Σύνθεση πρωτεϊνών και σημειακές μεταλλάξεις Γ. Παπανικολαόυ MD, PhD

Transcript

1 Σύνθεση πρωτεϊνών και σημειακές μεταλλάξεις Γ. Παπανικολαόυ MD, PhD

2 Κεντρικό δόγμα DNA Μεταγραφή RNA Αντιγραφή Αντίστροφη μεταγραφάση Μετάφραση mrna Πρωτείνη RNA γονίδια trna rrna SnRNA microrna κα

3 Ροή της γενετικής πληροφορίας και κυτταρικά διαμερίσματα Ευκαρυώτες Προκαρυώτες DNA Ιντρόνια Γονίδιο Εξόνια DNA ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Γονίδιο mrna ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Καλύπτρα RNA Προσθήκη καλύπτρας & πολυ-α ΑΑΑΑ mrna ΣΥΡΑΦΗ ΑΑΑΑ ΕΞΑΓΩΓΗ mrna ΑΑΑΑ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ Πρωτείνη ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ

4 Λειτουργική και εξελικτική σημασία των ιντρονίων Ρυθμιστικές αλληλουχίες της ενεργότητας των γονιδίων Κωδικοποίηση από ένα γονίδιο περισσότερων του ενός πολυπεπτιδίων (πολύ μεγαλύτερος αριθμός πρωτεϊνών από τον αριθμό των γονιδίων) Αναδιάταξη εξονίων και δημιουργία νέων πρωτεϊνών

5 Δομή προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών mrna Κωδικεύουσες αλληλουχίες 5 P P P AUG 3 UΑG Πρωτείνη 1 7 -μεθυλ-γουανοσίνη 5 G Δεσμός 5-5 Πρωτείνη 2 Κωδικόνιο έναρξης Πρωτείνη 3 Κωδικεύουσα αλληλουχία AUG 3 UΑΑ P P P CH3 Κωδικόνιο λήξης AAAA 5 UTR ORF (πλαίσιο ανάγνωσης) 3 UTR (3 μη μεταφραζόμενη περιοχή) (5 μη μεταφραζόμενη περιοχή) 5 καλύπτρα Πρωτείνη

6 Μονοκιστρονικά και πολυκιστρονικά mrna Πολυκιστρονικά - Προκαρυώτες Μονοκιστρονικά Ευκαρυώτες Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

7 Τροποποιήσεις των άκρων του πρωτογενούς μεταγράφου Προσθήκη 5' καλύπτρας Πολυαδενυλίωση 7 -μεθυλ-γουανοσίνη Δεσμός G P P P Διευκόλυνση της εξόδου του ώριμου mrna από τον πυρήνα Προστασία του mrna από την αποικοδομητική δράση υδρολυτικών ενζύμων Διευκόλυνση της πρόσδεσης των ριβοσωμάτων στο 5' άκρο του mrna AAAA CH3 5 καλύπτρα Πολυαδενυλίωση 3

8 Δομή ευκαρυωτικού mrna 7 -μεθυλ-γουανοσίνη 5 G Δεσμός 5-5 Κωδικόνιο έναρξης Κωδικεύουσα αλληλουχία AUG 3 UΑΑ P P P CH3 Κωδικόνιο λήξης AAAA 5 UTR ORF (πλαίσιο ανάγνωσης) 3 UTR (3 μη μεταφραζόμενη περιοχή) (5 μη μεταφραζόμενη περιοχή) 5 καλύπτρα Πρωτείνη

9 Πλαίσιο ανάγνωσης Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

10 Δομή t-rna Προσδεμένο αμινοξύ Met 3 5 Συνθετάσες των αμινοάκυλο- trna Κωδικόνια βραχίονα αποδέκτη Θηλιά T Θηλιά D Αντικωδικόνιο UAC AUG Κωδικόνιο mrna = αντικωδικόνιο trna Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

11 trna της ζύμης Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

12 t-rna και συνθετάσες των αμινοακυλο-trna Aμινοξύ H H2N C R Συνθετάσες των αμινοάκυλο- trna O C Aμινοξύ H H2N C OH 3 5 Κωδικόνια βραχίονα αποδέκτη ATP Met AMP Δεσμός υψηλής ενέργειας O C O 3 5 Αντικωδικόνιο Αντικωδικόνιο UAC AUG ΠΕΡΙΠΟΥ 45 ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ trna (Αριθμός που ποικίλει ανάλογα με το είδος) Κωδικόνια βραχίονα αποδέκτη

13 Οι αμινοακυλο-trna συνθετάσες είναι εξαιρετικά ακριβείς Για κάθε αμινοξύ υπάρχει μια διαφορετική συνθετάση που αναγνωρίζει το αντικωδικόνιο και τα κωδικόνια του βραχίονα αποδέκτη Αμινοξέα που μοιάζουν μεταξύ τους, μπορούν να διακριθούν με εξαιρετική ακρίβεια 20 αμινοξέα 20 συνθετάσες Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

