ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΩΝ ΙΑ ΟΧΙΚΩΝ ΕΓΧΥΣΕΩΝ ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ο-φθαλα ΙΑΛ ΕΫ ΗΣ ΩΣ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΟΦΙΑ ΑΝΤ. ΠΑΠΑ ΗΜΗΤΡΙΟΥ ΧΗΜΙΚΟΣ Επιβλέπων: ΛΕΚΤΟΡΑΣ Π.. ΤΖΑΝΑΒΑΡΑΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, 2012

2 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥ ΩΝ ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΗ ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΩΝ ΙΑ ΟΧΙΚΩΝ ΕΓΧΥΣΕΩΝ ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ο-φθαλα ΙΑΛ ΕΫ ΗΣ ΩΣ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΠΑΠΑ ΗΜΗΤΡΙΟΥ ΣΟΦΙΑ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ : ΛΕΚΤΟΡΑΣ Π.. ΤΖΑΝΑΒΑΡΑΣ Τριµελής εξεταστική επιτροπή :. Θεµελής, Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Αρ. Ανθεµίδης, Αναπληρωτής Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Π. Τζαναβάρας, Λέκτορας Τµήµατος Χηµείας ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Για να πραγµατοποιηθεί αυτή η ερευνητική εργασία χρειάστηκε αρκετή προσπάθεια και επιµονή γι αυτό και ήταν απαραίτητη η βοήθεια, τόσο σε θεωρητικό όσο και σε πρακτικό επίπεδο, αρκετών ανθρώπων. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω το Λέκτορα Π. Τζαναβάρα, επιβλέποντα µου, για την καθοδήγηση του κατά τη διάρκεια τόσο της πειραµατικής διαδικασίας όσο και της συγγραφής της µεταπτυχιακής µου διατριβής, καθώς και για την αµέριστη κατανόηση του στο περιορισµένο πρόγραµµα µου. Επίσης οφείλω ευχαριστίες σε όλα τα µέλη του Εργαστηρίου Αναλυτικής Χηµείας Τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ που συνετέλεσαν ώστε η εργασία µου να διεξαχθεί σε ένα φιλικό και δηµιουργικό περιβάλλον.

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στην παρούσα µεταπτυχιακή διατριβή έγινε προσπάθεια ανάπτυξης µιας αναλυτικής τεχνικής τριών φαρµακευτικά δραστικών πρωτοταγών αµινών. Χρησιµοποιήθηκε φθορισµοµετρικός ανιχνευτής και η µέθοδος βασίζεται στην αυτόµατη τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή (Sequential Injection Analysis, SIA). Οι ενώσεις οι οποίες µελετήθηκαν ήταν η αµανταδίνη, η µεµαντίνη και η ριµανταδίνη και όλες χρησιµοποιούνται για την καταπολέµηση των συµπτωµάτων της νόσου Αλτσχάιµερ. Στο πρώτο κοµµάτι της µεταπτυχιακής αυτής εργασίας δίνεται έµφαση στο θεωρητικό υπόβαθρο της τεχνικής SIA αλλά και του φθορισµού. Επίσης µιας και είναι απαραίτητη η παραγωγοποίηση των ενώσεων αυτών για την φθορισµοµετρική ανίχνευση τους δίνονται οι απαραίτητες πληροφορίες για το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης, της ο-φθαλαδιαλδεΰδης. Τέλος δίνεται ένας πίνακας βιβλιογραφικής επισκόπησης των ουσιών αυτών τα τελευταία χρόνια. Στο δεύτερο µέρος αναφέρονται οι ακριβείς πειραµατικές συνθήκες που χρησιµοποιήθηκαν κατά την ανάπτυξη και επικύρωση της µεθόδου καθώς και τα αποτελέσµατα που ελήφθησαν κατά την ανάλυση φαρµάκων που κυκλοφορούν στο εµπόριο

5 Περιεχόµενα 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος-ευχαριστίες... i Κεφάλαιο Αυτοµατισµός στο αναλυτικό εργαστήριο Ορισµοί Ανάγκη για αυτοµατοποίηση - Πλεονεκτήµατα... 5 Κεφάλαιο Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA Εισαγωγή Ιστορική εξέλιξη Βασικές αρχές λειτουργίας Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Τυπικά στάδια κύκλου ανάλυσης µε τη SIA Αναχαίτιση ροής σε συστήµατα SIA (stopped flow -SIA) Πλεονεκτήµατα Μειονεκτήµατα SIA Κεφάλαιο Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα Κεφάλαιο Φθορισµοµετρία Φωταύγεια Σχέση δοµής ενώσεως και φθορισµού Φαινόµενο Quenching Αναλυτική φθορισµοµετρία... 22

6 Περιεχόµενα 2 Κεφάλαιο Εφαρµογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρµακευτική ανάλυση Κεφάλαιο Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και χρησιµοποιούµενων αντιδραστηρίων Η νόσος του Αλτσχάιµερ Αµανταδίνη (ΑΜΑ) Μεµαντίνη (ΜΕΜ) Ριµανταδίνη (RIM) Ο φθαλαδιαλδεΰδη Κεφάλαιο Βιβλιογραφική επισκόπηση Κεφάλαιο Αντιδραστήρια - Οργανολογία Αντιδραστήρια Κεφάλαιο Αυτόµατος φθορισµοµετρικός προσδιορισµός φαρµακευτικά δραστικών αµινών µε την τεχνική των διαδοχικών εγχύσεων µετά από παραγωγοποίηση µε ο-φθαλαδιαλδεΰδη Αρχή µεθόδου Προσδιορισµός των αµινών σε υδατικά διαλύµατα Προσδιορισµός των αµινών σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Προσδιορισµός ΑΜΑ σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Προσδιορισµός ΜΕΜ σε φαρµακευτικά σκευάσµατα Αποτελέσµατα και Συζήτηση Προκαταρκτικά Πειράµατα Μελέτη γεωµετρικών παραµέτρων Επίδραση του χρόνου αναχαίτισης ροής στο σπείραµα αντίδρασης Επίδραση του όγκου του εγχυόµενου δείγµατος... 45

7 Περιεχόµενα Επίδραση του όγκου του αντιδραστηρίου (R) Επίδραση του όγκου της ΟΡΑ Μελέτη χηµικών παραµέτρων Επίδραση του ph Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της ΝΑC Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της OPA Επικύρωση της αναλυτικής µεθόδου Εύρος προσδιορισµού της µεθόδου Επαναληψιµότητα της µεθόδου Όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού Εκλεκτικότητα και ακρίβεια της µεθόδου Ανθεκτικότητα της µεθόδου Εφαρµογές της µεθόδου Συµπεράσµατα Κεφάλαιο ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Κεφάλαιο Περίληψη... 64

8 Αυτοµατισµός στο αναλυτικό εργαστήριο 4 Κεφάλαιο 1 Αυτοµατισµός στο αναλυτικό εργαστήριο 1.1. Ορισµοί Η έννοια της «αυτοµατοποίησης», όπως αυτή έχει οριστεί από την Επιτροπή Αναλυτικής ορολογίας της ιεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρµοσµένης Χηµείας (IUPAC) [1], παρερµηνεύεται συχνά από πολλούς αναλυτικούς χηµικούς, πιθανότατα γιατί ο ορισµός αυτός συµπεριλαµβάνει στη διατύπωσή του ορισµούς άλλων εννοιών, οι διαφορές των οποίων δεν είναι ούτε αυτές πλήρως κατανοητές. Για να δοθεί, εποµένως ο ορισµός της «αυτοµατοποίησης» κρίνεται σκόπιµο να δοθούν αρχικά οι ορισµοί όλων εκείνων των εννοιών που µπορεί να συγχέονται µεταξύ τους [1, 2]. Σύµφωνα, λοιπόν, µε την Επιτροπή Αναλυτικής ορολογίας της ιεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρµοσµένης Χηµείας (IUPAC), «µηχανισµός» ονοµάζεται ο κατάλληλος συνδυασµός των εξαρτηµάτων, ένα τουλάχιστον από τα οποία έχει την δυνατότητα να παράγει έργο ή µπορεί να κινείται. Μια «µηχανή» είναι µια διάταξη που αποτελείται από έναν οι περισσότερους µηχανισµούς. Οι µηχανισµοί αυτοί είναι σε θέση να εκτελούν µια ή περισσότερες λειτουργίες. Σύµφωνα πάντα µε την IUPAC µε τον όρο «µηχανοποίηση» ορίζεται η χρησιµοποίηση µηχανών για την αντικατάσταση, βελτίωση, επέκταση και συµπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας. Τα όργανα χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Τα «επιστηµονικά όργανα», που είναι συσκευές που χρησιµοποιούνται για την παρατήρηση, µέτρηση ή έλεγχο µιας ιδιότητας που αντικαθιστά, επεκτείνει ή συµπληρώνει την ανθρώπινη ικανότητα, και τα «αναλυτικά όργανα», συσκευές που χρησιµοποιούνται για την εκτέλεση µιας αναλυτικής µεθόδου. Τα όργανα είναι δυνατό να αποτελούνται από έναν ή περισσότερους µηχανισµούς. «Αυτοµατοποίηση», συνεπώς, καλείται η συνδυασµένη χρήση µηχανών και οργάνων µε σκοπό την αντικατάσταση, τη βελτίωση, την επέκταση και τέλος την συµπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας στην πραγµατοποίηση µιας δεδοµένης διεργασίας, κατά την οποία ένα τουλάχιστον βασικό στάδιο εκτελείται όχι από ανθρώπινη παρέµβαση αλλά από ένα σύστηµα «ανάδρασης» (ανατροφοδότησης, feedback). Το σύστηµα ανάδρασης είναι µια µηχανική ή ηλεκτρονική διάταξη που

