ΧΡΙΣΤΟΣ Π. ΠΟΛΥΤΑΡΧΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ. ιερεύνηση των µηχανισµών ρύθµισης της έκφρασης του. αυξητικού παράγοντα HARP από το Η 2 Ο 2

Transcript

1 ΧΡΙΣΤΟΣ Π. ΠΟΛΥΤΑΡΧΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ιερεύνηση των µηχανισµών ρύθµισης της έκφρασης του αυξητικού παράγοντα HARP από το Η 2 Ο 2 Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΠΑΤΡΑ 2005

2 ΧΡΙΣΤΟΣ Π. ΠΟΛΥΤΑΡΧΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ιερεύνηση των µηχανισµών ρύθµισης της έκφρασης του αυξητικού παράγοντα HARP από το Η 2 Ο 2 Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Π. ΚΟΡ ΟΠΑΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Σ.ΤΖΑΡΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Ν.ΚΑΡΑΜΑΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Α.ΠΑΠΑΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Π.ΚΑΤΣΩΡΗΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Κ.ΠΟΥΛΑΣ ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Ε.ΠΑΠΑ ΗΜΗΤΡΙΟΥ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ

3 Πρόλογος Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρµακολογίας του Τµήµατος Φαρµακευτικής του Πανεπιστηµίου Πατρών, υπό την επίβλεψη της Επίκουρου Καθηγήτριας Ευαγγελίας Παπαδηµητρίου. Πρέπει να οµολογήσω ότι αισθάνοµαι ιδιαίτερα τυχερός που βρέθηκα και εργάστηκα στο συγκεκριµένο εργαστήριο τα τελευταία χρόνια, τα οποία υπήρξαν για εµένα τα πλέον δηµιουργικά και ευχάριστα. Αρχικά οφείλω να ευχαριστήσω την Κυρία Παπαδηµητρίου που µου έδωσε την ευκαιρία να δοκιµαστώ στην έρευνα, µε περιέβαλε µε εµπιστοσύνη, ενστερνίστηκε τους προβληµατισµούς µου και καθοδήγησε την εργασία µου. Πολλές ευχαριστίες οφείλω στον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τµήµατος Βιολογίας Παναγιώτη Κατσώρη, για τις πολύτιµες συµβουλές του και τις παραγωγικές συζητήσεις µας. Ευχαριστώ τον Καθηγητή του Τµήµατος Φαρµακευτικής Σωκράτη Τζάρτο για τη συµµετοχή του στην Τριµελή Εξεταστική Επιτροπή, τις συµβουλές και τις παρατηρήσεις του. Επίσης, τις ευχαριστίες µου οφείλω στους Καθηγητές Παύλο Κορδοπάτη (Τµήµατος Φαρµακευτικής) και Νικόλαο Καραµάνο (Τµήµατος Χηµείας) καθώς και στο Λέκτορα του Τµήµατος Φαρµακευτικής Κωνσταντίνο Πουλά, για τη συµµετοχή τους στην Επταµελή Εξεταστική Επιτροπή, τις εύστοχες παρατηρήσεις και οδηγίες τους. Ευχαριστώ τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τµήµατος Φαρµακευτικής Ανδρέα Παπαπετρόπουλο, για την εποικοδοµητική κριτική του, τα αντιδραστήρια (πλασµίδιο pgl3) και τα όργανα που µας παρείχε (φθορισµόµετρο), καθώς και για την ευκαιρία που µου έδωσε να εργαστώ πάνω σε ένα θέµα της ερευνητικής του οµάδας. Επιπλέον, δεν ξεχνώ ότι πολλά από αυτά που πέτυχα τα τελευταία χρόνια θα ήταν αδύνατα χωρίς την υλική και ηθική συµπαράσταση των γονέων µου, της θείας µου Σοφίας και της συµφοιτήτριάς µου Μαρίζας. Τελευταίοι, αλλά όχι έσχατοι, έρχονται οι µεταπτυχιακοί φοιτητές µε τους οποίους είχα τη χαρά να συνεργαστώ τα χρόνια παραµονής µου στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρµακολογίας.

4

5 Περιεχόµενα Περιεχόµενα ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1. ραστικές Μορφές Οξυγόνου Η γένεση µιας Θεωρίας Γενικά Παραγωγή ROS in vivo Ρύθµιση της παραγωγής των ROS Μηχανισµοί προστασίας από ROS σε κύτταρα και ιστούς ράσεις των ROS Το Η 2 Ο Μεταγωγή σήµατος από το Η 2 Ο 2 12 Σύνοψη HARP Γενικά οµή της πρωτεΐνης HARP οµή του γονιδίου της HARP Έκφραση του γονιδίου της HARP Yποδοχείς της HARP και µεταγωγή σήµατος Βιολογικές δράσεις της HARP Ρόλος της HARP στην ανάπτυξη HARP και κυτταρικός πολλαπλασιασµός HARP και αγγειογένεση HARP και φυσιολογική αγγειογένεση HARP και αγγειογένεση σε παθολογικές καταστάσεις HARP και καρκίνος Έκφραση της HARP και υποδοχέων της στον καρκίνο Ρόλος της HARP στον καρκίνο Η HARP ως διαγνωστικός µάρτυρας για τύπους καρκίνου Η HARP ως µόριο-στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου 42 Σύνοψη AP Γενικά Ρύθµιση του AP Μηχανισµοί ρύθµισης της δραστηριότητας του AP Σύσταση διµερών Μεταγραφική και µετα-µεταφραστική ρύθµιση Αλληλεπίδραση µε άλλους παράγοντες Βιολογικές δράσεις του AP Καρκινογένεση Απόπτωση και επιβίωση Κυτταρικός πολλαπλασιασµός Αγγειογένεση και Μετάσταση 58 Σύνοψη 61 ΣΚΟΠΟΣ 63 ΜΕΘΟ ΟΙ Προετοιµασία αυγών Μελέτη της επίδρασης των υπό εξέταση ουσιών στη χοριοαλλαντοϊκή 65 µεµβράνη (CAM) εµβρύου όρνιθας 2.1. Μελέτη της επίδρασης των υπό εξέταση ουσιών στον αριθµό των αγγείων της 66 CAM 2.2. Μελέτη της επίδρασης των υπό εξέταση ουσιών στην πρωτεΐνη HARP της 66 CAM i

6 Περιεχόµενα Οµογενοποίηση του ιστού της CAM Εκτίµηση της συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης σε διάλυµα (Bradford) Ανάλυση πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακριλαµιδίου σε 68 αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανάλυση της HARP κατά Western Αποµόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα οµφάλιου λώρου 72 ανθρώπου 4. Μέτρηση κυττάρων σε αιµατοκυτταρόµετρο Neubauer Ανακαλλιέργεια κυττάρων LNCaP, PC-LNCaP και AS-LNCaP Ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων LNCaP, PC- 78 LNCaP και AS-LNCaP 8. Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC Μελέτη του χηµειοτακτισµού των κυττάρων LNCaP, PC-LNCaP και AS-LNCaP Μελέτη του χηµειοτακτισµού των κυττάρων HUVEC Αποµόνωση HARP από το θρεπτικό µέσο των κυττάρων Αποµόνωση ολικού RNA από κύτταρα LNCaP Προσδιορισµός της συγκέντρωσης RNA Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊνικών οξέων σε πήκτωµα αγαρόζης Ανάλυση της έκφρασης γονιδίων µε τη χρήση συνδυασµένης αντίστροφης 89 µεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (RT-PCR) Σχεδιασµός εναρκτήριων αλληλουχιών (primers) Πραγµατοποίηση των αντιδράσεων RT-PCR Τεχνική Ολίγο-δεoξυριβονουκλεϊνικών δολωµάτων (Decoy ODN technique) Κλωνοποίηση της ρυθµιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP στο 96 πλασµίδιο pgl Εισαγωγή Πλασµιδιακό όχηµα pgl Σχεδιασµός και δηµιουργία της ρυθµιστικής αλληλουχίας της HARP, 98 κατάλληλης προς κλωνοποίηση στο όχηµα pgl Αποµόνωση γονιδιωµατικού DNA Προσδιορισµός της συγκέντρωσης DNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (polymerase chain reaction, PCR) Ανάλυση των προϊόντων PCR σε πήκτωµα αγαρόζης Εκχύλιση DNA από πήκτωµα αγαρόζης Προετοιµασία της ρυθµιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP και του 106 πλασµιδίου pgl3, για κλωνοποίηση Αντίδραση πέψης µε ένζυµα περιορισµού Αντίδραση σύνδεσης µορίων DNA µε συνεκτικά άκρα Εισαγωγή του πλασµιδιακού DNA σε βακτήρια (Transformation) Προετοιµασία δεκτικών βακτηριακών κυττάρων (competent cells) Μετασχηµατισµός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια Έλεγχος µετασχηµατισµένων βακτηριακών κυττάρων και αποµόνωση 114 πλασµιδιακού DNA µε τη µέθοδο βρασµού Μικρής κλίµακας αποµόνωση πλασµιδιακού DNA (Miniprep) Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης ηµιουργία σηµειακών µεταλλαγών στις αλληλουχίες δέσµευσης του 120 µεταγραφικού παράγοντα AP Αποµόνωση πυρηνικού εκχυλίσµατος από κύτταρα LNCaP Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισµός των υποµονάδων του µεταγραφικού 131 παράγοντα AP-1 µε τη µέθοδο ELISA 22. Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωµάτων και ηλεκτροφορηµάτων νουκλεϊνικών 137 οξέων µε σύστηµα ανάλυσης εικόνας 23. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων 138 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το H 2 O 2 επάγει την αγγειογένεση στην CAM εµβρύου όρνιθας in vivo Το H 2 O 2 αυξάνει τα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP στην CAM εµβρύου όρνιθας 140

7 Περιεχόµενα 3. Το H 2 O 2 επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων HUVEC Το H 2 O 2 επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC Το U0126 αναστέλλει την επαγωγική δράση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασµό των 143 κυττάρων HUVEC 6. Το U0126 αναστέλλει την επαγόµενη από το H 2 O 2 έκκριση της πρωτεΐνης HARP 145 στα κύτταρα HUVEC 7. Η κουρκουµίνη αναστέλλει την επαγωγική δράση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασµό 145 των κυττάρων HUVEC 8. Η κουρκουµίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το H 2 O 2 έκκριση της πρωτεΐνης 148 HARP στα κύτταρα HUVEC 9. Το H 2 O 2 επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων LNCaP Το H 2 O 2 επάγει την έκφραση και έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα 149 LNCaP 11. Η έκφραση της πρωτεΐνης HARP απαιτείται για την επαγωγική δράση του H 2 O στον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων LNCaP 12. Η κουρκουµίνη αναστέλλει την επαγωγική δράση του H 2 O 2 στον 153 πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων LNCaP 13. Η κουρκουµίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το H 2 O 2 έκφραση και έκκριση της 157 πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα LNCaP 14. Τα Ο Ν δολώµατα έναντι του AP-1 αναστέλλουν την επαγωγική δράση του H 2 O στον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων LNCaP 15. Τα Ο Ν δολώµατα έναντι του AP-1 αναστέλλουν την επαγόµενη από το H 2 O έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα LNCaP 16. Το H 2 O 2 επάγει τη δραστηριότητα του υποκινητή του γονιδίου της HARP στα 164 κύτταρα LNCaP 17. Εµπλοκή των πιθανών θέσεων δέσµευσης του AP-1 του υποκινητή του γονιδίου 165 της HARP στην επαγόµενη από το H 2 O 2 µεταγραφική δραστηριότητα 18. Το Η 2 Ο 2 επάγει την ικανότητα δέσµευσης συγκεκριµένων υποµονάδων του AP στη συντηρηµένη αλληλουχία δέσµευσης. 19. Το Η 2 Ο 2 επάγει την ικανότητα δέσµευσης των c-jun, JunD και Fra-1 στη 168 ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου της HARP ΣΥΖΗΤΗΣΗ 171 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 180 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 181 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 211 SUMMARY 213 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ 215 iii

8 Περιεχόµενα

9 Συντµήσεις και ξενόγλωσσοι όροι ACE ALK AMPS AP-1 AP-1-dmt AP-1-mtI AP-1-mtII ARE ASK AS-LNCaP ATF BMP BSA bzip C/EBP CAM CAT CK CRE CS-A CS-C Angiotensin Converting Enzyme Anaplastic Lymphoma Kinase Ammonium Persulfate Activator Protein-1 AP-1 double mutant AP-1 mutant I AP-1 mutant II Antioxidant Response Element Apoptosis Signaling regulating Kinase LNCaP cells transfected with the plasmid containing antisense HARP Activator Transcription Factor Bone Morphogenetic Protein Bovine Serum Albumin basic leucine-zipper Proteins CAAT-box/Enhancer Binding Protein Chorioallantoic Membrane Chloramphenycol Acetyl Transferase Casein Kinase c-amp Responsive Element Chondroitin Sulfate-A Chondroitin Sulfate-C CTF/NF1 CAAT-box-binding Factor/Nuclear Factor 1 DS Dermatan Sulfate

10 DTT ECGS EDTA EGF ELISA EMT ERK FAK FGF-2 GR GSK Dithiothreitol Endothelial Cell Growth Supplement Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Epidermal Growth Factor Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Epithelial Mesenchymal Transition Extracellular Signal Regulated Kinase Focal Adhesion Kinase Fibroblast Growth Factor-2 Glycocorticoid Receptor Glycogen Synthase Kinase H H 2 O 2 HARP HB-GAM Hepes HIV HS HSPG HUVEC IFN-γ IL-1 inos IPTG JDP JNK Heparin-Affin Regulatory Peptide Heparin-Binding Growth Associated Molecule (N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N -[2-ethanesulfonic acid]) Human Immunodeficiency Virus Heparan Sulfate Heparan Sulfate Proteoglycans Human Umbilical Vein Endothelial Cells Interferon-γ Interleucin-1 inducible-nitric Oxide Synthase Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside Jun Dimerization Partners c-jun N-terminal Kinase

11 K KS LTP M MAPK MARE MEF MK MMPs MTT mutap-1 MyoD NADPH NF-κΒ NGF NMR NO ODN OFRs OSF-1 PBS Κουρκουµίνη Keratan Sulfate Long-Term Potentiation Μάρτυρας Mitogen Activated Protein Kinase MAF-Responsive Element Myocyte-Enhancer Factor Midkine Matrix Metalloproteinases Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide mutated AP-1 sequence Myogenic Differentiation Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Hydrogen Nuclear Factor-κΒ Neural Growth Factor Nuclear Magnetic Resonance Nitric Oxide OligoDeoxyNucleotide Oxygen Free Radicals Osteoblast Specific Factor-1 Phosphate Buffer Saline PC-LNCaP LNCaP cells transfected with the plasmid pcdna 3.1 PCR PDGF PI3K Polymerase Chain Reaction Platelet Derived Growth Factor Phosphoinositide 3-Kinase

12 PKC Protein Kinase C PLA 2 Phospholipase A 2 PTN RAR RI-HB RLU ROS RPTPβ/ζ RSK RT-PCR SAPK SCID SCLC SDS Pleiotrophin Retinoic Acid Receptor Retinoic acid-inducible Heparin Binding protein Relative Luciferase Units Reactive Oxygen Species Receptor-like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ Ribosomal S6 Kinase Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Stress Activated Protein Kinase Severe Combined Immunodeficiency Disease Small Cell Lung Carcinoma Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis SOD SRE TBE TBS Superoxide Dismutase Serum Response Element Tris-Borate EDTA Tris-buffered saline TBS-T Tris-buffered saline-tween 20 TCF TEMED TF II D TGF-β TNF-α T-Cell Factor N,N,N,N -Tetramethylethylene-diamine Transcription Factor II D Transforming Growth Factor-β Tumor Necrosis Factor-α

13 TRE TSR U u-pa UV VEGF TPA-Responsive Element Thrombospondin type I Repeat U0126 urokinase-plasminogen Activator Ultra Violet Vascular Endothelial Growth Factor

14

15 Εισαγωγή 1. ραστικές Μορφές Οξυγόνου 1.1. Η γένεση µιας Θεωρίας Η πρώτη απόδειξη της ύπαρξης των ελευθέρων ριζών ήρθε το 1845, µε την ανακάλυψη της νιτροσυλικής ρίζας υπό µορφή άλατος, (KSO 3 ) 2 NO. Το ενδιαφέρον για τις ελεύθερες ρίζες ουσιαστικά δηµιουργήθηκε µε την εργασία του Moses Gomberg, ο οποίος το 1900 απέδειξε την ύπαρξη της µεθυλικής ρίζας (OH 3 C. ) [1]. Το 1946, ο Michaelis πρότεινε ότι οι ελεύθερες ρίζες είναι ενδιάµεσα µόρια σε µεταβολικά µονοπάτια των βιολογικά ενεργών κυττάρων [2]. Η αξιοσηµείωτη αυτή πρόβλεψη όµως αντιµετωπίσθηκε µε µεγάλο σκεπτικισµό από τους βιοχηµικούς της εποχής του. Η βιοχηµεία του οξειδωτικού στρες εµφανίστηκε στο προσκήνιο µε την αναγνώριση ότι οι αερόβιοι οργανισµοί διαθέτουν ισχυρή και πλεονάζουσα αντιοξειδωτική προστασία. Η βιταµίνη Ε ανακαλύφθηκε το 1922, ενώ το 1957 ταυτοποιήθηκε ένα ένζυµο που προστατεύει τα ερυθρά αιµοσφαίρια από την επαγόµενη από το H 2 O 2 αποικοδόµηση της αιµοσφαιρίνης, µέσω της αναγωγικής ισχύος της γλουταθειόνης (GSH). Αυτό το ένζυµο, που περιέχει στο ενεργό του κέντρο σελήνιο, ονοµάστηκε υπεροξειδάση της γλουταθειόνης [3]. Η πραγµατικά συναρπαστική ιστορία των ελευθέρων ριζών ξεκινάει ουσιαστικά το 1969 όταν οι Mc Cord και Fridovich ανακάλυψαν µια πρωτεΐνη που περιέχει στο ενεργό της κέντρο χαλκό και καταλύει τη µετατροπή του ανιόντος του υπεροξειδίου (Ο.- 2 ) σε υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) [4]. Η πρωτεΐνη αυτή ονοµάστηκε δισµουτάση του υπεροξειδίου (SOD). Σήµερα είναι πλέον γνωστό ότι η βιταµίνη Ε, η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και οι δισµουτάσες του υπεροξειδίου, παρέχουν ένα πρωτογενές προστατευτικό φράγµα έναντι της τοξικότητας των ελευθέρων ριζών και των υπεροξειδίων στα κύτταρα των θηλαστικών. 1

16 Εισαγωγή 1.2. Γενικά Ελεύθερη ρίζα ονοµάζεται κάθε άτοµο ή µόριο που διαθέτει ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια. Τα ηλεκτρόνια που συζεύγνυνται σε τροχιακά έχουν αντιπαράλληλο spin και είναι πιο σταθερά σε σχέση µε τα ασύζευκτα. Έτσι, οι ρίζες είναι λιγότερο σταθερές σε σχέση µε τις µη-ρίζες, αν και η δραστικότητά τους ποικίλει. Κατά κανόνα, είναι ικανές να αντιδρούν αδιακρίτως, µε κάθε µόριο µε το οποίο έρχονται σε επαφή. Μια ελεύθερη ρίζα µπορεί να αντιδρά µε κάποια άλλη ρίζα ή µε άλλα µόρια, µέσω ποικίλων αλληλεπιδράσεων. Στην πρώτη περίπτωση, είναι πιθανό να συνδυάσουν τα ασύζευκτα ηλεκτρόνια τα οποία διαθέτουν, µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός οµοιοπολικού δεσµού. Επειδή όµως στους ζωντανούς οργανισµούς τα περισσότερα µόρια δεν απαντώνται µε τη µορφή ριζών, αυτό που φαίνεται πιο πιθανό να συµβεί είναι η ρίζα να δώσει το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο σε άλλο µόριο ή αντίστροφα, να προσλάβει ένα ηλεκτρόνιο από αυτό, αλλάζοντας έτσι το χαρακτήρα της. Συγχρόνως όµως, µε τον τρόπο αυτό δηµιουργείται µια νέα ρίζα. Γίνεται λοιπόν ξεκάθαρο ότι από µια ρίζα παράγεται µια άλλη, οδηγώντας σε µια αλυσίδα αντιδράσεων [5]. Στο πεδίο της Βιολογίας, ενδιαφέρον προσελκύει µια συγκεκριµένη κατηγορία ελευθέρων ριζών, οι ελεύθερες ρίζες του οξυγόνου (Oxygen Free Radicals, OFRs). Οι προσθήκες, σε βήµατα, µονήρων ηλεκτρονίων στο µοριακό οξυγόνο παράγουν ένα µοναδικό φάσµα πλέον δραστικών ενδιαµέσων προϊόντων, τις OFRs, που περιλαµβάνουν το ανιόν του υπεροξειδίου (Ο.- 2 ), τη ρίζα του υδροξυλίου (ΗΟ. ), υπεροξειδικές ρίζες λιπιδίων (LOO. ) και άλλων µορίων (ΧOO. ). Οι OFRs δεν είναι οι µόνες µορφές ελευθέρων ριζών. Για παράδειγµα, είναι δυνατόν να υπάρχουν καρβονυλικές και νιτροξυλικές ρίζες. Επιπλέον, µια πλειάδα ριζών παράγεται από ποικίλες βιολογικές αντιδράσεις, όπως οι φαινολικές και αρωµατικές µορφές που προκύπτουν κατά το ξενοβιοτικό µεταβολισµό ή ως φυσιολογικός µηχανισµός αποτοξίνωσης από φάρµακα. Οι OFRs αποτελούν τµήµα µιας µεγαλύτερης κατηγορίας µορίων, που ονοµάζονται δραστικές µορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS). Η κατηγορία των ROS, που ως µόρια είναι πιο ισχυρά οξειδωτικά σε σχέση µε το ίδιο το µοριακό οξυγόνο (Πίνακας 1), περιλαµβάνει εκτός των OFRs, το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), υπεροξείδια των λιπιδίων (LOOH), το µονήρες οξυγόνο ( 1 Ο 2 ), το υποχλωριώδες οξύ (HOCl) και άλλες ενώσεις [6]. 2

17 Εισαγωγή Μεταξύ των διαφόρων ROS, ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον έχουν προσελκύσει κατά κύριο λόγο οι Ο.- 2, ΗΟ. και Η 2 Ο 2. Πίνακας 1: Οι RΟS και τα κύρια χαρακτηριστικά τους Παραγωγή ROS in vivo Οι ROS και άλλες ελεύθερες ρίζες σχηµατίζονται διαρκώς στο ανθρώπινο σώµα από φυσιολογικές µεταβολικές διαδικασίες, όπως για παράδειγµα κατά την αντίδραση αναγωγής του οξυγόνου σε νερό ή από την αλυσίδα µεταφοράς ηλεκτρονίων των µιτοχονδρίων. Σε αυτήν την αντίδραση, το οξυγόνο ανάγεται κατά τέτοιον τρόπο, ώστε δύο ηλεκτρόνια (και δύο ζεύγη πρωτονίων) γίνονται δεκτά από κάθε άτοµο οξυγόνου, οδηγώντας έτσι στο σχηµατισµό του µορίου του νερού. Ταυτόχρονα όµως, ένα µικρό ποσοστό ηλεκτρονίων διαφεύγει από την κύρια οδό της αναπνευστικής αλυσίδας των µιτοχονδρίων, µε αποτέλεσµα τη 3

18 Εισαγωγή µονοσθενή αναγωγή του µοριακού οξυγόνου και τον τελικό σχηµατισµό του ανιόντος του υπεροξειδίου (Ο.- 2 ). Η οξείδωση της ηµιαναχθείσας ουβικινόνης (UQ.- 10 ) αποτελεί µια από τις κύριες πηγές υπεροξειδίου στα µιτοχόνδρια [7]: UQ Ο 2 Ο UQ 10.- Το Ο 2 παράγεται επίσης ως παραπροϊόν της αντίδρασης υδροξυλίωσης που καταλύεται από το κυτταρόχρωµα Ρ-450. Αποτελεί ένα από τα κύρια προϊόντα των αντιδράσεων που καταλύονται από την οξειδάση της NAD(P)H και την.- οξειδάση της ξανθίνης [8]. Τέλος, Ο 2 δύναται να παραχθεί και µέσω µη ενζυµικών αντιδράσεων [9]. Μετά από αντίδραση του Ο.- 2 µε νερό σχηµατίζεται υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) και µοριακό οξυγόνο. Το Η 2 Ο 2 µπορεί επίσης να παραχθεί σε αντιδράσεις που καταλύονται από την δισµουτάση του υπεροξειδίου, την αλδεϋδική αφυδρογονάση, την 5-λιποξυγενάση, την κυκλοξυγενάση, την οξειδάση των L- αµινοξέων και άλλα ένζυµα [10]. Η περαιτέρω αναγωγή του Η 2 Ο 2 αποσταθεροποιεί το δεσµό Ο-Ο, οδηγώντας στη παραγωγή ανιόντος του υδροξυλίου (ΟΗ - ) και υδροξυλικής ρίζας (ΗΟ. ). Παρουσία ελεύθερων ιόντων µετάλλων, όπως σιδήρου (Fe 2+ ) και χαλκού (Cu + ), τα οποία δρουν ως δότες ηλεκτρονίων, πραγµατοποιείται η αντίδραση Fenton: Η 2 Ο 2 + Fe 2+ ΟΗ - + ΗΟ. + Fe 3+ Η ΗΟ. έχει µικρό χρόνο ηµιζωής αλλά υψηλή δραστικότητα. ύναται να οξειδώσει όλες τις οργανικές ενώσεις που βρίσκονται πλησίον της θέσης παραγωγής της [9]. Είναι χαρακτηριστικό ότι παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων σιδήρου, η τοξικότητα του Η 2 Ο 2 πολλαπλασιάζεται κατά φορές. Οι τοξικές δράσεις της ΗΟ. συνίστανται σε µη αναστρέψιµες τροποποιήσεις των νουκλεϊνικών οξέων και των πρωτεϊνών, αλλά και σε ενεργοποίηση αλυσιδωτών αντιδράσεων οξείδωσης των λιπιδίων, που οδηγούν σε ρήξη της κυτταρικής µεµβράνης. Έτσι, η αποµάκρυνση µετάλλων µεταπτώσεως µπορεί να θεωρηθεί ως σηµαντικός µηχανισµός αντιοξειδωτικής άµυνας [11]. 4

19 Εισαγωγή 1.4. Ρύθµιση της παραγωγής των ROS Ποικίλα ενζυµικά συστήµατα διαµεσολαβούν τη σύνθεση ROS ως απόκριση σε εξωκυτταρικά ερεθίσµατα (Εικόνα 1) [10]. Για παράδειγµα, η ενεργοποίηση Ca 2+ - εξαρτώµενων πρωτεϊνασών οδηγεί σε πρωτεόλυση της αφυδρογονάσης της ξανθίνης και σχηµατισµό της οξειδάσης της ξανθίνης. Το ένζυµο αυτό καταλύει την αντίδραση µετατροπής της υποξανθίνης σε ξανθίνη και τη µετέπειτα µετατροπή της τελευταίας σε ουρικό οξύ, µε ταυτόχρονο σχηµατισµό Ο.- 2 [12]. Άλλα δύο ένζυµα που εντοπίζονται στην κυτταρική µεµβράνη και συµµετέχουν στην παραγωγή ROS είναι η οξειδάση της NAD(P)H και η 5-λιποξυγενάση. Η έκφραση της οξειδάσης της NAD(P)H είναι χαρακτηριστική για τα φαγοκύτταρα του αίµατος (ουδετερόφιλα, ηωζινόφιλα, µακροφάγα), τους ινοβλάστες [13], τα ενδοθηλιακά και τα λεία µυικά κύτταρα [14], τα αστροκύτταρα και τα χονδροκύτταρα, ενώ συστατικά του συµπλόκου του ενζύµου έχουν εντοπιστεί και σε πολλούς άλλους τύπους κυττάρων [15]. H οξειδάση της NAD(P)H καταλύει την αναγωγή του Ο 2 µε ταυτόχρονη οξείδωση των NADPH ή NADH. Το ένζυµο αυτό ενεργοποιείται από κυτταροκίνες που εµπλέκονται στη διαδικασία της φλεγµονής, όπως ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων TNF-α, η ιντερλευκίνη-1 (IL-1), η ιντερφερόνη-γ (IFN-γ), ο αυξητικός παράγοντας µετασχηµατισµού (TGF-β), καθώς και άλλοι αυξητικοί παράγοντες. Έτσι, σε καταστάσεις φλεγµονής στα ουδετερόφιλα, σχεδόν το 90% του καταναλισκόµενου Ο 2 µετατρέπεται σε Ο.- 2 και αµέσως σε Η 2 Ο 2 [16]. Το σύµπλοκο της οξειδάσης της NAD(P)H περιλαµβάνει το κυτταρόχρωµα b 558, το οποίο είναι σταθερά συνδεδεµένο στην κυτταρική µεµβράνη και συγκροτείται από δύο υποµονάδες, τις πρωτεΐνες p91 phox και p22 phox. Για την ενεργοποίηση του ενζύµου απαιτείται η δέσµευση άλλων τριών πρωτεϊνών (p40 phox, p47 phox, p67 phox ). Η δέσµευση κυτταροκινών στους αντίστοιχους υποδοχείς και ακολούθως η ενεργοποίηση της G-µεµβρανικής πρωτεΐνης Ras και της κυτταροπλασµατικής G-πρωτεΐνης p21 rac, συντελούν στη συγκρότηση του συµπλόκου. Η δέσµευση GTP στην p21 rac έχει ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση της και τη συµπλοκοποίηση µε τις p40 phox, p47 phox και p67 phox. Το ενεργό πλέον σύµπλοκο,.- µέσω της διαµεµβρανικής b 558, παράγει Ο 2 στο εξωκυτταρικό περιβάλλον [17, 18]. 5

20 Εισαγωγή Έχουν αναφερθεί πολλές πρωτεΐνες οµόλογες της οξειδάσης της NAD(P)H [19, 20]. Τα ενεργά σύµπλοκα αυτών περιλαµβάνουν την υποµονάδα p22 phox ή άλλα κυτταροχρώµατα της οµάδας b, όπως η b 5 +b 5R. Η συγκεκριµένη πρωτεΐνη µε δράση οξειδάσης της NAD(P)H εκφράζεται σε ποικιλία τύπων κυττάρων [21]. Ακόµη, ROS παράγονται κατά την αντίδραση οξείδωσης του αραχιδονικού οξέος που καταλύεται από την κυκλοξυγενάση και τη λιποξυγενάση. Για την αντίδραση αυτή απαιτούνται ελεύθερο αραχιδονικό οξύ για υπόστρωµα και ενεργοποίηση της φωσφολιπάσης Α 2 (PLA 2 ). Η όλη διαδικασία βρίσκεται υπό τον έλεγχο πεπτιδικών ορµονών (αγγειοτενσίνη), κυτταροκινών (TNF-α) και αυξητικών παραγόντων, όπως ο αυξητικός παράγοντας των αιµοπεταλίων (PDGF) [18, 22]. Η παραγωγή ROS από τα µιτοχόνδρια αυξάνεται στα κύτταρα υπό την επίδραση της IL-1 ή του TNF-α ή σε συνθήκες υποξίας [7]. Ο µηχανισµός της επαγόµενης από κυτταροκίνες παραγωγής ROS στα µιτοχόνδρια δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως. Ωστόσο, έχει προταθεί η εµπλοκή ενζύµων που συµµετέχουν στο µεταβολισµό των φωσφολιπιδίων [23]. Η ποσοτική σηµασία των ROS γίνεται αντιληπτή από το γεγονός ότι περίπου 250 γραµµάρια οξυγόνου καταναλώνονται κάθε µέρα από τον ανθρώπινο οργανισµό. Από αυτά, το 2-5% είναι δυνατόν να µετατραπεί σε ανιόν του υπεροξειδίου [24]. 6

21 Εισαγωγή Εικόνα 1: Τα κύρια µονοπάτια των δραστικών µορφών οξυγόνου (ROS) και οι µηχανισµοί αντιοξειδωτικής άµυνας. GSH: ανηγµένη γλουταθειόνη, GSSG: οξειδωµένη γλουταθειόνη, SOD: δισµουτάση του υπεροξειδίου Μηχανισµοί προστασίας από ROS σε κύτταρα και ιστούς Οι ROS είναι πολύ δραστικές για να είναι ανεκτές σε υψηλές συγκεντρώσεις στους ζωντανούς ιστούς. Ο έλεγχος των επιπέδων τους πιθανώς αποτέλεσε ισχυρό µηχανισµό εξελικτικής πίεσης µετά την εµφάνιση του οξυγόνου στην ατµόσφαιρα και µια σειρά ιεραρχηµένων µηχανισµών αναπτύχθηκε προκειµένου να αντιµετωπιστούν αυτά τα δραστικά ενδιάµεσα παράγωγα [24, 25, 26]. Προκειµένου να αποφευχθεί η συσσώρευση ROS, οι αερόβιοι οργανισµοί χρησιµοποιούν ένα αµυντικό σύστηµα που λειτουργεί στον ενδοκυτταρικό και εξωκυτταρικό χώρο, καθώς και στις κυτταρικές µεµβράνες (Εικόνα 1). Οι µηχανισµοί αντιοξειδωτικής άµυνας στοχεύουν τόσο στα πρώιµα στάδια σχηµατισµού ριζών, όσο και στην αλυσίδα των µετασχηµατισµών που αυτές υφίστανται. Η αντιοξειδωτική προστασία µπορεί να αναλυθεί σε τέσσερα διαδοχικά επίπεδα αµυντικής δράσης: 7

22 Εισαγωγή Επίπεδο πρόληψης Είναι ως επί το πλείστον ενζυµικό και περιλαµβάνει ένζυµα των οποίων η δραστικότητα εξαρτάται από τις ποσότητες µετάλλων που βρίσκονται σε ίχνη, όπως µαγγάνιο, χαλκός, ψευδάργυρος και σελήνιο (δισµουτάσες του υπεροξειδίου, υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης και καταλάση). Το επίπεδο αυτό σχετίζεται µε τον έλεγχο του σχηµατισµού των πρωτογενών δραστικών µορφών, που προέρχονται από το µοριακό οξυγόνο. Επίπεδο παρέµβασης στις αλυσιδωτές αντιδράσεις Περιλαµβάνει τις βιταµίνες C και Ε και πιθανώς τα καροτενοειδή. Σχετίζεται µε την αποφυγή συσσώρευσης των δευτερογενών ριζών και των αλυσιδωτών αντιδράσεων που οδηγούν στην υπεροξείδωση των λιπιδίων. Επίπεδο επιδιόρθωσης Σχετίζεται µε την αποµάκρυνση των τελικών προϊόντων-ριζών, µειώνοντας τις πιθανότητες περαιτέρω οξειδωτικών βλαβών, λόγω αντιδράσεων που καταλύονται από µέταλλα. Επίπεδο της προσαρµογής Οι ελεύθερες ρίζες χρησιµοποιούνται ως σήµατα που επάγουν τη σύνθεση και τη µεταφορά του κατάλληλου αντιοξειδωτικού παράγοντα στις θέσεις όπου δρουν [24, 26] ράσεις των ROS Οι ROS εµπλέκονται in vivo σε ποικίλες φυσιολογικές λειτουργίες. Για παράδειγµα, αποτελούν µέρος της αντιµικροβιακής δράσης των φαγοκυττάρων µέσω της ενεργοποίησης της οξειδάσης της NAD(P)H. Αυτός ο µηχανισµός άµυνας αποσκοπεί στην πρόκληση βλαβών στις µεµβράνες, στο DNA και άλλα κυτταρικά συστατικά του εισβάλλοντα µικροοργανισµού [25]. Οι ROS που παράγονται σε κύτταρα που δεν επιτελούν φαγοκυττάρωση, αποτελούν µόνον το 1/3 αυτών που παράγονται από τα ουδετερόφιλα. Οι ROS στα κύτταρα αυτά µπορούν να δρουν σε βιοχηµικά µονοπάτια ως ρυθµιστικά µόρια. Έτσι, 8

23 Εισαγωγή λεµφοκύτταρα και ινοβλάστες παράγουν διαρκώς µικρά ποσά ανιόντος του υπεροξειδίου, ως ρυθµιστή της κυτταρικής αύξησης [27]. Τα ενδοθηλιακά και τα λεία µυϊκά κύτταρα των αγγείων, καθώς και τα κύτταρα του θυρεοειδή, παράγουν ROS µέσω µη φαγοκυτταρικών ισοµορφών της οξειδάσης της NAD(P)H. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα και οι ινοβλάστες ευθύνονται για το µεγαλύτερο ποσοστό του παραγόµενων ROS στο φυσιολογικό αγγειακό τοίχωµα. Τα λεία µυϊκά κύτταρα των αγγείων -σε αντίθεση µε τα ουδετερόφιλα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τους ινοβλάστες- παράγουν υπεροξείδιο και υπεροξείδιο του υδρογόνου µόνο ενδοκυτταρικά [28]. Επιπρόσθετα, οι ROS εµπλέκονται στο µηχανισµό δράσης διαφόρων ενζύµων, όπως το κυτταρόχρωµα P-450 και η συνθετάση της προσταγλανδίνης [27]. Οι ROS εµπλέκονται µε ελεγχόµενο τρόπο σε φυσιολογικούς, βιοχηµικούς µηχανισµούς in vivo, αν όµως διαφύγουν από τον αυστηρό έλεγχο, γίνονται εξαιρετικά δραστικές και τοξικές. Αυξηµένη παραγωγή και συσσώρευση των ROS οδηγεί στην εκδήλωση του λεγόµενου οξειδωτικού στρες που συνδέεται µε κυτταροστατικά και κυτταροτοξικά φαινόµενα. Η παθοφυσιολογική κατάσταση της αυξηµένης παραγωγής ROS ή της ανεπάρκειας της αντιοξειδωτικής συσκευής, έχει ενοχοποιηθεί για µια σειρά, πλέον των 80, παθολογικών καταστάσεων, όπως ο καρκίνος [29], η αθηροσκλήρωση και η υπέρταση [30], η χρόνια φλεγµονή, η ισχαιµία/επαναιµάτωση [31], η ρευµατοειδής αρθρίτιδα [32], η ευαισθησία (λόγω ανοσοανεπάρκειας) σε µόλυνση από τον ιό HIV [33], η άπνοια κατά τη διάρκεια του ύπνου [34] και νευροεκφυλιστικές ασθένειες [35]. Οι ROS θεωρείται ότι παίζουν σηµαντικό ρόλο στην έναρξη, στην αύξηση και στη διατήρηση των καρκινικών όγκων. Ιδιαίτερη σηµασία έχει η παρατήρηση ότι η παραγωγή ROS είναι αυξηµένη σε καρκινικά -σε σύγκριση µε τα φυσιολογικάκύτταρα [36, 37]. Τα αυξηµένα επίπεδα των ROS κατά την αύξηση του όγκου φαίνεται να συντελούν στη διαρκή ενεργοποίηση µεταγραφικών παραγόντων [38]. Το οξειδωτικό στρες -µέσω της πρόκλησης βλαβών στο DNA- οδηγεί σε γενετική αστάθεια, η οποία πιθανώς συµβάλλει στη διαδικασία της καρκινογένεσης [39]. Η υπερέκφραση της καταλυτικής υποµονάδας της οξειδάσης της NAD(P)H (Mox1) σε ινοβλάστες, επάγει το µετασχηµατισµό τους σε καρκινικά, αλλά και την επιθετικότητα των όγκων που σχηµατίζονται σε αθυµικούς µύες [40]. Αντίστοιχα, καρκινικές κυτταρικές σειρές διαφορετικής προέλευσης, εµφανίζουν αυξηµένη 9

24 Εισαγωγή ικανότητα ανάπτυξης και µετάστασης, µε ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων των ενδογενώς παραγόµενων ROS [41, 42]. ιαταραχές της οξειδοαναγωγικής ισορροπίας, σχετίζονται και µε φυσιολογικές διαδικασίες στον οργανισµό. Ανάµεσα σ αυτές, οι ROS φαίνεται να έχουν πρωταγωνιστικό ρόλο στη γήρανση και το στρες [43]. Παραγωγή υψηλών επιπέδων ROS έχει ανιχνευθεί τόσο κατά τη χρόνια ακινητοποίηση των σκελετικών µυών [44], όσο και κατά την έντονη σωµατική άσκηση [45]. Σηµαντική είναι η εµπλοκή των ROS στο φαινόµενο αντιγραφικής γήρανσης των κυττάρων in vitro [46]. Τέλος, είναι σηµαντικό να αναφερθεί ότι οι δράσεις της ιοντίζουσας ακτινοβολίας σε βιολογικά συστήµατα υπολογίζεται ότι κατά τα 2/3 οφείλονται στην παραγωγή ROS από φωτόλυση του νερού [47] Το Η 2 Ο 2 Το Η 2 Ο 2 παράγεται αυθόρµητα από την αντίδραση του Ο.- 2 µε το νερό (k=5x10 5 M -1 sec -1 ) ή µέσω της δράσης της δισµουτάσης του υπεροξειδίου (SOD): 2Ο Η + Η 2 Ο 2 + Ο 2 Τρεις ισοµορφές του ενζύµου είναι γνωστές: Η κυτταροπλασµατική SOD1 και εξωκυτταρική SOD3 που φέρουν στην οµάδα της αίµης Cu 2+ ή Zn 2+ και η µιτοχονδριακή SOD2 που φέρει στην οµάδα της αίµης Mn 2+. Η δραστικότητα των ενζύµων αυτών είναι πολύ υψηλή (k cat =1,6x10 9 M -1 sec -1 ) [10]. Το µονοξείδιο του.- αζώτου (ΝΟ) αντιδρά πιο ισχυρά µε το Ο 2 από τις SOD. H αντίδραση αυτή οδηγεί στο σχηµατισµό των ραστικών Μορφών Αζώτου (Reactive Nitrogen Species, RNS), που περιλαµβάνουν τα ανιόντα νιτρώδες και νιτρικό και το υπεροξυνιτρώδες. Οι RNS φαίνεται να διαµεσολαβούν τις τοξικές δράσεις του ΝΟ. Όταν όµως η συγκέντρωση του ΝΟ στα κύτταρα είναι χαµηλή, το Ο.- 2 αντιδρά µε.- τις SOD προτού εµπλακεί σε άλλες αντιδράσεις [7]. Έτσι, η σύνθεση Ο 2 στα κύτταρα οδηγεί κατά κύριο λόγο σε αύξηση των επιπέδων του Η 2 Ο 2. Από την άλλη, τα επίπεδα του Η 2 Ο 2 ελέγχονται από ένζυµα, όπως η καταλάση, η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και η υπεροξειδάση της θειοριδοξίνης [8]. 10