14 Ταλάντευση Ορισμένα αμινοξέα έχουν περισσότερα από ένα trna Ορισμένα trna απαιτούν ακριβές ζευγάρωμα των βάσεων στις δύο πρώτες θέσεις αλλά ανέχονται λιγότερο ακριβές ζευγάρωμα στην τρίτη θέση Πολλά εναλλακτικά κωδικόνια για ένα αμινοξύ διαφέρουν μόνο ως προς το τρίτο νουκλεοτίδιο Ταλάντευση: ελαστικότητα στο ζευγάρωμα της τρίτης βάσης του αντικωδικονίου που εξηγεί γιατί τα συνώνυμα αντικωδικόνια διαφέρουν στην τρίτη βάση Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

15 Ταλάντευση Παράδειγμα U στο 5' άκρο του αντικωδικονίου Μπορεί να ζευγαρώσει: Eίτε με Α Είτε με G Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

16 Γενετικός κώδικας Εκφυλισμένος: περισσότερα από ένα κωδικόνια μπορεί να ορίζουν ένα αμινοξύ Σχεδόν καθολικός: κοινός από τα απλούστερα βακτήρια μέχρι τα ζώα και τα φυτά Συνήθως τα κωδικόνια που ορίζουν ένα αμινοξύ διαφέρουν ως προς την 3η βάση της τριπλέτας Ένδειξη της κοινής καταγωγής των οργανισμών Μικρές παραλλαγές σε μονοκύτταρους ευκαρυώτες και σε οργανίδια πχ μιτοχόνδρια Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

17 Ταχύτητα καθίζησης (Svedberg) Εκτός από την μάζα εξαρτάται και από το μέγεθος και το σχήμα Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

18 Σύνθεση προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

19 Συναρμολογημένο ριβόσωμα CAMPBELL REECE, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΟΣ Ι, ΠΕΚ 2010

20 Θέσεις πρόσδεσης trna Θέση P Θέση Ε πρόσδεση πεπτιδυλο-trna Θέση A πρόσδεση αμινοακυλο-trna Έξοδος mrna

21 Δομή ριβοσώματος CAMPBELL REECE, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΟΣ Ι, ΠΕΚ 2010

22 Μετάφραση CAMPBELL REECE, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΟΣ Ι, ΠΕΚ 2010 Το ριβόσωμα δεσμεύει τα αμινοξέα των trna και τα προσθέτει στο αυξανόμενο άκρο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας Αναγνώριση από το αντικωδικόνιο του κατάλληλου κωδικονίου στην αλυσίδα του mrna Στάδια Έναρξη Επιμήκυνση Τερματισμός

23 Έναρξη - σχηματισμός συμπλόκου έναρξης της μετάφρασης Μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος + trna (φορμυλιωμένη μεθειονίνη / μεθειονίνη) + mrna + παράγοντες έναρξης (ειδικές πρωτείνες) + GTP Πλαίσιο ανάγνωσης: αρχική μεθειονίνη, 5' καλύπτρα και αλληλουχίες ανοδικά της αρχικής μεθειονίνης (Kozak, Shine-Dalgano) CAMPBELL REECE, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΟΣ Ι, ΠΕΚ 2010

24 Έναρξη της μετάφρασης Αναγνώριση πλαισίου ανάγνωσης (προκαρυωτικοί οργανισμοί) Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

25 Σχηματισμός συμπλόκου έναρξης μεταγραφής Ευκαρυωτικά Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition Προκαρυωτικά

26 Επιμήκυνση CAMPBELL REECE, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΟΣ Ι, ΠΕΚ 2010 Παράγοντες επιμήκυνσης Κατανάλωση GTP (αναγνώριση κωδικονίου, μετατόπιση) Μετακίνηση του ριβοσώματος (3'->5')

27 Πεπτιδυλομεταφορά και μετατόπιση 3 5 H O H2N C C O 3 Met 5 H O H2N C C O 3 R 5 Θέση Ε Θέση P Θέση A Έξοδος πρόσδεση του πεπτιδυλο trna πρόσδεση αμινοακυλοtrna

28 Τερματισμός Δέσμευση του παράγοντα απελευθέρωσης στο κωδικόνιο τερματισμού Προσθήκη νερού και υδρόλυση του πεπτιδίου από το trna της θέσης P Αποσυναρμολογήση του ριβοσώματος CAMPBELL REECE, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΟΣ Ι, ΠΕΚ 2010

29 Αναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης Αναστολέας Προκαρυωτικά Ευκαρυωτικά Ερυθρομυκίνη + - Στρεπτομυκίνη + - Χλωραμφενικόλη + - Κυκλοεξαμίδιο - + Πουρομυκίνη + -

