ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. 60 ml P/N: Specimen Diluent Kit. 5.1 Liters P/N: Wash Reagent

Transcript

1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLACAP 72 Tests P/N: HLA-B*5701 Screening Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CTM SD 60 ml P/N: Specimen Diluent Kit COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: Wash Reagent ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ... 1 ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ... 1 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ... 3 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ... 5 ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ... 7 ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ... 8 ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ... 9 ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΑΛΛΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ ΠΑΡΕΜΒΑΛΛΟΜΕΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ AΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΜΗ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ To COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test είναι μια in vitro εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την παρουσία ή απουσία του αλληλόμορφου HLA-B*5701 σε ανθρώπινο ολικό περιφερικό αίμα EDTA χρησιμοποιώντας το COBAS AmpliPrep Όργανο για αυτόματη επεξεργασία δειγμάτων και τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή για αυτόματη ενίσχυση και ανίχνευση. Κατά τη συνταγογράφηση θεραπείας, ενδέχεται να χρησιμοποιηθούν πληροφορίες για την παρουσία ή την απουσία του αλληλόμορφου HLA-B*5701 από τους ιατρούς, προκειμένου να αποφευχθεί η συνταγογράφηση αμπακαβίρης, η οποία μπορεί να προκαλέσει εν δυνάμει επικίνδυνη αντίδραση υπερευαισθησίας σε ασθενείς που φέρουν το αλληλόμορφο HLA-B*5701. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Τα γονίδια HLA τάξης Ι και ΙΙ κωδικοποιούν για ετεροδιμερή μόρια στην επιφάνεια των κυττάρων που δεσμεύονται και παρουσιάζουν πεπτιδικά αντιγόνα σε CD8+ T λεμφοκύτταρα και CD4+ T λεμφοκύτταρα αντίστοιχα. Τα γονίδια HLA είναι τα πιο πολυμορφικά γονίδια στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Ο πιο πολυμορφικός από τους τόπους αυτούς, ο τόπος HLA-B, διαθέτει περισσότερες από 2000 παραλλαγές αλληλόμορφων. Η πλειονότητα αυτών των παραλλαγών αλληλόμορφων κωδικοποιούν πολυμορφικά κατάλοιπα στην αύλακα δέσμευσης πεπτιδίων που καθορίζουν τη φύση των πεπτιδίων που μπορούν να δεσμευθούν και τη φύση του Τ κυτταρικού υποδοχέα που αλληλεπιδρά με το σύμπλεγμα πεπτιδίων-hla. Ο αντιγονοειδικός υποδοχέας στα Τ λεμφοκύτταρα αναγνωρίζει τόσο το συγκεκριμένο πεπτίδιο όσο και το συγκεκριμένο μόριο παραλλαγής HLA και ενεργοποιεί ανοσοαπόκριση προς το πεπτίδιο. Οι παραλλαγές αλληλόμορφων στις θέσεις HLA σχετίζονται με μια πλειάδα ασθενειών, αυτοάνοσων, μολυσματικών και καρκίνων, καθώς και με αλλεργικές αντιδράσεις υπερευαισθησίας σε συγκεκριμένα φάρμακα. Η ενότητα «Πληροφορίες Αναθεώρησης Εγγράφου» βρίσκεται στο τέλος του παρόντος εγγράφου. 1

2 Πολλές ανεπιθύμητες ενέργειες των φαρμάκων οφείλονται σε παθογόνες ανοσοαποκρίσεις στο εκάστοτε φάρμακο ή σε πεπτίδια που έχουν τροποποιηθεί από το εκάστοτε φάρμακο. Πολλές από τις ανεπιθύμητες αυτές αποκρίσεις στα φάρμακα επηρεάζονται από τη γενετική ποικιλομορφία στα ιδιαίτερα πολυμορφικά γονίδια HLA, που κωδικοποιούν τα μόρια της τάξης Ι και της τάξης ΙΙ. Η αλλεργική υπερευαισθησία στον αναστολέα της αντίστροφης μεταγραφάσης του HIV, την αμπακαβίρη, σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με ένα συγκεκριμένο αλληλόμορφο στη θέση HLA-B, το HLA-B*5701. Οι θετικές και αρνητικές εκτιμήσεις πρόβλεψης του προσδοκώμενου για το HLA-B*5701 έχουν διαπιστωθεί στην κλινική δοκιμή PREDICT-1 1,2. Η εκτενής αυτή μελέτη καθώς και άλλες αναφορές 3,4,5 απέδειξαν ότι είναι εξαιρετικά χρήσιμη κλινικά η εξέταση των ασθενών για το αλληλόμορφο, με αποτέλεσμα το Υπουργείο Υγείας και Ανθρώπινων Υπηρεσιών (DHHS) των Η.Π.Α. και η Διεθνής Εταιρεία για το AIDS-Τμήμα Η.Π.Α. (IAS) να εκδώσουν σύσταση για τον έλεγχο του HLA-B*5701 πριν από τη χορήγηση θεραπείας σε ασθενείς με HIV στους οποίους δεν έχει χορηγηθεί στο παρελθόν αμπακαβίρη 6,7. Περίπου 5%-8% των ασθενών που έχουν προσβληθεί από τον ιό HIV και στους οποίους έχει χορηγηθεί το φάρμακο κατά του HIV αμπακαβίρη (GlaxoSmithKline, Brentford, United Kingdom) εμφανίζουν αλλεργική αντίδραση υπερευαισθησίας εντός των πρώτων 6 εβδομάδων μετά την έναρξη της θεραπείας. Στα κλινικά συμπτώματα συμπεριλαμβάνονται το εξάνθημα, ο πυρετός και γαστροεντερικά συμπτώματα, ενώ η συνεχής χρήση μπορεί να θέσει σε κίνδυνο τη ζωή. Μελέτες γενετικής συσχέτισης έδειξαν ότι η παρουσία του αλληλόμορφου HLA-B*5701 σε ασθενείς με HIV αποτελεί ιδιαίτερα σημαντικό παράγοντα κινδύνου για υπερευαισθησία στην αμπακαβίρη 1,2,3,4,5,7,8,9. Η συχνότητα του αλληλόμορφου του HLA-B*5701 ανέρχεται σε 2-4% στους καυκάσιους πληθυσμούς (μέση συχνότητα φορέων = 6%) και σε 0,01-0,05% και σε 2-5% σε αφρικανικούς και ασιατικούς πληθυσμούς, αντίστοιχα (The National Center for Biotechnology Information, Major Histocompatibility Database dbmhc). Λειτουργικές μελέτες in vitro αποκρίσεων Τ κυττάρων σε κύτταρα παλμικά επιφορτισμένα με αμπακαβίρη 10 υποδεικνύουν ότι το αλληλόμορφο B*5701 δεν είναι απλώς ένας γενετικός δείκτης που συσχετίζεται με την ανεπιθύμητη αυτή ενέργεια του φαρμάκου, αλλά ότι αποτελεί καθοριστικό αιτιώδη παράγοντα αλλεργικής υπερευαισθησίας. Συγκρίνοντας τις in vitro αποκρίσεις Τ κυττάρων μεταξύ των μορίων HLA που κωδικοποιούνται από άλλα αλληλόμορφα B*57, καθώς και τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα που παράγονται από κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση, οι συγγραφείς αυτοί συμπέραναν ότι ο πολυμορφισμός στη θέση 116 (Ser στο B*5701 και τα εξαιρετικά σπάνια B*5706 και B*5708 με τα Tyr στα B*5702, *5703,*5705,*5707 και *5709 και Asp στο B*5704) ήταν ο κύριος υπεύθυνος για την αναγνώριση και την απόκριση σε κύτταρα παρουσίασης αντιγόνου παλμικά επιφορτισμένα με αμπακαβίρη 10. Η μελέτη PREDICT-1 ήταν μια εκτενής τυχαιοποιημένη κλινική δοκιμή που δημοσιεύτηκε το 2008, επίκεντρο της οποίας ήταν ο προοπτικός γενετικός έλεγχος και η υπερευαισθησία στην αμπακαβίρη και η οποία απέδειξε την προγνωστική κλινική χρησιμότητα του ελέγχου του B*5701 για τη συγκεκριμένη ανεπιθύμητη ενέργεια του φαρμάκου 1,2. Στη μελέτη αυτή επιβεβαιώθηκε η αλλεργική υπερευαισθησία στην αμπακαβίρη με δοκιμή επιδερμικής ευαισθησίας και καθορισμό αλληλόμορφου B*5701 με την αλληλουχία των εξωνίων 2 και 3 HLA-B. Πρωταρχικός στόχος της μελέτης ήταν να εκτιμηθεί η κλινική χρησιμότητα του ελέγχου του HLA-B*5701 πριν από τη θεραπεία με φάρμακα HAART που περιέχουν αμπακαβίρη. Δευτερεύων στόχος ήταν να εκτιμηθούν οι επιπτώσεις του προσδοκώμενου ελέγχου HLA-B*5701 στην αξιοποίηση των πόρων της υγειονομικής περίθαλψης, καθώς και να εκτιμηθεί η αποτελεσματικότητα διαφόρων τεχνολογιών ανίχνευσης του HLA-B*5701. Με βάση τα αποτελέσματα της δοκιμής PREDICT-1 1,2, αλλά και μεταγενέστερων μελετών 3,4, ο έλεγχος για την παρουσία του HLA-B*5701 μεταξύ ασθενών με HIV στους οποίους δεν έχει χορηγηθεί ποτέ αμπακαβίρη είναι δυνατόν να ελαχιστοποιήσει τις αλλεργικές αντιδράσεις υπερευαισθησίας και να μεγιστοποιήσει τη συμβατότητα, ενώ από τον Ιούλιο του 2008 το DHHS και το IAS συνιστούν τη διεξαγωγή του πριν από τη θεραπεία 6,7. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test χρησιμοποιεί τεχνολογία PCR για τη διευκόλυνση του ελέγχου HLA-B*5701 στο συνηθισμένο κλινικό περιβάλλον για τη διαχείριση ασθενών με HIV. 2

