Ε Ν Θ Ε Τ Ο Π Ρ Ο Ϊ Ο Ν Τ Ο Σ

Transcript

1 Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, Connecticut Η.Π.Α. Τηλ.: +1 (203) ή (888) (Μόνο για τις Η.Π.Α. και Καναδά), Φαξ: +1 (203) Οι συνοδευτικές οδηγίες και οι αντίστοιχες μεταφράσεις για το προϊόν είναι διαθέσιμες στη διεύθυνση: Ε Ν Θ Ε Τ Ο Π Ρ Ο Ϊ Ο Ν Τ Ο Σ Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES SSO HLA για Μηδενικά Αλληλόμορφα Για διαγνωστική χρήση In Vitro. ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Ορισμός συμβόλων... 1 Οδηγίες χρήσης... 4 Κιτ/Αντιδραστήρια κατά αρ. καταλόγου... 1 A. Καθαρίστε το γενωμικό DNA... 4 Προοριζόμενη χρήση... 2 B. Ενίσχυση... 4 Σύνοψη και περιγραφή... 2 Γ. Υβριδισμός... 5 Αρχές της διαδικασίας... 2 Δ. Ανάλυση δείγματος με το όργανο Luminex... 6 Αντιδραστήρια... 3 Αποτελέσματα... 6 A. Ταυτοποίηση... 3 Έλεγχος ποιότητας... 7 B. Προειδοποιήσεις και Προφυλάξεις... 3 Περιορισμοί της διαδικασίας... 7 Γ. Οδηγίες φύλαξης... 3 Αντιμετώπιση προβλημάτων... 7 Δ. Καθαρισμός ή επεξεργασία που απαιτείται για τη χρήση... 3 Αναμενόμενες τιμές... 8 Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης... 8 E. Ενδείξεις αστάθειας... 3 Βιβλιογραφία... 8 Απαιτούμενα όργανα... 3 Περιορισμένες Άδειες... 8 Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα Συλλογή δειγμάτων και προετοιμασία... 3 εμπορικά σήματα... 8 Διαδικασία... 3 A. Παρεχόμενα υλικά... 3 Παράρτημα A... 9 B. Υλικά, αντιδραστήρια και εξοπλισμός που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται... 3 Γ. Συμπληρωματικά υλικά που παρέχονται από το χρήστ... 4 Ηλεκτροφόρηση γέλης... Ερμηνεία γέλης ΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΜΒΟΛΩΝ (Ετικέτες προϊόντων και συμπληρωματικά έγγραφα) Αριθμός παρτίδας Ημερομηνία λήξης Αριθμός καταλόγου Να κρατηθεί μακριά από το φως Άνω όριο θερμοκρασίας Επαρκεί για N δοκιμές Περιορισμοί θερμοκρασίας Να μην καταψυχθεί Προσοχή Βλ. Οδηγίες Χρήσης Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Κατασκευαστής Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα Κίνδυνος Σελίδα 1 από 9 LC1437CEEL.3 (05/15)

2 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΤΑ ΑΡ. ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ LCT -N Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES SSO HLA για Μηδενικά Αλληλόμορφα, Αρ. Καταλόγου LC-N Κιτ Εξακρίβωσης LIFECODES HLA για Μηδενικά Αλληλόμορφα για χρήση με το Luminex Αρ. Προϊόντος Αριθμός Όγκος Αντιδραστήριο Φύλαξη προϊόντος πλήρωσης 50 MX-N1 MX-N2 LIFECODES Μηδενικών Αλληλόμορφων Κλάσης 1 Κύριο Μείγμα LIFECODES Μηδενικών Αλληλόμορφων Κλάσης 2 Κύριο Μείγμα µl 2 έως 8 C µl 2 έως 8 C 2 έως 8 C LIFECODES Μηδενικών BM-N Αλληλόμορφων Μείγμα ινχηλατών µlx 2 Να προστατεύεται από το φως DS Διάλυμα αραίωσης ,7 ml 18 έως 30ºC Επαρκεί για 50 δείγματα TAQ LIFECODES Πολυμεράση Taq µl x 2-10CºCέως -30ºC Τα μείγματα ιχνηλατών είναι φωτοευαίσθητα: διατηρήστε στο ελάχιστο την έκθεση στο φως. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μη χρησιμοποιείτε συστατικά των οποίων η ημερομηνία λήξης έχει παρέλθει. ΠΡΟΣΟΧΗ: Δεν έχουν επικυρωθεί τυχόν αποκλίσεις από το συνιστώμενο πρωτόκολλο και τα απαιτούμενα υλικά, συμπεριλαμβανομένης και της LIFECODES Πολυμεράσης Taq.. ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Εξακρίβωση DNA Τάξης I και Τάξης II αλληλόμορφων σε συνδυασμό με τα κιτ εξακρίβωσης LIFECODES HLA SSO. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Η εξακρίβωση HLA με βάση το DNA με χρήση DNA ενισχυμένου με PCR είναι μια συνηθισμένη εργαστηριακή διαδικασία. Η ενίσχυση του DNA με PCR χρησιμοποιείται ως μέθοδος εμπλουτισμού μιας επιλεγμένης περιοχής DNA. Για την εξακρίβωση HLA χρησιμοποιείται ένας επακόλουθος προσδιορισμός που προσδιορίζει τις ιδιότητες του ενισχυμένου DNA. Διάφοροι τύποι προσδιορισμών, όπως οι τεχνολογίες SSP (1), άμεσου SSOP (2), RFLP (3) και SSOP ανάστροφου στυπώματος κηλίδων (4), έχουν χρησιμοποιηθεί στην εξακρίβωση HLA. Όμοια με τις μεθόδους SSOP και ανάστροφου στυπώματος κηλίδων, τα Κιτ εξακρίβωσης LIFECODES HLA-SSO χρησιμοποιούν ολιγονουκλεοτίδια ειδικά της αλληλουχίας (SSO) για να εξακριβώνουν ποια αλληλόμορφα HLA είναι παρόντα σε ένα ενισχυμένο με δείγμα PCR. Το σετ των χρησιμοποιούμενων SSO, όχι οι μεθοδολογίες, είναι αυτό που καθορίζει την ικανότητα διάκρισης των διαφόρων αλληλόμορφων που είναι παρόντα στην ενίσχυση PCR. Ενώ οι μέθοδοι ανάστροφου στυπώματος κηλίδων και SSOP χρησιμοποιούν ενζυμική ιχνηθέτηση και χρωματομετρικά υποστρώματα που απαιτούν επακόλουθη ανάπτυξη, ο προσδιορισμός LIFECODES είναι ένα ομοιογενές πολυπλεκτικό σύστημα. Δηλαδή, όλα τα SSO αναλύονται ταυτόχρονα και ολόκληρος ο προσδιορισμός εκτελείται σε ένα μόνο δοχείο αντίδρασης με την προσθήκη ενός μόνο αντιδραστηρίου. ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η διαδικασία εξακρίβωσης LIFECODES HLA-SSO βασίζεται στον υβριδισμό ιχνηθετημένου μονόκλωνου προϊόντος PCR σε ιχνηλάτες SSO. Η ενίσχυση του DNA με χρήση PCR συνήθως χρησιμοποιεί ισομοριακές ποσότητες πρόσθιου και ανάστροφου εκκινητή για την παραγωγή δίκλωνου προϊόντος DNA. Ωστόσο, αν η ποσότητα του ενός εκκινητή είναι σε περίσσεια σε σχέση με τον άλλο, η αντίδραση παράγει, εκτός από το δίκλωνο DNA, μια π οσότητα μονόκλωνου DNA. Κατά τους αρχικούς κύκλους του βήματος ενίσχυσης LIFECODES παράγεται δίκλωνο DNA. Αφού εξαντληθεί ο περιοριστικός εκκινητής, ο υπόλοιπος εκκινητής χρησιμοποιεί το δίκλωνο προϊόν ως εκμαγείο για την παραγωγή μονόκλωνου DNA. Η μέθοδος αυτή παράγει δίκλωνο και μονόκλωνο προϊόν τα οποία, αφού μετουσιωθούν, θα συμμετάσχουν και τα δύο στην αντίδραση υβριδισμού. Καθένας από τους διαφορετικούς ιχνηλάτες μπορεί να είναι ομόλογος προς μια αλληλουχία στο ενισχυμένο DNA η οποία είναι μοναδική σε ένα αλληλόμορφο ή μια ομάδα αλληλόμορφων. Με άλλα λόγια, οι ιχνηλάτες είναι σχεδιασμένοι έτσι ώστε κάθε ιχνηλάτης να υβριδοποιεί κατά προτίμηση μια συμπληρωματική περιοχή που μπορεί να είναι ή να μην είναι παρούσα στο ενισχυμένο DNA. Επιπρόσθετα, το ενισχυμένο DNA επίσης υβριδοποιείται σε έναν ή περισσότερους συναινετικούς ιχνηλάτες ομόλογους προς αλληλουχίες παρούσες σε όλα τα αλληλόμορφα ενός γενετικού τόπου. Η εξακρίβωση SSO μπορεί να επηρεαστεί από τον τύπο του βιολογικού υλικού, τη μέθοδο καθαρισμού, την ποσότητα και την ακεραιότητα του γενωμικού DNA. Επομένως, το σήμα που λαμβάνεται για τον(ους) συναινετικό(ούς) ιχνηλάτη(ες) μπορεί να χρησιμεύσει ως δείκτης της επιτυχίας των διαδικασιών ενίσχυσης και υβριδισμού. Επίσης, το σήμα που λαμβάνεται με τον συναινετικό ιχνηλάτη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ομαλοποίηση του σήματος των ειδικών για αλληλόμορφα ιχνηλατών και τη διόρθωση των διακυμάνσεων στην ποσότητα του ενισχυμένου προϊόντος στην αντίδραση υβριδισμού. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων που παρήχθησαν από την εξακρίβωση SSO μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εξακριβώσει την παρουσία ή απουσία συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA σε ενισχυμένο DNA και για να προσδιορίσει τα πιθανά αλληλόμορφα στο δείγμα. Για τη διαδικασία εξακρίβωσης LIFECODES HLA-SSO, οι ιχνηλάτες προσαρτώνται σε μικροσφαίρες Luminex που έχουν σχεδιαστεί για χρήση με το όργανο Luminex. Έως 100 διαφορετικοί πληθυσμοί μικροσφαιρών Luminex μπορούν να αναμειχθούν και να αναλυθούν από το όργανο Luminex επειδή κάθε πληθυσμός μικροσφαιρών ξεχωρίζει από τη μοναδική φθορίζουσα υπογραφή του ή το χρώμα του. Σε κάθε έγχρωμη μικροσφαίρα μπορεί να προσαρτηθεί διαφορετικός ιχνηλάτης SSO. Επομένως, ένα μείγμα διαφόρων ιχνηλατών μπορεί να διαχωριστεί μέσω της προσάρτησής τους σε διαφορετικές έγχρωμες μικροσφαίρες. Το όργανο Luminex μπορεί επίσης να προσδιορίσει την ποσότητα στις σχετικές ποσότητες ιχνηθετημένου προϊόντος PCR με υβριδισμό σε κάθε μικροσφαίρα Luminex. Επομένως, το σχετικό σήμα που λαμβάνεται με τους ιχνηλάτες SSO στον προσδιορισμό LIFECODES, όπως και με άλλες μεθόδους SSOP, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το χαρακτηρισμό των ιχνηλατών σαν να έχουν θετική ή αρνητική αντιδραστικότητα με το δείγμα ενισχυμένου DNA (βλ. ενότητα Αποτελέσματα). Αυτό, με τη σειρά του, παρέχει τις πληροφορίες που απαιτούνται για τον προσδιορισμό του φαινοτύπου HLA του δείγματος. Το μηδενικό 1 (Null 1) χρησιμοποιείται ως επιπρόσθετη δοκιμασία για την αύξηση ανάλυσης των προσδιορισμών LIFECODES HLA-A, HLA-B, HLA-C, λύνοντας την αμφιβολία αλληλόμορφων μεταξύ A*24:02/24:09N, B*51:01/ 51:11N, και C*04:01/04:09N. Το μηδενικό 2 (Null 2) χρησιμοποιείται ως επιπρόσθετη δοκιμασία για την αύξηση ανάλυσης του προσδιορισμού LIFECODES HLA-DRB3,4,5, λύνοντας την αμφιβολία αλληλόμορφων μεταξύ DRB4* 01:03/ DRB4* 01:03:01:02N, και DRB5*01:02/DRB5*01:08N Η συγχώνευση πληροφοριών από την ανάλυση Null 1 ή 2 με τον αντίστοιχο προσδιορισμό κιτ εξακρίβωσης συγκεκριμένου γενετικού τόπου LIFECODES SSO έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία υποτιθέμενης εξακρίβωσης ενός δείγματος που δύνανται να διεξαχθεί μέσω μη αυτόματης ανάλυσης ή με ανάλυση μέσω λογισμικού. Για μη αυτόματη ανάλυση, η παραγωγή των προσδιορισμών Null1 ή 2 προσδιορίζει την παρουσία ή απουσία συγκεκριμένων μηδενικών αλληλόμορφων. Το αποτέλεσμα από τα αντίστοιχα κιτ εξακρίβωσης συγκεκριμένου γενετικού τόπου LIFECODES SSO ενδέχεται να περιέχει αμφιβολίες σχετικά με αυτά τα μηδενικά αλληλόμορφα (π.χ., A*24:02/24:09N, B*51:01/ 51:11N, C*04:01/04:09N, DRB4* 01:03/ DRB4* 01:03:01:02N, ή DRB5*01:02/DRB5*01:08N). Εάν το μηδενικό αλληλόμορφο ταυτίζεται με το Μηδενικό προϊόν, όλοι οι συνδυασμοί αλληλόμορφων που δεν περιέχουν το Σελίδα 2 από 9 LC1437CEEL.3 (05/15)

