Μανδηλαρά Γεωργία Βιολόγος PhD, Επιστημονική Υπεύθυνη Εθνικού Κέντρου Αναφοράς Σαλμονελλών, Σιγκελλών, παθογόνων E.coli και λοιπών Εντεροπαθογόνων

Transcript

1 Μανδηλαρά Γεωργία Βιολόγος PhD, Επιστημονική Υπεύθυνη Εθνικού Κέντρου Αναφοράς Σαλμονελλών, Σιγκελλών, παθογόνων E.coli και λοιπών Εντεροπαθογόνων Τμήμα Μικροβιολογίας Εθνική Σχολή Δημόσιας Υγείας ΚΕΔΥ-ΚΕΕΛΠΝΟ

2 Λοιμώξεις Τοξινώσεις (τροφικές δηλητηριάσεις) [Intoxination]

3 -Αρχές 20 ου αιώνα Μολυσμένα τρόφιμα,γάλα, νερό τ.ν - Επανάσταση συνθήκες υγιεινής Αποχέτευση / επεξεργασία νερού Πλύσιμο χεριών Παστερίωση γάλακτος-1908 Οικιακά ψυγεία-1913 Grand Total Τροφιμογενή νοσήματα Αγγλία-Ουαλία Food Poisoning Notifications England and Wales, Year

4 (m illion) Growth of World Population (total) Source:W orld Population Prospects, United Nations

5

6 Πρωτογενής παραγωγή Αλυσίδα Παραγωγής Τροφίμων Διανομή Επεξεργασία Πώληση Κατανάλωση στο σπίτι Εστιατόριο Προετοιμασία φαγητού σπίτι

7 Εισαγωγή νέων και πολλαπλών «κρίσιμων» σημείων

8

9 εστιασμένη διάσπαρτη

10 Μια μεγάλη εστιασμένη επιδημία μπορεί να είναι εμφανής...

11 Μια επιδημία με κρούσματα διάσπαρτα γεωγραφικά... χρονικά...δύσκολα διερευνάται..εκτός αν: Απομόνωση παθογόνου από όλα τα κρούσματα

12

13 FDA

14 Οριζόντια μεταφορά γενετικού υλικού

15 Salmonella monophasic Typhimurium

16 γνωρίζουμε μόνο την κορυφή του παγόβουνου. υποδήλωση τροφιμογενών νοσημάτων καινοτόμες προσεγγίσεις (ενεργητική επιδημιολογική επιτήρηση, εκτίμηση κινδύνου, επιδημιολογικά μοντέλα)

17 Salmonella spp. Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Σαλμονελλών Salmonella spp Ολυμπιακοί Αγώνες : improved Surveillance -PulseNet ~1,200 outbreaks/year Outbreaks ~500 outbreaks/year Τροφιμογενείς επιδημίες ΗΠΑ,

18 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ

19 Ετήσια εκτίμηση περιστατικών τροφιμογενώννοσημάτων Η.Π.Α ,000 die of foodborne diseases CDC,2011 Ετήσια εκτίμηση νοσηλειών Ετήσια εκτίμηση θανάτων Listeria monocytogenes(ηλικιωμένους έγκυες γυναίκες) θνητότητα 20-30%

20 CDC

21 Επιτήρηση τροφιμογενών νοσημάτων στην Ελλάδα Σύστημα Υποχρεωτικής Δήλωσης Νοσημάτων (ΚΕΕΛΠΝΟ)

22 Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Σαλμονελλών-Σιγκελλώνκαι VTEC(ΕΚΑΣΣ) παραλαβή στελεχών μικροβίων& επιδημιολογικών δελτίων από δημόσια και ιδιωτικά νοσηλευτικά ιδρύματα ταυτοποίηση βιοχημική τυποποίηση οροτυποποίηση μοριακή τυποποίηση (Pulsed Field GelΕlectrophoresis) έλεγχος αντοχής σε αντιβιοτικά ( Διαπίστευση των μεθόδων οροτυποποίησης σαλμονελλώνκαι ελέγχου αντοχής σε αντιβιοτικά / PFGE από τον ΕΣΥΔ (ISO/IEC 17025) τράπεζα στελεχών από 1996 σήμερα αποστολή αποτελεσμάτων κοινοποίηση αποτελεσμάτων σε: ΚΕΕΛΠΝΟ (Γραφείο Τροφιμογενών Νοσημάτων) ECDC Υπουργείο Υγείας

23 ΔΙΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΣΧΗΜΑΤΑ- EKAΣΣ Οροτυποποίηση σαλμονελλών: WHO Global Foodborne Infections Network -GFN EQAS Έλεγχος αντοχής σε αντιβιοτικά (σαλμονέλλες και σιγκέλλες) : WHO Global Foodborne Infections Network -GFN EQAS PFGE εντεροβακτηριακών (σαλμονέλλα/ VTEC)+ Λιστέριας: ECDC-Statens Serum Institut Ταυτοποίηση και Τυποποίηση (+PFGE) Verocytotoxin E.coli και άλλων παθότυπων (enteroinvasive, enteroaggregative, enterotoxigenic, enteropathogenicκ.λ.π.): ΕU Reference Laboratory for E.coli IstitutoSuperiorediSanita & ECDC -WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Escherichia and Klebsiella Ανίχνευση VerocytotoxinE.coliκαι άλλων παθότυπωναπό τρόφιμα (π.χ. νερό, σπανάκι, σπόροι, φύτρα) : ΕU Reference Laboratory for E.coli Istituto Superiore di Sanita

