ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΟΥΣ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ ΤΣΑΟΥΣΗ ΙΑΤΡΟΥ

Transcript

1 1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΑΙΣΘΗΤΗΡΙΩΝ ΟΡΓΑΝΩΝ Β ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΣΤΑΥΡΟΣ Α. ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΈΤΟΣ: ΑΡΙΘΜΟΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ: 3789 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΟΥΣ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ ΤΣΑΟΥΣΗ ΙΑΤΡΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2016

2 2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΑΙΣΘΗΤΗΡΙΩΝ ΟΡΓΑΝΩΝ Β ΟΦΘΑΛΜΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΣΤΑΥΡΟΣ Α. ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΈΤΟΣ: ΑΡΙΘΜΟΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ: 3789 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΟΥΣ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΤΣΑΟΥΣΗΣ ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2016

3 3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ιωάννης Θ Τσινόπουλος, Αναπληρωτής Καθηγητής (Επιβλέπων) Σταύρος Α Δημητράκος, Καθηγητής Ulrich Welge-Luessen, Καθηγητής Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ιωάννης Θ. Τσινόπουλος. Αναπληρωτής Καθηγητής Σταύρος Α. Δημητράκος. Καθηγητής Ulrich Welge- Luessen. Καθηγητής Περικλής Μπραζιτίκος. Καθηγητής Νικόλαος Ζιάκας. Καθηγητής Στέργιος Λογοθετίδης. Καθηγητής Παναγιώτης Οικονομίδης. Καθηγητής «Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» Νόμος 5343/32, άρθρο 202, παρ. 2 και ν. 1268/82 άρθρο 50

4 4 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ-ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΜΕΑ ΑΙΣΘΗΤΗΡΙΩΝ ΟΡΓΑΝΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΣΤΑΥΡΟΣ Α. ΔΗΜΗΤΡΑΚΟΣ

5 5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΑΝΤΙ ΠΡΟΛΟΓΟΥ... 7 Α: ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α.1: ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΥ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Α.1.1: Εισαγωγικά στοιχεία Α.1.2: Πολλαπλασιαστική ικανότητα ενδοθηλιακών κυττάρων κερατοειδούς Α.1.3: Επεμβάσεις κερατοπλαστικής Α.1.4 : Καλλιέργεια ενδοθηλιακών κυττάρων κερατοειδούς Α.1.5 Καλλιεργηθέντα κύτταρα αντί κερατοπλαστικών ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α.2 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΓΩΝΙΑΚΟΥ ΔΙΚΤΥΩΤΟΥ (TRABECULAR MESHWORK) ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ A.2.1 Εισαγωγικά στοιχεία A.2.2: Δομή, βιοχημεία και κυτταρική βιολογία του γωνιακού δικτυωτού Α.2.3: In vitro καλλιέργεια ανθρωπίνων κυττάρων γωνιακού δικτυωτού Α.2.4: Άλλοι τύποι υποστρωμάτων καλλιέργειας Α.2.5: Νάνο-μηχανική σχεδίαση των in vitro μοντέλων καλλιέργειας κυττάρων TM ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α.3: ΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΟΦΘΑΛΜΙΚΩΝ ΙΣΤΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Α.3.1: Εισαγωγικά στοιχεία Εμβιομηχανικής Α.3.2: Αρχή λειτουργίας AFM Α.3.3: Έρευνες Εμβιομηχανικής και Οφθαλμολογία ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Β ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.1: IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΜΕΝΩΝ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΙΚΩΝ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΓΙΑ ΑΦΥΔΑΤΩΣΗ ΤΕΧΝΗΤΟΥ ΣΤΡΩΜΑΤΟΣ Β.1.1 Εισαγωγικά στοιχεία Β.1.2 Πειραματική διάταξη- μέθοδος Β.1.3 Ευρήματα και ποσοτικά αποτελέσματα Β.1.4 Συζήτηση-ερμηνεία ευρημάτων ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.2: ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΓΩΝΙΑΚΟΥ ΔΙΚΤΥΩΤΟΥ (TRABECULUM MESHWORK) ΠΑΝΩ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΠΕΡΙΦΑΚΙΟ Β.2.1: Εισαγωγικά στοιχεία Β.2.2: Πειραματική διάταξη Β.2.3: Αποτελέσματα μελέτης μορφολογίας και βιωσιμότητας κυττάρων... 62

6 6 Β.2.4: Συμπεράσματα ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.3: ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΜΠΛΕ ΤΟΥ ΤΡΥΠΑΝΙΟΥ (TRYPAN BLUE) ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΘΕΝΤΑ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΓΩΝΙΑΚΟΥ ΔΙΚΤΥΩΤΟΥ Β.3.1: Εισαγωγικά στοιχεία Β.3.2: Πειραματική διάταξη και μεθοδολογία Β.3.3: Ευρήματα πειράματος. Μορφολογία και βιωσιμότητα Β.3.4 Συμπεράσματα και συζήτηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.4: ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΠΡΩΤΟΓΕΝΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΘΕΝΤΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΑΕΡΑ: ΕΝΑ IN VITRO ΜΟΝΤΕΛΟ Β.4.1: Εισαγωγικά στοιχεία Β.4.2: Πειραματική διάταξη Β.4.3: Αποτελέσματα πειραμάτων Β.4.4: Συζήτηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.5: ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΘΕΝΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΓΩΝΙΑΚΟΥ ΔΙΚΤΥΩΤΟΥ (TRABECULAR MESHWORK) ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΑΕΡΑ Β.5.1 Εισαγωγή Β.5.2 Πειραματική διάταξη Β.5.3: Αποτελέσματα Β.5.4: Συζήτηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.6: ΜΕΛΕΤΗ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΠΡΟΣΘΙΟΥ ΠΕΡΙΦΑΚΙΟΥ ΤΟΥ ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΕΙΔΟΥΣ ΦΑΚΟΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ ΑΤΟΜΙΚΩΝ ΔΥΝΑΜΕΩΝ Β.6.1: Εισαγωγή Β.6.2 Μεθοδολογία και παραμετροποίηση μετρήσεων Β.6.3: Αποτελέσματα μετρήσεων Β.6.4: Συμπεράσματα ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.7: ΣΥΝΟΛΙΚΑ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ- ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΕΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΕΙΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΠΟΥ ΠΡΟΕΚΥΨΑΝ ΑΠΟ ΤΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΒΡΑΒΕΙΑ

7 7 ΑΝΤΙ ΠΡΟΛΟΓΟΥ Ξεκινώντας την διαδικασία της παρούσας διατριβής, είχα πάντα κατά νου να εκπληρώσω ένα έργο το οποίο θα μπορούσε να αφήσει κάτι χρήσιμο. Πλέον, σχεδόν 6 χρόνια αργότερα και ενώ γράφω πλέον αυτές τις γραμμές χιλιόμετρα μακριά από την αγαπημένη μου Θεσσαλονίκη, αισθάνομαι ότι μπορώ να παρουσιάσω τα αποτελέσματα αυτής της δουλειάς με αξιοπρεπή τρόπο. Το 2008 γυρνώντας από την Κρήτη ήξερα καλά ότι για να προωθήσουμε τη γνώση στην Ιατρική χρειαζόμαστε τη συνδρομή και άλλων επιστημών, πολύ περισσότερο στην Οφθαλμολογία όπου έχουμε να κάνουμε με μικροσκοπικές τάξεις μεγέθους, αλλά και τόσο ευαίσθητους ιστούς. Για τη μελέτη, των καλλιεργημένων ενδοθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς, χρειάστηκαν γνώσεις κυτταρολογίας, τοξικολογίας, μηχανικής και φυσικά οφθαλμολογίας. Είμαι χαρούμενος γιατί ήρθα σε επαφή με πλευρές της γνώσης που ειδάλλως δεν θα γνώριζα ποτέ. «Τα πράγματα λοιπόν, δεν είναι όπως είναι αλλά όπως τα γνωρίζουμε» Αυτονόητη είναι η ανάγκη να ευχαριστήσω αυτούς που κατά τη διάρκεια αυτών των χρόνων με συνέδραμαν. Τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, τους κκ Ιωάννη Τσινόπουλο, Σταύρο Δημητράκο και Ulrich Welge-Luessen, που ήταν πάντα πρόθυμοι να με βοηθήσουν με ιδέες ή παρέχοντας μου τα μέσα για τη λύση των προβλημάτων που ενέκυπταν. Επίσης τους καθηγητές Περικλή Μπραζιτίκο, Νικόλαο Ζιάκα, Στέργιο Λογοθετίδη και Παναγιώτη Οικονομίδη για τις υποδείξεις τους και τη συμμετοχή τους στην επταμελή εξεταστική επιτροπή. Οφείλω να αναφέρω τη συμβολή του κ Νικολάου Κοψαχείλη, με τον οποίο μοιραστήκαμε πολλές σκέψεις και αγωνίες στο εργαστήριο, θεωρώ ότι το διδακτορικό αυτό δεν θα μπορούσε να ολοκληρωθεί χωρίς τη δική του βοήθεια.

8 8 Να ευχαριστήσω τους εξ αίματος και εξ αγχιστείας γονείς μου, που μου συμπαραστάθηκαν σε όλη αυτή τη δύσκολη διαδρομή. Εκτός από τη βαθειά ευγνωμοσύνη μου να ζητήσω και μια συγγνώμη από τη σύντροφο της ζωής μου και τους δυο γιους μου για όλες τις ώρες και μέρες που στερήθηκαν το σύζυγο και τον πατέρα τους.

9 9 Στη Ζέφη, Στο Θεοδόσιο Στον Παναγιώτη

10 Α: ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 10

11 11 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α.1: ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΕΝΔΟΘΗΛΙΟΥ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Α.1.1: Εισαγωγικά στοιχεία Ο κερατοειδής χιτώνας είναι ένας υψηλού επιπέδου οργάνωσης διαφανής ιστός με πέντε διακριτές στιβάδες: (Α) το επιθήλιο (Β) τη μεμβράνη του Bowman (Γ) το στρώμα (Δ) τη μεμβράνη του Descemet (Δεσκεμέτειος μεμβράνη) και (Ε) το ενδοθήλιο. Συνολικά, ο κερατοειδής χιτώνας έχει πάχος περίπου 520 μm με το επιθήλιο να αποτελεί περίπου το 10% του ιστού. Το μεγαλύτερο μέρος του κερατοειδούς είναι το στρώμα από κολλαγόνο που έχει πάχος περίπου 450 μm. 1 Ο κερατοειδής χιτώνας προστατεύει τα ευαίσθητα εσωτερικά ανατομικά στοιχεία του οφθαλμού, και, το πιο σημαντικό, η μοναδική του σύνθεση αποτελεί το σημαντικότερο διαθλαστικό μέσο στην οπτική οδό, το οποίο εστιάζει το ορατό φως πάνω στον αμφιβληστροειδή. 2 Το διαστρωματωμένο πλακώδες μη κερατινοποιημένο επιθήλιο ενεργεί ως ο κύριος προστατευτικός φραγμός του κερατοειδούς. Η μεμβράνη του Bowman σχηματίζει το πρόσθιο όριο του στρώματος. Έχει πάχος περίπου 15 μm και αποτελείται από τυχαία προσανατολισμένα ινίδια κολλαγόνου τύπου Ι που περιβάλλονται και υποστηρίζονται από

12 12 ένα πλέγμα πρωτεογλυκανών. Το στρώμα του κερατοειδούς είναι ένας πυκνά διασυνδεδεμένος, διαφανής συνδετικός ιστός. Αποτελείται κυρίως από ινίδια κολλαγόνου τύπου Ι και πρωτεογλυκάνες. Η διαφάνεια του στρώματος έχει αποδοθεί στη σκέδαση και στην αρνητική συμβολή του φωτός από τη μοναδική αρχιτεκτονική διάταξη των συμμετρικά κατανεμημένων ινιδίων κολλαγόνου. 3 Η μεμβράνη του Descemet βρίσκεται στο οπίσθιο όριο του στρώματος. Συντίθεται από το ενδοθήλιο του κερατοειδούς και το πάχος της έχει αναφερθεί ότι αυξάνει με την ηλικία. Το ενδοθήλιο του κερατοειδούς είναι από φυσιολογικής απόψεως η πιο σημαντική μονοστιβάδα του κερατοειδούς. Αυτά τα μοναδικά εξάγωνα κύτταρα λειτουργούν ως φραγμός για την κίνηση υγρού προς το στρώμα, το οποίο λόγω της σύνθεσης του από γλυκοαμινογλυκάνες μπορεί να απορροφήσει μεγάλες ποσότητες υγρού με αποτέλεσμα το οίδημα κερατοειδούς, που μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια όρασης. Ως τα κύτταρα του κερατοειδούς χιτώνα με τη μεγαλύτερη μεταβολική ενεργότητα, οι αντλίες υγρών λειτουργούν συνεχώς μετακινώντας ενεργά υγρό από το στρώμα στον πρόσθιο θάλαμο του οφθαλμού. 4 Η δυναμική ισορροπία μεταξύ του φραγμού και της ενεργούς αντλίας ρυθμίζει την ενυδάτωση του κερατοειδούς, διατηρώντας τον κερατοειδή διαφανή. Η κερατοειδικής αιτιολογίας απώλεια όρασης, η κατάσταση δηλαδή κατά την οποία ο αμφιβληστροειδής είναι φυσιολογικός, αλλά ο κερατοειδής παρουσιάζει οίδημα, συχνά προκαλείται από δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και είναι η δεύτερη κύρια αιτία απώλειας της όρασης. Η πυκνότητα των κυττάρων του ενδοθηλίου του κερατοειδούς σε βρέφη ηλικίας 2 μηνών έχει αναφερθεί να φτάνει έως και τα κύτταρα/mm 2, με μέσο όρο τα κύτταρα/mm 2 κατά τη διάρκεια του πρώτου χρόνου της ζωής. Ο ταχύς ρυθμός με τον οποίο μειώνεται η πυκνότητα των κυττάρων του κερατοειδούς επιβραδύνεται σε ομαλότερη μείωση κατά τη διάρκεια της ενήλικης ζωής, περίπου 0,6% ετησίως, 5 πράγμα που δείχνει

13 13 επίσης ότι τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς (Human Corneal Endothelial Cells, HCECs) έχουν περιορισμένη ικανότητα να πολλαπλασιάζονται in vivo. Τα κύτταρα του ενδοθηλίου του κερατοειδούς έχουν κανονική σύσταση σε τελομερή, ως εκ τούτου η αδυναμία τους να πολλαπλασιάζονται in vivo δεν οφείλεται σε βραχέα τελομερή. Α.1.2: Πολλαπλασιαστική ικανότητα ενδοθηλιακών κυττάρων κερατοειδούς Οι Joyce et al. 6 έδειξαν ότι τα κύτταρα του ενδοθηλίου του κερατοειδούς παραμένουν στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου in vivo. Αν και το ενδοθήλιο του κερατοειδούς παραμένει σε μια μη αναπαραγωγική κατάσταση στον οφθαλμό, ex vivo μελέτες με μηχανικό τραυματισμό και με κατεργασία με EDTA έδειξαν ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα διατηρούν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται. 7 Δεδομένου ότι το ενδοθήλιο του κερατοειδούς δεν είναι σε θέση να διαιρεθεί ενεργά στον οφθαλμό, δεν μπορεί να υπόκειται σε οποιαδήποτε μορφή αναγεννητικής επούλωσης για την αντικατάσταση νεκρών ή τραυματισμένων κυττάρων. Αντί για αυτό, τα υφιστάμενα κύτταρα φυσιολογικά αυξάνουν σε μέγεθος ώστε να καλύψουν το κενό που δημιουργείται από την απόπτωση, διασφαλίζοντας την κρίσιμη σχετική αφυδάτωση και τη διαφάνεια του κερατοειδή. Το φαινόμενο της εξάπλωσης των κυττάρων μπορεί να συνδέεται με τη μεταβλητότητα του σχήματος και του μεγέθους των κυττάρων που παρατηρείται σε ηλικιωμένα άτομα. Εδώ, ακόμη και με την σχετιζόμενη με την ηλικία μείωση του ενδοθηλίου του κερατοειδούς, το μέσο απόθεμα τους είναι συνήθως αρκετό για να διατηρήσει επαρκώς τον φραγμό και τη λειτουργία της αντλίας για τη διάρκεια της ζωής, χωρίς την ανάγκη για κλινική παρέμβαση.

14 14 Ωστόσο, σε περιπτώσεις οξείας ή επιταχυνόμενης απώλειας των ενδοθηλιακών κυττάρων που οφείλεται σε παθήσεις όπως η γενετικής αιτιολογίας ενδοθηλιακή δυστροφία, το τραύμα ή προηγούμενη διαθλαστική ή ενδοφθάλμια χειρουργική επέμβαση, μπορεί να παρατηρηθεί ανεπάρκεια του ενδοθηλίου του κερατοειδούς που οδηγεί σε αδυναμία άντλησης υγρού από το στρώμα που διηθείται λόγω της διαφοράς πίεσης από τον πρόσθιο θάλαμο. Η ομαλή λειτουργία του ενδοθηλίου τίθεται σε κίνδυνο όταν η πυκνότητα των κυττάρων πέσει κάτω από ένα κρίσιμο όριο εύρους από τα 500 έως τα 1000 κύτταρα/mm 2. Αυτό οδηγεί σε οίδημα του στρώματος του κερατοειδούς, 8 θόλωση, μείωση της οπτικής οξύτητας, και καταλήγει σε κερατοειδικής αιτιολογίας τύφλωση. Σε τέτοιες περιπτώσεις, η μόνη επιλογή που απομένει για την αποκατάσταση της όρασης είναι να αντικατασταθεί το αναποτελεσματικό ενδοθήλιο με υγιές και λειτουργικό ενδοθήλιο δότη μέσω της μεταμόσχευσης κερατοειδούς.

15 15 Α.1.3: Επεμβάσεις κερατοπλαστικής Οι προβολές πληθυσμού των ανεπτυγμένων κρατών δείχνουν ότι ο αριθμός των ατόμων ηλικίας 50 ετών και άνω έχει αυξηθεί σημαντικά τις τελευταίες δεκαετίες, και η πίεση στα συστήματα υγειονομικής περίθαλψης σε παγκόσμιο επίπεδο θα είναι άνευ προηγουμένου κατά τη διάρκεια του 21ου αιώνα. Αυτό πιθανότατα θα σηματοδοτήσει μια σταδιακή αύξηση σε ηλικιωμένους ασθενείς με παθήσεις κερατοειδούς και σε αυξημένη ζήτηση για μοσχεύματα. Τα πτωματικά μοσχεύματα πρέπει να πληρούν αυστηρές προϋποθέσεις για την αποδοχή τους, που περιλαμβάνουν τις ορολογικές εξετάσεις και το ιατρικό ιστορικό του δότη. Ωστόσο, πολλά εν δυνάμει μοσχεύματα, συχνά από ηλικιωμένους δότες, δεν κρίνονται κατάλληλα για μεταμόσχευση λόγω του χαμηλού αριθμού ενδοθηλιακών κυττάρων και της αυξημένης πιθανότητας ηλικιακής αιτιολογίας εκφυλίσεων. Η διαθεσιμότητα των μοσχευμάτων επηρεάζεται επίσης από πιθανές πολιτιστικές, υλικοτεχνικές και διαδικαστικές δυσκολίες και το μόσχευμα διατρέχει τον κίνδυνο να καταστραφεί λόγω της καθυστερημένης λήψης ή εσφαλμένων χειρισμών κατά τη διάρκεια της. Αυτά είναι ορισμένα μόνο από τα εμπόδια που συμβάλλουν στην παγκόσμια έλλειψη κατάλληλων μοσχευμάτων. Ακόμη και υπό τις καλύτερες συνθήκες για τη μεταμόσχευση, το ενδεχόμενο της αποτυχίας λόγω ανοσολογικής απόρριψης, μόλυνσης, ή μη ανοσολογικής ενδοθηλιακής ανεπάρκειας είναι υπαρκτό και οδηγεί στην ανάγκη επανάληψης της μεταμόσχευσης. Αυτό επιδεινώνεται από το γεγονός ότι όπως αρκετές μελέτες έχουν δείξει, 9 η επανάληψη της μεταμόσχευσης κερατοειδούς έχει σημαντικά χειρότερη πρόγνωση σε σύγκριση με την αρχική επέμβαση. Για να αντιμετωπιστεί η παγκόσμια έλλειψη μοσχευμάτων, η ιδέα της χρήσης ενός κερατοειδούς για τη θεραπεία περισσότερων του ενός ασθενών έχει πραγματοποιηθεί με προσαρμοσμένη μεταμόσχευση στιβάδων του κερατοειδούς. Εδώ, ένα καλής ποιότητας

16 16 μόσχευμα μπορεί να διαιρεθεί σε τρία μέρη με τη χρήση μικροκερατόμου και τρυπανιού και να προκύψουν: (I) το περιφερικό σκληροκερατοειδικό χείλος με βιώσιμα βλαστοκύτταρα για τη μεταμόσχευση βλαστοκυττάρων (II) ένας πρόσθιος δίσκος που περιλαμβάνει εν μέρει το πάχος του στρώματος για την πρόσθια εν τω βάθει μερικού πάχους (lamellar) κερατοπλαστική (III) ένας οπίσθιος δίσκος που αποτελείται από μέρος του στρώματος και από το ενδοθήλιο για οπίσθια κερατοπλαστική (ενδοθηλίου). Σημαντικές προσπάθειες έχουν αναπτυχτεί προς την κατεύθυνση της μεταμόσχευσης ενδοθηλίου ή της κερατοπλαστικής μερικού πάχους ώστε υποκαταστήσουν την πιο επεμβατική διαμπερή κερατοπλαστική (PK) στη χειρουργική αντιμετώπιση παθήσεων του ενδοθηλίου του κερατοειδούς. Επιπλέον, λόγω των μόνιμων δομικών αλλαγών στο στρώμα του κερατοειδούς μετά από διαθλαστικές επεμβάσεις λέιζερ, εν δυνάμει μοσχεύματα ακατάλληλα για ολικού πάχους μεταμόσχευση κερατοειδούς μπορεί θεωρητικά ακόμα να συλλεχθούν και να χρησιμοποιηθούν για επεμβάσεις μερικού πάχους. Για να αντιμετωπιστεί περαιτέρω η προβλεπόμενη αύξηση της ζήτησης για ποιοτικά μοσχεύματα, υπάρχει σημαντικό κλινικό ενδιαφέρον στην ανάπτυξη κατάλληλων εναλλακτικών λύσεων μέσω της μηχανικής ιστών (tissue engineering). 10 Μια τέτοια εξέλιξη θα απαιτήσει συνεργατική διεπιστημονική έρευνα. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί μόνο με την καλλιέργεια ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro και την ανάπτυξη ενός καινοτόμου συστήματος που να επιτρέπει τη μεταμόσχευση λειτουργικού ιστού με εξειδικευμένες χειρουργικές τεχνικές.

