ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ. ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Επιδημιολογική καταγραφή των ηπατικών παθήσεων στους αιμορροφιλικούς ασθενείς» Παντελιάδου Άλκηστις-Κύρα Βακαλοπούλου Σοφία Γιουλεμέ Όλγα Χάιδιτς Άννα-Μπετίνα ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ 2014

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 3 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5 1. ΑΙΜΟΣΤΑΣΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ ΑΔΡΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΔΙΑΤΑΡΑΧΩΝ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ 6 2. ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑ ΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑΣ Α ΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑΣ Β ΣΠΑΝΙΕΣ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΕΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ ΧΡΟΝΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ ΣΤΟΝ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΟ ΑΣΘΕΝΗ ΙΣΤΟΡΙΑ ΤΗΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΗΞΗΣ ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ ΙΟΓΕΝΩΝ ΗΠΑΤΙΤΙΔΩΝ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ C ΗΠΑΤΊΤΙΔΑ Β ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΑΣΦΑΛΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΗΞΗΣ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ ΓΙΑ ΚΛΑΣΜΑΤΟΠΟΙΗΣΗ Επιλογή και έλεγχος δοτών Μέθοδοι συλλογής πλάσματος Έλεγχος για λοιμογόνους παράγοντες Επεξεργασία, κατάψυξη, αποθήκευση και μεταφορά πλάσματος Αποθήκευση μονάδων μέχρι τον επανέλεγχο του δότη ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ Στάδια της παραγωγικής διαδικασίας Περαιτέρω έλεγχος για λοιμογόνους παράγοντες Τυπικές μέθοδοι κάθαρσης πρωτεϊνών πλάσματος Αδρή περιγραφή της διαδικασίας κλασματοποίησης Μέθοδοι μείωσης του ιικού φορτίου Εισαγωγή Μέθοδοι αδρανοποίησης ιών Μέθοδοι απομάκρυνσης ιών Παρασκευή παραγόντων πήξης πλάσματος Παράγοντας VIII 41 1

3 Προθρομβινικό σύμπλεγμα Μεμονωμένος παράγοντας IX Παράγοντες VII, XI και ΧΙΙΙ ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑΣ ΚΕΝΤΡΑ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΩΝ ΠΡΟΦΥΛΑΚΤΙΚΗ ΦΡΟΝΤΙΔΑ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ Κατ επίκληση και προφυλακτική θεραπεία υποκατάστασης Προϊόντα για τη θεραπεία υποκατάστασης Επιλογή θεραπείας υποκατάστασης Άλλα θεραπευτικά μέσα Επιπλοκές θεραπείας υποκατάστασης Στόχοι για το μέλλον 49 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Τύπος νόσου Βαρύτητα νόσου Ηλικία δείγματος Ηπατίτιδα Β Ηπατίτιδα C ΣΥΣΧΕΤΙΣΕΙΣ Ηλικία και επαφή με τον HBV Ηλικία και επαφή με τον HCV Ηλικία και επαφή με τους ιούς της ηπατίτιδας Β και C Βαρύτητα αιμορροφιλίας και επαφή με τους ιούς της ηπατίτιδας Β και C ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 67 2

4 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ α 2 AP AFP AIDS ALT B19V BVDV CLIA CMIA CMV DEAE- DNA EASL EBV EIA EMA EUHASS FI FIa FII FIIa FV FVa FVII FVIIa FVIII FVIII FIX FIXa FX FXa FXI FXIII FDA FFP ggt GPIba GPVI HAV HAART HBcAb HBeAb HBeAg α 2 -antiplasmin a-fetoprotein Acquired immunodeficiency syndrome Alanine transaminase Parvovirus B19 Bovine viral diarrhea virus Chemiluminescent immunoassay Chemiluminescent microparticle immunoassay Cytomegalovirus Diethylaminoethyl- Deoxyribonucleic acid European Association for the Study of the Liver Epstein-Barr virus Enzyme immunoassay European Medicines Agency European Haemophilia Safety Surveillance System Factor I (fibrinogen) Factor I activated (fibrin) Factor II (prothrombin) Factor II activated (thrombin) Factor V Factor V activated Factor VII Factor VII activated Factor VIII Factor VIII activated Factor IX Factor IX activated Factor X Factor X activated Factor XI Factor XIII Food and Drug Administration Fresh frozen plasma gamma-glutamyltransferase Glycoprotein Iba Glycoprotein VI Hepatitis A virus Highly active anti-retroviral therapy Hepatitis B core antibody Hepatitis B e antibody Hepatitis B e antigen 3

5 HBsAb Hepatitis B surface antibody HBsAg Hepatitis B surface antigen HBV Hepatitis B virus HCV Hepatitis C virus HDV Hepatitis D virus HIV Human immunodeficiency virus HNF-4 Hepatocyte nuclear factor-4 HSV Herpes simplex virus HTLV Human T-lymphotropic virus ICD-10 International Classification of Diseases -10 ID-NAT Individual- Nucleic acid testing IgM Immunoglobulin M IgG Immunoglobulin G IU International Unit MP-NAT Minipool- Nucleic acid testing NAT Nucleic acid testing NRAs National Regulatory Authorities PAI-1 Plasminogen activator inhibitor -1 PCR Polymerase chain reaction PIC/S Pharmaceutical Inspection Convention and Pharmaceutical Inspection Cooperation Scheme PRV Pseudorabies virus QSEAL Quality Standards of Excellence, Assurance, and Leadership RNA Ribonucleic acid S/D Solvent/detergent SGPT Serum glutamic-pyruvate transaminase SINV Sindbis Virus SPSS Statistical package for the social sciences SVR Sustained virological response TAFI Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor TMA Transcription mediated amplification TF Tissue factor tpa Tissue plasminogen activator vcjd variant Creutzfeldt-Jacob disease vwf von Willebrand Factor WFH World Federation of Hemophilia WHO World Health Organization WNV West Nile virus 4

6 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΑΙΜΟΣΤΑΣΗ 1.1. ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ Ο μηχανισμός της αιμόστασης είναι ζωτικής σημασίας για τον ανθρώπινο οργανισμό, καθώς αποτρέπει την υπέρμετρη απώλεια αίματος μετά από τραυματισμό ενός αγγείου. Ως αιμόσταση ορίζεται η διαδικασία διαμέσου της οποίας ελέγχεται η αιμορραγία σε οποιαδήποτε θέση λύσης της συνέχειας του ενδοθηλίου. Πρόκειται για μια δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ της υπενδοθηλιακής στιβάδας, του ενδοθηλίου, των κυκλοφορούντων κυττάρων και των πρωτεϊνών του πλάσματος. Αμέσως μετά τον τραυματισμό ενός αγγείου, πλασματικές και κυτταρικές συνιστώσες επιστρατεύονται και ενεργοποιούνται με σκοπό την ελάττωση της αιμορραγίας και την έναρξη της αγγειακής αποκατάστασης. Η διαδικασία της αιμόστασης διαιρείται για λόγους καλύτερης κατανόησης σε δύο φάσεις: την πρωτογενή και τη δευτερογενή αιμόσταση. Ωστόσο, οι φάσεις αυτές in vivo είναι άρρηκτα συνδεδεμένες και εξελίσσονται αλληλοδιάδοχα. 1 Η πρωτογενής αιμόσταση διαμεσολαβείται από την τοπική έκλυση ενεργών αγγειοδραστικών ουσιών που προκαλούν αγγειοσύσπαση και, κατά συνέπεια, ελάττωση της ροής του αίματος. Λόγω της αγγειακής βλάβης, η υπενδοθηλιακή στιβάδα και διάφορες προπηκτικές πρωτεΐνες, όπως ο ιστικός παράγοντας και το κολλαγόνο, εκτίθενται και έρχονται σε επαφή με το αίμα. Τα αιμοπετάλια προσδένονται στον παράγοντα von Willebrand (von Willebrand Factor, vwf), που είναι ενσωματωμένος στο υπενδοθήλιο, διαμέσου της γλυκοπρωτεΐνης Iba (GPIba) που εκφράζουν, και, έτσι, σχηματίζουν ένα στρώμα πάνω από το εκτεθειμένο υπενδοθήλιο (αιμοπεταλιακή προσκόλληση). Ακολούθως, τα αιμοπετάλια ενεργοποιούνται μέσω υποδοχέων τους, όπως οι υποδοχείς κολλαγόνου, γλυκοπρωτεΐνη IV (GPVI) και ιντεγκρίνη α 2 β 1. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη μετακίνηση και αύξηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου, την ενεργοποίηση του υποδοχέα του ινωδογόνου (ιντεγκρίνη α IIb β 3 ) και την επακόλουθη αιμοπεταλιακή συσσώρευση. 1,2 Η δευτερογενής αιμόσταση ξεκινά με την έκθεση του ιστικού παράγοντα (tissue factor, TF) στο υπενδοθήλιο και στο τραυματισμένο ενδοθήλιο. Ο TF συνδέεται με τον κυκλοφορούντα σε μικρές ποσότητες ενεργοποιημένο παράγοντα VII (FVIIa) και σχηματίζει το σύμπλεγμα TF:FVIIa, το οποίο ενεργοποιεί τον παράγοντα Χ (FX) σε δραστικό παράγοντα Χ (FXa). Πρόκειται για την εξωγενή οδό ενεργοποίησης του FX. Ακολούθως, το σύμπλεγμα TF:FVIIa:FXa μετατρέπει μια μικρή ποσότητα προθρομβίνης (παράγοντας ΙΙ ή FII) σε θρομβίνη (ενεργοποιημένος παράγοντας ΙΙ ή FIIa), προκαλώντας μια αρχική αύξηση της θρομβίνης, ικανή να αποσπάσει τον παράγοντα VIII (FVIII) από τον vwf και να οδηγήσει σε ενίσχυση των διαφόρων αντιδράσεων της πήξης, μέσω ενεργοποίησης παραγόντων πήξης, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων VIII (FVIII), IX (FIX) και XI (FXI). Στις αντιδράσεις αυτές περιλαμβάνεται και η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, με αποτέλεσμα την έκφραση του επιφανειακού παράγοντα V (FV) και την ενεργοποίησή του σε FVa. Ο ενεργοποιημένος παράγοντας FIX (FIXa), που προκύπτει από αυτές τις αντιδράσεις, προσδένεται στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων. Ο ενεργοποιημένος FVIII (FVIIIa) σε σύμπλεγμα με τον FIXa αποτελεί την ενδογενή οδό ενεργοποίησης της πήξης και μετατρέπει μεγάλες ποσότητες FX σε FXa (ενδογενής οδός ενεργοποίησης του FX), ο οποίος, μαζί με τον FVa που βρίσκεται 5

7 στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων, προκαλεί την παραγωγή μεγαλύτερης ποσότητας θρομβίνης, ικανής να μετατρέψει το ινωδογόνο (παράγοντας Ι ή FI) σε ινική (ενεργοποιημένος παράγοντας Ι ή FIa) και επομένως να οδηγήσει στο σχηματισμό θρόμβου. Ο θρόμβος αυτός σταθεροποιείται από τον παράγοντα ΧΙΙΙ (FXIII) που ενεργοποιείται από τη θρομβίνη και από τον αναστολέα της ινωδόλυσης που ενεργοποιείται επίσης από τη θρομβίνη (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor, TAFI). 2,3 Τελικά, ο θρόμβος υφίσταται ινωδόλυση και έτσι αποκαθίσταται η φυσιολογική αρχιτεκτονική του αγγείου. Ο ινωδολυτικός μηχανισμός πυροδοτείται με την έκλυση του ιστικού ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (tissue plasminogen activator, tpa) στη θέση της βλάβης. Ο tpa μετατρέπει το πλασμινογόνο σε πλασμίνη, η οποία αλληλεπιδρά με κατάλοιπα λυσίνης και αργινίνης της ινικής και τη διασπά σε διαλυτά προϊόντα. 4 Τόσο ο αιμοστατικός όσο και ο ινωδολυτικός μηχανισμός ρυθμίζονται από αναστολείς που περιορίζουν τις παραπάνω διεργασίες στη θέση του αγγειακού τραυματισμού και εξαλείφουν τις διάφορες αντιδράσεις, ώστε να αποτραπεί η καθολική ενεργοποίηση και η παθολογική επέκταση των φαινομένων. Η αιμόσταση αναστέλλεται με τρεις κύριους μηχανισμούς που διαμεσολαβούνται από την αντιθρομβίνη, το σύμπλοκο των πρωτεϊνών C και S, και τον αναστολέα της οδού του ιστικού παράγοντα. Η ινωδόλυση αναστέλλεται κυρίως από τον αναστολέα 1 του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (plasminogen activator inhibitor -1, PAI-1) και από την α 2 -αντιπλασμίνη (α 2 -antiplasmin, α 2 AP) ΑΔΡΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΩΝ ΔΙΑΤΑΡΑΧΩΝ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ Οι διαταραχές του πηκτικού μηχανισμού είναι συνήθως κληρονομικές και μπορεί να αφορούν τα στοιχεία της πρωτογενούς αιμόστασης, δηλαδή τα αγγεία, τα αιμοπετάλια ή τον vwf, οπότε και εκδηλώνονται κυρίως με αιμορραγίες στους βλεννογόνους και το δέρμα, ή να αφορούν τα στοιχεία της δευτερογενούς αιμόστασης, δηλαδή τους παράγοντες πήξης, οπότε και εκδηλώνονται με ποικίλη συμπτωματολογία, αλλά κυρίως με μυϊκά αιματώματα, αίμαρθρα, οπισθοπεριτοναϊκές και ενδοκράνιες αιμορραγίες. 1 Αυτή η αιμορραγική διάθεση εμφανίζεται, όταν ένας ή περισσότεροι παράγοντες πήξης απουσιάζουν πλήρως ή είναι ελαττωμένοι σε βαθμό κάτω από 40% του φυσιολογικού ή δυσλειτουργούν. Παρουσία παράγοντα σε ποσοστό 100% σημαίνει ότι σε κάθε 1 ml πλάσματος υπάρχει μία διεθνής μονάδα (International Unit ή IU) παράγοντα πήξης. Από την παραπάνω περιγραφή του πηκτικού μηχανισμού γίνεται φανερό ότι οι FVIII και FIX, που εμπλέκονται στην ενδογενή οδό της πήξης, παίζουν σημαντικό ρόλο στην παραγωγή θρομβίνης και στον τελικό σχηματισμό του θρόμβου. Απουσία, μείωση ή δυσλειτουργία αυτών οδηγεί σε μειωμένη παραγωγή θρομβίνης στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων στην περιοχή αγγειακού τραυματισμού. Ανεπαρκής παραγωγή θρομβίνης οδηγεί σε σχηματισμό ενός θρόμβου με φτωχή δομική συνοχή. Επιπροσθέτως, η ανεπάρκεια θρομβίνης οδηγεί σε μειωμένη παραγωγή FXIIIa που χρειάζεται για τη σύνδεση των μονομερών ινικής, καθώς και σε μειωμένη παραγωγή TAFI. Τα δύο τελευταία γεγονότα έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός θρόμβου που δεν είναι ανθεκτικός στη φυσιολογική ινωδόλυση. Κατά συνέπεια, οι ανεπάρκειες των FVIII και FIX οδηγούν σε ασταθώς σχηματισμένους θρόμβους που είναι επιρρεπείς στη φυσιολογική ινωδόλυση. Αυτό κλινικά «μεταφράζεται» ως αιμορραγική διάθεση στην αιμορροφιλία. 1 6

8 Σύμφωνα με τη δέκατη αναθεώρηση της Διεθνούς Στατιστικής Ταξινόμησης Νόσων και Συναφών Προβλημάτων Υγείας (International Classification of Diseases - 10, ICD-10), που εκδόθηκε το 2008 από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (World Health Organization, WHO), στην κατηγορία «Διαταραχές της πήξης του αίματος, πορφύρα και άλλες αιμορραγικές καταστάσεις» (D65-D69) κατατάσσονται οι εξής παθήσεις: διάχυτη ενδαγγειακή πήξη (D65), κληρονομική ανεπάρκεια του παράγοντα VIII (D66), κληρονομική ανεπάρκεια του παράγοντα IX (D67), άλλες διαταραχές της πήξης του αίματος (D68), όπως νόσος von Willebrand, κληρονομική ανεπάρκεια του παράγοντα XI, κληρονομική ανεπάρκεια άλλων παραγόντων της πήξης, αιμορραγικές διαταραχές που οφείλονται σε κυκλοφορούντα αντιπηκτικά, επίκτητη ανεπάρκεια παράγοντα της πήξης και άλλες, και, τέλος, πορφύρα και άλλες αιμορραγικές καταστάσεις (D69) ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑ 2.1. ΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑΣ Α Η αιμορροφιλία Α είναι μια κληρονομική, Χ-φυλοσύνδετη υπολειπόμενη διαταραχή, που προκαλείται από την έλλειψη λειτουργικού παράγοντα FVIII της πήξης λόγω μεταλλάξεων στο γονίδιο αυτού. 6 Σε αυτήν την διαταραχή μπορούν να οδηγήσουν, επίσης, αυτόματες μεταλλάξεις ή επίκτητοι ανοσολογικοί μηχανισμοί (ανάπτυξη αυτοαντισώματος εναντίον του FVIII). 7 Φαίνεται ότι το 1/3 των περιπτώσεων οφείλεται σε νέες, αυτόματες μεταλλάξεις, οπότε και έχει αρνητικό οικογενειακό ιστορικό. Η βαρύτητα της κλινικής εικόνας της αιμορροφιλίας Α σχετίζεται με τα επίπεδα του FVIII. Έτσι, ασθενείς με επίπεδα φυσιολογικού παράγοντα κάτω από 1% (<0,01IU/ml) έχουν σοβαρή νόσο, ασθενείς με επίπεδα 1-5% (0,01-0,05IU/ml) έχουν νόσο μέτριας βαρύτητας, ενώ ασθενείς με επίπεδα φυσιολογικού παράγοντα πάνω από 5%, αλλά κάτω από 40% (>0,05 έως <0,40IU/ml) έχουν ήπια νόσο. 1,8 Η σοβαρή νόσος συνήθως εμφανίζεται σε παιδιά ηλικίας κάτω του ενός έτους, σχετίζεται με σοβαρές αιμορραγικές εκδηλώσεις, και αφορά στο 43-70% των ασθενών με αιμορροφιλία Α. Η νόσος μέτριας βαρύτητας εμφανίζεται συνήθως σε παιδιά ενός έως δύο ετών, εκδηλώνεται με αιμορραγία μετά από μικροτραυματισμούς, και αφορά στο 15-26% των περιπτώσεων. Τέλος, η ήπια νόσος εμφανίζεται σε παιδιά άνω των δύο ετών, εκδηλώνεται με αιμορραγία μόνο μετά από σοβαρό τραύμα ή επέμβαση, και αφορά στο 15-31% των περιπτώσεων. Ωστόσο, κάποιοι ασθενείς με σοβαρή νόσο παρουσιάζουν ηπιότερη κλινική πορεία. 9 Αυτό σε ένα μικρό ποσοστό ασθενών με σοβαρή αιμορροφιλία Α οφείλεται σε ταυτόχρονη κληρονόμηση της μετάλλαξης του παράγοντα V Leiden και άλλων προθρομβωτικών δεικτών, γεγονός το οποίο μερικώς αντιρροπεί την αιμορραγική τάση, με αποτέλεσμα λιγότερα αιμορραγικά επεισόδια και καθυστέρηση της εμφάνισης της πρώτης αιμορραγίας ΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑΣ Β Η αιμορροφιλία Β εμφανίζει τον ίδιο τύπο κληρονομικότητας με την αιμορροφιλία Α και προκαλείται από την έλλειψη λειτουργικού παράγοντα FΙΧ της πήξης, που οφείλεται σε ποικίλες βλάβες του γονιδίου του. 6 Όπως και η αιμορροφιλία Α, έτσι και η αιμορροφιλία Β μπορεί να προκληθεί από αυτόματες μεταλλάξεις ή επίκτητους ανοσολογικούς μηχανισμούς. 1 7

9 Η ταξινόμηση της βαρύτητας της αιμορροφιλίας Β γίνεται με βάση τα επίπεδα του παράγοντα ΙΧ. Και για αυτόν τον τύπο αιμορροφιλίας ισχύει η κατάταξη της σοβαρότητας της νόσου που αναφέρθηκε παραπάνω. Δηλαδή, η νόσος χαρακτηρίζεται ως ήπια, μέτριας βαρύτητας ή βαριά, εάν τα επίπεδα του φυσιολογικού παράγοντα ΙΧ είναι αντίστοιχα κάτω από 1%, 1-5% ή πάνω από 5% και κάτω από 40%. 1 44% των πασχόντων από αιμορροφιλία Β έχουν επίπεδα παράγοντα ΙΧ κάτω από 1%. Ο φαινότυπος Leyden της αιμορροφιλίας Β χαρακτηρίζεται από σοβαρή νόσο στην παιδική ηλικία, η οποία γίνεται ήπια μετά την εφηβεία, καθώς η μετάλλαξη στον προαγωγέα εμποδίζει τη σύνδεση του πυρηνικού παράγοντα-4 των ηπατοκυττάρων (hepatocyte nuclear factor-4, HNF-4), αλλά όχι και τη σύνδεση ενός στοιχείου εξαρτώμενου από τα ανδρογόνα. 11 Η αιμορροφιλία Α και η αιμορροφιλία Β δεν είναι κλινικά διακριτές. Οι αιμορροφιλικοί τύπου Α και Β με παρόμοια βαρύτητα νόσου εμφανίζουν αιμορραγικές εκδηλώσεις με παρόμοια συχνότητα. Έτσι, οι ασθενείς με ήπια μορφή νόσου συνήθως αιμορραγούν σημαντικά μόνο μετά από τραυματισμό ή χειρουργική επέμβαση, ενώ οι ασθενείς με βαριά μορφή νόσου εμφανίζουν συχνά επεισόδια αυτόματης ή εκτεταμένης αιμορραγίας, ιδιαιτέρως στις αρθρώσεις και τους μυς, μετά από ελάχιστο τραυματισμό ΣΠΑΝΙΕΣ ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΕΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ Ανεπάρκειες άλλων πηκτικών παραγόντων που διαδραματίζουν ρόλο στην παραγωγή θρομβίνης και στην σταθεροποίηση του θρόμβου ή στην αναστολή της ινωδόλυσης μπορεί επίσης να οδηγήσουν σε αιμορραγική διάθεση. Τέτοιες ανεπάρκειες αφορούν στο ινωδογόνο (FI), την προθρομβίνη (FII), τους FV, FV/FVIII, FVII, FX, FXI και FXIII. Η σοβαρότητα των αιμορραγικών επεισοδίων συνήθως σχετίζεται με τα επίπεδα του παράγοντα, με εξαίρεση την ανεπάρκεια του FXI, στην οποία ακόμα και ασθενείς με σοβαρή έλλειψη εμφανίζουν ποικίλη αιμορραγική διάθεση. Παρόλο που και οι ανεπάρκειες των FVIII και FIX κατατάσσονται στα σπάνια νοσήματα, οι ανεπάρκειες αυτών των παραγόντων είναι πολύ πιο σπάνιες. Όπως οι αιμορροφιλίες, έτσι και τα νοσήματα αυτά οφείλονται είτε σε γονιδιακή βλάβη που οδηγεί σε μειωμένη ή ελαττωματική παραγωγή της πρωτεΐνης είτε σε επίκτητη κατάσταση. Τα γονίδια των εν λόγω παραγόντων εντοπίζονται στα σωματικά χρωμοσώματα και ο τρόπος κληρονόμησης είναι αυτοσωματικός υπολειπόμενος. Η κλινική εικόνα και η ηλικία διάγνωσης ποικίλει και εξαρτάται από το είδος του παράγοντα που απουσιάζει και από τα επίπεδά του. Μπορεί να υπάρχει γνωστό οικογενειακό ιστορικό, αν και αυτό είναι σπάνιο σε νοσήματα κληρονομούμενα με τον αυτοσωματικό υπολειπόμενο χαρακτήρα, εκτός αν υπάρχει πάσχων αδερφός. Επομένως συνήθως η διάγνωση τίθεται μετά από αιμορραγικό επεισόδιο, που μπορεί να κυμαίνεται από ήπια αιμορραγία του δέρματος ή των βλεννογόνων μέχρι ενδοκράνια αιμορραγία. Για τη θεραπεία των ανεπαρκειών αυτών υπάρχουν μόνο λίγα εξειδικευμένα συμπυκνώματα παραγόντων πήξης. 1, ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Οι αιμορροφιλίες Α και Β συμπεριλαμβάνονται μεταξύ των σπάνιων παθήσεων. Η αιμορροφιλία Α είναι η πιο κοινή Χ-φυλοσύνδετη γενετική νόσος. Μετά τη νόσο von Willebrand, που είναι η πιο συχνή διαταραχή του πηκτικού μηχανισμού, αποτελεί τη δεύτερη συχνότερη ανεπάρκεια παράγοντα πήξης, και περίπου 80-85% των αιμορροφιλικών πάσχουν από αιμορροφιλία Α. Από αυτούς, περίπου τα 2/3 έχουν σοβαρή νόσο. Η επίπτωση της νόσου αυτής παγκοσμίως είναι περίπου 1 περίπτωση 8

10 ανά 5000 άρρενες. 14 Ο επιπολασμός της αιμορροφιλίας Α ποικίλει στα διάφορα κράτη και κυμαίνεται από 5,4 έως 14,5 περιπτώσεις ανά άρρενες. 15 Η αιμορροφιλία Β συναντάται πολύ σπανιότερα από την αιμορροφιλία Α. Η σχέση μεταξύ αιμορροφιλίας Α και Β είναι 4 προς 1 και η αιμορροφιλία Β είναι 4-6 φορές σπανιότερη από την αιμορροφιλία Α. Περίπου 14% των αιμορροφιλικών πάσχουν από αιμορροφιλία Β. Από αυτούς, περίπου οι μισοί έχουν επίπεδα παράγοντα πάνω από 1%, δηλαδή πάσχουν από νόσο ήπιας ή μέτριας βαρύτητας. Η επίπτωση της αιμορροφιλίας Β ανέρχεται σε 1 περίπτωση ανά άρρενες, ενώ ο επιπολασμός της νόσου είναι 5,3 περιπτώσεις ανά άρρενες. 14 Από τα παραπάνω γίνεται φανερό ότι επί του συνόλου των αιμορροφιλικών, μόνο το 1-6% πάσχουν από διάφορες άλλες σπάνιες ελλείψεις παραγόντων. Ο επιπολασμός τους κυμαίνεται από 1 έως 2 περιπτώσεις ανά εκατομμύριο πληθυσμού. Η αναλογική κατανομή όλων των αιμορραγικών διαθέσεων παγκοσμίως το 2012 φαίνεται στην Εικόνα 1, όπως καταγράφηκε από την Παγκόσμια Οργάνωση Αιμορροφιλίας. 16 Αιμορροφιλία Α Νόσος von Willebrand Αιμορροφιλία Β Άγνωστος τύπος Αιμορροφιλίας Άλλες αιμορραγικές διαταραχές Εικόνα 1 Τα δεδομένα της τελευταίας ετήσιας μελέτης που εξέδωσε η Παγκόσμια Οργάνωση Αιμορροφιλίας δείχνουν ότι το 2012 καταγράφηκαν παγκοσμίως ασθενείς με αιμορροφιλία Α ή Β (συμπεριλαμβάνονται και οι ασθενείς με άγνωστο τύπο) και ασθενείς με νόσο Willebrand. Οι αιμορροφιλικοί τύπου Α ανέρχονταν σε και οι τύπου Β σε Παρατηρείται μια σταδιακή αύξηση του συνολικού αριθμού των αιμορροφιλικών από το 1999 σε το 2012, που οφείλεται κατά κύριο λόγο στην αύξηση της διάγνωσης της νόσου, της καταγραφής των περιπτώσεων και του μέσου όρου ηλικίας των ασθενών. Ενδεικτικά στοιχεία για κάποια άλλα κράτη παρατίθενται στον Πίνακα 1. Για αρκετά κράτη της Αφρικής και ορισμένα της Ασίας τα δεδομένα είναι ελλιπή. Ωστόσο, το 91% του παγκόσμιου πληθυσμού καλύπτονταν από τα 109 κράτη που συμμετείχαν στην έρευνα. 16 9

11 Κράτος Πληθυσμός Αριθμός αιμορροφιλικών Ελλάδα ΗΠΑ Ηνωμένο Βασίλειο Καναδάς Βραζιλία Ινδία Κίνα Γαλλία Ρωσία Γερμανία Πίνακας 1 16 Από την ίδια πηγή φαίνεται ότι στην Ελλάδα το 2012 καταγράφηκαν 912 αιμορροφιλικοί, 836 ασθενείς με νόσο von Willebrand και 246 ασθενείς με άλλες αιμορραγικές διαταραχές (σπάνιες ανεπάρκειες παραγόντων πήξης, θρομβασθένειες και άλλες αιμοπεταλιακές διαταραχές). Περισσότερες λεπτομέρειες για τον αριθμό των πασχόντων ανά τύπο νόσου και ανά ηλικιακή ομάδα αναγράφονται στους Πίνακες 2 και 3. Από τους 761 ασθενείς με αιμορροφιλία Α, οι 271 εμφάνιζαν σοβαρή νόσο, οι 132 νόσο μέτριας βαρύτητας, ενώ οι υπόλοιποι ήπια νόσο. Σύμφωνα με το Εθνικό αρχείο καταγραφής, μεταξύ 147 ασθενών με αιμορροφιλία Β, οι 47 έχουν βαριά μορφή νόσου, οι 30 μέτριας βαρύτητας νόσο και οι 70 ήπια νόσο. 16 Τύπος νόσου Αριθμός πασχόντων Αιμορροφιλία Α 761 Αιμορροφιλία Β 151 Ανεπάρκεια FI 19 Ανεπάρκεια FII 1 Ανεπάρκεια FV 16 Ανεπάρκεια FVII 74 Ανεπάρκεια FX 6 Ανεπάρκεια FXI 70 Ανεπάρκεια FXIII 12 Πίνακας 2 16 Ηλικιακή ομάδα Αριθμός αιμορροφιλικών Α Αριθμός αιμορροφιλικών Β 0-4 ετών ετών ετών ετών ετών Άγνωστη ηλικία 22 6 Πίνακας

12 Η αιμορροφιλία μπορεί να εμφανιστεί εξίσου σε όλες τις φυλές και εθνικότητες. Καθώς η αιμορροφιλία είναι Χ-φυλοσύνδετο υπολειπόμενο νόσημα, όλα τα θήλεα τέκνα ενός αιμορροφιλικού πατέρα είναι υποχρεωτικά φορείς, ενώ όλα τα άρρενα τέκνα αυτού είναι υγιή. Από την άλλη πλευρά, τα θήλεα τέκνα μιας μητέρας-φορέα έχουν 50% πιθανότητα να είναι φορείς της νόσου, ενώ τα άρρενα τέκνα αυτής έχουν 50% πιθανότητα να πάσχουν από αιμορροφιλία. Επομένως, γίνεται φανερό, ότι η αιμορροφιλία, ως Χ-φυλοσύνδετο νόσημα, εκδηλώνεται κυρίως στους άρρενες. Έτσι, άνδρες με ένα μόνο αντίγραφο του παθολογικού παράγοντα VIII ή IX στο μοναδικό Χ χρωμόσωμά τους εμφανίζουν αιμορραγικές εκδηλώσεις. Οι άρρενες εντός μίας οικογένειας έχουν το ίδιο επίπεδο ανεπάρκειας παράγοντα, αφού φέρουν την ίδια γονιδιακή βλάβη. 1,12 Σύμφωνα με την Παγκόσμια Οργάνωση Αιμορροφιλίας, η αιμορροφιλία Α εμφανίζεται σε άνδρες σε ποσοστό 91% και η αιμορροφιλία Β σε ποσοστό 92%. Αντιθέτως, οι σπάνιες ανεπάρκειες παραγόντων πήξης που είναι αυτοσωματικά υπολειπόμενα νοσήματα εμφανίζονται εξίσου και στα δύο φύλα. 16 Οι γυναίκες συνήθως είναι ασυμπτωματικοί φορείς, αφού φέρουν ένα προσβεβλημένο και ένα φυσιολογικό Χ χρωμόσωμα, και εμφανίζουν ποικίλα επίπεδα παράγοντα. Ωστόσο, σπανίως, μπορεί να εμφανίσουν και οι γυναίκες-φορείς ήπιες αιμορραγικές εκδηλώσεις, εάν έχουν επίπεδα παράγοντα παρόμοια με αυτά της ήπιας αιμορροφιλίας (δηλαδή κάτω του αναμενόμενου ελάχιστου 50%), λόγω μη τυχαίας αδρανοποίησης του Χ χρωμοσώματος. Ακόμη χαμηλότερα επίπεδα παράγοντα και κατά συνέπεια πλήρης κλινική εκδήλωση νόσου σε γυναίκα μπορεί να οφείλονται σε ομοζυγωτία για το αιμορροφιλικό γονίδιο (αιμορροφιλικός πατέρας και μητέρα φορέας ή δύο ανεξάρτητες μεταλλάξεις ή συνδυασμός κληρονομικότητας και νέων μεταλλάξεων), ή σε εντονότερη απενεργοποίηση του φυσιολογικού γονιδίου στο ένα Χ χρωμόσωμα σε σχέση με το παθολογικό κατά τη διάρκεια τη πρώιμης εμβρυογένεσης, ή σε μονογονεϊκή ισοδισωμία (κληρονόμηση και των δύο φυλετικών χρωμοσωμάτων από τον έναν γονέα), ή, τέλος, σε σύνδρομο Turner (XO) και περιπτώσεις Χ μωσαϊκισμού. 17,18 Επίκτητοι αναστολείς των παραγόντων VIII και IX μπορούν να αναπτυχθούν και στα δύο φύλα ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ Η αιμορροφιλία είχε περιγραφεί από τους αρχαίους χρόνους. Το Ταλμούδ, που είναι συλλογή εβραϊκών κειμένων από τον 2 ο αιώνα μ.χ., όριζε ότι δεν έπρεπε να διενεργείται περιτομή στα άρρενα βρέφη εάν δύο αδερφοί αυτών είχαν ήδη πεθάνει από ανεξέλεγκτη αιμορραγία μετά από τη διαδικασία της περιτομής. Έτσι, ήδη από την εποχή αυτή η αιμορροφιλία είχε αναγνωριστεί ως θανατηφόρα συγγενής αιμορραγική διάθεση. Πολύ αργότερα, ο Άραβας ιατρός Albucasis, ο οποίος έζησε τον 12 ο αιώνα, περιέγραψε μια οικογένεια, της οποίας τα άρρενα μέλη πέθαναν από αιμορραγία μετά από ασήμαντο τραυματισμό. 12 Ωστόσο, μόλις τον 19ο αιώνα αναπτύχτηκε η έρευνα πάνω στο κληρονομικό αυτό νόσημα. Η πρώτη σύγχρονη περιγραφή της αιμορροφιλίας έγινε από τον John Conrad Otto, έναν ιατρό από τη Φιλαδέλφεια, ο οποίος το 1803 δημοσίευσε μια έκθεση αναφορικά με μια αιμορραγική διάθεση που παρατηρείται σε συγκεκριμένες οικογένειες. Στην έκθεση αυτή αναγνώριζε σαφώς τους κύριους χαρακτήρες της αιμορροφιλίας, αφού περιέγραφε μια κληρονομική τάση προς αιμορραγία που εμφανίζονταν σε άνδρες. 19 Ακολούθησε η πρώτη ανασκόπηση της αιμορροφιλίας από τον Nasse το

