ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΓΕΝΟΤΥΠΟΥ ΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΣΤΗ ΒΑΝΚΟΜΥΚΙΝΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ENTEROCOCCUS spp. ΑΠΟ ΥΓΙΗ ΖΩΑ ΚΑΙ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΛΟΙΜΩΔΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΙΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΛΟΙΜΩΔΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΓΕΝΟΤΥΠΟΥ ΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΣΤΗ ΒΑΝΚΟΜΥΚΙΝΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ENTEROCOCCUS spp. ΑΠΟ ΥΓΙΗ ΖΩΑ ΚΑΙ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Γ. ΤΖΑΒΑΡΑΣ ΣΤΡΑΤΙΩΤΙΚΟΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΛΟΙΜΩΔΩΝ ΚΑΙ ΠΑΡΑΣΙΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΛΟΙΜΩΔΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΓΕΝΟΤΥΠΟΥ ΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΣΤΗ ΒΑΝΚΟΜΥΚΙΝΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ENTEROCOCCUS spp. ΑΠΟ ΥΓΙΗ ΖΩΑ ΚΑΙ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Γ. ΤΖΑΒΑΡΑΣ ΣΤΡΑΤΙΩΤΙΚΟΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. σε συνεργασία με το Ινστιτούτο Κτηνιατρικών Ερευνών Θεσσαλονίκης του Εθνικού Ιδρύματος Αγροτικών Ερευνών (ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε.) Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Β. Σιάρκου Επίκουρη Καθηγήτρια Επιβλέπουσα Σ. Πουρνάρας Επίκουρος Καθηγητής Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Α. Ζδράγκας Ερευνητής Α Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής

3 Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή Β. Σιάρκου, Επίκουρη Καθηγήτρια Κτηνιατρική Σχολή, ΑΠΘ Σ. Πουρνάρας, Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Α. Ζδράγκας, Ερευνητής Α ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. Μ. Γιάγκου, Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, ΑΠΘ Χ. Παπαδοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Γ. Μπατζίας, Αναπληρωτής Καθηγητής Κτηνιατρική Σχολή, ΑΠΘ Δ. Σεργκελίδης, Λέκτορας Κτηνιατρική Σχολή, ΑΠΘ

4 Ιωάννης Γ. Τζαβάρας Α.Π.Θ. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΓΕΝΟΤΥΠΟΥ ΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΣΤΗ ΒΑΝΚΟΜΥΚΙΝΗ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ENTEROCOCCUS spp. ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΩΝ ΑΠΟ ΥΓΙΗ ΖΩΑ ΚΑΙ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ «Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής από την Κτηνιατρική Σχολή του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα» (Νόμος 5343/1392, άρθρο 202, παρ. 2).

5 Στη σύζυγό μου, Βασιλεία, και στο Γιωργάκη μας

6 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 1 ΜΕΡΟΣ Ι... 7 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΓΕΝΙΚΑ ΠΕΡΙ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ Ιστορική αναδρομή Περιγραφή του γένους Enterococcus Κατανομή στη φύση και επιδημιολογία των εντεροκόκκων Λοιμογονικότητα των Enterococcus spp Λοιμώξεις στα ζώα Ο ρόλος των εντεροκόκκων στην υγιεινή, παραγωγή και βιοτεχνολογία τροφίμων Καλλιέργεια, ταυτοποίηση και τυποποίηση των Enterococcus spp Μέθοδοι απομόνωσης Μέθοδοι ταυτοποίησης Μέθοδοι τυποποίησης Φαινοτυπικές μέθοδοι τυποποίησης Μοριακές μέθοδοι τυποποίησης ΑΝΤΟΧΗ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ ΣΤΑ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ Αντοχή στις β-λακτάμες Αντοχή στις αμινογλυκοσίδες Αντοχή στη βανκομυκίνη Μηχανισμοί αντοχής στη βανκομυκίνη Τύποι αντοχής στη βανκομυκίνη VanA τύπος VanB τύπος VanC τύπος VanD τύπος VanE τύπος VanG τύπος VanL τύπος VanM τύπος i

7 VanN τύπος Εντερόκοκκοι εξαρτημένοι από την παρουσία βανκομυκίνης Γενετικό περιβάλλον των van Οπερονίων Άλλοι μικροοργανισμοί με αντοχή στη βανκομυκίνη Αντοχή στα γλυκοπεπτίδια του Staphylococcus aureus ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΩΝ VRE Γεωγραφική Κατανομή και Εξάπλωση στα Νοσοκομεία Παράγοντες Κινδύνου (Risk factors) Αποικισμός και Λοίμωξη Δεξαμενή (Πηγή Μόλυνσης) Τρόποι Μετάδοσης Μέτρα Ελέγχου των VRE Συνετή χρήση της βανκομυκίνης και άλλων αντιμικροβιακών Προγράμματα εκπαίδευσης Ρόλος του μικροβιολογικού εργαστηρίου στην ανίχνευση, αναφορά και έλεγχο των VRE Εφαρμογή μέτρων ελέγχου λοίμωξης Αντιμετώπιση των VRE λοιμώξεων Οι VRE στην κοινότητα Οι VRE στα παραγωγικά ζώα Οι VRE στα ζώα συντροφιάς Οι VRE στην Ελλάδα ΜΕΡΟΣ ΙΙ ΔΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υλικά Δειγματοληπτικό υλικό για την απομόνωση VRE στελεχών Κλινικά στελέχη VRE Στελέχη αναφοράς Enterococcus spp Υλικά-Υποστρώματα απομόνωσης και καλλιέργειας των VRE στελεχών Enterococcosel Broth- Εκλεκτικός ζωμός Enterococcosel Agar-Εκλεκτικό άγαρ Brain Heart Infusion Agar ii

8 Brain Heart Infusion Broth Υλικά Βιοχημικής ταυτοποίησης των VRE στελεχών Ζωμός Phenol Red Broth Base Σάκχαρα και ουσίες για τον προσδιορισμό των αντιδράσεων ζύμωσης Brain Heart Infusion Broth με περιεκτικότητα σε NaCl 6,5% Brain Heart Infusion Broth με τελική τιμή ph 9, Ζωμός Trypticase Soy Broth Trypticase Soy Agar Υλικό συντήρησης των VRE στελεχών Υλικά για τη διενέργεια του ελέγχου της ευαισθησίας των VRE στελεχών με τη μέθοδο Kirby-Bauer Υπόστρωμα Mueller-Hinton Δισκία αντιμικροβιακών ουσιών Κλίμακα McFarland (Biomerieux) Υλικά για τη διενέργεια του ελέγχου της ευαισθησίας των VRE στελεχών με προσδιορισμό της Ελάχιστης Ανασταλτικής Συγκέντρωσης (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) Ζωμός Cation Adjusted Mueller-Hinton II Broth (CAMHB) Μητρικά Διαλύματα των αντιμικροβιακών ουσιών Πλάκες μικροτιτλοποιήσεων Θολωσίμετρο Υλικά για την προετοιμασία και διενέργεια της πολλαπλής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Multiplex Polymerase Chain Reaction, PCR) Σκεύασμα για την εκχύλιση του DNA των VRE στελεχών Εκκινητές Δεοξυνουκλεοτίδια (dntps) Taq DNA Πολυμεράση Υλικά για τη διενέργεια ηλεκτροφόρησης Γέλη ηλεκτροφόρησης Χρωστική κυανού της βρωμοφαινόλης (Blue juice) Δείκτης μοριακού βάρους Βρωμιούχο αιθίδιο Υλικά ηλεκτροφόρησης παλλόμενου πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) iii

9 Ρυθμιστικό διάλυμα SE (100 ml) Πηκτή αγαρόζης Μήτρες-Εκμαγεία (plug molds) Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (lysis buffer) (10 ml) Ρυθμιστικό διάλυμα πρωτεόλυσης (proteolysis buffer) (10 ml) Ρυθμιστικό διάλυμα TE (10 ml) Περιοριστικό ένζυμο (ενδονουκλεάση) SmaI Δείκτης μοριακού βάρους Γέλη ηλεκτροφόρησης Συσκευή ηλεκτροφόρησης Βρωμιούχο αιθίδιο Μέθοδοι Απομόνωση-Καλλιέργεια των VRE στελεχών Βιοχημική ταυτοποίηση των VRE στελεχών Παρασκευή αποθέματος (stock) VRE στελεχών Έλεγχος ευαισθησίας των VRE στελεχών-μέθοδος Kirby-Bauer Παρασκευή του ενοφθαλμίσματος Ενοφθαλμισμός Τοποθέτηση των δισκίων Ανάγνωση Προσδιορισμός της Ελάχιστης Ανασταλτικής Συγκέντρωσης (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) των αντιμικροβιακών ουσιών βανκομυκίνης και τεϊκοπλανίνης έναντι των VRE στελεχών Παρασκευή Μητρικού Διαλύματος Αντιμικροβιακής ουσίας Παρασκευή Εναιωρήματος Καλλιέργειας-Ενοφθαλμισμός Ανάγνωση Αποτελέσματος Εκχύλιση του DNA των VRE στελεχών Multiplex PCR Ηλεκτροφόρηση Παλλόμενου Πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) για το γενοτυπικό χαρακτηρισμό των VRE στελεχών In situ προετοιμασία του γονιδιωματικού DNA In situ πέψη του DNA PFGE Ανάλυση των PFGE ηλεκτροφορητικών προτύπων iv

10 4.2.9 Μεθοδολογία στατιστικής επεξεργασίας των αποτελεσμάτων ελέγχου ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά και Διαχωριστική Ανάλυση (Discriminant function analysis) των αντιμικροβιακών προφίλ των VRE στελεχών ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΕΠΙΠΟΛΑΣΜΟΥ ΤΩΝ VRE ΣΤΕΛΕΧΩΝ Σχεδιασμός και Εκτέλεση της Αναζήτησης VRE Στελεχών Αποτελέσματα και Συζήτηση ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ/ΑΝΤΟΧΗΣ ΤΩΝ VRE ΣΤΕΛΕΧΩΝ - ΔΙΑΧΩΡΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΦΙΛ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΤΩΝ VREF ΣΤΕΛΕΧΩΝ Σχεδιασμός και Εκτέλεση του Ελέγχου της Ευαισθησίας/Αντοχής των VRE στελεχών Αποτελέσματα και Συζήτηση Έλεγχος Ευαισθησίας/αντοχής των VRE στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη Έλεγχος Ευαισθησίας/Αντοχής των VRE σε άλλα αντιμικροβιακά Ανάλυση των προφίλ της αντιμικροβιακής αντοχής (φαινοτύπων) των VREF στελεχών-διαχωριστική Ανάλυση (Discriminant Analysis) Διαχωριστική Ανάλυση (Discriminant Analysis) ΓΕΝΟΤΥΠΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ - ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΚΛΩΝΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ VREF ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΣΕ ΠΑΛΛΟΜΕΝΟ ΠΕΔΙΟ (PFGE) Σχεδιασμός και Εκτέλεση της Μεθόδου Αποτελέσματα και Συζήτηση ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ v

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι εντερόκοκκοι, αν και αποτελούν μέλη της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας των ανθρώπων και των ζώων, συχνά προκαλούν λοιμώξεις,ενώ κατά τη διάρκεια της τελευταίας εικοσαετίας, έχουν αναδυθεί ως σημαντικά νοσοκομειακά παθογόνα, κυρίως εξαιτίας της αντοχής που παρουσιάζουν σε ευρύ φάσμα αντιμικροβιακών ουσιών (Aarestrup και συν., 2002 Tannock και Cook, 2002 Willems και van Schaik, 2009). Τα γλυκοπεπτίδια, κυρίως η βανκομυκίνη, χρησιμοποιούνται ως τελευταίας επιλογής αντιμικροβιακά για τη θεραπεία σοβαρών νοσοκομειακών λοιμώξεων που προκαλούνται από εντερόκοκκους και άλλα Gram θετικά βακτήρια (Rice, 2006). Ωστόσο, εντερόκοκκοι ανθεκτικοί στη βανκομυκίνη (Vancomycin Resistant Enterococci, VRE) έχουν απομονωθεί σε διάφορες χώρες δημιουργώντας προβλήματα στη θεραπεία των λοιμώξεων που αυτοί προκαλούν (Werner και συν., 2008a). Εν τω μεταξύ, η χρήση ενός άλλου γλυκοπεπτιδίου, της αβοπαρκίνης, ως αυξητικού παράγοντα στα παραγωγικά ζώα και τα πτηνά, οδήγησε επίσης στην εμφάνιση των VRE σε αυτά, τόσο στην Ευρώπη όσο και σε άλλες ηπείρους δείχνοντας ότι μπορεί να αποτελέσουν μια πιθανή δεξαμενή ανθεκτικών στη βανκομυκίνη γενετικών καθοριστών (Bustamante και συν., 2003 Manson και συν., 2004 Kuhn και συν., 2005). Όταν η σχέση μεταξύ αβοπαρκίνης και VRE επιβεβαιώθηκε, η χρήση της ως αυξητικός παράγοντας απαγορεύτηκε το 1997 (Οδηγία 97/6, European Committee). Ως επακόλουθο της κατάργησης της αβοπαρκίνης, ο επιπολασμός των VRE στα παραγωγικά ζώα μειώθηκε (Bager και συν., 1999 Klare και συν., 1999 Pantosti και συν., 1999). Ωστόσο, μελέτες σε διάφορες χώρες, έδειξαν υψηλό επιπολασμό των VRE, αρκετά χρόνια μετά την κατάργηση της αβοπαρκίνης υπογραμμίζοντας την εμμονή τους στο περιβάλλον των εκτροφών (Sorum και συν., 2006 Garcia-Migura και συν., 2007 Nilsson και συν., 2009) Σύμφωνα με επικαιροποιημένα στοιχεία, η Ελλάδα εμφανίζει ένα από τα υψηλότερα ποσοστά επιπολασμού, μεταξύ των χωρών της Ευρωπαϊκής Ένωσης (ΕΕ), σε νοσοκομειακά στελέχη VRE, με διαρκώς, ωστόσο, μειούμενη τάση [The European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net) interactive database, surveillance/ears-net/database/pages/database.aspx]. Επιπρόσθετα, VRE καθώς και υψηλά ποσοστά επιπολασμού VREF (Vancomycin Resistant Enterococcus faecium) έχουν αναφερθεί σε χοίρους και σε αστικά και νοσοκομειακά λύματα στην Ελλάδα (Kotzamanidis και συν., 2009 Gousia και συν., 2011). Επίσης, πρόσφατα έχει αναφερθεί η απομόνωση VRE σε παράκτια ύδατα του Θερμαϊκού Κόλπου (Zdragas και συν., 2008). 1

12 Υπό διερεύνηση θέματα που έχουν τεθεί από τη διεθνή επιστημονική κοινότητα αποτελούν: i) η παρουσία των VRE στους χοίρους και τα πτηνά, μετά την απαγόρευση από την Ευρωπαϊκή Ένωση (1997) της χρήσης ως αυξητικού παράγοντα, της αβοπαρκίνης, καθώς και η παρουσία των VRE σε είδη παραγωγικών ζώων στα οποία δεν χορηγούταν ευρέως αυτός ο παράγοντας, ii) η ύπαρξη διαφορών στον τύπο της αντοχής μεταξύ των VRE που απομονώνονται από τον άνθρωπο και τα ζώα, και iii) η μετάδοση VRE στελεχών από τα ζώα στον άνθρωπο. Σκοπός της διατριβής ήταν καταρχήν η διερεύνηση του επιπολασμού των VRE στα παραγωγικά ζώα (με έμφαση τα πτηνά) στον Ελλαδικό χώρο καθώς και σε άτομα που σχετίζονταν με αυτά (πτηνοσφαγείς και εκδοροσφαγείς), ο προσδιορισμός του van γενότυπου αυτών, καθώς και η αξιολόγηση της επιδημιολογικής τους συσχέτισης με κλινικά VRE στελέχη απομονωμένα κατά την ίδια χρονική περίοδο και από νοσηλευμένους ασθενείς από τις ίδιες γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας. Στο πρώτο μέρος της διατριβής γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση όσον αφορά τους εντερόκοκκους γενικά, την οικολογία τους και τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους καθώς και τις μεθόδους ταυτοποίησης και τυποποίησης. Επίσης, αναφέρονται οι μηχανισμοί αντοχής των εντεροκόκκων στα αντιμικροβιακά και ειδικά στα γλυκοπεπτίδια. Τέλος, γίνεται αναφορά στην επιδημιολογία των VRE στα νοσοκομεία, στην κοινότητα και στα ζώα. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής περιγράφονται τα υλικά και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της έρευνας, παρουσιάζονται και σχολιάζονται οι επιμέρους μελέτες με τα αποτελέσματά τους και μετά από μια γενική συζήτηση διατυπώνονται τα συμπεράσματα. Επιμέρους μελέτες που προγραμματίστηκαν και εκτελέστηκαν για την επίτευξη των επιστημονικών στόχων της διατριβής αποτελούν: α) Η διερεύνηση του επιπολασμού των VRE στελεχών β) Ο έλεγχος της ευαισθησίας των VRE στελεχών στα αντιμικροβιακά και η Διαχωριστική ανάλυση (Discriminant analysis) των προφίλ της αντιμικροβιακής αντοχής (antimicrobial resistance profiles, ARPs) των VREF στελεχών: γ) Ο γενοτυπικός χαρακτηρισμός με έλεγχο της κλωνικότητας των VREF στελεχών με την εφαρμογή της ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE): Η διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. Τμήμα της παρούσας μελέτης 2

13 πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Κτηνιατρικών Ερευνών Θεσσαλονίκης του Εθνικού Ιδρύματος Αγροτικών Ερευνών (ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε.). Η ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής δε θα ήταν ίσως εφικτή χωρίς τη συνεισφορά κάποιων ανθρώπων στους οποίους θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου: Ευχαριστώ βαθύτατα την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Βικτωρία Σιάρκου, η οποία ήταν συνέχεια δίπλα μου όλα αυτά τα χρόνια τόσο ως πρώην μέλος της Συμβουλευτικής Επιτροπής όσο και ως μετέπειτα επιβλέπουσά μου. Αισθάνομαι ειλικρινά την ανάγκη να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στο πρόσωπό της για τις αμέτρητες ώρες που αφιέρωσε στη συνεχή καθοδήγησή μου σε όλα τα στάδια εκπόνησης της διατριβής. Την ευχαριστώ επίσης θερμά γιατί με την υπομονή, την επιμονή της και το αμείωτο ενδιαφέρον της όλα αυτά τα χρόνια και ιδιαίτερα με τις ουσιαστικές και εποικοδομητικές διορθώσεις της στη συγγραφή του κειμένου της διατριβής, συνέβαλε καθοριστικά στην επιτυχή ολοκλήρωσή της. Ήταν ιδιαίτερη τιμή για μένα η συμμετοχή του Επίκουρου Καθηγητή κ. Σπύρο Πουρνάρα ως μέλους της Συμβουλευτικής Επιτροπής. Τον ευχαριστώ επίσης θερμά για την εξασφάλιση βακτηριακών νοσοκομειακών στελεχών από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λάρισας καθώς και για τις χρήσιμες παρατηρήσεις και συμβουλές του. Αισθάνομαι πολύ τυχερός που συμμετείχε στη Συμβουλευτική Επιτροπή ο Ερευνητής Α του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. κ. Αντώνιος Ζδράγκας, ο οποίος με την εποικοδομητική συνεργασία μας, συνετέλεσε ουσιαστικά στην ολοκλήρωση ενός σημαντικού τμήματος του πειραματικού μέρους της διατριβής στο ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε., αλλά και με βοήθησε στη συγγραφή των αποτελεσμάτων της διατριβής. Τον ευχαριστώ επίσης θερμότατα για την ψυχολογική στήριξη που μου παρείχε και τη συνεχή ενθάρρυνση. Θερμές ευχαριστίες εκφράζω στον Καθηγητή κ. Μηνά Γιάγκου, για τα θετικά του σχόλια και τις εύστοχες παρατηρήσεις του. Αισθάνομαι επίσης την ανάγκη ευχαριστήσω θερμά την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Χρυσάνθη Παπαδοπούλου που δέχθηκε να συμμετάσχει στην Επταμελή Εξεταστική Επιτροπή αλλά και για τα θετικά της σχόλια. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Μπατζία ευχαριστώ ιδιαίτερα για τις καίριες παρατηρήσεις και επισημάνσεις του στο κείμενο της παρούσας διατριβής. Ευχαριστώ επίσης θερμά τον Λέκτορα κ. Δανιήλ Σεργκελίδη τόσο για τις εύστοχες διορθώσεις του όσο και για τις πολύ εποικοδομητικές συζητήσεις που είχαμε γύρω από το θέμα της διατριβής. 3

14 Ευχαριστίες οφείλω στην συνταξιοδοτηθείσα καθηγήτρια κ. Ελευθερία Χατζοπούλου, και πρώην επιβλέπουσά μου, που μου ανέθεσε το θέμα της διατριβής και συνετέλεσε στην εξασφάλιση των απαραίτητων πόρων για την υλοποίηση της παρούσας έρευνας. Θερμότατα ευχαριστώ επίσης, την κ. Δανάη Σοφιανού, πρώην Δντρια του Μικροβιολογικού Τμήματος του Ιπποκρατείου Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης και πρώην μέλος της Συμβουλευτικής Επιτροπής, η οποία πέραν από την εξασφάλιση νοσοκομειακών βακτηριακών στελεχών από το Ιπποκράτειο Νοσοκομείο απαραίτητων για την υλοποίηση της παρούσας έρευνας, με στήριξε ουσιαστικά αλλά και ψυχολογικά με τις καίριες συμβουλές της σε όλη τη διάρκεια της διατριβής. Πολύτιμη ήταν η συμβολή του κ. Χαράλαμπου Κοτζαμανίδη, μοριακού βιολόγου και διδάκτορα του τμήματος Βιολογίας του ΑΠΘ, στην ανάλυση των αποτελεσμάτων και ιδιαίτερα των επιδημιολογικών δεδομένων της διατριβής, τον οποίο ευχαριστώ ειλικρινά για τη συνεργασία μας. Αισθάνομαι την υποχρέωση να ευχαριστήσω την κ. Σοφία Μπελιμπασάκη, Δντρια του Ινστιτούτου Κτηνιατρικών Ερευνών Θεσσαλονίκης (ΙΚΕΘ) του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε., η οποία μου επέτρεψε να εργαστώ στο Ινστιτούτο για την ολοκλήρωση σημαντικού τμήματος της διατριβής, όπως και την Βιργινία Γιαντζή αλλά και όλο το προσωπικό του ΙΚΕΘ, για την άψογη συνεργασία μας. Ευχαριστώ επίσης τον κ. Γεώργιο Βαφέα από το ΙΚΕΘ του ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε. ο οποίος με βοήθησε σημαντικά στην επεξεργασία των αποτελεσμάτων της επιδημιολογικής ανάλυσης της παρούσας διατριβής. Δε θα παραλείψω να ευχαριστήσω επίσης την παρασκευάστρια του εργαστηρίου, Χρύσα Χρηστογιώργου για τη βοήθειά της στην παρασκευή των θρεπτικών υποστρωμάτων. Το συνάδελφό μου και στενό φίλο Δημήτριο Κουτσόπουλο ευχαριστώ ιδιαίτερα για τη βοήθειά του στην ολοκλήρωση ενός τμήματος του πειραματικού μέρους της διατριβής. Επίσης ευχαριστώ θερμά το συνάδελφο και φίλο Ιωάννη Καζάκη για τη συνδρομή του στη συλλογή μέρους των δειγμάτων της διατριβής. Επιπλέον, αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω ειλικρινά τον Σχη (ΥΚ) Κων/νο Τερψίδη, Διευθυντή του Γ Κτηνιατρικού Νοσοκομείου (Γ ΚΝΟ), τον Άνχη (ΥΚ) Βασίλειο Παράσχο, Διευθυντή Εργαστηρίων του Γ ΚΝΟ καθώς και τον Άνχη (ΥΚ) Ελευθέριο Γιώτα, Τμηματάρχη του Μικροβιολογικού Τμήματος του Γ ΚΝΟ, για τις διευκολύνσεις που μου παρείχαν κατά τη συγγραφή της διατριβής. Επίσης, θα έθελα να ευχαριστήσω ανώνυμα όλους τους φίλους και γνωστούς που με στήριξαν ψυχολογικά. 4

15 Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τη σύζυγό μου, Βασιλεία, για την πολύπλευρη στήριξη και την αγάπη της καθώς και την αδιάκοπη συμπαράσταση, την εμπιστοσύνη αλλά και την υπομονή της, όλα αυτά τα χρόνια. 5

16 6

17 ΜΕΡΟΣ Ι ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1 ΓΕΝΙΚΑ ΠΕΡΙ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ 1.1 Ιστορική αναδρομή Με το γενικό όρο «εντερόκοκκοι», χαρακτηρίστηκαν καταρχήν οι εντερικής προέλευσης Gram θετικοί κόκκοι, που απομονώνονταν από κόπρανα ανθρώπων και που στη συνέχεια συμπεριλήφθηκαν στο γένος Streptococcus (Thiercelin, 1899). Με την καθιέρωση του συστήματος ταξινόμησης κατά Lancefield, οι «εντερόκοκκοι» ταξινομήθηκαν στην ομάδα D των στρεπτοκόκκων με βάση την παρουσία στο κυτταρικό τους τοίχωμα του ειδικού της ομάδας D αντιγόνου, διαφοροποιούμενοι από τα υπόλοιπα μέλη της ομάδας D, και με βάση τα καλλιεργητικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά τους (Lancefield, 1933 Sherman 1937, 1938). Αργότερα, μελέτες υβριδισμού DNA-DNA και DNA-rRNA έδειξαν ότι είδη της ομάδας D, όπως Streptococcus faecium, S. faecalis, S. avium, S. casseliflavus, S. durans, S. faecalis subsp. malodoratus και S. gallinarum ήταν σαφώς διακριτά από τα άλλα είδη στρεπτοκόκκων και ως εκ τούτου ταξινομήθηκαν σε ξεχωριστό γένος, το γένος Enterococcus (Schleifer, 1984 Schleifer και Kilpper-Balz, 1984). 1.2 Περιγραφή του γένους Enterococcus Το γένος Enterococcus περιλαμβάνει Gram θετικούς κόκκους, μη σπορογόνους, καταλάση και οξειδάση αρνητικούς, προαιρετικά αναερόβιους που διατάσσονται μεμονωμένα, κατά ζεύγη ή μικρές αλυσίδες και έχουν μέγεθος 0,6-2,5μm. Αναπτύσσονται ιδανικά στους 35 ο C, αν και τα περισσότερα είδη του γένους μπορούν να αναπτυχθούν σε μεγάλο εύρος θερμοκρασίας, από 10 ο C έως 45 ο C. Επίσης, αναπτύσσονται παρουσία 6,5% NaCl, σε ph 9,6 και υδρολύουν την εσκουλίνη παρουσία 40% χολικών αλάτων. Η περιεκτικότητα του DNA των εντεροκόκκων σε γουανίνη και κυτοσίνη (G+C) κυμαίνεται από 37% έως 45% (Schleifer και Kilpper-Balz, 1984). Οι εντερόκοκκοι επιβιώνουν στους 7

18 60 ο C για 30 λεπτά, ενώ είναι ανθεκτικοί σε απολυμαντικές ουσίες όπως η χλωρίνη, η γλουταραλδεϋδη και η αλκοόλη, χαρακτηριστικά που ευνοούν την επιβίωση και την εξάπλωσή τους στο περιβάλλον των νοσοκομείων (Bradley και Fraise, 1996). Τα είδη E. gallinarum και E. casseliflavus είναι κινητά. Οι δοκιμές που παρατίθενται στον Πίνακα 1.1 χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση και τη διάκριση των περισσότερων εντεροκόκκων από τους υπόλοιπους Gram-θετικούς καταλάση αρνητικούς κόκκους. Η φυλογενετική ανάλυση των Gram θετικών κόκκων, με βάση τη σύγκριση του 16S rrna, αποκάλυψε ότι το γένος Enterococcus συγγενεύει περισσότερο με τα γένη Vagococcus, Tetragenococcus παρά με τα γένη Streptococcus και Lactococcus (Εικόνα 1.1). Φυλογενετικές αναλύσεις οδήγησαν σε επαναταξινομήσεις μεταξύ των γενών π.χ. το προτεινόμενο νέο είδος Enterococcus serolicida φάνηκε ότι περιλάμβανε στελέχη ομόλογα με εκείνα του προϋπάρχοντα Lactococcus garvieae οπότε και διατηρήθηκε το όνομα του τελευταίου, ενώ το είδος Enterococcus solitarius ότι ανήκει στο γένος Tetragenococcus και όχι στο γένος Enterococcus (Williams και συν., 1991 Teixeira και συν., 1996). Μέχρι σήμερα, 38 διακριτά είδη περιλαμβάνονται στο γένος Enterococcus με βάση τα φυλογενετικά τους χαρακτηριστικά και την αλληλουχία του 16S rrna τους, τον υβριδισμό του DNA-DNA και την ανάλυση των ολικών κυτταρικών πρωτεϊνών τους (Whole Cell Protein, WCP): E. aquimarinus, E. asini, E. avium, E. caccae, E. camelliae, E. canintestini, E. canis, E. casseliflavus (E. flavescens), E. cecorum, E. columbae, E. devriesei, E. dispar, E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. gilvus, E. haemoperoxidus, E. hermanniensis, E. hirae, E. malodoratus, E. moraviensis, E. mundtii, E. pallens, E. phoeniculicola, E. pseudoavium, E. quebecensis, E. raffinosus, E. ratti, E. saccharolyticus, E. saccharominus (E. italicus), E. sileciacus, E. sulfurous, E. termitis, E. thailandicus, E. ureasiticus, E. viikkiensis και E. villorum (E. porcinus) (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature, Με βάση την ανάλυση ολικών κυτταρικών πρωτεϊνών, τα είδη E. casseliflavus και E. flavescens περιλάμβαναν ομόλογα στελέχη οπότε και συμπεριλήφθηκαν σε ένα είδος με το όνομα του πρώτου (Teixeira και συν., 1997). Το ίδιο συνέβη και με τα είδη E. vilorum και E. porcinus, με το δεύτερο να αποτελεί μεταγενέστερο συνώνυμο του πρώτου (De Graef και συν., 2003), όπως και για τα είδη E. saccharominus και E. italicus, με το δεύτερο επίσης να αποτελεί συνώνυμο του πρώτου (Naser και συν., 2006). 8

19 Πίνακας 1.1. Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά προαιρετικά αναεροβίων, Gram θετικών, καταλάση αρνητικών κόκκων. Γένος Διάταξη 2 Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά 1 VAN GAS BE PYR LAP NaCl 10 ο C Enterococcus Α Ε/Α * + + * + C * + C * v a/γ 45 ο C MOT HEM Vagococcus Α Ε a/γ Lactococcus Α Ε V+ + V- - a/γ Leuconostoc/Weissella Α Α + V+ - - V+ V- V- - a/γ Streptococcus Α Ε V- - V- - a/β/γ Nutritional var. Strep 3 Α Ε V- - a/γ Unusual Strep/genera 4 Α Ε - V+ V+ V+ V+ V- V- - a/γ Pediococcus Ζ/Τ Α V- - V+ - a Tetragenococcus Ζ/Τ Ε a Aerococcus 5 Ζ/Τ Ε - V+ V+ V- + - V- - a Helcococcus Ζ/Τ Ε γ Gemella Ζ/Τ/Α Ε γ Salt-tolerant Gemella 6 Ζ/Τ/Α Ε γ like Πηγή: 5 (Devriese και συν., 1993 Facklam και συν., 2002) 1 VAN: έλεγχος ευαισθησίας στη βανκομυκίνη, Ε: ευαίσθητο, Α: ανθεκτικό, GAS: παραγωγή αερίου σε ζωμό MRS, BE (Bile esculine): υδρόλυση εσκουλίνης παρουσία χολής, PYR (pyrrolidonylarylamidase): παραγωγή πυρολιδονυλικής αρυλαμιδάσης, LAP (leucine aminopeptidase): παραγωγή λευκίνης αμινοπεπτιδάσης, NaCl: ανάπτυξη σε ζωμό συγκέντρωσης 6,5% ΝαCl: 10 ο C και 45 ο C: ανάπτυξη στους 10 ο C και 45 ο C αντίστοιχα, MOT: κινητικότητα (moltility), HEM (Hemolysis): αιμολυτική δραστηριότητα σε άγαρ Trypticase soy εμπλουτισμένο με 5% αίμα προβάτου, + : 85% των στελεχών θετικά, - : 15% των στελεχών θετικά, V+: 50-84% των στελεχών θετικά, V- : 16-49% των στελεχών θετικά, v : ποικίλες αντιδράσεις (11-89% των στελεχών θετικά). 2 Α: αλυσίδες, Ζ: ζεύγη, Τ: τετράδες 3 Γένη Abiorophia και Granulicatella. 4 Ασυνήθιστα είδη στρεπτοκόκκων που συχνά απομονώνονται από ζώα και τα είδη Globicatella sanguinis και Dolosicoccus paucivorans. 5 Είδη A. viridians, A. urinae, A. sanguicola, και A. urinehominis. 6 Γένη Alloicoccus, Dolosigranulum, Facklamia και Ignavigranum. * Τα είδη E. cecorum, E. columbae, E. palens και E. saccharolyticus είναι PYR-αρνητικά. Τα είδη E. cecorum, E. columbae, και Ε. avium παρουσιάζουν πολύ φτωχή ανάπτυξη σε ζωμό συγκέντρωσης 6,5% NaCl και δεν αναπτύσσονται στους 10 ο C. Τα είδη E. dispar, E. sulfureus, E. malodoratus, E. moraviensis και E. haemoperoxidus δεν αναπτύσσονται στους 45 ο C. 9

20 Εικόνα 1.1. Φυλογενετική θέση του γένους Enterococcus στο 16S rrνα δενδρόγραμμα των Gram θετικών καταλάση αρνητικών κόκκων. Πηγή: Klein, Κατανομή στη φύση και επιδημιολογία των εντεροκόκκων Οι εντερόκοκκοι είναι ευρύτατα διαδεδομένοι στη φύση. Αποτελούν μέλη της φυσιολογικής χλωρίδας των περισσοτέρων θηλαστικών και πτηνών και ως εκ τούτου απαντούν ευρέως στο έδαφος, στα επιφανειακά νερά, στα φυτά, στα λαχανικά και τα τρόφιμα, ενώ έχει αναφερθεί η παρουσία τους σποραδικά σε αμφίβια και έντομα (Aarestrup και συν., 2002). Η κατανομή των Enterococcus spp. ποικίλλει ανάλογα με την προέλευσή τους (Πίνακας 1.2). Στον άνθρωπο οι εντερόκοκκοι αποτελούν το 1% της εντερικής μικροχλωρίδας με τα είδη E. faecium και E. faecalis να είναι τα περισσότερο συχνά. Οι πληθυσμοί του E. faecalis στα κόπρανα του ανθρώπου κυμαίνονται από ανά γραμμάριο (g), ενώ εκείνοι του E. faecium από ανά g (Franz και συν., 1999). Στα παραγωγικά ζώα όπως βοοειδή, χοίροι και πτηνά το είδος E. faecium επικρατεί, ενώ ακολουθούν τα είδη E. faecalis, E. hirae και E. durans. Η κατανομή των Enterococcus spp. 10

21 εξαρτάται εκτός από το είδος και από την ηλικία του ζώου (Aarestrup και συν., 2002). Έτσι στα ορνιθοειδή, ο E. faecalis επικρατεί στους νεοσσούς 1 ημέρας, ο E. faecium στα ηλικίας 3-4 εβδομάδων, ενώ ο E. cecorum σε μεγαλύτερα των 12 εβδομάδων. Αντίστοιχα, σε νεογέννητους μόσχους, επικρατέστερα είναι τα είδη E. faecium, E. faecalis και E. durans, που σταδιακά αντικαθίσταται από το είδος E. cecorum, ενώ στα ενήλικα βοοειδή σπανίως συναντάται κάποιο είδος εντεροκόκκων καθώς το μεγαλύτερο μέρος της εντερικής μικροχλωρίδας αποτελείται από το είδος Streptococcus bovis (Devriese και συν., 1992b). Στους χοίρους, αν και οι εντερόκοκκοι απομονώνονται συχνά από το έντερο ωστόσο, σπανιότερα απομονώνονται από τις αμυγδαλές και τα κόπρανα (Devriese και συν., 1994). Το είδος E. faecalis συναντάται πιο συχνά στο έντερο, ενώ το είδος E. faecium στα κόπρανα, με το τελευταίο να απομονώνεται σε χαμηλούς πληθυσμούς (Aarestrup και συν., 2002). Άλλα είδη όπως E. hirae και E. cecorum απομονώνονται σπανιότερα (Devriese και συν., 1994). Στους σκύλους και τις γάτες, το είδος E. faecalis συναντάται συχνότερα, ενώ τα είδη E. faecium και E. hirae σπανιότερα. Στα άλογα έχουν αναφερθεί τα είδη E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. gallinarum, E. casseliflavus και E. mundtii, ενώ στους όνους το είδος Ε. asini (de Vaux και συν., 1998). Τα είδη E. casseliflavus, E. mundtii και E. sulfureus είναι κυρίως φυτικής προέλευσης αν και μπορεί να αποικίζουν παροδικά και το έντερο ζώων (Aarestrup και συν., 2002). Πίνακας 1.2. Παρουσία εντεροκόκκων στον εντερικό σωλήνα ανθρώπων και ζώων Είδος Άνθρωποι Βοοειδή Χοίροι Πτηνά E. faecalis ++ (+) + ++ E. faecium E. durans/e. hirae (+) - (+) (+) E. gallinarum (+) - - (+) E. casseliflavus (+) E. cecorum/columbae : συνήθης, +: λιγότερο συχνή, (+):περιστασιακή, -:απουσία Πηγή: Klein, 2003 Ως μέλη της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου ανθρώπων και ζώων, χρησιμοποιούνται ως δείκτες κοπρανώδους μόλυνσης και ως εκ τούτου διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη δημόσια υγεία (Franz και συν., 1999). Ιδιαίτερα η παρουσία αυτών στα 11

22 επιφανειακά νερά αποτελεί απόδειξη μόλυνσης, συνήθως μη πρόσφατης, με περιττωματικές ουσίες γι αυτό και αποτελούν υποχρεωτική παράμετρο εξέτασης τόσο για το πόσιμο νερό όσο και για το νερό κολύμβησης [Κοινή Υπουργική Απόφαση Υ2/2600/2001 σε συμμόρφωση προς την Οδηγία 98/83 Ε.Ε. (ΦΕΚ 892/ ), Οδηγία 2006/7/ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου της 15ης Φεβρουαρίου 2006 σχετικά με τη διαχείριση της ποιότητας των υδάτων κολύμβησης]. Αν και δείκτες κακής υγιεινής, οι εντερόκοκκοι μπορεί να αποτελούν μέλη της χλωρίδας ορισμένων τροφίμων (Franz και συν., 1999), συμμετέχοντας μεταξύ άλλων στην ανάπτυξη οργανοληπτικών χαρακτηριστικών σε προϊόντα ζύμωσης (βλ. κεφ 1.6). Μελέτες της οικολογίας και επιδημιολογίας των εντεροκόκκων αναφέρουν τη συχνή παρουσία τους, ιδιαίτερα των E. faecium και E. faecalis, σε διάφορα τρόφιμα όπως ψάρια, τυριά, λουκάνικα, κιμά (Klein 2003 Peters και συν., 2003 Foulquie Moreno και συν., 2006). Τρόφιμα ζωικής προέλευσης (ωμά ή θερμικά επεξεργασμένα ή προϊόντα ζύμωσης) πολύ συχνά φέρουν εντερόκοκκους εφόσον αυτοί μπορεί να επιβιώσουν της παστερίωσης καθώς και ακραίων συνθηκών ανάπτυξης π.χ. ιδιαίτερα αλκαλικό ph (Fisher και Phillips, 2009). Μελέτη σε πανευρωπαϊκό επίπεδο έδειξε ότι τα αστικά λύματα καθώς και οι καλλιεργήσιμες εκτάσεις που χρησιμοποιούν κοπριά χοίρων περιέχουν σε ποσοστό 100% εντερόκοκκους, ενώ το ποσοστό μειώνεται στο 1/3 σε καλλιέργειες χωρίς ζωικά λιπάσματα (Kuhn και συν., 2003). Η κατανομή των Enterococcus spp. ποικίλλει ανάλογα με τη χώρα και το είδος του δείγματος. Έτσι, στη Σουηδία, κυριαρχεί ο E. faecalis στα επιφανειακά νερά, στα αστικά λύματα, στα νοσοκομειακά λύματα, στα κλινικά δείγματα και στα πτηνά, ενώ ο E. hirae στους χοίρους και τους μόσχους. Στην Ισπανία και το Ηνωμένο Βασίλειο κυριαρχεί ο E. faecium στα επιφανειακά νερά, στα αστικά και τα νοσοκομειακά λύματα, ενώ ο E. faecalis στα κλινικά δείγματα. Στη Δανία ο E. hirae επικρατεί σε μόσχους και χοίρους, ενώ ο E. faecalis στα πτηνά (Kuhn και συν., 2003). Γενικότερα, στα κλινικά δείγματα υπάρχει μικρότερη ποικιλία από τα υπόλοιπα ανθρώπινα και περιβαλλοντικά δείγματα με το E. faecalis συνήθως να κυριαρχεί, κυρίως λόγω της παρουσίας των παραγόντων λοιμογονικότητας που συνδέονται με αυτό το είδος (Kuhn και συν., 2003 Fisher και Phillips 2009). Οι νοσηλευόμενοι ασθενείς έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα εντεροκοκκικής μόλυνσης εξαιτίας του ότι το νοσοκομείο αποτελεί πηγή μόλυνσης και επομένως οι εντερόκοκκοι μπορούν να μολύνουν και να επιβιώσουν σε ένα ασθενή για μεγάλο χρονικό διάστημα (Brown και συν., 2006). Οι εντερόκοκκοι απομονώνονται πολύ συχνά σε περιπτώσεις περιοδοντίτιδας με το E. faecalis επίσης να κυριαρχεί (Peciuliene και συν., 2001). 12

23 1.4 Λοιμογονικότητα των Enterococcus spp. Οι εντερόκοκκοι αποτελούν μέλη της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας ανθρώπων και ζώων και στο παρελθόν παρόλο που αναγνωρίστηκαν ως δυνητικά παθογόνοι μικροοργανισμοί ικανοί να προκαλέσουν ενδοκαρδίτιδα, θεωρούνταν γενικά χαμηλής επικινδυνότητας παθογόνα. Ωστόσο, την τελευταία εικοσαετία οι εντερόκοκκοι αποτελούν μια από τις κύριες αιτίες νοσοκομειακών λοιμώξεων (Tannock και Cook, 2002). Όπως προαναφέρθηκε, ο E. faecalis αντιπροσωπεύει τις περισσότερες εντεροκοκκικές ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις, αν και την τελευταία 20ετία, η συχνότητα της εμφάνισης εντεροκοκκικών λοιμώξεωνr οφειλόμενων στον E. faecium αυξήθηκε, αύξηση που συνδέθηκε με την εμφάνιση αντοχής στα αντιμικροβιακά σε αυτό το είδος. Σήμερα πλέον, το 40% των εντεροκοκκικών λοιμώξεων οφείλεται στο E. faecium, ποσοστό σχεδόν τριπλάσιο από το αντίστοιχο στις αρχές της δεκαετίας του 1990 (Hidron και συν., 2008 Willems και van Schaik 2009). Ως παράγοντας λοιμογονικότητας θεωρείται ένα δραστικό μόριο που ενισχύει την ικανότητα ενός μικροοργανισμού να προκαλεί νόσο (Mundy και συν., 2000). Μερικοί από τους παράγοντες που καθορίζουν τη λοιμογόνο δύναμη των εντεροκόκκων είναι: α) η ικανότητα να αποικίζουν το γαστρεντερικό σωλήνα (ΓΣ), β) η ικανότητα προσκόλλησης σε εξωκυτταρικές δομικές πρωτεΐνες και γ) η ικανότητα προσκόλλησης σε διάφορα επιθήλια όπως το επιθήλιο της ουροδόχου κύστης και της στοματικής κοιλότητας (Fisher και Phillips, 2009). Ο παράγοντας Agg (aggregation substance), μία πρωτεΐνη επιφανείας του κυττάρου των εντεροκόκκων, κωδικοποιείται από πλασμίδια που επάγονται από φερομόνες, συμβάλλει στο σχηματισμό συσσωματωμάτων κατά τη διάρκεια της βακτηριακής σύζευξης διευκολύνοντας την πλασμιδιακή μεταφορά και επίσης διευκολύνει την προσκόλληση στην επιφάνεια ευκαρυωτικών κυττάρων και την υπεραντιγονική δραστηριότητα (Koch και συν., 2004 Foulquie Moreno και συν., 2006 Fisher και Phillips, 2009). Από την άλλη μεριά, η παρουσία του Agg αυξάνει την υδροφοβικότητα της επιφάνειας του κυττάρου του εντερόκοκκου γεγονός που καθυστερεί ή εμποδίζει την πρόσληψή τους από τα λυσοσωμικά κυστίδια (Eaton και Gasson, 2001) και παρατηρείται σχεδόν αποκλειστικά σε κλινικά στελέχη E. faecalis, αν και τελευταία η συχνότητα της εμφάνισής του σε στελέχη από τρόφιμα είναι αυξημένη (Eaton και Gasson 2001 Franz και συν., 2001). 13

24 Άλλη μια πρωτεΐνη της επιφάνειας του κυττάρου του E. faecalis είναι η Ace (Adhesion of collagen from E. faecalis). Πρόκειται για μια κολλαγόνο-δεσμευτική πρωτεΐνη που εμπλέκεται πιθανότατα στην παθογένεια της ενδοκαρδίτιδας (Koch και συν., 2004). Η εξωκυτταρική πρωτεΐνη επιφανείας Esp (Extracellular surface protein) σχετίζεται με το κυτταρικό τοίχωμα των εντεροκόκκων και περιγράφηκε καταρχήν στο στέλεχος E. faecalis ΜΜΗ594 (Shankar και συν., 1999). Το γονίδιο που την κωδικοποιεί είναι ασυνήθιστα μεγάλο (5622 ζεύγη βάσεων) και εμφανίζεται με μεγάλη συχνότητα σε κλινικά στελέχη. Θεωρείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση, τον αποικισμό και την εμπλοκή του ανοσοποιητικού συστήματος καθώς και στην αντοχή σε αντιμικροβιακές ουσίες και την παραγωγή βιοϋμενίων (biofilms) συμβάλλοντας στον αποικισμό των επιθηλιακών κυττάρων της ουροδόχου κύστης (Shankar και συν., 2001 Foulquie Moreno και συν., 2006). Η παρουσία του γονιδίου esp στον E. faecalis έχει βρεθεί εκτός των κλινικών στελεχών και σε στελέχη απομονωμένα από παραγωγικά ζώα και τρόφιμα (Hammerum και Jensen, 2002 Shankar και συν., 2002) και εντοπίζεται σε νησίδα παθογονικότητας (pathogenicity island, PAI) μεγέθους 150 Kb. Η εμφάνιση του κλώνου CC17 μεταξύ των κλινικών στελεχών του E. faecium γέννησε το ερώτημα κατά πόσο φέρει συγκεκριμένα χαρακτηριστικά που συμβάλλουν στη μετάδοση μεταξύ των νοσηλευομένων ασθενών (βλ. παρακάτω, κεφ 3.1). Πράγματι, το γονίδιο esp στο είδος E. faecium περιορίζεται αποκλειστικά σε ανθρώπινα κλινικά στελέχη του CC17 κλώνου (Willems και συν., 2001 Eaton και Gasson, 2002), εμπλέκοντας την πρωτεΐνη Esp στην παθογένεια των λοιμώξεων από E. faecium (Willems και συν., 2001 Coque και συν., 2002 Eaton and Gasson 2002 Leavis και συν., 2004 Klare και συν., 2005). Επιπλέον, η παρουσία του γονιδίου σε κλινικά στελέχη συνδέθηκε στενά με περιπτώσεις νοσοκομειακών στελεχών E. faecium ανθεκτικών στη βανκομυκίνη (vancomycin-resistant Enterococcus faecium, VREF), αναδεικνύοντας το ρόλο της Esp πρωτεΐνης στη μετάδοση των εντεροκοκκικών ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων (Willems και συν., 2001). Στο E. faecium η έκφραση της πρωτεΐνης Esp έδειξε ότι εμπλέκεται στην προσκόλληση καθώς και στο σχηματισμό βιοϋμενίου (Heikens και συν., 2007 Van Wamel και συν., 2007). Στο E. faecium, το γονίδιο esp εντοπίζεται σε νησίδα παθογονικότητας, διαφορετική ωστόσο από εκείνη του E. faecalis (Leavis και συν., 2004). Τα κλινικά στελέχη E. faecium που φέρουν το γονίδιο esp, εμφανίζουν, σε σχέση με τα στελέχη που δε φέρουν το γονίδιο, μεγαλύτερη αντοχή στην αμπικιλλίνη και τη σιπροφλοξακίνη (Billstrom και συν., 2008). Μία αιτία για την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης του E. faecium ως αίτιου βακτηριαιμίας και γενικά λοιμώξεων μπορεί να είναι η ικανότητά του να αποκτά πολλά διαφορετικά γονίδια αντοχής. 14

25 Επομένως, η επιλεκτική πίεση που ασκείται από τη χρήση αντιμικροβιακών ουσιών στο περιβάλλον του νοσοκομείου, που επιφέρει διαταραχή της ισορροπίας της φυσιολογικής χλωρίδας, επιτρέπει την επιλογή στελεχών, όπως E. faecium του κλώνου CC17, ανθεκτικών στην αμπικιλλίνη (Lester και συν., 2008). Ο κλώνος CC17 επικρατεί μεταξύ των κλινικών στελεχών E. faecium (Willems και συν., 2005 Top και συν., 2008b). Άλλοι δυνητικά παθογόνοι παράγοντες είναι το εκκρινόμενο αντιγόνο SagA και το επιφανειακό αντιγόνο Acm (Nallapareddy και συν., 2003 Teng και συν., 2003). Και τα 2 αντιγόνα προσκολλώνται σε δομικές πρωτεΐνες των κυττάρων του ανθρώπου όπως στο κολλαγόνο, το ινωδογόνο, τη φιμπρονεκτίνη και τη λαμινίνη. Η προσκόλληση σε δομικές πρωτεΐνες ίσως αποτελεί το αρχικό βήμα για τον αποικισμό του ξενιστή, αν και ο ακριβής ρόλος αυτών στην παθογένεια των λοιμώξεων από E. faecium δεν είναι απόλυτα κατανοητός (Top και συν., 2008a). Πολλά κλινικά στελέχη E. faecium είναι ανθεκτικά στη φαγοκυττάρωση από ουδετερόφιλα, που μπορεί να θεωρηθεί χαρακτηριστικό της παθογένειας τους (Arduino και συν., 1994). Στο νηματώδες παράσιτο Caenorhabdilis elegans έχουν βρεθεί στελέχη E. faecium που παράγουν υπεροξείδιο του υδρογόνου που προκαλεί αλλοιώσεις των κυττάρων του παρασίτου, ωστόσο απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση για την απόδειξη της σχέσης αυτής στον άνθρωπο και τα ζώα (Moy και συν., 2004). Μια ομάδα υδρολυτικών ενζύμων, που περιλαμβάνει την υαλουρονιδάση, τη ζελατινάση και τη σερίνη, εμπλέκεται επίσης στη λοιμογονικότητα του εντερόκοκκου. Η υαλουρονιδάση κωδικοποιείται από το χρωμοσωμικό γονίδιο hyl Efm, που περιγράφηκε σε κλινικά στελέχη E. faecium, και είναι ομόλογο εκείνου που υπάρχει στα είδη Streptococcus pyogenes και Streptococcus pneumoniae υπεύθυνου για τον αποικισμό του ρινοφάρυγγα (Rice και συν., 2003b). Η υαλουρονιδάση είναι ένζυμο αποικοδόμησης που δρα στο υαλουρονικό οξύ και σχετίζεται με την καταστροφή ιστών (Fisher και Phillips, 2009). Ο κύριος ρόλος της ζελατινάσης και της σερίνης στην λοιμογονικότητα των εντεροκόκκων συνίσταται στην αποικοδόμηση των ιστών του ξενιστή και στον σχηματισμό βιοϋμενίου (Gilmore και συν., 2002 Mohamed και Huang, 2007). Η ζελατινάση (GelE), είναι μια εξωκυτταρική μεταλλοπρωτεϊνάση ψευδαργύρου που εκκρίνεται από τον E. faecalis, είναι υπεύθυνη για την υδρόλυση της ζελατίνης, της καζεΐνης, της αιμοσφαιρίνης και άλλων βιοπεπτιδίων και κωδικοποιείται από το γονίδιο gele που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα (Koch και συν., 2004). Η ζελατινάση έχει περιγραφεί τόσο σε κλινικά στελέχη E. faecalis όσο και σε στελέχη απομονωμένα από τρόφιμα (Eaton και Gasson, 2001 Franz και συν., 2001), ενώ πρόσφατα έχει περιγραφεί και σε στελέχη E. faecium (Lopes Mde και συν., 2006). Το γονίδιο 15

26 spre, που κωδικοποιεί τη σερίνη, μεταγράφεται μαζί με το gele (Lopes Mde και συν., 2006). Η μεταγραφή και των 2 γονιδίων ρυθμίζεται από το οπερόνιο fsr (Qin και συν., 2000). Η κυτταρολυσίνη με β-αιμολυτικές ιδιότητες και βακτηριοκτόνος, για τα άλλα Gram θετικά βακτήρια, εμφανίζεται με μεγαλύτερη συχνότητα σε κλινικά στελέχη (Semedo και συν., 2003 Fisher και Phillips 2009). Τα γονίδια cyll s και cyll L, που είναι υπεύθυνα για την κωδικοποίηση της κυτταρολυσίνης, εντοπίζονται σε συζευκτικά πλασμίδια σχετιζόμενα με φερομόνες (pheromone responsive plasmids) (Koch και συν., 2004), δηλαδή είναι μικρά πεπτίδια (7-8 αμινοξέα) που εκκρίνονται από στελέχος E. faecalis και προάγουν τη συζευκτική μεταφορά των πλασμιδίων μεταξύ των στελεχών (Wirth, 1994) Λοιμώξεις στα ζώα Οι εντερόκοκκοι παρότι θεωρούνται μέλη της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου των περισσοτέρων θηλαστικών και πτηνών εντούτοις εμπλέκονται σε διάφορες λοιμώξεις σε αυτά. Έχουν αναγνωριστεί ως αίτιο μαστίτιδας βοοειδών σε περιπτώσεις ανεπαρκών συνθηκών υγιεινής. Ο επιπολασμός των εντεροκόκκων κυμαίνεται από 2-20% με τα είδη E. faecalis και E. faecium να είναι τα συχνότερα (Devriese και συν., 1999 Nam και συν., 2010a Nam και συν., 2010b). Οι εντερόκοκκοι έχουν αναφερθεί και ως αίτιο διάρροιας σε μόσχους (Rogers και συν., 1992 Ok και συν., 2009), χοιρίδια (Cheon και Chae, 1996 Teixeira και συν., 2001 Lu και συν., 2002), πώλους (Hollis και συν., 2008), σκύλους (Collins και συν., 1988 Jia και συν., 2009), γάτες (Helie και Higgins, 1999) και αρουραίους (Etheridge και συν., 1988 Etheridge και Vonderfecht, 1992 Teixeira και συν., 2001) με τα είδη E. durans και E. hirae να απομονώνονται στις περισσότερες των περιπτώσεων. Επίσης, οι εντερόκοκκοι έχουν εμπλακεί σε μαστίτιδα σε σκύλους (Manson και συν., 2003a), σε χολαγγειοηπατίτιδα σε γάτες (Pressel και συν., 2005), καθώς και σε μολύνσεις από καθετήρες σε σκύλους και γάτες (Marsh-Ng και συν., 2007). Τα πτηνά μολύνονται κυρίως από τα είδη E. faecalis, E. durans και E. hirae. Συνήθως προσβάλλονται την πρώτη εβδομάδα της ζωής τους με επιπολασμό από 1-10% προκαλώντας νευρικά συμπτώματα ή υψηλά ποσοστά θνητότητας. Οι εντερόκοκκοι έχουν απομονωθεί από εστιακές νεκρώσεις του εγκεφάλου και από περιστατικά ενδοκαρδίτιδας και σηψαιμίας (Devriese και συν., 1992a Cardona και συν., 1993 McNamee και King, 1996 Tankson και συν., 2002 Chadfield και συν., 2005). 16

