ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΙΠΛΩΜΑ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΘΝΙΚΟ Ι ΡΥΜΑ ΕΡΕΥΝΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΙΠΛΩΜΑ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ MIRNAS MIR-200 ΚΑΙ ΤΟΥ MIR-3069 ΣΤΟ ΠΟΛΥΣΤΑ ΙΑΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗΣ ΤΗΣ ΕΠΙ ΕΡΜΙ ΑΣ ΤΟΥ ΠΟΝΤΙΚΟΥ ΚΑΙ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΜΑΣΤΟΥ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΕΛΕΝΗ ΣΚΟΥΡΤΗ, ΑΜ: Βιολόγος ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: ΙΩΑΝΝΗΣ Π. ΤΡΟΥΓΚΑΚΟΣ Επίκουρος Καθηγητής, Τοµέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τµήµα Βιολογίας, ΕΚΠΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ: ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΖΟΥΜΠΟΥΡΛΗΣ Ερευνητής Α -Καθηγητής Ερευνών, Μονάδα Βιοϊατρικών Εφαρµογών, Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρµακευτικής Χηµείας και Βιοτεχνολογίας, ΕΙΕ ΑΘΗΝΑ

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Μ Ε:«ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ: Ανάλυση του ρόλου της οικογένειας mirnas mir-200 και του mir-3069 στο πολυσταδιακό σύστηµα καρκινογένεσης της επιδερµίδας του ποντικού και σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του µαστού του ανθρώπου ΕΛΕΝΗ ΣΚΟΥΡΤΗ ΑΜ: Βιολόγος ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: ΙΩΑΝΝΗΣ Π. ΤΡΟΥΓΚΑΚΟΣ Επίκουρος Καθηγητής, Τοµέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής, Τµήµα Βιολογίας, ΕΚΠΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ: ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΖΟΥΜΠΟΥΡΛΗΣ Ερευνητής Α -Καθηγητής Ερευνών, Μονάδα Βιοϊατρικών Εφαρµογών, Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρµακευτικής Χηµείας και Βιοτεχνολογίας, ΕΙΕ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Ιωάννης Π. Τρουγκάκος, Επίκουρος Καθηγητής Μαριάννα Αντωνέλου, Λέκτορας Βασίλειος Ζουµπουρλής, Ερευνητής Α Καθηγητής Ερευνών ΤΟΠΟΣ ΙΕΞΑΓΩΓΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ: Μονάδα Βιοϊατρικών Εφαρµογών, Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρµακευτικής Χηµείας και Βιοτεχνολογίας, ΕΙΕ, Αθήνα,

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ-ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Ερευνητή Α και ιευθυντή Ερευνών στο Εθνικό Ίδρυµα Ερευνών κύριο Βασίλειο Ζουµπουρλή, επιστηµονικό υπεύθυνο της διπλωµατικής µου εργασίας για την καθοδήγηση και τις πλούσιες γνώσεις που µου προσέφερε καθ όλη τη διάρκεια της διεξαγωγής της στο εργαστήριό του. Επίσης, ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στον Επίκουρο Καθηγητή του τοµέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής κύριο Ιωάννη Τρουγκάκο, επιβλέποντα της µεταπτυχιακής µου εργασίας, για την αµέριστη στήριξη και βοήθεια που µου προσέφερε κατά τη δηµιουργία της µελέτης αυτής αλλά και για τη πολύτιµη συµβολή του στην ολοκλήρωσή της. Ακόµη, ευχαριστώ πολύ τον Καθηγητή του Τοµέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής κύριο Σταύρο Χαµόδρακα ως διευθυντή του Μ Ε στα πλαίσια του οποίου ολοκληρώθηκε η παρούσα εργασία αλλά και την λέκτορα του Τοµέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής κυρία Μαριάννα Αντωνέλου ως µέλος της τριµελούς εξεταστικής µου επιτροπής. Επιπρόσθετα, επιθυµώ να εκφράσω τις ευχαριστίες µου στους επιστηµονικούς συνεργάτες του Ινστιτούτου Βιολογίας, Φαρµακευτικής Χηµείας και Βιοτεχνολογίας του Εθνικού Ιδρύµατος Ερευνών κύριο Σπυρίδωνα Βλαχόπουλο και κυρία Στυλιανή Λογοθέτη, το µεταδιδακτορικό ερευνητή κύριο Ιωάννη Χριστοδούλου, τον υποψήφιο διδάκτορα κύριο Σωτήριο Γαλτσίδη, τους µεταπτυχιακούς φοιτητές Ανδρέα Κρητικό και Νικόλα Χούρι καθώς επίσης και την προπτυχιακή φοιτήτρια Μαρία-Ελένη Ξυπολιτά για τη βοήθεια και τη συµπαράστασή τους. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωµοσύνη µου στην οικογένειά µου που µου συµπαραστέκεται τόσο ηθικά όσο και οικονοµικά και µε υποστηρίζει σε κάθε βήµα µου. Αθήνα, 1 Ιουλίου

4 ΣΥΝΤΟΜΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ ΠΡΟΣΩΠΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ Ονοµατεπώνυµο: Ελένη Σκούρτη Ηµεροµηνία γέννησης: Τόπος Γέννησης: Χολαργός Αττικής ΕΚΠΑΙ ΕΥΣΗ : Πτυχίο του Τµήµατος Βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστηµών, ΕΚΠΑ, βαθµός πτυχίου: 8,07 (Λίαν Καλώς) : Ενιαίο Λύκειο Μεταµόρφωσης, Βαθµός απολυτηρίου Γ τάξης: 19 και 5/10. ΞΕΝΕΣ ΓΛΩΣΣΕΣ Αγγλικά: Άριστο επίπεδο, πτυχίο: Certificate of Proficiency in English, University of Michigan. Γαλλικά: Μέτρια γνώση, πτυχίο: Β1. ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΣΕ ΣΥΝΕ ΡΙΑ: 34 ο Ετήσιο Επιστηµονικό Συνέδριο της EEBE, Τρίκαλα, Μάιος ο Πανελλήνιο Συνέδριο Βιοεπιστηµόνων, Πάτρα, Οκτώβριος ο Ετήσιο Επιστηµονικό Συνέδριο της EEBE, Ναύπλιο, Μάιος International workshop on: Ageing and cancer cell biology: Convergent and divergent molecular mechanisms, Ιούνιος, 2013, Αθήνα. Proc Int Symp Mol Med: Οκτώβριος 2013, Κρήτη. 8th conference of HSCBB13, Νοέµβριος 2013, Λαµία. 64 ο Συνέδριο Ελληνικής Εταιρίας Βιοχηµείας και Μοριακής Βιολογίας, Ίδρυµα Ευγενίδου, εκέµβριος 2013, Αθήνα. XIX International Taurine Meeting: Taurine a "very essential" amino acid, Μάιος 2014, Κρακοβία, Πολωνία. ΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ: Ε. Σκούρτη, Σ Λογοθέτη, Σ Βλαχόπουλος, Ι. Τρουγκάκος, Ι. Χριστοδούλου και Β. Ζουµπουρλής, MicroR As, καρκίνος και καρκινικά βλαστοκύτταρα: Από την έρευνα στην θεραπεία, Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής, 2013, 30(4): Ξυπολιτά Μ.Ε., Σκούρτη Ε., Κρητικός Α., Βλαχόπουλος Σ., Ζουµπουρλής Β., Η δοµή κι η λειτουργία των GTPασών και ο ρόλος τους στον καρκίνο του πνεύµονα, Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής, 2014, 31(2): Skourti E., Logotheti S, Kontos C, Dimoragka PT, Sideridou M, Trougakos IP, Gorgoulis V, Scorilas A, Michalopoulos I, Zoumpourlis V, mir-200 family and mir-205 mirnas are downregulated as mouse skin carcinogenesis progresses as well as in aggressive human breast cancer cell lines, PlosOne, 2014, Under submission. ΥΠΟΤΡΟΦΙΕΣ Μεταπτυχιακή υποτροφία από το Ίδρυµα Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ), Οκτώβριος

5 Περιεχόµενα Α. Εισαγωγή MiRNAs Ιστορική αναδροµή στην ανακάλυψη των mirnas Η βιογένεση των mirnas Τρόπος λειτουργίας των mirnas Θέσεις του γονιδιώµατος όπου βρίσκονται mirnas MiRNAs και επιγενετική Σύµπλοκο σίγησης µέσω παρεµβολής RNA RNAi παρεµβολή (RNAi) Τύποι ασθενειών µε συχνή υπερ- ή υπο- έκφραση µορίων mirnas Καρκίνος Τα ορόσηµα του καρκίνου Στόχευση των ορόσηµων του καρκίνου Τύποι καρκίνου Μετάσταση Το πολυσταδιακό σύστηµα ογκοογένεσης του δέρµατος του ποντικού Καρκίνος του µαστού Καρκινικές κυτταρικές σειρές του µαστού του ανθρώπου mirnas και καρκίνος Βιολογικές λειτουργίες που επηρεάζει η έκφραση των mirnas Τα mirnas ως βιοδείκτες του καρκίνου Εµπλοκή των mirnas στον καρκίνο Εµπλοκή των mirnas στη ρύθµιση του πολλαπλασιασµού Τα mirnas στη θεραπεία του καρκίνου (mirna targeted therapies)...44 Σκοπός της παρούσας διπλωµατικής εργασίας...49 Β. Υλικά και µέθοδοι

6 1 Καλλιέργειες κυτταρικών σειρών Καλλιέργεια σε φλάσκα (ή τρυβλίο Petri) Αλλαγή θρεπτικού υλικού Θρυψινοποίηση κυττάρων Πάγωµα κυττάρων Προετοιµασία υλικών καλλιέργειας Αποµόνωση RNA Μικροσυστοιχίες - Ανάλυση των δεδοµένων των µικροσυστοιχιών Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (quantitative Real Time PCR) Πολυαδενυλίωση και παραγωγή cdna από το αποµονωµένο ολικό RNA Ποσοτική PCR (qpcr)...63 Γ. Αποτελέσµατα Συζήτηση Ε. Μελλοντικές προοπτικές ΣΤ. Βιβλιογραφία

7 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6

8 1 MiRNAs Τα mirnas (µικροrnas) είναι µία οµάδα µικρών, µονόκλωνων στην ώριµη µορφή τους, µορίων RNAs που αποτελούνται από νουκλεοτίδια (µε µέσο µήκος τα 22 νουκλεοτίδια) και συµµετέχουν στην αρνητική ρύθµιση πολλών γονιδίων. Τα µόρια αυτά δεν κωδικοποιούν κάποιο πρωτεϊνικό προϊόν, αλλά ρυθµίζουν τη διαδικασία της µετάφρασης µορίων mrnas [1]. 1.1 Ιστορική αναδροµή στην ανακάλυψη των mirnas Η ανακάλυψη των mirnas έγινε µόλις το 1993 από τους Victor Ambros, Rosalind Lee και Rhonda Feinbaum. Οι συγκεκριµένοι ερευνητές µελετούσαν το ρόλο του γονιδίου lin-14 στην ανάπτυξη του Caenorabditis elegans και βρήκαν ότι η ποσότητα της πρωτεΐνης Lin-14 ρυθµιζόταν από ένα µικρού µήκους RNA που κωδικοποιούνταν από το γονίδιο lin-4. Στη συνέχεια ασχολήθηκαν µε την έκφραση αυτού του γονιδίου κι έτσι είδαν πως αρχικά σχηµατίζεται ένα πρόδροµο µόριο RNA που αποτελείται από 61 νουκλεοτίδια και ωριµάζει σε ένα τελικό RNA 22 νουκλεοτιδίων. Αυτό το τελικό µόριο περιείχε αλληλουχίες εν µέρει συµπληρωµατικές προς τη 3 UTR του mrna του lin-14. Η συµπληρωµατικότητα αυτή ήταν αναγκαία και επαρκής για την αναστολή της µετάφρασης του mrna στην πρωτεΐνη Lin-14. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, το lin-4 ήταν το πρώτο mirna που αναγνωρίστηκε. Έπειτα από µελέτη του µορίου, ανακαλύφθηκε πως όταν είναι ανενεργό, προωθείται ο πολλαπλασιασµός κι όχι η διαφοροποίηση κάποιων συγκεκριµένων επιθηλιακών κυττάρων του ζώου. Αρχικά, θεωρήθηκε πως η µορφή αυτή της γονιδιακής ρύθµισης ήταν παρούσα αποκλειστικά και µόνο στο συγκεκριµένο σκώληκα και µάλιστα µε µοναδική αντιπροσώπευση το lin-4. Αυτό το δεδοµένο άλλαξε το 2000, όταν και ανακαλύφθηκε ένα δεύτερο RNA µε παρόµοια λειτουργία, πάλι στον C. elegans. Πρόκειται για το let-7 το οποίο καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων lin-41, lin-14, lin-28, lin-42 και daf-12 σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια του ζώου και όπως και το lin-4 αυξάνεται κατά τη διαφοροποίηση και ελαττώνεται όταν έπεται κυτταρικός πολλαπλασιασµός. Το let-7 βρέθηκε στη συνέχεια να είναι εξαιρετικά συντηρηµένο σε αρκετά είδη. 7

9 Ακολούθησε η ανακάλυψη πάρα πολλών άλλων µορίων mirna, τα οποία αριθµώνται σε περισσότερα από 4000 µόρια, σε πολλούς οργανισµούς ανάµεσα στους οποίους και ο άνθρωπος. Έτσι, έγινε γνωστή η παρουσία των mirnas στα ευκαρυωτικά γονιδιώµατα ως ένα καθολικό φαινόµενο. Συγκεκριµένα, στο ανθρώπινο γονιδίωµα έχουν ταυτοποιηθεί περισσότερα από 800 τέτοια µόρια και προβλέπεται ότι υπάρχουν πάνω από 700 ακόµη. Γενικά, εκτός από τα µετάζωα, mirnas έχουν βρεθεί σε ιούς, πρώτιστα, µυξοµύκητες και φυτά. 1.2 Η βιογένεση των mirnas Η βιογένεση των mirnas περιλαµβάνει τα ακόλουθα στάδια: i. Μεταγραφή των mirnas Η µεταγραφή των mirnas γίνεται από την RNA πολυµεράση ΙΙ, χωρίς να αποκλείεται ορισµένα mirnas να µεταγράφονται από άλλες RNA πολυµεράσες (πολυµεράση ΙΙΙ). Αρχικά µάλιστα θεωρήθηκε ότι η RNA πολυµεράση ΙΙΙ είναι υπεύθυνη για τη µεταγραφή των mirnas, καθώς µεταγράφει τα περισσότερα µικρά RNAs (trnas, U6 snrna). Η πρώτη άµεση ένδειξη ότι η πλειοψηφία των mirnas µεταγράφεται από την RNA πολυµεράση ΙΙ είναι το γεγονός πως κατά κανόνα το αρχικό µετάγραφο έχει κάλυµµα στο 5 άκρο αλλά και ουρά πολυαδενίνης (πολύ-α ουρά). Αυτά αποτελούν προϊόντα αποκλειστικά της RNA πολυµεράσης ΙΙ. Επίσης, χορήγηση α-αµανιτίνης σε συγκέντρωση τέτοια που να αναστέλλει επιλεκτικά την ενεργότητα της RNA πολυµεράσης ΙΙ έχει διαπιστωθεί ότι µειώνει σηµαντικά τα επίπεδα των pri-mirna. Επιπρόσθετα σε όλα αυτά, µε ανοσοκατακρήµνιση χρωµατίνης (CHIP assay) βρέθηκε πως η RNA πολυµεράση ΙΙ συνδέεται σε υποκινητή κάποιου mirna που εξετάστηκε. Υπάρχουν επιπλέον ενδείξεις πως η µεταγραφή των mirnas δε συµβαίνει από την pol III. Αυτές περιλαµβάνουν το ότι πολλά αρχικά µετάγραφα mirnas έχουν µήκος αρκετών χιλιάδων βάσεων αλλά και το γεγονός ότι αρκετά περιέχουν τµήµατα µε περισσότερες από 4 διαδοχικές ουρακίλες, κάτι που θα οδηγούσε σε λήξη της µεταγραφής από την πολυµεράση ΙΙΙ [2,3]. 8

10 ii. Επεξεργασία από τη Drosha Το αποτέλεσµα της µεταγραφής είναι να προκύψει το pri-mirna που έχει µήκος αρκετές χιλιάδες βάσεις και αναδιπλώνεται δηµιουργώντας τοπική δοµή φουρκέτας. Έτσι, προκύπτει δοµή της µορφής µίσχος-θηλιά, η οποία υφίσταται πέψη από την πυρηνική RNάση ΙΙΙ Drosha ώστε τελικά να απελευθερωθεί η αµέσως επόµενη πρόδροµη µορφή του mirna, το pre-mirna. Αυτό αποτελείται µόνο από τη δοµή της µορφής λούπα-µίσχος, ενώ τα υπολείµµατα του pri-mirna αποικοδοµούνται στον πυρήνα. Παρόλα αυτά υπάρχουν ενδείξεις πως σε ορισµένες περιπτώσεις διαθέτουν διακριτές λειτουργίες. Η Drosha είναι µία µεγάλη πρωτεΐνη περίπου 160 kda και είναι συντηρηµένη στα µετάζωα. Έχει δύο επικράτειες RNάσης ΙΙΙ (RIIIDs) και µία επικράτεια σύνδεσης στο δίκλωνο RNA (dsrbd). ηµιουργεί ένα µεγάλο σύµπλοκo 500 kda στη Drosophila melanogaster και 600 kda στον άνθρωπο. Αυτό ονοµάζεται σύµπλοκο µικροεπεξεργασίας (microprocessor complex). Η Drosha αλληλεπιδρά µε το συµπαράγοντά της (120 kda), την κρίσιµη περιοχή για το σύνδροµο DiGeorge του γονιδίου 8 στον άνθρωπο (αντίστοιχα στη Drosophila melanogaster έχουµε την Pasha). Αυτός ο συµπαράγοντας περιλαµβάνει δύο επικράτειες πρόσδεσης δίκλωνου RNA, ενώ έχει υποτεθεί πως έχει κι µία επικράτεια αλληλεπίδρασης µε πλούσιες σε προλίνη περιοχές. Μία τέτοια περιοχή υπάρχει στη Drosha κι έτσι έχει θεωρηθεί πως ίσως αυτός να είναι ο τρόπος αλληλεπίδρασης µεταξύ των δύο µορίων. Αυτό που φαίνεται περίεργο είναι το πώς η Drosha αναγνωρίζει τα πολλά διαφορετικά micrornas που αποτελούν υποστρώµατά της ανάµεσα στα τόσα µόρια RNA που συναντά. Φαίνεται πως, αν και δεν είναι πλήρως ξεκαθαρισµένο το πώς αυτό συµβαίνει, µάλλον σχετίζεται µε αναγνώριση του δίκλωνου µίσχου και της µεγάλης τελικής θηλιάς των micrornas. Η Drosha κόβει «µετρώντας» περίπου 2 στροφές (22 νουκλεοτίδια) από την τελική θηλιά [2,3]. iii. Έξοδος στο κυτταρόπλασµα Την τροποποίηση από τη Drosha ακολουθεί η εξαγωγή του pre-mirna από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα µε τη διέλευση διαµέσου των πυρηνικών πόρων. Συγκεκριµένα, η µεταφορά των pre-mirnas από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα υποβοηθάται σε σηµαντικό βαθµό από την εξπορτίνη 5 (exportin-5) µε κατανάλωση 9

