ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Επίδραση υψηλής θερμοκρασίας στην αναπαραγωγή, επιβίωση και ικανότητα παρασιτισμού του Bracon brevicornis (Hymenoptera: Braconidae) με ξενιστή το Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae) ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΙΩΑΝΝΗΣ Γ. ΜΑΥΡΟΥΔΗΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Επίδραση υψηλής θερμοκρασίας στην αναπαραγωγή, επιβίωση και ικανότητα παρασιτισμού του Bracon brevicornis (Hymenoptera: Braconidae) με ξενιστή το Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae) ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΙΩΑΝΝΗΣ Γ. ΜΑΥΡΟΥΔΗΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: ΜΑΤΘΙΛΔΗ ΣΑΒΒΟΠΟΥΛΟΥ ΣΟΥΛΤΑΝΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Μ. ΣΑΒΒΟΠΟΥΛΟΥ ΣΟΥΛΤΑΝΗ, Καθηγήτρια Α.Π.Θ. Δ. ΠΡΟΦΗΤΟΥ ΑΘΑΝΑΣΙΑΔΟΥ, Καθηγήτρια Α.Π.Θ. Χ. Α. ΑΘΑΝΑΣΙΟΥ, Επίκουρος Καθηγητής Πανεπιστημίου Θεσσαλίας ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013 ii

3 Περιεχόμενα ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY vi vii x ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae) Συστηματική κατάταξη Περιγραφή Βιολογία Υμενόπτερα Εισαγωγή Ταξινόμηση Αναπαραγωγή Παράγοντες Βιολογικής Καταπολέμησης Παρασιτοειδή Γενικά Εύρεση ξενιστή Αποδοχή ξενιστή και συμπεριφορά ωοτοκίας Κατηγορίες παρασιτοειδών Braconidae Bracon brevicornis Συστηματική κατάταξη Περιγραφή Βιολογία Ξενιστές Γεωγραφική κατανομή Σκοπός της διατριβής 19 iii

4 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 2 Υλικά και μέθοδοι Συνθήκες εργαστηρίου Εκτροφή του B. brevicornis Εκτροφή προνυμφών του O. nubilalis Εκτροφή ενηλίκων του O. nubilalis Όργανα για τη διεξαγωγή των πειραμάτων 24 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Επίδραση υψηλών θερμοκρασιών σε ενήλικα του B. brevicornis, για διάρκεια μίας ώρας στην αναπαραγωγή, επιβίωση και ικανότητα παρασιτισμού με ξενιστή το O. nubilalis 3.1 Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Αποτελέσματα Επίδραση υψηλών θερμοκρασιών στην ωοπαραγωγή Επίδραση υψηλών θερμοκρασιών στο μέσο αριθμό αυγών ανά ημέρα Επίδραση υψηλών θερμοκρασιών στην εκκολαπτικότητα των αυγών Επίδραση υψηλών θερμοκρασιών στη διάρκεια προωοτοκίας Επίδραση υψηλών θερμοκρασιών στη διάρκεια ωοτοκίας Επίδραση υψηλών θερμοκρασιών στη διάρκεια μεταωοτοκίας Επίδραση υψηλών θερμοκρασιών στη διάρκεια ζωής ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων Θανατηφόρος θερμοκρασία Αναλογία φύλου Επίδραση υψηλών θερμοκρασιών στη διάρκεια ανάπτυξης ανηλίκων σταδίων Συζήτηση 42 iv

5 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Επίδραση της διάρκειας έκθεσης ενηλίκων του B. brevicornis στους 43 ο C στην αναπαραγωγή, επιβίωση και ικανότητα παρασιτισμού με ξενιστή το O. nubilalis 4.1 Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Αποτελέσματα Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην ωοπαραγωγή Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στο μέσο αριθμό αυγών ανά ημέρα Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην εκκολαπτικότητα Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στη διάρκεια προωοτοκίας Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στη διάρκεια ωοτοκίας Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στη διάρκεια μεταωοτοκίας Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στη διάρκεια ζωής ενηλίκων αρσενικών και θηλυκών ατόμων Θανατηφόρος χρόνος Αναλογία φύλου Επίδραση υψηλών θερμοκρασιών στη διάρκεια ανάπτυξης ανηλίκων σταδίων Συζήτηση Γενικά συμπεράσματα 63 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 67 v

6 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Οφείλω θερμές ευχαριστίες στην καθηγήτρια κα Μ. Σαββοπούλου-Σουλτάνη, επιβλέπουσα της μεταπτυχιακής μου διατριβής, για την ανάθεση του θέματος, την συνεχή καθοδήγηση και υποστήριξη, καθώς και για τις διορθώσεις της κατά την συγγραφή της εργασίας. Ευχαριστώ επίσης τους καθηγητές κα Δ. Προφήτου-Αθανασιάδου και κ. Χ. Αθανασίου για τη συμμετοχή τους στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Επίσης ευχαριστώ ιδιαίτερα τον διδάκτορα κ. Σ. Ανδρεάδη, για την συνεχή παρακολούθηση της πορείας του πειράματος, για τις εύστοχες υποδείξεις και τη βοήθειά του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων του πειράματος. Ευχαριστίες οφείλω και στον υποψήφιο διδάκτορα κ. Χ. Σπανούδη για τη βοήθειά του στη διεξαγωγή των πειραμάτων και τις συνεχείς συμβουλές του. Ευχαριστώ όλους τους διδάκτορες, υποψήφιους διδάκτορες και μεταπτυχιακούς φοιτητές με τους οποίους είχα άριστη συνεργασία σε όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Τέλος, ευχαριστώ ιδιαίτερα τη σύζυγό μου για την αμέριστη συμπαράσταση που μου επέδειξε καθ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. vi

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η επίδραση της υψηλής θερμοκρασίας σε ορισμένες βιολογικές παραμέτρους του παρασιτοειδούς Bracon brevicornis (Wesmael 1838) (Hymenoptera: Braconidae) με ξενιστή το έντομο Ostrinia nubilalis (Hübner) (Lepidoptera: Crambidae). Επίσης μελετήθηκε η επίδραση που είχε η διαφορετική διάρκεια έκθεσης του B. brevicornis σε υψηλή θερμοκρασία. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας της Γεωπονικής Σχολής και τα έντομα που χρησιμοποιήθηκαν προήλθαν από τις αποικίες που διατηρούνταν στο ίδιο Εργαστήριο. Το πρώτο μέρος των πειραμάτων είχε ως σκοπό τη μελέτη της επίδρασης υψηλών θερμοκρασιών στην μέση ωοπαραγωγή, στον μέσο αριθμό αυγών ανά ημέρα, στην εκκολαπτικότητα των αυγών, στη διάρκεια προωοτοκίας, ωοτοκίας, μεταωοτοκίας, στη διάρκεια ζωής ενηλίκων και στην αναλογία φύλου του παρασιτοειδούς B. brevicornis με ξενιστή προνύμφες του λεπιδοπτέρου O. nubilalis. Υπολογίστηκαν επίσης οι θανατηφόροι θερμοκρασίες για το 50 (LTemp 50 ) και 90% (LTemp 90 ) του πληθυσμού. Ακόμη μετρήθηκε η διάρκεια ανηλίκων σταδίων και έγινε σύγκριση της διάρκειας για κάθε φύλο σε κάθε θερμοκρασία. Οι θερμοκρασίες που δοκιμάστηκαν ήταν 39, 41, 43, 44 και 45 ο C ενώ μάρτυρας ήταν οι 25 ο C. Βρέθηκε ότι η μέση ωοπαραγωγή διέφερε μεταξύ ατόμων που δέχτηκαν την επίδραση 39 και 45 ο C, με την μεγαλύτερη στους 39 ο C ενώ σε θερμοκρασίες υψηλότερες από τους 43 ο C η μέση ωοπαραγωγή διέφερε σημαντικά από τον μάρτυρα. Ο μέσος αριθμός αυγών ανά ημέρα διέφερε μεταξύ ατόμων που δέχτηκαν την επίδραση 39 ο C από εκείνα που δέχτηκαν την επίδραση υψηλότερων θερμοκρασιών. Το ποσοστό εκκολαπτικότητας διέφερε σημαντικά μεταξύ 39 και 45 ο C ενώ σε όλες τις θερμοκρασίες διέφερε σημαντικά από τον μάρτυρα. Η μέση διάρκεια προωοτοκίας ήταν μικρότερη στους 39 ο C και μεγαλύτερη στους 45 ο C και διέφερε σημαντικά. Η μέση διάρκεια ωοτοκίας ήταν κατά πολύ μικρότερη στους 45 o C σε σύγκριση με τις υπόλοιπες θερμοκρασίες. Η μέση διάρκεια μεταωοτοκίας στις θερμοκρασίες 39 και 41 ο C διέφερε από εκείνη στις θερμοκρασίες 44 και 45 ο C. Η μέση διάρκεια ζωής του αρσενικού δε διέφερε σε καμία θερμοκρασία ενώ η διάρκεια ζωής του θηλυκού στους 45 ο C διέφερε σημαντικά από τη διάρκεια σε vii

