο μοντέλο γλυκοζυλίωσης, με αποτέλεσμα ο ώριμος γλυκοζυλιωμένος GHR να στερείται των πλούσιων σε μαννόζη υδατανθράκων. Τα επίπεδα του GHR στην κυτταρική επιφάνεια αντανακλούν μία ισορροπία μεταξύ δύο διαδικασιών: την ενδοκύττωση/αποδόμηση του υποδοχέα και τη μεταφορά των νεοσχηματισμένων υποδοχέων στην πλασματική μεμβράνη. Η ενδοκύττωση και αποδόμηση συμβαίνουν συνεχώς, ακόμα και απουσία διέγερσης από την GH, ενώ παρουσία GH η αποδόμηση του υποδοχέα επιταχύνεται. (275,276) Τα δεδομένα δείχνουν ότι η JAK2 συνδεόμενη με τον GHR επάγει μια εξαρτώμενη από τη δραστηριότητα του πρωτεασώματος πρωτεόλυση του GHR κι επιτρέπει τη μετατροπή του πρόδρομου υποδοχέα σε ώριμο. (277) Η ενδοκύττωση είναι η διεργασία με την οποία τα κύτταρα εσωτερικοποιούν εξωκυττάρια μακρομόρια ή πρωτεΐνες. Υπάρχουν περιοχές της κυτταροπλασματικής μεμβράνης που η εσωτερική της πλευρά καλύπτεται από πλέγμα που σχηματίζει η πρωτεΐνη κλαθρίνη. Οι περιοχές αυτές ονομάζονται βοθρία ή καλυμμένα κοιλώματα κλαθρίνης και σε αυτές βρίσκονται οι υποδοχείς GHR. Μετά την πρόσδεση της GH σχηματίζονται κυστίδια καλυμμένα με πλέγμα κλαθρίνης. Η κλαθρίνη στη συνέχεια απομακρύνεται με τη δράση ενζύμων κι επανέρχεται στα βοθρία, ενώ τα κυστίδια μεταφέρονται στα ενδοσώματα. Έχει επιβεβαιωθεί ότι η εσωτερικοποίηση του GHR είναι εξαρτώμενη από την ουβικουιτίνη και αυξάνεται μετά την πρόσδεση της GH. (278) Μια συγκεκριμένη περιοχή στην κυτταροπλασματική περιοχή είναι σημαντική για την εσωτερικοποίηση του GHR. O GHR δεν έχει ενδογενή δραστικότητα κινάσης. H εσωτερικοποίηση του GHR προϋποθέτει την επιστράτευση του συστήματος σύνδεσης της ουβικουιτίνης στο μοτίβο του μηχανισμού ουβικουιτινυλίωσης του GHR, αλλά όχι τη σύνδεση της ουβικουιτίνης στον GHR. 71

72 2.5 Αποδόμηση του GHR - Το σύστημα της ουβικουιτίνης Αρχικά, είχε βρεθεί ότι η ΑΤΡ-εξαρτώμενη σύνδεση της ουβικουιτίνης με παθολογικές κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες διαμεσολαβεί την αποδόμησή τους. Πλέον, η ουβικουιτινυλίωση θεωρείται ότι συμμετέχει σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, όπως η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η διαφοροποίηση και η ανάπτυξη, η απόκριση στο stress, η επιδιόρθωση του DNA, η μεταγραφή γονιδίων, η ανοσοαπόκριση, η ρύθμιση υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας και καναλιών ιόντων, η απώλεια μυικής μάζας και η απόπτωση. Η ουβικουιτίνη είναι μια μικρή ρυθμιστική πρωτεΐνη που έχει βρεθεί στους περισσότερους ιστούς των ευκαρυωτικών οργανισμών. Αναγνωρίσθηκε το 1975 ως μια πρωτεΐνη 8,5 kda που αποτελείται από 76 αμινοξέα. Κωδικοποιείται από τέσσερα διαφορετικά γονίδια. Ο ρόλος της είναι να κατευθύνει πρωτεΐνες σε κυτταρικά διαμερίσματα, όπως είναι το πρωτεάσωμα, το οποίο καταστρέφει και ανακυκλώνει πρωτεΐνες. Η ουβικουιτίνη συνδέεται με πρωτεΐνες και τις μαρκάρει ώστε να καταστραφούν. Σε άλλες περιπτώσεις, μπορεί να τις κατευθύνει σε άλλες εντοπίσεις στο κύτταρο, όπου ρυθμίζουν άλλες πρωτεΐνες και κυτταρικούς μηχανισμούς Ουβικουιτινυλίωση Η ουβικουιτινυλίωση είναι μια μετα-μεταφραστική τροποποίηση που καταλήγει στην πρόσδεση της ουβικουιτίνης σε περιοχές λυσίνης πρωτεϊνών-στόχων. Η διαδικασία αυτή είναι το αποτέλεσμα της διαδοχικής δράσης τριών ενζύμων: Του ενζύμου που ενεργοποιεί την ουβικουιτίνη (Ε1), του ενζύμου πρόσδεσης της ουβικουιτίνης (E2) και της λιγάσης της ουβικουιτίνης (Ε3), τα οποία στις περισσότερες περιπτώσεις αποτελούν ένα πρωτεϊνικό σύμπλεγμα. Αρχικά, σε ένα βήμα που προϋποθέτει την παρουσία ΑΤΡ, το ενεργοποιό της ουβικουιτίνης ένζυμο Ε1 σχηματίζει έναν υψηλής ενέργειας θειολικό εστέρα μεταξύ της δραστικής του περιοχής κυστεΐνης και της C-τελικής περιοχής γλυκίνης της ουβικουιτίνης. Στη συνέχεια, ένα συζευκτικό της ουβικουιτίνης ένζυμο, το Ε2, υποδέχεται την ενεργοποιημένη από το Ε1 ουβικουιτίνη και σχηματίζει ένα Ε2-S-Ub ενδιάμεσο, το οποίο περιλαμβάνει τη δραστική περιοχή κυστεΐνης του Ε2. Η τελική σύζευξη της ουβικουιτίνης στο υπόστρωμα μπορεί να διαμεσολαβηθεί άμεσα από το Ε2, συνήθως όμως είναι απαραίτητη επιπροσθέτως μια πρωτεϊνική λιγάση της ουβικουιτίνης (Ε3). Το σύμπλοκο της ουβικουιτίνης προσδένεται μέσω της C-τελικής γλυκίνης στην ε-αμινομάδα μιας περιοχής λυσίνης ή, σε μερικές περιπτώσεις, στην α- αμινομάδα της Ν-τελικής περιοχής του υποστρώματος. 72

73 Εικόνα 37. Το σύστημα ουβικουιτινυλίωσης Ένα υπόστρωμα μπορεί να τροποποιηθεί με μονοουβικουιτινυλίωση, ωστόσο, δεδομένου ότι η ουβικουιτίνη περιέχει 7 περιοχές λυσίνης, είναι δυνατόν να σχηματισθούν αλυσίδες πολυουβικουιτίνης. Γενικά, υποστρώματα με αλυσίδες των 4 ή περισσότερων μορίων ουβικουιτίνης, μαρκάρονται περισσότερο αποτελεσματικά για αποδόμηση από μία μεγάλη κυτταροπλασματική πρωτεάση, το πρωτεάσωμα 26S. Σε αντίθεση με το υπόστρωμα, τα μόρια ουβικουιτίνης δεν αποδομούνται, αλλά ανακυκλώνονται. Σημαντικό ρόλο στη διάρκεια και την ένταση των γεγονότων που ελέγχονται από ουβικουιτινυλίωση, αλλά και στην ομοιοστασία της ουβικουιτίνης, παίζουν ένζυμα αποουβικουιτινυλίωσης (DUBs). Η Ε3 λιγάση είναι που κυρίως καθορίζει την ειδικότητα του συστήματος της ουβικουιτίνης. Έως τώρα, στο γονιδίωμα των θηλαστικών έχουν βρεθεί μόνο δύο ισομορφές του ενζύμου Ε1 (Ε1a και E1b), σε αντίθεση με περισσότερες από 20 πρωτεΐνες Ε2 και περίπου 500 λιγάσες ουβικουιτίνης Ε3. Τα ένζυμα Ε3 διακρίνονται σε 3 κατηγορίες: 1) Αυτά που περιλαμβάνουν την περιοχή HECT, 2) Αυτά που περιλαμβάνουν την περιοχή RING-finger και 3) Αυτά που περιλαμβάνουν την περιοχή U-box Η ανακύκλωση του GHR Yπάρχουν χαρακτηριστικά που καθιστούν τη μεταβίβαση του σήματος μέσω GHR μοναδική, συγκρινόμενη με άλλων υποδοχέων: Κατ αρχάς, η ενδοκύττωση του GHR και ο χρόνος παραμονής του στην κυτταρική επιφάνεια δεν εξαρτάται από την παρουσία συνδέτη. Μετά την «άφιξη» στην κυτταρική επιφάνεια από το ενδοπλασματικό δίκτυο/σύμπλεγμα Golgi, ο GHR μεταφέρεται με οχήματα μεταφοράς στα λυσοσώματα για αποδόμηση. Επιπλέον, η ενδοκύττωση του GHR εξαρτάται από την ύπαρξη ενεργού συστήματος ουβικουιτίνης. Γενετικά και μοριακά πειράματα έχουν δείξει ότι τα μόρια του GHR συσσωρεύονται στην κυτταρική μεμβράνη αν το σύστημα της ουβικουιτίνης ανασταλεί. Επιπροσθέτως, η ουβικουιτινυλίωση του GHR συμπίπτει με την επιστράτευση βοθρίων κλαθρίνης. Είναι χαρακτηριστικό ότι δεν απαιτείται η ουβικουιτινυλίωση του GHR καθεαυτή, καθότι η αντικατάσταση όλων των περιοχών λυσίνης από 73

74 αργινίνες στην κυτταροπλασματική ουρά του GHR, δεν αναστέλλει την εσωτερικοποίηση/ενδοκυττάρωση. Σε μελέτες έχει αναγνωριστεί ως στόχος του συστήματος της ουβικουιτίνης στην κυτταροπλασματική ουρά του GHR μια αλληλουχία 10 αμινοξέων, η αλληλουχία DSWVEFIELD. Πρόκειται για το UbE μοτίβο για την εξαρτώμενη από ουβικουιτινυλίωση ενδοκύττωση. Το μοτίβο αυτό είναι επίσης απαραίτητο για τη μεταφορά του GHR στα MVBs (multivesicular bodies) για λυσοσωμιακή αποδόμηση. Εκτός από το σύστημα της ουβικουιτίνης, η υπομονάδα 26S του πρωτεασώματος εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση του GHR. Το πρωτεάσωμα 26S είναι ένα πολυκαταλυτικό ενζυμικό σύμπλεγμα που βρίσκεται στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα όλων των ευκαρυωτικών κυττάρων, το οποίο είναι υπεύθυνο για την αποδόμηση ουβικουιτινυλιωμένων πρωτεϊνών. Το πρωτεάσωμα αποτελείται από έναν πυρήνα 20S που σχετίζεται με ένα ή δύο ρυθμιστικά τμήματα 19S. H υπομονάδα 19S μπορεί να προσδεθεί στην αλυσίδα πολυουβικουιτίνης και την αποκόπτει από την πρωτεΐνη-στόχο. Η πρωτεΐνη-στόχος τότε ξετυλίγεται και αποδομείται στον πρωτεολυτικό πυρήνα, σχηματίζοντας πεπτίδια των 3-25 αμινοξέων σε μήκος. Oι αναστολείς του πρωτεασώματος αναστέλλουν τόσο την εσωτερικοποίηση του GHR όσο και τη μεταφορά από τα ενδοσώματα στα λυσοσώματα. Το ανασταλτικό αποτέλεσμα χάνεται όταν ο GHR «κόβεται» μετά το αμινοξύ 369, υποδηλώνοντας ότι είτε ο GHR είτε κάποια συνδεόμενη πρωτεΐνη πρέπει να αποδομηθούν στο πρωτεάσωμα πριν μπορέσει να γίνει η εσωτερικοποίηση. Προκύπτει λοιπόν ότι το σύστημα ουβικουιτίνης ρυθμίζει την ανακύκλωση του GHR μέσω δύο διαφορετικών γεγονότων: την εσωτερικοποίηση από την πλασματική μεμβράνη και τη μεταφορά από τα ενδοσώματα στα λυσοσώματα. Εικόνα 38. Η ανακύκλωση του υποδοχέα GHR Η GH ενεργοποιεί την τυροσιν-κινάση JAK2 μέσω ενός μοτίβου πλούσιου σε προλίνη (box 1) και πυροδοτεί την ενεργοποίηση των STATs. Οι σχετιζόμενες με το box 1 δραστηριότητες στον GHR δεν επιφέρουν ούτε την ενδοκύττωσή του ούτε την αποδόμησή του. Αντιθέτως, η ευαισθησία στην GH ρυθμίζεται από το μηχανισμό 74