11 ενέργειας σε µορφή GTP. Στη διαδικασία εξαγωγής στο κυτταρόπλασµα συµµετέχει και η Ran-GTPάση. Αυτή ενεργοποιείται µε πρόσδεση GTP το οποίο και υδρολύει έπειτα από ενεργοποίηση από µία πρωτεΐνη-ενεργοποιητή της ενεργότητας GTPάσης (GTPase Activation Protein, GAP). Στη συνέχεια, το GDP που φέρει συνδεδεµένο επάνω της αποµακρύνεται και ανταλλάσσεται µε GTP από έναν παράγοντα ανταλλαγής GTP (GTP Exchange Factor, GEF) [2,3]. iv. Επεξεργασία από την Dicer Μετά το στάδιο που µόλις περιγράφηκε έπεται η τροποποίηση από την κυτταροπλασµατική RNάση ΙΙΙ Dicer η οποία µετατρέπει το pre-mirna των 70 νουκλεοτιδίων σε δίκλωνο µόριο RNA των 22 νουκλεοτιδίων. Η πρωτεΐνη Dicer παρουσιάζει υψηλή συντηρητικότητα και συναντάται σχεδόν σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς (φυτά, ζώα και Schizosaccharomyces pombe). Έχει δύο domains RNάσης και ένα σύνδεσης RNA όπως και η Drosha. Επιπρόσθετα, η Dicer διαθέτει ένα µακρύ Ν-τελικό άκρο που περιλαµβάνει τις εξής τρεις λειτουργικές περιοχές (επικράτειες, domains): 1) επικράτεια RNA ελικάσης Dead-box 2) επικράτεια DUF283 3) επικράτεια PAZ Η Dicer συνδέεται µε µία σειρά από άλλες πρωτεΐνες, όπως η Rde-4 στο C. elegans, οι R2d2 και Fmr1 στην D. melanogaster και η οικογένεια των πρωτεϊνών αργοναυτών (Argonautes, Agos) σε διάφορους οργανισµούς. Έχει όµως δειχτεί ότι η κατάλυση συµβαίνει και απουσία των πρωτεϊνών αυτών. Θεωρείται πως σταθεροποιούν τα mirnas. Στη φάση αυτή, το ώριµο mirna ενσωµατώνεται στο λειτουργικό σύµπλοκο που ονοµάζεται mirnp, από το mirna-containing ribonucleoprotein complex. Άλλες ονοµασίες του συµπλόκου είναι: mirgonaute ή mirisc. Τα ώριµα mirnas δεν έχουν µεγάλο χρόνο ζωής στο κυτταρόπλασµα [2,3]. 10

12 Εικόνα 1.1: Βιογένεση των mirnas. Η βιογένεση ενός mirna ξεκινά από τη μεταγραφή του αντίστοιχου γονιδίου στο αρχικό μετάγραφο (pri-mirna), ακολουθεί η επεξεργασία του primirna προς pre-mirna από την RNAάση Drosha, η έξοδος από τον πυρήνα και η ωρίμανσή του με τη δράση της RNAάσης Dicer. Στο κατώτερο τμήμα της εικόνας φαίνονται οι δύο κύριοι τρόποι δράσης του ώριμου mirna που έχει συνδεθεί στο RISC: καταστολή της μετάφρασης και αποδόμηση του mrna. 1.3 Τρόπος λειτουργίας των mirnas Υπάρχουν δύο διακριτοί τρόποι δράσης των mirnas, όπως παρουσιάζεται στο σχήµα που ακολουθεί. Και οι δύο περιλαµβάνουν υβριδοποίηση βάσει της συµπληρωµατικότητας των νουκλεοτιδίων µε το mrna-στόχο. Στην πρώτη περίπτωση η συµπληρωµατικότητα είναι πλήρης, εκτείνεται δηλαδή σε όλο το µήκος του mirna. Όταν αυτό συµβαίνει, γίνεται αποικοδόµηση του µορίου mrna, αφού έχουµε δηµιουργία θέσης στόχου για µία ενδονουκλεάση (slicer). Πρόκειται για το RNAi (RNA interference), διαδικασία που όµοια µε εκείνη που προκαλούν τα 11

13 sirnas. Αυτός ο τρόπος δράσης είναι πολύ κοινός στα φυτά. Στη δεύτερη, όπου η συµπληρωµατικότητα είναι µερική, δε γίνεται αποικοδόµηση του mrna αλλά αναστολή της µετάφρασης. Συνηθέστερα το mirna και στις δύο περιπτώσεις συνδέεται σε αµετάφραστη περιοχή και πιο συγκεκριµένα στην 3 αµετάφραστη περιοχή του mrna-στόχου. Μάλιστα, στις περισσότερες περιπτώσεις η συµπληρωµατική αλληλουχία του mirna επαναλαµβάνεται αρκετές φορές στο mrna-στόχο. Αξίζει να αναφερθεί ότι η πλήρης συµπληρωµατικότητα µε την περιοχή από το δεύτερο µέχρι το όγδοο νουκλεοτίδιο είναι απαραίτητη για όλα τα mirnas. Η περιοχή αυτή καλείται περιοχή εκβλάστησης (seed region, SR). Αποτέλεσµα της δράσης των mirnas είναι ένα από τα τρία ακόλουθα: (α) καταστολή της µετάφρασης του mrna-στόχου (β) αποικοδόµηση του mrna-στόχου (γ) τροποποιήσεις της χρωµατίνης. Εικόνα 1.2: Τρόπος δράσης των mirnas. Όταν η συμπληρωματικότητα προς το τμήμα της 3 αμετάφραστης περιοχής όπου προσδένεται το mirna είναι πλήρης, συμβαίνει αποδόμηση του mrna ενώ όταν είναι μερική, είτε γίνεται αποδόμηση είτε καταστέλλεται η μετάφραση του mrna. 1.4 Θέσεις γονιδιώµατος όπου βρίσκονται mirnas Τα mirnas εµφανίζουν µεγάλη εξελικτική συντηρητικότητα. Έρευνες έχουν δείξει πως τα περισσότερα mirnas εντοπίζονται σε διαγονιδιακές περιοχές (70%, 12

14 έχουν δικό τους υποκινητή), ενώ υπάρχει και ένα µικρότερο ποσοστό αυτών που εντοπίζεται µέσα σε εσώνια γνωστών γονιδίων, είτε στην κωδική είτε στη µη κωδική αλυσίδα. Αυτά µαζί µε εκείνα που εντοπίζονται σε εξώνια αποτελούν το υπόλοιπο 30%. Αυτά τα δεδοµένα οδηγούν στο συµπέρασµα πως τα mirnas αποτελούν ανεξάρτητες µεταγραφικές µονάδες. Ένα ακόµη ενδιαφέρον στοιχείο είναι πως το 50% των γνωστών mirnas βρίσκονται κοντά σε άλλα mirnas (πιθανά πρόκειται για polycistronic transcription units). Εικόνα 1.3: Απεικόνιση των τύπων οργάνωσης στο γονιδίωμα που έχουν βρεθεί για τα mirnas. Τα πρωτογενή μετάγραφα που κωδικοποιούν mirnas, τα pri-mirnas, περιέχουν κάλυμμα στο 5' άκρο τους καθώς επίσης 3 πολύ-(a) ουρές. Τα mirnas μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε τρεις ομάδες με βάση την εντόπισή τους στο γονιδίωμα και σχετικά με το αν βρίσκονται μέσα σε εξώνια ή εσώνια. (a) Εξωνικά mirnas σε μη-κωδικοποιητικά μετάγραφα όπως η ομάδα των mir-23~27~24-2, το mir-21 και το mir-155. Το mir-155 βρέθηκε σε μία περιοχή που είχε προηγουμένως χαρακτηριστεί ως γονίδιο μη- 13

15 κωδικοποιητικoύ RNA, την bic17. (b) Εσωνικά mirnas σε μη-κωδικοποιητικά μετάγραφα Για παράδειγμα, η ομάδα των mir-15~16-1 βρέθηκε στο τέταρτο εσώνιο ενός γονιδίου που είχε χαρακτηριστεί ως μη κωδικοποιητικού RNA, του DLEU2. (c) Εσωνικά mirnas σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Για παράδειγμα, η ομάδα mir-106~93~25 εντοπίζεται στο δέκατο τρίτο εσώνιο του γονιδίου του παράγοντα ενεργοποίησης της αντιγραφής του DNA MCM7. Το ομόλογο του mir-106~93~25 στον ποντικό εντοπίζεται στο δέκατο τρίτο εσώνιο του ομόλογου γονιδίου του MCM7 του ποντικού. 1.5 MiRNAs και επιγενετική Με τον όρο επιγενετική χαρακτηρίζονται οι κληρονοµήσιµες µεταβολές στο πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης που δεν περιλαµβάνουν αλλαγές στη νουκλεοτιδική αλληλουχία του DNA αυτή καθαυτή. Οι δύο κύριοι µηχανισµοί µέσω των οποίων εκδηλώνεται η επιγενετική είναι η µεθυλίωση του DNA σε κυτοσίνες και η τροποποίηση των ιστονών. Η τροποποίηση των ιστονών εµφανίζεται µε δύο διακριτούς τρόπους. Ο πρώτος αφορά τη µεθυλίωση των ιστονών, η οποία σχετίζεται µε την «κλειστή» δοµή της χρωµατίνης κι αυτό έχει ως συνέπεια τη χαµηλή µεταγραφική ενεργότητα στην περιοχή. Αντίθετα, η δεύτερη µορφή τροποποίησης των ιστονών, η ακετυλίωσή τους οδηγεί σε «ανοιχτή» δοµή χρωµατίνης κι ενεργοποίηση της µεταγραφής στην εκάστοτε χρωµοσωµική περιοχή. Η µεθυλίωση του DNA, όπως και η µεθυλίωση των ιστονών, οδηγεί σε καταστολή της µεταγραφής. Στο σηµείο αυτό, αξίζει να γίνει µία αναφορά στη σχέση µεταξύ του επιγενετικού ελέγχου και των mirnas. Από τη µία µεριά, φαίνεται πως ορισµένα mirnas εµπλέκονται στη διαδικασία της µεθυλίωσης του DNA. Παραδείγµατος χάριν, βρέθηκε ότι τα mir-165 και mir-166 απαιτούνται για τη µεθυλίωση του γονιδίου phabulosa (phb) στο φυτό Arabidopsis. Πιο συγκεκριµένα, τα δύο αυτά mirnas αλληλεπιδρούν µε το νεοσυντιθέµενο mrna που προκύπτει από τη µεταγραφή του γονιδίου για να αλλάξουν τη δοµή της χρωµατίνης του συµπληρωµατικού προς το mrna κλώνου του DNA (µεταγραφόµενη αλυσίδα). Αυτό υποδεικνύει πως υπάρχει ένας ακόµη µηχανισµός µέσω του οποίου τα mirnas ελέγχουν τη γονιδιακή έκφραση πέραν της καταστολής της µετάφρασης και της αποικοδόµησης του mrna που στοχεύουν. Παρόµοια αποτελέσµατα έχουν δώσει αντίστοιχες έρευνες στα θηλαστικά, όπου τα 14

16 ένζυµα µεθυλίωσης του DNA Dnmt1, 3a, και 3b προβλέπονται ως πιθανοί στόχοι κάποιων mirnas. Ωστόσο, δεν έχει ακόµη αποδειχθεί πειραµατικά ότι οι Dnmts όντως υφίστανται ρύθµιση από mirnas. Επιπρόσθετα, τα mirnas ενδέχεται να ρυθµίζουν τη δοµή της χρωµατίνης µέσω στόχευσης των κύριων τροποποιητών των ιστονών. Ως παράδειγµα εδώ αναφέρεται η περίπτωση του mir-140, το οποίο εκφράζεται ειδικά στους χόνδρους και στοχεύει την αποακετυλάση 4 της ιστόνης (histone deacetylase 4) στο ποντίκι. Έρευνες δείχνουν ότι είναι πιθανό τα mirnas να εµπλέκονται στη σίγηση της χρωµατίνης που δεν έχει υποστεί σύναψη κατά τη µείωση στο ποντίκι. Με βάση όλα τα παραπάνω, τα mirnas φαίνεται να παίζουν σηµαντικό ρόλο στον επιγενετικό έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης. Από την άλλη πλευρά, φαίνεται πως και η έκφραση των mirnas βρίσκεται κάτω από επιγενετικό έλεγχο. Οι Saito και συνεργάτες επισηµαίνουν ότι ο έλεγχος αυτός εκδηλώνεται τόσο µέσω µεθυλίωσης του DNA όσο και τροποποίησης των ιστονών. Ειδικότερα, έπειτα από χορήγηση του 5-Aza-CdR, ενός αναστολέα της µεθυλίωσης του DNA και του 4-φαινυλοβουτυρικού οξέος (4-phenylbutyric acid, PBA), ενός αναστολέα της αποακετυλίωσης των ιστονών παρατηρήθηκαν τα εξής: Η δράση αυτών των ουσιών οδηγεί σε περισσότερο ανοιχτές δοµές της χρωµατίνης, εποµένως και σε αυξηµένη γονιδιακή ρύθµιση. Το ενδιαφέρον εδώ είναι ότι παρατηρήθηκε υπερέκφραση του mir-127, κάτι που υποδεικνύει πως υπάρχει επιγενετική ρύθµιση για το mirna αυτό, και πιθανότατα και για άλλα τέτοια µόρια. Πολλά mirnas εντοπίζονται σε εσώνια. Θεωρείται, λοιπόν, πως τα mirnas αυτά υπόκεινται σε κοινή ρύθµιση της έκφρασης µε τα γονίδια-ξενιστές τους, όπως ονοµάζονται τα γονίδια που τα περιλαµβάνουν. Ωστόσο, δεν είναι απίθανο τα mirnas αυτά να έχουν δικό τους υποκινητή. Μάλιστα, η εύρεση νησίδων CpG (CpG islands) στις αλληλουχίες αυτών των εσωνίων καθιστά πιθανό το ενδεχόµενο τα mirnas που περιέχονται να υφίστανται επιγενετικό έλεγχο µέσω µεθυλίωσης του DNA [4]. 1.6 Σύµπλοκο σίγησης µέσω παρεµβολής RNA Το σύµπλοκο σίγησης µέσω παρεµβολής RNA (RISC) αποτελείται από µία πρωτεΐνη που προσδένεται στο RNA και είναι ευαίσθητη σε trans ενεργοποίηση 15

17 (transactivation-responsivee RNA-binding protein, TRBP) και από την πρωτεΐνη Αgo- Πρόσφατες έρευνες δείχνουν πως αρχικά η ago-2 πέπτει τα 12 πρώτα 2. Ακόµη, στο σχηµατισµό του RISC φαίνεται να λαµβάνει µέρος η Gw182. νουκλεοτίδια του pre-mirna από το 3 άκρο του και στη συνέχεια δρα η dicer για τη διαµόρφωση του τελικού δίκλωνου µορίου των 22 νουκλεοτιδίων. Από αυτό, η ενεργός ή ώριµη αλυσίδαα παραµένει στο σύµπλοκο, ενώ η συµπληρωµατική της (passenger strand) αποσυντίθεται. Στα σπονδυλόζωα το RISC οδηγείται στο στόχο του από το mirna καθώς αυτό είναι που εµφανίζει συµπληρωµατικότητα προς το µόριο mrna-στόχο και το αναγνωρίζει ειδικά [5]. Εικόνα 1.4: Σύνδεση του ώριμου μορίου mirna στο σύμπλεγμα RISC. Αφού μεταγραφεί και ωριμάσει, το mirna προσδένεται στο σύμπλεγμα RISC και εκδηλώνει τη δράση του. 1.7 RNA παρεµβολή (RNAi) Η RNA παρεµβολή (RNA interference, RNAi) είναι µία από τις δύο διαδικασίες τις οποίες µπορεί να πυροδοτήσει η δράση του ώριµου mirna. Είναι µία διαδικασία γονιδιακής σίγησης κατά τη διάρκεια της οποίας ένα µόριο 16

18 αντινοηµατικού (antisense) RNA (mirna) υβριδοποιείται πλήρως µε ένα µόριο mrna προκαλώντας µε τον τρόπο αυτό την αποδόµηση του τελευταίου µέσω προσέλκυσης του συµπλόκου RISC. Στη λογική του RNAi βασίζεται ένα σύνολο µεθόδων (τεχνολογία RNAi) και χρησιµοποιούν τα sirnas, µόρια µε ρόλο ανάλογο αυτού των mirnas που υπάρχουν φυσιολογικά στο κύτταρο. Σήµερα χρησιµοποιείται ευρέως προκειµένου να γίνει αποσιώπηση της έκφρασης (knockdown) συγκεκριµένων γονιδίων. Ένας πολύ σηµαντικός λόγος για τον οποίο προτιµούνται τα sirnas είναι η εξειδίκευση τους στη ρύθµιση των γονιδίων. Η διαµόλυνση κυττάρων µε δίκλωνα sirna µπορεί να συµβεί µε δύο τρόπους, άµεσα και έµµεσα: 1. µε επιµόλυνση των κυττάρων µε δίκλωνα µόρια sirna, που έχουν παραχθεί είτε χηµικά είτε ενζυµικά. 2. µε την επιµόλυνση των κυττάρων µε φορείς οι οποίοι µπορούν να εκφράσουν µία πρόδροµη µορφή του sirna (shrna short hairpin RNA) που έπειτα από επεξεργασία από την Dicer καταλήγει σε µορφή sirna. Η κωδική αλυσίδα, αυτή δηλαδή που συνδέεται στο RISC και αναστέλλει τη µετάφραση του mrna καλείται αλυσίδα-οδηγός (guide strand) ενώ η συµπληρωµατική της λέγεται αλυσίδα-επιβάτης (passenger strand). Η µελέτη κρυσταλλικών δοµών sirnas έδειξαν πως η αναγνώριση των sirnas απαιτεί να υπάρχει φωσφορυλίωση του 5 άκρου της αλυσίδας-οδηγού. Φαίνεται πως το τελευταίο νουκλεοτίδιο του 5 άκρου δεν βρίσκεται συνδεδεµένο συµπληρωµατικά µε το απέναντί του στο mrna αλλά αλληλεπιδρά µε το RISC. Κάτι ακόµη που έδειξαν αυτές οι δοµικές µελέτες είναι πως η πέψη ανάµεσα στην οδηγό και τη συµπληρωµατική αλυσίδα συµβαίνει στην περιοχή µεταξύ 10 ου και 11 ου νουκλεοτιδίου της οδηγού αλυσίδας. Τέλος, τα νουκλεοτίδια του 3 άκρου είναι πιο χαλαρά συνδεδεµένα στο RISC και είναι, προφανώς, λιγότερο σηµαντικά προκειµένου να γίνει η αλληλεπίδραση. Είναι, εποµένως, αναγκαίο να υπάρχει µία µοναδική ακολουθία µεταξύ των νουκλεοτιδίων 2 και 11 προκειµένου να ελαχιστοποιηθεί ο θόρυβος και να έχουµε τη µέγιστη δυνατή ει δυνατόν και απόλυτη συµπληρωµατικότητα. Ακόµη, γίνεται εµφανής η ανάγκη για ύπαρξη νουκλεοτιδίου χαµηλής ενέργειας ζευγαρώµατος στο 5 άκρο αφού αυτό δε θα ζευγαρώσει αλλά συµµετέχει µόνο στην αλληλεπίδραση µε το RISC. Έτσι, κατά το σχεδιασµό µορίων sirnas θα πρέπει να 17