27 1.5 Ο ρόλος των εντεροκόκκων στην υγιεινή, παραγωγή και βιοτεχνολογία τροφίμων Η παρουσία των εντεροκόκκων σε πολλά τυριά, η συμμετοχή τους στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των προϊόντων ζύμωσης και η ικανότητά τους να παράγουν βακτηριοσίνες (εντεροσίνες) είναι πολύ σημαντικές ιδιότητες για την εφαρμογή τους στη βιομηχανία τροφίμων. Οι εντερόκοκκοι για περισσότερο από μία δεκαετία χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία τροφίμων για την ωρίμανση αυτών αλλά και ως προβιοτικά ή εκκινητές (Franz και συν., 2003 Foulquie Moreno και συν., 2006). Μελέτες της μικροχλωρίδας παραδοσιακών τυριών Μεσογειακών χωρών, τα οποία παράγονται κατά κύριο λόγο από νωπό πρόβειο ή κατσικίσιο γάλα και κατά δεύτερο από αγελαδινό, έδειξαν ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση αυτών μέσω της πρωτεόλυσης, της λιπόλυσης, της διάσπασης του κιτρικού, συμβάλλοντας έτσι στη γεύση και το άρωμά τους (Litopoulou-Tzanetaki και Tzanetakis, 1992 Manolopoulou και συν., 2003). Επίσης, χρησιμοποιούνται στη ζύμωση διαφόρων τροφίμων όπως λουκάνικα και επιτραπέζιες ελιές (de Castro και συν., 2002 Franz και συν., 2003 Hugas και συν., 2003). Η υδρόλυση της καζεΐνης παίζει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό της υφής του τυριού και θεωρείται σημαντική για την ανάπτυξη του αρώματος στο τυρί. Οι πρωτεϊνάσες των γαλακτικών βακτηρίων συμπεριλαμβανομένων και των εντεροκόκκων θεωρούνται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην υδρόλυση της καζεΐνης κατά την παραγωγή του τυριού (Foulquie Moreno και συν., 2006). Ωστόσο η πρωτεολυτική και πεπτιδολυτική δράση των εντεροκόκκων με εξαίρεση το είδος E. faecalis, είναι χαμηλή μεταξύ των άλλων γαλακτικών βακτηρίων (Sarantinopoulos και συν., 2001b). Η λιπολυτική δραστηριότητα των γαλακτικών βακτηρίων συμπεριλαμβανομένων των εντεροκόκκων παίζει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό του αρώματος πολλών τυριών μέσω της υδρόλυσης του λίπους. Μεταξύ των εντεροκόκκων, το είδος E. faecalis έχει τη μεγαλύτερη λιπολυτική δράση ακολουθούμενο από τα E. faecium και E. durans (Sarantinopoulos και συν., 2001a). Ενώσεις κιτρικού παρατηρούνται σε πολλές πρώτες ύλες τροφίμων όπως τα φρούτα, τα λαχανικά και το γάλα. Ο μεταβολισμός των, ενώσεων αυτών οδηγεί στην παραγωγή προϊόντων όπως το διακετύλιο, η ακεταλδεϋδη, η ακετοϊνη, και η 2,3-βουτανοδιόλη, που έχουν πολύ διακριτικά αρωματικά χαρακτηριστικά και επηρεάζουν την ποιότητα των προϊόντων ζύμωσης π.χ. το τυρί, το γάλα, την κρέμα και το βούτυρο (Hugenholtz, 1993). Τα περισσότερα γαλακτικά βακτήρια μεταβολίζουν το κιτρικό, παρουσία γλυκόζης ή λακτόζης 17

28 ως πηγή ενέργειας. Την τελευταία δεκαετία παρατηρείται αυξημένο ενδιαφέρον για τη ζύμωση που οι εντερόκοκκοι προκαλούν πιθανώς λόγω του γεγονότος ότι στελέχη E. faecium και E. faecalis, παρουσιάζονται σε υψηλούς πληθυσμούς σε πολλά τυριά ειδικά σε αυτά που παρασκευάζονται σε μεσογειακές χώρες (Sarantinopoulos και συν., 2003 Foulquie Moreno και συν., 2006). Οι εντερόκοκκοι, και συγκεκριμένα στελέχη E. faecium και E. faecalis, διατίθενται ως προβιοτικά στον άνθρωπο και σε ζωοτροφές. Το στέλεχος E. faecium SF 68 (Cylactin, LBC SF68 ME10, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland) χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της διάρροιας των παιδιών αλλά και την πρόληψη της διάρροιας από τη χρήση αντιβιοτικών, και γενικά σε ζωοτροφές (Foulquie Moreno και συν., 2006). Επίσης το στέλεχος E. faecium PR88 (E. faecium Fargo 688, Quest International, Naarden, The Netherlands) χρησιμοποιείται για τη συμπτωματική θεραπεία του ευερέθιστου κόλου στον άνθρωπο και στη βιομηχανία τροφίμων συγκεκριμένα για τη βελτίωση του αρώματος στο τυρί Cheddar (Foulquie Moreno και συν., 2006). Ωστόσο, η χρήση των εντεροκόκκων ως προβιοτικών παραμένει ένα αμφιλεγόμενο θέμα., ενώ τα οφέλη από τη χρήση τους ως προβιοτικά είναι δεδομένα, η ολοένα αυξανόμενη συσχέτισή τους με ανθρώπινες λοιμώξεις και απόκτησης αντοχής σε αντιμικροβιακές ουσίες έχουν εγείρει αρκετά ερωτηματικά σχετικά με τον κίνδυνο μετάδοσης γονιδίων λοιμογονικότητας ή αντοχής σε άλλους μικροοργανισμούς της χλωρίδας του γαστρεντερικού σωλήνα (Franz και συν., 2003). Οι εντερόκοκκοι παράγουν βακτηριοσίνες, επονομαζόμενες εντεροσίνες, οι οποίες είναι μικρά εξωκυτταρικά εκκρινόμενα, κατιονικά, αμφίφιλα πεπτίδια με αντιμικροβιακή δράση εναντίον συγγενικών φυλογενετικά βακτηρίων (Fisher και Phillips, 2009). Οι εντεροσίνες έχουν απομονωθεί από στελέχη εντεροκόκκων που προέρχονται από διαφορετικές πηγές όπως τρόφιμα (τυρί, κρέας, ψάρι, λαχανικά) ζώα και ανθρώπους (Foulquie Moreno και συν., 2006) και κωδικοποιούνται από τέσσερα γονίδια (Fisher και Phillips, 2009). Οι εντερόκοκκοι παράγουν μια σειρά από εντεροσίνες, συμπεριλαμβανομένων των εντεροσινών Α, Β, Ι, L και P, που έχουν δράση κατά των ειδών των γενών Listeria, Clostridium και κατά του είδους Staphylococcus aureus, ενώ τελευταία η δράση τους έχει αποδειχθεί και για Gram αρνητικά βακτήρια όπως Klebsiella και Pseudomonas spp. (De Kwaadsteniet και συν., 2005). Η βακτηριοκτόνος δράση τους συνίσταται στη διαταραχή της διαπερατότητας της κυτταρικής μεμβράνης και του διαμεμβρανικού δυναμικού, τη διαρροή απαραίτητων ενδοκυτταρικών μορίων και τον κυτταρικό θάνατο των βακτηρίων (Hechard και Sahl, 2002). Τις τελευταίες δεκαετίες στελέχη E. faecalis, E. faecium και E. durans που παράγουν βακτηριοσίνες (εντεροσίνες) χρησιμοποιούνται ως εκκινητικές καλλιέργειες στην 18

29 παρασκευή πολλών τυριών όπως cheddar, φέτα, Mozzarella (Foulquie Moreno και συν., 2006). Τέλος, οι εντερόκοκκοι συμπεριλαμβάνονται στους μικροοργανισμούς που διαθέτουν την ικανότητα παραγωγής βιογενών αμινών με την ενζυμική αποκαρβοξυλίωση των προδρόμων ελεύθερων αμινοξέων στα τρόφιμα. Οι βιογενείς αμίνες είναι οργανικές βάσεις μικρού μοριακού βάρους με αλιφατική, αρωματική ή ετεροκυκλική δομή (ισταμίνη, καδαβερίνη, τυραμίνη, πουτρεσκίνη κλπ) και έχουν ιδιαίτερη σημασία για την δημόσια υγεία και την ασφάλεια των τροφίμων (Alvarez και συν., 2007). Μπορούν να βρεθούν σχεδόν σε όλα τα είδη τροφίμων σε μεγάλο και ποικίλο εύρος συγκέντρωσης (Halász και συν., 1994 Vidal-Carou και συν., 2007). Υψηλή συγκέντρωση βιογενών αμινών παρατηρείται κυρίως σε ζυμούμενα προϊόντα κρέατος και γάλακτος, ιχθυηρά, κρασιά, ελιές και οινοπνευματώδη ποτά (κρασιά και μπύρες). Η παρουσία τους στα τρόφιμα συνιστά κίνδυνο για την δημόσια υγεία και είναι ανεπιθύμητη διότι εμφανίζουν βιολογική δραστηριότητα και προκαλούν δυσάρεστες καταστάσεις όταν απορροφώνται σε μεγάλες ποσότητες από τον ανθρώπινο οργανισμό. Οι καταστάσεις αυτές μπορεί να είναι αλλεργικές αντιδράσεις (κύριο αίτιο η ισταμίνη), ημικρανίες, αύξηση της αρτηριακής πίεσης, εμετοί κλπ. Οι εντερόκοκκοι θεωρούνται κυρίως παραγωγοί τυραμίνης (προϊόν αποκαρβοξυλίωσης της τυροσίνης), όμως διαθέτουν, σε μικρότερο βαθμό, την ικανότητα παραγωγής ισταμίνης, καδαβερίνης και πουτρεσκίνης (Pircher και συν., 2007 Pleva και συν., 2012) δια μέσου της αποκαρβοξυλίωσης των αμινοξέων ιστιδίνης, λυσίνης και ορνιθίνης, αντίστοιχα. 1.6 Καλλιέργεια, ταυτοποίηση και τυποποίηση των Enterococcus spp Μέθοδοι απομόνωσης Το αιματούχο άγαρ με συγκέντρωση 5% αίματος ζώου είναι κατάλληλο για την ανάπτυξη των εντεροκόκκων. Ορισμένα στελέχη E. faecalis είναι β-αιμολυτικά σε αιματούχο άγαρ με αίμα κονίκλου, αλόγου ή ανθρώπου αλλά όχι προβάτου, ενώ ορισμένα στελέχη E. durans είναι β-αιμολυτικά ανεξαρτήτως προέλευσης του αίματος που χρησιμοποιείται. Τα υπόλοιπα είδη είναι α-αιμολυτικά ή μη αιμολυτικά (Facklam και συν., 2002). Οι εντερόκοκκοι στην πλειονότητά τους αναπτύσσονται αεροβίως, ενώ ορισμένα μόνο στελέχη αναπτύσσονται σε ατμόσφαιρα με αυξημένα επίπεδα CO 2 (Teixeira και συν, 2007). Το υπόστρωμα Bile esculine (BE) azide αποτελεί εκλεκτικό υπόστρωμα για την απομόνωση 19

30 έναντι άλλων κυρίως Gram αρνητικών βακτηρίων. Οι εντερόκοκκοι στο εν λόγω υπόστρωμα σχηματίζουν μαύρες αποικίες λόγω υδρόλυσης της εσκουλίνης (Domig και συν., 2003a). Η αυξανόμενη εμφάνιση ανθεκτικών στη βανκομυκίνη εντεροκόκκων (VRE) ενίσχυσε την ανάγκη της έγκαιρης απομόνωσης και ταυτοποίησής τους για τον έλεγχο της εξάπλωσής τους στο περιβάλλον των νοσοκομείων (Cetinkaya και συν., 2000). Διάφορα εκλεκτικά υποστρώματα έχουν χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση των VRE από κόπρανα. Η χρήση εμπλουτιστικών-εκλεκτικών ζωμών για την απομόνωση των VRE είναι η πλέον αποτελεσματική (Facklam και συν., 2002). Ο ζωμός Enterococcosel (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md) έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλές μελέτες ως εκλεκτικό υπόστρωμα εμπλουτισμένο με βανκομυκίνη σε διάφορες συγκεντρώσεις, με τη συγκέντρωση των 6 μg/ml να είναι η περισσότερο αποδεκτή καθώς επιτρέπει την ανάπτυξη όλων των VRE, συμπεριλαμβανομένων και των στελεχών που παρουσιάζουν χαμηλή αντοχή στη βανκομυκίνη, όπως εκείνα που περιέχουν το vanc γονίδιο (βλ. παρακάτω κεφ ) (van Horn και συν., 1996 Ieven και συν., 1999 Facklam και συν., 2002). Επιπλέον, η καλλιέργεια σε Enterococcosel agar που περιέχει βανκομυκίνη (6 μg/ml), μετά από εμπλουτισμό σε ζωμό Enterococcosel με βανκομυκίνη 6 μg/ml αποτελούν την περισσότερο διαδεδομένη και ευαίσθητη μέθοδο απομόνωσης VRE (Facklam και συν., 2002 Teixeira και συν., 2007) Μέθοδοι ταυτοποίησης Οι εντερόκοκκοι χωρίζονται σε 5 ομάδες με βάση τα βιοχημικά τους χαρακτηριστικά (βλ 4.2.2). Τις τελευταίες δεκαετίες διάφορες μοριακές τεχνικές έχουν εφαρμοστεί, σε μια προσπάθεια να αναπτυχθούν ταχύτερες και ακριβέστερες μέθοδοι ταυτοποίησης των Enterococcus spp., όπως ο DNA-DNA υβριδισμός, η ανάλυση της αλληλουχίας του 16S rrna και η ανάλυση ολικών κυτταρικών προτεϊνών (Whole Cell Protein, WCP) (Farrow και συν., 1983 Schleifer και Kilpper-Balz, 1984 Collins και συν., 1989 Williams και συν., 1991 Merquior και συν., 1994), όπως επίσης η παλμική φασματοσκοπική ανάλυση (vibrational spectroscopic analysis), o τυχαίος πολλαπλασιασμός του πολυμορφικού DNA (randomly amplified polymorphic DNA, RAPD analysis), η ανάλυση πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων (fragment length polymorphism analysis) του ενισχυμένου 16S rdna, ο προσδιορισμός της αλληλουχίας των γονιδίων των D-Ala-D-Ala λιγασών (ddl) που εμπλέκονται στη σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος των 20

31 εντεροκόκκων, η ενίσχυση των ddl γονιδίων και των γονιδίων της αντοχής στη βανκομυκίνη (van) με τη δοκιμή της πολλαπλής PCR, κι άλλες τεχνικές (Facklam και συν., 2002). Διάφορα εμπορικά συστήματα, έχουν επίσης περιγραφεί για την ταυτοποίηση των ειδών του Enterococcus spp. όπως το API 20, API Rapid ID32 STREP, το σύστημα VITEK κι άλλα. Η ακρίβεια της ταυτοποίησης των εμπορικών συστημάτων, συγκρινόμενα με τις μοριακές μεθόδους ταυτοποίησης, έχει αξιολογηθεί και μόνο το 80% των απομονωθέντων στελεχών των εντεροκόκκων μπορεί με ακρίβεια να ταυτοποιηθεί με αυτά (Angeletti και συν., 2001 Teixeira και συν., 2007) Μέθοδοι τυποποίησης Με βάση το αυξημένο ενδιαφέρον σχετικά με την επιδημιολογία των εντεροκοκκικών λοιμώξεων κυρίως ως σημαντικών νοσοκομειακών παθογόνων και την εμφάνιση και εξάπλωση της αντοχής που αυτοί παρουσιάζουν έναντι των αντιμικροβιακών ουσιών, και με σκοπό τον έλεγχο των εντεροκοκκικών λοιμώξεων, αναπτύχθηκαν διάφοροι μέθοδοι τυποποίησης των στελεχών που εμπλέκονται. Η διερεύνηση της εξάπλωσης της αντοχής, που οι εντερόκοκκοι παρουσιάζουν, είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, κυρίως εξαιτίας της συχνής εμφάνισης των VRE. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την επιδημιολογική μελέτη εντεροκόκκων που απομονώνονται πρέπει να είναι σε θέση να διερευνούν την εξάπλωση των εντεροκόκκων σε διαφορετικά περιβάλλοντα και ξενιστές καθώς και την εξέλιξη των στελεχών που παρουσιάζουν αντοχή στα αντιμικροβιακά (Facklam και συν., 2002) Φαινοτυπικές μέθοδοι τυποποίησης Κλασσικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση της ποικιλομορφίας μεταξύ στελεχών συγκεκριμένου είδους, περιλαμβάνουν τη βιοτυποποίηση με βάση τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά του είδους και τον έλεγχο της ευαισθησίας σε αντιμικροβιακές ουσίες (Kuhn και συν., 1995), την οροτυποποίηση (Maekawa και συν., 1992), την ταυτοποίηση βακτηριοσινών (Kuhnen και συν., 1987) και λυσινών (Kuhnen και συν., 1987 Smyth και συν., 1987 Kuhnen και συν., 1988). Πρόκειται για πολύ χρονοβόρες μεθόδους περιορισμένης αξίας στις επιδημιολογικές μελέτες. 21

32 Μοριακές μέθοδοι τυποποίησης Η χρήση μοριακών μεθόδων τυποποίησης βελτίωσε σημαντικά τη δυνατότητα διαφοροποίησης των στελεχών των εντεροκόκκων παρέχοντας σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την επιδημιολογία των νοσοκομειακών εντεροκοκκικών λοιμώξεων ιδιαίτερα σε ό,τι αφορά κλινικά περιστατικά που οφείλονταν σε στελέχη που εμφάνιζαν σημαντική αντοχή. Οι πρώτες μοριακές τεχνικές τυποποίησης των εντεροκόκκων ήταν η ανάλυση του πλασμιδιακού προφίλ (analysis of plasmid profiles) και η ανάλυση γονιδιωματικού DNA με ένζυμο περιορισμού (restriction enzyme analysis of genomic DNA), που ωστόσο αποδείχθηκαν δυσεφάρμοστες στην πράξη (Savor και συν., 1998 Quednau και συν., 1999). Η πολυτοπική ηλεκτροφόρηση ενζύμων (multilocus enzyme electrophoresis) (Carvalho και συν., 1997), η ριβοτυπoποίηση (Gordillo και συν., 1993 Kuhn και συν., 1995), οι μέθοδοι της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction,PCR), όπως η PCR τυχαίας ενίσχυσης πολυμορφικού DNA (RAPD-PCR) (Descheemaeker και συν., 1997) και η επαναλαμβανόμενη εξωγονιδιακή παλινδρομική PCR (Repetitive Extragenic Palindromic PCR, REP-PCR) (Malathum και συν., 1998), έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση της γενετικής συσχέτισης στελεχών εντεροκόκκων. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας του DNA με PCR και ανάλυση του πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων εκ περιορισμού (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) έχει χρησιμοποιηθεί στην αναζήτηση διαφορών μεταξύ γονιδίων αντοχής των εντεροκόκκων (Patel και συν., 1997 Descheemaeker και συν., 1999 Donabedian και συν., 2000 Willems και συν., 2000). Μεγάλη ικανότητα διαφοροποίησης των εντεροκόκκων παρουσιάζει η τεχνική που περιλαμβάνει την πέψη του χρωμοσωμικού DNA με ενδονουκλεάσες περιορισμού και με ηλεκτροφόρηση των θραυσμάτων που προκύπτουν σε πήκτωμα αγαρόζης και σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (Pulsed-Field Gel Electrophoresis, PFGE), που επιτρέπει το διαχωρισμό τμημάτων DNA μεγαλύτερων από 1000 kbp (Murray και συν., 1990 Gordillo και συν., 1993 Green και συν., 1995). Τα αποτελέσματα από ένα μεγάλο αριθμό μελετών αποδεικνύουν ότι η πέψη του DNA με την ενδονουκλεάση SmaI και η εφαρμογή της PFGE, εμφανίζει σαφή πλεονεκτήματα στο διαχωρισμό των στελεχών (Gordillo και συν., 1993 Donabedian και συν., 1995 Tomayko and Murray 1995 Carvalho και συν., 1997 Descheemaeker και συν., 1997 Malathum και συν., 1998 Murray 1998 Bischoff και συν., 1999 Reinert και συν., 1999 Torell και συν., 1999 Donabedian και συν., 2010). 22

33 Η PFGE θεωρείται σήμερα αξιόπιστη μέθοδος τυποποίησης για την επιδημιολογική ανάλυση των στελεχών εντεροκόκκων γι αυτό και αποκαλείται gold standard μέθοδος (Facklam και συν., 2002 Teixeira και συν., 2007). Ωστόσο, λόγω της αυξημένης συχνότητας ανασυνδυασμού του DNA των εντεροκόκκων (Bonten και συν., 1998a Morrison και συν., 1999 Werner και συν., 2003b), η PFGE είναι κατάλληλη για την αναζήτηση της κλωνικότητας στελεχών που σχετίζονται με συγκεκριμένη χρονική και γεωγραφική εντόπιση παρά για μακρόχρονες και ευρείες επιδημιολογικές μελέτες (Top και συν., 2008a). Σε πολλές μελέτες, τα ευρήματα της PFGE, σε ό,τι αφορά την κλωνικότητα των στελεχών VREF, βρίσκονται σε συμφωνία με ευρήματα άλλων μεθόδων τυποποίησης, όπως η πολυτοπική τυποποίηση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (multilocus sequence typing, MLST) και η τυποποίηση του γενότυπου με υψηλής ανάλυσης τήξη (High Resolution Melting Genotyping, HRG), οι οποίες έχουν με επιτυχία χρησιμοποιηθεί για την επιδημιολογική συσχέτιση των VRE (Nallapareddy και συν., 2002 Bonora και συν., 2004 Abele-Horn και συν., 2006 Biendo και συν., 2010 Tong και συν., 2011). Η πολυτοπική τυποποίηση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (Multi-Locus Sequence Typing, MLST), παρέχει δεδομένα κατάλληλα για την ανάπτυξη μιας διαδικτυακής βάσης δεδομένων ( που περιλαμβάνει διάφορα προφίλ μικροοργανισμών συμπεριλαμβανομένων των E. faecium και E. faecalis (Maiden και συν., 1998 Homan και συν., 2002 Ruiz-Garbajosa και συν., 2006). Η τεχνική βασίζεται στην ταυτοποίηση αλληλουχιών τμημάτων επτά ή περισσοτέρων γονιδίων του βασικού μεταβολισμού, που βρίσκονται σε όλα τα στελέχη του είδους. Τα γονίδια που παρουσιάζουν έστω και μία διαφορά στην αλληλουχία τους θεωρούνται διαφορετικά αλλήλια. Ο συνδυασμός των αλληλίων που διαθέτει κάθε στέλεχος συνιστά το αριθμητικό προφίλ των αλληλίων και το κατατάσσει σε ένα συγκεκριμένο τύπο αλληλουχίας (sequence type, ST). Στελέχη με τα ίδια αλλήλια θεωρούνται στελέχη του ίδιου κλώνου. Η MLST έχει επιβεβαιώσει τη μη κλωνική συσχέτιση των στελεχών των ανθρώπων και των ζώων που είχε επισημανθεί με την PFGE (Bonora και συν., 2004). Είναι, ωστόσο, γνωστό ότι ο γενετικός διαχωρισμός που βασίζεται στην MLST και την PFGE δεν δίνει πάντα σύμφωνα αποτελέσματα (Ko και συν., 2005 Werner και συν., 2007), καθώς και ότι η MLST μπορεί να ανιχνεύσει γενετική συσχέτιση μεταξύ στελεχών που με τη PFGE εμφανίζουν ελάχιστη ή καθόλου ομοιότητα. Πράγματι, είναι γνωστό ότι μεγάλα κινητά γενετικά στοιχεία μπορεί να επηρεάσουν τα προϊόντα πέψης του DNA και επομένως και το αποτέλεσμα της PFGE (Willems και van Schaik, 2009), αλλά επίσης μπορεί να συνεισφέρουν και στη διαφορετικότητα των βασικών-δομικών γονιδίων που περιλαμβάνει η MLST ανάλυση (Manson και συν., 2003b Freitas και συν., 2011). Επομένως, 23

34 ο συνδυασμός των δύο μεθόδων μπορεί να παρέχει υψηλή ακρίβεια και αξιοπιστία στα αποτελέσματα. Τέλος, η τυποποίηση των νοσοκομειακών στελεχών με την MLST αποκάλυψε ότι στελέχη E. faecium υπεύθυνα επιδημιών παγκοσμίως ταξινομήθηκαν στον κλώνο C1 (Werner και συν., 2003a Bonora και συν., 2004 Coque και συν., 2005 Ko και συν., 2005 Lee και συν., 2006). Πρόσφατα, η ανάλυση MLST σε στελέχη E. faecium ζώων και ανθρώπων από διαφορετικές ηπείρους, ανακάλυψε την επιδημιολογική προέλευση επιδημικών στελεχών διακρίνοντας τα μέσα στον κλώνο C1 (Willems και συν., 2005). Ο ST17 είναι ο πρόγονος του κλώνου C1 και ως εκ τούτου μετονομάστηκε σε κλωνικό σύμπλεγμα-17 (clonal complex-17, CC17), που χαρακτηρίζεται από αντοχή στην αμπικιλλίνη και τις κινολόνες. Ο CC17 έχει αναγνωριστεί ως ο πληθυσμός των στελεχών E. faecium που έχει προσαρμοστεί στο νοσοκομείο και είναι υπεύθυνος για την πλειοψηφία των ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων που οφείλονται στο συγκεκριμένο είδος εντεροκόκκου. Για τη μελέτη της γενετικής συσχέτισης μεταξύ επιδημιολογικά μη συσχετιζόμενων E. faecium ανθεκτικών στη βανκομυκίνη (vancomycin-resistant E. faecium, VREF), επίσης έχει εφαρμοστεί ο πολυμορφισμός μήκους θραυσμάτων εξ ενίσχυσης (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP) (Willems και συν., 2000). Με αυτή την τεχνική, συγκεκριμένες γενοτυπικές ομάδες στελεχών E. faecium βρέθηκε να σχετίζονται με συγκεκριμένους ξενιστές όπως χοίρους, μόσχους, πουλερικά και ανθρώπους. Επίσης βρέθηκε ότι στελέχη VREF απομονωμένα από κόπρανα μη νοσηλευόμενων υγιών ατόμων είχαν γενετικές διαφορές με στελέχη νοσηλευομένων ασθενών απομονωμένων από κόπρανα ή κλινικά δείγματα. Τέτοιες διαφορές βρέθηκαν και μεταξύ στελεχών E. faecium ευαίσθητων στη βανκομυκίνη προερχομένων από διαφορετικές πηγές (Bruinsma και συν., 2002). Η ομαδοποίηση αυτή των νοσοκομειακών VREF, σε ένα κλώνο και ξεχωριστά από τα μη νοσοκομειακά στελέχη VREF, ήταν μάλλον μη αναμενόμενη, καθώς τα στελέχη αυτά προέρχονταν από διαφορετικές χώρες και διαφορετικές ηπείρους. Η AFLP επέδειξε παρόμοια διαχωριστική ικανότητα με τη PFGE στο διαχωρισμό νοσοκομειακών στελεχών E. faecium ανθεκτικών στην αμπικιλλίνη (Jureen και συν., 2004). Παρόλο που η AFLP θεωρήθηκε μια αξιόπιστη και γρήγορη μέθοδος επιδημιολογικής συσχέτισης των εντεροκόκκων, απεδείχθει ακατάλληλη για την ανταλλαγή δεδομένων μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων, όπως και για τη μελέτη σε παγκόσμιο επίπεδο της επιδημιολογίας των εντεροκόκκων. Η MLST επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της AFLP στην ταξινόμηση των στελεχών E. faecium ανάλογα με τον ξενιστή τους (Homan και συν., 2002). 24

35 Η ανάγκη για γρήγορη τυποποίηση των εντεροκόκκων που εμπλέκονται σε νοσοκομειακές λοιμώξεις με σκοπό την ανάληψη μέτρων ελέγχου των λοιμώξεων στα νοσοκομεία, δημιούργησε την ανάπτυξη μιας άλλης τεχνικής, την πολυτοπική ανάλυση μεταβλητού αριθμού τυχαίων επαναλήψεων [multiple-locus variable-number tandem repeat (VNTR) analysis (Multi-Locus Variable Analysis, MLVA)] παρόμοιας διαφοροποιητικής ικανότητας με τη MLST (Top και συν., 2004) 2 ΑΝΤΟΧΗ ΤΩΝ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ ΣΤΑ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ Οι εντερόκοκκοι εμφανίζουν αντοχή σε ένα μεγάλο εύρος αντιμικροβιακών ουσιών. Η αντοχή των εντεροκόκκων μπορεί να ταξινομηθεί σε εγγενή και επίκτητη (Πίνακας 2.1). Η εγγενής οφείλεται είτε στην έλλειψη του στόχου-υποδοχέα της αντιμικροβιακής ουσίας ή στην ανεπαρκή διέλευση της ουσίας στο ενδοκυτταρικό περιβάλλον-στόχο. Η εγγενής αντοχή σχετίζεται με χαρακτηριστικά που είναι παρόντα σε όλους ή τους περισσότερους εντερόκοκκους, ή με συγκεκριμένους μηχανισμούς αντοχής που σχετίζονται με ένα είδος ή μια ομάδα ειδών εντεροκόκκων (Πίνακας 2.1) (Teixeira και συν., 2007). Στην εγγενή αντοχή των εντεροκόκκων εμπλέκονται μεταξύ άλλων, δύο μεγάλες ομάδες αντιμικροβιακών ουσιών: οι αμινογλυκοσίδες και οι β-λακτάμες. Οι εντερόκοκκοι διαθέτουν ειδικές πενικιλλινοδεσμευτικές πρωτεΐνες (penicillin binding proteins, PBPs), τις PBP5, οι οποίες έχουν χαμηλή συγγένεια με τις β-λακτάμες. Επιπλέον, συνέπεια της χαμηλής διαπερατότητας του κυτταρικού τους τοιχώματος στις αμινογλυκοσίδες, αυτές δεν μπορούν να φτάσουν στο στόχο τους. Ωστόσο ο συνδυασμός αμινογλυκοσιδών και αναστολέων της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος, (π.χ. οι β-λακτάμες και τα γλυκοπεπτίδια) έχουν συνεργική δράση έναντι των εντεροκόκκων. Λόγω της ελαττωμένης δραστικότητας αρκετών αντιμικροβιακών ουσιών ως αποτέλεσμα της εγγενούς αντοχής, η συνιστώμενη θεραπεία των σοβαρών λοιμώξεων (π.χ ενδοκαρδίτιδα, μηνιγγίτιδα και άλλων συστημικών λοιμώξεων, ειδικά σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς) περιλαμβάνει έναν αναστολέα της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος, όπως οι β-λακτάμες (πενικιλλίνη) και τα γλυκοπεπτίδια, σε συνδυασμό με μία αμινογλυκοσίδη (γενταμυκίνη ή στρεπτομυκίνη). Αυτοί οι συνδυασμοί υπερπηδούν την εγγενή αντοχή που εμφανίζουν οι εντερόκοκκοι και επομένως επιτυγχάνεται συνεργική βακτηριοκτόνος δράση. Ωστόσο, η επίδραση της συνέργειας μεταξύ αμινογλυκοσιδών και β- λακτάμων ή γλυκοπεπτιδίων εξαφανίζεται εάν υπάρχει υψηλού επιπέδου αντοχή σε κάποια από τις παραπάνω ομάδες αντιβιοτικών. 25

36 Οι εντερόκοκκοι αποτελούν συχνή αιτία νοσοκομειακών λοιμώξεων από τη δεκαετία του Αυτό συσχετίστηκε άμεσα με την αυξημένη χρήση κεφαλλοσπορινών 2 ης γενεάς στις οποίες οι εντερόκοκκοι εμφανίζουν εγγενή αντοχή (Cetinkaya και συν., 2000). Σήμερα, οι εντερόκοκκοι αποτελούν σοβαρά νοσοκομειακά παθογόνα βακτήρια, συνιστώντας το δεύτερο πιο συχνό αίτιο νοσοκομειακών λοιμώξεων της ουροδόχου κύστης και τραυμάτων και το τρίτο συχνότερο αίτιο νοσοκομειακής βακτηριαιμίας στις Η.Π.Α. (Hidron και συν., 2008). Μέχρι πρόσφατα, η βανκομυκίνη, και ο συνδυασμός αμπικιλλίνης και αμινογλυκοσιδών ήταν παραδοσιακά τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα φάρμακα για τη θεραπεία των λοιμώξεων από πολυάντοχους εντερόκοκκους (Arias και συν., 2010). Μία από τις σημαντικότερες αιτίες της επιβίωσης των εντεροκόκκων στο περιβάλλον των νοσοκομείων, αποτελεί η πέραν της εγγενούς αντοχής, ικανότητά τους να αποκτούν αντοχή σε πολλά ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιμικροβιακά. Η εμφάνιση επίκτητης αντοχής ποικίλλει, προκύπτοντας είτε από μετάλλαξη στο DNA είτε από απόκτηση νέων γενετικών καθοριστών (γονιδίων) που εντοπίζονται σε πλασμίδια ή τρανσποζόνια (Leclercq 1997 Huycke και συν., 1998 Murray 1998). Οι εντερόκοκκοι έχουν αποκτήσει διάφορους γενετικούς καθοριστές που προσδίδουν αντοχή σε αρκετές κλάσεις αντιμικροβιακών ουσιών όπως, οι β-λακτάμες, οι αμινογλυκοσίδες, τα γλυκοπεπτίδια, οι κινολόνες, η χλωραμφενικόλη, τα μακρολίδια, οι λινκοσαμίδες και στρεπτογραμμίνες και οι τετρακυκλίνες. Ιδιαίτερα τις τελευταίες δεκαετίες, έχει σημειωθεί αυξημένη εμφάνιση επίκτητης υψηλού επιπέδου αντοχής σε αμινογλυκοσίδες (High-Level Resistance, HLR) και β-λακτάμες και αντοχής σε γλυκοπεπτίδια (ειδικά στη βανκομυκίνη) καθώς αυτές οι αντιμικροβιακές ουσίες χρησιμοποιούνται ευρύτατα στην κλινική πράξη για την αντιμετώπιση λοιμώξεων από πολυάντοχα στελέχη (Kak και Chow, 2002 Fisher και Phillips, 2009 Arias και συν., 2010). 26

37 Πίνακας 2.1. Τύποι και μηχανισμοί αντοχής των εντεροκόκκων έναντι αντιμικροβιακών ουσιών α Εγγενής αντοχή Είδος Μηχανισμός αντοχής β-λακτάμες Όλοι οι Χαμηλής συγγένειας πενικιλλινοδεσμευτικές Πενικιλλίνες ανθεκτικές στην πενικιλλινάση (χαμηλού επιπέδου) Καρβαπενέμες (μετρίου επιπέδου) Κεφαλοσπορίνες (υψηλού επιπέδου) Αμινογλυκοσίδες (χαμηλού εντερόκοκκοι Όλοι οι πρωτεΐνες (PBPs) Χαμηλή απορρόφηση επιπέδου) εντερόκοκκοι Αμινογλυκοσίδες (μετρίου επιπέδου) E. faecium Παραγωγή χρωμοσωμικού Λινκοσαμίδες και Στρεπτογραμίνες Α E. faecalis, E. avium, E. gallinarum, E. casseliflavus ενζύμου AAC(6 )-Ii 1 Πιθανολογούμενη εκροή (εξώθηση), χαμηλή απορρόφηση και διαπερατότητα Φθοριοκινολόνες E. faecalis 2 Χαμηλή διαπερατότητα και απορρόφηση, αναερόβιο περιβάλλον Τριμεθοπρίμη-σουλφαμεθοξαζόλη E. faecalis In vivo αντοχή λόγω χρήσης Γλυκοπεπτίδια (VanC) Επίκτητη αντιβιοαντοχή β-λακτάμες [Πενικιλλίνη, Αμπικιλλίνη (υψηλού επιπέδου)] Αμινογλυκοσίδες (υψηλού επιπέδου) E. gallinarum, E. casseliflavus E. faecium, E. faecαlis, E. hirae, E. raffinosus Κυρίως E. faecium και E. faecαlis, Σπανιότερα, E. gallinarum και E. casseliflavus εξωγενούς φυλλικού οξέος Παραγωγή πρόδρομης πεπτιδογλυκάνης με D-Ala-D-Ser άκρο Υπερπαραγωγή ή μεταβολή της PBP5 παραγωγή β-λακταμασών Παραγωγή ενζύμων αδρανοποιητικών των αμινογλυκοσιδών 3 AAC(6 )-Ie + APH (2 )-Ia AAC(6 )-Ii, APH(2 )-Ib, APH(2 )-Ic, APH(2 )-Id, APH(3 )-IIIa, ANT (3 )-Ia, ANT (4 )-Ia, ANT (6 )-Ia Μεταβολή του στόχου (μειωμένη συνδεσιμότητα με το ριβόσωμα) 27

38 Γλυκοπεπτίδια [βανκομυκίνη, τεϊκοπλανίνη) VanA, VanB, VanD, VanE, VanG, VanL, VanM, VanN Φθοροκινολόνες Χλωραμφενικόλη Μακρολίδια (Ερυθρομυκίνη) Λινκοσαμίδες (Κλινδαμυκίνη) Στρεπτογραμμίνες Β Τετρακυκλίνες Κυρίως E. faecium και E. faecαlis E. faecium, E. faecαlis E. faecium, E. faecαlis Πολλά είδη εντεροκόκκων E. faecium, Μεταβολή του στόχου (τροποποίηση του μηχανισμού βιοσύνθεσης πεπτιδογλυκάνης) Μεταβολή του στόχου (αλλαγές στην υπομονάδα Α της DNA γυράσης και Τοποϊσομεράσης IV) Παραγωγή ακετυλ-τρανσφεράσης της χλωραμφενικόλης Παραγωγή μεθυλιωτικών ενζύμων Τροποποίηση της ριβοσωμικής E. faecαlis πρωτεϊνης Οξαζολιδόνες (λινεζολίδη) E. faecium Μετάλλαξη στο γονίδιο του 23S rrna Ριφαμπικίνη Φουσιδικό οξύ Νιτροφουραντοϊνη 1 AAC:αμινογλυκοσίδη-ακετυλοτρανσφεράση, αντοχή σε τομπραμυκίνη, καναμυκίνη, νετιλμυκίνη και ντιμπεκασίνη. 2 Όλοι οι εντερόκοκκοι μπορεί να είναι ανθεκτικοί στις φθοριοκινολόνες σε αναερόβιο περιβάλλον λόγω αδρανοποίησης της βακτηριοκτόνου δράσης τους. 3 APH: αμινογλυκοσίδη-φωσφοτρασφεράση, αντοχή σε γενταμυκίνη, τομπραμυκίνη, νετιλμυκίνη, νεομυκίνη, καναμυκίνη, αμικασίνη, ντιμπεκασίνη. ANT: αμινογλυκοσίδηνουκλεοτιδυλτρανσφεράση, αντοχή σε στρεπτομυκίνη, τομπραμυκίνη, αμικασίνη, καναμυκίνη, ντιμπεκασίνη. α Πηγή: Facklam και συν., 2002 Tannock και Cook, 2002 Klare και συν., 2003 Top και συν., 2008a Η βανκομυκίνη χρησιμοποιήθηκε στην κλινική πράξη για περισσότερο από 30 χρόνια χωρίς την εμφάνιση χαρακτηριστικής αντοχής. Η τεϊκοπλανίνη είναι ένα άλλο γλυκοπεπτίδιο, το οποίο χρησιμοποιείται στην Ευρώπη, αλλά όχι στις ΗΠΑ. Λόγω της δραστικότητάς τους έναντι των ανθεκτικών στη μεθικιλλίνη σταφυλοκόκκων (methicillinresistant S. aureus, MRSA) και άλλων Gram θετικών βακτηρίων, τα γλυκοπεπτίδια έχουν ευρύτατα χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία λοιμώξεων που προκαλούνται από αυτούς τους μικροοργανισμούς (Gold και Moellering, 1996). Η χορήγηση της βανκομυκίνης per os, χρησιμοποιήθηκε ευρέως για τη θεραπεία εντεροκολίτιδας οφειλομένης στο Clostridium difficile (Cetinkaya και συν., 2000). Μετά τις πρώτες αναφορές για την απομόνωση 28

39 ανθεκτικών στην βανκομυκίνη στελεχών E. faecalis και E. faecium, σε Αγγλία και Γαλλία το 1988, (Leclercq και συν., 1988 Uttley και συν., 1988), παρόμοιες αναφορές δημοσιεύθηκαν που αφορούσαν νοσοκομεία στις ΗΠΑ (Frieden και συν., 1993). Από τότε, ανθεκτικοί στη βανκομυκίνη εντερόκοκκοι (Vancomycin Resistant Enterococci,VRE) εξαπλώθηκαν με απροσδόκητη ταχύτητα, λόγω της εκτεταμένης χρήσης βανκομυκίνης στην κλινική πράξη, και πλέον συναντώνται στις περισσότερες χώρες (Werner και συν., 2008a). Οι εντερόκοκκοι είναι οι δεύτεροι ή τρίτοι σε συχνότητα μικροοργανισμοί που απομονώνονται από ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις ιδιαίτερα σε βαριά πάσχοντες ασθενείς που έχουν νοσηλευθεί για μεγάλο χρονικό διάστημα και/ή έχουν λάβει πολλά αντιμικροβιακά (Malani και συν., 2002). Παρόλο που μέχρι σήμερα, 38 είδη εντεροκόκκων έχουν ταυτοποιηθεί (βλ. κεφ 1.2), μόνο δύο, όπως προαναφέρθηκε, είναι υπεύθυνα για την πλειοψηφία των λοιμώξεων σε ανθρώπους, τα είδη E. faecalis και E. faecium. Μέχρι την πρώτη εμφάνιση της αντοχής στη βανκομυκίνη, το είδος E. faecalis επικρατούσε μεταξύ των εντεροκόκκων που ήταν υπεύθυνοι για κλινικές λοιμώξεις, όπως βακτηριαιμία, ενδοκαρδίτιδα, λοιμώξεις ουροποιητικού και χειρουργικών τραυμάτων, συνιστώντας το 80% με 90% των κλινικών περιστατικών, ενώ το είδος E. faecium μόλις το 10% (Patterson και συν., 1995 Low και συν., 2001). Ωστόσο, η αναλογία αυτή άλλαξε υπέρ του E. faecium στα τέλη της δεκαετίας του 1990 στις ΗΠΑ (Treitman και συν., 2005) και στα μέσα της δεκαετίας στην Ευρώπη (Simonsen και συν., 2003 Thouverez και Talon 2004 Klare και συν., 2005), με αποτέλεσμα σήμερα να αποτελούν το 40% των νοσοκομειακών εντεροκοκκικών λοιμώξεων (Willems and van Schaik 2009). Άλλα είδη εντεροκόκκων, όπως E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans, E. avium και E. raffinosus, απομονώνονται σπανιότερα σε ποσοστά μικρότερα του 5% των κλινικών περιστατικών (Gordon και συν., 1992 Moellering 1992 Patterson και συν., 1995 Reid και συν., 2001). Η παρουσία VRE σε έναν ασθενή αυξάνει την πιθανότητα αποτυχίας στη θεραπεία κατά 20% και τη θνητότητα από 27% σε 52% σε σχέση με ένα ευαίσθητο στέλεχος (Brown και συν., 2006). Ένα γλυκοπεπτίδιο, η αβοπαρκίνη, χρησιμοποιούνταν στην Ευρώπη στα παραγωγικά ζώα και τα πτηνά ως αυξητικός παράγοντας. Ωστόσο, το 1995, η χρήση της αβοπαρκίνης απαγορεύτηκε στη Δανία εξαιτίας εμφάνισης επιλογής VRE στα ζώα και της ανησυχίας για τον κίνδυνο εξάπλωσης της αντοχής, μέσω της τροφικής αλυσίδας στον άνθρωπο (Aarestrup και συν., 2002). Αυτή η απαγόρευση ακολουθήθηκε από συνολική απαγόρευση της αβοπαρκίνης σε όλη την Ευρωπαϊκή Ένωση (ΕΕ) το

40 Εντερόκοκκοι ανθεκτικοί σε αντιμικροβιακές ουσίες απαντώνται και στα τρόφιμα και συγκεκριμένα σε προϊόντα κρέατος, γάλακτος και έτοιμα προς κατανάλωση τρόφιμα ακόμα και σε στελέχη που χρησιμοποιούνται ως προβιοτικά (Franz και συν., 2001 Giraffa, 2002). Τα στελέχη αυτά, και ειδικά τα VRE στελέχη μπορούν να παίζουν σημαντικό ρόλο ως φυσική δεξαμενή ανθεκτικών χαρακτηριστικών για την εξάπλωσή τους στο περιβάλλον (Foulquie Moreno και συν., 2006). Οι νοσηλευόμενοι άνθρωποι θα μπορούσαν επίσης, μέσω της τροφής να μολυνθούν. Η παρουσία VRE σε μη νοσηλευόμενους ανθρώπους που δεν έχουν κάνει χρήση αντιμικροβιακών, δείχνει ότι οι VRE μπορεί να έχουν αποκτηθεί μέσω της τροφικής αλυσίδας προερχόμενοι από τα ζώα (Mannu και συν., 2003). 2.1 Αντοχή στις β-λακτάμες Η χαμηλή ή υψηλή αντοχή στις β-λακτάμες είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του γένους Enterococcus. O E. faecalis είναι φορές λιγότερο ευαίσθητος στην πενικιλλίνη απ ότι οι στρεπτόκοκκοι, ενώ ο E. faecium είναι τουλάχιστον 4-16 φορές λιγότερο ευαίσθητος από τον E. faecalis (Murray, 1990). Ο κυριότερος μηχανισμός αυτής της εγγενούς αντοχής είναι η παραγωγή χαμηλής χημικής συγγένειας πρωτεϊνών δέσμευσης πενικιλλινών (PBPs) (Kak και Chow, 2002). Τα επίπεδα αντοχής διαφέρουν ανάλογα με την ουσία. Γενικά, οι πενικιλλίνες (αμπικιλλίνη) έχουν τη μεγαλύτερη δραστικότητα, οι καρβαπενέμες μικρότερη, ενώ οι κεφαλλοσπορίνες τη χαμηλότερη (Πίνακας 2.1) (Kak και Chow, 2002). Η αντοχή στις β-λακτάμες είναι ανάλογη της ποσότητας της παραγόμενης PBP5 (μιας ειδικής PBP) και εμφανίζεται κυρίως σε κλινικά στελέχη E. faecium (Murray, 2000). Οφείλεται είτε σε τροποποίηση στην PBP5 με συνέπεια την ακόμα χαμηλότερη ικανότητα σύνδεσης με την αμπικιλλίνη (Rybkine και συν., 1998) είτε σε υπερπαραγωγή PBP5 (Zorzi και συν., 1996). Αν και σπάνια, η αντοχή στις β-λακτάμες στο είδος E. faecalis οφείλεται συνήθως στην παραγωγή β-λακταμασών και είναι σταθερής έκφρασης και χαμηλού επιπέδου (Murray, 1992). Επιπρόσθετα, ένας άλλος μηχανισμός αντοχής στην αμπικιλλίνη και την ιμιπενέμη έχει αναφερθεί σε στελέχη E. faecalis οφειλόμενος σε μεταλλάξεις στο γονίδιο pbp4 (Ono και συν., 2005) 2.2 Αντοχή στις αμινογλυκοσίδες Στους εντερόκοκκους έχουν αναφερθεί 2 τύποι αντοχής στη στρεπτομυκίνη: (α) χαμηλή έως μέτρια αντοχή (MIC, μg/ml), η οποία είναι εγγενής και οφείλεται, 30

41 κυρίως, σε χαμηλή διαπερατότητα του κυτταρικού τοιχώματος των εντεροκόκκων, η οποία μπορεί να αντιμετωπιστεί με μια πενικιλλίνη (η οποία αυξάνει την πρόσληψη της αμινογλυκοσίδης), και (β) υψηλή αντοχή (MIC 2000 μg/ml), η οποία είναι επίκτητη και οφείλεται είτε στην παραγωγή ενζύμων αδρανοποιητικών των αμινογλυκοσιδών είτε σε μειωμένη συνδεσιμότητα με το ριβόσωμα (Πίνακας 2.1). Η αντοχή στη γενταμυκίνη οφείλεται κυρίως στην παρουσία του αδρανοποιητικού ενζύμου 2 -φωσφοτρανσφεράση-6 - ακετυλοτρανσφεράση (APH) που επιφέρει αντοχή πέραν της γενταμυκίνης, στην τομπραμυκίνη, τη νετιλμυκίνη, την αμικασίνη και την καναμυκίνη. Η αντοχή στη στρεπτομυκίνη συναντάται κυρίως σε στελέχη εντεροκόκκων που παράγουν αδενυλτρανσφεράση της στρεπτομυκίνης (ANT) και που παραμένουν ευαίσθητα στη γενταμυκίνη (Facklam και συν., 2002). Συνέργεια μεταξύ πενικιλλίνης και αμινογλυκοσίδης δεν παρατηρείται σε εντερόκοκκους με υψηλή αντοχή σε αμινογλυκοσίδες (MIC στρεπτομυκίνης 2000 μg/ml, MIC γενταμυκίνης 500 μg/ml). 2.3 Αντοχή στη βανκομυκίνη Μηχανισμοί αντοχής στη βανκομυκίνη Η διαδικασία σύνθεσης της πεπτιδογλυκάνης για την παραγωγή του κυτταρικού τοιχώματος των εντεροκόκκων, περιλαμβάνει διάφορα στάδια. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, το ένζυμο ρασεμάση μετατρέπει την L-αλανίνη σε D-αλανίνη (D-Ala). Εν συνεχεία, δύο μόρια D-αλανίνης, ενώνονται με τη βοήθεια του ενζύμου μιας λιγάσης για να σχηματίσουν το διπεπτίδιο D-Ala-D-Ala, το οποίο προστίθεται στο UDP-N-ακετυλμουραμιλ-τριπεπτίδιο, για να σχηματίσουν UDP-N-ακετυλμουραμιλ-πενταπεπτίδιο. Το UDP-N-ακετυλμουραμιλπενταπεπτίδιο δεσμεύεται από ένα λιπίδιο-μεταφορέα, που επιτρέπει τη μετατόπιση των πρόδρομων μορίων στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης, και στη συνέχεια ενσωματώνεται στην αναπτυσσόμενη πεπτιδογλυκάνη με τρανσγλυκοσυλίωση και επιτρέπει το σχηματισμό διασταυρούμενων γεφυρών (τρανσπεπτιδίωση) συνεισφέροντας στην ενίσχυση του τοιχώματος πεπτιδογλυκάνης των εντεροκόκκων (Courvalin, 2006). Η βανκομυκίνη συνδέεται ισχυρά στο D-Ala-D-Ala C-άκρο του πρόδρομου πενταπεπτιδίου, παρεμποδίζοντας την προσθήκη του στην αναπτυσσόμενη αλυσίδα της πεπτιδογλυκάνης και το σχηματισμό διασταυρούμενων γεφυρών για το σχηματισμό του κυτταρικού τοιχώματος (Εικόνα 2.1) (Depardieu και συν., 2007). Επειδή η βανκομυκίνη δεν αλληλεπιδρά με ένζυμα 31

42 του κυτταρικού τοιχώματος, αλλά σχηματίζει συμπλέγματα με τα πρόδρομα μόρια της πεπτιδογλυκάνης, η δραστικότητά της δεν καθορίζεται από τη χημική συγγένεια με ένζυμοστόχο, αλλά από την εξειδίκευση του υποστρώματος των ενζύμων που καθορίζουν τη δομή των πρόδρομων μορίων της πεπτιδογλυκάνης. Η αντοχή στη βανκομυκίνη οφείλεται στην παρουσία οπερονίων που κωδικοποιούν ένζυμα για τη σύνθεση πρόδρομων μορίων χαμηλής συγγένειας, στα οποία το D-Ala άκρο αντικαθίσταται από D-γαλακτικό (D-Lac) ή D-σερίνη (D-Ser), τροποποιώντας έτσι το στόχο δέσμευσης της βανκομυκίνης (Courvalin, 2006). Εικόνα 2.1. Βιοσύνθεση της πεπτιδογλυκάνης και μηχανισμός δράσης της βανκομυκίνης. Η δέσμευση της βανκομυκίνης στο D-Ala-D-Ala C-άκρο των πρόδρομων μορίων της πεπτιδογλυκάνης εμποδίζει τις αντιδράσεις που καταλύονται από τις τρανσγλυκοσυλάσες, τρανσπεπτιδάσες και τις D,D-καρβοξυπεπτιδάσες. Ddl: D-Ala-D-Ala λιγάση, Murf: πρωτεΐνη συνθετάση, UDP: διφωσφορική ουρακίλη. Πηγή: Courvalin, Τύποι αντοχής στη βανκομυκίνη Στους εντερόκοκκους έχουν αναγνωριστεί 9 φαινότυποι και γενότυποι αντοχής στη βανκομυκίνη: VanA, VanB, VanC, VanD, VanE, VanG, VanL, VanM και VanN (Πίνακας 2.2) (Arthur και Courvalin, 1993 Perichon και συν., 1997 Fines και συν., 1999 Courvalin 2006 Werner και συν., 2008a Xu και συν., 2010 Lebreton και συν., 2011). Οκτώ από 32

43 αυτούς (VanA, B, D, E, G, L, M και N) αντιστοιχούν σε επίκτητη αντοχή, ενώ ένας, ο VanC, απαντά εγγενώς στα είδη E. gallinarum και E. casseliflavus-e. flavescens. Οι φαινότυποι VanA και VanB αρχικά περιγράφηκαν στα είδη E. faecium και E. faecalis. Τα στελέχη με φαινότυπο VanA, εμφανίζουν επίκτητη υψηλή αντοχή στη βανκομυκίνη (MIC 64 μg/ml) και στην τεϊκοπλανίνη (MIC 16 μg/ml) (Πίνακας 2.2) (Werner και συν., 2008a). Πέραν της αντοχής έναντι των γλυκοπεπτιδίων (βανκομυκίνη, τεϊκοπλανίνη, αβοπαρκίνη και ριστοσετίνη), η αντοχή προκαλείται και έναντι μη γλυκοπεπτιδικών παραγόντων, όπως η βακιτρακίνη, η πολυμιξίνη Β και η ρομπενιδίνη (Lai και Kirsch, 1996). Ο φαινότυπος VanA οφείλεται στην παρουσία του γονιδίου vana που εντοπίζεται στο μεταφερόνιο (transposon) Tn1546 (Arthur και Courvalin, 1993 Arthur και συν., 1993). Ο φαινότυπος VanB χαρακτηρίζεται από επίπεδα αντοχής στη βανκομυκίνη που κυμαίνονται μεταξύ 4 και 1000 μg/ml και από ευαισθησία στην τεϊκοπλανίνη. Οι γενετικοί καθοριστές του φαινοτύπου VanB (vanb1-3 γονίδια), εντοπίζονται σε μεγάλα κινητά γενετικά τμήματα τα οποία μεταφέρονται από ένα στέλεχος εντεροκόκκου σε ένα άλλο (Quntilliani και συν., 1993 Quntilliani και Courvalin, 1994). Ο φαινότυπος VanC εμφανίζεται στα είδη E. gallinarum και E. casseliflavus, και χαρακτηρίζεται από εγγενή, χαμηλού επιπέδου αντοχή στη βανκομυκίνη (MIC = 2-32 μg/ml) και από ευαισθησία στην τεϊκοπλανίνη. Υπάρχουν ορισμένοι περιορισμοί αυτής της ταξινόμησης. Για παράδειγμα, το γονίδιο vana έχει εμφανιστεί, όπως στο είδος E. gallinarum, και σε άλλα είδη εντεροκόκκων (Dutka-Malen και συν., 1994). Επιπρόσθετα, στελέχη που φέρουν το γονίδιο vanb, μπορεί να εμφανίσουν αντοχή στην τεϊκοπλανίνη και επομένως να παρουσιάζουν φαινότυπο VanA (Slaughter και συν., 1996). Η ταξινόμηση της αντοχής στα γλυκοπεπτίδια στηρίζεται στην αλληλουχία του γονιδίου της λιγάσης παρά στα επίπεδα της αντοχής στα γλυκοπεπτίδια, επειδή τα όρια της MIC στη βανκομυκίνη και στην τεϊκοπλανίνη δεν είναι σαφώς διαχωρισμένα στους διάφορους τύπους αντοχής. Εννέα οπερόνια αντοχής έχουν αναγνωριστεί στους εντερόκοκκους σύμφωνα με το γονίδιο που κωδικοποιεί την D-alanyl-D-lactate (D-Ala-D- Lac) λιγάση (vana, vanb, vand και vanm) ή την D-alanyl-D-serine (D-Ala-D-Ser) λιγάση (vanc, vane, vang, vanl και vann) (Boyd και συν., 2006 Depardieu και συν., 2007 Xu και συν., 2010 Lebreton και συν., 2011). Η παραγωγή πρόδρομων ουσιών πεπτιδογλυκάνης με κατάληξη D-Ala-D-Lac και D-Ala-D-Ser σε συνδυασμό με τον περιορισμό της παραγωγής πρόδρομων ουσιών με D-Ala-D-Ala άκρο, είναι υπεύθυνα για την αντοχή. Αυτή η αντικατάσταση οδηγεί σε μειωμένη ικανότητα δέσμευσης των γλυκοπεπτιδίων με το στόχο τους (1000 φορές μικρότερη και 7 φορές μικρότερη για τις D-Ala-D-Lac και D-Ala-D-Ser 33