3 ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test είναι μια εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ανίχνευση του αλληλόμορφου HLA-B*5701 στο ολικό ανθρώπινο αίμα. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test βασίζεται σε δύο κύριες διαδικασίες: (1) στην προετοιμασία δειγμάτων για την απομόνωση του ανθρώπινου γονιδιωματικού DNA και (2) στην ταυτόχρονη ενίσχυση PCR και ανίχνευση του αλληλόμορφου HLA-B*5701 με διάσπαση ενός διπλά επισημασμένου ολιγονουκλεοτιδικού ιχνηθέτη ειδικού για το αλληλόμορφο HLA-B*5701. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test επιτρέπει την αυτοματοποιημένη προετοιμασία δειγμάτων ακολουθούμενη από την αυτοματοποιημένη ενίσχυση PCR και ανίχνευση του αλληλόμορφου HLA-B*5701. Το αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος περιέχει εκκινητές και ιχνηθέτες ειδικούς για το αλληλόμορφο HLA-B*5701, ανιχνεύοντας τις πολυμορφικές αλληλουχίες του εξωνίου 3. Το Κύριο Μίγμα δημιουργήθηκε για να διασφαλιστεί η στοχευμένη ανίχνευση του αλληλόμορφου HLA-B*5701. Η ανίχνευση ενισχυμένου DNA πραγματοποιείται με χρήση ενός διπλά επισημασμένου ολιγονουκλεοτιδικού ιχνηθέτη ειδικού για το HLA-B*5701. Το αντιδραστήριο Κυρίου Μίγματος περιέχει επίσης εκκινητές και έναν ιχνηθέτη ειδικούς για όλα τα αλληλόμορφα στη θέση HLA-B, ανιχνεύοντας τις αλληλουχίες εξωνίου 2. Η δεύτερη αυτή ομάδα εκκινητών και ιχνηθέτη λειτουργεί ως εσωτερικός έλεγχος ανάλυσης, αφού η θέση HLA-B απαντάται σε όλα τα δείγματα και οι εκκινητές και ο ιχνηθέτης ανιχνεύουν όλα τα αλληλόμορφα HLA-B. Η ανίχνευση του αλληλόμορφου HLA-B*5701 και του ενισχυμένου DNA εξωνίου 2 θέσης HLA-B πραγματοποιείται ταυτόχρονα με χρήση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Επιλογή Στόχου Η επιλογή πολυμορφικών αλληλουχιών στο εξώνιο 3 των γονιδίων HLA-B βασίστηκε στην τεκμηριωμένη συσχέτιση του HLA-B*5701 με την αλλεργική υπερευαισθησία στην αμπακαβίρη και τα in vitro πειραματικά δεδομένα που ενοχοποιούν το πολυμορφικό κατάλοιπο του αμινοξέος 116, που είναι κωδικοποιημένο στο εξώνιο 3. Το HLA-B*5701 κωδικοποιεί ένα κατάλοιπο σερίνης στη θέση 116, ενώ τα περισσότερα άλλα αλληλόμορφα HLA-B κωδικοποιούν τυροσίνη ή φαινυλαλανίνη στη θέση αυτή. Στόχος της δημιουργίας των εκκινητών και των ιχνηθετών για την ανάλυση αυτή είναι οι συγκεκριμένες πολυμορφικές αλληλουχίες στο εξώνιο 3 της θέσης HLA-B που διακρίνουν το αλληλόμορφο HLA-B*5701 από τα άλλα αλληλόμορφα της θέσης Β. Πιο συγκεκριμένα, ο ιχνηθέτης υβριδίζεται σε αλληλουχίες εξωνίου 3 που εκτείνονται στην περιοχή που κωδικοποιεί το κατάλοιπο αμινοξέος στη θέση 116, την κρίσιμη θέση αμινοξέος για τον προσδιορισμό της ανοσοαπάντησης στην αμπακαβίρη. Για εσωτερικό έλεγχο, ο επιλεγμένος στόχος της δημιουργίας των εκκινητών και των ιχνηθετών περιλαμβάνει αλληλουχίες στο εξώνιο 2 της θέσης HLA-B που εμφανίζονται σε όλα τα αλληλόμορφα στη θέση αυτή. Προετοιμασία Δειγμάτων Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test χρησιμοποιεί αυτοματοποιημένη προετοιμασία δείγματος στο COBAS AmpliPrep Όργανο με τη γενική τεχνική δέσμευσης σε βάση διοξειδίου του πυριτίου. Η διαδικασία επεξεργάζεται 250 µl ολικού αίματος διαλυμένου σε 250 µl COBAS TaqMan Αραιωτικό Δείγματος. Τα κύτταρα ολικού αίματος που περιέχουν ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA υποβάλλονται σε λύση μέσω επώασης σε υψηλή θερμοκρασία με χαοτροπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης/δέσμευσης που απελευθερώνει νουκλεϊκά οξέα. Σε κάθε δείγμα εισάγονται αντιδραστήριο λύσης και μαγνητικά σωματίδια γυαλιού και το μίγμα επωάζεται με τρόπο ώστε το ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA να δεσμεύεται στην επιφάνεια των μαγνητικών σωματιδίων γυαλιού. Οι αδέσμευτες ουσίες όπως άλατα, πρωτεΐνες και άλλες κυτταρικές ακαθαρσίες, απομακρύνονται με την πλύση των μαγνητικών σωματιδίων γυαλιού. Μετά το διαχωρισμό των μαγνητικών σωματιδίων γυαλιού και την ολοκλήρωση των σταδίων πλύσης, τα νουκλεϊκά οξέα που προσροφήθηκαν εκλούονται με υδατικό διάλυμα σε υψηλή θερμοκρασία. Το επεξεργασμένο δείγμα, που περιέχει το απελευθερωμένο ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA, προστίθεται στο μίγμα ενίσχυσης και μεταφέρεται στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. 3

