Kεφάλαιο 3: Γενετική ποικιλότητα: Η προέλευση και η ανίχνευσή της Οι άνθρωποι εμφανίζουν έναν αξιοπρόσεκτο βαθμό γενετικής ποικιλότητας (variation).

Transcript

1 Kεφάλαιο 3: Γενετική ποικιλότητα: Η προέλευση και η ανίχνευσή της Οι άνθρωποι εμφανίζουν έναν αξιοπρόσεκτο βαθμό γενετικής ποικιλότητας (variation). Αυτό φαίνεται σε χαρακτήρες όπως το ύψος, η πίεση του αίματος, και το χρώμα του δέρματος. Το φάσμα της γενετικής ποικιλότητας περιλαμβάνει ασθένειες, όπως κυστική ίνωση ή νευροϊνωμάτωση τύπου 1 (βλ. Κεφάλαιο 4). Η επιστήμη της Γενετικής γενικότερα μελετά τη βιολογική ποικιλότητα και της Ιατρικής Γενετικής ειδικότερα μελετά την γενετική ποικιλότητα στον άνθρωπο. Όλη η γενετική ποικιλότητα προέρχεται από τη διαδικασία που είναι γνωστή ως μεταλλαγή, η οποία ορίζεται ως μία αλλαγή στην ακολουθία του DNA. Οι μεταλλαγές μπορούν να έχουν επιπτώσεις είτε στην αναπαραγωγική σειρά (germline) μέσω των γαμετών είτε στα σωματικά κύτταρα (όλα τα άλλα κύτταρα του οργανισμού πλην των γαμετών). Οι μεταλλαγές στα σωματικά κύτταρα μπορούν να οδηγήσουν σε καρκίνο και είναι συνεπώς το ίδιο ανησυχητικές. Εν τούτοις, αυτό το κεφάλαιο επικεντρώνεται κυρίως στις μεταλλαγές της αναπαραγωγικής σειράς, επειδή μπορούν να διαβιβαστούν από τη μία γενεά στην επόμενη. Ως αποτέλεσμα των μεταλλαγών, ένα γονίδιο μπορεί να διαφέρει μεταξύ των ατόμων ως προς την αλληλουχία του DNA του. Οι διαφορετικές αλληλουχίες αναφέρονται ως αλληλόμορφα (alleles). Η θέση ενός γονιδίου σε ένα χρωμόσωμα καλείται γενετικός τόπος (locus). Παραδείγματος χάριν, λέγεται ότι ένα άτομο έχει ένα ορισμένο αλληλόμορφο γονίδιο στη γενετική θέση της β-αιμοσφαιρίνης στο χρωμόσωμα 11. Εάν ένα άτομο έχει το ίδιο αλληλόμορφο γονίδιο και στα δύο μέλη ενός χρωμοσωμικού ζεύγους, ονομάζεται ομοζυγώτης. Εάν τα αλληλόμορφα γονίδια διαφέρουν στην ακολουθία DNA, το άτομο είναι ετεροζυγώτης. Τα αλληλόμορφα γονίδια που είναι παρόντα σε μία δεδομένη γενετική θέση αναφέρονται ως ο γονότυπος του ατόμου. Μερικές γενετικές θέσεις ποικίλλουν σημαντικά μεταξύ των ατόμων. Εάν μία γενετική θέση έχει δύο ή περισσότερα αλληλόμορφα γονίδια των οποίων οι συχνότητες υπερβαίνουν το 1% σε έναν πληθυσμό, η γενετική θέση λέγεται πολυμορφική ("πολλές μορφές"). Η πολυμορφική γενετική θέση καλείται συχνά πολυμορφισμός. Σε αυτό το κεφάλαιο, εξετάζουμε τη μεταλλαγή ως τη πηγή της γενετικής ποικιλότητας. Συζητάμε τους τύπους των μεταλλαγών, τα αίτια και τις συνέπειές τους, καθώς και τις βιοχημικές και μοριακές τεχνικές που χρησιμοποιούνται για να ανιχνεύσουν τη γενετική ποικιλότητα στους ανθρώπινους πληθυσμούς. ΜΕΤΑΛΛΑΓΗ: Η ΠΗΓΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ Τύποι μεταλλαγών Μερικές μεταλλαγές οδηγούν στη μεταβολή του αριθμού ή της δομής των χρωμοσωμάτων ενός κυττάρου. Τέτοιες σημαντικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες μπορούν να παρατηρηθούν μικροσκοπικά και αποτελούν το αντικείμενο του Κεφαλαίου 6. Εδώ, θα εστιάσουμε στις μεταλλαγές που επηρεάζουν μοναδικά γονίδια και δεν είναι αντιληπτές μικροσκοπικά. Το μεγαλύτερο μέρος της συζήτησης αφορά στις μεταλλαγές των κωδικών περιοχών του DNA ή των ρυθμιστικών αλληλουχιών, δεδομένου ότι οι μεταλλαγές που εμφανίζονται σε άλλα μέρη του γονιδιώματος δεν έχουν συνήθως κλινικές συνέπειες. Ένας σημαντικός τύπος μονογονιδιακής μεταλλαγής (single-gene mutation) είναι η αντικατάσταση ζεύγους-βάσεων, στην οποία ένα ζευγάρι βάσεων αντικαθίσταται από άλλo*. (*στη μοριακή γενετική, οι αντικαταστάσεις βάσεων 1

2 ονομάζονται σημειακές μεταλλαγές (point mutations). Στη κλασική γενετική ο όρος αυτός υποδηλώνει κάθε μικροσκοπικά ανιχνεύσιμη μεταλλαγή). Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε μια αλλαγή στην αμινοξική αλληλουχία. Εν τούτοις, λόγω του εκφυλισμού του γενετικού κώδικα, πολλές από αυτές τις μεταλλαγές δεν αλλάζουν την αλληλουχία αμινοξέος και έτσι δεν έχουν καμία συνέπεια. Τέτοιες μεταλλαγές καλούνται σιωπηλές αντικαταστάσεις (silent substitutions). Οι μη σιωπηλές (Nonsilent) αντικαταστάσεις ζεύγους βάσεων περιλαμβάνουν δύο βασικούς τύπους: παρερμηνεύσιμες (missense) μεταλλαγές, που παράγουν μία αλλαγή σε ένα μοναδικό αμινοξύ, και ανερμηνεύσιμες (nonsense) μεταλλαγές, οι οποίες παράγουν ένα από τα τρία κωδικόνια λήξης (UAA, UAG, ή UGA) στο mrna (Eικόνα 3-1). Επειδή τα κωδικόνια λήξης σταματούν τη περαιτέρω μετάφραση του mrna, οι ανερμηνεύσιμες μεταλλαγές οδηγούν σε πρόωρη διακοπή της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Αντιθέτως, εάν ένα κωδικόνιο λήξης αλλάξει έτσι ώστε να κωδικοποιεί ένα αμινοξύ, παράγεται ένα ανώμαλα επιμηκυμένο πολυπεπτίδιο. Οι αλλαγές των αμινοξικών αλληλουχιών μπορούν να έχουν μεγάλες συνέπειες και πολλές από τις σοβαρές γενετικές ασθένειες που θα συζητηθούν είναι το αποτέλεσμα τέτοιων αλλαγών. Εικόνα 3.1. Αντικατάσταση ζεύγους βάσεων. Οι μεταλλαγές missense (A) παράγουν μία μοναδική αμινοξική μεταβολή, ενώ οι μεταλλαγές nonsense (B) παράγουν κωδικό λήξης στο mrna. Οι κωδικοί λήξης σταματούν τη μετάφραση του πολυπεπτιδίου. Ένας δεύτερος σημαντικός τύπος μεταλλαγής αποτελείται από ελλείψεις, (deletions) ή ενθέσεις (insertions), ενός ή περισσότερων ζευγών βάσεων. Αυτές οι μεταλλαγές, που μπορούν να οδηγήσουν σε προσθήκη ή έλλειψη αμινοξέων μιας πρωτεϊνης, είναι συχνά καταστροφικές (detrimental). Ένα παράδειγμα μιας τέτοιας μεταλλαγής είναι η έλλειψη 3-ζβ που προκαλεί τις περισσότερες περιπτώσεις της κυστικής ίνωσης που απαντούν στους Ευρωπαίους (βλ. Κεφάλαιο 4). Οι ελλείψεις και οι ενθέσεις τείνουν να είναι ιδιαίτερα επιβλαβείς όταν ο αριθμός των απόντων ή πρόσθετων ζευγαριών βάσεων δεν είναι πολλαπλάσιος του τρία. Επειδή τα κωδικόνια αποτελούνται 2

3 από ομάδες τριών ζευγών βάσεων, τέτοιες ενθέσεις ή ελλείψεις μπορούν να αλλάξουν όλα τα κωδικόνια που ακολουθούν. Αυτό καλείται μια μεταλλαγή μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης (frameshift mutation) (Εικόνα 3-2). Παραδείγματος χάριν, η ένθεση μίας μόνο βάσης (μίας Α στο δεύτερο κωδικό) θα μετέτρεπε μια ακολουθία DNA που διαβάζεται ως 5'- ACT GAA TTG CGT-3 σε 5'-ACT GAA TTG CGT-3. Αυτό θα άλλαζε την ακολουθία αμινοξέος από Thr-Asp-Cys-Val σε Thr-Glu-Leu-Arg. Συχνά, μια μεταλλαγή μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης παράγει κωδικόνιο λήξης μετά την ένθεση ή την έλλειψη, με συνέπεια να δημιουργηθεί ένα ατελές πολυπεπτίδιο. Εικόνα 3.2. Οι μεταλλαγές μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης προκύπτουν από την ένθεση ή την έλλειψη αριθμού βάσεων που δεν είναι πολλαπλάσιος του τρία. Αυτό αλλάζει όλα τα κωδικόνια που ακολουθούν μετά την περιοχή ένθεσης ή έλλειψης. Σε μεγαλύτερη κλίμακα, διπλασιασμοί ολόκληρων γονιδίων μπορούν να οδηγήσουν επίσης σε γενετική ασθένεια, όπως στην ασθένεια Charcot-Marie- Tooth. Αυτή η διαταραχή, που ονομάζεται από τους τρεις παθολόγους που την περιέγραψαν πριν από έναν αιώνα περίπου, είναι μια ασθένεια του περιφερικού νευρικού συστήματος που οδηγεί στην προοδευτική ατροφία των άπω μυϊκών άκρων. Προσβάλλει περίπου το 1 στα άτομα και απαντά με διαφορετικές μορφές. Περίπου 70% των ασθενών που έχουν την ποιο κοινή μορφή (τύπου 1) εμφανίζουν ένα διπλασιασμό 1,5 εκατομμύριου ζβ σε ένα αντίγραφο του χρωμοσώματος 17. Κατά συνέπεια, έχουν τρία, αντί δύο, αντίγραφα των γονιδίων που βρίσκονται σε αυτήν την περιοχή. Ένα από αυτά τα γονίδια, PMP22, κωδικοποιεί μία περιφερική πρωτεϊνη μυελίνης (myelin). Η αυξανόμενη δόση του γονιδιακού προϊόντος συμβάλλει με κάποιο τρόπο στην απομυελίνωση (demyelination) που είναι χαρακτηριστικό αυτής της μορφής της διαταραχής. Κατά ενδιαφέροντα τρόπο, μία έλλειψη (deletion) αυτής της περιοχής παράγει μία ευδιάκριτη ασθένεια, κληρονομική νευροπάθεια, που 3

4 προκαλεί παραλύσεις πίεσης (pressure palsies, paralysis). Επειδή είτε μία μείωση (κατά 50%) είτε μία αύξηση (κατά 150%) στο προϊόν του γονιδίου προκαλεί ασθένεια, το γονίδιο αυτό λέγεται ότι εμφανίζει ευαισθησία δόσης. Οι σημειακές μεταλλαγές στο ίδιο το γονίδιο PMP22 μπορούν να προκαλέσουν επίσης μία άλλη ασθένεια, το σύνδρομο Dejerine-Sottas (που χαρακτηρίζεται από αδυναμία των άπω μυϊκών άκρων, αλλαγές αισθητηρίων, μυϊκή ατροφία, και διευρυμένες νωτιαίες ρίζες νεύρων). Άλλοι τύποι μεταλλαγών μπορούν να αλλάξουν τη ρύθμιση της μεταγραφής ή της μετάφρασης. Μια μεταλλαγή στην περιοχή του υποκινητή μπορεί να μειώσει τη συγγένεια πρόσδεσης της RNA πολυμεράσης, με συνέπεια τη μειωμένη παραγωγή mrna. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η μειωμένη παραγωγή μιας πρωτεΐνης. Οι μεταλλαγές στις θέσεις πρόσδεσης των μεταγραφικών παραγόντων ή σε ενισχυτικές ακολουθίες γονιδίων μπορεί να έχουν παρόμοια αποτελέσματα. Οι μεταλλαγές μπορούν επίσης να παρεμποδίσουν το μάτισμα των εσονίων κατά την ωρίμανση του mrna από το νεομεταγραφόμενο αντίγραφο mrna. Μεταλλαγές στα σημεία ματίσματος (splice site mutations), που εμφανίζονται στα όρια εσονίων-εξονίων, αλλάζουν το σήμα που είναι απαραίτητο για την κατάλληλη αποκοπή ενός εσονίου. Οι μεταλλαγές στα σημεία ματίσματος μπορούν να εμφανιστούν στην ακολουθία GT που καθορίζει πάντα τη 5 θέση ματίσματος (τη θέση δότη, donor site) ή στην ακολουθία ΑG που καθορίζει τη 3 θέση (η περιοχή δέκτη, acceptor site). Μπορούν επίσης να πραγματοποιηθούν μεταλλαγές σε θέσεις που βρίσκονται κοντά στις περιοχές δότη και δέκτη. Όταν εμφανίζονται τέτοιες μεταλλαγές, η αποκοπή γίνεται συχνά μέσα στο επόμενο εξόνιο, σε θέση ματίσματος που βρίσκεται στο εξόνιο. Αυτές οι θέσεις ματίσματος, των οποίων οι ακολουθίες DNA διαφέρουν ελαφρώς από εκείνες των κανονικών θέσεων ματίσματος, είναι συνήθως αχρησιμοποίητες και "κρυμμένες" μέσα στο εξόνιο. Καλούνται έτσι κρυφές θέσεις ματίσματος (cryptic splice sites). Η χρήση μιας κρυφής θέσης ματίσματος οδηγεί σε μερική ή σε άλλες περιπτώσεις, σε ολική έλλειψη ενός εξονίου. Όπως δείχνει η Εικόνα 3-3, οι μεταλλαγές σε θέσεις ματίσματος μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε ανώμαλη εισαγωγή μέρους ή ολόκληρου εσονίου στο ώριμο mrna. Τέλος, μια μεταλλαγή μπορεί να εμφανιστεί σε κρυφή θέση ματίσματος, μεταβάλλοντάς τη σε κανονική θέση ματίσματος και έτσι να ανταγωνιστεί με την κανονική θέση ματίσματος. ιάφοροι τύποι ακολουθιών DNA είναι σε θέση να παράγουν πολλαπλά αντίγραφα του εαυτού τους, τα δε αντίγραφα αυτά παρεμβάλλονται έπειτα σε άλλες θέσεις στα χρωμοσώματα (παράδειγμα οι επαναλήψεις LINE και Alu, που αναφέρθηκαν στο Κεφάλαιο 2). Τέτοιες ενθέσεις μπορούν να προκαλέσουν τις μεταλλαγές μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης. Μέχρι σήμερα, δεν ήταν σαφές εάν αυτό το φαινόμενο, που έχει τεκμηριωθεί καλά στα πειραματόζωα όπως η ροσόφιλα, εκδηλώνεται στον άνθρωπο. Η ένθεση κινητών στοιχείων (mobile elements) έχει αποδειχθεί ότι προκαλεί μεμονωμένες περιπτώσεις νευροϊνωμάτωσης τύπου 1, μυϊκής δυστροφίας Duchenne, β-θαλασσαιμίας, οικογενούς καρκίνου του μαστού, οικογενούς πολύποδα (polyposis) (καρκίνος κόλου, παχέος εντέρου, colon cancer), και αιμορροφιλίας Α και B (διαταραχές πήξης του αίματος) στον άνθρωπο. Ο τελικός τύπος μεταλλαγής που εξετάζεται εδώ προσβάλλει τις διαδοχικά επαναλαμβανόμενες ακολουθίες DNA (βλ. Κεφάλαιο 2) που εμφανίζονται εντός ή πλησίον ορισμένων γονιδίων συνδεόμενων με κάποια ασθένεια. Οι 4

5 μονάδες επανάληψης έχουν συνήθως μήκος 3ζβ, έτσι ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα θα ήταν CAGCAGCAG. Ένα κανονικό άτομο έχει έναν σχετικά μικρό αριθμό (π.χ., 20 έως 30) από αυτές τις διαδοχικές επαναλήψεις σε μια συγκεκριμένη χρωμοσωμική θέση. Περιστασιακά, ο αριθμός επαναλήψεων αυξάνεται εντυπωσιακά κατά τη διάρκεια της μείωσης ή ενδεχομένως κατά την αρχή της εμβρυϊκής ανάπτυξης, έτσι ώστε ένα νεογέννητο μπορεί να έχει εκατοντάδες ή ακόμα και χιλιάδες επαναλήψεις. Όταν αυτό συμβεί σε ορισμένες περιοχές του γονιδιώματος, προκαλεί γενετική ασθένεια. Eik;ona 3.3 Α, κανονικό μάτισμα. Β, μεταλλαγή θέσης ματίσματος. Η ακολουθία δότη, GT, αντικαθίσταται με ΑΤ. Αυτό οδηγεί σε ανακριβές μάτισμα που αφήνει μέρος του εσονίου στο ώριμο αντίγραφο mrna. Σε ένα άλλο παράδειγμα της μεταλλαγής σε θέση ματίσματος (C), μια δεύτερη θέση δότη GT δημιουργείται μέσα στο πρώτο εσόνιο, με συνέπεια έναν συνδυασμό ανώμαλων και κανονικά ματισμένων προϊόντων mrna. Όπως άλλες μεταλλαγές, αυτές οι επεκτεινόμενες επαναλήψεις (expanded repeats) μπορούν να διαβιβαστούν στον απόγονο του ασθενή. Περισσότερες 5

6 από δώδεκα γενετικές ασθένειες είναι πλέον γνωστό ότι προκαλούνται από επεκτεινόμενες επαναλήψεις (expanded repeats) (βλ. Κεφάλαιο 4). Οι μεταλλαγές είναι η βάση και αφετηρία της γενετικής ποικιλότητας. Μερικές μεταλλαγές οδηγούν σε γενετική ασθένεια, αλλά άλλες δεν έχουν κανένα φυσικό αποτέλεσμα. Οι κύριοι τύποι μεταλλαγών είναι οι παρερμηνεύσιμες (missense), οι ανερμηνεύσιμες (nonsense), η μετατόπιση του πλαισίου ανάγνωσης (frameshift), μεταλλαγές στην περιοχή του υποκινητή (promoter), και μεταλλαγές στις θέσεις ματίσματος (splice site mutations). Οι μεταλλαγές μπορούν επίσης να προκληθούν από την τυχαία εισαγωγή κινητών στοιχείων, και μερικές γενετικές ασθένειες προκαλούνται από επεκτεινόμενες επαναλήψεις (expanded repeats). Μοριακές συνέπειες της μεταλλαγής Είναι χρήσιμο να σκεφτεί κανείς τις μεταλλαγές όσον αφορά τις επιπτώσεις τους στο πρωτεϊνικό προϊόν. Μιλώντας γενικά, οι μεταλλαγές μπορούν να παράγουν είτε αυξημένη λειτουργικότητα (gain of function) είτε μειωμένη λειτουργικότητα (loss of function) του πρωτεϊνικού προϊόντος. Οι μεταλλαγές που οδηγούν σε μειωμένη λειτουργικότητα του πρωτεϊνικού προϊόντος οδηγούν περιστασιακά σε ένα απολύτως νέο πρωτεϊνικό προϊόν. Συχνότερα, οδηγούν στην υπερέκφραση του προϊόντος ή σε ακατάλληλη έκφρασή του (δηλ., σε λανθασμένο ιστό ή σε λανθασμένο στάδιο ανάπτυξης). Οι μεταλλαγές που οδηγούν σε αυξημένη λειτουργικότητα του πρωτεϊνικού προϊόντος παράγουν επικρατείς διαταραχές*. [(*οι όροι επικρατές (dominant) και υπολειπόμενο (recessive) αναφέρονται διεξοδικότερα στο Κεφ. 4. Εν συντομία, επικρατής ασθένεια προκαλείται από ένα μοναδικό αντίγραφο μίας μεταλλαγής (πχ. νοσούν οι ετεροζυγώτες), ενώ μία υπολειπομένη ασθένεια απαιτεί την ύπαρξη και των δύο μεταλλαγμένων αλληλομόρφων (πχ. μόνο οι ομοζυγώτες νοσούν)]. Η ασθένεια Charcot- Marie-Tooth, που αναφέρθηκε προηγουμένως, μπορεί να προκύψει από την υπερέκφραση του πρωτεϊνικού προϊόντος και θεωρείται μεταλλαγή που προκαλεί αυξημένη λειτουργικότητα του πρωτεϊνικού προϊόντος. Η ασθένεια Huntington, που συζητείται στο κεφάλαιο 4, είναι ένα άλλο παράδειγμα. Οι μεταλλαγές που οδηγούν σε μειωμένη λειτουργικότητα παρατηρούνται συχνά σε υπολειπόμενες ασθένειες. Σε τέτοιες ασθένειες, η μεταλλαγή οδηγεί στην απώλεια του 50% του πρωτεϊνικού προϊόντος (π.χ. ένα μεταβολικό ένζυμο), αλλά το 50% που παραμένει είναι ικανοποιητικό για την κανονική λειτουργία. Ο ετεροζυγώτης είναι έτσι απρόσβλητος, αλλά ο ομοζυγώτης επηρεάζεται. Σε μερικές περιπτώσεις, εντούτοις, το 50% του πρωτεϊνικού προϊόντος του γονιδίου δεν επαρκεί για την κανονική λειτουργία (haploinsufficiency, απλοανεπάρκεια), και μπορεί να προκύψει μια επικρατής διαταραχή. Η απλοανεπάρκεια παρατηρείται, παραδείγματος χάριν, στην αυτοσωμική επικρατή διαταραχή γνωστή ως οικογενή υπερχοληστερολαιμία (familial hypercholesterolemia) (βλ. Κεφάλαιο 12). Σε αυτήν την ασθένεια, ένα μοναδικό μεταλλαγμένο αντίγραφο (heterozygosity, ετεροζυγωτία) μειώνει τον αριθμό των υποδοχέων λιποπρωτεϊνης χαμηλής πυκνότητας (LDL) κατά 50%. Τα επίπεδα χοληστερόλης στους ετεροζυγώτες είναι περίπου διπλάσια σε σχέση με εκείνα των κανονικών ομοζυγωτών, οδηγώντας σε μια ουσιαστική αύξηση του κινδύνου για καρδιακές παθήσεις. Όπως με τις περισσότερες διαταραχές που περιλαμβάνουν απλοανεπάρκεια (haploinsufficiency), η ασθένεια είναι σοβαρότερη στους προσβεβλημένους ομοζυγώτες (που έχουν λίγους ή καθόλου λειτουργικούς υποδοχείς LDL) απ' ότι στους ετεροζυγώτες. Τόσο η απλοανεπάρκεια όσο και οι μεταλλαγές που οδηγούν σε μειωμένη λειτουργικότητα του πρωτεϊνικού προϊόντος είναι παραδείγματα της ευαισθησίας δόσης, που προαναφέρθηκαν. Μια επικρατής αρνητική μεταλλαγή οδηγεί σε ένα πρωτεϊνικό προϊόν που είναι όχι μόνο μη λειτουργικό αλλά και εμποδίζει τη λειτουργία της πρωτεϊνης 6