44 πρόδρομες ουσίες πεπτιδογλυκάνης, αντίστοιχα) (Arthur και συν., 1996). Τα vana και vanm οπερόνια είναι υπεύθυνα για την υψηλού επιπέδου αντοχή, τα vand οπερόνια για τη μετρίου επιπέδου αντοχή, αντίστοιχα, και στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη, ενώ τα vanb οπερόνια για διάφορα επίπεδα αντοχής αποκλειστικά στη βανκομυκίνη μόνο. Αντίθετα, τα D- Ala-D-Ser οπερόνια είναι υπεύθυνα για χαμηλού επιπέδου αντοχή στη βανκομυκίνη, ενώ η τεϊκοπλανίνη διατηρεί τη δραστικότητά της (Courvalin, 2006). Τρεις πρωτεΐνες, λιγάση, δεϋδρογενάση (για τον D-Ala-D-Lac τύπο) ή σερίνη ρασεμάση (D-Ala-D-Ser τύπο) και D,Dδιπεπτιδάση απαιτούνται για την έκφραση της αντοχής (Depardieu και συν., 2007). Τα οπερόνια κωδικοποιούν επιπρόσθετες πρωτεΐνες, όπως D,D-καρβοξυπεπτιδάσες και ρυθμιστικές πρωτεΐνες, ως μέρη του ρυθμιστικού συστήματος αντοχής. Τα VanA τύπου αντοχής στελέχη εμφανίζουν υψηλά επίπεδα επαγώγιμης αντοχής στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη, ενώ τα στελέχη με VanB τύπο εμφανίζουν ποικίλα επίπεδα επαγώγιμης αντοχής αποκλειστικά στη βανκομυκίνη (Courvalin, 2006). Τα VanD τύπου αντοχής στελέχη χαρακτηρίζονται από σταθερής έκφρασης αντοχής σε μέτρια επίπεδα και στα 2 γλυκοπεπτίδια (Depardieu και συν., 2004a). Τα στελέχη με VanC, VanE και VanG τύπο παρουσιάζουν αντοχή σε χαμηλά επίπεδα βανκομυκίνης αλλά παραμένουν ευαίσθητα στην τεϊκοπλανίνη (Reynolds και Courvalin, 2005). Παρόλο που και οι 9 τύποι αντοχής εμπλέκουν συσχετιζόμενες ενζυματικές λειτουργίες, διαφοροποιούνται από την εντόπιση των αντίστοιχων γονιδίων και από τον τρόπο ρύθμισης της έκφρασής τους. Τα vana, vanb και vanm οπερόνια εντοπίζονται σε πλασμίδια ή στο χρωμόσωμα (vanb), ενώ τα vanc, vand, vane, vang, vanl και vann έχουν, έως τώρα μόνο χρωμοσωμική εντόπιση (Werner και συν., 2008a Cattoir και Leclercq, 2010 Xu και συν., 2010 Lebreton και συν., 2011). Οι VanG και VanN είναι οι μόνοι μεταβιβάσιμοι D-Ala-D-Ser τύποι αντοχής (Depardieu και συν., 2003 Lebreton και συν., 2011). Πίνακας 2.2. Τύποι αντοχής των εντεροκόκκων στη βανκομυκίνη Αντοχή Επίκτητη Εγγενής Επίπεδο Υψηλή Ποικίλη Ενδιάμεση Χαμηλή Χαμηλή Τύπος VanA VanM VanB VanD VanE VanG VanL VanN VanC1/C2/C3 Γονίδιο vana vanm vanb 1 vand 1 vane vang 2 vanl vann vanc Βανκομυκίνη MIC (mg/l) > Τεϊκοπλανίνη , ,5 0,5 S 3 0,5 0,5 1 34

45 Αντοχή Επίκτητη Εγγενής Επίπεδο Υψηλή Ποικίλη Ενδιάμεση Χαμηλή Χαμηλή Τύπος VanA VanM VanB VanD VanE VanG VanL VanN VanC1/C2/C3 Μεταβιβασιμότητα με σύζευξη Κινητό Γενετικό Στοιχείο Tn1546 Tn1547 Tn1549 Tn E. faecium E. faecium E. faecium E. faecium E. faecalis E faecium E.gallinarum E. faecalis E. faecalis E. faecalis E.casseliflavus E. gallinarum 4 S. bovis (E. flavescens) E.casseliflavus 1 Είδη E. avium E. durans E. mundtii E. raffinosus S. aureus Έκφραση Επαγώγιμη Επαγώγιμη Σταθερή Επαγώγιμη Σταθερή Σταθερή, Επαγώγιμη Εντοπισμός Πλασμίδιο/Χρωμόσωμα Χρωμόσωμα Χρωμόσωμα Χρωμόσωμα( ) Χρωμόσωμα Χρωμόσωμα Τροποποιημένος Στόχος D-Ala-D-Lac D-Ala-D-Ser 1 Υπάρχουν περισσότεροι του ενός υπότυποι των γονιδίων (vanb1-3, vand1-5, vang1-2) 2 Έχουν παρατηρηθεί στελέχη που φέρουν γενότυπο vana αλλά παρουσιάζουν ευαισθησία ή μέτρια επίπεδα αντοχής στην τεϊκοπλανίνη (MIC 2-8 μg/ml). 3 S:Ευαίσθητο (Sensitive). 4 Απόκτηση του vana ή του vanb επιπλέον των γονιδίων vanc1 ή vanc2/3, παρατηρείται σπανίως. Πηγή: Eom και συν., 2004 Werner και συν., 2008a Cattoir και Leclercq, VanA τύπος O φαινότυπος VanA είναι ο πιο συχνός τύπος αντοχής των εντεροκόκκων στα γλυκοπεπτίδια. Το vana οπερόνιο που περιλαμβάνει το vana γονίδιο και τα άλλα γονίδια που εμπλέκονται στην ρύθμιση και έκφραση της αντοχής στη βανκομυκίνη (vanr, vans, vanh, vanx και vanz) εντοπίζεται στο μεταφερόνιο (transposon) Τn1546 μεγέθους ζευγών βάσεων, το οποίο αρχικά ανιχνεύθηκε σε πλασμίδιο κλινικού στελέχους E. faecium (Arthur 35

46 και συν., 1993). Το οπερόνιο αυτό κωδικοποιεί συνολικά, 9 πολυπεπτίδια τα οποία μπορεί να ομαδοποιηθούν σε διάφορες λειτουργικές ομάδες: ενδομετάθεση (ORF1, ORF2), ρύθμιση της έκφρασης της αντοχής (VanR, VanS), σύνθεση του D-Ala-D-Ala διπεπτιδίου (VanH, VanA), υδρόλυση των πρόδρομων μορίων πεπτιδογλυκάνης (VanX, VanY) και ρύθμιση της αντοχής στην τεϊκοπλανίνη (VanZ) (Courvalin, 2006). Η έκφραση όλων αυτών των γονιδίων έχει σαν αποτέλεσμα τη σύνθεση μη φυσιολογικών πρόδρομων μορίων πεπτιδογλυκάνης που καταλήγουν σε D-Ala-D-Lac αντί σε D-Ala-D-Ala άκρο (Εικόνα 2.2α). Η βανκομυκίνη συνδέεται με το D-Ala-D-Lac με πολύ μικρότερη συγγένεια από ότι με το φυσιολογικό διπεπτίδιο (Bugg και συν., 1991). Ο κύριος μηχανισμός σύνθεσης του πενταπεπτιδίου που καταλήγει σε D-Ala-D-Lac έχει ως εξής: (α) Η πρωτεΐνη VanA είναι η λιγάση η οποία καταλύει το σχηματισμό εστερικού δεσμού μεταξύ D-Ala και D-Lac συντελώντας έτσι στην παραγωγή D-Ala-D-Lac κατά προτίμηση και δευτερευόντως D-Ala-D-Ala (Bugg και συν., 1991). Έτσι, το παραγόμενο διπεπτίδιο D-Ala-D-Lac αντικαθιστά το D-Ala-D-Ala διπεπτίδιο στη σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης, αντικατάσταση η οποία μειώνει σημαντικά τη χημική συγγένεια του μορίου με τα γλυκοπεπτίδια (β) Η VanH πρωτεϊνη είναι η υδροξυδεϋδρογενάση, η οποία δημιουργεί μια δεξαμενή από μόρια D-γαλακτικού (D-Lac) για χρήση στην παραπάνω αντίδραση (Reynolds και συν., 1994). (γ) Η VanX πρωτεϊνη είναι η D,-Dδιπεπτιδάση που, ενώ στερείται δράσης έναντι της D-Ala-D-Lac, υδρολύει τη D-Ala-D-Ala, που παράγεται από τη φυσική εντεροκοκκική λιγάση και επομένως ελαχιστοποιεί την ανταγωνιστική σύνθεση του φυσιολογικού πενταπεπτιδίου (Wu και συν., 1995). Το vana γονίδιο που κωδικοποιεί την VanA πρωτεΐνη, δεν μπορεί από μόνο του να επιφέρει αντοχή στη βανκομυκίνη, επειδή απαιτούνται τα D-υδροξυοξέα, όπως το D- γαλακτικό, που δεν παράγονται φυσιολογικά από τους εντερόκοκκους (Leclerq και Courvalin, 1997). Για την αντοχή απαραίτητα είναι και τα άλλα γενετικά στοιχεία του vana οπερονίου, όπως το vanh γονίδιο που κωδικοποιεί τη VanH πρωτεΐνη, υπεύθυνη για τη σύνθεση του D-γαλακτικού οξέος. 36

47 (α) Πενταπεπτίδιο Πενταπεπτίδιο (β) Εικόνα 2.2. VanA τύπος αντοχής στα γλυκοπεπτίδια. (α): Σύνθεση των πρόδρομων μορίων της πεπτιδογλυκάνης σε στέλεχος με VanA-τύπο αντοχής. Ddl: D-Ala-D-Ala λιγάση, Πέντα: L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Ala, Πενταπεπτίδιο: L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D- Lac, Τέτρα: L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala, Τρι: L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys. (β): Οργάνωση του vana οπερονίου. Τα λευκά βέλη αντιπροσωπεύουν γονίδια κωδικοποίησης και υποδεικνύουν την κατεύθυνση της μεταγραφής. Τα γονίδια της ρύθμισης και της αντοχής συμεταγράφονται από τους υποκινητές PR και PH, αντίστοιχα. Πηγή: Courvalin, 2006 Οι πρωτεΐνες VanR και VanS αποτελούν ένα σύστημα ρύθμισης της μεταγραφής της ομάδας γονιδίων vanhax (Arthur και συν., 1992). Η VanS δρα ως αισθητήρας της ανίχνευσης της παρουσίας βανκομυκίνης (Arthur και Courvalin, 1993 Arthur και συν., 1993) ή της πρώιμης επίδρασης της βανκομυκίνης στη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος (Sahm και συν., 1995). Η VanS ενεργοποιεί τη VanR, παρουσία βανκομυκίνης, που με τη σειρά της δρώντας ως κυτταροπλασματικός ενεργοποιητής της μεταγραφής, πυροδοτεί τη σύνθεση των άλλων πρωτεϊνών (VanH, VanA και VanX) που εμπλέκονται στην έκφραση της αντοχής. Σε στελέχη με φαινότυπο VanA, τόσο η βανκομυκίνη, όσο και η τεϊκοπλανίνη μπορεί να προκαλέσουν τη μεταγραφή, ωστόσο ο ακριβής μηχανισμός παραμένει άγνωστος. Τα γονίδια vany και vanz συνεισφέρουν αλλά δεν είναι απαραίτητα στην αντοχή. Η πρωτεΐνη VanY είναι μία D,-D-καρβοξυπεπτιδάση που απομακρύνει το πεπτίδιο D-Ala από οποιοδήποτε πεπτίδιο, όταν η εξάλειψη του D-Ala-D-Ala από την VanX είναι ατελής, συνεισφέροντας έτσι στην αύξηση της αντοχής (Arthur και συν., 1998). Η πρωτεΐνη VanZ αυξάνει την MIC της 37

48 τεϊκοπλανίνης αλλά όχι της βανκομυκίνης, μέσω μηχανισμών που ακόμα δεν έχουν αποσαφηνιστεί, και ως εκ τούτου δεν είναι απαραίτητη στην έκφραση του φαινοτύπου VanA. Το vana οπερόνιο έχει βρεθεί κυρίως στα είδη E. faecium και E. faecalis αλλά επίσης στα είδη E. avium, E. durans, E. raffinosus καθώς και σε άτυπα στελέχη του είδους E. gallinarum και E. casseliflavus με υψηλή αντοχή και στη βανκομυκίνη και στην τεϊκοπλανίνη (Πίνακας 2.2). Η χαρτογράφηση του vana οπερονίου αποκάλυψε μεγάλου βαθμού ετερογένεια στην οργάνωσή του (Handwerger και συν., 1995). Το μεταφερόνιο Tn1546 σε ορισμένα στελέχη εμφάνιζε αλληλουχίες εισδοχής (insertion sequences, ISs) μεταξύ των γονιδίων vans και vanh, ενώ η ομάδα των γονιδίων vana μπορεί να ενσωματωθεί σε ακόμα μεγαλύτερα κινητά γενετικά στοιχεία που περιέχουν επιπρόσθετες αλληλουχίες εισδοχής (Sletvold και συν., 2010). Οι διασταυρούμενες συνδέσεις των πρόδρομων μορίων στη σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης πραγματοποιούνται με τις πρωτεΐνες σύνδεσης πενικιλλινών (PBPs), από τις οποίες η PBP5 έχει αναφερθεί τους εντερόκοκκους. Η αντικατάσταση της D-αλανίνης με D-γαλακτικό δεν επηρεάζει τις διασταυρούμενες συνδέσεις των τροποποιημένων πρόδρομων μορίων του τοιχώματος πεπτιδογλυκάνης. Ωστόσο, οι PBPs εκτός της PBP5, των οποίων ο ρόλος είναι άγνωστος στη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος των εντεροκόκκων, είναι μάλλον απαραίτητες στον όλο μηχανισμό (al-obeid και συν., 1992). Οι υψηλού μοριακού βάρους PBPs έχουν μεγαλύτερη χημική συγγένεια με τις β-λακτάμες. Παρουσία βανκομυκίνης, το κύτταρο των εντεροκόκκων προκειμένου να χρησιμοποιήσει το μόριο με την κατάληξη D-Ala-D-Lac, πρέπει αντί της PBP5, να χρησιμοποιήσει τις άλλες PBPs, με συνέπεια την μεγάλη ευαισθησία του στις β-λακτάμες. Έτσι εξηγείται η συνέργεια που εμφανίζεται από το συνδυασμό των δύο ομάδων αντιβιοτικών (β-λακτάμες και αμινογλυκοσίδες) σε στελέχη ανθεκτικά στη βανκομυκίνη VanB τύπος Το vanb οπερόνιο περιέχει γονίδια που κωδικοποιούν επίσης μια λιγάση, μια δεϋδρογενάση και μια διπεπτιδάση, που παρουσιάζουν ομολογία αλληλουχίας 67%-76% με τις αντίστοιχες πρωτεΐνες του vana οπερονίου. Συγκεκριμένα, η VanB λιγάση παρουσιάζει 76% ομολογία με τη VanA λιγάση. Είναι μια πρωτεΐνη που ευνοεί την παραγωγή του πενταδεψιπεπτιδίου που απολήγει σε D-Ala-D-Lac (Evers και συν., 1993). Εν τω μεταξύ, μελέτες έχουν δείξει ετερογένεια στην αλληλουχία του vanb γονιδίου, προτείνοντας 3 38

49 υποτύπους: vanb-1, vanb-2 και vanb-3 (Dahl και συν., 1999). Ωστόσο, δεν υπάρχει συσχετισμός μεταξύ των vanb υποτύπων και του επιπέδου αντοχής στη βανκομυκίνη. Επιπρόσθετα, το vany B δεν παρατηρείται σε όλα τα στελέχη, και η θέση του διαφέρει από την αντίστοιχη του vany στο Tn1546 (Evers και Courvalin, 1996). Σημειώνεται ότι δεν υπάρχει ισοδύναμο γονίδιο του vanz στα στελέχη VRE με VanB φαινότυπο, ενώ η λειτουργία της πρωτεΐνης VanW, που κωδικοποιείται από το vanw γονίδιο στο vanb οπερόνιο, είναι άγνωστη. Τα υπόλοιπα γονίδια που εμπλέκονται στην έκφραση του φαινοτύπου είναι όπως και στο VanA τύπο: vanr B, vans B, vanh B, vanx B και vany B. Αν και υψηλή σχετικά ομολογία (70%) υπάρχει μεταξύ VanHAX και VanH B BX B, αξιοσημείωτα χαμηλή (25%-35%) παρατηρείται μεταξύ των VanRS και VanY των δύο φαινοτύπων (Evers και Courvalin, 1996). Το ρυθμιστικό σύστημα έκφρασης VanRS του VanB φαινοτύπου δεν επηρεάζεται από την παρουσία της τεϊκοπλανίνης. Η τεϊκοπλανίνη επάγει το μηχανισμό σύνθεσης των πρωτεϊνών VanA αλλά όχι της σύνθεσης των πρωτεϊνών VanΒ (Πίνακας 2.2). Αντίθετα, η παρουσία βανκομυκίνης είναι ικανή να πυροδοτήσει και τους δύο μηχανισμούς μεμονωμένα. Επιπλέον, ανθεκτικά στην τεϊκοπλανίνη στελέχη μπορούν να προέλθουν από στελέχη ευαίσθητα στην τεϊκοπλανίνη γενότυπου vanb, εφόσον καλλιεργηθούν σε υπόστρωμα που περιέχει τεϊκοπλανίνη (Cetinkaya και συν., 2000). Μια άλλη διαφορά των δύο φαινοτύπων είναι ότι o VanA τύπος είναι ευρύτατα διαδεδομένος και αποτελεί τον επικρατέστερο τύπο αντοχής στην Ευρώπη και στις ΗΠΑ. Στελέχη με τύπο VanB απομονώνονται συχνά στις ΗΠΑ, με ορισμένα νοσοκομεία να αναφέρουν αποκλειστικά VanB VRE στελέχη (Clark και συν., 1993). Το γονίδιο vana έχει παρατηρηθεί σε πολλά είδη εντεροκόκκων όπως επίσης και σε είδη των γενών Corynebacterium, Arcanobacterium και Lactococcus, ενώ το γονίδιο vanb έχει παρατηρηθεί κυρίως στα είδη E. faecium και E. faecalis. Αυτή η διαφορά στη διασπορά πιθανώς να οφείλεται στο γεγονός ότι το vana οπερόνιο εντοπίζεται συχνά σε ένα μεταφερόνιο παρόμοιο με το Tn1546, που συχνά αποτελεί τμήμα ενός συζευκτικού πλασμιδίου (Arthur και συν., 1993). Το σύμπλεγμα των γονιδίων vanb συχνά εντοπίζεται στο χρωμόσωμα και, ενώ αρχικά θεωρούνταν ότι δεν ήταν μεταβιβάσιμο σε άλλα βακτήρια, έχει διαπιστωθεί και σε πλασμίδια. Όταν είναι χρωμοσωμικό, μπορεί να μεταβιβαστεί ως τμήμα μεγαλύτερων κινητών γενετικών στοιχείων, που σχετίζονται με μεγάλα συζευκτικά τρανσποζόνια (Quntilliani και Courvalin, 1994). 39

50 VanC τύπος Χαμηλού επιπέδου εγγενής αντοχή στη βανκομυκίνη είναι τυπική στα είδη E. gallinarum, E. casseliflavus και E. flavescens (Πίνακας 2.2). Το vanc-1 γονίδιο έχει παρατηρηθεί στο είδος E. gallinarum, το vanc-2 στο είδος E. casseliflavus και το vanc-3 στο είδος E. flavescens (Clark και συν., 1998). Η VanC λιγάση του είδους E. gallinarum ευνοεί την παραγωγή ενός πενταπεπτιδίου που καταλήγει σε D-Ala-D-Ser (Εικόνα 2.3). Αντικατάσταση της D-αλανίνης με D-σερίνη έχει ως αποτέλεσμα την εξασθένιση της δέσμευσης της βανκομυκίνης στο νέο πενταπεπτίδιο. Αδρανοποίηση του γονιδίου vanc-1 αποκαλύπτει την παράλληλη παραγωγή του D-Ala-D-Ala πενταπεπτιδίου στο είδος E. gallinarum. Η δράση της D,D-διπεπτιδάσης και της D,D-καρβοξυπεπτιδάσης είναι ανάλογη με εκείνη των φαινοτύπων VanA και VanB. Το επίπεδο της αντοχής είναι ανάλογο της ισορροπίας που επιτυγχάνεται μεταξύ φυσιολογικής και μη φυσιολογικής σύνθεσης της πεπτιδογλυκάνης. Η παρουσία των μορίων D-Ala-D-Ala και D-Ala-D-Ser σε διάφορες συγκεντρώσεις εξηγεί τα ποικίλα επίπεδα αντοχής στη βανκομυκίνη που παρατηρούνται μεταξύ στελεχών με φαινότυπο VanC (Cetinkaya και συν., 2000). Συνεπώς, χαμηλές δόσεις ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC) εξηγούνται από την παρουσία υψηλότερων συγκεντρώσεων D-Ala-D-Ala, ενώ υψηλότερες MIC εξηγούνται από υψηλότερες συγκεντρώσεις D-Ala-D-Ser. Ο μηχανισμός αντοχής μπορεί να είναι επαγώγιμος ή ιδιοσυστατικός (Reynolds και Courvalin, 2005). Η οργάνωση του vanc οπερονίου, που έχει χρωμοσωμική εντόπιση και δεν είναι μεταβιβάσιμο, διαφέρει από αυτή των vana, vanb και vand. Τρεις πρωτεΐνες απαιτούνται για τoν VanC τύπο αντοχής: η VanC λιγάση που καταλύει τη σύνθεση της D-Ala-D-Ser, η VanT, μια ρασεμάση που παράγει D-Ser και η VanXY C που κατέχει ταυτόχρονα δράση D,Dδιπεπτιδάσης και D,D-καρβοξυπεπτιδάσης επιτρέποντας την υδρόλυση μορίων που καταλήγουν σε D-Ala., ενώ στα vana, vanb και vand οπερόνια, τα γονίδια του συστήματος ρύθμισης της έκφρασης της αντοχής (vanrs, vanr B S B και vanr D S D ) βρίσκονται εντοπισμένα αντίθετα προς τη φορά κατεύθυνσης των γονιδίων αντοχής, στο VanC οπερόνιο, τα αντίστοιχα γονίδια βρίσκονται προς την κατεύθυνση του vant. Το γονίδιο vanc-2 εμφανίζει περίπου 66% ομολογία με το vanc-1, ενώ υπάρχει υψηλή ομολογία (98%) μεταξύ των γονιδίων vanc-2 και vanc-3 (Clark και συν., 1998) και επομένως είναι δύσκολη η διαπίστωση του είδους, E. casseliflavus ή E. flavescens, από το οποίο το γονίδιο vanc προέρχεται (Dutta και Reynolds, 2003). Έχουν βρεθεί γονίδια σε στελέχη E. gallinarum και E. casseliflavus, που προκαλούν υψηλή αντοχή στη βανκομυκίνη (MIC>256μg/ml), πολύ 40

51 υψηλότερη από την αναμενόμενη καθώς και αντοχή στην τεϊκοπλανίνη εξαιτίας του ότι φέρουν και άλλο van γονίδιο (Dutka-Malen και συν., 1994). (α) (β) Εικόνα 2.3. VanC τύπος αντοχής στα γλυκοπεπτίδια. (α): Σύνθεση των πρόδρομων μορίων της πεπτιδογλυκάνης σε στέλεχος με VanC-τύπο αντοχής. Ddl: D-Ala-D-Ala λιγάση, Τέτρα, L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala, Τρι: L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys. (β): Οργάνωση του vanc οπερονίου. Τα λευκά βέλη αντιπροσωπεύουν γονίδια κωδικοποίησης και υποδεικνύουν την κατεύθυνση της μεταγραφής. Πηγή: Courvalin, VanD τύπος Ο VanD τύπος αντοχής είναι επίκτητος και οφείλεται σε ιδιοσυστατική έκφραση πρόδρομων μορίων πεπτιδογλυκάνης που καταλήγουν σε D-Ala-D-Lac (Πίνακας 2.2). Το vand οπερόνιο περιγράφηκε για πρώτη φορά σε στέλεχος που απομονώθηκε από νοσοκομείο της Ν. Υόρκης το 1991 (Perichon και συν., 1997). Έχει αποκλειστικά χρωμοσωμική εντόπιση και δεν είναι μεταβιβάσιμο σε άλλους εντερόκοκκους. Το στέλεχος που έφερε το γονίδιο ανήκε στο είδος E. faecium με MIC βανκομυκίνης 64 μg/ml και τεϊκοπλανίνης 4 μg/ml. Μελέτες προσδιορισμού της αλληλουχίας του γονιδίου της λιγάσης έδειξαν ομοιότητες με τα αντίστοιχα γονίδια vana και vanb (Depardieu και συν., 2004a). Ωστόσο, το vand οπερόνιο δε φέρει ομόλογα γονίδια με τα vanz ή vanw των vana και vanβ οπερονίων, αντίστοιχα. Τα στελέχη με VanD τύπο αντοχής εμφανίζουν αμελητέα δράση D,D-διπεπτιδάσης, γεγονός που 41

52 θα οδηγούσε σε ευαίσθητο στη βανκομυκίνη φαινότυπο καθώς αυτά τα στελέχη καθίστανται ανίκανα να εξουδετερώσουν πρόδρομα μόρια του D-Ala-D-Ala στόχου για τα γλυκοπεπτίδια. Εντούτοις, σε αυτά τα στελέχη δε λειτουργεί το μονοπάτι της «ευαισθησίας», αφού ταυτόχρονα, η Ddl λιγάση τους καθίσταται αδρανής λόγω μεταλλάξεων στο χρωμοσωμικό ddl γονίδιο (Εικόνα 2.4). Δεδομένου τούτου, τα στελέχη θα μπορούσαν να αναπτυχθούν μόνο παρουσία βανκομυκίνης αφού στηρίζονται στον επαγώγιμο μηχανισμό αντοχής της σύνθεσης της πεπτιδογλυκάνης. Ωστόσο, αυτό δε συμβαίνει, επειδή η έκφραση του γονιδίου είναι σταθερή λόγω μετάλλαξης (πλαισιοτροποποιητικής, σημειακής ή παρεμβολής) στην πρωτεΐνη-αισθητήρας VanS D ή σημειακής μετάλλαξης στη ρυθμιστική πρωτεΐνη VanR D (Depardieu και συν., 2004a). Ένα άλλο χαρακτηριστικό του VanD τύπου αντοχής είναι η ελαφρώς μειωμένη ευαισθησία στην τεϊκοπλανίνη (MIC 4 μg/ml) παρά τη σταθερή παραγωγή πρόδρομων μορίων πεπτιδογλυκάνης που καταλήγουν κυρίως σε D-Ala-D-Lac. Τα στελέχη με VanD τύπο, που μόνιμα έχουν ενεργοποιημένο το vand οπερόνιο, λόγω μετάλλαξης στο σύστημα ρύθμισης της έκφρασης της αντοχής και έχουν εξουδετερωμένο το μονοπάτι «ευαισθησίας» λόγω αδρανοποίησης της Ddl πρωτεΐνης, αποτελούν ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα tinkering ( τεχνουργίας ) τόσο στα εγγενή όσο και στα επίκτητα γονίδια, που έχει ως στόχο την επίτευξη υψηλότερου επιπέδου αντοχής (Depardieu και συν., 2004a). (α) Πενταπεπτίδιο Πενταπεπτίδιο (β) Εικόνα 2.4. VanD τύπος αντοχής στα γλυκοπεπτίδια. (α): Σύνθεση των πρόδρομων μορίων της πεπτιδογλυκάνης σε στέλεχος με VanD-τύπο αντοχής. (β): Οργάνωση του vand οπερονίου. Τα ανοικτά βέλη αντιπροσωπεύουν γονίδια κωδικοποίησης και υποδεικνύουν την 42

53 κατεύθυνση της μεταγραφής. Τα γονίδια της ρύθμισης και της αντοχής συμμεταγράφονται από τους υποκινητές PR και PH, αντίστοιχα. Ddl: D-alanine-D-alanine λιγάση, Πενταπεπτίδιο: L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Lac, Tri (Τριπεπτίδιο): L-Ala-γ-D-Glu-L- Lys, Διαγραφή: μεταλλαγμένο vansd μη λειτουργικό γονίδιο. Πηγή: Courvalin, VanE τύπος Το γονίδιο vane έχει περιγραφεί σε στέλεχος E. faecalis (BM4405) που παρουσίαζε αντοχή σε χαμηλά επίπεδα βανκομυκίνης (MIC 16 μg/ml) και ευαισθησία στην τεϊκοπλανίνη (MIC 0,5μg/ml) (Fines και συν., 1999). Ο τύπος αυτός της αντοχής οφείλεται στη σύνθεση πρόδρομων μορίων πεπτιδογλυκάνης που καταλήγουν σε D-Ala-D-Ser όπως ακριβώς στα είδη των εντεροκόκκων με εγγενή αντοχή. To vane οπερόνιο έχει οργάνωση ίδια με αυτή του vanc οπερονίου (Abadia Patino και συν., 2002) VanG τύπος Ο VanG τύπος είναι επίκτητος και χαρακτηρίζεται από χαμηλού επιπέδου αντοχή στη βανκομυκίνη (MIC 16 μg/ml) αλλά ευαισθησία στην τεϊκοπλανίνη (MIC 0,5μg/ml) (McKessar και συν., 2000) και από επαγώγιμη σύνθεση πρόδρομων μορίων πεπτιδογλυκάνης που καταλήγουν σε D-Ala-D-Ser. Το vang οπερόνιο εντοπίζεται στο χρωμόσωμα και αποτελείται από 7 γονίδια (Depardieu και συν., 2003). Σε αντίθεση με τα άλλα van οπερόνια, το σύμπλεγμα ρύθμισης της έκφρασης της αντοχής περιέχει 3 γονίδια (vanu G, vanr G και vans G ). Τα γονίδια vanr G και vans G έχουν μεγάλη ομοιότητα με τα γονίδια vanr D και vans D, ενώ το επιπρόσθετο γονίδιο vanu G κωδικοποιεί ένα μεταγραφικό ενεργοποιητή VanL τύπος Ο VanL φαινότυπος έχει ανιχνευθεί στο στέλεχος Enterococcus faecalis N , που παρουσίαζε χαμηλά επίπεδα αντοχής στη βανκομυκίνη (MIC 8 μg/ml) και έφερε ένα νέο D-Ala-D-Ser οπερόνιο (vanl) (Boyd και συν., 2008). Η οργάνωσή του vanl οπερονίου είναι παρόμοια με αυτή των vanc και vane οπερονίων. Ωστόσο, η ρασεμάση VanT στο vanl οπερόνιο κωδικοποιείται από 2 ξεχωριστά γονίδια, το vantm L και vantr L. Η αντοχή στη βανκομυκίνη είναι επαγώγιμη και η εντόπιση του γονιδιακού συμπλέγματος του vanl είναι χρωμοσωμική. 43

54 VanM τύπος To γονιδιακό σύμπλεγμα vanm, που ανιχνεύθηκε σε κλινικό στέλεχος E. faecium και κωδικοποιεί την παραγωγή πρόδρομων πεπτιδογλυκανών με D-Ala-D-Lac άκρο, χαρακτηρίζεται από υψηλή επαγώγιμη αντοχή στη βανκομυκίνη (MIC > 256 μg/ml) και την τεϊκοπλανίνη (MIC 96 μg/ml) (Xu και συν., 2010). Σύμφωνα με την ανάλυση της αλληλουχίας, το γονίδιο vanμ παρουσιάζει υψηλή ομολογία με το vanα. Ωστόσο, η οργάνωση του γονιδιακού συμπλέγματος vanμ είναι παρόμοια με εκείνη του vand, παρά το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το γονιδιακό σύμπλεγμα vanm έχουν μικρή συγγένεια με τις αντίστοιχες πρωτεΐνες του γονιδιακού συμπλέγματος vand VanN τύπος Πρόκειται για το μοναδικό μέχρι σήμερα μεταβιβάσιμο D-Ala-D-Ser τύπο αντοχής στον E. faecium. Ανιχνεύθηκε στο στέλεχος E. faecium UCN71 και χαρακτηρίζεται από χαμηλού επιπέδου αντοχή στη βανκομυκίνη (MIC 16 μg/ml) και από ευαισθησία στην τεϊκοπλανίνη (MIC 0,5 μg/ml) (Lebreton και συν., 2011). Η γενετική οργάνωση του vann οπερονίου είναι παρόμοια με εκείνη των αντίστοιχων vanc, vane και vanl. Η έκφραση της αντοχής είναι ιδιοσυστατική και μεταβιβάσιμη Εντερόκοκκοι εξαρτημένοι από την παρουσία βανκομυκίνης Ένα ενδιαφέρον φαινόμενο που παρατηρείται σε στελέχη με φαινότυπο VanA ή VanB είναι αυτό της εξάρτησης από τη βανκομυκίνη (Εικόνα 2.5) (Dever και συν., 1995). Στην περίπτωση αυτή, τα στελέχη εντεροκόκκων πέραν της αντοχής που παρουσιάζουν στη βανκομυκίνη ή/και την τεϊκοπλανίνη επιπλέον απαιτούν την παρουσία αυτών των αντιμικροβιακών για την ανάπτυξή τους. Εντερόκοκκοι εξαρτημένοι από τη βανκομυκίνη απομονώθηκαν από κλινικά δείγματα ασθενών σε μακροχρόνια αγωγή με βανκομυκίνη (Van Bambeke και συν., 1999) όταν καλλιεργήθηκαν σε υποστρώματα που περιείχαν βανκομυκίνη όπως αυτά που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση στελεχών Campylobacter spp. Μια πιθανή εξήγηση του φαινομένου είναι ότι οι εν λόγω εντερόκοκκοι διακόπτουν τη φυσιολογική σύνθεση του διπεπτιδίου D-Ala-D-Ala λόγω έλλειψης Ddl λιγάσης εξαιτίας διαφόρων μεταλλάξεων στο ddl γονίδιο και επομένως μπορούν να αναπτυχθούν μόνο εάν δημιουργηθεί μια υποκατάστατη δομή διπεπτιδίου. Στους περισσότερους VanA και VanB τύπους εντεροκόκκων αυτό μπορεί να συμβεί μόνο με την παρουσία βανκομυκίνης, η οποία 44

55 πυροδοτεί τη σύνθεση VanA ή VanB λιγάσης και VanH δεϋδρογενάσης υπεύθυνες για το σχηματισμό της D-Ala-D-Lac. Όσο επομένως υπάρχει βανκομυκίνη, η D-Ala-D-Lac καλύπτει την ανάγκη για D-Ala-D-Ala για τη σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης. Μόλις όμως η βανκομυκίνη απομακρυνθεί, η D-Ala-D-Lac παύει να συντίθεται και έτσι χωρίς D-Ala-D-Ala ούτε D-Ala-D-Lac, το κύτταρο δεν μπορεί να αναπτυχθεί. Επιστροφή στην κατάσταση «ανεξαρτησίας» από τη βανκομυκίνη μπορεί να παρατηρηθεί με μετάλλαξη στη VanS ή VanS B πρωτεΐνη που οδηγεί σε σταθερή παραγωγή D-Ala-D-Lac και κατά συνέπεια σε αντοχή στην τεϊκοπλανίνη ή με μετάλλαξη στο ddl γονίδιο που αποκαθιστά την παραγωγή D- Ala-D-Ala και οδηγεί σε Van φαινότυπο επαγώγιμο από τη βανκομυκίνη (Van Bambeke και συν., 1999). Πενταπεπτίδιο Πενταπεπτίδιο Εικόνα 2.5. Σύνθεση των πρόδρομων μορίων της πεπτιδογλυκάνης σε στέλεχος εξαρτώμενο από τη βανκομυκίνη. Λόγω της αδρανοποίησης της Ddl λιγάσης του χρωμοσώματος ξενιστή, η παρουσία της βανκομυκίνης στο θρεπτικό υπόστρωμα είναι απαραίτητη για να πυροδοτήσει το μηχανισμό της αντοχής, και να σχηματίσει D-Ala-D-Lac επιτρέποντας έτσι τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος. Πενταπεπτίδιο: L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-D-Ala-D-Lac, Tri (Τριπεπτίδιο): L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys. Πηγή: Courvalin, Γενετικό περιβάλλον των van Οπερονίων Το vana οπερόνιο ανιχνεύθηκε αρχικά στο μη συζευκτικό μεταφερόνιο Tn1546 (Arthur και συν., 1993). Ο VanA τύπος αντοχής σε κλινικά στελέχη εντεροκόκκων 45

56 εντοπίζεται σε μεταθετά στοιχεία, όμοια ή παρόμοια με το Tn1546, τα οποία συνήθως φέρονται γενικά σε πλασμίδια και περιστασιακά στο χρωμόσωμα του ξενιστή ως μέρος μεγάλων συζευκτικών στοιχείων. Τα μεταθετά στοιχεία που μοιάζουν με το Tn1546, είναι πολύ συντηρημένα («κλειστά»), εκτός από την παρουσία αλληλουχιών εισδοχής που έχουν μετατοπιστεί σε ενδογονιδιακές περιοχές που δεν είναι σημαντικές για την έκφραση της αντοχής. Η συζευκτική μεταφορά πλασμιδίων που έχουν αποκτήσει μεταθετά στοιχεία παρόμοια με το Tn1546, φαίνεται να ευθύνεται για την εξάπλωση της αντοχής στα γλυκοπεπτίδια στους εντερόκοκκους (Courvalin, 2006). Το vanβ οπερόνιο αποτελείται από γονίδια που συνήθως μεταφέρονται από μεγάλα γενετικά στοιχεία ( kb), τα οποία είναι μεταβιβάσιμα με σύζευξη από χρωμόσωμα σε χρωμόσωμα (Quntilliani και Courvalin, 1994). Τέτοια γενετικά στοιχεία έχουν βρεθεί και σε πλασμίδια σε κλινικά στελέχη εντεροκόκκων (Rice και συν., 1998). Η διασπορά του VanB τύπου αντοχής οφείλεται, σε μεγάλο βαθμό, στην εξάπλωση του συμπλέγματος vanb2 που μεταφέρεται σε συζευκτικά τρανσποζόνια του τύπου Tn916. Δύο ακόμα παρόμοια γενετικά στοιχεία, το Tn5382 (μέγεθος 27kb) (Carias και συν., 1998) και το Tn1549 (μέγεθος 34kb) (Garnier και συν., 2000), είναι ευρέως διαδεδομένα σε Ευρώπη και ΗΠΑ. O VanG τύπος αντοχής σχετίζεται με τη μεταφορά, από χρωμόσωμα σε χρωμόσωμα, γενετικών στοιχείων μοριακού βάρους περίπου 240 kb, τα οποία συμμεταφέρουν και το γονίδιο ermb, υπεύθυνο για την αντοχή στην ερυθρομυκίνη (Depardieu και συν., 2003) Άλλοι μικροοργανισμοί με αντοχή στη βανκομυκίνη Γονίδια αντοχής στη βανκομυκίνη είχαν ήδη απομονωθεί από βακτήρια που δεν ανήκουν στο γένος Enterococcus. Τα είδη βακτηρίων Lactobacillus casei, Pediococcus pentocaseus και Leuconostoc mesenteroides εμφανίζουν εγγενή αντοχή στα γλυκοπεπτίδια. Η ανάπτυξη της D-Ala-D-Lac συμβαίνει όπως και στους VanA ή VanB εντερόκοκκους (Handwerger και συν., 1994). Το γονίδιο vana έχει βρεθεί σε ανθεκτικά στη βανκομυκίνη κλινικά στελέχη Cellulomonas turbata, Arcanobacterium haemolyticum και Bacillus circulans (Power και συν., 1995 Fontana και συν., 1997). Το γονίδιο vanb3 έχει απομονωθεί από στέλεχος του είδους Streptococcus bovis (Poyart και συν., 1997). Η αντοχή στη βανκομυκίνη των μη εντεροκοκκικών βακτηρίων μπορεί να μεταβιβάστηκε στους εντερόκοκκους υπό την πίεση της αυξημένης χρήσης της βανκομυκίνης στην κλινική ιατρική πρακτική και της αβοπαρκίνης, ως αυξητικού παράγοντα, στην κτηνοτροφία. Η πηγή των γονιδίων των υπεύθυνων για την αντοχή στη βανκομυκίνη παραμένει άγνωστη. Οι 46

57 οργανισμοί που παράγουν γλυκοπεπτίδια, οι οποίοι προστατεύονται από τα προϊόντα του μεταβολισμού τους (γλυκοπεπτίδια), θα μπορούσε να αποτελεί μια πιθανή πηγή αφού φέρουν γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες ομόλογες των VanS, VanR, VanH, VanA και VanX (Marshall και συν., 1998). To Paenibacillus (πρώην Bacillus) papillae, ένα ανθεκτικό στη βανκομυκίνη βιοφυτοφάρμακο, χρησιμοποιήθηκε στις ΗΠΑ για περισσότερο από 50 χρόνια για την καταπολέμηση του σκαθαριού. Το γονίδιο της λιγάσης του P. papillae παρουσιάζει μεγάλη ομολογία με το αντίστοιχο vana και ονομάστηκε vanf, ωστόσο δεν έχει βρεθεί στους εντερόκοκκους (Patel και συν., 2000). Σε εργαστηριακό επίπεδο, έχει επιτευχθεί μεταβίβαση των γονιδίων των υπεύθυνων για το φαινότυπο VanA, μέσω σύζευξης, από εντερόκοκκους σε Streptococcus group A, Listeria monocytogenes, Lactococcus lactis και Staphylococcus aureus (Biavasco και συν., 1996). Μεταβίβαση γονιδίων αντοχής σε στελέχη του είδους Staphylococcus aureus, με συνέπεια υψηλά επίπεδα αντοχής στα γλυκοπεπτίδια, έχει περιγραφεί in vitro σε μοντέλο ποντικού αλλά και in vivo (βλ. παρακάτω κεφ ). Επίσης, ελαττωμένη ευαισθησία στη βανκομυκίνη του Staphylococcus aureus έχει περιγραφεί στην Ιαπωνία και τις ΗΠΑ αλλά με διαφορετικό μηχανισμό από αυτόν που αναφέρεται στους εντερόκοκκους (Smith και συν., 1999) Αντοχή στα γλυκοπεπτίδια του Staphylococcus aureus Το είδος Staphylococcus aureus αποτελεί μια από τις συχνότερες αιτίες ενδο- και εξωνοσοκομειακών λοιμώξεων των οποίων η θεραπεία είναι περίπλοκη εξαιτίας της ικανότητας του βακτηρίου να καθίσταται ανθεκτικό σε αντιμικροβιακές ουσίες. Η βανκομυκίνη αποτελεί το φάρμακο εκλογής για τη θεραπεία των λοιμώξεων που οφείλονται σε ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη στελέχη S. aureus (methicillin-resistant S. aureus, MRSA). Ωστόσο η αυξημένη χρήση της έχει οδηγήσει στην εμφάνιση 2 τύπων αντοχής στα γλυκοπεπτίδια του S. aureus (Perichon και Courvalin, 2009). Ο πρώτος τύπος, μέτριου επιπέδου αντοχής στη βανκομυκίνη του S. aureus (vancomycin-intermediate S. aureus, VISA), δεν σχετίζεται με την απόκτηση του vana οπερονίου αλλά με μια ασυνήθιστη πάχυνση του κυτταρικού τοιχώματος, που περιέχει διπεπτίδια ικανά να δεσμεύουν τη βανκομυκίνη, μειώνοντας έτσι τη διαθεσιμότητα του αντιμικροβιακού για τα μόρια-στόχος (Cui και συν., 2003). Ο δεύτερος τύπος, υψηλού επιπέδου αντοχής ση βανκομυκίνη του S. aureus (vancomycin-resistant S. aureus, VRSA), οφείλεται στο vana οπερόνιο, που μεταφέρεται μέσω του μεταφερονίου Tn1546 από εντερόκοκκους. 47

58 Όπως προαναφέρθηκε (βλ ), η μεταφορά του vana γονιδιακού συμπλέγματος από τους εντερόκοκκους στο είδος S. aureus, είχε επιτευχθεί in vitro το 1992 (Noble και συν., 1992) και οι ανησυχίες να συμβεί μεταβίβαση και στη φύση επιβεβαιώθηκαν το 2003 όταν απομονώθηκε στέλεχος MRSA με φαινότυπο VanA, από τραύμα ασθενή (Chang και συν., 2003). Από τότε, έχουν απομονωθεί συνολικά 11 στελέχη S. aureus ανθεκτικών στη μεθικιλλίνη (MRSA) με φαινότυπο VanA, από ασθενείς στις ΗΠΑ (9), στην Ινδία (1) και στο Ιράν (1), με υψηλού ή μέτριου επιπέδου αντοχής στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη (Miller και συν., 2002 Sievert και συν., 2002 Kacica και McDonald, 2004 Weigel και συν., 2007 Aligholi και συν., 2008 Saha και συν., 2008). Στη συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών από τους οποίους απομονώθηκαν τα στελέχη VRSA, απομονώθηκαν ταυτόχρονα και εντερόκοκκοι με αντοχή στα γλυκοπεπτίδια (glycopeptide-resistant enterococci, GRE), γεγονός που δείχνει ότι τα MRSA στελέχη απέκτησαν την αντοχή στη βανκομυκίνη από τα GRE στελέχη. Αυτό μπορεί να συνέβη μέσω μεταφοράς πλασμιδίου με σύζευξη από τον εντερόκοκκο-δότη στο S. aureus δέκτη είτε μέσω μετάθεσης του μεταφερονίου Tn1546 από το εισερχόμενο πλασμίδιο στο πλασμίδιο ή χρωμόσωμα του δέκτη και ανασυνδυασμό του (Perichon and Courvalin 2009). Σε κάθε περίπτωση, τα στελέχη VRSA είχαν αποκτήσει αντοχή στα γλυκοπεπτίδια από στελέχη GRE. Ο συνδυασμός βανκομυκίνης με μια β- λακτάμη έχει ισχυρό συνεργικό αποτέλεσμα in vitro παρά την αντοχή των στελεχών και στα 2 αντιμικροβιακά (βλ. κεφ. 2) όταν χορηγούνται ξεχωριστά. Ωστόσο, παραμένει ανησυχητικό το γεγονός ότι τα 5 από τα 9 στελέχη VRSA που απομονώθηκαν στις ΗΠΑ ανήκουν σε ένα πολυάντοχο κλώνο πολύ συχνό στις μονάδες εντατική θεραπείας (ΜΕΘ) των ΗΠΑ, γεγονός που θα μπορούσε να έχει δραματικές συνέπειες στη θεραπεία (Zhu και συν., 2008). Η εξάπλωση της αντοχής στη βανκομυκίνη σε περισσότερο παθογόνα βακτήρια, όπως οι σταφυλόκοκκοι και οι στρεπτόκοκκοι, αποτελεί σημαντικό κίνδυνο, καθώς αποδεικνύεται ότι δεν υπάρχει φραγμός στη μεταφορά γονιδίων μεταξύ Gram θετικών κόκκων. Στη φύση τέτοιου είδους μεταφορά, μπορεί να υποτιμάται καθώς συχνά μπορεί να μην εκφράζεται φαινοτυπικά στο νέο ξενιστή. Η μεγάλη χρονική καθυστέρηση στην εμφάνιση του VanA τύπου αντοχής στο είδος S. aureus και η μικρή συχνότητα εμφάνισής του μπορεί να οφείλεται σε ανεπαρκή αντιγραφή των εντεροκοκκικών πλασμιδίων στους σταφυλόκοκκους (Courvalin, 2006). 48

59 3 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΩΝ VRE 3.1 Γεωγραφική Κατανομή και Εξάπλωση στα Νοσοκομεία Οι VRE για πρώτη φορά απομονώθηκαν από ασθενείς στην Αγγλία και τη Γαλλία, το 1986 (Leclercq και συν., 1988 Uttley και συν., 1988), όμως μέχρι σήμερα έχουν εξαπλωθεί σε όλο τον κόσμο αποτελώντας σοβαρή απειλή για τη δημόσια υγεία. Στις ΗΠΑ, οι VRE είναι ιδιαίτερα διαδεδομένοι, σε αντίθεση με την Ευρώπη όπου παρατηρούνται σημαντικές διαφορές στον επιπολασμό σε κάθε χώρα (Werner και συν., 2008a Leclercq 2009 ECDC, 2010). Σύμφωνα με το Ευρωπαϊκό Δίκτυο Επιτήρησης Αντιμικροβιακής Αντοχής (European Antimicrobial Resistance Surveillance Network, EARS-Net) του Ευρωπαϊκού Κέντρου Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (European Centre for Disease Prevention and Control, ECDC), ο επιπολασμός των VREF σε σύνολο 28 χωρών της Ευρώπης για το έτος 2010, κυμάνθηκε στο 7,4%, ενώ των E. faecalis ανθεκτικών στη βανκομυκίνη (Vancomycin Resistant E. faecalis, VREFL) <5% (Πίνακας 3.1, Εικόνες 3.1 και 3.2). Μία χώρα (Ιρλανδία) ανέφερε επιπολασμό 38,7%, 5 χώρες από 10%-25% (Ελλάδα, Λεττονία, Λουξεμβούργο, Πορτογαλία και Ηνωμένο Βασίλειο), ενώ οι 22 από τις 28 χώρες ανέφεραν ποσοστά < 10%, με τις 8 από αυτές (Σουηδία, Κύπρος, Εσθονία, Βουλγαρία, Φιλανδία, Μάλτα, Ρουμανία και Ολλανδία) <1% (Πίνακας 3.1, Εικόνα 3.1). Ωστόσο, μια πρόσφατη έκθεση από τη Σουηδία επισημαίνει την τετραπλάσια αύξηση στις λοιμώξεις από VRE την περίοδο σε σχέση με την περίοδο (Soderblom και συν., 2010). Για την τριετία , 2 χώρες (Ιρλανδία, Λεττονία) εμφάνισαν αυξητική τάση στον επιπολασμό των VREF, την τριετία , ενώ σημαντική τάση μείωσης παρατηρήθηκε σε 4 χώρες (Γερμανία, Ελλάδα, Ηνωμένο Βασίλειο, Ιταλία, Εικόνα 3.3) (ECDC, 2010). Από το 1989, έτος που απομονώθηκαν VRE στις ΗΠΑ για πρώτη φορά (Frieden και συν., 1993), έως το 1993, το ποσοστό των εντεροκοκκικών λοιμώξεων που αναφέρθηκε από το Κέντρο Ελέγχου Νοσημάτων των ΗΠΑ (Centers for Disease Control and, CDC) και το Εθνικό Σύστημα Πρόληψης και Επιτήρησης Νοσοκομειακών Λοιμώξεων (Prevention s National Nosocomial Infections Surveillance system) και που σχετίζονταν με VRE, σχεδόν εικοσαπλασιάστηκε (από 0,3% σε 7,9%), ενώ πρόσφατα έφτασε το 28,5% (CDCP, 1993 NNIS, 2004). Η αύξηση οφείλεται κυρίως στην αύξηση των λοιμώξεων από VRE (από 0,4 σε 28,5%), καθώς και των συν-λοιμώξεων από VRE και MRSA (9,5%) στις Μονάδες Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ) (Streit και συν., 2004 Warren και συν., 2004), αν και αυξανόμενες τάσεις 49

60 παρουσιάζουν και οι λοιμώξεις από VRE εκτός ΜΕΘ, με χαρακτηριστικό τον επιπολασμό του αποικισμού των VRE σε ασθενείς που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση, ο οποίος φτάνει το 10% (Burrell και συν., 2005). Η επιδημιολογία των VRE λοιμώξεων διαφέρει μεταξύ Ευρώπης και ΗΠΑ. Στις ΗΠΑ, οι VRE έγιναν γρήγορα επιδημικοί και ενδημικοί σε πολλά νοσοκομεία, ενώ το ποσοστό των θετικών φορέων στην κοινότητα ήταν σχεδόν μηδενικό. Αντίθετα στην Ευρώπη, τα κρούσματα στα νοσοκομεία αρχικά ήταν πολύ σποραδικά παρά τη δεξαμενή των VRE στον υγιή πληθυσμό της κοινότητας καθώς και στα παραγωγικά ζώα, δεξαμενή που για τα ζώα είχε αποδοθεί στη χρήση της αβοπαρκίνης στην κτηνοτροφία και πτηνοτροφία (Goossens, 1998). Μετά την κατάργηση της αβοπαρκίνης το 1997, ο επιπολασμός των VRE στα παραγωγικά ζώα μειώθηκε, τουλάχιστον σε ορισμένες χώρες, ενώ μετά το 2000, ο επιπολασμός των κλινικών VRE στελεχών στα νοσοκομεία αυξήθηκε σημαντικά, κυρίως λόγω αύξησης των κρουσμάτων (Aarestrup και συν., 2001 Werner και συν., 2008b Leclercq, 2009). Επιπρόσθετα, την τελευταία δεκαετία έχουν αναφερθεί περιπτώσεις in vivo οριζόντιας μεταφοράς του γονιδίου vana, από στελέχη VRE σε στελέχη ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus ανθεκτικά στη μεθικιλλίνη (MRSA), καθιστώντας τα ανθεκτικά στη βανκομυκίνη (βλ ). Οι φαινότυποι VanA και VanB κυριαρχούν μεταξύ των VRE, με το ποσοστό του VanA να είναι υψηλότερο στις ΗΠΑ σε σχέση με την Ευρώπη, και παρατηρούνται κυρίως στο είδος E. faecium (Deshpande και συν., 2007 Willems και Bonten, 2007 Leclercq, 2009). Εκτός από την Ευρώπη και τις ΗΠΑ, στον Καναδά ο επιπολασμός των VRE που έχουν απομονωθεί από τις ΜΕΘ φτάνει το 6,7%, ενώ επίσης, νοσοκομειακά στελέχη VRE έχουν απομονωθεί στην Ασία, και στη Ν. Αμερική (Shin και συν., 2003 Zanella και συν., 2003 Taneja και συν., 2004 Nichol και συν., 2006 Zheng και συν., 2007 Talebi και συν., 2008 Zhanel και συν., 2008). Εκτεταμένα κρούσματα από στελέχη E. faecium VanB έχουν αναφερθεί, σποραδικά, σε Αυστραλία και Σιγκαπούρη (Bell και συν., 1998 Christiansen και συν., 2004 Chlebicki και Kurup, 2008). Την τελευταία 20ετία παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των νοσοκομειακών λοιμώξεων από E. faecium, που είχε ως συνέπεια όχι μόνο τη συνολική αύξηση των νοσοκομειακών εντεροκοκκικών λοιμώξεων αλλά και τη μερική αντικατάσταση του E. faecalis ως αίτιου νοσοκομειακών λοιμώξεων. Έτσι λοιπόν σήμερα, ο E. faecium αποτελεί το αίτιο για το 40% των νοσοκομειακών εντεροκοκκικών λοιμώξεων, σε σχέση με το 10% που αντιπροσώπευε στις αρχές της δεκαετίας του 1990 (Murdoch και συν., 2002 Treitman και συν., 2005 Top και συν., 2007). Αυτή η αλλαγή των νοσοκομειακών εντεροκόκκων υπέρ του 50

61 E. faecium συνδέθηκε με την αυξημένη εμφάνιση αντοχής στην αμπικιλλίνη και στη βανκομυκίνη κυρίως στο είδος αυτό και σε πολύ μικρότερο βαθμό στο E. faecalis. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι το 80% των στελεχών E. faecium που απομονώθηκαν από κλινικά δείγματα στις ΗΠΑ, ήταν ανθεκτικά στη βανκομυκίνη και το 90% στην αμπικιλλίνη. Για το E. faecalis, τα ποσοστά είναι δραματικά μικρότερα με μόλις το 6,9% των στελεχών, να είναι ανθεκτικά στη βανκομυκίνη, ενώ η αντοχή στην αμπικιλλίνη να είναι πρακτικά μηδενική (Hidron και συν., 2008). Σε παγκόσμιο επίπεδο, ο E. faecium αντιπροσωπεύει το 79,5% έως 99% των VRE στελεχών (Stampone και συν., 2005 Abele-Horn και συν., 2006 Deshpande και συν., 2007 Zhanel και συν., 2008 Leclercq, 2009). Ιδιαίτερα, ο επιπολασμός των VREF στις νοσοκομειακές εντεροκοκκικές λοιμώξεις του αίματος αγγίζει το 60% (Wisplinghoff και συν., 2004). Ο αυξημένος επιπολασμός των VREF στα νοσοκομεία παγκοσμίως έχει αποδοθεί στην εμφάνιση ενός ξεχωριστού πληθυσμού στελεχών, ο οποίος έχει άμεση συσχέτιση με την εμφάνιση επιδημιών στα νοσοκομεία και χαρακτηρίζεται, κυρίως, από υψηλού επιπέδου αντοχή στην αμπικιλλίνη και τη σιπροφλοξακίνη καθώς και από την ύπαρξη νησίδας παθογονικότητας (pathogenicity island, PAI) στο γένωμά του (Willems και συν., 2005). H χρήση μοριακών επιδημιολογικών τεχνικών όπως η AFLP, έδειξε μεγάλες γενετικές διαφορές μεταξύ των στελεχών VREF από νοσηλευόμενους ασθενείς και των VREF από μη νοσηλευόμενους υγιείς ανθρώπους (βλ. κεφ ). Μια πιθανή εξήγηση για την παρατηρούμενη διάκριση μεταξύ νοσοκομειακών και μη στελεχών είναι ότι στο νοσοκομειακό περιβάλλον επιλέχτηκε ένας κλώνος VREF ο οποίος υπάρχει φυσιολογικά σε χαμηλούς πληθυσμούς στο ανθρώπινο έντερο. Μια άλλη εξήγηση και ίσως πιο πιθανή, είναι ότι τα νοσοκομειακά στελέχη αποκτήθηκαν κατά τη νοσηλεία και μερικώς ή εξολοκλήρου αντικατέστησαν τη χλωρίδα των E. faecium του ασθενούς, πιθανώς λόγω της επιλεκτικής πίεσης των αντιμικροβιακών ή της επιλογής στελεχών με αυξημένη λοιμογονικότητα (Willems και van Schaik, 2009). Επιπρόσθετα, με τη χρήση της MLST, φάνηκε ότι αυτός ο πληθυσμός των νοσοκομειακών VREF ανήκει σε ένα συγκεκριμένο κλωνικό σύμπλεγμα (clonal complex, CC), το CC17, με παγκόσμια εξάπλωση (Willems και συν., 2005 Werner και συν., 2008a). Οι περισσότεροι κλώνοι του συμπλέγματος CC17, μεταξύ άλλων, περιέχουν στο γένωμά τους και μία νησίδα παθογονικότητας που φέρει γονίδια παθογονικότητας (esp, hyl Efm, acm, βλ. κεφ 1.4), γεγονός που τα διαφοροποιεί από τα μη νοσοκομειακά στελέχη (Rice και συν., 2003b Leavis και συν., 2004). Ωστόσο, το ποσοστό επιπολασμού των γονιδίων αυτών ποικίλλει στις διάφορες χώρες, ενώ υπάρχει σημαντικό ποσοστό στελεχών VREF του 51