4 Ενίσχυση PCR Ενίσχυση Στόχου Η αντίδραση ενίσχυσης PCR εκτελείται με το θερμοσταθερό ανασυνδυασμένο ένζυμο Thermus species Z05 DNA πολυμεράση (Z05). Τα δείγματα που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία προστίθενται στο μίγμα ενίσχυσης σε σωληνάρια ενίσχυσης (Κ-tubes), στα οποία πραγματοποιείται ενίσχυση PCR. Ο θερμοκυκλοποιητής στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή θερμαίνει το μίγμα αντίδρασης για την αποδιάταξη του γονιδιωματικού DNA και για την έκθεση των ειδικών αλληλουχιών στόχου εκκινητή. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι εκκινητές υβριδίζονται στο DNA στόχο. Η πολυμεράση Ζ05, παρουσία Mg 2+ /Mn 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntps), στους οποίους περιλαμβάνονται η τριφωσφορική δεοξυαδενοσίνη, δεοξυγουανοσίνη, δεοξυκυτιδίνη, δεοξυουριδίνη και δεοξυθυμιδίνη, επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές κατά μήκος του προτύπου-στόχου σχηματίζοντας μόρια δίκλωνου DNA που ονομάζονται κλώνοι (amplicon). Ο COBAS TaqMan Αναλυτής ή ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής επαναλαμβάνει αυτόματα τη διαδικασία αυτή για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους προορίζεται για το διπλασιασμό του DNA κλώνου (amplicon). Ο απαιτούμενος αριθμός κύκλων προγραμματίζεται εκ των προτέρων στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο στις δύο περιοχές των θέσεων HLA-B μεταξύ των εκκινητών. Δεν πραγματοποιείται ενίσχυση σε ολόκληρο το ανθρώπινο γονιδίωμα. Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του νουκλεϊκού οξέος στόχου από το δείγμα επιτυγχάνεται με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη-ν-γλυκοζυλάση) και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp). Το ένζυμο AmpErase αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη 11, αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης ως ενός από τα dntp του αντιδραστηρίου Κύριου Μίγματος. Για το λόγο αυτό, μόνο ο κλώνος (amplicon) περιέχει δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του DNA στόχου. Επίσης, οποιοδήποτε μη ειδικό προϊόν που σχηματίζεται μετά την αρχική ενεργοποίηση του Κύριου Μίγματος από το μαγνήσιο/μαγγάνιο καταστρέφεται από το ένζυμο AmpErase. To ένζυμο AmpErase, που περιλαμβάνεται στο αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος, καταλύει την απομάκρυνση των καταλοίπων δεοξυουριδίνης από το DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη ανοίγοντας την αλυσίδα της δεοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμαίνεται στο πρώτο βήμα θερμοκυκλοποίησης, η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase παραμένει αδρανές για παρατεταμένο χρονικό διάστημα σε θερμοκρασίες πάνω από 55 C, δηλαδή σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης και για το λόγο αυτόν δεν καταστρέφει τον κλώνο (amplicon) στόχο που δημιουργείται κατά την ενίσχυση. Ανίχνευση Προϊόντων PCR σε ένα COBAS TaqMan Test Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test χρησιμοποιεί τεχνολογία PCR πραγματικού χρόνου 12,13. Η χρήση ιχνηθετών με διπλή φθορίζουσα επισήμανση επιτρέπει την ανίχνευση της συσσώρευσης προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο παρακολουθώντας την ένταση εκπομπής των φθοριζουσών χρωστικών αναφορέα (reporter) που απελευθερώνονται κατά τη διαδικασία της ενίσχυσης. Οι ιχνηθέτες αποτελούνται από ειδικούς για το αλληλόμορφο HLA-B*5701 και το HLA-B ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες με χρωστική αναφορέα (reporter) και παρεμποδιστή (quencher). Στο COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test οι ιχνηθέτες αλληλόμορφου HLA-B*5701 και HLA-B επισημαίνονται με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές αναφορέα (reporter). Όταν αυτοί οι ιχνηθέτες είναι ανέπαφοι, ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) καταστέλλεται από την εγγύτητα της χρωστικής παρεμποδιστή (quencher), λόγω των φαινομένων μεταφοράς ενέργειας τύπου Förster. Κατά τη διάρκεια της PCR, ο ιχνηθέτης υβριδίζεται σε μια αλληλουχία στόχο και διασπάται από την 5' 3' δραστηριότητα νουκλεάσης της θερμοσταθερής Z05 DNA πολυμεράσης. Μόλις απελευθερωθούν και αποχωριστούν οι χρωστικές αναφορέα (reporter) και παρεμποδιστή (quencher), δεν πραγματοποιείται πλέον παρεμπόδιση και η φθορίζουσα δραστηριότητα της χρωστικής αναφορέα (reporter) αυξάνεται. Η ενίσχυση και ανίχνευση του DNA εξωνίου 3 HLA-B (αλληλόμορφο HLA-B*5701) και του DNA εξωνίου 2 HLA-B μετρώνται ανεξάρτητα σε διαφορετικά μήκη κύματος. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης εκπομπής των μεμονωμένων χρωστικών αναφορέα (reporter), επιτρέποντας την ανεξάρτητη ταυτοποίηση του DNA του αλληλόμορφου HLA-B*5701 και του DNA εξωνίου 2 HLA-B. 4

5 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test (P/N: ) HLACAP 72 τεστ B*5701 CS1 1 x 72 Εξετάσεις (Κασέτα Αντιδραστηρίου Μαγνητικών Σωματιδίων Γυαλιού HLA-B*5701) Μαγνητικά σωματίδια γυαλιού 93% Ισοπροπανόλη Xi 93% (w/w) Ισοπροπανόλη F Ερεθιστικό 93% (w/w) Ισοπροπανόλη Πολύ Εύφλεκτο B*5701 CS2 1 x 72 Εξετάσεις (Κασέτα Αντιδραστηρίου Λύσης HLA-B*5701) Διένυδρο κιτρικό νάτριο 42,5% Θειοκυανική γουανιδίνη < 14% Πολιδοκανόλη 0,9% Διθειοθρεϊτόλη Xn 42,5% (w/w) Θειοκυανική γουανιδίνη Επιβλαβές B*5701 CS3 1 x 72 Εξετάσεις (Κασέτα Πολλαπλών Αντιδραστηρίων HLA-B*5701) EB, v2.0 (Ρυθμιστικό Διάλυμα Έκλουσης) Ρυθμιστικό διάλυμα με βάση tris 0,2% Μεθυλπαραμπένη 1 x 8,1 ml 5

6 B*5701 CS4 1 x 72 Εξετάσεις Κασέτα Αντιδραστηρίου Ειδική για την Εξέταση HLA-B*5701 που περιέχει: B*5701 MMX 1 x 3,3 ml (Κύριο Μίγμα HLA-B*5701) Ρυθμιστικό διάλυμα Tricine Οξικό κάλιο Υδροξείδιο του καλίου 3% Διμεθυλοσουλφοξείδιο EDTA < 0,03% Tween 20 Γλυκερόλη < 0,03% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,003% Νοηματικοί και αντινοηματικοί εκκινητές στο αλληλόμορφο HLA-B*5701 και τις θέσεις HLA-B < 0,003% Ολιγονουκλεοτιδικό απταμερές < 0,003% Ειδικοί για το αλληλόμορφο HLA-B*5701 και τις θέσεις HLA-B ολιγονουκλεοτιδικοί ιχνηθέτες με φθορίζουσα επισήμανση < 0,05% Z05 DNA Πολυμεράση (μικροβιακό) < 0,1% Ένζυμο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) (μικροβιακό) 0,09% Αζίδιο του νατρίου CTM Mg 2+ /Mn 2+ 1 x 19,8 ml (CTM Διάλυμα Μαγνησίου / Μαγγανίου) < 0,2% Οξικό μαγνήσιο < 0,4% Οξικό μαγγάνιο Παγόμορφο οξικό οξύ 0,09% Αζίδιο του νατρίου B*5701 (+) C 6 x 0,25 ml (Θετικός Ορός Ελέγχου HLA-B*5701) Ρυθμιστικό Διάλυμα Tris EDTA < 0,001% Ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA 0,09% Αζίδιο του νατρίου B*5701 ( ) C 6 x 0,25 ml (Αρνητικός Ορός Ελέγχου HLA-B*5701) Ρυθμιστικό Διάλυμα Tris EDTA < 0,001% Ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA 0,09% Αζίδιο του νατρίου B*5701 (+) C Clip 1 x 6 Κλιπ (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου HLA-B*5701) B*5701 ( ) C Clip 1 x 6 Κλιπ (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Αρνητικού Ορού Ελέγχου HLA-B*5701) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Specimen Diluent Kit COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Κιτ Αραιωτικών Δειγμάτων (P/N: ) CTM SD (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αραιωτικό Δειγμάτων ) Ρυθμιστικό Διάλυμα Tris EDTA 0,09% Αζίδιο του Νατρίου CTM SD 60 ml 10 x 6 ml 6