24 ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ και ΤΡΟΦΙΜΟΓΕΝΕΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ Ανίχνευση-Απομόνωση-Ταυτοποίηση - Τυποποίηση Καλλιέργεια μ/ο Απομόνωση Βιοχημικές ιδιότητες (ταυτοποίηση) Οροτυποποίηση(τυποποίηση) Λυσιτυπία Αντιβιόγραμμα Φαινοτυπικές γονοτυπικές μεθόδους =άμεση ανίχνευση γενετικού υλικούdna/rna Γονίδιο: κομμάτι DNAπου περιέχει «κωδικές» αλληλουχίες (για ποια πρωτείνη κωδικοποιεί ) και «μη κωδικές» αλληλουχίες (καθορίζουν πότε το γονίδιο εκφράζεται) Π.χ. γονίδιο παραγωγής τοξινών των VTEC γονίδιο παραγωγής γλουκουρονιδάσης γονίδιο αντοχής σε ένα αντιβιοτικό

25 Ταυτοποίηση(=identification) Τυποποίηση(=typing) κατάταξη σε είδος κάτω από το επίπεδο είδος/υποείδος Φαινοτυπική ή/και γονοτυπική ανάλυση βακτηριακών καλλιεργημάτων με σκοπό την παραγωγή αποτυπώματος (fingerprint) ειδικό για κάθε στέλεχος ή κλώνο (Ταξινομική) βαθμίδα Οικογένεια Γένος Είδος Υποείδος Τύπος Στέλεχος (strain) Καλλιέργημα (isolate) Παράδειγμα Enterobacteriaceae Salmonella Salmonella enterica Salmonella enterica enterica 4,5:i:1,2 (ορότυπος Typhimurium) PT104 (λυσίτυπος) STYXB0120 (PFGE profile) Επιδημία Ασθενής επιδημίας

26 Μοριακές τεχνικές τυποποίησης / ταυτοποίησης Polymerase Chain Reaction (PCR) Real-Time PCR Reverse-Transcription PCR Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis (MLVA) Multi Locus Sequence Typing (MLST) Προτυποποιημένες μέθοδοι για κάθε μικροοργανισμό Διεργαστηριακά σχήματα ποιοτικού ελέγχου

27 Polymerase Chain Reaction (PCR) γονίδιο παραγωγής γλουκουρονιδάσης γονίδιο αντοχής σε ένα αντιβιοτικό γονίδιο παραγωγής τοξινών των VTEC

28 Κανονισμός (ΕΕ) αριθ. 209/2013 της Επιτροπής, της 11ης Μαρτίου 2013, για την τροποποίηση του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 2073/2005 όσον αφορά τα μικροβιολογικά κριτήρια για τα φύτρα και τους κανόνες δειγματοληψίας για τα σφάγια πουλερικών και το νωπό κρέας πουλερικών Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ Επίσημη Εφημερίδα αριθ. L 068 της 12/03/2013 σ ύδατα άρδευσης: απουσία στα 200ml

29

30 Insertion event Deletion event Foreign DNA Host DNA Host DNA Excised fragment Principle: Strain diversity Rearrangement event New Host DNA New Host DNA Host DNA New Host DNA Ποικιλομορφία στελεχών Μοριακές τεχνικές τυποποίησης Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis (MLVA) Multi Locus Sequence Typing (MLST)

31 ΓΙΑΤΙ ΤΥΠΟΠΟΙΟΥΜΕ; 1. Επιτήρηση τροφιμογενών νοσημάτων 2. Διερεύνηση επιδημιών 3. Μελέτη παθογένειας και πορείας λοίμωξης 4. Μελέτη γενετικής βακτηριακού πληθυσμού

32 1. Επιδημιολογική επιτήρηση τροφιμογενώννοσημάτων (surveillance) συστηματική και εξελισσόμενη διαδικασία συλλογής δεδομένων, αναλύσεων αποτελεσμάτων, ερμηνείας αποτελεσμάτων διασποράς αποτελεσμάτων λήψη μέτρων καταγραφή τάσεων νοσημάτων σχεδιασμός καταστολής Ανάλυση σε υπολογιστικά / ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων σύγκριση και συσχέτιση των αποτυπωμάτων σε τοπικό έως και παγκόσμιο επίπεδο, π.χ. Pulsenet

33 TESSy

34 Αύξηση monophasicsalmonellatyphimurium σε χώρες της Ε.Ε και Ελλάδα % %

35

36

37 According to our results, the main clone of monophasictyphimurium(1,4,5,[12]:i:-) circulating in humans in Greece is that of phage type DT120, R-type ASSuTSpTmand PFGE profile STYMXB.0010.This clonepredominates among pigisolates as well, indicating that pigs may be a reservoirof this clone in Greece. Cloneof DT193, R-type ASSuTand PFGE profile STYMXB.0131, is predominantwithin several Europeancountries [10,40], but has a low frequency in Greece.

