Τυποποίηση βακτηρίων Αρχές και μέθοδοι

Transcript

1 Η μοριακή επιδημιολογία στην κλινική μικροβιολογία και τη μικροβιολογία της Δημόσιας Υγείας-Νεότερες τεχνικές Τυποποίηση βακτηρίων Αρχές και μέθοδοι Κυριακή Τρυφινοπούλου Ιατρός Βιοπαθολόγος, MSc, MPH, PhD Κεντρικό Εργαστήριο Δημόσιας Υγείας ΕΣΔΥ/ΚΕΕΛΠΝΟ

2 Το ερώτημα 10 ασθενείς με γαστρεντερίτιδα από monophasic S.Typhimurium το τελευταίο δεκαπενθήμερο από διάφορες περιοχές της Αττικής αποτελούν κρούσματα στο πλαίσιο επιδημίας; και αν ναι, ποια είναι η πηγή μιας τροφιμογενούς επιδημίας; 3 λοιμώξεις δέρματος από MRSA ασθενών μιας χειρουργικής κλινικής είναι σποραδικά κρούσματα ή είναι κρούσματα στο πλαίσιο μιας ενδονοσοκομειακής επιδημίας? Πώς μεταδίδεται η ανθεκτική στις καρβαπενέμες Klebsiella pneumoniae μέσα σε ένα νοσοκομείο Πώς διασπείρονται οι διάφοροι ανθεκτικοί στα αντιβιοτικά μικροβιακοί κλώνοι Τοπικά; Σε εθνικό επίπεδο; Σε διεθνές επίπεδο;

3 Επιδημιολογική διερεύνηση λοιμώξεων Κλασική επιδημιολογία-επιδημιολογία «κρουσμάτων» Ποιος, Πού, Πότε μολύνθηκε Ποιοι παράγοντες (κινδύνου) διευκόλυναν αυτή την μόλυνση Επιδημιολογία λοιμώδους παράγοντα- Τυποποίηση Διασπορά μεταξύ των «κρουσμάτων» ενός συγκεκριμένου τύπου του συγκεκριμένου βακτηριακού είδους Τα βακτήρια που προέρχονται από διασπορά μοιάζουν περισσότερο μεταξύ τους σε σχέση με τα προερχόμενα από διαφορετικές πηγές

4 Τυποποίηση Δημιουργία αποτυπώματος (fingerprint) για κάθε isolate Ομαδοποίηση isolates σύμφωνα με την ομοιότητά τους (ως προς το τυποποιητικό χαρακτηριστικό) Σύγκριση τους Μη διακριτά μεταξύ τους Διακριτά από τα υπόλοιπα

5 Μοριακή επιδημιολογία λοιμωδών νοσημάτων Συνδυασμός κλασικής επιδημιολογίας με την ανάλυση των πολυμορφισμών των γονιδιωμάτων των παθογόνων μέσω εφαρμογής μοριακών τεχνικών Επιβεβαίωση ή όχι υποθέσεων /μελέτη σχετικά με τον τρόπο μετάδοσης του λοιμώδους αιτίου

6 Μικροβιακή τυποποίηση-εφαρμογές στην κλινική μικροβιολογία Pathotyping Κλινικό επίπεδο Διάγνωση πολυεστιακής λοίμωξης σε ασθενή Διαφορική διάγνωση ανάμεσα σε υποτροπή παρελθούσας λοίμωξης και σε νέα λοίμωξη (relapse vs re-infection) Ανεύρεση συγκεκριμένων τύπων με αυξημένη λοιμογόνο δύναμη ή μεταδοτικότητα Short-term epidemiological issues Εντόπιση διασποράς παθογόνου μεταξύ ορισμένου πληθυσμού νοσοκομειακών αρρώστων σε σύντομο χρονικό διάστημα Διερεύνηση επιδημικής έκρηξης/ δ.δ. από τοποχρονική συρροή ενδογενών λοιμώξεων Εφαρμογή μέτρων ελέγχου λοιμώξεων

