ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Γ. ΑΝΤΩΝΙΟΥ

Transcript

1 ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ Γ. ΑΝΤΩΝΙΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΑΠΘ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΜΕ ΠΡΩΤΟΤΑΓΗ Η ΕΥΤΕΡΟΤΑΓΗ ΑΜΙΝΟΜΑ Α ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΥΣ ΣΕ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΓΡΑ ΜΕ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΥ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2 ΜΕΛΗ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ 1. ΑΝΝΑ ΤΣΑΝΤΙΛΗ-ΚΑΚΟΥΛΙ ΟΥ Καθηγήτρια Φαρµακευτικής ΕΚΠΑ 2. ΧΡΗΣΤΟΣ Γ. ΚΟΝΤΟΓΙΑΝΝΗΣ Καθηγητής Φαρµακευτικής Ανάλυσης, Τµήµα Φαρµακευτικής Πανεπιστηµίου Πατρών 3. ΙΩΑΝΝΗΣ Α. ΣΤΡΑΤΗΣ Καθηγητής Αναλυτικής Χηµείας, Τµήµα Χηµείας ΑΠΘ 4. ΣΤΑΥΡΟΣ Χ. ΜΑΛΑΜΑΤΑΡΗΣ Καθηγητής Φαρµακευτικής Τεχνολογίας, Τµήµα Φαρµακευτικής ΑΠΘ 5. ΓΕΩΡΓΙΟΣ Α. ΖΑΧΑΡΙΑ ΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Αναλυτικής Χηµείας, Τµήµα Χηµείας ΑΠΘ 6. ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ Κ. ΜΑΡΚΟΠΟΥΛΟΥ Επίκουρη Καθηγήτρια Φαρµακευτικής Ανάλυσης, Τµήµα Φαρµακευτικής ΑΠΘ 7. ΙΩΑΝΝΗΣ Ε. ΚΟΥΝΤΟΥΡΕΛΛΗΣ Καθηγητής Φαρµακευτικής Ανάλυσης, Τµήµα Φαρµακευτικής ΑΠΘ

3 Αφιερωµένο στον λατρεµένο υιό µου, ΑΛΕΞΑΝ ΡΟ

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο της Φαρµακευτικής Ανάλυσης του Τοµέα Φαρµακευτικής Τεχνολογίας του Τµήµατος Φαρµακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, υπό την άµεση επίβλεψη του Καθηγητή κ. Ιωάννη Ε. Κουντουρέλλη, τον οποίο ευχαριστώ θερµά για την υπόδειξη του θέµατος, τη συνεχή επιστηµονική καθοδήγηση και το αµέριστο ενδιαφέρον του κατά τη διάρκεια της ερευνητικής µελέτης. Μέσα από τις εποικοδοµητικές παρατηρήσεις και συζητήσεις µας κατόρθωσε να διαµορφώσει τόσο τις επιστηµονικές ανησυχίες µου, όσο και να διαµορφώσει πολύ περισσότερο τον τρόπο σκέψης µου απέναντι στη ζωή. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την Επίκουρη Καθηγήτρια κ α Αικατερίνη Μαρκοπούλου για την πολύτιµη βοήθειά της στις φασµατοφωτοµετρικές µεθόδους και για τις εύστοχες παρατηρήσεις της κατά την ανάγνωση των δοκιµίων της διατριβής. Επίσης, ευχαριστώ τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ ο Γεώργιο Α. Ζαχαριάδη για τις ουσιαστικές επισηµάνσεις και παρεµβάσεις του στα στατιστικά στοιχεία της διατριβής. Τέλος, είµαι ευγνώµων στους γονείς µου, διότι µε τη διαπαιδαγώγησή τους και την καθοδήγησή τους µου έδωσαν όλα εκείνα τα αναγκαία εφόδια, ώστε να προσπαθώ σκληρά και να επιτυγχάνω τους στόχους που έχω θέσει.

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ...I-X ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΓΕΝΙΚΑ α) Πεδίο εφαρµογών της ΥΧΥΑ β) Ιστορική αναδροµή ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ α) Έλεγχος ροής και συστήµατα προγραµµατισµού..6-7 β) Συστήµατα έγχυσης δείγµατος ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΥΧΥΑ ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ ΑΛΛΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ 8-10 α) Στήλες ΥΧΥΑ..9 β) Αναλυτικές στήλες 9 γ) Προστατευτικές στήλες δ) Θερµοστάτες στήλης 10 ε) Τύποι υλικών πλήρωσης χρωµατογραφικών στηλών ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ α) Τύποι ανιχνευτών ΕΙ Η ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ 12-14

6 α) Χρωµατογραφία Προσρόφησης...12 β) Χρωµατογραφία Κατανοµής γ) Χρωµατογραφία Ιοντοανταλλαγής...13 δ) Χρωµατογραφία Συγγένειας ε) Χρωµατογραφία Αποκλεισµού Μεγέθους ή ιαπερατότητας Πηκτής ΒΑΣΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΤΗΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ α) Συντελεστής κατακράτησης β) Παράγοντας εκλεκτικότητας...15 γ) Αριθµός θεωρητικών πλακών δ) Παράγοντας ασυµµετρίας 16 ε) ιαχωριστική ικανότητα R s ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ α) Φυσικές ιδιότητες των διαλυτών β) Ασφάλεια ΙΑΜΟΡΙΑΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΤΟΥ ΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ α) Επιδράσεις διπόλου...26 β) Επιδράσεις δεσµού υδρογόνου γ) ιηλεκτρικές επιδράσεις ΙΟΝΙΚΗ ΙΣΧΥΣ ΚΑΙ ΠΟΛΙΚΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΙΑΛΥΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ α) Η πολικότητα των καθαρών διαλυτών β) Εκλεκτικότητα του διαλύτη...31

7 γ) Κατάταξη της εκλεκτικότητας των διαλυτών ΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΤΟΥ ROHRSCHNEIDER ΤΡΙΓΩΝΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ x e, x d, x n α) Μια συστηµατική προσέγγιση για τη βελτιστοποίηση της εκλεκτικότητας 36 β) Εκλεκτικότητα του διαλύτη στην ΥΧΥΑ-αντίστροφης φάσης ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΓΡΑΜΜΙΚΗΣ ΠΑΛΙΝ ΡΟΜΗΣΗΣ Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: 2.1 ΜΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΤΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙ- ΝΗΣ ΜΕ ΥΧΥΑ α) Φαρµακολογική δράση..41 β) Φυσικοχηµικές ιδιότητες ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: 3.1 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙ ΡΑΣΗΣ ΙΑΦΟΡΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΕ ΜΙΓΜΑ 2-ΙΜΙ ΑΖΟΛΙΝΩΝ α) Ξυλοµεταζολίνη.. 54 β) Φενοξαζολίνη γ) Τραµαζολίνη δ) Κλονιδίνη ε) Οξυµεταζολίνη..56

8 στ) Ανταζολίνη ζ) Τυµαζολίνη...57 η) Τολαζολίνη ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Όργανα και σκεύη ιαλύτες και αντιδραστήρια ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ 2-ΙΜΙ ΑΖΟΛΙΝΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: 4.1 ΜΕΛΕΤΗ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΞΥΛΟΜΕ- ΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΜΕ ΥΧΥΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Φαρµακολογική δράση ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Όργανα και σκεύη ΕΠΙΛΟΓΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΗΤΡΙΚΩΝ ΙΑΛΥΜΑΤΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΞΥΛΟΜΕΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΜΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΒΕΝΖΕΘΟΝΙΟΥ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ

9 4.10 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΒΕΝΖΕ- ΘΟΝΙΟΥ ΣΕ ΕΜΠΟΡΙΚΟ ΣΚΕΥΑΣΜΑ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΥΠΕΡΙΩ ΟΥΣ ΟΡΑΤΟΥ Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: 5.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΝΟΜΟΣ ΤΟΥ BEER ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΟΥ ΝΟΜΟΥ ΤΟΥ BEER ΣΕ ΜΙΓΜΑΤΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΣΤΟ ΝΟΜΟ ΤΟΥ BEER Οργανολογικές αποκλίσεις (INSTRUMENTAL DEVIATIONS) Χηµικές αποκλίσεις (CHEMICAL DEVIATIONS) ΤΙΜΕΣ ΤΩΝ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΩΝ ΓΡΑΜΜΟΜΟΡΙΑΚΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗ- ΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΡΡΟΦΟΥΝΤΑ ΣΩΜΑΤΙ ΙΑ ΑΠΟΡΡΟΦΟΥΝΤΑ ΣΩΜΑΤΙ ΙΑ µε π, σ και n ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΑ ΕΙ Η ΑΠΟΡΡΟΦΟΥΝΤΩΝ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΩΝ ΟΡΓΑΝΙΚΑ ΧΡΩΜΟΦΟΡΑ ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΖΥΓΙΑΣ ΤΩΝ ΧΡΩΜΟΦΟΡΩΝ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΤΡΟΠΟΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ Ε ΟΜΕΝΩΝ ΙΑΛΥΤΕΣ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ

10 5.16 ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΨΕΛΙ ΩΝ ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΧΕΣΗΣ ΜΕΤΑΞΥ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΚΑΙ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΓΜΑΤΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ UV-Vis ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΦΑΣΜΑΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΥΠΕΡΙΩ- ΟΥΣ-ΟΡΑΤΟΥ ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ Προσδιορισµός του λ max Ενίσχυση της διαχωριστικότητας (enhanced resolution) Αύξηση της διαφοράς (discrimination) των µικρότερων φασµατικών Λεπτοµερειών Εκλεκτική αφαίρεση (selective subtraction) Ο ΛΟΓΟΣ ΣΗΜΑΤΟΣ-ΠΡΟΣ-ΘΟΡΥΒΟ ΠΗΓΕΣ ΘΟΡΥΒΟΥ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΟΥ ΛΟΓΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ-ΠΡΟΣ-ΘΟΡΥΒΟ ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΙ ΕΞΟΜΑΛΥΝΣΗΣ ΣΗΜΑΤΩΝ α. Θεωρία β. Κινούµενη µέση τιµή γ. Αλγόριθµος Savitzky-Golay δ. Σύνολα µέσων τιµών ΜΕΤΡΑ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ.140

11 6.9 ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΟΡΙΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΕΩΣ.140 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΜΕΘΟ ΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Αντιδραστήρια ιαλύτες ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΜΕΤΡΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΟΥΣΙΩΝ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΕΞΟΜΑΛΥΝΣΗΣ ΘΟΡΥΒΟΥ ΣΤΑ ΦΑΣΜΑΤΑ ΠΑΡΑ- ΓΩΓΩΝ ΜΕΘΟ ΟΣ «ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΛΟΓΩΝ» (DERIVATIVE RATIO) ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο «ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙ- ΚΩΝ ΛΟΓΩΝ» ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΥΝ ΥΑΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ «ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΛΟΓΩΝ» (DERIVATIVE RATIO) ΚΑΙ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ «ΙΟ ΟΣ ΑΠΟ ΤΟ ΜΗ ΕΝ» (ZERO-CROSSING)

12 8.2 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο «ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΛΟΓΩΝ» ΚΑΙ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ «ΙΟ ΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΜΗ ΕΝ» ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο «ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΛΟΓΩΝ» ΚΑΙ ΤΗΣ «ΙΟ ΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΜΗ ΕΝ» ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΧΛΩΡΙΟΥΧΟΥ ΒΕΝΖΕΘΟΝΙΟΥ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο «ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ ΦΑΣΜΑ- ΤΙΚΩΝ ΛΟΓΩΝ» ΚΑΙ ΤΗΣ «ΙΟ ΟΥ ΑΠΟ ΤΟ ΜΗ ΕΝ» ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΜΕΘΟ ΟΣ «ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΛΟΓΩΝ ΜΕ ΙΠΛΟ ΙΑΙΡΕΤΗ» (DERIVATIVE RATIO DOUBLE DIVISOR) ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΒΕΝΖΕΘΟΝΙΟΥ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο «ΠΑΡΑ- ΓΩΓΙΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΛΟΓΩΝ ΜΕ ΙΠΛΟ ΙΑΙΡΕΤΗ» (DERIVATIVE RATIO DOUBLE DIVISOR, DRDD) ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ Υ ΡΟΧΛΩΡΙΚΗΣ ΚΛΟΒΟΥΤΙΝΟΛΗΣ ΣΕ ΣΙΡΟΠΙ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πειραµατικό µέρος Οργανολογία..210

13 10.3 ιαλύµατα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΚΙΤΡΙΚΗΣ ΒΟΥΤΑΜΥΡΑΤΗΣ ΣΕ ΣΙΡΟΠΙ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πειραµατικό µέρος Οργανολογία ιαλύµατα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΞΥΛΟΜΕΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΜΕ ΥΧΥΑ ΚΑΙ UV-Vis ΜΕΛΕΤΗ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΞΥΛΟΜΕΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΑ Ε ΟΜΕΝΑ ΥΧΥΑ ΚΑΙ UV-Vis ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΤΟΥ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΞΥΛΟΜΕΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΒΕΝΖΕΘΟΝΙΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΒΟΥΤΑΜΥΡΑΤΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΛΟΒΟΥΤΙΝΟΛΗΣ ΣΤΑ ΒΙΟΛΟ- ΓΙΚΑ ΥΓΡΑ

14 13.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΤΕΛΙΚΟ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

15 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. 1 ΓΕΝΙΚΑ Η Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Απόδοσης (ΥΧΥΑ) 1,2 - High Performance Liquid Chromatography (HPLC) - αναπτύχθηκε τις τελευταίες δεκαετίες ως µία από τις πλέον αξιόπιστες αναλυτικές τεχνικές στη Φαρµακευτική Βιοµηχανία, αλλά και για ερευνητικούς σκοπούς. Η σηµαντική αυτή άνοδος οφείλεται στους εξής λόγους: 3,4 α) στη χρήση των ηλεκτρονικών υπολογιστών, β) στην αλµατώδη εξέλιξη της τεχνολογίας στήλης (ελάττωση του µεγέθους των τεµαχιδίων του υλικού πλήρωσης, πακετάρισµα του υλικού πλήρωσης µε τη χρήση υπερήχων), γ) στη µεγάλη ικανότητά της να ανιχνεύει δραστικές ουσίες σε πολύ µικρές συγκεντρώσεις, δ) στη δυνατότητα της ΥΧΥΑ να διαχωρίζει και να προσδιορίζει ταυτόχρονα πολλές φαρµακευτικές ουσίες, εφόσον συνυπάρχουν σε κάποιο σκεύασµα. Επίσης να προσδιορίζει παραπροϊόντα (impurities) τα οποία εντοπίζονται στις αµιγείς δραστικές ουσίες προερχόµενα, είτε από τη σύνθεση ως κατάλοιπα, είτε ως προϊόντα διάσπασης των δραστικών ουσιών και τέλος ε) στη δυνατότητα της ΥΧΥΑ να προσδιορίζει µικροποσότητες (της τάξης των ng και pg) δραστικής ουσίας και των µεταβολιτών της σε βιολογικά υγρά και ιστούς. Η σύγχρονη οργανολογία της ΥΧΥΑ µπορεί να δώσει αξιόπιστα αποτελέσµατα, µε ακρίβεια και επαναληψιµότητα. Όπως όλες οι άλλες αναλυτικές τεχνικές, η ΥΧΥΑ εισήχθη αρχικά στην εργαστηριακή έρευνα, αλλά γρήγορα το πεδίο δράσης της επεκτάθηκε στο να συµπεριλάβει και αναλύσεις καθηµερινότητας, ώστε σήµερα να χρησιµοποιείται ως µία αξιόπιστη αναλυτική διαδικασία στην καθ ηµέρα εργαστηριακή πρακτική κυρίως για ποσοτικούς προσδιορισµούς. Σε σχέση µε την κλασική χρωµατογραφία διαφέρει, γιατί στην ΥΧΥΑ χρησιµοποιούνται υλικά πλήρωσης µε τεµαχίδια µικρού µεγέθους και κατά συνέπεια εφαρµόζονται µεγάλες πιέσεις. Υπερτερεί δε της κλασικής χρωµατογραφίας επιτυγχάνοντας ταχύτερους και καλύτερης απόδοσης διαχωρισµούς µιγµάτων. 5

16 Ο σχεδιασµός για έναν επιτυχή διαχωρισµό µε ΥΧΥΑ στηρίζεται στη σωστή επιλογή της κατάλληλης κινητής φάσης για συγκεκριµένη στήλη και δείγµα. Πρέπει επίσης να συνυπολογισθούν πολλές και διαφορετικές ιδιότητες ενός διαλύτη και κυρίως η ιονική ισχύς και η εκλεκτικότητά του. Η ΥΧΥΑ ανήκει στη χρωµατογραφία στήλης που βεβαίως ο διαχωρισµός είναι αποτέλεσµα της συνδυαστικής δράσης µιας στατικής και µιας κινητής φάσης. 6 Το δείγµα εφαρµόζεται στην κορυφή της στήλης και µε τη βοήθεια της κινητής φάσης τα συστατικά του µετακινούνται µε τη µορφή ζωνών κατά µήκος της στήλης και τελικά εκλούονται διαδοχικά. Οι υπό ανάλυση ουσίες κατανέµονται ή προσροφώνται µεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης κι αυτό έχει σαν αποτέλεσµα να µετακινούνται µε διαφορετικές ταχύτητες κατά µήκος της στήλης. Στην ΥΧΥΑ συνήθως χρησιµοποιείται µίγµα διαλυτών ή και βαθµιαία µεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης. Ο χρόνος ανάλυσης είναι της τάξης των µερικών λεπτών, ενώ η ακρίβεια και η επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων είναι πλήρως αποδεκτές. 7 Αρχικά, η ΥΧΥΑ πραγµατοποιείτο µε υάλινες στήλες διαµέτρου 1 έως 5 cm και µήκους 50 έως και 500 cm. Για την επίτευξη ρεαλιστικής ταχύτητας ροής, η διάµετρος των σωµατιδίων της στερεάς φάσης ήταν συνήθως 150 έως 250 µm. Ακόµη και έτσι οι ταχύτητες ροής ήταν µικρές, της τάξης των µερικών δεκάτων του χιλιοστόλιτρου ανά λεπτό. Συνεπώς, οι χρόνοι διαχωρισµού ήταν µεγάλοι και συχνά έφθαναν τις µερικές ώρες. Απόπειρες επιτάχυνσης µε εφαρµογή κενού ή µε άντληση, δεν ήταν αποτελεσµατικές, επειδή αυξήσεις στην ταχύτητα ροής προκαλούσαν αύξηση των υψών των θεωρητικών πλακών µακριά από το ελάχιστο, που εµφανίζεται στην τυπική καµπύλη ύψους πλάκας-ταχύτητας-ροής. Το αποτέλεσµα αυτών ήταν οι ελαττωµένες αποδόσεις. 8 Γρήγορα, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της ΥΧΥΑ, οι επιστήµονες κατάλαβαν ότι σηµαντική βελτίωση στην απόδοση της στήλης θα µπορούσε να επιτευχθεί µε ελάττωση του µεγέθους των σωµατιδίων του υλικού πλήρωσης της στήλης. Στο τέλος της δεκαετίας του 1960 αναπτύχθηκε η τεχνολογία παραγωγής και χρήσης πληρωτικών υλικών µε σωµατίδια διαµέτρου 3 έως και 10 µm. 9 Η τεχνολογία απαιτούσε εξελιγµένα όργανα, µε δυνατότητα λειτουργίας σε υψηλές πιέσεις, κάτι που ήταν αδύνατο να επιτευχθεί µε τις απλές υάλινες στήλες της κλασικής υγρής χρωµατογραφίας µε βαρυτική ροή. Η ονοµασία Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) χρησιµοποιείται για να διακρίνει αυτές τις νεότερες τεχνικές από τις παλαιότερες, που ακόµη χρησιµοποιούνται για παρασκευαστικούς σκοπούς. 10

17 α) ΠΕ ΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ ΤΗΣ ΥΧΥΑ Η ΥΧΥΑ είναι η πιο διαδεδοµένη απ όλες τις αναλυτικές τεχνικές διαχωρισµού, µε ετήσιες πωλήσεις σε όργανα ΥΧΥΑ που φθάνουν τα δισεκατοµµύρια δολάρια. Οι λόγοι αυτής της αποδοχής της τεχνικής είναι η ευαισθησία της, η εύκολη προσαρµογή της σε ακριβείς ποσοτικούς προσδιορισµούς, η καταλληλότητά της για διαχωρισµούς µη πτητικών ή θερµικά ευαίσθητων συστατικών και κυρίως, η εφαρµοσιµότητά της σε προσδιορισµούς ουσιών πρωτίστου ενδιαφέροντος για τη βιοµηχανία, το δηµόσιο και πολλά επιστηµονικά πεδία. Παραδείγµατα αποτελούν τα αµινοξέα, οι πρωτεΐνες, τα νουκλεϊκά οξέα, οι υδρογονάνθρακες, τα φάρµακα, τα τερπενοειδή, τα φυτοφάρµακα, τα αντιβιοτικά, τα στεροειδή, οι οργανοµεταλλικές ενώσεις και µια ποικιλία ανόργανων ουσιών. Στο Σχήµα 1 απεικονίζεται το πώς οι διάφορες τεχνικές υγρής χρωµατογραφίας τείνουν να αλληλοσυµπληρώνονται, σε ότι αφορά τα πεδία εφαρµογών. Συνεπώς, για ουσίες µε µοριακά βάρη µεγαλύτερα από , χρησιµοποιείται συχνά η υγρή χρωµατογραφία µοριακού αποκλεισµού αν και σήµερα είναι δυνατόν τέτοιες ενώσεις να προσδιορίζονται µε χρωµατογραφία κατανοµής αντίστροφης φάσης. Σχήµα 1: Εφαρµογές ΥΧΥΑ.

18 Για ιοντικές ενώσεις χαµηλού µοριακού βάρους χρησιµοποιείται ευρέως η χρωµατογραφία ιονανταλλαγής. Επιπλέον, η παραλλαγή αυτή της υγρής χρωµατογραφίας χρησιµοποιείται συχνά για διαχωρισµούς ενώσεων, που ανήκουν στην ίδια οµόλογη σειρά. Η χρωµατογραφία προσρόφησης συχνά επιλέγεται για διαχωρισµό µη-πολικών ενώσεων, ισοµερών και κατηγορίες ενώσεων, όπως είναι οι αλειφατικοί υδρογονάνθρακες από αλειφατικές αλκοόλες. 11 β) ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑ ΡΟΜΗ Το 1941 οι Martin και Synge περιέγραψαν τις αρχές της υγρής-υγρής χρωµατογραφίας κατανοµής και στην ίδια εργασία βρίσκονταν τα θεµέλια της υγρής χρωµατογραφίας υψηλής απόδοσης. Στην εργασία αυτή γίνεται λόγος για το ύψος κάποιων θεωρητικών στοιβάδων εντός της στήλης που είναι ισοδύναµες µε µία θεωρητική πλάκα. Αυτή η παράµετρος έχει υιοθετηθεί σήµερα ως µέτρο της χρωµατογραφικής ικανότητας της στήλης. Επίσης φαίνεται, ότι η αυξηµένη απόδοση της στήλης µπορούσε να επιτευχθεί µε τη χρήση τεµαχιδίων στατικής φάσης µικρότερου µεγέθους. Είναι ωστόσο παραδεκτό, ότι η ανάπτυξη της ΥΧΥΑ άρχισε τη δεκαετία του και µεταξύ , οι Kirkland, 13 Huber 14 και Horvath, Presis και Lipsky, 15 περιέγραψαν την πρώτη χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης, όπως τουλάχιστον χρησιµοποιείται σήµερα. Η ΥΧΥΑ είναι µία µέθοδος ανάλογη της αερίου χρωµατογραφίας, όπου η στατική φάση αποτελείται από κάποια στερεή ή υγρή επιφάνεια υπό τη µορφή πορώδους υλικού, πακεταρισµένου σε µεταλλική στήλη, όπου η υγρή κινητή φάση µετακινείται επειδή ασκείται πίεση. 1.2 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Για να αναπτυχθούν ικανοποιητικές ταχύτητες ροής του υγρού έκλουσης όταν χρησιµοποιούνται υλικά πλήρωσης αποτελούµενα από σωµατίδια µεγέθους 2 έως και 10 µm, που είναι συνηθισµένα στη σύγχρονη ΥΧΥΑ, οι απαιτούµενες πιέσεις από τις αντλίες φθάνουν τις µερικές χιλιάδες psi ( pounds per square inch, 1 atm = 14,696 psi). Ως συνέπεια αυτών των υψηλών πιέσεων, η οργανολογία της ΥΧΥΑ είναι πολυπλοκότερη, µε υψηλό κόστος, σε σύγκριση µε την οργανολογία άλλων ειδών χρωµατογραφίας. Στο Σχήµα 2 παρουσιάζονται τα σηµαντικότερα τµήµατα από τα οποία αποτελείται µια διάταξη ΥΧΥΑ. 16,17

19 Σχήµα 2: Σχηµατική παράσταση µιας διάταξης HPLC. Ένα σύγχρονο σύστηµα ΥΧΥΑ είναι εφοδιασµένο µε ένα ή περισσότερα υάλινα ή ανοξείδωτα δοχεία, καθένα από τα οποία περιέχει 200 έως 1000 ml διαλύτη. Τα δοχεία είναι συχνά εφοδιασµένα µε µέσα αποµάκρυνσης των διαλυµένων αερίων, συνήθως οξυγόνου και αζώτου, που παρεµποδίζουν το σχηµατισµό φυσαλίδων στη στήλη και στον ανιχνευτή των συστηµάτων. Οι φυσαλίδες αυτές προκαλούν διεύρυνση των κορυφών. Επιπλέον, εµποδίζουν συχνά τη σωστή λειτουργία του ανιχνευτή. Οι απαερωτές µπορεί να αποτελούνται από ένα σύστηµα άντλησης κενού, ένα σύστηµα απόσταξης, διατάξεις που θερµαίνουν και αναδεύουν τους διαλύτες ή (όπως φαίνεται στο Σχήµα 2) από συστήµατα εισαγωγής µικρών φυσαλίδων αδρανούς αερίου χαµηλής διαλυτότητας. Συχνά τα συστήµατα αυτά περιλαµβάνουν φίλτρα αποµάκρυνσης σκόνης και αιωρούµενων σωµατιδίων από τους διαλύτες για να προληφθούν πιθανές βλάβες στις αντλίες ή στα συστήµατα έγχυσης, όπως και η έµφραξη της στήλης. Όπως δείχνεται στο Σχήµα 2, δεν είναι αναγκαίο οι απαερωτές και τα φίλτρα να είναι ενσωµατωµένα τµήµατα ενός συστήµατος ΥΧΥΑ. Για παράδειγµα, ένας απλός τρόπος επεξεργασίας διαλυτών, πριν την εισαγωγή τους στο δοχείο, είναι η διήθησή τους µέσω µικροπορώδους φίλτρου

20 (millipore filter) µε εφαρµογή κενού. Η επεξεργασία αυτή αποµακρύνει αέρια και αιωρούµενα σωµατίδια. 18 Ο διαχωρισµός στον οποίο χρησιµοποιείται ένας διαλύτης σταθερής σύστασης καλείται ισοκρατική έκλουση (isocratic elution). Συχνά, η απόδοση διαχωρισµού ενισχύεται σηµαντικά µε τη βαθµιδωτή έκλουση (gradient elution). Εδώ χρησιµοποιούνται δύο ή τρία συστήµατα διαλυτών, που διαφέρουν σηµαντικά ως προς την πολικότητα. Αφού αρχίσει η έκλουση, ο λόγος των διαλυτών µεταβάλλεται µε τρόπο προγραµµατισµένο άλλες φορές συνεχώς και άλλες µε µια σειρά βηµάτων. Τα σύγχρονα συστήµατα ΥΧΥΑ συχνά είναι εφοδιασµένα µε διατάξεις, οι οποίες εισάγουν διαλύτες από δύο ή περισσότερα δοχεία σε θάλαµο ανάµιξης µε ρυθµούς που µεταβάλλονται συνεχώς. Ο λόγος των όγκων των διαλυτών µπορεί να µεταβάλλεται ως προς το χρόνο γραµµικά ή λογαριθµικά. Όταν η στατική φάση είναι πιο πολική από την κινητή φάση, αυτή η µορφή της ΥΧΥΑ ονοµάζεται κανονικής φάσεως χρωµατογραφία. Σ αυτή την περίπτωση, η στατική φάση έχει προσροφητικές ιδιότητες. Συνήθη υλικά πληρώσεως της στήλης περιλαµβάνουν τη silica και διάφορες πολικές δεσµευµένες φάσεις (κύανο-, διολο-, αµινο-). Στην ΥΧΥΑ κανονικής φάσης, οι αλληλεπιδράσεις διαλύτη-δείγµατος είναι σχετικά ισχυρές. 19 Αυτή η µέθοδος ΥΧΥΑ χρησιµοποιείται συνήθως για το διαχωρισµό συστατικών διαλυτών σε οργανικούς διαλύτες και για το διαχωρισµό ισοµερών. Η κινητή φάση συνίσταται από µη πολικούς διαλύτες, όπως εξάνιο ή 1,1,2-τριφθορο,1,1,2-τριχλωροαιθάνιο(freon). Τροποποιητές, όπως το µεθυλοχλωρίδιο ή ο µέθυλο-t-βουτυλαιθέρας, προστίθενται συχνά. Τα συστήµατα ΥΧΥΑ αντιστρόφου φάσεως, εισήχθησαν από τους Howard και Martin 20 το 1950, χρησιµοποιώντας µη πολική στατική φάση, σε συνδυασµό µε πολική κινητή φάση. Χαρακτηρίζονται από ισχυρές αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στην πολική κινητή φάση και τα µόρια του δείγµατος. Αντίθετα, η αλληλεπίδραση µεταξύ των µορίων του δείγµατος και της µη πολικής στατικής φάσης, είναι ασθενής. Αυτό υποδεικνύει, ότι οι αλληλεπιδράσεις, συνήθως µεταξύ δείγµατος και διαλύτη, είναι αυτές που καθορίζουν τη σχετική κατακράτηση και το διαχωρισµό στα συστήµατα ΥΧΥΑ αντιστρόφου φάσεως. Οι πιο συνηθισµένες αντίστροφες φάσεις είναι οι δεκαοκτυλο-(c 18 ), οκτυλο-(c 8 ), φαιναιθυλο- και κυανοπροπυλο- που είναι χηµικά συνδεδεµένες µε οξείδιο του πυριτίου. Η κινητή φάση, συνήθως συνίσταται από µεθανόλη, ακετονιτρίλιο ή τετραϋδροφουράνιο, αναµειγµένα µε νερό. α) ΕΛΕΓΧΟΣ ΡΟΗΣ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΥ Πολλά εµπορικά όργανα είναι εφοδιασµένα µε συσκευές ελεγχόµενες από υπολογιστή για τη µέτρηση της ταχύτητας ροής, η οποία υπολογίζεται από την πτώση πίεσης σε έναν

21 αναστολέα τοποθετηµένο στην έξοδο της αντλίας. Κάθε παρατηρούµενη διαφορά στο σήµα από µια προκαθορισµένη τιµή χρησιµοποιείται ακολούθως για αύξηση ή µείωση της ταχύτητας του κινητήρα της αντλίας. Επίσης, τα περισσότερα όργανα διαθέτουν έναν µηχανισµό µεταβολής της σύστασης του διαλύτη κατά συνεχή ή βηµατικό τρόπο. Για παράδειγµα, το όργανο του Σχήµατος 2 διαθέτει µια βαλβίδα, που επιτρέπει την ανάµιξη µέχρι και τεσσάρων διαλυτών κατά ένα εκ των προτέρων προγραµµατισµένο και συνεχώς µεταβαλλόµενο λόγο. 21 β) ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΕΓΧΥΣΗΣ ΕΙΓΜΑΤΟΣ Συχνά, ο περιοριστικός παράγοντας στην επαναληψιµότητα των µετρήσεων στην ΥΧΥΑ είναι ο τρόπος εισαγωγής των δειγµάτων στη στήλη. Το πρόβληµα επιδεινώνεται µε τη διεύρυνση των κορυφών, που προκαλεί η υπερφόρτωση των στηλών. Συνεπώς, οι όγκοι πρέπει να είναι οι ελάχιστοι δυνατοί, από µερικές δεκάδες ml έως 500 ml. Επιπλέον, είναι σηµαντικό να εισάγεται το δείγµα χωρίς να προκαλείται αποσυµπίεση του συστήµατος. Ο παλαιότερος και απλός τρόπος εισαγωγής δείγµατος ήταν η έγχυση µε σύριγγα µέσω ενός ελαστικού διαφράγµατος γνωστού ως septum. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται µικροσύριγγες σχεδιασµένες να αντέχουν σε πιέσεις µέχρι 1500 psi. Σε εγχύσεις αναχαίτισης ροής, η ροή του διαλύτη διακόπτεται στιγµιαία, αποµακρύνεται ένας προσαρµογέας στην κεφαλή της στήλης και το δείγµα εγχέεται απευθείας στην κορυφή (κεφαλή) της στήλης. Μετά την επανατοποθέτηση του προσαρµογέα, το σύστηµα επανέρχεται σε συνθήκες πίεσης. Το πλεονέκτηµα αυτής της τεχνικής είναι η απλότητά της. Η συνηθέστερα χρησιµοποιούµενη µέθοδος εισαγωγής δείγµατος στην ΥΧΥΑ βασίζεται σε βρόχους δειγµάτων, όπως αυτός που φαίνεται στα Σχήµατα 3 και 4. Σχήµα 3: Βρόχος δειγµατοληψίας ΥΧΥΑ. Με τη χειρολαβή της βαλβίδας, όπως δείχνεται στο αριστερό σχήµα, ο βρόχος γεµίζει από τη σύριγγα και η κινητή φάση ρέει από την αντλία προς τη

22 στήλη. Όταν η βαλβίδα τοποθετηθεί στη θέση που δείχνεται στο δεξιό σχήµα, ο βρόχος παρεµβάλλεται µεταξύ αντλίας και στήλης, οπότε η κινητή φάση µεταφέρει το δείγµα προς τη στήλη. Σχήµα 4: Περιστροφική βαλβίδα δείγµατος: α) θέση πλήρωσης του βρόχου ACB, β) εισαγωγή του δείγµατος στη στήλη. Οι διατάξεις αυτές είναι συχνά ένα αλληλένδετο τµήµα ενός υγροχρωµατογράφου µε βρόχους µεταβλητού όγκου από 5 έως 500 µl. Με βρόχους αυτού του τύπου εισάγονται δείγµατα σε πιέσεις µέχρι 7000 psi µε αποκλίσεις µικρότερες του 1%. Επίσης είναι διαθέσιµες βαλβίδες έγχυσης για µικροόγκους µε βρόχους δείγµατος από 0,5 έως 5µL. 1.3 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΥΧΥΑ ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ ΑΛΛΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Μερικά από τα πλεονεκτήµατα είναι: α) Οι στήλες της ΥΧΥΑ χρησιµοποιούνται πολλές φορές χωρίς την ανάγκη αναγέννησης. β) Η διαχωριστική ικανότητα τέτοιων στηλών είναι πολύ µεγαλύτερη από τις κοινές ανοικτές στήλες. γ) Ο χρόνος ανάλυσης είναι µικρότερος. δ) Η οργανολογία της ΥΧΥΑ αυτοµατοποιείται εύκολα, εποµένως είναι δυνατόν να πραγµατοποιηθεί µεγάλος αριθµός ποσοτικών αναλύσεων. ε) Επειδή η όλη διαδικασία της ανάλυσης εξαρτάται από την οργανολογία και λιγότερο από την ικανότητα του χειριστού-αναλυτή, η επαναληψιµότητα είναι καλύτερη.