17 17 Α.1.4 : Καλλιέργεια ενδοθηλιακών κυττάρων κερατοειδούς Είναι γενικά αποδεκτό ότι το ανθρώπινο ενδοθήλιο του κερατοειδούς δεν υφίσταται καμία λειτουργική αναγέννηση in vivo. Σε εργαστηριακές μελέτες έχει αποδειχθεί η ικανότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων να πολλαπλασιάζονται in vitro. Ωστόσο, οι διαδικασίες που εμπλέκονται στην απομόνωση και την επακόλουθη καλλιέργεια αυτών των πρωτογενών κυττάρων παρουσίασαν σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ των εργαστηρίων σε ό,τι αφορά τα πρωτόκολλα απομόνωσής τους, τις εξωκυττάριες μήτρες (extracellular matrices, ECM) που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση της κυτταρικής προσκόλλησης και, το σημαντικότερο, τα διαφορετικά θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια και τον πολλαπλασιασμό τους. Η απομόνωση και η καλλιέργεια των πρωτογενών κυττάρων έχουν εξελιχθεί πάνω από τέσσερις δεκαετίες από μια ήπια μέθοδο καλλιέργειας, η οποία επέτρεψε την μετανάστευση και την κυτταρική ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων, 11 σε μια σκληρότερη μέθοδο απόξεσης, όπου τα ενδοθηλιακά κύτταρα αποκολλήθηκαν από τη μεμβράνη του Descemet με τη χρήση μιας χειρουργικής λεπίδας. 12 Επί του παρόντος, η απομόνωση των ενδοθηλιακών κυττάρων περιλαμβάνει δύο στάδια (μέθοδος ξεφλουδίσματος-πέψης) κατά τα οποία το ενδοθήλιο αποκολλάται από τον κερατοειδή του δότη και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ενζυματική πέψη με χρήση κολλαγενάσης, 13 δισπάσης, 14 ή θρυψίνης / EDTA. 15 Ωστόσο, αυτή η τεχνική απομόνωσης μπορεί να οδηγήσει αναπόφευκτα σε συν-απομόνωση κυττάρων του στρώματος και σε επιμόλυνση της καλλιέργειας. Όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, το πάχος της μεμβράνης Descemet μπορεί να ποικίλλει από τον ένα δότη στον άλλο, και μία λεπτή & κολλώδης μεμβράνη (που βρίσκεται συχνά σε νεαρούς πτωματικούς δότες) είναι δύσκολο να αποκολληθεί και απαιτεί εκτεταμένους χειρισμούς. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μια λεπτή στιβάδα του οπίσθιου στρώματος μπορεί εν μέρει να αποκολληθεί κατά τη διαδικασία απολέπισης, παραμένοντας προσκολλημένη με τη μεμβράνη και το ενδοθήλιο. Μεταγενέστερη ενζυματική επεξεργασία

18 18 θα απελευθερώσει τόσο τα επιθηλιακά όσο και τα ανεπιθύμητα κύτταρα του στρώματος από τη μεμβράνη. Λόγω του αργού ρυθμού πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων, αυτά τα ξένα στρωματικά κύτταρα θα εξελιχθούν σε ινοβλάστες και θα καταλάβουν την καλλιέργεια. Οι Engelmann et al. 16 περιέγραψαν μια μέθοδο για την εξάλειψη των ινοβλαστών αυτών, βασιζόμενη στη χρήση ενός μέσου χωρίς L-βαλίνη, συμπληρωμένου με D-βαλίνη. Η υποκατάσταση της L-βαλίνης από την D-βαλίνη στην καλλιέργεια καταστέλλει την ανάπτυξη των ινοβλαστών, επειδή οι ινοβλάστες στερούνται της απαραίτητης οξειδάσης για τη μετατροπή της D-βαλίνης σε L-βαλίνη. Ωστόσο, η αφαίρεση της L-βαλίνης από ένα μέσο καλλιέργειας μπορεί να αποβεί δυσλειτουργική, ιδιαίτερα με τη χρήση σύνθετων συμπληρωμάτων, όπως έχει αναφερθεί σε ορισμένα από τα συστήματα καλλιέργειας ενδοθηλιακών κυττάρων. Αντί γι αυτό, η βελτίωση της τεχνικής της λήψης του ενδοθηλίου με την ενσωμάτωση της χρήσης της αντλίας κενού για τη διατήρηση των κυττάρων του στρώματος στη θέση τους και η καλύτερη κατάρτιση του τεχνικού που εκτελεί τη διαδικασία απομόνωσης θα επιτρέψουν την απομόνωση αποκλειστικά της μεμβράνης και της προσκολλημένης σε αυτήν στιβάδας ενδοθηλιακών κυττάρων. 17 Άλλες βελτιώσεις στην απομόνωση και την καλλιέργεια των ενδοθηλιακών κυττάρων περιλαμβάνουν τη χρήση επενδυμένων με εξωκυττάριες μήτρες επιφανειών για την ενίσχυση της προσκόλλησης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Μετά την ενζυματική διάσπαση του ενδοθηλίου, μεμονωμένα κύτταρα έχουν επιστρωθεί σε επενδυμένες επιφάνειες καλλιέργειας που περιλαμβάνουν κολλαγόνο, θρεπτικά συστατικά από βόεια ενδοθηλιακά κύτταρα, ένα μείγμα λαμινίνης και θειικής χονδροϊτίνης ή ένα εμπορικά διαθέσιμο μίγμα για επίστρωση (Athena Environmental Sciences Inc., Baltimore, MD) που περιέχει ινωδονεκτίνη, κολλαγόνο και λευκωματίνη. 18 Ωστόσο, έχει προταθεί ότι η επίστρωση με την εξωκυττάρια ουσία, μπορεί να μην είναι απαραίτητη για την καλλιέργεια των ενδοθηλιακών κυττάρων.

19 19 Έχει αναπτυχθεί ένα ευρύ φάσμα θρεπτικών μέσων που σε συνδυασμό με τη χρήση διαφόρων αυξητικών παραγόντων, έχει αποδειχθεί ότι μπορούν να υποστηρίξουν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Οι μιτογόνοι παράγοντες, όπως ο βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών, ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας και ο νευρικός αυξητικός παράγοντας προστίθενται για την ενίσχυση του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων. 19 Ωστόσο, η επίδραση του βασικού αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών ενδέχεται να παίζει ρόλο ως παράγοντας διαφοροποίησης και δεν έχει βελτιώσει σημαντικά την ανάπτυξη και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Εντούτοις, πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν συναντήσει δυσκολίες στη διατήρηση καλλιεργειών ενδοθηλιακών κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα. 20 Για παράδειγμα, οι καλλιέργειες τείνουν να γίνουν ετερογενείς με τα κύτταρα να λαμβάνουν τη μορφολογία των ινοβλαστών από γενιά σε γενιά. Λαμβάνοντας υπόψη την ποικιλομορφία των δοτών, καλλιέργειες από ηλικιωμένους δωρητές όχι μόνο πολλαπλασιάζονται πιο αργά, αλλά και σε μικρότερο βαθμό και εμφανίζουν μεγαλύτερη ετερογένεια σε σύγκριση με καλλιέργειες που προέρχονται από νεότερους δότες. 21 Επιπλέον, έχει τεκμηριωθεί η κυτταρική γήρανση που οδηγεί στην αδυναμία πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τουλάχιστον σε ένα ποσοστό των κυττάρων που είναι μορφολογικά μεγαλύτερα, με ακανόνιστο σχήμα, με πολλά κενοτόπια και, σε ορισμένες περιπτώσεις, πολυπύρηνα. 22 Ωστόσο, σε ορισμένες περιπτώσεις, κύτταρα προερχόμενα από ηλικιωμένους δότες λειτούργησαν σχετικά καλά σε σύγκριση με καλλιέργειες από νεότερους δότες. Αυτό μπορεί να οφείλεται στους παράγοντες που αφορούν την προετοιμασία των κερατοειδών και τη σχετική υγεία του δότη πριν από το θάνατο.

20 20 Σε γενικές γραμμές, το αποτέλεσμα μιας επιτυχημένης καλλιέργειας ενδοθηλιακών κυττάρων θα επηρεαστεί από το χρόνο που μεσολαβεί μεταξύ του θανάτου, της εξόρυξης και της διατήρηση των κερατοειδών των δοτών μέχρι την απομόνωση και την καλλιέργεια των ενδοθηλιακών κυττάρων. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η χρήση του Υ-27632, μιας συνθετικής ουσίας που αναστέλλει επιλεκτικά το μονοπάτι της p160 κινάσης, προώθησε την προσήλωση και τον πολλαπλασιασμό κυττάρων που είχαν απομονωθεί από πιθήκους. Μολονότι ο υποκείμενος μηχανισμός της παρατήρησης δεν είναι σαφής, είναι εύλογο ότι η αναστολή της υψηλής έντασης δραστηριότητας της κινάσης που παρατηρείται στα κύτταρα υπό ακραίες συνθήκες (συμπεριλαμβανομένου του κυτταρικού θανάτου) μπορεί να ευνοεί την επιβίωσή τους. 23 Ως εκ τούτου, η ενσωμάτωση ενός τέτοιου αναστολέα της κινάσης στην καλλιέργεια μπορεί να βελτιώσει την ικανότητα επιβίωσης των κυττάρων σε όλη τη διαδικασία της απομόνωσης, η οποία με τη σειρά της αυξάνει την αρχική πρόσδεση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Οι μέθοδοι για την απομόνωση και την καλλιέργεια ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro, σε συνδυασμό με τα θρεπτικά μέσα που υποστηρίζουν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό τους, συνεχώς εξελίσσονται και βελτιώνονται. Έχει αναφερθεί ότι κύτταρα που έχουν απομονωθεί από τη μεμβράνη του Descemet μπορούν να διατηρούνται σε κατάλληλο μέσο με αυξημένο ασβέστιο και ελεύθερο ορού ως σφαιρίδια μέχρι και τρεις εβδομάδες. Ωστόσο, οι μακράς διάρκειας καλλιέργειες απαιτούν ένα κρίσιμο συστατικό: τον ορό. Η προσθήκη του ορού, αν και απαραίτητη, εισάγει ένα περίπλοκο μείγμα πρωτεϊνών άγνωστης σύνθεσης σε απροσδιόριστη συγκέντρωση και παρουσιάζει μεγάλη μεταβλητότητα των βιολογικά δραστικών ενώσεων. 24 Η αστάθεια αυτή περιπλέκει και δυσχεραίνει τις μελέτες χαρακτηρισμού με στόχο τον καθορισμό των κρίσιμων παραγόντων που απαιτούνται για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Από θεραπευτική σκοπιά, είναι

21 21 επίσης σημαντικό τα κύτταρα να πολλαπλασιάζονται κάτω από συνθήκες ελεύθερες συστατικών που προέρχονται από ζωικές πηγές ώστε να μειώνεται ο κίνδυνος μετάδοσης ζωικών παθογόνων παραγόντων στον ανθρώπινο πληθυσμό. Μια παρόμοια προσέγγιση για την ανάπτυξη ενός πλήρως προσδιορισμένου ως προς τη σύσταση μέσου καλλιέργειας, ικανού να υποστηρίξει την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, καθώς και να διατηρήσει τη μοναδική τους λειτουργία, είναι πλέον μια εφικτή πρόταση. Α.1.5 Καλλιεργηθέντα κύτταρα αντί κερατοπλαστικών Η ιδέα της χρησιμοποίησης κυττάρων από καλλιέργειες ως εναλλακτική λύση αντί της κερατοπλαστικής ολικού πάχους στην αντικατάσταση του ελαττωματικού ενδοθηλίου έχει διατυπωθεί εδώ και τρεις δεκαετίες. 25 Δυνητικά, η χρήση κατασκευασμένων ιστών ως υποκατάστατα του ενδοθηλίου του κερατοειδούς μπορεί ενδεχομένως να αντιμετωπίσει την έλλειψη μοσχευμάτων που παρουσιάζεται σε παγκόσμιο επίπεδο. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τη θεραπεία της φυσαλιδώδους κερατοπάθειας. Ως εκ τούτου, η ικανότητα παρασκευής κυτταρικών καλλιεργειών in vitro με επαρκή αξιοπιστία θα τονώσει την περαιτέρω έρευνα για την ανάπτυξη ενός κατάλληλου συστήματος διανομής υπό τη μορφή ενός συνθετικού ή βιολογικού φορέα. Η ανάπτυξη συνθετικών φορέων πλήρους πάχους βασισμένων στο κολλαγόνο ως υποκατάστατα του κερατοειδούς ξεκίνησε πριν από περισσότερα από 10 χρόνια. 26 Οι πρόσφατες εξελίξεις περιλαμβάνουν τη χρήση του κολλαγόνου, την υαλοποίηση και την ενυδάτωσή του, ώστε να διαμορφωθεί μια λεπτή διαφανής μεμβράνη. 27 Ορισμένες μελέτες έχουν εξετάσει συνθετικά ικριώματα από ινώδες με αγαρόζη και κολλαγόνο με θειική χονδροϊτίνη ως πιθανούς φορείς. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες δεν έχουν επικυρωθεί λειτουργικά σε ένα in vivo μοντέλο μέχρι πρόσφατα. Οι

22 22 Koizumi et al. μεταμόσχευσαν κύτταρα από πίθηκο, καλλιεργημένα σε φορέα από υαλοποιημένο κολλαγόνο τύπου 1, στον πρόσθιο θάλαμο του οφθαλμού του πιθήκου, με το ενδοθήλιο του κερατοειδούς του να έχει αποξεθεί μηχανικά, και διατύπωσαν την άποψη ότι τα καλλιεργημένα κύτταρα μετανάστευσαν από την μεμβράνη κολλαγόνου στη Δεσκεμέτειο μεμβράνη του δέκτη με αποτέλεσμα την αποκατάσταση της διαφάνειας του κερατοειδούς. Τελικά, για να μπορούν να χρησιμοποιηθούν συνθετικοί φορείς σε οποιαδήποτε μορφή μεταμόσχευσης ενδοθηλίου κερατοειδούς, είναι σημαντικό να μπορεί να ελεγχθεί η σταθερότητα και η αποτελεσματικότητα τους αξιόπιστα και ανεξάρτητα. Μικρού πάχους βιολογικοί φορείς, όπως η ανθρώπινη αμνιακή μεμβράνη και βιοδιασπώμενες ζελατινώδεις μεμβράνες έχουν προταθεί ως πιθανοί αντικαταστάτες. Ωστόσο, η ανθρώπινη αμνιακή μεμβράνη δεν είναι πλήρως διαφανής και η σύσταση της δεν είναι σταθερή, γεγονός που υποβαθμίζει την κλινική της αξία στο πλαίσιο αυτό. Μελέτες έχουν δείξει ότι η λήψη κυττάρων που καλλιεργούνται σε μια πολυμερή θερμοαναδραστική επιφάνεια της καλλιέργειας ως ένα ενιαίο φύλλο χωρίς ενζυματική κατεργασία είναι εφικτή. Πειράματα σε κουνέλια απέδειξαν την λειτουργικότητα τέτοιων υμενίων, κατέδειξαν όμως και τη δυσκολία στην επεξεργασία τους. Εάν μια πιο στιβαρή βιοαποδομήσιμη εναλλακτική λύση, όπως μια μήτρα με βάση το ινώδες, μπορεί να ενσωματωθεί σε αυτές τις μελέτες, οι μεταμόσχευση των υμενίων σε πιθήκους θα είναι το επόμενο βήμα. Εναλλακτικά, αντί για λεπτούς βιολογικούς φορείς, άλλοι ερευνητές έχουν επιλέξει την προσέγγιση της χρήσης τμημάτων κερατοειδικού ιστού για τη μεταφορά των κυττάρων. 31 Το πλεονέκτημα της χρήσης ενός τέτοιου φορέα είναι ότι τόσο το σχήμα όσο και η διαφάνεια του κερατοειδούς μπορούν να διατηρηθούν. Εδώ, τα καλλιεργούμενα κύτταρα μπορούν να διαχωριστούν ενζυματικά μέχρι να σχηματιστεί εναιώρημα των κυττάρων και να τεθούν σε μια επιθυμητή πυκνότητα πάνω στην απογυμνωμένη από ενδοθήλιο Δεσκεμέτειο μεμβράνη

23 23 και στη συνέχεια απευθείας πάνω στο στρώμα του στρώματος. Η τεχνική αυτή έχει εφαρμοστεί με λειτουργική επιτυχία σε γάτες. Σε άλλη μελέτη των Honda et al., 32 η χρησιμοποίηση καλλιέργειας κυττάρων σε νωπούς δίσκους από στρώμα ανθρώπινου κερατοειδούς, έδειξε ελπιδοφόρα αποτελέσματα όταν οι δίσκοι με τα κύτταρα μεταμοσχεύθηκαν σε κουνέλια. Αν και η τεχνική αυτή είναι πολλά υποσχόμενη, είναι απαραίτητες η περαιτέρω βελτίωση της χρήσης του στρώματος ανθρώπινου κερατοειδούς ως φορέα για την επίτευξη της επιθυμητής πυκνότητας ενδοθηλιακών κυττάρων για μεταμόσχευση και η μακροπρόθεσμη αξιολόγηση της ως προς το πώς η πυκνότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων μπορεί να μειωθεί με την πάροδο του χρόνου. Η μεταμόσχευση κερατοειδούς έχει προχωρήσει ταχύτατα κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας, με μια μετατόπιση του ενδιαφέροντος από τις μεταμοσχεύσεις πλήρους πάχους στις οπίσθιες μεταμοσχεύσεις μερικού πάχους ή στις μεταμοσχεύσεις ενδοθηλίου. Η μερικού πάχους μεταμόσχευση αντικαθιστά τον προσβεβλημένο ιστό, αντί για το σύνολο του κερατοειδούς, και έχει σαφή πλεονεκτήματα στην ανάκτηση της οπτικής οξύτητας και της δομικής σταθερότητας. Οι χειρουργικές επεμβάσεις για την οπίσθια κερατοπλαστική έχουν εξελιχθεί από την Deep Lamellar Endothelial Keratoplasty (DLEK) 33 στην Descemet Stripping Endothelial Keratoplasty (DSEK), 34 την Descemet Stripping Automated Endothelial Keratoplasty (DSAEK) 35 και την Descemet Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK). 36 Μέχρι σήμερα, η DSEK και η DSAEK είναι οι πιο συνηθισμένες μερικού πάχους μεταμοσχεύσεις κερατοειδούς, που αντικαθιστούν ουσιαστικά το παθολογικό ενδοθήλιο και τη Δεσκεμέτειο του λήπτη με ένα μόσχευμα ενδοθηλίου, Δεσκεμετείου και ενός λεπτού τμήματος του στρώματος. Αυτό έχει πάχος μεταξύ 50 και 250 μm, ανάλογα με την τεχνική που χρησιμοποιείται κατά τη λήψη. Οι επεμβάσεις αυτές προσφέρουν καλύτερα αποτελέσματα στην ταχύτερη αποκατάσταση της οπτικής οξύτητας με

24 24 χαμηλότερο κίνδυνο διεγχειρητικών επιπλοκών σε σχέση με τις διαμπερείς κερατοπλαστικές. Ωστόσο, θέματα όπως η μετεγχειρητική απόπτωση ενδοθηλιακών κυττάρων και τα υψηλά ποσοστά απόρριψης του μοσχεύματος παραμένουν ανοικτά. Αυτές οι επιπλοκές έχουν μειωθεί με την ανάπτυξη νέων διατάξεων για την εισαγωγή των μοσχευμάτων, οι οποίες ελαχιστοποιούν τη διεγχειρητική καταστροφή κυττάρων κατά την εισαγωγή του μοσχεύματος του δότη και μειώνουν τα ποσοστά της μετεγχειρητικής απώλειας ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτές οι συσκευές προσφέρουν επίσης τη δυνατότητα λειτουργίας ως μέσων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παράδοση των καλλιεργημένων με την ιστική μηχανική κυττάρων στον πρόσθιο θάλαμο του οφθαλμού. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα διατηρούν την ικανότητά τους να πολλαπλασιάζονται in vitro, και οι αναπτυξιακοί τους μηχανισμοί γίνονται τώρα καλύτερα αντιληπτοί. Μολονότι τα κύτταρα δεν μπορούν να αναπαράγονται επ' αόριστον, στο πλαίσιο των τεχνητών ενδοθηλιακών μοσχευμάτων του κερατοειδούς, η χρήση των μη τροποποιημένων κυττάρων πλεονεκτεί σε σχέση με τη χρήση τροποποιημένων κυτταρικών γραμμών. Οι συνεχείς βελτιώσεις στο σύστημα καλλιέργειας των ενδοθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς μπορεί στο μέλλον να επιτρέψουν την καλλιέργεια και τον πολλαπλασιασμό κυττάρων του ίδιου του ασθενούς από ιστό που λαμβάνεται από την περιφέρεια του ενδοθηλίου του κερατοειδούς, τα οποίο φέρονται να είναι πιο παραγωγικά σε σχέση με τα κύτταρα του ενδοθηλίου του κεντρικού κερατοειδούς. 37 Μεταμόσχευση τεχνητού κερατοειδικού ενδοθηλίου προερχόμενου από το ενδοθήλιο του ίδιου του ασθενούς μπορεί επίσης να βελτιώσει τη μακροπρόθεσμη επιβίωση του μοσχεύματος. Όπως προαναφέρθηκε, πολλά υποσχόμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα, που καλλιεργούνται σε διάφορα συστήματα μεταφοράς, διατηρούν τη λειτουργικότητα τους στα ζώα. Ωστόσο, είναι απαραίτητο να βρεθεί ένας κατάλληλος

25 25 φορέας που να είναι επίσης κλινικά αποδεκτός και να θεσπιστεί ένα αξιόπιστο πρωτόκολλο για την επικύρωση του επιλεγμένου συστήματος μεταφοράς σε συνθήκες in vivo. Επιπλέον, η ανάπτυξη ενός κατάλληλου συστήματος καλλιέργειας για την ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων μπορεί επίσης να απαιτείται για μελλοντικές κλινικές δοκιμές. Εν κατακλείδι, καινοτόμες ανακαλύψεις στην τεχνολογία και τη φαρμακευτική θα βελτιώνουν συνεχώς τις χειρουργικές επεμβάσεις και τα αποτελέσματά τους. Η προοπτική μιας καινοτόμου θεραπευτικής στρατηγικής για μεταμόσχευση ενδοθηλίου καλλιεργημένου in vitro είναι πλέον πιθανή και η έρευνα μέχρι στιγμής έχει ελπιδοφόρα αποτελέσματα.

26 26 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α.2 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΓΩΝΙΑΚΟΥ ΔΙΚΤΥΩΤΟΥ (TRABECULAR MESHWORK) ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ A.2.1 Εισαγωγικά στοιχεία Μια από τις κύριες αιτίες μη αναστρέψιμης τύφλωσης στον κόσμο, είναι το γλαύκωμα, η χρόνια δηλαδή εκφύλιση των αμφιβληστροειδικών γαγγλιακών κυττάρων μαζί με τον υποστηρικτικό ιστό γλοίας και αγγείων που οδηγεί στην χαρακτηριστική κοίλανση της θηλής του οπτικού νεύρου. 38 Κατά τα τελευταία χρόνια έχει επιτελεστεί σημαντική πρόοδος στην έρευνα για τους παράγοντες κινδύνου του γλαυκώματος κατά την οποία έχουν εντοπιστεί 1) η αυξημένη ενδοφθάλμια πίεση (ΕΟΠ) ως κρίσιμος παράγοντας κινδύνου, 2) η εσωτερική περιοχή του τοιχώματος του γωνιακού δικτυωτού (trabecular meshwork, TM) έχει ταυτοποιηθεί ως το κύριο σημείο αντίστασης στην εκροή του υδατοειδούς υγρού 3) περίπου 30 γονίδια που παρέχουν μια γενετική βάση για το γλαύκωμα, συμπεριλαμβανομένων των myocilin, οπτινευρίνης, και SPARC, και 4) διάφορες κατηγορίες φαρμακευτικών παραγόντων για τη μείωση της ΕΟΠ στην αντιμετώπιση του γλαυκώματος ανοιχτής γωνίας. 39 Η περαιτέρω πρόοδος έχει πιθανότατα επιβραδυνθεί από τους περιορισμούς στη διαθεσιμότητα των κατάλληλων in vitro μοντέλων για τη μελέτη των κυττάρων του γωνιακού δικτυωτού ΤΜ και των λεπτομερών μηχανισμών στη ρύθμιση της ενδοφθάλμιας πίεσης. Τα διαθέσιμα σήμερα in vitro μοντέλα περιλαμβάνουν απομονωμένα κύτταρα και ιστούς, καθώς και καλλιεργημένες κυτταρικές γραμμές. Η μικρή ποσότητα του ΤΜ ιστού που μπορεί να ληφθεί από ένα οφθαλμό δεν επιτρέπει την επιτέλεση πολλών βιοχημικών και φαρμακολογικών πειραμάτων. 40 Η καλλιέργεια πρωτογενών κυττάρων γωνιακού δικτυωτού

27 27 (trabecular meshwork, TM) περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Polansky 41 και παραμένει η πρώτη επιλογή για βιοχημικά και φαρμακολογικά πειράματα. Μια ταχέως αναπτυσσόμενη και σταθερή ανθρώπινη TM (ΗΤΜ) κυτταρική γραμμή μπορεί να παράσχει ένα έγκυρο μοντέλο για φαρμακολογικές μελέτες, αλλά δεν είναι ιδανικό για την κατανόηση της φυσιολογίας να χρησιμοποιούνται συμβατικά 2D μοντέλα. Επί του παρόντος, τα πρόσθια τμήματα (anterior segments) ζωικών ή ανθρώπινων πτωματικών οφθαλμών χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της εκροής του υδατοειδούς υγρού (ΥΥ) και τη δοκιμή της επίδρασης των φαρμάκων στο ΤΜ, αλλά αυτά τα πειράματα αυτά είναι χρονοβόρα και δαπανηρά. Η ανάγκη για εύχρηστα in vitro μοντέλο είναι εμφανής αφού η θεραπεία του γλαυκώματος θα βελτιωθεί σημαντικά με την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που είναι υπεύθυνοι για την αντίσταση στην εκροή του ΥΥ. Ένα τέτοιο μοντέλο θα προωθήσει την κατανόηση της φυσιολογίας και παθολογίας του γλαυκώματος. Η αξιοποίηση των εξελίξεων στη μηχανική ιστών και μικρο-/ νανομηχανική ελπίζουμε να δημιουργήσει ένα τέτοιο 3D in vitro μοντέλο του ΤΜ που θα αποτελέσει τη βάση για μια σταθερή κατανόηση της λεπτομερούς δομής και λειτουργίας του.