7 Μικροβιακή τυποποίηση-εφαρμογές στη Δ. Υγεία Epityping Διερεύνηση επιδημικών εξάρσεων κρουσμάτων Αναγνώριση επιδημίας, ορισμός κρούσματος Αναγνώριση τρόπου μετάδοσης Πηγή, όχημα & αλυσίδα μετάδοσης Επιτήρηση νοσημάτων Ανίχνευση νέων παθογόνων κλώνων, τάσεις επίπεδο τοπικό, εθνικό, διεθνές

8 Η πρόκληση: Ποια τυποποιητική μέθοδο να διαλέξω;

9 Ποια μέθοδο τυποποίησης να επιλέξω? Η επιλογή της κατάλληλης μεθόδου εξαρτάται από Φύση του επιδημιολογικού προβλήματος ή ποια είναι η ερώτηση και γιατί την κάνουμε? Το συγκεκριμένο περιβάλλον Κλινική μικροβιολογία, μικροβιολογία Δ. Υγείας Το χρονικό και γεωγραφικό πλαίσιο Οι υπάρχουσες δυνατότητες Τα πλεονεκτήματα/μειονεκτήματα-περιορισμούς κάθε μεθόδου

10 Τυποποίηση σε κλινικόνοσοκομειακό επίπεδο Μικροεπιδημιολογική κλίμακα Βραχυπρόθεσμα Διερεύνηση επιδημικής έξαρσης σε ένα νοσοκομείο Τεκμηρίωση ενδονοσοκομειακής διασποράς Διευκρίνιση τρόπου διασποράς στον δεδομένο πληθυσμό ασθενών Κριτήρια επιλογής μεθόδου τυποποίησης υπάρχουσα τεχνική εξειδίκευση δυνατότητα χρήσης της σε επίπεδο ρουτίνας κόστος απαιτούμενος χρόνος απάντησης διαθεσιμότητα και συντήρηση του απαραίτητου εξοπλισμού χρησιμότητα του αποτελέσματος για περαιτέρω διερεύνηση για δήλωση του στις αρχές δημόσιας υγείας και έγκαιρη λήψη των απαραίτητων μέτρων ελέγχου

11 Τυποποίηση σε κλινικό-νοσοκομειακό επίπεδο Μικροεπιδημιολογική κλίμακα

12 Τυποποίηση σε επίπεδο Δημόσιας Υγείας Μακροεπιδημιολογική κλίμακα Κριτήρια επιλογής μεθόδου τυποποίησης Μακροπρόθεσμα Παρακολούθηση της διαχρονικής και γεωγραφικής διασποράς/εξέλιξης κλώνων σε εθνικό-διεθνές επίπεδο Επιτήρηση παγκόσμιων βακτηριακών κλώνων Εμφάνιση κλώνων υψηλού επιδημικού κινδύνου Απαραίτητη η κοινή γλώσσα επικοινωνίας μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων αναφοράς Προτυπωμένη μέθοδος Μέγιστη δυνατή ακρίβεια και αναπαραγωγιμότητα των αποτελεσμάτων Δυνατότητα ανάρτησης αποτελεσμάτων σε διεθνείς βάσεις δεδομένων Αντικειμενικά κριτήρια αξιολόγησης Κοινή ονοματολογία για την κατάταξη σε τύπους και υπότυπους

13 Τυποποίηση σε επίπεδο Δημόσιας Υγείας Μακροεπιδημιολογική κλίμακα Στο επίπεδο αυτό, οι μέθοδοι που βασίζονται στην αλληλούχιση υπερέχουν και πρέπει να επιλέγονται, όπως η SLST, η MLST και το whole genome sequencing.