8 μικρότερες θερμοκρασίες. Επιπλέον η διάρκεια ζωής του αρσενικού ήταν μεγαλύτερη από την αντίστοιχη του θηλυκού σε όλες τις θερμοκρασίες. Η θανατηφόρος θερμοκρασία για το 50% του πληθυσμού (LTemp 50 ) των αρσενικών ήταν μικρότερη από των θηλυκών και υπήρχε σημαντική διαφορά ενώ η θανατηφόρος θερμοκρασία για το 90% του πληθυσμού (LTemp 90 ) ήταν και πάλι μικρότερη, επίσης με σημαντική διαφορά. Η αναλογία φύλου (θηλυκά/ σύνολο απογόνων) από 0.72 στους 39 o C μειωνόταν στο 0.41 στους 44 o C και υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Τέλος παρατηρήθηκε ότι υπήρχε σημαντική διαφορά στη διάρκεια ανάπτυξης των ανηλίκων σταδίων των απογόνων σε σχέση με τη θερμοκρασία και την αλληλεπίδραση θερμοκρασίας και φύλλου αλλά όχι όμως με το φύλο. Στο δεύτερο μέρος των πειραμάτων μελετήθηκαν οι παραπάνω παράμετροι διατηρώντας σταθερή τη θερμοκρασία στους 43 ο C, έχοντας τοποθετήσει τα ενήλικα για μισή, 1, 2 και 4 ώρες σε θερμόλουτρο. Έτσι η μέση ωοπαραγωγή ήταν μικρότερη μετά από επίδραση 4 ωρών και μεγαλύτερη μετά από επίδραση μισής ώρας και διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους. Ο μέσος αριθμός αυγών ανά ημέρα δεν επηρεάστηκε από τη διαφορά στη διάρκεια έκθεσης. Το ποσοστό εκκολαπτικότητας διέφερε σημαντικά μεταξύ μισής και 4 ωρών έκθεσης, με το μικρότερο να παρατηρείται μετά από 4 ώρες έκθεσης σε 43 ο C. Στις 4 ώρες η μέση διάρκεια προωοτοκίας διέφερε σημαντικά από εκείνη της μικρότερης διάρκειας έκθεσης. Η μέση διάρκεια ωοτοκίας ήταν μικρότερη στις 4 ώρες και μεγαλύτερη σε μισή ώρα και παρατηρήθηκε μεταξύ τους σημαντική διαφορά ενώ η μέση διάρκεια μεταωοτοκίας δεν επηρεάστηκε σε καμία από τις τέσσερις μεταχειρίσεις. Η μέση διάρκεια ζωής του αρσενικού διέφερε σημαντικά στη μισή και στις 4 ώρες ενώ του θηλυκού δεν είχε σημαντική διαφορά με την μεγαλύτερη να μετρείται μετά από μισή και τη μικρότερη μετά από 4 ώρες έκθεσης στους 43 ο C. Ο θανατηφόρος χρόνος για το 50% του πληθυσμού (LTime 50 ) για τα αρσενικά ήταν 4 ώρες και για τα θηλυκά 4.1 και δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Αντίστοιχα ο θανατηφόρος χρόνος για το 90% του πληθυσμού (LTime 90 ) ήταν 5.6 και 5.8 ώρες, χωρίς σημαντική διαφορά. Η αναλογία φύλου μειωνόταν με αύξηση της διάρκειας έκθεσης σε 43 ο C από 0.83 στη μισή ώρα σε 0.41 σε 4 ώρες και υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Τέλος τόσο η διάρκεια έκθεσης, όσο και το φύλο viii

9 του ενηλίκου είχαν σημαντική επίδραση στη διάρκεια ανηλίκων σταδίων, όχι όμως και η αλληλεπίδρασή τους. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι η επίδραση υψηλών θερμοκρασιών αποτελεί σημαντικό παράγοντα στην ανάπτυξη, επιβίωση και παρασιτική ικανότητα του B. brevicornis. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων μπορούν να χρησιμοποιηθούν στον συγχρονισμό σταδίων του παρασιτοειδούς με τα στάδια φυτοφάγων εντόμων. Έτσι μπορεί να επιτυγχάνεται έγκαιρη απελευθέρωσή του, όπου χρησιμοποιείται το B. brevicornis ως μέσο βιολογικής καταπολέμησης σε προγράμματα βιολογικής καταπολέμησης εχθρών των φυτών. ix

10 SUMMARY This thesis deals with the influence of high temperatures on some aspects of the biology of parasitoid Bracon brevicornis (Wesmael 1838) (Hymenoptera: Braconidae) having Ostrinia nubilalis (Hübner) (Lepidoptera: Crambidae) as a host. It also deals with the influence of increasing duration of one constant temperature. The experiments took place at the Laboratory of Applied Zoology and Parasitology of the Aristotle University of Thessaloniki and the insects that were used came from the colonies that were reared in the laboratory. During the first part of the experiments, the influence of high temperatures on the mean fecundity, mean number of eggs per day, hatchability, duration of preoviposition, oviposition, postoviposition, longevity of adults and sex ratio of parasitoid B. brevicornis were studied. The temperature that causes mortality in 50% (LTemp 50 ) and 90% (LTemp 90 ) of the population has also been determined. Furthermore the development time (duration of immature stages) was determined and the duration for each sex was compared in each temperature. The studies were conducted in the following temperatures: 39, 41, 43, 44 and 45 ο C, while the control temperature was 25 ο C. Concerning the mean fecundity, it differed significantly between 39 ο C and 45 ο C, while in higher temperatures (44 and 45 ο C) it differed significantly from the control temperature. The mean number of eggs per day was different after exposition to 39 o C than in higher temperatures (43, 44 and 45 o C). The rate of hatchability differed significantly between 39 ο C and 45 ο C, while the control differed from all the higher temperatures. The duration of preoviposition was smaller after exposition to 39 o C than after exposition to 45 o C and differed significantly. The duration of oviposition was smaller at 45 ο C, compared to the other temperatures. After 1 hour of exposition to 39 and 41 ο C the duration of postoviposition differed significantly from the duration at 44 and 45 ο C. The male longevity was the same for all temperatures, while the female longevity at 45 ο C differed significantly from that of lower temperatures. Furthermore, male longevity was longer than female longevity after exposition to all temperatures. LTemp 50 for males was lower compared to females, with a significant difference, while LTemp 90 was lower as well, with a significant difference. The sex ratio (females/ total offspring) was reduced from 0.72 at 39 ο C to 0.41 at 44 ο C and x

11 between them there was a significant difference. It was observed that the change in temperature and the interaction between temperature and sex influenced significantly the development time of immature stages of immature, except the influence of sex. During the second part of the experiments the previous factors were observed, keeping the temperature constant (43 ο C), placing the couples for a duration of half, 1, 2 and 4 hours in this temperature. The mean fecundity was lower after 4 hours of exposition and higher after half an hour of exposition and they differed significantly. The number of eggs per day had not been influenced by varying duration of exposition to high temperature and the rate of hatchability differed significantly between half and 4 hours, being smaller after 4 hours of exposition to 43 o C. The mean duration of preoviposition after 4 hours of exposition differed significantly from the duration of preoviposition in smaller durations. The mean duration of oviposition was lower at 4 hours and higher at half an hour and there was also significant difference, whereas the mean duration of postoviposition was not influenced by the duration of exposition. The male longevity after half an hour differed significantly from that of 4 hours of exposition. The female longevity was not significantly different among the durations of exposition and the biggest was counted after half and the smallest after 4 hours of exposition. The highest was counted after half an hour and the lowest after 4 hours of exposition. Male longevity was longer than female longevity in all durations of exposition, apart from 4 hours of exposition. LTime 50 for males was 4 hours and for females 4.1 hours, which is not a significant difference. Furthermore, LTime 90 for males was 5.6 hours and for females 5.8 hours, which is not a significant difference either. Sex ratio was decreased, increasing the duration of exposition from 0.8 in half an hour to 0.4 in 4 hours which is a significant difference. Finally, the influence of duration of exposition and the influence of sex, influenced the duration of immature stages of progeny significantly, but not their interaction. Based on the previous data, the influence of high temperatures constitutes a major agent in development, survival and parasitic ability of B. brevicornis. The results of the experiments may be used for the timing of stages between the parasitoid and the pest. The successful timing of release could be included in IPM programs. xi

12 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae) Συστηματική κατάταξη Το έντομο Ostrinia nubilalis (Hübner) ή Pyrausta nubilalis, P. lupulinus, P. lupulinalis, P. silacealis, P. polygoni, P. vastatrix, Pyralis glabralis, Botys silacealis, B. zealis, Hapalia kasmirica, H. lupulina ανήκει στην οικογένεια Crambidae της τάξης των Λεπιδοπτέρων (Balachowsky 1966). Η κοινή του ονομασία είναι πυραλίδα του καλαμποκιού ενώ σε άλλες γλώσσες αναφέρεται στα αγγλικά ως European corn borer, στα γαλλικά ως Pyrale du maïs, στα γερμανικά ως Maiszünsler και στα Ιταλικά ως Piralide del mais. Στην Ελλάδα αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους εχθρούς του καλαμποκιού (Σταμόπουλος 1999). Παρακάτω φαίνεται η συστηματική κατάταξη του O. nubilalis (Hübner) (ITIS 2009): Βασίλειο Υποβασίλειο Φύλο Υποφύλο Κλάση Τάξη Υπεροικογένεια Οικογένεια Υποοικογένεια Γένος Είδος Animalia Eumetazoa Arthropoda Hexapoda Insecta Lepidoptera Pyraloidea Crambidae Pyraustinae Ostrinia nubilalis 1

