ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΑΡΓΑΡΙΤΕΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΑΡΓΑΡΙΤΕΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Α.Π.Θ. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟ ΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΑΝΘΕΛΜΙΝΘΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΕ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο της Φαρμακευτικής Ανάλυσης του Τομέα Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Ευχαριστώ εγκάρδια την επιβλέπουσα της διπλωματικής, Επίκουρη Καθηγήτρια Αικατερίνη Μαρκοπούλου για την υπόδειξη του θέματος, τη συνεχή καθοδήγηση και τις εύστοχες υποδείξεις της, τόσο κατά τη διεξαγωγή του πειραματικού μέρους, όσο και κατά το στάδιο συγγραφής της παρούσας εργασίας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Ιωάννη Κουντουρέλλη και τον Αναπληρωτή Καθηγητή Γεώργιο Ζαχαριάδη που με τίμησαν με τη συμμετοχή τους στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Ευχαριστώ επίσης θερμά όλους του διδάσκοντες μου στο ΠΜΣ για τη βοήθεια και το αμέριστο ενδιαφέρον που έδειξαν καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την υποψήφια διδάκτορα Μαρία Κούσκουρα για την άριστη συνεργασία, το ευχάριστο φιλικό κλίμα εντός του εργαστηρίου και για την πολύτιμη βοήθειά της, όποτε τη χρειάστηκα. Τέλος, οφείλω να ευχαριστήσω τους γονείς μου για τη στήριξη και τη συμπαράσταση τους καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Η συνεισφορά τους σε κάθε μου προσπάθεια είναι ανεκτίμητη. ii

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ii iii vii Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 1 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ ΓΕΝΙΚΑ ΕΙ Η ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ HPLC ΣΥΣΤΗΜΑ ΠΑΡΟΧΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗΣ ΕΙΓΜΑΤΟΣ ΣΤΗΛΗ ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ ΙΑΦΟΡΙΚΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΕΙΚΤΗ ΙΑΘΛΑΣΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΥΠΕΡΙΩ ΟΥΣ ΟΡΑΤΟΥ (UV-Vis ) ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΠΑΡΑΤΑΞΗΣ ΦΩΤΟ ΙΟ ΙΩΝ ΗΛΕΚΤΡΙΚΟΣ (ΑΜΠΕΡΟΜΕΤΡΙΚΟΣ) ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΜΑΖΩΝ ΕΞΑΤΜΙΣΤΙΚΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΣΚΕ ΑΣΗΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ (ELSD) ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΑΤΑΓΡΑΦΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΣΤΗΝ HPLC 16 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 18 ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ UV-VIS ΓΕΝΙΚΑ ΝΟΜΟΣ BEER ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ UV-VIS ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΟΒΟΛΗΣ ΜΕΡΙΚΩΝ ΕΛΑΧΙΣΤΩΝ ΤΕΤΡΑΓΩΝΩΝ (PLS) ΣΕ ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΕΣ ΟΜΕΣ 22 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 26 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΑ ΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΥ ΕΙ Η ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΣΧΕ ΙΑΣΜΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΙΚΟΙ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΙ 29 iii

4 3.3.2 ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΙ SIMPLEX ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΙ ΕΠΙΦΑΝΕΙΩΝ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΙ ΜΙΓΜΑΤΩΝ ΒΕΛΤΙΣΤΟΙ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΙ 32 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 34 ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ 34 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 38 ΕΛΜΙΝΘΙΑΣΕΙΣ - ΑΝΘΕΛΜΙΝΘΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΜΕΒΕΝ ΑΖΟΛΗ ΑΛΒΕΝ ΑΖΟΛΗ ΘΕΙΑΒΕΝ ΑΖΟΛΗ ΙΒΕΡΜΕΚΤΙΝΗ ΤΕΤΡΑΜΙΣΟΛΗ - ΛΕΒΑΜΙΣΟΛΗ ΙΑΙΘΥΛΚΑΡΒΑΜΑΖΙΝΗ ΠΙΠΕΡΑΖΙΝΗ ΠΑΜΟΪΚΗ ΠΥΡΑΝΤΕΛΗ ΠΑΜΟΪΚΟ ΠΥΡΒΙΝΙΟ ΠΡΑΖΙΚΟΥΑΝΤΕΛΗ ΝΙΚΛΟΖΑΜΙ Η 54 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 55 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 55 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 55 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 57 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΙΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΜΗΤΡΙΚΑ ΚΑΙ ΠΡΟΤΥΠΑ ΙΑΛΥΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΟΥΣΙΩΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΛΕΒΑΜΙΣΟΛΗΣ, ΘΕΙΑΒΕΝ ΑΖΟΛΗΣ, ΜΕΒΕΝ ΑΖΟΛΗΣ, ΑΛΒΕΝ ΑΖΟΛΗΣ, ΠΡΑΖΙΚΟΥΑΝΤΕΛΗΣ ΚΑΙ ΝΙΚΛΟΖΑΜΙ ΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑΤΟΣ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΥ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΓΡΑΜΜΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΕΥΡΟΥΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑΣ, ΕΝ ΙΑΜΕΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΑΚΡΙΒΕΙΑΣ 92 iv

5 7.6 ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΕΤΡΑΜΙΣΟΛΗΣ ΚΑΙ ΙΑΙΘΥΛΚΑΡΒΑΜΑΖΙΝΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΓΡΑΜΜΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΕΥΡΟΥΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑΣ, ΕΝ ΙΑΜΕΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΑΚΡΙΒΕΙΑΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΒΕΡΜΕΚΤΙΝΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΓΡΑΜΜΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΕΥΡΟΥΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑΣ, ΕΝ ΙΑΜΕΣΗΣ ΕΠΑΝΑΛΗΠΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΑΚΡΙΒΕΙΑΣ 106 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΑΝΘΕΛΜΙΝΘΙΚΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΙΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΙΑΛΥΜΑΤΩΝ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΟΥΣΙΩΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΙ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ 1 ΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΟΥ ΦΑΣΜΑΤΩΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΛΕΒΑΜΙΣΟΛΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Α ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΕΤΡΑΜΙΣΟΛΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Α ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΙΠΕΡΑΖΙΝΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Α ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΑΙΘΥΛΚΑΡΒΑΜΑΖΙΝΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Α ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΝΙΚΛΟΖΑΜΙ ΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Β ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΒΕΡΜΕΚΤΙΝΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Α ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΑΜΟΪΚΗΣ ΠΥΡΑΝΤΕΛΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Γ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ 143 v

6 8.6.8 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΑΜΟΪΚΟΥ ΠΥΡΒΙΝΙΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Β ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΕΒΕΝ ΑΖΟΛΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Γ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΛΒΕΝ ΑΖΟΛΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Γ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΘΕΙΑΒΕΝ ΑΖΟΛΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Β ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΑΖΙΚΟΥΑΝΤΕΛΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Α ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΛΕΒΑΜΙΣΟΛΗΣ - ΘΕΙΑΒΕΝ ΑΖΟΛΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΕΤΡΑΜΙΣΟΛΗΣ - ΙΑΙΘΥΛΚΑΡΒΑΜΑΖΙΝΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΛΕΒΑΜΙΣΟΛΗΣ ΘΕΙΑΒΕΝ ΑΖΟΛΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Β ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΕΤΡΑΜΙΣΟΛΗΣ ΙΑΙΘΥΛΚΑΡΒΑΜΑΖΙΝΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΕΚ ΟΧΟΥ Α ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΙ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ TΗΣ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ PLS 191 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 195 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 201 vi

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για τον προσδιορισμό ανθελμινθικών ουσιών σε φαρμακευτικά σκευάσματα με ταυτόχρονη συγκριτική μελέτη των αποτελεσμάτων τους. Συγκεκριμένα εξετάστηκαν οι δραστικές ουσίες μεβενδαζόλη, αλβενδαζόλη, θειαβενδαζόλη, ιβερμεκτίνη, τετραμισόλη, λεβαμισόλη, διαιθυλκαρβαμαζίνη, πιπεραζίνη, παμοϊκή πυραντέλη, παμοϊκό πυρβίνιο, πραζικουαντέλη και νικλοζαμίδη με εφαρμογή: i) Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (ΥΧΥΑ, HPLC) αντίστροφης φάσης (RP) ii) Φασματοφωτομετρίας παραγώγων υπεριώδους-ορατού iii) Ανάλυσης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS) Στη μελέτη με ΥΧΥΑ αρχικά διερευνήθηκε η χρωματογραφική συμπεριφορά των ουσιών υπό την επίδραση συστημάτων κινητής φάσης αποτελούμενων από διπλό (μεθανόλη νερό ή ακετονιτρίλιο νερό) ή τριπλό (μεθανόλη ακετονιτρίλιο νερό) μίγμα διαλυτών σε διάφορες αναλογίες. Με βάση την αρχική αυτή διερεύνηση και λαμβάνοντας υπόψη τους περιορισμούς που προέκυψαν, επιλέχτηκαν οι ουσίες και οι συνδυασμοί τους που μελετήθηκαν περαιτέρω και συγκεκριμένα: i) Ο ταυτόχρονος προσδιορισμός των ουσιών λεβαμισόλη, θειαβενδαζόλη, μεβενδαζόλη, αλβενδαζόλη, πραζικουαντέλη και νικλοζαμίδη. ii) Ο ταυτόχρονος προσδιορισμός των ουσιών τετραμισόλη και διαιθυλκαρβαμαζίνη. iii) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της ιβερμεκτίνης. Οι αναλύσεις όλων των ουσιών επιτεύχθηκαν σε στήλη HS C 18 (250x4,6mm) με μέγεθος σωματιδίων 5μm στους 40 ο C και η ανίχνευσή τους πραγματοποιήθηκε τόσο με ανιχνευτή UV παράταξης φωτοδιόδων όσο και με ELSD ανιχνευτή. Στον ταυτόχρονο προσδιορισμό των έξι ανθελμινθικών ουσιών εφαρμόστηκε μια μεθοδολογία διεξαγωγής πειραμάτων, γνωστή ως πειραματικός σχεδιασμός, με σκοπό τη βελτιστοποίηση του χρωματογραφικού διαχωρισμού τους. Με βάση τον «D-optimal» αλγόριθμο μελετήθηκε η συμμετοχή τριών διαλυτών (MeOH H 2 O ACN) στην κινητή φάση, καθώς τα δυαδικά μίγματα παρουσίαζαν φτωχό χρωματογραφικό διαχωρισμό. Αυτή η πειραματική προσέγγιση παρείχε τη δυνατότητα να μελετηθεί ταυτόχρονα και μια ακόμη χρωματογραφική παράμετρος, το ph, η επίδραση του οποίου ήταν σημαντική για την επίτευξη των βέλτιστων συνθηκών. Γενικότερα, διαπιστώθηκε ότι η χρήση μεθοδολογίας πειραματικού σχεδιασμού για την εύρεση και βελτιστοποίηση των συνθηκών χρωματογραφικής ανάλυσης, μπόρεσε να vii

8 εξοικονομήσει χρόνο και χρήμα, ενώ η ικανότητα πρόβλεψης του ήταν πολύ καλή με τις απόλυτες τιμές των σφαλμάτων πρόβλεψης να είναι ιδιαίτερα χαμηλές. Τελικά, ως κινητή φάση επιλέχτηκε μίγμα αποτελούμενο από ρυθμιστικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 0,05Μ σε ph 5,5, ακετονιτρίλιο και μεθανόλη (40:39:21 v/v/v), με ρυθμό ροής 1ml min -1. Το σύστημα παρείχε καλές για ποσοτικό προσδιορισμό κορυφές για όλες τις ουσίες με τους χρόνους κατακράτησης τους να κυμαίνονται από 3,5 ως 13 λεπτά. Όσον αφορά τον ταυτόχρονο προσδιορισμό τετραμισόλης και διαιθυλκαρβαμαζίνης, ικανοποιητικός διαχωρισμός επιτεύχθηκε με κινητή φάση αποτελούμενη από μεθανόλη και 0,05Μ ρυθμιστικό διάλυμα οξικού αμμωνίου σε αναλογία 30:70 v/v και ph 4,2 με τους χρόνους κατακράτησης των δύο ουσιών να είναι 5,7 και 7 λεπτά αντίστοιχα. Τέλος, για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ιβερμεκτίνης χρησιμοποιήθηκε κινητή φάση με μεγάλο ποσοστό οργανικού διαλύτη και συγκεκριμένα μίγμα ακετονιτριλίου και νερού σε αναλογία 95:5 v/v, με την ουσία να εκλούεται σε χρόνο 10 λεπτών περίπου. Η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης για τις καμπύλες αναφοράς όλων των ουσιών έδειξε καλή συσχέτιση, με συντελεστή προσδιορισμού R 2 μεγαλύτερο από 0,999 για τον UV και 0,997 για τον ELSD ανιχνευτή. Τέλος, οι μέθοδοι αξιολογήθηκαν ως προς την επαναληψιμότητα, την ενδιάμεση επαναληπτικότητα και την ακρίβεια intra-day και inter-day. Στον πίνακα που ακολουθεί εμφανίζονται τα χαρακτηριστικά των καμπυλών βαθμονόμησης των ουσιών που προσδιορίστηκαν με HPLC. UV ανιχνευτής, υψηλές συγκεντρώσεις Ουσία C (μg/ml) R 2 Κλίση Τομή LOD LOQ Λεβαμισόλη 93,60-312,00 0, , ,29 9,51 28,82 Θειαβενδαζόλη 37,92-126,40 0, , ,09 3,56 10,79 Μεβενδαζόλη 26,16-87,20 0, , ,01 2,00 6,06 Αλβενδαζόλη 29,04-96,80 0, , ,35 2,50 7,58 Πραζικουαντέλη 36,48-121,60 0, , ,23 2,36 7,15 Νικλοζαμίδη 53,28-177,60 0, , ,95 5,23 15,84 UV ανιχνευτής, χαμηλές συγκεντρώσεις Ουσία C (μg/ml) R 2 Κλίση Τομή LOD LOQ Λεβαμισόλη 3,55-17,76 0, , ,99 0,16 0,47 Θειαβενδαζόλη 2,00-9,98 0, ,52 294,08 0,14 0,42 Μεβενδαζόλη 2,33-11,65 0, , ,24 0,39 1,17 Αλβενδαζόλη 2,44-12,22 0, , ,47 0,21 0,65 Πραζικουαντέλη 3,92-19,58 0, , ,87 0,37 1,13 Νικλοζαμίδη 4,59-22,96 0, , ,97 0,32 0,97 Τετραμισόλη 3, ,648 0, ,51 1,56 ιαιθυλκαρβαμαζίνη 11,275-65,772 0, ,1-6418,7 0,60 1,83 Ιβερμεκτίνη 4, ,946 0, ,85 0,53 1,61 viii

9 ELSD ανιχνευτής Ουσία C (μg/ml) R 2 Κλίση (x) (1) Τομή (log α) (1) LOD LOQ Λεβαμισόλη 93,60-312,00 0,9970 1,35 3,47 11,06 33,50 Θειαβενδαζόλη 37,92-126,40 0,9992 1,28 4,20 4,58 13,80 Μεβενδαζόλη 26,16-87,20 0,9976 1,04 4,48 6,39 19,37 Αλβενδαζόλη 29,04-96,80 0,9971 0,86 4,74 8,41 25,47 Πραζικουαντέλη 36,48-121,60 0,9981 1,10 4,36 8,92 27,02 Νικλοζαμίδη 53,28-177,60 0,9972 1,03 4,33 15,03 45,54 Τετραμισόλη 64,32-321,6 0,9975 1,2847 3, ,58 34,74 ιαιθυλκαρβαμαζίνη 35,52-177,60 0,9985 1,88 2,7941 8,52 25,56 Ιβερμεκτίνη 4, ,946 0,9978 1,3815 4,3131 1,04 3,12 (1) loga= x logc + log α Στη συνέχεια της εργασίας αναπτύχθηκε μία μέθοδος ανάλυσης στην οποία χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτομετρία υπεριώδους (Uv-Vis) με ταυτόχρονη εφαρμογή κατάλληλων χημειομετρικών τεχνικών. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός όλων των υπό μελέτη ουσιών παρουσία κατάλληλου εκδόχου που παρεμβάλλει στην απορρόφηση τους, εφαρμόζοντας τη τεχνική «Παραγώγισης Φασματικών Λόγων» (Derivative Ratio). Η ίδια μέθοδος εφαρμόστηκε και για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό δυαδικών μιγμάτων Λεβαμισόλης- Θειαβενταζόλης, και Τετραμισόλης ιαιθυλκαρβαμαζίνης, ενώ για τον ποσοτικό προσδιορισμό των μιγμάτων αυτών παρουσία εκδόχου που συναπορροφά, εφαρμόστηκε η συνδυαστική τεχνική «Παραγώγισης Φασματικών Λόγων - ιόδου από το Μηδέν» (Derivative Ratio - Zero Crossing). Τα χαρακτηριστικά των καμπυλών βαθμονόμησης των ουσιών που προσδιορίστηκαν με φασματοφωτομετρία υπεριώδους και τεχνικές παραγώγισης, ήταν τα εξής: Μίγμα Προσδιοριζόμενο συστατικό C (μg/ml) R 2 Κλίση Τομή LOD LOQ Λεβαμισόλη Έκδοχο Α Λεβαμισόλη 6,72-23,52 0,9998 0,0139-0,0066 0,35 1,06 Τετραμισόλη - Έκδοχο Α Τετραμισόλη 7,104-24,864 0,9993 0,0135-0,0088 0,66 1,99 Πιπεραζίνη - Έκδοχο Α Πιπεραζίνη 40,16-100,4 0,999 0,0013-0,0044 3,29 9,96 ιαιθυλκαρβαμαζίνη - Έκδοχο Α ιαιθυλκαρβαμαζίνη 20,88-83,52 0,9997 0,0059-0,0041 1,46 4,42 Νικλοζαμίδη - Έκδοχο Β Νικλοζαμίδη 3,28-19,68 0,999 0,0316 0,0455 0,72 2,17 Ιβερμεκτίνη - Έκδοχο Α Ιβερμεκτίνη 2,032-12,192 0,9999 0,0705-0,0123 0,17 0,50 Παμοϊκή πυραντέλη - Έκδοχο Γ Παμοϊκή πυραντέλη 4,032-12,096 0,999 0,1196-0,0288 0,39 1,17 Παμοϊκό πυρβίνιο - Έκδοχο Β Παμοϊκό πυρβίνιο 4,56-9,12 0,999 0,0732 0,0076 0,19 0,59 ix