14 Κριτήρια αξιολόγησης μιας τυποποιητικής μεθόδου Τυποποιητική ικανότητα Ικανότητα να παράγει αποτέλεσμα για κάθε ένα καλλιέργημα Αναπαραγωγιμότητα Διακριτική ικανότητα Πρακτικότητα (ευκολία στην εφαρμογή) Ευκολία στην ερμηνεία Ικανότητα να δίνει επαναλαμβανόμενα το ίδιο τυποποιητικό αποτέλεσμα με το ίδιο βακτηριακό στέλεχος (διαφορετικός χρόνος, διαφορετικά εργαστήρια) Ικανότητα να παράγει αποτελέσματα που με σαφήνεια επιτρέπουν τη διάκριση μεταξύ επιδημιολογικώς ανεξάρτητων καλλιεργημάτων Εύρος βακτηριακών ειδών που τυποποιεί, ταχύτητα, χαμηλό κόστος, εξοπλισμός Εύκολα ερμηνεύσιμα, συγκρισιμότητα, καταχώρηση σε βάση δεδομένων

15 Τυποποιητικές μέθοδοι 1. Παραδοσιακές-Φαινότυπος 2. Μοριακές-Γονότυπος Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά (κωδικοποιούνται γενετικά) Μορφολογία Αντιγόνα επιφανείας Αντοχή στα αντιβιοτικά κ.α Γενετική σύσταση Ανάλυση γενετικού υλικού (DNA, RNA)

16 Αξιολόγηση φαινοτυπικών μεθόδων ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Μεγάλη εμπειρία παγκοσμίως Μέχρι πρόσφατα αποτελούσαν σύστημα αναφοράς Εξαιρετική τυποποιητική ικανότητα Τεχνικά απλές ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Μέτρια διακριτική ικανότητα Αστάθεια τυποποιητικού χαρακτηριστικού τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά μπορεί να διαφέρουν σε διαφορετικές καταστάσεις

17 Έλεγχος ευαισθησίας στα αντιβιοτικά Αποτελεί μια πρώτη ένδειξη για έναρξη επιδημιολογικής διερεύνησης Περιορισμοί: Αυξημένη συχνότητα απομόνωσης πολυανθεκτικών μικροοργανισμών (μικρή ευαισθησία) Αντοχή στα αντιβιοτικά και πίεση επιλογής από τη χορήγηση αντιβιοτικών Το ίδιο πλασμίδιο πολυαντοχής που προσδίδει τον ίδιο φαινότυπο αντοχής σε διαφορετικούς μικροβιακούς κλώνους (μικρή ειδικότητα)

18 Οροτυπία & Salmonella Παραμένει ακόμη προϋπόθεση για επιδημιολογικές διερευνήσεις Επιπρόσθετες μέθοδοι συχνά χρειάζονται για σύνδεση μεταξύ επιδημιών σε διαφορετικές χώρες S. Enteritidis και S. Typhimurium Οι πιο συχνοί ορότυποι Δεν αρκεί η οροτυπία για την αναγνώριση κάποιας επιδημικής έξαρσης Για σπάνιους οροτύπους, μπορεί και να επαρκεί για να αναγνωριστεί μια επιδημία σε τοπικό επίπεδο

19 Οροτυπία: ακόμη πολύτιμη! Οροτυπία: ακόμη πολύτιμη!

20 Λυσιτυπία (Phage typing) Βακτηριοφάγοι: ιοί που μολύνουν και καταστρέφουν βακτήρια Η αντοχή ή η ευαισθησία βακτηριακών καλλιεργημάτων σε συγκεκριμένο πάνελ φάγων χρησιμοποιείται για τη διάκριση στελεχών Περιορισμοί Απαιτητική τεχνικά Χρονοβόρα Δυσκολία στην ερμηνεία-συγκρισιμότητα PT1 PT4 PT21

21 Γονοτυπικές μέθοδοι τυποποίησης Ομαδοποίηση βακτηρίων με βάση την ομοιότητα στο γενετικό τους υλικό Το χρωμόσωμα: το θεμελιώδες μόριο της ταυτότητας του κυττάρου Παρέχουν νέα εργαλεία για την επιτήρηση λοιμωδών νοσημάτων και τη διερεύνηση επιδημιών

