ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΣΚΟΥΤΕΛΗ ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΣΚΟΥΤΕΛΗ ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ"

Μακεδνός Δεσποτόπουλος
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΣΚΟΥΤΕΛΗ ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, ΑΘΗΝΑ, 2012

2 ΣΚΟΠΟΣ ΠΡΑΚΤΙΚΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ Προτυποποίηση με ομολογία βακτηριακού ενζύμου. Η προτυποποίηση πρωτεϊνών με ομολογία, βασίζεται στην αναγνώριση μίας ή περισσοτέρων γνωστών πρωτεϊνικών δομών που πιθανόν να μοιάζουν με τη δομή της ακολουθίας προς διερεύνηση. Το μοντέλο δομής που αποδίδεται στην ακολουθία άγνωστης δομής, προέρχεται από ήδη γνωστές δομές (πρότυπα, templates) πρωτεϊνών με υψηλή ομοιότητα (στην ακολουθία), ως προς την ακολουθία άγνωστης δομής (ακολουθία στόχος). Για το σκοπό αυτό δούλεψα στο εργαστήριο Γενετικής του Γ.Π.Α.

3 Εργαστήριο Γενετικής

4 Πεπτιδογλυκάνη Ένα από τα στοιχεία του προστατευτικού τοιχώματος των gram- βακτηρίων. Ένας από τους κύριους στόχους του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή.

5 Πεπτιδογλυκάνη Αναγνώριση συστατικών της από τους NOD1 και NOD2, οι οποίοι κινούν την ανοσολογική απόκριση, με την ενεργοποίηση του NF-kb μονοπατιού. Προκειμένου να αποφύγουν την αναγνώριση, τα βακτήρια έχουν αναπτύξει μηχανισμό χημικής τροποποίησης της πεπτιδογλυκάνης, ειδικότερα μέσω N απακετυλίωσης, με τις απακετυλάσες της πεπτιδογλυκάνης.

6 Απακετυλάσες της πεπτιδογλυκάνης

7 NCBI Εθνικό Κέντρο Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας: τμήμα της εθνικής βιβλιοθήκης της Ιατρικής (NLM), μιας υπηρεσίας του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας (NIH) των ΗΠΑ. Δημιουργία βάσης δεδομένων για ακολουθίες του DNA. Χρήση του για την εύρεση των αμινοξικών ακολουθιών.

8 Απακετυλάσες 1. >gi ref NP_ peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase [Bacillus cereus ATCC 14579] BC >gi ref NP_ peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase [Bacillus cereus ATCC 14579]BC >gi ref NP_ peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase [Bacillus cereus ATCC 14579]BC >gi ref NP_ peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase [Bacillus cereus ATCC 14579]BC >gi ref NP_ peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase [Bacillus cereus ATCC 14579]BC >gi ref NP_ polysaccharide deacetylase [Bacillus cereus ATCC 14579]BC >gi ref NP_ peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase [Bacillus cereus ATCC 14579]BC3146

9 Απακετυλάσες 8. >gi ref NP_ polysaccharide deacetylase [Bacillus anthracis str. Ames]BA >gi ref NP_ polysaccharide deacetylase [Bacillus anthracis str. Ames]BA >gi ref NP_ polysaccharide deacetylase [Bacillus anthracis str. Ames]BA >gi ref NP_ polysaccharide deacetylase [Bacillus anthracis str. Ames]BA >gi ref NP_ polysaccharide deacetylase [Bacillus anthracis str. Ames]BA >gi ref NP_ polysaccharide deacetylase-like protein [Bacillus anthracis str. Ames]BA >gi ref NP_ polysaccharide deacetylase-like protein [Bacillus anthracis str. Ames]BA >2C1G 16. >2W3Z

10 NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool ) Βρίσκει περιοχές με τοπικές ομοιότητες μεταξύ ακολουθιών. Συγκρίνει νουκλεοτιδικές ή πρωτεΐνικές αλληλουχίες, με αλληλουχίες από βάσεις δεδομένων και υπολογίζει τη στατιστική σημαντικότητα των αποτελεσμάτων. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να συναχθούν λειτουργικές και εξελικτικές σχέσεις μεταξύ ακολουθιών καθώς και στον εντοπισμό μελών οικογενειών γονιδίων.

11 NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool ) Χρήση του NCBI BLAST για εύρεση ομόλογων ενζύμων με τα αρχικά.