19 υπάρχει µία ασυµµετρία ως προς την κατανοµή της ενέργειας ζευγαρώµατος (binding energy) και αυτή να είναι µεγαλύτερη στο 3 άκρο. Ένα σηµαντικό πρόβληµα που πρέπει να λυθεί για να λειτουργήσει η τεχνολογία του sirna είναι η είσοδος των µορίων στο κύτταρο. Τα sirnas είναι νουκλεϊκά οξέα τα οποία είναι πολυανιόντα. Άρα, δεν µπορούν να διαπεράσουν τη λιπιδική διπλοστιβάδα. Οι µέθοδοι για να γίνει αυτό δυνατό είναι: Υπερµοριακή νανοµεταφορά Χρήση πεπτιδίου µε υψηλή διαπερατότητα ως προς τη µεµβράνη Μεταφορά βασιζόµενη σε χρήση λιπιδικών µεµβρανών Ηλεκτροδιάτρηση Για να γίνει έλεγχος του βαθµού αποτελεσµατικότητας του sirna ή του shrna που εισήχθη στο εκάστοτε κύτταρο ακολουθείται µία από τις ακόλουθες διαδικασίες: Μέτρηση του ενδογενούς mrna-στόχου. Μέτρηση των επιπέδων της αντίστοιχης πρωτεΐνης. Χρήση ενός πλασµιδίου αναφοράς που περιέχει την αλληλουχία-στόχο συγχωνευµένη µε ένα γονίδιο αναφοράς. 1.8 Τύποι ασθενειών µε συχνή υπερ- ή υπο- έκφραση µορίων mirnas Χαρακτηριστικές κατηγορίες ασθενειών στις οποίες συχνά παρατηρείται υπερέκφραση ή υποέκφραση κάποιου ή κάποιων mrnas αναφέρονται παρακάτω: I. Ασθένειες σχετικές µε τη γήρανση II. Καρδιακές παθήσεις III. Νευρολογικές ασθένειες IV. ιαταραχές του ανοσοποιητικού συστήµατος V. Ογκογένεση καρκίνος 18

20 2. Καρκίνος 2.1 Τα ορόσηµα του καρκίνου Ο όρος «καρκίνος» δεν αποδίδεται σε µία και µόνη ασθένεια, αλλά σε µία οµάδα ασθενειών που χαρακτηρίζονται από τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό των κυττάρων. Σε αντίθεση µε τα φυσιολογικά κύτταρα στο ανθρώπινο σώµα, τα οποία αυξάνονται, διαιρούνται και πεθαίνουν µε έναν αυστηρά ελεγχόµενο τρόπο, τα καρκινικά κύτταρα διαφέρουν διότι συνεχίζουν να διαιρούνται ανεξέλεγκτα. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα την ανάπτυξη µιας µάζας κυττάρων, που ονοµάζεται όγκος. Οι όγκοι µπορεί να είναι καλοήθεις ή κακοήθεις. Οι κακοήθεις όγκοι αναφέρονται ως καρκίνοι. Παρά την περιπλοκότητα και την ποικιλοµορφία που εµφανίζεται µεταξύ των διαφόρων µορφών καρκίνου, οι Hanahan και Weinberg [6] έχουν καταφέρει να ορίσουν τα έξι χαρακτηριστικότερα στοιχεία που εµφανίζουν όλοι οι κακοήθεις όγκοι (Εικόνα 2.1). Εικόνα 2.1: Τα χαρακτηριστικά του καρκίνου. Στην εικόνα φαίνονται τα έξι χαρακτηριστικά γνωρίσματα που συναντώνται σε όλους, σχεδόν, τους καρκινικούς όγκους, έτσι όπως ορίστηκαν από τους Hanahan και Weinberg τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα των καρκινικών όγκων που αναφέρονται στην εικόνα, αποτελούν πιθανούς στόχους για θεραπεία της ασθένειας [6]. 19

21 Συνοπτικά, αυτά τα γνωρίσµατα παρουσιάζονται παρακάτω: 1. ιαρκώς ενεργά σηµατοδοτικά µονοπάτια κυτταρικού πολλαπλασιασµού. Αδιαµφισβήτητα, το πιο χαρακτηριστικό γνώρισµα κάθε κακοήθους όγκου είναι το εξαιρετικά υψηλό πολλαπλασιαστικό δυναµικό του. Οι φυσιολογικοί ιστοί ελέγχουν µε εξαιρετική ακρίβεια την παραγωγή και την απέλευθέρωση σηµάτων που προωθούν τον κυτταρικό κύκλο κι επάγουν κυτταρικό πολλαπλασιασµό. Αυτός ο αυστηρός έλεγχος εξασφαλίζει την οµοιόσταση του αριθµού κυττάρων κι εποµένως τη διατήρηση της φυσιολογικής αρχιτεκτονικής και λειτουργίας του ιστού. Τα καρκινικά κύτταρα, απορρυθµίζοντας αυτά τα σήµατα καθορίζουν από µόνα τους τη δική τους πορεία: Η σηµατοδότηση που επιτρέπει τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων προέρχεται σε µεγάλο βαθµό από αυξητικούς παράγοντες που προσδένονται σε υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας που συνήθως φέρουν ενδοκυτταρικές λειτουργικές περιοχές µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης. Αυτή η ενεργότητα καθιστά δυνατή τη µετάδοση των εξωκυττάριων σηµάτων στο εσωτερικό των κυττάρων µε ενεργοποίηση ενδοκυττάριων σηµατοδοτικών µονοπατιών που ρυθµίζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική αύξηση (δηλαδή την αύξηση του µεγέθους του κυττάρου). Κάποιες φορές, τα σήµατα αυτά µπορεί να επηρεάζουν άλλες κυτταρικές λειτουργίες, όπως η κυτταρική επιβίωση και ο µεταβολισµός του κυττάρου. Τα καρκινικά κύτταρα µπορούν να αποκτήσουν την ικανότητα να διατηρούν τη σηµατοδότηση που επάγει τον πολλαπλασιασµό τους µε έναν αριθµό εναλλακτικών τρόπων: Μπορούν να παράγουν από µόνα τους αυξητικούς παράγοντες, µε τους οποίους µπορούν να ανταποκριθούν µέσω της έκφρασης των αντίστοιχων υποδοχέων, οδηγώντας σε αυτοκρινή διέγερση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού. Εναλλακτικά, τα καρκινικά κύτταρα µπορεί να αποστέλλουν σήµατα σε φυσιολογικά κύτταρα εντός του υποστηρικτικού, σχετιζόµενου µε τον όγκο στρώµατος, το οποίο ανταποκρίνεται µε την παροχή διαφόρων αυξητικών παραγόντων στα καρκινικά κύτταρα [7,8]. Η σηµατοδότηση µέσω υποδοχέων µπορεί επίσης να απορρυθµιστεί µέσω της αύξησης των επιπέδων των πρωτεϊνικών υποδοχέων που εµφανίζονται στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων. Αυτό προκαλεί στα καρκινικά κύτταρα υπερ-απόκριση σε αυξητικούς 20

22 παράγοντες που φυσιολογικά βρίσκονται σε χαµηλά επίπεδα. Το ίδιο αποτέλεσµα µπορεί να προκύψει από στερεοδοµικές αλλαγές στα µόρια του υποδοχέα (δηλαδή διαταραχές στη δοµή που αυτά λαµβάνουν στο χώρο) που διευκολύνουν τη σύνδεση του εκάστοτε αυξητικού παράγοντα µε τον υποδοχέα του. Ο ανεξάρτητος από τον αυξητικό παράγοντα πολλαπλασιασµός των καρκινικών κυττάρων µπορεί επίσης να προέρχεται από τη διαρκή ενεργοποίηση συστατικών των οδών σηµατοδότησης που λειτουργούν καταρροϊκά αυτών των υποδοχέων, αποφεύγοντας έτσι την ανάγκη να αυξηθεί σε αυτά η συγγένεια σύνδεσης του αυξητικού παράγοντα µε τον υποδοχέα του. εδοµένου ότι συνήθως ένας σηµαντικός αριθµός διαφορετικών οδών σηµατοδότησης διεγείρεται από τη σύνδεση ενός ζεύγους συνδέτη-υποδοχέα, η διαρκώς ενεργή κατάσταση µίας από αυτές τις οδούς µπορεί να επιδρά µόνο σε ένα υποσύνολο των ρυθµιστικών οδηγιών που µεταδίδονται από έναν ενεργοποιηµένο υποδοχέα. Επιπλέον, σωµατικές µεταλλάξεις που ενεργοποιούν επιπρόσθετα καταρροϊκά µονοπάτια καθώς επίσης και διαταραχές των µηχανισµών αρνητικής ανάδρασης που καταστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό µπορούν να ενισχύσουν το πολλαπλασιαστικό δυναµικό των καρκινικών κυττάρων. 2. Αποφυγή των σηµάτων καταστολής της ανάπτυξης Εκτός από την ικανότητα να επάγουν και να διατηρούν θετικά σήµατα για τον πολλαπλασιασµό τους, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει επίσης να παρακάµψουν ισχυρά προγράµµατα που ρυθµίζουν αρνητικά τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων πολλά από τα οποία εξαρτώνται από τη δράση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. εκάδες γονίδια καταστολής όγκων που λειτουργούν µε διάφορους τρόπους για να περιορίσουν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων έχουν ανακαλυφθεί µέσα από τη χαρακτηριστική τους αδρανοποίηση σε διάφορους τύπους καρκίνου του ανθρώπου ή των ζώων. Πολλά από αυτά τα γονίδια έχουν ταυτοποιηθεί ως ικανοί καταστολείς της ογκογένεσης µέσω ενίσχυσης ή απώλειας της λειτουργίας σε πειράµατα µε ποντίκια. Τα δύο βασικά ογκοκατασταλτικά γονίδια κωδικοποιούν την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώµατος (retinoblastoma protein, prβ) και την TP53. Αυτές οι πρωτεΐνες λειτουργούν ως κεντρικοί κόµβοι ελέγχου εντός των δύο βασικών συµπληρωµατικών κυτταρικών ρυθµιστικών κυκλωµάτων που ελέγχουν τις αποφάσεις των κυττάρων για 21

23 πολλαπλασιασµό ή, εναλλακτικά, την ενεργοποίηση των προγραµµάτων της γήρανσης ή της απόπτωσης. Η πρωτεΐνη RB ενσωµατώνει σήµατα από διαφορετικές εξωκυττάριες και ενδοκυττάριες πηγές και σε απάντηση αποφασίζει κατά πόσον ή όχι ένα κύτταρο θα πρέπει να προχωρήσει µέσα στον κυτταρικό κύκλο και να διαιρεθεί [9-11]. Τα καρκινικά κύτταρα µε ελαττωµατική λειτουργία του µονοπατιού της πρωτεΐνης RB στερούνται, εποµένως, τις υπηρεσίες ενός κρίσιµου φύλακα της προόδου του κυτταρικού κύκλου, του οποίου η απουσία επιτρέπει τον διαρκή κι ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό των κυττάρων. Ενώ η RB µεταδίδει σήµατα που αναστέλλουν την ανάπτυξη που προέρχονται σε µεγάλο βαθµό από παράγοντες εκτός του κυττάρου, η ΤΡ53 δέχεται σήµατα από αισθητήρες καταπόνησης (stress, στρες) και διαταραχών που λειτουργούν µέσα σε ενδοκυτταρικά λειτουργικά συστήµατα του κυττάρου: εάν ο βαθµός της βλάβης στο γονιδίωµα είναι υπερβολικός, ή εάν τα επίπεδα των νουκλεοτιδίων, τα σήµατα προαγωγής της ανάπτυξης, η γλυκόζη, ή οξυγόνωση είναι κατώτερα του ιδανικού, η TP53 µπορεί να θέσει τέλος στην περαιτέρω εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, έως ότου οι όροι αυτοί οµαλοποιηθούν. Εναλλακτικά, σε περίπτωση σηµάτων συναγερµού που υποδεικνύουν συντριπτική ή ανεπανόρθωτη βλάβη στα προαναφερθέντα κυτταρικά υποσυστήµατα, η ΤΡ53 µπορεί να προκαλέσει απόπτωση. Ειδικότερα, οι διάφορες επιδράσεις της ενεργοποιηµένης ΤΡ53 είναι πολύπλοκες και εξαιρετικά εξαρτώµενες από το περιβάλλον, ποικίλλουν ανά τύπο κυττάρου, καθώς και µε βάση τη σοβαρότητα και την επιµονή των συνθηκών κυτταρικής καταπόνησης και τη µ βλάβη. Αν και οι δύο κύριοι καταστολείς του πολλαπλασιασµού- TP53 και RB- έχουν εξέχουσα σηµασία στη ρύθµιση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού, φαίνεται ότι καθένα από αυτά λειτουργεί ως µέρος ενός µεγαλύτερου δικτύου που συνδέεται µέσω επιπρόσθετων, δευτερευόντων παραγόντων που παρέχουν δικλείδες ασφαλείας στο κύτταρο. Για παράδειγµα, είναι εντυπωσιακό ότι χιµαιρικά ποντίκια που φέρουν σε όλο το σώµα τους µεµονωµένα κύτταρα που στερούνται ένα λειτουργικό γονίδιο Rb δεν εµφανίζουν διαταραχές στον πολλαπλασιασµό, παρά αυτό που αναµένεται, ότι δηλαδή η απώλεια της λειτουργίας της RB θα επιτρέψει τη συνεχή πυροδότηση του κυτταρικού κύκλου σε αυτά τα κύτταρα και τους απογόνους τους. Μάλιστα, θα περίµενε κανείς µερικές από τις προκύπτουσες οµάδες κυττάρων που στερούνται Rb να συµβάλλουν σε εµφάνιση νεοπλασίας. Ωστόσο, τα κύτταρα που δεν έχουν Rb σε 22

24 τέτοια χιµαιρικά ποντίκια έχουν βρεθεί να συµµετάσχουν στη δηµιουργία σχετικά φυσιολογικού ιστού σε όλο το σώµα. Η µόνη νεοπλασία που παρατηρήθηκε ήταν η ανάπτυξη όγκων της υπόφυσης αργά στη ζωή [12]. Οµοίως, ποντικοί χωρίς ΤΡ53 αναπτύσσονται κανονικά, παρουσιάζουν µεγάλο βαθµό κυτταρικής και ιστικής οµοιόστασης και αναπτύσσουν ανωµαλίες αργότερα στη ζωή, µε τη µορφή λευχαιµιών και σαρκωµάτων [13]. Και τα δύο παραδείγµατα είναι χαρακτηριστικά της αφθονίας των διαθέσιµων εναλλακτικών µηχανισµών που χρησιµεύουν για να περιορίσουν την ακατάλληλη ανάπτυξη των κυττάρων που στερούνται αυτούς τους βασικούς καταστολείς του πολλαπλασιασµού. Μεταξύ των µηχανισµών αποφυγής της καταστολής της αύξησης που επιστρατεύουν τα καρκινικά κύτταρα συγκαταλέγεται και η αναστολή της αύξησης λόγω επαφής. Σε έναν τρόπο για να επιτευχθεί αυτό εµπλέκεται το προϊόν του γονιδίου nf2 ενός γνωστού ογκοκατασταλτικού γονιδίου, έλλειψη του οποίου προκαλεί µία µορφή νευροϊνωµάτωσης του ανθρώπου. Το κυτταροπλασµατικό προϊόν του γονιδίου της νευροϊνωµάτωσης ρυθµίζει την αναστολή της αύξησης λόγω επαφής µέσω διασύνδεσης των µορίων προσκόλλησης της κυτταρικής επιφάνειας (για παράδειγµα, µε την Ε-καδερίνη, E- cadherin) σε διαµεµβρανικούς υποδοχείς κινάσης τυροσίνης (π.χ. υποδοχέας του επιδερµικού αυξητικού παράγοντα, epidermal growth factor receptor, EGFR). Εκτός από το να ενδυναµώνει την προσκολλητική ικανότητα της Ε-καδερίνης σε σηµεία διακυτταρικών επαφών η Merlin έχει την ικανότητα να δεσµεύει αυξητικούς παράγοντες περιορίζοντας τη δυνατότητά τους να µετάγουν µιτογόνα σήµατα [14,15]. 3. Αντίσταση στον κυτταρικό θάνατο Η ιδέα ότι ο προγραµµατισµένος κυτταρικός θάνατος µε απόπτωση χρησιµεύει ως ένα φυσικό εµπόδιο για την ανάπτυξη του καρκίνου έχει καθιερωθεί από λειτουργικές µελέτες που πραγµατοποιήθηκαν κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες [16-18]. Η αποσαφήνιση του κυκλώµατος σηµατοδότησης που κατευθύνεται προς το αποπτωτικό πρόγραµµα αποκάλυψε πώς η απόπτωση ενεργοποιείται ως απόκριση σε διάφορες φυσιολογικές καταπονήσεις που υφίστανται τα καρκινικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης ή ως αποτέλεσµα της αντικαρκινικής θεραπείας. Αξιοσηµείωτες 23