7 που παράγεται από το κανονικό αλληλόμορφο γονίδιο στον ετεροζυγώτη. Χαρακτηριστικά, οι επικρατείς αρνητικές μεταλλαγές παρατηρούνται σε γονίδια που κωδικοποιούν πολυμερείς πρωτεΐνες (δηλ. πρωτεΐνες που αποτελούνται από δύο ή περισσότερες υπομονάδες). Το κολλαγόνο τύπου Ι (βλ. Κεφάλαιο 2), που αποτελείται από τρεις ελικοειδείς υπομονάδες, είναι ένα παράδειγμα μιας τέτοιας πρωτεϊνης. Μία ανώμαλη έλικα που δημιουργείται από μια μοναδική μεταλλαγή μπορεί να συνδυαστεί με τις άλλες έλικες, παραμορφώνοντάς τις και παράγοντας μια σοβαρά συμβιβασμένη τριπλά ελικωμένη πρωτεΐνη. Οι μεταλλαγές μπορούν να οδηγήσουν είτε σε πρωτεϊνικό προϊόν αυξημένης ή μειωμένης λειτουργικότητας. Οι μεταλλαγές που οδηγούν σε πρωτεϊνικό προϊόν αυξημένης λειτουργικότητας παρουσιάζονται μερικές φορές στις επικρατείς ασθένειες. Η μειωμένη λειτουργικότητα φαίνεται (1) στις υπολειπόμενες ασθένειες (2) στις ασθένειες που αφορούν απλοανεπάρκεια (haploinsufficiency), όπου το 50% του γονιδιακού προϊόντος είναι ανεπαρκές για την κανονική λειτουργία και (3) σε επικρατείς αρνητικές μεταλλαγές, στις οποίες το ανώμαλο πρωτεϊνικό προϊόν παρεμβάλλεται με το κανονικό πρωτεϊνικό προϊόν. Κλινικές συνέπειες της μεταλλαγής: διαταραχές αιμοσφαιρίνης Οι γενετικές διαταραχές της ανθρώπινης αιμοσφαιρίνης είναι η πιο κοινή ομάδα μονογονιδιακών ασθενειών: εκτιμάται ότι το 7% του παγκόσμιου πληθυσμού φέρει μία ή περισσότερες μεταλλαγές των γονιδίων που συμμετέχουν στη σύνθεση της αιμοσφαιρίνης. Επειδή όλοι σχεδόν οι τύποι μεταλλαγών που περιγράφηκαν σε αυτό το κεφάλαιο έχουν παρατηρηθεί στις διαταραχές της αιμοσφαιρίνης, οι διαταραχές αυτές θα χρησιμεύσουν ως μια σημαντική απεικόνιση των κλινικών συνεπειών της μεταλλαγής. Το μόριο της αιμοσφαιρίνης είναι τετραμερές και αποτελείται από τέσσερεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, δύο α και δύο β. Οι β αλυσίδες κωδικοποιούνται από ένα γονίδιο στο χρωμόσωμα 11, και οι α από δύο γονίδια στο χρωμόσωμα 16 που είναι πολύ παρόμοια μεταξύ τους. Ένα κανονικό άτομο έχει συνεπώς δύο κανονικά β γονίδια και τέσσερα κανονικά α γονίδια (Εικόνα 3-4). Συνήθως, η αυστηρή ρύθμιση των γονιδίων αυτών εξασφαλίζει ισοζυγισμένη παραγωγή α και β αλυσίδων. Κάθε μια από αυτές τις σφαιρινικές (globin) αλυσίδες συνδέεται με μία ομάδα αίμης (heme), η οποία περιέχει ένα άτομο σιδήρου και δεσμεύει οξυγόνο. Αυτή η ιδιότητα επιτρέπει στην αιμοσφαιρίνη να εκτελεί τη ζωτικής σημασίας λειτουργία της μεταφοράς του οξυγόνου στα ερυθροκύτταρα. Οι διαταραχές της αιμοσφαιρίνης μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες: δομικές ανωμαλίες, που μεταβάλλουν το μόριο της αιμοσφαιρίνης, και θαλασσαιμίες (thalassemias), μια ομάδα καταστάσεων στην οποία είτε η α είτε η β αλυσίδα σφαιρίνης είναι μεν δομικά κανονική αλλά μειωμένη σε ποσότητα. Ένας άλλος όρος, κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HPFH), συμβαίνει όταν η εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη, που κωδικοποιείται από τα γονίδια α - σφαιρίνης και από δύο γονίδια τύπου β σφαιρίνης καλούμενα Α γ και το G γ (βλ. Εικόνα 3-4), συνεχίζει να παράγεται μετά από τη γέννηση (κανονικά, με τη γέννηση, παύει η παραγωγή γ - αλύσων και αρχίζει η παραγωγή β-αλύσων). Η HPFH (hereditary persistence of fetal hemoglobin) δεν προκαλεί ασθένεια αλλά αντίθετα μπορεί να εξισορροπήσει μία έλλειψη κανονικής αιμοσφαιρίνης στον ενήλικα. Έχει προσδιοριστεί μία μεγάλη σειρά διαφορετικών διαταραχών αιμοσφαιρίνης. Η συζήτηση που ακολουθεί είναι μία πολύ απλουστευμένη παρουσίαση των σημαντικότερων μορφών αυτών των διαταραχών. 7

8 Σχήμα 3.4 Η γονιδιακή ομάδα της α - σφαιρίνης στο χρωμόσωμα 16 και της β - σφαιρίνης στο χρωμόσωμα 11. Η ομάδα β - σφαιρίνης περιλαμβάνει το γονίδιο ε - σφαιρίνης, που κωδικοποιεί εμβρυονική σφαιρίνη, και τα γονίδια γ - σφαιρίνης, που κωδικοποιούν εμβρυϊκή σφαιρίνη. Το γονίδιο ψβ δεν εκφράζεται. Η γονιδιακή ομάδα α - σφαιρίνης περιλαμβάνει το γονίδιο ζ - σφαιρίνης, που κωδικοποιεί εμβρυονική α - σφαιρίνη. Οι διαταραχές της αιμοσφαιρίνης, οι μεταλλαγές που τις προκαλούν, και τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά τους γνωρίσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 3-1. Πινάκας 3-1. Περίληψη των σημαντικότερων διαταραχών της αιμοσφαιρίνης Ασθένεια ρεπανοκυτταρική ασθένεια HbH ασθένεια Εμβρυϊκός ύδρωπας (Hb Barts) β 0 - θαλασσαιμία β + - θαλασσαιμία Τύπος μεταλλαγής παρερμηνεύσιμη μεταλλαγή β- σφαιρίνης Έλλειψη ή διαταραχή των τριών από τα τέσσερα γονίδια α- σφαιρίνης Έλλειψη ή διαταραχή και των τεσσάρων γονιδίων της α- σφαιρίνης Χαρακτηριστικά γνωρίσματα της ασθένειας Αναιμία, εμφράγματα ιστού, μολύνσεις Μέτριας βαρύτητας αναιμία, σπληνομεγαλία Σοβαρή αναιμία ή υποξυαιμία (hypoxemia), συμφορητική (congestive) καρδιακή ανεπάρκεια, θνησιγένεια κατά τη γέννηση (stillbirth) ή νεογνικός θάνατος Συνήθως ανερμηνεύσιμη, Σοβαρή αναιμία, σπληνομεγαλία, μετατόπιση πλαισίου ανάγνωσης, ή σκελετικές ανωμαλίες, μολύνσεις μεταλλαγές στις θέσεις δότη ή συχνά μοιραίος κατά τη διάρκεια της δέκτη ματίσματος, δεν παράγεται β- πρώτης δεκαετίας εάν δεν σφαιρίνη αντιμετωπισθεί Συνήθως παρερμηνεύσιμες, ρυθμιστικές, συναινετικής ή σε κρυφές θέσεις ματίσματος μεταλλαγές, παραγωγή μικρών ποσοτήτων β-σφαιρίνης Χαρακτηριστικά γνωρίσματα παρόμοια με εκείνα της β 0 - θαλασσαιμίας αλλά συχνά κάπως ηπιότερα ΡΕΠΑΝΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΑΣΘΕΝΕΙΑ (SICKLE CELL DISEASE) Η σημαντικότερη από τις δομικές ανωμαλίες της αιμοσφαιρίνης είναι η δρεπανοκυτταρική ασθένεια, μία διαταραχή που προσβάλλει 1 περίπου άτομο ανά 400 με 600 γεννήσεις Αφρο-Αμερικανών. Είναι ακόμα συχνότερη σε μέρη της Αφρικής, όπου μπορεί να ανέλθει μέχρι και σε 1 πάσχοντα ανά 50 γεννήσεις, και παρατηρείται επίσης περιστασιακά στους Μεσογειακούς και Μεσανατολικούς πληθυσμούς. Η δρεπανοκυτταρική ασθένεια προκαλείται από μία μοναδική παρερμηνεύσιμη μεταλλαγή που επιφέρει αντικατάσταση 8

9 Εικόνα 3.5. Τα ερυθροκύτταρα των ασθενών με δρεπανοκυτταρική ασθένεια αποκτούν ένα χαρακτηριστικό σχήμα κάτω από συνθήκες χαμηλής τάσης οξυγόνου (A), Σύγκριση με κανονικά ερυθροκύτταρα (B). της βαλίνης με γλουταμινικό οξύ στη θέση 6 της β πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Σε ομόζυγη μορφή, αυτή η αντικατάσταση αμινοξέος αλλάζει τα χαρακτηριστικά του μορίου της αιμοσφαιρίνης έτσι ώστε τα ερυθροκύτταρα αποκτούν μία χαρακτηριστική μορφή "δρεπανιών" κάτω από συνθήκες χαμηλής τάσης οξυγόνου (Εικόνα 3-5Α). Αυτές οι συνθήκες απαντούν στα τριχοειδή αγγεία, η διάμετρος των οποίων είναι μικρότερη από αυτή του ερυθροκυττάρου. Τα κανονικά ερυθροκύτταρα (βλ. Εικόνα 3-5B) μπορεί να συμπιεστούν μέσω των τριχοειδών αγγείων, αλλά τα δρεπανοκύτταρα είναι λιγότερο εύκαμπτα και δεν μπορούν να διέλθουν μέσω των τριχοειδών αφού συμπιεστούν. Επιπλέον, τα ανώμαλα ερυθροκύτταρα τείνουν να κολλήσουν στο αγγειακό ενδοθήλιο (την εσωτερική επένδυση των αιμοφόρων αγγείων). Η επακόλουθη αγγειακή παρεμπόδιση παράγει τοπικά υποξυαιμία (hypoxemia) (έλλειψη οξυγόνου), επίπονες "κρίσεις" δρεπάνωσης και αποφράξεις σε διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των οστών, της σπλήνας, των νεφρών και των πνευμόνων (απόφραξη είναι ο ιστικός θάνατος λόγω υποξυαιμίας). Η πρόωρη καταστροφή των δρεπανοκυττάρων μειώνει τον αριθμό των ερυθροκυττάρων στη κυκλοφορία και το επίπεδο αιμοσφαιρίνης, προκαλώντας αναιμία. Ο σπλήνας διευρύνεται (σπληνομεγαλία), αλλά οι αποφράξεις καταστρέφουν τελικά αυτό το όργανο, παράγοντας κάποια απώλεια ανοσιακής λειτουργίας. Αυτό συμβάλλει σε επίμονα επανεμφανιζόμενες βακτηριακές μολύνσεις (ιδιαίτερα στη πνευμονία) που εμφανίζουν συνήθως άτομα με δρεπανοκυτταρική ασθένεια και τους προκαλεί συχνά το θάνατο. Στη Βόρεια Αμερική, υπολογίζεται ότι το προσδόκιμο ζωής των ατόμων με δρεπανοκυτταρική ασθένεια μειώνεται κατά 30 περίπου έτη. Η δρεπανοκυτταρική ασθένεια, που προκαλεί αναιμία, ιστικά εμφράγματα, και πολλαπλές μολύνσεις, είναι το αποτέλεσμα μιας μόνο παρερμηνεύσιμης μεταλλαγής που παράγει μια αντικατάσταση ενός αμινοξέος στη β αλυσίδα της αιμοσφαιρίνης. 9

10 ΘΑΛΑΣΣΑΙΜΙΑ Ο όρος θαλασσαιμία προέρχεται από την ελληνική λέξη θάλασσα, για να υποδηλώσει ότι πρωτοπεριγράφηκε στους πληθυσμούς που ζουν κοντά στη Μεσόγειο, αν και είναι επίσης κοινή σε μέρη της Αφρικής, της Μέσης Ανατολής, της Ινδίας και της Νοτιοανατολικής Ασίας. Η θαλασσαιμία μπορεί να διαιρεθεί σε δύο κύριες ομάδες, την α - θαλασσαιμία και την β - θαλασσαιμία, ανάλογα με την αλυσίδα σφαιρίνης που μειώνεται σε ποσότητα. Όταν ένας τύπος αλυσίδας μειώνεται σε αριθμό, ο άλλος τύπος αλυσίδας, αδυνατεί να συμμετάσχει στον σχηματισμό κανονικού τετραμερούς, τείνει να σχηματίσει μόρια που αποτελούνται από τέσσερεις αλυσίδες του πλεονάζοντος τύπου μόνο (που ονομάζονται ομοτετραμερή, σε αντίθεση με τα ετεροτετραμερή που σχηματίζονται κανονικά από α και β αλυσίδες). Στην α - θαλασσαιμία, οι αλυσίδες α - σφαιρίνης είναι ανεπαρκείς, έτσι ώστε οι β αλυσίδες (ή οι γ αλυσίδες στο έμβρυο) να βρίσκονται σε πλεόνασμα. Σχηματίζουν ομοτετραμερή που έχουν σημαντικά μειωμένη συγγένεια δέσμευσης οξυγόνου, οδηγώντας σε υποξυαιμία. Στη β - θαλασσαιμία, το πλεόνασμα των α - αλύσων σχηματίζει ομοτετραμερή που καθιζάνουν και βλάπτουν τις μεμβράνες των προδρόμων ερυθροκυττάρων. Αυτό οδηγεί στην πρόωρη καταστροφή των ερυθροκυττάρων και την αναιμία. Οι περισσότερες περιπτώσεις α θαλασσαιμίας οφείλονται σε ελλείψεις των γονιδίων της α-σφαιρίνης. Η έλλειψη ενός ή δύο από αυτά τα γονίδια δεν έχει καμία κλινική επίδραση. Η έλλειψη ή η διαταραχή τριών α γονιδίων προκαλεί μετρίως σοβαρή αναιμία και σπληνομεγαλία (ασθένεια HbH). Η απώλεια και των τεσσάρων α γονιδίων, μία κατάσταση που εμφανίζουν κυρίως οι Νοτιο-Ασιάτες, παράγει υποξυαιμία στο έμβρυο και εμβρυϊκό ύδρωπα (hydrops fetalis) (μία κατάσταση όπου υπάρχει μαζική συγκέντρωση υγρού). Σοβαρή υποξυαιμία οδηγεί απαρέκλητα σε θνησιγένεια κατά τη γέννηση (stillbirth) ή νεογνικό (neonatal) θάνατο. Οι α - θαλασσαιμίες προκαλούνται συνήθως από ελλείψεις γονιδίων α-σφαιρίνης. Η έλλειψη των τριών από αυτά τα γονίδια οδηγεί σε μετρίως σοβαρή αναιμία, και η απώλεια και των τεσσάρων είναι μοιραία. Άτομα με μεταλλαγή στο γονίδιο της β-σφαιρίνης σε ένα αντίγραφο του χρωμοσώματος 11 (ετεροζυγώτες) λέγεται ότι πάσχουν από β - θαλασσαιμία ελαφριάς μορφής, μία κατάσταση που προκαλεί ελάχιστη ή καθόλου αναιμία και δεν απαιτεί συνήθως κλινική υποστήριξη. Εκείνοι στους οποίους και τα δύο αντίγραφα του χρωμοσώματος φέρουν μία μεταλλαγή β - σφαιρίνης αναπτύσσουν είτε β - θαλασσαιμία μείζονος μορφής (που ονομάζεται και αναιμία Cooley) ή τη λιγότερο βαριά της μορφή, την ενδιάμεση β - θαλασσαιμία. Η β - σφαιρίνη μπορεί να απουσιάζει εντελώς (β 0 - θαλασσαιμία), ή μπορεί να μειωθεί σε περίπου 10% με 30% του κανονικού ποσού (β + - θαλασσαιμία). Χαρακτηριστικά, η β 0 - θαλασσαιμία παράγει έναν σοβαρότερο φαινότυπο ασθένειας, αλλά επειδή τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της ασθένειας προέρχονται από το πλεόνασμα των α-αλυσίδων, άτομα με β 0 - θαλασσαιμία επηρεάζονται λιγότερο όταν έχουν επίσης μεταλλαγές α - σφαιρίνης που μειώνουν την ποσότητα των αλυσίδων α - σφαιρίνης. Η β σφαιρίνη παράγεται μετά τη γέννηση, έτσι τα αποτελέσματα της β- θαλασσαιμίας μείζονος μορφής δεν φαίνονται κλινικά μέχρι την ηλικία των 2 έως 6 μηνών. Αυτοί οι ασθενείς αναπτύσσουν σοβαρή αναιμία, που αν δεν αντιμετωπισθεί κατάλληλα μπορεί να προκαλέσει σημαντική καθυστέρηση της αύξησης. Η αναιμία προκαλεί διόγκωση του μυελού των οστών, που με τη 10

11 σειρά του προκαλεί σκελετικές μεταβολές, που συμπεριλαμβάνουν προεξέχον άνω σαγόνι και ζυγωματικά και εκλέπτυνση των μακρών οστών (που τα καθιστούν ευαίσθητα σε κατάγματα). Η σπληνομεγαλία (Εικόνα 3-6) και οι μολύνσεις είναι συχνές και οι ασθενείς με μη θεραπεύσιμη β-θαλασσαιμία βαριάς μορφής συνήθως πεθαίνουν κατά τη διάρκεια της πρώτης δεκαετίας της ζωής τους. Η β-θαλασσαιμία μπορεί να έχει ποικίλη σοβαρότητα, ανάλογα με την ακριβή φύση της υπεύθυνης μεταλλαγής. Εικόνα 3.6. Παιδί με β - θαλασσαιμία μείζονος μορφής που έχει σοβαρή σπληνομεγαλία. Σε αντίθεση με την α - θαλασσαιμία, οι ελλείψεις γονιδίων είναι σχετικά σπάνιες στη β - θαλασσαιμία. Αντί αυτού, οι περισσότερες περιπτώσεις προκαλούνται από σημειακές μεταλλαγές βάσεων. Ανερμηνεύσιμες μεταλλαγές, οι οποίες οδηγούν στην πρόωρη λήξη της μετάφρασης της αλυσίδας της β - σφαιρίνης, προκαλούν συνήθως β 0 - θαλασσαιμία. Οι μεταλλαγές μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης επίσης παράγουν τυπικά τη μορφή β 0. Εκτός από τις μεταλλαγές στο ίδιο το γονίδιο β - σφαιρίνης, παρατηρούνται συχνά αλλαγές στις ρυθμιστικές ακολουθίες. Η μεταγραφή του γονιδίου της β - σφαιρίνης ρυθμίζεται από ένα υποκινητή, δύο ενισχυτές, και μια άνωθεν περιοχή γνωστή ως περιοχή ελέγχου (LCR, locus control region) (βλ. Εικόνα 3-4). Οι μεταλλαγές σε αυτές τις ρυθμιστικές περιοχές οδηγούν συνήθως στη μειωμένη σύνθεση mrna και σε μείωση, αλλά όχι πλήρη έλλειψη, β - σφαιρίνης (β + - θαλασσαιμία). Έχουν επίσης παρατηρηθεί διάφοροι τύποι μεταλλαγών σε θέσεις ματίσματος. Εάν μια σημειακή μεταλλαγή εμφανιστεί στη θέση δότη ή δέκτη, το κανονικό μάτισμα καταστρέφεται εντελώς, παράγοντας β 0 - θαλασσαιμία. Οι μεταλλαγές στις περιβάλλουσες συναινετικές ακολουθίες παράγουν συνήθως β + - θαλασσαιμία. Μεταλλαγές συμβαίνουν επίσης στα κρυφά σημεία ματίσματος 11