12 Ομόλογα ένζυμα με τα αρχικά μας 1. 1w1a 2. 1w1b 3. 1w c1g 5. 2c1i 6. 2iw0 7. 2vyo 8. 2w3z 9. 2y8u

13 Ποσοστό ομολογίας Accession number Ομολογία 2c1g 2y8u 37% 2iw0 36% 2w3z 2y8u 36% NP_ y8u 40% 2c1g 39% 2c1i 38% 2iw0 34% NP_ c1g 38% 2c1i 38% 2y8u 33% 2iw0 31% NP_ c1g 37% 2c1i 36% 2y8u 32% 3qbu 30% 2iw0 30% NP_ c1g 35% 2c1i 34% 2y8u 32% NP_ c1g 37% 2c1i 36% 2y8u 32% 2iw0 32%

14 Ποσοστό ομολογίας Accession number Ομολογία NP_ c1g 38% 2c1i 37% 3qbu 30% NP_ y8u 39% 2c1g 39% 2c1i 38% 2iw0 35% 3qbu 33% NP_ c1g 39% 2c1i 38% 2y8u 33% 2iw0 31% NP_ c1g 37% 2c1i 36% 2y8u 31% 3qbu 31% 2iw0 31% NP_ c1g 36% 2c1i 36% 2y8u 32% 2iw0 31% NP_ c1g 37% 2c1i 36%

15 DEEP VIEW Πρόγραμμα, το οποίο κατασκευάστηκε στο Ελβετικό Ινστιτούτο Βιοπληροφορικής και παρέχει ένα φιλικό προς το χρήστη περιβάλλον, το οποίο, Επιτρέπει την ανάλυση πολλών πρωτεϊνών ταυτόχρονα, Δίνεται η δυνατότητα υπέρθεσης μιας πρωτεΐνης πάνω σε άλλη, με σκοπό την πραγματοποίηση δομικών ευθυγραμμίσεων και σύγκρισης των ενεργών τους κέντρων ή άλλων σχετικών τμημάτων, Παρατηρούνται μεταλλάξεις αμινοξέων, δεσμοί υδρογόνου, γωνίες και αποστάσεις μεταξύ των ατόμων, χάρη στο έξυπνο περιβάλλον μενού και γραφικών του προγράμματος.

16 DEEP VIEW Χρήση του για δομική υπέρθεση των ενζύμων αρχικά με την BC1960 ως πρωτεΐνη αναφοράς, χωρίς τους υποκαταστάτες του κάθε ενζύμου.

17 PYMOL Σύστημα μοριακής απεικόνισης. Χρήση του για: δομική υπέρθεση των ενζύμων, με την BC1960 ως πρωτεΐνη αναφοράς, εισάγοντας και τους υποκαταστάτες πλέον, προς διευκόλυνση παρατήρησης του ενεργού κέντρου του κάθε ενζύμου. Παρατήρηση ενεργού κέντρου και των κοντινών σε αυτό, αμινοξέων.

18 Δομική Υπέρθεση των Ενζύμων χωρίς τους Υποκαταστάτες τους

19 Δομική Υπέρθεση των Ενζύμων με τους Υποκαταστάτες τους Εντοπισμός ενεργού κέντρου

20 Αμινοξέα σε απόσταση 6 Å από το ενεργό κέντρο του κάθε ενζύμου BC1960 (262) ASP77 ASP78 HIS128 HIS132 ARG166 PRO167 PRO168 TYR169 GLY170 TRP190 LEU220 HIS222 1W1B (259) ASP73 THR100 HIS124 HIS128 PRO164 PRO165 ARG166 HIS222 1W1A (259) ASP73 HIS124 HIS128 ARG163 PRO164 ARG166 GLY167 TRP187 LEU220 HIS222 1W17 (259) - 2C1G (463) από το ACT1464 ASP275 ASP276 HIS326 HIS330 ARG364 PRO365 PRO366 TYR367 GLY368 TRP385 LEU415 HIS417 από το ZN1467 ASN376 LEU378 ASP379 ALA454 HIS455 από το PEG1468 PRO366 TYR367 GLY368 TRP385 ASP388 TRP392 LEU415 HIS417 1C1I (463) από το MES1464 TYR367 TRP392 HIS417 από το ZN1465 ASN275 ASP276 LEU302 HIS326 HIS330 PRO366 TYR367 HIS417 από το SO ASN275 ASP276 HIS326 HIS330 PRO365 PRO366 TYR367 TRP385 LEU415 HIS417 2IW0 (254) από το ZN1255 ASP49 ASP50 ASN75 ASN78 HIS104 HIS108 ALA143 PRO144 TYR145 HIS206 από το ACT1256 ASP49 ASP50 HIS104 HIS108 ARG142 ALA143 PRO144 TYR145 LEU146 LEU204 HIS206 2VYO (220) από το ZN1224 ASP34 CYS155 TYR157 LEU183 HIS185 2W3Z (311) από το ZN1312 ASP114 ASP115 VAL141 HIS166 HIS170 TYR172 TYR212 PRO213 GLY214 HIS281 από το PO ASP114 ASP115 HIS166 HIS170 TYR172 ARG211 PRO213 GLY214 GLY215 TRP239 LEU279 HIS281 2Y8U (237) από το PO ASP47 ASP48 HIS97 HIS101 ARG135 PRO136 PRO137 TYR138 LEU139 LEU194 HIS196 από το CO1239 ASP47 ASP48 LEU73 HIS97 HIS101 PRO137 TYR138 HIS196

21 Προτυποποίηση πρωτεϊνών Η προτυποποίηση πρωτεϊνών χρησιμοποιεί δομές που έχουν ήδη αναλυθεί, ως σημεία εκκίνησης, ή πρότυπα. Αυτό είναι αποτελεσματικό, επειδή αν και ο αριθμός των πραγματικών πρωτεϊνών είναι τεράστιος, υπάρχει ένας περιορισμένος αριθμός τριτοταγών διαρθρωτικών μοτίβων στο οποίο ανήκουνοι περισσότερες πρωτεΐνες.