7 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης (P/N: ) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης) Διένυδρο κιτρικό νάτριο < 0,1% N-μεθυλισοθειαζολόνη-HCl PG WR 5,1 L ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ A. ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. B. Η παρούσα εξέταση προορίζεται για χρήση με ανθρώπινο ολικό αίμα στο αντιπηκτικό EDTA. C. Μην εκτελείτε αναρρόφηση με πιπέτα από το στόμα. D. Απαγορεύεται το κάπνισμα και η κατανάλωση τροφίμων και ποτών στους χώρους εργασίας του εργαστηρίου. Φοράτε προστατευτικά γάντια μίας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά κατά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων των κιτ. Πλένετε καλά τα χέρια σας μετά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων εξέτασης. E. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια και ριβονουκλεάση όταν αφαιρείτε τα κλάσματα δείγματος από τα φιαλίδια ορών ελέγχου. F. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών μίας χρήσης με ακροφύσια χωρίς RNase. G. Μη συγκεντρώνετε ορούς ελέγχου από διαφορετικές παρτίδες ή από διαφορετικές φιάλες της ίδιας παρτίδας. H. Μη συνδυάζετε κασέτες αντιδραστηρίων ή ορούς ελέγχου από διαφορετικά κιτ. I. Μην ανοίγετε τις κασέτες COBAS AmpliPrep και μην αλλάζετε, αναμιγνύετε, αφαιρείτε ή προσθέτετε φιάλες. J. Η απόρριψη των αχρησιμοποίητων αντιδραστηρίων, των απορριμμάτων και των δειγμάτων θα πρέπει να πραγματοποιείται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. K. Μη χρησιμοποιείτε ένα κιτ μετά την ημερομηνία λήξης του. L. Δελτία Δεδομένων Ασφάλειας Υλικών (MSDS) διατίθενται κατόπιν αίτησης από τα τοπικά γραφεία της Roche. M. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να πραγματοποιείται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως εκείνες που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 14 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 15. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απoσταγμένο νερό. Σημείωση: Τα υγρά λευκαντικά οικιακής χρήσης που διατίθενται στο εμπόριο περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Με την αραίωση λευκαντικού για οικιακή χρήση σε αναλογία 1:10 παράγεται διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. N. Τα B*5701 MMX, CTM Mg 2+ /Mn 2+, B*5701 (+) C, B*5701 ( ) C και CTM SD περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Κατά την απόρριψη διαλυμάτων που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα νερού για να αποφευχθεί ο σχηματισμός αζιδίων. O. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Αποφεύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Αν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Σε περίπτωση διαρροής αυτών των αντιδραστηρίων, αραιώστε με νερό πριν τα σκουπίσετε. 7

8 P. Μην επιτρέπετε την επαφή μεταξύ του B*5701 CS2 και των υγρών αποβλήτων από το COBAS AmpliPrep Όργανο που περιέχουν θειοκυανική γουανιδίνη με το διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικού). Τα μίγματα αυτά μπορεί να παράγουν ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο. Q. Όταν απορρίπτετε χρησιμοποιημένες Μονάδες Επεξεργασίας Δειγμάτων (SPUs) του COBAS AmpliPrep που περιέχουν θειοκυανική γουανιδίνη αποφύγετε οποιαδήποτε επαφή με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικό). Τα μίγματα αυτά μπορεί να παράγουν ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο. ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ A. Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια ή τους ορούς ελέγχου. B. Αποθηκεύετε τα B*5701 CS1, B*5701 CS2, B*5701 CS3 και B*5701 CS4 στους 2-8 C. Αν δεν χρησιμοποιηθούν, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά για 90 ημέρες στους 2-8 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. Τα B*5701 CS1, B*5701 CS2, B*5701 CS3 και B*5701 CS4 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για έως και 96 ώρες συνολικά μετά την τοποθέτησή τους στο COBAS AmpliPrep Όργανο. Τα αντιδραστήρια πρέπει να αποθηκεύονται στους 2-8 C μεταξύ των κύκλων των οργάνων. C. Αποθηκεύστε τα B*5701 (+) C και B*5701 ( ) C στους 2-8 C. Οι οροί ελέγχου αυτοί παραμένουν σταθεροί μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, η ποσότητα που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. D. Αποθηκεύστε το CTM SD στους 2-25 C. Το αραιωτικό δείγματος παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. E. Αποθηκεύετε τα κλιπ Γραμμωτού κώδικα [B*5701 (+) C Clip και B*5701 ( ) C Clip] στους 2-30 C. F. Αποθηκεύετε το PG WR στους 2-30 C. Το PG WR παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, το αντιδραστήριο αυτό παραμένει σταθερό για 60 ημέρες στους 2-30 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. 8

9 ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test (P/N: ) HLACAP B*5701 CS1 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Μαγνητικών Σωματιδίων Γυαλιού HLA-B*5701) B*5701 CS2 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Λύσης HLA-B*5701) B*5701 CS3 (Κασέτα Πολλαπλών Αντιδραστηρίων HLA-B*5701) B*5701 CS4 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Ειδικού για την Εξέταση HLA-B*5701) B*5701 (+) C (Θετικός Ορός Ελέγχου HLA-B*5701) B*5701 ( ) C (Αρνητικός Ορός Ελέγχου HLA-B*5701) B*5701 (+) C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου HLA-B*5701) B*5701 ( ) C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Αρνητικού Ορού Ελέγχου HLA-B*5701) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Specimen Diluent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αραιωτικό Δειγμάτων (P/N: ) CTM SD CTM SD (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αραιωτικό Δειγμάτων) C. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης (P/N: ) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης) 9

10 ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Όργανα και Λογισμικό Αναλώσιμα COBAS AmpliPrep Όργανο COBAS TaqMan Αναλυτής ή COBAS TaqMan 48 Αναλυτής Προαιρετικά: cobas p 630 Όργανο Προαιρετικά: Docking Station AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3 Σταθμός Δεδομένων για το AMPLILINK λογισμικό, με εκτυπωτή Εγχειρίδια Οργάνου και Λογισμικού: Εγχειρίδιο του COBAS AmpliPrep Οργάνου για χρήση με τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή ή το cobas p 630 όργανο και το AMPLILINK λογισμικό, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan αναλυτή (και του προαιρετικού docking station), για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 αναλυτή, για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3 Εγχειρίδιο εφαρμογής AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3 για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το cobas p 630 Όργανο. Προαιρετικά: Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου, Έκδοση Λογισμικού 2.2 Μονάδες επεξεργασίας δειγμάτων: SPUs Σωληνάρια εισόδου δειγμάτων (S-tubes) με κλιπ γραμμωτού κώδικα Υποδοχείς K-tips Κιβώτιο των 12 x 96 K-tube ΑΛΛΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Υποδοχέας Δειγμάτων (υποδοχέας SK24) Υποδοχέας Αντιδραστηρίων Υποδοχέας SPU Πωματιστής K-tube, μηχανοκίνητος Πωματιστής K-tube K-carrier Σύστημα μεταφοράς K-carrier Υποδοχέας K-carrier Συσκευές πιπέτας με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς RΝase (χωρητικότητα 1000 μl)* Γάντια μίας χρήσης, χωρίς πούδρα Αναδευτήρας τύπου Vortex * Οι πιπέτες πρέπει να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ακροφύσια με φραγή αερολυμάτων ή θετική μετατόπιση, χωρίς RNase, πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου ορίζεται, για την αποφυγή της διασταυρούμενης μόλυνσης των δειγμάτων και των κλώνων (amplicon). 10

