COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0

Transcript

1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0 ΓΙΑ IN VITRO ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV V Tests P/N: HBV Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: Wash Reagent ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, έκδοση 2.0 (v2.0) είναι μια in vitro εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ποσοτικοποίηση του DNA του Ιού Ηπατίτιδας Β (HΒV) στο ανθρώπινο πλάσμα και στον ορό, με τη χρήση του COBAS AmpliPrep Οργάνου για την αυτόματη επεξεργασία δειγμάτων και του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή για την αυτόματη ενίσχυση και ανίχνευση. Η εξέταση προορίζεται για χρήση ως βοήθημα στη διαχείριση των ασθενών με χρόνια μόλυνση HBV που υποβάλλονται σε αντι-ιική θεραπεία. Η ανάλυση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση των επιπέδων HBV DNA σε αρχικό επίπεδο και κατά τη διάρκεια της θεραπείας, ως βοήθημα στην αξιολόγηση της απόκρισης στη θεραπεία. Τα αποτελέσματα του COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 πρέπει να ερμηνεύονται λαμβάνοντας υπόψη όλα τα σχετικά κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 δεν προορίζεται για χρήση ως τεστ ελέγχου (screening test) σε αίμα ή παράγωγα αίματος για την παρουσία HBV ή ως διαγνωστική εξέταση για την επιβεβαίωση της παρουσίας μόλυνσης HBV. ΣΥΝΟΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ O Ιός της Ηπατίτιδας Β (HBV) είναι ένας από τους διάφορους ιούς που είναι γνωστό ότι προκαλούν ιική ηπατίτιδα. Περισσότεροι από δύο δισεκατομμύρια άνθρωποι παγκοσμίως έχουν προσβληθεί από τον HBV, εκ των οποίων περισσότεροι από 350 εκατομμύρια είναι χρόνιοι φορείς της μόλυνσης 1,2. Οι χρόνιοι φορείς αντιμετωπίζουν υψηλότερο κίνδυνο μακροχρόνιων επιπλοκών της μόλυνσης, συμπεριλαμβανομένης της χρόνιας ηπατίτιδας, της κίρρωσης και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος 3,4,5. Οι ορολογικοί δείκτες χρησιμοποιούνται ευρέως ως διαγνωστικοί και/ή προγνωστικοί δείκτες οξείας ή χρόνιας μόλυνσης HBV. Ο πιο κοινός δείκτης της μόλυνσης HBV είναι η παρουσία του αντιγόνου επιφανείας (HBsAg) του HBV. Αν και οι φορείς ενδέχεται να αποβάλουν το HBsAg και να αναπτύξουν αντίσωμα έναντι του HBsAg, φαίνεται ότι υπάρχει ακόμη κίνδυνος για σοβαρές επιπλοκές του ήπατος αργότερα στη ζωή τους 6,7. Το αντιγόνο e του HBV (HBeAg) χρησιμοποιείται γενικά ως δευτερεύων δείκτης για να υποδείξει ενεργό αναδιπλασιασμό του HBV που σχετίζεται με την προοδευτική ηπατική νόσο. Η αποτυχία κάθαρσης του HBeAg φαίνεται ότι αυξάνει τον κίνδυνο ηπατικής νόσου τελικού σταδίου 8,9. Οι παραλλαγές στελεχών του HBV μπορούν είτε να παράγουν HBeAg μη ανιχνεύσιμο στον ορό ή το στέλεχος μπορεί να χάσει την ιδιότητά του να παράγει HBeAg ακόμη και υπό την παρουσία ενεργούς μόλυνσης 10. Συνεπώς, η χρήση του δείκτη αυτού για την παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου ενδέχεται να είναι περιορισμένης χρησιμότητας 11. Έχει αναφερθεί ότι η ικανότητα ανίχνευσης του HBV DNA στον ορό έχει προγνωστική αξία για την έκβαση των οξέων και χρόνιων λοιμώξεων HBV Η μεθοδολογία μπορεί να επιτρέψει την ανίχνευση του HBV DNA μετά την κάθαρση του HBsAg 16 ή την ανίχνευση του HBV χωρίς ορολογικούς δείκτες 17. Ωστόσο, ακόμη δεν έχει καθιερωθεί μια σχέση μεταξύ των ορολογικών δεικτών και των επιπέδων HBV DNA. Η αποτελεσματικότητα της αντιικής θεραπείας που χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία ασθενών με HBV μπορεί να αξιολογηθεί επίσης με τη βοήθεια των ορολογικών δεικτών ή της μέτρησης της λειτουργίας του ενζύμου του ήπατος. Ωστόσο, η πιο άμεση και αξιόπιστη μέτρηση του αναδιπλασιασμού του ιού θεωρείται η ποσοτικοποίηση του ιικού Η ενότητα «Πληροφορίες Αναθεώρησης Εγγράφου» βρίσκεται στο τέλος του παρόντος εγγράφου EL 1 Doc Rev. 13.0

2 DNA του HBV στον ορό ή το πλάσμα 14, Τυχόν ραγδαία και διαρκής πτώση των επιπέδων HBV DNA των ασθενών που υποβάλλονται σε θεραπεία με άλφα-ιντερφερόνη, Λαμιβουδίνη, Γκανσικλοβίρη ή Adefovir Dipivoxil έχει αποδειχτεί ότι αποτελεί προγνωστικό παράγοντα για ευνοϊκή έκβαση της θεραπείας 11, Με την παρακολούθηση των επιπέδων HBV DNA μπορεί να προβλεφθεί η ανάπτυξη αντίστασης στη Λαμιβουδίνη 26. Επομένως, μια ποσοτική εξέταση για τη μέτρηση του HBV DNA αποτελεί πολύτιμο εργαλείο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με άλλους ορολογικούς δείκτες για την αντιμετώπιση της μόλυνσης HBV. Το HBV DNA στο πλάσμα και τον ορό μπορεί να προσδιοριστεί ποσοτικά με τεχνικές ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος, όπως είναι η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 χρησιμοποιεί την τεχνολογία PCR για την επίτευξη της μέγιστης ευαισθησίας και δυναμικού εύρους για την ποσοτική ανίχνευση του HBV DNA σε πλάσμα και ορό με αντιπηκτικό EDTA. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 είναι μια εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος για την ποσοτικοποίηση του DNA Ιού Ηπατίτιδας B (HBV) στο ανθρώπινο πλάσμα και τον ορό. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 βασίζεται σε δύο κύριες διαδικασίες: (1) στην προετοιμασία δειγμάτων για την απομόνωση του HBV DNA και (2) στην ταυτόχρονη ενίσχυση PCR 27 του DNA στόχου και την ανίχνευση ειδικού για το στόχο διπλά επισημασμένου διασπώμενου ολιγονουκλεοτιδικού ιχνηθέτη ανίχνευσης. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 επιτρέπει την αυτοματοποιημένη προετοιμασία δειγμάτων συνοδευόμενη από αυτοματοποιημένη ενίσχυση PCR και ανίχνευση του DNA στόχου του HBV και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης (QS) HBV. Το αντιδραστήριο Κυρίου Μίγματος περιέχει ζεύγη εκκινητών και ιχνηθέτες ειδικά για το HBV DNA και για το DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης (QS) HBV. Το Κύριο Μίγμα έχει αναπτυχθεί για τη διασφάλιση της ισοδύναμης ποσοτικοποίησης των γονότυπων Α έως Η του HBV. Η ανίχνευση του ενισχυμένου DNΑ εκτελείται με ειδικό για το στόχο και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης διπλά επισημασμένο ολιγονουκλεοτιδικό ιχνηθέτη που επιτρέπει την ανεξάρτητη ταυτοποίηση του κλώνου (amplicon) HBV και του κλώνου (amplicon) Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Η ποσοτικοποίηση του ιικού DNA του HBV εκτελείται με τη χρήση του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Αντισταθμίζει τυχόν φαινόμενα αναστολής και ελέγχει τις διαδικασίες προετοιμασίας και ενίσχυσης, επιτρέποντας ακριβέστερο ποσοτικό προσδιορισμό του HBV DNA σε κάθε δείγμα. Πρόκειται για μια μη μολυσματική σύνθεση DNA που περιέχει αλληλουχίες HBV με τις ίδιες ακριβώς περιοχές δέσμευσης εκκινητή με το DNA στόχο του HBV και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη που επιτρέπει το διαχωρισμό του κλώνου (amplicon) Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV από τον κλώνο (amplicon) του HBV. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV προστίθεται σε κάθε δείγμα σε γνωστό αριθμό αντιγράφων και μεταφέρεται μέσω διαδοχικών βημάτων προετοιμασίας δειγμάτων, ταυτόχρονης ενίσχυσης PCR και ανίχνευσης διπλά επισημασμένων διασπώμενων ολιγονουκλεοτιδικών ιχνηθετών ανίχνευσης. Ο COBAS TaqMan Αναλυτής ή ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής υπολογίζει τη συγκέντρωση HBV DNA στα δείγματα εξέτασης συγκρίνοντας το σήμα HBV με το σήμα Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου. Επιλογή Στόχου Η επιλογή της αλληλουχίας DNA στόχου για το HBV εξαρτάται από την ταυτοποίηση των περιοχών εντός του γονιδιώματος HBV που επιδεικνύουν μέγιστο βαθμό διατήρησης αλληλουχίας μεταξύ των διάφορων γονότυπων HBV. Η γενική προετοιμασία δείγματος σε βάση πυριτίου (generic silica-based specimen preparation) χρησιμοποιείται για τη δέσμευση του HBV DNA και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV, ενώ τα καθορισμένα ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιούνται ως εκκινητές για την ενίσχυση του HBV DNA και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Ένας ειδικός για το στόχο και ένας ειδικός για το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης διπλά επισημασμένος ολιγονουκλεοτιδικός ιχνηθέτης καθιστούν δυνατή τη μεμονωμένη ταυτοποίηση του κλώνου (amplicon) HBV και του κλώνου (amplicon) Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Αντίστοιχα, η κατάλληλη επιλογή εκκινητών και διπλά επισημασμένου ολιγονουκλεοτιδικού ιχνηθέτη είναι αποφασιστικής σημασίας για τη δυνατότητα της εξέτασης σε ό,τι αφορά την ενίσχυση και ανίχνευση των γονότυπων HBV EL 2 Doc Rev. 13.0

