ΚΑΚΟΥΛΙ ΟΥ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΚΑΚΟΥΛΙ ΟΥ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗΣ ΤΗΣ ΗΛΙΚΙΑΚΗΣ ΕΚΦΥΛΙΣΗΣ ΤΗΣ ΩΧΡΑΣ ΚΗΛΙ ΑΣ ΜΕ ΥΟ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥΣ ΣΤΟ ΓΟΝΙ ΙΟ ΤΟΥ CX3CR1 ΣΤΟΝ ΠΛΗΘΥΣΜΟ ΤΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Θεσσαλονίκη, 2009

2 ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Λαµπρόπουλος Αλέξανδρος 1,2, Αναπληρωτής Καθηγητής Τµήµατος Ιατρικής Α.Π.Θ. Κουβάτση Αναστασία 1,2, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τµήµατος Βιολογίας Α.Π.Θ. Σκούρας Ζαχαρίας 2, Καθηγητής Τµήµατος Βιολογίας Α.Π.Θ. 1 Επιβλέποντες καθηγητές 2 Μέλος εξεταστικής επιτροπής <<Η έγκρισις της παρούσης διπλωµατικής εργασίας υπό του Τµήµατος Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως (Ν.5343/1932, αρθρ.202, παρ.2)>> ii

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωµατική εργασία πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας του νοσοκοµείου Παπαγεωργίου, κατά τη διάρκεια του ακαδηµαϊκού έτους , στα πλαίσια του προγράµµατος µεταπτυχιακών σπουδών του τµήµατος Βιολογίας του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης Εφαρµοσµένη Γενετική και Βιοτεχνολογία. Καταρχήν, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά τον Αναπληρωτή Καθηγητή του τµήµατος Ιατρικής του Α.Π.Θ., κ. Αλέξανδρο Λαµπρόπουλο, που µε εµπιστεύθηκε και µε δέχτηκε στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας του νοσοκοµείου Παπαγεωργίου στο οποίο είναι υπεύθυνος. Από την αρχή της συνεργασίας µας υπήρξε πρόθυµος να µε βοηθήσει και να µε κατατοπίσει σε όλα τα θέµατα που προέκυπταν, µου παρείχε πολύτιµες συµβουλές και µου συµπαραστάθηκε στις δύσκολες στιγµές. Επίσης, τον ευχαριστώ για τις εύστοχες παρατηρήσεις και διορθώσεις του κατά τη συγγραφή του κειµένου. Επίσης, οφείλω ένα ευχαριστώ και στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του τµήµατος Βιολογίας του Α.Π.Θ., κ. Αναστασία Κουβάτση, που δέχτηκε να είναι συνεπιβλέπουσα στο θέµα της µεταπτυχιακής µου εργασίας και βοήθησε µε τις υποδείξεις της στο τελικό κείµενο. Ένα ευχαριστώ θα ήθελα να εκφράσω και στον Καθηγητή του τµήµατος Βιολογίας του Α.Π.Θ., κ. Ζαχαρία Σκούρα, που δέχτηκε να αποτελέσει το τρίτο µέλος της εξεταστικής επιτροπής. Από τον χώρο του εργαστηρίου, οφείλω να ευχαριστήσω τους συναδέλφους βιολόγους, Καταφυγιώτη Σωκράτη για την πολύ καλή συνεργασία και ιδιαιτέρως την Ντάιου Χρύσα, καθώς πέρα από την άψογη συνεργασία, οι συµβουλές της αποτέλεσαν και αποτελούν πολύτιµο µάθηµα για εµένα. Θεωρώ τη φιλική σχέση που αναπτύξαµε σηµαντική. Τελειώνοντας, θεωρώ υποχρέωσή µου να ευχαριστήσω τον Επίκουρο καθηγητή του τµήµατος Ιατρικής του Α.Π.Θ., κ. Φώτιο Τοπούζη και όλη την οµάδα συνεργατών του, για την παροχή των δειγµάτων αίµατος των ασθενών και της οµάδας ελέγχου, και τη συνεργασία που είχαµε για την πραγµατοποίηση αυτής της µελέτης στο σύνολό της. Η συµβολή τους στην πραγµατοποίηση της στατιστικής ανάλυσης (polychotomous και unconditional logistic regression) υπήρξε πολύτιµη. Τέλος, ευχαριστώ θερµά την οικογένειά µου για τη συµπαράσταση και τη στήριξη που µου παρείχαν, σε όλα τα χρόνια των σπουδών µου. Η υποµονή τους κατά την περίοδο συγγραφής του κειµένου υπήρξε τεράστια. iii

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ.1 ΟΠΤΙΚΗ ΕΞΑΣΘΕΝΗΣΗ...1 ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΤΗΣ AMD..2 ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙ ΟΥΣ...3 o ΑΛΛΑΓΕΣ ΜΕ ΤΗΝ ΗΛΙΚΙΑ..5 ΣΤΑ ΙΑ ΤΗΣ AMD ΙΑΓΝΩΣΗ..8 ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ..10 ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ. 16 ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΤΗΣ AMD..17 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝ ΥΝΟΥ 18 o o ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ.. 19 ΗΛΙΚΙΑ 19 ΚΑΠΝΙΣΜΑ..19 ΕΘΝΙΚΟΤΗΤΑ..22 ΙΑΤΡΟΦΗ...23 ΛΟΙΠΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ..24 ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ...25 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ..30 CX3CL1/CX3CR1.33 ΜΕΛΕΤΕΣ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗΣ ΤΩΝ ΥΟ SNPs (rs ΚΑΙ rs ) ΣΤΟ ΓΟΝΙ ΙΟ CX3CR1 ΜΕ ΤΗΝ AMD.41 ΣΚΟΠΟΣ...44 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ..45 ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΜΕΘΟ ΟΙ.46 o o o o ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA.46 ΑΛΥΣΙ ΩΤΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR)..48 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟÏΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR ΣΕ ΑΓΑΡΟΖΗ.52 ΠΕΨΗ ΜΕ ΕΝΖΥΜΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΑΓΑΡΟΖΗ (RFLP) 56 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 58 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...60 ΣΥΖΗΤΗΣΗ.71 ΠΕΡΙΛΗΨΗ..83 SUMMARY..84 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 85 iv

5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΠΤΙΚΗ ΕΞΑΣΘΕΝΗΣΗ Περίπου το 90% όλων των πληροφοριών που χρησιµοποιούµε για να αλληλεπιδράσουµε µε την κοινωνία παρέχεται µέσω του οπτικού µας συστήµατος. Παρά τα σηµαντικά κλινικά και θεραπευτικά επιτεύγµατα στην οφθαλµολογία, ο αριθµός των ατόµων που πάσχουν από σοβαρή οπτική εξασθένηση ολοένα και αυξάνεται. Η οπτική εξασθένηση που οδηγεί σε τύφλωση αποτελεί παγκοσµίως ένα βασικό εµπόδιο κατά της αύξησης και ανάπτυξης των πληθυσµών. Σύµφωνα µε τις τελευταίες εκτιµήσεις του παγκόσµιου οργανισµού υγείας (WHO-World Health Organization), περίπου 314 εκατοµµύρια άνθρωποι παγκοσµίως ζουν µε οπτική εξασθένηση, είτε λόγω ασθενειών των οφθαλµών (161 εκατοµµύρια) είτε λόγω αδιόρθωτων διαθλαστικών ανωµαλιών. Από αυτούς, τα 45 εκατοµµύρια είναι τυφλοί, εκ των οποίων το 90% ζει στις αναπτυσσόµενες χώρες. Οι κύριες αιτίες της τύφλωσης (Εικ. 1) είναι ο καταρράκτης (39%), οι αδιόρθωτες διαθλαστικές ανωµαλίες (18%), το γλαύκωµα (10%) και η ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας (7%) (WHO Report by the Secretariat, 2008). Στους ηλικιωµένους ωστόσο, η ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας ή AMD (Age related Macular Degeneration) αποτελεί την κύρια αιτία τύφλωσης παγκοσµίως (Resnikoff et al, 2004). Εικόνα 1. Αιτίες τύφλωσης παγκοσµίως (% επί των συνολικών περιπτώσεων τύφλωσης), σύµφωνα µε στοιχεία του WHO για το 2004 (Resnikoff et al, 2008). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 1

6 Επιπλέον, αν και η AMD είναι πιο συνηθισµένη ανάµεσα στους ηλικιωµένους στις ανεπτυγµένες χώρες, έχει αρχίσει να ανησυχεί και τις αναπτυσσόµενες χώρες, εξαιτίας των ταχέων δηµογραφικών αλλαγών και της αλλαγής στον τρόπο ζωής. Καθώς η AMD οδηγεί σε µη αναστρέψιµη τύφλωση, η διαχείρισή της αποτελεί πρόκληση για την παγκόσµια δηµόσια υγεία (Bressler et al, 2002). ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΤΗΣ AMD Αν και τα κλινικά χαρακτηριστικά της AMD περιγράφηκαν για πρώτη φορά το 1884 από τον Nettleship ως κεντρική διάστικτη γεροντική χοριοειδίτιδα (Nettleship Ε., 1884), ήταν ο Haab το 1885 που χρησιµοποίησε τον όρο γεροντική εκφύλιση της ωχράς κηλίδας (Haab Ο., 1885). Ο σηµερινός πιο κατάλληλος όρος είναι ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας ή AMD. Η AMD (OMIM # ) αποτελεί την πρώτη αιτία οπτικής εξασθένισης και τύφλωσης στις δυτικές χώρες σε άτοµα ηλικίας 65 ετών (la Cour et al, 2002). Είναι υπεύθυνη για το 8,7% του παγκόσµιου ποσοστού τύφλωσης λόγω ασθενειών των οφθαλµών, µε µία διακύµανση από σχεδόν 0% στην υπο-σαχάρια Αφρική έως και 50% στις βιοµηχανοποιηµένες χώρες. Ο αριθµός των ατόµων που προσβάλλονται αναµένεται να έχει διπλασιαστεί µέχρι το έτος 2020 σαν αποτέλεσµα της γήρανσης του παγκόσµιου πληθυσµού (Vision 2020, WHO). Ο WHO έχει υπολογίσει ότι 14 εκατοµµύρια άτοµα, τα περισσότερα των οποίων στις ανεπτυγµένες χώρες, είναι τυφλά ή έχουν σοβαρή οπτική εξασθένηση λόγω της AMD ( Σχεδόν το 35-40% του ανθρώπινου πληθυσµού ηλικίας 75 έχει σε κάποιο βαθµό της AMD (Smith et al, 2001), και περίπου το 6-8% των ατόµων σε αυτή την ηλικιακή οµάδα ταλαιπωρούνται από τα προχωρηµένα στάδια της ασθένειας, που προκαλούν και την πιο σοβαρή απώλεια όρασης (Friedman et al, 2004). Συνολικά, γύρω στα 8-10 εκατοµµύρια Αµερικανοί έχουν σε κάποιο βαθµό AMD, ενώ περισσότεροι από 1,75 εκατοµµύρια πάσχουν από την προχωρηµένη AMD (Seddon et al, 2006a) και ο αριθµός αυτός αναµένεται να φτάσει τα 3 εκατοµµύρια το έτος 2020 (Friedman et al, 2004). Η συχνότητα της προχωρηµένης AMD (νεοαγγείωση και/ή γεωγραφική ατροφία) στον πληθυσµό των ΗΠΑ >40 ετών υπολογίζεται σε 1,47% (Friedman et al, 2004). Στο Ηνωµένο Βασίλειο, η AMD είναι η πιο κοινή αιτία στις καταχωρήσεις ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 2

7 τύφλωσης (Evans et al, 1996). Οι Owen και συν. υπολόγισαν ότι άτοµα στο Ηνωµένο Βασίλειο ενδέχεται να έχουν οπτική εξασθένιση που οφείλεται στην AMD (Owen et al, 2003). Έχουν διενεργηθεί διάφορες πληθυσµιακές µελέτες για τη συχνότητα της AMD σε πολλά µέρη του κόσµου, αλλά οι διαγνωστικές διαδικασίες και ο ορισµός της πολλές φορές διαφέρουν σε µεγάλο βαθµό. Αυτό συµβαίνει κυρίως όταν συµπεριλαµβάνονται και τα πρώιµα συµπτώµατα της AMD. Έτσι είναι δύσκολο να γίνουν συγκρίσεις µεταξύ των πληθυσµών µε βάση αυτά τα δεδοµένα. Παρατηρείται µικρότερη διαφορά όσον αφορά την προχωρηµένη AMD. Από όλες τις µελέτες έχει βρεθεί ότι παρατηρείται µια εκθετική αύξηση µετά την ηλικία των 70. Ένας συνολικός υπολογισµός για τη συχνότητα της προχωρηµένης AMD σε άτοµα ηλικίας ετών είναι 1%, ενώ αυξάνεται σε 5% σε άτοµα ηλικίας ετών και σε 13% σε άτοµα 85 ετών. Η συχνότητα της πρώιµης AMD στην ηλικιακή οµάδα ετών είναι 15%, σε άτοµα ηλικίας ετών είναι 25%, ενώ για τα άτοµα ηλικίας 85 ετών ανέρχεται στο 30% (Jonasson et al, 2003; Vingerling et al, 1995; Mitchell et al, 1995; Klein et al, 1992). Για τον ευρωπαϊκό πληθυσµό, σύµφωνα µε τη µεγαλύτερη από άποψη αριθµού δείγµατος (4.753 άτοµα) επιδηµιολογική µελέτη, σε σύνολο 7 χωρών, η συχνότητα της προχωρηµένης AMD σε άτοµα ηλικίας >65 ετών εκτιµάται σε 3,3%. Συγκεκριµένα, το ποσοστό για την ξηρή AMD (γεωγραφική ατροφία) είναι 1,2%, ενώ για την υγρή AMD (νεοαγγειωτική) είναι 2,3%,ποσοστά παρόµοια µε αυτά άλλων δυτικών πληθυσµών. Εάν µεταφραστούν σε αριθµούς, περίπου 2,5 εκατοµµύρια Ευρωπαίοι ηλικίας >65ετών πάσχουν από προχωρηµένη AMD (Augood et al, 2006). Τέλος, η συχνότητα της προχωρηµένης AMD στον ελληνικό πληθυσµό δε διαφέρει σηµαντικά από αυτή άλλων καυκάσιων πληθυσµών και συγκεκριµένα, σύµφωνα µε τη µελέτη TES (Thessaloniki Eye Study), η συχνότητα της είναι 2,5%. Το ποσοστό για την υγρή AMD ανέρχεται σε 1,4%, ενώ για την ξηρή το ποσοστό είναι 1,3% (Topouzis et al, 2006). ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΑΜΦΙΒΛΗΣΤΡΟΕΙ ΟΥΣ Ο αµφιβληστροειδής είναι µια διαφανής εσωτερική επένδυση του βυθού του οφθαλµού, που αποτελείται από αρκετά στρώµατα υψηλά εξειδικευµένων κυττάρων ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 3

8 (Εικ. 2). Από αυτά, οι ραβδοειδείς και κωνοειδείς φωτοϋποδοχείς συλλαµβάνουν τις ηλιακές ακτίνες και τις µετατρέπουν σε ηλεκτροφυσιολογικές ώσεις. Ο εσωτερικός αµφιβληστροειδής είναι παρακείµενος στο υαλοειδές ενώ ο εξωτερικός στο χοριοειδές. Ο εξωτερικός αµφιβληστροειδής, που είναι η πιο σηµαντική δοµή στην AMD, αποτελείται από τα εξωτερικά τµήµατα των φωτοϋποδοχέων, το µελάγχρουν επιθήλιο του αµφιβληστροειδούς (Retinal Pigment Epithelium-RPE) και τη µεµβράνη του Bruch. Οι φωτοϋποδοχείς εξαρτώνται από ένα καλά λειτουργικό παρακείµενο RPE. Το RPE είναι µία µονή στοιβάδα από κυβοειδή κύτταρα, πλούσια σε µελανοσώµατα, από όπου προέρχεται και η ονοµασία και αποτελεί µέρος του αιµατο-οφθαλµικού φραγµού. Εκτελεί την σηµαντική λειτουργία της φαγοκυττάρωσης των χρησιµοποιηµένων εξωτερικών τµηµάτων των φωτοϋποδοχέων που αποβάλλονται καθηµερινά, ώστε να ανακυκλώνονται οι φωτοχρωστικές (όπως η ροδοψίνη) και τα µεµβρανικά λιπίδια (Ogden et al, 1994). Επίσης, µεταφέρει θρεπτικές ουσίες και αποικοδοµηµένα προϊόντα ανάµεσα στους φωτοϋποδοχείς και το παρακείµενο χοριοειδές αγγειακό πλέγµα, που διαχωρίζεται από το RPE µέσω της µεµβράνης του Bruch s (Walls G.L., 1963). Η µεµβράνη του Bruch είναι µια τριστρωµατική στοιβάδα κάτω από το RPE (Ogden et al, 1994). Αποτελεί ένα ηµιπερατό φράγµα ανταλλαγής που διαχωρίζει το RPE από το χοριοειδές, το οποίο προµηθεύει µε αίµα τα εξωτερικά στρώµατα του αµφιβληστροειδούς (Alfaro et al, 2005). Τόσο το RPE όσο και η µεµβράνη του Bruch παίζουν ένα κεντρικό ρόλο, από τη µία ως ένας φραγµός ανάµεσα στον υπο-αµφιβληστροειδικό χώρο και το χοριοειδές, και από την άλλη στη µεταφορά µορίων ανάµεσα σε αυτούς τους δύο χώρους (Ogden et al, 1994). Η ωχρά, ή ωχρά κηλίδα που στα λατινικά σηµαίνει κίτρινη κουκκίδα, είναι η κεντρική, οπίσθια περιοχή του αµφιβληστροειδούς [τα κεντρικά 25 mm 2 του αµφιβληστροειδούς (Ambati et al, 2003a)], η οποία είναι υπεύθυνη για την κεντρική όραση. Έχει διάµετρο 6 mm. Ο κύριος τύπος των κυττάρων των φωτοϋποδοχέων στην ωχρά κηλίδα είναι τα κωνοειδή, και η µεγαλύτερη πυκνότητά τους συναντάται στο βοθρίο (Ø 1.5 mm), που αποτελεί το κέντρο της ωχράς κηλίδας και την υπεύθυνη περιοχή για την οξεία όραση (Ogden et al, 1994). Στην ωχρά κηλίδα υπάρχει η πιο πυκνή συγκέντρωση σε φωτοϋποδοχείς από όλον τον αµφιβληστροειδή (Alfaro et al, 2005). Εξαιτίας αυτού, παρουσιάζει την υψηλότερη κατανάλωση οξυγόνου και τον υψηλότερο µεταβολικό ρυθµό (ανά γραµµάριο ιστού) από κάθε άλλο ιστό του σώµατος (Walls G.L., 1963). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 4

9 Εικόνα 2. Ανατοµικά στοιχεία του βολβού του οφθαλµού και εγκάρσια τοµή των διαφόρων στρωµάτων στην περιοχή της ωχράς κηλίδας (πηγή Novartis, από Seitsonen S., 2008). o Αλλαγές µε την ηλικία Με την ηλικία, µία αλλαγή που συµβαίνει στο µάτι είναι οι εστιακές εναποθέσεις εξω-κυτταρικών, πολυµορφικών υπολοίπων, ανάµεσα στο RPE και τη µεµβράνη του Bruch s. Αυτές οι εναποθέσεις, που ονοµάζονται drusen (Πίν. 1), παρατηρούνται κατά τη διάρκεια βυθοσκοπικής εξέτασης ως ωχρές κιτρινωπές αλλοιώσεις, τόσο στην περιοχή της ωχράς κηλίδας όσο και στον περιφερειακό αµφιβληστροειδή. Τα drusen κατηγοριοποιούνται σε µικρά (<63 µm σε διάµετρο), ενδιάµεσα ( µm), ή µεγάλα (>124 µm) (Bird et al, 1995; Klein et al, 1992). Τα drusen επίσης κατηγοριοποιούνται ως σκληρά ή µαλακά µε βάση την εµφάνιση των ορίων τους. Τα σκληρά drusen έχουν διακριτά όρια. Αντιστρόφως, τα µαλακά drusen γενικά έχουν ακαθόριστα άκρα, είναι συνήθως µεγάλα και µπορεί να είναι συµβάλλοντα (Bird et al, 1995). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 5

10 Πίνακας 1. Κάποια από τα συστατικά που έχουν βρεθεί στα ανθρώπινα drusen (Zarbin M.A., 2004). ΒΙΟΧΗΜΙΚΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΩΝ DRUSEN Α1-αντιτρυψίνη Β πεπτίδιο αµυλοειδούς Συστατικό Ρ αµυλοειδούς Απολιποπρωτεΐνες Β και Ε Εστέρες χοληστερόλης Παράγοντες συµπληρώµατος (C1q, C4, C5) Υποδοχέας συµπληρώµατος 1 Παράγοντας Χ Ανοσοσφαιρίνες Αντιγόνα ιστοσυµβατότητας τάξης ΙΙ Τµήµατα γλυκοπρωτεϊνών που αναγνωρίζονται από διάφορες λεκτίνες Προϊόντα προερχόµενα από υπεροξείδωση λιπιδίων Φωσφολιπίδια Αναστολέας 3 µεταλλοπρωτεϊνασών Ουβικουϊτίνη Βιτρονεκτίνη Τρανσθυρετίνη Στην AMD, διακόπτεται η στενή σύνδεση των φωτοϋποδοχέων, του RPE, της µεµβράνης του Bruch s και του χοριοειδούς. Κλινικά, η AMD ξεκινάει µε την ασυµπτωµατική εµφάνιση των drusen (Klein et al, 1992). Τι σηµατοδοτεί το σχηµατισµό τους δεν είναι ακόµη πλήρως κατανοητό, και επιπλέον ο σχηµατισµός τους δεν οδηγεί πάντα στην AMD. Ένα µάτι που έχει µόνο µερικά µικρά σκληρά drusen δε θεωρείται ότι πάσχει από AMD, καθώς τα drusen είναι ευρέως διαδεδοµένα σε άτοµα ηλικίας >50 ετών και θεωρούνται µέρος της φυσιολογικής γήρανσης. Ο υπερβολικός αριθµός drusen ωστόσο µπορεί να οδηγήσει σε βλάβη στο RPE (διαχωρίζουν σε µεγάλο βαθµό το RPE από το υποκείµενο χοριοειδές αγγειακό πλέγµα, και έτσι διακόπτουν τη λειτουργία του, οδηγώντας στην αποικοδόµηση των φωτοϋποδοχέων) (Chen et al, 2007). Βλάβες στο RPE και χρόνια ανώµαλη φλεγµονώδης απόκριση µπορεί να οδηγήσουν σε µεγάλες περιοχές αµφιβληστροειδικής ατροφίας (γεωγραφική ατροφία), σε έκφραση αγγειογενετικών κυτοκινών (όπως ο VEGF), ή και τα δύο (de Jong P.T., 2006). Επίσης, ανωµαλίες στο κολλαγόνο ή την ελαστίνη της µεµβράνης του Bruch s, στον εξωτερικό αµφιβληστροειδή ή στο χοριοειδές µπορούν να προδιαθέτουν κάποια άτοµα για αυτή τη διαδικασία (Marneros et al, 2007). Επακόλουθα, αναπτύσσεται χοριοειδής νεοαγγείωση (σχηµατισµός νέων ανώµαλων αγγείων) (CNV-Choroidal NeoVascularisation), που συνοδεύεται από αυξηµένη αγγειακή διαπερατότητα και ευθραυστότητα (Εικ. 3). Η CNV µπορεί να εκτείνεται πρόσθια µέσω διασπάσεων στη µεµβράνη του Bruch s και να οδηγήσει σε υπο-αµφιβληστροειδική αιµορραγία, ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 6

11 εξίδρωση υγρών, εναπόθεση λιπιδίων, αποκόλληση του RPE από το χοριοειδές, ινώδεις ουλές ή ένα συνδυασµό όλων αυτών των ευρηµάτων (de Jong P.T., 2006). Εικόνα 3. Απώλεια της κεντρικής όρασης σε ασθενείς µε AMD. (A) Αναπαράσταση του οπτικού πεδίου έτσι όπως το αντιλαµβάνεται ένα άτοµο µε φυσιολογική όραση και ένας ασθενής µε AMD. (B) Σχήµα ενός φυσιολογικού οφθαλµού σε σύγκριση µε έναν οφθαλµό ασθενή µε AMD. Απεικονίζονται οι εναποθέσεις των drusen (κίτρινες κουκκίδες) και η CNV στην ωχρά κηλίδα (κόκκινο). (C) Σχηµατική εγκάρσια τοµή ενός φυσιολογικού οφθαλµού: κατά µήκος της ωχράς κηλίδας διακρίνονται οι νευρικές στοιβάδες του αµφιβληστροειδούς, το RPE, η µεµβράνη του Bruch και τα χοριοειδή αγγεία. Στην AMD, η πολύ στενή σχέση ανάµεσα στους φωτοϋποδοχείς, το RPE, και τη χοριοειδή µεµβράνη διασπάται από τα drusen. Ο σχηµατισµός των drusen διαχωρίζει το RPE από τη µεµβράνη του Bruch και τα υποκείµενα χοριοειδή αγγεία σε συνδυασµό µε ατροφία του RPE και εκφυλισµό των φωτοϋποδοχέων (ξεχωριστά χαρακτηριστικά της ξηρής AMD). Στην υγρή AMD, όπου έχουµε CNV, παθολογικά διαρρηγµένα χοριοειδή αγγεία πολλαπλασιάζονται και διαπερνούν την αλλαγµένη µεµβράνη του Bruch, προεκβάλλοντας στον υπο-αµφιβληστροειδικό χώρο, προκαλώντας έτσι αιµορραγία και ταχεία απώλεια της όρασης (Chen et al, 2007). ΣΤΑ ΙΑ ΤΗΣ AMD Τα στάδια της ασθένειας αλλά και η αναγνώριση των κλινικών συµπτωµάτων της AMD (µεγάλα µαλακά drusen, εστιακή υπο/υπερ-µελάγχρωση του RPE, αποκόλληση του RPE, υπο-αµφιβληστροειδική αιµορραγία), είναι απαραίτητο να καθορίζονται επακριβώς, γιατί η παρουσία τους µπορεί να επηρεάσει τη συχνότητα ή/και το είδος της θεραπείας. Η ακριβής κλινική διάγνωση είναι σηµαντική τόσο για να καθοριστούν η πρόγνωση και η κλινική µεταχείριση, όσο και για τα ερευνητικά πρωτόκολλα σε επιδηµιολογικές µελέτες. Αν και υπάρχουν πολλά συστήµατα ταξινόµησης για την AMD (π.χ. Klein et al, 1991; Bird et al, 1995; van Leeuwen et al, 2003b; Seddon et al, 2006b), αυτό που χρησιµοποιείται ευρέως σήµερα είναι το σύστηµα που προτάθηκε από τη µελέτη ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 7

12 AREDS (Age-Related Eye Disease Study) (AREDS report 6, 2001). Σύµφωνα µε αυτό, η ασθένεια χωρίζεται σε πρώιµα, ενδιάµεσα και προχωρηµένα στάδια. Η πρώιµη AMD χαρακτηρίζεται από την παρουσία λίγων (<20), µεσαίου µεγέθους drusen ή ανωµαλιών στο RPE. Η ενδιάµεση AMD χαρακτηρίζεται από την παρουσία τουλάχιστον ενός µεγάλου drusen, πολυάριθµων µεσαίου µεγέθους drusen, ή γεωγραφική ατροφία που δεν εκτείνεται στο κέντρο της ωχράς κηλίδας. Τέλος, η προχωρηµένη AMD µπορεί να είναι είτε νεοαγγειωτική (υγρή/εξιδρωµατική), είτε µη-νεοαγγειωτική (ξηρή/ατροφική/µη-εξιδρωµατική). Η ξηρή AMD χαρακτηρίζεται από την παρουσία drusen και γεωγραφικής ατροφίας που εκτείνεται στο κέντρο της ωχράς κηλίδας, ενώ η υγρή AMD χαρακτηρίζεται από CNV και τα δευτερογενή αποτελέσµατα αυτής (Jager et al, 2008). ΙΑΓΝΩΣΗ Η κλινική διάγνωση της AMD γίνεται µε τον συνδυασµό ειδικής οφθαλµολογικής εξέτασης (βυθοσκόπηση ή φωτογράφηση του βυθού) µε συγκεκριµένες τεχνικές οφθαλµικής απεικόνισης, όπως η αγγειογραφία µε χορήγηση φλουοροσκεΐνης (FA-Fluorescein Angiography) ή µε χορήγηση πράσινης ινδοκυανίνης (ICG-Indocyanine Green Angiography) (Jager et al, 2008). Αυτές βοηθούν στο να αναγνωριστούν και να χαρακτηριστούν τα τµήµατα του οφθαλµού µε CNV, και επιπλέον επιτρέπουν την ταξινόµηση στα διάφορα στάδια (Bird et al, 1995). Νεότερες τεχνικές απεικόνισης, λιγότερο επεµβατικές, που χρησιµοποιούνται πλέον αρκετά στις κλινικές µελέτες, είναι η τοµογραφία οπτικής συνάφειας (OCT- Optical Coherence Tomography), η οφθαλµοσκόπηση σάρωσης µε λέιζερ (SLO - Scanning Laser Ophthalmoscopy), ο αυτό-φθορισµός του βυθού, και η λειτουργική απεικόνιση (µικρο-περιµέτρηση του βυθού) (Hubschman et al, 2009a). Θα πρέπει να τονιστεί ότι η αποτελεσµατικότητα των νέων φαρµακολογικών παραγόντων (που θα αναφερθούν στη συνέχεια) έχει τη δυνατότητα να αυξηθεί εκθετικά, όταν αυτοί χρησιµοποιούνται σε συνδυασµό µε τις νέες και βελτιωµένες τεχνικές απεικόνισης. Και αυτό αφορά κυρίως την υγρή AMD, όπου αυτές οι νέες τεχνικές επιτρέπουν ανίχνευση σε πρωιµότερα στάδια και αναγνώριση προγνωστικών παραγόντων. Εποµένως, µπορεί να ακολουθήσει και πιο ακριβής θεραπευτική αγωγή αλλά και να ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 8