11 ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Σημείωση: Σημείωση: Όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. Η παρούσα εξέταση έχει εγκριθεί μόνο για χρήση με ανθρώπινο ολικό αίμα που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικό EDTA. Η εξέταση άλλων τύπων δειγμάτων μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. A. Συλλογή Δειγμάτων Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test προορίζεται για χρήση με δείγματα ολικού αίματος. Το αίμα πρέπει να συλλέγεται σε αποστειρωμένα σωληνάρια με χρήση αντιπηκτικού EDTA (μοβ πώμα) και να αναμιγνύεται επαρκώς σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή των σωληναρίων. Αποθηκεύετε το ολικό αίμα στους 2-25 C για έως και 24 ώρες, στους 2-8 C για έως και 72 ώρες ή στους -20 έως -80 C για έως και 10 εβδομάδες. Κατά την αποθήκευση στους -20 έως -80 C, συνιστάται η αποθήκευση των δειγμάτων σε κλάσματα των 1 ml σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου 2,0 ml με βιδωτό πώμα (όπως τα Sarstedt ). B. Μεταφορά Δειγμάτων Η μεταφορά ολικού αίματος πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς που αφορούν στη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων 16. Το ολικό αίμα πρέπει να μεταφέρεται στους 2-25 C εντός 24 ωρών από τη συλλογή ή στους 2-8 C εντός 72 ωρών από τη συλλογή. C. Αποθήκευση Δειγμάτων Αποθηκεύετε το ολικό αίμα στους 2-25 C για έως και 24 ώρες, στους 2-8 C για έως και 72 ώρες ή στους -20 έως -80 C για έως και 10 εβδομάδες. ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Σημείωση: Για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας, λεπτομερή περιγραφή των πιθανών διευθετήσεων, εκτύπωση αποτελεσμάτων και ερμηνεία ενδείξεων, σχολίων και μηνυμάτων σφάλματος, ανατρέξτε στο (1) Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS AmpliPrep οργάνου για χρήση με τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή ή το cobas p 630 όργανο και το AMPLILINK λογισμικό, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3, (2) Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan Αναλυτή (και του προαιρετικού docking station) για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.2 και 3.3, (3) Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή για χρήση με το Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, έκδοση σειράς 3.2 και 3.3, (4) Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3 για χρήση με το COBAS AmpliPrep όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή και τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR αναλυτή και το p 630 όργανο, (5) Προαιρετικά: Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου, Έκδοση Λογισμικού 2.2. Μέγεθος Παρτίδας Κάθε κιτ περιέχει αντιδραστήρια για 72 εξετάσεις, οι οποίες μπορούν να εκτελεστούν σε παρτίδες των 12 έως 24 εξετάσεων. Ένα τουλάχιστον αντίγραφο από τα B*5701 ( ) C και B*5701 (+) C πρέπει να περιλαμβάνεται σε κάθε παρτίδα (βλέπε ενότητα «Ποιοτικός Έλεγχος»). Ροή Εργασιών Η ανάλυση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή πρέπει να ξεκινήσει εντός 240 λεπτών μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Σημείωση: Μην καταψύχετε και μην ψύχετε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία. 11

12 Προετοιμασία Δειγμάτων και Ορών Ελέγχου Σημείωση: Αν χρησιμοποιείτε κατεψυγμένα δείγματα, τοποθετήστε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου έως την πλήρη απόψυξή τους και στροβιλίστε για 3-5 δευτερόλεπτα πριν από τη χρήση. Οι οροί ελέγχου θα πρέπει να απομακρύνονται από το χώρο αποθήκευσης σε θερμοκρασία 2-8 C και να περιέρχονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση. Ρύθμιση του COBAS AmpliPrep Οργάνου Μέρος A. Συντήρηση και Εκκίνηση A1. Το COBAS AmpliPrep Όργανο είναι έτοιμο για λειτουργία στον τρόπο λειτουργίας αναμονής. A2. Ενεργοποιήστε το Σταθμό Δεδομένων για το AMPLILINK λογισμικό (ON). Προετοιμάστε το Σταθμό Δεδομένων ως εξής: a. Συνδεθείτε στο λειτουργικό σύστημα Windows XP. b. Κάντε διπλό κλικ στο εικονίδιο του AMPLILINK λογισμικού. c. Συνδεθείτε στο AMPLILINK λογισμικό εισάγοντας τον καθορισμένο κωδικό χειριστή και τον κωδικό πρόσβασης. A3. Ελέγξτε την παροχή του PG WR χρησιμοποιώντας την οθόνη Status και αντικαταστήστε αν χρειάζεται. A4. Διεξαγάγετε όλες τις εργασίες συντήρησης που αναφέρονται στην καρτέλα Due. Το COBAS AmpliPrep Όργανο θα πραγματοποιήσει αυτόματη εκκίνηση στο σύστημα. Μέρος B. Σημείωση: Φόρτωση Κασετών Αντιδραστηρίου Όλες οι κασέτες αντιδραστηρίου θα πρέπει να απομακρύνονται από το χώρο αποθήκευσης σε θερμοκρασία 2-8 C, να φορτώνονται αμέσως στο COBAS AmpliPrep Όργανο και να περιέρχονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος στο όργανο για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την επεξεργασία του πρώτου δείγματος. Μην αφήσετε τις κασέτες αντιδραστηρίου να περιέλθουν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος εκτός οργάνου, καθώς ενδέχεται να σχηματιστεί υγρασία στις ετικέτες γραμμωτού κώδικα. Μη σκουπίζετε την υγρασία από τις ετικέτες γραμμωτού κώδικα. B1. Τοποθετήστε το B*5701 CS1 σε έναν υποδοχέα αντιδραστηρίων. Τοποθετήστε τα B*5701 CS2, B*5701 CS3 και B*5701 CS4 σε ξεχωριστό υποδοχέα αντιδραστηρίων. B2. Φορτώστε τον υποδοχέα αντιδραστηρίων που περιέχει το B*5701 CS1 στη θέση υποδοχέα A του COBAS AmpliPrep Οργάνου. B3. Φορτώστε τον υποδοχέα αντιδραστηρίων που περιέχει τα B*5701 CS2, B*5701 CS3 και B*5701 CS4 στις θέσεις υποδοχέα B, C, D ή E του COBAS AmpliPrep Οργάνου. 12