75 ουβικουιτινυλίωσης, μέσω της εξαρτώμενης από την ουβικουιτίνη ενδοκύττωσης. Μετάλλαξη σε αυτό το μηχανισμό προκαλεί σημαντική μείωση της ενδοκύττωσης και της λυσοσωματικής αποδόμησης, καθιστώντας τα κύτταρα ευαίσθητα στην GH. Με τον τρόπο αυτό τα κύτταρα μπορούν να αντιδράσουν γρήγορα στο στρες και σε μεταβαλλόμενες αυξητικές καταστάσεις και δίνονται νέες θεραπευτικές δυνατότητες για τη ρύθμιση της ευαισθησίας στην GH χωρίς να υπάρχει παρέμβαση στις ευαίσθητες ορμονικές ισορροπίες των GH, IGF-I και της ινσουλίνης. 2.6 Ο διμερισμός του GHR Σύμφωνα με αρχικές δομικές μελέτες, ο επαγώμενος από την GH διμερισμός του GHR υπήρξε για καιρό το αποδεκτό μοντέλο ενεργοποίησης. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, η πρόσδεση της GH στην εξωκυττάρια περιοχή του GHR στα κύτταρα-στόχους, προάγει τον ομοδιμερισμό του υποδοχέα, με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός τριμερούς συμπλέγματος (GH-GHR 2 ). (279,280) Σύμφωνα με τις ίδιες ή σύγχρονες μελέτες, ανάλογα GH που δεν έχουν την ικανότητα να προάγουν το διμερισμό του GHR είναι ανενεργά, (281) η διαταραχή της περιοχής 2 στο μόριο της GH προκαλεί ανταγωνιστική δράση in vivo (282) και in vitro και η χρήση μονοκλονικών αντισωμάτων που παρεμποδίζουν το διμερισμό του GHR ανταγωνίζεται τον εξαρτώμενο από την GH κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η απουσία του ενδοκυττάριου τμήματος από τον GHR καταλήγει στο σχηματισμό ανενεργών διμερών. (283) Ωστόσο, μονοκλονικά αντισώματα που κατευθύνονται προς το εξωκυττάριο τμήμα του υποδοχέα και έχουν την ικανότητα να προάγουν το διμερισμό, αποτυγχάνουν να προκαλέσουν μεταβίβαση του σήματος, (285) γεγονός που υποδηλώνει ότι ο διμερισμός από μόνος του δεν επαρκεί ώστε να πυροδοτήσει τη σηματοδότηση και ότι οι δομικές αλλαγές που επάγονται από την GH είναι επίσης σημαντικές. Κρυσταλλογραφική ανάλυση έχει δείξει ότι ένα μόριο GH, προσδένεται σε δύο μόρια GHR, μέσω δύο περιοχών πρόσδεσης στον GHR (μία υψηλής συγγένειας περιοχή ή περιοχή 1, και μία μικρότερης συγγένειας περιοχή ή περιοχή 2). Σύμφωνα με το αρχικό μοντέλο, η GH προσδένεται σε ένα μόριο GHR μέσω της περιοχής 1 και κατόπιν σε ένα δεύτερο μόριο μέσω της περιοχής 2. (2,285,286) Η πρόσδεση στο δεύτερο μόριο GHR είναι εφικτή μόνο αν έχει προηγηθεί η πρόσδεση στο πρώτο μόριο. (286) Εικόνα 39. Η ενεργοποίηση της JAK2 από το τριμερές GH-GHR2 75

76 To τριμερές αυτό σύμπλεγμα μεταξύ των δύο μορίων GHR και GH σταθεροποιείται από την άμεση διαντίδραση μεταξύ των δύο παραμεμβρανικών περιοχών. Ο διμερισμός προκαλεί μία δομική αλλαγή που πυροδοτεί τον καταρράκτη αντιδράσεων της σηματοδότησης. Συγκεκριμένα, η πρόσδεση της GH σε δύο υποδοχείς GHR αυξάνει τη συγγένεια κάθε υποδοχέα με την JAK2. Με τον τρόπο αυτό, τα δύο συνδεόμενα με τους υποδοχείς GHR μόρια JAK2 έρχονται σε στενή επαφή, διευκολύνοντας τη διασταυρούμενη φωσφορυλίωση περιοχών τυροσίνης στην περιοχή κινάσης των JAK2. (287) Ακολούθως, τα ενεργοποιημένα μόρια JAK2 φωσφορυλιώνουν περιοχές τυροσίνης στον GHR και σε σηματοδοτικά μόρια. Ένας μίσχος περίπου 10 αμινοξέων διαχωρίζει την περιοχή διμερισμού από την κυτταρική μεμβράνη. Σύμφωνα όμως με ένα νεότερο μοντέλο διμερισμού, προσχηματισμένα διμερή GHR προϋπάρχουν της πρόσδεσης της GH. Oι υποδοχείς GHR σχηματίζουν διμερή αμέσως μετά τη σύνθεσή τους στο ενδοπλασματικό δίκτυο, τα οποία παραμένουν στην κυτταρική επιφάνεια. (288,289) H ασύμμετρη πρόσδεση της GH στις περιοχές πρόσδεσης των υποδοχέων του προσχηματισμένου διμερούς, προκαλεί σχετική περιστροφή των ενδοκυττάριων περιοχών των GHR. Επειδή η κυτταροπλασματική περιοχή καθενός υποδοχέα θεωρείται ότι συνδέεται με ένα μόριο JAK2, η περιστροφή αυτή φέρνει τα δύο μόρια JAK2 σε εγγύτητα, ικανή να επιτρέψει σε κάθε μόριο JAK2 να φωσφορυλιώσει την περιοχή τυροσίνης της περιοχής κινάσης του άλλου μορίου JAK2. (290) Η πτύχωση του υποδοχέα συμβαίνει πολύ γρήγορα, πιθανώς κατά τη διάρκεια και αμέσως μετά την ολοκλήρωση της μετάφρασης. Ο επακόλουθος διμερισμός είναι πιο αργός και συμβαίνει στο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο, ανεξάρτητα από την πρόσδεση της GH στην κυτταρική επιφάνεια. Εικόνα 40. Η διαδοχική πρόσδεση της GH στο προσχηματισμένο διμερές GHR και η έναρξη της σηματοδότησης Οποιοσδήποτε παράγοντας διακόπτει τη συνοχή του συμπλέγματος GH-GHR 2 μπορεί να μπλοκάρει τη λειτουργία της ορμόνης. Για παράδειγμα, η αλλαγή μιας απλής γλυκίνης στη θέση 120 σε αργινίνη θα παρεμποδίσει την πρόσδεση του υποδοχέα στη δεύτερη περιοχή πρόσδεσης της αυξητικής ορμόνης. 76

77 Εικόνα 41. Ο διμερισμός του υποδοχέα GHR Η μεγάλη πλάγια αλυσίδα της αργινίνης στη θέση 120 δεν μπορεί να καταληφθεί όταν ο δεύτερος υποδοχέας συνδέεται, γιατί δεν «ταιριάζει» με την τρυπτοφάνη στη θέση 104 του υποδοχέα (απεικονίζεται ως πράσινες σφαίρες). Επομένως, η τροποποιημένη ορμόνη δε σχηματίζει ενεργό σύμπλεγμα με ένα δεύτερο υποδοχέα και καταστέλλει την αύξηση. Ο ανεξαρτήτως από την πρόσδεση συνδέτη διμερισμός του GHR δεν είναι μόνο ένα πλεονέκτημα για τη μεταβίβαση του σήματος, αλλά είναι επιπλέον απαραίτητη συνθήκη για την εξαρτώμενη από το σύστημα ουβικουιτίνης ενδοκύττωση του GHR. Έχει βρεθεί σε κυτταρική σειρά πνεύμονα από Κινέζικα χάμστερ, στα οποία χρησιμοποιήθηκε ένα ένζυμο που ενεργοποιεί την ουβικουιτίνη, ότι τα μονομερή του GHR εσωτερικοποιούνταν ραγδαία και ανεξάρτητα από το ενεργοποιημένο σύστημα ουβικουιτίνης. Προφανώς, το σύστημα της ουβικουιτίνης αναγνωρίζει μόνο διμερή του υποδοχέα GHR. Η ενδοκυττάρια περιοχή του υποδοχέα δε φαίνεται να συμμετέχει στο διμερισμό του GHR, καθώς η εξάλειψη του 97% της περιοχής αυτής σε ένα μόριο GHR δεν επηρεάζει τον ετεροδιμερισμό του με ένα πλήρες μόριο GHR. Ομοίως, έγινε μετάλλαξη αμινοξέων της διαμεμβρανικής περιοχής του GHR σε περιοχές αλανίνης και δεν επηρεάστηκε ο διμερισμός του GHR. Έχει προταθεί από δεδομένα κρυσταλλογραφίας ότι αμινοξέα της υποπεριοχής 2 του εξωκυττάριου τμήματος του GHR παίζουν καθοριστικό ρόλο στο διμερισμό. Ωστόσο, μεταλλάξεις αυτών των αμινοξέων δεν επηρεάζουν το διμερισμό του GHR, πιθανώς γιατί μονές μεταλλάξεις δεν είναι ικανές να διαταράξουν την εκσεσημασμένη διαντίδραση μεταξύ των υποδοχέων GHR. Αντιθέτως, η αντικατάσταση ολόκληρου του εξωκυττάριου τμήματος του GHR με τμήμα της πρωτεΐνης που βρίσκεται σε επαφή με τον υποδοχέα του LDL, οδήγησε σε χιμαιρικά μονομερή. Πιθανότατα, το εξωκυττάριο τμήμα του GHR απαιτείται μόνο για την αρχική σύνδεση των υποδοχέων GHR, καθώς η πέψη με πρωτεάσες του εξωκυττάριου τμήματος υποδοχέων GHR που εντοπίζονται στην κυτταρική μεβράνη, ήδη διμερισμένων, δε διαταράσσει το διμερισμό των συνδεόμενων με τη μεμβράνη εναπομεινασών πρωτεϊνών. Αν οι υποδοχείς βρεθούν σε στενή επαφή, ο διμερισμός πιθανώς διατηρείται μέσω των ασθενώς διαντιδρώντων διαμεμβρανικών τμημάτων των υποδοχέων. 77

78 Αν και ο GHR διμερίζεται απουσία της GH, τα σηματοδοτικά μονοπάτια ενεργοποιούνται μόνο μετά την πρόσδεση της GH. Η ενεργοποίηση μετά την πρόσδεση της GH πιθανότατα προϋποθέτει μία δομική αλλαγή στον GHR, που οδηγεί στην ενεργοποίηση της JAK2 τυροσιν-κινάσης στην ενδοκυττάρια πλευρά. Μεταλλάξεις στην υποπεριοχή 2 παρεμποδίζουν αυτή την εξαρτώμενη από την GH δομική αναδιοργάνωση. Επειδή η GH προσδένεται διαδοχικά στα δύο μόρια GHR, η παρουσία προσχηματισμένων διμερών προσφέρει το πλεονέκτημα γρήγορης σηματοδότησης, δεδομένου ότι δε χάνεται χρόνος για την «επιστράτευση» δεύτερου μορίου GHR. Συμπερασματικά, ο αριθμός των λειτουργικών GHR στην κυτταρική επιφάνεια εξαρτάται από την ισορροπία ανάμεσα στη σύνθεση και την αποδόμηση. Η λειτουργικότητα επιτυγχάνεται μόνο αν οι υποδοχείς βρίσκονται με τη μορφή διμερών στην κυτταρική επιφάνεια, και μόνο τα διμερή παρέχουν το ειδικό «εισιτήριο» ώστε να ενδοκυττωθούν από το σύστημα της ουβικουιτίνης. (291) 2.7 Ενεργοποίηση κυτταροπλασματικών κινασών ως απάντηση στην GH O GHR δεν έχει ενδογενή ενζυμική δραστικότητα και επιστρατεύει κυτταροπλασματικές τυροσιν-κινάσες για τη διαδικασία της μεταγωγής του σήματος. Η πιο σημαντική τυροσιν-κινάση μέσω της οποίας διαμεσολαβούνται οι δράσεις της GH είναι η JAK2. H ενεργοποίηση της JAK2 καταλήγει στην ενεργοποίηση διάφορων τυροσιν-κινασών που δε βρίσκονται σε επαφή με τον υποδοχέα και οι οποίες μπορούν να επάγουν διαφορετικά, αλλά σε πολλές περιπτώσεις αλληλοσυνδεόμενα, σηματοδοτικά μονοπάτια. Η JAK2 συνδέεται με τον GHR μέσω του Box1, που βρίσκεται εγγύς της διαμεμβρανικής περιοχής. Η σπουδαιότητα της JAK2 αποδεικνύεται μετά από μετάλλαξη του Box1 ή απαλοιφή της JAK2. Και στις δύο περιπτώσεις ο GHR είναι ανενεργός. Αρχικά υπήρχε η άποψη ότι η πρόσδεση της GH στον GHR και ο διμερισμός του GHR επιστρατεύουν πρωτεΐνες JAK2 προς τον υποδοχέα. Ωστόσο, έχει αποδειχθεί ότι η JAK2 είναι σε μόνιμη σύνδεση με τους υποδοχείς και είναι πολύ πιθανό ότι η πρόσδεση του συνδέτη σταθεροποιεί το προσχηματισμένο σύμπλεγμα υποδοχέα- JAK2. Η JAK2 εκτός από το ρόλο που έχει στη σηματοδότηση της GH, εξασφαλίζει την επάρκεια του GHR στην κυτταρική επιφάνεια επηρεάζοντας τη σταθερότητά του (292,293). Έχει ήδη αναφερθεί ότι η επάρκεια του GHR στην κυτταρική επιφάνεια είναι καθοριστικός παράγων της κυτταρικής ευαισθησίας στην GH. H διαθεσιμότητα του GHR στην κυτταρική επιφάνεια εξαρτάται από την αρνητική ρύθμιση, καθώς και από την πρωτεόλυση και το shedding του εγγύς τμήματος της εξωκυττάριας περιοχής (294). H GH επάγει δομικές αλλαγές στον GHR που καταλήγουν σε φωσφορυλίωση και καταλυτική ενεργοποίηση της περιοχής κινάσης της JAK2. (295) H μέγιστη φωσφορυλίωση της JAK2 προϋποθέτει την παρουσία τουλάχιστον του ενός τρίτου της κυτταροπλασματικής ουράς του GHR. Όταν η JAK2 ενεργοποιείται, 78