25 Εισαγωγή Ανάµεσα στις διάφορες ROS, το Η 2 Ο 2 είναι το µόνο µε τη σταθερότητα που απαιτείται για την εγκαθίδρυση σταθερών συγκεντρώσεων in vivo [48, 49]. Είναι.- λιγότερο δραστικό από το Ο 2 και δύναται να δρα σε µεγαλύτερες αποστάσεις από τη θέση παραγωγής του. Βέβαια, το Η 2 Ο 2 είναι επίσης οξειδωτικό και σε αυξηµένες συγκεντρώσεις µπορεί να προκαλέσει το θάνατο οποιουδήποτε κυττάρου. Έχει τα πλεονεκτήµατα του µικρού µεγέθους και της έλλειψης φορτίου, που του επιτρέπουν τη διάχυση µέσω των κυτταρικών µεµβρανών. Αντίθετα, το Ο 2.- δεν δύναται να διαπεράσει τις µεµβράνες των κυττάρων [50]. Τα χαρακτηριστικά λοιπόν της σχετικής σταθερότητας, του µικρού µεγέθους και της έλλειψης φορτίου καθιστούν το Η 2 Ο 2 ιδανικό υποψήφιο µόριο για συµµετοχή σε µονοπάτια µεταγωγής σήµατος στο εσωτερικό του κυττάρου. Σε κυτταροκαλλιέργειες υψηλές συγκεντρώσεις του Η 2 Ο 2 προκαλούν κυτταρόσταση, απόπτωση ή/και νέκρωση [51]. Γενικά, θεωρείται ότι τα κύτταρα των θηλαστικών διατηρούν την ικανότητα πολλαπλασιασµού τους, όσο η ενδοκυτταρική συγκέντρωση του Η 2 Ο 2 παραµένει κάτω από τα 700 nm. Σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από το 1 µμ, τα κύτταρα υφίστανται στάση του κυτταρικού τους κύκλου ή κυτταρικό θάνατο [52]. Η διαφορά που παρατηρείται µεταξύ των συγκεντρώσεων που εφαρµόζονται εξωγενώς και των ενδοκυτταρικών επιπέδων, αποδίδεται στη διαβάθµιση που αναπτύσσεται κατά µήκος της κυτταρικής µεµβράνης. Η διαβάθµιση αυτή προκύπτει λόγω της παρουσίας στο εσωτερικό των κυττάρων αντιοξειδωτικών ενζύµων, όπως η καταλάση και η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης. Αποτέλεσµα είναι η εµφάνιση στο εσωτερικό των κυττάρων συγκεντρώσεων 10 φορές χαµηλότερων από τις αντίστοιχες στο εξωτερικό περιβάλλον [53, 54]. Ενώ µεγάλος αριθµός δηµοσιεύσεων εστιάζει στις επιβλαβείς δράσεις του Η 2 Ο 2 σε κύτταρα θηλαστικών, είναι σηµαντικό να τονιστεί ότι αποτελεί µορφή τόσο επιβλαβή, όσο και απαραίτητη στα αερόβια κύτταρα. Μία µακρά και συνεχώς εµπλουτιζόµενη λίστα αυξητικών παραγόντων, κυτταροκινών και άλλων µορίων, συσχετίζεται µε διέγερση της παραγωγής Η 2 Ο 2 στα κύτταρα. Αυξηµένη παραγωγή Η 2 Ο 2 (ή ROS γενικά) έχει διαπιστωθεί µετά από επίδραση του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF) [55], του PDGF [56], του TGF-β [57, 58], της ενδοθηλίνης-1 (endothelin-1) [59], της αγγειοτενσίνης ΙΙ [60], του TNF-α [61], της βραδυκινίνης [62], της θροµβίνης [63], της ισταµίνης [64], της IFN- 11

26 Εισαγωγή γ και της IL-1 [65]. Σε κάποιες από τις παραπάνω περιπτώσεις, η χρήση ενός µη ειδικού αντιοξειδωτικού, όπως η Ν-ακέτυλοκυστεΐνη, ανέστειλε τις δράσεις που επάγονται από τους αντίστοιχους παράγοντες [61]. Ακόµα, ουσίες που δεσµεύουν ειδικά το Η 2 Ο 2 ανέστειλαν τη µεταγωγή σήµατος που ενεργοποιείται µετά από δέσµευση του προσδέτη στον υποδοχέα του. Για παράδειγµα, η φωσφορυλίωση των ERK σε απόκριση στον VEGF ανεστάλη από την καταλάση [66]. Από τα παραπάνω υποδεικνύεται ένας ρόλος της παραγωγής του Η 2 Ο 2, θεµελιώδης στη µεταγωγή σήµατος από ποικίλους µεµβρανικούς υποδοχείς Μεταγωγή σήµατος από το Η 2 Ο 2 Η παρουσία χαµηλών συγκεντρώσεων Η 2 Ο 2 φαίνεται να αποτελεί προϋπόθεση για τη σωστή λειτουργία διαφόρων µονοπατιών µεταγωγής σήµατος, αλλά και ενισχύει τη µεταγωγή σήµατος από ποικίλους µεµβρανικούς υποδοχείς [67]. Η εµπλοκή όµως του Η 2 Ο 2 στην ενίσχυση του σήµατος και στη συνέχεια στο µονοπάτι µεταγωγής του, δεν έχει πλήρως χαρακτηριστεί στο µοριακό επίπεδο. Σε αυτή τη διαδικασία, πιθανώς ενέχονται παροδικές οξειδωτικές τροποποιήσεις διαφόρων πρωτεϊνών-σηµάτων ευαίσθητων στην οξειδοαναγωγή. Στους µηχανισµούς µεταγωγής σήµατος που είναι ευαίσθητοι στην οξειδοαναγωγή, κεντρικό ρόλο φαίνεται να παίζουν οι θειολοµάδες (-SH). Η οξείδωση των οµάδων αυτών είναι µια αναστρέψιµη διαδικασία, που συνιστά ένα διακόπτη ευαίσθητο στην οξειδοαναγωγή. Ειδικότερα η οξείδωση/αναγωγή των θειολοµάδων σε πρωτεΐνες-κλειδιά, φαίνεται να ελέγχει τη δυναµική της έκφρασης γονιδίων ευαίσθητων στην οξειδοαναγωγική κατάσταση. Η γλουταθειόνη (GSH), η οποία περιέχει µια θειολοµάδα, φαίνεται να λειτουργεί ως το πρωτογενές κυτταρικό οξειδοαναγωγικό διάλυµα. Στα κύτταρα βρίσκεται σε συγκέντρωση από 5 έως 10 mμ [8]. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, σχεδόν το 1% του ολικού ποσού της γλουταθειόνης του κυττάρου βρίσκεται στην οξειδωµένη της µορφή (GSSG) [68]. Έτσι, η οξείδωση µιας µικρής ποσότητάς της GSH στο κύτταρο µπορεί να µεταβάλλει σηµαντικά την αναλογία GSH/GSSG, µε άµεσο αποτέλεσµα τη µεταβολή του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης [69, 70]. Οι ROS προκαλούν το σχηµατισµό ενδοµοριακών και διαµοριακών δισουλφιδικών 12

27 Εισαγωγή δεσµών µεταξύ κυστεϊνών. Αυτή η τροποποίηση µπορεί να προκαλέσει δοµικές µεταβολές ή το σχηµατισµό διµερών και πολυµερών πρωτεϊνών, επηρεάζοντας τη λειτουργία τους [71]. Η δράση κινάσης της τυροσίνης στον υποδοχέα της ινσουλίνης ενισχύεται από σχετικά χαµηλές συγκεντρώσεις Η 2 Ο 2 ή ελαφρών οξειδωτικών µεταβολών στην ενδοκυτταρική -SH/-SS- ισορροπία [72]. Η επίδραση αυτή αποδίδεται στην οξειδωτική τροποποίηση οποιασδήποτε από τις 4 κυστεΐνες της περιοχής µε δράση κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα [73]. Μια ακόµη ενδιαφέρουσα περίπτωση υποδοχέα µε δράση κινάσης της τυροσίνης, είναι αυτή του επιδερµικού αυξητικού παράγοντα (EGF). Η δέσµευση του EGF στον υποδοχέα του οδηγεί σε διέγερση της παραγωγής Η 2 Ο 2 [74]. Εντούτοις, εξωγενώς χορηγούµενο Η 2 Ο 2 προκαλεί την ενεργοποίηση διαφορετικής κυτταροπλασµατικής περιοχής του υποδοχέα σε σχέση µε τον προσδέτη [75]. Η µεταγωγή σήµατος µέσω πρωτεϊνικών κινασών της τυροσίνης µπορεί να ενισχυθεί από την οξειδωτική αναστολή φωσφατασών της τυροσίνης [76, 77, 78]. Η µοριακή βάση αυτής της δράσης είναι σχετικά καλά διευκρινισµένη και περιλαµβάνει την τροποποίηση µιας βασικής, για την καταλυτική δράση, κυστεΐνης στο ενεργό κέντρο των ενζύµων [79]. Έτσι, οι φωσφατάσες µπορούν να απενεργοποιηθούν από αλλαγές στην ενδοκυτταρική ισορροπία -SH/-SS- [80]. Οι πρωτεϊνικές κινάσες που ενεργοποιούνται από µιτογόνα (Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK) αποτελούν συστατικά των µονοπατιών που συνδέουν τα εξωκυτταρικά ερεθίσµατα µε µεταγραφικούς παράγοντες, µετατρέποντας τελικά τα σήµατα σε κυτταρική απόκριση. Στα θηλαστικά υπάρχουν τρεις υποοµάδες των MAPK, οι ERK (Extacellular signal Regulated Kinase), οι JNK (c-jun N-terminal Kinase), και οι p38. Εκτενής µελέτη των κινασών αυτών ανέδειξε το ρόλο αφενός των ERK στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων, αφετέρου των κινασών που ενεργοποιούνται από στρες (Stress Activated Protein Kinase, SAPK), JNK και p38, στην απόκριση σε καταστάσεις στρες και τον προγραµµατισµένο κυτταρικό θάνατο. Το Η 2 Ο 2 ενεργοποιεί τις MAPK, όµως το φαινόµενο φαίνεται να εξαρτάται και από τον τύπο των κυττάρων [81]. Οι ERK, που διαµεσολαβούν τη µεταγωγή σήµατος από αυξητικούς παράγοντες, ενεργοποιούνται από το Η 2 Ο 2 σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων, όπως ενδοθηλιακά κύτταρα, λεµφοκύτταρα, ινοβλάστες. Η 13

28 Εισαγωγή ενεργοποίηση τους όµως διαρκεί για µικρότερο χρονικό διάστηµα σε σύγκριση µε αυτή των JNK [82]. Ιδιαίτερα ευαίσθητα σε οξειδωτική ρύθµιση είναι τα µονοπάτια µεταγωγής σήµατος στα οποία εµπλέκονται η JNK [83], η p38 MAPK [84] και ο µεταγραφικός παράγοντας AP-1 [85]. Η ενίσχυση της δράσης κινασών τυροσίνης της οικογένειας Src [86] και κάποιων ισοµορφών της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) [87], καθώς και η αποδιάταξη των συµπλόκων JNK/GSTp (S-µεταφοράση της γλουταθειόνης, ενδογενής αναστολέας των JNK) [71] και ASK1 (Apoptosis Signaling regulating Kinase1)/Trx (ενδογενής αναστολέας της ASK1) [88], πιθανώς συµβάλλουν στην ευαισθησία αυτών των µονοπατιών. Σε συνθήκες στρες, όπως κατά την έκθεση των κυττάρων σε αντικαρκινικά φάρµακα, το Η 2 Ο 2 προάγει την απόπτωση [89] ενεργοποιώντας τις JNK και p38 [90, 91, 92]. Η µεταγωγή σήµατος µέσω των JNK παίζει σηµαντικό ρόλο στην απόπτωση που εξαρτάται από τα µιτοχόνδρια ή/και υποδοχείς [93]. Το Η 2 Ο 2 παίζει σηµαντικό ρόλο στην απόπτωση που επάγεται από την πρωτεΐνη p53 [94], πιθανώς µέσω φωσφορυλίωσής της από τις JNK και p38 [95, 96]. Τέλος, µπορεί να δρα απευθείας στον αποπτωτικό µηχανισµό, προκαλώντας την εκπόλωση και δυσλειτουργία των µιτοχονδρίων [89]. Ωστόσο, υπάρχουν και δεδοµένα που αποδίδουν στις JNK, απουσία στρες, θετικό ρόλο στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων [97]. Πρόσφατα προτάθηκε ένα µοντέλο για την εξήγηση των διαφορικών δράσεων των ROS ανάλογα µε τη συγκέντρωση τους σε καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα, το οποίο εµπλέκει τις JNK και τον AP-1 (Εικόνα 2). Σύµφωνα µε αυτό, τα επίπεδα των ενδογενών ROS στα φυσιολογικά κύτταρα είναι σχετικά χαµηλά. Ο µετασχηµατισµός τους σε καρκινικά οδηγεί σε αύξηση των βασικών επιπέδων των ROS και ενίσχυση της δραστηριότητας των JNK. Αυτή η ενδιάµεση κατάσταση ευνοεί µιτογόνα σήµατα µέσω του AP-1 ή και άλλων µονοπατιών. Μικρή αύξηση στις ROS δύναται να προάγει περαιτέρω την αύξηση των κυττάρων, µε τα φυσιολογικά κύτταρα να εµφανίζουν µεγαλύτερη δεκτικότητα λόγω χαµηλότερου κατωφλίου. Υψηλότερα όµως επίπεδα των ROS (όπως στην περίπτωση αντικαρκινικών φαρµάκων), οδηγούν σε περαιτέρω ενεργοποίηση των JNK και αποπτωτική απόκριση των κυττάρων [98]. 14

29 Εισαγωγή Εικόνα 2: Μοντέλο που αναπαριστά σχηµατικά τη διαφορική δράση των ROS, ανάλογα µε τη συγκέντρωσή τους, σε καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα. Στα φυσιολογικά κύτταρα η συγκέντρωση των ROS διατηρείται σε χαµηλά επίπεδα. Μετά από έκθεση σε συνθήκες στρες, αυξάνεται η συγκέντρωση των ROS µε αποτέλεσµα την επαγόµενη κυτταρόσταση. Στα καρκινικά κύτταρα, η συγκέντρωση των ROS είναι υψηλότερη, προάγοντας µε τον τρόπο αυτό την κυτταρική αύξηση και τον πολλαπλασιασµό. Έκθεση των καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες στρες αυξάνει κατά πολύ την συγκέντρωση των ROS, µε τελικό αποτέλεσµα τον κυτταρικό θάνατο. Η δέσµευση στο DNA των περισσότερων µεταγραφικών παραγόντων είναι ευαίσθητη στις οξειδωτικές συνθήκες [99, 100]. Ένα καλά µελετηµένο µοντέλο οξειδωτικής ρύθµισης είναι η ενεργοποίηση του µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ [101, 102]. Οι ROS ή αλλαγές στην ισορροπία -SH/-SS- επάγουν ή ενισχύουν την ενεργοποίηση του NF-κB σε ποικιλία κυτταρικών τύπων, κάτω από ποικίλες συνθήκες [99, 84]. Είναι σηµαντικό όµως να σηµειωθεί ότι οι φυσιολογικές αποκρίσεις προϋποθέτουν µια λεπτή ισορροπία µεταξύ των οξειδωτικών συνθηκών που απαιτούνται για την ισχυροποίηση της µεταγωγής σήµατος και των αναγωγικών συνθηκών που απαιτούνται για την εκτέλεση των σηµάτων αυτών [103]. 15

30 Εισαγωγή Η σπουδαιότητα των ευαίσθητων στην οξείδωση µονοπατιών µεταγωγής σήµατος in vivo, υποστηρίζεται από την ύπαρξη ενός µεγάλου αριθµού ισοµορφών της NAD(P)H και από την απορρύθµιση (ή απώλεια ρύθµισης) των φυσιολογικών αποκρίσεων σε ποικίλες ασθένειες που σχετίζονται µε κατάσταση οξειδωτικού στρες. Εντούτοις, η συµβολή συγκεκριµένων πρωτεϊνών σε διαδικασίες που υπόκεινται σε οξειδοαναγωγική ρύθµιση in vivo, είναι προς το παρόν ασαφής. Πρέπει επίσης να σηµειωθεί ότι τα επίπεδα Η 2 Ο 2 που έχουν χρησιµοποιηθεί στις παραπάνω µελέτες είναι αρκετά υψηλά (συγκεντρώσεις 0,1-1 mm). Έτσι, το Η 2 Ο 2 συσχετίζεται µε µονοπάτια τα οποία ενεργοποιούνται µάλλον σε συνθήκες στρες παρά µε µιτογόνα σήµατα. Βέβαια, πιθανολογείται µια σχέση της διαφορετικής απόκρισης των κυττάρων σε διαφορετικά επίπεδα του Η 2 Ο 2 στη βάση της διάρκειας της ενεργοποίησης των µονοπατιών µεταγωγής σήµατος [67, 98]. Η ταυτοποίηση γονιδίων ευαίσθητων στο Η 2 Ο 2, πιθανώς θα ρίξει φως στους βιοχηµικούς µηχανισµούς που εµπλέκονται στις διεγερτικές µη τοξικές δράσεις του. 16

31 Εισαγωγή Σύνοψη Οι ROS συνιστούν µια κατηγορία παραγώγων του οξυγόνου, µε οξειδωτική δράση ισχυρότερη από αυτή του ίδιου του µοριακού οξυγόνου. Παράγονται κάτω από φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες. Υψηλές συγκεντρώσεις των ROS οδηγούν στην εκδήλωση του οξειδωτικού στρες, µε κυτταροστατικές ή/και κυτταροτοξικές δράσεις. Μικρά ποσά των ROS παράγονται στα κύτταρα διαρκώς, συµµετέχοντας σε ποικίλα βιοχηµικά µονοπάτια. Τα χαρακτηριστικά της σχετικής σταθερότητας, του µικρού µεγέθους και της έλλειψης φορτίου καθιστούν το Η 2 Ο 2 υποψήφιο µόριο για συµµετοχή σε µονοπάτια µεταγωγής σήµατος. Η ταυτοποίηση γονιδίων ευαίσθητων σε χαµηλές συγκεντρώσεις του Η 2 Ο 2, πιθανώς θα ρίξει φως στους βιοχηµικούς µηχανισµούς που εµπλέκονται στις διεγερτικές του δράσεις. 17

32 Εισαγωγή 2. HARP 2.1 Γενικά Η HARP (Heparin-Affin Regulatory Peptide) αποτελεί έναν κυτταρικό αυξητικό παράγοντα µε µοριακή µάζα 18 kda, που ανήκει σε µια σχετικά νέα οικογένεια αυξητικών παραγόντων που δεσµεύονται στην ηπαρίνη και η οποία περιλαµβάνει επιπλέον την πρωτεΐνη Μidkine (MK) [104] και την οµόλογη αυτής στα πτηνά, την επαγόµενη από το ρετινοϊκό οξύ πρωτεΐνη (Retinoic acid-inducible Heparin Binding protein, RI-HB) [105]. Το µόριο της HARP αποµονώθηκε παράλληλα από πολλές ερευνητικές οµάδες και από διάφορους ιστούς. Κάθε ερευνητική οµάδα, ανάλογα µε τον ιστό προέλευσης ή βάσει κάποιας από τις ιδιότητες του µορίου, έδωσε στον παράγοντα διαφορετική ονοµασία. Για το λόγο αυτό, απαντάται στη βιβλιογραφία µε πολλές ονοµασίες, από τις οποίες επικρατέστερες σήµερα είναι: HARP [106], πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) [107], HB-GAM (Heparin-Binding Growth Associated Molecule) [108] και OSF-1 (Osteoblast Specific Factor-1) [109]. Η HARP περιγράφηκε αρχικά ως κυτταροκίνη που η έκφρασή της ρυθµίζεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και ελέγχει την αύξηση κυττάρων του νευροεξωδέρµατος και µεσοδέρµατος. Ωστόσο, τα επίπεδά της µειώνονται στα τελευταία στάδια της εµβρυογένεσης, ενώ η έκφρασή της είναι περιορισµένη στον ενήλικα οργανισµό. Το όνοµα πλειοτροπίνη αντικατοπτρίζει την ικανότητά της να επηρεάζει την αύξηση και τη διαφοροποίηση µιας πληθώρας τύπων κυττάρων, όπως νευροβλάστες και ινοβλάστες, επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα [110] οµή της πρωτεΐνης HARP Η HARP, όπως προκύπτει από µελέτη του cdna της, είναι ένα πολυπεπτίδιο µε 168 αµινοξέα [111], µε υψηλή οµολογία σε διάφορα είδη, όπως ο άνθρωπος, ο επίµυς, ο βους και η όρνιθα [111, 112, 113]. Η φαινοµενική µοριακή µάζα της HARP όταν αναλύεται υπό αποδιατακτικές συνθήκες σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, είναι 18 kda. Αυτό δεν αντικατοπτρίζει την αµινοξική σύσταση του ώριµου µορίου, αφού µε φασµατοσκοπία µάζας στη HARP βοός, το µόριο εµφανίζεται να έχει µοριακή µάζα 15,3 kda [112]. Το παραπάνω φαινόµενο 18

33 Εισαγωγή οφείλεται πιθανότατα στη µεγάλη περιεκτικότητα του µορίου σε βασικά αµινοξέα. Έτσι, κατά την ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικές συνθήκες αυξάνεται το φαινοµενικό µοριακό βάρος του µορίου, λόγω µικρότερης κινητικότητας [105, 114]. Τα πρώτα 32 αµινοξέα του αµινοτελικού άκρου της HARP είναι υδρόφοβα και αποτελούν ένα σηµατοδοτικό πεπτίδιο, ενώ η καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης είναι υδρόφιλη [111, 112, 113]. Ανάλογα µε τον τύπο του κυττάρου, µπορεί να πραγµατοποιηθεί αποικοδόµηση του µορίου σε σηµείο µετά από το πεπτίδιο-σινιάλο, µε αποτέλεσµα την παραγωγή δύο διαφορετικών µορφών του µορίου που διαφέρουν στα 3 τελευταία αµινοξέα του αµινοτελικού άκρου. Η µια µορφή της πρωτεΐνης απαρτίζεται από 136 αµινοξέα και η άλλη από 139 [115]. Το 24% των αµινοξέων του ώριµου µορίου της HARP είναι βασικά αµινοξέα, κυρίως λυσίνες, ενώ περιλαµβάνει και 10 κυστεΐνες. Οι 28 λυσίνες του µορίου είναι οµαδοποιηµένες στο αµινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο. Οι περιοχές αυτές θεωρήθηκαν σηµαντικές για την ιδιότητα της HARP να συνδέεται µε την ηπαρίνη [116] και το εξωκυτταρικό υλικό [111, 117]. Οι περιοχές αυτές εµφανίζουν µια συνεκτική αλληλουχία βασικών αµινοξέων, που απαντάται σε αρκετούς αυξητικούς παράγοντες που εµφανίζουν συγγένεια για την ηπαρίνη. Οι κυστεΐνες συµµετέχουν στο σχηµατισµό πέντε ενδοπεπτιδικών δισουλφιδικών δεσµών. Υπάρχουν αναφορές οι οποίες εµπλέκουν έξι µόνο κυστεΐνες στη δηµιουργία των δισουλφιδικών δεσµών, ωστόσο οι περισσότερες εργασίες κάνουν λόγο για τη συµµετοχή όλων των κυστεϊνών σε δισουλφιδικές γέφυρες (Εικόνα 3) [118, 119, 120, 121]. Οι δισουλφιδικές γέφυρες αν και προσδίδουν σταθερότητα στο µόριο της HARP, σε ότι αφορά φυσικοχηµικές προσβολές από αλλαγές στο ph και οργανικούς διαλύτες, την καθιστούν ιδιαίτερα ευαίσθητη σε αναγωγικές συνθήκες. Επιπλέον, στο καρβοξυτελικό άκρο του µορίου υπάρχει µια αλληλουχία οµόλογη µε εκείνη των αναστολέων τύπου kazal [119]. Ωστόσο, µέχρι σήµερα δεν υπάρχει κάποια αναφορά για ενδεχόµενη ανασταλτική δράση στην τρυψίνη. 19

34 Εισαγωγή Εικόνα 3: Σχηµατική αναπαράσταση του µορίου της HARP, σύµφωνα µε το οποίο όλες οι κυστεΐνες συµβάλλουν στη δηµιουργία δισουλφιδικών δεσµών [122]. ιακρίνονται οι δύο κεντρικές περιοχές του µορίου, οι οποίες περιλαµβάνουν από τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχωτές επιφάνειες (αναπαρίστανται µε βέλη), καθώς και τα δύο άκρα του µορίου (αναπαρίστανται µε κυλίνδρους), τα οποία παρουσιάζονται να έχουν τυχαία διαµόρφωση [121]. Ενδιαφέρον προκαλεί η παρατήρηση ότι στην πρωτοταγή δοµή της HARP υπάρχουν τρεις περιοχές οι οποίες φέρουν το µοτίβο K-R/K-X-R/K. Οι περιοχές αυτές, που περιέχουν θετικά φορτισµένα αµινοξέα, εντοπίζονται κατά κανόνα σε εσωτερικές θέσεις της πολυπεπτιδικής αλυσίδας και θεωρούνται υπεύθυνες για την είσοδο πρωτεϊνών στον πυρήνα. Παρόλα αυτά, δεν έχει εξακριβωθεί µέχρι σήµερα η παρουσία της HARP στον πυρήνα. Έχει προταθεί ότι η HARP µπορεί να δεσµεύεται στη νουκλεολίνη [123], ενώ δεδοµένα της ερευνητικής µας οµάδας καταδεικνύουν την παρουσία της HARP στον πυρήνα ενδοθηλιακών κυττάρων της χοριοαλλαντοϊκής µεµβράνης εµβρύου όρνιθας (αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). Μέχρι σήµερα δεν υπάρχει κάποια αναφορά στην οποία να προσδιορίζεται µε σαφήνεια η τρισδιάστατη διαµόρφωση του µορίου της HARP. Ωστόσο, χρησιµοποίηση της τεχνικής του πυρηνικού µαγνητικού συντονισµού (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) απέδειξε ότι η ανασυνδυασµένη HARP που 20

35 Εισαγωγή παράχθηκε τόσο σε κύτταρα εντόµων, όσο και σε βακτήρια E. coli, αποτελείται από δύο κεντρικές περιοχές, οι οποίες συνδέονται µεταξύ τους µε ένα εύκαµπτο τµήµα [121]. Και οι δύο κεντρικές περιοχές περιέχουν από τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχωτές επιφάνειες, παρόµοιες µε εκείνες που εντοπίζονται στη ΜΚ [124]. Στην ίδια µελέτη αναφέρεται ότι τα δύο πλούσια σε λυσίνη άκρα της HARP έχουν τυχαία διαµόρφωση. Τα δεδοµένα αυτά έρχονται σε αντιπαράθεση µε παλαιότερη αναφορά, σύµφωνα µε την οποία τα άκρα της HARP διαθέτουν δοµή α-έλικας [125]. Η µελέτη των κεντρικών περιοχών της HARP και της ΜΚ αποκάλυψε ότι έχουν αλληλουχίες που αντιστοιχούν στις επαναλαµβανόµενες περιοχές της θροµβοσπονδίνης τύπου Ι (Thrombospondin type I repeat, TSR) [126, 121]. Οι περιοχές TSR των διαφόρων πρωτεϊνών έχουν παρόµοια δοµικά στοιχεία, τα οποία δικαιολογούν την ικανότητα δέσµευσής τους στην ηπαρίνη. Σε συµφωνία µε τα δεδοµένα αυτά, οι δύο κεντρικές περιοχές της HARP διατηρούν την ικανότητα δέσµευσής τους µε την ηπαρίνη, γεγονός που καθιστά δυνατή την αποµόνωση και τον καθαρισµό της, χρησιµοποιώντας χρωµατογραφία συγγένειας µε την ηπαρίνη [121]. Θα πρέπει ωστόσο να αναφερθεί ότι σύµφωνα µε άλλα δεδοµένα, οι β-πτυχωτές επιφάνειες της HARP και της ΜΚ δεν παρουσιάζουν ανάλογη τρισδιάστατη δοµή µε εκείνη των περιοχών TSR I [127, 128] οµή του γονιδίου της HARP Το γονίδιο της HARP έχει αναλυθεί στον άνθρωπο, τον επίµυ και το µυ. Εντοπίζεται στο 7 ο [107], το 6 ο [129] και το 4 ο χρωµόσωµα [107] αντίστοιχα και παρουσιάζει παρόµοια οργάνωση. Στον άνθρωπο οργανώνεται σε επτά εξώνια µε συνολικό µέγεθος 42 kb [130, 131]. Το mrna της HARP περιέχεται σε πέντε εξώνια που δίνουν προϊόν νουκλεοτιδίων. Το πεπτίδιο σινιάλο και τα πέντε πρώτα αµινοξέα του ώριµου µορίου κωδικοποιούνται στο 2 ο εξώνιο, ενώ η πρωτεΐνη κατά κύριο λόγο στα εξώνια 3 και 4 [131]. Η 5 -µη µεταφραζόµενη περιοχή (5 -UTR) του γονιδίου περιλαµβάνεται στο 1 ο εξώνιο, καθώς και σε πρόσθετες περιοχές αριστερά του 1 ου εξωνίου, οι οποίες έχουν ταυτοποιηθεί στον 21

36 Εισαγωγή άνθρωπο και το µυ [132, 133]. Η περιοχή αυτή των γονιδίων τυπικά περιέχει τις αλληλουχίες που ενέχονται στην έναρξη της µεταγραφής και τη ρύθµισή της. Το 1992, χαρακτηρίστηκε η ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου της HARP στον άνθρωπο. Σε αυτή την ανάλυση εντοπίστηκε η αλληλουχία CCAAT, 91 νουκλεοτίδια ανοδικά από τη βασική θέση έναρξης της µεταγραφής [107]. Στην αλληλουχία αυτή δύνανται να δεσµευτούν γενικοί µεταγραφικοί παράγοντες, όπως ο C/EBP (CAAT-box/Εnhancer-Βinding Protein) ή ο CTF/NF1 (CAAT-box-binding Factor/ NuclearFactor1) [134]. Εντούτοις, δεν ανευρέθηκε η αλληλουχία ΤΑΤΑ [107]. Στην αλληλουχία ΤΑΤΑ δεσµεύεται η πρωτεΐνη δέσµευσης στην ΤΑΤΑ (TATA-Binding Protein, TBP), η οποία αποτελεί βασικό συστατικό του µεταγραφικού παράγοντα ΙΙD (Transcription Factor IID, TF II D). Είναι αξιοσηµείωτο το γεγονός ότι η πρωτεΐνη TBP είναι απαραίτητη για τη µεταγραφή, ακόµη και αν απουσιάζει η αλληλουχία ΤΑΤΑ. Φαίνεται ότι ένας από τους ρόλους της αλληλουχίας αυτής είναι ο καθορισµός ενός ακριβούς σηµείου έναρξης της µεταγραφής [134]. Υποκινητές πολλών γονιδίων στερούνται της αλληλουχίας ΤΑΤΑ και χαρακτηρίζονται από πολλαπλά σηµεία έναρξης της µεταγραφής, όπως συµβαίνει και στην περίπτωση του γονιδίου της HARP [107]. Η αλληλουχία αυτή απουσιάζει επιπλέον από τη ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου της ΜΚ [135], του γονιδίου Wnt-2, το οποίο ενεργοποιείται σε µύες κατά την πρώιµη ανάπτυξη [136], της p18 που εκφράζεται σε εµβρυϊκούς ιστούς µυός [137] και άλλων γονιδίων. Το κοινό αυτό χαρακτηριστικό µεταξύ γονιδίων που ενεργοποιούνται κατά την ανάπτυξη, πιθανολογεί ένα διαφορετικό µηχανισµό ρύθµισης που ελέγχεται διαφορικά στο χώρο και το χρόνο. Στην εγγύς περιοχή του υποκινητή συνήθως εντοπίζονται αλληλουχίες δέσµευσης πολλαπλών µεταγραφικών παραγόντων, καθώς και πιθανών παραγόντων που εµπλέκονται σε έκφραση εξαρτώµενη από τον τύπο του κυττάρου. Σε περιοχές αποµακρυσµένες από τον υποκινητή εντοπίζονται ρυθµιστικές αλληλουχίες, τοποθετηµένες κατά τέτοιο τρόπο, ώστε να σχηµατίζονται σύνθετοι ενισχυτές. Αυτές οι περιοχές δύναται να είναι µικρές ή να περιέχουν επαναλαµβανόµενες θέσεις δέσµευσης διαφορετικών µεταγραφικών παραγόντων, διασπαρµένες σε εκατοντάδες βάσεις. Αν και οι ενισχυτές και ο υποκινητής συνήθως διευθετούνται κατά ένα γραµµικό πρότυπο στο DNA, φαίνεται ότι η αλληλεπίδραση 22

37 Εισαγωγή µεταγραφικών παραγόντων που δεσµεύονται στους ενισχυτές, µε συστατικά του βασικού υποκινητή, επιτυγχάνεται µε το σχηµατισµό θηλειάς που φέρνει σε γειτνίαση τις περιοχές αυτές [134]. Η αρχική ανάλυση του γονιδίου της HARP δεν ανέδειξε αλληλουχίες δέσµευσης για γενικούς µεταγραφικούς παράγοντες. Ωστόσο, στην αποµακρυσµένη 5 - περιοχή αναγνωρίστηκαν δύο πιθανές αλληλουχίες δέσµευσης για τον AP-1 (Activator protein-1), τέσσερις για το MyoD και µία αλληλουχία SRE (Serum Response Element) [107], χωρίς όµως να αξιολογηθεί η λειτουργικότητά τους. Αργότερα, προτάθηκε η ύπαρξη µίας αλληλουχίας δέσµευσης (GT1) του µεταγραφικού παράγοντα Sp1 (ρετροϊικής προελεύσεως), µε σηµαντικό ρόλο στην έκφραση της HARP σε κύτταρα χοριοκαρκινώµατος ανθρώπου [138]. Η κατανοµή των προτεινόµενων αλληλουχιών δέσµευσης µεταγραφικών παραγόντων στη ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου της HARP ανθρώπου, αναφέρονται στην Εικόνα 4. Στην 3 -UTR περιοχή του γονιδίου εντοπίστηκαν τρεις αλληλουχίες τύπου ΑΤΤΤΑ. Αυτές οι αλληλουχίες εντοπίζονται στην αντίστοιχη περιοχή και άλλων ογκογονιδίων και εµπλέκονται στη ρύθµιση της σταθερότητας του mrna [130]. 23

38 Εισαγωγή Εικόνα 4: Σχηµατική απεικόνιση της ρυθµιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP. ιακρίνεται η περιοχή CCAAT, πιθανές αλληλουχίες δέσµευσης µεταγραφικών παραγόντων και η βασική θέση έναρξης της µεταγραφής. Τα νουκλεοτίδια είναι αριθµηµένα συγκριτικά µε τη βασική θέση έναρξης της µεταγραφής (+1) Έκφραση του γονιδίου της HARP Με πειράµατα in situ υβριδοποίησης, βρέθηκε ότι η HARP εκφράζεται µε συγκεκριµένο αναπτυξιακό πρότυπο σε πολλούς µεσοδερµικούς και νευροεξωδερµικούς ιστούς, αλλά όχι στο ενδόδερµα και τους τροφοβλάστες [139]. Αυτό το πρότυπο έκφρασης υποδηλώνει ότι η HARP λαµβάνει µέρος στη νευριδίωση, την κυτταρική µετανάστευση, τη δευτερογενή οργανογένεση και τις αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στο µεσόδερµα και το επιθήλιο. Η HARP εκφράζεται (σε µικρότερα ποσά) και µετά από τη γέννηση, γεγονός το οποίο αναδεικνύει µια χρονική ρύθµιση της έκφρασης του µορίου [114]. Η HARP εκφράζεται κυρίως κατά τη µετεµβρυϊκή περίοδο στον αναπτυσσόµενο φλοιό της παρεγκεφαλίδας επίµυος και παραµένει σε υψηλά επίπεδα στο ενήλικο άτοµο [140, 141, 142]. Το mrna της HARP εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στο νεοπάλαιο φλοιό και στο µεσεγκέφαλο µυός [143] και πιθανώς εµπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις µεταξύ των νευρικών κυττάρων και των κυττάρων της γλοίας κατά την ανάπτυξη του οργανισµού, καθώς και στον ώριµο εγκέφαλο. Πράγµατι, το µύνηµα ανιχνεύεται κατά τη µετεµβρυϊκή περίοδο τόσο σε νευρώνες, όσο και σε κύτταρα της γλοίας [144]. Στο ώριµο άτοµο, το µόριο εκφράζεται κυρίως στον ιππόκαµπο και σε νευρώνες του φλοιού [139, 144]. Τόσο η πρωτεΐνη, όσο και το mrna της HARP ανιχνεύονται στο περιφερειακό νευρικό σύστηµα και κυρίως στα γάγγλια της ραχιαίας ρίζας και στις νευρικές προεκτάσεις [143], υποδηλώνοντας ότι πιθανώς να συµµετέχει στην οργάνωση των νευρικών ινών για την είσοδό τους 24

39 Εισαγωγή στο νωτιαίο µυελό. Μετά από τοπική ισχαιµία στην παρεγκεφαλίδα ενήλικα επίµυος, έχει αναφερθεί έκφραση της HARP σε µακροφάγα, αστροκύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα, σε περιοχές αυξηµένης αγγειογένεσης [145]. Μεγάλα ποσοστά έκφρασης της HARP έχουν αναφερθεί επίσης σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η νόσος Alzheimer και το σύνδροµο Down [146]. Κατά την εµβρυϊκή περίοδο, η HARP συµµετέχει στις αλληλεπιδράσεις επιθηλίου- µεσεγχύµατος. Με χρήση πολυκλωνικών αντισωµάτων έναντι της HARP έγινε φανερό ότι κατά την ανάπτυξη του µυός, η έκφραση του µορίου σε όργανα όπου επιτελείτο µορφογένεση, συµβάδιζε µε τη διαφοροποίηση του επιθηλίου [143]. Η HARP εντοπίστηκε στις βασικές µεµβράνες και στην κυτταρική επιφάνεια επιθηλιακών κυττάρων των αναπτυσσόµενων οργάνων. Επίσης, έγινε φανερό ότι ενώ ο FGF-2 διέγειρε, η HARP ανέστειλε τον πολλαπλασιασµό των µυϊκών κυττάρων, προάγοντας τη διαφοροποίηση τους στις περιοχές αυτές [143]. Στο αναπτυσσόµενο νευροµυϊκό σύστηµα επίµυος, η HARP βρίσκεται δεσµευµένη στην επιφάνεια των µυών των καταβολών των άκρων [147]. Η HARP βρίσκεται στα υψηλότερα επίπεδα παραγωγής της την περίοδο κατά την οποία πραγµατοποιείται ο σχηµατισµός των συνάψεων. Την ίδια χρονική περίοδο εντοπίζεται και στον αναπτυσσόµενο µυικό ιστό. Καθώς η HARP εντοπίζεται στην επιφάνεια των µυών και πριν από την άφιξη των αξόνων στην περιοχή όπου θα δηµιουργηθεί η σύναψη, είναι πιθανό να καθοδηγεί τους κώνους αύξησης προς την περιοχή αυτή και να συµβάλλει στη δηµιουργία της σύναψης [147]. Επιπρόσθετα, η HARP ανιχνεύεται στις ίδιες περιοχές µε τα συσσωµατώµατα των υποδοχέων ακετυλοχολίνης. Από σχετικά πειράµατα, φαίνεται ότι µπορεί να επάγει και τη συσσώρευση των υποδοχέων αυτών σε µυϊκά κύτταρα από Xenopus. Εάν τα κύτταρα αυτά καλλιεργηθούν µε αντισώµατα έναντι της HARP, τότε µειώνεται η συσσώρευση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης στα σηµεία δηµιουργίας συνάψεων [148]. Η HARP έχει αποµονωθεί από τη µήτρα ενήλικου βοός και εντοπίζεται γενικά στο ουρογεννητικό σύστηµα [149]. Το mrna της HARP ανιχνεύεται σε κύτταρα τα οποία έχουν αποµονωθεί από το επιθήλιο ενδοµητρίου, ενώ η πρωτεΐνη εντοπίζεται και στη µήτρα ενήλικα επίµυ [139]. Στο αναπαραγωγικό σύστηµα του αρσενικού ατόµου, η HARP έχει συσχετιστεί µε τον καρκίνο του προστάτη και εκφράζεται σε καλλιέργειες κυτταρικών σειρών που προέρχονται από το 25

40 Εισαγωγή συγκεκριµένο είδος καρκίνου [150, 151]. Τέλος, η πρωτεΐνη σχετίζεται µε το πεπτικό και το αναπνευστικό σύστηµα, τα αισθητήρια όργανα, τα µαλλιά και τις καταβολές των άκρων [143] Yποδοχείς της HARP και µεταγωγή σήµατος Η HARP έχει υψηλή συγγένεια µε την ηπαρίνη. Η ιδιότητά της αυτή έχει χρησιµοποιηθεί ευρύτατα για την αποµόνωση και τον καθαρισµό του µορίου από το θρεπτικό µέσο διαφόρων τύπων κυττάρων [152], αλλά και την ανίχνευσή του σε βιολογικά υγρά [153, 154], χρησιµοποιώντας χρωµατογραφία συγγένειας µε την ηπαρίνη. Με παρόµοιες τεχνικές έγινε φανερό ότι µια περιοχή δέκα µονοσακχαριτών είναι απαραίτητη στο µόριο της ηπαρίνης, προκειµένου αυτό να αλληλεπιδράσει µε τη HARP [117]. Οι περιοχές στο µόριο της HARP µέσω των οποίων πραγµατοποιείται η σύνδεση µε την ηπαρίνη, δεν είναι χαρακτηρισµένες σε ικανοποιητικό βαθµό. Αρχικά, διατυπώθηκε η άποψη ότι τα δύο πλούσια σε λυσίνη άκρα του µορίου είναι υπεύθυνα για την ιδιότητα αυτή [119]. Αργότερα, υποστηρίχθηκε ότι η δέσµευση στην ηπαρίνη πραγµατοποιείται µέσω των δύο κεντρικών περιοχών του µορίου [112]. Επιπλέον µελέτες αποκάλυψαν ότι η HARP υπόκειται σε αλλαγές στη διαµόρφωσή της µετά από δέσµευσή της στην ηπαρίνη και ότι οι β-πτυχές του µορίου και το σύνολο των δισουλφιδικών δεσµών συµµετέχουν στη διαδικασία αυτή [121]. Οι αλυσίδες θειϊκής ηπαράνης διαφόρων πρωτεογλυκανών της κυτταρικής επιφάνειας ή του εξωκυττάριου υλικού, παρουσιάζουν και αυτές ισχυρή ικανότητα δέσµευσης της HARP. Εκτός από τη θειϊκή ηπαράνη (Heparan Sulfate, HS), η HARP έχει συγγένεια σε µικρότερο βαθµό µε τη θειϊκή δερµατάνη (Dermatan Sulfate, DS), τη θειϊκή χονδροϊτίνη Α (Chondroitin Sulfate A, CS-A) και C (CS-C), αλλά όχι µε τη θειϊκή κερατάνη (Keratan Sulfate, KS) [155]. Μελέτες έδειξαν ότι είναι δυνατή η αλληλεπίδραση της HARP µε δύο πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης (Heparan Sulfate Proteoglycans, HSPG) της κυτταρικής επιφάνειας, τις συνδεκάνες 1 και 3 (syndecan-1, syndecan-3). Η συνδεκάνη 3, η οποία ονοµάζεται επίσης και Ν-συνδεκάνη (N-syndecan), αλληλεπιδρά και δεσµεύεται ισχυρά στη HARP. Αυτή η HSPG εµπλέκεται στην προέκταση των νευριτών που 26