3 Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 χρησιμοποιεί τρεις εκκινητές ενίσχυσης για PCR. Το σήμα δημιουργεί διπλά ο επισημασμένος ιχνηθέτης που υβριδίζεται στο μη νοηματικό κλώνο και διασπάται από την Z05 DNA πολυμεράση κατά τη φάση της επιμήκυνσης των εκκινητών. Ο κλώνος (amplicon) των γονότυπων A-F και Η αποτελείται από μια αλληλουχία 145 νουκλεοτιδίων. Ωστόσο, ο κλώνος (amplicon) του γονότυπου G αποτελείται από αλληλουχία 181 νουκλεοτιδίων. Η προσθήκη 36 βάσεων εντός της μονόκλωνης προπυρηνικής/ πυρηνικής περιοχής (pre-core/core region) υψηλής διατήρησης του γονιδιώματος HBV οδηγεί σε κλώνο (amplicon) υψηλότερης αλληλουχίας για το γονότυπο G 31. Προετοιμασία είγματος Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 χρησιμοποιεί αυτοματοποιημένη προετοιμασία δείγματος στο COBAS AmpliPrep Όργανο με γενική τεχνική δέσμευσης σε βάση πυριτίου (generic silica-based capture technique). Η διαδικασία επεξεργάζεται 500 µl πλάσματος ή ορού. Πραγματοποιείται λύση των σωματιδίων του ιού HBV μέσω επώασης σε υψηλή θερμοκρασία με πρωτεάση και χαοτροπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης/δέσμευσης που απελευθερώνει τα νουκλεϊκά οξέα και προστατεύει το απελευθερωμένο HBV DNA από DNases σε πλάσμα και ορό. Σε κάθε δείγμα εισάγεται πρωτεάση και ένας γνωστός αριθμός μορίων DΝΑ Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV με το αντιδραστήριο λύσης και τα μαγνητικά σωματίδια γυαλιού. Στη συνέχεια, το μίγμα επωάζεται και το HBV DNA και το DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV δεσμεύονται στην επιφάνεια των σωματιδίων γυαλιού. Οι αδέσμευτες ουσίες όπως άλατα, πρωτεΐνες και άλλες κυτταρικές ακαθαρσίες, απομακρύνονται με την πλύση των μαγνητικών σωματιδίων γυαλιού. Μετά το διαχωρισμό των σωματιδίων και την ολοκλήρωση των βημάτων πλύσης, τα νουκλεϊκά οξέα που προσροφήθηκαν εκλούονται με υδατικό διάλυμα σε υψηλή θερμοκρασία. Το επεξεργασμένο δείγμα, που περιέχει τα μαγνητικά σωματίδια γυαλιού καθώς και το απελευθερωμένο HBV DNA και το DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV, προστίθεται στο μίγμα ενίσχυσης και μεταφέρεται στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Ενίσχυση PCR Η αντίδραση ενίσχυσης PCR εκτελείται με το θερμοσταθερό ανασυνδυασμένο ένζυμο Thermus specie Z05 DNA Πολυμεράσης (Z05). Παρουσία μαγγανίου (Mn 2+ ) και με κατάλληλες συνθήκες ρυθμιστικού διαλύματος, το Z05 παρουσιάζει δραστηριότητα DNA πολυμεράσης 32, 33. Έτσι, είναι δυνατή η πραγματοποίηση ενίσχυσης PCR παράλληλα με την ανίχνευση του κλώνου (amplicon) σε πραγματικό χρόνο. Τα δείγματα που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία προστίθενται στο μίγμα ενίσχυσης σε σωληνάρια ενίσχυσης (Κ-tubes), στα οποία πραγματοποιείται ενίσχυση PCR. Παρουσία Mn 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntps) συμπεριλαμβανομένης της δεοξυαδενοσίνης, δεοξυγουανοσίνης, δεοξυκυτιδίνης και δεοξυουριδίνης, η Z05 DNA πολυμεράση επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές σχηματίζοντας έναν κλώνο DΝA. Ενίσχυση Στόχου Ο θερμοκυκλοποιητής στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή θερμαίνει το μίγμα αντίδρασης για την αποδιάταξη του δίκλωνου DNA και την έκθεση των αλληλουχιών-στόχου ειδικών για τον εκκινητή στο γονιδίωμα του κυκλικού DNA του HBV και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι εκκινητές υβριδίζονται στο DNA στόχο. Η θερμοσταθερή Thermus specie Z05 DNA Πολυμεράση (Z05), παρουσία Mn 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοζιτών (dntps), συμπεριλαμβανομένης της δεοξυαδενοσίνης, της δεοξυγουανοσίνης, της δεοξυκυτιδίνης και της δεοξυουριδίνης (στη θέση της θυμιδίνης), επεκτείνει τους υβριδισμένους εκκινητές κατά μήκος του προτύπου-στόχου για τη δημιουργία ενός μορίου δίκλωνου DNA, που ονομάζεται κλώνος (amplicon). Ο COBAS TaqMan Αναλυτής ή ο COBAS TaqMan 48 Αναλυτής επαναλαμβάνει αυτόματα τη διαδικασία αυτή για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους προορίζεται για το διπλασιασμό του DNA κλώνου (amplicon). Ο απαιτούμενος αριθμός κύκλων προγραμματίζεται εκ των προτέρων στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Η ενίσχυση πραγματοποιείται μόνο στην περιοχή του γονιδιώματος HBV μεταξύ των εκκινητών. εν ενισχύεται ολόκληρο το γονιδίωμα HBV EL 3 Doc Rev. 13.0