13 παρακολουθείται η απόκριση στη θεραπεία πιο άµεσα και λιγότερο επεµβατικά (Hubschman et al, 2009a). Στην πρώιµη AMD, η απώλεια όρασης είναι γενικά µέτρια ή και ασυµπτωµατική. Ωστόσο, µπορεί να υπάρχουν συµπτώµατα, όπως θολή όραση, µαύρα σηµάδια στην όραση (σκοτώµατα), µειωµένη ευαισθησία αντίθεσης, µη φυσιολογική προσαρµογή στο σκοτάδι και η ανάγκη για λαµπερότερο φωτισµό. Στους ασθενείς που έχουν ξηρή AMD, τυπικά αναπτύσσεται σταδιακή, λανθάνουσα απώλεια όρασης, µε κεντρικά ή περικεντρικά οπτικά σκοτώµατα, συνήθως µε την πάροδο µηνών ή και ετών. Αντιθέτως, οι ασθενείς µε υγρή AMD µπορεί να έχουν ξαφνική και βαθιά απώλεια όρασης µέσα σε ηµέρες ή εβδοµάδες, ως αποτέλεσµα της αιµορραγίας κάτω από τον αµφιβληστροειδή ή/και της συσσώρευσης υγρού, που είναι δευτερεύοντα της CNV (Jager et al, 2008). Καθώς τα συµπτώµατα συχνά ποικίλλουν, το κάθε µάτι θα πρέπει να εξετάζεται προσεκτικά (µε το άλλο µάτι καλυµµένο), µετρώντας την οπτική οξύτητα και ελέγχοντας για λεπτές διαστρεβλώσεις στο πλέγµα του Amsler (µια τετράγωνη εικόνα από κάθετες και οριζόντιες γραµµές που βοηθάει στην εκτίµηση του κεντρικού οπτικού πεδίου ενός ατόµου). Τα σκοτώµατα και οι οπτικές διαστρεβλώσεις εµφανίζονται ως διακοπές, διακυµάνσεις ή κοµµάτια που λείπουν στις γραµµές του πλέγµατος (Εικ. 4). Πολλοί ασθενείς αγνοούν αυτές τις λεπτές αλλαγές στην όρασή τους, εποµένως οι περιοδικές εξετάσεις από ειδικούς οφθαλµιάτρους είναι υψίστης σηµασίας για την εντόπιση της υγρής AMD, καθώς η έγκαιρη διάγνωση και αντιµετώπιση µπορεί να οδηγήσουν σε καλύτερη έκβαση (Jager et al, 2008). Επίσης, πρέπει να αναφερθεί ότι όταν αναπτυχθεί προχωρηµένη AMD στο ένα µάτι, υπάρχει σηµαντική πιθανότητα [43% σύµφωνα µε µια αναφορά (AREDS,report 8, 2001)] να αναπτυχθεί και στο άλλο µάτι µέσα σε 5 χρόνια. Ο κίνδυνος legal τύφλωσης και στα δύο µάτια (οπτική οξύτητα 20/200) για ένα άτοµο µε µονόπλευρη απώλεια όρασης λόγω υγρής AMD κυµαίνεται γύρω στο 12% µετά από µια περίοδο 5 ετών (Macular Photocoagulation Study Group, 1997). Αξίζει να σηµειωθεί ότι πολλοί ασθενείς αγνοούν ότι πάσχουν από AMD, ακόµα και όταν η ασθένεια έχει φτάσει σε προχωρηµένα στάδια. Αυτό οφείλεται στην γενικευµένη άγνοια του κοινού σχετικά µε αυτή την ασθένεια αλλά και στη λαθεµένη εντύπωση που έχουν πολλές φορές οι ηλικιωµένοι ότι η όραση εξασθενίζει µε τα χρόνια σαν ένα φυσικό επακόλουθο της γήρανσης. Ενδεικτικά, αναφέρεται ότι από το σύνολο των ασθενών µε AMD στη µελέτη TES στον ελληνικό πληθυσµό, το 67% ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 9

14 είχαν άγνοια για τη κατάστασή τους. Πιο συγκεκριµένα, το 58% των ασθενών µε υγρή και το 78% των ασθενών µε ξηρή AMD δε γνώριζαν ότι έπασχαν από την ασθένεια (Topouzis et al, 2006). Το εύρηµα αυτό τονίζει την σηµαντική ανάγκη για ενηµέρωση του κοινού αλλά και των ειδικών σχετικά µε την ασθένεια της AMD. Εικόνα 4. Το πλέγµα του Amsler µπορεί να χρησιµοποιηθεί για να ανιχνεύσει λεπτές περιοχές παραµόρφωσης (διακύµανση στις γραµµές του πλέγµατος, θολές γραµµές, σκοτεινές περιοχές), που αποτελούν ένδειξη για οπτική διαταραχή. Αριστερά, παρατηρούµε πώς βλέπει το πλέγµα ένα άτοµο µε φυσιολογική όραση και δεξιά πώς το βλέπει ένα άτοµο που πάσχει από AMD. ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ Υπάρχουν πλέον στοιχεία ότι διάφοροι παθογενετικοί παράγοντες αποτελούν τη βάση για την AMD. Για αυτό τον λόγο, οι διαθέσιµες θεραπείες δεν είναι θεραπείες της αιτίας αλλά βοηθούν γενικά στο να αποφευχθεί η περαιτέρω απώλεια όρασης (σπάνια οδηγούν σε βελτίωσή της). Καµία από τις µέχρι σήµερα χρησιµοποιούµενες θεραπείες δε µπορεί να γιατρέψει την AMD ή να αναστρέψει την πορεία της. Βέβαια υπάρχει η ελπίδα ότι µελλοντικά θα αναπτυχθούν θεραπείες µε καλύτερα αποτελέσµατα, καθώς γίνεται εκτεταµένη έρευνα για να καθοριστούν οι περιβαλλοντικοί παράγοντες που αποτελούν τους παράγοντες κινδύνου αλλά και να καθοριστεί η πορεία της νόσου σε µοριακό, γενετικό και κυτταρικό επίπεδο. Μέχρι σήµερα, δεν υπάρχει καθιερωµένη αποτελεσµατική θεραπεία για την ξηρού τύπου AMD, και οι περισσότερες θεραπείες αλλά και οι έρευνες κατευθύνονται προς την υγρού τύπου AMD (κατά της CNV). Στη βιβλιογραφία υπάρχει ένας µεγάλος αριθµός ανασκοπήσεων σχετικά µε τις ήδη υπάρχουσες θεραπείες αλλά και όσες ερευνώνται σε προ-κλινικές µελέτες ή κλινικές δοκιµές (Hubschman et al, 2009a+2009b; Augustin et al, 2009; Beutel et al, 2009; Kuppermann et al, 2009; Feret et al, ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 10

15 2007; Coleman et al, 2007; Nowak et al, 2006). Οι βασικότερες θεραπευτικές προσεγγίσεις παρουσιάζονται παρακάτω. Η πιο κοινή µέθοδος αντιµετώπισης της υγρής AMD είναι η θεραπεία µε αντιαγγειογενετικούς παράγοντες, ιδίως η χρήση παραγόντων αντι-vegf (Vascular Endothelial Growth Factor - Αγγειακός Ενδοθηλιακός Αυξητικός Παράγοντας). Ο VEGF εµπλέκεται σε µεγάλο βαθµό στη διαδικασία της αγγειογένεσης (θετικός ρυθµιστικός παράγοντας), ωστόσο υπάρχουν και άλλοι θετικοί (αυξητικοί παράγοντες ινοβλαστών, ηπατοκυττάρων και συνδετικού ιστού, αγγειοποιητίνες, TGF-a και -b, IL-8) αλλά και αρνητικοί (αγγειοστατίνη, ενδοστατίνη, προερχόµενος από το µελάγχρουν επιθήλιο παράγοντας), ρυθµιστικοί παράγοντες. Συνήθως, οι αντιαγγειογενετικοί παράγοντες χορηγούνται µε ενδοφθάλµιες ενέσεις στο υαλώδες σώµα του οφθαλµού, αλλά έχουν δοκιµαστεί και δοκιµάζονται και άλλες οδοί χορήγησης (συστηµική ή τοπική έγχυση µε σταγόνες ή τοπική µεταφορά µέσω ενός ιούγονιδιακή θεραπεία). Να σηµειωθεί ότι ένα πολύ σηµαντικό εµπόδιο στο συνδυασµό θεραπευτικών προσεγγίσεων για την AMD είναι και η στόχευση του φαρµάκου, καθώς εκτός από τη δυσκολία για επαναλαµβανόµενη χορήγηση στον χώρο του υαλώδους, η ανατοµία του οφθαλµού απαγορεύει µεγάλους όγκους φαρµάκων (Kuppermann D., 2009). Ο πρώτος αντι-vegf παράγοντας που εγκρίθηκε από το FDA ( εκέµβριος 2004) για τη θεραπεία της υγρής AMD, είναι το pegaptanib sodium (Macugen, από την Pfizer/Eyetech Pharmaceuticals), ένα απταµερές, ανταγωνιστής του VEGF (ολιγονουκλεοτίδιο RNA 28 bp). Το Macugen είναι ένα διάλυµα για ενδοφθάλµια έγχυση (0,3mg), που χορηγείται στο προσβεβληµένο µάτι κάθε έξι εβδοµάδες ( Ωστόσο, δε βελτιώνει την όραση, παρά µόνο µπορεί να τη σταθεροποιήσει και για αυτόν τον λόγο σήµερα δε χρησιµοποιείται ευρέως. Οι άλλοι δύο αντι-vegf παράγοντες που δρουν µε τον ίδιο τρόπο (πρόσδεση στον VEGF) και χρησιµοποιούνται σήµερα είναι το bevacizumab (Avastin, από την Genentech), το οποίο είναι ένα µονοκλωνικό αντίσωµα (ειδικό αντι-vegf ανασυνδυασµένο µονοκλωνικό αντίσωµα 149 kda) και το ranibizumab (Lucentis, από την Genetech), που είναι ένα κοµµάτι του Avastin (48 kda). Το Lucentis έχει εγκριθεί από το FDA (Ιούνιος 2006), χορηγείται µία φορά το µήνα (0,5mg) και αποτελεί τη µοναδική εγκεκριµένη από το FDA θεραπεία για την υγρή AMD που έχει αποδειχθεί να σταθεροποιεί ή και να βελτιώνει την όραση. Το Avastin από την άλλη, ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 11

16 έχει εγκριθεί από το FDA (Φεβρουάριος 2004) για τη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου µε συστηµική χορήγηση, αλλά ακόµη δεν έχει εγκριθεί για τη θεραπεία της υγρής AMD ( Πολλές µελέτες έχουν δείξει ότι το Avastin χορηγούµενο ενδοφθάλµια (1mg ή 1,25mg µηνιαία) οδηγεί σε βελτίωση στην οπτική οξύτητα παρόµοια µε τη βελτίωση που προκαλεί το Lucentis. Καθώς η διαφορά στο κόστος αυτών των δύο φαρµάκων είναι τεράστια ($1.950 για το Lucentis και περίπου $30 για το Avastin), η ενδεχόµενη παρόµοια αποτελεσµατικότητα του Avastin σε συνδυασµό µε το δραµατικά χαµηλότερο κόστος πιθανώς να οδηγήσει σε επικράτησή του όταν εγκριθεί από το FDA. Ωστόσο πρέπει να σηµειωθεί ότι καθώς το Avastin κυκλοφορεί στην αγορά, χρησιµοποιείται πλέον ευρέως χωρίς άδεια. Υπάρχει ένα πλήθος άλλων αντι-αγγειογενετικών φαρµακευτικών ουσιών που δοκιµάζονται σε προ-κλινικές ή κλινικές µελέτες, µε τα αρχικά αποτελέσµατα να είναι ενθαρρυντικά (Πίν. 2). Πίνακας 2. Φαρµακευτικές ουσίες που δοκιµάζονται για τη θεραπεία της AMD και ο τρόπος δράσης τους. Ουσία Anecortave acetate (Retaane) sirna bevasiranib sirna Sirna-027 VEGF Trap AdPEDF.11 Triamcinolone acetonide Vatalanib Ανασυνδυασµένη βασοστατίνη Infliximab (Remicade) Rapamycin Daclizumab E10030 Volociximab ARC1905 Short hairpin RNA (shrnas) Στόχος/δράση Αγγειοστατικός παράγοντας (προέρχεται από κορτιζένη) mrna του VEGF mrna του VEGF-R1 Ανασυνδυασµένος διαλυτός υποδοχέας του VEGF Αντι-αγγειογενετική κυτοκίνη (PEDF), µε χρήση αδενοϊού Αντι-φλεγµονώδες κορτικοστεροειδές Αναστολέας κινασών τυροσίνης των VEGFR1/VEGFR2, Αναστολέας αγγειογένεσης Κατά του µονοπατιού του TNF Αντι-αγγειογενετικές ιδιότητες Αντίσωµα κατά του υποδοχέα της IL-2 Απταµερές, αντι-pdgf Αντίσωµα κατά της a5β1 ιντεγκρίνης Aπταµερές, αντι-c5 Κατά του VEGF µέσω αδενοϊικών φορέων Μια πρόσφατη µελέτη από τους Takeda και συν. αποκάλυψε ένα νέο πιθανό θεραπευτικό στόχο για την AMD, τον υποδοχέα 3 της χηµειοκίνης µε µοτίβο CC (CCR3), που εκφράζεται ειδικά στα χοριοειδή ενδοθηλιακά κύτταρα µόνο σε ασθενείς µε AMD. Σε ένα πειραµατικό µοντέλο CNV σε ποντικούς, οι ερευνητές έδειξαν ότι ένα αντι-ccr3 αντίσωµα ήταν ασφαλές, θεραπευτικά αποτελεσµατικό και ελαφρώς πιο δραστικό από το αντι-vegf αντίσωµα. Επιπλέον, ενώ µέχρι σήµερα το CCR3 ήταν γνωστό ως στοιχείο του µονοπατιού της φλεγµονής και όχι της ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 12

17 αγγειογένεσης, οι συγγραφείς βρήκαν ότι οι επιδράσεις του CCR3 στο µοντέλο τους έγιναν µέσω ενός αντι-αγγειογενετικού µονοπατιού (ανεξάρτητου του VEGF), και όχι µέσω φλεγµονής (Takeda et al, 2009). Μία θεραπεία που χρησιµοποιείται εδώ και χρόνια ευρέως µε γενικά καλή έκβαση (καθώς σταθεροποιεί προσωρινά τα ήδη υπάρχοντα διαρρέοντα αγγεία του αίµατος, αλλά δεν αποτρέπει το σχηµατισµό νέων ανώµαλων αγγείων) είναι η φωτοδυναµική θεραπεία (PhotoDynamic Therapy-PDT). Ο φωτοευαίσθητος παράγοντας verteporfin (Visudyne, από την Novartis), που έχει εγκριθεί από το FDA τον Απρίλιο του 2000, χορηγείται µε ένεση τοπικά, και ενεργοποιείται εστιασµένα πάνω από την ωχρά κηλίδα µε λέιζερ, προκαλώντας τοπική θρόµβωση στις περιοχές µε CNV. Η µέθοδος σχετίζεται µε σοβαρές παρενέργειες και για αυτό τον λόγο σήµερα γίνονται έρευνες συνδυαστικής θεραπείας PDT µε αντι-αγγειογενετικούς παράγοντες (triamcinolone acetonide + dexamethasone - τριπλή θεραπεία). Επίσης, σε συγκεκριµένες περιπτώσεις προχωρηµένης CNV χρησιµοποιείται η συγκόλληση µε θερµικό λέιζερ (Thermal Laser Photocoagulation - TLP), η οποία ωστόσο ενέχει τον κίνδυνο για προσωρινή και άµεση απώλεια όρασης. Η χειρουργική αφαίρεση των περιοχών µε CNV πλέον χρησιµοποιείται µόνο σε πολύ ειδικές περιπτώσεις, καθώς φαίνεται να έχει χαµηλή αποτελεσµατικότητα, µεγάλη πιθανότητα να επανεµφανιστεί CNV αλλά και σοβαρούς κινδύνους. Πιο πρόσφατα, ξεκίνησαν να γίνονται µελέτες χειρουργικής µετατόπισης της ωχράς κηλίδας. Εδώ, ο αµφιβληστροειδής αποκολλάται και ανυψώνεται πάνω από την περιοχή της CNV προς µια περιοχή µε φυσιολογικά κύτταρα RPE. Αυτή η προσέγγιση επιτρέπει να θεραπευτεί η CNV µε διάφορους τρόπους. Τέλος, δοκιµάζεται και η µεταµόσχευση κυττάρων του αµφιβληστροειδούς (µελλοντικά ίσως χρησιµοποιηθούν και στελεχιαία κύτταρα), τόσο για να σταµατήσει η ανάπτυξη της ασθένειας όσο και για να βελτιωθεί η οπτική λειτουργία. Αν και η ξηρή AMD αντιπροσωπεύει το 90% όλων των περιστατικών µε AMD, δεν υπάρχει διαθέσιµη αποτελεσµατική θεραπεία. Καθώς τώρα έχουν αρχίσει να γίνονται περισσότερο κατανοητές οι παθολογικές διαδικασίες που συµµετέχουν, νέες προσεγγίσεις ερευνώνται για την πρόληψη και την θεραπεία της. Η ξηρή AMD είναι µια νευροεκφυλιστική ασθένεια του αµφιβληστροειδούς. Το RPE φαίνεται να αποτελεί στόχο φλεγµονής, οξειδωτικού στρες, και πιθανόν συσσώρευσης λιποφουσκινών. Εποµένως, η αποτροπή αυτών των παραγόντων µπορεί να καθυστερήσει την εξέλιξη της. ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 13

18 εδοµένα από τη µελέτη AREDS (Age-Related Eye Disease Study) έχουν δείξει την προληπτική επίδραση των αντιοξειδωτικών στην καθυστέρηση της εξέλιξης της ξηρής AMD. Συγκεκριµένα, η χρήση ενός ηµερήσιου συµπληρώµατος αντιοξειδωτικών, που αποτελείται από βιταµίνη C (500mg), βιταµίνη E (400 IU), β- καροτένιο (15mg), οξείδια ψευδαργύρου (80mg) και οξείδια χαλκού (2mg), βρέθηκε να µειώνει τον ρυθµό της εξέλιξης από ενδιάµεση σε προχωρηµένη AMD κατά 25% σε µια περίοδο 5 ετών και να οδηγεί σε µείωση 19% στον κίνδυνο µέτριας απώλειας όρασης (AREDS report no.8, 2001). Επιπλέον, αναφέρεται ότι από τα 1,3 εκατοµµύρια άτοµα που εκτιµάται ότι θα αναπτύξουν προχωρηµένη AMD, οι θα µπορούσαν να την αποφύγουν (και έτσι να αποφύγουν την απώλεια όρασης κατά τα επόµενα 5 έτη), εάν λαµβάνουν συµπληρώµατα τύπου της µελέτης AREDS (Bressler et al, 2003). Τα συµπληρώµατα αυτά πλέον συνιστώνται από τους οφθαλµιάτρους, για την πρόληψη κυρίως της ξηρής αλλά και της υγρής AMD. Σύµφωνα µε τελευταία δεδοµένα, τα καροτενοειδή λουτεΐνη και ζεαξανθίνη, που βρίσκονται φυσιολογικά στην ωχρά κηλίδα και βοηθούν στην προστασία του αµφιβληστροειδούς και του RPE από βλάβες που προκαλούνται από το φως, δείχνουν προστατευτικό ρόλο κατά των επιζήµιων φωτο-οξειδωτικών διαδικασιών που λαµβάνουν χώρα κατά την πορεία της λιποφουσκογένεσης, έχοντας έτσι επίδραση στην ανάπτυξη της AMD. Επιπλέον, το πολυακόρεστο ω-3 λιπαρό οξύ DHA (DocosaHexaenoic Acid) βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στα εξωτερικά τµήµατα των φωτοϋποδοχέων, που συνεχώς απορρίπτονται και ανακυκλώνονται υπό φυσιολογικές συνθήκες. Μία ανεπάρκεια στο DHA εποµένως, θα µπορούσε να βλάπτει τη λειτουργία του αµφιβληστροειδούς και να επάγει την AMD. Επί του παρόντος εκτιµάται στην κλινική µελέτη AREDS2 (ξεκίνησε το φθινόπωρο του 2006) η αποτελεσµατικότητα των παραπάνω ουσιών (λουτεΐνη-10mg/ηµέρα, ζεαξανθίνη- 2mg/ηµέρα, DHA+εικοσαπεντανοϊκό οξύ σε σύνολο 1g/ηµέρα) στη µείωση της εξέλιξης σε προχωρηµένη ξηρή και υγρή AMD. Ο σηµαντικός ρόλος της φλεγµονής στην παθοφυσιολογία της ξηρής AMD έχει καθιερωθεί από την πρόσφατη ανακάλυψη της συσχέτισης µεταλλάξεων στον παράγοντα H του συµπληρώµατος (CFH) µε την AMD. Αυτές οι µεταλλάξεις είναι υπεύθυνες για αυξηµένη ενεργοποίηση του εναλλακτικού µονοπατιού του συµπληρώµατος. Εποµένως, ένας αναστολέας του εναλλακτικού µονοπατιού πιθανόν να έχει αποτελεσµατικό ρόλο ως θεραπεία κατά της AMD (έρευνες µε τον POT-4 αναστολέας του παράγοντα του συµπληρώµατος C3). Επιπλέον, σε πιλοτικές µελέτες ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 14

19 ελέγχεται το φάρµακο Copaxone, ένα νέο ανοσο-ρυθµιστικό φάρµακο για το οποίο προκαταρκτικά αποτελέσµατα έδειξαν ότι µειώνει τα drusen και προλαµβάνει την εξέλιξη σε ξηρή AMD. Επίσης, και στην περίπτωση της ξηρής AMD, ερευνάται εάν η µεταµόσχευση υγιών κυττάρων του αµφιβληστροειδούς (µελλοντικά ίσως και στελεχιαίων) µπορεί να επιτρέψει την ανανέωση των φωτοϋποδοχέων. Για τους ασθενείς µε σοβαρή απώλεια όρασης, ένας τρόπος αποκατάστασης είναι η χρήση διαφόρων βοηθηµάτων χαµηλής όρασης όπως µεγεθυντικοί φακοί, µηχανές ανάγνωσης, ηχητικά βιβλία, ηλεκτρονικές συσκευές µεγέθυνσης, ειδικό λογισµικό υπολογιστών. Η εµφύτευση τεχνητών ενδοφθάλµιων συσκευών (µικροσκοπικά εµφυτεύσιµα τηλεσκόπια) µπορεί επίσης να ωφελήσει ασθενείς που δεν ανταποκρίνονται σε άλλες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Μελλοντικά αυτές οι συσκευές µπορεί να βοηθήσουν στην αποκατάσταση λειτουργικής όρασης, αλλά προς το παρόν η τεχνογνωσία είναι αρκετά πρωτόγονη. Μια µελέτη φάσης 1/2 βρίσκεται σε εξέλιξη για την αποτελεσµατικότητα ενός τέτοιου οπτικού προσθετικού εµφυτεύµατος. Ο βασικότερος περιορισµός και ανησυχία του FDA αφορά στην απώλεια ενδοθηλιακών κυττάρων λόγω τραυµατισµού κατά τη διαδικασία της εµφύτευσης. Ο πρωταρχικός στόχος στη διαχείριση της AMD είναι να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια όρασης και η σχετιζόµενη φυσική και συναισθηµατική εξασθένηση των ασθενών, ώστε να βελτιστοποιηθεί η σχετιζόµενη µε την όραση ποιότητα ζωής τους. Θα πρέπει να σηµειωθεί ότι οι περισσότερες από τις θεραπείες συνδέονται µε διάφορες παρενέργειες (ήπιες ή και σοβαρότερες), απαιτούν επαναλήψεις κατά τακτά χρονικά διαστήµατα, και πάντα ανάλογα µε την περίπτωση θα πρέπει να επιλέγεται αυτή που δίνει το µεγαλύτερο πλεονέκτηµα στον κάθε ασθενή. Αυτό εξαρτάται από το είδος και το στάδιο της ασθένειας, την έκταση των προκληθέντων βλαβών, αλλά και το γενετικό υπόβαθρο του κάθε ασθενή. Για παράδειγµα, µελέτες έχουν αποδείξει ότι ασθενείς οµόζυγοι για το αλληλόµορφο T1277C (Tyr402His) του γονιδίου CFH ανταποκρίνονται λιγότερο σε θεραπεία µε Avastin σε σχέση µε τους ετερόζυγους (Brantley et al, 2007). Επιπλέον, καθώς η παθοφυσιολογία της ασθένειας είναι γνωστό σήµερα ότι είναι περίπλοκη, η στρατηγική που επιχειρείται είναι ένας συνδυασµός πολλών θεραπειών που έχουν συνεργατικό τρόπο δράσης, ώστε (θεωρητικά τουλάχιστον) να µειωθεί η συχνότητα των επαναχορηγήσεων και να επιτραπεί σταθεροποίηση ή και βελτίωση της όρασης µεγαλύτερη από αυτήν που προσφέρει η µονοθεραπεία µεµονωµένα. ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 15

20 Τέλος, πέρα από τις θεραπευτικές προσεγγίσεις, ως µέσο πρόληψης της AMD προτείνεται µε βάση πλήθος επιδηµιολογικών µελετών τα άτοµα από νωρίς στη ζωή τους να ακολουθούν µια ισορροπηµένη δίαιτα, φτωχή σε λιπαρά και πλούσια σε αντιοξειδωτικές ουσίες, να διατηρούν φυσιολογικό βάρος και πίεση, αλλά κυρίως να αποφεύγουν το κάπνισµα. ΕΠΙΠΤΩΣΕΙΣ Η επίπτωση της AMD στους ασθενείς είναι τεράστια. Καθώς η ασθένεια εξελίσσεται, οι ασθενείς υποφέρουν από ένα µεγάλο αριθµό προβληµάτων µε την όρασή τους, όπως µειωµένη κεντρική οπτική οξύτητα, εξασθενηµένη έγχρωµη όραση, µειωµένη ευαισθησία αντίθεσης. Αυτά µε τη σειρά τους έχουν σηµαντικές και καταστροφικές επιδράσεις στην ψυχοκοινωνική συµπεριφορά τους. Αυτό ισχύει κυρίως για την υγρή AMD, η οποία παρόλο που αφορά µόνο ένα 10% όλων των ασθενών µε AMD, είναι υπεύθυνη για το 90% της απώλειας όρασης από αυτή την ασθένεια (Woo and Au Eong, 2008). Η οπτική εξασθένηση που προκαλεί η AMD, περιορίζει την ικανότητα ενός ασθενούς να φέρει σε πέρας δραστηριότητες της καθηµερινής ζωής του, και για αυτό τον λόγο µειώνει το αίσθηµα αυτονοµίας και ανεξαρτησίας του. Συγκεκριµένα, το άτοµο παρουσιάζει αυξηµένη δυσκολία στο να αναγνωρίζει πρόσωπα (συµπεριλαµβανοµένων των οικείων του) και άλλους στόχους του πραγµατικού κόσµου, χρειάζεται πολύ µεγαλύτερο διάστηµα για να διεκπεραιώσει καθηµερινές δραστηριότητες, όπως το διάβασµα αλλά και η εντόπιση πραγµάτων µέσα στο ίδιο του το σπίτι, χάνει την ικανότητα οδήγησης, και επίσης βρίσκεται σε µεγαλύτερο κίνδυνο για πτώσεις και κατάγµατα και έχει αυξηµένη ανάγκη νοσηλευτικής φροντίδας (Woo and Au Eong, 2008). Επιπλέον, η προχωρηµένη AMD συσχετίζεται µε χαµηλότερα σκορ σε πολλές ειδικές µετρήσεις για την ποιότητα ζωής που σχετίζονται µε την όραση (Quality Of Life - QOL). Ανάλογα µε τη σοβαρότητά της, η AMD έχει βρεθεί ότι προκαλεί 17%- 63% µείωση στην QOL, σε σχέση µε ασθένειες όπως ο καρκίνος, το έµφραγµα και το εγκεφαλικό επεισόδιο (Brown et al, 2006). Σε µια µελέτη τους, οι Brody και συν. βρήκαν ότι περίπου το 1/3 των ασθενών µε AMD έπασχε από κλινική κατάθλιψη (Brody et al, 2001), ενώ σε αντίστοιχη µελέτη, οι Ronver και συν. βρήκαν ότι το 33% ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 16