10 Μίγμα Προσδιοριζόμενο συστατικό C (μg/ml) R 2 Κλίση Τομή LOD LOQ Μεβενδαζόλη - Έκδοχο Γ Μεβενδαζόλη 4,992-16,64 0,9991 0,1926-0,0325 0,49 1,48 Αλβενδαζόλη - Έκδοχο Γ Αλβενδαζόλη 7,64-45,84 0,9999 0,1352 0,107 0,62 1,87 Θειαβενδαζόλη - Έκδοχο Β Θειαβενδαζόλη 1,9968-8,9856 0,9999 1,0655 0,0599 0,10 0,29 Πραζικουαντέλη - Έκδοχο Α Πραζικουαντέλη 6,528-39,168 0,9996 0,0144 0,0061 0,95 2,87 Λεβαμισόλη Λεβαμισόλη 6,72-23,52 0,9998 0,0015-0,0002 0,32 0,65 Θειαβενδαζόλη Θειαβενδαζόλη 1,9968-8,9856 0,9999 0,1155 0,0079 0,10 0,31 Τετραμισόλη 7,104-24,864 0,999 0,027 0,0004 0,77 2,33 ιαιθυλκαρβαμαζίνη 20,88-83,52 0,9996 0,0007-0,0003 1,7 5,16 Τετραμισόλη - ιαιθυλκαρβαμαζίνη Λεβαμισόλη Θειαβενδαζόλη Έκδοχο Β Τετραμισόλη ιαιθυλκαρβαμαζίνη Έκδοχο Α Λεβαμισόλη 6,72-23,52 0,9996 0,0332 0,0277 0,49 1,48 Θειαβενδαζόλη 1,9968-8,9856 0,9999 1,0655 0,0599 0,10 0,29 Τετραμισόλη 7,104-24,864 0,9986 0,0157 0,0667 0,91 2,95 ιαιθυλκαρβαμαζίνη 20,88-83,52 0,9985 0,0034 0,0076 3,48 10,53 Για όλες τις μεθόδους πραγματοποιήθηκε έλεγχος για την αξιοπιστία τους, ο οποίος περιλάμβανε την παρασκευή μια σειράς μικτών δειγμάτων, με διαφορετικές συγκεντρώσεις ως προς τη δραστική ουσία και στη συνέχεια τον επαναπροσδιορισμό τους ως άγνωστα, με τις ανακτήσεις να παρουσιάζουν ικανοποιητικές τιμές. Τέλος, αναπτύχθηκε η χημειομετρική μέθοδος «Προβολές Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων σε Λανθάνουσες ομές» με τη βοήθεια του υπολογιστικού προγράμματος Simca-P. Με τη μέθοδο της διασταυρούμενης αξιολόγησης (cross validation) καθορίστηκε ο αριθμός των συνιστωσών (components) που δίνει την ελάχιστη τιμή PRESS (Predicted-Residual-Sum-Of-Squares) για τη βέλτιστη πρόβλεψη του μοντέλου και υπολογίστηκαν οι τιμές r 2, Q 2, RMSEP (Root Mean Square Error of Prediction) και RMSEE (Root Mean Square Error of Estimation), ώστε να προσδιοριστούν τελικά οι % τιμές ανάκτησης των δραστικών ουσιών. Στον παρακάτω πίνακα εμφανίζονται τα στατιστικά αποτελέσματα της επεξεργασίας με την τεχνική PLS Μίγμα Λεβαμισόλη Έκδοχο Α Τετραμισόλη - Έκδοχο Α Πιπεραζίνη - Έκδοχο Α ιαιθυλκαρβαμαζίνη - Έκδοχο Α Προσδιοριζόμενο συστατικό C (μg/ml) Συνιστώσες Q 2 r 2 RMSEE RMSEP Λεβαμισόλη 6,72-23,52 2 0,978 0,998 0,4814 0,8829 Τετραμισόλη 7,104-24, ,999 0,999 0,0643 0,3256 Πιπεραζίνη 40,16-100,4 2 0,998 0,999 1,1512 2,872 ιαιθυλκαρβαμαζίνη 20,88-83,52 2 0,998 0,999 1,1527 1,3643 x

11 Μίγμα Νικλοζαμίδη - Έκδοχο Β Ιβερμεκτίνη - Έκδοχο Α Παμοϊκή πυραντέλη - Έκδοχο Γ Παμοϊκό πυρβίνιο - Έκδοχο Β Μεβενδαζόλη - Έκδοχο Γ Αλβενδαζόλη - Έκδοχο Γ Θειαβενδαζόλη - Έκδοχο Β Πραζικουαντέλη - Έκδοχο Α Λεβαμισόλη Θειαβενδαζόλη Τετραμισόλη - ιαιθυλκαρβαμαζίνη Λεβαμισόλη Θειαβενδαζόλη Έκδοχο Β Τετραμισόλη ιαιθυλκαρβαμαζίνη Έκδοχο Α Προσδιοριζόμενο συστατικό C (μg/ml) Συνιστώσες Q 2 r 2 RMSEE RMSEP Νικλοζαμίδη 3,28-19,68 3 0,999 0,999 0,1894 0,1747 Ιβερμεκτίνη 2,032-12, ,999 0,999 0,0599 0,0531 Παμοϊκή πυραντέλη 4,032-12, ,999 0,999 0,1272 0,4698 Παμοϊκό πυρβίνιο 4,56-9,12 2 0,998 0,999 0,0379 0,124 Μεβενδαζόλη 4,992-16,64 2 0,990 0,998 0,3141 0,5115 Αλβενδαζόλη 7,64-45,84 2 0,976 0,999 0,1899 0,2219 Θειαβενδαζόλη 1,9968-8, ,985 0,999 0,0491 0,0454 Πραζικουαντέλη 6,528-39, ,999 0,999 0,2442 0,7767 Θειαβενδαζόλη 1,9968-8, ,999 0,999 0,0254 0,1659 Λεβαμισόλη 6,72-23,52 2 0,999 0,999 0,1465 0,0811 Θειαβενδαζόλη 1,9968-8, ,999 0,999 0,0356 0,0643 Τετραμισόλη 7,104-24, ,999 0,999 0,1709 0,1101 ιαιθυλκαρβαμαζίνη 20,88-83,52 3 0,999 0,999 0,7619 1,0668 Λεβαμισόλη 6,72-23,52 3 0,999 0,999 0,0987 0,1346 Τετραμισόλη 7,104-24, ,996 0,998 0,4521 0,6343 ιαιθυλκαρβαμαζίνη 20,88-83,52 3 0,999 0,999 0,3983 1,4767 Ακολούθησε μια συγκριτική μελέτη % των τιμών ανάκτησης των ουσιών όπως αυτές προέκυψαν από τις διάφορες μεθόδους ανάλυσης. Ουσία Αλβενδαζόλη Συγκέντρωση C χαμηλή C μεσαία HPLC UV HPLC UV (υψηλότερες C) (χαμηλότερες C) % % Ανάκτηση Ανάκτηση 101,61 (29,04 mg/ml) 98,64 (48,4 mg/ml) 100,19 (96,8 mg/ml) 100,46 (2,4448mg/ml) 100,37 (6,112mg/ml) 100,05 (12,224mg/ml) HPLC-ELSD % Ανάκτηση 103,40 (29,04mg/ml) 95,31 (48,4 mg/ml) 102,49 (96,8 mg/ml) UV- Derivative % Ανάκτηση 98,93 (7,64 mg/ml) 99,78 (30,56mg/ml) 100,08 (45,84 mg/ml) PLS % Ανάκτηση 100,63 (7,64mg/ml) 101,20 (30,56mg/ml) 100,08 (45,84 mg/ml) C υψηλή Μέση % ανάκτηση 100,15 100,29 100,40 99,56 100,64 % RSD 1,48 0,21 4,41 0,66 0,56 xi

12 Ουσία Μεβενδαζόλη HPLC UV HPLC UV (υψηλότερες C) (χαμηλότερες C) % % Συγκέντρωση Ανάκτηση Ανάκτηση 101,71 101,34 C χαμηλή (26,16 mg/ml) (2,3296 mg/ml) 98,57 100,76 C μεσαία (43,6 mg/ml) (5,824 mg/ml) 100,2 101,26 C υψηλή (87,2 mg/ml) (11,648 mg/ml) HPLC-ELSD % Ανάκτηση 104,31 (26,16mg/ml) 95,01 (43,6mg/ml) 103,16 (87,2 mg/ml) UV- Derivative % Ανάκτηση 102,08 (4,992 mg/ml) 99,48 (13,312mg/ml) 101,21 (16,64 mg/ml) PLS % Ανάκτηση 95,66 (4,992 mg/ml) 95,72 (13,312mg/ml) 99,99 (16,64mg/ml) Μέση % ανάκτηση 100,16 101,12 100,83 100,92 97,12 % RSD 1,57 0,31 5,03 1,31 2,56 Πραζικουαντέλη C χαμηλή C μεσαία 100,05 (36,48 mg/ml) 99,95 (60,8 mg/ml) 100,01 (121,6 mg/ml) 99,38 (3,92 mg/ml) 99,92 (9,792 mg/ml) 100,69 (19,58 mg/ml) 102,63 (36,48 mg/ml) 95,63 (60,8 mg/ml) 101,94 (121,6mg/ml) 99,50 (13,056mg/ml) 101,16 (26,112mg/ml) 99,42 (39,168 mg/ml) 105,75 (13,056mg/ml) 103,52 (26,112mg/ml) 101,74 (39,168 mg/ml) C υψηλή Μέση % ανάκτηση 100,00 100,00 100,07 100,03 103,67 % RSD 0,05 0,66 3,86 0,98 1,94 Νικλοζαμίδη C χαμηλή C μεσαία 100,74 (53,28 mg/ml) 99,38 (88,8 mg/ml) 100,09 (177,60 mg/ml) 100,74 (4,592 mg/ml) 100,4 (11,48 mg/ml) 99,91 (22,96 mg/ml) 102,67 (53,28 mg/ml) 95,51 (88,8 mg/ml) 101,96 (177,60 mg/ml) 97,09 (3,28mg/ml) 100,79 (13,12mg/ml) 99,00 (19,68 mg/ml) 98,12 (3,28mg/ml) 98,40 (13,12mg/ml) 98,69 (19,68 mg/ml) C υψηλή Μέση % ανάκτηση 100,07 100,35 100,05 98,96 98,40 % RSD 0,68 0,42 3,94 1,87 0,29 C χαμηλή - Ιβερμεκτίνη C μεσαία - 101,83 (4,8768 mg/ml) 98,61 (12,192 mg/ml) 101,96 (21,946mg/ml) 102,62 (4,8768mg/ml) 97,11 (12,192mg/ml) 101,37 (21,946mg/ml) 100,25 (4,064mg/ml) 100,34 (8,128mg/ml) 99,44 (12,192 mg/ml) 99,46 (4,064mg/ml) 100,04 (8,128mg/ml) 99,20 (12,192 mg/ml) C υψηλή - Μέση % ανάκτηση - 100,80 100,37 100,01 99,57 % RSD - 1,88 2,88 0,50 0,43 xii

13 Ουσία Λεβαμισόλη Συγκέντρωση C χαμηλή C μεσαία HPLC UV HPLC UV (υψηλότερες C) (χαμηλότερες C) % % Ανάκτηση Ανάκτηση 102,61 (93,60 mg/ml) 97,81 (156 mg/ml) 100,31 (312 mg/ml) 100,36 (3,552mg/ml) 99,77 (8,88 mg/ml) 101,17 (17,76 mg/ml) HPLC- ELSD % Ανάκτηση 102,95 (93,60mg/ml) 95,11 (156 mg/ml) 102,17 (312 mg/ml) UV- Derivative (δραστική ουσία + έκδοχο) % Ανάκτηση 99,31 (10,08 mg/ml) 99,61 (16,8mg/ml) 99,93 (23,52 mg/ml) UV- Derivative (διπλό μίγμα δραστικών ουσιών) % Ανάκτηση 98,68 (10,08 mg/ml) 98,71 (16,8mg/ml) 99,01 (23,52 mg/ml) UV- Derivative (μίγμα δραστικών ουσιών + έκδοχο) % Ανάκτηση 101,03 (10,08 mg/ml) 98,78 (16,8mg/ml) 99,01 (23,52 mg/ml) PLS (δραστική ουσία + έκδοχο) % Ανάκτηση 97,59 (10,08 mg/ml) 97,80 (16,8mg/ml) 98,93 (23,52 mg/ml) PLS (διπλό μίγμα δραστικών ουσιών) % Ανάκτηση PLS (μίγμα δραστικών ουσιών + έκδοχο) % Ανάκτηση 98,38 100,69 (10,08mg/ml) (10,08mg/ml) 99,66 (16,8mg/ml) 100,04 (23,52mg/ml) 100,01 (16,8mg/ml) 100,74 (23,52mg/ml) C υψηλή Μέση % ανάκτηση 100,24 100,43 100,08 99,62 98,80 99,61 98,11 99,36 100,48 % RSD 2,39 0,70 4,32 0,31 0,18 1,24 0,73 0,88 0,41 Θειαβενδαζόλη C χαμηλή C μεσαία 103,08 (37,92 mg/ml) 97,42 (63,2 mg/ml) 100,37 (126,4 mg/ml) 101,46 (1,9968 mg/ml) 99,99 (4,992 mg/ml) 99,96 (9,984 mg/ml) 102,79 (37,92mg/ml) 95,33 (63,2 mg/ml) 102,05 (126,4mg/ml) 98,97 (2,995mg/ml) 100 (6,989mg/ml) 100,15 (8,986 mg/ml) 99,88 (2,995mg/ml) 99,72 (6,989mg/ml) 100,40 (8,986 mg/ml) 98,97 (2,995mg/ml) 100 (6,989mg/ml) 100,15 (8,986 mg/ml) 100,09 (2,995mg/ml) 100,28 (6,989mg/ml) 100,30 (8,986 mg/ml) 101,62 (2,995mg/ml) 100,71 (6,989mg/ml) 100,64 (8,986mg/ml) 105,07 (2,995mg/ml) 102,28 (6,989mg/ml) 101,95 (8,986 mg/ml) C υψηλή Μέση % ανάκτηση 100,29 100,47 100,06 99,71 100,00 99,71 100,22 100,99 103,10 % RSD 2,82 0,85 4,11 0,64 0,36 0,64 0,12 0,54 1,66

14 101,58 103,43 98,69 96,73 96,09 99,68 98,79 97,33 C χαμηλή - (3,1968 mg/ml) (64,32mg/ml) (10,656mg/ml) (10,656mg/ml) (10,656mg/ml) (10,656mg/ml) (10,656mg/ml) (10,656mg/ml) 101,52 97,01 100,8 100,74 100,17 95,02 100,25 98,10 C μεσαία - (5,328 mg/ml) (160,8mg/ml) (17,76mg/ml) (17,76mg/ml) (17,76mg/ml) (17,76mg/ml) (17,76mg/ml) (17,76mg/ml) 98,31 102,27 98,94 99,07 95,98 96,67 99,24 97,22 Τετραμισόλη C υψηλή - (18,648 mg/ml) (321,6mg/ml) (24,864 mg/ml) (24,864 mg/ml) (24,864 mg/ml) (24,864 mg/ml) (24,864 mg/ml (24,864 mg/ml Μέση % ανάκτηση - 100,47 100,90 99,48 98,85 97,41 97,12 99,43 97,55 % RSD - 1,86 3,39 1,16 2,04 2,45 2,43 0,75 0,49 101,05 96,79 99,27 102,81 108,56 102,02 100,55 103,58 C χαμηλή - (11,275 mg/ml) (35,52mg/ml) (20,88mg/ml) (20,88mg/ml) (20,88mg/ml) (20,88mg/ml) (20,88mg/ml) (20,88mg/ml) 98,63 98,53 99,85 100,95 94,31 101,30 101,30 103,12 C μεσαία - (18,792 mg/ml) (88,8 mg/ml) (41,76mg/ml) (41,76mg/ml) (41,76mg/ml) (41,76mg/ml) (41,76mg/ml) (41,76mg/ml) ιαιθυλκαρβαμαζίνη 100,98 102,15 99,84 101,12 102,21 100,49 100,49 101,66 C υψηλή - (65,772 mg/ml) (177,5mg/ml) (83,52 mg/ml) (83,52 mg/ml) (83,52 mg/ml) (83,52 mg/ml) (83,52 mg/ml) (83,52 mg/ml) Μέση % ανάκτηση - 100,22 99,16 99,65 101,63 101,69 101,27 100,78 102,79 % RSD - 1,37 2,76 0,33 1,01 7,02 0,76 0,45 0,98 xiv

15 Για τις ουσίες πιπεραζίνη, παμοϊκή πυραντέλη και παμοϊκό πυρβίνιο, για τις οποίες δεν ήταν δυνατός ο χρωματογραφικός προσδιορισμός, οι % τιμές ανάκτησης για τρία δείγματα, με χρήση φασματοφωτομετρικών μεθόδων, εμφανίζονται στον παρακάτω πίνακα: Ουσία Πιπεραζίνη Παμοϊκή πυραντέλη Παμοϊκό πυρβίνιο Συγκέντρωση C χαμηλή C μεσαία C υψηλή UV- Derivative % Ανάκτηση 102,58 (40,16mg/ml) 100,68 (80,32mg/ml) 100,45 (100,40 mg/ml) PLS % Ανάκτηση 96,59 (40,16mg/ml) 96,32 (80,32mg/ml) 98,34 (100,40 mg/ml) Μέση % ανάκτηση 101,24 97,08 % RSD 1,15 1,13 C χαμηλή C μεσαία C υψηλή 97,86 (5,376mg/ml) 99,1 (9,408mg/ml) 100,86 (12,096 mg/ml) 108,04 (5,376mg/ml) 103,67 (9,408mg/ml) 104,17 (12,096 mg/ml) Μέση % ανάκτηση 99,27 105,29 % RSD 1,52 2,27 C χαμηλή C μεσαία C υψηλή 100,53 (4,56mg/ml) 100,09 (7,296mg/ml) 100,77 (9,12mg/ml) 97,99 (4,56mg/ml) 98,19 (7,296mg/ml) 98,83 (9,12mg/ml) Μέση % ανάκτηση 100,46 98,34 % RSD 0,34 0,45 Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την πολύ καλή ακρίβεια τόσο των χρωματογραφικών, όσο και των φασματοφωτομετρικών μεθόδων, με την HPLC ELSD να εμφανίζει μικρότερη επαναληπτικότητα (precision), δηλαδή μεγαλύτερη διασπορά αποτελεσμάτων. Παράλληλα συγκρίθηκαν δύο ακόμα κρίσιμες παράμετροι αξιολόγησης αναλυτικών μεθόδων, όπως το όριο ανίχνευσης (LOD) και το όριο ποσοτικής αποτίμησης (LOQ). Η μέθοδος PLS δεν παρείχε αντίστοιχες τιμές, ενώ για τις υπόλοιπες μεθόδους προέκυψε ότι η UV-Derivative και HPLC-UV είναι το ίδιο ευαίσθητες, ενώ η HPLC-ELSD φαίνεται να υστερεί αρκετά έναντι των άλλων. Τελικά, επιβεβαιώθηκε ότι όλες οι μέθοδοι που μελετήθηκαν για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό ανθελμινθικών φαρμάκων σε σκευάσματα, θεωρούνται κατάλληλες για αναλύσεις ρουτίνας διότι είναι οικονομικές, ευέλικτες και αξιόπιστες.

