ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ. Διερεύνηση του βιολογικού ρόλου της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης Ζ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ Διερεύνηση του βιολογικού ρόλου της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης Ζ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ-ΝΑΣΙΡ ΣΟΚΑΤ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2017

2

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Με το πέρας του δεύτερου κύκλου σπουδών θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους με βοήθησαν και με στήριξαν ώστε να φτάσω μέχρι αυτό το σημείο. Πρώτον από όλους, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή μου, Κωνσταντίνο Σταθόπουλο, για την υποστήριξη και την καθοδήγησή του από την πρώτη στιγμή που έγινα μέλος του εργαστηρίου. Μέσα από τις υποδείξεις του και τις συζητήσεις μας μπόρεσα να καταφέρω και να γίνω καλύτερος επιστήμονας και όχι μόνο. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω τα άλλα δύο μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής. Τον Καθηγητή Διονύσιο Δραΐνα, για τις συμβουλές του, την υποστήριξη καθώς και για τη φιλική συνεργασία. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή Γεώργιο Ντίνο που δέχτηκε να είναι μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής καθώς και για την άψογη συνεργασία του σε διάφορους τομείς. Θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου κ. Δημήτρη Καλπαξή, την κα. Κωσταντίνα Νίκα καθώς και την κa. Κατερίνα Γραφανάκη για τις φιλικές συμβουλές τους. Ένα ιδιαίτερο ευχαριστώ οφείλω στον Ηλία Σκεπαρνιά και στη Λένα Καλιάτση για τη στενή συνεργασία που είχαμε, για τη φιλία τους, καθώς και για την ανεκτίμητη βοήθεια σε ό,τι και αν χρειαζόμουν. Δεν θα ήθελα να παραλείψω να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου, το Γιώργο Κυριακόπουλο, τη Νικολέτα Γιαρίμογλου, τη Βίκη Κατωπόδη και τη Βίκυ Σταματοπούλου για τη συνεργασία αλλά και τη φιλία τους. Ευχαριστώ πολύ για τη στους συμφοιτητές και φίλους Γιάννη, Γιώτα και Έλενα και Γωγώ, καθώς και την Πατρούλα για την βοήθειά της. Για την τεράστια στήριξη και βοήθεια ώστε να ολοκληρώσω επιτυχώς το συγκεκριμένο κύκλο σπουδών οφείλω ένα τεράστιο ευχαριστώ στο Ίδρυμα Μποδοσάκη. Η οικονομική στήριξη τους μου επέτρεψε να αφιερωθώ στις σπουδές μου και να αποδώσω πολύ καλύτερα. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένεια μου, την αδερφή μου Μαρία και τους γονείς μου Αγγελική και Αλήμ για την συμπαράσταση αυτά τα χρόνια και την πίστη τους σε μένα. Η υποστήριξή τους ήταν και θα είναι πάντα ανεκτίμητη.

4

5 Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών στις Βιοϊατρικές Επιστήμες του Τμήματος Ιατρικής, του Πανεπιστημίου Πατρών ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Καθηγητής Κωνσταντίνος Σταθόπουλος (Επιβλέπων Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 2. Καθηγητής Διονύσιος Δραΐνας (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 3. Αναπληρωτής Καθηγητής Γεώργιος Ντίνος (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών)

6 Περιεχόμενα Περίληψη... 7 Abstract... 8 Εισαγωγή Το μεταφορικό RNA, trna (transfer-rna) και η βιογένεσή του Ωρίμανση του 5 άκρου των trnas Απομάκρυνση των ιντρονίων από τα trnas Ωρίμανση του 3 άκρου των trnas Η ενδονουκλεοτιδική απομάκρυνση της 3 ακόλουθου αλληλουχία καταλύεται από την RNase Z Η RNase Z Οι μορφές της RNase Z στον άνθρωπο Φυλογενετική κατανομή των RNase Z σε όλες τις επικράτειες της ζωής Δομή των ενζύμων RNase Z Τα 5'-άκρα και το CCA μοτίβο αναστέλλουν την RNase Z O ρόλος της προκαρυωτικής RNase Z πέρα από τη βιογένεση των trnas Ο βιολογικός ρόλος της RNase Z L των ευκαρυωτικών οργανισμών Ανθρώπινη RNase Z L και παθογένεια Ο βιολογικός ρόλος της RNase Z S των ευκαρυωτικών οργανισμών Τα θραύσματα trna ως ρυθμιστικά μόρια Το σύστημα CRISPR/Cas Ο βιολογικός ρόλος των αλληλουχιών CRISPR Αξιοποίηση της Cas9 για εξειδικευμένη γονιδιωματική επεξεργασία Οι τροποποιημένες μορφές της Cas9 έχουν νέες χρήσιμες λειτουργίες Σκοπός Υλικά-Μέθοδοι Α.Υλικά Χημικά Ένζυμα-Αντιδραστήρια Αντισώματα Kit Θρεπτικά μέσα... 44

7 6. Διαλύματα Βακτηριακά στελέχη Πλασμιδιακοί φορείς Εκκινητές-Ολιγονουκλεοτίδια Β. Μέθοδοι Ομοπαράθεση αμινοξικών αλληλουχιών και φυλογενετική ανάλυση Κλωνοποίηση των ανθρώπινων RNase Z S (ELAC1), RNase Z L (ELAC2) και Angiogenin (ANG) σε φορείς έκφρασης Έκφραση και απομόνωση των RNase Z S και RNase Z L Ανάλυση πρωτεϊνών Προσδιορισμός δραστικότας της RNase Z S Εύρεση βέλτιστων συνθηκών αντίδρασης Προσδιορισμός δραστικότητας της RNase Z L Κυτταρικές σειρές και καλλιέργεια Ανάλυση κυτταρικού κύκλου με χρήση κυτταρομετρίας ροής Υπερέκφραση των RNase Z S και RNase Z L σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 και προσδιορισμός της γονιδιακής έκφρασης Απαλοιφή της RNase Z S σε κύτταρα HEK-293T με τη χρήση του συστήματος γονιδιωματικής επεξεργασία CRISPR-Cas Αποτελέσματα Διαφορικός υποκυττάριος εντοπισμός των RNase Z S και RNase Z L Η RNase Z S έχει δράση ενδονουλεάσης Οι συνθήκες στρες επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης σημαντικών ριβονουκλεασών Υπερέκφραση της ANG δεν επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης των ELAC1 και ELAC Η έκφραση του ELAC1 (RNase Z S ) επιφέρει αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων AGO και σημαντικών lncrnas Η έκφραση του ELAC2 (RNase Z L ) επιφέρει σημαντικές αλλαγές στην έκφραση γονιδίων AGO, ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου και lncrnas Η υπερέκφραση των ELAC1 και ELAC2 δεν επηρεάζει σημαντικά τον κυτταρικό κύκλο Πλήρης απαλοιφή του γονιδίου ELAC1 δεν επηρεάζει τη κυτταρική βιωσιμότητα Τα τροποποιημένα κύτταρα παρουσιάζουν παρόμοια μορφολογία με τα φυσιολογικά Δεν επηρεάζεται ο κυτταρικός κύκλος από την απαλοιφή της RNase Z S Συζήτηση... 97

8 Βιβλιογραφία Παράρτημα

9 Περίληψη Η ριβονουκλεάση Ζ (RNase Z) είναι η υπεύθυνη ενδονουκλεάση για την αφαίρεση των 3 ακόλουθων αλληλουχιών από τα πρόδρομα μόρια trna, ένα απαραίτητο βήμα όχι μόνο για τη βιογένεση των trnas αλλά επίσης για την παραγωγή μίας νέας ομάδας μικρών μη κωδικών μορίων RNA, τα οποία ονομάζονται trnaderived fragments (trfs). Στον άνθρωπο υπάρχουν δύο μορφές RNase Z, η RNase Z L (92.2 kd) η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο ELAC2 και η RNase Z S (40kD) η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο ELAC1. H RNase Z L είναι υπεύθυνη για την ωρίμανση τόσο των πυρηνικών όσο και των μιτοχονδριακών RNA, για την παραγωγή trfs της σειράς 1 καθώς και για την ωρίμανση σημαντικών μεγάλων μη κωδικών RNAs (lncrnas) όπως το MALAT-1. Από την άλλη, η RNase Z S (ELAC1) έχει μέχρι τώρα απροσδιόριστο βιολογικό ρόλο και εντοπίζεται εξ ολοκλήρου στο κυτταρόπλασμα. Για να διαλευκανθεί ο ρόλος της RNase Z S αλλά και για να μελετηθεί περαιτέρω η RNase Z L, αρχικά, κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες στέρησης θρεπτικών στοιχείων, καθώς και παρουσία Η 2 Ο 2 ώστε να προσδιοριστούν συγκεκριμένα πρότυπα συνέκφρασης. Παρατηρήθηκε ταυτόχρονη αύξηση των ELAC1-ANG γεγονός που αναδεικνύει τον ρόλο αυτών των πρωτεϊνών σε αποκρίσεις στο στρες αλλά και στη δημιουργία θραυσμάτων trnas. Στη συνέχεια υπερεκφράστηκαν τα γονίδια ELAC1 και ELAC2 σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 με σκοπό τη μελέτη των επιπέδων έκφρασης σημαντικών γονιδίων τα προϊόντα των οποίων συμμετέχουν στην ωρίμανση αλλά και στη θραύση trnas, στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, στο μηχανισμό RNAi και παράλληλα μελετήθηκαν και τα επίπεδα έκφρασης σημαντικών lncrnas. Επιπλέον έγινε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου μετά από την υπερέκφραση για να δούμε πως επηρεάζεται από τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Το πρότυπο έκφρασης για αυτά τα γονίδια, ύστερα από υπερέκφραση του ELAC1 αναδεικνύει τον προστατευτικό ρόλο που ενδέχεται να έχει η RNase Z S καθώς μειορυθμίζονται lncrnas που ευνοούν τη μετάσταση και την επαναφορά σε μία βλαστική κατάσταση. Παράλληλα τα επίπεδα έκφρασης των AGO1 και AGO2 ήταν μειωμένα σε σημαντικό βαθμό και πιθανότατα να επηρεάζεται πληθώρα mrnas που στοχεύονται από σύμπλοκα RISC (RNA-induced silencing complex) τα οποία περιέχουν μία από αυτές τις AGO πρωτεΐνες. Υπερεκφράζοντας το γονίδιο ELAC2 παρατηρήθηκε ένα πρότυπο έκφρασης από όλα τα γονίδια που μελετήθηκαν το οποίο υποδηλώνει ότι η RNase Z L ευνοεί το πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση. Επιπλέον, αλλάζοντας την αναλογία των επιπέδων έκφρασης των AGO γονιδίων πιθανότατα επάγει περαιτέρω πλειοτροπικές αλλαγές στα κύτταρα. Τέλος, στη παρούσα διπλωματική εργασία δημιουργήθηκε μία κυτταρική σειρά HEK-293T στην οποία απαλείφθηκε το γονίδιο ELAC1 με την χρήση της τεχνικής γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR-Cas9 και πιστοποιήθηκε η έλλειψη μιας σημαντικής ριβονουκλεάσης. Η απουσία της πρωτεΐνης δεν φαίνεται να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων αλλά επίσης ούτε τη μορφολογία και την κατανομή των κυττάρων στις διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. 7

10 Abstract Ribonuclease Z (RNase Z) is the endonuclease responsible for the removal of the 3 trailer sequences from trna precursors, an essential step not only in trna biogenesis, but also in the production of a new class of small non-coding RNAs, termed trna-derived fragments (trfs). In human, two RNase Z forms exist, RNase Z L (92.2 kd) encoded by the ELAC2 gene and RNase Z S (40 kd) encoded by the ELAC1 gene. RNase Z L is responsible for the maturation of both nuclear and mitochondrial trnas, the generation of series- trna-derived fragments and the maturation of essential long non-coding RNAs (lncrnas) such as MALAT-1. On the other hand, RNase Z S (ELAC1) has elusive, so far, biological role and has been reported to be present exclusively in the cytoplasm. To elucidate the role of RNase Z S, but also to further study RNase Z L, initially, A549 cells were grown under nutrient starvation or in the presence of Η 2 Ο 2 in order to identify specific co-expression patterns. A simultaneous increase of ANG and ELAC1 expression was observed, thus verifying the role of both of proteins in stress response and trna fragmentation. Furthermore, ELAC1 and ELAC2 genes were overexpressed in A549 lung cancer cells with the aim to study the expression levels of key genes encoding proteins involved in trna maturation and fragmentation, cell cycle regulation, RNAi along with the expression of several important lncrnas. Also, cell cycle analysis of transfected A549 was performed to check if it is affected by these two proteins. The expression pattern of the above-mentioned genes after overexpressing ELAC1 brings out the possible protective role of RNase Z S, since lncrnas that promote metastasis and the regression in a stem-like state. Meanwhile the expression levels of AGO1 and AGO2 were lowered in a great extent and it is possible that many mrnas targeted by AGO1- or AGO2-loaded RNA-induced silencing complexes are affected. By overexpressing ELAC2 the expression pattern observed indicates that RNase Z L favors cell proliferation of cancer cells, metastasis and by changing the ratio of AGO genes it is possible that great amount of processes can be affected. The most important element of the present thesis was the creation of a HEK-293T ELAC1 knock-out cell line. For the creation of this cell line the versatile CRISPR-Cas9 system was used. The elimination of RNase Z S was confirmed via Western Blotting. The cells are viable and the absence of the protein affects neither the cell morphology nor the distribution of cells in each cell cycle phase. 8

11 Εισαγωγή

12 Εισαγωγή 10

13 Εισαγωγή 1. Το μεταφορικό RNA, trna (transfer-rna) και η βιογένεσή του Τα μόρια μεταφορικού RNA (trna) αποτελούν τους προσαρμοστές που μεταφράζουν τη γλώσσα του γενετικού κώδικα σε πολυπεπτιδικές αλυσίδες αποτελώντας έτσι το συνδετικό κρίκο μεταξύ mrna και πρωτεϊνών. Τα trnas διαθέτουν χαρακτηριστική δευτεροταγή (σχήμα τριφυλλιού) καθώς και τριτοταγή (σχήματος L) δομή (Εικόνα 1). Πάνω στο ριβόσωμα, το αντικωδικόνιο που βρίσκεται στο κάτω άκρο αλληλοεπιδρά με το κωδικόνιο στο mrna και στο άλλο άκρο φέρει το αντίστοιχο αμινοξύ το οποίο στη συνέχεια μπορεί να προστεθεί στην πεπτιδική αλυσίδα που βρίσκεται σε ένα άλλο trna, μέσω της καταλυτικής δράσης της πεπτίδυλ-τρανσφεράσης του ριβοσώματος. Προκειμένου το trna να μπορεί να λάβει μέρος σε αυτή τη διαδικασία θα πρέπει να έχει την κατάλληλη ώριμη διαμόρφωση. Σε αντίθετη περίπτωση δεν μπορεί να αναγνωριστεί από σημαντικές πρωτεΐνες όπως οι αμινοάκυλ-trna συνθετάσες, οι οποίες συνδέουν το κατάλληλο αμινοξύ στo 3 άκρο των trnas και από του διάφορους παράγοντες επιμήκυνσης, πεπτιδικής σύνθεσης και μετατόπισης κατά την πρωτεΐνοσύνθεση των ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών οργανισμών (1). Εικόνα 1 Η L διαμόρφωση του trna. Τα τελευταία χρόνια, πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι τα trnas διαθέτουν επιπλέον λειτουργίες πέρα από την συμμετοχή τους στην πρωτεϊνοσύνθεση (2). Μη αμινοακυλιωμένα trna αναγνωρίζονται από διάφορες δομές όπως οι T-box ριβοδιακόπτες στους προκαρυωτικούς οργανισμούς και την Gen2 κινάση στη ζύμη και στον άνθρωπο με σκοπό την απάντηση στην έλλειψη κάποιου αμινοξέος ενεργοποιώντας γονίδια ή άλλους παράγοντες (3, 4). Επιπροσθέτως, τα trnas μπορούν να δράσουν και ως εκκινητές για την αντιγραφή του γενετικού υλικού ρετροϊών κάτι που πιστεύεται ότι μπορεί να αντιπροσωπεύει και έναν από τους ρόλους των trnas στον αρχέγονο κόσμο του RNA (5). Επιπλέον πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι τα trnas, κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες στρες, μπορούν να κοπούν σε συγκεκριμένα σημεία από συγκεκριμένες νουκλεάσες 11

14 Εισαγωγή όπως η αγγειογενίνη και η DICER οδηγώντας στην παραγωγή θραυσμάτων trna με διαφορετικά μεγέθη, όπως τα trna-halves και τα trfs. Αυτές οι τομές των trnas δεν αποτελούν τυχαία θραύσματα αποικοδόμησης, αντιθέτως αποτελούν μία νέα ομάδα ρυθμιστικών και σηματοδοτικών μορίων που μπορούν να ρυθμίσουν την γονιδιακή έκφραση (6). Οι τύποι και οι λειτουργίες των μορίων αυτών θα συζητηθούν αναλυτικά παρακάτω. Από τη μεταγραφή των γονιδίων αυτών προκύπτουν τα πρόδρομα μόρια trna (pre-trna). Τα πρόδρομα αυτά μόρια, φέρουν επιπρόσθετες αλληλουχίες στα 5 και 3 άκρα τους καθώς και εσωτερικά παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες, τα ιντρόνια. Για να προβιβαστούν σε λειτουργικά trnas, υποβάλλονται σε μία πληθώρα μετά-μεταγραφικών τροποποιήσεων. Η σωστή διαμόρφωση των trnas επιτυγχάνεται έπειτα από πέντε κύρια στάδια επεξεργασίας του πρόδρομου μεταγράφου: 1) αφαίρεση της 5 οδηγού αλληλουχίας από ένα ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο, την RNase P, 2) αφαίρεση της 3 ακόλουθου αλληλουχίας από εξωνουκλεάσες ή ενδονουκλεάσες όπως η RNAse Z, 3) προσθήκη του CCA άκρου στους ευκαρυώτες, σε αρκετά βακτήρια και σε κάποια αρχαία, 4) την απομάκρυνση των ιντρονίων στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και σε κάποια αρχαία, από συγκεκριμένη ενδονουκλεάση που αφαιρεί το ιντρόνιο και μία λιγάση που θα ενώσει τα εξώνια, και 5) πληθώρα τροποποιήσεων σε διαφορετικές βάσεις (Εικόνα 2) (1). Εικόνα 2 Απεικόνιση της δευτεροταγούς δομής του πρόδρομου και ώριμου trna. Κάθε νουκλεοτίδιο αντιπροσωπεύεται από ένα κύκλο, πράσινο αν είναι μέρος του ώριμου trna, μωβ για την οδηγό και ακόλουθη αλληλουχία και με μπλε το ιντρόνιο. Δεξιά υποδεικνύονται με βέλη στο σχήμα του ώριμου trna οι τροποποιήσεις που λαμβάνουν χώρα. 2. Ωρίμανση του 5 άκρου των trnas Η ωρίμανση του 5 -άκρου των trnas καταλύεται από την RNase P. Η RNase P είναι μία μέταλλοεξαρτώμενη ενδονουκλεάση και καταλύει την υδρόλυση του φωσφοδιεστερικού δεσμού που ενώνει την αλληλουχία οδηγό με το υπόλοιπο pre-trna ωριμάζοντας έτσι το 5 άκρο (Εικόνα 3) (7).Υπάρχουν δύο τύποι RNase P ενζύμων: 1) τα RNA-εξαρτώμενα ένζυμα (ριβοένζυμα), για τα οποία το ενεργό κέντρο εντοπίζεται σε μία καταλυτική RNA υπομονάδα, και 2) RNase P ένζυμα που αποτελούνται μόνο από πρωτεΐνες (PRORPs). 12

15 Εισαγωγή Εικόνα 3 H RNase P καταλύει τη μεταλλο-εξαρτώμενη, ενδονουκλεοτιδική διάσπαση της 5 οδηγού αλληλουχίας των pre-trnas. Η RNase P εντοπίζεται σε όλες τις επικράτειες της ζωής και σχεδόν σε όλα τα είδη, με τη μοναδική εξαίρεση μέχρι τώρα, τον υποχρεωτικά συμβιωτικό οργανισμό Nanoarcaheum equitans, οποίος δεν κωδικοποιεί pre-trnas με 5 αλληλουχίες οδηγούς οπότε και δεν χρειάζονται την RNase P (8, 9). Ενώ η RNAεξαρτώμενη RNase P έχει βρεθεί σε όλες τις επικράτειες της ζωής, οι PRORPs έχουν εντοπιστεί στους ευκαρυώτες και στο υπερθερμόφιλο βακτήριο Aquifex aeolicus (10, 11). Το βακτήριο αυτό φαίνεται να απέκτησε την PRORP μέσω οριζόντιας μεταφορά γονιδίων από κάποιο αρχαίο καθώς περαιτέρω βιοπληροφορική ανάλυση εντόπισε ομόλογες πρωτεΐνες σε πολλά αρχαία και μερικά επιπλέον βακτήρια. Πιθανότητα οι PRORPs να εμφανίστηκαν νωρίς στην εξέλιξη, σε ένα κοινό πρόγονο των αρχαίων και των ευκαρυωτικών οργανισμών καθώς εντοπίζονται σε αρκετά διαφορετικούς οργανισμούς όπως αρχαία, φυτά, τρυπανοσώματα και ζώα. Υπάρχουν παραδείγματα φυλογενετικών κλάδων που δεν φέρουν μία από τις δύο μορφές της RNase P αλλά αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι έχουν μία αρκετά διαφορετική RNA υπομονάδα η οποία δεν μπορεί να εντοπιστεί στο γονιδίωμα ή ότι υπάρχουν ακόμα κενά στην αλληλουχία των γονιδιωμάτων τους (12, 13). 3. Απομάκρυνση των ιντρονίων από τα trnas Τα ιντρόνια εντοπίζονται σε πληθώρα γονιδίων trna σε όλες τις επικράτειες της ζωής. Τα βακτήρια διαθέτουν μικρό αριθμό trnas με ιντρόνια τύπου Ι μέσα στην περιοχή του αντικωδικονίου. Η αντίδραση για την αφαίρεση των ιντρονίων καταλύεται από αλληλουχίες του ιντρονίου. Παρόμοιος μηχανισμός παρατηρείται και στα γονιδιώματα των οργανιδίων των ευκαρυωτικών οργανισμών. Από την άλλη, τα γονιδιώματα των αρχαίων και των ευκαρυωτών διαθέτουν trna με ιντρόνια των οποίων η αφαίρεση είναι πλήρως εξαρτημένη από πρωτεϊνικά ένζυμα (14). 13

16 Εισαγωγή Τα ιντρόνια που εντοπίζονται στα trnas των αρχαίων και των ευκαρυωτών βρίσκονται ανάμεσα στα νουκλεοτίδια 37 και 38, ωστόσο υπάρχουν και ελάχιστες περιπτώσεις ιντρονίων που δεν ακολουθούν αυτό το πρότυπο. Επειδή το ιντρόνιο διαταράσσει τη δομή στελέχους-βρόγχου του αντικωδικονίου, η απομάκρυνσή του είναι απαραίτητη για να είναι λειτουργικό το trna, παρόλα αυτά η υπόλοιπη δομή του trna δεν επηρεάζεται. Οι 5 και 3 θέσεις κοπής του ιντρονίου εντοπίζονται σε μικρές μονόκλωνες περιοχές οι οποίες βρίσκονται ανάμεσα σε δύο δίκλωνες. Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένες διαφορές ανάμεσα στα αρχαία και στους ευκαρυώτες οι οποίες συνοψίζονται στην Εικόνα 4. Για την απομάκρυνση των ιντρονίων τα αρχαία και οι ευκαρυώτες αξιοποιούν παρόμοιες ομάδες ενζύμων, την trna ενδονουκλεάση ματίσματος (Sen), η οποία είναι υπεύθυνη και για την αναγνώριση των σημείων κοπής, και την trna λιγάση. Ορισμένοι οργανισμοί απαιτούν επιπρόσθετους παράγοντες για το στάδιο λιγάσης. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς η απομάκρυνση των ιντρονίων και η ένωσή τους πραγματοποιείται στον πυρήνα με εξαίρεση το ζυμομύκητα στον οποίο πραγματοποιείται στο κυτταρόπλασμα και συγκεκριμένα στην επιφάνεια των μιτοχονδρίων (14, 15). Εικόνα 4 Η δευτεροταγής δομή των pre-trnas των αρχαίων και των ευκαρυωτικών οργανισμών και οι θέσεις ματίσματος για την αφαίρεση των ιντρονίων. Η ευκαρυωτική ενδονουκλεάση ματίσματος αποτελείται από τέσσερεις υπομονάδες: τις Sen2, Sen34, Sen54 και Sen15 οι οποίες ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά στον S. Cerevisiae (16). Από τις τέσσερεις υπομονάδες, οι Sen2 και Sen34 διαθέτουν καταλυτικά κέντρα και είναι υπεύθυνες για την κοπή στο 5 και στο 3 του ιντρονίου αντίστοιχα. H Sen54 αλληλοεπιδρά με το βραχίονα D των pre-trnas και τοποθετεί τις καταλυτικές υπομονάδες στην κατάλληλη θέση ώστε να γίνει επιτυχής κατάλυση. Στον άνθρωπο υπάρχουν και οι τέσσερεις ομόλογες πρωτεΐνες Tsen2, Tsen34, Tsen54, Tsen15 καθώς και μία επιπλέον η hclp1. Τα εξώνια στη συνέχεια πρέπει να ενωθούν από την trna λιγάση. Υπάρχουν δύο τελείως διαφορετικά χημικά μονοπάτια για την αντίδραση λιγάσης τα οποία κατηγοριοποιούνται με βάση την πηγή του φωσφωρικού που θα ενώσει τα δύο εξώνια (Εικόνα 5). Το πρώτο, το μονοπάτι 5 φωσφορικού, παράγει ένα 3 άκρο με 2 φωσφορικό και 3 -ΟΗ. Το δεύτερο, το μονοπάτι 3 φωσφορικού, παράγει ένα 3 άκρο όπου υπάρχει 2 -ΟΗ και 3 φωσφορικό. Στη πρώτη περίπτωση για να ενωθούν τα δύο εξώνια χρησιμοποιείται ένα 14

17 Εισαγωγή νέο φωσφωρικό το οποίο προέρχεται από ένα τριφωσφωρικό νουκλεοτίδιο. Ενώ στη δεύτερη περίπτωση χρησιμοποιείται το φωσφωρικό που υπάρχει στο 3 άκρο του 5 εξωνίου. Στα σπονδυλωτά το κύριο μονοπάτι είναι αυτό του 3 φωσφωρικού ενώ στα φυτά και στους μύκητες το μονοπάτι του 5 φωσφορικού. Αν και ο μηχανισμός με τον οποίο πραγματοποιείται η ένωση των εξωνίων στα θηλαστικά ήταν γνωστός από το 1983 το ένζυμο το οποίο είναι υπεύθυνο για αυτή τη διαδικασία, το HCSPC117, ανακαλύφθηκε μόλις το 2011 (17). Εικόνα 5 Σύνοψη του μηχανισμού απομάκρυνσης των ιντρονίων. Οι πρωτεΐνες του ζυμομύκητα, των θηλαστικών και των προκαρυωτών διακρίνονται με μαύρο, μπλε και πορτοκαλί αντίστοιχα. 4. Ωρίμανση του 3 άκρου των trnas Για ορισμένα σταθερά RNAs, όπως το ριβοσωμικό RNA, οι μικρής σημασίας ετερογένειες στο 3 άκρο είναι συμβατές με τη λειτουργία του RNA (18). Αντιθέτως, η ωρίμανση του 3 άκρου των trnas πρέπει να συμβεί με υψηλή ακρίβεια, δηλαδή για τα πρόδρομα μόρια που περιέχουν την CCA αλληλουχία να αφαιρεθούν όλα τα καθοδικά νουκλεοτίδια και για τα trnas που δεν φέρουν το CCA η επεξεργασία του 3 άκρου πρέπει να γίνει ακριβώς μέχρι και το νουκλεοτιδίο διαχωριστή, ώστε στη συνέχεια να προσδεθεί η CCA τριπλέτα από την trna νουκλεοτιδυλ-τρανσφεράση, δομή απαραίτητη για την αμινοακυλίωση. Ενώ η ωρίμανση του 5 άκρου είναι πάρα πολύ καλά συντηρημένη σε όλες τις επικράτειες της ζωής, η επεξεργασία του 3 άκρου διαφέρει σημαντικά ανάμεσα στις επικράτειες καθώς ακόμα και ανάμεσα στους οργανισμούς της κάθε μίας. Δύο κύριοι τρόποι έχουν περιγραφθεί: 1) η ωρίμανση ενός σταδίου που συμβαίνει μέσω απευθείας ενδονουκλεοτιδικής τομής στο 3 άκρο των trnas (μονοπάτι Β, Εικόνα 6) και 2) η ωρίμανση πολλών σταδίων η οποία περιλαμβάνει ενδο- και εξωνουκλεάσες (μονοπάτι Α, Εικόνα 6). Το μονοπάτι ωρίμανσης ενός σταδίου πάντα καταλύεται από το ένζυμο RNase Z, ενώ οι συμμετέχοντες 15

18 Εισαγωγή πρωτεΐνες στο μονοπάτι πολλών σταδίων περιλαμβάνει πολλές εξωνουκλεάσες οι οποίες μπορεί να είναι πλεονάζουσες. Ορισμένοι οργανισμοί χρησιμοποιούν μόνο ένα από τα δύο μονοπάτια. Ενώ άλλοι χρησιμοποιούν το πρώτο μονοπάτι και έχουν το δεύτερο μονοπάτι σε εφεδρεία, σε περίπτωση που το πρώτο μονοπάτι δεν είναι λειτουργικό και αντιστρόφως. Στην περίπτωση που υπάρχει μόνο ένα μονοπάτι, το συγκεκριμένο μονοπάτι είναι απαραίτητο για τη ζωή (19). Το ποιο μονοπάτι θα κυριαρχήσει εξαρτάται από την αλληλουχία και τη διαμόρφωση του pre-trna. Ένα βασικό στοιχείο είναι η παρουσία ή η απουσία του CCA στο πρόδρομο μετάγραφο. Αν υπάρχει το CCA, τα pre-trnas ωριμάζουν συνήθως μέσω του μονοπατιού πολλών σταδίων. Επιπλέον το μήκος και η δομή της 3 αλληλουχίας, η οποία μπορεί να είναι αρκετά εκτενής και να περιέχει περιοχές με συγκεκριμένη δομή, όπως στην περίπτωση των πολυκιστρονικών μεταγράφων. Στην περίπτωση των αρχαίων, οι μεταγραφικές μονάδες περιέχουν ένα trna τα 3' άκρα του οποίου είναι συνήθως αρκετά μικρά και μπορούν εύκολα να αφαιρεθούν από εξωνουκλεάσες. Στα βακτήρια, γονίδια trna μεταγράφονται σε πρόδρομα μόρια trna που περιέχουν 3' δομές της μορφής στελέχους-βρόχου, οι οποίες πιθανόν απαιτούν 5'-ενδονουκλεολυτική διάσπαση στο στέλεχος-βρόχο. Στην περίπτωση των πολυκιστρονικών μεταγράφων (τα οποία απαντώνται και στα μιτοχόνδρια), η ενδονουκλεολυτική επεξεργασία καθοδικά του trna είναι απαραίτητη. Αυτή η διάσπαση μπορεί να συμβεί είτε άμεσα στο νουκλεοτίδιο-διαχωριστή (D) του 3' άκρου (μονοπάτι Β, Εικόνα 6) ή ακόμη πιο καθοδικά (μονοπάτι Α, Εικόνα 6) (19). Εικόνα 6 Τα δύο μονοπάτια επεξεργασίας του 3 άκρου του trna στους προκαρυωτικούς οργανισμούς. Α. ωρίμανση πολλών σταδίων που περιλαμβάνει ενδο- και εξωνουκλεάσες. Η δράση των τελευταίων πραγματοποιείται μετά την δράση της RNase P στο 5 -άκρο, B. ωρίμανση ενός σταδίου με άμεση ενδονουκλεολυτική διάσπαση στο 3'-άκρο του trna από την RNase Z. 16