13 1.1.2 Περιγραφή Το σώμα του ενηλίκου ατόμου έχει μήκος 12-15mm ενώ το άνοιγμα των πτερύγων έχει μήκος 20-33mm. Το σώμα του αρσενικού (Εικόνα 1) είναι λίγο μικρότερο από του θηλυκού και οι πτέρυγές του έχουν διαφορετικό χρώμα, αλλά μοιάζει πολύ στο σχήμα των πτερύγων και στο σχήμα και τις θέσεις των ζωνών και κηλίδων των πτερύγων. Ακόμη, το σώμα του αρσενικού είναι πιο λεπτό από του θηλυκού και η άκρη της κοιλίας του προεξέχει χαρακτηριστικά από τις πτέρυγες όταν αυτές είναι διπλωμένες (Balachowsky 1966, Τζανακάκης 1980, Σταμόπουλος 1999, Capinera 2008). Οι πρόσθιες πτέρυγες του αρσενικού έχουν χρώμα καστανό, με κίτρινο το πλείστο του βασικού 1/4 του μήκους τους και με μια κίτρινη εγκάρσια τεθλασμένη ή κυματοειδή ζώνη στο ακραίο 1/3 τους. Η εγκάρσια αυτή ζώνη ορίζεται δεξιά και αριστερά από δύο σκοτεινές επίσης τεθλασμένες γραμμές. Κοντά στην πρόσθια παρυφή της πτέρυγας και περίπου στο μισό του μήκους της, υπάρχει μια μικρή κίτρινη κηλίδα. Οι οπίσθιες πτέρυγες είναι λίγο πιο σκοτεινές ιδίως στην άκρη, συνήθως τεφρές, με μία μικρή κίτρινη εγκάρσια ζώνη στο ακραίο 1/3 του μήκους τους (Εικόνα 1) (Della Beffa 1962, Τζανακάκης 1980). Εικόνα 1. Ενήλικο αρσενικό άτομο O. nubilalis. Στο θηλυκό (Εικόνα 2) οι πρόσθιες πτέρυγες είναι ανοικτοκάστανες ως ωχροκίτρινες με κίτρινο το βασικό τους μέρος και κίτρινη εγκάρσια ζώνη στις ίδιες θέσεις με το αρσενικό. Η κηλίδα κοντά στην πρόσθια παρυφή της πτέρυγας είναι στενόμακρη και μεγαλύτερη του αρσενικού. Όταν το βασικό χρώμα των πρόσθιων 2

14 πτερύγων είναι ωχροκίτρινο, οι κίτρινες κηλίδες δε διακρίνονται ενώ είναι σαφείς οι τρεις σκοτεινές, συνήθως ανοικτοκάστανες τεθλασμένες ή κυματοειδείς γραμμές που πλαισιώνουν το βασικό 1/4 και την τεθλασμένη εγκάρσια ζώνη. Οι οπίσθιες πτέρυγες του θηλυκού είναι ωχροκίτρινες με δύο εγκάρσιες κυματοειδείς ακόμα ανοιχτότερες ζώνες, που καταλαμβάνουν το μεγαλύτερο μέρος της πτέρυγας και των οποίων η εξωτερική (όταν οι πτέρυγες είναι ανοικτές) αποτελεί συνέχεια της τεθλασμένης κίτρινης ζώνης των πρόσθιων πτερύγων (Della Beffa 1962, Τζανακάκης 1980). Εικόνα 2. Ενήλικο θηλυκό άτομο O. nubilalis. Τα θηλυκά αποθέτουν τα αυγά τους την άνοιξη, κατά ομάδες, συνήθως στην κάτω επιφάνεια των φύλλων και σπανιότερα στα στελέχη και τους σπάδικες του καλαμποκιού (Wyniger 1962) (Εικόνα 3). Κάθε ωοπλάκα έχει αυγά, ελαφρώς πεπλατυσμένα και κολλημένα μεταξύ τους όπως τα λέπια των ψαριών. Το μήκος του κάθε αυγού κυμαίνεται στα 0,5-1,0mm και το χρώμα του είναι λευκό ενώ αργότερα καθώς ωριμάζει αποκτά κίτρινο χρώμα (Τζανακάκης 1980, Σταμόπουλος 1999, Gordh and Headrick 2005, Capinera 2008). Εικόνα 3. Ομάδα αυγών (ωοπλάκα) του O. nubilalis. 3

15 Η νεαρή προνύμφη είναι λευκοκίτρινη ή ωχροκίτρινη με μαύρη κεφαλή ενώ αργότερα και ιδιαίτερα στα τελευταία στάδια αποκτά ρόδινο χρωματισμό με κεφαλή και προθωρακική πλάκα καστανή. Στις πλευρές του σώματος έχει κατά μήκος σκοτεινοκάστανες ή ανοιχτές κόκκινες γραμμές, και σε κάθε δακτύλιο φέρει έξι μικρά σκοτεινοκάστανα φυμάτια. Το χρώμα της εξαρτάται από το είδος του φυτού όπου τρέφεται και αναπτύσσεται. Το τελικό της μήκος μπορεί να φτάσει τα 25-30mm (Εικόνα 4). Εικόνα 4. Ανεπτυγμένη προνύμφη του εντόμου O. nubilalis. Η νύμφη φέρει καστανό χρωματισμό και βρίσκεται συνήθως μέσα σε λεπτό βομβύκιο, το οποίο υφαίνει εντός της προνυμφικής στοάς. Οι διαστάσεις της διαφέρουν ανάλογα με το φύλο. Οι νύμφες των αρσενικών ατόμων έχουν μήκος περίπου 13-14mm και πλάτος 2-2,5mm ενώ των θηλυκών έχουν μήκος 16-17mm και πλάτος 3,5-4mm. Στην άκρη της κοιλίας υπάρχουν 5-8 αγκαθωτές απολήξεις, ελαφρώς προς τα μέσα κυρτωμένες, τις οποίες χρησιμοποιούν κατά τέτοιο τρόπο ώστε να στηρίζονται στο βομβύκιο. Η ανάπτυξη της νύμφης σταματά κάτω από τους 13 ο C (Εικόνα 5). Εικόνα 5. Νύμφη του εντόμου O. nubilalis. 4

16 1.1.3 Βιολογία Στην Ελλάδα το O. nubilalis έχει 2-3 γενεές το έτος ανάλογα με την περιοχή που αναπτύσσεται (Τζανακάκης 1980, Σταμόπουλος 1999, Andreadis et al. 2008). Ωστόσο, υπάρχουν γεωγραφικοί πληθυσμοί του O. nubilalis με μία μόνο γενεά το έτος, που εντοπίζονται κυρίως στη Βόρεια Ευρώπη, δηλαδή με μακριά περίοδο διάπαυσης (Balachowsky 1966, OEPP/EPPO 1999, Saeglitz 2004). Διαχειμάζει ως ανεπτυγμένη προνύμφη μέσα στα στελέχη των φυτών ξενιστών. Τα ενήλικα εμφανίζονται την άνοιξη και αποθέτουν τα αυγά τους στην κάτω επιφάνεια των φύλλων. Καθοριστικός παράγοντας τόσο της ωοτοκίας όσο και της εκκολαπτικότητας των αυγών είναι η ύπαρξη υψηλής σχετικής υγρασίας. Σχετική υγρασία κάτω από 70% είναι δυσμενής για την εκκόλαψη των αυγών ενώ οι ευνοϊκότερες συνθήκες ανάπτυξης κατά το στάδιο αυτό είναι θερμοκρασία 29 ο C και σχετική υγρασία 96%. Το θηλυκό προκειμένου να ωοτοκήσει κανονικά πρέπει να παίρνει καθημερινά νερό. Ο αριθμός των αυγών ανά θηλυκό άτομο είναι κατά μέσο όρο αυγά και εξαρτάται από την προηγούμενη κατάστασή του (διάπαυση, θερμοκρασία ανάπτυξης, θρεπτικά συστατικά που προσέλαβε) (Τζανακάκης 1980, Σταμόπουλος 1999). Οι νεαρές προνύμφες αρχικά τρέφονται για μικρό χρονικό διάστημα στην επιφάνεια του φυτού με τρυφερά φύλλα, κάνοντας σειρές χαρακτηριστικών μικρών οπών. Κατόπιν διασπείρονται στο φυτό και μπαίνουν στα στελέχη όπου αναπτύσσονται τρώγοντας το εσωτερικό του βλαστού και ορύσσοντας στοά (στοά εισόδου). Η νύμφωση γίνεται μέσα στη στοά, αφού πρώτα η προνύμφη ανοίξει οπή για την έξοδο του ενηλίκου (οπή εξόδου) (Σταμόπουλος 1999). Η προνυμφική στοά μπορεί να είναι προς την κορυφή του στελέχους, ανάλογα με το είδος του φυτού, το πάχος του στελέχους και την εποχή του έτους. Στο καλαμπόκι, οι μεγαλύτερης ηλικίας προνύμφες προχωρούν από το βλαστό εσωτερικά προς τους σπάδικες, τους οποίους αυλακώνουν και καταστρέφουν (Balachowsky and Mesnil 1935, Τζανακάκης 1980, Capinera 2008). Η τροφική δραστηριότητα των ανεπτυγμένων προνυμφών θεωρείται ως η πιο καταστροφική, καθώς έχει ως αποτέλεσμα το σπάσιμο των στελεχών. Εκτός όμως από την εξασθένηση των φυτών, τη μείωση της παραγωγής και το σπάσιμο των στελεχών που συντελείται, οι οπές εισόδου των προνυμφών στα στελέχη διευκολύνουν παράλληλα την είσοδο παθογόνων μικροοργανισμών που επιδεινώνουν τη ζημιά (Della Beffa 1962, Τζανακάκης 1980). 5