12 που βρίσκονται σε εσόνια ή εξόνια του γονίδιου της β - σφαιρίνης, καθιστώντας τα σημεία αυτά διαθέσιμα στο μηχανισμό ματίσματος. Αυτές οι πρόσθετες θέσεις ματίσματος ανταγωνίζονται έπειτα με τις κανονικές, παράγοντας μερικές κανονικές και μερικές ανώμαλες αλυσίδες β - σφαιρίνης. Το αποτέλεσμα είναι συνήθως β + - θαλασσαιμία. Πολλοί διαφορετικοί τύποι μεταλλαγών μπορούν να προκαλέσουν β - θαλασσαιμία. Ανερμηνεύσιμες, μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης, και μεταλλαγές θέσεων χορηγών και αποδεκτών ματίσματος προκαλούν τις σοβαρότερες μορφές της ασθένειας. Οι ρυθμιστικές μεταλλαγές και εκείνες των συναινετικών και των κρυφών θέσεων ματίσματος προκαλούν τις ασθενέστερες μορφές της ασθένειας. Έχουν αναφερθεί περισσότερες από 300 διαφορετικές μεταλλαγές στο γονίδιο της β-σφαιρίνης. Συνεπώς, οι περισσότεροι ασθενείς με β - θαλασσαιμία δεν είναι "ομοζυγώτες" υπό την ακριβή έννοια: έχουν συνήθως μία διαφορετική μεταλλαγή β - σφαιρίνης σε κάθε αντίγραφο του χρωμοσώματος 11 και ονομάζονται διπλοί ετεροζυγώτες (compound heterozygotes). Ακόμα κι αν οι μεταλλαγές διαφέρουν, κάθε ένα από τα δύο γονίδια β - σφαιρίνης αλλάζει, προκαλώντας ασθένεια. Συχνά αναφέρεται αόριστα ο όρος "ομοζυγώτης" στους σύνθετους ετεροζυγώτες. Ασθενείς με δρεπανοκυτταρική ασθένεια ή με β θαλασσαιμία βαριάς μορφής αντιμετωπίζονται μερικές φορές με μεταγγίσεις αίματος και με χηλικούς (chelating) παράγοντες για την απομάκρυνση του πλεονάζοντος σιδήρου που εισάγεται στον οργανισμό με τη μετάγγιση. Η προληπτική χορήγηση αντιβιοτικών και ο εμβολιασμός κατά του πνευμονόκοκκου (antipneumococcal vaccination) χρησιμοποιούνται για τη μείωση των βακτηριακών μολύνσεων σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική ασθένεια, και χορηγούνται αναλγητικά για την ανακούφιση από τον πόνο κατά τη διάρκεια των κρίσεων δρεπάνωσης. Μεταμόσχευση μυελού των οστών, η οποία παρέχει βλαστοκύτταρα δότη (donor stem cells) που παράγουν γενετικά κανονικά ερυθροκύτταρα, γίνεται σε ασθενείς με β θαλασσαιμία βαριάς μορφής ή δρεπανοκυτταρική ασθένεια. Εν τούτοις, είναι συχνά αδύνατο να βρεθεί συμβατός δότης, και το ποσοστό θνησιμότητας από αυτήν την διαδικασία είναι ακόμα αρκετά υψηλό (περίπου 5% με 30%, ανάλογα με τη δριμύτητα της ασθένειας και την ηλικία του ασθενή). Μία έλλειψη της κανονικής β σφαιρίνης του ενήλικα μπορεί να αντισταθμιστεί με την επανενεργοποίηση των γονιδίων που κωδικοποιούν την εμβρυϊκή β - σφαιρίνη (τα γονίδια γ - σφαιρίνης, που αναφέραμε προηγουμένως). Ουσίες όπως η υδροξυουρία και το βουτυρικό οξύ (butyrate) μπορούν να επανενεργοποιήσουν αυτά τα γονίδια και ερευνώνται. Επίσης, οι διαταραχές της αιμοσφαιρίνης είναι πιθανοί υποψήφιοι για γονιδιακή θεραπεία (βλ. Κεφάλαιο 13). Αίτια μεταλλαγής Ένας μεγάλος αριθμός παραγόντων είναι γνωστό ότι προκαλεί επαγόμενες μεταλλαγές. Αυτές οι μεταλλαγές, που αποδίδονται σε γνωστές περιβαλλοντικές αιτίες, μπορούν να αντιπαραβληθούν με τις αυτόματες μεταλλαγές, οι οποίες προκύπτουν φυσικά κατά το διπλασιασμό του DNA. Οι παράγοντες που προκαλούν επαγόμενες μεταλλαγές είναι συλλογικά γνωστοί ως μεταλλαξογόνα (mutagens). Μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι η ακτινοβολία είναι μια σημαντική κατηγορία μεταλλαξογόνου (Κλινικά σχόλια 3-1). Η ιονίζουσα ακτινοβολία, όπως αυτή που παράγεται από τις ακτίνες X και τα πυρηνικά απόβλητα, μπορεί να αφαιρέσει ηλεκτρόνια από τα άτομα, σχηματίζοντας ηλεκτρικά φορτισμένα ιόντα. Όταν αυτά τα ιόντα τοποθετούνται 12

13 μέσα ή κοντά στο μόριο του DNA, μπορούν να προωθήσουν χημικές αντιδράσεις που αλλάζουν τις βάσεις του DNA. Η ιονίζουσα ακτινοβολία μπορεί επίσης να σπάσει τους δεσμούς του δίκλωνου DNA. Αυτή η μορφή ακτινοβολίας μπορεί να φθάσει σε όλα τα κύτταρα του σώματος, συμπεριλαμβανομένων των αναπαραγωγικών κυττάρων. Η μη ιονίζουσα ακτινοβολία δεν σχηματίζει φορτισμένα ιόντα αλλά μπορεί να κινήσει τα ηλεκτρόνια από εσωτερικές σε εξωτερικές τροχιές μέσα σε ένα άτομο. Το άτομο γίνεται χημικά ασταθές. Η υπεριώδης (UV) ακτινοβολία, που απαντά φυσικά στο φως του ήλιου, είναι παράδειγμα μη ιονίζουσας ακτινοβολίας. Η UV ακτινοβολία προκαλεί σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ παρακείμενων βάσεων πυριμιδίνης (δηλ., κυτοσίνης ή θυμίνης). Αυτά τα διμερή πυριμιδίνης (pyrimidine dimers) (διμερές είναι ένα μόριο που έχει δύο υπομονάδες) είναι ανίκανα να ζευγαρώσουν κατάλληλα με πουρίνες κατά τη διάρκεια του διπλασιασμού του DNA, γεγονός που οδηγεί σε αντικατάσταση ενός ζεύγους βάσεων (Εικόνα 3-7). Επειδή η UV ακτινοβολία απορροφάται από την επιδερμίδα, δεν φθάνει στην αναπαραγωγική σειρά αλλά μπορεί να προκαλέσει καρκίνο του δέρματος (Κλινικά σχόλια 3-2). Ποικίλες χημικές ουσίες μπορούν επίσης να προκαλέσουν μεταλλαγές, μερικές φορές λόγω της χημικής τους ομοιότητας με τις βάσεις του DNA. Λόγω αυτής της ομοιότητας, αυτά τα ανάλογα βάσεων, όπως η 5- βρωμοουρακίλη, μπορούν να αντικαταστήσουν μια αληθινή βάση DNA κατά τη διάρκεια του διπλασιασμού. Το ανάλογο δεν είναι ακριβώς το ίδιο με τη βάση που αντικαθιστά, έτσι μπορεί να προκαλέσει λάθη στο ζευγάρωμα κατά τη διάρκεια των επόμενων διπλασιασμών. Άλλα χημικά μεταλλαξογόνα, όπως οι χρωστικές ουσίες ακριδίνης, μπορούν να παρεμβληθούν φυσικά μεταξύ των υπαρχουσών βάσεων, παραμορφώνοντας την έλικα DNA και προκαλώντας μεταλλαγές μετατόπισης του πλαισίου ανάγνωσης. Ακόμα άλλα μεταλλαξογόνα μπορούν άμεσα να αλλάξουν τις βάσεις του DNA, προκαλώντας λάθη διπλασιασμού. Ένα παράδειγμα των τελευταίων είναι το νιτρώδες οξύ, που αφαιρεί μία αμινομάδα από την κυτοσίνη μετατρέποντάς τη σε ουρακίλη. Αν και η ουρακίλη βρίσκεται κανονικά στο RNA, μιμείται τη δράση ζευγαρώματος της θυμίνης στο DNA. Κατά συνέπεια, ζευγαρώνει με την αδενίνη αντί της γουανίνης, όπως θα έκανε η αρχική κυτοσίνη. Το τελικό αποτέλεσμα είναι μία αντικατάσταση ενός ζεύγους βάσεων. ΚΛΙΝΙΚΑ ΣΧΟΛΙΑ 3.1 Τα αποτελέσματα της ακτινοβολίας στα ποσοστά μεταλλαγής Επειδή η μεταλλαγή είναι ένα σπάνιο γεγονός, συμβαίνει σε λιγότερο από ένα σε γονίδια σε κάθε γενιά, είναι δύσκολο να εκτιμηθεί άμεσα στους ανθρώπους. Η σχέση μεταξύ της έκθεσης στην ακτινοβολία και της μεταλλαγής είναι ομοίως δύσκολο να αξιολογηθεί. Για ένα πρόσωπο που ζει σε μια αναπτυγμένη χώρα, μια χαρακτηριστική έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία που θα προσλάβει καθ όλη τη διάρκεια της ζωής του είναι περίπου 6 έως 7 rem*. (*το rem είναι μονάδα μέτρησης της έκθεσης σε ακτινοβολία. Ισοδυναμεί με περίπου 0.01 joule απορροφούμενης ενέργειας ανά χιλιόγραμμο ιστού). Περίπου το ένα τρίτο αυτού του ποσού θεωρείται ότι προέρχεται από ιατρικές και οδοντιατρικές ακτινογραφίες ακτινών X. Ατυχείς περιπτώσεις έχουν προκύψει στις οποίες ειδικοί ανθρώπινοι πληθυσμοί προσέλαβαν πολύ μεγαλύτερες δόσεις ακτινοβολίας. Ένας τέτοιος πληθυσμός που μελετήθηκε λεπτομερέστερα είναι οι επιζώντες της έκρηξης της ατομικής βόμβας στη Χιροσίμα και το Ναγκασάκι της Ιαπωνίας, κατά τον ΙΙ παγκόσμιο πόλεμο. Πολλοί από εκείνους που εκτέθηκαν στις υψηλές δόσεις της ακτινοβολίας πέθαναν από την 13

14 ασθένεια ακτινοβολίας. Άλλοι επέζησαν, και πολλοί από τους επιζώντες παρήγαγαν απογόνους. Μεγάλη ομάδα Ιαπώνων και Αμερικανών επιστημόνων διεξήγαγε ιατρικές και γενετικές έρευνες σε επιζώντες για να μελετήσει τα αποτελέσματα της έκθεσης στην ακτινοβολία στον πληθυσμό αυτό. Ένας σημαντικός αριθμός των εκτεθέντων ανέπτυξε καρκίνους και χρωμοσωμικές ανωμαλίες στα σωματικά κύτταρα, πιθανώς σαν συνέπεια της έκθεσης στην ακτινοβολία. Για να αξιολογήσουν τα αποτελέσματα της έκθεσης στην ακτινοβολία στην αναπαραγωγική σειρά των υπό μελέτη ακτνοβοληθέντων, οι επιστήμονες σύγκριναν τους απόγονους εκείνων που υπέστησαν σοβαρή έκθεση σε ακτινοβολία με τους απόγονους εκείνων που δεν ακτινοβολήθηκαν. Αν και είναι δύσκολο να καθιερωθούν οι δόσεις της ακτινοβολίας με ακρίβεια, δεν υπάρχει καμία αμφιβολία ότι, γενικά, εκείνοι που βρίσκονταν πιο κοντά στην έκρηξη εκτέθηκαν σε υψηλότερα επίπεδα ακτινοβολίας και υπέστησαν σοβαρότερες βλάβες. Υπολογίζεται ότι η εκτεθειμένη ομάδα προσέλαβε κατά προσέγγιση 30 έως 60 rem ακτινοβολία, πολλές φορές μεγαλύτερη από τη μέση έκθεση σε ακτινοβολία που προσλαμβάνεται κατά τη διάρκειας της ζωής. Σε μία σειρά περισσότερων από απόγονους αυτών των ατόμων, οι ερευνητές αξιολόγησαν έναν μεγάλο αριθμό παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των θνησιγενειών, χρωμοσωμικών ανωμαλιών, γενετικών ατελειών, ανάπτυξη καρκίνου πριν την ηλικία των 20 ετών, θάνατο πριν την ηλικία των 26 ετών, και διάφορα μέτρα αύξησης και ανάπτυξης (π.χ., δείκτης νοημοσύνης, intelligence quotient). εν υπήρξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των απογόνων των ατόμων που εκτέθηκαν στην ακτινοβολία και των απόγονων εκείνων που δεν εκτέθηκαν. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν άμεσες γενετικές μελέτες των μεταλλαγών χρησιμοποιώντας πολυμορφισμούς μινιδορυφόρων και ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, μια τεχνική που ανιχνεύει τις μεταλλαγές που οδηγούν σε αμινοξικές αλλαγές (συζητούνται σε άλλο σημείο αυτού του κεφαλαίου). Οι γονείς και απόγονοι συγκρίθηκαν για να προσδιοριστεί η εμφάνιση μεταλλαγών σε διάφορες θέσεις στη αναπαραγωγική σειρά. Οι αριθμοί μεταλλαγών που ανιχνεύθηκαν στις εκτεθειμένες και μη εκτεθειμένες ομάδες ήταν στατιστικά ισοδύναμοι. Πιο πρόσφατα, οι μελέτες εκείνων που εκτέθηκαν στην ακτινοβολία από το ατύχημα των εγκαταστάσεων πυρηνικής ενέργειας του Τσέρνομπιλ κατέδειξαν μια σημαντική αύξηση στους καρκίνους του θυρεοειδούς μεταξύ των παιδιών που εκτέθηκαν στην ακτινοβολία. Αυτό απεικονίζει τα αποτελέσματα των σωματικών μεταλλαγών. Εντούτοις παραμένουν ασαφείς οι ενδείξεις αυξημένης συχνότητας των μεταλλαγών της αναπαραγωγικής σειράς. ιάφορες άλλες μελέτες των αποτελεσμάτων της ακτινοβολίας στους ανθρώπους έχουν αναφερθεί, συμπεριλαμβανομένων των ερευνών για εκείνους που ζουν κοντά στις εγκαταστάσεις πυρηνικής ενέργειας. Οι δόσεις ακτινοβολίας που προσλαμβάνονται από αυτά τα άτομα είναι ουσιαστικά μικρότερες από εκείνες των πληθυσμών που συζητήθηκαν προηγουμένως, και τα αποτελέσματα των μελετών αυτών είναι διφορούμενα. Είναι αξιοπρόσεκτο ότι, ακόμα κι αν υπήρξαν σημαντικά στοιχεία για τα αποτελέσματα ακτινοβολίας στα σωματικά κύτταρα στις μελέτες Χιροσίμα- Ναγκασάκι, καμία ανιχνεύσιμη επίδραση δεν θα μπορούσε να φανεί στα κύτταρα της αναπαραγωγικής σειράς. Τι θα μπορούσε να το ερμηνεύσει αυτό; Είναι πιθανό ότι οι μηχανισμοί επιδιόρθωσης του DNA συμμετέχουν τουλάχιστον μερικά. Επίσης, πρέπει να αναγνωρισθεί ότι, ακόμη και με ένα μεγάλο δείγμα ατόμων που προσέλαβαν τις σχετικά υψηλές δόσεις της ακτινοβολίας, τα αυξανόμενα επίπεδα μεταλλαγής είναι δύσκολο να ανιχνευθούν. Αυτά τα αποτελέσματα συνηγορούν στο ότι ο κίνδυνος της ακτινοβολίας δεν πρέπει να αγνοείται. Η υπέργεια πυρηνική δοκιμή νοτιοδυτικά της Αμερικής προκάλεσε αυξημένα ποσοστά λευχαιμίας και καρκίνου του θυρεοειδούς σε τμήμα του πληθυσμού. Το ραδόνιο, ένα ραδιενεργό αέριο που παράγεται από την αποσύνθεση του φυσικού ουράνιου, μπορεί να βρεθεί σε επικίνδυνα υψηλά επίπεδα σε μερικά σπίτια και θέτει έναν κίνδυνο για τον καρκίνο πνευμόνων. Οποιαδήποτε 14

15 περιττή έκθεση στην ακτινοβολία, ιδιαίτερα των γονάδων ή των αναπτυσσόμενων εμβρύων, πρέπει να αποφεύγεται όσο το δυνατό. Εικόνα 3.7. ιμερή πυριμιδίνης δημιουργούνται όταν σχηματίζονται ομοιοπολικοί δεσμοί μεταξύ των παρακείμενων βάσεων πυριμιδίνης (κυτοσίνη ή θυμίνη). Αυτό παραμορφώνει το DNA, παρεμποδίζοντας το κανονικό ζευγάρωμα των βάσεων (A). Η ατέλεια επιδιορθώνεται με αφαίρεση και αντικατάσταση του διμερούς και των εκατέρωθεν βάσεων, χρησιμοποιώντας τη συμπληρωματική αλυσίδα του DNA σαν καλούπι (B). Εκατοντάδες χημικές ουσίες είναι τώρα γνωστές ως μεταλλαξογόνες σε πειραματόζωα. Μεταξύ αυτών είναι η μουστάρδα αζώτου, το βινυλ χλωρίδιο, αλκυλοποιητικοί παράγοντες, φορμαλδεϋδη, νιτρώδες νάτριο, και σακχαρίνη. Μερικές από αυτές τις χημικές ουσίες είναι πολύ ποιο ισχυρά μεταλλαξογόνα από άλλες. Η μουστάρδα αζώτου, παραδείγματος χάριν, είναι ένα ισχυρό μεταλλαξογόνο, ενώ η σακχαρίνη είναι σχετικά ασθενής. Αν και μερικές μεταλλαξογόνες χημικές ουσίες παράγονται από τους ανθρώπους, πολλές απαντούν φυσικά στο περιβάλλον (π.χ., η αφλατοξίνη B1, είναι κοινή μολυσματική πρόσμιξη των τροφίμων). Πολλές ουσίες στο περιβάλλον είναι γνωστές ως μεταλλαξογόνες, συμπεριλαμβανομένης της ιονίζουσας και μη ιονίζουσας ακτινοβολίας και εκατοντάδων διαφορετικών χημικών ουσιών. Αυτά τα μεταλλαξογόνα είναι σε θέση να προκαλέσουν αντικαταστάσεις, ελλείψεις, και μετατοπίσεις του πλαισίου ανάγνωσης των βάσεων. Η ιονίζουσα ακτινοβολία μπορεί να προκαλέσει σπασίματα στο δίκλωνο μόριο του DNA. Μερικά μεταλλαξογόνα απαντούν στη φύση, ενώ άλλα παράγονται από τον άνθρωπο. Επιδιόρθωση DNA Θεωρώντας ότι 3 δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων DNA πρέπει να διπλασιασθούν σε κάθε κυτταροδιαίρεση, και αντιλαμβανόμενοι το μεγάλο αριθμό μεταλλαξογόνων στον οποίο εκτιθέμεθα, ο διπλασιασμός του DNA είναι εκπληκτικά ακριβής. Ένας αρχικός λόγος για αυτήν την ακρίβεια είναι η διαδικασία της επιδιόρθωσης του DNA, η οποία πραγματοποιείται σε όλα τα φυσιολογικά κύτταρα των ανώτερων οργανισμών. Μερικές δωδεκάδες ενζύμων συμμετέχουν στην επιδιόρθωση του κατεστραμμένου DNA. 15