4 Επιλεκτική Ενίσχυση Η επιλεκτική ενίσχυση του νουκλεϊκού οξέος-στόχου από το δείγμα επιτυγχάνεται στο COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη- N-γλυκοζυλάση) και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp). Το ένζυμο AmpErase αναγνωρίζει και καταλύει τη διάσπαση των κλώνων DNA που περιέχουν δεοξυουριδίνη 34, αλλά όχι του DNA που περιέχει δεοξυθυμιδίνη. Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon) λόγω της χρήσης τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης ως ενός από τα dntps του αντιδραστηρίου Κύριου Μίγματος. Για το λόγο αυτό, μόνο ο κλώνος (amplicon) περιέχει δεοξυουριδίνη. Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο (amplicon) ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του DNA στόχου. Επίσης, οποιοδήποτε μη ειδικό προϊόν που σχηματίζεται μετά την αρχική ενεργοποίηση του Κύριου Μίγματος από μαγγάνιο καταστρέφεται από το ένζυμο AmpErase. To ένζυμο AmpErase, που περιλαμβάνεται στο αντιδραστήριο Κύριου Μίγματος, καταλύει τη σχάση του DNA που περιέχει δεοξυουριδίνη στα ιζήματα της δεοξυουριδίνης ανοίγοντας την αλυσίδα της δεοξυριβόζης στη θέση C1. Όταν θερμαίνεται στο πρώτο βήμα θερμοκυκλοποίησης, η αλυσίδα DNA του κλώνου (amplicon) διασπάται στη θέση της δεοξυουριδίνης, καθιστώντας το DNA μη ενισχύσιμο. Το ένζυμο AmpErase παραμένει αδρανές για παρατεταμένο χρονικό διάστημα μόλις εκτεθεί σε θερμοκρασίες πάνω από 55 C, δηλαδή σε όλα τα βήματα της θερμοκυκλοποίησης και για το λόγο αυτόν δεν καταστρέφει τον κλώνο (amplicon) στόχο που δημιουργείται κατά την ενίσχυση. Ανίχνευση Προϊόντων PCR σε COBAS TaqMan Test Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HΒV Test, v2.0 χρησιμοποιεί τεχνολογία PCR πραγματικού χρόνου 27,28. Η χρήση ιχνηθετών με διπλή φθορίζουσα επισήμανση επιτρέπει την ανίχνευση της συσσώρευσης προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο παρακολουθώντας την ένταση εκπομπής των φθοριζουσών χρωστικών αναφορέα (reporter) που απελευθερώνονται κατά τη διαδικασία της ενίσχυσης. Οι ιχνηθέτες αποτελούνται από ειδικούς για το HBV και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV ολιγονουκλεοτιδικούς ιχνηθέτες με χρωστική αναφορέα (reporter) και παρεμποδιστή (quencher). Στο COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 οι ιχνηθέτες HBV και HBV Προτύπου Ποσοτικοποίησης επισημαίνονται με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές αναφορέα (reporter). Όταν αυτοί οι ιχνηθέτες είναι ανέπαφοι, ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) καταστέλλεται από την εγγύτητα της χρωστικής παρεμποδιστή (quencher), λόγω των φαινομένων μεταφοράς ενέργειας τύπου Förster. Κατά τη διάρκεια της PCR, ο ιχνηθέτης υβριδίζεται σε μια αλληλουχία στόχο και διασπάται από την 5' 3' δραστηριότητα νουκλεάσης της θερμοσταθερής Z05 DNA πολυμεράσης. Μόλις απελευθερωθούν και αποχωριστούν οι χρωστικές αναφορέα (reporter) και παρεμποδιστή (quencher), δεν πραγματοποιείται πλέον παρεμπόδιση και η φθορίζουσα δραστηριότητα της χρωστικής αναφορέα (reporter) αυξάνεται. Η ενίσχυση του HBV DNA και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV μετρούνται ανεξάρτητα σε διαφορετικά μήκη κύματος. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων, καθένας από τους οποίους έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης εκπομπής των μεμονωμένων χρωστικών αναφορέα (reporter), επιτρέποντας την ξεχωριστή ταυτοποίηση του HBV και του DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Ο κύκλος PCR, όπου η αρχή της καμπύλης αύξησης παρουσιάζει εκθετική αύξηση, σχετίζεται με την ποσότητα του υλικού εκκίνησης κατά την έναρξη της PCR EL 4 Doc Rev. 13.0

5 Βασικά στοιχεία Ποσοτικοποίησης του COBAS TaqMan Test Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HΒV Test, v2.0 είναι μια ποσοτική εξέταση με ιδιαίτερα ευρύ δυναμικό εύρος, εφόσον η παρακολούθηση του κλώνου (amplicon) διεξάγεται κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης της ενίσχυσης. Όσο υψηλότερος είναι ο τίτλος HBV ενός δείγματος, τόσο συντομότερα ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) του ιχνηθέτη HBV υπερβαίνει το αρχικό επίπεδο φθορισμού (βλέπε Σχήμα 1). Εφόσον το ποσοστό DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV είναι σταθερό σε όλα τα δείγματα, ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) του ιχνηθέτη Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV θα πρέπει να εμφανίζεται στον ίδιο κύκλο για όλα τα δείγματα (βλέπε Σχήμα 2). Σε δείγματα, στα οποία επηρεάζεται ο φθορισμός Προτύπου Ποσοτικοποίησης (QS), η συγκέντρωση ρυθμίζεται ανάλογα. Η εμφάνιση των συγκεκριμένων σημάτων φθορισμού αναφέρεται ως κρίσιμη τιμή κατωφλίου (Ct). Η τιμή Ct ορίζεται ως ο κλασματικός αριθμός κύκλων, όπου ο φθορισμός της χρωστικής αναφορέα (reporter) υπερβαίνει την προκαθορισμένη τιμή κατωφλίου (Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού) και ξεκινά τη φάση εκθετικής αύξησης του σήματος αυτού (βλέπε Σχήμα 3). Η υψηλότερη τιμή Ct υποδεικνύει χαμηλότερο τίτλο αρχικού υλικού στόχου HBV. Η διπλάσια αύξηση του τίτλου συσχετίζεται με μείωση 1 Ct για το HBV DNΑ στόχο, ενώ δεκαπλάσια αύξηση του τίτλου συσχετίζεται με μείωση 3,3 Ct. Στο Σχήμα 1 απεικονίζονται οι καμπύλες αύξησης στόχου για μια σειρά αραιώσεων που κυμαίνονται σε εύρος 5-log 10. Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του ιού, οι καμπύλες αύξησης μετατοπίζονται σε προηγούμενους κύκλους. Για το λόγο αυτό, η τέρμα αριστερή καμπύλη αύξησης αντιστοιχεί στο υψηλότερο επίπεδο ιικού τίτλου, ενώ η τέρμα δεξιά καμπύλη αύξησης αντιστοιχεί στο χαμηλότερο επίπεδο ιικού τίτλου. Σχήμα 1 Καμπύλες Αύξησης Στόχου για μια Σειρά Αραιώσεων Ιού που Κυμαίνονται σε Εύρος 5-Log 10 9,00 8,00 Ομαλοποιημένος Φθορισμός 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Υψηλότερος Τίτλος Χαμηλότερος Τίτλος -1, Αριθμός Κύκλου Στο Σχήμα 2 απεικονίζονται οι καμπύλες αύξησης Προτύπου Ποσοτικοποίησης για δείγματα ιικής σειράς αραιώσεων που κυμαίνονται σε εύρος 5-log 10. Η ποσότητα του Προτύπου Ποσοτικοποίησης που προστίθεται σε κάθε δείγμα είναι σταθερή για κάθε αντίδραση. Η τιμή Ct του Προτύπου Ποσοτικοποίησης είναι ίδια, ανεξάρτητα από τον ιικό τίτλο EL 5 Doc Rev. 13.0

6 Σχήμα 2 Καμπύλες Αύξησης Προτύπου Ποσοτικοποίησης για μια Σειρά Αραιώσεων που Κυμαίνονται σε Εύρος 5-Log 10 35,00 Ομαλοποιημένος Φθορισμός 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Χαμηλότερος Τίτλος Υψηλότερος Τίτλος -5, Αριθμός Κύκλου Στο Σχήμα 3 απεικονίζεται ένα παράδειγμα του τρόπου ομαλοποίησης των τιμών φθορισμού κάθε κύκλου για κάθε καμπύλη αύξησης. Ο κλασματικός αριθμός κύκλων (Ct) υπολογίζεται στο σημείο τομής του σήματος φθορισμού με το Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού. Σχήμα 3 Ομαλοποίηση Τιμών Φθορισμού σε Κάθε Κύκλο για Κάθε Καμπύλη Αύξησης Ομαλοποιημένος Φθορισμός 1 0,9 0,8 Τιμή Ct = 27,1 0,7 Αποδιδόμενο Επίπεδο Φθορισμού 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0-0,1-0, Αριθμός Κύκλου EL 6 Doc Rev. 13.0