28 28 A.2.2: Δομή, βιοχημεία και κυτταρική βιολογία του γωνιακού δικτυωτού Τα κύρια ανατομικά στοιχεία του οφθαλμού, τα οποία έχουν σχέση με την παραγωγή και αποχέτευση του υδατοειδούς υγρού είναι: 1.το ακτινωτό σώμα, 2.η γωνία του προσθίου θαλάμου (γωνιακό δικτυωτό ή trabeculum) και 3.το κανάλι του Schlemm. Το ακτινωτό σώμα: Χαρακτηρίζεται από υψηλή αγγείωση. Σε τμήμα της επιφάνειάς του (ακτινωτός στέφανος) εμφανίζει τις ακτινοειδείς προβολές, πτυχές, που είναι ιδιαίτερα αγγειοβριθείς και παράγουν το υδατοειδές υγρό με υπερδιήθηση και ενεργό έκκριση. Άλλη μοίρα του ακτινωτού σώματος είναι ο ακτινωτός μυς. Έχει λείες μυϊκές ίνες και νευρώνεται από το παρασυμπαθητικό σύστημα. Εμφανίζει δυο μοίρες: Α) την έξω ή επιμήκη, οι ίνες της οποίας μεταβαίνουν προς τα εμπρός σε τένοντα, ο οποίος καταφύεται σε μοίρα της γωνίας του προσθίου θαλάμου, ώστε η σύσπασή τους τείνει μηχανικά το trabeculum διευκολύνοντας έτσι την εκροή του υδατοειδούς υγρού Β) την έσω ή κυκλοτερή, που εξυπηρετεί την λειτουργία της προσαρμογής. Οι κύριες λειτουργίες του ακτινωτού σώματος είναι: α) Η παραγωγή του υδατοειδούς υγρού. β) Η λειτουργία της προσαρμογής. γ) Η διευκόλυνση της αποχέτευσης του υδατοειδούς υγρού με την μηχανική έκταση του trabeculum από την σύσπαση των επιμηκών μυϊκών ινών. Συμμετοχή και στη ραγοειδοσκληρική οδό αποχέτευσης.

29 29 δ) Η διατήρηση του αιματοϋδατοειδικού φραγμού, που φυσιολογικά επιτρέπει μόνο τη διήθηση ύδατος και μικρομοριακών ουσιών προς τον οπίσθιο θάλαμο. Το γωνιακό δικτυωτό αποτελεί την κύρια οδό εκροής υδατοειδούς υγρού από τον οφθαλμό. Από την παραγωγή του στο ακτινωτό σώμα, το υδατοειδές υγρό εισέρχεται στον πρόσθιο θάλαμο του οφθαλμού, και μέσω του γωνιακού δικτυωτού και του ενδοθηλίου του καναλιού του Schlemm (SC) στα κανάλια συλλογής και τελικά το επισκλήριο φλεβικό δίκτυο. 42 Έτσι, φαίνεται ότι η κύρια αιτία του πρωτογενούς γλαυκώματος ανοικτής γωνίας (της πιο κοινής μορφής γλαυκώματος) είναι η αυξημένη αντίσταση στη ροή του υδατοειδούς υγρού μέσω του TM και/ ή του SC λόγω ανατομικών ή/και βιοχημικών μεταβολών. Το γωνιακό δικτυωτό (trabecular meshwork) είναι πορώδες και εκτείνεται σε ένα μέσο πάχος 70 μm στο πρόσθιο τμήμα και μεταξύ 100 και 130 μm στο οπίσθιο τμήμα. 43 Το TM περιλαμβάνει τρεις περιοχές που διαφέρουν ως προς τη δομή και την προέλευση, επιτρέποντας την διήθηση του υδατοειδούς υγρού προς μια κατεύθυνση. Εξετάζοντας το ΤΜ μέσω του πρόσθιου θαλάμου του οφθαλμού, πρώτα συναντούμε το εσωτερικό ραγοειδικό γωνιακό δικτυωτό (uveal trabecular meshwork, UTM), ακολουθούμενο από το βαθύτερο κερατοειδοσκληρικό γωνιακό δικτυωτό (corneoscleral trabecular meshwork, CTM), και τελευταία, την παρασωλήνια (juxtacanalicular) μοίρα του ΤΜ (juxtacanalicular trabecular meshwork, JTM) ή ηθμοειδή περιοχή, η οποία εντοπίζεται σε άμεση γειτνίαση με το εσωτερικό τοίχωμα του ενδοθηλίου του σωλήνα του Schlemm (SC). 44 Η πρόσθια πλευρά του ακτινωτού σώματος δημιουργεί την UTM, η οποία αποτελείται από ένα έως τρία στρώματα δοκίδων ή πετάλων, ενώ το CTM σχηματίζει 8-15 δοκιδωτά στρώματα, τα οποία είναι παχύτερα από εκείνα του UTM και προέρχονται από το σκληρό χιτώνα. Κάθε δοκίδα αποτελείται από έναν πυρήνα από κολλαγόνο (τύποι Ι και III) 45

30 30 και ελαστίνη που καλύπτεται από επίπεδα κύτταρα τα οποία στηρίζονται σε ένα βασικό πέταλο πλούσιο σε κολλαγόνο τύπου IV και λαμινίνη. Οι δοκίδες στη συνέχεια συνδέονται μεταξύ τους μαζί σε πολλά στρώματα που δημιουργούν τη χαρακτηριστικά δομή του ΤΜ. Τα ανοικτά διαστήματα μεταξύ των δοκίδων κυμαίνονται από μm στις εσωτερικές περιοχές του UTM και 2-15 μm στα εξωτερικά στρώματα του CTM. Υποστηρίζεται ότι, ως αποτέλεσμα της υψηλής πορώδους δομής τους, τόσο η UTM όσο και η CTM παρουσιάζουν μικρή αντίσταση στην εκροή του υδατοειδούς υγρού. Σε αντίθεση, το JCT, η λεπτότερη περιοχή του ΤΜ, είναι η περιοχή πιθανότατα που συμβάλει περισσότερο στην αντίσταση εκροής. 46 Το κανάλι του Schlemm: είναι κυκλοτερής σωληνοειδής κατασκευή, η οποία βρίσκεται προς τα έξω του γωνιακού δικτυωτού και σε επαφή με αυτό. Συλλέγει το υδατοειδές υγρό, το οποίο διέρχεται μέσα από τα ανοίγματα του trabeculum. Προς την σκληρική πλευρά έχει στο τοίχωμά του στόμια συλλεκτικών σωληνίσκων, τα συλλεκτικά κανάλια ή υδάτινες φλέβες, διαμέσου των οποίων το υδατοειδές υγρό καταλήγει στο επισκληρικό φλεβικό σύστημα (στη φλεβική κυκλοφορία). Η επιτυχής απομόνωση κυττάρων γωνιακού δικτυωτού από ανθρώπινο δότη κατέστησε δυνατή την καλλιέργεια αυτών των κυττάρων και κατά επέκταση ένα τρόπο για τη μελέτη αυτών των κυττάρων και την κατανόηση των ιδιοτήτων τους Τα κύτταρα αυτά όταν καλλιεργούνται σχηματίζουν μια μονοστιβάδα από επίπεδα κύτταρα και περιέχουν στο κυτταρόπλασμα άφθονα μικρονημάτια διαμέτρου 10 nm αλλά και μικρότερες ίνες (διαμέτρου 5-6 nm) στην περιφέρεια του κυττάρου, γύρω από τον πυρήνα. 50 Βιοχημικά, τα κύτταρα ΗΤΜ χαρακτηρίζονται από ειδικούς κυτταρικούς δείκτες και ικανότητα φαγοκυττάρωσης. Αυξημένη έκφραση της μυοκιλίνης (myocilin) σε απόκριση μετά από θεραπεία με δεξαμεθαζόνη παραμένει ένα από τα βασικά χαρακτηριστικά των

31 31 κυττάρων ΗΤΜ 51 ενώ η αβ-κρυσταλλίνη είναι μια άλλη πρωτεΐνη που εντοπίζεται στην JTM περιοχή του γωνιακού δικτυωτού και η έκφραση της επάγεται από παράγοντες στρες, αλλά και από TFG-β2. 52 Άλλες αξιόλογες πρωτεΐνες που περιέχουν, χωρίς να είναι ειδικές για τα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού είναι οι: α2-αδρενεργικός υποδοχέας, ακουαπορίνη-1, ακετυλιωμένες και ακετοακετυλιωμένες λιποπρωτεϊνες χαμηλής πυκνότητας, ενεργοποιητής ιστικού πλασμινογόνου και η ακτίνη λείων μυϊκών ινών. 53 Τα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού είναι ενεργά φαγοκύτταρα, διευκολύνοντας την απομάκρυνση των θραυσμάτων (debris) από το σύστημα εκροής και αυτή η σημαντική ιδιότητα τους προτάθηκε ως το αίτιο της αυξημένης ενδοφθάλμιας πίεσης μετά από θεραπεία με στεροειδή λόγω της μειωμένης ικανότητας φαγοκυττάρωσης των ΤΜ κυττάρων. 54,55

32 32 Α.2.3: In vitro καλλιέργεια ανθρωπίνων κυττάρων γωνιακού δικτυωτού Παραδοσιακά μοντέλα δυο διαστάσεων (2D) Οι περισσότερες από τις εξελίξεις για την κατανόηση της βιολογίας των ΤΜ κυττάρων έχουν διευκολυνθεί από τα μοντέλα που χρησιμοποιούν 2D in vitro καλλιέργειες. Διάφορες μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση και καλλιέργεια αυτών των κυττάρων Μια in vitro κυτταρική καλλιέργεια 2D συχνά οδηγεί σε διαφορετική γονιδιακή έκφραση, οδηγώντας σε απώλεια της λειτουργίας, και τελικά, απώλεια του φαινοτύπου. 59 Η μορφή και υφή του υποστρώματος της καλλιέργειας φαίνεται ότι επηρεάζει τη γονιδιακή έκφραση και την εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας σε κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού. 60,61 Είναι λογικό να σκεφτεί κανείς ότι η 2D κυτταρική καλλιέργεια σε άκαμπτα πλαστικά τρυβλία δεν θα μιμείται με απόλυτη ταύτιση τις in vivo ιδιότητες και τις λειτουργίες των κυττάρων αυτών όμως παρά το γεγονός αυτό, τα πρωτόκολλα για κανονική καλλιέργεια ΗΤΜ κυττάρων είναι καλά εδραιωμένα και προσφέρουν μια βάση για την εν γένει κατανόηση των ιδιοτήτων των κυττάρων του γωνιακού δικτυωτού αποτέλεσμα. Σημαντικές προκλήσεις είναι η σύγκριση μεταξύ φυσιολογικών και γλαυκωματικών κύτταρων ΤΜ αλλά και η έλλειψη των μοριακών δεικτών που θα βοηθήσουν στη διάκριση μεταξύ των υποτύπων κυττάρων του ΤΜ. Η αβκρυστάλλινη είναι ο μόνος δείκτης που μπορεί να βοηθήσει στη διάκριση των JTM κύτταρων, ωστόσο, η ειδικότητα της αβ-κρυσταλλίνης είναι μικρή καθώς βρίσκεται και σε άλλους τύπους κυττάρων εκτός από κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού. 62

33 33 Α.2.4: Άλλοι τύποι υποστρωμάτων καλλιέργειας Η πολυπλοκότητα του συμπλέγματος γωνιακό δικτυωτό (trabecular meshwork, TM) και κύτταρα του ΤΜ με τις πολλές αλληλεπιδράσεις δεν ευνοεί μια «γενικής χρήσης» προσέγγιση για την καλλιέργεια κυττάρων. Διάφορες ερευνητικές ομάδες έχουν προσπαθήσει να καλλιεργήσουν αυτά τα κύτταρα σε διάφορα υποστρώματα ώστε να μελετηθούν συγκεκριμένες λειτουργίες ή χαρακτηριστικά. Δεδομένης της πορώδους δομής του TM, κάποιες ομάδες έχουν καλλιεργήσει κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού σε μικροπορώδη φίλτρα για την εκτέλεση μελετών και μελέτες σχετικά με την επίδραση φαρμακολογικών παραγόντων. 63,64 Ο McKee και συνεργάτες χρησιμοποίησαν υδρογέλες πολυακρυλαμιδίου για να μιμηθούν τη συμπεριφορά των φυσιολογικών και γλαυκωματικών κυττάρων ΗΤΜ, για να μελετηθεί η μηχανοβιολογία αυτών των κυττάρων, ειδικότερα η αποσυναρμολόγηση και επαναπολυμερισμός του κυτταροσκελετού τους σε απόκριση προς την πρωτεινη Latrunculin -Β (Lat-Β) 65 και απέδειξαν ότι η το υπόστρωμα μεταβάλει ριζικά την δυναμική του κυτταροσκελετού και το ίδιο το μέτρο ελαστικότητας (elastic modulus) των κυττάρων. Κύτταρα του TM που καλλιεργούνται σε υποστρώματα με μειωμένη ελαστικότητα παρουσίασαν δραματικές αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία σε απόκριση προς Lat-B, λόγω ελάττωσης της πυκνότητας των δικτύων ακτίνης τους. Γενικότερα, η καλλιέργεια αυτών των κυττάρων σε μίκρο/νάνο-υποστρώματα θα μπορούσε να είναι επωφελής για να μελετηθούν συγκεκριμένες λειτουργίες και χαρακτηριστικά που απαντώνται στο in vivo περιβάλλον.

34 34 Α.2.5: Νάνο-μηχανική σχεδίαση των in vitro μοντέλων καλλιέργειας κυττάρων TM Η μηχανική ιστών (tissue engineering) είναι ένα διεπιστημονικό πεδίο που εφαρμόζει τις αρχές και τις τεχνικές της μηχανικής και εκείνα της βιολογίας για την παραγωγή λειτουργικών δομών αντίγραφων συγκεκριμένων ιστών Τα βασικά συστατικά της επιστήμης αυτής περιλαμβάνουν κύτταρα, ικριώματα (scaffolds) και μόρια σηματοδότησης (signaling molecules). Σε γενικές γραμμές, τα κύτταρα καλλιεργούνται σε ικριώματα βιοϋλικών για να αναδημιουργηθεί η κατάλληλη μικροαρχιτεκτονική των ιστών. 69 Τα κύτταρα θα μπορούσαν να είναι πρωτογενή κύτταρα, γενετικά τροποποιημένα κύτταρα, αθάνατες κυτταρικές σειρές, ή βλαστικά κύτταρα 70 ενώ φυσικά, συνθετικά, ή υβριδικά ικριώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κυτταρική ανάπτυξη και μορφογένεση των ιστών, η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη μηχανική ιστών Η προσθήκη μορίων σηματοδότησης ενισχύει περαιτέρω την μηχανική μορφογένεση του ιστού. 74 Με τις εξελίξεις στον τομέα της Νανοτεχνολογίας, ικριώματα νάνο διαστάσεων χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο στη μηχανική ιστών για να προσομοιώσουν πιστά την in vivo μορφολογίας του ιστού και τη λειτουργία του. 75 Το τρισδιάστατα (3D) βιομιμητικά (biomimetics) μοντέλα μηχανικής των ιστών παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρώτη γραμμή της ανακάλυψης και ανάπτυξης φαρμάκων Έτσι, ένα bioengineered (βιο-τεχνολογικό) γωνιακό δικτυωτό TM μπορεί να είναι το ιδανικό μοντέλο για την κατανόηση της βιολογίας αλλά και της φυσιολογίας της εκροής του υδατοειδούς υγρού. Το ιδανικό αυτό μοντέλο θα ενσωματώσει τα κύτταρα του ΤΜ αλλά και βιοχημικές και βιοφυσικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους σε μια 3D βιοσυμβατή, πορώδη δομή για να δώσει ένα TM με χαρακτηριστικές in vivo δομές και λειτουργίες. Λόγω της πολυπλοκότητας που προκύπτει με τις παραδοσιακές προσεγγίσεις "top-down" (π.χ., τα περίπλοκα χαρακτηριστικά της μικροδομής

35 35 των ιστών όπως η κυτταρική πυκνότητα και μικροαρχιτεκτονική), 79 η έρευνα αναμένεται να επικεντρωθεί σε μια νέα αντεστραμμένη προσέγγιση "bottom-up" για TM μηχανικής όπου τμηματικά δομικά στοιχεία με συγκεκριμένες μικρό-αρχιτεκτονικές θα χρησιμοποιούνται για την αναδημιουργία τρισδιάστατων τμημάτων ιστού. 80

36 36 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α.3: ΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΟΦΘΑΛΜΙΚΩΝ ΙΣΤΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Α.3.1: Εισαγωγικά στοιχεία Εμβιομηχανικής Η Εμβιομηχανική (Biomechanics) είναι ένας κλάδος του τομέα της βιοτεχνολογίας, η οποία ορίζεται ως η εφαρμογή των αρχών της μηχανικής σε βιολογικά συστήματα. Οι μηχανικές ιδιότητες είναι θεμελιώδεις ιδιότητες των κυττάρων και των ιστών των ζωντανών οργανισμών. Οι μηχανικές ιδιότητες ενός μόνο κυττάρου καθορίζονται από το συνδυασμό των μηχανικών ιδιοτήτων των αλληλοεξαρτώμενων κυτταρικών συστατικών. Η ποσοτική εκτίμηση των μηχανικών ιδιοτήτων των κυττάρων εξαρτάται από την κατάσταση των κυττάρων, τη μέθοδο μέτρησης, και το χρησιμοποιούμενο θεωρητικό μοντέλο. Ο απλούστερος τύπος κίνησης είναι η μηχανική κίνηση που μπορεί να θεωρηθεί τμήμα πολυπλοκότερων τύπων τύπους κίνησης (φυσικών, χημικών και βιολογικός). Οι μηχανικές ιδιότητες ανήκουν στις κύριες ιδιότητες των κυττάρων και των ιστών ενός ζωντανού οργανισμού. Τα κύτταρα ενός οργανισμού υποβάλλονται τακτικά σε ένα σύνολο μηχανικών δυνάμεων με τη μορφή τάσης, πίεσης ή ροής. Σε πολλές περιπτώσεις, οι μηχανικές ιδιότητες των κυττάρων παίζουν καθοριστικό ρόλο στην ικανότητά τους να αντέχουν μηχανικές φόρτισης κατά την εκτέλεση των φυσιολογικών λειτουργιών τους. Σε άλλες περιπτώσεις, ένα μηχανικό σήμα/ερέθισμα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο ρύθμισης της κυτταρικής συμπεριφοράς σε φυσιολογικά ή μη φυσιολογικά κύτταρα. Τα κύτταρα θεωρούνται ότι είναι φυσικές πολυσύνθετες δομές. Έχουν αξιοπρόσεκτες μηχανικές ιδιότητες: είναι σε θέση να διατηρήσουν το σχήμα τους υπό μηχανικές

37 37 καταπονήσεις, όπως τα στερεά, αλλά επίσης και παρουσιάζουν μεγάλες αναστρέψιμες παραμορφώσεις, οι οποίες είναι χαρακτηριστικές των υγρών. Οι μηχανικές ιδιότητες των κυττάρων εξαρτώνται κυρίως από τις ιδιότητες του βασικών συστατικών τους. Το μηχανικό φορτίο κυρίως αναλαμβάνεται από τον κυτταροσκελετό, ένα δίκτυο δύο ή τριών διαστάσεων από φυσικά βιοπολυμερή (πρωτεΐνες). Οι μηχανικές ιδιότητες των πολυμερών και των βιοπολυμερών εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από το αν είναι άμορφα, άμορφα-κρυσταλλικά ή κρυσταλλικά πολυμερή. Οι μηχανικές ιδιότητες των άμορφων πολυμερών εξαρτώνται από τη φυσική τους κατάσταση: ιξώδες- ροή (υγρά), υψηλή ελαστικότητα (ελαστικά ή στερεά). Η έννοια της ελαστικής και εξαιρετικά ελαστικής παραμόρφωσης των πολυμερών είναι μια εξιδανίκευση, διότι στην πραγματικότητα παραμορφώνοντας πολυμερή ένα μέρος της ενέργειας πάντοτε διαχέεται αμετάκλητα με μορφή θερμότητας. Ως εκ τούτου, τα πραγματικά πολυμερή έχουν ιδιότητες ιξωδοελαστικού υλικού. Αυτό σημαίνει ότι τα ιξωδοελαστικά υλικά παρουσιάζουν τόσο ελαστικά (μέτρα ελαστικότητας) και ιξώδη (συντελεστής ιξώδους) χαρακτηριστικά όταν υφίστανται παραμορφώσεις. Εάν ένα ελαστικό εξάρτημα μπορεί να μοντελοποιηθεί ως ένα ελαστικό ελατήριο, ένα ιξώδες συστατικό μπορεί να μοντελοποιηθεί ως ένας αποσβεστήρας. Ελαστικότητα στη μηχανική είναι η ιδιότητα ενός αντικειμένου να επιστρέφει στο αρχικό σχήμα του μετά από μια προκαλούμενη παραμόρφωση. Οι ελαστικές ιδιότητες των σωμάτων ποσοτικά χαρακτηρίζονται από τις ελαστικές παραμέτρους. Το μέτρο ελαστικότητας προσδιορίζεται από τη σχέση μεταξύ εφαρμοζόμενης δύναμης και προκαλούμενης παραμόρφωσης. Διαφορετικοί τύποι παραμόρφωσης χαρακτηρίζονται από διαφορετικά μέτρα ελαστικότητας. Τα πιο συνηθισμένα μέτρα ελαστικότητας που χρησιμοποιείται για την εκτίμηση των μηχανικών ιδιοτήτων των κυττάρων είναι: μέτρο ελαστικότητας (ή Young s modulus, E), μέτρο διάτμησης (ή shear modulus, G), και συντελεστής κάμψης υλικού, ( ή

38 38 flexural modulus /bending modulus, kb). Οι ελαστικές ιδιότητες ενός ισοτροπικού υλικού μπορεί να περιγραφεί από δύο συνδυαζόμενες ελαστικές παραμέτρους (παράμετροι Lame), ενώ στην περίπτωση των ανισοτροπικών υλικών, ο αριθμός των παραμέτρων αυξάνει και για κρυστάλλους φτάσει τις 21 και εξαρτάται από το βαθμό κρυσταλλικής συμμετρίας. Για πολλά χρόνια, οι επιστήμονες έχουν ερευνήσει και μοντελοποιήσει τις μηχανικές ιδιότητες κυττάρων και ιστών. Οι εκτιμώμενες τιμές για τις μηχανικές παραμέτρους των κυττάρων βρίσκονται σε ένα πολύ ευρύ φάσμα. 81,82 Είναι σαφές ότι οι εκτιμώμενες τιμές των μηχανικών παραμέτρων των κυττάρων εξαρτώνται από τις πειραματικές μεθόδους και τα χρησιμοποιούμενα θεωρητικά μοντέλα αλλά από και τον κυτταρικό τύπο, την κατάσταση των κυττάρων και τις πειραματικές συνθήκες. Λόγω της ιεραρχίας των δομών των κυττάρων, οι μηχανικές ιδιότητες θα πρέπει να εξεταστούν χωριστά σε κάθε επίπεδο: μακροσκοπικό (ολόκληρο το κύτταρο), μέσο (κυτταροσκελετός και οργανίδια) και νάνο (μοριακά συμπλέγματα) επίπεδο. Οι μηχανικές ιδιότητες πολλών τύπων κυττάρων όπως κύτταρα γλοίας, αιμοπετάλια, καρδιοκύτταρα, μακροφάγα, ενδοθηλιακά, επιθηλιακά, ινοβλάστες, και οστεοβλάστες έχουν μελετηθεί. Έχει αποδειχθεί ότι οι μηχανικές ιδιότητες παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στις κυτταρικές εξεργασίες και έτσι μπορούν να χρησιμεύσουν ως δείκτης της κυτταρικής λειτουργίας. 86 Οι μηχανικές ιδιότητες των ευκαρυωτικών κυττάρων καθορίζονται κυρίως από τον κυτταροσκελετό ακτίνης. Η ακτίνη μπορεί να σχηματίζει ινίδια διπλής έλικας με περιοδικότητα 3.7 nm. Ένας μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ακτίνη ελέγχουν την αρχιτεκτονική του κυτταροσκελετού. Αυτό το δίκτυο είναι πολύ ενεργό κυτταρικό συστατικό που βρίσκεται κάτω από συνεχή αναδιαμόρφωση και για αυτό το λόγο δεν είναι μόνο υπεύθυνο για το σχήμα του κυττάρου αλλά επίσης συμμετέχει σε λειτουργίες

39 39 όπως η μετανάστευση κυττάρων 87 και η κυτταρική διαίρεση. 88 Μόνο περιορισμένος αριθμός τεχνικών υπάρχει για τη μέτρηση των κυτταρικών μηχανικών ιδιοτήτων. Παραδοσιακά αυτό το ερώτημα προσπάθησε να απαντηθεί είτε με τη βοήθεια των μικρο-πιπετών 89 και των cell poker. 90 Πιο πρόσφατα αρκετές τεχνικές έχουν αναδειχθεί όπως η scanning acoustic microscope, τα optical tweezers, 91,92 τα magnetic tweezers 93,94 και η μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων (Atomic force microscopy, AFM). Η μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων εμφανίζεται ως η πιο κατάλληλη μέθοδος για τον υπολογισμό του μέτρου ελαστικότητας των ανθρώπινων κυττάρων, αφού οι μηχανικές τους ιδιότητες επηρεάζονται κυρίως από στοιχεία του κολλαγόνου σε μίκρο/νάνο επίπεδο.