17 1.2. ΥΜΕΝΟΠΤΕΡΑ Εισαγωγή Η τάξη των Υμενοπτέρων περιλαμβάνει πολύ μεγάλο αριθμό ειδών, μεταξύ των οποίων τα μυρμήγκια, οι μέλισσες και σφήκες όπως και λιγότερο γνωστά είδη όπως παρασιτοειδή της οικογένειας Chalcididae και Ichneumonidae. Είναι κοινά σε όλες τις Ηπείρους, εκτός της Ανταρκτικής. Το μέγεθός τους ποικίλει από μικροσκοπικά είδη με μήκος ενηλίκων μικρότερο από 1mm μέχρι και 10cm. Είναι ολομετάβολα και έχουν δύο ζεύγη μεμβρανωδών πτερύγων. Οι Gauld και Bolton (1996) αναφέρουν τέσσερα χαρακτηριστικά της βιολογίας των Υμενοπτέρων τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξή τους. Αυτά είναι: 1. Ο μηχανισμός ωοτοκίας, που χρησιμοποιείται για εναπόθεση αυγών και έγχυση του δηλητηρίου που προκαλεί παράλυση του ξενιστή. 2. Προμήθεια επαρκούς ποσότητας τροφής για την προνύμφη στο σημείο που έχει αποθέσει το αυγό. 3. Διαφοροποίηση της διατροφής της προνύμφης, σχετιζόμενη με την αποθήκευση τροφικών αποθεμάτων μέχρι τη νύμφωση και 4. Απλοειδής προαιρετική αρρενοτόκος παρθενογένεση. Το θηλυκό αποθέτει γονιμοποιημένα (διπλοειδή) αυγά που δίνουν θηλυκά και αγονιμοποίητα (απλοειδή) που δίνουν αρσενικά. Η πλειοψηφία τους παρουσιάζει αρρενοτόκο παρθενογένεση. Τα ενήλικα τρέφονται με νέκταρ, μελιτώδεις εκκρίσεις και άλλες ζαχαρούχες ενώσεις. Η προνύμφη μπορεί να τρέφεται με φυτά, μύκητες ή με ζωικούς οργανισμούς Ταξινόμηση Τα Υμενόπτερα χωρίζονται σε δύο μεγάλες υποτάξεις, τα Σύμφυτα και τα Απόκριτα. Στα Σύμφυτα το 1 ο γαστρικό άρθρο έχει το πλάτος του επόμενου ουρομερούς και η ένωση της κοιλίας με το θώρακα είναι πλατειά. Οι προνύμφες έχουν καλά ανεπτυγμένη κεφαλική κάψα, είναι καμποειδείς και έχουν ένα ζεύγος απλών οφθαλμών. Όσες ζουν μέσα σε φυτικούς ιστούς έχουν μόνο μικρά θωρακικά πόδια και δεν έχουν ψευδόποδες. Στα Απόκριτα το 1 ο γαστρικό άρθρο είναι πολύ στενό και ονομάζεται μίσχος. Η προνύμφη είναι άποδη, ευκέφαλη και δυσκίνητη. 6

18 Ζουν ως παρασιτοειδή μέσα στο σώμα εντόμων ή άλλων Αρθροπόδων ή μέσα σε φυτικούς ιστούς (καρπούς, κηκίδες) ή σε κελιά που κατασκευάζουν τα ενήλικα (Σαββοπούλου-Σουλτάνη 1999). Η τάξη των Υμενοπτέρων περιλαμβάνει 19 υπεροικογένειες και 95 οικογένειες. Οι υπεροικογένειες Chalcidoidea, Cynipoidea, Ichneumonoidea, Proctotrupoidea και Platygastroidea περιλαμβάνουν την πλειοψηφία των παρασιτοειδών. Η τάξη Hymenoptera εκτιμάται ότι περιλαμβάνει σχεδόν είδη. Οι μεγαλύτερες οικογένειες είναι οι: Ichneumonidae (περισσότερα από είδη) και Braconidae (περίπου είδη) (Johnson 2001). Περισσότερα από το 50% των παρασιτοειδών ανήκουν στην τάξη των Υμενοπτέρων (Godfray 1994) Αναπαραγωγή Τα Υμενόπτερα τα χαρακτηρίζει η απλοειδής προαιρετική αρρενοτόκος παρθενογένεση που είναι πολύ σημαντική για την εξέλιξή τους. Οι απόγονοι προέρχονται από γονιμοποιημένα και μη-γονιμοποιημένα αυγά. Τα γονομοποιημένα αυγά εξελίσσονται σε διπλοειδή άτομα που είναι συνήθως θηλυκά και τα μη γονιμοποιημένα εξελίσσονται σε απλοειδή και είναι συνήθως αρσενικά. Τα συζευγμένα θηλυκά αποθηκεύουν τα σπερματοζωάρια στη σπερμοθήκη. Το θηλυκό έχει τη δυνατότητα να ελέγχει την απελευθέρωση των σπερματοζωαρίων δια μέσω του ωαγωγού, ελέγχοντας έτσι το φύλο των απογόνων. Σε μερικά παρασιτοειδή το μέγεθος του ξενιστή μπορεί να επηρεάσει την απόθεση αυγών που θα δώσουν αρσενικά ή θηλυκά άτομα. Άλλη μορφή παρθενογένεσης είναι η θηλυτόκος, όπου το θηλυκό δεν συζεύγνυται με το αρσενικό και τα αγονιμοποίητα αυγά δίνουν θηλυκούς απογόνους. Η θηλυτόκος παρθενογένεση προκαλείται από βακτηριακή μόλυνση, από βακτήρια του γένους Wolbachia. Μολύνσεις από τα συγκεκριμένα βακτήρια έχουν παρατηρηθεί σε μεγάλο αριθμό ειδών εντόμων και η οικολογική και εξελικτική σημασία της μόλυνσης είναι πολύ μεγάλη. 7

19 1.2.4 Παράγοντες Βιολογικής Καταπολέμησης Τα Υμενόπτερα θεωρούνται σημαντικοί παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης καθώς, θανατώνοντας τον ξενιστή τους, μειώνουν τον πληθυσμό του. Έχουν τα εξής πλεονεκτήματα: 1. είναι εξειδικευμένα ως προς τους ξενιστές τους, 2. μπορούν να διατηρούν τον πληθυσμό τους, ως παρασιτοειδή, σε σταθερά επίπεδα στη διάρκεια του χρόνου παρέχοντας συνεχή βιολογική καταπολέμηση, 3. παρασιτούν τους ξενιστές σε όλα τα περιβάλλοντα, ανεξαρτήτως της πολυπλοκότητάς τους 4. οι πληθυσμοί τους ακολουθούν αυτούς των ξενιστών τους, αυξάνονται όταν αυξάνουν οι πληθυσμοί του ξενιστή και μειώνονται όταν οι αντίστοιχοι των ξενιστών έχουν πέσει σε χαμηλά επίπεδα. Όταν ένας νέος εχθρός εισαχθεί σε μία περιοχή, αναπτύσσει πολύ γρήγορα μεγάλο πληθυσμό, απουσία παρασιτοειδούς. Τα προγράμματα βιολογικής καταπολέμησης περιλαμβάνουν την μελέτη του φυσικού περιβάλλοντος και των εχθρών των επιζήμιων εντόμων αλλά και την εισαγωγή τους στο περιβάλλον. Μερικά προγράμματα βιολογικής καταπολέμησης είναι πολύ επιτυχημένα, επιτυγχάνοντας μακροπρόθεσμο έλεγχο των εχθρών των φυτών. Οι οικογένειες παρασιτοειδών Encyrtidae και Aphelinidae αποτελούν παραδείγματα επιτυχούς βιολογικής καταπολέμησης εντόμων που ανήκουν στην υποτάξη των Ομοπτέρων. Τα παρασιτοειδή είναι διαδεδομένα σε όλα σχεδόν τα οικοσυστήματα και είναι γνωστό πως αποτελούν σύμμαχο του ανθρώπου ενάντια σε εχθρούς αγρών και δασών. Υπάρχουν δύο κύριες κατηγορίες βιολογικής καταπολέμησης με τα παρασιτοειδή: η κλασσική και η περιοδική. Στην κλασσική βιολογική καταπολέμηση ένα παρασιτοειδές απελευθερώνεται σε μια περιοχή για να ελέγξει έναν εχθρό. Επιδιώκεται η επίτευξη μόνιμης εγκατάστασης του εντομοφάγου εντόμου σε μία τουλάχιστον θέση. Η χρησιμοποίηση των παρασιτοειδών γίνεται είτε με την εισαγωγή και εποικισμό τους, είτε με την υποβοήθηση ιθαγενών ειδών. Στη δεύτερη κατηγορία, την περιοδική, σκοπός είναι η υποβοήθηση ειδών που υπάρχουν ήδη σε μία περιοχή. Έχουν χρησιμοποιηθεί δύο τρόποι εξαπόλυσης: η εξαπόλυση μεγάλου αριθμού και η εξαπόλυση σχετικά μικρού αριθμού εντόμων (Τζανακάκης 1995). 8