16 Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ 1.1 ΓΕΝΙΚΑ Χρωματογραφία [1], είναι η αναλυτική μέθοδος που χρησιμοποιείται ευρύτατα στη φαρμακευτική [2] για τον προσδιορισμό δραστικών ουσιών τόσο σε φαρμακοτεχνικά σκευάσματα όσο και σε βιολογικά υγρά. Γενικά περιλαμβάνει σειρά τεχνικών φυσικού διαχωρισμού και προσδιορισμού των συστατικών μίγματος ανόργανων ή οργανικών ενώσεων. Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με κατανομή των προσδιοριζόμενων συστατικών μεταξύ δύο φάσεων, μιας στατικής και μιας κινητής και βασίζεται στις διαφορές που υπάρχουν σε ορισμένες ιδιότητες τους όπως είναι η λιποφιλικότητα, η πολικότητα, τα ηλεκτρικά φορτία (για ιονικές ενώσεις) και το μέγεθος των μορίων. Οι ιδιότητες αυτές διαφοροποιούν τη σχετική φυσικοχημική συγγένεια κάθε συστατικού προς τις δύο φάσεις της χρωματογραφικής στήλης. Έτσι, η κινητή φάση, διερχόμενη μέσα από τη στατική, προκαλεί διαφορετική μετατόπιση στα συστατικά του μίγματος, τα οποία διαχωρίζονται μεταξύ τους και συνήθως εξέρχονται από τη στήλη σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Εάν στην έξοδο της στήλης υπάρχει σύστημα ανιχνεύσεως και καταμετρήσεως της ποσότητας κάθε συστατικού πραγματοποιείται και ποσοτικός προσδιορισμός των συστατικών. Οι χρωματογραφικές τεχνικές ανάλογα με τη φύση της κινητής φάσης ταξινομούνται σε τρεις κύριες κατηγορίες: την υγρή χρωματογραφία (LC) αν η κινητή φάση είναι υγρή, την αέρια χρωματογραφία (GC) αν η κινητή φάση είναι αέρια και την υπερκρίσιμη ρευστή χρωματογραφία (SFC) αν η κινητή φάση βρίσκεται σε υπερκρίσιμη κατάσταση. Ανάλογα με τη διάταξη της στατικής φάσης διακρίνουμε την επίπεδη χρωματογραφία και τη χρωματογραφία στήλης [3]. Η υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης, που μετονομάστηκε αργότερα σε υψηλής απόδοσης (HPLC), αποτελεί εξέλιξη της κλασικής υγρής χρωματογραφίας στήλης. Οφείλει την ανάπτυξή της στην πρόοδο της τεχνολογίας, καθώς άρχισαν να κατασκευάζονται χαλύβδινες στήλες ανθεκτικές στις μεγάλες πιέσεις και αντλίες υψηλής πίεσης, σταθερής παροχής. Επίσης, αναπτύχθηκαν διάφοροι τύποι 1

17 ανιχνευτών, όπως ανιχνευτές υπεριώδους-ορατού, αγωγιμομετρικοί και φθορισμομετρικοί ανιχνευτές, ανιχνευτές δείκτη διάθλασης κ.λ.π. Σε σχέση με την κλασική χρωματογραφία διαφέρει, γιατί στην HPLC χρησιμοποιούνται υλικά πλήρωσης με τεμαχίδια μικρού μεγέθους και εφαρμόζονται μεγάλες πιέσεις. Υπερτερεί δε της κλασικής χρωματογραφίας επιτυγχάνοντας ταχύτερους και καλύτερης απόδοσης διαχωρισμούς μιγμάτων. Για το λόγο αυτό η κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιείται κυρίως για διαχωρισμούς και σπανιότερα για ποσοτικούς προσδιορισμούς μικρής σχετικώς ακρίβειας, ενώ η HPLC είναι σήμερα η περισσότερο χρησιμοποιούμενη χρωματογραφική τεχνική για την ποσοτική ανάλυση πολύπλοκων μιγμάτων [1]. Στην HPLC το δείγμα εφαρμόζεται στην κορυφή της στήλης και με τη βοήθεια της κινητής φάσης τα συστατικά του μετακινούνται με τη μορφή ζωνών κατά μήκος της στήλης και τελικά εκλούονται διαδοχικά. Οι υπό ανάλυση ουσίες κατανέμονται ή προσροφώνται μεταξύ της στατικής και κινητής φάσης κι αυτό έχει σαν αποτέλεσμα να μετακινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της στήλης. Συνήθως ως κινητή φάση χρησιμοποιείται μίγμα διαλυτών σε σταθερή αναλογία (isocratic) ή με βαθμιαία μεταβολή της σύστασης τους (gradient), ενώ σαν στατική φάση είναι δυνατή η χρησιμοποίηση αναλυτικών στηλών σε σειρά, έτσι ώστε να επιτυγχάνεται καλύτερος διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος. Ο χρόνος ανάλυσης είναι της τάξης των μερικών λεπτών ενώ η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα είναι πολύ καλές. 1.2 ΕΙ Η ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Στην HPLC μπορούν να εφαρμοστούν όλα τα είδη των μηχανισμών που λαμβάνουν χώρα στους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς με την κατάλληλη χρήση υλικού πλήρωσης της στήλης (στατική φάση) και του διαλύτη έκλουσης (κινητή φάση). Στο σχήμα 1.1 δίνεται η ταξινόμηση των μορφών της ΗPLC ανάλογα με τις ιδιότητες των ενώσεων που διαχωρίζονται: την πολικότητα, διαλυτότητα και το μοριακό βάρος. 2

18 Σχήμα 1.1: Εφαρμογές μηχανισμών HPLC στην ανάλυση διαφόρων ενώσεων [4] Με βάση το υλικό πλήρωσης της στήλης και κατά συνέπεια το μηχανισμό διαχωρισμού των υπό ανάλυση ουσιών, η HPLC διακρίνεται σε: 1) Χρωματογραφία Προσρόφησης: Είναι η παλιότερη χρωματογραφική τεχνική στην οποία ο διαχωρισμός των διαφόρων ουσιών βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό προσρόφησης στη στατική φάση. Οι κυριότερες αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι ηλεκτροστατικής, διπόλου-διπόλου, διπόλου-επαγόμενου διπόλου, δυνάμεις London, ή συνδυασμός αυτών. Το προσροφητικό υλικό πρέπει να έχει μεγάλο εμβαδό επιφανείας, που να διαθέτει μεγάλο αριθμό χημικώς ενεργών κέντρων. Θεωρείται χρωματογραφία κανονικής φάσης όπου η στατική φάση (συνήθως SiΟ 2 ή ΑΙ 2 Ο 3 ) είναι πολικότερη από την κινητή (μη πολικοί διαλύτες όπως εξάνιο, χλωροφόρμιο κ.ά). Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό σχετικώς μη πολικών, αδιάλυτων στο νερό οργανικών ενώσεων με μοριακό βάρος μικρότερο από Ένα μεγάλο πλεονέκτημά της σε σχέση με άλλες μεθόδους είναι η ικανότητά της να διαχωρίζει μίγματα ισομερών, όπως μέτα- και πάρα- υποκατεστημένων βενζολικών παραγώγων. [3] 2) Χρωματογραφία Κατανομής: Ο διαχωρισμός στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μίγματος μεταξύ της κινητής και της υγρής στατικής φάσης και εφαρμόζεται στην ανάλυση ομόλογων, μη ιονικών ενώσεων. ιαχωρίζεται σε χρωματογραφία αντίστροφης φάσης και χρωματογραφία κανονικής φάσης. Στη χρωματογραφία κατανομής αντίστροφης φάσης, η στατική φάση, η οποία είναι λιγότερο πολική της κινητής, αποτελείται από διοξείδιο του πυριτίου, συζευγμένο με 3

19 διάφορες ομάδες (bonded phase), όπως αλκύλια, φαινύλιο, αιθερομάδες κ.α., ενώ η κινητή φάση αποτελείται από μίγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο κ.ά.) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα ή νερό. Αποτελεί την πιο διαδεδομένη τεχνική HPLC αφού χρησιμοποιείται στο 80% περίπου των αναλυτικών εφαρμογών. Στη χρωματογραφία κατανομής κανονικής φάσης, κατ αντιστοιχία με την χρωματογραφία προσρόφησης, η στατική φάση (διοξείδιο του πυριτίου συζευγμένο με διόλες, αμινομάδες, κυανομάδες κ.α.) είναι πολικότερη από την κινητή (οργανικοί μη πολικοί διαλύτες). 3) Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής: Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης. Αναλυτικότερα, όσον αφορά την κατιοντοανταλλαγή, βασίζεται στην ακόλουθη ισορροπία: + RSO Χ + Y RSO 3 Υ + Χ + + όπου: RSO 3 Χ είναι η δραστική ομάδα της στατικής φάσης και Υ το αναλυόμενο κατιόν. Ανάλογη ισορροπία ισχύει και στην περίπτωση της ανιοντοανταλλαγής. Οι κυριότερες παράμετροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι το αντίθετο ιόν της δραστικής ομάδας της στατικής φάσης, η ιονική ισχύς, το ph, ο τροποποιητής της κινητής φάσης και η θερμοκρασία. Ως υλικά πλήρωσης χρησιμοποιούνται διάφορες ρητίνες που αποτελούν συμπολυμερή στυρενίου-διβινυλοβενζολίου, στα οποία έχουν εισαχθεί σουλφονικές ή καρβοξυλικές ομάδες, τριτοταγείς ή τεταρτοταγείς αμίνες. 4) Χρωματογραφία Συγγένειας: Για να επιτευχθεί διαχωρισμός, οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες (ligands) οι οποίοι είναι συνδεδεμένοι με ομοιοπολικούς δεσμούς στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου. Αποτελεί την πιο σύγχρονη και πιο εκλεκτική χρωματογραφική τεχνική. Στην κατηγορία αυτή ανήκει η Χρωματογραφία Εναντιομερών με την οποία διαχωρίζονται εναντιομερείς μορφές ενώσεων που παρουσιάζουν χειρομορφία (Chiral Chromatography). 5) Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγέθους ή ιάχυσης Πηκτής: Ο διαχωρισμός γίνεται με βάση το μέγεθος των μορίων των συστατικών καθώς αυτά μετακινούνται μέσα από το πορώδες δίκτυο της στατικής φάσης. Ουσίες μεγαλύτερου μεγέθους από το μέγεθος των πόρων αποκλείονται από το να εισέλθουν στο δίκτυο και παρασυρόμενες από την κινητή φάση εκλούονται πρώτες. Οι υπόλοιπες ουσίες ανάλογα με το μέγεθός τους περιπλανώνται λιγότερο ή περισσότερο στο δικτυωτό σύμπλεγμα της στατικής φάσεως και εκλούονται κατά σειρά μεγέθους. Η Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγέθους βρίσκει εφαρμογές στους προσδιορισμούς και το χαρακτηρισμό των πολυμερών. 4

20 1.3 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ HPLC Ένα σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης περιλαμβάνει πέντε βασικά τμήματα [3, 5] (Σχήμα 1.2) : 1. Το σύστημα παροχής κινητής φάσης 2. Το σύστημα εισαγωγής δείγματος 3. Τη στήλη 4. Τον ανιχνευτή και 5. Τον καταγραφέα Σχήμα 1.2: Τυπική διάταξη Υγρού Χρωματογράφου Υψηλής Απόδοσης ΣΥΣΤΗΜΑ ΠΑΡΟΧΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ Μία σύγχρονη συσκευή HPLC είναι εξοπλισμένη με έναν ή περισσότερους υάλινους περιέκτες καθένας από τους οποίους περιέχει 500 ml ή περισσότερο από κάποιον διαλύτη. Συχνά περιλαμβάνονται φίλτρα και απαερωτές ώστε να μην φτάνουν σωματίδια και φυσαλίδες στη στήλη και τον ανιχνευτή. Έκλουση με έναν διαλύτη ή μίγμα διαλυτών σταθερής σύστασης καλείται ισοκρατική έκλουση. Στην βαθμιδωτή έκλουση, χρησιμοποιούνται δύο ή και περισσότεροι διαλύτες με σημαντική διαφορά στην πολικότητά τους. Η αναλογία των διαλυτών μεταβάλλεται βαθμιαία ή κατά τακτά χρονικά διαστήματα. Η κινητή φάση, μέσω των αντλιών, ωθείται στη στήλη. Οι αντλίες πρέπει να είναι ικανές να λαμβάνουν ακριβή όγκο διαλύτη, χωρίς παλμούς και με επαναλαμβανόμενη σταθερή ταχύτητα ροής και πίεση. Οι αντλίες HPLC είναι συνήθως δύο τύπων: α) οι αντλίες σταθερής ροής και β) οι αντλίες σταθερής πίεσης. Βασικό πλεονέκτημα των αντλιών σταθερής ροής είναι ότι εξασφαλίζουν 5

21 επαναλήψιμο όγκο έκλουσης και σταθερό εμβαδόν κορυφής, ανεξάρτητα από τις μεταβολές στο ιξώδες της κινητής φάσης. Οι αντλίες σταθερής πίεσης είναι πιο απλές στην κατασκευή, έχουν χαμηλότερο κόστος και δεν προκαλούν παλμούς με αποτέλεσμα να μειώνεται ο θόρυβος της βασικής γραμμής στο χρωματογράφημα. Εντούτοις δεν διατηρούν σταθερή την ταχύτητα ροής με συνέπεια να παρατηρούνται μεταβολές στο εμβαδόν των κορυφών και των χρόνων κατακράτησης των ουσιών και ανακρίβειες κατά τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗΣ ΕΙΓΜΑΤΟΣ Η μονάδα εισαγωγής του δείγματος σε ένα σύστημα HPLC παρεμβάλλεται μεταξύ της αντλίας και της χρωματογραφικής στήλης. Η εισαγωγή του δείγματος μπορεί να γίνει με τους εξής τρόπους: 1) με μικροσύριγγα, και 2) με ειδική βαλβίδα εισαγωγής δείγματος. Η μικροσύριγγα, με την οποία γίνεται απ' ευθείας εισαγωγή του δείγματος στην αναλυτική στήλη, χρησιμοποιείται ελάχιστα καθώς προϋποθέτει διακοπή της ροής του εκλουστικού με αποτέλεσμα να παρατηρείται αστάθεια στη βασική γραμμή. Επιπλέον είναι δυνατόν να παρατηρηθεί απόφραξη της στήλης από μικρά σωματίδια. Συνηθέστερα, η εισαγωγή του δείγματος γίνεται διαμέσου μιας βαλβίδας εισαγωγής η οποία περιλαμβάνει έναν βρόγχο (Σχήμα 1.3). Το δείγμα εισάγεται στο βρόχο (θέση «φορτώσεως») και στη συνέχεια παρασύρεται από την κινητή φάση έπειτα από περιστροφή της βαλβίδας στη θέση «εισαγωγής» και οδηγείται στη στήλη. Μια σωστά κατασκευασμένη βαλβίδα εισαγωγής δείγματος πρέπει να εισάγει ακριβή και επαναλήψιμο όγκο δείγματος συμβάλλοντας και αυτή στην ποιότητα των χρωματογραφικών διαχωρισμών. Το μεγάλο πλεονέκτημα των βαλβίδων είναι ότι δεν διακόπτουμε τη ροή του εκλουστικού και ότι επιτρέπουν την εισαγωγή του δείγματος υπό υψηλή πίεση. Μειονεκτούν όμως στο ότι έχουμε κάποια αραίωση του δείγματος πριν την τελική προώθηση στην αναλυτική στήλη. Η εισαγωγή ενός δείγματος σ' ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης μπορεί να γίνει χειροκίνητα ή με αυτόματους δειγματολήπτες. Οι αυτόματοι δειγματολήπτες αποτελούνται από τη βαλβίδα εισαγωγής, το βρόχο δείγματος, τη σύριγγα, τα φιαλίδια που περιέχουν τα δείγματα και το περιστρεφόμενο δίσκο, στον οποίο τοποθετούνται τα δείγματα. Κατά την εισαγωγή του δείγματος, ο δίσκος περιστρέφεται μέχρι το προγραμματισμένο φιαλίδιο να βρεθεί κάτω από τη μικροσύριγγα. Στη συνέχεια, η μικροσύριγγα εισέρχεται στη φιάλη του δείγματος και λαμβάνει μια ορισμένη ποσότητα δείγματος, η οποία και διοχετεύεται στο βρόχο της βαλβίδας. 6

22 Σχήμα 1.3: Βρόχος δειγματοληψίας HPLC. Με τη χειρολαβή της βαλβίδας, όπως φαίνεται στο αριστερό σχήμα, ο βρόχος γεμίζει από τη σύριγγα και η κινητή φάση ρέει από την αντλία προς τη στήλη. Όταν η βαλβίδα τοποθετηθεί στη θέση που φαίνεται στο δεξιό σχήμα, ο βρόχος παρεμβάλλεται μεταξύ αντλίας και στήλης, οπότε η κινητή φάση μεταφέρει το δείγμα προς τη στήλη ΣΤΗΛΗ Ευθύγραμμοι σωλήνες από χάλυβα αποτελούν ιδανικές στήλες για την HPLC. Σπανιότερα και εφόσον η εφαρμοζόμενη πίεση είναι χαμηλή (<600 psi) είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν στήλες από γυαλί [3]. Η πλήρωση τέτοιων στηλών είναι πολύ δύσκολο να γίνει από τον αναλυτή και γι' αυτό οι στήλες συνήθως αγοράζονται έτοιμες από διάφορες παρασκευάστριες εταιρείες. Οι περισσότερες στήλες HPLC έχουν μήκος από 10 έως 30 cm. Συνήθως οι στήλες είναι ευθύγραμμες. Όταν απαιτείται επιμήκυνσή τους, αυτή επιτυγχάνεται με σύζευξη δύο ή περισσοτέρων στηλών σε σειρά. Περιστασιακά χρησιμοποιούνται σπειροειδείς στήλες, αν και λόγω σχήματος η αποτελεσματικότητά τους δεν είναι καλή. Συνήθως δεν απαιτείται θερμοστατούμενη στήλη στην υγρή - στερεή χρωματογραφία προσροφήσεως, αλλά πολλές φορές αυτό είναι απαραίτητο στους άλλους τύπους υγρής- υγρής χρωματογραφίας (κατανομής, ιοντοανταλλαγής, μοριακού αποκλεισμού). Τα σύγχρονα όργανα είναι σήμερα εφοδιασμένα με θερμοστάτες, που ελέγχουν τη θερμοκρασία της στήλης στην περιοχή θερμοκρασιών δωματίου μέχρι 100 ή 150 ο C με ακρίβεια μερικών δεκάτων του βαθμού. Πρέπει να λαμβάνεται υπόψη ότι μερικοί ανιχνευτές, όπως το διαθλασίμετρο, είναι πολύ ευαίσθητοι σε αλλαγές της θερμοκρασίας και γι' αυτό απαιτείται ψύξη του υγρού εκλούσεως μετά την έξοδό του από τη στήλη και πριν την είσοδο του στον ανιχνευτή. 7

23 Η παρασκευή των στηλών είναι ένα πολύ κρίσιμο στάδιο για την καλή απόδοση της τεχνικής. Τα υλικά στηρίξεως (Corasil, Zipax, Celite, κλπ.) ξηραίνονται πριν από την επικάλυψή τους με την υγρή στατική φάση, ενώ τα στερεά υλικά προσροφήσεως ενεργοποιούνται με πύρωση. Για την ελαχιστοποίηση των λιμναζόντων χώρων στη στήλη, απαιτείται άριστη πλήρωσή της, δηλαδή οι πόροι του υλικού στηρίξεως πρέπει να γεμίζουν τελείως με την υγρή στατική φάση. Μια καλά πληρωμένη στήλη της μορφής αυτής, μπορεί να έχει μια απόδοση περίπου 400 θεωρητικών πλακών ανά cm με σωματίδια 5-10 μm. Επειδή η κινητή φάση μπορεί να διαλύει μερικώς την υγρή στατική φάση, με αποτέλεσμα τη βαθμιαία καταστροφή της, συνήθως παρεμβάλλεται μια μικρή στήλη πριν από την κύρια στήλη, πληρωμένη με το ίδιο υλικό (προστήλη). Έτσι η κινητή φάση φθάνει στην κύρια στήλη κορεσμένη με την υγρή στατική φάση. Η προστήλη επίσης προστατεύει την κύρια στήλη από ακαθαρσίες που προσροφούνται μη αντιστρεπτά ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ Ο ανιχνευτής στην HPLC είναι κρίσιμο στοιχείο του συστήματος, γιατί κάνει ορατό το διαχωρισμό που γίνεται στη στήλη και επιτρέπει την αξιοποίησή του στην ανάλυση. Αντίθετα με την αέρια χρωματογραφία, στην υγρή χρωματογραφία δεν υπάρχουν καθολικοί (universal), υψηλής ευαισθησίας, ανιχνευτές, όπως ο ανιχνευτής φλόγας και ο θερμικής αγωγιμότητας. Οι ανιχνευτές της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης κατατάσσονται σε γενικούς και ειδικούς ανιχνευτές. Οι γενικοί ανιχνευτές μετράνε την αλλαγή μίας ιδιότητας της κινητής φάσης, η τιμή της οποίας επηρεάζεται από την παρουσία των εκλουόμενων συστατικών. Τέτοιοι είναι οι ανιχνευτές δείκτη διάθλασης και αγωγιμότητας. Οι ειδικοί ανιχνευτές μετράνε την αλλαγή μιας φυσικοχημικής ιδιότητας των αναλυόμενων συστατικών, όπως π.χ. οι ανιχνευτές ορατούυπεριώδους και οι πολαρογραφικοί ανιχνευτές. Ο ανιχνευτής, αφού μετρήσει την αλλαγή της ιδιότητας, τη μετατρέπει σε ηλεκτρικό σήμα. Ένας ιδανικός ανιχνευτής στην HPLC πρέπει να έχει τα εξής χαρακτηριστικά: 1) Να αποκρίνεται σε όλα τα συστατικά του μίγματος ή να έχει γνωστή εκλεκτικότητα αποκρίσεως. 2) Να επιτρέπει χαμηλά όρια ανιχνεύσεως, στην περιοχή των ng-μg. 3) Να μην αποκρίνεται στην κινητή φάση. 4) Να παρέχει γραμμική απόκριση στην περιοχή συγκεντρώσεων των διαχωριζόμενων συστατικών, ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην ποσοτική ανάλυση. 8