21 των ασθενών µε AMD είχε κατάθλιψη, που συσχετίστηκε και µε περαιτέρω µείωση στην οπτική λειτουργία (όπως την αντιλαµβάνονταν οι ίδιοι οι ασθενείς), ανεξάρτητα από αλλαγές στην οπτική οξύτητα και την ιατρική τους κατάσταση. Αυτά ισχύουν ακόµη και στην περίπτωση που πάσχει το ένα µόνο µάτι (Ronver et al, 2002). Σε οικονοµική κλίµακα, τόσο οι ασθενείς µε AMD όσο και η κοινωνία, πληρώνουν ένα µεγάλο τίµηµα (Smiddy et al, 2007). Τα άµεσα κόστη για τους ασθενείς (φάρµακα, εξετάσεις) είναι πολύ µεγάλα, και λαµβάνοντας υπόψη και τα έµµεσα (απώλεια παραγωγικότητας, ανεργία, έξοδα περίθαλψης), το οικονοµικό βάρος είναι ακόµη υψηλότερο και κάθε χρόνο αυξάνεται. Το συνολικό ετήσιο κόστος για την περίθαλψη των ασθενών µε AMD έχει υπολογιστεί ότι είναι 7 φορές υψηλότερο σε σχέση µε τους µη-ασθενείς (Lotery et al, 2007). Στις ΗΠΑ, η ασθένεια αποτελεί ένα σηµαντικό οικονοµικό βάρος στο σύστηµα υγείας της χώρας, για µια απλή ασθένεια των οφθαλµών, και αυτό ίσχυε ακόµη και πριν εφαρµοστούν η φωτοδυναµική θεραπεία και η χορήγηση αντι-vegf φαρµάκων. Το µέσο κόστος για έναν ασθενή µε υγρή και ξηρή AMD στις ΗΠΑ έχει υπολογιστεί σε $1.607 και $832 αντίστοιχα, σε σύγκριση µε τα $658 των υπολοίπων ατόµων (που πάσχουν από άλλες παθήσεις, π.χ. βλεφαρίτιδα) (Coleman et al, 2008). Παροµοίως και για την Ευρώπη, το ετήσιο κόστος για την AMD σε Γαλλία, Γερµανία, Ιταλία και Αγγλία εκτιµάται ότι κυµαίνεται µεταξύ 51,3 και 101,1 εκατοµµύρια (Bonastre et al, 2002). ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΤΗΣ AMD Παρά την εντατική βασική και κλινική έρευνα, η παθογένεση της AMD παραµένει ασαφής, πιθανώς λόγω του πολυπαραγοντικού της χαρακτήρα. Εκτός από την ισχυρή ηλικιακή εξάρτηση της ασθένειας, µια πολύπλοκη αλληλεπίδραση µεταβολικών, λειτουργικών, γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων φαίνεται ότι δηµιουργεί το υπόστρωµα για χρόνια αναπτυσσόµενες αλλαγές στην περιοχή της ωχράς κηλίδας, που µπορεί να συνεισφέρουν σε ποικίλο βαθµό στην έναρξη και την τελική εικόνα της AMD (Nowak J.Ζ., 2006). Η παθοφυσιολογία της AMD είναι περίπλοκη. Εκτός από την γενετική προδιάθεση, τέσσερις τουλάχιστον διαδικασίες ενέχονται στην εκδήλωση της ασθένειας: 1) η λιποφουσκινογένεση (σύνδεση µε το οξειδωτικό στρες), 2) ο σχηµατισµός drusen (drusoγένεση), 3) η τοπική φλεγµονή και 4) η νεοαγγείωση ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 17

22 (στην περίπτωση της υγρής µορφής) (βλ. για λεπτοµέρειες Ding et al, 2009; Montezuma et al, 2007; Nowak J.Ζ., 2006). Στην Εικ. 5 αναπαριστάνονται σχηµατικά οι βασικές διαδικασίες που ενέχονται στην ανάπτυξη της AMD. Εικόνα 5. Τέσσερις βασικές διαδικασίες ενέχονται στην παθογένεση της AMD: σχηµατισµός λιποφουσκινών, σχηµατισµός drusen, τοπική φλεγµονή και νεοαγγείωση. [POS: εξωτερικό τµήµα φωτοϋποδοχέων (Photoreceptor Outer Segment), RPE: µελάγχρουν επιθήλιο αµφιβληστροειδούς, CFH: παράγοντας Η συµπληρώµατος] (Nowak J.Z., 2006). ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝ ΥΝΟΥ Η AMD προκαλείται από συνδυασµό περιβαλλοντικών παραγόντων και γενετικής προδιάθεσης. Για παράδειγµα, παραλλαγές στα γονίδια CFH (1q32) και LOC (10q26) αυξάνουν τον κίνδυνο, ανεξάρτητα από τροποποιήσιµους παράγοντες κινδύνους, και περιβαλλοντικοί παράγοντες, ιδίως το κάπνισµα, αυξάνουν τον κίνδυνο ανεξάρτητα από αυτές τις γενετικές παραλλαγές (Montezuma et al, 2007). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 18

23 ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Ηλικία Ο πιο καλά τεκµηριωµένος και σηµαντικός δηµογραφικός/περιβαλλοντικός παράγοντας κινδύνου για την AMD (και ξεκάθαρα µη τροποποιήσιµος) είναι η ηλικία. Η αύξηση στην ηλικία σχετίζεται µε κατακόρυφη αύξηση στα περιστατικά, τη συχνότητα και την εξέλιξη της AMD (Jager et al, 2008; Haddad et al, 2006). Μελέτες έχουν δείξει ότι η AMD δεν είναι συχνή πριν την ηλικία των 55 και γίνεται πολύ κοινή σε άτοµα ηλικίας άνω των 75 (Montezuma et al, 2007). Για την πρώιµη AMD έχει αναφερθεί αύξηση στη συχνότητα από 8% σε άτοµα ηλικίας σε 30% σε άτοµα ηλικίας >75 ετών. Παροµοίως, η συχνότητα της προχωρηµένης AMD αυξάνεται από ποσοστό 0,1% στα άτοµα ετών σε 7,1% στα άτοµα ηλικίας >75 ετών (Jager et al, 2008). Η ηλικιακή εξάρτηση της αύξησης του κινδύνου για AMD µπορεί να οφείλεται στη σταδιακή, αθροιστική βλάβη στον αµφιβληστροειδή λόγω του καθηµερινού οξειδωτικού στρες. Η απώλεια της φυσιολογικής λειτουργίας των κυττάρων του RPE µε τη γήρανση, µπορεί επίσης να συνεισφέρει στο σχηµατισµό των εναποθέσεων των drusen που παρατηρούνται κλασικά στην AMD. Εναλλακτικά, οι σχετιζόµενες µε την ηλικία βλάβες στο µιτοχονδριακό DNA µπορεί να παίζουν ρόλο στην παθογένεση της ασθένειας. Περαιτέρω µελέτες για την επίδραση της γήρανσης στη δοµή και τη λειτουργία του αµφιβληστροειδούς είναι απαραίτητες για να αναλυθούν οι παθολογικές αλλαγές που οδηγούν στην AMD (Ding et al, 2009). Κάπνισµα Οι υπολογισµοί δείχνουν ότι το χρόνιο κάπνισµα µειώνει το προσδόκιµο ζωής κατά 7 χρόνια κατά µέσο όρο. Αυτός ο νωρίτερος θάνατος των καπνιστών, συνήθως ορίζεται ως πρώιµος. Ωστόσο, από επιστηµονικής άποψης, υπάρχουν στοιχεία ότι οι καπνιστές δείχνουν πρότυπα επιταχυντικής γήρανσης, και ότι η βιολογική ηλικία θανάτου τους µπορεί να είναι η ίδια µε αυτή των µη-καπνιστών που πεθαίνουν 7 χρόνια αργότερα. Παροµοίως, λόγω του καπνίσµατος µειώνεται µέχρι και 14 χρόνια η ζωή ελεύθερη ασθενειών (Bernhard et al, 2007). Οι πιο σχετικές ασθένειες που ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 19

24 προκαλούν αυτή την αύξηση στη νοσηρότητα είναι κλασικές ηλικιο-εξαρτώµενες ασθένειες όπως η οστεοπόρωση, καρκίνοι, καρδιοαγγειακές ασθένειες και η AMD. Όπως συµβαίνει και µε τη φυσιολογική διαδικασία γήρανσης, το γενετικό υπόβαθρο του κάθε ατόµου καθορίζει ποια όργανα είναι τα πιο ευαίσθητα σε βλάβες και συνεπώς νοσούν. Εύλογοι βιολογικοί µηχανισµοί υποστηρίζουν την εµπλοκή του καπνίσµατος στην αιτιολογία της AMD. Αν και η παθογένεση της AMD και ο µηχανισµός δράσης του καπνίσµατος στο µάτι δεν είναι πλήρως κατανοητά, ο κίνδυνος ανάπτυξης AMD είναι πιθανόν να περιλαµβάνει περισσότερους του ενός µηχανισµούς. Πρώτον, η AMD µπορεί να αντικατοπτρίζει µια συσσωρευµένη οξειδωτική βλάβη στον αµφιβληστροειδή και το κάπνισµα είναι γνωστό ότι δυσκολεύει την προστατευτική επίδραση των αντιοξειδωτικών µορίων στον αµφιβληστροειδή (Beatty et al, 2000). Το κάπνισµα µπορεί επίσης να µειώνει τη ροή του αίµατος στα χοριοειδή αγγεία του µατιού [που έχει δειχθεί ότι ισχύει στην AMD (Lutty et al, 1999)], και να προάγει ισχαιµία, υποξία και µικρο-εµφράξεις. Όλες αυτές οι συνθήκες θα µπορούσαν να αυξάνουν την ευπάθεια της ωχράς κηλίδας σε εκφυλιστικές αλλαγές (Solberg et al, 1998). Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκθεση σε συστατικά του καπνού αυξάνει την παρουσία προ-φλεγµονωδών κυτοκινών σε ex vivo παρασκευάσµατα ιστών (Patton et al, 2002) και το µέγεθος και τη σοβαρότητα της CNV σε πειραµατικά µοντέλα ποντικών (Suner et al, 2004), προτείνοντας έτσι άµεσες τοξικές επιδράσεις. Το κάπνισµα επίσης έχει βρεθεί ότι πυροδοτεί το εναλλακτικό µονοπάτι ενεργοποίησης του συµπληρώµατος και αυξάνει τη στρατολόγηση λευκοκυττάρων, τόσο σε ενδοθηλιακούς όσο και σε επιθηλιακούς ιστούς (Maresh et al, 2005). Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι µειώνει την πυκνότητα της µελάγχρωσης στην ωχρά κηλίδα, δηλαδή τα επίπεδα των προστατευτικών καροτενοειδών λουτεΐνης και ζεαξανθίνης (Hammond et al, 2000). Με βάση µελέτες που έχουν υποδείξει µια ανοσολογική συνιστώσα για την AMD, είναι πιθανό ότι µέρος του κινδύνου που σχετίζεται µε το κάπνισµα συγκεντρώνεται µέσω φλεγµονωδών µονοπατιών, καθώς µέσω της συνεχούς κυτταρικής βλάβης που προκαλεί, το κάπνισµα οδηγεί σε µια κατάσταση χρόνιας φλεγµονής και στον αµφιβληστροειδή (Bernhard et al, 2007). Το κάπνισµα αποτελεί τον κύριο τροποποιήσιµο παράγοντα κινδύνου για την AMD. O αυξηµένος κίνδυνος εµφάνισης AMD στους καπνιστές προτάθηκε για πρώτη φορά από τους Paetkau και συν. (Paetkau et al, 1978) και από τότε, οι ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 20

25 περισσότερες µελέτες έχουν επιβεβαιώσει τη θετική συσχέτιση ανάµεσα στο κάπνισµα και την AMD (π.χ. Klein et al, 2008; Tan et al, 2007; Smith et al, 2001). Το κάπνισµα έχει συσχετιστεί µε την πρώιµη AMD σε κάποιες µελέτες αλλά όχι σε όλες. Τα δεδοµένα για την προχωρηµένη AMD είναι πιο επαναλήψιµα. Μία πρόσφατη συστηµατική ανασκόπηση κατέληξε στο συµπέρασµα ότι το κάπνισµα αποτελεί σηµαντικό παράγοντα κινδύνου για την AMD. Συγκεκριµένα, τα επιδηµιολογικά στοιχεία έδειξαν ότι υπάρχει µια αιτιώδης συσχέτιση ανάµεσα στο κάπνισµα και την ανάπτυξη προχωρηµένης AMD, µε τον κίνδυνο να είναι αυξηµένος 2 έως 3 φορές για τους καπνιστές, σε σχέση µε αυτούς που δεν έχουν καπνίσει ποτέ (Thornton et al, 2005). Και στον ευρωπαϊκό πληθυσµό, η µελέτη EUREYE επιβεβαίωσε τη συσχέτιση καπνίσµατος και προχωρηµένης AMD (αποδόσιµο κλάσµα 27%), ενώ δε βρήκε να υπάρχει σχέση µε τα πρώιµα στάδια της ασθένειας. Συγκεκριµένα, 1 στις 4 περιπτώσεις υγρής και 1 στις 3 περιπτώσεις ξηρής AMD προτείνεται ότι θα µπορούσαν να προληφθούν, εάν οι ασθενείς δεν κάπνιζαν (Chakravarthy et al, 2007). Υπάρχουν στοιχεία ότι οι πρώην καπνιστές έχουν µειωµένο κίνδυνο, οπότε προτείνεται µια αντιστρεπτότητα της επίδρασης. Αυτή θα ήταν σηµαντική ειδικά εάν ο κίνδυνος µειωνόταν ουσιαστικά µετά τη διακοπή του καπνίσµατος και θα µπορούσε να αποτελεί πολύ σηµαντικό µήνυµα για τη δηµόσια υγεία. Για παράδειγµα, τα αποτελέσµατα από τη µελέτη EUREYE έδειξαν ότι η µακροχρόνια διακοπή (πάνω από 20 χρόνια) του καπνίσµατος µπορεί να µειώσει τις αρνητικές επιδράσεις του (Chakravarthy et al, 2007). Ωστόσο, η ανασκόπηση του 2005 στην οποία είχαν συµπεριληφθεί 17 µελέτες, κατέληξε ότι όσον αφορά τη διακοπή του καπνίσµατος ή τα χρόνια που έχουν περάσει από τη διακοπή και την AMD, τα στοιχεία είναι αντιφατικά (Thornton et al, 2005). Επιπλέον, υπάρχουν ισχυρά στοιχεία για σύνδεση της AMD µε το ενεργητικό κάπνισµα, ενώ τα στοιχεία για την αύξηση του κινδύνου µέσω του παθητικού καπνίσµατος είναι σποραδικά (Thornton et al, 2005). Τέλος, έχει δειχθεί ότι όσο πιο βαρύς καπνιστής είναι κάποιος, σε τόσο µεγαλύτερο κίνδυνο βρίσκεται να εµφανίσει προχωρηµένη AMD, ακόµη και σε νεότερη ηλικία. ηλαδή, έχει βρεθεί ότι υφίσταται σχέση δοσο-εξάρτησης ανάµεσα στα πακέτα/έτος καπνίσµατος και την AMD (Khan et al, 2006; Thornton et al, 2005). Η AMD, όπως προαναφέρθηκε είναι µια σύνθετη ασθένεια, που προκύπτει από τις αλληλεπιδράσεις διαφόρων περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων. Και ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 21

26 στην περίπτωση του καπνίσµατος, τα άτοµα µε γενετική προδιάθεση που καπνίζουν είναι πιο πιθανό να εµφανίσουν AMD. Για παράδειγµα, έχει δειχθεί ότι υπάρχει συνεργατική επίδραση καπνίσµατος και µιας γενετικής παραλλαγής στον τόπο 10q26 (γονίδιο LOC387715), οπότε η συσχέτιση ανάµεσα στην AMD και το κάπνισµα είναι 3 φορές πιο ισχυρή (Schmidt et al, 2006). Παροµοίως, µια µελέτη έχει αναφέρει ότι η οµοζυγωτία για το αλληλόµορφο κινδύνου T1277C (Tyr402His) στο γονίδιο CFH σε καπνιστές µε ιστορικό περισσότερων από 10 πακέτων την ηµέρα, αυξάνει τον κίνδυνο ανάπτυξης νεοαγγειακής AMD κατά έναν παράγοντα της τάξης του 144 (DeAngelis et al, 2007). Ακόµη, αναφέρεται ότι στο Ηνωµένο Βασίλειο έχει εκτιµηθεί ότι περιστατικά AMD (περίπου το ¼ των περιστατικών AMD στη χώρα) και περιστατικά τύφλωσης σχετιζόµενης µε την AMD σε άτοµα ηλικίας >69 ετών, µπορεί να αποδίδονται στο κάπνισµα. Τόσο ο γενικός πληθυσµός όσο και πολλοί ασθενείς που παρακολουθούνται από οφθαλµολογικές κλινικές, αγνοούν την ισχυρή συσχέτιση του καπνίσµατος µε τις ασθένειες των µατιών (Kelly et al, 2004). Για παράδειγµα, σε ένα βρετανικό νοσοκοµείο, µόλις το 9,5% των ασθενών ηλικίας >18 ετών γνώριζαν το κάπνισµα ως πιθανό παράγοντα πρόκλησης τύφλωσης, συγκριτικά µε τα ποσοστά των ασθενών που το συσχέτισαν µε καρκίνο του πνεύµονα, καρδιαγγειακά νοσήµατα και έµφραγµα (92,2, 87,6 και 70,6 % αντίστοιχα). Αλλά και µια άλλη έρευνα σε 14 χώρες έδειξε ότι από όσους γνώριζαν για την AMD, µόνο ένα ποσοστό 32% προσδιόριζε το κάπνισµα ως παράγοντα κινδύνου για την ασθένεια. Λίγα στοιχεία υπάρχουν και ως προς την γνώση των ειδικών. Ενδεικτικά, µια µελέτη που διεξήχθη το 2006 σε οφθαλµιάτρους στη Σιγκαπούρη, έδειξε ότι µόνο το 66% αυτών γνώριζαν ότι το κάπνισµα αποτελεί παράγοντα κινδύνου για την AMD (Loo et al, 2009). Ανέκδοτες αναφορές προτείνουν ότι όταν προειδοποιούνται για τον κίνδυνο, οι περισσότεροι ασθενείς είναι πρόθυµοι να διακόψουν το κάπνισµα, ίσως γιατί ο κίνδυνος τύφλωσης µπορεί να είναι πιο υποκινητικός από τις προειδοποιήσεις για άλλες ασθένειες που σχετίζονται µε το κάπνισµα (Kelly et al, 2004). Εθνικότητα Πλήθος επιδηµιολογικών µελετών έχουν δείξει ότι τα περιστατικά και η συχνότητα της AMD ποικίλλουν σηµαντικά στις διάφορες περιοχές και ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 22

27 πληθυσµιακές οµάδες ανά τον κόσµο (Montezuma et al, 2007). Η συχνότητα της πρώιµης AMD στους µαύρους γενικά είναι συγκρίσιµη µε αυτή στο λευκό πληθυσµό, αλλά η συχνότητα της υγρής AMD είναι πολύ πιο χαµηλή στους µαύρους (Haddad et al, 2006). Χαµηλότερη συχνότητα της προχωρηµένης AMD διαπιστώνεται και στους ασιατικούς πληθυσµούς, όπως και στα άτοµα ισπανικής καταγωγής σε σχέση µε τον λευκό πληθυσµό, η οποία όµως φαίνεται να είναι µεγαλύτερη από ότι στους µαύρους (Jager et al, 2008). Η AMD φαίνεται να υπερισχύει σε άτοµα µε λιγότερη µελάγχρωση και µια πιθανή εξήγηση για αυτή την παρατηρούµενη τάση αποδίδεται στον ενισχυµένο προστατευτικό ρόλο της µελανίνης στα κύτταρα του RPE και τα χοριοειδή µελανοκύτταρα (Tuo et al, 2004a; van Leeuwen et al, 2003a). εν είναι ξεκάθαρο αν αυτές οι πληθυσµιακές διαφορές οφείλονται σε γενετικούς ή περιβαλλοντικούς παράγοντες ή και τα δύο. Θα ήταν ενδιαφέρον να εκτιµηθεί, γιατί η παρατηρούµενη παγκόσµια αύξηση της συχνότητας της AMD σηµειώνεται και σε πληθυσµιακές οµάδες που προηγούµενα δε φαινόταν να βρίσκονται σε µεγάλο κίνδυνο. Αυτό, θα µπορούσε να οφείλεται στις αλλαγές των περιβαλλοντικών παραγόντων κινδύνου (που αντικατοπτρίζουν αλλαγές στον τρόπο ζωής, όπως το κάπνισµα και η διατροφή), στις βελτιωµένες µεθόδους διάγνωσης αλλά και στην αύξηση στο προσδόκιµο ζωής αυτών των πληθυσµών (Montezuma et al, 2007). Ωστόσο, η διαφορά στη συχνότητα της ασθένειας ανάµεσα στις πληθυσµιακές οµάδες τονίζει τη σηµασία του σωστού σχεδιασµού στις γενετικές µελέτες (Swaroop et al, 2007). ιατροφή Ο συνδυασµός υψηλών συγκεντρώσεων οξυγόνου, πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, και έντονης έκθεσης στο φως, καθιστούν τον αµφιβληστροειδή πολύ επιρρεπή στην παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου. Ως αµυντικό µηχανισµό, ο αµφιβληστροειδής περιέχει υψηλά επίπεδα αντιοξειδωτικών ενζύµων (υπεροξειδική δεσµουτάση και υπεροξειδάση της γλουταθειόνης), που χρειάζονται συµπαράγοντες (όπως ο ψευδάργυρος και ο χαλκός), και τους οποίους συναντούµε σε υψηλές συγκεντρώσεις σε οφθαλµικούς ιστούς. Το ιχνοστοιχείο στο οποίο έχει δοθεί ιδιαίτερη προσοχή είναι ο ψευδάργυρος, καθώς είναι συµπαράγοντας για πολλά αντιοξειδωτικά ένζυµα και βρίσκεται σε µεγάλες συγκεντρώσεις στον ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 23

28 αµφιβληστροειδή. Επιπλέον προστασία µπορεί να παρέχεται και από βιταµίνες και συγκεκριµένα καροτενοειδή, που αποµακρύνουν τις ενεργές ρίζες του οξυγόνου (scavengers). Η ωχρά κηλίδα περιέχει µεγάλες ποσότητες καροτενοειδών, και συγκεκριµένα λουτεΐνης και ζεαξανθίνης (van Leeuwen et al, 2003a). Εξαιτίας των παραπάνω, πολλοί ερευνητές είχαν διατυπώσει την υπόθεση ότι τα αντιοξειδωτικά των τροφών και οι µεταλλικοί συµπαράγοντες µπορούν να προσφέρουν προστασία έναντι της AMD (Tuo et al, 2004a). Τα περισσότερα αποδεικτικά στοιχεία για την επίδραση της συγκεκριµένης διατροφής στην AMD έχουν προκύψει από διάφορες κλινικές δοκιµές, όπως η AREDS, η VISION (VEGF Inhibition Study Ιn Ocular Neovascularization) και η MARINA (Clinical Trial and Minimally Classic/Occult Trial of the Anti-VEGF Antibody Ranibizumab Ιn the Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration) (Ding et al, 2009). Σύµφωνα µε αυτές, προτείνεται ότι µια υψηλή πρόσληψη αντιοξειδωτικών, ψευδαργύρου, βιταµίνης C και E, λουτεΐνης και ζεαξανθίνης, αλλά και ω-3 λιπαρών οξέων µέσω της διατροφής, µπορεί να δράσει προστατευτικά έναντι της εµφάνισης και της εξέλιξης της AMD. Τα στοιχεία αυτά περιέχονται κυρίως στα σκούρα πράσινα και φυλλώδη λαχανικά, στα φρούτα, τα καρύδια και τα ψάρια (Montezuma et al, 2007; Jager et al, 2008). Από την άλλη, σε µια πρόσφατη µελέτη βρέθηκε ότι η υψηλή πρόσληψη β- καροτενίου συσχετίζεται µε αυξηµένο κίνδυνο εµφάνισης υγρής AMD (Ding et al, 2009), ενώ και η υψηλή πρόσληψη λίπους (ζωικού αλλά και φυτικού) και λινολενικού οξέος έχουν συσχετιστεί µε αυξηµένο κίνδυνο για AMD (Cho et al, 2001). Λοιποί παράγοντες Η προστατευτική/επιβλαβής επίδραση ενός πλήθους άλλων δηµογραφικών/περιβαλλοντικών παραγόντων στην εµφάνιση και την εξέλιξη της AMD έχει εξεταστεί σε πλήθος µελετών, ωστόσο τα αποτελέσµατα είναι αντιφατικά. Εποµένως, δε µπορούν να θεωρηθούν εξακριβωµένοι παράγοντες κινδύνου, και απαιτείται έλεγχος σε µεγαλύτερες οµάδες πληθυσµών αλλά και καλύτερος σχεδιασµών των εκάστοτε µελετών. Υπάρχει πλήθος ανασκοπήσεων που αναφέρονται σε αυτούς τους παράγοντες, για παράδειγµα στην έκθεση στο φως (και ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 24

29 σε συγκεκριµένα είδη ακτινοβολίας), στην κατανάλωση αλκοόλ, στο φύλο και σε διάφορους οφθαλµικούς παράγοντες, όπως το χρώµα της ίριδας ή ο καταρράκτης (Ding et al, 2009; Jager et al, 2008; Montezuma et al, 2007; van Leeuwen et al, 2003a). Επιπλέον, ερευνάται η σχέση και ανάµεσα στις καρδιοπάθειες και την AMD, τόσο γενικά όσο και επιµέρους µε τους διάφορους παράγοντες που αποτελούν παράγοντες κινδύνου για εµφάνιση καρδιοπάθειας (π.χ. παχυσαρκία, υπέρταση, υψηλά επίπεδα χοληστερόλης). Αυτή η υπόθεση για συσχέτιση οφείλεται στα ιστοπαθολογικά ευρήµατα των drusen που δείχνουν ότι αυτά αποτελούνται από πρωτεΐνες παρόµοιες µε αυτές που περιέχονται στις εναποθέσεις της αθηρωµατικής πλάκας, αλλά και ότι στη µεµβράνη του Bruch s συσσωρεύονται λιπαρά οξέα και χοληστερόλη µε την πάροδο των χρόνων (van Leeuwen et al, 2003a). Τέλος, πραγµατοποιούνται µελέτες για την εύρεση βιοδεικτών (biomarkers), δηλαδή µορίων που να εντοπίζονται στο πλάσµα και να σχετίζονται µε κίνδυνο εµφάνισης ή ταχύτερης εξέλιξης της AMD. Σε αυτά τα πλαίσια, έχει βρεθεί ότι η C- αντιδραστική πρωτεΐνη (C Reactive Protein-CRP), βρίσκεται σε σηµαντικά µεγαλύτερα επίπεδα στους ασθενείς µε AMD και σχετίζεται µε εξέλιξη στα πιο προχωρηµένα στάδια της ασθένειας (Seddon et al, 2005), όπως και τα µόρια CML (N"-carboxymethyllysine) και pentosidine, που συνεντοπίζονται µε τα σύµπλοκα του CEP (Carboxyethylpyrrole) στα drusen και τη µεµβράνη του Bruch s (Ni et al, 2009). Συγκεκριµένα, τα επίπεδα του CEP στο πλάσµα σε συνδυασµό µε άλλους γενετικούς δείκτες, έχει δειχθεί ότι µπορούν να ξεχωρίζουν τους ασθενείς µε AMD από τα άτοµα ελέγχου µε ακρίβεια έως και 80% (Gu et al, 2009). Ωστόσο, απαιτούνται πολύ περισσότερες µελέτες µέχρι να περάσουν σε κλινική εφαρµογή τα ευρήµατα αυτά. ΓΕΝΕΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Πολλές κοινές ασθένειες είναι σύνθετες και πολυπαραγοντικές, δηλαδή οφείλονται στην αλληλεπίδραση γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Ενώ για περισσότερες από 2000 Μεντελικές ασθένειες έχουν αναγνωριστεί οι µεταλλάξεις στα υπεύθυνα γονίδια κατά τη διάρκεια των δύο προηγούµενων δεκαετιών, η πρόοδος στην κατανόηση των συχνών πολυπαραγοντικών ασθενειών υπήρξε πιο αργή. Η ολοκλήρωση της ακολουθίας του ανθρώπινου γονιδιώµατος και η αναγνώριση ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 25

30 εκατοµµυρίων δι-αλληλοµορφικών πολυµορφισµών (Single Nucleotide Polymorphisms-SNPs) έχει οδηγήσει στην αποκάλυψη της γενετικής συνεισφοράς στην προδιάθεση για πολλές κοινές ασθένειες, όπως ο διαβήτης, η στεφανιαία νόσος και η AMD (Swaroop et al, 2007). Ασθένειες που αφορούν την ωχρά κηλίδα και έχουν πρώιµη εµφάνιση, όπως η νόσος του Stargardt s, είναι γνωστό εδώ και δεκαετίες ότι έχουν κληρονοµική βάση. Σε αντίθεση, στα µέσα της δεκαετίας του 1990, µόνο ένας µικρός αριθµός δηµοσιεύσεων πρότεινε τον ρόλο γονιδίων στον καθορισµό του κινδύνου για AMD, και ήταν δύσκολο να πειστούν οι περισσότεροι γιατροί και επιστήµονες σχετικά µε την αξία των γενετικών µελετών. Πρόσφατες µελέτες έχουν όχι µόνο τεκµηριώσει αναµφίβολα το ρόλο των γενετικών πολυµορφισµών στην παθογένεση της AMD, αλλά επίσης έχουν κάνει εφικτή την αποκάλυψη του ρόλου των αλληλεπιδράσεων γονιδίου-γονιδίου και γονιδίου-περιβάλλοντος σε αυτή την σύνθετη ασθένεια (Swaroop et al, 2007). Περαιτέρω διασαφήνιση της γενετικής προδιάθεσης και των πιθανών αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στους πολυµορφισµούς και τους περιβαλλοντικούς παράγοντες (κάπνισµα, διατροφή) θα βοηθήσουν στο να διαφωτιστούν οι µηχανισµοί που εµπλέκονται στην παθολογία της AMD. Επιπλέον, µπορεί σύντοµα να είναι εφικτό να παρέχεται προ-συµπτωµατική διάγνωση, οδηγώντας έτσι σε καλύτερες στρατηγικές διαχείρισης της ασθένειας για τα άτοµα που βρίσκονται σε υψηλό κίνδυνο. Πρέπει να σηµειωθεί ότι λόγω της φύσης της ασθένειας, οι µελέτες για γενετικούς καθοριστικούς παράγοντες για την AMD αναπτύχθηκαν αργά. Οι λόγοι είναι οι εξής: (1) Η AMD είναι ασθένεια των γηρατειών. Εκδηλώνεται αργά κατά τη ζωή ενός ανθρώπου και αυτό µπορεί να περιορίσει την κλινική έρευνα στη µελέτη µιας µόνο γενιάς στο σωστό ηλικιακό εύρος, καθώς συχνά οι γονείς των ασθενών έχουν πεθάνει και τα παιδιά τους είναι γενικά αρκετά νέα για να έχουν συµπτώµατα της ασθένειας. (2) Η AMD είναι µια σύνθετη ασθένεια, µε φαινοτυπική ετερογένεια και πολυάριθµους αιτιολογικούς παράγοντες (γενετικούς και περιβαλλοντικούς). Παρά τις δυσκολίες, έχει γίνει σηµαντική πρόοδος στη γενετική µελέτη της AMD (ανασκοπήσεις: Patel et al, 2008; Swaroop et al, 2007; Montezuma et al, 2007; Haddad et al, 2006; Tuo et al, 2004a) Η γενετική βάση για την AMD περιγράφηκε για πρώτη φορά 36 χρόνια πριν, όταν παρατηρήθηκε ένας ξεκάθαρα υψηλότερος βαθµός συµφωνίας στους ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 26