13 Ο όρος «αιμορροφιλία» ( hemophilia ) χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά σε μια γραπτή αναφορά του Hopff το 1828 στο Πανεπιστήμιο της Ζυρίχης. Η αιμορραγική διάθεση στην αιμορροφιλία αρχικά αποδίδονταν σε ευθραυστότητα των αιμοφόρων αγγείων. Το 1840 αποδείχτηκε ότι η αιμορροφιλία οφείλονταν στην έλλειψη κάποιου στοιχείου από το αίμα, αφού η αιμορραγική διαταραχή διορθώνονταν με μετάγγιση ολικού αίματος. Ο Wright απέδειξε την ύπαρξη εργαστηριακού ελλείμματος στην πήξη του αίματος το Ακολούθως, το 1911 δείχτηκε ότι το φυσιολογικό πλάσμα μπορούσε να μειώσει το χρόνο πήξης του ολικού αίματος αιμορροφιλικού ασθενούς. Αργότερα, το 1937, οι Patek και Taylor από το Πανεπιστήμιο Χάρβαρντ παρατήρησαν ότι ένας παράγοντας του φυσιολογικού πλάσματος επιτάχυνε την πήξη του αιμορροφιλικού αίματος και οδηγούσε σε διόρθωση της βλάβης. Ο παράγοντας αυτός ονομάστηκε αντιαιμορροφιλική σφαιρίνη. Επρόκειτο για τον FVIII. Μέθοδος μέτρησης του FVIII εισήχθη το Την εποχή εκείνη δεν ήταν ακόμη γνωστή η στενή σχέση μεταξύ του FVIII και του vwf. Για πρώτη φορά το 1953 περιγράφηκαν τα μειωμένα επίπεδα FVIII σε ασθενείς με ανεπάρκεια vwf. Η περαιτέρω έρευνα από το Nilson και τους συνεργάτες του αποσαφήνισε την αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο αυτών παραγόντων πήξης. 20,21 Το 1944 ο Pavlosky από το Μπουένος Άιρες έδειξε ότι το αίμα ενός αιμορροφιλικού μπορεί να διορθώσει το έλλειμμα στην πηκτική οδό ενός άλλου αιμορροφιλικού και αντιστρόφως. 22 Επρόκειτο προφανώς για δύο ασθενείς με έλλειψη διαφορετικής πρωτεΐνης της πήξης. Με βάση αυτή και άλλες παρόμοιες παρατηρήσεις, το 1952 αναγνωρίστηκε ότι κάποιες περιπτώσεις αιμορροφιλίας οφείλονταν στην έλλειψη ενός άλλου παράγοντα πήξης διαφορετικού από αυτόν που έλειπε στην μέχρι τότε γνωστή αιμορροφιλία. 12 Έτσι περιγράφηκε η ανεπάρκεια του FIX και αυτός ο τύπος αιμορροφιλίας ονομάστηκε αιμορροφιλία Β για να διακριθεί από την περισσότερο συνήθη αιμορροφιλία Α. Η αιμορροφιλία Β συχνά αναφέρονταν ως νόσος Christmas, από το επώνυμο του πρώτου πάσχοντος παιδιού που μελετήθηκε λεπτομερώς. Η αιμορροφιλία μερικές φορές χαρακτηρίζεται ως «βασιλική νόσος», καθώς αρκετά μέλη βασιλικών οικογενειών στην Ευρώπη εμφάνιζαν τη νόσο, επειδή η Βικτώρια, βασίλισσα της Αγγλίας από το 1837 έως το 1901, ήταν φορέας αιμορροφιλίας Β. Ο Λεοπόλδος, όγδοος υιός αυτής, ήταν αιμορροφιλικός, εμφάνιζε συχνά αιμορραγικά επεισόδια και πέθανε από εγκεφαλική αιμορραγία στην ηλικία των 31 ετών. Η Αλίκη και η Βεατρίκη, δύο κόρες της βασίλισσας Βικτωρίας, ήταν φορείς αιμορροφιλίας Β και μετέδωσαν τη νόσο στις βασιλικές οικογένειες της Ισπανίας, της Γερμανίας και της Ρωσίας. 23,24 Όλες οι παραπάνω ανακαλύψεις συνέβαλαν στην αναγνώριση της νόσου και της παθογένειάς της και επέτρεψαν την ακριβή διάγνωση αυτής, χτίζοντας τη βάση για τη σύγχρονη θεραπεία αυτής της αιμορραγικής διαταραχής ΧΡΟΝΟΛΟΓΙΚΗ ΕΞΕΛΙΞΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ Μετά την πρόοδο που έγινε στην αναγνώριση της νόσου, την κατανόηση της παθογένειάς της και την ακριβή διάγνωση αυτής, οι προσπάθειες στράφηκαν στην αντιμετώπισή της. Τη δεκαετία του 1950 και στις αρχές της δεκαετίας του 1960 ο μόνος τρόπος αντιμετώπισης των αιμορροφιλικών ήταν η χορήγηση ολικού αίματος ή νωπού κατεψυγμένου πλάσματος. Όμως, τα προϊόντα αυτά δεν περιέχουν ποσότητα FVIII ή FIX ικανή να σταματήσει μια σοβαρή αιμορραγία. Για το λόγο αυτό οι περισσότεροι βαρέως πάσχοντες αιμορροφιλικοί πέθαιναν κατά την παιδική ηλικία ή τα πρώτα χρόνια της ενήλικης ζωής λόγω εκσεσημασμένης αιμορραγίας 12

14 μετά από τραύμα ή χειρουργική επέμβαση ή λόγω αιμορραγίας σε ζωτικά όργανα, ιδιαίτερα στον εγκέφαλο. Η αιμορραγία αποτελούσε την εποχή εκείνη τη συχνότερη αιτία θανάτου στην ομάδα αυτή των ασθενών. 25 Ήδη από τις αρχές της δεκαετίας του 1940, υπό την πίεση ανάπτυξης προϊόντων για τη θεραπεία των τραυματιών πολέμου, είχαν ξεκινήσει οι προσπάθειες κλασματοποίησης του πλάσματος, με σκοπό την παρασκευή παραγώγων (αλβουμίνη, ανοσοσφαιρίνες, παράγοντες πήξης, αναστολείς πρωτεασών). Τότε, ο Edwin Cohn περιέγραψε μια μέθοδο κλασματοποίησης του πλάσματος με αιθανόλη προς απομόνωση των συστατικών του. Αργότερα ανακαλύφθηκαν επιπρόσθετες μέθοδοι για απομόνωση συγκεκριμένων πρωτεϊνών, όπως η χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων, η χρωματογραφία συγγένειας και άλλες τεχνικές διαχωρισμού. Ωστόσο, οι παραλλαγές της αρχικής διαδικασίας με αιθανόλη (κατά Cohn) παραμένουν η βάση για την παραγωγή των παραγώγων πλάσματος. 26 Το 1964 ο Judith Pool ανακάλυψε ότι το κρυοκαθίζημα που προέρχεται από το πλάσμα περιέχει μεγάλες ποσότητες του FVIII. Αυτή η ανακάλυψη αποτέλεσε τεράστια πρόοδο στη θεραπεία της αιμορροφιλίας Α. Για πρώτη φορά έγινε δυνατή η χορήγηση ικανοποιητικής ποσότητας FVIII σε σχετικά μικρούς όγκους με σκοπό τον έλεγχο σοβαρών αιμορραγικών επεισοδίων και τη διενέργεια μεγάλων χειρουργικών επεμβάσεων. 27,28 Μια δεκαετία αργότερα, χρησιμοποιώντας το κρυοκαθίζημα από μεγάλες δεξαμενές πλάσματος, αναπτύχθηκαν μέθοδοι απομόνωσης του FVIII, καθώς και του προθρομβινικού συμπλέγματος (FII, FVII, FIX, FX). Η προσπάθεια δημιουργίας συμπυκνωμάτων FIX οδήγησε στην παραγωγή του προθρομβινικού συμπλέγματος λόγω ταυτόχρονης κάθαρσης όλων των μοριακά πανομοιότυπων εξαρτώμενων από τη βιταμίνη Κ παραγόντων. Ακολούθως, επιτεύχθηκε και η απομόνωση του FIX από το προθρομβινικό σύμπλεγμα, γεγονός το οποίο έφερε επανάσταση στη θεραπεία της αιμορροφιλίας Β. Το κεκαθαρμένο συμπύκνωμα FIX ενεργοποιεί την πήξη σε πολύ μικρότερο βαθμό από το προθρομβινικό σύμπλεγμα, οπότε η χρήση του συνδέεται με μειωμένη επίπτωση θρομβώσεων. Πριν από αυτή την κάθαρση του FIX, οι ασθενείς που ελάμβαναν το προθρομβινικό σύμπλεγμα εμφάνιζαν υπέρμετρη κινητοποίηση του πηκτικού μηχανισμού (διάχυτη ενδαγγειακή πήξη, εν τω βάθει φλεβοθρόμβωση, πνευμονική εμβολή, έμφραγμα μυοκαρδίου), καθώς οι προαναφερθέντες παράγοντες ενεργοποιούνται μέσα στο σύμπλεγμα αυτό. 29,30 Η σύγχρονη αντιμετώπιση της αιμορροφιλίας θεωρείται ότι ξεκινάει τη δεκαετία του 1970 με την παραγωγή και χρήση λυοφιλοποιημένων συμπυκνωμάτων παραγόντων πήξης πλάσματος. 25 Η καινοτομία αυτή βελτίωσε σημαντικά την ποιότητα ζωής και το προσδόκιμο επιβίωσης των αιμορροφιλικών, καθώς κατέστησε δυνατή την ευρεία εφαρμογή θεραπείας υποκατάστασης κατ επίκληση στο σπίτι, με αποτέλεσμα τον άμεσο έλεγχο των αιμορραγιών και την ελάττωση της μυοσκελετικής βλάβης που παρατηρούνταν στους ασθενείς που υποθεραπεύτηκαν ή δεν έλαβαν καθόλου θεραπεία. Παράλληλα, αρχικά στη Σουηδία και ακολούθως σε άλλα κράτη ξεκίνησε η εφαρμογή της πρωτογενούς προφύλαξης, με αποτέλεσμα την αποφυγή των αιμορραγικών επεισοδίων και την περαιτέρω μείωση της εμφάνισης αρθροπάθειας. 31 Την εποχή αυτή αναπτύχθηκαν τα εξειδικευμένα Κέντρα Αιμορροφιλικών. Αυτά αρχικά ήταν ιδιαίτερα επιβαρυμένα με το έργο της αντιμετώπισης των επειγόντων περιστατικών. Σταδιακά, όμως, με τη βελτίωση των θεραπευτικών δυνατοτήτων απαλλάχθηκαν σε σημαντικό βαθμό από το έργο αυτό και στράφηκαν προς την προσφορά ολοκληρωμένης φροντίδας με τη συνεργασία διαφόρων εξειδικευμένων επαγγελματιών υγείας, όπως ορθοπεδικών, φυσιοθεραπευτών, κοινωνικών λειτουργών και οδοντιάτρων. Εκλεκτικές ορθοπεδικές χειρουργικές επεμβάσεις άρχισαν να διενεργούνται με ασφάλεια και συνέβαλαν στη 13

15 διόρθωση ή ελαχιστοποίηση των μυοσκελετικών ανωμαλιών που είχαν αναπτυχθεί ως συνέπεια των αιμορραγικών επεισοδίων στους μυς και τις αρθρώσεις που παρέμειναν χωρίς θεραπεία. 32 Επιπλέον, το 1977 ανακαλύφθηκε η δεσμοπρεσσίνη, ένα συνθετικό φάρμακο που αυξάνει τα επίπεδα FVIII και vwf. Η δεσμοπρεσσίνη αποτελεί ένα φθηνό και ασφαλές θεραπευτικό μέσο για πολλούς ασθενείς με ήπια αιμορροφιλία Α, αφού ελαττώνει ή καταργεί τη χρήση παραγώγων πλάσματος και κατά συνέπεια μειώνει το κόστος της θεραπείας και τον κίνδυνο λοιμώξεων μεταδιδόμενων με το αίμα. 33 Ωστόσο, αυτή η πρώτη χρυσή περίοδος στη θεραπεία της αιμορροφιλίας έληξε άδοξα, όταν αποδείχτηκε ότι τα συμπυκνώματα παραγόντων πήξης πλάσματος, εκτός από την επανάσταση που είχαν φέρει στη θεραπεία της αιμορροφιλίας, ήταν υπεύθυνα για σημαντική νοσηρότητα και θνητότητα στους αιμορροφιλικούς. Κατά τη διάρκεια των πρώτων ετών της δεκαετίας του 1980, την πρώτη χρυσή περίοδο της θεραπείας της αιμορροφιλίας διαδέχτηκε μία σκοτεινή περίοδος, που χαρακτηρίζονταν από την εμφάνιση ιογενών λοιμώξεων, οι οποίες μεταδόθηκαν στους αιμορροφιλικούς μέσω μολυσμένων συμπυκνωμάτων παραγόντων πήξης που παρασκευάζονταν από δεξαμενές πλάσματος χιλιάδων δοτών. 32,34 Οι ασθενείς που έλαβαν FVIII και FIX προερχόμενους από πλάσμα στις δεκαετίες του 1970 και 1980 εκτέθηκαν στον κίνδυνο λοίμωξης με τους ιούς της ηπατίτιδας A (Hepatitis A Virus ή HAV), B (Hepatitis B Virus ή HBV), C (Hepatitis C Virus ή HCV) και D (Hepatitis D Virus ή HDV), καθώς και με τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (Human Immunodeficiency Virus ή HIV). Την εποχή εκείνη περίπου 65% των βαρέως πασχόντων αιμορροφιλικών μολύνθηκαν με HIV και σχεδόν όλοι οι αιμορροφιλικοί που έλαβαν θεραπεία μολύνθηκαν με τον HBV, καθώς και με τον HCV, ο οποίος τότε ονομάζονταν ιός της μη-α, μη-β ηπατίτιδας. 35 Έτσι, ενώ μέχρι τότε η ενδοκράνια αιμορραγία ήταν η κύρια αιτία θανάτου των αιμορροφιλικών, από τα τέλη της δεκαετίας του 1970 μέχρι τη δεκαετία του 1990 το σύνδρομο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας (Acquired Immunodeficiency Syndrome ή AIDS) αποτελούσε την κύρια αιτία θανάτου σε αυτόν τον πληθυσμό. 36,37 Ως συνέπεια των δραματικών επιπτώσεων της επιδημίας AIDS και ηπατίτιδας κατά την περίοδο αυτή, επιτακτική έγινε η ανάγκη για ασφαλή μέσα θεραπείας της αιμορροφιλίας. Η ανάπτυξη και εφαρμογή τεχνικών μείωσης ιών κατά την παραγωγή παραγόντων πήξης από το πλάσμα, η προσεκτική επιλογή των δοτών, και η υιοθέτηση νέων μεθόδων ολοένα και υψηλότερης ευαισθησίας για τον ιολογικό έλεγχο του πλάσματος των δοτών βελτίωσαν σημαντικά την ασφάλεια των προϊόντων πλάσματος. Έκτοτε, κάθε τέτοιο προϊόν πηκτικού παράγοντα που παράγεται από μια δεξαμενή επιλεγμένων δοτών που έχει ελεγχθεί επανειλημμένα για HIV, HBV και HCV, υπόκειται επιπλέον σε διαδικασίες αδρανοποίησης/ απομάκρυνσης ιών. Ήδη το 1987 εφαρμόζονταν συστηματικά αποτελεσματικές μέθοδοι μείωσης του ιικού φορτίου σε όλα τα προϊόντα και έλεγχος του πλάσματος για το επιφανειακό αντιγόνο του HBV (HBsAg) και για anti-hiv αντισώματα, ενώ από το 1992 εισήχθη στο έλεγχο αυτό και ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης anti-hcv αντισωμάτων. Έτσι, από το 1987 οι παράγοντες πήξης πλάσματος θεωρούνται πλέον ασφαλείς και τα τελευταία 25 χρόνια δεν παρατηρήθηκε αιματογενής μετάδοση ιών ηπατίτιδας ή HIV. 25,38 Τα σχετιζόμενα με τη μετάδοση ιών στους αιμορροφιλικούς ασθενείς γεγονότα, καθώς και τα μέτρα που σταδιακά ελήφθησαν για την αντιμετώπιση του προβλήματος αυτού περιγράφονται αναλυτικά σε ακόλουθες ενότητες. Η πιο σημαντική εξέλιξη στην κατεύθυνση των ασφαλών θεραπευτικών μέσων βασίστηκε στην κλωνοποίηση των γονιδίων F9 και F8 το 1982 και το 1984, 14

16 αντίστοιχα, και στην ραγδαία πρόοδο της τεχνολογίας του DNA, τα οποία οδήγησαν στη βιομηχανική παραγωγή ανασυνδυασμένου FVIII αρχικά και FIX ακολούθως. Το 1989 δημοσιεύτηκε η πρώτη αναφορά της κλινικής αποτελεσματικότητας του ανασυνδυασμένου FVIII σε δύο ασθενείς με αιμορροφιλία Α. 39 Έκτοτε ξεκίνησε η χορήγηση αυτών των προϊόντων που σταδιακά όχι μόνο αντικατέστησαν σε μεγάλο βαθμό τα προερχόμενα από το πλάσμα, αλλά και βελτιώθηκαν ως προς την ασφάλεια και την καθαρότητά τους. Τις δεκαετίες του 1990 και 2000 βελτιώθηκε σημαντικά η συνολική διαχείριση των αιμορροφιλικών ασθενών με την εισαγωγή προγραμμάτων ανοσοανοχής το 1994, τη βελτίωση των θεραπειών εναντίον του HIV (Highly Active Anti-Retroviral Therapy ή HAART) το 1996, την ανάπτυξη ανασυνδυασμένου ενεργοποιημένου FVII το 1996 και ανασυνδυασμένου FIX το 1997 και την ανακάλυψη νέων φαρμακευτικών μέσων εναντίον του HCV (συνδυασμένη θεραπεία με α-ιντερφερόνη και ριμπαβιρίνη) το Παράλληλα, από το 2000 άρχισε να εξελίσσεται η έρευνα στον τομέα της γονιδιακής θεραπείας. Έτσι, μπορεί να ειπωθεί ότι από το 1990 ξεκίνησε μια νέα χρυσή περίοδος στη θεραπεία της αιμορροφιλίας. 34,40,41 3. ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ ΣΤΟΝ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΟ ΑΣΘΕΝΗ 3.1. ΙΣΤΟΡΙΑ ΤΗΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΗΞΗΣ ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ ΙΟΓΕΝΩΝ ΗΠΑΤΙΤΙΔΩΝ Ο κίνδυνος μετάδοσης ηπατίτιδας με τα παράγωγα πλάσματος είχε αναγνωριστεί πολύ πριν την έγκριση των ευαίσθητων τεχνικών ανίχνευσης του HBsAg στις δωρεές αίματος το 1973 και την επιβολή του ελέγχου των δοτών από τον FDA (Food and Drug Administration) το Ο κίνδυνος αυτός είχε καταδειχθεί ήδη το 1943, όταν αμερικανοί στρατιώτες στη Νότια Αφρική, οι οποίοι έλαβαν εμβόλιο κατά του κίτρινου πυρετού που περιείχε ανθρώπειο ορό, εμφάνισαν ηπατίτιδα. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώθηκε στα αποθηκευμένα δείγματα τη δεκαετία του 1970, όταν ανακαλύφθηκαν οι πρώτες διαγνωστικές δοκιμασίες. Μετά την έναρξη της εφαρμογής ευαίσθητων μεθόδων ανίχνευσης του HBsAg το 1975 και τον αποκλεισμό των μολυσμένων μονάδων, το 90% των εναπομεινάντων περιπτώσεων μετά μετάγγιση ηπατίτιδας ταξινομήθηκαν ως μη-α, μη-β ηπατίτιδα. Από αυτές τις περιπτώσεις, το μεγαλύτερο ποσοστό οφείλονταν στον HCV, όπως αποδείχτηκε αργότερα, όταν ανακαλύφθηκαν μέθοδοι ανίχνευσης του anti-hcv αντισώματος. 38,42 Το HBsAg είναι θετικό στην οξεία και στη χρόνια λοίμωξη. Αρχικά για την ανίχνευσή του χρησιμοποιήθηκε η ενζυμική ανοσοπροσροφητική μέθοδος (enzymelinked immunosorbent assay ή EIA) και μεταγενέστερα μια παρόμοια τεχνική χημειοφωταύγειας (chemiluminescent assay ή CLIA). Επί θετικού αποτελέσματος, το δείγμα υποβάλλεται σε επιβεβαιωτική δοκιμασία. Ακόμη και μετά την επιβεβαιωτική δοκιμασία υπάρχει ένας μικρός αριθμός ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. Ωστόσο, οι δότες με θετική επιβεβαιωτική δοκιμασία αποκλείονται. Ο έλεγχος για το HBcAb ξεκίνησε το Τότε, το αντίσωμα αυτό χρησιμοποιήθηκε ως έμμεσος δείκτης ανίχνευσης φορέων μη-α, μη-β ηπατίτιδας. Από το 1990 το HBcAb άρχισε να χρησιμοποιείται ως δείκτης HBV λοίμωξης. Αναπτύσσεται νωρίς κατά την πορεία της HBV λοίμωξης και παραμένει θετικό είτε η λοίμωξη αποδράμει είτε μεταπέσει σε χρόνια. 43 Πριν από την ανακάλυψη του HCV και του αντισώματος εναντίον αυτού, η διάγνωση της μη-α, μη-β ηπατίτιδας βασίζονταν μόνο στη λήψη ιστορικού και σε κάποιους έμμεσους δείκτες. Ήδη τότε ο διενεργούμενος έλεγχος των δοτών για 15

17 παράγοντες κινδύνου από το ιστορικό τους (χρήση ενδοφλέβιων ουσιών, πολλαπλοί ερωτικοί σύντροφοι, έκτιση ποινής σε φυλακή, κ.λπ.), για ορολογικούς δείκτες HBV λοίμωξης (HBsAg και HBcAb) και για παθολογική τιμή πυροσταφυλικής τρανσαμινάσης (SGPT ή ALT) είχε προκαλέσει εντυπωσιακή μείωση στα ποσοστά μη-α, μη-β μετά μετάγγιση ηπατίτιδας. Η μέτρηση της ALT στα πλαίσια του ελέγχου των αιμοδοτών ξεκίνησε το 1986 και αποτελούσε τότε έμμεσο δείκτη αναγνώρισης δοτών με μη-α, μη-β ηπατίτιδα. Ο HCV ανακαλύφθηκε το Ακολούθως, το 1990 άρχισε ο έλεγχος για anti-hcv αντισώματα με τη χρήση της ΕΙΑ. Το 1992 άρχισε να εφαρμόζεται μια δεύτερης γενιάς, βελτιωμένη EIA με πολλαπλά αντιγόνα (ΕΙΑ 2.0), ενώ το 1996 μία ακόμη νεότερη (ΕΙΑ 3.0). Η ΕΙΑ 3.0 πλεονεκτεί έναντι της ΕΙΑ 2.0 για δύο λόγους: 1) ανιχνεύει τη λοίμωξη νωρίτερα, μειώνοντας τη διάρκεια της φάσης «παραθύρου» από 82 ημέρες που χαρακτηρίζουν την ΕΙΑ 2.0 σε 70 ημέρες, και 2) ανιχνεύει περίπου 3% περισσότερους νοσούντες με μη ιαιμική λοίμωξη. 44 Το AIDS ως κλινική οντότητα αναγνωρίστηκε μεταξύ του 1981 και Ωστόσο, μόλις το 1984 και εξαιτίας της επιδημίας HIV που εμφανίστηκε στον αιμορροφιλικό πληθυσμό, έγινε γνωστό ότι οφείλεται σε ιό και ότι υπάρχει κίνδυνος μετάδοσης αυτού του ιού με τα παράγωγα πλάσματος. O HIV αναγνωρίστηκε το 1984 και το 1985 εγκρίθηκε ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης του anti-hiv-1 αντισώματος. Από το 1992 εφαρμόστηκε μια νέα, υψηλής ευαισθησίας μέθοδος, που έχει τη δυνατότητα να ανιχνεύει και τα IgM αντισώματα εκτός των IgG, αλλά και τα αντισώματα κατά του HIV-2, αφού περιλαμβάνει και ειδικά αντιγόνα του HIV-2. Αυτή η μέθοδος προσδιορισμού αντισωμάτων μπορεί να είναι η EIA ή η CLIA.Με βάση αυτή τη μέθοδο η ανίχνευση θετικών αντισωμάτων στον ορό χρειάζεται περίπου 3 εβδομάδες. 45 Το 1996 προστέθηκε στον έλεγχο ρουτίνας των δοτών μέθοδος ανίχνευσης της p24 ιικής πρωτεΐνης. Αυτή έχει πλέον εγκαταλειφθεί, καθώς μειονεκτεί έναντι των νεότερων μεθόδων. Παρά την προσεκτική επιλογή των δοτών με βάση το ιστορικό τους, τον εφαρμοζόμενο ορολογικό έλεγχο των δωρεών και την σταδιακή βελτίωση της ευαισθησίας των μεθόδων ανίχνευσης, οι FVIII και FIX εξακολουθούσαν να αποτελούν πηγή μόλυνσης για τους αιμορροφιλικούς, μέχρι την ανάπτυξη μεθόδων σταθεροποίησης των παραγώγων αυτών που κατέστησαν εφικτή την εφαρμογή τεχνικών αδρανοποίησης των ιών με θέρμανση ή άλλα μέσα χωρίς παράλληλη απώλεια της δραστικότητας των παραγώγων. Πριν την εφαρμογή τεχνικών αδρανοποίησης, η πλειοψηφία των αιμορροφιλικών που έλαβαν FVIII και FIX μολύνθηκαν με HBV, και μετά την αναγνώριση του HCV φάνηκε ότι οι περισσότεροι μολύνθηκαν επίσης και με HCV, εκ των οποίων πολλοί ανέπτυξαν χρόνια λοίμωξη. Επίσης, πάνω από το 50% των βαρέως πασχόντων μολύνθηκαν με HIV. 38 Οι πρώτες τεχνικές αδρανοποίησης του HBV ανακαλύφθηκαν στη Γερμανία το 1980 και 1981, αλλά αρχικά δεν έγιναν ευρέως γνωστές, επειδή ήταν δημοσιευμένες στη γερμανική γλώσσα και δεν ανακοινώθηκαν σε κάποιο διεθνές συνέδριο. Ακόμη όμως και όταν έγιναν ευρέως γνωστές, δεν εφαρμόστηκαν άμεσα στα προϊόντα FVIII και FIX, καθώς υπήρχε ανησυχία για την επίδρασή της θέρμανσης στη δραστικότητα των παραγώγων. Από τις αρχές του 1983 ξεκίνησε η εφαρμογή των τεχνικών αυτών στον FVIII με σκοπό την αδρανοποίηση του HBV, για την οποία είχαν αποδειχθεί αποτελεσματικές και είχαν εγκριθεί. Με βάση τα προαναφερθέντα συμπεραίνεται ότι οι πρώτες τεχνικές αδρανοποίησης εφαρμόστηκαν στα παράγωγα πλάσματος σε μια εποχή κατά την οποία η επιστημονική κοινότητα δε θεωρούσε το AIDS λοιμώδες νόσημα. Μετά την αναγνώριση της πραγματικής φύσεως της νόσου στις αρχές του

18 εντατικοποιήθηκαν οι προσπάθειες ανάπτυξης νέων ισχυρών μεθόδων αδρανοποίησης ιών στα προϊόντα FVIII και FIX. Ήδη από το 1985, όλες οι καινούριες παρτίδες FVIII και FIX είχαν υποβληθεί σε κάποια τεχνική αδρανοποίησης, και παρά την αποτυχία κάποιων από τις αρχικές μεθόδους να απενεργοποιήσουν τον HIV σε ικανοποιητικό βαθμό, από το 1987 είχαν ενσωματωθεί κατάλληλες τεχνικές αδρανοποίησης ιών στην παραγωγική διαδικασία όλων των εγκεκριμένων FVIII και FIX προϊόντων, οι οποίες κατέστρεφαν τον HIV ακόμα και όταν αυτός ανευρίσκονταν σε υψηλές συγκεντρώσεις. 38 Έτσι, μετάδοση HBV με παράγωγα πλάσματος δεν καταγράφηκε μετά την ενσωμάτωση αποτελεσματικών τεχνικών αδρανοποίησης στην παραγωγή των προϊόντων αυτών από όλους τους κατασκευαστές το Αυτό τεκμηριώνεται από μελέτες σε αιμορροφιλικούς που έλαβαν πρώτη φορά παράγοντες πήξης μετά το 1987, δηλαδή έλαβαν μόνο αδρανοποιημένους για ιούς παράγοντες. Στο αποτέλεσμα αυτό συνέβαλε, βέβαια, και ο έλεγχος των δωρεών για HBsAg που διενεργούνταν ήδη από το Όσον αφορά στη μετάδοση HCV, δεν καταγράφηκαν περιπτώσεις μόλυνσης με τον ιό αυτό από τις παρτίδες FVIII και FIX που παρασκευάστηκαν μετά την εφαρμογή των τεχνικών αδρανοποίησης και του ελέγχου του πλάσματος για το anti-hcv αντίσωμα που ξεκίνησε το 1990 και βελτιώθηκε σημαντικά ως προς την ευαισθησία του το Η απουσία μετάδοσης HCV καταδεικνύεται σε πολλές μελέτες. Σε μια προοπτική μελέτη από το 1993 έως το 1996 δεν παρατηρήθηκε θετικοποίηση του anti-hcv αντισώματος σε κανέναν ασθενή σε 71 Κέντρα Αιμορροφιλικών στις ΗΠΑ. Σε μια άλλη μελέτη, δεν ανιχνεύθηκε HCV RNA σε καμία από τις 38 παρτίδες FVIII που παρασκευάστηκαν από το 1992 μέχρι το 1993, δηλαδή μετά την έναρξη του ευαίσθητου ελέγχου για το anti-hcv αντίσωμα, ενώ ανιχνεύθηκε σε 76 από 183 παρτίδες FVIII που παρασκευάστηκαν από το 1976 μέχρι το Μια ακόμη μελέτη έδειξε ότι ο επιπολασμός του anti-hcv αντισώματος ήταν 83% σε ασθενείς που έλαβαν παράγοντες για πρώτη φορά πριν το 1985 και μόνο 6% σε 80 ασθενείς που έλαβαν παράγοντες για πρώτη φορά μεταξύ του 1985 και Επίσης, μελέτες έδειξαν τη σημαντική επίδραση της δεύτερης γενιάς μεθόδων ανίχνευσης του anti-hcv αντισώματος (ΕΙΑ 2.0) στην εκμηδένιση της μετάδοσης HCV. 48 Ο υψηλός επιπολασμός anti-hcv που εξακολουθεί να υπάρχει στον αιμορροφιλικό πληθυσμό οφείλεται σε παρελθοντική έκθεση, ενώ νέες περιπτώσεις οξείας HCV λοίμωξης δεν καταγράφονται. Τέλος, όσον αφορά στη μετάδοση HIV δεν παρατηρήθηκε θετικοποίηση του anti-hiv αντισώματος σε αιμορροφιλικούς που έλαβαν μόνο προϊόντα FVIII και FIX, τα οποία είχαν παρασκευαστεί από πλάσμα ελεγμένο για HIV (ήδη από το 1985) και στα οποία είχαν εφαρμοστεί επαρκείς μέθοδοι αδρανοποίησης μετά το Αυτό το γεγονός καταδεικνύεται από μελέτη που διενεργήθηκε μεταξύ του 1987 και 1990 σε όλα τα Κέντρα Αιμορροφιλικών στις ΗΠΑ. 49 Από το 1999 άρχισε να εφαρμόζεται στα πλαίσια του ελέγχου ρουτίνας των δοτών μια νέα τεχνολογία ανίχνευσης ιικών νουκλεϊκών οξέων (Nucleic Acid Testing ή NAT), με σκοπό την περαιτέρω μείωση του κινδύνου μετάδοσης ιών κατά τη χορήγηση αίματος, πλάσματος και προϊόντων τους, αφού η μέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη και ανιχνεύει το γενετικό υλικό του ιού και όχι τους μεταγενέστερα εμφανιζόμενους ορολογικούς δείκτες. Ο ΝΑΤ συνήθως διενεργείται σε δεξαμενές δειγμάτων (Mini-Pool Nucleic Acid Testing ή MP-NAT) 6 έως 12 δοτών. Χρησιμοποιούνται δύο τεχνικές ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων: η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction ή PCR) και η διαμεσολαβούμενη από μεταγραφή ενίσχυση (Transcription Mediated Amplification ή TMA). 50 Αν από μια δεξαμενή δειγμάτων προκύψει ένα θετικό αποτέλεσμα, τότε 17