19 Εισαγωγή 4.1 Η ενδονουκλεοτιδική απομάκρυνση της 3 ακόλουθου αλληλουχία καταλύεται από την RNase Z Η ανίχνευση της ενδονουκλεοτιδικής επεξεργασίας των 3 άκρων των trnas περιγράφθηκε για πρώτη φορά το 1979 (20). Ωστόσο η πρωτεΐνη καθώς και το αντίστοιχο γονίδιο δεν είχε ταυτοποιηθεί μέχρι το 2002 (21). Με βάση την αλληλουχία του ανακαλυφθέντος ενζύμου RNase Z, πολλά ομόλογα του εντοπίστηκαν και στις τρεις επικράτειες της ζωής (Βακτήρια, Αρχαία και Ευκαρυώτες) (21, 22). Συνώνυμα για την RNase Ζ αποτελούν: trnase Ζ, 3'-tRNase, 3'-pre-tRNase, ElaC, ZiPD, και RNase ΒΝ. Όπως προείπαμε, τα RNase Ζ ένζυμα απαντούν σε δύο μορφές: μια μικρή μορφή (μήκους αμινοξέων) που υπάρχουν και στις τρεις επικράτειες της ζωής, και μία μεγάλη μορφή ( αμινοξέα), η οποία μέχρι στιγμής έχει βρεθεί μόνο στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. 5. Η RNase Z 5.1 Οι μορφές της RNase Z στον άνθρωπο Η ριβονουκλεάση Ζ στον άνθρωπο εντοπίζεται σε δύο μορφές. Μία μικρή, την RNase Z S (40 kd) η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο ELAC1 και μία μεγάλη, την RNase Z L (92.2 kd) η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο ELAC2. Η RNase Z S εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα ενώ η RNase Z L στον πυρήνα και τα μιτοχόνδρια. Ο διπλός εντοπισμός της μεγάλης μορφής οφείλεται στην ύπαρξη ενός δυσμενούς αναγνωριστικού πλαισίου στο πρώτο κωδικόνιο έναρξης, οπότε η μετάφραση μπορεί να ξεκινήσει εναλλακτικά και από το δεύτερο. Τα αμινοξέα που κωδικοποιούνται από τα κωδικόνια ανάμεσα στα δύο κωδικόνια έναρξης αποτελούν το σήμα για στόχευση στα μιτοχόνδρια. Έτσι όταν η μετάφραση ξεκινά από το πρώτο κωδικόνιο έναρξης οδηγούμαστε στην σύνθεση της μιτοχονδριακής ισομορφής και όταν ξεκινά από το δεύτερο συντίθεται η πυρηνική (23). Η RNase Z L έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχει στην ωρίμανση τόσο των πυρηνικών όσο και των μιτοχονδριακών trnas. Ο βιολογικό ρόλος της RNase Z S του ανθρώπου όσο και των υπόλοιπων ζωικών οργανισμών και γενικότερα των ευκαρυωτικών οργανισμών δεν έχει μελετηθεί, ωστόσο υπάρχει μία μελέτη που έχει δείξει ότι στα φυτά συμμετέχει στην επεξεργασία συγκεκριμένων mrnas (24). 5.2 Φυλογενετική κατανομή των RNase Z σε όλες τις επικράτειες της ζωής Αφού ανακαλύφθηκε το πρώτο γονίδιο που κωδικοποιεί μία RNase Ζ, με τη χρήση του αλγορίθμου BLAST βρέθηκε ότι η RNase Ζ είναι ευρέως διαδεδομένη στους οργανισμούς. Όσον αφορά τους προκαρυωτικούς οργανισμούς, τα βακτήρια κωδικοποιούν μία RNase Ζ S και έχει εντοπιστεί σε όλες τις οικογένειες βακτηρίων αλλά όχι σε όλα τα είδη της κάθε οικογένειας κάτι που μπορεί κάλλιστα να οφείλεται σε ελλιπή στοιχεία για 17

20 Εισαγωγή το γονιδίωμα αυτών των ειδών. Επιπλέον εντοπίζεται σε όλα σχεδόν τα κυανοβακτήρια και όλα τα αρχαία (25). Στους ευκαρυώτες εμφανίστηκε κατά την εξέλιξη η RNase Z L, κατά πάσα πιθανότητα μέσω διπλασιασμού της κωδικής περιοχής της RNase Z S. Η μεγάλη μορφή εντοπίζεται σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και είναι υπεύθυνη για την ωρίμανση των πυρηνικών και των μιτοχονδριακών trnas. Ορισμένα δεδομένα υποστηρίζουν ότι μπορεί να έχει και περαιτέρω μη καταλυτικές ιδιότητες, όπως για παράδειγμα να δρα ως αντάπτορας σε εναρκτήρια μεταγραφικά σύμπλοκα της RNA Pol II (26). Παρόλα αυτά, αν και την κύρια δραστικότητα RNase Z έχει αναλάβει η μεγάλη μορφή, υπάρχει και η RNase Z S σε όλα τα ζώα, με εξαίρεση τους νηματώδεις σκώληκες και τα αρθρόποδα (τα οποία είναι κοντινά παρακλάδια των πρωτοστόμιων), και τους περισσότερους μύκητες (εξαίρεση αποτελούν τα Basidiomycota, Chytridiomycota και Zygomycota) (27, 28). Η RNase Z S θα πρέπει να έχει αποκτήσει κάποιο καινούριο ρόλο. Στα φυτά μία μικρή μορφή εντοπίζεται πιθανότατα στα πλαστίδια π.χ. χλωροπλάστες, και εμπλέκεται στον RNA μεταβολισμό αυτών (29). Όσον αφορά τον αριθμό γονιδίων, οι μύκητες διαθέτουν το πολύ ένα γονίδιο για RNase Z S και ένα ή δύο γονίδια RNase Z L. Τα φυτά φαίνεται να έχουν δύο γονίδια για την RNase Z S και ένα ή δύο γονίδια για την RNase Z L. Τέλος τα μετάζωα διαθέτουν ένα γονίδιο για κάθε μορφή, με εξαίρεση τους νηματώδεις και τα αρθρόποδα που δεν διαθέτουν RNase Z S. 5.3 Δομή των ενζύμων RNase Z Τα ένζυμα RNase Z ανήκουν στην οικογένεια των Zn-εξαρτώμενων β-λακταμασών με ένα υψηλά συντηρημένο μοτίβο HxHxDH (x: οποιοδήποτε υδρόφοβο αμινοξύ που προσδένει Zn). Όπως ήδη αναφέραμε διακρίνονται δύο μορφές RNase Z, η RNase Z S και η RNase Z L (Εικόνα 7). Εικόνα 7 Σύγκριση των δευτεροταγών δομών των RNase Z S και RNase Z L. 18

21 Εισαγωγή RNase Z S Όσον αφορά την RNase Z S είναι γνωστές οι κρυσταλλικές δομές των B. subtilis, T. maritima, E. coli και H. sapiens (30 32). Όλες οι πρωτεΐνες διαθέτουν την χαρακτηριστική διαμόρφωση των β-λακταμασών και τα HxHxDH μοτίβα τους συμμετέχουν στον προσανατολισμό των απαραίτητων για την κατάλυση ιόντων Zn. Υπάρχει ένας ευέλικτος βραχίονας σε όλα τα ένζυμα ο οποίος προεξέχει από την υπόλοιπη σφαιρική πρωτεΐνη και βρίσκεται ανάμεσα στην τρίτη και τέταρτη β-αλυσίδα από την α-έλικα που βρίσκεται δίπλα στον β-πυρήνα. Αυτός ο βραχίονας αποτελείται από μία συμπαγή σφαιρική περιοχή που προεξέχει από τον πυρήνα της β-λακταμάσης μέσω ενός «μίσχου» που αποτελείται από δύο αλυσίδες. Όλες οι δομές των RNase Z S μέχρι στιγμής σχηματίζουν παρόμοια διμερή με τις δύο υπομονάδες να κοιτούν μακριά η μία από την άλλη. Πολλές πληροφορίες για το πως δρα το ένζυμο αυτό έδωσε η κρυσταλλική δόμή της RNase Z S του B. subtilis έχοντας προσδεμένο το trna Thr καθώς ξεκαθάρισε το ρόλο της κάθε υπομονάδας (Εικόνα 8) (31). Η κρυσταλλική δομή της RNase Z S του B. subtilis (BsuTrz) στη μορφή συμπλόκου με ένα trna Thr αποκάλυψε ένα μονομερές της RNase Z συμπλοκοποιημένο σε 52 nt του trna στην ασύμμετρη μονάδα (31). Ένα λειτουργικό διμερές δημιουργήθηκε από κρυσταλλογραφική συμμετρία που υποδηλώνει ότι και οι δύο υπομονάδες του διμερούς μπορούν να δεσμεύουν δύο μόρια trna ταυτόχρονα (Εικόνα 8). Για το βρόχο του αντικωδικονίου και το 3'-άκρο δεν ανιχνεύτηκε ηλεκτρονιακή πυκνότητα, αλλά όλα τα νουκλεοτίδια του Τ- βραχίονα και του βραχίονα-δέκτη ήταν ορατά στο σύμπλοκο πρωτεΐνης-trna. Προηγούμενα δεδομένα που υποδεικνύουν ότι ο Τ-βραχίονας και ο βραχίονας-δέκτης εμπλέκονται στην αναγνώριση του trna, επιβεβαιώνονται από την παρατήρηση ότι οι μόνες επαφές μεταξύ της RNase Z και του trna είναι με νουκλεοτίδια από τον Τ-βραχίονα και τον βραχίονα υποδοχής (33, 34). Ο Τ-βραχίονας και ο βραχίονας υποδοχής πακετάρoνται μεταξύ του ευέλικτου βραχίονα της μιας υπομονάδας και της α7 έλικας της άλλης (25). Η αναγνώριση των υποστρωμάτων των trna γίνεται κυρίως μέσω του φωσφο-σακχαρικού σκελετού και παρόλο της μεγάλης ποικιλίας των υποστρωμάτων των πρόδρομων μορίων trna, με διαφορετικές πρωτοταγείς αλληλουχίες, οι τριτοταγείς δομές είναι πολύ συντηρημένες. Δύο θετικά φορτισμένα μοτίβα στην RNase Ζ διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην δεσμευτική ικανότητα του trna, με το ένα να βρίσκεται κοντά στο καταλυτικό κέντρο και το δεύτερο στον ευέλικτο βραχίονα. Το ζευγάρι νουκλεοτιδίων G 1 -C 72 και το νουκλεοτιδίο διαχωριστής U 73 αντιπροσωπεύουν τις βασικές περιοχές επαφής με την παρακείμενη μονομερή υπομονάδα που περιέχει την αντίστοιχη καταλυτική θέση. Ταυτοποιήθηκαν επίσης δύο επαφές με βάση την ειδικότητα των βάσεων με υψηλά συντηρημένα κατάλοιπα γουανοσίνης στις θέσεις 1 και 19 (31). 19

22 Εισαγωγή Εικόνα 8 Η δομή της RNase Z S του B. subtilis έχοντας προσδεμένο ένα trna RNase Z L Οι RNase Z L αποτελούνται από δύο διακριτές περιοχές που συνδέονται μέσω ενός συνδέτη μεγάλου μήκους (περίπου 60 αμινοξέα). H C-τελική επικράτεια (CTD) μοιράζεται σημαντική ομοιότητα ως προς την αλληλουχία με τα RNase Z S ένζυμα, ενώ η αλληλουχία της Ν-τελικής επικράτειας (NTD) αποκλίνει από αυτό της οικογένειας των β-λακταμασών. Παρόλο αυτών των διαφορών, προβλέπεται ότι η NTD θα έχει μία αναδίπλωση τύπου β-λακταμάσης (25). Επιπροσθέτως, η NTD έχει χάσει μοτίβα όπως το HxHxDH τα οποία είναι σημαντικά για την κατάλυση, ωστόσο διαθέτει τον ευέλικτο βραχίονα που συμμετέχει στην πρόσδεση του trna. Από την άλλη το CTD διαθέτει όλα τα σημαντικά καταλυτικά στοιχεία αλλά έχει χάσει τον ευέλικτο βραχίονα. Μέχρι πρόσφατα δεν υπήρχε κάποια γνωστή κρυσταλλική δομή για την RNase Z L και η πρώτη που δημοσιεύτηκε είναι αυτή του ζυμομύκητα, Saccharomyces cerevisiae (Εικόνα 9) (35). Από τη μελέτη αυτή επαληθεύτηκαν οι προβλέψεις που αναφέρθηκαν παραπάνω καθώς βρέθηκαν δύο παρόμοιες περιοχές β- λακταμάσης και στις δύο επικράτειες αλλά μόνο η CTD διαθέτει ένα πλήρες καταλυτικό κέντρο. Η RNase Z L δρα ως μονομερές σε αντίθεση με την μικρή μορφή καθώς οι δύο διακριτές επικράτειες μιμούνται το διμερές της RNase Z S, κάτι που φάνηκε όταν εφάρμοσαν τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα πάνω στη δομή της RNase Z S του B. subtilis. Από την παραπάνω σύγκριση ξεδιαλύθηκε και ο διακριτός ρόλος της κάθε επικράτειας. Πρώτον, παρόλο που ο ευέλικτος βραχίονας της NTD φαίνεται να μην έχει την χαρακτηριστική δομή απουσία υποστρώματος, είναι στην κατάλληλη θέση για να αναγνωρίσει το υπόστρωμα όπως κάνει ο βραχίονας της RNase Z S του B. subtilis. Στην CTD, ο ευέλικτος βραχίονας έχει αντικατασταθεί από μία κοντή θηλεία η οποία είναι πάρα πολύ μικρή για να μπορέσει να αγκαλιάσει το T-loop του trna, αλλά η α17 έλικα (η αντίστοιχη της α7 της RNase Z S του B. subtilis), είναι παρούσα και είναι αυτή που καθοδηγεί το 3 άκρο του trna προς το 20

23 Εισαγωγή ενεργό κέντρο της CTD. Οι επαφές που φαίνεται να δημιουργούνται είναι παρόμοιες με αυτές που παρατηρήθηκαν στο σύμπλοκο BsuTrz/tRNA Thr. Όποτε η NTD αναγνωρίζει και προσδένει το υπόστρωμα και η CTD που διαθέτει το ενεργό κέντρο αφαιρεί την 3 ακόλουθο αλληλουχία. Εικόνα 9 Μοντέλο πρόσδεσης του trna στην RNase Z L του ζυμομύκητα. 5.4 Τα 5'-άκρα και το CCA μοτίβο αναστέλλουν την RNase Z Ορισμένα ένζυμα RNase Ζ αναστέλλονται από την παρουσία του CCA μοτίβου, ενώ άλλα όχι. Η παρουσία των μακρών 5'- άκρων αναστέλλουν επίσης ή επιβραδύνουν τη δραστηριότητα της RNase Ζ, με εξαίρεση το ένζυμο του υπερθερμοφιλικού αρχαιοβακτηρίου P. furiosus, PfuTrz (36). Τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα της BsuTrz βοηθούν στο να εξηγηθούν οι ανασταλτικές επιδράσεις αυτών των στοιχείων. Συγκρίθηκε η δομή της BsuTrz, η οποία δεν μπορεί να διασπάσει υποστρώματα που φέρουν ένα 3'-CCA, με αυτή της TmaTrz, η οποία διασπά το 3' άκρο αμέσως μετά το μοτίβο CCA. Προτάθηκε πως ο βρόχος μεταξύ β1 και β2 στην RNase Ζ του Β.subtilis θα μπορούσε να είναι υπεύθυνος για την ανασταλτική επίδραση στα πρόδρομα μόρια trna που περιέχουν το μοτίβο CCA μιας και η RNase Ζ του Τ.maritima στερείται αυτού του βρόχου. Στις BsuTrz και EcoTrz, αυτός ο βρόχος καλύπτει το κέντρο ενεργοποίησης που οδηγεί σε πιθανή ''σύγκρουση'' του βρόχου με την αμινομάδα της C74. Υπάρχει ένα στενό κανάλι στο οποίο χωράει μονόκλωνο RNA που οδηγεί από το καταλυτικό κέντρο προς το εξωτερικό της πρωτεΐνης. Αυτό το κανάλι, το οποίο προτείνεται να είναι η διαδρομή εξόδου για το 3'-άκρο των πρόδρομων μορίων trnas μπορεί να εξηγήσει γιατί τα 5'-άκρα μπορούν να αναστείλουν τα RNase Ζ ένζυμα. Όσο μεγαλύτερο είναι το 5'-άκρο του trna, τόσο υψηλότερη είναι η πιθανότητα η 5'-οδηγός αλληλουχία και το 3' άκρο να ενώνονται μέσω ζευγαρώματος βάσεων και έτσι να εμποδίζεται η είσοδος του 3' μονόκλωνου άκρου μέσα στο κανάλι (30). 21

24 Εισαγωγή 5.5 O ρόλος της προκαρυωτικής RNase Z πέρα από τη βιογένεση των trnas Όλες οι μελέτες πάνω σε ένζυμα RNase Z μέχρι σήμερα επιβεβαιώνουν την in vitro δραστικότητα επεξεργασίας του 3 άκρου των pre-trnas. Πιο συγκεκριμένα διασπούν τα πρόδρομα trnas στο νουκλεοτίδιο-διαχωριστή αφήνοντας μία 3 -υδροξυλομάδα στο 3 -άκρο του trna και μία 5'-φωσφορική ομάδα στο άκρο που απελευθερώνεται (37). Φυσικά αυτό ισχύει για τα trnas που δεν διαθέτουν CCA άκρο και πρέπει να προστεθεί μεταγενέστερα, όμως η RNase Z εντοπίζεται και σε οργανισμούς που όλα τους τα trna διαθέτουν το CCA στο πρόδρομο μετάγραφο π.χ. στο E. coli. Τέτοιες περιπτώσεις οργανισμών ανέδειξαν έναν επιπλέον φυσιολογικό ρόλο που θα μπορούσε να έχει η RNase Z. Επιπλέον στους προκαρυωτικούς οργανισμούς έχουν βρεθεί επιπλέον μετάγραφα πέρα από trnas που υπόκεινται σε επεξεργασία από την RNase Z. Απαλείφοντας το γονίδιο που κωδικοποιεί τις ριβονουκλεάσες RNase E και RNase Z στο E. coli και συγκρίνοντας την έκφραση γονιδίων με στέλεχος που είχε απαλειφθεί μόνο η RNase E καθώς και στέλεχος αγρίου τύπου έδειξε ότι ένας μικρός αριθμός γονιδίων είχαν πιο σταθερά μετάγραφα (38). Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στη συγκεκριμένη μελέτη οι ερευνητές κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι πιθανότατα η RNase Ζ αναγνωρίζει ως υπόστρωμα και αποικοδομεί κάποια mrnas, όπως το rpst mrna που κωδικοποιεί την ριβοσωμική πρωτεΐνη S20, σε διαφορετικές θέσεις από ότι η RNase E. Αυτή η δραστικότητα μπορεί να είναι πολύ πιο σημαντική σε προκαρυωτικούς οργανισμούς που δεν κωδικοποιούν την RNase E. Επιπλέον θα μπορούσε να δρα ως ένας εφεδρικός μηχανισμός για να διασώζει pre-trnas στα οποία έχουν ενσωματωθεί λάθος νουκλεοτίδια μέσα στην τριπλέτα CCA. Ένα άλλο παράδειγμα έρχεται από το αρχαίο Haloferax volcanii. Φαίνεται πως η RNase Ζ σε αυτό τον οργανισμό είναι υπεύθυνη για την ωρίμανση του 5 άκρου του 5S rrna. Αυτό είναι δυνατό να συμβεί καθώς ανοδικά του 5S rrna στο μετάγραφο σχηματίζεται μία δομή που μοιάζει με μικρό trna και αναγνωρίζεται ως 3 ακόλουθος αλληλουχία από την RNase Z οδηγώντας έτσι σε ένα ώριμο 5 άκρο (39). 5.6 Ο βιολογικός ρόλος της RNase Z L των ευκαρυωτικών οργανισμών Αριθμός γονιδίων και ο μηχανισμός του διπλού εντοπισμού της RNase Z L Όλοι οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί διαθέτουν τουλάχιστον μία RNase Z L. Αν υπάρχει ένα γονίδιο όπως για παράδειγμα στη ζύμη και στα θηλαστικά τότε από το γονίδιο αυτό προκύπτει η πυρηνική αλλά και η μιτοχονδριακή ισομορφή είτε μέσω εναλλακτικού ματίσματος, είτε μέσω εναλλακτικής έναρξης της μετάφρασης. Σύμφωνα με μελέτες που έχουν γίνει στην D. melanogaster, φαίνεται πως στα σπονδυλωτά και πιθανότατα στα αρθρόποδα κυριαρχεί ο μηχανισμός της εναλλακτικής έναρξης της μετάφρασης και αυτό συμβαίνει καθώς η αλληλουχία στόχευσης προς τα μιτοχόνδρια διαθέτει στα δύο άκρα της δύο κατάλοιπα 22

25 Εισαγωγή μεθειονίνης άρα και δύο κωδικόνια έναρξης στο mrna. Στην περίπτωση αυτή το πρώτο κωδικόνιο συνήθως στη θέση -3 διαθέτει μία πυριμιδίνη αντί για πουρίνη και έτσι το εναρκτήριο σύμπλοκο της μετάφρασης μπορεί να μη το αναγνωρίσει, να το προσπεράσει και να ξεκινήσει τη μετάφραση από το δεύτερο κωδικόνιο έναρξης που διαθέτει πουρίνη στη -3 θέση. Έτσι στην πρώτη περίπτωση παράγεται η μιτοχονδριακή πρωτεΐνη και στη δεύτερη η πυρηνική καθώς δεν διαθέτει το MTS (23, 28). Στον S. cerevisiae το γονίδιο TRZ1 παράγει την πυρηνική είτε την μιτοχονδριακή ισομορφή μέσω εναλλακτικού ματίσματος. Ο S. pombe από την άλλη διαθέτει δύο γονίδια των οποίων τα προϊόντα εντοπίζονται αποκλειστικά στον πυρήνα ή στα μιτοχόνδρια (40). Τα φυτά διαθέτουν ένα ή δύο γονίδια RNase Z L. Στις περιπτώσεις που υπάρχει μόνο ένα γονίδιο τότε ο μηχανισμός με τον οποίο η πρωτεΐνη εντοπίζεται στον πυρήνα και στα μιτοχόνδρια είναι παρόμοιος με αυτόν στα σπονδυλωτά. Το προϊόν του δεύτερου γονιδίου κωδικοποιεί μόνο μιτοχονδριακή RNase Z L και έτσι ορισμένα φυτά διαθέτουν μία πυρηνική και δύο μιτοχονδριακές πρωτεΐνες (41, 42) Ο ρόλος της RNase Z L στον πυρήνα Η RNase Z L είναι υπεύθυνη για την ωρίμανση των πυρηνικών και μιτοχονδριακών πρόδρομων trna, αφαιρώντας την 3 ακόλουθο αλληλουχία ενδονουκλεοτιδικά όπως έχει ήδη δειχθεί στη Drosophila melanogaster (28). Τα μετάγραφα αυτά δεσμεύει στο 3 άκρο η πρωτεΐνη La (lupus antigen) προστατεύοντας τα από εξωνουκλεάσες αποκλείοντάς τα έτσι από τον εξωνουκλεοτιδικό τρόπο ωρίμανσης του 3 άκρου των pre-trnas. Παρόλα αυτά φαίνεται πως η πρωτεΐνη αυτή δεν εξυπηρετεί μόνο την ωρίμανση των trnas. Στον S. pombe η απουσία της La δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα και πιθανολογείται ότι τα trnas σε αυτή την περίπτωση ωριμάζουν μέσω του εξωνουκλεοτιδικού μονοπατιού και η RNase Z L δεν θα εξυπηρετεί τον πρωταρχικό σκοπό της. Ωστόσο, αν ταυτόχρονα με τη La απαλειφθεί και η πυρηνική RNase Z τα κύτταρα δεν είναι βιώσιμα όπως δείχθηκε στο S. Pombe (43). Έτσι οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότι η RNase Z L του πυρήνα διαθέτει και επιπλέον λειτουργίες πέρα από την ωρίμανση των pre-trnas ή ότι κάποια από τα pretrnas ωριμάζουν αποκλειστικά μέσω του ενδονουκλεοτιδικού μονοπατιού. Επίσης μπορούν να υπάρχουν επιπλέον RNA υποστρώματα στον πυρήνα στων οποίων την ωρίμανση συμμετέχει η RNase Z L, όπως έχει δειχθεί μέχρι τώρα για το lncrna MALAT-1 (44). Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης σε ανθρώπινα κύτταρα προστάτη προκειμένου να βρεθούν πρωτεΐνες οι οποίες αλληλοεπιδρούν με τις Smad πρωτεΐνες έδειξαν ότι η RNase Z L αλληλοεπιδρά με τις SMAD2 και SMAD3. Οι πρωτεΐνες αυτές σχηματίζουν τριμερή και δρουν ως μεταγραφικοί παράγοντες όντας οι τελεστές της TGF-β σηματοδότησης, προκαλώντας αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη G1 φάση. Περαιτέρω λειτουργικά πειράματα έδειξαν ότι η RNase Z L πιθανότατα να αλληλοεπιδρά με μεταγραφικά σύμπλοκα που διαθέτουν Smad2 και να λειτουργεί ως γέφυρα, επιτρέποντας την αλληλεπίδραση και με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες προωθώντας έτσι την έκφραση σημαντικών γονιδίων που οδηγούν σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου όπως του p21 (Εικόνα 10) (26). 23

26 Εισαγωγή Εικόνα 10 Προτεινόμενο μοντέλο για το πως η RNase Z L (ELAC2) διευκολύνει την επαγόμενη από TGF-β/Smad αναστολή της ανάπτυξης κυττάρων προστάτη. Έπειτα από ανασοκατακρήμνιση και κλασμάτωση των κυτταρικών διαμερισμάτων, σε κύτταρα HeLa βρέθηκε ότι πέρα από τις Smad πρωτεΐνες, η RNase Z L αλληλοεπιδρά με το σύμπλοκο γ-τουμπουλίνης στο κυτταρόπλασμα. Η ίδια μελέτη έδειξε ότι υπερέκφραση της RNase Z L προκαλεί μία καθυστέρηση στη διαίρεση των κυττάρων στη φάση G2. Ωστόσο όπως φάνηκε αργότερα η RNase Z L εντοπίζεται στον πυρήνα και στα μιτοχόνδρια (23). Είναι πιθανό να διαρρεύσουν πυρηνικές πρωτεΐνες κατά την κλασμάτωση. Επιπλέον στη μελέτη αυτή η κωδική περιοχή του ELAC2 γονιδίου κλωνοποιήθηκε καθοδικά μίας Kozak αλληλουχίας και δύο αλληλουχιών FLAG διαταράσσοντας έτσι το φυσιολογικό εντοπισμό της πρωτεΐνης. Όποτε τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης είναι αμφισβητήσιμα Ο ρόλος στης RNase Z L στα μιτοχόνδρια Τα μιτοχόνδρια είναι ζωτικής σημασίας για το κύτταρό και για αυτό η απορρύθμιση των μιτοχονδριακών διεργασιών έχει πλειοτροπικές επιδράσεις στο κύτταρο. Η μεταγραφή στα μιτοχόνδρια δίνει γένεση σε πολυκιστρονικά μετάγραφα τα οποία πρέπει να διαχωριστούν για να είναι λειτουργικά. Τα τελευταία χρόνια έχει γίνει σημαντική πρόοδος στη μελέτη του μεταβολισμού των RNA μορίων στα μιτοχόνδρια. Είναι πλέον γνωστό ότι ο ρόλος του διαχωριστή ανήκει στη μιτοχονδριακή RNase P και RNase Z L καθώς τα μόρια trna καθορίζουν τα όρια των κιστρονίων (Εικόνα 11) (43, 45 47). 24

27 Εισαγωγή Εικόνα 11 Βιογένεση του RNA στα μιτοχόνδρια. Πέρα από την βιογένεση μιτοχονδριακών RNA, η RNase Z συμμετέχει πιθανότατα και στην επιδιόρθωση των trnas. Σε πολλά μιτοχονδριακά γονιδιώματα μεταζώων έχουν εντοπιστεί γονίδια trna τα οποία αλληλεπικαλύπτονται στον ίδιο κλώνο mtdna. Αυτό αποτελεί πρόβλημα καθώς μόνο ένα από τα δύο θα είναι πλήρως ώριμο ενώ το δεύτερο θα παρουσιάζει κάποιο έλλειμα. Στην περίπτωση των ανθρώπινων μιτοχονδρίων, τα γονίδια για τα trna Tyr and trna Cys μοιράζονται ένα νουκλεοτίδιο (48). Το trna Tyr βρίσκεται ανοδικά του trna Cys και φαίνεται πως η ενδονουκλεοτιδική διάσπαση γίνεται από την RNase P οπότε παράγεται ένα φυσιολογικό trna Cys και ένα trna Tyr το οποίο δεν διαθέτει πλέον το νουκλεοτίδιο διαχωριστή οπότε και δεν μπορεί να προστεθεί σε αυτό το CCA τρινουκλεοτίδιο (49). Μέχρι τώρα δεν ήταν γνωστό ποιες πρωτεΐνες επιδιορθώνουν αυτά τα trnas ωστόσο μία πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι τα συγκεκριμένα trnas πολυαδενυλιώνονται από την μιτοχονδριακή poly(a) πολυμεράση και στη συνέχεια αφαιρείται η πολύ(α) ουρά μέχρι την τελευταία αδενίνη είτε από την μιτοχονδριακή αποαδενυλάση PDE12, είτε ενδονουκλεοτιδικά από την RNase Z L (Εικόνα 12). Η RNase Z L, η RNase P και το RNA αποικοδομόσωμα των μιτοχονδρίων στη ζύμη αποτελούν μέρος ενός μεγάλου σταθερού συμπλόκου το οποίο αποτελείται από 136 πρωτεΐνες ανάμεσα στις οποίες βρίσκονται μέλη σημαντικών διεργασιών όπως του μονοπατιού σύνθεσης λιπαρών οξέων, της μετάφρασης, του μεταβολισμού και της αναδίπλωσης πρωτεϊνών (50). 25

28 Εισαγωγή Εικόνα 12 Μοντέλο του τρόπου επιδιόρθωσης του ανθρώπινου μιτοχονδριακού trna Tyr. (1) Προσθήκη μόνο μίας αδενίνης από την mtpap, (2) ολιγοαδενυλίωση. (3) Αφαίρεση των περισσευούμενων καταλοίπων αδενίνης, (4) προσθήκη CCA άκρου. 5.7 Ανθρώπινη RNase Z L και παθογένεια Το γονίδιο ELAC2 χαρακτηρίστηκε αρχικά ως ένας γενετικός τόπος στον οποίο είχαν παρατηρηθεί συγκεκριμένοι πολυμορφισμοί οι οποίοι είχαν συσχετισθεί με προδιάθεση στον καρκίνο του προστάτη (51). Από τότε εντοπίστηκαν και άλλες μεταλλάξεις στο συγκεκριμένο γονίδιο αλλά έπειτα από μία συλλογική ανάλυση όλων των μελετών οι πιο σημαντικές που εντοπίστηκαν είναι Ser217Leu όσο και ο Ala541Thr (52). Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο ELAC2 είναι σπάνιες. Μέσω αναλύσεων της αλληλούχιας του γονιδίου ELAC2 εντοπίστηκαν αυτές οι δύο κοινές μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος, οι οποίες μπορεί να λειτουργήσουν ως παράγοντες αυξημένης εμφάνισης καρκίνου του προστάτη. Η πρώτη αντικατάσταση αμινοξέος, Ser217Leu, βρίσκεται στο υδρόφιλο τμήμα της αλληλουχίας της πρωτεΐνης, και η υποκατάσταση με το υδρόφοβο αμινοξύ λευκίνη μπορεί να μεταβάλλει τη δομή της πρωτεΐνης. Η δεύτερη αντικατάσταση αμινοξέος, Ala541Thr, βρίσκεται δίπλα στο μοτίβο ιστιδίνης και μπορεί να επηρεάσει την λειτουργία της πρωτεΐνης. Ο πολυμορφισμός Ser217Leu συσχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του προστάτη στους Καυκάσιους και στους Ασιάτες, αλλά όχι στους Αφρικανούς (γενετικά μοντέλα). Επιπλέον, ο πολυμορφισμός Ala541Thr συσχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του προστάτη στους Ασιάτες, αλλά όχι στους Καυκάσιους και στους Αφρικανούς. Στο σημείο αυτό να σημειωθεί ότι οι συγκεκριμένες μεταλλάξεις δεν επηρεάζουν τη δραστικότητα του ενζύμου ούτε την ικανότητα της πρωτεΐνης να αλληλοεπιδρά με Smad πρωτεΐνες (26, 53). Ορισμένες αντικαταστάσεις αμινοξέων μπορούν να μην επηρεάζουν τη δράση της RNase Z L στον πυρήνα αλλά είναι πιθανό να μεταβάλλουν τη λειτουργία της πρωτεΐνης αλλά και τις αλληλεπιδράσεις με άλλες πρωτεΐνες στα μιτοχόνδρια. Πράγματι πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι σε ασθενείς με υπερτροφική καρδιομυοπάθεια καθώς ή σε ασθενείς με διανοητικές 26