40 40 Α.3.2: Αρχή λειτουργίας AFM Το είδος αυτό μικροσκοπίας πλησιάζει περισσότερο την αφή παρά την όραση αφού ένα tip ή νανοστυλός προσαρμοσμένο σε μικροπρόβολο σαρώνει το δείγμα που είναι ακινητοποιημένο πάνω σε ακίνητο υπόστρωμα όπως μίκα η χρυσό. Μια δέσμη λέιζερ ανακλάται στον πρόβολο και οι κάθετες κινήσεις του προβόλου διαβάζονται από ένα ευαίσθητο αισθητήρα φωτός. Το μικροσκόπιο ατομικών δυνάμεων συνδυάζει υψηλή ευαισθησία στην εφαρμογή και μέτρηση δυνάμεων, ακρίβεια στην τοποθέτηση του tip σε τρείς διαστάσεις σε σχέση με το δείγμα. Επίσης σημαντική είναι η δυνατότητα λειτουργίας σε υγρό περιβάλλον και έτσι είναι ικανό να παρακολουθήσει τις βιολογικές διεργασίες in situ. Μια εφαρμογή που χρησιμοποιεί όλα αυτά τα χαρακτηριστικά είναι η μελέτη της μηχανικής των κυττάρων και των ιστών. Βέβαια για να προσδιοριστούν οι ελαστικές ιδιότητες των κυττάρων ποσοτικά και με επαναληψιμότητα είναι αναγκαίες οι καμπύλες δυνάμεων ως συνάρτηση της θέσης των κυττάρων. 95 H διαδικασία για την λήψη της τοπογραφίας με το AFM μπορεί να περιγραφεί με τα παρακάτω βήματα: 1. Καθώς η ακίδα σαρώνει το δείγμα, λόγω των ανωμαλιών στην επιφάνεια, ασκούνται διαφορετικές δυνάμεις που αναγκάζουν τον πρόβολο (cantilever) να λυγίζει. 2. Μια δέσμη Laser ανακλάται στο πίσω μέρος του πρόβολου καταλήγοντας σε μια φωτοδίοδο. Οι αποκλίσεις της ακίδας (λόγω της τοπογραφίας) ανιχνεύονται και καταγράφονται υπό μορφή τάσης στην έξοδο της φωτοδιόδου. Η δύναμη μεταξύ ακίδας και δείγματος καθορίζεται από την τάση στη φωτοδίοδο.

41 41 3. Αρχικά προεπιλέγεται μια τάση (setpoint) της οποίας η τιμή μεταβάλλεται εξαιτίας του ανάγλυφου της επιφάνειας κατά την διάρκεια της σάρωσης. Η τοπογραφία της επιφάνειας λαμβάνεται με την απαίτηση η τάση (άρα και η δύναμη μεταξύ δείγματος-ακίδας) να διατηρείται σταθερή. 4. Στη συνέχεια η τάση οδηγείται σε έναν ελεγκτή (Controller), όπου υπάρχει η δυνατότητα μέσω ενός Η/Υ να μεταβληθεί. Ο ελεγκτής επικοινωνεί με τον scanner επιβάλλοντας του να ανέβει ή να κατέβει, ώστε η εν λόγω τάση άρα και δύναμη μεταξύ ακίδας δείγματος να παραμένει σταθερή. 5. Με απλά λόγια o πιεζοκρύσταλος αντιλαμβάνεται, μέσω του κυκλώματος ανάδρασης, την μετατόπιση της δέσμης του Laser στη φωτοδίοδο και μετακινείται ανάλογα κατά z ώστε να επαναφέρει την δέσμη στην αρχική της θέση (Setpoint). Έτσι σταθεροποιείται και η δύναμη ακίδας-δείγματος. 6. Η μετατόπιση του πιεζοκρυστάλλου κατά z στην θέση (x,y), καταγράφεται από Η/Υ και λαμβάνεται η τοπογραφία της επιφάνειας του δείγματος. Ανάλογα με τον τρόπο επαφής ακίδας-δείγματος, η μικροσκοπία ατομικής δύναμης διακρίνεται στην μέθοδο με συνεχή επαφή (Contact Mode) και στην μέθοδο με περιοδική επαφή (Tapping Mode ή semi-contact mode). Η ελαστική απόκριση των κυττάρων στα πειράματα μπορεί να προέλθει από διάφορα τμήματα του κυττάρου. Αφού το tip πλησιάζει από το εξωτερικό περιβάλλον πρώτα θα συναντήσει το γλυκοκάλυκα, την κυτταρική μεμβράνη και κατόπιν τα κυτταρικά οργανίδια και τον κυτταροσκελετό. Για τα ευκαρυωτικά κύτταρα ο γλυκοκάλυκας και η κυτταρική μεμβράνη είναι πολύ μαλακά και μπορούν να αγνοηθούν. Για άλλους τύπους κυττάρων όπως

42 42 φυτικά κύτταρα ή βακτήρια με διαφορετική σύσταση τοιχώματος, το τοίχωμα μπορεί να γίνει πολύ σκληρό και να είναι το κυρίαρχο στοιχείο της κυτταρικής παραμόρφωσης. 96 Με τα ως τώρα δεδομένα το κυρίαρχο συμπέρασμα είναι ότι δεν μπορεί να αποδειχθεί πλήρως ότι οι μηχανικές ιδιότητες οφείλονται αποκλειστικά στην ακτίνη ενώ υπάρχει η πιθανότητα οι μηχανικές ιδιότητες να συσχετίζονται σημαντικά με τη βιοχημική σύσταση.

43 43 Α.3.3: Έρευνες Εμβιομηχανικής και Οφθαλμολογία Ολοένα και πιο συχνή πλέον είναι η εφαρμογή των αρχών της Μηχανικής σε έρευνες σχετικές με οφθαλμικούς ιστούς και κύτταρα. Οι Dias και συνεργάτες, προσπάθησαν να αξιολογήσουν την ελαστικότητα του πρόσθιου και οπίσθιου στρώματος του κερατοειδούς μετά από διασύνδεση κολλαγόνου (collagen cross linking, CXL) χρησιμοποιώντας Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (AFM). Το μέτρο ελαστικότητας (Young modulus) του πρόσθιου στρώματος αυξήθηκε μετά τη θεραπεία με CXL, ενώ για το οπίσθιο στρώμα δεν καταδείχτηκε σημαντική διαφορά στο μέτρο ελαστικότητας μετά τη θεραπεία με CXL. 97 Μια άλλη ομάδα ερευνητών επιχείρησε να καθορίσει το μέτρο ελαστικότητας της πρόσθιας βασικής μεμβράνης (anterior basement membrane) και της μεμβράνης Descemet του ανθρώπινου κερατοειδή με μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM). Οι τιμές που λήφθησαν για την μέτρο ελαστικότητας της πρόσθιας βασικής μεμβράνης ήταν από 2 έως 15 kpa, με μια μέση τιμή 7,5 ± 4,2 kpa. Το μέτρο ελαστικότητας της Descemet μεμβράνη βρέθηκε να είναι ελαφρώς υψηλότερο, με μια μέση τιμή 50 ± 17,8 kpa και ευρος από kpa. Η τοπογραφία της μεμβράνης Descemet έχει δειχθεί ότι είναι παρόμοια με εκείνη της πρόσθιας βασικής μεμβράνης, αλλά με μικρότερο μέγεθος πόρων με αποτέλεσμα μια πιο πυκνή δομή. Αυτή η δομική διαφορά μπορεί να ευθύνεται για τις παρατηρούμενες διαφορές στην ελαστικότητα. Ο προσδιορισμός αυτών των τιμών θα επιτρέψει το σχεδιασμό ενός καλύτερο μοντέλου του κυτταρικού περιβάλλοντος καθώς και θα προσφέρει βοήθεια στο σχεδιασμό και την κατασκευή του τεχνητού κερατοειδή. 98 Από την ίδια ομάδα ερευνητών προήρθε και μια άλλη μελέτη όπου συγκρίθηκε η ακαμψία του γωνιακού δικτυωτού (trabecular meshwork, TM) σε φυσιολογικό και γλαυκωματικό ιστός. Ένα μαθηματικό μοντέλο αναπτύχθηκε για να προβλέψει την επίδραση των αλλαγών στην ακαμψία του

44 44 juxtacanalicular στρώματος του ΤΜ στη δυναμική της ροής μέσω αυτής της περιοχής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ακαμψία του γλαυκωματικού TM είναι σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με εκείνη των κανονικών ΤΜ. Η μοντελοποίηση δείχνει σημαντική μείωση στην εκροή του ΥΥ και μεταβολές στα βιοφυσικά χαρακτηριστικά του ΤΜ μπορεί να συμμετέχουν άμεσα στην εμφάνιση και την εξέλιξη του γλαυκώματος. 99 Παρόμοιες μελέτες αφορούν ακόμη και σε κύτταρα του αμφιβληστροειδούς αλλά και της κεφαλής του οπτικού νεύρου. Οι μηχανικές ιδιότητες του νευρωνικού ιστού καθορίζουν τη λειτουργία τους και την αλληλεπίδραση των κυττάρων. Ο ανθρώπινος αμφιβληστροειδής είναι υπό μηχανική τάση, η οποία μπορεί να προκαλέσει σοβαρά προβλήματα κατά τη διάρκεια μιας χειρουργικής επέμβασης. Επιπλέον, οι αλλαγές στα κύτταρα και την ελαστικότητα των ιστών που λαμβάνουν χώρα εξαιτίας μιας οφθαλμικής νόσου, όπως εκφύλιση της ωχρής κηλίδας, μπορεί να οδηγήσουν σε ρήξη των ιστών και τύφλωση. Η ερευνητική δραστηριότητα στοχεύει στην καλύτερη κατανόηση των μηχανικών ιδιοτήτων του ιστού του αμφιβληστροειδούς και πώς οι τοπικές ετερογένειες θα μπορούσαν να επηρεάσουν ολόκληρη την ελαστικότητα του ιστού. Μαζί με την εφαρμογή των διαφόρων φαρμάκων, η έρευνα θα ανοίξει το δρόμο για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις των παθήσεων των οφθαλμών από τη σκοπιά της επιστήμης των υλικών.

45 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ Β ΜΕΡΟΣ 45

46 46 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.1: IN VITRO ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΜΕΝΩΝ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΙΚΩΝ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΓΙΑ ΑΦΥΔΑΤΩΣΗ ΤΕΧΝΗΤΟΥ ΣΤΡΩΜΑΤΟΣ Β.1.1 Εισαγωγικά στοιχεία Η χειρουργική μεταμόσχευση κερατοειδούς είναι η συμβατική θεραπεία για τη αντιμετώπιση παθήσεων του κερατοειδούς που προκύπτει από δυσλειτουργία του ενδοθηλίου σε καταστάσεις όπως ψευδοφακική bullous κερατοπάθεια (PBK) και δυστροφία του Fuchs. 100,101 Η διαμπερής κερατοπλαστική (penetrating keratoplasty, PKP) ήταν το gold standard για τη θεραπεία αυτών των καταστάσεων μέχρι πρόσφατα, όταν εισήχθησαν τεχνικές τμηματικών μεταμοσχεύσεων όπως οι Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK) & Descemet's membrane endothelial keratoplasty (DMEK) και οι οποίες υιοθετήθηκαν από ένα μεγάλο αριθμό χειρουργών κερατοειδούς. 102,103 Και στις δυο αυτές κατηγορίες επεμβάσεων (διαμπερείς και τμηματικές τεχνικές) υπάρχει προφανής ανάγκη για ανθρώπινους δότες-δωρητές μοσχευμάτων κερατοειδούς. Με τη σημαντική αύξηση του αριθμού των ανθρώπων που έχουν ανάγκη αυτής της επέμβασης, οι ερευνητές έχουν προσπαθήσει να αναπτύξουν εναλλακτικές προσεγγίσεις, όπως η χρήση δομών που προκύπτουν από εμβιομηχανικές διαδικασίες (Bioengineering), προκειμένου να αντιμετωπιστεί η συνεχιζόμενη αύξηση των αναγκών Οι επιστήμονες έχουν καταφέρει να καλλιεργήσουν ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς (HCEC) με τη χρήση ειδικών μέσων και τεχνικών Ο απώτερος στόχος είναι η μεταφορά αυτών των κυττάρων στον πρόσθιο θάλαμο ενός ζωντανού οφθαλμού. Μέχρι στιγμής, οι καλλιεργούμενες HCEC έχουν χρησιμοποιηθεί σε ζωικά μοντέλα. Ασφαλώς θα πρέπει να

47 47 οριστούν σημαντικές πτυχές της in vivo συμπεριφορά τους, ώστε να επιχειρηθεί η εφαρμογή τους σε ανθρώπους. 111 Το ενδιαφέρον για την αναγεννητική (regenerative) Ιατρική, και πιο ειδικά για την Οφθαλμολογία, συνεχώς αυξάνεται. Νέα εργαλεία και τεχνικές, εκτός από ανοσοϊστοχημεία, απαιτούνται για να εξετάσει κανείς την ποιότητα των καλλιεργούμενων κυττάρων. Ο κύριος ρόλος των ενδοθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς (περίπου 3500 κύτταρα/mm 2 σε νεαρούς ενήλικες) είναι η διατήρηση της διαφάνειας του κερατοειδούς. Αυτό επιτυγχάνεται με δύο μηχανισμούς: α) με το σχηματισμό ενός παθητικού φραγμού μεταξύ του κερατοειδούς και των υδατικών συστατικών που β) ενεργώντας ως αντλία (αντλία Να-Κ ΑΤΡάσης) για την απομάκρυνση υγρού από το στρώμα του κερατοειδούς. 112 Η αποιδηματική αυτή ικανότητα του ενδοθηλίου είναι μια ένδειξη της ακεραιότητας του. Αυτή η ιδιότητα αξιολογείται κλινικά μέσω της παχυμετρίας κερατοειδούς. Το κεντρικό πάχος του κερατοειδούς ως επί το πλείστον συσχετίζεται με τον υφιστάμενο αριθμό ενδοθηλιακών κυττάρων, αν και υπάρχουν αναφορές ότι κερατοειδείς με σημαντικά μειωμένο αριθμό ενδοθηλιακών κυττάρων μπορούν επίσης να διατηρούν ικανοποιητικό πάχος και διαφανεια. 113,114 Ο σκοπός της πειραματικής μελέτης ήταν να διερευνηθεί η δυνατότητα των καλλιεργηθέντων ενδοθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς HCECs για απομάκρυνση του ύδατος από μια υδρόφιλη τεχνητή μάζα κολλαγόνου που προσομοιάζει με το κερατοειδικό στρώμα. Η γνώση αυτή θα συμβάλει στην γενικότερη κατανόηση της αναμενόμενης συμπεριφοράς τους in vivo.

48 48 Β.1.2 Πειραματική διάταξη- μέθοδος Πρωτόκολλο κυτταρικής καλλιέργειας Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις συστάσεις της Διακήρυξης του Ελσίνκι. Τμήματα οφθαλμών (scleral rims) από δότες κερατοειδών από την Τράπεζα Κερατοειδούς του πανεπιστημίου του Erlangen στη Νυρεμβέργη της Γερμανίας που χρησιμοποιούνται για μεταμοσχεύσεις PKP χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των πρωτογενών ενδοθηλιακών κυττάρων (HCECs). Για την καλλιέργεια των HCECs, χρησιμοποιήθηκε ένα προηγουμένως περιγραφέν πρωτόκολλο. 115 Εν συντομία, κερατοειδικός ιστός από το σκληροκερατοειδικό όριο (ΣΚΟ) τοποθετήθηκε σε μια πλάκα καλλιέργειας πολυστυρενίου που περιέχει τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM, Invitrogen, USA), με 50 U / ml πενικιλλίνη και 50 μg / ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen ). Η μεμβράνη Descemet (DM) μαζί με το συνημμένο ενδοθήλιο του κερατοειδούς αποκόπηκε από το στρώμα, 1 mm από το γωνιακό δικτυωτό (trabecular meshwork), και τοποθετήθηκε σε μια πλάκα καλλιέργειας πολυστυρενίου που περιέχει 1.2 U / ml δισπάση σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Ο ιστός επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 C, και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν ήπια σε φυσιολογικό ορό. Η δισπάση στη συνέχεια αδρανοποιείται με αιώρηση των κυττάρων σε ένα μέσο που περιέχει ϋμεμ, 50 U / ml πενικιλίνη, και 50 μg / ml στρεπτομυκίνη. Μετά από ήπια φυγοκέντρηση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει DΜΕΜ, 50 U / ml πενικιλλίνη, 50 μg / ml στρεπτομυκίνη, 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, ThermoFisher Scientific, ΝΥ, USA), και 2 ng / ml βασικό αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (Invitrogen ). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μια πλάκα 6-θέσεων στους 37 C σε 5% CO2 και 95% υγροποιημένο αέρα. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε δύο ημέρες. Τα κύτταρα έφθασαν σε τέτοια πυκνότητα ώστε να χαρακτηριστούν confluent (συρρέοντα) σε ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε κατεργασία με θρυψίνη / EDTA.

49 49 Προετοιμασία τεχνητού κολλαγόνου Το κολλαγόνο προετοιμάστηκε σε δοχεία (plates) που περιείχαν 180 μl διαλύματος κολλαγόνου (3 mg τύπου Ι κολλαγόνο σε 10 ml οξικού οξέος 0,1%, Invitrogen ), 30 μl μέσου αναπτύξεως ενδοθηλιακών κυττάρων, 30 μl του Puffer Α (2,2 g NaHCO3 συν 4,77 g HEPES σε 100 ml 0,05N NaOH, Invitrogen ) που είχε θερμανθεί στους 37 C για 5 λεπτά. Ταξινόμηση δειγμάτων Προκειμένου να δημιουργήσουμε ένα μοντέλο του οπίσθιου τμήματος του κερατοειδούς, χρησιμοποιήσαμε τα καλλιεργούμενα κύτταρα, τεχνητές μεμβράνες κολλαγόνου ίππων, (RESORBA Medical GmbH, Νυρεμβέργη, Γερμανία) ως υποκατάστατο της μεμβράνης Descemet, καθώς και τη μάζα τεχνητού κολλαγόνου (που αντιπροσωπεύουν το στρώμα του κερατοειδούς). Οι μεμβράνες κολλαγόνου, VISU-FOIL resorb και VISU- FOIL resorb F (λεπτή και παχύτερη έκδοση), παρασκευάστηκαν με βάση κολλαγόνου ίππων και προταθήκαν στην αντιμετώπιση των έλκων του κερατοειδούς χιτώνα. Η λεπτή μεμβράνη (resorb) περιείχε 2,1 mg κολλαγόνου/cm2 ενώ η παχύτερη (resorb F) περιείχε 2,8 mg κολλαγόνου/cm2. Είχαμε τέσσερα διαφορετικά σετ (ομάδες) των μοντέλων και τέσσερα δείγματα από κάθε σετ: 1) Στο σετ 1, τα ενδοθηλιακά κύτταρα τοποθετήθηκαν απευθείας επάνω σε τεχνητό κολλαγόνο και DMEM. 2) Στο σύνολο 2, τα ενδοθηλιακά κύτταρα τοποθετήθηκαν επάνω σε μια λεπτή μεμβράνη RESORBA, που βρισκόταν με τη σειρά της πάνω από την τεχνητή μάζα κολλαγόνου και DMEM.

50 50 3) Στο σετ 3, τα ενδοθηλιακά κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μεμβράνη πάχους RESORBA, που πάνω από την τεχνητή μάζα κολλαγόνου και DMEM. 4) Στο σετ 4, μόνη η τεχνητή κολλαγόνου τοποθετήθηκε σε DMEM (μάρτυρες). Πριν από την τοποθέτηση των HCECs επί των δειγμάτων, μετρήθηκε το κεντρικό πάχος των σχηματιζόμενων δομών (δηλαδή, η τεχνητή μεμβράνη και η μάζα του κολλαγόνου) χρησιμοποιώντας οπτική τομογραφία συνοχής (SL SCAN-1, Topcon Corporation, Τόκιο, Ιαπωνία ) προσαρμοσμένη σε σχισμοειδή λυχνία. Μετά από επώαση των δομών επί μία νύκτα εντός DMEM, αλλάξαμε το μέσο ανάπτυξης κάθε 12 ώρες για δύο ημέρες για να εξασφαλίσει την επιβίωση των κυττάρων του ενδοθηλίου. Μετά από δύο ημέρες απομακρύναμε το μέσο και μετρήθηκε το πάχος κάθε δείγματος και πάλι χρησιμοποιώντας την ίδια διαδικασία όπως πριν. Περαιτέρω, σταθεροποιήσαμε (fixation) τα δείγματα και τa εξετάσαμε στο μικροσκόπιο. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του Microsoft Excel 2007 για Windows (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) και SPSS για Windows, έκδοση 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Το t-test και η δοκιμή ANOVA χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση μεταξύ των ομάδων. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίσθηκε σε 0,05.

51 51 Β.1.3 Ευρήματα και ποσοτικά αποτελέσματα Εξετάσαμε 4 δείγματα από κάθε ομάδα και υπολογίστηκε η μέση τιμή. Το μέσο πάχος του κολλαγόνου πριν από την τοποθέτηση των κυττάρων και του μέσου ανάπτυξης ήταν χιλιοστά στο σετ 1, χιλιοστά στο σετ 2, χιλιοστά στο σετ 3 και χιλιοστά στο σετ 4. Μετά από δύο ημέρες αλληλεπίδρασης, το μέσο πάχος ήταν 0,881 χιλιοστά στο σετ 1, 1,162 χιλιοστά στο σετ 2, 1,943 χιλιοστά στο σετ 3. Το πάχος που δεν ήταν δυνατό να μετρηθεί στο σετ 4 (ομάδα ελέγχου), όπου το κολλαγόνο είχε απορροφήσει μεγάλες ποσότητες υγρών και οπτική τομογραφία συνοχής ήταν τεχνικά αδύνατο να εκτελεστεί. Η μέση ποσοστιαία μείωση του πάχους ήταν 66% στο σετ 1, 57% στο σετ 2 και το 13% στο σετ 3 (Εικόνα Β.1.α).

52 52 Εικόνα Β.1.α: Σύγκριση του πάχους του συμπλέγματος ( τεχνητού κολλαγόνου και κολλαγονικής μεμβράνης) πριν και μετά από 48ωρη επώαση με τα κύτταρα καλλιεργούνται HCEC. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει ένα σύνολο (κύτταρα χωρίς μεμβράνη, κύτταρα σε λεπτή μεμβράνη και τα κύτταρα σε μεμβράνη πάχους αντίστοιχα). Η πρώτη στήλη παρουσιάζει τις αρχικές μετρήσεις και η δεύτερη στήλη, τις μετρήσεις του πάχους μετά την ημέρα 2. (Tsaousis et al, Cornea 2016) Η διαφορά μεταξύ των σετ 1 και 2 δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Ρ = 0,518), ωστόσο, υπήρξε σημαντική διαφορά μεταξύ σετ 1 και σετ 3 (Ρ <0,001) καθώς και μεταξύ των σετ 2 και 3 (Ρ = 0,015). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται γραφικά στην Εικόνα Β.1.β.