23 στ) Είναι δυνατή η ταυτόχρονη διεξαγωγή χρωµατογραφικών αναλύσεων φαρµάκων διαφορετικής χηµικής δοµής. α) ΣΤΗΛΕΣ ΥΧΥΑ Οι στήλες της ΥΧΥΑ συνήθως κατασκευάζονται από σωλήνες µικρής διαµέτρου (mm) από ανοξείδωτο χάλυβα, αν και περιστασιακά χρησιµοποιούνται και παχύτοιχοι υάλινοι σωλήνες. Οι τελευταίοι χρησιµοποιούνται σε πιέσεις µικρότερες από 600 psi. Εκατοντάδες πακεταρισµένων στηλών µε διαφορετικό µέγεθος και υλικό πλήρωσης είναι διαθέσιµες από διαφορετικούς κατασκευαστές. β) ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΣΤΗΛΕΣ Οι περισσότερες στήλες ΥΧΥΑ έχουν µήκος από 10 έως 30 cm. Συνήθως οι στήλες είναι ευθύγραµµες. Όταν απαιτείται επιµήκυνσή τους, αυτή επιτυγχάνεται µε σύζευξη δύο ή περισσοτέρων στηλών σε σειρά. Περιστασιακά χρησιµοποιούνται σπειροειδείς στήλες, αν και λόγω σχήµατος η αποτελεσµατικότητά τους δεν είναι καλή. Η εσωτερική διάµετρος των στηλών είναι συνήθως 4 έως 10 mm και το µέγεθος σωµατιδίων του υλικού πλήρωσης είναι 5 ή 10 µm. Σήµερα, η πιο συνηθισµένη στήλη έχει µήκος 25 cm, εσωτερική διάµετρος 4,6 mm και υλικό πλήρωσης µε σωµατίδια µεγέθους 5 µm. Στήλες αυτού του τύπου διαθέτουν έως θεωρητικές πλάκες/m. Πρόσφατα, ορισµένοι κατασκευαστές προσφέρουν στήλες ΥΧΥΑ, µε µικρότερες διαστάσεις από αυτές που ήδη περιγράφηκαν. 22 Οι στήλες αυτές έχουν εσωτερικές διαµέτρους από 1 έως 4,6 mm και µέγεθος σωµατιδίων υλικού πλήρωσης 3 έως 5 µm. Το µήκος τους είναι µικρό (3 έως 7,5 cm). Οι στήλες του τύπου αυτού διαθέτουν µέχρι και πλάκες/m και προσφέρουν το πλεονέκτηµα της ταχύτητας και της ελάχιστης κατανάλωσης διαλύτη. Η τελευταία ιδιότητα έχει ιδιαίτερη σηµασία, επειδή οι διαλύτες υψηλής καθαρότητας, που απαιτούνται στην ΥΧΥΑ είναι δαπανηροί τόσο στην αγορά όσο και στη διάθεσή τους ως εργαστηριακά απόβλητα. γ) ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΕΣ ΣΤΗΛΕΣ Συνήθως πριν από την αναλυτική στήλη, παρεµβάλλεται µια µικρή προστατευτική στήλη 23 (guard column) ή προστήλη (pre-column) για να αυξήσει το χρόνο ζωής της, αποµακρύνοντας όχι µόνο τα αιωρούµενα σωµατίδια και τις προσµίξεις από το διαλύτη, αλλά και συστατικά του δείγµατος που συνδέονται µε τη στατική φάση µη αντιστρεπτά. Επιπλέον, στη χρωµατογραφία υγρού-υγρού, η προστήλη προκαλεί κορεσµό της κινητής φάσης µε τη στατική έτσι, ώστε να ελαχιστοποιούνται οι απώλειες του διαλύτη της αναλυτικής στήλης. Η σύσταση του υλικού της προστήλης πρέπει να είναι παρόµοια µε αυτό της αναλυτικής στήλης. Ωστόσο, το µέγεθος των

24 σωµατιδίων είναι συνήθως µεγαλύτερο για να ελαχιστοποιείται η πτώση πίεσης. Όταν η προστήλη ρυπαίνεται, αναγοµώνεται ή απορρίπτεται και αντικαθίσταται µε νέα του ιδίου τύπου. Εποµένως, η προστήλη θυσιάζεται για την προστασία της δαπανηρότερης αναλυτικής στήλης. δ) ΘΕΡΜΟΣΤΑΤΕΣ ΣΤΗΛΗΣ Σε πολλές εφαρµογές ο αυστηρός έλεγχος της θερµοκρασίας της στήλης δεν είναι αναγκαίος και οι στήλες λειτουργούν σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Ωστόσο συχνά λαµβάνονται καλύτερα χρωµατογραφήµατα διατηρώντας τη θερµοκρασία της στήλης σταθερή εντός µερικών δεκάτων του βαθµού Κελσίου. Τα σύγχρονα όργανα είναι σήµερα εφοδιασµένα µε θερµοστάτες, που ελέγχουν τη θερµοκρασία της στήλης στην περιοχή θερµοκρασιών δωµατίου µέχρι 100 ή C µε ακρίβεια µερικών δεκάτων του βαθµού. Επίσης, οι στήλες µπορεί να συνδέονται µε µανδύες ύδατος τροφοδοτούµενους από υδατόλουτρο σταθερής θερµοκρασίας για τον ακριβή έλεγχο της θερµοκρασίας. ε) ΤΥΠΟΙ ΥΛΙΚΩΝ ΠΛΗΡΩΣΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΣΤΗΛΩΝ Στην ΥΧΥΑ χρησιµοποιούνται δύο βασικοί τύποι πληρωτικών υλικών, ο πρώτος τύπος αποτελείται από σωµατίδια σφαιροειδή (pellicular) και ο δεύτερος από πορώδη. Τα πρώτα αποτελούνται από σφαιρικά σωµατίδια από ύαλο ή πολυµερές µε τυπικές διαµέτρους 30 έως 40 µm. Στην επιφάνεια των σφαιριδίων αυτών αποτίθεται λεπτό πορώδες στρώµα, όπως SiO 2, αλουµίνα, συνθετική ρητίνη πολυστερινίου-διβινυλοβενζολίου ή µια ιονανταλλακτική ρητίνη. Για µερικές εφαρµογές προστίθεται ένα επιπλέον στρώµα, αποτελούµενο από µια υγρή στατική φάση, που συγκρατείται µε προσρόφηση. Εναλλακτικά, τα σφαιρίδια µπορεί να υποστούν χηµική επεξεργασία για να παραχθεί ένα οργανικό επιφανειακό στρώµα. Αυτό το είδος υλικού πλήρωσης χρησιµοποιείται συχνότατα για την κατασκευή προστηλών κι όχι για αναλυτικές στήλες. Το υλικό πλήρωσης µε βάση τα πορώδη σωµατίδια αποτελείται από µικροσωµατίδια διαµέτρου 3 έως 10 µm. Καταβάλλεται κάθε προσπάθεια για την ελαχιστοποίηση του εύρους περιοχής µεγεθών τους. Τα σωµατίδια αποτελούνται από SiO 2, αλουµίνα, συνθετικές ρητίνες πολυστερινίου-διβινυλοβενζολίου ή µια ιονανταλλακτική ρητίνη. Το SiO 2 είναι το συνηθέστερο υλικό πλήρωσης στην ΥΧΥΑ. Τα σωµατίδια του SiO 2 παρασκευάζονται µε συσσωµάτωση σωµατιδίων SiO 2 µεγέθους µικρότερου από ένα µm σε συνθήκες που οδηγούν στο σχηµατισµό µεγαλύτερων σωµατιδίων πολύ στενής περιοχής τιµών διαµέτρου. Τα σχηµατιζόµενα σωµατίδια συχνά καλύπτονται µε λεπτά οργανικά στρώµατα, που συνδέονται µε την επιφάνεια µε χηµικό ή φυσικό τρόπο.

25 1.4 ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ Αντίθετα µε την αέριο χρωµατογραφία, στην υγρή χρωµατογραφία δεν υπάρχουν ανιχνευτές 24, που βασίζονται σε γενικές ιδιότητες της ύλης και τόσο αξιόπιστοι, όπως ο ανιχνευτής φλόγας και ο θερµικής αγωγιµότητας. Η µεγάλη πρόκληση στην ανάπτυξη της υγρής χρωµατογραφίας είναι η βελτίωση των ανιχνευτών. Ο ιδανικός ανιχνευτής για την ΥΧΥΑ πρέπει να έχει όλες τις ιδιότητες που αναφέρονται στους ανιχνευτές της αερίου χρωµατογραφίας µε τη διαφορά ότι ο ανιχνευτής της ΥΧΥΑ δεν απαιτείται να αποκρίνεται σε τόσο µεγάλη περιοχή θερµοκρασιών. Επιπλέον, ένας ανιχνευτής ΥΧΥΑ πρέπει να έχει τον ελάχιστο δυνατό εσωτερικό όγκο για να περιορίζεται η διεύρυνση των κορυφών. α) ΤΥΠΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΤΩΝ Υπάρχουν δύο βασικοί τύποι ανιχνευτών ΥΧΥΑ 25. Αυτοί που ανταποκρίνονται σε µια βασική ιδιότητα (bulk property detectors) της κινητής φάσης, όπως ο δείκτης διάθλασης, η διηλεκτρική σταθερά ή η πυκνότητα, οι τιµές των οποίων επηρεάζονται από την παρουσία των εκλουόµενων συστατικών. Αντίθετα, υπάρχουν ανιχνευτές που αποκρίνονται σε ιδιότητα του εκλουόµενου συστατικού (solute property detectors), όπως είναι η απορρόφηση στο υπεριώδες, ο φθορισµός ή το ρεύµα διάχυσης. Την ιδιότητα αυτή δεν πρέπει να διαθέτει η κινητή φάση. Στον Πίνακα 1 αναφέρονται οι συνηθέστεροι ανιχνευτές ΥΧΥΑ και µερικές από τις πιο σηµαντικές ιδιότητές τους. Μια καταγραφή του 1982, από 365 δηµοσιευµένες εργασίες στις οποίες η ΥΧΥΑ έπαιζε σηµαντικό ρόλο, αποκάλυψε ότι στο 71% γινόταν χρήση ανιχνευτή απορρόφησης UV, στο 15% φθορισµού, στο 5,4% δείκτη διάθλασης, στο 4,3% γινόταν χρήση ηλεκτροχηµικού ανιχνευτή και στο 4,3% χρησιµοποιήθηκαν διάφορα άλλα συστήµατα µέτρησης. 26 Από τους ανιχνευτές απορρόφησης UV, το 39% βασίσθηκε σε µια από τις γραµµές εκποµπής υδραργύρου, το 13% σε επιλεγµένη ακτινοβολία από πηγή δευτερίου και το 48% σε ακτινοβολία επιλεγµένη µε µονοχρωµάτορα. ΠΙΝΑΚΑΣ 1: Απόδοση ανιχνευτών ΥΧΥΑ. Ανιχνευτής ΥΧΥΑ ιαθεσιµότητα Όριο ανίχνευσης µάζας Όριο ανίχνευσης µάζας στο εµπόριο (LOD) (LOD) (εµπορικοί ανιχνευτές) α (υπάρχουσα κατάσταση) β Απορρόφησης Ναι γ 100 pg-1 ng 1 pg Φθορισµού Ναι γ 1-10 pg 10 fg Ηλεκτροχηµικός Ναι γ 10 pg 1 ng 100 fg είκτη διάθλασης Ναι 100 ng 1 µg 10 ng

26 Αγωγιµότητας Ναι 500 pg 1 ng 500 pg Φασµατοµετρίας Ναι δ 100 pg 1 ng 1 pg µαζών Ναι δ 1 µg 100 ng FT-IR Ναι 10 µg 500 mg Σκέδαση φωτός ε Όχι - 1 ng Οπτικής ενεργότητας Όχι - 10 ng Επιλογής στοιχείου Όχι - 1 pg 1 ng Φωτοϊοντισµού α Το όριο ανίχνευσης µάζας (LOD) υπολογίζεται ως η εγχεόµενη µάζα που αποδίδει σήµα ίσο µε το πενταπλάσιο του θορύβου (σ), χρησιµοποιώντας ένα γραµµοµοριακό βάρος 200 g/mol. Έγχυση 10 ml για συνήθη ή 1 ml για µικροσωληνώδη LC. β Ορίζεται όπως στο α, αλλά ο όγκος έγχυσης είναι γενικά µικρότερος. γ Εµπορικά διαθέσιµοι για µικροσωληνώδη LC. δ Εµπορικά διαθέσιµοι, ωστόσο υψηλού κόστους. ε Συµπεριλαµβανοµένης της σκέδασης φωτός µικρής γωνίας και της νεφελοµετρίας. 1.5 ΕΙ Η ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Στην ΥΧΥΑ µπορούν να εφαρµοστούν όλα τα είδη των φυσικοχηµικών µηχανισµών που λαµβάνουν χώρα στους χρωµατογραφικούς διαχωρισµούς, 27 µε την κατάλληλη χρήση υλικού πλήρωσης της στήλης, δηλαδή της στατικής φάσης και του διαλύτη έκλουσης της λεγόµενης κινητής φάσης. Έτσι λοιπόν, µε βάση το υλικό πλήρωσης της στήλης και κατά συνέπεια το µηχανισµό διαχωρισµού των υπό ανάλυση ουσιών (φαρµάκων) 28, η ΥΧΥΑ διακρίνεται σε: 1) Χρωµατογραφία Προσρόφησης: είναι η παλαιότερη χρωµατογραφική τεχνική 29, στην οποία τα συστατικά του µίγµατος αλληλεπιδρούν (προσροφούνται) στην επιφάνεια ή σε ορισµένες θέσεις της επιφάνειας της-στερεής συνήθως-στατικής φάσης. Η ισορροπία που αποκαθίσταται µεταξύ των προσροφηµένων σωµατιδίων και των σωµατιδίων στην κινητή φάση, η οποία µπορεί να είναι υγρή ή αέρια, πετυχαίνει το διαχωρισµό. Οι αλληλεπιδράσεις που λαµβάνουν χώρα είναι ηλεκτροστατικής φύσης, διπόλου-διπόλου, δυνάµεις London, ή συνδυασµός των δυνάµεων αυτών. Κατατάσσεται στη χρωµατογραφία κανονικής φάσης, όπου η στατική φάση (διοξείδιο του πυριτίου SiO 2 ή αλουµίνα Al 2 O 3 ) είναι πολικότερη από την κινητή φάση που αποτελείται από µη πολικούς διαλύτες, όπως εξάνιο, χλωροφόρµιο κ.ά. 2) Χρωµατογραφία Κατανοµής: εφαρµόζεται στην ανάλυση οµόλογων µη ιονικών ενώσεων 30. Η υγρή στατική φάση σχηµατίζει ένα λεπτό υµένιο στην επιφάνεια του στερεού

27 υποστρώµατος. Ο διαχωρισµός βασίζεται στη διαφορετική κατανοµή µεταξύ της υγρής κινητής και της υγρής στατικής φάσης. Κατατάσσεται στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης, όπου η στατική φάση που είναι λιγότερο πολική της κινητής, αποτελείται από διοξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ) συζευγµένο µε οµοιοπολικό δεσµό µε αλκύλια, φαινύλια, αµινοοµάδες, διόλες κ.ά., ενώ η κινητή φάση αποτελείται από µίγµατα οργανικών διαλυτών (µεθανόλη, ακετονιτρίλιο) µε υδατικά ρυθµιστικά διαλύµατα ή νερό. Τα υλικά της συζευγµένης φάσης πλεονεκτούν ως προς τη σταθερότητα, αλλά και τη συµβατότητα µε µεγάλη ποικιλία εκλουστικών συστηµάτων. Είναι η πιο διαδεδοµένη τεχνική ΥΧΥΑ και χρησιµοποιείται στο 80% περίπου των αναλυτικών εφαρµογών. 3) Χρωµατογραφία Ιοντοανταλλαγής: ο διαχωρισµός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των αναλυόµενων ιόντων και των φορτισµένων οµάδων της στατικής φάσης 31. Έτσι στην περίπτωση της κατιοντοανταλλαγής λαµβάνει χώρα η ισορροπία: RSO 3 X + + Y + RSO 3 Y + + X + όπου: RSO - 3 X + είναι η δραστική οµάδα της στατικής φάσης και Y + το αναλυόµενο κατιόν. Ανάλογη ισορροπία ισχύει και στην περίπτωση της ανιοντοανταλλαγής. Οι κυριότερες παράµετροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής είναι το αντίθετο ιόν της δραστικής οµάδας της στατικής φάσης, η ιονική ισχύς, το ph, ο τροποποιητής της κινητής φάσης και η θερµοκρασία. Ως υλικά πλήρωσης χρησιµοποιούνται διάφορες ρητίνες που αποτελούν συµπολυµερή στυρενίου-διβινυλοβενζολίου, στα οποία έχουν εισαχθεί σουλφονικές ή καρβοξυλικές οµάδες, τριτοταγείς ή τεταρτοταγείς αµίνες. 4) Χρωµατογραφία Συγγένειας (Affinity Chromatography): για να επιτευχθεί διαχωρισµός, οι προσδιοριζόµενες ενώσεις δεσµεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες (ligands) 32 οι οποίοι είναι συνδεδεµένοι µε οµοιοπολικούς δεσµούς στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου. Για παράδειγµα ο υποκαταστάτης µπορεί να είναι ένα είδος αντισώµατος σε µια συγκεκριµένη πρωτεΐνη. Κατά τη διέλευση µέσα από τη στήλη µίγµατος µεγάλου αριθµού πρωτεϊνών, µόνο µία πρωτεΐνη αντιδρά µε το συγκεκριµένο αντίσωµα. Μετά την έκπλυση των υπολοίπων συστατικών από τη στήλη, η επιθυµητή πρωτεΐνη αποδεσµεύεται από το αντίσωµα µε µεταβολή της τιµής ph ή της ιονικής ισχύος. Αποτελεί την πιο σύγχρονη και πιο εκλεκτική χρωµατογραφική τεχνική. Στην κατηγορία αυτή ανήκει η Χρωµατογραφία Εναντιοµερών µε την οποία διαχωρίζονται εναντιοµερείς µορφές ενώσεων που παρουσιάζουν χειροµορφία (Chiral Chromatography) 33. Για µερικά φάρµακα που παρουσιάζουν χειροµορφία, η επιθυµητή φαρµακολογική δράση οφείλεται εφ

28 ολοκλήρου στο ένα εναντιοµερές, ενώ ο αντίποδας είναι υπεύθυνος για σηµαντικές ανεπιθύµητες ενέργειες. Η Χρωµατογραφία Εναντιοµερών είναι αποτελεσµατική µέθοδος για το διαχωρισµό των ρακεµικών µιγµάτων. 5) Χρωµατογραφία Αποκλεισµού Μεγέθους (Size Exclusion) ή ιαπερατότητας Πηκτής (Gel Permeation Chromatography): ο διαχωρισµός επιτυγχάνεται µε βάση το σχήµα και το µέγεθος των µορίων των υπό ανάλυση ενώσεων. Τα µεγαλύτερα µόρια προχωρούν µε µεγαλύτερη ταχύτητα. Σ αντίθεση µε τα άλλα είδη χρωµατογραφίας, δεν υπάρχει αλληλεπίδραση ανάµεσα στη στατική φάση και τα διαχωριζόµενα συστατικά. Η υγρή ή η αέρια κινητή φάση διαπερνά µέσα από πορώδη πηκτή. Το µέγεθος των πόρων είναι µικρό και αποκλείονται τα µεγάλα µόρια του προσδιοριζόµενου συστατικού που προχωρούν, χωρίς να εισέλθουν στην πηκτή, ενώ τα µικρά µόρια εξέρχονται από τη στήλη σε µεγαλύτερο χρόνο. Η Χρωµατογραφία Αποκλεισµού Μεγέθους βρίσκει εφαρµογές στους προσδιορισµούς και το χαρακτηρισµό των πολυµερών. 1.6 ΒΑΣΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΤΗΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ Υπάρχουν τέσσερις βασικές χρωµατογραφικές παράµετροι 34, οι οποίες είναι χρήσιµες στην αξιολόγηση της ποιότητας των χρωµατογραφηµάτων και στη διάγνωση των προβληµάτων, όταν προκύπτουν: 1) Συντελεστής κατακράτησης (capacity factor) 2) Παράγοντας εκλεκτικότητας (selectivity factor) 3) Αριθµός θεωρητικών πλακών (column plate number) 4) Παράγοντας ασυµµετρίας (asymmetry factor) 5) ιαχωριστική ικανότητα (Resolution) α) ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΉΣ ΚΑΤΑΚΡΑΤΗΣΗΣ (CAPACITY FACTOR) Ο συντελεστής κατακράτησης 35 k είναι πιο χρήσιµο µέτρο της κατακράτησης από το χρόνο κατακράτησης t R, επειδή ο χρόνος κατακράτησης µεταβάλλεται όταν το µήκος της στήλης ή η ταχύτητα ροής αλλάζουν. Αντίθετα το k δεν µεταβάλλεται. Ο υπολογισµός του k απαιτεί τη µέτρηση του νεκρού χρόνου της στήλης t 0, από το χρωµατογράφηµα. Ο νεκρός χρόνος της στήλης t 0, είναι ο χρόνος που απαιτείται για να περάσει από τη στήλη ένα µόριο, που θεωρητικά δεν κατακρατείται, όπως αυτό το µόριο του διαλύτη. Ο νεκρός χρόνος µετράται, από τη στιγµή της εφαρµογής του δείγµατος στη στήλη, ως την εµφάνιση της πρώτης διαταραχής της βασικής γραµµής. Σε περιπτώσεις, όπου το t 0 δεν είναι εµφανές στο χρωµατογράφηµα,

29 µπορεί να καταστεί απαραίτητη η έγχυση µιας ουσίας, που είναι γνωστό ότι δεν κατακρατείται, όπως η ουρακίλη, για την υγρή χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης. Ο παράγοντας k δίνεται από τον τύπο: k = t R- t 0 / t 0 Ο συντελεστής κατακράτησης µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τη σύγκριση της κατακράτησης σε διαχωρισµούς, κατά τους οποίους το µήκος της στήλης ή ο ρυθµός ροής αλλάζουν. Ο συντελεστής κατακράτησης µπορεί να µεταβάλλεται και να βρίσκεται υπό έλεγχο, αλλάζοντας την ισχύ της κινητής φάσης. Ένας καλός εµπειρικός κανόνας για διαχωρισµούς αντιστρόφου φάσης είναι, ότι µια µεταβολή κατά 10% στην ισχύ της κινητής φάσης θα διπλασιάσει ή θα τριπλασιάσει την τιµή του k. Αλλάζοντας το k µε ρύθµιση της ισχύος της κινητής φάσης, αλλάζει το t R για όλες τις κορυφές σε ένα χρωµατογράφηµα. Μεγαλύτερα k δίνουν ευρύτερες και χαµηλότερες κορυφές, ενώ k, µε τιµή µεγαλύτερη του 1 και µικρότερη του 20, είναι επιθυµητά για τους περισσότερους διαχωρισµούς φαρµάκων. β) ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Ο παράγοντας εκλεκτικότητας 36 (selectivity factor) α, είναι ο λόγος των συντελεστών κατακράτησης δύο κορυφών, δηλαδή α = k 2 /k 1 όπου: k 2 και k 1 είναι οι συντελεστές κατακράτησης των κορυφών που µας ενδιαφέρουν. Με βάση τον ορισµό αυτό ο α είναι πάντοτε µεγαλύτερος από τη µονάδα. Όπως το k, έτσι και το α είναι συνάρτηση του είδους της κινητής και της στατικής φάσης. Μπορεί να µεταβάλλεται αλλάζοντας τον τύπο της στήλης, για παράδειγµα από C 18 σε φαινυλαιθυλο-στατική φάση. Η αλλαγή σύστασης της κινητής φάσης θα επηρεάσει επίσης το α. Για παράδειγµα, η αντικατάσταση τετραϋδροφουρανίου αντί του ακετονιτριλίου. Αυτές οι αλλαγές µπορούν συχνά να βοηθήσουν στο διαχωρισµό δύο φαρµάκων που χαρακτηρίζονται από σχεδόν όµοιους χρόνους κατακράτησης. γ) ΑΡΙΘΜΟΣ ΘΕΩΡΗΤΙΚΩΝ ΠΛΑΚΩΝ Ο αριθµός των θεωρητικών πλακών Ν, είναι µέτρο του εύρους των κορυφών 37. Το Ν, συνήθως υπολογίζεται για να επιβεβαιώσει αν µια στήλη πληρεί τις προδιαγραφές του κατασκευαστή ή να επιβεβαιώσει την κατάσταση της στήλης, µετά από επανειληµµένες αναλύσεις. Η µέτρηση του Ν πιο εύκολα γίνεται µε την εξίσωση: Ν = 5,54 (t R /W 1/2 ) 2 όπου: t R είναι ο χρόνος κατακράτησης και W 1/2 το εύρος της κορυφής στο ήµισυ του ύψους της. Στήλες µε µεγάλες τιµές Ν δίνουν στενότερες κορυφές και γενικά καλύτερους διαχωρισµούς. Η

30 µέσο εύρος των κορυφών: 39 R s = [ ( t R ) B - ( t R ) A ] / ( 1 / 2 ) ( W Α + W Β ) διάµετρος των τεµαχιδίων της στατικής φάσης είναι αντιστρόφως ανάλογη του Ν. Έτσι αλλάζοντας από µία στήλη πληρωθείσα µε τεµαχίδια 10µm, σε µία µε 5 µm, διπλασιάζεται η τιµή του Ν (όταν οι άλλοι παράγοντες δεν µεταβάλλονται). Αύξηση του µήκους της στήλης αυξάνει την τιµή του Ν ανάλογα µε το µήκος. Επίσης αυξάνει η πίεση κατά µήκος της στήλης. Αύξηση του ιξώδους της κινητής φάσης, αυξάνει επίσης την πίεση του συστήµατος και ελαττώνει το συντελεστή διάχυσης για τα συστατικά του δείγµατος. Ακόµη προκαλεί µείωση του αριθµού πλακών της στήλης. δ) ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΑΣΥΜΜΕΤΡΙΑΣ Ο παράγοντας ασυµµετρίας Α s είναι το ποσοτικό µέτρο του σχηµατισµού "ουράς" των χρωµατογραφικών κορυφών 38. Για τον υπολογισµό του Α s χαράσσεται µία κάθετος µεταξύ του µεγίστου της κορυφής ως τη βασική γραµµή. Στο 10% του ύψους της κορυφής, το εύρος από αυτή τη γραµµή ως το εµπρόσθιο και ως το πίσω µέρος της κορυφής µετρούνται. ιαιρώντας τα µήκη AC και CB µεταξύ τους, καθορίζεται το Α s της κορυφής. Γενικά, οι τιµές του Α s µεταξύ των τιµών 0,9 και 1,2 είναι οι βέλτιστες για την καλύτερη απόδοση της στήλης. Παρακάτω δίνονται η σχηµατική παράσταση και ο τύπος του παράγοντα ασυµµετρίας: ε) ΙΑΧΩΡΙΣΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ R s (Resolution) Είναι ένα ποσοτικό µέτρο του σχετικού διαχωρισµού δύο διαδοχικών χρωµατογραφικών κορυφών και ισούται µε την απόσταση µεταξύ των µέσων των δύο κορυφών, διαιρεµένη µε το

31 Σχήµα 5: ιαχωρισµοί κορυφών µε τρεις διαφορετικές διαχωριστικές ικανότητες. Οι τιµές (t R ) A και (t R ) B αναφέρονται στο χρόνο κατακράτησης των ταινιών του σχήµατος, ενώ W A και W B είναι οι τιµές του εύρους των κορυφών. Όταν το R s είναι ίσο µε 1,5 οι δύο ταινίες διαχωρίζονται ικανοποιητικά (αντιστοιχεί ουσιαστικά σε πλήρη διαχωρισµό των δύο συστατικών), αντίθετα µε µια διαχωριστική ικανότητα 0,75 που αντιστοιχεί σε ατελή διαχωρισµό. Μεγαλύτερες τιµές R s αντικατοπτρίζουν καλύτερο διαχωρισµό, ενώ µικρότερες τιµές δείχνουν φτωχό διαχωρισµό. Το κρίσιµο σηµείο ενός διαχωρισµού υγρής χρωµατογραφίας είναι, εάν οι κορυφές που µας ενδιαφέρουν διαχωρίζονται ικανοποιητικά από άλλες ή όχι. Παρόλο που εµπειρικά και µόνο στο χρωµατογράφηµα, συνήθως φαίνεται αν ο διαχωρισµός είναι επαρκής, είναι γενικά επιθυµητό, το κοίλο τµήµα µεταξύ των ταινιών να επιστρέφει στη βασική γραµµή.

32 Η κατανόηση του ρόλου των k, α και Ν στη διαχωριστική ικανότητα της στήλης είναι αναγκαία για τη συστηµατική βελτίωση φτωχών διαχωρισµών χρωµατογραφικών κορυφών. Γι αυτό, η χρήση της θεµελιώδους εξίσωσης στην υγρή χρωµατογραφία που µας επιτρέπει να ελέγξουµε τη διαχωριστική ικανότητα αλλάζοντας τα α, Ν ή k, θα µπορούσε να εκφραστεί ως εξής: R 1 k s= ( a 1) N 4 (1+ k ) Οι τρεις όροι α, Ν, k, είναι σχεδόν ανεξάρτητοι και µπορούν να µεταβληθούν χωριστά στον έλεγχο ενός διαχωρισµού. Η εκλεκτικότητα ενός διαχωρισµού, εκφρασµένη ως παράγοντας διαχωρισµού α (όρος α-1 της εξίσωσης), µεταβάλλεται αλλάζοντας τη σύσταση της κινητής και στατικής φάσης. Η ικανότητα διαχωρισµού, όπως εκφράζεται από τον αριθµό των θεωρητικών πλακών (Ν), µεταβάλλεται αλλάζοντας το µήκος της στήλης ή την ταχύτητα ροής του διαλύτη ή αλλάζοντας το υλικό πληρώσεως της στήλης. Ο όρος 1+ k που περιλαµβάνει τον παράγοντα χωρητικότητας k, µεταβάλλεται αλλάζοντας την ισχύ του διαλύτη, δηλαδή την ικανότητα της κινητής φάσης να δίνει µεγάλες ή µικρές τιµές k για ένα δεδοµένο µίγµα δραστικών ουσιών. Σχήµα 6: Επίδραση των παραµέτρων Ν, k και α στο διαχωρισµό δύο συστατικών δείγµατος.

33 Αλλαγές στις τιµές των παραµέτρων Ν, k και α, µπορούν να βελτιώσουν την τιµή R s. Για παράδειγµα αύξηση του αριθµού των πλακών Ν, καταλήγει σε λήψη στενότερων χρωµατογραφικών κορυφών, αύξηση του ύψους των ταινιών και του R s. Ωστόσο απαιτείται τετραπλασιασµός της τιµής του Ν για να διπλασιαστεί το R s, γιατί εξαρτάται από την τετραγωνική ρίζα του Ν. Μείωση της ταχύτητας ροής θα προκαλέσει αύξηση της τιµής του Ν µιας στήλης µε τεµαχίδια 10 µ ή µεγαλύτερα, αλλά στην πράξη συνήθως, δεν επιφέρει αισθητά αποτελέσµατα στις στήλες που χρησιµοποιούνται σήµερα, µε µέγεθος τεµαχιδίων 3 και 5 µ. Η χρήση διπλών στηλών ή η αντικατάσταση µιας ήδη µεταχειρισµένης στήλης, από µια καινούργια θα επιφέρει επαρκή αύξηση στο Ν και συνεπώς στο R s. Γενικά, η αύξηση της τιµής του Ν δεν είναι η καλύτερη προσέγγιση στο πρόβληµα της αύξησης του R s, γιατί µπορεί να αυξήσει το χρόνο διαχωρισµού των υπό ανάλυση φαρµάκων. Αύξηση του παράγοντα διαχωρισµού α, οδηγεί σε σηµαντική αύξηση του R s. Αλλάζοντας τον αρχικό διαλύτη στην κινητή φάση µεταβάλλουµε εύκολα το α. Για παράδειγµα, αντικατάσταση µεθανόλης από ακετονιτρίλιο στην αντιστρόφου φάσεως ΥΧΥΑ ή του µεθυλοχλωριδίου από t-βουτυλοµεθυλαιθέρα στην ΥΧΥΑ κανονικής φάσεως, συνήθως αλλάζει τις τιµές του α 40. Η βέλτιστη περιοχή για το k είναι 1< k <20. Μεγαλύτερες τιµές από το 20 πολύ λίγο µεταβάλλουν το R s. Στην πραγµατικότητα αυξάνουν το χρόνο ανάλυσης, το εύρος της ταινίας, ενώ µειώνουν το ύψος της κορυφής. Όταν το R s πρέπει να αυξηθεί και το k για τον αρχικό διαχωρισµό είναι µικρό, τότε πρέπει να αυξηθεί σ αυτή τη βέλτιστη περιοχή. Αυτό γιατί, η ρύθµιση του k είναι ο ευκολότερος και ο πιο εύχρηστος τρόπος για την αύξηση της τιµής του R s εάν αυτή είναι ανεπαρκής. Αλλά αν το k είναι ήδη εντός της βέλτιστης περιοχής και το R s εξακολουθεί να είναι οριακό, η καλύτερη λύση είναι συνήθως αύξηση του Ν, όχι όµως µε αλλαγή του υλικού πληρώσεως της στήλης. Οι τιµές του k ελέγχονται µέσω της ισχύος του διαλύτη κατά τέτοιο τρόπο, ώστε αλλαγή κατά 10% στην ισχύ του διαλύτη διπλασιάζει ή τριπλασιάζει το k. Όταν η τιµή του k πρέπει να αυξηθεί, επιλέγεται ασθενέστερος διαλύτης ως προς την εκλουστική ισχύ, ενώ όταν το k πρέπει να µειωθεί χρησιµοποιείται ισχυρότερος. Όταν η τιµή του R s είναι µεγαλύτερη του αναγκαίου, συχνά µπορεί να µειωθεί για να ελαττωθεί ο χρόνος αναλύσεως. Ο συνήθης τρόπος για τη µείωση του R s είναι η µείωση του Ν, ελαττώνοντας το µήκος της στήλης. Σε µια τέτοια περίπτωση, αύξηση της ροής του διαλύτη θα µειώσει το χρόνο ανάλυσης, όµως σε περίπτωση που χρησιµοποιούνται στήλες µεγέθους τεµαχιδίων 5 µ ή και µικρότερου, η τιµή του R s ελάχιστα µεταβάλλεται.

34 1.7 ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ Η επιλογή των κατάλληλων χρωµατογραφικών συνθηκών κάτω από τις οποίες πραγµατοποιείται συγκεκριµένος διαχωρισµός σε ΥΧΥΑ, µπορεί να αυξήσει σηµαντικά την αξιοπιστία των αποτελεσµάτων. Συνεπώς, οι ιδανικές συνθήκες είναι δυνατόν να καθοριστούν, σύµφωνα µε τις ακόλουθες παραµέτρους: 41 I. Ευαισθησία (sensitivity) : ίνεται από την κλίση της καµπύλης αναφοράς και δηλώνει το ρυθµό µεταβολής του µεγέθους της ένδειξης προς τη µεταβολή της ποσότητας της ουσίας. II. Όριο ανίχνευσης (detection limit): Αναφέρεται στην ελάχιστη ποσότητα της ουσίας, που µπορεί να ανιχνευτεί αξιόπιστα σε ένα δείγµα µε την κατάλληλη µέθοδο. Σχεδόν σε κάθε αναλυτική µέθοδο µια απόκριση ή σήµα µπορεί να µετρηθεί, ακόµα και όταν απουσιάζει το υπό ανάλυση συστατικό. Αυτή η απόκριση ονοµάζεται τυφλό ή σήµα υποβάθρου ή θόρυβος (blanc, background, noise). Ως όριο ανίχνευσης θεωρείται εκείνη η συγκέντρωση ή ποσότητα, για την οποία η απόκριση της µεθόδου µπορεί να διακριθεί από το τυφλό ή το θόρυβο. Έτσι µπορούµε να ορίσουµε, ότι το όριο ανίχνευσης ενός συστατικού µε µία µέθοδο, είναι εκείνη η συγκέντρωση ή ποσότητα του συστατικού, για την οποία η απόκριση της µεθόδου διαφέρει από την απόκριση του τυφλού κατά το τριπλάσιο της τυπικής απόκλισης του µέσου όρου του τυφλού. III. Εκλεκτικότητα (selectivity): Είναι η ικανότητα αναγνώρισης και προσδιορισµού µιας ή περισσοτέρων σχετικών ουσιών σε άγνωστο δείγµα. Μεταβάλλεται µε την αλλαγή της σύστασης της κινητής ή της στατικής φάσης. Χαρακτηρίζεται από την τιµή της σχετικής κατακράτησης "α". IV. Εξειδίκευση (specificity): Σχετίζεται µε τον αριθµό των ουσιών που µπορούν να ανιχνευθούν και να προσδιοριστούν µε την ίδια µέθοδο. V. Αξιοπιστία της µεθόδου (reliability): Η ακρίβεια και η επαναληψιµότητα αποτελούν το µέτρο της αξιοπιστίας ενός αναλυτικού αποτελέσµατος ή γενικότερα µια αναλυτικής µεθόδου. Το πρώτο από τα παραπάνω µεγέθη, καθορίζει το σφάλµα ενός προσδιορισµού και αποτελεί µέτρο κυρίως των συστηµατικών σφαλµάτων, ενώ το δεύτερο κυρίως των τυχαίων. Η επαναληψιµότητα (reproducibility) µιας σειράς µετρήσεων χαρακτηρίζει τη συµφωνία των αποτελεσµάτων µεταξύ τους. Ως µέτρο εκτίµησης της επαναληψιµότητας µιας µεθόδου θεωρούνται, συνήθως η τυπική απόκλιση και η επί τοις εκατό (%) σχετική τυπική

35 απόκλιση, που συµβολίζονται µε την τιµή SD και %RSD (γνωστή και ως συντελεστής µεταβλητότητας, coefficient of variation). τη σχέση: Η τυπική απόκλιση S (Standard Deviation) για µικρό αριθµό µετρήσεων, ορίζεται από S = Σ( x1 x) N 1 όπου: Ν είναι ο αριθµός των επαναλαµβανόµενων µετρήσεων. Η τυπική απόκλιση S στην πραγµατικότητα είναι η τυπική απόκλιση µιας µεµονωµένης µετρήσεως. Επειδή αναλυτικό ενδιαφέρον παρουσιάζει η µέση τιµή (x) των µετρήσεων, είναι επιθυµητή η συσχέτιση της τυπικής απόκλισης µε τη µέση τιµή. Αυτή εκφράζεται µε την % σχετική τυπική απόκλιση (%RSD) ή συντελεστή µεταβλητότητας (CV) που δίνεται από τη σχέση: RSD% = S/x. 100 Έχει διαπιστωθεί ότι η βέλτιστη επαναληψιµότητα επιτυγχάνεται ως επί το πλείστον, όταν οι µετρήσεις ολοκληρώνονται σε µία µόνο µέρα (within-day precision), ενώ η επαναληψιµότητα των µετρήσεων που διενεργούνται σε διαφορετικές µέρες (among-days precision) δίνει λιγότερο ικανοποιητικά αποτελέσµατα. Τα σφάλµατα αυτά οφείλονται σε διάφορους παράγοντες, όπως σε παλαίωση των αντιδραστηρίων και των προτύπων διαλυµάτων, σε αστάθεια των αναλυτικών οργάνων και έχουν καθοριστική σηµασία, όταν η µέθοδος προορίζεται για την εκτέλεση µεγάλου αριθµού αναλύσεων σε τακτά χρονικά διαστήµατα. Η ακρίβεια (accuracy) ενός αναλυτικού αποτελέσµατος, χαρακτηρίζει την προσέγγιση της πειραµατικής τιµής προς την "αληθινή ή παραδεκτή" τιµή µ και συνήθως εκφράζεται µε το απόλυτο σφάλµα Ε, δηλαδή τη διαφορά µεταξύ της αντιπροσωπευτικής πειραµατικής τιµής x (µεµονωµένης µέτρησης x i, µέσης τιµής x ή της διάµεσης Μ) και της παραδεκτής τιµής µ: Ε = x µ Τα καθορισµένα σφάλµατα µιας µεθόδου είναι µονοκατευθυνόµενα, δηλαδή επιδρούν στο αποτέλεσµα µιας µέτρησης πάντοτε µε την ίδια φορά (θετικά ή αρνητικά), όσες φορές και αν επαναληφθεί η µέτρηση και παραµένουν σταθερά για µια σειρά µετρήσεων που διεξάγονται κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Τα καθορισµένα σφάλµατα µπορεί να είναι είτε σταθερά, όταν το απόλυτο µέγεθος του σφάλµατος Ε είναι το ίδιο σε όλα τα δείγµατα, ανεξάρτητα από την ποσότητα του προσδιοριζόµενου συστατικού, είτε αναλογικά, όταν το απόλυτο σφάλµα είναι ανάλογο προς την ποσότητα του συστατικού, ενώ το σχετικό σφάλµα (Ε/µ) είναι σταθερό. 2

36 Ο καθορισµός του είδους και του µεγέθους ενός πιθανού καθορισµένου σφάλµατος µιας αναλυτικής µεθόδου, επιτυγχάνεται µε τον προσδιορισµό γνωστών προτύπων διαλυµάτων µεταβαλλόµενης συγκέντρωσης της υπό ανάλυση ουσίας (µ i ). Η γραφική παράσταση (καµπύλη αναφοράς) των πειραµατικών τιµών x i ως προς µ i ή ο υπολογισµός της εξίσωσης x i = α µ i + β µε τη µέθοδο των ελάχιστων τετραγώνων, καθορίζει το είδος και το µέγεθος του καθορισµένου σφάλµατος. Ο όρος β της σχέσεως, ισούται µε το σταθερό καθορισµένο σφάλµα, ενώ το µέγεθος (α-1) х 100 ισούται µε το επί % σχετικό αναλογικό σφάλµα. Όσο µικρότερο είναι το σφάλµα, τόσο µεγαλύτερη είναι η ακρίβεια της µεθόδου. Σε µια ποσοτική ανάλυση, η "αληθινή" τιµή της µετρούµενης ποσότητας παραµένει στην πραγµατικότητα άγνωστη και δεν υπάρχει τρόπος να προσδιορίσουµε την ακρίβεια του αποτελέσµατος της ανάλυσης. Είναι όµως δυνατός ο έλεγχος της ακρίβειας της µεθόδου, µε την ανάλυση γνωστού προτύπου δείγµατος, παρόµοιας κατά το δυνατόν συστάσεως, µε το άγνωστο δείγµα. Ο έλεγχος της ακρίβειας της µεθόδου επιβάλλεται, τόσο κατά το στάδιο της ανάπτυξής της, όσο και περιοδικά κατά την εφαρµογή της. 1.8 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟ ΟΣΗΣ-ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ Ιδιαίτερα στην ΥΧΥΑ-αντίστροφης φάσης 42,43, η κινητή φάση είναι συνήθως µίγµα διαφόρων αναλογιών, δύο ή περισσοτέρων πολικών οργανικών διαλυτών και νερού ή ρυθµιστικού διαλύµατος στην κατάλληλη τιµή ph. Στην ΥΧΥΑ-κανονικής φάσης, η κινητή φάση είναι συνήθως µίγµα διαφόρων αναλογιών κατ όγκο δύο ή περισσοτέρων µη πολικών διαλυτών. Ένας οργανικός διαλύτης για να χρησιµοποιηθεί στην ΥΧΥΑ πρέπει να είναι υψηλής καθαρότητας, να µην καταστρέφει το δείγµα, να µην αποσυντίθεται εύκολα, να µην είναι πτητικός, να έχει χαµηλό ιξώδες, χαµηλή πίεση επαναφοράς και µεγάλη ικανότητα διαχωρισµού. Επίσης πρέπει να έχει χαµηλή τοξικότητα, να µην απορροφά στο UV και να είναι σχετικά φθηνός. Στο Σχήµα 7 φαίνεται η γενική προσέγγιση επιλογής µιας κινητής φάσης στην ΥΧΥΑ. Το τρίγωνο αναπαριστά όλους τους πιθανούς διαλύτες που είναι κατάλληλοι για να χρησιµοποιηθούν στην ΥΧΥΑ. Αρχικά, απορρίπτονται όλοι εκείνοι των οποίων οι φυσικές ιδιότητες (σηµείο βρασµού, ιξώδες, απορρόφηση στο UV, κτλ.) τους καθιστούν ακατάλληλους για άµεση εφαρµογή στην ΥΧΥΑ και οι οποίοι απεικονίζονται µε τις παράλληλες γραµµές στη βάση του τριγώνου.

