ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑΣ Β ΣΕ ΥΛΙΚΟ ΒΙΟΨΙΩΝ ΗΠΑΤΟΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ TOMEAΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ Σ. ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑΣ Β ΣΕ ΥΛΙΚΟ ΒΙΟΨΙΩΝ ΗΠΑΤΟΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Α. ΣΟΥΛΤΟΓΙΑΝΝΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΟΑΝΑΤΟΜΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΡΟΔΡΟΜΟΣ ΧΥΤΙΡΟΓΛΟΥ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΕΝΗ ΒΡΕΤΤΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΛΕΝΤΙΝΗ ΤΖΙΟΥΦΑ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΡΟΔΡΟΜΟΣ ΧΥΤΙΡΟΓΛΟΥ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΕΝΗ ΒΡΕΤΤΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΛΕΝΤΙΝΗ ΤΖΙΟΥΦΑ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΑΚΡΙΒΙΑΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΕΥΓΕΝΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΑΡΙΑ ΡΑΠΤΟΠΟΥΛΟΥ-ΓΙΓΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκριση της διδακτορικής αυτής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως.» (νόμος 5343/32, άρθρο 202, 2 και νόμος 1268, άρθρο 50, 8)

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Β. ΝΤΟΜΠΡΟΣ

4

5 Στη μητέρα μου και στη μνήμη του πατέρα μου Στην οικογένειά μου

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 1 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3 1. ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ... 5 Ανατομική και λειτουργική μονάδα του ήπατος... 5 Τα ηπατοκύτταρα... 7 Τα κολπώδη τριχοειδή αγγεία και ο χώρος του Disse Τα πυλαία διαστήματα Ο ΙΟΣ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑΣ Β ΚΑΙ Ο ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΟΥ Ο ιός της ηπατίτιδας Β.14 Κύκλος ζωής του ιού HΠΑΤΙΤΙΔΑ Β Επιδημιολογικά δεδομένα Κλινικά ευρήματα οξείας και χρόνιας ηπατίτιδας Ορολογικοί δείκτες HBV λοίμωξης Εργαστηριακή προσέγγιση ασθενών με θετικό HBsAg Παθογένεια της ηπατίτιδας Β Οξεία ηπατίτιδα Β: Παθολογοανατομικά Ευρήματα Διαφορική διάγνωση οξείας ηπατίτιδας Β Χρόνια ηπατίτιδα Β: Παθολογοανατομικά Ευρήματα Ανίχνευση των αντιγόνων του HBV σε ιστολογικά παρασκευάσματα με μεθόδους ανοσοιστοχημείας Συστήματα ταξινόμησης χρόνιας ηπατίτιδας Χρησιμότητα της βιοψίας ήπατος σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 55 ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ... 57

8 1. Βιοψίες ήπατος Ιστολογική εξέταση Ανοσοιστοχημικές χρώσεις Εκχύλιση DNA Μοριακή ποσοτική διερεύνηση αλληλουχιών του HBV Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα Ιστολογικά ευρήματα Ανοσοιστοχημικά ευρήματα Ευρήματα μοριακής μελέτης Σύγκριση αποτελεσμάτων μεθόδων ανίχνευσης των μορίων του ιού Αποτελέσματα στατιστικής ανάλυσης Εικόνες ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο ιός της ηπατίτιδας Β (ΗΒV) είναι το συχνότερο αίτιο χρόνιας ηπατίτιδας. Η ηπατίτιδα Β αποτελεί πολύ σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας, καθώς το 1/3 περίπου του παγκόσμιου πληθυσμού έχει ορολογικούς δείκτες ενδεικτικούς παρούσας ή παρελθούσας λοίμωξης από τον ΗΒV. Οι ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β εμφανίζουν σημαντικό κίνδυνο ανάπτυξης κίρρωσης, ηπατικής ανεπάρκειας και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Ο κύκλος ζωής του ιού έχει μελετηθεί εντατικά κατά τα τελευταία έτη. Παρά το ότι ο ιός δεν είναι άμεσα κυτταροτοξικός για τα ηπατοκύτταρα, η ανοσολογική απάντηση του ξενιστή μπορεί να προκαλέσει σοβαρές αλλοιώσεις στο ηπατικό παρέγχυμα. Η χρόνια λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας Β συντηρείται από την παρουσία του cccdna. Το cccdna είναι ένα μόριο του ΗΒV που παίζει μείζονα ρόλο στον πολλαπλασιασμό του ιού. Η χρονιότητα της ΗΒV λοίμωξης, η αντοχή σε θεραπευτικά σχήματα και η αναζωπύρωση της λοίμωξης μετά από διακοπή της θεραπείας σχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με την παρουσία του cccdna και την αδυναμία του ανοσολογικού συστήματος και της θεραπευτικής αγωγής να απαλλάξουν τα ηπατοκύτταρα από το ccc DNA. Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει από διάφορους ερευνητές προσπάθειες ανίχνευσης των επιπέδων του cccdna και άλλων μορίων του HBV στο ηπατικό παρέγχυμα με ευαίσθητες μοριακές μεθόδους. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση των μορίων του HBV στο ηπατικό παρέγχυμα με σύγχρονη ευαίσθητη μέθοδο ποσοτικής ανίχνευσης και η συσχέτιση των ευρημάτων με κλινικοεργαστηριακές, ιστολογικές και ανοσοϊστοχημικές παραμέτρους. Συγκεκριμένα, προσπαθήσαμε να ανιχνεύσουμε με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (quantitative real-time PCR) το ολικό 1

10 DNA του ιού και το cccdna και συγκρίναμε τα αποτελέσματα με τις ως άνω παραμέτρους. Ο απώτερος στόχος της διερεύνησης είναι η πιθανή μελλοντική χρησιμοποίηση της νέας αυτής μεθόδου στη διαγνωστική εκτίμηση ασθενών πριν και μετά από θεραπεία. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω ολόψυχα τον επιβλέποντα της διατριβής κ. Πρόδρομο Χυτίρογλου, Αναπληρωτή Καθηγητή Παθολογικής Ανατομικής του Α.Π.Θ., για την ανάθεση του θέματος, την ηθική συμπαράσταση και την καθοδήγησή του σε όλα τα στάδια της εκπόνησης της διατριβής. Ευχαριστώ θερμά τα μέλη της συμβουλευτικής επιτροπής, κ. Ελένη Βρεττού, Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής του Α.Π.Θ. και κ. Βαλεντίνη Τζιούφα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής του Α.Π.Θ. για τις πολύτιμες συμβουλές τους και την αμέριστη συμπαράστασή τους. Ευχαριστώ επίσης θερμά τον κ. Ευάγγελο Ακριβιάδη, Καθηγητή Παθολογίας του Α.Π.Θ., χωρίς την πολύτιμη βοήθεια του οποίου στο κλινικό εργαστηριακό μέρος της μελέτης, η παρούσα διατριβή θα ήταν αδύνατη. Ευχαριστώ ολόψυχα την κ. Βασιλική Κωτούλα, Λέκτορα Παθολογικής Ανατομικής του Α.Π.Θ., η οποία σχεδίασε τις μοριακές μεθόδους που εφαρμόστηκαν στην παρούσα διατριβή, για την καθοδήγηση και την ανεκτίμητη βοήθειά της. Ευχαριστώ επίσης τον κ. Χαράλαμπο Μιχαλούδη, Μηχανολόγο Μηχανικό, για τη βοήθειά του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Τέλος, ευχαριστώ όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής και ιδιαίτερα τον τέως Διευθυντή Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Παπαδημητρίου και τον νυν Διευθυντή Καθηγητή κ. Γεώργιο Καρκαβέλα για την άψογη φιλοξενία που μου παρείχαν. 2

11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

12

13 1. ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ Το ήπαρ είναι ένα από τα σπουδαιότερα όργανα του ανθρωπίνου σώματος και αποτελεί τον μεγαλύτερο αδένα αυτού. Αποκαλείται και «βιοχημικό εργαστήριο» του οργανισμού λόγω των πολλών λειτουργιών τις οποίες επιτελεί. Βρίσκεται στην άνω κοιλία υποδιαφραγματικά και καταλαμβάνει το δεξιό υποχόνδριο, τη μεγαλύτερη μοίρα του ιδίως επιγαστρίου και τμήμα του αριστερού υποχονδρίου. Το βάρος του ήπατος ανέρχεται από 1200 έως 1800 gr και αντιπροσωπεύει περίπου το 2% του συνολικού βάρους του σώματος στον ενήλικα 1. Το ήπαρ περιβάλλεται εξωτερικά στη μεγαλύτερη έκτασή του από περιτόναιο (ορογόνος χιτώνας). Κάτω από τον ορογόνο βρίσκεται μία λεπτή κάψα ινώδους συνδετικού ιστού, η κάψα του Glisson. Από την κάψα του Glisson πορεύονται προσεκβολές προς το εσωτερικό του ήπατος με τη μορφή πετάλων συνδετικού ιστού, τα οποία συνεχώς διακλαδίζονται σχηματίζοντας λεπτότερα διαφραγμάτια εντος του ηπατικού παρεγχύματος. Κατά τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα πλέγμα συνδετικού ιστού εντός του οποίου βρίσκονται τα ηπατικά κύτταρα. Ανατομική και λειτουργική μονάδα του ήπατος Μέχρι σήμερα έχουν προταθεί τρεις ανατομικές-λειτουργικές μονάδες για το ήπαρ : το ηπατικό λόβιο, το πυλαίο λόβιο και το απλό ή σύνθετο ηπατικό βοτρύδιο. Το κλασικό ηπατικό λόβιο (hepatic lobule) περιγράφηκε από τον Kiernan 109 το1836 και χρησιμοποιείται ακόμη και σήμερα στη μελέτη των παθήσεων του ήπατος ως βασική δομική μονάδα του ηπατικού παρεγχύματος 2. Το ηπατικό λόβιο έχει σχήμα πολυεδρικό (εξαγωνικό σε 5

14 δισδιάστατη απεικόνιση ιστολογικής τομής) στο κέντρο του οποίου βρίσκεται η κεντρική φλέβα, από την οποία πορεύονται ακτινοειδώς συστήματα δοκίδων ηπατοκυττάρων. Τα όρια του ηπατικού λοβίου αποτελούνται από συνδετικό ιστό και στις γωνίες όπου συναντώνται τρία λόβια σχηματίζονται τα πυλαία διαστήματα. Κάθε πυλαίο διάστημα περιέχει έναν κλάδο της πυλαίας φλέβας, έναν κλάδο της ιδίως ηπατικής αρτηρίας, ένα χοληφόρο αγγείο, λεμφαγγεία και νευρικούς κλαδίσκους. Τα ηπατικά λόβια δεν αποτελούν ανεξάρτητες λειτουργικές μονάδες, αφού έχουν κοινή αγγείωση με παρακείμενα λόβια από αγγεία κοινών πυλαίων διαστημάτων. Το πυλαίο λόβιο (portal lobule) περιγράφηκε από τον Mall το 1906 ως ανατομική-λειτουργική μονάδα του ήπατος 145,16. Έχει σχήμα πρισματικό (τριγωνικό σε δυσδιάστατη απεικόνιση ιστολογικής τομής). Στο κέντρο του πυλαίου λοβίου βρίσκεται ένα πυλαίο διάστημα. Τα όριά του καθορίζονται από μία τεθλασμένη γραμμή η οποία φέρεται δια των κεντρικών φλεβών παρακειμένων ηπατικών λοβίων. Το πυλαίο λόβιο είναι αυτοτελές στην αιμάτωσή του. Το ηπατικό βοτρύδιο (hepatic acinus) προτάθηκε από τον Rappaport 183,184 το1954 ως η ανεξάρτητη λειτουργική μονάδα του ήπατος. Έχει σχήμα ελλειψοειδές. Στο κέντρο του βοτρυδίου βρίσκεται ένας τελικός κλάδος πυλαίας φλέβας, ηπατικής αρτηρίας και χοληφόρου αγγείου 185. Από εκεί πορεύονται με ακτινωτή διάταξη δοκίδες ηπατικών κυττάρων. Συνεπώς το βοτρύδιο περιλαμβάνει την περιοχή του ηπατικού ιστού που αιματώνεται από τους συγκεκριμένους τελικούς αγγειακούς κλάδους της μεσολόβιας σχισμής και οριοθετείται στο κλασσικό ηπατικό λόβιο από δύο γειτονικές κεντρικές φλέβες. Τα ηπατοκύτταρα ενός βοτρυδίου διαφοροποιούνται ως προς την αιμάτωση και τη λειτουργία τους ανάλογα με την απόστασή τους από τους τελικούς αγγειακούς κλάδους και χωρίζονται σε τρεις ομόκεντρες ζώνες 102. Έτσι τα κύτταρα που βρίσκονται 6

15 κοντά στα αγγεία αποτελούν τη ζώνη Ι. Τα κύτταρα αυτά έχουν καλύτερη οξυγόνωση και διαθέτουν άφθονα μιτοχόνδρια και οργανύλλια. Τα κύτταρα που βρίσκονται κοντά στην κεντρική φλέβα αποτελούν τη ζώνη ΙΙΙ και έχουν πτωχότερη οξυγόνωση και λιγότερα μιτοχόνδρια. Ανάμεσά τους βρίσκεται η ζώνη ΙΙ, τα κύτταρα της οποίας έχουν ενδιάμεση μορφή. Η έννοια του βοτρυδίου έχει επίκεντρο την αιμάτωση και τη μεταβολική λειτουργία και εξηγεί πολλά παθολογοανατομικά ευρήματα (πχ νέκρωση ηπατοκυττάρων στην περιφέρεια των βοτρυδίων) 103. Το σύνθετο βοτρύδιο (complex acinus) αποτελείται από 3 τουλάχιστον γειτονικά βοτρύδια. Τρία ή τέσσερα σύνθετα βοτρύδια αποτελούν ένα βοτρυοειδές σύμπλεγμα (acinar agglomerate). Ας σημειωθεί επίσης ότι ο Matsumoto το 1982 εισήγαγε την έννοια του πρωτογενούς λοβίου (primary lobule) το οποίο έχει κωνοειδές σχήμα. Κάθε κλασικό ηπατικό λόβιο αποτελείται από έξι έως οκτώ πρωτογενή λόβια (primary lobules). Επομένως το κλασικό λόβιο συνιστά ένα δευτερογενές λόβιο 149. Έχουν προταθεί επίσης το χόλεον (choleon) από τον Hoffman και το χολεοήπατον (choleohepaton) από τους Ekataksin και Wake 58. Τα ηπατοκύτταρα Τα ηπατοκύτταρα (ηπατικά επιθηλιακά κύτταρα) έχουν μέγιστη διάμετρο μ περίπου και σχήμα πολυγωνικό. Η κυτταρική μεμβράνη είναι ευδιάκριτη και περιλαμβάνει τρεις ειδικές (επιτελούσες διαφορετική λειτουργία ) περιοχές: την βασεοπλαγία ή κολποειδική (basolateral ή sinusoidal), η οποία εμφανίζει άφθονες μικρολάχνες, την χοληφόρο τριχοειδική ή χολαγγειολική (canalicular) η οποία επίσης εμφανίζει μικρολάχνες και την πλαγία (lateral) η οποία εκτείνεται από την άκρη του 7

16 χοληφόρου τριχοειδούς έως την άκρη του κολπώδους τριχοειδούς και επιτελεί τη λειτουργία της σύνδεσης και επικοινωνίας των ηπατοκυττάρων μεταξύ τους 241. Οι πυρήνες έχουν υποστρόγγυλο σχήμα, ένα ή δύο πυρήνια και διάσπαρτη χρωματίνη. Καταλαμβάνουν κεντρική θέση στο ηπατοκύτταρο και χωρίζονται σε τρεις τύπους: τους μικρού μεγέθους (διαμέτρου 10 μm) διπλοειδείς (80% περίπου), τους μεσαίου μεγέθους (διαμέτρου 15 μm) τετραπλοειδείς (16% περίπου) και τους μεγάλου μεγέθους (διαμέτρου 25 μm) πολυπλοειδείς (4% περίπου) 83. Κύριος παράγοντας που επηρεάζει την ποσοστιαία αναλογία των πυρήνων των ανωτέρω τύπων είναι η ηλικία, με αύξηση των τετραπλοειδών και πολυπλοειδών στις μεγαλύτερες ηλικίες 139. Διαταραχή στην ποσοστιαία αναλογία συμβαίνει και σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις 231. Η πυρηνική μεμβράνη είναι δίστοιβη και εμφανίζει άφθονους πόρους. Μιτωτική δραστηριότητα σπάνια ανευρίσκεται στα ηπατοκύτταρα των ενηλίκων (περίπου μία μίτωση ανά κύτταρα). Αυτό συμβαίνει επειδή είναι μακρόβια κύτταρα (ο χρόνος ζωής τους μπορεί να ξεπεράσει τις 300 ημέρες) 140. Το κυτταρόπλασμα των ηπατοκυττάρων είναι ηωσινόφιλο, άφθονο και περιέχει πολλά και ποικίλα οργανύλλια, τα οποία είναι υπεύθυνα για διάφορες μεταβολικές δραστηριότητες. Το Ε.Δ. είναι κατά 60% κοκκώδες και κατά 40% λείο. Η αναλογία αυτή μεταβάλλεται ανάλογα με την επικρατούσα λειτουργία στο κάθε ηπατοκύτταρο. Η λειτουργία του ΕΔ περιλαμβάνει σύνθεση πρωτεινών, μεταβολισμό λιπών, παραγωγή χοληστερόλης, μεταβολισμό ξένων ουσιών (φαρμάκων), σύνθεση ασκορβικού οξέος και αποδόμηση αίμης 236. Η συσκευή Golgi περιλαμβάνει 50 περίπου πεδία εντός των κυττάρων, τα οποία βρίσκονται κοντά στα χοληφόρα τριχοειδή ή στους πυρήνες. Η λειτουργία της συνίσταται στην έκκριση λιποπρωτεινών και άλλων εκκριτικών πρωτεινών, στην παραγωγή λυσοσωματίων και πιθανόν στην έκκριση χολής. Τα λυσοσώματα (περίπου 8

17 30 τον αριθμό ανά ηπατοκύτταρο) βρίσκονται κυρίως πλησίον χοληφόρων τριχοειδών και παρουσιάζουν έντονο πλειομορφισμό ανάλογα με τη λειτουργική κατάσταση του κυττάρου. Έτσι επιτελούν αυτοπεψία κυτταροπλασματικών οργανυλλίων (αυτοφαγική δράση) και συσσωμάτωση λιποφουσκίνης και εξωγενών ουσιών (σιδήρου και χαλκού) (ετεροφαγική δράση) 46. Τα υπεροξυσώματα (330 έως 600 ανά ηπατοκύτταρο) είναι μικρά ωοειδή κυστίδια και χρησιμοποιούν ενεργό μοριακό οξυγόνο για να οξειδώσουν διάφορες ουσίες με ταυτόχρονο σχηματισμό υπεροξειδίου του υδρογόνου, το οποίο υδρολύεται με καταλύτη την υπεροξειδική καταλάση. Τα υπεροξυσώματα συμμετέχουν μεταξύ των άλλων και στο μεταβολισμό των λιπιδίων και διαφόρων εξωγενών ουσιών 192. Τα μιτοχόνδρια των ηπατοκυττάρων (περίπου 1000 ανά ηπατοκύτταρο) είναι μεγάλα οργανύλλια και έχουν παρόμοια δομή και λειτουργία με τα μιτοχόνδρια των υπολοίπων κυττάρων. Ο κυτταρικός σκελετός αποτελείται από σωληνίσκους, μικροϊνίδια και ενδιάμεσα ινίδια όπως και στα υπόλοιπα κύτταρα. Τα ηπατοκύτταρα εκκρίνουν τη χολή στα χοληφόρα τριχοειδή, τα οποία στην ουσία είναι μεσοκυττάριοι χώροι, διαμέτρου μ, που το τοίχωμά τους, αποτελείται από τις χολαγγειολικές περιοχές των κυτταρικών μεμβρανών. Αυτές σχηματίζουν μικρολάχνες που προβάλλουν στον αυλό των χοληφόρων τριχοειδών και έτσι σε εγκάρσια διατομή ο αυλός των σωληναρίων εμφανίζει ακανόνιστο σχήμα. Τα χοληφόρα τριχοειδή εκβάλλουν στους πόρους του Hering που επαλείφονται εν μέρει από ηπατοκύτταρα και εν μέρει από επιθηλιακά κύτταρα χοληφόρων και διαθέτουν βασική μεμβράνη. Αυτοί στην περιφέρεια των λοβίων μεταπίπτουν στα χολαγγειόλια (bile ductules), που διαθέτουν βασική μεμβράνη και επαλείφονται μόνο από επιθηλιακά κύτταρα χοληφόρων 192a. Στα πυλαία διαστήματα, τα χολαγγειόλια σχηματίζουν τους μεσολόβιους 9