41 Εισαγωγή προκαλείται από τη HARP, αφού εάν χρησιµοποιηθούν αντισώµατα έναντι της Ν- συνδεκάνης ή πραγµατοποιηθεί επώαση των νευρώνων µε ηπαριτινάση, η δράση αυτή αναστέλλεται [156, 140]. Η HARP δεσµεύεται επίσης στην πρωτεογλυκάνη 6Β4, η οποία ονοµάζεται και φωσφακάνη (phosphacan). Η πρωτεογλυκάνη αυτή αντιπροσωπεύει την κύρια πρωτεογλυκάνη θειϊκής χονδροϊτίνης στον εγκέφαλο και αποτελεί µια εξωκυτταρικά τροποποιηµένη µορφή του διαµεµβρανικού υποδοχέα µε δράση φωσφατάσης τυροσινών β/ζ (Receptor-like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ, RPTPβ/ζ) [157]. Μέχρι σήµερα έχουν ανιχνευθεί τρεις διαφορετικές ισοµορφές της RPTPβ/ζ, δύο διαµεµβρανικές και µία εκκρινόµενη (γνωστή και ως φωσφακάνη), οι οποίες είναι αποτέλεσµα εναλλακτικής ωρίµανσης του µετάγραφου. Οι ισοµορφές της RPTPβ/ζ ανιχνεύονται στο αναπτυσσόµενο νευρικό σύστηµα, κυρίως στη γλοία και στα αστροκύτταρα και θεωρείται ότι παίζουν ρόλο στη µετανάστευση των νευρώνων και στον προσανατολισµό των νευριτών. Οι διαµεµβρανικές µορφές της RPTPβ/ζ εντοπίζονται σε ζώνες πολλαπλασιασµού, ενώ η φωσφακάνη κατανέµεται σε µεγάλες ποσότητες σε ολόκληρο τον εγκέφαλο. Επιπλέον, οι διαµεµβρανικές ισοµορφές του µορίου εκφράζονται στους κώνους µετανάστευσης νευρικών κυττάρων. Σε κυτταροκαλλιέργειες, η µετανάστευση των νευριτών που επάγεται από την παρουσία της HARP στο θρεπτικό µέσο, αναστέλλεται εάν χρησιµοποιηθούν αντισώµατα έναντι του εξωκυτταρικού τµήµατος της RPTPβ/ζ [157]. Πρόσφατα, αναδείχτηκε ο ρόλος της RPTPβ/ζ ως υποδοχέα της HARP στα ενδοθηλιακά κύτταρα από φλέβα ανθρώπινου οµφάλιου λώρου (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) και αποσαφηνίστηκε το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος της HARP στα κύτταρα αυτά. Η HARP µετά από τη δέσµευσή της στην RPTPβ/ζ επάγει τη µετανάστευση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων HUVEC. Η δέσµευση αυτή οδηγεί σε ενεργοποίηση της κινάσης Src, της κινάσης εστιακής προσκόλλησης FAK (Focal Adhesion Kinase), της 3-κινάσης των φωσφοϊνοσιτιδίων (PI3K) και των ERK. Επιπλέον, η µείωση της έκφρασης της RPTPβ/ζ, µε τη χρησιµοποίηση παρεµβαλλόµενου RNA, παρεµπόδισε τα ενδοκυττάρια σήµατα και την επακόλουθη επαγωγή της µετανάστευσης και διαφοροποίησης των κυττάρων που προκαλείται από τη HARP [158]. 27

42 Εισαγωγή Ο πιο πρόσφατα χαρακτηρισµένος υποδοχέας της HARP έχει δράση κινάσης της τυροσίνης και ονοµάζεται κινάση του αναπλαστικού λεµφώµατος (Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK). Πρόκειται για µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη µε µοριακή µάζα 200 kda. Η HARP δεσµεύεται στην εξωκυτταρική περιοχή της ALK µε υψηλή συγγένεια. Η δέσµευση αυτή είναι ειδική για τη συγκεκριµένη περιοχή του υποδοχέα και πιθανότατα πραγµατοποιείται µέσω του καρβοξυτελικού άκρου της HARP, και πιο συγκεκριµένα µε το τµήµα που περιλαµβάνει τα αµινοξέα [159]. έσµευση της HARP στην ALK έχει παρατηρηθεί σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [160]. Η δέσµευση της HARP στην ALK προάγει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασµό των επιθηλιακών κυττάρων SW-13 και των ινοβλαστών NIH3T3. Οι παραπάνω διαδικασίες φαίνεται ότι δροµολογούνται µέσω της κινάσης PI3K αλλά και του µονοπατιού των κινασών MAPΚ [161]. Ωστόσο, σύγχρονες αναφορές θέτουν υπό αµφισβήτηση την ικανότητα ενεργοποίησης του υποδοχέα ALK από τη HARP. Αφενός αντισώµατα ανταγωνιστές για τον υποδοχέα δεν ανέστειλαν τη µεταγωγή σήµατος από τη HARP, αφετέρου αντισώµατα αγωνιστές οδήγησαν στην ενεργοποίηση διαφορετικών µονοπατιού [162]. Πιθανώς η ικανότητα ενεργοποίησης της ALK από την HARP, εξαρτάται από τη µορφή µε την οποία παρουσιάζεται η τελευταία στον υποδοχέα. Έτσι, ενώ το µόριο δεν ενεργοποιεί την ALK, το αντίστοιχο πεπτίδιο των 15 kda, που προέχεται από πρωτεολυτική αποικοδόµηση της HARP, δύναται να ενεργοποιήσει τον υποδοχέα [163]. 28

43 Εισαγωγή 2.6. Βιολογικές δράσεις της HARP Ρόλος της HARP στην ανάπτυξη Η πρώτη αναφερθείσα δράση της HARP είναι η ικανότητά της να επάγει την προέκταση νευριτών σε νευρικά κύτταρα [108]. Μετέπειτα µελέτες έδειξαν ότι η HARP επάγει την προέκταση νευριτών µόνο σε νευρώνες που προέρχονται από την 17 η έως την 19 η ηµέρα ανάπτυξης του εµβρύου, ενώ δεν έχει ανάλογη δράση σε νευρώνες εµβρύων µεταξύ 20 ης και 21 ης ηµέρας ανάπτυξης [164]. Επιπλέον, η HARP παίζει σηµαντικό ρόλο στα γεγονότα που λαµβάνουν χώρα κατά τη διαφοροποίηση και την οργάνωση του εγκεφάλου [140]. Πρόσφατες µελέτες υποδεικνύουν τη HARP ως µόριο που ευθύνεται τόσο για την αναστολή πολλαπλασιασµού των πολυδύναµων κυττάρων του µετωπιαίου φλοιού, όσο και για την επαγωγή της διαφοροποίησής τους. Παράλληλα, η HARP αντισταθµίζει τη µιτογόνο δράση του FGF-2 στα κύτταρα αυτά [165]. Η HARP διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια ανάπτυξης του νευρικού συστήµατος και της µνήµης, καθώς ρυθµίζει το κατώφλιο επίπεδο της µακροχρόνιας ρύθµισης (Long-Term Potentiation, LTP) των νευρώνων της C1 περιοχής του ιππόκαµπου. Μύες, στους οποίους έχει απαλειφθεί το γονίδιο της HARP, εµφανίζουν σηµαντικά χαµηλότερα επίπεδα LTP, φαινόµενο το οποίο αναστρέφεται µετά από χορήγηση εξωγενούς HARP [166]. Επιπλέον, η HARP φαίνεται να συµµετέχει στη µορφογένεση των κυττάρων Purkinje στην αναπτυσσόµενη παρεγκεφαλίδα [167]. Όπως προαναφέρθηκε, η HARP εµπλέκεται στη δηµιουργία της νευροµυϊκής σύναψης, αφού επάγει τη συσσώρευση των υποδοχέων της ακετυλοχολίνης στον Xenopus και εντοπίζεται στην περιοχή όπου παρατηρείται η σύνδεση, δηλαδή ανάµεσα στους σωµίτες [148, 168]. Η HARP εµπλέκεται επίσης και στην οστεογένεση που επάγεται από τη µορφογενετική πρωτεΐνη των οστών (Bone Morphogenetic Protein, BMP), ρυθµίζοντας τη δράση της τελευταίας [169]. Επίσης επάγει τη χονδρογένεση στα αναπτυσσόµενα άκρα της όρνιθας [170], ενώ επάγει και τη µετανάστευση των οστεοβλαστών [171]. Τέλος, η HARP φαίνεται να έχει σηµαντικό ρόλο στη διαδικασία της σπερµατογένεσης, αφού υπάρχουν δεδοµένα που υποστηρίζουν ότι η καταστολή 29

44 Εισαγωγή της µπορεί να οδηγήσει σε στειρότητα. Όταν εµβρυικά κύτταρα µυών διαµολύνθηκαν µε ανενεργές µορφές του µορίου, αναπτύχθηκαν µη γόνιµοι χιµαιρικοί µύες. Οι µύες αυτοί, έφεραν ατροφικούς όρχεις, ενώ τα παραγόµενα από αυτούς σπερµατοζωάρια παρουσίαζαν µεγάλο ποσοστό απόπτωσης σε όλα τα στάδια διαφοροποίησής τους [172] HARP και κυτταρικός πολλαπλασιασµός Πολλές είναι οι αναφορές που καταδεικνύουν τη HARP ως µιτογόνο µόριο για πολλούς τύπους κυττάρων, όπως ενδοθηλιακά [106, 152], επιθηλιακά [173, 155], ινοβλάστες [174, 173] και λεία µυϊκά [118]. Εντούτοις, πολλοί ερευνητές αµφισβήτησαν τη µιτογόνο δράση της HARP, διατυπώνοντας την άποψη ότι η συγκεκριµένη δράση πιθανώς οφείλεται στην επιµόλυνση της HARP κατά τη διάρκεια της αποµόνωσης, µε άλλους αυξητικούς παράγοντες, όπως οι FGF [112, 164]. Παρόλα αυτά, αντισώµατα έναντι του FGF-2 δεν ήταν ικανά να αναστείλουν τη µιτογόνο δράση της HARP στα επιθηλιακά κύτταρα BEL, αποδεικνύοντας µε τον τρόπο αυτό ότι οι δύο αυξητικοί παράγοντες έχουν ανεξάρτητη δράση [175]. Μέχρι και σήµερα, η µιτογόνος δράση της HARP είναι ένα αµφιλεγόµενο θέµα, αφού υπάρχουν αντικρουόµενες αναφορές ανάλογα µε το είδος της HARP που χρησιµοποιείται και τον τύπο των κυττάρων που µελετώνται. Γενικά, σήµερα είναι αποδεκτό ότι υπάρχουν διάφορες µορφές του µορίου που ασκούν µια ποικιλία δράσεων [147, 175, 176, 163]. Πολύ πρόσφατα δεδοµένα υποστηρίζουν την άποψη ότι η πολυδιάστατη απόκριση διαφορετικών συστηµάτων στο µόριο της HARP, οφείλεται στη διαφορετική δράση ξεχωριστών τµηµάτων του µορίου. Τα τµήµατα αυτά του µορίου της HARP δύναται να σχηµατίζονται υπό την επίδραση των εκάστοτε συστατικών του µικροπεριβάλλοντος των κυττάρων [176], και να δρούν σε διαφορετικούς υποδοχείς [163]. 30

45 Εισαγωγή HARP και αγγειογένεση Η αγγειογένεση, ο σχηµατισµός νέων αιµοφόρων αγγείων από προϋπάρχοντα, είναι µια πολύπλοκη διαδικασία (Εικόνα 5) που χαρακτηρίζει ποικίλες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Αγγειογένεση κάτω από αυστηρό έλεγχο παρατηρείται στο αναπαραγωγικό σύστηµα των θηλυκών ατόµων στα θηλαστικά και κατά την επούλωση πληγών [177]. Ανεξέλεγκτη αγγειογένεση παρατηρείται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως η ρευµατοειδής αρθρίτιδα, η διαβητική αµφιβληστροειδοπάθεια, η ψωρίαση και η αιµαγγείωση. Τέλος, η ανάπτυξη καρκινικών όγκων και η µετάσταση είναι διαδικασίες εξαρτώµενες από την αγγειογένεση [178]. 31

46 Εισαγωγή Εικόνα 5: ιαδοχικά στάδια αγγειογένεσης. Α) Φυσιολογικό τριχοειδές αγγείο. Β) Έναρξη της αγγειογένεσης: Αγγειοδιαστολή, ενεργοποίηση αιµοπεταλίων, µακροφάγων και ενδοθηλιακών κυττάρων, αποκοκκίωση ιστιοκυττάρων, έκκριση πρωτεολυτικών ενζύµων, αποικοδόµηση Βασικής Μεµβράνης και αύξηση της διαπερατότητας του αγγείου. Γ) Έναρξη σχηµατισµού αυλού: Σχηµατισµός ψευδοποδίων, αποικοδόµηση εξωκυτταρικού υλικού, µετανάστευση και πολλαπλασιασµός ενδοθηλιακών κυττάρων και σχηµατισµός εκβλαστήµατος. ) ηµιουργία αναστοµώσεως (θηλειάς): Σχηµατισµός της Βασικής Μεµβράνης και των συνδέσµων κυττάρου-κυττάρου, ωρίµανση τοιχώµατος, εγκαθίδρυση αιµατικής ροής και µετανάστευση περικυττάρων. ΒΜ: Βασική Μεµβράνη, ΕΚ: Ενδοθηλιακά Κύτταρα, ΕΥ: Εξωκυτταρικό υλικό, Ι: Ιστιοκύτταρα, Μ: Μακροφάγα, Π: Περικύτταρα, Α: Αιµοπετάλια και ΕΑ: Ερυθρά Αιµοσφαίρια HARP και φυσιολογική αγγειογένεση Ένας πιθανός ρόλος της HARP στη φυσιολογική αγγειογένεση διαφάνηκε για πρώτη φορά, όταν ανιχνεύθηκε το mrna και αποµονώθηκε η πρωτεΐνη της από αγγειοβριθείς ιστούς, όπως είναι η µήτρα βοός και η µήτρα επίµυος [179, 139]. Πληθώρα αναφορών υποδεικνύει µια θετική συσχέτιση της HARP µε την αγγειογένεση in vivo, αλλά και διαδικασίες που σχετίζονται µε την in vitro 32

47 Εισαγωγή αγγειογένεση. Πολλές in vitro µελέτες δείχνουν ότι η HARP επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση πολλών τύπων ενδοθηλιακών κυττάρων [106, 180, 153, 181, 182, 183, 151]. Επιπλέον, η HARP διεγείρει τα ενδοθηλιακά κύτταρα ώστε να σχηµατίσουν αυλούς in vitro, σε µια ποικιλία πηκτωµάτων όπως κολλαγόνου [180, 182], ινώδους [182] και matrigel [182, 151]. Η ανίχνευση τόσο του µηνύµατος, όσο και της πρωτεΐνης της HARP σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC παραπέµπει σε ένα πιθανό αυτοκρινή ρόλο για τον αυξητικό αυτό παράγοντα [122]. Η αγγειογενετική δράση της HARP έχει επιπλέον διαπιστωθεί και σε in vivo συστήµατα µελέτης, όπως η χοριοαλλαντοϊκή µεµβράνη εµβρύου όρνιθας (CAM assay) και εµφυτεύµατα matrigel σε µυς [182, 159]. Πρόσφατα δεδοµένα της ερευνητικής µας οµάδας, προτείνουν ότι η HARP που εκκρίνεται από κύτταρα καρκίνου του προστάτη (LNCaP) επάγει την αγγειογένεση στην CAM εµβρύου όρνιθας. Όταν στα κύτταρα αυτά κατεστάλη η έκφραση της HARP, παρατηρήθηκε σηµαντική αναστολή της επαγωγής του σχηµατισµού νέων αγγείων [151]. Ο εντοπισµός των περιοχών της HARP που είναι υπεύθυνες για τη βιολογική δράση της, ειδικά όσον αφορά στην αγγειογένεση, θεωρείται πολύ σηµαντικός. Τα µέχρι σήµερα αποτελέσµατα υποστηρίζουν ότι διαφορετικές περιοχές του µορίου µπορούν να έχουν ακόµη και αντίθετες δράσεις. Τα δύο πλούσια σε λυσίνη άκρα µπορούν να επάγουν την αγγειογένεση τόσο in vitro όσο και in vivo [152, 182]. Επιπλέον, τόσο το τµήµα που περιλαµβάνει τα τελευταία 25 αµινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου του µορίου, όσο και αυτό που περιλαµβάνει τα αµινοξέα , θεωρούνται πολύ σηµαντικά για τη αγγειογενετική δράση της HARP [115, 172]. Η πλασµίνη µπορεί να αποικοδοµήσει το µόριο της HARP και να δηµιουργήσει πέντε διαφορετικά πεπτίδια που επηρεάζουν µε διαφορετικό τρόπο την αγγειογένεση in vivo και in vitro [176]. Η HARP αποτελεί υπόστρωµα για την τρυψίνη και τη χυµοτρυψίνη [125], ενώ έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι και άλλα πρωτεολυτικά ένζυµα είναι πιθανόν να αποικοδοµούν τη HARP, ρυθµίζοντας µε τον τρόπο αυτό την αγγειογενετική της δράση. Η παραπάνω υπόθεση ενισχύεται από την παρατήρηση ότι πεπτίδια που προκύπτουν µετά από πρωτεόλυση της HARP, ανιχνεύονται στο θρεπτικό µέσο ενδοθηλιακών κυττάρων και αρκετών καρκινικών κυτταρικών σειρών [152, 122]. 33

48 Εισαγωγή Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η πρόσφατη παρατήρηση άµεσης αλληλεπίδρασης της HARP και του VEGF 165 [184]. Ο VEGF είναι από τους σηµαντικότερους επαγωγείς αγγειογένεσης µε διττό ρόλο, αφού συµµετέχει στο σχηµατισµό νέων αγγείων αλλά και στην οµοιόστασή τους [178, 185]. Προτείνεται ότι η αλληλεπίδραση που πραγµατοποιείται µέσω των δύο β-πτυχωτών δοµών του µορίου της HARP έχει ως αποτέλεσµα την αναστολή της αγγειογενετικής δράσης του VEGF 165 [176, 184]. Τέλος, φαίνεται ότι η HARP µπορεί να επηρεάζει τη λειτουργία του αγγειακού συστήµατος γενικότερα, καθώς αποτελεί ρυθµιστή του συστήµατος ρενίνηςαγγειοτενσίνης. Σε αορτή από µύες, όπου είχε απαλειφθεί το γονίδιο της HARP, παρατηρήθηκαν πολύ χαµηλότερα επίπεδα του mrna του ενζύµου µετατροπής της αγγειοτενσίνης (Angiotensin Converting Enzyme, ACE). Αντίθετα, παρατηρήθηκε πολύ µεγάλη αύξηση στα ώριµα µετάγραφα των υποδοχέων της αγγειοτενσίνης ΙΙ, τύπου 1 και 2 [186]. Τα αποτελέσµατα αυτά είναι ιδιαίτερης σηµασίας, καθώς το σύστηµα ρενίνης-αγγειοτενσίνης εµπλέκεται σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες, µεταξύ των οποίων και η αγγειογένεση HARP και αγγειογένεση σε παθολογικές καταστάσεις Ο αγγειογενετικός ρόλος της HARP σχετίζεται µε την παθογένεση του ενδοµητρίου, µια ήπια γυναικολογική διαταραχή [187]. Επιπλέον στα ενήλικα άτοµα, η HARP εντοπίζεται σε καταστάσεις φλεγµονής, όπως κατά τη ρευµατοειδή αρθρίτιδα, όπου µπορεί να δρα ως παρακρινής αγγειογενετικός παράγοντας. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP είναι ιδιαίτερα αυξηµένα στο υγρό των αρθρώσεων ασθενών µε ρευµατοειδή αρθρίτιδα και λιγότερο σε ασθενείς µε οστεοαρθρίτιδα [188]. Παρόλα αυτά, είναι αξιόλογη η παρατήρηση ότι στα πρώτα στάδια της οστεοαρθρίτιδας, τα επίπεδα της HARP είναι επίσης αυξηµένα [189]. Πολλές βιβλιογραφικές αναφορές αναδεικνύουν την HARP ως σηµαντικό υποψήφιο παράγοντα, που µεσολαβεί στην επαγόµενη από καρκινικούς όγκους αγγειογένεση. Είναι πλέον αποδεκτό ότι η δηµιουργία νέων αγγείων αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη ενός όγκου, αφού µε τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται η τροφοδοσία του µε οξυγόνο και µε τα απαραίτητα θρεπτικά 34

49 Εισαγωγή συστατικά [190]. Επιπρόσθετα, αρκετές είναι οι έρευνες που συσχετίζουν την αγγειοβρίθεια των όγκων µε την ικανότητά τους να προκαλούν µεταστάσεις [191, 192]. Θρεπτικό µέσο από καλλιέργειες κυττάρων καρκίνου επινεφριδίων ανθρώπου (SW-13), που είχαν επιµολυνθεί ώστε να υπερεκφράζουν HARP, είχε µιτογόνο δράση σε ενδοθηλιακά κύτταρα διαφόρων τύπων [173]. Κατά παρόµοιο τρόπο, η πρωτεΐνη HARP που αποµονώθηκε από κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύµονα, διέγειρε τον πολλαπλασιασµό των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC [193]. Όταν κύτταρα µελανώµατος ανθρώπου (1205Lu), στα οποία είχε κατασταλεί η έκφραση της HARP, ενέθηκαν σε αθυµικούς µύες, επιβραδύνθηκε σηµαντικά τόσο η αύξηση των όγκων, όσο και η επαγόµενη από αυτούς αγγειογένεση. Παράλληλα, παρατηρήθηκαν αυξηµένα επίπεδα απόπτωσης των συγκεκριµένων κυττάρων και µειωµένη µεταστατική ικανότητα [194]. Επίσης, κύτταρα MCF-7 από καρκίνωµα µαστού ανθρώπου, τα οποία είχαν επιµολυνθεί ώστε να υπερεκφράζουν HARP, προήγαγαν τον πολλαπλασιασµό ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro και το σχηµατισµό νέων αγγείων in vivo [195]. Τέλος, µια σχετικά πρόσφατη αναφορά υποδεικνύει τη HARP ως ένα πιθανό ρυθµιστικό µόριο που προσδίδει σε καρκινικά κύτταρα την ικανότητα µετάστασης, µε τρόπο ανεξάρτητο από τη διαδικασία της διείσδυσης (invasion). Μετά από έλεγχο µιας πλειάδας γνωστών αγγειογενετικών παραγόντων, µόνον η HARP βρέθηκε να ελέγχει την αγγειογένεση και την επακόλουθη µεταστατική ικανότητα κυτταρικής σειράς από καρκίνο µαστού τρωκτικού (MCH 66) [196]. 35

50 Εισαγωγή 2.7. HARP και καρκίνος Η καρκινογένεση είναι µια πολυσύνθετη διαδικασία που περιλαµβάνει τη µετατροπή των φυσιολογικών κυττάρων σε καρκινικά (µια διαδικασία που καλείται µετασχηµατισµός, transformation), την απώλεια ικανότητας διαφοροποίησης των κυττάρων, τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό και τη µετάστασή τους. Οι παραπάνω αποκρίσεις, πιστεύεται ότι πυροδοτούνται από αυξητικούς παράγοντες που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα, παίζοντας καθοριστικό ρόλο στην επακόλουθη ανάπτυξη και µετάσταση των καρκινικών όγκων [197] Έκφραση της HARP και υποδοχέων της στον καρκίνο Ο πιθανός ρόλος της HARP στον καρκίνο, προτάθηκε µετά από αποµόνωση του αυξητικού αυτού παράγοντα από το θρεπτικό µέσο καλλιεργειών επιθηλιακών κυττάρων καρκίνου του µαστού (MDA-MB-231) [198]. Έλεγχος µιας πληθώρας κυτταρικών σειρών καρκίνου ανθρώπου, καθώς και δειγµάτων όγκων, έδειξε ότι η HARP εκφράζεται στις 18 από τις 36 κυτταρικές σειρές που ελέγχθηκαν, καθώς και στο 60% των δειγµάτων από όγκους µαστού. Αξιοσηµείωτο είναι το γεγονός ότι οι καρκινικές κυτταρικές σειρές στις οποίες εκφράζεται η HARP είναι διαφορετικής προέλευσης, για παράδειγµα µελάνωµα, καρκίνος του µαστού και του προστάτη και χοριοκαρκίνωµα (Πίνακας 2) [173]. Εξαιτίας της µεσοδερµικής και νευροεξωδερµικής της προέλευσης, δεν προκάλεσε έκπληξη το γεγονός ότι υψηλά επίπεδα έκφρασης της HARP παρατηρήθηκαν σε µηνιγγιώµατα [199], νευροβλαστώµατα [200], γλοιοβλαστώµατα [201], µελάνωµα [202] και σε κυτταρικές σειρές µικροκυτταρικού καρκινώµατος του πνεύµονα (Small Cell Lung Cancer, SCLC) [193]. Αξίζει να αναφερθεί στο σηµείο αυτό ότι η HARP θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί ως µοριακός µάρτυρας για τη διάγνωση του µικροκυτταρικού καρκινώµατος πνεύµονα, αφού το mrna της ανιχνεύεται συχνότερα και σε υψηλότερα επίπεδα συγκριτικά µε το µη µικροκυτταρικό καρκίνωµα του πνεύµονα [193]. Επιπλέον, υψηλά επίπεδα έκφρασης της HARP έχουν παρατηρηθεί στο 78% των δειγµάτων όγκων από ασθενείς µε καρκίνο του παγκρέατος [110]. Πρόσφατες αναφορές επισηµαίνουν την έκφραση της HARP σε κακοήθεις όγκους των όρχεων [203], σε καρκίνο αυχένος της µήτρας [204], καθώς και σε συµπαγείς όγκους παιδιών [205]. Τέλος, η έκφραση της HARP έχει 36

51 Εισαγωγή συσχετιστεί και µε διαδικασίες που προηγούνται της ανάπτυξης νεοπλασίας του ήπατος [206]. Πίνακας 2: Ανίχνευση του µηνύµατος της HARP σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και ιστούς [122]. Το γεγονός ότι η HARP µπορεί να δρα ως ογκογόνος παράγοντας, ενισχύεται από δεδοµένα που αναφέρουν αυξηµένη έκφραση των υποδοχέων της σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές και δείγµατα όγκων ανθρώπου. Έτσι, η ALK έχει παρατηρηθεί ότι υπερεκφράζεται στο γλοιοβλάστωµα, στο 35% κυτταρικών σειρών καρκίνου του µαστού και στο 50% δειγµάτων όγκων από ασθενείς µε καρκίνο του µαστού [207]. Η RPTPβ/ζ υπερεκφράζεται επίσης σε µια πληθώρα καρκίνων, όπως στο γλοιοβλάστωµα και στο νευροβλάστωµα [209], στο 37

52 Εισαγωγή µελάνωµα και στον καρκίνο αυχένος µήτρας [204]. Ωστόσο, η έκφραση της RPTPβ/ζ είναι µειωµένη στον καρκίνο του παχέος εντέρου [210] Ρόλος της HARP στον καρκίνο Η πρώτη αναφορά εµπλοκής της HARP στην ανάπτυξη των όγκων περιγράφηκε το 1992 από τον Wellstein και την ερευνητική του οµάδα, όταν αποµονώθηκε από το θρεπτικό µέσο καλλιέργειας των κυττάρων MDA-MB-231 και φάνηκε ότι ανασυνδυασµένη HARP ευκαρυωτικής προέλευσης, επάγει τη µίτωση επιθηλιακών κυττάρων. Επίσης, η συγκεκριµένη ερευνητική οµάδα ανίχνευσε τη HARP και στο θρεπτικό µέσο καλλιέργειας κυττάρων µελανώµατος ανθρώπου [114]. Η ανάδειξη της HARP ως σηµαντικού καρκινικού αυξητικού παράγοντα επιβεβαιώθηκε από την ίδια ερευνητική οµάδα. Συγκεκριµένα, έδειξαν ότι το θρεπτικό µέσο καλλιέργειας κυττάρων SW-13, που είχαν διαµολυνθεί µε το cdna της HARP, διεγείρει ενδοθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες και τα ίδια τα κύτταρα SW- 13. Επιπλέον, τα κύτταρα SW-13 απέκτησαν αυτονοµία στην ανάπτυξή τους σε τρισδιάστατο περιβάλλον και ανεξαρτησία από την προσκόλληση σε υπόστρωµα (σε πήκτωµα soft agar), ενώ ένεση των κυττάρων σε αθυµικούς µύες είχε ως αποτέλεσµα την εγκαθίδρυση και ανάπτυξη όγκων [173]. Κατά αντιστοιχία, η HARP που αποµονώθηκε από κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύµονα, προήγαγε τον πολλαπλασιασµό και την ανάπτυξη σε soft agar διαφόρων τύπων κυττάρων, όπως ενδοθηλιακών, ινοβλαστών και κυττάρων SW-13 [193]. Αντίθετα, η HARP που παράγεται από κύτταρα γλοιώµατος, δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων αυτών, αλλά διέγειρε τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση κυττάρων µικρογλοίας [201]. Ίσως στην περίπτωση αυτή, η HARP δρα ως παρακρινής αυξητικός παράγοντας, που παράγεται από τα γλοιώµατα και δρα σε ενδοθηλιακά κύτταρα και κύτταρα µικρογλοίας. Μια πρόσφατη αναφορά της ερευνητικής µας οµάδας αναδεικνύει τη HARP ως σηµαντικό αυξητικό παράγοντα για τα επιθηλιακά κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου προστάτη, LNCaP. Η HARP ανιχνεύθηκε στο υγρό θρεπτικό µέσο καλλιέργειας των κυττάρων, ενώ ταυτόχρονα ανασυνδυασµένη HARP βακτηριακής προέλευσης διέγειρε τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων 38

53 Εισαγωγή LNCaP. Παράλληλα, υγρό θρεπτικό µέσο καλλιέργειας κυττάρων LNCaP προκάλεσε επαγωγή του πολλαπλασιασµού και της µετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC και προήγαγε το σχηµατισµό αυλών σε πήκτωµα matrigel. Φαίνεται λοιπόν ότι η HARP αποτελεί σηµαντικό αυξητικό παράγοντα στον καρκίνο του ανθρώπινου προστάτη, αφού έχει τόσο αυτοκρινή δράση στα επιθηλιακά κύτταρα, όσο και παρακρινή δράση σε ενδοθηλιακά κύτταρα [151]. Το γεγονός ότι το γονίδιο της HARP εκφράζεται στον καρκίνο του µαστού και σε κύτταρα µελανώµατος, αλλά όχι σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα µαστού και σε µελανοκύτταρα [114], δηµιούργησε υπόνοιες ότι το συγκεκριµένο γονίδιο πιθανώς επάγεται κατά την εγκαθίδρυση καρκινικού φαινότυπου στα κύτταρα (transformation). Η διερεύνηση της υπόθεσης αυτής θα µπορούσε να παρέχει ένα ελκυστικό µοντέλο για την κατανόηση τόσο των διαδικασιών που µεσολαβούν ώστε ένα κύτταρο να µετασχηµατιστεί σε καρκινικό, όσο και φυσιολογικών διαδικασιών που ενέχονται στη ρύθµιση της ανάπτυξης [211]. Πράγµατι, αποδείχθηκε ότι υπερέκφραση της HARP σε κυτταρική σειρά ινοβλαστών (NIH 3T3) οδήγησε σε καρκινικό φαινότυπο. Το συµπέρασµα αυτό εξήχθη από µελέτη τεσσάρων, ανεξάρτητων µεταξύ τους, κριτηρίων: Του αριθµού των κυττάρων όταν είναι προσκολληµένα σε υπόστρωµα, του σχηµατισµού εστιών προσκόλλησης, της ανάπτυξης των κυττάρων σε συνθήκες ανεξάρτητες από προσκόλληση σε υπόστρωµα και του σχηµατισµού όγκων σε αθυµικούς µύες [212]. Παρόλο που δεν διαλευκάνθηκε ο ακριβής µηχανισµός µε τον οποίο η HARP προκαλεί µετασχηµατισµό των κυττάρων NIH 3T3, η απρόσµενη εµφάνιση και ανάπτυξη όγκων στους αθυµικούς µύες έδειξε ότι υπερέκφραση του γονιδίου της HARP µπορεί να προκαλέσει σηµαντική αποδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, µε επακόλουθη ανεξέλεγκτη αύξηση. Όπως προαναφέρθηκε, πέραν της µιτογόνου δράσης της, η HARP επάγει την in vitro προέκταση νευριτών. Η δράση της αυτή, επίσης υποδεικνύει ότι η HARP επηρεάζει τη δοµή του κυτταροσκελετού ή/και δρα ως µόριο προσκόλλησης προκειµένου να διεκπεραιωθεί τόσο η προέκταση των νευριτών, όσο και η ανάπτυξη σε πήκτωµα soft agar. Σε αντίθεση µε τα παραπάνω, έχει προταθεί ότι η υπερέκφραση της HARP στα κύτταρα NIH 3T3 φαίνεται περισσότερο να εµπλέκεται στην κυτταρική ηρεµία παρά σ ένα καρκινογενετικό φαινότυπο. Συγκεκριµένα, η HARP ανιχνεύθηκε στο 39

54 Εισαγωγή θρεπτικό µέσο των φυσιολογικών κυττάρων, κάτι το οποίο δεν συνέβη όταν αυτά µετασχηµατίστηκαν από το ras ή άλλα ογκογονίδια [213]. Σε καρκινικά κύτταρα µαστού ανθρώπου, η HARP φαίνεται να κατέχει πρωταγωνιστικό ρόλο στη ρύθµιση και διατήρηση του καρκινικού φαινότυπου. Κύτταρα MDA-MB-231 διαµολύνθηκαν µε µεταλλαγµένο cdna της HARP, ώστε να εκφράζουν µια µορφή της πρωτεΐνης που δηµιουργεί ετεροδιµερή µε την ενδογενή HARP, εµποδίζοντας µε τον τρόπο αυτό τη δράση της τελευταίας. Παρατηρήθηκε ότι η παραπάνω παρέµβαση οδήγησε σε ανάσχεση του πολλαπλασιασµού των κυττάρων και του σχηµατισµού αποικιών σε πήκτωµα soft agar, ενώ ταυτόχρονα ανεστάλη πλήρως ο σχηµατισµός όγκων σε αθυµικούς µύες [214]. Τα αποτελέσµατα αυτά προτείνουν ότι η συστατική έκφραση της HARP θα µπορούσε να είναι καθοριστικής σηµασίας για τον in vivo επιθετικό φαινότυπο καρκίνων του µαστού. Προκειµένου να διαλευκανθεί ο µηχανισµός µε το οποίο η HARP εµπλέκεται στο µετασχηµατισµό των κυττάρων, ο Duel και η ερευνητική του οµάδα δηµιούργησαν µια σειρά ανασυνδυασµένων πλασµιδίων, στα οποία είχαν κλωνοποιήσει διαφορετικά τµήµατα του µορίου της HARP. Κύτταρα NIH 3T3 διαµολύνθηκαν µε τα πλασµίδια αυτά και µελετήθηκε η ικανότητα µετασχηµατισµού των κυττάρων αυτών σε καρκινικά. ιαπιστώθηκε ότι το τµήµα που περιλαµβάνει τα αµινοξέα του µορίου της HARP, είναι απαραίτητο για το µετασχηµατισµό των κυττάρων NIH 3T3. Επιπλέον, τα πλούσια σε λυσίνη άκρα του µορίου ήταν απαραίτητα για την επαγόµενη, από το παραπάνω πεπτίδιο, έναρξη της διαδικασίας του µετασχηµατισµού [172]. Πρόσφατες µελέτες αναφέρουν και το καρβοξυτελικό τµήµα του µορίου της HARP (που περιλαµβάνει τα τελευταία 26 αµινοξέα), ως απαραίτητο για τη µιτογόνο και αγγειογενετική δράση, καθώς και για διαδικασίες που σχετίζονται µε το µετασχηµατισµό των κυττάρων [115, 159]. Σε µια προσπάθεια περαιτέρω εµβάθυνσης στον τρόπο µε τον οποίο εκπληρώνονται όλες οι προαναφερθείσες δράσεις της HARP, διαπιστώθηκε ότι η δέσµευσή της στον υποδοχέα ALK και η επακόλουθη µεταγωγή σήµατος, αποτελούν προϋπόθεση για την ανάπτυξη πολλών τύπων καρκίνου. Καταστολή της έκφρασης της ALK σε κύτταρα καρκίνου του µαστού (Hs578T), ανέστειλε σηµαντικά την ανάπτυξη όγκων σε αθυµικούς µύες και παρέτεινε την επιβίωσή τους. Παρατηρήθηκε επίσης σηµαντική επαγωγή της απόπτωσης µέσα στους 40

55 Εισαγωγή όγκους [215], κάτι το οποίο αναφέρθηκε και για την κυτταρική σειρά γλοιοβλαστώµατος U87MG [207]. Στην ανάπτυξη του γλοιοβλαστώµατος εµπλέκεται επιπλέον και ο υποδοχέας RPTPβ/ζ, αφού πρόσφατα δεδοµένα δείχνουν µια ρυθµιστική δράση του στη µετανάστευση των κυττάρων. Μάλιστα προτείνεται ότι αντισώµατα έναντι του RPTPβ/ζ, θα αποτελούσαν χρήσιµα θεραπευτικά εργαλεία για όγκους του εγκεφάλου [209] Η HARP ως διαγνωστικός µάρτυρας για τύπους καρκίνου Μελέτες σε µύες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα της HARP στον ορό αίµατος σχετίζονται άµεσα µε το µέγεθος του όγκου. Στον άνθρωπο, αυξηµένα επίπεδα HARP έχουν ανιχνευθεί στον ορό αίµατος ασθενών µε καρκίνο του παγκρέατος και του κόλον του εντέρου, κάτι το οποίο δεν παρατηρείται σε περιπτώσεις καρκίνου του στοµάχου. Και στα δύο είδη (µυς και άνθρωπος), τα επίπεδα της HARP µειώνονται αισθητά µετά από επιτυχή αποµάκρυνση του όγκου [110]. Μια πιο λεπτοµερής ανάλυση έδειξε ότι στον ιστό του παγκρέατος η έκφραση της HARP αυξάνεται σηµαντικά σε περιπτώσεις φλεγµονής (35%) και καρκίνου (65%) του συγκεκριµένου ιστού. Επίσης, αυξηµένα επίπεδα της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν στον ορό αίµατος ασθενών µε χρόνια παγκρεατίτιδα, µια ασθένεια που συνήθως προηγείται του καρκίνου του παγκρέατος [216]. Από κλινικής πλευράς, κατά τη διάγνωση είναι δύσκολο να διακριθεί ο καρκίνος του παγκρέατος από τη χρόνια παγκρεατίτιδα. Γίνεται λοιπόν σαφές, ότι θα είχε µεγάλη κλινική αξία ένας διαγνωστικός µάρτυρας που θα επέτρεπε τη διάκριση των ασθενειών αυτών [217]. Επιπλέον, η HARP θα µπορούσε να είναι ένας νέος διαγνωστικός µάρτυρας για τον καρκίνο των όρχεων, καθώς βρέθηκε ότι τα επίπεδά της ήταν αυξηµένα στον ορό αίµατος ασθενών, µε ιδιαίτερη αύξηση στα πρώϊµα στάδια της νόσου [203]. Τέλος, πρόσφατα δεδοµένα αναφέρουν αυξηµένα επίπεδα της HARP στον ορό αίµατος ασθενών µε νευροβλάστωµα, γλοίωµα [218] και µελάνωµα [219] (Πίνακας 3). 41

56 Εισαγωγή Πίνακας 3: Ανίχνευση της πρωτεΐνης της HARP στον ορό αίµατος ασθενών µε διαφορετικό τύπο καρκίνου Η HARP ως µόριο-στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου Έχει αποδειχθεί ότι αρκετοί αυξητικοί παράγοντες έχουν ογκογενετική και αγγειογενετική δράση, ενώ αυξηµένα επίπεδά τους ανιχνεύονται σε καρκινικούς ιστούς. Έτσι, θα µπορούσαν να έχουν αναπτυχθεί πολλές θεραπευτικές προσεγγίσεις µε στόχο τους συγκεκριµένους παράγοντες. Ωστόσο, η δυσκολία εφαρµογής τέτοιων θεραπευτικών προσεγγίσεων, έγκειται στο γεγονός ότι οι αυξητικοί αυτοί παράγοντες εκφράζονται ταυτόχρονα και σε φυσιολογικά κύτταρα, διαδραµατίζοντας σηµαντικό ρόλο σε ποικίλες βιολογικές λειτουργίες. Στις µέρες µας αποτελεί πρόκληση η ανίχνευση αυξητικών παραγόντων που παρουσιάζουν ένα αυστηρό πρότυπο έκφρασης, κυρίως σε καρκινικά κύτταρα. Όπως προαναφέρθηκε, η HARP παρουσιάζει περιορισµένο πρότυπο έκφρασης στους ιστούς του ενήλικα ανθρώπου, γεγονός που την καθιστά ελκυστική ως θεραπευτικό µόριο-στόχο. Όταν σε κύτταρα µελανώµατος ανθρώπου (WM852) που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του mrna της HARP, κατεστάλη η έκφρασή της µε χρησιµοποίηση ριβοζοενζύµων, µειώθηκε ο αριθµός των αποικιών σε πήκτωµα soft agar και επιβραδύνθηκε η ανάπτυξη όγκων σε µύες [220]. Παροµοίως, η καταστολή της έκφρασης της HARP σε άλλη κυτταρική σειρά µελανώµατος (1205Lu), οδήγησε σε αναστολή αύξησης του όγκου και της αγγειογένεσης σε αθυµικούς µύες [194]. Η χρησιµοποίηση ριβοζοενζύµων έναντι του mrna της HARP έχει εφαρµοσθεί επιπλέον σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος (Colo357) και είχε ως αποτέλεσµα την αναχαίτιση του πολλαπλασιασµού των κυττάρων, του σχηµατισµού αποικιών 42