7 Ποσοτικοποίηση του HBV DNA Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 προσδιορίζει ποσοτικά το ιικό DNA του HBV χρησιμοποιώντας μια δεύτερη αλληλουχία στόχου (Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV), η οποία προστίθεται σε κάθε δείγμα εξέτασης σε γνωστή συγκέντρωση. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV είναι μια μη μολυσματική σύνθεση DNA που περιέχει τμήματα αλληλουχιών HBV με περιοχές δέσμευσης εκκινητή ακριβώς ίδιες με εκείνες της αλληλουχίας στόχου HBV. Το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV περιέχει περιοχές δέσμευσης εκκινητή HBV και δημιουργεί ένα προϊόν ενίσχυσης με ίδιο μήκος και με ίδια σύνθεση βάσης όπως το DNA στόχο του HBV. Η περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη ανίχνευσης του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HΒV έχει τροποποιηθεί για τη διαφοροποίηση του κλώνου (amplicon) Προτύπου Ποσοτικοποίησης HΒV από τον κλώνο (amplicon) στόχου HΒV. Κατά τη διάρκεια της φάσης υβριδισμού της PCR στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τα δείγματα εκτίθενται σε φως και διεγείρονται από φιλτραρισμένο φως, ενώ συλλέγονται φιλτραρισμένα δεδομένα φθορισμού εκπομπής για κάθε δείγμα. Στη συνέχεια, οι τιμές κάθε δείγματος διορθώνονται για τυχόν διακυμάνσεις που προκύπτουν από το όργανο. Αυτές οι τιμές φθορισμού αποστέλλονται από το όργανο στο AMPLILINK λογισμικό και αποθηκεύονται σε βάση δεδομένων. Εκτελούνται προέλεγχοι για να προσδιορίσουν εάν τα δεδομένα του HBV DNΑ και του DNΑ Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV αντιπροσωπεύουν έγκυρα σετ και στο σύστημα εμφανίζονται ενδείξεις όταν τα δεδομένα βρίσκονται εκτός των προκαθορισμένων ορίων. Μετά την επιτυχή ολοκλήρωση όλων των προελέγχων, οι τιμές φθορισμού υποβάλλονται σε επεξεργασία για τη δημιουργία τιμών Ct για το HBV DNA και το DNA Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Οι ειδικές για την παρτίδα σταθερές βαθμονόμησης που παρέχονται με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της τιμής τίτλου για τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου με βάση τις τιμές Ct HBV DNΑ και DNΑ Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 προτυποποιείται με βάση το ιεθνές Πρότυπο του ΠΟΥ σχετικά με το DNA του Ιού Ηπατίτιδας Β για Εξέταση Αναλύσεων NAT (Εξέταση Ενίσχυσης Νουκλεϊκού Οξέος) (NIBSC 97/746) 29 και τα αποτελέσματα των τίτλων εκφράζονται σε ιεθνείς Μονάδες (IU/mL). ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (P/N: ) HBV2 CS1 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Μαγνητικών Σωματιδίων Γυαλιού HBV) Μαγνητικά σωματίδια γυαλιού 93% Ισοπροπανόλη HBV2 CS2 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Λύσης HBV) Κιτρικό νάτριο διένυδρο 42,5% Θειοκυανική γουανιδίνη < 5% Πολυδοκανόλη 0,9% ιθειεθρυτόλη HBV2 CS3 Κασέτα Πολλαπλού Αντιδραστηρίου HBV που περιέχει: Pase ( ιάλυμα Πρωτεϊνάσης) Ρυθμιστικό διάλυμα Tris < 0,05% EDTA Χλωριούχο ασβέστιο Οξικό ασβέστιο 7,8% Πρωτεϊνάση Γλυκερόλη HBV V Εξετάσεις 1 x 72 Εξετάσεις 1 x 7,0 ml 1 x 72 Εξετάσεις 1x 78 ml 1 x 72 Εξετάσεις 1 x 3,8 ml EL 7 Doc Rev. 13.0

8 EB, v2.0 (Ρυθμιστικό ιάλυμα Έκλουσης, v2.0) Ρυθμιστικό διάλυμα με βάση tris 0,2% Μεθυλπαραμπένη HBV2 CS4 Κασέτα Αντιδραστηρίου ειδική για την εξέταση HBV που περιέχει: HBV QS, v2.0 (Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV, v2.0) Ρυθμιστικό διάλυμα Τris-HCI EDTA < 0,005% Poly ra RNA (συνθετικό) < 0,001% μη μολυσματικό, γραμμικοποιημένο, δίκλωνο DNA πλασμίδιο που περιέχει προσθήκη με αλληλουχίες δέσμευσης εκκινητή HBV και μια μοναδική περιοχή δέσμευσης ιχνηθέτη 0,05% Αζίδιο του νατρίου HBV MMX, v2.0 (HBV Κύριο Μίγμα, v2.0) Ρυθμιστικό διάλυμα Tricine Οξικό κάλιο Υδροξείδιο του καλίου 0,09% Αζίδιο του νατρίου Γλυκερόλη < 0,04% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,003% Νοηματικοί και αντινοηματικοί εκκινητές HBV < 0,003% Ολιγονουκλεοτιδική απταμέρη < 0,003% Ειδικοί για το HBV και το Πρότυπο Ποσοτικοποίησης HBV ολιγονουκλεοτιδικοί ιχνηθέτες με φθορίζουσα επισήμανση < 0,05% Z05 DNA Πολυμεράσης (μικροβιακό) < 0,1% Ένζυμο AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) (μικροβιακό) HBV Mn 2+ (HBV ιάλυμα Μαγγανίου) < 0,5% Οξικό μαγγάνιο Παγόμορφο οξικό οξύ 0,09% Αζίδιο του νατρίου HBV H(+)C, v2.0 (Θετικός Ορός Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης HBV, v2.0) < 0,001% Γραμμικοποιημένο, δίκλωνο DNA πλασμίδιο που περιέχει αλληλουχίες HBV Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρών σύμφωνα με εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR 0,1% Συντηρητικό ProClin x 8,1 ml 1 x 72 Εξετάσεις 1 x 3,6 ml 1 x 3,4 ml 1 x 19,8 ml 6 x 1,0 ml EL 8 Doc Rev. 13.0

9 HBV L(+)C, v2.0 (Θετικός Ορός Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης HBV, v2.0) < 0,001% Γραμμικοποιημένο, δίκλωνο DNA πλασμίδιο που περιέχει αλληλουχίες HBV Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρών σύμφωνα με εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 CTM ( ) C [COBAS TaqMan Αρνητικός Ορός Ελέγχου (Ανθρώπινο Πλάσμα)] Αρνητικό Ανθρώπινο Πλάσμα, μη αντιδρών σύμφωνα με εξετάσεις ανίχνευσης αντισωμάτων HCV, αντισωμάτων HIV-1/2, HIV p24 αντιγόνου και HBsAg. Τα HIV-1 RNA, HCV RNA και HBV DNA δεν ανιχνεύτηκαν με μεθόδους PCR 0,1% Συντηρητικό ProClin 300 HBV H(+)C, v2.0 Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης HBV, v2.0) HBV L(+)C, v2.0 Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης HBV, v2.0) HBV ( ) C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Αρνητικού Ορού Ελέγχου HBV) 6 x 1,0 ml 6 x 1,0 ml 1 x 6 Κλιπ 1 x 6 Κλιπ 1 x 6 Κλιπ COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης (P/N: ) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης) Κιτρικό νάτριο διένυδρο < 0,1% N-μεθυλισοθειαζολόνη-HCl PG WR 1 x 5,1 L ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ A. ΓΙΑ IN VITRO ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ. B. Η παρούσα εξέταση προορίζεται για χρήση με ανθρώπινο ορό ή πλάσμα που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικό EDTA. C. Μην εκτελείτε αναρρόφηση με πιπέτα από το στόμα. D. Μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε στους χώρους εργασίας των εργαστηρίων. Φοράτε προστατευτικά γάντια μίας χρήσης, ποδιές εργαστηρίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε δείγματα και κιτ αντιδραστηρίων. Πλένετε καλά τα χέρια σας μετά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων της εξέτασης. E. Αποφεύγετε τη μόλυνση των αντιδραστηρίων από μικρόβια και ριβονουκλεάση όταν αφαιρείτε τα κλάσματα δείγματος από τις φιάλες ορών ελέγχου. F. Συνιστάται η χρήση αποστειρωμένων πιπετών μίας χρήσης με ακροφύσια χωρίς DNase EL 9 Doc Rev. 13.0