18 χοληφόρους πόρους (interlobular bile ducts), οι οποίοι στη συνέχεια σχηματίζουν τους διαφραγματικούς πόρους και τους μεγάλους πόρους των πυλών του ήπατος. Τα κολπώδη τριχοειδή αγγεία και ο χώρος του Disse Τα κολπώδη τριχοειδή είναι εξειδικευμένα τριχοειδή αγγεία με διάμετρο μεγαλύτερη από τα υπόλοιπα τριχοειδή 18 ( η διάμετρός τους είναι περίπου 10 μ. αλλά όταν διατείνονται μπορεί να φθάσει τα 30 μ.). Στα κολπώδη τριχοειδή ανευρίσκονται τέσσερα διαφορετικά είδη κυττάρων, το καθένα από τα οποία έχει τη δική του μορφολογία, τοπογραφική κατανομή και λειτουργία: τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα Kupffer επαλείφουν εσωτερικά τα κολπώδη τριχοειδή, τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα βρίσκονται στο χώρο του Disse και τα σχετιζόμενα με το ήπαρ λεμφοκύτταρα (HAL) βρίσκονται εντός του αυλού των κολπωδών τριχοειδών. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι μικρά κύτταρα με λίγο κυτταρόπλασμα και επιμήκη βαθυχρωματικό πυρήνα. Δεν έχουν βασική μεμβράνη, ούτε μεσοκυττάριες συνδέσεις, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών αγγείων της κυκλοφορίας. Μαζί με τα ηπατοκύτταρα αφορίζουν το χώρο του Disse. Σχηματίζουν μια λεπτή στιβάδα που εμφανίζει πολλαπλά ανοίγματα (θυρίδες). Οι θυρίδες είναι μεγαλύτερες στις περιφλεβικές περιοχές και μικρότερες στις περιπυλαίες. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η διάμετρός τους μπορεί να μεταβάλλεται από ενδογενείς παράγοντες (πχ. σεροτονίνη) ή εξωγενείς παράγοντες (πχ. αλκοόλ). Οι θυρίδες των ενδοθηλιακών κυττάρων επιτρέπουν την δίοδο πλάσματος από τον αυλό των κολπωδών τριχοειδών στο χώρο του Disse, όπου έρχεται σε επαφή με τα ηπατοκύτταρα

19 Τα κύτταρα Kupffer ανήκουν στο δικτυοενδοθηλιακό σύστημα και είναι εξειδικευμένα φαγοκύτταρα, αλλά έχουν φαινοτυπικές διαφορές από τα άλλα μακροφάγα του οργανισμού. Έχουν ανώμαλο αστεροειδές σχήμα και ευμεγέθεις πυρήνες με σχήμα φασιόλου. Περιέχουν λυσοσώματα και φαγοσωμάτια και έχουν Ε.Δ. πλούσιο σε υπεροξειδάση. Η λειτουργία τους είναι η φαγοκυττάρωση μικροοργανισμών, εκφυλισμένων κυττάρων, νεοπλασματικών κυττάρων και διαφόρων μακρομορίων. Παίζουν επίσης μείζονα ρόλο στον καθαρισμό των ενδοτοξινών που προέρχονται από τον εντερικό σωλήνα και φθάνουν στο ήπαρ μέσω της πυλαίας κυκλοφορίας. Τα ενεργοποιημένα κύτταρα Kupffer εκκρίνουν διάφορες κυτοκίνες 64 οι οποίες επηρεάζουν τις λειτουργίες ηπατοκυττάρων, αστεροειδών κυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων. Αν και είναι συγκεντρωμένα σε περιπυλαίες θέσεις, έχουν μεταναστευτική ικανότητα και μπορούν να κινούνται προς την κατεύθυνση περιοχών με ηπατική βλάβη και προς τους επιχώριους λεμφαδένες. Στο χώρο του Disse ανευρίσκονται τα αστεροειδή κύτταρα (hepatic stellate cells H.S.C.) ή κύτταρα του Ito. Τα κύτταρα αυτά με τις μακρές πρωτοπλασματικές απολήξεις τους περιβάλλουν τα κολπώδη τριχοειδή και αποτελούν το 10% περίπου των κολποειδικών κυττάρων 92. Ομοιάζουν με περικύτταρα και περιέχουν πολλά μικρά σταγονίδια λίπους στο κυτταρόπλασμά τους πλούσια σε βιταμίνη Α. Θεωρούνται μεσεγχυματογενούς προελεύσεως (όπως υποδηλώνει η θετικότητά τους σε ανοσοϊσοχημικές χρώσεις βιμεντίνης, δεσμίνης και ακτίνης λείων μυικών ινών) με πιθανή νευρική-νευροεξωδερμική διαφοροποίηση. Λειτουργία τους είναι η παραγωγή των πρωτεϊνών του χώρου του Disse και η αποθήκευση της βιταμίνης Α. Έχουν επίσης αγγειοσυσταλτική δράση δρώντας όπως τα περικύτταρα γύρω από τα κολπώδη τριχοειδή και συμμετέχουν στη διαδικασία της αναγέννησης του ηπατικού παρεγχύματος. 11

20 Το φυσιολογικό ήπαρ περιέχει 1x10 10 λεμφοειδή κύτταρα 140. Ανοσοφαινοτυπικές μελέτες έδειξαν ότι υπάρχει μεγάλος και ετερογενής πληθυσμός λεμφοκυττάρων στο ήπαρ τα οποία αναφέρονται ως «λεμφοκύτταρα συσχετιζόμενα με το ήπαρ» και αποτελούν ένα ειδικό τμήμα του λεμφικού συστήματος 44. Κυρίως ανευρίσκονται γύρω από τα πυλαία διαστήματα, αλλά και διάσπαρτα εντός του ηπατικού παρεγχύματος. Ανευρίσκονται επίσης στα κολπώδη τριχοειδή πλησίον κυττάρων Kupffer ή ενδοθηλιακών κυττάρων. Στο περιφερικό αίμα το 85% των λεμφοκυττάρων είναι Τ- και Β- κύτταρα. Το 65% των λεμφοκυττάρων του ήπατος είναι κύτταρα ΝΚ, Τ-κύτταρα που εκφράζουν υποδοχείς γδ και Τ-κύτταρα που εκφράζουν ΝΚ μόρια (ΝΤΚ κύτταρα) 165. Στο περιφερικό αίμα η αναλογία των ανωτέρω τριών ειδών κυττάρων είναι 13%,2% και 2% αντίστοιχα. Τα ηπατικά κύτταρα ΝΚ (50% του συνολικού αριθμού των λεμφοκυττάρων του ήπατος) δεν έχουν υποδοχείς για εξειδικευμένα αντιγόνα. Κατά προτίμηση θανατώνουν κύτταρα-στόχους τα οποία έχουν έλλειψη μορίων MHC τάξεως 1. Συνεπώς τα ηπατικά ΝΚ έχουν την ικανότητα καταστροφής νεοπλασματικών κυττάρων (γι αυτό και ο πληθυσμός τους αυξάνεται δραματικά σε κακοήθειες) και συμμετοχής σε ανοσολογικές απαντήσεις εναντίον μικροοργανισμών (ιών, βακτηριδίων και παρασίτων). Το ήπαρ περιέχει τον μεγαλύτερο αριθμό γδ Τ-cells του οργανισμού. Εκκρίνουν διάφορες κυτοκίνες και μπορούν να λύουν κύτταρα στόχους 205. Τα ΝΚΤ («σύνθετα» κύτταρα που εκφράζουν ταυτόχρονα τόσο υποδοχέα Τ-κυττάρων, όσο υποδοχέα ΝΚ κυττάρων) επηρεάζουν την τοπική ανοσολογική αντίδραση παράγοντας κυτοκίνες και αναπτύσσοντας κυτταροτοξικές δραστηριότητες. Ο μεγάλος αριθμός των λεμφοκυττάρων και η ποικιλία του πληθυσμού τους (παράμετροι που διαφέρουν από άτομο σε άτομο ανάλογα με την ανοσολογική του κατάσταση) καθιστούν το ήπαρ σημαντικό ανοσολογικό όργανο

21 Τα πυλαία διαστήματα Τα πυλαία διαστήματα αποτελούνται από συνδετικό ιστό που περιέχει κλάδους της ηπατικής αρτηρίας, της πυλαίας φλέβας και του χοληφόρου δένδρου, καθώς και λεμφαγγεία και κλαδίσκους νεύρων του συμπαθητικού και παρασυμπαθητικού συστήματος. Η εξωκυττάρια ουσία του ήπατος περιλαμβάνει κολλαγόνο, γλυκοπρωτείνες και πρωτεογλυκάνες και παράγεται από ηπατοκύτταρα, αστεροειδή κύτταρα, ινοβλάστες και μυοϊνοβλάστες. Τα επιθηλιακά κύτταρα των μικρών χοληφόρων είναι κυβοειδή ή χαμηλά κυλινδρικά, ενώ των μεγάλων χοληφόρων είναι υψηλά κυλινδρικά. Τα επιθηλιακά κύτταρα των χοληφόρων έχουν εκκριτικό, αλλά και απορροφητικό ρόλο. Η επιφάνειά τους προς τον αυλό φέρει μικρολάχνες 225. Το ήπαρ περιλαμβάνει σχετικά μικρή ποσότητα συνδετικού ιστού παρά το μεγάλο του μέγεθος. Στο φυσιολογικό ήπαρ ανευρίσκονται ίνες κολλαγόνου τύπου Ι, ΙΙΙ, ΙV, V, VI και XVIII 160. Ίνες κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ απαντώνται στην κάψα του Glisson. Κολλαγόνο τύπου Ι απαντάται στα πυλαία διαστήματα και στα μεσολόβια διαφραγμάτια. Ο χώρος του Disse περιέχει λεπτές ίνες κολλαγόνου τύπου ΙV (δικτυωτές ίνες). Κολλαγόνο τύπου ΙΙ δεν απαντάται στο ήπαρ 228. Στην κίρρωση, μεγάλες ποσότητες κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ εναποτίθενται στα πυλαία διαστήματα και τα λόβια δημιουργώντας ποικίλου πάχους ινώδη διαφραγμάτια. Οι γλυκοπρωτείνες περιλαμβάνουν λαμινίνη, ινονεκτίνη, εντακτίνη, ουνδουλίνη και ελαστίνη. Οι πρωτεογλυκάνες περιλαμβάνουν θειικά άλατα χονδροϊτίνης, δερματάνης, κερατάνης και ηπαράνης, καθώς και ηπαρίνη. 13

22 2. Ο ΙΟΣ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑΣ Β ΚΑΙ Ο ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΟΥ Ο ιός της ηπατίτιδας Β Ο ιός της ηπατίτιδας Β (hepatitis B virus HBV) είναι ένας DNA ιός με διάμετρο 42nm που ανήκει στην οικογένεια Hepadnaviridae 115. Στην ίδια οικογένεια κατατάσσονται επίσης οι ιοί ηπατίτιδας της μαρμότας (Woodchuck H.V.), ηπατίτιδας του σκίουρου (ground squirrel H.V.) και ηπατίτιδας της πάπιας Πεκίνου (Peking duck H.V.). Χαρακτηριστικό όλων των ιών της οικογένειας είναι ο τροπισμός για τα ηπατοκύτταρα. Οι ιοί αυτοί προκαλούν ηπατίτιδα (οξεία και χρόνια), καθώς και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα. Το σωματίδιο (virion) του ιού έχει διάμετρο 42 nm και περιέχει κυκλικό, μερικώς δίκλωνο DNA (relaxed circular, partially double stranded DNA). Παρά το μικρό του μέγεθος (3,2 kb) έχει πολύπλοκη δομή 12 (Σχήμα 1). Καλύπτεται από εξωτερικό περίβλημα τριών πολυπεπτιδίων πάχους 4 nm το οποίο περιβάλλει σφαιρικό πυρήνα διαμέτρου 27 nm. To εξωτερικό πρωτεϊνικό περίβλημα αποτελείται από την πρωτεΐνη επιφανείας με τον αντιγονικό επίτοπο HΒsAg και τις πρωτεΐνες προ-s1 και προ-s2. Ο νουκλεοκαψιδικός πυρήνας αποτελείται από το DNA του ιού, την πολυμεράση και την πυρηνική πρωτεΐνη c, με επίτοπο HΒcAg 115. Το γονιδίωμα του ιού έχει 4 πλαίσια μεταγραφής τα οποία κωδικοποιούν το σχηματισμό 7 πολυπεπτιδίων: την DNA πολυμεράση του ιού, τις πρωτεΐνες του περιβλήματος, την πυρηνική πρωτεΐνη (core) c, την προπυρηνική πρωτεΐνη (precore) e την πολυλειτουργική πρωτεΐνη Χ

23 Κατά την εξέταση με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μπορούν να παρατηρηθούν τρείς ξεχωριστές μορφές του HBV: Τα πλήρη σφαιρικά σωματίδια του ιού διαμέτρου 42 nm (σωματίδια του Dane), μικρά σφαιρικά σωματίδια διαμέτρου 22 nm και νηματοειδή ή σχήματος ράβδου σωματίδια (διαμέτρου επίσης 22 nm) 104. Τα μικρά σφαιρικά και νηματοειδή σωματίδια αποτελούνται από επιφανειακό αντιγόνο (ΗΒsΑg) του ιού και δεν περιέχουν ιικό DΝΑ. Το εξωτερικό περίβλημα του ιικού σωματιδίου περιλαμβάνει το επιφανειακό αντιγόνο (ΗΒsΑg). Το επιφανειακό αντιγόνο δεν είναι λοιμογόνο, διότι δεν περιέχει DΝΑ του ιού, αλλά αποτελείται από διάφορα άλλα αντιγόνα, βάσει των οποίων υποδιαιρείται σε 4 αντιγονικούς υποτύπους. Όλοι οι υπότυποι έχουν κοινό το αντιγόνο a. Υπάρχουν επίσης 2 ομάδες αμοιβαίως αποκλειομένων αντιγονικών παραγόντων, d και y, οι οποίες ουδέποτε συνυπάρχουν, καθώς και w και r, οι οποίες επίσης ουδέποτε συνυπάρχουν. Κατ' αυτόν τον τρόπο υπάρχουν 4 υπότυποι του ΗΒsΑg: adw, ayw, adr και ayr 59. Αυτοί οι υπότυποι μπορεί να ταξινομηθούν περαιτέρω σε εννέα ορότυπους (ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adrq- και adrq+) 38. Οι υπότυποι και ορότυποι δεν διαφέρουν μεταξύ τους στη λοιμογόνο δύναμη, την κλινική εικόνα ή τη χρονιότητα της ιοφορίας, είναι όμως χρήσιμη η διάκριση τους για επιδημιολογικούς λόγους. Η κατανομή των υποτύπων διαφέρει ανά γεωγραφική περιοχή 164. Στην Ελλάδα μέχρι τις αρχές της δεκαετίας 1970 επικρατούσε στην οξεία ηπατίτιδα ο παράγοντας y σε αναλογία 95% περίπου. Τη δεκαετία του 1980 παρατηρήθηκε ελάττωση του y σε 60% και αύξηση του παράγοντα d σε 40% περίπου 2. Η ίδια κατανομή παρατηρείται στην Κ. Ευρώπη και Β. Αμερική, όπου επίσης επιπολάζουν οι παράγοντες d και y. Οι πρόοδοι στη Μοριακή Βιολογία έδειξαν ότι υπάρχουν μοριακές ποικιλίες του HBV, οι οποίες αντανακλούν στην ποικιλία των υποτύπων. 15

24 Έτσι ο HBV μπορεί να ταξινομηθεί σε οκτώ γονοτύπους (Α έως H) 41. Η ποικιλομορφία αφορά οποιοδήποτε σημείο του γονιδιώματος του ιού και αποδίδεται σε μεταλλάξεις μεμονωμένων ή πολλαπλών γονιδιακών περιοχών. Η ανίχνευση και η μελέτη των γονοτύπων αποτελεί τρόπο επιβεβαίωσης της κλινικής αντίστασης, λόγω της παρουσίας μεταλλαγμένου στελέχους της ηπατίτιδας Β ανθεκτικού στο φάρμακο 121. Ο πολλαπλασιασμός του ιού της ηπατίτιδας Β μέσω της ανάστροφης γραφής του γονιδιώματος σε RΝΑ και στη συνέχεια σε DΝΑ, επιτρέπει εμφάνιση μεταλλάξεων, εξαιτίας του ότι η ανάστροφη μεταγραφάση που παίζει τον πρωταγωνιστικό ρόλο στερείται επιδιορθωτικής δράσης σε αντίθεση με την DΝΑ πολυμεράση, και έτσι δεν αντιγράφει πιστά την προγονιδιακή αλληλουχία 132. Ο ιός λοιπόν λόγω αυτών των μεταλλάξεων που παρατηρούνται, κυκλοφορεί στον ορό ως πληθυσμός συγγενικών στελεχών με μικρές διαφοροποιήσεις στην αλληλουχία των βάσεων 17,95. Εκτός όμως από τη φυσική ετερογένεια μεταξύ στελεχών του ιού, υπάρχουν και μεταλλαγμένα στελέχη του ιού που είτε σχετίζονται με την πορεία της χρόνιας ηπατίτιδας είτε είναι απότοκα θεραπευτικών παρεμβάσεων 118,168 (εμβόλια, θεραπεία). Δύο τυπικές μεταλλάξεις συμβαίνουν μετά από θεραπεία με λαμιβουδίνη 248,4. Στις μεταλλάξεις αυτές η μεθειονίνη αντικαθίσταται από βαλίνη ή ισολευκίνη στο κωδώνιο 552 και η λευκίνη από μεθειονίνη κωδώνιο 528 του γονιδιώματος του HBV 130. Μία χαρακτηριστική μετάλλαξη με ιδιαίτερη σημασία για τη χώρα μας είναι η υποκατάσταση βάσης γουανίνης από αδενίνη στην προπυρηνική περιοχή (στο προτελευταίο κωδικόνιο του προ- C γονιδίου), στο νουκλεοτίδιο 1896 με τελικό αποτέλεσμα την αναστολή της μετάφρασης του ΗΒeΑg. Η μετάλλαξη αυτή εμφανίζεται συχνά στις χώρες της Μεσογείου και της Άπω Ανατολής. Οι ασθενείς με την μετάλλαξη αυτή 16

25 του HBV δεν εκφράζουν το ΗΒeΑg στον ορό, παρά την σοβαρότητα της κλινικής τους εικόνας 21. Ο ιός της ηπατίτιδας Β διατηρείται στη θερμοκρασία -20 C για χρονικό διάστημα τουλάχιστον 20 ετών. Διατηρείται επίσης, σε 37 C επί 60' λεπτά και σε ξηρή κατάσταση σε 25 C επί μία εβδομάδα. Η λοιμογόνος δύναμη του ιού καταστρέφεται με την επίδραση διαφόρων απολυμαντικών ουσιών, όπως το υποχλωριώδες νάτριο 0,5%, η γλουταραλδεΰδη, η ισοπροπυλική αλκοόλη (70%) και τα ιωδιούχα σκευάσματα. Ο ΗΒV δεν καταστρέφεται με την υπεριώδη ακτινοβολία 115. Σχήμα 1: Η γονιδιακή δομή του HBV: Το γονίδιο S κωδικοποιεί την μείζονα πρωτεΐνη του περιβλήματος, το HBsAg. Οι περιοχές pre-s1 και pre-s2 κωδικοποιούν μία μεσαία και μία μεγάλη πρωτεΐνη. Το γονίδιο P κωδικοποιεί την DNA πολυμεράση. Το γονίδιο C κωδικοποιεί δύο πρωτεΐνες, το HBcAg και το HBeAg. Το γονίδιο X κωδικοποιεί την πρωτεϊνη HbxAg

26 Κύκλος ζωής του ιού Από τη στιγμή που εισέρχεται το σωματίδιο (βίριον) του HBV στο ηπατοκύτταρο με ενδοκυττάρωση από την κολποειδική περιοχή της κυτταρικής μεμβράνης, αποβάλλει το περίβλημά του και μετακινείται στον πυρήνα 247 (Σχήμα 2). Εκεί ελευθερώνεται το γονιδίωμα του ιού και οργανώνεται γύρω από νουκλεοσώματα για να ωριμάσει και να σχηματισθεί το μικροχρωμόσωμα του ιού 42. Το γονιδίωμα υφίσταται πλέον όχι ως κυκλικό μερικώς δίκλωνο DNA (μορφή με την οποία απαντούσε στο καψίδιο) αλλά ως «κυκλικό ομοιοπολικά κλειστό» (closed fully double stranded circular DNA, ccc DNA) 162. Το ccc DNA είναι ο οδηγός (template) για τη μεταγραφή του HBV χρησιμοποιώντας κυτταρική RNA πολυμεράση. Τουλάχιστον 4 πλαίσια μεταγραφής καθορίζονται από το ccc DNA: Ένα προγενωμικό RNA και 3 υπογενωμικά mrna 162. To προγενωμικό RNA χρησιμεύει ως οδηγός για πολλαπλασιασμό του γονιδιώματος με ανάστροφη μεταγραφή και ως mrna για σύνθεση του HBcAg, του HBeAg και της πολυμεράσης του HBV 74. Τα υπογενωμικά mrna χρησιμεύουν για σύνθεση των πρωτεϊνών του περιβλήματος και της πρωτεΐνης Χ 204. Αφού παραχθεί το προγενωμικό RNA, μετακινείται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα όπου σχηματίζεται το νουκλεοκαψίδιο του ιού (core) 93. Κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης των νουκλεοκαψιδίων το προγενωμικό RNA μεταγράφεται ανάστροφα σε κυκλικό μερικώς δίκλωνο DNA 128. Τα νουκλεοκαψίδια κατόπιν μετακινούνται στο ενδοπλασματικό δίκτυο όπου αποκτούν τις πρωτεΐνες του περιβλήματός τους, γίνονται βίρια και εξέρχονται από το κύτταρο. Άρα τα νουκλοκαψίδια του ιού που παράγονται ενδοκυττάρια μπορούν να ακολουθήσουν δύο οδούς: προς τον πυρήνα ή προς το ενδοπλασματικό δίκυο. Στα αρχικά στάδια της λοίμωξης (όταν και υπάρχει μικρός αριθμός περιβλημάτων) τα νουκλεοκαψίδια ακολουθούν 18