57 Εισαγωγή σε πήκτωµα soft agar και της ανάπτυξης όγκων σε ζώα. Η προσθήκη HARP στα συγκεκριµένα κύτταρα, ανέστρεψε εν µέρει τη δράση των ριβοζοενζύµων [208]. Θα ήταν πολύ ενδιαφέρον να διευκρινιστεί εάν ο φαινότυπος και άλλων καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν τη HARP, δύναται να επηρεαστεί από ριβοζοένζυµα έναντι αυτής, καθώς και σε ποιο βαθµό ο συγκεκριµένος αυξητικός παράγοντας επηρεάζει την ανάπτυξή τους in vivo. Απ αυτήν την άποψη, θα ήταν εξαιρετικής σηµασίας η ανάπτυξη και δραστικότητα ριβοζοενζύµων έναντι της HARP στο πλειόµορφο γλοιοβλάστωµα, αφού όπως έχει δειχθεί είναι ένας τύπος καρκίνου που χρησιµοποιεί την HARP ως κύριο αγγειογενετικό παράγοντα [221]. Σε µια σχετικά πρόσφατη έρευνα, χρησιµοποιήθηκαν ριβοζοένζυµα έναντι της ενδογενούς ALK σε κύτταρα γλοιοβλαστώµατος (487MG). ιαπιστώθηκε ότι παρεµποδίστηκε, η επαγόµενη από τη HARP φωσφορυλίωση της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Akt. Επιπρόσθετα, η αναστολή έκφρασης της ALK επέφερε αύξηση της ευαισθησίας των κυττάρων σε έναν κυτταροτοξικό παράγοντα (σισπλατίνη) που χρησιµοποιείται στη θεραπεία του γλοιοβλαστώµατος [207]. Μια διαφορετική γενετική προσέγγιση χρησιµοποιήθηκε πρόσφατα προκειµένου να κατασταλεί η έκφραση της HARP στα κύτταρα µελανώµατος 1205Lu. Χρησιµοποιήθηκε ως φορέας ένας αδενοϊός, στον οποίο είχε κλωνοποιηθεί νουκλεοτιδική αλληλουχία συµπληρωµατική του mrna της HARP (antisense, AS). Η ανάπτυξη µελανώµατος ανεστάλη σηµαντικά όταν τα συγκεκριµένα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε τρισδιάστατο περιβάλλον, σε πήκτωµα soft agar και σε µύες που είχε κατασταλεί το ανοσοποιητικό τους σύστηµα (SCID mice). Αξιοσηµείωτη ήταν η παρατήρηση ότι µειώθηκε η έκφραση της κυκλίνης Ε (ρυθµιστικό µόριο του κυτταρικού κύκλου), ενώ αυξήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 (αναστολέας του κυτταρικού κύκλου) [220]. Παρόµοια αποτελέσµατα ελήφθησαν από την ερευνητική µας οµάδα, όταν κατεστάλη η έκφραση της HARP στην καρκινική κυτταρική σειρά ανθρώπινου προστάτη LNCaP. Συγκεκριµένα χρησιµοποιήθηκε πλασµιδιακός φορέας στον οποίο είχε κλωνοποιηθεί αλληλουχία antisense έναντι του mrna της HARP. Η µείωση έκφρασης της HARP προκάλεσε σηµαντική αναστολή του πολλαπλασιασµού και της µετανάστευσης των κυττάρων, καθώς και τον αριθµό αποικιών σε πήκτωµα 43

58 Εισαγωγή soft agar. Παράλληλα αναχαιτίστηκε η παρακρινής αγγειογενετική δράση της HARP in vitro και in vivo [151]. 44

59 Εισαγωγή Σύνοψη Η HARP ανήκει σε µια νέα οικογένεια αυξητικών παραγόντων που παρουσιάζουν συγγένεια για την ηπαρίνη. Η HARP εκφράζεται διαφορικά κατά τη διάρκεια της πρώιµης ανάπτυξης, αλλά η έκφρασή της µειώνεται σταθερά µετά τη γέννηση. Η HARP εκδηλώνει σηµαντικές βιολογικές δράσεις, συµπεριλαµβανοµένων των εξής: Μιτογόνο, αντιαποπτωτική, χηµειοτακτική, αγγειογενετική και ικανότητα µετασχηµατισµού κυττάρων σε καρκινικά. Η HARP εκφράζεται σε πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές και όγκους διαφορετικής προέλευσης. Τα αυξηµένα επίπεδα της HARP στον ορό αίµατος ασθενών µε καρκίνο, καθιστούν τον παράγοντα αυτό υποψήφιο διαγνωστικό µάρτυρα για πολλούς τύπους καρκίνου. Το περιορισµένο πρότυπο έκφρασης της HARP στον ενήλικα άνθρωπο, την καθιστά ελκυστική ως µελλοντικό θεραπευτικό µόριο-στόχο. 45

60 Εισαγωγή 3. AP Γενικά Ο µεταγραφικός παράγοντας AP-1 (Activator Protein-1) έχει ταυτοποιηθεί εδώ και περίπου 20 χρόνια [223, 224, 225] και οι οµόλογες πρωτεΐνες στους ρετροϊούς ακόµη νωρίτερα [226]. Ωστόσο, η βιολογική του σηµασία και οι φυσιολογικές λειτουργίες των συστατικών του αποτελούν, ακόµη και σήµερα, αντικείµενο έρευνας. Πρόσφατα ερευνητικά δεδοµένα προσεγγίζουν τον τρόπο µε τον οποίο ο παράγοντας αυτός ελέγχει τον πολλαπλασιασµό, την επιβίωση και το θάνατο των κυττάρων. Οι πρωτεΐνες που αποτελούν τον AP-1 είναι γνωστές ως bzip πρωτεΐνες (basic leucine-zipper proteins), αφού διµερίζονται µέσω ενός µοτίβου-φερµουάρ λευκίνης. Οι πρωτεΐνες αυτές περιέχουν επιπλέον µια βασική περιοχή, µεσω της οποίας αλληλεπιδρούν µε τη δοµή του DNA (Εικόνα 6.Α). Στα θηλαστικά, τα πρωτεϊνικά σύµπλοκα του AP-1 αποτελούν οµοδιµερή ή ετεροδιµερή, που προέρχονται από συνδυασµό µελών των οικογενειών πρωτεϊνών Jun (c-jun, JunB και JunD), Fos (c-fos, FosB, Fra-1 και Fra-2), των πρωτεϊνών που διµερίζονται µε τις Jun (Jun Dimerization Partners, JDP1 και JDP2) και τους µεταγραφικούς παράγοντες-ενεργοποιητές (Activator Transcription Factor, ATF2, LRF1/ATF3 και β-atf). Κάποιες από τις πρωτεΐνες Maf δύναται να ετεροδιµεριστούν µε τις c-jun ή c-fos (v-maf, c-maf και Nrl), ενώ άλλες µόνο µε τη c-fos (MafB, MafF, MafG και MafK) [97]. Ανάµεσα στα σύµπλοκα αυτά, τα πλέον σηµαντικά και µελετηµένα αφορούν στα µέλη των οικογενειών Jun και Fos. Οι πρωτεΐνες Jun σχηµατίζουν σταθερά διµερή, τα οποία δεσµεύονται στην αλληλουχία TRE (TPA-Responsive Element) του DNA. Η ονοµασία της αλληλουχίας αυτής προέρχεται από την ιδιότητά της να ρυθµίζει την επαγόµενη, από το φορβολεστέρα TPA (12-O-TetradecanoylPhorbol-Acetate) µεταγραφική δραστηριότητα [223]. Οι πρωτεΐνες Fos δε σχηµατίζουν σταθερά οµοδιµερή, αλλά µετά από διµερισµό τους µε πρωτεΐνες Jun οδηγούν σε ετεροδιµερή σύµπλοκα µεγαλύτερης σταθερότητας (Εικόνα 6.Β), συγκριτικά µε τα Jun/Jun οµοδιµερή [227, 228]. 46

61 Εισαγωγή Εικόνα Ε.6: Ο µεταγραφικός παράγοντας AP-1. Ο AP-1 περιλαµβάνει πρωτεΐνες των οικογενειών Jun και Fos. Οι πρωτεΐνες αυτές δύνανται να σχηµατίσουν οµοδιµερή και ετεροδιµερή µέσω αλληλεπίδρασης περιοχών µε δοµή φερµουάρ λευκίνης. (Α) Σχηµατική απεικόνιση του σχηµατισµού διµερούς µεταξύ πρωτεϊνών Jun και Fos. Ο διµερισµός πραγµατοποιείται στις περιοχές µε δοµή φερµουάρ λευκίνης, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία συµπλόκου AP-1 σχήµατος Χ δοµών α-έλικας που δεσµεύεται στο «σκελετό» της έλικας του DNA. (Β) ιαφορετικοί συνδυασµοί πρωτεϊνών των οικογενειών Fos και Jun, έχουν ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό ποικιλίας σταθερών συµπλόκων του AP-1. Η δράση των συµπλόκων του AP-1 υπόκειται σε επιπλέον ρύθµιση µέσω φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών που το συγκροτούν. Ο αριθµός των πρωτεϊνών που έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρούν µε συστατικά του AP-1 και µεταβάλλουν τη µεταγραφική του δραστηριότητα είναι µεγάλος και αυξάνεται διαρκώς. Η κατανόηση της φυσιολογικής σηµασίας των αλληλεπιδράσεων αυτών, αλλά και των µηχανισµών µέσω των οποίων ρυθµίζουν τη δραστηριότητα του AP-1, αποτελεί στόχο σύγχρονων ερευνητικών προσπαθειών. Τέλος, πέραν της αλληλουχίας TRE έχει ανακαλυφθεί ένα πλήθος αλληλουχιών στις οποίες ο AP-1 µπορεί να δεσµευτεί (Εικόνα 7), ενώ η λίστα συνεχώς εµπλουτίζεται. 47

62 Εισαγωγή Εικόνα Ε.7: ιαφορετικά σύµπλοκα του µεταγραφικού παράγοντα AP-1 αναγνωρίζουν διαφορετικές αλληλουχίες στους υποκινητές και ενισχυτές γονιδίων-στόχων. Η κύρια αλληλουχία δέσµευσης του AP-1 είναι η TRE (TPA-Responsive Element). Παρόλα αυτά, κάποια διµερή δείχνουν προτίµηση για δέσµευση σε αλληλουχίες όπως η CRE (c-amp Response Element), οι MAREs (MAF-Recognition Elements) και οι AREs (Antioxidant- Response Elements) Ρύθµιση του AP-1 Ο AP-1 είχε αρχικά αναγνωριστεί ως ένας µεταγραφικός παράγοντας που συµβάλλει στην έκφραση γονιδίων, τόσο µετά από διέγερση από το TPA [223], όσο και στη βασική, µη διεγερµένη κατάσταση [225]. Σύντοµα αναγνωρίστηκαν και άλλοι παράγοντες οι οποίοι επάγουν τη δραστηριότητα του AP-1, όπως ο ορός [229], διάφοροι αυξητικοί παράγοντες και προϊόντα ογκογονιδίων [230, 231], ο TNFα (Tumor Necrosis Factor) [232] και η IL-1 [233]. Η παρατήρηση ότι αυξητικοί και ογκογόνοι παράγοντες επάγουν τη δραστηριότητα του AP-1, καθώς και το ότι οι πρωτεΐνες Jun και Fos κωδικοποιούνται από ογκογονίδια, συντείνουν σ ένα σηµαντικό ρόλο για το µεταγραφικό αυτό παράγοντα, τόσο στην αύξηση των κυττάρων όσο και στο µετασχηµατισµό τους. Πέραν των ενδογενών ερεθισµάτων, η δραστηριότητα του AP-1 επάγεται επιπλέον από µια πλειάδα περιβαλλοντικών παραγόντων, οι οποίοι δηµιουργούν καταστάσεις στρες στα κύτταρα, όπως για παράδειγµα η υπεριώδης ακτινοβολία 48

63 Εισαγωγή (UV) [234]. Είναι χαρακτηριστικό ότι το γονίδιο c-jun, αποτελεί ένα από τα πλέον ευαίσθητα γονίδια στην ακτινοβολία UV [235]. Έκθεση σε ακτινοβολία UV οδηγεί σε φωσφορυλίωση της c-jun [236] και ταυτόχρονα επαγωγή της µεταγραφής του γονιδίου της [237]. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η διέγερση του γονιδίου c-jun προέκυψε εξελικτικά ως αναγκαία και φυσιολογική απόκριση στην επίδραση της ακτινοβολίας UV, δεδοµένου ότι ο πρώτος οργανισµός που προσαρµόστηκε στη ζωή έξω από το νερό θα έπρεπε να είναι ικανός να ανταπεξέλθει στα αυξηµένα επίπεδα ακτινοβολίας UV που επικρατούσαν εκείνη τη χρονική περίοδο στον πλανήτη. Συµπερασµατικά, η δραστηριότητα του µεταγραφικού παράγοντα AP-1 επηρεάζεται από µιτογόνους παράγοντες, καταστάσεις φλεγµονής και συνθήκες στρες Μηχανισµοί ρύθµισης της δραστηριότητας του AP-1 Η ρύθµιση της δραστηριότητας του AP-1 είναι µια πολύπλοκη διαδικασία στην οποία εµπλέκονται η µεταβολή της σύστασης των διµερών, τροποποιήσεις στο µεταγραφικό και µετα-µεταφραστικό επίπεδο και αλληλεπιδράσεις µε άλλες πρωτεΐνες Σύσταση διµερών Η διαφορική έκφραση των υποµονάδων του AP-1 ως απόκριση σε εξωκυττάρια ερεθίσµατα, θεωρείται ένας από τους βασικούς µηχανισµούς ρύθµισης της δραστηριότητας του AP-1. Η συγγένεια δέσµευσης στο DNA και η ικανότητα ενεργοποίησης του συµπλόκου της µεταγραφής (trans-ενεργοποίηση, transactivation) των πρωτεϊνών Jun ποικίλει, µε τη c-jun να εµφανίζει την υψηλότερη δράση [238]. Για παράδειγµα, ετεροδιµερισµός της c-fos µε τη c-jun επάγει περαιτέρω τη µεταγραφική δραστηριότητα, ενώ διµερισµός της c-fos µε την JunB την εξασθενεί [239]. Όντως, οι βιολογικές δράσεις των συµπλόκων AP-1 που περιλαµβάνουν τις συγκεκριµένες πρωτεΐνες, ρυθµίζονται από τον ανταγωνισµό µεταξύ των c-jun και JunB [240, 241]. 49

64 Εισαγωγή Με τη χρησιµοποίηση διµερών συµπλόκων AP-1, τα οποία προέρχονται από σύνδεση συγκεκριµένων µονοµερών µέσω εύκαµπτων πολυπεπτιδικών αλυσίδων, ανεδείχθη η σηµασία της σύστασης του συµπλόκου στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων. Συγκεκριµένα, τα διµερή c-jun/fra-2, σε αντίθεση µε τα διµερή c-jun/fra-1 και c-jun/c-fos, προάγουν την είσοδο αθανοτοποιηµένων ινοβλαστών στον κυτταρικό κύκλο [242]. Επιπλέον, εισαγωγή µεταλλαγών και τροποποίηση της περιοχής διµερισµού (φερµουάρ λευκίνης) διαφόρων υποµονάδων, έδειξε ότι η επαγόµενη από τη c-jun ογκογένεση διακρίνεται σε δύο διαφορετικά µονοπάτια. Έτσι, η αύξηση των κυττάρων ανεξάρτητα από την παρουσία αυξητικών παραγόντων, προϋποθέτει τη δράση των συµπλόκων c-jun/atf2, ενώ η αύξηση σε τρισδιάστατο περιβάλλον (ανεξάρτητα από την προσκόλληση σε υπόστρωµα) τη δράση του συµπλόκου c- Jun/c-Fos [243]. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι οι διαφορετικοί συνδυασµοί υποµονάδων του AP-1, καθοδηγούν τις διαφορετικές βιολογικές δράσεις του µεταγραφικού αυτού παράγοντα Μεταγραφική και µετα-µεταφραστική ρύθµιση Η δραστηριότητα του AP-1 ρυθµίζεται από ένα πολυσύνθετο δίκτυο µονοπατιών µεταγωγής σήµατος, στα οποία εµπλέκονται τα εξωγενή σήµατα και οι MAP κινάσες ERK, p38 και JNK [244] (Εικόνα 8). Ενεργοποίηση των ERK φαίνεται να επάγεται κυρίως από αυξητικούς παράγοντες. Η ενεργοποίηση των ERK οδηγεί σε φωσφορυλίωση των µεταγραφικών παραγόντων TCF (Ternary Complex Factors) και επαγωγή µεταγραφής των γονιδίων fos [245]. Τα προϊόντα των γονιδίων αυτών διµερίζονται µε τις Jun πρωτεΐνες, σχηµατίζοντας σταθερά σύµπλοκα. Η παρουσία αλληλουχιών δέσµευσης του AP-1 στη ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου c-jun, οδηγεί σε αυξηµένη µεταγραφή του από τα παραπάνω σύµπλοκα [246]. Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών MEF2 (Myocyte-Enhancer Factor 2) από τις ERK και η ακόλουθη δέσµευση των παραγόντων αυτών στη ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου c-jun, µπορεί επίσης να συµβάλλει στην επαγωγή της µεταγραφής του τελευταίου [248]. 50

65 Εισαγωγή Εικόνα 8: Μεταγραφική και µετα-µεταφραστική ρύθµιση της δραστηριότητας του AP-1. Η ενεργοποίηση του AP-1 διεγείρεται από ένα πολύπλοκο δίκτυο µονοπατιών µεταγωγής σήµατος που περιλαµβάνει εξωτερικά σινιάλα (για παράδειγµα αυξητικούς παράγοντες) και MAP κινάσες, όπως οι οικογένειες των ERK, p38 και JNK. Οι MAP κινάσες ενεργοποιούν ποικίλους µεταγραφικούς παράγοντες (TCF, MEF2, ATF2 και Jun), οι οποίοι µε τη σειρά τους επάγουν τη µεταγραφή γονιδίων fos και jun. Μετα-µεταφραστική φωσφορυλίωση των συµπλόκων AP-1 από µια πλειάδα κινασών, επίσης ρυθµίζει τη δραστηριότητα του µεταγραφικού παράγοντα. Η φωσφορυλίωση δύναται να επιδρά στη δυνατότητα trans-ενεργοποίησης, στην ικανότητα δέσµευσης στο DNA και στη σταθερότητα του συµπλόκου AP-1. 51

66 Εισαγωγή Τα άλλα δύο µονοπάτια των MAP κινασών (JNK και p38) φαίνεται να ενεργοποιούνται κυρίως µετά από επίδραση κυτταροκινών και ακτινοβολίας UV [236]. Η p38 δύναται να επάγει τόσο τους µεταγραφικούς παράγοντες TCF, όσο και τη φωσφορυλίωση του MEF2c [248], διεγείροντας µε τον τρόπο αυτό τη µεταγραφή των γονιδίων fos, αλλά και του c-jun. Οι JNK φωσφορυλιώνουν και επάγουν τη µεταγραφική δραστηριότητα τόσο της ίδιας της πρωτεΐνης c-jun, όσο και της ATF2, οδηγώντας σε αύξηση της έκφρασης του γονιδίου c-jun. Στις παραπάνω περιπτώσεις, η φωσφορυλίωση οδηγεί σε επαγωγή της transενεργοποίησης, χωρίς σηµαντική επίδραση στην ικανότητα δέσµευσης στο DNA [236]. Ακολούθως, η φωσφορυλίωση από τις κινάσες GSK-3β (Glycogen- Synthase-Kinase-3β), CKII (Casein Kinase) και RSK2 (Ribosomal S6 Kinase 2), διαµεσολαβούν στη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Fos και Jun, ρυθµίζοντας τη δυνατότητα trans-ενεργοποίησης και την ικανότητα δέσµευσης στο DNA [244]. Φαίνεται ότι ανάλογα µε το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος, αλλά και τη διάρκεια της ενεργοποίησής του, καθορίζεται η δραστηριότητα του AP-1 και οι βιολογικές του δράσεις Αλληλεπίδραση µε άλλους παράγοντες Η συνεργασία µε προϊόντα άλλων ογκογονιδίων, τα οποία συνήθως επάγουν την έκφραση των Jun και Fos ή/και µέσω µετα-µεταφραστικών µηχανισµών που ενισχύουν τη δράση του AP-1, συµβάλλει στην εµφάνιση καρκινικού φαινότυπου στα κύτταρα. Είναι χαρακτηριστική η περίπτωση στην οποία ενεργοποίηση του µονοπατιού της Ras επάγει την έκφραση πρωτεϊνών του ΑP-1, κυρίως των Fra-1 και c-jun [249]. Ανάµεσα στις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν µε τον AP-1, ιδιαίτερη κλινική σηµασία παρουσιάζουν οι υποδοχείς των γλυκοκορτικοειδών (GR) και του ρετινοϊκού οξέος (RAR) [250, 251]. Και οι δύο µπορούν να αναστείλουν τη µεταγραφή γονιδίων-στόχων του AP-1, µέσω αµοιβαίας αρνητικής παρεµβολής (transrepression). Εντούτοις, σε κάποιους ιστούς και κύτταρα, ο AP- 1 σε συνεργασία µε τον GR ενεργοποιεί γονίδια µέσω σύνθετων αλληλουχιών δέσµευσης στο DNA. Η σύσταση του AP-1 φαίνεται να καθορίζει τη θετική ή αρνητική αλληλεπίδραση µε τον υποδοχέα GR. Είναι γνωστό ότι τα γλυκοκορτικοειδή επάγουν την απόπτωση στα λευχαιµικά κύτταρα. Στην περίπτωση αυτή, η καταστολή έκφρασης κάποιων γονιδίων µέσω 52

67 Εισαγωγή αλληλεπιδράσεων του GR µε τους AP-1 και NF-κΒ, φαίνεται να είναι απαραίτητη για τη δράση αυτή [250]. Αντίστοιχα, τα ρετινοειδή, οι προσδέτες των RAR, έχουν ογκοκατασταλτικές ιδιότητες. Τουλάχιστον σε κάποιες από τις περιπτώσεις, η καταστολή αποδίδεται σε αρνητική ρύθµιση του AP-1 [251, 252] Βιολογικές δράσεις του AP Καρκινογένεση Η ικανότητα των υποµονάδων του AP-1 να µετασχηµατίσουν κύτταρα (δηλαδή να οδηγήσουν σε καρκινικό φαινότυπο), βασίζεται στην παρουσία περιοχών µε υψηλή δραστικότητα trans-ενεργοποίησης. Σε µύες, η c-fos επάγει το σχηµατισµό οστεοσαρκώµατος, µετασχηµατίζοντας χονδροβλάστες [253] και οστεοβλάστες [254]. Η c-jun αντίστοιχα είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη καρκίνου του δέρµατος και του ήπατος [255, 256]. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες που δε φέρουν περιοχές ισχυρής trans-ενεργοποίησης θεωρείται ότι εµφανίζουν πλήρη αδυναµία (όπως οι JunB και JunD), ή χαµηλή ικανότητα µετασχηµατισµού (όπως οι Fra-1 και Fra-2) [257, 258, 259]. Υπερέκφραση όµως των Fra-1 και Fra-2 σε διαγονιδιακούς µύες, οδήγησε σε ανάπτυξη καρκίνου του πνεύµονα και επιθηλίων αντίστοιχα [260]. Κάποιες από τις πρωτεΐνες του AP-1 όχι µόνο δεν εµφανίζουν ικανότητα µετασχηµατισµού των κυττάρων, αλλά είναι ικανές και να καταστείλουν την καρκινογένεση, όπως για παράδειγµα η JunB. Η JunB ανταγωνίζεται την c-jun [261] και η ανασταλτική της δράση στην ογκογένεση έχει αξιολογηθεί in vitro [239] και in vivo [262]. Φαίνεται ότι οι διεγερτικές και/ή ανασταλτικές ιδιότητες του AP-1 στην καρκινογένεση, εξαρτώνται από την ανταγωνιστική δράση µεταξύ των διαφόρων πρωτεϊνών Jun, αλλά πιθανώς και από τον τύπο, το στάδιο και το γενετικό πρότυπο του καρκίνου. 53

68 Εισαγωγή Απόπτωση και επιβίωση Η δραστηριότητα του AP-1 επάγεται, πέραν των αυξητικών παραγόντων, από στρες που προκαλείται από παράγοντες, όπως η ακτινοβολία UV και οι αλκυλιωτικοί παράγοντες. Οι τελευταίοι προκαλούν κυτταρόσταση ή/και κυτταρικό θάνατο. Το αποτέλεσµα της ενεργοποίησης του AP-1 φαίνεται να εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου. Έτσι, ο ΑΡ-1 ενώ µπορεί να επάγει την απόπτωση σε κάποιους τύπους κυττάρων, σε άλλους η έκφρασή του αποτελεί προϋπόθεση για την επιβίωση. εδοµένης της ποικιλίας συµπλόκων του AP-1, οι λειτουργίες του συγκεκριµένου µεταγραφικού παράγοντα πιθανόν εξαρτώνται στο επίπεδο αυτό, από τη σύσταση του συµπλόκου, αλλά και από µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις και αλληλεπιδράσεις µε άλλους παράγοντες. Ο ρόλος του AP-1 στην απόπτωση διευκρινίστηκε από µελέτες στο νευρικό σύστηµα. Έτσι, σε διαγονιδιακούς µύες, µετά από επίδραση καϊνικού οξέος που είναι ισχυρός ενεργοποιητής των υποδοχέων του L-γλουταµινικού οξέος, παρατηρήθηκε αυξηµένη έκφραση της c-fos, που συσχετίστηκε µε το θάνατο των νευρικών κυττάρων [263]. Επιπλέον µελέτες σε κύτταρα φαιοχρωµοκυττώµατος PC12 και νευρικά κύτταρα, έδειξαν ότι αναστολή της έκφρασης της c-jun προστατεύει τα κύτταρα από την επαγόµενη από απουσία του αυξητικού παράγοντα των νεύρων (Neural Growth Factor, NGF) απόπτωση ή χρόνια εκπόλωση [264, 265, 266]. Εκτοπική έκφραση c-jun ή c-fos, προκαλεί απόπτωση σε νευρώνες του συµπαθητικού συστήµατος, σε ινοβλάστες µυός, σε εµβρυϊκά κύτταρα ινδικού χοιριδίου (SHE) και σε κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου (RKO) [267, 265, 268]. Εντούτοις, οι c-jun και c-fos επάγονται και από φυσιολογικά ή παθολογικά ερεθίσµατα, που δεν οδηγούν απαραίτητα στο θάνατο των νευρικών κυττάρων [269]. Το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος των JNK, έχει ενοχοποιηθεί για την απόπτωση των νευρικών κυττάρων [266, 270]. Άλλα γενετικά δεδοµένα υποστηρίζουν το ρόλο της c-jun στις αποπτωτικές δράσεις των JNK, µετά από ενεργοποίηση µακράς διάρκειας [271, 272]. Παρόλα αυτά, πρέπει να επισηµανθεί ότι σε ποικίλες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις του κεντρικού νευρικού συστήµατος, η ενεργοποίηση του µονοπατιού των JNK και η φωσφορυλίωση της c-jun δεν συµβαδίζει πάντα µε αποπτωτικά φαινόµενα [273, 269]. 54

69 Εισαγωγή Οι πρωτεΐνες που απαρτίζουν το µεταγραφικό παράγοντα AP-1, φαίνεται να εµπλέκονται επιπλέον στην επαγωγή της απόπτωσης µετά από έκθεση των κυττάρων σε γενοτοξικό στρες. Η έκφραση ενός µη λειτουργικού µεταλλάγµατος της c-jun ανέστειλε την απόπτωση λευχαιµικών κυττάρων ανθρώπου, η οποία προκαλείται µετά από έκθεση των κυττάρων σε παράγοντες που προκαλούν βλάβες στο DNA [274]. Επιπρόσθετα, ινοβλάστες c-jun -/- αλλά και jnk1-/-, jnk2-/- παρουσίασαν αντίσταση στην απόπτωση που προκαλείται από ακτινοβολία UVC [275, 93]. Ινοβλάστες c-jun -/- εµφάνισαν επίσης αντίσταση στη δράση αλκυλιωτικών παραγόντων [276]. Σε αντίθεση µε τα παραπάνω, κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής ανάπτυξης, ο AP-1 όχι µόνο δεν επάγει την απόπτωση, αλλά φαίνεται να παίζει ένα µάλλον προστατευτικό ρόλο [277, 278]. Η επιβίωση των κυττάρων είναι πιθανόν να καθορίζεται σε µεγάλο βαθµό από την ανταγωνιστική δράση του AP-1 µε την πρωτεΐνη p53 [256]. Παράλληλα, η αντιαποπτωτική δράση των πρωτεϊνών Jun διαµεσολαβείται από την πρωτεΐνη Bcl3 [279]. Αντίθετα, αναστολή της JunB σε κύτταρα της µυελοειδούς σειράς οδηγεί στην αυξηµένη έκφραση των αντιαποπτωτικών Bcl2 και Bcl-xl [262]. Επιπλέον, οι c-jun και JunD παίζουν προστατευτικό ρόλο έναντι των δράσεων του TNF-α [280]. Η εξειδίκευση της δράσης του AP-1 µε βάση τον τύπο του κυττάρου, αποδίδεται τελικά στη διαφορική ρύθµιση αποπτωτικών και αντιαποπτωτικών γονιδίων. Παραδείγµατα αναφέρονται στον Πίνακα 4. 55

70 Εισαγωγή Πίνακας 4: Επίδραση του µεταγραφικού παράγοντα AP-1 στην έκφραση γονιδίων που ενέχονται στην απόπτωση Κυτταρικός πολλαπλασιασµός Η ικανότητα υποµονάδων του AP-1 να επάγουν το µετασχηµατισµό, αναδεικνύει την πιθανή εµπλοκή τους στη διέγερση του πολλαπλασιασµού των κυττάρων. Έτσι, ολιγονουκλεοτίδια µε την αντινοηµατική αλληλουχία (antisense) έναντι των c-fos και c-jun, ανέστειλαν τον πολλαπλασιασµό ινοβλαστών µυός και λευχαιµικών ερυθροκυττάρων αντίστοιχα [286, 287]. Ενδοκυτταρική χορήγηση αντισωµάτων, (µε µικροένεση), έναντι πρωτεϊνών Fos και Jun έδειξε ότι η δραστηριότητα του AP-1 είναι απαραίτητη για την είσοδο στον κυτταρικό κύκλο αλλά και την πρόοδό του [288]. Αντίθετα, ελλείψει c-fos, δεν επηρεάζεται o πολλαπλασιασµός ινοβλαστών και εµβρυϊκών βλαστοκυττάρων, πιθανώς λόγω εξισορρόπησης µέσω της επαγωγής της έκφρασης άλλων µελών της οικογένειας Fos [289]. Όντως, απαλοιφή της έκφρασης και της FosB οδηγεί σε µειωµένο πολλαπλασιασµό στα ίδια κύτταρα. Αντίστοιχα, µύες c-fos -/- fosb -/- εµφανίζουν µικρότερο σωµατικό µέγεθος κατά 30%, σε σχέση µε τους αντίστοιχους µάρτυρες (άγριου τύπου) και τα µονά µεταλλάγµατα [290]. Σε αντίθεση µε τις πρωτεΐνες Fos, απαλοιφή µιας από τις Jun, µε µοναδική εξαίρεση την JunB, οδηγεί σε σηµαντική µεταβολή των ιδιοτήτων που σχετίζονται µε την αύξηση του κυττάρου. Σε ινοβλάστες c-jun -/- εκδηλώνεται γρήγορα ένας 56

71 Εισαγωγή φαινότυπος ψευδo-γήρανσης, µε δραµατική αύξηση του χρόνου µετάβασης µεταξύ των σταδίων του κυτταρικού κύκλου [281, 291]. Αντίστοιχα, απαλοιφή του γονιδίου c-jun σε ηπατοκύτταρα, οδήγησε σε µειωµένη ικανότητα πολλαπλασιασµού τους κατά την αναγέννηση του ήπατος in vivo [292]. Είναι ενδιαφέρον το ότι όταν τροποποιήθηκαν οι θέσεις φωσφορυλίωσης της c-jun από την JNK παρατηρήθηκε µικρότερη ανασταλτική επίδραση στον πολλαπλασιασµό των ινοβλαστών [272]. Σε µύες jund -/-, παρατηρήθηκε επίσης µια συσχέτιση της έλλειψης της JunD µε µειωµένη ικανότητα πολλαπλασιασµού και µειωµένο σωµατικό βάρος [282, 293]. Εντούτοις, σε αθανατοποιηµένους ινοβλάστες µετά από απαλοιφή της JunD, παρατηρήθηκε αύξηση του ρυθµού πολλαπλασιασµού τους [282]. Αυτή η ασυµφωνία αποδίδεται σε µια πιθανή εξισορρόπηση της απουσίας της JunD στη δεύτερη περίπτωση, µε έκφραση υψηλότερων επιπέδων c-jun [97]. Σε ότι αφορά στην JunB, απαλοιφή του γονιδίου που την κωδικοποιεί δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασµό εµβρυϊκών βλαστοκυττάρων και ινοβλαστών [294]. Παράλληλα, υπάρχουν δεδοµένα που την καθιστούν αρνητικό ρυθµιστή του κυτταρικού πολλαπλασιασµού [262]. Είναι χαρακτηριστικό ότι η ανασταλτική κυτταροκίνη TGF-β επάγει τη µεταγραφή του γονιδίου junb ισχυρότερα από αυτή του c-jun [295]. Τα παραπάνω δεδοµένα υποδεικνύουν ένα θετικό ρόλο των c-fos και c-jun και αρνητικό της JunB, στη ρύθµιση του πολλαπλασιασµού των κυττάρων. Αντίθετα, ο ρόλος της JunD φαίνεται να είναι πιο πολύπλοκος. Στον Πίνακα 5 γίνεται αναφορά σε κάποια από τα γονίδια που αποτελούν στόχους του AP-1 και ενέχονται στην επαγωγική δράση συµπλόκων του µεταγραφικού αυτού παράγοντα στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων. 57

72 Εισαγωγή Πίνακας 5: Επίδραση του µεταγραφικού παράγοντα AP-1, στην έκφραση γονιδίων που ενέχονται στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων Αγγειογένεση και Μετάσταση Κάποια από τα γονίδια που ρυθµίζονται από τον AP-1 παίζουν σηµαντικό ρόλο στην αγγειογένεση και τη µετάσταση (Πίνακας 6). Οι δύο διαδικασίες προϋποθέτουν την αποικοδόµηση του εξωκυττάριου υλικού και το σχηµατισµό νέων τριχοειδών αιµοφόρων αγγείων. Οι c-fos και Fra-1 ρυθµίζουν την έκφραση των µεταλλοπροτεϊνασών (MMPs) [306] και πρωτεϊνασών του συστήµατος ενεργοποιητών του πλασµινογόνου τύπου ουροκινάσης (urokinase-plasminogen Activator, u-pa) [307], οι οποίες δύνανται να προάγουν τόσο την αγγειογένεση, όσο και την ικανότητα διείσδυσης των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, το γονίδιο του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου D (VEGFD) και του αγγειογενετικού παράγοντα proliferin, έχουν χαρακτηριστεί ως στόχοι της c-fos [308] και της c-jun (ή της JunB) αντίστοιχα [309]. 58

73 Εισαγωγή Πίνακας 6: Ο µεταγραφικός παράγοντας AP-1 επηρεάζει την έκφραση γονιδίων, τα οποία σχετίζονται µε την αγγειογένεση και την ικανότητα µετάστασης. Ένα από τα χαρακτηριστικά της µετάστασης και διεισδυτικότητας των καρκινικών κυττάρων είναι η µετάπτωσή τους από επιθηλιακή σε µεσεγχυµατική µορφολογία (Epithelial Mesenchymal Transition, EMT). Τόσο η c-fos, όσο και η c-jun, επάγουν την ΕΜΤ σε επιθηλιακά κύτταρα µαστού [310, 311]. Εντούτοις, υπερέκφραση της c-fos επάγει µόνο τη διεισδυτικότητα των κυττάρων σε υπόστρωµα κολλαγόνου [310]. Επίσης, έχει βρεθεί ότι απαλοιφή του γονιδίου c- jun αναστέλλει τη διεισδυτική ικανότητα διαφορετικών τύπων κυττάρων [312]. 59

74 Εισαγωγή Εν κατακλείδι, ο AP-1 έχει συσχετιστεί µε ένα ευρύ φάσµα κυτταρικών λειτουργιών που περιλαµβάνουν την απόπτωση, τον πολλαπλασιασµό, τη διαφοροποίηση και το µετασχηµατισµό. Έτσι, συχνά ο AP-1 απεικονίζεται ως το µόριο-κλειδί στην επιλογή του προρισµού του κυττάρου σε απόκριση στα εξωκυτταρικά ερεθίσµατα. Η αποσαφήνιση των γονιδίων-στόχων του AP-1 πιθανά θα προάγει την αξιολόγηση του ρόλου του µεταγραφικού αυτού παράγοντα. 60

75 Εισαγωγή Σύνοψη Ο µεταγραφικός παράγοντας AP-1 περιλαµβάνει πρωτεΐνες των οικογενειών Jun, Fos, ATF και MAF. Οι πρωτεΐνες αυτές δύνανται να σχηµατίσουν οµοδιµερή και ετεροδιµερή σύµπλοκα µέσω περιοχών µε δοµή φερµουάρ λευκίνης. Η δραστικότητα του AP-1 ρυθµίζεται από τη σύσταση του διµερούς συµπλόκου, µεταγραφικές και µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις και αλληλεπιδράσεις µε άλλες πρωτεΐνες. Κάποιες από τις πρωτεΐνες που αποτελούν συστατικά του AP-1, όπως οι c-jun και c-fos, προάγουν την καρκινογένεση και την ανάπτυξη των όγκων. Αντίθετα, άλλες πρωτεΐνες των οικογενειών Jun και Fos ενέχονται στην καταστολή σχηµατισµού όγκων. Η επαγωγική ή ανασταλτική δράση του AP-1 στη διαδικασία ανάπτυξης του καρκίνου, φαίνεται να εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από τον τύπο του κυττάρου, το βαθµό διαφοροποίησής του, το στάδιο του καρκίνου και το γενετικό του προφίλ. Ο AP-1 επάγει ή αναστέλλει το σχηµατισµό όγκων, ρυθµίζοντας µια πλειάδα γονιδίων που εµπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, την απόπτωση, την αγγειογένεση και την ικανότητα διείσδυσης των καρκινικών κυττάρων. Ο AP-1 αποτελεί µόριο-στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου και άλλων παθολογικών καταστάσεων. 61

76

77 Σκοπός Σκοπός της παρούσας εργασίας Τα τελευταία χρόνια µια πληθώρα ερευνητικών εργασιών συσχετίζει την παραγωγή των δραστικών µορφών οξυγόνου (ROS) µε ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες. Στο επίπεδο του κυττάρου, η παραγωγή ROS δύναται να προκληθεί τόσο από φυσιολογικά ερεθίσµατα (όπως ορµόνες και κυτταροκίνες) όσο και από εξωγενείς παράγοντες (όπως µικροοργανισµοί και ακτινοβολία). Η αυξηµένη παραγωγή ROS ενέχεται στην παθογένεση του καρκίνου, του σακχαρώδη διαβήτη, της αθηροσκλήρωσης, των νευροεκφυλιστικών παθήσεων, της ρευµατοειδούς αρθρίτιδας και άλλων ασθενειών [103]. Σε υψηλές συγκεντρώσεις, οι ROS καθίστανται κυτταροτοξικές, καθώς προκαλούν βλάβες στην κυτταρική µεµβράνη και µη αναστρέψιµες αλλαγές στη δοµή του DNA. Εντούτοις, σε χαµηλά επίπεδα φαίνεται να δρουν ως ειδικά µόρια που συµµετέχουν στη µεταγωγή σήµατος. Το Η 2 Ο 2 αποτελεί την πλέον σηµαντική δραστική µορφή οξυγόνου, αφού είναι το µόνο µε τη χηµική σταθερότητα που απαιτείται για την εγκαθίδρυση σηµαντικής και σταθερής συγκέντρωσης in vivo [48, 49]. Επιπρόσθετα, το πλεονέκτηµα του µικρού µεγέθους και της έλλειψης φορτίου επιτρέπει στο Η 2 Ο 2 να διαχέεται ελεύθερα διαµέσου των κυτταρικών µεµβρανών [50]. Αυτές οι ιδιότητες (σχετική χηµική σταθερότητα, έλλειψη πολικότητας και µικρό µοριακό µέγεθος) καθιστούν το Η 2 Ο 2 ιδανικό υποψήφιο µόριο στην ενδοκυττάρια µεταγωγή σήµατος. Η HARP, γνωστή και ως πλειοτροπίνη, είναι ένας αυξητικός παράγοντας 18 kda µε υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη. Είναι µιτογόνος για διαφορετικούς τύπους κυττάρων [152, 184], επάγει την αγγειογένεση in vitro και in vivo [195, 194, 182] και προσδίδει καρκινικό φαινότυπο σε αρκετές κυτταρικές σειρές [212, 214]. Η ανίχνευση του mrna ή/και της πρωτεΐνης της HARP σε ποικίλες καρκινικές κυτταρικές σειρές και σε όγκους διαφορετικής προέλευσης, όπως το νευροβλάστωµα [200], το µελάνωµα [202], ο καρκίνος του µαστού και του παγκρέατος [173, 110], υποδεικνύει ένα σηµαντικό ρόλο του αυξητικού αυτού παράγοντα στην ανάπτυξη του καρκίνου και στην αγγειογένεση. Πρόσφατα, η ερευνητική µας οµάδα ανέδειξε το διττό ρόλο της HARP στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη, αφού διαπιστώθηκε ότι αποτελεί σηµαντικό αυτοκρινή αυξητικό παράγοντα για την καρκινική κυτταρική σειρά προστάτη LNCaP ενώ 63