31 µονοζυγωτικούς δίδυµους σε σχέση µε τους διζυγωτικούς (Gass et al, 1973). Από τότε έγιναν πολλές µελέτες, τόσο µε δίδυµους, όσο και σε οικογένειες (σύγκριση δηλαδή της συχνότητας εµφάνισης της AMD σε συγγενείς πασχόντων σε σχέση µε τους συγγενείς ατόµων ελέγχου), τα αποτελέσµατα των οποίων έδειξαν ξεκάθαρα ότι υπάρχει γενετική συνιστώσα για την AMD. Μετέπειτα µελέτες έδειξαν ότι περίπου το 20% των ασθενών µε AMD έχουν θετικό οικογενειακό ιστορικό. Σε µια πρόσφατη µελέτη, οι Luo και συν. ανάλυσαν οικογένειες µε 4764 ασθενείς µε AMD, υπολογίζοντας το µέγεθος του οικογενειακού κινδύνου. Τα αποτελέσµατά τους έδειξαν ότι για την AMD, ο κίνδυνος που αποδίδεται (Population-Attributable Risk- PAR) στο θετικό οικογενειακό ιστορικό είναι 0,34. Ο κίνδυνος επανεµφάνισης σε συγγενείς των ατόµων που πάσχουν είναι αυξηµένος και συγκεκριµένα για τα αδέρφια 2,95, τα πρώτα ξαδέρφια 1,29, τα δεύτερα ξαδέρφια 1,13 και τους γονείς 5,66 (Luo et al, 2008). Οι µελέτες γενετικής σύνδεσης αναζητούν µε την ανάλυση γνωστών γενετικών δεικτών περιοχές των χρωµοσωµάτων που συν-κληρονοµούνται στα άτοµα των οικογενειών που πάσχουν από την ασθένεια. Τα αποτελέσµατα από µελέτες σύνδεσης για την περίπτωση της AMD στο σύνολό τους ήταν θετικά (Swaroop et al, 2007). Η πρώτη αναφορά σύνδεσης σε µία µεγάλη οικογένεια µε ξηρή AMD, υπέδειξε ένα γενετικό τόπο (ARMD1) στο χρωµόσωµα 1q25-q31 (Klein et al, 1998). Οι πλειοψηφία των επόµενων µελετών σύνδεσης υπέδειξαν µεγάλο αριθµό χρωµοσωµικών περιοχών στις οποίες εντοπίζονται υπεύθυνα γονίδια (susceptibility loci), µε µεγάλη ή µικρή συνεισφορά για εκδήλωση AMD (Εικ. 6). Οι χρωµοσωµικές περιοχές που υποδείχθηκαν από πολυάριθµες ανεξάρτητες µελέτες και επιβεβαιώθηκαν από µετα-αναλύσεις είναι οι 1q31-32 και 10q26 (Fisher et al, 2005). Όπως θα σηµειωθεί και παρακάτω, οι περιοχές αυτές περικλείουν τα αλληλόµορφα που έχουν αναγνωρισθεί µέχρι σήµερα να ασκούν τις µεγαλύτερες επιδράσεις στην AMD. Οι αναλύσεις συσχέτισης εκτιµούν εάν συγκεκριµένα αλληλόµορφα βρίσκονται σε υψηλότερη συχνότητα από όσο θα µπορούσε να εξηγηθεί από τύχη σε µια οµάδα ασθενών, σε σχέση µε την οµάδα των υγιών ατόµων ελέγχου (Montezuma et al, 2007). Θετικά στοιχεία για µια τέτοια συσχέτιση µπορεί να δείχνουν ότι το ίδιο το αλληλόµορφο σχετίζεται µε την ασθένεια ή ότι βρίσκεται σε ανισορροπία σύνδεσης µε κάποιο αλληλόµορφο που σχετίζεται µε την ασθένεια. Ενώ στις µελέτες σύνδεσης αναλύονται γενετικοί δείκτες που συν-κληρονοµούνται µαζί µε την ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 27

32 ασθένεια, οι µελέτες συσχέτισης αναγνωρίζουν συγκεκριµένα αλληλόµορφα γενετικών δεικτών, που είτε προκαλούν την ασθένεια, είτε βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης µε αλληλόµορφα που προκαλούν την ασθένεια (Haddad et al, 2006). Εικόνα 6. Οι χρωµοσωµικές περιοχές όπου εντοπίζονται οι πιθανοί γενετικοί τόποι που ευθύνονται για την εκδήλωση AMD, που προέκυψαν από τις διάφορες µελέτες σύνδεσης (Swaroop et al, 2007). Μια κατηγορία ποικιλοµορφίας του DNA είναι τα SNPs. Τα SNPs µπορούν να οριστούν ως διατηρούµενες αντικαταστάσεις ενός νουκλεοτιδίου στην αλληλουχία του γονιδιώµατος, όπου η αντικατάσταση αυτή σε πληθυσµιακό επίπεδο απαντάται µε συχνότητα µεγαλύτερη του 1%. Η ανάλυση των SNPs αποτελεί ελκυστικό εργαλείο στην εξερεύνηση της γενετικής συνιστώσας σύνθετων ασθενειών όπως και η AMD, γιατί αυτοί οι πολυµορφισµοί µπορούν εύκολα να βρεθούν και να χαρακτηριστούν, βρίσκονται σε αφθονία και είναι σε µεγάλο βαθµό σταθεροί (Tuo et al, 2004a). Στο σχεδιασµό των µελετών συσχέτισης διαφόρων SNPs µε την AMD έχουν ακολουθηθεί κατά βάση τέσσερις ερευνητικές προσεγγίσεις: (1) εξετάζονται SNPs που ήδη έχουν σχετιστεί µε άλλες ηλικιο-εξαρτώµενες ασθένειες µε παρόµοια παθολογικά χαρακτηριστικά µε την AMD, (2) εξετάζονται SNPs σε γονίδια που έχουν εµπλακεί σύµφωνα µε µελέτες σε µονογονιδιακές εκφυλιστικές ασθένειες του αµφιβληστροειδούς και της ωχράς κηλίδας [π.χ. Stargardt macular dystrophy (STGD), Sorsby fundus dystrophy (SFD), Best disease, Late-onset retinal ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 28

33 degeneration (L-ORD)], (3) εξετάζονται SNPs σε γονίδια που παίζουν ρόλο στα µονοπάτια που ενέχονται στην ανάπτυξη και την παθογένεση της AMD (Tuo et al, 2004a), (4) εξετάζονται SNPs σε περιοχές που έχουν δώσει θετικά αποτελέσµατα σε προηγούµενες µελέτες σύνδεσης. Μέχρι σήµερα έχει εξεταστεί ένας πολύ µεγάλος αριθµός SNPs για πιθανή συσχέτιση µε την AMD (Πίν. 3) και µέχρι τώρα, την πιο ισχυρή και επαναλήψιµη συσχέτιση µε την AMD έχουν δείξει οι πολυµορφισµοί στο γονίδιο CFH (θέση 1q32) και στα γονίδια LOC387715/HTRA1 (θέση 10q26). Πολυµορφισµοί στα γονίδια APOE, C2 και BF επίσης δείχνουν επαναλήψιµη, αλλά µικρότερη συσχέτιση µε την AMD και φαίνεται ότι συνεισφέρουν στην προδιάθεση για την ασθένεια (Swaroop et al, 2007). Πίνακας 3. Ενδεικτικά αναφέρονται οι γενετικές µελέτες συσχέτισης υποψήφιων γονιδίων µε την AMD, µε τουλάχιστον ένα θετικό αποτέλεσµα µέχρι και το 2006 (Haddad et al, 2006). Χρωµόσωµα Γονίδιο Μελέτες 1p ABCA4 (ABCR) Allikmets et al, 1997; Kuroiwa et al, 1999; Allikmets et al, 2000; Fuse et al, 2000; Rivera et al, 2000; Souied et al, 2000; Guymer et al, 2001; Shroyer et al, 2001; Webster et al, 2001; Stone et al, 1998; Bernstein et al, 2002; Baum et al, 2003; Schmidt et al, 2003; De La Paz et al, q CFH Edwards et al, 2005; Haines et al, 2005; Klein et al, 2005; Hageman et al, 2005; Zareparsi et al, 2005; Conley et al, 2005; Jakobsdottir et al, 2005; Souied et al, 2005; Magnusson et al, 2006 HEMICENTIN (FIBULIN 6) Schultz et al, 2003; Abecasis et al, 2004; Hayashi et al, 2004; Iyengar et al, 2004; Stone et al, 2004; Conley et al, p CX3CR1 Tuo et al, p BF & C2 Gold et al, 2006 HLA genes Goverdhan et al, 2005 VEGF Haines et al, q ELOVL4 Ayyagari et al, 2001; Conley et al, 2005 SOD2 Kimura et al, 2000; Esfandiary et al, q PON1 Ikeda et al, 2001; Baird et al, 2004; Esfandiary et al, p VLDLR Conley et al, 2005; Haines et al, q TLR4 Zareparsi et al, q GRK5/PLEKHA1/ Jakobsdottir et al, 2005; Rivera et al, 2005 LOC p LRP6 Haines et al, q FIBULIN 5 Stone et al, q ACE Hamdi et al, 2002; Conley et al, 2005; Haines et al, q APOE Seddon et al, 1996; Souied et al, 1998; Pang et al, 2000; Simonelli et al, 2001; Schmidt et al, 2002; Klaver et al, 1998; Schmidt et al, 2000; Schultz et al, 2003; Baird et al, 2004; Gotoh et al, 2004; Zareparsi et al, 2004; Conley et al, 2005; Schmidt et al, 2005; Wong et al, p CST3 Zurdel et al, q MMP9 Fiotti et al, 2005 ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 29

34 Συγκεκριµένα, σύµφωνα µε µια µετα-ανάλυση, ο κίνδυνος εµφάνισης AMD για τους φορείς του αλληλόµορφου κινδύνου T1277C (Tyr402His) στο γονίδιο CFH είναι 2,5 φορές αυξηµένος, ενώ για τους οµοζυγώτες είναι 6 φορές αυξηµένος σε σχέση µε αυτούς που φέρουν το φυσιολογικό αλληλόµορφο (Thakkinstian et al, 2006). Εξαιτίας αυτής της ισχυρής συσχέτισης, δόθηκε µεγάλο ενδιαφέρον στην πιθανή εµπλοκή του συστήµατος του συµπληρώµατος στην παθογένεση της AMD και έτσι οι επόµενες µελέτες επιβεβαίωσαν ότι υπάρχει συσχέτιση και µε πολυµορφισµούς στα γονίδια C2, C3 και BF, που όλα κωδικοποιούν για παράγοντες του συµπληρώµατος (Seitsonen S., 2008; Swaroop et al, 2007). Συνολικά, τα δεδοµένα προτείνουν ότι οι πολυµορφισµοί στα γονίδια CFH, BF και C2 µπορεί να εξηγούν περίπου το 75% των περιπτώσεων AMD (Jager et al, 2008). Επιπλέον, ο πολυµορφισµός G205T (Ala69Ser) στο γονίδιο LOC387715/ ARMS2 (που βρίσκεται σε ανισορροπία σύνδεσης µε το γονίδιο HTRA1), έχει συσχετιστεί σηµαντικά µε την ανάπτυξη προχωρηµένης AMD, ανεξάρτητα από το CFH (Jager et al, 2008). ιάφορες µελέτες έχουν δείξει µια επίδραση δοσοεξάρτησης µε OR που κυµαίνονται από 1,7-2,7 για τους ετερόζυγους, µέχρι 5,7-8,6 για τους οµόζυγους για το αλληλόµορφο κινδύνου, σε σχέση µε το φυσιολογικό αλληλόµορφο (Seddon et al, 2007; Shuler et al, 2007). Συµπερασµατικά, και σε αντίθεση µε πολλές άλλες σύνθετες ασθένειες όπου ο κάθε πολυµορφισµός µπορεί να συνεισφέρει µόνο σε σχετικά µικρό ποσοστό στην αιτιολογία της ασθένειας, δε φαίνεται να ισχύει το ίδιο και στην περίπτωση της AMD. Οι δύο παραπάνω πολυµορφισµοί σε συνδυασµό, φαίνεται να εξηγούν µέχρι και το 70% των περιστατικών AMD (Seitsonen S., 2008). Η αναγνώριση των γενετικών παραγόντων που ενέχονται στην παθογένεση της AMD µπορεί τελικά να οδηγήσει στην αναγνώριση των ατόµων που βρίσκονται σε υψηλό κίνδυνο και να διευκολύνει την πρωιµότερη διάγνωση, να αποτρέψει την ασθένεια ή να µειώσει τη σοβαρότητά της, αλλά και να βελτιώσει τις θεραπευτικές επιλογές (Montezuma et al, 2007). ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ Πρόσφατα, έχει δοθεί ιδιαίτερη σηµασία στον πιθανό κρίσιµο ρόλο του ανοσολογικού συστήµατος στην παθογένεση της AMD, τονίζοντας τη σηµασία της ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 30

35 τοπικής φλεγµονής (ανασκοπήσεις: Ding et al, 2009; Patel and Chan, 2008; Nussenblatt and Ferris, 2007; Donoso et al, 2006; Anderson et al, 2002). Πιο συγκεκριµένα, ιδιαίτερη έµφαση δίνεται στη συµµετοχή των µακροφάγων. Πολλά κύτταρα της φλεγµονής, συµπεριλαµβανοµένων και των µακροφάγων, έχουν βρεθεί σε ιστολογικά δείγµατα ασθενών µε AMD, και εντοπίζονται σε περιοχές ατροφίας του RPE, διαρρηγµένων µεµβρανών του Bruch's και CNV (π.χ. Lopez et al, 1991; Killingsworth et al, 1990). Ο ρόλος των µακροφάγων στην παθογένεση της AMD παραµένει αµφιλεγόµενος. Κάποιες µελέτες έχουν δείξει ότι τα µακροφάγα εκφράζουν τον VEGF και έτσι προάγουν άµεσα τη CNV (Grossniklaus et al, 2002). Σε µία άλλη µελέτη, αναλύοντας τις µεµβράνες των CNV από ασθενείς µε AMD, οι ερευνητές κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι τα µακροφάγα που συσσωρεύονται σε περιοχές CNV δρουν προστατευτικά, φαγοκυτταρώνοντας τις οξειδωµένες λιποπρωτεΐνες που συσσωρεύονται στην περιοχή µε την πάροδο των χρόνων. Ωστόσο, καθώς υπάρχουν σηµαντικές οµοιότητες ανάµεσα στην AMD και την αθηροσκλήρωση (όπου είναι γενικά αποδεκτό ότι τα µακροφάγα συνεισφέρουν στην παραγωγή των αθηρωµατικών πλακών), οι ίδιοι ερευνητές υποθέτουν ότι η συσσώρευση των µακροφάγων µπορεί επίσης να σχετίζεται µε την παθογένεση της AMD (Kamei et al, 2007). Oι µελέτες σε ζωικά µοντέλα (ποντικούς) έχουν επίσης καταλήξει σε αντιφατικά αποτελέσµατα. Οι Espinosa-Heidmann και συν. και οι Sakurai και συν. έδειξαν ανεξάρτητα ότι η ολική αφαίρεση των µακροφάγων µειώνει την επαγόµενη από λέιζερ CNV (πιθανόν µειώνοντας την έκκριση του VEGF από τα µακροφάγα) (Espinosa-Heidmann et al, 2003; Sakurai et al, 2003), ενώ οι Apte και συν. στη δική τους µελέτη έδειξαν το αντίθετο, ότι δηλαδή τα µακροφάγα αναστέλλουν τη CNV που επάγεται από λέιζερ (Apte et al, 2006). Επιπλέον, οι χηµειοκίνες, που διαµεσολαβούν στην επιστράτευση των µακροφάγων στον αµφιβληστροειδή, έχουν επίσης συσχετιστεί µε την AMD. Οι χηµειοκίνες που εκφράζονται στο µάτι, συνδέονται µε τους υποδοχείς των χηµειοκινών (που εκφράζονται σε φλεγµονώδη κύτταρα όπως τα µακροφάγα), και έτσι προάγουν την κινητοποίηση αυτών των κυττάρων από τη γειτονική αγγείωση µέσα στον οφθαλµικό ιστό, καθώς και ανάµεσα σε διάφορες περιοχές του οφθαλµού. Πιστεύεται ότι αλλαγές ή ανεπάρκειες στις χηµειοκίνες ή/και τους υποδοχείς τους οδηγούν σε εξασθενηµένη (εξαρτώµενη από χηµειοκίνες) µετανάστευση των φλεγµονωδών κυττάρων και τελικά στην AMD (Forrester et al, 2003). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 31

36 Η χηµειοκίνη που µελετήθηκε πρώτη και έδειξε κάποια σχέση µε την AMD είναι η CCL2 (CC Chemokine Ligand 2) καθώς και ο υποδοχέας της CCR2 (CC Chemokine Receptor 2), δύο µόρια που εµπλέκονται στη χηµειόταξη των µακροφάγων και/ή των κυττάρων της µικρογλοίας. Μελέτες σε γερασµένα διαγονιδιακά ποντίκια που στερούνταν την CCL2 ή τον CCR2 (CCL2 -/- και CCR2 -/- αντίστοιχα), έδειξαν ότι αυτά ανέπτυσσαν πολλά από τα βασικά χαρακτηριστικά της AMD (εναποθέσεις τύπου drusen, συσσώρευση λιποφουσκινών και παραγόντων του συµπληρώµατος στο RPE, CNV). Η παρατήρηση αυτή οδήγησε στην πρόταση ότι η επιστράτευση των µακροφάγων µέσω των CCL2/CCR2 προσφέρει προστασία έναντι της εµφάνισης AMD. Επιπλέον, φάνηκε ότι τα συστατικά των drusen (C5, IgG, προϊόντα γλυκοσυλίωσης) που συσσωρεύονταν στα µάτια των CCL2 -/- και CCR2 -/- ποντικών, ρύθµιζαν θετικά την έκφραση του CCR2 στα κύτταρα του RPE και τα χοριοειδή ενδοθηλιακά κύτταρα. ιατυπώθηκε εποµένως η υπόθεση ότι η αυξηµένη έκφραση CCR2 λόγω αυτών των εναποθέσεων προάγει την διείσδυση των µακροφάγων σε αυτό τον χώρο ώστε να τον καθαρίσουν. Και όντως, φάνηκε in vitro ότι τα µακροφάγα προσκολλούνταν στην IgG και το C5, διευκολύνοντας έτσι την εκκαθάριση των τελευταίων (Ambati et al, 2003b). Ωστόσο, σε µια άλλη µελέτη µε CCR2 -/- ποντικούς, παρατηρήθηκε ότι η εξαρτώµενη από το σύστηµα CCL2/CCR2 επιστράτευση των µακροφάγων, σχετίζεται µε την ανάπτυξη CNV. Συγκεκριµένα, στους CCR2 -/- ποντικούς εµφανιζόταν σηµαντικά µειωµένη επιστράτευση µακροφάγων στην περιοχή της επαγόµενης βλάβης και αυτό τελικά, αντίθετα µε το αναµενόµενο, οδηγούσε στο µη σχηµατισµό CNV (Tsutsumi et al, 2003). Εποµένως, αν και γενικά είναι αποδεκτό πως τα µακροφάγα συσσωρεύονται στις περιοχές των αλλοιώσεων που σχετίζονται µε την AMD, είναι ακόµη ασαφές εάν αυτά τα µακροφάγα έχουν έναν προ-amd ρόλο (επάγουν) ή εάν συσσωρεύονται ως απόκριση στα παθολογικά drusen και τις βλάβες που σχετίζονται µε την AMD (προστατεύουν) (Patel et al, 2008). Με αυτά αλλά και άλλα υποσχόµενα αρχικά ευρήµατα, η σκέψη να αναλυθούν σε µελέτες συσχέτισης γονίδια που εµπλέκονται σε αυτούς τους ανοσολογικούς µηχανισµούς, που φαίνεται να ενέχονται στην εµφάνιση και παθογένεση της AMD, έγινε αρκετά ενδιαφέρουσα. Ένα από τα γονίδια αυτά είναι και το γονίδιο που κωδικοποιεί για τον υποδοχέα της χηµειοκίνης CX3CL1, o ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 32

37 CX3CR1 (CX3 Chemokine Receptor 1). Μέχρι σήµερα έχουν διενεργηθεί δύο µελέτες συσχέτισής που αφορούν το γονίδιο αυτό µε την ασθένεια AMD. CX3CL1/CX3CR1 Οι χηµειοκίνες περιγράφηκαν αρχικά ως µικρές (συνήθως 8-10kDa) χηµειοελκτικές κυτοκίνες, που συνθέτονται στον τόπο της φλεγµονής και σήµερα είναι γνωστό ότι αποτελούν βασικές ρυθµιστικές πρωτεΐνες για τη στρατολόγηση και κυκλοφορία των λευκοκυττάρων (Taub and Oppenheim, 1994; Rollins B.J., 1997). Ωστόσο, υπάρχουν αυξανόµενα στοιχεία ότι δεν περιορίζονται µόνο στη συµµετοχή τους στην κυκλοφορία των λευκοκυττάρων, αλλά είναι πολυ-λειτουργικοί διαµεσολαβητές, που δρουν σε µια ποικιλία κυτταρικών τύπων, παίζοντας ρόλο και στην αγγειογένεση, την κυτταρική επιβίωση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και τη νευροδιαβίβαση. Εποµένως, τα φάρµακα που τις στοχεύουν συγκαταλέγονται στις πιο υποσχόµενες νέες αντι-φλεγµονώδεις θεραπείες, καθώς µπορεί να είναι πιο επιλεκτικά από τα ισχύοντα αντι-φλεγµονώδη φάρµακα και λιγότερο επιβλαβή από τα ανοσοκατασταλτικά (Ransohoff et al, 2007). Περισσότερες από 50 χηµειοκίνες έχουν αναγνωριστεί µέχρι σήµερα (Umehara et al, 2006) και υποδιαιρούνται σε τέσσερις υπο-οικογένειες, τις C-, CC-, CXC- και CX3C- χηµειοκίνες, µε βάση τον αριθµό και τη διάταξη των πρώτων δύο κυστεϊνών σε ένα διατηρηµένο δοµικό µοτίβο κυστεΐνης (Εικ. 7). Οι διαφορετικές οµάδες χηµειοκινών τείνουν να επιδεικνύουν διαφορετικό εύρος ειδικότητας για τα λευκοκύτταρα, και οι χηµειοκίνες που παράγονται κατά τη διαδικασία της φλεγµονής καθορίζουν την έκταση, την ποιότητα και τη διάρκεια της κυτταρικής διείσδυσης (Rollins B.J., 1997; Murphy P.M., 1994). Ωστόσο, η µη φυσιολογική αυξηµένη έκφραση χηµειοκινών µπορεί να οδηγήσει σε εκτεταµένη κυτταρική βλάβη, που προκαλείται από τα ενεργοποιηµένα λευκοκύτταρα (Gerard and Rollins, 2001; Proudfoot A.E., 2002). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 33

38 Εικόνα 7. Σχηµατική απεικόνιση αλληλεπιδράσεων κυτοκινών (εδώ συγκαταλέγονται και οι χηµειοκίνες) -υποδοχέων κυτοκινών ( Η φρακταλκίνη (CX3CL1- CX3C Ligand 1), µία µεγάλη πρωτεΐνη 373 αµινοξέων, που περιλαµβάνει πολλές διαφορετικές περιοχές (domains), είναι η πρώτη και µοναδική CX3C χηµειοκίνη που έχει περιγραφεί µέχρι σήµερα και είναι δοµικά διακριτή από τις άλλες χηµειοκίνες (Bazan et al, 1997; Pan et al, 1997). Το γονίδιο για την CX3CL1 εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 16q13, γειτονικά µε γονίδια για τις χηµειοκίνες της υποοικογένειας CC- (Nomiyama et al, 1998). Ανήκει στην οµάδα των διαµεµβρανικών χηµειοκινών, που περιλαµβάνει µόνο δύο µέλη, την CX3CL1 και την CXCL16 (Matloubian et al, 2000). Αυτές οι χηµειοκίνες θεωρούνται ειδικοί πράκτορες µέσα στην οικογένεια των χηµειοκινών (Ludwig and Weber, 2007). Η CX3CL1 είναι µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη που εκφράζεται στην κυτταρική επιφάνεια (Εικ. 8). Η εξωκυτταρική της περιοχή αποτελείται από µια περιοχή χηµειοκίνης (τα πρώτα 76 αµινοξέα), µε µία νέα διάταξη των κυστεϊνών (CXXXC: τρία αµινοξέα διαχωρίζουν τις πρώτες δύο κυστεΐνες), και στη συνέχεια από έναν εκτεταµένο µίσχο παρόµοιο µε βλεννίνη (mucin-like). Ακολουθεί µία διαµεµβρανική περιοχή και τέλος µια ενδοκυτταρική περιοχή 37 αµινοξέων (Εικ. 9). H διαλυτή CX3CL1 µπορεί να απελευθερωθεί, πιθανόν µέσω πρωτεόλυσης σε µια διβασική θέση διάσπασης κοντά στη µεµβράνη, από τα ένζυµα TACE/ADAM17 ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 34

39 (TNF-Α Converting Enzyme) και ADAM10 (Garton et al, 2001; Tsou et al, 2001; Hundhausen et al, 2003) και επίσης από την καθεψίνη S (Clark et al, 2007). Αυτή η διαλυτή µορφή παρουσιάζει αποτελεσµατική χηµειοτακτική δράση για τα µονοκύτταρα, τα ΝΚ κύτταρα και τα T κύτταρα που εκφράζουν τον CX3CR1 µέσω του τυπικού µονοπατιού σηµατοδότησης των GPCRs (Bazan et al, 1997). Εικόνα 8. οµή της διαµεµβρανικής χηµειοκίνης CX3CL1 (και της CXCL16). Παρατηρείται µία περιοχή χηµειοκίνης, έναν εύκαµπτο, υψηλά Ο-γλυκοσυλιωµένο µίσχο παρόµοιο µε βλεννίνη, µία διαµεµβρανική περιοχή και µία µικρή κυτοπλασµατική ουρά. Η πρωτεολυτική διάσπαση µέσω της ADAM10 ή της ADAM17 κοντά στην κυτταρική µεµβράνη οδηγεί στην απελευθέρωση της διαλυτής CX3CL1. Το εναποµένον C-τελικό κοµµάτι πιθανόν αποµακρύνεται από την κυτταρική µεµβράνη, µέσω διάσπασης δια του συµπλόκου της γ-σεκρετάσης (Ludwig and Mentlein, 2008). Στην περίπτωση της CX3CL1, η περιοχή της χηµειοκίνης παρουσιάζεται πάνω από τον προσδεµένο στη µεµβράνη µίσχο παρόµοιο µε βλεννίνη και η προσδεµένη στη µεµβράνη CX3CL1 από µόνη της λειτουργεί ως µόριο προσκόλλησης, προλαµβάνοντας έτσι την ανάγκη για συσχέτιση τόσο µε πρωτεογλυκάνες όσο και άλλα µόρια προσκόλλησης. Όντως, τα κύτταρα που εκφράζουν CX3CR1 συνδέονται ταχύτατα και µε µεγάλη συγγένεια σε ακινητοποιηµένη CX3CL1 ή σε κύτταρα που εκφράζουν CX3CL1, τόσο σε στατικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες φυσιολογικής ροής (Goda et al, 2000; Fong et al, 1998). Πρόσθετα µε την ενδογενή λειτουργία προσκόλλησης της CX3CL1, ο CX3CR1 µπορεί επίσης να µετάγει σήµατα µέσω των G πρωτεϊνών, που ενισχύουν την πρόσδεση της ιντεγκρίνης στους συνδέτες της (ICAM και VCAM-1) (Goda et al, 2000), οδηγώντας σε πολύ πιο ενισχυµένη κυτταρική προσκόλληση συγκριτικά µε το κάθε σύστηµα ανεξάρτητα (Umehara et al, 2004). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 35