13 Μέρος Γ. Φόρτωση Αναλώσιμων Σημείωση: Καθορίστε τον αριθμό των COBAS AmpliPrep κασετών αντιδραστηρίου, των Μονάδων Επεξεργασίας Δειγμάτων (SPU), των Σωληναρίων Δειγμάτων Εισόδου (S-tube), των K-tips και των K-tube που απαιτούνται. Απαιτείται μια μονάδα επεξεργασίας δείγματος (SPU), ένα S-tube Εισόδου, ένα K-tip και ένα Κ-tube για κάθε δείγμα ή ορό ελέγχου. Υπάρχει δυνατότητα πολλαπλών ροών εργασιών για χρήση του COBAS AmpliPrep Οργάνου με τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται, φορτώστε τον κατάλληλο αριθμό υποδοχέων κασετών αντιδραστηρίου, υποδοχέων δειγμάτων με S-tube Εισόδου, υποδοχέων SPU, υποδοχέων K-tip, υποδοχέων K-tube και K-carrier σε υποδοχείς K-carrier στις αντίστοιχες θέσεις υποδοχέων του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ1. Τοποθετήστε τις μονάδες επεξεργασίας δειγμάτων (SPU) στους υποδοχείς SPU και φορτώστε τους υποδοχείς στις θέσεις υποδοχέα J, K ή L του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ2. Ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται, φορτώστε τους γεμάτους υποδοχείς K-tube στις θέσεις υποδοχέα M, N, O ή P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ3. Φορτώστε τους γεμάτους υποδοχείς K-tip στις θέσεις υποδοχέα M, N, O ή P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ4. Για τη ροή εργασιών 3 που χρησιμοποιεί τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, φορτώστε τους K-carriers στους υποδοχείς K-carrier στις θέσεις υποδοχέα M, N, O ή P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Μέρος Δ. Εντολή και Φόρτωση Δειγμάτων Δ1. Προετοιμάστε τους υποδοχείς δειγμάτων ως εξής: Προσαρμόστε ένα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα σε κάθε θέση υποδοχέα δειγμάτων όπου πρόκειται να τοποθετηθεί δείγμα (S-tube). Προσαρμόστε ένα από τα ειδικά για τους ορούς ελέγχου κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα [B*5701 ( ) C και B*5701 (+) C] σε κάθε θέση υποδοχέα δείγματος όπου πρόκειται να τοποθετηθούν οροί ελέγχου (S-tube). Τα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα για τους ορούς ελέγχου πρέπει να έχουν τον ίδιο αριθμό παρτίδας ορού ελέγχου με τον αριθμό παρτίδας που υπάρχει στα φιαλίδια ορού ελέγχου του κιτ. Φροντίστε να τοποθετήσετε το σωστό ορό ελέγχου στη θέση με το κατάλληλο κλιπ γραμμωτού κώδικα ορού ελέγχου. Τοποθετήστε ένα S-tube Εισόδου σε κάθε θέση που περιλαμβάνει ένα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα. Δ2. Χρησιμοποιώντας το AMPLILINK λογισμικό, δημιουργήστε εντολές δείγματος για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου στην καρτέλα Sample του παραθύρου Orders. Επιλέξτε το κατάλληλο αρχείο εξέτασης και ολοκληρώστε τη διαδικασία με αποθήκευση. Δ3. Αντιστοιχίστε τις εντολές δειγμάτων και ορών ελέγχου στις θέσεις υποδοχέα δειγμάτων στην καρτέλα Sample Rack του παραθύρου Orders. Ο αριθμός υποδοχέα δειγμάτων πρέπει να προορίζεται για τον υποδοχέα που προετοιμάστηκε στο Βήμα Δ1. Δ4. Εκτυπώστε την αναφορά Sample Rack Order για να τη χρησιμοποιήσετε ως φύλλο εργασίας. Δ5. Προετοιμάστε υποδοχείς δειγμάτων και ορών ελέγχου στην καθορισμένη περιοχή για προσθήκη δειγμάτων και ορών ελέγχου ως εξής: Δ6. Μεταφέρετε 250 µl του CTM SD σε κάθε S-tube Εισόδου με επισήμανση γραμμωτού κώδικα χρησιμοποιώντας μια συσκευή μικροπιπέτας με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς RNase. 13

14 Δ7. Στροβιλίστε κάθε δείγμα και ορό ελέγχου [B*5701 ( ) C και B*5701 (+) C] για 3 έως 5 δευτερόλεπτα και μεταφέρετε 250 μl στο αντίστοιχο S-tube Εισόδου με επισήμανση γραμμωτού κώδικα χρησιμοποιώντας μια συσκευή μικροπιπέτας με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς RNase. Αποφεύγετε τη μεταφορά σωματιδίων και/ή θρόμβων ινώδους από το αρχικό δείγμα στο S-tube Εισόδου. Φροντίστε να μην μολυνθούν τα γάντια κατά το χειρισμό των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να μεταφέρονται σε θέσεις σωληναρίων, όπως καθορίζεται και καταγράφεται στο φύλλο εργασίας στο βήμα Δ4. Τα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα για τους ορούς ελέγχου πρέπει να έχουν τον ίδιο αριθμό παρτίδας ορού ελέγχου με τον αριθμό παρτίδας που υπάρχει στα φιαλίδια ορού ελέγχου του κιτ. Τοποθετήστε το σωστό ορό ελέγχου στη θέση με το κατάλληλο κλιπ γραμμωτού κώδικα ορού ελέγχου. Αποφεύγετε την επιμόλυνση του επάνω μέρους των S-tubes με δείγματα ή ορούς ελέγχου. Αν χρησιμοποιείτε το cobas p 630 όργανο για την προετοιμασία των δειγμάτων, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 Οργάνου. Δ8. Για τις ροές εργασίας 1 και 2, φορτώστε τους υποδοχείς δειγμάτων που είναι γεμάτοι με S-tube Εισόδου στις θέσεις υποδοχέα F, G ή H του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Δ9. Για τη ροή εργασιών 3, χρησιμοποιώντας τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, φορτώστε τους υποδοχείς δειγμάτων με S-tubes Εισόδου και K-tubes (ένα για κάθε S-tube Εισόδου, φορτωμένο στη δεξιά θέση, δίπλα στα S-tubes Εισόδου) στις θέσεις υποδοχέα F, G ή H του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Μέρος E. Έναρξη ανάλυσης στο COBAS AmpliPrep Όργανο E1. Θέστε σε λειτουργία το COBAS AmpliPrep Όργανο χρησιμοποιώντας το AMPLILINK λογισμικό. Μέρος ΣΤ. Τερματισμός ανάλυσης στο COBAS AmpliPrep Όργανο και Μεταφορά στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή (μόνο για τις ροές εργασιών 2 και 3) ΣΤ1. Ελέγξτε αν υπάρχουν τυχόν ενδείξεις ή μηνύματα σφάλματος. ΣΤ2. Μεταφέρετε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία από το COBAS AmpliPrep Όργανο σε υποδοχείς δειγμάτων (για τον COBAS TaqMan Αναλυτή χωρίς Docking Station) ή σε υποδοχείς K-carrier (για τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή), ανάλογα με τη ροή εργασιών (για περαιτέρω λεπτομέρειες, βλέπε Μέρος Ζ). ΣΤ3. Απομακρύνετε τα απορρίμματα από το COBAS AmpliPrep Όργανο. Σημείωση: Όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία δεν πρέπει να εκτίθενται σε φως μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας δειγμάτων και ορών ελέγχου. Ενίσχυση και Ανίχνευση Ρύθμιση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Η ανάλυση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή πρέπει να ξεκινήσει εντός 240 λεπτών μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. Σημείωση: Μην καταψύχετε και μην ψύχετε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία. 14

15 Μέρος Ζ. Φόρτωση Δειγμάτων που Έχουν Υποβληθεί σε Επεξεργασία Ζ1. Ανάλογα με τη ροή εργασιών, εκτελέστε τα κατάλληλα βήματα για τη μεταφορά των K-tubes στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή: Ροή εργασιών 1: Αυτόματη μεταφορά των K-carrier μέσω docking station στον COBAS TaqMan Αναλυτή. Δεν απαιτείται χειροκίνητη παρέμβαση. Ροή εργασιών 2: Χειροκίνητη μεταφορά των K-tubes σε υποδοχείς δειγμάτων στον COBAS TaqMan Αναλυτή. Ροή εργασιών 3: Χειροκίνητη μεταφορά των K-carrier στους υποδοχείς K-carrier του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Χειροκίνητη μεταφορά των K-carriers στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή με χρήση του Μεταφορέα K-carrier. Μέρος Η. Έναρξη Ανάλυσης στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή H1. Θέστε σε λειτουργία τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή χρησιμοποιώντας μία από τις παρακάτω επιλογές, ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται: Ροή εργασιών 1: Δεν απαιτείται παρέμβαση. Ροή εργασιών 2: Αυτόματη εκκίνηση του COBAS TaqMan Αναλυτή μετά από την εισαγωγή των υποδοχέων δειγμάτων. Ροή εργασιών 3: Γεμίστε το K-carrier με άδεια K-tubes, σε περίπτωση που υπάρχουν λιγότερα από 6 K-tubes στο K-carrier. Η πλήρωση ελέγχεται από το AMPLILINK λογισμικό. Ανοίξτε το κάλυμμα του θερμοκυκλοποιητή, φορτώστε τα K-carrier και κλείστε το καπάκι. Ξεκινήστε την ανάλυση στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Μέρος Θ. Τέλος Ανάλυσης στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Θ1. Μετά την ολοκλήρωση της ανάλυσης στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, εκτυπώστε την Αναφορά Αποτελεσμάτων. Ελέγξτε αν υπάρχουν τυχόν ενδείξεις ή μηνύματα σφάλματος στην Αναφορά αποτελεσμάτων. Τα δείγματα με ενδείξεις και σχόλια ερμηνεύονται όπως περιγράφεται στην ενότητα «Αποτελέσματα». Μετά την αποδοχή, αποθηκεύστε τα δεδομένα σε αρχείο. Θ2. Αφαιρέστε τα χρησιμοποιημένα K-tube από τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή από τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ο COBAS TaqMan Αναλυτής ή ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής προσδιορίζει αυτόματα την παρουσία ή την απουσία του αλληλόμορφου HLA-B*5701 για τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου. AMPLILINK Λογισμικό: Καθορίζει την τιμή Κατωφλίου του Κύκλου (Ct) για το αλληλόμορφο HLA-B*5701 και τις θέσεις HLA-B. Καθορίζει το αποτέλεσμα HLA-B*5701 βάσει των τιμών Ct για το αλληλόμορφο HLA-B*5701 και τις θέσεις HLA-B. Καθορίζει ότι τα B*5701 (+) C και B*5701 ( ) C έχουν το σωστό αποτέλεσμα HLA-B*