78 Σκοπός παράλληλα κατέχει και παρακρινή δράση επάγοντας την αγγειογένεση in vitro και in vivo [151]. Το µόριο της HARP είναι υψηλά συντηρηµένο ανάµεσα στον άνθρωπο, τον επίµυ, τον βου και το µυ [109, 111]. Το γονίδιό της ακολουθεί ένα αυστηρά καθορισµένο πρότυπο έκφρασης στο χώρο και το χρόνο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει έναν πιθανό σηµαντικό ρόλο της HARP στη ρύθµιση διαφορετικών βιολογικών διεργασιών. Όταν το 1992 κλωνοποιήθηκε, για πρώτη φορά, η ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου της HARP, δεν βρέθηκαν αλληλουχίες δέσµευσης για τους γνωστούς γενικούς µεταγραφικούς παράγοντες. Εντούτοις, προτάθηκε η ύπαρξη δύο πιθανών αλληλουχιών δέσµευσης για το µεταγραφικό παράγοντα AP-1, σε αποµακρυσµένη περιοχή ανοδικά του υποκινητή [107]. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της επίδρασης χαµηλών συγκεντρώσεων Η 2 Ο 2 στον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων από φλέβα ανθρώπινου οµφάλιου λώρου (HUVEC) και των καρκινικών κυττάρων LNCaP. Παράλληλα, εξετάστηκε η πιθανή εµπλοκή της HARP στις παραπάνω διαδικασίες. Χρησιµοποιώντας φαρµακολογικές και γενετικές προσεγγίσεις, µελετήθηκε ο τρόπος µε τον οποίο το Η2Ο2 επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου της HARP. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η πιθανή δέσµευση του µεταγραφικού παράγοντα AP-1 στη ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου της HARP και η επακόλουθη µεταγραφική δραστηριότητα. 64

79 Μέθοδοι 1. Προετοιµασία αυγών [317] Τα γονιµοποιηµένα αυγά όρνιθας (Leghorn, από τον αγροτικό πτηνοτροφικό συνεταιρισµό «Πίνδος» Ιωάννινα), µετά την παραλαβή τους καθαρίζονται µε νερό και τοποθετούνται σε οριζόντια θέση στην αυγοθήκη. Στη συνέχεια τοποθετούνται και παραµένουν σε επωαστικό θάλαµο µε θερµοκρασία 37 0 C και σχετική υγρασία περίπου 55%. Η χρονική αυτή στιγµή θεωρείται η ώρα 0 της ανάπτυξης του εµβρύου. Την τρίτη ηµέρα ανάπτυξης αφαιρείται αλβουµίνη (λεύκωµα) από το εσωτερικό του αυγού. Αυτό γίνεται ως εξής: Στο οξύ άκρο του κάθε αυγού ανοίγεται οπή µε τη βοήθεια βελόνας ανατοµίας. Χρειάζεται προσοχή ώστε να µη σπάσει το αυγό και η βελόνα να µην προχωρήσει σε µεγάλο βάθος, γιατί υπάρχει κίνδυνος τραυµατισµού του εµβρύου. Με όµοιο τρόπο ανοίγεται δεύτερη οπή στο αµβλύ άκρο του αυγού. Στη συνέχεια και µε χρήση σύριγγας, αναρροφώνται 2,5-3 ml αλβουµίνης και τέλος η οπή του κελύφους κλείνεται µε κολλητική ταινία. Την τέταρτη ηµέρα ανάπτυξης ακολουθεί άνοιγµα παραθύρων (διαστάσεων περίπου 1 x 2 cm) στο πάνω µέρος του κάθε αυγού. Η διαδικασία αυτή γίνεται µε προσοχή ώστε να µην πέσουν θραύσµατα κελύφους πάνω στη χοριοαλλαντοϊκή µεµβράνη (CAM). Τα παράθυρα καλύπτονται µε κολλητική ταινία και τα αυγά επανατοποθετούνται στον επωαστικό θάλαµο. 2. Μελέτη της επίδρασης των υπό εξέταση ουσιών στη χοριοαλλαντοϊκή µεµβράνη (CAM) εµβρύου όρνιθας [317] Την ένατη ηµέρα ανάπτυξης του εµβρύου, ελαστικοί δακτύλιοι διαµέτρου 1 cm, πλένονται και αποστειρώνονται για 1 ώρα µε υπεριώδη ακτινοβολία. Οι δακτύλιοι στη συνέχεια τοποθετούνται πάνω στην CAM και προστίθενται οι υπό εξέταση ουσίες σε τελικό όγκο 20 µl. Συγκεκριµένα για το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ), δοκιµάστηκαν οι δόσεις 0,2, 1, 2 και 10 nmol cm

80 Μέθοδοι Σε κάθε πείραµα υπάρχει µια οµάδα αυγών, στα οποία δεν εναποτίθεται η υπό εξέταση ουσία (αλλά µόνο 20 µl του διαλύτη) και χρησιµοποιείται ως µάρτυρας Μελέτη της επίδρασης των υπό εξέταση ουσιών στον αριθµό των αγγείων της CAM [317] Μετά από 48 ώρες επώασης στους 37 0 C, δηλαδή την ενδέκατη ηµέρα ανάπτυξης, γίνεται in situ µονιµοποίηση, ενίοντας 3-4 ml διαλύµατος φορµόλης (µονιµοποιητικό διάλυµα Carson s) σε κάθε αυγό. Ακολουθεί εκτοµή της CAM περιµετρικά και εξωτερικά του δακτυλίου και τοποθέτηση του παρασκευάσµατος σε αντικειµενοφόρο πλάκα. Όταν στεγνώσει ο ιστός, ακολουθεί η λήψη εικόνων του αγγειακού δικτύου µέσω στερεοσκοπίου εφοδιασµένου µε ψηφιακή κάµερα σε µεγέθυνση 2,5X, και ποσοτικοποίηση του αριθµού των αγγείων µε προγράµµατα ανάλυσης εικόνας (Image PC, Scion Corporation). ιαλύµατα Μονιµοποιητικό διάλυµα Carson s: 0,1 Μ NaOH 0,1 Μ NaH 2 PO. 4 H 2 O 10% κ.ό. φορµόλη 37-40% 2.2. Μελέτη της επίδρασης των υπό εξέταση ουσιών στην πρωτεΐνη HARP της CAM [318] Τα τµήµατα της CAM που περιβάλλονται από τους δακτυλίους, συλλέγονται 24 και 48 ώρες µετά την εναπόθεση των υπό εξέταση µορίων. Κάθε οµάδα περιλαµβάνει τουλάχιστον πέντε αυγά. Η εκτοµή του ιστού γίνεται στους 4 0 C ως εξής: 66

81 Μέθοδοι Το τµήµα της CAM που περιβάλλεται από το δακτύλιο κόβεται και τοποθετείται σε τρυβλίο petri που περιέχει ρυθµιστικό διάλυµα PBS ph 7,4. Ο ιστός τεµαχίζεται, τοποθετείται σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου και φυγοκεντρείται στους 4 0 C, για 2 λεπτά, σε g. Mετά τη φυγοκέντρηση αφαιρείται το υπερκείµενο υγρό, και το δείγµα φυλάσσεται στους C µέχρι να χρησιµοποιηθεί. PBS (10X) ph 7,4 ιαλύµατα 0,1 Μ Na 2 HPO 4 0,05 Μ KH 2 PO 4 0,2 Μ NaCl Οµογενοποίηση του ιστού της CAM [318] Οµογενοποίηση του ιστού (από 5 αυγά) στους 4 0 C σε 300 µl ρυθµιστικό διάλυµα οµογενοποίησης. Χρησιµοποιείται οµογενοποιητής Potter-Elvenjem. Φυγοκέντρηση στους 4 0 C, για 30 λεπτά, σε g και µεταφορά του υπερκειµένου σε νέο σωληνάριο. Ακολουθεί προσδιορισµός ολικών πρωτεϊνών στο υπερκείµενο, µε τη µέθοδο Bradford. ιαλύµατα Ρυθµιστικό διάλυµα οµογενοποίησης (ph=7,4): 50 mm Tris-HCl 0,25% κ.β. SDS 150 mm NaCl 1 mm EDTA 1 mm PMSF 1 µg/ml απροτινίνη 1 mm Na 3 VO 4 67

82 Μέθοδοι Προσδιορισµός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεινών σε διάλυµα (Μέθοδος BRADFORD) [319] Προσθήκη 1 µl δείγµατος σε 1 ml αντιδραστήριο Bradford και ανάδευση σε αναδευτήρα Vortex. Επώαση για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου και φωτοµέτρηση στα 595 nm (σε φασµατοφωτόµετρο Hitachi U-1100). Για την κατασκευή πρότυπης καµπύλης χρησιµοποιείται αλβουµίνη βόϊου ορού (Bovine Serum Albumin, BSA). Τα δείγµατα ετοιµάζονται για ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western για την πρωτεΐνη HARP. Υπολογίζεται κάθε δείγµα που θα ηλεκτροφορηθεί να περιέχει 25 µg πρωτεΐνης. ιαλύµατα ιάλυµα Bradford (1X): 0,1 mm Coomasie G-250 5% κ.ό. 95% αιθανόλη 10% κ.ό. 85% H 3 PO 4 ιήθηση του διαλύµατος 5 φορές µε χρήση διηθητικού χαρτιού Ανάλυση πρωτεϊνών µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακριλαµιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) [320, 321] Παρασκευή 10 ml πηκτώµατος διαχωρισµού: 17,5% Απεσταγµένο νερό 1,34 ml 30% ακρυλαµίδιο 5,84 ml 1,5 M Tris ph 8,8 2,5 ml 10% SDS 0,1 ml 20% AMPS 0,1 ml TEMED 0,01 ml 68

83 Μέθοδοι Όταν το διάλυµα έχει πολυµεριστεί, η επιφάνεια του πηκτώµατος διαχωρισµού ξεπλένεται µε απεσταγµένο νερό και προστίθεται το πήκτωµα συµπύκνωσης, το οποίο ετοιµάζεται όπως φαίνεται στο πίνακα που ακολουθεί: 3,5 % Απεσταγµένο νερό 1,84 ml 30% ακρυλαµίδιο 0,35 ml 0,5 M Tris ph 6,8 0,76 ml 10% SDS 0,03 ml 20% AMPS 0,03 ml TEMED 0,003 ml Μέχρι να πολυµεριστεί το πήκτωµα (περίπου 20 λεπτά) προετοιµάζονται τα δείγµατα. Συγκεκριµένα, τα δείγµατα που έχουν προκύψει από οµογενοποίηση της CAM (25 µg/δείγµα), αραιώνονται 1:1 µε ρυθµιστικό διάλυµα δειγµάτων ηλεκτροφόρησης 2Χ. Ακολουθεί θέρµανση των δειγµάτων για 5 λεπτά στους C και φυγοκέντρηση για 3 λεπτά σε g. Τα δείγµατα µεταφέρονται στις θέσεις που έχουν σχηµατιστεί στο πήκτωµα πακεταρίσµατος. Με τροφοδοτικό συνεχούς ρεύµατος εφαρµόζεται ηλεκτρικό πεδίο σταθερής έντασης 35 ma και τα δείγµατα µετακινούνται από τον αρνητικό στο θετικό πόλο του συστήµατος µε ταχύτητα ανάλογη του µοριακού τους βάρους. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, γίνεται τοποθέτηση του πηκτώµατος διαχωρισµού σε κατάλληλη συσκευή, για µεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωµα σε µεµβράνη PVDF (Western blot). ιαλύµατα ιάλυµα ακρυλαµιδίου 30% κ.β (30 ακρυλαµίδιο/1 µεθυλεν-δις-ακρυλαµίδιο): 30 g Ακρυλαµίδιο 1 g Bis-ακρυλαµίδιο 100 ml απεσταγµένο νερό 69

84 Μέθοδοι 1,5 Μ Tris-HCl, ph 8,8 0,5 M Tris-HCl, ph 6,8 ιάλυµα SDS 10% κ.β (δωδεκακυλοθειϊκό νάτριο) ιάλυµα Υπερθειϊκού αµµωνίου (AMPS) 20% κ.β TEMED (Ν,Ν,Ν,Ν -Τετραµεθυλ-αιθυλεν-διαµίνη) Ρυθµιστικό διάλυµα δειγµάτων (2Χ): 4 Μ ουρία 0,03 Μ SDS 0,05 M Tris 10% κ.ό. γλυκερόλη 2% κ.β κυανούν της βρωµοφαινόλης 10% κ.ό. µερκαπτοαιθανόλη Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροδίων (5X): 2 Μ γλυκίνη 0,25 Μ Tris-base 0,02 Μ SDS Ανάλυση της HARP κατά Western [151] Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, το πήκτωµα τοποθετείται σε κατάλληλη συσκευή για τη µεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη PVDF. Η µεταφορά πραγµατοποιείται µε εφαρµογή οµοιογενούς ηλεκτρικού πεδίου (ηλεκτροµεταφορά). Το πήκτωµα και η µεµβράνη εµβαπτίζονται σε ρυθµιστικό διάλυµα µεταφοράς και εφαρµόζεται σταθερή ένταση ρεύµατος 400 ma για 2 ώρες, µε τέτοιο τρόπο, ώστε οι αρνητικά φορτισµένες πρωτεΐνες οι οποίες βρίσκονται στο πήκτωµα να µεταφερθούν στη µεµβράνη PVDF (η οποία είναι τοποθετηµένη µεταξύ του πηκτώµατος, µε το οποίο είναι σε επαφή, και του θετικού πόλου). Μετά την ολοκλήρωση της µεταφοράς, η µεµβράνη ξεπλένεται µε TBS-Τ για 5 λεπτά υπό ανακίνηση, σε θερµοκρασία δωµατίου. 70

85 Μέθοδοι Ακολουθεί κάλυψη των ελεύθερων θέσεων δέσµευσης της µεµβράνης (ώστε να αποφευχθεί η µη ειδική δέσµευση αντισωµάτων στη µεµβράνη) µε την επώαση της µεµβράνης σε ρυθµιστικό διάλυµα TBS-T µε 3% κ.β. BSA στους 4 0 C, για όλο το βράδυ και υπό ανακίνηση. Ακολουθεί απόχυση του παραπάνω διαλύµατος και η µεµβράνη υφίσταται 3 πλυσίµατα των 5 λεπτών µε διάλυµα TBS-T σε θερµοκρασία δωµατίου. Η µεµβράνη εµβαπτίζεται στο διάλυµα πρώτου αντισώµατος, συγκέντρωσης 45 µg/ml, το οποίο είναι αραιωµένο σε TBS-T. Ακολουθεί επώαση της µεµβράνης υπό ανακίνηση σε θερµοκρασία δωµατίου για 1 ώρα. Ακολουθεί απόχυση του παραπάνω διαλύµατος και η µεµβράνη υφίσταται 3 πλυσίµατα των 5 λεπτών µε διάλυµα TBS-T σε θερµοκρασία δωµατίου. Η µεµβράνη επωάζεται στο διάλυµα δεύτερου αντισώµατος, το οποίο είναι αραιωµένο 1:7.500 σε TBS-T, σε θερµοκρασία δωµατίου υπό ανακίνηση. Ακολουθεί απόχυση του παραπάνω διαλύµατος και η µεµβράνη υφίσταται 3 πλυσίµατα των 5 λεπτών µε διάλυµα TBS-T. Το ανοσοαποτύπωµα της πρωτεΐνης στη µεµβράνη εµφανίζεται µε σύστηµα χηµειοφωταύγειας. Υλικά και ιαλύµατα Ρυθµιστικό διάλυµα για την συσκευή µεταφοράς πρωτεϊνών: 0,04 Μ Γλυκίνη 0,05 Μ Tris-base 1 mm SDS 20% κ.ό. Μεθανόλη (απόλυτη) Ρυθµιστικό διάλυµα TBS ph 7,6: 0,02 Μ Tris-base 0,3 Μ NaCl 0,38% κ.ό. HCl (πυκνό) Ρυθµιστικό διάλυµα TBS-Tween 20 ph 7,6 (TBS-T): Ρυθµιστικό διάλυµα TBS 0,05% κ.ό. Tween 20 71

86 Μέθοδοι Σύστηµα Χηµειοφωταύγειας: Χρησιµοποιήθηκε το ολοκληρωµένο σύστηµα χηµειοφωταύγειας από την εταιρεία Chemicon (ChemiLucent, Chemicon International Inc., CA). Αντίσωµα έναντι της HARP: Πολυκλωνικό αντίσωµα, αποµονωµένο µε χρωµατογραφία συγγένειας (Lab.CRRET, France). εύτερο αντίσωµα Anti-Goat IgG (Β3148, mouse, clone GT-34): Συνδεδεµένο µε υπεροξειδάση, της εταιρείας Sigma (Sigma, Greece). Μεµβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride): Millipore Immobilon-P Transfer Membrane. 3. Αποµόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα οµφάλιου λώρου ανθρώπου [322] Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν οµφάλιοι λώροι ανθρώπου για την αποµόνωση κυττάρων HUVEC. Οι οµφάλιοι λώροι προέρχονται από καισαρικές επεµβάσεις που πραγµατοποιούνται στην Ιδιωτική Κλινική της Πάτρας. Μετά το τέλος κάθε επέµβασης, ο οµφάλιος λώρος εµβαπτίζεται σε ισοτονικό ρυθµιστικό διάλυµα (PBS) και µεταφέρεται στον εργαστηριακό χώρο για την περαιτέρω διαδικασία αποµόνωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η κολλαγενάση αραιώνεται µε θρεπτικό µέσο Μ199 µέχρι τελικής συγκέντρωσης 0,01%. Η αραίωση γίνεται πάντα σε θρεπτικό µέσο ή σε άλλο διάλυµα το οποίο περιέχει Ca 2+, τα οποία είναι απαραίτητα για τη δράση του ενζύµου. Το θρεπτικό µέσο που χρησιµοποιείται δεν πρέπει να περιέχει ορό, ο οποίος περιέχει αναστολείς διαφόρων ενζύµων, µεταξύ των οποίων είναι και η κολλαγενάση. Ο οµφάλιος λώρος έχει δύο αρτηρίες και µία φλέβα, η οποία είναι µεγαλύτερη, πιο εύκολα διακριτή και µε µαλακότερα τοιχώµατα. Ξεπλένεται η φλέβα µε PBS, ώστε να αποµακρυνθούν υπολείµµατα αίµατος και θρόµβοι. Με αιµοστάτη φράσσεται το ένα άκρο του οµφάλιου λώρου. Από το άλλο άκρο του οµφάλιου λώρου, χρησιµοποιώντας σύριγγα των 20 ml, διοχετεύεται µέσα στη φλέβα το θρεπτικό µέσο µε την κολλαγενάση. 72

87 Μέθοδοι Με αιµοστάτη φράσσεται και το δεύτερο άκρο του οµφάλιου λώρου. Ο οµφάλιος λώρος τοποθετείται σε αποστειρωµένο δοχείο και επωάζεται σε υδατόλουτρο για λεπτά στους 37 0 C. Το διάλυµα που περιέχεται στον οµφάλιο λώρο (θρεπτικό µέσο µε κολλαγενάση και αποκολληµένα κύτταρα HUVEC) συλλέγεται σε αποστειρωµένο σωληνάριο των 50 ml. Αφαιρείται ο αιµοστάτης και από το άλλο άκρο του οµφάλιου λώρου. Ο οµφάλιος λώρος ξεπλένεται µε PBS και το έκλουµα συλλέγεται στο ίδιο σωληνάριο. Πραγµατοποιείται φυγοκέντρηση των κυττάρων σε θερµοκρασία δωµατίου, στα 500 g για 4 λεπτά. Το υπερκείµενο απορρίπτεται και τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 10 ml πλήρους θρεπτικού µέσου. Το εναιώρηµα των κυττάρων µεταφέρεται σε τρυβλίο κατάλληλο για την καλλιέργεια κυττάρων. Τα κύτταρα επωάζονται σε ολική υγρασία, στους 37 0 C και σε ατµόσφαιρα 5% CO 2 για µία ηµέρα. Την επόµενη ηµέρα αφαιρείται υπό κενό το θρεπτικό µέσο, το οποίο περιέχει επιπλέον ερυθρά αιµοσφαίρια που δεν έχουν προσκολληθεί στον πυθµένα του τρυβλίου. Τα κύτταρα ξεπλένονται δύο φορές µε PBS. Προστίθενται 10 ml πλήρους θρεπτικού µέσου και ακολουθεί παρατήρηση στο µικροσκόπιο. Εάν η αποµόνωση των κυττάρων είναι επιτυχής, διακρίνονται συσσωµατώµατα κυττάρων τα οποία είναι προσκολληµένα στο δάπεδο του τρυβλίου. Τα κύτταρα επωάζονται ανανεώνοντας το θρεπτικό µέσο κάθε 3-4 ηµέρες, µέχρις ότου φτάσουν σε βαθµό κάλυψης 80-90% του πυθµένα του τρυβλίου. ιαλύµατα ιάλυµα κολλαγενάσης 1% κ.β: 0,1 g κολλαγενάση τύπου 1Α σε 10 ml Μ199* Το διάλυµα µοιράζεται σε ποσότητες µικρότερου όγκου και φυλάσσεται στους C, µέχρι να χρησιµοποιηθεί. Για την αποµόνωση των κυττάρων η κολλαγενάση χρησιµοποιείται σε τελική συγκέντρωση 0,01%. 73

88 Μέθοδοι Θρεπτικό µέσο Μ199*: M199 (earl s) Πενικιλλίνη- στρεπτοµυκίνη Γενταµυκίνη Αµφοτερικίνη N-ακετυλ-L-αλανυλ-L-γλουταµίνη 500 ml 100 U/ml 50 µg/ml 2,5 µg/ml 2 mμ Πλήρες θρεπτικό µέσο για HUVEC M199* 85 ml Ορός βοός (fetal bovine serum, FBS) 15 ml Endothelial cell growth supplement (ECGS) 15 mg Ηπαρίνη 5 U/ml Τo εκχύλισµα ECGS είναι εµπλουτισµένο σε αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (fibroblast growth factor, FGF) και είναι απαραίτητο για την ικανοποιητική ανάπτυξη των HUVEC. Η ηπαρίνη χρησιµοποιείται προκειµένου να ενεργοποιηθεί ο ECGS. Το θρεπτικό µέσο αποστειρώνεται µε διοχέτευσή του µε σύριγγα των 20 ml, µέσα από φίλτρο µε πόρους που έχουν διάµετρο 0,2 µm και φυλάσσεται στους 4 0 C. 4. Μέτρηση κυττάρων σε αιµατοκυτταρόµετρο Neubauer Το αιµατοκυτταρόµετρο (Εικόνα 9) είναι µια τροποποιηµένη αντικειµενοφόρος πλάκα που έχει δυο κατάλληλα επεξεργασµένες επιφάνειες. Κάθε µια από αυτές έχει ένα τετραγωνισµένο πλέγµα, το οποίο αποτελείται από 9 αρχικά τετράγωνα µε µήκος πλευράς 1 mm (εµβαδόν 1 mm 2 ). Κάθε τετράγωνο ορίζεται από τρεις παράλληλες γραµµές (µε απόσταση µεταξύ τους 2,5 µm), που χρησιµεύουν για τον καθορισµό της θέσης των κυττάρων εντός ή εκτός του πλέγµατος. Σε κάθε ένα από τα αρχικά τετράγωνα περιέχονται επιπλέον διαβαθµίσεις, για διευκόλυνση της µέτρησης των κυττάρων. Το επίπεδο του πλέγµατος βρίσκεται 0,1 mm χαµηλότερα από δυο ακµές, στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Υπάρχει µια κοίλη επιφάνεια µεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισµένης επιφάνειας και των σηµείων όπου στηρίζεται η καλυπτρίδα. Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρηµα και µε τριχοειδικά φαινόµενα απλώνεται στην τετραγωνισµένη επιφάνεια. 74

89 Μέθοδοι 1.0 mm Πρώτο τετράγωνο περι οχή βάθος όγκος = µετρήσιµα = µη µετρήσιµα Εικόνα 9: Αιµατοκυτταρόµετρο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηµατικά και ο τρόπος υπολογισµού των κυττάρων. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήµατος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0,1 mm 3 (1,0 mm 2 x 0,1 mm) ή 10-4 ml. Έτσι, η συγκέντρωση των κυττάρων στο αρχικό εναιώρηµα (κύτταρα/ml) είναι: Μέτρηση στο ένα τετράγωνο Χ Ανακαλλιέργεια κυττάρων LNCaP, PC-LNCaP και AS-LNCaP [151] Στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιµοποιήθηκε η κυτταρική σειρά LNCaP (επιθηλιακά κύτταρα από καρκίνο ανθρώπινου προστάτη). Επίσης χρησιµοποιήθηκαν κύτταρα LNCaP σταθερά µετασχηµατισµένα (stable transfection) µε πλασµίδιο, στο οποίο έχει κλωνοποιηθεί αλληλουχία για την παραγωγή της αντινοηµατικής αλληλουχίας του mrna της HARP (Antisense LNCaP, AS-LNCaP). Το συγκεκριµένο πλασµίδιο φέρει επιπλέον γονίδιο για 75

90 Μέθοδοι ανθεκτικότητα έναντι της νεοµυκίνης. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν τα κύτταρα PC-LNCaP, δηλαδή LNCaP σταθερά µετασχηµατισµένα µόνο µε το πλασµίδιο φορέα (χωρίς την κωδικοποιούσα αλληλουχία για το antisense του mrna της HARP). Για τα κύτταρα LNCaP ισχύει η κάτωθι πειραµατική πορεία ανακαλλιέργειας. Η ανακαλλιέργεια πραγµατοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει κατά 80-90% την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται. Ο προσδιορισµός του βαθµού κάλυψης γίνεται µε παρατήρηση του τρυβλίου στο µικροσκόπιο. Κύτταρα υγιή θεωρούνται αυτά τα οποία είναι προσκολληµένα στο δάπεδο του τρυβλίου. Το τρυβλίο µε τα κύτταρα µεταφέρεται σε θάλαµο νηµατικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. Αποµάκρυνση του θρεπτικού µέσου της καλλιέργειας και ξέπλυµα των κυττάρων δύο φορές µε PBS. Με τη διαδικασία αυτή αποµακρύνονται τυχόν εναποµείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς της τρυψίνης. Ανά τρυβλίο διαµέτρου 100 mm προστίθεται 1 ml τρυψίνης. Η πορεία αποκόλλησης των κυττάρων παρακολουθείται στο µικροσκόπιο. Η επιβίωση των κυττάρων κινδυνεύει σε περίπτωση παραµονής τους πλέον των 10 λεπτών στην τρυψίνη. Με την ολοκλήρωση της αποκόλλησης των κυττάρων, η τρυψίνη αναστέλλεται µε την προσθήκη 3 ml πλήρους θρεπτικού µέσου RPMI-1640 που περιέχει 10% ορό. Το εναιώρηµα των κυττάρων µεταφέρεται σε αποστειρωµένο σωλήνα των 15 ml. Προστίθεται PBS και συλλέγονται τα κύτταρα που έχουν εναποµείνει µέσα στο τρυβλίο. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στους 26 0 C στα 500 g. Το υπερκείµενο θρεπτικό µέσο αποµακρύνεται και προστίθεται πλήρες θρεπτικό µέσο RPMI-1640 µέχρι τελικού όγκου 3 ml. Τα κύτταρα επαναιωρούνται µε τη βοήθεια πιπέτας. Από το εναιώρηµα των κυττάρων προστίθενται 10 µl στην ειδική υποδοχή του αιµατοκυτταρόµετρου και µετράται ο αριθµός των κυττάρων στο µικροσκόπιο. 76

91 Μέθοδοι Για κάθε ανακαλλιέργεια χρησιµοποιούνται κύτταρα ανά ml πλήρους θρεπτικού µέσου, εκτός από τις περιπτώσεις που τα κύτταρα θα χρησιµοποιηθούν σε ειδικά πειράµατα. Για τα κύτταρα AS-LNCaP και PC-LNCaP ισχύει η παραπάνω πειραµατική πορεία ανακαλλιέργειας, µε τη διαφορά ότι στο θρεπτικό µέσο περιλαµβάνεται πάντα το αντιβιοτικό νεοµυκίνη G 418 σε τελική συγκέντρωση 600 µg/ml. Υλικά και ιαλύµατα Θρεπτικό µέσο RPMI-1640 RPMI-1640 (+γλουταµίνη) Πενικιλλίνη-στρεπτοµυκίνη Γενταµυκίνη Αµφοτερικίνη 500 ml 100 U/ml 50 µg/ml 2,5 µg/ml Πλήρες Θρεπτικό µέσο για κύτταρα LNCaP RPMI-1640 (+γλουταµίνη) Ορρός βοός (fetal bovine serum, FΒS) 45 ml 5 ml PBS Τρυψίνη EDTA: 0,05%-0,02% σε PBS χωρίς Ca +2 Αιµατοκυτταρόµετρο ιάλυµα Νεοµυκίνης G 418, 50 mg/ml (σε νερό) (Sigma) 6. Ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC [323] Το πειραµατικό πρωτόκολλο που ακολουθείται για την ανακαλλιέργεια των κυττάρων HUVEC είναι όµοιο µε αυτό που ακολουθείται για τα κύτταρα LNCaP. Εξαίρεση αποτελούν οι παρακάτω τροποποιήσεις: Για την καλλιέργεια των κυττάρων HUVEC απαιτείται να έχει προηγηθεί 77

92 Μέθοδοι επίστρωση των τρυβλίων µε διάλυµα ζελατίνης 1% κ.β. Το θρεπτικό µέσο που χρησιµοποιείται είναι πλήρες M199*. Υλικά και ιαλύµατα ιάλυµα ζελατίνης 1% κ.β σε PBS PBS Τρυψίνη EDTA M199* Πλήρες θρεπτικό µέσο Αιµατοκυτταρόµετρο 7. Έλεγχος επίδρασης των υπό εξέταση ουσιών στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων LNCaP, PC-LNCaP και AS-LNCaP [151] Μετά από αποκόλληση των κυττάρων µε την επίδραση τρυψίνης υπολογίζεται ο αριθµός των κυττάρων σε αιµατοκυτταρόµετρο, όπως περιγράφεται παραπάνω. Ακολούθως: Σε πλακίδιο που έχει 24 µικροκυψελίδες µεταφέρονται ανά µικροκυψελίδα κύτταρα σε τελικό όγκο 0,5 ml πλήρους θρεπτικού µέσου. Τα κύτταρα επωάζονται για 24 ώρες ώστε να προσκολληθούν στον πυθµένα του πλακιδίου σε απόλυτη υγρασία στους 37 0 C σε ατµόσφαιρα 5% CO 2. Το θρεπτικό µέσο των κυττάρων αποµακρύνεται υπό κενό και αντικαθίσταται από θρεπτικό µέσο (RPMI-1640) που περιέχει 2% κ.ό. ορό. Τα κύτταρα επωάζονται για 24 ώρες. Το θρεπτικό µέσο των κυττάρων αποµακρύνεται υπό κενό και αντικαθίσταται εκ νέου µε θρεπτικό µέσο που περιέχει 2% κ.ό. ορό, στο οποίο προστίθενται οι υπό εξέταση ουσίες στις επιθυµητές συγκεντρώσεις. 78

93 Μέθοδοι Μετά από τη συµπλήρωση 48 ωρών, προστίθεται 1/10 του όγκου του θρεπτικού µέσου (50 µl) από το διάλυµα ΜΤΤ 10Χ ανά µικροκυψελίδα. Επώαση για 2 ώρες σε απόλυτη υγρασία, στους 37 ο C σε ατµόσφαιρα 5% CO 2 και αποµάκρυνση του θρεπτικού µέσου που βρίσκεται στις µικροκυψελίδες υπό κενό. Ξέπλυµα των κυττάρων 2 φορές µε PBS και προσθήκη 100 µl οξινισµένης ισοπροπανόλης ανά µικροκυψελίδα. Ήπια ανακίνηση ώστε να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορµαζάνης. Μεταφορά των εκχυλισµάτων σε πλακίδιο ELISA 96 µικροκυψελίδων και φωτοµέτρηση στα 490 nm χρησιµοποιώντας φωτόµετρο για ELISA. Από τις απορροφήσεις υπολογίζεται ο αριθµός των κυττάρων βάσει της πρότυπης καµπύλης που έχει κατασκευαστεί. Για τα κύτταρα PC- και AS-LNCaP ισχύει η παραπάνω πειραµατική πορεία µε τη διαφορά ότι σε όλα τα στάδια, στο θρεπτικό µέσο των κυττάρων περιέχεται επιπλέον το αντιβιοτικό νεοµυκίνη G 418 σε τελική συγκέντρωση 600 µg/ml. Υλικά και ιαλύµατα Πλακίδια 24 µικροκυψελίδων κατάλληλα για κυτταροκαλλιέργειες (Greiner) Αιµατοκυτταρόµετρο PBS Πλήρες θρεπτικό µέσο για κύτταρα LNCaP Θρεπτικό µέσο RPMI-1640 ιάλυµα ΜΤΤ 10Χ: 5 mg MTT (Sigma) ανά ml PBS. ιάλυµα οξινισµένης ισοπροπανόλης 0,33% κ.ό. ιάλυµα Νεοµυκίνης G 418, 50 mg/ml (σε νερό) 79

94 Μέθοδοι 8. Έλεγχος επίδρασης των υπό εξέταση ουσιών στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC [323] Η πειραµατική πορεία ελέγχου της επίδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC είναι όµοια µε την πορεία που ακολουθείται για τα κύτταρα LNCaP, µε κάποιες τροποποιήσεις: Χρησιµοποιείται υγρό θρεπτικό µέσο M199*. Στο πλακίδιο 24 µικροκυψελίδων προστίθενται κύτταρα ανά µικροκυψελίδα σε τελικό όγκο 0,5 ml πλήρους θρεπτικού µέσου. Πριν την προσθήκη των κυττάρων στο πλακίδιο, προηγείται επίστρωση των πυθµένων των µικροκυψελίδων µε ζελατίνη. Υλικά και ιαλύµατα Πλακίδια 24 µικροκυψελίδων κατάλληλα για κυτταροκαλλιέργειες (greiner) Αιµατοκυτταρόµετρο ιάλυµα ζελατίνης PBS Θρεπτικό µέσο Μ199* ιάλυµα ΜΤΤ 10Χ ιάλυµα οξινισµένης ισοπροπανόλης 0,33% κ.ό. 80

95 Μέθοδοι 9. Μελέτη του χηµειοτακτισµού των κυττάρων LNCaP, PC-LNCaP και AS-LNCaP (Τransfilter assay) [151, 324] Χρησιµοποιείται πλακίδιο, στην κάθε µικροκυψελίδα του οποίου εισέρχεται µία ένθεση που χωρίζει το κελίο σε δύο µέρη, µέσω µιας µεµβράνης πολυµερούς ανθρακικών (transwell plates) (Εικόνα 10). Εικόνα 10: Σχηµατική απεικόνιση του Transfilter assay. (α) Τα κύτταρα εναποτίθενται στην εσωτερική µικροκυψελίδα, πάνω στην πορώδη µεµβράνη, ενώ η υπό εξέταση ουσία στην εξωτερική µικροκυψελίδα. (β) Οι πόροι της µεµβράνης είναι αρκετά µικροί ώστε να επιτρέπουν µόνο την ενεργή διέλευση των κυττάρων. Χηµειοτακτικοί παράγοντες επάγουν τη µετανάστευση των κυττάρων µέσω του φίλτρου, προς την εξωτερική µικροκυψελίδα. (γ) Τα κύτταρα που δεν µετανάστευσαν αποµακρύνονται. Ακολουθεί χρώση και µέτρηση των κυττάρων. (δ) και (ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του πορώδους φίλτρου χωρίς κύτταρα (δ) ή µε κύτταρα που έχουν µεταναστεύσει (ε). Στις φωτογραφίες διακρίνονται οι πόροι της µεµβράνης (µικρά βέλη) και τα κύτταρα µετά από µονιµοποίηση και χρώση (µεγάλα βέλη) [324]. Σε κάθε µικροκυψελίδα και στο κάτω µέρος της µεµβράνης (εξωτερική µικροκυψελίδα), προστίθενται 600 µl θρεπτικό µέσο RPMI-1640 που περιέχει 0,5% BSA και 0,5% ορό, αν πρόκειται για κελίo αναφοράς (µάρτυρας). Στην περίπτωση µελέτης της χηµειοτακτικής δράσης µιας ουσίας, η ουσία 81

96 Μέθοδοι προστίθεται στην εξωτερική µικροκυψελίδα και σε θρεπτικό µέσο ίδιο µε αυτό του κελιού-µάρτυρα. Στη συνέχεια, στο πάνω µέρος της µεµβράνης (εσωτερική µικροκυψελίδα) προστίθενται 100 µl θρεπτικού µέσου RPMI-1640 που περιέχει 0,5% BSA και κύτταρα LNCaP. Για τα κύτταρα PC- και AS-LNCaP, στο θρεπτικό µέσο των κυττάρων προστίθεται επιπλέον το αντιβιοτικό νεοµυκίνη G 418 σε τελική συγκέντρωση 600 µg/ml. Επώαση του πλακιδίου στον κλίβανο των κυττάρων για 20 ώρες και µονιµοποίηση των κυττάρων εµβαπτίζοντας τη µεµβράνη σε µονιµοποιητικό διάλυµα Carson s για 5 λεπτά. Προσεκτική αποµάκρυνση των κυττάρων που βρίσκονται στο πάνω µέρος της µεµβράνης µε ένα βαµβακοφόρο στυλεό και έλεγχος στο µικροσκόπιο. Με µεγάλη προσοχή κόβεται η µεµβράνη µε τη βοήθεια νυστεριού, ανακτώντας τη µεγαλύτερη δυνατή επιφάνεια. Τοποθέτηση της µεµβράνης σε αντικειµενοφόρο πλάκα, έτσι ώστε τα κύτταρα που µετανάστευσαν προς την εξωτερική µικροκυψελίδα να βρίσκονται στην επάνω επιφάνεια. Χρώση των κυττάρων µε εναπόθεση 1-2 σταγόνων διαλύµατος της χρωστικής κυανούν της τολουϊδίνης στη µεµβράνη για λεπτά. Αποχρωµατισµός της µεµβράνης µε διαδοχικές εµβαπτίσεις σε νερό και τοποθέτηση σε αντικειµενοφόρο πλάκα, µε τα κύτταρα προς την κάτω επιφάνεια. Μέτρηση των κυττάρων στο µικροσκόπιο σε όλη την έκταση της µεµβράνης, µε τη βοήθεια ενός βαθµονοµηµένου πλέγµατος. Υλικά και ιαλύµατα Σύστηµα µελέτης χηµειοτακτισµού Τransfilter assay: Μικροπλακίδια Transwell µε διάµετρο πόρων µεµβράνης 8 µm (Costar, Avon, France). Θρεπτικό µέσο RPMI ,5% κ.β BSA και 0,5% κ.ό. ορό Θρεπτικό µέσο RPMI ,5% κ.β BSA ιάλυµα κυανούν της τολουϊδίνης: 0,33% κ.β κυανούν της τολουϊδίνης σε PBS, ph 6,6. Μονιµοποιητικό διάλυµα Carson s 82

97 Μέθοδοι ιάλυµα Νεοµυκίνης G 418, 50 mg/ml (σε νερό) 10. Μελέτη του χηµειοτακτισµού των κυττάρων HUVEC (Transfilter assay) [323, 324] Η πειραµατική πορεία ελέγχου της επίδρασης ουσιών στο χηµειοτακτισµό των κυττάρων HUVEC, είναι όµοια µε την πορεία που ακολουθείται για τα κύτταρα LNCaP µε κάποιες τροποποιήσεις: Σε κάθε µικροκυψελίδα και στο κάτω µέρος της µεµβράνης (εξωτερική µικροκυψελίδα), προστίθενται 600 µl θρεπτικό µέσο Μ199* που περιέχει 0,25% BSA, αν πρόκειται για κελίο αναφοράς (µάρτυρας). Στην περίπτωση µελέτης της χηµειοτακτικής δράσης µιας ουσίας, η ουσία προστίθεται στην εξωτερική µικροκυψελίδα και σε θρεπτικό µέσο ίδιο µε αυτό του κελιού- µάρτυρα. Στο πάνω µέρος της µεµβράνης (εσωτερική µικροκυψελίδα) προστίθενται 100 µl θρεπτικού µέσου Μ199* που περιέχει 0,25% BSA και κύτταρα HUVEC. H επώαση του πλακιδίου στον κλίβανο των κυττάρων πραγµατοποιείται για 4 ώρες. Υλικά και ιαλύµατα Σύστηµα µελέτης χηµειοτακτισµού Τransfilter assay Μ199* 0,25% κ.β BSA ιάλυµα κυανούν της τολουϊδίνης 0,33% κ.β. 83

98 Μέθοδοι 11. Αποµόνωση HARP από το υγρό θρεπτικό µέσο καλλιέργειας των κυττάρων [151] Η πειραµατική αυτή πορεία εφαρµόστηκε τόσο στα κύτταρα LNCaP όσο και στα HUVEC. Επώαση των κυττάρων σε 5 ml πλήρους θρεπτικού µέσου µέχρι βαθµού πλήρους κάλυψης του πυθµένα τρυβλίου διαµέτρου 60 mm. Αφαίρεση του θρεπτικού µέσου και επώαση των κυττάρων µε θρεπτικό µέσο που περιέχει 2% ορό, για 16 ώρες στον κλίβανο των κυττάρων. Ανανέωση του θρεπτικού µέσου (µε θρεπτικό µέσο που επίσης περιέχει 2% κ.ό. ορό) και προσθήκη των υπό εξέταση ουσιών. Επώαση για 24 ώρες στον κλίβανο των κυττάρων. Συλλογή του θρεπτικού µέσου σε σωληνάριο των 15 ml και προσθήκη διαλύµατος Α, ώστε η τελική συγκέντρωση σε NaCl να είναι 0,5 Μ. Προσθήκη 50 µl σφαιριδίων ηπαρίνης-σεφαρόζης σε κάθε σωληνάριο και ανακίνηση στους 4 0 C για 16 ώρες. Φυγοκέντρηση στα g, στους 4 0 C, για 5 λεπτά. Αποµάκρυνση του υπερκείµενου, επαναιώρηση των σφαιριδίων σε 10 ml διαλύµατος Β και φυγοκέντρηση στα g, στους 4 0 C, για 5 λεπτά (Χ2). Αποµάκρυνση του υπερκείµενου, επαναιώρηση των σφαιριδίων σε 10 ml διαλύµατος Γ και φυγοκέντρηση στα g, στους 4 0 C, για 5 λεπτά (Χ2). Αποµάκρυνση του υπερκείµενου και προσθήκη 50 µl διαλύµατος δειγµάτων ηλεκτροφόρησης. Ανάλυση των πρωτεϊνών (40 µl από το κάθε δείγµα) σε SDS-PAGE και ταυτοποίηση της HARP κατά Western (βλέπε παραγράφους και 2.2.4). 84

