ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΣΒΟΛΩΝ ΤΩΝ ΚΗΡΗΘΡΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΕΝΤΟΜΟ GALLERIA MELLONELLA (LEPIDOPTERA: PYRALIDAE) ΜΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΣΒΟΛΩΝ ΤΩΝ ΚΗΡΗΘΡΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΕΝΤΟΜΟ GALLERIA MELLONELLA (LEPIDOPTERA: PYRALIDAE) ΜΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΠΠΑΣ Σ. ΧΡΗΣΤΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΣΒΟΛΩΝ ΤΩΝ ΚΗΡΗΘΡΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΕΝΤΟΜΟ GALLERIA MELLONELLA (LEPIDOPTERA: PYRALIDAE) ΜΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΠΠΑΣ Σ. ΧΡΗΣΤΟΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ Α.Π.Θ. ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: ΜΑΤΘΙΛΔΗ ΣΑΒΒΟΠΟΥΛΟΥ ΣΟΥΛΤΑΝΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Μ. ΣΑΒΒΟΠΟΥΛΟΥ ΣΟΥΛΤΑΝΗ, Καθηγήτρια Α.Π.Θ. Δ. ΠΡΟΦΗΤΟΥ ΑΘΑΝΑΣΙΑΔΟΥ, Καθηγήτρια Α.Π.Θ. Α. ΘΡΑΣΥΒΟΥΛΟΥ, Καθηγητής Α.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος Ευχαριστίες... 5 Περίληψη... 6 Abstract... 8 Κεφάλαιο 1: Γενική εισαγωγή Φυσικοί εχθροί Φυσικοί εχθροί εντόμων Παρασιτοειδή έντομα Υμενόπτερα Αρθρόποδα Αποθηκευμένων προϊόντων Το έντομο Galleria mellonella L Καταπολέμηση Bacillus thuringiensis Σκοπός διατριβής Κεφάλαιο 2: Γενικά υλικά και μέθοδοι Συνθήκες εργαστηρίου Εκτροφή του πληθυσμού του Bracon brevicornis Εκτροφή του πληθυσμού Galleria mellonella Το Β Κεφάλαιο 3: Επίδραση του Bacillus thuringiensis var. aizawai σε βιολογικές παραμέτρους του Bracon brevicornis Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Έντομα Υποθανατηφόρες δόσεις Επίδραση του Bacillus thuringiensis var. aizawai (Β401) σε βιολογικες παραμέτρους του Bracon brevicornis, μέσω του ξενιστή Galleria mellonella Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Υποθανατηφόρες δόσεις LD 10, LD 30, LD 50 και LD 70 του Β401 για το Galleria mellonella Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην ωοπαραγωγή του Bracon brevicornis Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην εκκολαπτικότητα των αυγών του Bracon brevicornis

4 Επιδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην επιβιωση των προνυμφων του Bracon brevicornis Επίδραση του B401 (Bacillus huringiensis var. aizawai) στην επιβίωση των prepupa του Bracon brevicornis Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην επιβίωση των νυμφών του Bracon brevicornis Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην επιβίωση των ανήλικων σταδίων του Bracon brevicornis Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην αναλογία φύλου του Bracon brevicornis Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην διάρκεια ανάπτυξης του Bracon brevicornis Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην διάρκεια ζωής των ενήλικων απογόνων ατόμων του Bracon brevicornis Συζήτηση Κεφάλαιο 4: Πρακτική εφαρμογή Βιοδοκιμές στο εργαστήριο Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Έντομα Βιοδοκιμές Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Αποτελεσματικότητα του Bracon brevicornis, του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) και της συνδυασμένης δράσης τους εναντίον του Galleria mellonella Μείωση της προκαλούμενης καταστροφής της επιφάνειας του πλαισίου μετά από την εφαρμογή του Bracon brevicornis, του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) και της συνδυασμένης δράσης τους εναντίον του Galleria mellonella Μείωση του βάρους του πλαισίου μετά από την εφαρμογή του Bracon brevicornis, του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) και των δυο εναντίον του Galleria mellonella Συζήτηση Κεφάλαιο 5: Γενικά συμπεράσματα Βιβλιογραφία

5 Πρόλογος Ευχαριστίες Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Η ολοκλήρωση της εργασίας αυτής έγινε στο πλαίσιο της υλοποίησης του μεταπτυχιακού προγράμματος το οποίο συγχρηματοδοτήθηκε μέσω της πράξης «Πρόγραμμα χορήγησης υποτροφιών ΙΚΥ με διαδικασία εξατομίκευσης αξιολόγησης ακαδημαϊκού έτους » από πόρους του Ε.Π. «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου (ΕΚΤ) και του ΕΣΠΑ ( ). Θερμές ευχαριστίες οφείλω στην καθηγήτρια κ. Ματθίλδη Σαββοπούλου- Σουλτάνη για την υπόδειξη του θέματος της διατριβής, την καθοδήγησή της κατά τη συγγραφή της εργασίας αλλά και τη συνεχή υποστήριξή της κατά τη διάρκεια των σπουδών μου. Επίσης, ευχαριστώ την καθηγήτρια κ. Δήμητρα Προφήτου Αθανασιάδου και τον καθηγητή κ. Ανδρέα Θρασυβούλου για τη συμμετοχή τους στην εξεταστική επιτροπή αλλά και για τις χρήσιμες υποδείξεις τους. Ιδιαίτερα τον κύριο Θρασυβούλου για την στήριξη του καθόλη την διάρκεια των σπουδών μου. Ευχαριστώ τον υποψήφιο διδάκτορα κ. Χρήστο Σπανούδη για την συμβολή του στη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών όπως και για τη βοήθεια στη διεξαγωγή των πειραμάτων. Ευχαριστώ επίσης θερμά όλους τους διδάκτορες, υποψήφιους διδάκτορες, μεταπτυχιακούς και προπτυχιακούς φοιτητές με τους οποίους συνεργάστηκα με άψογο τρόπο και σε φιλικό κλίμα. Τέλος, ευχαριστώ ιδιαίτερα τους γονείς μου για την αμέριστη συμπαράστασή τους, υλική και ηθική, όλα τα χρόνια των σπουδών μου, καθώς και τους φίλους μου. Παππάς Χρήστος 5

6 Περίληψη Τα τελευταία χρόνια η χρήση βιολογικών σκευασμάτων θεωρείται ως μία εναλλακτική και αποτελεσματική μέθοδος για την αντιμετώπιση των εχθρών αποθηκευμένων προιόντων. Ωστόσο, η έρευνα γύρω από τυχόν δυσμενείς επιδράσεις των βιολογικών σκευασμάτων σε ωφέλιμα έντομα είναι περιορισμένη. Σκοπός της παρούσας εργασίας στο πρώτο μέρος ήταν η μελέτη της επίδρασης υποθανατηφόρων δόσεων του Β401 (Βacillus thuringiensis var. aizawai) (LD 10, LD 30, LD 50, LD 70 ) και του χρόνου έκθεσης του ξενιστή, στην επιβίωση, ωοτοκία, διάρκεια ανάπτυξης και διάρκεια ζωής του εκτοπαρασιτοεδούς Bracon brevicornis (Hymenoptera: Braconidae), με ξενιστή το Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Παρατηρήθηκε υψηλή θνησιμότητα στις προνύμφες του Bracon brevicornis που αναπτύχθηκαν σε προνύμφες του Galleria mellonella οι οποίες είχαν προηγουμένως τραφεί σε τεχνητή τροφή εμποτισμένη με τις υποθανατηφόρες δόσεις του B401. Συγκεκριμένα, η θνησιμότητα των προνυμφών του παρασιτοειδούς έφτασε το 88% στο LD 70, περίπου το 80% στο LD 50 και το 74% τόσο στο LD 30 και όσο το LD 10, σημαντικά υψηλότερη σε σχέση με το μάρτυρα (35%). Όσον αφορά την ωοτοκία του Bracon brevicornis δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μεταχειρίσεων και του μάρτυρα, καθώς η συνολική ωοτοκία κυμάνθηκε από 360 μέχρι 422 αυγά σε όλες τις περιπτώσεις. Ομοίως, η διάρκεια ανάπτυξης των ανήλικων σταδίων του Bracon brevicornis δεν επηρεάστηκε από την έκθεση του ξενιστή στο B401, καθώς κυμάνθηκε στα ίδια επίπεδα τόσο στις διαφορετικές δόσεις του B401 όσο και στο μάρτυρα. Αντίθετα, η διάρκεια ζωής τόσο των αρσενικών όσο και των θηλυκών ενήλικων απογόνων του παρασιτοειδούς ήταν σημαντικά μικρότερη στις υποθανατηφόρες δόσεις του B401 που δοκιμάστηκαν, σε σχέση με το μάρτυρα. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι αρσενικά άτομα του Bracon brevicornis που αναπτύχθηκαν σε προνύμφες του Galleria mellonella που είχαν εκτεθεί σε υποθανατηφόρο δόση LD 50, παρουσίασαν σημαντικά μικρότερη διάρκεια ζωής (26 ημέρες), σε σχέση με αυτά που αναπτύχθηκαν στο μάρτυρα (36 ημέρες). Αντίστοιχα, σε θηλυκά άτομα του παρασιτοειδούς που αναπτύχτηκαν στις ίδιες συνθήκες (LD 50 ) η διάρκεια ζωής ήταν 37 ημέρες, σημαντικά μικρότερη σε σχέση με το μάρτυρα (45 ημέρες). Όσον αφορά στο διαφορετικό χρόνο έκθεσης του ξενιστή, παρατηρήθηκε και εκεί μια διαφοροποίηση μεταξύ των επεμβάσεων με μεγαλύτερα ποσοστά επιβίωσης 6

7 προνυμφών στις 6 ώρες και μικρότερα στις 24 ώρες ενώ σε αυτή την περίπτωση δεν φάνηκε να επηρεάζεται σημαντικά η διάρκεια ζωής των ενήλικων απογόνων του παρασιτοειδούς. Στο δεύτερο μέρος ελέγχθηκε η δυνατότητα εξαπόλυσης ενήλικων παρασιτοειδών στην αποθήκη, σε συνδυασμό ή όχι με το Β401. Έγινε εξαπόλυση 5 ζευγαριών παρασιτοειδών, ενώ η δοσολογία που χρησιμοποιήθηκε για το σκεύασμα ήταν 1ml ανά πλαίσιο. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η εξαπόλυση των παρασιτοειδών είχε υψηλή αποτελεσματικότητα που έφτασε το 100% όπως και στην συνδυασμένη χρήση. Το σκεύασμα από μόνο του είχε αποτελεσματικότητα που οριακά ξεπέρασε το 50% ενώ ο μάρτυρας είχε θνησιμότητα 6%. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και στον έλεγχο της καταστροφής της επιφάνειας των πλαισίων και της μείωσης του βάρους τους. Έτσι, μεγαλύτερη καταστροφή (55%) και μείωση βάρους (40%) υπήρχε στο μάρτυρα, ενώ μικρότερη καταστροφή (4%) και μείωση του βάρους (3%) παρατηρήθηκε στην συνδυασμένη δράση του παρασιτοειδούς και του σκευάσματος. 7

8 Abstract In recent years, the use of biological pesticides is considered to be an alternative and effective method of controlling stored product pests. However, the research on possible adverse effects of those pesticides on beneficial insects is limited. The aim of this study was to investigate the effects of sublethal doses of Β401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai)(ld 10, LD 30, LD 50 LD 70 ) and several hours of exposure of the host, on survival, fecundity, developmental time and adult longevity of Bracon brevicornis (Hymenoptera: Braconidae) parasitizing larvae of Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). According to the results, high mortality was observed in larvae of Bracon brevicornis, developed on larvae of Galleria mellonella which were previously fed to artificial diet impregnated with sublethal doses of B401. Specifically, the mortality of the larval stages of the parasitoid reached 88% at LD 70, 80% at LD 50, 74% at LD 30 and at LD 10 significantly higher compared to the control (35%). As for fecundity of Bracon brevicornis, no significant differences were observed between treatments and control, as females oviposited from 360 to 422 eggs during their lifespan. Similarly, developmental time of larval instars of Bracon brevicornis did not seem to be influenced by the exposure of the host larvae to B401, as it remained at the same levels in the different treatments and the control. Adult longevity of both male and female individuals of the parasitoid was significantly lower in sublethal doses of B401, compared to the control. Specifically, male individuals of Bracon brevicornis developed on larvae of Galleria mellonella which were exposed to the sublethal dose of LD 50, had a significantly shorter life span (26 days), compared to those developed on the control (36 days). Correspondingly, adult longevity of female parasitoids that were developed under the same conditions (LD 50 ) was 37 days, significantly lower compared to the control (45 days). As for the various exposure times of the host, there was observed a difference among the treatments with higher larval survival rates at 6 hours and lower at 24 hours, while in this case did not appear to affect significantly the lifetime of the adult offspring parasitoid. In the second part of this study, the potential of releasing adult parasitoids in the storeroom, alone or in combination with B401 was tested. For this purpose, 5 pairs of parasitoids were released in boxes filled with waxpaper. The dosage used in the formulation was 1 ml per frame. The results showed that the release of parasitoids had 8

9 high efficiency, which reached 100% in the combined use with B401. The efficacy of B401 alone was 50%, while the control mortality was 6%. Similar results were observed in the percentage of destruction of the surface and the reduction of the weight of the frames. Thus, bigger damage (55%) and weight decrease (40%) was observed in the control compared to the combined action of the parasitoid and B401 (4% damage of the surface and 3% weight reduction). 9

10 Κεφάλαιο 1: Γενική εισαγωγή 1.1. Φυσικοί εχθροί Είναι σπάνιο να υπάρχουν οργανισμοί χωρίς φυσικούς εχθρούς. Οι φυσικοί εχθροί έχουν τη μοναδική ιδιότητα να αλληλεπιδρούν με τους πληθυσμούς της λείας ή του ξενιστή τους και να τους διατηρούν σε χαμηλότερα επίπεδα απ ότι θα απαντιόνταν χωρίς την παρουσία τους. Κάποια είδη φυσικών εχθρών είναι αποτελεσματικά σε εξαιρετικά χαμηλές πυκνότητες λείας ή ξενιστή ενώ άλλα σε υψηλές Φυσικοί εχθροί εντόμων Δεν έχει εκτιμηθεί με ακρίβεια ο συνολικός αριθμός των εντόμων που είναι φυσικοί εχθροί άλλων εντόμων. Υπολογίζεται ότι υπάρχουν εκατομμύρια είδη εντόμων, συμπεριλαμβανομένων και των εντόμων φυσικών εχθρών. Εκτιμάται επίσης ότι έχει βρεθεί και ταυτοποιηθεί μόνο το 15% των υπαρχόντων ειδών που αποτελούν φυσικούς εχθρούς εντόμων (Debach and Rosen 1991). Βασιζόμενοι σε μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί με φυσικούς εχθρούς εντόμων που είναι κύριοι εχθροί καλλιεργειών, φαίνεται ότι τα περισσότερα είδη εντόμων που τρέφονται πάνω σε φυτά έχουν περισσότερους από ένα φυσικούς εχθρούς. Μερικά είδη εντόμων έχουν πάνω από 100 καταγεγραμμένους εχθρούς. Πολλοί φυσικοί εχθροί επιτίθενται σε διαφορετικά είδη λείας ή ξενιστή ενώ άλλοι είναι πιο εξειδικευμένοι. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα δεδομένα, θα μπορούσε να εκτιμηθεί ότι υπάρχουν πιθανώς τόσα εντομοφάγα έντομα όσα είναι και τα είδη εντόμων που αποτελούν τη λεία ή τον ξενιστή τους, δηλαδή αρκετά εκατομμύρια είδη φυσικών εχθρών (Debach and Rosen 1991). Οποιοσδήποτε οργανισμός που τρέφεται με έναν άλλο οργανισμό είναι, εξ ορισμού, φυσικός εχθρός. Στη βιολογική καταπολέμηση, οι φυσικοί εχθροί αναφέρονται ως παράσιτα, παρασιτοειδή, αρπακτικά ή παθογόνα. Αποτελεσματικός βιολογικός έλεγχος μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση οργανισμών από οποιαδήποτε από αυτές τις ομάδες, αλλά τα σημαντικότερα θεωρούνται τα παρασιτοειδή, με τα αρπακτικά να έρχονται δεύτερα σε σημασία. 10

11 Το παράσιτο (parasite) προσβάλλει κατά κανόνα ένα μόνο άτομο του ξενιστή του, το οποίο εξασθενίζει χωρίς όμως να το σκοτώνει. Αντίθετα, το παρασιτοειδές (parasitoid) καταστρέφει ζωτικά όργανα και ιστούς του ξενιστή ώστε τελικά ο ξενιστής πεθαίνει. Για αυτό το λόγο στη βιολογική καταπολέμηση χρησιμοποιούνται κυρίως παρασιτοειδή εντομοφάγα έντομα και όχι παράσιτα (Τζανακάκης 1995). Τόσο τα παρασιτοειδή όσο και τα αρπακτικά είναι ζωικοί οργανισμοί που τρέφονται με άλλους ζωικούς οργανισμούς, αλλά το παρασιτοειδές ολοκληρώνει την ανάπτυξή του σε έναν μόνο ξενιστή ενώ το αρπακτικό καταναλώνει αρκετά (ή πολλά) άτομα λείας κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής του. Εντούτοις, όπως συμβαίνει με πολλούς άλλους όρους, αυτή η διάκριση δεν είναι πάντα ξεκάθαρη, καθώς πολλά είδη φυσικών εχθρών παρουσιάζουν χαρακτηριστικά τόσο του παρασιτοειδούς όσο και του αρπακτικού. Τέτοιο παράδειγμα αποτελεί το Υμενόπτερο Scutellista cyanea. Αυτός ο συχνά απαντώμενος φυσικός εχθρός κοκκοειδών αναπτύσσεται συνήθως ως αρπακτικό αυγών, με τις προνύμφες του να καταναλώνουν εκατοντάδες αυγών του κοκκοειδούς αλλά παράλληλα αν δεν υπάρχουν τα αυγά μπορεί επίσης να αναπτυχθεί ως παρασιτοειδές του ίδιου εντόμου (Lampson and Morse 1992). Επίσης, πολλά είδη Υμενοπτέρων, που αναπτύσσονται στα προνυμφικά τους στάδια ως παρασιτοειδή, τρέφονται ως ενήλικα με τον αιμόλεμφο των ξενιστών τους, τον οποίο λαμβάνουν με νύγμα του ξενιστή με τον ωοθέτη τους. Αυτή η τροφική δραστηριότητα των ενηλίκων είναι πιθανό να προκαλέσει μεγαλύτερη θνησιμότητα των ξενιστών από ότι ο παρασιτισμός (Jervis and Kidd 1986). 11

12 1.3 Παρασιτοειδή έντομα Σημασία των παρασιτοειδών Είναι διαδεδομένα σε όλα σχεδόν τα οικοσυστήματα, είναι σύμμαχοι του ανθρώπου ενάντια σε εχθρούς αγρών και δασών. Υπάρχουν δύο κύριες κατηγορίες βιολογικής καταπολέμησης με τα παρασιτοειδή: η κλασσική και η inundative. Στην κλασσική βιολογική καταπολέμηση ένα παρασιτοειδές απελευθερώνεται σε μια περιοχή για να ελέγξει έναν εχθρό. Κανονικά, ο εχθρός δεν είναι γηγενές είδος που έχει τυχαία εισαχθεί σε μια νέα περιοχή, και το παρασιτοειδές παρασιτεί τον εχθρό σε μια περιοχή προέλευσής του. Το παρασιτοειδές εξαπολύεται μία ή περισσότερες φορές μέχρι να εγκατασταθεί. Αν και μόνο το 10-20% των προσπαθειών είναι επιτυχημένο, έχουν σημαντική επίδραση στον έλεγχο των εχθρών και τα οφέλη από την προστασία της καλλιέργειας είναι πολλαπλάσια από το κόστος εφαρμογής του προγράμματος της βιολογικής καταπολέμησης. Στη δεύτερη κατηγορία, inundative, μεγάλος αριθμός παρασιτοειδών ελευθερώνεται σε μια καλλιέργεια για την αντιμετώπιση ενός εχθρού. Οι εφαρμογές γίνονται πολύ συχνά, αλλά δεν αποτελεί στόχο η μακροπρόθεσμη εγκατάστασή του. Στην πραγματικότητα το παρασιτοειδές δρα ως βιολογικό εντομοκτόνο. Η κατηγορία αυτή χρησιμοποιείται σήμερα σε δύο διαφορετικές καταστάσεις. Η πρώτη είναι όταν η εργασία είναι σχετικά φθηνή, ώστε το κόστος μαζικής εκτροφής δεν είναι πολύ μεγάλο. Η δεύτερη αφορά σε καλλιέργειες σε κλειστούς χώρους, π.χ. θερμοκήπια, οι οποίες έχουν μεγάλη αξία. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η καταπολέμηση του αλευρώδη στην τομάτα. Η inundative βιολογική καταπολέμηση, ευνοείται σε αυτές τις περιπτώσεις εξαιτίας της μειούμενης επίδρασης από τα υπολείμματα των φαρμάκων και εξαιτίας της γενικότερης ανάγκης να μειωθούν οι εισροές φαρμάκων, ώστε να μην διαταράσσεται η επικονίαση μέσω των εντόμων (Godfray 1994) Βιολογικά χαρακτηριστικά και ορισμοί Τα περισσότερα έντομα που παρασιτούν άλλα έντομα είναι protelean παρασιτοειδή, δηλαδή παρασιτούν μόνο τα προνυμφικά στάδια και ζουν εκτός του 12