3 μηδενικό αλληλόμορφο δύνανται να απαλειφτούν από τα αποτελέσματα που αποκτώνται από το αντίστοιχο κιτ εξακρίβωσης συγκεκριμένου γενετικού τόπου LIFECODES SSO. Εάν λείπει το μηδενικό αλληλόμορφο στο αποτέλεσμα του Μηδενικού προϊόντος, όλοι συνδυασμοί αλληλόμορφων που περιέχουν το Μηδενικό αλληλόμορφο δύνανται να εξαλειφτούν από τα αποτελέσματα που αποκτώνται από από το αντίστοιχο κιτ εξακρίβωσης συγκεκριμένου γενετικού τόπου LIFECODES SSO. Στο ένθετο του προϊόντος και στο λογισμικό, η διαδικασία αυτή που συνδυάζει τα αποτελέσματα των δύο προϊόντων αναφέρεται ως συγχώνευση των αποτελεσμάτων. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ A. Ταυτοποίηση Δείτε τους πίνακες στην ενότητα Αντιδραστήρια κατά αρ. καταλόγου για τον πλήρη κατάλογο των αριθμών καταλόγου. B. Προειδοποιήσεις ή Προφυλάξεις 1. Για διαγνωστική χρήση in vitro. 2. Πρέπει να προβλέπονται χωριστές πιπέτες για τους χειρισμούς προ-pcr και για τους χειρισμούς μετα-pcr. 3. Βιολογικός κίνδυνος: Όλα τα βιολογικά δείγματα και τα δείγματα αίματος πρέπει να αντιμετωπίζονται σαν να είναι δυνητικά μολυσματικά. Να χρησιμοποιείτε τις Γενικές Προφυλάξεις κατά το χειρισμό. 4. Το Διάλυμα αραίωσης, τα μείγματα ιχνηλατών, η TAQ πολυμεράση και η PE-Στρεπταβιδίνη περιέχουν επικίνδυνα συστατικά. Αποφύγετε την επαφή με τα μάτια και το δέρμα και απορρίψτε όλα τα υλικά μετά τη χρήση, σύμφωνα με τους τοπικούς κανονισμούς. Για πρόσθετες πληροφορίες, ανατρέξτε στα σχετικά Φύλλα δεδομένων ασφαλείας υλικού. Γ. Οδηγίες φύλαξης 1. Για τις κατάλληλες θερμοκρασίες φύλαξης, ανατρέξτε στην ετικέτα συσκευασίας του συστατικού του κιτ. 2. Τα μείγματα ιχνηλατών και η PE-Στρεπταβιδίνη είναι φωτοευαίσθητα υλικά. ΚΡΑΤΗΣΤΕ ΤΑ ΜΑΚΡΙΑ ΑΠΟ ΦΩΣ, ΜΗΝ ΤΑ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ. 3. Μη χρησιμοποιείτε συστατικά των οποίων η ημερομηνία λήξης έχει παρέλθει. Δ. Καθαρισμός ή επεξεργασία που απαιτείται για τη χρήση Βλ. «Συλλογή δειγμάτων και προετοιμασία». E. Ενδείξεις αστάθειας 1. Αν έχουν κατακρημνιστεί άλατα στο διάλυμα κατά την αποστολή ή τη φύλαξη, διαλύστε πάλι πλήρως πριν από τη χρήση με δονητική ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου (18 έως 30ºC). 2. Μη χρησιμοποιείτε στρεπταβιδίνη συζευγμένη με R-φυκοερυθρίνη, η οποία έχει καταψυχθεί κατά την αποστολή ή την αποθήκευση. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΟΡΓΑΝΑ 1. Όργανο Luminex, XY PLATFORM (Αριθμός προϊόντος , ) 2. Έχουν επικυρωθεί οι ακόλουθοι Θερμικoί Ανακυκλωτές: 96-Well GeneAmp PCR σύστημα 9700 ρυθμιζόμενο σε τρόπο MAX (Βασικός Αρ. Καταλ. N , Gold Block Αρ. Καταλ ), Θερμικός Ανακυκλωτής Veriti 96-Well ρυθμιζόμενος σε τρόπο 9700 MAX (Αρ. Καταλ ). Αναφερθείτε στον Πίνακα Table 2 για τις μέγιστες ταχύτητες κλιμάκωσης. Προσοχή: Δεν έχουν επικυρωθεί άλλοι ανακυκλωτές και ταχύτητες κλιμάκωσης. ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ α. Το ανθρώπινο DNA δύναται να εξαγνιστεί από ολικό αίμα, στιβάδα λευκοκυττάρων και παρειακή απόξεση με εγκεκριμένη μέθοδο που ανταποκρίνεται στα παρακάτω κριτήρια. DNA που βγαίνει από αίμα και έχει συντηρηθεί σε EDTA και ACD (Κιτρικιούχο Όξινη Δεξτρόζη) έχει τεθεί υπό δοκιμασία και έχει αποδειχθεί ότι δίνει την αναμενόμενη απόδοση σε αυτήν την ανάλυση. Β. Το DNA που βγαίνει από αίμα που έχει συντηρηθεί σε ηπαρίνη δεν δύνανται να χρησιμοποιηθεί σε αυτήν την ανάλυση. Δεν έχουν τεθεί υπό δοκιμασία άλλα συντηρητικά. Γ. Το απομονωμένο DNA πρέπει να βρίσκεται σε 10 mm TRIS, ph 8,0-9,0 ή σε νερό χωρίς νουκλεάση. Αν υπάρχει χηλωτής, όπως το EDTA, η τελική συγκέντρωση του χηλωτή δεν πρέπει να υπερβαίνει την τιμή 0,5 mm. Δ. Η παρουσία αλκοόλης, απορρυπαντικών ή αλάτων μπορεί να έχει αρνητική επίδραση στην ενίσχυση του DNA. Ε. Η τελική συγκέντρωση του DNA πρέπει να είναι ng/µl. Ζ. Οι μετρήσεις απορροφητικότητας του δείγματος DNA στα 260 και 280nm πρέπει να δώσουν μια αναλογία 1,65 έως 2,0. Η. Το DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί αμέσως μετά την απομόνωσή του ή να καταψυχθεί στους 20 ο C για έως 1 έτος. Η επανειλημμένη ψύξη/απόψυξη πρέπει να αποφεύγεται γιατί αυτή η διαδικασία μπορεί να προκαλέσει αλλοίωση του DNA. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Προσοχή: Δεν έχουν επικυρωθεί τυχόν αποκλίσεις από το συνιστώμενο πρωτόκολλο και τα απαιτούμενα υλικά. A. Παρεχόμενα υλικά (Βλ. πίνακες στην ενότητα Κιτ/Αντιδραστήρια κατά αρ. καταλόγου για ειδικές πληροφορίες) Κατάλληλο Κύριο Μείγμα (MX) Πίνακας κατωφλίων, Διαγράμματα ιχνηλάτησης Κατάλληλο μείγμα/μείγματα ιχνηλάτησης (ΒΜ) LIFECODES Πολυμεράση Taq (LIFECODES Αρ. Καταλ. Διάλυμα αραίωσης (DS) ) x 2 B. Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Τα παρακάτω υλικά χρησιμοποιήθηκαν για την εγκυρότητα του κιτ: Υγρό Ελύτρου Luminex (1x Lifecodes Αρ. Κατ ) Νερό χωρίς νουκλεάση (Lifecodes Αρ. Κατ , 20ml) Σωληνάρια και πώματα PCR Λωρίδες σωληναρίων Corning Thermowell φρέαρ (Costar Αρ. Καταλ. 6542, LIFECODES Αρ. Καταλ ) ή πλάκες φρεατίων Corning Thermowell PCR 96 (Αρ. Καταλ. CLS6551) ή Thermoscientific AB Gene Superplate 96-πλάκα φρεατίου PCR (Αρ. Καταλ. AB-2100) Πλάκα Costar (Costar Αρ. Καταλ. 6509, LIFECODES Αρ. Καταλ ) Διαφανής ταινία πολυαιθυλενίου Thermowell (Costar Αρ (LIFECODES Αρ. Καταλ ) (PE)-Στρεπταβιδίνη συζευγμένη με φυκοερυθρίνη (SA-PE), 1mg/mL (LIFECODES Αρ. Κατ ) Κιτ Βαθμονόμησης Luminex (Κιτ Βαθμονόμησης Luminex 100/200, Κιτ Επαλήθευσης Απόδοσης Luminex 100/200, LIFECODES Αρ. Καταλ και αντίστοιχα) Σελίδα 3 από 9 LC1437CEEL.3 (05/15)