79 φωσφορυλιώνει τον GHR σε πολλαπλές περιοχές τυροσίνης. Φωσφορυλιωμένα συμπλέγματα των GHR-JAK2 παρέχουν πολλαπλές περιοχές πρόσδεσης για σηματοδοτικά μόρια που περιέχουν SH2 ή μοτίβα πρόσδεσης φωσφοτυροσίνης (PTB). H JAK2 ανήκει στην οικογένεια των Janus Associated Kinases που περιλαμβάνει επίσης τις JAK1, JAK3 και Tyk2. Η GH έχει επίσης την ικανότητα να επάγει τη φωσφορυλίωση των JAK1 και JAK3, αλλά σε πολύ μικρότερα επίπεδα ενεργοποίησης σε σχέση με την JAK2. Aν και δεν έχει αποδειχθεί ότι η GH ενεργοποιεί την Tyk2, έχει ανιχνευθεί επαφή του Tyk2 με τον υποδοχέα σε ανθρώπινα ηπατικά κύτταρα, επομένως ίσως η GH χρησιμοποιεί αυτή την κινάση. Η GH επιστρατεύει, μέσω ενεργοποίησης της JAK2, άλλες τυροσιν-κινάσες εκτός του υποδοχέα, όπως είναι οι c-src, c-fyn και FAK. Αν και ο ακριβής ρόλος της ενεργοποίησης αυτών των πρωτεϊνών από την GH δεν είναι ξεκάθαρος, κάποιες μελέτες υποδηλώνουν ότι άλλες πρωτεΐνες εξαρτώμενες από την GH, όπως οι FAK, p130cas και c-cbl μπορούν να δράσουν ως υποκατάστατα για τη c-src. H ενεργοποίηση της FAK επάγει αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού ακτίνης. 2.8 Σηματοδοτικά μονοπάτια εξαρτώμενα από την GH Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η πρόσδεση της αυξητικής ορμόνης στον υποδοχέα της οδηγεί στην ενεργοποίηση και αυτοφωσφορυλίωση των συνδεόμενων με τον υποδοχέα κυτταροπλασματικών τυροσιν-κινασών Janus kinases-2 (JAK-2). H ενεργοποίηση των JAK-2 προάγει την τυροσιν-φωσφορυλίωση του GHR και άλλων πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα τη φωσφορυλίωση των Signal Transducers and Activators of Transcription (STATs) και άλλων μονοπατιών, όπως της ERK κινάσης (Extracellular Signal Regulated-kinase), της MAP κινάσης (Mitogen-activated Protein Kinase) και της PI3 κινάσης (Phosphoinisitol 3 Kinase). (296,297) To μονοπάτι JAK/STAT Το μονοπάτι JAK/STAT αποτελεί πρότυπο σηματοδοτικό μηχανισμό για κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες στα θηλαστικά και, από μηχανιστικής άποψης, είναι ένα σχετικά απλό μονοπάτι.. Η πρόσδεση της GH στον υποδοχέα της φέρνει δύο μόρια JAK2 σε εγγύτητα, επιτρέποντας τη διασταυρούμενη φωσφορυλίωσή τους. Οι ενεργοποιημένες JAK2 φωσφορυλιώνουν στη συνέχεια τους υποδοχείς GHR κι επιπρόσθετους στόχους, όπως είναι οι πρωτεΐνες STAT. Σύντομα μετά τη φωσφορυλίωση του συμπλέγματος GHR/JAK2, οι πρωτεΐνες STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription), που είναι δυνητικά μεταγραφικοί παράγοντες, επιστρατεύονται στο ενεργοποιημένο σύμπλεγμα. Οι πρωτεΐνες STAT των θηλαστικών διατηρούν μία συντηρημένη περιοχή τυροσίνης κοντά στο καρβοξυτελικό άκρο, που είναι η περιοχή που φωσφορυλιώνεται από την JAK2. 79

80 Μετά τη φωσφορυλίωσή τους οι πρωτεΐνες STAT αποσυνδέονται από τον υποδοχέα, ομοδιμερίζονται ή ετεροδιμερίζονται δια μέσου της περιοχής SH2 κάθε μορίου STAT και μεταναστεύουν στον πυρήνα, όπου προσδένονται σε ειδικά στοιχεία απόκρισης του DNA (DNA response elements). Kατά συνέπεια, ρυθμίζουν τη μεταγραφή γονιδίων. ( ) Εικόνα 42. Το μονοπάτι JAK/STAT Η είσοδος των φωσφορυλιωμένων STAT στον πυρήνα γίνεται μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτάται από την ιμπορτίνη-α5 και μέσω του πυρηνικού μονοπατιού Ran. Με τον τρόπο αυτό, το μονοπάτι JAK/STAT αποτελεί έναν άμεσο μηχανισμό μετατροπής ενός εξωκυττάριου σήματος σε μεταφραστική απόκριση. Η ενεργοποίηση της JAK2 διεγείρει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την κυτταρική μετανάστευση και την απόπτωση. Αυτά τα κυτταρικά γεγονότα είναι κρίσιμα για την αιμοποίηση, την ανοσιακή ανάπτυξη, την ανάπτυξη του μαζικού αδένα, τη λιπογένεση, τη σεξουαλική διαφοροποίηση και άλλες διεργασίες. Είναι προφανές ότι μεταλλάξεις που μειώνουν τη δραστηριότητα του μονοπατιού JAK/STAT επηρεάζουν τις προαναφερόμενες διεργασίες. (303) Αντιθέτως, μεταλλάξεις που ενεργοποιούν συνεχόμενα ή αποτυγχάνουν να ρυθμίσουν σωστά τη σηματοδότηση μέσω JAK, προκαλούν φλεγμονώδη νόσο, ερυθροκυττάρωση, γιγαντισμό και λευχαιμίες. Οι πρωτεΐνες STAT παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. (304) Πρόκειται για τη μόνη γνωστή έως τώρα οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων που η δραστηριότητά τους ρυθμίζεται από τυροσινφωσφορυλίωση. Έως τώρα, έχουν αναγνωριστεί στα θηλαστικά επτά πρωτεΐνες STAT (STAT1-STAT5a, STAT5b και STAT6). Oι δύο ισομορφές STAT5 κωδικοποιούνται από δύο διαφορετικά γονίδια, τα οποία έχουν περίπου 95% ομολογία στην κωδικοποιούσα αλληλουχία τους. Οι δύο αυτές ισομορφές έχουν τόσο αλληλοκαλυπτόμενες όσο και διακριτές λειτουργίες στη μεταβίβαση του σήματος της GH. Εκτός από τις πρωτεΐνες STAT5a και STAT5b, η GH μπορεί να ενεργοποιήσει επίσης τις πρωτεΐνες STAT1 και STAT3. Οι πρωτεΐνες STAT περιλαμβάνουν 6 καλά συντηρημένες περιοχές: την αμινοτελική περιοχή, μία coiled-coil περιοχή, την περιοχή πρόσδεσης στο DNA, τη συνδετική περιοχή, μία περιοχή SH2 και την περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής 80

81 (που εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης). Η παρουσία μίας τυροσίνης στο καρβοξυτελικό άκρο, που είναι το υπόστρωμα για τις JAK κινάσες, έχει συντηρηθεί κατά την εξέλιξη. Οι πρωτεΐνες STAT προσδένονται στους υποδοχείς κυτταροκινών μέσω της περιοχής SH2. Όλες οι δομικές περιοχές στις πρωτεΐνες STAT είναι σημαντικές για τη μεταγραφική τους δραστηριότητα. Η περιοχή SH2 και το αμινοτελικό άκρο (περιοχές 1-120) είναι κρίσιμα για τη σταθερότητα της διαντίδρασης STAT-DNA. Η coiled-coil περιοχή σχηματίζει μία υδρόφιλη επιφάνεια πρόσδεσης για ενδεχόμενες πρωτεϊνικές διαντιδράσεις. Η απομάκρυνση των 50 καρβοξυτελικών περιοχών επιτρέπει το διμερισμό και την πρόσδεση στο DNA, αλλά δεν επιτυγχάνεται η ενεργοποίηση της μεταγραφής. Οι περιοχές SH2, η αμινοτελική περιοχή και η coil-coiled περιοχή συνεισφέρουν στην πρόσδεση στο DNA. H καρβοξυτελική περιοχή έχει ιδιότητες διασταυρούμενης ενεργοποίησης. Εικόνα 43. Η χημική δομή των STAT Η γονιδιακή στόχευση στα ποντίκια έχει διαλευκάνει το μοριακό ρόλο κάθε μέλους της οικογένειας των STAT πρωτεϊνών. Η ανάλυση knockout ποντικιών δείχνει ότι η πρωτεΐνη STAΤ5b εμπλέκεται άμεσα στην κατά μήκος αύξηση και στις φυλετικά διαφορετικές αποκρίσεις στην GH ως προς την έκφραση ηπατικών γονιδίων. Η απουσία της πρωτεΐνης SΤAT5b σε ποντίκια συνεπάγεται μείωση κατά 27% της σωματικής αύξησης στα άρρενα, αυξημένα επίπεδα GH στο πλάσμα, μειωμένα κυκλοφορούντα επίπεδα IGF-Ι και παχυσαρκία. Παρατηρείται επίσης απώλεια των εξαρτώμενων από το φύλο αποκρίσεων στην GH. H έκφραση ειδικών για τα άρρενα ηπατικών γονιδίων, όπως η πρωτεΐνη MUP (major urinary protein), ήταν μειωμένη στα ίδια επίπεδα με αυτά των θηλέων άγριου τύπου, ενώ τα επίπεδα έκφρασης επικρατών γονιδίων ήταν υψηλότερα από τα αντίστοιχα των θηλέων άγριου τύπου. Επιπλέον, η πρωτεΐνη STAT5b είναι απαραίτητη για την εξαρτώμενη από την GH ηπατική έκφραση των IGF-Ι, IGFBP3, ALS, SOCS1, SOCS2, SOCS3 και CIS, όπως και για τη διέγερση της λιπόλυσης στο λιπώδη ιστό. 81

82 Ο φαινότυπος των ποντικιών STAT5a-/- περιλαμβάνει διαταραγμένη ανάπτυξη του μαζικού αδένα και της γαλακτογένεσης, χωρίς διαταραχή στη σωματική αύξηση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η πρωτεΐνη STAT5a είναι απαραίτητη για τη λειτουργία της προλακτίνης, αλλά όχι για τη δράση της GH. Φαίνεται πως υπάρχει συνεργασία των πρωτεϊνών STAT5a και STAT5b στην εξαρτώμενη από την GH έκφραση του ALS. Tα ποντίκια με απουσία των γονιδίων STAT5a/b (double knockouts) παρουσιάζουν επιπρόσθετους φαινότυπους, όπως μη γονιμότητα στα θήλεα και πιο έντονη διαταραχή στην αύξηση. Παρά τη μεγάλη ομολογία των δύο ισομορφών της πρωτεΐνης STAT5, έχουν εντελώς διακριτό ρόλο. Έχει αναφερθεί ότι η έκφραση της πρωτεΐνης STAT5b είναι δεκαπλάσια από αυτή της πρωτεΐνης STAT5a στο ήπαρ και πολύ μεγαλύτερη στα άρρενα συγκριτικά με τα θήλεα. Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών STAT από την GH μπορεί να εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Για παράδειγμα, η GH δεν μπορεί να διεγείρει τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών STAT1 και STAT3 στα ΙΜ-9 λεμφοκύτταρα, παρά την ικανότητα της IFN-γ να ενεργοποιεί αυτές τις STAT πρωτεΐνες στην ίδια κυτταρική σειρά. Στην κυτταρική σειρά 3T3-F442A των ινοβλαστών η GH ρυθμίζει την έκφραση του c-fos μέσω της ενεργοποίησης των πρωτεϊνών STAT1 και STAT3. Αυτή η εξειδίκευση ίσως οφείλεται στη διαντίδραση των πρωτεϊνών STAT με άλλους ειδικούς για τον κάθε ιστό μεταγραφικούς παράγοντες για τη ρύθμιση σύνθετων response elements ενός συγκεκριμένου γονιδίου. Παράγων STAT που απουσιάζει STAT1 STAT2 STAT3 Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά ποντικιών Μειωμένη απόκριση στις ιντερφερόνες, επομένως μειωμένος έλεγχος αύξησης και ευαλωτότητα σε όγκους Μειωμένη απόκριση σε ιντερφερόνες Eμβρυικός θάνατος: μειωμένη απόκριση σε παθογόνα και πολλαπλές διαταραχές στους ιστούς, όπως στην κυτταρική επιβίωση STAT4 Μειωμένη κυτταρική διαφοροποίηση των ΤΗ1 κυττάρων που προκαλείται από απώλεια της απαντητικότητας στην IL-12 STAT5a Μειωμένη ανάπτυξη του μαζικού αδένα λόγω απώλειας της απαντητικότητας στην PRL (προλακτίνη). STAT5b Μειωμένη αύξηση λόγω τροποποιημένης απαντητικότητας στην GH STAT6 Μειωμένη κυτταρική διαφοροποίηση των ΤΗ2 κυττάρων που προκαλείται από απώλεια της απαντητικότητας στην IL-4 Πίνακας 2. Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά ποντικιών στα οποία απουσιάζουν ειδικές STAT πρωτεΐνες 82