99 Μέθοδοι Υλικά και ιαλύµατα ιάλυµα Α: 20 mm Hepes ph 7,4 2 M NaCl 1 mm PMSF 5 mm EDTA 1 µg/ml απροτινίνη ιάλυµα Β: 20 mm Hepes ph 7,4 0,5 M NaCl ιάλυµα Γ: 20 mm Hepes ph 7,4 Σφαιρίδια ηπαρίνης-σεφαρόζης: Heparin Sepharose beads (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden). 12. Αποµόνωση ολικού RNA από κύτταρα LNCaP Χρησιµοποιήθηκε το ολοκληρωµένο σύστηµα αποµόνωσης RNA NucleoSpin RNA II της εταιρείας Macherey-Nagel (Germany), µε το οποίο πραγµατοποιείται αποµόνωση ολικού RNA µέσω της προσρόφησής του σε ειδική στήλη χρωµατογραφίας. Ακολουθείται η εξής πειραµατική πορεία: Λύση των κυττάρων (~4Χ10 6 ) και έντονη ανάδευση µε 350 µl διαλύµατος λύσης (RA1), στο οποίο έχει προστεθεί β-µερκαπτοαιθανόλη (σε αναλογία 1:100). Μεταφορά του εκχυλίσµατος των κυττάρων σε στήλη χρωµατογραφίας που φέρει φίλτρο και συλλογή του διαλύµατος των νουκλεϊκών οξέων µετά από φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό. Απόρριψη της στήλης και προσθήκη 350 µl αιθανόλης 70% κ.ό. στο διάλυµα που έχει συλλεχθεί. Ακολουθεί έντονη ανάδευση. Μεταφορά του διαλύµατος σε νέα στήλη και φυγοκέντρηση στα g για 30 δευτερόλεπτα. Στο στάδιο αυτό τα νουκλεϊνικά οξέα προσροφούνται στο φίλτρο της στήλης και οι πρωτεΐνες διέρχονται από τη στήλη και συλλέγονται σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου. 85

100 Μέθοδοι Αφαλάτωση του φίλτρου της στήλης µε προσθήκη 350 µl διαλύµατος αφαλάτωσης (MDB-Membrane Desalting Buffer) και φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό. Προσθήκη διαλύµατος DNάσης στην επιφάνεια του φίλτρου και επώαση για 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Προσθήκη 200 µl διαλύµατος αναστολής της DNάσης (RA2) στην επιφάνεια του φίλτρου. Φυγοκέντρηση στα g για 30 δευτερόλεπτα και µεταφορά της στήλης σε νέο σωληνάριο µικροφυγοκέντρου. Προσθήκη 600 µl διαλύµατος έκλουσης DNA (RA3). Φυγοκέντρηση στα g για 30 δευτερόλεπτα, απόρριψη του εκλούµατος, προσθήκη στην επιφάνεια του φίλτρου εκ νέου 350 µl από το διάλυµα RA3 και φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες. Μεταφορά της στήλης σε νέο σωληνάριο µικροφυγοκέντρου και έκλουση του RNA µε προσθήκη 60 µl αποστειρωµένου Η 2 Ο στην επιφάνεια του φίλτρου. Φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό και διατήρηση του διαλύµατος RNA στους C. Στο διάλυµα ολικού RNA, προκειµένου να χρησιµοποιηθεί σε περαιτέρω αναλύσεις, πραγµατοποιείται προσδιορισµός της συγκέντρωσης ολικού RNA µε φασµατοφωτοµετρική µέθοδο. Επίσης προκειµένου να ελεγχθεί η ποιότητά του, πραγµατοποιείται ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης 1% κ.β. (Βλέπε παράγραφο 14). 13. Προσδιορισµός της συγκέντρωσης RNA [325] Σε αποστειρωµένο σωληνάριο eppendorf, τοποθετείται 1 ml αποστειρωµένο νερό και 4 µl από το διάλυµα του νουκλεϊνικού οξέος. Το διάλυµα µεταφέρεται σε κυψελίδα φωτόµετρου κατασκευασµένη από χαλαζία. Σε δεύτερη κυψελίδα τοποθετείται 1 ml αποστειρωµένου νερού, που χρησιµοποιείται ως τυφλό για το µηδενισµό του φωτόµετρου, κάθε φορά πριν τη φωτοµέτρηση δείγµατος. Το δείγµα φωτοµετρείται σε δύο διαφορετικά µήκη κύµατος, στα 260 nm που απορροφούν τα νουκλεϊνικά οξέα και στα 280 nm 86

101 Μέθοδοι που απορροφούν οι πρωτεΐνες. Η συγκέντρωση RNA υπολογίζεται από τον εξής τύπο: Συγκέντρωση RNA = O.Α. 260nm x 40 x αραίωση Η συγκέντρωση δίνεται σε ng/µl. (Ο συντελεστής 40 εξάγεται από την παρατήρηση ότι ένα διάλυµα RNA, συγκέντρωσης 40 ng/µl, έχει απορρόφηση 1 στα 260 nm). Ο λόγος της οπτικής απορρόφησης στα 260nm ως προς την οπτική απορρόφηση στα 280nm αποτελεί δείκτη της καθαρότητας του δείγµατος. Αν ο λόγος αυτός είναι µικρότερος του 1,8, τότε η περιεκτικότητα του δείγµατος σε πρωτεΐνες είναι υψηλή, κάτι που µπορεί να προκαλέσει προβλήµατα στις περαιτέρω αναλύσεις. 14. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊνικών οξέων σε πήκτωµα αγαρόζης [326, 327] Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης είναι η κύρια µέθοδος που χρησιµοποιείται για την ανάλυση νουκλεϊνικών οξέων. Στα πηκτώµατα αγαρόζης, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα γραµµικών µορίων είναι αντιστρόφως ανάλογη του λογάριθµου του µοριακού τους βάρους. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα εξαρτάται επίσης και από τη συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωµα. Στον Πίνακα 7 παρατίθενται τα πηκτώµατα διαφορετικού ποσοστού αγαρόζης, που χρησιµοποιούνται για την ανάλυση συγκεκριµένων µεγεθών τµηµάτων νουκλεϊνικών οξέων. Παρασκευή του πηκτώµατος αγαρόζης σε ρυθµιστικό διάλυµα Τris-βορικού (ΤΒΕ): Σε µια µικρή κωνική φιάλη προστίθεται προζυγισµένη ποσότητα αγαρόζης, σε συγκεκριµένο όγκο διαλύµατος ηλεκτροφόρησης 0,5Χ TBE. Το διάλυµα θερµαίνεται σε φούρνο µικροκυµάτων µέχρι να διαλυθεί όλη η ποσότητα της αγαρόζης. Όταν η θερµοκρασία του διαλύµατος της αγαρόζης φτάσει στους 50 0 C, προστίθεται βρωµιούχο αιθίδιο σε τελική συγκέντρωση 1 µg/ml. Το διάλυµα 87

102 Μέθοδοι αγαρόζης αποχύνεται στον ειδικό φορέα. Στα δείγµατα των νουκλεϊνικών οξέων προστίθεται διάλυµα δειγµάτων 6Χ σε αναλογία 1:5. Όταν πολυµεριστεί η αγαρόζη, τα προς ανάλυση δείγµατα φέρονται στις ειδικές εγκοπές του πηκτώµατος. Σε οµοιογενές ηλεκτρικό πεδίο (50 V) τα νουκλεϊνικά οξέα αναλύονται µε βάση το µέγεθος τους. Η ανάλυση των δειγµάτων γίνεται σε οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης. Η παρατήρηση των πηκτωµάτων γίνεται µε χρήση διερχόµενου υπεριώδους φωτός. Πίνακας 7: Οι συγκεντρώσεις αγαρόζης που χρησιµοποιούνται για την ανάλυση νουκλεϊνικών οξέων διαφορετικών µεγεθών. Μέγεθος δίκλωνων µορίων (Kbp) Ποσοστό αγαρόζης (% κ.β) , ,6 10-0,8 0,7 7-0,5 0,9 6-0,4 1,2 4-0,2 1,5 3-0,1 2 5Χ TBE 0,45 M Tris-base 0,45 M Βορικό οξύ 0,01 Μ EDTA ph 8,0 ιαλύµατα ιάλυµα Βρωµιούχου αιθίδιου 10 mg/ml 6X διάλυµα δειγµάτων 0,25% κ.β κυανούν της βρωµοφαινόλης 30% κ.ό γλυκερόλη σε Η 2 Ο 88

103 Μέθοδοι 15. Ανάλυση της έκφρασης γονιδίων µε τη χρήση συνδυασµένης αντίστροφης µεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (RT-PCR) [151] 15.1 Σχεδιασµός εναρκτήριων αλληλουχιών (primers) Χρησιµοποιείται η αλληλουχία του µετάγραφου (mrna) του γονιδίου που µελετάται. Οι εναρκτήριες αλληλουχίες (primers) σχεδιάζονται µε κατάλληλο λογισµικό (Omiga 3), ορίζοντας τα εξής χαρακτηριστικά: Το µέγεθος των primers θα πρέπει να κυµαίνεται από 18 έως 22 βάσεις. Η περιεκτικότητα των primers σε GC θα πρέπει να κυµαίνεται µεταξύ 40% και 60%, µε βέλτιστη αυτή της τάξης του 50%. Η θερµοκρασία σύνδεσης (T m ) των primers να κυµαίνεται µεταξύ 45 και 65 0 C, µε βέλτιστη τη θερµοκρασία των 55 0 C. Οι primers δε θα πρέπει να σχηµατίζουν δοµές φουρκέτας (λόγω συµπληρωµατικότητας περιοχών της πρωτοδιάταξης ενός εκάστου) και δεν πρέπει να είναι συµπληρωµατικοί µεταξύ τους. Το µέγεθος του προϊόντος, µετά την αντίδραση της RT-PCR, θα πρέπει να κυµαίνεται µεταξύ βάσεων, µε βέλτιστο µέγεθος αυτό των 600 βάσεων. Η περιεκτικότητα του προϊόντος σε GC θα πρέπει να κυµαίνεται µεταξύ 40% και 60%, µε βέλτιστη περιεκτικότητα 50%. Λαµβάνοντας υπόψη τις παραµέτρους που προαναφέρθηκαν, σχεδιάστηκαν primers για το ώριµο µετάγραφο (mrna) της HARP και της β-ακτίνης, τα χαρακτηριστικά των οποίων παρατίθενται παρακάτω: 89

104 Μέθοδοι Human HARP 5 Primer (forward) Μήκος: 19 b Αλληλουχία: 5 -AGCGTCGAAAATTTGCAGC-3 %GC: 47,4 T m : 53,1 0 C 3 Primer (reverse) Μήκος: 19 b Αλληλουχία: 5 -TTGGTCAGTTTGCCACAGG-3 %GC: 52,6 T m : 51,5 0 C ιαφορά θερµοκρασίας σύνδεσης (T m ) των 2 primers: 1,6 0 C. Μέγεθος του προϊόντος που αναµένεται: 412 bp. Human β-actin 5 Primer (forward) Μήκος: 30 b Αλληλουχία: 5 -GCACACTTAGCCGTGTTCTTTGCACTTTCT-3 %GC: 46,7 T m : 65,2 0 C 3 Primer (reverse) Μήκος: 30 b Αλληλουχία: 5 -AGGCGTACAGGGATAGCACAGCCTGGATAG-3 %GC: 56,7 T m : 67,3 0 C ιαφορά θερµοκρασίας σύνδεσης (T m ) των 2 primers: 2,1 0 C. Μέγεθος του προϊόντος που αναµένεται: 172 bp. 90

105 Μέθοδοι Πραγµατοποίηση των αντιδράσεων RT-PCR Για τη µελέτη της έκφρασης γονιδίων µε την τεχνική RT-PCR χρησιµοποιήθηκε το ολοκληρωµένο σύστηµα Access RT-PCR system της εταιρείας Promega. Για κάθε αντίδραση RT-PCR χρησιµοποιούνται 250 ng ολικού RNA. Σε σωληνάριο κατάλληλο για την πραγµατοποίηση αντιδράσεων PCR, αναµιγνύονται τα αντιδραστήρια µε την σειρά και τις ποσότητες που αναγράφονται στον Πίνακα 8 που ακολουθεί. Τα δείγµατα τοποθετούνται σε ειδική συσκευή PCR (GeneAmp PCR System 2400, Perkin Elmer). Αρχικά πραγµατοποιείται επώαση στους 48 0 C για 45 λεπτά προκειµένου να πραγµατοποιηθεί η αντίστροφη µεταγραφή και εποµένως η παραγωγή µονόκλωνου cdna. Ακολουθεί επώαση στους 94 0 C για 2 λεπτά, προκειµένου να απενεργοποιηθεί η αντίστροφη µεταγραφάση (AMV) και να επικρατήσουν αποδιατακτικές συνθήκες. Οι συνθήκες των αντιδράσεων που χρησιµοποιήθηκαν για τη HARP και τη β- ακτίνη, περιέχονται στον Πίνακα 9. 91

106 Μέθοδοι Πίνακας 8: Ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιµοποιούνται για την πραγµατοποίηση κάθε αντίδρασης RT-PCR. Αντιδραστήριο Όγκος Τελική συγκέντρωση Rnase free H 2 O µέχρι τελικού όγκου 25 µl X µl Ρυθµιστικό διάλυµα AMV/Tfl 5X 5 µl 1 X ιάλυµα νουκλεοτιδίων (dntp mix 10 mm) 0,5 µl 0,2 mm Primer (5 ) 25 pmol 1 µμ Primer (3 ) 25 pmol 1 µμ ιάλυµα MgSO 4 25 mm 1 µl 1 mm AMV αντίστροφη µεταγραφάση (5u/µl) 0,5 µl 0,1 u/µl Tfl πολυµεράση (5u/µl) 0,5 µl 0,1 u/µl RNA 250 ng Y µl 10 ng/µl Τελικός όγκος 25 µl Πίνακας 9: Πρότυπο των συνθηκών που χρησιµοποιήθηκαν για τις αντιδράσεις της RT- PCR. hharp hβ-actin Στάδιο Αποδιάταξη Σύνδεση Πολυµερισµός Θερµοκρασία, Χρόνος 94 0 C, 1 λεπτό 55 0 C, 1 λεπτό 68 0 C, 2 λεπτά Θερµοκρασία, Χρόνος 94 0 C, 1 λεπτό 53 0 C, 1 λεπτό 68 0 C, 2 λεπτά Τα παραπάνω διαδοχικά στάδια (κύκλοι) επαναλαµβάνονται 35 φορές και ακολουθεί ένα τελικό στάδιο πολυµερισµού στους 68 0 C για 10 λεπτά. Το δείγµα παραµένει στους 4 0 C µέχρι να αναλυθεί ηλεκτροφορητικά σε πήκτωµα αγαρόζης 2% κ.β. 92

107 Μέθοδοι 16. Τεχνική Ολίγο-δεoξυριβονουκλεϊνικών δολωµάτων (Decoy ODN technique) [328] Για την παρασκευή δίκλωνων ολίγο-δεoξυριβονουκλεϊνικών δολωµάτων (Ο Ν) χρησιµοποιούνται συµπληρωµατικές µονόκλωνες Ο Ν αλυσίδες που φέρουν και στα 2 άκρα τους από 4 νουκλεοτίδια δεσµευµένα µε φωσφοροθειϊκούς εστέρες (phosphorothioate-bonded). Η τροποποίηση αυτή παρέχει σταθερότητα στα δίκλωνα Ο Ν, παρεµποδίζοντας την πέψη τους από ενδονουκλεάσες στο εσωτερικό των κυττάρων. Χρησιµοποιήθηκαν δύο διαφορετικά δίκλωνα Ο Ν: Ένα µόριο που έφερε άθικτη τη συντηρηµένη αλληλουχία δέσµευσης του µεταγραφικού παράγοντα AP-1 και ένα µόριο που έφερε µεταλλαγµένη την ίδια αλληλουχία. Συγκεκριµένα, στο µεταλλαγµένο δίκλωνο µόριο (mutant, mutap-1), έχει αντικατασταθεί η δεύτερη βάση (γουανίνη) του επτανουκλεοτιδίου δέσµευσης του AP-1 από θυµίνη. Οι αλληλουχίες των µονόκλωνων αλυσίδων των Ο Ν που χρησιµοποιήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα 10. Πίνακας 10: Αλληλουχία των µονόκλωνων Ο Ν. Παρατίθεται η αλληλουχία των νοηµατικών και αντι-νοηµατικών κλώνων (sense και antisense αντίστοιχα). AP-1 Ο Ν mutap-1 Μονόκλωνη Αλυσίδα sense antisense sense antisense Αλληλουχία 5 -C*G*C*T*TGATGACTCAGCC*G*G*A*A-3 3 -G*C*G*A*ACTACTGAGTCGG*C*C*T*T-5 5 -C*G*C*T*TGATTACTTAGCC*G*G*A*A-3 3 -G*C*G*A*ACTAATGAATCGG*C*C*T*T-5 Ο υβριδισµός των συµπληρωµατικών µονόκλωνων µορίων σε δίκλωνα Ο Ν επιτεύχθηκε µε ανάµειξη τους σε αναλογία 1:1, θέρµανσή τους σε θερµοκρασία 95 ο C για 5 λεπτά και ακολούθως επώασή τους σε θερµοκρασία δωµατίου ( C) για 3 ώρες. Η απόδοση της αντίδρασης υβριδισµού ελέγχθηκε σε πήκτωµα 93

108 Μέθοδοι αγαρόζης περιεκτικότητας 2,5% κ.β και 0,1% βρωµιούχο αιθίδιο και φάνηκε να υπερέχει του 90% (Εικόνα 11). Εικόνα 11: Αντιπροσωπευτική εικόνα ηλεκτροφόρησης των προϊόντων της αντίδρασης υβριδισµού. Στις διαδροµές 1 και 3 αναλύθηκαν τα µονόκλωνα ολιγοδεοξυνουκλεοτίδια AP-1 και mutap-1 αντίστοιχα. Στις διαδροµές 2 και 4 αναλύθηκαν τα δίκλωνα ολιγοδεοξυνουκλεοτίδια AP-1 και mutap-1 αντίστοιχα. Για την παροδική διαµόλυνση (transient transfection) των κυττάρων LNCaP µε τα δίκλωνα Ο Ν, χρησιµοποιήθηκε το κατιονικό πολυµερές πολυαιθυλενιµίνη jetpei TM (Polyplus transfection, Qbiogene, France). Η πειραµατική πορεία που ακολουθεί αναφέρεται για εφαρµογή σε καλλιέργειες κυττάρων LNCaP σε τρυβλίo διαµέτρου 60 mm: Σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου µεταφέρονται 94 µl NaCl 0,9% και προστίθενται 6 µl (900 pmol) του δίκλωνου Ο Ν. Παράλληλα, σε ένα δεύτερο σωληνάριο µεταφέρονται 88 µl NaCl 0,9% και προστίθενται 12 µl του πολυµερούς. Έπεται ανάδευση και ήπια φυγοκέντρηση. Το διάλυµα του πολυµερούς µεταβιβάζεται στο διάλυµα του Ο Ν. Έπεται ανάδευση, ήπια φυγοκέντρηση και επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου για 30 λεπτά. Το θρεπτικό µέσο των κυττάρων (σε βαθµό κάλυψης ~80%) αποµακρύνεται και προστίθενται 2 ml RPMI-1640 (χωρίς ορό). Το διάλυµα του συµπλόκου µεταφέρεται στάγδην στα κύτταρα LNCaP και ακολουθεί επώαση των κυττάρων για 4 ώρες, σε επωαστικό θάλαµο κυτταροκαλλιεργειών. 94

109 Μέθοδοι Το υγρό θρεπτικό µέσο των κυττάρων ανανεώνεται µε RPMI-1640 που περιέχει 2% κ.ό. ορό και ακολουθεί επώαση για 16 ώρες. Ανανέωση του υγρού θρεπτικού µέσου των κυττάρων (RPMI-1640 που περιέχει 2% κ.ό. ορό) και προσθήκη των υπό εξέταση ουσιών. Μετά από 24 ώρες, το θρεπτικό µέσο της καλλιέργειας των κυττάρων συλλέγεται και χρησιµοποιείται για ανάλυση κατά Western της πρωτεΐνης HARP (βλέπε παραγράφους 11, και 2.2.4). Η παραπάνω µέθοδος χρησιµοποιείται επιπλέον για τα πειράµατα µελέτης πολλαπλασιασµού και µετανάστευσης των κυττάρων LNCaP. Για τη µελέτη της µετανάστευσης, µετά την διαµόλυνση των κυττάρων µε τα Ο Ν και την επώαση τους για 16 ώρες όπως αναφέρεται παραπάνω, έπεται αποκόλληση τους από το τρυβλίο και η εφαρµογή του Τransfilter assay (βλέπε παράγραφο 9). Σε ότι αφορά στη µελέτη του πολλαπλασιασµού, η πειραµατική πορεία που ακολουθείται είναι τροποποιηµένη στα εξής σηµεία: Χρησιµοποιείται καλλιέργεια κυττάρων LNCaP σε πλακίδιο 24 µικροκυψελίδων. Σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου µεταφέρονται 9,4 µl NaCl 0,9% και προστίθενται 0,6 µl (90 pmol) του δίκλωνου Ο Ν. Παράλληλα, σε ένα δεύτερο σωληνάριο µεταφέρονται 8,8 µl NaCl 0,9% και προστίθενται 1,2 µl του πολυµερούς. Το διάλυµα του πολυµερούς επωάζεται µε το διάλυµα του Ο Ν για 30 λεπτά. Το θρεπτικό µέσο των κυττάρων αποµακρύνεται, προστίθενται 200 µl RPMI (χωρίς ορό) και στη συνέχεια το διάλυµα πολυµερούς-ο Ν (20 µl) ανά µικροκυψελίδα. Η επίδραση των υπό εξέταση ουσιών στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων LNCaP, ελέγχεται µετά από 48 ώρες (βλέπε παράγραφο 7). 95

110 Μέθοδοι ιάλυµα NaCl 0,9% κ.β ιαλύµατα ιάλυµα µονόκλωνων Ο Ν 100 pmol/µl (Biopaths Co, Greece): AP-1 sense AP-1 antisense AP-1 Mutant sense AP-1 Mutant antisense Θρεπτικό µέσο RPMI-1640 Ορός βοός (fetal bovine serum, FBS) jetpei TM (Polyplus transfection, Qbiogene, France) 17. Κλωνοποίηση της ρυθµιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP στο πλασµίδιο pgl Εισαγωγή Προκειµένου να είναι εφικτή και συνάµα πιο εύκολη η κλωνοποίηση της ρυθµιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP στο πλασµίδιο pgl3, σχεδιάστηκε µια στρατηγική λαµβανοµένων υπόψη των εξής παραγόντων: - Η κλωνοποίηση έχει µεγαλύτερες πιθανότητες επιτυχίας όταν µονάχα ένα τµήµα DNA πρόκειται να εισαχθεί στο πλασµιδιακό όχηµα. - Αποδοτικότερη κλωνοποίηση συµβαίνει όταν το πλασµίδιο και το ξένο παρεµβαλλόµενο τµήµα DNA έχουν συµπληρωµατικά µεταξύ τους άκρα (συνεκτικά άκρα), συγκριτικά µε την περίπτωση που έχουν τυφλά άκρα. - Ακόµη µεγαλύτερη απόδοση κλωνοποίησης επιτυγχάνεται όταν τα δύο µόρια DNA (πλασµίδιο και εισερχόµενο τµήµα) πέπτονται από δύο διαφορετικά ένζυµα περιορισµού. Με τον τρόπο αυτό, προκύπτουν σε κάθε µόριο DNA δύο προεξέχοντα, µονόκλωνα, µη συµπληρωµατικά µεταξύ τους άκρα. Η κλωνοποίηση αυτού του τύπου είναι γνωστή ως κλωνοποίηση συγκεκριµένης διεύθυνσης (directional cloning), εφόσον το νέο τµήµα DNA παρεµβάλλεται στο πλασµιδιακό όχηµα µε µία συγκεκριµένη φορά. Έτσι, επιτυγχάνεται 96

111 Μέθοδοι σηµαντική µείωση του ποσοστού επανασυνδεδεµένων πλασµιδίων, τα οποία δεν περιέχουν το επιθυµητό παρεµβαλλόµενο τµήµα DNA Πλασµιδιακό όχηµα pgl3 Το πλασµίδιο pgl3 ανήκει σε µια κατηγορία φορέων, γνωστών ως φορέων που φέρουν κάποιο γονίδιο αναφοράς (reporter vectors). Το pgl3 περιέχει µερικώς τροποποιηµένη, την κωδική περιοχή του γονιδίου της πρωτεΐνης λουσιφεράσης (luciferase). Η λουσιφεράση είναι ένα ένζυµο που φυσιολογικά εκφράζεται στο κολεόπτερο Photinus pyralis (της οικογένειας Lambiridae) και καταλύει µια αντίδραση παραγωγής φθορισµού. Για το λόγο αυτό, το πλήρες όνοµα του πλασµιδίου είναι pgl3-όχηµα µε γονίδιο αναφοράς τη λουσιφεράση (pgl3 Luciferase reporter vector). Το pgl3 αποτελεί ερευνητικό εργαλείο για την ποσοτική ανάλυση παραγόντων που ρυθµίζουν τη γονιδιακή έκφραση σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Οι παράγοντες αυτοί διακρίνονται σε: - Παράγοντες που δρουν µε µηχανισµό cis, όπως είναι οι υποκινητές και οι ενισχυτές. - Παράγοντες που δρουν µε µηχανισµό trans, όπως είναι οι µεταγραφικοί παράγοντες. Στην παρούσα διατριβή χρησιµοποιήθηκε συγκεκριµένα ο φορέας pgl3-basic vector (Promega), µε µέγεθος bp. Στην Εικόνα 12 παρατίθεται σχηµατικά ο γενετικός χάρτης του pgl3-basic vector καθώς και οι θέσεις συγκεκριµένων αλληλουχιών. 97

112 Μέθοδοι Εικόνα 12: Γενετικός χάρτης του pgl3-basic vector. luc+: cdna που κωδικοποιεί την τροποποιηµένη πρωτεΐνη luciferase. Amp r : Γονίδιο που προσδίδει στην E. coli ανθεκτικότητα στην αµπικιλλίνη. f1 ori: Περιοχή έναρξης της αντιγραφής, προερχόµενη από νηµατοειδείς φάγους. ori: Περιοχή έναρξης της αντιγραφής για την E. coli. SV 40 σινιάλο poly (A): Εξυπηρετεί την πολυαδενυλίωση του µεταγράφου της λουσιφεράσης στο 3 άκρο (εισαγωγή poly A ουράς) και τον τερµατισµό της µεταγραφής. Συνθετικό σινιάλο poly (A) / θέση παύσης της µεταγραφής: Εξυπηρετεί στην αποτροπή έναρξης τυχαίας, µη ειδικής µεταγραφικής δραστηριότητας σε οποιαδήποτε περιοχή του πλασµιδίου. Τα βέλη στο εσωτερικό των περιοχών luc+ και Amp r υποδηλώνουν τη φορά της µεταγραφής. Το βέλος στην περιοχή f1 ori υποδηλώνει τη φορά σύνθεσης δίκλωνου DNA. Επίσης παρατίθεται ο χάρτης περιορισµού του πλασµιδίου, µε ειδικότερη έµφαση στο χάρτη περιορισµού της περιοχής κλωνοποίησης (1-58) Σχεδιασµός και δηµιουργία της ρυθµιστικής αλληλουχίας της HARP, κατάλληλης προς κλωνοποίηση στο όχηµα pgl3 Πριν κανείς προχωρήσει στην κλωνοποίηση ενός συγκεκριµένου τµήµατος DNA σε ένα συγκεκριµένο φορέα, απαιτείται αφενός να διαπιστώσει κατά πόσον αυτή η ιδέα είναι υλοποιήσιµη, αφετέρου ποια είναι η καλύτερη και αποδοτικότερη στρατηγική (λαµβανοµένων υπόψη των παραγόντων που προαναφέρθηκαν στην παράγραφο 17.1). 98

113 Μέθοδοι Έχοντας εις γνώσιν τη ρυθµιστική αλληλουχία του γονιδίου της HARP [107] (Εικόνα 13), βρέθηκε ο χάρτης περιορισµού της συγκεκριµένης αλληλουχίας. Εικόνα 13: Νουκλεοτιδική αλληλουχία της ρυθµιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP στον άνθρωπο. Οι αρνητικοί αριθµοί αντιστοιχούν στη ρυθµιστική περιοχή του γονιδίου, ενώ οι θετικοί στο εξώνιο 1. Η θέση έναρξης της µεταγραφής του mrna υποδεικνύεται µε +1. Η αλληλουχία CCAAT τοποθετείται µέσα σε τετράγωνο, 96 νουκλεοτίδια ανοδικά του σηµείου έναρξης της µεταγραφής. Οι πιθανές θέσεις δέσµευσης (επτανουκλεοτίδια) για το µεταγραφικό παράγοντα AP-1 παρατίθενται µε έντονη γραφή και είναι τοποθετηµένες µέσα σε κύκλο. 99

114 Μέθοδοι Η ανεύρεση του χάρτη περιορισµού πραγµατοποιήθηκε µε κατάλληλο λογισµικό (NEB cutter). Οι πληροφορίες του χάρτη περιορισµού αξιοποιήθηκαν µε τέτοιο τρόπο, ώστε να διαπιστωθεί αν υπάρχουν ένζυµα περιορισµού (κατά προτίµηση, δύο διαφορετικά ένζυµα) που πληρούν τα εξής κριτήρια: - Να πέπτουν την αλληλουχία στα άκρα της ή να µην την πέπτουν σε κανένα σηµείο. - Να δηµιουργούν προεξέχοντα µονόκλωνα άκρα (και όχι τυφλά) και αν είναι δυνατό, να καταλύουν την αντίδραση πέψης σε κοινό διάλυµα. - Να πέπτουν το πλασµίδιο pgl3 στην περιοχή κλωνοποίησης (Βλέπε Εικόνα 12). Χρησιµοποιήθηκαν τα ένζυµα περιορισµού Mlu I και Bgl II, τα οποία πληρούν τα παραπάνω κριτήρια. Μοναδικό µειονέκτηµα των συγκεκριµένων ενζύµων είναι ότι δεν πέπτουν σε κανένα σηµείο την επιθυµητή αλληλουχία. Το πρόβληµα αυτό ξεπεράστηκε δηµιουργώντας θέσεις πέψης (για τα συγκεκριµένα ένζυµα) στα άκρα της ρυθµιστικής αλληλουχίας της HARP, χρησιµοποιώντας την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR). Συγκεκριµένα, οι αλληλουχίες εκκίνησης (primers) που χρησιµοποιούνται στην PCR, σχεδιάζονται ώστε να περιέχουν στο 5 -άκρο την κατάλληλη αλληλουχία για το εκάστοτε ένζυµο περιορισµού. Επίσης στο 5 -άκρο (πριν από την αλληλουχία για το ένζυµο περιορισµού) προστίθενται 2 επιπλέον νουκλεοτίδια, επειδή τα περισσότερα ένζυµα περιορισµού αδυνατούν να πέψουν αλληλουχίες που τοποθετούνται στο άκρο ενός τµήµατος DNA (βλέπε παράγραφο ). Η πειραµατική πορεία που ακολουθήθηκε ώστε να αποκτηθεί η επιθυµητή αλληλουχία παρατίθεται παρακάτω Αποµόνωση γονιδιωµατικού DNA Χρησιµοποιήθηκε το ολοκληρωµένο σύστηµα αποµόνωσης Genomic DNA mini Kit (Geneaid, Biotech Ltd., Taiwan). Αναλυτικά: Κύτταρα LNCaP καλλιεργούνται σε τρυβλίο διαµέτρου 60 mm. Όταν καλύψουν όλη την επιφάνεια του τρυβλίου προκειµένου να αποκολληθούν, επωάζονται 100

115 Μέθοδοι µε τρυψίνη και το εναιώρηµα µεταφέρεται σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου 1,5 ml. Φυγοκέντρηση για 20 δευτερόλεπτα στα g και αποµάκρυνση του υπερκείµενου. Στο ίζηµα προστίθενται 150 µl διαλύµατος λύσης RBC και 200 µl διαλύµατος GB και ακολουθεί ανάδευση για 5 δευτερόλεπτα. Επώαση του διαλύµατος στους 70 0 C για 20 λεπτά. Κατά τη διάρκεια της επώασης πραγµατοποιείται αναστροφή του σωληναρίου ανά 5 λεπτά. Προσθήκη RNάσης σε τελική συγκέντρωση 100 mg/ml και ανάδευση σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά. Προσθήκη 200 µl απόλυτης αιθανόλης και ανάδευση για 10 δευτερόλεπτα. Το περιεχόµενο του σωληναρίου µεταφέρεται σε στήλη GD προσαρµοσµένη εντός σωληναρίου συλλογής 2 ml. Φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα g και αποµάκρυνση του εκλούµατος. Προσθήκη 500 µl διαλύµατος έκπλυσης, φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα στα g και αποµάκρυνση του εκλούµατος (x2). Φυγοκέντρηση για 3 λεπτά στα g και αποµάκρυνση του εκλούµατος (x2). H στήλη GD µεταφέρεται εντός νέου σωληναρίου µικροφυγοκέντρου 1,5ml. Προσθήκη 50 µl διαλύµατος έκλουσης (10mM Tris-HCl ph 8,5), που έχει προθερµανθεί στους 70 0 C, επώαση για 10 λεπτά και φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα στα g (x2). Η συγκέντρωση του γονιδιωµατικού DNA προσδιορίζεται φασµατοφωτοµετρικά. Προκειµένου να ελεγχθεί η ακεραιότητά του, 1µg DNA αναλύεται ηλεκτροφορητικά σε πήκτωµα αγαρόζης 0,8% κ.ό. (βλέπε παράγραφο 14). Το συγκεκριµένο DNA χρησιµοποιείται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (βλέπε παράγραφο ). 101

116 Μέθοδοι Προσδιορισµός της συγκέντρωσης DNA [325] Η πειραµατική πορεία που ακολουθείται είναι ίδια µε αυτή του προσδιορισµού της συγκέντρωσης RNA (βλέπε παράγραφο 13), µε τη διαφορά ότι η συγκέντρωση του DNA προσδιορίζεται µε διαφορετικό µαθηµατικό τύπο. Η συγκέντρωση DNA υπολογίζεται από τον εξής τύπο: Συγκέντρωση DNA = O.Α. 260nm x 50 x αραίωση Η συγκέντρωση δίνεται σε ng/µl. (Ο συντελεστής 50 εξάγεται από την παρατήρηση ότι ένα διάλυµα DNA, συγκέντρωσης 50 ng/µl, έχει απορρόφηση 1 στα 260 nm) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (polymerase chain reaction, PCR) [329, 330] Χρησιµοποιούνται συστατικά του ολοκληρωµένου συστήµατος Access RT-PCR System από την εταιρεία Promega. Τα απαραίτητα συστατικά για κάθε αντίδραση, σε κάθε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου για την PCR, περιέχονται στον Πίνακα

117 Μέθοδοι Πίνακας 11: Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιµοποιούνται για την πραγµατοποίηση κάθε αντίδρασης PCR. Όγκος Nuclease-free water Χ µl Τελική συγκέντρωση Tfl 5X Reaction Buffer 10 µl 1 X dntp Mix 1 µl 0,2 mm primer (5 ) 0,5 µl (50 pmol) 1 µm primer (3 ) 0,5 µl (50 pmol) 1 µm 25 mm MgSO 4 3 µl 1,5 mm Tfl DNA Polymerase (5U/µl) 1 µl 0,1 U/µl είγµα (DNA) Y µl 10 ng/µl Τελικός όγκος 50 µl Το δείγµα DNA που χρησιµοποιήθηκε είναι γονιδιωµατικό DNA που αποµονώθηκε από κύτταρα LNCaP. Οι εναρκτήριες αλληλουχίες (primers) που χρησιµοποιήθηκαν σχεδιάστηκαν µε κατάλληλο λογισµικό (Primer 3). Οι primers σχεδιάστηκαν για τη ρυθµιστική αλληλουχία του γονιδίου της HARP και επιλέχθηκαν αυτοί που πληρούσαν τα απαραίτητα κριτήρια. Αρχικά επιλέχθηκαν οι εξής: Primer (5 ) Μήκος: 20 b Αλληλουχία: 5 -GTCGACTCGATCCAAGAACC-3 GC%: 55 T m : 59,66 0 C Primer (3 ) Μήκος: 22 b Αλληλουχία: 5 -TTTGAGTTGGAAACGTCCTCTC-3 GC%: 45,45 T m : 60,64 0 C ιαφορά θερµοκρασίας σύνδεσης (T m ) των 2 primers: 0,98 0 C Μέγεθος του προϊόντος που αναµένεται: bp 103

118 Μέθοδοι Στους primers που τελικά χρησιµοποιήθηκαν, προστέθηκε στο 5 άκρο µια επιπλέον αλληλουχία για τα ένζυµα περιορισµού Mlu I και Bgl II (βλέπε παράγραφο 17.3). Οι primers που τελικά χρησιµοποιήθηκαν, παρασκευάστηκαν από την εταιρεία Biopaths Co και έχουν την εξής αλληλουχία: Primer (5 ): 5 -ATACGCGTTGTCGACTCGATCCAAGAACC-3 Primer (3 ): 5 -GCAGATCTGTTTGAGTTGGAAACGTCCTCTC-3 (Οι αλληλουχίες που αναγνωρίζονται από τα ένζυµα περιορισµού, παρατίθενται µε έντονη γραφή. Στον 5 -primer έχει προστεθεί η αλληλουχία για το ένζυµο Mlu I, ενώ στον 3 -primer η αλληλουχία για το ένζυµο Bgl II). Τα αντιδραστήρια προστίθενται στο διάλυµα της αντίδρασης στους 4 0 C, και το σωληνάριο µεταφέρεται στη συσκευή της PCR. Προηγείται επώαση στους 94 0 C για 4 λεπτά προκειµένου να αποδιαταχθεί το δίκλωνο DNA. Οι συνθήκες των αντιδράσεων που χρησιµοποιήθηκαν για τη ρυθµιστική αλληλουχία του γονιδίου της HARP, περιέχονται στον Πίνακα 12. Πίνακας 12: Πρότυπο των συνθηκών που χρησιµοποιήθηκαν για τις αντιδράσεις της PCR. Στάδιο Θερµοκρασία Χρόνος Αποδιάταξη 94 0 C 45 δευτερόλεπτα Σύνδεση 55,5 0 C 1 λεπτό Πολυµερισµός 68 0 C 4,5 λεπτά Τα παραπάνω διαδοχικά στάδια (κύκλοι) επαναλαµβάνονται 35 φορές και ακολουθεί ένα τελικό στάδιο ολοκλήρωσης του πολυµερισµού στους 68 0 C για 10 λεπτά. Το δείγµα παραµένει στους 4 0 C µέχρι να αναλυθεί ηλεκτροφορητικά σε πήκτωµα αγαρόζης 0,8% κ.β. 104

119 Μέθοδοι Ανάλυση των προϊόντων της PCR σε πήκτωµα αγαρόζης [326, 327] Τα προϊόντα της PCR αναλύονται µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης 0,8% κ.β. (βλέπε παράγραφο 14). Για την ταυτοποίηση του µεγέθους του επιθυµητού προϊόντος, παράλληλα µε το δείγµα ηλεκτροφορούνται 4 µl (1 µg) µαρτύρων µοριακού βάρους που καλύπτουν εύρος τιµών bp (Lambda DNA/BstE II Digest, HT Biotechnology, UK) Εκχύλιση DNA από πήκτωµα αγαρόζης Μετά την ηλεκτροφόρηση και ταυτοποίηση του επιθυµητού προϊόντος DNA, πραγµατοποιείται εκχύλιση του συγκεκριµένου µορίου από το πήκτωµα αγαρόζης. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιείται το ολοκληρωµένο σύστηµα Nucleospin Extract II (Macherey-Nagel, Germany). Αναλυτικά: Εκτέµνεται το τµήµα του πηκτώµατος που περιέχει το επιθυµητό DNA, ζυγίζεται και φέρεται εντός σωληναρίου µικροφυγοκέντρου 1,5 ml. Προστίθενται 200 µl διαλύµατος ΝΤ ανά 100 mg πηκτώµατος αγαρόζης και το δείγµα επωάζεται στους 50 0 C, µε ανάδευση ανά 3 λεπτά, µέχρι την πλήρη διάλυση του πηκτώµατος. Το διάλυµα µεταφέρεται σε στήλη Nucleospin Extract II, η οποία έχει προσαρµοστεί σε σωληνάριο συλλογής 2 ml. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και το έκλουµα αποµακρύνεται. Η µεµβράνη σίλικας της στήλης εκπλένεται µε προσθήκη 600 µl διαλύµατος ΝΤ3. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και απόρριψη του εκλούµατος. Η µεµβράνη ξηραίνεται µε φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα g και η στήλη µεταφέρεται σε καθαρό σωληνάριο µικροφυγοκέντρου 1,5 ml. Προστίθενται 20 µl διαλύµατος έκλουσης ΝΕ, που έχει προθερµανθεί στους 70 0 C, ακολουθεί επώαση για 2 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. 105

120 Μέθοδοι Προετοιµασία της ρυθµιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP και του πλασµιδίου pgl3, για κλωνοποίηση Αντίδραση πέψης µε ένζυµα περιορισµού Πραγµατοποιούνται παράλληλα δύο αντιδράσεις (µία για το πλασµίδιο pgl3 και µία για το τµήµα DNA που επιθυµείται να κλωνοποιηθεί), σε δύο διαφορετικά σωληνάρια µικροφυγοκέντρου. Η όλη διαδικασία πραγµατοποιείται στους 4 0 C. Η ποσότητα του πλασµιδιακού DNA που χρησιµοποιείται ανά αντίδραση είναι 500 ng. Για τη ρυθµιστική αλληλουχία του γονιδίου της HARP που έχει προκύψει µετά από PCR και εκχύλιση από πήκτωµα αγαρόζης, χρησιµοποιείται όλη σχεδόν η ποσότητα του διαλύµατος (16 µl). Σε αποστειρωµένο σωληνάριο µικροφυγοκέντρου προστίθεται το διάλυµα DNA και ο κατάλληλος όγκος αποστειρωµένου νερού µέχρι τελικού όγκου 17 µl. Προσθήκη 2 µl το ρυθµιστικού διαλύµατος πέψης των ενζύµων (10 Χ). Προσθήκη των ενζύµων περιορισµού Mlu I και Bgl II. Από κάθε ένζυµο προστίθενται 5 units (0,5 µl). Ήπια ανάδευση των συστατικών της αντίδρασης και επώαση στους 37 0 C για 1 ώρα. Τοποθέτηση των δειγµάτων στον πάγο και προσθήκη 2 µl διαλύµατος δειγµάτων ηλεκτροφόρησης 10 Χ. Ηλεκτροφόρηση των δειγµάτων σε πήκτωµα αγαρόζης 0,8% κ.β. και παρατήρηση µε τη διέλευση υπεριώδους φωτός. 106