19 μόνο διενεργείται περαιτέρω έλεγχος για να καθοριστεί ποιο δείγμα προκάλεσε το θετικό αποτέλεσμα και ποιο συγκεκριμένα ιικό νουκλεϊκό οξύ απομονώνεται στο θετικό δείγμα. Το θετικό δείγμα τελικά καταστρέφεται, ενώ τα υπόλοιπα χρησιμοποιούνται κανονικά. Η διενέργεια ΝΑΤ σε μεμονωμένα δείγματα (Individual Nucleic Acid Testing ή ID-NAT) είναι συγκριτικά ακριβότερη και χρονοβόρα, αλλά παρουσιάζει μεγαλύτερη ευαισθησία. Το τελευταίο αυτό οφείλεται στη μείωση της διάρκειας της φάσης «παραθύρου», δηλαδή στη μείωση του χρονικού διαστήματος από τη στιγμή της μόλυνσης μέχρι τη στιγμή της εργαστηριακής ανίχνευσης του λοιμογόνου παράγοντα, κατά το οποίο το άτομο ήδη μεταδίδει τη λοίμωξη. Ωστόσο, επειδή το κόστος του ID-NAT είναι εξαιρετικά υψηλό και η σχέση κόστουςαποτελεσματικότητας μη ικανοποιητική, χρησιμοποιείται ευρέως ο MP-NAT. 45,51 Ο MP-NAT που έχει ενσωματωθεί στη διαδικασία παραγωγής παραγώγων πλάσματος αφορά τους HIV, HCV και HBV, Η μέθοδος HCV MP-NAT μειώνει την περίοδο «παραθύρου», κατά την οποία η λοίμωξη δεν είναι ανιχνεύσιμη, σε 23 ημέρες, ενώ το αντίστοιχο διάστημα με την ΕΙΑ 3.0 είναι 70 ημέρες. Ο HIV MP-NAT ανιχνεύει το HIV-1 RNA, το οποίο εμφανίζεται νωρίτερα από την p24 ιική πρωτεΐνη και το anti-hιv-1 αντίσωμα, μειώνοντας την περίοδο «παραθύρου» σε 11 ημέρες. Ο HBV MP-NAT, που περιορίζει την περίοδο «παραθύρου» από 59 σε 34 ημέρες, μειώνει σημαντικά το ποσοστό της ορολογικά μη ανιχνεύσιμης HBV λοίμωξης σε ενδημικές περιοχές όπως η Κίνα, σε αντίθεση με τις περιοχές χαμηλού επιπολασμού, όπου το ποσοστό μειώνεται ελάχιστα. 38 Τα γεγονότα που σχετίζονται με τη μετάδοση ιογενών λοιμώξεων στον αιμορροφιλικό πληθυσμό, τα μέτρα επίλυσης του προβλήματος αυτού που ελήφθησαν σταδιακά και η χρονολογική εξέλιξη της αντιαιμορροφιλικής θεραπείας παρουσιάζονται στον Πίνακα 4 σε χρονολογική σειρά. Χρονολογία Γεγονός Αρχές δεκαετίας 1940 Κλασματοποίηση του πλάσματος κατά Cohn Δεκαετία 1950 μέχρι Διαθέσιμα θεραπευτικά μέσα: μόνο ολικό αίμα και FFP αρχές δεκαετίας Κρυοκαθίζημα Δεκαετία 1970 Συμπυκνωμένοι παράγοντες πήξης πλάσματος Θεραπεία κατ οίκον Προφυλακτική θεραπεία Κέντρα Αιμορροφιλικών Ορθοπεδικές επεμβάσεις 1973 Ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης HBsAg 1975 Έλεγχος δοτών για HBsAg 1977 Δεσμοπρεσσίνη Αρχές δεκαετίας 1980 Έναρξη εμφάνισης ιογενών λοιμώξεων (HIV, HCV, HBV) 1980 και 1981 Πρώτες τεχνικές αδρανοποίησης ιών (χωρίς ευρεία αναγνώριση και εφαρμογή) 1982 Κλωνοποίηση γονιδίου F9 Αρχές 1983 Ανακάλυψη εμβολίου κατά της ηπατίτιδας Β Εφαρμογή τεχνικών αδρανοποίησης του HBV στα προϊόντα FVIII 1984 Κλωνοποίηση γονιδίου F8 Αναγνώριση ιικής αιτιολογίας AIDS Μέθοδος ανίχνευσης HIV Εντατικοποίηση προσπαθειών ανακάλυψης τεχνικών αδρανοποίησης 18

20 1985 Έγκριση μεθόδου ανίχνευσης HIV Εφαρμογή τεχνικών αδρανοποίησης σε όλα τα παράγωγα πλάσματος 1986 Ανίχνευση επιπέδων ALT στους δότες ως δείκτη μη-α, μη-β ηπατίτιδας 1987 Ενσωμάτωση κατάλληλων τεχνικών αδρανοποίησης ιών σε όλα τα παράγωγα πλάσματος Ασφαλείς παράγοντες πήξης πλάσματος Εξάλειψη μετάδοσης HBV και HIV και σημαντική μείωση μετάδοσης μη-α, μη-β ηπατίτιδας 1989 Ανακάλυψη HCV Ευαίσθητη μέθοδος ανίχνευσης anti-hcv αντισώματος Ανασυνδυασμένος FVIII 1990 Έγκριση μεθόδου ανίχνευσης anti-hcv αντισώματος 1992 Υψηλής ευαισθησίας μέθοδος ανίχνευσης HIV 2 ης γενιάς μέθοδος ανίχνευσης anti-hcv αντισώματος στον έλεγχο των δοτών Εξάλειψη μετάδοσης HCV Έναρξη μαζικού εμβολιασμού κατά της ηπατίτιδας Β 1994 Εισαγωγή προγραμμάτων ανοσοανοχής 1996 HAART Ανασυνδυασμένος FVII 3 ης γενιάς μέθοδος ανίχνευσης anti-hcv αντισώματος στον έλεγχο των δοτών 1997 Ανασυνδυασμένος FIX 1999 ΝΑΤ στον έλεγχο των δοτών 2002 Έναρξη έρευνας για γονιδιακή θεραπεία Νέες anti-hcv θεραπείες 3.2. ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ C Πίνακας 4 Η χρόνια HCV λοίμωξη είναι μια από τις πιο συχνές χρόνιες ηπατοπάθειες και ευθύνεται για 8000 έως θανάτους ετησίως. Παγκοσμίως, υπολογίζεται, ότι το 2005 πάνω από 185 εκατομμύρια άνθρωποι ήταν θετικοί για το anti-hcv αντίσωμα (επιπολασμός 2,8%). 52 Η συνολική επίπτωση το 2010 υπολογίζεται σε 0,3 περιστατικά ανά πληθυσμού. 53 Η οξεία ηπατίτιδα C σε ποσοστό 55-85% των περιπτώσεων οδηγεί σε χρόνια λοίμωξη. Από τους ασθενείς με χρόνια λοίμωξη, το 60-80% εμφανίζουν χρόνια ηπατίτιδα C με παθολογικά επίπεδα ALT. Περίπου 20-30% των φορέων θα αναπτύξουν κίρρωση μετά από ένα μέσο χρονικό διάστημα 20 έως 30 ετών. Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα αναπτύσσεται σε ποσοστό 1,5 έως 2% κάθε έτος στην ομάδα αυτή των ασθενών. Οι περισσότεροι ασθενείς με HCV λοίμωξη στις ΗΠΑ και στην Ευρώπη έχουν μολυνθεί μέσω χρήσης ενδοφλέβιων ουσιών ή μετάγγισης αίματος και προϊόντων του. Η μετάγγιση αποτελούσε σημαντικό παράγοντα κινδύνου οξείας λοίμωξης στο παρελθόν, και φαίνεται ότι ήταν υπεύθυνη για το 0,5 με 10% των περιπτώσεων HCV λοίμωξης. Από κάποιες μελέτες φαίνεται ότι πάνω από 10% των μεταγγιζόμενων μολύνονταν με HCV. Η μετάδοση HCV με τη μετάγγιση είναι πολύ σπάνια μετά το 1990, οπότε και ξεκίνησε ο 19

21 συστηματικός έλεγχος του χορηγούμενου αίματος και των προϊόντων του για την παρουσία HCV. 54 Η ηπατίτιδα C αποτελεί σημαντική συνοσηρότητα στους ενήλικες αιμορροφιλικούς ασθενείς και είναι η κύρια αιτία χρόνιας ηπατοπάθειας, ηπατικής ανεπάρκειας, μεταμόσχευσης ήπατος και θανάτου στην ομάδα αυτή. Αυτές οι μακροχρόνιες επιπτώσεις του HCV στο ήπαρ γίνονται πλέον εμφανείς, επειδή αυξήθηκε ο μέσος όρος ζωής των αιμορροφιλικών, ως αποτέλεσμα της βελτίωσης στη φροντίδα τους. Σχεδόν όλοι (98%) οι αιμορροφιλικοί ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με παράγοντες πήξης πλάσματος τη δεκαετία του 1970 και στις αρχές της δεκαετίας του 1980 πριν την εισαγωγή των τεχνικών αδρανοποίησης το 1985 μολύνθηκαν με HCV. Ακόμη και αρκετοί ασθενείς που είχαν αντιμετωπιστεί με νωπό κατεψυγμένο πλάσμα ή κρυοκαθίζημα μολύνθηκαν με τον ιό αυτό. Παρόλο που κάποιες από τις πρώτες τεχνικές αδρανοποίησης δεν ήταν 100% αποτελεσματικές, μετά το 1992, οπότε εισήχθησαν και οι ευαίσθητες μέθοδοι διάγνωσης, δεν παρατηρήθηκε μετάδοση HCV με παράγωγα πλάσματος. 55 Σήμερα, με την εφαρμογή αυστηρών κριτηρίων επιλογής δοτών, ορολογικού ελέγχου, ελέγχου για το RNA του ιού και συνδυασμού τεχνικών αδρανοποίησης/απομάκρυνσης ιών, τα παράγωγα πλάσματος θεωρούνται πλέον ασφαλή. Τα νεότερα ανασυνδυασμένα προϊόντα είναι επίσης ελεύθερα του κινδύνου μετάδοσης HCV, καθώς δεν περιέχουν ανθρώπεια βιολογικά υλικά. 56,57 Σύμφωνα με τα αρχεία του Κέντρου Αιμορροφιλικών στο Π.Γ.Ν.Α. «Λαϊκό», το 70 80% περίπου των αιμορροφιλικών με βαριά και ενδιάμεση νόσο στην Ελλάδα είναι θετικά για τον HCV. Επίσης, το 70% των ατόμων με βαριά αιμορροφιλία και το 40% του ολικού αιμορροφιλικού πληθυσμού είναι θετικά για τον HIV. 58 Η Παγκόσμια Οργάνωση Αιμορροφιλίας κατέγραψε αιμορροφιλικούς με HCV λοίμωξη και 5121 με HIV λοίμωξη το 2012 σε 62 χώρες που παρείχαν δεδομένα. Ενδεικτικά δεδομένα για κάποιες χώρες παρουσιάζονται στον Πίνακα Κράτος HCV (+) αιμορροφιλικοί Σύνολο αιμορροφιλικών Κίνα Γαλλία Γερμανία Ελλάδα Ινδία Ιταλία Ιαπωνία Ηνωμένο Βασίλειο ΗΠΑ Νότια Αφρική Πίνακας 5 16 Μετά τη μόλυνση με HCV, περίπου 20% των ασθενών εμφανίζουν αυτόματη κάθαρση, ενώ το υπόλοιπο 80% χρόνια HCV λοίμωξη. 59 Η χρόνια λοίμωξη συνήθως διαδράμει ασυμπτωματικά, αλλά μπορεί να συνοδεύεται από καταβολή. Η κατάσταση μπορεί να παραμένει σταθερή με καθόλου ή ελάχιστη ηπατική βλάβη για αρκετές δεκαετίες. Ωστόσο, η χρόνια φλεγμονή του ήπατος μπορεί να προκαλέσει εξελισσόμενη ηπατική ίνωση και κίρρωση που μπορεί να οδηγήσουν σε ανάπτυξη ηπατικής νόσου τελικού σταδίου με μη αντιρροπούμενη κίρρωση, αιμορραγία οισοφαγικών κιρσών, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και τελικά θάνατο. Περίπου 20-30% των αιμορροφιλικών με χρόνια HCV λοίμωξη αναπτύσσουν τελικά κίρρωση, με 20

22 επίπτωση που αυξάνει ταχύτατα μετά από 15 χρόνια λοίμωξης. 55 Οι αιμορροφιλικοί που είναι ακόμη εν ζωή και έχουν HCV λοίμωξη σε ηλικία 65 ετών έχουν κίρρωση σε ποσοστό 60%. 60 Περίπου 10% των αιμορροφιλικών με κίρρωση εμφανίζουν τελικού σταδίου ηπατική νόσο εντός των επόμενων 5-10 ετών. 55 Από διάφορες μελέτες φαίνεται ότι το άρρεν φύλο, η μεγαλύτερη ηλικία κατά τη μόλυνση με HCV, η συλλοίμωξη με HIV, η κατάχρηση αλκοόλ και το κάπνισμα αυξάνουν τον κίνδυνο ανάπτυξης ηπατικής νόσου τελικού σταδίου, ενώ η επιτυχής αντιική θεραπεία μειώνει τον κίνδυνο αυτό. Έτσι, πολύ μικρό ποσοστό ασθενών με αυτόματη κάθαρση ή με επιτυχή θεραπεία εμφανίζει ηπατική νόσο τελικού σταδίου 61,62. Η χρόνια HCV λοίμωξη αποτελεί σημαντικό παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, που αποτελεί κύρια αιτία θανάτου των ηλικιωμένων αιμορροφιλικών ασθενών. Η επίπτωση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος σε ασθενείς με κίρρωση ανέρχεται σε 1-4% ανά έτος. 63,64 Είναι πιθανό ότι αρκετοί αιμορροφιλικοί με ήπια νόσο που έλαβαν θεραπευτικά προϊόντα πριν το 1992 μόνο μία ή λίγες φορές και μολύνθηκαν με HCV δεν απευθύνονται στα εξειδικευμένα Κέντρα Αιμορροφιλικών για την παρακολούθησή τους κι έτσι δεν έχουν ελεγχθεί για HCV. Οι αιμορροφιλικοί με χρόνια HCV λοίμωξη πρέπει να εμβολιάζονται κατά των ιών HAV και HBV, εκτός εάν έχουν φυσική ανοσία για τους ιούς αυτούς, γιατί η οξεία HAV ή HBV λοίμωξη στο έδαφος αυτό προκαλεί βαριά ηπατίτιδα. Οι ασθενείς με καλή ανοσολογική απάντηση στον αρχικό εμβολιασμό δεν χρειάζονται παρακολούθηση του τίτλου των αντισωμάτων ή αναμνηστικές δόσεις, καθώς η ανοσιακή μνήμη θα οδηγήσει σε προστατευτική απάντηση σε τυχόν μελλοντική έκθεση στους ιούς αυτούς. 65 Όλοι οι αιμορροφιλικοί που έλαβαν παράγοντες πήξης πλάσματος ή άλλα προϊόντα πλάσματος ή αίματος πριν το 1992 πρέπει να ελέγχονται για την ανίχνευση του anti-hcv αντισώματος με ΕΙΑ 3 ης γενιάς στα Κέντρα Αιμορροφιλικών της περιοχής τους. Σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος διενεργείται HCV RNA PCR για να διερευνηθεί το ενδεχόμενο αυτόματης ιικής κάθαρσης. Εάν και αυτή η εξέταση αποβεί θετική, σημαίνει ότι ο αιμορροφιλικός έχει χρόνια HCV λοίμωξη και πρέπει να απευθυνθεί σε ηπατολόγο για περαιτέρω εκτίμηση που περιλαμβάνει ποσοτικό προσδιορισμό του ιικού φορτίου, καθορισμό του γονότυπου του ιού και αξιολόγηση του σταδίου της ηπατικής βλάβης. 57 Η αξιολόγηση του σταδίου της ηπατικής βλάβης μπορεί να γίνει με μη επεμβατικές μεθόδους. Έχουν αναπτυχθεί διάφοροι αλγόριθμοι που βασίζονται σε βιοχημικές εξετάσεις. Παράδειγμα τέτοιου αλγορίθμου αποτελεί το Fibrotest, που συνδυάζει τις παραμέτρους ηλικία, φύλο, α2-μακροσφαιρίνη, απτοσφαιρίνη, γ-gt, ολική χολερυθρίνη και Α1-απολιποπρωτεΐνη, και καταλήγει σε μια βαθμολογία που σχετίζεται με τη σοβαρότητα της ηπατικής νόσου. Ωστόσο, αυτές οι μη επεμβατικές μέθοδοι έχουν περιορισμένη αξία, γιατί, ενώ είναι χρήσιμες στη διάκριση ασθενών με κίρρωση ή με ήπια μόνο ηπατική νόσο, δεν αξιολογούν τα ενδιάμεσα στάδια της ηπατικής βλάβης, τα οποία όμως αφορούν στην πλειονότητα των ασθενών. 66 Το γεγονός αυτό καταδεικνύεται και στις λίγες μελέτες που αξιολογούν αυτές τις μεθόδους σε μολυσμένους με HCV αιμορροφιλικούς ασθενείς, στις οποίες φαίνεται ότι οι μέθοδοι αυτές αναγνωρίζουν καλύτερα τους κιρρωτικούς ασθενείς. 67 Μια άλλη νεότερη μη επεμβατική μέθοδος είναι η ελαστογραφία ήπατος (fibroscan), που αποτελεί εναλλακτική επιλογή της ηπατικής βιοψίας και είναι ιδιαίτερα χρήσιμη σε αιμορροφιλικούς ασθενείς. Από την εξέταση προκύπτει μια τιμή (fibroscan score) που είναι αντιστρόφως ανάλογη προς την ελαστικότητα του ήπατος, οπότε και αποτελεί μέτρο της σοβαρότητας της ίνωσης του οργάνου, χωρίς να σχετίζεται όμως με την αιτία αυτής

23 Η βιοψία ήπατος, δηλαδή η άμεση ιστολογική εξέταση του ηπατικού ιστού, αποτελεί τη μέθοδο εκλογής για την αξιολόγηση του σταδίου της ηπατικής νόσου, της φλεγμονής και της βαρύτητας. Από παλαιότερα είχε αναγνωριστεί ο κίνδυνος αιμορραγίας μετά από βιοψία ήπατος σε αιμορροφιλικό ασθενή. Ωστόσο, εάν χορηγηθεί επαρκώς και σωστά θεραπεία υποκατάστασης, ο κίνδυνος αυτός δεν υπερβαίνει τον κίνδυνο αιμορραγίας στον γενικό πληθυσμό. Έτσι, τα επίπεδα του παράγοντα πρέπει να είναι φυσιολογικά πριν τη διενέργεια της βιοψίας. 69 Η βιοψία ήπατος δεν είναι απαραίτητη για τη λήψη της απόφασης θεραπείας. Ενδείκνυται σε ασθενείς, στους οποίους υπάρχει αμφιβολία για την αιτία της ηπατικής βλάβης. Ασθενείς με προχωρημένη ίνωση και κίρρωση στην ελαστογραφία ή στη βιοψία ή με οισοφαγικούς κιρσούς πρέπει να παρακολουθούνται τακτικά με ενδοσκόπηση. Επίσης, όλοι οι ασθενείς με προχωρημένη ίνωση και κίρρωση πρέπει να υποβάλλονται σε προληπτικούς υπερηχογραφικούς ελέγχους σε συνδυασμό με τη μέτρηση της α-φετοπρωτεΐνης (AFP) για την ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. 57,70 Κύριος στόχος της αντιικής θεραπείας είναι η εκρίζωση του HCV και η παρεμπόδιση της εξέλιξης της ίνωσης σε ηπατική νόσο τελικού σταδίου. Ιδανικά η ίαση πρέπει να επιτευχθεί πριν την ανάπτυξη κίρρωσης, ώστε να αποφευχθεί η εξέλιξη προς ηπατική νόσο τελικού σταδίου και να μειωθεί ο κίνδυνος ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. 57 Η φαρμακευτική θεραπεία της ηπατίτιδας C στον αιμορροφιλικό ασθενή δε διαφέρει από την εφαρμοζόμενη στους υπόλοιπους ασθενείς με HCV λοίμωξη και πρέπει να ακολουθεί τις κατευθυντήριες οδηγίες. Μέχρι προσφάτως, η ιδανική αντιική θεραπεία αποτελούνταν από τον συνδυασμό πεγκυλιωμένης ιντερφερόνης-α με ριμπαβιρίνη, ο οποίος είναι επιτυχής σε περίπου 50% των ασθενών με γονότυπο 1 ή 4 του HCV και σε 80-90% των ασθενών με γονότυπο 2 ή 3. Τελευταία, προστέθηκαν στη θεραπεία του γονότυπου 1 του HCV, που είναι ο πιο συχνός στους αιμορροφιλικούς ασθενείς, οι αναστολείς πρωτεασών και έτσι επιτυγχάνονται μεγαλύτερα ποσοστά απάντησης με ελαφρώς όμως περισσότερες ανεπιθύμητες ενέργειες. Αναμένεται ότι η προσθήκη αναστολέων πολυμεράσης θα οδηγήσει σε μακροχρόνια ιολογική απάντηση (Sustained Virological Response ή SVR) αρνητικό HCV RNA 24 εβδομάδες μετά το τέλος της θεραπείας, σε 90-95% των ασθενών. Πρόσφατες μελέτες με αναστολείς πρωτεασών και άλλους άμεσα δρώντες αντιιικούς παράγοντες σε διάφορους συνδυασμούς δείχνουν ενθαρρυντικά αποτελέσματα όσον αφορά στη διάρκεια, την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια της θεραπείας και επισημαίνουν ότι θεραπευτικά σχήματα χωρίς ιντερφερόνη είναι επίσης δυνατό να χρησιμοποιηθούν. Η αντιιική θεραπεία έχει ιδιαίτερη ένδειξη σε ασθενής με εκτεταμένη ή εξελισσόμενη ηπατική ίνωση. 62,71-73 Αρκετοί αιμορροφιλικοί εμφανίζουν συλλοίμωξη με HCV και HIV. Η HAART έφερε επανάσταση στην πρόγνωση της HIV λοίμωξης. Έτσι, η HCV λοίμωξη απέκτησε πολύ μεγαλύτερη σημασία. Πράγματι, η ηπατική νόσος έγινε η πιο κοινή αιτία θανάτου των ασθενών με συλλοίμωξη HCV/HIV. 74 Σε όλους τους οροθετικούς για HIV ασθενείς πρέπει να γίνεται PCR για HCV RNA, καθώς περίπου 6% αυτών αδυνατούν να αναπτύξουν ανιχνεύσιμα επίπεδα anti-hcv αντισωμάτων. Έτσι, μια αρνητική δοκιμασία ανίχνευσης αντισωμάτων δεν πρέπει να θεωρείται ενδεικτική απουσίας HCV λοίμωξης. 75 Η συλλοίμωξη σχετίζεται με καταστολή της ανοσιακής απάντησης εναντίον του HCV, μειωμένη κάθαρση του HCV, και κατά συνέπεια έντονη ηπατική φλεγμονή. Ασθενείς με συλλοίμωξη έχουν διπλάσιο περίπου κίνδυνο ανάπτυξης κίρρωσης και εξελίσσονται ταχύτερα σε ηπατική ανεπάρκεια σε σχέση με ασθενείς με HCV μονολοίμωξη. 59,62,76 Σε μια προοπτική μελέτη 1816 αιμορροφιλικών, ηπατική νόσο τελικού σταδίου ανέπτυξε το 14% των ασθενών με 22

24 συλλοίμωξη και μόνο το 2,6% των ασθενών με μονολοίμωξη. Στην ίδια μελέτη φάνηκε ότι η συλλοίμωξη HCV/HIV σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης ηπατικής νόσου τελικού σταδίου στους αιμορροφιλικούς ιδιαίτερα σε συνύπαρξη HBV λοίμωξης, χαμηλών CD4+ λεμφοκυττάρων και μεγάλης ηλικίας. 35 Για το λόγο αυτό είναι πολύ σημαντική η θεραπεία της HCV λοίμωξης στην ομάδα αυτή των ασθενών. Για καλύτερη απάντηση στη θεραπεία της ηπατίτιδας C, η HIV λοίμωξη πρέπει να κατασταλεί πλήρως με τη χορήγηση HAART. Στην περίπτωση αυτή, η HAART δεν πρέπει να περιλαμβάνει ζιδοβουδίνη, η οποία αντενδείκνυται σε συγχορήγηση με ριμπαβιρίνη λόγω πρόκλησης σοβαρής αναιμίας. 77 Επίσης, η διδανοσίνη και η σταβουδίνη πρέπει να αποφεύγονται λόγω αλληλεπίδρασης με τη ριμπαβιρίνη και του κινδύνου σοβαρής γαλακτικής οξέωσης. 78 Τέλος, υπάρχουν αναφορές ότι η αβακαβίρη μπορεί να σχετίζεται με φτωχή απάντηση στη θεραπεία της ηπατίτιδας C λόγω ανασταλτικής δράσης αυτής στη ριμπαβιρίνη. 79 Οι ασθενείς με συλλοίμωξη φαίνεται να έχουν χαμηλότερα ποσοστά SVR με τη θεραπεία με πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη και ριμπαβιρίνη συγκριτικά με τους ασθενείς με μονολοίμωξη. 80 Η μεταμόσχευση ήπατος είναι συχνά η μόνη διαθέσιμη θεραπευτική επιλογή. Οι ενδείξεις για μεταμόσχευση ήπατος στους αιμορροφιλικούς ασθενείς με λοίμωξη HCV που εμφανίζουν τελικού σταδίου ηπατική νόσο ή ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα δε διαφέρουν από το γενικό πληθυσμό. Επίσης, το αποτέλεσμα και η μακροχρόνια επιβίωση μετά τη μεταμόσχευση ομοιάζουν σε αιμορροφιλικούς και μη ασθενείς. Ασθενείς με συλλοίμωξη, στους οποίους η HIV λοίμωξη δεν εξελίσσεται ή είναι σταθερή υπό HAART μπορούν επίσης να υποβληθούν σε μεταμόσχευση, αλλά εμφανίζουν χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης μετά τη μεταμόσχευση σε σχέση με τους ασθενείς με μονολοίμωξη. Το πλεονέκτημα της μεταμόσχευσης στους αιμορροφιλικούς είναι ότι, επειδή το μεταμοσχευμένο ήπαρ είναι ικανό να παράγει φυσιολογικά επίπεδα FVIII και FIX, οι ασθενείς μετά τη μεταμόσχευση δεν πάσχουν πλέον από αιμορροφιλία. Δυστυχώς, συχνή είναι η υποτροπή της HCV λοίμωξης στο μόσχευμα μετά από άλλοτε άλλο χρόνο, η οποία επιπλέον σχετίζεται συχνά με επιταχυνόμενη εξέλιξη της νόσου. Η πρώτη μεταμόσχευση ήπατος σε αιμορροφιλικό ασθενή αναφέρεται το Έκτοτε, διενεργήθηκαν πολλές επιτυχείς μεταμοσχεύσεις με χορήγηση παραγόντων πήξης προεγχειρητικά, περιεγχειρητικά και μετεγχειρητικά. 81, ΗΠΑΤΊΤΙΔΑ Β Η HBV λοίμωξη αποτελεί σημαντικό πρόβλημα της δημόσιας υγείας σε πολλά κράτη στον κόσμο, παρά τον επιτυχή εμβολιασμό και την αποτελεσματική αντιιική θεραπεία, και μπορεί να οδηγήσει σε χρόνια ηπατίτιδα, ηπατική κίρρωση, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, μεταμόσχευση ήπατος και θάνατο. Το 1982 ανακαλύφθηκε και άρχισε να εφαρμόζεται ασφαλές και αποτελεσματικό εμβόλιο κατά της ηπατίτιδας Β και το 1992 ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (World Health Organization ή WHO) συνέστησε εμβολιασμό κατά της ηπατίτιδας Β στην παιδική ηλικία παγκοσμίως. Έτσι, σήμερα το εμβόλιο χορηγείται στο γενικό πληθυσμό στην παιδική ηλικία σε πολλά κράτη. Ο πλήρης βασικός εμβολιασμός παρέχει μακροχρόνια ή και εφ όρου ζωής προστασία σε πάνω από 95% των εμβολιασμένων, ανεξαρτήτως της ηλικίας τους. Σύμφωνα με τον WHO, οι αιμορροφιλικοί ανήκουν στις ομάδες υψηλού κινδύνου που πρέπει να εμβολιάζονται. 83,84 Παγκοσμίως, υπολογίζεται ότι πάνω από 2 δισεκατομμύρια άνθρωποι έχουν μολυνθεί με τον HBV και πάνω από εκατομμύρια άνθρωποι έχουν χρόνια 23

25 HBV λοίμωξη. Περίπου άνθρωποι πεθαίνουν κάθε χρόνο από τις συνέπειες του HBV. 83,85 Ο WHO αναγνώρισε περιοχές με υψηλό επιπολασμό (>8%) της χρόνιας HBV λοίμωξης, περιοχές με ενδιάμεσο επιπολασμό (2-8%) και περιοχές με χαμηλό επιπολασμό (<2%). Περιοχές υψηλής ενδημικότητας είναι η νοτιοανατολική Ασία και η λεκάνη του Ειρηνικού (με εξαίρεση την Ιαπωνία, την Αυστραλία και τη Νέα Ζηλανδία), η υποσαχάρια Αφρική, η λεκάνη του Αμαζονίου, τμήματα της Μέσης Ανατολής, οι Δημοκρατίες της Κεντρικής Ασίας και κάποια κράτη της ανατολικής Ευρώπης. Στις περιοχές αυτές, το 70-90% των ανθρώπων έχουν μολυνθεί με HBV πριν την ηλικία των 40 ετών και 8-20% είναι φορείς. Περιοχές χαμηλής ενδημικότητας είναι η βόρεια Αμερική, η δυτική και βόρεια Ευρώπη, η Αυστραλία και τμήματα της νότιας Αμερικής, όπου κάτω από 20% των ανθρώπων έχουν μολυνθεί με HBV και κάτω από 2% είναι φορείς. Ο επιπολασμός HBsAg στην Ευρώπη κυμαίνεται μεταξύ 0,1% και 5,6% στα διάφορα κράτη, με τα υψηλότερα επίπεδα να παρατηρούνται στην Ελλάδα και στη Ρουμανία. 83 Η πλειοψηφία των φορέων HBsAg διαβιεί σε κράτη με περιορισμένους πόρους, ενώ στα ανεπτυγμένα κράτη η πλειοψηφία των φορέων είναι μετανάστες. Ο επιπολασμός HBsAg στους μετανάστες από περιοχές υψηλής ή ενδιάμεσης ενδημικότητας είναι 5-90 φορές μεγαλύτερος από αυτόν του πληθυσμού της χώρας υποδοχής. 86 Ο επιπολασμός της χρόνιας HBV λοίμωξης μειώθηκε από το 1990 έως το 2005 στις περισσότερες περιοχές του πλανήτη, γεγονός που μπορεί να οφείλεται στον επιτυχή μαζικό εμβολιασμό. 87 Στις περιοχές υψηλού επιπολασμού κυριαρχεί η περιγεννητική μετάδοση, στις περιοχές ενδιάμεσου επιπολασμού η οριζόντια μετάδοση, ιδίως κατά την παιδική ηλικία, ενώ στις περιοχές χαμηλού επιπολασμού η μετάδοση με τη σεξουαλική επαφή και τη χρήση ενδοφλέβιων ουσιών. Στα περισσότερα κράτη το αίμα και τα προϊόντα του είναι πλέον ασφαλή ως προς τη μετάδοση HBV, αφού τις τελευταίες 3 δεκαετίες εφαρμόζονται αυστηρά μέτρα ασφαλείας. 88 Σε μια αναδρομική ανασκόπηση των καταγραφών της μετά από μετάγγιση ηπατίτιδας Β από το 1991 έως το 1997 στο Ηνωμένο Βασίλειο, υπολογίστηκε ότι ο κίνδυνος μόλυνσης με τον HBV μετά από μετάγγιση ήταν 0,6%. 89 Κατά τις δεκαετίες του 1970 και 1980 η πλειοψηφία των αιμορροφιλικών ήρθε σε επαφή με τον HBV μέσω των παραγώγων πλάσματος. Μελέτες κατά τις δεκαετίες αυτές έδειχναν επιπολασμό ηπατίτιδας Β πάνω από 60% στον αιμορροφιλικό πληθυσμό. Το 1975 άρχισε ο έλεγχος των δοτών για HBsAg και το 1987 ενσωματώθηκαν τεχνικές αδρανοποίησης στην παραγωγική διαδικασία των παραγόντων πήξης. Έκτοτε δεν παρατηρήθηκε μετάδοση HBV με παράγωγα πλάσματος. 38 Ως συνέπεια αυτών, σήμερα πολλοί αιμορροφιλικοί εμφανίζουν θετικούς ορολογικούς δείκτες παρελθούσας λοίμωξης και φυσικής ανοσίας (HBcAb και HBsAb), ενώ κάτω από 5% είναι εμφανίζουν χρόνια HBV λοίμωξη με θετικό HBsAg. 90 Η φυσική πορεία, η διάγνωση και η θεραπεία της ηπατίτιδας Β στον αιμορροφιλικό ασθενή δεν διαφέρουν από τον μη αιμορροφιλικό πληθυσμό. Η ηλικία της λοίμωξης σχετίζεται αντίστροφα με τον κίνδυνο μετάπτωσης σε χρονιότητα. Έτσι, το ποσοστό εξέλιξης από οξεία προς χρόνια HBV λοίμωξη είναι περίπου 90% για περιπτώσεις περιγεννητικής λοίμωξης, 20-50% για περιπτώσεις λοίμωξης σε ηλικία 1 έως 5 ετών, και κάτω από 5% για περιπτώσεις λοίμωξης στην ενήλικη ζωή. 53 Η οξεία HBV λοίμωξη είναι κλινική διάγνωση που χαρακτηρίζεται από συμπτώματα, τρανσαμινασαιμία, θετικό HBsAg, συνήθως θετικά IgM αντισώματα κατά του πυρηνικού αντιγόνου του HBV (IgM HBcAb), ανιχνεύσιμο HBV DNA και συνήθως θετικό αντιγόνο e του HBV (HBeAg), το οποίο όμως είναι μικρής κλινικής αξίας στη φάση αυτή. Η χρόνια HBV λοίμωξη ορίζεται ως παραμονή του HBsAg για πάνω από 6 μήνες. Οι ασθενείς με χρόνια HBV λοίμωξη δεν 24