27 την οδό προς τον πυρήνα όπου ελευθερώνεται το γονιδίωμα του ιού και παράγεται ccc DNA. Προϊούσης της λοιμώξεως, συγκεντρώνεται αρκετό ccc DNA με αποτέλεσμα να αρχίζει να αυξάνει και ο αριθμός των πρωτεϊνών του περιβλήματος 233,126. Όταν οι πρωτεΐνες του περιβλήματος φθάσουν σε υψηλά επίπεδα ασκείται μηχανισμός αρνητικής ανάδρασης (negative feedback) 128 στο ccc DNA με αποτέλεσμα την επανακατεύθυνση των νουκλεοκαψιδίων προς την οδό του ενδοπλασματικου δικτύου για σχηματισμό βιρίων 219. Πιθανή αποτυχία του ρυθμιστικού αυτού μηχανισμού οδηγεί σε υψηλά επίπεδα ccc DNA με αποτέλεσμα τον θάνατο του ηπατοκυττάρου 127. Η ελεγχόμενη παραγωγή και ρύθμιση των επιπέδων του ccc DNA είναι σημαντικός παράγοντας για τη διατήρηση της παρουσίας του ιού 132. Υπολογίζεται ότι ο πληθυσμός του ccc DNA κυμαίνεται από 5 έως 50 μόρια ανά ηπατοκύτταρο 204,91. Ο χρόνος ημίσειας ζωής του ccc DNA είναι μεγάλος. Τόσο η χρονιότητα της ΗΒV λοίμωξης, όσο και η αντοχή σε θεραπευτικά σχήματα σχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με την αδυναμία του ηπατοκυττάρου να απαλλαγεί από το ccc DNA 220,137. Τα περισσότερα αντιιικά φάρμακα έχουν μικρή ή καθόλου επίδραση στο ccc DNA, με αποτέλεσμα την ταχεία επανεμφάνιση του HBV DNA στον ορό ασθενών μετά τη διακοπή της αντιιικής θεραπείας 24,134. Είναι σαφές ότι η φαρμακευτική έρευνα στρέφεται πλέον σε μηχανισμούς εκρίζωσης του ccc DNA από τα ηπατοκύτταρα, πράγμα το οποίο θα οδηγήσει και στην εκρίζωση της χρόνιας ΗΒV λοίμωξης 133,176. Παρόλο που η κύρια πηγή ιικής παραγωγής είναι τα ηπατοκύτταρα, μελέτες έχουν καταδείξει την παρουσία HBV DNA και σε άλλα κύτταρα είτε ενδοηπατικά (επιθηλιακά κύτταρα χοληφόρων) 122 είτε εξωηπατικά ( πάγκρεας 211, νεφρός, σπλήνας, μυελός των οστών) 11. Η φυσική ιστορία της ΗΒV λοίμωξης περιλαμβάνει τρεις ή τέσσερις φάσεις. 19

28 Στην πρώτη φάση (φάση της ανοχής) το ανοσολογικό σύστημα του ασθενούς δεν αντιδρά με αποτέλεσμα τον απρόσκοπτο πολλαπλασιασμό του ιού. Στην περιγεννητική λοίμωξη η φάση αυτή διαρκεί δεκαετίες 232, ενώ στον ενήλικα 2 έως 4 εβδομάδες και αντιστοιχεί στην περίοδο επώασης της οξείας λοίμωξης 182. Στη δεύτερη φάση (φάση της κάθαρσης) ο πολλαπλασιασμός του ιού συνεχίζεται, αλλά το ανοσολογικό σύστημα του ασθενή αντιδρά με σκοπό την εξάλειψή του. Στην οξεία λοίμωξη η φάση αυτή αντιστοιχεί στην περίοδο των κλινικών συμπτωμάτων και διαρκεί 2 έως 4 εβδομάδες 82. Στη χρόνια λοίμωξη διαρκεί από μήνες έως χρόνια. Στην τρίτη φάση (φάση της ενσωμάτωσης) το DNA του ιού ενσωματώνεται στο DNA του ηπατοκυττάρου και πολλαπλασιάζεται ελάχιστα. Η φάση αυτή αντιστοιχεί στην ανενεργό φορεία και διαρκεί εφόρου ζωής 67. Ορισμένοι όμως ασθενείς μπορεί να εμφανίσουν επαναδραστηριοποίηση της νόσου 80 (φάση της αναζωπύρωσης) 249. Η ικανότητα του ιικού DNA να ενσωματώνεται στο DNA των χρωματοσωμάτων φαίνεται ότι σχετίζεται με την ηπατοκαρκινογένεση, καθώς πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι οι θέσεις ενσωμάτωσης δεν είναι τυχαίες 159a. Αυτές συχνά αφορούν γονίδια κυτταρικής αύξησης και πολλαπλασιασμού, όπως το γονίδιο της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης 175a. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι στην καρκινογένεση συμβάλλει και η πρωτεϊνη HBxAg 232a. Συγκεκριμένα, απενεργοποιεί το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 και το γονίδιο p55sen, τα οποία συμβάλλουν στην κυτταρική γήρανση. Επίσης, μπορεί να ελαττώσει την έκφραση των γονιδίων p21 και sui1, τα οποία αναστέλλουν την αύξηση των ηπατοκυττάρων 68a. 20

29 Σχήμα 2: Σχηματική παράσταση του κύκλου ζωής του HBV

30 3. HΠΑΤΙΤΙΔΑ Β Επιδημιολογικά δεδομένα H λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας Β αποτελεί ένα πολύ σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας. Υπολογίζεται ότι 2 δισεκατομμύρια άνθρωποι -το 1/3 σχεδόν του παγκόσμιου πληθυσμού- έχουν ορολογικούς δείκτες ενδεικτικούς παρελθούσας ή τρέχουσας λοίμωξης από τον ΗΒV, ενώ περισσότεροι από 360 εκατομμύρια άνθρωποι παγκοσμίως είναι μολυσμένοι από τον HΒV (χρόνιοι φορείς) 116. Σύμφωνα με την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας, το 2000 καταγράφηκαν 5,2 εκατομμύρια περιπτώσεις οξείας ηπατίτιδας Β. H λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας Β μεταπίπτει σε χρονιότητα σε ποσοστό περίπου 5% 122. Οι πάσχοντες από χρόνια ηπατίτιδα Β παρουσιάζουν σημαντικό κίνδυνο ανάπτυξης κίρρωσης, ηπατικής ανεπάρκειας και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος 34. (Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα βρίσκεται στην 6η θέση των κακοήθων νεοπλασμάτων παγκοσμίως 174 και 70% περίπου των περιπτώσεων σχετίζονται με τον ιό της ηπατίτιδας Β) 66,49. Σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β ο κίνδυνος ανάπτυξης ΗΚΚ είναι περίπου 100 φορές υψηλότερος από τον υπόλοιπο πληθυσμό 7. Άλλωστε, η παγκόσμια γεωγραφική κατανομή του ΗΚΚ είναι παρόμοια με αυτή της ηπατίτιδας Β 63. Η ενδημικότητα του ιού της ηπατίτιδας Β ποικίλλει ευρέως στις διάφορες γεωγραφικές περιοχές 147 και καθορίζεται κυρίως από την ηλικία κατά τη λοίμωξη 106. Υψηλή ενδημικότητα παρατηρείται στις περιοχές εκείνες στις οποίες ο επιπολασμός του HΒsAg είναι υψηλός, δηλαδή μεγαλύτερος του 8% (Κίνα, ΝΑ Ασία 5, Μέση Ανατολή, Ανατολική Ευρώπη, Κεντρική Αφρική 3,61, περιοχές του Αμαζονίου και Αλάσκα 150 ). Στις περιοχές αυτές οι περισσότερες νέες λοιμώξεις συμβαίνουν περιγεννητικά ή κατά την πρώτη παιδική ηλικία 86. Ορολογικοί δείκτες 22

31 παρελθούσας ή τρέχουσας λοίμωξης ανευρίσκονται σε ποσοστό 70-90% του πληθυσμού 152. Μέσης ενδημικότητας είναι οι περιοχές όπου ο επιπολασμός του HΒsAg κυμαίνεται από 2-7% (Ιαπωνία, ΝΑ. Ευρώπη, Κεντρική και Νότια Αμερική). Οι νέες λοιμώξεις συμβαίνουν σε όλες τις ηλικιακές ομάδες. Ορολογικοί δείκτες παρελθούσας ή τρέχουσας λοίμωξης ανευρίσκονται σε ποσοστό 10-60% του πληθυσμού. Χαμηλή ενδημικότητα παρατηρείται στις περιοχές εκείνες όπου ο επιπολασμός του HΒsAg είναι μικρότερος του 2% (Β. Αμερική, Δ. Ευρώπη και Αυστραλία 224 ). Οι περισσότερες νέες λοιμώξεις συμβαίνουν σε ενήλικες και σε άτομα τα οποία έρχονται σε επαφή με το αίμα ή τα παράγωγα αίματος άλλων ατόμων. Τέτοιες ομάδες υψηλού κινδύνου είναι οι εργαζόμενοι στο χώρο της υγείας 20, οι χρήστες ενδοφλεβίων ουσιών 147 και άτομα με ανεξέλεγκτη σεξουαλική συμπεριφορά. Η μετάδοση του ιού μπορεί να γίνει με ελάχιστη ποσότητα αίματος 108. Ορολογικοί δείκτες παρελθούσας ή τρέχουσας λοίμωξης ανευρίσκονται σε ποσοστό 5-7% του πληθυσμού. Τα γεγονότα τα οποία σημάδεψαν την επιδημιολογία της ηπατίτιδας Β τα τελευταία 20 χρόνια είναι η ανακάλυψη του εμβολίου, ο συστηματικός έλεγχος των εγκύων γυναικών 29 και ο συστηματικός εμβολιασμός των παιδιών, η εισαγωγή της PCR για τον προσδιορισμό του DNA του ιού και η προσθήκη νέων φαρμάκων (λαμιβουδίνη αρχικά και αδεφοβίρη και πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη αργότερα 178 ). Έτσι τα τελευταία χρόνια έχει αλλάξει η επιδημιολογία της νόσου 56. Στις περιοχές χαμηλής ενδημικότητας, όπως είναι οι ΗΠΑ, όπου εφαρμόζεται εδώ και μία δεκαπενταετία συστηματικός εμβολιασμός νεογνών και εφήβων, ο επιπολασμός της νόσου ελαττώθηκε στις ηλικίες κάτω των 12 ετών. Σήμερα στις ΗΠΑ η οροθετικότητα στο ΗΒsΑg είναι 0.35% 147, ενώ σε πληθυσμούς μεταναστών, όπως είναι οι Ασιάτες αμερικανοί πρώτης γενεάς, το ποσοστό είναι σαφώς υψηλότερο 43. Σε κάποιες χώρες ή περιοχές της Ευρώπης έχει επίσης ελαττωθεί περαιτέρω ο επιπολασμός της νόσου 49 (π.χ. Βέλγιο 23

32 0,7%, Καταλωνία 0,7% 194 ), γεγονός που αποδίδεται στον εμβολιασμό αλλά και στην αλλαγή συμπεριφοράς του πληθυσμού υψηλού κινδύνου, λόγω καλύτερης ενημέρωσης και λόγω του φόβου μετάδοσης άλλων σοβαρών νοσημάτων, όπως το ΑΙDS. Ο νεογνικός και παιδικός εμβολιασμός είχε εντυπωσιακά αποτελέσματα στις χώρες με υψηλή ενδημικότητα του ιού. Σύμφωνα με μελέτες στην Ταϊβάν η οροθετικότητα σε παιδιά κάτω των 10 ετών μειώθηκε από 10% σε 1,1% μετά το ,216. Παρατηρήθηκε επίσης ανάλογη μείωση της επίπτωσης του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος σε παιδιά που γεννήθηκαν μετά την έναρξη των προγραμμάτων εμβολιασμού 28,217. Παρόμοιες μελέτες και σε άλλες χώρες και περιοχές υψηλής ενδημικότητας έδειξαν ανάλογη μείωση της οροθετικότητας (στην Ινδονησία η οροθετικότητα έπεσε από 6,2 σε 1,9% 193, στη Γκάμπια από 12% στο 3% 70,71, στην Αλάσκα από 16% στο 0% 150 ). Αποτέλεσμα του εμβολιασμού ήταν οι αλλαγές στον παγκόσμιο χάρτη της ΗΒV λοίμωξης τα τελευταία χρόνια. Αρκετές χώρες της Α. και ΝΑ. Ασίας που ανήκαν στις περιοχές υψηλής ενδημικότητας 163 (Ταϊβάν 30, Κορέα 105,111, Ταϊλάνδη, Φιλιππίνες 154,218 ) μετακινήθηκαν στη ζώνη ενδιάμεσης ενδημικότητας, ενώ άλλες χώρες (Ιαπωνία, Σιγκαπούρη) μετακινήθηκαν στη ζώνη χαμηλής ενδημικότητας. Η Ελλάδα συγκαταλέγεται στις περιοχές ενδιάμεσης ενδημικότητας, σε αυτές δηλαδή με επιπολασμό ΗΒsΑg 2-7% και θετικούς ορολογικούς δείκτες παρελθούσας ή παρούσας λοίμωξης σε ποσοστό 10-60% του πληθυσμού 117. Πριν 20 έτη ο κύριος τρόπος μετάδοσης του ΗΒV στη χώρα μας ήταν η κάθετη και η ενδοοικογενειακή μετάδοση, με κύρια αίτια τις χαμηλού επιπέδου κοινωνικοοικονομικές συνθήκες και τη χρήση βελονών πολλαπλών χρήσεων 251,117. Τα τελευταία χρόνια όμως έχει μειωθεί ο επιπολασμός του ΗΒsΑg, ιδιαίτερα στις μικρές ηλικίες 186,81. Οι λόγοι αυτής της μείωσης είναι η καλύτερη ενημέρωση του πληθυσμού με συνέπεια την 24

33 αλλαγή επικίνδυνων συμπεριφορών, τα αυστηρότερα μέτρα για τον περιορισμό της ιατρογενούς διασποράς, ο έλεγχος των εγκύων και φυσικά η ευρεία εφαρμογή του εμβολιασμού 79,173. Σε μελέτες του αιμοδοτικού πληθυσμού της Αθήνας και άλλων περιοχών της χώρας παρατηρείται σαφής πτωτική τάση της οροθετικότητας του ΗΒsΑg 117. Παρόλα αυτά υπάρχουν γεωγραφικές εστίες με μεγάλη ενδημικότητα, καθώς επίσης και ομάδες πληθυσμού (οικονομικοί μετανάστες κυρίως) με ποικίλλοντα ποσοστά υψηλού επιπολασμού του HBsAg (2.5-12%) 172. Οι επιδημιολογικές μελέτες σε αυτές τις ομάδες δεν είναι πολλές ούτε μεγάλες, είναι όμως ενδεικτικές του μεγέθους του προβλήματος και της ανάγκης λήψης ειδικών μέτρων 117. Σε ανάλογες μελέτες στην Ιταλία 169,170 ο επιπολασμός της νόσου είναι πολύ μεγαλύτερος στους πληθυσμούς των οικονομικών μεταναστών. Ο ιός της ηπατίτιδας Β μεταδίδεται με μολυσμένα υγρά του σώματος. Το αίμα αποτελεί την πιο σημαντική οδό μετάδοσης αλλά και άλλα υγρά του σώματος έχουν ενοχοποιηθεί, όπως το σπέρμα και ο σίελος. Ο όρος ηπατίτιδα εξ' «ομολόγου ορού» είναι σήμερα ξεπερασμένος. Τρεις τρόποι μετάδοσης έχουν αναγνωρισθεί, η περιγεννητική 57 (διαπλακουντιακά 246, κατά τη διάρκεια του τοκετού και κατά τη διάρκεια του θηλασμού) 35, η σεξουαλική και η παρεντερική. Κλινικά ευρήματα οξείας και χρόνιας ηπατίτιδας Β Τα συμπτώματα της οξείας ηπατίτιδας B εμφανίζονται μετά από χρόνο επώασης που κυμαίνεται από 30 έως 180 ημέρες. Τα πρόδρομα συμπτώματα της οξείας ηπατίτιδας B είναι συστηματικά και ποικίλα 26. Γενικά συμπτώματα γριππώδους συνδρομής, όπως ανορεξία, ναυτία και έμετος, αλλαγές στην όσφρηση και τη γεύση, κακουχία, αρθραλγίες, μυαλγίες, κεφαλαλγία, φωτοφοβία, φαρυγγίτιδα, βήχας και ρινόρροια, 25

34 μπορεί να προηγούνται του ικτέρου κατά 1 έως 2 εβδομάδες 53. Σπάνια, τα γενικά συμπτώματα μπορεί να συνοδεύονται από χαμηλό ή υψηλό πυρετό. Υπέρχρωση ούρων και αποχρωματισμός κοπράνων μπορεί να παρατηρηθούν από τον ασθενή λίγες ημέρες πριν την εγκατάσταση του ικτέρου. Με την εγκατάσταση του κλινικού ικτέρου, τα γενικά συμπτώματα συνήθως υποχωρούν σταδιακά, αλλά σε μερικούς ασθενείς είναι συχνή μια ήπια απώλεια βάρους. Το ήπαρ διογκώνεται και γίνεται ευαίσθητο και μπορεί να συνυπάρχει άλγος στο δεξιό άνω τεταρτημόριο. Σπάνια, οι ασθενείς εμφανίζονται με εικόνα χολόστασης, που μιμείται εξωηπατική χολική απόφραξη 256. Μεγαλοσπληνία και τραχηλική λεμφαδενοπάθεια παρατηρούνται στο 10 έως 20% των ασθενών με οξεία ηπατίτιδα Β 250. Σπάνια, εμφανίζονται αραχνοειδή αγγειώματα κατά την ικτερική φάση, τα οποία εξαφανίζονται κατά την ανάρρωση. Έχει επίσης περιγραφεί εκδήλωση ήπιας οξείας παγκρεατίτιδας 101. Κατά τη διάρκεια της φάσης ανάρρωσης, εξαφανίζονται τα γενικά συμπτώματα, αλλά συνήθως παραμένει η ηπατική διόγκωση. Η διάρκεια της μετα-ικτερικής φάσης ποικίλλει, κυμαινόμενη από 2 έως 12 εβδομάδες. Η πλήρης ανάνηψη αναμένεται 3 με 4 μήνες μετά την έναρξη του ικτέρου 142. Ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών με ιογενή ηπατίτιδα Β δεν εμφανίζουν ίκτερο 221. Όσο εντονότερη είναι η συμπτωματολογία του οξέος επεισοδίου τόσο λιγότερες είναι οι πιθανότητες ανάπτυξης χρονιότητας. Όταν υπάρχει οξεία ηπατίτιδα Β και ταυτόχρονη συλλοίμωξη από ΗDV 189, τα κλινικά χαρακτηριστικά μπορεί να μη διακρίνονται από αυτά της απλής ΗΒV λοίμωξης μόνης ή να είναι βαρύτερα 215,179. Η κλινική εικόνα της χρόνιας ηπατίτιδας B ποικίλλει. Μπορεί να εμφανίζεται από ασυμπτωματική λοίμωξη έως ηπατική ανεπάρκεια τελικού σταδίου 54. Η έναρξη της νόσου συνήθως είναι ύπουλη. Η κόπωση αποτελεί 26

35 σύνηθες σύμπτωμα. Ίκτερος (επίμονος ή διαλείπων) μπορεί να εμφανίζεται σε βαρύτερες περιπτώσεις. Σε προχωρημένη ηπατική νόσο οι συνηθέστερες επιπλοκές της κίρρωσης περιλαμβάνουν ασκίτη, οίδημα, αιμορραγία κιρσών οισοφάγου, εγκεφαλοπάθεια και διαταραχές πήξης του αίματος 54. Η επιλοίμωξη με τον ιό ΗDV σε έναν ασθενή με χρόνια ηπατίτιδα Β οδηγεί συχνά σε κλινική επιδείνωση και εμφανίζεται συνήθως ως επεισόδιο που μοιάζει με οξεία ιογενή ηπατίτιδα 19,129. Άλλες περιπτώσεις στις οποίες ασθενείς με ηπατίτιδα Β εμφανίζουν επεισόδια που μοιάζουν με οξεία ηπατίτιδα μπορεί να συνοδεύουν την αυτόματη αναζωπύρωση, την αυτόματη ορομετατροπή από ΗΒeΑg σε αντι-ηβe ή την επανάκτηση ανοσολογικής επάρκειας σε ιατρογενώς ανοσοκατασταλμένους ασθενείς με χρόνια ΗΒV λοίμωξη, όταν διακόπτονται τα κυτταροτοξικά - ανοσοκατασταλτικά φάρμακα 135. Ορολογικοί δείκτες HBV λοίμωξης Η ανίχνευση στον ορό του αίματος των διαφόρων αντιγόνων του ιού της ηπατίτιδας Β και των αντισωμάτων τους (δηλ. του ΗΒsΑg, του ΗΒeΑg, του anti-ηβs, του anti-ηβc και του anti-ηβe), των «δεικτών ηπατίτιδας Β» όπως είναι γνωστοί, χρησιμεύουν για τη διάγνωση της νόσου και την παρακολούθηση της εξελίξεως της 94. ΗΒsAg (παλαιότερος όρος: αυστραλιανό αντιγόνο): Αποτελεί τον αντιγονικό επίτοπο της πρωτεΐνης επιφανείας και είναι ο πιο σημαντικός δείκτης που πιστοποιεί την ύπαρξη ΗΒV λοίμωξης. Ανιχνεύεται στον ορό ασθενών με οξεία αλλά και χρόνια λοίμωξη. Είναι ο πρώτος εμφανιζόμενος δείκτης της οξείας ΗΒV λοίμωξης. Εμφανίζεται στον ορό 27