16 Επαλήθευση Παρτίδας AMPLILINK έκδοση Σειράς 3.3 Ελέγξτε το παράθυρο αποτελεσμάτων του AMPLILINK λογισμικού ή την εκτύπωση για ενδείξεις και σχόλια για να βεβαιωθείτε ότι η παρτίδα είναι έγκυρη. Για εντολές ορών ελέγχου, διεξάγεται έλεγχος για να καθοριστεί εάν το αποτέλεσμα HLA-B*5701 είναι έγκυρο. Εάν το αποτέλεσμα HLA-B*5701 δεν είναι έγκυρο, εμφανίζεται μια ΕΝΔΕΙΞΗ που υποδεικνύει ότι ο ορός ελέγχου δεν είναι αποδεκτός. Η παρτίδα είναι έγκυρη, εάν δεν εμφανίζονται ενδείξεις για κανέναν ορό ελέγχου [B*5701 (+) C και B*5701 ( ) C]. Η παρτίδα δεν είναι έγκυρη αν εμφανίζονται κάποιες από τις παρακάτω ενδείξεις για τους Ορούς Ελέγχου HLA-B*5701: Αρνητικός Ορός Ελέγχου HLA-B*5701 Ένδειξη Αποτέλεσμα Ερμηνεία NC_INVALID Invalid Ένα μη έγκυρο αποτέλεσμα (αρνητικό Κανάλι 2) ή αποτέλεσμα που ήταν θετικό για HLA-B*5701 (Κανάλι 1 θετικό) Θετικός Ορός Ελέγχου HLA-B*5701 Ένδειξη Αποτέλεσμα Ερμηνεία PC_INVALID Invalid Ένα μη έγκυρο αποτέλεσμα (αρνητικό Κανάλι 2) ή αποτέλεσμα που ήταν αρνητικό για HLA-B*5701 (Κανάλι 1 αρνητικό) Αν η παρτίδα δεν είναι έγκυρη, επαναλάβετε την εξέταση ολόκληρης της παρτίδας, συμπεριλαμβανομένης της προετοιμασίας δείγματος και ορού ελέγχου, ενίσχυσης και ανίχνευσης. Ερμηνεία των Αποτελεσμάτων Για μια έγκυρη παρτίδα, ελέγξτε κάθε μεμονωμένο δείγμα για ενδείξεις ή σχόλια στην εκτύπωση αποτελεσμάτων. Ερμηνεύστε τα αποτελέσματα ως εξής: Μια έγκυρη παρτίδα μπορεί να περιλαμβάνει έγκυρα και μη έγκυρα αποτελέσματα δείγματος, ανάλογα με τις ενδείξεις και/ή τα σχόλια που λαμβάνονται για τα μεμονωμένα δείγματα. Τα αποτελέσματα δειγμάτων ερμηνεύονται ως εξής: Αποτέλεσμα Negative B*5701 Positive B*5701 Invalid Ερμηνεία Το δείγμα θεωρείται αρνητικό για το αλληλόμορφο HLA-B*5701. Το δείγμα θεωρείται θετικό για το αλληλόμορφο HLA-B*5701. Μη έγκυρο αποτέλεσμα. 16

17 ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Σε κάθε παρτίδα εξέτασης πρέπει να συμπεριληφθεί ένα αντίγραφο από τον Αρνητικό Ορό Ελέγχου HLA-B*5701 και από τον Θετικό Ορό Ελέγχου HLA-B*5701. Η παρτίδα είναι έγκυρη, εάν δεν εμφανίζονται ενδείξεις για κανέναν ορό ελέγχου [B*5701 (+) C και B*5701 ( ) C]. Ελέγξτε αν υπάρχουν ενδείξεις και σχόλια στην εκτύπωση της παρτίδας για να βεβαιωθείτε ότι η παρτίδα είναι έγκυρη. Αρνητικός Ορός Ελέγχου HLA-B*5701 Το B*5701 ( ) C πρέπει να δίνει αποτέλεσμα «Negative». Αν το B*5701 ( ) C επισημαίνεται ως μη έγκυρο, τότε ολόκληρη η παρτίδα είναι μη έγκυρη. Επαναλάβετε ολόκληρη τη διαδικασία (προετοιμασία δειγμάτων και ορών ελέγχου, ενίσχυση και ανίχνευση). Σε περίπτωση που προκύπτει διαρκώς μη έγκυρο B*5701 ( ) C σε πολλές παρτίδες, επικοινωνήστε με τα τοπικά γραφεία της Roche για την παροχή τεχνικής υποστήριξης. Θετικός Ορός Ελέγχου HLA-B*5701 Το B*5701 (+) C πρέπει να δίνει αποτέλεσμα «Positive». Αν το B*5701 (+) C επισημαίνεται ως μη έγκυρο, τότε ολόκληρη η παρτίδα είναι μη έγκυρη. Επαναλάβετε ολόκληρη τη διαδικασία (προετοιμασία δειγμάτων και ορών ελέγχου, ενίσχυση και ανίχνευση). Σε περίπτωση που προκύπτει διαρκώς μη έγκυρο B*5701 (+) C σε πολλές παρτίδες, επικοινωνήστε με τα τοπικά γραφεία της Roche για την παροχή τεχνικής υποστήριξης. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όπως συμβαίνει με όλες τις διαδικασίες εξέτασης, η ορθή εργαστηριακή πρακτική είναι απαραίτητη για τη σωστή εκτέλεση αυτής της ανάλυσης. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 1. Η παρούσα εξέταση έχει εγκριθεί μόνο για χρήση με ανθρώπινο ολικό αίμα που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικό EDTA. Η εξέταση άλλων τύπων δειγμάτων μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. 2. Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων εξαρτάται από τις ορθές διαδικασίες συλλογής, μεταφοράς, αποθήκευσης και επεξεργασίας των δειγμάτων. 3. Η παρουσία του ενζύμου AmpErase στο Κύριο Μίγμα του COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test μειώνει τον κίνδυνο μόλυνσης του κλώνου (amplicon). Ωστόσο, η μόλυνση από ορούς ελέγχου και κλινικά δείγματα μπορεί να αποφευχθεί μόνο ακολουθώντας τις ορθές εργαστηριακές πρακτικές και τις διαδικασίες που περιγράφονται στο παρόν Ένθετο Συσκευασίας. 4. Η χρήση αυτού του προϊόντος πρέπει να επιτρέπεται μόνο σε προσωπικό εκπαιδευμένο στις τεχνικές PCR. 5. Το παρόν προϊόν μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο με το COBAS AmpliPrep Όργανο και τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. 6. Σε σπάνιες περιπτώσεις, νέα αλληλόμορφα HLA-B*57 που ανακαλύπτονται και που καλύπτονται από τους εκκινητές και/ή τους ιχνηθέτες του COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test ενδέχεται να οδηγήσουν σε θετικό αποτέλεσμα HLA-B* Η ανίχνευση του αλληλόμορφου HLA-B*5701 εξαρτάται από την ποσότητα γονιδιωματικού DNA που βρίσκεται στο δείγμα και μπορεί να επηρεαστεί από τις μεθόδους συλλογής δείγματος και από παράγοντες ασθενή. 8. Λόγω εγγενών διαφορών μεταξύ των τεχνολογιών, πριν από τη μετάβαση στην επόμενη τεχνολογία, συνιστάται η πραγματοποίηση μελετών συσχετισμού μεθόδων από το χειριστή στο εργαστήριο για την ποσοτικοποίηση των διαφορών τεχνολογίας. 17