13 ξενιστή τους ως ενήλικα. Καταναλώνουν συνήθως όλο ή το μεγαλύτερο μέρος του σώματος του ξενιστή και έπειτα νυμφώνονται, είτε εσωτερικά είτε εξωτερικά του ξενιστή τους. Το ενήλικο παρασιτοειδές εξέρχεται από τις νύμφες και αρχίζει την επόμενη γενεά ψάχνοντας νέους ξενιστές να αποθέσει τα αυγά του. Τα περισσότερα ενήλικα παρασιτοειδή χρειάζονται τροφή όπως μελίτωμα, νέκταρ ή γύρη για την επιβίωση και αναπαραγωγή τους ενώ άλλα τρέφονται με τον αιμόλεμφο του ξενιστή τους. Επίσης, μερικά ενήλικα παρασιτοειδή χρειάζονται νερό για την επιβίωσή τους. Μπορεί να έχουν μια γενεά (univoltine) σε μια αντίστοιχη γενεά του ξενιστή ή δύο ή περισσότερες γενεές (multivoltine) σε ένα ξενιστή. Ο βιολογικός κύκλος είναι συνήθως σύντομος, κυμαινόμενος από 10 ημέρες έως 4 εβδομάδες αναλόγως της εποχής που αναπτύσσονται τα παρασιτοειδή. Εντούτοις, μερικά απαιτούν ένα έτος ή περισσότερο, εάν ο ξενιστής τους έχει μια μόνο γενεά το έτος. Τα παρασιτοειδή μπορούν να ταξινομηθούν με πολλούς τρόπους. Όσον αφορά στο εύρος ξενιστών τους, τα παρασιτοειδή έντομα ανάλογα με το εύρος των ξενιστών που παρασιτούν διακρίνονται σε μονοφάγα, ολιγοφάγα και πολυφάγα. Τα μονοφάγα είδη παρασιτοειδών παρασιτούν μόνο ένα είδος ξενιστή, ενώ τα ολιγοφάγα περιορίζονται μόνο σε στενά συγγενικά είδη ξενιστών. Τα πολυφάγα είδη παρασιτοειδών παρασιτούν είδη ξενιστών που δεν είναι συγγενή μεταξύ τους (Godfray and Hassell, 1988). Μια κοινή διάκριση είναι μεταξύ εκτοπαρασιτοειδών, τα οποία τρέφονται πάνω στο ξενιστή τους, και ενδοπαρασιτοειδών, τα οποία αναπτύσσονται εσωτερικά του ξενιστή τους. Ορισμένα είδη μπορεί αρχικά να αναπτύσσονται ως ενδοπαρασιτοειδή, να εξέλθουν αργότερα από τον ξενιστή τους και να συνεχίσουν να τρέφονται απ αυτόν εξωτερικά ενώ άλλα είδη μπορεί να ξεκινήσουν το βιολογικό τους κύκλο ως εκτοπαρασιτοειδή και να εισέλθουν αργότερα στον ξενιστή. Τα εκτοπαρασιτοειδή αναπτύσσονται συχνά σε ξενιστές που ζουν σε προστατευμένες περιοχές - μια προνύμφη σε ένα σωρό φύλλων ή μια στοά, νύμφες σε ένα κουκούλι κ.λ.π.- όπου είναι λιγότερο πιθανό να απομακρυνθούν και να χάσουν τον ξενιστή τους. Πολλά είδη εκτοπαρασιτοειδών νύσσουν και παραλύουν τον ξενιστή τους πριν αποθέσουν τα αυγά τους. Τα ενδοπαρασιτοειδή από την άλλη προστατεύονται συνήθως μέσα στο σώμα του ξενιστή, αλλά η αναπνοή σε υγρό μέσο απαιτεί ειδικές προσαρμογές των παρασιτοειδών. Ορισμένες ενδοπαρασιτικές προνύμφες μπορούν να 13

14 λάβουν άμεσα το οξυγόνο από τα υγρά του σώματος του ξενιστή. Άλλες προνύμφες λαμβάνουν τον εξωτερικό αέρα με την ένωση των τραχειών τους με τις τραχείες του ξενιστή τους, όπως πολλά Δίπτερα της οικογένειας Tachinidae, ή μέσω του προεξέχοντα μίσχου των αυγών τους, όπως τα παρασιτοειδή που ανήκουν στην οικογένεια των Encyrtidae. Πολλά ενδοπαρασιτοειδή μουμιοποιούν τους ξενιστές τους, μόλις ολοκληρώσουν την προνυμφική τους ανάπτυξη. Αυτό είναι χαρακτηριστικό σε παρασιτισμένες αφίδες, των οποίων το δερμάτιο εκτείνεται και γίνεται σκληρό με χρώμα άχυρου. Επιπλέον, τα ενδοπαρασιτοειδή είναι πιο εξειδικευμένα ως προς τον ξενιστή σε σχέση με τα εκτοπαρασιτοειδή και η διάρκεια ζωής των ενηλίκων είναι μεγαλύτερη σε σύγκριση με αυτή των ενηλίκων των εκτοπαρασιτοειδών (Tobias 1967, Câpek 1970). Τόσο τα εκτοπαρασιτοειδή όσο και τα ενδοπαρασιτοειδή μπορεί να είναι είτε μονήρη (solitary), όταν αναπτύσσεται μόνο μια προνύμφη παρασιτοειδούς ανά ξενιστή, είτε αγελαία (gregarious), όταν αναπτύσσονται περισσότερες από μια προνύμφες παρασιτοειδούς στον ίδιο ξενιστή (από δύο έως μερικές χιλιάδες άτομα), αλλά κι αυτό δεν είναι πάντα ξεκάθαρο, καθώς πολλά είδη μπορεί να αναπτυχθούν ως solitary σε έναν μικρόσωμο ξενιστή και ως gregarious σε έναν μεγαλύτερο. Μια ακραία περίπτωση της υποχρεωτικής gregarious ανάπτυξης είναι ορισμένα πολυεμβρυονικά είδη, στα οποία ένα αυγό μπορεί να δώσει αρκετούς έως εκατοντάδες όμοιους απογόνους. Αγελαία ανάπτυξη πρέπει να διακρίνεται από την περίπτωση του υπερπαρασιτισμού (superparasitism), όπου ένας ξενιστής παρασιτείται από περισσότερα του ενός παρασιτοειδή συγκεκριμένου είδους, με αποτέλεσμα αυτά να μην μπορούν να αναπτυχθούν επιτυχώς επάνω του. Σε τέτοιες περιπτώσεις, ο ενδοειδικός ανταγωνισμός οδηγεί συνήθως στο θάνατο των υπεράριθμων παρασιτοειδών ή στην εμφάνιση μικρών, παραμορφωμένων ενηλίκων ή στο θάνατο όλων των ανταγωνιστών. Τα παρασιτοειδή είναι σε θέση να ξεχωρίσουν τους υγιείς από τους παρασιτισμένους ξενιστές και αποφεύγουν συνήθως, τουλάχιστον ως ένα βαθμό, να ωοτοκήσουν σε ήδη παρασιτισμένους ξενιστές. Αυτό μπορεί να περιλαμβάνει το «μαρκάρισμα» ενός παρασιτισμένου ξενιστή με διάφορα μηχανικά ή χημικά μέσα. Μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει η δυνατότητα να αποφευχθεί ο υπερπαρασιτισμός μέσω της μάθησης των εντόμων και αυτό βελτιώνεται όσο το θηλυκό παρασιτοειδές αποκτά «εμπειρία» (Van Lenteren and Bakker 1975). 14

15 Ομοίως, ο πλειοπαρασιτισμός (multiparasitism), όταν δηλαδή ένας ξενιστής παρασιτείται από παρασιτοειδή που ανήκουν σε διαφορετικά είδη, συνήθως οδηγεί στο θάνατο μερικών ή όλων των ανταγωνιστών-παρασιτοειδών. Τα παρασιτοειδή επίσης διακρίνονται στα κοινοβιοτικά (koinobiont) (από τις ελληνικές λέξεις «κοινός» και «βίος»), δηλαδή αυτά που εξελίσσονται σε ξενιστές που συνεχίζουν να τρέφονται και να αναπτύσσονται για ένα διάστημα και στα ιδιοβιοτικά (idiobiont) (από τις ελληνικές λέξεις «ίδιος» και «βίος»), δηλαδή αυτά που θανατώνουν τον ξενιστή τους αμέσως μετά ή πριν τον παρασιτισμό και δεν επιτρέπουν την περαιτέρω ανάπτυξή του. Όλα τα προνυμφικά και νυμφικά στάδια των εντόμων υπόκεινται σε επίθεση από τα παρασιτοειδή. Συνεπώς, μερικά είδη είναι παρασιτοειδή αυγών, άλλα είναι παρασιτοειδή προνυμφών και άλλα είναι παρασιτοειδή νυμφών. Κάποια είδη είναι παρασιτοειδή αυγών-προνυμφών, τα οποία ωοτοκούν στο αυγό του ξενιστή τους αλλά ολοκληρώνουν την ανάπτυξή τους στην προνύμφη ενώ άλλα είναι παρασιτοειδή προνυμφών-νυμφών ή παρασιτοειδή αυγών-νυμφών. Τα ενήλικα έντομα παρασιτούνται λιγότερο συχνά, αν και ορισμένα Υμενόπτερα και Δίπτερα παρασιτοειδή επιτίθενται σε ενήλικα Κολεόπτερα, μυρμήγκια ή μέλισσες. Παρασιτισμός μπορεί να συμβεί σε οποιοδήποτε τροφικό επίπεδο μιας τροφικής αλυσίδας. Κατά συνέπεια, πολλά παρασιτοειδή πρώτου βαθμού, που αναπτύσσονται σε ένα φυτοφάγο ξενιστή, παρασιτούνται με τη σειρά τους από τα υπερπαρασιτοειδή (hyperparasites), τα οποία είναι είτε δευτέρου βαθμού (αναπτύσσονται σε ένα αρασιτοειδές πρώτου βαθμού) είτε τρίτου βαθμού (αναπτύσσονται σε ένα υπερπαρασιτοειδές δευτέρου βαθμού), ή ακόμα και τετάρτου βαθμού κοκ. Τα υπερπαρασιτοειδή των βλαβερών ειδών μπορεί να εμποδίσουν την ευεργετική δράση των παρασιτοειδών πρώτου βαθμού και γι αυτό διαχωρίζονται προσεκτικά σε χώρους καραντίνας σε όλα τα βιολογικά προγράμματα εισαγωγής φυσικών εχθρών (Sullivan 1987). Τα παρασιτοειδή μπορούν επίσης να ταξινομηθούν σύμφωνα με τα σημεία του σώματος του ξενιστή στα οποία αποθέτουν τα αυγά τους ή σπανιότερα τις προνύμφες τους. Τα περισσότερα ενδοπαρασιτοειδή εναποθέτουν τα αυγά τους μέσα στον ξενιστή, είτε ελεύθερα στη σωματική κοιλότητα είτε σε συγκεκριμένα όργανα, όπως το έντερο, 15

16 ένα συγκεκριμένο μυ ή γάγγλιο νεύρων είτε προσκολλώνται στο εσωτερικό τοίχωμα του σώματος. Άλλα ενδοπαρασιτοειδή και τα περισσότερα εκτοπαρασιτοειδή αποθέτουν τα αυγά τους εξωτερικά επάνω στον ξενιστή, μερικές φορές επί ενός χαρακτηριστικού σημείου στο σώμα του. Όταν ο ξενιστής είναι εκτεθειμένος, το παρασιτοειδές μπορεί να κολλήσει ή να ενσωματώσει τα αυγά στον εξωσκελετό του, ενώ όταν ο ξενιστής βρίσκεται προφυλαγμένος σε μια στοά, ένα κουκούλι κ.λπ., το παρασιτοειδές μπορεί απλά να γεννήσει τα αυγά του πάνω ή κοντά του, συχνά παραλύοντας τον πριν ή κατά την απόθεση των αυγών. Επίσης, υπάρχουν παρασιτοειδή που αποθέτουν τα αυγά ή τις προνύμφες τους μακριά από τους ξενιστές τους. Ορισμένα Υμενόπτερα και Δίπτερα της οικογένειας Tachinidae γεννούν τα πολυάριθμα αυγά τους επάνω στα φυτά με τα οποία τρέφονται οι ξενιστές τους. Όταν ένα τέτοιο αυγό λαμβάνεται από τον ξενιστή μέσω της τροφικής δραστηριότητας, εκκολάπτεται στην πεπτική οδό και η προνύμφη κατόπιν εισχωρεί μέσω του εντέρου στη σωματική κοιλότητα του ξενιστή, όπου συνεχίζει να αναπτύσσεται ως παρασιτοειδές πρώτου βαθμού. Αλλά οι πιο σύνθετοι βιολογικοί κύκλοι παρουσιάζονται στα παρασιτοειδή στα οποία η προνύμφη πρώτου σταδίου, κι όχι το ενήλικο θηλυκό, είναι αυτή που έχει ως ρόλο τον εντοπισμό του ξενιστή. Τα αυγά τέτοιων ειδών αποτίθενται και εκκολάπτονται επάνω στα φυτά και οι προνύμφες κατόπιν αναμένουν ή αναζητούν ενεργά έναν κατάλληλο ξενιστή. Προφανώς, οι περισσότεροι απόγονοι μπορεί να πεθάνουν εξαιτίας της μη έγκαιρης εύρεσης κατάλληλου ξενιστή, αλλά αυτό αντισταθμίζεται συνήθως από την τεράστια ωοπαραγωγή, μέχρι αρκετές χιλιάδες αυγά ανά θηλυκό. Στα περισσότερα παρασιτικά είδη και τα δύο φύλα αναπτύσσονται με παρόμοιο τρόπο. Εντούτοις, σε ορισμένα Υμενόπτερα της οικογένειας Aphelinidae, ο βιολογικός κύκλος του αρσενικού διαφέρει εμφανώς από αυτόν του θηλυκού. Ενώ τα θηλυκά αναπτύσσονται σε όλη τη διάρκεια της ανάπτυξής τους ως ενδοπαρασιτοειδή πρώτου βαθμού κοκκοειδών ή αλευρωδών, τα αρσενικά μπορούν να αναπτυχθούν ως εκτοπαρασιτοειδή πρώτου βαθμού των ίδιων ξενιστών, ή -σε άλλα είδη- ως ενδοπαρασιτοειδή των αυγών κάποιων ειδών Λεπιδοπτέρων ή ακόμα και ως υπερπαρασιτοειδή. Μια ακραία περίπτωση είναι αυτή των adelphoparasitic ή 16

17 autoparasitic ειδών, στα οποία το αρσενικό μπορεί να αναπτυχθεί ως παρασιτοειδές δευτέρου βαθμού εις βάρος ενός θηλυκού του ίδιου είδους (Viggiani 1984). Τέλος, υπάρχουν τα κλεπτοπαράσιτα (cleptoparasites), τα οποία χρειάζονται έναν παραλυμένο ξενιστή για την ανάπτυξη των απογόνων τους αλλά δεν είναι τα ίδια ικανά να προκαλέσουν την παράλυσή του, κι έτσι χρησιμοποιούν τους ξενιστές που παραλύονται από άλλα είδη, αφού πρώτα τα εξολοθρεύσουν. Όπως τα υπερπαρασιτοειδή, έτσι και τα είδη με κλεπτοπαρασιτικές συνήθειες πρέπει να αποφεύγονται στα προγράμματα βιολογικής καταπολέμησης. Οι κύριες ομάδες παρασιτοειδών που χρησιμοποιούνται για το βιολογικό έλεγχο των εντόμων είναι τα Υμενόπτερα. Οι πιο σημαντικές οικογένειες Υμενόπτερων παρασιτοειδών είναι τα Braconidae και Ichneumonidae. Είδη της οικογένειας Ichneumonidae είναι μεγαλύτερα σε μέγεθος σε σύγκριση με είδη της οικογένειας Braconidae. Ωστόσο, για την ταξινομική τους διάκριση απαιτείται η εξέταση των νευρώσεων της εμπρόσθιας πτέρυγας. Τα Braconidae έχουν ένα recurrent νεύρο, ενώ τα Ichneumonidae έχουν δύο, με αποτέλεσμα να είναι πιο άρτια η νεύρωση των πτερύγων τους (Câpek 1970, Tobias 1967) Εντοπισμός ξενιστή Τα παρασιτοειδή χρησιμοποιούν ερεθίσματα (cues) για τον εντοπισμό του ξενιστή. Αυτά είναι χημικά, οπτικά, αφής, θερμικά και ακουστικά. Τα φυτά που προσβάλλονται από φυτοφάγα εκλύουν ένα μείγμα πτητικών ουσιών, τα οποία προσελκύουν τα παρασιτοειδή. Τα φυτά αντιδρούν σε ορισμένα φυτοφάγα, τον σιελό τους και άλλες εκκρίσεις που μπορεί να είναι πολύ εξειδικευμένες, έτσι ώστε τα φυτά να έχουν επιλέξει το έντομο-προστάτη τους ενάντια στα φυτοφάγα. Συχνά τα θηλυκά παρασιτοειδή προσελκύονται από πτητικές χημικές ουσίες, που εκλύονται από το φυτό επάνω στο οποίο τρέφεται ο ξενιστής του παρασιτοειδούς. Άλλα αισθητήρια (sensory modalities) περιλαμβάνουν την όραση, εξερεύνηση με την αφή, εντοπισμός του παλμού του υποστρώματος και εντοπισμός θερμότητας. Οι αισθητήριες δομές τους βρίσκονται στις κεραίες, τους ταρσούς, τα στοματικά μόρια και στον ωοθέτη (Johnson 2001). Αρκετά παρασιτοειδή έλκονται από τα αποχωρήματα των φυτοφάγων, από πτητικές 17

18 ουσίες που σχετίζονται με εκκρίσεις από τους σιελογόνους και γναθικούς αδένες. Μερικοί ξενιστές έχουν συμβιωτική σχέση με άλλους οργανισμούς οι οποίοι προσελκύουν τα παρασιτοειδή. Από την άλλη οι ξενιστές χρησιμοποιούν διάφορες μεθόδους, όπως μιμιτισμός, ακινησία, διατήρηση εκπομπής χημικών ουσιών σε σταθερό επίπεδο. Τα παρασιτοειδή έλκονται από τις φερομόνες σύζευξης τόσο για την εξεύρεση ενήλικου ξενιστή, όσο και για αυτά που χρησιμοποιούν την παρουσία ενήλικου για τον εντοπισμό άλλων σταδίων ανάπτυξης του ξενιστή. Τα παρασιτοειδή γεννιούνται με έμφυτη ιεραρχία στην ανταπόκριση σε διάφορα ερεθίσματα, ωστόσο η ιεραρχία αυτή αλλάζει χάρη στην εμπειρία που αποκτούν (Godfray 1994). Τα παρασιτοειδή επιλέγουν εκείνο το είδος ξενιστή που θα εξασφαλίσει το μεγαλύτερο ποσοστό επιβίωσης των αυγών τους ή γενικότερα θα αυξήσει την προσαρμοστικότητα των απογόνων τους Αποδοχή ξενιστή και στρατηγική ωοτοκίας Αφού το παρασιτοειδές εγκατασταθεί στον ξενιστή, πρέπει να αποφασίσει αν ο ξενιστής έχει την ποιότητα ώστε να ωοτοκήσει σε αυτόν, ή να ψάξει για άλλον, πιθανόν χρησιμοποιώντας τον τρέχοντα μόνο ως τροφή, ώστε να μην σπαταλήσει αυγά. Όταν ο ξενιστής παρέχει αρκετή τροφή, τα gregarious παρασιτοειδή πρέπει να αποφασίσουν για τον αριθμό των αυγών που θα αποθέσουν ενώ επιπλέον τα Hymenoptera παρασιτοειδή πρέπει να αποφασίσουν κα για το φύλο των αυγών. Μόνο τα Hymenoptera παρασιτοειδή πρέπει να πάρουν αυτή την απόφαση, γιατί έχουν απλοδιπλοειδές γενετικό σύστημα, όπου από γονιμοποιημένα αυγά προέρχονται απόγονοι θηλυκά άτομα και από αγονιμοποίητα αρσενικά. Επιλέγοντας αν θα γονιμοποιήσει το αυγό ο γονέας επιλέγει το φύλο των απογόνων. Πριν την απόθεση αυγών, τα παρασιτοειδή καθορίζουν αν ο ξενιστής είναι κατάλληλος εξετάζοντάς τον εξωτερικά, και στην περίπτωση ενδοπαρασιτισμού εσωτερικά με τον ωοθέτη τους. Ακόμα και αν ένας ξενιστής μπορεί να υποστηρίξει την ανάπτυξη μιας προνύμφης παρασιτοειδούς μπορεί να μην είναι κατάλληλος αν οι απόγονοι που θα προκύψουν είναι πολύ μικρού μεγέθους. Τα παρασιτοειδή παράγουν περιορισμένο 18