36 λίγες εβδομάδες μετά την αρχική έκθεση του ασθενή (1-3 εβδομάδες πριν την εκδήλωση των κλινικών συμπτωμάτων). Μετά από την ανοσολογική απάντηση του ασθενή και εφόσον επέλθει κάθαρση του ιού, το ΗΒsAg εξαφανίζεται από τον ορό, συνήθως 3-4 μήνες μετά την αρχική έκθεση στον ΗΒV 15. Παραμονή του στον ορό πέραν των 6 μηνών σημαίνει χρόνια ΗΒV λοίμωξη 82. Οι συγκεντρώσεις του ΗΒsAg στον ορό δεν σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό του ιού και τη βαρύτητα της νόσου και δεν υποδηλώνουν εάν η λοίμωξη είναι οξεία ή χρόνια 254. ΗΒsAg στον ορό χωρίς την παρουσία άλλων ορολογικών δεικτών HBV λοίμωξης μπορεί να ανευρίσκεται σε πρώιμη φάση οξείας λοίμωξης (πριν από την έναρξη των συμπτωμάτων), σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς ή σε ασθενείς με μεταλλαγμένο ιό. Αnti-ΗBs: Αποτελεί αντίσωμα κατά του αντιγόνου επιφανείας (HBsAg). Η παρουσία του στον ορό υποδηλώνει την ανάπτυξη ανοσίας έναντι του ιού, είτε μετά από φυσική λοίμωξη, είτε μετά από χορήγηση εμβολίου. Στην οξεία αυτοπεριοριζόμενη ηπατίτιδα Β, το anti-ηβs εμφανίζεται στον ορό κατά την αποδρομή της λοίμωξης μετά την αρνητικοποίηση του ΗBsΑg, ενώ μερικές φορές υπάρχει μια χρονική περίοδος κατά την οποία δεν ανιχνεύεται ούτε το αντιγόνο ούτε το αντίσωμα («φάση παραθύρου»). Παρουσία του anti-ηbs στον ορό χωρίς την παρουσία άλλων ορολογικών δεικτών HBV λοίμωξης μπορεί να σημαίνει προηγηθέντα εμβολιασμό, παλαιά λοίμωξη με πολύ χαμηλούς τίτλους (μη ανιχνεύσιμους) anti-hbc και anti-ηbe, ή ψευδώς θετικό αποτέλεσμα. HBeAg: Αποτελεί μη δομική πρωτεΐνη του νουκλεοκαψιδίου του ιού. Το HBeAg ανιχνεύεται στον ορό ασθενών με οξεία αλλά και χρόνια λοίμωξη. Εμφανίζεται σχεδόν ταυτόχρονα με το HBsAg κατά τη διάρκεια της οξείας λοίμωξης. Σε ασθενείς με οξεία αυτοπεριοριζόμενη ηπατίτιδα Β τα επίπεδα 28

37 του HBeAg ελαττώνονται βαθμιαία και γίνονται μη ανιχνεύσιμα πριν από την κάθαρση του HBsAg 82. Παραμονή του HBeAg πέραν των 6 μηνών σημαίνει χρόνια ΗΒV λοίμωξη. Στη χρόνια HBV λοίμωξη τα επίπεδα του HBeAg είναι άμεσα συνδεδεμένα με υψηλού βαθμού ιαιμία, ενεργό πολλαπλασιασμό του ιού και αυξημένη μεταδοτικότητα. Εξαίρεση αποτελούν οι περιπτώσεις μεταλλάξεων του ιού στην προπυρηνική περιοχή στο νουκλεοτίδιο 1896 όπου δεν εκφράζεται το HBeAg. Σε αυτούς τους ασθενείς έχουμε ενεργό πολλαπλασιασμό του ιού με αρνητικό HBeAg 197. Anti-HΒe: Το anti-ηbe είναι ΙgG αντίσωμα έναντι του HBeΑg. Στην οξεία αυτοπεριοριζόμενη ηπατίτιδα Β ανιχνεύεται στον ορό σχετικά νωρίς. Συνήθως υποδηλώνει μη ενεργότητα, μειωμένη μολυσματικότητα και καλή έκβαση (όταν βέβαια πρόκειται για το μη μεταλλαγμένο φυσικό στέλεχος του ιού) 22. Σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β τα anti-ηbe αντισώματα εμφανίζονται στη φάση της κάθαρσης στο στάδιο της ορομετατροπής του HBeΑg 210. HBcAg: Αποτελεί το αντιγόνο της core πρωτεΐνης του πυρήνα του ιού. Δεν ανιχνεύεται στον ορό κατά τη διάγνωση της οξείας ή της χρόνιας λοίμωξης, λόγω του ότι περικλείεται σε περίβλημα από ΗΒsAg. Ανιχνεύεται μόνο στο ηπατικό παρέγχυμα με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους. Η ανεύρεσή του στο ηπατικό παρέγχυμα αποτελεί δείκτη ενεργού πολλαπλασιασμού του ιού. ΑntiHBc: Τα αντισώματα έναντι του HBcAg μπορεί να είναι IgG ή/και IgM. Στην οξεία HBV λοίμωξη υψηλοί τίτλοι IgM anti-ηβc εμφανίζονται σχεδόν ταυτόχρονα με το ΗBsΑg κατά την έναρξη της συμπτωματολογίας 29

38 και βαθμιαία υποχωρούν δίνοντας τη θέση τους σε IgG anti-ηβc τα οποία διατηρούνται εφ`όρου ζωής. Σε ασθενείς με χρόνια λοίμωξη, τα επίπεδα των ΙgΜ anti-ηβc παραμένουν ανιχνεύσιμα παρουσιάζοντας διακυμάνσεις, πιθανότατα ανάλογα με τον πολλαπλασιασμό του ιού και την ενεργότητα της νόσου. Ανίχνευση μόνο του anti-ηβc χωρίς παρουσία άλλου ορολογικού δείκτη HBV λοίμωξης μπορεί να οφείλεται σε οξεία ΗΒV λοίμωξη που βρίσκεται σε «φάση παραθύρου» 62, σε αποδραμούσα λοίμωξη στην οποία τα επίπεδα του anti-ηβs είναι μη ανιχνεύσιμα, ή σε χρόνια λοίμωξη όπου το HBsAg είναι μη ανιχνεύσιμο 9. HBV DNA: Η παρουσία του ΗΒV DΝΑ στον ορό των ασθενών αποτελεί τον πλέον αξιόπιστο δείκτη ενεργού πολλαπλασιασμού του ιού, συνεπώς και δείκτη μολυσματικότητας 143. Στην οξεία ΗΒV λοίμωξη το ΗΒV DΝΑ συνήθως ανιχνεύεται εντός ολίγων ημερών μετά από την έναρξη της λοίμωξης και εξαφανίζεται με την αποδρομή της 84. Στη χρόνια ΗΒV λοίμωξη τα επίπεδα του ΗΒV DΝΑ δεν είναι σταθερά και εξαρτώνται από την φάση της λοίμωξης 114. Στη φάση ανοσολογικής ανοχής μετά από οξεία λοίμωξη ανιχνεύονται υψηλά επίπεδα ΗΒV DΝΑ. Στη φάση της κάθαρσης ανιχνεύονται χαμηλότερα επίπεδα ΗΒV DΝΑ. Στη φάση ενσωμάτωσης, τα επίπεδα του ΗΒV DΝΑ είναι πολύ χαμηλά ή και μη ανιχνεύσιμα και τέλος στη φάση αναζωπύρωσης έχουμε πάλι υψηλά επίπεδα ΗΒV DΝΑ στον ορό. Τα επίπεδα του ΗΒV DΝΑ στον ορό ασθενών με χρόνια λοίμωξη αποτελούν σημαντικό παράγοντα που προδικάζει την εξέλιξη της νόσου και την πιθανή ανταπόκριση στη θεραπευτική αγωγή. Τα επίπεδα του ΗΒV DΝΑ δεν φαίνεται πάντα να σχετίζονται με την βαρύτητα της ιστολογικής εικόνας, παρά μόνο κατά τις φάσεις της αναζωπύρωσης

39 Οι πρώτοι ορολογικοί δείκτες που εμφανίζονται στην οξεία HBV λοίμωξη είναι το ΗΒsΑg, το ΗBeΑg και το ΗΒV DΝΑ (Σχήμα 3). Ακολουθεί η εμφάνιση του ΙgΜ anti-ηβc και κατόπιν η εμφάνιση των ΙgG αντισωμάτων anti-ηβc, anti -ΗΒe και anti ΗΒs κατά σειρά. Μετά την ίαση στην οξεία αυτοπεριοριζόμενη ηπατίτιδα Β οι τίτλοι των ανωτέρω αντισωμάτων σταδιακά μειώνονται. Το anti-ηβe και το ΗΒV DΝΑ συνήθως δεν προσδιορίζονται σε άτομα με παρελθούσα Β λοίμωξη, ενώ και τα επίπεδα του anti-ηβs μπορεί να μην είναι ανιχνεύσιμα, αλλά αυξάνονται σε κάθε νέα έκθεση στον ιό. Στη χρόνια HBV λοίμωξη στη φάση της ανοχής δεν υπάρχουν συμπτώματα, οι τρανσαμινάσες είναι σχεδόν φυσιολογικές, τα ΗΒsΑg, ΗBeΑg είναι θετικά, τα ΙgΜ anti-hbc σχετικά χαμηλά και το ΗΒV DΝΑ στον ορό βρίσκεται σε υψηλά επίπεδα (Σχήμα 4). Στη φάση της κάθαρσης οι τρανσαμινάσες είναι αυξημένες, τα ΙgΜ anti-hbc σε υψηλούς τίτλους, το ΗΒV DΝΑ στον ορό σχετικά μειωμένο και παρατηρείται σταδιακή ορομετατροπή του ΗBeΑg σε anti-ηβe. Στη φάση της ενσωμάτωσης οι τρανσαμινάσες είναι φυσιολογικές, τα ΙgΜ anti-hbc μόλις ανιχνεύονται, το ΗBeΑg είναι αρνητικό και το ΗΒV DΝΑ στον ορό δεν ανιχνεύεται παρά μόνο με ΡCR σε ορισμένους ασθενείς. Η φάση αυτή αντιστοιχεί στην περίοδο του «ανενεργού φορέα» 48. Η περίοδος αυτή μπορεί να διαρκέσει εφ'όρου ζωής, αλλά μερικοί ασθενείς μπορεί να εμφανίσουν αυτομάτως ή μετά από ανοσοκαταστολή επαναδραστηριοποίηση της λοίμωξης με αύξηση των τρανσαμινασών και θετικοποίηση του ΗBeΑg 68. Εξαιρούνται βέβαια οι ασθενείς με μετάλλαξη του γονιδιώματος του ιού στην προπυρηνική περιοχή, οι οποίοι εμφανίζουν αρνητικό ΗBeΑg με παρουσία anti-ηβe αντισωμάτων. 31

40 Εβδομάδες Σχήμα 3: Οξεία HBV λοίμωξη Ορολογικοί δείκτες Μήνες Σχήμα 4: Χρόνια HBV λοίμωξη Ορολογικοί δείκτες 32

41 Εργαστηριακή προσέγγιση ασθενών με θετικό HBsAg Η παραμονή του HBsAg στον ορό για τουλάχιστον 6 μήνες σημαίνει χρόνια HBV λοίμωξη 41a. Η ενεργότητα ή μη της λοίμωξης εξαρτάται από τον πολλαπλασιασμό του ιού. Σε κάθε άτομο με θετικό HbsAg, μετά την κλινική εκτίμηση θα πρέπει να γίνεται βιοχημικός έλεγχος του ήπατος, έλεγχος των ορολογικών δεικτών της HBV λοίμωξης και ορισμένες φορές βιοψία ήπατος 25. Η περαιτέρω πορεία εξαρτάται κυρίως από τις τιμές των τρανσαμινασών. Όταν οι τρανσαμινάσες είναι φυσιολογικές και οι δείκτες ενεργού πολλαπλασιασμού (HBeAg, HBV DNA, IgM anti-hbc) αρνητικοί, πρόκειται για «ανενεργούς φορείς». Τα άτομα αυτά απλώς χρήζουν ελέγχου σε τακτά χρονικά διαστήματα επειδή υπάρχει πιθανότητα μελλοντικής ενεργοποίησης του ιού ή ανάπτυξης ηπατοκυτταρικού καρκινώματος 47. Αντίθετα, όταν οι τρανσαμινάσες είναι παθολογικές οι ασθενείς πρέπει να υποβληθούν σε περαιτέρω έλεγχο, προκειμένου να διερευνηθεί εάν η αύξηση των τρανσαμινασών οφείλεται σε αναζωπύρωση του HBV ή σε άλλα αίτια 151. Στην πρώτη περίπτωση, ο πολλαπλασιασμός του ιού διαπιστώνεται με τους γνωστούς δείκτες (HBeAg, HBV DNA, IgM anti- HBc) 191. Η βιοψία ήπατος θα τεκμηριώσει τη διάγνωση, θα αποκλείσει άλλες αιτίες και θα καταδείξει τον βαθμό της ηπατοκυτταρικής βλάβης και το στάδιο της νόσου. Στη δεύτερη περίπτωση (παθολογικές τρανσαμινάσες χωρίς πολλαπλασιασμό του ιού) ο έλεγχος στρέφεται προς άλλα αίτια ηπατοκυτταρικής βλάβης που μπορεί να σχετίζονται ή όχι με την υπάρχουσα HBV λοίμωξη και πιο συγκεκριμένα λοίμωξη με άλλους ηπατοτρόπους ιούς (HDV ή HCV), ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, κατάχρηση αλκοόλ, λήψη φαρμάκων ή άλλα παθολογικά αίτια (αυτοάνοσα νοσήματα, αγγειακές βλάβες κ.α.)

42 Παθογένεια της ηπατίτιδας Β Ο ιός της ηπατίτιδας Β είναι ηπατοτρόπος, αλλά δεν είναι άμεσα κυτταροτοξικός για τα ηπατοκύτταρα. Η ποικιλία των κλινικών εκδηλώσεων και ιστολογικών εικόνων, καθώς και η έκβαση της λοίμωξης από τον HBV εξαρτώνται από την ανοσολογική απάντηση του ξενιστή. Η ανοσολογική απάντηση επηρεάζεται από τον πολλαπλασιασμό του ιού 155. Η σπάνια περίπτωση κατά την οποία ο ιός είναι απευθείας κυτταροτοξικός για τα ηπατοκύτταρα είναι το σύνδρομο ινώδους χολοστατικής ηπατίτιδας το οποίο απαντάται σε ασθενείς με μεταμόσχευση ήπατος και υποτροπή HBV λοίμωξης 229. Κατά την οξεία φάση της λοίμωξης η ανοσολογική απάντηση είναι έντονη, πολυκλωνική 34 και ειδική καταλήγοντας σε οξεία αυτοπεριοριζόμενη ηπατίτιδα 35. Οι αντι-ιικές κυτοκίνες όπως οι ιντερφερόνες α, β και γ, καθώς και ο παράγων νέκρωσης όγκου α (TNF-α) 85 έχουν τη μεγαλύτερη συμμετοχή στη διαδικασία της κάθαρσης του ιού 72, ενώ η καταστροφή των προσβεβλημένων ηπατοκυττάρων από εξειδικευμένα CD8+Tκυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα παραδόξως συνεισφέρει τόσο στην κάθαρση του ιού, όσο και στην ανάπτυξη ηπατικής βλάβης 10,35. Στην οξεία αυτοπεριοριζόμενη ηπατίτιδα, το τελικό αποτέλεσμα είναι η λύση της φλεγμονής λόγω του ότι ο αριθμός των κυττάρων που καθαίρονται από τον ιό είναι μεγαλύτερος από τον αριθμό των κυττάρων που καταστρέφονται. Σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β η παρουσία των CD8+Tλεμφοκυττάρων είναι μηδαμινή και η ανοσολογική απάντηση του ξενιστή περιλαμβάνει κυρίως CD4+T- λεμφοκύτταρα. Η ανοσολογική απάντηση στους ασθενείς αυτούς είναι μη ειδική και δεν μπορεί να ελέγξει τον πολλαπλασιασμό του ιού, αλλά συνεχίζει να καταστρέφει ηπατοκύτταρα με αποτέλεσμα την ανάπτυξη προϊούσας ηπατικής βλάβης 187. Με την 34

43 πάροδο του χρόνου σε ορισμένους ασθενείς τα επίπεδα του ιού πέφτουν πολύ χαμηλά με αποτέλεσμα να παύει το ερέθισμα για πρόκληση περαιτέρω ηπατικής βλάβης 188. Η έκβαση της ηπατίτιδας Β επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες 119, όπως η ηλικία του ξενιστή κατά την μόλυνση με τον ιό 96, οι μεταλλάξεις του ιού, τα επίπεδα του ιού στο αίμα, το φύλο, η ανοσολογική κατάσταση του ξενιστή, η χρήση αλκοόλ και η συλλοίμωξη με άλλους ηπατοτρόπους ιούς 29. Οξεία ηπατίτιδα Β: Παθολογοανατομικά ευρήματα Η ιστολογική εικόνα της οξείας ηπατίτιδας Β είναι ίδια με την ιστολογική εικόνα των οξειών ηπατιτίδων από τους άλλους ηπατοτρόπους ιούς. Χαρακτηρίζεται μορφολογικά από συνδυασμό φλεγμονώδους κυτταρικής διήθησης με παρουσία μακροφάγων, βλάβη ηπατοκυττάρων και αναγέννηση. Η ποιοτική και ποσοτική παρουσία των ως άνω στοιχείων ποικίλλει ανάλογα με την αντίδραση του ξενιστή και τον παράγοντα χρόνο. Τα ιστοπαθολογικά ευρήματα διαφέρουν σημαντικά από αυτά που απαντώνται σε μία κλασσική οξεία φλεγμονή, επειδή αντιπροσωπεύουν κυρίως μία ανοσολογική απάντηση του ξενιστή σε αντιγόνα του ιού που ανευρίσκονται στα ηπατοκύτταρα, παρά μια αγγειακή και κυτταρική απάντηση σε ιστική βλάβη 69. Παρόλα αυτά κάποια χαρακτηριστικά γνωρίσματα οξείας φλεγμονής απαντώνται σε περιορισμένη έκταση: το ήπαρ είναι διογκωμένο και ευαίσθητο και τα αιμοφόρα αγγεία διατεταμένα. Επιπροσθέτως μπορεί να έχουμε παρουσία πολυμορφοπυρήνων λευκοκυττάρων ως δευτερογενή απάντηση στη βλάβη των ηπατοκυττάρων, καθώς και υπερπλασία μικρών χοληφόρων πόρων. 35

44 Μακροσκοπικά, στα αρχικά στάδια το ήπαρ είναι οιδηματώδες και εξέρυθρο. Σε ασθενείς με σοβαρού βαθμού χολόσταση, η χροιά του ήπατος είναι κίτρινη ή πράσινη. Σε κεραυνοβόλο ηπατίτιδα το ήπαρ συρρικνούται, γίνεται μαλακό και η κάψα του ρυτιδώνεται. Εάν ο ασθενής επιζήσει για εβδομάδες ή μήνες μπορεί να παρατηρηθούν αναγεννητικά οζία υποκαψικά ή και εντός του παρεγχύματος. Σε παρακείμενες θέσεις παρατηρούνται αιμορραγικές ή νεκρωτικές εστίες. Σε άλλες περιπτώσεις η νέκρωση είναι διάχυτη σε όλο το ηπατικό παρέγχυμα 69. Σε κεραυνοβόλο ηπατίτιδα συχνά συνυπάρχουν αλλοιώσεις και σε άλλα όργανα εκτός του ήπατος. Τα ευρήματα περιλαμβάνουν πνευμονία, σηψαιμία, εγκεφαλικό οίδημα, αιμορραγίες στο Γ.Ε.Σ. και παγκρεατίτιδα. Οι αλλοιώσεις αυτές εξηγούν τις περιπτώσεις ασθενών που καταλήγουν παρόλο που οι ηπατοκυτταρικές αλλοιώσεις είναι περιορισμένες ή παρόλο που υπάρχουν ήδη αρκετές αναγεννητικές εστίες. Είδη (τύποι) ηπατικής νέκρωσης που παρατηρούνται στην οξεία ηπατίτιδα Β 13 : Εστιακή ενδολόβια νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα: Μεμονωμένα ηπατοκύτταρα εκφυλίζονται και αποθνήσκουν (με λυτική νέκρωση ή απόπτωση). Στις εστίες απώλειας ηπατοκυττάρων παρατηρούνται αθροίσεις κυττάρων φλεγμονής που αποτελούνται κυρίως από μικρά λεμφοκύτταρα και ιστιοκύτταρα. Τα κυτταρικά υπολείμματα απομακρύνονται με την κυκλοφορία του αίματος ή με τον μηχανισμό της φαγοκυττάρωσης. Συρρέουσα και γεφυροποιός νέκρωση: Το είδος αυτό της νέκρωσης δημιουργείται όταν συρρέουν ομάδες παρακείμενων νεκρών ηπατοκυττάρων. Συνήθως συρρέουσα νέκρωση παρατηρείται σε κεντρολοβιακή θέση γύρω από την κεντρική φλέβα (τελικό ηπατικό φλεβίδιο). Η συρρέουσα νέκρωση που συνδέει παρακείμενα αγγεία μεταξύ τους ονομάζεται 36