22 Γονοτυπικές μέθοδοι τυποποίησης Fragment-based PCR-based Amplified fragment length polymorphism (AFLP) PCR-Restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) Random amplification of polymorphic DNA (RAPD) Repetitive-element PCR (rep-pcr) Multilocus variable number tandem repeat (VNTR) analysis (MLVA) Not PCR-based Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) Restriction fragment length polymorphism (RFLP) Sequence-based Single locus sequence typing: (SLT) Multilocus sequence typing (MLST) Whole genome sequencing (WGS)

23 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) Ένζυμα που κόβουν το χρωμόσωμα σε κομμάτια, για να είναι πρακτικά δυνατή η σύγκριση των 2 μορίων Τα κομμάτια στα οποία κόπηκε το DNA γίνονται ορατά μετά από ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο Καλλιεργήματα με ίδιο ηλεκτροφορητικό προφίλ χαρακτηρίζονται ως μη διακριτά και όχι ως όμοια 23

24 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) Πλεονεκτήματα Υψηλή διακριτική ικανότητα Μεγάλη αναπαραγωγιμότητατητα-προτυποποιημένα πρωτόκολλα Βάσεις δεδομένων (Pulse-net) Μέθοδος αναφοράς για ποικίλα βακτήρια Μειονεκτήματα Απαιτήσεις για ειδικό εξοπλισμό και εξειδικευμένο προσωπικό Χρονοβόρα Δεν ενδείκνυται για πολύ κλωνικά στελέχη (πχ S. Enteritidis)

25 Amplified fragment length polymorphism (AFLP)

26 Amplified fragment length polymorphism (AFLP) Πλεονεκτήματα Υψηλή επαναληψιμότητα Μεγάλη διακριτική ικανότητα Ταυτόχρονη ανάλυση πολλαπλών γενετικών τόπων Μειονεκτήματα Σύνθετη διαδικασία Χρονοβόρα (τυπικά 3 ημέρες) Ακριβή

27 Random amplification of polymorphic DNA (RAPD) and arbitrary primed polymerase chain reaction (AP-PCR) Βασίζεται στον πολλαπλασιασμό τυχαίων περιοχών του DNA με τη χρήση τυχαίων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών σε χαμηλή θερμοκρασία Μελετά διαφοροποιήσεις σε όλο το μήκος του χρωμοσώματος Δεν είναι απαραίτητη η γνώση από πριν της αλληλουχίας

28 Random amplification of polymorphic DNA (RAPD) and arbitrary primed polymerase chain reaction (AP-PCR) Πλεονεκτήματα Ταχύτητα Ευκολία εφαρμογής Μη απαραίτητη η γνώση της αλληλουχίας από πριν Μειονεκτήματα Χαμηλή αναπαραγωγιμότητα Χαμηλή συγκρισιμότητα μεταξύ εργαστηρίων

29 Repetitive-element polymerase chain reaction, Rep-PCR Χρησιμοποιεί εκκινητές ειδικούς για επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες που υπάρχουν διάσπαρτες στο χρωμόσωμα κάποιων βακτηριακών ειδών Πλεονεκτήματα Ταχύτητα Χαμηλό κόστος Υψηλή διακριτική ικανότητα Μειονεκτήματα Χαμηλή αναπαραγωγιμότητα επί συμβατικής ηλεκτροφόρησης σε αγαρόζη ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence) REP (repetitive extragenic palindromic sequence) BOX (repetitive intergenic sequence elements of Streptococcus)

30 MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem repeat Analysis) Βασίζεται στην PCR Πολ/σμος των περιοχών επαναλαμβανόμενου DNA Διαχωρισμός των προϊόντων PCR και ακριβής υπολογισμός των μεγεθών τους Μέθοδος εκλογής για Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis 30

31 Multilocus VNTR analysis (MLVA) Πλεονεκτήματα Υψηλή διακριτική ικανότητα Χαμηλό κόστος Ευκολία εφαρμογής Ταχύτητα Μειονεκτήματα Δεν υπάρχει κοινό πρωτόκολλο Οι εκκινητές πρέπει να σχεδιάζονται ειδικά για συγκεκριμένο παθογόνο