20 1.3 ΠΑΡΑΣΙΤΟΕΙΔΗ Γενικά Παρασιτοειδή είναι μια ομάδα εντόμων των οποίων η προνύμφη αναπτύσσεται πάνω ή μέσα στο σώμα άλλων εντόμων, τα οποία περιστασιακά σκοτώνουν. Η πλειοψηφία των παρασιτοειδών ανήκει στην τάξη των Υμενοπτέρων ή Διπτέρων και είναι πάρα πολλά σε αριθμό και εξαπλωμένα σε όλα σχεδόν τα οικοσυστήματα. Τα παρασιτοειδή είναι σημαντικά στην οικολογία πληθυσμών γιατί ρυθμίζουν ή ελέγχουν τους πληθυσμούς αρκετών ξενιστών τους. Περίπου 10% από το καταγεγραμμένων ειδών εντόμων είναι παρασιτοειδή. Σύμφωνα με άλλους συγγραφείς υπάρχουν 4-8 εκατομμύρια είδη εντόμων στη Γη, από τα οποία 1,5-2 εκατομ. είναι παρασιτοειδή (Godfray 1994). Τα παρασιτοειδή δεν παρουσιάζουν μεγάλες διαφοροποιήσεις μεταξύ τους και η προνύμφη τους τρέφεται σε άλλα έντομα, εκτός από λίγα είδη που έχουν ως ξενιστές άλλα αρθρόποδα και μαλάκια. Το ενήλικο θηλυκό παρασιτοειδές αποθέτει τα αυγά του επάνω, μέσα ή περιστασιακά κοντά στο σώμα του ξενιστή του ενώ μετά την εκκόλαψη οι προνύμφες τρέφονται από τον ξενιστή, ώσπου τελικά τον θανατώνουν. Στα παρασιτοειδή, ένας μόνο ξενιστής απαιτείται για την πλήρη ανάπτυξη (Godfray 1994) Εύρεση ξενιστή Τα παρασιτοειδή χρησιμοποιούν διάφορα ερεθίσματα για τον εντοπισμό του ξενιστή. Αυτά μπορεί να είναι χημικά, οπτικά, αφής, θερμικά και ηχητικά. Τα φυτά που προσβάλλονται από φυτοφάγα έντομα εκλύουν ένα μείγμα πτητικών ουσιών που προσελκύουν τα παρασιτοειδή. Τα φυτά αντιδρούν σε ορισμένα φυτοφάγα και στο σίελό τους, και άλλες εκκρίσεις μπορεί να είναι πολύ εξειδικευμένες, έτσι ώστε τα φυτά να έχουν επιλέξει το έντομο-προστάτη τους ενάντια στα φυτοφάγα. Συχνά τα θηλυκά παρασιτοειδή προσελκύονται από πτητικές χημικές ουσίες, που εκλύονται από το φυτό επάνω στο οποίο τρέφεται ο ξενιστής του παρασιτοειδούς. Οι αισθητήριες δομές για την ανίχνευση των ερεθισμάτων βρίσκονται στις κεραίες, τους ταρσούς, τα στοματικά μόρια και στον ωοθέτη (Johnson 2001). Αρκετά παρασιτοειδή έλκονται από τα αποχωρήματα των φυτοφάγων ή από πτητικές ουσίες που 9

21 σχετίζονται με εκκρίσεις από τους σιελογόνους και γναθικούς αδένες. Μερικοί ξενιστές έχουν συμβιωτική σχέση με άλλους οργανισμούς οι οποίοι προσελκύουν τα παρασιτοειδή. Για παράδειγμα τα ξυλοφάγα Υμενόπτερα σχετίζονται με συμβιωτικούς μύκητες που πέπτουν το ξύλο και τα παρασιτοειδή προσελκύονται από χημικές ουσίες που απελευθερώνονται από τον μύκητα. Οι ξενιστές χρησιμοποιούν διάφορες μεθόδους, όπως μιμιτισμός, ακινησία, εκπομπή χημικών ουσιών, προκειμένου να αποφύγουν τους θηρευτές τους. Τα παρασιτοειδή προσελκύονται από τις φερομόνες σύζευξης για την εξεύρεση ενήλικου ξενιστή. Τα παρασιτοειδή έχουν έμφυτη μία ιεραρχία στην ανταπόκριση σε διάφορα ερεθίσματα, ωστόσο η ιεραρχία αυτή αλλάζει με την εμπειρία που αποκτούν (Godfray 1994) Αποδοχή ξενιστή και συμπεριφορά ωοτοκίας Αφού το παρασιτοειδές εντοπίσει τον ξενιστή, πρέπει να αποφασίσει εάν ο ξενιστής έχει την ποιότητα ώστε να ωοτοκήσει σε αυτόν ή να ψάξει για άλλον, πιθανόν χρησιμοποιώντας τον υπάρχοντα μόνο ως τροφή, ώστε να μην σπαταλήσει αυγά. Όταν ο ξενιστής παρέχει αρκετή τροφή, τα αγελαία παρασιτοειδή πρέπει να αποφασίσουν για τον αριθμό των αυγών που θα αποθέσουν ενώ επιπλέον τα παρασιτοειδή Υμενόπτερα πρέπει να αποφασίσουν και για το φύλο των αυγών. Αυτό συμβαίνει μόνο στα παρασιτοειδή της τάξης των Υμενοπτέρων. Επιλέγοντας αν θα γονιμοποιήσει το αυγό ο γονέας ουσιαστικά επιλέγει το φύλο των απογόνων. Πριν την απόθεση αυγών, τα παρασιτοειδή καθορίζουν αν ο ξενιστής είναι κατάλληλος εξετάζοντάς τον αρχικά εξωτερικά, και στην περίπτωση ενδοπαρασιτισμού και εσωτερικά χρησιμοποιώντας τα αισθητήρια που υπάρχουν στον ωοθέτη τους. Ακόμα και αν ένας ξενιστής μπορεί να υποστηρίξει την ανάπτυξη μιας προνύμφης παρασιτοειδούς μπορεί να μην είναι κατάλληλος αν οι απόγονοι που θα προκύψουν είναι πολύ μικρού μεγέθους. Τα παρασιτοειδή παράγουν περιορισμένο αριθμό αυγών και αυξάνοντας την ικανότητα προσαρμογής τους, εξαντλούν τα αποθέματα των αυγών τους. Πολλά ενήλικα παρασιτοειδή τρέφονται από τον ξενιστή τους, αν και αυτό οδηγεί στην καταστροφή του ξενιστή, αλλά παρέχεται στο παρασιτοειδές ενέργεια και θρεπτικά συστατικά και έτσι παράγει περισσότερα αυγά. Τα παρασιτοειδή ρυθμίζουν το μέγεθος του αυγού ανάλογα με το μέγεθος των 10

22 διαθέσιμων πόρων και αποθέτουν αυγά ανάλογα με το μέγεθος του ξενιστή (Godfray 1994) Κατηγορίες παρασιτοειδών Ένας τρόπος ταξινόμησης είναι από το στάδιο του ξενιστή το οποίο προσβάλλουν. Η πιο κοινή κατηγορία αποτελείται από αυτά που παρασιτούν προνυμφικά ή νυμφικά στάδια, αν και υπάρχουν κάποια που παρασιτούν στο στάδιο του αυγού και της νύμφης. Ελάχιστα παρασιτούν τον ξενιστή στο ενήλικο στάδιο, επειδή κατά το στάδιο αυτό ο ξενιστής μπορεί και αμύνεται στις επιθέσεις του παρασιτοειδούς. Τα παρασιτοειδή αυγών αποθέτουν τα αυγά τους εντός των αυγών του ξενιστή και είναι συνήθως πολύ μικρά έντομα. Τα πιο κοινά είναι τα Trichogrammatidae και Mymaridae. Τα τελευταία είναι τα μικρότερα έντομα. Σε μερικά από τα παρασιτοειδή αυγών η προνύμφη τους θανατώνει τον ξενιστή όταν αυτός φτάσει στο στάδιο της προνύμφης ή νύμφης. Ένας άλλος τρόπος ταξινόμησης είναι ανάλογα με την μορφή της προνυμφικής ανάπτυξης του παρασιτοειδούς, οπότε έχουμε τα ενδοπαρασιτοειδή και τα εκτοπαρασιτοειδή. Τα πρώτα τρέφονται εσωτερικά ενώ τα δεύτερα εξωτερικά του σώματος της προνύμφης του ξενιστή. Υπάρχουν παρασιτοειδή που ξεκινάνε τον βιολογικό τους κύκλο ως εκτοπαρασιτοειδή και την ολοκληρώνουν ως ενδοπαρασιτοειδή. Εκτοπαρασιτισμός παρατηρείται συχνότερα σε είδη που επιτίθενται σε προφυλαγμένους ξενιστές μέσα σε φυτικούς ιστούς, όπου το εξωτερικά τρεφόμενο παρασιτοειδές προστατεύεται από το περιβάλλον και από άλλους άρπαγες. Τα παρασιτοειδή μπορούν επίσης να ταξινομηθούν σε ιδιοβιοτικά (idiobionts) και κοινοβιοτικά (koinobionts). Τα ιδιοβιοτικά σκοτώνουν ή προσωρινά παραλύουν τον ξενιστή τους ενώ τα κοινοβιοτικά δεν παραλύουν τον ξενιστή τους ή το κάνουν περιστασιακά, ώστε ο ξενιστής να επανέρχεται και να συνεχίζει να τρέφεται. Το παρασιτοειδές αναστέλλει την κανονική ανάπτυξή του ως προνύμφη πρώτου σταδίου, μέχρις ότου ο ξενιστής του να φτάσει σε τέτοιο μέγεθος που να μπορεί να υποστηριχθεί η ανάπτυξή του, οπότε και ολοκληρώνει την ανάπτυξή του που οδηγεί στο θάνατο του ξενιστή. Τα κοινοβιοτικά συναντώνται μόνο στα ενδοπαρασιτοειδή. Κατά τη διάρκεια της περιόδου όπου η ανάπτυξη σταματάει, η προνύμφη του παρασιτοειδούς βρίσκεται σε κίνδυνο από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή. 11