10 G. Μη συγκεντρώνετε ορούς ελέγχου από διαφορετικές παρτίδες ή από διαφορετικά φιαλίδια της ίδιας παρτίδας. H. Μην αναμιγνύετε κασέτες αντιδραστηρίων ή ορούς ελέγχου από διαφορετικά κιτ. I. Μην ανοίγετε τις κασέτες COBAS AmpliPrep και μην αλλάζετε, αναμιγνύετε, αφαιρείτε ή προσθέτετε φιάλες. J. Η απόρριψη των αχρησιμοποίητων αντιδραστηρίων, των απορριμμάτων και των δειγμάτων θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς. K. Μη χρησιμοποιείτε κιτ μετά την ημερομηνία λήξης τους. L. ιατίθενται ελτία εδομένων Ασφάλειας (SDS), κατόπιν αιτήματος από τα γραφεία της Roche στην περιοχή σας. M. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να πραγματοποιείται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως εκείνες που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 35 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 36. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απoσταγμένο νερό. Σημείωση: Τα οικιακά υγρά λευκαντικά που διατίθενται στο εμπόριο περιέχουν κατά κανόνα υποχλωριώδες νάτριο σε συγκέντρωση 5,25%. Με την αραίωση οικιακού λευκαντικού σε αναλογία 1:10 παράγεται διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%. N. ΠΡΟΣΟΧΗ: Τα CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 και HBV H(+)C, v2.0 περιέχουν Ανθρώπινο Πλάσμα που προέρχεται από ανθρώπινο αίμα. Το υλικό προέλευσης έχει ελεγχθεί και έχει βρεθεί ότι δεν αντιδρά υπό την παρουσία Αντιγόνου Επιφανείας Ηπατίτιδας Β (HBsAg), αντισωμάτων HIV-1/2 και HCV και HIV p24 αντιγόνου. Η εξέταση του αρνητικού ανθρώπινου πλάσματος με τις μεθόδους PCR δεν έδειξε ανιχνεύσιμο HIV-1 RNA, HCV RNA ή HBV DNA. Καμία γνωστή μέθοδος εξέτασης δεν διασφαλίζει απόλυτα ότι τα παράγωγα που προέρχονται από ανθρώπινο αίμα δεν μεταδίδουν μολυσματικούς παράγοντες. Για το λόγο αυτό, όλα τα υλικά ανθρώπινης προέλευσης πρέπει να θεωρούνται εν δυνάμει μολυσματικά. Τα CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 και HBV H(+)C, v2.0 πρέπει να αντιμετωπίζονται ως μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να πραγματοποιείται με ασφαλείς εργαστηριακές διαδικασίες, όπως εκείνες που περιγράφονται στην τεκμηρίωση Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 35 και στο έγγραφο CLSI M29-A3 36. Καθαρίζετε καλά και απολυμαίνετε όλες τις επιφάνειες εργασίας με φρέσκο διάλυμα 0,5% υποχλωριώδους νατρίου σε απιονισμένο ή απoσταγμένο νερό. O. Τα HBV QS, v2.0, HBV Mn 2+ και HBV MMX, v2.0 περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να αντιδράσει με το μόλυβδο και το χαλκό των σωληνώσεων και να δημιουργήσει υψηλής εκρηκτικότητας αζίδια μετάλλου. Κατά την απόρριψη διαλυμάτων που περιέχουν αζίδιο του νατρίου στους νεροχύτες των εργαστηρίων, ρίχνετε άφθονη ποσότητα νερού για να αποφευχθεί ο σχηματισμός αζιδίου. P. Φοράτε προστατευτικά γυαλιά, ποδιές εργαστηρίου και γάντια μίας χρήσης όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Αποφεύγετε την επαφή των υλικών αυτών με το δέρμα, τα μάτια ή τους βλεννογόνους. Σε περίπτωση επαφής, ξεπλύνετε αμέσως με άφθονη ποσότητα νερού. Αν δεν υπάρξει άμεση αντιμετώπιση, μπορεί να προκληθούν εγκαύματα. Αν πέσουν σταγόνες από τα αντιδραστήρια, αραιώστε με νερό πριν τις σκουπίσετε. Q. Μην επιτρέπετε την επαφή του HBV2 CS2 και των υγρών αποβλήτων από το COBAS AmpliPrep Όργανο, που περιέχουν θειοκυανική γουανιδίνη, με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικού). Τα μίγματα αυτά μπορεί να παράγουν ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο. R. Κατά την απόρριψη χρησιμοποιημένων Μονάδων Επεξεργασίας ειγμάτων (SPUs) του COBAS AmpliPrep που περιέχουν θειοκυανική γουανιδίνη, αποφεύγετε οποιαδήποτε επαφή με διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (λευκαντικό). Τα μίγματα αυτά μπορεί να παράγουν ένα ιδιαίτερα τοξικό αέριο EL 10 Doc Rev. 13.0

11 ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ A. Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια ή τους ορούς ελέγχου. B. Αποθηκεύετε τα HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 και HBV2 CS4 στους 2-8 C. Τα αντιδραστήρια που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί παραμένουν σταθερά μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια αυτά παραμένουν σταθερά για 63 ημέρες στους 2-8 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα επέλθει πρώτη. Τα HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 και HBV2 CS4 μπορούν να χρησιμοποιηθούν για έως και 64 ώρες συνολικά μετά την τοποθέτησή τους στο COBAS AmpliPrep Όργανο. Τα αντιδραστήρια πρέπει να αποθηκεύονται στους 2-8 C μεταξύ των κύκλων των οργάνων. C. Αποθηκεύετε τα HBV H(+)C, v2.0, HBV L(+)C, v2.0 και CTM ( ) C στους 2-8 C. Οι οροί ελέγχου παραμένουν σταθεροί μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, η ποσότητα που δεν έχει χρησιμοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται. D. Αποθηκεύστε τα κλιπ Γραμμωτού κώδικα [HBV H(+)C, v2.0 Clip, HBV L(+)C, v2.0 Clip και HBV ( ) C Clip] στους 2-30 C. E. Αποθηκεύστε το PG WR στους 2-30 C. Το PG WR παραμένει σταθερό μέχρι την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Μετά το άνοιγμα, το αντιδραστήριο αυτό παραμένει σταθερό για 28 ημέρες στους 2-30 C ή μέχρι την ημερομηνία λήξης, ανάλογα με την κατάσταση που θα παρέλθει πρώτη. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (P/N: ) HBV V2.0 HBV2 CS1 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Μαγνητικών Σωματιδίων Γυαλιού HBV) HBV2 CS2 (Κασέτα Αντιδραστηρίου Λύσης HBV) HBV2 CS3 (Κασέτα Πολλαπλού Αντιδραστηρίου HBV) HBV2 CS4 (Κασέτα Αντιδραστηρίου ειδική για την εξέταση HBV) ΗΒV H(+)C, v2.0 (Θετικός Ορός Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης HΒV, v2.0) HΒV L(+)C, v2.0 (Θετικός Ορός Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης HΒV, v2.0) CTM ( ) C [COBAS TaqMan Αρνητικός Ορός Ελέγχου (Ανθρώπινο Πλάσμα)] HBV H(+)C, v2.0 Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Υψηλής Συγκέντρωσης HΒV, v2.0) HBV L(+)C, v2.0 Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Θετικού Ορού Ελέγχου Χαμηλής Συγκέντρωσης HΒV, v2.0) HBV ( ) C Clip (Κλιπ Γραμμωτού Κώδικα Αρνητικού Ορού Ελέγχου HΒV) EL 11 Doc Rev. 13.0

12 B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης (P/N: ) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Αντιδραστήριο Πλύσης) ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Όργανα και Λογισμικό COBAS AmpliPrep Όργανο COBAS TaqMan Αναλυτής ή COBAS TaqMan 48 Αναλυτής Προαιρετικά: Docking Station Προαιρετικά: cobas p 630 όργανο AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3 ή 3.4 Μονάδα Ελέγχου για το AMPLILINK Λογισμικό, με εκτυπωτή Εγχειρίδια Οργάνου και Λογισμικού: Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS AmpliPrep οργάνου για χρήση με το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3 και 3.4 Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan Αναλυτή για χρήση με το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3 και 3.4 Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή για χρήση με το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3 και 3.4 Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή και το cobas p 630 όργανο Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.4 Προαιρετικά: Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου, Έκδοση Λογισμικού 2.2 Αρχείο Ορισμού Εξέτασης (TDF). Για το όνομα και την τρέχουσα έκδοση του TDF, ανατρέξτε στην Καρτέλα Στοιχείων Προϊόντος που παρέχεται μαζί με το κιτ. Υλικά μίας χρήσης Μονάδες επεξεργασίας δειγμάτων: SPUs Σωληνάρια δειγμάτων εισόδου (S-tubes) με κλιπ γραμμωτού κώδικα Υποδοχείς K-tips Κιβώτιο των 12 x 96 K-tube ή EL 12 Doc Rev. 13.0