62 συμπλέγματος CC17, το οποίο δε φέρει κανένα από τα παραπάνω γονίδια παθογονικότητας (Novais και συν., 2005b Leclercq, 2009). Ο παραπάνω πληθυσμός κυκλοφορεί στα νοσοκομεία για περισσότερο από 20 χρόνια, ενώ αρχικά ήταν ανθεκτικός μόνο στην αμπικιλλίνη και έφερε νησίδα παθογονικότητας. Το περιβάλλον των νοσοκομείων, λόγω της επιλεκτικής πίεσης από την κατάχρηση των αντιμικροβιακών, ευνόησε τον παραπάνω πληθυσμό του συμπλέγματος CC17 με αποτέλεσμα να κυριαρχήσει μεταξύ των κλινικών στελεχών καθώς και στα επιδημικά στελέχη εντεροκόκκων. Ακολούθησε η απόκτηση, την τελευταία δεκαετία, των γονιδίων vana ή vanb μέσω οριζόντιας μεταφοράς, που κατέληξε στην εμφάνιση των VRE με πανδημικές δυνατότητες (Willems και συν., 2005 Leclercq, 2009). Στελέχη του συμπλέγματος CC17, το οποίο στη συντριπτική του πλειοψηφία αποτελείται από στελέχη κλινικά και επιδημικά, έχουν απομονωθεί και στην κοινότητα αλλά και σποραδικά σε παραγωγικά ζώα, κυρίως χοίρους,καθώς και ζώα συντροφιάς (Willems και συν., 2005 Willems και van Schaik, 2009 Freitas και συν., 2011). Τη δεκαετία του 1990 οι νοσοκομειακές λοιμώξεις από VRE περιλάμβαναν ευρεία διασπορά περιορισμένου αριθμού κλώνων, σύμφωνα με την ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου (PFGE), όχι μόνο μέσα στα νοσοκομεία αλλά και μεταξύ γειτονικών νοσοκομείων, μέσω της διακίνησης ασθενών (Cetinkaya και συν., 2000). Οι αρχικές νοσοκομειακές επιδημίες που οφείλονταν σε 1 ή 2 VRE κλώνους, βαθμιαία εξελίχθηκαν σε πολυκλωνικές (Bonten και συν., 1996). Η πολυκλωνικότητα μπορεί να είναι το αποτέλεσμα επαναλαμβανόμενης εισαγωγής νέων VRE κλώνων στα νοσοκομεία ή οριζόντιας μεταφοράς van ανθεκτικών γονιδίων, μέσω πλασμιδίων ή μεταφερονίων, με το τελευταίο να έχει παρατηρηθεί πολύ συχνά σε νοσοκομεία της Ευρώπης, Αμερικής και Ασίας (Kawalec και συν., 2000 Novais και συν., 2005b Nichol και συν., 2006 Yoo και συν., 2006 Zheng και συν., 2007 Talebi και συν., 2008 Werner και συν., 2008b). 52

63 Πίνακας 3.1. Επιπολασμός ανθεκτικών στη βανκομυκίνη νοσοκομειακών στελεχών Ε. faecium (VREF), στην Ευρώπη για το έτος Πηγή: ECDC, Χώρα VREF Αριθμός απομονώσεων % Αντοχή Αυστρία 354 4,0 Βέλγιο 79 2,5 Βουλγαρία 23 0 Κύπρος 23 0 Τσεχία 188 4,8 Δανία 501 1,8 Εσθονία 23 0 Φιλανδία Γαλλία 540 1,1 Γερμανία 437 8,5 Ελλάδα ,5 Ουγγαρία 105 1,9 Ισλανδία 16 6,3 Ιρλανδία ,7 Ιταλία 412 3,9 Λεττονία Λιθουανία 24 8,3 Λουξεμβούργο 9 11,1 Μάλτα 12 0 Ολλανδία 365 0,5 Νορβηγία 135 1,5 Πολωνία 102 7,8 Πορτογαλία 67 23,9 Ρουμανία 10 0 Σλοβενία 59 1,7 Ισπανία 471 1,5 Σουηδία Ηνωμένο Βασίλειο ,4 53

64 Εικόνα 3.1. Επιπολασμός νοσοκομειακών στελεχών E. faecium ανθεκτικών στη βανκομυκίνη (VREF) στην Ευρώπη για το έτος Πηγή: ECDC, Εικόνα 3.2. Επιπολασμός νοσοκομειακών στελεχών E. faecalis ανθεκτικών στη βανκομυκίνη (VREFL) στην Ευρώπη για το έτος Πηγή: ECDC,

65 Εικόνα 3.3. Επιπολασμός νοσοκομειακών στελεχών E. faecium ανθεκτικών στη βανκομυκίνη (VREF) στην Ευρώπη, για τη χρονολογική περίοδο Περιλαμβάνονται μόνο οι χώρες που ανέφεραν 20 ή περισσότερες απομονώσεις ανά έτος. Τα σύμβολα > και < δείχνουν σημαντικές αυξητικές τάσεις και τάσεις μείωσης, αντίστοιχα. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν 55

66 σημαντικές τάσεις στα συνολικά δεδομένα, τα οποία δεν υποστηρίζονται από δεδομένα από τα εργαστήρια αναφοράς. ** Τα δεδομένα για την Ιρλανδία παρουσιάζουν σημαντική αυξητική τάση μόνο για τα δεδομένα από τα εργαστήρια που αναφέρουν συνεχώς τα τελευταία τέσσερα χρόνια. Συντομεύσεις: EE: Ευρωπαϊκή Ένωση, SE: Σουηδία, FI: Φιλανδία, NL: Ολλανδία, FR: Γαλλία, NO: Νορβηγία, ES: Ισπανία, SI: Σλοβενία, DK: Δανία, HU: Ουγγαρία, BE: Βέλγιο, IT: Ιταλία, AT: Αυστρία, CZ: Τσεχία, DE: Γερμανία, UK: Ηνωμένο Βασίλειο, LV: Λεττονία, EL: Ελλάδα, PT: Πορτογαλία, IE: Ιρλανδία Πηγή: ECDC, Παράγοντες Κινδύνου (Risk factors) Τα ποσοστά ανίχνευσης των VRE αυξάνονται σε ασθενείς με χρόνια νεφρική και ηπατική ανεπάρκεια, αιμοκάθαρση, μεταμόσχευση οργάνων, ενδοαγγειακούς καθετήρες ή καθετήρες στην ουροδόχο κύστη, σε ασθενείς με μακρόχρονη νοσηλεία, ειδικά στις Μονάδες Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ) καθώς επίσης και σε ασθενείς με πολλαπλή και παρατεταμένη χορήγηση αντιμικροβιακών και κορτικοστεροειδών (Cetinkaya και συν., 2000 Ostrowsky και συν., 2001 Patel, 2003 Rivera και Boucher, 2011). Άλλοι παράγοντες κινδύνου που συνδέονται με αποικισμό ή λοίμωξη από VRE μπορεί να είναι η προηγούμενη θεραπεία με γλυκοπεπτίδια κατά αναερόβιων μικροοργανισμών, η έκθεση σε μολυσμένο ιατρικό εξοπλισμό όπως ηλεκτρονικά θερμόμετρα και η επαφή με ασθενή που φέρει VRE (Bonten και συν., 1996 Zirakzadeh και Patel, 2006 Chlebicki και Kurup, 2008). Ιδιαίτερα, όταν η αναλογία των ασθενών που είναι φορείς VRE σε μια Μονάδα, είναι άνω του 50%, οι υπόλοιποι παράγοντες κινδύνου είναι ήσσονος σημαντικότητας (Bonten και συν., 1998b). Η παρατεταμένη χορήγηση αντιμικροβιακών διευκολύνει τη μετάδοση των VRE μέσω δύο μηχανισμών: α) καταστέλλει τη φυσιολογική ανταγωνιστική εντερική χλωρίδα παρέχοντας πλεονέκτημα στην επιλογή των VRE, και β) αυξάνει τη συγκέντρωση των VRE στα κόπρανα των αποικισμένων ασθενών (Donskey και συν., 2000). Παρεντερική χρήση βανκομυκίνης, λήψη κεφαλλοσπορινών 2 ης ή 3 ης γενεάς καθώς και αντιμικροβιακών κατά αναεροβίων βακτηρίων ( π.χ.. μετρονιδαζόλη), αποτελούν επίσης παράγοντες κινδύνου, μέσω της διαταραχής της εντερικής μικροχλωρίδας και την επιτάχυνση της ανάπτυξης ευκαιριακά παθογόνων βακτηρίων, όπως είναι οι εντερόκοκκοι (Cetinkaya και συν., 2000 Donskey και συν., 2000 Fridkin και συν., 2001 Paterson 2004). Η χρήση της βανκομυκίνης per os μπορεί να ευνοεί τον αποικισμό με VRE (Luber και συν., 1996). Η χρήση βανκομυκίνης προδιαθέτει στην εμφάνιση VRE μέσω της αναστολής της ανάπτυξης των Gram θετικών μελών της φυσιολογικής εντερικής χλωρίδας και ευνοώντας την ανάπτυξη των VRE, οι οποίοι μπορεί να είναι παρόντες σε πολύ μικρούς 56

67 πληθυσμούς στο γαστρεντερικό σωλήνα υγιών ανθρώπων (Van der Auwera και συν., 1996). Άλλος σημαντικός παράγοντας κινδύνου αποτελεί η επιδερμίδα των νοσηλευομένων ασθενών με βακτηριαιμία από VRE. Έρευνα έδειξε ότι το ποσοστό αποικισμού του δέρματος των ασθενών έφτανε το 86% (Beezhold και συν., 1997). Τέλος, το ιατρικό και νοσηλευτικό προσωπικό καθώς και τα μέλη των οικογενειών τους που έρχονται σε άμεση επαφή, είναι σε κίνδυνο για αποικισμό με VRE (Murray, 2000) Αποικισμός και Λοίμωξη Άπαξ και οι VRE εγκατασταθούν στο περιβάλλον ενός νοσοκομείου, η ταχεία ανάπτυξη της αντοχής τους σε πολλά αντιμικροβιακά καθιστά δύσκολη την εξουδετέρωσή τους. Σε πολλά νοσοκομεία οι περισσότεροι ασθενείς που είναι θετικοί σε VRE, είναι φορείς παρά νοσούν από το βακτήριο. Η αναλογία των νοσούντων προς φορέων ασθενών, εξαρτάται από το είδος των ασθενών (πολύ υψηλή σε μονάδες μεταμοσχεύσεων και ογκολογικές μονάδες) και μπορεί να φτάσει το 1:10 στα νοσοκομεία (Zaas και συν., 2002 Chavers και συν., 2003 Deshpande και συν., 2007 Leclercq 2009). Η λοίμωξη από VRE συνήθως ακολουθεί μετά από τον αποικισμό του εντερικού σωλήνα με VRE (Zirakzadeh και Patel, 2006). Λοιμώξεις από VRE παρατηρούνται σε εξασθενημένους ή βαριά άρρωστους ασθενείς. Πύλες εισόδου για τους VRE αποτελούν το ουροποιητικό σύστημα, ο γαστρεντερικός σωλήνας, τα τραύματα και οι καθετήρες (Bonten και συν., 2001). Οι λοιμώξεις του ουροποιητικού από VRE περιλαμβάνουν κυστίτιδα, πυελονεφρίτιδα, προστατίτιδα και περινεφρικά αποστήματα, ωστόσο, η παρουσία τους στα ούρα μπορεί να εκδηλώνεται και μόνο με ασυμπτωματική βακτηριουρία (Wong και συν., 2000). Σε λήπτες ηπατικού μοσχεύματος, οι λοιμώξεις από VRE περιλαμβάνουν στένωση ή απόφραξη χοληφόρων αγγείων, ηπατικά αποστήματα, θρόμβωση ηπατικής αρτηρίας (Newell και συν., 1998). Η βακτηριαιμία είναι συνήθης και προκύπτει από τις παραπάνω λοιμώξεις, ενώ μηνιγγίτιδα, ενδοκαρδίτιδα και λοιμώξεις του δέρματος και των μαλακών ιστών έχουν επίσης αναφερθεί (Bishara και συν., 1999 Shaikh και συν., 2001 Zirakzadeh και Patel, 2006). Τα ποσοστά θνητότητας σε ασθενείς με VRE βακτηριαιμία ποικίλλουν. Οι ασθενείς με αυτόλογη μεταμόσχευση βλαστικών περιφερικών κυττάρων έχουν ποσοστά θνητότητας μέχρι 10%, οι ασθενείς με ενδοκαρδίτιδα ξεπερνούν το 30%, οι καρκινοπαθείς πάνω από 50%, ενώ οι λήπτες ηπατικού μοσχεύματος μπορεί να φτάνουν το 70% (Murray, 2000 Zaas και συν., 2002 Chavers και συν., 2003 El-Khoury και Fishman, 2003). 57

68 3.1.3 Δεξαμενή (Πηγή Μόλυνσης) Μέχρι σήμερα, οι νοσηλευόμενοι ασθενείς που φέρουν VRE στον εντερικό τους σωλήνα φαίνεται να είναι η μεγαλύτερη δεξαμενή μόλυνσης. Επειδή οι περισσότεροι ασθενείς με VRE είναι ασυμπτωματικοί, αυτή η δεξαμενή εύκολα μπορεί να περάσει απαρατήρητη εκτός κι αν καλλιέργειες αντιπροσωπευτικών δειγμάτων λαμβάνονται από τους παραπάνω ασθενείς (Zirakzadeh και Patel, 2006). Ο εντερικός σωλήνας χωρίς αμφιβολία είναι η μεγαλύτερη δεξαμενή του E. faecium, ωστόσο η παρουσία θετικών κλινικών δειγμάτων σε περίπτωση απουσίας θετικών δειγμάτων κοπράνων υποδηλώνει και την ύπαρξη απευθείας εξωγενούς μόλυνσης (Wade, 1995). Σε μια μελέτη, το 33% των ασθενών με ηπατική νόσο και αποικισμένοι με VRE, βρέθηκαν επίσης να είναι θετικοί σε επιχρίσματα (βύσματα) από το λάρυγγα (Wade, 1995). Ο αποικισμός σε αυτό το σημείο μπορεί να προέρχεται από τα χέρια του νοσηλευτικού προσωπικού κατά τη διάρκεια τραχειοστομίας ή άλλου ενδοτραχειακού χειρισμού. Ο στοματοφαρυγγικός αποικισμός σε αυτήν την περίπτωση μπορεί να αποτελεί πηγή διασταυρούμενης επιμόλυνσης ειδικότερα αν το νοσηλευτικό προσωπικό δεν απολυμαίνει επαρκώς τα χέρια του. Τα νοσοκομεία οφείλουν να αναπτύξουν μεθόδους γρήγορης εντόπισης τέτοιων ασθενών τη στιγμή της εισαγωγής τους, έτσι ώστε να τοποθετούνται στην απομόνωση έως ότου κοινοποιηθούν τα αποτελέσματα από τις καλλιέργειες (Zirakzadeh και Patel, 2006) Τρόποι Μετάδοσης Ο πιο κοινός τρόπος νοσοκομειακής μετάδοσης των VRE είναι τα χέρια του ιατρικού και νοσηλευτικού προσωπικού τα οποία μολύνονται παροδικά, ενώ φροντίζουν τους ασθενείς. Δείγματα από χέρια προσωπικού έχουν δώσει θετικές καλλιέργειες VRE και άλλων ανθεκτικών εντεροκόκκων (Duckro και συν., 2005). Εντερόκοκκοι έχουν απομονωθεί από καλλιέργειες από περιβαλλοντικά δείγματα νοσοκομείων κατά τη διάρκεια εμφάνισης κρουσμάτων (Cetinkaya και συν., 2000). Εφόσον οι εντερόκοκκοι επιβιώνουν για αρκετές ημέρες, εβδομάδες ή και μήνες σε ξηρές επιφάνειες, είναι επόμενο ότι αυτές θα αποτελούν πηγή μόλυνσης του προσωπικού που, με αυτόν τον τρόπο, θα μολύνει τα χέρια και το ρουχισμό του (Wendt και συν., 1998). Επιπρόσθετα, ιατρικός εξοπλισμός π.χ. πιεσόμετρα, θερμόμετρα, στηθοσκόπια, καρδιογράφοι, φλεβοκαθετήρες και έπιπλα (κρεβάτια, καρέκλες, τραπέζια), καθώς και πόρτες, πόμολα, πατώματα, νιπτήρες, κλινοσκεπάσματα, μπορεί συχνά να μολυνθούν με VRE και να αποτελέσουν δεξαμενή μόλυνσης (Slaughter και συν.,

69 Muto και συν., 2003 Zirakzadeh και Patel, 2006). Ευρεία μόλυνση του περιβάλλοντος με VRE είναι πολύ πιθανή σε θαλάμους ασθενών με διάρροια. Σε ορισμένες μελέτες, στελέχη από μολυσμένες επιφάνειες και από ασθενείς του θαλάμου αποδείχθηκαν γενετικά αδιαφοροποίητα (Slaughter και συν., 1996). Οι VRE παρουσιάζουν αντοχή και παραμένουν σε επιφάνειες π.χ.. πατώματα και έπιπλα, από 7 ημέρες μέχρι και 4 μήνες διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στη μετάδοση των VRE (Wendt και συν., 1998 Neely και Maley 2000 Zirakzadeh και Patel, 2006). Επιπρόσθετα, ο αποικισμός με VRE μπορεί να διαρκέσει για μεγάλες χρονικές περιόδους και να αποτελέσει δεξαμενή μετάδοσης των VRE σε άλλους ασθενείς. Οι ασθενείς πολύ συχνά παραμένουν φορείς του ίδιου ή περισσοτέρων του ενός VRE στελεχών ακόμα και κατά τη χρονική στιγμή που θα ξαναεισαχθούν στο νοσοκομείο. Τέλος, ο ρόλος των εργαζομένων στα νοσοκομεία στην επιδημιολογία των VRE είναι επίσης σημαντικός αφού VRE έχουν απομονωθεί από τα χέρια αυτών σε ποσοστό 26-41% (Cetinkaya και συν., 2000). Ορισμένες κατηγορίες ασθενών ανήκουν στις ομάδες υψηλού κινδύνου σε ό,τι αφορά μόλυνση ή αποικισμό με VRE. Τέτοιες ομάδες περιλαμβάνουν ασθενείς με ανοσοκαταστολή, ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε ενδοκοιλιακή ή καρδιοθωρακική χειρουργική επέμβαση, και ασθενείς καθετηριασμένους με ουροκαθετήρα ή φλεβοκαθετήρα όπως ασθενείς σε ΜΕΘ, σε μονάδες μεταμοσχεύσεων ή σε ογκολογικές μονάδες, και ασθενείς με παρατεταμένη παραμονή σε νοσοκομείο ή ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με πολυάριθμα αντιμικροβιακά φάρμακα (CDCP, 1995 Zirakzadeh και Patel, 2006). Επειδή οι εντερόκοκκοι είναι μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του γαστρεντερικού σωλήνα αλλά και του γεννητικού σωλήνα του θήλεος, οι περισσότερες λοιμώξεις με αυτούς τους μικροοργανισμούς αποδόθηκαν σε αυτήν την ενδογενή χλωρίδα. Ωστόσο, μελέτες απέδειξαν ότι οι εντερόκοκκοι, συμπεριλαμβανομένων και των VRE, μπορεί να μεταδοθούν από ασθενή σε ασθενή με άμεση επαφή ή έμμεσα μέσω παροδικής μεταφοράς στα χέρια του προσωπικού των νοσοκομείων, μολυσμένων επιφανειών ή ιατρογενούς εξοπλισμού (Duckro και συν., 2005). Εκτός του υπάρχοντος προβλήματος των VRE, η πιθανότητα εμφάνισης αντοχής στη βανκομυκίνη σε κλινικά στελέχη S. aureus, αποτελεί σημαντικό πρόβλημα για τη δημόσια υγεία. Το γονίδιο vana, το οποίο είναι συχνά πλασμιδιακής εντόπισης, έχει μεταδοθεί in vitro και in vivo από εντερόκοκκους σε μια ποικιλία Gram θετικών μικροοργανισμών, συμπεριλαμβανομένου του είδους S. aureus (βλ. κεφ και 2.3.6). 59

70 3.1.5 Μέτρα Ελέγχου των VRE Οι προσπάθειες που έχουν καταβληθεί για τον έλεγχο των διαφόρων κρουσμάτων VRE, έχουν επιβεβαιώσει ότι οι άμεσες παρεμβάσεις μπορούν να περιορίσουν τη μετάδοση των VRE στα νοσοκομεία (Ostrowsky και συν., 2001 Lucet και συν., 2007). Στην προσπάθεια αυτή έχουν εκδοθεί διάφοροι κατευθυντήριοι οδηγοί για την πρόληψη και τον έλεγχο των VRE (HICPAC, 1995 Muto και συν., 2003). Οι οδηγοί αυτοί επικεντρώνονται κυρίως: α) στην ορθολογική χρήση της βανκομυκίνης, β) στην εκπαίδευση του ιατρικού και νοσηλευτικού προσωπικού, γ) στην αποτελεσματική χρήση του μικροβιολογικού εργαστηρίου και δ) στην εφαρμογή μέτρων ελέγχου της λοίμωξης (συμπεριλαμβανομένων της χρήσης γαντιών και ιατρικής ποδιάς και της απομόνωσης των ασθενών). Για να ελαχιστοποιηθεί η ενδονοσοκομειακή μετάδοση των VRE, τα νοσοκομεία οφείλουν να εφαρμόζουν μέτρα που απαιτούν καθολική συμμετοχή τμημάτων και προσωπικού. Τα προγράμματα επιτήρησης και έγκαιρης προειδοποίησης παραμένουν απαραίτητα, αφού η εμφάνιση κρουσμάτων VRE είναι πάντα απρόβλεπτη και απαιτεί άμεση παρέμβαση Συνετή χρήση της βανκομυκίνης και άλλων αντιμικροβιακών Η αλόγιστη χρήση αντιμικροβιακών αποτελεί μια από τις κύριες αιτίες του σύγχρονου παγκόσμιου προβλήματος της αντοχής στα αντιμικροβιακά. Μελέτες έχουν δείξει ότι έως και το 50% των νοσηλευομένων ασθενών λαμβάνουν μη ενδεδειγμένη αντιμικροβιακή αγωγή ή αγωγή ακόμα κι όταν δεν υπάρχει καμία ένδειξη για τη χορήγησή της (Hecker και συν., 2003 Arnold και συν., 2006). Οι προσπάθειες για τον έλεγχο των ανθεκτικών μικροοργανισμών επικεντρώνονται στη μείωση της χρήσης των αντιμικροβιακών και στη μείωση των παραγόντων που ευνοούν την εξάπλωση των μικροοργανισμών. Η λογική στηρίζεται στο γεγονός ότι η παρουσία ενός αντιμικροβιακού παρέχει τρομακτικό πλεονέκτημα στον ανθεκτικό μικροοργανισμό και μπορεί να αυξήσει τον πληθυσμό του πολλές φορές (Cetinkaya και συν., 2000). Όσο μεγαλύτερος είναι ο τίτλος του μικροοργανισμού με αντοχή σε ένα κλινικό δείγμα, τόσο αυτός μπορεί να μεταδοθεί σε άλλα άτομα. Αυτό κάνει τις προσπάθειες περιορισμού της μετάδοσης πολύ σημαντικές αλλά και πιο δύσκολες. Ένας παράγοντας που μπορεί να δυσκολέψει την ικανότητα περιορισμού των VRE μειώνοντας τη χρήση της βανκομυκίνης, είναι το γεγονός ότι οι VRE συχνά είναι ταυτόχρονα ανθεκτικοί σε πολλά άλλα αντιμικροβιακά. Χρήση ενός από αυτά τα αντιμικροβιακά θα 60

71 μπορούσε να αποτελέσει ένα παράγοντα επιλογής για τους VRE (Cetinkaya και συν., 2000). Η χρήση 3 ης γενιάς κεφαλλοσπορινών καθώς και η λήψη αντιμικροβιακών με σημαντική δράση κατά των αναερόβιων μικροοργανισμών έχει αποδειχθεί ότι αποτελούν σημαντικούς παράγοντες κινδύνου για τη λοίμωξη ή τον αποικισμό με VRE γενικά (βλ ). Η ηλεκτρονική συνταγογράφηση μπορεί να αποτελέσει την πιο καινοτόμο και πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τον περιορισμό της αλόγιστης και μη ενδεδειγμένης χρήσης των αντιμικροβιακών στο μέλλον (Paul και συν., 2006) Προγράμματα εκπαίδευσης Η ανίχνευση και ο περιορισμός των VRE απαιτούν μια πολύ προσεκτική προσέγγιση και υψηλά επίπεδα επαγρύπνησης από το προσωπικό του νοσοκομείου. Συνεχή εκπαιδευτικά προγράμματα για το προσωπικό του νοσοκομείου θα πρέπει να περιλαμβάνουν πληροφορίες σχετικά την επιδημιολογία των VRE και τις πιθανές επιπτώσεις τους στην περίθαλψη του ασθενή (Muto και συν., 2003) Ρόλος του μικροβιολογικού εργαστηρίου στην ανίχνευση, αναφορά και έλεγχο των VRE Η έγκαιρη ανίχνευση των ασθενών με αποικισμό ή λοίμωξη με VRE είναι πολύ σημαντικός παράγοντας στην πρόληψη της νοσοκομειακής μετάδοσης. Εφόσον ο επιπολασμός των VRE φτάσει υψηλά επίπεδα σε ένα νοσοκομείο, είναι πολύ δύσκολη η πρόληψη της μετάδοσης. Το μικροβιολογικό εργαστήριο αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια στην εξάπλωση των VRE στο νοσοκομείο. Εφόσον VRE ανιχνευθούν σε ένα νοσοκομείο, όλοι οι εντερόκοκκοι που απομονώνονται από όλες τις κλινικές και τμήματα θα πρέπει να ελέγχονται για την αντοχή τους στη βανκομυκίνη (Muto και συν., 2003). Η εφαρμογή μοριακών μεθόδων, όπως η PFGE και MLST, παρέχει την πιο ακριβή ενημέρωση για την επιδημιολογική συσχέτιση των στελεχών που είναι παρόντα σε ένα νοσοκομείο και τους τρόπους μετάδοσης (βλ ). 61

72 Εφαρμογή μέτρων ελέγχου λοίμωξης Η σωστή εφαρμογή των μέτρων ελέγχου λοίμωξης μπορεί να μειώσει τη μετάδοση των VRE ακόμα και κατά 39% (Perencevich και συν., 2004). Τα μέτρα αυτά συνοψίζονται όπως παρακάτω: α) Απομόνωση των ασθενών που βρέθηκαν θετικοί σε VRE, β) Χρήση γαντιών και χειρουργικής ποδιάς κατά την είσοδο σε θάλαμο με VRE ασθενείς, όπως και αλλαγή γαντιών ή/και ρουχισμού σε περίπτωση επαφής με υλικό που μπορεί να περιέχει υψηλές συγκεντρώσεις VRE (π.χ. κόπρανα, ούρα, κλινοσκεπάσματα κλπ) ή/και με επιφάνειες δυνητικά μολυσμένες με VRE στο δωμάτιο του ασθενούς (π.χ. πόμολα, τουαλέτες κλπ) γ) Πλύσιμο χεριών κατά την έξοδο από θάλαμο με VRE ασθενείς, με αντισηπτικό σαπούνι (Cetinkaya και συν., 2000 Zirakzadeh και Patel, 2006). Επειδή εκτεταμένος αποικισμός με VRE, μέσα στα νοσοκομεία, μπορεί να συμβεί μέσω ενός συγκριτικά μικρού αριθμού καταγεγραμμένων λοιμώξεων από VRE, είναι αναγκαία η παρακολούθηση του αποικισμού μέσα από ένα πρόγραμμα επιτήρησης των ασθενών στις μονάδες υψηλού κινδύνου (Borgmann και συν., 2007). Μόνο με την εφαρμογή καλλιεργειών επιτήρησης είναι δυνατό να εντοπιστούν οι ασυμπτωματικοί φορείς VRE, επιτρέποντας την υιοθέτηση κατάλληλων προφυλάξεων για να εμποδιστεί η εξάπλωση των VRE. Επιπρόσθετα, η χρήση εξοπλισμού όπως στηθοσκόπια, πιεσόμετρα ή θερμόμετρα θα πρέπει να περιορίζεται σε ασθενείς VRE. Σε περίπτωση που τέτοιες συσκευές πρόκειται να χρησιμοποιηθούν και σε άλλους ασθενείς, θα πρέπει πρώτα να απολυμαίνονται επαρκώς (Ostrowsky και συν., 2001) Αντιμετώπιση των VRE λοιμώξεων Παρά το γεγονός ότι δεν υπάρχει κανένα αντιμικροβιακό για την αποτελεσματική αντιμετώπιση του αποικισμού από VRE, αρκετές θεραπευτικές επιλογές είναι διαθέσιμες για την αντιμετώπιση των VRE λοιμώξεων. Σε κάθε περίπτωση, ο έλεγχος της αντιμικροβιακής ευαισθησίας συνίσταται για την επιβεβαίωση της αποτελεσματικότητας του χρησιμοποιούμενου αντιμικροβιακού. Οι σοβαρές εντεροκοκκικές λοιμώξεις (π.χ. βακτηριαιμία και ενδοκαρδίτιδα) απαιτούν θεραπεία με ένα βακτηριοκτόνο συνδυασμό αντιμικροβιακών, που περιλαμβάνει μια πενικιλλίνη (π.χ. αμπικιλλίνη ή πενικιλλίνη G), στην οποία το στέλεχος εντεροκόκκου είναι ευαίσθητο, και μια αμινογλυκοσίδη (π.χ. γενταμυκίνη ή στρεπτομυκίνη) στην οποία το στέλεχος εντεροκόκκου δε θα παρουσιάζει υψηλού επιπέδου 62

73 αντοχή (Rivera και Boucher, 2011). Η βανκομυκίνη, σε συνδυασμό με μια αμινογλυκοσίδη, έχει συνεργική δράση κατά των εντεροκόκκων in vitro και in vivo, και γι αυτό συστήνεται ως φάρμακο εκλογής σε ασθενείς αλλεργικούς στην πενικιλλίνη καθώς και στη θεραπεία βακτηρίων ανθεκτικών στην αμπικιλλίνη και πενικιλλίνη. Η γενταμυκίνη και η στρεπτομυκίνη αποτελούν τις συνιστώμενες αμινογλυκοσίδες για τη συνεργική θεραπεία σε συνδυασμό με έναν αναστολέα σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος, ο οποίος αυξάνει την πρόσληψη των παραπάνω αντιμικροβιακών εμποδίζοντας τη σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης. Ωστόσο, η εμφάνιση υψηλού επιπέδου αντοχής στις αμινογλυκοσίδες και στην αμπικιλλίνη/πενικιλλίνη, σε συνδυασμό με τη ραγδαία εξάπλωση της αντοχής στη βανκομυκίνη, έχει σαν αποτέλεσμα των περιορισμό των θεραπευτικών δυνατοτήτων (Arias και συν., 2010). Επιπρόσθετα, εκτός από την εμφάνιση υψηλού επιπέδου αντοχής των εντεροκόκκων στις αμινογλυκοσίδες, η χρήση των τελευταίων είναι περιορισμένη λόγω της νεφροτοξικότητάς τους. Η θεραπεία λοιμώξεων που οφείλονται σε VRE, ειδικά E. faecium, είναι εξαιρετικά προβληματική λόγω της αντοχής που εμφανίζουν σε πολλά αντιβιοτικά. Η πενικιλλίνη ή η αμπικιλλίνη με ή χωρίς τη συνεργική δράση με μια αμινογλυκοσίδη, θα ήταν μια λογική θεραπευτική επιλογή για έναν μη αλλεργικό στην πενικιλλίνη ασθενή που έχει προσβληθεί με στέλεχος E. faecalis ανθεκτικό στη βανκομυκίνη (Cetinkaya και συν., 2000). Σχεδόν όλα τα στελέχη E. faecalis είναι τουλάχιστον μέτρια ευαίσθητα στην αμπικιλλίνη. Δυστυχώς όμως, η αντοχή στη βανκομυκίνη εμφανίστηκε κυρίως σε στελέχη E. faecium, που είναι εγγενώς πιο ανθεκτικά στην πενικιλλίνη και στην αμπικιλλίνη. Η εμφάνιση της αντοχής στις β-λακτάμες αποκλείει τη χρήση αυτών των αντιμικροβιακών από τη θεραπεία σοβαρών εντεροκοκκικών λοιμώξεων, εκτός από δύο σημαντικές εξαιρέσεις: α) λοιμώξεις που οφείλονται σε στελέχη E. faecalis, τα οποία παράγουν β-λακταμάσες (βλ. κεφάλαιο 2.1), ανταποκρίνονται στο συνδυασμό β-λακτάμης/αναστολέα β-λακταμασών (π.χ. αμπικιλλίνη/σουλβακτάμη) συν μια αμινογλυκοσίδη, για τη θεραπεία της ενδοκαρδίτιδας, β) στελέχη E. faecium, με MICs αμπικιλλίνης 64 mg/l, μπορεί να ανταποκρίνονται σε θεραπεία με υψηλές δόσεις αμπικιλλίνης συν μια αμινογλυκοσίδη (Arias και συν., 2010). Εναλλακτικά της συνεργικής δράσης της αμπικιλλίνης με μια αμινογλυκοσίδη, έχει επίσης αναφερθεί επιτυχώς ο συνδυασμός της αμπικιλλίνης με την κεφτριαξόνη ή την κεφοταξίμη για την αντιμετώπιση στελεχών E. faecalis (Gavalda και συν., 2007). Ο συνδυασμός ενός γλυκοπεπτιδίου και μιας β-λακτάμης είναι αποτελεσματικός ακόμα κι όταν στελέχη VREF είναι ανθεκτικά στην αμπικιλλίνη και στη βανκομυκίνη καθώς ο συνδυασμός των δύο φαρμάκων είναι αυτός που προκαλεί την αναστολή της ανάπτυξης. Σε 63

74 τέτοια στελέχη, η MIC της αμπικιλλίνης μειώνεται παρουσία βανκομυκίνης. Αυτό πιθανώς συμβαίνει επειδή το βακτηριακό κύτταρο, προκειμένου να χρησιμοποιήσει το πρόδρομο μόριο που περιέχει D-Ala-D-Lac και που η σύνθεσή του επάγεται από την παρουσία της βανκομυκίνης, πρέπει να στραφεί στη χρήση διαφορετικού ενζύμου για τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος παρουσία της βανκομυκίνης (υψηλού μοριακού βάρους PBPs, βλ. κεφ 2.1). Εφόσον αυτό το ένζυμο αναστέλλεται πιο εύκολα από την αμπικιλλίνη, τότε η MIC της αμπικιλλίνης μειώνεται (Cetinkaya και συν., 2000). Ωστόσο, πολλά ανθεκτικά στην αμπικιλλίνη και στη βανκομυκίνη στελέχη E. faecium δεν εμφανίζουν αυτή την ιδιότητα ή υπάρχουν υποπληθυσμοί ανθεκτικοί στο συνδυασμό των δύο ουσιών. Τα αντιμικροβιακά κουινοπριστίνη και δαλφοπριστίνη (quinupristin-dalfopristin) ανήκουν στις στρεπτογραμμίνες, συνδυάζονται σε αναλογία 30:70, και δρουν συνεργικά στη θεραπεία λοιμώξεων από ανθεκτικά στη βανκομυκίνη στελέχη E. faecium. Έχουν βακτηριοστατική δράση γι αυτά τα στελέχη, αλλά είναι ανενεργά στα περισσότερα στελέχη E. faecalis (Cetinkaya και συν., 2000). Ο συνδυασμός κινουπριστίνης-δαλφοπριστίνης θεωρείται το πρώτο εγκεκριμένο αντιμικροβιακό για τη θεραπεία ασθενών με σοβαρές λοιμώξεις που σχετίζονται με βακτηριαιμία οφειλόμενη σε στελέχη E. faecium ανθεκτικών στη βανκομυκίνη. Η δράση τους αφορά στο βακτηριακό ριβόσωμα 50S, με το οποίο συνδέονται διαδοχικά σε διαφορετικές θέσεις, δημιουργώντας έτσι ένα σταθερό σύμπλοκο φαρμάκου-ριβοσώματος που αλληλεπιδρά σε διαφορετικά σημεία-στόχους του 23S RNA, εμποδίζοντας την πρωτεϊνοσύνθεση. Η ανάπτυξη αντοχής συμβαίνει μέσω τροποποίησης του ριβοσώματος, ενζυματικής αδρανοποίησης και/ή αντλιών εξόδου (efflux pump). Η ραμοπλανίνη, ένα λιπογλυκοδεψιπεπτίδιο, είναι ακόμα πιο δραστική. Αναστέλλει τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος δρώντας στο επίπεδο του σχηματισμού των λιπιδίων, ενώ η βανκομυκίνη και η δαπτομυκίνη (βλ. παρακάτω) παρεμβαίνουν στη σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης εμποδίζοντας την τρανσγλυκοσυλίωση (Somner και Reynolds, 1990). Ωστόσο, λόγω τοξικότητας χρησιμοποιείται μόνο τοπικά (Woodford και συν., 1995). Μελέτες έδειξαν ότι η ραμοπλανίνη θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την εξουδετέρωση GRE από το γαστρεντερικό σωλήνα (Dahms και συν., 1998) καθώς και του C. difficile (Biavasco και συν., 1991). Μια από τις πιο δραστικές ουσίες κατά των VRE είναι ένα ημισυνθετικό γλυκοπεπτίδιο, η οριταβανσίνη (LY333328), η οποίο εμφανίζει τόσο βακτηριοκτόνο όσο και βακτηριοστατική δράση κατά των εντεροκόκκων σε συνδυασμό με γενταμυκίνη (Schwalbe και συν., 1996 Lefort και συν., 2000). Η δράση της εναντίον στελεχών VREF, δε στοχεύει στο D-Ala-D-Ala άκρο των πρόδρομων μορίων της πεπτιδογλυκάνης αλλά σε άλλες θέσεις, 64

75 και επιπρόσθετα διαταράσσει το δυναμικό της κυτταρικής μεμβράνης και τη διαπερατότητα (Patti και συν., 2009). Η λινεζολίδη, ανήκει σε μια νέα τάξη συνθετικών αντιμικροβιακών, τις οξαζολιδόνες, με αποτελεσματική δράση κατά των εντεροκόκκων, που η χρήση τους εγκρίθηκε (Birmingham και συν., 2003). Χορηγείται από το στόμα ή ενδοφλέβια και, αντίθετα με τη κινουπριστίνη-δαλφοπριστίνη, είναι δραστική εναντίον τόσο στελεχών E. faecium όσο και E. faecalis, E. casseliflavus και E. gallinarum. Η λινεζολίδη αναστέλλει τη σύνθεση ριβοσωμικών πρωτεϊνών αλλά σε διαφορετικό σημείο από άλλα αντιμικροβιακά που έχουν ως στόχο δράσης τη 50S ριβοσωμική υπομονάδα (χλωραμφαινικόλη, μακρολίδια, λινκοσαμίδες, στρεπτογραμμίνες, αμινογλυκοσίδες, τερακυκλίνη). Συγκεκριμένα, η λινεζολίδη δεσμεύεται στη θέση 23S του ριβοσωμικού RNA της 50S υπομονάδας και εμποδίζει τη δημιουργία ενός λειτουργικού 70S συμπλέγματος έναρξης, που αποτελεί απαραίτητο στοιχείο στη διαδικασία της βακτηριακής μετάφρασης. Λόγω λοιπόν, του μοναδικού μηχανισμού δράσης της, δεν έχει παρατηρηθεί η ανάπτυξη διασταυρούμενης αντοχής μεταξύ αυτής και των παραπάνω αντιμικροβιακών ουσιών που έχουν τον ίδιο στόχο δράσης. Η ανάπτυξη επίκτητης αντοχής στη λινεζολίδη είναι ασυνήθης και οφείλεται σε μεταλλάξεις του γονιδίου που κωδικοποιεί τη 23S βακτηριακή ριβοσωμική υπομονάδα. Περιπτώσεις εντεροκόκκων ανθεκτικών στη λινεζολίδη έχουν αναφερθεί σε νοσοκομεία στις ΗΠΑ και σε χώρες της Ευρώπης (Herrero και συν., 2002 Rahim και συν., 2003 Krawczyk και συν., 2004 Schwartz και συν., 2004 Kainer και συν., 2007), μεταξύ των οποίων και στην Ελλάδα (Bersos και συν., 2004 Spiliopoulou και συν., 2011 Ntokou και συν., 2012). Η τιγκεκυκλίνη, είναι μια γλυκυλκυκλίνη, παράγωγο της τετρακυκλίνης, με παρόμοιο τρόπο δράσης, δηλαδή, ενώνεται με την υπομονάδα 30S των βακτηριακών ριβοσωματίων, αναστέλλοντας την ενσωμάτωση αμινοξέων στην επιμηκυνόμενη πολυπεπτιδική άλυσο, διακόπτοντας την πρωτεϊνοσύνθεση (Rubinstein και Vaughan, 2005). Είναι δραστική in vitro έναντι πολλών Gram αρνητικών και Gram θετικών, αεροβίων και αναεροβίων βακτηρίων συμπεριλαμβανομένων των MRSA και των VRE, ωστόσο δεν υπάρχουν κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία λοιμώξεων από τα παραπάνω βακτήρια. Πολλοί VRE είναι ευαίσθητοι στη νιτροφουραντοΐνη, που έχει χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία λοιμώξεων του κατώτερου ουροποιητικού από VRE, αλλά δεν έχει δραστικότητα έναντι άλλων VRE λοιμώξεων (Zirakzadeh και Patel, 2006). Επίσης, η τετρακυκλίνη, η δοξυκυκλίνη καθώς και ο συνδυασμός νοβοβιοκίνης με σιπροφλοξακίνη και δοξυκυκλίνη έχουν αναφερθεί ως αποτελεσματικές θεραπείες των VRE λοιμώξεων, ωστόσο, δεν υπάρχουν κλινικές μελέτες που να τις υποστηρίζουν (Linden και Miller, 1999). 65

76 Η φωσφομυκίνη (fosfomycin) είναι ένα παράγωγο του φωσφοενολοπυροσταφυλικού που απομονώθηκε από καλλιέργειες ειδών Streptomyces spp. το 1969 (Hendlin και συν., 1969) και αναστέλλει μη αντιστρεπτά την τρανσφεράση του ενολοπυροσταφυλικού (MurA), η οποία εμποδίζει το σχηματισμό του Ν-ακετυλμουραμικού οξέος που αποτελεί ουσιώδες δομικό στοιχείο του κυτταρικού τοιχώματος. Η φωσφομυκίνη χρησιμοποιείται ευρέως στην Ευρώπη, ωστόσο στις ΗΠΑ είναι εγκεκριμένη για τη θεραπεία μη επιπλεγμένων λοιμώξεων του ουροποιητικού που προκαλούνται από E. faecalis και E. coli (Swaminathan και Alangaden, 2011). Είναι δραστική in vitro εναντίον τόσο Gram θετικών όσο και Gram αρνητικών βακτηρίων και μπορεί να θεωρηθεί ως θεραπευτική επιλογή για τη θεραπεία λοιμώξεων από πολυάντοχα παθογόνα βακτήρια (Rivera και Boucher, 2011). Η δαπτομυκίνη ανήκει σε μια νέα ομάδα αντιμικροβιακών που ανακαλύφθηκε τo Πρόκειται για ένα κυκλικό λιποπεπτίδιο, προϊόν του Streptomyces roseosporus και έχει ταχεία βακτηριοκτόνο δράση έναντι των περισσοτέρων Gram θετικών βακτηρίων συμπεριλαμβανομένων των VRE και των MRSA (Poutsiaka και συν., 2007). Ωστόσο, λόγω μη ύπαρξης ικανοποιητικού αριθμού κλινικών μελετών, η χρήση της είναι περιορισμένη (Rybak και συν., 2000 Pankey και συν., 2005). Επιπρόσθετα, ανθεκτικά στη δαπτομυκίνη στελέχη Enterococcus spp. έχουν αναφερθεί μετά από μακροχρόνια θεραπεία με το συγκεκριμένο αντιμικροβιακό (Munoz-Price και συν., 2005). Μελλοντικές θεραπευτικές επιλογές για την αντιμετώπιση των VRE λοιμώξεων μπορεί να αποτελέσουν οι μαννοπεπτιμυκίνες και η νταλμπαβανσίνη. Οι μαννοπεπτιμυκίνες αποτελούν μια νεώτερη κατηγορία ημισυνθετικών γλυκοπεπτιδίων, που όπως η βανκομυκίνη εμποδίζουν τη τρανσγλυκοσυλίωση των μορίων πεπτιδογλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος. Έχουν in vivo βακτηριοκτόνο δράση έναντι πολλών Gram θετικών βακτηρίων, συμπεριλαμβανομένων των VRE (Ruzin και συν., 2004). Η νταλμπαβανσίνη, ένα άλλο ημισυνθετικό γλυκοπεπτίδιο, μοιάζει με την τεϊκοπλανίνη με την οποία έχει παρόμοια δράση. Το βασικό της πλεονέκτημα είναι ο μεγάλος χρόνος ημίσειας ζωής της με αποτέλεσμα τη χρήση της άπαξ εβδομαδιαίως. Ωστόσο, αν και είναι δραστική έναντι των VRE με φαινότυπο VanB, έχουν ελαττωμένη δραστικότητα έναντι των VRE με φαινότυπο VanA (Streit και συν., 2005). 3.2 Οι VRE στην κοινότητα Η πρώτη ένδειξη για την ύπαρξη δεξαμενής VRE εκτός νοσοκομείων (κοινότητα), ήταν η απομόνωση στελεχών E. faecium με φαινότυπο VanA (VREF) το 1993 από λύματα 66

77 μονάδας επεξεργασίας λυμάτων σε μια μικρή πόλη της Γερμανίας όπου δεν υπήρχε νοσοκομείο καθώς και από ακατέργαστα λύματα, από κρέας κοτόπουλου και από δείγματα κοπράνων από παραγωγικά ζώα και ανθρώπους από την κοινότητα στο Ηνωμένο Βασίλειο (Bates και συν., 1993 Klare και συν., 1993). Ακολούθησε η απομόνωση τέτοιων στελεχών από λύματα και στην Ισπανία (Torres και συν., 1994). H υπόθεση ότι η χρήση της αβοπαρκίνης ως αυξητικού παράγοντα στα παραγωγικά ζώα και στα πτηνά θα μπορούσε να ήταν υπεύθυνη γι αυτήν την ένδειξη, ενισχύθηκε από την απομόνωση στελεχών E. faecium με φαινότυπο VanA (VREF) από δείγματα κοπράνων από χοίρους και πτηνά σε φάρμες που χρησιμοποιούσαν αβοπαρκίνη (Aarestrup, 1995 Klare και συν., 1995a Witte και Klare, 1995 Klare και συν., 1995b). Η επόμενη υπόθεση είχε σχέση με το αν στελέχη VREF μπορούν να φτάσουν στους ανθρώπους μέσω της τροφικής αλυσίδας από μολυσμένα με VREF προϊόντα κρέατος. Πράγματι, προϊόντα όπως φρέσκο ή κατεψυγμένο κοτόπουλο ή γαλοπούλα, βρέθηκαν μολυσμένα σε υψηλούς αριθμούς και επομένως μπορούσαν να μολύνουν άλλα τρόφιμα (π.χ.. λαχανικά ή ωμές σαλάτες) ή την κουζίνα καθαυτή, και επομένως η μετάδοση VREF σε ανθρώπους ήταν εφικτή. Στο πλαίσιο αυτό, το 1994 (κι, ενώ ακόμα χρησιμοποιούνταν αβοπαρκίνη στα παραγωγικά ζώα και πτηνά), ο επιπολασμός των VREF σε υγιείς ανθρώπους από την κοινότητα στη Γερμανία ήταν 12%, ενώ την ίδια περίπου χρονική περίοδο, VREF στελέχη απομονώθηκαν από την κοινότητα και σε άλλες χώρες, όπως η Δανία και η Ολλανδία (Klare και συν., 1995a Aarestrup και συν., 1996 Van der Auwera και συν., 1996 Endtz και συν., 1997 van den Bogaard και συν., 1997). Στις ΗΠΑ, όπου η αβοπαρκίνη δεν έχει ποτέ χρησιμοποιηθεί ως αυξητικός παράγοντας, τα περιστατικά απομόνωσης VRE από ανθρώπους στο εξωνοσοκομειακό περιβάλλον (κοινότητα) είναι πολύ σποραδικά (Cetinkaya και συν., 2000 D'Agata και συν., 2001), ενώ μόλις πρόσφατα απομονώθηκαν και από χοίρους (Donabedian και συν., 2010). Μετά την κατάργηση της αβοπαρκίνης, στη Δανία και Νορβηγία το 1995, στη Γερμανία το 1996 και σε όλη την ΕΕ το 1997, ο επιπολασμός των VRE στα παραγωγικά ζώα, στα προϊόντα κρέατος και στους ανθρώπους της κοινότητας μειώθηκε, τουλάχιστον σε ορισμένες χώρες. Έτσι, στη Γερμανία ο επιπολασμός στους υγιείς ανθρώπους της κοινότητας από 12%, μειώθηκε στο 3% το 1999 (Klare και συν., 1999) δείχνοντας ότι η κατάργηση της αβοπαρκίνης μπορεί να είχε σημαντική επίδραση στη μείωση της δεξαμενής των VRE στους υγιείς ανθρώπους της κοινότητας. Μελέτες στην Ευρώπη έδειξαν ότι ο επιπολασμός των VREF απομονωμένων από κτηνοτρόφους ή εκδοροσφαγείς ή ανθρώπους που εργάζονται στην παραγωγή ή επεξεργασία τροφίμων ζωικής προέλευσης κυμαίνεται από 5%-27,8% 67

78 (Kruse και συν., 1999 Borgen και συν., 2000 van den Bogaard και συν., 2002 del Campo και συν., 2003 Sorum και συν., 2006). Επίσης, o επιπολασμός των VREF απομονωμένων από υγιή άτομα της κοινότητας σύμφωνα με άλλες ευρωπαϊκές μελέτες κυμαίνεται από 0%- 14% (Endtz και συν., 1997 Klare και συν., 1999 Gambarotto και συν., 2000 Balzereit- Scheuerlein και Stephan, 2001 del Campo και συν., 2003 Eisner και συν., 2005 Novais και συν., 2006). Ωστόσο, σε παλαιότερες έρευνες στην Ολλανδία, αμέσως μετά την κατάργηση της αβοπαρκίνης (1997), αναφέρθηκαν ποσοστά VREF 39% σε πτηνοτρόφους, 20% σε πτηνοσφαγείς και 14% σε υγιείς εθελοντές της κοινότητας (van den Bogaard και συν., 1997). Το ποσοστό του αποικισμού του ανθρώπινου εντέρου έχει άμεση σχέση με το βαθμό έκθεσης των ανθρώπων σε ζώα που είναι θετικά σε VRE, και έχουν αναφερθεί ποσοστά από 18%-60% (van den Bogaard και συν., 1997 Kruse και συν., 1999 Stobberingh και συν., 1999 Borgen και συν., 2000). Έτσι, το προσωπικό που εργάζεται σε εκτροφές και σφαγεία φαίνεται να έχει μεγαλύτερο κίνδυνο αποικισμού με VRE. Πράγματι, έχουν αναφερθεί περιπτώσεις μετάδοσης VRE στελεχών από ζώα σε υγιείς ανθρώπους, οι οποίοι βρίσκονται σε άμεση επαφή με ζώα (van den Bogaard και συν., 1997 Simonsen και συν., 1998 Stobberingh και συν., 1999 Hammerum και συν., 2004 Agerso και συν., 2008 Larsen και συν., 2010). Οι διαφορές στον επιπολασμό του αποικισμού με VRE των ανθρώπων της κοινότητας που παρατηρούνται στις παραπάνω μελέτες από τις διάφορες χώρες σχετίζονται, εκτός από το βαθμό έκθεσης στα ζώα, και με τη διάρκεια της χρήσης της αβοπαρκίνης. Έτσι, στη Σουηδία η αβοπαρκίνη καταργήθηκε νωρίς, μόλις το 1986 και στη Νορβηγία η χρήση της διήρκεσε μόνο για 10 χρόνια, με αποτέλεσμα ο επιπολασμός των VRE σε υγιείς ανθρώπους στην κοινότητα να είναι εξαιρετικά χαμηλός (Torell και συν., 1999). Επίσης, και η μέθοδος απομόνωσης των VRE επηρεάζει το αποτέλεσμα, με το στάδιο του εκλεκτικού εμπλουτισμού σε ζωμό να ενισχύει την ανάκτηση των VRE σε σχέση με την απευθείας σπορά σε στερεό υπόστρωμα (βλ. κεφ. 3.3). Επίσης, η χρήση άλλων αυξητικών παραγόντων σε ορισμένες χώρες, (π.χ. τυλοζίνη) έχει βοηθήσει στη συνεπιλογή στελεχών VRE, λόγω της γενετικής σύνδεσης του vana οπερονίου με άλλους γενετικούς καθοριστές (π.χ. γονίδιο erm). Πράγματι, έχει αποδειχθεί η γενετική σύνδεση των γονιδίων των υπεύθυνων για την αντοχή στη βανκομυκίνη (vana) και στα μακρολίδια (erm) (Aarestrup, 2000a Manson και συν., 2004 Lauderdale και συν., 2007). Έτσι, η χρήση των μακρολιδίων μπορεί να βοηθήσει στην επιλογή του εντερικού αποικισμού με VRE που φέρουν vana οπερόνιο γενετικά συνδεδεμένο με το γονίδιο erm. 68

79 Περαιτέρω μοριακές αναλύσεις στελεχών VREF vana από διαφορετικές πηγές (ανθρώπων και ζώων), έδειξαν υψηλή πολυκλωνικότητα καθώς και πολυμορφισμούς του vana οπερονίου, διαφοροποιώντας το σε αρκετούς τύπους. Μερικοί από αυτούς τους τύπους του vana οπερονίου βρέθηκαν κοινοί σε στελέχη VREF από ανθρώπους, πτηνά, χοίρους και άλλες πηγές (Willems και συν., 1999 Klare και συν., 2003 Biavasco και συν., 2007), υποστηρίζοντας τη μετάδοση του vana οπερονίου μεταξύ διαφορετικών πηγών. Επιπρόσθετα, η διαπίστωση λοιμογόνων στελεχών VRE στο κρέας δείχνει την εμπλοκή των τροφίμων και της τροφικής αλυσίδας στην εξάπλωση λοιμογόνων VRE στους ανθρώπους (Biavasco και συν., 2007). Από τα παραπάνω εγείρονται ερωτήματα σχετικά με τη δυνατότητα στελέχη VRE ή τα γονίδια αντοχής τους να φτάσουν στον άνθρωπο μέσω της τροφικής αλυσίδας ή μέσω της επαφής με ζώα συντροφιάς (βλ. κεφ. 3.4). Επιπρόσθετα, ο ρόλος των ζώων ως δεξαμενές μεταδοτικών VRE κλώνων, ο παροδικός ή ο μόνιμος αποικισμός του ανθρώπινου εντέρου με VRE ζωικής προέλευσης και ο επακόλουθος κίνδυνος μεταφοράς γονιδίων αντοχής στην εντερική χλωρίδα, αποτελούν θέματα που ακόμα δημιουργούν προβληματισμό (Phillips και συν., 2004 Phillips, 2007). 3.3 Οι VRE στα παραγωγικά ζώα Τα είδη του γένους Enterococcus αποτελούν μέλη της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου των παραγωγικών ζώων και γενικά θεωρούνται δυνητική δεξαμενή γονιδίων αντοχής που μπορούν να εξαπλωθούν σε παθογόνα και άλλα συμβιωτικά βακτήρια μέσω της τροφικής αλυσίδας (Wang και συν., 2006). Για το λόγο αυτό τα είδη E. faecium και E. faecalis, που απομονώνονται πολύ συχνά από κόπρανα ζώων, χρησιμοποιούνται ως βακτήρια "δείκτες". Τα είδη αυτά έχουν συμπεριληφθεί στις εκθέσεις των προγραμμάτων παρακολούθησης της αντιμικροβιακής αντοχής ως αντιπροσωπευτικά των Gram θετικών βακτηρίων της εντερικής χλωρίδας των ζώων. Επίσης αποτελούν δείκτες της επιλεκτικής πίεσης που ασκείται από τη χρήση των αντιμικροβιακών ουσιών στους πληθυσμούς των βακτηρίων του εντέρου των παραγωγικών ζώων. Για πρώτη φορά, το 1993, αναφέρθηκαν φάρμες των οποίων τα πτηνά και οι χοίροι είχαν αποικιστεί με VREF, ενώ ταυτόχρονα και οι άνθρωποι που εργάζονταν στις παραπάνω φάρμες βρέθηκαν αποικισμένοι με VREF (Bates και συν., 1993). Το 1995, μελέτες από Γερμανία και Ολλανδία αποκάλυψαν παρουσία στελεχών VRE VanA φαινοτύπου σε χοίρους και πτηνά που λάμβαναν αβοπαρκίνη ως αυξητικό παράγοντα (Aarestrup 1995 Klare και συν., 1995b). Η στενή συσχέτιση μεταξύ αβοπαρκίνης και βανκομυκίνης αποδείχθηκε 69