29 Εισαγωγή διαταραχές έχουν εντοπιστεί μεταλλάξεις στο γονίδιο ELAC2 και παρατηρούνται ελαττώματα στην επεξεργασία μιτοχονδριακών RNAs (54 56). 5.8 Ο βιολογικός ρόλος της RNase Z S των ευκαρυωτικών οργανισμών Εκ πρώτης όψεως η ύπαρξη της RNase Z S στους ευκαρυώτες φαίνεται περιττή. Αυτό μπορεί να ειπωθεί μόνο για την κυτταροπλασματική μορφή και όχι για αυτή που πιθανότατα εντοπίζεται στα πλαστίδια των φυτών όπου και κωδικοποιούνται pre-trnas. Η μοναδική μελέτη που έχει δημοσιευθεί για μία κυτταροπλασματική RNase Z S είναι για το ρύζι, Oryza sativa. Συγκεκριμένα εντόπισαν σε ένα στέλεχος ρυζιού που παρουσιάζει στειρότητα σε υψηλές θερμοκρασίες, ότι ο γενετικός τόπο που είναι υπεύθυνος για αυτό το φαινότυπο είναι το γονίδιο που κωδικοποιεί την κυτταροπλασματική RNase Z S. Παρατήρησαν ότι σε υψηλές θερμοκρασίες συσσωρεύονται mrnas που κωδικοποιούν πεπτίδια ουβικιτίνης τα οποία συνδέονται στη ριβοσωμική πρωτεΐνη L40. Από περαιτέρω in vitro βιοχημικά πειράματα έδειξαν ότι η κυτταροπλασματική RNase Z S μπορεί και αποικοδομεί μέσω ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης της συγκεκριμένη ομάδα mrnas (24) (Εικόνα 13). Το αν στα μετάζωα η δράση της RNase Z S είναι παρόμοια παραμένει άγνωστο. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι RNase Z S των φυτών είναι ως επι το πλείστο παρόμοια με αυτή του Τ.maritima στο ότι δεν αναστέλλεται από την τριπλέτα CCA (41). Εικόνα 13 Μοντέλο της δράσης της RNase Z S1 του Oryza sativa. 27

30 Εισαγωγή 6. Τα θραύσματα trna ως ρυθμιστικά μόρια Με το έναυσμα του νέου αιώνα, λόγω της εξέλιξης των τεχνολογιών αλληλούχισης, έγινε δυνατή η ανίχνευση νέων τύπων μορίων RNA τα οποία ανήκουν στην κατηγορία των non-coding RNAs καθώς δεν μεταφράζονται σε πρωτεΐνες. Αντιθέτως έχουν κυρίως ρυθμιστικό ρόλο ελέγχοντας τα επίπεδα των μεταγράφων mrnα. Η πιο σημαντική ανακάλυψη της προηγούμενης δεκαετίας ήταν αυτή των micrornas τα οποία αποτελούν σημαντικά ρυθμιστικά στοιχεία για τα κύτταρα καθώς μέσω του συμπλόκου RISC, εντοπίζουν mrna στόχους μέσω μερικής ή ολικής συμπληρωματικότητας και προκαλείται ενδονουκλεοτιδική διάσπαση η αναστολή της μετάφρασης. Τα τελευταία πέντε χρόνια όμως, έρχεται στο προσκήνιο μία νέα ομάδα non-coding RNAs και περιλαμβάνει τμήματα RNA τα οποία προκύπτουν από ώριμα ή και ανώριμα trnas (6). Τα trnas αποτελούν το συνδετικό κρίκο μεταξύ mrna και πρωτεϊνών έχοντας χαρακτηριστική και μοναδική πρωτοταγή, δευτεροταγή καθώς και τριτοταγή δομή που εξασφαλίζει ότι θα είναι λειτουργικά. Αν υπάρξει κάποιο λάθος κατά την αναδίπλωση των trnas ή την τροποποίηση των βάσεων, αναγνωρίζεται από ειδικούς παράγοντες και οδηγούνται προς αποικοδόμηση. Τα προϊόντα αποικοδόμησης των trna θεωρούνταν μέχρι τώρα άχρηστα υπολείμματα για αυτό και δεν μελετήθηκαν παραπάνω, τελευταία όμως αναδεικνύεται η λειτουργική τους σημασία. Τα τμήματα των trnas έπαψαν να θεωρούνται τυχαία προϊόντα αποικοδόμησης λόγω της παρατήρησης ότι ήδη γνωστά ncrnas μπορούν να υποστούν τροποποίηση και να δώσουν μικρότερα τμήματα RNA τα οποία έχουν νέους ρόλους. Αυτή η νέα κλάση ncrnas είναι αρκετά ετερογενής κάτι που θα παρουσιασθεί στη συνέχεια (Εικόνα 14). Τα trna halves αποτελούν έναν από τους πρώτους τύπους trna τμημάτων που μελετήθηκαν. Προέρχονται από το 3 ή το 5 ώριμων RNA έπειτα από ενδονουκλεοτιδική διάσπαση στη θηλιά αντικωδικονίου. Η διάσπαση trnas με αυτό των τρόπο φαίνεται πως είναι κυρίως οφειλόμενη σε θρεπτικό, βιολογικό ή φυσικοχημικό στρες, παρατηρούνται όμως και σε μη στρεσογόνες καταστάσεις. Επιπλέον ο τύπος του στρες επηρεάζει και την έκταση της διάσπασης. Τα καλύτερα χαρακτηρισμένα ένζυμα που προκαλούν τέτοιου είδους διάσπαση είναι η Rny1 στη ζύμη και η Angiogenin σε ανώτερα θηλαστικά. Παρόμοια ένζυμα και μηχανισμοί έχουν περιγραφθεί και σε βακτηριακά είδη όπου δρουν ως ένα είδους σύστημα άμυνας απέναντι σε φάγους και άλλα εισβάλοντα είδη. Στη συνέχεια έχει παρατηρηθεί ότι κάθε ένα από τα δύο τμήματα των trna έχει διαφορετική σταθερότητα. Αυτή η σταθερότητα αλλά και η προτίμηση σε κάποιο συγκεκριμένο trna αλλάζει ανάλογα με τις φυσιολογικές συνθήκες. Επιπροσθέτως τα trna halves εμφανίζουν διαφορές στον υποκυττάριο εντοπισμό τους, κάτι που μαζί με το αμέσως προηγούμενο υπαινίσσεται ότι δεν πρόκειται για μία τυχαία διάσπαση. Η λειτουργία των 5 trna halves φαίνεται να είναι η αναστολή της μετάφρασης και η προαγωγή του σχηματισμού κοκκίων λόγω στρες, μελέτη των οποίων έδειξε ότι αποτελούνται κυρίως από σταματημένα προεναρκτήρια μεταφραστικά σύμπλοκα. Παραμένουν 28

31 Εισαγωγή πολλά ερωτήματα να απαντηθούν όπως ο ρόλος των 3 trna halves αλλά τελευταία παρατηρήθηκε η πιθανή συμμετοχή των trna halves στην ομοιόσταση του RNA σε στρεσογόνες καταστάσεις ρυθμίζοντας τον RNAi μηχανισμό (57). Εικόνα 14 Η δημιουργία των trfs, οι στόχοι και η λειτουργία τους. Πέρα από τα trna halves, έχουν παρατηρηθεί σε όλους τους οργανισμούς μικρότερα τμήματα, τα trnaderived fragments ή trfs. Υπάρχουν τέσσερεις βασικοί τύποι trfs: τα 5 trfs (trf-5), τα 3 CCA trfs (trf-3), τα 3 U trfs (trf-1) και τα 5 leader-exon trfs. Τα 5 trfs δημιουργούνται έπειτα από ρήξη μέσα ή γύρω από τη D θηλιά των ώριμων trnas καθώς είναι απούσες οι 5 αλληλουχίες οδηγοί, αν και δεν μπορεί να αποκλειστεί και η προέλευση από 5 trna halves μέσω 3 εξωνουκλεοτιδικής αποικοδόμησης. Συνήθως τα παρατηρούμενα 5 trfs σε ένα κύτταρο προέρχονται από ένα και μόνο είδος trna και έχουν μέγεθος από βάσεις. Λόγω του μεγέθους των 5 trfs καθώς και της δίκλωνης φύσης του trna από το οποίο προέρχεται, ερευνήθηκε το αν υπάρχουν ομοιότητες μεταξύ αυτών και των μικρών RNA του RNAi μηχανισμού. Σε κύτταρα HeLa μελετήθηκε ένα 5 trf από το trna Glu μήκους 19 βάσεων το οποίο βρισκόταν σε παρόμοια επίπεδα με γνήσια mirnas και φάνηκε ότι μπορεί να παράγεται με τη βοήθεια της Dicer. Από την άλλη όμως εμφανίζει μικρή συγγένεια με τις πρωτεΐνες Ago, κάτι που ίσως εξηγείται από τις τροποποιήσεις στο 5 άκρο. Από την άλλη, 5 trfs σε μονοκύτταρα και στην Arabidopsis thaliana φαίνεται να μπορούν να προσδεθούν σε κάποιες Ago πρωτεΐνες. Έχει προταθεί επίσης ότι τα 5 trfs μπορεί να παίζουν 29

32 Εισαγωγή ρόλο στη ομοιόσταση των mi/sirnas παρεμβαίνοντας στην επεξεργασία καθώς και στη δέσμευση αυτών με το RISC. Ένας επιπλέον λειτουργικός ρόλος αυτών των trfs φαίνεται να είναι η αναστολή της μετάφρασης όπως παρατηρήθηκε στο αρχαίο Haloferax volcanii σε κατάσταση αλκαλικού στρες καθώς και από ότι φαίνεται και στον άνθρωπο, αλλά ο ακριβής μηχανισμός αναστολής της μετάφρασης δεν είναι ακόμα γνωστός (58). Τα 3 CCA trfs προέρχονται από το 3 άκρο των trnas ύστερα από θραύση στη Τ θηλειά και διαθέτουν το CCA τρινουκλεοτίδιο. Το ένζυμο που εμπλέκεται πιθανότατα στην παραγωγή αυτών των trf είναι η Dicer αν και έχει αναδειχθεί και ο ρόλος της Angiogenin στην παραγωγή των 3 CCA (59). Τα 3 CCA trfs που έχουν χαρακτηρισθεί μέχρι τώρα μπορούν να δράσουν μέσω του RNAi μηχανισμού όπως τα mirna αν και λόγω του CCA στο 3 άκρο δεν μπορούν να αλληλοεπιδράσουν με την Μοv10, μία ελικάση του RISC. Μία επιπρόσθετη λειτουργία των 3 CCA trf φαίνεται να είναι και προστασία από ιούς μέσω του RNAi μηχανισμού. Τέλος φαίνεται ότι τα 3 CCA trf διευκολύνουν την Τwi12 να ρυθμίζει την βιογένεση των ριβοσωμάτων έπειτα από αλλαγές στις κυτταρικές συνθήκες αναγνωρίζοντας τα επίπεδα των trnas στο κυτταρόπλασμα (6). Τα 3 U trf προέρχονται από το 3 άκρο των pre-trnas ξεκινώντας συνήθως από το 3 άκρο του ώριμου trna και τελειώνοντας στα U κατάλοιπα που δημιουργούνται από την RNA πολυμεράση II κατά τον τερματισμό της μεταγραφής. Παράγονται πιθανότατα στον πυρήνα από pre-trna έπειτα από ενδονουκλεοτιδική διάσπαση από την RNase Z L και στη συνέχεια εξάγονται στο κυτταρόπλασμα (58). Ο ρόλος τους φαίνεται να είναι η ρύθμιση του RNAi μηχανισμού μέσω ανταγωνισμού με τα μικρά RNA για πρόσδεση στις AGO πρωτεΐνες, κάτι που έχει παρατηρηθεί σε σπονδυλωτά και αρχαία. Επιπλέον έχουν συσχετιστεί με την προώθηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καρκινικών κυττάρων προστάτη (60). Υπάρχουν trf που δεν ανήκουν σε κάποια από τις παραπάνω κατηγορίες. Κάποια 3 trf προκύπτουν από ρήξη στη θηλιά του αντικωδικονίου και συνήθως παράγονται σε καταστάσεις στρες. Μία νέα ομάδα 5 trf προκύπτει από pre-trna, τα 5 leader-exon trf που ευαισθητοποιoύν τα κύτταρα στο οξειδωτικό στρες ενεργοποιώντας το p53 ογκοκατασταλτικό μονοπάτι. Συνοψίζοντας, τα trf αποτελούν ξεκάθαρα μία νέα ομάδα ρυθμιστικών ncrna και δεν πρόκειται για τυχαία προϊόντα αποικοδόμησης trna καθώς παρουσιάζουν χαρακτηριστικά πρότυπα έκφρασης σε μεγάλο φάσμα οργανισμών, παράγονται μόνο κάτω από συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες, δεν συσχετίζονται με το codon usage της εκάστοτε φυσιολογικής κατάστασης, η παραγωγή τους γίνεται με συγκεκριμένες ρίξεις στο trna και με μεγαλύτερη ακρίβεια από ότι στα mirna και επιπλέον δεν αλλάζει η διαθεσιμότητα των ώριμων trna λόγω διάσπασης. Τα νέα αυτά ρυθμιστικά μόρια δρουν κυρίως ως ρυθμιστές της μετάφρασης καθώς και ως mirna, σίγουρα όμως επιπλέον λειτουργίες των trf καθώς και νέα trf αναμένονται να ανακαλυφθούν στο άμεσο μέλλον (58). 30

33 Εισαγωγή 7. Το σύστημα CRISPR/Cas9 Προγραμματιζόμενες μηχανές γονιδιωματικής επεξεργασίας χρησιμοποιούνται ευρέως εδώ και δύο δεκαετίες οι οποίες αποτελούν νουκλεάσες που αναγνωρίζουν το στόχο τους μέσω αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-dna. Δύο τέτοια παραδείγματα είναι οι ZFNs (zinc-finger nucleases) και οι TALENs (transcription activator-like effector nucleases). Και στις δύο περιπτώσεις DNA-προσδενώμενες περιοχές μεταγραφικών παραγόντων έχουν ενωθεί με την επικράτεια νουκλεάσης του περιοριστικού ενζύμου FokI το οποίο δρα ως διμερές. Όταν ο στόχος είναι δύο παρακείμενες αλληλουχίες οι δύο FokI περιοχές διμερίζονται και προκαλούν δίκλωνη ρήξη στο ενδιάμεσο τμήμα DNA (Εικόνα 15). Αξιοποιώντας στη συνέχεια τους ενδογενής μηχανισμούς επιδιόρθωσης οι επιστήμονες μπορούν να δημιουργήσουν μεταλλάξεις σε αυτές τις θέσεις. Το γεγονός όμως ότι απαιτούνται αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-dna δυσχεραίνει την κατασκευή DNA-binding περιοχών για κάθε νέο στόχο καθώς δεν είναι δυνατό να προβλεφθεί η δομή που πρέπει να έχει η πρωτεΐνη για να στοχεύει τη συγκεκριμένη αλληλουχία και απαιτούνται εξειδικευμένες διαδικασίες οι οποίες είναι κοστοβόρες αλλά και χρονοβόρες. Το γεγονός ότι η Cas9 είναι μία RNA-καθοδηγούμενη νουκλεάση η οποία αναγνωρίζει το στόχο της με τη δημιουργία ζευγών Watson-Crick, που σημαίνει ότι για να στοχευθεί μία καινούρια αλληλουχία απλά χρειάζεται να αλλάξει η αλληλουχία του RNA, ήταν αυτό που έφερε την επανάσταση στην τεχνολογία της γονιδιωματικής επεξεργασίας (61). Εικόνα 15 Γραφική αναπαράσταση του μηχανισμού δράσης των ZFNs και TALENs. 7.1 Ο βιολογικός ρόλος των αλληλουχιών CRISPR Το σύστημα CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic Repeats) είναι ένας μηχανισμός επίκτητης ανοσίας που υπάρχει σε πολλά βακτήρια και στην πλειονότητα των χαρακτηρισμένων αρχαίων. Οι οργανισμοί στους οποίους υπάρχει ο συγκεκριμένος μηχανισμός, ενσωματώνουν στο γονιδίωμα τους θραύσματα DNA από εισβάλοντες βακτηριοφάγους και πλασμίδια τα οποία στη συνέχεια μπορούν να μεταγράψουν ως CRISPR RNAs (crrnas). Το CRISPR αμυντικό σύστημα λειτουργεί μέσω της συνεργασίας πολλών Cas (CRISPR-associated protein) πρωτεϊνών. Με βάση τις διαφορές στα στοιχεία που τα απαρτίζουν 31

34 Εισαγωγή και το μηχανισμό με τον οποίο δρουν, τα CRISPR συστήματα διαχωρίζονται σε δύο κλάσεις. Η κλάση 1 για να προκαλέσει ενδονουκλεοτιδική διάσπαση καθοδηγούμενη από ένα μόριο RNA απαιτεί το σχηματισμό ενός μεγάλου συμπλόκου που απαρτίζεται από πολλές πρωτεΐνες, ενώ η κλάση 2 απαιτεί μόνο μία RNAκαθοδηγούμενη ενδονουκλεάση, π.χ. την Cas9 ή την Cpf1, για να διαμεσολαβήσει την διάσπαση ενός εισβάλοντος γενετικού υλικού (61). Γενικότερα, τα CRISPR συστήματα λειτουργούν σε τρία στάδια για να πραγματοποιηθεί μία πλήρης ανοσολογική απόκριση ως προς το ξένο DNA. Στο πρώτο στάδιο, θραύσματα DNA από εισβάλοντα πλασμίδια ή φάγους, τα οποία ονομάζονται protospacers, ενσωματώνονται στο CRISPR γενετικό τόπο του οργανισμού ως διαστήματα μεταξύ crrna επαναλήψεων. Στο δεύτερο στάδιο εκφράζονται οι Cas πρωτεΐνες, η CRISPR κασέτα που περιέχει τα αποκτημένα protospacers μεταγράφεται σε pre-crrna και το pre-crrna επεξεργάζεται με ενδονουκλεοτιδικές διασπάσεις σε ώριμο crrna από τις Cas πρωτεΐνες και άλλους παράγοντες. Το πλήρως επεξεργασμένο crrna είναι ο οδηγός ο οποίος περιέχει την οδηγό αλληλουχία που είναι υπεύθυνη για την στόχευση του εισβάλοντος γονιδιώματος καθώς και ένα τμήμα της επαναλαμβανόμενης crrna αλληλουχίας, η οποία βοηθά στην αναγνώριση του crrna από τις Cas πρωτεΐνες και άλλα RNA στοιχεία. Στα τύπου ΙΙ CRISPR συστήματα απαιτείται η ύπαρξη του tracrrna (noncoding transactivating CRISPR RNA) το οποίο υβριδοποιείται με την επαναλαμβανόμενη crrna αλληλουχία, για να επεξεργαστεί σωστά το crrna, για την πρόσδεση αυτού στην Cas9 καθώς και την Cas9-διαμεσολαβούμενη θραύση του στόχου. Στο τρίτο στάδιο, οι Cas πρωτεΐνες αναγνωρίζουν τον κατάλληλο στόχο με την καθοδήγηση του ζεύγους crrna-tracrrna και κόβουν το γονιδίωμα του στόχου προστατεύοντας έτσι το κύτταρο από τη μόλυνση. Η δράση πολλών CRISPR συστημάτων εξαρτάται από την παρουσία μίας εξειδικευμένης αλληλουχίας PAM (Protospacer adjacent motif), η οποία έχει μήκος 2-6 bp, δίπλα στο στόχο του crrna στο εισβάλον γονιδίωμα. 7.2 Αξιοποίηση της Cas9 για εξειδικευμένη γονιδιωματική επεξεργασία Η θραύση του στόχου από την Cas9 καθοδηγείται από δύο μόρια RNA: το crrna το οποίο αναγνωρίζει το στόχο μέσω μίας περιοχής περίπου 20 ζευγών βάσεων και το tracrrna που υβριδοποιείται με το crrna. Το σύμπλοκο Cas9 μαζί με το ζεύγος crrna-tracrrna τροποποιήθηκε ώστε να χρησιμοποιηθεί για την επεξεργασία του γενετικού υλικού κατά βούληση (62, 63). Για να απλοποιηθεί το σύστημα, το crrna μαζί με το tracrrna συγχωνεύθηκαν σε ένα χιμαιρικό μόριο RNA το sgrna (single guide RNA). Το σύστημα μίας πρωτεΐνης και ενός RNA, Cas9-sgRNA, είναι το πιο διαδεδομένο για γονιδιωματική τροποποίηση αλλά και για άλλες εφαρμογές που βασίζονται στην Cas9. Το σύμπλοκο Cas9-sgRNA μπορεί να προσδεθεί και να δράσει σε DNA που δημιουργεί συμπληρωματικά ζεύγη με το sgrna και είναι δίπλα σε μία PAM (NGG) αλληλουχία. 32

35 Εισαγωγή Έτσι μπορεί να στοχεύει οποιοδήποτε στόχο που διαθέτει PAM (NGG) αλληλουχία απλά αλλάζοντας τα 20 νουκλεοτίδια της οδηγού αλληλουχίας (61, 64). Αφού δημιουργηθεί το δίκλωνο ρήγμα οι μεταλλάξεις προκαλούνται από τη δράση των μηχανισμών επιδιόρθωσης της βλάβης. Όταν δρα ο μηχανισμός ένωσης των άκρων χωρίς ομόλογο ανασυνδυασμό προστίθενται ή αφαιρούνται νουκλεοτίδια τα οποία εισάγουν τυχαίες μεταλλάξεις και στην περίπτωση μιας κωδικής περιοχής μπορεί με αυτό τον τρόπο να διαταραχθεί το αναγνωστικό πλαίσιο. Με την αξιοποίηση του μηχανισμού επιδιόρθωσης μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού είναι δυνατό να πραγματοποιηθεί η επιθυμητή μετάλλαξη καθώς θα χρησιμοποιηθεί ως μήτρα για την επιδιόρθωση ένα τμήμα DNA που χορηγείται εξωγενώς και φέρει ομόλογα άκρα με την περιοχή στόχο (Εικόνα 16). Εικόνα 16 Μηχανισμός της δράσης της Cas9 και μεταλλαγμάτων αυτής. 7.3 Οι τροποποιημένες μορφές της Cas9 έχουν νέες χρήσιμες λειτουργίες Η Cas9 διαθέτει δυο περιοχές νουκλεάσης και η μία υδρολύει έναν από τους δύο κλώνους του DNA. Μεταλλάσσοντας μία από τις δύο περιοχές νουκλεάσης, δημιουργήθηκε η μορφή nickase της Cas9 (ncas9) η 33

36 Εισαγωγή οποία δημιουργεί μονόκλωνα ρήγματα. Χρησιμοποιώντας δύο ncas9 που στοχεύουν παρακείμενες θέσεις μπορούν να προκαλέσουν ένα δίκλωνο ρήγμα με τρόπο παρόμοιο με αυτόν των TALENs. Επιπλέον η χρήση δύο ncas9 για την πρόκληση δίκλωνων ρηγμάτων ενισχύει την εξειδίκευση του συστήματος (Εικόνα 16). Αν μεταλλαχθούν και οι δύο περιοχές νουκλεάσης τότε η Cas9 (dcas9) μπορεί μόνο να προσδεθεί στο DNA (Εικόνα 16). Αυτό επιτρέπει στην dcas9 να συνδεθεί με άλλες πρωτεΐνες ή περιοχές πρωτεϊνών και να πραγματοποιήσει στοχευμένες και εξειδικευμένες γενετικές και επιγενετικές τροποποιήσεις. Συνεπώς είναι δυνατό να προστεθούν περιοχές μεταγραφικών παραγόντων και να ενεργοποιηθεί ή να κατασταλεί η μεταγραφή ενός γονιδίου. Άλλες πρωτεΐνες που έχουν χρησιμοποιηθεί είναι DNA απομεθυλάσες, FokI και φθορίζουσες πρωτεΐνες (65). 34

37 Σκοπός

38 36

39 Σκοπός της διπλωματικής εργασίας Τα τελευταία χρόνια έχει αναδειχθεί ο ρόλος σημαντικών ριβονουκλεασών οι οποίες μέσω της δράσης τους δίνουν γένεση σε ρυθμιστικά μη κωδικά μόρια RNA τα οποία μπορούν να επηρεάσουν τη γονιδιακή έκφραση, την πρωτεινοσύνθεση αλλά και άλλες σημαντικές κυτταρικές διεργασίες. Μία τέτοια ριβονουκλεάση είναι η RNase Z L η οποία ευθύνεται για την παραγωγή trfs-1 και lncrnas και μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν δείξει ότι εμφανίζει αυξημένα επίπεδα έκφρασης στον καρκίνο του πνεύμονα. Στον άνθρωπο υπάρχει και μία μικρότερη μορφή, η RNase Z S, η οποία έχει έναν άγνωστο ρόλο μέχρι σήμερα. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση του βιολογικού ρόλου και των δύο μορφών της RNase Z στον άνθρωπο με μεγαλύτερη έμφαση στην RNase Z S. Για το λόγο αυτό θα μελετηθεί αρχικά ο κυτταρικός εντοπισμός και η ενζυμική δραστικότητα των δύο αυτών μορφών. Για την ανάδειξη του ρόλου αυτών ριβονουκλεασών στον καρκίνο του πνεύμονα θα προσδιοριστεί το πρότυπο έκφρασης των γονιδίων που τις κωδικοποιούν αλλά και άλλων σε συνθήκες στρες, κάτι που ενδεχομένως να αναδείξει συγκεκριμένα πρότυπα συνέκφρασης. Επιπλέον θα υπερεκφραστούν τα γονίδια ELAC1 και ELAC2 σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα για τη μελέτη του κυτταρικού κύκλου και της έκφρασης σημαντικών γονιδίων που εμπλέκονται στη δημιουργία trfs, στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, τη βιογένεση mirnas καθώς και σημαντικών lncrnas που ρυθμίζουν την μεταστατικότητα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τέλος, για την περαιτέρω μελέτη του βιολογικού ρόλου της RNase Z S θα γίνει απαλοιφή του γονιδίου ELAC1 σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ με τη χρήση του συστήματος CRISPR-Cas9 και θα πραγματοποιηθούν συγκριτικές μελέτες με φυσιολογικά κύτταρα. 37

40 38

41 Υλικά-Μέθοδοι

42 Υλικά-Μέθοδοι 40

43 Υλικά-Μέθοδοι Α.Υλικά 1. Χημικά ΥΛΙΚΑ Acetic acid Acrylamide Agar Agarose Ammonium persulfate Bis-acrylamide b-mercaptoethanol Bromophenol blue Calcium Chloride Chloroform Coomassie G250 Coomassie R250 DEPC Dialysis Tubing Di-sodium hydrogen phosphate DMEM DMSO dntps EDTA Ethanol 99% denatured Ethanol Absolute FBS Fetal Bovine Serum Gel Red Glycerol HEPES Hoechst HydroChloric acid Imidazole Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG) ΕΤΑΙΡΕΙΑ MERK SIGMA - ALDRICH SERVA Biorad SERVA SERVA SERVA SIGMA - ALDRICH MERCK MERCK Fluka PANREAC APPLICHEM RESEARCH ORGANICS SIGMA MERCK GIBCO SIGMA - ALDRICH BIOLINE SERVA APPLICHEM MERCK BIOSERA BIOTIUM DUCHEFA SIGMA - ALDRICH THERMO FISHER SCIENTIFIC MERCK ALDRICH SERVA 41

44 Υλικά-Μέθοδοι Kanamycin Magnesium chloride hexahydrate Magnesium sulfate β Mercaptoethanol Methanol Methylene-bisacrylamide Nickel nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) Agarose Na 2 HPO4. 2H 2 O N-N methylane bis-acrylamide PBS (Phosphate Buffer) PEPTONE Peptone Enzymatic Digest Phenol Phenol equilibrated, stabilized Penicillin/Streptomycin Polyethylene glycol (10000) Propidium iodide Protein Ladder PVDF SDS Sodium acetate trihydrate Sodium Chloride SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate TEMED Tris Tris ultrapure Triton-X-100 Trypsin EDTA 10X Tryptic Soy broth Tween-20 Xylene cyanol Yeast extract SERVA MERCK MERCK SERVA CHEM-LAB SERVA MACHEREY-NAGEL MERCK SERVA TAKARA MERCK SIGMA MERCK APPLICHEM BIOSERA SERVA SIGMA - ALDRICH NEB MACHEREY-NAGEL SERVA MERCK SIGMA THERMO FISHER SCIENTIFIC RESEARCH ORGANICS DUCHEFA APPLICHEM MERCK BIOSERA BIOLIFE SIGMA - ALDRICH SERVA SIGMA 42

45 Υλικά-Μέθοδοι 2. Ένζυμα-Αντιδραστήρια Όνομα BamHI BbsI DNase I DraI HindIII Lipofectamine 2000 Mitotracker Red NdeI NheI PNK Poly(A)-Polymerase Protein Ladder (10-250kDa) Recombinant RNase Inhibitor Superscript II-Reverse Transcriptase T4 DNA Ligase T7 Endonuclease I T7 RNA Polymerase TRIzol XhoI Εταιρεία NEB NEB NEB NEB NEB Invitrogen THERMO FISCER SCIENTIFIC TAKARA NEB NEB AMBION NEB TAKARA INVITROGEN NEB NEB TAKARA AMBION TAKARA 3. Αντισώματα Mouse monoclonal anti-rnase Z1 (sc ) Santa Cruz Biotecnhology Goat anti-mouse IgG (HRP) (sc ) Santa Cruz Biotecnhology 4. Kit Όνομα Kapa 2G Fast PCR Kit Kapa HiFi Kapa SYBR Fast qpcr Master Mix (2X) NucleoSpin Plasmid DNA Mini Prep NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Εταιρεία KAPA BIOSYSTEMS KAPA BIOSYSTEMS KAPA BIOSYSTEMS MACHEREY NAGEL MACHEREY NAGEL 43