19 αριθμό αυγών και αυξάνοντας την προσαρμοστικότητα τους, εξαντλούν τα αποθέματα των αυγών τους. Πολλά ενήλικα παρασιτοειδή τρέφονται από τον ξενιστή τους, αν και αυτό οδηγεί στην καταστροφή του ξενιστή, αλλά παρέχεται στο παρασιτοειδές ενέργεια και θρεπτικά συστατικά και έτσι παράγει περισσότερα αυγά. Τα παρασιτοειδή ρυθμίζουν το μέγεθος της ωοπαραγωγής ανάλογα με το μέγεθος των διαθέσιμων πόρων και αποθέτουν αυγά ανάλογα με το μέγεθος του ξενιστή (Godfray 1994) Υμενόπτερα Γενικά Η τάξη Υμενόπτερα περιλαμβάνει πολύ μεγάλο αριθμό ειδών, μεταξύ των οποίων περιλαμβάνονται μερμύγκια, μέλισσες και σφήκες όπως και λιγότερα γνωστά είδη όπως Chalcidae, Ichneumodidae, και διάφορα ξυλοφάγα Υμενόπτερα. Είναι κοινά σε όλες τις Ηπείρους, εκτός της Ανταρκτικής. Το μέγεθός τους ποικίλει από μικροσκοπικά είδη με μήκος ενηλίκων μικρότερο από 1mm μέχρι και 10cm. Είναι ολομετάβολα και έχουν δύο ζεύγη μεμβρανωδών πτερύγων. Οι Gauld και Bolton (1996) αναφέρουν τέσσερα στοιχεία της βιολογίας των Υμενοπτέρων τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξή τους. Αυτά είναι: 1. Ο μηχανισμός ωοτοκίας, που χρησιμοποιείται για εναπόθεση αυγών και για έκχυση του δηλητηρίου 2. Γονική παροχή για την προνύμφη (πχ η τροφή) 3. Επίδραση της τροφής στην ανάπτυξη των προνυμφών μέχρι το στάδιο της νύμφης και 4. Απλο-διπλοειδής καθορισμός του φύλου. Η πλειοψηφία τους παρουσιάζει αρρενοτόκο παρθενογένεση. Τα ενήλικα τρέφονται με νέκταρ, μελιτώδεις εκκρίσεις και άλλες ζαχαρούχες ενώσεις, ενώ η προνύμφη τρέφεται με φυτά, μύκητες, ενώ άλλες τρέφονται με ζωικούς οργανισμούς ως 19

20 άρπαγες ή παρασιτοειδή. Η προνύμφη των μελισσών τρέφεται από τη γύρη που συλλέγεται και αποθηκεύεται από το ενήλικο θηλυκό. Ο ωοθέτης εξειδικεύεται στο να εναποθέτει αυγά επάνω ή εντός του φυτού ή άλλων αρθροπόδων που αποτελούν και την πηγή τροφής για την προνύμφη. Επίσης μερικά είδη Υμενοπτέρων παρουσιάζουν κοινωνική συμπεριφορά (Johnson 2001) Ταξινόμηση Τα Υμενόπτερα χωρίζονται σε δύο μεγάλες υποτάξεις, τα Symphyta και τα Apocrita. Τα πρώτα περιλαμβάνουν φυτοφάγα και ξυλοφάγα Υμενόπτερα όπου οι προνύμφες καταναλώνουν φυτικούς ιστούς και μύκητες, τρεφόμενες σε φύλλα ή άνθη ή μέσα σε όγκους που παράγονται στα φύλλα. Στα Apocrita το πρώτο άρθρο της κοιλίας είναι ενωμένο και ενιαίο με το θώρακα και χωριστό από τα υπόλοιπα τμήματα της κοιλίας. Η προνύμφη είναι γενικά ακίνητη και απλή στη δομή, τρέφεται από άλλα αρθρόποδα, περιλαμβάνοντας αρπακτικά είδη των οποίων η προνύμφη τρέφεται σε διάφορα είδη λείας και παρασιτοειδή των οποίων η προνύμφη τρέφεται από ένα άτομο του ξενιστή (Johnson 2001). Η τάξη των Υμενοπτέρων περιλαμβάνει 19 υπεροικογένειες και 95 οικογένειες. Οι υπεροικογένειες Tenthredinoidea, Megalodontoidea, Cephoidea και Xyeloidea περιλαμβάνουν τα φυτοφάγα Υμενόπτερα. Τα ξυλοφάγα Υμενόπτερα αποτελούντε από τέσσερεις οικογένειες των Siricoidea. Τα Apocrita περιλαμβάνουν μερικές υπεροικογένειες παρασιτοειδών: τις Trigonalyoidea, Ceraphronoidea, Evanioidea, Megalyroidea και Stephanoidea. Οι υπεροικογένειες Chalcidoidea, Cynipoidea, Ichneumonoidea, Proctotrupoidea και Platygastroidea περιλαμβάνουν την πλειοψηφία των παρασιτοειδών. Η οικογένεια Ichneumonidae περιέχει περίπου γνωστά είδη. Οι υπόλοιπες τέσσερεις υπεροικογένειες Chrysidoidea, Vespoidea, Apoidea και Sphecoidea περιλαμβάνουν τα Αculeata, ή stinging Hymenoptera. Η υπεροικογένεια Chrysidoidea περιλαμβάνει μικρές οικογένειες παρασιτοειδών, η Formicοidae τα μυρμήγκια η Vespoidea περιλαμβάνει τις σφήκες, η Apoidea περιλαμβάνει τις μέλισσες και η Sphecoidea περιλαμβάνει ένα μεγάλο αριθμό από παρασιτικά Υμενόπτερα. 20

21 Η τάξη Hymenoptera εκτιμάται ότι περιλαμβάνει σχεδόν είδη. Οι μεγαλύτερες οικογένειες είναι οι: Ichneumonidae (περισσότερα από είδη), Braconidae (περίπου είδη), Formicidae ( είδη) και Sphecidae (8.000 είδη) (Johnson 2001) Αναπαραγωγή Τα Υμενόπτερα τα χαρακτηρίζει η αρρενοτόκος παρθενογένεση, ή απλοδιπλοειδής αναπαραγωγή, η οποία είναι πολύ σημαντική για την εξέλιξή τους. Οι απόγονοι προέρχονται από γονιμοποιημένα και μη-γονιμοποιημένα αυγά, τα πρώτα αναπτύσσονται σε διπλοειδή άτομα και είναι συνήθως θηλυκά, ενώ από τα δεύτερα προέρχονται απλοειδή αρσενικά. Τα συζευγμένα θηλυκά αποθηκεύουν τα σπερματοζωάρια στη σπερμοθήκη. Το θηλυκό έχει τη δυνατότητα να ελέγχει την απελευθέρωση των σπερματοζωαρίων δια μέσω του ωαγωγού (oviduct), ελέγχοντας έτσι το φύλο των απογόνων. Σε μερικά παρασιτοειδή το μέγεθος του ξενιστή μπορεί να επηρεάσει την απόθεση αυγών που θα δώσουν αρσενικά ή θηλυκά άτομα. Σε άλλες περιπτώσεις, η παρουσία και δεύτερου θηλυκού στον ξενιστή επηρεάζει την αναλογία φύλου. Άλλη μορφή παρθενογένεσης είναι η θηλυτόκος, όπου το θηλυκό δεν συζεύγνυται με το αρσενικό και τα αγονιμοποίητα αυγά δίνουν θηλυκούς απογόνους. Η θηλυτόκος παρθενογένεση προκαλείται από βακτηριακή μόλυνση, από βακτήρια του γένους Wolbachia. Μολύνσεις από τα συγκεκριμένα βακτήρια έχουν παρατηρηθεί σε μεγάλο αριθμό ειδών εντόμων και η οικολογική και εξελικτική σημασία της μόλυνσης είναι πολλή μεγάλη Συμπεριφορά ωοτοκίας Τα Υμενόπτερα είναι γνωστά ως νύσσοντα έντομα. Το κεντρί (κατασκευή τροποποιημένου ωοθέτη) είναι βασικό σε όλα τα Υμενόπτερα. Επειδή τα όργανα απόθεσης αυγών σχετίζονται με το θηλυκό, μόνο το θηλυκό μπορεί να νύσσει. Ο ωοθέτης αποτελείται από δύο ζεύγη προσαρτήσεων που επιμηκύνονται, τις γοναποφύσεις 21

22 ή βαλβίδες ωοτοκίας, που συνδέονται με το έβδομο και όγδοο κοιλιακό τμήμα. Οι γοναποφύσεις συνδέονται μεταξύ τους και λειτουργούν ως μία ενιαία μονάδα. Όταν δεν χρησιμοποιείται, ο ωοθέτης καλύπτεται από τις γονόπλακες. Ο ωοθέτης λειτουργεί επίσης για την παράλυση του ξενιστή και μαζί με το δηλητήριο χρησιμοποιούνται ως μέσο άμυνας των παρασιτοειδών (Johnson 2001) Παράγοντες Βιολογικής Καταπολέμησης Τα Υμενόπτερα θεωρούνται σημαντικοί παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης, καθώς, θανατώνοντας τον ξενιστή τους, μειώνουν τον πληθυσμό του. Έχουν τα εξής πλεονεκτήματα: 1. είναι εξειδικευμένα ως προς τους ξενιστές τους, 2. μπορούν να διατηρούν τον πληθυσμό τους σε σταθερά επίπεδα στη διάρκεια του χρόνου παρέχοντας συνεχή βιολογική καταπολέμηση, 3. παρασιτούν τους ξενιστές σε όλα τα περιβάλλοντα, ανεξαρτήτως της πολυπλοκότητάς τους 4. οι πληθυσμοί τους ακολουθούν αυτούς των ξενιστών τους, αυξάνονται όταν αυξάνουν οι πληθυσμοί του ξενιστή και μειώνονται όταν οι αντίστοιχοι των ξενιστών έχουν πέσει σε χαμηλά επίπεδα. Όταν ένας νέος εχθρός εισαχθεί σε μία περιοχή, αναπτύσσει πολύ γρήγορα μεγάλο πληθυσμό, απουσία παρασιτοειδούς. Τα προγράμματα βιολογικής καταπολέμησης περιλαμβάνουν την μελέτη του φυσικού περιβάλλοντος και των εχθρών των επιζήμιων εντόμων και την εισαγωγή τους στο περιβάλλον. Μερικά προγράμματα βιολογικής καταπολέμησης ήταν πολύ επιτυχημένα, επιτυγχάνοντας μακροπρόθεσμο έλεγχο των εχθρών των φυτών. Οι οικογένειες παρασιτοειδών Encyrtidae και Aphelinidae αποτελούν παραδείγματα επιτυχούς βιολογικής καταπολέμησης εντόμων Homoptera. 22

23 1.4.6 Braconidae Η οικογένεια Braconidae αποτελεί μία από τις πολυπληθέστερες σε αριθμό ειδών οικογένεια εντόμων. Εκτιμάται ότι αποτελείται από είδη. Είναι ευρέως εξαπλωμένη και αποτελεί την δεύτερη μεγαλύτερη οικογένεια των Υμενοπτέρων (Wharton and Van Achterberg, 2000). Η οικογένεια περιλαμβάνει περίπου 40 υποοικογένειες. Μελέτες για την ταξινόμησή τους έχουν γίνει από τον Van Achterberg (1993), τον Sharkey (1993) και τον Wharton et al (1997). Είναι ενδο- και εκτοπαρασιτοειδή προνυμφών εντόμων, ιδιαίτερα των Λεπιδοπτέρων, Κολεοπτέρων και Διπτέρων. Χρησιμοποιούνται παγκοσμίως στην βιολογική καταπολέμηση. Τα διάφορα είδη μπορούν να αναγνωριστούν από τα νεύρα στις πτέρυγες. Η εμφάνιση των πρώτων ειδών της οικογένειας χρονολογείται από την Κρητιδική (Rasnitsyn, 1983; Whitfield, 2002), διαφοροποιήθηκε στα τέλη της περιόδου αυτής, όταν εμφανίστηκαν τα ανθοφόρα φυτά και τα φυτοφάγα έντομα (Basibuyuk et al. 1999; Whitfield 2002, Belshaw et al 2000). Πολλά είδη εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τους ξενιστές τους και έτσι αποτελούν σημαντικά μέσα βιολογικής καταπολέμησης των εντόμων αυτών. Χρησιμοποιούνται επίσης ως μοντέλα για την μελέτη της επίδρασης ξενιστή παρασιτοειδούς. Παρασιτούν επίσης ενήλικα άτομα (ειδικά Ημίπτερα και Κολεόπτερα) και δύο είδη των υποοικογενειών Mesostoinae και Doryctinae σχηματίζουν κηκίδες (galls) στα φυτά (Austin and Dangerfield 1998) Περιγραφή Το μέγεθός τους ποικίλλει από 1mm έως 3-4cm σε μήκος (χωρίς να υπολογίζεται ο ωοθέτης στα θηλυκά, που σε μερικά είδη μπορεί να έχει μήκος όσο και το σώμα). Τα ενήλικα ωοτοκούν εντός, επάνω ή κοντά στο σώμα άλλων εντόμων και τα ανήλικα στάδιά τους συμπληρώνουν την ανάπτυξή τους εις βάρος των ξενιστών τους. Στην πλειοψηφία τους είναι πρωτογενή παρασιτοειδή άλλων εντόμων, κυρίως του προνυμφικού σταδίου τους (Κολεόπτερα. Λεπιδόπτερα, Ημίπτερα) όπως και μερικών ημιμετάβολων εντόμων (αφίδες, Heteroptera, Embiidina). Η οικογένεια περιλαμβάνει έκτο και ένδο-παρασιτοειδή τα οποία θανατώνουν τον ξενιστή τους, με τα τελευταία να 23

24 σχηματίζουν επεκτεινόμενες προσαρμογές για την ενίσχυση της επιβίωσης της προνύμφης στους ξενιστές (Stoltz and Vinson, 1979, Whitfield and Asgari, 2003). Κάποιες υποοικογένειες παρασιτούν και ενήλικα Ημιπτέρων και Κολεοπτέρων, και είδη των υποοικογενειών σχηματίζουν κηκίδες στα φυτά (Mesostoinae και Doryctinae) ( Austin and Dangerfield 1998) Bracon brevicornis (Wesmael) (Hymenoptera: Braconidae) Το εκτοπαρασιτοειδές Bracon brevicornis ανήκει στην τάξη των Υμενοπτέρων και στην οικογένεια Braconidae και περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1838 από τον Wesmael. Η ταξινομική κατάταξη είναι η εξής: (ITIS,1996) Πίνακας 1: Ταξινομική κατάταξη του Bracon brevicornis (Wesmael) Βασίλειο Φύλο Υποφύλο Κλάση Τάξη Υποτάξη Υπεροικογένεια Οικογένεια Animalia Arthropoda Hexapoda Insecta Hymenoptera Apocrita Ichneumonoidea Braconidae Γένος Bracon Fabricius, 1805 Είδος Bracon brevicornis Wesmael,

25 Μορφολογικά χαρακτηριστικά Το σώμα του ενηλίκου έχει μήκος 1,8-2,6 mm και το χρώμα του σώματος είναι από κίτρινο-καστανό μέχρι σκούρο καφέ ή μαύρο (Εικόνα 1). Το άνοιγμα πτερύγων είναι 1,9-2,6 mm. Η κεραία του θηλυκού έχει άρθρα και του αρσενικού άρθρα. Ο τροχαντήρας των οπίσθιων ποδιών αποτελείται από 2 άρθρα, οι πτέρυγές του έχουν 1 ή κανένα κλειστό κύτταρο. Το χρώμα του σώματος του ενηλίκου διαφέρει από ανοικτό κίτρινο σε μαύρο, ανάλογα με την θερμοκρασία ανάπτυξης και είναι ίδιο στην κοιλιακή και νωτιαία πλευρά. Τα γεννητικά όργανα του θηλυκού αποτελούνται από ένα ζευγάρι εκτεινόμενων γοναποφύσεων μαύρου χρώματος και ένος καστανού χρώματος κεντριού. Ο γεννητικός οπλισμός του αρσενικού αποτελείται από ένα εσωτερικό και ένα εξωτερικό ζεύγος δαγκανών. Τα θηλυκά κεντρίζουν την προνύμφη του ξενιστή από την οποία περιστασιακά τρέφονται και αποθέτουν τα αυγά τους. Τα αρσενικά είναι αδιάφορα για τις προνύμφες, αλλά παρουσιάζουν χαρακτηριστικές αντιδράσεις προς τα θηλυκά, όπως κάνοντας έντονες γρήγορες κινήσεις των πτερύγων, πλησιάζοντας στο σώμα τους και χτυπώντας με τις πτέρυγες και τις κεραίες κατά την διάρκεια της σύζευξης. Στα αρσενικά άτομα οι κεραίες είναι πιο μακριές από των θηλυκών, το οποίο αποτελεί χαρακτηριστικό για την διάκριση των δύο φύλων. Ένα δεύτερο χαρακτηριστικό διάκρισης των δύο φύλων είναι ο ωοθέτης με το κεντρί που διακρίνεται στο άκρο της κοιλίας των θηλυκών. Με αυτό πραγματοποιεί νύγματα και εγχείει το δηλητήριο κυρίως στην κοιλιακή περιοχή της προνύμφης, η οποία παραλύει σε 3-4 ώρες. Το αυγό είναι ελλειψοειδές και έχει τη τυπική μορφή των αυγών των Υμενοπτέρων (Εικόνα 2). Η προνύμφη είναι λευκή, άποδη και ακέφαλη. Η prepupa είναι ρόδινη και αρχίζει να υφαίνει το βομβύκιο για να νυμφωθεί. Η νύμφη τέλος περιβάλλεται από βομβύκιο (Εικόνα 3β). 25

26 Εικόνα 1: α) Αρσενικό Bracon brevicornis β) Θηλυκό Bracon brevicornis α β Εικόνα 3: Αυγά Bracon brevicornis α β Εικόνα 2:α) Προνύμφες Bracon brevicornis παρασιτούν προνύμφη Galleria mellonella β) Νύμφες Bracon brevicornis 26

27 Βιολογία Η διάρκεια ανάπτυξης επηρεάζεται σημαντικά από την θερμοκρασία. Σε ευνοϊκές θερμοκρασίες (25 ο C), η θνησιμότητα δεν επηρεάζεται από μικρές διακυμάνσεις της, όμως σε ακραίες θερμοκρασίες η θνησιμότητα αυξάνεται. Σε ευνοϊκές θερμοκρασίες, τα αυγά εκκολάπτονται σε δύο με τρεις ημέρες, η προνύμφη τρέφεται από το σώμα της προνύμφης του ξενιστή και φτάνει σε μήκος περίπου τα 5 mm. Με την ολοκλήρωση της ανάπτυξής της δημιουργεί μετάξινο βομβύκιο με ίνες από τους σιελογόνους αδένες. Το βομβύκιο τελικά περιβάλλει όλο το σώμα, με την πλευρά που εφάπτεται στο τριβλίο να αποτελείται από λιγότερες ίνες. Από το σημείο αυτό φαίνεται καθαρά η ανάπτυξη της νύμφης. Μετά από δύο με τρείς ημέρες η νύμφη αρχίζει να μεταμορφώνεται σε ενήλικο. Έτσι την δεύτερη ημέρα αρχίζουν να σχηματίζονται οι σύνθετοι οφθαλμοί ενώ την τρίτη οι κεραίες εμφανίζονται στην κοιλιακή πλευρά, στα αρσενικά πιο μακριές από των θηλυκών, το οποίο αποτελεί χαρακτηριστικό για την διάκριση των δύο φύλων. Ένα δεύτερο χαρακτηριστικό διάκρισης των δύο φύλο είναι ο ωοθέτης με το κεντρί που διακρίνεται στο άκρο της κοιλίας των θηλυκών. Το 1921 ξεκίνησαν μελέτες γενετικής, από τον Whiting που παρατήρησε ότι υπάρχουν τρείς τύποι ατόμων. α) Αρσενικά άτομα που προέρχονται από μη γονιμοποιημένα αυγά, τα οποία είναι απλοειδή, και εμφανίζουν χαρακτηριστικά της μητέρας. β) Τα θηλυκά προκύπτουν από γονιμοποιημένα αυγά. γ) Σε ορισμένες περιπτώσεις έχουν εμφανιστεί και διπλοειδή αρσενικά (Whiting 1921) Γεωγραφική κατανομή Το Bracon brevicornis είναι ένα κοσμοπολίτικο είδος το οποίο είναι γνωστό σε πολλές χώρες της Ευρώπης, Ασίας, Αφρικής, καθώς και στην Αμερική (Elzinga et al. 2007). Η εξάπλωση του παρασιτοειδούς φαίνεται στην εικόνα 4. Είναι διαδεδομένο στην Ευρώπη, Δυτική Αφρική, Ασία, Ινδία, Νότια Αφρική. Την δεκαετία του 1950, εισήχθη από την Ινδία στον Καναδά, τις Η.Π.Α. και το Μεξικό για την αντιμετώπιση εχθρών όπως του Pectinophora gossypiella και του Diatraea saccaralis. 27