40 Εικόνα 9. Σχηµατική δοµή των διαφόρων περιοχών (domains) της CX3CL1, σε σχέση µε τις άλλες χηµειοκίνες. Στην αρχή βρίσκεται το προβλεπόµενο πεπτίδιο σήµατος, στη συνέχεια υπάρχει µια Ν- τελική περιοχή χηµειοκίνης (1-76) µε την µοναδική παρεµβολή 3 αµινοξέων ανάµεσα στις κυστεΐνες (CX3C), έπειτα ο µίσχος παρόµοιος µε βλεννίνη (77-317) µε τις προβλεπόµενες O-γλυκοσυλιωµένες σερίνες και θρεονίνες ( ), στη συνέχεια η διαµεµβρανική περιοχή ( ) και τέλος η ενδοκυτταρική περιοχή ( ). Το RR υποδεικνύει ένα διβασικό µοτίβο κοντά στη µεµβράνη (θέση διάσπασης) (Umehara et al, 2004). Αλληλεπιδρώντας µε τον υποδοχέα της, η απελευθερωµένη διαλυτή CX3CL1 δρα ως χηµειοελκτικός παράγοντας, επάγοντας τη µετανάστευση µονοκυττάρων, NK κυττάρων, κυττάρων µικρογλοίας, Th1 λεµφοκυττάρων, SMCs (Smooth Muscle Cells) και ECs (Endothelial Cells) (Ludwig and Weber, 2007). Πρόσθετα στην χηµειοτακτική λειτουργία της διαλυτής CX3CL1, και η προσδεµένη στη µεµβράνη CX3CL1 έχει έµµεση χηµειοτακτική δράση, ενισχύοντας την επίδραση άλλων χηµειοκινών στη µετανάστευση των λευκοκυττάρων που εκφράζουν CX3CR1 (Nishimura et al, 2002) (Εικ. 10). Εφόσον η CX3CL1 προάγει την κυτταρική µετανάστευση και ενεργοποιεί τα θετικά σε CX3CR1 κύτταρα για να παράγουν IFN-γ, είναι πιθανόν ότι ενέχεται στην ανοσοπαθογένεση διαφόρων νοσηµάτων µέσω χρόνιας φλεγµονής (Umehara et al, 2004). Πλέον, έχει φανεί ότι το σύστηµα CX3CL1/CX3CR1 είναι σηµαντικό σε πολλές κλινικές ασθένειες, όπως η αθηροσκλήρωση, καρδιαγγειακές ασθένειες, η απόρριψη µοσχεύµατος, η σπειραµατονεφρίτιδα, η ρευµατοειδής αρθρίτιδα, ο ερυθηµατώδης λύκος, η µόλυνση µε τον ιό HIV και άλλες πολλές φλεγµονώδεις ασθένειες (Fevang et al, 2009; Charo and Ransohoff, 2006). Επιπλέον, υπάρχουν στοιχεία από in vitro µελέτες ότι η λειτουργία του συστήµατος CX3CL1/CX3CR1 στην αγγείωση δεν περιορίζεται µόνο στην στρατολόγηση των λευκοκυττάρων, καθώς έχει βρεθεί ότι η CX3CL1 επάγει την παραγωγή κυτοκινών και τον πολλαπλασιασµό στα αγγειακά κύτταρα ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 36

41 (Chandrasekar et al, 2003), αλλά και την αγγειογένεση, µέσω ενεργοποίησης του µονοπατιού του VEGF (Ryu et al, 2008). Εικόνα 10. Βιολογικές λειτουργίες της CX3CL1: 1. Η δέσµευση του CX3CR1 και των ιντεγκρινών µέσω συνέκφρασης της CX3CL1 και των συνδετών ιντεγκρίνης, οδηγεί σε ισχυρή προσκόλληση. 2. Τα κυτοτοξικά CX3CR1 + κύτταρα (NK, CD8 + T και γδ T) περιέχουν κυτοπλασµατικά κοκκία. Όταν αυτά τα κύτταρα ενεργοποιούνται από την προσδεµένη στη µεµβράνη CX3CL1 ή τον ενεργοποιηµένο υποδοχέα, µπορεί να βλάψουν τα γειτονικά ECs (ενδοθηλιακά κύτταρα). 3. Η προσδεµένη στη µεµβράνη CX3CL1 ενισχύει την επίδραση άλλων χηµειοκινών στη µετανάστευση των CX3CR1 + κυττάρων στους ιστούς. 4. Τα CX3CR1 + κύτταρα που έχουν µεταναστεύσει, µετά από ενεργοποίηση από την CX3CL1, παράγουν IFN-γ, οδηγώντας σε Th1 απόκριση. Η IFN-γ επίσης ενισχύει την έκφραση της CX3CL1 στα ECs, υποδεικνύοντας ένα βρόχο παρακρινικού συστήµατος ανάδρασης (paracrine-feedback loop system) (Umehara et al, 2004). Αν και πολλές µελέτες έχουν δείξει ότι η CX3CL1 είναι επαγώγιµη χηµειοκίνη, υπάρχουν δεδοµένα που δείχνουν ότι έχει και ιδιοστατικές λειτουργίες, καθώς εκφράζεται ιδιοστατικά από τα νευρωνικά και τα µικρογλοιακά κύτταρα. Το γεγονός αυτό µπορεί να σχετίζεται µε την αλληλεπίδραση νευρώνων-µικρογλοίας, τη νευρωνική επιβίωση και νευροπροστασία ή µε υποδοχείς ερεθισµάτων πόνου (Ludwig and Mentlein, 2008). Ο υποδοχέας για την CX3CL1 όπως προαναφέρθηκε είναι ο CX3CR1 (CX3C Receptor 1). Ο CX3CR1 ανήκει στην οικογένεια των GPCRs (G Protein Coupled Receptors) και είναι υψηλά ειδικός υποδοχέας για την CX3CL1, καθώς και συνυποδοχέας για την είσοδο του HIV (Combadiere et al, 1998; Imai et al, 1997). Η επαγόµενη από την CX3CL1 κυτταρική µετανάστευση είναι ευαίσθητη σε αναστολή µέσω αναστολέων των Gi-πρωτεϊνών. Ποντικοί στους οποίους έχει γίνει κατευθυνόµενη προσθήκη της πρωτεΐνης GFP (αφαίρεση του τµήµατος του γονιδίου ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 37

42 CX3CR1 εκτός από την περιοχή του προαγωγέα του, ο οποίος κατευθύνει τη µεταγραφή του γονιδίου GFP), έχουν χρησιµοποιηθεί για τη µελέτη της κατανοµής του υποδοχέα στα µονοκύτταρα µέσω µικροσκοπίας φθορισµού (Jung et al, 2000). Ο CX3CR1 εκφράζεται σε κύτταρα νευρώνων και µικρογλοίας, σε µονοκύτταρα, δενδριτικά κύτταρα, υπο-οµάδες T-κυττάρων, CD16 + NK κύτταρα, SMCs, ECs και αιµοπετάλια (Ludwig and Weber, 2007). Επιπλέον, τόσο η CX3CL1 όσο και ο CX3CR1 βρίσκονται σε µεγάλες ποσότητες στον αµφιβληστροειδή (Combadiere et al, 1998; Foxman et al, 2002), όπου εκφράζονται ιδιοστατικά, αλλά και σε απόκριση σε φλεγµονώδεις καταστάσεις (Silverman et al, 2003). To γονίδιο για τον CX3CR1 εντοπίζεται στον άνθρωπο στη χρωµοσωµική περιοχή 3p21.3 (Εικ. 11), περίπου 10 Mb από το βασικό σύµπλεγµα των υποδοχέων των χηµειοκινών CCR1, CCR3, CCR2 και CCR5 (Maho et al, 1999). Αποτελείται από 2 εξόνια και καλύπτει µια περιοχή bp. Κωδικοποιεί για µια πρωτεΐνη µοριακού βάρους Da, που αποτελείται από 355 αµινοξέα ( και όπως όλοι οι GPCRs, έχει δοµή που συνίσταται από 7 διαµεµβρανικές περιοχές. Εικόνα 11. Εντοπισµός του γονιδίου που κωδικοποιεί για τον CX3CR1 στον άνθρωπο, στη χρωµοσωµική περιοχή 3p21.3 ( Λίγα είναι γνωστά για πώς πρέπει να είναι η δοµή του CX3CR,1 ώστε να υπάρχει µια λειτουργική αλληλεπίδρασή του µε την CX3CL1. Έχουν αναγνωριστεί δύο µη-συνώνυµα (non-synonymous) SNPs που επηρεάζουν τα κωδικόνια 249 (rs ) και 280 (rs ) αντίστοιχα, και βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης. Αυτοί οι πολυµορφισµοί προκαλούν αµινοξικές αλλαγές, στη θέση 249 από βαλίνη σε ισολευκίνη (V249I) και στη θέση 280 από θρεονίνη σε µεθειονίνη (T280M) (Faure et al, 2000). Τα κωδικόνια αυτά βρίσκονται στην έλικα ανάµεσα στις διαµεµβρανικές περιοχές 6 και 7, στο µόριο του υποδοχέα (Εικ. 12). Η λειτουργική ανάλυση έχει δείξει ότι στα λευκοκύτταρα από άτοµα οµόζυγα I249/M280 υπάρχει σηµαντική µείωση στον αριθµό των θέσεων πρόσδεσης του υποδοχέα µε την CX3CL1 αλλά και µειωµένη συγγένεια πρόσδεσης µε την CX3CL1 σε σχέση µε τα κύτταρα µε γενότυπο V249/T280 (Faure et al, 2000). Τα ίδια ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 38

43 αποτελέσµατα, αλλά µόνο για το αλληλόµορφο Ι249, έχουν βρεθεί και σε επόµενη µελέτη (Moatti et al, 2001). Και στις δύο αυτές µελέτες, το αλληλόµορφο Ι249 βρέθηκε επίσης να εκφράζεται πολύ λιγότερο, σε σχέση µε το V249. Επιπλέον, σε επόµενη λειτουργική µελέτη βρέθηκε ότι τα κύτταρα µε γενότυπο I249/Μ280 δείχνουν γενικευµένη εξασθενηµένη λειτουργία του CX3CR1, δηλαδή µειωµένη χηµειόταξη αλλά και CX3CL1-επαγόµενη προσκόλληση, εξαιτίας σηµαντικής µείωσης στην κινητική της πρόσδεσης µε την CX3CL1 (µειωµένη συγγένεια πρόσδεσης) (McDermott et al, 2003). Εικόνα 12. οµή του CX3CR1, αποτελούµενη από 7 διαµεµβρανικές περιοχές και 6 έλικες, όπως σε όλους τους GPCRs ( Ωστόσο, σε µια επόµενη µελέτη βρέθηκε κάτι µη αναµενόµενο. Τα κύτταρα µε γενότυπο Ι249/Μ280 και V249/Τ280 αποκρίνονται µε τον ίδιο τρόπο στη διαλυτή CX3CL1, αλλά συµπεριφέρονται διαφορετικά στην προσδεµένη στη µεµβράνη CX3CL1. Συγκεκριµένα, η προσκόλληση που διαµεσολαβήθηκε από την CX3CL1 στα κύτταρα Ι249/Μ280, ήταν σηµαντικά υψηλότερη σε σχέση µε τα κύτταρα V249/Τ280, και αυτό αποδόθηκε µόνο σε επίδραση του αλληλόµορφου Ι249. Καθώς αναφέρουν, είναι η πρώτη φορά που µια µετάλλαξη σε έναν υποδοχέα χηµειοκίνης σχετίζεται µε αυξηµένη λειτουργία του υποδοχέα (Daoudi et al, 2004). Μόνο υποθέσεις µπορούν να γίνουν για το πώς µια ηµι-συντηρητική αλλαγή (βαλίνη σε ισολευκίνη) µπορεί να έχει τόσο δραµατικές επιπτώσεις. Πρόσφατες µελέτες τονίζουν ότι η σχετική κίνηση της έλικας ανάµεσα στις διαµεµβρανικές περιοχές 6 και 7 (στην οποία όπως προαναφέρθηκε εντοπίζονται οι συγκεκριµένοι πολυµορφισµοί) παίζει σηµαντικό ρόλο στις αλλαγές στη διαµόρφωση των GPCRs (Meng and Bourne, 2001; Decaillot et al, 2003). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 39

44 Επιπλέον, απαιτούνται περισσότερες µελέτες ώστε να καθοριστεί κατά πόσο αυτοί καθαυτοί οι συγκεκριµένοι πολυµορφισµοί αλλάζουν τη λειτουργία του υποδοχέα ή βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης µε κάποιον άλλο πολυµορφισµό που αποτελεί την αιτία αυτής της αλλαγής, ή ακόµη αν συνδέονται µε πολυµορφισµούς στην περιοχή του προαγωγέα που µπορεί να επηρεάζουν την έκφραση του CX3CR1, ανεξάρτητα της δοµής του. Για παράδειγµα, µια µελέτη προτείνει ότι ο πολυµορφισµός I249 συνδέεται µε έναν πολυµορφισµό στην περιοχή του προαγωγέα (DeVries et al, 2003). Επιπλέον, δε θα πρέπει να αγνοηθεί η πιθανότητα αυτοί οι πολυµορφισµοί να βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης µε λειτουργικούς πολυµορφισµούς σε κοντινά γονίδια υποδοχέων χηµειοκινών, όπως ο CCR8. Οι δύο αυτοί πολυµορφισµοί έχουν µελετηθεί για πιθανή συσχέτιση µε το AIDS, όπου τα αποτελέσµατα γενικά δεν είναι ταυτόσηµα. Συγκεκριµένα, όσον αφορά της εξέλιξη της νόσου, έχει βρεθεί αυξηµένος κίνδυνος για το αλληλόµορφο Μ280 (αλλά όχι το I249) (Faure et al, 2003; Faure et al, 2000), ήπια προστατευτική επίδραση του αλληλόµορφου Μ280 σε ετεροζυγωτία (McDermott et al, 2000), ή καµία συσχέτιση (Kwa et al, 2003; Hendel et al, 2001). Μία άλλη µελέτη, κατέληξε ότι κανένα από τα δύο αλληλόµορφα δεν προσφέρει προστασία έναντι της µόλυνσης µε τον ιό HIV (Suresh et al, 2006). Ακόµη, σε άλλη µελέτη βρέθηκε αυξηµένη ανοσολογική απόκριση σε συγκεκριµένη αγωγή στους ασθενείς µε το αλληλόµορφο Ι249 ή το Μ280 (Passam et al, 2007). Εποµένως, η συσχέτισή τους µε το AIDS δεν είναι ξεκάθαρη. Επιπλέον, οι πολυµορφισµοί αυτοί έχουν µελετηθεί και για πιθανή συσχέτιση µε καρδιαγγειακά νοσήµατα. Και εδώ, τα αποτελέσµατα είναι αντιφατικά. Άλλες µελέτες υποστηρίζουν µια αθηρο-προστατευτική επίδραση, είτε για το αλληλόµορφο Ι249 (Moatti et al, 2001; McDermott et al, 2001), είτε για το αλληλόµορφο Μ280 (Apostolakis et al, 2007), είτε και για τα δύο (Lavergne et al, 2005; McDermott et al, 2003). Τέλος, άλλες έχουν αποτύχει να βρουν κάποια συσχέτιση (Hattori et al, 2005), ενώ το πιο εντυπωσιακό είναι ότι σε µία βρέθηκαν αντίθετες επιδράσεις, δηλαδή η παρουσία του Ι249 είναι επιβλαβής, ενώ η παρουσία του Μ280 προστατευτική (Niessner et al, 2005). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 40

45 Μελέτες συσχέτισης των δύο SNPs (rs και rs ) στο γονίδιο CX3CR1 µε την AMD Η πρώτη µελέτη συσχέτισης των δύο αυτών πολυµορφισµών (V249I και Τ280Μ) στο γονίδιο του CX3CR1 µε την AMD πραγµατοποιήθηκε το 2004 από τους Tuo και συν. στις Η.Π.Α (Tuo et al, 2004b; Chan et al, 2005). Οι ερευνητές βρήκαν αυξηµένη συχνότητα των πολυµορφικών αλληλόµορφων I249 και M280 (µε µεγαλύτερο odds ratio για το τελευταίο) στους ασθενείς µε AMD σε σχέση µε τις δύο οµάδες ελέγχου που συµπεριέλαβαν, εποµένως υποθέτουν ότι αποτελούν παράγοντα κινδύνου για την εµφάνιση AMD. Επιπλέον, σύγκριναν την έκφραση του CX3CR1 σε ιστολογικές τοµές (από αρχείο ασθενών και υγιών ατόµων), όπου παρατήρησαν ότι δεν ανιχνεύθηκε mrna του CX3CR1 σε κύτταρα ασθενών T/M280, ωστόσο ανιχνεύθηκε σε κύτταρα υγιών ατόµων Τ/Τ280 και T/M280 (στους Τ/Μ χαµηλότερη), αλλά και ασθενών T/T280 (χαµηλότερη από υγιείς). Επίσης, παρατήρησαν και χαµηλότερη πρωτεϊνική έκφραση του CX3CR1 σε κύτταρα της περιοχής της ωχράς κηλίδας ασθενούς T/M280, σε σχέση µε την περιοχή του αµφιβληστροειδούς εκτός της ωχράς κηλίδας. Σε αντίθεση, παρόµοια επίπεδα πρωτεΐνης CX3CR1 ανιχνεύθηκαν στα κύτταρα και της ωχράς κηλίδας και του υπόλοιπου αµφιβληστροειδικού χώρου σε υγιές άτοµο Τ/Μ280 και ασθενή T/Τ280. Συνολικά, από τα δεδοµένα τους οι ερευνητές υπέθεσαν το παρακάτω µοντέλο: τα µακροφάγα, λόγω µειωµένης λειτουργίας της χηµειοκίνης CX3CR1 ή/και µειωµένης έκφρασης της πρωτεΐνης CX3CR1 (στην περίπτωση γενότυπου Τ/Μ ή Μ/Μ και V/I ή V/V), δε στρατολογούνται επαρκώς στην περιοχή της ωχράς κηλίδας, και έτσι η περιοχή δεν καθαρίζεται και σταδιακά συσσωρεύονται τα drusen. Η δεύτερη µελέτη συσχέτισης, που συµπεριέλαβε και πειράµατα σε ένα νέο µοντέλο ποντικών (CX3CR1 -/- ), διεξήχθη από τους Combadière και συν. στη Γαλλία (Combadière et al, 2007). Καταρχήν, οι ερευνητές έδειξαν µε ανοσοϊστοχηµεία ότι τόσο στους ανθρώπους όσο και στους ποντικούς, τα µόνα κύτταρα στην περιοχή του αµφιβληστροειδούς που εκφράζουν τον CX3CR1 είναι τα µικρογλοιακά κύτταρα (ανοσολογικά κύτταρα που κατοικούν στο κεντρικό νευρικό σύστηµα). Στους ασθενείς µε AMD, αυτά τα κύτταρα συσσωρεύονταν στον υποαµφιβληστροειδικό χώρο (Subretinal Microglial Cells-SrMCs), στις περιοχές όπου εντοπίζονταν οι βλάβες οι σχετιζόµενες µε την ασθένεια (στα drusen και σε εγγύτητα µε την CNV). Η οµοζυγωτία για το αλληλόµορφο Μ280 (αλλά όχι για το Ι249) σχετίστηκε µε ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 41

46 αυξηµένο κίνδυνο εµφάνισης AMD. Για να εκτιµηθεί η επίπτωση του πολυµορφισµού στην λειτουργία του υποδοχέα, µελέτησαν in vitro τη χηµειόταξη των µονοκυττάρων σε απόκριση στον CCL2 (στην παρουσία προσδεδεµένου CX3CL1), που προέρχονταν από ασθενείς οµόζυγους V/T και οµόζυγους I/M. Στην περίπτωση οµοζυγωτίας Ι/Μ, τα µονοκύτταρα µετανάστευαν σε µικρότερο βαθµό, δείχνοντας έτσι ότι η χηµειόταξη των µονοκυττάρων στους Ι/M ασθενείς είναι εξασθενηµένη. Στους ποντικούς CX3CR1 -/-, όπως και στους ασθενείς µε AMD, τα MCs συσσωρεύονταν στον υποαµφιβληστροειδικό χώρο, τόσο ως αποτέλεσµα γήρανσης, όσο και µετά από επίδραση µε λέιζερ. Αυτή η συσσώρευση σχετίστηκε µε παθολογικά και µορφολογικά γνωρίσµατα της AMD (σχηµατισµό drusen, CNV και εκφυλισµό φωτοϋποδοχέων). Όπως αναφέρουν, ήταν η πρώτη φορά που ένα µοντέλο ποντικού προσοµοίαζε µε ένα τόσο ολοκληρωµένο τρόπο τα χαρακτηριστικά συµπτώµατα της AMD. Συνοψίζοντας, από τα δεδοµένα τους οι ερευνητές υπέθεσαν το παρακάτω µοντέλο: τα συσσωρευµένα SrMCs αποτελούν την κινητήριο δύναµη στην παθογένεση της AMD και όχι απλά µια δευτερογενή συνέπεια του εκφυλισµού του RPE ή των φωτοϋποδοχέων. Συγκεκριµένα, η συσσώρευση των SrMCs, που προκύπτει από µια ανωµαλία στη µετανάστευση που σχετίζεται µε τον CX3CR1, παίζει σηµαντικό ρόλο στο σχηµατισµό των drusen, τη CNV και τον εκφυλισµό του αµφιβληστροειδούς. Η ίδια ερευνητική οµάδα, για να επιβεβαιώσει το ρόλο του CX3CR1 στην παθογένεση της AMD αλλά και να µελετήσει τη µοίρα των SrMCs συνέχισε τη µελέτη, και κατέληξε στο συµπέρασµα ότι η συσσώρευση των MCs στις θέσεις της βλάβης στoυς CX3CR1 -/- ποντικούς είναι ανεξάρτητη από τον CX3CR1 και προηγείται του εκφυλισµού των φωτοϋποδοχέων. Ο ρόλος του CX3CR1 πιθανόν αφορά στη συµµετοχή του στην έξοδο των MCs µακριά από τον υποαµφιβληστροειδικό τους εντοπισµό (Raoul et al, 2008). Εποµένως, τα αποτελέσµατά τους περιγράφουν µια νέα οδό εκκαθάρισης που απαιτεί περαιτέρω έρευνες για να διευκρινιστεί ο µηχανισµός της. Επίσης, η ερευνητική οµάδα των Tuo και συν., µετά την παρατήρηση ότι οι διαγονιδιακοί ποντικοί CX3CR1 -/- που αναπτύχθηκαν από την οµάδα των Combadière και συν. εµφανίζουν τα βασικά χαρακτηριστικά της AMD, και σε συνδυασµό µε τα προηγούµενα ευρήµατα για τους CCL2 -/- ποντικούς, οδηγήθηκαν ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 42

47 στην κατασκευή ενός διπλά µεταλλαγµένου ποντικού CCL2 -/- /CX3CR1 -/-. Η υπόθεση που ήθελαν να ελέγξουν ήταν κατά πόσο η ανεπάρκεια και στα δύο αυτά µόρια έχει συνεργατική επίδραση στην εµφάνιση της ασθένειας (Tuo et al, 2007). Η υπόθεσή τους επιβεβαιώθηκε, καθώς οι CCL2 -/- /CX3CR1 -/- ποντικοί ανέπτυσσαν εκφυλιστική ασθένεια του αµφιβληστροειδούς, µε ευρέα παθολογικά γνωρίσµατα που µιµούνταν την AMD πολύ νωρίτερα, τα αποτελέσµατά τους ήταν επαναλήψιµα και ο φαινότυπος ισχυρά διεισδυτικός. Επιπλέον, παρατήρησαν και αυτοί µικρογλοιακά κύτταρα στις περιοχές του αµφιβληστροειδούς που είχαν υποστεί βλάβη στους CCL2 -/- /CX3CR1 -/- ποντικούς, αλλά όχι στους ποντικούς άγριου τύπου, ενισχύοντας την υπόθεση για σηµαντική συνεισφορά των κυττάρων αυτών στην παθογένεση της ασθένειας. Τα αποτελέσµατα αυτά υπογραµµίζουν το σηµαντικό ρόλο αυτών των δύο χηµειοκινών (και των µονοπατιών που σχετίζονται µε αυτές) στην ανάπτυξη της AMD (Chan et al, 2008). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 43

48 ΣΚΟΠΟΣ Ο σκοπός της συγκεκριµένης µεταπτυχιακής διπλωµατικής εργασίας είναι η µελέτη της κατανοµής των συχνοτήτων των δύο πολυµορφισµών V249Ι και Τ280Μ στο γονίδιο του CX3CR1, σε ένα τυχαίο δείγµα πληθυσµού από τη Θεσσαλονίκη. Συγκεκριµένα, το δείγµα αποτελείται από µία οµάδα ασθενών µε AMD (όλα τα στάδια) και από µία οµάδα ελέγχου. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα από τις µελέτες που προαναφέρθηκαν, το γονίδιο αυτό, αλλά και οι συγκεκριµένοι πολυµορφισµοί, φαίνεται να εµπλέκονται στην εµφάνιση της AMD. Εποµένως, η σύγκριση της συχνότητας εµφάνισης των πολυµορφισµών αυτών στις δικές µας οµάδες, θα δείξει κατά πόσο υπάρχει συσχέτισή τους µε την ασθένεια AMD και στον ελληνικό πληθυσµό. Μια πιθανή θετική ή αρνητική συσχέτιση, θα ενισχύσει ή θα έρθει σε αντίθεση µε τα αποτελέσµατα των δύο προηγούµενων µελετών, που διενεργήθηκαν σε διαφορετικές πληθυσµιακές οµάδες. Επιπλέον, καθώς η AMD αποτελεί µια πολύπλοκη πολυπαραγοντική ασθένεια, που επηρεάζεται τόσο από γενετικά στοιχεία όσο και από περιβαλλοντικούς παράγοντες, θα διερευνηθεί στην παρούσα εργασία και η πιθανή συσχέτιση των πολυµορφισµών αυτών µε την AMD, σε συνδυασµό µε γνωστούς περιβαλλοντικούς/δηµογραφικούς παράγοντες κινδύνου (κάπνισµα, φύλο, ηλικία). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 44

49 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΥΛΙΚΟ Το βιολογικό υλικό για τη µελέτη αποτέλεσε µια οµάδα ασθενών και µια οµάδα ελέγχου, οι οποίοι συµµετείχαν στο πρόγραµµα Thessaloniki Eye Study (TES), µια µεγάλη πληθυσµιακή (population-based), επιδηµιολογική και γενετική µελέτη για το γλαύκωµα και την AMD στον ελληνικό πληθυσµό (Topouzis et al, 2006). Στην TES, άτοµα ηλικίας άνω των 60 ετών επιλέχθηκαν τυχαία µέσω των δηµοτολογίων του δήµου Θεσσαλονίκης. Η TES εγκρίθηκε από την επιτροπή ηθικής για τα νοσοκοµεία του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου. Τόσο οι ασθενείς όσο και η οµάδα ελέγχου, πριν τη συµµετοχή τους και µετά από ενηµέρωση έδωσαν γραπτή συγκατάθεση και υποβλήθηκαν σε µια πλήρη οφθαλµολογική εξέταση. Όσον αφορά την AMD, κατηγοριοποιήθηκαν σε οµάδες µε βάση το σύστηµα οµαδοποίησης του International ARM Epidemiological Study Group (Bird et al, 1995). Σύµφωνα µε αυτό, υπάρχουν 4 οµάδες ασθενών (οµάδα 1:πολύ πρώιµο στάδιο, οµάδα 2:πρώιµο στάδιο, οµάδα 3:ενδιάµεσο στάδιο, οµάδα 4:προχωρηµένο στάδιο). Επιπλέον, έγινε περαιτέρω διαχωρισµός της οµάδας 4 σε ξηρή ή υγρή AMD, εποµένως αναφέρονται ως οµάδα 4 οι ασθενείς µε ξηρή και ως οµάδα 5 οι ασθενείς µε υγρή AMD. είγµατα αίµατος συλλέχθηκαν από την πλειονότητα των συµµετεχόντων. Για το σκοπό της παρούσας case-control µελέτης συσχέτισης, χρησιµοποιήθηκαν δείγµατα αίµατος από ένα σύνολο 232 ασθενών (όλων των οµάδων AMD) και 175 ατόµων που καθιστούσαν την οµάδα ελέγχου (µάρτυρες). Συγκεκριµένα, η οµάδα των ασθενών περιλάµβανε 54 άτοµα µε AMD βαθµού 1, 71 άτοµα µε AMD βαθµού 2, 57 άτοµα µε AMD βαθµού 3, 22 άτοµα µε AMD βαθµού 4 και 28 άτοµα µε AMD βαθµού 5. Επιπλέον, οι συµµετέχοντες απάντησαν σε συγκεκριµένο ερωτηµατολόγιο, όσον αφορά τη σχέση τους µε το κάπνισµα, δηµιουργώντας έτσι ένα αρκετά αναλυτικό ιστορικό καπνίσµατος. Οι ερωτήσεις είχαν σκοπό να καθορίσουν την ηλικία έναρξης του καπνίσµατος, την ηλικία διακοπής του (εφόσον κάτι τέτοιο συνέβη) και την ποσότητα του καπνού που καταναλώθηκε σε διαφορετικές περιόδους (µέχρι και 25 χρόνια στο παρελθόν). ε συµπεριλήφθηκαν πληροφορίες για την ποσότητα των τσιγάρων που οι συµµετέχοντες κάπνιζαν πριν από τα προηγούµενα 25 ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 45