46 Υλικά-Μέθοδοι 5. Θρεπτικά μέσα 5.1 Θρεπτικά μέσα για την καλλιέργεια βακτηριών Υγρό θρεπτικό μέσο (LB Broth) 0,5% w/v yeast extract, 1% w/v tryptone, 1% w/v NaCl, ph 7.2 Στερεό θρεπτικό μέσο (LB Agar) 0.5% w/v yeast extract, 1% w/v tryptone, 1% w/v NaCl, Άγαρ 1.5% w/v ph Για την καλλιέργεια ανθρώπινων κυτταρικών σειρών Πλήρες θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών: DMEM high glucose stable glutamine, 5-10% fetal bovine serum (FBS), 1x penicillin-streptomycin Διάλυμα ψύξης: FBS, 10% DMSO 6. Διαλύματα 6.1 Διαλύματα για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων ΤΑΕ (50x) Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης: Tris base 24.2% w/v, Οξικό οξύ 5.71% v/v, EDTA 50 mm, ph 8.6 ΤΒΕ (10x) για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (Running buffer) 890 mm Tris, 890 mm boric acid, 20 mm EDTA RNA Loading buffer (F-EDTA) (2x) για την ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου: 90% formamide, 0.5% EDTA, 0.1% xylene cyanol and 0.1% bromphenol blue Ακρυλαμίδιο 70% w/v acrylamide / bis-acrylamide (19/1) σε ddh2ο 6.2 Διαλύματα για ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 2x Protein Loading Buffer: 90 mm Tris HCl ph 6.8, 20% γλυκερόλη, 2% SDS, 0.02% bromo-phenol blue, 0.1 M DTT Running buffer (10x): Ρυθμιστικό διάλυμα για την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου: Tris base 1,5 % w/v, Γλυκίνη 7.2% v/v, SDS 0.5% w/v, ph 8.3 Ρυθμιστικό διάλυμα TRIS- HCl ph 8.8, 1.5M Ρυθμιστικό διάλυμα TRIS- HCl ph 6.8, 0.5M SDS 10% v/w Ακρυλαμίδιο 30% v/w acrylamide/bis- acrylamide (29/1) σε ddh2ο Διάλυμα χρώσης: 1gr/L Coomassie Brilliant Blue, 48% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ. Διάλυμα αποχρωματισμού (Destain solution): 45% μεθανόλη, 10% οξικό οξύ Ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς πρωτεϊνών (Transfer blotting buffer): M Tris, M γλυκίνη, 20% μεθανόλη 44

47 Υλικά-Μέθοδοι Ανάλογα με την συσκευή και την περιεκτικότητα ακρυλαμιδίου που θα χρειαστούμε θα αναζητούμε τους πίνακες για την αναλογία των διαλυμάτων στοκ που θα πρέπει να αναμείξουμε και προσθέτουμε στο τέλος APS και TEMED. 6.3 Διαλύματα για απομόνωση πρωτεΐνης έπειτα από έκφραση σε ετερόλογο σύστημα Διάλυμα λύσης (Lysis byffer): (50mM Tris-HCl ph M, 100mM KCl, 5% glycerol, 0.8mM PMSF, 2mM Merca/nol, 0.2% Triton, 4mM imidazole). Τα υλικά Triton X-100, mercapto-ethanol, lysozyme, PMSF στο διάλυμα λύσης τα προσθέτουμε λίγο πριν διαλύσουμε τα κύτταρα. Διάλυμα έκπλυσης στήλης (Wash buffer): (50mM Tris-HCl ph 7.5, 100mM KCl, 5% Glycerol, 20mM imidazole) Διάλυμα έκλουσης (Elution buffer): (50mM Tris-HCl ph 7.5, 100mM KCl, 5% Glycerol, 150mM imidazole) Διάλυμα διαπίδυσης/αποθήκευσης της πρωτεΐνης (Dialysis buffer): (20 mm Hepes ph 7.5, 75mM NaCl, 1.5 mm MgCl2, 0.1 mm DTT, 10% glycerol) 7. Βακτηριακά στελέχη Dh5a Χρωμοσωμικός γενότυπος: fhua2 lac(del)u169 phoa glnv44 Φ80' lacz(del)m15 gyra96 reca1 rela1 enda1 thi-1 hsdr17. Αυτό το στέλεχος E.coli μετασχηματίζεται με μεγάλη απόδοση και ο γενότυπός του προσδίδει διάφορα χαρακτηριστικά που είναι πολύ χρήσιμα για μεθόδους ανασυνδυασμένου DNA. Για παράδειγμα η μετάλλαξη enda1 απενεργοποιεί μία ενδοκυτταρική ενδονουκλεάση που αποικοδομεί πλασμιδιακό DNA σε διάφορες μικροπαρασκευαστικές μεθόδους. Stbl3 Χρωμοσομικός γενότυπος: F - mcrb mrrhsds20(r - B, m - B ) reca13 supe44 ara-14 galk2 lacy1 proa2 rpsl20(str R ) xyl-5 λ - leumtl-1. Το συγκεκριμένο στέλες E. coli συνιστάται να χρησιμοποιείται όταν κλωνοποιούνται ασταθή ενθέματα όπως DNA λεντοϊών που περιέχουν επαναλήψεις ή μπορεί απλά να είναι μεγάλα σε μέγεθος και αυτό γιατί σε αυτά τα κύτταρα ο ρυθμός ανασυνδιασμού είναι μειωμένος έτσι αποτρέπονται μη επιθυμητές τροποποιήσεις στα εισαγόμενα πλασμίδια. Rosetta (DE3) Χρωμοσωμικός γενότυπος: F - - ompt hsds B (r B m - B ) gal dcm (DE3) prare (Cam R ). Αυτό το βακτηριακό στέλεχος είναι παράγωγο του BL21 σχεδιασμένα ώστε να ενισχύσουν την έκφραση ευκαρυωτικών πρωτεϊνών που περιέχουν κωδικόνια που δεν χρησιμοποιούνται συχνά στο E.coli. Αυτό το στέλεχος παρέχουν trnas για τα κωδικόνια AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA. Το DH3 δείχνει ότι το στέλεχος αυτό είναι λυσογόνο του φάγου λdh3 και έτσι έχει ενσωματωμένο στο χρωμόσωμα ένα αντίγραφο του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης υπό τον έλεγχο του υποκινητή του lacuv5. Τέτοια στελέχη είναι κατάλληλα για την παραγωγή πρωτεϊνών από γονίδια κλωνοποιημένα σε φορείς pet μέσω επαγωγής από IPTG. 45

48 Υλικά-Μέθοδοι 8. Πλασμιδιακοί φορείς pet-28b: Πρόκειται για πλασμιδιακό φορέα μεγέθους 5368 bp (Novagen), ο οποίος διαθέτει το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό Καναμυκίνη (Εικόνα 17). Χρησιμοποιείται για την κλωνοποίηση και έκφραση γονιδίων μέσω της Τ7 RNA πολυμεράσης. Στο πλασμίδιο pet-28b μετά τον προαγωγέα της Τ7 RNA πολυμεράσης υπάρχει ο πολυσυνδέτης (polylinker), όπου βρίσκονται όλες οι θέσεις αναγνώρισης και κοπής από τα ένζυμα περιορισμού (Εικόνα 17). Εικόνα 17 Πλασμιδιακός χάρτης του pet28b. Έτσι, με τη χρήση των κατάλληλων ενζύμων είναι δυνατή η εισαγωγή του επιθυμητού γονιδίου και στη συνέχεια η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου αυτού μετά από την πρόσδεση της Τ7 RNA πολυμεράσης στον προαγωγέα της. Προστίθενται έξι τριάδες νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν έξι ιστιδίνες στην αρχή η στο τέλος της αμινοξικής αλληλουχίας. Για να προστεθεί η αλληλουχία και στο τέλος όπως στην περίπτωση του pet-28b θα πρέπει να απαλειφθεί το κωδικόνιο λήξης της μετάφρασης της κωδικής περιοχής. Η μεταγραφή σταματά από ένα κωδικόνιο λήξης αμέσως μετά τα νουκλεοτίδια που κωδικοποιούν τις έξι ιστιδίνες. 46

49 Υλικά-Μέθοδοι pcdna 3.1: Πρόκειται για πλασμιδιακό φορέα μεγέθους 5428 bp, που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αμπικιλλίνη και διαθέτει υποκινητή του κυτταρομεγαλοιού (CMV). Για τον ενδοκυττάριο εντοπισμό χρησιμοποιήθηκε ο ίδιο φορέας στον οποίο είναι κλωνοποιημένο το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη EGFP (ανάμεσα στις θέσεις BamH1-EcoR1) (Εικόνα 18) Εικόνα 18 Πλασμιδιακός χάρτης του pcdna3.1. pspcas9(bb)-2a-puro (PX459) V2.0: Ο φορέας αυτός, μεγέθους 9175bp, είναι ικανός να εκφράζει την αγρίου τύπου νουκλεάση Cas9 από τον οργανισμό Streptococcus pyogenes στην οποία όμως έχει προστεθεί η αλληλουχία NLS ώστε αυτή να εντοπίζεται στον πυρήνα. Επιπλέον στο C-τελικό άκρο της Cas9 έχει προστεθεί και η πεπτιδική αλυσίδα μίας πρωτεΐνης που διασπά την πουρομυκίνη και άρα δίνει ανθεκτικότητα σε αυτό το αντιβιοτικό με σκοπό την δυνατότητα θετικής επιλογής των μετασχηματισμένων κυττάρων. Ανάμεσα στο πεπτίδιο αυτό και στην Cas9 υπάρχει το πεπτίδιο T2A το οποίο αυτοπρωτεολύεται και έτσι διαχωρίζει την Cas9 από το PUROR πεπτίδιο (Εικόνα 19). Ο φορέας αυτό διαθέτει επίσης θέση για την κλωνοποίηση αλληλουχιών που θα προστεθούν στο sgrna και θα καθοδηγήσουν την Cas9 νουκλεάση 47

50 Υλικά-Μέθοδοι στο στόχο. Η μεταγραφική μονάδα για το sgrna ελέγχεται από τον U6 υποκινητή και η αυτή της Cas9 από τον Cbh υποκινητή. To pspcas9(bb)-2a-puro (PX459) V2.0 προέρχεται από το εργαστήριο του Feng Zhang(64). Εικόνα 19 Πλασμιδιακός χάρτης του φορέα pspcas9(bb)-2a-puro (PX459) V

51 Υλικά-Μέθοδοι 9. Εκκινητές-Ολιγονουκλεοτίδια Εκκινητής ANG_NheI_F ANG_BamHI_R ELAC2_1_NheI_F ELAC2_BamHI_R ELAC2_NdeI_F ELAC2_XhoI_R ELAC2_3 UTR_F ELAC1_NheF ELAC1_HindIII_R ELAC1_NdeI_F ELAC1_XhoI_R sgrna_elac1#1_top sgrna_elac1#1_bot sgrna_elac1#2_top sgrna_elac1#2_bot hactbf hactbr AGO1F AGO1R AGO2F AGO2R AGO3F AGO3R AGO4F AGO4R ANGF ANGR CCNA2F CCNA2R CCNB1F CCNB1R CCND1F CCND1R CCNE1F CCNE1R DANCR_F DANCR_R DICERF DICERR DROSHAF DROSHAR ELAC1 (trnase Z)F ELAC1 (trnase Z)R ELAC2 (trnase Z)F ELAC2 (trnase Z)R GAS5F GAS5R Αλληλουχία (Forward primer) GGTGACAGCTAGCATGGTGATGGGCCTGG GACTCGGGATCCTTACGGACGACGGAAAATTGAC GGTGACAGCTAGCATGTGGGCGCTTTGCTCGCTG GACTCGGGGATCCCTGGGCTCTGACCTTCTTGG GGTGACACATATGTGGGCGCTTTGCTCGCTG GACTCGGCTCGAGTCACTGGGCTCTGACCTTCT GGTGACAGCTAGCGGGCGCATGTGGGCGCTTTGCTCGCTG GGTGACAGCTAGCATGTCTATGGATGTGACATTC GACTCGGAAGCTTTTTCTTGATTGGAATGCTTA GGTGACACATATGTCTATGGATGTGACATTC GACTCGGCTCGAGTCATTTCTTGATTGGAATGC caccgttcggtgtgaaggcgagtgc aaacgcactcgccttcacaccgaac caccggctgtggtccttcggtgtga aaacgcactcgccttcacaccgaac AGCGAGCATCCCCCAAAGTT GGGCACGAAGGCTCATCATT GGGTATATGGGATGGAAGCGG TCAAAGTCGACCCGTTCGTT AGTTGATTTCCAGGCGATGC TCTGCCAACCTCTCTGGACC AGGACACCTCCAGCCATACA ACCGCACAAAAAGCAGTTGG TTGCTGCTTCCAAAGGTGATG TTCCCACTTGAAGGGTAGGC AACCCATCTCCCGTTGAAGG GTTATCCTGAGCCAGGGTCG CTGGTGGTCTGTGTTCTGTGA TCTTGGATGCCAGTCTTACTC TGTGATTGCTGCCATAATTCTAAGT ACACAAAACCAAAATGAAAACTGGC CAATGACCCCGCACGATTTC CATGGAGGGCGGATTGGAA GCTGCCCTCTCCACATTATCA ATAGCAGCACTTACAAAACAGTTCA GCGCCACTATGTAGCGGGTT TCAATGGCTTGTGCCTGTAGTT GTACGACTACCACAAGTACTTC ATAGTACACCTGCCAGACTGT ATCGGTTGTTCCTGAACCTGC GGTTGTCACTCCAACGGTCT TGTGGTCCTTCGGTGTGAAG AGAGTTCCATGGTTCGCCAG GCTCACCAGTTTCCGCTGTA GACACAAACACAGCAGCCAG ATGCAGGCAGACCTGTTATCC TGTGCCATGAGACTCCATCAG 49

52 Υλικά-Μέθοδοι HOTAIR_F HOTAIR_R HULCF HULCR TP53F TP53R MALAT1F MALAT1R SSBF SSBR P21F P21R P27F P27R PDE12F PDE12R GGCGAGAGAATTAAGTGCTGC TGGTTCGCTTTCACCTTCGT TCAAGCAAGAAGTTTCCTGGCA AATTTGCCACAGGTTGAACACTT CTGCATTTTCACCCCACCCTT CACACAGGTGGCAGCAAAGTT AAAGCGGGCAACCACTTTTC CACCAAAGACCTCGACACCA AGAAATTTGTAGAGACCCCTGGC TTTGCTTCTTGCTCCTGTTTAGC TCTGACCCCAAACACCTTCCAG GACACATGGGGAGCCGAG GCTGTGTGGCCTTATCCGC TCTCAGGGGCTTCTCTTAGTG TCCCCAGTCATGAAAGCCCT TCAAGGTTCAATGTCAAATGCAGA Β. Μέθοδοι 1. Ομοπαράθεση αμινοξικών αλληλουχιών και φυλογενετική ανάλυση Αμινοξικές αλληλουχίες της RNase Z S και RNase Z L από αντιπροσωπευτικούς προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς αντλήθηκαν από την βάση δεδομένων Uniprot ( καθώς και με τη χρήση του εργαλείου Protein B.L.A.S.T. (Basic Local Alignment Search Tool ). Η ομοπαράθεση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Clustal X2 ( το οποίο αξιοποιεί τον αλγόριθμο CLUSTALW. Από την στοίχιση αυτή μπορούν να αναγνωριστούν οι διαφορές στην αμινοξική αλληλουχία των ομόλογων πρωτεϊνών που εμφανίστηκαν κατά την διάρκεια της εξέλιξης καθώς και οι συντηρημένες περιοχές οι οποίες είναι απαραίτητες για την λειτουργία της πρωτεΐνης. Χρησιμοποιώντας το αποτέλεσμα της παραπάνω ομοπαράθεσης ένα κατάλληλο λογισμικό μπορεί να κατασκευάσει ένα φυλογενετικό δέντρο στο οποίο απεικονίζονται οι γενετικές αποστάσεις των οργανισμών αυτών. Για την κατασκευή του φυλογενετικού δέντρου χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό MEGA7 ( Το δέντρο κατασκευάστηκε με τη μέθοδο Maximum Likelihood και θέτοντας την τιμή Bootstrap 500, δηλαδή έγιναν 500 επαναλήψεις της ανάλυσης και το δέντρο που προέκυψε είναι ο μέσος όρος αυτών των δέντρων. 50

53 Υλικά-Μέθοδοι 2. Κλωνοποίηση των ανθρώπινων RNase Z S (ELAC1), RNase Z L (ELAC2) και Angiogenin (ANG) σε φορείς έκφρασης 2.1 Στρατηγική κλωνοποίησης Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας κλωνοποιήθηκε η κωδική περιοχή των γονιδίων ELAC1, ELAC2 και ANG σε κατάλληλους φορείς έκφρασης. Με σκοπό την έκφραση και απομόνωση της πρωτεΐνης σε προκαρυωτικό σύστημα η εκάστοτε κωδική περιοχή κλωνοποιήθηκε στο φορέα pet28b. Για να εκφραστούν οι πρωτεΐνες μέσα σε ευκαρυωτικά κύτταρα οι αντίστοιχες περιοχές κλωνοποιήθηκαν στο φορέα pcdna3.1 και στον pcdna3.1-egfp για τον υποκυττάριο εντοπισμό. Σε κάθε περίπτωση πραγματοποιήθηκε ενίσχυση της κωδικής περιοχής χρησιμοποιώντας κατάλληλους εκκινητές οι οποίοι έφεραν την κατάλληλη θέση αναγνώρισης για ένα ένζυμο περιορισμού καθώς και επιπλέον νουκλεοτίδια στο 5 άκρο για να είναι δυνατή η απευθείας πέψη του προϊόντος της αντίδρασης. ELAC1 (RNase Z S ): Η κωδική περιοχή του γονιδίου ELAC1 κλωνοποιήθηκε σε φορέα pcdna3.1-egfp καθώς και pet28b. Η κωδική περιοχή ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το φορέα pcdna3.1-elac1 (Genscript). Για την κλωνοποίηση στο φορέα pcdna3.1-egfp χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών ELAC1_NheI_F - ELAC1_HindIII_R και ο κάθε ένας διαθέτει μία θέση αναγνώρισης από το ένζυμο περιορισμού που αναγράφεται στο όνομα του. Στον εκκινητή ELAC1_HindIII_R, έχει αφαιρεθεί το κωδικόνιο λήξης καθώς η μετάφραση πρέπει να μεταφραστεί και η περιοχή της EGFP, ώστε να παράγεται η υβριδική πρωτεΐνη RNase Z S -EGFP. Για την κλωνοποίηση στο φορέα pet28b χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος ELAC1_NdeI_F και ELAC1_XhoI_R και στη συγκεκριμένη περίπτωση διατηρήθηκε το κωδικόνιο λήξης οπότε το His-tag προστίθεται μόνο στο αμινοτελικό άκρο. ELAC2 (RNase Z L ): H RNase Z L εντοπίζεται σε δύο υποκυττάρια διαμερίσματα, στον πυρήνα και στα μιτοχόνδρια. Όταν ξεκινά η μετάφραση από το πρώτο κωδικόνιο έναρξης τότε η πρωτεΐνη δρομολογείται προς τα μιτοχόνδρια και όταν η μετάφραση ξεκινά από το δεύτερο κωδικόνιο έναρξης στο +46, η πρωτεΐνη χάνει το MTS (Mitochondrial Targeting Sequence) και δρομολογείται προς τον πυρήνα. Επιπλέον, για να μην επηρεάσουμε το αναγνωριστικό πλαίσιο του πρώτου κωδικονίου, συμπεριλήφθηκαν στον forward εκκινητή και 6 νουκλεοτίδια που υπάρχουν φυσιολογικά ανοδικά του πρώτου κωδικονίου έναρξης. Ως υπόστρωμα για την PCR σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιήθηκε ο φορέας pcdna3.1-elac2 (Genscript). Για την κλωνοποίηση ολόκληρης της κωδικής περιοχής σε φορέα pcdna3.1 χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος εκκινητών ELAC2_1_NheI_F και ELAC2_XhoI_R. Για τη μελέτη του διπλού εντοπισμού της έκφρασης αυτής της πρωτεΐνης κλωνοποιήθηκαν στο φορέα pcdna3.1-egfp, ολόκληρη η κωδική περιοχή, καθώς και η κωδική περιοχή από το +46 και έπειτα. Στην πρώτη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος ELAC2_1_NheI_F και ELAC2_BamHI_R και στη δεύτερη το ζεύγος ELAC2_2_NheI_F και ELAC2_BamHI_R. Σε αυτή την περίπτωση το κωδικόνιο λήξης έχει αφαιρεθεί ώστε η μετάφραση να μπορέσει να συνεχίσει και να προστεθεί η EGFP στο C-τελικό άκρο της RNase Z L. Θέλοντας να εκφράσουμε και να απομονώσουμε την πρωτεΐνη σε 51

54 Υλικά-Μέθοδοι προκαρυωτικό σύστημα κλωνοποιήθηκε η κωδική περιοχή της πυρηνικής πρωτεΐνης στον φορέα pet28b έπειτα από ενίσχυση με PCR με το ζεύγος εκκινητών ELAC2_NdeI_F και ELAC2_XhoI_R. Angiogenin (ANG): Η πλήρης κωδική περιοχή της ANG ενισχύθηκε με το ζεύγος ANG_NheI_F και ANG_BamHI_F χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα cdna από ολικό RNA κυττάρων HEK-293T και στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στον φορέα pcdna Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Για να ενισχυθεί η εκάστοτε κωδική περιοχή καθώς και για εισαχθούν οι επιθυμητές θέσεις περιορισμού ώστε να κλωνοποιηθούν στους κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς χρησιμοποιήθηκε η PCR σύμφωνα με το πρωτόκολλο που ακολουθεί. Αντιδραστήριο Όγκος Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης (5x) 5 μl Premixed dntps (10mM) 0.75 μl Forward primer(10μμ) 0.75 μl Reverse primer (10μΜ) 0.75 μl Υπόστρωμα* - DNA πολυμεράση (HiFi, Kapa Biosystems) (1U/μL) 0.5 μl Sterile ddη2ο μl Συνολικός όγκος 25 μl Η αντίδραση PCR ξεκινάει με ένα στάδιο αποδιάταξης σε θερμοκρασία 95 ο C για 5 λεπτά. Ακολουθούν 25 κύκλοι, καθένας από τους οποίους αποτελείται από ένα βήμα μετουσίωσης στους 98 ο C για 20 δευτερόλεπτα, ένα στάδιο υβριδισμού για την σύνδεση των εκκινητών στους 65 ο C για 15 δευτερόλεπτα και ένα στάδιο πολυμερισμού κατά το οποίο δρα η πολυμεράση στους 72 ο C για δευτερόλεπτα/kb δευτερόλεπτα. Η αντίδραση ολοκληρώνεται με ένα στάδιο σε θερμοκρασία υβριδισμού 72 ο C για 5 λεπτά και στη συνέχεια η αντίδραση ψύχεται μέχρι τους 16 ο C. 2.3 Απομόνωση και καθαρισμός τμημάτων DNA Για το διαχωρισμό του τμήματος DNA και τον προσδιορισμό του μεγέθους του το δείγμα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1.5%. Για την παρασκευή πηκτής χρησιμοποιήθηκε 0.45g αγαρόζης σε 30ml ΤΑΕ buffer 1x. Το διάλυμα θερμάνθηκε μέχρι να διαλυθεί όλη η ποσότητα της αγαρόζης και να γίνει διαυγές. Ακολουθήσε προσθήκη 0,8μl Gel Red, ήπια ανάδευση και στη συνέχεια τοποθέτηση στη συσκευή ηλεκτροφόρησης όπου και αφέθηκε να πήξει. Τα δείγματα που πρόκειται να ηλεκτροφορηθούν, προετοιμάστηκαν με την προσθήκη 6x loading buffer. Ως μάρτυρας μοριακού βάρους χρησιμοποιήθηκε ο Hyperladder II. Η απομόνωση και ο καθαρισμός τμημάτων DNA από πηκτή αγαρόζης (DNA extraction from agarose gels) έγινε με βάση το πρωτόκολλο του kit NucleoSpin PCR clean-up, Gel extraction της MACHEREY- NAGEL. Περιληπτικά: 52

55 Υλικά-Μέθοδοι 1. Εξαγωγή του τμήματος DNA διάλυση της πηκτής. Αρχικά εξάγεται από την πηκτή αγαρόζης η ζώνη με το τμήμα του DNA που επιθυμούμε να απομονώσουμε με τη χρήση ενός αποστειρωμένου νυστεριού. Το κομμάτι αυτό διαλύεται σε buffer NTΙ σε αναλογία 200μl buffer για κάθε 100mg πηκτής αγαρόζης (για πηκτή αγαρόζης μέχρι και 2%). Η διάλυση επιτυγχάνεται με θέρμανση στους 50 C για 5-10 λεπτά με ανάδευση κάθε 2-3 λεπτά. 2. Δέσμευση του DNA Πλύση της μεμβράνης σιλικόνης Το δείγμα φορτώνεται σε στήλη, η οποία τοποθετείται σε ένα συλλεκτικό σωλήνα (collecting tube) των 2mL. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g, το έκλουσμα απομακρύνεται και η στήλη επανατοποθετείται στο συλλεκτικό σωλήνα. Προστίθενται 700μl NT3 buffer, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g και απομακρύνεται το έκλουσμα. 3. Ξήρανση της μεμβράνης σιλικόνης Έκλουση του DNA Η στήλη φυγοκεντρείται για 2 λεπτά στις x g με σκοπό την πλήρη απομάκρυνση του buffer NT3. Το βήμα αυτό είναι απαραίτητο γιατί έτσι επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της αιθανόλης που περιέχει το buffer, η οποία είναι πιθανόν να αναστείλει ακόλουθες αντιδράσεις. Ακολούθως, η στήλη μεταφέρεται σε νέο σωλήνα (Recovery Tube) και προστίθενται 15-30μl Elution Buffer NE. Ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό με σκοπό την αύξηση της απόδοσης της έκλουσης του DNA. Τέλος, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις x g. Το εκλουόμενο DNA φυλάσσεται στους -20 ο C ή χρησιμοποιείται άμεσα. 2.4 Εισαγωγή στους επιθυμητούς πλασμιδιακούς φορείς Σε όλους τους εκκινητές είχαν προστεθεί στο 5 άκρο τους πέντε επιπλέον νουκλεοτίδια ώστε να μπορούν να προσδεθούν και να δράσουν στα άκρα των προϊόντων PCR τα κατάλληλα ένζυμα περιορισμού. Κάθε προϊόν PCR και ο αντίστοιχος πλασμιδιακός φορέας επωάστηκαν με τον κατάλληλο συνδυασμό ενζύμων περιορισμού όπως αναγράφεται στους εκκινητές (παράγραφος 2.1). Η κάθε μία αντίδραση περιέχει τα εξής: Αντιδραστήριο Ρυθμιστικό διάλυμα 10x Ενζυμο 1 10U/μL Ενζυμο 2 10U/μL Αρχικό πλασμίδιο με ένθετο ddh2o sterile μέχρι τελικού όγκου Ποσότητα 4 μl 1 μl 1 μl 500ng 20 μl 53

56 Υλικά-Μέθοδοι Το ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιείται σε κάθε πέψη είναι αυτό στο οποίο και τα δύο ένζυμα παρουσιάζουν βέλτιστη δραστικότητα. Αυτή η πληροφορία υπάρχει σε ειδικούς πίνακες που παρέχει η εκάστοτε εταιρεία. Το μείγμα επωάζεται για 90 λεπτά στους 37 o C και στη συνέχεια ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα αγαρόζης για τον έλεγχο της αντίδρασης, το διαχωρισμό των προϊόντων. Οι ζώνες ενδιαφέροντος απομονώνονται με το NucleoSpin PCR clean-up, Gel extraction Kit όπως αναφέρθηκε παραπάνω και ποσοτικοποιούνται με τη χρήση UV φασματοφωτομέτρου. Τα τμήματα DNA που απομονώθηκαν φέρουν κολλώδη άκρα και χρησιμοποιούνται σε αντίδραση συνένωσης με τη χρήση T4 DNA λιγάσης για τη δημιουργία των ανασυνδυασμένων φορέων. Η Τ4 DNA λιγάση καταλύει τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ 3 -ΟΗ και 5 -Ρ άκρων. Το μείγμα της αντίδρασης περιλαμβάνει τα εξής: Αντιδραστήριο 10x Τ4 DNA Ligase Buffer T4 DNA Ligase (NEB) Πλασμίδιο Ένθετο ddh2o sterile μέχρι τελικού όγκου Ποσότητα 2 μl 1 μl 50 ng x 20 μl Η ποσότητα του ενθέματος εξαρτάται από το μήκος του. Τοποθετούμε τόσο ένθεμα ώστε η αναλογία μορίων ενθέματος προς τον πλασμιδιακό φορέα να είναι 3:1. Για τον υπολογισμό της ποσότητας που απαιτείται χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο Ligation Calculator της NEB ( Το μείγμα επωάζεται στους 16 ο C για 16 hrs και προϊόντα της αντίδρασης συνένωσης χρησιμοποιούνται για μετασχηματισμό δεκτικών DH5a 2.5 Μετασχηματισμός βακτηρίων με πλασμιδιακό DNA Τα δεκτικά βακτήρια Ε. coli που χρησιμοποιήθηκαν ανήκουν στο στέλεχος DH5a (Invitrogen). 1. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πάγο μέχρι να ξεπαγώσουν. 2. Ανάμειξη 50μl δεκτικών βακτηρίων σε σωληνάρια τύπου eppendorf, με 5 μl από την αντίδραση με τη λιγάσης σε στείρες συνθήκες. 3. Επώαση στον πάγο για 20 λεπτά. 4. Τοποθέτηση των βακτηρίων στους 42 C για 45 δευτερόλεπτα. 5. Mεταφορά στον πάγο για 2min. 6. Προσθήκη 1 ml LB (προθερμασμένο στους 37 C) και επώαση στους 37 C, 1 ώρα υπό ανάδευση. 7. Συλλογή κυττάρων με φυγοκέντρηση και επαναδιαλύση σε 100 μl LB. 8. Επίστρωση σε τρυβλίο με θρεπτικό LB-άγαρ παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού. 54

57 Υλικά-Μέθοδοι 9. Τα τρυβλία στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 o C για ώρες 2.6 Εύρεση θετικών αποικιών με Colony PCR Για να βρεθούν οι θετικές αποικίες έπειτα από μετασχηματισμό με τους φορείς pet28b και pcdna3.1, που δεν επιτρέπουν blue/white screening, έγινε αναζήτηση θετικών αποικιών με Colony PCR. Για να γίνει Colony PCR, αφαιρούνται με ένα tip των 10 μl λίγα κύτταρα από την αποικία και επαναιωρούνται σε 50 μl αποστειρωμένο ddh 2 O. Αντί για DNA σε διάλυμα, χρησιμοποιείται το DNA των βακτηρίων. Η αντίδραση για κάθε αποικία γίνεται σύμφωνα με το παρακάτω πρωτόκολλο: Αντιδραστήρια Bacteria Κapa 2GFast Polymerase Forward primer Reverse primer 2G Buffer 5x dntps ddh 2 O Όγκος 5 μl 0,08 μl 0.4 μl 0.4 μl 4 μl 1 μl 9.12 μl Η αντίδραση PCR ξεκινάει με ένα στάδιο αποδιάταξης σε θερμοκρασία 95 ο C για 5 λεπτά. Σε αυτό το βήμα λύνονται τα κύτταρα και απελευθερώνεται το DNA. Ακολουθούν 30 κύκλοι, καθένας από τους οποίους αποτελείται από ένα βήμα μετουσίωσης στους 95 ο C για 15 δευτερόλεπτα, ένα στάδιο υβριδισμού για την σύνδεση των εκκινητών στους 60 ο C για 15 δευτερόλεπτα και ένα στάδιο πολυμερισμού κατά το οποίο δρα η πολυμεράση στους 72 ο C για 30 δευτερόλεπτα δευτερόλεπτα. Η αντίδραση ολοκληρώνεται με ένα στάδιο σε θερμοκρασία υβριδισμού 72 ο C για 1 λεπτό και στη συνέχεια η αντίδραση ψύχεται μέχρι τους 16 ο C. Το περιεχόμενο των αντιδράσεων ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης 1,5% και οι θετικές αποικίες ενοφθαλμίδονται σε υγρό θρεπτικό μέσο. 2.7 Απομόνωση πλασμιδίακού DNA με μικροπαρασκευαστική μέθοδο Για απομόνωση πλασμιδιακού DΝΑ με την μικροπαρασκευαστική μέθοδο (mini prep) ήταν απαραίτητη η υγρή καλλιέργεια βακτηρίων. 7.5 ml L-broth που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό εμβολιάσθηκαν με αποικίες ή με παγωμένα βακτήρια αποθηκευμένα σε διάλυμα γλυκερόλης, με τη χρήση κρικοφόρου στυλεού και επωάστηκαν σε τροχιακό αναδευτήρα (orbital shaker) στους 37 C για όλη τη νύχτα (>16 ώρες). Πριν προχωρήσουμε παρακάτω 700 μl αναπτυγμένης υγρής καλλιέργειας βακτηρίων αναμείχθηκαν με 700μl διάλυμα γλυκερόλης 50%, σε στείρες συνθήκες, και διατηρήθηκαν στους -80 C για μελλοντική χρήση. Ακολουθήσε απομόνωση πλασμιδιακού DNA με βάση το πρωτόκολλο απομόνωσης πλασμιδιακού DNA από κύτταρα E. coli του kit NucleoSpin Plasmid της MACHEREY-NAGEL. Περιληπτικά: 55