16 Αναγνωρίζουν συλλογικά μία αλλαγμένη βάση, την αποκόπτουν με αποκοπή της αλυσίδας DNA, την αντικαθιστούν με τη σωστή βάση (που καθορίζεται από τη συμπληρωματική αλυσίδα) και ξανασφραγίζουν-επανασυγκολούν το DNA. Υπολογίζεται ότι αυτοί οι μηχανισμοί επισκευής διορθώνουν 99,9% των αρχικών λαθών. Επειδή η επιδιόρθωση του DNA είναι απαραίτητη για τον ακριβή διπλασιασμό του DNA, οι ατέλειες στα συστήματα επιδιόρθωσης DNA μπορούν να οδηγήσουν σε πολλούς τύπους ασθενειών. Παραδείγματος χάριν, οι κληρονομήσιμες μεταλλαγές γονιδίων αρμόδιων για την επιδιόρθωση κακοσυνδυασμένου DNA (DNA mismatch repair) έχει σαν αποτέλεσμα την παραμονή κυττάρων με λάθη κατά τον διπλασιασμό (δηλ. κακών συνδυασμών) που μπορεί να οδηγήσει σε μερικούς τύπους καρκίνων (βλ. Κεφάλαιο 11). Μία συμβιβασμένη δυνατότητα επιδιόρθωσης σπασιμάτων του δίκλωνου DNA (double-stranded DNA breaks) μπορεί να οδηγήσει σε καρκίνο ωοθηκών ή/και μαστού. Η επιδιόρθωση δια της αποκοπής νουκλεοτιδίων (nucleotide excision repair) είναι απαραίτητη για την αφαίρεση των μεγαλύτερων αλλαγών στην έλικα DNA (π.χ., διμερή πυριμιδίνης), οι δε ατέλειες στην επισκευή αποκοπής οδηγούν σε διάφορες ασθένειες, όπως η μελαγχρωματική ξηροδερμία (xeroderma pigmentosum, ΧP) (βλ. Κλινικά σχόλια 3-2). Η επιδιόρθωση του DNA βοηθά να εξασφαλισθεί η ακρίβεια της αλληλουχίας του DNA με τη διόρθωση των λαθών διπλασιασμού (αταίριαστοι συνδυασμοί, mismatches), επιδιορθώνοντας σπασίματα στο δίκλωνο DNA, και αποσπώντας τα χαλασμένα νουκλεοτίδια. ΚΛΙΝΙΚΑ ΣΧΟΛΙΑ 3,2 Μελαγχρωματική ξηροδερμία: Μια ασθένεια προκαλούμενη από ελαττωματική επιδιόρθωση του DNA Μία αναπόφευκτη συνέπεια της έκθεσης στην UV ακτινοβολία είναι ο σχηματισμός ενδεχόμενα επικίνδυνων διμερών πυριμιδίνης στο DNA των κυττάρων του δέρματος. Ευτυχώς, ένα ιδιαίτερα αποδοτικό σύστημα ενζύμων επισκευάζει συνήθως αυτά τα διμερή στα κανονικά άτομα. Στα άτομα που πάσχουν από το σπάνιο νόσημα της μελαγχρωματικής ξηροδερμίας (XP), το σύστημα αυτό δεν λειτουργεί κανονικά και τα λάθη διπλασιασμού που προκύπτουν οδηγούν σε αντικαταστάσεις ζευγών βάσεων στα κύτταρα του δέρματος. Η σοβαρότητα της νόσου XP εμφανίζει ποικιλία, και εκδηλώνεται συνήθως στα 10 πρώτα έτη της ζωής. Το δέρμα είναι ξηρό και φολιδωτό (ξηροδερμία), και φέρει εκτενή φακίδωση και ανώμαλη δερματική χρώση (pigmentosum) συνοδευόμενη από πολυάριθμους όγκους του δέρματος (Εικόνα 3-8). Σε μερικές περιπτώσεις εμφανίζονται νευρολογικές ανωμαλίες. Υπολογίζεται ότι ο κίνδυνος ανάπτυξης όγκων δέρματος σε άτομα με XP είναι περίπου φορές υψηλότερος. Αυτοί οι καρκίνοι συγκεντρώνονται πρώτιστα στα ηλιοεκτιθέμενα μέρη του σώματος. Οι ασθενείς ενθαρρύνονται να αποφεύγουν τις πηγές υπεριώδους (UV) φωτός (π.χ., φως του ήλιου), και οι αυξήσεις του αριθμού των καρκίνων αφαιρούνται χειρουργικά. Οι ασθενείς με XP μπορούν να αναπτύξουν σοβαρές κακοήθειες που οδηγούν μερικές φορές στο θάνατο πριν από την ηλικία των 20 ετών. Αρκετά επιδιορθωτικά ένζυμα συμμετέχουν στην επιδιόρθωση των διμερών πυριμιδίνης. Αυτά περιλαμβάνουν ελικάσες που ξετυλίγουν τη δίκλωνη έλικα του DNA, μια ενδονουκλεάση που κόβει το DNA στο σημείο του διμερούς, μία εξονουκλεάση που αφαιρεί το διμερές και γειτονικά νουκλεοτίδια, μια πολυμεράση που καλύπτει το κενό με βάσεις DNA (χρησιμοποιώντας τη συμπληρωματική αλυσίδα του DNA ως πρότυπο-καλούπι), και μία λιγάση που επανασυνδέει το διορθωμένο τμήμα του DNA στον αρχικό κλώνο. Μια κληρονομήσιμη μεταλλαγή σε οποιοδήποτε από τα επτά γονίδια των επιδιορθωτικών ενζύμων μπορεί να δημιουργήσει XP. 16

17 Εκόνα 3.8. Μελαχρωματική ξηροδερμία [Xeroderma pigmentosum (XP)]. Το δέρμα αυτού του ασθενή έχει πολλαπλά υπερκεχρωσμένα τραύματα, και δύο όγκους δέρματος στο μέτωπο που έχουν μαρκαριστεί για αποκοπή. Η XP περιλαμβάνει δύο διακριτές κατηγορίες μεταλλαγών. Οι μεταλλαγές στα γονίδια των επιδιορθωτικών ενζύμων συμβαίνουν στην αναπαραγωγική σειρά και μπορούν επομένως να μεταβιβαστούν από τη μία γενιά στην επόμενη. Επειδή οδηγούν σε ανεπαρκή επιδιόρθωση του DNA, επιτρέπουν την επικράτηση μεταλλαγών στα κύτταρα του δέρματος, με συνέπεια την ανάπτυξη όγκων. Οι μεταλλαγές στα κύτταρα του δέρματος δεν μπορούν, φυσικά, να κληρονομηθούν. Αν και η XP είναι πιθανώς η καλύτερα γνωστή ασθένεια που προκύπτει από την ανεπαρκή επιδιόρθωση του DNA, δεν είναι η μοναδική. Άλλα παραδείγματα δίνονται στον Πίνακα 3-2. Εικόνα 3.9. Μεθυλίωση κυτοσίνης. Η προσθήκη μιας μεθυλικής ομάδας (CH3) σε μια βάση κυτοσίνης σχηματίζει 5-μεθυλκυτοσίνη. Η επακόλουθη απώλεια μιας αμινομάδας (απαμίνωση, deamination) σχηματίζει θυμίνη. Το αποτέλεσμα είναι μια αντικατάσταση κυτοσίνης με θυμίνη. Πίνακας 3-2. Παραδείγματα. ασθενειών που προκαλούνται από ατέλειες κατά την επιδιόρθωση του DNA. 17

18 Ασθένεια Μελαγχρωματική ξηροδερμία (Xeroderma pigmentosum, XP) Σύνδρομο Cockayne Χαρακτηριστικά γνωρίσματα Τύπος ατέλειας επισκευής Όγκοι δέρματος, Ατέλειες επιδιόρθωσης φωτοευαισθησία, καταρράκτες, νουκλεοτιδικής αποκοπής νευρολογικές ανωμαλίες συμπεριλαμβανομένων των μεταλλαγών στα γονίδια ελικάσης και ενδονουκλεάσης Μειωμένο ανάστημα, σκελετικές Ελαττωματική επισκευή της UVεπαγομένης ζημίας σε ανωμαλίες, οπτική ατροφία, κώφωση, φωτοευαισθησία, μεταγραφικά ενεργό DNA, διανοητική καθυστέρηση αξιοσημείωτη αιτιολογική και συμπτωματική επικάλυψη με XP και trichothiodystrophy Αναιμία Fanconi Αναιμία, ευαισθησία στη Τουλάχιστον οκτώ διαφορετικά λευχαιμία, δυσμορφίες άκρων, γονίδια μπορεί να εμπλέκονται, νεφρών, και καρδιάς, αλλά οι ακριβείς τους ρόλοι στην χρωμοσωμική αστάθεια επιδιόρθωση του DNA δεν είναι ακόμα γνωστοί Σύνδρομο Bloom Ανεπαρκής αύξηση, Μεταλλαγές στην οικογένεια reqq ανοσοανεπάρκεια, χρωμοσωμική ελικάσης αστάθεια, αυξημένη εμφάνιση καρκίνου Σύνδρομο Werner Καταρράκτες, οστεοπόρωση, Μεταλλαγές στην οικογένεια αθηροσκλήρωση, απώλεια ελικάση reqq ελαστικότητας δέρματος, βραχύ ανάστημα, διαβήτης, αυξημένη εμφάνιση καρκίνου, μερικές φορές περιγράφεται σαν "πρόωρη γήρανση" Aταξία Telangiectasia Παρεγκεφαλλιδική αταξία, Το κανονικό γονιδιακό προϊόν telangiectases, * άνοσο είναι πιθανό να εμπλέκεται στη ανεπάρκεια, αυξανόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου εμφάνιση καρκίνου, μετά από την εμφάνιση βλάβης χρωμοσωμική αστάθεια του DNA Κληρονομικός μη Κεντρικοί όγκοι εντέρων, Μεταλλαγές σε οποιαδήποτε από πολυποδικός αυξημένη ευαισθησία σε τα έξι γονίδια επιδιόρθωσης του (nonpolyposis) διάφορους άλλους τύπους αταίριαστου DNA καρκίνος του ορθού και καρκίνων του παχέως εντέρου (colorectal) Telangiectases (τελανγκειεκστασία) είναι αγγειακά τραύματα που προκαλούνται από τη διαστολή των μικρών αιμοφόρων αγγείων. Αυτό τυπικά προκαλεί αποχρωματισμό του δέρματος. Ποσοστά μεταλλαγής Πόσο συχνές είναι οι αυθόρμητες μεταλλαγές; Σε νουκλεοτιδικό επίπεδο, το ποσοστό μεταλλαγής υπολογίζεται σε περίπου 10-9 ανά ζεύγος βάσεων ανά κυτταροδιαίρεση (αυτός ο αριθμός αντιπροσωπεύει τις μεταλλαγές που ξεφεύγουν από τη διαδικασία της επιδιόρθωσης του DNA). Σε γονιδιακό επίπεδο, το ποσοστό μεταλλαγής είναι αρκετά μεταβλητό, κυμαίνεται από 10-4 έως 10-7 ανά γενετική θέση ανά κυτταροδιαίρεση. Υπάρχουν τουλάχιστον δύο λόγοι για το μεγάλο αυτό εύρος διακύμανσης. 18

19 1. Τα γονίδια ποικίλλουν παρά πολύ σε μέγεθος. Το γονίδιο της σωματοστατίνης, παραδείγματος χάριν, είναι αρκετά μικρό, περιέχει 1.480ζβ. Αντίθετα, το γονίδιο που ευθύνεται για τη μυϊκή δυστροφία Duchenne (DMD) εκτείνεται περισσότερο από ζβ. Όπως θα αναμένονταν, τα μεγαλύτερα γονίδια αποτελούν μεγαλύτερους "στόχους" για μεταλλαγές και συνήθως μεταλλάσσονται συχνότερα από τα μικρότερα γονίδια. Το γονίδιο DMD, καθώς επίσης και τα γονίδια αιμορροφιλίας τύπου Α και νευροϊνωμάτωσης τύπου 1, είναι όλα πολύ μεγάλα και έχουν υψηλά ποσοστά μεταλλαγής. 2. Έχει επιβεβαιωθεί ότι ορισμένες νουκλεοτιδικές ακολουθίες είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες σε μεταλλαγή και ονομάζονται καυτά σημεία μεταλλαγής (mutation hot spots). Το πιο γνωστό παράδειγμα είναι η δινουκλεοτιδική αλληλουχία CG. Στα θηλαστικά, περίπου 80% των δινουκλεοτιδίων CG μεθυλιώνονται: μία μεθυλική ομάδα συνδέεται στη βάση κυτοσίνης. Η μεθυλιωμένη κυτοσίνη, 5-μεθυλκυτοσίνη, χάνει εύκολα μία αμινομάδα και μετατρέπεται έτσι σε θυμίνη. Το τελικό αποτέλεσμα είναι μία μεταλλαγή από κυτοσίνη σε θυμίνη (Εικόνα 3-9). Οι έρευνες για τις μεταλλαγές στις ανθρώπινες γενετικές ασθένειες έχουν δείξει ότι το ποσοστό μεταλλαγής στα δινουκλεοτίδια CG είναι περίπου 12 φορές υψηλότερο απ' ότι σε άλλες δινουκλεοτιδικές ακολουθίες. Τα καυτά σημεία μεταλλαγής, υπό μορφή δινουκλεοτιδίων CG, έχουν προσδιοριστεί σε έναν αριθμό σημαντικών ανθρώπινων γονίδιων που σχετίζονται με την εμφάνιση ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων του προκολλαγόνου που ευθύνεται για ατελή οστεογένεση (βλ. Κεφάλαιο 2). Άλλα παραδείγματα ασθενειών συζητούνται στα Κεφάλαια 4 και 5. Τα ποσοστά μεταλλαγής ποικίλλουν επίσης αρκετά με την ηλικία του γονέα. Κάποιες χρωμοσωμικές ανωμαλίες αυξάνουν εντυπωσιακά με τη μητρική ηλικία (βλ. Κεφάλαιο 6). Επιπλέον, οι μονογονιδιακές μεταλλαγές μπορούν να αυξηθούν με την πατρική ηλικία. Αυτή η αύξηση παρατηρείται σε αρκετές μονογονιδιακές διαταραχές, συμπεριλαμβανομένου του συνδρόμου Marfan και της αχονδροπλασίας. Όπως παρουσιάζει η Εικόνα 3-10, ο κίνδυνος γέννησης παιδιού με σύνδρομο Marfan είναι περίπου πέντε φορές υψηλότερος για άρρενα μεγαλύτερο των 40 ετών απ' ότι ετών. Αυτή η πατρική επίδραση ηλικίας αποδίδεται συνήθως στο γεγονός ότι τα στελεχιακά κύτταρα (stem cells) που δημιουργούν τα κύτταρα σπέρματος συνεχίζουν να διαιρούνται καθ' όλη τη διάρκεια της ζωής, που τους επιτρέπει μία προοδευτική συγκέντρωση των λαθών που συμβαίνουν κατά το διπλασιασμό του DNA. Τα ποσοστά μεταλλαγής ποικίλλουν σημαντικά στα διαφορετικά μέρη του γονιδιώματος. Τα μεγάλα γονίδια, λόγω του μεγέθους τους, είναι γενικά πιθανότεροι στόχοι μεταλλαγών σχετικά με τα μικρά γονίδια. Υπάρχουν επίσης καυτά σημεία μεταλλαγής, ιδιαίτερα σε μεθυλιωμένα δινουκλεοτίδια CG. Για μερικές μονογονιδιακές διαταραχές, υπάρχει σημαντική αύξηση στον κίνδυνο μεταλλαγής με την προχωρημένη πατρική ηλικία. 19

20 Εικόνα 3.10 Επίδραση πατρικής ηλικίας. Για μερικές μονογονιδιακές διαταραχές, ο κίνδυνος να γεννηθεί παιδί με τη πάθηση (άξονας Υ) αυξάνεται με την ηλικία του πατέρα (άξονας Χ). ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ Για αιώνες, οι εμφανείς διαφορές μεταξύ των ατόμων, όπως το χρώμα του δέρματος, η μορφή και το μέγεθος του σώματος, αποτελούσαν συνεχή πηγή θαυμασμού και αναζήτησης. Μόνο στο 20ό αιώνα ήταν δυνατό να εξεταστεί η γονιδιακή ποικιλότητα, ως αποτέλεσμα μεταλλαγών που συσσωρεύθηκαν διαχρονικά. Η αξιολόγηση και η μέτρηση αυτής της ποικιλότητας σε πληθυσμούς και οικογένειες είναι σημαντική για τη χαρτογράφηση γονιδίων σε συγκεκριμένες θέσεις στα χρωμοσώματα, ένα βασικό βήμα στον καθορισμό της λειτουργίας των γονιδίων (βλ. Κεφάλαιο 8). Η αξιολόγηση της γενετικής ποικιλότητας αποτελεί και τη βάση της γενετικής διάγνωσης, και είναι ιδιαίτερα χρήσιμη στην ιατροδικαστική. Σε αυτό το τμήμα, διάφορες βασικές προσεγγίσεις στην ανίχνευση της γενετικής ποικιλότητας του ανθρώπου συζητούνται σε ιστορική ακολουθία. Ομάδες αίματος Αρκετές δωδεκάδες συστημάτων ομάδων αίματος έχουν καθοριστεί βάσει των αντιγόνων που βρίσκονται στις επιφάνειες των ερυθροκυττάρων. Μερικά περιλαμβάνονται στον καθορισμό του εάν ένα δεδομένο άτομο μπορεί να λάβει μια μετάγγιση αίματος από έναν δεδομένο χορηγό-δότη αίματος. Επειδή τα άτομα διαφέρουν εκτενώς από την άποψη των ομάδων αίματος, αυτά τα συστήματα παρείχαν ένα σημαντικό αρχικό τρόπο προσδιορισμού της γενετικής ποικιλότητας. Κάθε ένα από τα συστήματα ομάδας αίματος καθορίζεται από ένα διαφορετικό γονίδιο ή μία ομάδα γονιδίων. Τα διάφορα αντιγόνα που μπορούν να εκφραστούν μέσα σε ένα σύστημα είναι το αποτέλεσμα των διαφορετικών αλληλουχιών DNA σε αυτά τα γονίδια. Θα συζητηθούν τα συστήματα ομάδας αίματος ABO και Rh λόγω της ιδιαίτερης σημασίας τους στην ιατρική. ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ABO Μεταγγίσεις αίματος πραγματοποιούνταν ήδη από το 1818, αλλά ήταν συχνά ανεπιτυχείς. Μετά από τη μετάγγιση, μερικοί λήπτες ανέπτυσσαν 20

21 μαζική και μερικές φορές μοιραία, αιμολυτική αντίδραση. Το 1900 ο Karl Landsteiner ανακάλυψε ότι αυτή η αντίδραση προκαλούνταν από τα αντιγόνα ABO στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων. Το σύστημα ABO αποτελείται από δύο σημαντικά αντιγόνα, που ονόμασε Α και Β. Τα άτομα μπορεί να έχουν έναν από τέσσερεις τύπους αίματος: εκείνοι με τον τύπο αίματος Α φέρουν το αντιγόνο Α στα ερυθροκύτταρά τους, εκείνοι με τον τύπο Β φέρουν το αντιγόνο Β, εκείνοι με τον τύπο ΑΒ φέρουν και το Α και το Β, και εκείνοι με τον τύπο Ο δεν φέρουν κανένα αντιγόνο. Κάθε άτομο έχει τα αντισώματα που αντιδρούν ενάντια σε οποιαδήποτε αντιγόνα που δεν βρίσκονται στις επιφάνειες των ερυθροκυττάρων τους. Παραδείγματος χάριν, ένα άτομο με ομάδα αίματος τύπου Α έχει αντισώματα αντι-β, και η μετάγγιση αίματος τύπου Β σε αυτό το άτομο θα προκαλούσε μία σοβαρή αντίδραση αντισωμάτων. Στο εργαστήριο είναι απλή υπόθεση ο καθορισμός του τύπου ABO με μίξη ενός μικρού δείγματος αίματος με διαφορετικά διαλύματα αντισωμάτων και αξιολόγηση των συνδυασμών που προκαλούν τη συγκόλληση που είναι χαρακτηριστική της αλληλεπίδρασης αντισώματοςαντιγόνου. Το σύστημα ABO, που κωδικοποιείται από ένα μοναδικό γονίδιο στο χρωμόσωμα 9, αποτελείται από τρία αρχικά αλληλόμορφα γονίδια, επονομαζόμενα Ι Α, Ι Β, και Ι Ο. (Υπάρχουν επίσης υποκατηγορίες και των Ι Α και των Ι Β αλληλόμορφων γονιδίων, αλλά δεν εξετάζονται εδώ.) Τα άτομα με το Ι Α αλληλόμορφο γονίδιο έχουν το αντιγόνο Α στις επιφάνειες των ερυθροκυττάρων τους (τύπος αίματος Α), ενώ εκείνοι με το Ι Β έχουν το αντιγόνο Β στις επιφάνειες των κυττάρων τους (τύπος αίματος Β). Εκείνοι και με τα δύο αλληλόμορφα γονίδια εκφράζουν και τα δύο αντιγόνα (τύπος αίματος ΑΒ), και εκείνοι με μόνο δύο αντίγραφα του αλληλόμορφου γονιδίου Ι Ο δεν έχουν κανένα αντιγόνο (αίμα τύπου Ο). Επειδή το αλληλόμορφο γονίδιο Ι Ο δεν παράγει κανένα αντιγόνο, άτομα που είναι Ι Α Ι Ο ή Ι Β Ι Ο ετεροζυγώτες έχουν τις ομάδες αίματος Α και Β, αντίστοιχα (Πίνακας 3-3). Επειδή οι πληθυσμοί ποικίλλουν ουσιαστικά από την άποψη της συχνότητας με την οποία τα αλληλόμορφα γονίδια ABO εμφανίζονται, η γενετική θέση ABO ήταν το πρώτο σύστημα ομάδας αίματος που χρησιμοποιήθηκε εκτενώς σε μελέτες γενετικής ποικιλότητας σε επίπεδο ατόμων και πληθυσμών. Παραδείγματος χάριν, οι πρώτες μελέτες έδειξαν ότι το αντιγόνο Α είναι σχετικά κοινό στους υτικο-ευρωπαϊκούς πληθυσμούς, ενώ το αντιγόνο Β είναι ιδιαίτερα κοινό μεταξύ των Ασιατών. Κανένα αντιγόνο δεν είναι κοινό μεταξύ των εγγενών Νότιο-Αμερικανικών πληθυσμών, η μεγάλη πλειοψηφία των οποίων έχει τον τύπο αίματος Ο. ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ RH Όπως και το σύστημα ABO, το σύστημα Rh καθορίζεται βάσει των αντιγόνων που είναι παρόντα στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων. Το σύστημα ονομάστηκε από τον πίθηκο rhesus, το πειραματόζωο στο οποίο πρωτοαπομονώθηκε από τον Landsteiner τα τέλη της δεκαετίας του '30. Τυποποιείται στο εργαστήριο από μια διαδικασία παρόμοια με αυτήν που περιγράφεται για το σύστημα ABO. Το σύστημα Rh ποικίλλει αρκετά μεταξύ των ατόμων και των πληθυσμών και έτσι είναι ένα άλλο ιδιαίτερα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη της γενετική ποικιλότητας. Πρόσφατα διευκρινίστηκε η μοριακή βάση της ποικιλίας των συστημάτων ABO και Rh (για περαιτέρω λεπτομέρειες, δείτε τα προτεινόμενα άρθρα στο τέλος αυτού του κεφαλαίου). 21