50 χρόνια, καθώς στους ηλικιωµένους, η ανάκληση τέτοιων πληροφοριών πριν αυτή την περίοδο µπορεί να είναι ανεπαρκής. Ακολούθησε αποµόνωση DNA από τα δείγµατα αίµατος των ασθενών και των µαρτύρων και στη συνέχεια ανάλυση των δύο υπό διερεύνηση πολυµορφισµών. ΜΕΘΟ ΟΙ Α. Αποµόνωση DNA Η αποµόνωση του γονιδιωµατικού DNA από το περιφερικό αίµα έγινε χρησιµοποιώντας το kit αποµόνωσης της Qiagen, QIAamp DNA Blood Mini Kit. Συνοπτικά, η διαδικασία περιλαµβάνει (Εικ. 13): Ανακίνηση του σωλήνα µε το αίµα. Τοποθέτηση σε σωληνάριο τύπου eppendorf 200 µl αίµατος. Προσθήκη 200 µl διαλύµατος λύσης (AL1) και 20 µl πρωτεϊνάσης Κ. Ανάδευση (vortex) και επώαση σε θερµοκρασία 56 ο C για 10 λεπτά. Προσθήκη 200 µl αιθανόλης 100%, ανάδευση και µεταφορά στην ειδική στήλη της Qiagen (QIAamp Mini Spin Column). Φυγοκέντρηση στις στροφές για 1 λεπτό. Αλλαγή υποδοχέα (collection tube) και προσθήκη 500 µl διαλύµατος πλύσης AW1. Φυγοκέντρηση στις στροφές για 1 λεπτό. Αλλαγή υποδοχέα και προσθήκη 500 µl διαλύµατος πλύσης AW2. Φυγοκέντρηση στις στροφές για 3 λεπτά. Αφαίρεση υπερκειµένου και φυγοκέντρηση ξανά στις στροφές για 1 λεπτό. Τοποθέτηση της στήλης µέσα σε σωληνάριο τύπου eppendorf. Προσθήκη 50 µl H 2 O, επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά και τέλος φυγοκέντρηση στις στροφές για 1 λεπτό. Ακολουθώντας αυτή τη διαδικασία, το αποτέλεσµα είναι η αποµόνωση καθαρού DNA από τα εµπύρηνα λευκοκύτταρα του αίµατος, αφού έχουν αποµακρυνθεί πρωτεΐνες, άλατα και άλλα µόρια που θα µπορούσαν να λειτουργήσουν ανασταλτικά στην PCR ή/και άλλες ενζυµατικές αντιδράσεις. Το ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 46

51 DNA που λήφθηκε, µετά από µέτρηση σε φωτόµετρο, είχε µέση συγκέντρωση ng/µl. Εικόνα 13. Σχηµατική απεικόνιση της µεθοδολογίας αποµόνωσης DNA από περιφερικό αίµα, σύµφωνα µε το kit της Qiagen (QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 47

52 Β. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) Η PCR (Polymerase Chain Reaction) αποτελεί µια in vitro τεχνική που έχει διευκολύνει σε πολύ µεγάλο βαθµό ένα πλήθος εφαρµογών και µε την οποία γίνεται εκλεκτικός πολλαπλασιασµός µιας συγκεκριµένης ακολουθίας DNA της τάξης του 10 6 (Saiki et al, 1988). Η µέθοδος αναπτύχθηκε από τον K. Mullis το Για την ανακάλυψή του αυτή ο Mullis τιµήθηκε µε το βραβείο Nobel το Η PCR στην ουσία είναι η ίδια διαδικασία µε αυτήν που συµβαίνει φυσικά σε κάθε ζωντανό οργανισµό (αντιγραφή του DNA), µεταφερµένη στο εργαστήριο (in vitro). Η ιδέα του Mullis ήταν ότι έκανε πράξη την προσθήκη µέσα σε δοκιµαστικό σωλήνα όλων των απαραίτητων συστατικών (µόριο DNA, DNA πολυµεράση, δύο εκκινητές και τέσσερα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια), πετυχαίνοντας τον διπλασιασµό αυτού του µορίου DNA και την ενίσχυσή του εκατοµµύρια φορές µέσα σε λίγα λεπτά. Ορισµένες από τις εφαρµογές της PCR είναι: Γενετικό αποτύπωµα (DNA fingerprinting) Πληθυσµιακή ανάλυση αλληλόµορφων ιάγνωση γενετικών ασθενειών Εύρεση πρωτοταγούς ακολουθίας (sequencing) Άµεση κλωνοποίηση γονιδιωµατικών ακολουθιών DNA και ακολουθιών cdna Ταυτοποίηση διαφόρων παθογόνων ή µη µικροοργανισµών Κατευθυνόµενη µεταλλαξιγένεση Έλεγχος πατρότητας Η PCR χαρακτηρίζεται από εκλεκτικότητα, ευαισθησία και ταχύτητα (τα 3 Ss: Selectivity, Sensitivity, Speed) (Arnheim and Erlich, 1992). Οι δύο ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές πλαισιώνουν το κοµµάτι του DNA που επιθυµείται να ενισχυθεί, και ακολουθούν επαναλαµβανόµενοι κύκλοι (25-40) τριών σταδίων (Εικ. 14). Αρχικά γίνεται θερµική αποδιάταξη του DNA, κατά την οποία σπάνε οι υδρογονικοί δεσµοί ανάµεσα στις συµπληρωµατικές βάσεις (91-96 o C). Στη συνέχεια γίνεται η σύνδεση (υβριδισµός) των εκκινητών στη συµπληρωµατική τους ακολουθία (45-65 ο C) και τέλος η επιµήκυνση των συνδεµένων εκκινητών από την DNA πολυµεράση (72 ο C). Οι εκκινητές συνδέονται στους αντίθετους κλώνους της ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 48

53 ακολουθίας-στόχου και έχουν τέτοιο προσανατολισµό ώστε η σύνθεση του DNA από την πολυµεράση να γίνεται στο µεταξύ τους διάστηµα, διπλασιάζοντας αποτελεσµατικά το ποσό αυτού του τµήµατος DNA. Κάθε επιτυχηµένος κύκλος κατόπιν διπλασιάζει το ποσό του DNA που έχει συντεθεί στον προηγούµενο κύκλο. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την εκθετική συσσώρευση του συγκεκριµένου τµήµατοςστόχου 2 n φορές, όπου n ο αριθµός των κύκλων (Saiki et al, 1988). Πριν από τον πρώτο κύκλο, το DNA συχνά αποδιατάσσεται για 5-10 λεπτά ώστε να διασφαλιστεί ότι θα είναι µονόκλωνο και θα µπορεί να υβριδιστεί µε τους µονόκλωνους εκκινητές. Επίσης, µετά το τέλος όλων των κύκλων, εφαρµόζεται συνήθως ένα τελικό στάδιο επιµήκυνσης (5-10 λεπτά) για να διασφαλιστεί ότι οποιοδήποτε DNA έχει αποµείνει µονόκλωνο θα αντιγραφεί επιτυχώς. Η αντίδραση χρειάζεται τα εξής συστατικά: DNA που χρησιµεύει ως εκµαγείο ύο εκκινητές Taq πολυµεράση Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (ισοµοριακό µίγµα και των τεσσάρων δεοξυνουκλεοτιδίων datp, dttp, dgtp, dctp) Ρυθµιστικό διάλυµα (ρυθµίζει το ph στο οποίο η δράση της πολυµεράσης είναι άριστη) Ιόντα Mg 2+ (εάν δεν περιέχονται στο ρυθµιστικό διάλυµα, προστίθενται συµπληρωµατικά). Χρησιµοποιούνται από την πολυµεράση ως µεταλλικός συµπαράγοντας Εικόνα 14. ιαδικασία της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυµεράσης ( ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 49

54 Οι δύο εκκινητές είναι ολιγονουκλεοτιδικές ακολουθίες συµπληρωµατικές µε τα άκρα του τµήµατος DNA που επιθυµείται να ενισχυθεί. Ο σχεδιασµός και η επιλογή τους γίνεται µε βάση τις σταθερές περιοχές του DNA-στόχου. Κάποια από τα χαρακτηριστικά των ιδανικών εκκινητών είναι (Strachan and Read, 1999) : Μήκος συνήθως γύρω στις 20 βάσεις. Περιεχόµενο σε GC αντίστοιχο µε εκείνο του DNA-στόχου (50%-60% GC). Απουσία συµπληρωµατικότητας µεταξύ των δύο εκκινητών, καθώς και µεταξύ διαφορετικών περιοχών του ίδιου εκκινητή, ώστε να αποφεύγεται η δηµιουργία δευτεροταγών δοµών. Όχι τρεις ή περισσότερες G ή C στη σειρά, στο 3 άκρο του εκκινητή. Απουσία αλληλοεπικάλυψης των δύο εκκινητών στο 3 άκρο, προς αποφυγή δηµιουργίας διµερών εκκινητών. Παραπλήσια θερµοκρασία τήξης (T m ). Η τιµή της σταθεράς T m καθορίζεται από τη σύσταση των εκκινητών σε A, T, G και C [2Χ(A+T)+4Χ(G+C)]. Επιθυµητές T m κυµαίνονται µεταξύ 55 o C-65 o C. Η Taq πολυµεράση καθοδηγεί τη σύνθεση της συµπληρωµατικής αλυσίδας DNA, χρησιµοποιώντας τα τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια. Προσθέτει µέχρι και 100 βάσεις σε λιγότερο από ένα λεπτό. Ένα από τα µειονεκτήµατά της είναι ότι στερείται 3-5 δράσης εξωνουκλεάσης. Αυτό οδηγεί σε υψηλό βαθµό λαθών (περίπου 1/ βάσεις) (Arnheim and Erlich, 1992). Στην αυτοµατοποίηση της PCR, εκτός από τη χρήση της Taq πολυµεράσης, συνέβαλε και η δηµιουργία των θερµικών κυκλοποιητών (thermal cyclers). Τα µηχανήµατα αυτά ρυθµίζουν αυτόµατα και ταχύτατα τις εναλλαγές της θερµοκρασίας που συµβαίνουν κατά τη διάρκεια των διαφόρων σταδίων της PCR (Εικ. 15). Η επιτυχής και ειδική ενίσχυση του κοµµατιού DNA που ενδιαφέρει, εξαρτάται από τη συγκέντρωση των δύο εκκινητών και των δεοξυνουκλεοτιδίων, τη µοναδικότητα των εκκινητών, το µήκος των εκκινητών αλλά και της ακολουθίας DNA που θα ενισχυθεί, τη συγκέντρωση των ιόντων Mg 2+, τον αριθµό των κύκλων και κυρίως από τη θερµοκρασία σύνδεσης των εκκινητών (Τ a -T annealing ). Συνήθως είναι 5 o C κάτω από την T m του εκκινητή µε την κατώτερη T m. Τέλος, ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνεται και για την αποφυγή επιµόλυνσης του µίγµατος αντίδρασης µε εξωγενές DNA και για το λόγο αυτό πάντα στο πείραµα συµπεριλαµβάνεται και ένας µάρτυρας ελέγχου (τυφλό). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 50

55 Εικόνα 15. Θερµικός κυκλοποιητής (µηχάνηµα PCR). Η αντίδραση PCR στην παρούσα µελέτη πραγµατοποιήθηκε µε τον θερµικό κυκλοποιητή Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Οι συνθήκες για την αντίδραση δίνονται στον Πίνακα (Πίν. 4). Πίνακας 4. Συνθήκες PCR που ακολουθήθηκαν. ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ ΧΡΟΝΟΣ ΚΥΚΛΟΙ ΣΤΑ ΙΟ 95 C 5 λεπτά 1 Αρχική αποδιάταξη 95 C 45 δευτερόλεπτα 35 Αποδιάταξη 55 C 45 δευτερόλεπτα 35 Υβριδισµός 72 C 45 δευτερόλεπτα 35 Επιµήκυνση 72 C 7 λεπτά 1 Τελική επιµήκυνση Για την ενίσχυση του τµήµατος µεγέθους 330 bp στο γονίδιο του CX3CR1 στο οποίο περιέχονται οι δύο προς εξέταση πολυµορφικές θέσεις, χρησιµοποιήθηκαν οι εκκινητές από την εργασία του Bayley και συν. (Bayley et al, 2003). Η ακολουθία των εκκινητών είναι η παρακάτω: CX3CR1-F: 5 -AGCCATTAAACTGATCCTTCTG- 3 CX3CR1-R: 5 -AGAACACTTCCATGCCTGC- 3 ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 51

56 Η θέση τους στο γονίδιο, καθώς και η ακολουθία που περικλείουν, δίνεται στην Εικ AGCCATTAAACTGATCCTTCTGGTGGTCATCGTGTTTTTCCTCTTCTGGA CACCCTACAACGTTATGATTTTCCTGGAGACGCTTAAGCTCTATGACTTCT TTCCCAGTTGTGACATGAGGAAGGATCTGAGGCTGGCCCTCAGTGTGACT GAGACGGTTGCATTTAGCCATTGTTGCCTGAATCCTCTCATCTATGCATTT GCTGGGGAGAAGTTCAGAAGATACCTTTACCACCTGTATGGGAAATGCCT GGCTGTCCTGTGTGGGCGCTCAGTCCACGTTGATTTCTCCTCATCTGAATC ACAAAGGAGCAGGCATGGAAGTGTTCT 3 Εικόνα 16. Η ακολουθία του τµήµατος µεγέθους 330 bp στο γονίδιο του CX3CR1 που πρόκειται να ενισχυθεί. Υποδεικνύονται οι δύο εκκινητές, καθώς και οι δύο πολυµορφικές θέσεις. Το πρωτόκολλο που χρησιµοποιήθηκε για την PCR δίνεται στον Πίν. 5: Πίνακας 5. Πρωτόκολλο PCR για την ενίσχυση τµήµατος του γονιδίου CX3CR1. ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΠΟΣΟΤΗΤΑ(µl) ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ Ρυθµιστικό διάλυµα 10Χ Taq buffer (100 mm Tris-HCl, ph=8.8, 500 mm KCl) 5 1Χ MgCl mm Μείγµα ολιγονουκλεοτιδίων (ATP, TTP, CTP, GTP) µm CX3CR1-F pmol CX3CR1-R pmol Taq πολυµεράση U/µl DNA ng Αποσταγµένο νερό (ih 2 O) Συνολικός όγκος 50 - Β. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε αγαρόζη Τα προϊόντα των αντιδράσεων της PCR ελέγχθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5% (Invitrogen Life Technologies), προκειµένου να διαπιστωθεί εάν η αντίδραση ήταν επιτυχής. Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης είναι µία απλή και γρήγορη διαδικασία που χρησιµοποιείται για το διαχωρισµό τµηµάτων ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 52

57 νουκλεϊνικών οξέων και µπορεί να ανιχνεύσει µέχρι και 1ng DNA. Στηρίζεται στην ιδιότητα των νουκλεϊνικών οξέων να µετακινούνται προς την άνοδο (+) όταν βρεθούν σε ηλεκτρικό πεδίο, εξαιτίας των αρνητικά φορτισµένων φωσφορικών οµάδων των νουκλεοτιδίων. Λόγω της µικρής µηχανικής αντοχής της αγαρόζης, οι πηκτές αγαρόζης ηλεκτροφορούνται οριζόντια (Εικ. 17). Εικόνα 17. Συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης. Η κινητικότητα των µορίων DNA κατά την ηλεκτροφόρηση στην πηκτή αγαρόζης, εξαρτάται από τις ακόλουθες παραµέτρους (Maniatis et al, 1982): 1. Το µοριακό µέγεθος των τµηµάτων του DNA που πρόκειται να διαχωριστούν. Η κινητικότητα γραµµικών δίκλωνων µορίων DNA είναι αντιστρόφως ανάλογη προς το δεκαδικό λογάριθµο του αριθµού των ζευγών των νουκλεοτιδίων. 2. Τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Η αγαρόζη είναι ένας φυτικός πολυσακχαρίτης που παράγεται από θαλάσσια ροδοφύκη και η πηκτή που σχηµατίζει δεν είναι συµπαγής, αλλά περιλαµβάνει πόρους, το µέγεθος των οποίων είναι αντιστρόφως ανάλογο προς τη συγκέντρωσή της. Όσο πιο µικρή είναι η συγκέντρωση της αγαρόζης, τόσο µεγαλύτερους πόρους σχηµατίζει και εποµένως τόσο πιο µεγάλα τµήµατα DNA διαχωρίζει 3. Τη διαµόρφωση του DNA. Κυκλικό και γραµµικό DNA του ίδιου µοριακού βάρους εµφανίζουν διαφορετική ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες ηλεκτροφόρησης, το κυκλικό DNA µετακινείται ταχύτερα από το αντίστοιχου µεγέθους γραµµικό. ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 53

58 4. Την εφαρµοζόµενη τάση. Αύξηση της τάσης προκαλεί αύξηση της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του DNA. 5. Το χρησιµοποιούµενο ρυθµιστικό διάλυµα. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του DNA εξαρτάται από τη σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος της ηλεκτροφόρησης καθώς και από την ιονική του ισχύ. Υπάρχουν δύο κύρια ρυθµιστικά διαλύµατα που χρησιµοποιούνται στην ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, το ΤΑΕ (Tris-Acetate EDTA) και το ΤΒΕ (Tris-Borate EDTA). Το TBE έχει το πλεονέκτηµα ότι έχει πολύ υψηλή ρυθµιστική ικανότητα, συγκριτικά µε το ΤΑΕ. Η παρασκευή της πηκτής αγαρόζης 1,5% γίνεται ως εξής: Σε κωνική φιάλη προστίθενται 200ml διαλύµατος ΤΒΕ 1Χ (40ml ΤΒΕ 5Χ και 160ml ih 2 O) και 1,8 gr αγαρόζης. Το παρασκεύασµα βράζεται για 4 λεπτά, ώστε το περιεχόµενό του να γίνει διαυγές. Στη συνέχεια το περιεχόµενο της φιάλης αφήνεται να κρυώσει (κάτω από νερό βρύσης) µέχρι η θερµοκρασία του να φτάσει τους 50 ο C περίπου. Προστίθενται 12µl βρωµιούχο αιθίδιο (EtBr) και γίνεται καλή ανακίνηση. Το βρωµιούχο αιθίδιο έχει την ικανότητα να φθορίζει, λόγω σχηµατισµού συµπλόκων παρεµβολής µε το δίκλωνο DNA, όταν διεγερθεί από υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Τέλος, το περιεχόµενο της κωνικής φιάλης αδειάζεται στον ειδικό υποδοχέα, όπου έχουµε τοποθετήσει τις ειδικές χτένες για τη δηµιουργία πηγαδιών. Η αγαρόζη αφήνεται να πήξει για 30 λεπτά περίπου, σε θερµοκρασία δωµατίου. Τέλος, αφαιρούνται οι χτένες και η πηκτή τοποθετείται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης, η οποία είναι γεµάτη µε ρυθµιστικό διάλυµα ΤΒΕ 1Χ. Τα δείγµατα φορτώνονται σε κάθε πηγαδάκι (10µl), αφού προηγουµένως έχουν αναµιχθεί µε διάλυµα φόρτωσης 1µl. Το διάλυµα φόρτωσης περιέχει κυανούν του ξυλενίου, µπλε της βρωµοφαινόλης, γλυκερόλη και ih 2 O. Το κυανούν του ξυλενίου και το µπλε της ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 54

59 βρωµοφαινόλης είναι δύο χρωστικές ιχνηλασιµότητας χαµηλού µοριακού βάρους, που µετακινούνται στην πηκτή και επιτρέπουν να προσδιοριστεί το κατά πόσο έχει µετακινηθεί το DNA. Το µπλε της βρωµοφαινόλης µετακινείται περίπου όπως και ένα τµήµα γραµµικού δίκλωνου DNA µεγέθους 300 βάσεων, ενώ το κυανούν του ξυλενίου όπως ένα τµήµα µεγέθους βάσεων, σε πηκτή αγαρόζης 1%. Εποµένως, στην πηκτή η πρώτη χρωστική που παρατηρείται είναι το κυανούν του ξυλενίου και η δεύτερη - η οποία δεν πρέπει να εξαφανιστεί από την πηκτή όταν µελετάµε µικρά κοµµάτια DNA- είναι το µπλε της βρωµοφαινόλης. Η γλυκερόλη από την άλλη, είναι µια πυκνή ουσία που επιτρέπει στα δείγµατα DNA να πέσουν µέσα στα πηγαδάκια της πηκτής. Μαζί µε τα δείγµατα φορτώνεται και ένας µάρτυρας (100bp ladder) (5 µl) που δίνει ζώνες γνωστού µεγέθους (ανά 100 ζεύγη βάσεων) ώστε να µπορέσουν να εξαχθούν συµπεράσµατα για το µέγεθος σε ζεύγη βάσεων του DNA των δειγµάτων. Η συσκευή τίθεται σε λειτουργία στα 160 Volt και 150 ma και τα δείγµατα ηλεκτροφορούνται για 20 λεπτά περίπου (Εικ. 18). Στη συνέχεια, γίνεται παρατήρηση των ζωνών σε υπεριώδη ακτινοβολία και φωτογράφιση. Εικόνα 18. Σχηµατική απεικόνιση της διαδικασίας της ηλεκτροφόρησης ( S: πηγαδάκια. ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 55

60 Γ. Πέψη µε ένζυµα περιορισµού και ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη (RFLP) Για τη διερεύνηση των πολυµορφισµών, έγινε χρήση της µεθόδου RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism-πολυµορφισµός µήκους περιοριστικών τµηµάτων), η οποία βασίζεται στη χρήση ειδικών ενζύµων, των ενδονουκλεασών περιορισµού. Τα ένζυµα αυτά έχουν αποµονωθεί από βακτήρια και έχουν την ιδιότητα να αναγνωρίζουν και να κόβουν σε συγκεκριµένες αλληλουχίες το DNA (Roberts R.J., 2005). Κάθε ένζυµο περιορισµού εµφανίζει χαρακτηριστικό πρότυπο πέψης σε ένα τµήµα DNA, δηλαδή δηµιουργείται καθορισµένος αριθµός τµηµάτων DNA συγκεκριµένου µεγέθους. Μετάλλαξη σε µία θέση θα οδηγήσει σε απώλεια ή δηµιουργία µιας θέσης κοπής. Συγκεκριµένα, για την ανίχνευση του πολυµορφισµού V249I, έγινε πέψη µε το ένζυµο περιορισµού AclI. Το ένζυµο αυτό αποµονώνεται από το βακτήριο Acinetobacter calcoaceticus M4 και η αλληλουχία που αναγνωρίζει είναι: Παροµοίως, για την ανίχνευση του πολυµορφισµού Τ280Μ, έγινε πέψη µε το ένζυµο περιορισµού BsmAI. Το ένζυµο αυτό αποµονώνεται από το βακτήριο Bacillus stearothermophilus A664 και η αλληλουχία που αναγνωρίζει είναι: Τα πρωτόκολλα που ακολουθήθηκαν για τις δύο πέψεις αναφέρονται στους παρακάτω Πίνακες (Πίν. 6 και 7). Πίνακας 6. Πρωτόκολλο πέψης για την ανίχνευση του πολυµορφισµού V249I. Πολυµορφισµός V249I Ποσότητα / Συνθήκη Ρυθµιστικό διάλυµα 4 2µl BSA 0.5µl AclI (3U/µl) 1µl Προϊόν PCR 10µl Θερµοκρασία επώασης Χρόνος επώασης 37 o C Ο/Ν ***BSA= Bovine Serum Albumin (βόειος αλβουµίνη ορού) ***O/N= ώρες ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 56

61 Πίνακας 7. Πρωτόκολλο πέψης για την ανίχνευση του πολυµορφισµού T280M. Πολυµορφισµός T280M Ποσότητα / Συνθήκη Ρυθµιστικό διάλυµα 3 2µl BsmAI(5U/µl) 1µl Προϊόν PCR 10µl Θερµοκρασία επώασης Χρόνος επώασης 55 o C Ο/Ν Το αποτέλεσµα της πέψης ελέγχθηκε µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 3,5% (Invitrogen Life Technologies). Μετά το πέρας της επώασης, η συνολική ποσότητα από κάθε δείγµα φορτώθηκε στα πηγαδάκια της πηκτής αγαρόζης, αφού προηγουµένως είχε αναµιχθεί µε διάλυµα φόρτωσης 1µl. Φορτώθηκε µαζί µε τα δείγµατα και ο µάρτυρας 50bp ladder (1 µl). Τα δείγµατα ηλεκτροφορήθηκαν για µία ώρα περίπου (140 Volt και 120 ma). Στη συνέχεια, έγινε παρατήρηση των ζωνών και των διαφορετικών προτύπων σε υπεριώδη ακτινοβολία και φωτογράφιση. Οι δύο πολυµορφισµοί V249I και T280M, εξαφανίζουν από µία θέση κοπής για τα ένζυµα AclI και BsmAI αντίστοιχα. Συγκεκριµένα, η αντικατάσταση G A στη θέση 745 (που οδηγεί σε αντικατάσταση στο κωδικόνιο 249 V I) καταστρέφει τη θέση κοπής για το AclI (µπλε επισήµανση Εικ. 19), ενώ η αντικατάσταση C T στη θέση 839 (αντικατάσταση στο κωδικόνιο 280 T M) καταστρέφει τη δεύτερη θέση κοπής καθοδικά για το BsmAI (κόκκινη επισήµανση Εικ. 19). 5 AGCCATTAAACTGATCCTTCTGGTGGTCATCGTGTTTTTCCTCTTCTGGA CACCCTACAA/CGTTATGATTT/TCCTGGAGACGCTTAAGCTCTATGACTTC TTTCCCAGTTGTGACATGAGGAAGGATCTGAGGCTGGCCCTCAGTG/TGAC TGAGACGGTTGCATTTAGCCATTGTTGCCTGAATCCTCTCATCTATGCATT TGCTGGGGAGAAGTTCAGAAGATACCTTTACCACCTGTATGGGAAATGCC TGGCTGTCCTGTGTGGGCGCTCAGTCCACGTTGATTTCTCCTCATCTGAAT CACAAAGGAGCAGGCATGGAAGTGTTCT 3 Εικόνα 19. Η ακολουθία του τµήµατος µεγέθους 330 bp στο γονίδιο του CX3CR1 που ενισχύθηκε. Υποδεικνύονται οι δύο εκκινητές, οι δύο πολυµορφικές θέσεις και οι θέσεις αναγνώρισης των ενδονουκλεασών περιορισµού που χρησιµοποιήθηκαν. Εποµένως, στην περίπτωση που υπάρχει στην ακολουθία γουανίνη (G wildtype), το AclI κόβει το προϊόν της PCR σε δύο κοµµάτια µήκους 270 bp και 60 bp, ενώ στην περίπτωση που αντικαθίσταται από αδενίνη (Α) το προϊόν παραµένει άκοπο ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 57

62 (330 bp). Για τον άλλο πολυµορφισµό, στην περίπτωση που υπάρχει κυτοσίνη (C wild type), το BsmAI κόβει το προϊόν της PCR σε τρία κοµµάτια µε µήκη 184 bp, 75 bp και 71 bp, ενώ στην περίπτωση που αντικαθίσταται από θυµίνη (Τ), όπου η δεύτερη θέση κοπής εξαφανίζεται, προκύπτουν δύο κοµµάτια (259 bp και 71 bp) (Εικ. 20). Εικόνα 20. Αναµενόµενα ηλεκτροφορητικά πρότυπα για την ανίχνευση των πολυµορφισµών V249I (αριστερά) και T280M (δεξιά).. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Αρχικά ελέγχθηκε κατά πόσο υπάρχει στις γενοτυπικές συχνότητες ισορροπία Hardy-Weinberg για την κάθε οµάδα ασθενών και µαρτύρων, µε τη δοκιµασία x 2 και 1 βαθµό ελευθερίας. Η κατανοµή των συχνοτήτων των γενοτύπων και των αλληλόµορφων για τους πολυµορφισµούς V249I και T280M, στις διάφορες οµάδες ασθενών και την οµάδα των control, συγκρίθηκε µε τη δοκιµασία του Pearson s x 2 test. Ως κριτήριο στατιστικής σηµαντικότητας θεωρήθηκε η τιµή του p<0.05. Για να εκτιµηθεί ο βαθµός της συσχέτισης του κάθε πολυµορφισµού µε τα διάφορα στάδια AMD, έγινε υπολογισµός των odds ratios (ORs) και των 95% διαστηµάτων εµπιστοσύνης (Confidence Intervals-CIs), µε ανάλυση λογιστικής παλινδρόµησης (logistic regression). Χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS Στη συνέχεια, πραγµατοποιήθηκε περαιτέρω στατιστική ανάλυση µε προσθήκη πολλαπλών µεταβλητών (multivariate logistic regression - polychotomous και unconditional), για να εξεταστεί κατά πόσο υπάρχει διαφοροποίηση στη ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 58

63 συσχέτιση των πολυµορφισµών µε τα στάδια της AMD, όταν λαµβάνονται υπόψη (adjusting) και οι πιθανές δηµογραφικές/περιβαλλοντικές µεταβλητές (ηλικία, φύλο, κάπνισµα) που εξετάζονται παράλληλα. Εποµένως, γίνεται εκτίµηση και της ανεξάρτητης συσχέτισης µε κάθε έναν από αυτούς τους παράγοντες *. Όσον αφορά την παράµετρο του καπνίσµατος, οι συµµετέχοντες κατηγοριοποιήθηκαν σε µηκαπνιστές, πρώην καπνιστές και νυν-καπνιστές. Οι πρώην καπνιστές διαφοροποιήθηκαν επιπλέον σε δύο οµάδες, ανάλογα µε το πόσα χρόνια είχαν µεσολαβήσει από τη διακοπή του καπνίσµατος ( 20 έτη διακοπής, <20 έτη διακοπής). Για να εκτιµηθεί µια ποσοτική τιµή της έκθεσης στον καπνό, υπολογίστηκαν τα πακέτα/έτος καπνίσµατος, µε βάση το µέσο όρο των τσιγάρων που κάπνιζε το κάθε άτοµο την ηµέρα, διαιρεµένο µε το 20 (συνηθισµένο µέγεθος πακέτου) και πολλαπλασιασµένο επί τον αριθµό των ετών που το άτοµο κάπνιζε. * Η polychotomous και η unconditional logistic regression ανάλυση διενεργήθηκαν από τη βιοστατιστικολόγο, συνεργάτη του κ. Τοπούζη, Sinsheimer Janet (Πανεπιστήµιο Los Angeles). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 59