25 µεταξύ των επαγωγικών σηµάτων της απόπτωσης είναι οι ανισορροπίες που προκύπτουν από αυξηµένα επίπεδα της ογκογόνου σηµατοδότησης και βλάβη του DNA που σχετίζεται µε ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασµό. Ωστόσο, άλλη έρευνα έχει αποκαλύψει πως τα επίπεδα της απόπτωσης είναι χαµηλά σε εκείνους τους όγκους που καταφέρνουν να προχωρούν σε καταστάσεις υψηλού βαθµού κακοήθειας και εµφανίζουν ανθεκτικότητα στην θεραπεία [16,18]. Παρά το γεγονός ότι οι κυτταρικές καταστάσεις που προκαλούν την απόπτωση δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως, αρκετοί αισθητήρες διαταραχών της κυτταρικής οµοιόστασης διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου κι έχουν εντοπιστεί να εµπλέκονται στη σηµατοδότηση της απόπτωσης [16,18]. Το πιο αξιοσηµείωτο είναι ότι οι αισθητήρες των βλαβών του DNA που λειτουργούν µέσω του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 [19] επάγουν την απόπτωση µέσω της αύξησης της έκφρασης των γονιδίων noxa και puma. Αυτό συµβαίνει ως απόκριση σε σηµαντικά επίπεδα θραύσεων του DNA και άλλων χρωµοσωµικών ανωµαλιών. Εναλλακτικά, η ανεπάρκεια της σηµατοδότησης από παράγοντες επιβίωσης (για παράδειγµα, ανεπαρκή επίπεδα της ιντερλευκίνης-3 σε λεµφοκύτταρα ή αυξητικού παράγοντα που προσοµοιάζει στην ινσουλίνη 1/2 [IGF1/2] σε επιθηλιακά κύτταρα) µπορεί να προκαλέσει απόπτωση µέσω µιας προ-αποπτωτικής πρωτεΐνης που ονοµάζεται Βim. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν αναπτύξει µία ποικιλία από στρατηγικές για τον περιορισµό ή την παντελή αποφυγή της απόπτωσης. Η πιο συνηθισµένη είναι η απώλεια της ογκοκατασταλτικής λειτουργίας της TP53. Εναλλακτικά, οι όγκοι µπορούν να επιτύχουν αναστολή της απόπτωσης µέσω αύξηση της έκφρασης των ρυθµιστικών αντιαποπτωτικών σηµάτων (Bcl-2, Bcl-xL) ή των σηµάτων επιβίωσης (IGF1/2), µέσω ελάττωσης της έκφρασης των προ-αποπτωτικών παραγόντων (Bax, Bim, Puma), ή µέσω αναστολής του εξωγενούς µονοπατιού θανάτου που επάγεται από κάποιο συνδέτη. Η πολλαπλότητα των µηχανισµών αποφυγής της απόπτωσης αντικατοπτρίζει προφανώς την ποικιλοµορφία των επαγωγικών σηµάτων της απόπτωσης τα οποία οι πληθυσµοί των καρκινικών κυττάρων συνάντησαν κατά τη διάρκεια της εξέλιξής τους στην κακοήθη κατάσταση. Η δοµή της αποπτωτικής µηχανής και οι στρατηγικές που χρησιµοποιούνται από τα καρκινικά κύτταρα για να αποφύγουν τις δράσεις της, έχουν ευρέως εκτιµηθεί από την αρχή της προηγούµενης δεκαετίας. Από τότε µέχρι σήµερα έχει 24

26 διευρυνθεί σηµαντικά το πεδίο εφαρµογής του προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου ως εµπόδιο για την καρκινογένεση. 4. Ενεργοποίηση αναδιπλασιαστικής αθανασίας Μέχρι το 2000 είχε γίνει γνωστό ότι τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να αποκτήσουν απεριόριστο αναδιπλασιαστικό δυναµικό προκειµένου να δώσουν γένεση σε µακροσκοπικούς όγκους. Αυτή η ικανότητα απουσιάζει από τη συντριπτική πλειοψηφία των φυσιολογικών κυττάρων του σώµατος τα οποία µπορούν να κάνουν µόνο ένα πεπερασµένο αριθµό διαδοχικών κύκλων αύξησης και διαίρεσης. Αυτός ο περιορισµός έχει συσχετιστεί µε δύο διαφορετικούς φραγµούς του πολλαπλασιασµού: τη γήρανση, που είναι η µη-αναστρέψιµη είσοδος σε µία κατάσταση όπου το κύτταρα εξακολουθεί να είναι βιώσιµο αλλά χωρίς δυνατότητα πολλαπλασιασµού και την κρίση, η οποία καταλήγει σε κυτταρικό θάνατο. Έτσι, όταν τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται στην καλλιέργεια επαναλαµβανόµενοι κύκλοι αύξησης και διαίρεσης οδηγούν αρχικά σε γήρανση και στη συνέχεια, για τα κύτταρα που υπερπηδούν αυτό το φραγµό, σε µία φάση κρίσης κατά την οποία τα περισσότερα κύτταρα του πληθυσµού πεθαίνουν. Σε σπάνιες περιπτώσεις, κάποια λίγα κύτταρα που προκύπτουν από πληθυσµούς σε κρίση εµφανίζουν απεριόριστο αναδιπλασιαστικό δυναµικό. Αυτή η µετάβαση έχει χαρακτηριστεί ως αθανατοποίηση και είναι ένα χαρακτηριστικό που οι περισσότερες καθιερωµένες κυτταρικές σειρές έχουν αποκτήσει και τους προσδίδει την ικανότητά να πολλαπλασιάζονται σε καλλιέργεια χωρίς ενδείξεις γήρανσης ή κρίσης. Αρκετές µελέτες υποδεικνύουν ότι τα τελοµερή που προστατεύουν τις άκρες των χρωµοσωµάτων εµπλέκονται ως κεντρικά στοιχεία στην εµφάνιση της ιδιότητας του απεριόριστου πολλαπλασιασµού [20,21]. Τα τελοµερή, αποτελούµενα από πολλαπλές εξανουκλεοτιδικές επαναλήψεις κονταίνουν σταδιακά στα µη αθανατοποιηµένα κύτταρα που πολλαπλασιάζονται στην καλλιέργεια, χάνοντας τελικά την ικανότητα τους να προστατεύουν τα άκρα των χρωµοσωµάτων. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα να γίνονται ενώσεις µεταξύ των άκρων των διαφορετικών χρωµοσωµάτων οι οποίες δηµιουργούν ασταθή δικεντρικά χρωµοσώµατα των οποίων η διάλυση οδηγεί σε µία αναδιάταξη του καρυότυπου που απειλεί την κυτταρική βιωσιµότητα. Κατά συνέπεια, το µήκος των τελοµερών του DNA σε ένα κύτταρο υπαγορεύει πόσες διαδοχικές γενιές 25

27 κυττάρων µπορεί να δώσει πριν τα τελοµερή κοντύνουν πάρα πολύ και συνεπώς χαθούν οι προστατευτικές λειτουργίες τους, προκαλώντας την είσοδο σε κρίση. Η τελοµεράση, η εξειδικευµένη DNA πολυµεράση η οποία προσθέτει τα χαρακτηριστικά εξανουκλεοτίδια των τελοµερών στα άκρα των χρωµοσωµάτων, απουσιάζει συνήθως από µη αθανατοποιηµένα κύτταρα, αλλά εκφράζεται σε σηµαντικά επίπεδα στη συντριπτική πλειοψηφία (90%) των αυθόρµητα αθανατοποιηµένων κυττάρων, συµπεριλαµβανοµένων των καρκινικών κυττάρων του ανθρώπου. Με την επιµήκυνση του τελοµερικό DNA, η τελοµεράση είναι σε θέση να αντιµετωπίσει την προοδευτική διάβρωση των τελοµερών που θα προέκυπτε σε περίπτωση απουσίας της. Η παρουσία της δραστικότητας της τελοµεράσης, είτε σε αυθόρµητα αθανατοποιηµένα κύτταρα ή σε κύτταρα στα οποία έχει επαχθεί η έκφραση του ενζύµου, συσχετίζεται µε την αντίσταση στην επαγωγή τόσο της γήρανσης όσο και της κρίσης/απόπτωσης. Αντίθετα, η καταστολή της δράσης της τελοµεράσης οδηγεί σε βράχυνση των τελοµερών και την ενεργοποίηση του ενός ή του άλλου από αυτούς τους δύο φραγµούς του πολλαπλασιασµού. Τα δύο εµπόδια στη γήρανση και στην κρίση/απόπτωση έχουν χαρακτηριστεί ως ζωτικής σηµασίας άµυνες των κυττάρων µας κατά της ανάπτυξης του καρκίνου που στρατολογούνται για να παρεµποδίσουν την εµφάνιση των κλώνων των προνεοπλαστικών και νεοπλασµατικών κυττάρων. Σύµφωνα µε αυτή τη σκέψη, οι περισσότερες αρχόµενες νεοπλασίες εξαντλούν το περιθώριο του πολλαπλασιαστικού τους δυναµικού και σταµατούν την πορεία τους λόγω του ενός ή του άλλου από αυτά τα εµπόδια. Η ενδεχόµενη διαιώνιση των σπάνια προκυπτόντων κυττάρων που προχωρούν σε σχηµατισµό όγκων έχει αποδοθεί στην ικανότητά των κυττάρων αυτών να διατηρούν το µήκος του τελοµερικού DNA επαρκές για να αποφευχθεί η ενεργοποίηση της γήρανση ή της απόπτωσης. Αυτό επιτυγχάνεται συνήθως µε υπερέκφραση της τελοµεράσης ή, λιγότερο συχνά, µέσω ενός εναλλακτικού µηχανισµού διατήρησης των τελοµερών που βασίζεται στον ανασυνδυασµό. Ως εκ τούτου, η βράχυνση των τελοµερών θεωρείται ως ένα εσωτερικό ρολόι που καθορίζει τον περιορισµένο αριθµό διαιρέσεων στις οποίες µπορούν να προβούν τα φυσιολογικά κύτταρα κι εποµένως ένα εµπόδιο που πρέπει να υπερπηδηθεί από τα καρκινικά κύτταρα. 26

28 5. Επαγωγή αγγειογένεσης Όπως και οι φυσιολογικοί ιστοί, οι όγκοι απαιτούν θρεπτικά συστατικά και οξυγόνο, καθώς και την δυνατότητα να εκκενώσουν τα άχρηστα µεταβολικά προϊόντα και το διοξείδιο του άνθρακα. Τα σχετιζόµενα µε τον όγκο νεοσχηµατιζόµενα αγγεία, που παράγονται µε τη διαδικασία της αγγειογένεσης, εξυπηρετούν αυτές τις ανάγκες. Κατά την εµβρυογένεση, η ανάπτυξη του αγγειακού συστήµατος περιλαµβάνει την γέννηση νέων ενδοθηλιακών κυττάρων και τη συναρµολόγηση τους µέσα σε σωλήνες (αγγειογένεση) καθώς επίσης και την εκβλάστηση (αγγειογένεση) νέων αγγείων από τα υπάρχοντα. Έπειτα από αυτή τη µορφογένεση, η αγγείωση επιστρατεύεται ξανά σε εξαιρετικά σπάνιες περιπτώσεις. Για παράδειγµα, στον ενήλικα, η αγγειογένεση ενεργοποιείται ως µέρος των φυσιολογικών διεργασιών όπως η επούλωση των πληγών και ο γυναικείος αναπαραγωγικός κύκλος, αλλά µόνο παροδικά. Αντίθετα, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου, ένα µονοπάτι αγγειογένεσης παραµένει διαρκώς ενεργοποιηµένο προκαλώντας συνεχώς εκβλάστηση νέων αγγείων που βοηθούν στη διατήρηση και στην επέκταση των νεοπλασµάτων [22]. Ένας σηµαντικός αριθµός µελετών δείχνουν ότι τα µονοπάτια αγγειογένεσης ελέγχονται από ρυθµιστικούς παράγοντες που είτε επάγουν είτε καταστέλλουν την αγγειογένεση [23,24]. Μερικά από αυτά τα ρυθµιστικά µόρια είναι πρωτεΐνες που δεσµεύονται σε επιφανειακούς υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυττάρων των αγγείων οι οποίοι διεγείρουν ή αναστέλλουν την αγγειογένεση. Οι πιο χαρακτηριστικές περιπτώσεις τέτοιων επαγωγέων και αναστολέων της αγγειογένεσης είναι ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας-α (VEGF- A) και η θροµβοσπονδίνη-1 (TSP-1) αντίστοιχα. Η αγγειογένεση επάγεται πολύ νωρίς κατά τη διάρκεια της πολυσταδιακής ανάπτυξη των διηθητικών καρκίνων, τόσο σε ζωικά µοντέλα όσο και σε ανθρώπους. Οι ιστολογικές αναλύσεις των προκαρκινικών, µη διεισδυτικών βλαβών, συµπεριλαµβανοµένων των δυσπλασιών και in situ καρκινώµατα που προκύπτουν σε µία ποικιλία οργάνων, έχουν αποκαλύψει την πρώιµη ενεργοποίηση του αγγειογενετικού µηχανισµού [22,25]. Αρχικά, η αγγειογένεση είχε προβλεφθεί ότι είναι σηµαντική µόνο κατά το σχηµατισµό των ταχέως αναπτυσσόµενων µακροσκοπικών όγκων, αλλά πιο πρόσφατα δεδοµένα υποδεικνύουν ότι η αγγειογένεση συµβάλλει επίσης στην προκαρκινική φάση 27

29 εξέλιξης των νεοπλασµάτων, ενισχύοντας περαιτέρω τη θέση της ως χαρακτηριστικό γνώρισµα του καρκίνου. Η τελευταία δεκαετία έχει γνωρίσει µία εκπληκτική έξαρση της έρευνας για τη σχετιζόµενη µε τον όγκο αγγειογένεση. 6. Ενίσχυση της διεισδυτικής και της µεταστατικής ικανότητας Μέχρι το 2000, οι µηχανισµοί που διέπουν την εισβολή και τη µετάσταση ήταν σε µεγάλο βαθµό ασαφείς. Ήταν εµφανές ότι τα καρκινικά κύτταρα που προκύπτουν από επιθηλιακούς ιστούς και σταδιακά προχωρούν σε υψηλότερους βαθµούς κακοήθειας, η οποία αντικατοπτρίζεται στην τοπική εισβολή και την αποµακρυσµένη µετάσταση, εµφανίζουν µεταβολές στο σχήµα τους καθώς και στην προσκόλληση τους στην εξωκυτταρική µήτρα (ECM) και στις διασυνδέσεις τους µε άλλα κύτταρα. Η καλύτερα χαρακτηρισµένη από αυτές τις αλλαγές περιελαµβάνει την απώλεια από τα καρκινικά κύτταρα της Ε-καδερίνης, ενός βασικού µόριο κυτταρικής προσκόλλησης. Με τη διαµόρφωση συνδέσµων προσκόλλησης στα γειτονικά επιθηλιακά κύτταρα, η Ε-καδερίνης βοηθά να σχηµατιστεί η χαρακτηριστική δοµή των επιθηλίων µε τα κύτταρα τοποθετηµένα στενά το ένα δίπλα στο άλλο. Η αυξηµένη έκφραση της Ε-καδερίνης έχει χαρακτηριστεί ως σηµαντικός ανταγωνιστής της εισβολής και της µετάστασης, ενώ η απαλοιφή της έκφρασής της είναι γνωστό πως ενισχύει αυτούς τους φαινοτύπους. Η συχνά παρατηρούµενη υποέκφραση και περιστασιακή απενεργοποίηση µέσω µεταλλάξεων της Ε-καδερίνης σε καρκινώµατα του ανθρώπου έδωσαν σηµαντικά στοιχεία για το ρόλο της ως βασικού καταστολέα αυτής της δυνατότητας [26,27]. Επιπροσθέτως, η έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν άλλα µόρια κυτταρικής προσκόλλησης έχει δειχθεί ότι µεταβάλλεται σε ορισµένα εξαιρετικά επιθετικά καρκινώµατα, µε αυτά που ευνοούν τις κυτταρικές διασυνδέσεις να υποεκφράζονται. Αντίθετα, µόρια κυτταρικής προσκόλλησης που συνδέονται µε τις µεταναστεύσεις των κυττάρων που συµβαίνουν κατά τη διάρκεια της εµβρυογένεσης και φλεγµονής συχνά υπερεκφράζονται. Για παράδειγµα, τα επίπεδα της Ν-καδερίνης (Ν-cadherin), η οποία εκφράζεται φυσιολογικά σε µεταναστευτικούς νευρώνες και µεσεγχυµατικά κυττάρων κατά την οργανογένεση, αυξάνεται σε πολλά διεισδυτικά καρκινικά κύτταρα των όγκων. 28

30 Η πολυσταδιακή διαδικασία διήθησης και µετάστασης έχει σχηµατοποιηθεί ως µία ακολουθία διακριτών βηµάτων, που συχνά αποκαλείται ως καταρράκτης εισβολής-µετάστασης καταρράκτη [28,29]. Αυτή η προσέγγιση περιλαµβάνει µία διαδοχή κυτταρικών αλλαγών, µε πρώτη από αυτές µία τοπική εισβολή, η οποία ακολουθείται από ενδαγγείωση από καρκινικά κύτταρα στα πλησιέστερα αγγεία του αίµατος και της λέµφου. Το επόµενο βήµα είναι η µετακίνηση των καρκινικών αυτών κυττάρων µέσω του αίµατος ή της λέµφου. Έπειτα, συµβαίνει διαφυγή των καρκινικών κυττάρων από τους αυλούς των αγγείων στο παρέγχυµα του αποµακρυσµένου ιστού (εξαγγείωση), σχηµατισµός µικρών οζιδίων των καρκινικών κυττάρων (µικροµεταστάσεων), και, τέλος, ανάπτυξη των µικροµεταστάσεων σε µακροσκοπικούς όγκους. Αυτό το τελευταίο βήµα ονοµάζεται εποικισµός. Οι µελέτες σχετικά µε τη διηθητική και τη µεταστατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων έχουν ενταθεί την τελευταία δεκαετία οι διαδικασίες αυτές αναδείχθηκαν περισσότερο µε τη χρήση των κατάλληλων ζωικών µοντέλων στα οποία αναγνωρίστηκαν σηµαντικά ρυθµιστικά των διαδικασιών αυτών γονίδια. Ενώ η µετάσταση παραµένει ακόµα ένας αναδυόµενος τοµέας γεµάτος µε µεγάλα αναπάντητα ερωτήµατα, σηµαντική πρόοδος έχει σηµειωθεί όσον αφορά την οριοθέτηση σηµαντικών χαρακτηριστικών αυτής της σύνθετης διεργασίας. 2.2 Στόχευση των ορόσηµων του καρκίνου Με βάση όσα παρουσιάστηκαν παραπάνω, τα πεδία που θα µπορούσαν να αποτελέσουν στόχους για την αντιµετώπιση του καρκίνου είναι τα εξής [6]: 1. Ένα πρώτο πεδίο που θα µπορούσε να στοχευθεί προκειµένου να αντιµετωπιστεί η εξέλιξη της καρκινογένεσης είναι η αντίσταση στον κυτταρικό θάνατο. Κάτι τέτοιο µπορεί να γίνει εφικτό µε χρήση µορίων που µιµούνται δοµικά τις πρωτεΐνες µε προαποπτωτικές επικράτειες ΒΗ Όσον αφορά τη διαδικασία εξασφάλισης ενέργειας, έχει δειχθεί πως τα καρκινικά κύτταρα δείχνουν µία προτίµηση να οξειδώνουν γλυκόζη και µία τάση ανεξαρτητοποίησης από το µιτοχόνδριο. Εποµένως, θα µπορούσε να σχεδιαστεί µία θεραπευτική αγωγή µε αναστολείς της αερόβιας γλυκόλυσης. 3. Η διαρκής µεταγωγή σήµατος για κυτταρικό πολλαπλασιασµό αποτελεί ένα ακόµη γνώρισµα των καρκινικών κυττάρων. Για το λόγο αυτό, µία ακόµη ιδέα 29