23 Η προνύμφη του παρασιτοειδούς χρειάζεται μόνο ένα άτομο του ξενιστή για την ανάπτυξή της, είναι όμως δυνατό πολλά παρασιτοειδή να μοιράζονται τον ίδιο ξενιστή. Είδη που μόνο ένα άτομο παρασιτοειδούς αναπτύσσεται ανά ξενιστή ορίζονται ως μονήρη (solitary) ενώ τα άλλα ως αγελαία (gregarious). Οι προνύμφες των μονήρων παρασιτοειδών έχουν μεγάλες κάτω γνάθους που τις χρησιμοποιούν για να επιτίθενται σε άλλα παρασιτοειδή μέσα στον ξενιστή, είτε του ιδίου είτε άλλου είδους. Αντιθέτως στα αγελαία από ένα μόνο ξενιστή προέρχεται πολύ μεγάλος αριθμός παρασιτοειδών, όπως για παράδειγμα στα Braconidae όπου από μία μόνο προνύμφη ξενιστή μπορούν να εξέλθουν μερικές εκατοντάδες άτομα του παρασιτοειδούς. Η αγελαία ανάπτυξη πρέπει να διακρίνεται από την περίπτωση του υπερπαρασιτισμού (superparasitism), όπου ένας ξενιστής παρασιτείται από περισσότερα του ενός παρασιτοειδή συγκεκριμένου είδους, με αποτέλεσμα αυτά να μην μπορούν να αναπτυχθούν επιτυχώς επάνω του. Σε τέτοιες περιπτώσεις, ο ενδοειδικός ανταγωνισμός οδηγεί συνήθως στο θάνατο των υπεράριθμων παρασιτοειδών ή στην εμφάνιση μικρών, παραμορφωμένων ενηλίκων ή στο θάνατο όλων των ανταγωνιστών. Τα παρασιτοειδή είναι σε θέση να ξεχωρίσουν τους υγιείς από τους παρασιτισμένους ξενιστές και αποφεύγουν συνήθως, τουλάχιστον ως ένα βαθμό, να ωοτοκήσουν σε ήδη παρασιτισμένους ξενιστές. Αυτό μπορεί να περιλαμβάνει το «μαρκάρισμα» ενός παρασιτισμένου ξενιστή με διάφορα μηχανικά ή χημικά μέσα. Μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει η δυνατότητα να αποφευχθεί ο υπερπαρασιτισμός μέσω της μάθησης των εντόμων και αυτό βελτιώνεται όσο το θηλυκό παρασιτοειδές αποκτά «εμπειρία» (Van Lenteren and Bakker 1975). Ομοίως, ο πλειοπαρασιτισμός (multiparasitism), όταν δηλαδή ένας ξενιστής παρασιτείται από παρασιτοειδή που ανήκουν σε διαφορετικά είδη, συνήθως οδηγεί στο θάνατο μερικών ή όλων των ανταγωνιστών. Τα παρασιτοειδή διακρίνονται ακόμα σε pro-ovigenic και synovigenic. Στα είδη της πρώτης κατηγορίας το θηλυκό εμφανίζεται με όλα τα αυγά του ώριμα ενώ στη δεύτερη ανήκουν τα θηλυκά, που με την εμφάνισή τους, μόνο ένα μέρος των αυγών είναι ώριμα. Στη δεύτερη κατηγορία η παραγωγή αυγών στηρίζεται στην ικανότητα του θηλυκού να χρησιμοποιεί τα θρεπτικά στοιχεία που προέρχονται από τον ξενιστή. Ακόμη διακρίνονται σε concurrent και non-concurrent παρασιτοειδή. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν είδη που το θηλυκό χρησιμοποιεί τον ίδιο ξενιστή για 12

24 τροφή και ωοτοκία ενώ στη δεύτερη τα παρασιτοειδή χρησιμοποιούν διαφορετικό ξενιστή για τροφή και διαφορετικό για ωοτοκία. Μία άλλη διάκριση που μπορεί να γίνει ανάλογα με το αν το θηλυκό πριν την εναπόθεση αυγών τρέφεται από τον ξενιστή ή όχι. Στα αναυτογενή (anautogenous) το θηλυκό τρέφεται από το σώμα της προνύμφης του ξενιστή και στη συνέχεια αποθέτει τα αυγά, ώστε να αναπληρώσει την έλλειψη θρεπτικών στοιχείων, τα οποία μεταφέρονται από τον ξενιστή για την ωρίμαση των αυγών. Αντίθετα στα αυτογενή (autogenous), τα θηλυκά δεν απαιτείται να τραφούν πριν την ωοτοκία, τα απαραίτητα στοιχεία τα προμηθεύεται το θηλυκό από προηγούμενα στάδια (Jervis et al. 1986) Braconidae Η οικογένεια Braconidae αποτελεί μία από τις πολυπληθέστερες σε αριθμό ειδών οικογένειες εντόμων. Εκτιμάται ότι αποτελείται από είδη (Johnson 2001). Είναι ευρέως εξαπλωμένη και αποτελεί την δεύτερη μεγαλύτερη οικογένεια των Υμενοπτέρων (Wharton et al. 2000). Η οικογένεια περιλαμβάνει περίπου 40 υποοικογένειες. Μελέτες για την ταξινόμησή τους έχουν γίνει από τον van Achterberg (1993), τον Sharkey(1993) και τον Wharton (1997). Είναι ενδο- και εκτοπαρασιτοειδή προνυμφών εντόμων, ιδιαίτερα Λεπιδοπτέρων, Κολεοπτέρων και Διπτέρων. Χρησιμοποιούνται παγκοσμίως στην βιολογική καταπολέμηση. Τα διάφορα είδη μπορούν να αναγνωριστούν από τις νευρώσεις στις πτέρυγες. Η εμφάνιση των πρώτων ειδών της οικογένειας χρονολογείται από την Κρητιδική περίοδο (Rasnitsyn 1983, Whitfield 2002). Διαφοροποιήθηκε στα τέλη της περιόδου αυτής, όταν εμφανίστηκαν τα ανθοφόρα φυτά και τα ολομετάβολα φυτοφάγα (Basibuyuk et al. 1999, Whitfield 2002, Belshaw et al. 2000). Χρησιμοποιούνται ως μοντέλα για την μελέτη της αλληλεπίδρασης ξενιστή παρασιτοειδούς. Παρασιτούν επίσης ενήλικα άτομα (ειδικά Ημίπτερα και Κολεόπτερα) ενώ δύο είδη των υποοικογενειών Mesostoinae και Doryctinae σχηματίζουν κηκίδες στα φυτά (Infante et al. 1995, Austin and Dangerfield 1998). 13

25 1.4 Bracon brevicornis (Wesmael) (Hymenoptera: Braconidae) Συστηματική κατάταξη Το εκτοπαρασιτοειδές B. brevicornis ανήκει στην τάξη των Υμενοπτέρων και στην Οικογένεια Braconidae. Η ταξινομική κατάταξη είναι η εξής (ITIS 1996): Βασίλειο Φύλο Υποφύλο Κλάση Τάξη Υποτάξη Υπεροικογένεια Οικογένεια Γένος Είδος Animalia Arthropoda Hexapoda Insecta Hymenoptera Apocrita Ichneumonoidea Braconidae Bracon Bracon brevicornis Περιγραφή Το σώμα του ενηλίκου έχει μήκος mm και άνοιγμα πτερύγων mm. Το χρώμα του σώματος ποικίλλει από κίτρινο-καστανό έως σκούρο καστανό ή μαύρο. Η κεραία του θηλυκού (Εικόνα 6) έχει άρθρα και του αρσενικού άρθρα (van Achterberg and Walker 1998). Τα αρσενικά (Εικόνα 7) έχουν μακρύτερες κεραίες, μικρότερες πτέρυγες και πόδια, και μεγαλύτερους σύνθετους οφθαλμούς. Τα γεννητικά όργανα του θηλυκού αποτελούνται από ένα ζευγάρι εκτεινόμενων γοναποφύσεων, μαύρα περιφερειακά, και ένα κεντρί καστανού χρώματος (Εικόνα 8). Ο γεννητικός οπλισμός του αρσενικού αποτελείται από ένα εσωτερικό και ένα εξωτερικό ζεύγος δαγκανών. 14