83 Έχει βρεθεί ότι η GH ενεργοποιεί διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια εκτός του STAT. Ο ακριβής ρόλος και η συμμετοχή του καθενός από αυτά τα μονοπάτια στις φυσιολογικές δράσεις της GH δεν είναι πλήρως γνωστά, δεδομένου ότι πολλά από αυτά τα μονοπάτια ενεργοποιούνται επίσης από διάφορους αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα στοιχεία προκύπτουν από in vitro συστήματα. Μερικά από τα ενεργοποιούμενα από την GH μονοπάτια φαίνονται στην εικόνα. Εικόνα 44. Τα κύρια σηματοδοτικά μονοπάτια της GH Η συμμετοχή καθενός από αυτά τα μονοπάτια στις φυσιολογικές δράσεις της GH παραμένει ασαφής, γιατί μπορεί να ενεργοποιηθούν και από άλλους αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες. (305) Το μονοπάτι Ras/Raf/MEK/ERK (ή της ΜΑΡΚ κινάσης) Το μονοπάτι της mitogen-activated protein kinase (ΜΑΡΚ) είναι παρόν σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς κι ελέγχει σημαντικές κυτταρικές διεργασίες, όπως είναι ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η κυτταρική επιβίωση, η νευρολογική λειτουργία, η ανοσιακή απόκριση και η απόπτωση. Tο μονοπάτι αυτό μεταφέρει σήματα από τους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας σε μεταγραφικούς παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων. 83

84 Εικόνα 45. Οι δράσεις του μονοπατιού Ras/Raf/MEK/ERK Το μονοπάτι της ΜΑΡ κινάσης περιλαμβάνει ενεργοποίηση πρωτεϊνικών σεριν- /θρεονιν- κινασών, οι οποίες είναι ιδιαιτέρως συντηρημένες κατά την εξέλιξη. Δύο συστατικά του μονοπατιού αυτού, τα Ras και Raf, είναι πρωτοογκογονίδια. Το μονοπάτι ενεργοποιείται από διάφορους αυξητικούς παράγοντες, παράγοντες διαφοροποίησης, ορμόνες και ουσίες που προάγουν την ογκογένεση. Σημαντικός παράγοντας ενεργοποίησης του μονοπατιού είναι η πρόσδεση της GH στον υποδοχέα της GHR. Τα περισσότερα ερεθίσματα, όπως και η GH, ενεργοποιούν τις πρωτεΐνες Ras επάγοντας την ανταλλαγή GDP με GTP. Η πρωτεΐνη SOS (Son of sevenless homologes), είναι παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων (GTP exchange factor). Δεσμεύεται στην πρωτεΐνη Ras επιβάλλοντας την απομάκρυνση της GDP (ανενεργός) και τη δέσμευση GTP (ενεργός). Εικόνα 46. Το μονοπάτι της ΜΑΡΚ κινάσης Η πρόσδεση της GH στον υποδοχέα της, μετά την ενεργοποίηση της JAK2, ενεργοποιεί τις MAPK (Mitogen activated protein kinases) μέσω των συνδεόμενων με την JAK2 πρωτεϊνών Shc (Src homology 2 domain containing transforming protein 1) και Grb2 (Growth factor receptor-boound protein 2). Συγκεκριμένα, η GH 84

85 διεγείρει το σύμπλεγμα Shc-Grb2-SOS το οποίο ενεργοποιεί την πρωτεΐνη Ras. Αυτό προϋποθέτει, όπως ήδη αναφέρθηκε, την επιστράτευση παραγόντων που ανταλλάσσουν το GDP με GTP στην κυτταρική μεμβράνη όπου βρίσκεται η Ras. (306) Η πρωτεΐνη Ras έχει βρεθεί ότι μπορεί να προσδεθεί στην πρωτεΐνη Raf με μεγάλη συγγένεια. (307) Για να πυροδοτηθεί όμως η καταλυτική δραστηριότητα της Raf, η πρωτεΐνη Ras πρέπει να είναι κατάλληλα τοποθετημένη στην κυτταρική μεμβράνη. Τα γεγονότα αυτά καταλήγουν στην ενεργοποίηση της MAP/ERK κινάσης (ΜΕΚ) και της ERK1 και -2 (extracellular signal regulated kinase). ( ) Εικόνα 47. Τρισδιάστατη απεικόνιση του ενεργοποιημένου μονοπατιού της ΜΑΡΚ κινάσης Η GH έχει βρεθεί ότι επάγει άμεσα τη φωσφορυλίωση των ERK 1/2 κατά χρονοεξαρτώμενο και δοσοεξαρτώμενο τρόπο στα ηπατοκύτταρα ψαριών. (311) Μία ακόμα ενδιαφέρουσα πορεία της επαγώμενης από την GH ενεργοποίησης της ERK είναι η μέσω JAK2 τυροσιν-φωσφορυλίωση του EGFR. O Yamauchi και συν. έδειξαν ότι η επαγώμενη από την GH φωσφορυλίωση του EGFR, πιθανώς στην περιοχή Υ1068, επιτρέπει τη σύνδεση του Grb2 στην περιοχή αυτή και πυροδοτεί την επαγώμενη από την GH ενεργοποίηση της ERK. (312) Σε ορισμένα κύτταρα, όπως είναι η κυτταρική σειρά 3Τ3-F442A από έμβρυα ποντικιού που μοιάζουν με ινοβλάστες, η GH αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό που επάγεται από τον EGF. Σε αυτά τα κύτταρα η GH προκαλεί απευαισθητοποίηση της επαγώμενης από τον EGF ενεργοποίησης του ΕrbB-2, μέσω της ενεργοποίησης του ERK. (313) Επιπροσθέτως, σε προλιποκύτταρα επίμυ έχει βρεθεί ότι η GH και ο EGF συνεργούν ειδικά για την ενεργοποίηση της ERK. Η περιοχή συνέργειάς τους είναι το επίπεδο ενεργοποίησης της MEK και όχι κάποιο επίπεδο νωρίτερα στον καταρράκτη των αντιδράσεων. Επίσης, μετά από συνεργική δράση της GH και του EGF, αποφωσφορυλιώνεται η πρωτεΐνη KSR (Kinase Suppressor of Ras) σε μία κρίσιμη περιοχή σερίνης, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των MEK-ERK. H KSR είναι μια 85

86 πρωτεΐνη που διευκολύνει τη φωσφορυλίωση της ΜΕΚ από τη Raf. Με τον τρόπο αυτό η GH ευαισθητοποιεί τα κύτταρα αυτά στην EGF-επαγώμενη ενεργοποίηση της ERK. (314) Εκτός από το ρόλο της ERK στον πολλαπλασιασμό, η ενεργοποίησή της έχει συσχετισθεί με την ενεργοποίηση του ογκογονιδίου c-fos που διεγείρεται από την GH. (315) Eπίσης, η πλήρης ενεργοποίηση της επαγώμενης από την GH σηματοδότησης του STAT5 μπορεί να εξαρτάται από την ενεργοποίηση της ERK. (316) Άλλες ΜΑΡ κινάσες όπως η JNK και η p38, έχει βρεθεί ότι ενεργοποιούνται ως απάντηση στην GH. Η p38 επιτρέπει τη μιτογένεση και την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού. ( ) Το μονοπάτι PI3K/Akt Η σεριν-/θρεονιν- κινάση Akt, γνωστή επίσης και ως πρωτεϊνική κινάση Β/ΡΚΒ, έχει κρίσιμο ρυθμιστικό ρόλο σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες, όπως η εξέλιξη του καρκίνου και ο μεταβολισμός της ινσουλίνης. Το μονοπάτι της Akt ενεργοποιείται από διάφορα ερεθίσματα, σημαντικό εκ των οποίων είναι η πρόσδεση της GΗ στον υποδοχέα της GHR. Αποτέλεσμα είναι η παραγωγή 3,4,5 τριφωσφορικής φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης από την 3,4 διφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη μέσω δράσης της κινάσης της φωσφοϊνοσιτίδης 3 (Phosphoinositide 3-kinase/PΙ3Κ). Τα λιπίδια αυτά λειτουργούν ως σημεία πρόσδεσης στην κυτταρική μεμβράνη πρωτεϊνών όπως η Akt. Εικόνα 48. Το μονοπάτι PI3K/Akt Υπάρχουν τρεις ισομορφές της Akt (Akt1, Akt2, Akt3). Η Akt ρυθμίζει την κυτταρική αύξηση μέσω της δράσης της στο σύμπλεγμα TSC1/TSC2 και στα μονοπάτια mtor. Ρυθμίζει επίσης τον κυτταρικό κύκλο και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω της άμεσης δράσης της στους αναστολείς των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών p21 και p27 και της έμμεσης δράσης της στα επίπεδα 86

87 της κυκλίνης D και της p53. Επιπλέον, αποτελεί μείζονα ρυθμιστή της κυτταρικής επιβίωσης μέσω άμεσης αναστολής προαποπτωτικών σημάτων. Αρνητικός ρυθμιστής της PI3K, αυτού του κύριου ρυθμιστή της κυτταρικής αύξησης, του μεταβολισμού και της επιβίωσης, είναι η πρωτεΐνη PTEN. Η πρωτεΐνη αυτή είναι γνωστή και για την ογκοκατασταλτική της δράση. (319) Τα μονοπάτια Ras/Raf/MEK/ERK και Ras/PI3K/PTEN/Akt διαντιδρούν μεταξύ τους ρυθμίζοντας την αύξηση και σε κάποιες περιπτώσεις την ογκογένεση. Για παράδειγμα, σε ορισμένα κύτταρα, η μετάλλαξη της PTEN μπορεί να καταστείλει το μονοπάτι Ras/Raf/MEK/ERK, λόγω της ικανότητας του ενεργοποιημένου Akt να φωσφορυλιώνει και να απενεργοποιεί διάφορα Rafs. Αν και τα δύο αυτά μονοπάτια θεωρείται ότι έχουν αντιαποπτωτικές δράσεις και ότι προκαλούν αντίσταση σε φάρμακα, σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές παρουσιάζουν ειδικές δράσεις. Επιπλέον, τα δύο μονοπάτια αλληλεπιδρούν με το μονοπάτι p53. (321) Έχει βρεθεί σε ηπατοκύτταρα ότι τα σηματοδοτικά μονοπάτια ERK, PI3K/Akt και JAK2/STAT5 διαμεσολαβούν την εξαρτώμενη από την GH έκφραση του mrna του IGF-I και την έκκριση του IGF-I To μονοπάτι της Phospholipase C (PLC)/PKC/Ca +2 Η φωσφολιπάση C (PLC) καταλύει την υδρόλυση της 4,5 διφωσφορικής φωσφατιδυλινοσιτόλης σε 1,4,5 τριφωσφορική ινοσιτόλη (IP3) και διακυλογλυκερόλη (DAG), που δρουν ως δεύτερα σηματοδοτικά μόρια. Η ΙΡ3 αυξάνει τα ενδοκυττάρια επίπεδα Ca +2, ενώ η DAG ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση C (PKC). Εικόνα 49. Το μονοπάτι της φωσφολιπάσης C H φωσφολιπάση C έχει βρεθεί ότι φωσφορυλιώνεται ως απάντηση στην GH μέσω άμεσης πρόσδεσης στο σύμπλεγμα GHR/JAK2. Η ενεργοποίηση μονοπατιών από τη φωσφολιπάση C φαίνεται ότι εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Για παράδειγμα, η GH επάγει την παραγωγή της DAG και της ΙΡ3 στα κύτταρα του εγγύς νεφρικού σωληναρίου, (321) ενώ επάγει μόνο την παραγωγή της DAG στα κύτταρα των β- νησιδίων του παγκρέατος. (322) 87