58 Υλικά-Μέθοδοι 1. Συλλογή των βακτηριακών κυττάρων Μεταφορά 5ml από την βακτηριακή καλλιέργεια σε Eppendorf, φυγοκέντρηση για 1min, g και απόχυση υπερκειμένου. 2. Λύση κυττάρων Προσθήκη 250μl Βuffer A1 και επαναιώρηση του κυτταρικού ιζήματος. Ακολουθεί προσθήκη 250 μl Buffer Α2. Ήπια ανάμειξη και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5min. Προσθήκη 300μl Buffer A3 και ήπια ανάμιξη 6-8 φορές. Φυγοκέντρηση 5-10min, xg σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Δέσμευση DNA Τοποθέτηση στήλης NucleoSpin σε ένα συλλεκτικό σωλήνα (collecting tube) των 2ml και μεταφορά υπερκειμένου πάνω στη στήλη. Φυγοκέντρηση για 1min στα xg και απόχυση φιλτραρισμένου δ/τος. 4. Πλύση της μεμβράνης σιλικόνης Προσθήκη στη στήλη 600μl Buffer Α4 το οποίο περιέχει αιθανόλη. Φυγοκέντρηση 1min, στις x g και απόχυση εκλούσματος. Ακολουθεί μια επιπλέον φυγοκέντρηση για 2min στις xg, για ξήρανση της στήλης και απόχυση καταλοίπων αιθανόλης. 5. Έκλουση υψηλής καθαρότητας DNA Τοποθέτηση της στήλης σε συλλεκτικό σωλήνα (collecting tube) των 1,5ml των και προσθήκη 50μl αποστειρωμένου ddh 2 Ο. Επώαση για 1min σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκέντρηση για 1min στις 11000xg. Το εκλουόμενο πλασμιδιακό DNA φυλάχθηκε στους -20 C. 2.8 Έλεγχος για μεταλλάξεις στα ενθέματα Τα πλασμίδια τα οποία έχουν προκύψει από ένθεση προϊόντος PCR ελέγχονται με αλληλούχιση. Η αλληλούχιση του πλασμιδίου pet28 γίνεται με τους εκκινητές T7_promoter και T7_Terminal_primer που υβριδοποιούνται ανοδικά και καθοδικά του σημείου ένθεσης καλύπτοντας έτσι όλο το ένθετο. Για το πλασμίδο pcdna3.1 χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές CMV_F και BGH-rev. Τους εκκινητές αυτούς τους διαθέτει η υπηρεσία που κάνει την αλληλούχιση. Μία αντίδραση Sanger μπορεί να καλύψει έως και 800 βάσεις καλύπτοντας έτσι ένα ένθετο ~ 1600 βάσεων. Στην περίπτωση του ELAC2, επειδή η κωδική περιοχή έχει μέγεθος 2400 βάσεις χρησιμοποιήθηκαν και οι primer ELAC2F και ELAC2R που υβριδοποιούνται μέσα στην κωδική περιοχή. Τα χρωματογραφήματα αναλύονται με λογισμικό ApE ( για να επιβεβαιωθεί η ορθότητα της αλληλουχίας. 56

59 Υλικά-Μέθοδοι 3. Έκφραση και απομόνωση των RNase Z S και RNase Z L 3.1 Έκφραση της πρωτεΐνης Σε 5ml LB Broth με καναμυκίνη σε τελική συγκέντρωση 50 μg/ml, ενοφθαλμίζονται κύτταρα Rosetta που περιέχουν το επιθυμητό πλασμίδιο (pet-28b με το εκάστοτε ανασυνδυασμένο τμήμα) και επωάζονται για ώρες στους 37 ο C υπό ανάδευση (210 rpm). Ακολουθεί μεταφορά 1,5ml της Ο/Ν καλλιέργειας σε 0.5 L φρέσκου θρεπτικού μέσου LB παρουσία καναμυκίνης στην περίπτωση της RNase Z S, και 2*2,5ml σε 2*1L LB για την RNase Z L παρουσία καναμυκίνης. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται μέτρηση της οπτικής απορρόφησης στα 600nm (OD 600 ) και επώαση της καλλιέργειας στους 37 ο C υπό ανάδευση έως ότου το OD 600 φτάσει περίπου το 0,6 που αντιστοιχεί στη εκθετική φάση ανάπτυξης. Προσθέτουμε IPTG σε τελική συγκέντρωση 0.5 mm. Το IPTG δρα ως επαγωγέας της έκφρασης του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης της οποίας ο προαγωγέας στο πλασμίδιο pet-28b, βρίσκεται μπροστά από τον polylinker. Η έκφραση του γονιδίου αυτού στα κύτταρα του E. coli αναστέλλεται από τον καταστολέα LacIQ. Το IPTG δεσμεύει και απομακρύνει τον καταστολέα από το DNA επιτρέποντας έτσι την έκφραση της Τ7 RNA πολυμεράσης, η οποία με τη σειρά της θα αναγνωρίσει τον προαγωγέα της στο πλασμίδιο και θα μεταγράψει τα γονίδια που βρίσκονται μετά από αυτόν, που στη συγκεκριμένη περίπτωση είναι το εκάστοτε ανασυνδυασμένο τμήμα. Μετά την προσθήκη του IPTG συνεχίζεται η επώαση της καλλιέργειας σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στα 4500 x g για 10 min στους 4 ο C, το υπερκείμενο αφαιρείται και το ίζημα αποθηκεύεται στους -80 ο C. 3.2 Απομόνωση της πρωτεΐνης Α. Ομογενοποίηση των κυττάρων Πριν την ομογενοποίηση το ίζημα των κυττάρων επωάζεται στον πάγο μέχρι να ξεπαγώσει. Στη συνέχεια αναδιαλύεται σε 3-5 ml διαλύματος λύσης / gr νωπού βάρους κυττάρων. Το διάλυμα λύσης περιέχει από 2 έως 10 mm ιμιδαζόλιο, το οποίο ανταγωνίζεται τα κατάλοιπα ιστιδινών για την πρόσδεση στη στήλη νικελίου, μειώνοντας έτσι τη μη ειδική πρόσδεση πρωτεϊνών με ιστιδίνες στη χρωματογραφία. Στο κυτταρικό διάλυμα προστίθεται λυσοζύμη σε τελική συγκέντρωση 1 mg/ml, ώστε να διευκολυνθεί η λύση των κυτταρικών τοιχωμάτων και ακολουθεί επώαση στο πάγο για 30 λεπτά και ανάδευση ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Η ομογενοποίηση των κυττάρων γίνεται σε συσκευή υπερήχων με 5 χτυπήματα (bursts) σε ισχύ W, διάρκειας 10 δευτερολέπτων το καθένα, στον πάγο. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g, για 90 λεπτά στους 4 ο C. Και συλλέγουμε το υπερκείμενο. Από το υπερκείμενο κρατάμε ένα κλάσμα ~500 μl (Input) 57

60 Υλικά-Μέθοδοι Β. Απομόνωση της πρωτεΐνης Καθαρισμός διαλυτής πρωτεΐνης με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου νικελίου Το υπερκείμενο το οποίο συλλέγεται σε ένα αποστειρωμένο σωλήνα Falcon των 50ml αναμειγνύεται με επαναιωρημένα σφαιρίδια Ni-NTA αγαρόζης και επωάζεται/ανακινείται για 30 λεπτά σε περιστρεφόμενο ρότορα. Στα σφαιρίδια κατακρατείται η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη μέσω σύνδεσης των ιστιδινών που περιέχει με τα άτομα του νικελίου. Mε το πέρας των 30 λεπτών το διάλυμα φορτώνεται πίσω στη στήλη σιγά. To διάλυμα που διαπερνά τη στήλη δεν θα περιέχει όσες πρωτεΐνες κατακρατήθηκαν από τα σφαιρίδια και συλλέγεται ένα κλάσμα (Flow Through). Εφόσον μεταφερθεί όλο το μείγμα υπερκειμένου-σφαιριδίων και έχει πακεταριστεί η στήλη, πραγματοποιείται ξέπλυμα της στήλης με το διάλυμα έκπλυσης (Wash) ώστε να απομακρυνθούν όσες πρωτεΐνες έχουν προσδεθεί μη ειδικά. Αφού ξεπλυθεί η στήλη για μικρό χρονικό διάστημα συλλέγεται το κλάσμα Wash 1. Στο τέλος του ξεπλύματος συλλέγεται το κλάσμα Wash 2.. Για την ανάκτηση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, η στήλη ξεπλένεται με μεγάλη συγκέντρωση ιμιδαζολίου (200 mm) (διάλυμα έκλουσης). Το ιμιδαζόλιο δεσμεύεται στα ακινητοποιημένα ιόντα νικελίου και ανταγωνίζεται τα κατάλοιπα ιστιδίνης των ανασυνδυασμένων πρωτεΐνών στη δέσμευση. Έτσι αποδεσμέυονται οι πρωτεΐνες από τη στήλη. Κατά την έκλουση συλλέγονται κλάσματα κάθε 500μl. Συλλέγονται 10 κλάσματα (E1,E2,..), τα δύο τελευταία εκλούονται με δ/μα έκλουσης 400mM. Σε κάποια από αυτά τα κλάσματα θα βρίσκεται και η πρωτεΐνη μας. 4. Ανάλυση πρωτεϊνών Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/ πολυακρυλαμιδίου. Πριν προχωρήσουμε στην ηλεκτροφόρηση, έγινε ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης της πρωτεϊνης σε κάθε κλάσμα με τη μέθοδο Bradford. Έπειτα ηλεκτροφοτήθηκαν τα κλάσματα που είχαν σηματική ποσότητα πρωτεΐνης. Για το διαχωρισμό των πρωτεϊνών πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, η οποία αποτελείται από δύο επιμέρους πηκτές, τη πηκτή διαχωρισμού (separating gel) και τη πηκτή συγκέντρωσης (stacking gel). Η πηκτή συγκέντρωσης έχει περιεκτικότητα 4% σε ακρυλαμίδιο και ph 6.8. Η περιεκτικότητα της πηκτής διαχωρισμού εξαρτάται από το εύρος των μοριακών βαρών των πρωτεϊνών για το οποίο επιθυμούμε τη μέγιστη διαχωριστική ικανότητα, ενώ το ph είναι 8.8. Για τον βέλτιστο διαχωρισμό πρωτεϊνών με μοριακά βάρη από 20 έως 90 kda η περιεκτικότητα της πηκτής διαχωρισμού πρέπει να είναι 10%. Η προετοιμασία των δειγμάτων πριν φορτωθούν στην πηκτή περιλαμβάνει την ανάμειξη των δειγμάτων με Protein loading buffer Dye (2x) και την θέρμανση αυτών στους 98 ο C, για 10 λεπτά. Οι διαστάσεις του πηκτώματος είναι 7cm x 9cm x 1mm και η ηλεκτροφόρηση γίνεται αρχικά στα 80V και αφού περάσει το μέτωπο στη πήκτη διαχωρισμού ανεβάζουμε την τάση στα 120V μέχρι το τέλος. Μετά το πέρας της 58

61 Υλικά-Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης, η πηκτή διαχωρισμού μεταφέρεται σε διάλυμα χρωματισμού (staining solution) Coomassie Brilliant Blue. Το διάλυμα θερμαίνεται ελαφρώς και επωάζεται για λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια πραγματοποιείται αποχρωματισμός της πηκτής με το διάλυμα αποχρωματισμού (destaining solution). Η διαδικασία αποχρωματισμού διαρκεί για περίπου 1-2 ώρες, αλλά κάθε μισή με μια ώρα είναι απαραίτητη η ανανέωση του διαλύματος. Στο τέλος της διαδικασίας είναι ευδιάκριτες οι ζώνες των πρωτεϊνών, εξαιτίας της μπλε χρωστικής Coomasie Brilliant Blue, ενώ είναι δυνατός και ο προσδιορισμός του μοριακού βάρους των πρωτεϊνικών τμημάτων μέσω της σύγκρισης των ζωνών με τους μάρτυρες μοριακού βάρους. Τα κλάσματα που περιέχουν σε μεγαλύτερη καθαρότητα (3 κλάσματα) το εκάστοτε ανασυνδυασμένο πολυπεπτίδιο τοποθετούνται σε μεβράνη διαπίδυσης και συμπυκνώνουμε την πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας PEG (πολύαιθυλεν-γλυκόλη). Αφού ο όγκος μειωθεί σε ~1ml, η μεμβράνη μεταφέρεται στο διάλυμα διαπίδησης (dialysis buffer) και φυλάσσονται στους 4 ο C. Η συγκέντρωση της καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης προσδιορίζεται με την μέθοδο Bradford και η καθαρότητα προσδιορίζεται με ηλεκτροφόρηση. Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Μετά τη διαπίδυση, τα κλάσματα με τη μεγαλύτερη καθαρότητα από τη χρωματογραφία συγγένειας, χρησιμοποιήθηκαν για το δεύτερο στάδιο καθαρισμού. Το στάδιο αυτό περιλαμβάνει τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης (size exclusion chromatography) σε στήλη Superdex /300 GL (GE Healthcare). Στη χρωματογραφία μοριακής διήθησης οι πρωτεΐνες μετακινούνται διαμέσου ενός πορώδους υλικού και διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθός τους. Τα μικρότερα μόρια παγιδεύονται στους πόρους του υλικού της στήλης και διανύουν μεγαλύτερη απόσταση μέχρι την έξοδο από αυτήν. Έτσι οι πρωτεΐνες μεγαλύτερου μεγέθους που δεν εισέρχονται στους πόρους του υλικού, εκλούονται πρώτες από τη στήλη της μοριακής διήθησης και ακολουθούν οι μικρότερες. Η έξοδος της στήλης συνδέεται με ένα φασματοφωτόμετρο UV. Για κάθε κλάσμα που εξέρχεται από τη στήλη δίδεται η απορρόφηση στα 280 nm. Έτσι τα διάφορα κλάσματα που περνούν από τη στήλη αναπαρίστανται σε ένα γράφημα χρόνου-απορρόφησης. Τα κλάσματα που συλλέγονται από τη διαδικασία της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης ηλεκτροφορούνται σε αποδιατακτικό πήκτωμα SDS/πολυακρυλαμιδίου για την ανίχνευση του εκάστοτε επιθυμητού πολυπεπτιδίου και τον έλεγχο της καθαρότητας. Τα δείγματα καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης διατηρούνται στους 4 C. Ανάλυση πρωτεϊνών με ανοσοαποτύπωμα Western (Western blot) Μετά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε αποδιατακτικές, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν από την πηκτή σε μεμβράνη PVDF εφαρμόζοντας κάθετο ως προς το πήκτωμα ηλεκτρικό πεδίο, τάσης 42V για 3.5 ώρες στους 4ºC και τάση 42V. Μετά την μεταφορά των πρωτεϊνών, οι μεμβράνες επωάστηκαν για όλο το 59

62 Υλικά-Μέθοδοι βράδυ σε 5% άπαχο γάλα σκόνη ελεύθερο λιπιδίων διαλυμένο σε PBS-Τ (Tween 0.1%). Στην συνέχεια οι μεμβράνες επωάστηκαν με το πρώτο αντίσωμα mouse anti-rnase Z1 (1:150) σε PBS-T με 2.5% άπαχο γάλα για 3h, σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες εκπλύθηκαν 3 φορές από 10 λεπτά με 0,1% PBS-Τween και ακολούθησε επώαση με το δεύτερο αντίσωμα goat anti-mouse IgG (HRP) (1:2000) σε PBS-T με 2.5% άπαχο γάλα για 1.5 ώρες, σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανάδευση. Οι μεμβράνες εκπλύθηκαν 3 φορές από 10 λεπτά με 1x PBS-Τ και μία φορά με 1x PBS και στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε σκοτεινό θάλαμο χρησιμοποιώντας το SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (Thermo). Η έκθεση των μεμβρανών πραγματοποιήθηκε με φιλμ αυτό-ραδιογραφίας (UltraCruz Autoradiography Film) 5. Προσδιορισμός δραστικότας της RNase Z S O προσδιορισμός της δραστικότητας έγινε χρησιμοποιώντας ραδιενεργά σεσημασμένα υποστρώματα. Τα υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι το πρόδρομο μόριο trna Arg με [γ- 32 P] ATP. Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν οι εξής: 45mM Hepes ph=7.5, 75mM NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.1mM DTT, 10% glycerol. Η κάθε αντίδραση ετοιμάστηκε σύμφωνα με τις παρακάτω ποσότητες. RRI (1U/μl)) Ραδιενεργό υπόστρωμα RNaseZ S Reaction buffer 1x Τελικός όγκος 1 μl counts/seconds 7 μl 7 μl 15 μl Ετοιμάστηκε μία αντίδραση για κάθε χρόνο, δηλαδή συνολικά: 4*15μl και αφαιρούνταν κάθε φορά 15μl στα 0, 15, 30, 45 και 60 λεπτά. Επίσης ετοιμάστηκαν άλλες 2 αντιδράσεις control (απουσία ενζύμου) για τους χρόνους 0 και 60 λεπτά. Το Reaction buffer είναι το διάλυμα διαπίδυσης (45mM Hepes ph=7.5, 75mM NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.1mM DTT, 10% glycerol). Στο ίδιο διάλυμα βρίσκεται το ένζυμο και το RRI (RNase Inhibitor). Οι αντιδράσεις σταματούν με την προσθήκη 2μl EDTA 0.5M και τοποθέτηση των δειγμάτων στον πάγο. Αφού συλλεχθούν όλες οι αντιδράσεις γίνεται απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων με φαινόλη και στη συνέχεια ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% χρησιμοποιώντας ως αποδιατακτικό ουρία (Urea) 8 Μ. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται στα 15 ma για περίπου 2.5 ώρες. 6. Εύρεση βέλτιστων συνθηκών αντίδρασης Στη συνέχεια ελέγχθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες αντίδρασης για μελλοντική κινητική ανάλυση in vitro. Αλλάξαμε το διάλυμα στο οποίο βρίσκεται η πρωτεΐνη μας προκειμένου να μην έχει τα ιόντα στα οποία 60

63 Υλικά-Μέθοδοι θέλαμε να ελέγξουμε στη συνέχεια. Το καινούριο διάλυμα διαπίδυσης περιείχε Hepes 45mM ph 7.5, γλυκερόλη 5% και DTT 1%. Ελέγχθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες αντίδρασης για κάθε συστατικό (για NaCl, KCl, MgCl 2, και θερμοκρασία) σε ph 7.5. Σε ένα Eppendorf μεταφέρθηκαν 435cps υποστρώματος trna Arg και 58μl αναστολέων RNAασών. Από αυτό το δ/μα μεταφέρθηκαν 2μl σε κάθε αντίδραση (15-20 cps ανά αντίδραση). Επιπλέον σε κάθε αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν 7μl ενζύμου. Οι 29 συνολικά αντιδράσεις έγιναν σε τελικό όγκο 15μl η καθεμία. Για NaCl: Ετοιμάστηκαν 5 αντιδράσεις, η αντίδραση ελέγχου που δεν περιείχε NaCl, και άλλες 4 με συγκέντρωση NaCl: 10, 25, 50 και 100 mm αντίστοιχα. Για KCl: Ετοιμάστηκαν 5 αντιδράσεις, η αντίδραση ελέγχου που δεν περιείχε ΚCl, και άλλες 4 με συγκέντρωση ΚCl: 5, 10, 25 και 50 mm αντίστοιχα. Για MgCl 2 : Ετοιμάστηκαν 6 αντιδράσεις, η αντίδραση ελέγχου που δεν περιείχε MgCl 2, και άλλες 5 με συγκέντρωση MgCl 2 : 0.5, 1, 1.5, 2.5 και 5 mm αντίστοιχα. Για θερμοκρασία: Ετοιμάστηκε από μία αντίδραση στους 25, 30, 37 και 42 ο C και οι αντίστοιχες αντιδράσεις χωρίς ένζυμο για να ελέγξουμε τυχόν μη ειδική υδρόλυση σε κάθε θερμοκρασία. Για τη ρύθμιση των υπολοίπων συνθηκών σε κάθε περίπτωση ετοιμάστηκαν πυκνά (10x) ρυθμιστικά διαλύματα. Τα ρυθμιστικά διαλύματα (buffers 10x) που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση προετοιμάστηκαν χρησιμοποιώντας stock διαλύματα NaCl (5M), MgCl 2 (1M), DTT(1M), Hepes ph=7.5 (1M). Για NaCl: 450mM Hepes ph=7.5, 15mM MgCl 2, 1mM DTT και DEPC H 2 0 Για KCl: 450mM Hepes ph=7.5, 15mM MgCl 2, 1mM DTT και DEPC H 2 0 Για MgCl 2 : 450mM Hepes ph=7.5, 750mM NaCl, 1mM DTT και DEPC H 2 0 Για θερμοκρασία: 450 mm Hepes ph=7.5, 750mM NaCl, 15mM MgCl 2, 1mM DTT και DEPC H 2 0 Οι αντιδράσεις επωάστηκαν για 10 λεπτά. Οι αντιδράσεις σταματούν με την προσθήκη 2μl EDTA 0.5M και τοποθέτηση των δειγμάτων στον πάγο. Αφού συλλεχθούν όλες οι αντιδράσεις γίνεται απομόνωση των νουκλεικών οξέων με διάλυμα φαινόλης-χλωροφορμίου-ισοαμυλικής αλκοόλης (25:24:1) και στη συνέχεια ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% χρησιμοποιώντας ως αποδιατακτικό ουρία 8 M. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται στα 15 ma για περίπου 2.5 ώρες. Το πήκτωμα αφαιρέθηκε και το αφήσαμε για εμφάνιση όλο το βράδυ κάτω από πλάκα φωτοδιεγειρόμενου φθορισμού και σαρώθηκε την επόμενη μέρα. 61

64 Υλικά-Μέθοδοι 7. Προσδιορισμός δραστικότητας της RNase Z L O προσδιορισμός της δραστικότητας έγινε χρησιμοποιώντας μη ραδιενεργά υποστρώματα υποστρώματα. Τα υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι το πρόδρομο μόριο trna Arg. Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν οι εξής: 45mM Hepes ph=7.5, 75mM NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.1mM DTT, 10% glycerol. Η κάθε αντίδραση ετοιμάστηκε σύμφωνα με τις παρακάτω ποσότητες. RRI (1U/μl)) Υπόστρωμα RNaseZ L Reaction buffer 1x Τελικός όγκος 1 μl 500ng 5 μl 7 μl 15 μl Ετοιμάστηκε μία αντίδραση για κάθε χρόνο, δηλαδή συνολικά: 4*15μl και αφαιρούνταν κάθε φορά 15μl στα 0, 15, 30, 45 και 60 λεπτά. Επίσης ετοιμάστηκαν άλλες 2 αντιδράσεις control για τους χρόνους 0 και 60 λεπτά. Για τα 60 λεπτά αντί ενζύμου προστέθηκε παρόμοιας σύστασης δείγματος που προερχόταν από κύτταρα στα οποία δεν έγινε επαγωγή με IPTG. Το Reaction buffer είναι το διάλυμα διαπίδυσης (45mM Hepes ph=7.5, 75mM NaCl, 1.5 mm MgCl2, 0.1mM DTT, 10% glycerol). Στο ίδιο διάλυμα βρίσκεται το ένζυμο και το RRI (RNase Inhibitor). Οι αντιδράσεις σταματούν με την προσθήκη 2μl EDTA 0.5M και τοποθέτηση των δειγμάτων στον πάγο. Αφού συλλεχθούν όλες οι αντιδράσεις γίνεται απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων με φαινόλη και στη συνέχεια ηλεκτροφορούνται σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% χρησιμοποιώντας ως αποδιατακτικό ουρία (Urea) 8 Μ. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται στα 10 ma για περίπου 90 λεπτά. Στη συνέχεια έγινε χρώση με EtBr και έγινε εμφάνιση σε UV Transluminator. 8. Κυτταρικές σειρές και καλλιέργεια H κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη αναφέρονται στον ακόλουθο πίνακα: Κυτταρική σειρά Α549 Περιγραφή Ανθρώπινα κύτταρα μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα Πηγή προέλευσης ATCC ΗΕΚ 293Τ Ανθρώπινα κύτταρα από εμβρυικό νεφρό ATCC H κυτταρική σειρά ΗΕΚ-293 δημιουργήθηκε το 1973 έπειτα από μετασχηματισμό καλλιεργειών φυσιολογικών εμβρυικών κυττάρων νεφρού με DNA από τον αδενοϊό 5. Τα 293Τ κύτταρα προέρχονται από τα 62

65 Υλικά-Μέθοδοι κύτταρα ΗΕΚ-293 και εκφράζουν σταθερά το μεγάλο T αντιγόνο του SV40 και ενισχύει την αντιγραφή ειδικών πλασμιδιακών φορέων όπως ο pcdna3.1 Η κυτταρική σειρά Α549 είναι ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα. Προέρχονται από κυψελιδικό αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα. Απομονώθηκαν από Καυκάσιο άντρα 58 ετών, που έπασχε από μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα. Φέρουν αγρίου τύπου γονίδιο της p53 και μεταλλάξεις στα γονίδια K-Ras, p16 INK4A και p14 ARF. H κυτταρική σειρά Α549 καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό υλικό DMEM (Dulbecco s Modified Eagles Medium). Το θρεπτικό υλικό εμπλουτίστηκε με 10% εμβρυϊκό ορό μόσχου (Fetal Bovine Serum), 100 μg/ml πενικιλίνη, 100 μg/ml στρεπτομυκίνη. Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε επωαστικό κλίβανο στους 37 C, 5%CO 2. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε και καλλιέργεια των συγκεκριμένων κυττάρων έπειτα από επαγωγή στρες. Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε ήταν DMEM (Dulbecco s Modified Eagles Medium). Στον παρακάτω πίνακα αναγράφονται οι συνθήκες στρες που επιλέχθηκαν καθώς και κάθε υλικό το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την επαγωγή του στρες. Συνθήκες καλλιέργειας 1. Full Medium- Πλήρες θρεπτικό υλικό (Μάρτυρας) 2. Serum Starvation- Στέρηση ορού εμβρύου βοός. 3. Glucose starvation- Στέρηση πηγών γλυκόζης. 4. Glucose & FBS starvation- Στέρηση ορού εμβρύου βοός και πηγών γλυκόζης. 5. Χορήγηση 500μM υπεροξειδίου (Η ) 10% ορός εμβρύου βοός -FBS 4.5g/l γλυκόζη 1mM Πυροσταφυλικού 1mM Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 4.5g/l γλυκόζη 1mM Πυροσταφυλικού 1mM Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 10% ορός εμβρύου βοός -FBS 1mM Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 1mM Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 10% ορός εμβρύου βοός -FBS 4.5g/l γλυκόζη 1mM Πυροσταφυλικού 1mM Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 500μΜ Η Υποκυττάριος εντοπισμός των RNaseZ S (ELAC1) και RNaseZ L (ELAC2.1, ELAC2.2) Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA Πλασμιδιακό DNA απομονώθηκε με την μικροπαρασκευαστική μέθοδο (παράγραφος-2.3). Μετά την απομόνωση του DNA ακολουθήθηκε καθαρισμός του, γιατί τα συγκεκριμένα πλασμίδια θα χρησιμοποιηθούν 63

66 Υλικά-Μέθοδοι για διαμόλυνση κυτταρικής σειράς (ΗΕΚ-293T/Human Embryonic Kidney cells) και η πιθανότητα μόλυνσής τους θα οδηγούσε στην αποτυχία του πειράματος. Phenol extraction Στο δείγμα μας προσθέτουμε ίσο όγκο διαλύματος φαινόλης-χλωροφορμίου-ισοαμυλικής αλκοόλης (25:24:1). Ακολουθεί ανάδευση του δείγματος για ½ λεπτό και στη συνέχεια επωάζεται για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Έπειτα πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα x g και η υδατική φάση μεταφέρεται σε ένα νέο eppendorf. Σε αυτή προστίθεται ίσος όγκος χλωροφορμίου-ισοαμυλικής αλκοόλης (24:1) και όπως και προηγουμένως αναδεύεται για ½ λεπτό. Το μείγμα φυγοκεντρείται για 5 λεπτά στα x g και η υδατική φάση μεταφέρεται σε νέο eppendorf. Ethanol precipitation Προστίθεται 1/10 του όγκου NaOAc (Sodium Acetate) με συγκέντρωση 3M και ph 5.2. Στη συνέχεια, προστίθεται ποσότητα αιθανόλης 100% που ισοδυναμεί με 2.5 φορές στον όγκο του διαλύματος μας και επωάζεται στους -80 ο C για 30 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στα x g στους 4 o C και το ίζημα ξεπλένεται με 1ml ψυχρής αιθανόλης 70%. Ακολουθεί φυγοκέντρηση 15 λεπτά στα x g. Στους 4 o C. Αφαιρείται το υπερκείμενο και τα πλασμίδια έχουν παραμείνει στο σωλήνα eppendorf με τη μορφή ιζήματος. Ξηραίνουμε τα πλασμίδια στο θάλαμο καθέτου νηματικής ροής και τέλος τα αναδιαλύουμε σε 50 μl ddh 2 O sterile. 8.2 Διατήρηση και καλλιέργεια ανθρώπινων κυτταρικών σειρών Απόψυξη των κυττάρων Ένα φιαλίδιο κατάψυξης κυττάρων που περιέχει 3*106 περίπου κύτταρα μεταφέρεται παγωμένο κατευθείαν σε υδατόλουτρο στους 37 o C μέχρι να τηχθεί όλο το θρεπτικό υλικό που περιέχει τα κύτταρα. Τα κύτταρα μεταφέρονται σε 15 ml falcon μαζί με 3.5 ml PBS και φυγοκεντρούνται σε 200 x g για 5 λεπτά. Με τον τρόπο αφαιρείται το DMSO, το οποίο είναι τοξικό για τα κύτταρα. Αφαιρείται το υπερκείμενο, τα κύτταρα επαναιωρούνται σε πλήρες θρεπτικό μέσο DMEM και μεταφέρονται σε τρυβλίο των 10 cm σε τελικό όγκο θρεπτικό 10ml. Την επόμενη μέρα αφαιρείται το υπάρχον θρεπτικό και συμπληρώνεται με φρέσκο θρεπτικό μέσο. Ανακαλλιέργεια Όταν τα κύτταρα καλύψουν 100% την επιφάνεια του τρυβλίου, πριν αρχίσουν και δημιουργούν διπλοστοιβάδες πρέπει να αποκολληθούν, να αραιωθούν και να στρωθούν σε νέο τρυβλίο σε ποσότητα τέτοια που να καλύπτει το 10-20% της επιφάνειας. Για την αποκόλληση των κυττάρων είναι απαραίτητη η επεξεργασία με θρυψίνη. Τα κύτταρα αυτά αποκολλώνται μετά από επώαση με 5 ml θρυψίνης στους 37 0 C για 10 λεπτά. Προστίθεται φρέσκο θρεπτικό μέσο και τα κύτταρα αποκολλώνται με ελαφρύ πιπετάρισμα. Τα κύτταρα μεταφέρονται σε σωλήνα falcon των 15ml, φυγοκεντρούνται για 5 λεπτά στις 1500 στροφές και 64