53 53 Εικόνα Β.1.β: Γραφική παρουσίαση των μετρήσεων πάχους για κάθε δείγμα σε όλα τα σετ. Τα αποτελέσματα ήταν σταθερά εκτός από ένα δείγμα του σετ 2, όπου παρατηρήσαμε ότι η λεπτή μεμβράνη δεν είχε τοποθετηθεί σωστά και αυτό οδήγησε σε μείωση του χώρου επαφή των ενδοθηλιακών κυττάρων / κολλαγόνου στρώμα και επομένως στην καθυστέρηση της διαδικασίας αφυδάτωσης. (Tsaousis et al, Cornea 2016) Η μικροσκοπική εξέταση των δειγμάτων με τις τεχνητές μεμβράνες έδειξαν ότι η αποίδηση/αφυδάτωση του τεχνητού κολλαγόνου δεν ήταν βέλτιστη στο μοντέλο με την πιο παχιά μεμβράνη, με μεγάλα διαστήματα μεταξύ των ινών του κολλαγόνου που προκαλούσαν αύξηση του πάχους της δομής. (Εικόνα Β.1.γ) Εικόνα Β.1.γ: Δυο δείγματα χρωσμένα με αιματοξυλίνη και ηωσίνη μετά από 48 ώρες αλληλεπίδραση με καλλιεργούμενα HCECs. (20x) Α δείγμα του σετ 2 (λεπτή μεμβράνη) δείχνει ότι μειώθηκε σημαντικά το πάχος. B. δείγμα του σετ 3 (παχιά μεμβράνη) που δείχνουν αυξημένο πάχος του στρώματος σε σύγκριση με το μοντέλο με τη λεπτή μεμβράνη. (Tsaousis et al, Cornea 2016)

54 54 Β.1.4 Συζήτηση-ερμηνεία ευρημάτων Η λεπτή μεμβράνη επέτρεψε στην ενδοθηλιακή αντλία να λειτουργήσει αποτελεσματικά και να διατηρήσει το πάχος του τεχνητού στρώματος. Αυτό το αποτέλεσμα παρατηρήθηκε επίσης όταν τα καλλιεργηθέντα κύτταρα τοποθετούνται απευθείας επάνω στο τεχνητό κολλαγόνο. Σε αντίθεση, τα τεχνητά μοντέλα οπίσθιου κερατοειδή με την παχιά τεχνητή μεμβράνης δεν βρέθηκαν επαρκώς αφυδατωμένα. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με το κλινικό εύρημα της πάχυνση της μεμβράνης Descemet στη Fuchs ενδοθηλιακή δυστροφία. 116,117 του κερατοειδούς Μια άλλη παρατήρηση είναι ότι ήταν το πάχος της παχιάς μεμβράνης βρέθηκε σημαντικά αυξημένη μετά την έκθεση στον διατροφικό υγρό, πιθανώς εμποδίζοντας περαιτέρω την αφυδάτωση του στρώματος από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Όπως ήταν αναμενόμενο, υπήρξε πλήρης αποδιοργάνωση του στρώματος σε απουσία ενδοθηλιακών κυττάρων. Σε κύτταρα χωρίς την τεχνητή μεμβράνη επιτεύχθηκε αποτελεσματική αφυδάτωση του υποκείμενου στρώματος. Φυσικά, δεν ήταν δυνατόν με το παρόν στατικό μοντέλο να διερευνήσει τη συμπεριφορά των ενδοθηλιακών κυττάρων, όσον αφορά την προσκόλληση τους στο στρώμα και υποθέτοντας ότι η έλλειψη αλληλεπίδρασης των ενδοθηλιακών κυττάρων με βασική μεμβράνη τους θα μπορούσε να τροποποιήσει τους την μακροχρόνια απόδοσή τους. Η παρούσα μελέτη έχει ορισμένους περιορισμούς. Πρώτον, η μέτρηση του πάχους διεξήχθη με ένα μη τυποποιημένο τρόπο, αν και η οπτική τομογραφία συνοχής έχει δείξει επαρκή ακρίβεια στη μέτρηση παρόμοιων ιστούς σε vivo. 118 Δεύτερον, η δύναμη που οδηγεί το υδατοειδές υγρό εντός του κερατοειδούς εξαρτάται άμεσα από την ενδοφθάλμια πίεση 119 αλλά μόνο η υδροστατική πίεση ενεργεί στο μοντέλο μας. Βέβαια αυτή η πίεση ήταν η ίδια σε όλες τις περιπτώσεις και, κατά συνέπεια, υποθέτουμε ότι οι δοκιμαζόμενες δομές θα συμπεριφέρονται παρόμοια όταν υποβάλλονται σε υψηλότερες πιέσεις επίσης. Ένας τρίτος

55 55 περιορισμός ήταν ότι με το μοντέλο μας, στην παρούσα μορφή του, δεν θα μπορούσε να αξιολογηθεί η in vivo σταθερότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων εν απουσία μιας λειτουργικής μεμβράνης Descemet. Σε κάθε περίπτωση, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει τη σημασία της μεμβράνης Descemet στην καλή λειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς. Δείξαμε ότι η μεμβράνη Descemet είναι ένας πολύ σημαντικός παράγοντας, για τη διατήρηση της αφυδατωμένης κατάστασης του στρώματος, η οποία είναι απαραίτητη για τη διαφάνεια του κερατοειδούς. Το πάχος της μεμβράνης Descemet είναι επίσης πολύ σημαντικό για την ορθή λειτουργία της αντλίας του ενδοθηλίου. Περαιτέρω μελέτες θα διευκρινίσουν τον αναμφίβολα σημαντικό ρόλο της μεμβράνης Descemet στη φυσιολογία του κερατοειδή και ανάλογες in vitro μοντέλα θα μπορούσαν να είναι πολύ κατατοπιστικά. Το όραμα της Εμβιομηχανική να δημιουργήσουμε ένα βιώσιμο και λειτουργικό τεχνητό ανθρώπινο κερατοειδή, ο οποίος θα είναι κατάλληλος για μεταμόσχευση, είναι ακόμη πολύ μακριά από την πραγματικότητα. Εν τω μεταξύ, όπως δείχνει η παρούσα μελέτη, διάφορες πτυχές της παθοφυσιολογία του κερατοειδούς μπορούν να διευκρινιστούν με τη βοήθεια των bioengineered ιστών.

56 56 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.2: ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΓΩΝΙΑΚΟΥ ΔΙΚΤΥΩΤΟΥ (TRABECULUM MESHWORK) ΠΑΝΩ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΠΕΡΙΦΑΚΙΟ Β.2.1: Εισαγωγικά στοιχεία Η καλλιέργεια ανθρωπίνων κυττάρων οποιουδήποτε είδους είναι χωρίς αμφισβήτηση μια απαιτητική διαδικασία. Μέσα από την ανάπτυξη μιας ολόκληρης νέας εποχής που περιγράφεται αδρά με τον όρο Biomedical Engineering ή Εμβιομηχανική όπως θα μπορούσε να είναι μια κοντινή ελληνική απόδοση, η καλλιέργεια κυττάρων θα μπορούσε να έχει πρακτικές εφαρμογές, όπως η δημιουργία δομών ιστικού χαρακτήρα που θα μπορούσαν να αντικαταστήσουν, αντίστοιχες δομές του ανθρωπίνου σώματος, «βλαμμένες» από νόσους. Επιπρόσθετα, καλλιεργώντας κύτταρα ποικίλων τύπων συμβάλλουμε στην αύξηση των εργαλείων για πολυάριθμες in vitro μελέτες. Στην Οφθαλμολογία έχουν γίνει πολλές απόπειρες να καλλιεργηθούν διάφοροι τύποι κυττάρων όπως είναι επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς, κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου του αμφιβληστροειδούς, αστροκύτταρα, κερατινοκύτταρα και κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού Ο δυνητικός τελικός στόχος αυτών των προσπαθειών θα ήταν οι απευθείας in vivo εφαρμογές των καλλιεργηθέντων βιο-υλικών για τη θεραπεία διαφόρων οφθαλμικών νοσημάτων. 125 Τέτοια νοσήματα θα μπορούσαν να είναι δυστροφίες του κερατοειδούς και τραύματα, το γλαύκωμα και οι ατροφίες του οπτικού νεύρου. Ειδικότερα για το γλαύκωμα, έχει παρατηρηθεί μείωση του αριθμού των κυττάρων του γωνιακού δικτυωτού με την πάροδο της ηλικίας αλλά και την εμφάνιση γλαυκώματος. 126,127 Άλλοι παράγοντες όπως το μηχανικό

57 57 και οξειδωτικό stress μπορεί επίσης να οδηγήσει σε θάνατο των ΗΤΜ κυττάρων και επομένως σε δυσλειτουργία του γωνιακού δικτυωτού. 128,129 Σε αντίθεση με τις οδηγίες για την καλλιέργεια κυττάρων του πλάσματος, ένα υπόστρωμα θεωρείται απαραίτητο για την υποστήριξη των καλλιεργειών οφθαλμικών κυττάρων ώστε αυτά να αποκτήσουν την τυπική τους μορφολογία. 130 Τα πιο δημοφιλή υποστρώματα μέχρι τώρα ήταν διάφορα είδη συνθετικών μεμβρανών αλλά και αμνιακές μεμβρανες Ειδικότερα για τα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού κατά τις προηγούμενες προσπάθειες δεν έγινε χρήση κανενός είδους υποστρώματος Σκοπός αυτής της μελέτης είναι να καταδείξει την καταλληλότητα του προσθίου ανθρωπίνου περιφακίου ως υπόστρωμα για την καλλιέργεια ανθρωπίνων κυττάρων του γωνιακού δικτυωτού (ΗΤΜ cells) Β.2.2: Πειραματική διάταξη Απομόνωση ανθρωπίνων πρόσθιων περιφακίων Τα πρόσθια περιφάκια (AC, anterior capsules) ετοιμαστήκαν από τους οφθαλμούς δοτών των οποίων οι κερατοειδείς χρησιμοποιηθήκαν για μεταμοσχεύσεις. Ο τρόπος με τον οποίο πάρθηκαν τα μοσχεύματα αλλά και κάθε ιστός περιελάμβανε ασφαλώς κάθε απαραίτητη έγκριση και συναίνεση σύμφωνα με τη διακήρυξη του Ελσίνκι και επίσης από την αρμόδια επιτροπή ηθικής του Friedrich- Alexander πανεπιστημίου στο Erlangen της Βαυαρίας. Χρησιμοποιώντας κατάλληλα χειρουργικά εργαλεία έγιναν τομές στο μεσημβρινό των φακών και τα περιφάκια διαχωρίστηκαν προσεκτικά. Με αυτό τον τρόπο πάρθηκε το μεγαλύτερο μέρος του προσθίου περιφακίου. Τα περιφάκια στη συνέχεια εμβυθίστηκαν σε

58 58 διάλυμα Trypsin/EDTA 0.05/0.02% (PAN-Biotech, Germany) για 10 λεπτά της ώρας και πλύθηκαν δυο φορές με PBS (PAN-Biotech, Germany). Έπειτα, τα περιφάκια εμβαπτίσθηκαν σε αποσταγμένο νερό για 12 ώρες ώστε να αποκολληθούν τα επιθηλιακά κύτταρα του κρυσταλλοειδούς φακού που βρίσκονταν επί της οπίσθιας επιφάνειας του προσθίου τμήματος του ανθρωπίνου περιφακίου. Ακολούθως, τα περιφάκια πλύθηκαν άλλες δυο φορές με PBS και μεταφέρθηκαν σε ειδικά δοχεία για καλλιέργεια κυττάρων από πολυστυρένιο (cell polystyrene culture plates (Nunc, Rochester, USA)). Οπτική μικροσκοπία χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνευτούν τυχόν υπολειπόμενα επιθηλιακά κύτταρα. Πρωτόκολλο κυτταρικής καλλιέργειας Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν για τις καλλιέργειες προήρθαν από τέσσερεις δότες με μέση ηλικία 65±9 χρόνων (λήφθησαν 12±14 ώρες post-mortem) της τράπεζας κερατοειδούς του Erlangen. Τα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού αναπτύχτηκαν και ταξινομήθηκαν όπως έχει προταθεί από παλαιότερες εργασίες. 135,136 Τα κύτταρα που προήρθαν από το ηθμοειδές (cribriform) τμήμα του δικτυωτού και το εξωτερικό τμήμα του κερατοειδοσκληρικού (corneoscleral) δικτυωτού ονομάστηκαν ηθμοειδή κύτταρα (cribriform), ενώ αυτά που προήρθαν από το εσωτερικό τμήμα του κερατοειδοσκληρικού δικτυωτού και το ραγοειδιτικό τμήμα του δικτυωτού ονομάστηκαν κερατοειδοσκληρικά. Τα συρρέοντα (confluent) ΗΤΜ κύτταρα διακρίθηκαν από τα άλλα όπως αυτά του σκληραίου πτερνιστήρα (scleral spur) αλλά και αυτά του κυκλικού μυός (ciliary muscle) με βάση τη μορφολογία τους αλλά και ανοσοιστοχημικες χρώσεις (staining). Συρρέοντα κύτταρα τρίτου passage αφού έγιναν confluent μετά από 7 ημέρες επεξεργαστήκαν με αντισώματα έναντι της ακτίνης λείων μυϊκών κυττάρων (mouse, clone No. 1A4 Ig G2a anti-bovine; Dakopatts, Hamburg, Germany) σε διάλυση 1:150, δεσμίνη (mouse, clone D33 anti-human IGG1; Dakopatts) σε διάλυση 1:10, και B-κρυσταλλίνη

59 59 (rabbit) σε διάλυση 1:100. Για τη χρώση με τα αντισώματα εναντίον -sm actin and desmin, τα κύτταρα μονιμοποιηθήκαν με πάγο και κρύα μεθανόλη για τρία λεπτά. Για την B- crystallin η μονιμοποίηση έγινε με 4% παραφορμαλδεύδη για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από δυο πλύσεις με PBS που περιείχε 0.1% Triton X-100. Όλα τα αντισώματα διατηρήθηκαν από πριν στους 4 C. Μετα την πλύση με το PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με fluorescein-labeled ανοσοσφαιρίνες (swine anti-mouse and swine anti-rabbit immunoglobulins, Dakopatts) σε διάλυση 1:20. Τα slides ελεγχθήκαν και φωτογραφήθηκαν με τη βοήθεια ενός μικροσκοπίου Leitz Aristoplan (Leitz, Wetzlar, Germany). Στο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης τα ηθμοειδή κύτταρα δεν είχαν μεγάλες διαφορές από τα κερατοειδοσκληρικά, όπως έχει άλλωστε μελετηθεί και παλαιότερα. Τα ηθμοειδή (cribriform) κύτταρα προσέλαβαν έντονα την abcrystallin, ενώ τα περισσότερα από τα κερατοειδοσκληρικά δεν χρώστηκαν. Αυτές οι διαφορές παρατηρήθηκαν στα κύτταρα που προέκυψαν από τις καλλιέργειες και των τεσσάρων δοτών. Καμιά από τις καλλιέργειες δεν ήταν θετική για χρώση δεσμίνης ενώ μόνο λίγα κύτταρα και των δυο κατηγοριών εμφάνισαν συγγένεια με την a-sm ακτίνη. Μετά τον χαρακτηρισμό τα ηθμοειδή και κερατοειδοσκληρικά ΗΤΜ κύτταρα τρίτου passage επωάστηκαν για 24 ώρες σε serum-free Ham s F-10 μέσο καλλιέργειας ενώ το μέσο ανανεωνόταν καθημερινά έως ότου τα κύτταρα να έφταναν να χαρακτηρίζονται confluent (συρρέοντα). Δύο ομάδες από καλλιέργειες κυττάρων (για κάθε οφθαλμό δότου) γωνιακού δικτυωτού σχηματίστηκαν: η ομάδα 1 αποτελείτο από 10 δείγματα κυττάρων που τοποθετήθηκαν πάνω στα περιφάκια ενώ η ομάδα 2 αποτελούνταν από 10 αντίστοιχα δείγματα που αναπτύχθηκαν πάνω σε 10 δοχεία καλλιεργειών από πολυστυρένιο (Nunc).

60 60 Αξιολόγηση κυτταροκαλλιεργειών Η βιωσιμότητα (viability) και η μορφολογία των κυττάρων παρακολουθήθηκαν κατά τις ημέρες 1,3,5,και 7 μη τη βοηθεια ενός λογισμικού ανάλυσης εικόνας (Cell^f; Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Germany). Η μικροσκοπική εξέταση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια ενός ανεστραμμένου (inverted) μικροσκοπίου (Diavert, Leitz Wetzlar, Leica Germany). Οι εικόνες λήφθησαν με τη χρήση ψηφιακής κάμερας (Color View, Olympus Soft Imaging System). Δοκιμασία βιωσιμότητας ζώντων-νεκρών κυττάρων (Live dead cell viability assay) Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με βάση μια χημική δοκιμασία διχρωματικού (assay) φθορισμού μη μεμβρανο-διαπερατου propidium iodide (Sigma Aldrich, Munich,Germany) και μεμβρανο-διαπερατού Hoechst (Intergen; Purchase, NY, USA).Η δοκιμασία είχε σαν αποτέλεσμα οι πυρήνες των μη ζώντων κυττάρων να λαμβάνουν κόκκινο χρώμα ενώ τα κύτταρα των ζώντων κυττάρων να χρωματίζονται μπλε. Για την αξιολόγηση λοιπόν της βιωσιμότητας των κυττάρων, αυτά πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 2.0 µg/ml propidium iodide και 1.0 µg/ml Hoechst για 20 min στους 37 C. Έπειτα, τα κύτταρα απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο Olympus U-RFL-T, BX51, Germany). Οι επισημασμένοι πυρήνες μετρήθηκαν με βάση μικροφωτογραφίες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως το ποσοστό των ζώντων προς τα νεκρά κύτταρα. Ανοσοιστοχημεία Με την ανοσοιστοχημεία μελετήθηκαν οι: Zonula occludens-1 (ZO-1), μια tightjunction-σχετιζόμενη πρωτεΐνη, η βιμεντίνη, η σχετιζόμενη με τον κυτταροσκελετό ιστική

61 61 τρανσγλουταμινάση (ttgase) and η Na + /K + -adenosine τριφωσφατάση (Na + /K + -ATPase, μια πρωτεΐνη που συνδέεται με τη λειτουργία των κυττάρων ως αντλίες όντων. Το σύμπλεγμα καλλιεργημένων κυττάρων προσθίου περιφακίου μονιμοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου με 4% φορμαλδεΰδη και PBS. Μετά από αρκετές πλύσεις με PBS, τα δείγματα έγιναν διαπερατά με 5λεπτη επώαση σε PBS που περιείχε 0.1% Triton X-100, στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν για 60 λεπτά με 1% bovine ορό αλβουμίνης για να αποκλειστούν μη ειδικές συνδέσεις (non-specific binding). Ακολούθως έγιναν τρεις πλύσεις με PBS και δίωρη επώαση σε θερμοκρασία δωματίου με μονοκλωνικα αντισώματα mouse anti-zo-1 σε διάλυση 1:200 (Invitrogen, Carlsbad, CA) και 1:500-diluted mouse anti- Na + /K + -ATPase σε διάλυση 1:500 (Abcam). Το συμπλεγμα HTM-AC έπειτα επωάστηκε για μια ώρα με ένα αντίσωμα goat anti-mouse IgG (FAB Specific) σε διάλυση 1:400 (Invitrogen) και πλύθηκε για άλλες τρεις φορές. Για την ιστική τρανσγλουταμινάση το πρωτεύον αντίσωμα ήταν ένα rabbit anti-ttgase πολυκλωνικό αντίσωμα σε διάλυση 1:200 (Abcam, Munich, Germany) και το δευτερεύον αντίσωμα ηταν ένα FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody σε διάλυση 1:400 (Sigma, Munich,Germany). Τέλος για τη βιμεντίνη το πρωτεύον αντίσωμα ήταν το goat anti-vimentin αντίσωμα (Sigma) σε διάλυση 1:100 και το δευτερεύον αντίσωμα ήταν το FITC-conjugated rabbit anti-goat IgG αντίσωμα (Sigma) σε διάλυση 1:300. Αρνητικά δείγματα έλεγχου εξασφαλίστηκαν με τη χρήση του ίδιου blocking buffer χωρίς το πρωτεύον αντίσωμα. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με ένα DAPI stock διάλυμα 10 mg/ml για 10 λεπτά και έπειτα πλύθηκαν τρεις φορές. Έπειτα τα δείγματα τοποθετήθηκαν πάνω σε γυάλινα slides (DAKO) και αυτά εξετάστηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus U-RFL-T, BX51, Germany).

62 62 Β.2.3: Αποτελέσματα μελέτης μορφολογίας και βιωσιμότητας κυττάρων Μορφολογία κυττάρων Τα trabeculae επικαλύπτονται in situ από μια μονή στιβάδα πεπλατυσμένων κυττάρων γωνιακού δικτυωτού που βρίσκονται πάνω σε μια βασική lamina. 137,138 Τα καλλιεργημένα TM κύτταρα παρουσίασαν το χαρακτηριστικό μονόστιβο pattern, στρογγυλών, μερικώς επιμηκυμένων με όρια που αλληλεπικαλυπτονται. 139,140 (Εικόνα Β.2.α) Εικόνα Β.2.α: εικόνες οπτικό μικροσκόπιο που δείχνουν ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα γωνιακού δικτυωτού που αναπτύσσονται ανάπτυξης στην πρόσθια κάψα κατά την ημέρα 1 (Α), ημέρα 3 (Β), την ημέρα 5 (C) και την ημέρα 7 (D). Διατηρήθηκε η χαρακτηριστική διάταξη της μονοστιβάδας, με στρογγυλό, μερικώς επίμηκες σχήμα στη μορφολογία των κυττάρων, ενώ το πρόσθιο περιφάκιο καλύφθηκε με κύτταρα την ημέρα 7 (Μεγέθυνση χ 100) (Kopsachilis, Tsaousis et al, Cell Tissue Bank 2013) Η βιωσιμότητα βρέθηκε να είναι πάνω από 95% σε όλες τις περιπτώσεις. Ανοσοιστοχημεία: Η μελέτη μέσω της ανοσοιστοχημείας της ZO-1, μιας πρωτεΐνης που σχετίζεται με tight junction, πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το κατά πόσον τα κύτταρα του συμπλέγματος HTM-AC σχηματίζουν tight junctions που είναι υπεύθυνες για τη σταθεροποίηση της μονόστιβης δομής. Η ZO-1 βρέθηκε στα όρια των κυττάρων του HTM- AC συμπλέγματος, αποδεικνύοντας το σχηματισμό εστιακών tight junctional complexes. Na + /K + -ATPase βρέθηκε επίσης στα βασεοπλευρικά τμήματα των HTM s. Η ιστικη τρανσγλουταμινάση που λαμβάνει μέρος στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, προσκόλληση κυττάρων και αλληλεπίδραση μεταξύ κυττάρων και εξωκυττάριας ουσίας

63 63 επίσης ανιχνεύτηκε. Επιπρόσθετα, η βιμεντίνη, μέλος της ομάδας των πρωτεϊνών των ενδιάμεσων ινιδίων (intermediate filament group), δηλαδή απαραίτητο δομικό στοιχείο των κυττάρων του γωνιακού δικτυωτού, ανιχνεύτηκε σε πλευρικά σημεία των κυτταρικών μεμβρανών. (Εικόνα Β.2.β) Εικόνα Β.2.β: Ανοσοιστοχημικές χρώσεις έδειξαν την έκφραση πρωτεΐνων των κυττάρων του γωνιακού δικτυωτού που σχετίζονται με τη λειτουργία τους. Από τα κύτταρα εκφράστηκαν η ΖΟ-1 (Α) η Na / K-ΑΤΡάση που συνδέεται με αντλία ιόντων (Β) η βιμεντίνη που συνδέεται με τον κυτταροσκελετό (C) και τρανσγλουταμινάση ιστού (D) (πράσινο). Οι πυρήνες χρωματίζονται με DAPI (μπλε). (Kopsachilis, Tsaousis et al, Cell Tissue Bank 2013)

64 64 Β.2.4: Συμπεράσματα Τα καλλιεργηθέντα TM κύτταρα παρουσιάζουν πολλές κοινές λειτουργίες με τα HTM κύτταρα in situ 141 και επομένως τα καλλιεργηθέντα αυτά κύτταρα cultured HTM cells θα μπορούσαν να αποτελέσουν κατάλληλο υλικό για την διερεύνηση πολλών βιολογικών ιδιοτήτων των κυττάρων του γωνιακού δικτυωτού όπως επίσης και για την εκτέλεση πειραμάτων σχετικά με την τοξικότητα διαφόρων παραγόντων η την αλληλεπίδραση των ΗΤΜ κυττάρων με το περιβάλλον τους. Εφόσον παρατηρείται μείωση του αριθμού των κυττάρων σε καταστάσεις όπως το γλαύκωμα, ένας θεραπευτικός στίχος θα μπορούσε να είναι η εκλεκτική διευκόλυνση της ανάπτυξης αυτών των κυττάρων vivo. Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να αναφερθεί ότι όπως έχει αποδεικνύεται από την επανεποίκιση σημείων που έχουν υποστεί ακτινοβόληση με θερμικό λέιζερ (laser trabeculoplasty, LTP) με νέα μεταναστεύοντα ΗΤΜ κύτταρα, αυτά διατηρούν τη δυνατότητα για in vivo πολλαπλασιασμό. 142 Το γωνιακό δικτυωτό (trabeculum) είναι μια πολύπλοκη δομή που εξαρτάται από την δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ της εξωκυτταριας ουσίας, της βασικής μεμβράνης των κυττάρων του γωνιακού δικτυωτού αλλά και των ίδιων των κυττάρων. Έτσι γίνεται κατανοητό ότι αποτυγχάνουμε να προσομοιάσουμε τις in situ συνθήκες καλύτερα με το σύμπλεγμα περιφακίου- καλλιεργημένων κυττάρων από ότι με μια απλή καλλιέργεια ΗΤΜ κυττάρων σε ένα απλό συνθετικό δοχείο. Όσο για την επιλογή του προσθίου περιφακίου ως υποστρώματος για την καλλιέργεια, ρόλο έπαιξε η εμπειρία των προηγούμενων χρόνων, όπου το περιφάκιο χρησιμοποιήθηκε ως φορέας (carrier) για την ex vivo καλλιέργεια και ανάπτυξη άλλων τύπων οφθαλμικών κυττάρων όπως επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα κερατοειδούς. 143,144 Η αυξανόμενη χρήση του προσθίου περιφακίου για πειράματα αυτού του τύπου ενισχύεται

65 65 από τις εξαιρετικές οπτικές και μηχανικός ιδιότητες του. Κυρίως αποτελείται από κολλαγόνο τύπου IV και θειικές γλυκοζαμινογλυκάνες. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν για πρώτη φορά ότι το πρόσθιο περιφάκιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό κυττάρων του γωνιακού δικτυωτού. Το σύμπλεγμα HTM-AC εμφανίζει μορφολογία παρόμοιε με αυτή που διαπιστώνεται in situ Ανοσοιστοχημική μελέτη των tissue transglutaminase, ZO-1, Na + /K + -ATPase, και βιμεντίνης επιβεβαίωσε την κατάλληλη θέση αυτών των πρωτεϊνών και την υπόθεση ότι αυτά τα ισοδύναμα ιστών που έχουν προκύψει από εμβιομηχανικές διεργασίες έχουν επαρκή αριθμό κυττάρων που διατηρούν τη λειτουργικότητά τους. Αυτός ο πρωτοποριακός bioengineered ιστός θα μπορούσε, μετά από αρκετή έρευνα βεβαίως, να αποτελέσει μια εναλλακτική επιλογή για την ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών για την αντιμετώπιση του γλαυκώματος.