38 2. Διερεύνηση επιδημιών Τυποποίηση: αριθμό στελεχών αρχική εστία πορεία μετάδοσης αποτελεσματικότητα μέτρων ελέγχου

39 Επιδημία Salmonella entericaser. 6,7:k:-από κοτόπουλο σε ψησταριά XbaI, Salmonella enterica ser. 6,7:k:- 121 S. Thompson S. Thompson S. Thompson S. Thompson S. Thompson S. Thompson αντοχή:amp,spe,kan,tob, str,sss/δήλωσε ότι έφαγε στον 2 ευαίσθητο μονοφασικό κόπρανα 231 ευαίσθητο μονοφασικό κόπρανα 4648 σουβλάκι, αντοχή:amp,spe,kan,tob, str,sss 380 αντοχή:amp,spe,kan,tob, str,sss/δήλωσε ότι έφαγε στον; 350 αντοχή:amp,spe,kan,tob, str,sss/δήλωσε ότι έφαγε στον; 70/2011 ευαίσθητο(ἄν και δήλωσε ότι έφαγε στον) -κόπρανα 71/2011 ευαίσθητο (ἄν και δήλωσε ότι έφαγε στον) -κόπρανα 73/2011 αντοχή:amp,spe,kan,tob, str,sss-αίμα του 70/2011/δήλωσε ότι έφαγε στον 90/2011 αντοχή:amp,spe,kan,tob, str,sss /δήλωσε ότι έφαγε στον αλέκτωρ αντοχή:amp,spe,kan,tob, str,sss /δήλωσε ότι έφαγε στον 101/2011 αντοχή:amp,spe,kan,tob, str,sss /δήλωσε ότι έφαγε στον 105/2011 αντοχή:amp,spe,kan,tob, str,sss /δήλωσε ότι έφαγε στον 109/2011 αντοχή:amp,spe,kan,tob, str,sss /δήλωσε ότι έφαγε στον 110/2011 ευαίσθητο μονοφασικό -κόπρανα

40 Σπόροι fenugreek Φύτρα fenugreek

41

42

43

44 The sequence data indicate that the patient's isolates probably did not arise from an EHEC pathogen, but rather from a germ called EAEC (entero-aggregative Escherichia coli). This germ is able to attach particularly strongly to the epithelium. It then forms cell aggregates and initiates its normal, pathological programme. More than 96 percent of the genetic material of the Hamburg isolates are identical to that of an EAEC strain. The pathological potential of the EAEC germ has increased significantly by acquiring a special gene from other E. coli strains, such as EHEC, by means of bacterial viruses (phages) and integrating it into its own chromosome. This gene produces the so-called Shiga toxin, which originates from the pathogen causing shigellosis. It is a toxin which may trigger the haemolytic uraemic syndrome (HUS), namely blood decomposition, as well as complications, such as renal failure. This combination makes the bacterium dangerous: Its cells probably form large plaques in the intestine by attaching and aggregating, and this cell mass then produces a highly active poison. In addition, a so-called resistance plasmid protects the germ from a wide spectrum of antibiotics.

45 Fenugreek= Trigonella graecium Δεν απομονώθηκε το μικρόβιο από τρόφιμο ετερογενής κατανομή μικροβίου σε διαφορετικές παρτίδες χαμηλό μικροβιακό φορτίο στους σπόρους (πολλαπλασιάστηκε κατά τη φύτρωση) χαμηλή περιεκτικότητα νερού στους σπόρους, το μικρόβιο είναι stressed Επιδημίες strong evidence (ισχυρή ένδειξη) weak evidence (αδύναμη ένδειξη)

46 Θετικός μάρτ Καλλιέργημα Γερμανίδας Θετικός μάρτ Καλλιέργημα Γερμανίδας Απομόνωση E.coli από Γερμανίδα τουρίστρια στους Παξούς Vtx2 (626bp) Vtx2α(350bp) -Ίδιο φαινότυπο αντοχής με επιδημικό στέλεχος -Ίδιο προφίλ PFGE - Eνημέρωση ECDC

47 Επιδημία Salmonella Thompson στην Ολλανδία, από σολωμό που επεξεργάζεται σε εργοστάσιο στην Ελλάδα

48

49

50

51

52

53 Outbreaks : improved Surveillance -PulseNet ~500 outbreaks/year ~1,200 outbreaks/year Μοριακή τυποποίηση «αποτύπωμα» σε μοριακό επίπεδο απαραίτητο εργαλείο στην επιδημιολογική επιτήρηση και διερεύνηση επιδημιών -Πάντα συνεκτίμηση με επιδημιολογικά δεδομένα

54

55

56

57 Ευχαριστώ... ΕΚΑΣΣ Μανδηλαρά Γεωργία Καραδήμας Κλέων Βουλγαράκη Ασημίνα