45 γεφυροποιός νέκρωση. Ο ένας τύπος της γεφυροποιού νεκρώσεως είναι ο «κεντρικο-κεντρικός», στον οποίο η νέκρωση συνδέει κεντρικές φλέβες μεταξύ τους, χωρίς να επεκτείνεται σε πυλαία διαστήματα. Ο άλλος τύπος γεφυροποιού νεκρώσεως είναι ο «κεντρικο-πυλαίος» στον οποίο η νέκρωση συνδέει κεντρικές φλέβες με πυλαία διαστήματα. Ο τύπος αυτός αφορά αρχικά τη ζώνη 3 του ηπατικού βοτρυδίου και αργότερα μπορεί να επεκταθεί στη ζώνη 2 και στη ζώνη 1, με αποτέλεσμα την καταστροφή ολόκληρου του βοτρυδίου (πανβοτρυδική ή πανλοβιακή νέκρωση). Τα τελευταία χρόνια έχει επικρατήσει η χρησιμοποίηση του όρου «γεφυροποιός νέκρωση» για τον κεντρικο-πυλαίο τύπο και όχι για τον κεντρικο-κεντρικό 69. Διαβρωτική νέκρωση (piecemeal necrosis) ή ηπατίτιδα της αφοριστικής πλάκας (interface hepatitis) ή περιπυλαία νέκρωση: Η νέκρωση αυτή αφορά σε απώλεια ηπατοκυττάρων στο σημείο επαφής (την αφοριστική πλάκα) μεταξύ του παρεγχύματος και του συνδετικού ιστού των πυλαίων διαστημάτων και συνοδεύεται από ποικίλου βαθμού φλεγμονή και ίνωση. Η απώλεια των ηπατοκυττάρων οφείλεται περισσότερο σε απόπτωση παρά σε νέκρωση 175. Συνεπώς καταλληλότερος όρος είναι «ηπατίτιδα της αφοριστικής πλάκας» και όχι «διαβρωτική νέκρωση». Ο τύπος αυτός συνήθως αφορά την ζώνη 1 και οδηγεί σε διεύρυνση των πυλαίων διαστημάτων. «Κλασσική» οξεία ηπατίτιδα Οι αλλοιώσεις περιλαμβάνουν εκφύλιση και θάνατο ηπατοκυττάρων, αναγεννητική εξεργασία, χολόσταση, φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις και υπερπλασία κολποειδικών κυττάρων. Η νέκρωση μπορεί να είναι εστιακή ή συρρέουσα. Οι ιστολογικές αλλοιώσεις (και κυρίως η συρρέουσα 37

46 νέκρωση) είναι περισσότερο σοβαρές γύρω από το τελικό ηπατικό φλεβίδιο του βοτρυδίου. Πιθανός λόγος είναι οι λειτουργικές και μορφολογικές διαφορές μεταξύ των ηπατοκυττάρων των τριών ζωνών του βοτρυδίου. (Η περιεκτικότητα του αίματος σε οξυγόνο και θρεπτικές ουσίες μειώνεται από τη ζώνη 1 προς τη ζώνη 3 με αποτέλεσμα την ελάττωση της αντίστασης των ηπατοκυττάρων σε βλαπτικούς παράγοντες) 102. Επίσης παρατηρούνται στοιχεία φλεγμονής στα πυλαία διαστήματα, καθώς και εκφυλιστικές αλλοιώσεις μικρών χοληφόρων πόρων. Μακροκενοτοπιώδης στεάτωση είναι σπάνιο εύρημα. Στα αρχικά στάδια της οξείας ηπατίτιδας τα κύτταρα Kupffer είναι ευδιάκριτα και παρουσιάζουν μιτωτική δραστηριότητα. Η ηπατοκυτταρική νέκρωση και απόπτωση επίσης είναι παρούσα από τα αρχικά στάδια. Τα ηπατοκύτταρα παρουσιάζουν οίδημα ως αποτέλεσμα της διάτασης του ενδοπλασματικού δικτύου. Λόγω της ιστολογικής εικόνας των οιδηματωδών κυττάρων χρησιμοποιείται ο όρος «αεροσφαιροειδής εκφύλιση» (ballooning degeneration). Η συγκεκριμένη ιστολογική εικόνα δεν είναι διαγνωστική για ηπατίτιδα, λόγω του ότι μπορεί να παρατηρηθεί και σε άλλες περιπτώσεις, όπως σε αλκοολική νόσο 255 και μετά από μεταμόσχευση ήπατος. Οι πυρήνες των κυττάρων είναι επίσης οιδηματώδεις εξαιτίας συσσώρευσης πρωτεϊνών. Τα πυρήνια μπορεί να είναι περισσότερο εμφανή. Επίσης μπορεί να παρατηρηθούν σποραδικές μιτώσεις και πολυπύρηνες μορφές. Σε αντίθεση με τα οιδηματώδη (αεροσφαιροειδή) κύτταρα ανευρίσκονται επίσης ηπατοκύτταρα με έντονα ηωσινόφιλο κυτταρόπλασμα και πυκνωτικούς πυρήνες, προφανώς λόγω ενεργοποίησης της διαδικασίας της απόπτωσης. Τα κύτταρα αυτά είναι λιγότερα από τα οιδηματώδη, αλλά συνήθως είναι μεγαλύτερα σε μέγεθος από τα φυσιολογικά ηπατοκύτταρα. 38

47 Οι δύο αυτοί τύποι κυττάρων (τα οιδηματώδη και τα ηωσινόφιλα) αντιπροσωπεύουν διαφορετικά στάδια κυτταρικής εκφύλισης και όχι διαφορετική αντίδραση στον βλαπτικό παράγοντα. Τα ηωσινόφιλα κύτταρα έχουν διάφορα σχήματα (στρογγυλά, ρομβοειδή, γωνιώδη) ως αποτέλεσμα της πίεσης από τα παρακείμενα οιδηματώδη κύτταρα. Ο σχηματισμός των οξύφιλων σωματίων (παλαιότερος όρος: Councilman bodies) είναι τελικό στάδιο αυτής της διαδικασίας. Τα οξύφιλα σωμάτια είναι κυτταρικά υπολείμματα σφαιροειδούς συνήθως σχήματος (χωρίς να αποκλείεται να βρεθούν μορφές με άλλα ανώμαλα σχήματα) τα οποία μπορεί να περιέχουν ή όχι πυρηνικά υπολείμματα. Τα κύτταρα που προσβάλλονται «θρυμματίζονται» και η διαδικασία αυτή αποτελεί παράδειγμα τελικού σταδίου απόπτωσης. Μερικά οξύφιλα σωμάτια ευρίσκονται σε επαφή με κύτταρα Kupffer ή λεμφοκύτταρα, ενώ άλλα βρίσκονται ελεύθερα στις ηπατικές δοκίδες ή στα κολπώδη τριχοειδή, χωρίς να έρχονται σε επαφή με άλλα κύτταρα. Τα οξύφιλα σωμάτια όπως και τα αεροσφαιροειδή κύτταρα είναι χαρακτηριστικά ιστολογικά γνωρίσματα της οξείας ηπατίτιδας, χωρίς όμως να είναι παθογνωμονικά. Η απώλεια ηπατοκυττάρων (και κυρίως στις περιπτώσεις όπου η νέκρωση είναι συρρέουσα) οδηγεί σε ελλείμματα στις ηπατικές δοκίδες με επακόλουθο την κατάρρευση και «σύμπτωση» του δικτύου των δικτυωτών ινών. Παρατηρείται επίσης μικρή αύξηση του συνδετικού ιστού (κολλαγόνο τύπoυ ΙΙΙ και τύπου V) τόσο στα πυλαία διαστήματα, όσο και σε περιοχές εστιακής νέκρωσης, καθώς και αύξηση του αριθμού των ινοβλαστών στα πυλαία διαστήματα. Στις αναγεννητικές αλλοιώσεις περιλαμβάνεται η αυξημένη μιτωτική δραστηριότητα (οι μιτώσεις είναι σπάνιες στα φυσιολογικά ηπατοκύτταρα), η παρουσία πολυπυρήνων κυτταρικών μορφών και η αλλαγή της δομής 39

48 των ηπατικών δοκίδων. Οι τελευταίες γίνονται παχύτερες ή σχηματίζουν ψευδοαδενοειδείς σηματισμούς (ροζέτες). Η χολόσταση είναι συχνή στην οξεία ηπατίτιδα. Βύσματα χολής ανευρίσκονται σε μικρούς χοληφόρους πόρους και μπορεί να προκαλούν διάταση του αυλού τους. Ενδοκυττάρια παρουσία χολής είναι δύσκολο να αναγνωρισθεί αλλά και να διαφοροδιαγνωσθεί από λιποφουσκίνη. Οι φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις στην οξεία ηπατίτιδα αποτελούνται κυρίως από λεμφοκύτταρα, πλασματοκύτταρα και μακροφάγα. Εντός του παρεγχύματος οι φλεγμονώδεις διηθήσεις είναι περισσότερες σε περιοχές καταστροφής ηπατοκυττάρων, συνήθως πέριξ φλεβιδίων. Μονοπύρηνα φαγοκύτταρα (είτε ενεργοποιημένα κύτταρα Kupffer, είτε άλλα φαγοκύτταρα της κυκλοφορίας) ανευρίσκονται με τη μορφή μεγάλων (υπερτροφικών), ακανονίστου σχήματος κυττάρων σε περιοχές ηπατοκυτταρικής καταστροφής. Συχνά περιέχουν καστανόφαιη χρωστική λόγω φαγοκυττάρωσης χολής. Μπορεί επίσης να περιέχουν αιμοσιδηρίνη. Άσχετα με το είδος της χρωστικής που περιέχουν, είναι έντονα θετικά σε PAS-διαστάση. Φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις με προεξάρχοντα τα Τ-λεμφοκύτταρα παρατηρούνται στα περισσότερα πυλαία διαστήματα. Μπορεί να ανευρεθούν επίσης πλασματοκύτταρα (περιέχοντα IgG) και μακροφάγα. Η φλεγμονώδης κυτταρική διήθηση στα πυλαία μπορεί να είναι διάχυτη ή εστιακή με σχηματισμό λεμφοζιδίων. Οι αλλοιώσεις που παρατηρούνται στους μικρούς χοληφόρους πόρους είναι συνήθως ήπιες και αφορούν αλλαγές στο σχήμα, το μέγεθος και τη διάταξη των πυρήνων των επιθηλιακών κυττάρων. Σπανιότερα παρατηρείται οίδημα των επιθηλιακών κυττάρων και διάταση του αυλού των χοληφόρων πόρων. Ως ειδικές μορφές κλασσικής οξείας ηπατίτιδας περιγράφονται η γιγαντοκυτταρική μορφή με παρουσία άφθονων γιγάντιων πολυπυρήνων 40

49 ηπατοκυττάρων 230 και η σπάνια χολοστατική μορφή με έντονη χολόσταση και ελάχιστη νέκρωση 50. Οξεία ηπατίτιδα με ελάχιστες αλλοιώσεις Παρατηρούνται οι αλλοιώσεις της κλασσικής οξείας ηπατίτιδας σε ήπιο βαθμό. Είναι δύσκολη η διάγνωσή της επειδή τα ιστολογικά ευρήματα είναι τα ίδια με αυτά που ανευρίσκονται στη μη ειδική αντιδραστική ηπατίτιδα που συνοδεύει συνήθως εξωηπατικές λοιμώξεις. Οξεία ηπατίτιδα με γεφυροποιό νέκρωση Παρατηρούνται οι αλλοιώσεις της κλασσικής οξείας ηπατίτιδας με εστιακή νέκρωση και επιπροσθέτως γεφυροποιός νέκρωση «κεντρικοπυλαίου» τύπου. Ο λόγος που τονίζεται η γεφυροποιός νέκρωση είναι ότι θεωρείται προδιαθεσικός παράγοντας για την ανάπτυξη κιρρώσεως. Η ιστολογική εικόνα των γεφυρών ποικίλλει ανάλογα με το στάδιο της νόσου. Στα αρχικά στάδια αρκετά ηπατοκύτταρα αποθνήσκουν και εξαφανίζονται αφήνοντας ένα λεπτό στρώμα συνδετικού ιστού που διηθείται από λεμφοκύτταρα και μακροφάγα. Με το πέρασμα του χρόνου ο συνδετικός ιστός συμπίπτει και δημιουργεί «παθητικά» διαφραγμάτια που διατρέχουν το ηπατικό παρέγχυμα. Η γεφυροποιός νέκρωση αναπτύσσεται συνήθως τις πρώτες εβδομάδες της νόσου, αλλά η απουσία της σε βιοψία δεν αποκλείει την πιθανότητα να εμφανισθεί αργότερα. Ο συνδυασμός νέκρωσης, δημιουργίας διαφραγματίων και ηπατοκυτταρικής αναγέννησης οδηγεί σε διαταραχή της αρχιτεκτονικής του ηπατικού παρεγχύματος, πράγμα που μπορεί να δώσει εσφαλμένα ιστολο- 41

50 γική εικόνα χρόνιας ηπατίτιδας ή κίρρωσης. Χρήσιμο διαφοροδιαγνωστικό στοιχείο (εκτός από τα υπόλοιπα ιστολογικά ευρήματα της οξείας ηπατίτιδας) είναι οι διαφορές των «παθητικών» διαφραγματίων της οξείας ηπατίτιδας από τα διαφραγμάτια της χρόνιας ηπατίτιδας και της κίρρωσης. Συγκεκριμένα τα παθητικά διαφραγμάτια δεν περιέχουν ελαστικές ίνες σε αντίθεση με τα διαφραγμάτια της χρόνιας ηπατίτιδας και της κίρρωσης, τα οποία περιέχουν τέτοιες ίνες (χρώση Verchoff Elastica) 198. Οξεία ηπατίτιδα με πανλοβιακή νέκρωση Είναι η πιο σοβαρή μορφή οξείας ηπατίτιδας. Παρατηρείται σχεδόν πλήρης καταστροφή των ηπατικών κυττάρων σε όλη την έκταση του λοβίου. Όταν η καταστροφή αφορά αρκετά παρακείμενα λόβια ονομάζεται πολυλοβιακή, ενώ όταν αφορά όλα τα λόβια (πανλοβιακή) ονομάζεται μαζική ηπατική νέκρωση 77 και αντιστοιχεί στην κλινική εικόνα της κεραυνοβόλου ηπατίτιδας που συνήθως οδηγεί σε οξεία ηπατική ανεπάρκεια και κώμα 97. Οι περιοχές της πολυλοβιακής καταστροφής έχουν ετερογενή κατανομή εντός του ήπατος, πράγμα το οποίο έχει επίπτωση στην αντιπροσωπευτικότητα των δειγμάτων βιοψιών διά βελόνης 88. Τα ιστολογικά ευρήματα περιλαμβάνουν εκτεταμένη απώλεια ηπατοκυττάρων, υπερπλασία μικρών χοληφόρων πόρων (χολαγγειολική αντίδραση), φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις, αιμορραγικές διηθήσεις, αγγειίτιδα κεντρικών φλεβών και σύμπτωση του δικτύου των δικτυωτών ινών. Οι αλλοιώσεις που παρατηρούνται στους μικρούς χοληφόρους πόρους είναι χαρακτηριστικές και αποτελούν μία προσπάθεια αναγέννησης από προγονικά ηπατικά κύτταρα. Έτσι συναντούμε τα «νεοχολαγγειόλια», στα οποία ανευρίσκονται «μεταβατικές» μορφές επιθηλιακών κυττάρων με ενδιάμεσους χαρακτήρες ηπατοκυττάρων και κυττάρων χοληφόρων 82a. 42

51 Οι φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις ποικίλλουν σε ένταση και αποτελούνται κυρίως από μακροφάγα που περιέχουν χολοχρωστικές. Στους ασθενείς που επιζούν παρατηρείται σύμπτωση και ουλοποίηση των νεκρωτικών ζωνών, καθώς και παρακείμενες αναγεννητικές περιοχές με οζώδη διαμόρφωση 252. Οξεία ηπατίτιδα με περιπυλαία νέκρωση Παρατηρούνται οι συνήθεις αλλοιώσεις της κλασσικής οξείας ηπατίτιδας και επιπροσθέτως σημαντικού βαθμού νέκρωση στις περιπυλαίες ζώνες που συνοδεύεται από έντονες περιπυλαίες φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις. Οι τελευταίες αποτελούνται από λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα. Παρατηρείται επίσης υπερπλασία μικρών χοληφόρων. Αποτέλεσμα της περιπυλαίας νέκρωσης είναι η διεύρυνση των πυλαίων διαστημάτων και η σύνδεση παρακειμένων πυλαίων διαστημάτων μεταξύ τους. Διαφορική διάγνωση οξείας ηπατίτιδας Β Η διάγνωση της οξείας ηπατίτιδας Β με βάση μόνο την ιστολογική εικόνα είναι πολύ δύσκολη ή αδύνατη 78. Η τελική διάγνωση γίνεται με συνδυασμό των κλινικών, ορολογικών και ιστολογικών ευρημάτων. Η οξεία ηπατίτιδα Β έχει, όπως προαναφέρθηκε, όμοια ιστολογικά ευρήματα με τις ηπατίτιδες που προκαλούνται από τους άλλους ηπατοτρόπους ιούς 10 ( ηπατίτιδα Α, ηπατίτιδα C, ηπατίτιδα δ, ηπατίτιδα Ε). Σε λίγες όμως περιπτώσεις και μάλιστα στα τελικά στάδια της οξείας ηπατίτιδας Β μπορεί να ανιχνευθούν με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους σε 43

52 μικρές ποσότητες το HBsAg ή το HBcAg. Τα αντιγόνα αυτά ανιχνεύονται χαρακτηριστικά στη χρόνια ηπατίτιδα Β. Όσον αφορά τις υπόλοιπες οξείες ιογενείς ηπατίτιδες, στη λοιμώδη μονοπυρήνωση (ιός Εpstein-Βarr) η ηπατοκυτταρική καταστροφή είναι κατά κανόνα ελάχιστη ή και απούσα και επιπλέον αναγνωρίζονται άτυπες μορφές λεμφοκυττάρων στα κολπώδη τριχοειδή και στα πυλαία διαστήματα, ενώ στις ηπατίτιδες από ιούς τύπου έρπητα (ιός του απλού έρπητα και μεγαλοκυτταροϊός) ανευρίσκονται τα χαρακτηριστικά έγκλειστα 223. Στις φαρμακευτικές ηπατίτιδες έχουμε συνήθως ήπιες φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις στα πυλαία διαστήματα, καθώς και παρουσία ουδετεροφίλων ή ηωσινοφίλων λευκοκυττάρων. Τα κοκκιώματα δεν είναι σπάνια. Συχνά παρατηρείται χολόσταση, ενώ σπάνια ανευρίσκεται καταστροφή χοληφόρων πόρων. Στην αλκοολική ηπατίτιδα κυριαρχούν περισσότερο τα πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα, σε σχέση με τα λεμφοκύτταρα και υπάρχουν λιπώδης διήθηση, σωμάτια Mallory και κεντρική υαλοειδής σκλήρυνση 254,60. Στην αυτοάνοσο ηπατίτιδα το μόνο ιδιαίτερο διαφοροδιαγνωστικό ιστολογικό χαρακτηριστικό είναι τα άφθονα πλασματοκύτταρα 222. Τέλος, στη χρόνια ηπατίτιδα Β, η νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα κατά κανόνα αφορά περισσότερο τα πυλαία διαστήματα και τις περιπυλαίες ζώνες, παρά τα λόβια, ενώ κατά κανόνα ανευρίσκονται και τα χαρακτηριστικά κύτταρα με «υαλοκοκκώδες» κυταρόπλασμα. Όπως προαναφέρθηκε, όταν υπάρχουν ινώδη διαφραγμάτια, αυτά περιέχουν ελαστικές ίνες. Επιπλέον, κατά τον ανοσοϊστοχημικό έλεγχο συνήθως ανιχνεύονται τα αντιγόνα HBsAg και HBcAg. 44