80 γρήγορα μέσω της διασταυρούμενης αντοχής που παρουσίαζαν στελέχη E. faecium και στα δύο γλυκοπεπτίδια (Klare και συν., 1995a Aarestrup και συν., 1996). Επιπρόσθετα, άλλες μελέτες στη Δανία, τη Νορβηγία και την Ιαπωνία επιβεβαίωσαν τη συσχέτιση μεταξύ της χρήσης της αβοπαρκίνης και της εμφάνισης VRE σε πτηνά και χοίρους (Bager και συν., 1997 Yoshimura και συν., 1998 Kruse και συν., 1999). Δεδομένου της συσχέτισης αυτής, η χρήση της αβοπαρκίνης απαγορεύτηκε από την ΕΕ (Οδηγία 97/6). Ως επακόλουθο της κατάργησης της αβοπαρκίνης, ο επιπολασμός των VRE στα παραγωγικά ζώα μειώθηκε. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι σε έρευνα στη Δανία, ο επιπολασμός των VRE στα πουλερικά μειώθηκε από >80% το 1995, σε <5% το 1998 (Bager και συν., 1999), στην Ιταλία σε κρέας κοτόπουλου από 14,6% το 1997, στο 8% το 1998 (Pantosti και συν., 1999) και στη Γερμανία σε κρέας πουλερικών ο επιπολασμός μειώθηκε από το 100% το 1994, στο 26% το 1997 (Klare και συν., 1999). Ωστόσο, μελέτες στη Δανία, τη Νορβηγία, τη Σουηδία και το Ηνωμένο Βασίλειο, έδειξαν υψηλό επιπολασμό των VREF με φαινότυπο VanA, 3-8 χρόνια μετά κατάργηση της αβοπαρκίνης υπογραμμίζοντας την εμμονή τους στο περιβάλλον των εκτροφών (Borgen και συν., 2000 Heuer και συν., 2002 Garcia-Migura και συν., 2005 Johnsen και συν., 2005 Sorum και συν., 2006 Nilsson και συν., 2009). Επιπρόσθετα, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η αύξηση στον επιπολασμό των VREF μπορεί να σχετίζεται με την εξάπλωση μεμονωμένων κλώνων στελεχών E. faecium που φέρουν το vana γονίδιο (Nilsson και συν., 2009). Οι προαναφερθείσες μελέτες αναφέρουν επίσης ότι η vana αντοχή στα ζώα είναι πιο συχνή σε στελέχη E. faecium σε σύγκριση με στελέχη E. faecalis. Σύμφωνα με πρόσφατα επιδημιολογικά στοιχεία (EFSA, 2012) για το 2010, 7 χώρες μέλη της Ευρωπαϊκής Ένωσης (ΕΕ) και 1 χώρα μη μέλος (Ελβετία) κατέγραψαν δεδομένα για την αντοχή έναντι των αντιμικροβιακών των στελεχών εντεροκόκκων απομονωμένων από ορνιθοειδή, χοίρους και βοοειδή. Μόνο 2 χώρες (Δανία και Σουηδία) ανέφεραν αποτελέσματα αντοχής από εντερόκοκκους και από κρέας. Τα ποσοστά αντοχής στελεχών VREF που αναφέρθηκαν ήταν 0,3% σε ορνίθια, 0,9% σε χοίρους και 0% στα βοοειδή, ενώ αντίστοιχα τα ποσοστά αντοχής στελεχών VREFL ήταν 0,7%, 0% και 0,6 %, αντίστοιχα (Πίνακες 3.2 και 3.3). Οι μεγάλες αποκλίσεις που παρατηρούνται στα ποσοστά επιπολασμού οφείλονται μεταξύ άλλων (βλ. κεφ 3.2), και στη χρήση ή όχι εκλεκτικών ή μη μεθόδων απομόνωσης VRE. Επειδή η συγκέντρωση των VRE ανά γραμμάριο κοπράνων συγκρινόμενη με την ολική συγκέντρωση εντεροκόκκων είναι πολύ χαμηλή (Kempf και συν., 2008 DANMAP, 2010), αυτό έχει ως συνέπεια, η χρήση μη εκλεκτικών μεθόδων απομόνωσης VRE, όπως η 70

81 απευθείας σπορά σε εκλεκτικό στερεό υπόστρωμα, να οδηγεί στην απομόνωση χαμηλότερων πληθυσμών VRE, αποτυγχάνοντας να ανιχνεύσει εκείνους τους φορείς που φέρουν VRE σε χαμηλούς πληθυσμούς (Heuer και συν., 2002 Domig και συν., 2003α). Με την εφαρμογή του εμπλουτιστικού σταδίου στις μεθόδους απομόνωσης των VRE (εκλεκτικός ζωμός ενισχυμένος με βανκομυκίνη), ανιχνεύονται υψηλότεροι πληθυσμοί VRE, αντικατοπτρίζοντας έτσι πιο ρεαλιστικά τον πραγματικό επιπολασμό τους (Ieven και συν., 1999 Novicki και συν., 2004). Έτσι λοιπόν, σε αντίθεση με τα στοιχεία της EFSA, μεμονωμένα επιδημιολογικά στοιχεία από διάφορες ευρωπαϊκές χώρες, με βάση τα Εθνικά Προγράμματα Επιτήρησης της Αντιβιοαντοχής, αναφέρουν ποσοστά επιπολασμού των VREF σε πουλερικά από 0%-23%, πιο συγκεκριμένα 0,9% στην Ολλανδία (MARAN, 2009), 1,2% στην Ισπανία (VAV, 2005), 9,3% στην Ιταλία (ITAVARM, 2003), 1,6% στη Γαλλία (Kempf και συν., 2008), 0% στη Δανία και τη Νορβηγία (DANMAP, 2010 NORM/NORM-VET, 2010), 23% στη Σουηδία (SVARM, 2010). Επίσης ποσοστό επιπολασμού VREF 42,4% αναφέρθηκε στην Αυστρία (Eisner και συν., 2005), ενώ επιπλέον παρουσία VREF έχει αναφερθεί και στην Πορτογαλία (Novais και συν., 2005a). Στην Τουρκία, πρόσφατα παρατηρήθηκε σε εντερόκοκκους που απομονώθηκαν από δείγματα πουλερικών, απουσία γονιδίων vana και vanb (Kasimoglu- Dogru και συν., 2010). Επιπρόσθετα, στη Ν. Ζηλανδία αναφέρεται ποσοστό επιπολασμού των VRE ίσο με 5,8%, αλλά με κυρίαρχο είδος το E. faecalis (Manson και συν., 2003b), και στην Κόστα-Ρίκα 14,8%, με κυρίαρχο είδος το E. faecium (Bustamante και συν., 2003). Ωστόσο, ακόμα παλαιότερες μελέτες αμέσως μετά την κατάργηση της αβοπαρκίνης αναφέρουν ποσοστά επιπολασμού μέχρι και 88,1% (Bager και συν., 1999 Klare και συν., 1999 Pantosti και συν., 1999 van den Bogaard και συν., 2000 Aarestrup και συν., 2001 Garcia-Migura και συν., 2005 Sorum και συν., 2006 Nilsson και συν., 2009). VRE έχουν αναφερθεί σε πουλερικά και στην Ασία. Συγκεκριμένα, σε μελέτη στην Ταϊβάν, μετά την κατάργηση της αβοπαρκίνης (2000), το ποσοστό των VRE μειώθηκε από 13,7% (2000) στο 3,7% (2003) για το E. faecalis, και από 3,4% (2000) στο 0% (2003) για το E. faecium. Επίσης, το ποσοστό των θετικών VRE πτηνοτροφείων μειώθηκε από 25% (2000) στο 8,8% (2003) (Lauderdale και συν., 2007). Στην Κορέα, 4 χρόνια μετά την κατάργηση της αβοπαρκίνης (1997), VREF απομονώθηκαν από το 16,7% των δειγμάτων κρέατος πουλερικών (Lim και συν., 2006). Επίσης, η παρουσία VRE έχει αναφερθεί σε πουλερικά στη Μαλαισία (Radu και συν., 2001) και στην Ιαπωνία (Ozawa και συν., 2002 Tanimoto και συν., 2005). 71

82 Σε ό,τι αφορά τον επιπολασμό των VREF στους χοίρους, κυμαίνεται από 0%-23,3% και πιο συγκεκριμένα, 0% σε Νορβηγία (NORM/NORM-VET, 2010) και Σουηδία (SVARM, 2010), 6,2% στη Γαλλία (Kempf και συν., 2008), 1% στη Δανία (DANMAP, 2010), 10% στην Ιταλία (ITAVARM, 2003), 1,2% στην Ισπανία (VAV, 2005), 1% στην Ολλανδία (MARAN, 2009) και 23,3% στην Αυστρία (Eisner και συν., 2005). Επίσης, πρόσφατα αναφέρθηκε επιπολασμός των VREF σε χοίρους στην Πορτογαλία 25,3% (Ramos και συν., 2012), 1,9% στην Κορέα (Lim και συν., 2006), 10,9% στην Κόστα-Ρίκα (Bustamante και συν., 2003) αλλά και στις ΗΠΑ, σε ποσοστό 10,9% (Donabedian και συν., 2010), ενώ η παρουσία VREF στους χοίρους έχει καταγραφεί και στην Ελβετία (Boerlin και συν., 2001). Σε ό,τι αφορά το ποσοστό επιπολασμού VREF στα βοοειδή, κυμαίνεται από 0%- 21,6%, και συγκεκριμένα 0% στη Δανία (DANMAP, 2010), Πορτογαλία (Ramos και συν., 2012), Κορέα (Lim και συν., 2006) και Κόστα-Ρίκα (Bustamante και συν., 2003), 6,6% στην Ιταλία (ITAVARM, 2003) και 21,6% στην Αυστρία (Eisner και συν., 2005). Πίνακας 3.2. Αντοχή (%) στην βανκομυκίνη στελεχών Enterococcus faecium (VREF) από ορνίθια, χοίρους και βοοειδή για το Πηγή: EFSA, 2012 * ΧΩΡΑ ΟΡΝΙΘΙΑ ΧΟΙΡΟΙ ΒΟΟΕΙΔΗ N % R N % R N % R ΑΥΣΤΡΙΑ ΔΑΝΙΑ ΓΑΛΛΙΑ 190 0, ΕΣΘΟΝΙΑ ΦΙΛΑΝΔΙΑ ΟΛΛΑΝΔΙΑ 215 0, ΣΟΥΗΔΙΑ ΣΥΝΟΛΟ 675 0, , ΕΛΒΕΤΙΑ N= ο αριθμός των στελεχών Enterococcus faecium που μελετήθηκαν % R = το ποσοστό των ανθεκτικών στελεχών. * Όριo αντοχής (breakpoints,μg/ml) βανκομυκίνης 4μg/ml 72

83 Πίνακας 3.3. Αντοχή (%) στην βανκομυκίνη στελεχών Enterococcus faecalis (VREFL) από ορνίθια, χοίρους και βοοειδή για το Πηγή: EFSA, 2012 * ΧΩΡΑ ΟΡΝΙΘΙΑ ΧΟΙΡΟΙ ΒΟΟΕΙΔΗ N % R N % R N % R ΑΥΣΤΡΙΑ ΔΑΝΙΑ ΓΑΛΛΙΑ ΟΛΛΑΝΔΙΑ ΣΟΥΗΔΙΑ ΦΙΛΑΝΔΙΑ ΣΥΝΟΛΟ 548 0, ,6 ΕΛΒΕΤΙΑ N= ο αριθμός των στελεχών Enterococcus faecalis που μελετήθηκαν % R = το ποσοστό των ανθεκτικών στελεχών. * Όριo αντοχής (breakpoints,μg/ml) βανκομυκίνης 4μg/ml 3.4 Οι VRE στα ζώα συντροφιάς Λόγω της πολύ στενής επαφής μεταξύ ζώων συντροφιάς και ανθρώπων, η πιθανότητα μεταφοράς βακτηρίων και επομένως και εντεροκόκκων ή ακόμα και οριζόντιας μεταφοράς γενετικών στοιχείων είναι πολύ υψηλή (Simjee και συν., 2002 Guardabassi και συν., 2004 Ghosh και συν., 2012). Η ανίχνευση στελεχών VRE σε δείγματα κοπράνων από κατοικίδιους σκύλους και γάτες στην Ευρώπη σχετίστηκε με την κατανάλωση μολυσμένων τροφίμων (Devriese και συν., 1996 van Belkun και συν., 1996). Όπως υφίσταται η πιθανότητα της μετάδοσης στελεχών VRE VanA μεταξύ παραγωγικών ζώων και ανθρώπων, το ίδιο ισχύει και στην περίπτωση του αποικισμού των ζώων συντροφιάς με VRE. Έχει αποδειχθεί ότι υγιή ζώα συντροφιάς φέρουν ανθεκτικά σε αντιμικροβιακά στελέχη εντεροκόκκων, τα οποία σχετίζονται με ανθρώπινες λοιμώξεις και επομένως μπορεί να διασκορπίζουν τέτοια στελέχη στο περιβάλλον (Guardabassi και συν., 2004 Damborg και συν., 2009 Jackson και συν., 2009). Πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι εντεροκοκκικά στελέχη σκύλων ανήκαν στον ανθρώπινο νοσοκομειακό κλωνικό σύμπλεγμα CC17 (Ghosh και συν., 2011), επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα της AFLP ανάλυσης, με την οποία οι σκύλοι και οι γάτες θεωρούνται μια πιθανή πηγή VRE για τους νοσηλευόμενους ασθενείς λόγω ομοιότητας των AFLP προτύπων μεταξύ ανθρώπινων κλινικών στελεχών και στελεχών από ζώα συντροφιάς (Willems και συν., 2000). Επιπρόσθετα, στη Ν. Ζηλανδία ένα στέλεχος VREFL απομονωμένο από μαστίτιδα σκύλου βρέθηκε να είναι μη διακριτό, με βάση τη PFGE από ανθρώπινα στελέχη και στελέχη πτηνών (Manson και συν., 2003a). Επίσης, στελέχη VREF 73

84 έχουν εμπλακεί σε χολαγγειοηπατίτιδα γάτας (Pressel και συν., 2005). Έχει βρεθεί γενικά ότι VRE στελέχη απομονωμένα από σκύλους φέρουν το vana οπερόνιο και εμφανίζουν αντοχή σε διάφορα αντιμικροβιακά όπως τα μακρολίδια, η τετρακυκλίνη και οι αμινογλυκοσίδες (Simjee και συν., 2002 Torres και συν., 2003 Herrero και συν., 2004). Συνεπώς, αν και η βανκομυκίνη δε χρησιμοποιείται φυσιολογικά στην κτηνιατρική των μικρών ζώων, στελέχη VRE πιθανώς να συνεπιλέγονται από τη χρήση τέτοιων αντιμικροβιακών. 3.5 Οι VRE στην Ελλάδα Σύμφωνα με επικαιροποιημένα επιδημιολογικά στοιχεία, η Ελλάδα εμφανίζει ένα από τα υψηλότερα ποσοστά επιπολασμού κλινικών στελεχών VREF (22,5%) μεταξύ των χωρών της ΕΕ, καταλαμβάνοντας την 3 η θέση μετά την Ιρλανδία και την Πορτογαλία (βλ. κεφ. 3.1, Πίνακας 3.1). Ωστόσο, το ποσοστό βαίνει διαρκώς μειούμενο τα τελευταία χρόνια, με χαρακτηριστικό το γεγονός ότι το 2006 ο επιπολασμός των νοσοκομειακών VREF ήταν 42,5%, ποσοστό σχεδόν διπλάσιο από αυτό του 2010 (βλ. Εικόνα 3.3, Πίνακα 3.4). Σε ό,τι αφορά τον επιπολασμό των VREFL, η Ελλάδα είναι 1 η μεταξύ των χωρών της ΕΕ [The European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net) interactive database, με ποσοστό 2,8%, αλλά με σαφώς μειωμένες τάσεις την τελευταία τετραετία (Πίνακας 3.5). Ο VanA τύπος επικρατεί μεταξύ κλινικών στελεχών VREF που προέρχονται από τις ΜΕΘ και άλλα τμήματα των ελληνικών νοσοκομείων (Kouppari και συν., 2000 Demertzi και συν., 2001 Maniatis και συν., 2001 Kalocheretis και συν., 2004 Kolonitsiou και συν., 2004 Sofianou και συν., 2004 Gikas και συν., 2005 Metallidis και συν., 2006 Souli και συν., 2009 Protonotariou και συν., 2010). Ωστόσο, από νοσοκομεία έχουν απομονωθεί και οι VanB και VanC φαινότυποι καθώς και άλλα είδη VRE (E. faecalis, E. gallinarum, E. casseliflavus/flavescens) (Christidou και συν., 2004 Gikas και συν., 2005 Metallidis και συν., 2006). Επιπρόσθετα, VRE καθώς και υψηλά ποσοστά επιπολασμού VREF έχουν αναφερθεί σε χοίρους και σε αστικά και νοσοκομειακά λύματα στην Ελλάδα (Kotzamanidis και συν., 2009 Gousia και συν., 2011). Επίσης, πρόσφατα έχει αναφερθεί η απομόνωση VRE με χαμηλό επίπεδο αντοχής στη βανκομυκίνη, σε παράκτια ύδατα του Θερμαϊκού Κόλπου (Zdragas και συν., 2008). Τέλος, εντερόκοκκοι με αντοχή σε άλλες αντιμικροβιακές ουσίες, όπως ερυθρομυκίνη, ριφαμπικίνη και αμινογλυκοσίδες, έχουν απομονωθεί σε νοσοκομεία και κολυμβητικά ύδατα (Pournaras και συν., 2000 Arvanitidou και συν., 2001). 74

85 Πίνακας 3.4. Αντοχή νοσοκομειακών στελεχών VREF στην Ελλάδα, για τη χρονολογική περίοδο Πηγή: EARS-Net, Net/database/Pages/database.aspx Πίνακας 3.5. Αντοχή στην βανκομυκίνη νοσοκομειακών στελεχών Enterococcus faecalis στην Ελλάδα, για τη χρονολογική περίοδο Πηγή: EARS-Net, 75

86 76

87 ΜΕΡΟΣ ΙΙ ΔΙΚΗ ΜΑΣ ΕΡΕΥΝΑ Κύριος στόχος της έρευνας ήταν i) η διερεύνηση του επιπολασμού των VRE στα παραγωγικά ζώα (πτηνά, χοίρους, βοοειδή) στον Ελλαδικό χώρο καθώς και σε άτομα που σχετίζονταν με αυτά (πτηνοσφαγείς και εκδοροσφαγείς) και ο προσδιορισμός του van γενότυπου αυτών και ii) η αξιολόγηση της επιδημιολογικής τους συσχέτισης με κλινικά VRE στελέχη απομονωμένα από νοσηλευμένους ασθενείς, με βάση αφενός το προφίλ της αντιμικροβιακής τους αντοχής (antimicrobial resistance profiles, ARPs) και αφετέρου τα γενοτυπικά τους χαρακτηριστικά - κλωνικότητα με την εφαρμογή της μοριακής μεθόδου της ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο πεδίο (Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE). Για την επίτευξη των επιστημονικών στόχων της διατριβής, προγραμματίστηκαν και εκτελέστηκαν τρεις βασικές επιμέρους μελέτες: α) ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΕΠΙΠΟΛΑΣΜΟΥ ΤΩΝ VRE ΣΤΕΛΕΧΩΝ. β) ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ/ΑΝΤΟΧΗΣ ΤΩΝ VRE ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΣΤΑ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΚΑΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ (DISCRIMINANT ANALYSIS) ΤΩΝ ΠΡΟΦΙΛ ΤΗΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ (ANTIMICROBIAL RESISTANCE PROFILS, ARPs) ΤΩΝ VREF ΣΤΕΛΕΧΩΝ. γ) ΓΕΝΟΤΥΠΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΚΛΩΝΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ VREF ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΣΕ ΠΑΛΛΟΜΕΝΟ ΠΕΔΙΟ (PULSED-FIELD GEL ELECTROPHORESIS, PFGE). 77

88 78

89 4 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 Υλικά Δειγματοληπτικό υλικό για την απομόνωση VRE στελεχών Με σκοπό την απομόνωση στελεχών εντεροκόκκων, δείγματα περιεχομένου εντέρου ή δείγματα κοπράνων λήφθηκαν από υγιή πτηνά και ζώα ή από ανθρώπους, αντίστοιχα. Συγκεκριμένα τα δείγματα που λαμβάνονταν ήταν: α) Ολόκληρο το τυφλό έντερο ορνιθίων κρεοπαραγωγής συλλέγονταν κατά τη στιγμή της σφαγής τους και τοποθετούνταν, σε ξεχωριστό περιέκτη. Η συλλογή των δειγμάτων (τυφλών) γινόταν με τη μέθοδο της συστηματικής δειγματοληψίας. β) Περιεχόμενο παχέως (τυφλού) εντέρου λαμβάνονταν από μόσχους ή χοίρους κατά τη σφαγή τους και τοποθετούνταν για κάθε ζώο ξεχωριστά, σε αποστειρωμένα φιαλίδια. Η συλλογή των δειγμάτων γινόταν με απλή τυχαία δειγματοληψία (χρήση πίνακα τυχαίων αριθμών). γ) Δείγματα κοπράνων λαμβάνονταν από το προσωπικό, από πτηνοσφαγείς και εκδοροσφαγείς, των σφαγείων στα οποία γινόταν δειγματοληψία στα ορνίθια ή τους χοίρους και τους μόσχους, αντίστοιχα, και τοποθετούνταν σε αποστειρωμένα φιαλίδια. Η συλλογή των παραπάνω παθολογικών υλικών γινόταν όσο το δυνατό με άσηπτο τρόπο για την αποφυγή επιμολύνσεων. Αμέσως μετά τη συλλογή οι περιέκτες (σακούλες και φιαλίδια) διατηρούνταν στους 4 ο C. Η μεταφορά των δειγμάτων στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Λοιμωδών Νοσημάτων της Κτηνιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ) πραγματοποιούνταν σε ισοθερμικούς περιέκτες σε θερμοκρασία ψυγείου και στο συντομότερο δυνατό μετά τη λήψη τους χρόνο Κλινικά στελέχη VRE Συνολικά 63 στελέχη εντεροκόκκων που απομονώθηκαν από κλινικά δείγματα από νοσηλευόμενους ασθενείς, ενήλικες και νεογνά, του Ιπποκράτειου Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης και του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Λάρισας χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Τα κλινικά στελέχη είχαν απομονωθεί από κόπρανα, αίμα, ούρα, ασκίτη ή ΕΝΥ και είχαν ταυτοποιηθεί με τη δοκιμή API Strep 79

90 (Biomerieux, France) και με τον αυτόματο αναλυτή VITEK 2 της BioMerieux (Mercy L Etoile, France). Τα δείγματα των ενηλίκων ασθενών συλλέχθηκαν κατά τη χρονική περίοδο μεταξύ Ιανουαρίου 2006 και Νοεμβρίου 2009, ενώ εκείνα των νεογνών κατά τη διάρκεια μιας επιδημίας που εμφανίστηκε στο Ιπποκράτειο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης τον Ιούλιο Στελέχη αναφοράς Enterococcus spp. Ως στελέχη αναφοράς για τις συγκρίσεις των στελεχών που απομονώθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν: α) Τα στελέχη Enterococcus faecalis ATCC και Staphylococcus aureus ATCC 25923, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως στελέχη μάρτυρες κατά την εκτέλεση των δοκιμών Kirby-Bauer και MIC. β) VRE στελέχη αναφοράς του Ινστιτούτου Pasteur (Paris-France): E. faecium BM4147 (vana), E. faecalis V583 (vanb), Ε. gallinarum BM4174 (vanc1), Ε. faecium BM4339 (vand), Ε. faecalis BM4405 (VanE ), Ε. faecalis BM4518 (vang), χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες κατά την εκτέλεση της PCR Υλικά-Υποστρώματα απομόνωσης και καλλιέργειας των VRE στελεχών Enterococcosel Broth- Εκλεκτικός ζωμός Για τον εκλεκτικό πολλαπλασιασμό των ανθεκτικών στη βανκομυκίνη εντεροκόκκων (VRE) χρησιμοποιήθηκε το υλικό (ζωμός) Enterococcosel Broth (van Horn και συν., 1996 Teixeira και συν., 2007) της εταιρείας Beckton Diginson (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD), που έχει την παρακάτω σύνθεση (ανά λίτρο υλικού): Pagreatic Digest of Casein 17 g Peptic Digest of Animal Tissue 3 g Yest extract 5 g Oxgall 10 g Sodium Chloride 5 g Sodium Citrate 1 g Esculine 1 g 80

91 Ferric Ammonium Citrate 0,5 g Sodium Azide 0,25 g Στο υλικό η εσκουλίνη (esculine) χρησίμευε για την ανίχνευση της υδρόλυσής της από τους εντερόκοκκους, ο κιτρικός σίδηρος (ferric ammonium citrate) για την παροχή ιόντων σιδήρου, τα χολικά άλατα (oxgall) για την αναστολή της ανάπτυξης των Gram θετικών βακτηρίων πλην των εντεροκόκκων και το αζίδιο του νατρίου (sodium azide) για την αναστολή των Gram αρνητικών βακτηρίων. Η εσκουλίνη παράγει με την υδρόλυσή της από τους εντερόκοκκους, γλυκόζη και εσκουλετίνη. Η εσκουλετίνη αντιδρά με τα ιόντα σιδήρου και παράγει σκούρο καφέ ή μαύρο χρώμα στο υπόστρωμα επιτρέποντας την αναγνώριση των εντεροκόκκων (Isenberg, 2004). To ph του ζωμού ήταν 7,1 ± 0,2 στους 25 ο C. Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 43 g έτοιμης σκόνης σε 1 lt απεσταγμένου νερού σε θερμοκρασία βρασμού για να επιτευχθεί πλήρης διάλυση της σκόνης. Ακολουθούσε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 ο C για 15 min. Στο παραπάνω διάλυμα, μετά την αποστείρωση και την πτώση της θερμοκρασίας του στους 45 ο C σε υδατόλουτρο, γινόταν προσθήκη του αντιβιοτικού βανκομυκίνη (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo, USA). Η αποστείρωση με διήθηση του διαλύματος του παραπάνω αντιβιοτικού γινόταν με συσκευή διήθησης υγρών (Vacuum Manifold Nalgene M46664 και Nalgene for 47mm filter F2036). Χρησιμοποιούνταν μικροβιοκρατή φίλτρα με διάμετρο πόρων 0,2 μm (Supor 200-Gelman Laboratory ). Η ανάμειξη του διαλύματος της βανκομυκίνης γινόταν σε αναδευτήρα (stirrer) τύπου Drehzahl Heidolph με τη βοήθεια ειδικού αποστειρωμένου μαγνήτη τύπου Plastilab Kartell μεγέθους 4,5 x 15 mm (Ancoretta Magnetica). Το διάλυμα της βανκομυκίνης ήταν πυκνότητας 6 mg/ml απεσταγμένου νερού και από το διάλυμα αυτό προσθέτονταν 1 ml σε 999 ml ζωμού Enterococcosel Broth, ώστε η τελική συγκέντρωση του να είναι 6 μg/ml. Η διανομή του υλικού γινόταν, υπό άσηπτες συνθήκες, σε στείρους δοκιμαστικούς σωλήνες 16 x 160 mm, ανά 10 ml, και διατηρούνταν στους 4 ο C Enterococcosel Agar-Εκλεκτικό άγαρ Έχει την ίδια σύνθεση με το Enterococcosel broth και επιπλέον περιέχει άγαρ (13,5g ανά λίτρο υποστρώματος, BD Diagnostic Systems, Sparks, MD). Η διαδικασία της παρασκευής του υποστρώματος και της προσθήκης της βανκομυκίνης ήταν η ίδια με αυτήν του Enterococcosel Broth (βλ ). Μετά την αποστείρωση και την πτώση της θερμοκρασίας του υποστρώματος στους 45 ο C σε υδατόλουτρο, γινόταν η διανομή του σε 81

92 τρυβλία πετρί διαμέτρου 100 mm. Μετά την πήξη του υποστρώματος, τα τρυβλία διατηρούνταν στους 4 ο C. Το εκλεκτικό υπόστρωμα Enterococcosel Agar εμπλουτισμένο με βανκομυκίνη (Sigma Chemical Co., St Louis, Mo, USA) σε συγκέντρωση 6μg/ml, επιτρέπει τον πολλαπλασιασμό των ανθεκτικών στη βανκομυκίνη εντεροκόκκων (VRE) και σε συνδυασμό με το Enterococcosel Broth (παρ ), αποτελεί την πιο ευαίσθητη και ευρύτατα διαδεδομένη μέθοδο απομόνωσης των VRE (Ieven και συν., 1999 Teixeira και συν., 2007) Brain Heart Infusion Agar Το εμπλουτιστικό υπόστρωμα Brain Heart Infusion Agar (Merck, KGaA, Germany) χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα ανακαλλιέργειας των απομονωθέντων εντεροκόκκων από τα εκλεκτικά υποστρώματα, με την παρακάτω σύνθεση (ανά λίτρο υλικού): Nutrient substrate (brain heart, heart extract and peptones) 27,5 g D(+)glucose 2 g Sodium chloride 5 g di-sodium hydrogen phosphate 2,5 g Agar-agar 15 g To ph του ζωμού ήταν 7,4 ± 0,2 στους 25 ο C. Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 52 g έτοιμης σκόνης σε 1 lt απεσταγμένου νερού, μέχρι για να επιτευχθεί πλήρης διάλυση της σκόνης. Ακολουθούσε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 ο για 15 min. Μετά την αποστείρωση και την πτώση της θερμοκρασίας του θρεπτικού υποστρώματος στους 45 ο C, σε υδατόλουτρο, γινόταν η διανομή σε τρυβλία πετρί διαμέτρου 100 mm. Μετά την πήξη του υποστρώματος, τα τρυβλία διατηρούνταν στους 4 ο C Brain Heart Infusion Broth Ο ζωμός Brain Heart Infusion (Merck, KGaA, Germany) χρησιμοποιήθηκε ως υλικό των VRE στελεχών για την εκχύλιση και την in situ προετοιμασία του DNA. Επίσης χρησιμοποιήθηκε ως συστατικό του μέσου συντήρησης καλλιεργειών εντεροκόκκων σε βαθειά κατάψυξη (βλ. παρακάτω 4.1.6) καθώς και ως υλικό βιοχημικής ταυτοποίησης των εντεροκόκκων (βλ. παρακάτω και ). Έχει την ίδια σύνθεση με το Brain Heart Infusion Agar με τη διαφορά ότι δεν περιέχει άγαρ. Η διαδικασία της παρασκευής του υποστρώματος ήταν η ίδια με αυτήν του Brain Heart Infusion Agar (βλ ). Η διανομή 82

93 του υλικού γινόταν, σε στείρους δοκιμαστικούς σωλήνες 16 x 160 mm, ανά 10 ml. Ακολουθούσε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 ο C για 15 min και εν συνεχεία, διατήρηση στους 4 ο C Υλικά Βιοχημικής ταυτοποίησης των VRE στελεχών Ζωμός Phenol Red Broth Base Χρησιμοποιήθηκε ο ζωμός Phenol Red Broth Base (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD) με την παρακάτω σύνθεση (ανά λίτρο υλικού): Pancreatic Digest of Casein 10 g Sodium Chloride 5 g Phenol Red 0,018 g To ph του ζωμού ήταν 7,4 ± 0,2 στους 25 ο C. Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 15,018 g έτοιμης σκόνης σε 1 λίτρο απεσταγμένου νερού, μέχρι να επιτευχθεί πλήρης διάλυση. Ακολουθούσε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 ο C για 15 min. Ο ζωμός χρησιμοποιούνταν ως βάση για την προσθήκη σακχάρων σε τελική συγκέντρωση 0,5% και τον προσδιορισμό των βιοχημικών αντιδράσεων ζύμωσης. Συγκεκριμένα, μετά την αποστείρωση του ζωμού και την πτώση της θερμοκρασίας του στους 45 ο C, γινόταν η προσθήκη του σακχάρου αφού είχε προηγηθεί η αποστείρωση με διήθηση διαλύματος 10% του σακχάρου με συσκευή διήθησης υγρών (Vacuum Manifold Nalgene M46664 και Nalgene for 47mm filter F2036) και μικροβιοκρατή φίλτρα με διάμετρο πόρων 0,2 μm (Supor 200-Gelman Laboratory ). Το διάλυμα του σακχάρου ήταν 10% κ.ο. και από το διάλυμα αυτό προσθέτονταν 0,5 ml se 10 ml ζωμού Phenol Red Broth Base, ώστε η τελική συγκέντρωση του να είναι 0,5%. Η διανομή του υλικού γινόταν, υπό άσηπτες συνθήκες, σε δοκιμαστικούς σωλήνες 16 x 160 mm, ανά 10 ml, και εν συνεχεία, διατηρούνταν στους 4 ο C Σάκχαρα και ουσίες για τον προσδιορισμό των αντιδράσεων ζύμωσης Οι παρακάτω ουσίες και σάκχαρα της εταιρείας Beckton-Dickinson (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD) χρησιμοποιήθηκαν για τη βιοχημική ταυτοποίηση των εντεροκόκκων: χολή 40%, L-αραβινόζη, μαννιτόλη, σορβόζη, D-σορβιτόλη, σακχαρόζη, λακτόζη, ριβόζη, D- 83

94 ραφινόζη, μέθυλο-α-d-γλυκοπυρανοσίδη, αργινίνη, πυροσταφυλικό οξύ (Manero και Blanch, 1999) Brain Heart Infusion Broth με περιεκτικότητα σε NaCl 6,5% Το υλικό Brain Heart Infusion Broth (βλ ), στο οποίο προστίθονταν ανάλογη ποσότητα NaCl (60g NaCl για την παρασκευή 1 lt υποστρώματος) ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 6,5%, χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των εντεροκόκκων. Η παρασκευή, η αποστείρωση και η ρύθμιση του ph γινόταν σύμφωνα με την παράγραφο Brain Heart Infusion Broth με τελική τιμή ph 9,6 Το υλικό αυτό χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των εντεροκόκκων. Η παρασκευή και η αποστείρωση γινόταν σύμφωνα με την παράγραφο Μετά την αποστείρωση το ph ρυθμιζόταν ώστε η τελική τιμή να είναι 9, Ζωμός Trypticase Soy Broth Χρησιμοποιήθηκε ζωμός Trypticase Soy Broth (Merck, KGaA, Germany) για τον έλεγχο της κινητικότητας των VRE, με την παρακάτω σύνθεση (ανά λίτρο υποστρώματος): Casein peptone (pancreatic) 17 g Soya peptone (papain digest.) 3 g Sodium chloride 5 g Dipotassium hydrogen phosphate 2,5 g Glucose 2,5 g To ph ήταν 7,3 ± 0,2 στους 37 ο C. Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 30 g έτοιμης σκόνης σε 1 lt απεσταγμένου νερού, μέχρι για να επιτευχθεί πλήρης διάλυση της σκόνης. Η διανομή του υλικού γινόταν, σε στείρους δοκιμαστικούς σωλήνες 16 x 160 mm, ανά 10 ml. Ακολουθούσε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 ο για 15 min και εν συνεχεία, διατηρούνταν στους 4 ο C. 84

95 Trypticase Soy Agar Χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα Trypticase Soy Agar (Merck, KGaA, Germany) για την ανακαλλιέργεια των εντεροκόκκων μεσκοπό την εφαρμογή της Kirby-Bauer. Είχε την ίδια σύνθεση με το Trypticase Soy Broth, και επιπλέον περιείχε και agar-agar σε αναλογία 15 g ανά λίτρο υποστρώματος Υλικό συντήρησης των VRE στελεχών Με σκοπό τη συντήρηση των καλλιεργειών των εντεροκόκκων χρησιμοποιήθηκε ο εμπλουτιστικός ζωμός Brain Heart Infusion (βλ ). Συγκεκριμένα, σε στείρο eppendorf προστίθονταν 0,8 ml υγρής καλλιέργειας εντεροκόκκων 24ωρης καλλιέργειας σε ζωμό Brain Heart Infusion, καθώς και 0,2 ml αποστειρωμένης γλυκερόλης, έτσι ώστε η αναλογία της γλυκερόλης στο υλικό συντήρησης να ήταν 20% κ.ο. Ακολουθούσε η συντήρηση σε βαθειά κατάψυξη (-80 o C) Υλικά για τη διενέργεια του ελέγχου της ευαισθησίας των VRE στελεχών με τη μέθοδο Kirby-Bauer Υπόστρωμα Mueller-Hinton Χρησιμοποιήθηκε το υπόστρωμα Mueller-Hinton (Beckton Dickinson, Cockeysville, MD, USA) για τον έλεγχο της ευαισθησίας των απομονωθέντων εντεροκόκκων σε 14 αντιμικροβιακές ουσίες με τη μέθοδο Kirby Bauer, με την παρακάτω σύνθεση (ανά λίτρο υποστρώματος): Beef Extract 2 g Acid Hydrolysate of Casein 17,5 g Starch 1,5 g Agar 17 g To ph ήταν 7,3 ± 0,2 στους 37 ο C. Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 38 g έτοιμης σκόνης σε 1 lt απεσταγμένου νερού, μέχρι να επιτευχθεί πλήρης διάλυση της. Ακολουθούσε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 ο C για 15 min. Μετά την αποστείρωση και την πτώση της θερμοκρασίας του θρεπτικού υποστρώματος στους 45 ο C, σε υδατόλουτρο, 85

96 γινόταν η διανομή σε τρυβλία πετρί διαμέτρου 100 mm. Μετά την πήξη του υποστρώματος, τα τρυβλία διατηρούνταν στους 4 ο C Δισκία αντιμικροβιακών ουσιών Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα δισκία του οίκου Beckton Dickinson, Cockeysville, MD, USA: βανκομυκίνη (30 μg), τεϊκοπλανίνη (30 μg), βακιτρακίνη (10IU), αμπικιλλίνη (10μg), πενικιλλίνη (10IU), γενταμυκίνη (120μg), στρεπτομυκίνη (300μg), νεομυκίνη (30μg), ερυθρομυκίνη (15μg), τετρακυκλίνη (30μg), σιπροφλοξακίνη (5μg), χλωραμφαινικόλη (10μg), σουλφαμεθοξαζόλη-τριμεθοπρίμη (23,75/1,25μg) και λινεζολίδη (30μg) Κλίμακα McFarland (Biomerieux) Η κλίμακα McFarland της εταιρείας Biomerieux χρησιμοποιούταν για τον έλεγχο της θολερότητας του εναιωρήματος της καλλιέργειας εντεροκόκκων στη μέθοδο Kirby Bauer Υλικά για τη διενέργεια του ελέγχου της ευαισθησίας των VRE στελεχών με προσδιορισμό της Ελάχιστης Ανασταλτικής Συγκέντρωσης (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) Ζωμός Cation Adjusted Mueller-Hinton II Broth (CAMHB) Χρησιμοποιήθηκε o ζωμός Cation Adjusted Mueller-Hinton II Broth (Beckton Dickinson, Cockeysville, MD, USA) για τον έλεγχο της ευαισθησίας και τον προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) των απομονωθέντων εντεροκόκκων στη βανκομυκίνη και στην τεϊκοπλανίνη. Ο ζωμός CAMHB, περιέχει ιόντα Ca ++ και Mg ++ υπό μορφή CaCl 2 και MgCl 2 σε τελική συγκέντρωση mg/l και 10-12,5 mg/l, αντίστοιχα, σύμφωνα με τις απαιτήσεις του Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006a). Σύνθεση: Beef Extract 3 g Acid Hydrolysate of Casein 17,5 g 86

97 Starch 1,5 g To ph ήταν 7,3 ± 0,1 στους 37 ο C. Για την παρασκευή του αναμιγνύονταν 22 g έτοιμης σκόνης σε 1 lt απεσταγμένου νερού, μέχρι για να επιτευχθεί πλήρης διάλυση της. Η διανομή του υλικού γινόταν, σε στείρους δοκιμαστικούς σωλήνες 16 x 160 mm, ανά 10 ml. Ακολουθούσε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 ο C για 15 min και εν συνεχεία, διατήρηση στους 4 ο C Μητρικά Διαλύματα των αντιμικροβιακών ουσιών Η βανκομυκίνη (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) που χρησιμοποιήθηκε είχε δραστικότητα (potency) 1145 μg/mg, ενώ η τεϊκοπλανίνη (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) 858,8 μg/mg Πλάκες μικροτιτλοποιήσεων Χρησιμοποιήθηκαν πλάκες μικροτιτλοποιήσεων (Linbro, microtitration plate, Flow Laboratories) των 96 βοθρίων στις οποίες χρησιμοποιούνταν τα συγκεκριμένα μητρικά διαλύματα καθαρών αντιμικροβιακών ουσιών Θολωσίμετρο Για τη μέτρηση της θολερότητας του ενοφθαλμίσματος του εναιωρήματος της καλλιέργειας εντεροκόκκων χρησιμοποιούταν θολωσίμετρο (BioMerieux, Mercy L Etoile, France) Υλικά για την προετοιμασία και διενέργεια της πολλαπλής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Multiplex Polymerase Chain Reaction, PCR) Σκεύασμα για την εκχύλιση του DNA των VRE στελεχών Χρησιμοποιήθηκε το εμπορικό kit εκχύλισης βακτηριακού υλικού NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel Gmbh & Co. KG, Germany), που περιλάμβανε πρωτεϊνάση Κ και μικροστήλες (NucleoSpin Tissue column). 87

98 Εκκινητές Οκτώ ζεύγη εκκινητών (primers) (Πίνακας 4.1) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των van γονιδίων αντοχής και τη μοριακή ταυτοποίηση των ειδών E. faecium και E. faecalis (Depardieu και συν., 2004b). Πίνακας 4.1. Χρησιμοποιούμενοι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές Εκκινητής α Αλληλουχία (5 3 ) Γονίδιο Θέση β Μέγεθος PCR ΕΑ1(F) ΕΑ2 (R) ΕB3 (F) ΕB4 (R) EC5 (F) EC8 (R) ED1 (F) ED2 (R) EE1 (F) EE2 (R) EG1 (F) EG2 (R) DD13 (F) DD3-2 (R) FAC1-1 (F) FAC2-1 (R) GGGAAAACGACAATTGC GTACAATGCGGCCGTTA ACGGAATGGGAAGCCGA TGCACCCGATTTCGTTC vana vanb ATGGATTGGTAYTKGTAT γ vanc1/2 133 TAGCGGGAGTGMCYMGTAA γ TGTGGGATGCGATATTCAA TGCAGCCAAGTATCCGGTAA TGTGGTATCGGAGCTGCAG ATAGTTTAGCTGGTAAC CGGCATCCGCTGTTTTTGA GAACGATAGACCAATGCCTT CACCTGAAGAAACAGGC ATGGCTACTTCAATTTCACG GAGTAAATCACTGAACGA CGCTGATGGTATCGATTCAT 150/142 vand vane vang ddl (E. faecalis) ddl (E. faecium) προϊόντος (bp) /827 α F: forward, R: reverse β Η αρίθμηση των νουκλεοτιδίων ξεκινά από το κωδικώνιο έναρξης του γονιδίου γ Κυτοσίνη= Γουανίνη ή Θυμίνη, Μεθειονίνη= Αδενίνη ή Κυτοσίνη, Ουρακίλη= Κυτοσίνη ή Θυμίνη Δεοξυνουκλεοτίδια (dntps) Χρησιμοποιήθηκαν δεοξυνουκλεοτίδια της invitrogen TM, τελικής συγκέντρωσης 10mM το καθένα (datp, dctp, dgtp και dttp). 88

99 Taq DNA Πολυμεράση Χρησιμοποιήθηκε Taq DNA Polymerase (invitrogen, Carlsbad, CA 92008, USA) συγκέντρωσης 5 units/μl σε διάλυμα που περιείχε 20 mm Tris-HCL (ph 8.0), 0.1 mm EDTA, 1 mm DTT, 50% (v/v) glycerol και σταθεροποιητές Υλικά για τη διενέργεια ηλεκτροφόρησης Γέλη ηλεκτροφόρησης Η τελική συγκέντρωση της γέλης ηλεκτροφόρησης ήταν 1,5%. Για την παρασκευή της γέλης ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιούταν διάλυμα TAE 50X και αγαρόζη: α) Αρχικά παρασκευαζόταν διάλυμα ΤΑΕ 50Χ και διαλυόταν 2% με δισαπεσταγμένο νερό για την παρασκευή του τελικού προϊόντος κατά την ώρα της χρήσης. Το διάλυμα TAE 50Χ παρασκευαζόταν από τα εξής υλικά: Tris base 242 g (Ultra Pure TM,invitrogen) Glacial acetic acid 57,1 ml 0,5M EDTA, ph 8 100ml Απεσταγμένο νερό 842,9 ml Το διάλυμα 0,5M EDTA παρασκευαζόταν από τα εξής υλικά: EDTA 93g (Ultra Pure TM,invitrogen) NaOH ταμπλέτες 10 g (Merck) Απεσταγμένο νερό 450ml Γινόταν ρύθμιση του ph και συμπλήρωση με απεσταγμένο νερό έως τα 500ml. β) Η παρασκευή της γέλης ηλεκτροφόρησης γινόταν με τη χρησιμοποίηση αγαρόζης υψηλής καθαρότητας (ΗΤ Βiotechnology Ltd, UK) σε διάλυμα 1Χ ΤΑΕ αραιωμένο, σε αναλογία 1,5% Χρωστική κυανού της βρωμοφαινόλης (Blue juice) Ως διάλυμα φόρτωσης για την ανάμιξη με το προϊόν της PCR και την εισαγωγή στα φρεάτια της γέλης ηλεκτροφόρησης, χρησιμοποιούνταν χρωστική κυανού της βρωμοφαινόλης (10X Blue Juice gel Loading Buffer, invitrogen), που περιείχε 0,3% (w/v) 89

100 κυανό της βρωμοφαινόλης, 10 Mm Tris-HCl (ph 7,5), 10 mm EDTA και 65% (w/v) σουκρόζη Δείκτης μοριακού βάρους Χρησιμοποιήθηκε δείκτης μοριακού βάρους (invitrogen TM ), σε συγκέντρωση 1μg/μl και διαλυμένος σε 10mΜ Tris-HCL (ph 7,5), 1mM EDTA. Κατά την παρατήρησή του σε βρωμιούχο αιθίδιο, αναλύεται κλάσματα των 100 bp ( bp). Το κλάσμα των 600 bp εμπεριέχει περισσότερο DNA σε σχέση με τα άλλα και γι αυτό το λόγο εμφανίζεται στις φωτογραφίες 2-3 φορές περισσότερο έντονο μετά τη βαφή με βρωμιούχο αιθίδιο Βρωμιούχο αιθίδιο Η χρώση της γέλης ηλεκτροφόρησης γινόταν με διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου (5 μg/ml, invitrogene, UK) Υλικά ηλεκτροφόρησης παλλόμενου πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) Ρυθμιστικό διάλυμα SE (100 ml) Το ρυθμιστικό διάλυμα SE, που χρησιμοποιούταν για την in situ προετοιμασία του γονιδιωματικού DNA, παρασκευαζόταν από τα παρακάτω υλικά: 25 mm EDTA (ph 7,5) (Ultra Pure TM,invitrogen) 5 ml 75 mm NaCl 1,875 ml απεσταγμένο νερό 93,125 ml Πηκτή αγαρόζης Χρησιμοποιήθηκε αγαρόζη χαμηλής τήξης Certified TM Low Melt Agarose (BIO- RAD) για την παρασκευή των εκμαγείων (blocks) αγαρόζης. 90

101 Μήτρες-Εκμαγεία (plug molds) Χρησιμοποιήθηκαν ειδικές μήτρες-εκμαγεία πολυστυρενίου (Disposable Plug Molds # , BIORAD) με 10 φρεάτια η κάθε μία. Η μήτρα έφερε ενσωματωμένο ένα ειδικό έμβολο με δυνατότητα απόσπασης έτσι ώστε να ωθήσει τα μεμονωμένα εκμαγεία της αγαρόζης από τα φρεάτια σε σωληνάρια. Η διανομή της αγαρόζης γινόταν στην ανοικτή πλευρά των φρεατίων και μετά τη στερεοποίησή της, με το ειδικό έμβολο, ωθούνταν σε σωληνάρια eppendorf. Οι μήτρες μετά τη χρήση τους αποστειρώνονταν σε διάλυμα αιθανόλης ή διάλυμα χλωρίνης 10% κι έτσι μπορούσαν να επαναχρησιμοποιηθούν Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (lysis buffer) (10 ml) 100 mm EDTA (ph 7,5) (Ultra Pure TM, invitrogen) 2,00 ml 6mM Tris Cl (ph 7,6) (Ultra Pure TM, invitrogen) 60 μl 1Μ NaCl 2,5 ml 0,5% Brij 58 0,5 ml 0,5% (w/v) Ν-lauroylsarcosine 0,5 ml 0,2% (w/v) sodium deoxycholate 0,2 ml 20 μg/ml RNase 50 μl 1 mg/ml λυσοζύμη (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 0,2 ml d H 2 O 3,99 ml Ρυθμιστικό διάλυμα πρωτεόλυσης (proteolysis buffer) (10 ml) 0,5 M EDTA (ph 8,5) (Ultra Pure TM, invitrogen) 9 ml 1% (w/v) Ν-lauroylsarcosine 1 ml 2 mg/ml πρωτεΐνάση K (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 1 ml Ρυθμιστικό διάλυμα TE (10 ml) 10 mm Tris Cl (Ultra Pure TM, invitrogen) 100 μl 1 mm EDTA (Ultra Pure TM, invitrogen) 20 μl d H 2 O 9,88 ml 91

102 Περιοριστικό ένζυμο (ενδονουκλεάση) SmaI Χρησιμοποιήθηκε η ενδονουκλεάση SmaI (New England BioLabs INC ) R0141S συγκέντρωσης U/ml Δείκτης μοριακού βάρους Ο δείκτης Low Range PFGE (2,03 194,0 kbp, Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης μοριακών βαρών και ταυτόχρονα ως πρότυπο αναφοράς για τη διευθέτηση των ηλεκτροφορητικών προτύπων (normalization) των στελεχών Enterococcus spp. που βρίσκονταν σε διαφορετικές πηκτές αγαρόζης Γέλη ηλεκτροφόρησης Για την παρασκευή της γέλης ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιούνταν διάλυμα TBE και αγαρόζη: α) Αρχικά παρασκευαζόταν ρυθμιστικό διάλυμα ΤBE για την παρασκευή του τελικού προϊόντος κατά την ώρα της χρήσης. Το διάλυμα ΤΒΕ παρασκευαζόταν από τα εξής υλικά: Tris base 108 g (Ultra Pure TM, invitrogen) Boric acid 55 g 0,5M EDTA ph 8 40 ml (βλ ) Απεσταγμένο νερό 1000 ml To τελικό διάλυμα της ηλεκτροφόρησης παρασκευαζόταν με αραίωση του διαλύματος TBE σε αναλογία 10% (0,5 Χ TBE), σε απεσταγμένο νερό. β) Η παρασκευή της γέλης ηλεκτροφόρησης γινόταν με τη χρησιμοποίηση αγαρόζης υψηλής καθαρότητας (ΗΤ Βiotechnology Ltd, UK) στο διάλυμα 0,5 Χ TBE σε αναλογία 1% Συσκευή ηλεκτροφόρησης Η συσκευή CHEF-DR III system (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) χρησιμοποιούνταν για την ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο πεδίο. 92

103 Βρωμιούχο αιθίδιο Η χρώση της γέλης ηλεκτροφόρησης γινόταν με διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου (5 μg/ml, invitrogene, UK). 4.2 Μέθοδοι Απομόνωση-Καλλιέργεια των VRE στελεχών Για την ανίχνευση των ανθεκτικών στη βανκομυκίνη εντερόκοκκων (VRE), τα δείγματα περιεχομένου του τυφλού ή τα δείγματα κοπράνων (βλ ) καλλιεργούνταν σε εκλεκτικά υποστρώματα εμπλουτισμένα βανκομυκίνη (βλ , ). Περίπου 0,5 g από κάθε δείγμα αραιωνόταν σε 5 ml φυσιολογικού ορού. Μετά από επανειλημμένη ανάδευση, 0,1 ml από το εναιώρημα ενοφθαλμιζόταν στον εκλεκτικό ζωμό Enterococcosel Broth εμπλουτισμένο με βανκομυκίνη (εκλεκτικός προεμπλουτισμός) και επωαζόταν για 48 ώρες στους 37 o C. Μετά την επώαση, πραγματοποιούνταν τυφλή ανακαλλιέργεια με επιφανειακή εξάπλωση 0,1 ml υλικού Enterococcosel Broth σε στερεό υπόστρωμα Enterococcosel Agar εμπλουτισμένο με βανκομυκίνη. Μετά την επώαση, για κάθε δείγμα επιλέγονταν 4-5 διαφορετικές αποικίες, ανάλογα με το μέγεθός τους και τη μορφολογία τους καθώς και την αντίδραση υδρόλυσης της εσκουλίνης, απομονώνονταν και συλλέγονταν σε υλικό συντήρησης (βλ ) και αποθηκεύονταν στους -80 C Βιοχημική ταυτοποίηση των VRE στελεχών Η προκαταρκτική ταυτοποίηση των ύποπτων VRE αποικιών πραγματοποιούνταν με τυπικές για τους εντερόκοκκους βιοχημικές δοκιμές που περιλάμβαναν Gram χρώση, δοκιμή καταλάσης, υδρόλυση εσκουλίνης και ανάπτυξη παρουσία 40% (κ.ο.) χολής, ανάπτυξη σε ζωμό Brain Heart Infusion με 6,5% NaCl ή σε ph 9,6 στους 37 o C και στους 45 o C. Πρόσθετες βιοχημικές εξετάσεις πραγματοποιούνταν για την ταυτοποίηση των ύποπτων VRE αποικιών σε επίπεδο είδους, που περιλάμβαναν ζύμωση σακχάρων (1%) L-αραβινόζη, μαννιτόλη, σορβόζη, D-σορβιτόλη, σακχαρόζη, λακτόζη, ριβόζη, D-ραφινόζη και μεθυλο-α-dγλυκoπυρανoσίδη, υδρόλυση αργινίνης, διάσπαση του πυροσταφυλικού οξέος και παραγωγή χρωστικής (Πίνακας 4.2). Η δοκιμή της κινητικότητας πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τους (Van Horn και συν., 2002). Εν συντομία, ετοιμαζόταν εναιώρημα του προς εξέταση 93

104 στελέχους σε ζωμό Trypticase Soy Broth. Ακολουθούσε επώαση στους 30 ο C για 2 ώρες. Τα στελέχη Enterobacter aerogenes (κινητό) και Klebsiella pneumonia (μη κινητό) χρησιμοποιούνταν ως θετικός (κινητικότητα στο καθορισμένο χρονικό διάστημα της επώασης) και αρνητικός μάρτυρας, αντίστοιχα, σε κάθε δοκιμή. Μετά την επώαση, μία σταγόνα εναιωρήματος (περίπου 50 μl) εξεταζόταν στο μικροσκόπιο υπό σκοτεινό πεδίο σε μεγέθυνση x 400 και x Η κινητικότητα επιβεβαιωνόταν με την παρατήρηση αλυσίδων κόκκων που εμφάνιζαν ταχεία, κατευθυντική κίνηση σε σύγκριση με τον αρνητικό μη κινητό μάρτυρα που επιδείκνυε μόνο δονούμενη κίνηση χαρακτηριστική της κίνησης Brown. Για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων των παραπάνω εξετάσεων, χρησιμοποιούνταν ειδικά για τη βιοχημική ταυτοποίηση εντεροκόκκων διαγράμματα ροής (σχήμα 4.1) (Manero και Blanch, 1999 Domig και συν., 2003b Facklam και συν., 2003). 94