67 Υλικά-Μέθοδοι επαναιωρούνται σε 3 ml θρεπτικό μέσο. Από το εναιώρημα των κυττάρων μεταφέρουμε το 1/5 σε νέο τρυβλίο σε τελικό όγκο 10 ml πλήρες θρεπτικού. Κατάψυξη των κυττάρων Όταν τα κύτταρα καλύψουν το 90% της επιφάνειας αποκολλώνται και μεταφέρονται σε σωλήνα falcon των 15ml και φυγοκεντρούνται σε x g για 5 λεπτά. Αφαιρείται το υπερκείμενο και αναδιαλύονται σε 3 ml διάλυμα ψύξης. Σε ειδικά φιαλίδια μεταφέρεται 1ml από το εναιώρημα των κυττάρων και αποθηκεύεται στου -80 ο C. 8.3 Μελέτη υποκυττάριου εντοπισμού των RNase Z S και RNase Z L Σε 12-well τρυβλίο, χρησιμοποιήθηκαν 8 πηγάδια στα οποία προστέθηκε κατάλληλη ποσότητα κυττάρων ΗΕΚ-293Τ από ένα τρυβλίο των 100mm έτσι ώστε να έχουμε πληρότητα περίπου 70-80% την επόμενη μέρα σε κάθε πηγάδι μετά από επώαση στους 37 o C. Η πληρότητα αυτή ενδείκνυται για τη διαμόλυνση. Για τη διαμόλυνση χρησιμοποιήθηκε η λιποφεκταμίνη, ένα πολυκατιονικό συνθετικό λιπίδιο αναμειγμένο με φωσφατιδυλο-αιθανολαμίνη. Το αντιδραστήριο αυτό συνδυαζόμενο με DNA, σχηματίζει λιποσώματα που συντήκονται με την κυτταρική μεμβράνη των κυττάρων στόχων και αποχύνουν το περιεχόμενο DNA στο εσωτερικό του κυττάρου. Μεταβολές των χρησιμοποιούμενων συγκεντρώσεων DNA και λιποφεκταμίνης είναι απαραίτητες για την βελτιστοποίηση της διαμόλυνσης. Επίσης, είναι αναγκαία η ύπαρξη αρνητικού μάρτυρα κυττάρων τα οποία διαμολύνονται με πλασμιδιακό φορέα που δεν είναι ανασυνδιασμένος (pcdna 3.1 GFP). Προετοιμασία των τρυβλίων Πορεία: Αφαιρείται το πλήρες θρεπτικό και προστίθενται 3ml trypsin. Τα κύτταρα τοποθετούνται στους 37 0 C για μερικά λεπτά (3-5 min) μέχρι να αποκολληθούν τα κύτταρα. Προστίθεται 7 ml DMEM και τα κύτταρα αναμειγνύονται με την πιππέτα. Σε κάθε ένα πηγάδι, στο οποίο υπάρχει ήδη 1 καλυπτρίδα, προστίθεται 1 ml πλήρους θρεπτικού DMEM 10% FBS (εμβρυϊκός ορός βοός), και 0,2 ml από τα αναδιαλυμένα σε DMEM κύτταρα του μεγάλου τρυβλίου. Το 12-well τρυβλίο τοποθετείται στους 37 0 C με 5% CO 2 overnight. Διαμόλυνση Για την διαδικασία της διαμόλυνσης χρησιμοποιήθηκαν: θρεπτικό μέσο Opti-MEM, λιποφεκταμίνη και τα επιθυμητά πλασμίδια (pcdna3.1-egfp, pcdna3.1-elac1+gfp, pcdna3.1-elac2.1+gfp, pcdna3.1- ELAC2.2+GFP ). Πραγματοποιήθηκαν δύο επαναλήψεις σε κάθε περίπτωση. Πορεία: Σε ένα σωλήνα eppendorf πρσθέτουμε 100μl Opti-MEM και 1,6 μg πλασμιδιακού DNA. 65

68 Υλικά-Μέθοδοι Σε ένα άλλο σωλήνα προσθέτουμε 100 μl Opti-MEM και 4 μl λιποφεκταμίνη και επωάζουμε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δύο διαλύματα συγχωνεύονται (transfection mix) και επωάζονται για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Σε κάθε πηγαδάκι προσθέτουμε σταγόνα-σταγόνα το transfection mix κυρίως πάνω από τις καλυπτρίδες. Τα κύτταρα επωάζονται για 6 ώρες αφαιρείται το θρεπτικό και ανανεώνεται. Ακολουθεί επώαση για 24 ώρες στους 37 Ο C σε 5% CO 2. Παρατήρηση των κυττάρων Ύστερα από τη διαδικασία της διαμόλυνσης και την επώαση που ακολούθησε τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες με σκοπό τον υποκυττάριο εντοπισμό των pcdna3.1-egfp, pcdna3.1-elac1+gfp, pcdna3.1-elac2.1+gfp, pcdna3.1-elac2.2+gfp. Πριν τη μονιμοποίηση των κυττάρων, επωάστηκαν για 30 λεπτά σε πλήρες θρεπτικό υλικό παρουσία 150nM Mitotracker Red στους 37 ο C. Στη συνέχεια προετοιμάστηκαν οι καλυπτρίδες ως εξής: Προετοιμασία καλυπτρίδων για παρατήρηση σε συνεστιακό μικροσκόπιο Πορεία: Ξεπλένουμε τα κύτταρα δύο φορές με PBS. Προσθέτουμε 4% PFA για μονιμοποίηση και επωάζουμε για 10 λεπτά υπό αναδευση. Ακολουθούν άλλα δύο ξεπλύματα με PBS. Πρoετοιμάζουμε σε ένα eppendorf 1 μl χρωστικής πυρήνα Hoechst (10μg/ml) + 2 ml PBS και προσθέτουμε από 500 μl σε κάθε πηγάδι. Επώαση για 5 λεπτά στους 37 ο C (υπό συνθήκες σκότους). Ξεπλένουμε 2 φορές με PBS για 5 λεπτά. Τοποθέτηση κυττάρων σε αντικειμενοφόρο πλάκα Στην αντικειμενοφόρο βάζουμε μία σταγόνα στερεοποιητικού Mowiol και πάνω της τοποθετούμε την καλυπτρίδα από το κάθε πηγάδι. Αφήνουμε σε σκοτεινό μέρος για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα διατηρούμε στο ψυγείο καλυμμένα (υπό συνθήκες σκότους) μέχρι να παρατηρηθούν στο συνεστιακό μικροσκόπιο. 66

69 Υλικά-Μέθοδοι 9. Ανάλυση κυτταρικού κύκλου με χρήση κυτταρομετρίας ροής Με την κυτταρομετρία ροής γίνεται μέτρηση του ποσοστού των κυττάρων που βρίσκονται σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου (ανάλυση του κυτταρικού κύκλου) καθώς και του ολικού περιεχόμενου του DNA ενός κυτταρικού πληθυσμού. Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του ποσοστού των κυττάρων στη φάση ηρεμίας (G0/G1), στη φάση σύνθεσης DNA (S) και στη φάση μίτωσης (G2/M). Η διαδικασία έχει ως εξής. Tα κύτταρα συλλέγονται και μονιμοποιούνται σε 70% παγωμένη αιθανόλη και φυλάχθηκαν για τουλάχιστον 16 ώρες σε καταψύκτη -20 C. Στη συνέχεια πραγματοποιούνται πλύσεις µε 1Χ PBS και τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 200μl PBS το οποίο περιέχει 8µg/ml ιωδιούχου προπιδίου (Propidium Iodide και 100μg/ml RNAse A. Το ιωδιούχο προπίδιο είναι μία φθορίζουσα ουσία η οποία έχει την ικανότητα να παρεμβάλλεται ανάμεσα στις βάσεις του DNA (αλλά και του RNA) και για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται για τη σήμανση νουκλεϊκών οξέων. Το ένζυμο RNAse A χρησιμοποιείται για να απομακρύνει το RNA από τα δείγματά μας. Τα δείγματα αναλύθηκαν σε κυτταρομετρητή Becton Dickinson BD FACSCalibur. Τα δεδομένα αναλύθηκαν μέσω του λογισμικού FlowJo V Υπερέκφραση των RNase Z S και RNase Z L σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 και προσδιορισμός της γονιδιακής έκφρασης Κύτταρα A549 διαμολύνθηκαν με πλασμίδιο pcdna3.1 το οποίο περιείχε είτε τo ELAC1 είτε τo ELAC2 με δύο replicates σε κάθε περίπτωση. Το θρεπτικό υλικό ανανεώθηκε μετά από 6 ώρες και 24 μετά από την ανανέωση θρεπτικού απομονώθηκε ολικό RNA από τα κύτταρα αυτά με τη χρήση Trizol: 1. Αφαίρεση θρεπτικού υλικού και ξέπλυμα των κυττάρων, 2 φορές από 1-3ml 1x PBS. 2. Προσθήκη ποσότητας δ/τος Trizol σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Τρυβλίο Ποσοστό κυττάρων TRIzol Reagen (ml) 6 well (35 mm) 100% 1 ml TRIzol Reagent 60 mm dish 100% 1.5 ml 3. Λύση των κυττάρων και συλλογή ολόκληρης της ποσότητας σε σωλήνα τύπου eppendorf. 4. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. 5. Προστέθηκαν 200μl χλωροφορμίου για κάθε 1 ml TRIzol Reagent που χρησιμοποιήθηκε. 6. Φυγοκέντρηση στις g για 15 λεπτά στους 4ºC. 7. Συλλογή η υπερκείμενη υδατική φάση 8. Προσθήκη ίσου όγκου με την υδατική φάση, ισοπροπανόλης 100%. Φυγοκέντρηση στις g για 15 λεπτά στους 4 ο C. 67

70 Υλικά-Μέθοδοι 9. Αφαίρεση υπερκειμένου και προσθήκη 1ml ψυχρής αιθανόλης 75%. Φυγοκέντρηση στις g για 15 λεπτά στους 4 ο C. 10. Αφαίρεση υπερκειμένου και ξήρανση δειγμάτων για 3 λεπτά ώστε να απομακρυνθούν τα κατάλοιπα αιθανόλης. 11. Το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε αποστειρωμένο DEPC ddh 2 O 12. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε 1.5% πηκτή αγαρόζης για την διαπίστωση της ακεραιότητας του RNA. Επίδραση με ένζυμο DNase I Για απομάκρυνση γενομικού DNA από τα δείγματα πραγματοποιήθηκε αντίδραση με το ένζυμο DNase Ι της εταιρείας Ambion. Το ένζυμο θα πέψει τυχόν μόρια DNA που υπάρχουν στα δείγματα, χωρίς καμία επίδραση στο RNA. 13. Προσθήκη 5μl DNase Buffer I στο δείγμα μας 14. Προσθήκη 1μl DNase I (2U/μl) 15. Προσθήκη 0,3 μl RRI (Ribosafe RNase Inhibitor) (προαιρετικά) 16. Ήπια ανάδευση με δίνη (Vortex). 17. Τοποθέτηση δειγμάτων στους 37ºC, για λεπτά Καθαρισμός δειγμάτων με Phenol extraction-ethanol precipitation Μετά το πέρας των 40 λεπτών ακολούθησε απενεργοποίηση του ενζύμου και καθαρισμός των δειγμάτων ως εξής: 1. Προσθήκη ίσου όγκου διαλύματος φαινόλης και ανάδευση με vortex 2. Φυγοκέντρηση στις x g για 3 λεπτά. 3. Συλλογή υπερκείμενης φάσης σε νέο Eppendorf. 4. Για την απομάκρυνση τυχόν καταλοίπων φαινόλης προστέθηκε ίσος όγκος χλωροφορμίου και ακολούθησε ανάδευση με vortex. 5. Φυγοκέντρηση στις x g για 3 λεπτά στους 4ºC. Η υπερκείμενη φάση συλλέχθηκε σε νέο Eppendorf. 6. Ακολούθησε κατακρήμνιση των δειγμάτων με προσθήκη 1/10 του όγκου οξικού Νάτριου (NaOAc) 3M ph 5,2 και προσθήκη 2,5 φορές του όγκου ψυχρής 100% αιθανόλης. 7. Ανάδευση των δειγμάτων και αποθήκευση στους -80 o C για 30 λεπτά. 8. Φυγοκέντρηση x g για 30 λεπτά στους 4 o C. Αφαίρεση υπερκειμένου και για επιπλέον πλύση των δειγμάτων με 75% ψυχρή αιθανόλη και ακολούθησε φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στους 4 o C. 9. Αφαίρεση υπερκειμένου και ξήρανση των δειγμάτων για 3 min ώστε να φύγουν κατάλοιπα αιθανόλης. 10. Επαναδιάλυση σε αποστειρωμένο DEPC H 2 O. 11. Στη συνέχεια τα δείγματα φωτομετρήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν. 68

71 Υλικά-Μέθοδοι Δημιουργία cdna από ολικό RNA Η κατασκευή του cdna από το ολικό RNA των δειγμάτων, έγινε με χρήση του ενζύμου της αντίστροφης μεταγραφάσης (reverse transcriptase) σύμφωνα με το πρωτόκολλο BioScript TM Reverse Transcriptase της Bioline. Τα βήματα αναγράφονται παρακάτω: Παρασκευή μείγματος 1 και μείγματος 2 Μείγμα 1 Μείγμα 2 Ολικό RNA 2,5 μg 5x RT Buffer 4 μl 40 μm Random Hexamers 4 μm RRI 40U 10 mm dntps mix 1 mm Reverse Transcriptase 100 U DEPC-Treated Water Εως 10μl DEPC-Treated Water Εως 10μl 1. Επώαση του μείγματος 1 στους 70ºC για 5 λεπτά και μεταφορά στον πάγο 2. Ανάμιξη του μείγματος 2 στο μείγμα 1 ακολουθούμενο από ήπια ανάδευση. 3. Επώαση στους 25 o C για 2λεπτά προκειμένου να δράσει η αντίστροφη μεταγραφάση. 4. Επώαση στους 42 o C για 30 λεπτά προκειμένου να δράσει η αντίστροφη μεταγραφάση 5. Τερματισμός αντίδρασης με επώαση στους 70 ο C για 15 λεπτά 6. Αποθήκευση στους -20ºC Ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης γονιδίων με τη μέθοδο της Real time PCR Για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο της τυπικής αντίδρασης two step Real-Time PCR με χρήση του KAPA SYBR FAST Universal qpcr Kit της KAPA Biosystems. RNase free water Forward Primer Reverse Primer (ή Outer) KAPA SYBR FAST ROX Low (50x) KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix (2X) cdna Total Ανα αντίδραση 7,8 μl 0,4 μl 0,4 μl 0,4 μl 10,0 μl 1 μl 19 μl 69

72 Υλικά-Μέθοδοι Βήμα Θερμοκρασία Διάρκεια Κύκλοι Αρχική αποδιάταξη - ενεργοποίηση της πολυμεράσης 95 ο C 3 min 1 Μετουσίωση 90 ο C 3 sec 40 Επέκταση 60 ο C 30 sec Πλήρης Αποδιάταξη 95 ο C 1 min 1 Λήψη καμπύλης τήξης 55 ο C-95 ο C 1 Κατόπιν της αντίδρασης τα δεδομένα, οι κύκλοι δηλαδή (τιμές Ct), εξάγονται και σε φύλο excel προς ανάλυση σύμφωνα με τον τύπο 2 -ΔΔCt (66). Η κανονικοποίηση πραγματοποιήθηκε με βάση το γονίδιο της β-actin 11. Απαλοιφή της RNase Z S σε κύτταρα HEK-293T με τη χρήση του συστήματος γονιδιωματικής επεξεργασία CRISPR-Cas9 Για να εξαλείψουμε την έκφραση της RNase Z S σε κύτταρα HEK-293T αξιοποιήθηκε το σύστημα CRISPR- Cas9. Χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο pspcas9(bb)-2a-puro (PX459). O φορέας αυτός έχει τη δυνατότητα να εκφράσει την Cas9 νουκλεάση καθώς και ένα sgrna. Για να είναι λειτουργικό το sgrna θα πρέπει να κλωνοποιήσουμε στο φορέα αυτό την οδηγό αλληλουχία που θα στοχεύει το γενετικό τόπο που επιθυμούμε. Ο τρόπος με τον οποίο θα εξαλείψουμε την πρωτεΐνη είναι αυτός της διατάραξης του αναγνωστικού πλαισίου της κωδικής περιοχής. Η τροποποίηση θα πρέπει να γίνει όσο πιο ανοδικά γίνεται στην κωδική περιοχή ώστε σε περίπτωση που παράγεται κάποια πρωτεΐνη, να έχει διαφορετική αμινοξική αλληλουχία. Έτσι το τμήμα που επιλέχθηκε να στοχευθεί είναι αυτό που βρίσκεται καθοδικά του κωδικονίου έναρξης στο δεύτερο εξώνιο του γονιδίου ELAC1. Η θέση μέσα στο φορέα PX459 στην οποία θα κλωνοποιηθεί η οδηγός αλληλουχία διαθέτει δύο θέσεις αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού τύπου ΙΙ, BbsI. Έπειτα από πέψη με το συγκεκριμένο ένζυμο, το πλασμίδιο χάνει το τμήμα που φαίνεται στην Εικόνα 20 και δημιουργούνται τα κολλώδη άκρα τα οποία θα χρησιμοποιηθούν για την κλωνοποίηση της οδηγού αλληλουχίας η οποία έχει τη μορφή δίκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου και φέρει μονόκλωνα άκρα συμπληρωματικά αυτών του πλασμιδίου. Έτσι το ολιγονουκλεοτίδιο εισέρχεται με το σωστό προσανατολισμό. Το ολιγονουκλεοτίδια σχεδιάζονται όπως φαίνεται στην Εικόνα 20. Η οδηγός αλληλουχία σχεδιάζεται με τη βοήθεια του εργαλείου που βρίσκεται στη τοποθεσία Στο συγκεκριμένο εργαλείο εισάγεται το επιθυμητό τμήμα το οποίο θέλουμε να στοχεύσουμε και παρουσιάζει όλες τις δυνατές αλληλουχίες είκοσι νουκλεοτιδίων που διαθέτουν την PAM 70

73 Υλικά-Μέθοδοι (NGG). Επιπλέον αναζητεί στο γονιδίωμα μη επιθυμητούς που θα μπορούσαν να αναγνωριστούν από την Cas9 όταν αυτή καθοδηγείται από την συγκεκριμένη οδηγό αλληλουχία και δίνει σε κάθε αλληλουχία ένα βαθμό. Όσο μεγαλύτερος αυτός ο βαθμός τόσο λιγότερους μη επιθυμητούς στόχους μπορεί να αναγνωρίσει η Cas9. Στο Παράρτημα παρουσιάζονται αναλυτικά οι μη επιθυμητοί στόχοι. Επιπλέον μέσω της ανάλυσης το εργαλείο παραθέτει και τους δυνατούς συνδυασμούς οδηγών αλληλουχιών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε περίπτωση που είναι επιθυμητή η χρήση της nickase Cas9. Εικόνα 20 Θέση κλωνοποίησης στο φορέα PX459 (πάνω), πρότυπο για τη σχεδίαση των ολιγονουκλεοτιδίων (κάτω). Το τμήμα του δεύτερου εξωνίου που χρησιμοποιήθηκε είναι το εξής: GGTGGAAGATGTCTATGGATGTGACATTCCTGGGGACGGGTGCAGCATACCCATCTCCAACCCGGGGTGCCTCTGC TGTGGTCCTTCGGTGTGAAGGCGAGTGCTGGCTCTTTGACTGTGGGGAGGGAACACAGACACAGCTTATGAAAAGC CAACTTAAAGCAG Οι αλληλουχίες οδηγοί που επιλέχθηκαν είναι οι δύο με τον καλύτερο βαθμό. Όνομα Αλληλουχία Σκορ Αριθμός Off-targets (σε εξώνια άλλων γονιδίων) sgrna #1 TTCGGTGTGAAGGCGAGTGC 89% 74(15) sgrna #2 GCTGTGGTCCTTCGGTGTGA 86% 129(21) Στο παράρτημα παρατίθενται αναλυτικά τα αποτελέσματα 71

74 Υλικά-Μέθοδοι 11.1 Διαδικασία κλωνοποίησης οδηγών αλληλουχιών. Σχεδιάστηκαν τα ολιγονουκλεοτίδια που θα χρησιμοποιήσουμε όπως φαίνεται στην Εικόνα 20. Αρχικά γίνεται πέψη του πλασμιδίου px459 σύμφωνα με το πρωτόκολλο που ακολουθεί: Πλασμίδιο BbsI (NEB) 10x Cutsmart Buffer ddh 2 O 500ng 1μl 2μl Μέχρι τα 20 μl Η αντίδραση στη συνέχεια επωάζεται στους 37 ο C για 90 λεπτά, διαχωρίζονται τα προϊόντα με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% και εξάγεται από το πήκτωμα η ζώνη που αντιστοιχεί στο γραμμοποιημένο πλασμίδιο. Παράλληλα γίνεται υβριδοποίηση και φωσφορυλίωση των ολικονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιούνται για την κλωνοποίηση της οδηγού αλληλουχίας. Τα ζεύγη είναι τα sgrna_elac1#1_top - sgrna_elac1#1_bot και sgrna_elac1#2_top - sgrna_elac1#2_bot που παρατίθενται στον πίνακα των εκκινητώνολιγονουκλεοτιδίων (Υλικά-9) Ολιγονουκλεοτίδιο 1 (100μM) Ολιγονουκλεοτίδιο 2 (100μM) 10Χ T4 Ligation buffer (NEB) ddh 2 O T4 PNK (NEB) Σύνολο 1 μl 1 μl 1 μl 6.5 μl 0.5 μl 10 μl Τα περιεχόμενα της αντίδρασης προστίθενται με τη σειρά που παρουσιάζονται στον πίνακα. Στη συνέχεια η αντίδραση επωάζεται σε έναν θερμοκυκλοποιητή για 30 λεπτά τους 37 ο C, 5 λεπτά στους 95 ο C και τέλος ψύχεται μέχρι τους 25 ο C με ρυθμό 5 ο C/λεπτό. Το περιεχόμενο της αντίδραση στη συνέχεια αραιώνεται 200 φορές. Ακολουθεί η αντίδραση λιγάσης όπου το δίκλωνο και φωσφωρυλιωμένο ολιγονουκλεοτίδια θα ενσωματωθεί στο γραμμοποιημένο px459. H αντίδραση προετοιμάζεται ως εξής: Γραμμοποιημένο px459 Δικλώνο ολιγονουκλεοτίδιο (1:200 αραίωση) 10X T4 Ligase buffer (NEB) ddh 2 O T4 DNA Ligase (NEB) 50 ng 1 μl 2 μl Μέχρι 19 μl 1 μl Τα περιεχόμενα της αντίδρασης προστίθενται με τη σειρά που παρουσιάζονται στον πίνακα. Στη συνέχεια η αντίδραση επωάζεται στους 16 o C για 16 ώρες. Τέλος, 5 μl από την αντίδραση χρησιμοποιούνται 72

75 Υλικά-Μέθοδοι για μετασχηματισμό του στελέχους E. coli, Stbl3 και από αυτά απομονώνουμε το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως Δημιουργία κλώνων ΗΕΚ 293Τ που δεν εκφράζουν το γονίδιο ELAC1 Δύο plate των 60mm διαμολύνθηκαν είτε με το PX459 που εκφράζει το sgrna #1 είτε το sgrna #2 όπως περιγράφθηκε παραπάνω (παράγραφος 7.3-Διαμόλυνση). Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με το πλήρες θρεπτικό μέσο. Μετά τις 24 ώρες αφαιρέθηκε το θρεπτικό μέσο και αντικαταστάθηκε με πλήρες θρεπτικό μέσο που περιείχε 3μg/ml πουρομυκίνη και έτσι κάνουμε θετική επιλογή για τα μετασχηματισμένα κύτταρα. Η επιλογή διήρκησε 48 ώρες και τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία των 100 mm σε μικρές πυκνότητες. Τα τρυβλία αυτά καλλιεργήθηκαν για 2 εβδομάδες κατά τις οποίες το θρεπτικό ανανεωνόταν κάθε τρείς μέρες. Με το πέρας των δύο εβδομάδων μπορούσαμε να παρατηρήσουμε των σχηματισμό ευδιάκριτων αποικιών. Χρησιμοποιώντας μία πιππέτα των 10 μl με την οποία είχαμε αναρροφήσει ποσότητα θρυψίνη αναταράξαμε κάθε αποικία και την αναρροφήσαμε. Το περιεχόμενο του ακροφυσίου εναποτέθηκε σε ένα πηγάδι ενός πιάτου των 48 πηγαδιών. Συνολικά απομονώθηκαν 43 αποικίες που προέκυψαν από διαμόλυνση των κυττάρων με px459 που φέρει το sgrna #1 και 13 αποικίες που προέκυψαν από διαμόλυνση με px459 που φέρει το sgrna #2. Οι αποικίες αυτές καλλιεργήθηκαν μέχρι να πολλαπλασιαστούν και να καλύψουν το πηγάδι στο οποίο βρίσκονται οπότε και τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε πηγάδια ενός πιάτου που διαθέτει 24 πηγάδια. Αφού κάλυψαν και αυτό το πηγάδι μεταφέρθηκαν σε πιάτα των 35 mm και αφού το κάλυψαν, τα 3/4 των κυττάρων αποθηκεύτηκαν στους -80 o C και το 1/4 χρησιμοποιήθηκε για απομόνωση γενομικού DNA με τη χρήση Trizol, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή Έλεγχος για τροποποιημένους κλώνους Ενισχύθηκε με PCR ένα τμήμα του γονιδιωματικού DNA μεγέθους 603 bp το οποίο περιλαμβάνει το εξώνιο το οποίο στοχεύει η Cas9 από πειραματικούς κλώνους καθώς και από φυσιολογικά κύτταρα στα οποία δεν διαμολύνθηκαν. Το προϊόν της αντίδρασης ηλεκτροφορείται σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5% διαχωρίζεται από τυχόν παραπροϊόντα και απομονώνεται από αυτό όπως έχει περιγραφθεί παραπάνω. Το τμήμα αυτό αναπαρίσταται γραφικά στην Εικόνα 21. Εικόνα 21 Γραφική αναπαράσταση του ενισχυμένου τμήματος γονιδιωματικού DNA. 73

76 Υλικά-Μέθοδοι Για να εντοπιστούν οι τροποποιημένοι κλώνοι αναμείχθηκαν ενισχυμένα τμήματα από DNA των κλώνων με τμήμα από φυσιολογικά κύτταρα. Το μείγμα αυτό τοποθετήθηκε σε έναν θερμοκυκλοποιήτη και αποδιατάχθηκε στους 95 ο C και στη συνέχεια επανήλθε με αργό ρυθμό στους 25 βαθμούς. Με τη διαδικασία αυτή έχει σχηματιστεί ένας σημαντικός αριθμός δίκλωνων υβριδίων καθώς ο κάθε κλώνος θα έχει διαφορετική προέλευση. Η γονιδιωματική τροποποίηση θα εμφανίζεται ως μία ατέλεια ζευγάρωσης βάσεων στο σημείο που δρα η Cas9. Έτσι, επωάζοντας με μία ενδονουκλεάση που αναγνωρίζει μονόκλωνο DNA μπορούμε να οπτικοποιήσουμε την ύπαρξη αυτών των υβριδίων μετά από ηλεκτροφόρηση. Το πρότυπο ζώνωσης σε περίπτωση τροποποιήμενου κλώνου είναι προβλέψιμο και άρα μπορούμε να βγάλουμε ασφαλές συμπέρασμα για την ύπαρξη ή μη των τροποποιήσεων. Για βρούμε τη φύση της μετάλλαξης απλά κάνουμε αλληλούχιση των ενισχυμένων προϊόντων. Η όλη διαδικασία συνοψίζεται στην Εικόνα 22. Εικόνα 22 Σύνοψη της διαδικασίας που ακολουθείται για την αναγνώριση τροποποιημένων κλώνων. 74

77 Υλικά-Μέθοδοι Στην προκειμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε η T7 Endonuclease I για την πέψη των υβριδίων και το ακριβές πρωτόκολλο περιγράφεται παρακάτω: PCR product από κλώνο PCR product από φυσιολογικά κύτταρα Buffer 2 (NEB) ddh 2 O 150 ng 150 ng 2 μl μέχρι τα 19,5 μl Σε ένα θερμοκυκλοποιήτη εισήχθη το παρακάτω πρόγραμμα: Βήμα Θερμοκρασία Ρυθμός μεταβολής Διάρκεια Αρχική αποδιάταξη 95 C 5 λεπτά Υβριδοποίηση C -2 C/sec C -0.1 C/sec Hold 4 C Hold Στο μείγμα αυτό γίνεται προσθήκη 0.5 μl (5 Units) T7 Endonuclease I και ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 45 λεπτά. Η αντίδραση στη συνέχεια ηλεκτροφορείται σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5 % για να διαχωριστούν οι ζώνες. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, στους θετικούς κλώνους αναμένουμε τρεις ζώνες, μεγέθους 603,~363 και ~240 bp. 75

78 Υλικά-Μέθοδοι 76

79 Αποτελέσματα

80 Αποτελέσματα 78

81 Αποτελέσματα 1. Διαφορικός υποκυττάριος εντοπισμός των RNase Z S και RNase Z L Από τα πειράματα υποκυττάριου εντοπισμού γίνεται φανερό ότι η μεγαλύτερη ποσότητα της ανασυνδυασμένης RNase Z S εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Επιπλέον όταν διαμολύνουμε τα κύτταρα με φορέα στον οποίο έχουμε κλωνοποιήσει ολόκληρη την κωδική περιοχή του γονιδίου ELAC2 (ELAC2.1), η οποία περιέχει την αλληλουχία στόχευσης προς τα μιτοχόνδρια η RNase Z L εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια μέσω της Ν-τελικής ακολουθίας των αμινοξέων της αλλά και στον πυρήνα. Τέλος, διαμολύνοντας με φορέα που περιέχει την κωδική περιοχή του ELAC2 από το δεύτερο κωδικόνιο έναρξης (ELAC2.2), η RNase Z L εντοπίζεται αποκλειστικά στον πυρήνα καθώς δεν κωδικοποιείται η αλληλουχία στόχευσης προς τα μιτοχόνδρια. Το πρότυπο αυτό συμβαδίζει απόλυτα με παρατηρήσεις που έχουν γίνει από παρόμοιες προηγούμενες μελέτες οι οποίες αναφέρουν ότι ο διπλός εντοπισμός της RNase Z L οφείλεται σε εναλλακτική έναρξη της μετάφρασης (23). Εικόνα 23 Εικόνες από συνεστιακό μικροσκόπιο που δείχνουν τον υποκυττάριο εντοπισμό του EGFP (Control), ELAC1-EGFP, ELAC2.1-EGFP και ELAC2.2-EGFP. Η χρώση του πυρήνα έγινε με τη χρωστική Hoechst και των μιτοχονδρίων με τη χρωστική Mitotracker Red. 79

82 Αποτελέσματα 2. Η RNase Z S έχει δράση ενδονουλεάσης Η έκφραση των πρωτεϊνών έγινε σε ετερόλογο σύστημα και συγκεκριμένα στο στέλεχος E. coli Rosetta. Από το κυτταρικό εκχύλισμα των οποίων απομονώθηκε με χρωματογραφία συγγένειας χρησιμοποιώντας στήλη ακινητοποιημένου νικελίου (Ni-NTA Agarose Macheray Nagel). Οι απομονωμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS PAGE) (Εικόνα 24) καθώς και μέσω ανάλυσης Bradford. Εικόνα 24 SDS-PAGE των κλασμάτων της απομόνωσης. (Α,Β) Αποτέλεσμα του καθαρισμού με χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Τα κλάσματα Ε6-Ε7 όντας τα πιο καθαρά και πιο πλούσια σε πρωτεΐνη συγχωνεύθηκαν και συμπυκνώθηκαν. Τα κλάσματα με τη μεγαλύτερη ποσότητα (Ε8,Ε9,Ε10) (Εικόνα 24) αλλά και τη μεγαλύτερη καθαρότητα ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης συγχωνεύθηκαν και τοποθετήθηκαν σε μεμβράνη διαπίδυσης ώστε να προχωρήσουμε σε συμπύκνωση της πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας PEG μέχρι ο όγκος να μειωθεί σε 1 ml. Στη συνέχεια καθαρίστηκαν περαιτέρω μέσω χρωματογραφίας μοριακής διήθησης με τη χρήση στήλης Sephacryl S200 (GE Healthcare Life Sciences). Τα κλάσματα που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα είναι τα 6-8 (Εικόνα 24, κάτω). Η ανασυνδυασμένη RNase Z S μετά από τη διαδικασία αυτή είχε συγκέντρωση 15 μg/μl. 80