66 66 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.3: ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΜΠΛΕ ΤΟΥ ΤΡΥΠΑΝΙΟΥ (TRYPAN BLUE) ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΘΕΝΤΑ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΓΩΝΙΑΚΟΥ ΔΙΚΤΥΩΤΟΥ. Β.3.1: Εισαγωγικά στοιχεία Το μπλε του τρυπανίου (Trypan blue, TB) είναι μια ανιονική υδρόφιλη χρωστική που ανήκει στην ομάδα των azo χρωστικών dyes. Ο χημικός τύπος της ένωσης είναι C 34 H 24 N 6 Na 4 O 14 S 4 και το μοριακό βάρος 960 Daltons. 145 Είναι εμπορικά διαθέσιμο ως Vision Blue για την επέμβαση καταρράκτη (0.06% συγκέντρωση, DORC International Zuidland, The Netherlands) όπως επίσης και ως Membrane Blue για vitreoretinal χειρουργική (0.15% συγκέντρωση, DORC International). Κατά την διάρκεια των τελευταίων ετών το ΤΒ έχει χρησιμοποιηθεί σε αρκετούς τομείς της Οφθαλμολογίας. Έχει χρήση σε τράπεζες οφθαλμών όπου χρησιμεύει για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας κερατοειδικών ενδοθηλιακών κυττάρων εξαιτίας της ικανότητάς του να χρωματίζει κατεστραμμένα η νεκρά ενδοθηλιακά κύτταρα. 146 Σε επεμβάσεις κερατοπλαστικής έχει προταθεί η χρήση του TB για την αποφυγή της διάτρησης της δεσκεμετείου μεμβράνης (Descemet membrane, DM) κατά την διαδικασία διαχωρισμού της από το στρώμα (τμηματική κερατοπλαστική, lamellar keratoplasty) 147 όπως και στη χρώση της DM του δότου αλλά και των κερατοειδικών ιστών του δέκτη (διαμπερής κερατοπλαστική, penetrating keratoplasty). 148 Πάντως, η πιο διαδεδομένη εφαρμογή του TB αφορά στην χρώση του προσθίου περιφακίου (anterior lens capsule, ALC) που διευκολύνει την διαδικασία της συνεχούς καψουλόρηξης (continuous curvilinear capsulorhexis, CCC) κατά τη διάρκεια επεμβάσεων καταρράκτη όπου η ρόδινη ανταύγεια του αμφιβληστροειδούς δεν είναι επαρκής. 149,150 Ενώ ορισμένες αναφορές σχετικά με την επίδραση του ΤΒ στις μηχανικές ιδιότητες του προσθίου περιφακίου είναι αντικρουόμενες, τα αποτελέσματα

67 67 από την κλινική εφαρμογή του είναι τουλάχιστον ενθαρρυντικά Με τη χρήση του ΤΒ σε συγκέντρωση 0.06%. βελτιώνεται η δυνατότητα του χειρούργου καταρράκτη να καταστήσει το πρόσθιο περιφάκιο ορατό. 159 Σε σύντομο διάστημα μετά την έναρξη της χρήσης του στις επεμβάσεις καταρράκτη, το ΤΒ προτάθηκε επίσης να χρησιμοποιηθεί και σε επεμβάσεις υαλοειδούς-αμφιβληστροειδούς 160 για την καλύτερη αναδειξη (visualisation) της έσω αφοριστικής μεμβράνης 161 και κυρίως των επι-αμφιβληστροειδικών μεμβρανών (ERMs) χάρη στην συγγένεια (affinity) του ΤΒ με τα νεκρά κύτταρα γλοίας των μεμβρανών αυτων. 162,163 Η τοξική επίδραση του ΤΒ στα κερατοειδικά αλλά και τα αμφιβληστροειδικά κύτταρα έχει μελετηθεί επαρκώς. Πειράματα σε ζωικά ή in vitro μοντέλα έχουν δειξει ότι το ΤΒ δεν επιδεικνύει τοξικότητα σε ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς Οι Nanavaty et al. Ισχυρίστηκαν ότι το ΤΒ έχει τοξική δράση σε επιθηλιακά κύτταρα του κρυσταλλοειδούς φακού 167 (lens epithelial cells, LECs), ενώ αντίθετα οι Melendez et al. δεν διαπίστωσαν κάτι αντίστοιχο στα LECs. 168 Όσον αφορά στα κύτταρα του οπισθίου ημιμορίου, ανάλογες μελέτες δεν κατέδειξαν κάποιου είδους τοξική δράση του ΤΒ (σε συγκέντρωση ως και 0.2%) σε κύτταρα του μελάγχρου επιθηλίου (RPE) ή στα κύτταρα του Muller Συμπερασματικά, ενώ αρκετές μελέτες έχουν εξετάσει την τοξικότητα του ΤΒ για τα ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς αλλά και τα κύτταρα του αμφιβληστροειδούς δεν υπάρχουν αντίστοιχες μελέτες σχετικά με την τοξικότητα του ΤΒ στα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού (ΗΤΜ cells) παρά το γεγονός ότι αυτά τα κύτταρα επίσης εκτίθενται σε αυτόν τον παράγοντα κατά τη χρήση του στις ενδοβόλβιες οφθαλμικές επεμβάσεις. Επομένως, ο στόχος της μελέτης αυτής ήταν να αξιολογηθεί η επίδραση του ΤΒ σε καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού.

68 68 Β.3.2: Πειραματική διάταξη και μεθοδολογία Πρωτόκολλο κυτταρικής καλλιέργειας Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν για τις καλλιέργειες προήρθαν από τέσσερεις δότες χωρίς κάποιο ιστορικό σημαντικής οφθαλμικής νόσου με μέση ηλικία 63±7 χρόνων (λήφθησαν 12±18 ώρες post-mortem) της τράπεζας κερατοειδούς του Erlangen. Τα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού αναπτύχτηκαν και ταξινομήθηκαν όπως έχει προταθεί από παλαιότερες εργασίες. 172,173 Τα κύτταρα που προήρθαν από το ηθμοειδές (cribriform) τμήμα του δικτυωτού και το εξωτερικό τμήμα του κερατοειδοσκληρικού (corneoscleral) δικτυωτού ονομάστηκαν ηθμοειδή κύτταρα (cribriform) ενώ αυτά που προήρθαν από το εσωτερικό τμήμα του κερατοειδοσκληρικού δικτυωτού και το ραγοειδιτικό τμήμα του δικτυωτού ονομάστηκαν κερατοειδοσκληρικά. Τα συρρέοντα (confluent) ΗΤΜ κύτταρα διακρίθηκαν από τα άλλα όπως αυτά του σκληραιου πτερνιστήρα (scleral spur) αλλά και αυτά του κυκλικού μυός (ciliary muscle) με βάση τη μορφολογία τους αλλά και ανοσοιστοχημικες χρώσεις (staining). Συρρέοντα κύτταρα τρίτου passage αφού έγιναν confluent μετά από 7 ημέρες επεξεργαστήκαν με αντισώματα έναντι της ακτίνης λείων μυϊκών κυττάρων (mouse, clone No. 1A4 Ig G2a anti-bovine; Dakopatts, Hamburg, Germany) σε διάλυση 1:150, δεσμίνη (mouse, clone D33 anti-human IGG1; Dakopatts) σε διάλυση 1:10, και B-κρυσταλλίνη (rabbit) σε διάλυση 1:100. Για τη χρώση με τα αντισώματα εναντίον -sm actin and desmin, τα κύτταρα μονιμοποιηθήκαν με πάγο και κρύα μεθανόλη για τρία λεπτά. Για την B- crystallin η μονιμοποίηση έγινε με 4% παραφορμαλδεύδη για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από δυο πλύσεις με PBS που περιείχε 0.1% Triton X-100. Όλα τα αντισώματα διατηρηθηκαν από πριν στους 4 C. Μετα την πλύση με το PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με fluorescein-labeled ανοσοσφαιρίνες (swine anti-mouse and swine anti-rabbit immunoglobulins, Dakopatts) σε

69 69 διάλυση 1:20. Τα slides ελεγχθήκαν και φωτογραφήθηκαν με τη βοηθεια ενός Leitz Aristoplan μικροσκοπίου (Leitz, Wetzlar, Germany). Στο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης τα ηθμοειδή κύτταρα δεν είχαν μεγάλες διαφορές από τα κερατοειδοσκληρικά, όπως έχει άλλωστε μελετηθεί και παλαιότερα. Τα ηθμοειδή (cribriform) κύτταρα προσέλαβαν έντονα την ab-crystallin, ενώ τα περισσότερα από τα κερατοειδοσκληρικα δεν χρωστηκαν (Εικόνα Β.2.α). Εικόνα Β.3.α: Χρώση ανοσοφθορισμού για αβ-κρυσταλλίνη σε καλλιέργειες μονοστιβάδας κυττάρων ηθμοειδούς μοίρας γωνιακού δικτυωτού (Α) και του κερατοειδοσκληρικού γωνιακού δικτυωτού (Β) (θηλυκός δότης, 65 ετών). (Α) Τα κύτταρα της ηθμοειδούς μοίρας γωνιακού δικτυωτού παρουσίασαν αξιοσημείωτη συγγένεια με την αβ-κρυστάλλινη (έντονη χρώση). (Β) Οι μονοστοιβάδες των corneoscleral κύτταρων του γωνιακού δικτυωτού δεν επέδειξαν μεγάλη συγγένεια με την αβκρυστάλλινη. (Tsaousis et al, Clin Experiment Ophthalmol 2013) Αυτές οι διαφορές παρατηρήθηκαν στα κύτταρα που προέκυψαν από τις καλλιέργειες και των τεσσάρων δοτών. Καμιά από τις καλλιέργειες δεν ήταν θετική για χρώση δεσμίνης ενώ μόνο λίγα κύτταρα και των δυο κατηγοριών εμφάνισαν συγγένεια με την a-sm ακτίνη. Μετά τον χαρακτηρισμό τα ηθμοειδή και κερατοειδοσκληρικά ΗΤΜ κύτταρα τρίτου passage επωάστηκαν για 24 ώρες σε serum-free Ham s F-10 μέσο καλλιέργειας (Gibco-Life Science Technology, Karlsruhe, Germany). ενώ το μέσο ανανεωνόταν καθημερινά έως ότου τα κύτταρα να έφταναν confluency (το χαρακτηρισμό τους δηλαδή ως συρρέοντα).

70 70 Ο τρόπος με τον οποίο εξασφαλίστηκαν τα απαραίτητα για τη μελέτη βιολογικά δείγματα περιελάμβανε ασφαλώς κάθε απαραίτητη έγκριση και συναίνεση σε απόλυτη συμφωνία με τη διακήρυξη του Ελσίνκι και επίσης από την αρμόδια επιτροπή ηθικής του Friedrich- Alexander πανεπιστημίου στο Erlangen της Βαυαρίας. Έκθεση στο TB Τα HTM κύτταρα μεταφερθήκαν με κατάλληλες πιπέτες (pipetted) σε γυάλινα δοχεία (2-well glass chamber slides, System ; Nunc, Rochester, USA) σε συγκεντρώσεις 5 x 10 3 κύτταρα/δοχείο 24 ώρες πριν την έκθεση. Η χρονοεξαρτώμενη τοξικότητα εξετάστηκε με βάση συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα που αντιστοιχούν στην χρήση του ΤΒ σε επεμβάσεις προσθίου ημιμορίου. Κύτταρα που τοποθετηθήκαν σε ίδια δοχεία εξετάστηκαν με μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης και τεστ βιωσιμότητας (viability assays) πριν την έκθεση τους σε ΤΒ χρησιμεύοντας έτσι ως μάρτυρες ελέγχου. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ΤΒ στους 37 C για 5, 30, 60 δευτερόλεπτα και 5, 15, 30 και 60 λεπτά της ώρας χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο σκεύασμα ΤΒ (Vision Blue, 0.06%). Επιλογή των συγκεκριμένων χρόνων έγινε με βάση ένα άτυπο ερωτηματολόγιο σε χειρουργούς καταρράκτη Ελλάδος και Γερμανίας όπου η παρουσία του ΤΒ στον πρόβιο θάλαμο προσδιορίστηκε από μερικά δευτερόλεπτα μέχρι περίπου ένα λεπτό. Μετά την έκθεση στο ΤΒ τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές για την πλήρη απομάκρυνση του ΤΒ. Όλα τα πειράματα επαναλήφτηκαν τρεις φορές. Δοκιμασία βιωσιμότητας ζώντων-νεκρών κυττάρων (Live dead cell viability assay) Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με βάση μια χημική δοκιμασία διχρωματικού (assay) φθορισμού μη μεμβρανο-διαπερατου propidium iodide (Sigma Aldrich, Munich,Germany) και μεμβρανο-διαπερατού Hoechst (Intergen; Purchase, NY, USA).Η δοκιμασία είχε σαν αποτέλεσμα οι πυρήνες των μη ζώντων κυττάρων να λαμβάνουν κόκκινο χρώμα ενώ τα κύτταρα των ζώντων κυττάρων να χρωματίζονται μπλε. Για την

71 71 αξιολόγηση λοιπόν της βιωσιμότητας των κυττάρων, αυτά πλύθηκαν με phosphate-buffered saline (PBS) και επωάστηκαν με 2.0 µg/ml propidium iodide και 1.0 µg/ml Hoechst για 20 min στους 37 C. Έπειτα, τα κύτταρα απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο Olympus U- RFL-T, BX51, Germany). Οι επισημασμένοι πυρήνες μετρήθηκαν με βάση μικροφωτογραφίες (σε τέσσερις διαφορετικές περιοχές κάθε δείγματος). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως το ποσοστό των ζώντων κυττάρων (μέση τιμή από τις τέσσερις μετρήσεις και έτσι μετρήθηκε η συνολική βιωσιμότητα (μέση τιμή ± SD). Τα αποτελέσματα εκφραστήκαν ως μέση τιμή ± SD. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του λογισμικού SPSS for Windows (SPSS 16.0, Illinois, US). Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο 0.05%.

72 72 Β.3.3: Ευρήματα πειράματος. Μορφολογία και βιωσιμότητα Εξέταση της μορφολογίας των κυττάρων Παρατηρώντας τις φωτογραφίες των κυττάρων που λήφθησαν μετά την έκθεση τους στο ΤΒ έγινε σαφές ότι μέχρι τα 60 δευτερόλεπτο τα κύτταρα δεν παρουσίαση μεταβολές στη μορφολογία τους. Αντίθετα, για τα κύτταρα που εκτέθηκαν στο ΤΒ για 5-60 λεπτά της ώρας παρατηρήθηκε αποδιοργάνωση της κυτταρικές τους μορφολογικής δομής ενώ επίσης παρατηρήθηκε συρρίκνωση των κυττάρων σε βαθμό ανάλογο του χρόνου έκθεσης τους. (Εικόνα Β.3.β) Εικόνα Β.3.β: Μικροφωτογραφίες αντίθεσης φάσης που δείχνουν τα ανθρώπινα κύτταρα γωνιακού δικτυωτού μετά την έκθεση για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (από πάνω αριστερά προς τα πάνω δεξιά: μηδέν δευτερόλεπτα ( ομάδα έλεγχος), 5 δευτερόλεπτα, 30 δευτερόλεπτα, 60 δευτερόλεπτα και από κάτω αριστερά προς τα κάτω δεξιά:. 5 λεπτά 15 λεπτά, 30 λεπτά και 60 λεπτά) σε Trypan Blue και συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται συνήθως για τη χειρουργική επέμβαση καταρράκτη. Εμφανείς μορφολογικές διαφορές εμφανίζονται σε καλλιέργειες που εκτίθενται σε ΤΒ για 5 λεπτά (μεγέθυνση, x100). (Tsaousis et al, Clin Experiment Ophthalmol 2013) Αποτελέσματα βιωσιμότητας Μέτα από έκθεση σε ΤΒ για 5, 30 και 60 δευτερόλεπτα η μέση βιωσιμότητα των ΗΤΜ κυττάρων ήταν αρκετή υψηλή: 96.0%±3.6%, 94.8%±3.5% και 92.5%±4.4% αντίστοιχα. Δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων. Ανιχνεύσιμη τοξική

73 73 επίδραση επισημάνθηκε στα κύτταρα που εκτέθηκαν σε ΤΒ για 5 λεπτά με τη βιωσιμότητα να πέφτει στο 85.0%±3.7%, ενώ περαιτέρω έκθεση για 15, 30 και 60 λεπτά είχε σαν αποτέλεσμα ακόμη χειρότερη βιωσιμότητα για τα κύτταρα: 77.0%±6.7 %, 70.8%±5.9% και 68.3±8.7% αντίστοιχα. (Εικόνα Β.3.γ) Εικόνα Β.3.γ: Η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με χρώση όλων των πυρήνων με Hoechst και των νεκρών κύτταρων με ιωδιούχο προπίδιο. (Α) Αντιπροσωπευτική μικροφωτογραφία φθορισμού της Hoechst με χρωματισμένα ανθρώπινα καλλιεργημένα κύτταρα γωνιακου δικτυωτού μετά από έκθεση σε κυανούν του τρυπανίου για 5 δευτερόλεπτα. (Β) μη βιώσιμα κύτταρα στο αντίστοιχο πεδίο. Η βιωσιμότητα ήταν ανώτερη του 95%. (C) Τα βιώσιμα κύτταρα μετά από παρατεταμένο χρόνο έκθεσης (> 24 ώρες) χρησίμευσαν ως αρνητικός έλεγχος και (Δ) μη βιώσιμα κύτταρα στο αντίστοιχο πεδίο. Η βιωσιμότητα μειώθηκε δραστικά (Μεγέθυνση x200). (Tsaousis et al, Clin Experiment Ophthalmol 2013)

74 74 Β.3.4 Συμπεράσματα και συζήτηση Το Trypan Blue (TB) είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη χρωστική για την χρώση του προσθίου περιφακίου σε επεμβάσεις καταρράκτη όπου η ρόδινη ανταύγεια δεν προσφέρει ευκρινή διάκριση του περιφακίου από το χειρουργό. Παρά τις πολυάριθμες αναφορές σχετικά με την τοξικότητα του ΤΒ σε άλλα κύτταρα του προσθίου και οπισθίου ημιμορίου δεν υπήρχαν σχετικά με την τοξικότητα αυτή στα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού είτε σε ζωικά είτε σε vitro μοντέλα. Οι Ζιάκας et al. 174 έδειξαν ότι η χρήση του ΤΒ κατά την επέμβαση του καταρράκτη δεν έχει σημαντική επίδραση στην ενδοφθάλμια πίεση στον άμεσο και πρώιμο μετεγχειρητικό χρόνο εννοώντας έτσι τη μη τοξική δράση του ΤΒ στο γωνιακό δικτυωτό. Η μελέτη μας, παρουσιάζει τις μορφολογικές αλλαγές που λαμβάνουν χώρα στα ΗΤΜ κύτταρα μετά την έκθεση τους σε ΤΒ συγκεντρώσεων αναλόγων με αυτές των εμπορικά διαθέσιμων παρασκευάσματα για χρήση στον πρόσθιο θάλαμο (Vision Blue 0.06%). Μετά από έκθεση των κυττάρων σε ΤΒ για 5 δευτερόλεπτα καμιά αλλαγή δεν παρατηρήθηκε. Μετά από έκθεση για δευτερόλεπτα τα κύτταρα διατηρούσαν τη δομή τους και μόνο μια λέπτυνση παρατηρήθηκε δείχνοντας έτσι την επίδραση κάποιου stress. Μετά από 5 λεπτά έκθεσης ο αριθμός των κυττάρων μειωνόταν σημαντικά και διαπιστώθηκε σημαντική αλλαγή της μορφής τους με αξιοσημείωτη συρρίκνωση. 175,176 Σχετικά με την βιωσιμότητα των καλλιεργηθέντων κυττάρων, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι το ΤΒ στη συγκέντρωση 0.06% δεν εμφανίζει σημαντική τοξική δράση στα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού και για χρόνο έκθεσης έως 60 δευτερόλεπτα. Μετά από αυτό το όριο η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώνεται έως και το 60 ο λεπτό όπου η βιωσιμότητα μετράται στο επίπεδο του 68.3%

75 75 Προηγούμενες μελέτες έδειξαν μα πιθανή συσχέτιση μεταξύ της τοξικής δράσης του ΤΒ με αντίστοιχη ελάττωση της μιτοχονδριακής δραστηριότητας που μπορεί να οφείλεται στο σχηματισμό ελεύθερων ριζών οξυγόνου. 177,178 Τα δικά μας αποτελέσματα για τα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού κατέδειξαν ότι δεν υπάρχει τοξική δράση για χρόνο έκθεσης 60 δευτερόλεπτα αλλά σίγουρα θα χρειαστούν περαιτέρω μελέτες κυρίως σε ευαίσθητες κατηγορίες ασθενών όπως γλαυκωματικούς η ασθενείς προχωρημένης ηλικίας έτσι ώστε να διασαφηνιστούν όλοι οι πιθανοί μηχανισμοί τοξικοτητας. 179,180 Η παρούσα μελέτη έχει κάποιους περιορισμούς: 1) Ένα συνολικό μειονέκτημα είναι ότι πρόκειται για μια in vitro μελέτη και έτσι γίνεται αντιληπτό ότι τα αποτελέσματα της δεν μπορούν να μεταφερθούν αυτούσια και για το in vivo περιβάλλον. Είναι σίγουρα αδύνατο να συμπεριληφθούν όλοι οι παράγοντες που επηρεάζουν την vivo λειτουργία των κυττάρων αυτών. Αυτή η μελέτη είχε σαν σκοπό την διερεύνηση της επίδρασης του ΤΒ στα ΗΤΜ κύτταρα κάτω από τις συγκεκριμένες συνθήκες. 2) Μια άλλη παράμετρος που είναι δύσκολο να ρυθμιστεί και μπορεί να επηρεάζει τα αποτελέσματα είναι ο προσδιορισμός του ακριβούς χρόνου που παραμένει το ΤΒ στον πρόσθιο θάλαμο. Η είσοδος του ΤΒ στα διάκενα του γωνιακού δικτυωτού και η πιθανή προσκόλλησή του στην εξωκυττάρια ουσία μάλλον αυξάνει το χρόνο έκθεσης των κυττάρων στο ΤΒ. Ένας ακόμη λόγος για την αύξηση του χρόνου έκθεσης TB είναι η παρουσία του ιξωδοελαστικού υλικού και η δυσκολία της ακόλουθης απομάκρυνσης του ΤΒ. Η παρούσα μελέτη διερεύνησε τη βραχυχρόνια επίδραση του ΤΒ στα καλλιεργηθέντα κύτταρα και έτσι αυτή η πιθανή αύξηση του χρόνου έκθεσης στο in vivo περιβάλλον δεν επηρέασε τα αποτελέσματα.