28 Εικόνα 4: Γεωγραφική εξάπλωση του Bracon brevicornis Ξενιστές Είναι πολυφάγο έντομο, που προσβάλλει άτομα των οικογενειών Crambidae και Pyralidae στα αποθηκευμένα προϊόντα και στον αγρό (Van Achterberg and Walker, 1998). Μεταξύ των σημαντικότερων ξενιστών του περιλαμβάνονται τα Opisina arenosella Walker (Lepidoptera: Crytophasidae), Goniozus nephantidis (Hymenoptera: Bethylidae) (Venkatesan et al, 2009), Eublemma amabilis (Lepidoptera: Noctuidae) (Sharma et al, 2000), Chilo partellus Swinhoe (Lepidoptera: Pyralidae), Pectinophora gossypiella Saunders (Lepidoptera: Gelechiidae), Corcyra cephalonica Stainton (Lepidoptera: Pyralidae), Earias insulana (Lepidoptera: Noctuidae) (Srivastava et al, 1997), Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae), Spondoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Επίσης παρασιτεί την πυραλίδα των αλεύρων, Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae), το Plodia interpunctella (Lepidoptera: Pyralidae), την εφέστια των σύκων, Ephestia cautella Walker (Lepidoptera: Pyralidae) και το Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Ο Shenefelt (1978) παραθέτει 85 ξενιστές, συμπεριλαμβανομένου το Ephestia cautella Hubner (Lepidoptera: Noctuidae), Heliothis spp. (Lepidoptera: Noctuidae) και A. catalaunalis (Lepidoptera: Crambidae). Κάποιες καλλιέργειες προσελκύουν φυσικούς πληθυσμούς του Bracon brevicornis, όπως άνηθος, μαϊντανός, αγριαψιθιά, ζίννια, τριφύλλι, σόγια, ηλίανθος και κατιφές. 28

29 1.5. Αρθρόποδα Αποθηκευμένων προϊόντων Περί το 8000 π.χ ο άνθρωπος άρχισε να καλλιεργεί φυτά και να αποθηκεύει τα προϊόντα του. Έκτοτε τα έντομα αποβαίνουν επιζήμια στον άνθρωπο, τα κατοικίδια ζώα, τα καλλιεργούμενα φυτά και τα αποθηκευμένα γεωργικά προϊόντα. Μπορεί να υποτεθεί ότι μέχρι την αποθήκευση των προιόντων, τα έντομα αυτά διαβιούσαν σε φυσικά εξωτερικά περιβάλλοντα και στη συνέχεια μετακινήθηκαν μέσα στις αποθήκες όπου προσαρμόστηκαν και έγιναν έντομα αποθηκευμένων προιόντων (Ηλιόπουλος 2003). Με τον όρο έντομα αποθηκευμένων προιόντων χαρακτηρίζουμε τα αρθρόποδα εκείνα που προσβάλλουν εδώδιμα ή μη προϊόντα που βρίσκονται στη φάση της παραγωγής, της επεξεργασίας ή της αποθήκευσης τους. Η προσβολή αυτή μπορεί να γίνει αποκλειστικά στην αποθήκη, αλλά δεν είναι σπάνιες οι περιπτώσεις όπου η πρωτογενής προσβολή γίνεται στον αγρό και κατόπιν το αρθρόποδο συνεχίζει το βιολογικό του κύκλο στο αποθηκευμένο προϊόν. Τα είδη των διαφόρων αρθροπόδων που προσβάλλουν αποθηκευμένα προϊόντα ανέρχονται σε αρκετές εκατοντάδες και σύμφωνα με τον FAO οι απώλειες που έχουν οι λιγότερο ανεπτυγμένες χώρες σε κάθε είδους εδώδιμους σπόρους ανέρχοται σε περίπου 810εκ. τόνους ετησίως. Υπολογίζεται γενικά ότι τουλάχιστον το 10% της παγκόσμιας παραγωγής δημητριακών χάνεται κάθε χρόνο εξαιτίας τους. Χώρες όπως η Νιγηρία και η Αιθιοπία υπολογίζεται ότι χάνουν το 30% της παραγωγής τους σε καλαμπόκι από έντομα ενώ η Ιταλία αναφέρεται ότι χάνει το 5% της παραγωγής της σε δημητριακά. Οι κυριότεροι οργανισμοί που προσβάλλουν τα αποθηκευμένα γεωργικά προϊόντα είναι τα έντομα, τα ακάρεα, οι μύκητες, τα βακτήρια και τα τρωκτικά. Τα περισσότερα είδη εντόμων αποθηκευμένων προϊόντων ανήκουν στις τάξεις των Κολεόπτερων και Λεπιδοπτέρων ενώ κατά πολύ λιγότερα στις τάξεις των Διπτέρων, Υμενοπτέρων, Ψωκοπτέρων. Οι προσβολές αυτές αφορούν τόσο στην ποσοτική όσο και στην ποιοτική υποβάθμιση του προϊόντος από τους ίδιους τους εχθρούς αλλά και από δευτερογενείς μολύνσεις και προσβολές (Σταμόπουλος, 2008). Όπως όλα τα έμβια όντα έτσι και η μέλισσα είναι μπορεί να δεχθεί επίθεση σε όλα τα στάδια της ανάπτυξής του από διάφορους εχθρούς είτε άμεσα, όπως τα αρπακτικά, είτε έμμεσα, με τη διατάραξη της αποικίας με διάφορους τρόπους. 29

30 Οι εχθροί των μελισσών μπορούν να χαρακτηριστούν ως παράσιτα, αρπακτικά, ενοχλητικά ανάλογα με τη φύση της ζημίας τους και την αλληλεξάρτηση τους απο τις μέλισσες. Αυτή η διαφοροποίηση μερικές φορές δεν είναι ικανοποιητική, καθώς ο ίδιος εχθρός μπορεί συχνά να συμπεριφέρονται με διάφορους τρόπους και έτσι να δικαιολογεί την ένταξή του σε διαφορετικές ομάδες (Ben Hamida, 1999). Ένας σημαντικός εχθρός είναι τόσο στην κυψέλη αλλά κυρίως στις αποθήκες των κηρηθρών είναι το Gallerιa mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) κοινώς κηρόσκωρος Το έντομο Galleria mellonella L Γενικά Στην Ευρώπη και τις Ηνωμένες Πολιτείες, το Galleria mellonella εκτρέφεται εμπορικά για τις προνύμφες του και θεωρείτο ως χρήσιμο έντομο. Έκτος ότι οι προνύμφες του χρησιμοποιούνται ως δόλωμα για τα ψάρια, αποτελούν και ένα σημαντικό έντομο για πειραματισμό σε φυσιολογία, τοξικολογία και παθολογία (Nalini Ramarao et al 2012). Επίσης, μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως ξενιστές για τον πολλαπλασιασμό Διπτέρων και Υμενοπτέρων παράσιτοειδών (Morse και Nowogrodski, 1990). Για τους μελισσοκόμους σε όλο τον κόσμο όμως, ο κηρόσκωρος είναι σημαντικός εχθρός λόγω των σοβαρών ζημιών που μπορεί να προκαλέσει (Smith 1960, Singh 1962). Μπορεί να καταστρέψει ένα μεγάλο αριθμό κηρηθρών κάθε χρόνο, προσβάλλοντας το κερί στην αποθήκη. Αντίθετα, στις αποικίες μελισσών δεν κάνει μεγάλες ζημιές καθώς οι μέλισσες απομακρύνουν τις προνύμφες του. 30

31 Συστηματική κατάταξη Το Galleria mellonella ανήκει στην οικογένεια Pyralidae (Πίνακας 2), η οποία αποτελεί μια από τις πολυπληθέστερες σε είδη οικογένειες Λεπιδοπτέρων και περιλαμβάνει κάποιους από τους σημαντικότερους εχθρούς καλλιεργειών και αποθηκευμένων προϊόντων. Πίνακας 2: Συστηματική κατάταξη Galleria mellonella Βασίλειο Φύλο Κλάση Τάξη Οικογένεια Γένος Είδος Κοινή ονομασία Animalia Arthropoda Insecta Lepidoptera Pyralidae Galleria mellonella Κηρόσκωρος Μορφολογικά χαρακτηριστικά και βιολογία Ο κηρόσκωρος δραστηριοποιείται κυρίως τις βραδινές ώρες. Πετάει αναζητώντας διάφορες θέσεις για να αποθέσει τα αυγά του. Κυρίως αποθέτει ομάδες αυγών ( ) σε απροστάτευτες κηρήθρες μέσα στην κυψέλη ή σε κηρήθρες στην αποθήκη. Μπορεί, ακόμα, να τα αποθέσει και σε χαραμάδες και κοιλότητες της κυψέλης. 31

32 Τα αυγά (Εικόνα 6α) είναι αρκετά μικρά, χρώματος λευκού και κίτρινου. Εάν δεν απομακρυνθούν από τις μέλισσες, εκκολάπτονται μέσα σε 6-8 ημέρες και οι προνύμφες εξαπλώνονται μέσα στην κυψέλη. Το χρώμα των προνυμφών είναι λευκό Εικόνα 5: Ενήλικο Galleria mellonella προς κόκκινο και σκουραίνει όσο μεγαλώνουν και το μέγεθός τους είναι περίπου 30mm και μέγιστο βάρος τα 240mg. Οι προνύμφες τρέφονται κυρίως με μαύρο κερί (το μαύρο χρώμα υποδηλώνει ότι το κερί είναι αρκετά χρόνια μέσα στην κυψέλη), γιατί είναι πιο θρεπτικό διατροφικά, καθώς από τα χρόνια έχει εμπλουτιστεί με θρεπτικά στοιχεία. Επίσης, πολλές φορές καταναλώνουν νέκταρ και γύρη οπού πιθανόν υπάρχουν στα πλαίσια κηρήθρας. Η ανάπτυξη τους εξαρτάται άμεσα από τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος χώρου. Σε ιδανικές συνθήκες μπορούν να διπλασιάσουν το βάρος τους κάθε μέρα για τις πρώτες 10 ημέρες. Σε αντίθετη περίπτωση, όμως, όταν υπάρχει έλλειψη τροφής, μπορούν να επεκτείνουν τη διάρκεια ανάπτυξης τους μέχρι 6 μήνες. Μετά από 19 ημέρες η προνύμφη δημιουργεί ένα μετάξινο βομβύκιο και εισέρχεται στο στάδιο της νύμφης. Το χρώμα της μέσα στο μετάξινο βομβύκιο είναι κίτρινο έως κόκκινο και έχει μέγεθος 12-20mm. Ο αριθμός των προνυμφών μέσα στην κυψέλη μπορεί να φτάσει και τις 250. Μετά από 20 ημέρες το ενήλικο εξέρχεται από το βομβύκιο. Το ενήλικο έχει άνοιγμα πτερύγων μέχρι 30 mm και χρώμα γκρι με πορφυρόμαυρα περιθώρια (Εικόνα 5). Τα ενήλικα θηλυκά είναι μεγαλύτερα από τα αρσενικά (Morse 1978). Τα ενήλικα μπορούν να ζήσουν από 3 ημέρες μέχρι 1 μήνα, αλλά συνήθως τα θηλυκά μετά από 7 ημέρες πεθαίνουν στους 30 ο C (Nielsen and Brister, 1977) και δε χρειάζονται νερό και τρυφή. Μετά την έξοδο από το βομβύκιο, το θηλυκό είναι σε θέση να συζευχθεί σε 24 ώρες και να αρχίσει την ωοτοκία σύντομα (4-10 μέρες). Αποθέτει από 300 έως 800 αυγά (El Sawaf 1950) σε ένα διάστημα που διαρκεί από 3 32

33 μέχρι 30 μέρες Κατά τη διάρκεια του χειμώνα είτε επιβιώνουν μέσα στις κυψέλες που έχουν γόνο και η θερμοκρασία είναι υψηλή, είτε διαβιώνουν στις αποθήκες, είτε διαπαύουν στο στάδιο της προνύμφης μέσα στο κουκούλι. Πετάνε μόνο τις θερμές μέρες του χειμώνα (Nielsen and Brister 1977). Ο κηρόσκορος έχει αρκετές γενεές το έτος. Εικόνα 6: α) Αυγά Galleria mellonella α β) Προνύμφες Galleria mellonella β Ζημιές Οι ζημιές που προκαλούνται στο μελίσσι είναι σημαντικές. Ο κηρόσκωρος προσβάλλει κηρήθρες μέσα στην κυψέλη που δεν προστατεύονται από μέλισσες, ανοίγει στοές και τις επενδύει με ένα είδος μεταξιού, προκαλώντας έτσι έντονη ανησυχία σε αδύνατα μελίσσια και μερικές φορές λιποταξία. Η ευαισθησία της αποικίας προς επίθεση μπορεί να οφείλεται σε διάφορες αιτίες : υποσιτισμός, ασθένειες, απώλεια της βασίλισσας ή μεγάλης κλίμακας θνησιμότητα των εργατριών μελισσών που οφείλεται σε δηλητηρίαση από τα φυτοφάρμακα. Η μεγάλη ζημιά γίνεται σε κηρήθρες που αποθηκεύονται στις αποθήκες από τους μελισσοκόμους ή σε κενές κυψέλες που μένουν έξω κατά την διάρκεια του χειμώνα. Όπως προαναφέρθηκε ανοίγει στοές και τις επενδύει με ένα είδος μεταξιού, καταναλώνει μεγάλες ποσότητες κεριού, γύρης και μελιού αχρηστεύοντας έτσι τις κηρήθρες οι οποίες πλέον δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ξανά από τον μελισσοκόμο (Εικόνα 7 και 8). Ο κηρόσκωρος μπορεί επίσης να εμπλέκεται με μεταδοτικές ασθένειες, ιδιαίτερα με την 33

34 αμερικάνικη σηψηγονία (με την κατανάλωση μολυσμένων κηρηθρών). Στο μέσο έντερο του εντόμου συχνά φιλοξενούνται τα σπόρια του Paenibacillus larvae larvae, ο αιτιολογικός παράγοντας της αμερικάνικης σηψηγονίας. Τα σπόρια μπορούν να κυκλοφορήσουν και σε άλλες αποικίες με τα αποχωρήματα (Toumanoff 1939). Εικόνα 7: Κατεστραμμένη κηρήθρα Εικόνα 8: Κατεστραμμένες κηρήθρες 34

35 Καταπολέμηση Για την αντιμετώπιση του εντόμου, ο μελισσοκόμος πρέπει: να διατηρεί δυνατά μελίσσια για να εντοπίζουν τον κηρόσκορο και να τον απομακρύνουν από την κυψέλη να αφαιρεί τις κηρήθρες που δεν καλύπτονται από τις μέλισσες, να καθαρίζει συχνά τις βάσεις των κυψελών, να στοκάρει τις χαραμάδες και να απολυμαίνει όλα τα ξύλινα μέρη της κυψέλης με φλόγιστρο (Θρασυβούλου 2009). Υπάρχουν ακόμη αρκετοί αποτελεσματικοί τρόποι αντιμετώπισης, οι οποίοι αναφέρονται στη συνέχεια. Η χρήση παρα-διχλωρο-βενζόλιου (PDB) αποτελεί ένα από τα πολύ παλαιά σκευάσματα που χρησιμοποιήθηκαν ευρέως στην μελισσοκομία. Έχει τη μορφή κρυστάλλων και είναι γνωστό ως κηροσκορίνη. Σχετικές έρευνες τα τελευταία χρόνια απεκάλυψαν ότι σε ποσοστό 80% τα ελληνικά μέλια ήταν επιβαρημένα με αυτή την εντομοκτόνο ουσία και συνάμα καρκινογόνο για τον άνθρωπο, γι αυτό αποσύρθηκε από την αγορά (Wallner 1992, Bogdanov et al. 2004, Tananaki et al. 2004, Θρασυβούλου 2004). Η χρησιμοποίηση ψύξης ή θέρμανσης είναι μια εύκολη μέθοδος για τη συντήρηση των κηρηθρών. Με την τοποθέτησή τους σε ακραίες θερμοκρασίες, όπως φαίνεται στον πίνακα 3 επιτυγχάνεται η θανάτωση του εντόμου (Cantwell and Smith 1970, Παππάς 2002). Άλλο ένα χημικό μέσο είναι το θειάφι, το οποίο καίγεται στην κορυφή της στοίβας κυψελών που έχουν μέσα τις κηρήθρες ή σε στοιβαγμένες κηρήθρες σε αποθήκη ερμητικά κλειστή (για κάθε 100 κηρήθρες καίγονται 60 περίπου γραμμάρια θειάφι μέσα σε μεταλλικό δοχείο). Η επέμβαση πρέπει να 35

36 επαναλαμβάνεται γιατί δεν θανατώνονται τα αυγά του εντόμου (Bindernagel 1982). Οι ατμοί του οξικού οξέος θαντώνουν γρήγορα τα αυγά και τα ενήλικα. Συνιστάται η χρήση ποσότητας είτε 100 ml (καθαρότητας 90%) για 80 κηρήθρες, είτε αντίστοιχα ποσότητας 200 ml (καθαρότητας 60%) για χώρο ενός κυβικού μέτρου και οι κηρήθρες να παραμένουν σε κλειστό χώρο για ένα 24ωρο (Thaler 1991). Δεν αφήνει υπολείμματα αλλά διαβρώνει μεταλλικά τμήματα. Επίσης, η χρήση του μυρμηκικού οξέος είναι παρόμοια περίπου με εκείνης του οξικού οξέος και έχει την ίδια αποτελεσματικότητα. Μία εναλλακτική και αποτελεσματική βιολογική μέθοδος είναι η χρήση σκευασμάτων του βακτηρίου Bacillus thuringiensis (Ali et al. 1973). Τα σπόριά του ή/και οι τοξίνες κυκλοφορούν σε διάφορα σκευάσματα, όπως Β-401 και Certan. Το βακτήριο είναι εντελώς ακίνδυνο για τις μέλισσες (γόνο και ενήλικες) και για τον άνθρωπο. Πίνακας 3: Ώρες έκθεσης του κηρόσκωρου σε διάφορες θερμοκρασίες Θερμοκρασία έκθεσης ( C) Χρόνος που απαιτείται για την θανάτωση όλων των σταδίων του κηρόσκορου -17 1,5 ώρες ώρες ώρες -7 4,5 ώρες 0 5 ώρες 2 10 ημέρες 5 20 ημέρες ημέρες λεπτά 36

37 1.7. Bacillus thuringiensis Η οικογένεια Bacillaceae είναι μια ιδιαίτερα μεγάλη ταξινομική ομάδα των βακτηρίων που σχηματίζουν ενδοσπόρια, με τα δύο βασικά γένη Clostridium και Bacillus. Τα βακτήρια του γένους Clostridium είναι θετικά κατά Gram και αναερόβια και μερικά είδη συνδέονται συχνά με πολύ γνωστές ασθένειες του ανθρώπου όπως η αλλαντίαση (C. botulinum), ο τέτανος (C. tetani), και η γάγγραινα (C. perifringens). Το γένος Bacillus αποτελείται από αερόβια ή αναερόβια Gram-θετικά βακτήρια. Η πλειοψηφία των ειδών Bacillus σπανίως συνδέονται με ανθρώπινες ασθένειες με λίγες εξαιρέσεις εκτός του B. cereus και B. subtilis (Drobniewski 1993). Ο βάκιλος του είδους thuringiensis απομονώθηκε για πρώτη φορά από προσβεβλημένες προνύμφες μεταξοσκώληκα στην Ιαπωνία, στις αρχές του προηγούμενου αιώνα. Το όνομά του το πήρε από την περιοχή της Θουριγγίας στη Γερμανία, απ' όπου απομονώθηκε μια δεκαετία αργότερα (Van Frankenhuyzen 1993, Claus και Berkeley 1986). To Bacillus thuringiensis χαρακτηρίζεται από την παραγωγή, κατά τη σπορίωσή του, ενδοκυτταρικών παρασποριακών εγκλείστων κρυσταλλικής μορφής (κρυστάλλων), οι οποίοι περιέχουν πρωτεΐνες που εμφανίζουν εξειδικευμένη τοξική δράση σε μεγάλο φάσμα εντόμων καθώς και σε άλλα ασπόνδυλα (Van Frankenhuyzen 1993, Borgonie et al. 1995). Πολλά από τα έντομα αυτά (κυρίως Λεπιδόπτερα, Δίπτερα και Κολεόπτερα) βλάπτουν σημαντικές καλλιέργειες, όπως το βαμβάκι, το καλαμπόκι, την πατάτα, τον καπνό, πολλά λαχανικά, οπωροφόρα, καθώς επίσης και τα δέντρα των δασών (Navon 1993). Ολοκληρωμένες μελέτες για την κρυσταλλική δομή, την βιοχημεία και το εύρος της αποτελεσματικότητας που διεξήχθησαν οδήγησαν στην πρώτη εμπορική χρήση του Βacillus thuringiensis ως εντομοκτόνου το 1958 (Travis and Maureen, 2000). Τα εντομοκτόνα που βασίζονται στο Βacillus thuringiensis αποτελούν σήμερα το 80-90% των βιολογικών εντομοκτόνων. Κατά τα τελευταία χρόνια, αρκετά γονίδια που κωδικοποιούν τοξίνες του Βacillus thuringiensis έχουν μεταφερθεί γενετικά σε φυτά. Αυτά αναφέρονται ως Bt-φυτά και καλύπτουν το 19% του συνόλου των καλλιεργειών ΓΤΟ σε όλο τον κόσμο (Raddadi et al. 2009). Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός υποειδών του Βacillus, με διαφορετικά γονίδια δ-ενδοτοξίνης (cry γονίδια). Οι τοξίνες έχουν περιγραφεί από την πρώτη 37