37 Κατά συνέπεια αποκλείεται ένας µεγάλος αριθµός πιθανών διαλυτών για χρήση. Στη συνέχεια, επιλέγεται ένας διαλύτης ή µίγµα διαλυτών µε τη σωστή ιονική ισχύ, έτσι ώστε οι τιµές k του δείγµατος να βρίσκονται µεταξύ 2 k 5 για ένα δείγµα δύο ουσιών, ή µεταξύ 0,5 k 20 για πιο πολύπλοκα δείγµατα. Αυτό πάλι σηµαίνει ότι αποκλείονται αρκετοί διαλύτες που στο Σχήµα 7 απεικονίζονται µε τις διασταυρούµενες γραµµές, όµως και πάλι παραµένουν αρκετοί διαλύτες διαθέσιµοι µε αποδεκτή τιµή ιονικής ισχύος. Τελικά, µπορεί να προκύψουν επικαλυπτόµενες κορυφές σε ένα χρωµατογράφηµα, οπότε καθίσταται απαραίτητο να βελτιωθεί η εκλεκτικότητα ενός διαλύτη µε τη βοήθεια των τιµών α. Σε αυτή την περίπτωση επιλέγεται εκείνος ο διαλύτης, ο οποίος δίνει τις κατάλληλες τιµές α από αυτούς που αποµένουν στο Σχήµα 7 µε τη σωστή ιονική ισχύ. Έτσι καταλήγουµε σε µία κινητή φάση που χαρακτηρίζεται από όλες τις αποδεκτές παραµέτρους για τη συγκεκριµένη µελέτη, όπως φαίνεται στην καθαρή περιοχή της κορυφής του τριγώνου. Σχήµα 7: Γενική προσέγγιση επιλογής µιας κινητής φάσης στην ΥΧΥΑ. α) ΦΥΣΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΙΑΛΥΤΩΝ Τις περισσότερες φορές για τις µετρήσεις των πειραµάτων, µπορεί να χρησιµοποιηθεί ένας φωτοµετρικός ανιχνευτής υπεριώδους και είναι σηµαντικό να γνωρίζουµε τη χαµηλότερη τιµή µήκους κύµατος στο οποίο απορροφά υπεριώδη ακτινοβολία ο διαλύτης 44,45. Ασαφείς απορροφήσεις οι οποίες οφείλονται σε ίχνη των διαφόρων προσµίξεων που µπορεί να συνυπάρχουν µε το διαλύτη, είναι δυνατό να επιφέρουν µεταβολές στην απορρόφηση από 50 έως και 100 nm.

38 Για παράδειγµα, οι κορεσµένοι υδρογονάνθρακες, όπως το n-εξάνιο, απορροφούν κάτω από τα 190 nm, αλλά ακόµη και οι υψηλής καθαρότητας διαλύτες περιέχουν συχνά ολεφίνες µε παρόµοια σηµεία βρασµού (π.χ. το 1-εξάνιο). Αυτή η επιβάρυνση µε παραπροϊόντα, είναι ικανή να θολώσει το διαλύτη, έτσι ώστε να απορροφά πλέον κάτω από τα 260 nm. Πολλοί διαλύτες επίσης, καθίστανται ανενεργοί λόγω του ότι παρουσιάζουν την τάση να αντιδρούν µε το δείγµα, ή να πολυµερίζονται µε την παρουσία της στατικής φάσης. Όταν πάλι το δείγµα µετά την έξοδό του από τη στήλη επανακτάται, ώστε να χρησιµοποιηθεί για περαιτέρω αναλύσεις, διαλύτες µε υψηλά σηµεία βρασµού πρέπει να αποφεύγονται-ακόµη και αυτοί που είναι σχετικά σταθεροί. Επιπρόσθετα, µερικοί διαλύτες πρέπει να χρησιµοποιούνται όταν είναι εντός καθορισµένων χρονικών ορίων ή µόλις έχουν υποστεί την κατεργασία καθαρότητάς τους (π.χ. οι αιθέρες, οι οποίοι κατά την παραµονή τους οξειδώνονται σε υπεροξείδια). Άλλες δύο ακόµη ιδιότητες για τους διαλύτες είναι: το σηµείο βρασµού και το ιξώδες. ιαλύτες µε χαµηλά σηµεία βρασµού έχουν γενικότερα και χαµηλό ιξώδες. Συνήθως, είναι προτιµότερο το σηµείο βρασµού του διαλύτη να βρίσκεται ο C πάνω από αυτό του δείγµατος και το ιξώδες του να µην υπερβαίνει τα 0,5 cp στη θερµοκρασία διαχωρισµού. ιαλύτες µε χαµηλά σηµεία βρασµού είναι δύσκολο να χρησιµοποιηθούν, αφού τείνουν να σχηµατίζουν φυσαλίδες, οι οποίες επηρεάζουν την ακρίβεια της αντλίας και σε ακραίες περιπτώσεις οδηγούν στην απορρύθµιση των αρχικών επιλογών. Συνάλληλα, µίγµατα τέτοιων διαλυτών εύκολα αλλάζουν τη χηµική τους συµπεριφορά εξαιτίας της εξαέρωσης που λαµβάνει χώρα. ιαλύτες µε υψηλά σηµεία βρασµού είναι ιδιαιτέρως πηκτοί, µε συνέπεια να επηρεάζουν το διαχωρισµό των δραστικών ουσιών. β) ΑΣΦΑΛΕΙΑ ιαλύτες µε επιβεβαιωµένη την αναφλεξιµότητά τους 46, όπως ο διθειάνθρακας (CS 2 ), πρέπει να αποφεύγονται εάν είναι δυνατόν. υστυχώς, αυτοί οι διαλύτες προτιµώνται διότι έχουν χαµηλό ιξώδες και χαµηλό σηµείο βρασµού. Γενικά, είναι δύσκολο να αποφευχθεί η χρήση εύφλεκτων διαλυτών στην ΥΧΥΑ, και δικαιολογηµένα λαµβάνονται κάποιες προφυλάξεις, ώστε να µειωθεί ο κίνδυνος από τη χρήση τους. Έτσι, είναι απαραίτητο να υπάρχουν καλά αεριζόµενοι χώροι, να µην βρίσκονται σε κοντινά σηµεία συσκευές ανάφλεξης κάθε τύπου, όπου µπορεί να συγκεντρωθούν ατµοί εύφλεκτων διαλυτών. Προφανώς, τοξικοί διαλύτες πρέπει να αποφεύγονται. Όπως και στην περίπτωση των εύφλεκτων διαλυτών, το συνολικό ρίσκο από τους τοξικούς διαλύτες µπορεί να µειωθεί σηµαντικά µε το σωστό αερισµό των χώρων.

39 1.9 ΙΑΜΟΡΙΑΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΜΟΡΙΩΝ ΤΟΥ ΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ Μία κινητή φάση η οποία δίνει µικρές τιµές k για ένα συγκεκριµένο δείγµα, είναι ένας διαλύτης που αντιδρά ισχυρά µε τα µόρια της δραστικής ουσίας. Σαν αποτέλεσµα, ένας τέτοιος διαλύτης θα έχει εκλεκτική διαλυτοποίηση για τα µόρια της δραστικής ουσίας. Υπάρχουν τέσσερα (4) είδη αλληλεπιδράσεων στην ΥΧΥΑ µεταξύ των µορίων του διαλύτη και της 47, 48, 49 διαλυµένης ουσίας: ιασπορά ή έλξη, Σχηµατισµός διπόλου, εσµοί υδρογόνου και ιηλεκτρική σταθερά. Κάθε µία από αυτές τις αλληλεπιδράσεις απεικονίζεται σχηµατικά στο Σχήµα 8 Σχήµα 8: ιαµοριακές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των µορίων του δείγµατος και της κινητής φάσης. Επίδραση διασποράς ή έλξης υπάρχει µεταξύ κάθε ζεύγους παρακείµενων µορίων. Στο Σχήµα 8 ένα απλό µόριο Χ του δείγµατος και ένα µόριο S ενός διαλύτη, απεικονίζονται µε τα ηλεκτρόνια (e - ) τα οποία τα περιβάλλουν. Η επίδραση διασποράς ξεκινά γιατί αυτά τα e - βρίσκονται σε τυχαία κίνηση και κάθε δεδοµένη χρονική στιγµή µπορεί να θεωρηθεί µια οποιαδήποτε στερεοχηµική δοµή. Αυτή είναι η υπόθεση για το µόριο Χ στο παράδειγµα του Σχήµατος 8 και σαν αποτέλεσµα το Χ για τη δεδοµένη αυτή στιγµή κατέχει µία προσωρινή διπολική δοµή.

40 Αυτή η διπολική δοµή πολώνει τα e - του παρακείµενου µορίου S. Η προσωρινή περίσσεια e - στην πλευρά του Χ, που είναι πιο κοντά στο S, διεγείρει τα e - στο S, όπως δείχνεται από τα µικρά βέλη για τα e - του S στο Σχήµα 8. Το προκύπτον τελικό δίπολο που δηµιουργήθηκε στο S από το δίπολο στο Χ, κατόπιν επιδρά στην ηλεκτροστατική έλξη µεταξύ του Χ διαλύτη και του S δείγµατος. α) ΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΙΠΟΛΟΥ Όταν τα µόρια του διαλύτη και του δείγµατος έχουν τη µορφή διπόλων για µεγάλο χρονικό διάστηµα, τότε λαµβάνουν χώρα ισχυρές επιδράσεις µεταξύ των δύο διπόλων σε µία γραµµική διάταξη. Αυτό φαίνεται στο Σχήµα 8 για επίδραση µε διαµόρφωση διπόλου µεταξύ δύο µορίων ακετονιτριλίου. Αυτές οι επιδράσεις διπόλου, συνήθως συµβαίνουν µεταξύ διαφορετικών χαρακτηριστικών χηµικών οµάδων των δύο µορίων, έτσι ώστε τα µόρια των διαλυτών και των δειγµάτων που περιέχουν χαρακτηριστικές πολικές οµάδες, να αλληλεπιδρούν εκλεκτικά και η αλληλεπίδραση αυτή, είναι τόσο ισχυρότερη, όσο µεγαλύτερα είναι τα χρονικά διαστήµατα διπόλου. Μερικά παραδείγµατα διπόλου δίνονται στον Πίνακα που ακολουθεί: Τιµές ιπολικής Ροπής συγκεκριµένων οµάδων (in debyes) Amine, -N= (0,8-1,4) Halogen, -F, -Cl, (1,6-1,8) -Br, -I Ether, -O- (1,2) Ester, -COO- (1,8) Sulfide, -S- (1,4) Aldehyde, -CHO (2,5) Thiol, -SH (1,4) Ketone, -CO- (2,7) Carboxylic acid, -COOH (1,7) Nitro, -NO 2 (3,2) Hydroxy, -OH (1,7) Nitrile, -C N (3,5) Sulfoxide, -SO- (3,5) β) ΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ ΕΣΜΟΥ Υ ΡΟΓΟΝΟΥ Οι επιδράσεις δεσµών υδρογόνου µεταξύ ενός δότη και ενός δέκτη πρωτονίων είναι γνωστές στους επιστήµονες και απεικονίζονται στο Σχήµα 8 µε δότη το χλωροφόρµιο και δέκτη την τριαιθυλαµίνη. Οι δεσµοί υδρογόνου γίνονται ισχυρότεροι όταν ο δότης είναι ικανός να δώσει ένα πρωτόνιο και ο δέκτης είναι ικανός να το δεχθεί.

41 Για αυτό το λόγο, τα οξέα είναι ισχυροί δότες και οι βάσεις ισχυροί δέκτες πρωτονίων. Οι αλκοόλες, τα καρβοξυλικά οξέα και οι φαινόλες, είναι όλα ισχυροί δότες, όπως το χλωροφόρµιο. Τα αµίδια µε ιµινικές οµάδες N-H βρίσκονται στη µέση της κλίµακας ως δότες πρωτονίων, ενώ οι πρωτοταγείς και οι δευτεροταγείς αµίνες είναι "αδύναµοι" δότες. Άλλες ενώσεις, όπως αυτές που περιέχουν νιτροοµάδες, τα σουλφοξείδια και οι σουλφόνες, οι εστέρες και άλλες, µπορούν να αγνοηθούν ως πιθανοί δότες. Οι δέκτες πρωτονίων µε τη σειρά τους, µπορούν να ταξινοµηθούν σύµφωνα µε τη βασικότητά τους, µέσα από πειραµατικές µετρήσεις. Μία τέτοια µελέτη δίνεται στον Πίνακα που ακολουθεί: Οµάδες ραστικών Ουσιών έκτες Πρωτονίων Αρωµατικοί υδρογονάνθρακες 0,0-0,3 Αιθέρες 0,7-1,2 Εστέρες 0,8-1,3 Αµίνες 1,5-2,1 Αµίδια 2,1-2,4 Σουλφοξείδια 2,2-2,6 Αλκοόλες Μεγάλη τιµή γ) ΗΛΕΚΤΡΟΣΤΑΤΙΚΕΣ ΕΠΙ ΡΑΣΕΙΣ Οι ηλεκτροστατικές επιδράσεις αναφέρονται κυρίως στις αλληλεπιδράσεις των ιόντων του δείγµατος µε διαλύτες που παρουσιάζουν υψηλές τιµές της διηλεκτρικής σταθεράς (π.χ. νερό, αλκοόλες κτλ). Όπως φαίνεται και στο Σχήµα 8 ένα φορτισµένο ιόν του δείγµατος (R+) πολώνει µόρια του διαλύτη, επιδρώντας στην ηλεκτροστατική έλξη του R+ και των µορίων του διαλύτη. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις είναι γνωστό, ότι είναι αρκετά ισχυρές και προτιµούν την εκλεκτική διαλυτοποίηση ιονικών ή ιονιζόµενων µορίων του δείγµατος σε πολικές φάσεις, όπως είναι το νερό, η µεθανόλη και άλλα ΙΟΝΙΚΗ ΙΣΧΥΣ ΚΑΙ ΠΟΛΙΚΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΙΑΛΥΤΗ ΤΗΣ ΚΙΝΗΤΗΣ ΦΑΣΗΣ Αναφέρθηκε και παραπάνω, ότι η ολική αλληλεπίδραση των µορίων του διαλύτη της κινητής φάσης µε αυτά των µορίων του δείγµατος είναι αποτέλεσµα τεσσάρων παραµέτρων. Όσο µεγαλύτερη είναι η επίδραση της διασποράς, του διπόλου, του δεσµού υδρογόνου και της

42 διηλεκτρικής επίδρασης σε συνδυασµό, τόσο πιο ισχυρή είναι η έλξη µεταξύ των µορίων του διαλύτη και του δείγµατος 50,51. Η ικανότητα του διαλύτη και του δείγµατος να αλληλεπιδρούν µεταξύ τους µε τους τέσσερις αυτούς τρόπους, αναφέρεται ως πολικότητα (polarity) της δραστικής ουσίας. Έτσι, οι πολικοί διαλύτες προτιµούν να έλκουν και να διαλυτοποιούν πολικές δραστικές ουσίες. Κατά τον ίδιο τρόπο, η ιονική ισχύς ενός διαλύτη είναι άµεσα συνδεδεµένη µε την πολικότητά του. Συνεπώς, η ιονική ισχύς ενός διαλύτη στην ΥΧΥΑ-κανονικής φάσης αυξάνει µε την αύξηση της πολικότητας, όταν στην ΥΧΥΑ-αντίστροφης φάσης η ιονική ισχύς µειώνεται και αντίστοιχα αυξάνεται η πολικότητα. α) Η ΠΟΛΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΚΑΘΑΡΩΝ ΙΑΛΥΤΩΝ Υπάρχουν πολλοί λόγοι για τους οποίους θεωρείται ότι η τιµή P είναι ο καλύτερος δείκτης της πολικότητας σε σχέση µε άλλες ιδιότητες των διαλυτών. Η τιµή του κυµαίνεται σε ένα εύρος τιµών από -2 για τους µη πολικούς διαλύτες, έως το 10,2 για το νερό, τον πλέον πολικό διαλύτη. Μία µεταβολή του P κατά δύο µονάδες προκαλεί, κατά προσέγγιση, µία µείωση της τιµής k, σύµφωνα µε τη σχέση: k k 1 ( 1 )/ 2 10 P = P (1) 2 2 για την ΥΧΥΑ-κανονικής φάσης, όπου k 1 και k 2 οι τιµές για µία συγκεκριµένη δραστική ουσία αρχικά και τελικά, ενώ οι P 1 και P 2 αναφέρονται στις τιµές P ενός διαλύτη αρχικά και τελικά. Για την ΥΧΥΑ-αντίστροφης φάσης η Σχέση (1) παίρνει τη µορφή: k k 1 ( P2 P) / 2 = 10 (2) 2 1 Για παράδειγµα, µία µελέτη δείχνει ότι οι τιµές k στην αντίστροφη φάση ποικίλουν, κατά ένα παράγοντα 10 3, πηγαίνοντας από το νερό στη µεθανόλη. Εφ όσον οι τιµές P για το νερό και τη µεθανόλη είναι 5,1 και 10,2 αντίστοιχα, η προβλέψιµη τιµή από τη Σχέση (2) θα είναι 10 2,6, σε συµφωνία µε τις πειραµατικές τιµές. Επειδή το P βασίζεται στα πραγµατικά δεδοµένα διαλυτοποίησης, ενώ η διαλυτότητα του δείγµατος στην κινητή και τη στατική φάση που καθορίζει και το k, αναµένεται ότι το P µπορεί να δώσει µια δικαιολογηµένα ακριβή µέτρηση της ιονικής ισχύος του διαλύτη στην κατανοµή της ΥΧΥΑ. Επίσης το P είναι µια κατά προσέγγιση µέτρηση της ισχύος του διαλύτη, αλλά ένας καλύτερος δείκτης της ιονικής ισχύος του διαλύτη σ αυτή την περίπτωση, αποτελεί από τις πειραµατικές µετρήσεις η παράµετρος ο. Το Σχήµα 9 δείχνει την κατά προσέγγιση

43 συσχέτιση που υπάρχει µεταξύ των τιµών του ο και του P για µια ποικιλία καθαρών διαλυτών. Σχήµα 9: Συσχέτιση µεταξύ της παραµέτρου διαλυτότητας δ του Hildebrand(συνεχόµενη γραµµή) και της παραµέτρου ιονικής ισχύος(διακεκοµµένη γραµµή) ως προς την παράµετρο P. Πολλοί επιστήµονες είναι πιο εξοικειωµένοι µε ένα άλλο τρόπο καθορισµού της πολικότητας του διαλύτη: την παράµετρο διαλυτότητας δ του Hildebrand. Για τους περισσότερους διαλύτες το P και το δ συσχετίζονται, όπως φαίνεται στο Σχήµα 9. Για το λόγο αυτό οι τιµές P των διαλυτών που δεν αναφέρονται σε κάποιους πίνακες, µπορούν να υπολογιστούν από τις δ τιµές τους. Η µεγαλύτερη εξαίρεση στη σχέση µεταξύ P και δ που δείχνεται στο Σχήµα 9, αφορά ισχυρούς διαλύτες που είναι δέκτες (βάσεις) και που δεν είναι δότες πρωτονίων (π.χ. διαιθυλαιθέρας, τριαιθυλαµίνη κ.ά.). Τέτοιοι διαλύτες έχουν τιµές P περίπου 1,5 µονάδα µεγαλύτερη απ ότι προβλέπεται από τις δ τιµές τους δια µέσω του Σχήµατος 9. Επειδή οι τιµές του P µεταβάλλονται σε ένα εύρος τιµών έντεκα (11) µονάδων, µία αλλαγή στην κινητή φάση κατανοµής της ΥΧΥΑ µπορεί να προκαλέσει µία αλλαγή των k τιµών της τάξης του 10 5, η οποία είναι κατά πολύ µεγαλύτερη από την επιθυµητά προσδοκούµενη. Γι αυτό οι τιµές k για τις περισσότερες δραστικές, µπορούν να προσδιοριστούν επαρκώς για ιδανικούς διαχωρισµούς, µεταβάλλοντας την αναλογία των διαλυτών της κινητής φάσης. Όπως θα φανεί και στη συνέχεια, τα µίγµατα διαλυτών στην κινητή φάση, επιφέρουν πιο ικανοποιητικά αποτελέσµατα απ ότι οι καθαροί διαλύτες. Στην ΥΧΥΑ η ιονική ισχύς του διαλύτη, συνήθως ρυθµίζεται δια µέσου της χρήσης µίγµατος διαλυτών. Τυπικά, ο διαλύτης Α, ο οποίος είναι ασθενούς ιονικής ισχύος, µιγνύεται µε

44 το διαλύτη Β, ο οποίος είναι πολύ ισχυρής και κάποια ενδιάµεσα µίγµατα των δύο διαλυτών, θα έχουν την ακριβή ιονική ισχύ. Η πολικότητα P για ένα µίγµα διαλυτών, είναι ο αριθµητικός µέσος όρος των P τιµών των καθαρών διαλυτών στο µίγµα, υπολογιζόµενη σύµφωνα µε το κλάσµα του όγκου του κάθε διαλύτη. Για ένα µίγµα δύο διαλυτών που αποτελείται από τους διαλύτες Α και Β, η τιµή P για το µίγµα δίνεται από τη σχέση: P =Φ a P a +Φ b P b, (3) όπου Φ Α και Φ Β είναι τα κλάσµατα όγκου των διαλυτών Α και Β στο µίγµα, ενώ τα P A και P B αναφέρονται στις τιµές P των καθαρών διαλυτών. Μία µεταβολή του όγκου κατά 10% στη σύνθεση του µίγµατος (π.χ. µεθανόλη-νερό 30:40) µεταβάλλει την τιµή P του µίγµατος κατά 0,1 (P b -P α ). Στην ΥΧΥΑ-αντίστροφης φάσης, µε µεθανόλη-νερό ως κινητή φάση, η τιµή P για τη µεθανόλη και το νερό είναι ίση προς 5,1 και 10,2 αντίστοιχα. Έτσι µία αλλαγή στη σύνθεση του µίγµατος των διαλυτών κατά 10%, αντιστοιχεί σε µεταβολή της τιµής P του µίγµατος κατά µισή (0,5) µονάδα. Από την εξίσωση (2) αυτό αντιστοιχεί σε µία αύξηση κατά 1,7 στην τιµή k, το οποίο συµφωνεί µε την αύξηση κατά 1,5-2,5 µονάδες, που αναφέρεται από πολλούς ερευνητές. Στην ΥΧΥΑ η ισχύς ο του διαλύτη δεν έχει γραµµική εξάρτηση από τη σύσταση του µίγµατος, όπως στην εξίσωση (3). Αντίθετα, η τιµή ο αυξάνεται κατά πολύ µε την προσθήκη µικρών ποσοτήτων ενός ισχυρού διαλύτη Β σε έναν αδύνατο διαλύτη Α και µετά ασυµπτωµατικά πλησιάζει την τιµή του καθαρού διαλύτη Β. Αυτό φαίνεται πιο κάτω για µίγµατα από πεντάνιο (Α) και διαιθυλαιθέρα (Β) µε οξείδιο του πυριτίου (στατική φάση) ως προσροφητικό: %v Ether in pentane ο 0 0, , , , ,38 Οι τιµές ο για το µίγµα των διαλυτών µπορεί να υπολογισθεί από τις τιµές ο των καθαρών διαλυτών, σύµφωνα µε την εξίσωση:

45 ab = a + log( N b 10 an b ( b an b a ) ) + 1 N b (4) όπου: αb είναι η τιµή ο για το µίγµα των δύο διαλυτών Α και Β, α και b οι τιµές ο για τους καθαρούς διαλύτες Α και Β, α µία σταθερά η οποία παίρνει τιµές από 0,6 α 1,0, ενώ το n b ποικίλει από 4 έως 6. β) ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΙΑΛΥΤΗ Αφού επιλεγεί η κινητή φάση και η οποία δίνει τιµές k από 1 έως 5 ( υπό την προϋπόθεση ότι η ιονική ισχύς του διαλύτη να είναι η κατάλληλη για το διαχωρισµό), οι περισσότεροι διαχωρισµοί µπορούν να επιτευχθούν, βελτιστοποιώντας την απόδοση της στήλης. Σε µερικές περιπτώσεις είναι δυνατόν, δύο ή περισσότερες κορυφές των υπό εξέταση δραστικών να αλληλεπικαλύπτονται και µία αλλαγή στην ικανότητα διαχωρισµού, καθίσταται επιτακτική. Αυτό αποτελεί τη µεγαλύτερη επιτυχία της αλλαγής της κινητής φάσης, η οποία µε τη σειρά της επιτυγχάνεται διατηρώντας σταθερή την ιονική ισχύ του µίγµατος, ενώ ποικίλει η σύσταση της κινητής φάσης. Έχοντας αναµίξει έναν µη πολικό διαλύτη Α ( P α 1) µε έναν πολικό Β, προκύπτει το µίγµα Α/Β, του οποίου η τιµή P δίνει τη σωστή τιµή για την ιονική ισχύ και την κατάλληλη τιµή k για το διαχωρισµό. Στη συνέχεια προκειµένου να αλλαχθεί η εκλεκτικότητα του διαλύτη επιλέγεται ένας άλλος διαλύτης C στη θέση του B. Ξανά η σύνθεση είναι Α/C, ώστε να δώσει τη σωστή ιονική ισχύ ( δηλαδή ίση µε αυτή του πρώτου µίγµατος). Τότε P α 0, από τη σχέση (3) και φαίνεται ότι οι συστάσεις των δύο µιγµάτων συνδέονται µε τη σχέση: Pb Φ C = Φ b ( ) (5) P Παραδείγµατος χάριν υποτίθεται, πως το Α/Β είναι 25%v CHCl 3 /εξάνιο και A/C µίγµα Αιθυλαιθέρα/εξανίου. Τότε P b =4,4 (CHCl 3 ) και P c =2,9 (αιθυλαιθέρας), έτσι ώστε: Φ c =0,25( 4,4 ) =38%v αιθέρας/εξάνιο. 2,9 Η εξίσωση (5) µας επιτρέπει τη γρήγορη επιλογή κινητών φάσεων διαφορετικής σύστασης µε την ίδια πάντα ιονική ισχύ µε αυτή του αρχικού µίγµατος Α/Β. Εφόσον, η σχέση (5) είναι η καλύτερη προσέγγιση, περαιτέρω µικρές τροποποιήσεις της συγκέντρωσης του πολικού διαλύτη στην κινητή φάση επιφέρουν ρύθµιση των k τιµών µέσα στο εύρος 1 k 5. C

46 γ) ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΗΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΙΑΛΥΤΩΝ Η µεγαλύτερη αλλαγή στην εκλεκτικότητα της κινητής φάσης καθίσταται φανερή, όταν η συσχετιζόµενη σηµασία των ποικίλων διαµοριακών αλληλεπιδράσεων µεταξύ του διαλύτη και του δείγµατος, έχει µεταβληθεί πλήρως. Για αυτό, η υποκατάσταση ενός πολικού διαλύτη Β π.χ. µεθανόλη, από έναν οµόλογό του C π.χ. προπανόλη, ουσιαστικά επιδρά ελάχιστα σ αυτή την αλληλεπίδραση των µορίων ή στην εκλεκτικότητα του διαλύτη, γιατί και στις δύο περιπτώσεις (µίγµατα µεθανόλης και προπανόλης) ένας δότης πρωτονίων είναι παρών. Μια µεγαλύτερη αλλαγή επιτελείται στην εκλεκτικότητα, χρησιµοποιώντας έναν διαλύτη C, ο οποίος είτε είναι απλός δέκτης πρωτονίων (π.χ. αιθυλαιθέρας), είτε έχει µια «µεγάλη διπολική ροπή» (large dipole moment), π.χ. το µεθυλενοχλωρίδιο. Παρουσία του διαλύτη C, απλός δέκτης πρωτονίων όπως ο διαιθυλαιθέρας, τα µόρια του δείγµατος θα επιλέξουν να παραµείνουν δεσµευµένα στην κινητή φάση. Με τον διαλύτη C, ο οποίος εµφανίζει ισχυρή διπολική ροπή (large-dipole moment), τα µόρια του δείγµατος που και αυτά περιέχουν οµάδες µε ισχυρή διπολική ροπή, θα προτιµήσουν πάλι να συγκρατηθούν στην κινητή φάση. Αν τέλος, ο διαλύτης C είναι δότης πρωτονίων, όπως η µεθανόλη, τότε και τα µόρια του δείγµατος θα προτιµήσουν επίσης την κινητή φάση. Σε κάθε περίπτωση, η εκλεκτική προσρόφηση στην κινητή φάση, ενός συγκεκριµένου τύπου µορίου του δείγµατος, µειώνει τις k τιµές του, συγκριτικά µε τις κορυφές των άλλων δειγµάτων. Πιθανώς αυτό να έχει ως αποτέλεσµα µια επιθυµητή αλλαγή της χρωµατογραφικής κορυφής, όσον αφορά το χρόνο έκλουσης της δραστικής ουσίας. Γενικότερα, η εκλεκτικότητα του διαλύτη µέσω των διαµοριακών αλληλεπιδράσεων, µας επιτρέπει να επιτύχουµε την απαραίτητη αλλαγή, πολύ πιο γρήγορα απ ότι αν προσπαθούσαµε να µεταβάλλουµε την πολικότητα του διαλύτη C τυχαία. Μία εναλλακτική και πιο προσιτή λύση, είναι να ταξινοµηθούν οι περισσότερο εύχρηστοι διαλύτες, σύµφωνα µε την εκλεκτικότητά τους, χωρίς να ληφθούν ιδιαιτέρως υπόψη οι διαµοριακές αλληλεπιδράσεις. Τα δεδοµένα του Rohrschneider που χρησιµοποιήθηκαν για να καθοριστεί η πολικότητα των διαλυτών µε βάση τις τιµές P, επιτρέπουν επίσης την ταξινόµηση της εκλεκτικότητας των διαλυτών, σύµφωνα µε τις παραµέτρους: x d, x e και x n αντίστοιχα ΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΤΟΥ ROHRSCHNEIDER Πρωταρχικός στόχος είναι να απεξαρτητοποιηθεί η σταθερά διαλυτότητας Kg (σταθερά που αναφέρεται στην αέριο-υγρή χρωµατογραφία κατανοµής) από το µοριακό βάρος του

47 διαλύτη και της υπό ανάλυση ουσίας. Η επίδραση του µοριακού βάρους του διαλύτη ξεκινά από 52, 53 τη συγκέντρωση κατανοµής της σταθεράς Kg, σύµφωνα µε τη σχέση: όπου: Vs είναι ο µοριακός όγκος (ml/mole) του διαλύτη. Κ g = Kg Vs (6) Το µοριακό βάρος της υπό ανάλυση ουσίας επιδρά στις Kg τιµές και παρόµοια µπορεί να αντικατασταθεί µε την τιµή Κυ για ένα αλκάνιο, του οποίου ο µοριακός όγκος είναι ίδιος µε αυτόν της υπό ανάλυση ουσίας. Έτσι η σχέση παίρνει τη µορφή: ' K '' Κ g g = ή K υ log '' Κ g = log Κ g log (7) Κ υ Εδώ η τιµή '' Κ g αναφέρεται στη σταθερά διαλυτότητας της υπό ανάλυση ουσίας προσαρµοσµένη ως προς τα µοριακά βάρη του διαλύτη και της υπό ανάλυση ουσίας. Ο log Κ '' g είναι επίσης ανάλογος της ελεύθερης ενέργειας εξάτµισης του διαλύτη και υπολογίζεται αριθµητικά από τα δεδοµένα διαλυτότητας της αιθανόλης, του διοξανίου και του νιτροµεθανίου στον εκάστοτε διαλύτη. Στη συνέχεια καθορίζεται ο δείκτης πολικότητας P, ο οποίος αποτελεί µέτρο της ικανότητας του διαλύτη να αντιδρά µε πολικές δραστικές ουσίες. Έτσι: ' P log( Κ ) + log( Κ ) + log( Κ ) = (8) '' g ethanol '' g dioxane '' g nitrometha ne Η σχέση (8) εκφράζει τη διαφορά µεταξύ της ισχύος ενός διαλύτη και της εκλεκτικότητας αυτού. Τα δεδοµένα για τη µεθυλοαιθυλοκετόνη εξαιρούνται από την παραπάνω σχέση, επειδή βρέθηκε πως οι τιµές του logκ για αυτή, συσχετίζονται µε τις τιµές της αιθανόλης και για αυτό δίνουν λίγες πληροφορίες, σχετικά µε τις ιδιότητες του διαλύτη. Τελικά, καθορίζονται οι παράµετροι εκλεκτικότητας x e, x d και x n ως εξής: '' x e = log( Κ g ) ethanol / P '' x d = log( Κ g ) dioxane / P '' g '' xn = log( Κ g ) nitromethane / P (9) Οι παράµετροι x e, x d και x n αντιπροσωπεύουν το κλάσµα του P, συµβάλλοντας µέσω των αλληλεπιδράσεων που σχετίζονται, όπως προαναφέρθηκε, µε την αιθανόλη, το διοξάνιο και

48 το νιτροµεθάνιο, αντίστοιχα. Συνάλληλα, οι παράµετροι αυτοί απεικονίζουν την ικανότητα του διαλύτη να δρα σαν δέκτης πρωτονίου (x e ), σαν δότης (x d ), ή σαν µέσο µιας ισχυρής αλληλεπίδρασης διπόλου (x n ). Γι αυτό διαλύτες µε µεγάλη τιµή x e, θα αντιδρούν ιδιαίτερα ισχυρά µε την αιθανόλη, απ ότι µε το διοξάνιο και το νιτροµεθάνιο, πιθανώς µέσω σχηµατισµού δεσµών υδρογόνου µεταξύ της αιθανόλης και των διαλυτών, που είναι δέκτες πρωτονίων. Οµοίως, διαλύτες µε µεγάλες τιµές x n, αντιδρούν πολύ ισχυρά µε το πολικό νιτροµεθάνιο, µέσω σχηµατισµού διπόλου. Η παράµετρος P αυξάνει µαζί µε την πολικότητα του διαλύτη, έτσι ώστε ο διαλύτης να λαµβάνει µέρος σε ισχυρές διαµοριακές αλληλεπιδράσεις µε άλλα παρόµοια µόρια. Όπως έχει αναφερθεί, το P µπορεί να συγκριθεί µε την παράµετρο διαλυτότητας δ του Hildebrand. Η κύρια διαφορά µεταξύ του P και του δ είναι, ότι το δ υπολογίζεται για τους καθαρούς διαλύτες και µπορεί να αντιπροσωπεύει αλληλεπιδράσεις που υπάρχουν µόνο σε αυτούς. Το P από την άλλη πλευρά, υπολογίζεται σε ένα µεγάλο αριθµό δραστικών ουσιών και περιλαµβάνει όλα τα είδη των αλληλεπιδράσεων. Γι αυτό η τιµή δ για το διαλύτη διαιθυλαιθέρα είναι εξαιρετικά χαµηλή (δ=7,4) και αντίστοιχα το ίδιο για τον µη πολικό διαλύτη εξάνιο (δ=7,3). Είναι επίσης γνωστό, ότι ο διαιθυλαιθέρας είναι ισχυρός δότης πρωτονίων και µέτρια πολικός διαλύτης. Στον καθαρό διαλύτη διαιθυλαιθέρα, όπου δεν υπάρχουν µόρια δότες πρωτονίων, η βασικότητά του είναι αισθητά µειωµένη και σαν αποτέλεσµα η τιµή δ είναι χαµηλή. Από την άλλη πλευρά, όπως φαίνεται από τους πίνακες για τις τιµές P, η τιµή P για τον διαιθυλαιθέρα είναι αισθητά µεγαλύτερη (P =2,9) απ ότι για τους κορεσµένους υδρογονάνθρακες (-0,8 P 0,0) το οποίο αντανακλά άµεσα τη µέτρια πολικότητά τους ΤΡΙΓΩΝΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΤΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ x e, x d, x n Όταν οι τιµές x e, x d και x n για τον κάθε διαλύτη τοποθετηθούν σε τριγωνικό διάγραµµα, όπως αυτό φαίνεται στο Σχήµα 10, αποκαλύπτεται ότι πολλοί µεταξύ τους διαλύτες είναι τοποθετηµένοι σε κοινές οµάδες, µε βάση την παρόµοια εκλεκτικότητα που επιδεικνύουν 54.Για το λόγο αυτό, η οµάδα I περικλείει ασθενείς δέκτες πρωτονίων, όπως οι αιθέρες και οι αµίνες, η οµάδα II περικλείει δότες-δέκτες, όπως οι αλκοόλες, και η οµάδα VIII αποτελείται από ασθενείς δότες πρωτονίων, όπως το χλωροφόρµιο.