32 Sequence based methods 1. Sanger first generation sequencing Single locus sequence typing (SLST) e.g. spa typing Multi-locus sequence typing (MLST) 2. Next generation sequencing (NGS) Whole genome sequencing wgmlst, cgmlst 3. Third generation sequencing-direct reading of DNA sequence Oxford nanopore Electron microscope

33 Single locus sequence typing (SLST) Αλληλούχιση ενός γενετικού τόπου που παρουσιάζει ποικιλομορφία μεταξύ διαφορετικών στελεχών Spa typing για τον S.aureus Βασίζεται στην αλληλούχιση της πολυμορφικής περιοχής Χ του γονιδίου της πρωτεΐνης Α (spa) Μελετά τις επαναλήψεις 24bp στο 3 άκρο της περιοχής αυτής spa Typing Method for Discriminating among Staphylococcus aureus Isolates: Implications for Use of a Single Marker To Detect Genetic Micro- and Macrovariation. Larry K et al J. Clin. Microbiol. February 2004 vol. 42 no

34 MLST (MultiLocus Sequence Typing) Στηρίζεται στην αλληλούχιση πολλών γενετικών τόπων Ανάλυση 5-10 γονιδίων που κωδικοποιούν για ένζυμα του βασικού μεταβολισμού Μεταλλάσσονται με αργό ρυθμό Δεν επηρεάζονται γενικά από πίεση επιλογής

35 MLST Πλεονεκτήματα Συγκρισιμότητα: δεδομένα αλληλούχισης εύκολα συγκρίσιμα μεταξύ των εργαστηρίων μέσω του διαδικτύου Ακρίβεια και αναπαραγωγιμότητα Χρήσιμη για πληθυσμιακή και εξελικτική βιολογία (μακροεπιδημιολογία) Μειονεκτήματα Ακριβή Τεχνικά απαιτητική Λιγότερο διακριτική σε σχέση με άλλες μεθόδους Περιορισμοί Όχι χρήσιμη για τοπικά και χρονικά περιορισμένες επιδημιολογικές μελέτες Περιορισμένος πολυμορφισμός house keeping γονιδίων

36 Παγκόσμιες βάσεις δεδομένων

37 37 Whole genome sequencing Ταχεία αλληλούχιση όλου του γονιδιώματος Ύψιστο επίπεδο διακριτικής ικανότητας Ευρεία χρήση Δεδομένα εύκολα συγκρίσιμα Σύνθετη βιοπληροφορική για ανάλυση Κόστος πέφτει, αντικατάσταση άλλων τεχνικών

38 Next Generation Sequencing-NGS

39 NGS approaches Gene by gene/ allele based SNP typing: polymorphism cgmlst wgmlst

40 Gene by gene approaches Επέκταση της MLST Καθορισμός διαφορετικών αλληλίων και αλληλικών προφίλ σε σύγκριση με διαθέσιμες βάσεις σαφώς καθορισμένων γονιδίων του core genome. Διεθνή σχήματα για cg/mlst υπάρχουν για πολλά, αλλά όχι για όλα τα σημαντικά παθογόνα Διάφορα προγράμματα, όπως BioNumerics (Applied Maths, Sint- Martens-Latem,Belgium), SeqSphere+ (Ridom, Münster, Germany), και BIGSdb.