38 εμπορευματοποίηση του βάκιλου. Οι κρυσταλλικές πρωτεΐνες έχουν διαφορετικές δράσεις κατά συγκεκριμένων εντόμων και χωρίζονται σε τέσσερις κατηγορίες ανάλογα με την τοξίνη: Λεπιδόπτερα (CryI), Δίπτερα και Λεπιδόπτερα (CryII), Κολεόπτερα (CryIII) και Δίπτερα (CryIV) (Feitelson et al. 1992). Το σύστημα αυτό αναθεωρήθηκε αργότερα με βάση την ομολογία αλληλουχίας πρωτεϊνών. Σε αυτή τη νέα ονοματολογία, οι ρωμαϊκοί αριθμοί έχουν ανταλλαγεί με αραβικούς αριθμούς στον πρωτογενή βαθμό (π.χ. Cry1Aa) για να φιλοξενήσει το μεγάλο αριθμό των αναμενόμενων νέων αλληλουχιών (Crickmore et al. 1998). Το εμπορικό ενδιαφέρον για την εξεύρεση νέων εντομοκτόνων του βακίλου φαίνεται από τα στελέχη που αριθμούν και πλέον σε συλλογές σε όλο τον κόσμο (Sanchis et al. 1996). Η ιδιότητα του Βacillus thuringiensis να έχει εξειδικευμένη τοξική δράση στα έντομα (Schnepf et al. 1990) και η ιδιότητα να μην βλάπτει τα θηλαστικά και το περιβάλλον (McClintok et al. 1995) καθιστούν το Bacillus thuringiensis μεγάλης οικονομικής σημασίας, που μπορεί να αποτελέσει βιολογικό παράγοντα ελέγχου των οργανισμών αυτών. Το Βacillus thuringiensis χρησιμοποιείται στην αγορά σε τρία κυρίως είδη σκευασμάτων: σε συμπυκνωμένο αιώρημα (suspension concentrate), σε βρέξιμη σκόνη (wettable powder) και σε βρέξιμους κόκκους (wettable granules) (Bryant 1994). Η προτίμηση για το είδος του σκευάσματος καθορίζεται από το κόστος της μεταφοράς του, τη σταθερότητά του κατά την αποθήκευση και τη χρησιμότητα του (Bryant 1994). Πριν από την εφαρμογή ενός σκευάσματος Βacillus thuringiensis σε πρόγραμμα καταπολέμησης των εντόμων, θα πρέπει να ελέγχονται διάφοροι παράγοντες, όπως η ευαισθησία του εντόμου στο σκεύασμα σε συνάρτηση με το στάδιο ανάπτυξής του, η ταχύτητα προσέγγισης της τροφής από το έντομο (Hall et al. 1994), η θερμοκρασία του περιβάλλοντος (Li et al. 1995), η πυκνότητα της περιοχής σε έντομα, η ηλιακή ακτινοβολία (Becker and Margalit 1993) και η σταθερότητα του σκευάσματος. Κατά την εφαρμογή του εντομοκτόνου βασισμένου στο Βacillus thuringiensis θα πρέπει να λαμβάνονται επίσης υπόψη ο τρόπος εφαρμογής του εντομοκτόνου, η σταθερότητα του μικροοργανισμού που χρησιμοποιείται, η ταχύτητα αναπαραγωγής του μικροοργανισμού, η απομάκρυνση του βιολογικού εντομοκτόνου από το σημείο εφαρμογής του και η 38

39 επίδρασή του γενικά στη λειτουργία και ισορροπία του οικοσυστήματος στο οποίο εφαρμόζεται (Meadows 1993, Palm et al. 1994, Tapp and Stotzky 1995) Σκοπός διατριβής Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής ήταν η μελέτη της δυνατότητας συνδυασμού του παρασιτοειδούς, Bracon brevicornis (Hymenoptera: Braconidae) με σκεύασμα του Bacillus thuringiensis var. aizawai για την καταπολέμηση του κηρόσκωρου, Galleria mellonella. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση του βακίλου στη θνησιμότητα και άλλες βιολογικές παραμέτρους του παρασιτοειδούς. Επίσης, μελετήθηκε η αποτελεσματικότητα του παρασιτοειδούς και του βακίλου μόνα τους ή σε συνδυασμό εναντίον προνυμφών του κηρόσκωρου σε κηρήθρες σε συνθήκες αποθήκης. Συγκεκριμένα, στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του Β401 (Βacillus thuringiensis var. aizawai) (LD 10, LD 30, LD 50, LD 70 ) στις εξής βιολογικές παραμέτρους του Bracon brevicornis: ωοπαραγωγή, εκκολαπτικότητα, διάρκεια προνυμφικής ανάπτυξης, διάρκεια ζωής ενήλικων απογόνων (αρσενικών και θηλυκών), επιβίωση στα διαφορετικά στάδια ανάπτυξης και αναλογία φύλου. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση του διαφορετικού χρόνου έκθεσης του Galleria mellonella στην LD 50 του σκευάσματος (6, 12 και 24 ώρες), σε παρόμοιες με παραπάνω βιολογικές παραμέτρους του Bracon brevicornis. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η δυνατότητα εφαρμογής των παρασιτοειδών στις αποθήκες κηρηθρών και πόσο αποτελεσματικός είναι ο συνδυασμός τους με βιολογικά σκευάσματα βακίλου. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η αποτελεσματικότητα της εξαπόλυσης του Bracon brevicornis, του σκευάσματος Β401 καθώς και της ταυτόχρονης χρήσης τους, καθώς και πώς τα παραπάνω επηρέασαν την καταστροφή και μείωση του βάρους των πλαισίων. Τα αποτελέσματα της διατριβής συμβάλλουν στο σχεδιασμό μίας στρατηγικής καταπολέμησης του Galleria mellonella με πληθυσμούς παρασιτοειδών σε συνδυασμό με χρήση βιολογικών σκευασμάτων. Επίσης, συμβάλλουν στην έρευνα για την επίδραση των διάφορων βιολογικών σκευασμάτων σε ωφέλιμους οργανισμούς και πώς μπορεί να μειωθεί ο κίνδυνος για αυτούς με την ορθολογική χρήση των πρώτων. 39

40 Κεφάλαιο 2: Γενικά υλικά και μέθοδοι 2.1. Συνθήκες εργαστηρίου Οι αποικίες τόσο του παρασιτοειδούς Bracon brevicornis όσο και του ξενιστή Galleria mellonella διατηρούνταν σε σταθερές συνθήκες εργαστηρίου με θερμοκρασία 25±1 ο C, σχετική υγρασία 65±5% και φωτοπερίοδο 16:8 ώρες (Φ:Σ) με έναρξη της φωτόφασης στις 06:00 και λήξη στις 22:00. Το φως προερχόταν αποκλειστικά από τεχνητό φωτισμό με λαμπτήρες φθορίου. 2.2 Εκτροφή του πληθυσμού του Bracon brevicornis Ο αρχικός πληθυσμός του παρασιτοειδούς προήλθε από παρασιτισμένες προνύμφες του ρόδινου σκουληκιού Pectinophora gossypiella (Lepidoptera: Gelechiidae) που συλλέχθηκαν από βαμβάκι στην περιοχή της δυτικής Θεσσαλονίκης, το έτος Η αποικία διατηρούνταν στο Εργαστήριο Εφαρμοσμένης Ζωολογίας και Παρασιτολογίας της Σχολής Γεωπονίας, Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, με προνύμφες του εντόμου Galleria mellonella ως ξενιστή. Τα Bracon brevicornis διατηρούνταν σε σταθερές συνθήκες εργαστηρίου (θερμοκρασία 25±1 C, σχετική υγρασία 65±5% και φωτοπερίοδο 16 ώρες φως: 8 ώρες σκοτάδι). Τα ενήλικα τοποθετούνταν κατά ίσο αριθμό αρσενικών-θηλυκών, με τη βοήθεια αναρροφητικού συλλέκτη εντόμων, σε τριβλία Petri με διάμετρο 6 cm, όπου είχαν τοποθετηθεί προηγουμένως προνύμφες 3 ης - 4 ης ηλικίας του Galleria mellonella ώστε να ωοτοκήσουν τα παρασιτοειδή. Τα τριβλία τυλίγονταν με Parafilm για να παραμένει η σχετική υγρασία σε υψηλά επίπεδα και να αποφεύγεται έτσι η υψηλή θνησιμότητα των προνυμφών του παρασιτοειδούς, εξαιτίας ενδεχόμενης αφυδάτωσης της προνύμφης του ξενιστή. Στην επάνω πλευρά εσωτερικά του τριβλίου τοποθετούνταν, με τη βοήθεια σύριγγας, μερικές σταγόνες υδατικού διαλύματος μελιού 10% ως τροφή για τα ενήλικα παρασιτοειδή, ώστε να λαμβάνονται οι απαραίτητες πρωτεΐνες για την ωοπαραγωγή (Εικόνα 9). Τα παρασιτοειδή παρέμεναν για 24 ώρες στο τριβλίο και ακολούθως 40

41 απομακρύνονταν με προσοχή ώστε να μην μετακινηθούν οι παρασιτισμένες προνύμφες και καταστραφούν τα αυγά που έφεραν. Οι προνύμφες παρακολουθούνταν μέχρι την εμφάνιση των νέων παρασιτοειδών, τα οποία αμέσως μετά χρησιμοποιούνταν για τις ανάγκες του πειράματος. Εικόνα 9: Σταγόνες υδατικού διαλύματος μελιού 10% Εικόνα 10: Αποικία Bracon brevicornis 41

42 2.3. Εκτροφή του πληθυσμού Galleria mellonella Ο αρχικός πληθυσμός του Galleria mellonella προήλθε από προσβεβλημένα πλαίσια κυψελών από το Εργαστήριο Μελισσοκομίας του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης το έτος Τα έντομα διατηρούνταν σε σταθερές συνθήκες εργαστηρίου με θερμοκρασία 25±1 C, σχετική υγρασία 65±5% και φωτοπερίοδο 16 ώρες φως: 8 ώρες σκοτάδι. Το φως προερχόταν από τεχνητό φωτισμό με λαμπτήρες φθορίου. Τα ενήλικα άτομα τοποθετούνταν μέσα σε πλαστικά διαφανή κλουβιά (plexiglass) (20 x 20 x 20 cm) από την πρώτη ημέρα της ενηλικίωσής τους (Εικόνα 11α). Κάθε κλουβί περιείχε ένα κύπελλο με υδατικό διάλυμα ζάχαρης 10%, με οπή στο καπάκι όπου εισερχόταν οδοντιατρικό βαμβάκι μήκους 4 cm για να τρέφονται τα έντομα (Εικόνα 11β). Επίσης, τοποθετούνταν 3-4 φύλλα χαρτί για να αποθέσουν τα αυγά τους τα ενήλικα θηλυκά. Κάθε δυο ημέρες, συλλέγονταν τα αυγά από τα χαρτιά και απομακρύνονταν τα νεκρά άτομα. α β Εικόνα 11: α) Κλουβί ενήλικων Galleria mellonella β) Κύπελλο με υδατικό διάλυμα ζάχαρης 10% 42

43 Οι νεοεκκολαφθείσες προνύμφες τοποθετούνταν σε πλαστικά κύπελλα (Eικόνα 12), τα οποία περιείχαν ποσότητα τεχνητής τροφής και μεταφέρονταν σε κλίβανο με σταθερή θερμοκρασία στους 28±1 C και συνεχές σκοτάδι (προσομοίωση συνθηκών κυψέλης). Παρέμεναν εκεί μέχρι την ενηλικίωσή τους και στην συνέχεια τα ενήλικα άτομα τοποθετούνταν σε πλαστικά κλουβιά στο εργαστήριο. Για την εκτροφή των ανήλικων σταδίων του εντόμου χρησιμοποιήθηκε Εικόνα 12: Πλαστικά κύπελλα τεχνητή τροφή η οποία αποτελείται από τα ακόλουθα συστατικά: Αλεύρι (White flour) 350g, καλαμποκάλευρο (Corn flour) 200g, μαγιά μπύρας (Brewer s yeast) 70g, γάλα σε σκόνη (Milk powder) 130g, γλυκερίνη 150ml και μέλι 100ml. Όλα τα συστατικά ανακατεύονταν μαζί, για να ομογενοποιηθούν και στη συνέχεια το μείγμα τοποθετoύνταν σε πλαστικό δοχείο, το οποίο διατηρούνταν στο ψυγείο σε θερμοκρασία 4±1 C, μέχρι την ημέρα της χρησιμοποίησης του Το Β401 Το βιολογικό σκεύασμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Β401. Είναι συμπυκνωμένο υγρό εναιώρημα και περιέχει σπόρια και κρυσταλλικές πρωτεΐνες του Bacillus thuringiensis var. aizawai (1.5%). Η συντήρησή του έγινε σύμφωνα με τις προδιαγραφές της εταιρίας (σε δροσερό και σκιερό μέρος) ενώ με το άνοιγμα του τοποθετήθηκε στο ψυγείο (4 C). 43

44 Κεφάλαιο 3: Επίδραση του Bacillus thuringiensis var. aizawai σε βιολογικές παραμέτρους του Bracon brevicornis Εισαγωγή Το βακτήριο Bacillus thuringiensis είναι ένα θετικά κατά Gram βακτήριο που σχηματίζει σπόρους και θεωρείται το κυριότερα χρησιμοποιούμενο σε εμπορική κλίμακα στη γεωργία, τη διαχείριση των δασών και καταπολέμηση των κουνουπιών (βλ. γενική εισαγωγή). Αρκετά έντομα συμπεριλαμβανομένων Λεπιδοπτέρων, Διπτέρων και Κολεοπτέρων είναι ευαίσθητα σε αυτό (Crickmore et al. 1998). Η ολοκληρωμένη διαχείριση των διάφορων εχθρών που αφορούν το συνδυασμό του βακίλου και ενός φυσικού εχθρού, φαίνεται πως μειώνει τους πληθυσμούς των επιβλαβών οργανισμών χωρίς εμφανείς αρνητικές επιπτώσεις στα παρασιτοειδή (Weseloh and Andreadis 1982, Ulpah and Kok 1996) και ολοένα κερδίζει έδαφος (Groot and Dicke, 2002, Sharma et al. 2004). Από την άλλη μεριά, αν και πολλές φορές η καταπολέμηση είναι επιτυχής, ο συνδυασμός του βακίλου με ένα παράσιτοειδές έρχεται αντιμέτωπη με κάποια προβλήματα. Τα προβλήματα αυτά μπορεί να είναι άμεσα ή έμμεσα. Άμεσα μπορεί να είναι η θνησιμότητα των ωφελίμων από την απευθείας έκθεση τους στο βάκιλο. Έμμεσες είναι η μείωση των ποσοστών επιβίωσης των ανήλικων σταδίων του παρασιτοειδούς λόγω πρόωρου θανάτου του ξενιστή (Nealis and Van Frankenhuyzen, 1990) και της εμφάνισης των ενηλίκων (Atwood et al. 1997). Επίσης, μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη (Ahmad et al. 1978) ή μειωμένη διάρκεια ανάπτυξης των προνυμφικών σταδίων (Weseloh 1984) και αλλαγή της αναλογίας φύλου του παρασιτοειδούς (Wallner et al. 1983). Παρά τις μελέτες σχετικά με τον συνδυασμό βακίλου και ενός παρασιτοειδούς έναντι εντόμων εχθρών, η επίδρασή του σε άλλα τροφικά επίπεδα, όπως παρασιτοειδή εντόμων στόχων, δεν είναι ακόμη κατανοητό. Έχει παρατηρηθεί σε πολλές μελέτες ακόμα, πως επηρεάζεται η ικανότητα των διαφόρων παρασιτοειδών για τον εντοπισμό και αποφυγή ή μείωση της ωοτοκίας ή της μεταφορά των προνυμφών τους σε ξενιστές που έχουν μολυνθεί με διάφορα παθογόνα, συμπεριλαμβανομένων ιών (Sait et al. 1996), βακτηρίων (Lopez and Ferro 1995) και μυκήτων (Fransen and van Lenteren 1993, Mesquita and Lacey 2001). Στις περιπτώσεις 44

45 αυτές, ωστόσο, οι διακρίσεις ήταν εμφανείς μόνο όταν τα παρασιτοειδή παρασιτούσαν ξενιστές σε προχωρημένα στάδια της μόλυνσης. Έτσι, αυτοί οι μηχανισμοί είναι, στην καλύτερη περίπτωση, μόνον μερικώς αποτελεσματικοί στην πρόληψη ανταγωνιστικών αλληλεπιδράσεων. Έτσι τα τελευταία χρόνια η έρευνα των επιδράσεων του βακίλου αλλά και άλλων βιολογικών σκευασμάτων, έχει αυξηθεί ώστε να μπορεί να γίνει καλύτερος σχεδιασμός στρατηγικών για την αντιμετώπιση των διάφορων εχθρών. Στον παρακάτω πίνακα παρατίθενται μερικές από τις έρευνες αυτές. Πίνακας 4: Επίδραση του Bacillus thuringirnsis σε παρασιτοειδή (Tanaka and Minakuchi 2012). Έντομο εχθρός Παρασιτοειδές Επίδραση P. xylostella Trichogrammidae Καμία επίδραση P. interpuctella Habracon sp. Μικρό ποσοστό εμφάνισης ενηλίκων H. armigera Campoletis sp. Σημαντική μείωση πληθυσμού Ε. kuehniella Trichogramma sp. Καμία επίδραση P. rapae Cotesia sp. Μικρή επίδραση P. xylostella Cotesia sp. Χαμηλή αποτελεσματικότητα L. dispar Compsilura sp. Μείωση παρασιτισμού 45

46 Σε αυτό το κεφάλαιο της διατριβής μελετήθηκε η επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του Β401 (Βacillus thuringiensis var. aizawai) (LD 10, LD 30, LD 50, LD 70 ) στις εξής βιολογικές παραμέτρους του Bracon brevicornis: ωοπαραγωγή, εκκολαπτικότητα, διάρκεια προνυμφικής ανάπτυξης, διάρκεια ζωής ενήλικων απογόνων (αρσενικών και θηλυκών), επιβίωση στα διαφορετικά στάδια ανάπτυξης και αναλογία φύλου. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση του διαφορετικού χρόνου έκθεσης του Galleria mellonella στην LD 50 του σκευάσματος (6, 12 και 24 ώρες), σε παρόμοιες με παραπάνω βιολογικές παραμέτρους του Bracon brevicornis. 46

47 3.2. Υλικά και μέθοδοι Έντομα Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν έντομα των εργαστηριακών εκτροφών και συγκεκριμένα νεαρά ενήλικα μίας ημέρας του Bracon brevicornis καθώς και προνύμφες 3 ης - 4 ης ηλικίας του Galleria mellonella. Η μέθοδος εκτροφής των εντόμων περιγράφηκε αναλυτικά στο Κεφάλαιο Υποθανατηφόρες δόσεις Για τον υπολογισμό των υποθανατηφόρων δόσεων του B401 (LD 10, LD 30, LD 50 και LD 70 ), 50 προνύμφες Galleria mellonella αναπτύχθηκαν σε τροφή εμποτισμένη με 50μl, 25 μl, 12.5 μl, 6.25 μl, μl, μl, μl, μl, μl, 0 μl ανά γραμμάριο τροφής. Για την διευκόλυνση της ανάμειξης του σκευάσματος με την τροφή προηγήθηκε ανάμειξη του με 1 ml με απιονισμένο νερό. Μετά την ανάμειξη, η τροφή αφήνονταν να στεγνώσει για 24 ώρες. Στην συνέχεια εισάγονταν οι προνύμφες όπου και τρέφονταν με την εμποτισμένη με το B401 τροφή. Οι προνύμφες ήταν χωρισμένες σε ομάδες των 5 (10 επαναλήψεις), μαζί με 15g τροφής (Eικόνα 13) σε συνθήκες 25±1 ο C, 65±5% HR και συνεχής σκοτόφαση. Η θνησιμότητα καταγράφονταν 72 ώρες μετά την εισαγωγή των προνυμφών και γίνονταν διόρθωση με τον τύπο του Abbot (Αbbot, 1925): Δ.Θ.% = 100*(Μ Ε)/M Όπου: Δ.Θ. = διορθωμένη θνησιμότητα, Μ = άτομα που επιζούν στο μάρτυρα, Ε = άτομα που επιζούν σε κάποια δόση εντομοκτόνου 47

48 Εικόνα 13: Τριβλία με τροφη εμποτισμένη με B Επίδραση του Bacillus thuringiensis var. aizawai (Β401) σε βιολογικες παραμέτρους του Bracon brevicornis, μέσω του ξενιστή Galleria mellonella Προνύμφες του Galleria mellonella 3 ης - 4 ης ηλικίας μεταφέρονταν σε πλαστικό τριβλίο petri διαμέτρου 11cm με τεχνητή τροφή εμποτισμένη με υποθανατηφόρες δόσεις του Β401 (LD 10, LD 30, LD 50 και LD 70 ), για 24 ώρες και σε θερμοκρασία 25±1 C. Ακολούθως, συλλέγονταν με λαβίδα και τοποθετούνταν καθεμία σε άλλο πλαστικό τριβλίο petri (6 cm) χωρίς τροφή. Στην επάνω πλευρά και εσωτερικά στο τριβλίο είχε από πριν τοποθετηθεί μία σταγόνα υδατικού διαλύματος μελιού 10% με τη βοήθεια σύριγγας. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια αναρροφητικού συλλέκτη εντόμων μεταφέρονταν ένα αρσενικό και ένα θηλυκό ενήλικο άτομο του Bracon brevicornis, τα οποία παρέμεναν εκεί για 24 ώρες. Η διαδικασία επαναλαμβάνονταν μέχρι τα θάνατο του ενήλικου θηλυκού. Στην παρασιτισμένη προνύμφη μετρούνταν τα αυγά που απέθεσε το θηλυκό παρασιτοειδές και κλείνονταν με προσοχή με ταινία για να μην μειώνεται η σχετική υγρασία. Οι παρατηρήσεις πραγματοποιούνταν κάθε 24 ώρες και μετρήθηκε: η ωοπαραγωγή, η εκκολαπτικότητα, η διάρκεια της προνυμφικής ανάπτυξης, η διάρκεια 48