22 Πίνακας 3-3. Σχέση μεταξύ γονοτύπου ABO και τύπου αίματος Γονότυπος Τύπος αίματος Αντισώματα παρόντα Ι Α Ι Α Α Αντι-Β Ι Α Ι Ο Α Αντι-Β Ι Β Ι Β Β Αντι-Α Ι Β Ι Ο Β Αντι-Α Ι Α Ι Β ΑΒ Κανένα Ι Ο Ι Ο Ο Αντι-Α και αντι-β Τα συστήματα ABO και Rh είναι βασικά για τον καθορισμό της συμβατότητας των μεταγγίσεων αίματος και της μεταμόσχευσης των ιστών. Μερικοί συνδυασμοί αυτών των συστημάτων μπορούν να προκαλέσουν ασυμβατότητα μητέρας-εμβρύου, με σοβαρές μερικές φορές επιπτώσεις στο έμβρυο. Αυτά τα ζητήματα συζητούνται λεπτομερώς στο Κεφάλαιο 9. Οι ομάδες αίματος, των οποίων τα συστήματα ABO και Rh είναι παραδείγματα, έχουν συμβάλλει στην μελέτη της γενετικής ποικιλότητας του ανθρώπου. Η ποικιλότητα των ομάδων αίματος είναι αποτέλεσμα των αντιγόνων που εμφανίζονται στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων. Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών Αν και τα συστήματα ομάδων αίματος συνέβαλλαν στη μέτρηση της γενετικής ποικιλότητας, ο αριθμός τους είναι αρκετά περιορισμένος. Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, που αναπτύχθηκε αρχικά στη δεκαετία του '30 και εφαρμόστηκε ευρέως στον άνθρωπο στη δεκαετία του '50 και τη δεκαετία του '60, αύξησε αρκετά τον αριθμό των ανιχνεύσιμων πολυμορφικών συστημάτων. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί το γεγονός ότι μία μοναδική διαφορά αμινοξέος σε μία πρωτεΐνη (το αποτέλεσμα μιας μεταλλαγής στην αντίστοιχη αλληλουχία DNA) μπορεί να προκαλέσει μια μικρή διαφορά στο ηλεκτρικό φορτίο της πρωτεϊνης. Ένα παράδειγμα είναι η κοινή μεταλλαγή της δρεπανοκυτταρικής ασθένειας που προαναφέρθηκε. Η αντικατάσταση του γλουταμινικού οξέος με βαλίνη στην αλυσίδα της β - σφαιρίνης παράγει μια διαφορά στο ηλεκτρικό φορτίο επειδή το γλουταμινικό οξύ έχει δύο καρβοξυλικές ομάδες, ενώ η βαλίνη έχει μόνο μια καρβοξυλική ομάδα. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να καθορίσει εάν ένα άτομο έχει κανονική αιμοσφαιρίνη (HbA) ή τη μεταλλαγμένη δρεπανοκυτταρική (HbS). Η αιμοσφαιρίνη διαχωρίζεται ηλεκτροφορητικά σε πήκτωμα αμύλου, αγαρόζης, ή πολυακρυλαμίδης (Εικόνα 3-11A). Η μικρή διαφορά φορτίου ως αποτέλεσμα της διαφοράς αμινοξέος αναγκάζει τις μορφές HbA και HbS να μετακινηθούν με διαφορετική ταχύτητα μέσα στο πήκτωμα και η θέση τους μετά από ηλεκτροφόρηση αρκετών ωρών αποτυπώνεται με χρώση (Εικόνα 3-11B). Από την εικόνα που προκύπτει μπορεί να καθοριστεί εάν το άτομο είναι ομοζυγώτης HbA, ομοζυγώτης HbS, ή ετεροζυγώτης που έχει HbA στο ένα αλληλόμορφο χρωμόσωμα και HbS στο άλλο. Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών έχει χρησιμοποιηθεί για να ανιχνεύσει αλλαγή αμινοξέος σε εκατοντάδες ανθρώπινες πρωτεϊνες. Εν τούτοις, οι σιωπηλές αντικαταστάσεις, που δεν προκαλούν αλλαγή των αμινοξέων, δεν μπορούν να ανιχνευθούν με αυτή τη προσέγγιση. Επιπλέον, μερικές αντικαταστάσεις αμινοξέος δεν αλλάζουν το ηλεκτρικό φορτίο του πρωτεϊνικού μορίου. Για αυτούς τους λόγους, υπολογίζεται ότι η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ανιχνεύει μόνο το ένα τρίτο των μεταλλαγών που εμφανίζονται στο 22

23 DNA που κωδικοποιείται. Οι σημειακές αντικαταστάσεις βάσεων DNA δεν ανιχνεύονται συνήθως με την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών. Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ανιχνεύει τις αλλαγές στα γονίδια που κωδικοποιούν ορισμένες πρωτεΐνες του ορρού. Αυτές οι αλλαγές είναι αισθητές επειδή οι πρωτεΐνες με μικρές διαφορές στην αμινοξική τους αλληλουχία μετακινούνται ηλεκτροφορητικά σε διαφορετικά σημεία των πηκτωμάτων. Ανίχνευση της ποικιλότητας στο επίπεδο του DNA Υπολογίζεται ότι κατά μέσο όρο εμφανίζεται 1 αλλαγή στο ανθρώπινο DNA ανά 300 έως 500 ζβ. Κατά συνέπεια, περίπου 10 εκατομμύρια πολυμορφισμοί μπορούν να υπάρξουν μεταξύ των 3 δισεκατομμυρίων ζευγαριών βάσεων που αποτελούν το ανθρώπινο γονιδίωμα. εδομένου ότι υπάρχουν μόνο 100 περίπου ομάδες αίματος και ηλεκτροφορητικοί πολυμορφισμοί πρωτεϊνών, οι προσεγγίσεις αυτές έχουν ανιχνεύσει ένα μικρό μόνο ποσοστό της ποικιλότητας του ανθρώπινου DNA. Εξ άλλου η αξιολόγηση τέτοιας ποικιλότητας είναι κρίσιμη για τη χαρτογράφηση γονιδίων και τη γενετική διάγνωση (βλ. Κεφάλαια 8 και 13). Ευτυχώς, οι μοριακές τεχνικές που αναπτύχθηκαν κατά την διάρκεια των προηγούμενων 20 ετών επιτρέπουν την ανίχνευση χιλιάδων νέων πολυμορφισμών σε επίπεδο DNA. Αυτές οι τεχνικές, που έχουν επιφέρει επανάσταση στις πρακτικές και τις δυνατότητες της ιατρικής γενετικής, συζητούνται ακολούθως. ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ ΜΗΚΟΥΣ ΤΜΗΜΑΤΩΝ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ Μία αρχική προσέγγιση στην ανίχνευση της γενετικής ποικιλότητας σε επίπεδο DNA εκμεταλεύεται την ύπαρξη βακτηριακών ενζύμων γνωστών ως ενδονουκλεάσες περιορισμού ή ένζυμα περιορισμού. Αυτά τα ένζυμα παράγονται από τα διάφορα βακτηριακά είδη για "να περιορίσουν" με κοπή, ή διάσπαση, στις συγκεκριμένες αλληλουχίες αναγνώρισης του ενζύμου, την είσοδο του εισβάλλοντος ξένου DNA στο βακτηρίδιο. Αυτές οι αλληλουχίες αναφέρονται ως περιοχές περιορισμού ή περιοχές αναγνώρισης. Παραδείγματος χάριν, το εντερικό βακτηρίδιο Escherichia coli παράγει ένα ένζυμο περιορισμού, αποκαλούμενο EcoRI, το οποίο αναγνωρίζει την αλληλουχία GAATTC στο δίκλωνο μόριο του DNA. Κάθε φορά που απαντάται αυτή η αλληλουχία, το ένζυμο την διασπά μεταξύ του G και του Α παράγοντας τα τμήματα περιορισμού DNA. Τώρα φανταστείτε μια περιοχή DNA μήκους αρκετών χιλιάδων βάσεων που περιλαμβάνει τρεις θέσεις αναγνώρισης για EcoRI. Υποθέστε ότι υπάρχει ένας πολυμορφισμός στη μέση της περιοχής περιορισμού (π.χ., μερικά άτομα έχουν την ακολουθία GAATTT αντί της ακολουθίας GAATTC που αναγνωρίζεται από την EcoRI). Το ένζυμο δεν θα διασπάσει την ακολουθία GAATTT, αλλά θα διασπάσει τις κανονικές περιοχές περιορισμού που βρίσκονται σε κάθε πλευρά της πολυμορφικής ακολουθίας. Κατά συνέπεια, το συγκεκριμένο τμήμα DNA που παράγεται στο άτομο που στερείται την περιοχή περιορισμού θα είναι μακρύτερο απ' ότι στο άτομο που τον έχει (Εικόνα 3-12). Εάν αυτά τα διαφορετικά μήκη θα μπορούσαν να απεικονιστούν άμεσα, θα ήταν δυνατό να παρατηρηθούν οι διαφορές ακολουθίας DNA μεταξύ των ατόμων (δηλ., πολυμορφισμός DNA). Μια σειρά βημάτων έχει επινοηθεί που επιτρέπει αυτήν την απεικόνιση (Εικόνα 3-13). Κατ' αρχάς, το DNA εξάγεται από ένα δείγμα ιστού, συνήθως αίμα. Κατόπιν το DNA εκτίθεται σε ένα ένζυμο περιορισμού όπως η EcoRI. Αυτή η διαδικασία καλείται διάσπαση περιορισμού ή περιοριστική πέψη (restriction digest). Η διάσπαση παράγει τυπικά περισσότερα από 1 εκατομμύριο τμήματα DNA. Για την αξιολόγηση της ποικιλίας του μήκους, τα τμήματα αυτά υποβάλλονται σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. 23

24 Εικόνα Η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης των πρωτεϊνών. Ένα δείγμα ιστού φορτώνεται στα πηγάδια που βρίσκονται στην κορυφή του πηκτώματος, και εφαρμόζεται ηλεκτρικό ρεύμα κατά μήκος του πήκτωματος. (Α). Μετά από χρώση, οι ευδιάκριτες ζώνες, που αντιπροσωπεύουν τα μόρια με τα διαφορετικά ηλεκτρικά φορτία και επομένως διαφορετικές ακολουθίες αμινοξέων, γίνονται ορατές. Οι HbA ομοζυγώτες παρουσιάζουν μία μοναδική ζώνη πιο κοντά στο θετικό πόλο, ενώ οι ομοζυγώτες HbS παρουσιάζουν μία μοναδική ζώνη πιο κοντά στον αρνητικό πόλο (B). Οι ετεροζυγώτες, που έχουν και τα δύο αλληλόμορφα γονίδια, παρουσιάζουν δύο ζώνες. Αυτή η διαδικασία είναι παρόμοια με την πρωτεϊνική ηλεκτροφόρηση που περιγράφηκε προηγουμένως, εκτός από το ότι τα τμήματα DNA μετακινούνται στο πήκτωμα σύμφωνα με το μέγεθος παρά το ηλεκτρικό φορτίο. Τα μικρότερα τμήματα μετακινούνται γρηγορότερα από τα μεγαλύτερα. Το DNA μετουσιώνεται (δηλ., μετατρέπεται από δίκλωνη σε μονόκλωνη μορφή) με την έκθεση του σε αλκαλικό διάλυμα. Προκειμένου να καθοριστούν οι θέσεις των τμημάτων DNA, μεταφέρονται 24

25 από το πήκτωμα σε μια στερεή μεμβράνη, όπως νιτροκυτταρίνη (αυτό καλείται μεταφορά κατά Southern, από τον ερευνητή που εφηύρε τη διαδικασία στα μέσα της δεκαετίας του '70). Σε αυτό το σημείο, η στερεή μεμβράνη ή στύπωμα (blot), περιέχει πολλές χιλιάδες τμήματα που παρατάσσονται σύμφωνα με το μέγεθός τους. Εάν εξετάζαμε όλα αυτά τα τεμάχια μαζί, θα ήταν αδύνατο να διακριθεί το ένα από το άλλο λόγω του μεγάλου τους αριθμού. Πώς διαλέγουμε τα συγκεκριμένα τμήματα DNA; Εικόνα ιάσπαση του DNA με το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Στο Β, το ένζυμο διασπά τρεις ακολουθίες αναγνώρισης GAATTC, παράγοντας δύο μικρότερα τμήματα. Στο Α, η μέση ακολουθία είναι GAATTT αντί GAATTC, έτσι δεν μπορεί να διασπαστεί από το ένζυμο. Το αποτέλεσμα είναι ένα ενιαίο τμήμα μεγαλύτερο μήκους. Εδώ, είναι δυνατό να χρησιμοποιηθεί ο κανόνας της συμπληρωματικότητας των βάσεων του DNA. Ένα μόριο-ανιχνευτής κατασκευάζεται χρησιμοποιώντας τις τεχνικές ανασυνδυασμένου DNA (Πλαίσιο 3-1). Αυτός ο έλεγχος αποτελείται από ένα μικρό κομμάτι μονόκλωνου ανθρώπινου DNA (μήκους μερικών Kb) που έχει εισαχθεί σε ένα φορέα κλωνοποίησης όπως ένας βακτηριοφάγος, ένα πλασμίδιο, ή ένα κοσμίδιο. Το μόριο-ανιχνευτής σημαίνεται, συνήθως με ένα ραδιενεργό ισότοπο. Το στύπωμα εκτίθεται σε χιλιάδες αντίγραφα του ραδιενεργά σημασμένου μορίουανιχνευτή, ο οποίος υπό κατάλληλες συνθήκες θα αναγνωρίσει και θα προσδεθεί στη συμπληρωματική του αλληλουχία στα μονόκλωνα τμήματα DNA του στυπώματος (απαιτείται ένας μεγάλος αριθμός αντιγράφων του μορίου-ανιχνευτή έτσι ώστε να εμφανιστεί ισχυρό σήμα). ΠΛΑΙΣΙΟ 3.1 Γενετική μηχανική, ανασυνδυασμένο DNA, και κλωνοποίηση Τις τελευταίες δύο δεκαετίες, το μεγαλύτερο μέρος της κοινής γνώμης έχει αποκτήσει σχετική οικειότητα με τους όρους "ανασυνδυασμένο DNA," "κλωνοποίηση," και "γενετική μηχανική." Πράγματι, αυτές οι τεχνικές αποτελούν τον πυρήνα αυτού που συχνά ονομάζεται "νέα γενετική." Η γενετική μηχανική αναφέρεται στην εργαστηριακή αλλαγή των γονιδίων. ιάφορες αλλαγές μπορούν να γίνουν. Ιδιαίτερης σπουδαιότητας στην ιατρική γενετική χρήζει η κατασκευή κλώνων. Εν συντομία, ένας κλώνος είναι ένα ίδιο αντίγραφο μιας ακολουθίας DNA. Θα περιγραφεί στη συνέχεια μια προσέγγιση στην τεχνητή κλωνοποίηση των ανθρώπινων γονιδίων. Ο στόχος μας είναι να παρεμβάλουμε μια ανθρώπινη ακολουθία DNA σε έναν οργανισμό γρήγορα αναπαραγόμενο έτσι ώστε να δημιουργήσουμε γρήγορα πολλά αντίγραφα (κλώνοι) του DNA. Ένα σύστημα που χρησιμοποιείται συνήθως για αυτόν το λόγο είναι το πλασμίδιο, που είναι ένα μικρό, κυκλικό, αυτό-διπλασιαζόμενο κομμάτι DNA που εποικεί σε πολλά βακτήρια. Τα πλασμίδια μπορούν να αφαιρεθούν από τα βακτήρια ή να εισαχθούν σε αυτά χωρίς να αναστατώσουν σοβαρά τη βακτηριακή αύξηση ή την αναπαραγωγή. Για να εισαγάγουμε ανθρώπινο DNA σε πλασμίδιο, χρειαζόμαστε έναν τρόπο να κόψουμε το DNA σε ευκολοχείριστα τμήματα. Τα ένζυμα περιορισμού, που προαναφέρθηκαν, εκτελούν αυτήν την λειτουργία αποτελεσματικά. Η ακολουθία DNA 25

26 Σχήμα Η διαδικασία RFLP. Το DNA εξάγεται από τα δείγματα αίματος των εξεταζόμενων Α, Β, και Γ. Το DNA διασπάται με ένζυμο περιορισμού και φορτώνεται ακολούθως σε ένα πήκτωμα. Η ηλεκτροφόρηση διαχωρίζει τα τμήματα DNA ανάλογα με το μέγεθος. Το DNA μετουσιώνεται και μεταφέρεται σε στερεή μεμβράνη, όπου υβριδοποιείται με ραδιενεργά σημασμένο μόριο-ανιχνευτή. Η έκθεσή του σε ακτινολογικό φιλμ (αυτοραδιογραφία, autoradiography) αποκαλύπτει ειδικά τμήματα DNA (ζώνες) διαφορετικού μεγέθους στα άτομα Α, Β, και Γ. που αναγνωρίζεται από το ένζυμο περιορισμού EcoRI, GAATTC, έχει την εύχρηστη ιδιότητα ότι η συμπληρωματική ακολουθία της, CTTAAG, είναι η ίδια, με αντίθετη όμως φορά. Τέτοιες ακολουθίες καλούνται παλίνδρομες (palindromes). Όταν το πλασμίδιο ή το ανθρώπινο DNA διασπάται με EcoRI, τα τεμάχια που προκύπτουν έχουν άνισα- "συμπληρωματικά άκρα" (sticky ends) (Εικόνα 3-14). Εάν το ανθρώπινο DNA και το πλασμιδιακό DNA διασπαστούν με αυτό το ένζυμο, και οι δύο τύποι τμημάτων DNA που θα προκύψουν θα περιέχουν μονόκλωνα άκρα που μπορούν να υποβληθούν σε συμπληρωματική ένωση 26

27 βάσεων το ένα με το άλλο. Κατόπιν, όταν ανθρώπινο και πλασμιδιακό DNA αναμιχθούν μεταξύ τους, ανασυνδυάζονται (recombine) (εξ ού και ο όρος ανασυνδυασμένο DNA). Τα πλασμίδια που προκύπτουν περιέχουν ένθετα τμήματα ανθρώπινου DNA. Τα πλασμίδια επαναεισάγονται στα βακτήρια, όπου αναπαράγονται γρήγορα και αυτόνομα και μέσω της φυσικής κυτταροδιαίρεσης του ξενιστή. Η ανθρώπινη ακολουθία DNA, που αναπαράγεται μαζί με το πλασμιδιακό DNA, έχει έτσι κλωνοποιηθεί. Το πλασμίδιο αναφέρεται ως φορέας (vector). ιάφορα άλλα μόρια μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν σαν φορείς κλωνοποίησης, όπως οι βακτηριοφάγοι (ιοί που μολύνουν τα βακτηρίδια), τα κοσμίδια (υβρίδια φάγων-πλασμιδίων ικανά να μεταφέρουν μεγάλα σχετικά ένθετα DNA), τα τεχνητά χρωμοσώματα ζύμης (YACs, οχήματα που εισάγονται στα κύτταρα ζύμης και που συμπεριφέρονται σαν τα συνηθισμένα χρωμοσώματα ζύμης), τα βακτηριακά Εικόνα Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA. Ανθρώπινο και κυκλικό πλασμιδιακό DNA διασπώνται από ένα ένζυμο περιορισμού, παράγοντας μονόκλωνα συμπληρωματικά άκρα (1-3). Αυτό επιτρέπει στο ανθρώπινο DNA να ανασυνδυαστεί και να επαναδιαταχθεί με το πλασμιδιακό DNA. Εντός του πλασμιδιακού DNA, το ανθρώπινο DNA διπλασιάζεται πλέον όταν το πλασμίδιο εισαχθεί στο βακτήριο Escherichia coli (4) 27

28 τεχνητά χρωμοσώματα (BACs), και, πρόσφατα, τα ανθρώπινα τεχνητά χρωμοσώματα (βλ. Κεφάλαια 8 και 13). Ενώ τα πλασμίδια και οι βακτηριοφάγοι μπορούν να προσαρμόσουν σχετικά μικρά μόνο ένθετα (περίπου 10 και 20 Kb, αντίστοιχα), τα κοσμίδια μπορούν να φέρουν ένθετα 50 Kb περίπου, και τα YACs μπορεί να φέρουν ένθετα μήκους μέχρι και Kb. Η κλωνοποίηση χρησιμοποιείται τυπικά για να δημιουργήσει τα χιλιάδες αντίγραφα του ανθρώπινου DNA που απαιτούνται για τη στύπωση κατά Southern και τις άλλες πειραματικές εφαρμογές. Επιπλέον, αυτή η προσέγγιση χρησιμοποιείται τώρα για να παράγει γενετικά τροποποιημένα θεραπευτικά προϊόντα, όπως ινσουλίνη, ιντερφερόνη, ανθρώπινη αυξητική ορμόνη, παράγοντα πήξης VIII (που χρησιμοποιείται στην θεραπεία της αιμορροφιλίας τύπου Α, μιας διαταραχής της πήξης του αίματος), και ενεργοποιητή πλασμινογόνου ιστού (tissue plasminogen activator) (μια θρομβολυτική πρωτεΐνη του αίματος που βοηθά στην αποτροπή καρδιακών προσβολών και εμφραγμάτων). Όταν αυτά τα γονίδια κλωνοποιούνται σε βακτήρια ή άλλους οργανισμούς, ο οργανισμός παράγει το ανθρώπινο γονιδιακό προϊόν μαζί με τα δικά του γονιδιακά προϊόντα. Στο παρελθόν, αυτά τα προϊόντα λαμβάνονταν από αίμα δότη ή από άλλα ζώα και οι διαδικασίες απομόνωσης και εμπλουτισμού τους ήταν αργές και δαπανηρές. Τα γενετικά τροποποιημένα γονιδιακά προϊόντα γίνονται γρήγορα μια φτηνότερη και αποδοτικότερη εναλλακτική λύση. Επειδή το μέγεθος του μορίου-ανιχνευτή είναι μερικά μόνο Kb, το μόριοανιχνευτής προσδιορίζει ένα συγκεκριμένο τμήμα του DNA, συνήθως μόλις ένα ή δύο τμήματα. Για να απεικονιστεί η θέση του υβριδοποιημένου μορίου-ανιχνευτή, το στύπωμα εκτίθεται σε ακτινογραφικό φιλμ, που σκουραίνει στη θέση του μορίουανιχνευτή λόγω της εκπομπής των ραδιενεργών μορίων από τον σημασμένο μόριο. Αυτές οι θέσεις αναφέρονται συνήθως ως "ζώνες," και το φιλμ καλείται αυτοραδιογραφία (Εικόνα 3-15). Εικόνα Μία αυτοραδιογραφία, που παρουσιάζει τις θέσεις μιας ζώνης 4.1-Kb και μιας ζώνης 3.3-Kb. Κάθε σειρά αντιπροσωπεύει το DNA από ένα μέλος στην οικογένεια της οποίας το γενεαλογικό δέντρο παρουσιάζεται επάνω από το αυτοραδιογράφημα. Ο όρος πολυμορφισμοί μήκους τμημάτων περιορισμού (restriction fragment length polymorphism) πρέπει τώρα να είναι αυτεξήγητος. Πρόκειται για 28