105 Σχήμα 4.1. Διάγραμμα ροής ταυτοποίησης εντεροκόκκων και διαφοροποίησης από ορισμένα συγγενή είδη άλλων Gram θετικών κόκκων. Ανάπτυξη τυπικών αποικιών στο Enterococcosel agar Gram (+), καταλάση (-) Ανάπτυξη σε BHI 6,5%NaCl (-) (+) Streptococcus Gemella Pediococcus Tetragenococcus Ανάπτυξη σε BHI 45 o C Vagococcus Aerococcus Helcoccus Allolococcus Enterococcus (-) (+) Vagococcus Aerococcus Helcoccus Allolococcus Enterococcus Group I Group II MAN + SOR + ARG + Group III Group IV Κινητικότητα + E. gallinarum E. casseliflavus Παραγωγή χρωστικής E. casseliflavus 95 ARA + ARA - E. faecium E. faecalis

106 Πίνακας 4.2. Βιοχημικά χαρακτηριστικά ταυτοποίησης ειδών του γένους Enterococcus spp. και διαφοροποίησης από ορισμένα συγγενή είδη άλλων Gram θετικών κόκκων. ΕΙΔΟΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ α ΜΑΝ SOR ARG ARA SBL RAF TEL MOT PIG SUC PYU MGP Ομάδα Ι E. avium V E. canis E. gilvus E. malodoratus V E. pallens E. pseudoavium E. raffinosus V E. saccharolyticus Ομάδα ΙΙ E. faecalis + β - + β β + - Lactococcus spp V - - E. faecium + β V V γ β - - E. casseliflavus β + V + - β + β + β + V + E. gallinarum β β E. mundtii V Ομάδα III E. dispar E. durans E.haemoperoxidus V δ ε E. hirae E. porcinus ζ E. ratti Ομάδα IV E. asini E. cecorum E. sulfureus Ομάδα V E. columbae E. moraviensis Vagococcus spp Πηγή: Teixeira και συν.,

107 α Συντμήσεις και σύμβολα: ΜΑΝ: μαννιτόλη, SOR: σορβόζη, ARG: αργινίνη, ARA: αραβινόζη, SBL: σορβιτόλη, RAF: ραφινόζη, TEL: τελουρίτης 0,04%, MOT: κινητικότητα, PIG: χρωματισμός, SUC: σουκρόζη, PYU: πυρουβικό, MGP: μεθυλ-α-d-γλυκοπυρανοσίδη, +: 90% των στελεχών είναι θετικά, -: 10% των στελεχών είναι θετικά, V: ποικίλλει (11-89% των στελεχών είναι θετικά). β Σποραδικές εξαιρέσεις μπορεί να συμβούν (<3% των στελεχών εμφανίζουν παρεκκλίσεις). γ Τα στελέχη που απομονώνονται από ορνίθια είναι συχνά θετικά. δ Τα αρνητικά στη μαννιτόλη στελέχη κατατάσσονται στην Ομάδα III, ενώ τα θετικά στην Ομάδα II. ε Ελαφρώς κίτρινη χρωστική μπορεί να παραχθεί. ζ Τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του E. porcinus είναι ταυτόσημα με εκείνα του E. villorum. Τα είδη αυτά ανήκουν στην ίδια ταξινομική ομάδα Παρασκευή αποθέματος (stock) VRE στελεχών Όπως προαναφέρθηκε (βλ ), οι ύποπτες αποικίες εντεροκόκκων που απομονώνονταν, συλλέγονταν σε ειδικό υλικό συντήρησης (βλ ) και αποθηκεύονταν στους -80 C. Συγκεκριμένα, κάθε ύποπτη αποικία εντεροκόκκου που απομονώνονταν στο Enterococcosel agar, ανακαλλιεργούνταν σε ζωμό Brain Heart Infusion Broth (βλ ) στους 37 ο C για 24 ώρες. Ακολουθούσε μεταφορά υπό άσηπτες συνθήκες ποσότητας 0,8 ml εναιωρήματος της καλλιέργειας σε στείρο σωληνάκι eppendorf καθώς και 0,2 ml αποστειρωμένης γλυκερόλης, έτσι ώστε η αναλογία της γλυκερόλης στο υλικό συντήρησης να ήταν 20% κ.ο. Ακολουθούσε η συντήρηση σε βαθειά κατάψυξη (-80 o C) Έλεγχος ευαισθησίας των VRE στελεχών-μέθοδος Kirby-Bauer Όλα τα στελέχη των ύποπτων VRE εξετάστηκαν ως προς την ευαισθησία τους με τη μέθοδο Kirby-Bauer (CLSI, 2006b) σε άγαρ Mueller-Hinton (βλ ), χρησιμοποιώντας δισκία αντιμικροβιακών ουσιών (βλ ). Σε κάθε έλεγχο, τα στελέχη Enterococcus faecalis ATCC και Staphylococcus aureus ATCC χρησιμοποιoύνταν ως στελέχη αναφοράς Παρασκευή του ενοφθαλμίσματος Από καθαρή καλλιέργεια εντεροκόκκου VRE στελεχών σε υπόστρωμα Trypticase Soy agar, λαμβάνονταν 4-5 αποικίες και εναιωρούνταν σε 4-5 ml ζωμού Trypticase Soy Broth. Το εναιώρημα επωαζόταν στους 35 ο C μερικές ώρες (2-6) ώστε να αρχίσει ο πολλαπλασιασμός του και να εμφανισθεί θολερότητα του ζωμού με βάση την οποία γινόταν η εκτίμηση του πληθυσμού των βακτηρίων, περίπου 2 x 10 5 cfu/ml κύτταρα. Η θολερότητα συγκρινόταν με τη θολερότητα 0,5 της θολωμετρικής κλίμακας McFarland και ρυθμιζόταν με 97

108 προσθήκη αποστειρωμένου ισότονου διαλύματος NaCl ή ζωμού ή νέου εναιωρήματος του ίδιου βακτηρίου. Η ρύθμιση αυτής της θολερότητας γινόταν με τη βοήθεια θολωσίμετρου Ενοφθαλμισμός Το εναιώρημα θολερότητας 0,5 της θολωμετρικής κλίμακας McFarland ενοφθαλμιζόταν σε Muller-Hinton (MH) άγαρ, σε τρυβλίο. Συγκεκριμένα, βαμβακοφόρος στυλεός από μη τοξικό βαμβάκι βυθιζόταν στο μικροβιακό εναιώρημα, αποστραγγιζόταν το βύσμα με πιέσεις στις παρειές του σωληναρίου και επιστρωνόταν σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου. Η διαδικασία της επίστρωσης επαναλαμβάνονταν (x 3), περιστρέφοντας το τρυβλίο περίπου 60 ο κάθε φορά ώστε να επιτευχθεί ισοκατανομή του εναιωρήματος σε όλη την επιφάνεια του υποστρώματος (CLSI, 2006b). Η διαδικασία αυτή της σποράς ολοκληρωνόταν σε 15 min το αργότερο από την παρασκευή του ενοφθαλμίσματος. Ακολουθούσε κάλυψη του τρυβλίου με το κάλυμμα και παραμονή του για 3-5 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Τοποθέτηση των δισκίων Τα δισκία των αντιμικροβιακών ουσιών αφαιρούνταν από την ψύξη 1-2 ώρες πριν τη χρήση έτσι ώστε να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου. Εν συνεχεία, τοποθετούνταν ένα-ένα με λαβίδα ή με μικροσυσκευή πολλαπλών δισκίων (dispenser) στην επιφάνεια του υποστρώματος. Σε κάθε τρυβλίο διαμέτρου 100 mm τοποθετούνταν 5 δισκία έτσι ώστε να μην απέχουν λιγότερο από 24 mm το κέντρο του ενός από του άλλου. Μετά την τοποθέτηση των δισκίων και σε διάστημα όχι μεγαλύτερο των 15 min, αναστρέφονταν τα τρυβλία, τοποθετούνταν για επώαση στους 35 ο C για ώρες ή 24 ώρες, για την πλειονότητα των αντιμικροβιακών ή τη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη, αντίστοιχα Ανάγνωση Οι διάμετροι των ζωνών αναστολής ανάπτυξης γύρω από κάθε δισκίο μετρούνταν με ακρίβεια, με τη βοήθεια παχυμέτρου. Η ανάγνωση ιδιαίτερα της ζώνης αναστολής ανάπτυξης στη βανκομυκίνη πραγματοποιούνταν με τη βοήθεια του φωτός. Η περιοχή της ζώνης αναστολής ορίστηκε ως η περιοχή που δεν υπήρχε ορατή δια γυμνού οφθαλμού ανάπτυξη. Οποιαδήποτε ανάπτυξη μέσα στη ζώνη αναστολής υποδήλωνε αντοχή. Από τη διάμετρο της ζώνης γινόταν ο χαρακτηρισμός του στελέχους ως ευαίσθητο, μέτρια ευαίσθητο ή ανθεκτικό 98

109 βάσει των πινάκων του Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, πρώην NCCLS) των ΗΠΑ (CLSI, 2006c), ενώ για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας στη σουλφαμεθοξαζόλη/τριμεθοπρίμη, ακολουθήθηκαν οι οδηγίες της Ευρωπαϊκής Επιτροπής Δοκιμών Αντιβιοαντοχής (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST) σύμφωνα με τις οποίες, μία ζώνη αναστολής < 21mm, ήταν δηλωτική της αντοχής στη συγκεκριμένη ουσία (EUCAST, 2012). Για την επικύρωση του ελέγχου καταμετρούνταν παράλληλα και η ζώνη αναστολής των στελεχών αναφοράς (βλ ) Προσδιορισμός της Ελάχιστης Ανασταλτικής Συγκέντρωσης (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) των αντιμικροβιακών ουσιών βανκομυκίνης και τεϊκοπλανίνης έναντι των VRE στελεχών Ο προσδιορισμός της MIC της αντιμικροβιακής ουσίας γινόταν σύμφωνα με τη μέθοδο των Διαδοχικών Μικροαραιώσεων σε ζωμό (Broth Microdilution Method) (CLSI, 2006a). Σύμφωνα με τη μέθοδο, εναιώρημα του βακτηρίου γνωστής περιεκτικότητας σε cfu/ml προστίθονταν σε υποδιπλάσιες αραιώσεις της αντιμικροβιακής ουσίας. Η μέθοδος πραγματοποιούνταν σε πλάκες μικροτιτλοποιήσεων χωρητικότητας 96 βοθρίων. Σε κάθε σειρά βοθρίων υπήρχαν υποδιπλάσιες αραιώσεις του αντιμικροβιακού για τις οποίες χρησιμοποιούνταν συγκεκριμένα μητρικά διαλύματα καθαρών αντιμικροβιακών ουσιών. Η μικρότερη αραίωση του αντιμικροβιακού που ανέστελλε την ορατή ανάπτυξη, μετά από επώαση του βακτηρίου, αντιστοιχούσε στη MIC Παρασκευή Μητρικού Διαλύματος Αντιμικροβιακής ουσίας Για την παρασκευή του μητρικού διαλύματος εφαρμοζόταν ο παρακάτω τύπος: Volume (ml)=weight (mg) x Potency (μg/mg)/ Concentration (μg/ml) Το αρχικό μητρικό διάλυμα της αντιμικροβιακής ουσίας ρυθμιζόταν στην αρχική συγκέντρωση των 2000 μg/ml (Ericsson και Sherris, 1971 CLSI, 2006a), κατανεμόταν ισόποσα σε φιαλίδια και συντηρούνταν στους -80 ο C. Όταν απαιτούνταν, αποψυχόταν σε θερμοκρασία δωματίου και άμεσα αραιωνόταν με ζωμό CAMHB (βλ ) ώστε να επιτευχθεί συγκέντρωση 256 μg/ml καθαρής ουσίας. Ακολουθούσαν υποδιπλάσιες αραιώσεις του αντιμικροβιακού και διανομή ποσότητας 50 μl ανά βοθρίο σε κάθε οριζόντια σειρά βοθρίων. Σε ό,τι αφορά τη βανκομυκίνη οι συγκεντρώσεις κυμαίνονταν από 256 μg/ml (στην 99

110 πρώτη σειρά βοθρίων) μέχρι 4 μg/ml στην 7 η σειρά, ενώ για την τεϊκοπλανίνη οι συγκεντρώσεις κυμαίνονταν από 64 μg/ml έως 1 μg/ml. Η τελευταία οριζόντια σειρά χρησιμοποιούταν ως μάρτυρας στειρότητας και περιείχε μόνο ζωμό CAMHB χωρίς αντιμικροβιακή ουσία Παρασκευή Εναιωρήματος Καλλιέργειας-Ενοφθαλμισμός Το ενοφθάλμισμα παρασκευαζόταν με εναιώρηση καθαρών αποικιών καλλιέργειας στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης, σε ζωμό CAMHB, και με βάση τη θολερότητα ρυθμιζόταν η συγκέντρωση του βακτηρίου σε 5 x 10 5 cfu/ml ανά βοθρίο μετά τον ενοφθαλμισμό. Για τη μέτρηση της θολερότητας του ενοφθαλμίσματος χρησιμοποιούνταν ειδικό θολωσίμετρο. Αρχικά το εναιώρημα των αποικιών ρυθμιζόταν ώστε να αντιστοιχεί στην 0,5 θολερότητα της κλίμακας McFarland (10 8 cfu/ml). Εν συνεχεία το εναιώρημα αραιωνόταν 1:100 και 50 μl αυτού ενοφθαλμιζόταν σε κάθε βοθρίο, μιας κάθετης σειράς βοθρίων ώστε η τελική συγκέντρωση του βακτηρίου να είναι 5 x 10 5 cfu/ml ή 5 x 10 4 cfu ανά βοθρίο. Ο χρόνος που μεσολαβούσε από την παρασκευή του εναιωρήματος μέχρι τον ενοφθαλμισμό του στα βοθρία δεν ήταν μεγαλύτερος των 15 λεπτών. Σε κάθε κάθετη σειρά βοθρίων της πλάκας ενοφθαλμιζόταν διαφορετικό στέλεχος εντεροκόκκων, ενώ στην τελευταία κάθετη σειρά βοθρίων ενοφθαλμιζόταν το στέλεχος αναφοράς Enterococcus faecalis ATCC 29212, που χρησιμοποιούνταν ως αρνητικός μάρτυρας (ευαίσθητο στα αντιμικροβιακά στέλεχος). Η πλάκα εν συνεχεία σκεπαζόταν με κάλυμμα και ακολουθούσε επώαση στους 35 ο C για 24 ώρες. Έλεγχος καθαρότητας των ενοφθαλμισμάτων πραγματοποιούνταν παράλληλα με καλλιέργεια αυτών σε τρυβλία με αιματούχο άγαρ Ανάγνωση Αποτελέσματος Η διαπίστωση της εμφάνισης της θολερότητας στα βοθρία γινόταν με γυμνό μάτι αρχίζοντας από το βοθρίο με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση του αντιμικροβιακού και συγκρίνοντας με τον αρνητικό (διαυγή) μάρτυρα. Η ανάπτυξη του στελέχους στα βοθρία που περιείχαν αντιμικροβιακή ουσία συγκρινόταν επιπλέον με την ανάπτυξη του στο βοθρίο χωρίς την παρουσία αντιμικροβιακού έναντι του συγκεκριμένου στελέχους του εντεροκόκκου. 100

111 Η αραίωση στην οποία δεν υπήρχε ανάπτυξη, δήλωνε την MIC. Το αποτέλεσμα εκφραζόταν με τον αριθμό της αραίωσης σε μg/ml και χαρακτηριζόταν ως ευαίσθητο, ενδιάμεσο ή ανθεκτικό βάσει των πινάκων του CLSI των ΗΠΑ (CLSI, 2006a) Εκχύλιση του DNA των VRE στελεχών Για την εκχύλιση του ολικού γονιδιωματικού DNA των στελεχών των εντεροκόκκων που απομονώθηκαν, χρησιμοποιήθηκε το εμπορικό kit Nucleospin Tissue (Macherey- Nagel). Συγκεκριμένα, μετά την ανάπτυξη των βακτηριακών καλλιεργειών σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα Brain Heart Infusion, 1,5 ml της καλλιέργειας μεταφέρονταν σε μικροσωληνάρια τύπου eppendorf όπου τα βακτηριακά κύτταρα συλλέγονταν με φυγοκέντρηση (8.000 x g για 5 min). Τα κύτταρα του ιζήματος στη συνέχεια υφίσταντο την επεξεργασία των σταδίων λύσης, δέσμευσης του βακτηριακού γονιδιωματικού DNA στις μικροστήλες, έκπλυσης και αποδέσμευσής του ακολουθώντας τις συστηνόμενες οδηγίες. Το βακτηριακό DNA συλλεγόταν σε αποστειρωμένα σωληνάρια τύπου eppendorf και είτε χρησιμοποιούνταν άμεσα για την εξέτασή του με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), είτε αποθηκευόταν στους -20 o C μέχρι τη χρήση του Multiplex PCR H PCR πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη μεθοδολογία που περιγράφηκε από τους Depardieu και συνεργάτες (Depardieu και συν., 2004b) για τον προσδιορισμό των γονιδίων που καθορίζουν την αντοχή στη βανκομυκίνη όπως και για τον καθορισμό του είδους των εντεροκόκκων (E. faecium και E. faecalis). Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε 50 μl του μίγματος της αντίδρασης που περιείχε: 10 x PCR buffer [10 mm Tris-HCl (ph 9,0), 50 mm KCl] 5 μl 50 mμ MgCl 2 1,5 μl dntps (10 mm, Noucleotide Mix) 2 μl Εκκινητής I (10 μm) 2 μl (x 8) Εκκινητής II (10 μμ) 2 μl (x 8) Taq DNA πολυμεράση 0,3 μl Βακτηριακό DNA 2 μl Στείρο απεσταγμένο νερό 7,2 μl 101

112 Οκτώ διαφορετικά ζεύγη εκκινητών που αντιστοιχούν στα vana, vanb, vanc1-c2, vand, vane, vang, ddl (Ε. faecium) και ddl (E. faecalis) γονίδια χρησιμοποιήθηκαν στη multiplex PCR (βλ ). Για την εκτέλεση των αντιδράσεων της PCR, σύμφωνα με τα υλικά, χρησιμοποιήθηκε ο MJ Research θερμοκυκλοποιητής (μοντέλο PTC 200, Bio-Rad Laboratories, Inc). Οι συνθήκες της διαδικασίας αντιγραφής του DNA ήταν: ένας κύκλος αρχικής αποδιάταξης του DNA στους 94 o C για 3 min, 30 κύκλοι που ο καθένας περιελάμβανε τρία στάδια: α) αποδιάταξη στους 94 ο C για 1 min, β) πρόσδεση των εκκινητών στο DNA στόχο στους 54 ο C για 1 min, και γ) επιμήκυνση των εκκινητών στους 72 ο C για 1 min, καθώς και ένας τελευταίος κύκλος επιμήκυνσης στους 72 o C για 7 min. Ακολουθούσε ψύξη στους 4 o C. Σε κάθε αντίδραση ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιούνταν νερό ελεύθερο νουκλεασών για τον έλεγχο τυχόν επιμόλυνσης, ενώ στελέχη αναφοράς εντεροκόκκων, που έφεραν τα γονίδια vana, vanb, vanc1, vand, vane και vang, χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες (βλ ). Τα προϊόντα της PCR αναλύονταν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,5% (w/v), παρουσία του δείκτη μοριακών βαρών της κλίμακας 100 bp. Ως ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιήθηκε TAE 1X. Στις θέσεις υποδοχής της πηκτής τοποθετούνταν 9μl προϊόντος PCR αφού είχε προηγηθεί η ανάμιξή του με 4μl χρωστικής κυανού της βρωμοφαινόλης. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιούνταν σε συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης (Bio-Rad Laboratories, Inc) με σταθερή τάση λειτουργίας 110V για 90 min. Τέλος, η πηκτή αγαρόζης χρωματιζόταν για 30 min με βρωμιούχο αιθίδιο 5 μg/ml και ξεπλενόταν σε dh 2 O για 30 min με απαλή ανακίνηση, για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα χρωστικής. Ακολούθησε έκθεση της πηκτής αγαρόζης σε υπεριώδη ακτινοβολία σε τράπεζα φθορισμού (White/UV transluminator, UPV) και ψηφιακή αποτύπωσή της με σύστημα ανάλυσης εικόνας UV Foto/Phoresis I (Fotodyne,USA). Ο προσδιορισμός του μεγέθους των προϊόντων γινόταν με τη χρήση κλίμακας 100 bp του DNA Ladder Ηλεκτροφόρηση Παλλόμενου Πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) για το γενοτυπικό χαρακτηρισμό των VRE στελεχών In situ προετοιμασία του γονιδιωματικού DNA Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την in situ προετοιμασία του γονιδιωματικού DNA των VRE και τον εγκλεισμό του σε εκμαγεία (blocks) αγαρόζης, αποτελεί τροποποίηση 102

113 της μεθοδολογίας που περιγράφηκε από τους Turabelidze και συν., 2000 και Saeedi και συν., Συγκεκριμένα, μετά την ανάπτυξη των καλλιεργειών των VRE σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα Brain Heart Infusion, τα βακτηριακά κύτταρα συλλέγονταν με φυγοκέντρηση (4.000 x g για 10 min), ξεπλένονταν δύο φορές με SE ρυθμιστικό διάλυμα (βλ ) και επαναιωρούνταν στο ίδιο διάλυμα, έτσι ώστε να σχηματιστεί εναιώρημα με οπτική πυκνότητα περίπου 5 στα 600 nm (OD 600 ). Το εναιώρημα των κυττάρων (0,5 ml) θερμαινόταν στους 50 C και αναμιγνυόταν με ίσο όγκο διαλύματος αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξεως 2% (w/v) (βλ ). Το μίγμα του εναιωρήματος των κυττάρων και της αγαρόζης τοποθετούνταν σε ειδικές μήτρες οι οποίες σφραγίζονταν με χαρτοταινία και παρέμεναν σε θερμοκρασία δωματίου προς στερεοποίηση για το σχηματισμό των εκμαγείων της αγαρόζης. Στη συνέχεια, τα στερεοποιημένα εκμαγεία απομακρύνονταν με ειδικό έμβολο και τοποθετούνταν σε σωληνάρια eppendorfs για την πραγματοποίηση της λύσης των εγκλεισμένων βακτηριακών κυττάρων των VRE. Το κάθε εκμαγείο αγαρόζης εμβαπτιζόταν σε 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, που περιείχε λυσοζύμη (βλ ) και επωαζόταν στους 37 C για 16 h σε αναδευτήρα (Forma Scientific, USA) σε 100 rpm. Για την καταστροφή των πρωτεϊνών των κυτταρικών εκχυλισμάτων, γινόταν αντικατάσταση του διαλύματος λύσης με 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος πρωτεϊνόλυσης που περιείχε πρωτεϊνάση K (βλ ). Ακολούθως, τα εκμαγεία της αγαρόζης επωάζονταν στον αναδευτήρα σε 100 rpm, στους 53 ο C για 24 h ώστε να γίνει η πέψη όλων των πρωτεϊνών. Ακολουθούσε η διεργασία απομάκρυνσης της πρωτεϊνάσης K καθώς και των πρωτεϊνικών υπολειμμάτων από τα εκμαγεία της αγαρόζης, με την εμβάπτισή αυτών σε 1 ml διαλύματος 50 mm EDTA (ph 8.5) και την ανακίνησή τους στις 50 rpm, στους 50 ο C για 10 min, και η διαδικασία επαναλαμβανόταν 3 φορές In situ πέψη του DNA Πριν από τη διαδικασία της πέψης του DNA, τα εκμαγεία της αγαρόζης τεμαχίζονταν σε τμήματα κατάλληλου μεγέθους και παρέμεναν για 25 min στο ρυθμιστικό διάλυμα TE (βλ ), σε πάγο. Στη συνέχεια απομακρυνόταν το διάλυμα TE και προστίθονταν 180 μl H 2 O και 20 μl ρυθμιστικού διαλύματος του ενζύμου SmaI, με παραμονή σε πάγο για άλλα 25 min. Ακολουθούσε αφαίρεση του διαλύματος και προσθήκη εκ νέου 180 μl H 2 O, 20 μl ρυθμιστικού διαλύματος του ενζύμου και επιπρόσθετα 2 μl (40 U) 103

114 περιοριστικού ενζύμου SmaI και επώαση στους 25 ο C για 18 h έτσι ώστε να ολοκληρωθεί η πέψη PFGE Για το διαχωρισμό των θραυσμάτων (προϊόντων πέψης) του γονιδιωματικού DNA που προέκυπτε από τη δράση του ενζύμου περιορισμού SmaI και κατ επέκταση για τον προσδιορισμό των ηλεκτροφορητικών προτύπων των VRE στελεχών, διενεργούνταν ηλεκτροφόρηση σε παλλόμενο πεδίο. Σε κατάλληλη συσκευή ηλεκτροφόρησης (βλ ) τα προϊόντα της πέψης διαχωρίζονταν σε πηκτή αγαρόζης 1% (w/v) με ρυθμιστικό διάλυμα 0,5Χ TBE, υπό σταθερή τάση 220V και μεσοδιάστημα γραμμικού χρόνου μεταστροφής από 2 έως 35 sec (linear switch time rump), γωνία πεδίου από 110 ο έως 120 ο, στους 14 o C για 22 h. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πηκτές της αγαρόζης χρωματίζονταν για τουλάχιστον 30 min σε διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου 5 μg/ml σε dh 2 O με απαλή ανακίνηση και στη συνέχεια αποπλένονταν σε dh 2 O για 30 min, έτσι ώστε να απομακρυνθούν τα υπολείμματα χρωστικής. Ακολουθούσε έκθεση των ηλεκτροφορημμάτων σε υπεριώδη ακτινοβολία ( nm) και ψηφιακή αποτύπωσή τους με σύστημα ανάλυσης εικόνας Molecular Imager Gel Doc XR (Biorad Laboratories, Inc). Κατά την ηλεκτροφόρηση, το γονιδιωματικό DNA κάθε στελέχους αναλυόταν σε ζώνες ανάλογα με το μέγεθος των θραυσμάτων που προέκυπταν από τη δράση του περιοριστικού ενζύμου SmaI. Τέλος, με βάση το δείκτη μοριακών βαρών Low Range PFGE (2,03 194,0 kbp, βλ ) αναγνωρίζονταν και συγκρίνονταν τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα (normalization) του DNA των VRE στελεχών Ανάλυση των PFGE ηλεκτροφορητικών προτύπων Τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα του DNA των VRE στελεχών μετά την ψηφιακή τους καταγραφή, επεξεργάζονταν με τη χρήση του λογισμικού προγράμματος Fingerprinting II version 3.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Η ομαδοποίηση των ηλεκτροφορητικών προτύπων των VRE στελεχών επιτυγχανόταν με τη μέθοδο των ροπών χρησιμοποιώντας το συντελεστή συσχέτισης του Dice, καθώς και με την ανάλυση κατά συστάδες με τη μη σταθμισμένη μέθοδο ομάδων ζευγών, με αριθμητικούς μέσους όρους (unweighted pair group method with arithmetic average, UPGMA). 104

115 Η επαναληψιμότητα της PFGE ανάλυσης, προσδιοριζόταν με τη στατιστική επεξεργασία των ηλεκτροφορητικών προτύπων δύο στελεχών αναφοράς (E. faecium BM4147 και E. gallinarum BM4174) που προέρχονταν από ανεξάρτητα μίγματα αντιδράσεων και φορτώνονταν εις διπλούν σε δύο διαφορετικές πηκτές αγαρόζης. Τα ηλεκτροφορητικά τους πρότυπα αναλύονταν με τον τρόπο που περιγράφτηκε παραπάνω, και τα ποσοστά της ομοιότητας μεταξύ των επαναλήψεων, χρησιμοποιούνταν για να καθορίσει το όριο διάκρισης, κάτω από το οποίο τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα της PFGE θεωρούνταν διαφορετικά Μεθοδολογία στατιστικής επεξεργασίας των αποτελεσμάτων ελέγχου ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά και Διαχωριστική Ανάλυση (Discriminant function analysis) των αντιμικροβιακών προφίλ των VRE στελεχών Οι διαφορές της αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες των στελεχών VREF και E. gallinarum από τις διαφορετικές πηγές επεξεργάστηκαν με το στατιστικό πρόγραμμα SPSS v17.0, όπου τιμές P<0,05 εκτιμήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Οι συσχετισμοί μεταξύ των διαφορετικών πηγών των εντεροκόκκων υπολογίστηκαν με το συντελεστή συσχέτισης Pearson. Ο συσχετισμός των αντιμικροβιακών προφίλ, που προέκυπταν από τον έλεγχο της ευαισθησίας στις 14 αντιμικροβιακές ουσίες, μεταξύ των VREF στελεχών που απομονώθηκαν από ζώα/ορνίθια, σφαγείς και νοσηλευόμενους ασθενείς, καθορίστηκε με τη χρήση της Διαχωριστικής Ανάλυσης. Η μέθοδος εφαρμόζεται διεθνώς ως μια πολλαπλή ανάλυση των αντιμικροβιακών προφίλ για την ταξινόμηση στελεχών σε ομάδες διαφορετικής προέλευσης όπως εκείνης ανθρώπων, ζώων ή περιβάλλοντος (Wiggins, 1996 Choi και συν., 2003 Wiggins και συν., 2003 Carroll και συν., 2005 Vantarakis και συν., 2006). Πρόκειται για μια πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση που χωρίζει ένα σύνολο δεδομένων μεταβλητών σε έναν αριθμό από προκαθορισμένες ομάδες χρησιμοποιώντας γραμμικούς συνδυασμούς. Κατ αυτόν τον τρόπο τα αντιμικροβιακά προφίλ με παρόμοιες διακυμάνσεις στην ανάλυση των μεταβλητών, αποδίδουν παρόμοια αποτελέσματα διαχωρισμού και ως εκ τούτου ομαδοποιούνται μαζί όταν απεικονίζονται διαγραμματικά. Αντίθετα, προφίλ με διαφορετικές διακυμάνσεις εμφανίζονται τυπικά ορθογώνια μεταξύ τους (Carroll και συν., 2005). Σύμφωνα με τη Διαχωριστική Ανάλυση, στη μελέτη μας τα δεδομένα των αντιμικροβιακών προφίλ μετατράπηκαν σε δυαδικό κώδικα με βάση την ευαισθησία ή την αντοχή τους (Carroll και συν., 2005 Vantarakis και συν., 2006) και στη συνέχεια αναλύθηκαν με το λογισμικό StatistiXL [έκδοση 1.8, Πανεπιστήμιο Western Australia 105

116 ( υπολογίζοντας με αυτόν τον τρόπο των αριθμό των στελεχών της κάθε συγκεκριμένης πηγής (ορνίθια, σφαγείς, νοσηλευόμενοι ασθενείς) που ήταν "ορθά" ταξινομημένα στην αντίστοιχη πηγή προέλευσης. Το μέσο ποσοστό της "ορθής" ταξινόμησης (Average Rate of Correct Classification, ARCC) για την ανάλυση αυτή προσδιορίστηκε από το μέσο όρο των ποσοστών των ορθώς ταξινομημένων στελεχών για όλες τις πηγές (Wiggins, 1996). 106

117 5 ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΕΠΙΠΟΛΑΣΜΟΥ ΤΩΝ VRE ΣΤΕΛΕΧΩΝ 5.1 Σχεδιασμός και Εκτέλεση της Αναζήτησης VRE Στελεχών Με σκοπό την απομόνωση ικανοποιητικού αριθμού VRE στελεχών, που να προέρχονται από διαφορετικές εκτροφές, η συλλογή των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε σε σφαγεία πουλερικών και σφαγεία χοίρων και μόσχων του νομού Θεσσαλονίκης. Υλικά Συνολικά πεντακόσια (500) δείγματα τυφλού εντέρου κρεοπαραγωγών ορνιθίων συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια διαφορετικών επισκέψεων σε δύο σφαγεία πουλερικών του νομού Θεσσαλονίκης, με κωδική ονομασία Κ και Φ, κατά τη χρονική περίοδο μεταξύ Μαΐου 2005 και Ιουνίου Τα δείγματα προέρχονταν από οκτώ (8) πτηνοτροφεία ορνιθίων κρεοπαραγωγής της Βόρειας (Θεσσαλονίκη, Χαλκιδική, Σέρρες, Κιλκίς, Δράμα), με κωδικές ονομασίες Ο1-Ο8. Τα ορνίθια ήταν κατά μέσο όρο ηλικίας 5-6 εβδομάδων. Κατά την ίδια χρονική περίοδο και κατά τη διάρκεια διαφορετικών επισκέψεων σε δύο σφαγεία του νομού Θεσσαλονίκης, συλλέχθηκαν δείγματα περιεχομένου παχέος (τυφλού) εντέρου από εξήντα (60) μόσχους και διακόσια πενήντα (250) παχυνόμενους χοίρους. Οι μόσχοι προέρχονταν από επτά (7) εκτροφές της Βόρειας Ελλάδας (Θεσσαλονίκη, Σέρρες, Χαλκιδική), με κωδικές ονομασίες Μ1-Μ7, ενώ οι χοίροι από έξι (6) εκτροφές της Βόρειας και Κεντρικής Ελλάδας (Θεσσαλονίκη, Σέρρες, Πιερία, Ημαθία, Τρίκαλα, Αιτωλοακαρνανία), με κωδικές ονομασίες Χ1-Χ6. Επιπλέον, κατά την ίδια χρονική περίοδο, 50 δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν από ισάριθμους πτηνοσφαγείς που εργάζονταν στα πτηνοσφαγεία Κ και Φ καθώς και 50 δείγματα κοπράνων από ισάριθμους εκδοροσφαγείς που εργάζονταν στα ίδια σφαγεία που πραγματοποιήθηκε η σφαγή των χοίρων και των μόσχων. Επιπλέον, εξασφαλίστηκαν 63 κλινικά VREF στελέχη που είχαν απομονωθεί από ενήλικες ασθενείς του Ιπποκράτειου Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης (n=13) και του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Λάρισας (n=15) που νοσηλεύονταν κατά την περίοδο μεταξύ Ιανουαρίου 2006 και Νοεμβρίου 2009, καθώς και από νεογνά (n=35) κατά τη διάρκεια επιδημίας τον Ιούλιο του 2009 στο Ιπποκράτειο Νοσοκομείο (βλ ). 107

118 Πρωτόκολλο Απομόνωσης και Ταυτοποίησης Τα δείγματα μετά τον εκλεκτικό προεμπλουτισμό τους ενοφθαλμίζονταν σε εκλεκτικό υπόστρωμα όπου και επιχειρούταν η απομόνωση (βλ ). Η ταυτοποίηση των ύποπτων VRE αποικιών πραγματοποιούνταν με τυπικές για τους εντερόκοκκους βιοχημικές δοκιμές και τα αποτελέσματα ερμηνεύονταν με βάση ειδικά διαγράμματα ροής (βλ 4.2.2). Τα κλινικά VRE στελέχη των ενηλίκων είχαν απομονωθεί είτε από απευθείας ενοφθαλμισμό, ενώ εκείνα των νεογνών μετά από εκλεκτικό προεμπλουτισμό και είχαν ταυτοποιηθεί ως E. faecium (VREF) με βάση τη δοκιμή API Strep (Biomerieux, France) και με τον αυτόματο αναλυτή VITEK 2 της BioMerieux (Mercy L Etoile, France). Έλεγχος του Van φαινοτύπου αντοχής Για τον έλεγχο της αντοχής στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη όλα τα ύποπτα VRE στελέχη που απομονώνονταν, εξετάζονταν με τη μέθοδο Kirby-Bauer (4.2.4). Επιπρόσθετα, η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (MIC) της βανκομυκίνης και τεϊκοπλανίνης έναντι των VRE υπολογιζόταν με τη μέθοδο των διαδοχικών μικροαραιώσεων σύμφωνα με τις οδηγίες του CLSI (βλ ). Ανίχνευση του van γενότυπου Για την ανίχνευση των van γονιδίων και την επιβεβαίωση της απομόνωσης VRE, όλα τα ύποπτα στελέχη που παρουσίαζαν MIC βανκομυκίνης 2μg/ml εξετάζονταν με τη μέθοδο της πολλαπλής PCR (βλ ). Οι PCR αντιδράσεις πραγματοποιούνταν σε ολικό γονιδιωματικό DNA (βλ ) με τη χρήση εκκινητών (βλ ) ειδικών για την ανίχνευση των γονιδίων vana, vanb, vanc1-c2, vand, vane, vang και την επιβεβαίωση των ειδών E. faecium και E. faecalis, καθώς και με τη χρήση VRE στελεχών αναφοράς (βλ και Εικόνα 5.1). 5.2 Αποτελέσματα και Συζήτηση Από τα 550 δείγματα, συνολικά, που συλλέχθηκαν από τα κρεοπαραγωγά ορνίθια και τους πτηνοσφαγείς, 204 έδωσαν ανάπτυξη στο εκλεκτικό υπόστρωμα Enterococcosel Agar εκ των οποίων 179 ταξινομήθηκαν ως Enterococcus spp. Σύμφωνα με τα βιοχημικά τους χαρακτηριστικά, 131 ταυτοποιήθηκαν ως E. faecium, 3 ως E. faecalis και 45 ως Ε. 108

119 gallinarum και ως εκ τούτου ο Ε. faecium ήταν το πιο συχνά απομονωμένο είδος τόσο μεταξύ των κρεοπαραγωγών ορνιθίων όσο και μεταξύ των πτηνοσφαγέων. Η multiplex PCR επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα των βιοχημικών δοκιμών σε ό,τι αφορά την ταυτοποίηση των ειδών E. faecium και E. faecalis. Ωστόσο, τα 42 από τα 131 Ε. faecium καθώς και τα 3 E. faecalis στελέχη, των οποίων η MIC στη βανκομυκίνη κυμαινόταν από 2-4 μg/ml, παρήγαγαν μόνο ένα PCR-product που αντιστοιχούσε στο ddl γονίδιό τους, ενώ τα υπόλοιπα 89 στελέχη Ε. faecium (79 απομονωμένα από ορνίθια και 10 από πτηνοσφαγείς, Πίνακας 5.1) εμφάνισαν επιπλέον το γονίδιο vana (Εικόνες 5.2 και 5.3). Όπως αναμένονταν, και τα 45 E. gallinarum στελέχη (41 απομονωμένα από ορνίθια και 4 από πτηνοσφαγείς, Πίνακας 5.1) έφεραν το vanc γονίδιο (Εικόνες 5.4 και 5.5). Από μία απομόνωση VRE στελεχών πραγματοποιήθηκε στα 120 από τα 127 (94,5%) θετικά δείγματα, ενώ από 2-3 απομονώσεις πραγματοποιήθηκαν σε 7 δείγματα από τα κρεοπαραγωγά ορνίθια (Πίνακας 5.2). Επίσης, από ένα δείγμα τυφλού εντέρου ορνιθίου απομονώθηκαν ταυτόχρονα ένα στέλεχος E. faecium vana και ένα στέλεχος E. gallinarum vanc. Είναι ενδιαφέρον ότι κανένα άλλο γονίδιο δεν ανιχνεύθηκε μεταξύ των 134 ύποπτων στελεχών VRE (120 από ορνίθια και 14 από πτηνοσφαγείς). Στον Πίνακα 5.1 φαίνεται η κατανομή των VRE στελεχών. Συνολικά 120 στελέχη VRE ανακτήθηκαν από 112 (22,4%) δείγματα, από συνολικά 500, κρεοπαραγωγών ορνιθίων. Στελέχη VREF που έφεραν το γονίδιο vana κυριαρχούσαν και ανακτήθηκαν από 74 (14,8%) δείγματα από τα 5 από τα 8 (62,5%) συνολικά πτηνοτροφεία (Ο1, Ο3, Ο5, Ο6, Ο7), ενώ στελέχη E. gallinarum που έφεραν το γονίδιο vanc ανακτήθηκαν από 39 (7,8%) δείγματα επίσης από 5 πτηνοτροφεία (Ο1, Ο2, Ο3, Ο4, Ο5). Ένα πτηνοτροφείο (Ο8) ήταν αρνητικό σε VRE. Σε ό,τι αφορά τους πτηνοσφαγείς, VRE απομονώθηκαν από 14 (28%) δείγματα εκ των οποίων 10 (20%) ήταν θετικά σε VREF και 4 (8%) σε E. gallinarum. Σε ό,τι αφορά τα δείγματα κοπράνων των μόσχων (n=60), 20 έδωσαν ανάπτυξη σε Enterococcosel Agar εκ των οποίων 15 ταυτοποιήθηκαν ως E. faecium σύμφωνα με τα βιοχημικά τους χαρακτηριστικά. Στα 14 από αυτά, των οποίων η MIC της βανκομυκίνης κυμάνθηκε από 2-4 μg/ml, η multiplex PCR ανέδειξε μόνο το γονίδιο ddl E. faecium και 1 μόνο στέλεχος E. faecium, έφερε το γονίδιο vana και ως εκ τούτου ταυτοποιήθηκε ως VREF (Πίνακας 5.1). Σε ό,τι αφορά τα δείγματα κοπράνων υγιών παχυνόμενων χοίρων (n=250), 25 έδωσαν ανάπτυξη στο εκλεκτικό υπόστρωμα Enterococcosel agar εκ των οποίων 20 ταυτοποιήθηκαν ως E. faecium σύμφωνα με τα βιοχημικά τους χαρακτηριστικά. VRE δεν απομονώθηκαν από καμία εκτροφή χοίρων. Ομοίως, από τα δείγματα κοπράνων των εκδοροσφαγέων (n=50) που 109

120 εργάζονταν στα σφαγεία όπου πραγματοποιήθηκε η σφαγή των χοίρων και μόσχων της παρούσας μελέτης, δεν απομονώθηκε κανένα VRE στέλεχος. Τέλος, σε ό,τι αφορά τα 63 νοσοκομειακά στελέχη VREF, όλα έφεραν τα ddl Ε. faecium και vana γονίδια (Εικόνα 5.6). - ddl E. faecium (1091bp) - vang (941 bp) - vanc1/2 (815/827 bp) - vana (732 bp) - vanb (647bp) - vand (500bp) -ddl E. faecalis (475bp) - vane (450 bp) Εικόνα 5.1. Multiplex PCR μαρτύρων. Σειρά 1: E. faecalis vang (BM 4518), Σειρά 3: E. faecalis vanb (V583), Σειρά 4: E. faecium vand (BM 4339), Σειρά 6: E. gallinarum vanc (BM 4174), Σειρά 7: E. faecalis vane (BM4405), Σειρά 8: E. faecium vana (BM4147), Σειρά 10: E. faecalis vanb (H260), Σειρά 11: E. faecium vana (HM 1032), Σειρά 12: E. faecalis vanb (V 583), Σειρά 13: E. gallinarum vanc (BM 4174), Σειρά 15: E. faecium vanb (Caen-231), Σειρές 2, 5,9, 14: κενό. - ddl E. faecium (1091bp) - vanc1/2 (815/827 bp) - vana (732 bp) - vanb (647bp) - ddl E. faecalis (475bp) Εικόνα 5.2. Στελέχη VRE εντεροκόκκων ορνιθίων (1-12). Σειρές 1-11: E. faecium vana, Σειρά 12: E. gallinarum vanc1/2, Σειρά 13: E. faecium vana (BM4147), Σειρά 14: E. faecalis vanb (V583), Σειρά 15: αρνητικός μάρτυρας. 110

121 - ddl E. faecium (1091bp) - vanc1/2 (815/827 bp) - vana (732 bp) Εικόνα 5.3. Στελέχη εντεροκόκκων ορνιθίων. Σειρές 1, 3, 4, 5, 7-14: E. faecium vana, Σειρές 2, 6: vanc1/2, Σειρά 15: αρνητικός μάρτυρας. 1500bp- 1000bp- 600bp- - ddl E. faecium (1091bp) - vanc1/2 (815/827 bp) - vana (732 bp) - ddl E. faecalis (475bp) Εικόνα 5.4. Στελέχη εντεροκόκκων ορνιθίων (1-12). Σειρές 1, 3-7, 12-14: E. gallinarum vanc1/2, Σειρά 2: E. faecalis, Σειρές 8-11: E. faecium vana, Σειρά 15: E. gallinarum vanc (BM 4174). - ddl E. faecium (1091bp) - vanc1/2 (815/827 bp) - vana (732 bp) Εικόνα 5.5. Στελέχη εντεροκόκκων πτηνοσφαγέων. Σειρές 1, 2: E. faecium vana, Σειρές 5, 6, 9,10: vanc1/2, Σειρές 3, 4,7, 8, 11-14: κενό, Σειρά 15: αρνητικός μάρτυρας. 111

122 - ddl E. faecium (1091bp) - vana (732 bp) Εικόνα 5.6. Κλινικά VREF στελέχη. Σειρές 1-15: E. faecium vana Πίνακας 5.1. Επιπολασμός των VRE στελεχών Προέλευση Αριθμός δειγμάτων Αρ. (%) VRE θετικών δειγμάτων/ VRE Αρ. (%) VREF vana θετικών δειγμάτων/ VREF Αρ. (%) E. gallinarum θετικών δειγμάτων/ Ε. gallinarum vanc Κρεοπαραγωγά ορνίθια * O1/K ** (53) / (52) /57 2 (2) / 2 O2/K (20) / (20) /11 O3/K (27) / 27 9 (9) / 9 18 (18) /18 O4/K 50 2 (4) / (4) / 2 O5/K (30) / 16 8 (16) / 8 7 (14) / 8 O6/Φ 50 4 (8) / 4 4 (8) / 4 0 O7/Φ 50 1 (2) / 1 1 (2) / 1 0 O8/Φ Υποσύνολο ** (22,4) / (14,8) /79 39 (7,8) /41 Πτηνοσφαγείς * Κ 25 7 (28) / 7 4 (16) / 4 3 (12) / 3 Φ 25 7 (28) / 7 6 (24) / 6 1 (4) / 1 Υποσύνολο (28) / (20) /10 4 (8) / 4 Εκδοροσφαγείς Μόσχοι * M1V 60 1 (1,7)/ 1 1 (1,7)/ 1 0 Χοίροι Νοσηλευόμενοι ασθενείς Ιπποκράτειο (Ενήλικες) 13 Ιπποκράτειο (Νεογνά) 35 Λάρισα (Ενήλικες) 15 Υποσύνολο 63 Σύνολο (14) / (7) /45 * Ο1-Ο8: Κωδικός αριθμός πτηνοτροφείου, K/Φ: κωδικός πτηνοσφαγείου, M1: Κωδικός αριθμός εκτροφής μόσχων, V: κωδικός σφαγείου 112

123 ** Από ένα δείγμα τυφλού εντέρου ορνιθίου απομονώθηκαν ταυτόχρονα ένα στέλεχος E. faecium vana και ένα στέλεχος E. gallinarum vanc. Πίνακας 5.2 VRE απομονωθέντα στελέχη σε σχέση με τον αριθμό των θετικών δειγμάτων Προέλευση Αριθμός απομονώσεων ανά δείγμα Αριθμός θετικών δειγμάτων Αριθμός VRE απομονώσεων Κρεοπαραγωγά ορνίθια Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Υποσύνολο Μόσχοι Πτηνοσφαγείς Υποσύνολο Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι VREF vana-τύπου επικρατούν μεταξύ των VRE, γεγονός που έχει παρατηρηθεί και σε άλλες χώρες (Klare και συν., 1995a Bustamante και συν., 2003 Kuhn και συν., 2005 Werner και συν., 2008a). Το ποσοστό του επιπολασμού των VREF μεταξύ των ορνιθίων (14,8%), υποδηλώνει την αξιοσημείωτη εμμονή τους για περισσότερο από μια δεκαετία μετά την κατάργηση της αβοπαρκίνης, του γλυκοπεπτιδίου που μέχρι το 1997 χρησιμοποιούνταν ευρέως στην Ελλάδα όπως και σε άλλες χώρες, ως αυξητικός παράγοντας (βλ. κεφ. 3.3). Επικαιροποιημένα επιδημιολογικά δεδομένα από άλλες Ευρωπαϊκές χώρες αναφέρουν ποσοστά επιπολασμού μεταξύ των ορνιθίων έως 23% (Πίνακας 5.3). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι παλαιότερες μελέτες ανέφεραν ποσοστά μέχρι και 88,1% (Bager και συν., 1999 van den Bogaard και συν., 2000 Aarestrup και συν., 2001 van den Bogaard και συν., 2002 Eisner και συν., 2005 Garcia-Migura και συν., 2005 Sorum και συν., 2006 Nilsson και συν., 2009) (Πίνακας 5.3). 113

124 Θα πρέπει να τονιστεί ότι τα ευρωπαϊκά προγράμματα επιτήρησης χρησιμοποιούν διαφορετικές μεθόδους απομόνωσης των VRE (απομόνωση με εκλεκτικό προεμπλουτισμό σε ζωμό με βανκομυκίνη ή απευθείας σπορά σε εκλεκτικό στερεό υπόστρωμα με βανκομυκίνη και επιλογή μιας ή περισσοτέρων αποικιών ανά δείγμα ή απομόνωση με απευθείας σπορά σε εκλεκτικό στερεό υπόστρωμα χωρίς βανκομυκίνη). Οι διαφορές αυτές μπορεί εν μέρει να ευθύνονται για τις διακυμάνσεις που παρατηρούνται στα ποσοστά επιπολασμού (βλ. 3.2 και 3.3). Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί η Δανία όπου VREF απομονώθηκαν στο 47% των δειγμάτων από κόπρανα κρεοπαραγωγών ορνιθίων, χρησιμοποιώντας στη μέθοδο απομόνωσης και το στάδιο προεμπλουτισμού (υπόστρωμα Enterococcus selective broth ενισχυμένο με βανκομυκίνη), ενώ δεν απομονώθηκαν VREF με τη μέθοδο χωρίς το στάδιο προεμπλουτισμού (DANMAP, 2010). Αυτό οφείλεται στη σχετικά χαμηλή συγκέντρωση των VREF ανά γραμμάριο σε σχέση με το συνολικό πληθυσμό των E. faecium στα κόπρανα των κρεοπαραγωγών ορνιθίων. Επίσης, σημαντικό εύρημα στη μελέτη μας είναι ότι οι VREF απομονώθηκαν από το 62,5% των πτηνοτροφείων που δείχνει επίσης την εμμονή των VREF σε περιβάλλοντα στα οποία για περισσότερο από 10 χρόνια έχει εκλείψει η επιλεκτική πίεση που θα μπορούσε να ασκείται από τη χρήση της αβοπαρκίνης ως αυξητικού παράγοντα. Σε άλλες μελέτες που έχουν διεξαχθεί σε χώρες όπως η Νορβηγία, το Ηνωμένο Βασίλειο και η Δανία, το ποσοστό αυτό κυμαινόταν μεταξύ 74% και 99%, μόλις 3-5 χρόνια μετά την κατάργηση της αβοπαρκίνης (Borgen και συν., 2000 Heuer και συν., 2002 Garcia-Migura και συν., 2005), γεγονός που επιπλέον τονίζει τη μικρή μόνο μείωση του ποσοστού στην Ελλάδα παρά την παρέλευση διπλάσιου ή τριπλάσιου χρόνου από την κατάργηση της αβοπαρκίνης. Στοιχεία σχετικά με τον επιπολασμό των VREF μεταξύ ανθρώπων που εργάζονται στην παραγωγή τροφίμων ζωικής προέλευσης και σε εκτροφές, αναφέρουν ποσοστά που ποικίλλουν από 5%-27,8% (Πίνακας 5.4), τα οποία συμφωνούν με το ποσοστό επιπολασμού 20% που βρέθηκε στους πτηνοσφαγείς στη δική μας μελέτη. Αξίζει να σημειωθεί ότι, μελέτες που αφορούν υγιείς εθελοντές της κοινότητας και έχουν διεξαχθεί σε διάφορες Ευρωπαϊκές χώρες, έδειξαν ποσοστά επιπολασμού των VREF που κυμαίνονταν από 0%-14% (Πίνακας 5.4). Ωστόσο, σε παλαιότερη έρευνα, αμέσως μετά την κατάργηση της αβοπαρκίνης, αναφέρθηκαν ποσοστά VREF 39% σε πτηνοτρόφους, 20% σε πτηνοσφαγείς και 14% σε υγιείς εθελοντές της κοινότητας (van den Bogaard και συν., 1997). Σε ό,τι αφορά τα νοσοκομεία, ο επιπολασμός των VREF φαίνεται να έχει παραμείνει σταθερός τα τελευταία χρόνια στην Ευρώπη, μέχρι 10% για την πλειοψηφία των χωρών, με την Ελλάδα να αναφέρει 114

125 ποσοστό 22,5% (ECDC, 2010), αλλά με σημαντικές τάσεις μείωσης αφού τα προηγούμενα χρόνια το ποσοστό έφτανε μέχρι και 42,5% (βλ. κεφ. 3, Εικόνα 3.3, Πίνακα 3.4). Ο ρόλος των κρεοπαραγωγών ορνιθίων στην εξάπλωση της αντοχής στη βανκομυκίνη παραμένει καταρχήν ασαφής και ως εκ τούτου απαιτείται γενοτυπικός χαρακτηρισμός των VREF που απομονώνονται, τόσο από τα ορνίθια όσο και από τους ανθρώπους (βλ. παρακάτω κεφ. 7). Η προαναφερθείσα εμμονή των VREF που παρατηρήθηκε στα ορνίθια, συνέβη όπως έχει παρατηρηθεί και σε προηγούμενες μελέτες (Borgen και συν., 2000 Heuer και συν., 2002 Garcia-Migura και συν., 2005 Johnsen και συν., 2005 Sorum και συν., 2006 Garcia-Migura και συν., 2007 Nilsson και συν., 2009), χωρίς καμιά εμφανή επιλεκτική πίεση των γλυκοπεπτιδίων, γεγονός που εγείρει διάφορα ερωτήματα (βλ. κεφ. 8). Πίνακας 5.3 Επιπολασμός των VREF απομονωμένων από κρεοπαραγωγά ορνίθια ή γαλοπούλες στις διάφορες χώρες Χώρα Χρονολογία Μελέτης Είδος δειγμάτων Επιπολασμός Μέθοδος Απομόνωσης Βιβλιογραφία 2004 κόπρανα 42,4% (1) (Eisner και Αυστρία συν., 2005) 2010 κόπρανα 0% (2) (EFSA, 2012) 2005 κόπρανα 1% (2) ή (3) (Kempf και Γαλλία συν., 2008) 2010 κόπρανα 0% (2) (EFSA, 2012) 1995 κόπρανα 80% (4) (Bager και 1998 κόπρανα 5% συν., 1999) κόπρανα 1,4% (1) (Kuhn και συν., 2005) 2000 κόπρανα 5,8% (2) (Aarestrup και Δανία συν., 2001) 2001 κόπρανα 74,3% εκτροφές (3) (Heuer και θετικές σε VREF συν., 2002) 2010 κόπρανα 0% (2) (EFSA, 2012) 2010 κόπρανα 0% (4) (DANMAP, 2010) Ελβετία 2010 κόπρανα 0% (2) (EFSA, 2012) Ηνωμένο κόπρανα 66% (3) (Garcia- Βασίλειο Migura και συν., 2005) Ιταλία 2003 κόπρανα 9,3% (4) (ITAVARM, 2003) Ισπανία 2005 κόπρανα 1,2% (4) (VAV, 2005) 115

126 Χώρα Νορβηγία Ολλανδία Χρονολογία Μελέτης Είδος δειγμάτων κόπρανα Επιπολασμός 97% θετικές εκτροφές σε VREF 2000 κόπρανα 99% θετικές εκτροφές σε VREF Μέθοδος Απομόνωσης (1) Βιβλιογραφία (Kruse και συν., 1999) (3) (Borgen και συν., 2000) κόπρανα 88,1% (4) (Sorum και συν., 2006) 2010 κόπρανα 0% (4) (NORM/NOR M-VET, 2010) 1997 κόπρανα 50% ΔΑ (van den (γαλοπούλες) Bogaard και συν., 1997) 80% (3) (van den 1997 κόπρανα Bogaard και 82% (1) συν., 2002) 2009 κόπρανα 0,9% (4) (MARAN, 2009) 2010 κόπρανα 0% (2) (EFSA, 2012) κόπρανα 2% (1) (Kuhn και συν., 2005) , κόπρανα 20,7% (1) ( ) ή (Nilsson και Σουηδία (3) ( ) συν., 2009) 2010 κόπρανα 0% (2) (EFSA, 2012) 2010 κόπρανα 23% (3) (SVARM 2010) Αυστραλία κόπρανα 66% (1) (Manson και συν., 2004) Ιαπωνία κόπρανα 0,3% VREF και 2,8% εκτροφές (3) (Yoshimura και συν., 1998) θετικές σε VREF Κορέα 2003 κόπρανα 1,7% (4) (Jung και συν., 2006) Κόστα κόπρανα 14,8% VRE (3) (Bustamante Ρίκα Ταϊβάν κόπρανα Μείωση από 3,4% στο 0% (1): Εκλεκτικός προεμπλουτισμός σε ζωμό με βανκομυκίνη (2): Εκλεκτικός προεμπλουτισμός σε ζωμό χωρίς βανκομυκίνη (3): Απευθείας σπορά σε εκλεκτικό άγαρ με βανκομυκίνη (4): Απευθείας σπορά σε εκλεκτικό άγαρ χωρίς βανκομυκίνη ΔΑ: Δεν αναφέρεται και συν., 2003) (1) (Lauderdale και συν., 2007) 116