13 ΑΛΛΑ ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Υποδοχέας ειγμάτων (υποδοχέας SK 24) Υποδοχέας Αντιδραστηρίων Υποδοχέας SPU K-carrier Σύστημα μεταφοράς K-carrier Υποδοχέας K-carrier Συσκευές πιπέτας με ακροφύσια φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς DΝase (χωρητικότητα 1000 μl)* Γάντια μίας χρήσης, χωρίς πούδρα Αναδευτήρας τύπου Vortex * Οι συσκευές πιπέτας πρέπει να διαθέτουν ακρίβεια 3% του δηλούμενου όγκου. Τα ακροφύσια χωρίς DNase με φραγή αερολυμάτων ή θετική μετατόπιση πρέπει να χρησιμοποιούνται όπου καθορίζεται, για να αποφεύγεται η διασταυρούμενη μόλυνση των δειγμάτων και των κλώνων (amplicon). ΣΥΛΛΟΓΗ, ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Σημείωση: Όλα τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να θεωρούνται μολυσματικά και ο χειρισμός τους πρέπει να γίνεται ανάλογα. Σημείωση: Η παρούσα εξέταση έχει εγκριθεί μόνο για χρήση με ανθρώπινο ορό ή πλάσμα που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικό EDTA. Η εξέταση άλλων τύπων δειγμάτων μπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσματα. A. Συλλογή είγματος Το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HΒV Test, v2.0 προορίζεται για χρήση με δείγματα πλάσματος ή ορού. Το αίμα πρέπει να συλλέγεται σε αποστειρωμένα σωληνάρια με τη χρήση αντιπηκτικού EDTA (μοβ πώμα) ή σε Σωληνάρια ιαχωρισμού Ορού SST. Αποθηκεύετε το ολικό αίμα στους 2-25 C για διάστημα 24 ωρών το μέγιστο. ιαχωρίστε το πλάσμα ή τον ορό από το ολικό αίμα εντός 24 ωρών από τη συλλογή, με φυγοκέντριση στα x g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (15-30 C). Μεταφέρετε το πλάσμα ή τον ορό σε αποστειρωμένο σωληνάριο πολυπροπυλενίου. Στα Σχήματα 4 και 5 απεικονίζονται τα δεδομένα σταθερότητας δείγματος από μελέτες σταθερότητας δείγματος που διεξήχθησαν με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HΒV Test, v2.0. Σχήμα 4 Σταθερότητα ΗΒV σε Ολικό Αίμα (που έχει συλλεχθεί σε σωληνάρια με πλάσμα EDTΑ) Τίτλος log 10 (IU/mL) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Δείγμα 2-8 C <1 ώρα C 24 ώρα 2-8 C 24 ώρα EL 13 Doc Rev. 13.0

14 Σχήμα 5 Σταθερότητα ΗΒV σε Ολικό Αίμα (που έχει συλλεχθεί σε σωληνάρια διαχωρισμού ορού) Τίτλος log 10 (IU/mL) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Δείγμα 2-8 C <1 ώρα C 24 ώρα 2-8 C 24 ώρα B. Μεταφορά ειγμάτων Η μεταφορά του ολικού αίματος, του πλάσματος ή του ορού πρέπει να πραγματοποιείται σύμφωνα με τους κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς που αφορούν τη μεταφορά αιτιολογικών παραγόντων 37. Το ολικό αίμα πρέπει να μεταφέρεται στους 2-25 C και να υποβάλλεται σε φυγοκέντριση εντός 24 ωρών από τη συλλογή. Το πλάσμα ή ο ορός πρέπει να μεταφέρονται σε θερμοκρασία 2-8 C ή κατεψυγμένα σε θερμοκρασία -20 C έως -80 C. C. Αποθήκευση ειγμάτων Τα δείγματα πλάσματος ή ορού μπορούν να αποθηκεύονται σε θερμοκρασία C έως και 3 ημέρες, στους 2-8 C έως και 7 ημέρες ή κατεψυγμένα από τους -20 C έως -80 C για τουλάχιστον έξι εβδομάδες. Συνιστάται η αποθήκευση των δειγμάτων σε κλάσματα των µl σε αποστειρωμένα σωληνάρια πολυπροπυλενίου 2,0 ml με βιδωτό πώμα (όπως τα Sarstedt ). Στα Σχήματα 6 και 7 απεικονίζονται τα δεδομένα σταθερότητας δείγματος από μελέτες αποθήκευσης δείγματος που διεξήχθησαν με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HΒV Test, v EL 14 Doc Rev. 13.0

15 Σχήμα 6 Σταθερότητα HBV σε Πλάσμα EDTA Τίτλος log 10 (IU/mL) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Δείγμα 2-8 C 2 ώρες C 3 ημέρες 2-8 C 7 ημέρες -20 C 6 εβδομάδες -70 C 6 εβδομάδες Τίτλος log 10 (IU/mL) 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Σχήμα 7 Σταθερότητα HΒV σε Ορό Δείγμα 2-8 C 2 ώρες C 3 ημέρες 2-8 C 7 ημέρες -20 C 6 εβδομάδες -70 C 6 εβδομάδες Τα δείγματα πλάσματος και ορού μπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν έως και πέντε φορές χωρίς απώλεια του HBV DΝΑ. Στα Σχήματα 8 και 9 απεικονίζονται τα δεδομένα από μια μελέτη κατάψυξης-απόψυξης που διεξήχθηκε με το COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HΒV Test, v EL 15 Doc Rev. 13.0

16 Σχήμα 8 Αποτελέσματα HΒV Μετά Από Έως και Πέντε Κύκλους Κατάψυξης-Απόψυξης (K-A) (Πλάσμα EDTA) 3,0 Τίτλος log 10 (IU/mL) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Δείγμα 0x Κατάψυξη/Απόψυξη 3x Κατάψυξη/Απόψυξη 5x Κατάψυξη/Απόψυξη Σχήμα 9 Αποτελέσματα HΒV Μετά Από Έως και Πέντε Κύκλους Κατάψυξης-Απόψυξης (K-A) (Ορός) 3,0 Τίτλος log 10 (IU/mL) 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Δείγμα 0x Κατάψυξη/Απόψυξη 3x Κατάψυξη/Απόψυξη 5x Κατάψυξη/Απόψυξη EL 16 Doc Rev. 13.0

17 Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Σημείωση: Για λεπτομερείς οδηγίες λειτουργίας, λεπτομερή περιγραφή των πιθανών διευθετήσεων, εκτύπωση αποτελεσμάτων και ερμηνεία ενδείξεων, σχολίων και μηνυμάτων σφάλματος, ανατρέξτε στα εξής: (1) Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS AmpliPrep οργάνου για χρήση με το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3 και 3.4, (2) Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan Αναλυτή για χρήση με το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3 και 3.4, (3) Εγχειρίδιο Οργάνου του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή για χρήση με το AMPLILINK Λογισμικό, Έκδοση Σειράς 3.3 και 3.4, (4) Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.3, για χρήση με το COBAS AmpliPrep Όργανο, τον COBAS TaqMan Αναλυτή, τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, τον COBAS AMPLICOR Αναλυτή και το cobas p 630 όργανο, ή Εγχειρίδιο Εφαρμογής του AMPLILINK Λογισμικού, Έκδοση Σειράς 3.4, (5) προαιρετικό: Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου, Έκδοση Λογισμικού 2.2. Μέγεθος Παρτίδας Κάθε κιτ περιέχει αντιδραστήρια για 72 εξετάσεις, οι οποίες μπορούν να εκτελεστούν σε παρτίδες των 12 έως 24 εξετάσεων. Από κάθε ορό ελέγχου [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 και HBV H(+)C, v2.0] πρέπει να περιλαμβάνεται τουλάχιστον ένας σε κάθε παρτίδα (βλ. ενότητα «Ποιοτικός έλεγχος»). Ροή Εργασιών Η ανάλυση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή πρέπει να ξεκινήσει εντός 120 λεπτών μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας δειγμάτων και ορών ελέγχου. Σημείωση: Μην καταψύχετε ή αποθηκεύετε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία. Προετοιμασία ειγμάτων και Ορών Ελέγχου Σημείωση: Αν χρησιμοποιείτε κατεψυγμένα δείγματα, τοποθετήστε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου (15-30 C) έως την πλήρη απόψυξή τους και στροβιλίστε για 3-5 δευτερόλεπτα πριν από τη χρήση.οι οροί ελέγχου θα πρέπει να απομακρύνονται από το χώρο αποθήκευσης σε θερμοκρασία 2-8 C και να περιέρχονται σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση. Ρύθμιση του COBAS AmpliPrep Οργάνου Μέρος A. Συντήρηση και Εκκίνηση A1. Το COBAS AmpliPrep Όργανο είναι έτοιμο για λειτουργία στον τρόπο λειτουργίας αναμονής. A2. Ενεργοποιήστε (ON) τη Μονάδα Ελέγχου για το AMPLILINK λογισμικό. Προετοιμάστε τη Μονάδα Ελέγχου ως εξής: 1. Συνδεθείτε στο λειτουργικό σύστημα Microsoft Windows. 2. Κάντε διπλό κλικ στο εικονίδιο του AMPLILINK λογισμικού. 3. Συνδεθείτε στο AMPLILINK λογισμικό εισάγοντας τον καθορισμένο Κωδικό Χειριστή και τον κωδικό πρόσβασης. A3. Ελέγξτε την παροχή του PG WR χρησιμοποιώντας την Οθόνη Status και αντικαταστήστε αν χρειάζεται. A4. ιεξάγετε όλες τις εργασίες συντήρησης που αναφέρονται στον πίνακα Due. Το COBAS AmpliPrep Όργανο θα πραγματοποιήσει αυτόματη εκκίνηση στο σύστημα EL 17 Doc Rev. 13.0