29 πολυμορφισμούς, που αποκαλύπτονται από την παραλλαγή στα μήκη των τμημάτων περιορισμού. Τα RFLPs προκύπτουν από παραλλαγές στην αλληλουχία του DNA στις θέσεις περιορισμού. Αυτές οι παραλλαγές παράγουν τα διαφορετικού μήκους τμήματα DNA, τα οποία ταξινομούνται κατά την ηλεκτροφόρηση και απεικονίζονται μέσω της χρήσης σημασμένων μορίων-ανιχνευτών. Εικόνα ιάσπαση του DNA του γονιδίου της β - σφαιρίνης από το ένζυμο περιορισμού MstΙΙ. Η μεταλλαγή που οδηγεί σε δρεπανοκυτταρική αναιμία, αφαιρεί μία περιοχή αναγνώρισης MstΙΙ, παράγοντας έναν μακρύτερο τμήμα μήκους 1.3-Kb. Η κανονική ακολουθία DNA περιλαμβάνει την περιοχή περιορισμού (δηλ., την ακολουθία CCTGAG αντί της CCTGTG), έτσι παράγεται ένα κοντύτερο τεμάχιο μήκους 1.1-Kb. Επομένως, στην αυτοραδιογραφία, οι ομοζυγώτες δρεπανοκυττάρωσης έχουν μια μοναδική ζώνη μήκους 1.3-Kb, οι κανονικοί ομοζυγώτες έχουν μια μοναδική ζώνη μήκους 1.1-Kb, και οι ετεροζυγώτες έχουν και τις δύο ζώνες μήκους 1.1-Kb & 1.3-Kb. Σημειώστε ότι το σχέδιο ζώνωσης που απεικονίζεται εδώ, και βασίζεται στις διαφορές στην ακολουθία του DNA, μοιάζει με το σχέδιο ζώνωσης που παρουσιάζεται στην Εικόνα 3-11, το οποίο είναι βασισμένο στις ακολουθίες αμινοξέος αιμοσφαιρίνης που ανιχνεύονται με ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. Η διαδικασία RFLP μπορεί να διευκρινιστεί χρησιμοποιώντας το παράδειγμα της δρεπανοκυτταρικής ασθένειας. Όπως συζητήθηκε προηγουμένως, τα κανονικά άτομα έχουν γλουταμινικό οξύ στη θέση 6 του πολυπεπτιδίου της β - σφαιρίνης. Το γλουταμινικό οξύ κωδικοποιείται από την ακολουθία DNA GAG. Η μεταλλαγή που προκαλεί την δρεπανοκυτταρική αναιμία οδηγεί στην ακολουθία GTG στη θέση της GAG, αναγκάζοντας τη βαλίνη να αντικαταστήσει το γλουταμινικό οξύ. Το ένζυμο περιορισμού MstΙΙ αναγνωρίζει την ακολουθία DNA CCTNAGG (το Ν δηλώνει ότι το ένζυμο θα αναγνωρίσει οποιαδήποτε βάση DNA σε αυτή τη θέση). Κατά συνέπεια, το MstΙΙ αναγνωρίζει και διασπά την ακολουθία DNA του "κανονικού" χρωμοσώματος στη θέση αυτή, καθώς επίσης και στις θέσεις περιορισμού εκατέρωθεν αυτής (Εικόνα 3-16). Το αποτέλεσμα είναι δύο τμήματα DNA, ένα μήκους 1.100ζβ και ένα άλλο μήκους μόλις 200ζβ. Στα χρωμοσώματα που υπάρχει το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο, το MstΙΙ δεν μπορεί να αναγνωρίσει την ακολουθία, έτσι το μεταλλαγμένο DNA δε διασπάται στο σημείο αυτό. Εν τούτοις, οι περιοχές περιορισμού που πλαισιώνουν την περιοχή ενδιαφέροντος, που δεν ποικίλλουν, διασπώνται κανονικά. Το αποτέλεσμα είναι ένα ενιαίο τμήμα DNA που είναι μακρύτερο από το μεγάλου μήκους τμήμα που παράγεται από το κανονικό χρωμόσωμα (δηλ ζβ αντί 1.100ζβ). Επειδή τα μικρότερου μήκους τμήματα μετακινούνται γρηγορότερα στο πήκτωμα, τα δύο τμήματα διαφορετικού μεγέθους μπορούν εύκολα να διακριθούν μετά από την υβριδοποίηση του στυπώματος με ένα μόριο-ανιχνευτή που περιέχει το DNA του γονιδίου της β-σφαιρίνης. Σε αυτήν την περίπτωση, η προσέγγιση RFLP επιτρέπει την άμεση ανίχνευση της μεταλλαγής που προκάλεσε την ασθένεια. Στην τρέχουσα πρακτική, χρησιμοποιούνται 29

30 αποδοτικότερες μέθοδοι για να εξετάσουν τις δρεπανοκυτταρικές μεταλλαγές (βλ. Κεφάλαιο 13). Εν τούτοις, η προσέγγιση που περιγράφηκε εδώ παραμένει χρήσιμη για την ανίχνευση πολλών πολυμορφισμών και μεταλλαγών που προκαλούν ασθένεια. Υπάρχουν αρκετές χιλιάδες γνωστά ένζυμα περιορισμού, τα περισσότερα από τα οποία αναγνωρίζουν μια διακριτή ακολουθία DNA. Επιπλέον, χιλιάδες διαφορετικά μόρια-ανιχνευτές έχουν δημιουργηθεί, κάθε ένα αντιπροσωπεύοντας ένα διαφορετικό μικρό κομμάτι της ανθρώπινης ακολουθίας DNA. Με το συνδυασμό αυτών των διάφορων μορίων-ανιχνευτών και ενζύμων, οι ερευνητές έχουν προσδιορίσει χιλιάδες πολυμορφικές θέσεις στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Αυτοί οι πολυμορφισμοί συνέβαλαν στον εντοπισμό πολλών σημαντικών μονογονιδιακών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων εκείνων για την κυστική ίνωση, την ασθένεια Huntington, και τη νευροϊνωμάτωση τύπου 1 (βλ. Κεφάλαιο 8). ΙΑ ΟΧΙΚΑ ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΟΙ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΙ Η προσέγγιση που μόλις περιγράφηκε ανιχνεύει συνήθως την παρουσία ή την απουσία μιας περιοχής περιορισμού, τέτοιοι πολυμορφισμοί καλούνται συχνά πολυμορφισμοί περιοχών περιορισμού (restriction site polymorphisms) (RSPs). Αυτοί οι πολυμορφισμοί έχουν δύο μόνο πιθανά αλληλόμορφα γονίδια, τοποθετώντας ένα όριο στο ποσό της γενετικής ποικιλομορφίας που μπορεί να φανεί. Περισσότερη ποικιλομορφία θα μπορούσε να παρατηρηθεί εάν ένα πολυμορφικό σύστημα είχε πολλά αλληλόμορφα γονίδια και όχι μόνο δύο. Μία παραλλαγή της προσέγγισης RFLP έχει παράγει ακριβώς ένα τέτοιο σύστημα. Αυτή η ιδιαίτερη παραλλαγή εκμεταλλεύεται τους μινιδορυφόρους που υπάρχουν σε όλο το γονιδίωμα. Όπως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο 2, οι μινιδορυφόροι είναι περιοχές στις οποίες η ίδια ακολουθία DNA επαναλαμβάνεται με διαδοχικό τρόπο. Η γενετική παραλλαγή που μετριέται είναι ο αριθμός των επαναλήψεων σε μία δεδομένη περιοχή, η οποία ποικίλλει σημαντικά από άτομο σε άτομο-ως εκ τούτου ο όρος μεταβλητός αριθμός διαδοχικών επαναλήψεων (variable number of tandem repeats), ή VNTRs. Εικόνα Πολυμορφισμοί VNTR Οι διαφορετικού μήκους ζώνες, Α και Β, δημιουργούνται από τους διαφορετικούς αριθμούς διαδοχικών επαναλήψεων στο DNA σε δύο διαφορετικά χρωμοσώματα. Οι περιοχές περιορισμού βρίσκονται σε κάθε πλευρά (εκατέρωθεν) της περιοχής επανάληψης, και ένα ραδιενεργά σημασμένο μόριο-ανιχνευτής υβριδοποιείται στο DNA, επιτρέποντας την απεικόνιση τμημάτωνν διαφορετικού μήκους σε αυτοραδιογραφία. Τα VNTRs ανιχνεύονται με ανάλογη διαδικασία με αυτήν που χρησιμοποιείται στα συμβατικά RFLPs. Το DNA διασπάται με ένα ένζυμο περιορισμού, και τα τμήματα που προκύπτουν ηλεκτροφορούνται, μετουσιώνονται, και μεταφέρονται σε ένα στερεό μέσο. Η κύρια διαφορά είναι ότι χρησιμοποιούνται ειδικά μόριαανιχνευτές που υβριδοποιούνται σε μια μόνο δεδομένη μινιδορυφορική περιοχή. Εκτιμώντας ότι οι RSPs αποκαλύπτουν πολυμορφισμούς λόγω της παρουσίας ή της απουσίας μιας περιοχής περιορισμού, οι VNTRs αποκαλύπτουν πολυμορφισμούς 30

31 λόγω των διαφορετικών αριθμών επαναλήψεων που βρίσκονται μεταξύ δύο σημείων περιορισμού (Εικόνα 3-17). Ο αριθμός διαδοχικών επαναλήψεων μπορεί να ποικίλει αρκετά στους πληθυσμούς: μια μινιδορυφορική περιοχή θα μπορούσε να έχει μόνο 2 ή 3 επαναλήψεις ή ακόμα 20 ή περισσότερες. Αυτοί οι πολυμορφισμοί μπορούν επομένως να αποκαλύψουν έναν υψηλό βαθμό γενετικής ποικιλότητας. Αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για τη χαρτογράφηση γονιδίων με τη διαδικασία της ανάλυσης σύνδεσης, που συζητείται στο Κεφάλαιο 8. Τα VNTRs είναι μια μορφή RFLP που προκύπτει από την παραλλαγή στον αριθμό των διαδοχικών επαναλήψεων σε μια περιοχή DNA. Επειδή οι θέσεις VNTR μπορούν να έχουν πολλά διαφορετικά αλληλόμορφα γονίδια, είναι ιδιαίτερα χρήσιμες στην ιατρική γενετική καθώς και σε άλλες εφαρμογές. Ακριβώς όπως οι μινιδορυφορικές περιοχές μπορεί να ποικίλουν σε μήκος, και οι μικροδορυφόροι μπορεί επίσης να ποικίλουν στο μήκος ως αποτέλεσμα των διαφορετικών αριθμών επαναλήψεων (βλ. Κεφάλαιο 2). Κάθε μικροδορυφορική επανάληψη είναι σημαντικά μικρότερη από μία μινιδορυφορική επανάληψη (τυπικά μήκους 2, 3, ή 4ζβ). Αυτές αναφέρονται ως δινουκλεοτιδικές, τρινουκλεοτιδικές και τετρανουκλεοτιδικές επαναλήψεις, αντίστοιχα, και είναι γνωστές συλλογικά ως σύντομες ή βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις (short tandem repeats). Η σύντομη ή βραχεία διαδοχική επανάληψη μπορεί να εμφανιστεί αρκετές εκαντοντάδες φορές. Ο αριθμός αυτός ποικίλλει αρκετά μεταξύ των ατόμων και συνήθως μεταξύ των δύο ομόλογων χρωμοσωμάτων κάθε ατόμου. Αυτοί οι σύντομοι ή βραχείς διαδοχικά επαναλαμβανόμενοι πολυμορφισμοί (short tandem repeat polymorphisms) (STRPs) διαφέρoυν από τα VNTRs που μόλις αναφέραμε από την άποψη του μεγέθους και επίσης από το ότι δεν καθορίζονται από περιοριστικές θέσεις που να περιβάλλουν την περιοχή της επανάληψης. Αντ' αυτού, για την απομόνωσή τους χρησιμοποιείται η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης, που θα συζητηθεί στη συνέχεια. Όπως τα VNTRs, και τα STRPs είναι ιδιαίτερα χρήσιμα για τη χαρτογράφηση γονιδίων. Είναι αφθονότερα από τα VNTRs, διανέμονται πιο ομοιόμορφα στο γονιδίωμα, και είναι ευκολότερο να ελεγχθούν εργαστηριακά. Κατά συνέπεια, αποτελούν πολυμορφισμό επιλογής στις περισσότερες μελέτες χαρτογράφησης γονιδίων. Και οι δύο τύποι πολυμορφισμών είναι χρήσιμοι στις δικανικές/ιατροδικαστικές εφαρμογές, όπως ο έλεγχος πατρότητας και η αναγνώριση υπόπτων εγκλήματος (forensics) (Πλαίσιο 3-2). ΠΛΑΙΣΙΟ 3,2. Σχεδιαγράμματα-αποτυπώματα-προφίλ DNA στη δικανική ρύθμιση Λόγω του μεγάλου αριθμού πολυμορφισμών που παρατηρούνται στο ανθρώπινο γονιδίωμα, είναι ουσιαστικά σίγουρο ότι κάθε ένας από μας είναι γενετικά μοναδικός (με εξαίρεση τους μονοζυγωτικούς διδύμους). Συνεπώς η γενετική ποικιλότητα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να ταυτοποιήσει τα άτομα, ανάλογα με το συμβατικό δακτυλικό αποτύπωμα. Επειδή το DNA μπορεί να βρεθεί σε οποιοδήποτε δείγμα ιστού, συμπεριλαμβανομένου του αίματος, του σπέρματος, και ακόμη και της τρίχας, * (*ακόμα και τα δακτυλικά αποτυπώματα μπορεί να περιέχουν αρκετό DNA για ενίσχυση με PCR και προσδιορισμό του προφίλ του DNA) η γενετική ποικιλότητα θα μπορούσε να προσφέρει ουσιαστικές δυνατότητες στις δικανικές εφαρμογές (π.χ., εγκληματικές περιπτώσεις, διερεύνηση πατρότητας, αναγνώριση των θυμάτων ενός ατυχήματος). VNTRs και STRPs, με τα πολλά αλληλόμορφα γονίδιά τους, είναι πολύ χρήσιμα στην καθιέρωση ενός ιδιαίτερα εξειδικευμένου προφίλ DNA (DNA profile). Η αρχή ενός προφίλ DNA είναι αρκετά απλή. Εάν εξετάσουμε αρκετούς πολυμορφισμούς σε ένα δεδομένο άτομο, η πιθανότητα οποιοδήποτε άλλο άτομο στον πληθυσμό να έχει το ίδιο αλληλόμορφο γονίδιο σε κάθε γενετική θέση που εξετάζεται γίνεται εξαιρετικά μικρή. Το DNA που μένει στον τόπο ενός εγκλήματος υπό τη μορφή αίματος ή σπέρματος, 31

32 παραδείγματος χάριν, μπορεί να διερευνηθεί για μια σειρά VNTRs, ή/και STRPs. Λόγω της εξαιρετικής ευαισθησίας της τεχνικής PCR, ακόμη και ένα μικροσκοπικό, πεπαλαιωμένο για χρόνια δείγμα μπορεί να αποδώσει επαρκές DNA για εργαστηριακή ανάλυση (αν και απαιτείται μεγάλη προσοχή για την αποφυγή μολύνσεων με τη χρήση PCR σε τέτοια δείγματα). Τα ανιχνευμένα αλληλόμορφα γονίδια συγκρίνονται έπειτα με τα αλληλόμορφα γονίδια ενός υπόπτου (Εικόνα 3-18). Εάν τα αλληλόμορφα γονίδια στα δύο δείγματα ταιριάζουν, ο ύποπτος εμπλέκεται. Μία ερώτηση κλειδί είναι εάν ένα άλλο πρόσωπο στο γενικό πληθυσμό θα μπορούσε να έχει τα ίδια αλληλόμορφα γονίδια με τον ύποπτο. Θα μπορούσε τότε το προφίλ DNA να εμπλέξει ψευδώς το λανθασμένο πρόσωπο; Σε εγκληματικές περιπτώσεις, υπολογίζεται η πιθανότητα λήψης αλληλόμορφου ταιριάσματος με ένα τυχαίο μέλος του πληθυσμού. Λόγω του υψηλού βαθμού ποικιλότητας των αλληλόμορφων VNTRs και STRPs, η πιθανότητα είναι συνήθως πολύ μικρή. Μία ομάδα μόλις τεσσάρων θέσεων VNTR έχει συνήθως τυχαία πιθανότητα αντιστοίχισης περίπου 1 στο 1 εκατομμύριο. Η χρήση 13 STRPs, που είναι τώρα κοινή πρακτική, παράγει τυχαίες πιθανότητες αντιστοίχισης περίπου 1 στο 1 τρισεκατομμύριο. Υπό τον όρο ότι ένας αρκετά μεγάλος αριθμός θέσεων χρησιμοποιείται υπό καλά-ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες, και υπό τον όρο ότι τα στοιχεία συλλέγονται και αξιολογούνται προσεκτικά, τα προφίλ DNA μπορούν να εφοδιάσουν με ιδιαίτερα χρήσιμα δικανικά στοιχεία. Εικόνα Σχεδιαγράμματα DNA. Το αυτοραδιογράφημα δείχνει ότι το σχέδιο ζωνών του DNA από τον ύποπτο Α δεν ταιριάζει με το DNA που λαμβάνεται από τον τόπο εγκλήματος (C), ενώ το σχέδιο ζωνών από τον ύποπτο Β ταιριάζει. Στην πράξη, δοκιμάζονται διάφορα τέτοια VNTRs ή STRPs για να μειώσουν τη πιθανότητα ψευδούς αντιστοίχισης. (Εργαστήριο Jay Henry, Criminalistics ευγένειας, τμήμα δημόσιας ασφάλειας, κράτος του Utah.) Αν και τείνουμε να σκεφτούμε τέτοια στοιχεία από την άποψη του προσδιορισμού του ένοχου συμβαλλόμενου μέρους, πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι όταν δεν λαμβάνεται μία αντιστοιχία, ένας ύποπτος μπορεί να απαλλαχθεί. Έχει αναφερθεί ότι, μεταξύ των περιπτώσεων βιασμών στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν προφίλ DNA, περίπου το ένα τρίτο των υπόπτων ελευθερώθηκε επειδή το DNA τους δεν ταίριαξε με αυτό του ενοχοποιητικού δείγματος. Επιπλέον, η δοκιμή DNA "μετά τη καταδίκη" έχει οδηγήσει στην απελευθέρωση 32

33 διάφορων ατόμων που φυλακίστηκαν λανθασμένα. Κατά συνέπεια, τα προφίλ DNA μπορούν επίσης να ωφελήσουν εκείνους που κατηγορούνται ψευδώς. ΕΝΙΣΧΥΣΗ DNA ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙ ΩΤΗΣ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ Οι προσεγγίσεις RFLP και VNTR, που είναι χρήσιμες σε πολλές εφαρμογές, εξαρτήθηκαν αρχικά από τις διαδικασίες κλωνοποίησης και στύπωσης κατά Southern. Αυτές οι τεχνικές πάσχουν από ορισμένους περιορισμούς. Η κλωνοποίηση είναι χρονοβόρα, απαιτώντας συχνά μια εβδομάδα ή και περισσότερο εργαστηριακό χρόνο. Επιπλέον, η τυπική διαδικασία στύπωσης κατά Southern απαιτεί μεγάλα σχετικά ποσά καθαρού DNA, συνήθως αρκετά μικρογραμμάρια (έως 1ml φρέσκου αίματος θα απαιτούνταν για να παράγει τόσο πολύ DNA). Μία νεότερη προσέγγιση στην παραγωγή αντιγράφων DNA, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), έχει κάνει την ανίχνευση της γενετικής ποικιλότητας σε επίπεδο DNA αποδοτικότερη. Ουσιαστικά, η PCR είναι ένας τεχνητός τρόπος πολλαπλασιασμού μίας σύντομης, ειδικής αλληλουχίας DNA (μήκους μερικών Kb ή μικρότερης) πολύ γρήγορα, έτσι ώστε να προκύπτουν εκατομμύρια αντιγράφων της συγκεκριμένης ακολουθίας. Η διαδικασία PCR, που συνοψίζεται στην Εικόνα 3-19, απαιτεί τέσσερα συστατικά: 1. ύο εκκινητές, κάθε ένας από τους οποίους αποτελείται από 15 έως 20 βάσεις του DNA. Αυτές οι μικρές αλληλουχίες DNA ονομάζονται ολιγονουκλεοτίδια. Οι εκκινητές αντιστοιχούν στις ακολουθίες DNA με άμεση γειτνίαση στην ακολουθία ενδιαφέροντος (όπως μια ακολουθία που περιέχει έναν πολυμορφισμό διαδοχικής επανάληψης ή μια μεταλλαγή που προκαλεί ασθένεια). Οι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές συνθέτονται χρησιμοποιώντας ένα εργαστηριακό όργανο. 2. DNA πολυμεράση. Μία θερμικά σταθερή μορφή αυτού του ενζύμου, που προέρχεται κύρια από το βακτήριο Thermus aquaticus, εκτελεί τη ζωτικής σημασίας διαδικασία του διπλασιασμού του DNA (που καλείται εδώ επέκταση εκκινητών). 3. Ένας μεγάλος αριθμός ελεύθερων νουκλεοτιδίων DNA. 4. Γενωμικό DNA του ατόμου. Λόγω της εξαιρετικής ευαισθησίας της PCR, η ποσότητα του DNA μπορεί να είναι πολύ μικρή. Το γενωμικό DNA θερμαίνεται αρχικά σε μια σχετικά υψηλή θερμοκρασία (περίπου 95 C) έτσι ώστε μετουσιώνεται και μετατρέπεται σε μονόκλωνο. Εκτίθεται ακολούθως σε μεγάλες ποσότητες μορίων εκκινητών, που υβριδιοποιούνται, ή περιελίσσονται, στις συμπληρωματικές τους βάσεις στο γενωμικό DNA κατά τη διάρκεια της ψύξης του σε θερμοκρασίες ανέλιξης από 35 έως 65 C περίπου. Το DNA θερμαίνεται έπειτα σε μια ενδιάμεση θερμοκρασία (70 με 75 C). Παρουσία ενός μεγάλου αριθμού ελεύθερων βάσεων DNA, ένας νέος κλώνος DNA συντίθεται από την DNA πολυμεράση στη θερμοκρασία αυτή, ως προέκταση της ακολουθίας των εκκινητών. Το νεοσυντιθέμενο DNA αποτελείται από δίκλωνη αλυσίδα που έχει το 5 άκρο του εκκινητή στη μία πλευρά, και ακολουθείται από τις βάσεις που προστίθενται μέσω της επέκτασης του εκκινητή από την DNA πολυμεράση. Αυτό το δίκλωνο DNA θερμαίνεται πάλι σε υψηλή θερμοκρασία, για να μετουσιωθεί. Ο κύκλος θέρμανσης-ψύξης επαναλαμβάνεται. Τώρα, το νεοσυντιθέμενο DNA χρησιμεύει ως καλούπι για περαιτέρω σύνθεση. Καθώς επαναλαμβάνονται οι κύκλοι ψύξης-θέρμανσης, τα προϊόντα DNA που 33