4 Γ. Συμπληρωματικά υλικά που παρέχονται από το χρήστη Δονητικός αναδευτήρας Υλικ. συμπίεσης σιλικόνης Axygen Scientific αρ. CM-FLAT ή ισοδύναμο Συσκευή λουτρού υπερήχων Απολήξεις φίλτρων μικροφυγόκεντρου Συσκευές πιπεταρίσματος, Πολυκάναλες συσκευές πιπεταρίσματος και απολήξεις (1-20µL, µL, 1000µL) Λογισμικό ανάλυσης υπολογιστικού φύλλου Θερμαντική πλάκα 70% Ισοπροπανόλη ή 20% Λευκαντικό Δίσκος συγκράτησης - Applied Biosystems αρ (για χρήση μόνο με τον ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ: Τα μείγματα ιχνηλατών και η PE-Στρεπταβιδίνη είναι φωτοευαίσθητα υλικά: κρατήστε τα μακριά από το φως και μην τα καταψύχετε. Θερμάνετε τα σφαιρίδια στους 55-60ºC για τουλάχιστον 5-10 λεπτά για να υγροποιήσετε πλήρως τα συστατικά στο μείγμα ιχνηλατών. Χρησιμοποιήστε για λίγο (~15 δευτ.) τη συσκευή υπερήχων και μετά τοποθετήστε το μείγμα ιχνηλατών σε δονητικό αναδευτήρα για 15 δευτερόλεπτα περίπου για να εναιωρηθούν πλήρως τα σφαιρίδια. Να είστε ιδιαίτερα προσεκτικοί στη διαδικασία κλασμάτωσης, χρησιμοποιώντας βαθμονομημένες πιπέτες. Αν δεν το κάνετε, μπορεί να προκληθεί απώλεια του αντιδραστηρίου και αποτυχία του δείγματος. Όλες οι θερμοκρασίες πρέπει να διατηρούνται επακριβώς. Διακυμάνσεις της τάξης του +/- 0,5 C μπορεί να επηρεάσουν τα αποτελέσματα. Στο στάδιο υβριδισμού, τα δείγματα δεν πρέπει να παραμείνουν στην αραιωμένη κατάσταση στους 56 C για παραπάνω από 5 λεπτά (Βλ. ενότητα Αποτελέσματα). Συνιστάται να προσδιορίζετε τα ενισχυμένα δείγματα όσο γίνεται πιο γρήγορα. Αν τα δείγματα δεν μπορούν να μετρηθούν στο όργανο Luminex την ίδια ημέρα, το ενισχυμένο προϊόν μπορεί να φυλαχτεί για έως 3 ημέρες στους 2 έως 8 C πριν από τη χρήση. Για μεγαλύτερη διάρκεια αποθήκευσης,αποθηκεύστε στους -20 ο C για μία βδομάδα το πολύ, μέχρι να είναι έτοιμο για προσδιορισμό. Το ενισχυμένο προϊόν μπορεί να ψυχθεί και να αποψυχθεί μόνο μία φορά. Οι επανειλημμένες ψύξεις και αποψύξεις προκαλούν αλλοίωση των ενισχυμένων δειγμάτων και παράγουν φτωχά αποτελέσματα κατά τον προσδιορισμό. A. Καθαρίστε το γενωμικό DNA, χρησιμοποιώντας μια μέθοδο της επιλογής σας. Η τελική συγκέντρωση πρέπει να είναι ng/µl. Προσαρμόστε, αν χρειάζεται, με νερό χωρίς νουκλεάση. Διατηρήστε όλα τα δείγματα σε παρόμοιες συγκεντρώσεις. B. Ενίσχυση DNA (PCR) 1. Αφήστε το Κύριο Μείγμα να θερμανθεί σε θερμοκρασία δωματίου (18 έως30ºc). 2. Αναμείξτε απαλά με δονητικό αναδευτήρα τα αντιδραστήρια για 10 δευτερόλεπτα περίπου. Με αυτόν τον τρόπο διασφαλίζεται ότι τα άλατα είναι στο διάλυμα. Περιστρέψτε για σύντομο χρονικό διάστημα (5 10 δευτερόλεπτα) σε μικροφυγόκεντρο για να τοποθετηθεί το περιεχόμενο στον πυθμένα του σωληναρίου. 3. Χρησιμοποιώντας τον Πίνακα 1 παρακάτω, παρασκευάστε τα συστατικά για ενίσχυση n+1 αντιδράσεων χρησιμοποιώντας την ενδεικνυόμενη ποσότητα καθενός συστατικού ανά αντίδραση (εκτός από το DNA). Δημιουργήστε τελικό όγκο 20µl ανά αντίδραση με νερό χωρίς νουκλεάση. Αναμείξτε απαλά με δονητικό αναδευτήρα. 4. Μεταφέρετε με πιπέτα την κατάλληλη ποσότητα γενωμικού DNA (40 έως 120ng) στα σωληνάρια PCR. 5. Χωρίστε σε κλάσματα το μείγμα ενίσχυσης στα σωληνάρια PCR που περιέχουν το γενωμικό DNA. (Ο συνολικός όγκος του κύριου μείγματος και του γενωμικού DNA πρέπει να είναι ίσος με 20µl για κάθε αντίδραση δείγματος.) 6. Σφίξτε καλά τα καπάκια στα σωληνάρια για να εμποδίσετε την εξάτμιση κατά τη διάρκεια του PCR. 7. Τοποθετήστε τα δείγματα στο θερμικό ανακυκλωτή και εκτελέστε το πρόγραμμα, βλ. Πίνακα 2 και Πίνακα 3. Πίνακας 1. Συστατικά αντίδρασης για ενίσχυση Συστατικό Ποσότητα ανά αντίδραση δείγματος PCR LIFECODES Κύριο Μείγμα 6µl Γενωμικό DNA ng/µl Συνολικά ~80ng LIFECODES TAQ πολυμεράση 0,2µl (1U) Νερό χωρίς νουκλεάση Τελικός όγκος 20µl Πίνακας 2. Συνθήκες θερμικού ανακυκλωτή για ενίσχυση Θερμικός ανακυκλωτής GeneAmp PCR Σύστημα 9700 Θερμικός ανακυκλωτής Veriti 96-Well Τρόπος λειτουργίας (Ταχύτητα κλιμάκωσης) Τρόπος λειτουργίας MAX (3,9 C/δευτ.) ΜΕΓΙΣΤΟΣ τρόπος λειτουργίας 9700 (3,9 C/δευτ.) Σελίδα 4 από 9 LC1437CEEL.3 (05/15)

5 Πίνακας 3. Συνθήκες θερμικού ανακυκλωτή για ενίσχυση Θερμοκρασία και χρόνος Βήμα επώασης Αρ. κύκλων 1 95º C για 3 λεπ º C για 15 δευτ. 60º C για 30 δευτ. 72º C για 30 δευτ. 95º C για 10 δευτ. 63º C για 30 δευτ. 72º C για 30 δευτ. 4 72º C για 2 λεπ º C πάντα 1 Σημείωση: Για να είστε βέβαιοι για την ενίσχυση δειγμάτων, ανατρέξτε στην Ηλεκτροφόρηση γέλης προϊόντων (Παράρτημα A) Γ. Υβριδισμός Βεβαιωθείτε ότι τα συστατικά του ρυθμιστικού διαλύματος υβριδισμού του μείγματος ιχνηλατών LIFECODES είναι υγροποιημένα και ότι τα σφαιρίδια εναιωρούνται πλήρως. Ξεκινήστε το όργανο Luminex και τη Βάση XY και αφήστε τα να προθερμανθούν για 30 λεπτά. 1. Θερμάνετε το μείγμα ιχνηλατών σε θερμαντική πλάκα C για τουλάχιστον 5-10 λεπτά για να διαλυτοποιήσετε πλήρως τα συστατικά στο μείγμα ιχνηλατών. 2. Χρησιμοποιήστε για λίγο (~15 δευτ.) τη συσκευή υπερήχων και μετά τοποθετήστε το μείγμα ιχνηλατών σε δονητικό αναδευτήρα για 15 δευτερόλεπτα περίπου για να εναιωρηθούν πλήρως τα σφαιρίδια. 