127 Πίνακας 5.4 Επιπολασμός των VREF απομονωμένων από κόπρανα ανθρώπων που εργάζονται στην παραγωγή τροφίμων ζωικής προέλευσης, σε εκτροφές και υγιών εθελοντών της κοινότητας Χώρα Αυστρία 2004 Γερμανία Νορβηγία Ολλανδία Πορτογαλία Χρονολογία Μελέτης Είδος υγιείς εθελοντές Υγιείς εθελοντές υγιείς εθελοντές Επιπολασμός Μέθοδος Απομόνωσης * 0,5% (1) 12% (1) 3% (1) εκτροφείς 27,8% (1) 2000 εκτροφείς 18% (1) * Όπως Πίνακας 5.3 ΔΑ: Δεν αναφέρεται υγιείς εθελοντές 2% (1) πτηνοσφαγείς 20% ΔΑ εκτροφείς 39% ΔΑ Υγιείς εθελοντές 14% ΔΑ εκτροφείς 27% (3) 36% (1) πτηνοσφαγείς 13% (3) 17% (1) Υγιείς εθελοντές 0% (1) Χειριστές τροφίμων ζωικής 7% (1) προέλευσης υγιείς εθελοντές 5% (1) Βιβλιογραφία (Eisner και συν., 2005) (Klare και συν., 1995a) (Klare και συν., 1999) (Sorum και συν., 2006) (Borgen και συν., 2000) (Endtz και συν., 1997) (van den Bogaard και συν., 1997) (van den Bogaard και συν., 2002) (del Campo και συν., 2003) (Novais και συν., 2006) Ιδιαίτερα ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι από τους υγιείς μόσχους απομονώθηκε μόνο ένα vana-τύπου VREF στέλεχος από ένα δείγμα σε σύνολο 60 (ποσοστό επιπολασμού 1,7%), ενώ δεν απομονώθηκε άλλο είδος εντεροκόκκου που να φέρει γονίδιο van. Στελέχη VRE που έφεραν το γονίδιο vana έχουν απομονωθεί από κόπρανα βοοειδών σε ποσοστά 2-4% στη Γαλλία (de Jong και συν., 2009 Haenni και συν., 2009), 6,6% στην Ιταλία (ITAVARM, 2003), 21,6% στην Αυστρία (Eisner και συν., 2005), καθώς και από κρέας μόσχων στη Γερμανία (Klein και συν., 1998) και στην Κορέα (Jung και συν., 2007). Σε άλλες 117

128 μελέτες, αντίθετα, από δείγματα κοπράνων βοοειδών έχουν απομονωθεί μόνο VanC VRE (Bustamante και συν., 2003 Song και συν., 2005 Jung και συν., 2007 Ramos και συν., 2012) σε ποσοστά που κυμαίνονταν από 2,7%-13,1%. Τέλος, υπάρχουν μελέτες που αναφέρουν απουσία VRE σε δείγματα κοπράνων βοοειδών (Hershberger και συν., 2005 DANMAP 2010 Donabedian και συν., 2010 Kojima και συν., 2010) ή κρέατος μόσχων (Hayes και συν., 2003). Αξιοσημείωτο είναι, τέλος, και το γεγονός ότι VRE δεν απομονώθηκαν από τα δείγματα κοπράνων των χοίρων που προέρχονταν από 6 εκτροφές. Αντίθετα, σε προηγούμενη μελέτη, που διεξήχθη στη Βόρεια Ελλάδα, αναφέρθηκε η παρουσία VREF σε 17 από τις 20 εκτροφές χοίρων που εξετάστηκαν και που ήταν διαφορετικές από τις εκτροφές της δικής μας μελέτης (Kotzamanidis και συν., 2009). Σημειώνεται, επιπλέον, ότι η προσπάθεια απομόνωσης στην προηγούμενη μελέτη γινόταν μετά την ανάμειξη των δειγμάτων κοπράνων από ζώα μιας εκτροφής (pool sampling), ενώ η απομόνωση VRE στην παρούσα μελέτη γινόταν ανά ζώο, μιας και στόχος μας ήταν να ελέγξουμε το ποσοστό επιπολασμού ακόμα και μέσα στην ίδια εκτροφή (Πίνακας 5.1). Στην περίπτωση των ορνιθίων, τα ποσοστά των VRE στις εκτροφές κυμαίνονταν από 0% έως 53% (Πίνακας 5.1). Η παρουσία, λοιπόν, των VRE στελεχών σε μια εκτροφή μπορεί να ποικίλλει και πιθανόν να εξαρτάται από τη συνεπιλογή που μπορεί να συμβαίνει από τη χρήση άλλων αντιμικροβιακών στην εκτροφή (βλ. κεφ και κεφ. 8), αφού ο παράγοντας αβοπαρκίνη έχει πλέον εκλείψει. Πράγματι, επανερχόμενοι στο ποσοστό των VRE στους χοίρους, αρκετά μεγάλη διακύμανση έχει παρατηρηθεί και σε άλλες χώρες, με το ποσοστό επιπολασμού να κυμαίνεται από 0% έως 25,3%. Συγκεκριμένα έχουν αναφερθεί ποσοστά 25,3% στην Πορτογαλία (Ramos και συν., 2012), 23,3% στην Αυστρία (Eisner και συν., 2005), 10,9% στις ΗΠΑ (Donabedian και συν., 2010), 10% στην Ιταλία (ITAVARM, 2003), 6,2% στη Γαλλία (Kempf και συν., 2008), 1,2% στην Ισπανία (VAV, 2005), 1% στη Δανία και την Ολλανδία (MARAN, 2009 DANMAP, 2010) και 0% σε Νορβηγία (NORM/NORM-VET, 2010), Σουηδία (SVARM, 2010) και Κορέα (Seo και συν., 2005 Jung και συν., 2007). Το ποσοστό του επιπολασμού των στελεχών E. gallinarum vanc της δικής μας μελέτης τόσο μεταξύ των ορνιθίων όσο και μεταξύ των πτηνοσφαγέων (7,8% και 8%, αντίστοιχα, βλ. Πίνακα 5.2) συμφωνεί με μελέτες που αναφέρουν ποσοστό 11-13,2% σε κλινικά δείγματα σε νοσοκομεία της Ελλάδας (Christidou και συν., 2004 Gikas και συν., 2005 Metallidis και συν., 2006). Επιπρόσθετα, στελέχη E. gallinarum έχουν απομονωθεί πρόσφατα και σε παράκτια ύδατα του Θερμαϊκού κόλπου, χωρίς ωστόσο να φέρουν το γονίδιο vanc (Zdragas και συν., 2008). Ωστόσο, όπως και στους VREF, σημαντικές 118

129 διακυμάνσεις στα ποσοστά επιπολασμού των E. gallinarum vanc παρατηρούνται μεταξύ των διαφόρων χωρών. Έτσι, ενώ στη δική μας μελέτη το ποσοστό επιπολασμού των E. gallinarum vanc ήταν 7,8%, στην Αυστρία αναφέρθηκε ποσοστό 34,6% σε δείγματα από κόπρανα ορνιθίων (Eisner και συν., 2005), ενώ πρόσφατα, στη Μαλαισία και στην Κορέα, αναφέρθηκε ποσοστό 3,1%-4% σε δείγματα κοπράνων και το περιβάλλον εκτροφής κρεοπαραγωγών ορνιθίων (Seo και συν., 2005 Chan και συν., 2008 Getachew και συν., 2009). Επίσης, εντερόκοκκοι με VanC τύπο αντοχής στη βανκομυκίνη κυριαρχούσαν σε δείγματα κοπράνων κρεοπαραγωγών ορνιθίων στις ΗΠΑ και στη Βραζιλία, σε ποσοστά 11% και 13%, αντίστοιχα, με ταυτόχρονη απουσία άλλων τύπων αντοχής στη βανκομυκίνη (Rice και συν., 2003a Batista Xavier και συν., 2006). Σε παλαιότερες μελέτες, στελέχη E. gallinarum vanc απομονώθηκαν από δείγματα κρέατος ορνιθίων σε ποσοστό 9% στην Ολλανδία, (van den Braak και συν., 1998), 23% στην Πορτογαλία (Novais και συν., 2005a) και 100% στη Γαλλία (Gambarotto και συν., 2001). 119

130 120

131 6 ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ/ΑΝΤΟΧΗΣ ΤΩΝ VRE ΣΤΕΛΕΧΩΝ - ΔΙΑΧΩΡΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΦΙΛ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ ΤΩΝ VREF ΣΤΕΛΕΧΩΝ 6.1 Σχεδιασμός και Εκτέλεση του Ελέγχου της Ευαισθησίας/Αντοχής των VRE στελεχών Όπως προαναφέρθηκε (βλ. κεφ. 5.1), για τον έλεγχο του Van φαινοτύπου αντοχής, όλα τα στελέχη εντερόκοκκων που απομονώνονταν στο εκλεκτικό υπόστρωμα Enterococcosel agar, και ως εκ τούτου θεωρούνταν ως ύποπτα VRE, εξετάζονταν καταρχήν με τη μέθοδο Kirby-Bauer (βλ ) ως προς την αντοχή τους στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη και στη συνέχεια υπολογιζόταν η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (MIC) της βανκομυκίνης και της τεϊκοπλανίνης με τη μέθοδο των διαδοχικών μικροαραιώσεων (βλ ). Επιπρόσθετα του ελέγχου της αντοχής στη βανκομυκίνη και τεϊκοπλανίνη, όλα τα VRE στελέχη εξετάστηκαν με τη μέθοδο Kirby-Bauer για τον καθορισμό της ευαισθησίας που παρουσίαζαν στις αντιμικροβιακές ουσίες αμπικιλλίνη, πενικιλλίνη, βακιτρακίνη, γενταμυκίνη-hlr, στρεπτομυκίνη-hlr, νεομυκίνη, ερυθρομυκίνη, τετρακυκλίνη, σιπροφλοξακίνη, χλωραμφαινικόλη, σουλφαμεθοξαζόλη/τριμεθοπρίμη και λινεζολίδη (βλ ), σύμφωνα με τις οδηγίες του CLSI και/ή EUCAST (CLSI 2006b EUCAST 2012). Τα ποσοστά της αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες μεταξύ των στελεχών VRE, απομονωμένων από τις διαφορετικές πηγές, επεξεργάστηκαν στατιστικά με το στατιστικό πρόγραμμα SPSS v17.0, ενώ ο συσχετισμός των προφίλ της αντιμικροβιακής αντοχής μεταξύ των VREF στελεχών των πτηνών, των πτηνοσφαγέων και των νοσηλευομένων ασθενών καθορίστηκε με τη χρήση της Διαχωριστικής Ανάλυσης (βλ. κεφ ), βασισμένη στο σύνολο των 14 αντιμικροβιακών ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ευαισθησίας. Η Διαχωριστική Ανάλυση εφαρμόστηκε ως μια πολλαπλή ανάλυση των αντιμικροβιακών προφίλ (φαινοτύπων αντοχής) για την ταξινόμηση των στελεχών σε ομάδες διαφορετικών πηγών προέλευσης, στη συγκεκριμένη περίπτωση πτηνά, πτηνοσφαγείς και νοσηλευόμενοι ασθενείς. Με βάση αυτή την ανάλυση, τα δεδομένα των αντιμικροβιακών προφίλ μετατράπηκαν σε δυαδικό κώδικα με βάση την ευαισθησία ή την αντοχή τους (Carroll και συν., 2005 Vantarakis και συν., 2006) και στη συνέχεια αναλύθηκαν με το λογισμικό StatistiXL [έκδοση 1.8, Πανεπιστήμιο Western Australia ( 121

132 υπολογίζοντας με αυτόν τον τρόπο των αριθμό των στελεχών της κάθε συγκεκριμένης πηγής που "ορθά" ταξινομήθηκαν στην αντίστοιχη πηγή προέλευσής τους. Το μέσο ποσοστό της "ορθής" ταξινόμησης (Average Rate of Correct Classification, ARCC) για την ανάλυση αυτή προσδιορίστηκε από το μέσο όρο των ποσοστών των "ορθά" ταξινομημένων στελεχών για όλες τις πηγές (Wiggins, 1996). 6.2 Αποτελέσματα και Συζήτηση Έλεγχος Ευαισθησίας/αντοχής των VRE στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη H MIC της βανκομυκίνης και της τεϊκοπλανίνης ήταν 128 μg/ml για το 97,5% και 32 μg/ml για το 72,2% των στελεχών VREF των ορνιθίων, αντίστοιχα. Η MIC της τεϊκοπλανίνης ήταν 2-4 μg/ml για το 5,1% και 8 μg/ml για το 21,5% (Πίνακες 6.1, 6.2) γεγονός που υποδηλώνει ότι τα στελέχη αυτά, αν και σύμφωνα με τη μέθοδο Kirby-Bauer εμφάνισαν αντοχή στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη, εντούτοις σύμφωνα με τη MIC, παρουσίαζαν αντοχή μόνο στη βανκομυκίνη, δηλαδή δεν παρουσίαζαν φαινότυπο VanΑ. Ωστόσο, αυτά τα στελέχη VREF, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της πολλαπλής PCR έφεραν το γονίδιο vana (Πίνακας 6.2). Τέτοια στελέχη, δηλ με γενότυπο vana αλλά με διαφορετικό φαινότυπο έχουν αναφερθεί σε προηγούμενες μελέτες και η έλλειψη έκφρασης της αντοχής στην τεϊκοπλανίνη μπορεί να οφείλεται σε μεταλλάξεις ή αλλαγές στο vana οπερόνιο (Lauderdale και συν., 2002 Eom και συν., 2004 Oh και συν., 2007 Werner και συν., 2008b). Σε ό,τι αφορά τα κλινικά VREF στελέχη καθώς και το στέλεχος VREF που απομονώθηκε από μόσχο, η MIC της βανκομυκίνης και τεϊκοπλανίνης ήταν >128 μg/ml και >32 μg/ml, αντίστοιχα (Πίνακες 6.1 και 6.2). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι όλα τα κλινικά VREF στελέχη παρουσίαζαν MIC στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη >128 μg/ml και >32 μg/ml, αντίστοιχα, ενώ κανένα στέλεχος των πτηνοσφαγέων δεν παρουσίαζε ανάλογες MIC. Από τα 41 στελέχη του είδους E. gallinarum των ορνιθίων, σύμφωνα με τη μέθοδο Kirby-Bauer, 5 παρουσίαζαν αντοχή στη βανκομυκίνη, ενώ ήταν ευαίσθητα στην τεϊκοπλανίνη, ενώ τα υπόλοιπα 36 ήταν ευαίσθητα ή εμφάνιζαν ενδιάμεση ευαισθησία στη βανκομυκίνη και ευαισθησία στην τεϊκοπλανίνη (Πίνακας 6.2). Για τα στελέχη αυτά, η MIC της βανκομυκίνης κυμαινόταν από 4-16 μg/ml και της τεϊκοπλανίνης 0,5-2 μg/ml (Πίνακας 6.2). Τα στελέχη E. gallinarum των πτηνοσφαγέων ήταν ευαίσθητα στα γλυκοπεπτίδια 122

133 σύμφωνα με τη μέθοδο Kirby-Bauer. Για τα στελέχη αυτά η MIC της βανκομυκίνης κυμαινόταν από 8-16 μg/ml και της τεϊκοπλανίνης 1-2 μg/ml (Πίνακας 6.2). Πίνακας 6.1. MIC της βανκομυκίνης και της τεϊκοπλανίνης έναντι των VREF στελεχών που απομονώθηκαν από κρεοπαραγωγά ορνίθια, πτηνοσφαγείς, μόσχους και νοσηλευόμενους ασθενείς. Πηγή Βανκομυκίνη Τεϊκοπλανίνη MIC(μg/ml) * % VREF στελέχη MIC(μg/ml) * % VREF στελέχη Κρεοπαραγωγά ορνίθια >128 91,1 >32 45, , ,6 64 2,5 16 1,3 8 21,5 4 3,8 2 1,3 Πτηνοσφαγείς >128 0,0 >32 0, , , , ,0 Μόσχοι > ,0 >32 100,0 Νοσηλευόμενοι ασθενείς > ,0 >32 100,0 * Όρια αντοχής (breakpoints,μg/ml): Βανκομυκίνη 32 μg/ml,τεϊκοπλανίνη 32 μg/ml 123

134 Πίνακας 6.2. Συσχετισμός της αντοχής στη βανκομυκίνη και τεϊκοπλανίνη με βάση τη μέθοδο Kirby-Bauer και των τιμών της MIC και αποτελεσμάτων PCR στελεχών εντεροκόκκων που απομονώθηκαν από κρεοπαραγωγά ορνίθια, μόσχους, πτηνοσφαγείς και νοσηλευόμενους ασθενείς. Με γκρι σκίαση επισημαίνονται τα στελέχη VREF που, ενώ έφεραν το γονίδιο vana, παρουσίαζαν ευαισθησία ή ελαττωμένη αντοχή στην τεϊκοπλανίνη. Προέλευση Ο1K Ο2K Ο3K Kirby-Bauer Αριθμός VAN TEC στελεχών 57 R R 2 IS IS 9 IS S 5 S S 4 IS S 7 S S MIC (μg/ml) Αριθμός PCR VAN TEC στελεχών 15 >128 >32 17 > > >128 4 E. faecium 1 >128 2 vana E. gallinarum vanc ,5 E. faecium , E. gallinarum vanc IS S S S E. faecium 9 R R 8 >128 >32 E. faecium >32 vana IS S E. gallinarum vanc 13 S S 5 IS S 3 S S , E. faecium 124

135 Kirby-Bauer MIC (μg/ml) Προέλευση Αριθμός Αριθμός PCR VAN TEC VAN TEC στελεχών στελεχών Ο4K E. gallinarum 2 S S vanc 1 IS S E. faecalis 2 S S 2 4 0,5 8 R R 7 >128 >32 E. faecium >32 vana 5 R S E. gallinarum Ο5K vanc 3 IS S IS S E. faecium 1 S S 1 4 0,5 Ο6F 4 R R 3 >128 >32 E. faecium 1 > vana Ο7F 1 R R 1 >128 >32 E. faecium vana Μόσχοι 1 R R 1 >128 >32 E. faecium vana 10 R R E. faecium vana E. gallinarum 4 S S vanc Πτηνοσφαγείς 1 IS S Νοσηλευόμενοι ασθενείς 13 S S R R 63 >128 >32 E. faecium E. faecium vana Στα διαγράμματα που ακολουθούν ( ) απεικονίζονται οι κατανομές των τιμών MIC της βανκομυκίνης και της τεϊκοπλανίνης σε σχέση με τους κύκλους αναστολής ανάπτυξης, των στελεχών των εντεροκόκκων απομονωμένων από κρεοπαραγωγά ορνίθια, πτηνοσφαγείς, μόσχους και νοσηλευόμενους ασθενείς, με τα όρια αντοχής για τις παραπάνω ουσίες σύμφωνα με τις οδηγίες του CLSI (CLSI, 2006c). Όπως εμφανίζεται στο Διάγραμμα 6.1, 158 από τα 243 συνολικά στελέχη εντεροκόκκων εμφάνισαν, σύμφωνα με τη μέθοδο Kirby-Bauer, κύκλους αναστολής στη βανκομυκίνη από 6-14 mm, που αντιστοιχεί σε αντοχή (R 14 mm). Ωστόσο, 5 από τα 158 στελέχη (ποσοστό 3,2%) εμφάνιζαν ενδιάμεση αντοχή με 125

136 βάση την MIC που ήταν ίση με 16 μg/ml. Τα στελέχη αυτά ανήκαν στο είδος E. gallinarum και έφεραν το γονίδιο vanc (Διαγράμματα 6.1 και 6.5). Tα υπόλοιπα 153 από τα 158 στελέχη (ποσοστό 96,8%) εμφάνισαν τιμές MIC 64 μg/ml και ταυτοποιήθηκαν ως VREF και έφεραν το γονίδιο vana (Διαγράμματα 6.1 και 6.3). Για τα στελέχη αυτά, υπήρχε απόλυτη ταύτιση των αποτελεσμάτων των κύκλων αναστολής στη βανκομυκίνη και των τιμών MIC. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι από τα 28 στελέχη εντεροκόκκων που εμφάνισαν ενδιάμεση αντοχή στη βανκομυκίνη με τη μέθοδο Kirby-Bauer (κύκλοι αναστολής mm), μόνο 1 (ποσοστό 3,6%) αποδείχθηκε ευαίσθητο αφού εμφάνισε MIC ίση με 2 μg/ml, ενώ στα υπόλοιπα, η MIC κυμάνθηκε από 8-16 μg/ml (Διάγραμμα 6.1). Τέλος, από τα 56 στελέχη εντεροκόκκων που εμφάνισαν ευαισθησία στη βανκομυκίνη σύμφωνα με τη μέθοδο Kirby-Bauer (κύκλοι αναστολής mm), τα 39 (ποσοστό 69,6%) αποδείχθηκαν να έχουν ενδιάμεση ευαισθησία αφού εμφάνισαν τιμές MIC 8-16 μg/ml. Συμπερασματικά, σε ό,τι αφορά τη βανκομυκίνη, τα αποτελέσματα της μεθόδου Kirby-Bauer επιβεβαιώθηκαν με αυτά της μεθόδου των διαδοχικών μικροαραιώσεων, για τον προσδιορισμό της MIC, για τα 198 από τα 243 στελέχη εντεροκόκκων (ποσοστό 81,5%), ενώ για τα υπόλοιπα 45 στελέχη (ποσοστό 18,5%) υπήρχε απόκλιση αποτελεσμάτων. Επιπρόσθετα, όσα στελέχη παρουσίαζαν κύκλους αναστολής στη βανκομυκίνη 6-11 mm, εμφάνισαν τιμές MIC 64 μg/ml και έφεραν το γονίδιο vana (Διάγραμμα 6.3), ενώ από τα 6 στελέχη που είχαν κύκλο αναστολής στη βανκομυκίνη mm, μόνο το 1 εμφάνισε τιμή MIC 32 μg/ml (16,7%, Διάγραμμα 6.1). Σε ό,τι αφορά τα στελέχη E. gallinarum, υπήρξε ταύτιση αποτελεσμάτων μεταξύ κύκλων αναστολής και MIC της βανκομυκίνης για τα 13 από τα 45 στελέχη (28,9%) που παρουσίαζαν ενδιάμεση αντοχή (12 στελέχη) ή ευασισθησία (1 στέλεχος, Διάγραμμα 6.5). Πέντε στελέχη (11,1%) εμφάνισαν αντοχή με κύκλους αναστολής mm, ωστόσο η MIC τους (16 μg/ml) έδειχνε ενδιάμεση αντοχή, ενώ 27 στελέχη (60%) που εμφάνισαν ευαισθησία με κύκλους αναστολής mm, έδειξαν επίσης ενδιάμεση αντοχή με MIC 8-16 μg/ml. Σε ό,τι αφορά την τεϊκοπλανίνη, από τα 243 στελέχη εντεροκόκκων που εξετάστηκαν, τα 153 έδειξαν αντοχή, σύμφωνα με τη μέθοδο Kirby-Bauer, με κύκλους αναστολής 6-10 mm (Διάγραμμα 6.2). Για τα 126 από τα 153 στελέχη (ποσοστό 82,4%) υπήρχε απόλυτη ταύτιση αποτελεσμάτων με τη μέθοδο των διαδοχικών μικροαραιώσεων αφού εμφάνισαν τιμές MIC 32 μg/ml. Ωστόσο, για τα 6 στελέχη η MIC ήταν 16 μg/ml, εμφάνισαν δηλαδή ενδιάμεση αντοχή, και για τα 21 στελέχη η MIC ήταν 2-8 μg/ml, εμφάνισαν δηλαδή ευαισθησία ή ενδιάμεση ευαισθησία στην τεϊκοπλανίνη. Και τα 153 στελέχη, ωστόσο, βρέθηκαν να φέρουν το γονίδιο vana (Διαγράμματα 6.2 και 6.4). Απόλυτη ταύτιση αποτελεσμάτων υπήρχε και για 126

137 τα 90 από τα 243 στελέχη των εντεροκόκκων που ήταν ευαίσθητα στην τεϊκοπλανίνη με κύκλους αναστολής mm και τιμές MIC 0,5-4 μg/ml. Συμπερασματικά, σε ό,τι αφορά την τεϊκοπλανίνη, τα αποτελέσματα της μεθόδου Kirby-Bauer επιβεβαιώθηκαν με αυτά της μεθόδου διαδοχικών μικροαραιώσεων, για τον προσδιορισμό της MIC, για τα 216 από τα 243 στελέχη εντεροκόκκων (ποσοστό 88,9%), ενώ για τα υπόλοιπα 27 στελέχη (ποσοστό 11,1%) υπήρχε απόκλιση αποτελεσμάτων. Σε ό,τι αφορά τα στελέχη E. gallinarum, υπήρξε απόλυτη ταύτιση των αποτελεσμάτων μεταξύ κύκλων αναστολής και MIC της τεϊκοπλανίνης και για τα 45 στελέχη (100%) αφού όλα ήταν ευαίσθητα εμφανίζοντας κύκλους αναστολής 14-21mm και τιμές MIC 0,5-2 μg/ml (Διάγραμμα 6.6). VREF vana Διάγραμμα 6.1. Κατανομή των τιμών της MIC της βανκομυκίνης σε συνάρτηση με τους κύκλους αναστολής των στελεχών εντεροκόκκων (n=243) απομονωμένων από ορνίθια, πτηνοσφαγείς, μόσχους και νοσηλευόμενους ασθενείς. Οι κάθετες διακεκομμένες γραμμές υποδηλώνουν τα όρια αντοχής (R), ενδιάμεσης αντοχής (IS) και ευαισθησίας (S) με βάση τη μέθοδο Kirby-Bauer (R 14 mm, S 17 mm, 15 mm IS 16 mm), ενώ οι οριζόντιες τα αντίστοιχα όρια για την MIC (R 32 μg/ml, S 4 μg/ml, 8 μg/ml IS 16 μg/ml). 127

138 VREF vana Διάγραμμα 6.2. Κατανομή των τιμών MIC της τεϊκοπλανίνης σε συνάρτηση με τους κύκλους αναστολής των στελεχών εντεροκόκκων (n=243) απομονωμένων από ορνίθια, πτηνοσφαγείς, μόσχους και νοσηλευόμενους ασθενείς. Οι κάθετες διακεκομμένες γραμμές υποδηλώνουν τα όρια αντοχής (R), ενδιάμεσης αντοχής (IS) και ευαισθησίας (S) με βάση τη μέθοδο Kirby- Bauer (R 10 mm, S 14 mm, 11 mm IS 13 mm), ενώ οι οριζόντιες τα αντίστοιχα όρια για την MIC (R 32 μg/ml, S 8 μg/ml, IS=16 μg/ml). 128

139 Διάγραμμα 6.3. Κατανομή των τιμών της MIC της βανκομυκίνης σε συνάρτηση με τους κύκλους αναστολής των στελεχών VREF (n=153) απομονωμένων από ορνίθια, πτηνοσφαγείς, μόσχους και νοσηλευόμενους ασθενείς. Οι κάθετες και οριζόντιες διακεκομμένες γραμμές όπως στο Διάγραμμα 6.1. Διάγραμμα 6.4. Κατανομή των τιμών της MIC της τεϊκοπλανίνης σε συνάρτηση με τους κύκλους αναστολής των στελεχών VREF (n=153) απομονωμένων από ορνίθια, πτηνοσφαγείς, μόσχους και νοσηλευόμενους ασθενείς. Οι κάθετες και οριζόντιες διακεκομμένες γραμμές όπως στο Διάγραμμα

140 Διάγραμμα 6.5. Κατανομή των τιμών της MIC της βανκομυκίνης σε συνάρτηση με τους κύκλους αναστολής των στελεχών E. gallinarum (n=45) απομονωμένων από ορνίθια και πτηνοσφαγείς. Οι κάθετες και οριζόντιες διακεκομμένες γραμμές όπως στο Διάγραμμα 6.1. Διάγραμμα 6.6. Κατανομή τιμών MICτης τεϊκοπλανίνης σε συνάρτηση με τους κύκλους αναστολής των στελεχών E. gallinarum (n=45) απομονωμένων από ορνίθια και πτηνοσφαγείς. Οι κάθετες και οριζόντιες διακεκομμένες γραμμές όπως στο Διάγραμμα

141 Στα Διαγράμματα απεικονίζονται οι κατανομές των κύκλων αναστολής ανάπτυξης των στελεχών των εντεροκόκκων απομονωμένων από κρεοπαραγωγά ορνίθια, πτηνοσφαγείς, και νοσηλευόμενους ασθενείς. Σε ό,τι αφορά την κατανομή των κύκλων αναστολής ανάπτυξης των VREF των ορνιθίων (n=79) έναντι της βανκομυκίνης και της τεϊκοπλανίνης κατά την Kirby-Bauer (Διάγραμμα 6.7), το 88,6% (n=70) και το 56,9% (n=45) των στελεχών, αντίστοιχα, δεν εμφάνισαν αναστολή ανάπτυξης (κύκλος 6 mm), δηλωτικό της υψηλής αντοχής κάτι που επιβεβαιώθηκε και με τη MIC (Πίνακας 6.1). Ποσοστό 27,8% των VREF (n=22) εμφάνισε κύκλο αναστολής στην τεϊκοπλανίνη ίσο με 10 mm (όριο αντοχής), εκ των οποίων το 63,6% (n=14) είχε MIC στην τεϊκοπλανίνη 32 μg/ml, το 18,2% (n=4) είχε MIC 8 μg/ml, ενώ το υπόλοιπο 36,4% (n=4) είχε MIC στην τεϊκοπλανίνη 2-4 μg/ml, δηλαδή ήταν ευαίσθητα. Επιπλέον, το 15,2% των VREF στελεχών (n=12) εμφάνισαν κύκλο αναστολής στην τεϊκοπλανίνη ίσο με 8-9 mm, εκ των οποίων το 75% (n=9) είχε MIC στην τεϊκοπλανίνη 32 μg/ml και το υπόλοιπο 25% (n=3) είχε MIC 8-16 μg/ml. Όλα τα στελέχη VREF που εμφάνιζαν αντοχή στις αμινογλυκοσίδες, την τετρακυκλίνη και τη σουλφαμεθοξαζόλη/τριμεθοπρίμη, το 88,4% των στελεχών που παρουσίαζαν αντοχή στην ερυθρομυκίνη καθώς και το 80,8% των στελεχών με αντοχή στη νεομυκίνη, εμφάνισαν κύκλο ίσο με 6 mm, δηλωτικό της ισχυρής αντοχής. Στα στελέχη VREF των πτηνοσφαγέων, η κατανομή των κύκλων αναστολής στις 14 αντιμικροβιακές ουσίες έδειξε ότι όλα τα στελέχη που εμφάνισαν αντοχή σε όλες τις ουσίες που εξετάστηκαν, εμφάνισαν κύκλους αναστολής ίσους με 6 mm, με εξαίρεση τη σιπροφλοξακίνη όπου το 66,7% των στελεχών που παρουσίαζαν αντοχή σε αυτή την ουσία εμφάνισε κύκλο αναστολής ίσο με 10mm (όριο αντοχής ίσο με 15mm, Διάγραμμα 6.8). Ομοίως, σε ό,τι αφορά τα κλινικά στελέχη VREF, όλα σχεδόν τα στελέχη με αντοχή στις 14 εξεταζόμενες αντιμικροβιακές ουσίες εμφάνισαν κύκλους αναστολής 6 mm δηλωτικό της ισχυρής αντοχής τους (Διάγραμμα 6.9). Σε ό,τι αφορά την κατανομή των κύκλων αναστολής των στελεχών E. gallinarum των ορνιθίων (n=41), με τη μέθοδο Kirby-Bauer (Διάγραμμα 6.10), το 12,2% (n=5) παρουσίαζαν αντοχή στη βανκομυκίνη με κύκλους αναστολής mm, ενώ κανένα δεν ήταν ανθεκτικό στην τεϊκοπλανίνη. Ωστόσο, τα στελέχη E. gallinarum των ορνιθίων που παρουσίαζαν αντοχή στη βανκομυκίνη, σύμφωνα με τη με τη μέθοδο Kirby-Bauer, είχαν MIC στη βανκομυκίνη ίση με 16 μg/ml και στην τεϊκοπλανίνη 1-2 μg/ml (Πίνακας 6.2). Επίσης το 29,2% (n=12) παρουσίαζε ενδιάμεση αντοχή με κύκλους αναστολής 15-16mm (Διάγραμμα 6.10), που αντιστοιχούσε σε MIC στη βανκομυκίνη ίση με 8-16 μg/ml (Πίνακας 6.2, Διάγραμμα 6.5). Επίσης όλα τα στελέχη E. gallinarum των πτηνοσφαγέων, ήταν 131

142 ευαίσθητα στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη, σύμφωνα με τη μέθοδο Kirby-Bauer (κύκλοι αναστολής 17-21mm, Διάγραμμα 6.11), ενώ είχαν MIC στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη ίση με 8-16 μg/ml και 1-2 μg/ml (Πίνακας 6.2). Γενικά, από τα απομονωθέντα 134 VRE στελέχη (89 VREF και 45 E. gallinarum), τα 88 εμφάνισαν κύκλους αναστολής στη βανκομυκίνη ίσους με 6-11 mm και ήταν VREF με γενότυπο vana (Διαγράμματα 6.7, 6.8, 6.10), ενώ 6 στελέχη είχαν κύκλους αναστολής mm εκ των οποίων ένα ήταν VREF με γενότυπο vana (Διάγραμμα 6.7), και τα υπόλοιπα 5 ήταν E. gallinarum με γενότυπο vanc (Διάγραμμα 6.10). 132

143 Διάγραμμα 6.7. Κατανομή κύκλων αναστολής ανάπτυξης στελεχών VREF ορνιθίων (n=79) Αντοχή Συχνότητα εμφάνισης (%) ανάλογα με τον κύκλο αναστολής (mm) * Ουσία (%) VAN 100,0 88,6 1,3 2,5 3,8 2,5 1,3 TEC 100,0 56,9 5,1 10,1 27,8 BAC 29,1 17,7 11,4 2,5 6,3 6,3 34,2 20,2 1,3 AMP 16,5 1,3 1,3 5,1 1,3 7,6 11,4 12,7 3,8 1,3 2,5 7,6 3,8 10,1 6,3 7,6 6,3 3,8 5,1 1,3 PEN 41,8 11,4 1,3 5,1 6,3 3,8 3,8 3,8 6,3 3,8 1,3 1,3 1,3 1,3 2,5 5,1 3,8 3,8 12,7 5,1 10,1 2,5 2,5 1,3 HLG 21,5 21,5 1,3 1,3 6,3 6,3 8,9 34,2 1,3 13,9 2,5 2,5 HLS 41,8 41,8 2,5 6,3 12,7 12,7 5,1 3,8 1,3 3,8 2,5 1,3 2,5 2,5 1,3 NEM ,5 1,3 3,8 5,1 15,2 20,2 22,8 8,9 1,3 ERY 54,4 48,1 1,3 3,8 1,3 1,3 2,5 3,8 1,3 12,7 1,3 8,9 3,8 6,3 3,8 TET 100,0 100,0 CIP 30,4 7,6 1,3 3,8 5,1 1,3 7,6 3,8 5,1 11,4 17,7 8,9 11,4 10,1 5,1 CHL 1,3 1,3 2,5 2,5 7,6 7,6 6,3 10,1 5,1 22,8 5,1 16,5 1,3 8,9 1,3 1,3 SXT 48,1 48,1 5,1 8,9 12,7 2,5 7,6 6,3 8,9 LZD 0 7,6 15,2 17,7 22,8 2,5 11,5 6,3 10,1 2,5 3,8 * Οι κάθετες έντονες γραμμές σε κάθε γραμμή δείχνουν, η πρώτη το όριο αντοχής και η δεύτερη το όριο της ευαισθησίας για κάθε αντιμικροβιακή ουσία. Με γκρι σκίαση σημειώνεται το εύρος του ποσοστού των ανθεκτικών στελεχών Διάγραμμα 6.8. Κατανομή κύκλων αναστολής ανάπτυξης στελεχών VREF των πτηνοσφαγέων (n=10) Ουσία Αντοχή (%) Συχνότητα εμφάνισης (%) ανάλογα με τον κύκλο αναστολής (mm) * VAN 100,0 100 TEC 100,0 100 BAC 0, AMP 10, PEN 20, HLG 0, HLS 10, NEM 10, ERY 10, TET 40, CIP 30, CHL 0, SXT 30, LZD 0, * Οι κάθετες έντονες γραμμές σε κάθε γραμμή δείχνουν, η πρώτη το όριο αντοχής και η δεύτερη το όριο της ευαισθησίας για κάθε αντιμικροβιακή ουσία. Με γκρι σκίαση σημειώνεται το εύρος του ποσοστού των ανθεκτικών στελεχών 133

144 Διάγραμμα 6.9 Κατανομή κύκλων αναστολής ανάπτυξης στελεχών VREF νοσηλευομένων ασθενών (n=63) Συχνότητα εμφάνισης (%) ανάλογα με τον κύκλο αναστολής (mm) * Ουσία Αντοχή (%) VAN 100,0 100,0 TEC 100,0 100, BAC 7,9 4,8 3,2 1,6 3,2 12,7 14,3 23,8 7,9 3,2 3,2 7,9 4,8 6,3 3,2 AMP 93,7 93,7 1,6 3,2 1,6 PEN 93,7 90,5 1,6 1,6 1,6 1,6 3,2 HLG 66,7 66,7 1,6 1,6 3,2 9,5 9,5 4,8 1,6 1,6 1,6 HLS 50,8 50,8 1,6 1,6 1,6 4,8 14,3 19,0 4,8 1,6 NEM 42,9 36,5 1,6 4,8 14,3 12,7 12,7 3,2 11,1 4,8 ERY 57,1 52,4 4,8 3,2 1,6 6,3 3,2 1,6 4,8 6,3 3,2 6,3 3,2 1,6 1,6 TET 9,5 7,9 1,6 1,6 3,2 4,8 3,2 11,1 14,3 12,7 12,7 7,9 11,1 7,9 CIP 87,3 80,1 1,6 1,6 3,2 3,2 1,6 6,3 1,6 CHL 0,0 1,6 6,3 3,2 17,5 9,5 14,3 30,1 7,9 4,8 1,6 1,6 1,6 SXT 96,8 96,8 1,6 1,6 LZD 0,0 7,9 6,3 3,2 15,9 14,3 15,9 15,9 17,5 1,6 1,6 * Οι κάθετες έντονες γραμμές σε κάθε γραμμή δείχνουν, η πρώτη το όριο αντοχής και η δεύτερη το όριο της ευαισθησίας για κάθε αντιμικροβιακή ουσία. Με γκρι σκίαση σημειώνεται το εύρος του ποσοστού των ανθεκτικών στελεχών. Διάγραμμα Κατανομή των κύκλων αναστολής ανάπτυξης των στελεχών E. gallinarum (n=41) ορνιθίων Συχνότητα εμφάνισης (%) ανάλογα με τον κύκλο αναστολής (mm) * Ουσία Αντοχή (%) VAN 12,2 4,9 2,4 4,9 14,6 14,6 24,4 14,6 9,8 7,3 2,4 TEC 0,0 2,4 17,1 12,2 24,3 9,8 14,6 14,6 4,9 BAC 36,6 31,7 4,9 19,5 7,3 12,2 4,9 4,9 12,2 2,4 AMP 0,0 14,6 7,3 4,9 9,8 2,4 21,9 4,9 14,6 9,8 7,3 2,4 PEN 4,9 2,4 2,4 4,9 2,4 4,9 7,3 9,8 21,9 4,9 19,5 2,4 4,9 2,4 9,8 HLG 7,3 7,3 2,4 2,4 9,8 4,9 4,9 19,5 7,3 24,4 7,3 4,9 2,4 2,4 HLS 34,1 34,1 4,9 2,4 2,4 2,4 9,8 7,3 12,2 2,4 7,3 2,4 9,8 2,4 NEM 36,6 21,9 7,3 7,3 24,4 12,2 2,4 9,8 7,3 4,9 2,4 ERY 56,1 48,8 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 7,3 2,4 7,3 7,3 9,8 2,4 2,4 TET 82,9 70,7 7,3 4,9 2,4 4,9 2,4 7,3 CIP 19,5 2,4 4,9 9,8 2,4 4,9 4,9 9,8 21,9 12,2 9,8 7,3 4,9 2,4 2,4 CHL 4,9 2,4 2,4 2,4 2,4 9,8 4,9 9,8 7,3 24,4 14,6 7,3 7,3 2,4 2,4 SXT 12,2 12,2 21,9 2,4 12,2 2,4 19,5 9,8 17,1 2,4 LZD 0,0 4,9 4,9 24,4 4,9 29,3 2,4 17,1 9,8 2,4 * Οι κάθετες έντονες γραμμές σε κάθε γραμμή δείχνουν, η πρώτη το όριο αντοχής και η δεύτερη το όριο της ευαισθησίας για κάθε αντιμικροβιακή ουσία. Με γκρι σκίαση σημειώνεται το εύρος του ποσοστού των ανθεκτικών στελεχών. 134

145 Διάγραμμα Κατανομή κύκλων αναστολής ανάπτυξης στελεχών E. gallinarum των πτηνοσφαγέων (n=4) Ουσία Αντοχή (%) Κύκλος αναστολής (mm) VAN 0,0 25,0 25,0 25,0 25,0 TEC 0,0 25,0 25,0 25,0 25,0 BAC 0,0 25,0 25,0 25,0 25,0 AMP 0,0 25,0 50,0 25,0 PEN 0,0 25,0 25,0 25,0 25,0 HLG 0,0 25,0 25,0 25,0 25,0 HLS 0,0 50,0 25,0 25,0 NEM 0,0 25,0 25,0 25,0 25,0 ERY 0,0 50,0 50,0 TET 50,0 50,0 25,0 24,0 CIP 50,0 25,0 25,0 25,0 25,0 CHL 0,0 25,0 25,0 25,0 25,0 SXT 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 LZD 0,0 25,0 25,0 50,0 * Οι κάθετες έντονες γραμμές σε κάθε γραμμή δείχνουν, η πρώτη το όριο αντοχής και η δεύτερη το όριο της ευαισθησίας για κάθε αντιμικροβιακή ουσία. Με γκρι σκίαση σημειώνεται το εύρος του ποσοστού των ανθεκτικών στελεχών. 135

146 6.2.2 Έλεγχος Ευαισθησίας/Αντοχής των VRE σε άλλα αντιμικροβιακά Τα ποσοστά αντοχής των VREF που απομονώθηκαν από τις διαφορετικές πηγές παρουσιάζονται στον Πίνακα 6.3. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικός συσχετισμός στα ποσοστά των αντοχών στο σύνολο των αντιμικροβιακών ουσιών μεταξύ πτηνών και νοσηλευομένων ασθενών (P>0,05), ενώ αντίθετα, ο συσχετισμός ήταν στατιστικά σημαντικός μεταξύ ορνιθίων και πτηνοσφαγέων (P<0,01). Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, τα VREF στελέχη των ορνιθίων παρουσίαζαν σταθερά αντοχή στην τετρακυκλίνη (100%), ουσία που χρησιμοποιείται ευρύτατα στην κτηνιατρική πράξη (Aarestrup και συν., 2000b Lauderdale και συν., 2007). Αντίθετα, η συντριπτική πλειοψηφία των κλινικών VREF στελεχών παρουσίαζαν αντοχή στην αμπικιλλίνη (93,7%) και την πενικιλλίνη (93,7%), γεγονός το οποίο πιθανότατα εξηγείται από την ευρεία χρήση αυτών των ουσιών στα νοσοκομεία. Ωστόσο, χαμηλά ποσοστά αντοχής στην τετρακυκλίνη (9,5%) και την αμπικιλλίνη (16,5%) παρατηρήθηκαν μεταξύ των κλινικών VREF και των VREF των ορνιθίων, αντίστοιχα. Τα υψηλά ποσοστά στην αμπικιλλίνη σε συνδυασμό με τα υψηλά ποσοστά στην σιπροφλοξακίνη (87,3%) που παρουσίαζαν τα κλινικά VREF στελέχη, εκτός του ότι αντανακλούν την ευρεία χρήση τους στα νοσοκομεία, πιθανώς να σχετίζονται και με την εξάπλωση διεθνώς του γνωστού επιδημικού νοσοκομειακού κλώνου CC17 (Werner και συν., 2008a Willems και van Schaik, 2009). Τα στελέχη των πτηνοσφαγέων εμφάνισαν χαμηλά και μέτρια ποσοστά αντοχής στην αμπικιλλίνη (10%) και στη σιπροφλοξακίνη (30%), αντίστοιχα, ομοίως με των ορνιθίων. Επιπρόσθετα, εμφάνισαν μέτρια ποσοστά αντοχής στην τετρακυκλίνη (40%), ενώ πρακτικά όλα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα στις αμινογλυκοσίδες HLA καθώς αυτές οι ουσίες σπάνια χρησιμοποιούνται στην κοινότητα. Αντίθετα, τα ποσοστά αντοχής στις αμινογλυκοσίδες HL ήταν υψηλά μεταξύ των κλινικών VREF (66,7% στη γενταμυκίνη-hlr και 50,8% στη στρεπτομυκίνη-hlr) και μέτρια μεταξύ των VREF των ορνιθίων (21,5% στη γενταμυκίνη-hlr και 41,8% στη στρεπτομυκίνη-hlr), σε συμφωνία με άλλες αναφορές από Ελλάδα και άλλες χώρες (Maniatis και συν., 2001 van den Bogaard και συν., 2002 Bustamante και συν., 2003 Garcia-Migura και συν., 2005 Kotzamanidis και συν., 2009), πιθανότατα αντανακλώντας τη ευρεία χρήση αυτών των ουσιών στα αντίστοιχα περιβάλλοντα. Ωστόσο, δεν μπορεί να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι οι προαναφερθείσες παρατηρούμενες αντοχές μπορεί να είναι ένα σταθερό χαρακτηριστικό των VREF στελεχών, ειδικά σε αυτά τα περιβάλλοντα και όχι απλά ένα χαρακτηριστικό που οφείλεται στη χρήση 136

147 της αντίστοιχης ουσίας. Διαφορετικά ποσοστά αντοχής παρατηρήθηκαν και στη σουλφαμεθοξαζόλη/τριμεθοπρίμη μεταξύ των VREF στελεχών των διαφορετικών πηγών, με τα κλινικά στελέχη να εμφανίζουν πολύ υψηλότερα ποσοστά σε σύγκριση με αυτά των ορνιθίων και των πτηνοσφαγέων (96,8% σε σύγκριση με 48,1% και 30%, αντίστοιχα). Μια άλλη αντιμικροβιακή ουσία στην οποία τα VREF στελέχη των ορνιθίων και τα νοσοκομειακά εμφάνισαν σημαντικά υψηλά ποσοστά αντοχής ήταν η ερυθρομυκίνη (Πίνακας 6.3), πιθανώς λόγω της ευρείας χρήσης των μακρολιδίων στα αντίστοιχα περιβάλλοντα. Επιπρόσθετα, λόγω της γενετικής σύνδεσης των υπεύθυνων γονιδίων για την αντοχή στα μακρολίδια (erm) και τα γλυκοπεπτίδια (vana), όπως έχει αποδειχθεί σε άλλες μελέτες (Bager και συν., 1999 Aarestrup 2000a Borgen και συν., 2002 Manson και συν., 2004 Lauderdale και συν., 2007), η χρήση των μακρολιδίων μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα τη συνεπιλογή (coselection) στελεχών VREF, γεγονός που μπορεί να εξηγήσει την παρατηρούμενη εμμονή των VREF. Τέλος, όλα τα VREF στελέχη, ανεξαρτήτου πηγής, ήταν ευαίσθητα στη λινεζολίδη. Επιμέρους διαφορές στα ποσοστά αντοχής παρατηρήθηκαν και μεταξύ των στελεχών VREF που προέρχονται από την ίδια πηγή προέλευσης (Πίνακας 6.3). Μέτρια και χαμηλά ποσοστά στη στρεπτομυκίνη-hlr και γενταμυκίνη-hlr, αντίστοιχα, παρατηρήθηκαν μεταξύ των στελεχών VREF του Ο1 πτηνοτροφείου, πρακτικά όλα τα στελέχη των Ο6 και Ο7 ήταν ευαίσθητα στις αμινογλυκοσίδες HLA, ενώ πολύ υψηλά ποσοστά αντοχής εμφανίστηκαν μεταξύ των στελεχών των Ο3 και Ο5 πτηνοτροφείων. Ομοίως, η αντοχή στην ερυθρομυκίνη και τη σιπροφλοξακίνη ήταν μέτρια και χαμηλή, αντίστοιχα, σε ό,τι αφορά τα στελέχη του Ο1 πτηνοτροφείου σε αντίθεση με τα στελέχη των Ο3 και Ο5 πτηνοτροφείων, τα οποία παρουσίαζαν υψηλή αντοχή. Οι παρατηρούμενες διαφορές στην αντοχή στις παραπάνω αντιμικροβιακές ουσίες μπορεί να αντανακλούν στις διαφορετικές κτηνιατρικές πρακτικές που εφαρμόζονται σε κάθε πτηνοτροφείο σε ό,τι αφορά τη χρήση των αντίστοιχων αντιμικροβιακών ουσιών. Σε ό,τι αφορά τα κλινικά στελέχη VREF, εκείνα των νεογνών εμφάνισαν χαμηλά ποσοστά αντοχής στη στρεπτομυκίνη υψηλού επιπέδου, τη νεομυκίνη και την ερυθρομυκίνη, σε αντίθεση με τα στελέχη των ενηλίκων. Επιπλέον, στα κλινικά στελέχη της Λάρισας η αντοχή στη γενταμυκίνη υψηλού επιπέδου ήταν χαμηλή σε αντίθεση με τα νοσοκομειακά στελέχη του Ιπποκρατείου. Ομοίως και εδώ, οι παρατηρούμενες διαφορές στην αντοχή μεταξύ των διαφορετικών νοσοκομείων καθώς και μεταξύ διαφορετικών πτερύγων του ίδιου νοσοκομείου μπορεί να αντανακλούν στα διαφορετικά θεραπευτικά πρωτόκολλα σε ό,τι αφορά τη χρήση των αντίστοιχων αντιμικροβιακών ουσιών. 137

148 Τα στελέχη E. gallinarum των ορνιθίων, ομοίως με τα VREF στελέχη, εμφάνισαν υψηλά ποσοστά αντοχής στην τετρακυκλίνη (Πίνακας 6.4). Αυτό και πάλι υποδηλώνει την ευρεία χρήση της τετρακυκλίνης στην πτηνοτροφία. Παρομοίως, η αντοχή σε άλλες αντιμικροβιακές ουσίες όπως η ερυθρομυκίνη (56,1%) κυμάνθηκε σε σχετικά υψηλά επίπεδα, ενώ αντίθετα, η αντοχή στις αμινογλυκοσίδες HLA και τη σιπροφλοξακίνη και την πενικιλλίνη ήταν σαφώς χαμηλότερη. Επιπρόσθετα, όλα τα στελέχη E. gallinarum των ορνιθίων ήταν ευαίσθητα στην αμπικιλλίνη και τη λινεζολίδη. Τα στελέχη E. gallinarum των πτηνοσφαγέων εμφάνισαν αντοχή μόνο σε 3 από τις 14 αντιμικροβιακές ουσίες (Πίνακας 6.4) και συγκεκριμένα στην τετρακυκλίνη (50%), τη σιπροφλοξακίνη (50%) και τη σουλφαμεθοξαζόλη/τριμεθοπρίμη (25%). Τέλος, 5 στελέχη E. gallinarum των ορνιθίων ήταν ανθεκτικά στη βανκομυκίνη, σύμφωνα με τη μέθοδο Kirby-Bauer (Πίνακας 6.4, βλ. και Διαγράμματα 6.5 και 6.10), ωστόσο η MIC της βανκομυκίνης γι αυτά τα στελέχη ήταν 16 μg/ml (Πίνακας 6.2, βλ. παρακάτω). Παρά την επιμονή μας για τη λήψη στοιχείων σχετικά με τη χρήση αντιμικροβιακών ουσιών στις "συνήθεις" πρακτικές των πτηνοτροφείων, δεν υπήρξαν διαθέσιμες πληροφορίες από τους πτηνοτρόφους. Ωστόσο, όλα τα πτηνοτροφεία ήταν συμβατικά και όχι οργανικά και με βάση αυτό υπάρχει η γνώση της ευρείας χρήσης και άλλων αντιμικροβιακών (π.χ.. τετρακυκλίνης, πενικιλλίνης, στρεπτομυκίνης, καναμυκίνης, ερυθρομυκίνης, ενροφλοξακίνης), που χρησιμοποιούνται ευρέως στα πουλερικά στην Ελλάδα (Gousia και συν., 2011). Σε ό,τι αφορά τη σουλφαμεθοξαζόλη/τριμεθοπρίμη, αν και δεν θεωρείται κατάλληλη για τη χρήση της στις δοκιμές ευαισθησίας των εντεροκόκκων, λόγω της αναποτελεσματικότητάς της θεραπευτικά (Wisell και συν., 2008), εντούτοις, στη δική μας μελέτη χρησιμοποιήθηκε κυρίως ως επιδημιολογικός δείκτης, όπως άλλωστε έχει χρησιμοποιηθεί και σε άλλες μελέτες (Coque και συν., 2005 Khan και συν., 2005 Zhanel και συν., 2008 Bourdon και συν., 2011) αλλά και επιδημιολογικά προγράμματα επιτήρησης (NORM/NORM-VET, 2010). Ως γνωστόν, οι εντερόκοκκοι γενικά είναι ευαίσθητοι in vitro στη σουλφαμεθοξαζόλη/τριμεθοπρίμη, αλλά ανθεκτικοί in vivo, λόγω της ικανότητάς τους να χρησιμοποιούν εξωγενώς φυλλικό οξύ, θυμίνη ή/και θυμιδίνη, αντίθετα με τους υπόλοιπους μικροοργανισμούς, αναστέλλοντας έτσι τη δράση της ουσίας αυτής (Tannock και Cook, 2002). Ως εκ τούτου το κλινικό όφελος από τη χρήση της στη θεραπεία εντεροκοκκικών λοιμώξεων περιορίζεται στην αντιμετώπιση μη επιπλεγμένων κυστίτιδων (NORM/NORM- VET, 2010). Το υπόστρωμα Mueller-Hinton περιέχει σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις θυμίνη και θυμιδίνη σύμφωνα με τις τεχνικές προδιαγραφές του υποστρώματος ( 138

149 ds/technicalcenter/inserts/l007393%2811%29%280706%29.pdf). Για να επιβεβαιωθεί η χαμηλή συγκέντρωση θυμίνης και θυμιδίνης στο υπόστρωμα Mueller-Hinton, χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας το στέλεχος Enterococcus faecalis ATCC 29212, σύμφωνα με τις οδηγίες του CLSI (CLSI, 2006b), το οποίο θεωρείται ο πιο κατάλληλος δείκτης για την ανίχνευση της παρουσίας τέτοιων ανασταλτικών ουσιών (Crider και Colby, 1985). Η παρουσία ζώνης αναστολής ίσης με 21 mm στο υπόστρωμα Mueller-Hinton του μάρτυρα, επιβεβαίωσε τη χαμηλή συγκέντρωση του υποστρώματος σε θυμίνη και θυμιδίνη. Σε ό,τι αφορά τον προσδιορισμό της ευαισθησίας στη σουλφαμεθοξαζόλη/τριμεθοπρίμη, ακολουθήθηκαν οι οδηγίες του EUCAST (βλ ). 139