26 διαγιγνώσκονται κλινικά, καθώς σπάνια εμφανίζουν συμπτώματα, αλλά εργαστηριακά. Για το λόγο αυτό, οι ενήλικες που μολύνονται συχνά μένουν αδιάγνωστοι και δεν λαμβάνουν έγκαιρα θεραπεία. Το HBsAg είναι το κύριο μέτρο για την ανίχνευση και τη διάγνωση της χρόνιας λοίμωξης, ενώ το HBV DNA δε χρησιμοποιείται για ανίχνευση, αλλά καθορίζει τον κίνδυνο για σημαντική ηπατική νόσο και την ένδειξη για θεραπεία σε ασθενείς με θετικό HBsAg. Για σκοπούς ανίχνευσης χρησιμοποιείται επίσης και το HBcAb για να αναγνωριστούν περιπτώσεις στις οποίες το HBsAg είναι αρνητικό. 84,91 Όλοι οι αιμορροφιλικοί ασθενείς πρέπει να ελέγχονται στα Κέντρα Αιμορροφιλικών για HBsAg, HBsAb και HBcAb και, σε περίπτωση θετικού HBsAg, πρέπει να προσδιορίζεται το HBV DNA. Η φυσική ιστορία της χρόνιας HBV λοίμωξης κυμαίνεται από την κατάσταση του ανενεργού φορέα με καλή πρόγνωση μέχρι την εξελισσόμενη χρόνια ηπατίτιδα Β με υψηλό κίνδυνο κίρρωσης, μεταμόσχευσης ήπατος, ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και θανάτου σχετιζόμενου με το ήπαρ. Κίρρωση ήπατος αναπτύσσεται σε 20-30% των ασθενών με χρόνια λοίμωξη. 92 Ο κίνδυνος ανάπτυξης κίρρωσης σχετίζεται με το ιικό φορτίο, τη διάρκεια της λοίμωξης, το βαθμό της ίνωσης και της φλεγμονής, το άρρεν φύλο και την ύπαρξη συνοσηρότητας (κατανάλωση αλκοόλ, σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2, παχυσαρκία, συλλοίμωξη με HDV ή HIV). Για ασθενείς με αντιρροπούμενη κίρρωση που δε λαμβάνουν θεραπεία, η πενταετής επίπτωση μη αντιρροπούμενης κίρρωσης είναι 20%. 93 Η κίρρωση σχετίζεται με κίνδυνο ανάπτυξης ηπατοκυτταρικού καρκινώματος της τάξεως του 25%, και η HBV λοίμωξη αποτελεί την αιτία του 10-15% των ηπατοκυτταρικών καρκινωμάτων. Οι περισσότερες περιπτώσεις ηπατοκυτταρικού καρκινώματος συμβαίνουν σε κιρρωτικούς ασθενείς, ενώ κάποιες περιπτώσεις εμφανίζονται και σε ασθενείς χωρίς κίρρωση. Η ετήσια επίπτωση καρκινώματος είναι 2-6% σε κιρρωτικούς ασθενείς. Η επίπτωση ηπατοκυτταρικού καρκινώματος αυξάνεται επίσης σε ασθενείς με αυξημένα επίπεδα ALT ή με παροξύνσεις ALT. Η θνητότητα του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος είναι υψηλή, ιδιαίτερα όταν η διάγνωση αυτού γίνεται μετά την εμφάνιση συμπτωμάτων. Παρά τους προληπτικούς ελέγχους των ασθενών με HBV λοίμωξη, το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα συχνά ανιχνεύεται σε προχωρημένο στάδιο. Έτσι, η HBV λοίμωξη σχετίζεται με αύξηση της συνολικής θνησιμότητας. 94,95 Ιδανικό στόχο της θεραπείας αποτελεί η ορομετατροπή του HBsAg, που ισοδυναμεί με ίαση, αλλά δεν επιτυγχάνεται με τους χρησιμοποιούμενους αντιιικούς παράγοντες. Στους HBeAg θετικούς φορείς, η ορομετατροπή του αντιγόνου αυτού μπορεί να αποτελέσει στόχο της θεραπείας, γιατί σχετίζεται με χαμηλό ρυθμό αναπαραγωγής του ιού και βελτίωση της πρόγνωσης. Σήμερα, ο στόχος που τίθεται στη θεραπεία είναι η μακροχρόνια και αποτελεσματική καταστολή του πολλαπλασιασμού του HBV, που σχετίζεται με πτώση της ALT σε φυσιολογικά επίπεδα, ιστολογική βελτίωση της φλεγμονής και της ίνωσης και μείωση των επιπλοκών. 96 Σε όλες τις κατευθυντήριες οδηγίες η ένδειξη για θεραπεία βασίζεται στο HBV DNA, στην ALT και στη σοβαρότητα της ηπατικής βλάβης που συνήθως εκτιμάται με ηπατική βιοψία. Υπάρχουν δύο διαφορετικές στρατηγικές αντιμετώπισης της χρόνιας ηπατίτιδας Β: 1) πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη για συγκεκριμένη χρονική διάρκεια και 2) νουκλεοτιδικά/ νουκλεοσιδικά ανάλογα για μακροχρόνια ή και εφ όρου ζωής αγωγή. 91,95 H πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη άλφα 2α έχει εγκριθεί για τη χρόνια ηπατίτιδα Β. Χορηγείται σε ενέσιμη μορφή για 48 εβδομάδες, είναι περισσότερο αποτελεσματική στους HBeAg θετικούς ασθενείς, σχετίζεται με αρκετές ανεπιθύμητες ενέργειες και δεν επιτρέπεται να χορηγηθεί σε ασθενείς με προχωρημένη ή μη αντιρροπούμενη κίρρωση. Η από του στόματος χορήγηση των νουκλεοτιδίων/νουκλεοσιδίων οδηγεί 25

27 σε αποτελεσματική και μακροχρόνια καταστολή της αντιγραφής του ιικού DNA και συνήθως δεν προκαλεί σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες. Σήμερα, η εντεκαβίρη και η τενοφοβίρη αποτελούν τους πιο ικανούς αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης του HBV και σχετίζονται με πολύ χαμηλή ανάπτυξη αντίστασης σε πρωτοθεραπευόμενους ασθενείς. 97 Γι αυτό συστήνονται ως μονοθεραπεία πρώτης γραμμής. Τα παλαιότερα φάρμακα λαμιβουδίνη, αδεφοβίρη και τελμπιβουδίνη που σχετίζονται με συχνή ανάπτυξη αντίστασης πρέπει πλέον να χρησιμοποιούνται μόνο όταν τα νεότερα φάρμακα δεν είναι διαθέσιμα. 91 Τα νουκλεοσιδικά/νουκλεοτιδικά ανάλογα μπορούν να χορηγηθούν σε ασθενείς με προχωρημένη ή ακόμη και μη αντιρροπούμενη κίρρωση και σε ασθενείς μετά από μεταμόσχευση ήπατος. Συνολικά, σήμερα η θεραπεία της χρόνιας HBV λοίμωξης ελέγχει αποτελεσματικά την ιική αντιγραφή μακροπρόθεσμα σχεδόν σε όλους τους ασθενείς. Έτσι, μειώνει τον κίνδυνο εξέλιξης και επιδείνωσης της ηπατικής νόσου και μπορεί ακόμα να αναστρέψει την ηπατική ίνωση και την αρχόμενη κίρρωση. 98 Η επίδραση της θεραπείας στη μείωση της επίπτωσης ηπατοκυτταρικού καρκινώματος είναι λιγότερο σαφής, ιδιαίτερα όταν έχει εγκατασταθεί κίρρωση. 99 Συλλοίμωξη με HBV και HIV συναντάται συχνά στους αιμορροφιλικούς. Ο HIV είναι γνωστό ότι επηρεάζει τη φυσική πορεία της HBV λοίμωξης, αυξάνοντας το ρυθμό ιικής αντιγραφής και τον κίνδυνο φορείας και χρονιότητας. 100 Η αντιρετροϊική θεραπεία κατά του HIV και η σχετιζόμενη με αυτή ανασύσταση του ανοσιακού συστήματος μπορεί να οδηγήσουν σε άνοση ηπατική βλάβη, καθώς τα μολυσμένα ηπατοκύτταρα γίνονται στόχοι αυτού. Το γεγονός αυτό μπορεί να οδηγήσει σε τρανσαμινασαιμία, η οποία είναι πιθανό να αποδοθεί λανθασμένα σε φαρμακευτική τοξικότητα. Για το λόγο αυτό οι μολυσμένοι με HIV αιμορροφιλικοί πρέπει να ελέγχονται για HBV όχι μόνο με ορολογικούς δείκτες, αλλά και με ανίχνευση του HBV DNA. Στην αντιμετώπιση των ασθενών με συλλοίμωξη προτεραιότητα έχει ο έλεγχος του HIV. Οι περισσότεροι αντιιικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της HIV λοίμωξης δεν καταστέλλουν επαρκώς τον HBV. Για τους ασθενείς, στους οποίους η HIV λοίμωξη έχει τεθεί υπό έλεγχο και οι οποίοι είναι υποψήφιοι για θεραπεία της ηπατίτιδας Β, οι στόχοι και οι χρησιμοποιούμενοι φαρμακευτικοί παράγοντες είναι ίδιοι με τους ασθενείς με HBV μονολοίμωξη ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΑΣΦΑΛΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΗΞΗΣ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ 4.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το ανθρώπειο πλάσμα που συλλέγεται μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε ως θεραπευτικό προϊόν (νωπό κατεψυγμένο πλάσμα) είτε ως πρώτη ύλη για την παραγωγή φαρμακευτικών προϊόντων (προϊόντα ή παράγωγα πλάσματος). Αυτό το σύνθετο βιολογικό στοιχείο περιέχει χιλιάδες πρωτεΐνες με πολλές διαφορετικές φυσιολογικές λειτουργίες. Οι πρωτεΐνες που περιέχονται σε μεγαλύτερη ποσότητα είναι η αλβουμίνη και η ανοσοσφαιρίνη G (IgG) με συγκεντρώσεις περίπου 35 και 10g/l, αντίστοιχα, αντιπροσωπεύοντας το 80% του συνόλου των πρωτεϊνών του πλάσματος. Σε μικρότερη ποσότητα το πλάσμα περιέχει άλλες πρωτεΐνες, όπως τους αναστολείς πρωτεασών (π.χ. α1- αντιθρυψίνη σε συγκέντρωση 1,5g/l, αντιθρομβίνη σε συγκέντρωση 300mg/l) και τους παράγοντες πήξης (π.χ. FVIII σε συγκέντρωση λίγων ng/l). Σήμερα, περίπου 20 διαφορετικές πρωτεΐνες προερχόμενες από το πλάσμα χρησιμοποιούνται ως φαρμακευτικά προϊόντα και συχνά αποτελούν τη μόνη διαθέσιμη επιλογή για την πρόληψη, διαχείριση και θεραπεία συχνά απειλητικών για 26

28 τη ζωή καταστάσεων, όπως το τραύμα, οι συγγενείς ανεπάρκειες, οι ανοσολογικές διαταραχές και οι λοιμώξεις, καλύπτοντας τις ανάγκες μεγάλου αριθμού ασθενών. 102 Η βιομηχανική διαδικασία που χρησιμοποιείται για την απομόνωση των θεραπευτικών πρωτεϊνών του πλάσματος ονομάζεται κλασματοποίηση. Πάνω από 23 ως 28 εκατομμύρια λίτρα πλάσματος κλασματοποιούνται κάθε χρόνο παγκοσμίως σε παρτίδες μερικών χιλιάδων λίτρων σε περίπου 70 εργοστάσια. Η όλη διαδικασία, που παραμένει σε μεγάλο βαθμό βασισμένη στην επεξεργασία κλασματοποίησης με αιθανόλη, έχει εξελιχθεί αρκετά τα τελευταία χρόνια προς την κατεύθυνση της αύξησης της καθαρότητας των προϊόντων, της ενίσχυσης της ανάκτησης IgG και της απομόνωσης νέων πρωτεϊνών, όπως ο vwf και η πρωτεΐνη C. Εξαιτίας της ανθρώπινης προέλευσης της πρώτης ύλης και της ανάγκης συγκέντρωσης έως μονάδων πλάσματος στις δεξαμενές προς επεξεργασία, ο μεγαλύτερος κίνδυνος που συνδέεται με τα παράγωγα πλάσματος είναι η μετάδοση παθογόνων. Η σύγχρονη κλασματοποίηση του πλάσματος περιλαμβάνει διαδοχικά στάδια παραγωγής για την απομόνωση των αδρών κλασμάτων, τα οποία υφίστανται περαιτέρω επεξεργασία προς μεμονωμένα θεραπευτικά προϊόντα. Επικυρωμένα εξειδικευμένα στάδια για την αδρανοποίηση και/ ή απομάκρυνση λοιμογόνων παραγόντων που πιθανόν να υπάρχουν στην αρχική δεξαμενή πλάσματος αποτελούν αναπόσπαστο τμήμα της όλης διαδικασίας. 103 Αυτή η εξελιγμένη βιομηχανική διαδικασία διεξάγεται υπό υψηλές συνθήκες υγιεινής σε εξουσιοδοτημένες εγκαταστάσεις που συμμορφώνονται με τις ορθές παραγωγικές πρακτικές και ακολουθούν τις αρχές διασφάλισης ποιότητας. Με την πάροδο των ετών, η κλασματοποίηση του πλάσματος εξελίχθηκε από μια ιατρική υπηρεσία κυρίως προσανατολισμένη να καλύπτει τις ανάγκες των τοπικών κοινοτήτων σε μια παγκόσμια βιομηχανία παραγωγής που συμμορφώνεται σε αυστηρούς κανονισμούς που αφορούν τη συλλογή του προς κλασματοποίηση πλάσματος, την παρασκευή των προϊόντων και, τέλος, τη διανομή αυτών. Σε ένα τέτοιο αυστηρώς καθορισμένο και επαγγελματικό περιβάλλον, τα κλασματοποιημένα προϊόντα πλάσματος που παράγονται με τις σύγχρονες μεθόδους ανήκουν με βεβαιότητα στα χαμηλότερου κινδύνου βιολογικά προϊόντα που χρησιμοποιούνται στις μέρες μας ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ ΓΙΑ ΚΛΑΣΜΑΤΟΠΟΙΗΣΗ Η παραγωγή του πλάσματος που προορίζεται για κλασματοποίηση θεωρείται αναπόσπαστο κομμάτι της διαδικασίας παραγωγής των παραγώγων πλάσματος. Αυτό είναι λογικό δεδομένου ότι οι πρακτικές που χρησιμοποιούνται έχουν άμεση επίδραση στην ασφάλεια των παραγώγων, αφού μεμονωμένες μονάδες πλάσματος συλλέγονται σε μεγάλες δεξαμενές, από τις οποίες θα παρασκευαστούν θεραπευτικά σκευάσματα για χιλιάδες ασθενείς. Οι αξιώσεις για τη συλλογή του πλάσματος προς κλασματοποίηση διαφέρουν από εκείνες του πλάσματος που προορίζεται για χρήση ως FFP. Το πλάσμα προς κλασματοποίηση συλλέγεται σε ένα προκαθορισμένο περιβάλλον από εξουσιοδοτημένα/ αναγνωρισμένα ιδρύματα αίματος (Κέντρα Αιμοδοσίας και Κέντρα Πλασμαφαίρεσης) που επιθεωρούνται από τις οικείες Εθνικές Ρυθμιστικές Αρχές (National Regulatory Authorities ή NRAs). Οι εταιρίες κλασματοποίησης πλάσματος επίσης διενεργούν ελέγχους για να εξακριβώσουν ότι ο πάροχος πλάσματος πληροί τις προδιαγραφές. Ποικίλες αξιώσεις για τη συλλογή του πλάσματος προς κλασματοποίηση περιγράφονται από οργανισμούς, όπως οι PIC/S (Pharmaceutical Inspection Convention and Pharmaceutical Inspection 27

29 Cooperation Scheme), FDA (US Food and Drug Administration) και WHO (World Health Organization) και περιγράφονται ακολούθως. 103, Επιλογή και έλεγχος δοτών Οι δεξαμενές πλάσματος κυμαίνονται από 500 έως λίτρα. Κάθε λίτρο πλάσματος αντιστοιχεί περίπου σε 4 μονάδες πλάσματος προερχόμενες από 4 δωρεές ολικού αίματος ή σε 1,7 μονάδες πλάσματος από δότες πλασμαφαίρεσης. Έτσι, κάθε δεξαμενή περιέχει αρκετές χιλιάδες μονάδες πλάσματος (μέχρι και 60000) που αντιπροσωπεύουν το ατομικό αναμνηστικό λοιμωδών νοσημάτων κάθε δότη σε μορφή αντισωμάτων ή κάποιες φορές και αντιγόνων. Θα μπορούσε να ειπωθεί ότι υγιείς, ειλικρινείς δότες είναι το κλειδί για ασφαλή προϊόντα. Στη σύγχρονη εποχή όμως, που εφαρμόζονται συστηματικά εργαστηριακοί έλεγχοι των μεμονωμένων μονάδων και των δεξαμενών πλάσματος για ανίχνευση ιών, καθώς και ισχυρές διεργασίες μείωσης του ιικού φορτίου στα παράγωγα πλάσματος, ο ρόλος της επιλογής των δοτών με προσεκτική λήψη ιστορικού έχει περιοριστεί σημαντικά. Μπορεί, ωστόσο, να συμβάλλει στον περιορισμό της μετάδοσης νοσημάτων, για τα οποία δεν έχουν ανακαλυφθεί ειδικές διαγνωστικές διαδικασίες (π.χ. variant Creutzfeldt-Jacob disease ή vcjd), και στη μείωση των περιπτώσεων δωρεάς πλάσματος κατά την περίοδο «παραθύρου» της λοίμωξης, όπου ο δότης μεταδίδει τη νόσο αλλά οι διαγνωστικές δοκιμασίες είναι ακόμη αρνητικές. Αυτά επιτυγχάνονται με την αναγνώριση των ύποπτων δοτών που από το ιστορικό τους παρουσιάζουν παράγοντες κινδύνου λοίμωξης με τα συγκεκριμένα παθογόνα και τον αποκλεισμό τους από τη διαδικασία. 105 Οι υποψήφιοι δότες λαμβάνουν σχετικό εκπαιδευτικό υλικό που αφορά στους παράγοντες κινδύνου μόλυνσης με ιούς και στην πιθανότητα μετάδοσης του ιού στο λήπτη, με ιδιαίτερη έμφαση στο γεγονός ότι στα πρώτα στάδια της λοίμωξης το μολυσμένο άτομο μπορεί να είναι μεταδοτικό παρά τον αρνητικό διαγνωστικό έλεγχο. Επιπλέον, υποβάλλονται σε ερωτήσεις που προστατεύουν τον λήπτη από τη μόλυνση με λοιμώξεις μεταδιδόμενες με το πλάσμα και αφορούν τόσο στο ιατρικό αναμνηστικό (π.χ. λοιμώδη νοσήματα, παλαιότεροι και πρόσφατοι εμβολιασμοί) όσο και στην κοινωνική συμπεριφορά του δότη (π.χ. σεξουαλική ζωή, χρήση ενδοφλέβιων ουσιών), ώστε να αποδείξουν την απουσία παραγόντων κινδύνου και σημείων λοίμωξης και να επιβεβαιώσουν τη συμμόρφωσή τους με τη διαδικασία δωρεάς πλάσματος προς κλασματοποίηση. Χρησιμοποιούνται προκαθορισμένα ερωτηματολόγια που αφορούν στην μόλυνση με HIV, HCV, HBV, αλλά και στη vcjd. 106 Επίσης, στους δότες παρέχεται η δυνατότητα να αποκλείσουν τους εαυτούς τους από τη διαδικασία, αν θεωρούν ότι αποτελούν κίνδυνο για τη δημόσια υγεία. Το ατομικό αναμνηστικό των δοτών καταγράφεται και αρχειοθετείται. Κάποιες Αρχές απαιτούν τη συνεχή επιδημιολογική επιτήρηση του πληθυσμού των δοτών με σκοπό τον καθορισμό της επίπτωσης, του επιπολασμού και των τάσεων των γνωστών λοιμογόνων δεικτών (όπως των αντισωμάτων κατά των HIV-1, HIV-2 και HCV και του Αυστραλιανού αντιγόνου) στον πληθυσμό αυτό. Η ενέργεια αυτή συμβάλλει επίσης στην πρώιμη ανίχνευση αναδυόμενων ασθενειών και την έγκαιρη λήψη μέτρων για τον έλεγχο αυτών. Ένα επιπρόσθετο μέτρο προστασίας αποτελεί η καταγραφή των αποκλεισθέντων δοτών, καθώς ένα προηγουμένως θετικό αποτέλεσμα μπορεί μεταγενέστερα να μετατραπεί σε αρνητικό, ενώ το άτομο συνεχίζει να μεταδίδει τη νόσο. Κάτι τέτοιο μπορεί να οφείλεται είτε σε βιολογικό φαινόμενο, είτε σε διαγνωστικό λάθος. Επιπλέον, άτομα, τα οποία εθελοντικά κατά την πρώτη επίσκεψη δήλωσαν ιστορικό ηπατίτιδας, ενδοφλέβιας χρήσης ουσιών ή 28

30 συμπεριφοράς υψηλού κινδύνου, καταγράφονται στο αρχείο και αποκλείονται. Τα άτομα αυτά μπορεί να αποκρύψουν τέτοιες πληροφορίες σε επόμενη επίσκεψη. 107 Ως δότες πλάσματος προς κλασματοποίηση γίνονται τελικά δεκτά τα άτομα που πληρούν τα κριτήρια δωρεάς, όπως είναι η ηλικία του δότη και η συχνότητα των δωρεών, που δεν εμφανίζουν παράγοντες κινδύνου για αιματογενώς μεταδιδόμενα λοιμώδη νοσήματα και που συμμορφώνονται με τις προϋποθέσεις που ορίζει η εταιρία κλασματοποίησης και οι Εθνικές Ρυθμιστικές Αρχές του κράτους όπου γίνεται η συλλογή του πλάσματος αλλά και η χρήση των προϊόντων. Τα κριτήρια ένταξης λαμβάνουν υπόψη τα επιστημονικά δεδομένα για τους κινδύνους μετάδοσης παθογόνων με τα παράγωγα πλάσματος. Τα περισσότερα κριτήρια ένταξης των δοτών ολικού αίματος και των δοτών πλασμαφαίρεσης αλληλεπικαλύπτονται, με εξαίρεση τη συχνότητα δωρεών που είναι μεγαλύτερη για τους δότες πλασμαφαίρεσης. Για παράδειγμα, με σκοπό την πρόληψη μετάδοσης HIV αποκλείονται μόνιμα άτομα με κλινική ή εργαστηριακή διάγνωση HIV λοίμωξης, άνδρες που είχαν έστω και μία ομοφυλοφιλική σεξουαλική επαφή από το 1977 και χρήστες ενδοφλέβιων ουσιών, ενώ για την πρόληψη μετάδοσης ιογενούς ηπατίτιδας αποκλείονται μόνιμα άτομα με ιστορικό συμπτωματικής ιογενούς ηπατίτιδας μετά την ηλικία των δέκα ετών και άτομα που οποιαδήποτε στιγμή διαγνώστηκαν θετικά για HBsAg. 103, Μέθοδοι συλλογής πλάσματος Από το πλάσμα που προορίζεται για κλασματοποίηση περίπου το 35% προέρχεται από φυγοκέντρηση ολικού αίματος και το 65% συλλέγεται με μεθόδους πλασμαφαίρεσης. Η συλλογή, η επεξεργασία και η αποθήκευση του αίματος ή του πλάσματος αυτού παίζουν σημαντικό ρόλο στην ποιότητα του πλάσματος και στην ανάκτηση των πιο ασταθών πρωτεϊνών, όπως του FVIII. Πιο συγκεκριμένα, υφίσταται ο κίνδυνος ενεργοποίησης της πήξης, του συμπληρώματος και του ινωδολυτικού μηχανισμού, με αποτέλεσμα την παραγωγή πρωτεασών. Όσον αφορά στο προερχόμενο από ολικό αίμα πλάσμα, για να διατηρηθεί η συνοχή του και να περιοριστούν οι προαναφερθέντες κίνδυνοι, χρειάζεται καλή ανάμιξη του λαμβανόμενου αίματος με το αντιπηκτικό διάλυμα (διάλυμα κιτρικού νατρίου) από την αρχή μέχρι το τέλος της διαδικασίας συλλογής, διατήρηση της διάρκειας της συλλογής σε επίπεδα που δεν ξεπερνούν τα 15 λεπτά και αποφυγή των διακυμάνσεων θερμοκρασίας. Λίγες ώρες μετά τη συλλογή, το ολικό αίμα υποβάλλεται σε φυγοκέντρηση που διαχωρίζει τα κυτταρικά στοιχεία από το πλάσμα. Ο μέσος όγκος αυτού του πλάσματος που προέρχεται από μια μονάδα ολικού αίματος είναι 220ml και εξαρτάται από τον όγκο της μονάδας ( ml) και από τον αιματοκρίτη του δότη. 102 Η πλασμαφαίρεση είναι μια διαδικασία, κατά την οποία ολικό αίμα αφαιρείται από το δότη, αναμιγνύεται με αντιπηκτικό διάλυμα (διάλυμα κιτρικού οξέως 4%) και διαχωρίζεται άμεσα με φυσικούς τρόπους (φυγοκέντρηση, διήθηση ή συνδυασμός) στα συστατικά του. Σε ελάχιστο χρόνο, τα ερυθρά αιμοσφαίρια επιστρέφονται στο δότη, ενώ το πλάσμα ανακτάται και συλλέγεται σε δοχείο. Η διάρκεια της πλασμαφαίρεσης εξαρτάται από τον αριθμό των διενεργούμενων κύκλων και κυμαίνεται τυπικά μεταξύ 35 και 70 λεπτών. Ο όγκος του πλασμαφαιρεθέντος πλάσματος μπορεί να είναι από 450 έως 880ml, ανάλογα με τους κρατικούς κανονισμούς και το πρωτόκολλο συλλογής. Τέτοιου είδους πλάσμα μπορεί επίσης να παραχθεί ως παραπροϊόν στη διαδικασία της αιμοπεταλιαφαίρεσης. 109 Η διαδικασία παραγωγής συμπυκνωμένων παραγόντων πήξης και τα εφαρμοζόμενα μέτρα ασφαλείας ενάντια στα παθογόνα είναι πανομοιότυπα και για τις δύο 29

31 προαναφερθείσες πηγές προέλευσης πλάσματος. 107,110 Ανεξαρτήτως της μεθόδου συλλογής, το πλάσμα που προκύπτει είναι κατάλληλο για την παραγωγή όλων των προϊόντων. Ωστόσο, φαίνεται ότι η μέση περιεκτικότητα σε παράγοντες πήξης, και ιδίως στον FVIII, είναι χαμηλότερη στο πλάσμα που προέρχεται από μονάδες ολικού αίματος. Αυτό οφείλεται στο μεγαλύτερο χρονικό διάστημα που μεσολαβεί μέχρι την κατάψυξη του προερχόμενου από ολικό αίμα πλάσματος, αφού αυτό πρέπει πρώτα να φυγοκεντρηθεί, στη χρήση υψηλότερης συγκέντρωσης αντιπηκτικού, και στο υψηλότερο ποσοστό κυτταρικής επιμόλυνσης, η οποία ευθύνεται για την έκλυση πρωτεολυτικών ενζύμων που επηρεάζουν τη σταθερότητα των παραγόντων πήξης. Επιπλέον, να αναφερθεί ότι το πλάσμα που συλλέγεται με πλασμαφαίρεση περιέχει χαμηλότερη συγκέντρωση IgG, όταν προέρχεται από τακτικούς δότες. Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη και η ποιότητα των πρωτεϊνών δεν επηρεάζεται από το χρησιμοποιούμενο σύστημα πλασμαφαίρεσης. Ωστόσο, το υπολειπόμενο κυτταρικό περιεχόμενο ποικίλλει ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της συσκευής διαχωρισμού κυττάρων Έλεγχος για λοιμογόνους παράγοντες Έχουν αναγνωριστεί διάφορα παθογόνα που είναι δυνατό να μολύνουν το ανθρώπινο αίμα. Βακτήρια, παράσιτα και ενδοκυττάριοι ιοί δεν μεταδίδονται μέσω παραγώγων πλάσματος, είτε γιατί καταστρέφονται κατά τα στάδια κατάψυξης και απόψυξης του πλάσματος, είτε γιατί απομακρύνονται κατά τα στάδια διήθησης μέσω πόρων διαμέτρου 0,2-1μm που χρησιμοποιούνται στην παραγωγική διαδικασία. Λοιμογόνοι, μεταδιδόμενοι με το πλάσμα ιοί είναι οι εξής: HIV, HCV, HBV, HAV, Β19V και WNV (West Nile virus). 112 Τα ποικίλα και αλληλοσυμπληρούμενα επίπεδα ασφαλείας της παραγωγικής διαδικασίας των παραγώγων πλάσματος, που ξεκινούν από την επιλογή των δοτών και φτάνουν μέχρι την απελευθέρωση των τελικών προϊόντων στην κυκλοφορία εξασφαλίζουν την προστασία εναντίον αυτών των παθογόνων. 105 Βέβαια, η έκταση του ιολογικού ελέγχου που διενεργείται στο προς κλασματοποίηση πλάσμα συσχετίζεται άμεσα με την ικανότητα των ακολούθως εφαρμοζόμενων διαδικασιών να εκμηδενίσουν τον κίνδυνο μετάδοσης ιών. 102 Ένα μέρος του ελέγχου διενεργείται στα Κέντρα Αιμοδοσίας και Πλασμαφαίρεσης. Πιο συγκεκριμένα, τα Κέντρα Αιμοδοσίας και Πλασμαφαίρεσης είναι υπεύθυνα για την επιλογή των δοτών που περιγράφηκε παραπάνω, καθώς και για τον ορολογικό έλεγχο των μεμονωμένων μονάδων που συλλέγονται. Οι μεμονωμένες μονάδες πλάσματος πρέπει να είναι αρνητικές για anti-hiv-1, anti- HIV-2, anti-hcv και HBsAg. 102,103 Η ανίχνευση ιικών αντιγόνων και αντισωμάτων γίνεται είτε με την ενζυμική ανοσοπροσροφητική μέθοδο (enzyme-linked immunosorbent assay ή EIA) είτε με την παρόμοια τεχνική χημειοφωταύγειας (chemiluminescent assay ή CLIA). Κάθε δείγμα ελέγχεται και ταξινομείται ως αρνητικό ή αρχικώς θετικό. Τα αρχικώς θετικά δείγματα επανελέγχονται δύο ακόμη φορές με τη χρήση της ίδιας μεθόδου. Αν το δείγμα αποδειχθεί θετικό έστω σε έναν από τους δύο επανελέγχους, τότε θεωρείται θετικό και η συγκεκριμένη μονάδα καταστρέφεται. Αν το δείγμα είναι αρνητικό και στους δύο επανελέγχους, τότε θεωρείται αρνητικό και η συγκεκριμένη μονάδα διατίθεται προς χρήση. Αυτό είναι επιστημονικά αποδεκτό αν λάβει κανείς υπόψη το πρόβλημα των διασταυρούμενων αντιδράσεων που οδηγούν σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα, τα οποία όμως δεν επαληθεύονται στους προσεκτικούς επανελέγχους. Αυτές οι μέθοδοι ανίχνευσης βελτιώθηκαν ως προς την ευαισθησία και την ειδικότητά τους με την πάροδο των ετών