18 Μέρος B. Φόρτωση Κασετών Αντιδραστηρίου Σημείωση: Όλες οι κασέτες αντιδραστηρίου θα πρέπει να απομακρύνονται από το χώρο αποθήκευσης σε θερμοκρασία 2-8 C, να φορτώνονται αμέσως στο COBAS AmpliPrep Όργανο και να περιέρχονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος στο όργανο για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από την επεξεργασία του πρώτου δείγματος. Μην αφήσετε τις κασέτες αντιδραστηρίου να αποκτήσουν θερμοκρασία περιβάλλοντος εκτός οργάνου, καθώς ενδέχεται να σχηματιστεί υγρασία στις ετικέτες γραμμωτού κώδικα. Μη σκουπίζετε την υγρασία από τις ετικέτες γραμμωτού κώδικα. B1. Τοποθετήστε το HBV2 CS1 σε έναν υποδοχέα αντιδραστηρίων. Τοποθετήστε τα HBV2 CS2, HBV2 CS3 και HBV2 CS4 σε ξεχωριστό υποδοχέα αντιδραστηρίων. B2. Φορτώστε τον υποδοχέα αντιδραστηρίων που περιέχει το HBV2 CS1 στη θέση υποδοχέα Α του COBAS AmpliPrep Οργάνου. B3. Φορτώστε τον υποδοχέα αντιδραστηρίων που περιέχει τα HBV2 CS2, HBV2 CS3 και HBV2 CS4 στις θέσεις υποδοχέα B, C, D ή E του COBAS AmpliPrep Οργάνου. (Βλέπε Πίνακα 1 για περισσότερες πληροφορίες.) Μέρος Γ. Φόρτωση Υλικών μίας Χρήσης Σημείωση: Καθορίστε τον αριθμό των COBAS AmpliPrep κασετών αντιδραστηρίου, τις Μονάδες Επεξεργασίας ειγμάτων (SPUs), τα σωληνάρια ειγμάτων Εισόδου (S-tubes), τα K-tips και τα K-tubes που απαιτούνται. Απαιτείται μία μονάδα επεξεργασίας δειγμάτων, ένα S-tube Εισόδου, ένα K-tip και ένα K-tube για κάθε δείγμα ή ορό ελέγχου. Υπάρχει δυνατότητα πολλαπλών ροών εργασιών για χρήση του COBAS AmpliPrep Οργάνου με τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Για αναφορά, βλέπε τον παρακάτω Πίνακα 1. Ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται, φορτώστε τον κατάλληλο αριθμό υποδοχέων κασετών αντιδραστηρίου, υποδοχέων δειγμάτων με S-tubes Εισόδου, υποδοχέων SPU, υποδοχέων K-tip, υποδοχέων K-tube και K-carriers σε υποδοχείς K-carrier στις αντίστοιχες θέσεις υποδοχέων του COBAS AmpliPrep Οργάνου (για περισσότερες πληροφορίες, βλέπε Πίνακα 1). Γ1. Τοποθετήστε τις μονάδες επεξεργασίας δειγμάτων (SPU) στους υποδοχείς SPU και φορτώστε τους υποδοχείς στις θέσεις υποδοχέα J, K ή L του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ2. Ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται, φορτώστε τους γεμάτους υποδοχείς K-tube στις θέσεις υποδοχέα M, N, O ή P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ3. Φορτώστε τους γεμάτους υποδοχείς K-tip στις θέσεις υποδοχέα M, N, O ή P του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Γ4. Για τη ροή εργασιών 3 που χρησιμοποιεί τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, φορτώστε τους K-carriers στους υποδοχείς K-carrier στις θέσεις υποδοχέα M & N ή O & P του COBAS AmpliPrep Οργάνου EL 18 Doc Rev. 13.0

19 Πίνακας 1 Πιθανές Ροές Εργασιών για χρήση του COBAS AmpliPrep Οργάνου με τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Ροή Εργασιών COBAS AmpliPrep Όργανο, Docking Station και COBAS TaqMan Αναλυτής COBAS AmpliPrep Όργανο και COBAS TaqMan Αναλυτής COBAS AmpliPrep Όργανο και COBAS TaqMan 48 Αναλυτές Τρόπος μεταφοράς στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Αυτόματη μεταφορά K-carrier Χειροκίνητη μεταφορά των K-tubes μέσω υποδοχέων δειγμάτων στον COBAS TaqMan Αναλυτή Χειροκίνητη μεταφορά του K-carrier μέσω υποδοχέων K-carrier στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Υποδοχείς, φορείς και υλικά μίας χρήσης K-tubes σε γεμάτους υποδοχείς K-tube K-tips σε γεμάτους υποδοχείς K-tip S-tubes εισόδου που περιέχουν δείγματα και ορούς ελέγχου σε υποδοχείς δειγμάτων Μονάδες Επεξεργασίας ειγμάτων (SPU) σε υποδοχείς SPU CS1 σε υποδοχέα κασετών CS2, CS3, CS4 σε υποδοχέα κασετών K-tubes σε γεμάτους υποδοχείς K-tube K-tips σε γεμάτους υποδοχείς K-tip S-tubes εισόδου που περιέχουν δείγματα και ορούς ελέγχου σε υποδοχείς δειγμάτων Μονάδες Επεξεργασίας ειγμάτων (SPU) σε υποδοχείς SPU CS1 σε υποδοχέα κασετών CS2, CS3, CS4 σε υποδοχέα κασετών Μετά την ολοκλήρωση της επεξεργασίας δειγμάτων: K-tubes σε υποδοχείς δειγμάτων (έτοιμα για χειροκίνητη μεταφορά) K-tubes σε υποδοχείς δειγμάτων K-tips σε γεμάτους υποδοχείς K-tip S-tubes εισόδου που περιέχουν δείγματα και ορούς ελέγχου σε υποδοχείς δειγμάτων Μονάδες Επεξεργασίας ειγμάτων (SPU) σε υποδοχείς SPU CS1 σε υποδοχέα κασετών CS2, CS3, CS4 σε υποδοχέα κασετών Άδειο K-carrier με γραμμωτό κώδικα σε υποδοχέα K-carrier Μετά την ολοκλήρωση της επεξεργασίας δειγμάτων: K-tubes σε K-carrier σε υποδοχέα K-carrier Θέση στο COBAS AmpliPrep Όργανο M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Όπως παραπάνω (F-H) F - H M P F - H J L A B E M P Όπως παραπάνω (M P) EL 19 Doc Rev. 13.0