53 Χρόνια ηπατίτιδα Β: Παθολογοανατομικά ευρήματα Στη χρόνια ηπατίτιδα Β χωρίς κίρρωση το ήπαρ εμφανίζεται μακροσκοπικά φυσιολογικό ή με εστίες ίνωσης. Όταν εγκατασταθεί κίρρωση παρατηρούνται οι χαρακτηριστικοί όζοι της μακροοζώδους ή της μικτής (μικρο- και μακροοζώδους) κίρρωσης. Η χρόνια ηπατίτιδα Β παρουσιάζει κοινά ιστολογικά ευρήματα με τις άλλες χρόνιες ηπατίτιδες (ιογενείς ή μη), αλλά και κάποια ιδιαίτερα χαρακτηριστικά ιστολογικά γνωρίσματα. Τα κοινά ιστολογικά ευρήματα στις χρόνιες ηπατίτιδες είναι: εστίες ενδολόβιας νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας, συρρέουσα ή και γεφυροποιός νέκρωση, ηπατίτιδα αφοριστικής πλάκας (διαβρωτική νέκρωση), φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις στα πυλαία διαστήματα, αναγεννητική δραστηριότητα των ηπατοκυττάρων και ίνωση 50. Οι εστίες ενδολόβιας νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας, η συρρέουσα νέκρωση και η διαβρωτική νέκρωση έχουν περιγραφεί στη σελίδα 37. Οι φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις στα πυλαία διαστήματα είναι ηπίου, μετρίου ή σοβαρού βαθμού και μπορεί να εμφανίζονται σε ορισμένα ή και σε όλα τα πυλαία διαστήματα, προκαλώντας τη διεύρυνσή τους. Περιλαμβάνουν κυρίως CD4+ λεμφοκύτταρα, ποικίλο αριθμό πλασματοκυττάρων, καθώς και ιστιοκύτταρα και άωρες μορφές λεμφοκυττάρων 51. Τα λεμφοκύτταρα κατά θέσεις αθροίζονται και μπορεί να σχηματίσουν λεμφοζίδια. Σε ορισμένα μακροφάγα ανευρίσκεται υλικό θετικό στη χρώση PAS, το οποίο αντιστοιχεί σε υπολείμματα νεκρωμένων ηπατοκυττάρων. Η φλεγμονή μπορεί να επεκταθεί στα αγγεία των πυλαίων διαστημάτων και κυρίως στους κλάδους της πυλαίας φλέβας 125. Η ίνωση εμφανίζεται με τη μορφή πυλαίας ή ενδολόβιας (περιφλεβικής ή περικυτταρικής) ίνωσης (καταληκτικό στάδιο της 45

54 εστιακής νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητος) και με τη μορφή ινωδών διαφραγματίων. Αυτά μπορεί να είναι περιπυλαία (επέκταση του συνδετικού ιστού των πυλαίων διαστημάτων εντός του ηπατικού λοβίου), πυλαιο-πυλαία και πυλαιο-κεντρικά. Η δημιουργία περιπυλαίων και πυλαιο-πυλαίων διαφραγματίων είναι προφανώς αποτέλεσμα διαβρωτικής νέκρωσης, ενώ η δημιουργία πυλαιο-κεντρικών αποτέλεσμα γεφυροποιού νέκρωσης. Η σημασία της ίνωσης στην πρόοδο της χρόνιας ηπατίτιδας Β και ιδιαίτερα η ανάπτυξη ινωδών διαφραγματίων, και μάλιστα πυλαιοκεντρικών, είναι μεγάλη 32,65. Η αναγεννητική δραστηριότητα των ηπατοκυττάρων καθίσταται περισσότερο εμφανής σε προχωρημένα στάδια της νόσου και αναγνωρίζεται κυρίως από την πάχυνση των ηπατικών δοκίδων. Στην κίρρωση, τα ινώδη διαφραγμάτια αφορίζουν αναγεννητικούς όζους και περιβάλλουν τμήματα ηπατικού παρεγχύματος, με αποτέλεσμα τη διαταραχή της φυσιολογικής αρχιτεκτονικής του ηπατικού παρεγχύματος. Η κίρρωση είναι το τελικό αποτέλεσμα απώλειας ηπατοκυττάρων, ηπατοκυτταρικής αναγέννησης και προϊούσας ίνωσης. Επιπλέον, στην κίρρωση παρατηρούνται αποφρακτικού τύπου φλεβικές αλλοιώσεις και ανάπτυξη αρτηριοφλεβικών αναστομώσεων. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά ιστολογικά γνωρίσματα της χρόνιας ηπατίτιδας Β είναι τα ηπατοκύτταρα με «υαλοκοκκώδες» κυτταρόπλασμα («δίκην τριμμένης υάλου», ground glass hepatocytes) και οι «αμμώδεις πυρήνες» (sanded nuclei). Τα ηπατοκύτταρα με κυτταρόπλασμα δίκην τριμμένης υάλου ανευρίσκονται διάσπαρτα εντός του ηπατικού παρεγχύματος, μεμονωμένα ή σε ομάδες, και παρουσιάζουν λεπτοκοκκιώδη όψη σε ολόκληρο ή σε τμήμα του κυτταροπλάσματός τους. Η χαρακτηριστική αυτή όψη του κυτταροπλάσματος οφείλεται σε υπερπλασία του λείου ενδοπλασματικού δικτύου, το οποίο περιέχει άφθονο HBsAg. Συνήθως μεταξύ του κυτταροπλάσματος και της κυτταρικής 46

55 μεμβράνης παρατηρείται μία διαυγής άλως, αποτέλεσμα της απώθησης των υπολοίπων οργανυλλίων του κυττάρου. Τα κύτταρα αυτά εμφανίζουν θετικότητα στις ιστοχημικές χρώσεις κυανού της Βικτωρίας και ορσείνης (Shikata). Ανοσοϊστοχημικές χρώσεις επιβεβαιώνουν την παρουσία του HBsAg. Τα ηπατοκύτταρα με υαλοκοκκώδες κυτταρόπλασμα έχουν παρόμοια εικόνα με τα «ογκοκυτταρικά» ηπατοκύτταρα, τα οποία ανευρίσκονται σε διάφορες ηπατικές παθήσεις. Αυτά οφείλουν τη χαρακτηριστική τους εμφάνιση στην παρουσία άφθονων μιτοχονδρίων στο κυτταρόπλασμα, ενώ απουσιάζει η χαρακτηριστική διαυγής άλως. Ηπατοκύτταρα με χαρακτήρες που θυμίζουν υαλοκοκκώδες κυτταρόπλασμα μπορεί να εμφανισθούν και στη γλυκογονίαση τύπου IV 27. Τα κύτταρα αυτά όμως εμφανίζουν τη χαρακτηριστική θετικότητα του γλυκογόνου στη χρώση PAS, ενώ είναι αρνητικά στην ανοσοϊστοχημική χρώση για HBsAg. Έπίσης, στη μυοκλωνική επιληψία τα σωμάτια του Lafora 167 που έχουν παρόμοια μορφολογία, μπορεί εκτός των νευρώνων του ΚΝΣ να εντοπισθούν και στο κυτταρόπλασμα ηπατοκυττάρων 89. Επιπλέον, σε διαταραχές του μεταβολισμού του ινωδογόνου (συγγενείς ή επίκτητες 213 ) έγκλειστα ινωδογόνου εναποτίθενται εντός του κυτταροπλάσματος των ηπατοκυττάρων δίδοντας την εντύπωση ηπατοκυττάρων «ground glass» 148. Και στις περιπτώσεις αυτές, η ανοσοϊστοχημεία μπορεί να φανεί χρήσιμη, δείχνοντας θετικότητα στο ινωδογόνο και απουσία θετικότητας στο HBsAg 153. Επίσης, υπερπλασία του λείου ενδοπλασματικού δικτύου μπορεί να προκληθεί και από φαρμακευτικές ουσίες με αποτέλεσμα την λεπτοκοκκιώδη εμφάνιση του κυτταροπλάσματος των ηπατοκυττάρων 123,124. Τέλος, ηπατοκύτταρα με χαρακτήρες που θυμίζουν 47

56 υαλοκοκκώδες κυτταρόπλασμα μπορεί να παρατηρηθούν σε ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε μεταμόσχευση οργάνου 8. Τα ηπατοκύτταρα με «αμμώδεις πυρήνες» περιέχουν ηωσινόφιλα, λεπτοκοκκιώδη ενδοπυρηνικά έγκλειστα σε κεντρικές θέσεις των πυρήνων τους 10. Τα έγκλειστα περιέχουν HBcAg, πράγμα το οποίο επιβεβαιώνεται με ανοσοϊστοχημικές χρώσεις. Επομένως, η παρουσία αμμωδών πυρήνων είναι στοιχείο που συνηγορεί για ενεργό πολλαπλασιασμό του HBV. Όταν με την ηπατίτιδα Β συνυπάρχει και χρόνια ηπατίτιδα δ, συνήθως τα ιστολογικά ευρήματα είναι εντονότερα. Ανοσοϊστοχημικά, το HDVAg ανευρίσκεται κυρίως στους πυρήνες των ηπατοκυττάρων και λιγότερο στο κυτταρόπλασμα. Η συσσώρευση του HDVAg στους πυρήνες των ηπατοκυττάρων μπορεί να τους προσδώσει μορφολογία «αμμωδών» πυρήνων, όπως ακριβώς και η συσσώρευση του HΒsAg 158. Ανίχνευση των αντιγόνων του HBV σε ιστολογικά παρασκευάσματα με μεθόδους ανοσοϊστοχημείας Τα διάφορα αντιγόνα του HBV μπορεί να ανιχνευθούν με ανοστοϊστοχημικές χρώσεις και να επιβεβαιώσουν τη λοίμωξη, αλλά και να δώσουν πληροφορίες σχετικά με τον πολλαπλασιασμό του ιού και την ενεργό δραστηριότητα της νόσου. HBcAg: Εντοπίζεται κυρίως στους πυρήνες, αλλά μπορεί να εντοπισθεί επίσης στο κυτταρόπλασμα των ηπατοκυττάρων, σε περιπτώσεις με έντονο ενεργό πολλαπλασιασμό του HBV 55. Γενικώς, η παρουσία του HBcAg στους πυρήνες των ηπατοκυττάρων αποτελεί αξιόπιστο δείκτη πολλαπλασιασμού του ιού 40,171. Η παρουσία του στο κυτταρόπλασμα ή τις κυτταρικές μεμβράνες συνδέεται είτε με έντονη νεκροφλεγμονώδη δραστηριότητα 237 είτε με αναγεννητική δραστηριότητα των ηπατοκυττά- 48

57 ρων 242. HBsAg: Ανιχνεύεται στα «ground glass» ηπατοκύτταρα αλλά και σε άλλα ηπατοκύτταρα εκτός των «ground glass», κυρίως στο κυτταρόπλασμα διάχυτα ή εστιακά, αλλά και στις κυτταρικές μεμβράνες 208. HBeAg: Συνυπάρχει με το HBcAg και εντοπίζεται στους πυρήνες. Η παρουσία του HBeAg στους πυρήνες ηπατοκυττάρων αποτελεί αξιόπιστο δείκτη πολλαπλασιασμού του ιού 39. HBxAg: Τα αντιγόνο x αποτελεί τον πλέον ευαίσθητο δείκτη HBV λοίμωξης 234 επειδή εντοπίζεται σε μεγαλύτερο αριθμό ηπατοκυττάρων από τα αντιγόνα c και s 238. Συστήματα ταξινόμησης χρόνιας ηπατίτιδας Σε κάθε περίπτωση χρόνιας ηπατίτιδας η τελική διάγνωση πρέπει να περιλαμβάνει την αιτιολογία, τον βαθμό ενεργού δραστηριότητας της φλεγμονής (grade) και το στάδιο εξέλιξης της νόσου (stage) 99,226. Κάνοντας μία σύντομη ιστορική αναδρομή βλέπουμε ότι κατά τη δεκαετία του 1950 άρχισαν να εμφανίζονται οι όροι «χρόνια ενεργός» και «χρόνια εμμένουσα» ηπατίτιδα. Το 1968 προτάθηκε από διεθνή ομάδα ηπατοπαθολογοανατόμων σύστημα ταξινόμησης της χρόνιας ηπατίτιδας το οποίο περιελάμβανε τις δύο προαναφερθείσες κατηγορίες, δηλαδή τη χρόνια ενεργό ηπατίτιδα και τη χρόνια εμμένουσα ηπατίτιδα 180, ενώ αργότερα προστέθηκε και μία τρίτη κατηγορία, η χρόνια λοβιδιακή ηπατίτιδα. Το 1981 οι Κnoddell και συν. εισήγαγαν το σύστημα HAI (histological activity index) ως σύστημα διαβάθμισης των ιστολογικών αλλοιώσεων για κλινικές μελέτες 113. Τη δεκαετία του 1990 παρουσιάστηκαν νέα συστήματα ταξινόμησης (Scheuer , Ludwig 1993, Bianchi και Gudat 1994, 49

58 Ishak et al , Hytiroglou et al ), ως αποτέλεσμα των γνώσεων που αποκτήθηκαν στο χρονικό διάστημα που μεσολάβησε. Βασικό χαρακτηριστικό των νέων συστημάτων είναι η έμφαση στην αιτιολογία και ο διαχωρισμός του βαθμού ενεργού δραστηριότητας από το στάδιο της νόσου κατά τη διαβάθμιση των αλλοιώσεων 199,201, δεδομένου ότι ο πρώτος αντιπροσωπεύει ένα στιγμιότυπο της ενεργού δραστηριότητας της φλεγμονής που μπορεί να αυξομειώνεται με την πάροδο του χρόνου, ενώ το δεύτερο αντανακλά την πορεία της νόσου, η οποία είναι προοδευτική, εκτός και αν αντιμετωπισθεί θεραπευτικά. Ακολουθούν πίνακες με τα περισσότερο χρησιμοποιούμενα συστήματα ταξινόμησης. Πίνακας Α Ταξινόμηση Διεθνούς Ομάδας Ηπατοπαθολογοανατόμων (1968) Κατηγορία Χρόνια εμμένουσα ηπατίτιδα Χρόνια ενεργός ηπατίτιδα Χρόνια λοβιδιακή ηπατίτιδα Ιστολογικά χαρακτηριστικά Χρόνιες φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις στα πυλαία διαστήματα Διαβρωτική νέκρωση απούσα ή ήπια Διατήρηση της αρχιτεκτονικής των λοβίων Ίνωση απούσα ή ήπια Χρόνιες φλεγμονώδεις κυτταρικές διηθήσεις στα πυλαία διαστήματα με επέκταση στο λοβιακό παρέγχυμα (διαβρωτική νέκρωση) και παρουσία ή απουσία ινωδών διαφραγματίων. Προοδευτική διαταραχή της αρχιτεκτονικής, αλλά χωρίς παρουσία αναγεννητικών όζων Αλλοιώσεις φλεγμονής και νέκρωσης στα λόβια Αλλοιώσεις που προσομοιάζουν οξεία ηπατίτιδα, αλλά με διάρκεια μεγαλύτερη των 6 μηνών 50

59 Πίνακας Β Σύστημα βαθμολόγησης HAI κατά Κnoddell και συν. (1981) 113 Ιστολογικά χαρακτηριστικά Βαρύτητα Βαθμολογία Απούσα 0 Ήπια ΔΝ 1 1.Περιπυλαία φλεγμονή με Μέτρια ΔΝ 3 διαβρωτική νέκρωση (ΔΝ) ή/ και Έντονη ΔΝ 4 γεφυροποιό νέκρωση (ΓΝ). Μέτρια ΔΝ+ΓΝ 5 Έντονη ΔΝ+ΓΝ 6 Πολυλοβιακή νέκρωση 10 Απούσα 0 2. Ενδολοβιακή εκφύλιση και Ήπια 1 εστιακή νέκρωση ηπατοκυττάρων Μέτρια 3 Έντονη 4 Απούσα 0 3. Φλεγμονώδης διήθηση των Ήπια 1 πυλαίων διαστημάτων Μέτρια 3 Έντονη 4 Απούσα 0 Εντός των πυλαίων 4. Ίνωση διαστημάτων 1 Γεφυροποιός ίνωση 3 Κίρρωση 4 Μέγιστη Δυνατή Βαθμολογία 22 51

60 Πίνακας Γ Τροποποιημένο σύστημα βαθμολόγησης HAI: διαβάθμιση νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας (Ιshak και συν. 1995) 100 Α.Διαβρωτική νέκρωση βαθμός Απούσα 0 Ήπια (εστιακή, ορισμένα πυλαία διαστήματα) 1 Ήπια προς μέτρια (εστιακή, στα περισσότερα πυλαία διαστήματα) 2 Μέτρια 3 Σοβαρή 4 Β. Συρρέουσα νέκρωση Απούσα 0 Εστιακή 1 Νέκρωση Ζώνης 3 σε ορισμένες περιοχές 2 Νέκρωση Ζώνης 3 στις περισσότερες περιοχές 3 Νέκρωση Ζώνης 3 + ορισμένες εστίες πυλαιο-κεντρικής γεφυροποιού νέκρωσης 4 Νέκρωση Ζώνης 3 + πολλαπλές εστίες πυλαιο-κεντρικής γεφυροποιού νέκρωσης 5 Πανλοβιακή ή πολυλοβιακή νέκρωση 6 Γ. Εστίες ενδολόβιας νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητος Απούσες 0 Έως μία εστία ανά Ο.Π. (X100) 1 Δύο έως τέσσερις εστίες ανά Ο.Π. 2 Πέντε έως δέκα εστίες ανά Ο.Π. 3 Περισσότερες από δέκα εστίες ανά Ο.Π. 4 Δ. Φλεγμονή πυλαίων διαστημάτων Απούσα 0 Ήπια, σε ορισμένα ή σε όλα τα πυλαία διαστήματα 1 Μέτρια, σε ορισμένα ή σε όλα τα πυλαία διαστήματα 2 Μέτρια προς σοβαρή, σε όλα τα πυλαία διαστήματα 3 Σοβαρή σε όλα τα πυλαία διαστήματα 4 Μέγιστη Δυνατή Βαθμολογία 18 52

61 Πίνακας Δ Τροποποιημένο σύστημα σταδιοποίησης κατά Ιshak και συν. (1995) 100 Διαταραχή Αρχιτεκτονικής, ίνωση και κίρρωση βαθμός Χωρίς ίνωση 0 Επέκταση του συνδετικού ιστού από ορισμένα πυλαία διαστήματα 1 εντός των ηπατικών λοβίων, με ή χωρίς σχηματισμό διαφραγματίων Επέκταση του συνδετικού ιστού από τα περισσότερα πυλαία διαστήματα εντός των ηπατικών λοβίων, με ή χωρίς σχηματισμό 2 διαφραγματίων Επέκταση του συνδετικού ιστού από τα περισσότερα πυλαία διαστήματα εντός των ηπατικών λοβίων, με δημιουργία πυλαιοπυλαίων γεφυρών 3 Επέκταση του συνδετικού ιστού από τα πυλαία διαστήματα εντός των ηπατικών λοβίων, με δημιουργία πυλαιο-πυλαίων γεφυρών και πυλαιοκεντρικής ίνωσης 4 Εκσεσημασμένη πυλαιο-πυλαία και πυλαιο-κεντρική ίνωση, με 5 μετάπτωση προς κίρρωση Κίρρωση, πιθανή ή βεβαία 6 Πίνακας Ε Σύστημα βαθμολόγησης - σταδιοποίησης κατά Scheuer (1991) 200 Βαθμολόγηση νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας Πυλαία - περιπυλαία δραστηριότητα Ενδολόβια δραστηριότητα Βαθμός Απούσα ή ελάχιστη Απούσα 0 Φλεγμονή πυλαίων διαστημάτων Φλεγμονή αλλά όχι νέκρωση 1 Εστιακή νέκρωση ή παρουσία οξύφιλων Ηπίου βαθμού διαβρωτική νέκρωση σωματίων 2 Μετρίου βαθμού διαβρωτική νέκρωση Σοβαρού βαθμού εστίες νέκρωσης 3 Σοβαρού βαθμού διαβρωτική νέκρωση Γεφυροποιός νέκρωση 4 Βαθμολόγηση ίνωσης - κίρρωσης Στάδιο ίνωσης Βαθμός Χωρίς ίνωση 0 Ίνωση και διεύρυνση πυλαίων διαστημάτων 1 Περιπυλαία ή πυλαιο-πυλαία ινώδη διαφραγμάτια χωρίς διαταραχή της αρχιτεκτονικής 2 Ίνωση με διαταραχή της αρχιτεκτονικής, χωρίς προφανή κίρρωση 3 Πιθανή ή σαφής κίρρωση 4 53

62 Xρησιμότητα της βιοψίας ήπατος σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα B Με την ιστολογική εξέταση βιοψίας ήπατος σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β επιβεβαιώνεται η διάγνωση, διαπιστώνεται ο βαθμός της ενεργού δραστηριότητος της φλεγμονής και αξιολογείται το στάδιο της ίνωσης δηλαδή της εξέλιξης της νόσου 14. Ακόμα μπορεί να εκτιμηθεί το αποτέλεσμα της θεραπευτικής αγωγής, όταν υπάρχουν διαδοχικές βιοψίες σε βάθος χρόνου 138. Επίσης διαπιστώνεται η ύπαρξη προκαρκινωματωδών αλλοιώσεων και νεοπλασμάτων 144 είτε με στοχευμένες βιοψίες σε δυσπλαστικό όζο ή ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα είτε και σε τυχαίες βιοψίες στις οποίες ανευρίσκονται δυσπλαστικές κυτταρικές αλλοιώσεις Συγκεκριμένα, η αλλοίωση από μικρά κύτταρα είναι αποδεδειγμένα πλέον προκαρκινωματώδης, ενώ ή αλλοίωση από μεγάλα κύτταρα αποτελεί δείκτη αυξημένου κινδύνου ανάπτυξης ηπατοκυτταρικού καρκινώματος 97a. Ακόμα με τη βιοψία ήπατος διερευνώνται πιθανά άλλα πρόσθετα αίτια πρόκλησης ηπατικής βλάβης