24 5) Να μην επηρεάζεται από μεταβολές της θερμοκρασίας και της ταχύτητας ροής του υγρού εκλούσεως. 6) Να έχει αμελητέο νεκρό όγκο, ώστε να μη συμμετέχει στη διεύρυνση της ζώνης κάθε συστατικού και κατά συνέπεια της κορυφής του. 7) Να έχει χαμηλό επίπεδο θορύβου. Άλλοι παράμετροι που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την επιλογή ενός ανιχνευτή είναι το κόστος του, η ευκολία χρήσης του, η εμπορική του διαθεσιμότητα καθώς και η ευκολία συντήρησής του. Η ευαισθησία ενός ανιχνευτή S ορίζεται από τη σχέση S= Q/ R, όπου Q η μεταβολή μιας παραμέτρου, Q συγκέντρωσης, που μεταφράζει ο ανιχνευτής σε μια μεταβολή R ενός ηλεκτρικού σήματος R. Στην πράξη η ευαισθησία ενός ανιχνευτή υπολογίζεται από την ένταση της κορυφής ενός χρωματογραφήματος. Κατά γενικό κανόνα το ύψος ή το εμβαδό της κορυφής είναι απευθείας ανάλογο με το ποσό που εφαρμόζεται στη στήλη. Ένας ανιχνευτής παράγει θόρυβο, που συνήθως είναι ηλεκτρονικός ή μπορεί να παράγεται από την επίδραση της ροής, της πίεσης ή ακόμη και της αστάθειας της θερμοκρασίας. Ως θόρυβος ορίζονται οι στατιστικές διακυμάνσεις του πλάτους της βασικής γραμμής και περιλαμβάνει όλες τις τυχαίες διακυμάνσεις του σήματος του ανιχνευτή. Υπάρχουν τρία είδη θορύβου: ο θόρυβος ο οποίος εμφανίζεται με συχνότητα σημαντικά μικρότερη από το εύρος του χρωματογραφήματος και ονομάζεται θόρυβος μικρής συχνότητας (Short term noise), ο θόρυβος που έχει συχνότητα της ίδιας τάξης με εκείνης της κορυφής του χρωματογραφήματος και ονομάζεται θόρυβος μεγάλης συχνότητας (Long term noise) και ο θόρυβος που έχει περίοδο 10 min ή και περισσότερο και ονομάζεται απόκλιση βασικής γραμμής (Drift) και εμφανίζεται ως συνεχής αύξηση ή ελάττωση του σήματος, η οποία μπορεί να οφείλεται σε μεταβολές παραμέτρων, όπως η θερμοκρασία, η πίεση, η ροή ή ακόμα και σε ηλεκτρονικές και ηλεκτρικές μεταβολές. Σχήμα 1.4: Είδη θορύβου που εμφανίζονται σε ένα χρωματογράφημα 9

25 ΙΑΦΟΡΙΚΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΕΙΚΤΗ ΙΑΘΛΑΣΗΣ Μετρά διαφορές στο δείκτη διαθλάσεως (RI) του υγρού εκλούσεως, που προκαλούνται από την παρουσία των διαχωριζόμενων συστατικών του μίγματος και αποκρίνεται σε όλες σχεδόν τις ενώσεις. Αν και είναι γενικός ανιχνευτής δε βρίσκει μεγάλη εφαρμογή γιατί το σήμα του εξαρτάται από τη θερμοκρασία και τα όρια ανίχνευσης του δεν είναι ικανοποιητικά. Χρησιμοποιείται κυρίως στην ανάλυση σακχάρων, καθώς επίσης και στο διαχωρισμό και ανάλυση των πολυμερών ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΥΠΕΡΙΩ ΟΥΣ ΟΡΑΤΟΥ (UV-Vis ) Είναι ουσιαστικά ένα φασματοφωτόμετρο στο τέλος της στήλης του χρωματογράφου. Το υγρό εκλούσεως διαβιβάζεται μέσα από μια μικροκυψελίδα ροής όγκου 5-10 μl. Η ανίχνευση πραγματοποιείται στο μέγιστο της απορρόφησης ώστε να επιτυγχάνεται η μέγιστη ευαισθησία και ο μέγιστος λόγος σήματος προς τον ηλεκτρονικό θόρυβο της βασικής γραμμής. Η ευαισθησία αυτού του ανιχνευτή εξαρτάται από τη μοριακή απορροφητικότητα των διαφόρων συστατικών. Συνήθως ο ανιχνευτής μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συγκεντρώσεις της τάξεως του 0,01 μg/ml. εν επηρεάζεται από μεταβολές της θερμοκρασίας, είναι σχετικά φθηνός και μπορεί να χρησιμοποιηθεί και στη βαθμιδωτή έκλουση. Αποκρίνεται σε ένα μεγάλο αριθμό οργανικών ενώσεων και εξαιτίας των πλεονεκτημάτων του είναι ο περισσότερο χρησιμοποιούμενος ανιχνευτής. εν μπορεί να χρησιμοποιηθεί με διαλύτες κινητής φάσεως, που απορροφούν ισχυρά στο υπεριώδες, ή σε διαχωρισμούς συστατικών, που δεν απορροφούν στο υπεριώδες. Οι παλαιότερου τύπου ανιχνευτές UV-Vis ήταν σταθερού μήκους κύματος, ήταν οικονομικοί, λιγότερο ευαίσθητοι και δεν χρησιμοποιούνται πλέον. Πηγή ακτινοβολίας για την υπεριώδη περιοχή ( nm) ήταν λυχνία ατμών Hg χαμηλής πίεσης με έντονη εκπομπή στα 254 nm. Οι νεότερου τύπου ανιχνευτές είναι μεταβλητού μήκους κύματος και χρησιμοποιούν λυχνία δευτερίου ως πηγή ακτινοβολίας. Για την περιοχή του ορατού ( nm) χρησιμοποιείται λυχνία πυράκτωσης βολφραμίου. Έχουν καλύτερη ευαισθησία και ανάλογα με την περιοχή που η κάθε ένωση εμφανίζει μεγαλύτερη απορρόφηση επιλέγεται το κατάλληλο μήκος κύματος ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ Είναι μια παραλλαγή του φασματοφωτομετρικού ανιχνευτή απορροφήσεως, που μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο σε φθορίζουσες ουσίες (ειδικός ανιχνευτής). 10

26 Έντονο φθορισμό παρουσιάζουν αρωματικές ενώσεις λόγω συζευγμένων π ηλεκτρονίων. Σε μικρότερο βαθμό, φθορισμό εμφανίζουν αλειφατικές και αλεικυκλικές ενώσεις με καρβοξυλικές ομάδες και ενώσεις με υψηλά συζευγμένους διπλούς δεσμούς. Η ένταση του φθορισμού εξαρτάται από το μήκος κύματος διέγερσης της ένωσης. Η ευαισθησία του είναι πολύ μεγαλύτερη από αυτή του ανιχνευτή υπεριώδους ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΠΑΡΑΤΑΞΗΣ ΦΩΤΟ ΙΟ ΩΝ Με τον ανιχνευτή υπεριώδους η ταυτοποίηση ενός συστατικού βασίζεται αποκλειστικά και μόνο στο χρόνο συγκράτησής του, γεγονός που οδηγεί συχνά σε λανθασμένα αποτελέσματα, αφού πολλές φορές δεν επιτυγχάνεται πλήρης διαχωρισμός και δύο ή περισσότερες ουσίες εκλούονται ταυτόχρονα. Λύση στο πρόβλημα αυτό δόθηκε με ένα νέου τύπου ανιχνευτή υπεριώδους- ορατού, ο οποίος έδωσε νέα διάσταση στις αναλυτικές δυνατότητες της HPLC [6]. Ο ανιχνευτής αυτός, που είναι γνωστός ως ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων (photodiode array detector), συλλέγει τα δεδομένα της απορρόφησης της αναλυόμενης ένωσης σε όλο το φάσμα του ορατού ή του υπεριώδους. Η ουσιαστική διαφορά του με τον κλασικό ανιχνευτή UV-Vis είναι η παρουσία του ολογραφικού φράγματος στη θέση του μονοχρωμάτορα. Το δείγμα δέχεται ακτινοβολία ολόκληρου του φάσματος και η ακτινοβολία που βγαίνει από την κυψελίδα, αφού αναλυθεί στο ολογραφικό φράγμα, προσπίπτει σε παράταξη φωτοδιόδων, η οποία περιλαμβάνει από 35 ως 512 ή και παραπάνω φωτοευαίσθητα στοιχεία. Κάθε δίοδος δέχεται την ακτινοβολία ενός και μόνο nm και το σήμα αφού ενισχυθεί μετατρέπεται σε ψηφιακό και αποθηκεύεται στον υπολογιστή. Τα πλεονεκτήματα ενός ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων είναι αρκετά. Το σημαντικότερο από όλα είναι η συνεχής καταγραφή του ολικού φάσματος, που δίνει τη δυνατότητα κατασκευής τρισδιάστατων χρωματογραφημάτων (χρόνος, απορρόφηση, μήκος κύματος) καθώς και η δυνατότητα ποσοτικής εκτίμησης της ανάλυσης σε περισσότερα του ενός μήκη κύματος, γεγονός που αυξάνει την εκλεκτικότητα του προσδιορισμού. Η ευαισθησία του είναι μικρότερη σε σχέση με τον τυπικό ανιχνευτή UV και μπορεί να αυξηθεί, χρησιμοποιώντας κυψελίδα με τοιχώματα χαμηλού συντελεστή διάθλασης, όγκου 10 μl και μήκους 50 nm. 11

27 Σχήμα 1.5: Σχηματική παράσταση ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων ΗΛΕΚΤΡΙΚΟΣ (ΑΜΠΕΡΟΜΕΤΡΙΚΟΣ) ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ Ο όρος ηλεκροχημική ανίχνευση περιλαμβάνει τρεις κατηγορίες: α) αμπερομετρική, β) αγωγιμομετρική και γ) ποτενσιομετρική ανίχνευση. Η αμπερομετρική ανίχνευση αναφέρεται στη μέτρηση της έντασης ηλεκτρικού ρεύματος που παράγεται κατά την οξείδωση ή αναγωγή του συστατικού στην επιφάνεια μιας κυψελίδας συνεχούς ροής. Τα ηλεκτρόνια μεταφέρονται από την ουσία-φάρμακο στο ηλεκτρόδιο κατά την οξείδωση και το αντίστροφο κατά την αναγωγή. Στην αγωγιμομετρική ανίχνευση εφαρμόζεται εναλλασσόμενη διαφορά δυναμικού ανάμεσα στα δύο ηλεκτρόδια της κυψελίδας συνεχούς ροής. Τα αρνητικά φορτισμένα ανιόντα μετακινούνται προς το θετικό φορτισμένο ηλεκτρόδιο ενώ τα θετικά φορτισμένα κατιόντα προς το αρνητικά φορτισμένο ηλεκτρόδιο. Η ανίχνευση επιτυγχάνεται με μέτρηση του ρεύματος στην κυψελίδα. Η ποτενσιομετρική ανίχνευση αναφέρεται στη μέτρηση διαφοράς δυναμικού που αναπτύσσεται σ' ένα ηλεκτρόδιο ή σε μια μεμβράνη ενός εκλεκτικού ηλεκτροδίου ή ενός ηλεκτροδίου ph ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΜΑΖΩΝ Στη φασματομετρία μαζών, ηλεκτρόνια υψηλής ενεργειακής στάθμης προσκρούουν σε μόρια μιας ένωσης που βρίσκεται σε αέρια φάση και σε συνθήκες υψηλού κενού, με αποτέλεσμα να μετατρέπονται σε ιόντα με θετικό, συνήθως, 12

28 φορτίο. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια ηλεκτρικών πεδίων, τα παραχθέντα ιόντα ευθυγραμμίζονται σε λεπτή δέσμη. Η δέσμη διέρχεται μέσω ηλεκτρικού ή μαγνητικού πεδίου, οπότε το κάθε ιόν, ανάλογα με το λόγο μάζα/ηλεκτρικό φορτίο (m/z), αποκλίνει από την αρχική κατεύθυνση. Ο ανιχνευτής παράγει στην έξοδό του ηλεκτρικό σήμα (συνήθως ηλεκτρικό ρεύμα) ανάλογο του αριθμού ιόντων και του φορτίου τους, που δέχεται στη μονάδα του χρόνου. Η συνδυασμένη τεχνική υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μαζών (LC- MS) χαρακτηρίζεται από εξαιρετική ευαισθησία, εκλεκτικότητα και αξιοπιστία και αποτελεί σήμερα την πλέον αξιόπιστη τεχνική ταυτοποιήσεως ουσιών (ναρκωτικών, φαρμάκων, ουσιών doping) στα πολύπλοκα βιολογικά δείγματα. Τα μειονεκτήματά της είναι το μεγάλο κόστος αγοράς, λειτουργίας και συντήρησης του απαραίτητου εξοπλισμού καθώς και ο μεγάλος βαθμός εξειδίκευσης που απαιτείται για το χειρισμό των οργάνων και την ορθή ερμηνεία των φασμάτων μαζών ΕΞΑΤΜΙΣΤΙΚΟΣ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ ΣΚΕ ΑΣΗΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ (ELSD) Η ανίχνευση με ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) είναι μια τεχνική που μπορεί να εφαρμοστεί στην HPLC σε όλες τις ενώσεις που έχουν χαμηλότερη πτητικότητα σε σχέση με την κινητή φάση [7]. Αποτελείται από έναν εκνεφωτή που μετατρέπει το υγρό εκλούσεως που εξέρχεται από τη στήλη σε αερόλυμα, έναν θερμαινόμενο σωλήνα εξάτμισης του διαλύτη και μια οπτική κυψελίδα διαμέσου της οποίας διέρχεται ακτινοβολία η οποία σκεδάζεται από τα σωματίδια της ουσίας που επιθυμούμε να προσδιορίσουμε. Η ποσότητα του φωτός που σκεδάζεται είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ουσίας, ιδιότητα που καθιστά τον ELSD γενικό ανιχνευτή που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε προσδιορισμούς μορίων που δεν διαθέτουν χρωμοφόρες ομάδες. Ο εκνεφωτής είναι συνδεδεμένος απευθείας στη στήλη. Εδώ γίνεται η ανάμιξη του υγρού εκλούσεως με ένα αδρανές αέριο (συνήθως άζωτο, αργό ή ήλιο) το οποίο διαβιβάζεται υπό πίεση με αποτέλεσμα να προκύπτει αερόλυμα σταγονιδίων. Η μέση διάμετρος των σταγονιδίων και η ομοιομορφία τους είναι οι σημαντικότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την ευαισθησία και την επαναληψιμότητα της τεχνικής. Ένας καλός εκνεφωτής πρέπει να παράγει ένα ομοιογενές αερόλυμα μεγάλων σταγονιδίων με μικρή διασπορά του μεγέθους τους. Εντούτοις τα σταγονίδια δεν πρέπει να είναι πολύ μεγάλα καθώς καθίσταται αδύνατη η πλήρης εξάτμιση της κινητής φάσης και παρατηρούνται σφάλματα κατά την ανίχνευση. Οι παράγοντες που μπορούν να μεταβληθούν ώστε να προκύψει το κατάλληλο μέγεθος σταγονιδίων είναι η ταχύτητα ροής του αερίου και η ροή της κινητής φάσης. Συγκεκριμένα ελάττωση της ροής του αερίου και αύξηση της ροής 13

29 της κινητής φάσης οδηγούν σε αύξηση του μεγέθους των σταγονιδίων του αερολύματος. Τα πτητικά συστατικά του αερολύματος εξατμίζονται στον θερμαινόμενο σωλήνα που διαδέχεται τον εκνεφωτή, με αποτέλεσμα να απομένουν τα μη πτητικά τεμαχίδια της ουσίας, διασκορπισμένα σε μίγμα αερίου και ατμών του διαλύτη. Η ιδανική θερμοκρασία του σωλήνα εξάτμισης θεωρείται αυτή που εξασφαλίζει την πλήρη εξάτμιση της κινητής φάσης χωρίς απώλεια ουσίας εξαιτίας εξάτμισης ή θερμικής διάσπασης. Αν είναι χαμηλή, η απομάκρυνση του διαλύτη δεν είναι πλήρης, με συνέπεια ο θόρυβος του ανιχνευτή να αυξηθεί και να εμφανιστούν μεγάλες οξείες κορυφές στο χρωματογράφημα. Αντίθετα, πολύ υψηλή θερμοκρασία οδηγεί σε απώλεια ουσίας με αντίκτυπο στην ευαισθησία και ακρίβεια της μεθόδου. Τελευταία έχουν αναπτυχθεί ELSD συσκευές που μπορούν να εξατμίσουν το διαλύτη σε χαμηλή θερμοκρασία ο C, ώστε να είναι δυνατός ο προσδιορισμός θερμοευαίσθητων ουσιών. Το αερόλυμα μετά τη διαδικασία εξάτμισης, εισέρχεται στην οπτική κυψελίδα και διέρχεται διαμέσου της φωτεινής ακτινοβολίας. Κατά την αλληλεπίδραση του φωτός με τα σωματίδια της ουσίας, επιδιωκόμενο φαινόμενο είναι η σκέδαση κι όχι η απορρόφηση και κατάλληλες πηγές θεωρούνται εκείνες που παράγουν συνεχή φάσματα σε όλα τα μήκη κύματος, όπως τα νήματα βολφραμίου ή οι λυχνίες αλογόνου έναντι μονοχρωματικών διόδων εκπομπής λέιζερ. Το σκεδαζόμενο φως μετράται με φωτοπολλαπλασιαστή ή με φωτοδίοδο και παράγει το σήμα εξόδου. Συχνά η διάταξη περιλαμβάνει φωτοπαγίδα για τη δέσμευση της μη σκεδαζόμενης ακτινοβολίας. Οι διαδικασίες σκέδασης φωτός ταξινομούνται σε δύο τύπους: ελαστική σκέδαση, όπου η σκεδαζόμενη ακτινοβολία είναι της ίδιας συχνότητας με την αρχική ακτινοβολία και στην ανελαστική σκέδαση, όπου η σκεδαζόμενη ακτινοβολία είναι διαφορετικής συχνότητας. Στον ανιχνευτή ELSD η ανελαστική σκέδαση θεωρείται αμελητέα για αυτό και δεν εξετάζεται περαιτέρω. Η ελαστική σκέδαση διακρίνεται σε τρεις τύπους: Rayleigh, Debye και Mie. Ο μηχανισμός διάθλασης - ανάκλασης που προέρχεται από την παραγόμενη δευτερεύουσα εκπομπή ακτινοβολίας των σωματιδίων στη διαδρομή της αρχικής ακτίνας φαίνεται να είναι ένας επιπλέον δυνητικός μηχανισμός για την περιγραφή της σκέδασης στην οπτική κυψελίδα του ELSD. Το είδος της αλληλεπίδρασης μεταξύ του φωτός και των σωματιδίων εξαρτάται από το μέγεθος, το σχήμα, τις επιφανειακές ιδιότητες των σωματιδίων και το μήκος κύματος του αρχικού φωτός [8]. Στην πραγματικότητα, περισσότεροι από ένας μηχανισμοί σκέδασης λαμβάνουν χώρα. Αυτό οφείλεται στις διακυμάνσεις της διαμέτρου των σωματιδίων του αερολύματος, η οποία εξαρτάται από τις διαδικασίες εκνέφωσης και εξάτμισης, την πολυχρωματικότητα της φωτεινής πηγής και την εξάρτηση της μέσης διαμέτρου των σωματιδίων από τη συγκέντρωση του δείγματος. Καθώς ο εκνεφωτής 14