83 Αποτελέσματα Μέρος της πρωτεΐνης διατηρήθηκε στους -20 Ο C για μελλοντική χρήση και η υπόλοιπη ποσότητα διατηρήθηκε στους 4 Ο C. Αφού απομονώθηκε το ανασυνδυασμένο ένζυμο πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το πρόδρομο μόριο trna Arg (Εικόνα 25-Γ)το οποίο ήταν ραδιοσημασμένο με γ-32p ATP στο 5 άκρο. Οι αντιδράσεις προετοιμάσθηκαν όπως περιγράφθηκε προηγουμένως (Μέθοδοι-5), επωάστηκαν στους 37 o C και ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% χρησιμοποιώντας ως αποδιατακτικό ουρία (Urea 8Μ), στα 15 ma για ~2,5 ώρες. Τα αποτελέσματα οπτικοποιήθηκαν με έκθεση σε ειδική πλάκα και εμφάνιση στο Phosphorimager Fujifilm FLA Στην Εικόνα 2-Α φαίνονται οι ζώνες που αντιστοιχούν στα ραδιενεργά προϊόντα της αντίδρασης (κάτω ζώνες) καθώς και οι ζώνες που αντιστοιχούν στα ραδιενεργά μόρια trna που δεν υδρολύθηκαν (άνω ζώνες). Επίσης υποδηλώνεται ξεκάθαρα ότι η RNaseZ S εκδηλώνει δράση ριβονουκλεάσης, αποικοδομώντας το 3 άκρο του trna Arg. Σε χρόνο t=60 φτάνει η υδρόλυση σε ποσοστό 67% (Εικόνα 25-Β). Εικόνα 25 Α. Το ηλεκτροφόρημα της χρονοκαμπύλης. Η RNase Z S αποικοδομεί ειδικά το υπόστρωμα trna Arg. Συγκεκριμένα, μετά από 1 ώρα επώασης στους 37 ο C το επίπεδο υδρόλυσης του ραδιενεργά σημασμένου trna Arg φτάνει σε επίπεδο 67% αλλά ήδη από τα πρώτα 30 λεπτά έχει φτάσει σχεδόν στο μέγιστο το επίπεδο υδρόλυσης (63%) όπως φαίνεται και από το διάγραμμα. Β. Ποσοστά αντίδρασης συναρτήσει του χρόνου. Γ. Υπόστρωμα pre-trna Arg 81

84 Αποτελέσματα Για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών ετοιμάστηκαν οι αντιδράσεις όπως περιγράφθηκε προηγουμένως (Μέθοδοι-6). Και σε αυτή την περίπτωση ακολούθησε ηλεκτροφόρηση του υποστρώματος σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% σε αποδιατακτικές συνθήκες στα 15 ma για ~2,5 ώρες. Τα αποτελέσματα οπτικοποιήθηκαν με έκθεση σε ειδική πλάκα και εμφάνιση στο Phosphorimager Fujifilm FLA 3000 και ποσοτικοποιήθηκαν με το λογισμικό AIDA Image Analyzer. Στην Εικόνα 26 εμφανίζονται τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης των αντιδράσεων τα οποία και ποσοτικοποιήθηκαν. Oι βέλτιστες συνθήκες αντίδρασης είναι 50mM NaCl, 25mM KCl, 0mΜ MgCl 2 και θερμοκρασία 42 ο C. Όσον αφορά τη θερμοκρασία, θα πρέπει να μελετηθεί η δράση του ενζύμου και σε υψηλότερες θερμοκρασίες καθώς παρατηρείται μία τάση για περαιτέρω αύξηση της δραστικότητας του ενζύμου. Εικόνα 26 Ηλεκτροφορήσεις των αντιδράσεων για εύρεση βέλτιστων συνθηκών. Από αριστερά προς δεξιά: NaCl (mm): Control, 10, 25, 50, 100. KCl(mM): 5, 10, 25, 50. MgCl2(mM): Control, 0,5, 1, 1.5, 2.5, 5. Θερμοκρασία ( ο C): 25, 25-control, 30, 30-control, 37, 37-control, 42, 42-control. Με τον ίδιο τρόπο απομονώθηκε και η RNase Z L με τη διαφορά ότι δεν πραγματοποιήθηκε χρωματογραφία μοριακής διήθησης. Στην Εικόνα 27 είναι το αποτέλεσμα της SDS-PAGE των κλασμάτων μετά τη χρωματογραφία συγγένειας. Επειδή τα κλάσματα περιέχουν μεγάλη ποσότητα μη επιθυμητών πρωτεϊνών 82

85 Αποτελέσματα για να εντοπιστεί η ζώνη που αντιστοιχεί στην ανασυνδυασμένη RNase Z L έγινε σύγκριση με ένα control δείγμα το οποίο προέρχεται από τα ίδια κύτταρα στα οποία δεν είχε γίνει επαγωγή με IPTG. Εικόνα 27 SDS-PAGE των SDS-PAGE των κλασμάτων της απομόνωσης. Αφού συγκρίνουμε με το control, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ELAC2 είναι η ζώνη που βρίσκεται ψηλά στα κλάσματα έκκλουσης. Αφού απομονώθηκε η πρωτεΐνη πραγματοποιήθηκε μία αντίδραση χρονοκαμπύλης χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα μη σημασμένο πρόδρομο μόριο trna Arg (Εικόνα 28). Επειδή δεν απομονώθηκε πρωτεΐνη μεγάλης καθαρότητας στο control επωάσαμε και με το κλάσμα Control της Εικόνας 27, το οποίο απομονώθηκε από τα ίδια κύτταρα χωρίς επαγωγή με IPTG. Οι αντιδράσεις προετοιμάσθηκαν όπως περιγράφθηκε προηγουμένως (Μέθοδοι-5), επωάστηκαν στους 37 o C και ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Έγινε χρώση με EtBr και ακολουθήθηκε λήψη φωτογραφίας στο UV Transluminator. Εικόνα 28 10% UREA-PAGE για τον έλεγχο της δραστικότητας της ανασυνδυασμένης RNase Z L. 83

86 R e la tiv e e x p re s s io n Αποτελέσματα 3. Οι συνθήκες στρες επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασης σημαντικών ριβονουκλεασών Πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων σε συνθήκες έλλειψης FBS, γλυκόζης, FBS και γλυκόζης ταυτόχρονα καθώς και παρουσία υπεροξειδίου. Η επώαση έγινε για 48 ώρες μιας και από προηγούμενα πειράματα εκεί βλέπαμε ότι σταθεροποιούνταν η έκφραση των γονιδίων που μελετήθηκαν. Παρατηρήθηκε μία ξεκάθαρη τάση για υψηλότερη έκφραση όσον αφορά τις ριβονουκλεάσες. Η πιο δραματικές αλλαγές παρατηρήθηκαν στα επίπεδα έκφρασης της αγγειογενίνης (ANG), η οποία αυξάνεται 5.5 φορές απουσία γλυκόζης από το θρεπτικό μέσο και πάνω από 10 φορές απουσία ορού ή ορού και γλυκόζης. Το αποτέλεσμα αυτό είναι λογικό καθώς η αγγειογενίνη κάτω από καταστάσεις στρες μετατοπίζεται στο κυταρόπλασμα για να δημιουργήσει trna halves τα οποία στη συνέχεια θα ρυθμίσουν τις αποκρίσεις στο στρες. Παράλληλα παρατηρείται αύξηση της έκφρασης των RNase Z. Η σημαντικότερη αύξηση για τo ELAC2 παρατηρήθηκε σε συνθήκες έλλειψης γλυκόζης με 4.3 φορές αύξηση, ενώ για τo γονίδιο ELAC1 η σημαντικότερη αύξηση (5.7 φορές) παρατηρήθηκε όταν από το θρεπτικό μέσο είχε αφαιρεθεί η γλυκόζη και ο ορός. Μελετήθηκαν και τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου SSB το οποίο κωδικοποιεί την ανθρώπινη La καθώς θα μπορούσε να αλληλοεπιδρά με κάποιες από τις RNase Z καθώς προσδένεται στις 3 ακόλουθες αλληλουχίες των pre-trnas (Εικόνα 29) E L A C 1 (R N a s e Z S ) E L A C 2 (R N a s e Z L ) S S B (L a ) A N G 5 0 -F B S -G lu c o s e -F B S -G lu c o s e H 2 O 2 Εικόνα 29 Μεταβολή της έκφρασης των γονιδίων ANG, ELAC1, ELAC2 και SSB στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 όταν αυτά καλλιεργηθούν υπό στρεσογόνες συνθήκες. Σημαντικότερος σκοπός αυτού του πειράματος ήταν να βρεθεί κάποια συσχέτιση ανάμεσα σε αυτές τις ριβονουκλεάσες. Αναδεικνύονται δύο ζεύγη, τα γονίδια ANG-ELAC1 και ELAC2-SSB κυρίως λόγω του κοινού εντοπισμού τους στις συνθήκες αυτές αλλά και διότι εμφανίζουν τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στις ίδιες συνθήκες. 84

87 R e la tiv e E x p re s s io n R e la tiv e e x p re s s io n Αποτελέσματα 4. Υπερέκφραση της ANG δεν επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης των ELAC1 και ELAC2 Για να μελετηθεί αν η αγγειογενίνη επηρεάζει την έκφραση των ELAC1, ELAC2 και SSB κλωνοποιήθηκε η κωδική περιοχή από cdna κυττάρων HEK293T στον φορέα pcdna3.1 ώστε να το εισάγουμε σε κύτταρα Α549 και να γίνει υπερέκφραση του mrna της ANG. Ως control χρησιμοποιήθηκαν δείγματα κυττάρων που διαμολύνθηκαν με το φορέα pcdna 3.1 που δε περιέχει κάποιο ένθεμα. Αν και μετρήθηκε σημαντική υπερέκφραση της αγγειογενίνης στα κύτταρα αυτά δεν παρατηρήθηκε κάποια σημαντική μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που αναφέραμε προηγουμένως (Εικόνα 30). O v e re x p re s s io n o f A N G n s 5 0 n s n s A N G E L A C 1 E L A C 2 S S B A N G Εικόνα 30 Τα επίπεδα έκφραση των ELAC1, ELAC2, SSB και ANG έπειτα από υπερέκφραση της τελευταίας. Η ενδογενής αγγειογενίνη κάτω από φυσιολογικές συνθήκες εντοπίζεται στον πυρήνα και συγκεκριμένα στους πυρηνίσκους. Εκεί συμμετέχει ενεργά στη μεταγραφή rrna μέσω διαφόρων μηχανισμών (67 69). Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες η ANG που τυχαίνει να βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα δεσμεύεται από την πρωτεΐνη RNH1 η οποία καταστέλλει την ενζυμική της δράση, ενώ σε καταστάσεις στρες η ANG εξάγεται στο κυτταρόπλασμα παράγοντας έτσι τα tirnas (trna-derived stress-induced RNAs) και η ANG που παραμένει στον πυρήνα, δεσμεύεται με την RNH1 και έτσι καταστέλλεται η μεταγραφή των ριβοσωμικών RNAs (70 72, 69). Οπότε θα μπορούσε να μην επηρεάζεται η έκφραση των γονιδίων που μελετήσαμε από την ANG κάτω από φυσιολογικές συνθήκες και να παρατηρούνται αλλαγές μόνο σε καταστάσεις στρες. 85

88 Αποτελέσματα 5. Η έκφραση του ELAC1 (RNase Z S ) επιφέρει αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων AGO και σημαντικών lncrnas Όντας λίγα πράγματα γνωστά για την RNase Z S, μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης σημαντικών γονιδίων που κωδικοποιούν ριβονουκλεάσες, ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, στοιχεία του mirna μονοπατιού καθώς και σημαντικών lncrnas με την προοπτική να εντοπιστούν διαφορές και να αποκτηθεί μία πρώτη εικόνα για το βιολογικό της ρόλο. Τα κύτταρα Α549 διαμολύνθηκαν με πλασμίδιο pcdna3.1-elac1 και ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα που διαμολύνθηκαν με τον φορέα pcdna 3.1 που δεν περιέχει κάποιο ένθεμα. Από τα κύτταρα αυτά απομονώθηκε ολικό RNA το οποίο μετατράπηκε σε cdna και χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της γονιδιακής έκφραση μέσω qpcr (Εικόνα 31). Εικόνα 31 Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης σημαντικών γονιδίων έπειτα από υπερέκφραση του ELAC1 γονιδίου. 86

89 Αποτελέσματα Όσον αφορά τις ριβονουκλεάσες, παρατηρήθηκε μία μικρή αλλά στατιστικά σημαντική μείωση κατά 20% στην έκφραση των ELAC2 και PDE12 (Εικόνα 31). H PDE12 αποτελεί μία αποαδενυλάση και εντοπίζεται στα μιτοχόνδρια (73). Λίγα είναι γνωστά για τον βιολογικό της ρόλο αλλά όπως ήδη αναφέρθηκε, είναι πολύ πιθανό να συμμετέχει στην επιδιόρθωση μιτοχονδριακών trnas και επιπλέον πρόσφατα ανακαλύφθηκε ότι προστατεύει και από την τυχαία πολυαδενυλίωση των ώριμων trnas (74). Μικρές αλλαγές εντοπίστηκαν και στην έκφραση γονιδίων που εκφράζουν πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο και την ανάπτυξη των κυττάρων (Εικόνα 31). Στατιστικά σημαντικές αλλαγές εντοπίστηκαν στην έκφραση των p21, το οποίο παρουσιάζει μείωση 18%, p27 με μείωση 29%, p53 με μείωση 22% και η Cyclin B1 με μείωση 15%. Οι p21, p27 και p53 αποτελούν αναστολείς του κυτταρικού κύκλου(75 77). To p21 μαζί με το p53 συμμετέχουν ενεργά στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου έπειτα από στρες ή βλάβες στο DNA και μάλιστα το p53 ενισχύει την έκφραση του p21. Το p27 αναστέλλει τον κυτταρικό κύκλο στην G1 φάση κυρίως ωστόσο έχει τη δυνατότητα να ρυθμίσει και άλλα σύμπλοκα CDKs/Cyclins τα οποία ρυθμίζουν άλλες φάσεις του κυτταρικού κύκλου (76). Η Cyclin B1, η οποία ρυθμίζει τη μετάβαση από τη G2 φάση στη μίτωση. Η μείωση που παρατηρείται στην προκειμένη περίπτωση είναι αρκετά μικρή για να επιφέρει αλλαγές στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, κυρίως γιατί δρα και παράλληλα με την Cyclin A2 η οποία συμμετέχει στη ρύθμιση της G2/M μετάβασης και παρουσιάζει φυσιολογικά επίπεδα. Σημαντική μείωση παρατηρήθηκε στην έκφραση των γονιδίων AGO1 και AGO2, 54% και 82% αντίστοιχα, ωστόσο τα υπόλοιπα γονίδια που κωδικοποιούν μέλη του mirna μονοπατιού παρουσιάζουν ελάχιστη μείωση (Εικόνα 31). Από τις AGO πρωτεΐνες, η AGO2 είναι αυτή που επιτελεί το μεγαλύτερο ποσοστό αποσιώπησης μέσω ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης με την AGO3 να συμμετέχει στην αποικοδόμηση ενός ειδικού υποσυνόλου στόχων, κάτι που δείχθηκε από μία πολύ πρόσφατη μελέτη (78 80). Παρόλα αυτά οι AGO 1, 3 και 4 συμμετέχουν κυρίως στην καταστολή της μετάφρασης των στόχων τους. Το γεγονός όμως ότι μειώνεται η έκφραση του AGO2 δείχνει πιθανότατα έναν αναπρογραμματισμό που γίνεται στο κύτταρο με mrnas που κανονικά θα καταστρέφονταν από το RISC να «επιβιώνουν». Έτσι αλλάζει και ο πληθυσμός των mrnas και γενικότερα κυριαρχεί η λειτουργεία της αναστολής της μετάφρασης μέσω του RISC. Επιπροσθέτως επιλέχθηκαν πέντε σημαντικά long non-coding RNAs ώστε να δούμε πως επηρεάζονται από την υπερέκφραση του ELAC1. Μελετήθηκαν τα lncrnas MALAT-1, GAS5, HULC, HOTAIR και DANCR. Το MALAT-1 είναι ένα lncrna το οποίο ωριμάζει μέσω της RNase Z L και της RNase P στον πυρήνα (44). Το συγκεκριμένο RNA ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη μετάσταση και επίσης ρυθμίζει την κυτταρική κινητικότητα μέσω μεταγραφικής ή μετα-μεταγραφικής ρύθμισης σχετιζόμενων γονιδίων (81, 82). To GAS5 δρα αναστέλλοντας την κυτταρική ανάπτυξη καθώς μπορεί να δράσει ως ένα ψευδές ορμονικό στοιχείο απόκρισης (HRE) για τον υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών και έτσι εμποδίζει την έκφραση γονιδίων που ενεργοποιούνται από αυτόν τον υποδοχέα και πλέον έχει χαρακτηριστεί ως ογκοκατασταλτικό μόριο (83). Το HULC (Highly Up-regulated in Liver Cancer) ανακαλύφθηκε στον καρκίνο του ήπατος όπου και 87

90 Αποτελέσματα υπερεκφράζεται καθώς και σε καρκινικά κύτταρα που κάνουν μετάσταση στο ήπαρ(84, 85). Το συγκεκριμένο lncrna λειτουργεί σα «σφουγγάρι» και παγιδεύει συγκεκριμένα mirnas τα οποία έχουν ογκοκατασταλτική δράση. Υπερέκφραση αυτού ευνοεί τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση άρα και τη μετάσταση (86). Το HOTAIR είναι ένας επιγενετικός ρυθμιστής και αποτελεί σημαντικό παράγοντα διαφοροποίησης τους δέρματος (87). Το συγκεκριμένο lncrna εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε μεταστατικό καρκίνο του μαστού και είναι σημαντικός δείκτης επικείμενης μετάστασης και θανάτου (87, 88). Πλέον έχει εντοπιστεί σε πολλούς τύπους καρκίνου όπως ο καρκίνος του πνεύμονα (89). Το DANCR αποτελεί έναν ανταγωνιστή της διαφοροποίησης. Υπερέκφραση αυτού σε καρκίνους ανεβάζει το stemness των κυττάρων (90, 91). Έπειτα από υπερέκφραση των κυττάρων παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση στην έκφραση των MALAT-1, GAS5 και DANCR (Εικόνα 31). 88

91 Αποτελέσματα 6. Η έκφραση του ELAC2 (RNase Z L ) επιφέρει σημαντικές αλλαγές στην έκφραση γονιδίων AGO, ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου και lncrnas Κύτταρα Α549 διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο pcdna3.1-elac2 και ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα που διαμολύνθηκαν με το φορέα pcdna 3.1 που δεν περιέχει κάποιο ένθεμα όπως στην περίπτωση και η γονιδιακή έκφραση μελετήθηκε μέσω qpcr. Όταν υπερεκφράζουμε το γονίδιο ELAC2 παρατηρείται αύξηση της έκφρασης της ANG και μείωση της έκφρασης του ELAC1 οι οποίες όμως δεν είναι αξιοσημείωτες. Ωστόσο παρουσιάζεται μία μείωση 30% στην έκφραση του PDE12. Αυτό θα μπορούσε να είναι και αποτέλεσμα ενός μηχανισμού ανάδρομης τροφοδότησης καθώς ενδεχομένως η RNase Z L να αντικαθιστά την PDE12 σε κάποια διαδικασία, π.χ. στην επιδιόρθωση trna που αναφέραμε στη προηγούμενη ενότητα. Εικόνα 32 Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης σημαντικών γονιδίων έπειτα από υπερέκφραση του ELAC2. 89

92 Αποτελέσματα Στην Εικόνα 32 βλέπουμε πως όταν υπερεκφράζουμε το ELAC2 παρατηρούμε ένα παρόμοιο πρότυπο έκφρασης σε σχέση με την υπερέκφραση του ELAC1 όσον αφορά πρωτεΐνες καταστολείς του κυτταρικού κύκλου, p21, p27 και p53. Εδώ όμως παρατηρείται πιο δραματική μείωση του p27 της τάξης του 48,9%. Οπότε ίσως το κύτταρο να διευκολύνεται να προχωρήσει στην κάθε φάση. Ωστόσο αυτό μπορεί να αντισταθμίζεται από την μειωμένη έκφραση των κυκλινών Β1, Ε1 και D1. Επιπροσθέτως, παρατηρείται σημαντική μείωση της Cyclin A2. Μείωση της Cyclin A2 έχει βρεθεί ότι διευκολύνει τα καρκινικά κύτταρα να πραγματοποιήσουν EMT (epithelial to mesenchymal transition). Κύτταρα που δεν εκφράζουν καθόλου Cyclin Α2 φαίνεται να έχουν stem-like ιδιότητες(92, 93). Και εδώ παρατηρούμε μείωση της έκφρασης των AGO1 και 2, αλλά τώρα παρατηρούμε μία σημαντική αύξηση στην έκφραση της AGO3. Δηλαδή στη συγκεκριμένη περίπτωση η αλλαγές στον πληθυσμό των RNAs μπορεί να είναι μεγαλύτερες. Αναφέρθηκε ήδη ότι η RNase Z L συμμετέχει στην ωρίμανση του lncrna MALAT-1 και έπειτα από υπερέκφραση του ELAC2 φαίνεται να έχει παραπάνω έκφραση. Γενικότερα, με εξαίρεση το DANCR του οποίου η έκφραση μειώνεται όλες οι υπόλοιπες αλλαγές ευνοούν τον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. 90

93 Αποτελέσματα 7. Η υπερέκφραση των ELAC1 και ELAC2 δεν επηρεάζει σημαντικά τον κυτταρικό κύκλο Κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με τα πλασμίδια pcdna3.1, pcdna3.1-elac1 και pcdna3.1-elac2 προετοιμάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω και αναλύθηκαν σε κυτταρομετρητή ρόης με σκοπό να βρεθούν τυχόν αλλαγές στον κυτταρικό κύκλο. Εικόνα 33 Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου έπειτα από υπερέκφραση. Α. Control, B. ELAC1 overexpression, Γ. ELAC2 overexpression, Δ. Συγκριτικό γράφημα Παρατηρούμε ότι δεν υπάρχουν μεγάλες αλλαγές στα ποσοστά των κυττάρων που εντοπίζονται σε κάθε φάση (Εικόνα 33). Πιθανότατα λοιπόν να μην επηρεάζουν αυτές οι δύο πρωτεΐνες τον κυτταρικό κύκλο όταν εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα. Είναι όμως πιθανό να επηρεάζεται ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων κάτι το οποίο αξίζει να διερευνηθεί. 91

94 Αποτελέσματα 8. Πλήρης απαλοιφή του γονιδίου ELAC1 δεν επηρεάζει τη κυτταρική βιωσιμότητα Για την επιλογή των οδηγών αλληλουχιών που στοχεύουν το ELAC1 χρησιμοποιήθηκε το εργαλείο που βρίσκεται στον ιστότοπο και επιλέχθηκαν οι δύο καλύτερες αλληλουχίες οδηγοί. Η αλληλουχία στόχος που χρησιμοποιήθηκε είναι το μέρος του δεύτερου εξωνίου που ξεκινά από το κωδικόνιο έναρξης (Μέθοδοι-11.1). Χρησιμοποιήθηκαν οι δύο καλύτερες αλληλουχίες οδηγοί οι οποίες κλωνοποιήθηκαν στο φορέα pspcas9(bb)-2a-puro (PX459) V2.0. Ο συγκεκριμένος πλασμιδιακός φορέας εκφράζει την Cas9 καθώς και το sgrna. Κύτταρα ΗΕΚ-293T διαμολύνθηκαν με έναν από τους δύο πλασμιδιακούς φορείς και αφού απομονώθηκαν κλώνοι κυττάρων και επεκτάθηκαν, ελέγχθηκε η παρουσία ελλειμμάτων ή προσθηκών με τη χρήση της Τ7 ενδονουκλεάσης Ι όπως περιγράφθηκε προηγουμένως (Μέθοδοι-11.3). Εικόνα 34 Έλεγχος για τροποποιημένους κλώνους. Παρατηρείται το προβλεπόμενο πρότυπο ζώνωσης. Η διαφορική ένταση των προϊόντων οφείλεται στο ότι η Τ7 ενδονουκλεάση I, αναγνωρίζει πιο εύκολα μεγάλα ελλείματα η προσθήκες. Κάτω αναπαρίσταται γραφικά η ενισχυμένη περιοχή. Στη Εικόνα 35 φαίνονται τα αποτελέσματα της ανάλυσης, όπου εντοπίστηκαν έξι τροποποιημένοι κλώνοι και τα ενισχυμένα τμήματα από τους κλώνους 2,3,4,5,7 και 9 αλληλουχήθηκαν ώστε να ταυτοποιηθεί η ακριβής μετάλλαξη που έχει γίνει στη θέση στόχο. Προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι τα HEK-293T διαθέτουν ένα χρωμόσωμα 18, στο οποίο βρίσκεται και το γονίδιο της ELAC1 (94). Αυτό σημαίνει ότι θα πρέπει να ανιχνεύσουμε μόνο ένα αλληλόμορφο. Πράγματι σε 3 από τους 6 κλώνους που αλληλουχήθηκαν εντοπίστηκε μόνο ένα αλληλόμορφο. Στους υπόλοιπους, στην περιοχή όπου έχει γίνει η τροποποίηση εμφανίζονται πάνω από μία κορυφές σε κάθε θέση. Αυτό συμβαίνει διότι ο κλώνος που έχουμε δεν είναι ομοιογενής και 92

95 Αποτελέσματα αποτελείται από περισσότερους υποπληθυσμούς. Ταυτοποιήθηκαν λοιπόν οι μεταλλάξεις σε τρεις κλώνους σε έναν από αυτούς, τον κλώνο 4, δημιουργείται ένα έλλειμα 10 bp το οποίο οδηγεί στην εμφάνιση ενός πρώιμου κωδικονίου τερματισμού. Στους κλώνους 5 και 7 με το έλλειμα που δημιουργήθηκε, 23 και 2 bp αντίστοιχα, δε σχηματίζεται πρώιμο κωδικόνιο τερματισμού και στο συγκεκριμένο πλαίσιο ανάγνωσης δεν υπάρχει κάποιο κωδικόνιο τερματισμού μέχρι το τέλος του mrna. Στην περίπτωση του κλώνου 4 το mrna θα αποικοδομείται μέσω Nonsense-mediated decay ενώ στη δεύτερη περίπτωση πιθανότατα μέσω no-stop decay (95, 96). Ωστόσο η πιο ασφαλής επιλογή είναι η χρήση του κλώνου 4 για μελλοντικά πειράματα. Στην Εικόνα 35 αναπαρίστανται γραφικά οι αλλαγές στην κωδική περιοχή του γονιδίου ELAC1. Εικόνα 35 Γραφική αναπαράσταση των αλλαγών στην κωδική περιοχή του γονιδίου ELAC1. Προκειμένου να πιστοποιηθεί ότι δεν εκφράζεται η πρωτεΐνη, απομονώθηκαν ολικές πρωτεΐνες από κάθε κλώνο και πραγματοποιήθηκε ανάλυση Western (Εικόνα 36). Εικόνα 36 Δεν ανιχνεύθηκε έκφραση της RNase Z S στα τροποποιήμενα κύτταρα. Δεν ανιχνεύθηκε πρωτεΐνη της ELAC1 σε κανένα από τα κυτταρικά εκχυλίσματα και άρα η απαλοιφή του γονιδίου ήταν επιτυχής και τα κύτταρα παραμένουν βιώσιμα ακόμα και απουσία της RNase Z S. 93

96 Αποτελέσματα 9. Τα τροποποιημένα κύτταρα παρουσιάζουν παρόμοια μορφολογία με τα φυσιολογικά Ενώ καλλιεργούνταν τα κύτταρα κάναμε λήψη φωτογραφιών για να συγκρίνουμε τη μορφολογία τους. Η μορφολογία των κλώνων 4 και 5 φαίνεται παρόμοια με αυτή των φυσιολογικών κυττάρων ωστόσο ο κλώνος 7 εμφανίζει πολύ μεγάλες διαφορές με τα κύτταρα να έχουν χάσει τελείως τη συνήθη μορφολογία των HEK και έχουν γίνει πιο συμπαγή. Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στη μετάλλαξη έπειτα από δράση της Cas9 σε κάποιο μη ειδικό στόχο. Παρακάτω είναι η συγκριτική φωτογραφία των κυττάρων (Εικόνα 37). Εικόνα 37 Σύγκριση της μορφολογίας των τροποποιημένων κλώνων. 94

97 P e r c e n ta g e % Αποτελέσματα 10. Δεν επηρεάζεται ο κυτταρικός κύκλος από την απαλοιφή της RNase Z S Για να μελετηθεί αν η απουσία της RNase Z S επηρεάζει τον κυτταρικό κύκλο πραγματοποιήθηκε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου μέσω FACS όπως αναφέρθηκε και παραπάνω (Μέθοδοι-9). Από τα συγκεκριμένα αποτελέσματα δεν φάνηκε κάποια σημαντική αλλαγή στα ποσοστά των κυττάρων που βρίσκονται στη κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Ο κλώνος 7 φαίνεται να έχει μία μικρή αναστολή στη φάση G1 και αν λάβουμε υπόψιν και τη μορφολογία τους κατά πάσα πιθανότατα έχουν υποστεί κάποια μη αναμενόμενη μετάλλαξη. Αν η απουσία της RNase Z S προκαλούσε αναστολή στη G1 θα παρατηρούσαμε κάτι αντίστοιχο και στους άλλους δύο κλώνους. Στην Εικόνα 38 συνοψίζονται τα αποτελέσματα. 5 0 C o n tro l Κ λ ώ ν ο ς Κ λ ώ ν ο ς 5 Κ λ ώ ν ο ς G 0 /G 1 S G 2 /M Εικόνα 38 Αποτελέσματα από την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου των ELAC1 knock-out κυττάρων. Στο γράφημα συνοψίζονται τα αποτελέσματα για κάθε κλώνο. 95

98 Αποτελέσματα Δεν φαίνεται να επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό κυτταρικός κύκλος όταν απαλειφθεί η RNase Z S κάτι που παρατηρήθηκε και όταν υπερεκφράστηκε σε κύτταρα Α549. Αυτά τα δύο δεδομένα μαζί δείχνουν ότι πιθανότατα δεν εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Φυσικά όπως δείχθηκε προηγουμένως το γονίδιο ELAC1 αυξάνεται σε συνθήκες στρες, οπότε είναι πιθανό κάτω από φυσιολογικές συνθήκες να κυριαρχούν άλλοι μηχανισμοί και να μην ανιχνεύονται διαφορές. Επιπλέον όπως ήδη αναφέρθηκε θα μπορούσε να επηρεάζεται ο πολλαπλασιασμός κάτι που δεν μπορούμε να το συμπεράνουμε από το συγκεκριμένο πείραμα. 96