63 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

64

65 ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. Βιοψίες ήπατος Μελετήθηκαν συνολικά 54 βιοψίες ήπατος. Οι 38 προέρχονταν από ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β (ομάδα Α), ενώ οι 16 από ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε ορθοτοπική μεταμόσχευση ήπατος (ομάδα Β). Η μεταμόσχευση έγινε λόγω χρόνιας ηπατίτιδας Β με κίρρωση (n=14), κεραυνοβόλου ηπατίτιδας Β (n=1) και συνδρόμου Budd-Chiari (n=1). Ο τελευταίος ασθενής συμπεριλήφθηκε λόγω λοίμωξης με HBV ένα χρόνο μετά τη μεταμόσχευση. Οι βιοψίες ελήφθησαν δια βελόνης στο Ιπποκράτειο ΓΠΝ Θεσσαλονίκης από τον κ. Ακριβιάδη, μετά από συγκατάθεση των ασθενών και εστάλησαν για ιστολογική εξέταση στο Εργαστήριο Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής του ΑΠΘ. Από όλους τους ασθενείς ελήφθησαν κλινικές πληροφορίες και βασικές εργαστηριακές παράμετροι από τον ορό του αίματος (τιμές τρανσαμινασών, HBeAg, HBeAb και επίπεδα του ΗΒV DNA). Οι 38 ασθενείς της ομάδας Α δεν ήταν υπό αντιική θεραπεία κατά το χρόνο λήψης της βιοψίας. Όλοι οι ασθενείς της ομάδας Β ήταν υπό θεραπεία. 2. Ιστολογική εξέταση Όλες οι βιοψίες μετά από ιστολογική επεξεργασία σκηνώθηκαν σε κύβους παραφίνης. Από κάθε κύβο παραφίνης ελήφθησαν τομές πάχους 4μm στις οποίες πραγματοποιήθηκε χρώση αιματοξυλίνης εωσίνης. Επίσης ελήφθησαν άβαφες τομές στις οποίες πραγματοποιήθηκαν οι ιστοχημικές χρώσεις τρίχρωμη Masson, Gomori, PAS διαστάση και αιμοσιδηρίνη. Μετά από την ιστολογική εξέταση, προσδιορίστηκαν σε κάθε περίπτωση ο βαθμός ενεργού δραστηριότητας της φλεγμονής και το στάδιο 57

66 της ίνωσης. Επιπλέον, ο βαθμός ενεργού δραστηριότητας βαθμολογήθηκε ημιποσοτικά σύμφωνα με το τροποποιημένο σύστημα HAI (Πίνακας Γ), ενώ το στάδιο της ίνωσης σύμφωνα με ένα απλό σύστημα σταδιοποίησης 98. Έγινε κατάταξη των βιοψιών σε τέσσερις ομάδες βάσει του βαθμού ενεργού δραστηριότητας (HAI): Eνεργός δραστηριότητα Βαθμός HAI Ελάχιστη (φορείς) 0-3 Ήπια 4-8 Μέτρια 9-12 Έντονη >12 Επίσης έγινε κατάταξη των βιοψιών σε πέντε ομάδες βάσει του σταδίου ίνωσης: Ίνωση Βαθμός Απουσία ίνωσης 0 Ήπια ίνωση : ίνωση στα πυλαία διαστήματα χωρίς σχηματισμό 1 ινωδών διαφραγματίων Μέτρια ίνωση : ινώδη διαφραγμάτια που εκτείνονται από τα πυλαία διαστήματα εντός των ηπατικών λοβίων, χωρίς διαταραχή 2 αρχιτεκτονικής Έντονη ίνωση: ινώδη διαφραγμάτια που εκτείνονται από τα πυλαία διαστήματα εντός των ηπατικών λοβίων και φθάνουν σε τελικές 3 ηπατικές φλέβες ή σε άλλα πυλαία διαστήματα, με διαταραχή αρχιτεκτονικής ενδεικτική μετάπτωσης σε κίρρωση Κίρρωση 4 58

67 3. Ανοσοϊστοχημικές χρώσεις Από κάθε κύβο παραφίνης ελήφθησαν τομές για ανοσοϊστοχημεία. Πραγματοποιήθηκαν χρώσεις για ανίχνευση του επιφανειακού αντιγόνου (ΗΒsAg) και του πυρηνικού αντιγόνου (HBcAg) του ιού της ηπατίτιδας Β. Χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της στρεπταβιδίνης βιοτίνης: Οι τομές καταρχάς αποπαραφινώθηκαν σε διαλύματα ξυλόλης (2x10 min). Στη συνέχεια ενυδατώθηκαν με κατιούσα σειρά αλκοολών 100 ο, 96 ο και 70 ο. Μετά την ενυδάτωση, τοποθετήθηκαν για 20 min σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου (170 ml μεθανόλης 100 ο και 3ml H 2 O 2 30%) για τη δέσμευση της ενδογενούς υπεροξειδάσης. Για την αποκάλυψη των αντιγονικών θέσεων, για το HBcAg έγινε επώαση σε πρωτεινάση Κ (DAKO S 3020) για 5 min, ενώ για το ΗΒsAg βρασμός σε διάλυμα κιτρικού οξέος ph 6.0 για 3x7min. Στη συνέχεια, οι τομές εκπλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα TBS ( 3x5 min). Μετά την αποκάλυψη των αντιγονικών θέσεων οι τομές επωάσθηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα σε διάλυμα Ab diluent DAKO S 2022 για 30 min. Για την ανίχνευση του HBcAg χρησιμοποιήθηκε το ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα κονίκλου DAKO B 0586, ενώ για την ανίχνευση του ΗΒsAg χρησιμοποιήθηκε το ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα μυός DAKO M 3506, κλώνος 3Ε7. Κατόπιν οι τομές επωάσθηκαν με το σύμπλεγμα στρεπταβιδίνης βιοτίνης (Dako K 0690) (biotinylated link για 20 min, streptavidin HRP για 20 min) και στη συνέχεια με το χρωμογόνο (διαμινοβενζιδίνη) σε κατάλληλο υπόστρωμα (Dako K 3468) για 10 min. Τέλος οι τομές χρώσθηκαν με αιματοξυλίνη εωσίνη, αφυδατώθηκαν σε ανιούσα σειρά αλκοολών (70 ο, 96 ο και 100 ο ), διαφανοποιήθηκαν με ξυλόλη και επικαλύφθηκαν. 4. Εκχύλιση DNA Σε όσους ασθενείς υπήρχε επαρκές υλικό για ιστολογική εξέταση, 59

68 μικρό τεμάχιο από τον κύλινδρο της βιοψίας (μήκους 0,3 έως 0,5 εκ.) καταψύχθηκε στους -70 ο C και χρησιμοποιήθηκε για εκχύλιση DNA, ώστε να προσδιορισθούν ποσοτικά αλληλουχίες του ιού. Σε όλες τις περιπτώσεις η εκχύλιση του DNA έγινε με το QIAamp DNA Mini Kit [Qiagen, Hilden, Γερμανία], σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η επεξεργασία των δειγμάτων έγινε «τυφλά», χωρίς δηλαδή γνώση των κλινικών πληροφοριών. Συγκεκριμένα, κάθε μικρό τεμάχιο από τον κύλινδρο της βιοψίας (25 mg ιστού περίπου) κόπηκε σε μικρότερα τεμάχια, τα οποία τοποθετήθηκαν σε σωλήνα μικροφυγοκέντρου 1,5 ml, όπου προστέθηκαν 180 μl ρυθμιστικού διαλύματος ATL. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 20 μl πρωτεϊνάσης Κ και ακολούθησε ανάδευση με στροβιλισμό (vortex) και επώαση στους 56 ο C για 3 ώρες έως την πλήρη λύση του ιστού. Μετά έγινε σύντομη φυγοκέντρηση, προστέθηκαν 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος ATL, έγινε ανάδευση για 15 sec με δόνηση (pulse) και στροβιλισμό (vortex) και επώαση στους 70 ο C για 10 λεπτά. Στη συνέχεια προστέθηκαν 200 μl αιθυλικής αλκοόλης 100%, ακολούθησε ανάδευση για 15 sec με δόνηση (pulse) και στροβιλισμό (vortex) και στη συνέχεια φυγοκέντρηση. Κατόπιν το μίγμα (συνολικού όγκου 600 μl) μεταφέρθηκε σε ειδική στήλη και φυγοκεντρήθηκε στις 8000 στροφές (rpm) για 1 λεπτό. Στη συνέχεια απορρίφθηκε το συλλεκτικό σωληνάριο και η στήλη τοποθετήθηκε σε καθαρό συλλεκτικό σωληνάριο. Προστέθηκαν 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος AW1 και έγινε φυγοκέντρηση στις 8000 rpm για 1 λεπτό. Η στήλη τοποθετήθηκε εκ νέου σε καθαρό συλλεκτικό σωληνάριο, προστέθηκαν 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος AW2 και έγινε φυγοκέντρηση στις rpm για 3 λεπτά και κατόπιν επανάληψη με καθαρό συλλεκτικό σωληνάριο στις rpm για 1 λεπτό. Στη συνέχεια προστέθηκαν 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος AΕ, έγινε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά και τέλος φυγοκέντρηση στις 8000 rpm για 1 λεπτό. 60

69 Εκτός από τους ασθενείς της μελέτης, έγινε εκχύλιση DNA και από 7 βιοψίες ήπατος ασθενών χωρίς ιστορικό ηπατίτιδας Β (ομάδα «μαρτύρων»). Συγκεκριμένα, δύο από τους ασθενείς είχαν λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C, ένας είχε σύνδρομο Gilbert και τέσσερις είχαν υποβληθεί σε ορθοτοπική μεταμόσχευση ήπατος λόγω κίρρωσης οφειλομένης σε αιθανόλη, στον ιό της ηπατίτιδας C και σε πρωτοπαθή σκληρυντική χολαγγειίτιδα. 5. Μοριακή ποσοτική διερεύνηση αλληλουχιών του HBV Χρησιμοποιήθηκε η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (quantitative real-time PCR) για τον προσδιορισμό αλληλουχίας του γονιδίου HBS που αντιστοιχεί στο ολικό HBV DNA, καθώς και του cccdna του HBV. Για τη μοριακή διερεύνηση του cccdna χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές (primers) και ανιχνευτές που οι αλληλουχίες τους έχουν δημοσιευθεί στη βιβλιογραφία 240, με ορισμένες τροποποιήσεις για τις πολυμορφικές περιοχές, που είχαν ως σκοπό την ανίχνευση όσο το δυνατόν περισσότερων στελεχών του ιού. Σε κάθε δείγμα DNA διερευνήθηκαν ποσοτικά 3 στόχοι: γονίδιο HBS και cccdna του HBV, καθώς και τμήμα της αλληλουχίας του γονιδίου PLZF, ως μάρτυρας της μοριακής ακεραιότητας του υποστρώματος. Οι αλληλουχίες των εκκινητών και ανιχνευτών Taqman που χρησιμοποιήθηκαν, καθώς και το μέγεθος των αλληλουχιών-στόχων προς μεγέθυνση φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. Τα αντιδραστήρια αυτά αγοράσθηκαν από την εταιρεία TIB-MolBiol (Berlin, Γερμανία). 61

70 στόχος εκκινητής ID Αλληλουχία εκκινητών και ανιχνευτών (5' - 3') Μέγεθος στόχου HBV cccdna cccf1 cccr1 ACTCTTGGACTCBCAGCAATG CTTTATACGGGTCAATGTCCA 277 bp ccctm FAM-CTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCWTGTTCA-TAMRA γονίδιο HB S SF SR CCTCTTCATCCTGCTGCT AACTGAAAGCCAAACAGT 334 bp STM JOE-TCCCATCCCATCRTCCTGGGCTTT-Dabcyl «Μάρτυρας» DNA (γονίδιο PLZF) μαρτ3f μαρτ3r μαρτ3tm TGCGATGTGGTCATCATGGTG CGTGTCATTGTCGTCTGAGGC JOE-AGGACCTGGATGACCTGCTGTATGC-Dabcyl 300 bp Οι συγκεντρώσεις για κάθε αντίδραση PCR των 25μl ήταν: 10pmoles από κάθε εκκινητή, 5pmoles από τον αντίστοιχο ανιχνευτή, 1X Platinum Mix UDG (Invitrogen, Carlsbad, Καλιφόρνια), και ng DNA. Σημειώνεται ότι, παρά τις προσπάθειες, δεν ήταν δυνατό να ομαλοποιηθούν ιδανικά όλα τα δείγματα για την παραπάνω συγκέντρωση DNA. Δείγματα με μικρότερη αρχική συγκέντρωση χρησιμοποιήθηκαν επίσης, και ο αποκλεισμός έγινε σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ποσοτικοποίησης με την PCR, όπως περιγράφεται παρακάτω. Οι συνθήκες της PCR ήταν: 50 o C για 2min, 95 o C για 10min, και 50 κύκλοι στους 95 o C για 15sec και στους 60 ο C για 1min. Τα προϊόντα της PCR για τον κάθε στόχο κλωνοποιήθηκαν σε φορείς pgem και ταυτοποιήθηκαν με αλληλούχηση (sequencing). Τα κλωνοποιημένα αυτά προϊόντα χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία προτύπων που χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση με PCR. Για τη λήψη των προτύπων καμπυλών χρησιμοποιήθηκαν 4 διαδοχικές αραιώσεις για το κάθε πρότυπο HBS, cccdna και PZLF, οι οποίες υποβλήθηκαν εις διπλούν σε ποσοτική μεγέθυνση, παράλληλα με τα δείγματα προς διερεύνηση. Τα όρια ανίχνευσης τέθηκαν ως εξής: Στα 3x10 αντίγραφα για το cccdna, στα 1x 10 2 αντίγραφα για το γονίδιο S, και στα 1,5x10 κύτταρα. 62

71 Εντούτοις, το όριο ανίχνευσης για να συμπεριληφθεί ένα δείγμα στην ανάλυση τοποθετήθηκε στα 1500 κύτταρα, καθώς υπήρχε σημαντική απόκλιση των τιμών των αποτελεσμάτων για δείγματα με μικρότερη συγκέντρωση DNA. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το Opticon DNA software, version Οι πρότυπες καμπύλες έγιναν αποδεκτές με συντελεστή συσχέτισης > Στατιστική ανάλυση Πραγματοποίηθηκε στατιστική ανάλυση όλων των ιστολογικών, ανοσοϊστοχημικών και μοριακών παραμέτρων με σκοπό τη συσχέτιση των μεγεθών τους. Για τη στατιστική ανάλυση των πειραματικών δεδομένων, χρησιμοποιήσαμε το λογισμικό πακέτο SPSS 15.0 for Windows σε έναν επιτραπέζιο υπολογιστή τεχνολογίας IBM-Compatible, επεξεργαστικής ισχύος 2,2 GHz. Οι προσεγγίσεις που ακολουθήθηκαν ανάλογα με τον τύπο των δεδομένων ήταν: Μη παραμετρικός έλεγχος κατά Kruskal Wallis Ανάλυση Μεταβλητότητας Μονής Κατεύθυνσης (Oneway ANOVA) Έλεγχος Τ-Test Ανεξάρτητων Δειγμάτων Πίνακας Crosstab και έλεγχος σημαντικότητας κατά Pearson X 2. Ειδικότερα: Σε δεδομένα που και οι δύο εξεταζόμενοι παράγοντες ήταν σε ασυνεχή (διακριτή) μορφή, π.χ. σε κλάσεις, εφαρμόστηκε ο έλεγχος Crosstab από τον οποίο με χρήση της μεθοδολογίας Pearson Χ 2 ελέγχθηκε η ανεξαρτησία των δύο παραγόντων. Συγκεκριμένα θεωρήσαμε ως μηδενική υπόθεση Η ο ότι οι δύο παράγοντες είναι ανεξάρτητοι και ως εναλλακτική υπόθεση Η 1 ότι οι δύο παράγοντες είναι εξαρτημένοι. 63

72 Βασικές προϋποθέσεις ελέγχου: Τυχαίο δείγμα Ανεξάρτητες παρατηρήσεις Μέση συχνότητα «κελιών» μεγαλύτερη από 5 Ο δείκτης των αποτελεσμάτων του ελέγχου που μας ενδιαφέρει είναι η σημαντικότητα ή αλλιώς το p-value. Το p-value δίνει την πιθανότητα σφάλματος εάν απορρίψουμε τη μηδενική υπόθεση. Είναι το λεγόμενο σφάλμα β είδους. Συγκρίνουμε το p-value με το επίπεδο σημαντικότητας α που έχουμε ορίσει και εφόσον είναι χαμηλότερο απορρίπτουμε τη μηδενική υπόθεση ή με άλλα λόγια δεχόμαστε ότι υπάρχει εξάρτηση μεταξύ των εξεταζόμενων παραγόντων. Συνήθως χρησιμοποιούμε επίπεδο σημαντικότητας 0,95 ή α=0,05 (5%). Παρόλα αυτά η αυστηρότητα των ορίων του επίπεδο σημαντικότητας μπορεί να αλλάξει, αλλά πρέπει να είναι κοινή σε όλους τους ελέγχους. Σε πολλούς από τους ελέγχους που πραγματοποιήθηκαν, βρέθηκε ότι δεν πληρούνταν όλες οι προϋποθέσεις. Σε αυτή την περίπτωση, εκτός από τον έλεγχο Pearson X 2 έγινε έλεγχος και κατά Cramer V. Ο έλεγχος Cramer V, είναι ο πιο δημοφιλής έλεγχος που βασίζεται στις μετρήσεις κατά Χ 2. Το V ισούται με την τετραγωνική ρίζα του Χ 2, διαιρεμένο με τον αριθμό του δείγματος n και πολλαπλασιασμένο με έναν αριθμό M που ισούται με το μικρότερο μέγεθος από τον αριθμό των στηλών -1 ή των γραμμών -1. Το V δίνει τη συσχέτιση μεταξύ δύο παραγόντων, ως ποσοστό της μέγιστης δυνατής μεταβλητότητας. Σε δεδομένα που ο ένας από τους δύο παράγοντες ήταν σε διακριτή μορφή και ο άλλος σε συνεχή, πραγματοποιήθηκε ο έλεγχος Τ, ανεξάρτητων δειγμάτων. Σύμφωνα με αυτόν τον έλεγχο, θεωρούμε ως μηδενική υπόθεση ότι οι δύο παράγοντες έχουν ίδια μέση τιμή ενώ ως εναλλακτική υπόθεση θεωρούμε ότι η μέση τους τιμή διαφέρει και άρα η μία επηρεάζει την άλλη. Και σε αυτήν την περίπτωση εξετάζουμε τη 64

73 σημαντικότητα ή αλλιώς το p-value το οποίο πρέπει να είναι μικρότερο από το προκαθορισμένο επίπεδο σημαντικότητας. Σε δεδομένα που και οι δύο παράγοντες είναι σε συνεχή μορφή, διενεργήθηκε έλεγχος μεταβλητότητας επαναλαμβανόμενων μετρήσεων. Η λογική του ελέγχου ANOVA είναι ίδια με των Τ-tests που αναλύθηκε παραπάνω. Δηλαδή και πάλι ελέγχεται η διαφορά των μέσων τιμών των εξεταζόμενων παραγόντων. Και σε αυτή την περίπτωση μας ενδιαφέρει ο δείκτης της σημαντικότητας, p-value. Μια από τις βασικές παραδοχές των δύο παραπάνω ελέγχων είναι ότι οι μεταβλητότητες των εξεταζόμενων μεταβλητών είναι περίπου ίσες. Για να το διακριβώσουμε αυτό, να εξασφαλίσουμε δηλαδή την επάρκεια του προτύπου, διενεργούμε τον έλεγχο Levene ομοιογένειας των δειγμάτων. Σε περίπτωση που οι μεταβλητότητες διαφέρουν, πλήττεται η αξιοπιστία του ελέγχου και οδηγούμαστε σε Μη Παραμετρικούς Ελέγχους. Στην παρούσα ανάλυση λόγω της φύσης των μεταβλητών, διενεργήθηκε ο έλεγχος κατά Kruskal Wallis. Για ακόμη μια φορά το μέγεθος που δείχνει την εξάρτηση της μιας μεταβλητής από την άλλη, είναι ο δείκτης p-value. Γενικά όσο πιο μικρή είναι η τιμή του p-value, τόσο μεγαλύτερη είναι η ένδειξη εξάρτησης της μιας μεταβλητής από την άλλη. Παρατήρηση: Σε περιπτώσεις που από τον έλεγχο Levene βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των μεταβλητοτήτων των μεταβλητών, παρατέθηκαν οι πίνακες των μη παραμετρικών ελέγχων μόνο. 65