26 Εικόνα 6. Πλευρική όψη ενηλίκου θηλυκού (1), κεραία θηλυκού (2), κεραία αρσενικού (3) (van Achterberg and Walker 1998). Εικόνα 7. Ενήλικο αρσενικό του B. brevicornis. Εικόνα 8. Ενήλικο θηλυκό του B. brevicornis 15

27 Τα αυγά (Εικόνα 9) είναι επιμήκη, σχεδόν διάφανα, που σταδιακά γίνονται λευκά. Αποτίθενται από το ενήλικο θηλυκό εξωτερικά στο σώμα της προνύμφης του ξενιστή συνήθως στην κοιλιακή περιοχή, σε ομάδες με περισσότερα από 5 αυγά. Μετά την εκκόλαψη, η προνύμφη (Εικόνα 10Α) που είναι και αυτή λευκή γίνεται σταδιακά ανοικτοκόκκινη όταν φθάσει στο στάδιο της prepupa. Η prepupa (Εικόνα 10Β) πριν την μετατροπή της σε νύμφη απομακρύνεται από την νεκρή προνύμφη του ξενιστή σε προφυλαγμένη θέση, όπου σχηματίζει βομβύκιο (Εικόνα 10Γ). Εικόνα 9. Αυγά του B. brevicornis σε παρασιτισμένη προνύμφη O. nubilalis. Α Β Εικόνα 10. Προνύμφη (Α) και prepupa (Β) σε παρασιτισμένη προνύμφη O. nubilalis και νύμφη (Γ) του B. brevicornis. 16

28 1.4.3 Βιολογία Η διάρκεια ανάπτυξης επηρεάζεται σημαντικά από την θερμοκρασία. Σε ευνοϊκές θερμοκρασίες, η θνησιμότητα δεν επηρεάζεται από μικρές διακυμάνσεις της σχετικής υγρασίας, όμως σε ακραίες θερμοκρασίες η θνησιμότητα αυξάνεται. Σε ευνοϊκές θερμοκρασίες, τα αυγά εκκολάπτονται σε 2-3 ημέρες, η προνύμφη τρέφεται από το υγρό του σώματος της προνύμφης του ξενιστή και φτάνει σε μήκος περίπου 5mm. Με την ολοκλήρωση της ανάπτυξής της δημιουργεί μετάξινο βομβύκιο με ίνες από τους σιελογόνους αδένες. Το βομβύκιο τελικά περιβάλλει όλο το σώμα, με την πλευρά που εφάπτεται στο υπόστρωμα να αποτελείται από λιγότερες ίνες. Μετά από 2-3 ημέρες η νύμφη αρχίζει να μεταμορφώνεται σε ενήλικο. Έτσι την δεύτερη ημέρα αρχίζουν να σχηματίζονται οι σύνθετοι οφθαλμοί ενώ την τρίτη οι κεραίες εμφανίζονται στην κοιλιακή πλευρά. Τα θηλυκά παρασιτοειδή κεντρίζουν την προνύμφη του ξενιστή από την οποία περιστασιακά τρέφονται και αποθέτουν τα αυγά τους. Τα αρσενικά είναι αδιάφορα για τις προνύμφες, αλλά παρουσιάζουν χαρακτηριστικές αντιδράσεις προς τα θηλυκά, όπως κάνοντας έντονες γρήγορες κινήσεις των πτερύγων, πλησιάζοντας στο σώμα τους και χτυπώντας τις πτέρυγες και τις κεραίες κατά τη διάρκεια της σύζευξης. Το ενήλικο θηλυκό αφού εντοπίσει την προνύμφη του ξενιστή, την πλησιάζει και την εξερευνά με τις κεραίες. Προεκτείνει το κεντρί που εξέρχεται από την άκρη της κοιλίας και καμπυλώνει το σώμα όπως φαίνεται στην Εικόνα 11. Εικόνα 11. Ενήλικο θηλυκό B. brevicornis εγχύει δηλητήριο σε προνύμφη O. nubilalis. 17

29 Πραγματοποιεί νύγματα και εγχύει το δηλητήριο στην κοιλιακή περιοχή κυρίως, οπότε η προνύμφη παραλύει σε 3-4 ώρες, όπως για παράδειγμα το B. brevicornis βρέθηκε να παραλύει την προνύμφη του Opisina arenosella σε 3-5 ώρες (Venkatesan et al. 2009). Η προνύμφη αν και παραλύει και ακινητοποιείται, εντούτοις συνεχίζει να αναπνέει. Μετά από παρασιτισμό του Corcyra cephalonica από το B. brevicornis αναστέλλεται η δραστηριότητα της χολινεστεράσης κατά 40%. Η αύξηση της συγκέντρωσης της Ach των προνυμφών που έχει παραλύσει ένα παρασιτοειδές οδηγεί στον κορεσμό της χολινεστεράσης και στο σταμάτημα της νευρομυϊκής λειτουργίας (Bahira et al. 1976). Επίσης παρατηρήθηκε ότι το B. brevicornis με τον παρασιτισμό του στο Sesamia cretica (Lepidoptera: Noctuidae) εγχύει δύο παθογόνα βακτήρια, τα Serratia marcescens και Bacillus thuringiensis, και η προνύμφη ακινητοποιείται πιο γρήγορα Ξενιστές Το B. brevicornis παρασιτεί αρκετά είδη εντόμων, κυρίως Λεπιδοπτέρων όπως για παράδειγμα τα Opisina arenosella (Lepidoptera: Cryptophasidae) (Venkatesan et al. 2009), Eublemma amabilis (Lepidoptera: Noctuidae) (Sharma et al. 2000), Pectinophora gossypiella (Lepidoptera: Gelechiidae), Corcyra cephalonica (Lepidoptera: Galleriidae), Earias insulana (Lepidoptera: Noctuidae) (Srivastava et al. 1997), Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae), Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Επίσης, παρασιτεί το Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae), το Plodia interpunctella (Lepidoptera: Pyralidae), το Ephestia cautella (Lepidoptera: Pyralidae) και το Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Ο Shenefelt (1978) παραθέτει 85 ξενιστές, συμπεριλαμβανομένων ειδών του γένους Heliothis (Lepidoptera: Noctuidae) και Antigastra catalaunalis (Lepidoptera: Pyralidae). Κάποιες καλλιέργειες προσελκύουν φυσικούς πληθυσμούς του και αποτελούν ευνοϊκές τοποθεσίες για το B. brevicornis, όπως άνηθος, μαϊντανός, αγριαψιθιά, ζίννια, τριφύλλι, σόγια, ηλίανθος και κατιφές. 18

30 1.4.5 Γεωγραφική κατανομή Το B. brevicornis είναι διαδεδομένο στην Ευρώπη (Εικόνα 12), Δυτική Αφρική, Ασία, Ινδία, Νότια Αφρική (Elzinga et al. 2007). Την δεκαετία του 1950, εισήχθη από την Ινδία στον Καναδά, τις Η.Π.Α. και το Μεξικό για την αντιμετώπιση εχθρών όπως του P. gossypiella και του Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Pyralidae). Στην εικόνα 3 φαίνεται η γεωγραφική εξάπλωση του παρασιτοειδούς. Εικόνα 12. Εξάπλωση του B. brevicornis. (πηγή: Fauna Europaea 2004) 1.5 Σκοπός της διατριβής Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης υψηλών θερμοκρασιών σε διάφορες βιολογικές παραμέτρους του παρασιτοειδούς B. brevicornis. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας στην αναπαραγωγή, επιβίωση και ικανότητα παρασιτισμού του παρασιτοειδούς με ξενιστή προνύμφες του O. nubilalis. Τα πειράματα έγιναν με σκοπό να διαπιστωθεί αν το παρασιτοειδές μπορεί να αποτελέσει αποτελεσματικό μέσο βιολογικής καταπολέμησης εντόμων υπό συνθήκες υψηλής θερμοκρασίας. Ειδικότερα, το πρώτο μέρος των πειραμάτων είχε ως σκοπό τη μελέτη της επίδρασης της ίδιας διάρκειας τεσσάρων διαφορετικών υψηλών θερμοκρασιών στην αναπαραγωγή, επιβίωση και ικανότητα παρασιτισμού, σε συνθήκες εργαστηρίου. Μελετήθηκαν η ωοπαραγωγή, ο μέσος αριθμός αυγών ανά ημέρα, η εκκολαπτικότητα, η διάρκεια προωοτοκίας, ωοτοκίας, μεταωοτοκίας και η διάρκεια ζωής ενηλίκων. Ακόμη υπολογίστηκαν η θανατηφόρος θερμοκρασία για το 50 και 19