30 δημιουργεί σταγονίδια εκλούσματος σταθερής διαμέτρου, ο αριθμός των σταγονιδίων ανά μονάδα όγκου εκλούσματος είναι σταθερός, με συνέπεια ο όγκος των σωματιδίων του αναλυτή μετά την εξάτμιση της κινητής φάσης να είναι ανάλογος με τη συγκέντρωση του αναλυτή. Για τον ανιχνευτή ELSD δεν ισχύει ο νόμος του Beer με αποτέλεσμα να μην παρατηρείται γραμμική απόκριση. Το εμβαδό της χρωματογραφικής κορυφής (Α) φαίνεται να σχετίζεται καλώς με τη μάζα της ουσίας (m) σύμφωνα με την ακόλουθη εκθετική σχέση [9] : A=α m x όπου α και x είναι σταθερές που εξαρτώνται από το είδος του ανιχνευτή, καθώς επίσης και από την εκνέφωση και εξάτμιση, τη ροή κινητής φάσης και του φέροντος αερίου, τη σύσταση της κινητής φάσης, τη θερμοκρασία εξάτμισης κ.α. Επομένως για να ληφθεί γραμμικό διάγραμμα βαθμονόμησης απαιτείται λογαρίθμηση οπότε προκύπτει η εξίσωση [10]: log A=log α+x log m Σε ένα λογαριθμικό διάγραμμα log A σε συνάρτηση του log m, το x αντιστοιχεί στην κλίση (slope) της ευθείας, ενώ το log α στην τομή (intercept). Εκτός από την εκθετική συσχέτιση, πολυωνυμικές εξισώσεις δευτέρου και τρίτου βαθμού μπορούν να χρησιμοποιηθούν με σκοπό την καλή συσχέτιση της μάζας της ουσίας και του εμβαδού χρωματογραφικής κορυφής. Σχήμα 1.6: Σχηματική παράσταση ανιχνευτή ELSD [9]. 15

31 α β γ Σχήμα 1.7: Επιμέρους τμήματα ανιχνευτή ELSD: α) Εκνεφωτής, β) Σωλήνας εξάτμισης και γ) Οπτική κυψελίδα [11] ΣΥΣΤΗΜΑ ΚΑΤΑΓΡΑΦΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Το ηλεκτρικό σήμα του ανιχνευτή, με τη βοήθεια ειδικών σημάτων καταγραφής, καταγράφεται ως ένα σύνολο κορυφών (καμπύλες του Gauss) που αποτελούν το χρωματογράφημα. Η καταγραφή του χρωματογραφήματος μπορεί vα γίνει με απλό καταγραφικό σύστημα, ολοκληρωτή ή ηλεκτρονικό υπολογιστή. Ο ολοκληρωτής παρέχει το χρωματογράφημα στο οποίο εκτός από το χρόνο συγκράτησης κάθε συστατικού, δίνεται για κάθε κορυφή το ύψος ή το εμβαδό της, ώστε στη συνέχεια να μπορεί να γίνει ο ποσοτικός προσδιορισμός του. Στην περίπτωση χρησιμοποίησης ηλεκτρονικού υπολογιστή, αντί του αναλογικού καταγραφικού συστήματος, είναι απαραίτητη η μετατροπή του αναλογικού σήματος σε ψηφιακό, με τη χρήση ειδικού μετατροπέα. Τα πλεονεκτήματα που απορρέουν από τη χρήση Η/Υ για τη συλλογή και την επεξεργασία των αναλυτικών δεδομένων είναι η αποθήκευση των δεδομένων στη μνήμη του και η δυνατότητα επεξεργασίας των χρωματογραφημάτων. 1.4 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΣΤΗΝ HPLC Χρόνος Κατακράτησης ή Χρόνος Ανασχέσεως (t R ): Είναι ο χρόνος που μεσολαβεί μεταξύ εισαγωγής του δείγματος και εμφανίσεως του μεγίστου της κορυφής της ουσίας. Συντελεστής Κατακράτησης (k ): Ο συντελεστής κατακράτησης θεωρείται αντικειμενικότερο κριτήριο υπολογισμού της κατακράτησης μιας ουσίας από το t R, επειδή ο χρόνος κατακράτησης μεταβάλλεται όταν το μήκος της στήλης ή η ταχύτητα ροής αλλάζουν, ενώ το k παραμένει σταθερό. Ορίζεται ως ο λόγος του επιπλέον χρόνου που απαιτείται για την έκλουση της ουσίας σε σχέση με μια ουσία 16

32 που δεν κατακρατείται, προς το χρόνο στον οποίο εκλούεται η ουσία που δεν κατακρατείται. k = t R t M / t M t M :ορίζεται ο νεκρός χρόνος της στήλης, δηλαδή ο χρόνος που απαιτείται για να περάσει από τη στήλη ένα μόριο που θεωρητικά δεν κατακρατείται, όπως είναι αυτό του διαλύτη. Ο συντελεστής κατακράτησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σύγκριση της κατακράτησης σε διαχωρισμούς, κατά τους οποίους το μήκος της στήλης ή ο ρυθμός ροής αλλάζουν. ιαχωριστική Ικανότητα ή ιαχωριστικότητα (R S ): Είναι ένα ποσοτικό μέτρο του διαχωρισμού δύο διαδοχικών κορυφών και ισούται με την απόσταση μεταξύ των μέσων των δύο κορυφών, διαιρεμένη με το μέσο εύρος των κορυφών: R s = t R,B t R,A / 0,5(W Α +W Β ) Ο διαχωρισμός θεωρείται πρακτικά πλήρης όταν R s 1,5 [12]. Μεγαλύτερες τιμές R s αντικατοπτρίζουν καλύτερο διαχωρισμό, ενώ μικρότερες τιμές δείχνουν φτωχό διαχωρισμό. Σχήμα 1.8: ιαχωρισμός με τρεις διαφορετικές διαχωριστικές ικανότητες R s. 17

33 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ UV-VIS 2.1 ΓΕΝΙΚΑ Η Φασματοσκοπία (Φασματοφωτομετρία) είναι μια από τις χρησιμότερες ενόργανες τεχνικές ανάλυσης και μελετά την αλληλεπίδραση μεταξύ της ύλης και της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. ιακρίνεται σε Φασματοσκοπία απορρόφησης και Φασματοσκοπία εκπομπής. Στην πρώτη περίπτωση τα μόρια μιας ουσίας απορροφούν ενέργεια από μια καθορισμένη ακτινοβολία και μεταβαίνουν από τη βασική στη διεγερμένη κατάσταση, παρέχοντας τα φάσματα απορρόφησης. Αντιθέτως όταν τα μόρια μιας ουσίας από τη διεγερμένη κατάσταση μεταβαίνουν στη βασική, η διαφορά ενέργειας εκπέμπεται υπό μορφή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας οπότε λαμβάνονται φάσματα εκπομπής [13]. Πολλές χημικές ουσίες απορροφούν ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία, ιδιαίτερα στην υπεριώδη περιοχή του φάσματος και με χρήση του κατάλληλου οργάνου και τεχνικής είναι δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός τους σε ένα μίγμα. Το τμήμα του μορίου που είναι υπεύθυνο για την απορρόφηση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας, ονομάζεται χρωμοφόρο και η εμφάνιση των χαρακτηριστικών ταινιών απορροφήσεως των διαφόρων χρωμοφόρων ομάδων σε ένα φάσμα απορροφήσεως είναι ενδεικτική για την ύπαρξη των ομάδων αυτών στο μόριο. Η φασματοφωτομετρία υπεριώδους ορατού ( nm) χρησιμοποιείται κυρίως για τον ποσοτικό προσδιορισμό ουσιών, με συσχέτιση του ποσοστού απορροφήσεως ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας προς τη συγκέντρωση της ουσίας που είναι υπεύθυνη για την απορρόφηση (ποσοτική φασματοφωτομετρία). 2.2 ΝΟΜΟΣ BEER Όταν μονοχρωματική ακτινοβολία διέρχεται από διάλυμα, που περιέχει την ουσία Χ, η οποία απορροφά, η ισχύς της ακτινοβολίας ελαττώνεται προοδευτικά κατά μήκος της διαδρομής, λόγω απορροφήσεως της από την ουσία Χ. Η ελάττωση της ισχύος (P<P0), εξαρτάται από τη συγκέντρωση της ουσίας Χ και από την απόσταση που διάνυσε η δέσμη μέσα στο διάλυμα. Οι σχέσεις αυτές εκφράζονται από τον νόμο των Lambert-Beer, που συνήθως αναφέρεται ως νόμος του Beer και διατυπώνεται με την μορφή: 18

34 log P P o log T log 100 % T abc g / L bc mol / L (2.1) Όπου Α απορρόφηση P 0 ισχύς προσπίπτουσας ακτινοβολίας P ισχύς της εξερχόμενης ακτινοβολίας, μετά την διέλευση από το διάλυμα Τ διαπερατότητα, ίση με P/P 0 που εκφράζεται και στα (%Τ) a σταθερά αναλογίας, όταν η C εκφράζεται σε g/l, που καλείται απορροφητικότητα, με μονάδες g -1 Lcm -1 b μήκος διαδρομής που διανύθηκε μέσα στο διάλυμα και εκφράζεται συνήθως σε cm (πάχος κυψελίδας) ε σταθερά αναλογίας, όταν η C εκφράζεται σε mol/l, που καλείται μοριακή απορροφητικότητα, με μονάδες mol -1 Lcm -1 Ο νόμος του Beer προϋποθέτει ότι: α) ο μόνος μηχανισμός αλληλεπίδρασης ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας και διαλυμένης ουσίας είναι η απορρόφηση, β) η προσπίπτουσα ακτινοβολία είναι μονοχρωματική, γ) η απορρόφηση γίνεται σε ένα όγκο διαλύματος ομοιόμορφης διατομής και δ) ότι τα σωματίδια που απορροφούν δρουν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο και άσχετα από τον αριθμό και το είδος τους. Σε πολλές όμως περιπτώσεις παρατηρείται απόκλιση από τη γραμμική σχέση μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης οι οποίες περιορίζουν τη δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων που μπορεί να εφαρμοστεί ο νόμος του Beer. Ο νόμος του Beer δεν ισχύει για πυκνά διαλύματα (C>0,01M), διότι σε αυτά οι αποστάσεις μεταξύ των σωματιδίων που απορροφούν γίνονται τόσο μικρές, ώστε καθένα από αυτά να επηρεάζει την κατανομή φορτίου στα γειτονικά σωματίδια και συνεπώς και την ικανότητά τους να απορροφούν ακτινοβολία ορισμένου μήκους κύματος. Επίσης, σε πυκνά διαλύματα δεν παραμένει σταθερή και η μοριακή απορροφητικότητα ε. Η παραπάνω περίπτωση καθορίζει έναν περιορισμό θεμελιώδους σημασίας στη χρήση του νόμου του Beer και αποτελεί μια πραγματική απόκλιση. Υπάρχουν και φαινομενικές αποκλίσεις που μπορεί να οφείλονται στα χρησιμοποιούμενα όργανα και τον τρόπο διεξαγωγής των μετρήσεων απορρόφησης, όπως π.χ. στη μη γραμμική σχέση μεταξύ λαμβανόμενου σήματος και ισχύος της ακτινοβολίας, στη μη μονοχρωματικότητα της προσπίπτουσας ακτινοβολίας ή σε «παράσιτη» ακτινοβολία,δηλαδή σε ακτινοβολία που φθάνει στον ανιχνευτή χωρίς να ανήκει στην επιλεγμένη από το μονοχρωμάτορα δέσμη. Μια άλλη αιτία απόκλισης από το νόμο του Beer είναι οι χημικοί παράγοντες, π.χ. όταν το σύνολο της ουσίας που απορροφά δεν βρίσκεται στην ίδια χημική μορφή αλλά τα σωματίδια που απορροφούν συμμετέχουν σε χημικές ισορροπίες. Σε αυτήν την περίπτωση 19

35 οποιαδήποτε μετατόπιση στη θέση ισορροπίας συνεπάγεται φαινομενική απόκλιση από το νόμο του Beer. 2.3 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Οι βασικές δομικές μονάδες ενός φασματοφωτομέτρου είναι: 1) μια πηγή ακτινοβολίας σταθερής ισχύος, 2) ένας μονοχρωμάτορας για την απομόνωση της επιθυμητής ακτινοβολίας, 3) μια κυψελίδα για την τοποθέτηση του δείγματος και μια δεύτερη για την τοποθέτηση του τυφλού διαλύματος, 4) ένας ανιχνευτής ακτινοβολίας που μετατρέπει το οπτικό σήμα σε ηλεκτρικό και 5) ένα σύστημα μετρήσεως που περιλαμβάνει ενισχυτή του σήματος και όργανο αναγνώσεως. 1) Πηγή ακτινοβολίας. Στην υπεριώδη περιοχή ( nm) χρησιμοποιείται η λυχνία εκκενώσεως δευτερίου, ενώ στην ορατή ( nm) λυχνία πυρακτώσεως βολφραμίου, στην οποία σπείραμα από σύρμα βολφραμίου, ευρισκόμενο σε γυάλινο περίβλημα, πυρακτώνεται με ηλεκτρικό ρεύμα και φωτοβολεί. 2) Η ακτινοβολία που εκπέμπεται από την πηγή κατευθύνεται μέσω κατόπτρων στο μονοχρωμάτορα, όπου ένα φράγμα περιθλάσεως μπλοκάρει τα μήκη κύματος που δεν είναι επιθυμητά, επιτρέποντας τη διέλευση μόνο της προεπιλεγμένης μονοχρωματικής ακτινοβολίας. 3) Στη συνέχεια η δέσμη διχάζεται σε δύο τμήματα, ένα για το διάλυμα του δείγματος και ένα για το τυφλό ή διάλυμα αναφοράς (φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης). Καθεμία από τις δέσμες διέρχεται από μια κυψελίδα (που περιέχει το δείγμα και το τυφλό αντίστοιχα) όπου λαμβάνει χώρα απορρόφηση. Οι κυψελίδες είναι κατασκευασμένες από χαλαζία για μετρήσεις στην περιοχή του υπεριώδους ή από γυαλί για μετρήσεις στο ορατό, έχουν συγκεκριμένο πάχος, συνήθως 1cm και θα πρέπει να δείχνουν την ίδια απορρόφηση όταν περιέχουν το ίδιο διάλυμα. 4) Μετά τη διέλευσή τους από τις κυψελίδες, οι δέσμες κατευθύνονται προς τους αντίστοιχους ανιχνευτές για την μετατροπή του οπτικού σήματος σε ηλεκτρικό και την ενίσχυσή του. Ως ανιχνευτές χρησιμοποιούνται φωτοδίοδοι πυριτίου. Αυτοί αποτελούνται από ένα επίπεδο ηλεκτρόδιο Cu ή Fe, στο οποίο έχει αποτεθεί στρώμα ημιαγωγού, Si. Στην επιφάνεια του ημιαγωγού υπάρχει διαφανές μεταλλικό στρώμα Ag που δρα ως δεύτερο ηλεκτρόδιο (συλλέκτης). Όταν προσπίπτει ακτινοβολία στην επιφάνεια του ημιαγωγού, προκαλεί ροή ηλεκτρονίων από τον αγωγό προς το μεταλλικό στρώμα, το οποίο συνδέεται με εξωτερικό αγωγό και το κύκλωμα διαρρέεται από ασθενές ρεύμα. Στο σχήμα 2.1 απεικονίζεται σχηματικά ένα φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης 20

36 Σχήμα 2.1: Σχηματικό διάγραμμα φασματοφωτόμετρου διπλής δέσμης 2.4 ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ UV-VIS Η χρήση φασματοφωτομετρικών αναλυτικών μεθόδων για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό ουσιών χωρίς προηγούμενο διαχωρισμό τους έχει αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια [14, 15]. Αρχικά η διαδικασία περιελάμβανε την επίλυση ενός συστήματος εξισώσεων λαμβανόμενα από τα φάσματα απορρόφησης των ουσιών ενός μίγματος σε όσο το δυνατόν περισσότερα μήκη κύματος. Η ακρίβεια των αποτελεσμάτων, είναι φανερό ότι περιοριζόταν από το βαθμό αλληλοεπικάλυψης των απορροφήσεων. Η φασματοφωτομετρία παραγώγων υπεριώδους-ορατού πέτυχε να παρακάμψει πολλά από τα προβλήματα που παρουσίαζε η μελέτη φασμάτων μηδενικής απορρόφησης και να εξαλείψει τυχόν αλληλεπιδράσεις εκδόχων κατά την ανάλυση φαρμακευτικών σκευασμάτων [16]. Ο νόμος του Beer για ένα μίγμα δύο συστατικών Χ και Ψ σε μήκος κύματος λ i και εφόσον το πάχος της κυψελίδας είναι 1 cm, δίνεται από την παρακάτω σχέση : A i, ic, ic (2.2) ιαιρώντας κατά μέλη την εξίσωση (2.2) µε την αντίστοιχη εξίσωση απορρόφησης του φάσματος ενός προτύπου διαλύματος μιας από τις δύο ουσίες (π.χ. για την Χ ουσία µε συγκέντρωση C 0 Χ, ) και παραγωγίζοντας το αποτέλεσμα, προκύπτει η εξίσωση: d d i C 0 0 d C d i X X i λi, (2.3),, C X Από την εξίσωση (2.3) συμπεραίνουμε ότι το φάσμα των δυο ουσιών, επεξεργασμένο µε την τεχνική της «Παραγώγισης Φασματικών Λόγων» (Derivative Ratio), για την πρώτη παράγωγο, είναι ανεξάρτητο από την C Χ και 0 εξαρτάται µόνο από τις C Ψ και C Χ με αποτέλεσμα οι ουσίες να μπορούν να προσδιοριστούν από τις αντίστοιχες καμπύλες αναφοράς τους. 21

37 Αντίστοιχα ο νόμος του Beer για μίγμα τριών συστατικών Χ,Ψ και Ζ σε μήκος κύματος λ i και εφόσον το πάχος της κυψελίδας είναι 1 cm, δίνεται από την παρακάτω σχέση : A i, ic, ic Z, ic (2.4) ιαιρώντας κατά μέλη την εξίσωση (2.4) µε την αντίστοιχη εξίσωση του φάσματος ενός προτύπου διαλύματος μιας από τις τρεις ουσίες (π.χ. για την Χ ουσία µε συγκέντρωση C 0 Χ ) και παραγωγίζοντας το αποτέλεσμα, προκύπτει η εξίσωση: d λi d, C d i Z, i C d C X d,, i C d i, i (2.5) C X X Ομοίως η C Ψ μπορεί να προσδιοριστεί από τις καμπύλες αναφοράς εφόσον ο όρος d Z, i C 0 d, i ισούται με το μηδέν. Αυτό ισχύει στην περίπτωση που ο C X προσδιορισμός γίνει σε μήκος κύματος όπου η απορρόφηση της ουσίας Ζ (αφού διαιρεθεί και υποστεί παραγώγιση) ισούται με μηδέν (zero-crossing). Κατά τον ίδιο τρόπο υπολογίζονται και οι συγκεντρώσεις των υπολοίπων αγνώστων συγκεντρώσεων C Χ και C Ζ (τεχνική «Παραγώγισης Φασματικών Λόγων - ιόδου από το Μηδέν», Derivative Ratio-Zero Crossing). 2.5 ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΟΒΟΛΗΣ ΜΕΡΙΚΩΝ ΕΛΑΧΙΣΤΩΝ ΤΕΤΡΑΓΩΝΩΝ (PLS) ΣΕ ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΕΣ ΟΜΕΣ Η Ανάλυση Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (Προβολές Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων σε Λανθάνουσες ομές, Partial Least Squares Projections to Latent Structures, PLS) είναι μία χημειομετρική μέθοδος ανάλυσης, η οποία ανήκει στις στατιστικές μεθόδους πολλών μεταβλητών. Αυτές, σε αντίθεση με τις μεθόδους μιας μεταβλητής, χρησιμοποιούν πλήθος στοιχείων για την ανάλυση, κάτι που συνεπάγεται και πλήθος πληροφοριών που σχετίζονται με τα δεδομένα και δυνατότητα εξέτασης πιο πολύπλοκων συστημάτων. Η ανάλυση PLS εξάγει από ένα πλήθος μεταβλητών Χ έναν περιορισμένο αριθμό νέων (λανθάνουσων, latent) μεταβλητών που καλούνται κύριες συνιστώσες και συνοψίζουν την πληροφορία που περιέχεται στις αρχικές μεταβλητές, προβλέποντας ταυτόχρονα τις μεταβλητές Ψ και οδηγώντας σε καλή μοντελοποίηση των αποκρίσεων. Η μέθοδος PLS βρίσκει όλο και μεγαλύτερη εφαρμογή στον ταυτόχρονο προσδιορισμό φαρμακευτικών ουσιών χωρίς να προηγηθεί ο διαχωρισμός τους, με χρηση των UV φασμάτων τους [14, 15]. Η μέθοδος περιλαμβάνει την παρασκευή Ν δειγμάτων αναφοράς και λήψη ισάριθμων φασμάτων, Μ σημείων το καθένα. Οι 22