121 Μέθοδοι ιαλύµατα Ένζυµο περιορισµού Mlu I (Takara Bio Inc., Japan) Συγκέντρωση 10 Units/µl Προέλευση Micrococcus luteus ιάλυµα αποθήκευσης 10 mm Tris-HCl, ph 7,5 400 mm KCl 0,1 mm EDTA 1 mm DTT 0,01% BSA 50% Γλυκερόλη Θερµοκρασία πέψης 37 0 C Ένζυµο περιορισµού Bgl II (Takara Bio Inc., Japan) Συγκέντρωση 10 Units/µl Προέλευση Bacillus globigii ιάλυµα αποθήκευσης 10 mm Tris-HCl, ph 7,5 100 mm KCl 10 mm MgCl 2 0,1 mm EDTA 1 mm DTT 0,01% BSA 50% Γλυκερόλη Θερµοκρασία πέψης 37 0 C Ρυθµιστικό διάλυµα πέψης 10 Χ: 500 mm Tris-HCl, ph 7,5 100 mm MgCl 2 10 mm DTT 1000 mm NaCl Ρυθµιστικό διάλυµα δειγµάτων ηλεκτροφόρησης 10 Χ: 1% κ.β SDS 50% κ.ό. Γλυκερόλη 0,05% κ.β Κυανούν της βρωµοφαινόλης 107

122 Μέθοδοι Αντίδραση σύνδεσης µορίων DNA µε συνεκτικά άκρα Μετά την αντίδραση πέψης, τα δείγµατα ηλεκτροφορούνται σε πήκτωµα αγαρόζης 0,8%. Για την ταυτοποίηση του µεγέθους των θραυσµάτων DNA, παράλληλα µε το δείγµα ηλεκτροφορούνται 4 µl (1 µg) µαρτύρων µοριακού βάρους που καλύπτουν εύρος τιµών bp (Lambda DNA/BstE II Digest, HT Biotechnology, UK). Οι µάρτυρες που χρησιµοποιούνται είναι γνωστής συγκέντρωσης. Έτσι, µε την ηλεκτροφόρηση, πραγµατοποιείται επιπλέον εκτίµηση της συγκέντρωσης του κάθε θραύσµατος. Στη συνέχεια, τα δύο θραύσµατα DNA εκχυλίζονται από το πήκτωµα αγαρόζης. Η επιθυµητή αναλογία των δύο µορίων DNA που χρησιµοποιήθηκαν στην αντίδραση σύνδεσης είναι: Πλασµίδιο (pgl3) / Παρεµβαλλόµενη αλληλουχία (insert) = 1 / 3 Έτσι, ένας τύπος που προσδιορίζει την ποσότητα του insert που θα χρησιµοποιηθεί στην αντίδραση σύνδεσης, είναι ο κάτωθι: ng (insert) = [MW insert (kbp) / MW vector (kbp)] x ng (vector) x 3 όπου MW: µοριακό βάρος. Στην παρούσα αντίδραση σύνδεσης χρησιµοποιούνται 100 ng πλασµιδίου. Άρα, από τον παραπάνω τύπο εξάγεται ότι θα χρησιµοποιηθούν 141 ng της αλληλουχίας που επιθυµούµε να ενθέσουµε στο πλασµίδιο. Η αντίδραση σύνδεσης των δύο µορίων DNA καταλύεται in vitro από το ένζυµο Τ4 DNA λιγάση. Η πορεία που ακολουθείται είναι η εξής: Σε 100 ng από γραµµικό πλασµιδιακό DNA προστίθενται 141 ng από το DNA που επιθυµείται να κλωνοποιηθεί. Επώαση στους 50 0 C για 5 λεπτά. Το δείγµα τοποθετείται σε πάγο και προστίθενται : Ρυθµιστικό διάλυµα σύνδεσης 10 Χ 2 µl Τ4 DNA λιγάση (Weiss units) d H 2 O (µέχρι τελικού όγκου 20 µl) 1,5 u X Ακολουθεί επώαση στους 16 0 C για 16 ώρες. 108

123 Μέθοδοι Μετά την επώαση και πριν το µετασχηµατισµό των δεκτικών βακτηριακών κυττάρων, γίνεται απενεργοποίηση της αντίδρασης µε θέρµανση στους 60 0 C για 10 λεπτά. ιαλύµατα Ρυθµιστικό διάλυµα αντίδρασης σύνδεσης 10 Χ: 660 mm Tris-HCl, ph 7,6 66 mm MgCl mm DTT 1 mm ΑΤΡ Τ4 DNA λιγάση (Takara Bio Inc., Japan) Συγκέντρωση 350 Units/µl (2,8 Weiss units/µl) Προέλευση Εscherichia coli ιάλυµα αποθήκευσης 10 mm Tris-HCl, ph 7,5 50 mm KCl 0,1 mm EDTA 10 mm 2-µερκαπτοαιθανόλη 50% Γλυκερόλη Εισαγωγή του πλασµιδιακού DNA σε βακτήρια (Transformation) Προετοιµασία δεκτικών βακτηριακών κυττάρων (competent cells) [331] Τρυβλίο επιστρωµένο µε στερεό θρεπτικό υλικό εµβολιάζεται µε κύτταρα E.Coli του στελέχους XL-1 και επωάζεται στους 37 0 C για ώρες. Μία αποικία από το τρυβλίο µεταφέρεται υπό άσηπτες συνθήκες, σε 10 ml υγρού θρεπτικού υλικού και επωάζεται υπό ανάδευση στους 37 0 C για ώρες. 109

124 Μέθοδοι Εµβολιάζονται 100 ml θρεπτικού υλικού Psi µε 1 ml από την υγρή καλλιέργεια και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση στους 37 0 C µέχρι η απορρόφηση της καλλιέργειας να φτάσει 0,48 στα 550 nm. Η καλλιέργεια µοιράζεται υπό άσηπτες συνθήκες σε 2 σωλήνες (τύπου falcon) των 15 ml και επωάζεται στον πάγο για 15 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση των καλλιεργειών στα g για 5 λεπτά. Το υπερκείµενο απορρίπτεται και οι σωλήνες εναποτίθενται ανεστραµµένοι επάνω σε απορροφητικό χαρτί για να στεγνώσουν. Το ίζηµα επαναδιαλύεται σε 4 ml διαλύµατος Tfb I µε ήπια ανάδευση και επωάζεται στον πάγο για 15 λεπτά. Φυγοκέντρηση στα 5000 g για 5 λεπτά. Το υπερκείµενο απορρίπτεται και οι σωλήνες εναποτίθενται ανεστραµµένοι επάνω σε απορροφητικό χαρτί για να στεγνώσουν. Το ίζηµα επαναδιαλύεται σε 4 ml διαλύµατος Tfb IΙ µε ήπια ανάδευση και επωάζεται στον πάγο για 15 λεπτά. Οι καλλιέργειες µοιράζονται σε κλάσµατα των 200 µl σε παγωµένα σωληνάρια µικροφυγοκέντρου. Ψύξη σε υγρό N 2 και αποθήκευση στους 80 0 C. ιαλύµατα Θρεπτικό υλικό Psi: Εκχύλισµα µαγιάς 0,5% κ.β Βακτο-τρυπτόνη 2% κ.β Θειϊκό µαγνήσιο 0,5% κ.β Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται µε υδροξείδιο του καλίου στο 7,6 και το διάλυµα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. ιάλυµα Tfb I: 30 mm CH 3 COOK 100 mm RbCl 2 10 mm CaCl 2 50 mm MnCl 2 15% κ.ό. γλυκερόλη Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται µε αραιό οξικό οξύ (CH 3 COOH) στο 5,8 και το διάλυµα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο 110

125 Μέθοδοι ιάλυµα Tfb II: 10 mm MOPS 75 mm CaCl 2 10 mm RbCl 2 15% κ.ό. γλυκερόλη Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται µε αραιό καυστικό νάτριο (NaOH) στο 6,5 και το διάλυµα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. Υγρό θρεπτικό µέσο για ανάπτυξη βακτηρίων (LB medium): Εκχύλισµα µαγιάς 0,5% κ.β Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β ΝaCl 1% κ.β Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται, µε καυστικό νάτριο 1 N (NaOH), στο 7 και το διάλυµα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. Στερεό θρεπτικό υλικό για ανάπτυξη βακτηρίων (LB-agar): 1,5% κ.β άγαρ (bacto-agar) σε LB medium Το διάλυµα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό µέσο στερεοποιείται µετά από 10 λεπτά παραµονής σε θερµοκρασία δωµατίου Μετασχηµατισµός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων [331] Προκειµένου να πολλαπλασιαστεί το επιθυµητό πλασµιδιακό DNA (ανασυνδυασµένο µόριο DNA), είναι απαραίτητο να προηγηθεί µετασχηµατισµός (transformation) δεκτικών βακτηριακών κυττάρων. Αναλυτικά, για το µετασχηµατισµό των δεκτικών βακτηριακών κυττάρων ακολουθείται η παρακάτω διαδικασία: Σωληνάριο µικροφυγοκέντρου που περιέχει 200 µl βακτηρίων µεταφέρεται από τους C σε πάγο. Είναι απαραίτητο η θερµοκρασία των κυττάρων να µην υπερβεί τους 0 0 C. Σε άλλο σωληνάριο, επίσης στον πάγο, µεταφέρονται τα 20 µl από την αντίδραση σύνδεσης (βλέπε παράγραφο ). Σε περίπτωση που απλά επιθυµείται να πολλαπλασιαστεί πλασµιδιακό DNA (και δεν είναι προϊόν της 111

126 Μέθοδοι αντίδρασης σύνδεσης) µεταφέρονται 2 ng του πλασµιδιακού DNA. Στο σωληνάριο αυτό µεταφέρονται 100 µl των κυττάρων και παραµένει για 30 λεπτά στον πάγο. Το σωληνάριο µεταφέρεται σε υδατόλουτρο 42 0 C για 1,5 λεπτό. Αµέσως µεταφέρεται στον πάγο, όπου επωάζεται για 2-3 λεπτά. Σε αποστειρωµένο σωληνάριο των 15 ml που περιέχει 1 ml υγρού θρεπτικού µέσου SOC, προστίθεται το εναιώρηµα των κυττάρων. Ακολουθεί επώαση στους 37 0 C υπό ανάδευση για 2 ώρες. Από το ανωτέρω διάλυµα (SOC-κύτταρα), µεταφέρονται 40 µl σε τρυβλίο µε στερεό θρεπτικό µέσο. (Στο θρεπτικό µέσο, πριν τον πολυµερισµό του, προστίθεται αµπικιλλίνη. Η επιθυµητή τελική συγκέντρωση της αµπικιλλίνης στο στερεό θρεπτικό µέσο είναι 0,1 mg/ml). Το τρυβλίο τοποθετείται ανεστραµµένο σε επωαστικό θάλαµο θερµοκρασίας 37 0 C. Σε περίπτωση που το πλασµίδιο είναι προϊόν αντίδρασης του ενζύµου λιγάση, το ανωτέρω διάλυµα (SOC-κύτταρα) φυγοκεντρείται στα g για 30 δευτερόλεπτα. Απορρίπτεται το υπερκείµενο, το ίζηµα των κυττάρων επαναιωρείται σε 100 µl υγρού θρεπτικού µέσου LB και µεταφέρεται στο επιστρωµένο µε στερεό θρεπτικό µέσο (+ αµπικιλλίνη) τρυβλίο. Μετά από 16 ώρες επώασης, το τρυβλίο ελέγχεται µακροσκοπικά για την ανάπτυξη αποικιών βακτηρίων ανθεκτικών στην αµπικιλλίνη. ιαλύµατα Υγρό θρεπτικό µέσο για ανάπτυξη βακτηρίων SOC: Βακτο-τρυπτόνη 2% κ.β Εκχύλισµα µαγιάς 0,5% κ.β NaCl 0,05% κ.β KCl 2,5 mm Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται µε NaOH 1 N σε τιµή 7 και το διάλυµα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. Το διάλυµα διατηρείται στους 4 0 C και λίγο πριν τη χρήση, προστίθενται οι κατάλληλες ποσότητες από τα παρακάτω διαλύµατα, ώστε η επιθυµητή τελική συγκέντρωση του MgCl 2 να είναι 10 mm και της γλυκόζης 20 mm. 112

127 Μέθοδοι ιάλυµα MgCl 2 2Μ ιάλυµα γλυκόζης 1Μ Και το διάλυµα MgCl 2 και το διάλυµα γλυκόζης, αποστειρώνονται µε διοχέτευσή τους µέσα από φίλτρο µε πόρους διαµέτρου 0,2 µm. Υγρό θρεπτικό µέσο για ανάπτυξη βακτηρίων (LB medium) Στερεό θρεπτικό µέσο για ανάπτυξη βακτηρίων (LB-agar) Στο διάλυµα του θρεπτικού µέσου, όταν η θερµοκρασία φτάσει τους 50 0 C και πριν στερεοποιηθεί, προστίθεται ποσότητα διαλύµατος αµπικιλλίνης ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 0,1 mg/ml. ιάλυµα αµπικιλλίνης 50 mg/ml (σε νερό) Το διάλυµα αποστειρώνεται µε διοχέτευσή του µέσα από φίλτρο µε πόρους διαµέτρου 0,2 µm Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια [331] Μονήρεις αποικίες βακτηρίων που αναπτύσσονται στη στερεή καλλιέργεια, εµβολιάζονται εντός σωληναρίων 50 ml που περιέχουν 10 ml θρεπτικού υλικού. Στο υγρό θρεπτικό µέσο έχει προστεθεί αµπικιλλίνη, ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 0,1 mg/ml. Οι υγρές καλλιέργειες επωάζονται για 16 h στους 37 0 C υπό συνεχή ανάδευση. Από τα κύτταρα της υγρής καλλιέργειας αποµονώνεται το πλασµιδιακό DNA. 113

128 Μέθοδοι Έλεγχος µετασχηµατισµένων βακτηριακών κυττάρων και αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µε τη µέθοδο βρασµού Για την αποµόνωση του πλασµιδίου χρησιµοποιείται το πρωτόκολλο βρασµού (boiling protocol). Η πειραµατική πορεία έχει ως εξής: Σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου µεταφέρεται 1,5 ml της καλλιέργειας και µετά από φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα στα g, απορρίπτεται το υπερκείµενο. Στο ίζηµα προστίθενται 400 µl διαλύµατος STET και τα βακτήρια επαναιωρούνται προσεκτικά. Προστίθενται 32 µl διαλύµατος λυσοζύµης (10 mg/ml) και ακολουθεί ανάδευση. Το σωληνάριο µεταφέρεται σε υδατόλουτρο µε νερό, υπό βρασµό, για 50 δευτερόλεπτα. Άµεσα φυγοκεντρείται για 15 λεπτά στα g στους 4 0 C και αποµακρύνεται το ίζηµα. Προστίθενται 400 µl ισοπροπανόλης και µετά από ανάδευση το σωληνάριο τοποθετείται για 2 ώρες στους C. Μετά από φυγοκέντρηση για 15 λεπτά στα g, το υπερκείµενο αποµακρύνεται. Στο ίζηµα προστίθενται 500 µl διαλύµατος αιθανόλης 80% και αναδεύεται ήπια. Μετά από σύντοµη φυγοκέντρηση, το υπερκείµενο αποµακρύνεται και το ίζηµα επαναιωρείται σε 50 µl διαλύµατος ΤΕ. Η συγκέντρωση του διαλύµατος σε DNA προσδιορίζεται φασφατοφωτοµετρικά (βλέπε παράγραφο ). Προκειµένου να ελεγχθεί εάν η ένθεση της ρυθµιστικής αλληλουχίας της HARP στο πλασµίδιο pgl3 επετεύχθη, το πλασµιδιακό DNA πέπτεται µε τα ένζυµα περιορισµού Mlu I και Bgl II (βλέπε παράγραφο ). Το προϊόν της αντίδρασης πέψης ηλεκτροφορείται σε πήκτωµα αγαρόζης 0,8%. Για την ταυτοποίηση του µεγέθους των θραυσµάτων DNA, παράλληλα µε το δείγµα ηλεκτροφορούνται 4 µl (1 µg) µαρτύρων µοριακού βάρους που καλύπτουν εύρος τιµών bp (Εικόνα 14). 114

129 Μέθοδοι Εικόνα 14: Έλεγχος κλωνοποίησης της ρυθµιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP, στο πλασµίδιο pgl3. Τα προϊόντα, µετά από πέψη του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου µε τα ένζυµα περιορισµού, αναλύονται ηλεκτροφορητικά. Στη διαδροµή 1 αναλύονται οι µάρτυρες µοριακού βάρους ενώ στις 2 και 3 τα προϊόντα πέψης του pgl3 και του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου αντίστοιχα. STET 8% κ.β σουκρόζη 5% κ.ο Triton-X mm Tris-HCl ph 8,0 50 mm EDTA ιαλύµατα ιάλυµα Tris-EDTA (ΤΕ), ph 7,4: 10 mm Tris-base 1 mm EDTA ιάλυµα λυσοζύµης συγκέντρωσης 10 mg/ml σε ΤΕ ιάλυµα αιθανόλης 80% κ.ό. σε νερό 115

130 Μέθοδοι Μικρής κλίµακας αποµόνωση πλασµιδιακού DNA (Miniprep) Για την αποµόνωση πλασµιδιακού DNA από υγρή καλλιέργεια βακτηρίων E. coli µετασχηµατισµένων µε το επιθυµητό πλασµίδιο, χρησιµοποιήθηκε το ολοκληρωµένο σύστηµα Nucleospin Plasmid (Macherey-Nagel, Germany). Η πειραµατική πορεία που ακολουθείται είναι η εξής: Από καλλιέργεια όγκου 10 ml µεταφέρονται 1,5 ml σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου. Μετά από φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα στα g, απορρίπτεται το υπερκείµενο (x2). Προκειµένου να επιτευχθεί λύση των κυττάρων, προστίθενται 250 µl διαλύµατος Α1 και έπεται ανάδευση. Προστίθενται 250 µl διαλύµατος Α2 και το σωληνάριο αναστρέφεται 6-8 φορές. Επώαση για 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Προστίθενται 300 µl διαλύµατος Α3 και το σωληνάριο αναστρέφεται 6-8 φορές. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 10 δευτερόλεπτα στα g. Το υπερκείµενο φέρεται εντός στήλης Nucleospin Plasmid, η οποία έχει προσαρµοστεί σε σωληνάριο συλλογής 2 ml. Σε αυτό το στάδιο πραγµατοποιείται δέσµευση του DNA στη µεµβράνη σίλικας της στήλης. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και το έκλουµα αποµακρύνεται. Η µεµβράνη σίλικας της στήλης εκπλένεται µε προσθήκη 500 µl διαλύµατος AW, που έχει προθερµανθεί στους 50 0 C. Ακολουθεί επώαση για 2 λεπτά, φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και απόρριψη του εκλούµατος. Έκπλυση της µεµβράνης µε προσθήκη 600 µl διαλύµατος Α4 (που περιέχει αιθανόλη), φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και απόρριψη του εκλούµατος. Η µεµβράνη ξηραίνεται µε φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα g και η στήλη µεταφέρεται σε καθαρό σωληνάριο µικροφυγοκέντρου 1,5 ml. Προστίθενται 25 µl διαλύµατος έκλουσης ΑΕ, που έχει προθερµανθεί στους 70 0 C, ακολουθεί επώαση για 2 λεπτά και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g (Χ2). Για τον έλεγχο της καθαρότητας του πλασµιδίου, αφού έχει προηγηθεί φωτοµέτρηση για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσής του, ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης 0,8% κ.β. Παράλληλα µε το δείγµα 116

131 Μέθοδοι ηλεκτροφορούνται 4 µl (1 µg) µαρτύρων µοριακού βάρους που καλύπτουν εύρος τιµών bp. Προκειµένου να ελεγχθεί ότι το ανασυνδυασµένο µόριο DNA είναι το επιθυµητό, πραγµατοποιήθηκε έλεγχος της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων που το απαρτίζουν (αντίδραση sequencing). Η αντίδραση αυτή πραγµατοποιήθηκε από την εταιρεία Macrogen (Korea). Για τον έλεγχο της αλληλουχίας χρησιµοποιήθηκε διάλυµα πλασµιδίου συγκέντρωσης 100 ng/µl. Ο primer που χρησιµοποιήθηκε είναι ο ίδιος primer (5 ) που χρησιµοποιήθηκε για την επέκταση της ρυθµιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP, µε αντίδραση PCR (βλέπε παράγραφο ). 18. Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης [332] Πρόκειται για µια ευαίσθητη και γρήγορη τεχνική που χρησιµοποιείται για την µελέτη της γονιδιακής έκφρασης, τόσο σε ευκαρυωτικά όσο και προκαρυωτικά κύτταρα. Συνοπτικά, η αλληλουχία του υποκινητή (ή η ρυθµιστική αλληλουχία) του γονιδίου που µελετάται, συνδέεται στο γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης. Το πλασµίδιο εισάγεται στα ευκαρυωτικά κύτταρα (transfection) και ακολουθεί έκφραση της πρωτεΐνης λουσιφεράσης. Το ένζυµο της λουσιφεράσης αποτελείται από µια πολυπεπτιδική αλυσίδα µοριακού βάρους 60,7 kda και καταλύει την ΑΤΡ-εξαρτώµενη, οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση της λουσιφερίνης (luciferin). Για την πραγµατοποίηση της συγκεκριµένης αντίδρασης είναι απαραίτητη η παρουσία ιόντων µαγνησίου (Mg 2+ ). Αποτέλεσµα της αντίδρασης είναι η παραγωγή οξειδωµένης λουσιφερίνης και φωτός: Luciferin + ATP + O 2 oxyluciferin + AMP + PPi + CO 2 + φως Η εκποµπή φωτός διαρκεί µέχρι 20 δευτερόλεπτα και µετράται σε φθορισµόµετρο [333, 334]. 117

132 Μέθοδοι Στην παρούσα διατριβή προηγήθηκε η κλωνοποίηση της ρυθµιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP στο πλασµίδιο pgl3 και πραγµατοποιήθηκε παροδική διαµόλυνση (transient transfection) των κυττάρων LNCaP µε το συγκεκριµένο πλασµίδιο. Στο σηµείο αυτό αξίζει να σηµειωθεί ότι η λουσιφεράση έχει µικρό χρόνο ηµιζωής στα ευκαρυωτικά κύτταρα, συγκριτικά µε άλλες πρωτεΐνες αναφοράς όπως η CAT (chloramphenicol acetyltransferase), και για αυτό το λόγο επιλέγεται η µέθοδος παροδικής διαµόλυνσης των κυττάρων [335, 336]. οκιµάστηκαν τρεις διαφορετικές προσεγγίσεις διαµόλυνσης και πραγµατοποιήθηκε σύγκριση, προκειµένου να επιλεγεί η πλέον αποδοτική. Η σύγκριση έγινε βάσει της έντασης του εκπέµποντος φωτός στο µάρτυρα. Συγκεκριµένα, χρησιµοποιήθηκαν τα εξής αντιδραστήρια ως µέσα διαµόλυνσης: Το κατιονικό πολυµερές πολυαιθυλενιµίνη (jetpei TM, Polyplus transfection, Qbiogene), λιποσώµατα (Transfast, Promega) και η L-ορνιθίνη (Poly L-Ornithine, Sigma). Το µέσο διαµόλυνσης που αποδείχτηκε πιο αποδοτικό και ταυτόχρονα λιγότερο τοξικό, ήταν το κατιονικό πολυµερές πολυαιθυλενιµίνη (Εικόνα 15). Χρησιµοποιήθηκε το σύστηµα αντιδράσεων Luciferase Reporter Gene Assay, high sensitivity, της εταιρείας Roche. Σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης pgl3 basic hharppro2,3luc Poly-L-Ornithine Transfast jetpei Εικόνα 15: Σύγκριση τριών διαφορετικών µέσων διαµόλυνσης στα κύτταρα LNCaP. Μετά από παροδική διαµόλυνση των κυττάρων µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο, µετρήθηκε η δραστηριότητα λουσιφεράσης. Τα αποτελέσµατα εκφράστηκαν σε σύγκριση µε τη δραστηριότητα λουσιφεράσης (=1), σε κύτταρα που διαµολύνθηκαν µε το πλασµίδιο pgl3. 118

133 Μέθοδοι Η συνολική πειραµατική πορεία που ακολουθείται είναι η εξής: Χρησιµοποιείται καλλιέργεια κυττάρων LNCaP σε πλακίδιο µε 6 µικροκυψελίδες. Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε πλήρες θρεπτικό µέσο µέχρι να καλύψουν τον πυθµένα των µικροκυψελίδων. Σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου προστίθενται 3 µg πλασµιδιακού DNA σε NaCl 0,9% κ.β. µέχρι τελικού όγκου 100 µl. Παράλληλα, σε ένα δεύτερο σωληνάριο µεταφέρονται 90,4 µl NaCl 0,9% και προστίθενται 9,6 µl του πολυµερούς. Έπεται ανάδευση και ήπια φυγοκέντρηση. Το διάλυµα του πολυµερούς µεταβιβάζεται στο διάλυµα του πλασµιδίου. Έπεται ανάδευση, ήπια φυγοκέντρηση και επώαση σε θερµοκρασία δωµατίου για 30 λεπτά. Το θρεπτικό µέσο των κυττάρων αποµακρύνεται υπό κενό και προστίθενται 2 ml RPMI-1640 (χωρίς ορό). Το διάλυµα του συµπλόκου (200 µl) µεταφέρεται στάγδην στα κύτταρα LNCaP και ακολουθεί επώαση στον κλίβανο των κυττάρων για 4 ώρες. Το θρεπτικό µέσο των κυττάρων ανανεώνεται από RPMI-1640 που περιέχει ορό 2% κ.ό. Επώαση για 16 ώρες. Ανανέωση του θρεπτικού µέσου των κυττάρων (RPMI-1640 που περιέχει ορό 2% κ.ό.), προσθήκη των υπό εξέταση ουσιών και επώαση στον κλίβανο των κυττάρων για διάφορα χρονικά διαστήµατα. Αποµάκρυνση του θρεπτικού µέσου των κυττάρων και πλύσιµο (2Χ) µε PBS (δεν πρέπει να περιέχει Ca +2 και Mg +2 ). Προσθήκη διαλύµατος λύσης (250 µl/µικροκυψελίδα) και αποκόλληση των κυττάρων µε ειδική ελαστική ξύστρα (cell scraper). Μεταφορά σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου και επώαση για 15 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Φυγοκέντρηση στα g για 10 δευτερόλεπτα και συλλογή του υπερκείµενου εκχυλίσµατος των κυττάρων σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου. Σε σωληνάριο των 5 ml, µεταφέρονται 20 µl από το εκχύλισµα των κυττάρων και προσθέτονται 100 µl διαλύµατος αντιδραστηρίου λουσιφεράσης (Το αντιδραστήριο λουσιφεράσης έχει προεπωαστεί σε θερµοκρασία δωµατίου). Ακολουθεί ήπια ανάδευση. Απευθείας µέτρηση (1-5 δευτερόλεπτα µετά την 119

134 Μέθοδοι προσθήκη του αντιδραστηρίου λουσιφεράσης) σε φθορισµόµετρο (για 5 δευτερόλεπτα). Προκειµένου τα αποτελέσµατα να αναχθούν σε σχετικές µονάδες φθορισµού (Relative Light Units, RLU) ανά mg πρωτεΐνης, πραγµατοποιείται προσδιορισµός συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης στα εκχυλίσµατα των κυττάρων µε τη µέθοδο Bradford (βλέπε παράγραφο 4). Παρατήρηση: Τα στάδια της πειραµατικής πορείας στα οποία χρησιµοποιείται το αντιδραστήριο λουσιφεράσης, πραγµατοποιούνται µε ελάχιστο φωτισµό. Υλικά και ιαλύµατα Από το σύστηµα αντιδράσεων Luciferase Reporter Gene Assay, high sensitivity παρέχεται το διάλυµα λύσης των κυττάρων και το διάλυµα αντιδραστηρίων λουσιφεράσης. Φθορισµόµετρο: Junior luminometer, EG&G Berthold. 19. ηµιουργία σηµειακών µεταλλαγών στις αλληλουχίες δέσµευσης του µεταγραφικού παράγοντα AP-1 Για τη δηµιουργία σηµειακών µεταλλαγών στις εν δυνάµει αλληλουχίες δέσµευσης του µεταγραφικού παράγοντα AP-1, χρησιµοποιήθηκε το σύστηµα αντιδράσεων QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit της εταιρείας Stratagene. Πρόκειται για µια διαδικασία που περιλαµβάνει 4 στάδια, µε απόδοση σε σωστές µεταλλαγές άνω του 80%. Η διαδικασία αναπαρίσταται σχηµατικά στην Eικόνα

135 Μέθοδοι Εικόνα 16: Σχηµατική απεικόνιση της πειραµατικής διαδικασίας για την εισαγωγή σηµειακών µεταλλαγών σε συγκεκριµένες θέσεις του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου. Στάδιο 1 ο - Προετοιµασία του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου Πραγµατοποιείται κλωνοποίηση της επιθυµητής αλληλουχίας που πρόκειται να µεταλλαγεί, σε πλασµιδιακό φορέα. Στην παρούσα διατριβή, πραγµατοποιήθηκε κλωνοποίηση της ρυθµιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP στο πλασµίδιο pgl3 (βλέπε παράγραφο 17). Η ρυθµιστική αλληλουχία του γονιδίου της HARP φέρει δύο εν δυνάµει αλληλουχίες δέσµευσης του µεταγραφικού παράγοντα AP-1, στις οποίες επιθυµείται να πραγµατοποιηθεί σηµειακή µεταλλαγή. 121

136 Μέθοδοι Στάδιο 2 ο - Αντίδραση PCR Στο στάδιο αυτό πραγµατοποιείται αντίδραση PCR. Το DNA που πρόκειται να χρησιµοποιηθεί ως «µήτρα» στην αντίδραση PCR, είναι το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο. Το πλασµίδιο απαιτείται να έχει πολλαπλασιαστεί σε στελέχη E.Coli (dam + ), προκειµένου να είναι µεθυλιωµένο. Στην παρούσα διατριβή τα πλασµίδια πολλαπλασιάστηκαν στο στέλεχος XL-1 blue (dam + ). Επιπλέον, σχεδιάζονται primers που φέρουν την επιθυµητή µεταλλαγή. Ο σχεδιασµός των primers πραγµατοποιείται µε τη βοήθεια κατάλληλου λογισµικού (mutagenesis primers) της εταιρείας Stratagene (το λογισµικό αυτό είναι διαθέσιµο στο διαδίκτυο στην ιστοσελίδα Συνοψίζονται τα κύρια κριτήρια που λαµβάνονται υπόψη κατά το σχεδιασµό των συγκεκριµένων primers: - Και οι δύο primers πρέπει να περιέχουν την επιθυµητή µεταλλαγή και να είναι συµπληρωµατικοί της ίδιας αλληλουχίας, στις αντιπαράλληλες αλυσίδες του πλασµιδιακού DNA. - Οι primers πρέπει να έχουν µήκος βάσεις και Tm 78 0 C. - Η επιθυµητή µεταλλαγή πρέπει να απέχει βάσεις τουλάχιστον από τα δύο άκρα του κάθε primer. Στην παρούσα διατριβή χρησιµοποιήθηκαν δύο διαφορετικά ζευγάρια primers, τα οποία παρασκευάστηκαν από την εταιρεία Biopaths Co, προκειµένου να προκληθούν σηµειακές µεταλλαγές στις δύο επιθυµητές αλληλουχίες. Συγκεκριµένα, οι σηµειακές µεταλλαγές προκλήθηκαν στις θέσεις και (πριν από το σηµείο έναρξης της µεταγραφής). Και οι δύο θέσεις αντιστοιχούν στη δεύτερη βάση των επτανουκλεοτιδίων, που αποτελούν εν δυνάµει αλληλουχίες δέσµευσης του ΑΡ-1. Ουσιαστικά, πραγµατοποιήθηκε αντικατάσταση του ζευγαριού Α-Τ από το ζευγάρι G-C. Ο primer και το µεταλλαγµένο πλασµίδιο για τη σηµειακή µεταλλαγή στη θέση ονοµάζονται primer και πλασµίδιο mt I (mutant I) ενώ τα αντίστοιχα για τη θέση -1405, ονοµάζονται primer και πλασµίδιο mt II. Παρατίθενται οι νοηµατικές και αντινοηµατικές αλληλουχίες (sense και antisense αντίστοιχα) και τα χαρακτηριστικά των primers που χρησιµοποιήθηκαν. Η σηµειακή µεταλλαγή παρατίθεται µε έντονη γραφή. 122

137 Μέθοδοι Primer mt I: Sense 5 -TGTATACAATTTTAGTATATACCCATCTAAATAAAGGGTGATATTTTTGGTG TAAC-3 T m : 67,9 0 C Μήκος: 56 b Antisense 5 -GTTACACCAAAAATATCACCCTTTATTTAGATGGGTATATACTAAAATTGTA TACA-3 T m : 67,9 0 C Μήκος: 56 b Primer mt II: Sense 5 -CACACTTTATACAGGTGAAATCTAATTAAAACAAGCACTGCTTGCT-3 T m : 70 0 C Μήκος: 46 b Antisense 5 -AGCAAGCAGTGCTTGTTTTAATTAGATTTCACCTGTATAAAGTGTG-3 T m : 70 0 C Μήκος: 46 b Η σύνθεση και επέκταση των µεταλλαγµένων πλασµιδίων πραγµατοποιείται µε αντίδραση PCR. Τα απαραίτητα συστατικά για κάθε αντίδραση, σε κάθε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου για την PCR, περιέχονται στον Πίνακα

138 Μέθοδοι Πίνακας 13: Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιµοποιούνται για την πραγµατοποίηση κάθε αντίδρασης PCR. Όγκος Nuclease-free water Χ µl 10X Reaction Buffer 5 µl dntp Mix 1 µl primer (5 ) Χ µl (125 ng) primer (3 ) X µl (125 ng) PfuTurbo DNA Polymerase (2,5 U/µl) 1 µl είγµα (πλασµιδιακό DNA) X µl (25 ng) Τελικός όγκος 50 µl Τα αντιδραστήρια προστίθενται στο διάλυµα της αντίδρασης στους 4 0 C, και το σωληνάριο µεταφέρεται στη συσκευή της PCR. Προηγείται επώαση στους 95 0 C για 30 δευτερόλεπτα προκειµένου να αποδιαταχθεί το δίκλωνο κυκλικό DNA. Οι συνθήκες των αντιδράσεων που χρησιµοποιήθηκαν περιέχονται στον Πίνακα 14. Πίνακας 14: Πρότυπο των συνθηκών που χρησιµοποιήθηκαν για τις αντιδράσεις της PCR. Στάδιο Θερµοκρασία Χρόνος Αποδιάταξη 95 0 C 30 δευτερόλεπτα Σύνδεση 55 0 C 1 λεπτό Πολυµερισµός 68 0 C 8 λεπτά Η χρονική διάρκεια του τελευταίου σταδίου (που αναγράφεται στον πίνακα) καθορίζεται από το µέγεθος του πλασµιδίου (1 λεπτό / kb). 124

139 Μέθοδοι Τα παραπάνω διαδοχικά στάδια (κύκλοι) επαναλαµβάνονται 12 φορές. Ο τύπος της επιθυµητής µεταλλαγής, στην παρούσα φάση σηµειακή, είναι αυτός που καθορίζει τον αριθµό των κύκλων. Τέλος, ακολουθεί επώαση στους 37 0 C για 5 λεπτά, προκειµένου να προετοιµαστεί το δείγµα για το επόµενο στάδιο. Στάδιο 3 ο - Αντίδραση πέψης µε το ένζυµο περιορισµού Dpn I Από την αντίδραση της PCR έχουν προκύψει δίκλωνα, κυκλικά µόρια DNA, τα οποία είναι κοµµένα (nicked) στο σηµείο δέσµευσης του µεταλλαγµένου primer. Στο προϊόν κάθε αντίδρασης PCR προστίθεται από 1 µl ενζύµου περιορισµού Dpn I (10 U/µl) και ακολουθεί ήπια ανάδευση και φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό. Επώαση στους 37 0 C για 1 ώρα. Στο στάδιο αυτό πέπτονται οι µεθυλιωµένες, µη µεταλλαγµένες, µητρικές αλυσίδες DNA. Έτσι παραµένουν τα µεταλλαγµένα, θυγατρικά, κυκλικά, δίκλωνα µόρια DNA, τα οποία είναι κοµµένα (nicked) και µη µεθυλιωµένα. Στάδιο 4 ο - Μετασχηµατισµός υπερ-δεκτικών κυττάρων Στο στάδιο αυτό τα µόρια DNA τα οποία έχουν προκύψει από το στάδιο 3, εισάγονται σε υπερ-δεκτικά κύτταρα (supercompetent cells) XL-1 Blue. Μέσα στα κύτταρα, το µεταλλαγµένο πλασµιδιακό DNA µεθυλιώνεται και επιδιορθώνεται ώστε να πάψει να είναι κοµµένο. Απόψυξη 50 µl υπερ-δεκτικών κυττάρων XL-1 Blue σε σωληνάριο των 15 ml, στον πάγο. Προσθήκη 2 µl του προϊόντος πέψης (στάδιο 3), ήπια ανάδευση και επώαση στον πάγο για 30 λεπτά. Επώαση στους 42 0 C για 45 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια επώαση στον πάγο για 2 λεπτά. Προσθήκη 0,5 ml διαλύµατος NZY + broth (προθερµασµένου στους 42 0 C) και επώαση στους 37 0 C για 1 ώρα υπό ανάδευση. Μεταφορά 250 µl του παραπάνω διαλύµατος κυττάρων σε τρυβλίο επιστρωµένο µε στερεό θρεπτικό µέσο (που περιέχει αµπικιλλίνη σε 125

140 Μέθοδοι συγκέντρωση 0,1 mg/ml). Το τρυβλίο επωάζεται ανεστραµµένο σε επωαστικό θάλαµο στους 37 0 C για 16 ώρες και ελέγχεται µακροσκοπικά για την ανάπτυξη αποικιών βακτηρίων ανθεκτικών στην αµπικιλλίνη. Μονήρεις αποικίες βακτηρίων που αναπτύσσονται στη στερεή καλλιέργεια, εµβολιάζονται εντός σωληναρίων των 50 ml που περιέχουν 10 ml υγρού θρεπτικού υλικού. Στο υγρό θρεπτικό µέσο έχει προστεθεί αµπικιλλίνη, ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 0,1 mg/ml. Οι υγρές καλλιέργειες επωάζονται για 16 h στους 37 0 C υπό συνεχή ανάδευση. Από τα κύτταρα της υγρής καλλιέργειας αποµονώνεται το πλασµιδιακό DNA. Μετά από προσδιορισµό της συγκέντρωσης του πλασµιδιακού DNA µε φωτοµέτρηση, ακολουθεί πέψη µε τα ένζυµα περιορισµού Mlu I και Bgl II και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης 0,8%. Με τον τρόπο αυτό ελέγχεται ότι τα βακτήρια περιέχουν το επιθυµητό πλασµίδιο. Προκειµένου να ελεγχθεί ότι επιτεύχθηκαν οι επιθυµητές σηµειακές µεταλλαγές στη σωστή θέση, πραγµατοποιήθηκε έλεγχος της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων των µεταλλαγµένων πλασµιδίων (αντίδραση sequencing). Η αντίδραση αυτή πραγµατοποιήθηκε από την εταιρεία Macrogen (Korea). Για τον έλεγχο της αλληλουχίας χρησιµοποιήθηκε διάλυµα του κάθε πλασµιδίου, συγκέντρωσης 100 ng/µl. Ο primer που χρησιµοποιήθηκε είναι ο ίδιος primer (5 ) που χρησιµοποιήθηκε για τη δηµιουργία της ρυθµιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP µε αντίδραση PCR, προκειµένου να κλωνοποιηθεί (βλέπε παράγραφο ). ηµιουργία διπλού µεταλλάγµατος Προκειµένου να δηµιουργηθούν σηµειακές µεταλλαγές και στις δύο θέσεις δέσµευσης του µεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1, ακολουθείται η ίδια πειραµατική πορεία. Στην αντίδραση PCR χρησιµοποιείται ως «µήτρα» DNA, το µεταλλαγµένο πλασµίδιο mt I (φέρει µεταλλαγή στη θέση 1736). Είχε προηγηθεί ο έλεγχος της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων στο µεταλλαγµένο πλασµίδιο, µε αντίδραση sequencing. Οι primers που χρησιµοποιούνται είναι οι primers mt II, οι οποίοι φέρουν τη µεταλλαγή για τη δεύτερη θέση (-1405). Το πλασµίδιο αυτό ονοµάζεται dmt (double mutant). 126

141 Μέθοδοι Προκειµένου να ελεγχθεί ότι επιτεύχθηκαν και οι δύο σηµειακές µεταλλαγές στη σωστή θέση, πραγµατοποιήθηκε έλεγχος της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων του µεταλλαγµένου πλασµιδίου (αντίδραση sequencing). Αντίδραση ελέγχου Προκειµένου να ελεγχθεί η απόδοση του συγκεκριµένου συστήµατος αντιδράσεων, όσον αφορά στο ποσοστό των µεταλλαγµένων πλασµιδίων που προκύπτουν, πραγµατοποιήθηκε µια επιπλέον αντίδραση ελέγχου. Στην αντίδραση αυτή παρακάµπτεται το πρώτο στάδιο προετοιµασίας του πλασµιδίου, εφόσον το πλασµίδιο αυτό παρέχεται από την εταιρεία. Πρόκειται για το πλασµίδιο pwhitescript TM µεγέθους 4,5 kb. Το πλασµίδιο αυτό περιέχει στο γονίδιο της β- γαλακτοσιδάσης ένα κωδικόνιο τερµατισµού της µετάφρασης (ΤΑΑ) στη θέση που φυσιολογικά υπάρχει το κωδικόνιο (CAA) για το αµινοξύ γλουταµίνη (πρόκειται για το 9 ο αµινοξύ). Όταν το πλασµίδιο αυτό εισαχθεί σε κύτταρα XL-1 Blue supercompetent και τα κύτταρα αυτά µεταφερθούν σε τρυβλία επιστρωµένα µε στερεό θρεπτικό υλικό (που περιέχει αµπικιλλίνη, IPTG και X-gal) δηµιουργούνται λευκές αποικίες. Το λευκό χρώµα οφείλεται στο γεγονός ότι έχει ανασταλεί η δραστικότητα της β-γαλακτοσιδάσης. ιαφορετικά, το χρώµα των αποικιών είναι µπλε. Οι primers που χρησιµοποιούνται στην αντίδραση ελέγχου φέρουν την επιθυµητή σηµειακή µετάλλαξη στο γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης. Συγκεκριµένα, επιθυµείται να αντικατασταθεί η θυµίνη του κωδικόνιου λήξης από κυτοσίνη, προκειµένου να σχηµατιστεί η β-γαλακτοσιδάση. Όταν το µεταλλαγµένο πλασµίδιο εισαχθεί σε κύτταρα XL-1 Blue supercompetent και τα κύτταρα αυτά µεταφερθούν σε τρυβλία επιστρωµένα µε στερεό θρεπτικό υλικό (που περιέχει αµπικιλλίνη, IPTG και X-gal) δηµιουργούνται µπλε αποικίες (φαινότυπος β- γαλακτοσιδάσης, β-gal + ). Η πειραµατική πορεία που ακολουθείται για την αντίδραση ελέγχου είναι κοινή µε αυτή των δειγµάτων. Η µόνη διαφορά είναι ότι στα διαδοχικά στάδια (κύκλοι) της αντίδρασης PCR, το τρίτο στάδιο πολυµερισµού διαρκεί 5 λεπτά λόγω διαφορετικού µεγέθους του πλασµιδίου. Οι primers που χρησιµοποιούνται στην αντίδραση ελέγχου παρέχονται από την εταιρεία και είναι οι εξής: 127