31 90% του πληθυσμού (LTemp 50, LTemp 90 αντίστοιχα) και η αναλογία φύλου. Τέλος υπολογίστηκε η επίδραση της θερμοκρασίας, του φύλου και η αλληλεπίδρασή τους στη διάρκεια ανηλίκων σταδίων. Στο δεύτερο μέρος των πειραμάτων μελετήθηκε η επίδραση που είχε η διαφορετική διάρκεια έκθεσης του B. brevicornis σε υψηλές θερμοκρασίες. Στη σειρά αυτή πειραμάτων μελετήθηκαν οι ίδιοι παράγοντες με την προηγούμενη σειρά πειραμάτων, όπως επίσης η θανατηφόρος διάρκεια για το 50 και 90% του πληθυσμού (LTime 50 και LTime 90 αντίστοιχα) και η επίδραση της διάρκειας έκθεσης, του φύλου και της αλληλεπίδρασής τους στη διάρκεια ζωής ανηλίκων σταδίων. Από τα αποτελέσματα αυτά μπορεί να αξιολογηθεί η ικανότητα του εκτοπαρασιτοειδούς B. brevicornis ως παράγοντα βιολογικής καταπολέμησης του O. nubilalis, αλλά και η πιθανότητα δυσμενούς επίδρασης υψηλών θερμοκρασιών στη βιολογία και οικολογία του. 20

32 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Συνθήκες εργαστηρίου Η αποκία του παρασιτοειδούς B. brevicornis και του ξενιστή του O. nubilalis διατηρούνταν σε σταθερές συνθήκες εργαστηρίου με θερμοκρασία 25±1 ο C, σχετική υγρασία 65±5% και φωτοπερίοδο (Φ:Σ)16:8. Το φως προερχόταν από λαμπτήρες φθορίου. 2.2 Εκτροφή του B. brevicornis Η αρχική αποικία του παρασιτοειδούς προήλθε από εκτροφή που διατηρούταν στο Εργαστήριο Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Τα ενήλικα του παρασιτοειδούς τοποθετούνταν κατά ζεύγη, με τη βοήθεια αναρροφητήρα, σε τριβλία Petri διαμέτρου 6cm, όπου από πριν είχε τοποθετηθεί μια προνύμφη 4 ης ηλικίας του O. nubilalis. Τα τριβλία τυλίγονταν με parafilm για να παραμένει η σχετική υγρασία σταθερή, καθώς οι προνύμφες του O. nubilalis αφυδατώνονταν πολύ γρήγορα, με αποτέλεσμα να παρατηρείται μεγάλη θνησιμότητα των προνυμφών του παρασιτοειδούς. Στην εσωτερική πλευρά του καπακιού του τριβλίου, τοποθετούνταν με τη βοήθεια μιας σύριγγας, μια σταγόνα διαλύματος μελιού 50% για την λήψη τροφής από τα ενήλικα παρασιτοειδή, ώστε να λαμβάνονται τα απαραίτητα θρεπτικά συστατικά για την ωοπαραγωγή. Τα παρασιτοειδή παρέμεναν για 24 ώρες στο τριβλίο και ακολούθως απομακρύνονταν με προσοχή ώστε να μην μετακινηθεί η παρασιτισμένη προνύμφη και καταστραφούν τα αυγά τους. Η προνύμφη παρακολουθούνταν μέχρι την έξοδο των ενηλίκων, τα οποία αμέσως χρησιμοποιούνταν για τις ανάγκες του πειράματος. 2.3 Εκτροφή προνυμφών του O. nubilalis Οι νεοεκκολαφθείσες προνύμφες του O. nubilalis τοποθετούνταν σε πλαστικά κουτιά πλάτους 6cm, μήκους 11cm και ύψους 6cm, τα οποία περιείχαν τεχνητή 21

33 τροφή. Για την εκτροφή των προνυμφών του εντόμου χρησιμοποιήθηκε τεχνητή τροφή της οποίας η σύσταση φαίνεται στον Πίνακα 1. Πίνακας 1. Συστατικά τεχνητής τροφής των προνυμφών του O. nubilalis. ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΠΟΣΟΤΗΤΑ Νερό για άγαρ 340ml Άγαρ 23gr Νερό για τροφή 340ml Καλαμποκάλευρο 112gr Φύτρο σιταριού 28gr Μαγιά μπύρας (Brewer s yeast) 30gr Βενζοϊκό οξύ (Benzoic acid) 2gr Ασκορβικό οξύ (Ascorbic acid) 6gr Fumidil 1gr Μίγμα βιταμινών για έντομα 2gr Nipagin 1gr Sorbic acid 0.8gr Η τεχνητή τροφή παρασκευάζεται με την ακόλουθη διαδικασία: Αρχικά θερμαίνουμε 340 ml νερού έως τους 85 ο C και στη συνέχεια προσθέτουμε σε αυτό το άγαρ, τα συντηρητικά (βενζοϊκό οξύ, nipagine) και τα άλατα. Έπειτα, το παχύρευστο υγρό που δημιουργείται, αδειάζεται σε δοχείο αναμικτήρα (Mixer), όπου προστίθενται τα υπόλοιπα συστατικά με την σειρά που αναγράφονται στον Πίνακα 1. Το μείγμα αυτό ανακινείται για 3 λεπτά περίπου και στην συνέχεια αδειάζεται σε γυάλινα τριβλία Petri, διαμέτρου 9cm και πάχους 1cm περίπου, τα οποία έχουν αποστειρωθεί προηγουμένως (Εικόνα 13). Τα τριβλία παραμένουν ανοιχτά για περίπου μισή ώρα, μέχρι να κρυώσει καλά το μείγμα και να πήξει, και στη συνέχεια κλείνονται και διατηρούνται στο ψυγείο σε θερμοκρασία περίπου 5 o C μέχρι την ημέρα της χρησιμοποίησης τους. 22

34 Εικόνα 13. Τεχνητή τροφή σε γυάλινο τριβλίο Petri. Με την ανάπτυξη των προνυμφών και καθώς εξαντλούνταν η τροφή, οι προνύμφες μεγαλύτερων ηλικιών μεταφέρονταν σε νέο πλαστικό κουτί ίδιων διαστάσεων, με την προσθήκη νέας τροφής. Όταν παρατηρούνταν αφυδάτωση της τροφής ή πολλά αποχωρήματα, τα άτομα μεταφέρονταν σε καθαρά κουτιά όπου τοποθετούνταν νέα τροφή (Εικόνα 14). Στα κουτιά όπου υπήρχαν ανεπτυγμένες προνύμφες γινόταν καθημερινός έλεγχος για την ύπαρξη ή μη νυμφών, έτσι ώστε να απομακρυνθούν εγκαίρως για την αποφυγή απωλειών λόγω κανιβαλισμού. Οι νύμφες τοποθετούνταν σε γυάλινα τριβλία Petri διαμέτρου 9cm και ένα μικρό κομμάτι βαμβάκι εμποτισμένο με νερό για να παρέχεται στις νύμφες η απαραίτητη σχετική υγρασία έτσι ώστε να φτάσουν στην ενηλικίωση. Εικόνα 14. Εκτροφή προνυμφών σε τεχνητή τροφή. 23

35 2.4 Εκτροφή ενηλίκων του O. nubilalis Τα ενήλικα άτομα τοποθετούνταν σε πλαστικά διαφανή κύπελλα ύψους 9.8cm, διαμέτρου βάσης 5cm και κορυφής 7.3cm (Εικόνα 15). Σε κάθε κύπελλο τοποθετούνταν 3 ζεύγη ενήλικων ατόμων. Στη βάση του κυπέλλου ανοίγονταν 3 οπές διαμέτρου 1cm από όπου εισέρχονταν κατά το ήμισυ οδοντιατρικό βαμβάκι, μήκους 4cm. Το άνοιγμα του κυπέλλου καλύπτονταν με πλαστικό διαφανές καπάκι. Το κύπελλο με τα ενήλικα στη συνέχεια τοποθετούνταν εντός δεύτερου κυπέλλου όμοιων διαστάσεων που περιείχε 20 ml διαλύματος ζάχαρης 10% με το οποίο τρέφονταν τα ενήλικα. Τα θηλυκά αφού πρώτα συζευγνύονταν στη συνέχεια ωοτοκούσαν στα τοιχώματα του δοχείου. Μετά την παρέλευση 5 ημερών μεταφέρονταν σε νέο πλαστικό κύπελλο. Το κύπελλο με τα αυγά διατηρούνταν σε συνθήκες υψηλής σχετικής υγρασίας, έτσι ώστε να διευκολυνθεί η εκκόλαψη των προνυμφών. Οι νεοεκκολαφθείσες προνύμφες μεταφέρονταν με τη βοήθεια λεπτού πινέλου στα κύπελλα εκτροφής προνυμφών και ακολουθούνταν η διαδικασία εκτροφής που περιγράφηκε. Εικόνα 15. Ενήλικα άτομα σε πλαστικά διαφανή κύπελλα. 2.5 Όργανα για τη διεξαγωγή των πειραμάτων Για την εκτέλεση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε ο εξοπλισμός του Εργαστηρίου Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας. Πιο συγκεκριμένα για τα πειράματα της επίδρασης των υψηλών θερμοκρασιών χρησιμοποιήθηκε ειδική συσκευή υδατόλουτρου (Model 9505, PolyScience, IL, USA), το οποίο περιείχε περίπου 3 λίτρα διαλύματος απεσταγμένου νερού και αιθυλενογλυκόλης σε αναλογία 24