76 76 Η ελάττωση του αριθμού των κυττάρων λόγω της τοξικής επίδρασης του ΤΒ οδηγεί σε διαφοροποίηση της δομής του γωνιακού δικτυωτού, παρεμπόδιση της εκροής του υδατοειδούς υγρού και τελικά σε αύξηση της ενδοφθάλμιας πίεσης. 181 Επακόλουθα, η χρήση του ΤΒ θα έπρεπε ίσως να γίνεται με προσοχή στις περιπτώσεις που υποπτευόμαστε μη ομαλή λειτουργία του γωνιακού δικτυωτού. Εναλλακτικά, θα μπορούσε να γίνει ένεση του ΤΒ κάτω από το περιφάκιο η διάλυση σε χαμηλότερες συγκεντρωσεις 182,183 έχοντας υπόψη βέβαια ότι αυτές οι συστάσεις προκύπτουν από το παρόν εργαστηριακό μοντέλο και δεν μπορούν να θεωρηθούν ως γενικές κατευθυντήριες οδηγίες. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη είναι η πρώτη αναφορά που περιγράφει την επίδραση του ΤΒ σε ανθρώπινα καλλιεργημένα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η τοξικότητα είναι ευθέως ανάλογη του χρόνου έκθεσης.

77 77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.4: ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΠΡΩΤΟΓΕΝΗ ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΘΕΝΤΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΟΥΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΑΕΡΑ: ΕΝΑ IN VITRO ΜΟΝΤΕΛΟ. Β.4.1: Εισαγωγικά στοιχεία Η ένεση αέρα στον πρόσθιο θάλαμο του οφθαλμού είναι μια πολύ γνωστή πρακτική για πολλούς χειρουργούς καταρράκτη που προτιμούν να τοποθετούν μια μικρή φυσαλίδα αέρα στον πρόσθιο θάλαμο μετά την εμφύτευση του ενδοφθάλμιου φακού. Ο σκοπός αυτής της πρακτικής είναι κυρίως να εμποδιστεί η εισροή υγρών και εκκρίσεων από την οφθαλμική επιφάνεια και η μείωση του κινδύνου ενδοφθαλμίτιδας. 184,185 Μετά την εισαγωγή της τμηματικής (lamellar) κερατοπλαστικής και ιδιαίτερα των νέων τεχνικών, όπως η DSEK) και DMEK, η χρήση του υπολειπόμενου αέρα σε ενδοφθάλμιες επεμβάσεις αυξάνεται σημαντικά. Η έγχυση αέρα στον πρόσθιο θάλαμο είναι απαραίτητη για να υποστηρίξει την προσκόλληση του ιστού του δότη στο κερατοειδή στρώμα του κερατοειδή του δέκτη και την εξάλειψη της ανάγκης για ράμματα. Επιπλέον, επανέγχυση της φυσαλίδας αέρα με κατάλληλη τοποθέτηση της κεφαλής είναι η πιο αποδεκτή θεραπεία για αποκόλληση του μοσχεύματος μετά από DSEK. 186 Αυτές χειρουργικές τεχνικές είναι ιδανικό να εκτελείται μετά από ή σε συνδυασμό με επεμβάσεις καταρράκτη ιδίως λαμβάνοντας υπό όψιν ότι για τον αέρα έχει αναφερθεί η καταρρακτογόνος δράση του για τον κρυσταλλοειδή φακό. 187,188 Εκτός από το καταρρακτογόνο αποτέλεσμα υπάρχει σοβαρή ανησυχία για την πιθανή τοξική επίδραση του αέρα στα ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς. Αυτή η τοξικότητα έχει αναφερθεί μέσω ζωικών μοντέλων. 189,190 Πρόσφατα, οι Laundry et al. συνέκριναν την

78 78 τοξική επίδραση του αέρα και του SF6 που δείχνει ότι ο αέρας θα πρέπει να προτιμάται αποδεικνύοντας ότι είναι λιγότερο τοξικός αφού επάγει μικρότερης έντασης φλεγμονώδη αντίδραση. 191 Η τοξικότητα του αέρα για τα ενδοθηλιακά κύτταρα του ανθρώπινου κερατοειδή θα μπορούσε να εξηγηθεί από δύο κύριους μηχανισμούς: Πρώτον, η φυσαλίδα αέρα χωρίζει τον κερατοειδή και τα θρεπτικά συστατικά του υδατοειδούς υγρού και εμποδίζουν την ανταλλαγή των θρεπτικών ουσιών, ιδίως σε περιπτώσεις όπου η φυσαλίδα γεμίζει ολόκληρο τον πρόσθιο θάλαμο. 192 Δεύτερον, μια μηχανική αλληλεπίδραση, η οποία προκλήθηκε είτε από την πίεση στην επιφάνεια ή από τραύμα των κυττάρων από την ίδια τη φυσαλίδα, θα πρέπει επίσης να θεωρηθεί ως μια πιθανή αιτία της ενδοθηλιακής κυτταρικής βλάβης Αν και η ανάγκη για χρήση του αέρα σε DSEK και DMEK έχει ευρεία αποδοχή δεν υπάρχουν βιβλιογραφικές αναφορές σχετικά με την τοξικότητα του αέρα σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς. Παρά τις προηγούμενες αναφορές που χρησιμοποιούν ζωικά μοντέλα υπάρχει ουσιαστική ανάγκη για πειράματα σε ανθρώπινα κύτταρα και τα in vitro μοντέλα εμφανίζονται ως μια ελκυστική εναλλακτική. 196,197 Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η τοξική επίδραση της έκθεσης σε αέρα σε καλλιεργημένα πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς (HCECs).

79 79 Β.4.2: Πειραματική διάταξη Πρωτόκολλο κυτταρικής καλλιέργειας Τμήματα οφθαλμών (scleral rims) από 5 δότες κερατοειδών από την Τράπεζα Κερατοειδούς του πανεπιστημίου του Erlangen στη Νυρεμβέργη της Γερμανίας που χρησιμοποιούνται για μεταμοσχεύσεις PKP χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των πρωτογενών ενδοθηλιακών κυττάρων (HCECs) με τρόπο εναρμονισμένο με την Διακήρυξη του Ελσίνκι.. Η μέση πυκνότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων ήταν 2419± 323 cells/ mm 2. Για την καλλιέργεια των HCECs, χρησιμοποιήθηκε ένα προηγουμένως περιγραφέν πρωτόκολλο. 14 Εν συντομία, κερατοειδικός ιστός από το σκληροκερατοειδικό όριο (ΣΚΟ) τοποθετήθηκε σε μια πλάκα καλλιέργειας πολυστυρενίου που περιέχει τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM, Invitrogen, USA), με 50 U / ml πενικιλλίνη και 50 μg / ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen ). Η μεμβράνη Descemet (DM) μαζί με το συνημμένο ενδοθήλιο του κερατοειδούς αποκόπηκε από το στρώμα, 1 mm από το γωνιακό δικτυωτό (trabecular meshwork), και τοποθετείται σε μια πλάκα καλλιέργειας πολυστυρενίου που περιέχει 1.2 U / ml δισπάση σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Ο ιστός επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 C, και τα κύτταρα ήπια ξεπλύθηκαν σε φυσιολογικό ορό. Η δισπάση στη συνέχεια αδρανοποιείται με αιώρηση των κυττάρων σε ένα μέσο που περιέχει ϋμεμ, 50 U / ml πενικιλλίνη, και 50 μg / ml στρεπτομυκίνη. Μετά από ήπια φυγοκέντρηση, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει DΜΕΜ, 50 U / ml πενικιλλίνη, 50 μg / ml στρεπτομυκίνη, 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco, ThermoFisher Scientific, ΝΥ, USA), και 2 ng / ml βασικό αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (Invitrogen ). Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μια πλάκα 6-θέσεων στους 37 C σε 5% CO2 και 95% υγροποιημένο αέρα. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε δύο ημέρες. Τα κύτταρα έφθασαν σε

80 80 τέτοια πυκνότητα ώστε να χαρακτηριστούν confluent (συρρέοντα) σε ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε κατεργασία με θρυψίνη / EDTA και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια δυο θαλάμων. Ταξινόμηση δειγμάτων Μετά την επίτευξη συρροής (confluence) στα πλακίδια δύο θαλάμων, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε προσεκτικά και το φιλμ των ενδοθηλιακών κυττάρων ξεπλύθηκε ήπια τρεις φορές με PBS και το μέσο καλλιέργειας εναλλακτικά, με το τελευταίο να χρησιμοποιείται για την τελική πλύση. Τα πλακίδια τοποθετηθήκαν ανάποδα σε ένα τρυβλίο Petri γεμάτο με μέσο καλλιέργειας και πληρώθηκαν με αέρα χρησιμοποιώντας μια κενή σύριγγα (Εικόνα B.4.a), ξεκινώντας με αυτό τον τρόπο την έκθεση των κυττάρων στον αέρα.

81 81 Εικόνα B.4.a: Πειραματική διάταξη για τον έλεγχο της τοξικότητας του αέρα σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα κερατοειδούς σε ένα in vitro μοντέλο. Μετά την επίτευξη συρροής σε πλακίδια, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε προσεκτικά και το φύλλο ενδοθηλιακών κυττάρων ξεπλύθηκε ήπια με PBS. Τα πλακίδια γύρισαν ανάποδα σε ένα τρυβλίο Petri πολιτισμό γεμάτο με μέσο καλλιέργειας και γέμισαν με αέρα χρησιμοποιώντας μια άδεια σύριγγα, ξεκινώντας με αυτό τον τρόπο την έκθεση των κυττάρων στον αέρα. Τα πλακίδια στη συνέχεια επανατοποθετήθηκαν στο θάλαμο καλλιέργειας σε βέλτιστο περιβάλλον (37 C και 5% CO2). (Kopsachilis, Tsaousis et al, Cornea 2013) Τα πλακίδια στη συνέχεια επανατοποθετήθηκαν στο θάλαμο καλλιέργειας στο βέλτιστο περιβάλλον (37 C και 5% CO2). Η στιγμή της στρέψης του θαλάμου ανάποδα θεωρήθηκε ότι είναι η έναρξη του πειράματος. Έξι ομάδες των καλλιεργειών HCE χρησιμοποιήθηκαν και σε κάθε ομάδα περιελήφθησαν 4 δείγματα: Η Ομάδα 1 αποτελούνταν από δείγματα στα οποία τα HCE είχαν εκτεθεί στον αέρα για 30 λεπτά. Η Ομάδα 2 αποτελούνταν από HCE που εκτεθήκαν στον

82 82 αέρα για 1 ώρα, η Ομάδα 3 αποτελούνταν από HCE που εκτεθήκαν σε αέρα για και 3 ώρες και η Ομάδα 4 αποτελούνταν από HCE που εκτεθήκαν σε αέρα για 6 ώρες, στην ομάδα 5 η έκθεση ήταν 12 ώρες και στην ομάδα 6 η έκθεση διήρκεσε 24 ώρες. Εκτίμηση κυτταροκαλλιεργειών Η βιωσιμότητα και μορφολογία των κυττάρων εκτιμήθηκε στα 30 λεπτά, 1 ώρα, 3 ώρες, 6 ώρες, 12 ώρες και 24 ώρες. Το συρρέον (confluent) ενδοθήλιο φωτογραφήθηκε με τη βοήθεια ενός ειδικού λογισμικού φωτογραφικής ανάλυσης (Cell^f; Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Germany). Τέσσερα τυχαία δείγματα σε κάθε ομάδα φωτογραφήθηκαν και εξετάστηκαν από δυο ανεξαρτήτους εξεταστές. Τέσσερεις περιοχές επιλέχτηκαν τυχαία σε κάθε δείγμα και τα κύτταρα σε εκείνη την περιοχή εξετάστηκαν με μεγέθυνση 100. Η μικροσκοπική παρατήρηση έγινε με τη βοήθεια ενός ανεστραμμένου μικροσκοπίου (Diavert, Leitz Wetzlar, Leica Germany). Οι εικόνες καταγράφηκαν μέσω μιας ψηφιακής κάμερας (Color View, Olympus Soft Imaging System). Δοκιμασία βιωσιμότητας ζώντων-νεκρών κυττάρων (Live dead cell viability assay) Η βιωσιμότητα των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε με βάση μια χημική δοκιμασία διχρωματικού (assay) φθορισμού μη μεμβρανο-διαπερατού propidium iodide (Sigma Aldrich, Munich,Germany) και μεμβρανο-διαπερατού Hoechst (Intergen; Purchase, NY, USA).Η δοκιμασία είχε σαν αποτέλεσμα οι πυρήνες των μη ζώντων κυττάρων να λαμβάνουν κόκκινο χρώμα ενώ τα κύτταρα των ζώντων κυττάρων να χρωματίζονται μπλε. Για την αξιολόγηση λοιπόν της βιωσιμότητας των κυττάρων, αυτά πλύθηκαν με phosphate-buffered saline (PBS) και επωάστηκαν με 2.0 µg/ml propidium iodide και 1.0 µg/ml Hoechst για 20 min στους 37 C. Έπειτα, τα κύτταρα απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο Olympus U- RFL-T, BX51, Germany). Οι επισημασμένοι πυρήνες μετρήθηκαν με βάση

83 83 μικροφωτογραφίες (σε τέσσερις διαφορετικές περιοχές κάθε δείγματος). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως το ποσοστό των ζώντων κυττάρων (μέση τιμή από τις τέσσερις μετρήσεις και έτσι μετρήθηκε η συνολική βιωσιμότητα (μέση τιμή ± SD). Όλα τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος± τυπική απόκλιση (mean ± SD). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του λογισμικού SPSS for Windows (SPSS 16.0, Illinois, US). Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο 0.05%. Β.4.3: Αποτελέσματα πειραμάτων Μορφολογία κυττάρων Σε κάθε ομάδα παρατηρήθηκε χαρακτηριστική εξαγωνική μορφολογία των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά τη στιγμή της έκθεσης στον αέρα. Τα κύτταρα που εξετάστηκαν στα 30 και 60 λεπτά έδειξαν μια χαρακτηριστική εξάπλωση. Τρεις ώρες μετά την έκθεση, η μορφολογία των κυττάρων ήταν ακόμα άθικτη, όμως σε λίγα κύτταρα εντός της μονοστιβάδας εμφανίστηκε διευρυμένη δομή και επέδειξαν χαρακτηριστικά πιο γερασμένων κυττάρων. Έξι ώρες μετά την έκθεση τα ενδοθηλιακά κύτταρα άρχισαν να χάνουν τη χαρακτηριστική εξαγωνική μορφολογία τους και εμφανιζόταν διογκωμένα. (Εικόνα Β.4.β)

84 84 Εικόνα Β.4.β: Φωτογραφίες οπτικού μικροσκοπίου που δείχνουν πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα που εκτίθενται σε αέρα. Το τυπικό πολυγωνικό σχήμα στη μορφολογία των ενδοθηλιακών κυττάρων διατηρήθηκε στα 30 λεπτά μετά την έκθεση (Α), 60 λεπτά μετά την έκθεση (Β) και 3 ώρες μετά την έκθεση (C). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα άρχισαν να χάνουν το τυπικό εξαγωνικό σχήμα τους και εμφανίστηκε διευρυμένο στις 6 ώρες μετά την έκθεση στον αέρα. Όλα τα κύτταρα εμφανίστηκαν παραμορφωμένα στις 24 ώρες μετά την έκθεση σε αέρα (μεγέθυνση χ 100). (Kopsachilis, Tsaousis et al, Cornea 2013) Η βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικόνα Β.4.γ)

85 85 Εικόνα Β.4.γ: Η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με χρώση όλων των πυρήνων με Hoechst και των νεκρών κύτταρων με ιωδιούχο προπίδιο. (Α) Αντιπροσωπευτική μικροφωτογραφία φθορισμού της Hoechst με χρωματισμένα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα κερατοειδούς μετά από έκθεση σε αέρα για 1 ώρα. (Β) μη βιώσιμα κύτταρα στο αντίστοιχο πεδίο. Η βιωσιμότητα ήταν ανώτερη του 95%. (Γ) μικροφωτογραφία φθορισμού με Hoechst και χρωματισμένα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα κερατοειδούς μετά από έκθεση σε αέρα για 24 ώρες. (Δ) μη βιώσιμα κύτταρα στο αντίστοιχο πεδίο. Η βιωσιμότητα μετρήθηκε 30%. Τα δεδομένα υπολογιστήκαν με βάση την δειγματοληψία των 4 μικροφωτογραφιών ανά ομάδα σε όλες τις ομάδες (Μεγέθυνση x200). (Kopsachilis, Tsaousis et al, Cornea 2013)

86 86 Η βιωσιμότητα ήταν ανώτερη του 95% των ομάδων 1 έως 3. Η βιωσιμότητα για όλες τις ομάδες παρουσιάζονται στον επόμενο Πίνακα. TESTED GROUP (TIME OF EXPOSURE) PERCENTAGE OF CELL VIABILITY (%) Group 1 (30 minutes) 98,5±4,6 Group 2 (1 hour) 96,8±3,9 Group 3 (3 hours) 95,7±5,4 Group 4 (6 hours) 71,0±9,7 Group 5 (12 hours) 22,4±11,4 Group 6 (24 hours) 6,3±9,6 Πίνακας Β.4.I: Κυτταρική βιωσιμότητα πρωτογενών καλλιεργημένων ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων κερατοειδούς μετά από διαφορετικούς χρόνους έκθεσης στον αέρα. Β.4.4: Συζήτηση Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη in vitro μελέτη που ερευνά μια πιθανή τοξική επίδραση του αέρα σε ανθρώπινα καλλιεργημένα ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς. Οι πιθανοί παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί της τοξικότητας του αέρα σε κύτταρα έχουν περιγραφεί προηγουμένως στη βιβλιογραφία. 194 Πρώτον, αυτό συμβαίνει επειδή η φυσαλίδα αέρα διαχωρίζει το ενδοθήλιο του κερατοειδούς και το υδατοειδές υγρό με αποτέλεσμα να παρεμποδίζεται η ανταλλαγή θρεπτικών ουσιών. Δεύτερον, η φυσαλίδα αέρα προκαλεί μηχανική δράση, απότοκο της πίεσης επί των κυττάρων ή/και τραύμα από την ίδια τη φυσαλίδα και τρίτον, ο ίδιος ο αέρας μπορεί να αφυδατώσει την εκτεθειμένη επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η βιωσιμότητα που μετρήθηκε στο πείραμα μας βρέθηκε να έχει μειωθεί σημαντικά μετά από έξι ώρες έκθεση των κυττάρων στον αέρα, ενώ για λιγότερο χρόνο έκθεσης, τα κύτταρα εμφανίστηκαν να μην έχουν υποστεί σημαντικές βλάβες ζημιές από τον αέρα.

87 87 Όσον αφορά στη μορφολογία των κυττάρων, μετά από έξι ώρες έκθεσης έχει αλλάξει, παρουσιάζοντας μεγάλες παραμορφώσεις. Με πιο πεπλατυσμένο σχήμα και με συνακόλουθη απώλεια της τυπικής εξαγωνικότητας, υποδηλώνεται πιθανή ζημιά οργανιδίων και παραμόρφωση των δομικών κυτταρικών στοιχείων (πρωτεΐνες, λιπίδια) η οποία επιβεβαιώνεται από τη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά από αυτήν την κρίσιμη διάρκεια της εξάωρης έκθεσης. Κατά τη διάρκεια μιας χειρουργικής επέμβασης DMEK ή DSEK, ο μέγιστος χρόνος έκθεσης αέρα για τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι 60 minutes. 198 Στην παρούσα μελέτη, τα κύτταρα δεν δείχνουν σημαντική αλλαγή στη μορφολογία και τη βιωσιμότητά τους στα 60 λεπτά, επιβεβαιώνοντας έτσι την κλινική παρατήρηση του άθικτου ενδοθηλίου μετά από έκθεση στον αέρα, κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης DMEK. Παρ 'όλα αυτά, η σημαντική μεταβολή στην εμφάνιση και τη ζωτικότητα των κυττάρων μετά από 6 ώρες έκθεσης αέρα δείχνει ότι ο αέρας θα μπορούσε να είναι δυνητικά τοξικός για το ανθρώπινο ενδοθήλιο. Ένας περιορισμός της μελέτης είναι ότι το επιλεγμένο μοντέλο είναι στατικό και όχι δυναμικό όπως είναι στην πραγματικότητα το περιβάλλον αυτών των κυττάρων in vivo. Για παράδειγμα, απουσιάζει η πίεση που παρατηρείται κατά τη διάρκεια της έκθεσης στον αέρα, κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης DMEK ή ακόμη και η οποιασδήποτε κίνηση των κυττάρων στην μακρο-κλίμακα. Ωστόσο, δόθηκε προσοχή στη λεπτομέρεια, ενώ σχεδιάστηκε το πείραμα ώστε να μιμείται περισσότερο την in vivo κατάσταση. Επιπλέον, τα πλακίδια θαλάμου τέθηκαν πίσω στον κλίβανο στους 37 C και 5% CO2 το οποίο είναι οι πλησιέστερες πιθανές παράμετροι για το in vivo περιβάλλον. Ασφαλώς χρειάζεται να γίνει αρκετή περαιτέρω έρευνα ώστε να δημιουργηθεί ένα ευρέως αποδεκτό προσομοιωμένο μοντέλο του πρόσθιου θαλάμου του ματιού. Αυτό το επιθυμητό μοντέλο θα μπορούσε να λάβει υπόψη διάφορες παραμέτρους και να

88 88 προσομοιώσει καλύτερα τις in vivo συνθήκες. 199 Ερευνητές που διερεύνησαν την επίδραση της έκθεσης στον αέρα στα ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς σε ζωικά μοντέλα αντιμετώπισαν ανάλογες δυσκολίες που περιόρισαν τη γενίκευση των συμπερασμάτων σε ανθρώπινο επίπεδο. Το αποτέλεσμα της παρούσας μελέτης είναι ότι η έκθεση των πρωτογενών καλλιεργημένων ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων σε περιβάλλον αέρα φαίνεται να έχει σημαντική τοξική δράση μετά από μία χρονική περίοδο έξι ωρών στην δική μας πειραματική διάταξη. Περαιτέρω πειράματα θα διαφωτίσουν την ακριβή τοξική επίδραση του αέρα στα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα του κερατοειδούς.