9 Αυτοµατισµός στο αναλυτικό εργαστήριο 5 συνδυάζει την λήψη πληροφοριών, από διάφορους αισθητήρες, και την αποστολή εντολών τροποποιώντας τις επιµέρους λειτουργίες των οργάνων µε σκοπό την παραγωγή συγκεκριµένου έργου Ανάγκη για αυτοµατοποίηση - Πλεονεκτήµατα Οι ολοένα αυξανόµενες απαιτήσεις για γρήγορες, αξιόπιστες και οικονοµικές αναλύσεις πολλών και ταυτόχρονα διαφορετικής φύσεως δειγµάτων (βιολογικών, βιοµηχανικών, γεωργικών, κλινικών, φαρµακευτικών και άλλα) κατέστησαν τις τελευταίες δεκαετίες επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης αυτοµατοποιηµένων αναλυτικών τεχνικών. Για τον λόγο αυτό δεν είναι λίγες οι ερευνητικές οµάδες, που έχουν στρέψει το ερευνητικό τους ενδιαφέρον προς την κατεύθυνση αυτή [3]. Οι στόχοι, που έπρεπε να επιτευχθούν, ήταν πολλοί, µε αρχικό πάντα γνώµονα την αντικατάσταση της χειροκίνητης διαδικασίας. Ο σηµαντικότερος ίσως λόγος που οδήγησε στην ανάπτυξη αυτοµατοποιηµένων τεχνικών ήταν η απελευθέρωση του ανθρώπινου δυναµικού από αναλύσεις ρουτίνας. Αυτό θα επέφερε σηµαντικά οφέλη. Θα οδηγούσε όχι µόνο στον µεγαλύτερο δυνατό αριθµό αναλύσεων, αλλά και στην µεγαλύτερη ασφάλεια του προσωπικού, µιας και η έκθεσή του σε επικίνδυνους και τοξικούς διαλύτες θα περιοριζόταν, µε τον τρόπο αυτό, σηµαντικά. Πολύπλοκες µεθοδολογίες µπορούν πλέον να πραγµατοποιούνται σε σύντοµο χρονικό διάστηµα και µε λιγότερο κοπιαστικές και επίπονες προκατεργασίες του δείγµατος αλλά και πολύ πιο οικονοµικά. Ο µεγάλος αριθµός αναλύσεων οδηγεί στην µείωση του κόστους τις κάθε επιµέρους ανάλυσης και το πλεονέκτηµα αυτό γίνεται ακόµα σηµαντικότερο όταν τα προς ανάλυση δείγµατα είναι πολύτιµα ή περιορισµένης ποσότητας. Η ανάγκη για άµεση λήψη αναλυτικών αποτελεσµάτων και η βελτίωση της αναλυτικής διαδικασίας οδήγησαν και αυτές µε τη σειρά τους στην αυτοµατοποίηση των αναλυτικών διεργασιών. Ο περιορισµός της ανθρώπινης δράσης στις αναλύσεις οδηγεί στην εξάλειψη τυχαίων ή συστηµατικών σφαλµάτων, που προέρχονται από τον ανθρώπινο παράγοντα, βελτιώνοντας, έτσι, την ακρίβεια και την επαναληψιµότητα των µετρήσεων.

10 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA 6 Κεφάλαιο 2 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA 2.1 Εισαγωγή Ιστορική εξέλιξη Η τεχνική των Aυτόµατων Aναλύσεων µε Έγχυση του είγµατος σε Συνεχή Ροή (Flow injection analysis FIA) ανακαλύφθηκε κάπου στα µέσα του 1974 όταν οι Ruzicka και Hansen δούλευαν πάνω στην ανάπτυξη ενός αισθητήρα αερίων για τον προσδιορισµό ατµών αµµωνίας. Οι ερευνητές είχαν κατασκευάσει ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο, η αρχή λειτουργίας του οποίου βασιζόταν στη µέτρηση της µερικής πιέσεως του αερίου ύστερα από ανάµειξη του δείγµατος µε κινούµενο ρεύµα NaOH µε την βοήθεια µιας περισταλτικής αντλίας. Η ανάµειξη των ρευµάτων γινόταν αµέσως πριν τον ανιχνευτή και οι παραγόµενοι ατµοί NH 3 ανιχνεύονταν στη συνέχεια από το ηλεκτρόδιο. Το πρόβληµα, όµως, ήταν η πολύ αργή απόκριση του αισθητήρα για δείγµατα διαφορετικών συγκεντρώσεων. Σε µία στιγµή εκνευρισµού οι ερευνητές, µε τη χρήση µιας απλής σύριγγας, εισήγαγαν απευθείας στο ρεύµα NaOH µια ποσότητα δείγµατος ορισµένης συγκέντρωσης και προς µεγάλη τους έκπληξη παρατήρησαν την καταγραφή µιας κορυφής, η οποία ήταν επαναλήψιµη και ανάλογη της συγκεντρώσεως του προς ανάλυση συστατικού [4]. Χωρίς ακόµα να έχουν συνειδητοποιήσει την σηµαντικότητα της ανακάλυψης τους, δηµοσιεύουν στα 1975 την πρώτη τους εργασία [5] και µερικά χρόνια αργότερα δίνουν τον ορισµό της FIA στο πρώτο τους βιβλίο [6]. Σύµφωνα µε τους ερευνητές, «Η FIA είναι µια τεχνική που βασίζεται στην έγχυση ενός υγρού δείγµατος σε συνεχές, µη διακοπτόµενο, κινούµενο ρεύµα κατάλληλου υγρού. Το εγχυόµενο δείγµα σχηµατίζει µια ζώνη, που οδηγείται στον ανιχνευτή, ο οποίος µετρά τη συνεχή µεταβολή µιας φυσικοχηµικής παραµέτρου του δείγµατος, καθώς αυτό διέρχεται από την κυψελίδα συνεχούς ροής». Με τον ορισµό αυτόν ορίστηκε από την πρώτη στιγµή η πρώτη βασική αρχή της FIA, που δεν είναι άλλη από την έγχυση του δείγµατος σε µη διακοπτόµενο ρεύµα ροής. Παρόλα αυτά, στην δεύτερη έκδοση, ο ορισµός της νέας τεχνικής διατυπώνεται ξανά από τους ερευνητές όπως παρακάτω: «FIA ονοµάζεται η συλλογή πληροφοριών µέσω της βαθµίδωσης της συγκέντρωσης που δηµιουργείται όταν µια

11 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA 7 αυστηρά καθορισµένη ζώνη δείγµατος εγχυθεί και διασπαρθεί σε ένα µη διακοπτόµενο ρεύµα µεταφορέα»[4]. Η δεύτερη αυτή διατύπωση δεν αναιρεί την προηγούµενη αλλά δρα συµπληρωµατικά της πρώτης, εισάγοντας και τη δεύτερη αρχή της FIA, που είναι η αυστηρά καθορισµένη και ελεγχόµενη διασπορά της ζώνης του δείγµατος. Αυτή η αρχή, συνεπώς δίνει τη δυνατότητα στον χρήστη για λήψη αποτελεσµάτων πριν ακόµα ολοκληρωθεί η αντίδραση και φτάσει σε κατάσταση, τόσο φυσικής όσο και χηµικής, ισορροπίας. Οι βασικές αρχές της FIA είναι συνεπώς [3]: 1. Ο αυστηρά καθορισµένος όγκος δείγµατος, ο οποίος εγχύεται σε ρεύµα κατάλληλου µεταφορέα ή αντιδραστηρίου. 2. Η συνεχής και µη διακοπτόµενη ροή των διαλυµάτων. 3. Η ελεγχόµενη και επαναλήψιµη διασπορά της ζώνης του δείγµατος. 4. Ο επαναλήψιµος χρόνος παραµονής του δείγµατος στο σύστηµα. Μια δεκαετία περίπου µετά την εισαγωγή της FIA στην πραγµατικότητα της χηµικής ανάλυσης, η αυξανόµενη απαίτηση κυρίως από τους χώρους της βιοµηχανίας και της κλινικής χηµείας για µια αυτοµατοποιηµένη τεχνική, µε πιο απλά και ανθεκτικά µηχανικά µέρη, τα οποία να µην έχουν αυξηµένες απαιτήσεις για συντήρηση αλλά ταυτόχρονα να δίνουν αξιόπιστες και γρήγορες µετρήσεις, οδήγησε στην γέννηση της «Τεχνικής της ιαδοχικής Έγχυσης του δείγµατος σε Ροή» (Sequential Injection analysis, SIA) [7]. Η τεχνική αυτή αποτελεί ουσιαστικά τη δεύτερη γενιά της FIA, και ήρθε να επιλύσει τις δυσχέρειες και τα προβλήµατα αυτής. Τα προβλήµατα αυτά ήταν: 1. Η κατανάλωση µεγάλων όγκων αντιδραστηρίου, λόγω της συνεχούς λειτουργίας του οργάνου. 2. Η συχνά απαιτούµενη βαθµονόµηση του συστήµατος. 3. Το υψηλό πολλές φορές κόστος συντήρησης των µηχανικών τµηµάτων του συστήµατος, όπως οι περισταλτικές αντλίες, αλλά και των αναλώσιµων τµηµάτων, όπως τα κανάλια ροής που µε το πέρασµα του χρόνου φθείρονται. 4. Η ανάγκη χρησιµοποίησης πολλών καναλιών και πολλές φορές περίπλοκων διατάξεων για την ανάµιξη των διαλυµάτων και την αντίδραση τους.