88 Τα κύτταρα χρησιμοποιούν δύο μηχανισμούς για να αυξήσουν την ενδοκυττάρια συγκέντρωση ασβεστίου: την απελευθέρωση ασβεστίου από ενδοκυττάριες αποθήκες και την είσοδο ασβεστίου από τον εξωκυττάριο χώρο μέσω δυναμο-εξαρτώμενων καναλιών ασβεστίου. Έχει δειχθεί ότι η GH χρησιμοποιεί και τους δύο μηχανισμούς για να αυξήσει τη συγκέντρωση του ενδοκυττάριου ασβεστίου σε διάφορες κυτταρικές σειρές. (323) Tο μονοπάτι IRS (Insulin Receptor Substrates) και η ΡΙ3 κινάση Τα μόρια IRS είναι μεγάλες κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες που λειτουργούν ως πρωτεΐνες πρόσδεσης και συμμετέχουν στη σηματοδότηση της ινσουλίνης, της ιντερλευκίνης-4 και άλλων κυτταροκινών και πεπτιδικών ορμονών. Έχουν καθοριστικό ρόλο στη μεταβίβαση σημάτων στα ενδοκυττάρια μονοπάτια των PI3K/Akt και ERK/MAPΚ. Το μονοπάτι των υποκαταστάτων υποδοχέων ινσουλίνης IRS αποτελεί ένα ακόμα μονοπάτι μέσω του οποίου η GH ασκεί τις δράσεις της. Η GH και η ινσουλίνη έχουν μερικές κοινές κυτταρικές δράσεις, όπως η ενεργοποίηση της μεταφοράς γλυκόζης, η πρωτεϊνοσύνθεση, η διακίνηση αμινοξέων, η λιπογένεση, η γονιδιακή ρύθμιση, η διαφοροποίηση, η μιτογένεση, η αναστολή της απόπτωσης και η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού. Είναι αναμενόμενο λοιπόν ότι η GH και η ινσουλίνη μοιράζονται ορισμένα σηματοδοτικά μονοπάτια. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, η GH έχει την ικανότητα να διεγείρει την τυροσινφωσφορυλίωση των IRS-1 και IRS-2. Δεν έχει διερευνηθεί το αν συμβαίνει το ίδιο με τα υποκατάστατα υποδοχέων ινσουλίνης IRS- 3 και IRS-4. Η GH αυξάνει επίσης τη σχετιζόμενη με τα IRS-1 και IRS-2 (324, 325) δραστηριότητα της PI3K. Εικόνα 50. Η διέγερση των IRS από την GH και τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται 88

89 Οι πρωτεΐνες IRS-1, -2 και -3 συνδέονται με την JAK2 μέσω ενός μορίου πρόσδεσης (Grb2 ή CrkII) και φωσφορυλιώνονται από την GH. H φωσφορυλίωση των IRS δημιουργεί περιοχές πρόσδεσης για άλλα σηματοδοτικά μόρια που περιέχουν την περιοχή SH2, όπως είναι η ΡΙ3 κινάση και η SHP2. Μερικά από αυτά τα σηματοδοτικά μόρια ενεργοποιούνται ή φωσφορυλιώνονται από την GH. H PI3 κινάση φωσφορυλιώνει λιπίδια ινοσιτόλης δημιουργώντας πολυφωσφοϊνοσιτίδες, οι οποίες εμπλέκονται στη μεταβίβαση του σήματος. Έχει βρεθεί ο ρόλος της GH σε διαδικασίες που διαμεσολαβούνται από την ΡΙ3 κινάση, όπως η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, ο κυτταρικός μεταβολισμός, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η κυτταρική επιβίωση. 89

90 Κεφάλαιο 3 : Αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH Η ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών της GH είναι ταχεία και παροδική. Η μέγιστη επαγωγή της τυροσιν-φωσφορυλίωσης της JAK2 επιτυγχάνεται λίγα λεπτά μετά τη διέγερση από την GH. In vitro, η φάση ενεργοποίησης ακολουθείται από μία περίοδο απευαισθητοποίησης, κατά την οποία δεν μπορεί να επιτευχθεί η μέγιστη ενεργοποίηση της σηματοδότησης της GH. Yπάρχουν διάφορα επίπεδα στα οποία μπορεί να επιτευχθεί η αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης που διαμεσολαβείται από τον GHR: στη διακίνηση του υποδοχέα (εσωτερικοποίηση/ ανακύκλωση/ αποδόμηση), στην πρωτεόλυσή του, στην απενεργοποίηση θετικών ρυθμιστών της αποφωσφορυλίωσης, στην αποδόμηση ενδιάμεσων σηματοδοτικών μορίων, στη δράση των αρνητικών ρυθμιστών και, ίσως, και σε άλλους μηχανισμούς. (326,327) 3.1 Αρνητική ρύθμιση του GHR Έχει ήδη αναφερθεί ότι η ρύθμιση του αριθμού των ενεργών υποδοχέων GHR στις κυτταρικές μεμβράνες είναι βασικός μηχανισμός για τον έλεγχο της ευαισθησίας της GH. Η απομάκρυνση των υποδοχέων κυτταρικής επιφανείας είναι ένα αρχικό βήμα για τη λήξη της GH-εξαρτώμενης σηματοδότησης. Αυτό διαμεσολαβείται μέσω εσωτερικοποίησης/ενδοκύττωσης (328). Η συγκέντρωση του υποδοχέα GHR ρυθμίζεται σε πολλά επίπεδα από τη μεταγραφή ως την πρωτεϊνική σύνθεση και μεταφορά στην κυτταρική μεμβράνη. Σχεδόν όλοι οι νεοσυντιθέμενοι υποδοχείς GHR μετατρέπονται στην ώριμη μορφή τους και κατευθύνονται προς την κυτταροπλασματική μεβράνη. Ένα μικρό ποσοστό μπορεί επίσης να κατευθυνθεί προς τα λυσοσώματα. Σε κατάσταση σταθερότητας, η ανακύκλωση του GHR είναι ραγδαία. Ο χρόνος ημιζωής του GHR είναι λεπτά. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, στην κυτταροπλασματική μεμβράνη οι υποδοχείς μπορεί να ενδοκυττωθούν, να μεταφερθούν στα ενδοσώματα, όπου μπορούν να ανακυκλωθούν προς τη μεμβράνη ή να στοχοποιηθούν για αποδόμηση στα λυσοσώματα μέσω του συστήματος της ουβικουιτίνης. Ένα μέρος των υποδοχέων GHR της κυτταροπλασματικής μεμβράνης μπορεί να κοπεί από μεταλλοπρωτεάσες σχηματίζοντας την πρωτεΐνη GHBP. Η απόκριση στην GH είναι σε πολλές περιπτώσεις φυλο-εξαρτώμενη και υπόκειται σε νευροενδοκρινικό έλεγχο. Σε μοντέλο αρουραίων, η GH στο άρρεν φύλο εκκρίνεται σε τακτικές ώσεις κάθε 3,5-4 ώρες, ενώ στο θήλυ φύλο το προφίλ της GH είναι περισσότερο συνεχές. Αυτές οι διαφορές στα δύο φύλα καθορίζουν τη φυλοεξαρτώμενη έκφραση μεγάλου αριθμού παραγώγων ηπατικών γονιδίων, όπως είναι πρωτεΐνες πλάσματος, ένζυμα στεροειδών, υποδοχείς και άλλα σηματοδοτικά μόρια. 90

91 Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση ηπατικών γονιδίων στο άρρεν φύλο προϋποθέτει STAT5b και όχι STAT5a. To STAT5b ενεργοποιείται επανειλημμένα από κάθε ώση GΗ στο πλάσμα στους άρρενες αρουραίους, ενώ στους θήλεις, το συνεχές προφίλ της GH ρυθμίζει αρνητικά την GHR-JAK2-STAT5b σηματοδότηση, ώστε γίνεται πολύ γρηγορότερα η απενεργοποίηση του συμπλέγματος GHR-JAK2 μέσω μιας εξαρτώμενης από το πρωτεάσωμα διαδικασίας. Αυτή η αρνητική ρύθμιση σχετίζεται με την GH-επαγώμενη εσωτερικοποίηση του GHR και αποδόμηση μέσω του πρωτεασώματος και προϋποθέτει αυτούσιο το σύστημα ουβικουιτινυλίωσης Η ουβικουιτινυλίωση ως ρυθμιστικό σύστημα του GHR Ως κύριο ρυθμιστικό σύστημα του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα, το σύστημα της ουβικουιτίνης είναι αναμενόμενο να συμμετέχει στη διακίνηση διάφορων μεμβρανικών πρωτεϊνών σε ενδοκυττάριες τοποθεσίες. Η αποδόμηση των πρωτεϊνών από το μονοπάτι ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος προϋποθέτει δύο βήματα: 1) την ουβικουιτινυλίωση, δηλαδή την πρόσδεση της ουβικουιτίνης στην πρωτεΐνη και 2) την αποδόμηση της ουβικουιτινυλιωμένης πρωτεΐνης από το σύμπλεγμα 26S του πρωτεασώματος, με την απελευθέρωση της ουβικουιτίνης, η οποία μπορεί πλέον να ξαναχρησιμοποιηθεί. Μια σημαντική ρυθμιστική παράμετρος των μεμβρανικών πρωτεϊνών είναι ο χρόνος παραμονής τους στην κυτταρική επιφάνεια. Ο αριθμός συγκεκριμένων πρωτεϊνών στην κυτταρική επιφάνεια ρυθμίζεται από την έκφρασή τους (γονιδιακή έκφραση, σταθερότητα mrna, ρυθμό μετάφρασης). Ωστόσο, από τη στιγμή που μια μεμβρανική πρωτεΐνη έχει συντεθεί και μεταφερθεί στον αυλό του ενδοπλασματικού δικτύου, η παρουσία της στην κυτταρική επιφάνεια εξαρτάται από παράγοντες που διαφέρουν για κάθε πρωτεΐνη: το χρόνο, την αποτελεσματικότητα πολυμερισμού και τον ποιοτικό έλεγχο στο ενδοπλασματικό δίκτυο, το ρυθμό μεταφοράς από το ενδοπλασματικό δίκτυο στην κυτταρική μεμβράνη, το ρυθμό ενδοκύττωσης, την πρωτεόλυση στην κυτταρική επιφάνεια, την ικανότητα ανακύκλωσης στην ενδοκυττάρια πορεία και τη δραστηριότητα του λυσοσώματος. Η διαθεσιμότητα του υποδοχέα της αυξητικής ορμόνης (GHR) στην κυτταρική μεμβράνη ρυθμίζεται σε διάφορες περιοχές μέσα στο κύτταρο: α) Η ποσότητα των πρωτεϊνών που συντίθενται στο ενδοπλασματικό δίκτυο ρυθμίζεται από τη μεταγραφή γονιδίων. Επιπλέον, το σύστημα ποιοτικού ελέγχου του ενδοπλασματικού δικτύου ρυθμίζει την έξοδο των κατάλληλα πτυχωμένων πρωτεϊνών από αυτό, β) Στο σωμάτιο Golgi, οι πρωτεΐνες μπορούν είτε να κατευθυνθούν απευθείας στα λυσοσώματα είτε να μεταφερθούν στην κυτταρική επιφάνεια, γ) Στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, ο μηχανισμός ενδοκύττωσης μπορεί να επιλέξει πρωτεΐνες για ενδοκύττωση μέσω των βοθρίων κλαθρίνης ή οι πρωτεΐνες μπορεί να υποβληθούν σε πρωτεόλυση. δ) Στα ενδοσώματα, οι πρωτεΐνες είτε ανακυκλώνονται ξανά προς την κυτταροπλασματική μεμβράνη είτε μαρκάρονται στο λυσόσωμα για αποδόμηση. Σε καθεμιά από αυτές τις κυτταρικές τοποθεσίες, το σύστημα 91