41 cgmlst

42 NGS-SNP analysis Οι πολυμορφισμοί που οφείλονται μόνο σε μία βάση (σημειακές μεταλλαγές) ονομάζονται SNP (single nucleotide polymorphism)

43 Single Nucleotide Polymorphisms-SNPs 1 SNP difference A instead of C

44 Παράδειγμα: SNP address Το πρώτο ψηφίο δείχνει την ομάδα με όριο 250 SNPs, όπου το isolate κατατάσσεται και αντιστοίχως μέχρι το τελευταίο νούμερο που καταδεικνύει την ομάδα με 0 SNP διαφορές όπου το isolate ανήκει Ψηφίο 1 ο 2 ο 3 ο 4 ο 5 ο 6 ο 7 ο SNP address (1) SNP address (2) SNP address (3) SNP όριο Από Tim Dallman, PHE

45 45 American zip code State: 1 County: 2 Zip code: 1234 City: 3 Neighborhood: 4 Tim Dallman, PHE

46

47

48 Ανάλυση αποτελεσμάτων μοριακής τυποποίησης Πολλά εργαλεία βιοπληροφορικής/βάσεις δεδομένων εμπορικά διαθέσιμα ελεύθερα στο διαδίκτυο Για ανάλυση πηκτωμάτων ηλεκτροφόρησης συναρμολόγηση αλληλουχιών εκτίμηση φυλογενετικής σχέσης και δημιουργίας φυλογενετικών δέντρων σύγκριση αλληλουχιών και ανάλυση

49 Carrico JA et al, Euro Surveil.2013;18(4):pii20382

50 Carrico JA et al, Euro Surveil.2013;18(4):pii20382

51

52 Ερμηνεία και αξιολόγηση αποτελεσμάτων τυποποίησης Εκτίμηση μέσα στο συγκεκριμένο χρονικό και επιδημιολογικό πλαίσιο από το οποίο προήλθαν τα βακτηριακά καλλιεργήματα Σε συνάρτηση με τα συνοδά κλινικά ή επιδημιολογικά δεδομένα Ανεύρεση του index isolate με βάση Επιδημιολογικά δεδομένα (πρώτο κρούσμα επί επιδημίας) Κλινικά δεδομένα ( αρχικό καλλιέργημα ασθενούς με πολλαπλές λοιμώξεις) Δεδομένα τυποποίησης (ο επικρατής τύπος)

53 Ερμηνεία και αξιολόγηση αποτελεσμάτων τυποποίησης Γνώση της γενετικής του πληθυσμού του συγκεκριμένου μικροβίου Ρυθμός μεταλλαγών/ γενετικού ανασυνδυασμού στο σταθερό γ.υ. Mycobacterium tuberculosis: 4 SNPs /γονιδίωμα/ τετραετία H.pylori έως και 30 SNPs/ ανά γονιδίωμα / έτος Ικανότητα οριζόντιας ανταλλαγής γ.υ. Σαλμονέλλες: μικρή ικανότητα οριζόντιας ανταλλαγής γενετικού υλικού και εμφανή κλωνικότητα Πνευμονιόκοκκοι: μεγάλη ικανότητα οριζόντιας ανταλλαγής γενετικού υλικού, με αποτέλεσμα οι επάλληλες γενιές κυττάρων των μικροβιακών κλώνων τους να χάνουν γρήγορα την γενετική ομοιότητά τους.

54 Κριτήρια ερμηνείας PFGE κατά Tenover et al Αριθμός διαφορών σε μπάντες από επιδημικό στέλεχος Γενετικά γεγονότα που έχουν μεσολαβήσει Τυποποιητική ερμηνεία Επιδημιολογική ερμηνεία 0 0 Μη διακριτά μεταξύ τους Στενά σχετιζόμενα γενετικώς Δυνητικά σχετιζόμενα γενετικώς >7 3 Διακριτάδιαφορετικά μεταξύ τους Μέρος της επιδημίας Πιθανά μέρος επιδημίας Δυνατόν να είναι μέρος της επιδημίας Όχι μέρος της επιδημίας

55 Τροποποιημένα κριτήρια Tenover < 3 differences in restriction-fragment positions could have occurred by a single genetic event may represent subtypes of the same strain >3 restriction differences in restriction fragment positions less likely to be epidemiologically related Goering RV. In Rapid Detection of Infectious Agents, Specter, et.al. (eds), Plenum Press, New York, 1998, p.131.