12 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA Βασικές αρχές λειτουργίας Από την αρχή έγινε κατανοητό ότι η νέα τεχνική ανήκει στην οικογένεια της FIA καθώς διέπεται από τις ίδιες αρχές (έγχυση δείγµατος και αντιδραστηρίου, ελεγχόµενη διασπορά και επαναλήψιµος χρόνος από τη στιγµή της έγχυσης του δείγµατος µέχρι την έξοδό του). Η επιτυχία της νέας αυτής τεχνικής βασίζεται στον ακριβή έλεγχο τον δύο κινητικών διεργασιών που συµβαίνουν ταυτόχρονα, καθώς µετακινείται το δείγµα µέσα στο κανάλι. Οι διεργασίες αυτές είναι από τη µία η φυσική διασπορά των ζωνών του δείγµατος και τον αντιδραστηρίων και από την άλλη η χηµική διεργασία σχηµατισµού των προϊόντων, τα οποία οδηγούνται προς τον ανιχνευτή. Το επιπλέον χαρακτηριστικό της SIA που την διακρίνει από την FIA είναι η δυνατότητα αντιστροφής της ροής του δείγµατος και του αντιδραστηρίου µε τη βοήθεια της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής πολλαπλών θέσεων, έτσι ώστε να µπορούν να πραγµατοποιηθούν διάφορες χηµικές αντιδράσεις, χωρίς να απαιτείται ο επανασχεδιασµός του πολλαπλού τµήµατος ανάµειξης και αντιδράσεων, που απαιτείται στη FIA. Η καρδία εποµένως του αναλυτή είναι η βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Οι περιφερειακές θύρες της βαλβίδας είναι συνδεδεµένες µε τους περιέκτες των δειγµάτων, των αντιδραστηρίων και το σύστηµα ανίχνευσης, ενώ η κεντρική θύρα συνδέεται µέσω ενός σπειράµατος παραµονής (holding coil - HC) µε κατάλληλη αντλία, µε τη βοήθεια της οποίας µπορούµε να επιλέξουµε τη φορά της ροής των διαλυµάτων. Όταν η αντλία λειτουργεί προς τη µια κατεύθυνση αναρροφώνται, µέσω της βαλβίδας, συγκεκριµένοι όγκοι δείγµατος και αντιδραστηρίων από τον εκάστοτε περιέκτη και οδηγούνται στοιβάζονται στο σπείραµα παραµονής. Στη συνέχεια θέτουµε την αντλία σε λειτουργία, προς την αντίθετη κατεύθυνση αυτή τη φορά, και οι στοιβαγµένες ζώνες προωθούνται µέσω της ανάλογης θύρας της βαλβίδας προς το σύστηµα ανίχνευσης. Η χηµική αντίδραση πραγµατοποιείται µε διέλευση των ζωνών δια µέσω κατάλληλου σπειράµατος, στο οποίο λαµβάνει χώρα επικάλυψη των ζωνών και σχηµατισµός του επιθυµητού προϊόντος. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η µείωση κατανάλωσης όγκου δείγµατος και αντιδραστηρίων και συνεπώς η µείωση του όγκου των παραγόµενων αποβλήτων.

13 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA 9 Ένα τυπικό διάγραµµα ροής SIA καθώς και η αρχή λειτουργίας της τεχνικής δίνονται σχηµατικά στα Σχήµατα 2.1 και 2.2 αντίστοιχα. Σχήµα 2.1 : Τυπικό διάγραµµα ροής αναλυτή SIA. Σχήµα 2.2 : Αρχή λειτουργίας της SIA [8]. (A) Έγχυση καθορισµένου όγκου δείγµατος. (B)Έγχυση καθορισµένου όγκου αντιδραστηρίου - σχηµατίζονται ευδιάκριτες ζώνες. (Γ) Έγχυση του διαλύµατος του µεταφορέα ή δεύτερου διαλύµατος αντιδραστηρίου ( ) Αναστροφή της ροής - προώθηση προς τον ανιχνευτή. (E) Ανίχνευση καταγραφή κορυφής. Συνοψίζοντας µπορούµε να πούµε ότι η SIA είναι µια τεχνική συνεχούς ροής που πραγµατοποιείται µε απόλυτα επαναλήψιµο χειρισµό των ζωνών του δείγµατος και των αντιδραστηρίων σε συνθήκες µη θερµοδυναµικής ισορροπίας.

14 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA Οργανολογία ενός αναλυτή SIA Τα βασικά τµήµατα από τα οποία αποτελείται ένας αναλυτής SIA είναι: 1. Αντλία. Με τη βοήθεια της αντλίας πραγµατοποιείται η αναρρόφηση των ζωνών των δειγµάτων και των αντιδραστηρίων και στη συνέχεια, µε αλλαγή της φοράς λειτουργίας της, πραγµατοποιείται η προώθησή τους προς τον ανιχνευτή. Η λειτουργία της καθορίζεται από το κατάλληλο λογισµικό. Η λειτουργία της πρέπει να είναι πλήρως επαναλήψιµη και ακριβής. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων οι αντλίες που χρησιµοποιούνται σε συστήµατα SIA είναι είτε περισταλτικές είτε τύπου σύριγγας. Μειονέκτηµα των περισταλτικών είναι ότι δεν είναι εφικτό να δώσουν ροές τελείως απαλλαγµένες από παλµούς, ενώ οι σωλήνες που χρησιµοποιούνται φθείρονται σχετικά εύκολα και δεν επιτρέπουν τη χρήση όλου του φάσµατος των διαλυτών. Αντίθετα, οι αντλίες τύπου σύριγγας έχουν το µειονέκτηµα της καθορισµένης χωρητικότητας, µε αποτέλεσµα να απαιτείται περιοδικό ξαναγέµισµά τους µε το διάλυµα του µεταφορέα. 2. Βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Έχουν συνήθως 6-10 θέσεις. Βασικό χαρακτηριστικό που πρέπει να διακρίνει µια βαλβίδα είναι οι µικροί νεκροί όγκοι ώστε να αποφεύγεται επιπλέον διασπορά των ζωνών όταν δεν είναι επιθυµητή. Η λειτουργία της βαλβίδας καθορίζεται και αυτή ηλεκτρονικά από το εγκατεστηµένο λογισµικό στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. 3. Σπείραµα παραµονής (holding coil). Το σπείραµα αυτό τοποθετείται µεταξύ της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής. Σε αυτό οδηγούνται και στοιβάζονται διαδοχικά και µε τη σειρά που επιθυµεί ο χρήστης οι ζώνες των δειγµάτων και των αντιδραστηρίων πριν την προώθηση τους στον ανιχνευτή. Η χωρητικότητα του σπειράµατος αυτού θα πρέπει να είναι ικανή, ώστε να αποτρέπεται η είσοδος των ζωνών δείγµατος και αντιδραστηρίου στο διάλυµα του µεταφορέα και να αποφεύγεται η επιµόλυνσή του. 4. Σύστηµα ανίχνευσης. Πρακτικά χρησιµοποιούνται όλα τα διαθέσιµα συστήµατα ανίχνευσης τα οποία µπορούν να λειτουργήσουν σε συνθήκες συνεχούς ροής. 5. Λογισµικό ελέγχου. Η απαραίτητη χρήση κατάλληλου λογισµικού ελέγχου αποτελεί βασική διαφορά µεταξύ των τεχνικών FIA και SIA. Με το λογισµικό αυτό ελέγχονται πλήρως όλες οι απαραίτητες λειτουργίες του αναλυτή (εισαγωγή δειγµάτων και αντιδραστηρίων, σειρά ανάµιξης, παροχές όγκου κ.α.).

15 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA Τυπικά στάδια κύκλου ανάλυσης µε τη SIA Ένας τυπικός κύκλος ανάλυσης µε την τεχνική της SIA περιλαµβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1. Προώθηση του διαλύµατος του µεταφορέα προς τον ανιχνευτή (πλήρωση του σπειράµατος συγκράτησης, του σπειράµατος αντίδρασης και της κυψελίδας του ανιχνευτή) µέχρι λήψη σταθερής γραµµής βάσης. 2. Αναρρόφηση καθορισµένου όγκου δείγµατος στο σπείραµα παραµονής. 3. Αναρρόφηση καθορισµένων όγκων διαλυµάτων αντιδραστηρίων στο σπείραµα παραµονής. 4. Προώθηση του µίγµατος της αντίδρασης προς τον ανιχνευτή (ενδέχεται να εφαρµοστεί αναχαίτιση της ροής, πριν ή εντός του ανιχνευτή κατά περίπτωση). 5. Καταγραφή των σηµάτων. 6. Προώθηση του προϊόντος της αντίδρασης στα απόβλητα Αναχαίτιση ροής σε συστήµατα SIA (stopped flow -SIA) Με την τεχνική της αναχαίτισης της ροής παρέχεται στο χηµικό σύστηµα περισσότερος χρόνος προκειµένου να εξελιχθεί η αντίδραση, χωρίς την επίδραση της αξονικής διασποράς στις ζώνες του δείγµατος και των αντιδραστηρίων. Στόχοι της εφαρµογής της τεχνικής της αναχαίτισης της ροής είναι: 1. Η αύξηση της ευαισθησίας ενός προσδιορισµού σε περιπτώσεις αργών αντιδράσεων. 2. Η αύξηση της εκλεκτικότητας άρση παρεµποδίσεων υποστρώµατος. 3. Η κινητική θεωρητική µελέτη των αντιδράσεων. 4. Η ανάπτυξη µεθόδων ταυτόχρονων προσδιορισµών µε κινητική διαφοροποίηση. Στα Σχήµατα 2.3 και 2.4 δίνονται αντίστοιχα η αρχή της τεχνικής και τα τυπικά λαµβανόµενα καταγραφήµατα.