3. Συνδυάστε 15 µl από κατάλληλο μίγμα ιχνηλατών με 5 μl προϊόντος PCR για ειδικό γενετικό τόπο σε κάθε φρεάτιο θερμικού ανακυκλωτή με πλάκα 96 φρεατίων (Costar Αρ. 6509). Όταν εκτελείται κλασμάτωση στο μίγμα ιχνηλατών για περισσότερα από 10 φρεάτια, κουνήστε απαλά το μίγμα ιχνηλατών μετά από κάθε σετ των δέκα. Σφραγίστε το πλακίδιο με ταινία από πολυαιθυλένιο (Costar No. 6524). 4. Τοποθετήστε πλακίδιο συμπίεσης της σιλικόνης στο επάνω μέρος της πλάκας πριν από τον υβριδισμό. 5. Υβριδοποιήστε τα δείγματα υπό τις ακόλουθες συνθήκες επώασης: Πίνακας 4. Συνθήκες θερμικού ανακυκλωτή για υβριδισμό Βεβαιωθείτε ότι το λέιζερ ανίχνευσης στο όργανο Luminex έχει ενεργοποιηθεί τουλάχιστον 30 λεπτά πριν ολοκληρωθεί ο υβριδισμός. 6. Ενώ γίνεται υβριδισμός στα δείγματα, προετοιμάστε ένα μείγμα/διάλυμα αραίωσης SA-PE 1:200. Συνδυάστε 170µl διαλύματος αραίωσης (DS) και 0,85 µl 1mg/mL PE-Στρεπταβιδίνης (SA-PE) ανά δείγμα. Συνιστάται να παρασκευάσετε αρκετό μείγμα διαλύματος αραίωσης για n+1 δείγματα ώστε να αντισταθμιστούν οι απώλειες κατά τη μεταφορά με πιπέτα. (Βλ. Πίνακα 5) 7. Φυλάξτε το μείγμα διαλύματος αραίωσης / PE-Στρεπταβιδίνης σε σκοτεινό μέρος, σε θερμοκρασία δωματίου - η PE-Στρεπταβιδίνη είναι φωτοευαίσθητη! Το διάλυμα αραίωσης μπορεί να θερμανθεί στους 45º C για 5 λεπτά και να αναμειχθεί με δονητικό αναδευτήρα μόλις παραληφθεί για να διασφαλιστεί ότι όλα τα συστατικά είναι διαλυμένα. Το διάλυμα αραίωσης πρέπει να είναι σε θερμοκρασία δωματίου (18 30 C) πριν ετοιμαστεί το δείγμα. Παρασκευάστε πριν από τη χρήση και απορρίψτε το τμήμα που ενδεχομένως έχει απομείνει. Πίνακας 5. Όγκοι παρασκευής διαλύματος αραίωσης 97º C για 2 λεπτά 47º C για 10 λεπτά 56º C για 8 λεπτά 56º C ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ Αριθμός δειγμάτων Διάλυμα αραίωσης (DS) PE-Στρεπταβιδίνη (SA-PE) 1 170µl 0,85µl 5 850µl 4,25µl µl 8,5µl µl 17µl µl 42,5µl Σημείωση: ΜΗΝ ΑΚΥΡΩΣΕΤΕ ΤΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΥ ΠΡΙΝ ΑΦΑΙΡΕΣΕΤΕ ΤΟΝ ΔΙΣΚΟ ΑΠΟ ΤΟΝ ΘΕΡΜΙΚΟ ΑΝΑΚΥΚΛΩΤΗ! 8. Στους 56º C με διατήρηση (hold), με τον δίσκο στον θερμικό ανακυκλωτή, αραιώστε κάθε δείγμα με 170µl από το παρασκευασμένο μείγμα διαλύματος αραίωσης/pe- Στρεπταβιδίνης. Είναι ζωτικής σημασίας να αραιωθούν όλα τα δείγματα μέσα σε 5 λεπτά (μετά το βήμα HOLD (Αναμονή) διάρκειας 8 λεπτών στους 56 C). 9. Αφαιρέστε τον δίσκο δειγμάτων από τον θερμικό ανακυκλωτή και τοποθετήστε τον στο όργανο Luminex. Σελίδα 5 από 9 LC1437CEEL.3 (05/15)

6 Δ. Ανάλυση δείγματος με το όργανο Luminex * Για βέλτιστα αποτελέσματα, προσδιορίστε τα δείγματα αμέσως χρησιμοποιώντας το όργανο Luminex. 1. Ενεργοποιήστε το όργανο Luminex 30 λεπτά έως 4 ώρες πριν από τον προσδιορισμό των δειγμάτων. 2. Πριν από την ανάλυση των δειγμάτων στο όργανο Luminex, ετοιμάστε μια ανάλυση παρτίδας (Batch Run) με την οποία θα αναλυθούν τα δείγματα. α) Επιλέξτε Create a New Batch (Δημιουργία νέας παρτίδας) από το μενού File (Αρχείο). Για παράδειγμα, εάν αναλύετε για Τάξη Ι Μηδενικό, προσθέστε το μείγμα για την Τάξη Μηδενικό. Το εκμαγείο παρτίδας παρέχεται στην ιστοσελίδα και ονομάζεται, στη συγκεκριμένη περίπτωση, Μηδενικό 1 xxxxxx (αρ. παρτίδας). Σημειώστε ότι οι εκδόσεις των εκμαγείων είναι ειδικές του αριθμού παρτίδας και αντιστοιχούν στους αριθμούς παρτίδων του μείγματος ιχνηλάτη. Ακολουθήστε τα βήματα των οδηγιών δημιουργίας ομάδων που εμφανίζονται στην οθόνη. Όταν ονομάζετε την παρτίδα, μη συμπεριλάβετε κόμματα στο όνομα γιατί οι πληροφορίες μετά το κόμμα θα χαθούν κατά την εξαγωγή των δεδομένων. Για περισσότερες οδηγίες σχετικά με τη δημιουργία παρτίδων και πολλαπλών παρτίδων, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του Luminex. β) Κάντε κλικ στο κουμπί εκτίναξης για να εκτιναχτεί η βάση συγκράτησης της πλάκας. Τοποθετήστε την πλάκα του θερμικού ανακυκλωτή με τα 96 φρεάτια, η οποία περιέχει τα δείγματα, στη θερμαντική πλάκα XYP που υπάρχει στη βάση συγκράτησης της πλάκας. γ) Κάντε κλικ στο εικονίδιο Retract (Απόσυρση). Τα δείγματα είναι τώρα έτοιμα για ανάλυση. Θα πρέπει να εκτελεστεί ένα βήμα εκκινητή πριν ξεκινήσει η ανάλυση. δ) Μετά την ανάλυση των δειγμάτων από το όργανο, θα πρέπει να εκτελεστεί ένα βήμα καθαρισμού με 70% Ισοπροπανόλη ή 20% οικιακό λευκαντικό, και στη συνέχεια θα ακολουθήσουν δύο βήματα πλύσης. Στο σημείο αυτό μπορείτε να σβήσετε το όργανο, εφόσον δεν σκοπεύετε να το χρησιμοποιήσετε στο υπόλοιπο της ημέρας. 3. Αφού ολοκληρωθεί η ανάλυση μίας παρτίδας, τα δεδομένα εξάγονται ως αρχείο τιμών διαχωρισμένων με κόμμα (csv). Τα αρχεία αυτά ονομάζονται OUTPUT.CSV και είναι αποθηκευμένα σε έναν φάκελο με το Όνομα Παρτίδας καταχωρισμένο στο Luminex IS. Τα δεδομένα αυτά είναι κατόπιν διαθέσιμα για την εκτέλεση εξακριβώσεων όπως περιγράφεται παρακάτω. *Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του Luminex IS για τη λειτουργία του οργάνου, περιλαμβανομένης της καθημερινής εκκίνησης, της βαθμονόμησης, της συντήρησης και των διαδικασιών τερματισμού λειτουργίας. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η εξακρίβωση δειγμάτων μπορεί να εκτελεστεί ως εξής: Τα παραγόμενα αρχεία CSV μπορούν να ανοιχτούν και τα δεδομένα να υποστούν επεξεργασία με συνηθισμένα προγράμματα λογιστικών φύλλων όπως τα Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro ή παρόμοιο λογισμικό. Η ανάλυση περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα: 1) Επαληθεύστε ότι ο Number of Events (Αριθμός συμβάντων) για κάθε SSO σε κάθε δείγμα είναι τουλάχιστον 60. Οι πληροφορίες αυτές βρίσκονται στην ενότητα DataType: Count (Τύπος δεδομένων: Καταμέτρηση) του αρχείου CSV. 2) Εξακριβώστε ότι οι τιμές για τους συναινετικούς ιχνηλάτες για κάθε δείγμα είναι μεγαλύτερες από τη μικρότερη διάμεση ένταση φθορισμού ή MFI. Τα ελάχιστα κατώφλια είναι ειδικά της παρτίδας και μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα κατωφλίων. Προσοχή: Για να πάρετε αξιόπιστα αποτελέσματα, πρέπει να έχουν συλλεχθεί επαρκή δεδομένα από το όργανο Luminex. Συλλέξτε τουλάχιστον 60 συμβάντα για κάθε SSO. 3) Αφαιρέστε την τιμή του Background Control (Μάρτυρα θορύβου) για κάθε ιχνηλάτη από τις τιμές των δειγμάτων για να πάρετε το διορθωμένο ως προς τον θόρυβο σετ δεδομένων. Οι τιμές των μαρτύρων θορύβου είναι ειδικές της παρτίδας και μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα κατωφλίων. Οι τιμές θορύβου είναι οι μέσες τιμές MFI για κάθε σφαιρίδιο με τις οποίες αντισταθμίζεται ο θόρυβος του υπόβαθρου που οφείλεται στις διακυμάνσεις των σφαιριδίων. 4) Για κάθε δείγμα, διαιρέστε τα διορθωμένα για θόρυβο δεδομένα για κάθε ιχνηλάτη με τη διορθωμένη για θόρυβο τιμή του αντίστοιχου συναινετικού ιχνηλάτη για να πάρετε το ομαλοποιημένο σετ δεδομένων. MFI (Ιχνηλάτης) MFI (Τυφλός μάρτυρας για ιχνηλάτη) MFI (Συναινετικός) MFI (Τυφλός μάρτυρας για συναινετικό) 5) Για κάθε ιχνηλάτη, καταγράψτε την ομαλοποιημένη τιμή στο Φύλλο εργασίας με τον Πίνακα κατωφλίων. 6) Αφότου καθοριστούν όλες οι τιμές, το μοτίβο δραστηριότητας των ιχνηλατών (π.χ. ο συνδυασμός όλων των θετικών και αρνητικών αντιστοιχίσεων για ένα συγκεκριμένο δείγμα) μπορεί να συγκριθεί με τον Πίνακα Δραστηριότητας Ιχνηλατών (LC1024) που παρέχεται στην ιστοσελίδα. Προσοχή: Υπάρχει χωριστός πίνακας κατωφλίων για κάθε γενετικό τόπο. Οι πίνακες κατωφλίων είναι ειδικοί της παρτίδας. Βεβαιωθείτε ότι ο αριθμός παρτίδας στους πίνακες κατωφλίων ταιριάζει με τον αριθμό παρτίδας στο κιτ εξακρίβωσης. Αν μια ομαλοποιημένη τιμή για έναν συγκεκριμένο ιχνηλάτη βρίσκεται πάνω από το μέγιστο κατώφλι για μια αρνητική αντιστοίχιση και κάτω από την ελάχιστη τιμή για μια θετική αντιστοίχιση, το δείγμα θα πρέπει να θεωρηθεί απροσδιόριστο για το συγκεκριμένο ιχνηλάτη. Η εξακρίβωση του δείγματος μπορεί να γίνει, υποθέτοντας πρώτα ότι η τιμή είναι αρνητική και κατόπιν ότι η τιμή είναι θετική. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τις τιμές κατωφλίων, ανατρέξτε στην ενότητα ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ. Σελίδα 6 από 9 LC1437CEEL.3 (05/15)

7 ΈΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Συνιστάται η εκτέλεση ενός αρνητικού κι ενός θετικού ελέγχου σε κάθε δοκιμή, όπως ένα τυφλό διάλυμα ύδατος και ένα προηγουμένως αναγραφόμενο δείγμα αντίστοιχα. Οι ανιχνευτές συναίνεσης των ολιγονουκλεοτιδίων ειδικής αλληλουχίας (SSO), που είναι καταχωρημένοι στον Πίνακα Εισόδου, υβριδοποιούνται στα συγκεκριμένα αλληλόμορφα της αντίστοιχης θέσης. Οι τιμές που λαμβάνονται με τους ανιχνευτές συναίνεσης των ολιγονουκλεοτιδίων ειδικής αλληλουχίας (SSO) από τους θετικούς ελέγχους πρέπει να υπερβαίνουν την τιμή εισόδου για τα ολιγονουκλεοτίδια ειδικής αλληλουχίας (SSO) όπως έχει θεσπιστεί στο Φύλλο του Πίνακα Εισόδου. Το/τα μίγματα ανιχνευτή LIFECODES περιέχουν έναν ή περισσότερους ανιχνευτές συναίνεσης των ολιγονουκλεοτιδίων ειδικής αλληλουχίας που προσδιορίζονται στα φύλλα εργασίας του κιτ εξακρίβωσης. Αυτοί οι ανιχνευτές συναίνεσης υβριδίζονται σε όλα τα αλληλόμορφα και δρουν ως εσωτερικοί μάρτυρες για την επαλήθευση ενίσχυσης και για την επιβεβαίωση υβριδισμών. Εάν η ελάχιστη τιμή δεν ληφθεί για αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια ειδικής αλληλουχίας (SSO), το δείγμα ίσως να μην παράγει τον σωστό τύπο και πρέπει να γίνει επανάληψη της δοκιμής του δείγματος. Η δοκιμασία πρέπει να εκτελεστεί όπως συνιστάται στο εσωτερικό της συσκευασίας καθώς επίσης όπως εκτελείται με κάθε άλλη διαδικασία ποιοτικού ελέγχου που συμφωνεί με τις τοπικές απαιτήσεις και τις απαιτήσεις της πολιτείας, της ομοσπονδίας ή / και των υπηρεσιών διαπίστευσης. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Οι συνθήκες PCR και προσδιορισμού που περιγράφονται απαιτούν επακριβώς ελεγχόμενες συνθήκες. Αποκλίσεις από αυτές τις παραμέτρους μπορεί να οδηγήσουν σε αποτυχία του προϊόντος. Όλα τα όργανα πρέπει να βαθμονομηθούν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή και να χρησιμοποιηθούν εντός των παραμέτρων που ορίζει ο κατασκευαστής. 1) Τα σφαιρίδια πρέπει να προθερμανθούν και να εναιωρηθούν καλά πριν από τη χρήση. Με αυτόν τον τρόπο διασφαλίζεται ότι είναι διαλυμένα τα συστατικά του ρυθμιστικού διαλύματος υβριδισμού. 