56 WGS και κριτήρια αξιολόγησης της γενετικής συσχέτισης Δεν υπάρχουν εύκολα, κοινά όρια που να καθορίζουν τη συνάφεια ή τη σημαντική διαφορά Η γνώση της γενετικής των διαφορετικών βακτηριακών ειδών είναι κομβικής σημασίας Δεδομένα από καλά οργανωμένες μεγάλες μελέτες που προτείνουν όρια γενετικής συσχέτισης τόσο με βάση αριθμό διαφορών σε SNPs όσο και σε cgmlst αλλήλια, πρέπει να αντιμετωπίζονται ως κατευθυντήριες οδηγίες και όχι ως απόλυτοι κανόνες

57 Βακτήριο WGS και ενδεικτικά κριτήρια αξιολόγησης της γενετικής συσχέτισης Όριο γενετικής συνάφειας wg/cgmlst (alleles) SNPs A.baumannii 8 3 E.coli K.pneumoniae L.monocytogenes 10 3 E. faecium Τροποποιημένο από Schurch AC, Arredondo-Alonso S, Willems RJL, Goering RV. CMI. 2018;doi /j.cmi

58 Ερμηνεία και αξιολόγηση αποτελεσμάτων τυποποίησης Περιορισμοί τυποποίησης Όχι gold standard τυποποιητική μέθοδος για όλους τους μικροοργανισμούς Υπόκειται σε Φυσική βιολογική διαφοροποίηση Επιδημιολογικώς σχετιζόμενα καλλιεργήματα που ανήκουν στο ίδιο στέλεχος μπορεί να εμφανίσουν μικρές διαφορές, λόγω φαινοτυπικών ή ακόμη και γονοτυπικών αλλαγών, όταν συλλέγονται και εξετάζονται επί μακρών χρονικών περιόδων Τεχνικής φύσης διαφοροποίηση Περιορισμένη επαναληψιμότητα και διακριτική ικανότητα

59 Ερμηνεία αποτελεσμάτων τυποποίησης Στόχος της τυποποίησης είναι να δείξει εάν τα επιδημιολογικώς σχετιζόμενα καλλιεργήματα (isolates) που εμπλέκονται σε μια συρροή είναι και γενετικώς σχετιζόμενα και άρα αποτελούν το ίδιο στέλεχος που μεταδόθηκε είτε από κοινή πηγή είτε από ασθενή σε ασθενή Η τυποποίηση συμπληρώνει - δεν υποκαθιστά την επιδημιολογική διερεύνηση Τα αποτελέσματα της τυποποίησης πρέπει να ερμηνεύονται πάντα σε συνδυασμό με τα τοπικά επιδημιολογικά δεδομένα Ανάγκη αποστολής των σχετικών δεδομένων

60 Κρίσιμη η αποστολή των επιδημιολογικών δεδομένων Ελάχιστες απαιτήσεις: πού-ποιος-πότε Επιπλέον πληροφορίες για κοινά επιδημιολογικά χαρακτηριστικά: αν αλληλοεπικαλυπτόμενες περίοδοι νοσηλείας αν κοινή εξωγενής έκθεση προσωπικό περιβάλλον επεμβατική διαδικασία φάρμακα/οδός χορήγησης Πληροφορία μη ύπαρξης σαφούς επιδημιολογικής συσχέτισης Πιθανή εγκατάσταση στελέχους στο τμήμα/νοσοκομείο Ενδημικό το συγκεκριμένο στέλεχος τοπικά/εθνικά/διεθνώς Πληροφορία εάν η τυποποίηση στοχευμένη, πχ πριν και μετά ειδική παρέμβαση D.S. Blanc/ Infection, Genetics and Evolution 4 (2004)