16 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA 12 Σχήµα 2.3 : Προφίλ ζώνης του δείγµατος µε εφαρµογή αναχαίτισης της ροής [9]. Σχήµα 2.4 : Τυπικό γράφηµα εφαρµογής αναχαίτισης της ροής σε ένα σύστηµα SIA / FIA [10]. Στην περίπτωση α) ευνοείται ο σχηµατισµός του προϊόντος της αντίδρασης µε το χρόνο αναχαίτισης. Στην περίπτωση β) η αντίδραση είναι ανεξάρτητη του χρόνου αναχαίτισης και τέλος στην περίπτωση γ) το προϊόν της αντίδρασης αρχίζει να αποικοδοµείται κατά τον χρονικό διάστηµα αναχαίτισης της ροής.

17 Τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγµατος σε ροή SIA 13 Η αναχαίτιση της ροής µπορεί να πραγµατοποιηθεί είτε πριν είτε µέσα στην κυψελίδα του ανιχνευτή. Αναχαίτιση της ροής µέσα στον ανιχνευτή δίνει τη δυνατότητα στον αναλυτή να παρακολουθήσει την πορεία εξέλιξης της αντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο παρέχοντας τη δυνατότητα εξαγωγής συµπερασµάτων που αφορούν στο µηχανισµό της αντίδρασης. Με αναχαίτιση της ροής πριν τον ανιχνευτή απλά παρατείνεται ο χρόνος αντίδρασης. Η προσέγγιση αυτή επιλέγεται σε περιπτώσεις επίδρασης της ακτινοβολίας των οπτικών ανιχνευτών στην αντίδραση Πλεονεκτήµατα Μειονεκτήµατα SIA Τα βασικά πλεονεκτήµατα της SIA σε σχέση µε την FIA είναι: 1. Είναι οργανολογικά απλούστερη από τη FIA, αφού ανεξαρτήτως από τον αριθµό των διαλυµάτων, χρησιµοποιείται µια και µόνο βαλβίδα πολλαπλής επιλογής, µια µονοκαναλική αντλία και µόνο ένα κανάλι ροής. Όλες δηλαδή οι απαραίτητες διεργασίες για τον προσδιορισµό γίνονται σε µονοκαναλικό σύστηµα. 2. Η κατανάλωση των αντιδραστηρίων και των δειγµάτων καθώς και οι όγκοι των παραγόµενων αποβλήτων είναι σηµαντικά µικρότεροι αφού τα αντιδραστήρια εισάγονται µέσω της βαλβίδας σε αυστηρά καθορισµένους όγκους και δεν ρέουν συνεχώς. 3. Οι βασικές γεωµετρικές παράµετροι ενός συστήµατος SIA, δηλαδή οι όγκοι και οι ταχύτητες ροής, µπορούν εύκολα να µεταβάλλονται µε τη βοήθεια κατάλληλου λογισµικού. Τα κυριότερα µειονεκτήµατα της τεχνικής SIA, ως προς την πρόδροµή της, FIA, αφορούν το κόστος της οργανολογίας και της απόκτησης του απαραίτητου λογισµικού. Επίσης, είναι σχετικά δύσκολη η εφαρµογή πολύπλοκων χηµικών συστηµάτων που απαιτούν πολλαπλά στάδια αντιδράσεων, καθώς και τεχνικές προκατεργασίας όπως η εκχύλιση υγρού.

18 Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα 14 Κεφάλαιο 3 Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα Καθώς κύριος στόχος της παρούσας εργασίας αποτελεί ο προσδιορισµός της αµανταντίνης, ριµανταντίνης και µεµαντίνης σε υδατικά διαλύµατα και φαρµακευτικά σκευάσµατα, ύστερα από παραγωγοποίηση τους µε το αντιδραστήριο ο-φθαλαδιαλδεΰδη, κρίνεται απαραίτητη µια σύντοµη αναφορά στον ορισµό της παραγωγοποίησης, στους στόχους της και στα πλεονεκτήµατά της. Ως παραγωγοποίηση (derivatization) καλείται κάθε πορεία τροποποίησης µιας ένωσης µε χηµικές ή φυσικές µεθόδους υπό κατάλληλες συνθήκες [11], ώστε να δηµιουργηθεί µια νέα ένωση, συνήθως µε δοµή παρόµοια µε αυτήν της αρχικής (παράγωγο), κατάλληλη για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισµό της µε συνήθεις και καθιερωµένες µεθόδους χηµικής ανάλυσης. Το γενικό σχήµα µιας αντίδρασης παραγωγοποίησης είναι: Α (αρχική ένωση) + R (αντιδραστήριο) P (παράγωγο) Πιο συγκεκριµένα, κατά την παραγωγοποίηση, που δεν είναι τίποτα άλλο παρά ένα επιπλέον στάδιο προκατεργασίας του δείγµατος, µια συγκεκριµένη δραστική οµάδα της ένωσης συµµετέχει στην αντίδραση παραγωγοποίησης µε αποτέλεσµα την µετατροπή της ένωσης σε ένα παράγωγο, το οποίο διαφέρει από την αρχική ένωση ως προς διάφορες φυσικές ή χηµικές ιδιότητες, (π.χ. τη δραστικότητα, τη διαλυτότητα, την πολικότητα, το σηµείο ζέσεως, το σηµείο τήξεως, την ικανότητα φθορισµού, φωσφορισµού κ.α.). Οι νέες χαρακτηριστικές ιδιότητες που αποκτά το παράγωγο, µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισµό του. Στην παραγωγοποίηση καταφεύγει συχνά ο αναλυτικός χηµικός όταν η υπό µελέτη ένωση είναι µη επαρκώς σταθερή, όταν δεν είναι πτητική ή επαρκώς πτητική και τέλος όταν δεν είναι επαρκώς ανιχνεύσιµη µε το σύστηµα ανίχνευσης που είναι διαθέσιµο. Με την παραγωγοποίηση αίρονται οι παραπάνω δυσκολίες στην ανάλυση, καθώς, αυξάνεται η πτητικότητα των µη πτητικών ενώσεων, ελαττώνεται η πτητικότητα των πολύ πτητικών ενώσεων, εξουδετερώνονται ή παρακάµπτονται οι πολικές οµάδες

19 Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα 15 των µορίων, αυξάνεται η ανιχνευσιµότητα, και η σταθερότητα των ενώσεων καθώς και η ευαισθησία της ανάλυσης. Στη βιβλιογραφία υπάρχει αναφορά σε µεγάλο αριθµό εργασιών που έχουν χρησιµοποιήσει την παραγωγοποίηση ως στάδιο προκατεργασίας των δειγµάτων πριν την ανάλυσή τους. Στις περισσότερες εργασίες τα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης είναι εµπορικά διαθέσιµα, ενώ σε λίγες περιπτώσεις γίνεται αναφορά στην οργανική σύνθεση των αντιδραστηρίων αυτών πριν τη χρήση τους [12]. Η παραγωγοποίηση, παρά τα πολύ σηµαντικά πλεονεκτήµατα που προσφέρει στη χηµική ανάλυση, δεν παύει να αποτελεί ένα επιπλέον στάδιο προκατεργασίας του δείγµατος. εν είναι λίγοι οι ερευνητές που έχουν δηλώσει ότι η παραγωγοποίηση είναι στις περισσότερες των περιπτώσεων αναγκαίο κακό [12], καθώς βασικός στόχος µιας σύγχρονης αναλυτικής µεθόδου είναι να πραγµατοποιείται ο προσδιορισµός µε όσο το δυνατό λιγότερα στάδια προκατεργασίας του δείγµατος. Είναι φανερό, ότι η εισαγωγή ενός επιπλέον σταδίου προκατεργασίας, αυξάνει την αβεβαιότητα των αποτελεσµάτων µιας ανάλυσης. Ακόµα µεγαλύτερη είναι η αβεβαιότητα αυτή, όταν τα στάδια της παραγωγοποίησης και ο χειρισµός όλων των διαλυµάτων της γίνονται από κάποιον άνθρωπο. Στην περίπτωση αυτή θα πρέπει να συνυπολογίσει κανείς όλα εκείνα τυχαία και στατιστικά σφάλµατα, που εισάγονται στην ανάλυση λόγω του ανθρώπινου παράγοντα. Επιπλέον, κατά την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση µιας αντίδρασης παραγωγοποίησης, υπάρχουν πάρα πολλές παράµεροι, που πρέπει να µελετηθούν και να βελτιστοποιηθούν ώστε να πετύχουµε τελικά τη µεγαλύτερη δυνατή ευαισθησία και εκλεκτικότητα προσδιορισµού. Οι παράµετροι που µελετώνται συνήθως είναι η θερµοκρασία, ο χρόνος αντίδρασης, το ph, ο χρησιµοποιούµενος διαλύτης, η συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης και της ένωσης που πρέπει να παραγωγοποιηθεί και τέλος η συγκέντρωση όλων εκείνων των ενώσεων, η παρουσία των οποίων µπορεί πολλές φορές να είναι απαραίτητη για την πραγµατοποίηση της αντίδρασης ή την πορεία εξέλιξης της. Στο τελικό στάδιο της ανάλυσης, επιλέγονται και χρησιµοποιούνται εκείνες οι τιµές των παραµέτρων, οι οποίες προσδίδουν στη µέθοδο τη µεγαλύτερη εκλεκτικότητα, ακρίβεια και ευαισθησία [12].