99 Συζήτηση

100 Συζήτηση 98

101 Συζήτηση Συζήτηση Η RNase Z είναι μία ριβονουκλεάση η οποία εμφανίστηκε νωρίς στην εξέλιξη και εκφράζεται σε όλους τους οργανισμούς των οποίων το γονιδίωμα είναι γνωστό. Υπάρχουν δύο μορφές RNase Z μία μικρή, η RNase Z S, και μία μεγάλη, η RNase Z L. Η μεγάλη μορφή εμφανίστηκε στην αρχή της εξέλιξης των ευκαρυωτών καθώς εντοπίζεται σε όλα τα φύλα και αντικατέστησε με τη δράση της τη μικρή μορφή. Η μεγάλη μορφή ανέλαβε τον πρωταρχικό ρόλο για την ωρίμανση των πυρηνικών όσο και των μιτοχονδριακών trnas ενώ η RNase Z S απέκτησε ένα νέο ρόλο ο οποίος ακόμα δεν είναι σαφής. Η μόνη ευκαρυωτική RNase Z S που έχει μελετηθεί μέχρι σήμερα είναι αυτή του ρυζιού, Oryza sativa, στο οποίο ανακαλύφθηκε ότι η RNase Z S1 αποικοδομεί μία συγκεκριμένη ομάδα mrnas σε υψηλές θερμοκρασίες και απουσία της προκαλεί στειρότητα στις θερμοκρασίες αυτές (24). Παρόλα αυτά όπως φαίνεται και από το φυλογενετικό δέντρο (Εικόνα 39), η RNase Z S των φυτών είναι πιο συγγενική με τις RNase Z L και τις προκαρυωτικές RNase Z S. Οι RNase Z S των ζώων, η οποία εκφράζεται από το γονίδιο ELAC1, σχηματίζουν μία ξεχωριστή εξωομάδα γεγονός που δείχνει ότι πιθανότατα ότι ο ρόλος της διαφέρει ως ένα βαθμό από αυτόν στα φυτά. Επιπλέον η RNase Z S των φυτών παρουσιάζει ελάχιστα διαφορετική ενζυμική δραστικότητα καθώς δεν αναστέλλεται από το CCA άκρο (41). Μία πρόσφατη μελέτη σε ανθρώπινα κύτταρα έδειξε ότι το pre-trna Ile το οποίο διαθέτει μερικώς επεξεργασμένη 5 οδηγό αλληλουχία αλλά μία μεγάλου μήκους 3 ακόλουθο αλληλουχία μπορεί να εξαχθεί στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 40). Εκεί η RNase Z S πιστεύεται ότι ωριμάζει ατελώς την 3 οδηγό αλληλουχία και επανέρχεται στον πυρήνα για να ολοκληρωθεί η ωρίμανση από την πυρηνική RNase Z L (Εικόνα 40). Σύμφωνα με in vitro δεδομένα, η RNase Z L δεν μπορεί να αφαιρέσει την 3 αλληλουχία όταν έχει μεγάλο μήκος έτσι αφού αφαιρέσει το με μεγαλύτερο τμήμα η RNase Z S μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα από την RNase Z L (97). Επιπλέον αν και ξέρουμε αρκετά για το ρόλο της RNase Z L των ευκαρυωτών στην ωρίμανση πυρηνικών και μιτοχονδριακών trnas δεν έχουν μελετηθεί εκτενώς οι μη καταλυτικές ιδιότητες της πρωτεΐνης αυτής οι οποίες φαίνεται να είναι ενδιαφέρουσες (26). Προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριο μας πάνω στο καρκίνο του πνεύμονα, έδειξαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου ELAC2. Δεδομένου ότι είναι μία άκρως σημαντική πρωτεΐνη για τη ζωή, κυρίως λόγω της δράσης της στα μιτοχόνδρια, αποφασίσαμε να μελετήσουμε τη δράση των ανθρώπινων RNase Z μορφών πέρα από την βιογένεση trnas καθώς και να μελετήσουμε το ρόλο της ελάχιστα μελετημένης ELAC1. Μία από τις πρώτες παρατηρήσεις ήταν η αύξηση της έκφρασης των δύο μορφών κάτω από συνθήκες στρες. Κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες η γονιδιακή έκφραση αναπρογραμματίζεται με σκοπό την επιβίωση του κυττάρου. Σημαντικά μόρια σε αυτή τη διαδικασία είναι τα trna-halves τα οποία παράγονται από την αγγειογενίνη έπειτα από θρεπτικό, βιολογικό ή φυσικοχημικό στρες. Τα μόρια αυτά μπορούν να καταστείλουν τη μετάφραση κάτω 99

102 Συζήτηση Εικόνα 39 Δέντρο το οποίο κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας αμινοξικές αλληλουχιές ενζύμων RNase Z από αντιπροσωπευτικούς οργανισμούς. 100

103 Συζήτηση Εικόνα 40 Μοντέλο της ωρίμανσης trnaile σε ανθρώπινα κύτταρα. Τα πρόδρομα μόρια trnas που περιέχουν ιντρόνιο με μεγάλα 5 ' και 3' άκρα μεταγράφονται στον πυρήνα και υποβάλλονται σε ατελή επεξεργασία του 5' άκρου. Στη συνέχεια εξάγονται στο κυτταρόπλασμα για ατελή επεξεργασία του 3' άκρου μέσω της RNase Z S (συνεχές βέλος). Η ανάδρομη διαδρομή του πρόδρομου μορίου trna που περιέχει ιντρόνιο με μικρότερα πλέον 5 ' και 3' άκρα συμβαίνει από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα (διακεκομμένο βέλος). από στρεσογόνες συνθήκες αν και φαίνεται τώρα τελευταία ότι κατά πάσα πιθανότητα προκαλούν αναπρογραμματισμό της μετάφρασης και όχι πλήρη αναστολή (57). Η αγγειογενίνη για να προκαλέσει θραύση των trnas πρέπει να εισέλθει στο κυτταρόπλασμα κάτι που γίνεται μόνο κάτω από συνθήκες στρες και επιπλέον παρατηρήσαμε σημαντική συνέκφραση των ANG και ELAC1. Μιας και βρίσκονται και οι δύο στο κυτταρόπλασμα θεωρήσαμε πιθανό να συσχετίζονται με κάποιο τρόπο. Έχει δειχθεί ότι η RNase Z L μπορεί να υδρολύσει RNA στόχους χρησιμοποιώντας ως οδηγό ένα 5 trna-half (Εικόνα 41) (98). Ωστόσο, τα trnahalves εντοπίζονται κυρίως στο κυτταρόπλασμα όπου θα μπορούσε η RNase Z S να τα χρησιμοποιήσει και να στοχεύσει συγκεκριμένους στόχους RNA. Υπερεκφράζοντας το γονίδιο ELAC1 βρέθηκε ότι μειορυθμίζονται σε μεγάλο βαθμό τα γονίδια AGO1 και AGO2. Αφαιρώντας από το ρεπερτόριο των AGO πρωτεϊνών τις AGO1 και AGO2 και ειδικότερα την AGO2 που δρα μέσω ενδονουκλεοτιδικής διάσπασης επηρεάζοντας μία πλειάδα μεταγράφων, ασκείται μία πλειοτροπική επίδραση. Οι AGO3 και AGO4 που παρουσίασαν σταθερή έκφραση στην ίδια περίπτωση μπορούν να επιφέρουν αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση καθώς πιθανότατα μεγαλύτερο ποσοστό των RISC θα φέρει αυτές τις AGO πρωτεΐνες και έτσι ευνοείται η καταστολή της μετάφρασης των mrna στόχων τους. Από το ίδιο πείραμα φάνηκε ότι μειορυθμίζονται τα lncrnas MALAT-1, GAS5 και DANCR. Η μειορύθμιση των MALAT-1 και DANCR δρα προστατευτικά στην περίπτωση ενός καρκινικού κυττάρου ωστόσο παρατηρήθηκε 101

104 Συζήτηση μείωση και του GAS5 κάτι που σημαίνει ότι αν και μειώνεται η πιθανότητα για ένα κύτταρο να γίνει επιθετικό και να ξεκινήσει μία μετάσταση καθώς και να επανέλθει σε μία βλαστική κατάσταση συνεχίζει να διαιρείται. Στην περίπτωση του καρκίνου θα μπορούσε να ευνοεί τη διατήρηση συμπαγών όγκων in situ. Από την άλλη, υπερεκφράζοντας το γονίδιο ELAC2 αλλάζει σημαντικά το πρότυπο έκφρασης γονιδίων που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο. Παρατηρήθηκε χαμηλότερη γονιδιακή έκφραση της Cyclin A2 μειορύθμιση της οποίας διευκολύνει τα καρκινικά κύτταρα να πραγματοποιήσουν EMT (epithelial to mesenchymal transition) (93). Το παραπάνω μαζί με το γεγονός ότι αυξάνεται η έκφραση των MALAT1, HULC, HOTAIR, μειώνεται η έκφραση του GAS5 και μειώνεται η έκφραση καταστολέων του κυτταρικού κύκλου γέρνει τη ζυγαριά προς τον πιο έντονο πολλαπλασιασμό και αυξημένη τάση για μετάσταση. Επιπλέον, και σε αυτή την περίπτωση αλλάζει το πρότυπο έκφρασης των AGO γονιδίων με τη διαφορά εδώ ότι έχουμε ταυτόχρονη μείωση της έκφρασης των AGO1 και AGO2 και ταυτόχρονη αύξηση του AGO3. Οπότε η αυξημένη έκφραση του ELAC2 στο καρκίνο του πνεύμονα θα μπορούσε να δρα αρνητικά για την πρόγνωση μέσω αυτών των μηχανισμών. Εικόνα 41 Εν δυνάμει υποστρώματα της RNase Z L. Η RNase Z S θα μπορούσε να δράσει μέσω ενός 5 trna half στο κυτταρόπλασμα. 102

105 Συζήτηση Για να εξακριβώσουμε το βιολογικό ρόλο της ανθρώπινης RNase Z S προχωρήσαμε στην απαλοιφή του γονιδίου αυτού με τη χρήση της τεχνολογίας CRISPR-Cas9. Η απουσία της πρωτεΐνης δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα του κυττάρου γεγονός που δίνει νέα στοιχεία για τον πλεονασμό των ριβονουκλεασών στα θηλαστικά. Φαινοτυπικά δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές. Η μορφολογία δεν φάνηκε να επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό ωστόσο ένας κλώνος εμφάνιζε σημαντικές διαφορές, κάτι που πιθανότητα να οφείλεται στη δημιουργία μη επιθυμητών μεταλλάξεων λόγω της μη ειδικής δράσης της Cas9. Επιπλέον, η κατανομή των κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου δεν φαίνεται να αλλάζει απουσία της RNase Z S. Εικόνα 42 Μοντέλο για τον βιολογικό ρόλο της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης Ζ. Έχοντας δημιουργήσει μία κυτταρική σειρά η οποία δεν εκφράζει την RNase Z S του ανθρώπου μπορούμε να κάνουμε περαιτέρω συγκρίσεις με φυσιολογικά κύτταρα και θα μας επιτραπεί να κατανοήσουμε σε μεγαλύτερο βαθμό το βιολογικό ρόλο του ενζύμου αυτού (Εικόνα 42). Εφόσον πρόκειται για μία ριβονουκλεάση, το πρώτο βήμα θα μπορούσε να είναι η σύγκριση των επιπέδων έκφρασης μικρών αλλά και μεγάλων μορίων RNA με τη χρήση NGS. 103

106 Συζήτηση 104

107 Βιβλιογραφία

108 Βιβλιογραφία 106

109 Βιβλιογραφία 1. Hopper,A.K. and Phizicky,E.M. (2003) trna transfers to the limelight. Genes Dev., 17, Giegé,R. (2008) Toward a more complete view of trna biology. Nat. Struct. Mol. Biol., 15, Storz,G. and Storz,G. (2014) An Expanding Universe of Noncoding RNAs Malek,E., Jagannathan,S. and Driscoll,J.J. (2014) Correlation of long non-coding RNA expression with metastasis, drug resistance and clinical outcome in cancer. Oncotarget, 5, Mattick,J.S. and Makunin,I. V. (2006) Non-coding RNA. Hum. Mol. Genet., 15 Spec No, Gebetsberger,J. and Polacek,N. (2013) Slicing trnas to boost functional ncrna diversity. RNA Biol., 10, Frank,D.N. and Pace,N.R. (1998) RIBONUCLEASE P: Unity and Diversity in a trna Processing Ribozyme. Annu. Rev. Biochem., 67, Randau,L., Schröder,I. and Söll,D. (2008) Life without RNase P. Nature, 453, Randau,L. (2012) RNA processing in the minimal organism Nanoarchaeum equitans. Genome Biol., 13, R Howard,M.J., Liu,X., Lim,W.H., Klemm,B.P., Fierke,C. a., Koutmos,M. and Engelke,D.R. (2013) RNase P enzymes. RNA Biol., 10, Nickel,A.I., Wäber,N.B., Gößringer,M., Lechner,M., Linne,U., Toth,U., Rossmanith,W. and Hartmann,R.K. (2017) Minimal and RNA-free RNase P in Aquifex aeolicus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 114, Lechner,M., Rossmanith,W., Hartmann,R.K., Thölken,C., Gutmann,B., Giegé,P. and Gobert,A. (2015) Distribution of ribonucleoprotein and protein-only RNase P in Eukarya. Mol. Biol. Evol., 32, Klemm,B., Wu,N., Chen,Y., Liu,X., Kaitany,K., Howard,M. and Fierke,C. (2016) The Diversity of Ribonuclease P: Protein and RNA Catalysts with Analogous Biological Functions. Biomolecules, 6, Yoshihisa,T. (2014) Handling trna introns, archaeal way and eukaryotic way. Front. Genet., 5, Yoshihisa,T., Ohshima,C., Yunoki-Esaki,K. and Endo,T. (2007) Cytoplasmic splicing of trna in Saccharomyces cerevisiae. Genes to Cells, 12, Trotta,C.R., Miao,F., Arn,E.A., Stevens,S.W., Ho,C.K., Rauhut,R. and Abelson,J.N. (1997) The yeast trna splicing endonuclease: A tetrameric enzyme with two active site subunits homologous to the archaeal trna endonucleases. Cell, 89, Popow,J., Englert,M., Weitzer,S., Schleiffer,A., Mierzwa,B., Mechtler,K., Trowitzsch,S., Will,C.L., Lührmann,R., Söll,D., et al. (2011) HSPC117 is the essential subunit of a human trna splicing ligase complex. Science, 331, Li,Z. and Deutscher,M.P. (1995) The trna processing enzyme RNase T is essential for maturation of 5S RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 92, Hartmann,R.K., Gößringer,M., Späth,B., Fischer,S. and Marchfelder,A. (2009) Chapter 8 The Making of trnas and More - RNase P and trnase Z. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 85,

110 Βιβλιογραφία 20. Daiyasu,H., Osaka,K., Ishino,Y. and Toh,H. (2001) Expansion of the zinc metallo-hydrolase family of the β- lactamase fold. FEBS Lett., 503, Schiffer,S., Rösch,S. and Marchfelder,A. (2002) Assigning a function to a conserved group of proteins: the trna 3 -processing enzymes. EMBO J., 21, Vogel,A., Schilling,O., Späth,B. and Marchfelder,A. (2005) The trnase Z family of proteins: Physiological functions, substrate specificity and structural properties. Biol. Chem., 386, Rossmanith,W. (2011) Localization of Human RNase Z Isoforms: Dual Nuclear/Mitochondrial Targeting of the ELAC2 Gene Product by Alternative Translation Initiation. PLoS One, 6, e Zhou,H., Zhou,M., Yang,Y., Li,J., Zhu,L., Jiang,D., Dong,J., Liu,Q., Gu,L., Zhou,L., et al. (2014) RNase ZS1 processes UbL40 mrnas and controls thermosensitive genic male sterility in rice. Nat. Commun., 5, Redko,Y., Li de lasierra-gallay,i. and Condon,C. (2007) When all s zed and done: the structure and function of RNase Z in prokaryotes. Nat. Rev. Microbiol., 5, Noda,D., Itoh,S., Watanabe,Y., Inamitsu,M., Dennler,S., Itoh,F., Koike,S., Danielpour,D., ten Dijke,P. and Kato,M. (2006) ELAC2, a putative prostate cancer susceptibility gene product, potentiates TGFbeta/Smad-induced growth arrest of prostate cells. Oncogene, 25, Zhao,W., Yu,H., Li,S. and Huang,Y. (2010) Identification and analysis of candidate fungal trna 3 -end processing endonucleases trnase Zs, homologs of the putative prostate cancer susceptibility protein ELAC2. BMC Evol. Biol., 10, Dubrovsky,E.B. (2004) Drosophila RNase Z processes mitochondrial and nuclear pre-trna 3 ends in vivo. Nucleic Acids Res., 32, Schilling,O., Späth,B., Kostelecky,B., Marchfelder,A., Meyer-Klaucke,W. and Vogel,A. (2005) Exosite modules guide substrate recognition in the ZiPD/ElaC protein family. J. Biol. Chem., 280, de la Sierra-Gallay,I.L., Pellegrini,O. and Condon,C. (2005) Structural basis for substrate binding, cleavage and allostery in the trna maturase RNase Z. Nature, 433, Li de la Sierra-Gallay,I., Mathy,N., Pellegrini,O. and Condon,C. (2006) Structure of the ubiquitous 3 processing enzyme RNase Z bound to transfer RNA. Nat. Struct. Mol. Biol., 13, Ishii,R., Minagawa,A., Takaku,H., Takagi,M., Nashimoto,M. and Yokoyama,S. (2005) Crystal structure of the trna 3??? processing endoribonuclease trnase Z from Thermotoga maritima. J. Biol. Chem., 280, Nashimoto,M., Tamura,M. and Kaspar,R.L. (1999) Minimum requirements for substrates of mammalian trna 3 processing endoribonuclease. Biochemistry, 38, Schiffer,S., Helm,M., Théobald-Dietrich,A., Giegé,R. and Marchfelder,A. (2001) The plant trna 3 processing enzyme has a broad substrate spectrum. Biochemistry, 40, Ma,M., De La Sierra-Gallay,I.L., Lazar,N., Pellegrini,O., Durand,D., Marchfelder,A., Condon,C. and Van 108

111 Βιβλιογραφία Tilbeurgh,H. (2017) The crystal structure of Trz1, the long form RNase Z from yeast. Nucleic Acids Res., 45, Späth,B., Schubert,S., Lieberoth,A., Settele,F., Schütz,S., Fischer,S. and Marchfelder,A. (2008) Two archaeal trnase Z enzymes: Similar but different. Arch. Microbiol., 190, Rammelt,C. and Rossmanith,W. (2016) Repairing trna termini: News from the 3 end. RNA Biol., 13, Perwez,T. and Kushner,S.R. (2006) RNase Z in Escherichia coli plays a significant role in mrna decay. Mol. Microbiol., 60, Hölzle,A., Fischer,S., Heyer,R., Schütz,S., Zacharias,M., Walther,P., Allers,T. and Marchfelder,A. (2008) Maturation of the 5S rrna 5 end is catalyzed in vitro by the endonuclease trnase Z in the archaeon H. volcanii. RNA, 14, Gan,X., Yang,J., Li,J., Yu,H., Dai,H., Liu,J. and Huang,Y. (2011) The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has two distinct trnase Z(L)s encoded by two different genes and differentially targeted to the nucleus and mitochondria. Biochem. J., 435, Fan,L., Wang,Z., Liu,J., Guo,W., Yan,J. and Huang,Y. (2011) A survey of green plant trna 3 -end processing enzyme trnase Zs, homologs of the candidate prostate cancer susceptibility protein ELAC2. BMC Evol. Biol., 11, Canino,G., Bocian,E., Barbezier,N., Echeverria,M., Forner,J., Binder,S. and Marchfelder,A. (2009) Arabidopsis Encodes Four trnase Z Enzymes. Plant Physiol., 150, Zhao,Z., Su,W., Yuan,S. and Huang,Y. (2009) Functional conservation of trnase ZL among Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe and humans. Biochem. J., 422, Wilusz,J.E., Freier,S.M. and Spector,D.L. (2008) 3 end processing of a long nuclear-retained noncoding RNA yields a trna-like cytoplasmic RNA. Cell, 135, Xie,X. and Dubrovsky,E.B. (2015) Knockout of drosophila RNase ZL impairs mitochondrial transcript processing, respiration and cell cycle progression. Nucleic Acids Res., 43, Brzezniak,L.K., Bijata,M., Szczesny,R.J. and Stepien,P.P. (2011) Involvement of human ELAC2 gene product in 3 end processing of mitochondrial trnas. RNA Biol., 8, Chen,Y., Beck,A., Davenport,C., Chen,Y., Shattuck,D. and Tavtigian,S. V (2005) Characterization of TRZ1, a yeast homolog of the human candidate prostate cancer susceptibility gene ELAC2 encoding trnase Z. BMC Mol. Biol., 6, Anderson,S., Bankier,A.T., Barrell,B.G., de Bruijn,M.H.L., Coulson,A.R., Drouin,J., Eperon,I.C., Nierlich,D.P., Roe,B.A., Sanger,F., et al. (1981) Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature, 290, Reichert,A., Rothbauer,U. and Mörl,M. (1999) Processing and editing of overlapping trnas in human 109

112 Βιβλιογραφία mitochondria. J. Biol. Chem., 273, Daoud,R., Forget,L. and Lang,B.F. (2012) Yeast mitochondrial RNase P, RNase Z and the RNA degradosome are part of a stable supercomplex. Nucleic Acids Res., 40, Takaku,H., Minagawa,A., Takagi,M. and Nashimoto,M. (2003) A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes trna 3 processing endoribonuclease. Nucleic Acids Res., 31, Xu,B., Tong,N., Li,J., Zhang,Z. and Wu,H. (2010) ELAC2 polymorphisms and prostate cancer risk: a metaanalysis based on 18 case-control studies. Prostate Cancer Prostatic Dis., 13, Minagawa,A., Takaku,H., Takagi,M. and Nashimoto,M. (2005) The missense mutations in the candidate prostate cancer gene ELAC2 do not alter enzymatic properties of its product. Cancer Lett., 222, Haack,T.B., Kopajtich,R., Freisinger,P., Wieland,T., Rorbach,J., Nicholls,T.J., Baruffini,E., Walther,A., Danhauser,K., Zimmermann,F.A., et al. (2013) ELAC2 mutations cause a mitochondrial RNA processing defect associated with hypertrophic cardiomyopathy. Am. J. Hum. Genet., 93, Shinwari,Z.M.A., Almesned,A., Alakhfash,A., Al-Rashdan,A.M., Faqeih,E., Al-Humaidi,Z., Alomrani,A., Alghamdi,M., Colak,D., Alwadai,A., et al. (2017) The Phenotype and Outcome of Infantile Cardiomyopathy Caused by a Homozygous ELAC2 Mutation. Cardiol., 137, Akawi,N.A., Ben-Salem,S., Hertecant,J., John,A., Pramathan,T., Kizhakkedath,P., Ali,B.R. and Al-Gazali,L. (2016) A homozygous splicing mutation in ELAC2 suggests phenotypic variability including intellectual disability with minimal cardiac involvement. Orphanet J. Rare Dis., 11, Jurga,S., Erdmann,V.A. and Barciszewski,J. (2016) Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine Jurga,S., Erdmann,V.A., Barciszewski,J. (eds) Springer International Publishing, Cham. 58. Kumar,P., Kuscu,C. and Dutta,A. (2016) Biogenesis and Function of Transfer RNA-Related Fragments (trfs). Trends Biochem. Sci., 41, Li,Z., Ender,C., Meister,G., Moore,P.S., Chang,Y. and John,B. (2012) Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rrnas, snornas, snrnas, and trnas. Nucleic Acids Res., 40, Lee,Y.S., Shibata,Y., Malhotra,A. and Dutta,A. (2009) A novel class of small RNAs: trna-derived RNA fragments (trfs). Genes Dev., 23, Wang,H., La Russa,M. and Qi,L.S. (2016) CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annu. Rev. Biochem., 85, Jinek,M., Chylinski,K., Fonfara,I., Hauer,M., Doudna,J.A. and Charpentier,E. (2012) A Programmable Dual- RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science (80-. )., 337, Cong,L., Ran,F.A., Cox,D., Lin,S., Barretto,R., Habib,N., Hsu,P.D., Wu,X., Jiang,W., Marraffini,L.A., et al. (2013) Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science (80-. )., 339, Ran,F.A., Hsu,P.D., Wright,J., Agarwala,V., Scott,D.A. and Zhang,F. (2013) Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc., 8,

113 Βιβλιογραφία 65. Du,Y., Meng,Q., Zhang,J., Sun,M., Shen,B., Jiang,H., Kang,N., Gao,J., Huang,X. and Liu,J. (2015) Functional annotation of cis-regulatory elements in human cells by dcas9/sgrna. Cell Res., 25, Livak,K.J. and Schmittgen,T.D. (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2 ΔΔCT Method. Methods, 25, Xu,Z. ping, Tsuji,T., Riordan,J.F. and Hu,G. fu (2002) The nuclear function of angiogenin in endothelial cells is related to rrna production. Biochem. Biophys. Res. Commun., 294, Tsuji,T., Sun,Y., Kishimoto,K., Olson,K.A., Liu,S., Hirukawa,S. and Hu,G.F. (2005) Angiogenin is translocated to the nucleus of HeLa cells and is involved in ribosomal RNA transcription and cell proliferation. Cancer Res., 65, Hoang,T.T. and Raines,R.T. (2017) Molecular basis for the autonomous promotion of cell proliferation by angiogenin. Nucleic Acids Res., 45, Pizzo,E., Sarcinelli,C., Sheng,J., Fusco,S., Formiggini,F., Netti,P., Yu,W., D Alessio,G. and Hu,G. -f. (2013) Ribonuclease/angiogenin inhibitor 1 regulates stress-induced subcellular localization of angiogenin to control growth and survival. J. Cell Sci., 126, Emara,M.M., Ivanov,P., Hickman,T., Dawra,N., Tisdale,S., Kedersha,N., Hu,G.F. and Anderson,P. (2010) Angiogenin-induced trna-derived stress-induced RNAs promote stress-induced stress granule assembly. J. Biol. Chem., 285, Ivanov,P., Emara,M.M., Villen,J., Gygi,S.P. and Anderson,P. (2011) Angiogenin-Induced trna Fragments Inhibit Translation Initiation. Mol. Cell, 43, Rorbach,J., Nicholls,T.J.J. and Minczuk,M. (2011) PDE12 removes mitochondrial RNA poly(a) tails and controls translation in human mitochondria. Nucleic Acids Res., 39, Pearce,S.F., Rorbach,J., Van Haute,L., D Souza,A.R., Rebelo-Guiomar,P., Powell,C.A., Brierley,I., Firth,A.E. and Minczuk,M. (2017) Maturation of selected human mitochondrial trnas requires deadenylation. Elife, Gartel,A.L. and Radhakrishnan,S.K. (2005) Lost in transcription: p21 repression, mechanisms, and consequences. Cancer Res., 65, Hnit,S.S.T., Xie,C., Yao,M., Holst,J., Bensoussan,A., De Souza,P., Li,Z. and Dong,Q. (2015) P27 Kip1 signaling: Transcriptional and post-translational regulation. Int. J. Biochem. Cell Biol., 68, Speidel,D. (2015) The role of DNA damage responses in p53 biology. Arch. Toxicol., 89, Meister,G. (2013) Argonaute proteins: functional insights and emerging roles. Nat. Rev. Genet., 14, Liu,J., Carmell,M.A., Rivas,F. V, Marsden,C.G., Thomson,J.M., Song,J.-J., Hammond,S.M., Joshua-Tor,L. and Hannon,G.J. (2004) Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science, 305, Park,M.S., Phan,H.-D., Busch,F., Hinckley,S.H., Brackbill,J.A., Wysocki,V.H. and Nakanishi,K. (2017) Human 111

114 Βιβλιογραφία Argonaute3 has slicer activity. Nucleic Acids Res., 45, Gutschner,T., Hämmerle,M., Eissmann,M., Hsu,J., Kim,Y., Hung,G., Revenko,A., Arun,G., Stentrup,M., Gross,M., et al. (2013) The noncoding RNA MALAT1 is a critical regulator of the metastasis phenotype of lung cancer cells. Cancer Res., 73, Tano,K., Mizuno,R., Okada,T., Rakwal,R., Shibato,J., Masuo,Y., Ijiri,K. and Akimitsu,N. (2010) MALAT-1 enhances cell motility of lung adenocarcinoma cells by influencing the expression of motility-related genes. FEBS Lett., 584, Ma,C., Shi,X., Zhu,Q., Li,Q., Liu,Y., Yao,Y. and Song,Y. (2016) The growth arrest-specific transcript 5 (GAS5): a pivotal tumor suppressor long noncoding RNA in human cancers. Tumour Biol., 37, Panzitt,K., Tschernatsch,M.M.O., Guelly,C., Moustafa,T., Stradner,M., Strohmaier,H.M., Buck,C.R., Denk,H., Schroeder,R., Trauner,M., et al. (2007) Characterization of HULC, a novel gene with striking upregulation in hepatocellular carcinoma, as noncoding RNA. Gastroenterology, 132, Matouk,I.J., Abbasi,I., Hochberg,A., Galun,E., Dweik,H. and Akkawi,M. (2009) Highly upregulated in liver cancer noncoding RNA is overexpressed in hepatic colorectal metastasis. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 21, Kong,D. and Wang,Y. (2017) Knockdown of lncrna HULC inhibits proliferation, migration, invasion, and promotes apoptosis by sponging mir-122 in osteosarcoma. J. Cell. Biochem., /jcb Tsai,M.-C., Manor,O., Wan,Y., Mosammaparast,N., Wang,J.K., Lan,F., Shi,Y., Segal,E. and Chang,H.Y. (2010) Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes. Science, 329, WEIDLE,U.H., BIRZELE,F., KOLLMORGEN,G. and RÜGER,R. (2017) Long Non-coding RNAs and their Role in Metastasis. Cancer Genomics Proteomics, 14, Loewen,G., Jayawickramarajah,J., Zhuo,Y. and Shan,B. (2014) Functions of lncrna HOTAIR in lung cancer. J. Hematol. Oncol., 7, Yuan,S., Wang,J., Yang,F., Tao,Q., Zhang,J., Wang,L., Yang,Y., Liu,H., Wang,Z., Xu,Q., et al. (2016) Long noncoding RNA DANCR increases stemness features of hepatocellular carcinoma by derepression of CTNNB1. Hepatology, 63, Jia,J., Li,F., Tang,X.-S., Xu,S., Gao,Y., Shi,Q., Guo,W., Wang,X., He,D. and Guo,P. (2016) Long noncoding RNA DANCR promotes invasion of prostate cancer through epigenetically silencing expression of TIMP2/3. Oncotarget, 7, Loukil,A. (2015) Cyclin A2: At the crossroads of cell cycle and cell invasion. World J. Biol. Chem., 6, Bendris,N., Cheung,C.T., Leong,H.S., Lewis,J.D., Chambers,A.F., Blanchard,J.M. and Lemmers,B. (2014) Cyclin A2, a novel regulator of EMT. Cell. Mol. Life Sci., 71, Stepanenko,A.A. and Dmitrenko,V. V. (2015) HEK293 in cell biology and cancer research: Phenotype, karyotype, tumorigenicity, and stress-induced genome-phenotype evolution. Gene, 569,

115 Βιβλιογραφία 95. Garneau,N.L., Wilusz,J. and Wilusz,C.J. (2007) The highways and byways of mrna decay. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 8, Lykke-Andersen,S. and Jensen,T.H. (2015) Nonsense-mediated mrna decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., /nrm Wei,M., Zhao,X., Liu,M., Niu,M., Seif,E. and Kleiman,L. (2016) Export of Precursor trnaile from the Nucleus to the Cytoplasm in Human Cells. PLoS One, 11, e Elbarbary,R.A., Takaku,H., Uchiumi,N., Tamiya,H., Abe,M., Takahashi,M., Nishida,H. and Nashimoto,M. (2009) Modulation of Gene Expression by Human Cytosolic trnase ZL through 5 -Half-tRNA. PLoS One, 4, e

116 114

117 Παράρτημα 115

118 116

119 117

120 118

121 119

122 120

123 121

124 122

125 123

126 124

127 125

128 126