49 ζωής των ενήλικων απογόνων (αρσενικών και θηλυκών), η επιβίωση στα διαφορετικά στάδια ανάπτυξης καθώς και η αναλογία φύλου. Για κάθε μεταχείριση πραγματοποιήθηκαν 20 επαναλήψεις. Για την ωοπαραγωγή αθροίζονταν τα αυγά που απέθετε κάθε μέρα το θηλυκό. Η αναλογία φύλου υπολογίστηκε ως ο λόγος του αριθμού ενηλίκων θηλυκών, που προήλθε από κάθε επανάληψη-ζευγάρι παρασιτοειδών προς τον συνολικό αριθμό απογόνων του ζευγαριού αυτού. Τέλος, για την διάρκεια ανάπτυξης των ανήλικων σταδίων μετρούνταν ο χρόνος που χρειάζονταν από το ένα στάδιο στο άλλο. Ειδικά για την διάρκεια ζωής των ενήλικων απογόνων, όσα ενήλικα παρασιτοειδή εξέρχονταν επιτυχώς από τις νύμφες, μεταφέρονταν ανά τέσσερα (δυο αρσενικά και δυο θηλυκά) σε τριβλία petri (διαμέτρου 6 cm) και τους παρείχετο υδατικό διάλυμα μελιού 10% ως τροφή. Τα ενήλικα παρασιτοειδή διατηρούνταν μέσα σε κλιβάνους σε σταθερές συνθήκες (25±1 ο C, 65±5% HR και 16:8 Φ:Σ), μέχρι το θάνατό τους. Η τροφή αντικαθιστούταν κάθε δύο ημέρες. Με την ίδια διαδικασία έγινε και η μελέτη της επίδρασης της ώρας έκθεσης του ξενιστή Galleria mellonella στις διάφορες βιολογικές παραμέτρους του παρασιτοειδούς Bracon brevicornis. Αντί όμως των διάφορων δόσεων στα τριβλία petri που τρέφονταν οι προνύμφες του ξενιστή, η τροφή ήταν εμποτισμένη με την LD 50 και άλλαζε η διάρκεια παραμονής των προνυμφών στην τροφή (6 ώρες, 12 ώρες, 24 ώρες). 49

50 Στατιστική ανάλυση Η επίδραση των υποθανατηφόρων δόσεων του Β401 (Bacillus thuringiensis var.aizawai) στις βιολογικές παραμέτρους του Bracon brevicornis μελετήθηκε εφαρμόζοντας ανάλυση παραλλακτικότητας (One way ANOVA). Οι μέσοι όροι συγκρίθηκαν με το κριτήριο του Tukey s-b για επίπεδο σημαντικότητας p=0,05. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη βοήθεια του στατιστικού προγράμματος SPSS (SPSS Inc. 2006). Επίσης σε αποτελέσματα τα οποία υπήρχε πρόβλημα με την κανονικότητα των δεδομένων έγινε μετασχηματισμός δεδομένων σε τόξο εφαπτομένης. 50

51 3.3. Αποτελέσματα Υποθανατηφόρες δόσεις LD 10, LD 30, LD 50 και LD 70 του Β401 για το Galleria mellonella Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 5) συγκεντρώνονται όλα τα στοιχεία για την θνησιμότητα των προνυμφών του Galleria mellonella. Για την εύρεση των υποθανατηφόρων δόσεων LD 10, LD 30, LD 50 και LD 70 δημιουργήθηκε η γραφική παράσταση (Εικόνα 14) όπου στον άξονα των x ήταν οι λογάριθμοι των δόσεων και στον άξονα των y οι μονάδες probit. Από την ευθεία που προκύπτει, υπολογίζονται οι υποθανατηφόρες δόσεις και συγκεκριμένα η LD 10 είναι μl/gr τεχνητής τροφής, η LD 30 είναι μl/gr τεχνητής τροφής, η LD 50 είναι 2.42 μl/gr τεχνητής τροφής και η LD 70 είναι μl/gr τεχνητής τροφής. Πίνακας 5: Συγκεντρωτικά αποτελέσματα θνησιμότητας των προνυμφών του Galleria mellonella Δόση Log(Δόση) Θνησιμότητα (%) Διορθωμένη probit (μl/gr) θνησιμότητα (%) 0 (μάρτυρας)

52 Probit 7 6 y = x R² = log(dose) Εικόνα 14: Γραφική απεικόνιση των λογαρίθμων των δόσεων και των αριθμών probit που αντιστοιχούν στα ποσοστά θνησιμότητας 52

53 Αριθμός αυγών Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην ωοπαραγωγή του Bracon brevicornis Επίδραση των υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella στην ωοπαραγωγή του Bracon brevicornis Στην εικόνα 15 παρουσιάζεται η ωοπαραγωγή των ενήλικων θηλυκών του Bracon brevicornis σε προνύμφες του Galleria mellonella, οι οποίες είχαν τραφεί προηγουμένως με τις υποθανατηφόρες δόσεις του B401 (LD 10, LD 30, LD 50 και LD 70 ) σε τεχνητή τροφή. Συγκεκριμένα, η ωοπαραγωγή των ενήλικων θηλυκών σε προνύμφες που είχαν τραφεί σε τροφή εμποτισμένη με τις υποθανατηφόρες δόσεις LD 10, LD 30, LD 50 και LD 70 ήταν ± 21,29, ± 17.42, ± και ± αντίστοιχα, ενώ του μάρτυρα ήταν 401,65 ± 26,05. Σύμφωνα με την στατιστική ανάλυση δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των μεταχειρίσεων (F=0.887, df=4, p>0.05) a a a a a control LD10 LD30 LD50 LD70 Υποθανατηφόρες δόσεις Εικόνα 15: Επίδραση των υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonlla, στην ωοπαραγωγή του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 53

54 Αριθμός αυγών Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην ωοπαραγωγή του Bracon brevicornis Στην εικόνα 16 φαίνεται η ωοπαραγωγή των θηλυκών ενήλικων του Bracon brevicornis σε προνύμφες του Galleria mellonella, οι οποίες είχαν τραφεί προηγουμένως σε τεχνητή τροφή με την υποθανατηφόρο δόση LD 50 του B401, για διάφορες ώρες έκθεσης (6 ώρες, 12 ώρες, 24 ώρες). Συγκεκριμένα, η ωοπαραγωγή των ενήλικων θηλυκών σε προνύμφες που είχαν τραφεί σε τροφή εμποτισμένη με την υποθανατηφόρο δόση LD 50 για 6, 12 και 24 ώρες ήταν ± 15.53, ± και ± 26,14 αυγά αντίστοιχα. Η στατιστική ανάλυση έδειξε οτι δεν υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των μεταχειρίσεων (F=0.141, df=2, p>0.05) a a a h 12h 24h Ώρες έκθεσης Εικόνα 16: Επίδραση της LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην ωοπαραγωγή του Bracon brevicornis, σε διάφορες ώρες έκθεσης του ξενιστή. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 54

55 Ποστοστό εκκόλαψης Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην εκκολαπτικότητα των αυγών του Bracon brevicornis Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella στην εκκολαπτικότητα των αυγών του Bracon brevicornis Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ούτε στην εκκολαπτικότητα των αυγών του Bracon brevicornis όπως φαίνεται από την εικόνα 17 (F=2.418, df=4, p>0.05). Σε όλες τις μεταχειρίσεις η εκκολαπτικότητα δεν έπεσε κάτω από 96%. Συγκεκριμένα στο μάρτυρα η εκκολαπτικότητα ήταν 97.60% ± 0.17, ενώ σε αυγά που είχαν τοποθετηθεί σε προνύμφες του Galleria mellonella που είχαν τραφεί με τις υποθανατηφόρες δόσεις LD 10, LD 30, LD 50 και LD 70 η εκκολαπτικότητα κυμάνθηκε από ± 65% έως ± 1.54% a 96.65a 97.06a 97.19a 97.36a control LD10 LD30 LD50 LD70 Υποθανατηφόρες δόσεις Εικόνα 17: Επίδραση των υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella, στην εκκολαπτικότητα των αυγών του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 55

56 Ποσοστό εκκόλαψής Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην εκκολαπτικότητα των αυγών του Bracon brevicornis Στην εικόνα 18 φαίνεται ότι χρόνος έκθεσης δεν επηρέασε την εκκολαπτικότητα των αυγών του Bracon brevicornis. Αυτή κυμάνθηκε στα ίδια επίπεδα με την εκκολαπτικότητα των αυγών στις διάφορες δόσεις έχοντας μεγαλύτερη τιμή στις 24 ώρες με ποσοστό ± 0.29% και μικρότερη στις 6 ώρες με ποσοστό ± 0.31%, ενώ στις 12 ώρες το ποσοστό ήταν ± 0.39%. Στατιστικά σημαντικές διαφορές δεν υπάρχουν (F=0.438, df=2, p>0.05) a 96.91a 97.19a h 12h 24h Ώρες έκθεσης Εικόνα 18: Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην εκκολαπτικότητα των αυγών του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 56

57 Ποσοστό επιβίωσης προνυμφών Επιδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην επιβιωση των προνυμφων του Bracon brevicornis Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella στην επιβιωση των προνυμφων του Bracon brevicornis a b 26.33b 20.68c 12.68d 10 0 control LD10 LD30 LD50 LD70 Υποθανατηφόριες δόσεις Εικόνα 19: Επίδραση των υποθανατηφόρων δόσεων του Bacillus thuringiensis για το Galleria mellonella, στην επιβίωση των προνυμφών του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά Η επιβίωση των προνυμφών διαφέρει στατιστικά σημαντικά μεταξύ των μεταχειρίσεων (F=188.47, df=4, p<0.05). Όπως φαίνεται στην εικόνα 19, παρατηρήθηκε υψηλή θνησιμότητα στις προνύμφες του Bracon brevicornis που αναπτύχθηκαν σε προνύμφες του Galleria mellonella οι οποίες είχαν προηγουμένως τραφεί σε τεχνητή τροφή εμποτισμένη με τις υποθανατηφόρες δόσεις. Η μεγαλύτερη επιβίωση ήταν στο μάρτυρα με ποσοστό ± 1.57% ενώ αρκετά μικρότερη στις μεταχειρίσεις του βάκιλλου οι οποίες δεν ξεπέρασαν το 27%. Στις LD 10 και LD 30 τα ποσοστά επιβίωσης ήταν ± 1.85% και ± 1.31% αντίστοιχα και δεν διάφεραν μεταξύ τους αλλά 57

58 Ποσοστό επιβίωσης προνυμφών διάφεραν απο το μάρτυρα. Ακόμα πιο χαμηλά ήταν τα ποσοστά στις LD 50 και LD 70 και συγκεκριμένα ± 1.36% για την πρώτη και ± 1.14% για την δεύτερη, όπου διάφεραν μεταξύ τους αλλά και με τις άλλες μεταχειρίσεις Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην επιβίωση των προνυμφών του Bracon brevicornis Στην εικόνα 20 φαίνεται η επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του ξενιστή Galleria mellonella στην επιβίωση των παρανυμφών του Bracon. Μεγαλύτερη επιβίωση παρατηρήθηκε στον χρόνο έκθεσης των έξι ωρών με ποσοστό επιβίωσης 39.61% ± 1.58 διαφέροντας στατιστικά σημαντικά από τις 12 και 24 ώρες έκθεσης με ποσοστά επιβίωσης ± 2.05% και ± 1.42% αντίστοιχα (F=34.466, df=2, p<0.05). Όσο μικρότερη ήταν η έκθεση των προνυμφών του ξενιστή τόσο μεγαλύτερη ήταν η επιβίωση των προνυμφών του παρασιτοειδούς a b 20.76b 0 6h 12h 24h Ώρες έκθεσης Εικόνα 20: Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην επιβιωση των προνυμφων του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 58

59 Ποσοστό επιβ'ιωσης prepupa Επίδραση του B401 (Bacillus huringiensis var. aizawai) στην επιβίωση των prepupa του Bracon brevicornis Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella στην επιβίωση των prepupa του Bracon brevicornis Prepupa που προήλθαν από προνύμφες που είχαν αναπτυχθεί σε προνύμφες Galleria mellonella τρεφόμενες σε υποθανατηφόρες δόσεις του B401 διαφέρουν στατιστικά σημαντικά σε σχέση με τον μάρτυρα (F=3.855, df=4, p<0.05). Παρατηρήθηκε πως στις υποθανατηφόρες δόσεις η επιβίωση ήταν λίγο πιο μικρή σε σχέση με τον μάρτυρα. Συγκεκριμένα, η επιβίωση των prepupa του παρασιτοειδούς έφτασε το ± 0.34% στο μάρτυρα, ενώ στις άλλες επεμβάσεις κυμάνθηκε από ± 1.21% έως ± 1.42% a 93.05b b b 94.21b control LD10 LD30 LD50 LD70 Υποθανατηφόρες δόσεις Εικόνα 21: Επίδραση των υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella στην επιβίωση των prepupa του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 59

60 Ποσοστό επιβίωσης prepupa Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην επιβίωση των prepupa του Bracon brevicornis Σε αντίθεση με τις διάφορες δόσεις φαίνεται πως η διάρκεια έκθεσης στην LD 50 του ξενιστή Galleria mellonella δεν επηρέασε στατιστικά σημαντικά την επιβίωση των prepupa του Bracon brevicornis (Εικόνα 22) (F=0.320, df=2, p>0.05). Έτσι, η επιβίωση των prepupa κυμάνθηκε από ± 0,93% στην διάρκεια έκθεσης των 12 ωρών μέχρι ± 0.67% στην διάρκεια έκθεσης των 6 ωρών, ενώ στις 24 ώρες διάρκεια έκθεσης το ποσοστό ήταν ± 1.11% a 93.36a 93.62a h 12h 24h Ώρες έκθεσης Εικόνα 22: Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην επιβίωση των prepupa του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 60

61 Ποσοστό επιβίωσης νυμφών Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην επιβίωση των νυμφών του Bracon brevicornis Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων B401 για το Galleria mellonella στην επιβίωση των νυμφών του Bracon brevicornis Όσον αφορά στην επιβίωση των νυμφών του Bracon brevicornis που αναπτύχθηκαν σε προνύμφες του Galleria mellonella, οι οποίες είχαν τραφεί προηγουμένως με τις υποθανατηφόρες δόσεις του B401, παρατηρήθηκε υψηλή επιβίωση και σε όλες τις περιπτώσεις (Εικόνα 23). Τα ποσοστά επιβίωσης κυμάνθηκαν από ± 1,26% έως ± 0,49%. Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των μεταχειρίσεων (F=2.008, df=4, p>0.05) a 96.76a 93.82a 95.38a 94.79a control LD10 LD30 LD50 LD70 Υποθανατηφόρες δόσεις Εικόνα 23: Επίδραση των υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella, στην επιβίωση των νυμφών του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 61

62 Ποσοστό επιβίωσης νυμφών Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην επιβίωση των νυμφών του Bracon brevicornis Παρατηρήθηκε μια μικρή αύξηση της επιβίωσης με την αύξηση της διάρκειας χωρίς όμως να έχει κάποια βιολογική σημασία (Εικόνα 24). Έτσι η μέγιστη επιβίωση και σε αντίθεση με την επιβίωση των προνυμφών ήταν στην διάρκεια έκθεσης των 24 ωρών με ποσοστό ± 38% και ακολούθησε η επιβίωση στις 12 ώρες με ποσοστό ± 1.03% και η επιβίωση στις 6 ώρες με ποσοστό 92,43 ± 0.88%. Τα παραπάνω ποσοστά επιβίωσης δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά (F=2.319, df=2, p>0.05) a 92.84a 95.38a h 12h 24h Ώρες έκθεσης Εικόνα 24: Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην επιβίωση των νυμφών του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 62

63 Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην επιβίωση των ανήλικων σταδίων του Bracon brevicornis Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella, στην επιβίωση των ανήλικων σταδίων του Bracon brevicornis Στον πίνακα 6 φαίνεται στο σύνολο η επίδραση των διάφορων δόσεων του B401 στην επιβίωση των αυγών και ανήλικων σταδίων του Bracon brevicornis. Αυξάνοντας την δόση του σκευάσματος με τον βάκιλο παρατηρείται μείωση της επιβίωσης του παρασιτοειδούς. Φαίνεται και από τα προηγούμενα αποτελέσματα ότι καταλυτικό ρόλο σε αυτή την μείωση παίζει κυρίως η μεγάλη θνησιμότητα των προνυμφών στις διάφορες συγκεντρώσεις του βακίλου, όπου τράφηκαν προηγουμένως οι προνύμφες του Galleria mellonella. Από το στάδιο του αυγού έως και την έξοδο του ενήλικου, η επιβίωση για το μάρτυρα ήταν ± 1.4%, ενώ για τις μεταχειρίσεις του βακίλου αρκετά πιο χαμηλά και συγκεκριμένα κυμάνθηκαν από ± 1.01% έως 23.14%. Πίνακας 6: Επίδραση των υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella, στην επιβίωση του Bracon brevicornis Μεταχείριση Control Ποσοστό επιβίωσης 60.29a* LD b LD bc LD c LD d (F= , df=4, p<0.05) *μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 63

64 Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην επιβίωση των ανήλικων σταδίων του Bracon brevicornis Παρόμοια στον παρακάτω πίνακα 7 φαίνεται στο σύνολο η επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην LD 50 του ξενιστή Galleria mellonella στην επιβίωση των ανήλικων σταδίων του Bracon brevicornis. Όπως και στις διάφορες δόσεις έτσι και εδώ φαίνεται οτι σημαντικό ρόλο παίζει η επιβίωσης των προνυμφών, επηρεάζοντας στο σύνολο την επιβίωση από το αυγό μέχρι και την εμφάνιση του ενήλικου παρασιτοειδούς. Οι τρείς μεταχειρίσεις, δηλαδή 6 ώρες, 12 ώρες και 24 ώρες διαφέρουν στατιστικά σημαντικά όπως φαίνεται παρακάτω. Πίνακας 7: Επίδραση της διάρκειας έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην επιβίωση των ανήλικων σταδίων του Bracon brevicornis Μεταχείριση Ποσοστό επιβίωσης 6 ώρες 33.37a* 12 ώρες 20.88b (F= , df=4, p<0.05) 24 ώρες 17,98b *μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 64

65 Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην αναλογία φύλου του Bracon brevicornis Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella, στην αναλογία φύλου του Bracon brevicornis Η αναλογία φύλου υπολογίστηκε ως ο λόγος του συνολικού αριθμού ενηλίκων θηλυκών, που προήλθε από κάθε ζευγάρι παρασιτοειδών προς τον συνολικό αριθμό απογόνων του ζευγαριού αυτού και παρουσιάζεται στον πίνακα 8. Παρατηρείται ότι και στις πέντε περιπτώσεις τα αρσενικά ήταν περισσότερα από τα θηλυκά και η αναλογία φύλου κυμάνθηκε μεταξύ 43% και 48% χωρίς να διαφέρουν στατιστικ;a σημαντικά μεταξύ τους (F=1.85, df=4, p>0.05). Τα περισσότερα θηλυκά αναλογικά εμφανίστηκαν στην LD 50 και LD 70 (48%) ενώ τα λιγότερα στην LD 10 (43%). Πίνακας 8: Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella, στην αναλογία φύλου του Bracon brevicornis Μεταχείριση Αναλογία φύλου control 0.47 ± 0.02a* LD ± 0.02a LD ± 0.02a LD ± 0.02a LD ± 0.01a *μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 65

66 Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην αναλογία φύλου του Bracon brevicornis Η αναλογία φύλου του παρασιτοειδούς που αναπτύχθηκε σε προνύμφες του Galleria mellonella που είχαν εκτεθεί για τις 6 ώρες στην LD 50 ήταν 0,48 ± 0.01, για τις 12 ώρες ήταν 0,47 ± 0.01 και για τις 24 ώρες 0.48 ± Όπως φαίνεται και από το παρακάτω πίνακα (Πίνακα 9) οι μεταχειρίσεις δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά μεταξύ τους, με τα αρσενικά να υπερέχουν σε αριθμό σε όλες τις περιπτώσεις. Πίνακας 9: Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην αναλογία φύλου του Bracon brevicornis Μεταχείριση Ποσοστό επιβίωσης 6 ώρες 0,48a* 12 ώρες 0.47a (F=0.121, df=2, p>0.05) 24 ώρες 0.48a *μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 66