20 Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα 16 Οι συχνότερα απαντηµένες αντιδράσεις παραγωγοποίησης είναι οι αντιδράσεις ακυλίωσης, συλιλίωσης, αλκυκίωσης και εστεροποίησης [13]. Σε τι είδους αντίδραση παραγωγοποίησης θα προχωρήσει ένας αναλυτικός χηµικός, εξαρτάται από την ελεύθερη οµάδα της ένωσης που θέλει να παραγωγοποιήσει, από την αναλυτική τεχνική που χρησιµοποιεί για τους προσδιορισµούς και τέλος από το είδος των δειγµάτων που πρόκειται να αναλυθούν. Οι αντιδράσεις παραγωγοποίησης, που πραγµατοποιούνται ευκολότερα, είναι εκείνες στις οποίες υπάρχει ένα τουλάχιστον ευκίνητο άτοµο υδρογόνου στο µόριο της ένωσης. Σε αυτές τις κατηγορίες ενώσεων ανήκουν οι ενώσεις που περιέχουν ελεύθερες αµινοµάδες, ιµινοµάδες, καβοξυλοµάδες, σουλφυδρυλοµάδες και υδροξυλοµάδες. Τα περισσότερο υποσχόµενα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης, που χρησιµοποιούνται συνήθως για την παραγωγοποίηση θειολικών ενώσεων, πρέπει να πληρούν τις εξής δύο προϋποθέσεις, ως προς τα δοµικά χαρακτηριστικά τους. Πρέπει από τη µια να περιέχουν στο µόριό τους µια λειτουργική οµάδα, η οποία να µπορεί να αντιδρά µε τις θειολικές οµάδες (συνήθως αµινοµάδα ή αλογόνο), και από την άλλη να έχει µια επιπλέον οµάδα, η οποία θα προσδίδει στο µόριο ικανοποιητική δυνατότητα ανίχνευσης (κάποιο χρωµοφόρο ή φθοροφόρο [14]. Σχήµα 3.1: Σχηµατική απεικόνιση ενός αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης [3].

21 Παραγωγοποίηση: Ορισµός Στόχοι Πλεονεκτήµατα 17 Καθώς η αντίδραση παραγωγοποίησης, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, είναι συνήθως µια σχετικά επίπονη διαδικασία (από τη µια λόγω του ότι µπορεί να αποτελείται από περισσότερα του ενός στάδια και από την άλλη γιατί ο ανθρώπινος παράγοντας επιβαρύνει την ανάλυση µε σφάλµατα), ήταν αναγκαία η αυτοµατοποίησή της. Οι περισσότερες αυτοµατοποιηµένες αντιδράσεις παραγωγοποίησης χρησιµοποιούνται στη χρωµατογραφία. Εκεί το προς ανάλυση δείγµα παραγωγοποιείται είτε πριν τη χρωµατογραφική στήλη (pre-column derivatization), για αύξηση της διαχωριστικής ικανότητας και ελάττωση του χρόνου διαχωρισµού, είτε µετά τη στήλη (post column derivatization) για αύξηση της ευαισθησίας και εκλεκτικότητας της ανάλυσης. Ιδιαίτερα σηµαντική, όµως, ήταν η είσοδος της παραγωγοποίησης στις αυτοµατοποιηµένες αναλυτικές τεχνικές FIA και SIA [15]. Η ικανότητα, από τη µία, ανίχνευσης σχεδόν κάθε είδους µορίου µετά από παραγωγοποίηση του µε κατάλληλο αντιδραστήριο παραγωγοποίησης και ο αυτοµατισµός, από την άλλη, των τεχνικών αυτών, που εξαλείφει τις παρεµποδίσεις που προκύπτουν από τους ανθρώπινους χειρισµούς και αυξάνει στο µέγιστο δυνατό τον ρυθµό δειγµατοληψίας και αναλύσεων, καθιστά τη σύζευξη αυτών ένα ιδιαίτερα χρήσιµο εργαλείο σε κάθε αναλυτικό εργαστήριο, τόσο για µεµονωµένες αναλύσεις, όσο και για αναλύσεις ρουτίνας.

22 Φθορισµοµετρία 18 Κεφάλαιο 4 Φθορισµοµετρία 4.1 Φωταύγεια Άτοµα και µόρια πολλών ουσιών έχουν την ικανότητα να απορροφούν ενέργεια, µεταβαίνοντας σε µια νέα, υψηλότερης ενέργειας, ενεργειακή κατάσταση, η οποία χαρακτηρίζεται ως διεγερµένη. Κατόπιν, η ενέργεια αυτή αποβάλλεται γρήγορα και τα µόρια επανέρχονται στη βασική ενεργειακή τους κατάσταση. Η περίσσεια ποσότητα ενέργειας του ατόµου ή του µορίου µπορεί, µέσω συγκρούσεων, να µεταδοθεί σε άλλα σωµατίδια ή µπορεί, µέσω ταλαντώσεων και περιστροφών, να χαθεί µε τη µορφή θερµότητας. Σε άλλες περιπτώσεις η πλεονάζουσα ποσότητα ενέργειας µπορεί να καταναλωθεί για να αποσπασθούν ηλεκτρόνια από το άτοµο, προκειµένου να κατασταθεί δυνατή η πραγµατοποίηση µιας φωτοχηµικής αντίδρασης. Στις περιπτώσεις αυτές, που τα διεγερµένα µόρια αποβάλλουν την ενέργεια διέγερσης ή µέρος αυτής µε τη µορφή ακτινοβολίας, παρατηρείται το φαινόµενο της φωταύγειας. Για συγκεκριµένα µόρια, όπως π.χ. δύσκαµπτα συζυγιακά συστήµατα, οι απώλεια της ενέργειας κατά την ταλάντωση και την περιστροφή είναι βραδύτερη. Τέτοιου είδους διεγερµένα µόρια µπορούν να αποβάλλουν την ενέργειά τους εκπέµποντας φωτόνια και προκαλώντας το φαινόµενο του φθορισµού [16]. Η φωταύγεια είναι χαρακτηριστική ιδιότητα όλων των συστηµάτων που δε βρίσκονται σε κατάσταση ισορροπίας. Το πιο χαρακτηριστικό γνώρισµά της είναι ότι η διάρκεια του φαινοµένου, µετά τη διακοπή της δράσης της πηγής διέγερσης, είναι πάρα πολύ µικρή, της τάξεως του 1 ps. Οι πιθανές ενεργειακές µεταπτώσεις, που λαµβάνουν χώρα κατά τη διέγερση και αποδιέγερση ενός µορίου παρουσιάζονται σχηµατικά στο ενεργειακό διάγραµµα του Σχήµατος 4.1. Η διαφορά ανάµεσα σε µια απλή και µια τριπλή ενεργειακή κατάσταση αποτελεί συνέπεια της διαφοράς του spin (S) του ηλεκτρονίου. Η τιµή του αριθµού spin είναι +1/2 ή -1/2. Για κάθε οµοιοπολικό δεσµό απαιτούνται τουλάχιστον δύο ηλεκτρόνια, των οποίων µάλιστα τα spin θα πρέπει να είναι συζευγµένα (το ένα να έχει -1/2 και το άλλο

23 Φθορισµοµετρία 19 +1/2). Η τροχιακή γωνιακή ροπή οποιασδήποτε ενεργειακής κατάστασης δίνεται από τη σχέση [17] Μ = 2S + 1 όπου S: το συνολικό spin της συγκεκριµένης κατάστασης. Όταν όλα τα ηλεκτρόνια είναι συζευγµένα το Μ ισούται µε 1 ( 2 (1/ 2 1/ 2) + 1), ενώ όταν το spin ενός απλού ηλεκτρονίου αντιστρέφεται, η τιµή του Μ γίνεται 3. Αυτό δηµιουργεί αντίστοιχα και τις απλές, τριπλές καταστάσεις. Σχήµα 4.1: Ενεργειακό ιάγραµµα - Ηλεκτρονικές µεταπτώσεις - Μηχανισµοί διέγερσης και αποδιέγερσης των µορίων και οι προκύπτουσες εκπεµπόµενες ακτινοβολίες. S o χαρακτηρίζεται η χαµηλότερης ενέργειας, απλή, ενεργειακή κατάσταση S 1 η πρώτη απλή διεγερµένη κατάσταση S 2 η δεύτερη απλή διεγερµένη κατάσταση Τ 1 και Τ 2 ορίζονται αντίστοιχα η πρώτη και η δεύτερη τριπλή διεγερµένη κατάσταση. Αναλυτικότερα τα στάδια που παρατηρούµε είναι: 1. Απορρόφηση ενέργειας και µετάπτωση ηλεκτρονίων από µη δεσµικά (n) ή δεσµικά (π) τροχιακά σε αντιδεσµικά (π*) τροχιακά, οπότε το µόριο µεταβαίνει από τη θεµελιώδη κατάσταση, σε απλές διεγερµένες δονητικές στάθµες (S 1 ή S 2 ), που είναι επιτρεπόµενες.