18 ΠΑΡΕΜΒΑΛΛΟΜΕΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Τα αυξημένα επίπεδα τριγλυκεριδίων (έως και 3000 mg/dl), χολοερυθρίνης (έως και 20 mg/dl), λευκωματίνης (έως και 7000 mg/dl) και αιμοσφαιρίνης (έως και 500 mg/dl) στα δείγματα δεν αλληλεπίδρασαν με την ανίχνευση του αλληλόμορφου HLA-B*5701 σε θετικά δείγματα HLA-B*5701 και δεν επηρέασαν την ειδικότητα του COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test στα αρνητικά δείγματα HLA-B*5701. Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την οδηγία CLSI EP7-A2, χρησιμοποιώντας μία παρτίδα του COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test. Οι παρακάτω φαρμακευτικές ουσίες, που υποβλήθηκαν σε έλεγχο σε επίπεδο τριπλάσιο του Υψηλότερου Επιπέδου Συγκέντρωσης στο Πλάσμα (Cmax) δεν αλληλεπίδρασαν με την ανίχνευση του αλληλόμορφου HLA-B*5701 σε θετικά δείγματα HLA-B*5701 και δεν επηρέασαν την ειδικότητα του COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test στα αρνητικά δείγματα HLA-B*5701. Νουκλεοτιδικός Αναστολέας της Ανάστροφης Μεταγραφάσης και της DNA Πολυμεράσης Τενοφοβίρη DF Αναστολείς HIV Πρωτεάσης Σακιναβίρη Ριτοναβίρη Λοπιναβίρη/Ριτοναβίρη Αταζαναβίρη Μεθανοσουλφονική νελφιναβίρη Δαρουναβίρη Τιπραναβίρη Φοσαμπρεναβίρη Αναστολέας Ιντεγκράσης HIV Ραλτεγκραβίρη Νουκλεοσιδικοί Αναστολείς της Ανάστροφης Μεταγραφάσης και της DNA Πολυμεράσης Λαμιβουδίνη, 3TC Ζιδοβουδίνη Σταβουδίνη, 4dT Θειική αμπακαβίρη Διδανοσίνη, ddl Μη Νουκλεοσιδικοί Αναστολείς Ανάστροφης Μεταγραφάσης του HIV Νεβιραπίνη Εφαβιρένζη Εμτρισιταβίνη Αναστολείς Τήξης HIV Ενφουβιρτίδη Αναστολέας εισόδου HIV Μαραβιρόκη 18

19 AΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΜΗ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ A. Συσχετισμός Αναλύσεων Ο συσχετισμός του COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test σε σύγκριση με τα αποτελέσματα ανάλυσης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας κατά Sanger προσδιορίστηκε με ανάλυση των δειγμάτων ολικού αίματος και με τις δύο μεθόδους. Εξετάστηκαν συνολικά 300 μεμονωμένα κλινικά δείγματα, χρησιμοποιώντας τρεις παρτίδες κιτ του COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test. Διαπιστώθηκε ότι συνολικά 63 δείγματα που βρέθηκαν θετικά σε HLA-B*5701 από το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test βρέθηκαν επίσης θετικά σε HLA-B*5701 με ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας κατά Sanger. Διαπιστώθηκε ότι συνολικά 237 δείγματα που βρέθηκαν αρνητικά σε HLA-B*5701 από το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test βρέθηκαν επίσης αρνητικά σε HLA-B*5701 με ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας κατά Sanger. Τέσσερα δείγματα (από τα συνολικά 300) που έχουν παρόμοιες αλληλουχίες με το HLA-B*5701 (HLA-B*5702, HLA-B*5703) προσδιορίστηκαν ορθώς ως αρνητικά σε HLA-B*5701 από το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν και με τις δύο μεθόδους έδειξαν 100% συσχετισμό, 100% ευαισθησία, 100% ειδικότητα, 100% συμφωνία θετικών αποτελεσμάτων και 100% συμφωνία αρνητικών αποτελεσμάτων (Πίνακας 1). Αποτέλεσμα Ανάλυσης Νουκλεοτιδικής Αλληλουχίας κατά Sanger Πίνακας 1 Συσχετισμός αναλύσεων Θετικό σε HLA-B*5701 Αρνητικό σε HLA-B*5701 Αποτέλεσμα COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test Θετικό σε HLA-B*5701 Αρνητικό σε HLA-B* B. Όριο Ανίχνευσης Το όριο ανίχνευσης (LOD) του COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test προσδιορίστηκε με ανάλυση αραιώσεων τεσσάρων γονιδιωματικών DNA (2 θετικών σε HLA-B*5701 και 2 αρνητικών σε HLA-B*5701). Ο γονότυπος του γονιδιωματικού DNA καθορίστηκε με ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας κατά Sanger και η συγκέντρωση εισαγωγής DNA καθορίστηκε με φασματοφωτόμετρο στα A 260. Εξετάστηκαν συνολικά 20 αντίγραφα για κάθε επίπεδο εισαγωγής DNA, χρησιμοποιώντας τρεις παρτίδες κιτ του COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HLA-B*5701 Screening Test. Το επίπεδο εισαγωγής αντιπροσωπεύει την ποσότητα DNA που προστίθεται για την επεξεργασία από το COBAS AmpliPrep όργανο. Το χαμηλότερο επίπεδο γονιδιωματικού DNA στο οποίο εμφανίστηκε ποσοστό θετικότητας 95% για ορθή ανίχνευση θετικών στο HLA-B*5701 και αρνητικών στο HLA-B*5701 DNA ήταν 520 ng DNA εισαγωγής, όπως εμφανίζεται στους Πίνακες 2-5. Η ανάλυση PROBIT παρουσίασε ποσοστό επιτυχίας 95% για 429 και 469 ng DNA εισαγωγής για τα θετικά σε HLA-B*5701 γονιδιωματικά DNA και 151 και 319 ng DNA εισαγωγής για τα αρνητικά σε HLA-B*5701 γονιδιωματικά DNA. 19

20 DNA εισαγωγής (ng) Πίνακας 2 Όριο ανίχνευσης για θετικά σε HLA-B*5701 DNA #1 (LOVO Genomic DNA) Αντίγραφα DNA HLA-B*5701 Σύνολο Εξετάσεων Μη Έγκυρα Αποτελέσματα* Αρνητικοί Προσδιορισμοί B*5701 Θετικοί Προσδιορισμοί B*5701 Ποσοστό Θετικότητας B*5701** Μονόπλευρο Χαμηλότερο Όριο Εμπιστοσύνης 95% ,0% 95,1% ,3% 92,3% ,3% 37,1% ,0% 0,0% ,0% 0,0% ,0% 0,0% PROBIT 95% Ποσοστό Ευστοχίας 429 Διάστημα Εμπιστοσύνης 95% PROBIT (376, 537) * Μη έγκυρο λόγω του Καναλιού 2 Ct > 29,0. ** Το ποσοστό θετικότητας B*5701 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το σύνολο των εξετάσεων ως παρονομαστή. DNA εισαγωγής (ng) Πίνακας 3 Όριο ανίχνευσης για ομόζυγα θετικά σε HLA-B*5701 DNA #2 (WIN Genomic DNA) Αντίγραφα DNA HLA-B*5701 Σύνολο Μη Έγκυρα Εξετάσεων Αποτελέσματα* Αρνητικοί Προσδιορισμοί B*5701 Θετικοί Προσδιορισμοί B*5701 Ποσοστό Θετικότητας B*5701** Μονόπλευρο Χαμηλότερο Όριο Εμπιστοσύνης 95% ,3% 92,3% ,0% 95,1% ,3% 46,9% ,7% 0,1% ,0% 0,0% ,0% 0,0% PROBIT 95% Ποσοστό Ευστοχίας 469 Διάστημα Εμπιστοσύνης 95% PROBIT (407, 577) * Μη έγκυρο λόγω του Καναλιού 2 Ct > 29,0. ** Το ποσοστό θετικότητας B*5701 υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το σύνολο των εξετάσεων ως παρονομαστή. 20