38 τιμές των απορροφήσεων στα Μ μήκη κύματος τοποθετούνται σε πίνακα Χ διαστάσεων ΝxΜ ενώ οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις τοποθετούνται σε πίνακα Ψ που στοιχεία του είναι οι συγκεντρώσεις ενός συστατικού στα N φάσματα. Στο σχήμα που ακολουθεί περιγράφεται η παραπάνω διαδικασία [17] Ο πίνακας των φασματικών δεδομένων Χ αναλύεται σε άθροισμα παραγόντων που ονομάζονται ranks. Ο κάθε παράγοντας περικλείει μέσα του πληροφορία, που σχετίζεται με μεταβολές των στοιχείων του πίνακα, δηλαδή μεταβολές στα φασματικά χαρακτηριστικά. Αυτοί οι παράγοντες μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντί του αρχικού πίνακα για την ανάλυση και αναφέρονται ως «λανθάνοντες παράγοντες» διότι αναπαράγουν πιστά, εν δυνάμει ιδιότητες του συστήματος, αν και οι ίδιοι δεν προσδιορίζονται άμεσα από τις μετρήσεις. Στην περίπτωση της ανάλυσης PLS αυτοί οι παράγοντες επιλέγονται έτσι ώστε να προσεγγίζουν με όσο το δυνατόν καλύτερο τρόπο τα δεδομένα. Στη διαδικασία αυτή, οι τιμές των συγκεντρώσεων συσχετίζονται με εύρος φασματικής περιοχής αντί με ένα σημείο του φάσματος. Οι πληροφορίες που εμπεριέχονται στα δεδομένα που αναλύονται με αυτή τη μέθοδο είναι σαφώς περισσότερες από αυτές που λαμβάνονται στην ανάλυση με τη χρήση μιας μεταβλητής. ηλαδή, χρησιμοποιώντας εύρος φασματικής περιοχής αντί για συγκεκριμένο σημείο φάσματος ως δεδομένο, η ανάλυση μπορεί να χειριστεί περισσότερες πληροφορίες για την εύρεση της πιο ρεαλιστικής και αξιόπιστης συνάρτησης βαθμονόμησης. 23

39 Oπως σε κάθε μοντέλο Παλινδρόμησης, έτσι και στην Παλινδρόμηση Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων, απαραίτητος θεωρείται ο καθορισμός της σωστής πολυπλοκότητας (complexity) του μοντέλου μας. Λόγω της ύπαρξης πολλών και συσχετισμένων μεταξύ τους X μεταβλητών, ελλοχεύει ο κίνδυνος να πάρουμε ένα υπερορισμένο μοντέλο, δηλαδή ένα μοντέλο ναι μεν καλά προσαρμοσμένο στα δεδομένα μας, αλλά με λίγη έως μηδαμινή ικανότατα πρόβλεψης. Επομένως απαραίτητη είναι η κατασκευή ενός ελέγχου με τον οποίο θα διαπιστώνεται η σημαντικότητα στην πρόβλεψη κάθε PLS συνιστώσας και θα σταματάει την περαιτέρω προσαρμογή όταν οι εξαγόμενες συνιστώσες παύουν να είναι σημαντικές. Αυτός ο έλεγχος δύναται να πραγματοποιηθεί μέσω της τεχνικής του CV ( ιασταυρούμενη Αξιολόγηση, Cross Validation). Η διασταυρούμενη αξιολόγηση γίνεται με αφαίρεση αντικειμένων και επανάληψη της στατιστικής ανάλυσης κάθε φορά μέχρι όλα τα αντικείμενα να έχουν αφαιρεθεί μια φορά. Στη συνέχεια υπολογίζονται οι διαφορές μεταξύ των αρχικών και των προβλεπόμενων Y τιμών για τα δεδομένα που έχουν διαγραφεί. Ακολούθως υπολογίζεται το άθροισμα των τετραγώνων αυτών των διαφορών, απ όλα τα παράλληλα μοντέλα, το οποίο δίνει το PRESS (Predicted-Residual-Sum-Of- Squares). Το PRESS εκτιμά την ικανότητα πρόβλεψης του μοντέλου και δίνεται από τη σχέση: PRESS= i (Y im - Ŷ im ) 2 m Μια άλλη παράμετρος εκτίμησης της ικανότητας πρόβλεψης ενός μοντέλου είναι και ο διασταυρούμενος συντελεστής συσχέτισης, Q 2 για τον οποίον ισχύει: Q 2 =1-PRESS/SS με το SS να είναι το άθροισμα τετραγώνων του Y διορθωμένου για το μέσο. Ως κρίσιμες στατιστικές παράμετροι για την αξιολόγηση του μοντέλου PLS θεωρούνται οι τιμές RMSEP, RMSEE και r 2. RMSEP (Root Mean Square Error of Prediction) και RMSEE (Root Mean Square Error of Estimation) είναι οι τυπικές αποκλίσεις των υπολοίπων (residuals), των προτύπων και αγνώστων δειγμάτων από τις αντίστοιχες πραγματικές τους τιμές και υπολογίζονται από τις σχέσεις: ( obs pred RMSEP ) N 2 RMSEE ( c i N c i ) 2 24

40 όπου Ν είναι ο συνολικός αριθμός των υπό ανάλυση δειγμάτων. Ο συνολικός συντελεστής συσχετίσεως r 2 αποτελεί ένδειξη του βαθμού προσαρμογής των δεδομένων σε ευθεία γραμμή. Ιδανική τιμή του θεωρείται η μονάδα. 25

41 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΣ 3.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σύμφωνα με τον Montgomery [18] ως πείραμα ορίζεται μία δοκιμασία ή μια σειρά δοκιμασιών, κατά τις οποίες πραγματοποιούνται σκόπιμες αλλαγές στις μεταβλητές εισόδου (παράγοντες) μιας διαδικασίας ή ενός συστήματος, ώστε να εξακριβωθούν οι αιτίες των μεταβολών που αυτές μπορούν να προκαλέσουν στις αποκρίσεις εξόδου (σχήμα 3.1). Συχνά ο ερευνητής έχει να αντιμετωπίσει και έναν αριθμό μη ελεγχόμενων μεταβλητών εισόδου που μπορεί να είναι ασυνεχείς (πχ. η χρήση διαφορετικού οργάνου) ή συνεχείς (πχ. η θερμοκρασία ή η υγρασία). Πολλές φορές, ανάλογα με τις απαιτήσεις του πειράματος είναι δυνατόν να χρειαστεί να ελεγχθούν και οι μη ελεγχόμενοι παράγοντες. Ρόλος του ερευνητή είναι να καθορίσει την επίδραση που έχουν οι παράγοντες στις αποκρίσεις εξόδου του συστήματος ή της διαδικασίας και να προτείνει τις βέλτιστες δυνατές τιμές τους. Σχήμα 3.1: Σχηματική απεικόνιση συστήματος ή διαδικασίας. 26

42 Παραδοσιακά, η μέθοδος βελτιστοποίησης μιας διεργασίας, επιτυγχάνεται με τη μελέτη της επίδρασης ενός μόνο παράγοντα τη φορά, ενώ παραμένουν σταθεροί όλοι οι υπόλοιποι (η μέθοδος είναι γνωστή ως COST Changing One Single variable or factor at a Time ή OFAT/OVAT One Factor/Variable At a Time). Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, ακολουθώντας τη μέθοδο δοκιμής και απόρριψης, μεταβάλλονται τα επίπεδα ενός μόνο παράγοντα κάθε φορά και καταγράφεται η απόκριση. Εάν προκύπτει βελτίωση της απόκρισης, τα επίπεδα του παράγοντα μεταβάλλονται προς την ίδια κατεύθυνση έως ότου η απόκριση σταματήσει να βελτιώνεται σημαντικά. Όπως είναι φυσικό, η μέθοδος αυτή είναι χρονοβόρα και όχι απόλυτα αξιόπιστη, ειδικά σε περιπτώσεις που υπεισέρχονται πολλοί παράγοντες και υπάρχουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους [19]. Μια παρόμοια μέθοδος πειραματισμού που παραδοσιακά εφαρμόζεται σε βιομηχανίες ή/και εργαστήρια είναι γνωστή ως μέθοδος της εμπειρικής εκτίμησης των καλύτερων συνθηκών (best-guess approach). Κατά τη μέθοδο αυτή επιλέγεται ένας συνδυασμός επιπέδων για ορισμένο αριθμό παραγόντων και επιδιώκεται η βελτίωση των αποκρίσεων. Η επιτυχία της εν λόγω μεθόδου έγκειται κυρίως στη γνώση της διεργασίας και την εμπειρία που διαθέτει ο ερευνητής [20]. Με σκοπό την καταπολέμηση όλων των περιορισμών που εμφανίζονται με τη χρήση των παραδοσιακών μεθόδων σχεδιασμού, η ερευνητική κοινότητα στράφηκε προς τα μαθηματικά και τη στατιστική (συγκεκριμένα προς τις συστηματικές μεθόδους βελτιστοποίησης) για την εύρεση βέλτιστων λύσεων. Σήμερα ως βελτιστοποίηση [19] ορίζεται η μαθηματική μεθοδολογία ή διαδικασία με την οποία προσδιορίζεται η μέγιστη ή ελάχιστη τιμή μιας συνάρτησης πολλών μεταβλητών. ηλαδή κάθε πρόβλημα σχεδιασμού, λειτουργίας και ανάλυσης συστημάτων μπορεί να προσεγγιστεί με βελτιστοποίηση (μεγιστοποίηση ή ελαχιστοποίηση) καταλλήλων συναρτήσεων που περιγράφουν την κατάσταση και την ποιότητα του προϊόντος που παράγει το σύστημα. Γι αυτό σήμερα η βελτιστοποίηση αναπτύσσεται, αφενός ως καθαρά μαθηματική τεχνική και αφετέρου ως ειδικές εφαρμογές, ανάλογα με την κατηγορία των συστημάτων και των συνθηκών στις οποίες χρησιμοποιείται. Έτσι, αναπτύχθηκε μία νέα μέθοδος διεξαγωγής πειραμάτων, γνωστή ως πειραματικός σχεδιασμός (experimental design ή design of experiments - DoE) με στόχο τη δημιουργία ενός νέου εργαλείου βελτιστοποίησης. Οι πειραματικοί σχεδιασμοί είναι σε θέση να περιγράψουν ένα σύστημα με μικρό αριθμό πειραμάτων, εάν ταυτόχρονα μεταβάλλονται τα επίπεδα όλων των ανεξάρτητων παραγόντων κατά προκαθορισμένο τρόπο. Τα σχεδιασμένα επί τη βάσει των αρχών της στατιστικής πειράματα παρέχουν τη δυνατότητα της επεξεργασίας των δεδομένων, προς συλλογή χρησίμων πληροφοριών και εξαγωγή συμπερασμάτων. Σήμερα, η ανάπτυξη των πληροφορικών συστημάτων και η ενσωμάτωση των 27

43 πειραματικών σχεδιασμών σε στατιστικά προγράμματα έχει οδηγήσει στην περαιτέρω διάδοσή τους. 3.2 ΣΤΑ ΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΥ Η αλληλουχία βημάτων που πρέπει να ακολουθήσει ένας ερευνητής ώστε να αναπτύξει έναν επιτυχημένο πειραματικό σχεδιασμό είναι η εξής [18]: 1. Αναγνώριση και καθορισμός του προβλήματος. Το πρόβλημα που απαιτεί την εφαρμογή του πειραματικού σχεδιασμού πρέπει να αναγνωριστεί πολύπλευρα και ο στόχος να καθοριστεί πλήρως, ώστε να εξασφαλιστεί η εξοικονόμηση πόρων και προσπάθειας. 2. Επιλογή των παραγόντων εισόδου και των επιπέδων τους. Ο ερευνητής στο στάδιο αυτό καθορίζει ποιοι είναι οι παράγοντες που δύνανται να επηρεάσουν τη συμπεριφορά του συστήματος ή διαδικασίας. Στη συνέχεια επιλέγει αυτούς που επιθυμεί να κρατήσει σταθερούς και αυτούς που θέλει να μεταβάλλει ώστε να πετύχει το βέλτιστο αποτέλεσμα. Εφαρμόζοντας ένα μικρό αριθμό προπειραμάτων καθορίζονται τα επίπεδα των παραγόντων καθώς και τα όρια των τιμών τους. Είναι εξαιρετικά σημαντικό όλα τα επίπεδα να έχουν φυσικό νόημα (π.χ. αρνητικές τιμές για τη ρύθμιση των στροφών ενός αναδευτήρα, ή για τις τιμές του ph δεν έχουν φυσικό νόημα). 3. Επιλογή αποκρίσεων. Επιλέγονται από τον ερευνητή οι αποκρίσεις εξόδου, με κριτήριο να είναι χρήσιμες για την εξαγωγή συμπερασμάτων για το σύστημα ή διεργασία που μελετά. 4. Επιλογή του είδους του πειραματικού σχεδιασμού. Το στάδιο αυτό είναι σχετικά εύκολο, αν τα προηγούμενα βήματα έχουν γίνει σωστά. Η επιλογή του είδους του πειραματικού σχεδιασμού περιλαμβάνει των αριθμό των πειραμάτων που πρέπει να γίνουν συμπεριλαμβανομένου τυχόν επαναλήψεων (replicates), τον καθορισμό της σειράς με την οποία θα γίνει το καθένα (επιβάλλεται η διεξαγωγή σε τυχαία σειρά) και την απόφαση για το αν θα εφαρμοστεί ή όχι ομαδοποίηση (blocking) των πειραμάτων. Η ομαδοποίηση αυξάνει την ακρίβεια των πειραμάτων καθώς το πειραματικό υλικό χωρίζεται σε ομάδες που είναι περισσότερο ομοιογενείς από το σύνολο. Σημαντική βοήθεια για το στάδιο αυτό δίνουν και οι πολλές εφαρμογές που έχουν αναπτυχθεί. Ο ερευνητής μπορεί να εισάγει στο πρόγραμμα πληροφορίες σχετικά με τον αριθμό των παραγόντων, τα επίπεδά τους και το εύρος τιμών τους και αυτό να παρουσιάσει μια γκάμα σχεδιασμών για διερεύνηση ή και να προτείνει έναν συγκεκριμένο σχεδιασμό. Επίσης παρέχει ένα φύλλο εργασίας με όλα τα πειράματα που πρέπει να διεξαχθούν σε τυχαία (randomized) σειρά. 5. ιεξαγωγή των πειραμάτων. Κατά την εκτέλεση των πειραμάτων από τον ερευνητή έχει μεγάλη σημασία η συνεχής παρακολούθηση της διαδικασίας ώστε 28

44 όλα να πηγαίνουν σύμφωνα με το σχεδιασμό. Λάθη σε αυτό το στάδιο συνήθως έχουν ως συνέπεια την απώλεια της εγκυρότητας του πειραματικού σχεδιασμού. 6. Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Για την αξιολόγηση των τιμών που προκύπτουν από τα πειράματα που διεξήχθησαν στο προηγούμενο στάδιο είναι απαραίτητη η χρήση στατιστικών τεχνικών. Σήμερα υπάρχουν πολλές στατιστικές εφαρμογές που μπορούν εύκολα να κάνουν την ανάλυση των δεδομένων του πειραματικού σχεδιασμού και συχνά οι εφαρμογές που χρησιμοποιούνται στο τέταρτο βήμα έχουν ενσωματωμένη τη δυνατότητα αυτή. 7. Εξαγωγή συμπερασμάτων. Στο στάδιο αυτό ο ερευνητής αφού λάβει υπόψη την αξιολόγηση των πειραματικών δεδομένων καταλήγει στις βέλτιστες συνθήκες που θα χρησιμοποιηθούν στο εξεταζόμενο σύστημα ή διαδικασία. 3.3 ΕΙ Η ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΣΧΕ ΙΑΣΜΩΝ Τα κυριότερα είδη πειραματικού σχεδιασμού είναι οι παραγοντικοί σχεδιασμοί (factorial designs), οι σχεδιασμοί simplex, οι σχεδιασμοί επιφανειών απόκρισης (response surface designs), οι σχεδιασμοί μιγμάτων (mixture designs) και οι βέλτιστοι σχεδιασμοί (optimal designs) ΠΑΡΑΓΟΝΤΙΚΟΙ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΙ Ο εντοπισμός των στατιστικά σημαντικών παραγόντων (screening) γίνεται με τη βοήθεια κατάλληλων πειραματικών σχεδιασμών, που ονομάζονται παραγοντικοί σχεδιασμοί διότι επιτρέπουν την εξέταση της επιδράσεως ανεξαρτήτων παραγόντων. Περιλαμβάνουν 2 k πειράματα, όπου k είναι ο αριθμός των ανεξάρτητων παραγόντων και ο αριθμός 2 δηλώνει ότι εφαρμόζονται 2 επίπεδα για κάθε παράγοντα, ένα υψηλό και ένα χαμηλό. Όταν εξετάζονται όλοι οι δυνατοί συνδυασμοί παραγόντων και επιπέδων (2 k ), ονομάζονται πλήρεις παραγοντικοί σχεδιασμοί (full factorial), ενώ όταν εξετάζεται μέρος των δυνατών συνδυασμών, τότε ονομάζονται κλασματικοί παραγοντικοί σχεδιασμοί. Οι πλήρεις παραγοντικοί σχεδιασμοί έχουν το πλεονέκτημα ότι επιτρέπουν την εκτίμηση όλων των δυνατών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των παραγόντων και με την προσθήκη επιπλέον πειραματικών σημείων μπορούν να εξελιχθούν σε ανώτερης τάξης σχεδιασμούς (πχ. 3 k ή κεντρικό σύνθετο σχεδιασμό, CCD). Οι κλασματικοί παραγοντικοί σχεδιασμοί χαρακτηρίζονται από την ικανότητα τους να διακρίνουν ανεξάρτητα τις κύριες επιδράσεις των παραγόντων (main effects) και τις αλληλεπιδράσεις (interactions). 29

45 Στον πίνακα 3.1 δίνεται ο πίνακας σχεδιασμού για έναν 2 3 σχεδιασμό και στο σχήμα 3.2 δίνεται η διαγραμματική απεικόνισή του. παραγοντικό Πίνακας 3.1: Πίνακας σχεδιασμού για έναν 2 3 παραγοντικό σχεδιασμό. Σχήμα 3.2: ιαγραμματική απεικόνισή ενός 2 3 παραγοντικού σχεδιασμού ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΙ SIMPLEX Ως simplex ορίζεται το απλούστερο γεωμετρικό σχήμα ή σώμα που μπορεί να σχεδιαστεί με ορισμένο αριθμό γωνιών. Οι τιμές των επιπέδων των ανεξάρτητων παραγόντων αν παρασταθούν γραφικά στο χώρο συνιστούν κανονικό γεωμετρικό σχήμα με k+1 γωνίες σε k διαστάσεις. Έτσι για 2 παράγοντες (k=2) το simplex είναι ισόπλευρο τρίγωνο, ενώ για τρεις (k=3), κανονικό τετράεδρο. Ένα νέο σημείο προστίθεται προς την κατεύθυνση όπου προκύπτει βελτίωση της απόκρισης κάθε φορά και σχηματίζεται ένα νέο simplex. Ο σχεδιασμός αυτός έχει το πλεονέκτημα ότι μπορεί να πετύχει με προσθήκη διαδοχικών σημείων την περικύκλωση του 30