32 Μεταξύ φαινομενικά υγιών δοτών πλασμαφαίρεσης με αρνητικούς ορολογικούς δείκτες για τους εν λόγω ιούς υπάρχουν περίπου 54 θετικές για HBV, 36 θετικές για HCV και 1,5 θετικές για HIV-1 μονάδες πλάσματος, οι οποίες ελήφθησαν κατά την περίοδο «παραθύρου» της λοίμωξης που ο ορολογικός έλεγχος είναι αρνητικός. Οι αντίστοιχες ποσότητες για μονάδες πλάσματος που ελήφθησαν από ολικό αίμα είναι 29, 33,5 και 1,5. Αυτό σημαίνει ότι 1 σε κάθε 10 δεξαμενές πλάσματος των μονάδων μπορεί να περιέχει 1 μολυσμένη με HIV μονάδα, και κάθε δεξαμενή αυτού του μεγέθους μπορεί να περιέχει 2 μονάδες μολυσμένες με HBV και 2 μολυσμένες με HCV. 114 Από αυτά γίνεται φανερό ότι πολλά προϊόντα πλάσματος βασίζονται στις επιπρόσθετες διαδικασίες που περιγράφονται παρακάτω για να γίνουν ασφαλή. O υπόλοιπος έλεγχος για λοιμογόνους παράγοντες, καθώς και οι τεχνικές μείωσης του ιικού φορτίου διενεργούνται στις εταιρίες κλασματοποίησης και περιγράφονται ακολούθως. Στην Εικόνα 2 παρουσιάζονται συνοπτικά τα κύρια μέτρα που λαμβάνονται για την αποφυγή της μετάδοσης λοιμογόνων παραγόντων με τους παράγοντες πήξης πλάσματος κατά τη διαδικασία παραγωγής τους. Εικόνα Επεξεργασία, κατάψυξη, αποθήκευση και μεταφορά πλάσματος Αυτές είναι οι τελευταίες διαδικασίες που διενεργούνται στα Κέντρα Αιμοδοσίας και Πλασμαφαίρεσης. Η διατήρηση του FVIII κατά τη διάρκεια αυτών έχει μεγάλη σημασία για την παραγωγή συμπυκνωμάτων παραγόντων πήξης. Το προερχόμενο από πλασμαφαίρεση πλάσμα μπορεί να καταψυχθεί ταχέως στους -20 ο C, οπότε και διατηρείται ο FVIII. Αντιθέτως, το ολικό αίμα πρέπει πρώτα να φυγοκεντρηθεί για να αποδώσει πλάσμα. Όταν το αίμα ψύχεται στους 4 ο C μετά τη συλλογή του, το πλάσμα πρέπει να διαχωριστεί και να καταψυχθεί εντός 6 έως 8 ωρών για να διατηρηθεί ο FVIII. Έτσι, μετά των διαχωρισμό των έμμορφων συστατικών, το πλάσμα 31

33 καταψύχεται ταχέως σε θερμοκρασίες κάτω των -20 ο C. Τελικά, το πλάσμα που προορίζεται για κλασματοποίηση αποθηκεύεται σε θερμοκρασίες κάτω των -20 ο C ή και σε ακόμη χαμηλότερες για διάστημα αρκετών μηνών. Η θερμοκρασία αποθήκευσης πρέπει να διατηρείται κατά το δυνατόν σταθερή, ακόμα και κατά την μεταφορά του πλάσματος προς τις εταιρίες κλασματοποίησης, που μπορεί να βρίσκονται στην ίδια ή και σε άλλη ήπειρο. 103, Αποθήκευση μονάδων μέχρι τον επανέλεγχο του δότη Η βιομηχανία πλάσματος ανέπτυξε δύο ομάδες προτύπων για τη διασφάλιση της ποιότητας των παραγώγων πλάσματος: η πρώτη αφορά στη διαχείριση των δοτών και των αιμοδοτικών κέντρων (International Quality Plasma Program), ενώ η δεύτερη αφορά στη διαδικασία παρασκευής (Quality Standards of Excellence, Assurance, and Leadership ή QSEAL). Μέρος της δεύτερης ομάδας προτύπων αποτελεί η αποθήκευση των μονάδων πλάσματος για κάποιο χρονικό διάστημα, ένα μέτρο που χρησιμοποιείται για τη λύση του προβλήματος της περιόδου «παραθύρου». Η διαδικασία αυτή επιτρέπει την απόρριψη μονάδων που έχουν προηγουμένως συλλεχθεί από δότες που σε δεύτερο χρόνο αποδεικνύονται θετικοί σε κάποια δοκιμασία ανίχνευσης ιών. Πρόκειται, δηλαδή, για απόρριψη των δωρεών που ελήφθησαν κατά την περίοδο παραθύρου. Αυτό αποδείχτηκε πολύ αποτελεσματικό μέτρο αποφυγής της εισόδου στις δεξαμενές πλάσματος μονάδων από μολυσματικούς δότες που είναι αρνητικοί στον ορολογικό έλεγχο και στον έλεγχο νουκλεϊκών οξέων τη στιγμή της αιμοδοσίας. Η διαδικασία αυτή δεν αποτελεί ακριβώς καραντίνα, καθώς δεν οδηγεί σε απόρριψη μιας μολυσματικής μονάδας που δεν αναγνωρίστηκε με το ΝΑΤ, εάν ο δότης δεν επανεμφανιστεί. Η αποτελεσματικότητα του μέτρου οφείλεται στο γεγονός ότι ο μεγαλύτερος αριθμός των δοτών επανέρχεται και επανελέγχεται συστηματικά. Το πρότυπο QSEAL αναφέρεται εκτός από τη διαδικασία παρασκευής και στον έλεγχο των δοτών και στους ιολογικούς δείκτες με τρόπο που ταυτίζεται με το International Quality Plasma Program ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ Στάδια της παραγωγικής διαδικασίας Οι μονάδες πλάσματος από τα Κέντρα Αιμοδοσίας και Πλασμαφαίρεσης παραλαμβάνονται από τις εταιρίες κλασματοποίησης. Κατά την παραλαβή ελέγχονται οι διάφορες παράμετροι αποστολής (συσκευασία, ετικέτα, θερμοκρασία μεταφοράς, διαθεσιμότητα δειγμάτων για επιπρόσθετους ελέγχους, κ.λπ.). Εν συνεχεία, οι μονάδες τοποθετούνται σε καραντίνα σε ψυχρό χώρο (< -20 ο C) και ελέγχονται τα συνοδά έγγραφα (π.χ. υπογεγραμμένο πιστοποιητικό προέλευσης, ημερομηνία συλλογής, δεδομένα από τον ιολογικό έλεγχο, κ.λπ.). Επιπρόσθετες διαγνωστικές εξετάσεις και πιο συγκεκριμένα MP-NAT, αλλά και δειγματοληπτικός προσδιορισμός του FVIII σε μεμονωμένες μονάδες πλάσματος μπορεί να διενεργηθούν στο σημείο αυτό. Κατόπιν, οι εγκεκριμένες μονάδες πλάσματος μοιράζονται σε παρτίδες και τοποθετούνται σε ελεγχόμενη θερμοκρασία για λίγες ώρες για να διευκολυνθεί η διάνοιξή τους. Ακολουθεί το στάδιο της συγκέντρωσης του πλάσματος σε δεξαμενές (μέχρι και μονάδων) και της επεξεργασίας αυτού σε μεγάλη κλίματα. Το στάδιο αυτό περιλαμβάνει τις εξής διαδικασίες: διάνοιξη των συσκευασιών, συγκέντρωση του πλάσματος σε δεξαμενές, κρυοκαθίζηση, αδρή κλασματοποίηση όπως είναι επεξεργασία με αιθανόλη, ανάκτηση και αποθήκευση των ενδιάμεσων κλασμάτων για επακόλουθη επεξεργασία, σταδιακή κάθαρση μεμονωμένων πρωτεϊνών με ποικίλες μεθόδους που αναφέρονται στην επόμενη ενότητα, και μείωση 32

34 του ιικού φορτίου. Τα προϊόντα που προκύπτουν κατανέμονται στα τελικά δοχεία υπό άσηπτες συνθήκες. Αρκετά προϊόντα υποβάλλονται σε λυοφιλοποίηση για 3 έως 6 ημέρες. Ακολούθως, οι παρτίδες προϊόντων τοποθετούνται σε καραντίνα, ενώ ταυτόχρονα λαμβάνουν χώρα επιπρόσθετοι ποιοτικοί έλεγχοι και επανεξετάσεις των αρχείων της παραγωγικής διαδικασίας. Τέλος, οι εγκεκριμένες παρτίδες συσκευάζονται, τοποθετούνται σε κουτιά και είναι έτοιμες για αποστολή και διανομή Περαιτέρω έλεγχος για λοιμογόνους παράγοντες Ο εργαστηριακός έλεγχος για λοιμογόνους παράγοντες που ξεκινά στα Κέντρα Αιμοδοσίας και Πλασμαφαίρεσης συνεχίζεται στις εταιρίες κλασματοποίησης, ενσωματωμένος στα παραγωγικά στάδια. Εκεί αρχικά εκτελούνται μέθοδοι ανίχνευσης του γενετικού υλικού των ιών σε μικροδεξαμενές πλάσματος (Mini Pool - Nucleic Acid Testing ή MP-NAT). MP-NAT διενεργείται για τους HIV, HCV και HBV, αλλά και για τον HAV και τον παρβοϊό Β19 (Parvovirus B19 ή B19V) που δε φέρουν περίβλημα και είναι πιο ανθεκτικοί στις μεθόδους αδρανοποίησης. 102,117 Ο έλεγχος για το γενετικό υλικό του WNV, ο οποίος δικαιολογείται για την ασφάλεια την συστατικών του αίματος που δεν υποβάλλονται σε αδρανοποίηση ιών, δεν κρίνεται απαραίτητος για το πλάσμα που προορίζεται για κλασματοποίηση και πρόκειται να υποστεί ισχυρές διαδικασίες μείωσης των ιών με περίβλημα, στους οποίους περιλαμβάνονται και οι δύο αυτοί ιοί. 118 Όπως έχει προαναφερθεί, η ανίχνευση ιικών νουκλεϊκών οξέων (Nucleic Acid Testing, NAT) που επιτρέπει τον εντοπισμό περισσότερων επιμολυσμένων μονάδων λόγω της υψηλότερης ευαισθησίας της σε σχέση με τον ορολογικό έλεγχο προστέθηκε στους ελέγχους ρουτίνας το Η εφαρμογή του ΜP-NAT μείωσε το διαγνωστικό «παράθυρο» από 22 σε 11 ημέρες για τον HIV-1, από 59 σε 34 ημέρες για τον HBV και από 82 σε 23 ημέρες για τον HCV. Έτσι, οδήγησε σε ελάττωση της ποσότητας του ιού που εισέρχεται στη δεξαμενή πλάσματος προς κλασματοποίηση, μειώνοντας αφενός μεν τον αριθμό των μολυσμένων μονάδων που εισέρχονται στη δεξαμενή αφετέρου δε τη συγκέντρωση του ιού στη δεξαμενή, αφού οι μολυσμένες μονάδες που διαφεύγουν από τον ΝΑΤ έχουν πολύ χαμηλό ιικό φορτίο. 38,108 Στα επόμενα στάδια της παραγωγικής διαδικασίας, η βιομηχανική δεξαμενή πλάσματος, που συνήθως περιέχει το πλάσμα που προκύπτει μετά την αφαίρεση του κρυοϊζήματος, το οποίο αποτελεί το πρώτο ομογενοποιημένο κλάσμα πλάσματος, ελέγχεται περαιτέρω για να επιβεβαιωθεί η απουσία όλων των ορολογικών και γονιδιωματικών δεικτών των HIV, HCV, HBV, HAV και B19V. Πιο συγκεκριμένα, διενεργούνται οι εξής εξετάσεις: anti-hiv-1, anti-hiv-2, HIV NAT, anti-hcv, HCV NAT, HBsAg, HBV NAT, HAV NAT και Β19V NAT. Όλες οι διαγνωστικές δοκιμασίες πρέπει να είναι αρνητικές για να επιτραπεί η χρήση του πλάσματος για παρασκευή προϊόντων. Ο αποκλεισμός των θετικών μονάδων πλάσματος εξασφαλίζει ότι σχεδόν όλες οι μονάδες που εισέρχονται στη δεξαμενή πλάσματος δεν περιέχουν τους ιούς που ελέγχθηκαν. Ωστόσο, κάποια μολυσμένη μονάδα μπορεί να εισέλθει στη δεξαμενή, όταν τη στιγμή της δωρεάς πλάσματος ο δότης βρίσκεται στην περίοδο «παραθύρου» της λοίμωξης. Έτσι, παρά την αυστηρή επιλογή των δοτών και τον λεπτομερή και επανειλημμένο έλεγχο των μεμονωμένων μονάδων και των δεξαμενών, η παρουσία ιών στις δεξαμενές προς κλασματοποίηση δεν μπορεί να αποκλεισθεί. Για το λόγο αυτό, κατά τη διάρκεια των επόμενων παραγωγικών σταδίων στις εταιρίες κλασματοποίησης εφαρμόζονται τεχνικές αδρανοποίησης/ απομάκρυνσης ιών, οι οποίες παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην ασφάλεια των προϊόντων 33

35 και περιγράφονται διεξοδικά σε παρακάτω. Όλα αυτά τα αλληλοεπικαλυπτόμενα και αλληλοσυμπληρούμενα μέτρα εκμηδενίζουν τον κίνδυνο μετάδοσης ιών με τα παράγωγα πλάσματος Τυπικές μέθοδοι κάθαρσης πρωτεϊνών πλάσματος Κύρια τέτοια μέθοδο αποτελεί η κρυοκαθίζηση, δηλαδή η απόψυξη του ολικού πλάσματος σε θερμοκρασία +1 έως +4 ο C, κατά την οποία οι διάφορες πρωτεΐνες εμφανίζουν διαφορική διαλυτότητα και έτσι διαχωρίζονται. Αποτελεί το πρώτο βήμα της διαδικασίας κλασματοποίησης και είναι χρήσιμη για την παραγωγή του FVIII, του vwf και του ινωδογόνου. Άλλη κύρια μέθοδος κάθαρσης είναι η καθίζηση με αιθανόλη του πλάσματος που προκύπτει μετά την αφαίρεση του κρυοϊζηματος υπό καθορισμένες συνθήκες ph, θερμοκρασίας, πρωτεϊνικής συγκέντρωσης και ιοντικής ισχύος. Και στην περίπτωση αυτή ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται λόγω της διαφορικής διαλυτότητας των πρωτεϊνών στην αιθανόλη. Εφαρμόζεται κατά κύριο λόγο στην παραγωγή IgG και αλβουμίνης. Τρίτη μέθοδο διαχωρισμού αποτελεί η χρωματογραφία που μπορεί να είναι ανταλλαγής ιόντων, συγγένειας προς ειδικούς συνδέτες (π.χ. ηπαρίνη, μέταλλα), συγγένειας για μονοκλωνικά αντισώματα ή αποκλεισμού μεγέθους. Η αρχή διαχωρισμού βασίζεται στην διαφορική πρόσδεση των πρωτεϊνών στη χρωματογραφική στήλη ανάλογα με το ηλεκτρικό τους φορτίο, την συγγένειά τους προς τους ειδικούς συνδέτες ή τα μονοκλωνικά αντισώματα, ή το μοριακό τους βάρος, αντίστοιχα. Τέλος, μέθοδο κάθαρσης αποτελεί και η διήθηση που διαχωρίζει τις πρωτεΐνες με βάση το μοριακό τους βάρος και εφαρμόζεται σε όλα τα προϊόντα πλάσματος Αδρή περιγραφή της διαδικασίας κλασματοποίησης Η σύγχρονη διαδικασία κλασματοποίησης βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στην κρυοκαθίζηση και στην καθίζηση με αιθανόλη, όπως είχαν αναπτυχθεί τη δεκαετία του 1940 από τον Cohn στις ΗΠΑ ή τροποποιηθεί από τους Kistler και Nitschman στην Ευρώπη. 26,119 Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια αυξήθηκε η πολυπλοκότητα της διαδικασίας κλασματοποίησης με την εισαγωγή της χρωματογραφίας για την κάθαρση νέων πρωτεϊνών από τα υπάρχοντα κλάσματα, την ενσωμάτωση της χρωματογραφίας στη διαδικασία επεξεργασίας με αιθανόλη με σκοπό την ανάκτηση μεγαλύτερης ποσότητας IgG, και την προσθήκη εξειδικευμένων σταδίων αδρανοποίησης/ απομάκρυνσης ιών. 120 Το πρώτο βήμα της διαδικασίας όπως προαναφέρθηκε είναι η κρυοκαθίζηση του πλάσματος της δεξαμενής, από την οποία προκύπτει αφενός μεν το κρυοκαθίζημα (πλούσιο σε FVIII, vwf και ινωδογόνο), αφετέρου δε το πλάσμα από το οποίο έχει αφαιρεθεί το κρυοκαθίζημα. Το δεύτερο αυτό κλάσμα υποβάλλεται άμεσα σε χρωματογραφία για να ανακτηθούν οι ασταθείς παράγοντες πήξης (FIX, προθρομβινικό σύμπλεγμα) και αναστολείς πρωτεασών, και το εναπομείναν κλάσμα υπόκειται σε επεξεργασία με αιθανόλη. Παρόλο που η καθίζηση με αιθανόλη είναι η πιο διαδεδομένη μέθοδος κλασματοποίησης του πλάσματος παγκοσμίως, δεν δύναται να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή συμπυκνωμάτων παραγόντων πήξης, καθώς οδηγεί σε μετουσίωση των επιθυμητών πρωτεϊνών Μέθοδοι μείωσης του ιικού φορτίου Εισαγωγή Η ασφάλεια όσον αφορά στη μετάδοση παθογόνων είναι υψίστης σημασίας για τους συμπυκνωμένους παράγοντες πήξης πλάσματος που χρησιμοποιούνται στη 34

36 θεραπεία των αιμορραγικών διαθέσεων. Το ανθρώπειο πλάσμα, που είναι η πηγή αυτών των παραγώγων πλάσματος, είτε συλλέγεται με πλασμαφαίρεση από αμειβόμενους συνήθως δότες είτε προέρχεται από μονάδες ολικού αίματος εθελοντών δοτών. 107,110 Οι συμπυκνωμένοι παράγοντες πλάσματος προέρχονται από δεξαμενές πλάσματος μεγάλου αριθμού δοτών και το τελικό προϊόν περιλαμβάνει πλάσμα από διάφορους δότες (μέχρι και 60000). Ο έλεγχος των δοτών, των μεμονωμένων μονάδων πλάσματος και των δεξαμενών πλάσματος είναι τα πρώτα βήματα για την ασφάλεια των προϊόντων και περιγράφηκαν αναλυτικά στην προηγούμενη ενότητα. Τα βήματα αυτά ακολουθούνται από τις διαδικασίες αδρανοποίησης και/ ή απομάκρυνσης (δηλαδή μείωσης) των παθογόνων κατά τη διάρκεια της παραγωγής των προϊόντων. Τα τελευταία 30 χρόνια οι διαδικασίες αυτές έχουν ενσωματωθεί στην παραγωγική διαδικασία και έχουν σχεδόν εκμηδενίσει τη μετάδοση ιών. Έτσι, από τα τέλη της δεκαετίας του 1980 δεν έχει τεκμηριωθεί μετάδοση HIV, HCV ή HBV μέσω προϊόντων που έχουν υποβληθεί σε επεξεργασία για μείωση του ιικού φορτίου. 38 Οι προσπάθειες για αποφυγή της μετάδοσης λοιμογόνων παραγόντων επιταχύνθηκαν μετά την αναγνώριση της μετάδοσης HIV σε αιμορροφιλικούς το 1983 και την ταυτοποίηση του HCV ακολούθως. Η ανάπτυξη μεθόδων αδρανοποίησης παθογόνων ξεκίνησε από το FFP, επειδή αυτό δεν περιέχει κύτταρα, που μπορεί να καταστραφούν ή να υποστούν λειτουργικές διαταραχές από αυτές τις διαδικασίες. Από τα μέσα της δεκαετίας του 1980, βρέθηκαν μέθοδοι αδρανοποίησης των ιών με περίβλημα στα παράγωγα που κλασματοποιούνται από το πλάσμα. Ακόμη και η ίδια η κλασματοποίηση απομακρύνει αρκετά παθογόνα, αλλά αυτό τότε δεν ήταν ακόμη γνωστό και αυτή θεωρούνταν μόνο μέθοδος κάθαρσης πρωτεΐνης. Η επεξεργασία με διαλύτη και απορρυπαντικό περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1984 και χρησιμοποιήθηκε αρχικά για την αδρανοποίηση των HIV και HBV σε παράγοντες πήξης. Κατά τη δεκαετία του 1990 είχε αποδειχτεί ότι ιοί με λιπιδικό περίβλημα (HIV, HCV, HBV) δεν μεταδίδονταν μετά την εφαρμογή επεξεργασίας με διαλύτη και απορρυπαντικό (Solvent/ Detergent treatment ή S/D treatment). 38 Ωστόσο, τότε ήταν ήδη γνωστό ότι οι ιοί χωρίς λιπιδικό περίβλημα (HAV, B19V) δεν αδρανοποιούνταν με την εν λόγω μέθοδο. 122,123 Στη Γερμανία, ήδη από τα τέλη της δεκαετίας του 1970 είχε αναπτυχθεί η παστερίωση, δηλαδή η θέρμανση στους 60 ο C για 10 ώρες σε υδατικό διάλυμα, ως μέθοδος μείωσης του ιικού φορτίου για ένα συμπύκνωμα των παραγόντων πήξης VIII και vwf, το οποίο έλαβε έγκριση το 1981 και έκτοτε δεν καταγράφηκαν περιπτώσεις ιικής μετάδοσης με τη χρήση αυτού. 108 Πιο πρόσφατα, η πιθανή μετάδοση prions με τα προϊόντα αίματος προκάλεσε ανησυχία. Σταδιακά, οι διαδικασίες παραγωγής παραγώγων πλάσματος εξελίχθηκαν, ώστε να περιλαμβάνουν πολλαπλά στάδια με σκοπό την αποφυγή της μετάδοσης τόσο γνωστών όσο και νέων αναδυόμενων παθογόνων. Το ΕΜΑ εξέδωσε κατευθυντήριες οδηγίες για την ασφάλεια των παραγώγων πλάσματος. 124 Στα μέτρα περιλαμβάνονται η προσεκτική επιλογή των δοτών, ο έλεγχος του δωριζόμενου αίματος και των δεξαμενών πλάσματος για δείκτες λοίμωξης με γνωστούς ιούς και μια διαδικασία παρασκευής με υψηλή ικανότητα αδρανοποίησης και/ ή απομάκρυνσης μεγάλου εύρους διαφορετικών ιών μέσω σταδίων με αναγνωρισμένη ικανότητα μείωσης ιικού φορτίου. Ο EMA και o WHO (World Health Organization) συστήνουν την εφαρμογή δύο διακριτών σταδίων με συμπληρωματικό τρόπο αντιιικής δράσης (το πρώτο εναντίον ιών με περίβλημα, το δεύτερο εναντίον ιών χωρίς περίβλημα), ώστε να διασφαλίζεται ότι όσοι ιοί επιβιώσουν μετά το πρώτο στάδιο θα αδρανοποιηθούν ή απομακρυνθούν κατά το δεύτερο στάδιο. 125 Τουλάχιστον ένα στάδιο πρέπει να είναι αποτελεσματικό εναντίον 35

37 ιών χωρίς λιπιδικό περίβλημα. Ωστόσο, σύμφωνα με τον EMA, εάν στην διαδικασία παραγωγής περιλαμβάνεται ένα στάδιο που δρα αξιόπιστα εναντίον πολλών ιών με και χωρίς λιπιδικό περίβλημα και επιπρόσθετα στάδια παρασκευής επίσης συνεισφέρουν αξιόπιστα στη αντιική δράση, τότε το δεύτερο στάδιο αδρανοποίησης/ απομάκρυνσης ιών μπορεί να μην είναι απαραίτητο. Στις ΗΠΑ ορίζεται ότι η παρασκευή των παραγώγων πλάσματος πρέπει να περιλαμβάνει τουλάχιστον ένα αποτελεσματικό στάδιο αδρανοποίησης και/ ή απομάκρυνσης ιών. 126 Κάθε τέτοιο στάδιο πρέπει να έχει προηγουμένως αξιολογηθεί και επικυρωθεί. Επιπλέον, ο ΕΜΑ συστήνει μελέτες αξιολόγησης της δραστικότητας των εκάστοτε χρησιμοποιούμενων διαδικασιών εναντίον των prions. Φαίνεται ότι οι καθιερωμένες διαδικασίες παραγωγής συμπυκνωμάτων παραγόντων πήξης μειώνουν τη μολυσματικότητα με prions. 127 Όλα τα βιολογικά προϊόντα, συμπεριλαμβανομένων των ανασυνδυασμένων παραγόντων πήξης, πρέπει να υποβάλλονται σε διαδικασίες εξόντωσης παθογόνων με αλληλοσυμπληρούμενα βήματα, που έχουν επίσης αξιολογηθεί και επικυρωθεί και είναι ανάλογα προς τα χρησιμοποιούμενα στα παράγωγα πλάσματος. Παρόλο που δόθηκε ιδιαίτερη έμφαση στην ασφάλεια των παραγώγων πλάσματος λόγω των επιδημιών από ιούς που εμφανίστηκαν στους αιμορροφιλικούς πριν από το 1990, η πιθανότητα μόλυνσης με ιούς υφίσταται για όλα τα βιολογικά προϊόντα. 128 Η πιστή τήρηση αυστηρών κανόνων επιλογής δοτών και αποτελεσματικός έλεγχος των δωρεών μειώνει σημαντικά το ιικό φορτίο προς αδρανοποίηση/ απομάκρυνση από τις δεξαμενές του πλάσματος που προορίζονται για κλασματοποίηση. Ωστόσο, παθογόνα, για τα οποία δεν υπάρχουν ακόμα διαθέσιμες δοκιμασίες ανίχνευσης, και άλλα άγνωστα παθογόνα, αναδεικνύουν την αναγκαιότητα εφαρμογής τεχνικών αδρανοποίησης/απομάκρυνσης. 129,130 Επιπλέον, παρόλο που οι ορολογικές μέθοδοι ανίχνευσης ιικών δεικτών και ο έλεγχος νουκλεϊκών οξέων (NAT) διασφαλίζουν ότι σχεδόν όλες οι μονάδες πλάσματος που εισέρχονται στην παραγωγική διαδικασία είναι ελεύθερες από HBV, HCV και HIV, τα στάδια αδρανοποίησης/ απομάκρυνσης είναι απαραίτητα ακόμη και για αυτούς τους ιούς, καθώς στρέφονται εναντίον τυχόν ιών που εισήλθαν στις δεξαμενές πλάσματος κατά την περίοδο «παραθύρου» της λοίμωξης που οι δοκιμασίες ανίχνευσης είναι ακόμη αρνητικές. 108 Το 1999 υπολογίζονταν ότι ο ορολογικός έλεγχος κατά την περίοδο «παραθύρου» οδηγούσε σε αναγνώριση μίας μεταξύ δέκα δεξαμενών πλάσματος που περιείχαν μονάδα μολυσμένη με HIV και μίας μεταξύ πέντε δεξαμενών που περιείχαν μονάδα μολυσμένη με HCV ή HBV. 38 Η εφαρμογή του ΜP-NAT από το 1999, όπως προαναφέρθηκε, μείωσε το διαγνωστικό «παράθυρο» από 22 σε 11 ημέρες για τον HIV-1, από 59 σε 34 ημέρες για τον HBV και από 82 σε 23 ημέρες για τον HCV. Έτσι, ο ΝΑΤ οδήγησε σε ελάττωση της ποσότητας του ιού που εισέρχεται στη δεξαμενή πλάσματος προς κλασματοποίηση, μειώνοντας αφενός μεν τον αριθμό των μολυσμένων μονάδων που εισέρχονται στη δεξαμενή αφετέρου δε τη συγκέντρωση του ιού στη δεξαμενή, αφού οι μολυσμένες μονάδες που διαφεύγουν από τον ΝΑΤ έχουν πολύ χαμηλό ιικό φορτίο. 108 Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε ότι ο διαγνωστικός έλεγχος ακόμα και με τις πιο σύγχρονες μεθόδους δεν διασφαλίζει επαρκώς την ασφάλεια των προϊόντων, αφού οι δοκιμασίες έχουν όρια ανίχνευσης με βάση την ευαισθησία τους και είναι ειδικές για συγκεκριμένους στόχους. Για το λόγο αυτό απαραίτητη είναι η εφαρμογή τεχνικών αδρανοποίησης/ απομάκρυνσης. 131 Οι σπογγώδεις εγκεφαλοπάθειες είναι μια ομάδα μεταδιδόμενων, προοδευτικά εξελισσόμενων, νευροεκφυλιστικών νοσημάτων που σχετίζονται με τα prions. Μέχρι σήμερα, δεν έχει αναφερθεί ανάπτυξη της παραλλαγμένης μορφής της νόσου 36

38 Creutzfeldt-Jacob σε ασθενείς που έλαβαν παράγωγα πλάσματος. Ωστόσο, υπάρχει μια αναφορά ανίχνευσης prion κατά την αυτοψία ασυμπτωματικού αιμορροφιλικού ασθενούς, που πιθανότατα αποδίδεται σε συμπύκνωμα FVIII μολυσμένο με prion. 132 Επειδή δεν υπάρχει προς το παρόν διαθέσιμη κάποια δοκιμασία ανίχνευσης prions στο αίμα, μεγάλη σημασία για τη μείωση του κινδύνου μόλυνσης με prions αποκτούν η επιλογή των δοτών και οι παραγωγικές διαδικασίες. Έτσι, με βάση οδηγία των WHO, EMA και FDA, πολλά κράτη επέβαλλαν περιορισμούς στη δωρεά πλάσματος, απορρίπτοντας δότες που είναι σε κίνδυνο ανάπτυξης νόσου Creutzfeldt-Jacob και της παραλλαγής της, οι οποίοι αναγνωρίζονται μέσω μιας σειράς ερωτήσεων, με σκοπό τον αποκλεισμό των συγκεκριμένων δωρεών από τη συγκέντρωσή τους σε δεξαμενές και την περαιτέρω επεξεργασία τους. Επιπλέον, στη διαδικασία παραγωγής των παραγώγων πλάσματος συμπεριλαμβάνεται η λευκαφαίρεση, που συμβάλλει στη μείωση του κινδύνου μετάδοσης prions. Ακόμη και άλλα στάδια της παραγωγικής διαδικασίας, όπως η κατακρήμνιση, η χρωματογραφία και η διήθηση αποδεικνύονται αποτελεσματικά εναντίον των prions σε μελέτες αξιολόγησης. Όμως, η αδρανοποίηση των prions σε συμπυκνώματα παραγόντων πήξης δεν είναι εφικτή με τις σήμερα χρησιμοποιούμενες τεχνικές που περιγράφονται παρακάτω, και οι αναγκαίες τεχνικές αδρανοποίησης δεν μπορούν να εφαρμοστούν, επειδή μετουσιώνουν τους παράγοντες πήξης. Τέλος, να τονιστεί ότι οι μέθοδοι καθαρισμού και αποστείρωσης των υλικών και του εξοπλισμού που χρησιμοποιούνται κατά την παρασκευή των παραγώγων πλάσματος αδρανοποιούν και απομακρύνουν τα prions, οπότε αποφεύγεται η διασταυρούμενη επιμόλυνση των παρτίδων προϊόντων. 127,129,130,133 Οι εταιρίες κλασματοποίησης υποχρεώνονται από τις Ρυθμιστικές Αρχές να διενεργούν πειραματικές μελέτες επικύρωσης για να καθορίζουν την αποτελεσματικότητα και τη δύναμη της χρησιμοποιούμενης μεθόδου να αδρανοποιεί/ απομακρύνει τα παθογόνα και για να βεβαιώνουν την ασφάλεια των παραγόντων πήξης πλάσματος. 134 Η ικανότητα μιας μεθόδου να μειώνει το ιικό φορτίο ελέγχεται στο εργαστήριο, εφαρμόζοντας τη μέθοδο έναντι υψηλών τίτλων ιού και καθορίζοντας το βαθμό μείωσης που επιτυγχάνει. 108 Οι χρησιμοποιούμενοι ιοί πρέπει να ομοιάζουν με εκείνους που αποτελούν τη μεγαλύτερη απειλή για μόλυνση και να έχουν διαφορετικά χαρακτηριστικά γονιδιώματος, μεγέθους και περιβλημάτων (HIV, HCV, HBV) για να είναι αντιπροσωπευτικοί του μεγάλου εύρους ιών. 135 Μείωση μεγαλύτερη από 4 λογαρίθμους θεωρείται αποτελεσματική. 136 Η μείωση των prions στα παράγωγα πλάσματος αξιολογείται με παρόμοιο τρόπο Μέθοδοι αδρανοποίησης ιών Οι κύριες μέθοδοι αδρανοποίησης ιών, που είναι συμβατές με τη διατήρηση της βιολογικής δραστικότητας των παραγόντων πήξης και επομένως μπορούν να εφαρμοστούν κατά τη διαδικασία παραγωγής των παραγόντων πλάσματος, είναι η παστερίωση, η επεξεργασία με διαλύτη και απορρυπαντικό, η εφαρμογή ξηρής θερμότητας σε λυοφιλοποιημένα προϊόντα και η θερμική επεξεργασία με ατμό. 137 Οι περισσότερες είναι ενσωματωμένες στον κορμό της διαδικασίας κλασματοποίησης, αλλά η ξηρή θερμότητα εφαρμόζεται σε προϊόντα που βρίσκονται ήδη στα τελικά δοχεία τους. Οι τεχνικές αυτές διαδραματίζουν θεμελιώδη ρόλο στην ασφάλεια των παραγώγων πλάσματος και αποτελούν πλέον αναπόσπαστο τμήμα της διαδικασίας παραγωγής τους. Οι περισσότερες εταιρείες προϊόντων αίματος χρησιμοποιούν δύο μεθόδους απενεργοποίησης (επεξεργασία με διαλύτη και απορρυπαντικό και με θερμότητα) για να ελαχιστοποιήσουν τον κίνδυνο μετάδοσης ιών