22 Προτυποποίηση πρωτεϊνών Έχει προταθεί ότι υπάρχουν μόνο περίπου διαφορετικές πτυχές πρωτεϊνών στη φύση, αν και υπάρχουν πολλά εκατομμύρια διαφορετικών πρωτεϊνών. Οι μέθοδοι για το σκοπό αυτό έχουν χωριστεί σε δύο κατηγορίες, μία εκ των οποίων είναι και η ομόλογη (συγκριτική) προτυποποίηση.

23 EXPASY SWISS MODEL Πλήρως αυτοματοποιημένος διακομιστής μοντελοποίησης ομόλογων πρωτεϊνικών δομών, προσβάσιμος μέσω του ExPASy, ή από το DeepView. Σκοπός: να κάνει την μοντελοποίηση πρωτεϊνών προσβάσιμη σε όλους τους βιοχημικούς και μοριακούς βιολόγους σε όλο τον κόσμο.

24 EXPASY SWISS MODEL Χρήση της αυτοματοποιημένης εκδοχής του για modeling της BC1974, στηριζόμενοι στη δομή της BC1960.

25 BC1974 Παρουσίαση της δομής της BC1974, μέσω του Swiss Model, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο τη δομή της BC1960.

26 Υπέρθεση της BC1974 με βάση τη δομή της BC1960 : BC1960 : BC1974

27 Βιβλιογραφία 1. Baxevanis, A. D. and Ouellette B. F. F. (2001). Bioinformatics and The Internet, in Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Volume 43, Second Edition. Wiley J. & Sons, Inc., New York, USA. 2. Blair, D. E., van Aalten, D.M.F. (2004). Structures of Bacillus subtilis PdaA, a family 4 carbohydrate esterase, and a complex with N-acetyl-glucosamine. FEBS Letters, 570, Blair, D.E., Schüttelkopf, A.W., MacRae, J.I., and van Aalten, D.M.F. (2005). Proc Natl Acad Sci U S A.102(43): Blair, D.E., Hekmat, O., Schüttelkopf, A.W., Shrestha, B., Tokuyasu, K., Withers, S.G. and van Aalten D.M.F. (2006). Structure and Mechanism of Chitin Deacetylase from the Fungal Pathogen Colletotrichum lindemuthianum. Biochemistry, 45 (31), pp Chothia, C. and Lesk, A.M. (1986). The relation between the divergence of sequence and structure in proteins. EMBO J 5: Gopal, S., Schroeder, M., Pieper, U., Sczyrba, A., Aytekin-Kurban, G., Bekiranov, S., Fajardo, J.E., Eswar, N., Sanchez, R., Sali, A., Gaasterland, T. (2001). Homology -based annotation yields 1,042 new candidate genes in the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet 27(3):

28 Βιβλιογραφία 7. Shaik, M.M., Cendron, L., Percudani, R., Ζanotti, G. (2011). The Structure of Helicobacter pylori HP0310 Reveals an Atypical Peptidoglycan Deacetylase. PLoS ONE 6(4): e Sussman, J.L., Lin, D., Jiang, J., Manning, N.O., Prilusky, J., Rittera,O., and Abola, E.E. (1998). Protein Data Bank (PDB): Database of Three-Dimensional Structural Information of Biological Macromolecules. Acta Crystallogr., D. 54, Tsalafouta A., Psylinakis E., Kapetaniou E.G., Kotsifaki D., Deli A., Roidis A., Bouriotis V., and Kokkinidis M. (2008). Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the peptidoglycan N-acetylglucosamine deacetylase BC1960 from Bacillus cereus in the presence of its substrate (GlcNAc)6. Acta Cryst. F64, Zhang, Y. (2008). Progress and challenges in protein structure prediction. Curr Opin Struct Biol 18 (3):

Σχετικά έγγραφα

Βιοπληροφορική. Ενότητα 20: Υπολογιστικός Προσδιορισμός Δομής (2/3), 1 ΔΩ. Τμήμα: Βιοτεχνολογίας Όνομα καθηγητή: Τ. Θηραίου

Βιοπληροφορική. Ενότητα 20: Υπολογιστικός Προσδιορισμός Δομής (2/3), 1 ΔΩ. Τμήμα: Βιοτεχνολογίας Όνομα καθηγητή: Τ. Θηραίου Βιοπληροφορική Ενότητα 20: Υπολογιστικός Προσδιορισμός Δομής (2/3), 1 ΔΩ Τμήμα: Βιοτεχνολογίας Όνομα καθηγητή: Τ. Θηραίου Μαθησιακοί Στόχοι κατανόηση της μεθόδου προτυποποίησης πρωτεϊνών με ομολογία. παρουσίαση