64 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στις Εικ παρατηρούνται χαρακτηριστικές εικόνες από τα ενισχυµένα τµήµατα 330bp, µετά την αντίδραση της PCR καθώς και τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα που δηµιουργήθηκαν µετά από τις αντίστοιχες πέψεις. Ο προσδιορισµός των γενοτύπων έγινε µε επιτυχία στο σύνολο των 407 δειγµάτων. Εικόνα 21. Ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR για την ενίσχυση του τµήµατος 330 bp του γονιδίου CX3CR1, στο οποίο περιέχονται οι δύο πολυµορφικές θέσεις, σε πηκτή αγαρόζης 1,5%w/v. Εικόνα 22. Ηλεκτροφορητικό πρότυπο σε πηκτή αγαρόζης 3,5%w/v, µετά από πέψη µε το ένζυµο AclI, για την ανίχνευση του πολυµορφισµού V249I. ιακρίνονται οι 3 πιθανοί γενότυποι (VV: οµόζυγος, VI: ετερόζυγος, II: οµόζυγος για τον πολυµορφισµό, µάρτυρας 50bp ladder). Εικόνα 23. Ηλεκτροφορητικό πρότυπο σε πηκτή αγαρόζης 3,5%w/v, µετά από πέψη µε το ένζυµο BsmAI, για την ανίχνευση του πολυµορφισµού Τ280Μ. ιακρίνονται οι 3 πιθανοί γενότυποι (ΤΤ:οµόζυγος, ΤΜ:ετερόζυγος, ΜΜ:οµόζυγος για τον πολυµορφισµό, µάρτυρας 100bp ladder). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 60

65 Οι γενοτυπικές συχνότητες, καθώς και οι συχνότητες των αλληλόµορφων για την κάθε οµάδα ασθενών και τους µάρτυρες, δίνονται στους παρακάτω πίνακες. Πίν. 8. Συχνότητες γενοτύπων στις διάφορες οµάδες ασθενών και τους µάρτυρες που µελετήθηκαν. ΓΕΝΟΤΥΠΟΣ ΟΜΑ Α 1 (%) ΟΜΑ Α 2 (%) ΟΜΑ Α 3 (%) ΟΜΑ Α 4 (%) ΟΜΑ Α 5 (%) ΜΑΡΤΥΡΕΣ (%) V249I VV 34(63%) 36(50.7%) 29(50.9%) 7(31.8%) 13(46.4%) 87(49.7%) VI 14(25.9%) 32(45.1%) 21(36.8%) 9(40.9%) 9(32.2%) 70(40%) II 6(11.1%) 3(4.2%) 7(12.3%) 6(27.3%) 6(21.4%) 18(10.3%) T280M TT 41(75.9%) 53(74.6%) 43(75.4%) 15(68.2%) 22(78.6%) 120(68.6%) TM 11(20.4%) 18(25.4%) 11(19.3%) 4(18.2%) 4(14.3%) 49(28%) MM 2(3.7%) 0(0%) 3(5.3%) 3(13.6%) 2(7.1%) 6(3.4%) *οµάδα 1:πολύ πρώιµο στάδιο, οµάδα 2:πρώιµο στάδιο, οµάδα 3:ενδιάµεσο στάδιο, οµάδα 4:ξηρή AMD, οµάδα 5:υγρή AMD Πίν 9. Συχνότητες αλληλόµορφων στις διάφορες οµάδες ασθενών και τους µάρτυρες που µελετήθηκαν. ΑΛΛΗΛΟΜΟΡΦΟ ΟΜΑ Α 1 (%) ΟΜΑ Α 2 (%) ΟΜΑ Α 3 (%) ΟΜΑ Α 4 (%) ΟΜΑ Α 5 (%) ΜΑΡΤΥΡΕΣ (%) V249I V 82(76%) 104(73.2%) 79(69.3%) 23(52.3%) 35(62.5%) 244(69.7%) I 26(24%) 38(26.8%) 35(30.7%) 21(47.7%) 21(37.5%) 106(30.3%) T280M T 93(86.1%) 124(87.3%) 97(85.1%) 34(77.3%) 48(85.7%) 289(82.6%) M 15(13.9%) 18(12.7%) 17(14.9%) 10(22.7%) 8(14.3%) 61(17.4%) Στην οµάδα των µαρτύρων που χρησιµοποιήθηκαν, οι συχνότητες για τα δύο πολυµορφικά αλληλόµορφα (Ι249 και Μ280) είναι σε συµφωνία µε τις αντίστοιχες που έχουν καταγραφεί για τους καυκάσιους πληθυσµούς. Σύµφωνα µε το LocusLink, στους καυκάσιους η µέση συχνότητα του αλληλόµορφου Ι249 κυµαίνεται γύρω στο 28% ( ενώ για το αλληλόµορφο M280, υπολογίζεται µία συχνότητα γύρω στο 15% ( Επιπλέον, σε µία µελέτη που πραγµατοποιήθηκε στην Ελλάδα (κάτοικοι Κρήτης) σχετικά µε καρδιαγγειακά νοσήµατα, εκτιµήθηκε συν τοις άλλοις η συχνότητα και των συγκεκριµένων πολυµορφισµών (Apostolakis et al, 2007). Παρατηρούµε στον Πίν. 10 ότι οι γενοτυπικές συχνότητες στην οµάδα των µαρτύρων της συγκεκριµένης εργασίας είναι παρόµοιες µε τις αντίστοιχες της παρούσας µελέτης (p>0.05). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 61

66 Πίν 10. Σύγκριση γενοτυπικών συχνοτήτων στις οµάδες µαρτύρων που χρησιµοποιήθηκαν Στην παρούσα µελέτη και τη µελέτη των Apostolakis και συν. (2007). Apostolakis et al. (n=165) ική µας (n=175) T280M ΤΤ 109(66.1%) 120(68.6%) ΤΜ 53(32.1%) 49(28%) ΜΜ 3(1.8%) 6(3.4%) V249I VV 86(52.1%) 87(49.7%) VI 59(35.8%) 70(40%) II 20(12.1%) 18(10.3%) P value Για µεγαλύτερη στατιστική δύναµη στις αναλύσεις που ακολούθησαν, το δείγµα µειώθηκε στα 371 άτοµα. Αφαιρέθηκαν 36 άτοµα συνολικά, είτε λόγω εθνικότητας (άλλης από την ελληνική), είτε λόγω εξέτασης στο σπίτι (στάδια 0, 1 και 2), είτε λόγω ηλικιακών κριτηρίων. Συγκεκριµένα, παρέµειναν άτοµα ηλικίας >63 ετών και <88 ετών, στην κάθε οµάδα ασθενών και την οµάδα ελέγχου. Έτσι, όλες οι οµάδες ήταν ταιριασµένες ως προς την ηλικία µεταξύ τους (age-matched). Επιλέχθηκε να χρησιµοποιηθούν τα στάδια 1+2+µάρτυρες ως η οµάδα αναφοράς, καθώς τα µεν στάδια 1+2 έχουν ελάχιστες διαφορές στην κλινική εικόνα και τα συµπτώµατα και ανήκουν και τα δύο στα πρώιµα στάδια της ασθένειας, αλλά και η οµαδοποίηση αυτή συναντάται πολλές φορές στη βιβλιογραφία (αναφέρονται ως µηέχοντες την ασθένεια). Παροµοίως, τα στάδια 4+5 οµαδοποιήθηκαν ως προχωρηµένο στάδιο (ξηρή και υγρή AMD αντίστοιχα), αλλά και για λόγους στατιστικής δύναµης (αρκετά µικρός αριθµός στην κάθε οµάδα ξεχωριστά). Οι γενοτυπικές συχνότητες, καθώς και οι συχνότητες των αλληλόµορφων, για τις οµάδες που διαµορφώθηκαν τώρα και σύµφωνα µε τις οποίες διενεργήθηκε η στατιστική ανάλυση, δίνονται στους παρακάτω πίνακες (Πίν. 11 και 12). Πίν. 11. Συχνότητες γενοτύπων στις δύο οµάδες ασθενών και την οµάδα αναφοράς. ΓΕΝΟΤΥΠΟΣ ΟΜΑ ΕΣ 1+2+ΜΑΡΤΥΡΕΣ (%) ΟΜΑ Α 3 (%) ΟΜΑ ΕΣ 4+5 (%) V249I VV 147(53.1%) 24(49%) 18(40%) VI 105(37.9%) 18(36.7%) 16(35.6%) II 25(9%) 7(14.3%) 11(24.4%) T280M TT 201(72.6%) 36(73.5%) 34(75.6%) TM 69(24.9%) 10(20.4%) 6(13.3%) MM 7(2.5%) 3(6.1%) 5(11.1%) ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 62

67 Πίν 12. Συχνότητες αλληλόµορφων στις δύο οµάδες ασθενών και την οµάδα αναφοράς. ΑΛΛΗΛΟΜΟΡΦΟ ΟΜΑ ΕΣ 1+2+ΜΑΡΤΥΡΕΣ (%) ΟΜΑ Α 3 (%) ΟΜΑ ΕΣ 4+5 (%) V249I V 399(72%) 66(67.3%) 52(57.8%) I 155(28%) 32(32.7%) 38(42.2%) T280M T 471(85%) 82(83.7%) 74(82.2%) M 83(15%) 16(16.3%) 16(17.8%) Αρχικά, διενεργήθηκε ο έλεγχος x 2, µε 1 βαθµό ελευθερίας και επίπεδο σηµαντικότητας 0.05, για να εκτιµηθεί εάν οι κατανοµή των γενοτύπων στις διάφορες οµάδες της µελέτης βρίσκεται σε ισορροπία Hardy-Weinberg. Για τον πολυµορφισµό V249I, βρέθηκε να υπάρχει ισορροπία στην εµφάνιση των 3 γενοτύπων σε όλες τις οµάδες (x 2 =0.98; 1.33; 3.31, για τις οµάδες 1+2+µάρτυρες; 3; 4+5 αντίστοιχα). Για τον πολυµορφισµό Τ280Μ, υπήρχε επίσης ισορροπία για τις οµάδες 1+2+µάρτυρες και την οµάδα 3 (x 2 =0.14; 3.14, αντίστοιχα). Για τις οµάδες 4 και 5, ως οµάδα προχωρηµένου σταδίου (αλλά και µεµονωµένα), ο έλεγχος έδειξε ότι υπήρχε απόκλιση από την ισορροπία (x 2 =13.31 για οµάδα 4+5). Η αιτία για την απόκλιση από την ισορροπία Hardy-Weinberg σε αυτές τις οµάδες είναι πιθανόν ο µικρός αριθµός των συγκεκριµένων ασθενών, πράγµα που σαφώς αφαιρεί από τη στατιστική δύναµη των αποτελεσµάτων των επόµενων στατιστικών αναλύσεων (ο έλεγχος και µε τη δοκιµασία του Fisher s exact test που χρησιµοποιείται συνηθέστερα για µικρούς αριθµούς δειγµάτων οδήγησε στα ίδια συµπεράσµατα). Παρόλα αυτά, διενεργήθηκε στατιστική ανάλυση και για αυτόν τον πολυµορφισµό, έχοντας βέβαια υπόψη ότι η ερµηνεία δε µπορεί να θεωρηθεί απόλυτα αξιόπιστη. Στη συνέχεια, εφαρµόστηκε η δοκιµασία του Pearson s x 2 test και ο υπολογισµός µε απλή λογιστική παλινδρόµηση των odds ratio (και των 95% CI), ώστε να βρεθεί αν ανεξάρτητα από άλλες παραµέτρους, υπάρχει συσχέτιση κάποιου πολυµορφισµού µε τα στάδια της ασθένειας. Τα αποτελέσµατα από αυτή την ανάλυση για τον πολυµορφισµό V249I, σε επίπεδο γενοτύπων και σε επίπεδο αλληλόµορφων, δίνονται στους Πίν. 13 και 14. ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 63

68 Πίν. 13. Σύγκριση της κατανοµής των γενοτύπων για τον πολυµορφισµό V249I ανάµεσα στις διάφορες οµάδες που µελετήθηκαν. Γενότυπος Οµάδες Οµάδα 3 Οµάδες 4+5 V249I 1+2+µάρτυρες P value VV/VI/II # # P value # # OR (95%CI) - 1,680(0,683-4,130) # 3,261(1,474-7,218) # ΙΙ/VV+VI P value # # OR (95%CI) - 1,178(0,641-2,163) # 1,696(0,893-3,221) # VI+ΙΙ/VV #σε σύγκριση µε οµάδες 1+2+µάρτυρες Πίν. 14. Σύγκριση της κατανοµής των αλληλόµορφων για τον πολυµορφισµό V249I ανάµεσα στις διάφορες οµάδες που µελετήθηκαν. Αλληλόµορφο Οµάδες Οµάδα 3 Οµάδες 4+5 V249I 1+2+µάρτυρες P value # # OR (95%CI) I/V - 1,248 (0,787-1,979) # 1,881 (1,190-2,973) # #σε σύγκριση µε οµάδες 1+2+µάρτυρες Όπως παρατηρείται και από τους παραπάνω πίνακες, βρέθηκε να υπάρχει συσχέτιση ανάµεσα στον συγκεκριµένο πολυµορφισµό και τα προχωρηµένα στάδια της ασθένειας µόνο (στάδια 4+5). Η συσχέτιση αφορά σε επίπεδο αλληλόµορφων (p=0.006 OR=1,881), σε επίπεδο γενοτύπων [δηλαδή ανεξάρτητα µοντέλου (p=0.008)] και στο επίπεδο του γενοτύπου II vs VV+VI (p=0.002 OR=3,261). Το τελευταίο δείχνει ένα µοντέλο υπολειπόµενης επίδρασης (recessive model) του αλληλόµορφου I, ενώ η σύγκριση των γενοτύπων VI+II vs VV (που θα έδειχνε µια υπερέχουσα επίδραση-dominant model) έδωσε µη στατιστικά σηµαντικό αποτέλεσµα. Ωστόσο, και δεδοµένου του µικρού αριθµού των οµόζυγων για το αλληλόµορφο Ι249, αλλά και της έλλειψης βιολογικών δεδοµένων για το τι πραγµατικά ισχύει, δε µπορεί µε βεβαιότητα να ειπωθεί ότι ισχύει αυτό το µοντέλο. Εποµένως, στην ανάλυση που ακολουθεί στη συνέχεια (polychotomous logistic regression), θα προτιµηθεί το log-additive µοντέλο [δείχνει συν-υπεροχή (co-dominance)], που θεωρείται γενικά πιο δυνατό, ακόµη και εάν δεν είναι αυτό που ισχύει πραγµατικά. Σε αυτό το µοντέλο, το αλληλόµορφο Ι (αντιστοίχως και το Μ) έχει µια επίδραση x στον ετερόζυγο (VI) και µία επίδραση 2x στον οµόζυγο (ΙΙ) (στην κλίµακα του log). Για τον δεύτερο πολυµορφισµό, τα αποτελέσµατα από την ανάλυση, σε επίπεδο γενοτύπων και σε επίπεδο αλληλόµορφου δίνονται στους Πίν. 15 και 16. ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 64

69 Πίν. 15. Σύγκριση της κατανοµής των γενοτύπων για τον πολυµορφισµό Τ280Μ ανάµεσα στις διάφορες οµάδες που µελετήθηκαν. Γενότυπος T280M Οµάδες Οµάδα 3 Οµάδες µάρτυρες P value TT/TM/MM # # P value # # OR (95%CI) - 2,516(0,628-10,081) # 4,821(1,460-15,923) # MM/ TT+TM P value # # OR (95%CI) - 0,955(0,481-1,898) # 0,856(0,413-1,774) # ΤΜ+MΜ/TT #σε σύγκριση µε οµάδες 1+2+µάρτυρες Πίν. 16. Σύγκριση της κατανοµής των αλληλόµορφων για τον πολυµορφισµό Τ280Μ ανάµεσα στις διάφορες οµάδες που µελετήθηκαν. Αλληλόµορφο T280M Οµάδες Οµάδα 3 Οµάδες µάρτυρες P value # # OR (95%CI) M/T - 1,107 (0,617-1,986) # 1,227 (0,681-2,210) # #σε σύγκριση µε οµάδες 1+2+µάρτυρες Σε αυτή την περίπτωση, παρατηρείται ότι δεν υπάρχει συσχέτιση του πολυµορφισµού Τ280Μ σε επίπεδο αλληλόµορφου µε κάποιο από τα στάδια της AMD. Υπάρχει συσχέτιση σε επίπεδο γενοτύπου (p=0.007) και στο υπολειπόµενο µοντέλο (p=0.005 OR=4,821) µε τα προχωρηµένα στάδια (οµάδες 4+5). Για αυτόν τον πολυµορφισµό, ο αριθµός των οµόζυγων ΜΜ είναι ακόµη µικρότερος, και επειδή όπως προαναφέρθηκε δεν ισχύει η ισορροπία Hardy-Weinberg, η ερµηνεία θα πρέπει να είναι κάπως πιο προσεκτική. Και εδώ, στη συνέχεια θα προτιµηθεί το log-additive µοντέλο. Στη σύνθετη στατιστική ανάλυση (polychotomous logistic regression, Πίν.17-22), συνεκτιµήθηκε η συνεισφορά και άλλων περιβαλλοντικών/δηµογραφικών παραγόντων µε αυτή των γενετικών παραγόντων. ηλαδή, έγινε εκτίµηση για την πιθανή συσχέτιση της AMD µε τα ενδιάµεσα και τα προχωρηµένα στάδια (ξεχωριστά) καθεµιάς από τις παραµέτρους, διορθώνοντας κάθε φορά (adjusting) για όλες τις υπόλοιπες παραµέτρους. Όσον αφορά τη συσχέτιση µε τους πολυµορφισµούς, όπως προαναφέρθηκε προτιµήθηκε το log-additive µοντέλο, το οποίο θεωρείται αρκετά δυνατό, ακόµη και όταν το πραγµατικό µοντέλο είναι άλλο. Η σύγκριση και εδώ έγινε ξεχωριστά µε την ενδιάµεση (οµάδα 3) και ξεχωριστά µε ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 65

70 την προχωρηµένη (οµάδες 4+5) AMD, µε οµάδα αναφοράς τους µάρτυρες+ οµάδες 1+2. Αρχικά, συνεκτιµήθηκαν η ηλικία, το φύλο, η καταγωγή, το κάπνισµα και οι δύο πολυµορφισµοί. Στον Πίν. 17 παρατηρείται το αποτέλεσµα. Οι παράµετροι καταγωγή και πολυµορφισµός Τ280Μ δε βρέθηκε να συσχετίζονται, και για το λόγο αυτό αφαιρέθηκαν στη συνέχεια ως µη σηµαντικές (παροµοίως, και στις διαφορετικές παραµέτρους του καπνίσµατος, ο πολυµορφισµός Τ280Μ δε βρέθηκε ποτέ σηµαντικός και για το λόγο αυτό τα δεδοµένα δεν παρουσιάζονται). Πίνακας 17. Εκτίµηση της συσχέτισης διαφόρων µεταβλητών µε τη σοβαρότητα της AMD. AMD 3 # P value OR 95% CI Ηλικία * 0 1,121 1,06-1,185 Φύλο ** ,224 0,581-2,577 Καταγωγή Πόντος^ ,956 0,391-2,336 Κάπνισµα^^ ,068 0,507-2,252 Ι ,377 0,752-2,519 Μ ,841 0,393-1,802 AMD4+5 ## Ηλικία * 0 1,167 1,098-1,240 Φύλο ** ,644 1,170-5,976 Καταγωγή Πόντος^ ,522 0,167-1,631 Κάπνισµα^^ ,216 1,386-7,462 Ι ,312 1,266-4,220 5,344 Μ ,584 0,272-1,252 #AMD 3 vs AMD1+2+µάρτυρες ##AMD4+5 vs AMD1+2+µάρτυρες *Ηλικία=για κάθε έτος επιπλέον **Φύλο=άντρες ως οµάδα αναφοράς ^Καταγωγή Πόντος=άλλη καταγωγή ως οµάδα αναφοράς ^^Κάπνισµα=οµάδα αναφοράς οι µη-καπνιστές Ι249=οµάδα αναφοράς οι VV Μ280=οµάδα αναφοράς οι ΤΤ Παρατηρείται (Πίν. 18) ότι στην περίπτωση των προχωρηµένων σταδίων (AMD4+5) υπήρχε συσχέτιση µε όλες τις παραµέτρους, ενώ στην περίπτωση του ενδιάµεσου σταδίου (AMD3) υπήρχε συσχέτιση µόνο µε την ηλικία. Η συσχέτιση µε την ηλικία, τόσο στο στάδιο 3 όσο και στα στάδια 4+5, εξακολουθεί να υπάρχει σε όλες τις επόµενες αναλύσεις, όπου γίνονται διαφοροποιήσεις ως προς τον παράγοντα κάπνισµα. Επιπλέον, η συσχέτιση του αλληλόµορφου Ι249 µε τα προχωρηµένα στάδια, επίσης διατηρήθηκε σε όλες τις επόµενες αναλύσεις. Υπάρχει αντίφαση µόνο όσον αφορά το φύλο και τα προχωρηµένα στάδια, καθώς σε κάποιες περιπτώσεις φαίνεται να αποτελεί παράγοντα κινδύνου για προχωρηµένη AMD και σε άλλες όχι. ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 66

71 Πίν. 18. Επανάληψη της αρχικής ανάλυσης, µετά από αποµάκρυνση των µη σηµαντικών µεταβλητών. AMD 3 # P value OR 95% CI Ηλικία * 0 1,121 1,060-1,185 Φύλο ** ,215 0,578-2,551 Κάπνισµα^ ,065 0,506-2,241 Ι ,252 0,801-1,958 AMD 4+5 ## Ηλικία * 0 1,172 1,103-1,244 Φύλο ** ,634 1,174-5,910 Κάπνισµα^ ,199 1,387-7,381 Ι ,743 1,096-2,774 3,040 #AMD 3 vs AMD1+2+control ##AMD4+5 vs AMD1+2+µάρτυρες *Ηλικία=για κάθε έτος επιπλέον **Φύλο=άντρες ως οµάδα αναφοράς ^Κάπνισµα=οµάδα αναφοράς οι µη- και οι πρώην καπνιστές Ι249=οµάδα αναφοράς οι VV Στη συνέχεια, έγινε αντικατάσταση του καπνίσµατος, που είναι ιδιαίτερα γενικό, µε τους νυν καπνιστές (σε σχέση µε τους µη- και τους πρώην). Στον Πίν. 19 παρατηρείται ότι εδώ υπάρχει συσχέτιση και µε την ενδιάµεση AMD. Πίν. 19. Αντικατάσταση του καπνίσµατος µε τους νυν καπνιστές. AMD 3 # P value OR 95% CI Ηλικία * 0 1,136 1,073-1,203 Φύλο ** ,289 0,681-2,438 Νυν καπνιστές^ ,474 1,157-5,287 Ι ,201 0,762-1,892 AMD 4+5 ## Ηλικία * 0 1,175 1,106-1,248 Φύλο ** ,577 0,800-3,109 Νυν καπνιστές^ ,090 1,388-6,879 Ι ,692 1,063-2,693 2,862 #AMD 3 vs AMD1+2+control ##AMD4+5 vs AMD1+2+µάρτυρες *Ηλικία=για κάθε έτος επιπλέον **Φύλο=άντρες ως οµάδα αναφοράς ^Κάπνισµα=οµάδα αναφοράς οι µη-καπνιστές και οι πρώην καπνιστές Ι249=οµάδα αναφοράς οι VV Οι νυν καπνιστές αντικαταστάθηκαν έπειτα από αυτούς που καπνίζουν ακόµη συν αυτούς που διέκοψαν πρόσφατα, δηλαδή <20 χρόνια (πρόσφατοι καπνιστές) και βρέθηκε ότι σε αυτή την περίπτωση, υπάρχει συσχέτιση των πρόσφατων καπνιστών µε τα προχωρηµένα στάδια της ασθένειας µόνο (Πίν. 20). ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 67

72 Πίν. 20. Αντικατάσταση του καπνίσµατος µε τους πρόσφατους καπνιστές. AMD 3 # P value OR 95% CI Ηλικία * 0 1,128 1,067-1,194 Φύλο ** ,350 0,691-2,637 Πρόσφατοι καπνιστές^ ,538 0,765-3,093 Ι ,229 0,785-1,923 AMD 4+5 ## Ηλικία * 0 1,180 1,110-1,255 Φύλο ** ,021 0,979-4,173 Πρόσφατοι καπνιστές^ ,034 1,425-6,463 Ι ,726 1,087-2,738 2,978 #AMD 3 vs AMD1+2+control ##AMD4+5 vs AMD1+2+µάρτυρες *Ηλικία=για κάθε έτος επιπλέον **Φύλο=άντρες ως οµάδα αναφοράς ^Κάπνισµα=οµάδα αναφοράς οι µη-καπνιστές+όσοι διέκοψαν 20 χρόνια Ι249=οµάδα αναφοράς οι VV Για να εξακριβωθεί εάν η προηγούµενη συσχέτιση οφείλεται τόσο στο συνεχιζόµενο κάπνισµα όσο και στο κάπνισµα στο πρόσφατο παρελθόν, έγινε κατηγοριοποίηση των πρώην καπνιστών σε όσους έχουν διακόψει για <20 προηγούµενα χρόνια και σε όσους έχουν διακόψει για 20 προηγούµενα χρόνια. Παρατηρείται τώρα (Πίν. 21) ότι όσοι εξακολουθούν να καπνίζουν έχουν µεγαλύτερη πιθανότητα για προχωρηµένη ασθένεια, σε σχέση µε όσους δεν κάπνισαν ποτέ ή το έχουν διακόψει (ανεξαρτήτως ετών). Πίν. 21. Κατηγοριοποίηση σε νυν καπνιστές και όσους διέκοψαν το κάπνισµα για <20 ή 20 χρόνια. AMD 3 # P value OR 95% CI Ηλικία * 0 1,136 1,072-1,203 Φύλο ** ,023 0,489-2,139 Νυν καπνιστές^ ,995 0,860-4,630 <20^ ,674 0,235-1,933 19^ ,48 0,140-1,669 Ι ,187 0,752-1,872 AMD 4+5 ## Ηλικία * 0 1,183 1,112-1,259 Φύλο ** ,255 0,984-5,166 Νυν καπνιστές^ ,54 1,766-11,685 <20^ ,726 0,947-7,853 19^ ,768 0,507-6,161 Ι ,675 1,048-2,679 2,807 #AMD 3 vs AMD1+2+control ##AMD4+5 vs AMD1+2+µάρτυρες *Ηλικία=για κάθε έτος επιπλέον **Φύλο=άντρες ως οµάδα αναφοράς ^Κάπνισµα=οµάδα αναφοράς οι µη-καπνιστές Ι249=οµάδα αναφοράς οι VV ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 68

73 Τέλος, σε µια προσπάθεια να γίνει εκτίµηση της ποσοτικής έκθεσης στα συστατικά του καπνού, έγινε ανάλυση µε τα πακέτα/έτος καπνίσµατος και το αποτέλεσµα δείχνει ότι υπάρχει µικρή συσχέτιση µόνο µε τα προχωρηµένα στάδια (Πίν. 22). Πίν. 22. Αντικατάσταση µε τα πακέτα/έτος καπνίσµατος. P value OR 95% CI AMD 3 # Ηλικία * 0 1,114 1,055-1,1780 Φύλο ** ,901 0,455-1,785 Πακέτα/έτος^ ,986 0,971-1,002 Ι ,231 0,782-1,937 AMD 4+5 ## Ηλικία * 0 1,165 1,098-1,236 Φύλο ** ,509 1,124-5,560 Πακέτα/έτος^ ,016 1,006-1,028 Ι ,775 1,121-2,810 3,151 #AMD 3 vs AMD1+2+control ##AMD4+5 vs AMD1+2+µάρτυρες *Ηλικία=για κάθε έτος επιπλέον **Φύλο=άντρες ως οµάδα αναφοράς ^Κάπνισµα=οµάδα αναφοράς οι µη-καπνιστές Ι249=οµάδα αναφοράς οι VV Τέλος, έγινε εκτίµηση µε τη χρήση unconditional logistic regression ανάλυσης (Πίν ) της πιθανής συσχέτισης των παραπάνω παραµέτρων στους ασθενείς µε προχωρηµένα στάδια, µε οµάδα αναφοράς τα πρώιµα και ενδιάµεσα στάδια και τους µάρτυρες. Σε αυτή την περίπτωση, οι αναλύσεις έδειξαν ότι το αλληλόµορφο Ι249, η ηλικία και το κάπνισµα (είτε ως συνεχιζόµενο, είτε ως πρόσφατο είτε σε σχέση µε πακέτα/έτος) παρουσίαζαν θετική συσχέτιση, ενώ όταν ως παράµετρος χρησιµοποιήθηκαν τα πακέτα/έτος καπνίσµατος, και το φύλο βρέθηκε να αποτελεί παράγοντα κινδύνου. Πίν 23. Ανάλυση µε τις παραµέτρους του καπνίσµατος νυν-καπνιστές και πρώην/ποτέ καπνιστές. AMD 4+5 # P value OR 95% CI Ηλικία * 0 1,139 1,077-1,205 Νυν καπνιστές^ ,39 1,117-5,120 Ι ,603 1,025-2,508 2,569 # AMD4+5 vs AMD1+2+3+µάρτυρες *Ηλικία=για κάθε έτος επιπλέον ^Κάπνισµα=οµάδα αναφοράς οι µη-καπνιστές και οι πρώην καπνιστές Ι249=οµάδα αναφοράς οι VV ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 69

74 Πίν 24. Αντικατάσταση του καπνίσµατος µε τους πρόσφατους καπνιστές. AMD 4+5 # P value OR 95% CI Ηλικία * 0 1,143 1,079-1,210 Πρόσφατοι καπνιστές^ ,236 1,131-4,421 Ι ,632 1,048-2,541 2,663 # AMD4+5 vs AMD1+2+3+µάρτυρες *Ηλικία=για κάθε έτος επιπλέον ^Κάπνισµα=οµάδα αναφοράς οι µη-καπνιστές+όσοι διέκοψαν 20 χρόνια Ι249=οµάδα αναφοράς οι VV Πίν. 25. Αντικατάσταση µε τα πακέτα/έτος καπνίσµατος. AMD 4+5 # P value OR 95% CI Ηλικία * 0 1,139 1,076-1,205 Φύλο ** ,551 1,158-5,622 Πακέτα/έτος^ ,018 1,007-1,029 Ι ,695 1,082-2,657 2,874 # AMD4+5 vs AMD1+2+3+µάρτυρες *Ηλικία=για κάθε έτος επιπλέον **Φύλο=άντρες ως οµάδα αναφοράς ^Κάπνισµα=οµάδα αναφοράς οι µη-καπνιστές Ι249=οµάδα αναφοράς οι VV ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 70