31 είναι να χρησιµοποιηθούν αναστολείς του EGFR. Ο EGFR είναι υποδοχέας του επιδερµικού αυξητικού παράγοντα και διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στη µεταγωγή σήµατος για τον πολλαπλασιασµό. 4. Πολύ συχνά τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσουν µηχανισµούς αποφυγής των καταστολέων της αύξησης. Εποµένως, ένας πιθανός τρόπος αντιµετώπισης είναι ο σχεδιασµός και η χρήση αναστολέων των κυκλινοεξαρτώµενων κινασών, καθώς αυτές είναι µόρια-κλειδιά του κυτταρικού κύκλου. 5. Τα καρκινικά κύτταρα εµφανίζουν µηχανισµούς που συµβάλλουν στη διαφυγή τους από τον έλεγχο του ανοσοποιητικού συστήµατος. Σε αυτό το πεδίο, ενδέχεται να βοηθήσει η χρήση µονοκλωνικών αντισωµάτων anti- CTLA4 που ενεργοποιούν το ανοσοποιητικό σύστηµα. 6. εδοµένου ότι σε πολλές περιπτώσεις τα καρκινικά κύτταρα έχουν ενεργοποιηµένη την έκφραση της τελοµεράσης, το να σχεδιαστούν αναστολείς αυτού του ενζύµου είναι ένας από τους θεραπευτικούς στόχους. 7. Η προκαλούµενη από τον όγκο φλεγµονή µπορεί να αντιµετωπιστεί µε αντιφλεγµονώδη φάρµακα που έχουν εξειδικευµένη δράση. 8. Καθώς τα καρκινικά κύτταρα ενεργοποιούν τους µηχανισµούς διήθησης και µετάστασης, µία ακόµη θεραπευτική προσέγγιση αποτελεί και η αναστολή του αυξητικού παράγοντα των αιµοπεταλίων (Hepatocyte Growth Factor, HGF) και του c-met µε ειδικά σχεδιασµένα µόρια. Ο HGF µέσω αλληλεπίδρασής του µε τον c-met οδηγεί σε αυξηµένη κινητικότητα των κυττάρων κι ενισχυµένη διεισδυτική ικανότητα τους, χαρακτηριστικά απαραίτητα για τη διήθηση των γύρω ιστών από τα κύτταρα του όγκου και τη µετάσταση. 9. Η διεγειρόµενη από τα καρκινικά κύτταρα αγγειογένεση µπορεί να αποφευχθεί µε τη χορήγηση αναστολέων της σηµατοδότησης µέσω του VEGF. 10. Τέλος, οι αναστολείς της PARP (Poly ADP-ribose polymerase), ενδείκνυνται για την αντιµετώπιση της γονιδιωµατικής αστάθειας και της πρόκλησης µεταλλαγών. Η PARP ενεργοποιείται όταν ανιχνευτούν βλάβες στο DNA - κυρίως µε τη µορφή µονόκλωνων ρηγµάτων (single strand DNA breaks, ssb) και συµµετέχει στην επιδιόρθωση αυτών των βλαβών. Μπλοκάροντας, λοιπόν την επιδιόρθωση των µονόκλωνων ρηγµάτων του DNA θα 30

32 συσσωρευτούν βλάβες στο DNA. Αυτό θα οδηγήσει το κύτταρο σε απόπτωση. 2.3 Τύποι καρκίνων Ανάλογα µε τον ιστό προέλευσης των καρκινικών κυττάρων, διακρίνουµε τις εξής κατηγορίες καρκίνου: Καρκινώµατα: τα καρκινώµατα προέρχονται από επιθηλιακά κύτταρα. Σαρκώµατα: τα σαρκώµατα είναι καρκίνοι που προέρχονται από συνδετικό ιστό ή µυϊκά κύτταρα. Λευχαιµίες: πρόκειται για καρκίνους που προέρχονται από αιµοποιητικά κύτταρα. Καρκίνοι νευροενδοδερµικής προέλευσης. 2.4 Μοντέλα µετάστασης Με τον όρο µετάσταση εννοείται η µετακίνηση και εγκατάσταση καρκινικών κυττάρων από ένα όγκο που προϋπάρχει σε ένα αποµακρυσµένο σηµείο του σώµατος. Όσον αφορά στους τύπους µεταστάσεων, µία µετάσταση µπορεί να γίνει είτε µέσω του λεµφικού (λεµφογενής µετάσταση) είτε µέσω του κυκλοφορικού συστήµατος (αιµατογενής µετάσταση). Έχουν προταθεί δύο µοντέλα για την επεξήγηση του µηχανισµού µέσω του οποίου συµβαίνει η µετάσταση [30]. Το πρώτο ονοµάζεται µοντέλο γραµµικής εξέλιξης ενώ το δεύτερο µοντέλο παράλληλης εξέλιξης. Το µοντέλο της γραµµικής εξέλιξης: Η συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών ανωµαλιών οδηγεί σε µία σταδιακή ανάπτυξη της ασθένειας. Αυτό αποτελεί την κεντρική ιδέα αυτού του µοντέλου. Ειδικότερα, τα καρκινικά κύτταρα υφίστανται µία σειρά από µεταλλαγές και υπόκεινται σε ενός είδους επιλογή µέσα στον πρωτογενή όγκο. Αποτέλεσµα αυτής της διαδικασίας είναι να προκύψουν ορισµένα κύτταρα µε σχεδόν αυτόνοµη ανάπτυξη. Αυτά τα κύτταρα του όγκου εξαπλώνονται και µεµονωµένα καρκινικά κύτταρα φεύγουν από τη θέση του πρωτογενούς όγκου για να εγκατασταθούν και να αναπτυχθούν σε µία νέα. Η κλωνική εξάπλωση των υψηλής κακοήθειας κυττάρων σχετίζεται µε το µέγεθος του όγκου. 31

33 Η συσχέτιση που παρατηρείται µεταξύ του µεγέθους του όγκου και της µεταστατικής δραστηριότητας συνηγορεί υπέρ αυτού του µοντέλου. Όσον αφορά όµως τις γενετικές ενδείξεις αυτές είναι εναντίον αυτού του µοντέλου. Αυτό προκύπτει από το γεγονός ότι βρέθηκε πως τα υποθετικά υψηλής κακοήθειας καρκινικά κύτταρα (που εµφανίζουν τις γενετικές αλλαγές του πρωτογενούς όγκου) σπάνια µετακινούνται µέσω αίµατος ή λέµφου για να δώσουν µεταστάσεις. Το µοντέλο της παράλληλης εξέλιξης: Σύµφωνα µε αυτό το δεύτερο µοντέλο, η µετάσταση έχει συµβεί πριν εµφανιστούν τα πρώτα συµπτώµατα από τον πρωτογενή όγκο. Με άλλα λόγια, εδώ η έναρξη της µετάστασης δε βρίσκεται απαραίτητα κοντά χρονικά στην ολοκλήρωση της ανάπτυξης του πρωτογενούς όγκου. Μάλιστα, σε αυτή την περίπτωση η µετακίνηση στη νέα θέση κυττάρων που ακόµη «εξελίσσονται» αφήνει περιθώρια για αυτό που ονοµάζεται «αλλοπάτρια επιλογή» σε ένα καινούργιο διαφορετικό µικροπεριβάλλον. Αυτό το µοντέλο υποστηρίζεται από την κινητική ανάπτυξης των όγκων και των µεταστάσεών τους. Αυτό σηµαίνει πως, αν, για παράδειγµα, ο καρκίνος του µαστού χρειάζεται 12 χρόνια για να φτάσει 1cm σε διάµετρο, ένας µεταστατικός όγκος χρειάζεται περίπου 6-12 χρόνια για να φτάσει το ίδιο µέγεθος. Καθώς η µετάσταση φαίνεται να συµβαίνει συνήθως σε σχετικά πρώιµα στάδια ανάπτυξης του πρωτογενούς όγκου κι όχι στο τέλος της, γενετικά δεδοµένα ενισχύουν αυτό το µοντέλο. Αξίζει να αναφερθεί πως και τα δύο µοντέλα υποστηρίζουν µεταστάσεις που έπονται της πρώτης («µετάσταση από µετάσταση»). Αυτό της γραµµικής εξέλιξης θεωρεί πως η πρώτη µετάσταση µπορεί να αποτελέσει την πηγή για τη δεύτερη µετάσταση όπως ο αρχικός όγκος ήταν η πηγή για την πρώτη, ενώ εκείνο της παράλληλης εξέλιξης προϋποθέτει πως τα κύτταρα-ιδρυτές της µετάστασης µετακινούνται σε παραπάνω από µία θέσεις. 2.5 Το πολυσταδιακό σύστηµα καρκινογένεσης του δέρµατος του ποντικού Οι συνεχώς αυξανόµενες γνώσεις που παρέχει η έρευνα γύρω από τη διαδικασία της ογκογένεσης έχει κάνει εφικτό το σχεδιασµό πολλών µοντέλων καρκινογένεσης στον ποντικό. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελεί η 32

34 περίπτωση του πρότυπου πολυσταδιακού συστήµατος καρκινογένεσης της επιδερµίδας του ποντικού. Πρόκειται για ένα αν και τεχνητό ιδανικό σύστηµα µελέτης της καρκινογένεσης που αναπτύχθηκε από τον Allan Balmain. Προσφέρει τη δυνατότητα να διερευνηθούν και να προσδιοριστούν χρονικά τόσο οι ποιοτικές όσο και ποιοτικές µεταβολές στα ογκογονίδια και τα ογκοκατασταλτικά γονίδια που εµπλέκονται στη διαδικασία της καρκινογένεσης. ίνει τη δυνατότητα να διερευνηθούν οι τρόποι αλληλεπίδρασης καρκινογόνων µε το DNA και να προσδιοριστούν µε ακρίβεια οι µοριακοί µηχανισµοί που εµπλέκονται. Το πιο κοινό πρωτόκολλο επαγωγής της χηµικής καρκινογένεσης περιλαµβάνει δύο στάδια. Αρχικά, χορηγείται µία δόση του πολυκυκλικού αρωµατικού υδρογονάνθρακα 7,12-διµεθυλοβενζ-α-ανθρακένιο, γνωστό και ως DMBA. Η ουσία αυτή προκαλεί έναρξη της καρκινογένεσης. Η προαγωγή της καρκινογένεσης επιτυγχάνεται µε τη χρήση ενός φορµπολικού εστέρα, του 12-Ο- µε TPA τετραδεκανοϋλο-φορµπολ-13-οξικό (TPA). Η επάλειψη της επιδερµίδας γίνεται δύο φορές την εβδοµάδες. Έπειτα από εβδοµάδες πριν την αρχική έκθεση σε καρκινογόνες ουσίες, παρατηρείται ανάπτυξη πολλών καλοήθων θηλωµάτων. Κάποια από αυτά εξελίσσονται σε κακοήθεις µάζες πλακωδών κυττάρων (πλακώδη καρκινώµατα) [31]. Εικόνα 2.2: Το πρωτόκολλο χημικής καρκινογένεσης της επιδερμίδας του ποντικού. Φαίνεται η επαγωγή της έναρξης της καρκινογένεσης με DMBA καθώς επίσης και η προαγωγή και η εξέλιξη με τη χρήση του φορμπολικού εστέρα TPA (8). 33

35 Ένα σύνολο κυτταρικών σειρών έχουν καθιερωθεί έπειτα από την αποµόνωση των καρκινικών ιστών. Οι κυτταρικές σειρές είναι αντιπροσωπευτικές για τα στάδια της έναρξης, της προώθησης και της εξέλιξης της καρκινογένεσης της επιδερµίδας του ποντικού και παρουσιάζονται παρακάτω: Στάδιο της έναρξης: 1. C5N 2. Η-ras null 3. P1, P5 και P6 Στάδιο της προαγωγής: 4. B9 5. E4 6. PDV και PDVC57 Στάδιο της εξέλιξης: 7. D3 8. H11 9. A5 10. CarB και CarC Εικόνα 2.3: Oι κυριότερες κυτταρικές σειρές του πρότυπου συστήματος καρκινογένεσης 34

36 της επιδερμίδας του ποντικού ανά στάδιο. Επίσης, υποδεικνύονται με βέλη τα ζεύγη κυτταρικών σειρών που έχουν απομονωθεί από τον ίδιο όγκο στο ίδιο ποντίκι σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Χαρακτηριστικά κάθε σειράς: C5 : Η κυτταρική αυτή σειρά αποτελείται από αθανατοποιηµένα κύτταρα. Είναι κύτταρα τα οποία δεν είναι καρκινικά και θεωρείται πως αντιστοιχούν στο φυσιολογικό επιθήλιο. Η αθανατοποίηση είναι µία διαδικασία που αποτελεί προϋπόθεση της καρκινογένεσης. H-ras null: Πρόκειται για κύτταρα που µοιάζουν ως προς τις ιδιότητες µε τα αθανατοποιηµένα C5N. Ως προς τη γενετικό τους υλικό, αυτό που είναι γνωστό είναι πως δεν έχουν κανένα αντίγραφο από το γονίδιο H-ras, ένα πρωτο-ογκογονίδιο που βρίσκεται σε υπερέκφραση σε αρκετούς τύπους καρκίνου. P1, P5 και P6: Αυτές οι τρεις σειρές αποτελούν θηλώµατα, δηλαδή αντιπροσωπεύουν καλοήθεις καταστάσεις. Είναι κύτταρα ενδιάµεσα στα αθανατοποιηµένα και τα κακοήθη κύτταρα. Β9: Η κυτταρική σειρά B9 ανήκει στην κατηγορία των πλακωδών καρκινικών κυττάρων (squamous), που δεν είναι πολύ επιθετικά. Ε4: Η σειρά αυτή έχει τα ίδια χαρακτηριστικά µε τα κύτταρα B9. Οι κυτταρικές σειρές C5N, P1, P6, Ε4 και B9 έχουν τυπική µορφή επιθηλίου, µε κυβικό σχήµα κι ένα σχέδιο ανάπτυξης «πλακόστρωτου». PDV και PDVC57: Και οι δύο σειρές είναι πλακώδους µορφολογίας (squamous cells). Ως προς το γενετικό υπόβαθρο, το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των PDV είναι η παρουσία δύο φυσιολογικών προς ένα µεταλλαγµένο γονίδιο H-ras (2N:1M) ενώ στα PDVC57 υπάρχουν 2 µεταλλαγµένα και ένα φυσιολογικό H-ras (1N:2M). Τα PDVC57 έχουν µία πιο ετερογενή µορφολογία από τα PDV ενώ χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη τεράστιων κυττάρων και παρουσιάζουν µεγαλύτερο δυναµικό ογκογένεσης κατά την µεταµόσχευση τους σε ενήλικα συγγενικά ποντίκια. Ακόµη, είναι 8 φορές πιο επιρρεπή σε διήθηση και εκκρίνουν διπλάσια ποσότητα κολλαγενάσης IV σε σχέση µε τα PDV. Τέλος, είναι χηµειοτακτικά. 35

37 Α5, D3 και H11: Η κυτταρική σειρά Α5 αποτελείται από κύτταρα ατρακτοειδή (spindle cells). Αυτό το σχήµα έχει συνδεθεί µε ένα πιο επιθετικό προφίλ σε σχέση µε τα πλακώδη κύτταρα. Είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον το γεγονός πως οι σειρές Α5 και Β9 αποµονώθηκαν από τον ίδιο πρωτογενή όγκο. Ωστόσο, διαφέρουν τόσο ως προς τη µορφολογία, όσο και ως προς το αναπτυξιακό δυναµικό που διαθέτουν. Τα κύτταρα B9 φαίνεται να δίνουν γένεση καλά διαφοροποιηµένων όγκων (τα κύτταρα των οποίων έχουν πλακώδη µορφολογία) όταν ενίονται σε γυ νά αθυµικά ποντίκια, ενώ τα αντίστοιχα πειράµατα µε τις σειρές Α5 και CarB δίνουν επιθετικό µεταστατικό όγκο, προκαλώντας σχηµατισµό όγκων 4 και 2 εβδοµάδες µετά την ένεσή τους στα ζώα, αντίστοιχα. Σε αυτή την περίπτωση, η µορφολογία των κυττάρων των όγκων είναι ατρακτοειδής. Με άλλα λόγια, οι σειρές Α5 και CarB εµφανίζουν µορφολογία ινοβλαστών. Τα ίδια χαρακτηριστικά παρατηρούνται και στα D3. Tα Η11 έχουν επίσης ατρακτοειδές σχήµα, προέρχονται όµως απόδιαφορετικό όγκο από ό,τι τα Β9, Α5 και D3. CarB και CarC: Τα κύτταρα αυτών των σειρών έχουν ατρακτοειδή µορφολογία. Είναι καρκινικές κυτταρικές σειρές µε εξαιρετικά αυξηµένο ρυθµό πολλαπλασιασµού αλλά και µε υψηλό µεταστατικό δυναµικό. Συµπληρωµατικά στα παραπάνω, αναφέρεται το εξής: Έκφραση κερατίνης και Ε-καδερίνης παρουσιάζεται στα κύτταρα των σειρών C5N, P1, P6 και B9. Ο κυτταροσκελετός εµφανίζει αξιοσηµείωτες µεταβολές ενώ παρατηρείται απουσία έκφρασης της Ε-καδερίνης στα κύτταρα A5. Η σειρά CarB δεν εκφράζει κερατίνη, αλλά βιµεντίνη. 2.6 Καρκίνος του µαστού Ο καρκίνος του µαστού αναφέρεται σε οποιονδήποτε κακοήθη όγκο αναπτύσσεται στον ιστό του µαστού. Ο πιο συχνά εµφανιζόµενος τύπος καρκίνου είναι τα καρκινώµατα. Οι δύο πιο κοινοί τύποι καρκίνου του µαστού είναι το πορογενές καρκίνωµα του µαστού (ductal breast carcinoma) (Εικ. 1a), το οποίο προέρχεται από επιθηλιακά κύτταρα των γαλακτοφόρων πόρων και το λοβιακό καρκίνωµα του µαστού (lobular breast carcinoma) (Εικ. 1b) που προέρχεται από 36

38 επιθηλιακά κύτταρα των λοβών του µαστού. Η συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων καρκίνου του µαστού εµφανίζεται σε γυναίκες, ωστόσο έχουν αναφερθεί και περιπτώσεις καρκίνου του µαστού σε άνδρες. (α) (β) Εικόνα 2.3: Oι δύο πιο συχνά συναντώμενοι τύποι καρκίνου του μαστού. (α) Εδώ απεικονίζεται ιστολογική τομή από πορογενές καρκίνωμα του μαστού. (β) Στο τμήμα αυτό της εικόνας φαίνεται ιστολογικό παρασκεύασμα από λοβιακό καρκίνωμα του μαστού. Ανάλογα µε το αν τα κύτταρα ενός καρκινικού όγκου του µαστού εξαρτάται από την παροχή οιστρογόνων ή του EGF για να αυξηθούν, ο όγκος αυτός χαρακτηρίζεται ως θετικός ή αρνητικός για τους υποδοχείς οιστρογόνων Estrogen Receptor α and β positive/negative, ERα/ERβ(+/-)) και για τον υποδοχέα her2 του EGF (her2+/-) αντίστοιχα. 2.7 Καρκινικές κυτταρικές σειρές του ανθρώπου Μπορούµε να οµαδοποιήσουµε ένα σύνολο από κυτταρικές σειρές µαστού του ανθρώπου µε βάση τα χαρακτηριστικά, το ογκογόνο δυναµικό τους και την επιθετικότητά τους. 37