92 ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος μπορεί να ρυθμίζει με ειδικό τρόπο τα επίπεδα πρωτεϊνών με διάφορους μηχανισμούς H εσωτερικοποίηση του υποδοχέα GHR Oι Cheung και συν. ήταν οι πρώτοι που απέδειξαν την ουβικουιτινυλίωση του GHR το Έως τότε, ήταν ήδη γνωστό ότι ο GHR εισέρχεται εντός του κυττάρου στα λιποκύτταρα. Η πρόσδεση της GH αυξάνει την ουβικουιτινυλίωση του GHR και το ρυθμό εσωτερικοποίησής του. Και τα δύο αυτά αποτελέσματα προϋποθέτουν ένα ακέραιο σύστημα ουβικουιτίνης και δεν μπορούν να επέλθουν σε κύτταρα στα οποία απουσιάζει το ενεργοποιητικό της ουβικουιτίνης ένζυμο Ε1. Η εξαρτώμενη από την ουβικουιτίνη ενδοκύττωση του GHR εξαρτάται από το μοτίβο UbE του GHR, το οποίο περιλαμβάνει τη φαινυλαλανίνη 346. Παρά τα ευρήματα αυτά, φαίνεται ότι η διαδικασία της εσωτερικοποίησης μπορεί να εξελιχθεί και χωρίς την ουβικουιτινυλίωση του GHR. Αυτό προκύπτει από μελέτες με μεταλλάξεις που δείχνουν ότι η ενδοκύττωση του GHR δεν επηρεαζόταν από αντικατάσταση των περιοχών λυσίνης με αργινίνη στην κυτταροπλασματική περιοχή του GHR. Είναι ωστόσο ενδιαφέρον ότι είναι απαραίτητο ένα ακέραιο σύστημα ουβικουιτίνης για εσωτερικοποίηση τέτοιων τροποποιημένων μορφών GHR. Η κατατμημένη μορφή του GHR που περιλαμβάνει τις περιοχές μπορεί να εσωτερικοποιηθεί ανεξάρτητα από την ουβικουιτινυλίωση. Στην περίπτωση αυτή δρα ένας διαφορετικός μηχανισμός που χρησιμοποιεί ένα μοτίβο δύο μορίων λευκίνης του υποδοχέα. Η σημασία αυτού του μηχανισμού δεν είναι ξεκάθαρη, καθώς αυτές οι μορφές του υποδοχέα δεν έχουν δυνατότητα σηματοδότησης. Η αναστολή του πρωτεασώματος έχει ως αποτέλεσμα επίσης την αναστολή της εξαρτώμενης από την GH εσωτερικοποίησης και αποδόμησης του GHR, αλλά μόνο της πλήρους μορφής του GHR. Οι μορφές του GHR που στερούνται των περιοχών της ενδοκυττάριας περιοχής εσωτερικοποιούνται και ανακυκλώνονται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, παρά την αναστολή του πρωτεασώματος. Μία πολύ ισχυρή ένδειξη ότι το σύστημα ουβικουιτίνης-πρωτεασώματος εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση του GHR προκύπτει από το γεγονός ότι η αναστολή του πρωτεασώματος παρατείνει τη φωσφορυλίωση του GHR και την ενεργοποίηση των JAK2/STAT5. Η εσωτερικοποίηση καθεαυτή δεν αρκεί για την αρνητική ρύθμιση του υποδοχέα GHR, δεδομένου ότι το σύμπλεγμα GHR/JAK2 είναι ακόμα ενεργό στα ενδοσώματα. Οι συνδεόμενες με τον GHR πρωτεΐνες μπορεί να παίζουν σημαντικό ρόλο στην εσωτερικοποίηση του υποδοχέα. Η τελική απενεργοποίηση του GHR επιτυγχάνεται με την αποδόμηση του GHR στα λυσοσώματα και/ή στο πρωτεάσωμα. Το σύστημα της ουβικουιτίνης είναι απαραίτητο για τη μη λυσοσωματική αποδόμηση κυτταροπλασματικών και πυρηνικών πρωτεϊνών στο πρωτεάσωμα. Ωστόσο, έχει βρεθεί ότι το σύστημα αυτό είναι επίσης απαραίτητο για την επαγώμενη από το συνδέτη εσωτερικοποίηση του GHR, επομένως διαμεσολαβεί έμμεσα την αποδόμησή του στα λυσοσώματα. (344) 92

93 3.2 Δράσεις των αρνητικών ρυθμιστών Η οικογένεια πρωτεϊνών SOCS Ένας επιπρόσθετος μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης της GH σηματοδότησης, που ενεργοποιείται αυτόματα στα ηπατοκύτταρα περίπου 40 λεπτά μετά την εμφάνιση μιας GH ώσης, προϋποθέτει νέα πρωτεϊνική σύνθεση. Αυτό το μονοπάτι περιλαμβάνει γονίδια «άμεσης» απόκρισης που τα προϊόντα τους ρυθμίζουν αρνητικά τη σηματοδότηση προς το STAT5b από το σύμπλεγμα GHR-JAK2, παρεμποδίζοντας την ενεργοποίηση επιπρόσθετων STAT5b μορίων. Πρόδρομος για αυτό το μηχανισμό αρνητικής σηματοδότησης υπήρξε η ανακάλυψη ότι οι πρωτεΐνες SOCS και CIS, που αναστέλλουν τη σηματοδότηση από τους υποδοχείς κυτταροκινών μέσω JAK2, είναι πρώιμα γονιδιακά προϊόντα που επάγονται από κυτταροκίνες, μέσω ενός επαγώμενου από τις STAT μεταγραφικού μηχανισμού. ( ) H οικογένεια πρωτεϊνών SOCS αποτελεί μια οικογένεια αναστολέων της σηματοδότησης κυτταροκινών και ορμονών, που μπορεί να επαχθεί ταχέως μετά την έναρξη της σηματοδότησης από το σύμπλεγμα ενός υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας με την JAK2. Οι πρωτεΐνες SOCS αναγνωρίσθηκαν το 1997 από τρεις διαφορετικές ερευνητικές ομάδες. Η οικογένεια SOCS περιλαμβάνει τουλάχιστον οκτώ πρωτεΐνες: τη Cytokine-inducible SH2-containing protein, CIS, και τις πρωτεΐνες SOCS-1 έως SOCS-7, που έχουν παρόμοια αρχιτεκτονική. Όλα τα μέλη της έχουν μία μεταβλητή αμινοτελική περιοχή, μία κεντρική περιοχή SH2 (Src-homology 2) που επιτρέπει την πρόσδεσή τους σε περιοχές φωσφοτυροσίνης στις πρωτεΐνες-στόχους και ένα συντηρημένο καρβοξυτελικό μοτίβο, το SOCS box, που μπορεί να μαρκάρει τις πρωτεΐνες αυτές για αποδόμηση στο πρωτεάσωμα. (332) Εικόνα 51. Η δομή των πρωτεϊνών SOCS Έχει προταθεί ότι κάποια ζεύγη των πρωτεϊνών αυτών παρουσιάζουν στενότερη συσχέτιση μεταξύ τους παρά με άλλα μέλη της οικογένειας. Οι πρωτεΐνες SOCS-1 και SOCS-3 έχουν μεγάλη ομολογία στην αλληλουχία τους, η πρωτεΐνη SOCS-2 παρουσιάζει κατά 35% ομοιότητα αμινοξέων με την πρωτεΐνη CIS, οι πρωτεΐνες SOCS-4 και SOCS-5 έχουν επίσης σημαντικό βαθμό ομολογίας, όπως και οι 93

94 πρωτεΐνες SOCS-6 και SOCS-7. Εκτός από την περιοχή SH2 και το SOCS box, οι πρωτεΐνες SOCS-1 και SOCS-3 περιλαμβάνουν μία περιοχή kinase inhibitory region (KIR) στο αμινοτελικό άκρο, η οποία δεν έχει περιγραφεί για άλλα μέλη της οικογένειας. Το SOCS box έχει επίσης αναγνωριστεί σε άλλες πρωτεΐνες στις οποίες απουσιάζει η περιοχή SH2, αλλά υπάρχουν άλλες περιοχές που διαμεσολαβούν τις διαντιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (επαναλήψεις αγκυρίνης, επαναλήψεις WD40 ή SPRY περιοχές). Σε γενικές γραμμές, οι πρωτεΐνες SOCS βρίσκονται σε χαμηλά επίπεδα, ωστόσο η έκφρασή τους επάγεται ταχέως μετά τη διέγερση που προκαλούν διάφορες κυτταροκίνες ή αυξητικοί παράγοντες. Η έκφραση του mrna των πρωτεΐνών SOCS εξαρτάται από τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών STAT, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι πρωτεΐνες SOCS ρυθμίζουν τη δράση των κυτταροκινών μέσω αρνητικής ρύθμισης. Έχει βρεθεί ότι οι πρωτεΐνες SOCS κυρίως στοχεύουν το μονοπάτι JAK/STAT, επομένως ρυθμίζουν τη δράση πολλών κυτταροκινών. Οι δράσεις των SOCS μπορούν να αναδειχθούν αν μειωθεί η φωσφορυλίωση των JAK και STAT, ο διμερισμός των STAT, η μεταφορά στον πυρήνα και η μεταγραφική δραστηριότητα των STAT. Στον πίνακα 2 φαίνονται οι κυτταροκίνες και οι αυξητικοί παράγοντες των οποίων η σηματοδότηση αναστέλλεται από τις πρωτεΐνες SOCS. Μέλος οικογένειας SOCS CIS SOCS1 SOCS2 SOCS3 SOCS4 SOCS5 SOCS6 SOCS7 Παράγοντας που αναστέλλεται GH, PRL, EPO, IL-2, IL-3 GH, PRL, ινσουλίνη, λεπτίνη, EPO, TPO, TSLP, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IFNα/β, IFNγ, LIF, TNFα, IGF1 GH, PRL, IGF-1, IL-6, LIF GH, PRL, ινσουλίνη, λεπτίνη, ΕPO, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, IL-11, IFNα/β, IFNγ, LIF, IGF-1 EGF IL-4, IL-6, LIF, EGF Άγνωστο PRL, GH, λεπτίνη Πίνακας 3. Παράγοντες που αναστέλλονται από τα μέλη της οικογένειας SOCS 94

95 Τρόπος δράσης των πρωτεϊνών SOCS Διάφοροι μηχανισμοί μπορούν να εξηγήσουν τον τρόπο δράσης των SOCS πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες SOCS μπορούν να δράσουν ως: α) αναστολείς των πρωτεϊνών JAK, β) ανταγωνιστές πρόσδεσης σε θετικούς ρυθμιστές και γ) μέρος των συμπλεγμάτων λιγάσης της ουβικουιτίνης ώστε να προωθηθεί η διαδικασία της αποδόμησης. Ένα κοινό χαρακτηριστικό όλων των SOCS/CIS πρωτεϊνών είναι η κεντρική SH2 περιοχή, που επιτρέπει στις πρωτεΐνες αυτές να προσδένονται σε σηματοδοτικά μόρια που είναι φωσφορυλιωμένα σε περιοχές τυροσίνης. Στην περίπτωση της SOCS-1, η JAK2 έχει αναγνωρισθεί ως ο πρωταρχικός στόχος. (333) Η πρωτεΐνη SOCS-1, μέσω της SH2 περιοχής της, προσδένεται στο εσωτερικό της αγκύλης ενεργοποίησης της JAK2 (στην τυροσίνη 1007), με αποτέλεσμα τη μειωμένη φωσφορυλίωση των JAK2 και STAT5. Έχει βρεθεί ότι είναι απαραίτητη η περιοχή KIR για τη δράση της πρωτεΐνης SOCS-1 στην κινάση JAK2. Έχει προταθεί πως μετά την πρόσδεση της SOCS-1 στη φωσφορυλιωμένη JAK2, αναστέλλεται η δραστηριότητα της JAK2 μέσω της περιοχής KIR και άρα η πρόσβαση σε άλλα υποστρώματα της JAK2. Έχει βρεθεί ότι η SOCS-1 μπορεί να προσδεθεί σε κυτταροπλασματικές περιοχές του καρβοξυτελικού άκρου του GHR, ακόμα και απουσία τυροσιν-φωσφορυλίωσης. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η SOCS-1 μπορεί να συνδέεται με μη διεγερμένα μόρια υποδοχέα, αυξάνοντας με αυτό τον τρόπο τη συγγένειά της με το σύμπλεγμα υποδοχέα-κινάσης. (333) Η πρωτεΐνη SOCS-3 κυρίως προσδένεται στον ενεργοποιημένο υποδοχέα κυτταροκινών, επομένως εμποδίζει την πρόσδεση των STAT πρωτεϊνών, αλλά μπορεί επίσης να προσδεθεί στις πρωτεΐνες JAK. Όπως και η SOCS-1, η SOCS-3 αναστέλλει τη δραστηριότητα κινάσης της JAK2 μέσω της περιοχής KIR. Εικόνα 52. Μηχανισμός δράσης των πρωτεϊνών SOCS1/3 και CIS H πρωτεΐνη CIS συνδέεται μέσω της περιοχής SH2 στον ενεργοποιημένο υποδοχέα κυτταροκινών, και συγκεκριμένα στις περιοχές πρόσδεσης των πρωτεϊνών STAT. Πιστεύεται ότι η πρωτεΐνη CIS αναστέλλει τη σηματοδότηση καλύπτοντας 95