46 βέλτιστου χωρίς να είναι απαραίτητη η χρήση μαθηματικών προτύπων. Ωστόσο έχει το μειονέκτημα ότι περιγράφει το βέλτιστο χωρίς να το προσδιορίζει επακριβώς ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΙ ΕΠΙΦΑΝΕΙΩΝ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ Με τη βοήθεια των στατιστικών σχεδιασμών σπάνια εντοπίζεται ακριβώς το βέλτιστο πειραματικό σημείο. Συνήθως τα πειραματικά σημεία είναι κατανεμημένα έτσι ώστε να καλύπτουν την ευρύτερη δυνατή περιοχή μεταβολών των ανεξάρτητων παραγόντων. Έτσι το βέλτιστο σημείο πρέπει να προβλεφθεί βάσει του εμπειρικού προτύπου το οποίο προηγουμένως προσαρμόστηκε στα πειραματικά δεδομένα. Για το σκοπό αυτό κατασκευάζονται και αναλύονται τρισδιάστατες απεικονίσεις της σχέσεως απόκρισης ανεξαρτήτων παραγόντων οι οποίες είναι γνωστές ως επιφάνειες απόκρισης (response surfaces). Ο στόχος της περιγραφής της επιφάνειας απόκρισης είναι η εύρεση της συντομότερης οδού που οδηγεί στην ευρύτερη περιοχή ή πλησίον του σημείου των συνθηκών βέλτιστης προσαρμογής. Οι σχεδιασμοί επιφανειών απόκρισης συνήθως προσαρμόζονται σε μαθηματικά πρότυπα δεύτερης (ή ανώτερης) τάξης. Οι συνηθέστεροι σχεδιασμοί επιφάνειας απόκρισης είναι οι κεντρικοί σύνθετοι σχεδιασμοί (Central Composite Design CCD), οι σχεδιασμοί Box-Behnken και οι σχεδιασμοί Doehlert. Ο CCD σχεδιασμός βασίζεται σε μικρό σχετικά συνολικό αριθμό πειραμάτων από τα οποία ορισμένα αντιστοιχούν σε πλήρη ή κλασματικό παραγοντικό σχεδιασμό και κάποια επιπλέον σε αξονικά (2k) και κεντρικά σημεία. Συγκριτικά, θα μπορούσαμε να πούμε ότι ο CCD είναι ο πλέον εύχρηστος σχεδιασμός και πλεονεκτεί έναντι των άλλων από μαθηματικής πλευράς, διότι επιτρέπει τη λεπτομερή διερεύνηση της καμπυλότητας των επιφανειών απόκρισης ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΙ ΜΙΓΜΑΤΩΝ Σε όλα τα προηγούμενα είδη των σχεδιασμών οι υπό μελέτη παράγοντες μπορούν να μεταβληθούν ταυτόχρονα και να εκτιμηθεί η δράση τους σε διάφορα επίπεδα. Υπάρχουν όμως περιπτώσεις όπου αυτό δεν είναι εφικτό. Συγκεκριμένα υπάρχουν φορές όπου τα χαρακτηριστικά του τελικού προϊόντος οφείλονται περισσότερο στην χρησιμοποιούμενη αναλογία των παραγόντων, παρά στη συγκεκριμένη ποσότητά τους. Σε αυτές τις περιπτώσεις χρησιμοποιούνται οι σχεδιασμοί μιγμάτων. Γενικά, στους σχεδιασμούς μιγμάτων το ολικό άθροισμα των αναλογιών των παραγόντων είναι ίσο με τη μονάδα και οι τιμές των επιπέδων των παραγόντων δεν μπορούν να γίνουν αρνητικές. Ισχύει δηλαδή ότι: 31

47 0 x i 1 i = 1,2,, p και x 1 + x 2 + +x p = 1 (ή 100 τοις εκατό) όπου x 1, x 2,.. x p αντιστοιχούν στις αναλογίες των p συστατικών ενός μίγματος. Όταν οι εξεταζόμενοι σχεδιασμοί μιγμάτων διέπονται από αυτούς μόνο τους περιορισμούς τότε τα μοντέλα που εφαρμόζονται για την προσαρμογή τους είναι τύπου simplex (simplex lattice ή simplex- centroid). Εντούτοις είναι δυνατό να τεθούν και άλλοι περιορισμοί στους σχεδιασμούς μιγμάτων [21]. Συγκεκριμένα μπορούν να υπάρξουν ανώτερα και κατώτερα όρια για κάθε συστατικό του μίγματος της μορφής: L i x i U i i = 1,2,, p και x 1 + x 2 + +x p = 1 με L i 0 και U i 0 Στους σχεδιασμούς αυτούς, που ονομάζονται περιορισμένοι σχεδιασμοί μιγμάτων (constrained mixture designs), μπορούν να εφαρμοστούν εναλλακτικά των simplex μοντέλων και βέλτιστοι σχεδιασμοί (optimal designs). Όταν εκτός από την αναλογία των συστατικών του μίγματος, την εξεταζόμενη απόκριση επηρεάζει και κάποιος άλλος παράγοντας (πχ. το ph ή η θερμοκρασία), τότε ο σχεδιασμός καλείται διασταυρούμενος (crossed) και η χρήση σχεδιασμού προτεινόμενου από υπολογιστή (computer-aided design), όπως ο D-βέλτιστος, είναι επιτακτική ΒΕΛΤΙΣΤΟΙ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΙ Οι βέλτιστοι σχεδιασμοί (optimal designs) χρησιμοποιούνται στις περιπτώσεις όπου ο πειραματικός χώρος δεν έχει καθορισμένο σχήμα (κυβικό ή σφαιρικό). Γενικά οι σχεδιασμοί αυτοί δημιουργούνται με τη βοήθεια ενός αλγορίθμου, βασιζόμενοι σε συγκεκριμένα κριτήρια βελτιστοποίησης (optimality criterion) όπως είναι το D-, A-, G-, I- και V-. Το πιο διαδεδομένο κριτήριο βελτιστοποίησης είναι αυτό του τύπου D. Ένας σχεδιασμός λέμε ότι είναι D-optimal όταν το: που είναι το προσδιοριζόμενο στη μήτρα πληροφοριών X'X, ελαχιστοποιείται [18, 21]. Ο D-optimal σχεδιασμός βασίζεται στην ελαχιστοποίηση των διακυμάνσεων (variance) των παραμέτρων του σχεδιασμού για ένα προκαθορισμένο μοντέλο. Επομένως η βελτιστοποίηση που παρέχει ένας D-optimal σχεδιασμός είναι 32

48 εξαρτώμενη από κάποιο μοντέλο. Για το λόγο αυτό ο ερευνητής πρέπει να προσδιορίσει ποιο μοντέλο θα χρησιμοποιήσει ο υπολογιστής, ώστε να παράγει τα πειραματικά σημεία που θα χρησιμοποιηθούν. Εάν δοθεί από τον ερευνητή το μοντέλο, ο αλγόριθμος του προγράμματος επιλέγει το βέλτιστο σύνολο πειραματικών σημείων από ένα μεγαλύτερο σύνολο σημείων, που στην ουσία ταυτίζεται με όλους τους πιθανούς συνδυασμούς όλων των επιπέδων των μεταβλητών εισόδου που εξετάζονται. Για την επιλογή των κατάλληλων πειραματικών σημείων ο αλγόριθμος χρησιμοποιεί διαδικασίες ανταλλαγής. Συγκεκριμένα ανταλλάσει σημεία που αντιστοιχούν στο επιλεγμένο από τον ερευνητή μοντέλο με άλλα του ευρύτερου συνόλου σημείων, με σκοπό να βελτιώσει όσο το δυνατόν περισσότερο το κριτήριο βελτιστοποίησης [18]. 33

49 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ Η ανάπτυξη και εφαρμογή μιας ενόργανης μεθόδου αναλύσεως και γενικότερα κάθε αναλυτικής μεθόδου, προϋποθέτει την αξιολόγησή της. Για το λόγο αυτό πραγματοποιούνται μελέτες για την ακρίβεια, την επαναληπτικότητα, τη γραμμικότητα, το εύρος και τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού [1, 2, 22]. Ακρίβεια: Η ακρίβεια (accuracy) ενός αναλυτικού αποτελέσματος, χαρακτηρίζει την προσέγγιση της πειραματικής τιμής προς την "αληθινή ή παραδεκτή" τιμή μ και συνήθως εκφράζεται με το απόλυτο σφάλμα Ε, δηλαδή τη διαφορά μεταξύ της αντιπροσωπευτικής πειραματικής τιμής x (μεμονωμένης μέτρησης x i, μέσης τιμής x ή της διάμεσης Μ) και της παραδεκτής τιμής μ: Ε= x μ Όσο μικρότερο είναι το σφάλμα τόσο μεγαλύτερη είναι η ακρίβεια. Εναλλακτικά μπορεί να χρησιμοποιηθεί το σχετικό σφάλμα Ε r που είναι ο λόγος της απόλυτης τιμής του σφάλματος Ε προς την πραγματική τιμή μ Ε r = Ε/ μ Στην πράξη όμως ως μέτρο ακρίβειας χρησιμοποιείται το εκατοστιαίο ποσοστό ανάκτησης (% Recovery), το οποίο υπολογίζεται από τον επί τοις εκατό λόγο της μέσης συγκέντρωσης του ανευρίσκεται πειραματικά προς την πραγματική συγκέντρωση του εξεταζόμενου δείγματος. Επαναληπτικότητα: Η επαναληπτικότητα (precision) εκφράζει το βαθμό συμφωνίας μεταξύ των αποτελεσμάτων όταν η διαδικασία εφαρμόζεται κατ επανάληψη σε πολλαπλά δείγματα. ιακρίνεται σε : 1) Επαναληψιμότητα (repeatability ή intra-day precision), η οποία αντανακλά τις διακυμάνσεις εντός μιας μικρής χρονικής περιόδου με τις ίδιες συνθήκες λειτουργίας. 2) Ενδιάμεση επαναληπτικότητα (intermediate precision ή inter-day precision) που ορίζεται ως μακροπρόθεσμη διακύμανση των αποτελεσμάτων των μετρήσεων και προσδιορίζεται συγκρίνοντας τα αποτελέσματα μιας ανάλυσης σε ένα εργαστήριο με την πάροδο του χρόνου. 3) Αναπαραγωγιμότητα (reproducibility), η οποία εκφράζει την επαναληπτικότητα των αποτελεσμάτων μεταξύ εργαστηρίων με σκοπό την επιβεβαίωση ότι η μέθοδος δίνει τα ίδια αποτελέσματα σε διαφορετικά εργαστήρια. Ως μέτρο εκτίμησης της επαναληψιμότητας μιας μεθόδου θεωρούνται, συνήθως η τυπική απόκλιση S (Standard Deviation) και η επί τοις εκατό (%) σχετική τυπική απόκλιση RSD (Relative Standard Deviation). Η τυπική απόκλιση S ορίζεται από τη σχέση : 34

50 S ( xi N x) 1 όπου: Ν : ο αριθμός μετρήσεων x i : η αριθμητική τιμή που λαμβάνεται από κάθε μέτρηση x : ο μέσος όρος των πειραματικών μετρήσεων Η επί τοις εκατό (%) σχετική τυπική απόκλιση RSD ορίζεται ως ο επί τοις εκατό λόγος της απόλυτης τιμής της τυπικής αποκλίσεως S προς τη μέση τιμή των πειραματικών μετρήσεων και δίνεται από τη σχέση: % RSD= (S / x ) 100 Η έκφραση της επαναληπτικότητας με αυτόν τον τρόπο πλεονεκτεί γιατί είναι καθαρός αριθμός και εκφράζει την επαναληπτικότητα ως ποσοστό του αριθμητικού μέσου. Καλή επαναληπτικότητα δε συνεπάγεται αναγκαστικά και καλή ακρίβεια, γιατί είναι δυνατό να υπεισέρχεται στις μετρήσεις ένα καθορισμένο σφάλμα που να επηρεάζει εξίσου όλες τις μετρήσεις, χωρίς να βλάπτει με αυτόν τον τρόπο την επαναληπτικότητα τους. Σε γενικές γραμμές, η τιμή RSD που εκφράζει την inter-day precision είναι μεγαλύτερη από αυτήν της intra-day precision. Το γεγονός αυτό δικαιολογείται από το μεγαλύτερο αριθμό βημάτων που απαιτούνται για την επανάληψη των μετρήσεων σε περισσότερες από μια ημέρες σε σχέση με αυτά που απαιτούνται για την πραγματοποίηση τους εντός της ίδιας ημέρας (πχ. καθημερινή ετοιμασία προτύπων διαλυμάτων, αντιδραστηρίων κτλ) [23]. Γραμμικότητα και εύρος: Ως γραμμικότητα μιας αναλυτικής μεθόδου ορίζεται η ικανότητα υπολογισμού των αποτελεσμάτων σε αναλογία με τη συγκέντρωση των προσδιοριζόμενων συστατικών ενός δείγματος, σε συγκεκριμένο εύρος συγκεντρώσεων. Το εύρος είναι το διάστημα ανάμεσα στη χαμηλότερη και την υψηλότερη συγκέντρωση του συστατικού για το οποίο έχει αποδειχθεί ότι η αναλυτική μέθοδος έχει ένα κατάλληλο επίπεδο ακρίβειας, επαναληψιμότητας και γραμμικότητας. Στην Ενόργανη Ανάλυση, επομένως, είναι απαραίτητο να γνωρίζουμε τη σχέση που συνδέει δύο μεταβλητές y και x, ώστε να μπορεί να σχεδιαστεί καμπύλη αναφοράς. Συνήθως ως x (ανεξάρτητη μεταβλητή) λογίζεται η συγκέντρωση του δείγματος και ως y (εξαρτημένη μεταβλητή) κάποια μετρήσιμη παράμετρος της ουσίας, όπως η απορρόφηση ή το εμβαδόν της χρωματογραφικής της κορυφής, οπότε προκύπτει η σχέση: y= (x) Στην πράξη, συνήθως η σχέση είναι γραμμική, οπότε η παραπάνω εξίσωση γίνεται: 2 35

51 y=αx + β όπου α είναι η κλίση (slope) της ευθείας, δηλαδή η μεταβολή του y για μεταβολή του x κατά μια μονάδα και β είναι η τομή (intercept) της ευθείας με τον άξονα των y (δηλαδή η τιμή του y για x=0). Για την αντικειμενικότερη χάραξη της καλύτερης καμπύλης (ευθείας), συνήθως εφαρμόζεται η μέθοδος των ελαχίστων τετραγώνων, που βασίζεται στην αρχή ότι η καλύτερη καμπύλη (ευθεία) είναι εκείνη για την οποία το άθροισμα των τετραγώνων των αποκλίσεων είναι ελάχιστο. Το άθροισμα αυτό, S, για την εξίσωση y=αx + β είναι: s N i 1 ( ax i y i) 2 Με την εφαρμογή διαφορικού λογισμού στην παραπάνω εξίσωση υπολογίζεται ότι: a N N x y xi ( xi) i i 2 2 i x 2 x xi ( xi) i i 2 2 i N x y y i xiyi Με βάση τις υπολογισθείσες τιμές των συντελεστών α και β χαράσσουμε καμπύλη, γνωστή σαν ευθεία παλινδρόμησης ή συμμεταβολής (regression line), που παρέχει την άριστη γραμμική προσαρμογή των σημείων. Το μέτρο της καλής προσαρμογής μεταξύ των δύο μεταβλητών, x και y, δίνεται από το συντελεστή συσχετίσεως (correlation coefficient) r, που παρέχεται από τις σχέσεις: xiyi N xy r xi N x )( yi N y [ N N xiyi xi yi xi ( xi) ][ N yi ( Η προσαρμογή είναι τόσο καλύτερη, όσο πλησιέστερα προς τη μονάδα βρίσκεται η τιμή του r. Μια καμπύλη αναφοράς θεωρείται ικανοποιητική για τιμές 0,95 r 0,99, ενώ τιμές r 0,99 υποδηλώνουν πολύ καλή γραμμικότητα. Στην Ενόργανη Ανάλυση συχνότερα χρησιμοποιείται ο συντελεστής προσδιορισμού (coefficient of determination) R 2, ο οποίος ισούται με το τετράγωνο του συντελεστή συσχετίσεως r. 2 yi) 2 36

52 Στην παρούσα εργασία για την εκτίμηση της γραμμικότητας χρησιμοποιήθηκε το R 2, υπολογισμένο από την εφαρμογή Microsoft Office Excel Όριο ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικής αποτίμησης (LOQ): Η ελάχιστη συγκέντρωση ή ποσότητα που μπορεί να ανιχνευθεί αξιόπιστα αλλά όχι απαραίτητα και να προσδιοριστεί ποσοτικά με μια αναλυτική μέθοδο, ονομάζεται όριο ανίχνευσης της μεθόδου. Το όριο ποσοτικής αποτίμησης είναι η ελάχιστη συγκέντρωση ή ποσότητα που παρέχει επαναληπτικές μετρήσεις που καθιστούν δυνατό τον αξιόπιστο ποσοτικό προσδιορισμό. Τα LOD και LOQ υπολογίζονται βάσει της τυπικής απόκλισης της απόκρισης του σήματος της μεθόδου και της κλίσης της καμπύλης βαθμονόμησης Συγκεκριμένα ισχύουν οι παρακάτω σχέσεις : 3.3 σ 10 σ LOD= και LOQ= S S όπου: σ: το τυπικό σφάλμα της απόκρισης του σήματος, S: η κλίση της καμπύλης βαθμονόμησης του συστατικού. Εναλλακτικά ο προσδιορισμός των LOD και LOQ μπορεί να γίνει με υπολογισμό του λόγου σήμα προς θόρυβο (signal to noise, S/N) με σύγκριση των σημάτων που μετρούνται από δείγματα γνωστών χαμηλών συγκεντρώσεων της εξεταζόμενης ουσίας, με το σήμα που λαμβάνεται από τυφλό δείγμα (blank) και καθορισμό της ελάχιστης συγκέντρωσης που μπορεί να ανιχνευθεί ή να ποσοτικοποιηθεί αξιόπιστα. Ένας λόγος S/N ίσος με 3:1 θεωρείται αποδεκτός για το LOD, ενώ το LOQ υπολογίζεται από λόγο S/N ίσο με 10:1 [23]. 37

53 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΕΛΜΙΝΘΙΑΣΕΙΣ - ΑΝΘΕΛΜΙΝΘΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ 5.1 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Οι έλμινθες ή σκώληκες [24-26] είναι παράσιτα που κατατάσσονται στο υποβασιλείο των Μεταζώων και είναι παθογόνα για τον άνθρωπο και άλλους οργανισμούς-ξενιστές. Πρόκειται για πολυκυττάριους οργανισμούς, μακροσκοπικά ορατούς, των οποίων το μέγεθος μπορεί να φθάσει σε πολλά μέτρα. Στις ώριμες μορφές υπάρχει ανατομική διάκριση περιοχών του σώματος (κεφαλή, σώμα, ουρά) καθώς και ανατομική διάκριση συστημάτων και οργάνων (πεπτικό, αναπαραγωγικό, ενδο-εξωκρινές, κινητικό). Οι παρασιτικοί σκώληκες σε σύγκριση με τους σκώληκες που ζουν ελεύθεροι στη φύση έχουν υποστεί ουσιώδεις εξελικτικές βιολογικές και μορφολογικές τροποποιήσεις. Οι περισσότεροι έχουν κοντά στο στόμα εκκριτικούς αδένες με εκφορητικούς πόρους. Οι αδένες αυτοί παράγουν ένζυμα για την πέψη των ιστών του ξενιστή ή/και για τη μετανάστευση των ελμίνθων σε διάφορους ιστούς και συστήματα του παρασιτούμενου οργανισμού. Οι παρασιτικοί σκώληκες του ανθρώπου ταξινομούνται σε δύο φύλα: νηματέλμινθες και πλατυέλμινθες. Στο φύλο των νηματελμίνθων ανήκουν σκώληκες των οποίων η ώριμη (ενήλικη) μορφή έχει σχήμα κυλινδρικό, μονοκόμματο, νηματοειδές. Το πεπτικό τους σύστημα είναι καλά αναπτυγμένο και υπάρχει στόμα και πρωκτός. Συνήθως υπάρχει σαφής διάκριση φύλων, οι δε θηλυκοί σκώληκες έχουν μέγεθος μεγαλύτερο των αρσενικών. Οι θηλυκοί σκώληκες μετά από γονιμοποίηση, εμβρυοφορία και ωοτοκία γεννούν χιλιάδες αυγά ή νύμφες που - κατά περίπτωση - είναι οι λοιμογόνες μορφές των σκωλήκων για τον άνθρωπο. Στην κλάση των νηματωδών ανήκουν τα είδη Strongyloides, Ancylostoma, Necator, Ascaris, Enterobius, Wucheria, Brugia, Onchocerca και Trichuris. Στο φύλο των πλατυελμίνθων ανήκουν σκώληκες των οποίων η ώριμη (ενήλικη) μορφή δεν έχει πραγματική σωματική κοιλότητα και σε ραχιοκοιλιακή τομή είναι χαρακτηριστικά επίπεδη. ιακρίνονται δύο κλάσεις: οι κεστώδεις και οι τρηματώδεις σκώληκες. Οι ώριμες (ενήλικες) μορφές των κεστωδών σκωλήκων (ταινίες) είναι ερμαφρόδιτα, ταινιοειδή, κατατεμαχισμένα εντερικά παράσιτα χωρίς πεπτικό σύστημα, αλλά με μια απορροφητική επιφάνεια που καλύπτεται από τριχίδια. Στο 38