39 Εικόνα 2.3: Oι δέκα κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή την εργασία. Εδώ φαίνονται οι κυτταρικές σειρές MCF12A, BT-20, BT-474, MCF7, T47D, SK-BR-3, ZR-75.1, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435 σε καλλιέργεια. Η κατηγοριοποίηση αυτή είναι η ακόλουθη: 1. MCF12A. Τα κύτταρα αυτά, όντας αθανατοποιηµένα, µη κακοήθη κύτταρα µαστού προσοµοιάζουν τη φυσιολογική κατάσταση των επιθηλιακών κυττάρων του µαστού. Πιο συγκεκριµένα, τα κύτταρα εµφανίζουν τη χαρακτηριστική µορφολογία των επιθηλιακών κυττάρων του αυλού του µαστού. Στα πλαίσια της συγκεκριµένης µελέτης έχουν χρησιµοποιηθεί ως το in vitro ανάλογο του φυσιολογικού επιθηλιακού ιστού του µαστού. 2. ΒΤ-20. Τα κύτταρα ΒΤ-20 είναι αρνητικά τόσο για τους ER, PR όσο και για τον υποδοχέα του EGF her2. 3. ΒΤ-474. Τα κύτταρα αυτά προέρχονται από πορογενές καρκίνωµα του µαστού. Εµφανίζονται θετικά τόσο για τον υποδοχέα των οιστρογόνων (ER) και για τον υποδοχέα της προγεστερόνης (PR) όσο και για τον υποδοχέα του EGF her2, τον οποίο υπερεκφράζουν. 4. MCF7. Έχουν αποµονωθεί από µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του µαστού χωρίς όµως να εµφανίζουν πολύ υψηλό µεταστατικό δυναµικό in vitro. Εµφανίζονται θετικά για τους υποδοχείς οιστρογόνων και προγεστερόνης και εκφράζουν χαµηλά επίπεδα για τον υποδοχέα του EGF her2. 38

40 5. T47D. Είναι κύτταρα του µαστού αποµονωµένα από µετάσταση µε έκφραση των υποδοχέων των οιστρογόνων. Είναι θετικά για ER και PR και εκφράζουν χαµηλά επίπεδα her2. 6. SK-BR-3. Τα κύτταρα αυτά προέρχονται από µεταστατικό αδενοκαρκίνωµα του µαστού. Εµφανίζονται αρνητικά για τους υποδοχείς οιστρογόνων και προγεστερόνης (ER και PR) και θετικά για τον υποδοχέα του EGF her2, τον οποίο υπερεκφράζουν. 7. ZR Είναι µεταστατικά κύτταρα του µαστού θετικά PR και αρνητικά για her2 και ER. Εµφανίζουν υψηλό µεταστατικό δυναµικό. 8. MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435. Και οι τρεις κυτταρικές σειρές είναι τριπλά αρνητικές (ERα-, ERβ-, her2-) και έχοντας αποµονωθεί από µεταστατικούς καρκίνους εµφανίζουν εξαιρετικά υψηλό ογκογόνο δυναµικό. 39

41 3 mirnas και καρκίνος 3.1 Βιολογικές λειτουργίες που επηρεάζει η έκφραση των mirnas Οι λειτουργίες στις οποίες θεωρείται ότι εµπλέκεται η έκφραση των mirnas είναι οι ακόλουθες: Κυτταρικός πολλαπλασιασµός. Κυτταρικός θάνατος. Ανοσολογικές αποκρίσεις σε καρκινικούς όγκους. Αγγειογένεση σε όγκους. Μεταβολισµός καρκινικών κυττάρων. Γονιδιωµατική σταθερότητα των καρκινικών κυττάρων. υναµικό διήθησης και µετάστασης καρκινικών όγκων. Αντίσταση στο στρες. Μεταβολισµός των λιπιδίων (στη D. melanogaster). ιαµόρφωση προτύπου νευρώνων (στο C. elegans). Χαρακτηριστικό γνώρισµα των περισσότερων γονιδίων των mirnas είναι πως βρίσκονται στις λεγόµενες «εύθραυστες περιοχές του γονιδιώµατος», περιοχές δηλαδή στις οποίες παρατηρείται µία προτίµηση για διεξαγωγή διπλασιασµών, ελλείψεων, µετατοπίσεων και ενσωµατώσεων ξενικού DNA. Όσον αφορά τη συσχέτιση της έκφρασης των micrornas µε την καρκινογένεση, οι µελέτες που έχουν διεξαχθεί διερευνούν κυρίως: τη σχέση έκφρασης ανάµεσα στον καρκινικό ιστό και στον αντίστοιχο φυσιολογικό. τη σχέση ανάµεσα στην έκφραση και την πρόγνωση (µε συσχέτιση µε την επιβίωση του ασθενούς). το αν αύξηση ή µείωση της έκφρασης συσχετίζεται µε την καρκινογένεση. τέλος, έχει παρατηρηθεί πως η έκφραση συγκεκριµένων mirnas σχετίζεται µε την ευαισθησία και την αντίσταση στα χηµειοθεραπευτικά φάρµακα. 3.2 Τα mirnas ως βιοδείκτες του καρκίνου Τα micrornas αποτελούν εξαιρετικά σταθερά µόρια που συναντώνται στην κυκλοφορία του αίµατος, εποµένως ενδέχεται να αποτελέσουν ένα πολύ σηµαντικό 40

42 µοριακό δείκτη για την έγκαιρη διάγνωση των κακοηθειών. Αυτό είναι αποτέλεσµα του γεγονότος πως η µορφή των µορίων αυτών που κυκλοφορεί στο αίµα είναι προστατευµένη από τη δράση των RNασών. Πιο συγκεκριµένα, τα πλεονεκτήµατα που τα mirna παρουσιάζουν ως βιοδείκτες του καρκίνου είναι τα εξής: πολύ συχνά κάποιο ή κάποια mirnas εµφανίζονται απορρυθµισµένα σε κακοήθεις καταστάσεις. είναι πάρα πολύ σύνηθες να είναι ιστοειδικά τα εκάστοτε mirnas. διαθέτουν σταθερότητα σε µονιµοποιηµένους ιστούς. Αυτό οδηγεί στην υπόθεση πως και στον ορό και στο πλάσµα θα είναι εξίσου σταθερά. Αν και πειράµατα έδειξαν πως οι διαφορές στην ποσότητα του συνολικού mirna στο πλάσµα ή στον ορό φαίνεται πως δεν επηρεάζεται σηµαντικά από την παρουσία του όγκου, εντοπίστηκαν συγκεκριµένα mirnas που αυξάνονται σε µεγάλο βαθµό στις κακοήθειες [32]. 3.3 Εµπλοκή των mirnas στον καρκίνο Η εµπλοκή των mirnas στον καρκίνο έχει µελετηθεί εκτενώς τα τελευταία χρόνια. Φαίνεται ότι ο ρόλος αυτών των µικρών µορίων RNA στον καρκίνο έχει µεγάλο ενδιαφέρον κυρίως λόγω του δυναµικού που αυτά εµφανίζουν ως διαγνωστικοί ή προγνωστικοί δείκτες, καθώς και της πιθανότητας µελλοντικές θεραπευτικές προσεγγίσεις του καρκίνου να βασιστούν στη βιολογία των µορίων αυτών. Ειδικότερα, στον καρκίνο του προστάτη [33] έχει δειχθεί ότι το mir-152 καταστέλλει τη µετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη µέσω της στόχευσης του TGFβ. Επιπλέον, µία άλλη ερευνητική οµάδα [34], έχει διαπιστώσει ότι τόσο το mir-182 όσο και το mir-203 επάγει τη µετάβαση των επιθηλιακής µορφολογίας των κυττάρων προς µεσεγχυµατική (επιθηλιο- µεσεγχυµατική µετάβαση, epithelial to mesenchymal transition, EMT) µέσω της στόχευσης του SNAI2 στον καρκίνο του προστάτη. Είναι ενδιαφέρον να σηµειωθεί ακόµη ότι αυτή η διέγερση του EMT συνοδεύεται από την αυτάρκεια των σηµάτων ανάπτυξης και αυξάνει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Επιπρόσθετα σε όλα αυτά, η υπερέκφραση του mir-143 έχει δειχθεί ότι προάγει τη µετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και την διεισδυτικότητα των 41

43 καρκινικών κυττάρων τόσο in vitro όσο και in vivo (µετάσταση) καταστέλλοντας την έκφραση του γονιδίου fndc3b. Αυτό το γονίδιο είναι ένα µέλος της οικογένειας της ινονεκτίνης η οποία ρυθµίζει την κυτταρική κινητικότητα και βρίσκεται σε υποέκφραση σε κακοήθη κύτταρα µε υψηλό µεταστατικό δυναµικό, γεγονός που υποδεικνύει τον ογκοκατασταλτικό της ρόλο [35]. Ακόµη, στον καρκίνο του παχέος εντέρου, το mir-362-3p έχει βρεθεί ότι επάγει την παύση του κυτταρικού κύκλου και πως υψηλή έκφραση αυτού του mirna έχει συσχετιστεί µε καλή πρόγνωση [36]. Μία άλλη µελέτη έδειξε ότι mir-29c µπορεί να αποτελεί ένα νέο βιοδείκτη της κυκλοφορίας για την πρόβλεψη της πρώιµης υποτροπής του καρκίνου του παχέος εντέρου. Σε αυτή τη µελέτη, τα επίπεδα έκφρασης του mir-29c ήταν σηµαντικά υψηλότερα στα δείγµατα των ασθενών που δεν εµφάνισαν πρώιµη υποτροπή της νόσου σε σύγκριση µε εκείνων που εµφάνισαν [37]. Επιπλέον, το mir-218 αναστέλλει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και προάγει την απόπτωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου µέσω της καταστολής του BMI1 polycomb ring figure (BMI-1), ενός πολύ γνωστού ογκογονιδίου [38]. Ειδικότερα, το mir-218 βρέθηκε να επάγει την διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G2 µέσω της καταστολής της CDK4 και της υπερέκφρασης του p53, δύο καταρροϊκών στόχων του ΒΜΙ-1. Στην περίπτωση του καρκίνου του µαστού, το mir-30a δείχθηκε να καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου και να ελαττώνει το µεταστατικό δυναµικό διαµέσου της στόχευσης της metadherin, ενός µόριο που παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση των µονοπατιών που εµπλέκονται στη µεταστατική διαδικασία. Ειδικότερα, το mir-30a στοχεύει τη metadherin κι αυτό οδηγεί στην αναστολή της µετανάστευσης των κυττάρων και στη δήθηση των γειτονικών ιστών από τα καρκινικά κύτταρα. Αυτό σηµαίνει ότι ενδεχοµένως δρα ως ογκοκατασταλτικό µόριο [39]. Επιπλέον, το mir-133a δείχθηκε να ρυθµίζει τον κυτταρικό κύκλο και το ρυθµό πολλαπλασιασµού µέσω της στόχευσης του EGFR (µέσω του µονοπατιού µεταγωγής σήµατος της Akt). Έτσι, το mir-133a καταστέλλει την έκφραση του EGFR, αυτό οδηγεί σε µειωµένη µεταγωγή σήµατος µέσω του µοριακού µονοπατιού Akt µε αποτέλεσµα την επιβράδυνση του κυτταρικού κύκλου και του ρυθµού του κυτταρικού πολλαπλασιασµού [40]. Επιπλέον, το mir-124 ρυθµίζει αρνητικά το CD151, ένα µόριο που εκφράζεται κυρίως στα κύτταρα του καρκίνου του µαστού και προωθεί τη µετάσταση. Το mirna αυτό µπορεί να χαρακτηριστεί συνεπώς ως ένα ογκοκατασταλτικό µόριο [41]. Μία πρόσφατη µελέτη κατέδειξε την προώθηση της 42

44 EMT των κακοήθων όγκων του µαστού µέσω της καταστολής του υποδοχέα της αντιπονεκτίνης 1 από τα mir-221/222 που το στοχεύουν [42]. Επιπλέον, το mir-26a αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων και τη µετανάστευση µέσω της καταστολής της έκφρασης του Mcl-1, ενός αντι-αποπτωτικού µορίου [43], ενώ το mir-153 επάγει την απόπτωση σε µία επιθετική καρκινική κυτταρική σειρά του µαστού, την MDAMB231 [44]. Το mir-506 φαίνεται να ρυθµίζει την επαγόµενη από τον TGFβ ΕΜΤ [45]. 3.4 Εµπλοκή των mirnas στη ρύθµιση του πολλαπλασιασµού Τα mirnas φαίνεται να επιδρούν στα επίπεδα έκφρασης πολλών µορίων που διαδραµατίζουν κεντρικό ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Αυτό σηµαίνει πως απορρύθµιση των επιπέδων των mirnas αυτών είναι δυνατόν να οδηγήσει σε σηµαντικές αλλαγές της ενεργότητας των µονοπατιών που καθορίζουν την πρόοδο, την επιβράδυνση ή την παύση του κυτταρικού κύκλου. Για παράδειγµα, η οµάδα mir-15a-16-1 έχει δειχθεί πως εµφανίζει αντιπολλαπλασιαστικό δυναµικό. Πιο συγκεκριµένα, τα mirnas αυτά προκαλούν παύση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 µέσω στόχευσης κεντρικών ρυθµιστών του κυτταρικού κύκλου, όπως CDK1, CDK2, CDK6 καθώς επίσης και οι κυκλίνες D1, D3, και E1. Επιπρόσθετα, οι CDK4 και CDK6 στοχεύονται από πάρα πολλά ακόµη mirnas, όπως τα mir-24, mir-34a, mir-124, mir-125b, mir-129, mir-137 και mir-195. Ακόµη, η έκφραση του E2F1 καταστέλλεται από δύο mirnas της οµάδας mir-17-92, τα mir-17-5p και mir-20a αλλά και από τα mir-149, mir-330 και mir-331-3p. Ο E2F3, από την άλλη, στοχεύεται από τα mir-125b, mir-210 και mir-195 και τα επίπεδα του prb ρυθµίζονται από το mir-105a. Άλλα µέλη της οικογένειας prb, τα p107/rbl1 και p130/rbl2 στοχεύονται από δύο οµάδες mirnas, τις mir-290 και mir Μάλιστα, η υπερέκφραση ενός µοναδικού mirna της οµάδας mir-17-92, το mir- 17-5p, είναι αρκετή για την επαγωγή πολλαπλασιαστικής σηµατοδότησης σε καλλιεργούµενα κύτταρα. Οι αναστολείς του κυτταρικού κύκλου p27/kip1 και p57/kip2 καταστέλλονται από τα mir-221/222 και mir-181. Έκτοπη έκφραση της οµάδας mir ενεργοποιεί την CDK2 και ενισχύει την ογκογένεση καταστέλλοντας τα p27/kip1 και p57/kip2. Όλα αυτά αποτελούν ορισµένα µόνο παραδείγµατα κεντρικών µορίων του κυτταρικού πολλαπλασιασµού που ρυθµίζονται από mirnas. Στην επόµενη εικόνα (Εικ. 3.1) απεικονίζεται ένα ιδιαίτερα σύνθετο 43

45 δίκτυο των βασικών αλληλεπιδράσεων µεταξύ mirnas και στόχων τους που εµπλέκονται στον πολλαπλασιασµό. Εικόνα 3.1: Οι κυριότερες γνωστές αλληλεπιδράσεις μεταξύ mirnas και μορίων που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Όπως είναι εμφανές, οι αλληλεπιδράσεις αυτές είναι αρκετές και ιδιαίτερα πολύπλοκες. 3.5 Τα mirnas στη θεραπεία του καρκίνου (mirνa targeted therapies) Ένα ευρύ πεδίο µελέτης των mirnas σε σχέση µε τον καρκίνο είναι αυτό των θεραπευτικών mirnas [16]. Πρόκειται για τη χρήση µιµητικών µορίων mirnas για την αποκατάσταση των ενδογενών τους επιπέδων, όταν συναντάται υποέκφραση 44

46 ογκοκατασταλτικών mirnas. Στον αντίποδα αυτής της προσέγγισης, συναντώνται τα ανταγωνιστικά mirnas (Antagonistic MiRNA Oligonucleotides, AMOs), δηλαδή ολιγονουκλεοτίδια συµπληρωµατικά προς τα εκάστοτε ογκογόνα mirnas που χρησιµοποιούνται µε σκοπό την καταστολή της δράσης τους. Τα κύτταρα χρησιµοποιούν τα ενδογενή mirnas για RNAi. Η θεραπευτική RNAi τεχνολογία µπορεί να χρησιµοποιηθεί µε δύο τρόπους: (α) συνθετικό µικρό RNA (small interfering RNA, sirna) και (β) δοµή µίσχου-βρόχου µικρού µήκους επάνω σε φορέα (short hairpin RNA, shrna). Τα sirnas, όπως και τα mirnas, είναι δίκλωνα µόρια µήκους νουκλεοτιδίων, περιλαµβάνουν προεξοχές 2 νουκλεοτιδίων στα 3 άκρα και µπορούν να ενσωµατωθούν άµεσα στο RISC. Τα shrnas εισάγονται σε φορείς, εποµένως συντίθενται στον πυρήνα σαν τα mirnas. Πρόκειται για δοµές µίσχου-θηλιάς, που υφίστανται την ίδια επεξεργασία µε τα mirnas, συµπεριλαµβανοµένης της πέψης από την Dicer πριν την ενσωµάτωση στο RISC. Οι θεραπείες µε µικρά µόρια RNA εµφανίζουν πρακτικά πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα. Το sirna υφίσταται εύκολα χηµική τροποποίηση, όµως η µαζική παραγωγή αυτών των σύνθετων δοµών είναι πολύ δαπανηρή. Αντίθετα, τα shrnas είναι δύσκολο να τροποποιηθούν αλλά εύκολο να παραχθούν σε ποσότητες. Παρ όλα αυτά, υπάρχουν µέθοδοι για τροποποιήσεις των shrna που περιλαµβάνουν αλλαγή της ενσωµατωµένης αλληλουχίας, αλλαγή της ρύθµισης του υποκινητή, χρήση διαφορετικών πλασµιδιακών και ιικών φορέων για τν επιµόλυνση των κυττάρα και ρύθµιση ή επαγωγή της έκφρασης των shrnas. Και τα sirnas και τα shrnas παρουσιάζουν αποτελεσµατικότητα in vivo. Η τεχνολογία του RNA έχει αυξήσει τη δυναµική των στοχευµένων θεραπειών. Αρκετές µελέτες σε ζωικά συστήµατα έχουν δείξει τη θεραπευτική αποτελεσµατικότητα του RNAi και ορισµένες θεραπείες µε βάση το RNAi περνούν τον έλεγχο των κλινικών δοκιµών για την αντιµετώπιση του καρκίνου. Η αποτελεσµατικότητα των sirnas και των shrnas εξαρτάται από µία σειρά από παράγοντες, όπως: (α) η αποφυγή του ανοσοποιητικού συστήµατος, (β) η ικανότητα σίγησης και (γ) οι παρενέργειες. Τα sirnas µε µήκος µεγαλύτερο από νουκλεοτίδια επάγουν µία ανοσολογική απόκριση µε ιντερφερόνη ανάλογη µε αυτή που προκαλεί το δίκλωνο RNA (dsrna). Το φαινόµενο περιορίζεται µέσω της µείωση του µήκους του sirna ή µέσω χηµικής τροποποίησης. Τόσο τα sirnas όσο και τα shrnas ενεργοποιούν 45