20 Μέρος. Εντολή και Φόρτωση ειγμάτων 1. Προετοιμάστε τους υποδοχείς δειγμάτων ως εξής: Προσαρμόστε ένα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα σε κάθε θέση υποδοχέα δειγμάτων όπου πρόκειται να τοποθετηθεί δείγμα (S-tube). Προσαρμόστε ένα από τα ειδικά για τους ορούς ελέγχου κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 και HBV H(+)C, v2.0] σε κάθε θέση υποδοχέα δειγμάτων όπου πρόκειται να τοποθετηθούν οροί ελέγχου (S-tube). Το CTM ( ) C πρέπει να τοποθετηθεί στη θέση του υποδοχέα δειγμάτων μετά το τελευταίο κλινικό δείγμα ή θετικό ορό ελέγχου [HBV L(+)C, v2.0 ή HBV H(+)C, v2.0] σε κάθε παρτίδα των 12 έως 24 εξετάσεων. Τα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα για τους ορούς ελέγχου πρέπει να έχουν τον ίδιο αριθμό παρτίδας ορού ελέγχου με τον αριθμό παρτίδας που υπάρχει στα φιαλίδια ορού ελέγχου του κιτ. Φροντίστε να τοποθετήσετε το σωστό ορό ελέγχου στη θέση με το κατάλληλο κλιπ γραμμωτού κώδικα ορού ελέγχου. Τοποθετήστε ένα S-tube Εισόδου σε κάθε θέση που περιλαμβάνει ένα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα. 2. Χρησιμοποιώντας το AMPLILINK λογισμικό, δημιουργήστε εντολές δείγματος για κάθε δείγμα και ορό ελέγχου στο φάκελο Sample του παραθύρου Orders. Επιλέξτε το κατάλληλο αρχείο εξέτασης και ολοκληρώστε τη διαδικασία με αποθήκευση. 3. Αντιστοιχίστε τις εντολές δειγμάτων και ορών ελέγχου στις θέσεις υποδοχέα δειγμάτων, στο φάκελο Sample Rack του παραθύρου Orders. Ο αριθμός υποδοχέα δειγμάτων πρέπει να προορίζεται για τον υποδοχέα που προετοιμάστηκε στο Βήμα Εκτυπώστε την αναφορά Sample Rack Order για να τη χρησιμοποιήσετε ως φύλλο εργασίας. 5. Προετοιμάστε υποδοχείς δειγμάτων και ορών ελέγχου στην καθορισμένη περιοχή για προσθήκη δειγμάτων και ορών ελέγχου ως εξής: Στροβιλίστε κάθε δείγμα και ορό ελέγχου [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 και HBV H(+)C, v2.0] για 3 έως 5 δευτερόλεπτα. Φροντίστε να μην μολυνθούν τα γάντια κατά το χειρισμό των δειγμάτων και των ορών ελέγχου. 6. Μεταφέρετε 650 µl κάθε δείγματος και ορού ελέγχου [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 και HBV H(+)C, v2.0] στο αντίστοιχο S-tube Εισόδου με επισήμανση γραμμωτού κώδικα χρησιμοποιώντας μια μικροπιπέτα με ακροφύσιο φραγής αερολυμάτων ή θετικής μετατόπισης χωρίς DNase. Αποφεύγετε τη μεταφορά σωματιδίων και/ ή θρόμβων ινώδους από το αρχικό δείγμα στο S-tube Εισόδου. Τα δείγματα και οι οροί ελέγχου πρέπει να μεταφέρονται σε θέσεις σωληναρίων, όπως καθορίζεται και καταγράφεται στο φύλλο εργασίας στο βήμα 4. Τα κλιπ ετικέτας γραμμωτού κώδικα για τους ορούς ελέγχου πρέπει να έχουν τον ίδιο αριθμό παρτίδας ορού ελέγχου με τον αριθμό παρτίδας που υπάρχει στα φιαλίδια ορού ελέγχου του κιτ. Τοποθετήστε το σωστό ορό ελέγχου στη θέση με το κατάλληλο κλιπ γραμμωτού κώδικα ορού ελέγχου. Αποφεύγετε την επιμόλυνση του επάνω μέρους των S-tubes με δείγματα ή ορούς ελέγχου. 7. Αν χρησιμοποιείτε το cobas p 630 όργανο για την προετοιμασία δειγμάτων, ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο Χειριστή του cobas p 630 οργάνου. 8. Για τις ροές εργασιών 1 και 2, φορτώστε τους υποδοχείς δειγμάτων που είναι γεμάτοι με S-tubes Εισόδου στις θέσεις υποδοχέα F, G ή H του COBAS AmpliPrep Οργάνου. 9. Για τη ροή εργασιών 3, χρησιμοποιώντας τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή, φορτώστε τους υποδοχείς δειγμάτων με S-tubes Εισόδου και K-tubes (ένα για κάθε S-tube Εισόδου, φορτωμένο στη δεξιά θέση, δίπλα στα S-tubes Εισόδου) στις θέσεις υποδοχέα F, G ή H του COBAS AmpliPrep Οργάνου. Μέρος E. Έναρξη ανάλυσης στο COBAS AmpliPrep Όργανο E1. Θέστε σε λειτουργία το COBAS AmpliPrep Όργανο χρησιμοποιώντας το AMPLILINK λογισμικό EL 20 Doc Rev. 13.0

21 Μέρος ΣΤ. Τερματισμός ανάλυσης στο COBAS AmpliPrep Όργανο και Μεταφορά στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή (μόνο για τις ροές εργασιών 2 και 3) ΣΤ1. Ελέγξτε αν υπάρχουν τυχόν ενδείξεις ή μηνύματα σφάλματος. ΣΤ2. Μεταφέρετε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία από το COBAS AmpliPrep Όργανο σε υποδοχείς δειγμάτων (για τον COBAS TaqMan Αναλυτή χωρίς Docking Station) ή σε υποδοχείς K-carrier (για τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή), ανάλογα με τη ροή εργασιών (για περαιτέρω λεπτομέρειες, βλέπε Μέρος Ζ). ΣΤ3. Απομακρύνετε τα απορρίμματα από το COBAS AmpliPrep Όργανο. Σημείωση: Τα δείγματα και οροί ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία δεν πρέπει να εκτίθενται σε φως μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας δειγμάτων και ορών ελέγχου. Ενίσχυση και Ανίχνευση Ρύθμιση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή Η ανάλυση του COBAS TaqMan Αναλυτή ή του COBAS TaqMan 48 Αναλυτή πρέπει να ξεκινήσει εντός 120 λεπτών μετά την ολοκλήρωση της προετοιμασίας δειγμάτων και ορών ελέγχου. Σημείωση: Μην καταψύχετε ή αποθηκεύετε τα δείγματα και τους ορούς ελέγχου που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία. Μέρος Ζ. Φόρτωση δειγμάτων που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία Ζ1. Ανάλογα με τη ροή εργασιών, εκτελέστε τα κατάλληλα βήματα για τη μεταφορά των K-tubes στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή: Ροή Εργασιών 1: Ροή Εργασιών 2: Ροή Εργασιών 3: Αυτόματη μεταφορά των K-carrier μέσω docking station στον COBAS TaqMan Αναλυτή. εν απαιτείται χειροκίνητη παρέμβαση. Χειροκίνητη μεταφορά των K-tubes σε υποδοχείς δειγμάτων στον COBAS TaqMan Αναλυτή. Χειροκίνητη μεταφορά των K-carrier σε υποδοχείς K-carrier στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή. Μεταφέρετε χειροκίνητα τα K-carriers στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή χρησιμοποιώντας τον Μεταφορέα K-carrier. Μέρος Η. Έναρξη ανάλυσης στον COBAS TaqMan Αναλυτή ή στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή H1. Θέστε σε λειτουργία τον COBAS TaqMan Αναλυτή ή τον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή χρησιμοποιώντας μία από τις παρακάτω επιλογές, ανάλογα με τη ροή εργασιών που χρησιμοποιείται: Ροή Εργασιών 1: εν απαιτείται παρέμβαση. Ροή Εργασιών 2: Αυτόματη εκκίνηση του COBAS TaqMan Αναλυτή μετά την εισαγωγή των υποδοχέων δειγμάτων. Ροή Εργασιών 3: Γεμίστε το K-carrier με άδεια K-tubes, σε περίπτωση που υπάρχουν λιγότερα από 6 K-tubes στο K-carrier. Η πλήρωση ελέγχεται από το AMPLILINK λογισμικό. Ανοίξτε το κάλυμμα του θερμοκυκλοποιητή, φορτώστε τα K-carrier και κλείστε το καπάκι. Ξεκινήστε τη ανάλυση στον COBAS TaqMan 48 Αναλυτή EL 21 Doc Rev. 13.0