49 ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΤΩΝ ΙΑΛΥΤΩΝ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΟ ΤΡΙΓΩΝΟ SNYDER ΟΜΑ Α I II III IV V VIa VIb VII VIII ΙΑΛΥΤΕΣ Αλειφατικοί αιθέρες, Τριαλκυλοαµίνες, Τετραµεθυλογουανιδίνη Αλειφατικές αλκοόλες Πυριδίνες, Τετραυδροφουράνιο, αµίδια (εκτός της φορµαµίδης) Γλυκόλες, γλυκολαιθέρες, βενζυλοαλκοόλη, φορµαµίδη, οξεικό οξύ Μεθυλενοχλωρίδιο, αιθυλενοχλωρίδιο, tricresyl φωσφορικό Αλκυλοαλογονίδια, κετόνες, εστέρες, νιτρίλια, σουλφοξείδια, σουλφόνες, ανιλίνη και διοξάνιο Ενώσεις του αζώτου, ανθρακικό προπυλένιο, φαινυλοαλκυλοαιθέρες, αρωµατικοί υδρογονάνθρακες Halobenzenes, διφαινυλαιθέρες Fluoroalkanols, m-κρεζόλη, χλωροφόρµιο, νερό Σχήµα 10: Τρίγωνο του SNYDER.

50 α) ΜΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΓΙΑ ΤΗ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Η βελτιστοποίηση της εκλεκτικότητας µπορεί να καταδειχτεί µε ένα υποθετικό παράδειγµα: 55, 56 Υποθέτουµε ότι θέλουµε να πραγµατοποιήσουµε έναν αρχικό διαχωρισµό µε ΥΧΥΑ-αντίστροφης φάσης χρησιµοποιώντας ως διαλύτη µίγµα εξανίου (Α) και χλωροφορµίου (Β). Επιπλέον υποθέτουµε, ότι η σωστή ιονική ισχύς του διαλύτη βρέθηκε να είναι 20%v χλωροφόρµιο/εξάνιο ως κινητή φάση. Από τους πίνακες και την εξίσωση (3) υπολογίζεται το P, το οποίο είναι ίσο προς: (0,8 x 0,025) + (0,2 x 4,4) ή P = 0,9. Τώρα ας υποθέσουµε ότι θέλουµε να αλλάξουµε την εκλεκτικότητα διαχωρισµού: αυτό είναι πιο εύκολο να επιτευχθεί µε µία µεγάλη αλλαγή του πολικού διαλύτη. Από τους πίνακες βλέπουµε ότι το χλωροφόρµιο ανήκει στην οµάδα VIII. Από το τρίγωνο παρατηρούµε ότι οι οµάδες I και V είναι αρκετά µακριά από την οµάδα VIII και γι αυτό είναι πιο πιθανό να επιτευχθεί µία µεγάλη αλλαγή στην εκλεκτικότητα. Ας υποθέσουµε ότι προσπαθούµε να πάρουµε ένα διαλύτη από την οµάδα V. Από τους πίνακες µε τις τιµές P βλέπουµε ότι το µεθυλενοχλωρίδιο και το αιθυλενοχλωρίδιο ανήκουν στην οµάδα V. Επιλέγοντας το µεθυλενοχλωρίδιο, λόγω της χαµηλής του πτητικότητας αλλά και την ευκολία απόκτησής του, υπολογίζουµε από την εξίσωση (5), ότι η τελική του συγκέντρωση στο µίγµα θα είναι: 0,2(4,4/3,4) ή 26%v µεθυλενοχλωρίδιο/εξάνιο (του οποίου το P είναι ίσο προς 0,9). Εάν η τελευταία κινητή φάση δεν δίνει την επιθυµητή εκλεκτικότητα διαχωρισµού, µπορούµε να επαναλάβουµε την ίδια διαδικασία για έναν πολικό διαλύτη από την οµάδα I (π.χ. τριαιθυλαµίνη, διαιθυλαιθέρα), ή από κάποια άλλη οµάδα του τριγώνου. Εάν παρόλα ταύτα, ένας συγκεκριµένος πολικός διαλύτης δεν δίνει την απαιτούµενη εκλεκτικότητα, είναι µάλλον απίθανο κάποιος άλλος από την ίδια οµάδα να µπορεί να τη δώσει. β) ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΙΑΛΥΤΗ ΣΤΗΝ ΥΧΥΑ-ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΦΑΣΗΣ Στην ΥΧΥΑ-αντίστροφης φάσης, το νερό είναι ο πολικός διαλύτης Β και κάθε λιγότερο πολικός διαλύτης, που µπορεί να χρησιµοποιηθεί και ο οποίος µιγνύεται µε το νερό, είναι ο διαλύτης Α. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, µια αλλαγή στον µη πολικό διαλύτη (π.χ. από µεθανόλη σε ακετονιτρίλιο) έχει γενικότερα µικρότερη επίδραση στην εκλεκτικότητα του διαλύτη, έτσι ώστε στους διαχωρισµούς να υπάρχουν περισσότεροι περιορισµοί. Όµως σηµαντικές αλλαγές έχουν παρατηρηθεί κατά την αλλαγή του δεύτερου διαλύτη από µεθανόλη σε προπανόλη και στη συνέχεια σε ακετονιτρίλιο, και αυτή η πιθανότητα δεν µπορεί να αγνοηθεί.

51 Στην ΥΧΥΑ-αντίστροφης φάσης η ιονική ισχύς του διαλύτη πρέπει να διατηρείται σταθερή, ενώ µεταβάλλεται η σύσταση του λιγότερου πολικού διαλύτη. Έτσι η εξίσωση (5) µπορεί να γραφεί ως εξής: PW Pb Φ C = Φ b ( ) (10) P P Στη σχέση αυτή, το P W αναφέρεται στην τιµή P για το νερό ως διαλύτης Α και είναι ίση προς 10,2. Εναλλακτικά, µπορεί να καθοριστεί ένας πιο ακριβής τρόπος µέτρησης της ιονικής ισχύος, µε βάση την παράµετρο S, όπως: W C S b Φ C =Φ b ( ) (11) S Πειραµατικές τιµές για το S δείχνονται στον Πίνακα που ακολουθεί: C ΙΟΝΙΚΗ ΙΣΧΥΣ (ΥΧΥΑ-αντίστροφης φάσης) Νερό (0,0) ιοξάνιο (3,5) Μεθανόλη (3,0) Αιθανόλη (3,6) Ακετονιτρίλιο (3,1) i-προπανόλη (4,2) Ακετόνη (3,4) Τετραϋδροφουράνιο (4,4) Έτσι, εάν η αρχική κινητή φάση είναι 50%v µεθανόλη/νερό και επιδιώκεται να αλλαχθεί σε µίγµα τετραϋδροφορανίου/νερού, ο όγκος του τετραϋδροφορανίου που απαιτείται, ώστε να διατηρηθεί σταθερή η ιονική ισχύς της φάσης, είναι σύµφωνα µε την εξίσωση (11): Φ C 3,0 = 0,5( ) = 0,34 4,4 Συνεπώς, πρέπει να χρησιµοποιηθεί στην κινητή φάση η αναλογία όγκου: 34%v τετραϋδροφουράνιο/νερό, θεωρώντας ότι το k για 50%v µεθανόλη/νερό ήταν ήδη στο σωστό εύρος τιµών. Τριαδικά µίγµατα από δύο ισχυρούς πολικούς διαλύτες Β και C µε έναν µη πολικό διαλύτη Α, είναι µερικές φορές χρήσιµα στις επιµέρους ρυθµίσεις εκλεκτικότητας του διαλύτη, έτσι ώστε να δώσουν ενδιάµεσους διαχωρισµούς µεταξύ αυτών που δίνονται από τα συστήµατα των διαλυτών Α/Β και A/C. Αξίζει να τονιστεί, πως µε τα τριαδικά µίγµατα µπορεί αδιάκοπα να µεταβάλλεται, τόσο η ιονική ισχύς, όσο και η εκλεκτικότητα των διαλυτών.

52 Έτσι, η εκλεκτικότητα ρυθµίζεται από την αναλογία των συγκεντρώσεων των Β και C, ενώ η ιονική ισχύς µπορεί να ρυθµιστεί µεταβάλλοντας τη συγκέντρωση του Α ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΓΡΑΜΜΙΚΗΣ ΠΑΛΙΝ ΡΟΜΗΣΗΣ Στο σηµείο αυτό κρίνεται απαραίτητη η αναφορά σε στατιστικές έννοιες και µεθόδους, επειδή τα αριθµητικά δεδοµένα που προέκυψαν από τη συγκεκριµένη πειραµατική έρευνα, επεξεργάστηκαν και εκτιµήθηκαν µε τη βοήθεια ορισµένων αποδεκτών στατιστικών µεθόδων 57. Συγκεκριµένα η διερεύνηση της φύσης και της έντασης στη σχέση δύο µεταβλητών πραγµατοποιήθηκε µε τη µέθοδο της ανάλυσης παλινδρόµησης (regression analysis) και της συσχέτισης και στη συνέχεια αξιολογήθηκε η σηµαντικότητα της παλινδρόµησης, µέσω του συντελεστή συσχέτισης (r), του δείκτη F και της εξέτασης των υπολοίπων. Γενικά, µε την παλινδρόµηση εκτιµούµε τη σχέση µιας µεταβλητής ως προς µία άλλη, εκφράζοντας τη µία µεταβλητή σε γραµµική ή µη συνάρτηση της άλλης µεταβλητής. Με τη συσχέτιση εκτιµούµε το βαθµό κατά τον οποίο οι δύο µεταβλητές µεταβάλλονται µαζί ή την ένταση της γραµµικής σχέσεως δύο µεταβλητών 58. Η εύρεση της καλύτερης ευθείας που απεικονίζει τη γραµµική σχέση µεταξύ της ανεξάρτητης και της εξαρτηµένης µεταβλητής επιτυγχάνεται µε τη µέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. Η γενική µορφή της ευθείας είναι: y =α + βχ όπου οι συντελεστές α και β σηµειώνουν το σηµείο τοµής µε τον άξονα yy και την κλίση ως προς τον άξονα xx της ευθείας αυτής αντίστοιχα. Η θέση της ευθείας γραµµής των ελαχίστων τετραγώνων, έχει την ιδιότητα να ελαχιστοποιεί το άθροισµα των τετραγώνων των κατακόρυφων αποκλίσεων των πραγµατικών σηµείων από την ευθεία γραµµή των ελαχίστων τετραγώνων. Μετά την εκτίµηση της εξίσωσης παλινδρόµησης και για να διαπιστωθεί κατά πόσο η εξίσωση αυτή περιγράφει τη σχέση που υπάρχει µεταξύ των δύο µεταβλητών X και Y ή κατά πόσο µε τη γραµµή των ελαχίστων τετραγώνων, προσαρµόζεται η θεωρητική µε την πραγµατική κατάσταση. Με την ανάλυση της διακύµανσης της γραµµής παλινδρόµησης και πιο συγκεκριµένα µε το δείκτη Fα ελέγχεται η γραµµική ή όχι σχέση µεταξύ X και Y. Αν ο δείκτης F είναι µεγαλύτερος από την τιµή Fα (1, n-2) της F κατανοµής µε 1 και n-2 βαθµούς ελευθερίας και στάθµη εµπιστοσύνης α, τότε δεχόµαστε ότι υπάρχει γραµµική σχέση µεταξύ X και Y.

53 Για τη σωστή εκτίµηση µιας εξίσωσης παλινδρόµησης είναι σκόπιµο να εξετάζεται ταυτόχρονα µε το δείκτη F και ο συντελεστής γραµµικής συσχέτισης ( r ) του οποίου όταν η τιµή τείνει στη µονάδα (+1) φανερώνει ισχυρή γραµµική θετική συσχέτιση. Αν το µοντέλο προσαρµογής είναι σωστό, τα υπόλοιπα θα πρέπει να παρουσιάζουν τάσεις που τείνουν να το επιβεβαιώσουν. Τα υπόλοιπα ορίζονται ως οι n διαφορές e i = Y i -Ŷ i, i = 1, 2.. n όπου Y i είναι µια παρατήρηση και Ŷ i είναι η αντίστοιχη προσαρµοσµένη τιµή, που προσδιορίζεται από την οµώνυµη εξίσωση παλινδρόµησης. Από τον ορισµό αυτό είναι φανερό ότι τα υπόλοιπα είναι οι διαφορές µεταξύ αυτού που πραγµατικά παρατηρείται και εκείνου που προβλέπεται από την εξίσωση παλινδρόµησης, δηλαδή είναι η ποσότητα την οποία η εξίσωση παλινδρόµησης δεν είναι ικανή να ερµηνεύσει. Ένα επιτυχές διάγραµµα υπολοίπων θα πρέπει να δίνει τη συνολική εντύπωση που παρουσιάζεται στο Σχήµα 11 (α). Αντίθετα παραδείγµατα χαρακτηριστικών που δείχνουν ανεπιτυχή συµπεριφορά υπολοίπων, απεικονίζονται στο Σχήµα 11 (β). Σχήµα 11 (α): Επιτυχές διάγραµµα υπολοίπων. Σχήµα 11 (β): Παραδείγµατα ανεπιτυχούς συµπεριφοράς υπολοίπων.

54 Τα διαγράµµατα µη κανονικότητας, υποδεικνύουν αναλυτικά σε κάθε περίπτωση: (1) Μη σταθερή διασπορά: ανάγκη για σταθµισµένα ελάχιστα τετράγωνα ή µετασχηµατισµό των παρατηρήσεων Y i πριν κάνουµε µια ανάλυση παλινδρόµησης. (2) Σφάλµα στην ανάλυση: η παρέκκλιση από την εξίσωση προσαρµογής είναι σηµαντική γιατί αρνητικά υπόλοιπα αντιστοιχούν σε χαµηλές τιµές Ŷ, ενώ θετικά υπόλοιπα σε υψηλές τιµές της Ŷ. (3) Ανεπαρκές µοντέλο: ανάγκη για µετασχηµατισµό των παρατηρήσεων Y i πριν από την ανάλυση παλινδρόµησης. Στην παρούσα διατριβή ήταν αναγκαία η επέκταση της ανάλυσης απλής παλινδρόµησης και αντίστοιχα της απλής συσχέτισης στην ανάλυση της πολλαπλής παλινδρόµησης και πολλαπλής συσχέτισης, όπου µία µεταβλητή επεξηγείται από περισσότερες από µία ανεξάρτητες µεταβλητές. Για την ανάπτυξη των χρωµατογραφικών συστηµάτων µε τα οποία επιτεύχθηκε ο ποσοτικός προσδιορισµός των φαρµάκων, ήταν σηµαντική η µελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν την ανάλυση. Συγκεκριµένα, ήταν απαραίτητο να καθοριστεί πως επηρεάζεται ο συντελεστής κατακράτησης των υπό ανάλυση φαρµάκων, συγχρόνως από την τιµή του ph της κινητής φάσης και την περιεκτικότητα σε κάποιο διαλύτη ή τη συγκέντρωση του άλατος της υδατικής κινητής φάσης. Η απεικόνιση σε τρισδιάστατα επίπεδα των επιδράσεων της µιας µεταβλητής από τις άλλες µεταβλητές που µελετούνταν συγχρόνως, παρείχε χρήσιµες πληροφορίες. Η σταθερότητα των χρωµατογραφικών συστηµάτων εκτιµήθηκε κάθε φορά από την οµαλή και χωρίς διακυµάνσεις επιφάνεια που αναπτύσσονταν στην αντίστοιχη µελέτη. Επιπλέον, ήταν εφικτός ο καθορισµός του βέλτιστου συνδυασµού συνθηκών για την πραγµατοποίηση ποσοτικών προσδιορισµών ή χρωµατογραφικών διαχωρισµών των φαρµάκων µε άλλες συνυπάρχουσες ουσίες ή συγχορηγούµενα φάρµακα.

55 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΜΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΤΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΜΕ ΥΧΥΑ α) Φαρµακολογική δράση Η ναφαζολίνη (Septobore ) ανήκει στην κατηγορία των αγγειοσυσπαστικών-αδρενεργικών φαρµάκων 59,60. Είναι ένα συµπαθοµιµητικό φάρµακο που διεγείρει τους α-αδρενεργικούς υποδοχείς. Σε χαµηλές πυκνότητες χρησιµοποιείται σε ήσσονος σηµασίας τοπικούς ερεθισµούς του οφθαλµού. Στις αναφερθείσες συγκεντρώσεις σπανίως προκαλεί ανεπιθύµητες ενέργειες. Εντούτοις παρατεταµένη χορήγησή της δε συνιστάται, γιατί µπορεί να προκαλέσει τοπική υπεραιµία, επίσπευση εκδήλωσης λανθανουσών παθολογικών καταστάσεων κλπ. Η χρήση της αντενδείκνυται σε ξηρά κερατοεπιπεφυκίτιδα (σύνδροµο Sjögren). Συχνά συνδυάζεται µε αντισηπτικά (βενζαλκόνιο, βορικό οξύ), στυπτικά (θειικός ψευδάργυρος), άλλες ουσίες (πολυβινυλική αλκοόλη, υπροµελλόζη ή αντιισταµινικά). Η ενστάλαξη στον οφθαλµό προκαλεί συστολή των αγγείων του επιπεφυκότα, αναστέλλει την υπεραιµία και δηµιουργεί στον ασθενή το αίσθηµα της άµεσης ανακούφισης. Ενδείκνυται ως αποσυµφορητικό των οφθαλµών από τα συµπτώµατα που συνοδεύουν τους ήπιους ερεθισµούς του επιπεφυκότος και που προκαλούν: ο άνεµος, η σκόνη, ο καπνός, το µολυσµένο περιβάλλον, η κολύµβηση, οι φακοί επαφής και η κόπωση από µελέτη, η οδήγηση αυτοκινήτου ή η παρακολούθηση τηλεοράσεως. β) Φυσικοχηµικές ιδιότητες Η ναφαζολίνη µε τη µορφή υδροχλωρικού άλατος 61, είναι λευκή ή σχεδόν λευκή κρυσταλλική σκόνη, άοσµη µε πικρή γεύση, M r 246,73 και σηµείο τήξης τους C µε διάσπαση. Η ουσία είναι διαλυτή στο νερό και την αλκοόλη, πολύ λίγο διαλυτή στο χλωροφόρµιο και πρακτικά αδιάλυτη στον αιθέρα. Λόγω της χηµικής της δοµής συµπεριφέρεται ως βάση. Το χηµικό της όνοµα είναι: 2-(1-naphthylmethyl)-2-imidazoline monohydrochloride.

56 2.2 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Η ερευνητική µελέτη σκοπό είχε τη διερεύνηση της χρωµατογραφικής συµπεριφοράς της ναφαζολίνης, ώστε να αναπτυχθούν τα βέλτιστα χρωµατογραφικά συστήµατα για τον προσδιορισµό της. Η κατάλληλη επιλογή των χρωµατογραφικών συνθηκών µε τις οποίες διενεργείται µια ανάλυση µε ΥΧΥΑ µπορεί να αυξήσει σηµαντικά την ευαισθησία, την ακρίβεια, καθώς επίσης και την επαναληψιµότητα των µετρήσεων. Είναι επίσης γνωστό, πως οι κατάλληλες χρωµατογραφικές συνθήκες είναι εκείνες που επηρεάζουν σηµαντικά τη χρονική διάρκεια της χρωµατογραφικής ανάλυσης και τη συµµετρικότητα των χρωµατογραφικών κορυφών και είναι καθοριστικές για την επίτευξη διαχωρισµού των φαρµάκων από άλλες ουσίες µε τις οποίες συνυπάρχουν σε διάφορα δείγµατα. Στην πράξη η επιλογή των συνθηκών ανάλυσης της ναφαζολίνης, πραγµατοποιήθηκε δοκιµάζοντας µια σειρά από κινητές φάσεις µίγµατα οργανικών διαλυτών µε διαφορετική πολικότητα µε τέτοια σύνθεση, ώστε ο χρόνος κατακράτησης της υπό ανάλυση ουσίας να είναι αναλυτικά αποδεκτός και η συµµετρικότητα των κορυφών ικανοποιητική. Για το λόγο αυτό δοκιµάστηκαν κινητές φάσεις µε βάση το δυαδικό µίγµα διαλυτών: νερό-µεθανόλη µε αναλογία 50/50 v/v. Με κινητή φάση που συνίστατο από µίγµα των πιο πάνω διαλυτών παρατηρήθηκε ότι οι χρωµατογραφικές κορυφές της ναφαζολίνης ήταν ευρείες στη βάση, παρουσίαζαν ασυµµετρία και ο χρόνος κατακράτησης ήταν µεγαλύτερος από τον επιθυµητό. οκιµάσθηκε λοιπόν η προσθήκη αλάτων στην κινητή φάση που σκοπό είχε τη βελτίωση της συµµετρικότητας των κορυφών και τη µείωση του χρόνου κατακράτησης της ναφαζολίνης στη στήλη. Έχοντας υπόψη, ότι στην ΥΧΥΑ η κατακράτηση επηρεάζεται από τη συγκέντρωση και το είδος των ιόντων του άλατος που προστίθενται στην κινητή φάση, καθώς και από το ph της, θεωρήθηκε σκόπιµο να διερευνηθούν επιπλέον οι παράγοντες που επηρεάζουν την κατακράτηση της ναφαζολίνης. Με βάση τα παραπάνω επιλέχθηκαν, µέσα από µια διερευνητική διαδικασία, τα εξής άλατα: το CH 3 COOK, το CH 3 COONa, το CH 3 COONH 4 και τέλος το (CH 3 COO) 2 Mg ως τα καταλληλότερα για τον προσδιορισµό της ναφαζολίνης σε διάφορες τιµές συγκεντρώσεων. Είναι πιθανόν τα άλατα να παίζουν το ρόλο τροποποιητή και να επηρεάζουν την κατανοµή της υπό ανάλυση ουσίας-φαρµάκου στην κινητή φάση µε συνέπεια τη βελτίωση του χρόνου κατακράτησης της ναφαζολίνης, καθώς και της συµµετρικότητας των κορυφών.

57 Η επίδραση της τιµής του ph της υδατικής κινητής φάσης αποτέλεσε ένα ακόµη σηµείο διερεύνησης. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκαν διάφορα συστήµατα διαλυµάτων ναφαζολίνης µε κινητές φάσεις που είχαν διαφορετική τιµή ph κάθε φορά. Η ρύθµιση του εκάστοτε ph γινόταν µε προσθήκη παγόµορφου CH 3 COOH, ώστε να µην επηρεαστεί το χηµικό περιβάλλον µε την προσθήκη ιόντων διαφορετικού άλατος. Από τα αποτελέσµατα διαπιστώθηκε ότι οι συντελεστές κατακράτησης (Πίνακες 1-4) παρουσιάζουν ανάλογα υψηλές τιµές για υψηλές τιµές ph στην περιοχή 6,09-4,80, που σηµαίνει ότι ο ιονισµός της ναφαζολίνης είναι περιορισµένος, αφού στην κινητή φάση βρίσκονται κυρίως τα αδιάστατα µόρια της ουσίας. Όταν αντίθετα το ph βρίσκεται στην περιοχή τιµών 4,07-3,20, τότε ο ιονισµός της υπό ανάλυση ουσίας είναι σχεδόν πλήρης και οι χρόνοι έκλουσης είναι αρκετά µικροί. Στο σηµείο αυτό αξίζει να τονιστεί ότι για το σύνολο των υπό µελέτη αλάτων-εύρος τιµών ph από 4,80 έως και 4,07- δεν υπήρξε κάποια σηµαντική µεταβολή των τιµών του συντελεστή κατακράτησης k. Πίνακας 1: Τιµές του συντελεστή k της ναφαζολίνης µε µεταβολή της συγκέντρωσης του άλατος (CH 3 COOK) και του ph της κινητής φάσης. Συγκέντρωση άλατος(μ) 0,01 0,03 0,05 0,07 0,1 ph k 3,20 0,908 0,914 0,892 0,867 0,897 4,07 1,103 1,100 1,100 1,135 1,154 4,80 1,203 1,164 1,215 1,191 1,247 5,50 1,352 1,288 1,315 1,272 1,306 6,09 1,518 1,437 1,446 1,405 1,416

58 Πίνακας 2: Τιµές του συντελεστή k της ναφαζολίνης µε µεταβολή της συγκέντρωσης του άλατος (CH 3 COONa x 3H 2 O) και του ph της κινητής φάσης. Συγκέντρωση άλατος(μ) 0,01 0,03 0,05 0,07 0,1 ph k 3,20 0,922 0,893 0,907 0,887 0,828 4,07 1,219 1,205 1,068 1,075 1,076 4,80 1,333 1,336 1,177 1,154 1,182 5,50 1,478 1,401 1,301 1,303 1,333 6,09 1,685 1,608 1,578 1,484 1,504 Πίνακας 3: Τιµές του συντελεστή k της ναφαζολίνης µε µεταβολή της συγκέντρωσης του άλατος (CH 3 COONH 4 ) και του ph της κινητής φάσης. Συγκέντρωση άλατος(μ) 0,01 0,03 0,05 0,07 0,1 ph k 3,20 0,866 0,930 0,851 0,861 0,872 4,07 1,066 1,191 1,276 1,178 1,147 4,80 1,380 1,265 1,285 1,210 1,218 5,50 1,352 1,311 1,324 1,292 1,312 6,09 1,807 1,554 1,482 1,420 1,411

59 Πίνακας 4: Τιµές του συντελεστή k της ναφαζολίνης µε µεταβολή της συγκέντρωσης του άλατος [(CH 3 COO) 2 Mg 4H 2 O] και του ph της κινητής φάσης. Συγκέντρωση άλατος(μ) 0,01 0,03 0,05 0,07 0,1 ph k 3,20 1,135 1,092 1,114 1,103 1,121 4,07 1,539 1,574 1,615 1,529 1,592 4,80 1,627 1,688 1,731 1,618 1,704 5,50 1,730 1,770 1,791 1,688 1,794 6,09 1,813 1,826 1,842 1,852 1,847 Στο Σχήµα 12 δίνονται οι γραφικές παραστάσεις εξάρτησης των τιµών k από τις τιµές συγκέντρωσης του κάθε άλατος και το ph της κινητής φάσης. Σχήµα 12α: Γραφική παράσταση εξάρτησης των τιµών k της ναφαζολίνης από τις τιµές ph της υδατικής κινητής φάσης µε άλας το [(CH 3 COO) 2 Mg 4H 2 O] (C H 3 C O O ) 2 M g. 4 H 2 O 2,0 1,8 k ' 1,6 1,4 1,2 p H 6,0 9 p H 5,5 0 p H 4,8 0 p H 4,0 7 p H 3,2 0 1,0 0,0 0 0,0 2 0,0 4 0,0 6 0,0 8 0,1 0 0,1 2 M Άλατος

60 Σχήµα 12β: Γραφική παράσταση εξάρτησης των τιµών k της ναφαζολίνης από τις τιµές ph της υδατικής κινητής φάσης µε άλας το CH 3 COOK. 1,6 1,5 C H 3 C O O K p H 6,0 9 p H 5,5 0 p H 4,8 0 p H 4,0 7 p H 3,2 0 1,4 1,3 k ' 1,2 1,1 1,0 0,9 Σχήµα 12γ: Γραφική παράσταση εξάρτησης των τιµών k της ναφαζολίνης από τις τιµές ph της υδατικής κινητής φάσης µε άλας το CH 3 COONa x 3H 2 O 0,8 0,0 0 0,0 2 0,0 4 0,0 6 0,0 8 0,1 0 0,1 2 M Άλατος Σχήµα 12γ: Γραφική παράσταση εξάρτησης των τιµών k της ναφαζολίνης από τις τιµές ph της υδατικής κινητής φάσης µε άλας το CH 3 COONa х 3H 2 O. 1,8 C H 3 C O O N a. 3 H 2 O k ' 1,6 1,4 1,2 Σχήµα 12δ: Γραφική παράσταση εξάρτησης των τιµών k της ναφαζολίνης από τις p H τιµές 4,8 0 ph της υδατικής κινητής φάσης µε άλας το CH 3 COONH 4 p H 6,0 9 p H 5,5 0 p H 4,0 7 p H 3,2 0 1,0 0,8 0,6 0,0 0 0,0 2 0,0 4 0,0 6 0,0 8 0,1 0 0,1 2 M Άλατος

61 Σχήµα 12δ: Γραφική παράσταση εξάρτησης των τιµών k της ναφαζολίνης από τις τιµές ph της υδατικής κινητής φάσης µε άλας το CH 3 COONH 4. 2, 0 C H 3 C O O N H 4 1, 8 1, 6 p H 6, 0 9 p H 5, 5 0 p H 4, 8 0 p H 4, 0 7 p H 3, 2 0 k ' 1, 4 1, 2 1, 0 0, 8 0, 6 0, 0 0 0, 0 2 0, 0 4 0, 0 6 0, 0 8 0, 1 0 0, 1 2 M Ά λ α το ς Στη συνέχεια στο Σχήµα 13 δίνονται οι γραφικές παραστάσεις εξάρτησης των τιµών k από τις τιµές συγκέντρωσης του κάθε άλατος. Σχήµα 13: Γραφική παράσταση εξάρτησης των τιµών k της ναφαζολίνης από τη συγκέντρωση του κάθε άλατος. ( C H 3 C O O ) 2 M g. 4 H 2 O 2,0 1,8 k ' 1,6 1,4 1,2 0,0 1 M 0,0 3 M 0,0 5 M 0,0 7 M 0,1 M 0,0 1 M 0,0 3 M 0,0 5 M 0,0 7 M 0,1 0 M 1,0 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 p H

62 CH 3 CO OK 1,6 1,5 1,4 k' 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,01 M 0,03 M 0,05 M 0,07 M 0,10 M 0,8 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 ph C H 3 C O O N a. 3H 2 O 1,8 1,6 k' 1,4 1,2 1,0 0,8 0,01 M 0,03 M 0,05 M 0,07 M 0,10 M 0,6 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 ph

63 C H 3 C O O N H 4 2, 0 1, 8 1, 6 k ' 1, 4 1, 2 1, 0 0, 0 1 M 0, 0 3 M 0, 0 5 M 0, 0 7 M 0, 1 0 M 0, 8 3, 0 3, 5 4, 0 4, 5 5, 0 5, 5 6, 0 6, 5 p H Είναι επίσης γνωστό ότι οι µεταβολές της θερµοκρασίας στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης επηρεάζουν σηµαντικά τη διαλυτότητα, το συντελεστή κατακράτησης της ναφαζολίνης, το ιξώδες της κινητής φάσης και τέλος την αποτελεσµατικότητα της αναλυτικής στήλης 61. Συγκεκριµένα, αύξηση της θερµοκρασίας αυξάνει τη διαλυτότητα και παρέχει οξείες κορυφές ενώ µειώνει το ιξώδες της κινητής φάσης. Αναφορικά µε το χρόνο κατακράτησης, αύξηση ή µείωση της θερµοκρασίας προκαλεί αντίστοιχα αύξηση ή µείωση του χρόνου κατακράτησης και επιτάχυνση ή επιβράδυνση της αναλυτικής διαδικασίας. Λαµβάνοντας λοιπόν υπόψη την επίδραση της θερµοκρασίας στους παραπάνω παράγοντες, θεωρήθηκε αναγκαίο να ρυθµιστεί η θερµοκρασία του πειράµατος µε αυτή του χώρου του εργαστηρίου (25 0 C) ώστε να µην επηρεάζεται η παράµετρος k. Με βάση τα όσα αναφέρθηκαν παραπάνω και έπειτα από δοκιµασίες κινητών φάσεων µε προσθήκη διαφορετικού κάθε φορά άλατος, καθώς και διαφορετικής αυτού συγκεντρώσεως σε διαφορετικές τιµές ph, µελετήθηκε η συµπεριφορά της ναφαζολίνης προτύπου διαλύµατος, µιας εκ των 2-ιµιδαζολινών που παρουσιάζει την τυπική συµπεριφορά αυτών. Οι χρωµατογραφικές συνθήκες ήταν οι ακόλουθες: 1 Κινητή Φάση: α) Μίγµα υδατικού διαλύµατος CH 3 COOK-MeOH σε αναλογία 50/50 v/v, β) Μίγµα υδατικού διαλύµατος CH 3 COONa-MeOH σε αναλογία 50/50 v/v, γ) Μίγµα υδατικού διαλύµατος CH 3 COONH 4 -MeOH σε αναλογία 50/50 v/v,

64 δ) Μίγµα υδατικού διαλύµατος (CH 3 COO) 2 Mg-MeOH σε αναλογία 50/50 v/v. 2 Ταχύτητα ροής κινητής φάσης: 1mL/min 3 Θερµοκρασία στήλης: Περιβάλλον 4 Ευαισθησία ανιχνευτή: 0,01 A.u.f.s. 5 Ταχύτητα καταγραφής: 2mm/min. Η απεικόνιση της χρωµατογραφικής συµπεριφοράς της ναφαζολίνης για κάθε άλας χωριστά, µε τη µέθοδο της µη γραµµικής πολλαπλής συσχέτισης σε τρισδιάστατα διαγράµµατα επιβεβαίωσε τα πειραµατικά δεδοµένα. Ο συντελεστής συσχέτισης υπολογίστηκε µε βάση τη συγκέντρωση του κάθε άλατος συγκριτικά µε τις τιµές ph. Πιο συγκεκριµένα, ο συντελεστής συσχέτισης για το CH 3 COOK βρέθηκε να έχει την τιµή 0,925. Η εξίσωση παλινδρόµησης είναι: z = 0,3532 0,1103x + 0,1788y, όπου x και y είναι οι τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών της συγκέντρωσης του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } και ph αντίστοιχα, ενώ z είναι οι τιµές της εξαρτηµένης µεταβλητής k (συντελεστής κατακράτησης). Σχήµα 14: Μελέτη χρωµατογραφικής συµπεριφοράς της ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε α) το ph της υδατικής φάσης και β) τη συγκέντρωση του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } µε τη µέθοδο της µη γραµµικής πολλαπλής συσχέτισης. CH 3 COOK 1,6 1,5 1,4 1,3 k' 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 ph 3,0 0,00 0,02 0,04 0,06 M Άλατος 0,08 0,10 0,12

65 Ο συντελεστής συσχέτισης για το CH 3 COONa βρέθηκε να έχει την τιµή 0,938. Η εξίσωση παλινδρόµησης είναι: z = 0,2773 1,7213x + 0,2218y, όπου x και y είναι οι τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών της συγκέντρωσης του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } και ph αντίστοιχα, ενώ z είναι οι τιµές της εξαρτηµένης µεταβλητής k (συντελεστής κατακράτησης). Σχήµα 15: Μελέτη χρωµατογραφικής συµπεριφοράς της ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε α) το ph της υδατικής φάσης και β) τη συγκέντρωση του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } µε τη µέθοδο της µη γραµµικής πολλαπλής συσχέτισης. CH 3 COONa. 3H 2 O 1,8 1,6 1,4 k' 1,2 1,0 0,8 0,6 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 ph 3,0 0,00 0,02 0,04 0,06 M Άλατος 0,08 0,10 0,12 Ο συντελεστής συσχέτισης για το CH 3 COONH 4 βρέθηκε να έχει την τιµή 0,980. Η εξίσωση παλινδρόµησης είναι: z = 0,3299 1,1617x + 0,2039y, όπου x και y είναι οι τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών της συγκέντρωσης του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } και ph αντίστοιχα, ενώ z είναι οι τιµές της εξαρτηµένης µεταβλητής k (συντελεστής κατακράτησης).