96 ανταγωνιστικά τις περιοχές του ενεργοποιημένου υποδοχέα όπου προσδένονται οι πρωτεΐνες STAT. Επιπρόσθετα, έχει βρεθεί ότι η πρωτεΐνη CIS αναστέλλει τη μεταβίβαση του σήματος από τον GHR στο STAT5b μέσω ενός εξαρτώμενου από το πρωτεάσωμα μηχανισμού. Ευρήματα από μελέτες υποδηλώνουν ότι ο αναστολέας CIS και το πρωτεάσωμα ρυθμίζουν την εσωτερικοποίηση του GHR και ότι η CISεξαρτώμενη εσωτερικοποίηση του υποδοχέα είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη λήξη της GHR σηματοδότησης. (334) Σύμφωνα με μία πρόσφατη βιβλιογραφική αναφορά, η πρωτεΐνη CIS έχει επιπλέον δράσεις που αφορούν στην καθήλωση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 και στην κυτταρική απόπτωση. Ποντίκια στα οποία απουσιάζει η έκφραση της CIS εμφανίζουν ενεργοποίηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και μειωμένη κυτταρική απόπτωση στα δενδριτικά τους κύτταρα. (446) O μηχανισμός δράσης της πρωτεΐνης SOCS2 δεν είναι ακόμα γνωστός. Ωστόσο, έχει προταθεί ότι είναι ο ίδιος με το μηχανισμό δράσης της πρωτεΐνης CIS (πρόσδεση στον ενεργοποιημένο υποδοχέα κυτταροκινών και παρεμπόδιση της πρόσδεσης της πρωτεΐνης STAT5). Οι πρωτεΐνες CIS και SOCS-2 θεωρούνται ασθενέστεροι αναστολείς από τις SOCS-1 και SOCS-3 σε παρόμοια πρωτεϊνικά επίπεδα. H SOCS-2 μπορεί επίσης να έχει αρνητικές επιδράσεις σε κυτταροκίνες, ειδικά στην GH. Οι δράσεις των SOCS-4, SOCS-5, SOCS-6 και SOCS-7 παραμένουν λιγότερο γνωστές. Έχει βρεθεί ότι η SH2 περιοχή των SOCS-6 και SOCS-7 είναι ειδική για τα IRS-4 και IRS-2, που σημαίνει ότι ρυθμίζει τη σηματοδότηση του IGF-I, καθώς και για την υπομονάδα p85 της PI3Κ. Επιπλέον, η SOCS-6 είναι πιθανό ότι ρυθμίζει τη σηματοδότηση της ινσουλίνης σε ινσουλινοευαίσθητους ιστούς, όπως ο εγκέφαλος. Επίσης, η SOCS-6 προσδένεται στο σύμπλεγμα elongin B/C μέσω του SOCS box, δρώντας επομένως ως Ε3 λιγάση της ουβικουιτίνης που μαρκάρει πρωτεΐνες-στόχους για ουβικουιτινυλίωση και αποδόμηση στο πρωτεάσωμα. Έχει περιγραφεί ένα άλλο μοντέλο του μηχανισμού δράσης των πρωτεϊνών SOCS, που αναφέρεται στην περιοχή SOCS box. Η απουσία του SOCS box δεν επηρεάζει την ικανότητα πρόσδεσης των SOCS-1 και SOCS-3, ούτε την ανασταλτική τους δράση. Ωστόσο, μελέτες έχουν δείξει ότι μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών περιλαμβάνει το ονομαζόμενο SOCS box μοτίβο, προφανώς γιατί έχει σημαντικό λειτουργικό ρόλο. Επιπλέον, ποντίκια στα οποία απουσιάζει το SOCS box μοτίβο της πρωτεΐνης SOCS- 1 έχουν παρόμοιο φαινότυπο με τα ποντίκια στα οποία απουσιάζουν και τα δύο γονίδια SOCS-1 (SOCS-1-/-), γεγονός που υποδηλώνει ότι το SOCS box είναι πράγματι απαραίτητο για την πλήρη δραστηριότητα του SOCS-1. Οι ίδιες οι πρωτεΐνες SOCS μπορούν να στοχευθούν για ουβικουιτινυλίωση και αποδόμηση στο πρωτεάσωμα. Υπάρχουν αμφισβητούμενα αποτελέσματα σχετικά με το μηχανισμό που ρυθμίζει τη σταθερότητα των πρωτεϊνών CIS, SOCS-1 και SOCS- 3. Φαίνεται πως το σύμπλεγμα Elongin BC μπορεί να έχει διπλή δράση. Μπορεί να προαγάγει την αποδόμηση των πρωτεϊνών SOCS, όπως έχει βρεθεί για τις πρωτεΐνες CIS, SOCS-1 και SOCS-3, ενώ σε άλλα κυτταρικά συστήματα μπορεί να σταθεροποιήσει τις SOCS-1 και SOCS-3. Δεν μπορεί επί του παρόντος να προταθεί ένα γενικό μοντέλο για τη δράση των πρωτεϊνών SOCS. Φαίνεται πως ο μηχανισμός μέσω του οποίου κάθε μέλος της 96

97 οικογένειας ασκεί την ανασταλτική του δράση είναι ειδικός για κάθε κυτταρικό τύπο κι εξαρτάται από τις εμπλεκόμενες κυτταροκίνες. Αυτό μπορεί να εξηγείται από την παρουσία μη αναγνωρισμένων συνοδευτικών μορίων των πρωτεϊνών SOCS Η σηματοδότηση της αυξητικής ορμόνης και οι πρωτεΐνες SOCS Η GH επάγει την έκφραση των πρωτεϊνών SOCS με διαφορετική κινητική σε κυτταρικές σειρές ινοβλαστών, σε διάφορους ιστούς σε υποφυσιεκτομηθέντα ζώα και στα ηπατοκύτταρα. Στα ηπατοκύτταρα, η σηματοδότηση μέσω του υποδοχέα της GH, GHR, χαρακτηρίζεται, όπως έχει ήδη αναφερθεί, από την ενεργοποίηση πολλαπλών ενδοκυττάριων σηματοδοτικών μονοπατιών, μεταξύ των οποίων είναι αυτό των STAT, της MAP κινάσης, της PI3K και της πρωτεϊνικής κινάσης C. Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών STAT πραγματοποιείται μέσω μιας GH-επαγώμενης αντίδρασης τυροσιν-φωσφορυλίωσης, η οποία καταλύεται από τη συνδεόμενη με τον GHR τυροσιν-κινάση JAK2. Στο ήπαρ, που είναι σημαντικός ιστός-στόχος της GH, δύο στενά σχετιζόμενες πρωτεΐνες STAT, η STAT5a και η STAT5b, προσδένονται σε τυροσιν-φωσφορυλιωμένες περιοχές του GHR, γεγονός που επιτρέπει την άμεση τυροσιν-φωσφορυλίωση των STAT in vivo ως απάντηση σε φυσιολογικά επίπεδα της κυκλοφορούσας GH. Αυτό οδηγεί σε διμερισμό των ενεργοποιημένων STAT και μεταφορά τους στον πυρήνα, όπου προσδένονται σε στοιχεία απόκρισης (response elements) του DNA γονιδίων-στόχων και διεγείρουν τη γονιδιακή μεταγραφή. Οι πρωτεΐνες STAT1 και STAT3 ενεργοποιούν το γονίδιο c-fos, ενώ η STAT5 ενεργοποιεί γονίδια μέσω του GHRE (GH response element). Έχουν περιγραφεί διάφορα μεταγραφικά κύματα, με μεταγραφικούς παράγοντες τους Fos, Jun, EGR (early growth response protein) 1 και 2, KLF (Kruppel-like factor) 4 και ΧΒΡ (Χ boxbinding protein) 1 αρχικά, και τους ATF (activating transcription factor) 3 και GADD45-γ (growth arrest and DNA damage inducible gene 45-γ), στη συνέχεια. Οι μεταγραφικοί αυτοί παράγοντες πυροδοτούν μονοπάτια που ρυθμίζουν την ανοσοαπόκριση, το μεταβολισμό των υδατανθράκων και λιπιδίων και την παραγωγή του IGF-I. Αντίθετα, η διέγερση από την GH των STAT1 και STAT3 απαιτεί υψηλές συγκεντρώσεις GH και αφορά άμεσες διαντιδράσεις μεταξύ της JAK2 και των STAT, χωρίς να χρειάζονται οι ειδικές περιοχές φωσφοτυροσίνης της κυτταροπλασματικής περιοχής του GHR για να δράσουν ως περιοχές πρόσδεσης για την ενεργοποίηση του STAT5. Oι πρωτεΐνες SOCS/CIS έχουν αναγνωριστεί ως σημαντικοί αναστολείς της σηματοδότησης μέσω των υποδοχέων κυτταροκινών σε πολλούς ιστούς και κυτταρικούς τύπους. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεΐνες SOCS/CIS μπορούν να αναστείλουν τη σηματοδότηση της GH με πολλαπλούς μηχανισμούς. Έχει ήδη αναφερθεί ότι τέτοιοι μηχανισμοί είναι η άμεση αναστολή της JAK2, (στην περίπτωση της SOCS-1), η αναστολή της JAK2 με τρόπο που εξαρτάται από τις εγγύς μεμβρανικές περιοχές φωσφοτυροσίνης του GHR (στην περίπτωση της SOCS-3), και 97

98 η αναστολή της σηματοδότησης GHR-JAK2 μέσω άπω-μεμβρανικών περιοχών φωσφοτυροσίνης του GHR, (στην περίπτωση των CIS και SOCS-2). Εικόνα 53. Μηχανισμός δράσης των CIS, SOCS-1 και SOCS-3 H αναστολή της GH σηματοδότησης προς το STAT5b αφορά 2 μηχανισμούς: 1) Μία αρχική αναστολή της εξαρτώμενης από τον GHR ενεργοποίησης του STAT5b μέσω ανταγωνισμού ανάμεσα στη CIS και του STAT5b ως προς τις ίδιες ή αλληλοεπικαλυπτόμενες περιοχές φωσφοτυροσίνης στην κυτταροπλασματική ουρά του GHR, 2) Mία χρονοεξαρτώμενη, διαμεσολαβούμενη από το πρωτεάσωμα αναστολή, που αφορά την αποδόμηση της CIS, σε συνδυασμό με αποδόμηση του συμπλέγματος GHR-JAK2. Η υπόθεση αυτή επιβεβαιώνεται από το εύρημα ότι η GH διεγείρει μια χρονοεξαρτώμενη αποδόμηση της πρωτεΐνης CIS, η οποία αναστέλλεται από τον αναστολέα του πρωτεασώματος MG-132. Επιπλέον στοιχείο για τον προτεινόμενο ρόλο της CIS στην ενεργοποίηση της αποδόμησης του GHR που εξαρτάται από το πρωτεάσωμα, είναι το εύρημα ότι ο GHR υπόκειται σε αρνητική ρύθμιση μέσω της εσωτερικοποίησης του υποδοχέα, που εξαρτάται από το πρωτεάσωμα κι επάγεται από το συνδέτη. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η εσωτερικοποίηση του υποδοχέα δεν προϋποθέτει την ουβικουιτινυλίωση του υποδοχέα. Πιθανώς, η πρωτεΐνη CIS που συνδέεται στον υποδοχέα GHR δρα ως στόχος για ουβικουιτινυλίωση. Έχει αναφερθεί ότι το SOCS box δεσμεύει τις elongins B και C. Το δημιουργούμενο σύμπλεγμα δεσμεύει την elongin A ώστε να σχηματισθεί ένα ενεργό σύμπλεγμα μεταγραφικής επιμήκυνσης. Η elongin A αλληλεπιδρά με την elongin C. Είτε μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης της elongin B είτε μέσω της προκαλούμενης από την κουλίνη-2 ουβικουιτινυλίωσης των υποστρωμάτων, η JAK2 και οι σχετικές πρωτεΐνες SOCS μπορούν να καταστραφούν. (335,336) 98

99 Εικόνα 54. Σχηματική απεικόνιση των δύο τρόπων καταστροφής των SOCS και της JAK2 Γενικά, η έκφραση των CIS και SOCS3 επάγεται αμέσως μετά τη διέγερση με GH, αλλά παροδικά, ενώ η έκφραση της πρωτεΐνης SOCS2 αυξάνει σταδιακά και φτάνει στο μέγιστο 24 ώρες αργότερα. H SOCS3 προσδένεται στις φωσφορυλιωμένες περιοχές Y487 και Y332 του υποδοχέα GHR, ενώ η SOCS2 στην περιοχή Υ595. Φαίνεται επιπλέον ότι η SOCS1 προσδένεται επίσης στον GHR, αλλά σε αυτή την περίπτωση δεν απαιτείται ενεργοποίηση του υποδοχέα. Η ανασταλτική δράση της πρωτεΐνης CIS φαίνεται ότι είναι χρονοεξαρτώμενη και αφορά άμεση πρόσδεση στον GHR και επαγωγή της εξαρτώμενης από το πρωτεάσωμα αποδόμησης του GΗR. Οι συγκεκριμένες θέσεις στον GHR που απαιτούνται για τη διαντίδραση με την πρωτεΐνη CIS δεν έχουν ακόμα χαρτογραφηθεί. (337) Είναι αξιοσημείωτο ότι η υπερέκφραση της CIS σε διαγονιδιακά ποντίκια καταλήγει σε φαινότυπο παρόμοιο με αυτόν που ανευρίσκεται σε ποντίκια στα οποία απουσιάζει η πρωτεΐνη STAT5b. Aυτό υποδηλώνει ότι η CIS ίσως είναι σημαντικός παράγοντας για την αρνητική ρύθμιση της εξαρτώμενης από την GH σηματοδότησης. Ο φαινότυπος των ποντικιών στα οποία απουσιάζει η πρωτεΐνη SOCS2 (SOCS2-/-) προσδίδει στη SOCS2 σημαντικό ρόλο στην αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH. Tα SOCS2-/- ποντίκια είναι κατά 30-40% μεγαλύτερα από τα φυσιολογικά. Η αύξηση του βάρους οφείλεται σε αύξηση στο μέγεθος των οστών και σε ανάλογη αύξηση των περισσότερων οργάνων. Παρόμοιοι φαινότυποι έχουν βρεθεί επίσης σε ζώα που υπερεκφράζουν την GH, σε ασθενείς με μεγαλακρία και στην περίπτωση μίας μετάλλαξης στα ποντίκια που προκαλεί αύξηση στην μεταγεννητική ανάπτυξη κατά 40-50%. Στα τελευταία ποντίκια έχει βρεθεί μία μετάλλαξη στο χρωμόσωμα 10 που καταλήγει στην απενεργοποίηση της περιοχής SOCS2. Επιπρόσθετες μελέτες έχουν δείξει ότι, πράγματι, η πρωτεΐνη SOCS2 είναι απαραίτητη για την αρνητική ρύθμιση της σηματοδότησης της GH. Για παράδειγμα, η SOCS2 παρεμποδίζει την εξαρτώμενη από την GH αναστολή της διαφοροποίησης των αρχέγονων νευρικών κυττάρων. Κατά συνέπεια, τα ποντίκια SOCS2-/- έχουν λιγότερους νευρώνες στον αναπτυσσόμενο φλοιό, ενώ η υπερέκφραση της SOCS2 προκαλεί αυξημένη νευρωνική διαφοροποίηση. Έχει επίσης βρεθεί ότι η ανασταλτική δράση των οιστρογόνων στη σηματοδότηση της GH διαμεσολαβείται μέσω της πρωτεΐνης SOCS2. Τα οιστρογόνα αυξάνουν το mrna της SOCS2, η οποία 99