30 Μηχανισμοί δράσης των αναστολέων πρωτεϊνοσύνθεσης Χλωραμφενικόλη Κυκλοεξαμίδιο Πουρομυκίνη fmet (πρόωρη απελευθέρωση πεπτιδικής αλυσίδας) Α1 (αναστολή πεπτιδυλοτρανσφεράσης) Α2 Ερυθρομυκίνη (αναστολή μετατόπισης) fmet Α1 Α2 AUG mrna

31 Ταυτόχρονη μετάφραση ενός mrna Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

32 Πολυριβοσώματα Ταυτόχρονη μετάφραση ενός μορίου mrna από πολλά ριβοσώματα CAMPBELL REECE, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΟΣ Ι, ΠΕΚ 2010

33 Σύζευξη μεταγραφής και μετάφρασης (προκαρυώτες) Watson, Molecular Biology of the Gene, 7th edition

34 CAMPBELL REECE, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΟΣ Ι, ΠΕΚ 2010

35 Ριβοσώματα Κοκκιώδες ενδοπλασματικό δίκτυο Πρωτείνες μεμβρανών Πρωτείνες κυστιδίων για αποθήκευση ή έκκριση Ελεύθερα ριβοσώματα Διαλυτές πρωτείνες κυτοσολίου Πρωτείνες κυτταροπλασματικών δομικών ή κινητών στοιχείων

36 Στόχευση πρωτεϊνών σε κυτταρικά διαμερίσματα Σηματοδοτικό πεπτίδιο Σωμάτιο αναγνώρισης σήματος Υποδοχέας / σύμπλοκο μετατόπισης CAMPBELL REECE, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΜΟΣ Ι, ΠΕΚ 2010

37 Αναδίπλωση και μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις Σαπερόνες και αναδίπλωση των πρωτεϊνών Προσθήκη σακχάρων, λιπιδίων, φωσφορικών ριζών κα Κατάτμηση

38 DNA 5 - CCTAACTATGCTAATGCTTCGAAATAGGGACCCGTGAACGT GGATTGATACGATTACGAAGCTTTATCCCTGGGCACTTGCA - 5 RNA pol II mrna Met Leu Met Leu Arg Asp Arg Asn Pro STOP 5 - CCUAACUAUGCUAAUGCUUCGAAAUAGGGACCCGUGAACGU GGAUUGAUACGAUUACGAAGCUUUAUCCCUGGGCACUUGCA - 5 Άρα ή πρωτεΐνη αποτελείται από 9 αμινοξέα που με τη σειρά είναι: Met-Leu-Met-Leu-Arg-Asp-Arg-Asn-Pro

39 Ερώτηση 1 Έστω ότι η μεταγραφόμενη νουκλεοτιδική αλληλουχία του DNA που κωδικοποιεί το αμινοτελικό άκρο της παραπάνω πρωτεΐνης είναι: 5' - A T T A C A T T C T T T T T T C T C A T T A - 3' Ποια είναι τα πέντε πρώτα αμινοξέα της πρωτεΐνης που σχηματίστηκε; 5' U Α Α U G A G A A A A A A G A A U G U A A U - 3' Met Arg Lys Lys Asn

40 Ερώτηση 2 Έστω ότι η συμπληρωματική αλυσίδα που κωδικοποιεί το COOH - τελικό άκρο μιας μακριάς πρωτεΐνης του ανθρώπου έχει την παρακάτω νουκλεοτιδική αλληλουχία: 5' - C C A T G C T A A G T A T T G G G T - 3' Ποια είναι τα τελευταία αμινοξέα της πρωτεΐνης αυτής; 5' - C C A U G C U A A G U A U U G G G U - 3' Pro Cys ΛΗΞΗ UAA UAG UGA Λήξη

41 Σημειακές μεταλλάξεις (Αντικαταστάσεις) Παρανοηματικές: Αντικατάσταση βάσης που οδηγεί σε αντικατάσταση ενός αμινοξέως από άλλο αμινοξύ Σιωπηρές: Αντικατάσταση βάσης που όμως οδηγεί στην κωδικοποίηση του ίδιου αμινοξέως (λόγω του εκφυλισμού του γενετικού κώδικα) Μη νοηματικές: Η μετάλλαξη μετατρέπει ένα κωδικόνιο αμινοξέως σε κωδικόνιο τερματισμού

42 Σημειακές μεταλλάξεις (Ενθέσεις και ελλείμματα) Αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης 5' U Α Α U G A G A A A A A A G A A U G U A A U - 3' Met Arg Lys Lys Asn Έλλειμμα 5' U Α Α U G A A A A A A A G A A U G U A A U - 3' Met Lys Lys Arg Met

43 Σημειακές μεταλλάξεις (Ενθέσεις και ελλείμματα) Αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης 5' U Α Α U G A G A A A A A A G A A U G U A A U - 3' Met Arg Lys Lys Asn Ένθεση Α 5' U Α Α U G A AG A A A A A A G A A U G U A A U - 3' Met Lys Lys Lys Glu