66 Σχήµα 16: Μελέτη χρωµατογραφικής συµπεριφοράς της ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε α) το ph της υδατικής φάσης και β) τη συγκέντρωση του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } µε τη µέθοδο της µη γραµµικής πολλαπλής συσχέτισης. CH 3 COONH 4 2,0 1,8 1,6 k' 1,4 1,2 1,0 0,8 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 ph 3,0 0,00 0,02 0,04 0,06 M Άλατος 0,08 0,10 0,12 Ο συντελεστής συσχέτισης για το CH 3 COOMg βρέθηκε να έχει την τιµή 0,926. Η εξίσωση παλινδρόµησης είναι: z = 0, ,2649x + 0,2317y, όπου x και y είναι οι τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών της συγκέντρωσης του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } και ph αντίστοιχα, ενώ z είναι οι τιµές της εξαρτηµένης µεταβλητής k (συντελεστής κατακράτησης). Σχήµα 17: Μελέτη χρωµατογραφικής συµπεριφοράς της ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε α) το ph της υδατικής φάσης και β) τη συγκέντρωση του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } µε τη µέθοδο της µη γραµµικής πολλαπλής συσχέτισης.

67 (CH 3 COO) 2 Mgx4H 2 O 2,0 1,8 k' 1,6 1,4 1,2 1,0 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 ph 3,0 0,00 0,02 0,04 0,06 M Άλατος 0,08 0,10 0,12 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙ ΡΑΣΗΣ ΙΑΦΟΡΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΣΕ ΜΙΓΜΑ 2-ΙΜΙ ΑΖΟΛΙΝΩΝ Στο τµήµα αυτό της µελέτης, διερευνήθηκε η επίδραση των χρωµατογραφικών παραγόντων (ποσότητα άλατος, ph, σύσταση κινητής φάσης) που επηρεάζουν τη χρωµατογραφική συµπεριφορά της ναφαζολίνης (Septobore ) και των άλλων 2-ιµιδαζολινών, όπως αυτές επιλέχθηκαν µέσα από ένα πλήθος φαρµακευτικών ουσιών, διότι είναι γνωστή η χρήση τους σε ένα µεγάλο φάσµα της φαρµακευτικής. Πιο συγκεκριµένα χρησιµοποιήθηκαν για τις πειραµατικές µετρήσεις οκτώ (8) ακόµη ιµιδαζολίνες και αυτές ήταν: α. η ξυλοµεταζολίνη (Otrivin ), β. η φενοξαζολίνη (Aturgyl ), γ. η

68 τραµαζολίνη (Dexa-Rhina spray ), δ. η κλονιδίνη (Catapresan ), ε. η οξυµεταζολίνη (Ocuclear και Ronal ), στ. η ανταζολίνη (Vasocon και Zincfrin-A ), ζ. η τυµαζολίνη και τέλος η. η τολαζολίνη (Priscoline ). Σκοπός ήταν, αφ ενός η ανάπτυξη αξιόπιστων µεθόδων ποσοτικού προσδιορισµού τους, αφού από την υπάρχουσα βιβλιογραφία προκύπτει ότι για τις περισσότερες υπάρχει ελάχιστος αριθµός αναφορών σε απλές και όχι ταχείες µεθόδους προσδιορισµού τους, αφ ετέρου έγινε προσπάθεια διαχωρισµού των ουσιών αυτών µέσα από µια σειρά µιγµάτων, ώστε να πραγµατοποιηθεί ο καλύτερος δυνατός προσδιορισµός τους µε τη χάραξη πρότυπων καµπύλων αναφοράς. ιαπιστώθηκε ότι το ίδιο δυαδικό µίγµα διαλυτών, το οποίο έδωσε τα καλύτερα αποτελέσµατα για τη ναφαζολίνη, όσον αφορά το χρόνο έκλουσης και τη συµµετρικότητα των κορυφών, είχε παρόµοια επίδραση και στις υπόλοιπες 2-ιµιδαζολίνες, λόγω της κοινής ιµιδαζολινικής οµάδας που υπάρχει στο µόριό τους. Πιο συγκεκριµένα επιλέχθηκε το δυαδικό µίγµα κινητής φάσης που αποτελούνταν από νερό-µεθανόλη µε αναλογία 50/50 v/v, θερµοκρασία αυτή του περιβάλλοντος του εργαστηρίου (δηλ C), άλας το CH 3 COONH 4 και το ph ρυθµίστηκε στην περιοχή τιµών µεταξύ 6,09-3,20 µε την προσθήκη πάντα παγόµορφου CH 3 COOH, ώστε να µην επηρεαστεί το χηµικό περιβάλλον µε την προσθήκη ιόντων διαφορετικού άλατος. α ) ΞΥΛΟΜΕΤΑΖΟΛΙΝΗ Φαρµακολογική δράση Η ξυλοµεταζολίνη (Otrivin ) 67 : δρα κυρίως στους α-αδρενεργικούς υποδοχείς, προκαλεί αγγειοσυστολή των αιµοφόρων αγγείων της µύτης, προσφέρει γρήγορη και παρατεταµένη ανακούφιση από τη ρινική συµφόρηση, βοηθάει στη διάνοιξη των ρινικών διόδων. Το χηµικό της όνοµα είναι: 2-[(4-tert-butyl-2,6-dimethylphenyl)methyl]-4,5-dihydro-1Himidazole.

69 β ) ΦΕΝΟΞΑΖΟΛΙΝΗ Φαρµακολογική δράση Η φενοξαζολίνη (Aturgyl ) 68 : έχει έντονη δράση χορηγούµενη τοπικά, παρουσιάζει συµπαθοµιµητική δράση και δρα στους α-υποδοχείς της µύτης, πρόκειται για ένα αγγειοσυσπαστικό της µύτης. Το χηµικό της όνοµα είναι: 2-[(2-propan-2-ylphenoxy)methyl]-4,5-dihydro-1H-imidazole. γ ) ΤΡΑΜΑΖΟΛΙΝΗ Φαρµακολογική δράση Η τραµαζολίνη (Dexa-Rhinaspray ) : έχει έντονη δράση χορηγούµενη τοπικά, παρουσιάζει συµπαθοµιµητική δράση και δρα στους α-υποδοχείς της µύτης, πρόκειται για ένα αγγειοσυσπαστικό της µύτης, χρησιµοποιείται σε περιπτώσεις εµµένουσας και σοβαρής ρινικής συµφορήσεως (αλλεργική ρινίτιδα ή χρόνια ρινίτιδα). Το χηµικό της όνοµα είναι: N-(5,6,7,8-tetrahydronaphthalen-1-yl)-4,5-dihydro-1H-imidazol- 2-amine. δ ) ΚΛΟΝΙ ΙΝΗ Φαρµακολογική δράση Η κλονιδίνη (Catapresan ) : είναι ένας α 2 -αδρενεργικός αγωνιστής ο οποίος ενεργεί τόσο κεντρικά όσο και περιφερικά,

70 δρα κυρίως στο συµπαθητικό νευρικό σύστηµα, προκαλεί πτώση της υψηλής αρτηριακής πίεσης, χρησιµοποιείται για να θεραπεύσει όλες τις µορφές υπέρτασης εκτός από την οφειλόµενη σε φαιοχρωµοκύτωµα. Το χηµικό της όνοµα είναι: N-(2,6-dichlorophenyl)-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-amine. ε ) ΟΞΥΜΕΤΑΖΟΛΙΝΗ Φαρµακολογική δράση Η οξυµεταζολίνη (Ocuclear και Ronal ) : παρουσιάζει αντιισταµινική δράση, χορηγείται για την: I. ανακούφιση της υπεραιµίας και του οιδήµατος του επιπεφυκότα προκαλώντας αγγειοσυστολή των επιφανειακών αιµοφόρων αγγείων και II. συµπτωµατική ανακούφιση της ρινικής συµφόρησης σε χρόνιες και οξείες ρινίτιδες, παραρινοκολπίτιδες και ρινοφαρυγγίτιδες. ενδείκνυται η χρήση της στην οξεία αλλεργική επιπεφυκίτιδα, η δράση της διαρκεί για περίπου 6 ώρες. Το χηµικό της όνοµα είναι: 3-(4,5-dihydro-1H-imidazol-2-ylmethyl)- 2,4-dimethyl-6-tertbutyl-phenol. στ) ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗ Φαρµακολογική δράση Η ανταζολίνη (Vasocon και Zincfrin-Α ) : παρουσιάζει αντιισταµινική δράση, χορηγείται για την ανακούφιση της ρινικής συµφόρησης,

71 ως οφθαλµικό διάλυµα, σε συνδυασµό µε τη ναφαζολίνη, χρησιµοποιείται για την ανακούφιση των συµπτωµάτων της αλλεργικής επιπεφυκίτιδας. Το χηµικό της όνοµα είναι: N-(4,5-dihydro-1H-imidazol-2-ylmethyl)-N-(phenylmethyl)aniline. ζ ) ΤΥΜΑΖΟΛΙΝΗ Φαρµακολογική δράση Η τυµαζολίνη: έχει έντονη δράση χορηγούµενη τοπικά, παρουσιάζει συµπαθοµιµητική δράση και δρα στους α-υποδοχείς της µύτης, πρόκειται για ένα αγγειοσυσπαστικό της µύτης. Το χηµικό της όνοµα είναι: 2-[(5-methyl-2-propan-2-ylphenoxy)methyl]-4,5-dihydro-1Himidazole. η ) ΤΟΛΑΖΟΛΙΝΗ Φαρµακολογική δράση Η τολαζολίνη (Priscoline ) : αναστέλει τους α-αδρενεργικούς υποδοχείς, ανήκει στην κατηγορία των αγγειοδιασταλτικών, παρουσιάζει συµπαθοµιµητική και ισταµινική δράση, χρησιµοποιείται για να θεραπεύσει την πνευµονική υπέρταση στα νεογνά, καθώς και τους σπασµούς των περιφερικών αιµοφόρων αγγείων (ακροκυάνωση).

72 Το χηµικό της όνοµα είναι: 2-benzyl-4,5-dihydro-1H-imidazole. 3.2 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Όργανα και σκεύη Ο χρωµατογραφικός εξοπλισµός συνίσταται από ένα σύστηµα παροχής διαλύτη µε δύο αντλίες πιέσεως (µοντέλο LC-6A), µε φασµατοφωτοµετρικό ανιχνευτή υπεριώδους (µοντέλο SPD-6AV), του οίκου Shimadzu Instruments Corporation, Kyoto-Japan. Το όλο σύστηµα ελεγχόταν από προγραµµατιστή "system programmer", µοντέλο SCL-6B. Χρησιµοποιήθηκε θερµοστατούµενος φούρνος στήλης (µοντέλο CTO-6A) για τη ρύθµιση της θερµοκρασίας της στήλης. Τα δείγµατα εγχύθηκαν µέσω βαλβίδας εισαγωγής τύπου Rheodyne 7161, µε βρόγχο υποδοχής χωρητικότητας 20 µl. Τα χρωµατογραφήµατα καταγράφονταν σε θερµικό καταγραφέα τύπου "thermal printer", µοντέλο Chromatopac C-R 6A. Χρησιµοποιήθηκε ρυθµιστής πιέσεως, µοντέλο DGU-2A, για τη ρύθµιση του ποσού του αερίου ηλίου που διοχετεύονταν στην κινητή φάση. Όλη η οργανολογία ήταν του οίκου Shimadzu Instruments Corporation, Kyoto-Japan. Χρησιµοποιήθηκε αναδευτικό θερµαντικό σώµα react-therm προϊόν της Pierce, Rockford- USA, για την εξάτµιση των διαλυτών των δειγµάτων. Οβίδα παροχής αζώτου για τη συµπύκνωση ή εξάτµιση των διαλυµάτων. Χρησιµοποιήθηκαν δύο στήλες αντιστρόφου φάσης, προϊόντα Alltech: AQ-302, S-5 µm, 150 x 4,6 mm I.D., Νο AQ-302-5, S-5 µm, 150 x 4,6 mm I.D., Νο Για την προστασία των χρωµατογραφικών στηλών και την αύξηση της διάρκειας λειτουργίας τους, χρησιµοποιήθηκε προστήλη αντιστρόφου φάσης C 18 της εταιρείας Alltech. Συσκευή φυγοκέντρισης µοντέλο EBA 22, του οίκου Hettich Zentrifugen. Πεχάµετρο ακριβείας 0,01, τύπου PHM 63, Radiometer Analytical, Cedex-France. ονητής δοκιµαστικών σωλήνων (Vortex), µοντέλο k-550ge της εταιρείας Bophemia, New York, USA.

73 Αναλυτικός ζυγός Sartorius Λουτρό υπερήχων (Ultrasonic bath) της εταιρείας Bransonic 220. Μικροσύριγγα Hamilton-Bonaduz 50 µl. Συσκευή µαγνητικής ανάδευσης Heidolph. ιάφορα γενικής χρήσης γυάλινα όργανα και σκεύη, όπως: Φυγοκεντρικοί σωλήνες, Γυάλινοι σωλήνες ειδικής κατασκευής, χωρητικότητας 50 ml και σχήµατος κυλινδρικού µε εσµυρισµένο πώµα, Σιφώνια πληρώσεως των 1 ml, 2m L, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 10 ml και 25 ml. Φιάλες των 10, 25, 50 και 100 ml. Σφαιρικές φιάλες ειδικής κατασκευής χωρητικότητας 50 ml, µε κωνικό πυθµένα. Φιαλίδια πλαστικά των 1 ml και 2 ml µε κωνικό πυθµένα ιαλύτες και αντιδραστήρια Οι δραστικές ουσίες που χρησιµοποιήθηκαν στις χρωµατογραφικές µελέτες και αναλύσεις, ήταν απόλυτης χηµικής καθαρότητας και προσφέρθηκαν από διάφορες Φαρµακοβιοµηχανίες: I. Υδροχλωρική ξυλοµεταζολίνη από τη SIGMA Chemical Company II. Υδροχλωρική φενοξαζολίνη από τη SIGMA Chemical Company III. Μονοϋδρική τραµαζολίνη από τη Boehringer Ingelheim IV. Υδροχλωρική κλονιδίνη από τη Boehringer Ingelheim V. Υδροχλωρική οξυµεταζολίνη από τη Merck VI. Φωσφορική ανταζολίνη από τη SIGMA Chemical Company VII. Υδροχλωρική τυµαζολίνη από τη Merck VIII. Υδροχλωρική τολαζολίνη από τη CIBA IX. Υδροχλωρική ναφαζολίνη από τη SIGMA Chemical Company Οι διαλύτες µεθανόλη και νερό, ήταν προϊόντα της εταιρείας Merck, υψηλής καθαρότητας, κατάλληλοι για χρήση στην υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC grade). Άλατα: οξικό αµµώνιο, οξικό µαγνήσιο, οξικό νάτριο και οξικό κάλιο, προϊόντα της Sigma. Παγόµορφο οξικό οξύ, προϊόν της εταιρείας Merck. Αρχικά ή Μητρικά ιαλύµατα: ορισµένες ποσότητες ξυλοµεταζολίνης, οξυµεταζολίνης, τολαζολίνης, κλονιδίνης, ανταζολίνης, φενοξαζολίνης, τυµαζολίνης και τραµαζολίνης ζυγίστηκαν επακριβώς και διαλύθηκαν χωριστά σε µεθανόλη σε ογκοµετρική φιάλη χωρητικότητας 50 ml για την παρασκευή προτύπων διαλυµάτων (working standards),

74 κατάλληλων συγκεντρώσεων της τάξης των µg/ml. Τα πρότυπα διαλύµατα των προαναφερθέντων υπό ανάλυση ουσιών, παρασκευάστηκαν µε αραίωση καθορισµένης ποσότητας µητρικού διαλύµατος στην κατάλληλη κινητή φάση. 3.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η πειραµατική µελέτη πραγµατοποιήθηκε σε διαδοχικά στάδια, ώστε να διερευνηθεί η επίδραση των διαφόρων χρωµατογραφικών παραγόντων στο χρόνο έκλουσης των 2- ιµιδαζολινών και να καταστεί δυνατός ο προσδιορισµός τους µέσα από ένα αξιόπιστο αναλυτικό σύστηµα. Η παρούσα µελέτη είχε ως στόχο, τη διερεύνηση της επίδρασης της πολικότητας και του ph της κινητής φάσης στις χρωµατογραφικές παραµέτρους t R, k και R S των υπό προσδιορισµό ουσιών, ώστε να επιβεβαιωθούν οι µηχανισµοί αλληλεπίδρασής τους µε τη στατική ή κινητή φάση σε ελέγχους καθηµερινότητας για φαρµακευτικά σκευάσµατα, αφού στην υπάρχουσα βιβλιογραφία δεν έχει αναφερθεί κάποιο αντίστοιχο.. Αποτέλεσµα των παραπάνω ήταν: α) η ανεύρεση και η µελέτη της χρωµατογραφικής συµπεριφοράς των 2- ιµιδαζολινών, ώστε να είναι δυνατοί οι προσδιορισµοί των υπό ανάλυση ουσιών και β) να ευρεθεί το βέλτιστο χρωµατογραφικό σύστηµα που να διαχωρίζει τις δραστικές ουσίες µεταξύ τους και στη συνέχεια να πραγµατοποιηθεί ο ταυτόχρονος ποσοτικός προσδιορισµός τους. Στην πράξη, η επιλογή των συνθηκών ανάλυσης των 2-ιµιδαζολινών πραγµατοποιήθηκε, δοκιµάζοντας ως κινητές φάσεις, µίγµατα οργανικών διαλυτών µε διαφορετική πολικότητα, σε τέτοια σύνθεση, ώστε οι χρόνοι κατακράτησης των υπό ανάλυση ουσιών να είναι αναλυτικά αποδεκτοί και η συµµετρικότητα των κορυφών ικανοποιητική. οκιµάσθηκαν για το λόγο αυτό κινητές φάσεις µε βάση το δυαδικό µίγµα νερό-µεθανόλη σε διαφορετικές αναλογίες, ώστε να µεταβάλλεται σταδιακά η εκλουστική ικανότητα και η πολικότητα της κινητής φάσης. Έχοντας υπόψη, ότι στην ΥΧΥΑ η κατακράτηση επηρεάζεται από τη συγκέντρωση και το είδος των ιόντων του άλατος που προστίθενται στην κινητή φάση, από το ph της τελευταίας, καθώς και από τη θερµοκρασία της στήλης, θεωρήθηκε σκόπιµο να διερευνηθούν επιπλέον οι παράγοντες που επηρεάζουν την κατακράτηση των 2-ιµιδαζολινών. 3.4 ΕΠΙΛΟΓΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ Αρχικά δηµιουργήθηκε κινητή φάση µε διαλύτη το νερό 100%, διότι είναι ο πιο φθηνός διαλύτης και δεν επιβαρύνει τη στήλη. Για αυτό το λόγο προτιµάται ως το αρχικό διαλυτικό

75 µέσο, µε το οποίο ξεκινά µία αναλυτική µελέτη προσδιορισµού και διαχωρισµού δραστικών ουσιών. Η κινητή φάση µε 100% νερό έδωσε ευρείες κορυφές, χωρίς συµµετρικότητα και καθόλου ικανοποιητικούς χρόνους κατακράτησης. Για το λόγο αυτό δοκιµάστηκαν κινητές φάσεις µε βάση το δυαδικό µίγµα διαλυτών: νερό-µεθανόλη σε διάφορες αναλογίες v/v. Αρχικά δηµιουργήθηκε κινητή φάση µε αναλογία διαλυτών νερό-µεθανόλη 90/10 v/v. Στη συνέχεια αναπτύχθηκε µια σειρά χρωµατογραφικών συστηµάτων µε βάση το δυαδικό µίγµα των πιο πάνω διαλυτών, µε γνώµονα το τρίγωνο του Snyder και µε τέτοιο τρόπο ώστε να µεταβάλλεται σταδιακά η εκλουστική ικανότητα και η πολικότητα της κινητής φάσης. Έτσι δηµιουργήθηκαν διάφορα µίγµατα κινητής φάσης στα οποία αυξάνονταν κατά 5% v/v η αναλογία της µεθανόλης, ενώ αντίστοιχα µειώνονταν αυτή του νερού. Τελικά βρέθηκε ότι η καλύτερη αναλογία ήταν: νερό-µεθανόλη 50/50 v/v. Παρατηρήθηκε όµως ότι οι χρωµατογραφικές κορυφές ήταν ευρείες στη βάση, παρουσίαζαν ασυµµετρία και οι χρόνοι έκλουσης ήταν µεγαλύτεροι από τους επιθυµητούς. οκιµάστηκε λοιπόν η προσθήκη και τρίτου διαλύτη. Ο διαλύτης αυτός ήταν το ακετονιτρίλιο και ο οποίος, σύµφωνα µε το τρίγωνο του Snyder, βρίσκεται στην VIa οµάδα, δηλαδή στην άλλη πλευρά του τριγώνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η πολικότητα της κινητής φάσης µεταβάλλεται κατά πολύ. Αναπτύχθηκε έτσι µια σειρά χρωµατογραφικών συστηµάτων σε διάφορες αναλογίες %v/v, µε βάση το τριαδικό µίγµα των πιο πάνω διαλυτών, που όµως δεν απέδωσε συµµετρικές κορυφές και ικανοποιητικούς χρόνους. Η επόµενη προσπάθεια εστιάστηκε στην προσθήκη διαφόρων αλάτων όπως τα φωσφορικά, τα κιτρικά και τα οξικά άλατα. Η προσθήκη φωσφορικών αλάτων είχε ως αποτέλεσµα την εµφάνιση ιζήµατος στην κινητή φάση, γεγονός που οφείλεται στη µερική διαλυτοποίηση των αλάτων αυτών στο διαλύτη µεθανόλη. Ο κίνδυνος απόφραξης της αναλυτικής στήλης και των διόδων ροής των διαλυτών της κινητής φάσης ήταν σηµαντικός ανασταλτικός παράγοντας χρήσης ρυθµιστικών διαλυµάτων µε φωσφορικά. Το ίδιο αποτέλεσµα είχε και η προσθήκη κιτρικών αλάτων. Με βάση τα παραπάνω επιλέχθηκαν, µέσα από µια διερευνητική διαδικασία, τα οξικά άλατα και ειδικότερα τα εξής: το CH 3 COOK, το CH 3 COONa, το CH 3 COONH 4 και τέλος το (CH 3 COO) 2 Mg ως τα καταλληλότερα για τον προσδιορισµό των 2-ιµιδαζολινών σε διάφορες τιµές συγκεντρώσεων. Από τα οξικά αυτά άλατα, καλύτερα αποτελέσµατα έδωσε η προσθήκη οξικού αµµωνίου (CH 3 COONH 4 ) συγκέντρωσης 0,05 mol/l, ενώ η ρύθµιση του ph έγινε µε παγόµορφο οξικό οξύ, ώστε να µην επηρεαστεί το χηµικό περιβάλλον µε την προσθήκη ιόντων διαφορετικού άλατος. Ειδικότερα διαπιστώθηκε βελτίωση του χρόνου κατακράτησης των 2-

76 ιµιδαζολινών και της συµµετρικότητας των κορυφών. Η πλέον πιθανή ερµηνεία του φαινοµένου, είναι ότι τα άλατα παίζουν το ρόλο τροποποιητή και επηρεάζουν την κατανοµή της υπό ανάλυση ουσίας-φαρµάκου στη ρευστή στατική φάση. Κατά κύριο λόγο τα θετικά ιόντα του αµµωνίου σε όξινο ph ανταγωνίζονται την κατανοµή των υπό ανάλυση ουσιών στη στατική φάση και κατά δεύτερο καταλαµβάνουν τις ενεργές υδροξυλικές θέσεις αλληλεπίδρασης µεταξύ των 2-ιµιδαζολινών και της στατικής φάσης. Η ανάµιξη των ρυθµιστικών διαλυµάτων CH 3 COONH 4 CH 3 COOΗ ήταν πλήρης µε τους οργανικούς διαλύτες και έτσι αποφεύχθηκε η καθίζηση και ο σχηµατισµός ιζηµάτων. Είναι επίσης γνωστό ότι οι µεταβολές της θερµοκρασίας στη χρωµατογραφία αντίστροφης φάσης επηρεάζουν σηµαντικά τη διαλυτότητα, το συντελεστή κατακράτησης, το ιξώδες της κινητής φάσης και τέλος την αποτελεσµατικότητα της αναλυτικής στήλης. Συγκεκριµένα, αύξηση της θερµοκρασίας αυξάνει τη διαλυτότητα και παρέχει οξείες κορυφές, ενώ µειώνει το ιξώδες της κινητής φάσης. Αναφορικά µε το χρόνο κατακράτησης, αύξηση ή µείωση της θερµοκρασίας προκαλεί αντίστοιχα αύξηση ή µείωση του χρόνου κατακράτησης και επιτάχυνση ή επιβράδυνση της αναλυτικής διαδικασίας. Λαµβάνοντας λοιπόν υπόψη την επίδραση της θερµοκρασίας στους παραπάνω παράγοντες, θεωρήθηκε αναγκαίο να ρυθµιστεί η θερµοκρασία του πειράµατος µε αυτή του χώρου του εργαστηρίου (25 0 C), ώστε να µην επηρεάζεται η παράµετρος k. Με βάση τα όσα αναφέρθηκαν παραπάνω και έπειτα από δοκιµασίες κινητών φάσεων µε προσθήκη διαφορετικού κάθε φορά άλατος, καθώς και διαφορετικής αυτού συγκεντρώσεως σε διαφορετικές τιµές ph, µελετήθηκε η συµπεριφορά των 2-ιµιδαζολινών προτύπων διαλυµάτων. Οι χρωµατογραφικές συνθήκες ήταν οι ακόλουθες: 1. Κινητή φάση: α) Μίγµα υδατικού διαλύµατος CH 3 COOK-MeOH σε αναλογία 50/50 v/v, β) Μίγµα υδατικού διαλύµατος CH 3 COONa-MeOH σε αναλογία 50/50 v/v, γ) Μίγµα υδατικού διαλύµατος CH 3 COONH 4 -MeOH σε αναλογία 50/50 v/v, δ) Μίγµα υδατικού διαλύµατος (CH 3 COO) 2 Mg-MeOH σε αναλογία 50/50 v/v. 2. Ταχύτητα ροής κινητής φάσης: 1mL/min 3. Θερµοκρασία στήλης: Περιβάλλον 4. Ευαισθησία ανιχνευτή: 0,01 A.u.f.s.

77 5. Ταχύτητα καταγραφής: 2mm/min. 3.5 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ 2-ΙΜΙ ΑΖΟΛΙΝΩΝ Η πρώτη επιλογή κινητής φάσης ήταν αυτή µε αναλογία διαλυτών νερό µεθανόλη 65/35 v/v. Η υδατική φάση περιείχε και άλας οξικού αµµωνίου (CH 3 COONH 4 ) µε συγκέντρωση 0,05 mol/l (χαµηλή συγκέντρωση άλατος για να µην αυξάνεται η πίεση της στήλης). Επιλέχθηκαν να δοκιµαστούν κατά σειρά οι εξής δραστικές ουσίες: ξυλοµεταζολίνη, οξυµεταζολίνη, τολαζολίνη, ναφαζολίνη. Σε αυτές τις πειραµατικές συνθήκες ικανοποιητικά αποτελέσµατα έδωσε µόνο η ναφαζολίνη και για ph = 6,00, ενώ για τις υπόλοιπες 2-ιµιδαζολίνες οι χρόνοι έκλουσης ήταν ασταθείς, µε ευρείες κορυφές, γεγονός που καθιστούσε τη συνέχιση της µελέτης ανεδαφική. Για το λόγο αυτό θεωρήθηκε σκόπιµο να µεταβληθεί η αναλογία των διαλυτών, διατηρώντας σταθερά όλα τα υπόλοιπα πειραµατικά δεδοµένα, ώστε να επιτευχθούν καλύτερα αποτελέσµατα και για τις υπόλοιπες 2-ιµιδαζολίνες. Σχήµα 3.5.1: Χρωµατογράφηµα προτύπου διαλύµατος οξυµεταζολίνης. ιατηρώντας ίδια τα άλλα πειραµατικά δεδοµένα και µεταβάλλοντας µόνο την αναλογία των διαλυτών δηµιουργήθηκε µία νέα κινητή φάση µε αναλογία διαλυτών νερό µεθανόλη 60/40 v/v. Με αυτή τη φάση δοκιµάστηκε πρώτα η οξυµεταζολίνη σε ph = 6,44 (προσθήκη οξικού οξέος) και οι µετρήσεις επιλέχθηκε να γίνουν στο µέγιστο µήκος κύµατος (λ max = 284 nm) της ουσίας, διότι στο λ max έχουµε τη µεγαλύτερη ευαισθησία και εκλεκτικότητα. Η θερµοκρασία ήταν αυτή του περιβάλλοντος (Τ = 25 0 C). Παρατηρήθηκε ότι ο χρόνος έκλουσης της ουσίας δεν είχε επαναληψιµότητα, σύµφωνα µε το Σχήµα

78 Σχήµα 3.5.2: Χρωµατογραφήµατα προτύπων διαλυµάτων οξυµεταζολίνης χωρίς επαναληψιµότητα του t R. Το επόµενο βήµα ήταν να διατηρηθεί η θερµοκρασία του πειράµατος σταθερή µέσω του θερµοστατούµενου φούρνου στους 40 0 C. Με βάση τις καινούργιες πειραµατικές συνθήκες που προέκυψαν (Τ = 40 0 C, λ max = 284 nm, ph = 6,44) οι χρόνοι έκλουσης της οξυµεταζολίνης ήταν: t R1 = 22,963 min, t R2 = 23,133 min, t R3 = 23,318 min και t R4 = 23,365 min. Όπως γίνεται αντιληπτό, οι πιο πάνω χρόνοι δεν προσφέρονται για περαιτέρω µελέτη και επεξεργασία, γιατί ήταν πολύ µεγάλοι. Εν συνεχεία δοκιµάστηκαν και οι υπόλοιπες ιµιδαζολίνες, χωρίς όµως κάποια από αυτές να παρουσιάσει αναλυτικό ενδιαφέρον.

79 Σχήµα 3.5.3: Χρωµατογραφήµατα προτύπων διαλυµάτων οξυµεταζολίνης (t R1 = 22,963, t R2 = 23,133, t R3 = 23,318 και t R4 = 23,365 min). Λύση στο παραπάνω πρόβληµα επιχειρήθηκε να δοθεί µε την αλλαγή του ph. Σε αυτή τη φάση δοκιµάστηκε πρώτα η ξυλοµεταζολίνη σε ph = 4,00 (προσθήκη οξικού οξέος) και οι µετρήσεις επιλέχθηκε να γίνουν στο µέγιστο µήκος κύµατος (λ max = 266 nm) της ουσίας. Η θερµοκρασία ήταν αυτή του εργαστηρίου (Τ = 25 0 C). Παρατηρήθηκε ότι ο χρόνος έκλουσης της ουσίας δεν είχε επαναληψιµότητα, όπως φαίνεται στα παρακάτω χρωµατογραφήµατα. Για µια ακόµη φορά τα αποτελέσµατα δεν ήταν καθόλου ενθαρρυντικά και η όλη προσπάθεια επικεντρώθηκε στην εκ νέου αλλαγή της κινητής φάσης.

80 Σχήµα 3.5.4: Χρωµατογραφήµατα προτύπων διαλυµάτων ξυλοµεταζολίνης (t R1 = 5,752, t R2 = 25,822, και t R3 = 41,317 min). Κατόπιν διερεύνησης βρέθηκε, ότι η πιο κατάλληλη κινητή φάση ήταν αυτή µε αναλογία διαλυτών: νερό-µεθανόλη 50/50 v/v, ως η ιδανικότερη όλων για τη δηµιουργία του χρωµατογραφικού εκείνου συστήµατος, που θα επέτρεπε τον προσδιορισµό των εννέα (9) 2- ιµιδαζολινών, είτε µεµονωµένα, είτε σε µίγµα. Αρχικά, δοκιµάσθηκε η ξυλοµεταζολίνη για ph = 6,41, συγκέντρωση C = 184,64 µg/ml, λ = 266 nm, θερµοκρασία περιβάλλοντος και ταχύτητα ροής 1mL/min. Στη συνέχεια δοκιµάσθηκαν κατά σειρά και µεµονωµένα οι εννέα ιµιδαζολίνες του πειράµατος, ώστε να επιβεβαιωθεί και πειραµατικά η επιλογή του ιδανικού χρωµατογραφικού συστήµατος που

81 δηµιουργήθηκε µε βάση την αναλογία διαλυτών νερό/µεθανόλη: 50/50 v/v. Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων είναι αυτά που φαίνονται στον Πίνακα Πίνακας 3.5.1: Αποτελέσµατα µελέτης ΥΧΥΑ για τις 2-ιµιδαζολίνες. Α/Α ΡΑΣΤΙΚΗ ΟΥΣΙΑ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ph λ max Τ( 0 C) t R (min) C µg/ml 1. Ξυλοµεταζολίνη 184,64 µg/ml 6, C 18, Οξυµεταζολίνη 60,80 µg/ml 6, C 11, Τολαζολίνη 59,44 µg/ml 6, C 2, Ναφαζολίνη 3,50 µg/ml 6, C 4, Κλονιδίνη 18,40 µg/ml 6, C 2, Ανταζολίνη 15,60 µg/ml 6, C 9, Φενοξαζολίνη 15,44 µg/ml 6, C 9, Τυµαζολίνη 46,56 µg/ml 6, C 13, Τραµαζολίνη 33,60 µg/ml 6, C 5,300 Όπως γίνεται αντιληπτό από τα δεδοµένα του Πίνακα 3.5.1, µε τη συγκεκριµένη κινητή φάση κατέστη δυνατό να ανιχνευθούν όλες οι υπό µελέτη δραστικές ουσίες, µέσα σε αποδεκτούς αναλυτικούς χρόνους και µε καλή συµµετρικότητα κορυφών. Επιπρόσθετα, έχοντας υπόψη, ότι στην ΥΧΥΑ η κατακράτηση επηρεάζεται από τη συγκέντρωση και το είδος των ιόντων του άλατος που προστίθενται στην κινητή φάση, καθώς και από το ph της, θεωρήθηκε σκόπιµο να διερευνηθούν επιπλέον οι παράγοντες που επηρεάζουν την κατακράτηση των 2-ιµιδαζολινών. Με βάση τα παραπάνω επιλέχθηκαν, µέσα από µια διερευνητική διαδικασία, τα εξής άλατα: το CH 3 COOK, το CH 3 COONa, το CH 3 COONH 4 και τέλος το (CH 3 COO) 2 Mg ως τα καταλληλότερα για τον προσδιορισµό των 2-ιµιδαζολινών σε διάφορες τιµές συγκεντρώσεων. Είναι πιθανόν τα άλατα να παίζουν το ρόλο τροποποιητή και να επηρεάζουν την κατανοµή της υπό ανάλυση ουσίας-φαρµάκου στην κινητή φάση µε συνέπεια τη βελτίωση του χρόνου κατακράτησης των 2-ιµιδαζολινών, καθώς και της συµµετρικότητας των κορυφών. Η επίδραση της τιµής του ph της υδατικής κινητής φάσης αποτέλεσε ένα ακόµη σηµείο διερεύνησης. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκαν διάφορα συστήµατα διαλυµάτων των 2-

82 ιµιδαζολινών µε κινητές φάσεις που είχαν διαφορετική τιµή ph κάθε φορά. Η ρύθµιση του εκάστοτε ph γινόταν µε προσθήκη παγόµορφου CH 3 COOH, ώστε να µην επηρεαστεί το χηµικό περιβάλλον µε την προσθήκη ιόντων διαφορετικού άλατος. Από τα αποτελέσµατα διαπιστώθηκε ότι οι συντελεστές κατακράτησης παρουσιάζουν ανάλογα υψηλές τιµές για υψηλές τιµές ph στην περιοχή 6,09-4,80, που σηµαίνει ότι ο ιονισµός των 2-ιµιδαζολινών όπως και στην µελέτη της ναφαζολίνης είναι περιορισµένος, αφού στην κινητή φάση βρίσκονται κυρίως τα αδιάστατα µόρια της κάθε ουσίας. Όταν αντίθετα το ph βρίσκεται στην περιοχή τιµών 4,07-3,20, τότε ο ιονισµός της υπό ανάλυση ουσίας είναι σχεδόν πλήρης και οι χρόνοι έκλουσης είναι αρκετά µικροί. Στο σηµείο αυτό αξίζει να τονιστεί ότι για το σύνολο των υπό µελέτη αλάτων-εύρος τιµών ph από 4,80 έως και 4,07-δεν υπήρξε κάποια σηµαντική µεταβολή των τιµών του συντελεστή κατακράτησης k. i. Α και Β Μίγµα ιµιδαζολινών σε ph 4,80 και ph 5,50: Α Μίγµα ιµιδαζολινών σε ph 4,80 Α Μίγµα ιµιδαζολινών σε ph 5,50 Β Μίγµα ιµιδαζολινών σε ph 4,80 Β Μίγµα ιµιδαζολινών σε ph 5,50 ii. Α και Β Μίγµα ιµιδαζολινών σε ph 3,20 και ph 4,07:

83 Α Μίγµα ιµιδαζολινών σε ph 3,20 Α Μίγµα ιµιδαζολινών σε ph 4,07 Β Μίγµα ιµιδαζολινών σε ph 3,20 Β Μίγµα ιµιδαζολινών σε ph 4,07 Η απεικόνιση της χρωµατογραφικής συµπεριφοράς των 2-ιµιδαζολινών για κάθε άλας χωριστά, µε τη µέθοδο της µη γραµµικής πολλαπλής συσχέτισης σε τρισδιάστατα διαγράµµατα επιβεβαίωσε τα πειραµατικά δεδοµένα. Ο συντελεστής συσχέτισης υπολογίστηκε µε βάση τη συγκέντρωση του κάθε άλατος συγκριτικά µε τις τιµές ph. Στη συνέχεια παρουσιάζονται χαρακτηριστικά παραδείγµατα τριών 2-ιµιδαζολινών σε τρισδιάστατα απεικόνιση και πιο συγκεκριµένα: της ξυλοµεταζολίνης, της τολαζολίνης και της τραµαζολίνης. Στα διαγράµµατα αυτά µπορεί κανείς να παρατηρήσει, την παρόµοια συµπεριφορά µεταξύ των τριών αυτών 2-ιµιδαζολινών, σε συνάρτηση µε τη µεταβολή της κινητής φάσης µε την προσθήκη διαφορετικού κάθε φορά άλατος, καθώς και διαφορετικής αυτού συγκεντρώσεως σε διαφορετικές τιµές ph. Με τον τρόπο αυτό επιβεβαιώνεται και η ακολουθία των αποτελεσµάτων της ναφαζολίνης, η οποία και αποτέλεσε τον οδηγό για τη µελέτη της χρωµατογραφικής συµπεριφοράς των 2-ιµιδαζολινών.