34 Εικόνα Η διαδικασία PCR. Το γενωμικό DNA θερμαίνεται αρχικά και αποδιατάσσεται σχηματίζοντας μονόκλωνες αλυσίδες. Στην φάση επαναδιάταξης, το DNA ψύχεται, επιτρέποντας την υβριδοποίηση με τις ακολουθίες εκκινητών, που πλαισιώνουν την περιοχή ενδιαφέροντος. Κατόπιν η αντίδραση θερμαίνεται σε μια ενδιάμεση θερμοκρασία επέκτασης των εκκινητών, όπου η DNA πολυμεράση προσθέτει τις ελεύθερες βάσεις με κατεύθυνση 5 προς 3 κατά μήκος κάθε μονόκλωνης αλυσίδας, που αρχίζει από τον εκκινητή. Σχηματίζονται κομμάτια DNA με ίσα άκρα, που αποτελούν το υπόστρωμα για τον επόμενο κύκλο θέρμανσης και ψύξης. Η επαναλαμβανόμενη θερμική ανακύκλωση παράγει έναν μεγάλο αριθμό τμημάτων DNA που καταλήγουν σε κάθε τους άκρο στην αλληλουχία του εκκινητή. προσδένονται στον εκκινητή ενισχύονται γεωμετρικά: ο αριθμός αντιγράφων διπλασιάζεται σε κάθε κύκλο (δηλ., 2, 4, 8, 16, και τα λοιπά). Γι αυτό και η διαδικασία ονομάζεται "αλυσιδωτή αντίδραση." Χαρακτηριστικά, οι κύκλοι επαναλαμβάνονται 20 έως 30 φορές, παράγοντας εκατομμύρια αντίγραφα του αρχικού DNA. Εν περιλήψει, η διαδικασία PCR αποτελείται από τρία βασικά βήματα: Μετουσίωση DNA σε υψηλή θερμοκρασία, υβριδοποίηση εκκινητών σε χαμηλή θερμοκρασία, και επέκταση εκκινητών σε ενδιάμεση θερμοκρασία. Το αποτέλεσμα 34

35 είναι ένα προϊόν που αποτελείται σχεδόν εξ ολοκλήρου από μια καθορισμένη αλληλουχία DNA. Η PCR έχει διάφορα πλεονεκτήματα ως προς τις παλαιότερες τεχνικές. Κατ' αρχάς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί με εξαιρετικά μικρές ποσότητες DNA (συνήθως νανογραμμάρια, σχετικά με τα μικρογραμμάρια που απαιτούνται για την κλωνοποίηση). Το ποσό του DNA που βρίσκεται σε έναν παλαιό λεκέ αίματος, μία μόνο τρίχα, ή ακόμα και το πίσω μέρος ενός γραμματοσήμου που κολλήθηκε με σάλιο, είναι συχνά ικανοποιητικό για την ανάλυση. εύτερον, επειδή δεν απαιτείται κλωνοποίηση γονιδίων, η διαδικασία είναι πολύ γρηγορότερη από τις παλαιότερες τεχνικές. Η γενετική διάγνωση της δρεπανοκυτταρικής ασθένειας, που απαιτούσε μια εβδομάδα και πλέον με τις παλαιότερες τεχνικές, μπορεί να γίνει σε μία ημέρα με PCR. Τέλος, επειδή η PCR μπορεί να φτιάξει μεγάλες ποσότητες πολύ καθαρού DNA, περιορίζεται σημαντικά η χρήση ραδιενεργά σημασμένων μορίων-ανιχνευτών για ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών ή μεταλλαγών στο DNA. Αντί' αυτού, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ασφαλέστερες, μη ραδιενεργές ουσίες, όπως η βιοτίνη. Η PCR έχει μερικά μειονεκτήματα. Κατ' αρχάς, η σύνθεση εκκινητών απαιτεί προφανώς γνώση της ακολουθίας DNA που πλαισιώνει την προς ενίσχυση αλληλουχία DNA που μας ενδιαφέρει. Εάν καμία πληροφορία ακολουθίας δεν είναι διαθέσιμη, πρέπει να χρησιμοποιηθούν άλλες τεχνικές. εύτερον, η εξαιρετική ευαισθησία της PCR την καθιστά ευαίσθητη στη μόλυνση στο εργαστήριο. ιάφορες προφυλάξεις λαμβάνονται συνήθως για να περιφρουρήσουν το ενδεχόμενο μόλυνσης. Τέλος, επειδή είναι δύσκολο να εφαρμοστεί η PCR σε αλληλουχίες μακρύτερες από μερικά Kb, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ανιχνεύσει μεγαλύτερες ελλείψεις (δηλ., είναι δύσκολο έως αδύνατο να ενισχύσει τη μεγαλύτερου μήκους, κανονική ακολουθία). Οι τεχνικές στύπωσης κατά Southern χρησιμοποιούνται τυπικά αντ' αυτής. Επειδή η PCR είναι μια τέτοια δυναμική και ευπροσάρμοστη τεχνική, χρησιμοποιείται πλέον εκτενώς στη γενετική διάγνωση ασθενειών, τη δικανική ιατρική, και την εξελικτική γενετική. Έχει αντικαταστήσει τη τεχνική στύπωσης κατά Southern σε πολλές εφαρμογές και χρησιμοποιείται τώρα στον έλεγχο RFLPs και VNTRs. Η PCR είναι τόσο ευαίσθητη που έχει χρησιμοποιηθεί για να αναλύσει το DNA από τις αρχαίες μούμιες και ακόμη και από διάφορα δείγματα Neaderdal ηλικίας μεγαλύτερης των ετών. Η ανάλυση αυτών των δειγμάτων έδειξε ότι οι σύγχρονοι άνθρωποι είναι γενετικά αρκετά διακριτοί από τους Neaderdals και είναι έτσι απίθανο να έχουν εξελιχθεί ευθέως από αυτούς. Η PCR παρέχει ένα κατάλληλο και αποδοτικό τρόπο δημιουργίας εκατομμυρίων αντιγράφων μιας σύντομης ακολουθίας DNA. Οι κύκλοι ψύξης-θέρμανσης χρησιμοποιούνται για να αποδιατάξουν το DNA και να συνθέσουν έπειτα νέα αντίγραφα μιας συγκεκριμένης, ακολουθίας DNA που προσδιορίζεται & περιορίζεται από τις αλληλουχίες των δύο εκκινητών. Λόγω της ταχύτητας και της ευκολίας χρήσης της, αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται τώρα ευρέως για την αξιολόγηση της γενετικής ποικιλότητας, για τη διάγνωση των γενετικών ασθενειών, και για δικανικούς (ιατροδικαστικούς, forensic) λόγους. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΛΛΗΛΟUΧΙΑΣ DNA Σε πολλές γενετικές μελέτες, ένας πρωτεύων στόχος είναι ο καθορισμός της πραγματικής σειράς ζευγών βάσεων DNA που αποτελεί ένα γονίδιο ή ένα μέρος ενός γονιδίου. Μία τέτοια αλληλουχία DNA μπορεί να δείξει πολλά για τη φύση μιας συγκεκριμένης μεταλλαγής, τη λειτουργία ενός γονιδίου και το βαθμό ομοιότητας του γονιδίου με άλλα γνωστά γονίδια. Θα συζητήσουμε αρχικά μία τεχνική που έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για να προσδιορίσει τις αλληλουχίες του DNA. Ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του DNA με τη μέθοδο διδεόξυ (dideoxy), που αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger, χρησιμοποιεί τα 35

36 διδεοξυνουκλεοτίδια για τη διακοπή της επιμυκηνόμενης πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας. Αυτά είναι χημικά αρκετά παρόμοια με τα συνηθισμένα δεοξυνουκλεοτίδια, εκτός από το ότι δεν περιέχουν μια ομάδα υδροξυλίου στο 3 άνθρακα του σακχάρου. Αυτό αποτρέπει τον επόμενο σχηματισμό των φωσφοδιεστερικών δεσμών με τις ελεύθερες βάσεις DNA. Κατά συνέπεια, αν και τα διδεοξυνουκλεοτίδια ενσωματώνονται σε αυξανόμενη αλυσίδα DNA, κανένα νουκλεοτίδιο δεν μπορεί να προστεθεί μετά την ενσωμάτωσή τους. Τέσσερα διαφορετικά διδεοξυνουκλεοτίδια χρησιμοποιούνται, κάθε ένα που αντιστοιχεί σε μια από τις τέσσερις νουκλεοτιδικές βάσεις (Α, C, G, και Τ). Το μονόκλωνο DNA την αλληλουχία του οποίου επιθυμούμε να προσδιορίσουμε αναμιγνύεται με ραδιενεργά σημασμένους εκκινητές, την DNA πολυμεράση, τα συνηθισμένα νουκλεοτίδια, και ένα τύπο διδεοξυνουκλεοτιδίου (Εικόνα 3-20). Ο εκκινητής υβριδοποιείται στην κατάλληλη συμπληρωματική θέση στο μονόκλωνο DNA, και η DNA πολυμεράση προσθέτει τις ελεύθερες βάσεις στο αναπτυσσόμενο μόριο DNA, όπως στη διαδικασία PCR. Σε οποιαδήποτε δεδομένη θέση, είτε ένα συνηθισμένο νουκλεοτίδιο είτε το ομόλογο διδεοξυνουκλεοτίδιο μπορεί να ενσωματωθεί στην αλυσίδα, αυτό είναι μια τυχαία διαδικασία. Εν τούτοις, μόλις ένα διδεοξυνουκλεοτίδιο ενσωματωθεί, η αλυσίδα ολοκληρώνεται και τερματίζεται. Η διαδικασία παράγει έτσι τεμάχια DNA ποικίλου μήκους, με κάθε ένα να λήγει στο ίδιο διδεοξυνουκλεοτίδιο. Τα τμήματα DNA που προκύπτουν μπορούν να διαχωριστούν ηλεκτροφορητικά σύμφωνα με το μήκος τους, όπως συζητήθηκε προηγουμένως. Τέσσερεις διαφορετικές αντιδράσεις προσδιορισμού νουκλεοτιδικής αλληλοuχίας οργανώνονται, μια για κάθε βάση. Τα τμήματα που λαμβάνονται από κάθε αντίδραση υποβάλλονται σε ηλεκτροφόρηση το ένα δίπλα στο άλλο στο ίδιο πήκτωμα, έτσι ώστε η θέση κάθε τμήματος να μπορεί να συγκριθεί. εδομένου ότι κάθε ζώνη αντιστοιχεί σε μια αλυσίδα DNA που λήγει σε μια μοναδική βάση, η ακολουθία DNA μπορεί να διαβαστεί με την παρατήρηση της διάταξης των ζωνών στο πήκτωμα μετά από αυτοραδιογραφία (ο ραδιενεργά σημασμένος εκκινητής δείχνει τη θέση του τμήματος στην ταινία). Η νουκλεοτιδική αλληλουχία αρκετών εκατοντάδων ζευγών βάσεων μπορεί συνήθως να προσδιοριστεί σε μια σειρά αντιδράσεων. Η αλληλοuχία DNA μπορεί να ολοκληρωθεί χρησιμοποιώντας τη μέθοδο διδεόξυ (dideoxy). Αυτή η μέθοδος εξαρτάται από το γεγονός ότι διδεοξυνουκλεοτίδια (dideoxynucleotides) συμπεριφέρονται ανάλογα με τα συνηθισμένα δεοξυνουκλεοτίδια (deoxynucleotides), εκτός από το ότι, μόλις ενσωματωθούν στην αλυσίδα DNA, ολοκληρώνουν την αλυσίδα. Χαρακτηρίζουν έτσι τις θέσεις των συγκεκριμένων βάσεων. Πρέπει να είναι προφανές ότι αυτή η μέθοδος ανάλυσης της αλληλουχίας του DNA (sequencing), είναι μια σχετικά αργή, κοπιώδης, και επιρρεπής σε λάθη διαδικασία. Πιό πρόσφατα, έχουν αναπτυχθεί στρατηγικές αυτοματοποιημένου προσδιορισμού νουκλεοτιδικής αλληλουχίας DNA που χρησιμοποιούν συστήματα ανίχνευσης με φθορισμό, φωταύγεια, ή χρωματομετρία. Η χρήση των σημασμένων με φθορισμόχρωμα εκκινητών ή διδεοξυνουκλεοτιδίων έγινε η δημοφιλέστερη μέθοδος, εν μέρει επειδή μπορεί εύκολα να προσαρμοστεί σε γρήγορη αυτοματοποίηση. Χαρακτηριστικά, ο προσδιορισμός της αλληλουχίας ενός πρότυπου DNA γίνεται με μέθοδο ανάλογη της επιμήκυνσης του εκκινητή στη PCR. Κάθε ένα από τα τέσσερα διαφορετικά νουκλεοτίδια μπορεί να σημανθεί με φθορισμόχρωμα (fluorochrome) που εκπέμπει ένα διακριτό φάσμα φωτός. Τα σημασμένα με φθορισμόχρωμα προϊόντα της αντίδρασης ηλεκτροφορούνται μέσω ενός πολύ λεπτού πηκτώματος πολυακρυλαμίδης, και κατά τη πορεία τους διερχόμενα από ένα 36

37 Εικόνα Ανάλυση της αλληλουχίας του DNA (sequencing) με τη μέθοδο διδεόξυ (dideoxy). Ο σημασμένος εκκινητής προστίθεται στο μονόκλωνο DNA άγνωστης αλληλουχίας. Η DNA πολυμεράση προσθέτει ελεύθερες βάσεις στη μονόκλωνη αλυσίδα, χρησιμοποιώντας τον κανόνα συμπληρωματικότητας των βάσεων. Τέσσερεις διαφορετικές αντιδράσεις πραγματοποιούνται, που αντιστοιχούν στα τέσσερα διδεοξυνουκλεοτίδια (dideoxynucleotides) (ddatp, ddctp, ddgtp, και ddttp). Κάθε ένας από αυτά ολοκληρώνει την αλυσίδα του DNA όποτε ενσωματώνεται αντί του κανονικού δεοξυνουκλεοτιδίου (deoxynucleotide) (datp, dctp, dgtp, και dttp, που αντιστοιχεί στις βάσεις Α, C, G, και T, αντίστοιχα). Η διαδικασία οδηγεί σε τμήματα ποικίλου μήκους, τα οποία μπορούν να διαχωριστούν ηλεκτροφορητικά. Η θέση κάθε τμήματος υποδεικνύεται από την εκπομπή των ραδιενεργών μορίων από τους σημασμένους εκκινητές, που επιτρέπει άμεση ανάγνωση της αλληλουχίας DNA. παράθυρο, διεγείρονται από μια ακτίνα φωτός ενός λέϊζερ. Το εκπεμπόμενο φως συλλέγεται από μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή για τη μετάφρασή του σε ένα ηλεκτρονικό σήμα, και τη δημιουργία μιας σύνθετης εικόνας του πηκτώματος. Αυτή η εικόνα του πηκτώματος αναλύεται για να παραγάγει μια γραφική παράσταση στην οποία κάθε ένα από τα τέσσερα διαφορετικά νουκλεοτίδια απεικονίζεται από μια κορυφή διαφορετικού χρώματος (βλ. έγχρωμη εικόνα 1). Περίπου 500 βάσεις DNA από έως και 96 άτομα μπορεί να αναλυθεί σε ένα μόνο πήκτωμα σε 2 έως 4 ώρες. 37

38 Έγχρωμη Εικόνα 1. Αυτοματοποιημένη ανάλυση της αλληλουχίας του DNA. Α, εικόνα πηκτωμάτων που παράγεται από αυτοματοποιημένο αναλυτή (sequencer). Κάθε σειρά (lane) (με αρίθμηση από 1 38

39 έως 19) αντιπροσωπεύει μια ξεχωριστή αλληλουχία DNA. Τα διαφορετικά χρώματα που εκπέμπονται στην εικόνα του πηκτώματος λόγω σήμανσης με διάφορα φθορισμοχρώματα διαφοροποιούν τις βάσεις μεταξύ τους. Αυτό επιτρέπει το προσδιορισμό της ταυτότητας και τη κατάταξη των βάσεων σε μία αλυσίδα DNA. Β, αναλυθέντα στοιχεία από την ανάλυση ενός πρότυπου-καλουπιού DNA σε αυτοματοποιημένο αναλυτή DNA (sequencer). Οι κορυφές των διαφορετικών χρωμάτων αντιπροσωπεύουν την ταυτότητα και τη σχετική θέση των διαφορετικών νουκλεοτιδίων στην αλληλουχία DNA. Παραδείγματος χάριν, η άνω αριστερά κορυφή είναι μπλε και προσδιορίζει τη θέση μιας κυτοσίνης. Η επόμενη κορυφή είναι κόκκινη, δείχνοντας την παρουσία μίας θυμίνης. Αυτή η διαδικασία ανάλυσης της αλληλουχίας συνεχίζεται μέχρι το τέλος του αναλυόμενου προτύπου DNA (χαρακτηριστικά για μερικές εκατοντάδες ζεύγη βάσεων). Αυτοματοποιημένοι αναλυτές (automated sequencers) μπορούν επίσης να προσαρμοστούν στον έλεγχο STRPs, μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών, και άλλων τύπων πολυμορφισμών. Σε μια άλλη προσέγγιση στην αυτοματοποιημένη ανάλυση της αλληλουχίας, τα δείγματα DNA ηλεκτροφορούνται σε λεπτούς γυάλινους σωλήνες (που ονομάζονται τριχοειδή) παρά σε πηκτώματα πολυακρυλαμίδης. Επειδή αυτοί οι σωλήνες είναι πολύ λεπτοί, σχετικά λίγη θερμότητα παράγεται κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Κατά συνέπεια, η ανάλυση της αλληλουχίας με τριχοειδή είναι πολύ γρήγορη, επιτρέποντας την ανάλυση αλληλουχίας μήκους 600ζβ σε 96 δείγματα σε 15 περίπου λεπτά. Με τη χρήση υπολογιστών και προηγμένης αυτοματοποιημένης τεχνολογίας, οι προσεγγίσεις αυτές έχουν αυξήσει πολύ την πιθανή ταχύτητα ανάλυσης της αλληλουχίας του DNA. Οι τεχνικές αυτές έχουν επέτρεψαν την ολοκλήρωση της ανάλυσης αλληλουχίας DNA 3-δισεκατομμύρια-ζβ του ανθρώπινου γονιδιώματος. Η αυτοματοποιημένη αλληλούχιση DNA χρησιμοποιώντας φθορίζουσα σήμανση και ανίχνευση λέϊζερ, αυξάνει πολύ την ταχύτητα και την αποδοτικότητα της διαδικασίας ανάλυσης της αλληλουχίας. ΠΛΑΙΣΙΟ 3,3 Τα αίτια της γενετικής ποικιλότητας Αν και η μεταλλαγή είναι η τελευταία πηγή γενετικής ποικιλότητας, δεν μπορεί από μόνη της να ερμηνεύσει τις ουσιαστικές διαφορές στην επίπτωση πολλών γενετικών ασθενειών μεταξύ διαφορετικών εθνικών ομάδων. Γιατί, παραδείγματος χάριν, η δρεπανοκυτταρική ασθένεια εκδηλώνεται σε περίπου 1 κάθε 600 Αφρο-Αμερικανούς, αλλά σχεδόν ποτέ στους βόρειους Ευρωπαίους ή γιατί η κυστική ίνωση είναι 40 φορές συχνότερη στους Ευρωπαίους απ ότι στους Ασιάτες; Αν και η μεταλλαγή είναι η διαδικασία που εισάγει τις ασθένειες στους πληθυσμούς, διάφοροι εξελικτικοί παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της φυσικής επιλογής, της γενετικής τάσης (genetic drift) και της ροής των γονιδίων (gene flow), καθορίζουν πόσο κοινά γίνονται τα γονίδια που ευθύνονται για την πρόκληση ασθενειών σε έναν πληθυσμό. Αυτές οι δυνάμεις αλλάζουν τις συχνότητες των γονιδίων στους πληθυσμούς (μία συχνότητα γονιδίων ορίζεται ως το ποσοστό των χρωμοσωμάτων ενός πληθυσμού που έχουν ένα συγκεκριμένο αλληλόμορφο γονίδιο, μία έννοια θα συζητηθεί περαιτέρω στο Κεφάλαιο 4). Η φυσική επιλογή περιγράφεται συχνά και ως ο "συντάκτης" της γενετικής ποικιλότητας. Αυξάνει τη πληθυσμιακή συχνότητα των ευνοϊκών μεταλλαγών (δηλ., εκείνοι που φέρνουν τη μεταλλαγή θα παράγουν περισσότερους επιζώντες απόγονους), και μειώνει τη συχνότητα των γονιδίων που είναι δυσμενή σε ένα δεδομένο περιβάλλον (δηλ., οι φορείς των γονιδίων παράγουν λιγότερους επιζώντες απόγονους). Χαρακτηριστικά, οι μεταλλαγές ασθενειών εισάγονται συνεχώς σε έναν πληθυσμό μέσω των διαδικασιών λάθους που περιγράφηκαν, ενώ η φυσική επιλογή αφαιρεί τις μεταλλαγές. Ορισμένα περιβάλλοντα, εντούτοις, μπορούν να οδηγήσουν σε ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα για μία μεταλλαγή που οδηγεί σε ασθένεια. Η δρεπανοκυτταρική ασθένεια παρέχει πάλι ένα παράδειγμα. Όπως συζητήθηκε προηγουμένως, τα άτομα που είναι ομοζυγώτες για την υπεύθυνη μεταλλαγή είναι πιθανότερο να πεθάνουν νωρίς. Οι ετεροζυγώτες δεν έχουν συνήθως κανένα ιδιαίτερο πλεονέκτημα ή μειονέκτημα. Εν τούτοις, έχει αποδειχθεί ότι οι ετεροζυγώτες δρεπανοκυττάρωσης έχουν ένα ευδιάκριτο πλεονέκτημα επιβίωσης σε περιβάλλοντα όπου η ελονοσία Plasmodium falciparum είναι κοινή (π.χ., δυτική κεντρική Αφρική) (Εικόνα 3-39