39 Η παστερίωση, κοινώς χρησιμοποιούμενη μέθοδος, επιτυγχάνεται με θέρμανση των πρωτεϊνικών διαλυμάτων στους 60 ο C για ώρες. Με τον τρόπο αυτό μετουσιώνονται οι ιικές πρωτεΐνες και εμποδίζεται η αντιγραφή του ιού. 138 Επειδή οι παράγοντες πήξης είναι θερμοευαίσθητοι, γίνεται προσθήκη σταθεροποιητικών ουσιών (σακχάρων, αμινοξέων, οξικών αλάτων) με σκοπό τη διατήρηση της δομικής ακεραιότητας της πρωτεΐνης. Η μέθοδος αυτή απενεργοποιεί μεγάλο εύρος ιών με περίβλημα και χωρίς περίβλημα, όπως HIV, BVDV (Bovine Viral Diarrhea Virus: ειδικός ιός-πρότυπο για τον HCV), PRV (Pseudorabies Virus: μη-ειδικός ιός-πρότυπο για τον HBV), HSV-1 (Herpes Simplex Virus -1), WNV, HAV, B19V και ιός της πολιομυελίτιδας. Η μεμονωμένη εφαρμογή της φάνηκε ότι μειώνει τον HIV κατά τουλάχιστον 6,4 λογαρίθμους, τον ειδικό ιό-πρότυπο για τον HCV κατά τουλάχιστον 8,9 λογαρίθμους, τον μη-ειδικό ιό-πρότυπο για τον HBV κατά 4,6 λογαρίθμους και τον HAV κατά 4,2 λογαρίθμους. 139 Απαιτεί απλό εξοπλισμό για τη διενέργειά της. Ωστόσο, οι προστιθέμενες σταθεροποιητικές ουσίες μπορεί να σταθεροποιήσουν επίσης ιικά μόρια και έτσι να περιορίσουν την ικανότητα της μεθόδου να αδρανοποιεί ιούς. Επιπλέον οι ουσίες αυτές πρέπει να αφαιρεθούν μετά το πέρας της διαδικασίας. Ακόμη, ο HBV είναι σχετικά σταθερός στη θερμότητα. Η ομοιογένεια στην κατανομή της θερμοκρασίας καθ όλη τη διάρκεια της παστερίωσης πρέπει να αξιολογηθεί με τεχνικές χαρτογράφησης της θερμοκρασίας. 108 Η επεξεργασία με διαλύτη και απορρυπαντικό αποτελεί την πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδο. Τα πρωτεϊνικά διαλύματα επωάζονται για 4 έως 6 ώρες παρουσία οργανικού διαλύτη 0,3% [τρι(n-βουτυλο)φωσφορικό] και μη ιοντικού απορρυπαντικού 1% (Τriton X-100 ή Tween-80) στους 24 ο C. Η μέθοδος είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική εναντίον ιών με περίβλημα [HIV, HCV, HBV, HTLV (Human T-lymphotropic virus), EBV (Epstein-Barr virus), CMV (Cytomegalovirus)], καθώς καταστρέφει τις λιπιδικές μεμβράνες αυτών μέσα σε λίγα λεπτά, αποτρέποντας την προσκόλλησή τους στα κύτταρα. 140 Η μεμονωμένη εφαρμογή της φάνηκε ότι μειώνει τον HIV κατά τουλάχιστον 11,1 λογαρίθμους, τον ειδικό ιό-πρότυπο για τον HCV κατά τουλάχιστον 4,5 λογαρίθμους και τον μη-ειδικό ιό-πρότυπο για τον HBV κατά τουλάχιστον 8,5 λογαρίθμους. 139 Τα διαλύματα προϊόντων πρέπει πρώτα να φιλτράρονται για να απομακρύνονται ιοί παγιδευμένοι σε σωματίδια και κατ αυτό τον τρόπο προστατευμένοι από τον διαλύτη και το απορρυπαντικό. Δεν μετουσιώνει τις πρωτεΐνες ακόμη και τις πιο ασταθείς και απαιτεί απλό εξοπλισμό. Ωστόσο, οι ιοί χωρίς περίβλημα δεν αδρανοποιούνται με την επεξεργασία αυτή. Έχουν αναφερθεί αιμορροφιλικοί ασθενείς που εμφάνισαν HAV και B19V λοίμωξη μετά από θεραπεία με συμπυκνώματα FVIII που είχαν υποβληθεί σε επεξεργασία με διαλύτη και απορρυπαντικό. 122,123,141 Επομένως, χρειάζεται ένα δεύτερο συμπληρωματικό στάδιο στη διαδικασία παραγωγής για να καλυφτεί αυτό το κενό στην ασφάλεια. Επιπλέον, το πλάσμα που προορίζεται για παραγωγή παραγώγων ελέγχεται με δοκιμασίες ανίχνευσης του γενετικού υλικού των HAV και B19V, οπότε η μετάδοση των ιών αυτών εκμηδενίστηκε. Τα αντιδραστήρια πρέπει να αφαιρεθούν μετά το πέρας της διαδικασίας συνήθως με χρωματογραφία και η μέθοδος πρέπει να αξιολογείται ως προς την ομοιογένεια της κατανομής των ουσιών και τη διατήρηση σταθερής θερμοκρασίας καθ όλη τη διάρκεια της διαδικασίας. 142 Η ξηρή θερμότητα χρησιμοποιείται κυρίως ως δεύτερο στάδιο ιικής αδρανοποίησης. Εφαρμόζεται σε λυοφιλοποιημένα προϊόντα είτε στους 80 ο C για 72 ώρες είτε στους 100 ο C για 30 έως 120 λεπτά. Τα περισσότερα συμπυκνώματα πλάσματος υφίστανται λυοφιλοποίηση και ιδιαίτερα εκείνα που υποβάλλονται σε επεξεργασία με διαλύτη και απορρυπαντικό και κατόπιν με ξηρή θερμότητα προς εξουδετέρωση των ιών χωρίς περίβλημα που αντιστέκονται στην πρώτη μέθοδο. Η 38

40 ίδια η λυοφιλοποίηση παρέχει κάποιο βαθμό αδρανοποίησης ιών. 143 Η υγρασία των λυοφιλοποιημένων προϊόντων που υποβάλλονται σε ξηρή θερμότητα πρέπει να διατηρείται σε επίπεδο κάτω του 2%, καθώς η υπολειμματική υγρασία μπορεί να επηρεάσει τη σταθερότητα των προϊόντων. 144 Ωστόσο υψηλότερα επίπεδα υγρασίας μπορεί να ενισχύσουν την αδρανοποίηση ορισμένων ιών. 145 Η μέθοδος απενεργοποιεί ιούς με περίβλημα (HBV, HCV, HIV), καθώς και κάποιους χωρίς περίβλημα (HAV), όπως καταδεικνύεται από διάφορες μελέτες. Έτσι, ως δεύτερο στάδιο προσθέτει ασφάλεια εναντίον του HAV και των άλλων θερμοευαίσθητων ιών. 146 Μια μελέτη έδειξε ότι η εφαρμογή ξηρής θερμότητας 100 ο C στο λυοφιλοποιημένο συμπύκνωμα FVIII για 30 λεπτά απενεργοποίησε τους HAV και HIV σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα μέσα σε 10 λεπτά, διατηρώντας παράλληλα το 95% της δραστικότητας του FVIII. 144 Η μεμονωμένη εφαρμογή της φάνηκε ότι μειώνει τον HIV κατά 5,2 λογαρίθμους (στους 100 ο C για 30 λεπτά), τον ειδικό ιό-πρότυπο για τον HCV κατά τουλάχιστον 4,9 λογαρίθμους (στους 80 ο C για 72 ώρες), τον μη-ειδικό ιό-πρότυπο για τον HBV κατά 4,9 λογαρίθμους (στους 100 ο C για 120 λεπτά) και τον HAV κατά τουλάχιστον 5,8 λογαρίθμους (στους 80 ο C για 72 ώρες). 139 Παρόλο που ο Β19V φαίνεται να μειώνεται με την ξηρή θερμότητα στις μελέτες αξιολόγησης, ο βαθμός μείωσης μπορεί να μην είναι ικανοποιητικός για την πλήρη αδρανοποίηση του ιού στο τελικό προϊόν. 147 Η θερμική επεξεργασία με ατμό είναι η εφαρμογή θερμότητας σε λυοφιλοποιημένα προϊόντα στους 60 ο C για 10 ώρες με προσαρμογή της υγρασίας σε επίπεδο 7% ως 8%. Κάποια προϊόντα απαιτούν επιπρόσθετη θέρμανση στους 80 ο C για 1 ώρα. Μειονέκτημα της λυοφιλοποίησης αποτελεί ότι η αφυδάτωση σταθεροποιεί εκτός από τους παράγοντες πήξης και τυχόν ιούς που υπάρχουν στο προϊόν. Προσθέτοντας υδρατμούς στα λυοφιλοποιημένα προϊόντα πριν από τη θέρμανση αυτών, επιτυγχάνονται υψηλότερα επίπεδα ιικής αδρανοποίησης σε παρόμοιες θερμοκρασίες. Η έκταση της ιικής αδρανοποίησης εξαρτάται από τη θερμοκρασία, τη διάρκεια και την πίεση κατά την επεξεργασία. Η μέθοδος απενεργοποιεί ιούς με περίβλημα και κάποιους χωρίς περίβλημα και φαίνεται να είναι δραστική εναντίον των ιών της ηπατίτιδας και του HIV. 148 Η μεμονωμένη εφαρμογή της φάνηκε ότι μειώνει τον HIV κατά τουλάχιστον 6,8 λογαρίθμους, τον ειδικό ιόπρότυπο για τον HCV κατά τουλάχιστον 7,1 λογαρίθμους, τον μη-ειδικό ιό-πρότυπο για τον HBV κατά τουλάχιστον 7,4 λογαρίθμους και τον HAV κατά τουλάχιστον 4,5 λογαρίθμους. 139 Από 20 ασθενείς με αιμορροφιλία που έλαβαν προϊόντα FIX που είχαν υποβληθεί στη μέθοδο αυτή, κανείς δεν εμφάνισε δείκτες λοίμωξης με HCV και HIV σε διάστημα παρακολούθησης 6 έως 15 μηνών. 149 Ωστόσο, θερμική επεξεργασία με ατμό στους 60 ο C φαίνεται να είναι ανεπαρκής για την πλήρη απενεργοποίηση του HBV, ανάλογα με το ιικό φορτίο του αρχικού υλικού και της ποσότητας του προϊόντος που χορηγείται σε μη εμβολιασμένο για τη νόσο ασθενή. Υπάρχουν αναφορές αιμορροφιλικών ασθενών μη εμβολιασμένων κατά της ηπατίτιδας C που μολύνθηκαν με HBV μετά από λήψη προϊόντος FVIII επεξεργασμένου με ατμό Μέθοδοι απομάκρυνσης ιών Εκτός από την αδρανοποίηση, οι ιοί είναι επίσης δυνατό να απομακρυνθούν από τα παράγωγα πλάσματος με φυσικούς τρόπους. Οι μέθοδοι απομάκρυνσης ιών περιλαμβάνουν τις ήδη περιγραφείσες διαδικασίες κλασματοποίησης (καθίζηση, χρωματογραφία, διήθηση) και τη νανοδιήθηση. Πριν από τη δεκαετία του 1980, η κλασματοποίηση του πλάσματος που εφαρμόζονταν θεωρούνταν αποκλειστικά μέθοδος κάθαρσης πρωτεϊνών και στη διαδικασία παραγωγής των παραγώγων πλάσματος δεν συμπεριλαμβάνονταν κάποιο εξειδικευμένο στάδιο για τη μείωση του 39

41 ιικού φορτίου, εκτός της παστερίωσης της ανθρώπειου αλβουμίνης. Αργότερα, μελέτες αξιολόγησης της αντιιικής ικανότητας έδειξαν ότι η εφαρμοζόμενη κλασματοποίηση συνεισφέρει παράλληλα και στη συνολική ικανότητα μείωσης του ιικού φορτίου της παραγωγικής διαδικασίας των παραγόντων πήξης σε σημαντικό βαθμό. 151 Ωστόσο, η συνεισφορά αυτή είναι δύσκολο να καθοριστεί, οπότε και να εγγυηθεί την ασφάλεια. Έτσι, μετά την αρχική κρυοκαθίζηση, γίνεται κάθαρση πολλών συμπυκνωμάτων παραγόντων πήξης με χρωματογραφικές μεθόδους, όπως η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους, η χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων και η χρωματογραφία συγγένειας. Με τις μεθόδους αυτές, εκτός από την κάθαρση της επιθυμητής πρωτεΐνης, επιτυγχάνεται και απομάκρυνση ιών με περίβλημα αλλά και ιών χωρίς περίβλημα συμπεριλαμβανομένου του HAV και B19V. Μια μελέτη έδειξε ότι η εφαρμογή χρωματογραφίας συγγένειας με χηλικές ενώσεις ως μεθόδου κάθαρσης του FIX μείωσε τον ιό της πολιομυελίτιδας κατά 4,0 λογαρίθμους και τον SINV (Sindbis Virus) κατά 6,5 λογαρίθμους. 152 Κάθαρση του FVIII με τη χρήση χρωματογραφίας συγγένειας με μονοκλωνικά αντισώματα εναντίον του παράγοντα αυτού συνεισέφερε στη συνολική ικανότητα μείωσης του ιικού φορτίου της τάξεως των 5 ως 6 λογαρίθμων για τους HIV, SINV, ιό της φυσαλιδώδους στοματίτιδας και PRV πριν την παστερίωση. Η εφαρμογή χρωματογραφίας συγγένειας με μονοκλωνικό αντίσωμα για την κάθαρση του FIX οδήγησε σε μείωση κατά τουλάχιστον 5,8 λογαρίθμους των ιών με περίβλημα (HIV, BVDV, PRV και WNV), και κατά 3,3 και 6,6 λογαρίθμους των HAV και B19V αντίστοιχα. 139 Μειονέκτημα της χρωματογραφίας αποτελεί το γεγονός ότι η απομάκρυνση των ιών εξαρτάται από τη ρητίνη και το πρωτεϊνικό διάλυμα, ποικίλει για τους διάφορους ιούς και μεταβάλλεται με την ηλικία της ρητίνης. Επιπλέον, σημαντικό ζήτημα προκύπτει όσον αφορά στην επαναχρησιμοποίηση των χρωματογραφικών στηλών. Οι ιοί προσκολλώνται στις ρητίνες και δεν υφίστανται πλήρη έκπλυση. Για το λόγο αυτό, ο εξοπλισμός και τα υλικά πρέπει να αποστειρώνονται με επικυρωμένα φυσικά και/ ή χημικά μέσα αδρανοποίησης και απομάκρυνσης ιών, ώστε να αποφεύγεται η διασταυρούμενη επιμόλυνση επόμενων παρτίδων προϊόντων. Η νανοδιήθηση εισήχθη στις αρχές της δεκαετίας του 1990, αποτελεί μέθοδο που στοχεύει στην απομάκρυνση ιών και χρησιμοποιείται ως συμπληρωματική μέθοδος που ενισχύει την ασφάλεια εναντίον ιών χωρίς περίβλημα και άλλων ανθεκτικών παθογόνων. Η απομάκρυνση των ιών από τα συμπυκνώματα παραγόντων πήξης γίνεται με φίλτρα που φέρουν πόρους διαμέτρου μικρότερης της διαμέτρου των ιών. Οι πόροι μπορεί να έχουν διάμετρο 15, 20, 35 και 50nm. 153 Η νανοδιήθηση δεν είναι εφικτή κατά την παραγωγή προϊόντων που περιέχουν πρωτεΐνες με μέγεθος ίδιο ή μεγαλύτερο από αυτό των ιών ή των πόρων. Επομένως, η χρήση της περιορίζεται στην παραγωγή παραγόντων πήξης χαμηλού μοριακού βάρους, όπως ο FVIII και ο FIX. Έτσι, η διήθηση ενός συμπυκνώματος vwf διαμέσου πόρων 35nm οδήγησε σε μείωση κατά 5,0 λογαρίθμους ιών με περίβλημα όπως οι HIV, PRV και BVDV, αλλά και σε ταυτόχρονη απομάκρυνση των μεγάλων πολυμερών του vwf. 154 Η διαδοχική διήθηση συμπυκνώματος FVIII μέσω πόρων 35 και 15nm οδήγησε σε απομάκρυνση ιών με περίβλημα (HIV, BVDV, PRV) και ιών χωρίς περίβλημα (HAV). 155 Εφαρμοζόμενη μεμονωμένα, η νανοδιήθηση φάνηκε να μειώνει το ιικό φορτίο κατά τουλάχιστον 3,6 λογαρίθμους, ενώ σε συνδυασμό με επεξεργασία με διαλύτη και απορρυπαντικό και χρωματογραφία κατά τουλάχιστον 5,1 λογαρίθμους για όλους τους ιούς που ελέγχθηκαν. 139 Διήθηση ενός συμπυκνώματος FIX μέσω δύο φίλτρων εν σειρά απομάκρυνε αποτελεσματικά ιούς με και χωρίς περίβλημα. Η μεμονωμένη εφαρμογή της φάνηκε ότι μειώνει τον HIV κατά τουλάχιστον 6,4 λογαρίθμους 40

42 (35nm), τον ειδικό ιό-πρότυπο για τον HCV κατά 6,6 λογαρίθμους (35 και 15nm διαδοχικά), τον μη-ειδικό ιό-πρότυπο για τον HBV κατά τουλάχιστον 6,0 λογαρίθμους (35nm) και τον HAV κατά 6,8 λογαρίθμους (35 και 15nm διαδοχικά). Η διαδικασία αυτή δεν μετουσιώνει ούτε ενεργοποιεί τις πρωτεΐνες. Όμως, ο βαθμός απομάκρυνσης των ιών εξαρτάται από το μέγεθος των πόρων του φίλτρου και η απομάκρυνση των μικρότερου μεγέθους ιών μπορεί να είναι ατελής. 139, Παρασκευή παραγόντων πήξης πλάσματος Παράγοντας VIII Από τα μέσα της δεκαετίας του 1980 αναπτύχθηκαν πολλές γενιές FVIII που παρείχαν ασφάλεια εναντίον των HIV, HCV και HBV, βελτιωμένη καθαρότητα και ενισχυμένη ασφάλεια εναντίον των HAV και Β19V, ενώ το τελευταίο διάστημα γίνεται προσπάθεια για την αύξηση της ασφάλειας εναντίον των prions. 156 Σήμερα, όλα τα εγκεκριμένα συμπυκνώματα FVIII προέρχονται από το κρυοΐζημα. Αρχικά, το κρυοΐζημα υπόκειται σε ένα συνδυασμό προσρόφησης με υδροξείδιο του αργιλίου και καθίζησης, ή σε μεμονωμένη καθίζηση, με σκοπό τη μείωση του επιπέδου των υπαρχόντων ιχνών παραγόντων πήξης που εξαρτώνται από τη βιταμίνη Κ και που δύνανται να ενεργοποιήσουν τον FVIII σε επόμενα στάδια, καθώς και την αφαίρεση άλλων πρωτεϊνών όπως του ινωδογόνου. Το κεκαρθαρμένο κρυοΐζημα ακολούθως υποβάλλεται σε ιική αδρανοποίηση συνήθως μέσω επεξεργασίας με διαλύτη και απορρυπαντικό ή παστερίωσης. Τα επόμενα στάδια περιλαμβάνουν χρωματογραφία με ανταλλαγή ιόντων, με συγγένεια με μονοκλωνικά αντισώματα (anti-fviii ή antivwf) ή με συγγένεια με ακινητοποιημένη ηπαρίνη, με σκοπό την απομάκρυνση περιττών πρωτεϊνών (ινωδογόνο, ινωδονεκτίνη), μέρους ή όλου του vwf και διαφόρων αντιδραστηρίων (διαλύτης, απορρυπαντικό). Το διάλυμα ανοσοκεκαθαρμένου FVIII που προκύπτει υποβάλλεται περαιτέρω σε χρωματογραφία για την απομάκρυνση των τυχόν εκπλυθέντων IgG αντισωμάτων. Εν συνεχεία, κάποια προϊόντα FVIII υφίστανται νανοδιήθηση μέσα από πόρους διαμέτρου 35, 20, ή ακόμη και 15nm αν είναι επιθυμητή η μερική διάσταση του FVIII από τα πολυμερή υψηλού μοριακού βάρους του vwf. Εναλλακτικά, κάποια λυοφιλοποιημένα παρασκευάσματα υποβάλλονται σε επεξεργασία με ξηρή θερμότητα για απενεργοποίηση ιών χωρίς περίβλημα όπως ο HAV. Μερικά προϊόντα σταθεροποιούνται με την προσθήκη ανθρώπειου αλβουμίνης, ενώ άλλα περιέχουν vwf που συμβάλλει στη σταθεροποίηση. Η ανάκτηση του FVIII που επιτυγχάνεται εκφράζεται ανά λίτρο πλάσματος και κυμαίνεται μεταξύ 100 και 200IU (1 IU αντιστοιχεί στη φυσιολογική δραστηριότητα παράγοντα σε 1ml πλάσματος). Παράγοντες που ευθύνονται για τη μείωση της απόδοσης FVIII είναι η κρυοκαθίζηση, που οδηγεί σε απώλεια του 30% περίπου, η χρωματογραφική κάθαρση (απώλεια 20-30%) και η αδρανοποίηση ιών με θερμότητα (απώλεια 15-30%). Το τελικό προϊόν έχει δραστικότητα μεταξύ 10 και 250 IU/mg. 103,155, Προθρομβινικό σύμπλεγμα Το συμπύκνωμα προθρομβινικού συμπλέγματος περιέχει τους εξαρτώμενους από τη βιταμίνη Κ παράγοντες πήξης. Σε αυτό, οι παράγοντες IX, II, X και οι πρωτεΐνες C και S έχουν χαμηλή δραστικότητα μεταξύ 0,5 και 2 IU/mg. 158 Μερικά προϊόντα περιέχουν επίσης FVII, αλλά σε επίπεδα χαμηλότερα από αυτά του FIX. Η διαδικασία παρασκευής βασίζεται σε μια μέθοδο που εφαρμόζεται από το 1960 και χαρακτηρίζεται από προσρόφηση του πλάσματος, από το οποίο έχει αφαιρεθεί το κρυοκαθίζημα, σε DEAE-κυτταρίνη. Στο επόμενο στάδιο, η χρωματογραφία 41

43 ανταλλαγής ανιόντων οδηγεί σε ταυτόχρονη ανάκτηση πρωτεϊνών που φέρουν κατάλοιπα γ-καρβοξυγλουταμικού οξέως, καταλείποντας κλάσμα που περιέχει αλβουμίνη, IgG, αντιθρομβίνη και α1-αντιθρυψίνη. Η μείωση το ιικού φορτίου συνήθως επιτυγχάνεται με επεξεργασία με διαλύτη και απορρυπαντικό, ακολουθούμενη από νανοδιήθηση ή εφαρμογή ξηρής θερμότητας στο τελικό προϊόν. Σε κάποια προϊόντα εφαρμόζεται εναλλακτικά παστερίωση και θερμική επεξεργασία με ατμό. Την επεξεργασία με διαλύτη και απορρυπαντικό ακολουθεί ένα επιπρόσθετο στάδιο χρωματογραφίας ανταλλαγής ιόντων για την απομάκρυνση των χρησιμοποιούμενων αντιδραστηρίων. Η ανάκτηση του FIX κυμαίνεται μεταξύ 250 και 380 IU ανά λίτρο πλάσματος Μεμονωμένος παράγοντας IX Προϊόντα FIX υψηλής καθαρότητας αναπτύχθηκαν το 1989, οδηγώντας σε επανάσταση στη θεραπεία της αιμορροφιλίας Β, καθώς με τη χρήση αυτών μειώθηκε ο κίνδυνος θρομβώσεων που σχετίζονταν με το προθρομβινικό σύμπλεγμα. Ο FIX απομονώνεται χρωματογραφικά από το προθρομβινικό σύμπλεγμα με τη μέθοδο ανταλλαγής ανιόντων, συνδυαζόμενη με τη μέθοδο συγγένειας με ακινητοποιημένη ηπαρίνη ή με χηλικές ενώσεις ή με μονοκλωνικά αντισώματα. Η ανάκτηση του FIX κυμαίνεται μεταξύ 200 και 300 IU ανά λίτρο πλάσματος και το τελικό προϊόν έχει δραστικότητα μεταξύ 100 και 150 IU/mg. 30, Παράγοντες VII, XI και ΧΙΙΙ Στόχο κατά την προσπάθεια παραγωγής FVII αποτέλεσε η απομόνωση αυτού χωρίς την παρουσία των υπόλοιπων παραγόντων πήξης που εξαρτώνται από τη βιταμίνη Κ. Η διαδικασία παρασκευής περιλαμβάνει τη χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων ή την προσρόφηση με υδροξείδιο του αργιλίου και ομοιάζει με εκείνη που περιγράφηκε για το προθρομβινικό σύμπλεγμα και τον FIX. Επεξεργασία με διαλύτη και απορρυπαντικό, θερμική επεξεργασία με ατμό ή ξηρή θερμότητα εφαρμόζονται για την αδρανοποίηση ιών. Όσον αφορά στον FXI, προϊόντα αυτού παράγονται με εφαρμογή διήθησης που ακολουθείται από χρωματογραφία ανταλλαγής κατιόντων, η οποία οδηγεί σε παρασκεύασμα υψηλής καθαρότητας. Για τη μείωση του ιικού φορτίου χρησιμοποιείται συνδυασμός επεξεργασίας με διαλύτη και απορρυπαντικό και νανοδιήθησης. 159 Ο FXIII καταλύει το τελικό στάδιο του φυσιολογικού καταρράκτη της πήξης, σταθεροποιώντας τα πολυμερή ινικής. Ένας τρόπος παραγωγής του ξεκινά από ένα κλάσμα που έχει υποστεί επεξεργασία με αιθανόλη και στη συνέχεια υποβάλλεται σε καθίζηση με κιτρικό νάτριο και σε θέρμανση για απομάκρυνση του ινωδογόνου. Ακολούθως, το προϊόν υφίσταται παστερίωση με σορβιτόλη, υπερδιήθηση για απομάκρυνση της σορβιτόλης και λυοφιλοποίηση. Ένας άλλος τρόπος παραγωγής περιλαμβάνει διαδοχικά στάδια καθίζησης και παστερίωση ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΗΣ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΑΣ Η ιδανική διαχείριση των αιμορροφιλικών ασθενών είναι σύνθετη και περιλαμβάνει την παροχή προφυλακτικής φροντίδας, τη θεραπεία υποκατάστασης και την αντιμετώπιση των επιπλοκών τόσο της νόσου όσο και της αντιαιμορροφιλικής θεραπείας. Οι κύριες επιπλοκές είναι η αιμορροφιλική αρθροπάθεια, οι ιογενείς λοιμώξεις και η ανάπτυξη αναστολέα. Η αντιμετώπιση της ηπατίτιδας B και C αναφέρθηκαν συνοπτικά σε προηγούμενη ενότητα, ενώ η αντιμετώπιση των λοιπών επιπλοκών δεν αποτελεί αντικείμενο του παρόντος συγγράμματος. Η ολοκληρωμένη 42

44 και πολύπλευρη φροντίδα πρέπει να παρέχεται στους αιμορροφιλικούς άμεσα μετά τη διάγνωση της νόσου από εξειδικευμένα κέντρα διαχείρισης αιμορροφιλικών ασθενών ΚΕΝΤΡΑ ΑΙΜΟΡΡΟΦΙΛΙΚΩΝ Η χρονιότητα της νόσου, το ευρύ φάσμα των επιπλοκών της και οι επιπτώσεις της στην ψυχοσωματική υγεία και στην κοινωνικοοικονομική κατάσταση των ασθενών επιβάλλουν τη σύνθετη αντιμετώπιση των προβλημάτων του αιμορροφιλικού πληθυσμού από εξειδικευμένα Κέντρα Αιμορροφιλικών. 160 Οι συγγενείς αιμορραγικές διαθέσεις άρχισαν παγκοσμίως να παρακολουθούνται συστηματικά από εξειδικευμένα κέντρα από τη δεκαετία του Το 1976 δημιουργήθηκε στις ΗΠΑ ένα δίκτυο Κέντρων Αιμορροφιλικών χρηματοδοτούμενο από το κράτος. Η Παγκόσμια Οργάνωση Αιμορροφιλίας στα τέλη του 1970 συνέστησε τη δημιουργία τέτοιων κέντρων σε όλες τις χώρες, ενώ το 1999 η Σύνοδος των αντιπροσώπων των χωρών της Ευρωπαϊκής Ένωσης για την ασφάλεια και άριστη χρήση του αίματος, υπό την αιγίδα της Ευρωπαϊκής Ένωσης, συνιστά οι ασθενείς με συγγενείς αιμορραγικές διαθέσεις να παρακολουθούνται σε Κέντρα Αιμορροφιλικών. 58 Τα Κέντρα Αιμορροφιλικών είναι υπεύθυνα τόσο για θέματα άμεσα σχετιζόμενα με το νόσημα, όσο και για όλες τις επιπλοκές που μπορεί να εμφανιστούν στην πορεία ενός χρόνιου νοσήματος (απαραίτητες χειρουργικές επεμβάσεις, μεταδιδόμενα με τη μετάγγιση νοσήματα, κ.λπ.). Η επιστημονική ομάδα του Κέντρου αποτελείται από αιματολόγους, παθολόγους, ορθοπεδικούς, γαστρεντερολόγους, φυσιοθεραπευτές, νοσηλευτικό προσωπικό, ψυχιάτρους και κοινωνικούς λειτουργούς. Έτσι, αυτά τα ολοκληρωμένα Κέντρα παρέχουν εμπειρία στη διάγνωση, παρακολούθηση και θεραπεία των αιμορραγικών επεισοδίων και των επιπλοκών της νόσου, συμβουλευτική, ψυχολογική υποστήριξη, συνεχιζόμενη εκπαίδευση των ασθενών και συντονισμό της κατ οίκον θεραπείας και της πρόληψης, και φέρουν την ευθύνη της σωστής χρόνιας διαχείρισης και της μείωσης της νοσηρότητας και θνητότητας των αιμορροφιλικών. Μετά τις επιδημίες ιογενών λοιμώξεων στους αιμορροφιλικούς ασθενείς, τα Κέντρα Αιμορροφιλικών επιφορτίστηκαν και με το έργο της διαχείρισης των ιατρικών και ψυχοκοινωνικών συνεπειών των λοιμώξεων αυτών. Σημαντικός είναι και ο ρόλος που διαδραματίζουν στην έρευνα για τις αιμορραγικές διαθέσεις. 161 Νέα πρόκληση για τα Κέντρα αυτά αποτελεί η αντιμετώπιση της συνοσηρότητας του αιμορροφιλικού πληθυσμού που φτάνει πλέον σε μεγαλύτερες ηλικίες και εμφανίζει κοινές παθήσεις, για τις οποίες όμως η εμπειρία στη συγκεκριμένη ομάδα ασθενών είναι εξαιρετικά περιορισμένη. 162 Μελέτες δείχνουν ότι η συνολική επιβίωση των αιμορροφιλικών εξαρτάται από το επίπεδο εξειδίκευσης και εμπειρίας των θεραπόντων ιατρών τους και ότι η ολοκληρωμένη διαχείριση των ασθενών αυτών στα Κέντρα Αιμορροφιλικών οδήγησε σε μείωση της θνητότητας κατά 40%. 163 Σύμφωνα με την Παγκόσμια Οργάνωση Αιμορροφιλίας, σήμερα λειτουργούν παγκοσμίως 1131 οργανωμένα Κέντρα Αιμορροφιλικών και 127 σχετιζόμενες Εθνικές Οργανώσεις. Στην Ελλάδα, οι αιμορροφιλικοί ασθενείς απευθύνονται στα πέντε Κέντρα Αιμορροφιλικών, που βρίσκονται σε συνεχή λειτουργία, για θέματα διάγνωσης, συστηματικής παρακολούθησης, αντιμετώπισης, συμβουλευτικής, εκπαίδευσης και γενετικής καθοδήγησης. Τέτοια κέντρα λειτουργούν για ενήλικες στο Π.Γ.Ν.Α. «Λαϊκό», όπου και εξυπηρετείται το 65% των Ελλήνων αιμορροφιλικών, στο Π.Γ.Ν.Α. «Ιπποκράτειο» και στο Π.Γ.Ν.Θ. «Ιπποκράτειο», ενώ για παιδιά στο Νοσοκομείο Παίδων «Η Αγία Σοφία» στην Αθήνα και στο Π.Γ.Ν.Θ. «Ιπποκράτειο» στη Θεσσαλονίκη. Το Αιμορροφιλικό Κέντρο Βορείου Ελλάδος 43