84 Σχήµα 3.5.5: Μελέτη χρωµατογραφικής συµπεριφοράς της τολαζολίνης σε συνάρτηση µε α) το ph της υδατικής φάσης και β) τη συγκέντρωση του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } µε τη µέθοδο της µη γραµµικής πολλαπλής συσχέτισης. Τολαζολίνη µε χρησιµοποίηση του άλατος CH 3 COONH 4 0,44 0,42 0,40 0,38 0,36 k' 0,34 0,32 0,30 0,28 0,26 0,24 0,22 6,0 5,5 ph 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 0,00 0,02 0,04 0,06 M Άλατος 0,08 0,10 0,12 Ο συντελεστής συσχέτισης βρέθηκε να έχει την τιµή 0,957. Η εξίσωση παλινδρόµησης είναι: z = 0,1309 0,1526x + 0,0460y, όπου x και y είναι οι τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών της συγκέντρωσης του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } και ph αντίστοιχα, ενώ z είναι οι τιµές της εξαρτηµένης µεταβλητής k (συντελεστής κατακράτησης).

85 Σχήµα 3.5.6: Μελέτη χρωµατογραφικής συµπεριφοράς της ξυλοµεταζολίνης σε συνάρτηση µε α) το ph της υδατικής φάσης και β) τη συγκέντρωση του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } µε τη µέθοδο της µη γραµµικής πολλαπλής συσχέτισης. Ξυλοµεταζολίνη µε χρησιµοποίηση του άλατος CH 3 COONH 4 10,0 9,5 9,0 k' 8,5 8,0 7,5 5,5 ph 5,0 4,5 4,0 0,06 0,08 0,10 3,5 0,02 0,04 M Άλατος Ο συντελεστής συσχέτισης βρέθηκε να έχει την τιµή 0,962. Η εξίσωση παλινδρόµησης είναι: z = 6, ,6056x + 0,5575y, όπου x και y είναι οι τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών της συγκέντρωσης του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } και ph αντίστοιχα, ενώ z είναι οι τιµές της εξαρτηµένης µεταβλητής k (συντελεστής κατακράτησης).

86 Σχήµα 3.5.7: Μελέτη χρωµατογραφικής συµπεριφοράς της τραµαζολίνης σε συνάρτηση µε α) το ph της υδατικής φάσης και β) τη συγκέντρωση του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } µε τη µέθοδο της µη γραµµικής πολλαπλής συσχέτισης. Τραµαζολίνη µε χρησιµοποίηση του άλατος CH 3 COONH 4 2,2 2,1 2,0 1,9 k' 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 6 ph ,00 0,02 0,04 0,06 M Άλατος 0,08 0,10 0,12 Ο συντελεστής συσχέτισης βρέθηκε να έχει την τιµή 0,979. Η εξίσωση παλινδρόµησης είναι: z = 0,9418 1,1480x + 0,1924y, όπου x και y είναι οι τιµές των ανεξάρτητων µεταβλητών της συγκέντρωσης του άλατος {Μ ΆΛΑΤΟΣ } και ph αντίστοιχα, ενώ z είναι οι τιµές της εξαρτηµένης µεταβλητής k (συντελεστής κατακράτησης).

87 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΜΕΛΕΤΗ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ-ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ- ΞΥΛΟΜΕΤΑΖΟΛΙ- ΝΗΣ ΜΕ ΥΧΥΑ Στο Κεφάλαιο αυτό αναπτύχθηκε χρωµατογραφική µέθοδος ποσοτικού προσδιορισµού της ναφαζολίνης, ανταζολίνης και ξυλοµεταζολίνης παρουσία του συντηρητικού χλωριούχου βενζεθονίου (benzethonium chloride). Η µεθοδολογία για τον ταυτόχρονο διαχωρισµό της κάθε δραστικής ουσίας µε ΥΧΥΑ βασίστηκε σε στήλη ACE C 18 5µm (150x4,6)mm και κινητή φάση υδατικό διάλυµα οξικού αµµωνίου CH 3 COONH 4 0,01 mol/l σε ph=6,00 νερό:µεθανόλη 50/50v/v, ενώ ο διαχωρισµός των αντίστοιχων δραστικών, παρουσία του χλωριούχου βενζεθονίου και εξαιτίας της υδροφοβικότητάς του, επετεύχθη µε χρήση στήλης ACE CN 5µm (150x4,6). Η όλη διαδικασία εφαρµόστηκε µε την ίδια επιτυχία αποτελεσµάτων, τόσο για τις καθαρές δραστικές, όσο και για εµπορικό σκεύασµα (Zincfrin ). Τα αποτελέσµατα που ελήφθησαν από την προτεινόµενη µέθοδο, είναι δυνατόν να χρησιµοποιηθούν για αναλύσεις καθηµερινότητας σε µίγµατα. 4.2 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Φαρµακολογική δράση Η ξυλοµεταζολίνη και η ναφαζολίνη είναι αγγειοσυσταλτικά φάρµακα που συχνά συνδυάζονται µε ένα αντιισταµινικό 69, όπως η ανταζολίνη, για να ανακουφίσουν τους οφθαλµούς από τα δυσάρεστα συµπτώµατα των αλλεργιών. Σε µερικά κολλύρια, η σταθερότητα αυτού του συνδυασµού επιτυγχάνεται µε την προσθήκη µικρών ποσοτήτων (0,01-0,05%), του συντηρητικού χλωριούχου βενζεθονίου. Η βιβλιογραφική έρευνα αποκαλύπτει, ότι λίγες αναλυτικές µέθοδοι έχουν αναφερθεί για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό αυτού του µίγµατος ουσιών.οι µέθοδοι αυτοί περιλαµβάνουν ΥΧΥΑ αντίστροφης και κανονικής φάσης, Αέριο Χρωµατογραφία καθώς και τη µέθοδο Micelle-Stabilizer Room Temperature Phosphorimetric Method (MS-RTP) Καµία επίσηµη µεθοδολογία ανάλυσης δεν αναφέρεται στις διάφορες Φαρµακοποιίες για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό της ανταζολίνης µε την ναφαζολίνη ή την ξυλοµεταζολίνη σε συνδυασµό µε το βενζεθόνιο. Για το λόγο αυτό, η προτεινόµενη χρωµατογραφική τεχνική προσφέρει πρακτικά, αλλά και οικονοµικά πλεονεκτήµατα σε σχέση µε άλλες µεθόδους και αποτελεί µέθοδο επιλογής των

88 αντίστοιχων φαρµακευτικών σκευασµάτων (δισκίων) σε αναλύσεις καθηµερινότητας, όπως έλεγχος διαλυτοποίησης (dissolution) και έλεγχος οµοιοµορφίας δόσης (dose uniformity). 4.3 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Όργανα και σκεύη Ο χρωµατογραφικός εξοπλισµός συνίσταται από ένα σύστηµα παροχής διαλύτη µε δύο αντλίες πιέσεως (µοντέλο LC-20AD) και αυτόµατο δειγµατολήπτη µοντέλο SIL-10ADVP µε όγκο έγχυσης τα 25 µl, του οίκου Shimadzu Instruments Corporation, Kyoto-Japan. Η ανίχνευση του σήµατος γινόταν µέσω οργάνου συστάδας διόδων (Diode Array Detector) µοντέλο SPD-M20A, σε µήκη κύµατος 210, 240 και 280 nm αντίστοιχα. Οι χρωµατογραφικές κορυφές καταγράφονταν σε εκτυπωτή HP µοντέλο 940c και επεξεργάζονταν αυτόµατα από λογισµικό LC solution (S/NL S7), του οίκου Shimadzu Instruments Corporation, Kyoto-Japan. Χρησιµοποιήθηκε θερµοστατούµενος φούρνος στήλης (µοντέλο CTO-6A) για τη ρύθµιση της θερµοκρασίας της στήλης. Χρησιµοποιήθηκε ρυθµιστής πιέσεως, µοντέλο DGU-14A, για τη ρύθµιση του ποσού του αερίου ηλίου που διοχετεύονταν στην κινητή φάση. Όλη η οργανολογία ήταν του οίκου Shimadzu Instruments Corporation, Kyoto-Japan. Για το διαχωρισµό των δραστικών χρησιµοποιήθηκαν δύο στήλες: µία στήλη ACE C 18 αντιστρόφου φάσης, ενώ η παρουσία του χλωριούχου βενζεθονίου επέβαλλε τη χρήση στήλης CN 5 µm, 150 x 4,6 mm. Πεχάµετρο ακριβείας 0,01, τύπου PHM 63, Radiometer Analytical, Cedex-France. Αναλυτικός ζυγός Sartorius Λουτρό υπερήχων (Ultrasonic bath) της εταιρείας Bransonic 220. Συσκευή µαγνητικής ανάδευσης Heidolph. 4.4 ΕΠΙΛΟΓΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ Η βελτιστοποίηση των χρωµατογραφικών συνθηκών σε στήλη C 18 πραγµατοποιείται µε την αλλαγή των ρυθµιστικών διαλυµάτων σε διαφορετικά ph, επιτυγχάνοντας έτσι διαφορετικούς χρόνους κατακράτησης (συντελεστής κατακράτησης k ) και διαχωριστικής ικανότητας (R s ) των προσδιοριζόµενων φαρµακευτικών ουσιών. Επιπλέον κριτήριο επιλογής των κατάλληλων διαλυτών στην κινητή φάση, είναι να δηµιουργηθούν οι συνθήκες εκείνες που θα επιτρέψουν τον σαφή διαχωρισµό των δραστικών ουσιών µεταξύ τους, ναφαζολίνη-

89 ανταζολίνη-ξυλοµεταζολίνη, ενώ παράλληλα να επιτευχθεί συµµετρία των χρωµατογραφικών κορυφών τους (παράγοντας ασυµµετρίας Α s ). Οι παράγοντες αυτοί απαιτείται να διερευνηθούν µε απώτερο σκοπό να τελειοποιηθεί η εκλεκτικότητα της µεθόδου. Για το λόγο αυτό επιλέχθηκε να εφαρµοστούν εγχύσεις της κάθε δραστικής ξεχωριστά στην αναλυτική στήλη, µε διαφορετική κάθε φορά κινητή φάση και ταχύτητα ροής 1,2 ml/min. οκιµάζοντας λοιπόν ποικίλους συνδυασµούς κινητής φάσης βρέθηκε µέσα από την εν λόγω αναλυτική διαδικασία (Κεφάλαιο 3), ότι µε σύσταση διαλυτών νερό/µεθανόλη η παρουσία του οξικού αµµωνίου σε συγκέντρωση 0,01 mol/l και τιµή ph=6,00, παίζει σηµαντικό ρόλο στην βελτίωση της συµµετρικότητας των χρωµατογραφικών κορυφών. Θεωρητικά, ο ιονισµός των φαρµάκων µε βασικές ιδιότητες, αυξάνει την ικανότητα έκλουσης σε χαµηλές τιµές ph, ενώ µειώνεται σε υψηλές τιµές ph και το αντίθετο. Με βάση την ιδιαιτερότητα κάθε δραστικής ουσίας η οποία υπόκειται σε ανάλυση, η επίδραση του ph φαίνεται να ποικίλει. Επιπρόσθετα, η επίδραση του ph για τις κινητές φάσεις που διερευνήθηκαν στη συγκεκριµένη µελέτη, δεικνύει ότι αλλαγές στην τιµή του ph από 3 έως και 7, δεν επηρεάζουν σηµαντικά το χρόνο κατακράτησης των δραστικών ουσιών ναφαζολίνη, ανταζολίνη και ξυλοµεταζολίνη. Χρησιµοποιώντας στήλη ACE C 18 5µm (150x4,6)mm και µε την παρουσία µιας λιποφοβικής ουσίας, όπως το βενζεθόνιο (logp= 4,82), αυξάνεται δραµατικά ο χρόνος κατακράτησης του φαρµάκου, κάτι το οποίο καθιστά την ανάλυσή του πρακτικά αδύνατη. Επιπλέον, συγκέντρωση µεθανόλης µεγαλύτερη του 90% στην κινητή φάση δίνει ικανοποιητικούς χρόνους για το βενζεθόνιο, αλλά µειώνει σηµαντικά το συντελεστή R s για τις άλλες τρεις δραστικές. Το πρόβληµα αυτό µπορεί να αντιµετωπιστεί µε τη χρησιµοποίηση στήλης αντιθέτου φυσικοχηµικής συµπεριφοράς, όπως η στήλη κυανίου (-CN). Πράγµατι, ο διαχωρισµός ναφαζολίνης, ανταζολίνης και βενζεθονίου µπορεί να επιτευχθεί ικανοποιητικά σε µία στήλη κυανίου, γιατί είναι πολικότερη από µια στήλη C 18. Τελικά, λαµβάνοντας σοβαρά υπόψη τα πλήρη φάσµατα υπεριώδους όλων των αναλυόµενων ουσιών στην κινητή φάση, θεωρήθηκε το µήκος κύµατος των 210 nm, ως το πλέον κατάλληλο για τις ταυτόχρονες µετρήσεις και τους προσδιορισµούς τους. Βέβαια, χρησιµοποιώντας έναν ανιχνευτή πολλαπλών µηκών κύµατος (multi-wavelength detector), το λ max για κάθε δραστική χωριστά κρίνεται επίσης αποτελεσµατικό.

90 Έτσι, η συγκεκριµένη µελέτη µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως ένας καλός οδηγός για τον ταυτόχρονο, αλλά και τον επιµέρους προσδιορισµό των δραστικών ουσιών ναφαζολίνης, ανταζολίνης, ξυλοµεταζολίνης και βενζεθονίου σε διάφορους µεταξύ τους συνδυασµούς, µε την ΥΧΥΑ. 4.5 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΗΤΡΙΚΩΝ ΙΑΛΥΜΑΤΩΝ Ζυγίσθηκαν επακριβώς 0,0930g ανταζολίνης, 0,0522g ναφαζολίνης 0,0530g ξυλοµεταζολίνης και 0,0329g βενζεθονίου. Όλα µεταφέρθηκαν σε ογκοµετρική φιάλη των 100mL, όπου και αραιώθηκαν µε µεθανόλη. Ακολούθησαν δύο ακόµη αραιώσεις µε διαλύτη το νερό και έτσι δηµιουργήθηκαν τέσσερις (4) σειρές προτύπων (standards) διαλυµάτων, τα οποία συντέλεσαν στην δηµιουργία των αντίστοιχων καµπύλων αναφοράς. Κατάλληλες ποσότητες από τα παραπάνω µητρικά διαλυµάτα µεταφέρθηκαν σε δύο(2) διαφορετικές φιάλες των 50 ml όπου και αραιώθηκαν µε µεθανόλη. Έτσι, δηµιουργήθηκαν δύο ενδιάµεσα µικτά διαλύµατα µε τους αντίστοιχους παρόµοιους συνδυασµούς δραστικών ουσιών που προσφέρονταν για τις αναλύσεις ΥΧΥΑ. Από αυτά παρασκευάσθηκαν έξη (6) θυγατρικά διαλύµατα και οι συγκεντρώσεις, ήταν οι εξής: ναφαζολίνη από 2,506 έως 18,792 µg/ml, ανταζολίνη από 23,808 έως 178,56 µg/ml, ξυλοµεταζολίνη από 2,544 έως 19,080 µg/ml και βενζεθόνιο από 1,272 έως 7,632 µg/ml. Αρχικά, µελετήθηκε η χρωµατογραφική συµπεριφορά των τριών δραστικών (ανταζολίνη, ναφαζολίνη και ξυλοµεταζολίνη), ώστε να βρεθεί το κατάλληλο χρωµατογραφικό σύστηµα που θα τις διαχωρίζει και θα τις προσδιορίζει ικανοποιητικά σε µίγµα, ενώ στη συνέχεια µελετήθηκαν η ανταζολίνη και η ναφαζολίνη παρουσία του συντηρητικού χλωριούχου βενζεθονίου. 4.6 ΜΕΛΕΤΗ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΞΥΛΟΜΕΤΑΖΟΛΙ- ΝΗΣ Το ισοκρατικό σύστηµα που εφαρµόστηκε για τον προσδιορισµό των δραστικών ανταζολίνης-ναφαζολίνης-ξυλοµεταζολίνης αποτελούνταν από υδατική φάση, που περιείχε άλας οξικού αµµωνίου (CH 3 COONH 4 ) σε συγκέντρωση 0,01 mol/l µεθανόλη (50:50 v/v, ph=6,00), ενώ η ταχύτητα ροής ήταν 1,2 ml/min. Για το διαχωρισµό της κάθε δραστικής ουσίας χρησιµοποιήθηκε στήλη ACE C 18 5µm (150x4,6)mm, θερµοστατούµενη στους 40 ο C (Σχήµα 1).

91 mau 210nm,4nm (1.00) /1.888 naphazoline/2.570 antazoline/4.816 /7.268 xylometazoline/ min Σχήµα 1: Χρωµατογραφήµατα προτύπων διαλυµάτων: ναφαζολίνης (t R =2,570), ανταζολίνης (t R =4,816) και ξυλοµεταζολίνης (t R =11,433). Οι συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων των τριών δραστικών ουσιών, που χρησιµοποιήθηκαν για τη χάραξη καµπύλων αναφοράς, καθώς και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους στα συγκεκριµένα µήκη κύµατος, παρουσιάζονται ακολούθως: Ειδικότερα, στον Πίνακα 1 αναφέρονται οι συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων της ναφαζολίνης µε τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους, για λ = 265,0 nm. Πίνακας 1: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Ναφαζολίνη λ = 265,0 nm 1 2,

92 2 3, , , , , Η στατιστική επεξεργασία των αριθµητικών δεδοµένων του Πίνακα 1 έδειξε γραµµική εξάρτηση µεταξύ των συγκεντρώσεων των προτύπων διαλυµάτων της ναφαζολίνης και των αντίστοιχων εµβαδών των χρωµατογραφικών κορυφών και παρείχε την ακόλουθη εξίσωση παλινδρόµησης µε την αντίστοιχη καµπύλη αναφοράς: 5,E+05 5,E+05 Καµπύλη Αναφοράς Προτύπων ιαλυµάτων Ναφαζολίνης στα 265,0 nm. Εµβαδά Κορυφών 4,E+05 4,E+05 3,E+05 3,E+05 2,E+05 2,E+05 1,E+05 5,E+04 0,E+00 y = 23711x ,3 R 2 = 0, Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα 1: Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε τα εµβαδά κορυφών τους (Y) σε λ = 265,0 nm. Αντίστοιχα, οι συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων της ανταζολίνης, που χρησιµοποιήθηκαν για τη χάραξη καµπύλων αναφοράς, καθώς και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους στα συγκεκριµένα µήκη κύµατος, παρουσιάζονται στον Πίνακα 2 που ακολουθεί:

93 Πίνακας 2: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Ανταζολίνη λ = 205,0 nm λ = 210,0 nm 1 23, , , , , , Η στατιστική επεξεργασία των αριθµητικών δεδοµένων του Πίνακα 2 στα µήκη κύµατος που επιλέχθηκαν (205,0 nm και 210,0 nm), έδειξε γραµµική εξάρτηση µεταξύ των συγκεντρώσεων των προτύπων διαλυµάτων της ανταζολίνης και των αντίστοιχων εµβαδών των χρωµατογραφικών κορυφών και παρείχε την ακόλουθη εξίσωση παλινδρόµησης µε την αντίστοιχη καµπύλη αναφοράς: 2,E+07 2,E+07 Καµπύλη Αναφοράς Προτύπων ιαλυµάτων Ανταζολίνης στα 205,0 nm. Εµβαδά Κορυφών 1,E+07 1,E+07 1,E+07 8,E+06 6,E+06 4,E+06 2,E+06 0,E+00 y = 93455x R 2 = 0, Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα 2: Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης σε συνάρτηση µε τα εµβαδά κορυφών τους (Y) σε λ = 205,0 nm.

94 2,E+07 Καµπύλη Αναφοράς Προτύπων ιαλυµάτων Ανταζολίνης στα 210,0 nm. 1,E+07 Εµβαδά Κορυφών 1,E+07 1,E+07 8,E+06 6,E+06 4,E+06 y = 76979x R 2 = 0,9878 2,E+06 0,E Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα 3: Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης σε συνάρτηση µε τα εµβαδά κορυφών τους (Y) σε λ = 210,0 nm. Τέλος, οι συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων της ξυλοµεταζολίνης, που χρησιµοποιήθηκαν για τη χάραξη καµπύλων αναφοράς, καθώς και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους στα συγκεκριµένα µήκη κύµατος, παρουσιάζονται ακολούθως: Πίνακας 3: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή προτύπων διαλυµάτων ξυλοµεταζολίνης και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Ξυλοµεταζολίνη λ = 205,0 nm λ = 210,0 nm 1 2, , , , , ,

95 Η στατιστική επεξεργασία των αριθµητικών δεδοµένων του Πίνακα 3 έδειξε γραµµική εξάρτηση µεταξύ των συγκεντρώσεων των προτύπων διαλυµάτων της ξυλοµεταζολίνης και των αντίστοιχων εµβαδών των χρωµατογραφικών κορυφών και παρείχε την ακόλουθη εξίσωση παλινδρόµησης µε την αντίστοιχη καµπύλη αναφοράς: 3,E+06 Καµπύλη Αναφοράς Προτύπων ιαλυµάτων Ξυλοµεταζολίνης στα 205,0 nm. 2,E+06 Εµβαδά Κορυφών 2,E+06 1,E+06 5,E+05 y = x ,4 R 2 = 0,9999 0,E Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα 4: Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ξυλοµεταζολίνης σε συνάρτηση µε τα εµβαδά κορυφών τους (Y) σε λ = 205,0 nm. 2,E+06 Καµπύλη Αναφοράς Προτύπων ιαλυµάτων Ξυλοµεταζολίνης στα 210,0 nm. 1,E+06 Εµβαδά Κορυφών 1,E+06 1,E+06 8,E+05 6,E+05 4,E+05 y = 77066x + 803,89 R 2 = 0,9997 2,E+05 0,E Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα 5: Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ξυλοµεταζολίνης σε συνάρτηση µε τα εµβαδά κορυφών τους (Y) σε λ = 210,0 nm.

96 Τα χαρακτηριστικά των καµπύλων αναφοράς για την κάθε προσδιοριζόµενη ουσία, στα διάφορα µήκη κύµατος που µελετήθηκαν, παρουσιάζονται στον Πίνακα 4 που ακολουθεί: Πίνακας 4: Στατιστικά παλινδρόµησης προτύπων διαλυµάτων των δραστικών ουσιών ανταζολίνης ναφαζολίνης ξυλοµεταζολίνης κατά τον προσδιορισµό τους µε ΥΧΥΑ. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΑ ΠΑΛΙΝ ΡΟΜΗΣΗΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗ ΞΥΛΟΜΕΤΑΖΟΛΙΝ Η ΝΑΦΑΖΟΛΙ ΝΗ 205,0nm 210,0nm 205,0nm 210,0nm 265,0nm Πολλαπλό r 0,9999 0,9939 0,9999 0,9998 0,9998 R 2 0,9999 0,9878 0,9999 0,9997 0,9997 Τυπικό Σφάλµα Τοµή ,4 803, ,3 Κλίση LOD(µg/mL) 1,505 4,862 0,223 0,398 0,392 LOQ(µg/mL) 4,560 14,733 0,676 1,205 1,189 τύπου: Η επεξεργασία των τιµών των µεταβλητών παρείχε τις εξισώσεις παλινδρόµησης του Ανταζολίνη : για λ = 205,0 nm y = 93455x και R 2 = 0,9999 για λ = 210,0 nm y = 76979x και R 2 = 0,9878 Ξυλοµεταζολίνη : για λ = 205,0 nm y = x 8567,4 και R 2 = 0,9999 για λ = 210,0 nm y = 77066x + 803,89 και R 2 = 0,9997 Ναφαζολίνη : για λ = 265,0 nm y = 23711x 2620,3 και R 2 = 0,9997 Όπως φαίνεται στις παραπάνω σχέσεις, η τιµή του R 2 επιβεβαιώνοντας τη γραµµική συσχέτιση των αποτελεσµάτων. πλησιάζει τη µονάδα

97 4.7 ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ Για το έλεγχο αξιοπιστίας της µεθόδου, παρασκευάσθηκε µια σειρά µικτών δειγµάτων των τριών δραστικών στο εργαστήριο, σε διάφορες συγκεντρώσεις και στη συνέχεια θεωρώντας τα σαν άγνωστα επαναπροσδιορίστηκαν. ΕΙΓΜΑ C ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ (µg/ml) 23,808 35,712 47,616 59,520 71, ,56 C ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ (µg/ml) 3,758 5,011 6,264 7,517 18,792 2,506 C ΞΥΛΟΜΕΤΑΖΟΛΙΝΗΣ (µg/ml) 5,088 6,360 7,632 19,080 2,544 3,816 Οι συγκεντρώσεις των µικτών δειγµάτων, που χρησιµοποιήθηκαν για τον έλεγχο της επί τοις εκατό(%) ανάκτησης, καθώς και τα αντίστοιχα εµβαδά σε συγκεκριµένα µήκη κύµατος για την κάθε δραστική, αναφέρονται στον επόµενο πίνακα: Πίνακας 1: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή µικτών δειγµάτων ανταζολίνης και τα αντίστοιχα εµβαδά τους σε συγκεκριµένα µήκη κύµατος. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Ανταζολίνη λ = 205,0 nm λ = 210,0 nm 1 23, , , , , , Τέλος, η µελέτη ελέγχου ακρίβειας της µεθόδου έγινε στα µικτά δείγµατα, όπου και υπολογίστηκαν οι % τιµές ανάκτησης της ανταζολίνης (Πίνακες 2, 3).

98 Πίνακας 2: % Ευρεθέν ποσοστό ανταζολίνης στο µικτό δείγµα σε λ = 205,0 nm. Εµβαδόν κορυφής ανταζολίνης στο µικτό πρότυπο δείγµα για Ευρεθείσα συγκέντρωση % Ευρεθείσα ποσότητα σε µg/ml λ = 205,0 nm , , ,552 96, ,605 99, , , , , ,59 100,02 SD 1,4403 Mean 99,66 %RSD 1,4453 Πίνακας 3: % Ευρεθέν ποσοστό ανταζολίνης στο µικτό δείγµα σε λ = 210,0 nm. Εµβαδόν κορυφής ανταζολίνης Ευρεθείσα συγκέντρωση % Ευρεθείσα ποσότητα στο µικτό πρότυπο δείγµα για σε µg/ml λ = 210,0 nm ,11 101, ,10 101, ,22 101, ,98 100, ,95 99, ,41 99,36 SD 0,9220 Mean 100,52 %RSD 0,9173 Από τη µελέτη των παραπάνω αποτελεσµάτων, συµπεραίνουµε ότι οι ανακτήσεις για την ανταζολίνη ήταν ικανοποιητικές, άρα και η µέθοδος αξιόπιστη, ώστε να εφαρµοστεί στον ποσοτικό προσδιορισµό της παραπάνω δραστικής ουσίας σε υγρό ή στερεό φαρµακευτικό σκεύασµα.

99 Κατά τον ίδιο τρόπο, η διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον προσδιορισµό της ανταζολίνης, εφαρµόστηκε και στις δύο άλλες δραστικές: τη ναφαζολίνη και την ξυλοµεταζολίνη (Πίνακες 4-8). Πιο συγκεκριµένα, η ολική ανάκτηση των δειγµάτων, µε τη βοήθεια χάραξης καµπύλης αναφοράς για τα διάφορα µήκη κύµατος, όπως φαίνεται παρακάτω, είναι: Πίνακας 4: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή µικτών δειγµάτων ξυλοµεταζολίνης και τα αντίστοιχα εµβαδά τους σε συγκεκριµένα µήκη κύµατος. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Ξυλοµεταζολίνη λ = 205,0 nm λ = 210,0 nm 1 2, , , , , , Η µελέτη ελέγχου ακρίβειας της µεθόδου έγινε στα µικτά δείγµατα, όπου και υπολογίστηκαν οι % τιµές ανάκτησης της ξυλοµεταζολίνης (Πίνακες 5, 6). Πίνακας 5: % Ευρεθέν ποσοστό ξυλοµεταζολίνης στο µικτό δείγµα σε λ = 205,0 nm. Εµβαδόν κορυφής Ευρεθείσα % Ευρεθείσα ποσότητα ξυλοµεταζολίνης στο µικτό πρότυπο δείγµα για λ = 205,0 nm συγκέντρωση σε µg/ml ,481 97, , , , , , , ,569 99,17

100 ,072 99,96 SD 0,8506 Mean 100,20 %RSD 0,8489 Πίνακας 6: % Ευρεθέν ποσοστό ξυλοµεταζολίνης στο µικτό δείγµα σε λ = 210,0 nm. Εµβαδόν κορυφής Ευρεθείσα συγκέντρωση % Ευρεθείσα ποσότητα ξυλοµεταζολίνης στο µικτό πρότυπο δείγµα για λ = 210,0 nm σε µg/ml ,477 97, , , , , , , ,590 99, ,021 99,69 SD 1,4490 Mean 99,93 %RSD 1,4500 Πίνακας 7: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή µικτών δειγµάτων ναφαζολίνης και τα αντίστοιχα εµβαδά τους σε συγκεκριµένο µήκος κύµατος. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Ναφαζολίνη λ = 265,0 nm 1 2, , , , ,

101 6 18, Τέλος, η µελέτη ελέγχου ακρίβειας της µεθόδου όπως και για τις άλλες δύο δραστικές, έγινε στα µικτά δείγµατα, όπου και υπολογίστηκαν οι % τιµές ανάκτησης της ναφαζολίνης (Πίνακας 8). Πίνακας 8: % Ευρεθέν ποσοστό ναφαζολίνης στο µικτό δείγµα σε λ = 265,0 nm. Εµβαδόν κορυφής ναφαζολίνης Ευρεθείσα συγκέντρωση % Ευρεθείσα ποσότητα στο µικτό πρότυπο δείγµα για σε µg/ml λ = 265,0 nm , , , , ,841 96, , , ,444 99, , ,12 SD 2,0899 Mean 100,02 %RSD 2,0894 Από τη µελέτη των παραπάνω αποτελεσµάτων, συµπεραίνουµε ότι οι ανακτήσεις τόσο για την ξυλοµεταζολίνη όσο και για τη ναφαζολίνη ήταν ικανοποιητικές, άρα και η µέθοδος αξιόπιστη, ώστε να εφαρµοστεί στον ποσοτικό προσδιορισµό των παραπάνω δραστικών ουσιών σε φαρµακευτικό σκεύασµα. Στη συνέχεια παρουσιάζεται (Σχήµατα 1-5) η ολική ανάκτηση των δειγµάτων ανταζολίνης, ναφαζολίνης και ξυλοµεταζολίνης µε τη βοήθεια χάραξης καµπύλης αναφοράς για τα επιλεγµένα µήκη κύµατος:

102 Cευρεθείσες Ολική Ανάκτηση Ναφαζολίνης στα 265,0 nm y = 1,0004x - 0,0009 R 2 = 0,9997 C προστεθείσες C ευρεθείσες 0,000 0,000 2,506 2,531 3,758 3,852 5,011 4,841 6,264 6,375 7,517 7,444 18,792 18, C πραγµατικές Σχήµα 1: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 265,0 nm. Cευρεθείσες Ολική Ανάκτηση Ανταζολίνης στα 205,0 nm y = 1,0015x - 0,1704 R 2 = 0,9999 C πραγµατικές C ευρεθείσες 0,000 0,000 23,808 23,914 35,712 34,552 47,616 47,605 59,520 59,833 71,424 71, , , C πραγµατικές Σχήµα 2: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) ανταζολίνης σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 205,0 nm.

103 Cευρεθείσες Ολική Ανάκτηση Ανταζολίνης στα 210,0 nm C πραγµατικές C ευρεθείσες 0,000 0,000 23,808 24,110 35,712 36,100 47,616 48,220 59,520 59,980 71,424 70, , , y = 0,9914x + 0,5279 R 2 = 0, C πραγµατικές Σχήµα 3: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) ανταζολίνης σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 210,0 nm. Cευρεθείσες Ολική Ανάκτηση Ξυλοµεταζολίνης στα 205,0 nm C πραγµατικές C ευρεθείσες 0,000 0,000 2,544 2,481 3,816 3,852 5,088 5,097 6,360 6,450 7,632 7,569 19,080 19,072 5 y = 0,9998x + 0,0014 R 2 = 0, C πραγµατικές Σχήµα 4: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) ξυλοµεταζολίνης σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 205,0 nm.