100 καταστέλλει την εξαρτώμενη από την GH φωσφορυλίωση της JAK2. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι ο άξονας GH/IGF-1 είναι κύριος στόχος των δράσεων της SOCS2. Ωστόσο, οι ακριβείς μηχανισμοί μέσω των οποίων καθεμιά από τις πρωτεΐνες SOCS, και ιδιαίτερα η SOCS2, ασκούν την αρνητική τους δράση στη σηματοδότηση της GH δεν είναι πλήρως διευκρινισμένοι Φωσφατάσες Η ενεργοποίηση των εξαρτώμενων από την GH σηματοδοτικών μονοπατιών βασίζεται στην πρωτεϊνική φωσφορυλίωση περιοχών τυροσίνης, σερίνης ή θρεονίνης. Η ενεργοποίηση του GHR από την GH κινητοποιεί διάφορα αρνητικά ρυθμιστικά μονοπάτια σημαντικά για τον τερματισμό της GH σηματοδότησης. Ένας προφανής μηχανισμός για την απενεργοποίηση αυτής της διαδικασίας είναι η δράση φωσφατασών. Η δραστηριότητα των φωσφατασών είναι σημαντικός ρυθμιστής της σηματοδότησης της GH, τόσο σε επίπεδο υποδοχέα όσο και σε επίπεδο σηματοδοτικών μορίων. Διάφορες μελέτες έχουν αναγνωρίσει τρεις διαφορετικές φωσφατάσες που εμπλέκονται στην αρνητική ρύθμιση των δράσεων της GH: 1) την SHP (1 και 2), επίσης γνωστή ως ΡΤΡ-1, 2) την ΡΤΡ1Β και 3) την ΡΤΡ-Η1. Οι τυροσιν-φωσφατάσες SHP-1 και SHP-2, οι οποίες προσδένονται σε φωσφορυλιωμένες τυροσινικές περιοχές στον GHR, στην JAK2 και στον STAT5b μέσω των περιοχών τους SH2, καταλύουν την αποφωσφορυλίωση αυτών των σηματοδοτικών μορίων και προκαλούν την απενεργοποίησή τους. Οι SHP-1 και SHP-2 είναι οι δύο καλύτερα χαρακτηρισμένες φωσφατάσες που εμπλέκονται στη σηματοδότηση της GH. (338) Πρόκειται για τυροσιν-φωσφατάσες που περιέχουν την Src-homology domain 2/ SH2. Η GH μπορεί να ενεργοποιήσει την SHP1 και να επαγάγει τη μεταφορά της στον πυρήνα όπου προσδένεται στη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη STAT5b. Η ενζυμική δραστηριότητα της SHP-1 περιορίζει επίσης το βαθμό και τη διάρκεια της ενεργοποίησης της JAK2 μετά από διέγερση από GH. Αντιθέτως, η SHP-2 δρα και ως θετικός και ως αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης της GH, ανάλογα με τη συγκέντρωσή της τοπικά και με τον κυτταρικό τύπο. Η SHP-2 επιστρατεύεται στο σύμπλεγμα που επάγεται από την GH και το οποίο περιλαμβάνει τα GHR, JAK2 και SIRP (signal-regulatory protein) α. Η ενεργοποίηση από την GH επάγει την πρόσδεση της SHP-2 στην Grb2. Η περιοχή SH2 της SHP-2 συνδέεται ειδικά με τη φωσφορυλιωμένη τυροσίνη 595 του ανθρώπινου GHR και μετάλλαξη αυτής της περιοχής πρόσδεσης παρατείνει τη σηματοδότηση της GH. Αντιθέτως, η έκφραση καταλυτικά ανενεργού SHP-2 μειώνει τη μεταγραφική δραστηριότητα που ακολουθεί την ενεργοποίηση του GHR. (339) Ο ίδιος ο GHR αποφωσφορυλιώνεται από πρωτεϊνικές τυροσιν-φωσφατάσες (ΡΤΡs), όπως είναι οι PTP-1B, T cell PTP και PTP-H1. Η JAK2 επίσης είναι ένα φυσιολογικό υποκατάστατο της PTP-1B κατά τρόπο ανεξάρτητο από την GH. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες STAT3, STAT5a και STAT5b αποφωσφορυλιώνονται από την ΡΤΡ-1Β. H αποφωσφορυλίωση των πρωτεϊνών STAT μέσω των ΡΤΡ στον πυρήνα είναι 100

101 σημαντικό σήμα για μεταφορά των μορίων αυτών πίσω στο κυτταρόπλασμα. Η φωσφατάση TC45 είναι μία πυρηνική μορφή της TC-PTP που αποφωσφορυλιώνει τις πρωτεΐνες STAT1 και STAT5. Σε κύτταρα που το γονίδιο TC-PTP έχει εξαλειφθεί, η πυρηνική αποφωσφορυλίωση των ενεργοποιημένων από την GH STAT1 και STAT3, επηρεάζεται, όχι όμως και των STAT5 και STAΤ6. (340) Πράγματι, έχει βρεθεί ότι η προεπώαση με Vanadate, που είναι ένας γενικός αναστολέας των τυροσιν-φωσφατασών, παρατείνει την εξαρτώμενη από την GH φωσφορυλίωση των JAK2 και STAT5. Θεωρώντας πως το μονοπάτι GHR/JAK2/STAT5 είναι το κύριο σηματοδοτικό μονοπάτι της GH, η δράση των φωσφατασών αυτών των τριών πρωτεϊνών είναι κρίσιμη για την κυτταρική απόκριση Signal Regulatory Protein (SIRP) Οι πρωτεΐνες SIRP αποτελούν μια οικογένεια διαμεμβρανικών γλυκοπρωτεϊνών η πλειοψηφία των οποίων περιλαμβάνει μία κυτταροπλασματική περιοχή πλούσια σε προλίνη και τέσσερις κυτταροπλασματικές τυροσίνες, οι οποίες, όταν φωσφορυλιωθούν, προσδένονται στις τυροσιν-φωσφατάσες SHP. Οι πρωτεΐνες SIRP διακρίνονται στις SIRP-α και SIRP-β, οι οποίες παρουσιάζουν ομολογία κατά 90% στην εξωκυττάρια περιοχή. Η SIRP προσδένεται άμεσα στην JAK2 ως απόκριση στην GH, χωρίς να προηγηθεί τυροσυλ-φωσφορυλίωση, αν και η ίδια είναι ιδιαιτέρως φωσφορυλιωμένη σε μόρια τυροσίνης. H φωσφορυλιωμένη SIRP επιστρατεύει ένα ή περισσότερα μόρια τυροσιν-φωσφατάσης SHP-2, τα οποία αποφωσφορυλιώνουν τη SIRP και πιθανώς, την JAK2. Επομένως, η SIRP είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της δράσης της GH. (341,342) H υπερέκφραση της SIRP-α ρυθμίζει αρνητικά την ενεργοποιούμενη από την GH σηματοδότηση αναστέλλοντας τη φωσφορυλίωση των JAK2, STAT5b, STAT3, ERK1 και ERK2. Ο ακριβής μηχανισμός μέσω του οποίου η SIRP-α ρυθμίζει αρνητικά τη σηματοδότηση της GH δεν είναι σαφής. Μπορεί να αφορά πρόσδεση στην SHP-1, μία πρωτεϊνική τυροσιν-φωσφατάση που είναι γνωστό ότι δρα στην JAK2 και STAT5. Εναλλακτικά, μπορεί να ανταγωνίζεται τον GHR για την πρόσδεση θετικών ρυθμιστών, όπως είναι οι πρωτεΐνες SHP-2 ή JAK Πρωτεϊνικοί Αναστολείς των Eνεργοποιημένων STAT (Protein Inhibitors of Activated STATs/PIAS) Oι πρωτεΐνες PIAS έχουν αναγνωρισθεί ως αρνητικοί ρυθμιστές της σηματοδότησης κυτταροκινών λόγω της ικανότητάς τους να αναστέλλουν τη δράση των μεταγραφικών παραγόντων STAT. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι οι PIAS μπορούν να δράσουν ως συρρυθμιστές σε άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια, όπως αυτά των στεροειδών ορμονών και της p53. Πιο πρόσφατα στοιχεία υποδηλώνουν ότι οι PIAS μπορούν να δράσουν ως Ε3 λιγάσες διεγείροντας την πρόσδεση ρυθμιστών που μοιάζουν με την ουβικουιτίνη (SUMO) σε πρωτεΐνες-στόχους. Οι πρωτεΐνες (PIAS) 101

102 έχουν ως κοινή δομή το αμινοτελικό μοτίβο διαντίδρασης με πυρηνικό υποδοχέα και την περιοχή πρόσδεσης ψευδαργύρου RING (real interesting new gene)-like. (343) Έχουν αναγνωρισθεί 6 PIAS: oι PIAS1, PIAS3, PIAS3β, PIASxα, PIASxβ και PIASy, που μπορούν να διαντιδρούν με διαφορετικούς μεταγραφικούς παράγοντες και άλλες πρωτεΐνες. Αρκετοί νέοι μεταγραφικοί παράγοντες που ενεργοποιούνται από την GH έχουν αναγνωρισθεί πρόσφατα ως πιθανοί στόχοι της δράσης των PIAS. Επομένως, είναι πιθανός ο ρυθμιστικός ρόλος της οικογένειας αυτής σε συγκεκριμένες δράσεις της GH. Εικόνα 55. Τα σημαντικότερα μονοπάτια αρνητικής ρύθμισης της GH Η πρωτεΐνη β-transducing repeat-containing protein/β-trcp Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι φυσιολογικές δράσεις της αυξητικής ορμόνης είναι ευρείες και περιλαμβάνουν τη ρύθμιση του μεταβολισμού και τη σωματική αύξηση. Για το λόγο αυτό η απαντητικότητα των κυττάρων στην αυξητική ορμόνη υπόκειται σε στενή ρύθμιση. Όλα τα κύτταρα του ανθρώπινου οργανισμού έχουν υποδοχείς της αυξητικής ορμόνης. Η ενδοκύττωση και η αποδόμηση των υποδοχέων εξαρτώνται από το σύστημα της ουβικουιτίνης, το οποίο αποτελεί το μείζον σηματοδοτικό μονοπάτι για μη λυσοσωματική αποδόμηση. (344) Το εξαρτώμενο από την ουβικουιτίνη μοτίβο ενδοκύττωσης (UbE), που βρίσκεται στην κυτταροπλασματική ουρά του GHR, είναι απαραίτητο για την ενδοκύττωση και την αποδόμηση του υποδοχέα. Η πρωτεΐνη β-trcp (β-transducing repeat-containing protein) είναι σημαντικός παράγων που επιστρατεύεται στο μοτίβο UbE της ουβικουιτίνης κι επομένως διαμεσολαβεί την ενδοκύττωση και αποδόμηση του GHR. (345) Η β-trcp είναι η υπομονάδα F-box αναγνώρισης του υποστρώματος μιας Ε3 λιγάσης που βασίζεται στην κουλλίνη, της SCF. Φαίνεται ότι η β-trcp επιστρατεύει το μηχανισμό ουβικουιτινυλίωσης. Η διαντίδραση της β-trcp είναι το πρώτο βήμα για την ενδοκύττωση του GHR μέσω μιας διεργασίας εξαρτώμενης από την κλαθρίνη. Για να 102

103 εμπλακεί ο μηχανισμός ουβικουιτινυλίωσης σε αυτή τη διεργασία, ο GHR πρέπει να διμεριστεί. (346) Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η β-trcp περιέχει πράγματι μια περιοχή διμερισμού που είναι απαραίτητη για τ&eta