150 Πίνακας 6.3. Ποσοστά αντοχής VREF στελεχών που προέρχονται από διαφορετικές πηγές Αριθμός (%) VREF στελεχών Αντιμικροβιακό* Κρεοπαραγωγά ορνίθια Πτηνοσφαγείς Νοσηλευόμενοι ασθενείς O1 O3 O5 O6 O7 Πτηνοσφαγείο K Πτηνοσφαγείο Φ Υποσύνολο Πτηνοσφαγείο K Πτηνοσφαγείο Φ Υποσύνολο Ιπποκράτειο Λάρισα Νεογνά Ενήλικες Ενήλικες Υποσύνολο VAN 57 (100) 9 (100) 8 (100) 4 (100) 1 (100) 79 (100) 4 (100) 6 (100) 10 (100) 35 (100) 13 (100) 15 (100) 63 (100) TEC 57 (100) 9 (100) 8 (100) 4 (100) 1 (100) 79 (100) 4 (100) 6 (100) 10 (100) 35 (100) 13 (100) 15 (100) 63 (100) BAC 22 (38,6) 1 (11,1) (29,1) (38,5) 0 5 (7,9) AMP 6 (10,5) 2 (22,2) 2 (25) 2 (50) 1 (100) 13 (16,5) 0 1 (16,7) 1 (10) 31 (88,9) 13 (100) 15 (100) 59 (93,7) PEN 20 (35,1) 5 (55,6) 4 (50) 3 (75) 1 (100) 33 (41,8) 0 2 (33,3) 2 (20) 31 (88,9) 13 (100) 15 (100) 59 (93,7) HLG 1 (17,5) 8 (88,9) 8 (100) (21,5) (80) 12 (92,3) 2 (13,3) 42 (66,7) HLS 17 (29,8) 8 (88,9) 7 (87,5) 1 (25) 0 33 (41,8) 0 1 (16,7) 1 (10) 5 (14,3) 12 (92,3) 15 (100) 32 (50,8) NEM 4 (7) 9 (100) 8 (100) (26,6) 0 1 (16,7) 1 (10) 5 (14,3) 7 (53,8) 15 (100) 27 (42,9) ERY 23 (40,3) 8 (88,9) 8 (100) 3 (75) 1 (100) 43 (54,4) 0 1 (16,7) 1 (10) 8 (22,9) 13 (100) 15 (100) 36 (57,1) TET 57 (100) 9 (100) 8 (100) 4 (100) 1 (100) 79 (100) 3 (75) 1 (16,7) 4 (40) 1 (2,9) 5 (38,5) 0 6 (9,5) CIP 9 (15,8) 7 (77,8) 7 (87,5) 1 (25) 0 24 (30,4) 2 (50) 1 (16,7) 3 (30) 30 (85,7) 10 (76,9) 15 (100) 55 (87,3) CHL (12,5) (1,3) SXT 24 (42,1) 6 (66,7) 4 (50) 3 (75) 1 (100) 38 (48,1) 1 (25) 2 (33,3) 3 (30) 35 (100) 11 (84,6) 15 (100) 61 (96,8) LZD Σύνολο στελεχών * VAN: βανκομυκίνη, TEIC: τεϊκοπλανίνη, BAC: βακιτρακίνη, AMP:αμπικιλλίνη, PEN: πενικιλλίνη, HLG: γενταμυκίνη υψηλού επιπέδου, HLS: στρεπτομυκίνη υψηλού επιπέδου, NEM: νεομυκίνη, ERY: ερυθρομυκίνη, TET: τετρακυκλίνη, CIP: σιπροφλοξακίνη, CHL: χλωραμφενικόλη, SXT: σουλφαμεθοξαζόλη/τριμεθοπρίμη, LZD: λινεζολίδη. 140

151 Πίνακας 6.4. Ποσοστά αντοχής στελεχών E. gallinarum που απομονώθηκαν από ορνίθια και πτηνοσφαγείς Αντιμικροβιακό * Αριθμός (%) E. gallinarum στελεχών Αριθμός (%) E. gallinarum στελεχών Κρεοπαραγωγά ορνίθια Πτηνοσφαγείο K Πτηνοσφαγείς O1 O2 O3 O4 O5 Υποσύνολο Πτηνοσφαγείο K Πτηνοσφαγείο Φ Υποσύνολο VAN (62,5) 5 (12,2) TEC BAC 2 (100) 5 (45,4) 4 (22,2) 0 4 (50) 15 (36,6) AMP PEN (11,1) (4,9) HLG (11,1) 0 1 (12,5) 3 (7,3) HLS 2 (100) 2 (18,2) 8 (44,4) 0 2 (25) 14 (34,1) NEM 1 (50) 2 (18,2) 8 (44,4) 0 4 (50) 15 (36,6) ERY 2 (100) 5 (45,4) 9 (50) 1 (50) 6 (75) 23 (56,1) TET 2 (100) 8 (72,7) 14 (77,8) 2 (100) 8 (100) 34 (82,9) 2 (66,7) 0 2 (50) CIP 1 (50) 0 1 (5,6) 0 6 (75) 8 (19,5) 2 (66,7) 0 2 (50) CHL 0 1 (9,1) (12,5) 2 (4,9) SXT 1 (50) 0 3 (16,7) 0 1 (25) 5 (12,2) 0 1 (100) 1 (25) LZD Σύνολο στελεχών * Συντομεύσεις όπως Πίνακας

152 Ανάλυση των προφίλ της αντιμικροβιακής αντοχής (φαινοτύπων) των VREF στελεχών-διαχωριστική Ανάλυση (Discriminant Analysis) Η ανάλυση των φαινοτύπων των VREF στελεχών ανέδειξε 53 διακριτούς τύπους, εκ των οποίων τα στελέχη των ορνιθίων εμφάνισαν 31 τύπους, το στέλεχος του μόσχου 1, τα στελέχη των πτηνοσφαγέων 6 και τα κλινικά στελέχη 20. Μόνο 5 φαινότυποι (ποσοστό 9,4%) βρέθηκαν να μοιράζονται μεταξύ των στελεχών από τις διαφορετικές πηγές (Πίνακας 6.5, σκίαση γκρι χρώματος). Σημειώνεται ότι τα στελέχη των ορνιθίων παρουσίασαν έναν μόνο κοινό φαινότυπο με τα κλινικά στελέχη (11i) και τρεις κοινούς φαινοτύπους (3i, 4iii και 5v) με τα στελέχη των πτηνοσφαγέων, με τα τελευταία να μοιράζονται μόνο έναν κοινό φαινότυπο (9viii) με τα κλινικά στελέχη. Με ενδιαφέρον, το μοναδικό VREF στέλεχος που απομονώθηκε από κόπρανα μόσχων είχε φαινότυπο διαφορετικό από τους φαινοτύπους των υπολοίπων στελεχών των άλλων πηγών προέλευσης (φαινότυπος 9ix). Η ύπαρξη ποικίλλων φαινοτύπων σε συνδυασμό με τα διαφορετικά ποσοστά αντοχής μεταξύ των στελεχών των διαφορετικών πηγών (βλ. κεφ ) πιθανότατα να αντανακλά το ευρύ φάσμα της επιλεκτικής πίεσης που ασκείται από τη χρήση των αντιμικροβιακών παραγόντων σε κάθε περιβάλλον. Επιπρόσθετα, η ύπαρξη ποικίλλων φαινοτύπων μέσα στην ίδια πηγή αντανακλά τη διαφορετική επιλεκτική πίεση ακόμα και στα υποσύνολα του ίδιου περιβάλλοντος (πτηνοτροφείο ή νοσοκομείο). Πράγματι, κανένας φαινότυπος μεταξύ των στελεχών των ορνιθίων δεν παρατηρήθηκε που να επικρατεί, ωστόσο το 39,2% (31 από τα 79 στελέχη) μοιράζονταν 3 τύπους: τον τύπο 3i (VAN, TEC, TET), 4i (VAN, TEC, SXT, TET) και 7v (VAN, TEC, TET, ERY, PEN, AMP, BAC). Επιπρόσθετα, μόνο 5 από τους 31 φαινοτύπους των VREF των ορνιθίων βρέθηκαν να μοιράζονται μεταξύ των στελεχών που προέρχονταν από διαφορετικά πτηνοτροφεία (Πίνακας 6.6, φαινότυποι 5i, 7i, 8v, 9iii και 10iii). Κανένας κυρίαρχος φαινότυπος δεν παρατηρήθηκε ούτε μεταξύ των κλινικών στελεχών εκτός από τον 7vii (VAN, TEC, SXT, PEN, CIP, AMP, HLG) που παρατηρήθηκε στα 24 από τα 35 (38% των συνολικών κλινικών στελεχών VREF) επιδημικά στελέχη των νεογνών και τον 9viii (VAN, TEC, SXT, AMP, ERY, PEN, CIP, HLS, NEM) που παρατηρήθηκε στα 13 από τα 15 VREF στελέχη ενηλίκων του Νοσοκομείου Λάρισας και σε ένα στέλεχος νεογνών του Ιπποκρατείου (22,2% των συνολικών κλινικών στελεχών, Πίνακας 6.6). Επιπρόσθετα, μόνο δύο φαινότυποι βρέθηκαν κοινοί μεταξύ των κλινικών στελεχών από τα διαφορετικά νοσοκομεία: ο τύπος 9viii, όπως περιγράφηκε παραπάνω και ο τύπος 10v, που εμφανίστηκε 142

153 μεταξύ κλινικών στελεχών που απομονώθηκαν από ενήλικες των δύο Νοσοκομείων και τα νεογνά του Ιπποκρατείου. Εν τω μεταξύ, 43 από τα 79 (54,4%) VREF στελέχη των ορνιθίων, το στέλεχος VREF των μόσχων και τα 58 από τα 63 (92,1%) κλινικά στελέχη, ήταν πολυάντοχα, δηλ. παρουσίαζαν αντοχή σε 5 κλάσεις αντιμικροβιακών (Πίνακες 6.5 και 6.6). Αντίθετα από τα υψηλά ποσοστά στελεχών που εμφάνιζαν πολυαντοχή και παρατηρήθηκαν τόσο μεταξύ των στελεχών των ορνιθίων όσο και μεταξύ των κλινικών, μόνο 1 στα 10 (10%) στελέχη που απομονώθηκε από τους πτηνοσφαγείς παρουσίαζε αντοχή σε >5 κλάσεις αντιμικροβιακών. Όλα τα στελέχη των O3, O5, O7 πτηνοτροφείων, το 40,4% των στελεχών τoυ O1 και το 50% του O6 ήταν πολυάντοχα (Πίνακας 6.6). Η αντοχή στην τετρακυκλίνη συσχετιζόταν απόλυτα με την αντοχή στα γλυκοπεπτίδια (P=1, Πίνακας 6.7). Επιπρόσθετα, οι συσχετισμοί μεταξύ της αντοχής στις αμινογλυκοσίδες-hla, τη νεομυκίνη, την ερυθρομυκίνη, και τη σιπροφλοξακίνη ήταν στατιστικά σημαντικοί (P< 0,001, Πίνακας 6.7), με αποτέλεσμα υψηλό ποσοστό των πολυάντοχων στελεχών (32,6% δηλ. 14 από τα 43 στελέχη) να παρουσιάζει αντοχή και στις πέντε παραπάνω ουσίες (βλ. Πίνακα 6.5, συντομογραφίες με έντονη κόκκινη γραφή). Επίσης στατιστικά σημαντικοί (P< 0,001) ήταν και οι συσχετισμοί μεταξύ της αντοχής στη βακιτρακίνη, την πενικιλλίνη και την ερυθρομυκίνη (Πίνακας 6.7), με αποτέλεσμα και σε αυτή την περίπτωση υψηλό ποσοστό των πολυάντοχων στελεχών (44,2% δηλ. 19 στα 43 στελέχη) να παρουσιάζει αντοχή και στις τρεις παραπάνω ουσίες (βλ. Πίνακα 6.5, συντομογραφίες με έντονη μπλε γραφή). Η ύπαρξη στατιστικά σημαντικών συσχετισμών μεταξύ των αντοχών στις παραπάνω αντιμικροβιακές ουσίες υποδηλώνει την πιθανή συνεπιλογή τους. Σε ό,τι αφορά τα κλινικά VREF στελέχη, όλα των ενηλίκων που προέρχονταν από τα 2 νοσοκομεία και το 88,6% των νεογνών, ήταν πολυάντοχα (Πίνακας 6.6). Επιπρόσθετα, οι συσχετισμοί μεταξύ της αντοχής στην αμπικιλλίνη, την πενικιλλίνη, τη γενταμυκίνη-hlr, τη σιπροφλοξακίνη και τη σουλφαμεθοξαζόλη/τριμεθοπρίμη ήταν στατιστικά σημαντικοί (P< 0,001, Πίνακας 6.8), με αποτέλεσμα υψηλό ποσοστό των πολυάντοχων στελεχών (60,3% δηλ. 35 στα 58 στελέχη) να παρουσιάζει αντοχή και στις 5 παραπάνω ουσίες (βλ. Πίνακα 6.5 συντομογραφίες με έντονη καφέ γραφή), υποδηλώνοντας συνεπιλογή. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικοί συσχετισμοί στην αντοχή στις διάφορες αντιμικροβιακές ουσίες, μεταξύ VREF στελεχών των πτηνοσφαγέων (P> 0,05, Πίνακας 6.9). 143

154 Πίνακας 6.5. Κατανομή των φαινοτύπων αντοχής των VREF στελεχών απομονωμένων από κρεοπαραγωγά ορνίθια, πτηνοσφαγείς και νοσηλευόμενους ασθενείς Φαινότυπος αντοχής * Κωδικός Αριθμός (%) στελεχών Κρ.ορνίθια (n=79) Πτηνοσφαγείς (n=10) Ν. ασθενείς (n=63) VAN TEC 2i 4 (40,0) VAN TEC TET 3i 12 (15,2) 2 (20,0) VAN TEC TET SXT 4i 10 (12,7) VAN TEC TET NEM 4ii 2 (2,5) VAN TEC TET CIP 4iii 2 (2,5) 1 (10,0) VAN TEC SXT PEN 4iv 1 (10,0) VAN TEC SXT ERY 4v 1 (1,6) VAN TEC SXT HLG 4vi 1 (1,6) VAN TEC TET SXT HLS 5i 3 (3,8) VAN TEC TET SXT NEM 5ii 1 (1,2) VAN TEC TET ERY PEN 5iii 1 (1,2) VAN TEC TET ERY BAC 5iv 1 (1,2) VAN TEC TET SXT CIP 5v 4 (5,0) 1 (10,0) VAN TEC SXT ERY CIP 5vi 1 (1,6) VAN TEC SXT AMP PEN 5vii 1 (1,6) VAN TEC TET SXT NEM BAC 6i 1 (1,2) VAN TEC TET SXT PEN HLS 6ii 1 (1,2) VAN TEC TET ERY PEN BAC 6iii 2 (2,5) VAN TEC TET SXT ERY BAC 6iv 1 (1,2) VAN TEC SXT AMP ERY PEN 6v 1 (1,6) VAN TEC TET AMP SXT ERY PEN 7i 2 (2,5) VAN TEC TET AMP ERY PEN BAC 7ii 2 (2,5) VAN TEC TET SXT ERY PEN BAC 7iii 1 (1,2) VAN TEC TET SXT ERY CIP BAC 7iv 1 (1,2) VAN TEC TET ERY PEN BAC HLS 7v 9 (11,4) VAN TEC SXT ERY CIP HLS NEM 7vi 1 (1,6) VAN TEC SXT AMP CIP PEN HLG 7vii 24 (38,0) VAN TEC TET AMP SXT ERY PEN CIP 8i 1 (1,2) VAN TEC TET AMP ERY CIP HLG NEM 8ii 1 (1,2) VAN TEC TET AMP ERY PEN BAC HLS 8iii 3 (3,8) VAN TEC TET SXT ERY PEN CIP BAC 8iv 1 (1,2) VAN TEC TET ERY CIP HLS HLG NEM 8v 4 (5,0) VAN TEC TET AMP SXT ERY PEN NEM 8vi 1 (1,6) VAN TEC SXT AMP ERY PEN HLS HLG 8vii 1 (1,6) VAN TEC SXT AMP CIP PEN HLG HLS 8viii 1 (1,6) VAN TEC ERY AMP CIP PEN HLS HLG 8ix 2 (3,2) VAN TEC TET AMP SXT ERY PEN BAC HLS 9i 1 (1,2) VAN TEC TET AMP ERY CIP HLS HLG NEM 9ii 1 (1,2) VAN TEC TET SXT ERY CIP HLS HLG NEM 9iii 2 (2,5) VAN TEC TET ERY ERY CIP HLS HLG NEM 9iv 1 (1,2) VAN TEC TET AMP SXT ERY PEN CIP HLS 9v 1 (1,6) VAN TEC SXT AMP CIP PEN HLG HLS ERY 9vi 1 (1,6) VAN TEC SXT AMP ERY PEN HLS HLG BAC 9vii 1 (1,6) VAN TEC SXT AMP ERY PEN CIP HLS NEM 9viii 1 (10,0) 14 (22,2) VAN TEC TET AMP SXT PEN ERY CIP HLG 9ix Στέλεχος VREF μόσχου VAN TEC TET AMP SXT ERY PEN HLS HLG NEM 10i 1 (1,2) VAN TEC TET SXT ERY PEN HLS HLG NEM CHL 10ii 1 (1,2) VAN TEC TET SXT PEN ERY CIP HLS HLG NEM 10iii 5 (6,3) VAN TEC TET AMP SXT ERY PEN HLG NEM BAC 10iv 1 (1,6) VAN TEC SXT AMP ERY PEN CIP HLG HLS NEM 10v 6 (9,5) VAN TEC TET AMP SXT PEN ERY CIP HLS HLG NEM 11i 1 (1,2) 1 (1,6) VAN TEC SXT AMP ERY PEN CIP HLS HLG NEM BAC 11ii 1 (1,6) VAN TEC TET AMP SXT PEN CIP HLG HLS ERY NEM BAC 12i 2 (3,2) 144

155 * Συντομεύσεις όπως στον Πίνακα 6.3. Η σκίαση χρώματος γκρι δείχνει τους κοινούς φαινοτύπους στελεχών από 2 πηγές προέλευσης, χρώματος κίτρινου τους πολυάντοχους φαινοτύπους των ορνιθίων και χρώματος πράσινου των κλινικών στελεχών. Οι συντομογραφίες με έντονη μαύρη γραφή AMP και TET αντιπροσωπεύουν αντοχή στην αμπικιλλίνη και τετρακυκλίνη στελεχών VREF πτηνών και νοσηλευομένων ασθενών, αντίστοιχα, ενώ με έντονη κόκκινη και μπλε γραφή αντιπροσωπεύουν στατιστικά σημαντικούς συσχετισμούς αντοχής των πολυάντοχων στελεχών ορνιθίων και με έντονη καφέ γραφή των πολυάντοχων κλινικών στελεχών. Κωδικός Φαινοτύπου αντοχής Πίνακας 6.6. Κατανομή των φαινοτύπων αντοχής των VREF στελεχών, σε κάθε εκτροφή, πτηνοσφαγείο και νοσοκομείο Κρεοπαραγωγά ορνίθια (%) Αριθμός (%) στελεχών * Πτ/σφαγείς (%) Πτ/σφαγείο Νοσηλευόμενοι ασθενείς (%) O1Κ O3Κ O5Κ O6Φ O7Φ K F ΚΛ.Ι. ΚΛ.N.Ι. ΚΛ.Λ. Σύνολο στελεχών (%) 2i 4 (40) (2,6) 3i 12 (15,2) 2 (20) (9,2) 4i 10 (12,7) 10 4ii 2 (2,5) 2 4iii 2 (2,5) 1 (10) 3 4iv 1 (10) 1 18 (11,8) 4v 1 (1,6) 4vi 1 (1,6) 5i 2 (2,5) 1 (1,3) 2 1 5ii 1 (1,3) 1 5iii 1 (1,3) 1 5iv 1 (1,3) 1 13 (8,6) 5v 4 (5,0) 1 (10) 5 5vi 1 (1,6) 5vii 1 (1,6) 6i 1 (1,3) 1 6ii 1 (1,3) 1 6iii 2 (2,5) 2 6 (3,9) 6iv 1 (1,3) 1 6v 1 (1,6) 7i 1 (1,3) 1 (1,3) 2 7ii 2 (2,5) 2 7iii 1 (1,3) 1 7iv 1 (1,3) 1 40 (26,3) 7v 9 (11,4) 9 7vi 1 (1,6) 7vii 24 (38,1) 8i 1 (1,3) 1 8ii 1 (1,3) 1 8iii 3 (3,8) 3 8iv 1 (1,3) 1 8v 3 (3,8) 1 (1,3) 4 15 (9,9) 8vi 1 (1,6) 8vii 1 (1,6) 8viii 1 (1,6) 8ix 2 (3,2) 9i 1 (1,3) 1 9ii 1 (1,3) 1 9iii 1 (1,3) 1 (1,3) 2 9iv 1 (1,3) 1 9v 1 (1,6) 23 (15,1) 9vi 1 (1,6) 9vii 1 (1,6) 9viii 1 (10) 1 1 (1,6) 13 (20,6) 145

156 Κωδικός Φαινοτύπου αντοχής Κρεοπαραγωγά ορνίθια (%) Αριθμός (%) στελεχών * Πτ/σφαγείς (%) Πτ/σφαγείο Νοσηλευόμενοι ασθενείς (%) O1Κ O3Κ O5Κ O6Φ O7Φ K F ΚΛ.Ι. ΚΛ.N.Ι. ΚΛ.Λ. Σύνολο στελεχών (%) 10i 1 (1,3) 1 10ii 1 (1,3) 1 10iii 3 (3,8) 2 (2,5) 5 14 (9,2) 10iv 1 (1,6) 10v 2 (3,2) 2 (3,2) 2 (3,2) 11i 1 (1,3) 1 1 (1,6) 11ii 1 (1,6) 3 (2,0) 12i 2 (3,2) 2 (1,3) * ΚΛ.Ι.: στελέχη ενηλίκων Ιπποκράτειου Νοσοκομείου, ΚΛ.N.Ι.: στελέχη νεογνών Ιπποκράτειου Νοσοκομείου, ΚΛ.Λ.: στελέχη ενηλίκων Νοσοκομείου Λάρισας. Η σκίαση χρώματος γκρι δείχνει τους κοινούς φαινοτύπους στελεχών μεταξύ των διαφορετικών πτηνοτροφείων και των διαφορετικών νοσοκομείων. 146

157 Πίνακας 6.7. Συσχετισμός των αντοχών στις διάφορες αντιμικροβιακές ουσίες των στελεχών VREF των ορνιθίων (n=79). Για κάθε ουσία, η πρώτη οριζόντια γραμμή δείχνει το ποσοστό αντοχής για τα ευαίσθητα (S) και η δεύτερη για τα ανθεκτικά στελέχη (R). Αντιμικροβιακή ουσία VAN TEC BAC AMP PEN HLG HLS NEM ERY TET CIP CHL SXT LZD n Διασταυρούμενη Αντοχή (%) VAN TEC BAC AMP PEN HLG HLS NEM ERY TET CIP CHL SXT LZD S 0-0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 R ,0 100,0 29,1 16,5 41,8 21,5 41,8 26,6 54,4 100,0 30,4 1,3 48,1 0,0 S 0 0,0-0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 R ,0 100,0 29,1 16,5 41,8 21,5 41,8 26,6 54,4 100,0 30,4 1,3 48,1 0,0 S ,0 100,0 0,0 0,0 0,0 29,4 5,9 41,1 5,9 100,0 29,4 0,0 17,6 0,0 R ,0 100,0 100,0 26,1 82,6 0,0 56,5 4,3 95,6 100,0 8,7 0,0 26,1 0,0 S ,0 100,0 25,8 0,0 45,5 19,7 39,4 25,8 4,5 100,0 30,3 1,5 48,5 0,0 R ,0 100,0 46,2 100,0 84,6 30,8 53,8 30,8 100,0 100,0 30,8 0,0 46,2 0,0 S ,0 100,0 8,7 4,3 0,0 17,4 21,7 26,1 16,7 100,0 32,6 0,0 50,0 0,0 R ,0 100,0 57,6 33,3 100,0 27,3 34,8 27,3 48,5 100,0 24,2 3,0 45,5 0,0 S ,0 100,0 37,1 14,5 38,7 0,0 27,4 6,5 41,9 100,0 14,5 0,0 45,2 0,0 R ,0 100,0 0,0 23,5 52,9 100,0 94,1 100,0 100,0 100,0 88,2 5,9 58,8 0,0 S ,0 100,0 13,8 17,2 24,1 0,0 0,0 3,4 24,1 100,0 20,7 0,0 41,4 0,0 R ,0 100,0 39,4 21,2 69,7 48,5 100,0 48,5 87,9 100,0 42,4 3,0 45,5 0,0 S 8 100,0 100,0 50,0 25,0 75,0 0,0 50,0 0,0 75,0 100,0 0,0 0,0 25,0 0,0 R ,0 100,0 4,8 19,0 42,9 80,9 76,2 100,0 80,9 100,0 71,4 4,8 57,1 0,0 S ,0 100,0 0,0 0,0 3,3 0,0 13,3 10,0 0,0 100,0 6,7 0,0 50,0 0,0 R ,0 100,0 51,1 30,2 74,4 39,5 67,4 39,5 100,0 100,0 41,9 2,3 41,9 0,0 S 0 100,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0-0,0 0,0 0,0 0,0 R ,0 100,0 29,1 16,5 41,8 21,5 41,8 26,6 54,4 100,0 30,4 1,3 48,1 0,0 S ,0 100,0 66,7 8,3 100,0 0,0 50,0 8,3 58,3 100,0 0,0 0,0 25,0 0,0 R ,0 100,0 8,3 16,7 37,5 62,5 58,3 62,5 75,0 100,0 100,0 0,0 62,5 0,0 S ,0 100,0 40,3 10,5 36,8 3,5 33,3 10,5 42,1 100,0 12,3 0,0 42,1 0,0 R 1 100,0 100,0 0,0 0,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 S 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0-0,0 R ,0 100,0 15,8 15,8 39,5 26,3 39,5 31,6 47,4 100,0 47,4 2,6 100,0 0,0 S ,0 100,0 37,7 14,8 44,3 13,1 13,1 13,1 13,1 100,0 19,7 0,0 41,0 0,0 R 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0-147

158 Πίνακας 6.8. Συσχετισμός των αντοχών στις διάφορες αντιμικροβιακές ουσίες των στελεχών VREF των νοσηλευομένων ασθενών (n=63). Για κάθε ουσία, η πρώτη οριζόντια γραμμή δείχνει το ποσοστό αντοχής για τα ευαίσθητα (S) και η δεύτερη για τα ανθεκτικά στελέχη (R). Αντιμικροβιακή ουσία n Διασταυρούμενη Αντοχή (%) VAN TEC BAC AMP PEN HLG HLS NEM ERY TET CIP CHL SXT LZD VAN TEC BAC AMP PEN HLG HLS NEM ERY TET CIP CHL SXT LZD S 0-0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 R ,0 100,0 7,9 93,7 93,7 66,7 50,8 42,9 57,1 9,5 87,3 0,0 96,8 0,0 S 0 0,0-0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 R ,0 100,0 7,9 93,7 93,7 66,7 50,8 42,9 57,1 9,5 87,3 0,0 96,8 0,0 S ,0 100,0 0,0 92,7 92,7 63,6 49,1 38,2 52,7 5,5 90,9 0,0 96,4 0,0 R 5 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 80,0 80,0 100,0 60,0 60,0 0,0 100,0 0,0 S 4 100,0 100,0 0,0 0,0 0,0 25,0 25,0 25,0 75,0 0,0 50,0 0,0 100,0 0,0 R ,0 100,0 8,5 100,0 100,0 69,5 52,5 44,1 55,9 10,2 89,8 0,0 96,6 0,0 S 4 100,0 100,0 0,0 0,0 0,0 25,0 25,0 25,0 75,0 0,0 50,0 0,0 100,0 0,0 R ,0 100,0 8,5 100,0 100,0 69,5 52,5 44,1 55,9 10,2 89,8 0,0 96,6 0,0 S ,0 100,0 0,0 85,7 85,7 0,0 76,2 76,2 95,2 9,5 81,0 0,0 100,0 0,0 R ,0 100,0 11,9 97,6 97,6 100,0 38,1 26,2 38,2 9,5 90,5 0,0 95,2 0,0 S ,0 100,0 3,3 90,0 90,0 86,7 0,0 3,3 13,3 3,3 83,3 0,0 100,0 0,0 R ,0 100,0 12,5 96,9 96,9 50,0 100,0 78,1 96,9 12,5 93,8 0,0 93,8 0,0 S ,0 100,0 10,0 100,0 100,0 90,0 50,0 0,0 40,0 10,0 80,0 0,0 100,0 0,0 R ,0 100,0 14,8 96,3 96,3 40,7 92,6 100,0 100,0 18,5 92,6 0,0 100,0 0,0 S ,0 100,0 0,0 100,0 100,0 100,0 41,6 0,0 0,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 R ,0 100,0 13,9 91,7 91,7 44,4 86,1 75,0 100,0 16,7 77,8 0,0 94,4 0,0 S ,0 100,0 3,5 93,0 93,0 66,7 49,1 38,6 52,6 0,0 89,5 0,0 96,5 0,0 R 6 100,0 100,0 50,0 100,0 100,0 66,7 66,7 83,3 100,0 100,0 66,7 0,0 100,0 0,0 S 8 100,0 100,0 25,0 75,0 75,0 50,0 25,0 25,0 75,0 25,0 0,0 0,0 100,0 0,0 R ,0 100,0 5,5 94,5 96,4 69,1 54,5 45,5 50,9 72,7 100,0 0,0 92,7 0,0 S ,0 100,0 7,9 93,7 93,7 66,7 50,8 42,9 57,1 9,5 87,3 0,0 96,8 0,0 R 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0-0,0 0,0 S 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0-0,0 R ,0 100,0 81,9 93,4 93,4 65,6 49,2 0,0 55,7 9,8 92,7 0,0 100,0 0,0 S 63 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 R 0 100,0 100,0 7,9 93,7 93,7 66,7 50,8 42,9 57,1 9,5 87,3 0,0 96,8-148

159 Πίνακας 6.9. Συσχετισμός των αντοχών στις διάφορες αντιμικροβιακές ουσίες των στελεχών VREF των πτηνοσφαγέων (n=10). Για κάθε ουσία, η πρώτη οριζόντια γραμμή δείχνει το ποσοστό αντοχής για τα ευαίσθητα (S) και η δεύτερη για τα ανθεκτικά στελέχη (R). Αντιμικροβιακή ουσία VAN TEC BAC AMP PEN HLG HLS NEM ERY TET CIP CHL SXT LZD N Διασταυρούμενη Αντοχή (%) VAN TEC BAC AMP PEN HLG HLS NEM ERY TET CIP CHL SXT LZD S 0-0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 R ,0 100,0 0,0 10,0 20,0 0,0 10,0 10,0 10,0 40,0 30,0 0,0 30,0 0,0 S 0 0,0-0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 R ,0 100,0 0,0 10,0 20,0 0,0 10,0 10,0 10,0 40,0 30,0 0,0 30,0 0,0 S 7 100,0 100,0 0,0 14,3 28,6 0,0 14,3 14,3 14,3 42,9 42,9 0,0 42,9 0,0 R 0 0,0 0,0-0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 S 9 100,0 100,0 0,0 0,0 22,2 0,0 0,0 0,0 0,0 44,4 22,2 0,0 22,2 0,0 R 1 100,0 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 100,0 100,0 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 S 8 100,0 100,0 0,0 50,0 0,0 0,0 50,0 50,0 50,0 0,0 50,0 0,0 100,0 0,0 R 2 100,0 100,0 0,0 50,0 100,0 0,0 50,0 50,0 50,0 0,0 50,0 0,0 100,0 0,0 S ,0 100,0 0,0 10,0 20,0 0,0 10,0 10,0 10,0 40,0 30,0 0,0 30,0 0,0 R 0 100,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 S 9 100,0 100,0 0,0 0,0 11,1 0,0 0,0 0,0 0,0 44,4 22,2 0,0 22,2 0,0 R 1 100,0 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 100,0 100,0 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 S 6 100,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 33,3 0,0 16,7 0,0 R 1 100,0 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 100,0 100,0 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 S 8 100,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 42,9 28,6 0,0 14,3 0,0 R 1 100,0 100,0 0,0 100,0 100,0 0,0 100,0 100,0 100,0 0,0 100,0 0,0 100,0 0,0 S 6 100,0 100,0 0,0 16,7 33,3 0,0 16,7 16,7 16,7-16,7 0,0 33,3 0,0 R 4 100,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 50,0 0,0 25,0 0,0 S 3 100,0 100,0 0,0 0,0 33,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 33,3 0,0 R 3 100,0 100,0 0,0 33,3 33,3 0,0 33,3 33,3 33,3 66,6 100,0 0,0 66,7 0,0 S ,0 100,0 0,0 10,0 20,0 0,0 10,0 10,0 10,0 40,0 30,0 0,0 30,0 0,0 R 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0 S 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0-0,0 R 3 100,0 100,0 0,0 33,3 66,7 0,0 33,3 33,3 33,3 33,3 66,7 0,0 100,0 0,0 S ,0 100,0 0,0 10,0 20,0 0,0 10,0 10,0 10,0 40,0 30,0 0,0 30,0 0,0 R 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0-149

160 Η ανάλυση των φαινοτύπων αντοχής των στελεχών E. gallinarum, ανέδειξε 30 διακριτούς τύπους, εκ των οποίων τα στελέχη των ορνιθίων εμφάνισαν 28 τύπους και των πτηνοσφαγέων 2 χωρίς να μοιράζονται κανέναν κοινό φαινότυπο (Πίνακας 6.10). Τέσσερα στελέχη των ορνιθίων και ένα στέλεχος των πτηνοσφαγέων δεν ήταν ανθεκτικά σε καμία από τις εξεταζόμενες αντιμικροβιακές ουσίες. Όπως και για τα στελέχη VREF, έτσι και για τα στελέχη E. gallinarum, η ύπαρξη ποικίλλων και διαφορετικών φαινοτύπων μεταξύ των ορνιθίων αντανακλά τη διαφορετική επιλεκτική πίεση ακόμα και στα διαφορετικά πτηνοτροφεία. Κανένας φαινότυπος που να επικρατεί μεταξύ των στελεχών E. gallinarum των ορνιθίων δεν παρατηρήθηκε. Επιπρόσθετα, μόνο 4 από τους 28 φαινοτύπους των στελεχών E. gallinarum των ορνιθίων βρέθηκαν να μοιράζονται μεταξύ 2 ή 3 διαφορετικών πτηνοτροφείων (Πίνακας 6.10, φαινότυποι 1i, 2i, 2iii και 3ii). Εν τω μεταξύ, μόλις 6 από τα 41 στελέχη E. gallinarum (14,6%) των ορνιθίων, σε αντίθεση με τα στελέχη VREF, ήταν πολυάντοχα, δηλ. παρουσίαζαν αντοχή σε 5 κλάσεις αντιμικροβιακών, ενώ 3 από τα 4 στελέχη από τους πτηνοσφαγείς παρουσίαζαν αντοχή σε 2 κλάσεις (Πίνακας 6.10). Τα 4 από τα 6 πολυάντοχα στελέχη προέρχονταν από τo Ο5 πτηνοτροφείο, όπου όλα τα στελέχη VREF ήταν πολυάντοχα. (Πίνακες 6.6 και 6.10). Όλα τα στελέχη που παρουσίαζαν αντοχή στη βανκομυκίνη (κύκλος αναστολής mm, MIC 16μg/ml, Πίνακας 6.2 και Διάγραμμα 6.10), παρουσίαζαν αντοχή και στην τετρακυκλίνη (Πίνακες 6.10 και 6.11). Αυτό σε συνδυασμό με το γεγονός ότι o συσχετισμός μεταξύ της αντοχής στην τετρακυκλίνη, στη βανκομυκίνη και στην ερυθρομυκίνη ήταν στατιστικά σημαντικός (P<0,001, Πίνακας 6.11), υποδηλώνει την ύπαρξη πιθανής συνεπιλογής, παρόμοια με τα στελέχη VREF των ορνιθίων. 150

161 Πίνακας Κατανομή των φαινοτύπων αντοχής στελεχών E. gallinarum, των κρεοπαραγωγών ορνιθίων και των πτηνοσφαγέων. Φαινότυπος Κωδικός Αριθμός (%) στελεχών * Κρεοπαραγωγά ορνίθια (%) (n=41) Πτηνοσφαγείς (%) (n=4) O1K O2K O3K O4K O5K TET 1i 2 (4,9) 1 (2,4) 1 (2,4) SXT 1ii 1 (25) TET ERY 2i 1 (2,4) 1 (2,4) 1 (2,4) TET NEM 2ii 3 (7,3) TET BAC 2iii 1 (2,4) 1 (2,4) TET CIP 2iv 2 (50) TET ERY NEM 3i 1 (2,4) TET ERY BAC 3ii 2 (4,9) 1 (2,4) TET ERY HLS 3iii 1 (2,4) TET NEM HLS 3iv 1 (2,4) TET NEM SXT 3v 1 (2,4) TET CIP SXT 3vi 1 (2,4) TET CIP VAN 3vii 1 (2,4) ERY BAC HLS 3viii 1 (2,4) ERY HLS SXT 3ix 1 (2,4) ERY HLS PEN 3x 1 (2,4) TET ERY BAC HLS 4i 1 (2,4) TET ERY NEM HLS 4ii 1 (2,4) TET ERY NEM CIP 4iii 1 (2,4) TET ERY BAC SXT 4iv TET BAC CIP VAN 4v 1 (2,4) TET ERY NEM BAC HLS 5i 1 (2,4) TET ERY NEM CIP VAN 5ii 1 (2,4) TET ERY BAC SXT VAN 5iii 1 (2,4) TET ERY BAC HLS CHL 5iv 1 (2,4) TET ERY NEM BAC HLS HLG 6i 1 (2,4) TET ERY NEM HLS HLG PEN 6ii 1 (2,4) TET ERY NEM BAC HLS CIP SXT 7i 1 (2,4) TET ERY NEM BAC HLS CIP VAN 7ii 1 (2,4) TET ERY NEM BAC HLS CIP HLG CHL 8i 1 (2,4) * Συντομεύσεις όπως στον Πίνακα 6.3. Η σκίαση χρώματος γκρι δείχνει τους κοινούς φαινοτύπους στελεχών από 2 ή 3 πτηνοτροφεία. Με έντονη πλάγια γραφή επισημαίνονται οι φαινότυποι των στελεχών E. gallinarum των ανθεκτικών στη βανκομυκίνη. 151

162 Πίνακας Συσχετισμός των αντοχών στις διάφορες αντιμικροβιακές ουσίες των στελεχών E. gallinarum (n=41). Για κάθε ουσία, η πρώτη οριζόντια γραμμή δείχνει το ποσοστό αντοχής για τα ευαίσθητα (S) και η δεύτερη για τα ανθεκτικά στελέχη (R). Αντιμικροβιακή ουσία VAN TEC BAC AMP PEN HLG HLS NEM ERY TET CIP CHL SXT LZD n Διασταυρούμενη Αντοχή (%) VAN TEC BAC AMP PEN HLG HLS NEM ERY TET CIP CHL SXT LZD S 24-0,0 33,3 0,0 4,2 8,3 37,5 33,3 58,3 83,3 0,0 0,0 4,2 0,0 R 5 100,0 0,0 60,0 0,0 0,0 0,0 20,0 40,0 60,0 100,0 80,0 0,0 20,0 0,0 S 41 12,2 0,0 36,6 0,0 4,9 7,3 34,1 36,6 56,1 82,9 19,5 4,9 12,2 0,0 R 0 0,0-0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 S 8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 12,5 12,5 62,5 75,0 25,0 0,0 12,5 0,0 R 15 20,0 0,0 100,0 0,0 0,0 0,0 53,3 33,3 80,0 87,5 20,0 13,3 13,3 0,0 S 41 12,2 0,0 36,6 0,0 4,9 7,3 34,1 36,6 56,1 82,9 19,5 4,9 12,2 0,0 R 0 0,0 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 S 39 12,8 0,0 38,4 0,0 0,0 5,1 30,7 35,9 53,8 84,6 20,5 5,1 12,8 0,0 R 2 0,0 0,0 0,0 0,0 100,0 50,0 100,0 50,0 100,0 50,0 0,0 0,0 0,0 0,0 S 38 13,2 0,0 34,2 0,0 2,6 0,0 28,9 31,6 52,6 81,6 18,4 2,6 13,2 0,0 R 3 0,0 0,0 0,0 0,0 33,3 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 33,0 33,3 0,0 0,0 S 25 12,0 0,0 28,0 0,0 0,0 0,0 0,0 20,0 32,0 84,0 12,0 0,0 12,0 0,0 R 14 7,1 0,0 57,1 0,0 14,3 21,4 100,0 57,1 98,9 78,6 21,4 14,3 14,3 0,0 S 6 16,7 0,0 33,3 0,0 0,0 0,0 16,7 0,0 33,3 100,0 33,3 0,0 16,7 0,0 R 15 13,3 0,0 33,3 0,0 6,7 20,0 53,3 100,0 66,7 100,0 33,3 6,7 13,3 0,0 S 13 7,7 0,0 23,1 0,0 0,0 0,0 7,7 30,8 0,0 76,9 15,4 0,0 7,7 0,0 R 23 13,0 0,0 52,2 0,0 8,7 13,0 56,5 43,5 100,0 87,0 21,7 8,7 13,0 0,0 S 6 0,0 0,0 16,7 0,0 16,7 0,0 50,0 0,0 50,0 0,0 0,0 0,0 16,7 0,0 R 34 14,7 0,0 41,2 0,0 2,9 8,8 32,3 44,1 58,8 100,0 20,6 5,9 11,8 0,0 S 11 0,0 0,0 18,2 0,0 18,2 9,1 27,3 18,2 45,5 81,8 0,0 0,0 9,1 0,0 R 8 40,0 0,0 37,5 0,0 0,0 12,5 37,5 62,5 62,5 100,0 100,0 12,5 25,0 0,0 S 37 10,8 0,0 32,4 0,0 2,7 2,7 29,7 35,1 54,1 81,1 16,2 0,0 13,5 0,0 R 2 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0 50,0 100,0 50,0 100,0 100,0 50,0-0,0 0,0 S 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0-0,0 R 5 25,0 0,0 40,0 0,0 0,0 0,0 40,0 40,0 60,0 80,0 40,0 0,0 100,0 0,0 S 39 7,7 0,0 33,3 0,0 5,1 7,7 35,9 38,5 56,4 82,1 17,9 5,1 10,3 - R 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0-152

163 6.2.4 Διαχωριστική Ανάλυση (Discriminant Analysis) Ο συσχετισμός των αντιμικροβιακών προφίλ (φαινοτύπων αντοχής) μεταξύ των 152 VREF στελεχών των ορνιθίων, των πτηνοσφαγέων και των νοσηλευομένων ασθενών καθορίστηκε με τη χρήση της Διαχωριστικής Ανάλυσης, βασισμένη και στις 14 αντιμικροβιακές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ευαισθησίας. Το μέσο ποσοστό της "ορθής" ταξινόμησης (Average Rate of Correct Classification, ARCC), το οποίο προσδιορίστηκε από το μέσο όρο των ποσοστών των "ορθά" ταξινομημένων στελεχών ήταν 78,6%. Συγκεκριμένα, με βάση το φαινότυπο αντοχής τους, όλα τα στελέχη των ορνιθίων ταξινομήθηκαν στην πηγή τους (ποσοστό "ορθής" ταξινόμησης 100%), όπως υψηλό ήταν το ποσοστό της "ορθής" ταξινόμησης των κλινικών VREF (85,7% δηλ. 54 από τα 63 στελέχη), δείχνοντας έτσι ένα ξεκάθαρο διαχωρισμό μεταξύ τους και στενή σχέση με την προέλευσή τους (Πίνακας 6.12, Διάγραμμα 6.12). Το ποσοστό της ταξινόμησης των κλινικών VREF στην πηγή τους (85,7% των στελεχών) αντιστοιχούσε σε 12 φαινοτύπους (Διάγραμμα 6.12), ενώ 3 φαινότυποι (4,8% των στελεχών) και 5 φαινότυποι (9,5% των στελεχών) ομαδοποιήθηκαν με την πηγή των πτηνοσφαγέων και των ορνιθίων και, αντίστοιχα. Σε αντίθεση με το υψηλό ποσοστό της "ορθής" ταξινόμησης των στελεχών των δύο άλλων πηγών (ορνίθια και νοσηλευόμενοι ασθενείς), το ποσοστό της ταξινόμησης των VREF στελεχών των πτηνοσφαγέων στην πηγή προέλευσής τους ήταν μόλις 50%, δείχνοντας το χαμηλό συσχετισμό με την πηγή τους, ενώ το 40% των στελεχών των πτηνοσφαγέων ομαδοποιήθηκε με την πηγή των ορνιθίων (Πίνακας 6.12), λόγω κοινών φαινοτύπων που μοιράζονταν με τα στελέχη των ορνιθίων. Συγκεκριμένα το ποσοστό της "ορθής" ταξινόμησης των στελεχών των πτηνοσφαγέων (50%) αντιστοιχούσε σε 2 φαινοτύπους, ενώ 3 φαινότυποι (40% των στελεχών) και 1 φαινότυπος (10% των στελεχών) ταξινομήθηκαν με την πηγή των ορνιθίων και των νοσηλευομένων ασθενών, αντίστοιχα (Διάγραμμα 6.12). 153

164 Πίνακας Διαχωριστική Ανάλυση των VREF στελεχών από κρεοπαραγωγά ορνίθια, πτηνοσφαγείς και νοσηλευόμενους ασθενείς Προέλευση (αρ. στελεχών) Αρ. (%) VREF στελεχών που ταξινομήθηκαν ως (Πηγή): Ορνίθια Πτηνοσφαγείς Νοσηλευόμενοι ασθενείς Κρεοπαραγωγά ορνίθια (n=79) 79 (100) 0 0 Πτηνοσφαγείς (n=10) 4 (40) 5 (50) 1 (10) Νοσηλευόμενοι ασθενείς (n=63) 6 (9,5) 3 (4,8) 54 (85,7) 11i 9viii 5v 4iii 3i Διάγραμμα Διάγραμμα Διαχωριστικής ανάλυσης των φαινοτύπων αντοχής των στελεχών VREF από τις τρεις πηγές: κρεοπαραγωγά ορνίθια, πτηνοσφαγείς, νοσηλευόμενοι ασθενείς. Το βέλος δείχνει τον κοινούς φαινότυπους μεταξύ των στελεχών VREF από τις διαφορετικές πηγές. Η συνεχής γραμμή ( ) ορίζει την πηγή των ορνιθίων, η διακεκομμένη ( ) ορίζει την πηγή των κλινικών και η διακεκομμένη με παύλες ( ) ορίζει την πηγή των πτηνοσφαγέων. 154

165 7 ΓΕΝΟΤΥΠΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ - ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΚΛΩΝΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ VREF ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΣΕ ΠΑΛΛΟΜΕΝΟ ΠΕΔΙΟ (PFGE) 7.1 Σχεδιασμός και Εκτέλεση της Μεθόδου Μεταξύ των στόχων της μελέτης ήταν η αναζήτηση γενετικά σχετιζομένων στελεχών (κλώνων) μεταξύ των VREF που απομονώθηκαν από διαφορετικές πηγές προέλευσης και ο προσδιορισμός της επιδημιολογικής τους σχέσης, με βάση το γονιδιωματικό τους DNA. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκε και εφαρμόστηκε η PFGE, η οποία θεωρείται μια από τις περισσότερο αξιόπιστες μεθόδους ή όπως χαρακτηριστικά αναφέρεται ο «χρυσός κανόνας» για την επιδημιολογική ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας στελεχών εντεροκόκκων (Facklam και συν., 2002 Teixeira και συν., 2007). Ως ένζυμο περιορισμού χρησιμοποιήθηκε το SmaI (βλ ), που θεωρείται το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο ένζυμο για την πέψη του DNA εντεροκόκκων που απαιτείται για τη διαφοροποίηση των στελεχών με PFGE (Gordillo και συν., 1993 Donabedian και συν., 1995 Tomayko and Murray 1995 Carvalho και συν., 1997 Descheemaeker και συν., 1997 Malathum και συν., 1998 Murray 1998 Bischoff και συν., 1999 Reinert και συν., 1999 Torell και συν., 1999 Biavasco και συν., 2007 Donabedian και συν., 2010). Συγκεκριμένα, τα προϊόντα της πέψης αναλύονταν με PFGE και τα ηλεκτροφορητικά πρότυπα ερμηνεύονταν σύμφωνα με τα κριτήρια του Tenover (Tenover και συν., 1995) (Πίνακας 7.1). Το λογισμικό πρόγραμμα Fingerprinting II version 3.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc, USA) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του συντελεστή συσχέτισης του Dice και για τη δημιουργία δενδρογραμμάτων με την ανάλυση κατά συστάδες με τη μη σταθμισμένη μέθοδο ομάδων ζευγών με αριθμητικούς μέσους όρους (unweighted pair group method with arithmetic average, UPGMA) (βλ ). 155

166 Πίνακας 7.1. Κριτήρια αξιολόγησης των ηλεκτροφορητικών προτύπων των VRE στελεχών σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο (PFGE). Γενοτυποποίηση Αριθμός διαφορών στις ζώνες ηλεκτροφόρησης Παρόμοια στελέχη επιδημικού κλώνου 0 Στελέχη με πιθανή επιδημιολογική συσχέτιση με τον επιδημικό κλώνο 6 Στελέχη που δε σχετίζονται επιδημιολογικά με τον επιδημικό κλώνο > Αποτελέσματα και Συζήτηση Η PFGE ανάλυση του συνόλου των 153 VREF, απομονωμένων από διαφορετικές πηγές προέλευσης αποκάλυψε 119 διακριτά ηλεκτροφορητικά πρότυπα, που το καθένα περιλάμβανε DNA θραύσματα. Ενδεικτικά παρουσιάζονται εικόνες ηλεκτροφορητικών DNA προτύπων VREF στελεχών καθώς και στελεχών E. gallinarum vanc από τις διαφορετικές πηγές προέλευσης (Εικόνες ). Ποσοστό ομοιότητας μεγαλύτερο ή ίσο του 75%, βρέθηκε να αντιστοιχεί σε 6 ή λιγότερες από 6 διαφορές στα ηλεκτροφορητικά DNA πρότυπα, που λήφθηκαν ως κριτήριο ταξινόμησης και διαφοροποίησης των στελεχών (Tenover και συν., 1995). Σύμφωνα με τα παραπάνω, τα 71 από τα 79 VREF στελέχη των ορνιθίων ομαδοποιήθηκαν σε 4 πολυπληθείς κλωνικές ομάδες (κλώνους), που χαρακτηρίζονται με C (C1 έως C4, Εικόνα 7.7). Η πλειοψηφία (93,7%) των στελεχών του C1 κλώνου καθώς και όλα τα στελέχη των C3 και C4 κλώνων προέρχονταν από το O1 πτηνοτροφείο, ενώ τα στελέχη του C2 κλώνου προέρχονταν από τα O1, O3 και O5 πτηνοτροφεία. Τα στελέχη από το O6 (πλην ενός που ομαδοποιήθηκε στο C1) και O7 πτηνοτροφεία σχημάτισαν PFGE πρότυπα μη συσχετιζόμενα με τους C1-C4 κλώνους. Η ύπαρξη γενετικά αδιαφοροποίητων (μη διακριτών) PFGE προτύπων στελεχών ορνιθίων σε πτηνοτροφεία διαφορετικών περιοχών (C2 κλώνος) όπως επίσης και η διαφοροποίηση PFGE προτύπων από ένα πτηνοτροφείο (O1) σε 4 κλώνους, δείχνει ότι εκτός από κλωνική διασπορά, οριζόντια μεταφορά της αντοχής στη βανκομυκίνη επίσης έχει συμβεί. Η κλωνική ή/και οριζόντια μεταφορά ενισχύεται και από το γεγονός ότι από το δείγμα ενός ορνιθίου που απομονώθηκαν 3 στελέχη VREF (κεφ. 5.2, πίνακας 5.2), τα δύο ομαδοποιήθηκαν στον ίδιο κλώνο (C4 κλώνος), ενώ το τρίτο σχημάτισε 156

167 έναν ολιγάριθμο κλώνο με άλλα δύο στελέχη του Ο1 πτηνοτροφείου, μη συσχετιζόμενο με τους C κλώνους (Εικόνα 7.7). Η κλωνική διασπορά ίσως να οφείλεται στη μεταφορά ορνιθίων φορέων VREF από κοινό προμηθευτή. Άλλωστε, στην Ευρώπη συγκεκριμένες εταιρείες παράγουν νεοσσούς, που εισάγονται και στην Ελλάδα (Ross, Cobb, Hubbard). Σε ό,τι αφορά τα ανθρώπινα στελέχη, τα 37 από τα 63 κλινικά VREF ομαδοποιήθηκαν σε 4 κλώνους, που χαρακτηρίζονται με Η (Η1 έως Η4, Εικόνα 7.8). Οι κλώνοι Η1 και Η2 περιλάμβαναν στελέχη ενηλίκων από το Ιπποκράτειο και τη Λάρισα, ενώ τα 22 από τα 35 επιδημικά στελέχη των νεογνών ομαδοποιήθηκαν στους Η3 και Η4 κλώνους. Όλα τα υπόλοιπα κλινικά στελέχη σχημάτισαν PFGE πρότυπα μη συσχετιζόμενα με τους Η1- Η4 κλώνους. Κλωνική ή/και οριζόντια μεταφορά της αντοχής της βανκομυκίνης φαίνεται να έχει συμβεί μεταξύ των κλινικών στελεχών. Οι H1 και H2 κλώνοι μοιράζονταν στελέχη από διαφορετικά νοσοκομεία, πιθανώς λόγω διανοσοκομειακής μεταφοράς των ασθενών και κατά συνέπεια κλωνικής διασποράς των στελεχών, ενώ η πλειοψηφία των επιδημικών στελεχών των νεογνών μοιράστηκε σε 2 κλώνους (H3 και H4). Τέλος, σε ό,τι αφορά τα VREF στελέχη των πτηνοσφαγέων σχημάτισαν PFGE πρότυπα μη συσχετιζόμενα με τους Η αλλά ούτε και με τους C κλώνους. Κλωνική διασπορά της αντοχής της βανκομυκίνης φαίνεται να έχει συμβεί και μεταξύ των στελεχών των πτηνοσφαγέων, καθώς βρέθηκαν στελέχη με αδιαφοροποίητα PFGE ηλεκτροφορητικά πρότυπα τόσο μεταξύ πτηνοσφαγέων του ίδιου σφαγείου όσο και σε πτηνοσφαγείς που εργάζονταν σε διαφορετικά πτηνοσφαγεία (Εικόνα 7.9). Όσο για το VREF στέλεχος που απομονώθηκε από μόσχο, σχημάτισε ένα DNA ηλεκτροφορητικό πρότυπο μη συσχετιζόμενο με κανένα από τα άλλα πρότυπα των υπολοίπων 152 στελεχών VREF των ορνιθίων, των πτηνοσφαγέων και των νοσηλευομένων ασθενών (Εικόνα 7.10). Εν κατακλείδι, το 71,2% των VREF ομαδοποιήθηκε στους C και H κλώνους. Είναι ενδιαφέρον ότι οι H κλώνοι των κλινικών στελεχών παρουσίαζαν <60% ομοιότητα με τους C κλώνους που σχημάτιζαν τα VREF στελέχη των ορνιθίων, όπως και με την πλειοψηφία των PFGE προτύπων των στελεχών των πτηνοσφαγέων (Εικόνα 7.10), καθώς και με το PFGE πρότυπο του μόσχου, γεγονός που δείχνει ξεκάθαρα τη μη κλωνική διασπορά μεταξύ των τριών πηγών (νοσηλευόμενων ασθενών, ορνιθίων, και μόσχων). Αναφορικά με τα E. gallinarum vanc, ενδεικτικά παρουσιάζονται ηλεκτροφορητικά PFGE πρότυπα στελεχών ορνιθίων (Εικόνα 7.4) καθώς και των 4 στελεχών που απομονώθηκαν από πτηνοσφαγείς (Εικόνα 7.6), μη συσχετιζόμενων μεταξύ τους (Εικόνα 7.11). 157

168 Εικόνα 7.1. PFGE ηλεκτροφορητικά πρότυπα γονιδιωματικού DNA στελεχών εντεροκόκκων. L: Δείκτης Μοριακών Μαζών σε χιλιάδες βάσεις (kilo-bases) Σειρές 1-14, 15-18, 20-27: στελέχη VREF πτηνών Ο1 πτηνοτροφείου, Σειρά 19: κενό. Εικόνα 7.2. PFGE ηλεκτροφορητικά πρότυπα γονιδιωματικού DNA στελεχών εντεροκόκκων. L: Δείκτης Μοριακών Μαζών σε χιλιάδες βάσεις (kilo-bases) Σειρές 1-13, 14-25: στελέχη VREF ορνιθίων Ο1 πτηνοτροφείου, Σειρά 26: στέλεχος VREF BM

169 Εικόνα 7.3. PFGE ηλεκτροφορητικά πρότυπα γονιδιωματικού DNA στελεχών εντεροκόκκων. L: Δείκτης Μοριακών Μαζών σε χιλιάδες βάσεις (kilo-bases) Σειρές 1, 2, 4, 5: στελέχη VREF ορνιθίων Ο1 πτηνοτροφείου, Σειρές 6-13, 14-22: στελέχη VREF ορνιθίων Ο3-Ο5 πτηνοτροφείων, Σειρές 23-26: στελέχη VREF πτηνών Ο6 πτηνοτροφείου. Εικόνα 7.4. PFGE ηλεκτροφορητικά πρότυπα γονιδιωματικού DNA στελεχών εντεροκόκκων. L: Δείκτης Μοριακών Μαζών σε χιλιάδες βάσεις (kilo-bases) Σειρές 1-12, 14-21: κλινικά στελέχη VREF νεογνών Ιπποκρατείου Νοσοκομείου, Σειρά 22: στέλεχος VREF ορνιθίου Ο7 πτηνοτροφείου, Σειρές 23-26: στελέχη E. gallinarum vanc ορνιθίων. 159

170 Εικόνα 7.5. PFGE ηλεκτροφορητικά πρότυπα γονιδιωματικού DNA στελεχών VREF. L: Δείκτης Μοριακών Μαζών σε χιλιάδες βάσεις (kilo-bases) Σειρές 1, 3-11: στελέχη VREF πτηνοσφαγέων, Σειρά 2: στέλεχος VREF μόσχου. Εικόνα 7.6. PFGE ηλεκτροφορητικά πρότυπα γονιδιωματικού DNA στελεχών E. gallinarum. L: Δείκτης Μοριακών Μαζών σε χιλιάδες βάσεις (kilo-bases) Σειρές 1-4, στελέχη E. gallinarum vanc πτηνοσφαγέων. 160