104 Cευρεθείσες Ολική Ανάκτηση Ξυλοµεταζολίνης στα 210,0 nm C πραγµατικές C ευρεθείσες 0,000 0,000 2,544 2,477 3,816 3,851 5,088 5,140 6,360 6,433 7,632 7,590 19,080 19, y = 0,9969x + 0,0186 R 2 = 0, C πραγµατικές Σχήµα 5: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) ξυλοµεταζολίνης σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 210,0 nm. Τα χαρακτηριστικά των καµπύλων ανάκτησης των προσδιοριζόµενων ουσιών ανταζολίνης-ναφαζολίνης-ξυλοµεταζολίνης, στα διάφορα µήκη κύµατος που µελετήθηκαν, παρουσιάζονται στον Πίνακα 9 που ακολουθεί: Πίνακας 9: Στατιστικά παλινδρόµησης για την ανάκτηση των δραστικών ουσιών ανταζολίνης ναφαζολίνης ξυλοµεταζολίνης. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΑ ΠΑΛΙΝ ΡΟΜΗΣΗΣ Ναφαζολίνη Ανταζολίνη Ξυλοµεταζολίνη 265,0 nm 205,0 nm 210,0 nm 205,0 nm 210,0 nm Πολλαπλό r 0,9999 0,9999 0,9999 0,9999 0,9999 R 2 0,9997 0,9999 0,9999 0,9999 0,9999 Τυπικό Σφάλµα 0,1063 0,5264 0,4267 0,0591 0,0580 Τοµή -0,0009-0,1704 0,5279 0,0014 0,0186 Κλίση 1,0004 1,0015 0,9914 0,9998 0,9969

105 Η στατιστική επεξεργασία, µε βάση τον Πίνακα 10 δεικνύει ότι: α) τα επιλεχθέντα µήκη κύµατος 205, 210 και 265 nm προσφέρονται για τον προσδιορισµό των τριών δραστικών ουσιών, τόσο όταν αυτές συνυπάρχουν σε συνδυασµούς ανά ζεύγη, όσο και όταν µελετώνται µόνες τους και β) παρατηρείται µεγάλη ακρίβεια και επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων και κατά συνέπεια η συγκεκριµένη µελέτη κρίνεται πλήρως ικανοποιητική. Πίνακας 10: Στατιστικός έλεγχος της ανάκτησης των δραστικών ουσιών του µίγµατος ανταζολίνης ναφαζολίνης ξυλοµεταζολίνης. Ναφαζολίνη Ανταζολίνη Ξυλοµεταζολίνη Μήκος Κύµατος (nm) 265,0 205,0 210,0 205,0 210,0 Μέση Ανάκτηση 100,02 99,66 100,52 100,20 99,93 %RSD 2,0894 1,4453 0,9173 0,8489 1,4500 % Ολική Ανάκτηση 100,04 100,15 99,14 99,98 99,69 Σταθερό Σφάλµα -0,0009-0,1704 0,5279 0,0014 0,0186 Αναλογικό Σφάλµα (%) 0,04 0,15-0,86-0,02-0,31 Συντελεστής Συσχέτισης 0,9999 0,9999 0,9999 0,9999 0, ΜΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΒΕΝΖΕΘΟΝΙΟΥ Με σκοπό να διαχωριστούν και να προσδιοριστούν οι δραστικές ουσίες ανταζολίνη και ναφαζολίνη, παρουσία του συντηρητικού χλωριούχου βενζεθονίου (Σχήµα 2), χρησιµοποιήθηκε ακριβώς η ίδια µεθοδολογία που ακολουθήθηκε στο προηγούµενο κεφάλαιο, για τον προσδιορισµό των δραστικών ουσιών ανταζολίνης-ναφαζολίνης-ξυλοµεταζολίνης, µε τη διαφορά ότι στην συγκεκριµένη περίπτωση χρησιµοποιήθηκε στήλη ACE CΝ 5µm (150x4,6)mm

106 mau 280nm,4nm (1.00) naphazoline/4.346 antazoline/5.202 benzethonium/ /1.487 / min Σχήµα 2: Χρωµατογραφήµατα προτύπων διαλυµάτων: ναφαζολίνης (t R =4,346), ανταζολίνης (t R =5,202) και χλωριούχου βενζεθονίου (t R =14,786). Πιο συγκεκριµένα, οι συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων των τριών ουσιών, που χρησιµοποιήθηκαν για τη χάραξη καµπύλων αναφοράς, καθώς και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους σε συγκεκριµένα µήκη κύµατος, παρουσιάζονται ακολούθως: Πίνακας 1: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους σε συγκεκριµένο µήκος κύµατος. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Ναφαζολίνη λ = 280,0 nm 1 1, , ,

107 4 5, , , Η στατιστική επεξεργασία των αριθµητικών δεδοµένων του Πίνακα 1 έδειξε γραµµική εξάρτηση µεταξύ των συγκεντρώσεων των προτύπων διαλυµάτων της ναφαζολίνης και των αντίστοιχων εµβαδών των χρωµατογραφικών κορυφών και παρείχε την ακόλουθη εξίσωση παλινδρόµησης µε την αντίστοιχη καµπύλη αναφοράς: Εµβαδά Κορυφών Καµπύλη Αναφοράς Προτύπων ιαλυµάτων Ναφαζολίνης στα 280,0 nm. y = 10728x R 2 = 0, Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα 1: Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε τα εµβαδά κορυφών τους (Y) σε λ = 280,0 nm. Αντίστοιχα, οι συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων της ανταζολίνης, που χρησιµοποιήθηκαν για τη χάραξη καµπύλων αναφοράς, καθώς και τα αντίστοιχα εµβαδά των κορυφών τους σε λ = 243,0 nm, παρουσιάζονται στον Πίνακα που ακολουθεί: Πίνακας 2: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους σε συγκεκριµένο µήκος κύµατος. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Ανταζολίνη λ = 243,0 nm 1 11,

108 2 23, , , , , Η στατιστική επεξεργασία των αριθµητικών δεδοµένων του Πίνακα 2 στο µήκος κύµατος που επιλέχθηκε (243,0 nm), έδειξε γραµµική εξάρτηση µεταξύ των συγκεντρώσεων των προτύπων διαλυµάτων της ανταζολίνης και των αντίστοιχων εµβαδών των χρωµατογραφικών κορυφών και παρείχε την ακόλουθη εξίσωση παλινδρόµησης µε την αντίστοιχη καµπύλη αναφοράς: Καµπύλη Αναφοράς Προτύπων ιαλυµάτων Ανταζολίνης στα 243,0 nm Εµβαδά Κορυφών y = 7685,1x R 2 = 0, Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα 2: Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης σε συνάρτηση µε τα εµβαδά κορυφών τους (Y) σε λ = 243,0 nm. Τέλος, οι συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων του βενζεθονίου, που χρησιµοποιήθηκαν για τη χάραξη καµπύλων αναφοράς, καθώς και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους σε µήκος κύµατος λ = 269,0 nm, παρουσιάζονται ακολούθως:

109 Πίνακας 3: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή προτύπων διαλυµάτων βενζεθονίου και τα αντίστοιχα εµβαδά κορυφών τους σε µήκος κύµατος λ = 269,0 nm. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Βενζεθόνιο λ = 269,0 nm 1 1, , , , , , Η στατιστική επεξεργασία των αριθµητικών δεδοµένων του Πίνακα 3 έδειξε γραµµική εξάρτηση µεταξύ των συγκεντρώσεων των προτύπων διαλυµάτων του βενζεθονίου και των αντίστοιχων εµβαδών των χρωµατογραφικών κορυφών και παρείχε την ακόλουθη εξίσωση παλινδρόµησης µε την αντίστοιχη καµπύλη αναφοράς: Καµπύλη Αναφοράς Προτύπων ιαλυµάτων Βενζεθονίου στα 243,0 nm Εµβαδά Κορυφών y = x R 2 = 0, Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα 3: Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων βενζεθονίου σε συνάρτηση µε τα εµβαδά κορυφών τους (Y) σε λ = 269,0 nm. Τα χαρακτηριστικά των καµπύλων αναφοράς για την κάθε προσδιοριζόµενη ουσία, στα διάφορα µήκη κύµατος που µελετήθηκαν, παρουσιάζονται στον Πίνακα 4 που ακολουθεί:

110 Πίνακας 4: Στατιστικά παλινδρόµησης προτύπων διαλυµάτων των δραστικών ουσιών ανταζολίνης ναφαζολίνης βενζεθονίου κατά τον προσδιορισµό τους µε ΥΧΥΑ. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΑ ΠΑΛΙΝ ΡΟΜΗΣΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗ ΒΕΝΖΕΘΟΝΙΟ 280,0nm 243,0nm 269,0nm Πολλαπλό r 0,9999 0,9992 0,9997 R 2 0,9999 0,9984 0,9994 Τυπικό Σφάλµα 311, , ,73 Τοµή Κλίση , LOD(µg/mL) 0,096 3,289 0,207 LOQ(µg/mL) 0,290 9,967 0,627 Η επεξεργασία των τιµών των µεταβλητών παρείχε τις εξισώσεις παλινδρόµησης του τύπου: Ναφαζολίνη : για λ = 280,0 nm y = 10728x και R 2 = 0,9999 Ανταζολίνη : για λ = 243,0 nm y = 7685,1x και R 2 = 0,9984 Βενζεθόνιο : για λ = 269,0 nm y = x και R 2 = 0,9994 Όπως φαίνεται στις παραπάνω σχέσεις, η τιµή του R 2 επιβεβαιώνοντας τη γραµµική συσχέτιση των αποτελεσµάτων. πλησιάζει τη µονάδα 4.9 ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ Για το έλεγχο αξιοπιστίας της µεθόδου, παρασκευάσθηκε µια σειρά µικτών δειγµάτων των τριών δραστικών στο εργαστήριο, σε διάφορες συγκεντρώσεις και στη συνέχεια θεωρώντας τα σαν άγνωστα επαναπροσδιορίστηκαν.

111 ΕΙΓΜΑ C ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ (µg/ml) 11,704 23,808 35,712 47,616 59,520 71,424 C ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ (µg/ml) 2,506 3,758 5,011 6,264 7,517 1,253 C ΒΕΝΖΕΘΟΝΙΟΥ (µg/ml) 3,816 5,088 6,360 7,632 1,272 2,544 Οι συγκεντρώσεις των µικτών δειγµάτων, που χρησιµοποιήθηκαν για τη χάραξη καµπύλων αναφοράς, καθώς και τα αντίστοιχα εµβαδά σε συγκεκριµένα µήκη κύµατος για την κάθε δραστική, αναφέρονται στον επόµενο πίνακα: Πίνακας 1: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή µικτών δειγµάτων ανταζολίνης και τα αντίστοιχα εµβαδά τους σε συγκεκριµένο µήκος κύµατος. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Ανταζολίνη λ = 243,0 nm 1 11, , , , , , Αντίστοιχα, η µελέτη ελέγχου ακρίβειας της µεθόδου έγινε στα µικτά δείγµατα, όπου και υπολογίστηκαν οι % τιµές ανάκτησης της ανταζολίνης (Πίνακας 2). Πίνακας 2: % Ευρεθέν ποσοστό ανταζολίνης στο µικτό δείγµα σε λ = 243,0 nm. Εµβαδόν κορυφής ανταζολίνης Ευρεθείσα συγκέντρωση % Ευρεθείσα ποσότητα στο µικτό πρότυπο δείγµα για σε µg/ml λ = 243,0 nm ,523 96, ,756 99,78

112 , , , , ,179 99, , ,09 SD 1,3223 Mean 99,42 %RSD 1,3300 Από τη µελέτη των παραπάνω αποτελεσµάτων, συµπεραίνουµε ότι οι ανακτήσεις για την ανταζολίνη ήταν ικανοποιητικές, άρα και η µέθοδος αξιόπιστη, ώστε να εφαρµοστεί στον ποσοτικό προσδιορισµό της παραπάνω δραστικής ουσίας σε υγρό ή στερεό φαρµακευτικό σκεύασµα. Κατά τον ίδιο τρόπο, η διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον προσδιορισµό της ανταζολίνης, εφαρµόστηκε και για τις άλλες δύο δραστικές: τη ναφαζολίνη και το βενζεθόνιο. Πιο συγκεκριµένα, η ολική ανάκτηση των δειγµάτων, µε τη βοήθεια χάραξης καµπύλης αναφοράς για τα διάφορα µήκη κύµατος, όπως φαίνεται παρακάτω είναι: Πίνακας 3: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή µικτών δειγµάτων ναφαζολίνης και τα αντίστοιχα εµβαδά σε συγκεκριµένο µήκος κύµατος. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Ναφαζολίνη λ = 280,0 nm 1 1, , , , , , Τέλος, η µελέτη ελέγχου ακρίβειας της µεθόδου έγινε στα µικτά δείγµατα, όπου και υπολογίστηκαν οι % τιµές ανάκτησης της ναφαζολίνης (Πίνακας 4).

113 Πίνακας 4: % Ευρεθέν ποσοστό ναφαζολίνης στο µικτό δείγµα σε λ = 280,0 nm. Εµβαδόν κορυφής ναφαζολίνης Ευρεθείσα συγκέντρωση % Ευρεθείσα ποσότητα στο µικτό πρότυπο δείγµα για σε µg/ml λ = 280,0 nm , , ,452 97, ,733 99, , , ,248 99, , ,07 SD 1,6754 Mean 100,12 %RSD 1,6733 Πίνακας 5: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή µικτών δειγµάτων βενζεθονίου και τα αντίστοιχα εµβαδά σε συγκεκριµένα µήκη κύµατος. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Εµβαδά Κορυφών Α/Α Βενζεθόνιο λ = 269,0 nm 1 1, , , , , , Τέλος, η µελέτη ελέγχου ακρίβειας της µεθόδου έγινε στα µικτά δείγµατα, όπου και υπολογίστηκαν οι % τιµές ανάκτησης του βενζεθονίου (Πίνακας 6).

114 Πίνακας 6: % Ευρεθέν ποσοστό βενζεθονίου στο µικτό δείγµα σε λ = 269,0 nm. Εµβαδόν κορυφής βενζεθονίου στο µικτό πρότυπο δείγµα για λ = 269,0 nm Ευρεθείσα συγκέντρωση σε µg/ml % Ευρεθείσα ποσότητα ,258 98, ,531 99, , , ,015 98, , , , ,35 SD 1,6291 Mean 100,27 %RSD 1,6247 Από τη µελέτη των παραπάνω αποτελεσµάτων, συµπεραίνουµε ότι οι ανακτήσεις τόσο για τη ναφαζολίνη όσο και για το βενζεθόνιο ήταν ικανοποιητικές, άρα και η µέθοδος αξιόπιστη, ώστε να εφαρµοστεί στον ποσοτικό προσδιορισµό των παραπάνω δραστικών ουσιών σε φαρµακευτικό σκεύασµα. Όπως επίσης γίνεται αντιληπτό από τα αποτελέσµατα, τα τρία µήκη κύµατος (243 nm, 269 nm και 280 nm) που επιλέχτηκαν για τις πειραµατικές µετρήσεις των τριών δραστικών ουσιών, είναι ικανοποιητικά και µπορούν να χρησιµοποιηθούν σε αναλύσεις καθηµερινότητας για τους ποσοτικούς προσδιορισµούς αυτών. Στη συνέχεια παρουσιάζεται η ολική ανάκτηση των δειγµάτων ανταζολίνης, ναφαζολίνης και βενζεθονίου µε τη βοήθεια χάραξης καµπύλης αναφοράς για τα επιλεγµένα µήκη κύµατος:

115 Cευρεθείσες Ολική Ανάκτηση Ανταζολίνης στα 243,0 nm C πραγµατικές C ευρεθείσες 0,000 0,000 11,904 11,523 23,808 23,756 35,712 35,845 47,616 47,642 59,520 59,179 71,424 71, y = 1,001x - 0,1157 R 2 = 0, C πραγµατικές Σχήµα 1: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) ανταζολίνης σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 243,0 nm. Cευρεθείσες Ολική Ανάκτηση Ναφαζολίνης στα 280,0 nm C πραγµατικές C ευρεθείσες 0,000 0,000 1,253 1,289 2,506 2,452 3,758 3,733 5,011 5,054 6,264 6,248 7,517 7,522 2 y = 1,0002x - 0,0024 R 2 = 0, C πραγµατικές Σχήµα 2: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 280,0 nm.

116 Cευρεθείσες Ολική Ανάκτηση Βενζεθονίου στα 269,0 nm y = 1,0068x - 0,0075 R 2 = 0,9995 C πραγµατικές C ευρεθείσες 0,000 0,000 1,272 1,258 2,544 2,531 3,816 3,922 5,088 5,015 6,360 6,457 7,632 7, C πραγµατικές Σχήµα 3: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) βενζεθονίου σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 269,0 nm. Πίνακας 7: Στατιστικός έλεγχος για τον προσδιορισµό του µίγµατος ανταζολίνης ναφαζολίνης βενζεθονίου. Ανταζολίνη Βενζεθόνιο Ναφαζολίνη Μήκος Κύµατος (nm) 243,0 269,0 280,0 Μέση Ανάκτηση 99,42 100,27 100,12 %RSD 1,3300 1,6733 1,6247 % Ολική Ανάκτηση 100,10 100,68 100,02 Σταθερό Σφάλµα -0,1157-0,0075-0,0024 Αναλογικό Σφάλµα (%) 0,10 0,68 0,02 Συντελεστής Συσχέτισης 0,9999 0,9998 0,9999 Τα χαρακτηριστικά των καµπύλων ανάκτησης των προσδιοριζόµενων ουσιών ανταζολίνης-ναφαζολίνης-βενζεθονίου, στα διάφορα µήκη κύµατος που µελετήθηκαν, παρουσιάζονται στον Πίνακα 8 που ακολουθεί:

117 Πίνακας 8: Στατιστικά παλινδρόµησης καµπύλων αναφοράς των ουσιών ανταζολίνης ναφαζολίνης βενζεθονίου κατά τον προσδιορισµό τους µε ΥΧΥΑ. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΑ ΠΑΛΙΝ ΡΟΜΗΣΗΣ Ανταζολίνη Βενζεθόνιο Ναφαζολίνη Μήκος Κύµατος (nm) 243,0 nm 269,0 nm 280,0 nm Πολλαπλό r 0,9999 0,9998 0,9999 R 2 0,9999 0,9995 0,9998 Τυπικό Σφάλµα 0,2183 0,0671 0,0372 Τοµή -0,1157-0,0075-0,0024 Κλίση 1,001 1,0068 1,0002 Η στατιστική επεξεργασία, µε βάση τους Πίνακες 7 και 8, καταδεικνύει ότι: α) τα επιλεγέντα µήκη κύµατος (243 nm, 269 nm και 280 nm) προσφέρονται για τον προσδιορισµό των τριών δραστικών ουσιών, όταν αυτές συνυπάρχουν σε µίγµα, και β) παρατηρείται µεγάλη ακρίβεια και επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων και κατά συνέπεια η συγκεκριµένη µελέτη κρίνεται πλήρως ικανοποιητική ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΒΕΝΖΕΘΟΝΙΟΥ ΣΕ ΕΜΠΟΡΙΚΟ ΣΚΕΥΑΣΜΑ Ακολούθως η ίδια µεθοδολογία εφαρµόστηκε σε σειρά δειγµάτων διαφορετικών επιπέδων των δύο δραστικών ουσιών, για κολλύριο το οποίο κυκλοφορεί στο εµπόριο και έγινε έλεγχος στο ποσοστό ανάκτησης της ουσίας, καθώς και στην επαναληψιµότητα της συγκεκριµένης µεθόδου.

118 Cευρεθείσες Ολική Ανάκτηση Ανταζολίνης σε κολλύριο στα 243,0 nm y = 1,007x - 0,1419 R 2 = 0,9991 C κολλυρίου C ευρεθείσες 0,00 0,00 8,00 7,85 12,00 11,68 16,00 16,22 20,00 20,21 24,00 23,34 28,00 28,34 32,00 32, C κολλυρίου Σχήµα 1: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) ανταζολίνης στο κολλύριο σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 243,0 nm. Cευρεθείσες 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 Ολική Ανάκτηση Ναφαζολίνης σε κολλύριο στα 280,0 nm C κολλυρίου C ευρεθείσες 0,000 0,000 0,800 0,795 1,200 1,220 1,600 1,623 2,000 2,042 2,400 2,372 2,800 2,771 3,200 3,214 1,0 0,5 y = 0,9965x + 0,0107 R 2 = 0,9995 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 C κολλυρίου Σχήµα 2: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) ναφαζολίνης στο κολλύριο σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 280,0 nm.

119 Cευρεθείσες Ολική Ανάκτηση Βενζεθονίου σε κολλύριο στα 269,0 nm y = 0,9944x - 0,9372 R 2 = 0,9996 C κολλυρίου C ευρεθείσες 0,00 0,00 50,00 48,54 75,00 73,27 100,00 98,55 125,00 123,18 150,00 147,36 175,00 171,03 200,00 200, C κολλυρίου Σχήµα 3: Καµπύλη αναφοράς των προστιθέµενων τιµών συγκέντρωσης (Χ) χλωριούχου βενζεθονίου στο κολλύριο σε συνάρτηση µε τις ευρεθείσες (Y) σε λ = 269,0 nm. Πίνακας 1: Στατιστικός έλεγχος για τον προσδιορισµό του µίγµατος ανταζολίνης ναφαζολίνης βενζεθονίου σε κολλύριο. Ανταζολίνη Ναφαζολίνη Βενζεθόνιο Μήκος Κύµατος (nm) 243,0 280,0 269,0 Μέση Ανάκτηση 99,57 100,40 98,31 %RSD 1,9123 1,3586 1,0596 % Ολική Ανάκτηση 100,70 99,65 99,44 Σταθερό Σφάλµα -0,1419 0,0107-0,9372 Αναλογικό Σφάλµα (%) Συντελεστής Συσχέτισης 0,70 0,35 0,56 0,9995 0,9997 0,9998

120 ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΥΠΕΡΙΩ ΟΥΣ ΟΡΑΤΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η φασµατοσκοπία µοριακής απορρόφησης στηρίζεται στη µέτρηση της διαπερατότητας Τ, ή της απορρόφησης Α διαλυµάτων, που τοποθετούνται σε διαφανείς κυψελίδες οπτικής διαδροµής b cm.συνήθως, η συγκέντρωση c ενός αναλύτη που απορροφά συνδέεται γραµµικά µε την απορρόφηση, σύµφωνα µε την εξίσωση: A = -logt = log P 0 /P = εbc (1) Όλες οι µεταβλητές στην εξίσωση αυτή ορίζονται στον Πίνακα (1). Η εξίσωση αυτή αποτελεί τη µαθηµατική έκφραση του νόµου του Beer. Πίνακας 1: Σηµαντικοί όροι και σύµβολα για τη µέτρηση της απορρόφησης Όρος και σύµβολο * Ορισµός Εναλλακτικό όνοµα και σύµβολο Ακτινοβολούµενη ισχύς P, P 0 Η ενέργεια της ακτινοβολίας (σε Ένταση ακτινοβολίας I, I 0 erg), που προσπίπτει σε µια επιφάνεια 1 cm 2 ενός ανιχνευτή ανά δευτερόλεπτο Απορρόφηση Α log (P 0 /P) Οπτική πυκνότητα D, απόσβεση E ιαπερατότητα Τ P 0 /P Εκποµπή, διάδοση Μήκος διαδροµής της ακτινοβολίας b Απορροφητικότητα α A/bc Συντελεστής απόσβεσης k Γραµµοµοριακή απορροφητικότητα ε A/bc Γραµµοµοριακός συντελεστής απόσβεσης * Ορολογία προτεινόµενη από την American Chemical Society. Η c µπορεί να εκφράζεται σε g/l ή σε άλλες καθορισµένες µονάδες και το b σε cm ή σε άλλες µονάδες. Η c εκφράζεται σε mol/l, το b σε cm. _ l, d

121 Μετρήσεις που βασίζονται στην απορρόφηση της ορατής και της υπεριώδους ακτινοβολίας χρησιµοποιούνται ευρύτατα για την αναγνώριση και τον προσδιορισµό δεκάδων χιλιάδων ανόργανων και οργανικών ενώσεων. Οι µέθοδοι µοριακής απορρόφησης στο ορατό και υπεριώδες είναι πιθανώς οι πλέον χρησιµοποιούµενες από όλες τις άλλες τεχνικές ποσοτικής ανάλυσης, τόσο στα χηµικά όσο και στα κλινικά εργαστήρια. Σχήµα 5.1: Περιοχές του ηλεκτροµαγνητικού φάσµατος 5.2 ΙΑΠΕΡΑΤΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ Συνήθως, η διαπερατότητα και η απορρόφηση όπως ορίζονται στον Πίνακα 1, δεν µπορούν να µετρηθούν στο εργαστήριο, επειδή το διάλυµα-δείγµα πρέπει να τοποθετηθεί σε ένα δοχείο µε τοιχώµατα διαπερατά στο φως γνωστό ως κυψελίδα (cell). Όπως φαίνεται στο Σχήµα 5.2, στις δύο διεπιφάνειες αέρας/τοίχωµα αλλά και στις δύο διεπιφάνειες τοίχωµα/διάλυµα, συµβαίνουν ανακλάσεις. Η προκαλούµενη εξασθένιση της δέσµης είναι σηµαντική. Εξασθένιση µιας δέσµης µπορεί να συµβεί ακόµα και ως αποτέλεσµα σκέδασης από τα µεγάλα µόρια, αλλά και της απορρόφησης από τα τοιχώµατα της κυψελίδας. Για αντιστάθµιση αυτών των φαινοµένων συγκρίνεται η ισχύς της δέσµης, που διαπερνά το διάλυµα του αναλύτη µε την ισχύ της δέσµης, που διαπερνά την κυψελίδα όταν αυτή περιέχει µόνο το διαλύτη.

122 Σχήµα 5.2: Απώλειες από ανάκλαση και σκέδαση. Οι πραγµατικές τιµές της διαπερατότητας και της απορρόφησης, που προσεγγίζουν την πραγµατική διαπερατότητα και απορρόφηση, υπολογίζονται µε τις εξισώσεις: P T = P διάλυµα διαλύτης = P P 0 (2) A=log P διαλύτης P διάλυµα log P 0 (3) P Οι όροι P 0 και P, αναφέρονται στην ισχύ της ακτινοβολίας µετά τη διέλευσή της από την κυψελίδα που περιέχει το διαλύτη και τον αναλύτη αντίστοιχα. 5.3 ΝΟΜΟΣ ΤΟΥ BEER Η εξίσωση (1) περιγράφει το νόµο του Beer Η ισχύς της σχέσης αυτής µπορεί να ερµηνευθεί ως εξής: Στο Σχήµα 5.3, στο τµήµα του απορροφούντος υλικού (στερεού, υγρού ή αερίου), µια δέσµη παράλληλης µονοχρωµατικής ακτινοβολίας ισχύος P 0 προσπίπτει κάθετα σε µια επιφάνεια. Μετά από διαδροµή µήκους b µέσα στο υλικό, που περιέχει τα απορροφούντα άτοµα ή µόρια, η ισχύς της µειώνεται στην τιµή P ως αποτέλεσµα απορρόφησης.

123 Εξετάζοντας τώρα κανείς µια κάθετη τοµή του τµήµατος της επιφάνειας S η οποία έχει ένα απείρως µικρό πάχος dx, παρατηρεί ότι στην τοµή αυτή υπάρχουν dn σωµατίδια που απορροφούν. Υποθέτοντας ότι κάθε σωµατίδιο αντιστοιχεί µε µία επιφάνεια πάνω στην οποία παγιδεύονται τα φωτόνια, αυτό σηµαίνει ότι εάν ένα φωτόνιο πλησιάσει κατά τύχη µια από αυτές τις περιοχές, απορροφάται αµέσως. Η ολική προβαλλόµενη επιφάνεια αυτών των επιφανειών-παγίδων µέσα στην τοµή, συµβολίζεται ως ds. Ο λόγος της απορροφούσας επιφάνειας προς τη συνολική επιφάνεια είναι ds/s. Ο λόγος αυτός αντιστοιχεί στατιστικά στην πιθανότητα σύλληψης των φωτονίων από την εξεταζόµενη τοµή. Σχήµα 5.3: Εξασθένιση της ακτινοβολίας αρχικής ισχύος P 0 από ένα διάλυµα που περιέχει c mole αναλύτη στο λίτρο, οπτικής διαδροµής b cm. P<P 0. cm 2 Η ισχύς της εισερχόµενης δέσµης P x, είναι ανάλογη προς τον αριθµό των φωτονίων ανά και το dp x παριστά την απορροφούµενη ισχύ από την τοµή. Το κλάσµα των απορροφούµενων φωτονίων θα είναι -dp x / P x και είναι ίσο µε τη µέση πιθανότητα σύλληψής τους. Το αρνητικό σηµείο δείχνει ότι επέρχεται µείωση της P. Θα ισχύει -dp x / P x = ds/s (4) Γνωρίζοντας ότι το ds είναι το άθροισµα όλων των επιφανειών των σωµατιδίων που παγιδεύουν φωτόνια µέσα στην τοµή αυτή, αυτό θα είναι ανάλογο µε τον αριθµό τους, δηλαδή ds = α dn (5) όπου dn είναι ο αριθµός των σωµατιδίων και α µια σταθερά αναλογίας, η οποία µπορεί να ονοµασθεί διατοµή παγίδευσης. Συνδυάζοντας τις εξισώσεις 4 και 5 και ολοκληρώνοντας για το διάστηµα από 0 έως n προκύπτει η εξίσωση P X = P dp P η οποία µετά τον υπολογισµό των ολοκληρωµάτων, δίνει 0 - ln X P P 0 = 0 n α n S adn S

124 Με µετατροπή του φυσικού λογάριθµου σε δεκαδικό λογάριθµο και αντιστρέφοντας τα κλάσµατα, λαµβάνουµε P0 an log = (6) P 2,303 S όπου n είναι ο ολικός αριθµός των σωµατιδίων µέσα στην τοµή του υλικού που δείχνει το Σχήµα 5.3. Η επιφάνεια S µπορεί να εκφρασθεί µέσω του όγκου V του τµήµατος του υλικού σε cm 3 και του µήκους b σε cm. Τότε θα είναι V S = cm 2 b Αντικατάσταση του S στην εξίσωση (6) δίνει log P P nb = (7) 2,303 V 0 α Να σηµειωθεί ότι το n/n έχει διαστάσεις συγκέντρωσης (αριθµός σωµατιδίων ανά cm 3 ) και µπορεί να µετατραπεί σε µονάδες mole ανά λίτρο: nσωµατ ίδια αριθµός mol = 23 6,02 10 σωµατ ίδια / mol οπότε η c σε mol/l είναι c = n 6, cm mol Vcm Συνδυάζοντας τη σχέση αυτή µε την εξίσωση 7 προκύπτει 3 3 / L 1000n = 6, V mol / L 23 P0 6,02 10 abc log = P 2, Τελικά οι σταθερές της παραπάνω έκφρασης συγκεντρώνονται σε έναν όρο ε και προκύπτει η τελική σχέση P log 0 = εbc = A P (8) που αποτελεί τη µαθηµατική έκφραση του νόµου του Beer. 5.4 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΟΥ ΝΟΜΟΥ ΤΟΥ BEER ΣΕ ΜΙΓΜΑΤΑ Ο νόµος του Beer εφαρµόζεται και σε υλικά που περιέχουν περισσότερα από ένα απορροφούντα συστατικά. Εάν δεν υπάρχει αλληλεπίδραση µεταξύ των διαφόρων συστατικών του µίγµατος, η ολική απορρόφηση ενός τέτοιου συστήµατος παρέχεται από τη σχέση: A ολική = A 1 +A 2 + +A n = ε 1 bc 1 +ε 2 bc 2 +.+ε n bc n (9)

125 όπου οι δείκτες 1,2,3,., n αναφέρονται στα επιµέρους συστατικά του µίγµατος. 5.5 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΣΤΟ ΝΟΜΟ ΤΟΥ BEER Στη γραµµικότητα µεταξύ απορρόφησης και οπτικής διαδροµής, παρουσιάζονται πολύ λίγες εξαιρέσεις. Ωστόσο, συχνά παρουσιάζονται αποκλίσεις 95 από τη γραµµικότητα µεταξύ της µετρούµενης απορρόφησης και της συγκέντρωσης, όταν η οπτική διαδροµή b είναι σταθερή. Μερικές από τις αποκλίσεις αυτές είναι θεµελιώδους σηµασίας και αντιπροσωπεύουν πραγµατικούς περιορισµούς του νόµου. Ωστόσο, άλλες αποκλίσεις εµφανίζονται ως συνέπεια του τρόπου µέτρησης της απορρόφησης ή ως αποτέλεσµα χηµικών µεταβολών, που συνδέονται µε αλλαγές της συγκέντρωσης. Οι δύο τελευταίοι περιορισµοί είναι γνωστοί ως οργανολογικές αποκλίσεις (instrumental deviations) και χηµικές αποκλίσεις (chemical deviations), αντίστοιχα ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΠΟΚΛΙΣΕΙΣ (INSTRUMENTAL DEVIATIONS) Ένας από τους κυριότερους παράγοντες αποκλίσεων, που οφείλονται στα χρησιµοποιούµενα όργανα 96-98, είναι το σήµα θορύβου (ηλεκτρικός θόρυβος, θόρυβοι Johnson κλπ), καθώς και η µη σωστή ρύθµιση του 0% και του 100% της κλίµακας της διαπερατότητας (0%Τ και 100%Τ). Στα περισσότερα σύγχρονα όργανα, µεταβολές στην ισχύ της πηγής ακτινοβολίας και την απόκριση του ανιχνευτή, δεν αποτελούν σηµαντικές αιτίες σφαλµάτων. Σηµαντική επίδραση στην ακρίβεια των φασµατοφωτοµετρικών µετρήσεων έχει το ονοµαστικό εύρος ταινίας (band slit width) που είναι το εύρος σε nm, των µηκών κύµατος της ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας που διέρχεται από το δείγµα. Όταν το εύρος της σχισµής του µονοχρωµάτορα είναι µεγάλο, τότε η ακτινοβολία που διέρχεται από το φασµατοφωτοµετρούµενο διάλυµα έχει µεγάλο ονοµαστικό εύρος ταινίας. Αύξηση του ονοµαστικού εύρους ταινίας προκαλεί: I. ελάττωση της έντασης των κορυφών του φάσµατος, II. ελάττωση της διαχωριστικότητας των φασµατικών ζωνών, III. εξαφάνιση των φασµατικών λεπτοµερειών και IV. εξάλειψη του σήµατος θορύβου. Αξίζει να σηµειωθεί ότι το εµβαδόν της ζώνης απορρόφησης επηρεάζεται λιγότερο από το ονοµαστικό εύρος ταινίας και εποµένως η ολοκλήρωση των ζωνών απορρόφησης για ποσοτικούς προσδιορισµούς παρέχει µεγαλύτερη ακρίβεια.