54 λεπτό έντερο του ανθρώπου εγκαθίστανται διάφορα είδη κεστωδών σκωλήκων των τάξεων Pseudophyllidea (ψευδοφυλλίδια) και Cyclophyllidea (κυκλοφυλλίδια). Η ανάπτυξη των σκωλήκων αυτών ολοκληρώνεται σε έναν ή περισσότερους ενδιάμεσους ξενιστές. Ο άνθρωπος προσβάλλεται επίσης και από νυμφικές μορφές (κυστίκερκοι). Αυτές εγκαθίστανται και αναπτύσσονται σε ιστούς ζωτικών οργάνων (ήπαρ, πνεύμονες, ΚΝΣ) και κατά κανόνα προκαλούν μεγαλύτερη βλάβη από τα εντερικά στάδια των κεστωδών (π.χ. κυστίκερκοι των ειδών εχινοκόκκου). Οι ώριμες (ενήλικες) μορφές των τρηματωδών σκωλήκων είναι τυπικά ερμαφρόδιτα αποπλατυσμένα ή απιοειδή, εντερικά ή ηπατικά παράσιτα. Εξαίρεση αποτελούν τα σχιστοσώματα (Schistosoma), που έχουν χωριστά φυλά, παρασιτούν στο αγγειακό σύστημα και διαθέτουν όργανα προσκόλλησης στο στόμα και στην κοιλιά. Στον κύκλο της ζωής τους συμμετέχουν σαλιγκάρια ως πρώτοι και πολλές φορές αρθρόποδα ή ψάρια ως δεύτεροι ενδιάμεσοι ξενιστές. Λοιμώξεις από τρηματώδεις σκώληκες γίνονται μόνο σε συγκεκριμένους βιότοπους που παρέχουν στους ενδιάμεσους ξενιστές τις κατάλληλες συνθήκες διαβίωσης. Στο σχήμα 5.1 εμφανίζεται ο επιπολασμός διαφόρων παρασιτώσεων παγκοσμίως. Τριχινέλλα Στρογγυλοείδης Ταινίες Σχιστοσώματα Οξύουρος Φιλάριες Τριχίουρος Αγκυλόστομα Ασκαρίδες Λοιμώξεις (100 εκατομμύρια) Σχήμα 5.1: Επιπολασμός των ελμινθιάσεων παγκοσμίως [24] Τα παρασιτοκτόνα που είναι δραστικά έναντι μιας ή περισσοτέρων κατηγοριών ελμινθών λέγονται ανθελμινθικά [24, 27-29]. Από τις αρχές του αιώνα χρησιμοποιήθηκαν διάφορα χημειοθεραπευτικά κατά των παρασίτων, που ασφαλώς ήταν λιγότερο δραστικά και περισσότερο τοξικά από τα σύγχρονα. Ο θειικός χαλκός, ο αρσενικικός μόλυβδος, οι ενώσεις κασσιτέρου, η νικοτίνη, η φαινοθειαζίνη είναι μερικά από τα πρώτα ανθελμινθικά τα οποία σήμερα θεωρούνται ξεπερασμένα. 39

55 Στόχος της φαρμακολογικής έρευνας στον τομέα των ανθελμινθικών ήταν και είναι πάντοτε η σύνθεση αντιπαρασιτικών που ενώ από τη μια θα διαθέτουν μεγάλη τοξικότητα έναντι του παρασίτου, από την άλλη θα είναι ελάχιστα ή καθόλου τοξικά για τον ξενιστή. Το ζητούμενο λοιπόν στη σύνθεση ενός ιδανικού ανθελμινθικού είναι η δράση του να βλάπτει τέτοιες βιοχημικές διεργασίες στο σώμα του παρασίτου οι οποίες να μην είναι κοινές με του ξενιστή. Στον πίνακα 5.1 εμφανίζεται η κατάταξη των ανθελμινθικών που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία ανάλογα με τη χημική δομή και τη δράση τους. ΑΝΤΙΝΗΜΑΤΩ Η ΡΑΣΗ ΑΝΤΙΤΡΗΜΑΤΩ Η ΡΑΣΗ ΤΑΙΝΙΟΚΤΟΝΟΣ ΡΑΣΗ ΒΕΝΖΙΜΙ ΑΖΟΛΕΣ Μεβενδαζόλη Mebendazole + Αλβενδαζόλη Albendazole Θειαβενδαζόλη Thiabendazole + ΜΑΚΡΟΛΙ ΙΑ Ιβερμεκτίνη Ivermectin + ΙΜΙ ΑΖΟΘΕΙΑΖΟΛΕΣ Λεβαμισόλη Levamisole + Τετραμισόλη Tetramisole + ΤΕΤΡΑΫ ΡΟΠΥΡΙΜΙ ΙΝΕΣ Πυραντέλη παμοϊκή Pyrantel pamoate + ΣΑΛΙΚΥΛΑΝΙ ΕΣ Νικλοζαμίδη Niclosamide + ΙΑΦΟΡΕΣ Πιπεραζίνη Piperazine + ιαιθυλκαρβαμαζίνη Diethylcarbamazine + Παμοϊκό πυρβίνιο Pyrvinium Pamoate + Πραζικουαντέλη Praziquantel + + Πίνακας 5.1: Κατάταξη ανθελμινθικών ουσιών [28] 5.2 ΜΕΒΕΝ ΑΖΟΛΗ ΕΝ ΕΙΞΕΙΣ - ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΗ ΡΑΣΗ Η μεβενδαζόλη είναι μια συνθετική βενζιμιδαζόλη, αποτελεσματική εναντίον ενός ευρέος φάσματος νηματωδών. Είναι φάρμακο εκλογής για τη θεραπεία των λοιμώξεων από τριχίουρο, οξύουρο, νεκάτορα, αγκυλόστομα του δωδεκαδακτύλου και ασκαρίδα. ρα με το να συνδέεται και να παρεμβαίνει στη σύνθεση των μικροσωληνίσκων του παρασίτου, ενώ επίσης μειώνει την πρόσληψη γλυκόζης. Τα προσβεβλημένα παράσιτα αποβάλλονται με τα κόπρανα. 40

56 ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ Η μεβενδαζόλη είναι λευκή ή υποκίτρινη, σχεδόν άοσμη σκόνη, πρακτικώς αδιάλυτη στο νερό, στην αλκοόλη, στο χλωροφόρμιο και στον αιθέρα. ιαλύεται σε φορμικό οξύ. Η χημική της δομή είναι η ακόλουθη: C 16 H 13 N 3 O 3 Μ.Β. : 295,3 ΑΝΕΠΙΘΥΜΗΤΕΣ ΕΝΕΡΓΕΙΕΣ ΑΝΤΕΝ ΕΙΞΕΙΣ Η μεβενδαζόλη όταν λαμβάνεται από το στόμα απορροφάται σε μικρό μόνο ποσοστό, εκτός αν συνοδεύεται από πολύ λιπαρό γεύμα. Ως εκ τούτου, το φάρμακο είναι σχετικά απαλλαγμένο τοξικών ενεργειών, αν και οι ασθενείς μπορεί να παραπονεθούν για κοιλιακό πόνο και διάρροια. Εντούτοις αντενδείκνυται σε εγκύους επειδή έχει εμφανιστεί εμβρυοτοξική και τερατογόνος δράση του σε πειράματα με ζώα. ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ Η μέθοδος προσδιορισμού της μεβενδαζόλης που προτείνεται από την Ευρωπαϊκή Φαρμακοποιία [30] είναι αυτή της ποτενσιομετρικής τιτλοδότησης. Η Αμερικάνικη Φαρμακοποιία [31] προτείνει φασματοσκοπία UV για το πόσιμο διάλυμα και χρωματογραφία HPLC για τα δισκία. Άλλες μέθοδοι που έχουν χρησιμοποιηθεί είναι η φασματομετρία υπερύθρου [32], η φασματομετρία υπερύθρου µέσω µετασχηµατισµού Fourier (FTIR) [33], η υγρή χρωματογραφίαφασματοφωτομετρία μαζών (LC-MS) [34], η φθορισμομετρία [35], η πολαρομετρία [36] και η κουλομετρία [37]. 5.3 ΑΛΒΕΝ ΑΖΟΛΗ ΕΝ ΕΙΞΕΙΣ - ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΗ ΡΑΣΗ 41

57 Η αλβενδαζόλη είναι μια βενζιμιδαζόλη τελευταίας γενιάς, παρόμοιας χημικής σύστασης με την μεβενδαζόλη και έχει ευρεία χρήση στη χημειοθεραπεία των νηματοειδών λοιμώξεων. Ταυτόχρονα εμφανίζει δράση έναντι και των άλλων κύριων ομάδων ελμίνθων, των τρηματωδών και των κεστωδών (ταινίες). Μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν θεραπεία πρώτης εκλογής σε εχινοκοκκιάσεις στις οποίες η χειρουργική επέμβαση δεν είναι δυνατή λόγω της εντόπισης πολλαπλών κύστεων. Ο μηχανισμός δράσης της είναι όμοιος με αυτόν της μεβενδαζόλης. ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ Η αλβενδαζόλη είναι λευκή ή υποκίτρινη σκόνη, πρακτικώς αδιάλυτη στο νερό, στην αλκοόλη, ελαφρώς διαλυτή στον αιθέρα και στο διχλωρομεθάνιο και ευκόλως διαλυτή στο φορμικό οξύ. Εξαιτίας της ευαισθησίας της πρέπει να αποθηκεύεται σε αεροστεγώς κλειστούς και αδιαφανείς περιέκτες. Η χημική της δομή έχει ως εξής: C 12 H 15 N 3 O 2 S Μ.Β. : ΑΝΕΠΙΘΥΜΗΤΕΣ ΕΝΕΡΓΕΙΕΣ ΑΝΤΕΝ ΕΙΞΕΙΣ Όμοιες με της μεβενδαζόλης. ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ Η μέθοδος που προτείνεται από την Ευρωπαϊκή Φαρμακοποιία [30] είναι αυτή της ποτενσιομετρικής τιτλοδότησης. Η Αμερικάνικη Φαρμακοποιία [31] προτείνει χρωματογραφία HPLC για το πόσιμο διάλυμα και τα δισκία. Άλλες μέθοδοι που έχουν χρησιμοποιηθεί είναι η φθορισμομετρία [38], η χρωματογραφία LC-MS [39] και η βολταμετρία [40]. 42

58 5.4 ΘΕΙΑΒΕΝ ΑΖΟΛΗ ΕΝ ΕΙΞΕΙΣ - ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΗ ΡΑΣΗ Η θειαβενδαζόλη αποτελεί την πρώτη ανθελμινθική ουσία της ομάδας των βενζιμιδαζολών. Ήταν ουσιαστικά το πρώτο ευρέος φάσματος ανθελμινθικό με υψηλό βαθμό δραστικότητας και μεγάλα περιθώρια ασφάλειας. Είναι αποτελεσματική για την αντιμετώπιση της στρογγυλοειδίασης (από Strongyloides stercoralis), της δερματικής μεταναστευτικής προνύμφης (γνωστής ως ερπητικό εξάνθημα) και των αρχικών σταδίων της τριχίνωσης (από Trichinella spiralis). Ο κύριος μηχανισμός δράσης της πιθανότατα έγκειται στην ιδιότητά της να συνενώνεται με τη σωληνίνη (tubulin), μια πρωτεΐνη απαραίτητη στο σχηματισμό και τη λειτουργία των μικροσωληναρίων στα απορροφητικά εντερικά κύτταρα των νηματωδών σκωλήκων. ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ Η θειαβενδαζόλη είναι λευκή κρυσταλλική σκόνη, πρακτικώς αδιάλυτη στο νερό, ελαφρώς διαλυτή στην αλκοόλη, στην ακετόνη και στο διχλωρομεθάνιο. Η χημική της δομή παρουσιάζεται παρακάτω: C 10 H 7 N 3 S Μ.Β. : 201,2 ΑΝΕΠΙΘΥΜΗΤΕΣ ΕΝΕΡΓΕΙΕΣ ΑΝΤΕΝ ΕΙΞΕΙΣ Οι συνηθέστερες ανεπιθύμητες ενέργειες είναι ανορεξία, ζάλη, ναυτία και έμετος. Έχουν αναφερθεί και συμπτώματα από το ΚΝΣ. Από τις περιπτώσεις με πολύμορφο ερύθημα και σύνδρομο Steven Johnson που αποδόθηκαν σε χορήγηση θειαβενδαζόλης, μερικές κατέληξαν σε θάνατο. Η θειαβενδαζόλη δεν εμφανίζει εμβρυοτοξική και τερατογόνο δράση. Εντούτοις εμφάνιση σημείων υπερευαισθησίας επιβάλλει διακοπή του φαρμάκου. 43

59 ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ Η μέθοδος που προτείνεται από την Ευρωπαϊκή Φαρμακοποιία [30] είναι αυτή της ποτενσιομετρικής τιτλοδότησης. Η Αμερικάνικη Φαρμακοποιία [31] προτείνει χρωματογραφία HPLC για το πόσιμο διάλυμα και τα δισκία. Άλλες μέθοδοι που έχουν χρησιμοποιηθεί είναι η φθορισμομετρία [41], η χρωματογραφία LC-MS [42] και η αέρια χρωματογραφία-φασματοφωτομετρία μαζών (GC-MS) [43]. 5.5 ΙΒΕΡΜΕΚΤΙΝΗ ΕΝ ΕΙΞΕΙΣ - ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΗ ΡΑΣΗ Η ιβερμεκτίνη χρησιμοποιείται στη χημειοθεραπεία των νηματωδών και είναι το φάρμακο εκλογής για τη θεραπεία της ογκοκέρκωσης (γνωστή και ως τύφλωση του ποταμού) που προκαλείται από το νηματώδες Onchocerca volvulus. Πρόκειται για μακρολιδιακή αντιπαρασιτική ουσία και ανήκει στην κατηγορία των αβερμεκτινών. Στοχεύει στους υποδοχείς του γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABA) του παρασίτου ενισχύοντας την εκροή χλωριούχων και προκαλώντας υπερπόλωση, αναστολή μεταβίβασης της νευρικής ώσης και τελικά παράλυση του νηματώδη σκώληκα. εν έχει αξιόλογη δράση κατά των τρηματωδών και των κεστωδών σκωλήκων, γιατί στα παράσιτα αυτά το γ-αμινοβουτυρικό οξύ δεν ανευρίσκεται ως νευροδιαβιβαστής. ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ Η ιβερμεκτίνη είναι λευκή ή υποκίτρινη, ελαφρώς υγροσκοπική, κρυσταλλική σκόνη. Είναι πρακτικά αδιάλυτη στο νερό, ενώ διαλύεται σε ακετόνη, ακετονιτρίλιο, διχλωρομεθάνιο και μεθανόλη. Είναι απαραίτητο να διατηρείται σε αεροστεγείς περιέκτες σε θερμοκρασία 2-8 ο C. 44

60 C 47 H 72 O 14 Μ.Β. : 861,1 ΑΝΕΠΙΘΥΜΗΤΕΣ ΕΝΕΡΓΕΙΕΣ ΑΝΤΕΝ ΕΙΞΕΙΣ Η ιβερμεκτίνη δε διαπερνά τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και με δεδομένο ότι στα θηλαστικά το γ-αμινοβουτυρικό οξύ λειτουργεί ως νευροδιαβιβαστής μόνο στον εγκέφαλο και στον νωτιαίο μυελό, δεν εμφανίζει τοξική δράση. Ωστόσο αντενδείκνυται σε ασθενείς με μηνιγγίτιδα, επειδή ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός τους είναι πιο διαπερατός και θα μπορούσαν να εμφανισθούν δράσεις στο ΚΝΣ. εν πρέπει να χορηγείται σε ασθενείς που παίρνουν βενζοδιαζεπίνες ή βαρβιτουρικά, φάρμακα τα οποία δρουν στον GABA υποδοχέα. Ο θάνατος των μικροφιλαριών σε ασθενείς που πάσχουν από φιλαρίαση μπορεί να προκαλέσει αντίδραση τύπου Mazotti με συμπτώματα όπως πυρετό, κεφαλαλγία, ζάλη, υπνηλία και υπόταση. Τέλος η ιβερμεκτίνη δεν πρέπει να χορηγείται σε εγκύους. ΜΕΘΟ ΟΙ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ Τόσο η Ευρωπαϊκή [30] όσο και η Αμερικάνικη Φαρμακοποιία [31] προτείνουν υγρή χρωματογραφια για τον προσδιορισμό της ιβερμεκτίνης. Άλλες μέθοδοι που έχουν μελετηθεί είναι η φθορισμομετρική [44] και η χρωματογραφία LC-MS [45]. 5.6 ΤΕΤΡΑΜΙΣΟΛΗ - ΛΕΒΑΜΙΣΟΛΗ ΕΝ ΕΙΞΕΙΣ - ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΗ ΡΑΣΗ 45

61 Η τετραμισόλη ανήκει στην ομάδα των ιμιδαζοθειαζολών και χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά σαν ανθελμινθικό το Στην πραγματικότητα η τετραμισόλη είναι ρακεμικό μίγμα του δεξιόστροφου (D) και του αριστερόστροφου (L) ισομερούς. Οφείλει την ανθελμινθική της δράση σχεδόν αποκλειστικά στο αριστερόστροφο ισομερές της, τη λεβαμισόλη, η χρήση της οποίας επέτρεψε τη μείωση της δόσης στο ήμισυ με ταυτόχρονη αύξηση του θεραπευτικού δείκτη, ενώ η αποτελεσματικότητα παρέμεινε σχεδόν η ίδια. Τόσο η λεβαμισόλη, όσο και η τετραμισόλη χορηγούνται από το στόμα υπό μορφή υδροχλωρικών αλάτων. Η ανθελμινθική δράση τους οφείλεται στο γεγονός ότι οι ουσίες αυτές συνδεόμενες με τους χολινεργικούς υποδοχείς των γαγγλίων προκαλούν συνεχή χολινεργική διέγερση, η οποία εκδηλώνεται με παρατεταμένη σύσπαση των μυών και οδηγεί σε σπαστική παράλυση του παρασίτου. Επίσης έπειτα από μακροχρόνια χορήγηση φαίνεται ότι ενισχύουν την άμυνα του ξενιστή δρώντας ως ανοσοδιεγερτικά, αυξάνοντας την απόκριση των Τ-λεμφοκυττάρων εναντίον του παρασίτου. Η δράση τους εμφανίζεται σε νηματώδεις σκώληκες. ΦΥΣΙΚΟΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ Η λεβαμισόλη υπό μορφή υδροχλωρικού άλατος είναι λευκή ή σχεδόν λευκή κρυσταλλική σκόνη. ιαλύεται στο νερό και την αλκοόλη. Είναι ελαφρώς διαλυτή στο διχλωρομεθάνιο και αδιάλυτη στον αιθέρα. Το ph ενός υδατικού διαλύματος 5% β/ο υδροχλωρικής λεβαμισόλης είναι μεταξύ 3 και 4,5. C 11 H 12 N 2 S HCl Μ.Β. : 240,75 Τετραμισόλη C 11 H 12 N 2 S HCl Μ.Β. : 240,75 Λεβαμισόλη 46