45 στεγάζεται στη Β Πανεπιστημιακή Προπαιδευτική Κλινική του «Ιπποκράτειου» Γ.Ν.Θ. Ακόμη, από το 1964 στην Ελλάδα λειτουργεί ο Σύλλογος Προστασίας Ελλήνων Αιμορροφιλικών (Σ.Π.Ε.Α), που αποτελεί μέλος της Παγκόσμιας Οργάνωσης Αιμορροφιλίας, με σκοπό την προαγωγή και προστασία της ζωής και της υγείας των ατόμων με αιμορροφιλία ή άλλη συγγενή κληρονομική αιμορραγική διάθεση, την πρόληψη, θεραπεία και αποκατάσταση των δυσάρεστων συνεπειών και αναπηριών, την προάσπιση των συμφερόντων των ατόμων αυτών, καθώς και την υποστήριξη και αποκατάσταση τους ΠΡΟΦΥΛΑΚΤΙΚΗ ΦΡΟΝΤΙΔΑ Στα πλαίσια της ολοκληρωμένης διαχείρισης των ασθενών, τα Κέντρα Αιμορροφιλικών λαμβάνουν μέριμνα για ζητήματα έμμεσα σχετιζόμενα με το κύριο νόσημα. Ο εμβολιασμός των αιμορροφιλικών παιδιών αποτελεί θέμα που χρήζει προσοχής. Βασικοί εμβολιασμοί, όπως για διφθερίτιδα-τέτανο-κοκκύτη ή για ιλαράερυθρά-παρωτίτιδα, πρέπει να χορηγούνται βαθιά στον υποδόριο ιστό και όχι ενδομυϊκά όπως συνηθίζεται με τη χρήση πολύ λεπτής βελόνας και με εφαρμογή πίεσης και παγοκύστης στη θέση μετά την ένεση. Το εμβόλιο κατά της ηπατίτιδας Β πρέπει να χορηγείται σε όλα τα βρέφη με αιμορροφιλία το συντομότερο δυνατόν μετά τη γέννηση, ενώ το εμβόλιο κατά της ηπατίτιδας Α χορηγείται μετά την ηλικία του ενός έτους. Ένα άλλο σημαντικό ζήτημα αποτελεί η στοματική υγιεινή των πασχόντων. Οι αιμορροφιλικοί ασθενείς από μικρή ηλικία πρέπει να διδάσκονται τη σωστή περιποίηση των οδόντων και γενικότερα της στοματικής κοιλότητας και να αναγνωρίζουν περιοχές που μπορεί να προκαλέσουν αιμορραγία. 165 Περίπου 50% των αδιάγνωστων αιμορροφιλικών αιμορραγούν μετά από την περιτομή. Για το λόγο αυτό, στα αγόρια που γεννιούνται από γνωστές μητέρες- φορείς ή μητέρες, στις οποίες πιθανολογείται φορεία, δεν πρέπει να διενεργείται περιτομή μέχρι να αποκλειστεί το ενδεχόμενο της αιμορροφιλίας. Το ζήτημα της περιτομής στα αιμορροφιλικά αγόρια παραμένει αμφιλεγόμενο και αποτελεί ένα σημαντικό κοινωνικό πρόβλημα για αυτές τις οικογένειες. Η χρήση της κόλλας ινικής είναι ασφαλής, μειώνει την ανάγκη θεραπείας υποκατάστασης μετά από την περιτομή και ελαττώνει σημαντικά το κόστος της θεραπείας. 166 Η γενετική και ψυχοκοινωνική συμβουλευτική, καθώς και η ενημέρωση σχετικά με τη νόσο είναι απαραίτητες για το περιβάλλον του αιμορροφιλικού νεογνού, ειδικά για το 30% των περιπτώσεων που, όπως προαναφέρθηκε, δεν έχει προηγούμενη εμπειρία με τη νόσο. Στόχο αποτελεί η φυσιολογική κοινωνικοποίηση και ανάπτυξη με ελάχιστους μόνο περιορισμούς. Επιπλέον, τα αιμορροφιλικά παιδιά είναι ιδιαίτερα επιρρεπή στην απώλεια της καλής φυσικής κατάστασης και στην παχυσαρκία, λόγω των περιορισμών στη φυσική τους δραστηριότητα. Για το λόγο αυτό, ενθαρρύνεται ένα τακτικό πρόγραμμα σωματικής άσκησης, καθώς και ένα πρόγραμμα άσκησης μετά τα αιμορραγικά επεισόδια, τα οποία πρέπει να προκύπτουν μετά από συζήτηση του ασθενούς και της οικογένειάς του, εφόσον πρόκειται για μικρά παιδιά με τους θεράποντες ιατρούς του τοπικού Αιμορροφιλικού Κέντρου. Φαίνεται ότι η άσκηση και η συμμετοχή σε αθλητικές δραστηριότητες έχει αυξηθεί μετά την εφαρμογή της πρωτογενούς προφύλαξης στον ανεπτυγμένο κόσμο ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ Κατ επίκληση και προφυλακτική θεραπεία υποκατάστασης 44

46 Οι παράγοντες πήξης χορηγούνται είτε κατ επίκληση για να σταματήσει ή να περιοριστεί μια υπάρχουσα αιμορραγία είτε προφυλακτικά για να προληφθεί και όχι να υποχωρήσει ένα αιμορραγικό επεισόδιο. Η δοσολογία είναι σχετικά προκαθορισμένη και εξαρτάται από το σωματικό βάρος, τον όγκο κατανομής και τη θέση και βαρύτητα της αιμορραγίας, αλλά η διάρκεια της θεραπείας, η επιλογή του κατάλληλου προϊόντος και η εφαρμογή πρωτογενούς ή δευτερογενούς προφύλαξης καθορίζονται από εξειδικευμένο προσωπικό. Η κατ επίκληση θεραπεία εφαρμόζεται κατά τη στιγμή της αιμορραγίας. Έγκαιρη αντιμετώπιση ενός αιμορραγικού επεισοδίου με τον κατάλληλο παράγοντα πήξης στη σωστή δοσολογία οδηγεί σε μείωση της απαιτούμενης διάρκειας θεραπείας, ελάττωση των υποτροπών και βελτίωση της ποιότητας ζωής. Τα τελευταία χρόνια εφαρμόζεται ευρέως η κατ οίκον θεραπεία με λήψη θεραπείας υποκατάστασης άμεσα τη στιγμή της αιμορραγίας από τον ίδιο τον ασθενή. Το γεγονός αυτό συμβάλλει όχι μόνο στη βελτίωση της ποιότητας ζωής αυτών των χρονίως πασχόντων ασθενών, αλλά και στην ενίσχυση του αισθήματος ασφάλειας και ανεξαρτησίας τους και στη μείωση του συνολικού κόστους της θεραπείας. Στην Ελλάδα, σύμφωνα με τα αρχεία του Κέντρου Αιμορροφιλικών στο Π.Γ.Ν.Α. «Λαϊκό», το 80% των αιμορροφιλικών λαμβάνει θεραπεία κατ οίκον. 58 Η προφυλακτική θεραπεία συνίσταται στη συστηματική χορήγηση θεραπείας υποκατάστασης με σκοπό τη μείωση της εμφάνισης αιμορραγικών επεισοδίων σε ασθενείς με βαριά αιμορροφιλία. Στόχος είναι η διατήρηση των επιπέδων του παράγοντα σε ποσοστό πάνω από 1%, μετατρέποντας έτσι τη σοβαρή νόσο σε μέτριας βαρύτητας. 168 Η πρωτογενής προφύλαξη ξεκινά τα πρώτα χρόνια της ζωής (συνήθως σε ηλικία 3 ετών) ή μετά από περιορισμένο αριθμό αιμορραγικών επεισοδίων και μειώνει σημαντικά τον κίνδυνο επακόλουθης αρθροπάθειας. 169 Η δευτερογενής προφύλαξη ξεκινά σε ασθενείς που εμφανίζουν ήδη κάποιο βαθμό αιμορροφιλικής αρθροπάθειας Προϊόντα για τη θεραπεία υποκατάστασης Για τη θεραπεία υποκατάστασης της αιμορροφιλίας Α χρησιμοποιούνται προϊόντα του FVIII. Αυτά τα προϊόντα είτε προέρχονται από επεξεργασμένο ανθρώπειο πλάσμα είτε παράγονται από κυτταρικές σειρές κατασκευασμένες να εκφράζουν μεγάλες ποσότητες FVIII με μεθόδους ανασυνδυασμένου DNA. Τα προϊόντα αυτά χορηγούνται ενδοφλεβίως. Τα παράγωγα πλάσματος ταξινομούνται με βάση την καθαρότητά τους, ενώ τα ανασυνδυασμένα προϊόντα χαρακτηρίζονται από τη γενιά τους. Και στις δύο περιπτώσεις, η διαβάθμιση αντανακλά το βαθμό έκθεσης σε ανθρώπειες ή ζωικές πρωτεΐνες. 171,172 Σήμερα στο εμπόριο κυκλοφορούν και ανασυνδυασμένοι παράγοντες VIII και IX από διάφορους κατασκευαστές και χαρακτηρίζονται από τη χρησιμοποιούμενη μέθοδο κάθαρσης και ιικής απενεργοποίησης. Για την παραγωγή συμπυκνωμένων παραγόντων πλάσματος απαιτείται μια μεγάλη δεξαμενή πλάσματος από δότες που έχουν ελεγχθεί προσεκτικά, η οποία υφίσταται επεξεργασία, ώστε να αποδώσει συμπυκνώματα παραγόντων πήξης. Τα συμπυκνώματα αυτά χαρακτηρίζονται από την καθαρότητά τους, η οποία αντανακλά την ποσότητα της πρωτεΐνης που τα επιμολύνει και εξαρτάται από τη διαδικασία κάθαρσης που εφαρμόζεται κατά την παραγωγή τους. Διακρίνονται σε ενδιάμεσης, υψηλής και πολύ υψηλής καθαρότητας προϊόντα. Σε αυτά προστίθεται αλβουμίνη για τη σταθεροποίησή τους. Τα προϊόντα ενδιάμεσης καθαρότητας κατασκευάζονται με συμβατικές μεθόδους καθίζησης και προσρόφησης, ενώ τα υψηλής καθαρότητας με χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων. Τα πολύ υψηλής καθαρότητας παράγωγα πλάσματος προκύπτουν με χρωματογραφία συγγένειας με μονοκλωνικά αντισώματα, 45

47 έχουν πολύ υψηλή συγκέντρωση παράγοντα (3000 μονάδες) ανά mg πρωτεΐνης, και εμφανίζουν πρακτικά την ίδια καθαρότητα με τα ανασυνδυασμένα προϊόντα. Στα προϊόντα αυτά εφαρμόζονται τεχνικές αδρανοποίησης, αποτελεσματικές εναντίον του HIV και των ιών της ηπατίτιδας. 165,171 Όσον αφορά στον ανασυνδυασμένο FVIII, τα πρώτης γενιάς προϊόντα παράγονται με τη βοήθεια κυτταρικών σειρών από χάμστερ και σταθεροποιούνται με ανθρώπειο αλβουμίνη, η οποία αποτελεί και τη μοναδική πηγή επιμόλυνσης με ιούς του ανθρώπου. Ωστόσο, ο θεωρητικός κίνδυνος για επιμόλυνση με άλλους ιούς θηλαστικών ή με άλλους λοιμώδεις παράγοντες παραμένει. 173 Μελέτες ασφάλειας δεν επιβεβαιώνουν μετάδοση ιών με τα προϊόντα αυτά. Ο δεύτερης γενιάς ανασυνδυασμένος FVIII χαρακτηρίζεται από την έλλειψη του τμήματος του FVIII που κωδικοποιείται από την περιοχή Β του γονιδίου. Η έλλειψη αυτή δεν επηρεάζει τη λειτουργικότητα του παράγοντα, ενώ παράλληλα καθιστά το μόριο του FVIII πιο μικρό και πιο σταθερό. Έτσι, δεν απαιτείται προσθήκη αλβουμίνης για σταθεροποίηση, η οποία δυνητικά αποτελεί πηγή επιμόλυνσης. 174 Στα τρίτης γενιάς προϊόντα δεν προστίθενται ανθρώπειες ή ζωικές πρωτεΐνες κατά τη διαδικασία παραγωγής ή κατά την τελική προετοιμασία τους. 175 Ο ανασυνδυασμένος FVIII έχει όγκο κατανομής 0,5 του όγκου πλάσματος και χρόνο ημίσειας ζωής 8 έως 12 ώρες. 176 Τελευταία, γίνεται προσπάθεια ανάπτυξης τροποποιημένων προϊόντων FVIII με μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής, με σκοπό την επιμήκυνση των μεσοδιαστημάτων χορήγησης. 172,177,178 Για τη θεραπεία υποκατάστασης της αιμορροφιλίας Β χρησιμοποιούνται προϊόντα του FΙΧ. Και για την υποκατάσταση του FIX, υπάρχουν παράγωγα πλάσματος και ανασυνδυασμένα προϊόντα. Οι συμπυκνωμένοι παράγοντες προκύπτουν με μεθόδους κάθαρσης από το ανθρώπειο πλάσμα. Φαίνεται ότι εκείνα τα παράγωγα πλάσματος που προκύπτουν με χρωματογραφία συγγένειας με μονοκλωνικό αντίσωμα και κατόπιν υπόκεινται σε διεργασίες αδρανοποίησης ιών είναι τα περισσότερο ασφαλή. 171 Τα ανασυνδυασμένα προϊόντα FIX έχουν χρόνο ημίσειας ζωής 16 έως 17 ώρες, δεν υφίστανται προσθήκη αλβουμίνης και έχουν μεγάλο όγκο κατανομής (1 έως 1,2 του όγκου πλάσματος). Επομένως, είναι ασφαλέστερα και αποτελεσματικότερα από τα παράγωγα πλάσματος. 172,179 Γίνεται προσπάθεια περαιτέρω επεξεργασίας των ανασυνδυασμένων προϊόντων με σκοπό την επιμήκυνση του χρόνου ημίσειας ζωής αυτών, η οποία θα επιτρέψει τη χορήγησή τους μία φορά την εβδομάδα. 180 Κατά τις δεκαετίες του 1970 και 1980, η προσπάθεια δημιουργίας συμπυκνωμάτων FIX είχε οδηγήσει, όπως προαναφέρθηκε, στην παραγωγή του συμπυκνωμένου προθρομβινικού συμπλέγματος. Η χρήση του όμως συνδέθηκε με αυξημένο κίνδυνο δημιουργίας θρόμβων και για το λόγο αυτό δε χρησιμοποιείται πλέον στη θεραπεία της αιμορροφιλίας Β. Χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ασθενών με επίκτητο ανασταλτή ως προς τον παράγοντα VIII και IX. Ο θρομβωτικός κίνδυνος από τη χρήση του προθρομβινικού συμπλέγματος είναι μεγάλος σε ασθενείς που λαμβάνουν υψηλές ή πολλαπλές δόσεις αυτού και σε ασθενείς με ηπατική νόσο που δεν επιτυγχάνουν επαρκή κάθαρση του προϊόντος αυτού από την κυκλοφορία. 29 Ως θεραπεία υποκατάστασης έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν το νωπό κατεψυγμένο πλάσμα (Fresh Frozen Plasma, FFP) και το κρυοΐζημα. Το FFP παρασκευάζεται είτε από μονάδες ολικού αίματος είτε από πλάσμα που συλλέγεται με πλασμαφαίρεση. Περιέχει φυσιολογικά επίπεδα όλων των σταθερών παραγόντων πήξης, αλβουμίνη, ανοσοσφαιρίνες και τουλάχιστον το 70% της αρχικής ποσότητας του FVIII. Αποτελεί χαμηλής καθαρότητας προϊόν αναπλήρωσης των παραγόντων, αφού δεν παρουσιάζει αυξημένη συγκέντρωση κάποιας από τις πρωτεΐνες, οπότε και 46

48 δεν πρέπει να χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ελλείψεων παραγόντων πήξης ή ως πηγή αλβουμίνης ή για την έκπτυξη του ενδαγγειακού όγκου. Με βάση τις κατευθυντήριες οδηγίες μετάγγισης αίματος και παραγώγων του που εξέδωσε η Ελληνική Αιματολογική Εταιρεία το 2010, η χορήγηση FFP για την ανεπάρκεια μεμονωμένων παραγόντων πήξης ενδείκνυται μόνο στην περίπτωση που δεν υπάρχει διαθέσιμος συμπυκνωμένος παράγοντας σε κατάσταση αιμορραγίας ή για την αποφυγή αιμορραγίας σε χειρουργικές ή άλλες επεμβατικές τεχνικές. 181 Έτσι, η χρήση του έχει περιοριστεί σε καταστάσεις και κράτη όπου τα κατάλληλα συμπυκνώματα δεν είναι διαθέσιμα. Η δόση του πλάσματος που απαιτείται για την αύξηση του FVIII σε θεραπευτικά επίπεδα είναι ιδιαίτερα υψηλή και μπορεί να οδηγήσει σε υπερφόρτωση της κυκλοφορίας, ειδικά σε βαρέως πάσχοντες αιμορροφιλικούς. 182 Όταν το FFP αποψύχεται στους 4 ο C, παραμένει ίζημα, το οποίο μπορεί να ληφθεί με φυγοκέντρηση, και ονομάζεται κρυοΐζημα. Το κρυοΐζημα αποτελεί επίσης χαμηλής καθαρότητας προϊόν αναπλήρωσης των παραγόντων και έχει τον ίδιο κίνδυνο λοίμωξης όπως μια μονάδα FFP. Περιέχει όλη σχεδόν την ποσότητα του FVIII, του ινωδογόνου, της ινωδονεκτίνης, του FXIII και του vwf της μονάδας FFP, συγκεντρωμένη σε έναν όγκο 10-20ml (αντί των αρχικών 250ml). Η συγκέντρωση του παράγοντα VIII είναι περίπου 100 μονάδες ανά συσκευασία και για να επιτευχθούν θεραπευτικές συγκεντρώσεις του παράγοντα απαιτείται σχετικά μεγάλος αριθμός ασκών. Δεν χρησιμοποιείται πλέον για τη θεραπεία της αιμορροφιλίας Α, λόγω προηγούμενης εμπειρίας με μετάδοση ιών, εκτός εάν υπάρχει έλλειψη συμπυκνωμένων παραγόντων πήξης Επιλογή θεραπείας υποκατάστασης Καθώς και τα παράγωγα πλάσματος και τα ανασυνδυασμένα προϊόντα επιτυγχάνουν ικανοποιητική αιμόσταση, η επιλογή του προϊόντος που θα χορηγηθεί εξαρτάται από την ασφάλεια, την καθαρότητα, το κόστος και την πιθανότητα ανάπτυξης αναστολέα. 184 Η καθαρότητα και η ασφάλεια σε σχέση με τη μετάδοση ιών είναι εξαιρετικά σημαντικές παράμετροι, καθώς στο παρελθόν πολλοί αιμορροφιλικοί μολύνθηκαν με ιούς μέσω των μεταγγίσεων. Παρόλο που η ασφάλεια των παραγόντων πήξης πλάσματος βελτιώθηκε δραματικά τα τελευταία 25 χρόνια, η πιθανότητα μετάδοσης ιών δεν είναι μηδενική και ο φόβος μετάδοσης νέων ή αγνώστων παθογόνων με το αίμα και τα παράγωγά του εξακολουθεί να υφίσταται. Ιοί ακόμη άγνωστοι αλλά κλινικά σημαντικοί μπορεί να είναι ανθεκτικοί στις σήμερα χρησιμοποιούμενες τεχνικές αδρανοποίησης και επομένως να μολύνουν τους αιμορροφιλικούς ασθενείς. Αυτό καταδεικνύεται από τις αναφορές μετάδοσης του Β19V μέσω παραγόντων πλάσματος, ο οποίος όμως προκαλεί μόνο ήπια νόσο. 122,123 Επιπλέον, ανησυχία υπάρχει όσον αφορά στη μετάδοση prions μέσω των προϊόντων πλάσματος. Έχει αναφερθεί ανίχνευση vcjd κατά τη νεκροψία ενός αιμορροφιλικού χωρίς νευρολογικά σημεία και συμπτώματα στο Ηνωμένο Βασίλειο, ο οποίος έλαβε FVIII που είχε κατασκευαστεί από δεξαμενές πλάσματος, οι οποίες έγινε γνωστό ότι περιελάμβαναν πλάσμα από μολυσμένο με vcjd δότη. 132 Και η ασφάλεια των ανασυνδυασμένων προϊόντων αυξήθηκε την τελευταία δεκαετία με σκοπό την περαιτέρω ελαχιστοποίηση του κινδύνου μετάδοσης παθογόνων στους αιμορροφιλικούς. Αυτό επιτεύχθηκε μέσω της βελτίωσης των μεθόδων κάθαρσης πρωτεϊνών και της εφαρμογής τεχνικών αδρανοποίησης ιών παρόμοιων με τις εφαρμοζόμενες στα προϊόντα πλάσματος. 128 Ένα επιπλέον μέτρο αποτελεί η απομάκρυνση των ανθρώπειων και ζωικών πρωτεϊνών από όλα τα στάδια παρασκευής των ανασυνδυασμένων παραγόντων. 185 Για την παραγωγή της πρώτης 47

49 γενιάς ανασυνδυασμένου FVIII χρησιμοποιούνταν ζωικές πρωτεΐνες στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας, και για τη σταθεροποίηση του τελικού προϊόντος γινόταν προσθήκη ανθρώπειου αλβουμίνης. Κατά την παραγωγή της δεύτερης γενιάς ανασυνδυασμένου FVIII χρησιμοποιούνταν ανθρώπειες πρωτεΐνες στο μέσο καλλιέργειας, αλλά δεν γινόταν προσθήκη αλβουμίνης στο τελικό προϊόν. Τελικά αναπτύχθηκαν τα τρίτης γενιάς προϊόντα, για την κατασκευή των οποίων δε χρησιμοποιείται αλβουμίνη ούτε στο μέσο καλλιέργειας ούτε στο τελικό προϊόν. 177 Έτσι, σε πολλά δυτικά κράτη, όπου η ασφάλεια είναι το πρωταρχικό μέλημα και το κόστος δεν αποτελεί περιοριστικό παράγοντα, συστήνεται όλοι οι πρωτοθεραπευόμενοι, καθώς και οι ελάχιστα θεραπευμένοι ασθενείς να λαμβάνουν μόνο πολύ υψηλής καθαρότητας παράγωγα πλάσματος ή κατά προτίμηση ανασυνδυασμένα προϊόντα. Οι ανασυνδυασμένοι παράγοντες προτείνονται ως θεραπεία εκλογής για την αντιμετώπιση των αιμορραγικών επεισοδίων από το Ιατρικό και Επιστημονικό Συμβούλιο των ΗΠΑ, του Καναδά και του Ηνωμένου Βασιλείου. Στην Ιρλανδία και στο Ηνωμένο Βασίλειο χορηγούνται σχεδόν αποκλειστικά ανασυνδυασμένοι παράγοντες, ενώ στην Ελλάδα παρατηρείται επίσης εκτεταμένη χορήγηση αυτών. Με σκοπό τον έλεγχο της μακροχρόνιας ασφάλειας της θεραπείας υποκατάστασης της αιμορροφιλίας, ξεκίνησε το 2008 ένα ευρωπαϊκό πρόγραμμα επιτήρησης της ασφάλειας των αιμορροφιλικών (European Haemophilia Safety Surveillance System, EUHASS). Ως προς την πιθανότητα ανάπτυξης αναστολέα, δεν έχει τεκμηριωθεί σαφής συσχέτιση με τη χορήγηση της μια ή της άλλης κατηγορίας προϊόντων. 20,32,58,131, Άλλα θεραπευτικά μέσα Εκτός από τη θεραπεία υποκατάστασης, δύο επιπλέον θεραπευτικές επιλογές για τους αιμορροφιλικούς ασθενείς αποτελούν η δεσμοπρεσσίνη και οι αντιινωδολυτικοί παράγοντες. Η δεσμοπρεσσίνη είναι ένα συνθετικό ανάλογο της βαζοπρεσσίνης, δηλαδή της αντιδιουρητικής ορμόνης, χωρίς αγγειοσυσπαστική δράση. Χορηγούμενη σε ασθενείς με ήπια μορφή αιμορροφιλίας, η δεσμοπρεσσίνη προκαλεί αύξηση των επιπέδων του κυκλοφορούντα FVIII, καθώς τον απελευθερώνει από περιοχές αποθήκευσής του στο ενδοθήλιο. Έχει σχετικά χαμηλό κόστος και δεν συνοδεύεται από τον κίνδυνο μετάδοσης ιογενών λοιμώξεων. Επομένως, αποτελεί θεραπεία εκλογής των αιμορραγικών επεισοδίων ήπιας έως μέτριας βαρύτητας για την ομάδα αυτή των ασθενών. 8,33 Οι αντιινωδολυτικοί παράγοντες (τρανεξαμικό οξύ, ε- αμινοκαπροϊκό οξύ) εμποδίζουν την ινωδόλυση αναστέλλοντας την ενεργοποίηση του πλασμινογόνου μέσα στο θρόμβο ινικής. Έτσι, αποτελούν χρήσιμα θεραπευτικά συμπληρώματα για τη σταθεροποίηση των θρόμβων σε περιοχές αυξημένης ινωδόλυσης, όπως η στοματική κοιλότητα, και σε ασθενείς με επεισόδια επίσταξης ή μηνορραγίας που δεν ελέγχονται Επιπλοκές θεραπείας υποκατάστασης Οι συμπυκνωμένοι παράγοντες έφτασαν σε υψηλά επίπεδα ασφάλειας όσον αφορά στη μετάδοση ιών εντός των τελευταίων 15 ετών. Έτσι, σήμερα η πιο σοβαρή επιπλοκή της θεραπείας της αιμορροφιλίας είναι χωρίς καμία αμφιβολία η ανάπτυξη ανασταλτών, η οποία καθιστά αναποτελεσματική τη θεραπεία υποκατάστασης με έγχυση συμπυκνωμένων παραγόντων, εκθέτοντας τους ασθενείς σε αυξημένο κίνδυνο νοσηρότητας και θνητότητας. 186,187 Πρόκειται για την ανάπτυξη αντισωμάτων, κυρίως IgG, που αναστέλλουν τον εκάστοτε χορηγούμενο παράγοντα πήξης. Τέτοια αλλοαντισώματα αναπτύσσονται περίπου στο 20-30% των ασθενών με βαριά αιμορροφιλία Α και μόνο στο 3-5% των ασθενών με βαριά αιμορροφιλία Β, στους 48

50 οποίους όμως φαίνεται να σχετίζονται με σοβαρές αλλεργικές αντιδράσεις (αναφυλαξία, νεφριτιδικό σύνδρομο). Η εμφάνισή τους είναι πολύ σπάνια σε ασθενείς με ήπια ή ενδιάμεση αιμορροφιλία. Πολλές μελέτες διερεύνησαν καταστάσεις που συνεισφέρουν στην ανάπτυξη ανασταλτή και ανέδειξαν τη σημασία γενετικών (εθνικότητα, μεταλλάξεις του F8 γονιδίου, γονότυπος του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας, πολυμορφισμοί γονιδίων σχετιζόμενων με την ανοσολογική απάντηση, όπως της ιντερλευκίνης-1 και του παράγοντα νέκρωσης όγκων-α), καθώς και περιβαλλοντικών παραγόντων κινδύνου (αριθμός ημερών έκθεσης στον FVIII, ηλικία πρώτης έκθεσης στον FVIII, τύπος του χορηγούμενου συμπυκνώματος, τρόπος θεραπείας). 188 Από αυτά συμπεραίνεται ότι η δημιουργία ανασταλτή στον αιμορροφιλικό ασθενή είναι μια σύνθετη και πολυπαραγοντική διαδικασία. 189 Μελέτες in vitro έδειξαν ότι η παρουσία του vwf στον συμπυκνωμένο FVIII που προέρχεται από πλάσμα οδηγεί σε μείωση της ανοσογονικότητας του FVIII, μέσω κάλυψης αντιγονικών επιτόπων και προστασίας του μορίου του FVIII από την ενδοκυττάρωση από αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. 190 Με βάση αυτές τις μελέτες έγινε προσπάθεια διερεύνησης του ρόλου του τύπου του χορηγούμενου FVIII (προερχόμενος από πλάσμα ή ανασυνδυασμένος) στην πιθανότητα ανάπτυξης ανασταλτή, με αντικρουόμενα όμως αποτελέσματα από τις διάφορες έρευνες, όσον αφορά στην ύπαρξη διαφοράς στην ανοσογονικότητα του προερχόμενου από πλάσμα και του ανασυνδυασμένου FVIII Στόχοι για το μέλλον Στη σύγχρονη εποχή, η θεραπεία που παρέχεται στους αιμορροφιλικούς έχει φτάσει σε υψηλά επίπεδα ποιότητας, και φαίνεται να αποτελεί την πιο αποτελεσματική και ασφαλή θεραπεία που είναι διαθέσιμη για μονογονιδιακή νόσο. Η μείωση των θανάτων από αιμορραγία, η αποφυγή των αιμάρθρων και της απότοκης αιμορροφιλικής αρθροπάθειας, η κατ οίκον θεραπεία, η παραγωγή ασφαλών προϊόντων, η αντιμετώπιση των αιματογενώς μεταδιδόμενων λοιμώξεων μέσω της παρακολούθησης των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα ως προς την ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος ή ηπατικής ανεπάρκειας και της εφαρμογής νέων θεραπειών (HAART για HIV και νεότερες θεραπείες για HCV) οδήγησαν σε σημαντική βελτίωση της ποιότητας ζωής και μείωση της νοσηρότητας και θνητότητας στον αιμορροφιλικό πληθυσμό. Στόχοι για το μέλλον είναι η παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων συμπυκνωμένων προερχόμενων από πλάσμα και ανασυνδυασμένων παραγόντων με σκοπό την κάλυψη των αναγκών σε όλες τις χώρες, η ανάπτυξη μορίων με μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής (π.χ. πεγκυλιωμένοι παράγοντες πήξης) και μικρότερη ανοσογονικότητα, η διευκρίνιση του ρόλου της δευτερογενούς προφύλαξης στην αιμορροφιλική αρθροπάθεια και στην ποιότητα ζωής των αιμορροφιλικών, η αναγνώριση της καλύτερης θεραπείας ανοσοανοχής για τους αιμορροφιλικούς με ανασταλτή και η ευρεία εισαγωγή της γονιδιακής θεραπείας που θεραπεύει οριστικά τη νόσο. 25,194 Αποτέλεσμα όλης αυτής της προόδου που έγινε στον τομέα της θεραπείας της αιμορροφιλίας είναι η επιμήκυνση του προσδόκιμου επιβίωσης των αιμορροφιλικών, το οποίο σταδιακά έφτασε στο επίπεδο των ανδρών στο γενικό πληθυσμό, τουλάχιστον στα κράτη υψηλού ή μέσου εισοδήματος. 25,195 Ωστόσο, καθώς οι αιμορροφιλικοί φτάνουν πλέον σε μεγαλύτερες ηλικίες, εμφανίζουν παθήσεις (π.χ. καρδιαγγειακά νοσήματα, κακοήθειες, νεφρική νόσο) που παλαιότερα δεν συναντιόνταν στην ομάδα αυτή των ασθενών που απεβίωνε σε νεαρή ηλικία. Η αντιμετώπιση αυτής της συνοσηρότητας αποτελεί νέα πρόκληση στη ολοκληρωμένη διαχείριση του αιμορροφιλικού ασθενούς στα Κέντρα Αιμορροφιλικών. 162,196,197 49

51 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η αιμορροφιλία Α και η αιμορροφιλία Β είναι Χ-φυλοσύνδετα νοσήματα με αιμορραγική διάθεση που περιλαμβάνονται μεταξύ των σπανίων παθήσεων και οφείλονται σε μεταλλάξεις στα γονίδια των παραγόντων VIII και IX της πήξης, αντίστοιχα. Οι δύο αυτοί παράγοντες συμμετέχουν στην ενδογενή οδό της πήξης. Οι αιμορροφιλικοί μπορεί να εμφανίζουν σοβαρή, ενδιάμεση ή ήπια μορφή νόσου, η οποία καθορίζεται από επίπεδα του παράγοντα στο πλάσμα κάτω από 1%, 1-5% και 5-40%, αντίστοιχα. Η επίπτωση της αιμορροφιλίας Α ανέρχεται παγκοσμίως σε 1 περιστατικό ανά 5000 γεννήσεις ζώντων αρρένων, ενώ της αιμορροφιλίας Β σε 1 ανά Ανεπάρκειες άλλων παραγόντων του καταρράκτη της πήξης μπορεί επίσης να οδηγήσουν σε αιμορραγική διάθεση. Πρόκειται για τις σπάνιες ανεπάρκειες παραγόντων πήξης, που κληρονομούνται με τον αυτοσωματικό υπολειπόμενο χαρακτήρα και ο επιπολασμός τους κυμαίνεται από 1 έως 2 περιπτώσεις ανά εκατομμύριο πληθυσμού. Επί του συνόλου των αιμορροφιλικών, περίπου 80-85% πάσχει από αιμορροφιλία Α, 14% από αιμορροφιλία Β και το υπόλοιπο 1-6% από σπάνιες ανεπάρκειες πηκτικών παραγόντων. Οι πρώτες αναφορές στην αιμορροφιλία χρονολογούνται από την αρχαιότητα, ενώ η πρώτη σύγχρονη περιγραφή της νόσου έγινε το Ωστόσο, μόλις το 1937 αναγνωρίστηκε η έλλειψη της αντιαιμορροφιλικής σφαιρίνης (FVIII) ως αίτιο της αιμορραγικής διάθεσης και το 1952 διακρίθηκε η αιμορροφιλία Β από την Α. Μετά την αναγνώριση της νόσου και τη διευκρίνιση της παθογένειάς της, που οδήγησαν στην ακριβή διάγνωση αυτής, ξεκίνησαν οι προσπάθειες για στοχευμένη αντιμετώπιση της αιμορροφιλίας. Έτσι, ενώ τις δεκαετίες του 1950 και 1960, οι αιμορροφιλικοί μπορούσαν να αντιμετωπιστούν μόνο με ολικό αίμα, νωπό κατεψυγμένο πλάσμα και κρυοκαθίζημα, από τη δεκαετία του 1970 ξεκίνησε η σύγχρονη διαχείριση των αιμορροφιλικών με συμπυκνωμένους παράγοντες πήξης πλάσματος, που οδήγησε σε βελτίωση της ποιότητας ζωής και μείωση της νοσηρότητας και θνητότητας στον αιμορροφιλικό πληθυσμό. Όμως, από τις αρχές της δεκαετίας του 1980 ξέσπασε επιδημία AIDS και ηπατίτιδας στους αιμορροφιλικούς ασθενείς, οι οποίοι εκτέθηκαν στους ιούς HIV, HCV και HBV μέσω των προϊόντων αίματος και ιδίως των παραγόντων πήξης πλάσματος που έλαβαν σε μεγάλο βαθμό ιδίως οι βαρέως πάσχοντες και που παρασκευάζονταν από δεξαμενές πλάσματος χιλιάδων δοτών, οι οποίες περιείχαν το ατομικό αναμνηστικό λοιμωδών νοσημάτων καθενός από αυτούς. Σχεδόν όλοι οι αιμορροφιλικοί ήρθαν σε επαφή με τον HBV και τον HCV, ο οποίος τότε ήταν ακόμη γνωστός ως ιός της μη-α, μη-β ηπατίτιδας, και περίπου 65% των βαρέως πασχόντων μολύνθηκαν με HIV. Συχνή ήταν και η συλλοίμωξη με HIV και ιούς της ηπατίτιδας. Έτσι, επιτακτική έγινε η ανάγκη για ασφαλή θεραπευτικά μέσα και έκτοτε σταδιακά ελήφθησαν διάφορα μέτρα προς την κατεύθυνση αυτή: προσεκτική επιλογή δοτών, έλεγχος των μεμονωμένων μονάδων και των δεξαμενών πλάσματος για τους πλασματογενώς μεταδιδόμενους ιούς με μεθόδους ολοένα και υψηλότερης ευαισθησίας, εφαρμογή τεχνικών αδρανοποίησης και/ή απομάκρυνσης ιών στα παράγωγα πλάσματος από το 1987, και τέλος χρήση των ανασυνδυασμένων παραγόντων πήξης. Παρά τα μέτρα που ελήφθησαν, οι αιμορροφιλικοί που έλαβαν προϊόντα αίματος και πλάσματος πριν από το 1987, οπότε και εισήχθησαν συστηματικά οι τεχνικές μείωσης του ιικού φορτίου στην παραγωγική διαδικασία, μολύνθηκαν με τον HBV, αναπτύσσοντας είτε φυσική ανοσία είτε χρόνια HBV λοίμωξη, καθώς και με τον 50