47 τους υποδοχείς τύπου Toll (Toll Like Receptors, TLRs) και την ανοσολογική απόκριση: αυτό µπορεί να εξαλειφθεί µε τη χρήση µικρών πλασµιδιακών φορέων ή µη µεθυλιωµένων πλασµιδιακών φορέων χωρίς CpG. Το sirna, ακόµη κι όταν προστατεύεται µέσω χηµικών τροποποιήσεων, είναι ευάλωτο σε αποδόµηση και µεταβολικές διαδικασίες. Ενώ το shrna παρουσιάζει τις επιθυµητές στοχευµένες δράσεις όταν είναι παρόν σε λιγότερα από 5 αντίγραφα, το sirna απαιτεί δόσεις σε κλίµακα nanomolar για τα ίδια αποτελέσµατα. Αυτό είναι ένα αποτέλεσµα της συνεχούς σύνθεσης του shrna, που συµβάλλει σε λιγότερο παροδικά αποτελέσµατα. Από την άλλη µεριά, οι θεραπείες που βασίζονται στο RNAi έχουν πολλές παρενέργειες που επιδρούν στη γονιδιακή έκφραση οδηγώντας σε µη επιθυµητούς φαινοτύπους. Αυτό οφείλεται στο ότι τα µικρά RNAs µπορούν να προσδεθούν σε µετάγραφα mrnas µε µερική συµπληρωµατικότητα. Τα sirnas, όπως και τα mirnas, έχουν µία περιοχή εκβλάστησης (seed region, SR) από το 2ο µέχρι το 8ο νουκλεοτίδιο που είναι συµπληρωµατικό µε το 3 άκρο του mrna. Χηµικές τροποποιήσεις ειδικά στη θέση 2 µπορούν να βελτιώσουν σηµαντικά την ειδικότητα στόχευσης. Ωστόσο, η µεγάλη δόση sirnas που απαιτείται αυξάνει την πιθανότητα για παρενέργειες. Συγκρίνοντας τις θεραπείες µε τα sirnas µε αυτές µε τα shrnas ίδιων δόσεων, τα shrnas έχουν λιγότερες παρενέργειες ίσως λόγω των διαφορών στο µηχανισµό δράσης. Τα shrnas αντιµετωπίζουν την ίδια πυρηνική και κυτταροπλασµατική ρύθµιση µε τα mirnas, ενώ τα sirnas όχι. Οι αλληλουχίες των shrnas µετατρέπονται σε µετάγραφα pri-mirna. Η επαγωγή της απόπτωσης από τα mir-15a και mir-16-1 στη χρόνια λεµφογενή λευχαιµία (chronic lymphoid leukaemia, CLL) και η αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων από το let-7 αποτελούν παραδείγµατα θεραπευτικής χρήσης των mirnas. ύο ακόµη τέτοιες περιπτώσεις είναι ο περιορισµός της διήθησης και της µετανάστευσης των κυττάρων που οφείλεται στο mir-125 στον καρκίνο του µαστού και η χρήση anti-mir-21 AMOs για την πρόκληση της προαποπτωτικής απόκρισης στο γλοιοβλάστωµα και στον καρκίνο του µαστού. Η χρήση anti-mir-21 AMOs αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων του χολαγγειώµατος στην gemcitabine. Αυτό δείχνει ότι µία θεραπεία βασισµένη σε mirnas µπορεί να συνδυαστεί µε τη χηµειοθεραπεία. Το πρώτο εµπόδιο για να είναι µία τέτοια προσέγγιση αποτελεσµατική είναι η στόχευση των mirnas/αμοs στα κύτταρα στόχους in vivo. 46

48 Η αύξηση της αποτελεσµατικότητας και της σταθερότητας και η µείωση της τοξικότητας των AMOs έχει επιτευχθεί µέσω της ανάπτυξης ολιγονουκλεοτιδίων µε 2 -Ο-µεθυλο- ή 2 -Ο-µεθυλαιθυλο- καταλοίπα. Ένας δεύτερος τρόπος για να γίνει αυτό είναι η χρήση νουκλεοτιδίων όπου ο δακτύλιος της ριβόζης είναι «κλειδωµένος» µε µία γέφυρα µεθυλίου που συνδέει το άτοµο 2 -Ο µε το άτοµο 4 -C (locked nucleic acids, LNA τροποποιηµένα νουκλεοτίδια). Ο συνδυασµός DNA/LNA AMOs έχει χρησιµοποιηθεί για την καταστολή του mir-21 µε αποτέλεσµα την αύξηση του αποπτωτικού θανάτου σε κύτταρα γλοιοβλαστώµατος. Τα ολιγονουκλεοτίδια που βασίζονται στην τεχνολογία του LNA έχουν αποδειχθεί µη τοξικά σε δόσεις µικρότερες των 5mg/kg/ηµέρα σε ποντίκια και έχουν αντικαρκινικά αποτελέσµατα in vivo. Έτσι, είναι πιθανό η θεραπευτική αγωγή για τον καρκίνο in vivo µε ΑΜΟs να είναι εφικτή. Έχει δειχτεί επίσης ότι η ενδοφλέβια χορήγηση ΑΜΟs συνδεδεµένων µε χοληστερόλη σε ποντίκια καταστέλλει σηµαντικά τη δράση των mir-16, mir-122, mir-192 και mir-194 σε διάφορα όργανα. Ακόµη, καθώς το anti-mir-122 AMO επηρεάζει τη βιοσύνθεση της χοληστερόλης, τα ποντίκια στα οποία αυτό χορηγείται εµφανίζουν µειωµένα επίπεδα χοληστερόλης στο πλάσµα. Προς το παρόν, δεν υπάρχουν αναφορές για την χρήση mirnas για in vivo θεραπεία. Παρ όλα αυτά, η αύξηση των µελετών για in vivo χρήση sirnas και shrnas για τη σίγηση γονιδίων-στόχων έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη τεχνικών χρήσιµων στην καθοδήγηση των mirnas στα κατάλληλα κύτταρα. Οι αντικαρκινικές προσεγγίσεις που βασίζονται στη συστηµική καθοδήγηση των sirna/shrna σε προκλινικά µοντέλα έχουν βελτιωθεί τα τελευταία χρόνια µε τη χρήση ιικών φορέων, λιποσωµάτων και νανοσωµατιδίων. Είναι πιθανό ότι παρόµοιες προσεγγίσεις θα µπορούσαν να γίνουν µε τη χρήση mirnas ως θεραπευτικών µορίων. Το πλεονέκτηµα των mirnas έναντι των sirna/shrna είναι η δυνατότητα που δίνουν για στόχευση πολλών γονιδίων µε ένα µόνο µόριο. Παρόµοια µε τα mirnas, τα sirnas/shrnas µπορούν να αλληλεπιδρούν µε αρκετούς στόχους, όµως εδώ το φαινόµενο αποτελεί µειονέκτηµα λόγω του ότι οι στόχοι είναι µη προβλέψιµοι και προκαλούν, πιθανώς, παρενέργειες. Για τα mirnas η αποκατάσταση της έκφρασής τους στα καρκινικά κύτταρα πιθανότατα αποκαθιστά και το συνολικό δίκτυο των φυσιολογικών αλληλοεπιδράσεων. Συνοψίζοντας και σύµφωνα µε τα παραπάνω, έχουµε τις εξής περιπτώσεις: Αντι-miRNA ολιγονουκλεοτίδια (ΑΜΟ), δηλαδή µονόκλωνα χηµικά τροποποιηµένα (συνήθως µε 2 -Ο-µεθυλοµάδα, ή για ακόµη µεγαλύτερη 47

49 ειδικότητα, 2-Ο-µεθοξυαιθυλοµάδα) µόρια νουκλεϊκού οξέος µε νουκλεοτίδια που στοχεύουν ειδικά ένα συγκεκριµένο mirna µε βάση τη συµπληρωµατικότητα των βάσεων κατά Watson-Crick. Η υβριδοποίηση του αντινοηµατικού ολιγονουκλεοτιδίου µε το mirna οδηγεί σε αποικοδόµηση του υπερεκφραζόµενου mirna. Ανταγωνιστικά mirnas, που είναι µονόκλωνα µόρια 23 νουκλεοτιδίων µε κατάλληλη χηµική τροποποίηση προκειµένου να µην υφίστανται γρήγορη αποσύνθεση. Και µε αυτά σταµατάει η λειτουργία των εκάστοτε mirnas. «Κλειδωµένα» νουκλεϊκά οξέα (LNA), τα οποία έχουν υποστεί µία ιδιαίτερη επεξεργασία, την LNA τεχνολογία, έχουν δηλαδή «κλειδωµένη» τη ριβόζη µε µία γέφυρα µεθυλίου που συνδέει το 2 -O µε το 4 -C. Στοχεύουν σε αναστολή του υπερεκφραζόµενου mirna. Τα mirna-σφουγγάρια (mirnas-sponges) έχουν πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης του mirna και µεταγράφονται από φορείς που εκφράζονται σε κύτταρα θηλαστικών. Για αυξηµένη ειδικότητα γίνεται µία τροποποίηση µε την εισαγωγή ενός εξογκώµατος στο σηµείο όπου κόβει η Ago-2. Τα µιµητικά mirna αντιπροσωπεύουν µία πιθανή θεραπεία κατά την οποία εισάγεται στα κύτταρα ένα δίκλωνο µόριο που θα υποστεί την επεξεργασία ωρίµανσης που υφίσταται φυσιολογικά το ενδογενές πρόδροµο µόριο mirna που υποεκφράζεται σε κάθε περίπτωση. Αντίθετα από τα mirna-σφουγγάρια, τα mirna-µάσκες (mirnas-masks) είναι µονόκλωνα τροποποιηµένα µε 2 -Ο-µεθυλοµάδα αντινοηµατικά ολιγονουκλεοτίδια που υβριδοποιούνται τέλεια µε το mrna-στόχο. Έτσι δεν επιτρέπουν πρόσβαση του mirna στο mrna. Τέλος, µπορούν να χρησιµοποιηθούν διάφορα «φάρµακα» που µπλοκάρουν µονοπάτια του κυτταρικού κύκλου. Αυτή η στρατηγική σε αντίθεση µε τις προηγούµενες είναι έµµεση. Πολύ σηµαντικό πρόβληµα στην εισαγωγή των συνθετικών αυτών µορίων στον οργανισµό αποτελούν τόσο οι παρενέργειες λόγω όχι απόλυτα στοχευµένης δράσης, όσο και το ότι έχουν µικρή διάρκεια ζωής. 48

50 Σκοπός της εργασίας Σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν η διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης αλλά και του λειτουργικού ρόλου των mirnas της οικογένειας mir-200 και του mir-3069 στις κυτταρικές σειρές του πολυσταδιακού συστήµατος καρκινογένεσης της επιδερµίδας του ποντικού καθώς επίσης και σε µία οµάδα από κυτταρικές σειρές καρκίνου του µαστού του ανθρώπου. Η επιλογή των συγκεκριµένων µορίων σχετίζεται µε προηγούµενα αποτελέσµατά µας, όπου µε χρήση της τεχνικής των µικροσυστοιχιών είχαµε δείξει ότι τα mirnas αυτά εµφανίζουν τις µεγαλύτερες µεταβολές στην έκφρασή τους καθώς η καρκινογένεση προχωρά από τα καλοήθη θηλώµατα στα πλακώδη καρκινώµατα καταλήγοντας στα ατρακτοειδή καρκινώµατα της επιδερµίδας του ποντικού. Πιο συγκεκριµένα, τα mirnas της οικογένειας mir- 200 υποεκφράζονται κατά την εξέλιξη της καρκινογένεσης ενώ το mir p φάνηκε να υπερεκφράζεται µε την αύξηση του ογκογόνου δυναµικού των κυττάρων. Έτσι, στα πλαίσια αυτής της εργασίας στοχεύσαµε στην αποσαφήνιση του ρόλου που ενδεχοµένως κατέχουν τα mirnas αυτά κατά την εξέλιξη της καρκινογένεσης. 49

51 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 50

52 Συνοπτικά, οι πειραµατικές διαδικασίες που πραγµατοποιούνται στα πλαίσια αυτής της διπλωµατικής είναι οι ακόλουθες: 1. Καλλιέργειες καρκινικών κυττάρων 2. Εκχύλιση RNA 3. Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου 4. Χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής 51

53 1 Καλλιέργειες κυτταρικών σειρών Για την καλλιέργεια των κυτταρικών σειρών τα οποία µελετώνται χρησιµοποιείται θρεπτικό υλικό DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium) που περιέχει 10% ορό (FBS, fetus bovine serum) και 1% αντιβιοτικά ευρέως φάσµατος (Pen-Str, πενικιλλίνη-στρεπτοµυκίνη). 1.1 Καλλιέργεια κυττάρων σε φλάσκα (ή τρυβλίο Petri) Οι κυτταρικές σειρές που αναπτύσσουµε προέρχονται από το πολυσταδιακό σύστηµα καρκινογένεσης της επιδερµίδας του ποντικού και είναι οι εξής: 1) C5N 2) H-ras null 3) P1 4) P6 5) MSP5 6) PDV 7) PDVC57 8) B9 9) E4 10) A5 11) D3 12) H11 13) CarB 14) CarC Βγάζουµε από το υγρό άζωτο τις αµπούλες µε τα κύτταρα που θα καλλιεργήσουµε και τα τοποθετούµε σε ένα στατό το οποίο στη συνέχεια βάζουµε µέσα στο υδατόλουτρο των 37 ο C µέχρις ότου οι αµπούλες ξεπαγώσουν. Ετοιµάζουµε µία φλάσκα (ή ένα τρυβλίο) για κάθε κυτταρική σειρά γράφοντας επάνω της το όνοµα της εκάστοτε κυτταρικής σειράς και ηµεροµηνία. Καθαρίζουµε τον απαγωγό µε ένα χαρτί εµποτισµένο µε εργαστηριακή αιθανόλη. Προηγουµένως, έχουµε αφήσει περίπου 1 ώρα τη λάµπα υπεριώδους για να αποστειρώσουµε το χώρο και να ελαχιστοποιήσουµε την πιθανότητα κάποιας µόλυνσης. Προσθέτουµε σε κάθε φλάσκα 15-20ml θρεπτικό υλικό (αν πρόκειται για φλάσκα των 75ml - µεγάλη) ή 5-52

54 8ml αν πρόκειται για φλάσκα των 25ml - µικρή). Αν έχουµε τρυβλία για την καλλιέργεια, προσθέτουµε περίπου 7-10ml θρεπτικού υλικού σε κάθε τρυβλίο των 60mm. Αφού αναδεύσω το περιεχόµενο κάθε αµπούλας µε την πιπέτα Gilson, το µεταφέρω στο εσωτερικό της φλάσκας. Μεταφέρουµε τα κύτταρα σε κλίβανο των 37 ο C. 1.2 Αλλαγή θρεπτικού υλικού Παίρνουµε τη φλάσκα µε τα κύτταρα στα οποία θέλουµε να κάνουµε την αλλαγή θρεπτικού υλικού. Αναρροφάµε µε µία πιπέτα Pasteur το θρεπτικό υλικό από τη φλάσκα (ή το τρυβλίο). Προσθέτουµε 10ml PBS (Phosphate buffered saline) για να ξεπλύνουµε τα κύτταρα. Αναρροφάµε το PBS και προσθέτουµε φρέσκο θρεπτικό υλικό. 1.3 Θρυψινοποίηση κυττάρων Με µία πιπέτα Pasteur αναρροφάµε το θρεπτικό υλικό από τη φλάσκα. Ξεπλένουµε µε PBS, προσθέτωντας µε µία πιπέτα των 10ml, 8-10ml. Αναρροφάµε το PBS. Προσθέτουµε 2-3ml θρυψίνης αφού την αναδεύσουµε και τοποθετούµε τη φλάσκα σε κλίβανο 37 ο C. Αφήνουµε να δράσει η θρυψίνη για Υποβοηθούµε τη θρυψινοποίηση χτυπώντας λίγο τα τοιχώµατα της φλάσκας. Όταν ολοκληρωθεί η θρυψινοποίηση, κάτι που ελέγχουµε παρατηρώντας τα κύτταρα στο µικροσκόπιο και βλέποντας αν έχουν ξεκολλήσει από τη φλάσκα, προσθέτουµε µερικά ml θρεπτικού υλικού (5-10). Το θρεπτικό υλικό έχει ορό (FBS) ο οποίος περιλαµβάνει αναστολέα της θρυψίνης και εµποδίζει την περιατέρω δράση της θρυψίνης. ιαφορετικά, αν αφήσουµε το ένζυµο να δράσει κι άλλο θα σκοτώσει τα κύτταρα. Μεταφέρουµε τα κύτταρα σε ένα σωλήνα universal και φυγοκεντρούµε για 5 στις 1800rpm. Μόλις τελειώσει η φυγοκέντρηση, αναρροφάµε το υπερκείµενο και επαναιωρούµε σε 1ml θρεπτικού υλικού τα κύτταρα. Στο σηµείο αυτό µπορούµε να χωρίσουµε το 1ml κυττάρων σε δύο νέες φλάσκες. 1.4 Πάγωµα κυττάρων Ακολουθούµε τη διαδικασία της θρυψινοποίησης που περιγράφηκε πιο πάνω. Φτιάχνουµε υγρό παγώµατος. Το υγρό παγώµατος αποτελείται από 50% FBS, 10% DMSO και 40% θρεπτικό υλικό (DMEM). Έτσι, για ένα aliquot του 1ml χρειάζονται 53