67 Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην διάρκεια ανάπτυξης του Bracon brevicornis Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella στην διάρκεια ανάπτυξης του Bracon brevicornis Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 10) παρουσιάζεται το σύνολο της ανήλικης ζωής αλλά και των επιμέρους σταδίων ανάπτυξης του Bracon brevicornis, όπου αναπτύχθηκαν σε προνύμφες Galleria mellonella που είχαν προηγουμένως τραφεί με τις υποθανατηφόρες δόσεις LD 10, LD 30, LD 50 και LD 70 του B401. Πίνακας 10: Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella στην διάρκεια ανάπτυξης του Bracon brevicornis Μεταχείριση Αυγά (ημέρες) Προνύμφες (ημέρες) Prepupa (ημέρες) Νύμφες (ημέρες) Σύνολο (ημέρες) Control 1.09± 0.02a* 3.07 ± 0.03a 1.10 ± 0.03a 6.93 ± 0.07a ± 0.08a LD ± 0.03a 3.08 ± 0.03a 1.12 ± 0.03a 6.52 ± 0.07a ± 0.09a LD ± 0.03a 3.05 ± 0.02a 1.07 ± 0.03a 6.44 ± 0.07a ± 0.08a LD ± 0.03a 3.03 ± 0.02a 1.04 ± 0.02a 6.41 ± 0.07a ± 0.08a LD ± 0.03a 3.12 ± 0.03a 1.14 ± 0.03a 6.29 ± 0.07a ± 0.07a (F=0.737, df=4, p>0.05) (F=1.774, df=4, p>0.05) (F=1.864, df=4, p>0.05) (F=1.355, df=4, p>0.05) (F=1.800, df=4, p>0.05) *μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά Τόσο στα επιμέρους στάδια ανάπτυξης όσο και στο σύνολο της ανήλικης ζωής δεν παρατηρούνται στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των περοπτώσεων. Η εκκόλαψη των αυγών πραγματοποιήθηκε 1 ημέρα μετά την εναπόθεση των αυγών σε 67

68 όλες τις περιπτώσεις με μικρές αποκλίσεις που δεν ξεπέρασαν τις λίγες ώρες. Το στάδιο της προνύμφης διήρκησε 3 μέρες με μεγαλύτερη διάρκεια στην LD 70 που ο μέσος όρος έφτασε τις 3.12 ± 0.03 ημέρες ενώ την μικρότερη στην LD 50 με μέσο όρο τις 3.03 ± 0.02 ημέρες. Όσον αφορά στο στάδιο της prepupa διήρκησε όσο το στάδιο του αυγού ξεπερνώντας οριακά την 1 μέρα και συγκεκριμένα με μέγιστη διάρκεια 1.14 ± 0.03 στην LD 70. Για το στάδιο της νύμφης, οι τιμές κυμάνθηκαν στις 6 με 7 ημέρες με μεγαλύτερη διάρκεια στο μάρτυρα όπου ο χρόνος ήταν 6.93 ± Αθροίζοντας τους παραπάνω χρόνους ολοκλήρωσης των επιμέρους σταδίων υπολογίζεται η διάρκεια ανάπτυξης, (από την στιγμή της εναπόθεσης του αυγού μέχρι της έξοδου του ενηλίκου) η οποία κυμάνθηκε μεταξύ 11 και 12 ημερών. Συγκεκριμένα, για τον μάρτυρα ήταν ± 0.08 ημέρες, για την LD 10 ήταν ± 0.09 ημέρες, για την LD 30 ήταν ± 0.08 ημέρες, για την LD 50 ήταν 11,58 ± 0,08 ημέρες και για την LD 70 ήταν ± 0.07 ημέρες. Φαίνεται οτι δεν υπάρχει κάποια συσχέτιση μεταξύ της διάρκειας ανάπτυξης και της δοσολογίας του βάκιλλου, καθώς ούτε στατιστικά σημαντικές διαφορές υπάρχουν μεταξύ των μεταχειρίσεων, ούτε κάποια ανάλογή ή αντιστρόφως ανάλογη συμμεταβολή Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην διάρκεια ανάπτυξης του Bracon brevicornis Με τον ίδιο τρόπο παρουσιάζεται και στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 11) το σύνολο της ανήλικης ζωής αλλά και των επιμέρους σταδίων ανάπτυξης του Bracon brevicornis, όπου αναπτύχθηκαν σε προνύμφες Galleria mellonella που είχαν προηγουμένως τραφεί με την υποθανατηφόρο δόση LD 50 του B401 για 6, 12 και 24 ώρες. 68

69 Πίνακας 11: Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην διάρκεια ανάπτυξης του Bracon brevicornis Μεταχείριση Αυγά (ημέρες) Προνύμφες (ημέρες) Prepupa (ημέρες) Νύμφες (ημέρες) Σύνολο (ημέρες) 6 ώρες 1.14 ± 0.03a* 3.04 ± 0.02a 1.03 ± 0.02a 6.42 ± 0.07a ± 0.08a 12 ώρες 1.12 ± 0.03a 3.06 ± 0.02a 1.03 ± 0.02a 6.41 ± 0.07a ± 0.07a 24 ώρες 1.10 ± 0.03a 3.03 ± 0.02a 1.04 ± 0.02a 6.41 ± 0.07a ± 0.08a (F=0.376, df=2, p>0.05) (F=0.559, df=2, p>0.05) (F=0.102, df=2, p>0.05) (F=0.008, df=2, p>0.05) (F=0.121, df=2, p>0.05) *μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά Όπως φαίνεται και από τον πίνακα, η διάρκεια ανάπτυξης του παρασιτοειδούς δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τις διάφορες ώρες έκθεσης του ξενιστή σε τροφή εμποτισμένη με LD 50. Οι τιμές κυμάνθηκαν όπως και στις διάφορες δόσεις. Η εκκόλαψη των αυγών πραγματοποιήθηκε μετά από 1 ημέρα, η διάρκεια ανάπτυξης των προνυμφών ήταν περίπου τρείς μέρες, η διάρκεια της prepupa ήταν 1 ημέρα, το στάδιο της νύμφης διήρκησε γύρω στις 6.5 ημέρες ενώ στο σύνολο η διάρκεια ανάπτυξης έφτασε τις 11,5 ημέρες. Στο σύνολο υπάρχει μια πολύ μικρή αύξηση με την μείωση των ωρών έκθεσης, χωρίς όμως να έχει κάποια βιολογική σημασία ή να μπορεί να εξαχθεί κάποιο σχετικό συμπέρασμα. 69

70 Ημέρες Επίδραση του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) στην διάρκεια ζωής των ενήλικων απογόνων ατόμων του Bracon brevicornis Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella στην διάρκεια ζωής των ενήλικων απογόνων ατόμων του Bracon brevicornis Στην εικόνα 25 φαίνεται η επίδραση που είχαν οι διάφορες μεταχειρίσεις (Μάρτυρας, LD 10, LD 30, LD 50, LD 70 ) στην διάρκεια ζωής των ενήλικων αρσενικών απογόνων (οι προνύμφες τους είχαν αναπτυχθεί σε προνύμφες Galleria mellonella που είχαν τραφεί με τις υποθανατηφόρες δόσεις του B401) του Bracon brevicornis, ενώ στην εικόνα 26 φαίνεται η επίδραση των μεταχειρίσεων στους ενήλικους θηλυκούς απογόνους a b 27.55c 26.04d 25.89d control LD10 LD30 LD50 LD70 Υποθανατηφόρες δόσεις Εικόνα 25: Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella στην διάρκεια ζωής των ενήλικων αρσενικών ατόμων του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 70

71 Ημέρες a 39.72b 36.17c 35.98c 35.99c control LD10 LD30 LD50 LD70 Υποθανατηφόρες δόσεις Εικόνα 26: Επίδραση υποθανατηφόρων δόσεων του B401 για το Galleria mellonella στην διάρκεια ζωής των ενήλικων θηλυκών ατόμων του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά Με βάση τα αποτελέσματα των παραπάνω ιστογραμμάτων παρατηρείται ότι όσο πιο μεγάλη ήταν η δοσολογία τόσο πιο μικρή ήταν η διάρκεια ζωής τόσο των ενήλικων αρσενικών όσο και των ενήλικων θηλυκών ατόμων. Όσον αφορά στα αρσενικά, την μέγιστη διάρκεια ζωής είχαν τα άτομα του μάρτυρα (35.83 ± 0.45 ημέρες) τα οποία είχαν δηλαδή αναπτυχθεί σε προνύμφες Galleria mellonella που είχαν τραφεί σε τροφή χωρίς να είναι εμποτισμένη με βάκιλλο. Ακολούθησαν με φθίνουσα σειρά τα ενήλικα θηλυκά που αναπτύχθηκαν σε προνύμφες που είχαν τραφεί σε τροφή εμποτισμένη με LD 10 (29.63 ± 0.32 ημέρες), με LD 30 (27.55 ± 0.46 ημέρες), με LD 50 (26.04 ± 0.42 ημέρες) και με LD 70 (25.89 ± 0,29 ημέρες). Οι παραπάνω μεταχειρίσεις διαφέρουν στατιστικά σημαντικά μεταξύ τους (F= , df=4, p<0.05), εκτός από την διάρκεια ζωής των ενήλικων αρσενικών μεταξύ της LD 50 και LD 70. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα και για την διάρκεια ζωής των ενήλικων θηλυκών απογόνων. Υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφορές (F= , df=4, 71

72 Ημέρες p<0.05), χωρίς όμως να διαφέρουν οι μεταχειρίσεις της LD 30, LD 50 και LD 70. Έτσι, την μεγαλύτερη διάρκεια ζωής ενήλικων θηλυκών την είχε ο μάρτυρας με ± 0.35 ημέρες και ακολούθησαν η LD 10 με ημέρες, η LD 30 με ± 0.48 ημέρες, η LD 50 με ± 0.37 ημέρες και η LD 70 με ± 0.22 ημέρες Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην διάρκεια ζωής των ενήλικων απογόνων ατόμων του Bracon brevicornis Σε αντίθεση με τις διάφορες δόσης, φαίνεται πως η έκθεση του ξενιστή σε μια συγκεκριμένη δόση (LD 50 ) για 6, 12, και 24 ώρες δεν επηρεάζει την διάρκεια ανάπτυξης ούτε των αρσενικών ούτε των θηλυκών απογόνων του παρασιτοειδούς. Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται η διάρκεια ζωής των αρσενικών (Εικονα 27) και θηλυκών (Εικόνα 28) απογόνων a 26.74a 26.06a h 12h 24h Ώρες έκθεσης Εικόνα 27: Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην διάρκεια ζωής των αρσενικών απογόνων ατόμων του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά 72

73 Ημέρες a 35.70a 35.98a h 12h 24h Ώρες έκθεσης Εικόνα 28: Επίδραση του χρόνου έκθεσης στην LD 50 του B401 του ξενιστή Galleria mellonella στην διάρκεια ζωής των θηλυκών απογόνων ατόμων του Bracon brevicornis. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά Για τα αρσενικά η διάρκεια ζωής των ενήλικων που είχαν αναπτυχθεί σε προνύμφες που τράφηκαν για 6 ώρες με την LD 50 ήταν ± 0.23 ημέρες, για 12 ώρες ± 0.25 ημέρες και για 24 ώρες ± 0.42 ημέρες. Οι μεταχειρίσεις δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά μεταξύ τους (F=1.327, df=2, p>0.05). Η LD 50 επηρέασε την διάρκεια ζωής, μειώνοντας την από το μάρτυρα που είχε αναπτυχθεί σε προνύμφες που είχαν τραφεί σε τροφή χωρις βάκιλο (βλ. παραπάνω) είτε οι προνύμφες εκτέθηκαν για 6 ώρες, είτε για 12 ώρες, είτε για 24 ώρες. Κάτι αντίστοιχο ισχύει και για τους ενήλικους θηλυκούς απογόνους. Οι μεταχειρίσεις δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά μεταξύ τους (F=0.240, df=2, p>0.05), μειωμένες όμως σε σχέση με το μάρτυρα του προηγούμενου πειράματος. Συγκεκριμένα η διάρκεια ζωής των ενήλικων θηλυκών ήταν ημέρες για την έκθεση των προνυμφών του ξενιστή στην LD 50 για 6 ώρες, ± 0.25 ημέρες για 12 ώρες και ± 0.37 ημέρες για 24 ώρες. 73

74 3.4. Συζήτηση Τα βιολογικά εντομοκτόνα, όπως ήδη αναφέρθηκε, χρησιμοποιούνται τα τελευταία χρόνια και αποτελούν μια αποτελεσματική μέθοδο καταπολέμησης για φυσικούς εχθρούς αποθηκευμένων προϊόντων. Ωστόσο, η έρευνα γύρω από τυχόν δυσμενείς επιδράσεις των βιολογικών σκευασμάτων σε ωφέλιμα έντομα είναι περιορισμένη. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ταυτόχρονη χρήση του βιολογικού σκευάσματος Β401 (Bacillus thuringiensis) και του παρασιτοειδούς εντόμου Bracon. brevicornis, για την αντιμετώπιση ενός από τους κυριότερους εχθρούς των μελισσών, του Galleria mellonella. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, η χρήση του Β401 δεν επηρεάσε την ωοτοκία και εκκολαπτικότητα του Bracon brevicornis, αλλά ούτε και την επιβίωση των prepupa και νυμφών του παρασιτοειδούς. Αντίθετα, παρατηρήθηκαν υψηλά ποσοστά θνησιμότητας των προνυμφών του Bracon brevicornis που αναπτύχθηκαν σε προνύμφες του Galleria mellonella, οι οποίες είχαν τραφεί προηγουμένως με τεχνητή τροφή με διάφορες υποθανατηφόρες δόσεις του B401 και σε διάφορες ώρες έκθεσης του ξενιστή. Ακόμα παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στο χρόνο επιβίωσης των ενήλικων απογόνων μετά από ανάπτυξη σε προνύμφες ξενιστή που είχαν τραφεί με διάφορες υποθανατηφόρες δόσεις του B401. Υψηλή θνησιμότητα προνυμφών παρασιτοειδών που αναπτύσσονται σε μολυσμένες προνύμφες ξενιστές έχει παρατηρηθεί και στο παρελθόν (Raguraman and Singh, 1998, Mohan et al. 2008, Akinkurolere et al. 2009). Για παράδειγμα κατά τους Mohan et al. (2008), σε πειράματα τα οποία έγιναν με το ενδοπαρασιτοειδές έντομο Campoletis chlorideae Uchida (Hymenoptera: Ichneumonidae) σε προνύμφες του Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae), που είχαν τραφεί προηγουμένως σε υποθανατηφόρες δόσεις του Bacillus thuringiensis kurstaki, παρατηρήθηκαν υψηλά ποσοστά θνησιμότητας στις προνύμφες του παρασιτοειδούς και οι απόγονοί του αναπτύσσονταν με αργούς ρυθμούς. Τα σκευάσματα αναμένεται να επηρεάσουν τους φυσικούς εχθρούς, είτε μέσω της άμεσης διατροφής των ενήλικων ή έμμεσα όταν τρέφονται με τις προνύμφες όπου έχουν τραφεί από ξενιστή τρεφόμενο με βάκιλο. Η επίδραση αυτή στην επιβίωση και την ανάπτυξη των παρασιτοειδών μπορεί να οφείλεται στο μειωμένο μέγεθος λείας λόγω του 74

75 βακίλου, στην κακή διατροφική ποιότητα ή και τις τοξίνες που περιέχονται στον ίδιο τον ξενιστή από τον βάκιλο (Mohan et al. 2008). Οι ξενιστές είναι μικροί σε μέγεθος με κακή διατροφική ποιότητα για να παρέχουν τα απαραίτητα για τη σωστή ανάπτυξη των παρασιτοειδών (Romeis et al. 2006). Επίσης μία από τις πιθανές εξηγήσεις για το θέμα αυτό θα μπορούσε να είναι ο πρόωρος θάνατος των ξενιστών, το οποίο έχει αναφερθεί από τον Nguyen et al. (2005) για το παρασιτοειδές Meteorus pulchricornis. Μερικές φορές, οι προνύμφες των παρασιτοειδών παρουσιάζουν παρατεταμένη προνυμφική ανάπτυξη, μειωμένο βάρος και αλλαγμένη συμπεριφορά. Τυπικό παράδειγμα έμμεσων επιπτώσεων βακίλου σε ωφέλιμα, που οφείλονται σε μείωση της ποιότητας του ξενιστή είναι μια μελέτη για το αρπακτικό Chrysoperla carnea. Όταν οι προνύμφες του τρέφονταν με προνύμφες Λεπιδοπτέρων που είχαν προηγουμένως τραφεί με γενετικά τροποποιημένο καλαμπόκι που εκφράζει την cry1 τοξίνη, η ανάπτυξη των προνυμφών ήταν σημαντικά παρατεταμένη και παρατηρήθηκε υψηλή θνησιμότητα. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν συνέπεια των υποθανατηφόρων δόσεων στα Λεπιδόπτερα ξενιστές, όπου ήταν χαμηλότερης θρεπτικής ποιότητας (Dutton et al. 2002). Ο Grbin (1997) ανέφερε οτι ο βάκιλος που σκότωσε 40 % των προνυμφών της Plutella xylostella όχι μόνο επιβράδυνε την ανάπτυξη των επιζώντων ατόμων, αλλά οδήγησε σε μια πιο αργή ανάπτυξη παρασιτοειδούς Cotesia plutellae. Ωστόσο, η μικρή παράταση της ζωής του παρασιτοειδούς, όπως παρατηρήθηκε και στην παρούσα μελέτη δεν θα μπορούσε να έχει οποιαδήποτε βιολογική σημασία. Στην παρούσα μελέτη επίσης φαίνεται ότι επηρεάζεται η διάρκεια ζωής των απογόνων του παρασιτοειδούς. Σε όσες προνύμφες αναπτύχθηκαν σε ξενιστές τρεφόμενους με βάκιλο μειώθηκε ο χρόνος επιβίωσης των ενήλικων απογόνων. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με άλλες μελέτες που υποστηρίζουν ότι δεν επηρεάζεται σημαντικά η επιβίωση των απογόνων ενηλίκων (Akinkurolere et al. 2009). Στην μελέτη αυτή φαίνεται ότι η ζωή των απογόνων δεν επηρεάζεται άμεσα από την τοξίνη του βάκιλου. Η μακροβιότητα των ενηλίκων μειώθηκε μόνο όταν τα παρασιτοειδή αναπτύχθηκαν από μερικούς ξενιστές που είχαν επηρεαστεί πολύ από τον βάκιλο (Mohan et al. 2008, Liu et al. 2005). Ωστόσο, αυτή η παρατήρηση είναι σε αντίθεση με τα ευρήματα της παρούσης μελέτης όπως προαναφέρθηκε αλλά και της μελέτης του Salama et al. (1991), όπου ανέφεραν ότι η ανάπτυξη και η αναπαραγωγή του Bracon brevicornis επηρεάστηκαν 75

76 αρνητικά μετά απο τροφοδότηση με μέλι εμποτισμένο με την τοξίνη του βακίλου. Επίσης αν η τοξίνη σκοτώνει τον ξενιστή πάρα πολύ γρήγορα ή καθυστερεί η ανάπτυξη, το παρασιτοειδές δεν έχει επαρκείς πόρους για να αναπτυχθεί (Liu et al., 2005, Mohan et al. 2008). Εν κατακλείδι, είναι απαραίτητο να κατανοηθούν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των παραγόντων βιολογικού ελέγχου. Ο βάκιλος έχει προταθεί ως αβλαβές για τα ωφέλιμα λόγω της χαμηλής άμεσης τοξικότητας. Ωστόσο, φαίνεται από αυτή την μελέτη ότι ο Bacillus thuringiensis var. aizwai σκοτώνει τις προνύμφες του Bracon brevicornis έμμεσα μέσω του ξενιστή του (Galleria mellonella). Ως εκ τούτου, η επιτυχής χρήση πολλαπλών παραγόντων βιολογικού ελέγχου θα εξαρτηθεί από την στενή παρακολούθηση της συμβατότητάς τους. 76

77 Κεφάλαιο 4: Πρακτική εφαρμογή Βιοδοκιμές στο εργαστήριο 4.1. Εισαγωγή Δύο ή περισσότεροι βιολογικοί παράγοντες ελέγχου μπορεί να θεωρηθεί ότι δρουν συνεργιστικά στον έλεγχο του πληθυσμού των επιβλαβών οργανισμών, όταν τα αποτελέσματα του ελέγχου που ασκούν σε συνδυασμό υπερβαίνει το άθροισμα των αποτελεσμάτων που θα αναμενόταν αν ενεργούσαν εντελώς ανεξάρτητα (Robertson and Priesler 1992). Όταν το καθαρό αποτέλεσμα των εξαρτημένων δράσεων είναι η αξιοποίηση ενός αποτελέσματος, το αποτέλεσμα ονομάζεται συνέργια. Αν έχουμε όμως μείωση του αποτελέσματος, περιγράφεται ως παρέμβαση ή ανταγωνισμό. Οι επιδράσεις μπορεί να εκφράζονται με διάφορους τρόπους, όπως στην θνησιμότητα ή στο χρόνο θανάτωσης, ή ακόμη και στην ζημιά των καλλιεργειών ή την απόδοση τους. Η συνέργεια μεταξύ διαφόρων παραγόντων είναι σύνηθες φαινόμενο στα διάφορα περιβάλλοντα. Ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα μπορεί μερικές φορές να οφείλεται στη συνδυασμένη δράση των δύο ή περισσοτέρων παραγόντων ακόμα και όταν η αλληλεπίδρασή τους δεν επηρεάζει άμεσα την ευαισθησία του ξενιστή ή την μολυσματικότητα ή ικανότητα παρασιτισμού. Αλληλεπιδράσεις στις οποίες τα διάφορα είδη δεν έρχονται σε άμεση επαφή έχουν οριστεί ως έμμεσες αλληλεπιδράσεις (Wootton, 1994). Οικονομική συνέργεια είναι ένας χρήσιμος όρος που χρησιμοποιείται για αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν στον αγρό ή τα θερμοκήπια ή την αποθήκη (Benz 1971). Το αποτέλεσμα δεν κρίνεται από την καταπολέμηση του εχθρού, αλλά μάλλον από την μείωση των ζημιών στις καλλιέργειες ή την αύξηση της απόδοσης. Η χρησιμότητα αυτού του όρου είναι εύκολα εμφανές στον τομέα της έρευνας, όπου οι διάφοροι παράγοντες ελέγχου αλλά και οι αλληλεπιδράσεις που παράγει ένα συνεργιστικό αποτέλεσμα μπορεί να είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Σε μελέτες του για την τοξική επιπτώση των χημικών μειγμάτων, ο Bliss (1939) καθόρισε τρεις βασικούς τύπους κοινής δράσης: την ανεξάρτητη δράση, την παρόμοια δράση και την συνεργιστική δράση. 77