52 HCV, αναπτύσσοντας σε μεγάλο ποσοστό χρόνια HCV λοίμωξη, με εξαίρεση τις περιπτώσεις αυτόματης κάθαρσης του ιού. Ο επιπολασμός της φυσικής ανοσίας στην ηπατίτιδα Β και του anti-hcv αντισώματος παραμένει ιδιαίτερα υψηλός στον αιμορροφιλικό πληθυσμό λόγω της επαφής με τους ιούς της ηπατίτιδας κατά τις δεκαετίες του 1970 και 1980, ενώ οξεία HBV και HCV λοίμωξη από παράγωγα πλάσματος δεν παρατηρείται πλέον στους ασθενείς αυτούς. Καθώς η μέση επιβίωση των αιμορροφιλικών ασθενών έχει αυξηθεί σημαντικά σε σχέση με το παρελθόν και πλησιάζει εκείνη του γενικού πληθυσμού λόγω της έγκαιρης διάγνωσης και της βελτίωσης των θεραπευτικών μέσων και της συνολικής φροντίδας των πασχόντων, η χρόνια ηπατίτιδα αποτελεί σημαντική συνοσηρότητα στον ενήλικα αιμορροφιλικό ασθενή και μπορεί να οδηγήσει σε ίνωση και κίρρωση ήπατος, ηπατική νόσο τελικού σταδίου, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και θάνατο. Η φυσική πορεία, η διάγνωση και η θεραπεία της χρόνιας HBV και HCV λοίμωξης είναι όμοιες με το γενικό πληθυσμό. Τυχόν συλλοίμωξη με τον HIV που είναι συχνή στον αιμορροφιλικό πληθυσμό λόγω της κοινής πηγής μόλυνσης επιβαρύνει την πρόγνωση. Τα σύγχρονα χρησιμοποιούμενα αντιιικά φάρμακα έχουν βελτιώσει την ποιότητα ζωής και μειώσει τη νοσηρότητα και θνητότητα των αιμορροφιλικών με ηπατίτιδα. Η παρούσα διπλωματική εργασία αποτελεί μελέτη χρονικής στιγμής του επιπολασμού των ηπατικών παθήσεων στον αιμορροφιλικό πληθυσμό. Πιο συγκεκριμένα, σκοπός της είναι η επιδημιολογική καταγραφή της φυσικής επαφής με τους ιούς της ηπατίτιδας Β και C, της χρόνιας HBV και HCV λοίμωξης, της αυτόματης κάθαρσης του HCV, της συλλοίμωξης με ιούς ηπατίτιδας και HIV, που επιβαρύνει την πορεία της ηπατικής νόσου, στον πληθυσμό αυτό, της απάντησης στη θεραπεία για την ηπατίτιδα C και η κατάδειξη της σχέσης της μόλυνσης με τον HBV και HCV με την ηλικία των αιμορροφιλικών και με τη βαρύτητα της αιμορροφιλίας. 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η έρευνα διενεργήθηκε στο Αιμορροφιλικό Κέντρο Βορείου Ελλάδος, το οποίο αποτελεί τμήμα της Β Προπαιδευτικής Παθολογικής Κλινικής, που στεγάζεται στο 2ο όροφο του κτιρίου «Αγ. Σοφία» στο «Ιπποκράτειο» Π.Γ.Ν.Θ. Η καταγραφή ξεκίνησε τον Φεβρουάριο του 2014 και ολοκληρώθηκε τον Σεπτέμβριο του Στο Αιμορροφιλικό Κέντρο Βορείου Ελλάδος είναι καταχωρημένοι 259 φάκελοι αιμορροφιλικών ασθενών. Από το σύνολο αυτό αποκλείστηκαν 8 φάκελοι λόγω ελλιπών δεδομένων. Το τελικό δείγμα της έρευνας αποτελείται, επομένως, από 251 αιμορροφιλικούς ασθενείς (96,9%), μέγεθος που θεωρείται ικανοποιητικό και διασφαλίζει σε σημαντικό βαθμό την αξιοπιστία των εξαγόμενων παρατηρήσεων και συμπερασμάτων. Χρησιμοποιήθηκαν οι ιατρικοί φάκελοι των ασθενών που πάσχουν από αιμορροφιλία Α, αιμορροφιλία Β και άλλες σπάνιες ανεπάρκειες παραγόντων, που είναι καταχωρημένοι στο Αιμορροφιλικό Κέντρο. Πληροφορίες σχετικά με τους αιμορροφιλικούς ασθενείς που έλαβαν κατά το παρελθόν ή λαμβάνουν κατά την παρούσα φάση θεραπεία για την ηπατίτιδα C ανακτήθηκαν από τους ιατρικούς φακέλους αυτών που διατηρούνται στο Εξωτερικό Ιατρείο της Γαστρεντερολογικής Κλινικής ή στο Αρχείο της Γαστρεντερολογικής Κλινικής. Επιπλέον, τηλεφωνική επικοινωνία με τον ασθενή χρειάστηκε για περιπτώσεις στις οποίες από το καταγεγραμμένο στο φάκελο ατομικό αναμνηστικό του ασθενούς δεν ήταν σαφές αν είχε προηγηθεί θεραπεία κατά της ηπατίτιδας C στο Αιμορροφιλικό Κέντρο του Π.Γ.Ν.Α «Λαϊκό», όπου παρακολουθούνταν πολλοί αιμορροφιλικοί πριν την ίδρυση του Αιμορροφιλικού Κέντρου Βορείου Ελλάδος. 51

53 Από τους ιατρικούς φακέλους των ασθενών καταγράφηκαν ανώνυμα τα εξής στοιχεία: ημερομηνία γέννησης, φύλο, τύπος αιμορροφιλίας, βαρύτητα νόσου, ημερομηνία έναρξης παρακολούθησης στο Αιμορροφιλικό Κέντρο, θετικότητα ή μη ως προς τους δείκτες HBcAb, HBsAg, HBsAb, anti-hcv αντίσωμα, HIV Ag/Ab, ποιοτικός ή ποσοτικός προσδιορισμός HBV DNA και HCV RNA, γονότυπος HCV, λήψη μίας η περισσοτέρων αντιιικών θεραπειών κατά της ηπατίτιδας C, έκβαση θεραπειών (SVR). Η κατάταξη της βαρύτητας της αιμορροφιλίας έγινε ως εξής: βαριά νόσος με ποσοστό παράγοντα 1%, ενδιάμεση νόσος με ποσοστό 1-5% και ήπια νόσος με ποσοστό >5% και <40%. Όσον αφορά στην ηπατίτιδα Β, σε επαφή με τον HBV μέσω των προϊόντων αίματος θεωρήθηκε ότι ήρθαν όλοι οι αιμορροφιλικοί ασθενείς που εμφανίζουν είτε HBsAg (+) είτε HBcAb (+). Όλοι οι αιμορροφιλικοί με HBsAg (+) πάσχουν από χρόνια HBV λοίμωξη, ενώ εκείνοι με HBcAb (+) και HBsAb (+) ή (-) ή οριακό έχουν έρθει σε φυσική επαφή με τον HBV. Από τους τελευταίους αυτούς, όσοι εμφανίζουν HBcAb (+) και HBsAb (+) έχουν φυσική ανοσία έναντι στην ηπατίτιδα Β. Οι αιμορροφιλικοί με HBsAb (+) και αρνητικούς τους υπόλοιπους δείκτες ηπατίτιδας Β θεωρούνται εμβολιασμένοι και δεν συμπεριελήφθησαν στις αναλύσεις. Όσον αφορά στην ηπατίτιδα C, σε επαφή με τον HCV μέσω των προϊόντων αίματος θεωρήθηκε ότι ήρθαν στο παρελθόν όλοι οι αιμορροφιλικοί με anti-hcv αντίσωμα (+). Όσοι από αυτούς από τη στιγμή της έναρξης της παρακολούθησής τους στο Αιμορροφιλικό Κέντρο Βορείου Ελλάδος, δηλαδή περίπου δύο δεκαετίες μετά τη μόλυνσή τους με τον HCV, δεν είχαν ποτέ θετική τιμή HCV RNA στους διενεργηθέντες με ποιοτική ή ποσοτική PCR ελέγχους, και δεν είχαν λάβει ποτέ θεραπεία κατά της ηπατίτιδας C, θεωρήθηκε ότι εμφάνισαν αυτόματη κάθαρση. Μεταξύ αυτών που δεν πέτυχαν αυτόματη κάθαρση, συνέχισαν να παρακολουθούνται τακτικά και δεν είχαν ελλιπή δεδομένα στους φακέλους τους, έγινε καταγραφή του HCV γονότυπου. Μεταξύ των ασθενών με χρόνια HCV λοίμωξη που έλαβαν αντιιική θεραπεία μία ή περισσότερες φορές υπολογίστηκε το ποσοστό SVR μετά από οποιασδήποτε μορφής πρώτη θεραπεία και μετά από οποιασδήποτε μορφής περισσότερες από μια θεραπείες. Το είδος της χορηγούμενης θεραπείας δεν λήφθηκε υπόψη, καθώς κρίθηκε έξω από τους σκοπούς της παρούσας μελέτης. Ο ορολογικός έλεγχος αντιγόνων και αντισωμάτων των HBV και HCV έγινε με μέθοδο χημειοφωταύγειας, και συγκεκριμένα με CMIA (Chemiluminescent Microparticle Immunoassay), ενώ ο ποσοτικός ή ποιοτικός προσδιορισμός των νουκλεϊκών οξέων των ιών αυτών DNA και RNA, αντίστοιχα έγινε με PCR. Οι παρακλινικές αυτές εξετάσεις βρίσκονταν σε έντυπη μορφή μέσα στους ιατρικούς φακέλους των ασθενών και είχαν διενεργηθεί στο Εργαστήριο Βιοπαθολογίας του «Ιπποκράτειου» Π.Γ.Ν.Θ. σε κάποια χρονική στιγμή μετά την έναρξη της παρακολούθησης των αιμορροφιλικών ασθενών στο Αιμορροφιλικό Κέντρο Βορείου Ελλάδος. Για τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό πακέτο IBM SPSS Statistics version 20 και οι σχετικοί έλεγχοι Pearson s Χ 2 και Fisher s exact test για τη σύγκριση των αναλογιών ανάμεσα σε δυο ομάδες, ο συντελεστής συσχέτισης του Pearson, καθώς και ο έλεγχος της έντασης της εξάρτησης Cramer s V. 52

54 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Τύπος νόσου Σε σχέση με τον τύπο της αιμορροφιλίας, η μεγαλύτερη συχνότητα με 185 άτομα παρατηρείται στους αιμορροφιλικούς τύπου Α. Η κατανομή του δείγματος ως προς τον τύπο της αιμορροφιλίας παρουσιάζεται στον Πίνακα 6 και στην Εικόνα 3. Όσον αφορά στις σπάνιες ανεπάρκειες παραγόντων πήξης, η μεγαλύτερη συχνότητα παρατηρήθηκε στην έλλειψη του FVII. Αναλυτικά η κατανομή των ασθενών με σπάνιες ανεπάρκειες παρουσιάζεται στον Πίνακα 7 και στην Εικόνα 4. Στον Πίνακα 7 αναγράφονται και οι ασθενείς με αταξινόμητες/μικτές ανεπάρκειες πηκτικών παραγόντων. Τύπος νόσου Συχνότητα Σχετική Συχνότητα (%) Αιμορροφιλία Α ,71% Αιμορροφιλία Β 35 13,94% Σπάνιες ανεπάρκειες 31 12,35% Σύνολο ,0 Πίνακας 6 12,35% 13,94% 73,71% Αιμορροφιλία Α Αιμορροφιλία Β Σπάνιες ανεπάρκειες Εικόνα 3 Σπάνιες ανεπάρκειες Συχνότητα Σχετική Συχνότητα (%) Έλλειψη FV 2 6,45% Έλλειψη FVII 18 58,06% Έλλειψη FX 2 6,45% Έλλειψη FXI 4 12,90% Έλλειψη FXII 3 9,68% Έλλειψη FXIII 1 3,23% Αταξινόμητες/Μικτές 1 3,23% Σύνολο ,0 Πίνακας 7 53

55 Σχετική Συχνότητα (%) 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 6,45% 58,06% 6,45% 12,90% 9,68% 3,23% 3,23% FV FVII FX FXI FXII FXIII Αταξ./ Μικτές Έλλειψη Παράγοντα Εικόνα Βαρύτητα νόσου Σχετικά με τη βαρύτητα της αιμορροφιλίας Α και Β, οι περισσότεροι ασθενείς (146) έχουν ήπια νόσο, 41 ασθενείς ενδιάμεση και 33 ασθενείς βαριά. Η κατανομή των αιμορροφιλικών ως προς τη βαρύτητα της νόσου ανά τύπο αιμορροφιλίας, αλλά και συνολικά, παρουσιάζεται στον Πίνακα 8 και στην Εικόνα 5. Βαρύτητα Αιμορροφιλία Α και Β Αιμορροφιλία Α Αιμορροφιλία Β Συχνότητα Σχετική Συχνότητα (%) Συχνότητα Σχετική Συχνότητα (%) Συχνότητα Σχετική Συχνότητα (%) Ήπια ,36% ,70% 30 85,71% Ενδιάμεση 41 18,64% 37 20,00% 4 11,43% Βαριά 33 15,00% 32 17,30% 1 2,86% Σύνολο , , ,0 Πίνακας 8 15,00% 18,64% 66,36% ΗΠΙΑ ΕΝΔΙΑΜΕΣΗ ΒΑΡΙΑ Εικόνα Ηλικία δείγματος Το ηλικιακό εύρος των ασθενών με αιμορροφιλία Α, αιμορροφιλία Β και σπάνιες ανεπάρκειες παραγόντων πήξης είναι από τα 18 μέχρι τα 88 έτη. Η μέση ηλικία του δείγματος είναι τα 44,79 έτη, ενώ άνω των 77 ετών υπάρχουν μόνο 2 άτομα στο δείγμα. Η ποσοστιαία κατανομή της ηλικίας του δείγματος παρουσιάζεται 54

56 Σχετική Συχνότητα (%) στον Πίνακα 9 και στην Εικόνα 6, ενώ τα βασικά στατιστικά μεγέθη για το σύνολο των ασθενών, αλλά και ξεχωριστά για την αιμορροφιλία Α και Β, στον Πίνακα 10. Ηλικία Συχνότητα Σχετική Συχνότητα (%) Αθροιστική Σχετική Συχνότητα (%) ,13% 17,13% ,92% 37,05% ,11% 60,16% ,74% 74,90% ,15% 88,05% ,16% 99,20% ,80% 100% Σύνολο % Πίνακας 9 25% 23,11% 20% 15% 17,13% 19,92% 14,74% 13,15% 11,16% 10% 5% 0% 0,80% Ηλικιακές ομάδες Εικόνα 6 Ηλικία Σύνολο (Α, Β, Αιμορροφιλία Α Αιμορροφιλία Β σπάνιες) Μέση τιμή 44,79 44,79 47,63 Τυπική απόκλιση 16,244 16,842 14,236 Ελάχιστη Τιμή Μέγιστη Τιμή Πίνακας Ηπατίτιδα Β Μεταξύ των 247 αιμορροφιλικών με καταχωρημένους δείκτες ηπατίτιδας Β στο φάκελό τους σε επαφή με τον HBV έχει έρθει το 32,39%. Από αυτούς τους 80 ασθενείς που ήρθαν σε επαφή με τον HBV, οι 6 έχουν αναπτύξει χρόνια HBV λοίμωξη. Τα αποτελέσματα αυτά παρουσιάζονται στον Πίνακα 11 και στην Εικόνα 7. 55

57 Δείκτες ηπατίτιδας Β Συχνότητα Σχετική Συχνότητα (%) HBsAg (-) & HBcAb (-) ,61% HBsAg (-) & HBcAb (+) 74 29,96% HBsAg (+) 6 2,43% Σύνολο ,0 Πίνακας 11 29,96% 2,43% 67,61% HBsAg (-) & HBcAb (-) HBsAg (-) & HBcAb (+) HBsAg (+) Εικόνα Ηπατίτιδα C Από το σύνολο των 251 αιμορροφιλικών ασθενών (Α, Β και σπάνιες) 85 (33,9%) ασθενείς έχουν έρθει σε επαφή με τον HCV και εμφανίζουν θετικό anti- HCV αντίσωμα, ενώ οι υπόλοιποι 166 (66,1%) είναι αρνητικοί ως προς το anti-hcv αντίσωμα. Από τους 85 anti-hcv θετικούς αιμορροφιλικούς, 18 (21,18%) εμφάνισαν αυτόματη κάθαρση του ιού, ενώ 53 (62,35%) έχουν χρόνια HCV λοίμωξη. Τα ποσοστά αυτόματης κάθαρσης παρουσιάζονται στον Πίνακα 12 και στην Εικόνα 8. Συχνότητα Σχετική Συχνότητα (%) HCV λοίμωξη 53 62,35% Αυτόματη κάθαρση 18 21,18% Άγνωστη έκβαση 14 16,47% Σύνολο ,00% Πίνακας 12 16,47% HCV λοίμωξη 21,18% 62,35% Αυτόματη κάθαρση Άγνωστη έκβαση Εικόνα 8 56

58 Μεταξύ των 34 ασθενών που υποβλήθηκαν έως σήμερα σε οποιαδήποτε θεραπεία κατά της ηπατίτιδας C, το 52,94% πέτυχε SVR μετά την πρώτη θεραπεία. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται αναλυτικότερα στον Πίνακα 13. Το είδος της χορηγούμενης θεραπείας δεν λήφθηκε υπόψη. SVR Συχνότητα Σχετική Συχνότητα (%) SVR μετά από μια θεραπεία 18 52,94% SVR μετά από περισσότερες από μια 6 17,65% θεραπείες Μη επίτευξη SVR μετά από μια ή 10 29,41% περισσότερες θεραπείες Σύνολο ,00% Πίνακας 13 Μεταξύ των 85 anti-hcv θετικών αιμορροφιλικών, στο 60% υπάρχει στο φάκελο καταγεγραμμένος ο γονότυπος του HCV. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 14, το μεγαλύτερο ποσοστό anti-hcv θετικών αιμορροφιλικών (47,06%) μολύνθηκε από τον γονότυπο 1 και ένας ασθενής φαίνεται ότι έχει μολυνθεί με δύο γονότυπους HCV. Γονότυποι HCV Συχνότητα Σχετική Συχνότητα (%) 1 (α & β) 40 47,06% 2 7 8,24% 3α 3 3,53% 1 & 2 1 1,18% Άγνωστος 34 40,00% Σύνολο ,00% Πίνακας 14 Στο σύνολο του δείγματος, υπάρχουν 5 αιμορροφιλικοί που φαίνεται να έχουν έρθει σε επαφή και με τον HBV και με τον HCV. Ακόμα υπάρχουν 9 αιμορροφιλικοί ασθενείς που εμφανίζουν συλλοίμωξη HIV και HCV ΣΥΣΧΕΤΙΣΕΙΣ Ηλικία και επαφή με τον HBV Για τη διενέργεια των δοκιμασιών που σχετίζονται με τη χρονολογική εξέλιξη της HBV μόλυνσης στον αιμορροφιλικό πληθυσμό χρησιμοποιήθηκαν δύο χρονολογίες-«ορόσημα», κατά τις οποίες ξεκίνησε η εφαρμογή αποτελεσματικών μέτρων κατά της μετάδοσης HBV με τα παράγωγα πλάσματος. Η πρώτη από αυτές είναι το έτος 1975, οπότε και άρχισε να εφαρμόζεται παγκοσμίως συστηματικά ο έλεγχος των δοτών αίματος και προϊόντων του για το HBsAg. Η δεύτερη είναι το έτος 1987, οπότε και εισήχθησαν στην παραγωγική διαδικασία όλων των εγκεκριμένων παραγόντων πήξης πλάσματος κατάλληλες τεχνικές μείωσης του ιικού φορτίου. 38 Για τις ανάγκες της έρευνας έγινε η παραδοχή ότι η διάγνωση της αιμορροφιλίας και η πρώτη χορήγηση θεραπείας για αυτήν έγιναν τη στιγμή της γέννησης του κάθε ασθενούς. Στα πλαίσια αυτά έλαβαν χώρα τρεις στατιστικές δοκιμασίες, οι οποίες βασίζονται στους ελέγχους Χ 2 και στον ακριβή έλεγχο του Fischer και διενεργήθηκαν 57

59 σε επίπεδο σημαντικότητας α=5%. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε ο ακριβής έλεγχος του Fischer για τη σύγκριση του αριθμού των αιμορροφιλικών που ήρθαν σε επαφή με τον HBV πριν και μετά τις δύο χρονολογίες-«ορόσημα», ενώ στη συνέχεια συγκρίθηκαν οι συχνότητες εμφάνισης HBV επαφής στους αιμορροφιλικούς και στις τρεις υποπεριόδους (πριν το 1975, από το 1975 έως το 1987, και μετά το 1987), ταυτόχρονα, μέσω του ελέγχου Χ 2. Τα αποτελέσματα των ελέγχων παρουσιάζονται στους Πίνακες 15 έως 17. Οι έλεγχοι αυτοί διενεργήθηκαν επί των 220 αιμορροφιλικών τύπου Α και Β, ενώ οι 31 ασθενείς με σπάνιες ανεπάρκειες εξαιρέθηκαν από την ανάλυση αυτή. Επαφή με τον HBV Ημερομηνία γέννησης Ναι Όχι Σύνολο Πριν το (47,1%) 72 (52,9%) 136 Μετά το (13,1%) 73 (86,9%) 84 Σύνολο Πίνακας 15: Επίδραση του ελέγχου των δοτών για HBsAg στη συχνότητα επαφής με τον HBV Επαφή με τον HBV Ημερομηνία γέννησης Ναι Όχι Σύνολο Πριν το (40,0%) 111 (60,0%) 185 Μετά το (2,9%) 34 (97,1%) 35 Σύνολο Πίνακας 16: Επίδραση της εφαρμογής τεχνικών μείωσης του ιικού φορτίου στη συχνότητα επαφής με τον HBV Τα αποτελέσματα των ελέγχων κατέδειξαν στατιστικώς σημαντική διαφορά των συχνοτήτων μόλυνσης με HBV πριν και μετά την επιβολή του ελέγχου των δοτών (pvalue=0,000), καθώς και πριν και μετά την εφαρμογή κατάλληλων τεχνικών μείωσης του ιικού φορτίου στην παραγωγική διαδικασία των παραγόντων πήξης πλάσματος (p-value=0,000). Ειδικότερα, φαίνεται ότι η σχετική συχνότητα των αιμορροφιλικών που ήρθαν σε επαφή με τον HBV μειώθηκε σημαντικά κατά 37,1%, δηλαδή από 40,0% πριν το 1987 σε μόλις 2,9% μετά το Επαφή με τον HBV Ημερομηνία γέννησης Ναι Όχι Σύνολο Πριν το (47,1%) 72 (52,9%) 136 Από 1975 έως (20,4%) 39 (79,6%) 49 Μετά το (2,9%) 34 (97,1%) 35 Σύνολο Πίνακας 17: Επίδραση των διαδοχικών μέτρων ασφαλείας κατά της μετάδοσης του HBV στη συχνότητα επαφής με τον ιό Τα αποτελέσματα του ελέγχου κατέδειξαν στατιστικώς σημαντική διαφορά των συχνοτήτων μόλυνσης με HBV μεταξύ των τριών αυτών υποπεριόδων (pvalue=0,000). Ειδικότερα, φαίνεται ότι η σχετική συχνότητα των αιμορροφιλικών που ήρθαν σε επαφή με τον HBV μειώθηκε σταδιακά από 47,1% πριν την επιβολή του ελέγχου των δοτών, σε 20,4% μετά τoν έλεγχο αυτό, και τελικά σε 2,9% μετά τη συστηματική εφαρμογή των τεχνικών ιικής μείωσης. Οι έλεγχοι ανά δύο μεταξύ των υποπεριόδων κατέδειξαν επίσης τις προαναφερθείσες διαφορές ως στατιστικά 58

60 Σχετική Συχνότητα (%) σημαντικές (p-value=0,000, και 0,000 για τους ελέγχους μεταξύ 1ης και 2ης και 2ης και 3ης υποπεριόδου, αντίστοιχα). Με την πρόοδο της ηλικίας παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική (Pearson s X 2, p-value < 0.001) αυξητική τάση της σχετικής συχνότητας (%) των αιμορροφιλικών που έχουν έρθει σε επαφή με τον HBV ανά ηλικιακή ομάδα, με μέτρια ένταση (Cramer s V = 0.415). Συγκεκριμένα, στις μικρότερες ηλικίες μόνο δυο ασθενείς (5,13%) έχουν έρθει σε επαφή με τον ιό, ενώ το ποσοστό αυτό αυξάνεται με την αύξηση της ηλικίας, φτάνοντας το 100 % στην ηλικιακή ομάδα 78 έως 88 ετών, αν και στην ομάδα αυτή υπάρχουν μόνο 2 ασθενείς. Αναλυτικά η κατανομή όσων έχουν έρθει σε επαφή με τον HBV ανά ηλικιακή ομάδα παρουσιάζεται στον Πίνακα 18 και στην Εικόνα 9. Ηλικιακή ομάδα Πλήθος ομάδας Συχνότητα επαφής με τον HBV Σχετική (%) Συχνότητα επαφής με τον HBV , , , , , , Πίνακας % 100% 80% 60% 40% 20% 0% 100,00% 65,38% 43,75% 51,61% 23,08% 29,41% 5,13% Ηλικιακές ομάδες Εικόνα Ηλικία και επαφή με τον HCV Για τη διενέργεια των δοκιμασιών που σχετίζονται με τη χρονολογική εξέλιξη της HCV μόλυνσης στον αιμορροφιλικό πληθυσμό χρησιμοποιήθηκαν επίσης δύο χρονολογίες-«ορόσημα», κατά τις οποίες ξεκίνησε η εφαρμογή αποτελεσματικών μέτρων κατά της μετάδοσης HCV με τα παράγωγα πλάσματος. Η πρώτη από αυτές είναι το έτος 1987, οπότε και εισήχθησαν στην παραγωγική διαδικασία όλων των εγκεκριμένων παραγόντων πήξης πλάσματος κατάλληλες τεχνικές μείωσης του ιικού φορτίου. 38 Η δεύτερη είναι το έτος 1992, οπότε και άρχισε η εφαρμογή μεθόδου υψηλής ευαισθησίας ανίχνευσης του anti-hcv αντισώματος στον πληθυσμό των δοτών, η οποία μείωσε το φορτίο HCV που εισέρχονταν στην προς επεξεργασία δεξαμενή πλάσματος. 44 Και σε αυτούς τους συγκριτικούς ελέγχους έγινε η παραδοχή 59

61 ότι η διάγνωση της αιμορροφιλίας και η πρώτη χορήγηση θεραπείας για αυτήν έγιναν τη στιγμή της γέννησης του κάθε ασθενούς. Στα πλαίσια αυτά έλαβαν χώρα τρεις στατιστικές δοκιμασίες, οι οποίες βασίζονται στους ελέγχους Χ 2 και στον ακριβή έλεγχο του Fischer και διενεργήθηκαν σε επίπεδο σημαντικότητας α=5%. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε ο ακριβής έλεγχος του Fischer για τη σύγκριση του αριθμού των αιμορροφιλικών που ήρθαν σε επαφή με τον HCV πριν και μετά τις δύο χρονολογίες-«ορόσημα», ενώ στη συνέχεια συγκρίθηκαν οι συχνότητες εμφάνισης HCV επαφής στους αιμορροφιλικούς και στις τρεις υποπεριόδους (πριν το 1987, από το 1987 έως το 1992, και μετά το 1992), ταυτόχρονα, μέσω του ελέγχου Χ 2. Τα αποτελέσματα των ελέγχων παρουσιάζονται στους Πίνακες 19 έως 21. Και αυτοί οι έλεγχοι διενεργήθηκαν επί των 220 αιμορροφιλικών τύπου Α και Β, ενώ οι 31 ασθενείς με σπάνιες ανεπάρκειες εξαιρέθηκαν. Επαφή με τον HCV Ημερομηνία γέννησης Ναι Όχι Σύνολο Πριν το (44,3%) 103 (55,7 %) 185 Μετά το (0,0%) 35 (100,0%) 35 Σύνολο Πίνακας 19: Επίδραση της εφαρμογής τεχνικών μείωσης του ιικού φορτίου στη συχνότητα επαφής με τον HCV Επαφή με τον HCV Ημερομηνία γέννησης Ναι Όχι Σύνολο Πριν το (40,4%) 128 (59,6%) 210 Μετά το (0,0%) 10 (100,0%) 10 Σύνολο Πίνακας 20: Επίδραση της εφαρμογής ευαίσθητης μεθόδου ανίχνευσης του anti-hcv αντισώματος στους δότες πλάσματος Τα αποτελέσματα του ελέγχου κατέδειξαν στατιστικώς σημαντική διαφορά των συχνοτήτων μόλυνσης με HCV πριν και μετά την εφαρμογή των κατάλληλων τεχνικών μείωσης του ιικού φορτίου στην παραγωγική διαδικασία των παραγόντων πήξης πλάσματος (p-value=0,000), καθώς και πριν και μετά την εφαρμογή της ευαίσθητης μεθόδου ανίχνευσης του anti-hcv αντισώματος (p-value=0,013). Ειδικότερα, φαίνεται ότι η σχετική συχνότητα των αιμορροφιλικών που ήρθαν σε επαφή με τον HCV μειώθηκε σημαντικά κατά 44,3%, δηλαδή από 44,3% πριν το 1987 σε 0,0% μετά το Επίσης, η σχετική συχνότητα των αιμορροφιλικών που ήρθαν σε επαφή με τον HCV μειώθηκε σημαντικά κατά 40,4%, δηλαδή από 40,4% πριν το 1992 σε 0,0% μετά το Επαφή με τον HCV Ημερομηνία γέννησης Ναι Όχι Σύνολο Πριν το (44,3%) 103 (55,7%) 185 Από 1987 έως (0,0%) 25 (100,0%) 25 Μετά το (0,0%) 10 (100,0%) 10 Σύνολο Πίνακας 21: Επίδραση των διαδοχικών μέτρων ασφαλείας κατά της μετάδοσης του HCV στη συχνότητα επαφής με τον ιό 60

62 Σχετική Συχνότητα (%) Τα αποτελέσματα του ελέγχου κατέδειξαν στατιστικώς σημαντική διαφορά των συχνοτήτων μόλυνσης με HCV μεταξύ των τριών αυτών υποπεριόδων (pvalue=0,000). Ειδικότερα, φαίνεται ότι η σχετική συχνότητα των αιμορροφιλικών που ήρθαν σε επαφή με τον HCV μειώθηκε από 44,3% πριν τη συστηματική εφαρμογή των τεχνικών ιικής μείωσης σε 0,0% μετά την εισαγωγή τους, και δεν μεταβλήθηκε περαιτέρω μετά τα επιπλέον μέτρα. Οι έλεγχοι ανά δύο μεταξύ των υποπεριόδων κατέδειξαν επίσης την προαναφερθείσα διαφορά ως στατιστικά σημαντική μεταξύ 1ης και 2ης υποπεριόδου (p-value=0,000) και ως μη στατιστικά σημαντική μεταξύ 2ης και 3ης υποπεριόδου (p-value=1,000). Από την κατανομή των αιμορροφιλικών ασθενών που ήρθαν σε επαφή με τον HCV σε ηλικιακές ομάδες προκύπτει στατιστικά σημαντική αντίστροφη σχέση ηλικίας και ποσοστού ασθενών που ήρθαν σε επαφή με τον ιό (Pearson s X 2, p-value < 0.001), μέτριας έντασης (Cramer s V = 0.398), καθώς η σχετική συχνότητα των περιστατικών βαίνει μειούμενη όσο αυξάνεται η ηλικία. Εξαίρεση στη διαφαινόμενη αυτή τάση αποτελεί η νεαρότερη ηλικιακή ομάδα. Αναλυτικά η κατανομή όσων έχουν έρθει σε επαφή με τον HCV ανά ηλικιακή ομάδα παρουσιάζεται στον Πίνακα 22 και στην Εικόνα 10. Ηλικιακή ομάδα Πλήθος ομάδας Συχνότητα επαφής με τον HCV Σχετική (%) Συχνότητα επαφής με τον HCV , , , , , Πίνακας 22 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 53,85% 50,98% 46,88% 38,71% 30,77% 0,00% 0,00% Ηλικιακές ομάδες Εικόνα Ηλικία και επαφή με τους ιούς της ηπατίτιδας Β και C Για τη διενέργεια δοκιμασίας που σχετίζεται με τη χρονολογική εξέλιξη της μόλυνσης του αιμορροφιλικού πληθυσμού με ιούς ηπατίτιδας Β και C χρησιμοποιήθηκε το έτος-«ορόσημο» 1987, οπότε και εισήχθησαν στην παραγωγική 61