55 500µl FBS, 100µl DMSO και 400µl θρεπτικό υλικό. Γράφουµε στην αµπούλα το όνοµα της κυτταρικής σειράς και την ηµεροµηνία. Μόλις τελειώσει η φυγοκέντρηση, επαναιωρούµε τα κύτταρα στο υγρό παγώµατος και τα µεταφέρουµε στην αµπούλα. Τοποθετούµε την αµπουλά σε ειδικό δοχείο µε ισοπροπανόλη και µεταφέρουµε στους -80 ο C.Έπειτα από 2-3 ηµέρες µεταφέρουµε στο υγρό άζωτο (-200 ο C). 1.5 Προετοιµασία υλικών καλλιέργειας DMEM: Σε ένα αποστειρωµένο δοχείο προσθέτουµε 50ml FBS, 5ml Pen-Str και συµπληρώνουµε µέχρι τα 500ml µε DMEM. Το DMEM περιέχει γλουταµίνη και γλυκόζη, εποµένως δε χρειάζεται να προσθέσουµε. Γράφουµε έξω από το δοχείο 1Χ DMEM + 1% Pen-Str + 10% FBS, ηµεροµηνία και το κλείνουµε το καπάκι και βάζουµε parafilm. Αποθηκεύουµε στο ψυγείο. PBS: Σε ένα αποστειρωµένο δοχείο προσθέτουµε 50ml PBS 10Χ και συµπληρώνουµε µέχρι τα 500ml µε dh 2 O. Γράφουµε έξω από το δοχείο 1Χ PBS και ηµεροµηνία. Κλείνουµε το καπάκι και σκεπάζουµε µε parafilm. Αποθηκεύουµε στο ψυγείο. Η σύσταση του PBS (phosphate buffered saline) φαίνεται στον επόµενο πίνακα: άλας συγκέντρωση συγκέντρωση (mmol/l) (g/l) NaCl KCl Na 2 HPO 4 2 H 2 O KH 2 PO ph ιάλυµα θρυψίνης 0,05%: Προσθέτουµε σε ένα αποστειρωµένο δοχείο 5ml θρυψίνης 10Χ (0,5%) και συµπληρώνουµε µέχρι τα 50ml µε dh 2 O. Γράφουµε έξω από το δοχείο θρυψίνη και ηµεροµηνία. Αποθηκεύουµε στο ψυγείο. 54

56 2 Αποµόνωση RNA Αποµονώσαµε το RNA µε χρήση της προτυποποιηµένης µεθόδου mirvana mirna Isolation Kit της εταιρίας Ambion. Το πρωτόκολλο φαίνεται παρακάτω: Αποµόνωση RNA µε το mirvana mirna Kit (Ambion) Το συγκεκριµένο πρωτόκολλο δίνει τη δυνατότητα για αποµόνωση είτε ολικού RNA είτε RNA εµπλουτισµένο σε µικρά µόρια RNA (στα οποία συµπεριλαµβάνονται και τα mirnas). Παρ όλα αυτά, όταν έχουµε ως στόχο την µελέτη του προφίλ έκφρασης των mirnas µε χρήση µικροσυστοιχιών, θεωρείται προτιµότερη η αποµόνωση ολικού RNA ούτως ώστε να είναι δυνατή η ποσοτικοποίηση και ο έλεγχος της ποιότητας του RNA. Ο έλεγχος της ποιότητας του RNA περιλαµβάνει έλεγχο της καθαρότητας του (απουσία πρωτεϊνικών και οργανικών προσµίξεων) και της ακεραιότητάς του (ότι δηλαδή δεν έχει υποστεί κατακερµατισµό) και απαιτείται προκειµένου να διαπιστωθεί αν είναι κατάλληλο για ανάλυση συστοιχιών mirna. Η διαδικασία είναι η ακόλουθη: 1) Αρχικά, προετοιµάζουµε τα διαλύµατα ξεπλύµατος που θα χρησιµοποιήσουµε. Προσθέτουµε 21ml αιθανόλης (ACS) 100% στο mirna wash solution 1 και 40ml στο µπουκάλι Wash Solution 2/3. Αναδεύουµε καλά. 2) Κάνουµε λύση των κυττάρων. Παίρνουµε τα τρυβλία όπου έχουµε αναπτύξει καθεµία κυτταρική σειρά. Ξεπλένουµε τα κύτταρα µε κρύο PBS. Αναρροφάµε το PBS. Προσθέτουµε µL διάλυµα λύσης, Lysis/Binding Solution για κύτταρα. Αναδεύουµε πολύ καλά για πρόκληση πλήρους λύσης των κυττάρων. 3) Προχωράµε στην οργανική εκχύλιση. Προσθέτουµε 1/10 του όγκου των (λυµένων) κυττάρων διάλυµα οµογενοποίησης (Homogenate Additive) και αναδεύουµε καλά. Αφήνουµε το µίγµα στον πάγο για 10. Προσθέτουµε ένα όγκο Acid Phenol: Chloroform (ίσο µε τον όγκο πριν από την προσθήκη του διαλύµατος οµογενοποίησης). Αναδεύουµε για

57 Φυγοκεντρούµε για 5 σε µέγιστη ταχύτητα (13.000rpm) σε θερµοκρασία δωµατίου για διαχωρισµό υδατικής και οργανικής φάσης. Μετά τη φυγοκέντρηση, η µεσόφαση θα πρέπει να είναι συµπαγής. Αν δεν είναι, επαναλαµβάνουµε τη φυγοκέντρηση. Αποµακρύνουµε προσεκτικά την ανώτερη υδατική φάση και τη µεταφέρουµε σε ένα νέο σωληνάκι. Σηµειώνουµε τον όγκο. 4) Το επόµενο στάδιο είναι η τελική αποµόνωση. Ως διάλυµα επαναιώρησης χρησιµοποιούµε το Elution Solution, το οποίο και προθερµαίνουµε στους 95 o C. Η αιθανόλη που θα χρησιµοποιήσουµε πρέπει να είναι σε θερµοκρασία δωµατίου. 4.1) Αποµόνωση ολικού RNA Προσθέτουµε 1,25 όγκους 100% αιθανόλης θερµοκρασίας δωµατίου στην υδατική φάση. Τοποθετούµε µία κολόνα (filter cartridge) σε ένα σωληνάκι συλλογής. Μεταφέρουµε το µίγµα υδατικής φάσης/αιθανόλης στην κολόνα (µέχρι 700µl). Κάνουµε spin στη φυγόκεντρο για 15 στις rpm για να περάσει το µίγµα από την κολόνα. Μεγαλύτερη ταχύτητα ενδέχεται να καταστρέψει την κολόνα. Απορρίπτουµε το υγρό που βρίσκεται στο σωληνάκι συλλογής. Επαναλαµβάνουµε µέχρι να περάσει όλο το µίγµα (αν έχουµε όγκο>700µl). Χρησιµοποιούµε το ίδιο σωληνάκι συλλογής στα βήµατα ξεπλύµατος. Προσθέτουµε 700µl mirna wash solution 1 στην κολόνα και κάνουµε spin για 5-10 στις rpm. Αποµακρύνουµε το υγρό που περνάει στο σωληνάκι συλλογής και επανατοποθετούµε την κολόνα. Προσθέτουµε 500µl mirna wash solution 2/3 στην κολόνα και κάνουµε spin για 5-10 στις rpm. Αποµακρύνουµε το υγρό. Επαναλαµβάνουµε το προηγούµενο βήµα. Επανατοποθετούµε την κολόνα στο σωληνάκι συλλογής και κάνουµε spin στις rpm για 1. Με τον τρόπο αυτό αποµακρύνουµε το εναποµείναν υγρό από την κολόνα. Μεταφέρουµε την κολόνα σε νέο σωληνάκι συλλογής. 56

58 Προσθέτουµε 100µl Elution Solution στο κέντρο της κολόνας. Κάνουµε spin για στις rpm για ανάκτηση του RNA. Συλλέγουµε το υγρό, στο οποίο βρίσκεται διαλυµένο το RNA και το αποθηκεύουµε στους -20 ο C ή σε χαµηλότερη θερµοκρασία (π.χ. στους -80 ο C). 4.2) Αποµόνωση ολικού RNA Προσθέτουµε 1/3 του όγκου 100% αιθανόλης θερµοκρασίας δωµατίου στην υδατική φάση. Αναδεύουµε καλά. Τοποθετούµε µία κολόνα (filter cartridge) σε ένα σωληνάκι συλλογής. Μεταφέρουµε το µίγµα υδατικής φάσης/αιθανόλης στην κολόνα (µέχρι 700µl). Κάνουµε spin στη φυγόκεντρο για 15 στους rpm για να περάσει το µίγµα από την κολόνα. Μεγαλύτερη ταχύτητα ενδέχεται να καταστρέψει την κολόνα. Κρατάµε το υγρό από το σωληνάκι συλλογής. Επαναλαµβάνουµε σε καινούργιο σωληνάκι µέχρι να περάσει όλο το µίγµα (αν έχουµε όγκο>700µl). Προσθέτουµε 2/3 του όγκου 100% αιθανόλης θερµοκρασίας δωµατίου. Αναδεύουµε καλά. Τοποθετούµε µία κολόνα (filter cartridge) σε ένα σωληνάκι συλλογής. Μεταφέρουµε το µίγµα στην κολόνα (µέχρι 700µl). Κάνουµε spin στη φυγόκεντρο για 15 στους rpm για να περάσει το µίγµα από την κολόνα. Απορρίπτουµε το υγρό που περνάει στο σωληνάκι συλλογής. Επαναλαµβάνουµε µέχρι να περάσει όλο το µίγµα. ιατηρούµε το σωληνάκι συλλογής για τα βήµατα του πλυσίµατος που ακολουθούν. Προσθέτουµε 700µl mirna wash solution 1 στην κολόνα και κάνουµε spin για 5-10 στους rpm. Αποµακρύνουµε το υγρό που περνάει στο σωληνάκι συλλογής και επανατοποθετούµε την κολόνα. Προσθέτουµε 500µl mirna wash solution 2/3 στην κολόνα και κάνουµε spin για 5-10 στους rpm. Αποµακρύνουµε το υγρό. Επαναλαµβάνουµε το προηγούµενο βήµα. Επανατοποθετούµε την κολόνα στο σωληνάκι συλλογής και κάνουµε spin στους rpm για 1. Με τον τρόπο αυτό αποµακρύνουµε το εναποµείναν υγρό από την κολόνα. Μεταφέρουµε την κολόνα σε νέο σωληνάκι συλλογής. 57

59 Προσθέτουµε 100µl Elution Solution στο κέντρο στους κολόνας. Κάνουµε spin για στους rpm για ανάκτηση του RNA. Συλλέγουµε το υγρό, στο οποίο βρίσκεται διαλυµένο το RNA και το αποθηκεύουµε στους -20 ο C ή σε χαµηλότερη θερµοκρασία (π.χ. στους -80 ο C). 58

60 3 Μικροσυστοιχίες - Ανάλυση των δεδοµένων των µικροσυστοιχιών Η εξαγωγή του προτύπου έκφρασης των mirnas στις προαναφερθείσες κυτταρικές σειρές έγινε µε χρήση της προτυποποιηµένης µεθόδου µικροσυστοιχιών Exiqon mircury LNA microrna array. Κάθε πλάκα περιείχε 3078 οµάδες ανιχνευτών µε 4 ανιχνευτές το καθένα οι οποίοι στοχεύουν όλα τα mirnas του ανθρώπου, του ποντικού και του αρουραίου που είναι διαθέσιµα στη mirbase Εκτός των καθηλωµένων ανιχνευτών ελέγχου, συνθετικά mirnas ελέγχου χωρίς σήµανση (spike-in unlabeled synthetic control micrornas, Spike-in kit v2) προστέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις και σε ίσες ποσότητες τόσο σε Hy3 και σε Hy5 σηµασµένες αντιδράσεις πριν την υβριδοποίηση. Μετά την υβριδοποίηση, οι πλάκες των µικροσυστοιχιών σαρώθηκαν και οι εικόνες που προέκυψαν αναλύθηκαν µε χρήση του ImaGene 9 (BioDiscovery), όπου το σήµα και ποσοτικοποιήθηκε η µέση ένταση υποβάθρου για κάθε σηµείο και των δύο καναλιών. Η επεξεργασία των αρχικών µας δεδοµένων πραγµατοποιήθηκε µε χρήση του R/Bioconductor suite [46] και συγκεκριµένα του πακέτου Limma [47]. Η πιο πρόσφατη έκδοση του αρχείου GAL (mirbase 19.0) για το Mus musculus λήφθηκε από την ιστοσελίδα της Exiqon (Product No , Lot No 34013). Με σκοπό την αποµάκρυνση των µη ειδκών δεσµεύσεων το ποσοτικοποιηµένο σήµα από κάθε ανιχνευτή διορθώθηκαν µε βάση το υπόβαθρο µέσω του Normexp + offset 10 [48]. Η ενδο-κανονικοποίηση των συστοιχιών [49] επιτεύχθηκε µε µία βελτιωµένη έκδοση του composite loess normalization, όπου η συνολική καµπύλη παράγεται µέσω µιας οµάδας µη-διαφοροποιηµένης έκφρασης spike-in σηµείων ελέγχου και εφαρµόζεται σε όλα τα σηµεία [50,51][50,51][50,51]. Σε αυτό το στάδιο οι δύο τιµές έντασης για κάθε ιχνηθέτη που αντιστοιχούν στο δείγµα µας και στο δείγµα αναφοράς µετασχηµατίζονται σε ένα µοναδικό λόγο λογαρίθµων µε βάση το 2. Τότε, η Aquantile [50] κανονικοποίηση µεταξύ των συστοιχιών [49] επιβεβαίωσε την ίδια εµπειρική κατανοµή των A-values (µέσες εντάσεις) των 4412 ανιχνευτών που στοχεύουν ειδικά 1103 RNA µόρια ποντικού (κάθε µόριο RNA ανιχνεύεται µέσω µιας οµάδας 4 πανοµοιότυπων ιχνηθετών) κατά µήκος των συστοιχιών, ενώ οι M- values (log-ratios) διατηρούνται ίδιες. Τα δεδοµένα κανονικοποίησης µετασχηµατίζονται σε ένα SPSS συµβατό εκτενές αρχείο µε χρήση του πακέτου Reshape [52] από το R/Bioconductor suite. Αυτό το αρχείο εισήχθηκε στο SPSS 59

61 (IBM) και τα δεδοµένα χωρίστηκαν µε βάση το όνοµα του mirna. Μία ανάλυση ANOVA δύο κατευθύνσεων έγινε όπως περιγράφεται εδώ: το mirna χρησιµοποιήθηκε ως ο σταθερός παράγοντας ώστε να φτιαχτούν οµάδες mirnas, το Cell Line (κυτταρική σειρά) θεωρήθηκε ως ανεξάρτητος παράγοντας και το Intensity (ένταση) ελήφθη ως η εξαρτηµένη µεταβλητή. Μία ανάλυση Post Hoc µε βάση τη µέθοδο πολλαπλών συγκρίσεων Tukey s Honest Significant Difference (HSD) [53] διεξήχθη για τις συγκρίσεις των εντάσεων ανά ζεύγη κυτταρικών σειρών για κάθε mirna. Το αποτέλεσµα της ανάλυσης περιείχε όλες τις 91 συγκρίσεις ανά ζεύγη µεταξύ των 14 κυτταρικών σειρών για κάθε mirna και πολλαπλό έλεγχο των προσαρµοσµένων p-values για κάθε σύγκριση που δείχνει τις στατιστικά σηµαντικές διαφορές. Οι µέσες κανονικοποιηµένες εντάσεις για κάθε mirna και κυτταρική σειρά χρησιµοποιήθηκαν για την ανάλυση συνέκφρασης όπως έχει περιγραφεί στο παρελθόν [54]. Ειδικότερα, ένας πίνακας αποστάσεων µεταξύ όλων των mirnas δηµιουργήθηκε µε βάση τους συντελεστές συσχέτισης του Pearson. Ο αλγόριθµος Neighbor Join [55] χρησιµοποιήθηκε για την οµαδοποίηση και για το σχηµατισµό ενός δέντρου που αναπαριστά το τοπίο συνέκφρασης των mirnas στις κυτταρικές σειρές. Η πρόβλεψη των συντηρηµένων αλληλουχιών που προβλέπεται ότι στοχεύονται από τα mirnas του ποντικού µε καλό mirsvr score [56] ελήφθησαν από την πηγή των προβλέψεων στόχευσης και των προτύπων έκφρασης microrna.org [57] από όπου µία οµάδα ονοµάτων γονιδίων-στόχων αναφοράς προέκυψαν. Μία διακριτή λίστα γονιδίων-στόχων επίσης δηµιουργήθηκε για κάθε επιλεγµένο mirna. Αυτές η λίστες συγκρίθηκαν µε την οµάδα των γονιδίων-στόχων αναφοράς µε χρήση του WebGestalt [58], προκειµένου να οµαδοποιηθούν τα γονίδια-στόχοι των mirna σε υπερ-εκπροσωπούµενα µονοπάτια KEGG (KEGG Pathways) [59,60]. We selected Επιλέξαµε πιθανά γονίδια-στόχους των mirna από τα σχετικά µονοπάτια KEGG Pathway προς πειραµατική επιβεβαίωση. 60

62 4 Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης πραγµατικού χρόνου (q- Real Time PCR) Η ποσοτική PCR είναι µια µέθοδος ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης που χρησιµοποιείται όλο και περισσότερο τελευταία λόγω της αυξηµένης ευαισθησίας της µεθόδου. Μία µέθοδος ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης µεταγράφων πραγµατικού χρόνου χρησιµοποιεί τη SYBR Green I, µια χρωστική η οποία προσδένεται µη ειδικά σε δίκλωνο DNA (ds DNA). Το Master Mix που χρησιµοποιείται στην αντίδραση είναι το KAPA SYBR FAST qpcr Kit Master Mix (2X), που περιέχει µία hot start DNA πολυµεράση. Η αύξηση στο φθορισµό αποδίδεται µε γραµµικό τρόπο, καθώς το προϊόν της PCR αυξάνεται µετά από έναν αριθµό κύκλων. Η χρωστική SYBR Green I έχει υψηλή συγγένεια πρόσδεσης µε τη µικρή αύλακα του δίκλωνου DNA. Έχει µέγιστο διέγερσης στα 497 nm και µέγιστο εκποµπής στα 520 nm. Πριν προσδεθεί στο DNA εκπέµπει λίγο φθορισµό. Ωστόσο, όταν προσδεθεί σε δίκλωνο DNA ο φθορισµός αυξάνεται σηµαντικά, γεγονός που καθιστά εύκολη την ανίχνευση του συσωρευµένου προϊόντος κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Κατά την αποδιάταξη, το DNA γίνεται µονόκλωνο. Στο στάδιο αυτό η SYBR Green είναι ελεύθερη στο διάλυµα και εκπέµπει λίγο φθορισµό. Κατά το στάδιο της ανασύνδεσης, οι εκκινητές υβριδοποιούνται µε την αλληλουχία στόχο σχηµατίζοντας δίκλωνο DNA στο οποίο η SYBR Green I µπορεί να προσδεθεί. Στο στάδιο της επέκτασης, περισσότερο DNA γίνεται δίκλωνο και ακόµα µεγαλύτερη ποσότητα της SYBR Green I προσδένεται (Εικόνα 1). Εικόνα 1: Τρόπος σύνδεσης της χρωστικής SYBR Green σε δίκλωνο DNA. Η ιδιότητα της να προσδένεται μόνο σε δίκλωνο DNA αυτή είναι που καθιστά τη χρωστική ιδανική για την ποσοτικοποίηση DNA σε ένα δείγμα. 61