24 Φθορισµοµετρία Αποβολή ενέργειας, µε µετάπτωση των ηλεκτρονίων στη χαµηλότερη δονητική στάθµη, της διεγερµένης κατάστασης στην οποία βρίσκεται, και µετατροπή της ενέργειας αυτής σε θερµική ή ενέργεια δονήσεων, ταλαντώσεων και περιστροφών. 3. Εσωτερική µετατροπή, δηλαδή µεταφορά ενέργειας από τη χαµηλότερη δονητική στάθµη µιας ενεργειακής κατάστασης σε υψηλότερη δονητική στάθµη της αµέσως χαµηλότερης δονητικής κατάστασης. 4. Εκποµπή ακτινοβολίας κατά τη µετάπτωση µεταξύ ηλεκτρονικών καταστάσεων της ίδιας πολλαπλότητας και εκποµπή ακτινοβολίας φθορισµού. 5. Εξωτερική µετατροπή, η οποία πραγµατοποιείται µε µεταφορά ενέργειας στο διαλύτη ή άλλη συνυπάρχοντα στο διάλυµα µόρια, χωρίς εκποµπή ακτινοβολίας 6. Η διέγερση σε τριπλή ενεργειακή κατάσταση είναι απαγορευµένη. 7. Η διέγερση ηλεκτρονίων στην τριπλή κατάσταση ενισχύεται από την αποδιέγερση, χωρίς εκποµπή ακτινοβολίας, σε καταστάσεις διαφορετικής πολλαπλότητας, (δηλαδή από S 1 σε T 1 ). 8. Η αποδιέγερση τριπλής κατάστασης µε εκποµπή ακτινοβολίας φωσφορισµού. 4.2 Σχέση δοµής ενώσεως και φθορισµού Η δοµή των µορίων σχετίζεται άµεσα µε την ικανότητα τους να δίνουν αποδιεγέρσεις µε εκποµπή ακτινοβολίας φθορισµού. Απαραίτητη προϋπόθεση για να µπορεί µια ένωση να φθορίζει είναι να έχουν τα µόριά της τέτοια δοµή, ώστε να απορροφούν υπεριώδη ή ορατή ακτινοβολία. Η ακαµψία, δε, του µορίου πρέπει να είναι µεγάλη, γιατί µόνο στην περίπτωση αυτή η ενεργειακή διαφορά µεταξύ της βασικής (S 0 ) και της πρώτης απλής διεγερµένης (S 1 ) µπορεί να αποτρέψει την αποδιέγερση µέσω του µηχανισµού της εσωτερικής µετατροπής. Γενικά, κατά κανόνα, ικανότητα φθορισµού έχουν οι ενώσεις εκείνες που περιέχουν στο µόριό τους αρωµατικούς δακτυλίους ή πολλαπλούς συζυγιακούς διπλούς δεσµούς. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι, ο φθορισµός των συζυγιακών ενώσεων γίνεται ακόµα µεγαλύτερος σε περιπτώσεις µορίων µε επίπεδη συµµετρία, πράγµα αναµενόµενο, αν αναλογιστεί κανείς ότι η ακαµψία των µορίων είναι αποτέλεσµα της επίπεδης συµµετρίας τους [18]. Η παρουσία υποκαταστατών στο µόριο

25 Φθορισµοµετρία 21 επηρεάζει σε µεγάλο βαθµό το φθορισµό του, καθώς η εισαγωγή υποκαταστατών επιφέρει µεταβολές στη µορφή των τροχιακών. Υποκαταστάτες δότες ηλεκτρονίων αυξάνουν την απόδοση φθορισµού, ενώ αντίθετα η προσθήκη υποκαταστατών δεκτών ηλεκτρονίων µειώνει την ικανότητα του φθορισµού. Η ικανότητα φθορισµού f είναι χαρακτηριστική παράµετρος για κάθε µόριο και ορίζεται ως ο αριθµός των φωτονίων που εκπέµπονται προς τον αριθµό των φωτονίων που απορροφώνται, κατά τις διαδικασίες αποδιέγερσης και διέγερσης αντίστοιχα, στη µονάδα του χρόνου. Η σχέση ανάµεσα στην ένταση της ακτινοβολίας φθορισµού F και τη συγκέντρωση c δίνεται από τη σχέση: F = k * f * (I 0 I 0 * 10 -εcl ) όπου Ι ο : η ένταση της ακτινοβολίας απορρόφησης f: ικανότητα φθορισµού της ουσίας k: σταθερά που εξαρτάται από τις προδιαγραφες του οργάνου ε: µοριακός συντελεστής απόσβεσης l: η διαδροµή της ακτινοβολίας στη κυψελίδα του δείγµατος c: η συγκέντρωση ποσότητας της ουσίας Για αραιά διαλύµατα (c < 10-5 ) η παραπάνω εξίσωση γίνεται: F = k * f * I 0 * εlc Οι παράγοντες που επηρεάζουν την ένταση της ακτινοβολίας φθορισµού είναι συνοπτικά οι παρακάτω. 1. Ακτινοβολία Ramman, που προέρχεται από τα µόρια του διαλύτη. Προκύπτει από την απορρόφηση µέρους της ακτινοβολίας διέγερσης από τα µόρια του περιβάλλοντος για δονητικές και περιστροφικές κινήσεις. Αποτέλεσµα είναι η εµφάνιση ακτινοβολίας σκέδασης σε µήκη κύµατος µεγαλύτερα αυτών της ακτινοβολίας διέγερσης. 2. Ακτινοβολία φθορισµού που προκαλείται από το υλικό της κυψελίδας του ανιχνευτή (γηγενής φθορισµός). 3. Ακτινοβολία που προκαλείται από σκέδαση της ακτινοβολίας διέγερσης όταν αυτή προσπίπτει στα µόρια τις ουσίας.

26 Φθορισµοµετρία Ακτινοβολία που προέρχεται από προσµίξεις που βρίσκονται στους διαλύτες ή στα αντιδραστήρια. 5. Ακτινοβολία από άλλα συστατικά του δείγµατος. Φαινόµενο παρόµοιο µε το φθορισµό αποτελεί ο φωσφορισµός. Η διαφορά των δύο αυτών φαινοµένων είναι ότι στο φθορισµό η εκποµπή ακτινοβολίας συµβαίνει από την απλή ενεργειακή κατάσταση στη βασική, µε το µηχανισµό S 1 S o, ενώ ο φωσφορισµός συµβαίνει από την τριπλή ενεργειακή κατάσταση στη βασική, µε το µηχανισµό Τ 1 S o Φαινόµενο Quenching Ένας από τους παράγοντες που επηρεάζουν την ακρίβεια του ποσοτικού προσδιορισµού, όταν χρησιµοποιείται φθορισµοµετρικός ανιχνευτής, είναι η ελάττωση της έντασης φθορισµού (Quenching). Η ελάττωση αυτή οφείλεται σε αυξηµένη απορρόφηση είτε της προσπίπτουσας είτε της εκπεµπόµενης ακτινοβολίας από το διάλυµα. Η αυξηµένη απορρόφηση της ακτινοβολίας από την ουσία οφείλεται είτε στην ίδια την ουσία που προσδιορίζεται, όταν βρίσκεται σε µεγάλες συγκεντρώσεις, είτε στην παρουσία ξένων µορίων. Μιας και η αύξηση της ευαισθησίας αποτελεί έναν από τους κυριότερους στόχους κατά την ανάπτυξη µιας φθορισµοµετρικής τεχνικής και η απόσβεση της ακτινοβολίας φθορισµού µειώνει την ευαισθησία, απαραίτητη προϋπόθεση, κατά τον σχεδιασµό µιας αναλυτικής πορείας, είναι να εξετάζεται προσεκτικά το σύστηµα για την εξάλειψη όλων εκείνων των παραµέτρων που συµβάλλουν στην ανάπτυξη του φαινοµένου Quenching Αναλυτική φθορισµοµετρία Το αρχικό στάδιο κατά την ανάπτυξη µιας αναλυτικής µεθοδολογίας που βασίζεται σε φθορισµοµετρική ανίχνευση περιλαµβάνει τη λήψη των φασµάτων διέγερσης και εκποµπής των προς µελέτη ενώσεων. Με τον όρο φάσµα διέγερσης (excitation spectrum) εννοούµε την γραφική απεικόνιση της έντασης ακτινοβολίας φθορισµού F, υπό σταθερό µήκος κύµατος ακτινοβολίας φθορισµού, λ em, σε συνάρτηση του µήκους