142 Μέθοδοι Primer (5 ): 5 -CCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCAC-3 Primer (3 ): 5 -GTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGG-3 Υλικά και ιαλύµατα Υγρό θρεπτικό µέσο για ανάπτυξη βακτηρίων (LB medium) Στερεό θρεπτικό υλικό για ανάπτυξη βακτηρίων (LB-agar): 2% κ.β. άγαρ (bacto-agar) σε LB medium Το διάλυµα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο και µεταφέρεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό µέσο στερεοποιείται µετά από 10 λεπτά παραµονής σε θερµοκρασία δωµατίου. Στο διάλυµα του θρεπτικού µέσου, όταν η θερµοκρασία είναι στους 50 0 C και πριν στερεοποιηθεί, προστίθεται ποσότητα διαλύµατος αµπικιλλίνης σε τελική συγκέντρωση 0,1 mg/ml. Για την αντίδραση ελέγχου προστίθενται επιπλέον της αµπικιλλίνης X-gal και IPTG, σε τελική συγκέντρωση 80 µg/ml και 20 mm αντίστοιχα. Τα δύο αυτά αντιδραστήρια δεν πρέπει να αναµιχθούν πριν την προσθήκη τους στο διάλυµα του θρεπτικού µέσου γιατί υπάρχει κίνδυνος κατακρήµνισής τους. ιάλυµα IPTG 1,34 Μ (σε νερό) ιάλυµα X-gal 20 mg/ml (σε διµεθυλοφορµαµίδιο DMF) Το διάλυµα αυτό διατηρείται σε συνθήκες µειωµένου φωτισµού. ιάλυµα αµπικιλλίνης 50 mg/ml (σε νερό) Υγρό θρεπτικό µέσο για ανάπτυξη βακτηρίων (ΝZY + broth medium): NZ amine (casein hydrolysate) 1% Εκχύλισµα µαγιάς 0,5% ΝaCl 0,5% Ρυθµίζεται το ph στο 7,5 (µε διάλυµα NaOH 1N) και το διάλυµα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. Πριν την χρήση, προστίθενται ανά ml διαλύµατος τα κάτωθι διαλύµατα: (Τα διαλύµατα αυτά πριν την προσθήκη τους, αποστειρώνονται µε διαβίβασή τους µέσα από φίλτρο µε πόρους διαµέτρου 0,2 µm). ιάλυµα MgCl 2 1M 12,5 µl ιάλυµα MgSO 4 1M 12,5 µl ιάλυµα γλυκόζης 2Μ 10 µl 128

143 Μέθοδοι PfuTurbo DNA πολυµεράση (2,5 U/µl) (Stratagene) Dpn I ένζυµο περιορισµού (10 U/µl) (Stratagene) pwhitescript TM 4,5 kb πλασµίδιο (5 ng/µl) (Stratagene) XL-1 Blue supercompetent cells (Stratagene) Falcon 2059 σωληνάρια πολυπροπυλενίου (15 ml) 20. Αποµόνωση πυρηνικού εκχυλίσµατος από κύτταρα LNCaP [337] Χρησιµοποιήθηκε το ολοκληρωµένο σύστηµα για αποµόνωση πυρηνικού εκχυλίσµατος Nuclear Extract Kit, της εταιρείας Active Motif. Η πειραµατική πορεία που παρατίθεται παρακάτω, εφαρµόζεται για καλλιέργεια κυττάρων LNCaP σε τρυβλίο διαµέτρου 100 mm. Όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει τον πυθµένα του τρυβλίου, γίνεται επώαση µε θρεπτικό µέσο που περιέχει 2 % κ.ό. ορό, για 16 ώρες, στον κλίβανο των κυττάρων. Ακολουθεί ανανέωση του θρεπτικού µέσου, µε θρεπτικό µέσο που περιέχει 2 % ορό, και προσθήκη των υπό εξέταση ουσιών. Μετά από συγκεκριµένο χρονικό διάστηµα, αφαιρείται το υγρό θρεπτικό µέσο και ακολουθεί έκπλυση των κυττάρων µε 5 ml παγωµένου διαλύµατος PBS. Το διάλυµα PBS περιέχει αναστολείς φωσφατασών σε αναλογία 1:20. Αποµάκρυνση του παραπάνω διαλύµατος και προσθήκη εκ νέου 3 ml παγωµένου διαλύµατος PBS (µε αναστολείς φωσφατασών). Αποκόλληση των κυττάρων από τον πυθµένα του τρυβλίου µε τη χρήση ελαστικής ξύστρας (cell scraper) και µεταφορά σε παγωµένο σωλήνα των 15 ml. Φυγοκέντρηση στα 500 rpm, για 5 λεπτά, στους 4 0 C. Απόχυση του υπερκείµενου και διατήρηση του ιζήµατος των κυττάρων στον πάγο. Προσθήκη 500 µl υποτονικού διαλύµατος (1Χ) στο ίζηµα των κυττάρων και ήπια ανάδευση. Στο στάδιο αυτό γίνεται λύση των κυττάρων και το εκχύλισµα 129

144 Μέθοδοι µεταφέρεται σε παγωµένο σωληνάριο µικροφυγοκέντρου. Ακολουθεί επώαση στον πάγο για 15 λεπτά. Η λύση των κυττάρων υποβοηθάται µε την προσθήκη 25 µl απορρυπαντικού και δυνατή ανάδευση για 10 δευτερόλεπτα. Φυγοκέντρηση στα g, για 30 δευτερόλεπτα, στους 4 0 C. Το υπερκείµενο, που αποτελεί το κυτταροπλασµατικό κλάσµα, φυλάσσεται στους C. Στο ίζηµα, που περιέχει τους πυρήνες των κυττάρων, προστίθενται 50 µl πλήρους διαλύµατος λύσης πυρήνων και ακολουθεί έντονη ανάδευση για 10 δευτερόλεπτα. Επώαση για 30 λεπτά, στους 4 0 C, υπό ανάδευση. Έντονη ανάδευση για 30 δευτερόλεπτα και φυγοκέντρηση στα g, για 10 λεπτά, στους 4 0 C. Το υπερκείµενο, πυρηνικό εκχύλισµα, µεταφέρεται σε παγωµένο σωληνάριο µικροφυγοκέντρου και φυλάσσεται στους C. Πριν τη χρησιµοποίηση των δειγµάτων, πραγµατοποιείται προσδιορισµός ολικής πρωτεΐνης µε τη µέθοδο Bradford (Ως τυφλό χρησιµοποιείται το πλήρες διάλυµα λύσης των πυρήνων). Υλικά και ιαλύµατα Τα αντιδραστήρια περιέχονται στο ολοκληρωµένο σύστηµα Nuclear Extract Kit. ιάλυµα PBS 10 X ιάλυµα αναστολέων φωσφατασών ιάλυµα λύσης ΑΜ1 1 Μ ιθειοθρεϊτόλη (DTT) ιάλυµα αναστολέων πρωτεϊνασών Απορρυπαντικό Υποτονικό διάλυµα 10 Χ Πλήρες διάλυµα λύσης πυρήνων: ιάλυµα λύσης ΑΜ1 DTT σε τελική συγκέντρωση 1 mm 130

145 Μέθοδοι Αναστολείς πρωτεϊνασών σε αναλογία 1: Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισµός των υποµονάδων του µεταγραφικού παράγοντα AP-1 µε τη µέθοδο ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) [338, 339] Χρησιµοποιήθηκε το ολοκληρωµένο σύστηµα TransAM TM AP-1 Family, της εταιρείας Active Motif. Πρόκειται για ένα σύστηµα, το οποίο βασίζεται στην αρχή της τεχνικής ELISA. Παρέχεται πλακίδιο που αποτελείται από 96 µικροκυψελίδες. Στον πυθµένα των µικροκυψελίδων έχουν προσκολληθεί ολιγονουκλεοτίδια που φέρουν την αλληλουχία δέσµευσης του AP-1 (TPA-responsive element). Τα διµερή του µεταγραφικού παράγοντα AP-1, που περιέχονται στα πυρηνικά εκχυλίσµατα των κυττάρων, δεσµεύονται σε αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια και ανιχνεύονται µε αντισώµατα ειδικά για κάθε υποµονάδα του AP-1: c-fos, FosB, Fra-1, Fra-2, c-jun, JunB και JunD. Με την προσθήκη δεύτερου αντισώµατος που φέρει δεσµευµένη υπεροξειδάση, επιτυγχάνεται παραγωγή χρώµατος και ποσοτικός προσδιορισµός µε φασµατοφωτοµετρία. Με τη µέθοδο αυτή διαπιστώνεται οποιαδήποτε µεταβολή στην ικανότητα δέσµευσης κάθε υποµονάδας στο DNA, µετά από κάποιο ερέθισµα. Πραγµατοποιούνται ταυτόχρονα και πειράµατα ανταγωνιστικής δέσµευσης. Συγκεκριµένα, πριν προστεθούν τα δείγµατα στις µικροκυψελίδες, επωάζονται µε διαλυτά ολιγονουκλεοτίδια που φέρουν την αλληλουχία δέσµευσης του ΑΡ-1. Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια που φέρουν τις εν δυνάµει αλληλουχίες δέσµευσης του ΑΡ-1, οι οποίες ανιχνεύονται στο γονίδιο της HARP. Χρησιµοποιήθηκαν δύο είδη ολιγονουκλεοτιδίων: Τα πρώτα φέρουν την πιθανή αλληλουχία δέσµευσης του ΑΡ-1 (normal I και ΙΙ), της ρυθµιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP, ενώ τα δεύτερα φέρουν σηµειακή µεταλλαγή στη δεύτερη βάση του επτανουκλεοτιδίου δέσµευσης του ΑΡ-1 (mutant I και II). Με τα πειράµατα ανταγωνιστικής δέσµευσης διαπιστώνεται η ταυτότητα των υποµονάδων που συµµετέχουν στο σχηµατισµό διµερούς. Ταυτόχρονα 131

146 Μέθοδοι διαπιστώνεται και η συγγένεια των λειτουργικών διµερών µε την υπό µελέτη εν δυνάµει αλληλουχία δέσµευσης, συγκριτικά µε τη συντηρηµένη αλληλουχία. Η διαδικασία µπορεί να διακριθεί στα ακόλουθα 4 στάδια: 1 Ο Στάδιο: έσµευση του ΑΡ-1 στην καθηλωµένη νουκλεοτιδική αλληλουχία. Στα πυρηνικά εκχυλίσµατα που έχουν αποµονωθεί από κύτταρα LNCaP, πραγµατοποιείται ποσοτικός προσδιορισµός ολικών πρωτεινών µε τη µέθοδο Bradford. Από κάθε δείγµα χρησιµοποιούνται 5 µg ολικής πρωτεΐνης. Τα δείγµατα αραιώνονται µε πλήρες διάλυµα λύσης, σε τελικό όγκο 20 µl. Σε κάθε µικροκυψελίδα προστίθενται 30 µl πλήρους διαλύµατος δέσµευσης και 20 µl δείγµατος. Ως θετικός µάρτυρας, χρησιµοποιείται πυρηνικό εκχύλισµα που παρέχεται από την εταιρεία (5 µg δείγµατος WI-38 σε τελικό όγκο 20 µl). Στη µικροκυψελίδα που χρησιµοποιείται ως τυφλό, προστίθενται 20 µl πλήρους διαλύµατος λύσης. Για τα πειράµατα ανταγωνιστικής δέσµευσης, αρχικά παρασκευάζονται τα δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια. Σε σωληνάριο µικροφυγοκέντρου αναµιγνύονται ίσοι όγκοι από τα συµπληρωµατικά µονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια (sense και antisense). Ακολουθεί αποδιάταξη στους 95 0 C για 5 λεπτά και σχηµατισµός των δίκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων µε επώαση για 3 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου. Έλεγχος του σχηµατισµού των δίκλωνων ολιγονουκλεοτιδίων, πραγµατοποιείται µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης (Εικόνα 17). Στη συνέχεια, 31,8 µl πλήρους διαλύµατος δέσµευσης που περιέχει 20 pmol δίκλωνου ολιγονουκλεοτιδίου προστίθενται ανά δείγµα. Ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά, σε θερµοκρασία δωµατίου, υπό ανάδευση και προσθήκη του µίγµατος στη µικροκυψελίδα. Επίσης, χρησιµοποιήθηκαν ως µάρτυρες δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια που φέρουν τη συντηρηµένη αλληλουχία δέσµευσης του ΑΡ-1. Τα ολιγονουκλεοτίδια αυτά παρέχονται από την εταιρεία και διακρίνονται σε αυτά που φέρουν τη συντηρηµένη αλληλουχία (AP-1 wild type) και σε αυτά που φέρουν µεταλλαγµένη την αλληλουχία δέσµευσης του ΑΡ-1 (AP-1 mutated). 132

147 Μέθοδοι Εικόνα 17: Αντιπροσωπευτική εικόνα ηλεκτροφόρησης των προϊόντων της αντίδρασης υβριδισµού. Στις διαδροµές 1 και 3 αναλύθηκαν τα µονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια normal I και II αντίστοιχα. Στις διαδροµές 2 και 4 αναλύθηκαν τα δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια normal I και II αντίστοιχα. Οι µικροκυψελίδες καλύπτονται µε κολλητική ταινία και ακολουθεί επώαση για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, υπό ανάδευση. Ακολουθεί πλύσιµο κάθε µικροψελίδας µε 200 µl διαλύµατος έκπλυσης 1Χ. Η διαδικασία αυτή πραγµατοποιείται 3 φορές. Για κάθε έκπλυση, το πλακίδιο αναποδογυρίζεται προκειµένου να αδειάσουν οι µικροκυψελίδες και στη συνέχεια στραγγίζει µε 3 χτυπήµατα πάνω σε απορροφητικό χαρτί. 2 Ο Στάδιο: έσµευση του πρώτου αντισώµατος. Προσθήκη 100 µl διαλύµατος του πρώτου αντισώµατος ανά µικροκυψελίδα (Η αραίωση των αντισωµάτων πραγµατοποιείται σε διάλυµα δέσµευσης των αντισωµάτων 1Χ. Η αραίωση για κάθε αντίσωµα αναγράφεται στον Πίνακα 15). Το πλακίδιο καλύπτεται µε κολλητική ταινία και ακολουθεί επώαση για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, χωρίς ανάδευση. Ακολουθεί πλύσιµο κάθε µικροκυψελίδας µε 200 µl διαλύµατος έκπλυσης 1Χ (3 φορές), µε τον τρόπο που αναγράφεται στο στάδιο

148 Μέθοδοι 3 Ο Στάδιο: έσµευση του δεύτερου αντισώµατος. Προσθήκη 100 µl διαλύµατος του δεύτερου αντισώµατος ανά µικροκυψελίδα. Το δεύτερο αντίσωµα αραιώνεται σε διάλυµα δέσµευσης των αντισωµάτων 1Χ, σε αναλογία 1:1000. Το πλακίδιο καλύπτεται µε κολλητική ταινία και ακολουθεί επώαση για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, χωρίς ανάδευση. Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης, το διάλυµα ανάπτυξης χρώµατος φέρεται σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθεί πλύσιµο κάθε µικροκυψελίδας µε 200 µl διαλύµατος έκπλυσης 1Χ (4 φορές), µε τον τρόπο που αναγράφεται στο στάδιο 1. 4 Ο Στάδιο: Χρωµογόνος αντίδραση. Προσθήκη 100 µl διαλύµατος ανάπτυξης ανά µικροκυψελίδα. Επώαση για 2-20 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου, µε αποφυγή της άµεσης έκθεσης σε φως. Η επώαση διαρκεί µέχρι την ανάπτυξη κυανού και σκούρου κυανού χρώµατος στα δείγµατα και στο θετικό µάρτυρα. Προσθήκη 100 µl διαλύµατος αναστολής της αντίδρασης. Το διάλυµα αυτό περιέχει οξύ, οπότε το χρώµα από κυανό µετατρέπεται σε κίτρινο. Τα επόµενα 5 λεπτά, ακολουθεί φωτοµέτρηση σε µήκος κύµατος 450 nm µε µήκος κύµατος αναφοράς τα 655 nm. Υλικά και ιαλύµατα Όλα τα αντιδραστήρια περιέχονται στο ολοκληρωµένο σύστηµα TransAM TM AP-1 Family. Πλακίδιο 96 µικροκυψελίδων 1Μ ιθειοθρεϊτόλη (DTT) ιάλυµα περιέχον µίγµα αναστολέων πρωτεϊνασών Poly [d(i-c)] (17 µg/ml) ιάλυµα λύσης, ΑΜ1 ιάλυµα δέσµευσης, ΑΜ2 134

149 Μέθοδοι 10Χ ιάλυµα έκπλυσης, ΑΜ2 10Χ ιάλυµα δέσµευσης αντισώµατος, ΑΜ3 ιάλυµα ανάπτυξης της χρωµογόνου αντίδρασης ιάλυµα αναστολής της χρωµογόνου αντίδρασης Πυρηνικό εκχύλισµα WI-38 (2,5 µg/µl) Ολιγονουκλεοτίδια AP-1 wild type (10 pmol/µl) Ολιγονουκλεοτίδια AP-1 mutated (10 pmol/µl) 2 ο Αντίσωµα συνδεδεµένο µε υπεροξειδάση (HRP-conjugated) (0,4 µg/µl) Πίνακας 15: Στον πίνακα παρατίθενται τα αντισώµατα που χρησιµοποιούνται για την ανίχνευση των υποµονάδων του ΑΡ-1 και η αραίωση µε την οποία χρησιµοποιείται το καθένα. 1 ο Αντίσωµα Αραίωση Anti-cFos 1:1000 Anti-FosB 1:1500 Anti-Fra1 1:1500 Anti-Fra2 1:1500 Anti-JunB 1:1500 Anti-JunD 1:1500 Anti-phospho-cJun 1:500 Σηµείωση: Το αντίσωµα Anti-phospho-cJun ανιχνεύει φωσφορυλίωση σε σερίνη, στην πρωτεΐνη c-jun στη θέση 73 και στην πρωτεΐνη JunD στη θέση 100. Πλήρες διάλυµα λύσης πυρήνων: ιάλυµα λύσης, ΑΜ1 DTT σε τελική συγκέντρωση 1 mm Αναστολείς πρωτεϊνασών σε αναλογία 1:

150 Μέθοδοι Πλήρες διάλυµα δέσµευσης: ιάλυµα δέσµευσης, ΑΜ2 DTT σε τελική συγκέντρωση 1 mm Poly [d(i-c)] σε τελική συγκέντρωση 0,17 µg/ml Ολιγονουκλεοτίδια normal I Sense 5 -TGTATACAATTTTAGTATATACCCATCTGAATAAAGGGTGATATTTTTGGTG TAAC-3 T m : 69,2 0 C Μήκος: 56 b Antisense 5 -GTTACACCAAAAATATCACCCTTTATTCAGATGGGTATATACTAAAATTGTA TACA-3 T m : 69,2 0 C Μήκος: 56 b Ολιγονουκλεοτίδια mutant I Sense 5 -TGTATACAATTTTAGTATATACCCATCTAAATAAAGGGTGATATTTTTGGTG TAAC-3 T m : 67,9 0 C Μήκος: 56 b Antisense 5 -GTTACACCAAAAATATCACCCTTTATTTAGATGGGTATATACTAAAATTGTA TACA-3 T m : 67,9 0 C Μήκος: 56 b Ολιγονουκλεοτίδια normal II Sense 5 -CACACTTTATACAGGTGAAATCTGATTAAAACAAGCACTGCTTGCT-3 T m : 71,7 0 C Μήκος: 46 b 136

151 Μέθοδοι Antisense 5 -AGCAAGCAGTGCTTGTTTTAATCAGATTTCACCTGTATAAAGTGTG-3 T m : 71,7 0 C Μήκος: 46 b Ολιγονουκλεοτίδια mutant II Sense 5 CACACTTTATACAGGTGAAATCTAATTAAAACAAGCACTGCTTGCT3 T m : 70 0 C Μήκος: 46 b Antisense 5 AGCAAGCAGTGCTTGTTTTAATTAGATTTCACCTGTATAAAGTGTG3 T m : 70 0 C Μήκος: 46 b 22. Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωµάτων και ηλεκτροφορηµάτων νουκλεϊνικών οξέων µε σύστηµα ανάλυσης εικόνας Προκειµένου να εξαχθούν ποσοτικά συµπεράσµατα από ανοσοαποτυπώµατα ή ηλεκτροφορήµατα νουκλεϊνικών οξέων, γίνεται ποσοτικοποίηση των ζωνών µε τη χρήση συστήµατος ανάλυσης εικόνας. Η φωτογράφηση των ανοσοαποτυπωµάτων και των ηλεκτροφορηµάτων πραγµατοποιείται µε ψηφιακή φωτογραφική µηχανή Olympus Camedia C-2500L. Η φωτογράφηση των ανοσοαποτυπωµάτων πραγµατοποιείται µε τη χρήση διερχόµενου λευκού φωτός, ενώ η φωτογράφηση των ηλεκτροφορηµάτων νουκλεϊνικών οξέων µε τη χρήση διερχόµενου υπεριώδους φωτός. Ακολούθως, οι φωτογραφίες µεταφέρονται σε ηλεκτρονικό υπολογιστή και αναλύονται µε το πρόγραµµα Scion Image (Scion Corporation). Το λογισµικό είναι ρυθµισµένο κατάλληλα ώστε για κάθε ζώνη που περιγράφεται να καταγράφεται αυτόµατα σε ένα λογιστικό φύλλο η επιφάνεια της ζώνης και η µέση έντασή της. Το γινόµενο των δύο αυτών παραµέτρων είναι ανάλογο της ποσότητας της 137

152 Μέθοδοι πρωτεΐνης ή του νουκλεϊνικού οξέος που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη και χρησιµοποιείται περαιτέρω για τις ποσοτικές αναλύσεις. 23. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων έγινε µε τη χρήση του unpaired t-test ή του test ANOVA. 138

153 Αποτελέσµατα 1. Το H 2 O 2 επάγει την αγγειογένεση στο in vivo σύστηµα µελέτης της CAM εµβρύου όρνιθας Σε προηγούµενη µελέτη είχαµε δείξει ότι το ενδογενώς παραγόµενο H 2 O 2 εµπλέκεται στη ρύθµιση της αγγειογένεσης, στο in vivo µοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής µεµβράνης (CAM) εµβρύου όρνιθας [317]. Προκειµένου να αξιολογηθεί η επίδραση του εξωγενώς χορηγούµενου H 2 O 2 στην αγγειογένεση στο µοντέλο αυτό, την 9 η µέρα ανάπτυξης του εµβρύου διαφορετικές ποσότητες H 2 O 2 εναποτέθηκαν επί της CAM και η πυκνότητα του αγγειακού δικτύου προσδιορίστηκε 48 ώρες αργότερα, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 18, το H 2 O 2 οδήγησε σε δοσο-εξαρτώµενη αύξηση της πυκνότητας του αγγειακού δικτύου, η οποία ήταν µέγιστη στη δόση των 2 nmol cm -2. A B % Μεταβολή σε σχέση µε το µάρτυρα ,2 *** 1 *** 2 *** 10 H 2 O 2 (nmol cm -2 ) Εικόνα 18: Επίδραση του H 2 O 2 στην έκταση του αγγειακού πλέγµατος στην CAM εµβρύου όρνιθας. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα των αγγείων της CAM εµβρύου όρνιθας µετά την επίδραση του H 2 O 2. Μ: µάρτυρας, Η: H 2 O 2 σε δόση 2 nmol cm -2. (Β) οκιµάστηκαν τέσσερις διαφορετικές δόσεις της υπό εξέταση ουσίας και 48 ώρες αργότερα έγινε ποσοτικοποίηση του αγγειακού δικτύου, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της % αλλαγής του συνολικού µήκους των αγγείων σε σχέση µε το µάρτυρα. ***P< 0,

154 Αποτελέσµατα 2. Το H 2 O 2 αυξάνει τα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP στην CAM εµβρύου όρνιθας Προηγούµενες µελέτες του εργαστηρίου ανέδειξαν την επαγωγική δράση του αυξητικού παράγοντα HARP στην αγγειογένεση, στο in vivo µοντέλο της CAM εµβρύου όρνιθας [182]. Παρόµοια δράση εµφάνισαν και πεπτίδια που προέρχονται από πρωτεολυτική αποικοδόµηση του µορίου [176]. Η πιθανή επίδραση του H 2 O 2 στα επίπεδα της HARP στην CAM, εξετάστηκε µε ανάλυση κατά Western έναντι της HARP σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα 24 και 48 ώρες µετά την επίδραση του H 2 O 2, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 19, το H 2 O 2 στη δόση µε τη µέγιστη αγγειογενετική δράση (2 nmol cm -2 ) προκάλεσε σηµαντική αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης HARP στις 24 ώρες (250±50%). Στις 48 ώρες, τα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP ήταν παρόµοια µε αυτά του µάρτυρα. A B 24h 48h 300 p<0,01 % Μεταβολή σε σχέση µε το µάρτυρα M H M H Εικόνα 19: Επίδραση του H 2 O 2 στα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP στον ιστό της CAM εµβρύου όρνιθας. (Α) Ανάλυση κατά Western για την πρωτεΐνη HARP σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα µετά από επίδραση H 2 O 2, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Αντιπροσωπευτική εικόνα από 3 ανεξάρτητα µεταξύ τους πειράµατα. (Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν µε σύστηµα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της % µεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση µε το µάρτυρα στις 24 ώρες. Μ: µάρτυρας, Η: H 2 O 2 σε δόση 2 nmol cm

155 Αποτελέσµατα 3. Το H 2 O 2 επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων HUVEC Προκειµένου να µελετηθεί η επίδραση του H 2 O 2 σε λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται µε την αγγειογένεση, µελετήθηκε η επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων HUVEC. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 20.Α, 48 ώρες µετά την επίδρασή του, το H 2 O 2 οδήγησε σε αύξηση του αριθµού των κυττάρων. Επιπρόσθετα, διαπιστώθηκε ότι η επαγωγική δράση του είναι εξαρτώµενη από τη συγκέντρωση, µε το µέγιστο αποτέλεσµα στη συγκέντρωση των 10 µμ (39±8% επαγωγή). Μεγαλύτερες συγκεντρώσεις από 10 µμ ήταν τοξικές για τα κύτταρα (αποτελέσµατα που δεν παρουσιάζονται), σε συµφωνία µε την υπάρχουσα βιβλιογραφία [67]. Το H 2 O 2 στη συγκέντρωση των 10 µμ, αύξησε σηµαντικά (27±6% επαγωγή) τον αριθµό των µεταναστευόντων κυττάρων (Εικόνα 20.Β). 4. Το H 2 O 2 επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC Σε προηγούµενες µελέτες της ερευνητικής µας οµάδας, είχε διαπιστωθεί ότι ο αυξητικός παράγοντας HARP επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων HUVEC [151, 158]. Συγχρόνως, είχε διατυπωθεί η υπόθεση αυτοκρινούς δράσης της HARP στα κύτταρα HUVEC, δεδοµένου ότι ο συγκεκριµένος αυξητικός παράγοντας εκφράζεται και εκκρίνεται από τα ίδια τα κύτταρα [122]. Προκειµένου να διερευνηθεί η πιθανή εµπλοκή της HARP στις κυτταρικές λειτουργίες που επάγονται από το H 2 O 2 (Εικόνα 20), αρχικά, µελετήθηκε η επίδραση του H 2 O 2 στα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό µέσο των κυττάρων HUVEC. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 21, 24 ώρες µετά την προσθήκη του H 2 O 2, τα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP αυξήθηκαν µε τρόπο εξαρτώµενο από τη συγκέντρωση, µε µέγιστη παρατηρούµενη δράση στη συγκέντρωση των 10 µμ (90±28% αύξηση) (Εικόνα 21). 141

156 Αποτελέσµατα A * * Αριθµός κυττάρων (x10 3 ) ,1 0, H 2 O 2 (µμ) B Αριθµός Κυττάρων * Μάρτυρας Η 2 Ο 2 (10 µμ) Εικόνα 20: Επίδραση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων HUVEC. (Α) Τα κύτταρα επωάστηκαν µε διαφορετικές συγκεντρώσεις H 2 O 2 και ο αριθµός τους προσδιορίστηκε µετά από 48 ώρες µε τη µέθοδο ΜΤΤ, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (Β) Η µετανάστευση των κυττάρων εκτιµήθηκε µε σύστηµα χηµειοτακτισµού Transwell: 4 ώρες µετά την προσθήκη του H 2 O 2, εκτιµήθηκε ο αριθµός των µεταναστευόντων κυττάρων όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα του αριθµού των κυττάρων. *P< 0,

157 Αποτελέσµατα A B % Μεταβολή σε σχέση µε το µάρτυρα 225 ** H 2 O 2 (µμ) Εικόνα 21: Επίδραση του H 2 O 2 στα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP που εκκρίνεται από τα κύτταρα HUVEC. (Α) Ανάλυση κατά Western για την πρωτεΐνη HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό µέσο των κυττάρων, 24 ώρες µετά την επίδραση του H 2 O 2, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Αντιπροσωπευτική εικόνα από 3 ανεξάρτητα µεταξύ τους πειράµατα. Στην πρώτη διαδροµή χρησιµοποιήθηκαν 250 ng ανασυνδυασµένης ανθρώπινης HARP βακτηριακής προέλευσης, ως µάρτυρας µοριακού βάρους (18 kda). (Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν µε σύστηµα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της % µεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση µε το µάρτυρα. **P< 0, Το U0126 αναστέλλει την επαγωγική δράση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC Είναι γνωστό ότι το H 2 O 2 επάγει τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών ERK1/2 σε ενδοθηλιακά κύτταρα [340]. Οι κινάσες αυτές θεωρείται ότι διαµεσολαβούν τη µιτογόνο δράση διαφόρων παραγόντων και η φωσφορυλίωσή τους είναι προϊόν της δράσης των κινασών ΜΕΚ1/2. Για να διερευνηθεί η πιθανή εµπλοκή των ERK1/2 στη µιτογόνο δράση του H 2 O 2, χρησιµοποιήθηκε ένας αναστολέας των κινασών ΜΕΚ1/2 (U0126). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 22.Α, το U0126 δεν επηρέασε σηµαντικά τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC σε συγκεντρώσεις µέχρι 0,1 µμ. Εντούτοις, προεπώαση των κυττάρων για 30 λεπτά 143

158 Αποτελέσµατα µε U0126 στη συγκέντρωση των 0,1 µμ, οδήγησε σε αναστολή του επαγόµενου από το H 2 O 2 πολλαπλασιασµού των HUVEC (Εικόνα 22.Β). A Αριθµός κυττάρων (x10 3 ) *** *** , 001 0,01 0, U0126 (µμ) B 45 p<0,05 p<0,05 40 Αριθµός κυττάρων (x10 3 ) M U H U+H Εικόνα 22: Επίδραση του U0126 στον επαγόµενο από το H 2 O 2 πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC. Τα κύτταρα (Α) επωάστηκαν µε διαφορετικές συγκεντρώσεις U0126 ή (Β) προεπωάστηκαν µε U0126, προστέθηκε H 2 O 2 και ο αριθµός τους προσδιορίστηκε µετά από 48 ώρες µε την µέθοδο ΜΤΤ, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Μ: µάρτυρας, U: U0126 σε συγκέντρωση 0,1 µμ, Η: H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 µμ, U+H: U0126 σε συγκέντρωση 0,1 µμ και H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 µμ. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα του αριθµού των κυττάρων. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σηµαντική διαφορά σε σχέση µε το µάρτυρα. ***P< 0,

159 Αποτελέσµατα 6. Το U0126 αναστέλλει την επαγόµενη από το H 2 O 2 έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC Προκειµένου να διερευνηθεί ο µηχανισµός µε τον οποίο το H 2 O 2 επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC, µελετήθηκε η πιθανή συµµετοχή των κινασών ERK1/2 στο συγκεκριµένο µονοπάτι µεταγωγής σήµατος. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 23.Α, 15 λεπτά µετά την επίδραση του H 2 O 2 επάγεται η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών ERK1/2. Το U0126, στη συγκέντρωση των 0,1 µμ, δεν επηρέασε τα επίπεδα της εκκρινόµενης πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC. Εντούτοις, προεπώαση των κυττάρων για 30 λεπτά µε U0126 στη συγκέντρωση των 0,1 µμ, οδήγησε σε αναστολή της επαγόµενης από το H 2 O 2 έκκρισης της πρωτεΐνης HARP (Εικόνα 23.Β και Γ). 7. Η κουρκουµίνη αναστέλλει την επαγωγική δράση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC Η οξειδωτική κατάσταση του κυττάρου επηρεάζει τη δραστηριότητα διαφόρων µεταγραφικών παραγόντων, ανάµεσα στους οποίους ιδιαίτερη θέση κατέχει ο AP- 1 [15]. Ο µεταγραφικός παράγοντας AP-1 εµπλέκεται σε ποικίλες βιολογικές δράσεις, όπως ο πολλαπλασιασµός των κυττάρων [97]. Προκειµένου να διερευνηθεί η πιθανή εµπλοκή του µεταγραφικού παράγοντα AP-1 στoν επαγόµενο από το H 2 O 2 πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC, χρησιµοποιήθηκε η κουρκουµίνη, ένας αναστολέας του µονοπατιού JNK/AP-1 [341]. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 24.Α, η κουρκουµίνη δεν επηρέασε σηµαντικά τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC σε συγκεντρώσεις µέχρι 5 µμ. Εντούτοις, προεπώαση των κυττάρων για 1 ώρα µε κουρκουµίνη στη συγκέντρωση των 5 µμ, οδήγησε σε αναστολή του επαγόµενου από το H 2 O 2 πολλαπλασιασµού των HUVEC (Εικόνα 24.Β). 145

160 Αποτελέσµατα A B Γ % Μεταβολή σε σχέση µε το µάρτυρα p<0,01 p<0,05 M H U U+H Εικόνα 23: Επίδραση του U0126 στην έκκριση της πρωτεΐνης HARP, µετά από διέγερση των κυττάρων HUVEC µε H 2 O 2. (Α) Ανάλυση κατά Western για perk1/2 και ολικές ERK1/2 µετά από επίδραση H 2 O 2. (Β) Ανάλυση κατά Western για την πρωτεΐνη HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό µέσο των κυττάρων, 24 ώρες µετά την επίδραση του H 2 O 2 ή/και U0126, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Αντιπροσωπευτική εικόνα από 4 ανεξάρτητα µεταξύ τους πειράµατα. (Γ) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν µε σύστηµα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της % µεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση µε το µάρτυρα. Μ: µάρτυρας, U: U0126 σε συγκέντρωση 0,1 µμ, Η: H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 µμ, U+H: U0126 σε συγκέντρωση 0,1 µμ και H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 µμ. 146

161 Αποτελέσµατα A 35 Αριθµός κυττάρων (x10 3 ) * *** *** *** Κουρκουµίνη (µμ) B 45 p<0,05 p<0,05 40 Αριθµός κυττάρων (x10 3 ) M K H K+H Εικόνα 24: Επίδραση της κουρκουµίνης στην επαγωγική δράση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων HUVEC. Τα κύτταρα (Α) επωάστηκαν µε διαφορετικές συγκεντρώσεις κουρκουµίνης, ή (Β) προεπωάστηκαν µε κουρκουµίνη, προστέθηκε H 2 O 2 και ο αριθµός τους προσδιορίστηκε µετά από 48 ώρες µε τη µέθοδο ΜΤΤ, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Μ: µάρτυρας, Κ: κουρκουµίνη σε συγκέντρωση 5 µμ, Η: H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 µμ, Κ+Η: κουρκουµίνη σε συγκέντρωση 5 µμ και H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 µμ. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα του αριθµού των κυττάρων. *P< 0,05, ***P< 0,

162 Αποτελέσµατα A.8. Η κουρκουµίνη αναστέλλει την επαγόµενη από το H 2 O 2 έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC εδοµένου ότι προεπώαση των κυττάρων µε κουρκουµίνη οδήγησε σε αναστολή του επαγόµενου από το H 2 O 2 πολλαπλασιασµού των κυττάρων HUVEC, διερευνήθηκε η επίδραση της κουρκουµίνης στην έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα ίδια κύτταρα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 25, η κουρκουµίνη στη συγκέντρωση των 5 µμ, δεν επηρέασε σηµαντικά τα επίπεδα της εκκρινόµενης πρωτεΐνης HARP. Εντούτοις, προεπώαση των κυττάρων για 1 ώρα µε κουρκουµίνη στη συγκέντρωση των 5 µμ, οδήγησε σε αναστολή της επαγόµενης από το H 2 O 2 έκκρισης της πρωτεΐνης HARP (108±28%). A B % Μεταβολή σε σχέση µε το µάρτυρα p<0,01 p<0,05 M H K+H K Εικόνα 25: Επίδραση της κουρκουµίνης στην έκκριση της πρωτεΐνης HARP µετά τη διέγερση των κυττάρων HUVEC από το H 2 O 2. (Α) Ανάλυση κατά Western για την πρωτεΐνη HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό µέσο των κυττάρων, 24 ώρες µετά την επίδραση του H 2 O 2 ή/και κουρκουµίνης, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Αντιπροσωπευτική εικόνα από 4 ανεξάρτητα µεταξύ τους πειράµατα. (Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν µε σύστηµα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της % µεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση µε το µάρτυρα. Μ: µάρτυρας, Η: H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 µμ, Κ+Η: κουρκουµίνη σε συγκέντρωση 5 µμ και H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 µμ, Κ: κουρκουµίνη σε συγκέντρωση 5 µμ. 148

163 Αποτελέσµατα 9. Το H 2 O 2 επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων LNCaP Αρχικά, µελετήθηκε η επίδραση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων LNCaP. Σε συµφωνία µε τα αποτελέσµατα στα κύτταρα HUVEC, παρατηρήθηκε µια επαγωγική, εξαρτώµενη από τη συγκέντρωση δράση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασµό των κυττάρων LNCaP, µε το µέγιστο αποτέλεσµα (72±8% επαγωγή) στη συγκέντρωση των 5 µμ (Εικόνα 26.Α). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 26.Β, το H 2 O 2 στη συγκέντρωση των 5 µμ αύξησε σηµαντικά και τον αριθµό των µεταναστευόντων κυττάρων LNCaP (51±14% επαγωγή). 10. Το H 2 O 2 επάγει την έκφραση και έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα LNCaP Έχοντας ως δεδοµένο ότι το H 2 O 2 επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC, διερευνήθηκε η επίδραση του H 2 O 2 στα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα LNCaP. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 27, 24 ώρες µετά τη διέγερση των κυττάρων µε H 2 O 2 τα επίπεδα της εκκρινόµενης πρωτεΐνης HARP αυξήθηκαν µε τρόπο εξαρτώµενο από τη συγκέντρωση. Η µέγιστη δράση παρατηρήθηκε στη συγκέντρωση των 5 µμ (120±35% επαγωγή). Επιπλέον, διερευνήθηκε το εάν τα αυξηµένα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP σε απόκριση στο H 2 O 2, συσχετίζονται µε αντίστοιχη αύξηση στα επίπεδα του µηνύµατος. Όντως, τα επίπεδα του mrna της HARP παρουσίασαν αύξηση ήδη από τις 3 ώρες, ενώ η αύξηση ήταν µέγιστη (109±36% επαγωγή) 5 ώρες µετά την προσθήκη του H 2 O 2 στο θρεπτικό µέσο των κυττάρων (Εικόνα 28). 149

164 Αποτελέσµατα A Αριθµός κυττάρων (x10 3 ) *** *** ** , H 2 O 2 (µμ) B 1400 * 1200 Αριθµός Κυττάρων Μάρτυρας Η 2 Ο 2 (5 µμ) Εικόνα 26: Επίδραση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασµό και τη µετανάστευση των κυττάρων LNCaP. (Α) Τα κύτταρα επωάστηκαν µε διαφορετικές συγκεντρώσεις H 2 O 2 και ο αριθµός τους προσδιορίστηκε µετά από 48 ώρες µε τη µέθοδο ΜΤΤ, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (Β) Η µετανάστευση των κυττάρων εκτιµήθηκε µε σύστηµα χηµειοτακτισµού Transwell: 20 ώρες µετά την προσθήκη του H 2 O 2, εκτιµήθηκε ο αριθµός των µεταναστευόντων κυττάρων, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα του αριθµού των κυττάρων. *P< 0,05, **P< 0,01, ***P< 0,

165 Αποτελέσµατα A B % Μεταβολή σε σχέση µε το µάρτυρα ** 0 0, H 2 O 2 (µμ) Εικόνα 27: Επίδραση του H 2 O 2 στα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό µέσο των κυττάρων LNCaP. (Α) Ανάλυση κατά Western για την πρωτεΐνη HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό µέσο των κυττάρων, 24 ώρες µετά την επίδραση του H 2 O 2, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Στην πρώτη διαδροµή χρησιµοποιήθηκαν 250 ng ανασυνδυασµένης ανθρώπινης HARP βακτηριακής προέλευσης, ως µάρτυρας µοριακού βάρους (18 kda). Αντιπροσωπευτική εικόνα από 3 ανεξάρτητα µεταξύ τους πειράµατα. (Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν µε σύστηµα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της % µεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση µε το µάρτυρα. **P< 0,

166 Αποτελέσµατα A B % Μεταβολή σε σχέση µε το µάρτυρα ** Χρόνος (ώρες) Εικόνα 28: Επίδραση του H 2 O 2 στα επίπεδα του mrna της HARP στα κύτταρα LNCaP. (Α) Ηλεκτροφορητική ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR για HARP και β-ακτίνη, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η β-ακτίνη χρησιµοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Αντιπροσωπευτική εικόνα από 6 ανεξάρτητα µεταξύ τους πειράµατα. (Β) Τα επίπεδα του mrna της HARP ποσοτικοποιήθηκαν µε σύστηµα ανάλυσης εικόνας και ο λόγος των mrna HARP/β-ακτίνη υπολογίστηκε για κάθε δείγµα. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως µέση τιµή ± σταθερό σφάλµα της % µεταβολής των σχετικών επιπέδων του mrna της HARP στα κύτταρα που επωάστηκαν µε H 2 O 2 σε σχέση µε το µάρτυρα. **P< 0,