40 21). Επειδή το παράσιτο της ελονοσίας δεν επιζεί καλά στα ερυθροκύτταρα των ετεροζυγωτών δρεπανοκυττάρωσης, αυτά τα άτομα είναι λιγότερο πιθανό να ενδώσουν στην ελονοσία απ ότι οι κανονικοί ομοζυγώτες, παρέχοντας ένα εκλεκτικό πλεονέκτημα στο γονίδιο δρεπανοκυττάρωσης σε αυτό το περιβάλλον. Ενώ δηλαδή υπάρχει επιλογή ενάντια στο γονίδιο στους ομοζυγώτες δρεπανοκυττάρωσης, υπάρχει επιλογή για το γονίδιο ή υπέρ του γονιδίου στους ετεροζυγώτες. Το αποτέλεσμα είναι ότι το γονίδιο της ασθένειας εμμένει σε μία σχετικά υψηλή συχνότητα σε πολλούς Αφρικανικούς πληθυσμούς. Στα περιβάλλοντα που δεν ευνοούν την ελονοσία (π.χ., βόρεια Ευρώπη), η μεταλλαγή που προκαλεί την δρεπανοκυτταρική αναιμία δεν έχει κανένα πλεονέκτημα, και η φυσική επιλογή δρα έντονα εναντίον της εξαλείφοντας τους ομοζυγώτες. Αυτό το παράδειγμα απεικονίζει την έννοια ότι η ποικιλία στην επίπτωση της γενετικής ασθένειας μεταξύ των πληθυσμών μπορεί να προκληθεί από τη φυσική επιλογή που λειτουργεί διαφορικά στα διαφορετικά περιβάλλοντα. Εικόνα Συσχετισμός μεταξύ της συχνότητας του αλληλόμορφου γονιδίου που ευθύνεται για τη δρεπανοκυττάρωση και της κατανομής της ελονοσίας Plasmodium falciparum. Η γενετική τάση (genetic drift) είναι μία άλλη δύναμη που μπορεί να αναγκάσει τα γονίδια που ευθύνονται για την πρόκληση ασθενειών να εμφανίζουν ποικίλες συχνότητες μεταξύ των πληθυσμών. Για να καταλάβετε τη διαδικασία της γενετικής τάσης, θεωρήστε μία άσκηση ρίψης νομίσματος στην οποία πετιούνται 10 νομίσματα. Επειδή "οι κεφαλές" και "οι ουρές" είναι εξίσου πιθανές, ο αναμενόμενος αριθμός κεφαλών και ουρών σε αυτήν την άσκηση θα ήταν από 5 έκαστος. Εν τούτοις, είναι εμφανές ότι, θα μπορούσε να παρατηρηθεί κατά τύχη, μία ουσιαστική απόκλιση από αυτήν την προσδοκία. εν θα ήταν απίθανο να δούμε 7 κεφαλές και 3 ουρές σε 10 ρίψεις, παραδείγματος χάριν. Εν τούτοις, εάν ριφθούν νομίσματα, ο βαθμός απόκλισης από το αναμενόμενο ποσοστό των κεφαλών 50% και των ουρών 50% είναι πολύ μικρότερος. Μία λογική έκβαση ρίψεων μπορεί να είναι 470 κεφαλές και 530 ουρές, αλλά θα ήταν αρκετά απίθανο να λάβουμε 700 κεφαλές και 300 ουρές. Επομένως, υπάρχει λιγότερη τυχαία διακύμανση στα μεγαλύτερα δείγματα. Η ίδια αρχή ισχύει για τις συχνότητες των γονιδίων στους πληθυσμούς. Σε έναν πολύ μικρό πληθυσμό, μία συχνότητα γονιδίων μπορεί να αποκλίνει σημαντικά από τη μία γενιά στην επόμενη, αλλά αυτό είναι απίθανο σε ένα μεγάλο πληθυσμό. Κατά συνέπεια, η γενετική απόκλιση είναι μεγαλύτερη στους μικρότερους πληθυσμούς και οι γενετικές ασθένειες, που είναι άλλωστε σπάνιες, μπορούν να εμφανιστούν αρκετά συχνότερα σε ένα μικρό πληθυσμό. Παραδείγματος χάριν, το σύνδρομο Ellis-van Creveld, μία σπάνια διαταραχή που περιλαμβάνει μειωμένο ανάστημα, πολυδακτυλία (πρόσθετοι δείκτες), και σύμφυτες καρδιακές ατέλειες, εμφανίζεται με πολύ μεγάλη συχνότητα μεταξύ του παλαιού πληθυσμού των Amish της Πενσυλβάνιας, που ιδρύθηκε στις Ηνωμένες Πολιτείες από 50 περίπου ζευγάρια. Λόγω του μικρού αυτού μεγέθους του πληθυσμού, υπήρξε μεγάλη δυνατότητα 40

41 γενετικής τάσης, με συνέπεια τις αυξημένες συχνότητες ορισμένων αλληλόμορφων γονιδίων που προκαλούν ασθένεια. Είναι κοινό να παρατηρείται η επίδραση της γενετικής τάσης σε μικρούς, απομονωμένους πληθυσμούς ανά τον κόσμο. Ακόμη και οι σχετικά μεγάλοι πληθυσμοί μπορεί να είχαν δοκιμάσει τα αποτελέσματα της τάσης στο πρόσφατο παρελθόν εάν υποβλήθηκαν σε αυστηρές πληθυσμιακές αλλοιώσεις-αυξομειώσεις ή καθιερώθηκαν από έναν μικρό αριθμό ιδρυτών (επίδραση ιδρυτών) (founder effect). Παραδείγματος χάριν, περισσότερες από 30 ειδάλλως σπάνιες γενετικές ασθένειες απαντούν με υψηλή συχνότητα στον πληθυσμό της Φινλανδίας, ο οποίος θεωρείται να έχει ιδρυθεί αρχικά από έναν μικρό αριθμό ατόμων περίπου 100 γενιές πριν. Η φαινυλκετονουρία και η κυστική ίνωση, που είναι κοινές σε άλλους καυκάσιους πληθυσμούς, είναι σχετικά σπάνιες στη Φινλανδία, γεγονός που δηλώνει ότι η γενετική τάση μπορεί και να αυξήσει και να μειώσει τη συχνότητα των γονιδίων των ασθενειών. ιάφορες γενετικές ασθένειες (π.χ., torsion δυστονία, ασθένεια Tay - Sachs, ασθένεια Gaucher) εμφανίζονται με αυξημένη συχνότητα στον εβραϊκό πληθυσμό Αshkenazi (βλ. Κεφάλαιο 7) αυτό μπορεί να είναι το αποτέλεσμα πληθυσμιακών αλλαγών που εμφανίστηκαν στην ιστορία αυτού του πληθυσμού. Η ροή των γονιδίων (gene flow) εμφανίζεται όταν οι πληθυσμοί ανταλλάσσουν μετανάστες που ζευγαρώνουν μεταξύ τους. ιαχρονικά, η ροή των γονιδίων μεταξύ των πληθυσμών τείνει να τους καταστήσει γενετικά παρόμοιους μεταξύ τους. Ένας λόγος για τον οποίο η δρεπανοκυτταρική ασθένεια είναι λιγότερο κοινή μεταξύ των Αφρο-Αμερικανών απ' ότι σε πολλούς Αφρικανικούς πληθυσμούς είναι η ροή των γονιδίων μεταξύ Αφρο- Αμερικανών και Καυκάσιων στη Βόρεια Αμερική (αυτή η ίδια διαδικασία είναι πιθανό να έχει αυξήσει τη συχνότητα της κυστικής ίνωσης στον Aφρo-Aμερικανικό πληθυσμό). Επιπλέον, επειδή δεν υπάρχει ελονοσία P. falciparum στη Βόρεια Αμερική, ο Αφρο-Αμερικανικός πληθυσμός δεν δοκιμάζει την επιλογή υπέρ της δρεπανοκυτταρικής μεταλλαγής. Οι δυνάμεις μεταλλαγής, της φυσικής επιλογής, της γενετικής τάσης ή απόκλισης και της ροής των γονιδίων αλληλεπιδρούν με σύνθετους και μερικές φορές απροσδόκητους τρόπους επηρεάζοντας τη κατανομή και επικράτηση των γενετικών ασθενειών στους πληθυσμούς. Η μελέτη των τρόπων με τους οποίους αυτές οι διαδικασίες επηρεάζουν τη γενετική εξέλιξη αναφέρεται ως γενετική πληθυσμών. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ ΣΕ ΕΠΙΠΕ Ο DNA Η ανίχνευση μεταλλαγών ή πολυμορφισμών σε αλληλουχίες DNA είναι συχνά ένα κρίσιμο βήμα στο να κατανοήσουμε πώς ένα γονίδιο προκαλεί μια συγκεκριμένη ασθένεια. Οι νέες μοριακές μέθοδοι έχουν διευρύνει τις δυνατότητες ανίχνευσης ποικιλότητας και παραλλαγών στην αλληλουχία του DNA. Η προσέγγιση στύπωσης κατά Southern επιτρέπει την ανίχνευση σχετικά μεγάλων ελλείψεων, μικρότερες όμως ελλείψεις από 50ζβ δεν μπορούν να φανούν λόγω της περιορισμένης ανάλυσης αυτής της τεχνικής. Οι μεταλλαγές που αλλάζουν μια θέση περιορισμού μπορούν επίσης να αναγνωριστούν με στύπωση κατά Southern, αλλά οι περισσότερες μεταλλαγές δεν εμφανίζονται σε θέσεις περιορισμού. Αφ ότου ενισχυθεί μια συγκεκριμένη περιοχή του DNA με PCR, μπορεί να αναλυθεί άμεσα με την τεχνική που περιγράφηκε προηγουμένως. Οι μεταλλαγές ανιχνεύονται έπειτα με τη σύγκριση της ακολουθίας DNA ενός ασθενή με αυτήν ενός απρόσβλητου-υγιούς ατόμου. Αν και η άμεση ανάλυση της αλληλουχίας είναι ένας χρήσιμος και ακριβής τρόπος ανίχνευσης μεταλλαγών, μπορεί να είναι πολύ χρονοβόρος. Άλλες τεχνικές παρέχουν μια γρηγορότερη προσέγγιση στην έρευνα μεγάλων αριθμών ασθενών για μεταλλαγές. Αυτές οι τεχνικές μπορούν έμμεσα να δείξουν την ύπαρξη και τη θέση μιας μεταλλαγής, μετά από την οποία το DNA στην υποδειγμένη περιοχή μπορεί να αναλυθεί για να προσδιοριστεί η ειδική μεταλλαγή (Πίνακας 3-4). ύο προσεγγίσεις που αναφέρονται εδώ χρησιμοποιούν το γεγονός ότι, υπό ορισμένους όρους, οι μεταλλαγές αλλάζουν την κινητικότητα των τμημάτων DNA 41

42 στην ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων. Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα αποδιατακτικής κλίσης (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) χρησιμοποιεί ένα πήκτωμα στο οποίο υπάρχει μια αυξανόμενη κλίση ενός παράγοντα μετουσίωσης, όπως η θερμοκρασία. Στη μονόκλωνη ανάλυση πολυμορφισμού διαμόρφωσης (single-strand conformation polymorphism, SSCP), η αλλαγή της δευτεροταγούς δομής ενός τμήματος DNA από μια μεταλλαγή στην ακολουθία DNA αλλάζει το ποσοστό μετανάστευσης ενός μονόκλωνου τμήματος DNA σε ένα μη-αποδιατακτικό πήκτωμα. Χρησιμοποιώντας καθεμία από αυτές τις τεχνικές, οι διαφορές ακολουθίας μεταξύ του DNA ενός ασθενή και αυτού ενός κανονικού μορίου-ανιχνευτή μπορούν να προσδιοριστούν (Εικόνα 3-22). Μόλις ανιχνευθεί μια διαφορά, το DNA του ασθενή μπορεί να αναλυθεί για να καθοριστεί η ακριβής φύση της μεταλλαγής. Πίνακας 3-4. Μέθοδοι ανίχνευσης μεταλλαγής Τεχνική Συνοπτική περιγραφή Εφαρμογή Στύπωμα κατά Southern Πέψη εξεταζόμενου DNA με ένζυμο Ανίχνευση ενθέσεων, ή περιορισμού, ανάλυση των τμημάτων ελλείψεων, ανακατανομών σε ηλεκτροφόρηση αγαρόζης, συναρμολόγηση τμημάτων μεταφορά του DNA σε νάϋλον DNA σε φυσικό χάρτη μεμβράνη και υβριδοποίηση των τμημάτων DNA με σημασμένο μόριοανιχνευτή Άμεση ανάλυση της Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής Ανίχνευση ενθέσεων, ή αλληλουχίας του DNA αλληλουχίας του εξεταζόμενου DNA ελλείψεων, σημειακών που ανιχνεύεται από χημική μεταλλαγών, ανακατανομών διάσπαση, λήξη της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας με διδεόξυδη, ή με φθορισμόχρωμα (fluorochrome) Ανάλυση ιαφορική ηλεκτροφορητική Ανίχνευση μικρών πολυμορφισμού κινητικότητα του μονόκλωνου ενθέσεων, ή ελλείψεων, μονόκλωνης διαμόρφωσης (SSCP) εξεταζόμενου DNA με τις διαφορετικές σημειακών μεταλλαγών δευτεροταγείς δομές (conformations) μέσω ενός μη αποδιατακτικού πηκτώματος Ηλεκτροφορητική ίκλωνα μόρια DNA μετακινούνται Ανίχνευση μικρών ενθέσεων ανάλυση σε πήκτωμα με ηλεκτροφορητικά μέσω πηκτώματος ή ελλείψεων, σημειακών αποδιατακτική κλίση αυξανόμενης αποδιατακτικής κλίσης μεταλλαγών (DGGE) (π.χ., χημικά, θερμοκρασία) μέχρι την αποδιάταξη των κλώνων του DNA, τα αλληλόμορφα αναλύονται σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης Σχάση αταίριαστου Υβριδοποίηση σημασμένου μορίουανιχνευτή Ανίχνευση μικρών ενθέσεων ζεύγους DNA στο εξεταζόμενο DNA, ή ελλείψεων, σημειακών σχάση του DNA σε ασύζευκτα σημεία μεταλλαγών ζεύγους βάσεων Υβριδισμός ειδικού Επιλεκτική υβριδοποίηση σημασμένου Ανίχνευση των ολιγονουκλεοτιδικού αλληλόμορφου (ASO) ελέγχου στο εξεταζόμενο DNA με τη αλληλόμορφων γονιδίων της μοναδική συμπληρωματική σύσταση γνωστής σύνθεσης βάσεων Φασματομετρία μάζας Ανίχνευση της φυσικής μάζας των Ανίχνευση μικρών ενθέσεων παράλληλων και αντιπαράλληλων ή ελλείψεων, σημειακών κλώνων του εξεταζόμενου DNA μεταλλαγών Υβριδισμός Υβριδισμός εξεταζόμενου DNA σε Ανίχνευση εξεταζόμενου μικροσυστοιχιών DNA ολιγονουκλεοτιδικές σειρές που DNA δοκιμής γνωστής διατάσσονται σε τσιπ σιλικόνης ή σύνθεσης γυάλινα πλακάκια Πρωτεϊνική αποκοπή Το εξεταζόμενο DNA χρησιμοποιείται Ανίχνευση μετατόπισης 42

43 για να συνθέσει συμπληρωματικό DNA πλαισίου ανάγνωσης, (cdna) με RT-PCR με 5 εκκινητή που περιοχής ματίσματος, ή περιέχει τον υποκινητή του γονίδιου ανερμηνεύσιμων T7, το DNA μεταφράζeται και το μεταλλαγών, που οδηγούν προϊόν αναλύεται σε SDS-PAGE σε περικοπή του πρωτεϊνικού προϊόντος Εικόνα Ανάλυση πολυμορφισμού μονόκλωνης διαμόρφωσης (SSCP) είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για να καλύψει γρήγορα μια περιοχή του DNA για διαφορές μεταξύ ατόμων. Ανάλογα με την νουκλεοτιδική της αλληλουχία, η διαμόρφωση κάθε αλυσίδας DNA ποικίλλει σε ένα μη αποδιατακτικό πήκτωμα, αλλάζοντας την κινητικότητά της μέσω του πηκτώματος. Αυτό επιτρέπει τη διαφοροποίηση μεταξύ ενός κανονικού αλληλόμορφου γονιδίου (μικρό βέλος) και ενός μεταλλαγμένου αλληλόμορφου γονιδίου (μεγάλο βέλος) σε αυτήν την οικογένεια με μια επικρατή αυτοσωμική διαταραχή. 43

44 Εικόνα Σχηματικό διάγραμμα μικροσυστοιχίας. Ολιγονουκλεοτίδια τοποθετούνται ή συντίθενται σε ένα τσιπ. Εκτίθενται έπειτα σε σημασμένο DNA ενός ατόμου. Υβριδισμός θα συμβεί μόνο εάν το ολιγονουκλεοτίδιο περιέχει μια ακολουθία DNA που είναι συμπληρωματική με αυτή του DNA του ατόμου. Η φθορίζουσα δέσμευση δηλώνει τη θέση της συμπληρωματικής ολιγονουκλεοτιδικής αλληλουχίας στο τσιπ. Μια άλλη προσέγγιση ανίχνευσης μεταλλαγών χρησιμοποιεί τις χημικές ουσίες ή τα ένζυμα που διασπούν το DNA όταν υπάρχει ένας κακός-ασυμβίβαστος συνδυασμός ζευγαρώματος μεταξύ δύο συμπληρωματικά υβριδοποιήσιμων ακολουθιών DNA (δηλ., ένα σκέλος περιέχει την κανονική ακολουθία, ενώ το άλλο σκέλος περιέχει μια αλλαγμένη βάση). Αυτή η σχάση αταίριαστου ζεύγους (mismatch cleavage) παράγει τμήματα διαφορετικού μήκους που μπορούν έπειτα να ανιχνευθούν σε ένα πήκτωμα. Η μέθοδος mismatch έχει προσαρμοστεί για χρήση σε αυτοματοποιημένη ανάλυση της αλληλουχίας, αυξάνοντας πολύ την αποδοτικότητα και την ταχύτητα αυτής της μεθόδου. Πολλή πρόοδος σημειώνεται τώρα στην κατασκευή DNA microarrays μικροσυστοιχιών DNA (ή DNA chips) και την χρησιμοποίηση τους για την ανίχνευση των μεταλλαγών (Εικόνα 3-23, έγχρωμη εικόνα 2). Για να κατασκευαστεί μία μικροσυστοιχία DNA, τοποθετούνται ρομποτικά ολιγονουκλεοτίδια σε ένα μικρό γυάλινο πλακάκι. Μια επιφάνεια (1 εκατ 2 ) μπορεί να περιέχει εκατοντάδες χιλιάδες διαφορετικά ολιγονουκλεοτίδια. Αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια αποτελούνται από κανονικές ακολουθίες DNA καθώς επίσης και ακολουθίες DNA που περιέχουν γνωστές μεταλλαγές που προκαλούν ασθένεια. DNA ενός ατόμου σημασμένο με Έγχρωμη Εικόνα 2. Μία μικροσυστοιχία (microarray) που περιέχει ολιγονουκλεοτίδια. Αυτή η μικροσυστοιχία εκτέθηκε σε DNA από κανονικούς ινοβλάστες (κόκκινη σήμανση, δείτε τα βέλη) και σε DNA από ινοβλάστες ενός ασθενούς με νόσο Niemann-Pick, τύπου C (πράσινη σήμανση). Τα βέλη δείχνουν τις περιοχές στις οποίες υπήρξε ένα ισχυρό σήμα υβριδισμού είτε με το κανονικό DNA είτε 44