27 Φθορισµοµετρία 23 κύµατος της ακτινοβολίας διέγερσης, λ ex. Αντιθέτως, µε τον όρο φάσµα εκποµπής (fluorescence spectrum) εννοούµε την γραφική απεικόνιση της έντασης ακτινοβολίας φθορισµού F, υπό σταθερό µήκος κύµατος ακτινοβολίας διέγερσης, λ ex, σε συνάρτηση του µήκους κύµατος της ακτινοβολίας φθορισµού, λ em. Για τη λήψη φασµάτων διέγερσης και εκποµπής απαιτείται η διαθέσιµη οργανολογία να παρέχει τη δυνατότητα σάρωσης του µήκους κύµατος διέγερσης και εκποµπής. Για την εκλεκτική µέτρηση ενός µόνο φθοροφόρου συστατικού, σε ένα διάλυµα µέσα στο οποίο µπορεί να υπάρχουν και άλλα φθοροφόρα, επιλέγεται το κατάλληλο µήκος κύµατος διέγερσης, ώστε να διεγερθεί εκλεκτικά µόνο τα µόρια της προς ανάλυση ουσίας, ή εκποµπής, ώστε να µετρηθεί εκλεκτικά η εκποµπή της ένωσης που ενδιαφέρει. Τα βασικά πλεονεκτήµατα της φθορισµοµετρικής ανίχνευσης είναι: 1. Υψηλή ευαισθησία. 2. Υψηλή εκλεκτικότητα σε σχέση µε την φασµατοφωτοµετρία υπεριώδους-ορατού λόγο του συνδυασµού των δύο µηκών κύµατος διέγερσης και εκποµπής. Σχήµα 4.2 : ιάταξη σχισµών σε ένα τυπικό φθορισµόµετρο.

28 Εφαρµογές των τεχνικών FIA και SIA 24 Κεφάλαιο 5 Εφαρµογές των τεχνικών FIA και SIA στη φαρµακευτική ανάλυση Οι ασθενείς οφείλουν να έχουν τον υψηλότερο δυνατό βαθµό εµπιστοσύνης όσον αφορά στην ποιότητα και την αποτελεσµατικότητα των φαρµάκων, τα οποία τους συνταγογραφούνται. Η λήψη, παρόλα αυτά, φαρµάκων κρύβει τόσο οφέλη όσο και κινδύνους για την ανθρώπινη υγεία. Προκειµένου να διασφαλιστεί, ότι η ισορροπία µεταξύ των οφελών και των κινδύνων κλείνει προς όφελος του ασθενή, ο έλεγχος της αποτελεσµατικότητας των φαρµάκων και της ασφάλειάς τους πρέπει να είναι εξονυχιστικός και συνεχής. Για το λόγο αυτό, οι κανονισµοί, που αφορούν σήµερα στα φαρµακευτικά σκευάσµατα και καθορίζονται από αρµόδιους και εξουσιοδοτηµένους εθνικούς φορείς (Εθνικός Οργανισµός Φαρµάκων), γίνονται ολοένα και πιο αυστηροί. Οι κανονισµοί αυτοί ελέγχουν και καθορίζουν όλα τα στάδια από τα οποία περνά ένα φαρµακευτικό προϊόν κατά την παραγωγή, τη διακίνηση και την αποθήκευση του. Ο έλεγχος ποιότητας ενός φαρµακευτικού σκευάσµατος περιλαµβάνει µια πληθώρα δοκιµών, στις οποίες περιλαµβάνονται µεταξύ άλλων: 1. Ποσοτικός προσδιορισµός και έλεγχος καθαρότητας του δραστικού συστατικού. 2. Έλεγχος διαλυτοποίησης. 3. Οµοιοµορφία της περιεκτικότητας. 4. Έλεγχος των Α υλών. 5. Έλεγχος διαδικασίας παραγωγής (in process control). Στα παραπάνω πλαίσια, η αναλυτική χηµεία παίζει καθοριστικό ρόλο τόσο στη διασφάλιση της ποιότητας των εµπορικά διαθέσιµων φαρµακευτικών σκευασµάτων, όσο και στην έρευνα για ανάπτυξη νέων φαρµακοτεχνικών µορφών και δραστικών ουσιών. Οι απαιτήσεις των αναλυτικών µεθόδων για την αποτελεσµατική εφαρµογή τους στον έλεγχο ποιότητας των φαρµάκων µεταξύ άλλων περιλαµβάνουν: 1. Υψηλό βαθµό αυτοµατοποίησης. 2. Υψηλό ρυθµό ανάλυσης δειγµάτων σε βιοµηχανική κλίµακα. 3. Απλή προκατεργασία των δειγµάτων. 4. Χαµηλό κόστος αντιδραστηρίων. 5. Απλές διαδικασίες ελέγχου και χειρισµού.

29 Εφαρµογές των τεχνικών FIA και SIA 25 Είναι φανερό ότι οι τεχνικές συνεχούς ροής όπως η FIA και η SIA πληρούν τα περισσότερα, αν όχι όλα, από τα παραπάνω κριτήρια. Αποτέλεσµα αυτού είναι η ύπαρξη στη διεθνή βιβλιογραφία εκατοντάδων αναφορών που περιγράφουν την ανάπτυξη αυτόµατων µεθόδων FIA και SIA για τον έλεγχο ποιότητας φαρµακευτικών σκευασµάτων, τόσο σε ακαδηµαϊκό όσο και σε βιοµηχανικό επίπεδο [19-23].

30 Xαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 26 Κεφάλαιο 6 Γενικά χαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και χρησιµοποιούµενων αντιδραστηρίων 6.1 Η νόσος του Αλτσχάιµερ Η νόσος του Αλτσχάιµερ είναι µια εκφυλιστική νόσος, η οποία αργά και προοδευτικά καταστρέφει εγκεφαλικά κύτταρα. Πήρε το όνοµά της από τον Alois Alzheimer, έναν Γερµανό νευρολόγο, ο οποίος το 1907 πρώτος περιέγραψε τα συµπτώµατα και τα νευροπαθολογοανατοµικά ευρήµατα της νόσου, όπως είναι οι πλάκες και οι νευροϊνιδιακές εκφυλίσεις στον εγκέφαλο. Η νόσος προσβάλλει τη µνήµη και τη νοητική λειτουργία (π.χ., σκέψη, οµιλία κ.λπ.), αλλά µπορεί επίσης να οδηγήσει και σε άλλα προβλήµατα, όπως σε σύγχυση, αλλαγές στη διάθεση και αποπροσανατολισµό σε χρόνο και χώρο. Αρχικά, τα συµπτώµατα όπως η διαταραχή στη µνήµη και η απώλεια των νοητικών λειτουργιών, µπορεί να είναι τόσο ήπια ώστε να περνούν απαρατήρητα, τόσο από το ίδιο το άτοµο όσο και από την οικογένεια και τους φίλους του. Ωστόσο, καθώς η νόσος εξελίσσεται, τα συµπτώµατα γίνονται ολοένα και πιο εµφανή και αρχίζουν να εµπλέκονται µε την καθηµερινή εργασία και τις κοινωνικές δραστηριότητες. Πρακτικές δυσκολίες µε καθηµερινές ασχολίες, όπως το ντύσιµο, το πλύσιµο, η τουαλέτα προοδευτικά γίνονται τόσο σοβαρές ώστε, µε την πάροδο του χρόνου, το άτοµο εξαρτάται ολοκληρωτικά από τους άλλους. Η νόσος του Αλτσχάιµερ δεν είναι ούτε µολυσµατική ούτε µεταδοτική. Είναι µια ανίατη νόσος, η οποία προκαλεί µια γενική αποδιοργάνωση στην υγεία. Ωστόσο, η πιο συχνή αιτία θανάτου είναι η πνευµονία, γιατί, καθώς η νόσος εξελίσσεται, το ανοσολογικό σύστηµα αποδυναµώνεται, ενώ παρουσιάζεται απώλεια βάρους, που αυξάνει τον κίνδυνο λοιµώξεων του ανωτέρου και του κατωτέρου αναπνευστικού συστήµατος. Προς το παρόν, δεν υπάρχει κάποια προληπτική ή θεραπευτική αγωγή που να παρεµβαίνει στην εξέλιξη της νόσου του Αλτσχάιµερ. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια υπάρχει πρόοδος στην ανάπτυξη χολινεργικών φαρµάκων τα οποία έχουν θετική επίδραση στα συµπτώµατα της νόσου.