74

75 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Κλινικοεργαστηριακά ευρήματα Από τους 54 ασθενείς, οι 37 ήταν άνδρες (ποσοστό 65,6%) και οι 17 γυναίκες (ποσοστό 34,4%). Η ηλικία των ασθενών κυμαίνονταν από 15 έως 72 ετών, με ενδιάμεση ηλικία 43,5 έτη. Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών και η βασική κλινική διάγνωση φαίνονται στον Πίνακα 1 (ομάδα Α) και στον Πίνακα 2 (ομάδα Β). Οι τιμές των τρανσαμινασών κατά το χρόνο της λήψεως της βιοψίας φαίνονται επίσης αναλυτικά στους Πίνακες 1 και 2. Δεκαοκτώ ασθενείς είχαν φυσιολογικές τιμές τρανσαμινασών στο ορό του αίματος, ενώ 36 ασθενείς είχαν παθολογικές τιμές τρανσαμινασών. Μόνο 2 ασθενείς είχαν θετικό το HBeAg στον ορό του αίματος. Κανείς από τους 16 μεταμοσχευμένους ασθενείς δεν είχε θετικό το HBeAg, ενώ όλοι είχαν θετικό το HBeAb. Τα ευρήματα της ορολογικής εξέτασης για HBeAg / HBeAb φαίνονται αναλυτικά στους πίνακες 1 και 2 και συνοπτικά κατωτέρω: HBeAg Ομάδα Α Ομάδα Β Αρνητικό Θετικό 2 0 Σύνολο βιοψιών Εκοσιεννέα ασθενείς της ομάδας Α και όλοι οι ασθενείς της ομάδας Β είχαν δεδομένα σχετικά με το HBV DNA στο ορό του αίματος. Οι τιμές φαίνονται αναλυτικά στους πίνακες 1 και 2 και συνοπτικά κατωτέρω: HBV DNA στον ορό Ομάδα Α Ομάδα B Αρνητικό 1 13 Θετικό 28 3 Σύνολο βιοψιών

76 Πίνακας 1: Κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα των ασθενών της ομάδας Α. 68

77 (Πίνακας 1 συν.) 69

78 Πίνακας 2: Κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα των ασθενών της ομάδας Β 70

79 2. Ιστολογικά ευρήματα Βάσει των ευρημάτων της ιστολογικής εξέτασης έγινε βαθμολόγηση της βαρύτητας των αλλοιώσεων. Συγκεκριμένα ο βαθμός ενεργού δραστηριότητας (HAI) προέκυψε από την αξιολόγηση της διαβρωτικής και γεφυροποιού νέκρωσης, των εστιών ενδολόβιας νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας και της φλεγμονής των πυλαίων διαστημάτων. Το στάδιο της ίνωσης προέκυψε από την αξιολόγηση της αύξησης του συνδετικού ιστού στα πυλαία διαστήματα, του σχηματισμού ινωδών διαφραγματίων και της διαταραχής της αρχιτεκτονικής του παρεγχύματος (οζώδης διαμόρφωση και κίρρωση). Επίσης αξιολογήθηκαν και τα λοιπά ιστολογικά ευρήματα και κυρίως η παρουσία ηπατοκυττάρων με «υαλοκοκκώδες» κυτταρόπλασμα, που, ως γνωστόν οφείλεται σε υπερπλασία του ενδοπλασματικού δικτύου με παρουσία HBsAg, καθώς και η παρουσία «αμμωδών πυρήνων» που οφείλεται σε παρουσία HBcAg. Ο βαθμός ενεργού δραστηριότητας και το στάδιο ίνωσης όλων των περιπτώσεων φαίνονται αναλυτικά στους Πίνακες 3 (ομάδα Α) και 4 (ομάδα Β). Αντιπροσωπευτικά ιστολογικά ευρήματα απεικονίζονται στις εικόνες 1,2,3 και 4. Οι 4 ομάδες βιοψιών με βάση το βαθμό ενεργού δραστηριότητας (HAI) περιέλαβαν τους κατωτέρω αριθμούς περιπτώσεων: Ομάδες βιοψών με βάση το βαθμό ενεργού δραστηριότητας (HAI) Ομάδα Α Ομάδα B 1 Ελάχιστη (HAI 0-3) Ήπια (HAI 4-8) Μέτρια (HAI 9-12) Έντονη (HAI >13) 8 0 Σύνολο βιοψιών

80 Οι 5 ομάδες βιοψιών με βάση το στάδιο ίνωσης περιέλαβαν τους κατωτέρω αριθμούς περιπτώσεων: Ομάδες βιοψών με βάση το στάδιο ίνωσης Ομάδα Α Ομάδα B 0 (απουσία ίνωσης) (ήπια ίνωση) (μέτρια ίνωση) (έντονη ίνωση) (κίρρωση) 4 0 Σύνολο βιοψιών Ανοσοϊστοχημικά ευρήματα Αξιολογήθηκε η παρουσία των αντιγόνων του HBV (ΗΒsAg και HBcAg), το ποσοστό των θετικών ηπατοκυττάρων (ημιποσοτική εκτίμηση), αλλά και η εντόπιση του HBcAg στους πυρήνες ή και το κυτταρόπλασμα. Το ΗΒsAg ανιχνεύθηκε ανοσοϊστοχημικά σε 33 από τις 38 βιοψίες ασθενών της ομάδας Α. Σε 18 περιπτώσεις ο αριθμός των θετικών ηπατοκυττάρων ήταν μεγάλος, σε 11 ήταν μέτριος και σε 4 μικρός. Όσον αφορά τους μεταμοσχευμένους ασθενείς (ομάδα Β), το ΗΒsAg ανιχνεύθηκε ανοσοϊστοχημικά σε 3 από τις 16 βιοψίες. Σε 2 περιπτώσεις ο αριθμός των θετικών ηπατοκυττάρων ήταν μεγάλος και σε 1 μικρός. Το ΗΒcAg ανιχνεύθηκε ανοσοϊστοχημικά σε 16 από τις 38 βιοψίες ασθενών της ομάδας Α. Σε 3 περιπτώσεις ο αριθμός των θετικών ηπατοκυττάρων ήταν μεγάλος, σε 5 ήταν μέτριος και σε 8 μικρός. Σε 10 βιοψίες η παρουσία του HBcAg ήταν πυρηνική, ενώ σε 6 η παρουσία του ήταν πυρηνική και κυτταροπλασματική. Όσον αφορά τους μεταμοσχευμένους ασθενείς (ομάδα Β), το ΗΒcAg ανιχνεύθηκε ανοσοϊστοχημικά σε 1 από τις 16 βιοψίες, με μεγάλο αριθμό θετικών ηπατοκυττάρων 72

81 και πυρηνική εντόπιση. Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημικά ευρήματα απεικονίζονται στις εικόνες 5 και 6. Τα ανοσοϊστοχημικά ευρήματα όλων των περιπτώσεων φαίνονται αναλυτικά στους πίνακες 3 (ομάδα Α) και 4 (ομάδα Β) και συνοπτικά κατωτέρω: HBsAg Ομάδα Α Ομάδα B Αρνητικό 5 13 Θετικό + (σπάνια έως λίγα ηπατοκύτταρα) 4 1 Θετικό ++ (αρκετά ηπατοκύτταρα) 11 0 Θετικό +++ (πολλά ηπατοκύτταρα) 18 2 Σύνολο βιοψιών HBcAg Ομάδα Α Ομάδα B αρνητικό Θετικό + (σπάνια έως λίγα ηπατοκύτταρα) 8 0 Θετικό ++ (αρκετά ηπατοκύτταρα) 5 0 Θετικό +++ (πολλά ηπατοκύτταρα) 3 1 Σύνολο βιοψιών

82 Πίνακας 3: Ιστολογικά και ανοσοϊστοχημικά ευρήματα των ασθενών της ομάδας Α. Αρ. Πρωτ. Ενεργός δραστηριότητα (HAI) Στάδιο ίνωσης Ηπατοκύτταρα θετικά στο HBsAg Ηπατοκύτταρα θετικά στο HBcAg JS4 έντονη (13) 3 λίγα αρνητικό JS5 μέτρια (12) 3 αρκετά αρνητικό JS6 μέτρια (9) 2 πολλά πολλά(π/κ) JS7 έντονη (13) 2 αρκετά αρκετά(π) JS8 ήπια (6) 1 πολλά αρνητικό JS9 ήπια (7) 0 αρκετά αρκετά(π/κ) JS10 μέτρια (10) 4 πολλά αρνητικό JS11 μέτρια (10) 2 πολλά αρκετά(π) JS12 ήπια (7) 3 αρκετά αρνητικό JS14 μέτρια (9) 3 πολλά αρκετά(π/κ) JS15 ήπια (5) 2 αρκετά αρνητικό JS16 ήπια (4) 0 πολλά αρνητικό JS17 ήπια (7) 2 πολλά πολλά(π) JS18 μέτρια (9) 2 πολλά λίγα(π) JS19 ήπια (8) 2 πολλά αρνητικό JS20 έντονη 4 αρκετά λίγα(π/κ) JS21 μέτρια 1 πολλά σπάνια(π) JS22 έντονη (14) 2 πολλά πολλά(π/k) JS23 έντονη (15) 3 αρκετά αρνητικό JS24 ελάχιστη (2) 1 αρκετά αρνητικό JS25 ελάχιστη (2) 1 πολλά αρνητικό JS26 ήπια 4 αρνητικό αρνητικό JS27 ελάχιστη 1 αρνητικό αρνητικό JS28 ήπια (8) 3 πολλά αρνητικό JS30 μέτρια (10) 3 αρνητικό αρνητικό JS31 μέτρια (10) 2 λίγα αρκετά(π/κ) JS33 ελάχιστη 0 πολλά αρνητικό JS34 έντονη (13) 3 αρκετά λίγα(π) JS35 ήπια (8) 3 αρκετά λίγα(π) JS54 ήπια (8) 2 πολλά σπάνια(π) JS55 έντονη (14) 2 αρκετά αρνητικό JS57 μέτρια (9) 4 αρνητικό σπάνια(π) JS65 έντονη (14) 3 πολλά αρνητικό JS67 ήπια (4) 1 αρνητικό αρνητικό JS68 ελάχιστη (2) 1 λίγα λίγα(π) JS72 μέτρια (9) 2 πολλά αρνητικό JS73 ελάχιστη (3) 1 πολλά αρνητικό JS74 ελάχιστη 1 σπάνια αρνητικό 74

83 Πίνακας 4: Ιστολογικά και ανοσοϊστοχημικά ευρήματα των ασθενών της ομάδας Β. Αρ. Πρωτ. Ενεργός δραστηριότητα (HAI) Στάδιο ίνωσης Ηπατοκύτταρα θετικά στο HBsAg Ηπατοκύτταρα θετικά στο HBcAg JS36 ήπια 1 αρνητικό αρνητικό JS37 απούσα (0) 0 αρνητικό αρνητικό JS38 ήπια 1 αρνητικό αρνητικό JS39 ήπια 1 αρνητικό αρνητικό JS40 ήπια 1 αρνητικό αρνητικό JS41 απούσα (0) 0 αρνητικό αρνητικό JS42 ήπια (4) 2 λίγα αρνητικό JS43 απούσα (0) 0 αρνητικό αρνητικό JS44 ήπια (8) 1 αρνητικό αρνητικό JS45 απούσα (0) 0 αρνητικό αρνητικό JS47 ήπια (5) 2 πολλά αρνητικό JS48 απούσα (0) 0 αρνητικό αρνητικό JS51 απούσα (0) 0 αρνητικό αρνητικό JS59 ήπια 1 αρνητικό αρνητικό JS60 ήπια (5) 1 αρνητικό αρνητικό JS64 μέτρια 0 πολλά πολλά ( Π ) 4. Ευρήματα μοριακής μελέτης Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου, όλοι (n=7) οι μάρτυρες χωρίς ιστορικό ηπατίτιδας Β ήταν θετικοί στις αλληλουχίες του γονιδίου μάρτυρα (για την ποιότητα του DNA) και αρνητικοί στο γονίδιο S και το cccdna. Τριαντατέσσερις από τους 38 ασθενείς της ομάδας Α ήταν θετικοί και 4 αρνητικοί για αλληλουχίες του γονιδίου S του HBV, ενώ 10 από τους 38 ασθενείς ήταν θετικοί για παρουσία cccdna και 28 αρνητικοί. Όσον αφορά τους μεταμοσχευμένους ασθενείς (ομάδα Β), 3 από τους 16 ασθενείς ήταν θετικοί και 13 αρνητικοί για αλληλουχίες του γονιδίου S του 75

84 HBV, ενώ όλοι ήταν αρνητικοί για παρουσία cccdna. Αντιπροσωπευτικά ευρήματα από τη μοριακή μελέτη απεικονίζονται στην εικόνα 7. Τα ευρήματα της μοριακής εξέτασης φαίνονται αναλυτικά στους πίνακες 5 και 6, ενώ κατωτέρω φαίνεται συνοπτικά ο αριθμός των θετικών και αρνητικών περιπτώσεων στις ομάδες ασθενών. HBV DNA γονίδιο S Ομάδα Α Ομάδα B Αρνητικό 4 13 Θετικό 34 3 Σύνολο βιοψιών cccdna Ομάδα Α Ομάδα B Αρνητικό Θετικό 10 0 Σύνολο βιοψιών

85 Πίνακας 5: Μοριακά ευρήματα διερεύνησης του HBV των ασθενών της ομάδας Α Αρ. ccc ccc copies / S copies cells Πρωτ. copies cell S copies / cell ccc / S ratio JS4 27, , ,18 0, , , JS5 N/D 46498, ,29 N/A 0, N/A JS6 20, , ,09 0, , , JS7 8, , ,75 0, , , JS8 N/D 6563, N/A 0, N/A JS9 46, , ,41 0, , , JS10 N/D 29761, ,43 N/A 8, N/A JS11 0, , ,85 8,7574E-06 0, ,36E-05 JS12 N/D 2772,8 664,75 N/A 4, N/A JS14 5, , ,66 0, , , JS15 N/D 3365, ,08 N/A 0, N/A JS16 N/D 7927, ,43 N/A 0, N/A JS , ,53 0, , , JS18 N/D 21234, ,04 N/A 1, N/A JS19 N/D N/D 552,99 N/A N/A N/A JS20 146, , ,78 0, , , JS21 N/D ,91 N/A 0, N/A JS22 47, , ,63 0, , , JS23 N/D ,3 N/A 0, N/A JS24 N/D 5111, ,73 N/A 0, N/A JS25 N/D 7464, ,76 N/A 0, N/A JS26 N/D 1438, ,83 N/A 0, N/A JS27 N/D ,27 N/A 0, N/A JS28 N/D 3048, ,61 N/A 0, N/A JS30 N/D 7523, ,13 N/A 0, N/A JS31 906, , ,8 0, , , JS33 N/D 3602, ,16 N/A 1, N/A JS34 N/D 12439, ,23 N/A 1, N/A JS35 N/D 4265, ,91 N/A 0, N/A JS54 N/D 8025, ,36 N/A 3, N/A JS55 N/D 1927, ,3 N/A 0, N/A JS57 N/D N/D 487,29 N/A N/A N/A JS65 N/D 1882, ,43 N/A 0, N/A JS67 N/D N/D 7189,52 N/A N/A N/A JS68 N/D 8013, ,3 N/A 0, N/A JS72 N/D 492, ,58 N/A 0, N/A JS73 N/D 370, ,06 N/A 0, N/A JS74 N/D N/D 563,68 N/A N/A N/A 77

86 Πίνακας 6: Μοριακά ευρήματα διερεύνησης του HBV των ασθενών της ομάδας B. Αρ. ccc ccc copies / S copies/ ccc/ S copies cells Πρωτ. copies cell cell S ratio JS36 N/D N/D 8920,89 N/A N/A N/A JS37 N/D N/D 4974,28 N/A N/A N/A JS38 N/D N/D 9137,23 N/A N/A N/A JS39 N/D N/D 23263,59 N/A N/A N/A JS40 N/D N/D ,34 N/A N/A N/A JS41 N/D N/D 44223,32 N/A N/A N/A JS42 N/D 2355, ,2 N/A 0, N/A JS43 N/D N/D 35083,94 N/A N/A N/A JS44 N/D N/D 10842,82 N/A N/A N/A JS45 N/D N/D 2865,52 N/A N/A N/A JS47 N/D 7639, ,72 N/A 2, N/A JS48 N/D N/D 15620,56 N/A N/A N/A JS51 N/D N/D 4013,22 N/A N/A N/A JS59 N/D N/D 3085,69 N/A N/A N/A JS60 N/D N/D 2219 N/A N/A N/A JS64 N/D 21629, ,8 N/A 0, N/A Συντομογραφίες: Ν/Α: μη εφαρμόσιμο, Ν/D: μη ανιχνεύσιμο. 78

87 5. Σύγκριση αποτελεσμάτων μεθόδων ανίχνευσης των μορίων του ιού. Ακολουθούν συγκριτικοί πίνακες των αποτελεσμάτων της ποσοτικής PCR για αλληλουχίες του γονιδίου S του HBV και του cccdna σε συνάρτηση με τα ιστολογικά και ανοσοϊστοχημικά ευρήματα. 79

88 Πίνακας 7: Συγκριτικός πίνακας των αποτελεσμάτων των διαφόρων μεθόδων ανίχνευσης των μορίων του ιού σε συνάρτηση με τα ιστολογικά και ανοσοϊστοχημικά ευρήματα των ασθενών της ομάδας Α. 80

89 (Πίνακας 7 συν.) 81

90 Πίνακας 8: Συγκριτικός πίνακας των αποτελεσμάτων των διαφόρων μεθόδων ανίχνευσης των μορίων του ιού σε συνάρτηση με τα ιστολογικά και ανοσοϊστοχημικά ευρήματα των ασθενών της ομάδας B. 82

91 6. Αποτελέσματα στατιστικής ανάλυσης. Τόσο στους ασθενείς της ομάδας Α, όσο και σε εκείνους της ομάδας Β, βρέθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση της ενεργού δραστηριότητας της φλεγμονής με την ίνωση (ομάδα Α: p=0,013), (ομάδα Β: p=0,020). Επιπλέον, στους ασθενείς της ομάδας Β, η στατιστική ανάλυση έδειξε συσχέτιση της ενεργού δραστηριότητας με την παρουσία ή όχι του HBcAg στα ηπατοκύτταρα (p=0,010). Σε καμία από τις δύο ομάδες δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση της ίνωσης με ανοσοϊστοχημικές ή μοριακές παραμέτρους. Η έκφραση του HBcAg, όπως ανιχνεύθηκε ανοσοϊστοχημικά, είχε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με τα επίπεδα του cccdna στα ηπατοκύτταρα (ομάδα Α: p<0,001), αλλά και με το HBV DNA του ορού (ομάδα Α: p=0,025, ομάδα Β: p=0,021). Από την άλλη πλευρά, η ανοσοϊστοχημική έκφραση του HΒsAg είχε συσχέτιση με τα επίπεδα του γονιδίου S των ηπατοκυττάρων μόνο στην ομάδα Β (p<0,001). Στην ομάδα Α, τα επίπεδα του γονιδίου S των ηπατοκυττάρων είχαν σημαντική συσχέτιση με το HBV DNA του ορού (p<0,001). Τα επίπεδα του cccdna στα ηπατοκύτταρα σχετίζονταν με το HBV DNA του ορού, όταν αυτό εκτιμάτο κατά κλάσεις δηλαδή μεγαλύτερο ή μικρότερο του 10 5 IU/ml (ομάδα Α: p=0,004). Τέλος, στους ασθενείς της ομάδας Β διαπιστώθηκε συσχέτιση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης του HΒsAg με εκείνη του HΒcAg (p=0,024) και με τα επίπεδα HBV DNA του ορού (p=0,007). Τα ευρήματα της στατιστικής ανάλυσης φαίνονται στους πίνακες 9 (ομάδα Α) και 10 (ομάδα Β). 83

92 Πίνακας 9: Στατιστικά αποτελέσματα (ομάδα Α). Σημείωση: DNA ορού /κλάσεις = DNA <του 10 5 ή DNA > του 10 5 IU/ml. N/D: μη ανιχνεύσιμο, N/S: μη σημαντικό, N/A: μη εφαρμόσιμο. 84

93 Πίνακας 10: Στατιστικά αποτελέσματα (ομάδα B). Σημείωση: DNA ορού /κλάσεις = DNA <του 10 5 ή DNA > του 10 5 IU/ml. N/D: μη ανιχνεύσιμο, N/S: μη σημαντικό, N/A: μη εφαρμόσιμο. 85

94 7. Εικόνες Εικόνα 1: Χρόνια ηπατίτιδα Β. Εστία ενδολόβιας νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας. Διακρίνονται επίσης άφθονα ηπατοκύτταρα με κυτταρόπλασμα «δίκην τριμμένης υάλου» (ground glass hepatocytes). Χρώση Α&Ε (μεγέθυνση Χ 400) 86

95 Εικόνα 2: Χρόνια ηπατίτιδα Β. Γεφυροποιός νέκρωση. Χρώση Α&Ε (μεγέθυνση Χ400) Εικόνα 3: Χρόνια ηπατίτιδα Β. Διαβρωτική νέκρωση. Χρώση Α&Ε (μεγέθυνση Χ 400) 87

96 Εικόνα 4: Χρόνια ηπατίτιδα Β. Ίνωση με σχηματισμό ινωδών διαφραγματίων που συνδέουν παρακείμενα πυλαία διαστήματα. Χρώση Τρίχρωμη Masson. (μεγέθυνση Χ 200) Εικόνα 5: Χρόνια ηπατίτιδα Β. Ηπατοκύτταρα θετικά στην ανοσοϊστοχημική χρώση για HΒsAg. (μεγέθυνση Χ 200) 88

97 Εικόνα 6: Χρόνια ηπατίτιδα Β. Ηπατοκύτταρα με πυρηνική και κυτταροπλασματική θετικότητα στην ανοσοϊστοχημική χρώση για HΒcAg. (μεγέθυνση Χ 400) Εικόνα 7: Ανάλυση αποτελεσμάτων της μοριακής εξέτασης με το Opticon DNA software, version 2.01: πρότυπες καμπύλες. 89