2) Οι επωάσεις στους 47ºC και 56ºC απαιτούν υψηλό βαθμό ακρίβειας (+/- 0,5ºC). Πρέπει να χρησιμοποιηθεί θερμικός ανακυκλωτής. Η θερμοκρασία πρέπει να επαληθεύεται στα φρεάτια της πλάκας 96 φρεατίων του θερμικού ανακυκλωτή με ένα θερμόζευγος (π.χ., Bio-Rad, Αρ. μοντέλου VPT-0300 ή ισοδύναμο). Η θερμοκρασία μέσα στα φρεάτια και μεταξύ των φρεατίων δεν πρέπει να παρουσιάζει διακυμάνσεις μεγαλύτερες από +/- 0,5ºC. 3) Ο χρόνος στους 56ºC είναι κρίσιμης σημασίας και δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 13 λεπτά συνολικά. Σε αυτόν τον χρόνο περιλαμβάνεται η 8 λεπτά επώαση και χρόνος 5 λεπτών το πολύ για την αραίωση όλων των δειγμάτων με μείγμα διαλύματος αραίωσης/pe-στρεπταβιδίνης. 4) Αφότου αραιωθεί, η ανάλυση δείγματος πρέπει να ολοκληρωθεί εντός 1 ώρας (προστατεύστε το από το φως). 5) Μην αναμείξετε συστατικά από άλλα κιτ και παρτίδες. Λόγω της σύνθετης φύσης της εξακρίβωσης HLA, η ερμηνεία των δεδομένων και οι αντιστοιχίσεις των τύπων πρέπει να εκτελούνται από εξειδικευμένο προσωπικό. ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΠΙΘΑΝΗ ΑΙΤΙΑ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ Χαμηλός αριθμός Το μείγμα ιχνηλατών δεν έχει εναιωρηθεί καλά Προθερμάνετε, χρησιμοποιήστε τη συσκευή υπερήχων σφαιριδίων και τον δονητικό αναδευτήρα και επαναλάβετε τον Αποτυχία κατωφλίου CON Πολλαπλές αποτυχίες SSO ή το δείγμα δεν μπορεί να παράγει αποτέλεσμα εξακρίβωσης HLA Το όργανο δεν λειτουργεί καλά Το δείγμα δεν ενισχύθηκε ή ενισχύθηκε ανεπαρκώς* Εκτός βαθμονόμησης Η διαδρομή ροής του δείγματος είναι φραγμένη Χαμηλό DNA Άλατα στο Κύριο Μείγμα δεν έχουν διαλυθεί Ανεπαρκής πολυμεράση Taq πολυμεράση Οι συνθήκες ενίσχυσης δεν βρίσκονται εντός των καθορισμένων παραμέτρων προσδιορισμό. Βαθμονομήστε το όργανο. (Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του Luminex IS.) Αφαιρέστε και τοποθετήστε τη βελόνα στη συσκευή υπερήχων. Εκτελέστε αντίστροφη έκπλυση. Αν το πρόβλημα επιμένει, επικοινωνήστε με την Immucor Transplant Diagnostics, Inc (888) Ελέγξτε τη συγκέντρωση και καθαρότητα του DNA. Θερμάνετε το Κύριο Μείγμα στους 37ºC για 5 λεπτά, χρησιμοποιήστε απαλά τον δονητικό αναδευτήρα και φυγοκεντρήστε για σύντομο χρονικό διάστημα. Χρησιμοποιήστε την Ταq επικυρωμένη. Δοκιμάστε LIFECODES Πολυμεράση Taq, Αρ. Καταλ Εκτελέστε το θερμικό προφίλ στον θερμικό ανακυκλωτή για να επαληθεύσετε ότι οι παράμετροι βρίσκονται εντός του καθορισμένου εύρους. Χαμηλή διάμεση τιμή έντασης φθορισμού (MFI) Θερμάνετε το διάλυμα αραίωσης στους 45 ο C για 5 λεπτά πριν από τη χρήση και χρησιμοποιήστε δονητικό αναδευτήρα. Φυλάξτε σε θερμοκρασία δωματίου. Αντικαταστήστε την PE-Στρεπταβιδίνη. Ενίσχυση ειδική των αλληλόμορφων Οι συνθήκες ενίσχυσης δεν βρίσκονται εντός των καθορισμένων παραμέτρων Το δείγμα DNA έχει μολυνθεί Το DNA έχει αλλοιωθεί μερικώς Εξάτμιση κατά τη διάρκεια του βήματος υβριδισμού * Η ενίσχυση PCR μπορεί να επαληθευτεί με ηλεκτροφόρηση γέλης (βλ. Παράρτημα A). Εκτελέστε το θερμικό προφίλ στον θερμικό ανακυκλωτή για να επαληθεύσετε ότι οι παράμετροι βρίσκονται εντός του καθορισμένου εύρους. Απομονώστε πάλι DNA από το δείγμα αίματος. Αν δεν χρησιμοποιείτε ολόκληρη την πλάκα, αφήστε μία σειρά άδεια σε κάθε πλευρά των δειγμάτων που θα προσδιοριστούν ώστε να σφραγιστεί καλά η πλάκα. Σελίδα 7 από 9 LC1437CEEL.3 (05/15)

8 ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ Κάθε γενετικός τόπος έχει έναν ιχνηλάτη CON και δύο ιχνηλάτες SSO. Εάν ένα δείγμα περιέχει έναν από τους γενετικούς τόπους που αναλύθηκαν, ο συναινετικός ιχνηλάτης και τουλάχιστον ένας από τους SSO ινχηλάτες για αυτόν τον γενετικό τόπο πρέπει να είναι θετικός. Οι τιμές ιχνηλάτη μπορούν να διαχωριστούν συνήθως ως θετικές και αρνητικές. Σε ορισμένες σπάνιες περιπτώσεις, μια τιμή ενδέχεται να βρίσκεται μεταξύ της θετικής και αρνητικής τιμής αποκοπής και συνεπώς θεωρείται ως απροσδιόριστη. Αν ένα δείγμα περιλαμβάνει απροσδιόριστες τιμές για συγκεκριμένο ιχνηλάτη SSO, η εξακρίβωση του δείγματος πρέπει να γίνει με την υπόθεση ότι ο ιχνηλάτης είναι αρνητικός και κατόπιν με την υπόθεση ότι ο ιχνηλάτης είναι θετικός. Εάν δύο ιχνηλάτες SSO για ένα γενετικό τόπο είναι απροσδιόριστοι, το δείγμα δεν δύναται να προσδιοριστεί και πρέπει να επαναπροσδιοριστεί. Όπως έχει αναφερθεί στην ενότητα Περιορισμοί της Διαδικασίας, η εφαρμογή του πρωτοκόλλου είναι κρίσιμης σημασίας. Οποιαδήποτε απόκλιση μπορεί να προκαλέσει αποτυχία εξακρίβωσης του δείγματος. ΕΙΔΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Όταν τα κιτ εξακρίβωσης LIFECODES HLA SSO Μηδενικών Αλληλόμορφων χρησιμοποιούνται σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο ένθετο του προϊόντος, μπορούν να καθοριστούν τα δείγματα Κλάσης I και Κλάσης II HLA τύπου DNA. Η ανάλυση HLA-Μηδενικών Αλληλόμορφων Κλάσης 1 (Null 1) δείχνει 100% συμφωνία (97,4% χαμηλότερο όριο του Διαστήματος Εμπιστοσύνης 95%)για εστία Α, 100% συμφωνία (97,4% χαμηλότερο του Διαστήματος Εμπιστοσύνης 95%) για εστία Β και 100% συμφωνία (97,4% χαμηλότερο όριο του Διαστήματος Εμπιστοσύνης 95%) για εστία C για 139 δείγματα που αξιολογήθηκαν όταν συγκρίνονται με αποτελέσματα που αποκτήθηκαν με διφορική αλληλουχία. Η ανάλυση HLA Μηδενικών Αλληλόμορφων Κλάσης 2 (Null2) δείχνει 97,1% συμφωνία (92,7% χαμηλότερο όριο του Διαστήματος Εμπιστοσύνης 95%) για εστία DRB 4 και 98,5% συμφωνία (94,8% χαμηλότερο όριο του Διαστήματος Εμπιστοσύνης 95%) για εστία DRB 5 για 137 δείγματα που αξιολογήθηκαν όταν συγκρίνονται με αποτελέσματα που αποκτήθηκαν με αμφίδρομη αλληλουχία. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39: Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΕΣ ΑΔΕΙΕΣ Η πολυμεράση Taq κατασκευάζεται για την Immucor Transplant Diagnostics by Promega Corp. Εχει παρασχεθεί άδεια στην Promega υπό τα Διπλώματα Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ και και των αντιστοίχων του σε άλλες χώρες. Η αγορά του παρόντος προϊόντος περιλαμβάνει μια περιορισμένη, μη μεταβιβαζόμενη άδεια σύμφωνα με το Δίπλωμα Ευρεσιτεχνίας ΗΠΑ ή των αντιστοίχων του σε άλλες χώρες, τα οποία ανήκουν στην εταιρεία Luminex Corporation, για εκτέλεση πολυπλεκτικής ανάλυσης κλινικών δειγμάτων για εξακρίβωση HLA. Κατασκευαστής: Immucor Transplant Diagnostics, Inc., 550 West Avenue, Stamford, Connecticut Η.Π.Α. Τηλ.: +1 (203) ή (888) (Μόνο για τις Η.Π.Α. και Καναδά), Φαξ: +1 (203) Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark 63322, Germany Phone: (+49) , Fax: (+49) Τεχνική Εξυπηρέτηση για την Ευρώπη: Τηλ: +32/ Τελευταία αναθεώρηση και έκδοση του εγγράφου: Αναθ 3 ; ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΤΑ ΑΚΟΛΟΥΘΑ ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΣΗΜΑΤΑ AB Gene AB Gene House Luminex Costar Corning Incorporated Gene Amp Microseal Bio-Rad Laboratories, Inc. Veriti IDNA Agarose Lonza Group, Ltd. LIFECODES GelStar Lonza Group, Ltd. Luminex Corporation Roche Molecular System Applied Biosystem Immucor Inc. Σελίδα 8 από 9 LC1437CEEL.3 (05/15)

9 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ A Ηλεκτροφόρηση γέλης Οι αντιδράσεις PCR που εκτελούνται στα Κιτ εξακρίβωσης LIFECODES HLA-SSO προορίζονται να παράγουν δίκλωνα και μονόκλωνα προϊόντα, τα οποία είναι τα κύρια προϊόντα που υβριδοποιούνται σε SSO. Για διασφάλιση της ποιότητας ή για να αντιμετωπιστούν τα προβλήματα σε ένα πείραμα μπορεί να χρειαστεί να εκτελέσετε ηλεκτροφόρηση γέλης για να εξετάσετε την αντίδραση PCR ως προς την παρουσία ενισχυμένου DNA. Απαιτούμενα υλικά (τα αναφερόμενα ή ισοδύναμα) Electrophoresis Grade Agarose (Lonza Group, Ltd. IDNA Agarose Αρ ) Συσκευή ηλεκτροφόρησης/τροφοδοσία ρεύματος 1X Ρυθμιστικό διάλυμα γέλης (40xTAE, Promega Αρ. V4281) GelStar Nucleic Acid Gel Stain (Lonza Group, Ltd. Αρ ) UV Transilluminator (ChromatoVUE, UVP Inc. Αρ. μοντέλου TM36) Σύστημα φωτογραφικής απεικόνισης Η σχετική μετανάστευση του μονόκλωνου προϊόντος εξαρτάται από τη συγκέντρωση της γέλης και το ρυθμιστικό σύστημα που θα χρησιμοποιηθεί. Οι κατά προσέγγιση μεταναστεύσεις για κάθε ενίσχυση αναφέρονται παρακάτω για δείγματα που αναλύθηκαν σε γέλη αγαρόζης 2% σε 1X TAE ρυθμιστικό διάλυμα. Συνθήκες ηλεκτροφόρησης 1. Αφαιρέστε το GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Group, Ltd. Αρ ) από τον καταψύκτη για να αποψυχθεί. Διατηρήστε το σε σκοτεινό μέρος. 2. Η γέλη που χρησιμοποιείται στη διαδικασία πρέπει να είναι 2%, δηλ. για ένα στρώμα γέλης 200ml χρησιμοποιήστε 4 grams αγαρόζης σε 200ml 1X TAE (Αραιώστε από 40X TAE). Προσθέστε 10µl GelStar Nucleic Acid Stain στην αποψυχθείσα αγαρόζη. Όταν ρίχνετε τη γέλη, βεβαιωθείτε ότι έχετε αφήσει αρκετό χώρο για να διατρέξει το DNA ικανοποιητική απόσταση (2,5 έως 5 cm). ΠΡΟΣΟΧΗ: Το GelStar είναι δυνητικά καρκινογόνο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μπορείτε να χρησιμοποιείτε γέλες με 20µl Βρωμιούχου Αιθιδίου 10mg/mL αντί για το GelStar Nucleic Acid Stain. Η ένταση ζώνης του προϊόντος θα είναι χαμηλότερη σε γέλες που περιέχουν Βρωμιούχο Αιθίδιο σε σχέση με τις γέλες που περιέχουν GelStar. ΠΡΟΣΟΧΗ: Το Βρωμιούχο Αιθίδιο είναι γνωστό καρκινογόνο. 3. Διατηρήστε τη γέλη σε σκοτεινό μέρος και αφήστε την να στερεοποιηθεί. 4. Φορτώστε ένα μείγμα 2,5µL του κάθε προϊόντος PCR και 2,5µL 2 X φόρτωσης buffer με ορατές χρωστική ουσία ανά δείγμα, ανά ενίσχυση. Αφήστε τη γέλη στο σκοτάδι στα 160 Volt περίπου για 45 λεπτά ή μέχρι να δείτε χωριστές ζώνες για το μονόκλωνο και το δίκλωνο προϊόν (η ζώνη του κυανού βρωμοφαινόλης ή άλλος ορατός δείκτης μεταναστεύει 2,5 έως 5 cm από τα φρεάτια). 5. Φωτογραφήστε χρησιμοποιώντας τη συσκευή υπεριώδους διαφανοσκόπησης (UV Transilluminator) με φωτογραφικό φίλτρο GelStar Yellow Photographic Filter (Lonza Group, Ltd. No 50536). ΠΡΟΣΟΧΗ: Να φοράτε προστατευτικό εξοπλισμό όταν χειρίζεστε το GelStar Nucleic Acid Stain ή Βρωμιούχο Αιθίδιο, καθώς και όταν φωτογραφίζετε τη γέλη χρησιμοποιώντας τη συσκευή UV Transilluminator. 6. Ανάλυση γέλης Μηδενικό Κλάσης 1 Μηδενικό Κλάσης 2 Δίκλωνο(α) (bp) ~210, ~280 ~180, ~280 Μονόκλωνο (bp) ~150,~180 ~140,~180 Ερμηνεία γέλης Φρεάτιο Δίκλωνο DNA Μονόκλωνο DNA Ζώνη εκκινητή Ενίσχυση (Έντονο) (λιγότερο έντονο) Χωρίς ενίσχυση Σελίδα 9 από 9 LC1437CEEL.3 (05/15)