61 Ασυμφωνία εργαστηριακών αποτελεσμάτων με τα επιδημιολογικά δεδομένα- πού μπορεί να οφείλεται? Μη διακριτά μεταξύ τους στελέχη επί απουσίας επιδημιολογικής συσχέτισης Ενδημικό στέλεχος Μη επαρκής διαφοροποιητική ικανότητα της παρούσας μεθόδου Εργαστηριακό λάθος Άγνωστη ακόμη επιδημιολογική σχέση Διακριτά στελέχη με την τυποποίηση αλλά ύπαρξη άμεσης επιδημιολογικής σχέσης Evolutionary drift Μικτή λοίμωξη Εργαστηριακό λάθος Ψευδώς θετική η επιδημιολογική συσχέτιση

62 Πώς χρησιμοποιείται το αποτέλεσμα της τυποποίησης από την ΕΝΛ; Η παρεχόμενη τεκμηρίωση της κλωνικότητας μπορεί να αξιοποιηθεί για Εντοπισμό μη εμφανών προβλημάτων, πχ περιβαλλοντικής επιμόλυνσης Ως ένδειξη πιθανής χαλάρωσης ή ύπαρξης κάποιων κενών στα μέτρα ελέγχου Αύξηση της αποτελεσματικότητας της διερεύνησης και άρα της σχέσης κόστους-αποτελεσματικότητας της επιτήρησης των νοσοκομειακών λοιμώξεων στο δεδομένο νοσοκομείο Ως πληροφορία για στοχευμένη παρέμβαση/αντιμετώπιση

63 Ευχαριστώ για την προσοχή σας

64 Βιβλιογραφία Sabat AJ, Budimir A, Nashev D, Sá-Leão R, van Dijl JM, Laurent F, et al. Overview of molecular typing methods for outbreak detection and epidemiological surveillance. Euro Surveill. 2013;18(4):pii= Goering RV, Köck R, Grundmann H, Werner G, Friedrich AW, on behalf of the ESCMID Study Group for Epidemiological Markers (ESGEM). From Theory to Practice: Molecular Strain Typing for the Clinical and Public Health Setting. Euro Surveill. 2013;18(4):pii=20383 A. van Belkum, P. T. Tassios, L. Dijkshoorn, S. Haeggman, B. Cookson, N. K. Fry et al for the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM). Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology. Clinical Microbiology and Infectious Diseases, CMI. 2007; 13 (Suppl. 3): 1 46 Schürch AC, Arredondo-Alonso S, Willems RJL, Goering RV, Whole genome sequencing (WGS) options for bacterial strain typing and epidemiological analysis based on single nucleotide polymorphism (SNP) vs gene-by-gene-based approaches, Clinical Microbiology and Infection (2018), doi: /j.cmi J.W.A. Rossen, A.W. Friedrich, J. Moran-Gilad, on behalf of the ESCMID Study Group for Genomic and Molecular Diagnostics (ESGMD). Practical issues in implementing whole-genomesequencing in routine diagnostic microbiology. Clinical Microbiology and Infection (2017), Nadon C, Van Walle I, Gerner-Smidt P, Campos J, Chinen I, Concepcion-Acevedo J, et al. PulseNet International: Vision for the implementation of whole genome sequencing (WGS) for global food-borne disease surveillance. Euro Surveill. 2017;22(23):pii= DOI:

65 Βιβλιογραφία European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC roadmap for integration ofmolecular and genomic typing into European-level surveillance and epidemic preparedness Version 2.1, Stockholm: ECDC; European Centre for Disease Prevention and Control. Expert opinion on whole genome sequencing for public health surveillance. Stockholm: ECDC; Carrico JA, Sabat AJ, Friedrich AW, RamirezM, on behalf of the ESCMID Study Group for Epidemiological Markers. Bioinformatics in bacterial molecular epidemiology and public health: databases, tools and the nextgeneration revolution. EuroSurveill. 2013;18(4):pII=20382 Βατόπουλος Α, Βουρλή Σ, Γιακκούπη Π. Ο ρόλος του μικροβιολογικού εργαστηρίου στην επιδημιολογική επιτήρηση και διερεύνηση επιδημιών. Σημειώσεις για το μάθημα Μικροβιολογίας της Δημόσιας Υγείας, Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Εθνική Σχολή Δημόσιας Υγείας.