78 Ο συνεργισμός μεταξύ των παραγόντων μπορεί να οφείλεται σε διάφορους μηχανισμούς. Πιο κοινός μηχανισμός είναι όταν οι δυο παράγοντες επιδρούν στην φυσιολογία του εχθρού εντόμου, έχοντας κοινό στόχο κατά του εντόμου. Για παράδειγμα, η μικροβιακή μόλυνση θέτει σε κίνδυνο το ανοσοποιητικό σύστημα ενός εντόμου, αφήνοντάς το πιο ευάλωτο σε μια εισβολή από ένα παράσιτο ή αντιθέτως, όταν ένα έντομο είναι παρασιτισμένο ή υπό την πίεση ενός άρπαγα τότε γίνεται πιο ευάλωτο στα διάφορα παθογόνα. Οι τοξίνες που παράγονται από παθογόνα βακτήρια ή μύκητες αναστέλλουν την κυτταρική ανοσο-αποκρίση στα έντομα (Boucias and Pendland 1998) και έτσι είναι πιο ευάλωτα σε ένα ευρύ φάσμα των εχθρών. Επίσης, προνύμφες εντόμων προσβεβλημένες από Bacillus popilliae έχουν αποδυναμωμένο το τοίχωμα του μέσου εντέρου προνύμφες, καθιστώντας αυτές πιο επιρρεπής σε διείσδυση από παρασιτικούς νηματώδεις (Thurston et al. 1994). Ακόμα, προνύμφες μετά από την έκθεση τους στον παθογόνο Bacillus thuringiensis japonensis έχουν δειχθεί ότι είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε νηματώδεις λόγω άγνωστων μηχανισμών (Koppenhöfer and Kaya 1997). Τέτοιες επιδράσεις των παθογόνων μικροβίων ή μικροβιακές τοξίνες στο τοίχωμα του εντέρου ή άλλα μέρη του σώματος μπορεί επίσης να προδιαθέτουν ένα ξενιστή στην εισβολή από παράσιτα. Ένας άλλος μηχανισμός είναι η επίδραση στην ανάπτυξη του εντόμου ξενιστή. Η ανώμαλη ανάπτυξη είναι ένα κοινό αποτέλεσμα παρασιτισμού ή της προσβολής από παθογόνα. Έντομα με προσβολές από παθογόνα, έχουν κακή ανάπτυξη και έτσι, είναι πιο ευάλωτα σε αρπακτικά και παρασιτοειδή ειδικά σε περιπτώσεις που τα μικρότερα στάδια του εντόμου είναι πιο ευάλωτα. Από την άλλη πλευρά, παρατηρήθηκε από τον Hochberg (1991), ότι η διάρκεια ζωής των προνύμφων της Pieris brassicae L που φέρουν τόσο το παρασιτοειδές Apanteles glomeratus L και ένα granu-ιό ήταν μικρότερη από εκείνη των νυμφών που έχουν μολυνθεί μόνο από τον ιό. Επίσης μπορεί να επηρεάζεται η συμπεριφορά του ξενιστή. Οι επιπτώσεις της μικροβιακής μόλυνσης που περιγράφονται παραπάνω συνήθως, περιλαμβάνουν μη φυσιολογική συμπεριφορά και, μια μεγάλη ποικιλία από αλλαγμένη συμπεριφορά αυξάνοντας σημαντικά την ευαισθησία σε διάφορους φυσικούς εχθρούς. Οι Lopez και Ferro (1995) και Cloutier και Jean (1998) απέδειξαν ότι η εξασθένηση των προνύμφών ενός σκαθαριού της πατάτας από τον Βacillus thuringiensis, το έκανε λιγότερο ικανό να 78

79 αποκρούσει τις επιθέσεις από φυσικούς εχθρούς όπως άτομα της οικογένειας Τachinidae. Τέλος, πολλές φορές οι αλληλεπιδράσεις εχθρών-παθογόνων-ξενιστών εξαρτώνται από την πυκνότητα των πληθυσμών των ξενιστών (όσο αυξάνονται αυξάνεται και ο αριθμός των πιθανών ξενιστών ως ένα σημείο). Αυτό δημιουργεί ισχυρές πιέσεις στους πληθυσμούς των εντόμων και σε πολλές περιπτώσεις, τους εμποδίζει να περάσουν το οικονομικό όριο (Ο.Α.Π) (Berryman, 1999). Αυτό ισχύει κυρίως για άρπαγες υψηλής απόδοσης, των οποίων η αποτελεσματικότητα είναι υψηλή σε μεγάλο εύρος ξενιστών (DeBach and Rosen 1991). Συνήθως, όμως, η αποτελεσματικότητα των εχθρών σε υψηλές πυκνότητες ξενιστών δεν είναι ικανοποιητική (λόγω handling time). Αυτό είναι το κοινό πρόβλημα που σχετίζεται με βιολογικό έλεγχο, και μία από τις στρατηγικές που επιδιώκεται ως λύση είναι η συνδυασμένη δράση πολλών μέσων. Σε τέτοια προγράμματα, υπάρχουν δυνατότητες για ένα ευρύ φάσμα αλληλεπιδράσεων μεταξύ αυτών των μέσων, συμπεριλαμβανομένης και της συνέργιας. Βασικές προϋποθέσεις για την συνδυασμένη χρήση παθογόνων και παρασιτοειδών είναι (Opender and Dhaliwal. 2003): το παθογόνο να μπορεί να παράγει στάδια έκτος εντόμων το παράσιτο ή το παθογόνο να είναι μέτριo σε μέγεθος το σύμπλεγμα φυσικοί εχθροί-παθογόνα να έχουν υψηλά ποσοστά μετάδοσης και διασποράς και να υπάρχει κάποιος βαθμός επικάλυψης στο χρονοδιάγραμμα των επιθέσεων των εχθρών και της προσβολής από το παθογόνο. Σκοπός αυτού του κεφαλαίου ήταν η μελέτη της δυνατότητας εφαρμογής των παρασιτοειδών στις αποθήκες κηρηθρών και πόσο αποτελεσματικός είναι ο συνδυασμός τους με βιολογικά σκευάσματα βακίλου. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η αποτελεσματικότητα της εξαπόλυσης του Bracon brevicornis, του σκευάσματος Β401 καθώς και της ταυτόχρονης χρήσης τους, καθώς και πώς τα παραπάνω επηρέασαν την καταστροφή και μείωση του βάρους των πλαισίων. 79

80 4.2. Υλικά και μέθοδοι Έντομα Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν έντομα των εργαστηριακών εκτροφών και συγκεκριμένα νεαρά ενήλικα μίας ημέρας του Bracon brevicornis καθώς και προνύμφες 3 ης - 4 ης ηλικίας του Galleria mellonella. Η μέθοδος εκτροφής των εντόμων περιγράφηκε αναλυτικά στο Κεφάλαιο Βιοδοκιμές Για τις βιοδοκιμές χρησιμοποιήθηκαν φυσικά πλαίσια κηρήθρας, τα οποία αποθηκεύονταν για 24 ώρες σε καταψύκτη για να θανατωθούν πιθανώς αυγά ή προνύμφες από Galleria mellonella τα οποία μπορεί να προϋπήρχαν στα πλαίσια ή να αποτραπεί οποιαδήποτε προσβολή στο εργαστήριο πριν από την διεξαγωγή των πειραμάτων. Για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας του Bracon brevicornis, 50 προνύμφες του Galleria mellonella 3 ης - 4 ης προνυμφικής ηλικίας μεταφέρονταν σε πλαίσια κηρήθρας και αφήνονταν για 6 ώρες ώστε να εγκατασταθούν. Στην συνέχεια, 5 νεαρά σε ηλικία ζευγάρια Bracon brevicornis εξαπολύονταν ώστε να παρασιτήσουν τις προνύμφες του Galleria mellonella. Για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας του Β401, 50 προνύμφες του Galleria mellonella 3 ης - 4 ης ηλικίας μεταφέρονταν σε πλαίσια κηρήθρας τα οποία είχαν ψεκαστεί την προηγούμενη μέρα με το σκεύασμα Β401. Η δόση που χρησιμοποιήθηκε ήταν η συνιστώμενη από τις οδηγίες χρήσεως και συγκεκριμένα 1 ml ανά 20ml νερό ανά πλαίσιο. Για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας της συνδυασμένης δράσης του σκευάσματος και του παρασιτοειδόυς, 50 προνύμφες του Galleria mellonella 3 ης - 4 ης ηλικίας μεταφέρονταν σε πλαίσια κηρήθρας που είχε ψεκαστεί την προηγούμενη μέρα με την συνιστώμενη δόση Β401 (βλ. παραπάνω) και αφήνονταν για 6 ώρες ώστε να εγκατασταθούν. Στην συνέχεια, 5 νεαρά σε ηλικία ζευγάρια Bracon brevicornis εξαπολύονταν ώστε να παρασιτήσουν τις προνύμφες του Galleria mellonella. Στο 80

81 μάρτυρα τοποθετήθηκαν 50 προνύμφες Galleria mellonella χωρίς να γίνει εξαπόλυση παρασιτοειδών και ψεκασμός πλαισίων. Τα πλαίσια κηρήθρας ήταν τοποθετημένα σε χάρτινα κουτιά διαστάσεων 50cm x 30cm x 10cm (για κάθε επανάληψη χρησιμοποιούνταν το μισό πλαισιο ~ 340cm 2 ). Μαζί με τα ζευγάρια του παρασιτοειδούς (όπου γινόταν εξαπόλυση) τοποθετούνταν και πλαστικά καπάκια διαμέτρου 6cm με σταγόνες υδατικού διαλύματος μελιού 10%, σε περίπτωση που τα πλαίσια δεν είχαν μέλι για να τραφούν τα παρασιτοειδή. Η θνησιμότητα και ο παρασιτισμός ελέγχονταν μετά από 10 ημέρες και το πείραμα επαναλήφθηκε 20 φορές. Για την επίδραση των επεμβάσεων στην καταστροφή της επιφάνειας των πλαισίων, μετριόταν η επιφάνεια πριν την είσοδο των προνυμφών του Galleria mellonella και μετά το πέρας των πειραμάτων, δηλαδή μετά από 10 ημέρες. Η καταστροφή εκφράστηκε ως ο λόγος της κατεστραμμένης επιφάνειας προς την αρχική επιφάνεια. Εικόνα29: Χάρτινα κουτιά τοποθέτησης κηρηθρών 81

82 Για την επίδραση των επεμβάσεων στην μείωση του βάρους των πλαισίων, μετριόταν το βάρος πριν την είσοδο των προνυμφών του Galleria mellonella και μετά το πέρας των πειραμάτων, δηλαδή μετά από 10 ημέρες. Η μείωση εκφράστηκε ως ο λόγος του τελικού βάρους (οι νεκρές προνύμφες και τα αποχωρήματα τους απομακρύνονταν) προς το αρχικό βάρος Στατιστική ανάλυση Η αποτελεσματικότητα της εξαπόλυσης του παρασιτοειδόυς Bracon brevicornis, του σκευάσματος Β401 (Bacillus thuringiensis var.aizawai) και της συνδυασμένης δράσης τους εναντίον του Galleria mellonella καθώς και η κατεστραμμένη επιφάνεια και η μείωση του βάρους μελετήθηκε εφαρμόζοντας ανάλυση παραλλακτικότητας (One way ANOVA). Οι μέσοι όροι συγκρίθηκαν με το κριτήριο του Tukey s-b για επίπεδο σημαντικότητας P = 0,05. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη βοήθεια του στατιστικού προγράμματος SPSS 21 (SPSS Inc. 2006). Επίσης στα αποτελέσματα έγινε μετασχηματισμός δεδομένων σε τόξο εφαπτομένης.. 82

83 4.3.Αποτελέσματα Αποτελεσματικότητα του Bracon brevicornis, του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) και της συνδυασμένης δράσης τους εναντίον του Galleria mellonella Στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 30) φαίνεται η αποτελεσματικότητα του Bracon brevicornis, του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) και της συνδυασμένης δράσης τους εναντίον του Galleria mellonella. B401+Bracon b B c Bracon 99.70b control 5.90a Ποσοστό αποτελεσματικότητας(%) Εικόνα 30: Αποτελεσματικότητα του Bracon brevicornis, του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) και της συνδυασμένης δράσης τους εναντίον του Galleria mellonella. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά (F= , df=3, p<0.05) Η υψηλότερη θνησιμότητα άρα και αποτελεσματικότητα παρατηρήθηκε στην συνδυασμένη δράση του παρασιτοειδούς και του βιολογικού σκευάσματος Β401 με ποσοστό 100% σε όλες τις επαναλήψεις. Αμέσως μικρότερη αποτελεσματικότητα και χωρίς να διαφέρει στατιστικά σημαντικά από την συνδυασμένη δράση, είχε η εξαπόλυση του παρασιτοειδούς, η οποία έφτασε το ποσοστό 99,70 ± 1,64%. Τονίζεται ότι στις 83

84 περισσότερες επαναλήψεις (στις 17 από τις 20) η αποτελεσματικότητα ήταν ίδια με αυτή της συνδυασμένης (100%) με εξαίρεση τρεις επαναλήψεις. Σε αυτές τις τρείς περιπτώσεις τα παρασιτοειδή δεν κατάφεραν να παρασιτήσουν όλες τις προνύμφες. Σχετικά μέτρια και αρκετά πιο χαμηλή ήταν η αποτελεσματικότητα του σκευάσματος Β401 με ποσοστό ± 1.49%. Η αποτελεσματικότητα του βακίλου διαφέρει στατιστικά σημαντικά και είναι χαμηλότερη από εκείνη της συνδυασμένης δράσης του σκευάσματος και του παρασιτοειδούς αλλά και της εξαπόλυσης του παρασιτοειδούς μεμονωμένα. Είναι όμως μεγαλύτερη από εκείνη του μάρτυρα, όπου η θνησιμότητα χωρίς εφαρμογή του σκευάσματος και εξαπόλυση του παρασιτοειδούς ήταν 5.90 ± 0.95%. Άξιο λόγου είναι η ικανότητα των παρασιτοειδών να βρίσκουν και να παρασιτούν τις προνύμφες εντός των στοών που είχαν δημιουργήσει κατά την τροφική τους δραστηριότητα (Εικόνα 31). Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι στην συνδυασμένη δράση παρασιτοειδούς και βακίλου, αν και η θνησιμότητα ήταν αρκετά υψηλή δεν παρατηρήθηκε ο ίδιος βαθμός παρασιτισμού, ή τουλάχιστον το ίδιο ποσοστό επιβίωσης των παρασιτοειδών. Η συγκεκριμένη παρατήρηση έγινε οπτικά με την διαπίστωση παρουσίας προνυμφών του παρασιτοειδούς στις προνύμφες του Galleria mellonella. Αυτό είναι απόρροια δυο παραγόντων: πρώτον της θνησιμότητας των προνυμφών του ξενιστή από το βάκιλο και δεύτερον της επίδρασης του βακίλου στην επιβίωση των παρασιτοειδών. 84

85 α β γ δ Εικόνα 31: α) Prepupa Bracon brevicornis εντός στοάς β) Προνύμφες Bracon brevicornis πάνω σε Galleria mellonella γ) Νύμφες Bracon brevicornis ανάμεσα σε αποχωρήματα Galleria mellonella δ) Νύμφες Bracon brevicornis 85

86 Μείωση της προκαλούμενης καταστροφής της επιφάνειας του πλαισίου μετά από την εφαρμογή του Bracon brevicornis, του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) και της συνδυασμένης δράσης τους εναντίον του Galleria mellonella Τα αποτελέσματα για την προκαλούμενη καταστροφή της επιφάνειας του πλαισίου μετά από την εφαρμογή του Bracon brevicornis, του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) και της συνδυασμένης δράσης τους εναντίον του Galleria mellonella, φαίνονται στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 32). Καταστροφή θεωρήθηκε οποιαδήποτε παραμόρφωση της επιφάνειας του πλαισίου, στοών εξ αιτίας της τροφικής δραστηριότητας, ύπαρξη αποχωρημάτων και ιστών που δημιουργούσαν οι προνύμφες. B401+Bracon 3.57c B b Bracon 9.07b control 54.73a Ποσοστό καταστροφής Εικόνα 32: Μείωση της προκαλούμενης καταστροφής της επιφάνειας του πλαισίου μετά από την εφαρμογή του Bracon brevicornis, του B401 (Bacillus thuringiensis var. aizawai) και της συνδυασμένης δράσης τους εναντίον του Galleria mellonella. Μέσοι όροι που ακολουθούνται από ίδιο γράμμα δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά (F= , df=3, p<0.05) 86

87 Όπως ήταν αναμενόμενο, η μεγαλύτερη καταστροφή καταγράφηκε στον μάρτυρα με ποσοστό ± 0.63%. Η καταστροφή του μισού και πλέον πλαισίου από τις προνύμφες θεωρείται επιζήμια καθώς το πλαίσιο είναι ακατάλληλο για χρήση. Οι προνύμφες του Galleria mellonella δημιούργησαν στοές στην κηρήθρα, κατανάλωσαν κερί, μέλι αλλά και γύρη σε όποιες περιπτώσεις αυτά υπήρχαν. Μάλιστα παρατηρήθηκε ότι όταν το πλαίσιο είχε μέλι και γύρη η ανάπτυξη των προνυμφών ήταν πιο γρήγορη από ότι στα πλαίσια στα οποία δεν υπήρχαν. Επίσης, υπήρχαν άφθονα αποχωρήματα και έντονη παρουσία ιστών επάνω και εντός των πλαισίων (Εικόνα 33). Σε αντίθεση με τον μάρτυρα, η καταστροφή των πλαισίων στις υπόλοιπες μεταχειρίσεις ήταν αρκετά μικρή χωρίς να ξεπερνάει το 10%. Στην επέμβαση της εξαπόλυσης του παρασιτοειδούς η καταστροφή έφτασε το 9.07 ± 0.57% και στην επέμβαση του σκευάσματος Β401 ήταν 8.95 ± 0.81%. Γενικά, παρατηρήθηκε μειωμένη ύπαρξη αποχωρημάτων και ιστών, ενώ ο αριθμός και το μήκος των στοών περιορίστηκαν σε μεγάλο βαθμό (Εικόνα 34). Ειδικά στις εφαρμογές του σκευάσματος Β401 (Εικόνα35) οι προνύμφες, οι οποίες δεν πέθαναν, είχαν την τάση να αναπτύσσονται περιμετρικά των πλαισίων ή εκτός αυτών. Ακόμα η ανάπτυξή τους ήταν αρκετά αργή έως μηδενική καθώς οι περισσότερες είτε δεν εκδύονταν είτε προτιμούσαν να κρύβονταν σε τρύπες όπου άνοιγαν στο κουτί. Οι δύο αυτές επεμβάσεις δεν διαφέρουν στατιστικά σημαντικά μεταξύ τους, αλλά διαφέρουν από τον μάρτυρα και την συνδυασμένη επέμβαση. Η μικρότερη καταστροφή πλαισίων καταγράφηκε στην συνδυασμένη επέμβαση, δηλαδή όταν έγινε η εξαπόλυση των παρασιτοειδών αλλά και ο ψεκασμός των πλαισίων με το σκεύασμα Β401. Συγκεκριμένα, το ποσοστό αυτό ήταν 3.57 ± 0.39% και η παρουσία στοών, ιστών και αποχωρημάτων ήταν πάρα πολύ μικρή (Εικόνα 36). Οι προνύμφες του Galleria mellonella δεν κατάφεραν να καταστρέψουν το πλαίσιο της κηρήθρας σε ποσοστό ώστε να είναι ακατάλληλο για χρήση. Έτσι, αν και η αποτελεσματικότητα δεν διαφέρει μεταξύ του παρασιτοειδούς και της συνδυασμένης δράσης, η δεύτερη είναι πιο επιθυμητή καθώς επιτυγχάνεται η μέγιστη αποτελεσματικότητα με την ελάχιστη καταστροφή των κηρηθρών. Στην εικόνα 37 φαίνεται η διαφορά της καταστροφής μεταξύ των επεμβάσεων. 87

88 Εικόνα 33: Καταστροφή πλαισίου στο μάρτυρα Εικόνα 34: Καταστροφή πλαισίου μετα από εξαπόλυση Bracon brevicornis 88

89 Εικόνα 35: Καταστροφή πλαισίου μετα από εφαρμογή Β401 Εικόνα 36: Καταστροφή πλαισίου μετά από εξαπόλυση εφαρμογή Β401 και Bracon 89 brevicornis

90 α β γ δ Εικόνα 37: α) Μάρτυρας β) Bracon brevicornis γ)β401 δ) Β401 + Bracon brevicornis 90