89 89 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.5: ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΗΘΕΝΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΓΩΝΙΑΚΟΥ ΔΙΚΤΥΩΤΟΥ (TRABECULAR MESHWORK) ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΘΕΣΗ ΣΕ ΑΕΡΑ Β.5.1 Εισαγωγή Η χρήση του αέρα στον πρόσθιο θάλαμο του οφθαλμού κατά την διάρκεια επέμβασης καταρράκτη είναι καθιερωμένη μεταξύ πολλών χειρουργών καταρράκτη. Έγχυση μιας μικρής φυσαλίδας αέρα στον πρόσθιο θάλαμο μετά την εμφύτευση του ενδοφακού χρησιμοποιείται για την πρόληψη της εισροής υγρού από την οφθαλμική επιφάνεια και κατά συνέπεια να μειωθεί η πιθανότητα της ανάπτυξη μιας μετεγχειρητικής ενδοφθάλμιας λοίμωξης. 200,201 Εκτός από την φακοθρυψία, η χρησιμοποίηση του αέρα στις ενδοφθάλμιες επεμβάσεις αυξάνεται σημαντικά μετά την εισαγωγή των τεχνικών τμηματικής κερατοπλαστικής. Σε επεμβάσεις όπως οι DSEK και DMEK, η χρήση του αέρα είναι ζωτικής σημασίας για την επικόλληση του μεταμοσχευθέντος ιστού στο στρώμα του κερατοειδούς υποδοχής και εξαλείφουν την ανάγκη για τοποθέτηση ραμμάτων. Για τις περιπτώσεις όπου παρουσιάζεται αποκόλληση του μοσχεύματος μετά από DSAE, γίνεται συνήθως επανέγχυση φυσαλίδας αέρα. 202 Όπως και για κάθε υλικό που χρησιμοποιείται ενδοφθάλμια, οι οφθαλμίατροι, είναι σε εγρήγορση σχετικά με την πιθανή τοξική επίδραση του αέρα στους ενδοφθάλμιους ιστούς. Υπάρχουν αναφορές που δείχνουν αυξημένο ποσοστό καταρράκτη σε ασθενείς με κρυσταλλοειδή φακό που υποβλήθηκαν σε τμηματική κερατοπλαστική με τη χρήση μιας φυσαλίδα αέρα. 203,204 Αρκετές μελέτες επιχείρησαν να διερευνήσουν την τοξική επίδραση του αέρα για τα ανθρώπινα κύτταρα του κερατοειδούς Οι προτεινόμενοι μηχανισμοί περιλαμβάνουν το διαχωρισμό του κερατοειδούς από το υδατοειδές υγρό και τη μηχανική πίεση της φυσαλίδας αέρα στην εσωτερική πλευρά του κερατοειδούς. 210,211

90 90 Αν και υπάρχουν κάποιες μελέτες με επίκεντρο την τοξική επίδραση του αέρα για τα ενδοθηλιακά κύτταρα κερατοειδούς, υπάρχει έλλειψη παρόμοιων μελετών για κύτταρα του γωνιακού δικτύου. Η ποσότητα του αέρα που χρησιμοποιείται στην τμηματική κερατοπλαστική είναι αρκετά μεγάλη για να επηρεάσει αυτά τα κύτταρα και η διερεύνηση αυτής της αλληλεπίδρασης θα είχε μεγάλο κλινικό ενδιαφέρον. Σε περίπτωση που η τοξικότητα του αέρα είναι σημαντική για τα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού, θα μπορούσαν να υιοθετηθούν εναλλακτικές πρακτικές, όπως η μικρότερη σε διάρκεια έκθεση. Η καλλιέργεια ανθρώπινων κυττάρων γωνιακού δικτυωτού επιτρέπει τη μελέτη των δομικών και λειτουργικών ιδιοτήτων αυτού του διακριτού τύπου κυττάρων υπό αναπαραγώγιμες πειραματικές συνθήκες. Ανθρώπινα κύτταρα γωνιακού δικτυωτού μπορούν να αναπτυχθούν αποτελεσματικά από μοσχεύματα από την γωνία του προσθίου θαλάμου και τα καλλιεργημένα κύτταρα μπορούν να διατηρήσουν τα διακριτά μορφολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των μη καλλιεργημένων κύτταρων γωνιακού δικτυωτού. 212,213 Το μοντέλο των καλλιεργημένων πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων γωνιακού δικτυωτού έχει χρησιμοποιηθεί πρόσφατα σε μελέτες για την εξερεύνηση των ιδιοτήτων τους και τις αλληλεπιδράσεις τους με άλλους παράγοντες. 214 Φαίνεται λοιπόν να είναι ένα κατάλληλος υλικό για τη διερεύνηση της τοξικότητας του αέρα. Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να διερευνήσει την τοξική επίδραση σε αέρα έκθεσης για καλλιεργημένα πρωτογενή κύτταρα γωνιακού δικτυωτού (HTM).

91 91 Β.5.2 Πειραματική διάταξη Πρωτόκολλο κυτταρικής καλλιέργειας Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν για τις καλλιέργειες προήρθαν από πέντε δότες χωρίς κάποιο ιστορικό σημαντικής οφθαλμικής νόσου με μέση ηλικία 57±12 χρόνων (λήφθησαν 16±8 ώρες post-mortem) της τράπεζας κερατοειδούς του Erlangen σύμφωνα με το συστάσεις της Διακήρυξης του Ελσίνκι.. Τα κύτταρα από το HTM αναπτύχθηκαν με τη χρήση ενός ελαφρώς τροποποιημένου πρωτοκόλλου. Οι οφθαλμοί τοποθετήθηκαν σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά κατά την άφιξη και κόπηκαν σε δύο μέρη, δια μέσου της πριονωτής περιφέρειας με ένα αποστειρωμένο νυστέρι. Ο φακού και η ίριδα απομακρύνθηκαν από το πρόσθιο τμήμα. Το trabeculum απομονώθηκε προσεκτικά από τους περιβάλλοντες ιστούς. 215 Ο ιστός κόπηκε σε μικρά τμήματα, και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 C σε ατμόσφαιρα 5% CO2 σε Ham F-10 σε μέσο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό, 2 mm L-γλουταμίνη, και 0.25 lg / ml γενταμυκίνη (Gibco). Μετά από 2 εβδομάδες, τα μη-προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν και επεξεργάστηκαν με 0,25% θρυψίνη και 1 mm EDTA για 10 λεπτά. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και επανεπιστρώθηκαν σε Petri τρυβλία. Συρρέοντα (Confluent) ΗΤΜ κύτταρα (περάσματος 3) επωάστηκαν για 24 ώρες σε μέσο Ham F-10 άνευ-ορού και το μέσο αλλάχθηκε καθημερινά μέχρις ότου τα κύτταρα φτάσουν σε confluence. Μετά την επίτευξη συρροής, τα κύτταρα τοποθετηθήκαν (5Χ 10 4 ανά θέση) σε δοχεία δυο θέσεων (two well chamber slides). Ταξινόμηση δειγμάτων: Μετά την επίτευξη συρροής στα πλακίδια, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε προσεκτικά και το φιλμ των trabeculum κυττάρων ξεπλύθηκαν ήπια με PBS. Τα δοχεία τοποθετήθηκαν ανάποδα σε ένα τρυβλίο καλλιεργειών Petri γεμίζουν με αέρα με χρήση σύριγγας των 5 ml, (Εικ. 1) αρχίζοντας έτσι την έκθεση των

92 92 κυττάρων σε περιβάλλον αέρα. Τα δοχεία στη συνέχεια τοποθετηθήκαν πίσω στον κλίβανο καλλιεργειών και σε βέλτιστο περιβάλλον (37 C και 5% CO2). Το χρονικό σημείο της πλήρωση με αέρα θεωρήθηκε ότι είναι ο χρόνος 0. Έξι ομάδες των καλλιεργειών κυττάρων ΗΤΜ με 4 δείγματα απο κάθε ομάδα χρησιμοποιήθηκαν για τις ανάγκες του πειράματος: Η ομάδα 1 αποτελούνταν από δείγματα στα οποία τα κύτταρα HTM εκτέθηκαν σε αέρα για 30 λεπτά. Η ομάδα 2 αποτελούνταν από κύτταρα HTM εκτέθηκαν σε αέρα για 1 ώρα, η ομάδα 3 για 3 ώρες η ομάδα 4 για 6 ώρες η ομάδα 5 για 12 ώρες και, τέλος, η ομάδα 6 για 24 ώρες. Εκτίμηση κυτταροκαλλιεργειών Η βιωσιμότητα και μορφολογία των κυττάρων εκτιμήθηκε στα 30 λεπτά, 1 ώρα, 3 ώρες, 6 ώρες, 12 ώρες και 24 ώρες. Τα συρρέοντα (confluent) trabecular κύτταρα φωτογραφήθηκε με τη βοήθεια ενός ειδικού λογισμικού φωτογραφικής ανάλυσης (Cell^f; Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Germany). Τέσσερα τυχαία δείγματα σε κάθε ομάδα φωτογραφήθηκαν και εξετάστηκαν από δυο ανεξαρτήτους εξεταστές. Τέσσερεις περιοχές επιλέχτηκαν τυχαία σε κάθε δείγμα και τα κύτταρα σε εκείνη την περιοχή εξετάστηκαν με μεγέθυνση 200. Η μικροσκοπική παρατήρηση έγινε με τη βοήθεια ενός ανεστραμμένου μικροσκοπίου (Diavert, Leitz Wetzlar, Leica Germany). Οι εικόνες καταγράφηκαν μέσω μιας ψηφιακής κάμερας (Color View, Olympus Soft Imaging System). Δοκιμασία βιωσιμότητας ζώντων-νεκρών κυττάρων (Live dead cell viability assay): Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με βάση μια χημική δοκιμασία δι-χρωματικού (assay) φθορισμού μη μεμβρανο-διαπερατου propidium iodide (Sigma Aldrich, Munich,Germany) και μεμβρανο-διαπερατού Hoechst (Intergen; Purchase, NY, USA).Η δοκιμασία είχε σαν αποτέλεσμα οι πυρήνες των μη ζώντων κυττάρων να λαμβάνουν κόκκινο χρώμα ενώ τα κύτταρα των ζώντων κυττάρων να χρωματίζονται μπλε. Για την αξιολόγηση λοιπόν της βιωσιμότητας των κυττάρων, αυτά πλύθηκαν με PBS και

93 93 επωάστηκαν με 2.0 µg/ml propidium iodide και 1.0 µg/ml Hoechst για 20 min στους 37 C. Έπειτα, τα κύτταρα απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο Olympus U-RFL-T, BX51, Germany). Οι επισημασμένοι πυρήνες μετρήθηκαν με βάση μικροφωτογραφίες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως το ποσοστό των ζώντων κυττάρων (μέση τιμή από τις τέσσερις μετρήσεις και έτσι μετρήθηκε η συνολική βιωσιμότητα (μέση τιμή ± SD). Τα αποτελέσματα εκφραστήκαν ως μέση τιμή ± SD. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του λογισμικού SPSS for Windows (SPSS 16.0, Illinois, US). Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο 0.05%.

94 94 Β.5.3: Αποτελέσματα Μορφολογία των κυττάρων Σε κάθε ομάδα η τυπική μορφολογία των κυττάρων του γωνιακού δικτυωτού (trabecular meshwork) παρατηρήθηκε από τη στιγμή της έκθεσης στον αέρα. Τα κύτταρα εξετάστηκαν στα 30, 60 λεπτά και 180 λεπτά μετά την έκθεση στον αέρα και επέδειξαν ένα χαρακτηριστικό μοτίβο μονοστιβάδας, με στρογγυλό ή μερικώς επίμηκες σχήμα και περικλείοντας πολλαπλές αποφύσεις με επικαλυπτόμενα όρια (Εικόνα Β.5.α). Εικόνα Β.5.α: Εικόνες από οπτικό μικροσκόπιο που δείχνουν πρωτογενή κύτταρα γωνιακού δικτυωτού που εκτίθενται στον αέρα. Το τυπικό στρόγγυλο και μερικώς επίμηκες σχήμα των κυττάρων διατηρήθηκε σε 30 λεπτά (Α), 60 λεπτά (Β) και 3 ώρες μετά την έκθεση (C). Τα κύτταρα γωνιακού δικτυωτού άρχισαν να χάνουν τους τυπική μορφολογία και εμφανίστηκαν διευρυμένα στις 6 ώρες μετά την έκθεση στον αέρα. Όλα τα κύτταρα εμφανίστηκαν να παραμορφώνονται στις 24 ώρες μετά την έκθεση σε αέρα (μεγέθυνση χ 200). (Kopsachilis, Tsaousis et al, Toxicol In Vitro 2014) Στις 6 ώρες μετά την έκθεση, η μορφολογία των κυττάρων ήταν ακόμα άθικτη ωστόσο λίγα κύτταρα εντός της μονοστιβάδας παρουσιάσθηκε ελαφρώς παραμορφωμένα και παρουσίασαν τα χαρακτηριστικά πιο γερασμένων κυττάρων. Στις 12 ώρες μετά την έκθεση

95 95 στον αέρα τα ΗΤΜ κύτταρα άρχισαν να χάνουν την τυπική τους μορφολογία. Στις 24 ώρες η μεγάλη πλειονότητα των κυττάρων εμφανίστηκαν ως μη βιώσιμα. Αποτελέσματα βιωσιμότητας Η βιωσιμότητα ήταν πάνω από 94% στις ομάδες 1-3 (Εικόνα Β.5.β). Στην ομάδα 4 η βιωσιμότητα μετρήθηκε 82,7 ± 5,3% και στην ομάδα 5 39,5 ± 9,7%. Στην τελευταία ομάδα, η μέση βιωσιμότητα μετρήθηκε 12,7 ± 8,3%. Εικόνα Β.5.β: Η βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με χρώση όλων των πυρήνων με Hoechst και των νεκρών κύτταρων με ιωδιούχο προπίδιο. Αντιπροσωπευτική μικροφωτογραφία φθορισμού της με Hoechst χρώσης των ανθρώπινων κυττάρων γωνιακού δικτυωτού μετά από έκθεση σε αέρα για 1 ώρα (Α) και 3 ώρες (C). Μη βιώσιμα κύτταρα στα αντίστοιχα πεδία. Η βιωσιμότητα ήταν ανώτερη απο94% (Β) και (Δ). Μικροφωτογραφία φθορισμού με Hoechst χρώση ανθρώπινων κυττάρων γωνιακού δικτυωτού

96 96 μετά από έκθεση σε αέρα για 24 ώρες (Ε). Μη βιώσιμα κύτταρα στο αντίστοιχο πεδίο (F). Η βιωσιμότητα μετρήθηκε 12,7%. Τα δεδομένα υπολογίστηκαν με βάση δείγμα 4 μικροφωτογραφιών ανά ομάδα σε όλες τις ομάδες (Μεγέθυνση x200). (Kopsachilis, Tsaousis et al, Toxicol In Vitro 2014) Β.5.4: Συζήτηση Αυτή είναι η πρώτη in vitro μελέτη που δείχνει την τοξική επίδραση του αέρα σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα γωνιακού δικτυωτού. Ο βιωσιμότητα που μετρήθηκε στο πείραμά μας άρχισε να μειώνεται μετά από 6 ώρες έκθεση των κυττάρων στον αέρα. Επίσης, η μορφολογία των κυττάρων άλλαξε, αποκαλύπτοντας μεγάλη παραμόρφωση των HTM μετά από έκθεση για 6 ώρες. Κατά τη διενέργεια μιας χειρουργικής επέμβασης DMEK και DSEK ο μέγιστος χρόνος έκθεσης σε αέρα για τα HTM είναι περίπου 60 λεπτά. 216 Στο πείραμά μας τα κύτταρα δεν δείχνουν να έχουν σημαντική αλλαγή στη μορφολογία και βιωσιμότητά τους στα 60 λεπτά, επιβεβαιώνοντας έτσι την κλινική παρατήρηση της σταθερής ενδοφθάλμιας πίεσης μετά από έκθεση στον αέρα κατά τη διάρκεια DMEK αλλά και χειρουργική επέμβαση καταρράκτη. Αν και δεν υπάρχει απόδειξη της μείωσης της βιωσιμότητας κατά τη διάρκεια της πρώτης ώρας έκθεσης θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι τα εκτεθειμένα κύτταρα είναι μεν κάτω από την stress, αλλά μπορούν εύκολα να ανακτήσουν πλήρως τη λειτουργικότητα τους όταν η έκθεση στον αέρα τερματιστεί. Ωστόσο, η αλλαγή στην εμφάνιση και βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 6 ώρες από την έκθεση αέρα δείχνει ότι ο αέρας θα μπορούσε είναι δυνητικά τοξικός για τα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού ανθρώπινη ακόμα και στο σύντομο χρονικό διάστημα των 60 λεπτών της έκθεσης του αέρα κατά τη διάρκεια μιας τμηματικής χειρουργικής επέμβασης κερατοειδούς. Επιπλέον, είναι αρκετά κοινό ότι μια φυσαλίδα αέρα θα τοποθετείται στον πρόσθιο θάλαμο και θα παραμείνει εκεί για ένα χρονικό διάστημα έως και 24 ώρες. Αυτό είναι κοινό στη σύγχρονη χειρουργική επέμβαση καταρράκτη, την DALK (deep anterior lamellar

97 97 keratoplasty) και στην περίπτωση της αποτυχημένης DMEK και DSEK χειρουργικής επέμβασης. Η μείωση των κυττάρων μετά την τοξική επίδραση του αέρα θα μπορούσε να προκαλέσει εκφύλιση των δοκίδων του trabeculum, απόφραξη της εκροής του υδατοειδούς υγρού και τελικά αύξηση της ενδοφθάλμιας πίεσης. 217 Ένας σημαντικός περιορισμός αυτής της μελέτης είναι ότι τα κύτταρα εκτέθηκαν στο περιβάλλον αέρα χωρίς μηχανική πίεση καθώς αυτό λαμβάνει χώρα με την έγχυση αέρα στον πρόσθιο θάλαμο κατά την διάρκεια μιας χειρουργικής επέμβασης DMEK. Έτσι μπορεί να πιθανολογηθεί ότι η υψηλότερη πίεση που δημιουργείται κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης θα μπορούσε να προκαλέσει μια πιο γρήγορη και σημαντική τοξική δράση στα ΗΤΜ κύτταρα. Εν κατακλείδι, λαμβάνοντας υπόψη την αποδεδειγμένη τοξικότητα του αέρα μετά από μια παρατεταμένη επαφή, προτείνεται ότι η χρήση ενός φυσαλίδα αέρα θα πρέπει να να χρησιμοποιείται με προσοχή σε ασθενείς με γλαύκωμα. Περαιτέρω πειράματα που ενδεχομένως θα συμπεριλάβουν τη χρήση ενός τεχνητού πρόσθιου θαλάμου είναι αναγκαία προκειμένου ώστε να μελετηθεί η τοξική επίδραση του αέρα στα ανθρώπινα κύτταρα του γωνιακού δικτυωτού.

98 98 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β.6: ΜΕΛΕΤΗ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟΥ ΠΡΟΣΘΙΟΥ ΠΕΡΙΦΑΚΙΟΥ ΤΟΥ ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΕΙΔΟΥΣ ΦΑΚΟΥ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ ΑΤΟΜΙΚΩΝ ΔΥΝΑΜΕΩΝ Β.6.1: Εισαγωγή Η μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων (Atomic force Microscopy, AFM) ή μικροσκοπία δυνάμεων σαρώσεως (scanning force microscopy, SFM) είναι ένα ισχυρό ερευνητικό εργαλείο που χρησιμοποιείται ευρέως για την ανάλυση ενός στερεού (rigid) σε επίπεδα νανοκλίμακας όπως και για τη μέτρηση των μηχανικών ιδιοτήτων οργανικών ή ανόργανων υλικών. 218,219 Ειδικότερο στην Οφθαλμολογία το AFM έχει χρησιμοποιηθεί αρκετές φορές όπως στην απεικόνιση και μελέτη του σκληρού χιτώνα και του κερατοειδούς, τη μελέτη μοντέλων ενδοφακών, 223,224 φακών επαφής 225,226 όπως και στη διερεύνηση μορίων σχετικών με την όραση Αρκετοί ερευνητές εστίασαν στη μελέτη του προσθίου περιφακίου, ανθρώπινου (HLC) η ζωικής προέλευσης με τη βοήθεια του AFM. 231,232 Ειδικό ενδιαφέρον παρουσιάζει η μέτρηση του elastic (Young s) modulus του περιφακίου. Ένα από τα προβλήματα που προέκυψαν ήταν οι διαφορετικές μεθοδολογίες που ακολουθήθηκαν από τα διάφορα εργαστήρια. Αυτή η ποικιλότητα δεν επιτρέπει την άμεση σύγκριση των αποτελεσμάτων. Μια από τις κρίσιμες παραμέτρους είναι το ποια είναι η βέλτιστη τιμή της εφαρμοζόμενης από το AFM δύναμης κάτι το οποίο δεν διερευνήθηκε σε κάποια από τις προηγούμενες μελέτες. Η μελέτη των εμβιομηχανικών ιδιοτήτων των βιολογικών ιστών με εργαλεία της Νανοτεχνολογίας εμφανίζεται να υπόσχετε αρκετά για το μέλλον αλλά η θεμελίωση ενός γενικότερου consensus για τη μεθοδολογία που θα ακολουθείται μοιάζει απαραίτητη.

99 99 Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της επίδρασης του μεγέθους της εφαρμοζόμενης δύναμης (indentation or loading force amount) στον προσδιορισμό του Young s modulus του ανθρώπινου προσθίου περιφακίου μέσω της μικροσκοπίας ατομικών δυνάμεων (Atomic Force Microscopy). Β.6.2 Μεθοδολογία και παραμετροποίηση μετρήσεων Απομόνωση περιφακίου κρυσταλλοειδούς φακού (Lens capsule isolation) Τα ανθρώπινα πρόσθια περιφάκια (human anterior lens capsules, HLC) ληφθησαν από ασθενείς χωρίς κάποια σημαντική παθολογία από το οφθαλμολογικό τους αναμνηστικό (εκτός από καταρράκτη φυσικά) κατά τη διάρκεια επεμβάσεως φακοθρυψίας και μετά την εκτέλεση συνεχούς καψουλόρηξης (continuous curvilinear capsulorrhexis). Ο τρόπος με τον οποίο πάρθηκαν τα δείγματα περιελάμβανε ασφαλώς κάθε απαραίτητη έγκριση και συναίνεση σύμφωνα με τη διακήρυξη του Ελσίνκι και επίσης από την αρμόδια επιτροπή ηθικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Η μορφολογία της επιφάνειας των δειγμάτων εξετάστηκε με μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων και συγκεκριμένα με ένα SOLVER P47 Scanning Probe Microscope (NT-MDT), σε semi-contact λειτουργία (mode), όπου το cantilever tip (ακίδα) ταλαντώνεται πάνω από την επιφάνεια του δείγματος και μόλις ακουμπά την επιφάνεια στο κατώτερο σημείο του εύρους ταλάντωσης. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με All measurements were performed with silicon cantilevers σιλικόνης (10 nm ονομαστική καμπυλότητα του tip) σε συνθήκες περιβάλλοντος. H καμπύλη αναφοράς δύναμης-απόστασης υπολογίστηκε για το sapphire υπόστρωμα έτσι ώστε να προσδιοριστεί η απόκριση του cantilever.

100 100 Παράμετροι Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το cantilever και μέγιστες δυνάμεις indentation της τάξης των 2, 5, 10, 20 και 30 nn (τυχαία επιλεγμένες τιμές). Tο deflection signal (DFL) σε na ανιχνεύτηκε στη φωτοδίοδο και καταγράφηκε ως συνάρτηση της πιεζοηλεκτρικής μετατόπισης. Αυτές οι καταγραφές επαναλήφτηκαν πέντε φορές για κάθε δείγμα και έτσι συνολικά πέντε συνεχόμενες μετρήσεις έλαβαν χώρα σε κοντινές περιοχές κάθε δείγματος. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου. Ανάλυση δεδομένων To DFL σήμα σε σχέση με την πιεζοηλεκτρική μετατόπιση καταγράφηκε κατά τη διάρκεια των μετρήσεων και μετατράπηκε σε δύναμη indentation προς βάθος indentation αφού υπολογίστηκε η spring σταθερά του cantilever και η συμπεριφορά του όταν ερευνά ένα στέρεο υπόστρωμα. Η σχέση δύναμης και βάθους αναλύθηκε με βάση το μοντέλο του Hertz κατάλληλα τροποποιημένου για κωνικό tip: 233 F E 1 v 2 2 tan a 2 Όπου F [N] η μετρούμενη εφαρμοζόμενη δύναμη, E [N/m2] το Young s modulus, ν το Poisson s ratio (0.47), 234 α η semi-opening γωνία του tip (α=18 μοίρες) και δ το μετρούμενο indentation βάθος. Η διασπορά (dispersion) των αποτελεσμάτων υπολογίστηκε μέσω του συντελεστή μεταβλητότητας (coefficient of variation) και η μέση τιμή χρησιμοποιήθηκε για την σύγκριση των διαφορετικών σετ μετρήσεων. Tο NOVA λογισμικό (NT-MDT Co, Zelenograd, Moscow, Russia) χρησιμοποιήθηκε για τον σχηματισμό των καμπυλών ενώ η

101 101 ανάλυση έλαβε χώρα με το Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) και το Excel for Windows (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA). Β.6.3: Αποτελέσματα μετρήσεων Τέσσερα δείγματα ανθρωπινού προσθίου περιφακίου πάρθηκαν από ασθενείς (75.25±4.03 χρόνια ηλικίας) κατά τη διάρκεια επεμβάσεων φακοθρυψίας και εξετάστηκαν. Οι μέσες τιμές του Young s modulus των μετρήσεων όπως και η μεταβλητότητα για κάθε διαφορετική εφαρμοζόμενη δύναμη υπολογιστήκαν. (Εικόνα Β.6.α) Εικόνα Β.6.α: Μέσες τιμές (± 2SD) των μετρήσεων για τις διαφορετικές δυνάμεις φόρτωσης σε κάθε δείγμα. (Tsaousis et al, Int Ophthalmol 2014)