31 Xαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 27 Έχει αποδειχθεί ότι τα άτοµα που υποφέρουν από τη νόσο έχουν ελαττωµένα επίπεδα ακετυλοχολίνης, ενός νευροδιαβιβαστή (χηµική ουσία που είναι υπεύθυνη για τη µεταβίβαση µηνυµάτων από ένα κύτταρο σε άλλο) που παίζει σηµαντικό ρόλο στη µνηµονική διαδικασία. Έχουν παρασκευαστεί συγκεκριµένα φάρµακα που µπορούν ν' αναστείλουν το ένζυµο που αποδοµεί την ακετυλοχολίνη. Σε ορισµένους ασθενείς, τα φάρµακα αυτά βελτιώνουν κυρίως τη µνήµη και τη συγκέντρωση αλλά και τις περισσότερες από τις λοιπές γνωστικές ικανότητες. Υπάρχουν επιπρόσθετες ενδείξεις ότι ορισµένα από αυτά έχουν τη δυνατότητα να βελτιώσουν τις καθηµερινές δραστηριότητες των ασθενών και να επιβραδύνουν την επιδείνωση των συµπτωµάτων. 6.2 Αµανταδίνη (ΑΜΑ) Ένα αντιβιοτικό το οποίο χρησιµοποιείται για την προληπτική ή συµπτωµατική θεραπεία της γρίπης Α ((Σχήµα 6.1). Επίσης χρησιµοποιείται στην καταπολέµηση των συνδρόµων Parkinson, Alzheimer και της µεθερπητικής νευραλγίας. Ο τρόπος που δρα κατά των κινητικών ανωµαλιών δεν είναι απόλυτα κατανοητός αλλά πιθανώς οφείλεται στην αύξηση της σύνθεσης αλλά και της απελευθέρωσης της ντοπαµίνης [24-27]. Αν και δεν φαίνεται να έχει απευθείας αντιχολινεργική δράση, σε µελέτες παρουσιάζονται τέτοιου είδους παρενέργειες όπως ξηρότητα στόµατος, κατακράτηση υγρών και δυσκοιλιότητα. Βρίσκεται µε τη µορφή υδροχλωρικού άλατος σε κρυσταλλική µορφή και συνήθως κάθε κάψουλα περιέχει 100 mg ένωσης. Η δράση της σαν αντιιικό οφείλεται στην αναστολή της αναπαραγωγής του ιού της γρίπης Α ενώ δεν έχει καµία ευεργετική δράση στη γρίπη Β. Συνήθεις παρενέργειες είναι ναυτία, ζαλάδα και αϋπνία. Σε περίπτωση που ληφθεί µεγαλύτερη ποσότητα από µια κανονική δόση µπορεί να προκαλέσει θάνατο. Επίσης έχουν αναφερθεί αυτοκτονικές τάσεις σε ανθρώπους µε και χωρίς ιστορικό ψυχιατρικών προβληµάτων. Κατάθλιψη, αποπροσανατολισµός, επιθετική συµπεριφορά, αλλαγή προσωπικότητας, αϋπνία είναι κάποια από τα συµπτώµατα που εµφανίζουν οι αυτόχειρες.

32 Xαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 28 Σχήµα 6.1 : Στερεοχηµικός τύπος ΑΜΑ (C 10 H 17 N- MW = g mol 1 ). 6.3 Μεµαντίνη (ΜΕΜ) Η µεµαντίνη (Σχήµα 6.2) (1-Amino-3,5-dimethyladamantane) µε επίσηµη ονοµασία κατά IUPAC 3,5-dimethyladamantan-1-amine (CAS Number: ) συµµετέχει ως δότης και δέκτης σε δεσµό υδρογόνου [27]. Είναι µια τρικυκλική αµίνη που έχει παραπλήσιες χηµικές και φαρµακευτικές ιδιότητες µε την αµανταδίνη και το α-µέθυλο υποκατάστατο της, την ριµανταδίνη. Σχήµα 6.2 : Στερεοχηµικός τύπος ΜΕΜ (C 12 H 21 N- MW = g mol 1 ). Υπάρχει σε µορφή χαπιών µε λευκό ή υπόλευκο χρώµα και είναι διαλυτή στο νερό. Λαµβάνεται από τους ασθενείς από το στόµα σε µορφή επικαλυµµένων κάψουλων και συγκέντρωση 5 και 10 mg. Η µεµαντίνη (1-amino-3-dimethyladamantane) είναι ένα παράγωγο της αδαµαντίνης το οποίο συνταγογραφείται για πολλές νευρολογικές διαταράξεις. Απορροφάται πλήρως από τον ανθρώπινο οργανισµό µε µέγιστη συγκέντρωση µεταξύ 3 και 7 ωρών από την ώρα λήψης του φαρµάκου, ενώ αποβάλλεται κυρίως µε τα ούρα.

33 Xαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 29 Ανήκει σε µια νέα γενιά φαρµάκων κατά του Αλτσχάιµερ δρώντας στο γλουταµινεργικό σύστηµα και µπλοκάροντας τους N-methyl-D-aspartate (NMDA) γλουταµινικούς δέκτες. Μακροχρόνια υπερενεργοποιήση των δεκτών αυτών µπορεί να οδηγήσει σε νευρωνικό θάνατο, συνεπώς ο ανταγωνισµός των NMDA θα µπορούσε να προσφέρει προστασία στα νεύρα και να παίξει σηµαντικό ρόλο στη θεραπεία του Αλτσχάιµερ. Λαµβάνοντας υπόψη την περιορισµένη αποτελεσµατικότητα των ακετυλοχολινικών αναστολέων που ήδη κυκλοφορούν στο εµπόριο (όπως donepezil, rivastigmine) και στοχεύουν στο χολινεργικό σύστηµα και στην συµπτωµατική βελτίωση της νόσου, είναι µείζονος σηµασίας η ανάπτυξη νέων φαρµάκων. Το φάρµακο memantine (Namenda) δίδεται σε ασθενείς µε µέτρια έως σοβαρή άνοια. 6.4 Ριµανταδίνη (RIM) Αναστολέας RNA [27] (Σχήµα 6.3) ο οποίος χρησιµοποιείται σαν αντιικό για την προφύλαξη και θεραπεία της γρίπης Α. Πιο συγκεκριµένα το χηµικό όνοµα του είναι alpha-methyltricyclo-( /3.7)decane-1-methanamine. Βρίσκεται µε τη µορφή χαπιού και σιροπιού και λαµβάνεται από το στόµα. Είναι µια ουσία µη ανταγωνιστική, µέτριας συγγένειας µε τους NMDA (N-methyl-D-aspartate) ανταγωνιστικούς υποδοχείς. Η αρχή του µηχανισµού της δράσης πιστεύεται ότι είναι το σταµάτηµα της ροής (διαµέσου καναλιών υποδοχέων NMDA) ενός γλουταµικού δέκτη και των συναφών ενώσεων οι οποίες λαµβάνουν µέρος στη λειτουργία του εγκεφάλου. Σχήµα 6.3 : Στερεοχηµικός τύπος RIM (C 12 H 21 N - MW = g mol 1 ).

34 Xαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων Ο φθαλαδιαλδεΰδη Η ο-φθαλαδιαλδεΰδη (ΟΡΑ) (Σχήµα 6.4), µε συστηµατική ονοµασία κατά IUPAC 1,2- δικαρβοξυλαλδεΰδη, είναι ένα γνωστό αντιδραστήριο παραγωγοποίησης το οποίο έχει χαµηλό γηγενή φθορισµό. Παρουσία, όµως, θειολικών ενώσεων και ενώσεων µε πρωτοταγή αµινοµάδα, πραγµατοποιείται αντίδραση σχηµατισµού ισοϊνδολών, οι οποίες έχουν έντονη ικανότητα φθορισµού [28, 29] (Σχήµα 6.5). Η αντίδραση γίνεται γρήγορα σε θερµοκρασία δωµατίου και σε αλκαλικό ph (ph: 8 11), ενώ τα φθοροφόρα παράγωγα, συχνά, µπορεί να δώσουν δευτερεύουσες αντιδράσεις µε άλλα µόρια του περιβάλλοντος, µε αποτέλεσµα της µείωσης της έντασης ακτινοβολίας φθορισµού [28]. O H H Σχήµα 6.4 : Συντακτικός τύπος ΟΡΑ. (ΜW = 134 g mol -1 ). O CHO SR + RSH + R'NH N R' 2 CHO Σχήµα 6.5 : Αντίδραση ΟΡΑ µε θειόλες παρουσία ενώσεων µε πρωτοταγή αµινοµάδα.

35 Xαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 31 Ακόµα και σήµερα ο µηχανισµός της αντίδρασης δεν είναι πλήρως κατανοητός [30]. Οι Wong, Larry, Sternson και Schowen είχαν προσπαθήσει παλαιότερα, µε µελέτες της κινητικής της αντίδρασης, να εξηγήσουν το µηχανισµό της και κατέληξαν σε δύο πιθανές εκδοχές, όπως φαίνεται στο Σχήµα 6.6. Σχήµα 6.6 : Πιθανοί µηχανισµοί αντίδρασης της ΟΡΑ µε θειόλες παρουσία ενώσεων µε πρωτοταγείς αµινο-οµάδες. Σε υδατικά διαλύµατα η ΟΡΑ βρίσκεται σε τρεις διαφορετικές µορφές, όπως φαίνεται στο Σχήµα 6.7. Την άνυδρη, την ένυδρη και την ηµικεταλική [14, 31].

36 Xαρακτηριστικά ιδιότητες προσδιοριζόµενων ενώσεων και αντιδραστηρίων 32 Σχήµα 6.7 : Μορφές ΟΡΑ σε υδατικά διαλύµατα. Άνυδρη µορφή (Α), ένυδρη µορφή (Β) και ηµικεταλική µορφή του µορίου (Γ) [14, 31]. Η ΟΡΑ έχει χρησιµοποιηθεί ευρύτατα σε προσδιορισµούς αµινοξέων και άλλων αµινοενώσεων αλλά και σε προσδιορισµούς θειολικών ενώσεων ως αντιδραστήριο παραγωγοποίησης σε συστήµατα HPLC. Μάλιστα από το 1982 µέχρι το 1998, σχεδόν το 30% όλων των εργασιών που αναφέρονταν σε παραγωγοποίηση και HPLC, χρησιµοποιούσαν την ΟΡΑ. Οι αναφορές αντίθετα του αντιδραστηρίου σε συστήµατα SIA ή FIA είναι πιο περιορισµένες [32].