75 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν να ερευνηθεί κατά πόσο υπάρχει συσχέτιση των δύο πολυµορφισµών V249I και Τ280Μ στο γονίδιο CX3CR1 µε τη σοβαρότητα της AMD στον ελληνικό πληθυσµό, και σε επόµενο βήµα να ερευνηθεί και κατά πόσο η συγκεκριµένη συσχέτιση (εφόσον υφίσταται) εξακολουθεί να υπάρχει και όταν γίνεται ταυτόχρονη συσχέτιση µε άλλους πιθανούς δηµογραφικούς/περιβαλλοντικούς παράγοντες κινδύνου. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατά, προκύπτει ότι µόνο ο πολυµορφισµός V249I συσχετίζεται µε την προχωρηµένη AMD, ενώ δε βρέθηκε στατιστικά σηµαντική συσχέτισή του µε την ενδιάµεση AMD. Η συσχέτιση αφορά τόσο στο υπολειπόµενο µοντέλο (ΙΙ vs VV+VI στους AMD4+5: OR=3,261), όσο και σε επίπεδο αλληλόµορφων (AMD4+5: OR=1,881). Η συσχέτιση µε το αλληλόµορφο Ι249 στις οµάδες προχωρηµένων σταδίων (4+5) εξακολουθεί να υφίσταται, και µετά από ρύθµιση για άλλες περιβαλλοντικές παραµέτρους (ηλικία, κάπνισµα, φύλο). Σε αυτή την περίπτωση, για τους ετεροζυγώτες VI το OR κυµαίνεται γύρω στο 1,7 ενώ για τους οµοζυγώτες ΙΙ γύρω στο 2,9 (σε σχέση µε τους VV). Η συχνότητα του πολυµορφισµού Τ280Μ, όταν συνεκτιµήθηκαν και οι λοιποί παράγοντες, δε βρέθηκε να διαφέρει στατιστικά σηµαντικά στα ενδιάµεσα ή τα προχωρηµένα στάδια. Υπήρξε µια συσχέτιση της προχωρηµένης AMD στην αρχική ανάλυση (υπολειπόµενο µοντέλο ΜΜ vs ΤΤ+ΤΜ, AMD4+5: OR=4,821). Ωστόσο, θα πρέπει να αναφερθεί ξανά ότι για τον πολυµορφισµό Τ280Μ, στις οµάδες 4 και 5 (µεµονωµένα και ως µία οµάδα 4+5), βρέθηκε απόκλιση από την ισορροπία Hardy- Weinberg (x 2 >3,84). Αυτή η απόκλιση, πιθανόν οφείλεται στον αρκετά µικρό αριθµό των ασθενών σε αυτές τις οµάδες, και το µικρό βαθµό οµοζυγωτίας που παρατηρείται για το αλληλόµορφο Μ. Επισηµαίνεται ότι η στατιστική ανάλυση που διενεργήθηκε για τον συγκεκριµένο πολυµορφισµό, εξαιτίας του παραπάνω ευρήµατος, δε µπορεί να θεωρηθεί απόλυτα αξιόπιστη, όσον αφορά τη σύγκριση στα στάδια 4+5 µε την οµάδα αναφοράς. Ως συνέπεια, πολύ πιθανόν να έγινε υπο-εκτίµηση της συσχέτισης αυτού του πολυµορφισµού µε την προχωρηµένη AMD, που όπως φάνηκε από τις προηγούµενες δύο µελέτες (Tuo et al, 2004b; Combadière et al, 2007) αποτελεί και στις δύο παράγοντα κινδύνου. ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 71

76 Ωστόσο, και λαµβάνοντας και αυτόν τον περιορισµό υπόψη, τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης φαίνεται να συµφωνούν µε τα αποτελέσµατα της αµερικανικής µελέτης του 2004, όσον αφορά τον πολυµορφισµό V249I, αντιθέτως, είναι αντίστροφα από αυτά της γαλλικής µελέτης του Συγκεκριµένα, στην περίπτωση των Tuo και συν. και οι δύο πολυµορφισµοί βρέθηκαν να είναι σηµαντικοί για την εµφάνιση προχωρηµένης AMD, ενώ στην περίπτωση των Combadiere και συν. µόνο ο πολυµορφισµός Τ280Μ βρέθηκε να αποτελεί παράγοντα κινδύνου για την εµφάνιση AMD (γενικά). Βεβαίως στο σύνολό τους, οι 3 µελέτες διαφέρουν στο σχεδιασµό και την ανάλυση και για το λόγο αυτό δε µπορούν να συγκριθούν άµεσα τα αποτελέσµατα και να εξαχθούν τελικά συµπεράσµατα. Το γεγονός αυτό αποτελεί πρόβληµα σε πολλές µελέτες συσχέτισης. Αυτό που πρέπει να τονιστεί είναι ότι για να ειπωθεί µε ακρίβεια ότι κάποιος πολυµορφισµός συνδέεται µε µια συγκεκριµένη ασθένεια, απαιτείται πλήθος µελετών σε µεγάλο αριθµό δειγµάτων αλλά και συγκεκριµένες παράµετροι στο σχεδιασµό που θα πρέπει να τηρούνται στις διάφορες µελέτες (βλ. Little et al, 2009). Στη συνέχεια, θα παρουσιαστούν τα σηµεία στα οποία οι προηγούµενες µελέτες διαφέρουν από την παρούσα, σε µια προσπάθεια να εξηγηθεί αυτή η µερική ασυµφωνία των αποτελεσµάτων. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης, παρατηρείται ότι έχει βρεθεί συσχέτιση µόνο µε τον πολυµορφισµό V249I, και όχι µε τον πολυµορφισµό Τ280Μ ο οποίος θεωρείται σηµαντικός και στις δύο προηγούµενες µελέτες. Όπως προαναφέρθηκε, η έλλειψη ισορροπίας Hardy-Weinberg για τον δεύτερο πολυµορφισµό στις οµάδες 4+5, πολύ πιθανόν εξηγεί αυτή την έλλειψη συσχέτισης. Οι συγκεκριµένοι πολυµορφισµοί, έχει αναφερθεί από τις διάφορες µελέτες συσχέτισης (για την AMD, το AIDS και τα καρδιαγγειακά νοσήµατα) ότι βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης στους καυκάσιους πληθυσµούς. Εποµένως, στις περισσότερες µελέτες µπορεί να είναι γενικά δύσκολο να βρεθεί ποιος από τους δύο είναι αυτός που συσχετίζεται (βρίσκεται συνήθως συσχέτιση και µε τους δύο). Η ανισορροπία σύνδεσης δεν είναι τέλεια, µε την έννοια ότι όταν συναντάται το αλληλόµορφο Μ πάντα υπάρχει το αλληλόµορφο Ι αλλά στην αντίθετη περίπτωση, το αλληλόµορφο Ι µπορεί να συναντάται και χωρίς το αλληλόµορφο Μ. Επίσης, στη βιβλιογραφία έχουν βρεθεί και λίγα περιστατικά VV/TM (Nassar et al, 2008), αλλά και στην παρούσα µελέτη βρέθηκε ένα περιστατικό VV/MM. Συνεπώς, µπορεί πράγµατι να υπάρχει διαφοροποίηση ως προς τους δύο αυτούς πολυµορφισµούς και ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 72

77 επόµενες µελέτες όπου θα συµπεριλαµβάνεται πολύ µεγαλύτερος αριθµός δειγµάτων, να επιτύχουν να το δείξουν. Το µεγαλύτερο πλεονέκτηµα της παρούσας µελέτης είναι ότι αποτελεί µια population-based µελέτη συσχέτισης, που σηµαίνει ότι τόσο οι ασθενείς όσο και η οµάδα ελέγχου έχουν επιλεγεί τυχαία από τον ελληνικό πληθυσµό (συγκεκριµένα την πόλη της Θεσσαλονίκης). Εποµένως, αφαιρείται το ενδεχόµενο σφάλµατος (bias) λόγω του τρόπου επιλογής του δείγµατος, το οποίο στις προηγούµενες δύο µελέτες υπάρχει, ειδικά στη γαλλική µελέτη σε µεγάλο βαθµό. Ακόµη, οι διάφορες οµάδες είναι σε µεγάλο βαθµό ταιριασµένες ως προς την ηλικία (age-matched), καθώς δε συµπεριλήφθηκαν άτοµα 63 ετών ή 88 ετών, σε καµία από τις οµάδες ασθενών αλλά και την οµάδα των µαρτύρων. Εποµένως, αφαιρείται και το σφάλµα λόγω σηµαντικών ηλικιακών διαφορών στις διάφορες οµάδες. Επίσης, η παρούσα µελέτη αφορά τη συσχέτιση αυτών των πολυµορφισµών µε την AMD στον αρκετά οµοιογενή γενετικά πληθυσµό της Ελλάδας. Στις προηγούµενες δύο µελέτες αναφέρεται ότι οι πληθυσµοί είναι καυκάσιας καταγωγής (µε την εξαίρεση που επισηµάνθηκε), αλλά αυτό είναι αρκετά γενικό, καθώς οι µεν Τuo και συν. αναφέρονται σε άτοµα που διαµένουν στις ΗΠΑ, ενώ οι Combadière και συν. σε άτοµα που διαµένουν στη Γαλλία. Όπως αντιλαµβανόµαστε, οι πληθυσµοί είναι ιδιαίτερα ετερογενείς σε αυτές τις χώρες. Μία επιπλέον διαφοροποίηση από τις προηγούµενες µελέτες είναι ότι γίνεται διαχωρισµός σε πρώιµα, ενδιάµεσα και προχωρηµένα στάδια της ασθένειας. Οι ασθενείς των σταδίων 1 και 2, αποτελούν µαζί µε τα άτοµα που δεν εµφανίζουν κανένα σηµάδι της AMD, την οµάδα αναφοράς (ελέγχου), καθώς η ασθένεια σε αυτούς είναι πολύ πρώιµη, και η πλειονότητα αυτών δεν πρόκειται να την εξελίξει σε πιο προχωρηµένο στάδιο (στη βιβλιογραφία πολλές φορές αναφέρονται ως µηέχοντες την ασθένεια). Οι ασθενείς του σταδίου 3 (ενδιάµεσο στάδιο) εξετάζονται ξεχωριστά από αυτούς των σταδίων 4 και 5 (προχωρηµένο στάδιο), καθώς και σε αυτή την περίπτωση ένα µικρό ποσοστό θα εξελίξει τη νόσο. Όντως, παρατηρείται ότι υπάρχει στατιστικά σηµαντική διαφορά ανάµεσα σε αυτές τις τρεις οµάδες, γεγονός που υποδεικνύει ότι ο πολυµορφισµός αποτελεί παράγοντα κινδύνου µόνο για τα προχωρηµένα στάδια της ασθένειας. Το σηµείο στο οποίο όπως προαναφέρθηκε αναγνωρίζεται ότι υστερεί η παρούσα µελέτη, είναι ο µικρός αριθµός των ασθενών, ιδίως στα στάδια 4 και 5, που αποτελούν και τα πιο προχωρηµένα στάδια. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι εξαρχής ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 73

78 το δείγµα της µελέτης TES ήταν σχετικά µικρό (2.554 άτοµα), και σε αυτό µόνο ένα ποσοστό 1,3% και 1,4% αντιστοιχούσε στα στάδια 4 και 5, αντίστοιχα. Ο αριθµός αυτός µειώθηκε επιπλέον καθώς για κάποια άτοµα δεν υπήρχε δείγµα αίµατος καθώς είχαν αποβιώσει όταν ξεκίνησε η συλλογή αίµατος (µην ξεχνάµε ότι η ηλικιακή οµάδα είναι αρκετά προχωρηµένη). Επιπλέον, δε συµπεριλήφθηκαν συγγενικά άτοµα, αλλά και άτοµα καταγωγής άλλης εκτός από την ελληνική, ώστε η µελέτη να έχει περισσότερη δύναµη. Το µικρό µέγεθος του δείγµατος πολύ πιθανό να έχει επηρεάσει το αποτέλεσµα (ειδικά ως προς τον πολυµορφισµό T280M), και σίγουρα επόµενες µελέτες σε µεγαλύτερα δείγµατα θα ενισχύσουν ή θα απορρίψουν τα αποτελέσµατα αυτά. Οι προηγούµενες µελέτες µπορεί να συµπεριέλαβαν σχετικά µεγαλύτερο αριθµό ασθενών, ωστόσο στην περίπτωση της γαλλικής µελέτης, δεν υπάρχουν στοιχεία για τα στάδια της ασθένειας, ενώ στην περίπτωση των Αµερικανών, οι 32 PD ασθενείς αποτελούν πολύ µικρό δείγµα, για να µπορέσει να εξαχθεί µε σιγουριά το συµπέρασµα ότι σε αυτούς υπάρχει ακόµη µεγαλύτερη συσχέτιση. Στην εργασία αυτή έγινε µία προσπάθεια να υπολογιστεί η ανεξάρτητη συνεισφορά και άλλων περιβαλλοντικών/δηµογραφικών παραγόντων, που ελέγχονται συχνά ως παράγοντες για την εµφάνιση AMD, πράγµα το οποίο δεν επιχειρήθηκε στις δύο προηγούµενες. Συγκεκριµένα η ηλικία και το κάπνισµα αποτελούν τεκµηριωµένους παράγοντες κινδύνου. Το αλληλόµορφο Μ280 και σε αυτή την περίπτωση δε βρέθηκε να αποτελεί παράγοντα κινδύνου. Παροµοίως, το αλληλόµορφο I249 αποτελούσε πάντα παράγοντα κινδύνου για τα προχωρηµένα στάδια, όταν συνυπολογίζονταν και αυτές οι παράµετροι. Το κάπνισµα (µε τις διάφορες κατηγοριοποιήσεις) επίσης βρέθηκε πάντα να συσχετίζεται ισχυρά µε την εµφάνιση προχωρηµένης AMD, όταν λαµβάνονταν υπόψη οι άλλες παράµετροι. Από τις αναλύσεις φάνηκε ότι την πιο σηµαντική επίδραση ασκεί το κάπνισµα όταν εξακολουθεί να υπάρχει στις συνήθειες των ασθενών (p=0.02 OR=4,54 για τους νυν-καπνιστές), ενώ η διακοπή του, ιδίως όταν αφορά >20 χρόνια, µπορεί και να αντιστρέφει την αρνητική επίδραση (p>0.05). Επίσης, παρατηρήθηκε και µία σχέση δοσο-εξάρτησης, καθώς όσο περισσότερα τα πακέτα/έτος, τόσο µεγαλύτερος ο κίνδυνος. Όσον αφορά τα ενδιάµεσα στάδια, το συνεχιζόµενο κάπνισµα επίσης φάνηκε να σχετίζεται (p=0.019 OR=2,474), ενώ σε όλες τις άλλες περιπτώσεις δε φάνηκε να αποτελεί παράγοντα κινδύνου. Συσχέτιση βρέθηκε πάντοτε και µε την αυξανόµενη ηλικία, τόσο στα προχωρηµένα όσο και στα ενδιάµεσα στάδια (AMD3), και αυτό ήταν αναµενόµενο, ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 74

79 καθώς η AMD ως γνωστόν αποτελεί µια ισχυρά ηλικιο-εξαρτώµενη ασθένεια. Τα αποτελέσµατα για την επίδραση του φύλου ήταν αντιφατικά. Ερχόµενοι τώρα στα αποτελέσµατα των προηγούµενων µελετών, οι Tuo και συν., όπως αναφέρθηκε και στο θεωρητικό κοµµάτι, από το σύνολο των πειραµάτων που διεξήγαγαν, προτείνουν το πιθανό µοντέλο που φαίνεται στην Εικ. 24 ως τον τρόπο µε τον οποίο σχετίζεται ο CX3CR1 µε την AMD. Πιο συγκεκριµένα, η µειωµένη προσέλευση των µακροφάγων στον χώρο της ωχράς κηλίδας όπου συσσωρεύονται οι εναποθέσεις µε την πάροδο των ετών, έχει ως αποτέλεσµα να µην αποµακρύνονται αυτές και σταδιακά να σχηµατίζονται τα drusen. Αυτή η µειωµένη προσέλευση οφείλεται στη µειωµένη χηµειοτακτική δράση του συστήµατος CX3CL1/CX3CR1 ή/και στη µειωµένη έκφραση του CX3CR1, που µε τη σειρά τους φάνηκε να σχετίζονται µε τα αλληλόµορφα Ι249 και Μ280 στο γονίδιο του CX3CR1. Εικόνα 24. Προτεινόµενος µηχανισµός από τους Tuo και συν., µέσω του οποίου τροποποιήσεις στο µόριο του CX3CR1 που συνδέονται µε τα αλληλόµορφα Ι249 και Μ280, µπορούν να οδηγήσουν στην εµφάνιση προχωρηµένης AMD (Tuo et al, 2004b). Ο βασικός περιορισµός της µελέτης τους αφορά στην οµάδα ελέγχου (µάρτυρες) που χρησιµοποίησαν: 105 άτοµα που είχαν υποβληθεί σε οφθαλµολογική εξέταση, ήταν σχετικά νεότερης ηλικίας από τους ασθενείς (µέση ηλικία τα 68,2 έτη± 7,8 έτη), και αποτελούνταν εκτός από εθελοντές και από άτοµα του συγγενικού ή φιλικού περιβάλλοντος των ασθενών. Η δεύτερη οµάδα ελέγχου που χρησιµοποίησαν (δότες αίµατος), δε φαίνεται να προσδίδει κάτι στη δύναµη της εργασίας τους, καθώς αφορά σε 171 άτοµα πολύ νεαρότερης ηλικίας (40,1±12,1 έτη), που δεν είχαν εξεταστεί οφθαλµολογικά. Είναι πολύ πιθανόν κάποιοι από αυτούς να πάσχουν από ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 75

80 την ασθένεια (σε πρώιµο στάδιο πιο πιθανά) και όταν φθάσουν στην ηλικία των ασθενών (που ελέγχθηκαν σε αυτή τη µελέτη) να είναι και οι ίδιοι προχωρηµένοι ασθενείς. Στα αποτελέσµατά τους, όπως ήταν αναµενόµενο, φάνηκε ότι δεν υπάρχει στατιστικά σηµαντική συσχέτιση ανάµεσα στους δότες αίµατος και τους ασθενείς (Πίν. 26 και 27). Πίνακας 26. Γενοτυπικές συχνότητες για τους πολυµορφισµούς V249I και Τ280Μ (Tuo et al, 2004b). 85 CD (79,1±8,9) 32 PD (82,8, 63-96) 105 ΜΑΡΤΥΡΕΣ (68,2±7,8) 171 ΟΤΕΣ ΑΙΜΑΤΟΣ (40,1±12,1) TT 55(64.7%) 16(49.9%) 82(78.1%) 128(74.8%) TM 27(31.8%) 13(43.8%) 23(21.9%) 41(24%) MM 3(3.5%) 3(6.3%) 0(0%) 2(1.2%) P value # * 0.04 # / * 0.09 # OR (95%CI) # * 1,94(1,02-3,69) # / 3,57(1,55-8,20) * 1,62(0,92-2,85) # VV 38(44.7%) 63(60.3%) 98(57.4%) VI 42(49.4%) 39(37.1%) 65(38%) II 5(5.9%) 3(2.6%) 8(4.6%) P value # 0.04 # 0.06 # OR (95%CI) # 1,86(1,04-3,31) # 1,66(0,98-2,8) # TM+MM vs TT και VI+II vs VV # σε σχέση µε τους CD ασθενείς * σε σχέση µε τους PD ασθενείς Πίνακας 27. Αλληλοµορφικές συχνότητες των πολυµορφισµών V249I και Τ280Μ (Tuo et al, 2004b). 170 CD 64 PD 210 ΜΑΡΤΥΡΕΣ 342 ΟΤΕΣ T 137(80.6%) 45(70.3%) 187(89%) 298(86.1%) M 33(19.4%) 19(29.7%) 23(11%) 48(13.9%) P value # * 0.02 # /0.001 * 0.1 # OR (95%CI) # * 1,96(1,10-3,48) # / 3,19(1,60-6,39) * 1,50(0,92-2,43) # V 118(70%) 165(78.6%) 261(76.3%) I 52(30%) 45(21.4%) 81(23.7%) P value # 0.04 # 0.09 OR (95%CI) # 1,62(1,02-2,60) # 1,42(0,94-2,14) # # M vs T και I vs V # σε σχέση µε τους CD ασθενείς * σε σχέση µε τους PD ασθενείς Επίσης, έχουν συµπεριλάβει δύο οµάδες ασθενών σε προχωρηµένα στάδια, τους κλινικά διαγνωσµένους (CD, n=85) και τους παθολογικά διαγνωσµένους (PD, n=32). Οι PD αφορούν σε ασθενείς οι οποίοι είχαν αποβιώσει και των οποίων είχαν διατηρηθεί ιστολογικά δείγµατα του αµφιβληστροειδούς τους. Αναφέρονται στοιχεία για την κατάταξή τους σε υγρή ή ξηρή AMD, αλλά όχι συγκεκριµένη µέθοδος ταξινόµησης. Κατέληξαν ότι και σε επίπεδο γενοτύπου (TM+MM vs TT; VI+II vs VV, υπερέχον µοντέλο) αλλά και σε επίπεδο αλληλόµορφων, η συχνότητα και των δύο πολυµορφισµών ήταν στατιστικά υψηλότερη στους CD ασθενείς σε σχέση µε τους µάρτυρες. Αυτή η συσχέτιση βρέθηκε να είναι ακόµη µεγαλύτερη για τον πολυµορφισµό Τ280Μ και τους PD ασθενείς. εν ελέγχθηκε στους PD ασθενείς η συχνότητα του πολυµορφισµού V249I. Σε προηγούµενες µελέτες, αλλά και σε αυτή, ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 76

81 παρατηρήθηκε οι δύο πολυµορφισµοί να βρίσκονται σε ανισορροπία σύνδεσης, που όµως δεν ισχύει vice versa όπως προαναφέρθηκε. Εποµένως, ίσως θα ήταν σκόπιµο να είχε ελεγχθεί και ο δεύτερος πολυµορφισµός, για πιο ακριβή αποτελέσµατα. Επιπλέον, ενώ όλοι οι CD ασθενείς και τα άτοµα ελέγχου ήταν καυκάσιας καταγωγής, για τους PD ασθενείς, δεν υπάρχουν ακριβή στοιχεία. Από τους 32, οι 26 ήταν καυκάσιας καταγωγής, ο 1 αφρο-αµερικανικής και για τους υπόλοιπους 5 δε δίνονται στοιχεία. Πολύ πιθανόν να έχει επηρεαστεί το αποτέλεσµα, καθώς οι συγκεκριµένοι πολυµορφισµοί αναφέρεται στη βιβλιογραφία ότι είναι συχνοί στους καυκάσιους πληθυσµούς. Επίσης, και η ηλικία των PD ασθενών ήταν αρκετά µεγαλύτερη από την αντίστοιχη των CD ασθενών (βλ. Πίν. 26). Στο αρχικό δείγµα των 40 PD, ως µέση ηλικία αναφέρονται τα 82,8 χρόνια, µε µια διακύµανση από έτη. Καθώς η AMD είναι µια ισχυρά ηλικιο-εξαρτώµενη ασθένεια, οι µελέτες συσχέτισης που την αφορούν θα πρέπει να περιλαµβάνουν πολύ καλά ταιριασµένες οµάδες ασθενών και ελέγχου ως προς την ηλικία (age-matched), διαφορετικά ενδέχεται να υπάρχει σφάλµα (bias) στο στατιστικό αποτέλεσµα. Στη συγκεκριµένη µελέτη, οι µάρτυρες είναι µικρότεροι ηλικιακά από τους CD ασθενείς, οι οποίοι µε τη σειρά τους είναι µικρότεροι ηλικιακά από τους PD ασθενείς. Οι Combadière και συν. από την άλλη, σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της δικής τους µελέτης µε τους διαγονιδιακούς CX3CR1 -/- ποντικούς, και σε συνδυασµό µε τα άλλα στοιχεία, προτείνουν το µοντέλο που φαίνεται στην Εικ. 25 ως τον πιθανό ρόλο του CX3CR1 και των κυττάρων µικρογλοίας στην AMD. Εδώ, τα κύτταρα της µικρογλοίας συσσωρεύονται στις περιοχές του αµφιβληστροειδούς που έχουν υποστεί βλάβη, και στην περίπτωση που αυτά δεν εκφράζουν CX3CR1 ή έχουν µια ανωµαλία στις ιδιότητές του, παραµένουν εκεί, όπου συνεισφέρουν στο σχηµατισµό των drusen αλλά και επιτείνουν τη φλεγµονή, καθώς δρουν ως προ-φλεγµονώδη µόρια. Αυτές οι τροποποιηµένες ιδιότητες του CX3CR1 βρέθηκε να σχετίζονται µόνο µε το αλληλόµορφο Μ280. Σε αυτή την µελέτη, ο σχεδιασµός ήταν ακόµη πιο ασαφής. Καταρχήν, συµπεριλήφθηκαν 284 ασθενείς µε AMD, για τους οποίους αναφέρεται απλά ότι ήταν καυκάσιας καταγωγής και έπασχαν από την ασθένεια. ε δόθηκαν στοιχεία για την ηλικία αλλά και τα στάδια της ασθένειας. Εµµέσως, άφησαν να εννοηθεί ότι αφορούσαν σε όλα τα στάδια, καθώς σε κάποιο σηµείο αναφέρεται ότι η συσχέτιση που βρήκαν ήταν ανεξάρτητη ηλικίας και σοβαρότητας της ασθένειας. ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 77

82 Εικόνα 25. Προτεινόµενος ρόλος του CX3CR1 και των κυττάρων µικρογλοίας στην AMD, σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα των Combadière και συν.. (A) Φυσιολογικός αµφιβληστροειδής, όπου τα εξωτερικά τµήµατα των φωτοϋποδοχέων απορρίπτονται συνεχώς από τις κορυφές των κυττάρων και ανακυκλώνονται. (B) Επιπλέον, τα κύτταρα της µικρογλοίας που εκφράζουν CX3CR1 (αντιφλεγµονώδη), φαγοκυτταρώνουν τα κυτταρικά υπόλοιπα που προκύπτουν από τις καθηµερινές προσβολές (όπως η γήρανση και το κυτταρικό στρες), βοηθώντας να διατηρηθεί ο οφθαλµός υγιής. (C) Η AMD, ξεκινά από τις ίδιες καθηµερινές προσβολές. Ωστόσο, τα CX3CR1 -/- κύτταρα της µικρογλοίας που επιστρατεύονται στην περιοχή της βλάβης, παραµένουν εκεί, εν µέρει λόγω ανώµαλης µετανάστευσης (η οποία σχετίζεται µε οµοζυγωτία για το Μ αλληλόµορφο). Τα CX3CR1 -/- κύτταρα µικρογλοίας είναι προ-φλεγµονώδη (βλ. Arnold et al, 2007) και επιστρατεύουν άλλα προφλεγµονώδη κύτταρα. Αυτή η απόκριση αυξάνει την κυτταρική βλάβη που συµβαίνει µε τον φυσιολογικό εκφυλισµό. (D) Η αυξηµένη συνάθροιση των προ-φλεγµονωδών, CX3CR1 -/- κυττάρων µικρογλοίας στον υπο-αµφιβληστροειδικό χώρο φαίνεται να προσθέτει στο σχηµατισµό των drusen, τα οποία συµβάλλουν στην απώλεια της λειτουργίας των RPE και στον εκφυλισµό των φωτοϋποδοχέων (ξηρή AMD). (E) Τέλος, καθώς τα drusen επαυξάνονται σταδιακά και διαχωρίζουν τα RPE από την χοριοειδή αγγείωση, η συνακόλουθη υποξία πυροδοτεί προ-αγγειογενετικά σήµατα, που επάγουν την CNV (υγρή AMD) (Chen et al, 2007). Το βασικότερο µειονέκτηµα της µελέτης τους ήταν ότι τα άτοµα που χρησιµοποίησαν ως οµάδες ελέγχου δεν είχαν υποβληθεί σε οφθαλµολογική εξέταση και περιλάµβαναν έναν αρκετά µεγάλο αριθµό ατόµων, που είχαν συµµετάσχει σε διάφορες άλλες ερευνητικές µελέτες στη Γαλλία, µε θέµα κυρίως καρδιαγγειακά νοσήµατα. εν αναφέρθηκε ούτε εάν ήταν age-matched ως προς τους ασθενείς, ούτε κάποιο άλλο στοιχείο για αυτούς. Βέβαια επισήµαναν και οι ίδιοι ότι σίγουρα κάποιοι από αυτούς µπορεί ήδη να έπασχαν ή µελλοντικά να εµφάνιζαν AMD, ωστόσο δε θεώρησαν ότι αυτό αφαιρεί από την δύναµη της στατιστικής ανάλυσής τους. Η θετική συσχέτιση του πολυµορφισµού Τ280Μ ήταν ελαφρώς µεγαλύτερη από αυτή των Tuo και συν. µε τους CD ασθενείς (OR 1,976-2,695), ωστόσο δε µπορεί να γίνει άµεση σύγκριση, καθώς κατά πρώτον σε αυτή τη µελέτη η θετική συσχέτιση αφορούσε την οµογυζωτία για το αλληλόµορφο Μ vs ετεροζυγωτία/οµοζυγωτία για το ΠΜΣ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΠΘ 78