126 Η ταχύτητα σάρωσης ενός φάσµατος επηρεάζει επίσης τις φασµατοφωτοµετρικές µετρήσεις. Αύξηση του ρυθµού σάρωσης προκαλεί ελάττωση της τιµής απορρόφησης στο λ max και µετατόπιση των µηκών κύµατος της ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας σε σχέση µε αυτά που λαµβάνονται όταν η ταχύτητα σάρωσης είναι µικρή. Αυτές οι αλλαγές στη µορφή του φάσµατος προκαλούν σφάλµατα τόσο στην ποιοτική όσο και στην ποσοτική ανάλυση ουσιών. Επιπλέον, όταν η ταχύτητα σάρωσης είναι µεγάλη και ο χρόνος απόκρισης µικρός, η εξοµάλυνση του θορύβου είναι δυσκολότερη µε αποτέλεσµα να αυξάνονται τα αντίστοιχα σφάλµατα. Είναι γενικότερα παραδεκτό, ότι η ακρίβεια είναι καλύτερη όταν επιλέγονται µικρές ταχύτητες και µεγάλοι χρόνοι απόκρισης ΧΗΜΙΚΕΣ ΑΠΟΚΛΙΣΕΙΣ (CHEMICAL DEVIATIONS) ιάφοροι χηµικοί παράγοντες µπορούν να γίνουν αιτία αποκλίσεων από το νόµο του Lambert-Beer. Ένας τέτοιος παράγοντας είναι η συσσωµάτωση των µορίων της αναλυόµενης ουσίας που µπορεί να προκληθεί από αλληλεπιδράσεις µε το διαλύτη. Μεγάλα υδρόφοβα µόρια, όπως είναι τα µόρια του ανθρακενίου, έχουν την τάση να σχηµατίζουν συσσωµατώµατα, όταν µεγάλες συγκεντρώσεις αυτών διαλυθούν σε πολύ πολικούς διαλύτες. Αν το συσσωµάτωµα καθιζήσει, τότε η συγκέντρωση της αναλυόµενης ουσίας είναι µικρότερη. Ο σκεδασµός εξάλλου της προσπίπτουσας ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας θα προκαλέσει σηµαντικά σφάλµατα, µε αποτέλεσµα να µην ισχύει ο νόµος Lambert-Beer. Αποκλίσεις από το νόµο Lambert-Beer προκαλούνται ακόµη και όταν δεν γίνει καθίζηση του συσσωµατώµατος, γιατί η µοριακή απορροφητικότητα του συσσωµατώµατος είναι συχνά διαφορετική από αυτή της µεµονωµένης ουσίας, είτε γιατί η συσσωµάτωση προκαλεί µείωση του αριθµού των σωµατιδίων της αναλυόµενης ουσίας και εποµένως ελάττωση της συγκέντρωσης των µορφών που απορροφούν (ο σχηµατισµός συσσωµατώµατος από τέσσερα µόρια ανθρακενίου σηµαίνει ότι υπάρχουν τρία σωµατίδια λιγότερα στο διάλυµα από ότι πριν τη συσσωµάτωση). Εποµένως η απορρόφηση θα είναι µικρότερη από αυτή που θα είχαµε αν δεν γινόταν η συσσωµάτωση. Ο σχηµατισµός διµερών που συνδέονται µεταξύ τους µε δεσµούς υδρογόνου µπορεί να προκαλέσει αποκλίσεις ανάλογης µορφής. Χαρακτηριστική αιτία χηµικής απόκλισης, αποτελεί και το γεγονός ότι ορισµένες ουσίες παρουσιάζουν τάση να διίστανται κατά τη διάλυσή τους. Σε αραιά διαλύµατα το βενζοϊκό οξύ (0.01Μ) διίσταται κατά ένα µέρος σε βενζοϊκά ανιόντα και επακολουθεί χηµική ισορροπία ανάµεσα στα ανιόντα αυτά και στο αδιάστατο οξύ. Αφού η µοριακή απορροφητικότητα και το λ max των δύο µορφών είναι διαφορετικά, η απορρόφηση που µετρείται σε µήκος κύµατος

127 διαφορετικό από το ισοσβεστικό σηµείο λ ισοσβ (το µήκος κύµατος στο οποίο οι µοριακές απορροφητικότητες και των δύο µορφών είναι ίσες) θα προκαλέσει σφάλµατα κατά τον υπολογισµό της συγκέντρωσης του βενζοϊκού οξέος. Για την άρση της δυσκολίας αυτής, η ισορροπία µετατοπίζεται προς όφελος της µιας µορφής και µετρείται η απορρόφηση στο λ max της µορφής αυτής. Η δυσκολία αίρεται και µε µέτρηση της απορρόφησης στο ισοσβεστικό σηµείο, αν και συχνά το σηµείο αυτό βρίσκεται µακριά από το λ max µε αποτέλεσµα να ελαττώνεται έτσι η ευαισθησία της µεθόδου. Ο φθορισµός σπάνια παρεµποδίζει τις µετρήσεις απορρόφησης στην υπεριώδη και ορατή περιοχή του φάσµατος της ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας. Στη φασµατοφωτοµετρία απορρόφησης υπεριώδους-ορατού η ένταση των πηγών ακτινοβολίας είναι πολύ µικρή µε αποτέλεσµα να λαµβάνουν χώρα µόνο διεγέρσεις µε µικρή ενέργεια διέγερσης. Αυτό σε συνδυασµό µε το γεγονός ότι ο φθορισµός των περισσότερων ουσιών που απορροφούν είναι πολύ µικρός, οδηγεί στο συµπέρασµα ότι ο φθορισµός που προκαλείται από φασµατοφωτοµετρικά πειράµατα είναι ασήµαντος. Στις ουσίες όµως που παρουσιάζουν ιδιαίτερα έντονο φθορισµό παρατηρούνται φαινοµενικές αποκλίσεις από το νόµο Lambert-Beer. Στις περιπτώσεις αυτές για µεγαλύτερη ακρίβεια στους υπολογισµούς πρέπει να γίνουν καµπύλες αναφοράς. 5.6 ΤΙΜΕΣ ΤΩΝ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΩΝ ΓΡΑΜΜΟΜΟΡΙΑΚΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Εµπειρικά, οι συντελεστές γραµµοµοριακής απορροφητικότητας, οι οποίοι παρατηρούνται στη φασµατοσκοπία ορατού-υπεριώδους, κυµαίνονται από 0 ως και Για κάθε κορυφή, η τάξη µεγέθους του συντελεστή εξαρτάται από τη διατοµή σύλληψης (ds) του µορίου, καθώς και από την πιθανότητα να συµβεί µια µετάπτωση µε απορρόφηση ενέργειας. Η σχέση που συνδέει τον συντελεστή ε µε τις παραπάνω µεταβλητές, αποδεικνύεται ότι είναι της µορφής: 99,100 ε = 8, PA όπου P είναι η πιθανότητα διέγερσης και A είναι η επιφάνεια του στόχου σε τετραγωνικά εκατοστόµετρα. Για τυπικά οργανικά µόρια, η επιφάνεια αυτή είναι περίπου cm 2, όπως υπολογίστηκε από µελέτες περίθλασης ηλεκτρονίων και ακτίνων-χ, ενώ οι τιµές για την πιθανότητα µετάπτωσης κυµαίνονται από 0 έως 1. Για τις κβαντοµηχανικά επιτρεπόµενες µεταπτώσεις, οι τιµές της πιθανότητας P κυµαίνονται από 0,1 έως 1, γεγονός που οδηγεί σε περιοχές υψηλής απορρόφησης (ε max = 10 4 έως 10 5 ). Κορυφές, που χαρακτηρίζονται από γραµµοµοριακές απορροφητικότητες µικρότερες του 10 3 θεωρούνται χαµηλής έντασης και

128 προκύπτουν από τις λεγόµενες απαγορευµένες µεταπτώσεις, των οποίων η πιθανότητα να συµβούν είναι µικρότερη από 0, ΑΠΟΡΡΟΦΟΥΝΤΑ ΣΩΜΑΤΙ ΙΑ Η απορρόφηση ορατής ή υπεριώδους ακτινοβολίας από ένα ατοµικό ή µοριακό σωµατίδιο Μ, µπορεί να θεωρηθεί σαν µια διαδικασία δύο σταδίων, το πρώτο από τα οποία περιλαµβάνει την ηλεκτρονιακή διέγερση του Μ, σύµφωνα µε την εξίσωση: Μ + hν Μ* Το προϊόν της αντίδρασης µεταξύ του Μ και του φωτονίου είναι ένα ηλεκτρονιακά διεγερµένο ενδιάµεσο σωµατίδιο, που συµβολίζεται ως Μ*. Ο χρόνος ηµιζωής του διεγερµένου σωµατιδίου είναι µικρός (10-8 έως 10-7 s) και η ύπαρξή του τερµατίζεται µε µια από τις πολλές πορείες αποδιέγερσης. Η συνηθισµένη µορφή αποδιέγερσης συνίσταται στη µετατροπή της ενέργειας, που προσλήφθηκε κατά τη διέγερση, σε θερµότητα, δηλαδή: Μ* Μ + θερµότητα Αποδιέγερση µπορεί να πραγµατοποιηθεί και µε διάσπαση του Μ* και σχηµατισµό ενός νέου σωµατιδίου. Η πορεία αυτή ονοµάζεται φωτοχηµική αντίδραση. Εναλλακτικά, η διαδικασία αποδιέγερσης µπορεί να περιλαµβάνει εκποµπή φθορισµού ή φωσφορισµού. Πρέπει να τονιστεί εδώ, ότι ο χρόνος ηµιζωής του Μ* είναι τόσο µικρός, που η συγκέντρωσή του πρέπει να θεωρείται αµελητέα σε οποιαδήποτε χρονική στιγµή. Επιπλέον, το ποσό της θερµότητας που απελευθερώνεται κατά την αποδιέγερση είναι συνήθως µη ανιχνεύσιµο. Έτσι, οι µετρήσεις της απορρόφησης δηµιουργούν µια απειροελάχιστη διαταραχή στο εξεταζόµενο σύστηµα εκτός από την περίπτωση που πραγµατοποιούνται φωτοχηµικές διασπάσεις. Συνήθως, η απορρόφηση της ορατής ή υπεριώδους ακτινοβολίας οφείλεται στη διέγερση δεσµικών ηλεκτρονίων και κατά συνέπεια τα µήκη κύµατος των απορροφήσεων µπορούν να συσχετισθούν µε τους τύπους των δεσµών στα εξεταζόµενα σωµατίδια. Έτσι, η φασµατοµετρία µοριακής απορρόφησης αποτελεί ένα χρήσιµο µέσο για την ταυτοποίηση χαρακτηριστικών οµάδων σε ένα µόριο. Ωστόσο, πολύ µεγαλύτερη είναι η χρησιµότητα της φασµατοµετρίας ορατού και υπεριώδους, στον ποσοτικό προσδιορισµό των ενώσεων που περιέχουν τις οµάδες αυτές. Για την παρουσίαση αυτή θα ήταν χρήσιµο να διακρίνουµε τρεις τύπους ηλεκτρονιακών µεταπτώσεων και µε βάση αυτούς να ταξινοµήσουµε τα απορροφούντα σωµατίδια σε τρεις κατηγορίες. Οι τρεις αυτές κατηγορίες περιλαµβάνουν µεταπτώσεις: (1) π, σ και n ηλεκτρονίων, (2) d και f ηλεκτρόνια και (3) ηλεκτρόνια µεταφοράς φορτίου.

129 5.8 ΑΠΟΡΡΟΦΟΥΝΤΑ ΣΩΜΑΤΙ ΙΑ µε π, σ και n ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΑ Τα σωµατίδια που απορροφούν και περιέχουν π, σ και n ηλεκτρόνια είναι κυρίως οργανικά µόρια και ιόντα, καθώς και ένας αριθµός ανόργανων ανιόντων. Όλες οι οργανικές ενώσεις έχουν την ικανότητα να απορροφούν ηλεκτροµαγνητική ακτινοβολία, καθώς όλες περιέχουν ηλεκτρόνια σθένους, τα οποία µπορούν να διεγερθούν σε υψηλότερες ενεργειακές καταστάσεις. Οι ενέργειες που συνδέονται µε διέγερση ηλεκτρονίων απλών δεσµών είναι τόσο µεγάλες, ώστε η απορρόφηση ακτινοβολίας περιορίζεται στη λεγόµενη περιοχή υπεριώδους κενού (λ<185 nm), όπου απορροφούν ισχυρά και τα συστατικά της ατµόσφαιρας. Οι πειραµατικές δυσκολίες για µετρήσεις στην περιοχή αυτή είναι τόσο µεγάλες, ώστε οι φασµατοφωτοµετρικές µελέτες των οργανικών ενώσεων πραγµατοποιούνται αποκλειστικά σε µήκη κύµατος µεγαλύτερα από 185 nm. Η απορρόφηση ακτινοβολίας µεγαλύτερου µήκους κύµατος στην ορατή και υπεριώδη περιοχή, οφείλεται σε έναν περιορισµένο αριθµό χαρακτηριστικών οµάδων, που καλούνται χρωµοφόρα και οι οποίες περιέχουν ηλεκτρόνια σθένους µε σχετικά χαµηλές ενέργειες διέγερσης. Τα ηλεκτρονιακά φάσµατα των οργανικών µορίων, που περιέχουν χρωµοφόρα, είναι συνήθως πολύπλοκα, επειδή οι µεταπτώσεις των δονητικών και ηλεκτρονιακών σταθµών προστίθενται και δηµιουργούν περιοχές αλληλεπικάλυψης. Το αποτέλεσµα είναι µια ευρεία ζώνη απορρόφησης, η οποία συχνά φαίνεται να είναι συνεχής. Η πολύπλοκη υφή του φάσµατος καθιστά κάθε λεπτοµερειακή θεωρητική ανάλυσή του από δύσκολη έως αδύνατη. Ωστόσο, είναι δυνατή η εξαγωγή ποιοτικών και ηµιποσοτικών συµπερασµάτων ως προς τις υπεύθυνες ηλεκτρονιακές µεταπτώσεις για ορισµένα φάσµατα απορρόφησης, µε εξέταση των εµπλεκόµενων µοριακών τροχιακών. 5.9 ΕΙ Η ΑΠΟΡΡΟΦΟΥΝΤΩΝ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΩΝ Τα ηλεκτρόνια 101, 102 που συνεισφέρουν στην απορρόφηση ενός οργανικού µορίου είναι: (1) αυτά που συµµετέχουν απευθείας στον σχηµατισµό δεσµών και εποµένως συνδέονται µε περισσότερα από ένα άτοµα, (2) µη δεσµικά ή µονήρη εξωτερικά ηλεκτρόνια, που συνήθως εντοπίζονται γύρω από άτοµα όπως το οξυγόνο, τα αλογόνα, το θείο και το άζωτο. Ο οµοιοπολικός δεσµός πραγµατοποιείται επειδή τα ηλεκτρόνια που τον σχηµατίζουν κινούνται στον χώρο πάνω από τα δύο ατοµικά κέντρα, κατά τρόπο ο οποίος ελαχιστοποιεί τις απωστικές δυνάµεις Coulomb µεταξύ των δύο κέντρων. Αυτά τα µη εντοπισµένα πεδία µεταξύ των ατόµων, τα οποία καταλαµβάνονται από δεσµικά ηλεκτρόνια, καλούνται µοριακά τροχιακά

130 (molecular orbitals) και µπορεί να θεωρηθούν ως αποτέλεσµα επικάλυψης των ατοµικών τροχιακών. Όταν δύο ατοµικά τροχιακά συνδυάζονται, τότε προκύπτει είτε ένα δεσµικό µοριακό τροχιακό χαµηλής ενέργειας ή ένα αντιδεσµικό µοριακό τροχιακό υψηλής ενέργειας. Στη θεµελιώδη κατάσταση, τα ηλεκτρόνια του µορίου καταλαµβάνουν το δεσµικό τροχιακό. Τα µοριακά τροχιακά, που σχετίζονται µε απλούς δεσµούς σε οργανικά µόρια αναφέρονται ως σίγµα (σ) και τα αντίστοιχα ηλεκτρόνια ως ηλεκτρόνια σ. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήµα (5.9.1α), η κατανοµή της πυκνότητας του ηλεκτρονιακού νέφους ενός τροχιακού σ είναι σφαιρικά συµµετρική γύρω από τον άξονα του δεσµού. Η µέση πυκνότητα του αρνητικού φορτίου, που πηγάζει από την περιστροφή των δύο ηλεκτρονίων γύρω από τους θετικά φορτισµένους πυρήνες, δείχνεται µε το ποσοστό σκίασης. Ο διπλός δεσµός σε ένα οργανικό µόριο αποτελείται από δύο είδη µοριακών τροχιακών: ένα τροχιακό σίγµα (σ), που αντιστοιχεί στο ένα ζεύγος δεσµικών ηλεκτρονίων και ένα τροχιακό πι (π), που αντιστοιχεί στο άλλο. Τα µοριακά τροχιακά π σχηµατίζονται από την πλευρική (παράλληλη) επικάλυψη των ατοµικών τροχιακών p. Η κατανοµή του φορτίου σε αυτά χαρακτηρίζεται από ένα κοµβικό ή µηδενικό επίπεδο (nodal plane), δηλαδή µια περιοχή χαµηλής πυκνότητας φορτίου κατά µήκος του άξονα του δεσµού και από µια µέγιστη πυκνότητα σε περιοχές πάνω και κάτω από το κοµβικό επίπεδο ( Σχήµα 5.9.1β). Σχήµα 5.9.1: Κατανοµή ηλεκτρονίων στα µοριακά τροχιακά σ και π. Επίσης στα Σχήµατα (5.9.1γ και 5.9.1δ), φαίνονται οι κατανοµές φορτίου για τα αντιδεσµικά τροχιακά σ και π, τα οποία συµβολίζονται µε σ* και π*, αντίστοιχα. Εκτός από τα σ και π ηλεκτρόνια, πολλά οργανικά µόρια περιέχουν επιπλέον και µη δεσµικά ηλεκτρόνια. Αυτά τα µονήρη, κυρίως, ηλεκτρόνια συµβολίζονται ως n. Στο Σχήµα (5.9.2) παρουσιάζονται τα τρία είδη των ηλεκτρονίων στο µόριο της φορµαλδεΰδης.

131 Σχήµα 5.9.2: Τα είδη των µοριακών τροχιακών στο µόριο της φορµαλδεΰδης. Όπως φαίνεται στο Σχήµα (5.9.3), οι ενέργειες για τα διάφορα είδη των µοριακών τροχιακών διαφέρουν σηµαντικά. Κατά γενικό κανόνα τα ενεργειακά επίπεδα των µη δεσµικών ηλεκτρονίων βρίσκονται µεταξύ αυτών των δεσµικών και αντιδεσµικών π και σ ηλεκτρονίων. Οι ηλεκτρονιακές µεταπτώσεις ανάµεσα σε ορισµένες ενεργειακές στάθµες µπορεί να αποδοθούν σε απορρόφηση ακτινοβολίας. Όπως δείχνεται στο Σχήµα (5.9.3), τέσσερα είδη µεταπτώσεων είναι δυνατόν να συµβούν: σ σ*, n σ*, n π*, και π π*. Μεταπτώσεις σ σ*. Εδώ, ένα ηλεκτρόνιο διεγείρεται από ένα δεσµικό τροχιακό προς το αντίστοιχο αντιδεσµικό, µε απορρόφηση ακτινοβολίας. Τότε το µόριο αναφέρεται ότι βρίσκεται στη σ, σ* διεγερµένη κατάσταση. Σε σύγκριση µε τις άλλες δυνατές µεταπτώσεις, η ενέργεια που απαιτείται για µια µετάπτωση σ σ* είναι µεγάλη (πρώτο βέλος στο Σχήµα 5.9.3), και αντιστοιχεί σε συχνότητες ακτινοβολίας στην περιοχή του υπεριώδους κενού. Σχήµα 5.9.3: Ηλεκτρονιακές ενεργειακές στάθµες σε ένα µόριο. Για παράδειγµα, το µεθάνιο το οποίο περιέχει µόνο απλούς δεσµούς C H και εποµένως µπορεί να δώσει µόνο µεταπτώσεις σ σ*, εµφανίζει µέγιστη απορρόφηση στα 125 nm. Το αιθάνιο παρουσιάζει µέγιστο στα 135 nm, το οποίο προκύπτει από ανάλογες µεταπτώσεις αν και εδώ περιλαµβάνονται και τα ηλεκτρόνια του δεσµού C C. Επειδή η ισχύς του δεσµού C C είναι µικρότερη από την ισχύ του δεσµού C H, απαιτείται µικρότερη ενέργεια για τη διέγερση και έτσι η κορυφή της απορρόφησης είναι µετατοπισµένη προς µεγαλύτερα µήκη κύµατος. Τα

132 µέγιστα της απορρόφησης λόγω των µεταπτώσεων σ σ* σπάνια παρατηρούνται στην προσιτή περιοχή της υπεριώδους ακτινοβολίας. Μεταπτώσεις n σ*. Οι κορεσµένες ενώσεις οι οποίες περιέχουν άτοµα µε ελεύθερα ζεύγη ηλεκτρονίων (µη δεσµικά ηλεκτρόνια) µπορούν να δώσουν µεταπτώσεις n σ*. Σε γενικές γραµµές, οι µεταπτώσεις απαιτούν µικρότερη ενέργεια από τις σ σ* και είναι δυνατόν να προέλθουν από ακτινοβολίες µε µήκη κύµατος 150 έως 250 nm, µε τις εντονότερες κορυφές να είναι κάτω από τα 200 nm. Στον Πίνακα φαίνονται τα χαρακτηριστικά απορρόφησης κάποιων τυπικών µεταπτώσεων n σ*. Οι ενεργειακές απαιτήσεις των µεταπτώσεων αυτών εξαρτώνται κυρίως από το είδος του δεσµού και σε µικρότερο βαθµό από τη δοµή του µορίου. Οι γραµµοµοριακές απορροφητικότητες, που αντιστοιχούν στις µεταπτώσεις n σ* είναι µικρού ή µεσαίου µεγέθους και κυµαίνονται από 100 έως και 3000 L cm -1 mol -1. Τα µέγιστα των µεταπτώσεων n σ* τείνουν να µετατοπισθούν προς µικρότερα µήκη κύµατος, σε διαλύτες µεγάλης πολικότητας, όπως το ύδωρ και η αιθανόλη. Ο αριθµός των χαρακτηριστικών οµάδων των οργανικών ενώσεων που δίνουν κορυφές µεταπτώσεων n σ* στην περιοχή του προσιτού υπεριώδους είναι σχετικά µικρός. Πίνακας 5.9.1: Παραδείγµατα απορροφήσεων που οφείλονται σε µεταπτώσεις n σ* α Ένωση λ max (nm) ε max H 2 O CH 3 OH CH 3 Cl CH 3 I (CH 3 ) 2 S β (CH 3 ) 2 O CH 3 NH (CH 3 ) 3 N α Σε αέρια κατάσταση. β Σε αιθανόλη. Μεταπτώσεις n π* και π π*. Οι περισσότερες εφαρµογές της φασµατοφωτοµετρίας µοριακής απορρόφησης, όσον αφορά στις οργανικές ενώσεις, βασίζονται στη µετάπτωση n ή π ηλεκτρονίων στην π* διεγερµένη κατάσταση. Ο λόγος είναι ότι οι ενέργειες που απαιτούνται

133 για τις µεταπτώσεις αυτές βρίσκονται στη φασµατική περιοχή των nm, όπου δεν παρουσιάζονται πειραµατικές δυσκολίες κατά τις µετρήσεις. Και οι δύο κατηγορίες µεταπτώσεων προϋποθέτουν την παρουσία µιας ακόρεστης χαρακτηριστικής οµάδας στο µόριο της οργανικής ένωσης, η οποία παρέχει τα τροχιακά π. Για τις οµάδες αυτές ισχύει ο όρος χρωµοφόρο. Οι γραµµοµοριακές απορροφητικότητες για κορυφές απορρόφησης από την n στην π* διεγερµένη κατάσταση είναι σχετικά χαµηλές και κυµαίνονται από 10 έως και 100 L cm -1 mol -1 και για τις µεταπτώσεις π π* βρίσκονται στην περιοχή των έως L cm -1 mol -1. Άλλη µια χαρακτηριστική διαφορά ανάµεσα στα δύο αυτά είδη απορρόφησης, είναι η επίδραση του διαλύτη στο µήκος κύµατος της κορυφής. Έτσι διαλύτες µε µεγάλη πολικότητα µετατοπίζουν τις κορυφές των µεταπτώσεων n π* προς µικρότερα µήκη κύµατος (υψοχρωµατική ή κυανή µετατόπιση). Στην περίπτωση των µεταπτώσεων π π*, επικρατεί συνήθως η αντίθετη τάση ( βαθυχρωµική ή ερυθρά µετατόπιση). Το υψοχρωµικό φαινόµενο προκαλείται πιθανόν από την αύξηση της επιδιαλύτωσης του ελεύθερου ηλεκτρονιακού ζεύγους, κάτι που προκαλεί µείωση της ενέργειας του τροχιακού n. Οι πιο έκδηλες επιπτώσεις του παραπάνω φαινοµένου (κυανή µετατόπιση 30 nm και πλέον), παρατηρούνται σε υδρολυτικούς διαλύτες, όπως το ύδωρ και οι αλκοόλες, οπότε σχηµατίζονται δεσµοί υδρογόνου µεταξύ πρωτονίων διαλύτη και ελευθέρων ζευγών ηλεκτρονίων. Εδώ, η ενέργεια των τροχιακών n µειώνεται κατά ένα ποσό που ισοδυναµεί µε την ενέργεια του δεσµού υδρογόνου. Ωστόσο, σε µια µετάπτωση n π*, το µονήρες n ηλεκτρόνιο που αποµένει, δεν µπορεί να διατηρήσει τον δεσµό υδρογόνου και έτσι η ενέργεια της διεγερµένης κατάστασης n, π* δεν επηρεάζεται από το είδος του διαλύτη. Συµβαίνει και πάλι µια κυανή µετατόπιση, η οποία όµως ελάχιστα αντιστοιχεί στην ενέργεια του δεσµού υδρογόνου. Ένα άλλο φαινόµενο επίδρασης του διαλύτη, το οποίο επηρεάζει τόσο τις π π*, όσο και τις n π* µεταπτώσεις, είναι αυτό που οδηγεί σε βαθυχρωµική µετατόπιση µε την αύξηση της πολικότητας του διαλύτη. Η επίδραση αυτή είναι µικρή (συνήθως µικρότερη από 5 nm) και έτσι επισκιάζεται από την προαναφερθείσα υψοχρωµική µετατόπιση, ιδιαίτερα στις µεταπτώσεις n π*. Με αυτήν τη βαθυχρωµική µετατόπιση, οι ελκτικές δυνάµεις διπόλουδιπόλου που αναπτύσσονται µεταξύ διαλύτη και απορροφούντος συστήµατος, τείνουν να µειώσουν την ενέργεια τόσο της βασικής, όσο και της διεγερµένης κατάστασης. Η επίδραση είναι εντονότερη στη διεγερµένη κατάσταση. Έτσι η ενεργειακή διαφορά µειώνεται µε αύξηση της πολικότητας του διαλύτη, µε αποτέλεσµα µια µικρή βαθυχρωµική µετατόπιση.

134 5.10 ΟΡΓΑΝΙΚΑ ΧΡΩΜΟΦΟΡΑ Στον Πίνακα 5.10 παρατίθενται µερικά συνήθη οργανικά χρωµοφόρα, καθώς και οι περιοχές µέγιστης απορρόφησης. Τα δεδοµένα αυτά µπορούν να χρησιµεύσουν ως ένας χονδρικός οδηγός αναγνώρισης χαρακτηριστικών οµάδων, καθώς και τα ακριβή µέγιστα εξαρτώνται από τον διαλύτη και από τις δοµικές λεπτοµέρειες των µορίων, τα οποία περιέχουν τα χρωµοφόρα. Επιπλέον, οι κορυφές είναι κατά κανόνα πλατιές λόγω δονητικών αλληλεπιδράσεων. Έτσι, ο καθορισµός του ακριβούς µεγίστου είναι δύσκολος. Πίνακας 5.10: Χαρακτηριστικά απορρόφησης µερικών συνηθισµένων χρωµοφόρων Τα φάσµατα που απεικονίζονται στο Σχήµα 5.10 είναι χαρακτηριστικά πολλών οργανικών ενώσεων.

135 Σχήµα 5.10: Φάσµατα υπεριώδους για κάποιες τυπικές οργανικές ενώσεις ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΤΗΣ ΣΥΖΥΓΙΑΣ ΤΩΝ ΧΡΩΜΟΦΟΡΩΝ Σύµφωνα µε τη θεωρία των µοριακών τροχιακών, τα π ηλεκτρόνια απεντοπίζονται ακόµη περισσότερο λόγω του συζυγιακού φαινοµένου. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα το τροχιακό να περιλαµβάνει τέσσερα ή και περισσότερα ατοµικά κέντρα. Συνέπεια του απεντοπισµού αυτού είναι να ελαττωθεί η ενέργεια των τροχιακών π* και να αποκτήσουν αυτά λιγότερο αντιδεσµικό χαρακτήρα. Έτσι τα µέγιστα της απορρόφησης µετατοπίζονται σε µεγαλύτερα µήκη κύµατος. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 5.11, οι απορροφήσεις των πολυχρωµοφόρων σε µία και µόνο οργανική ένωση είναι σχεδόν αθροιστικές, µε την προϋπόθεση ότι οι χρωµοφόρες οµάδες χωρίζονται µεταξύ τους µε περισσότερους από έναν απλούς δεσµούς. Ωστόσο, η συζυγία των χρωµοφόρων οµάδων επιδρά σηµαντικά στα φασµατικά χαρακτηριστικά. Π.χ. όπως φαίνεται στον Πίνακα 5.11 το 1,3-βουταδιένιο, CH 2 =CH CH=CH 2, παρουσιάζει µια περιοχή ισχυρής απορρόφησης µετατοπισµένη κατά 20 nm προς µεγαλύτερα µήκη κύµατος, σε σχέση µε την αντίστοιχη κορυφή ενός µη συζυγούς διενίου. Στην περίπτωση που η συζυγία επεκτείνεται και σε τρίτο διπλό δεσµό η βαθυχρωµική επίδραση είναι ισχυρότερη.

136 Πίνακας 5.11: Επίδραση πολυχρωµοφόρων στην απορρόφηση Παρόµοια συµπεριφορά παρατηρείται και στην περίπτωση συζυγίας µεταξύ του διπλού δεσµού άνθρακα-οξυγόνου των αλδεϋδών, κετονών και των καρβοξυλικών οξέων και ενός ολεφινικού διπλού δεσµού (όπως φαίνεται και στον Πίνακα 5.11). Ανάλογα φαινόµενα παρατηρούνται όταν δύο καρβονυλικές ή καρβοξυλικές οµάδες βρίσκονται σε συζυγία µεταξύ τους. Για τις α, β ακόρεστες αλδεΰδες και κετόνες, η ασθενής κορυφή που οφείλεται στις µεταπτώσεις n π* µετατοπίζεται τουλάχιστον κατά 40 nm προς µεγαλύτερα µήκη κύµατος. Επιπλέον, εµφανίζεται ακόµη µία έντονη κορυφή, η οποία οφείλεται σε µια µετάπτωση π π*. Η τελευταία εντοπίζεται στην περιοχή του υπεριώδους κενού, µόνο στην περίπτωση που το καρβονύλιο δεν είναι συζυγιακό. Τα µήκη κύµατος των κορυφών απορρόφησης των συζυγιακών συστηµάτων, εξαρτώνται σε µεγάλο βαθµό από το είδος των οµάδων, που συνδέονται µε τα άτοµα του διπλού δεσµού. Για την ερµηνεία και την πρόβλεψη της επίδρασης των υποκαταστατών αυτών, έχουν διατυπωθεί διάφοροι εµπειρικοί κανόνες, οι οποίοι έχουν αποδειχθεί χρήσιµοι σε δοµικούς προσδιορισµούς ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΑΡΩΜΑΤΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ Το υπεριώδες φάσµα των αρωµατικών υδρογονανθράκων χαρακτηρίζεται από τρεις περιοχές απορρόφησης, οι οποίες οφείλονται σε µεταπτώσεις π π*. Για παράδειγµα, το βενζόλιο εµφανίζει µια έντονη κορυφή στα 184 nm (ε max ~ ), µια ασθενέστερη, γνωστή

137 ως Ε 2, στα 204 nm (ε max = 7.900) και µια ακόµα ασθενέστερη, γνωστή ως Β, στα 256 nm (ε max = 200). Οι κορυφές απορρόφησης σε µεγάλα µήκη κύµατος, ενώσεων όπως οι ατµοί βενζολίου, η 1,2,4,5-τετραζίνη (Σχήµα 5.12α) καθώς και πολλών άλλων αρωµατικών ενώσεων, περιλαµβάνουν µια σειρά από οξείες κορυφές, οι οποίες οφείλονται στην αθροιστική επικάλυψη των βασικών ηλεκτρονιακών µεταπτώσεων µε δονητικές µεταπτώσεις. Σχήµα 5.12: Φάσµα υπεριώδους της 1,2,4,5-τετραζίνης (α) σε αέρια κατάσταση, (β) σε διάλυµα εξανίου και (γ) σε υδατικό διάλυµα. Όπως φαίνεται και στο Σχήµα 5.12α, οι διάφοροι διαλύτες τείνουν να µειώσουν (ή και να εξαλείψουν) τη λεπτή υφή, όπως συµβαίνει και µε διάφορους υποκαταστάτες. Και οι τρεις χαρακτηριστικές κορυφές του βενζολίου επηρεάζονται σηµαντικά από την παρουσία υποκαταστατών στο δακτύλιο. Ιδιαίτερα ενδιαφέρουν οι επιδράσεις στα µεγαλύτερα µήκη κύµατος, επειδή µπορούν να εξετασθούν µε τα συνηθισµένα φασµατοφωτοµετρικά όργανα. Στον Πίνακα 5.12 φαίνονται οι επιδράσεις ορισµένων υποκαταστατών. Ως αυξόχρωµη ορίζεται κάθε χαρακτηριστική οµάδα, η οποία ενώ η ίδια δεν απορροφά στο υπεριώδες, έχει την ικανότητα να µετατοπίζει τις κορυφές των χρωµοφόρων σε µεγαλύτερα µήκη κύµατος, καθώς και να τις ενισχύει. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 5.12 οι οµάδες ΟΗ και ΝΗ 2 έχουν αυξοχρωµική δράση στις χρωµοφόρες οµάδες του βενζολίου και ιδιαίτερα στην

138 κορυφή Β. Οι αυξοχρωµικοί υποκαταστάτες διαθέτουν τουλάχιστον ένα ζεύγος n ηλεκτρονίων, τα οποία είναι δυνατόν να αλληλεπιδράσουν µε τα π ηλεκτρόνια του δακτυλίου. Η αλληλεπίδραση αυτή φαίνεται ότι σταθεροποιεί τη διεγερµένη κατάσταση π*. Έτσι, µειώνει την ενέργειά της και προκαλεί βαθυχρωµική µετατόπιση. Πρέπει να σηµειωθεί, ότι το αυξοχρωµικό αποτέλεσµα είναι εντονότερο στο φαινολικό ιόν από ότι στη φαινόλη πιθανόν λόγω του επιπλέον ζεύγους ασύζευκτων ηλεκτρονίων που διαθέτει το ιόν. Αντίθετα, στην ανιλίνη τα µη δεσµικά ηλεκτρόνια χάνονται κατά τον σχηµατισµό του κατιόντος και έτσι η αυξοχρωµική δράση της εκµηδενίζεται. Πίνακας 5.12: Χαρακτηριστικά απορρόφησης αρωµατικών ενώσεων 5.13 ΤΡΟΠΟΙ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ Ε ΟΜΕΝΩΝ Στην ποιοτική µοριακή φασµατοφωτοµετρία συναντώνται διάφοροι τύποι παρουσίασης των φασµάτων Ο άξονας των τεταγµένων είναι συνήθως η επί τοις εκατό διαπερατότητα, η απορρόφηση, ο λογάριθµος απορρόφησης ή η γραµµοµοριακή απορροφητικότητα. Ο άξονας των τετµηµένων είναι συνήθως το µήκος κύµατος ή ο κυµατάριθµος και σπανιότερα η συχνότητα. Στο Σχήµα 5.13 παρουσιάζεται η επίδραση της συγκέντρωσης του αναλύτη σε τρεις από τους συνηθέστερους τρόπους παρουσίασης φασµάτων.

139 Σχήµα 5.13: Τρόποι καταγραφής φασµάτων. Οι αριθµοί κάτω από τις καµπύλες δείχνουν τις συγκεντρώσεις τουkmno 4 σε ppm, b=2,00 cm. Σύγκριση µεταξύ του (α) και (β) φανερώνει ότι τα καταγραφήµατα απορρόφησης παρουσιάζουν µεγαλύτερες διαφορές στις κορυφές σε σχέση µε τα αντίστοιχα της διαπερατότητας. Αντίθετα στην περίπτωση των κοιλάδων, µεγαλύτερες διαφορές παρουσιάζονται σε υψηλές διαπερατότητες. Γραφική παράσταση µε τον λογάριθµο της απορρόφησης στον άξονα των τεταγµένων αποκαλύπτει λιγότερες φασµατικές λεπτοµέρειες, αλλά είναι χρήσιµη για τη σύγκριση των φασµάτων, επειδή φάσµατα διαφορετικών συγκεντρώσεων εµφανίζονται πάντοτε ίδια και µετατοπισµένα µόνο ως προς τον κατακόρυφο άξονα ΙΑΛΥΤΕΣ Για την επιλογή του κατάλληλου διαλύτη πρέπει να ληφθεί υπόψη τόσο η διαπερατότητά του, όσο και οι πιθανές αλληλεπιδράσεις µε το σύστηµα που απορροφά. Κατά γενικό κανόνα, πολικοί διαλύτες όπως ύδωρ, αλκοόλες, εστέρες και κετόνες τείνουν να εξαλείψουν τη λεπτή φασµατική υφή, που οφείλεται σε δονητικά φαινόµενα. Φάσµατα παρόµοια µε αυτά που

140 λαµβάνονται µε δείγµατα σε αέρια φάση είναι πιθανότερο να ληφθούν µε απολικούς διαλύτες, όπως π.χ. µε υδρογονάνθρακες. Επιπλέον, οι θέσεις των µεγίστων επηρεάζονται από τη φύση του διαλύτη. Κατά συνέπεια, θα πρέπει να χρησιµοποιείται ο ίδιος διαλύτης, όταν συγκρίνονται φάσµατα µε σκοπό την ταυτοποίηση ενώσεων. Στον Πίνακα 5.14 παρουσιάζονται ορισµένοι κοινοί διαλύτες, καθώς και τα µήκη κύµατος κάτω από τα οποία δεν θα πρέπει να χρησιµοποιούνται λόγω αυτοαπορρόφησης. Τα όρια αυτά εξαρτώνται σε µεγάλο βαθµό από την καθαρότητα του διαλύτη. Οι συνηθέστεροι διαλύτες για τη φασµατοφωτοµετρία υπεριώδους είναι το ύδωρ, η αιθανόλη, το κυκλοεξάνιο και το 1,4-διοξάνιο. Για την ορατή περιοχή, κάθε µη-έγχρωµος διαλύτης είναι κατάλληλος. Πίνακας 5.14: ιαλύτες που χρησιµοποιούνται στο υπεριώδες και στο ορατό ιαλύτης Ελάχιστο διαπερατότητας (nm) κατά προσέγγιση α Ύδωρ 190 Αιθανόλη 210 n-εξάνιο 195 Κυκλοεξάνιο 210 Βενζόλιο 280 ιαιθυλαιθέρας 210 Ακετόνη 330 1,4- ιοξάνιο 220 Μεθανόλη 210 Ακετονιτρίλιο 210 α Για κυψελίδα 1 cm 5.15 ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ Η φασµατοφωτοµετρία µοριακής απορρόφησης είναι από τα χρησιµότερα και πιο διαδεδοµένα εργαλεία στη διάθεση των επιστηµόνων για την πραγµατοποίηση ποσοτικών προσδιορισµών. Στα σηµαντικότερα χαρακτηριστικά των φασµατοφωτοµετρικών µεθόδων περιλαµβάνονται: (1) η ευρεία εφαρµοσιµότητα τόσο σε οργανικά, όσο και σε ανόργανα συστήµατα, (2) όρια προσδιορισµών της τάξης των 10-4 έως 10-5 Μ, τα οποία µπορεί να φτάσουν και µέχρι 10-6 έως 10-7 Μ, µε κατάλληλες τροποποιήσεις, (3) µέτρια µέχρι και µεγάλη εκλεκτικότητα, (4) καλή ακρίβεια (συνήθως συναντώνται σχετικές αβεβαιότητες στην περιοχή

141 του 1 έως και 3%, αν και µε κατάλληλες προφυλάξεις µπορεί να µειωθούν και σε δέκατα του 1%), και (5) εύκολη συλλογή των αποτελεσµάτων. Στα πρώτα βήµατα µιας φασµατοφωτοµετρικής ανάλυσης περιλαµβάνεται ο καθορισµός των βέλτιστων συνθηκών και η κατασκευή µιας καµπύλης αναφοράς, η οποία συνδέει την απορρόφηση µε τη συγκέντρωση. Οι φασµατοφωτοµετρικές µετρήσεις πραγµατοποιούνται συνήθως σε µήκος κύµατος, το οποίο αντιστοιχεί σε µια κορυφή απορρόφησης, επειδή εκεί η µεταβολή της απορρόφησης ανά µονάδα συγκέντρωσης είναι µεγαλύτερη, µε αποτέλεσµα να λαµβάνεται η µεγαλύτερη ευαισθησία. Επιπλέον, στην περιοχή του µεγίστου η καµπύλη απορρόφησης µπορεί να θεωρηθεί ως πρακτικά ανεξάρτητη από το µήκος κύµατος και εποµένως αναµένονται µικρότερες αποκλίσεις από το νόµο του Beer. Τέλος, οι µετρήσεις είναι λιγότερο ευαίσθητες σε τυχαία σφάλµατα που µπορεί να προκύψουν από την αδυναµία ακριβούς αναπαραγωγής του ίδιου µήκους κύµατος. Οι συνηθέστερες παράµετροι που επηρεάζουν το φάσµα απορρόφησης µιας ουσίας είναι η φύση του διαλύτη, το ph του διαλύµατος, η θερµοκρασία, οι συγκεντρώσεις των διαφόρων ηλεκτρολυτών και η ύπαρξη παρεµποδίσεων. Η επίδραση των παραπάνω παραµέτρων πρέπει να είναι γνωστή και οι τιµές τους πρέπει να ρυθµίζονται έτσι, ώστε µικρές µεταβολές στην τιµή τους να µην επηρεάζουν τη µετρούµενη απορρόφηση ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΚΥΨΕΛΙ ΩΝ Για ακριβείς φασµατοφωτοµετρικές αναλύσεις απαιτούνται αντικρισµένες (ταιριασµένες) κυψελίδες υψηλής ποιότητας. Οι κυψελίδες πρέπει να βαθµονοµούνται µεταξύ τους, ώστε να εντοπισθούν τυχόν διαφορές, οι οποίες οφείλονται σε χαραγµατιές, φθορές κλπ. Εξίσου σηµαντική είναι η χρησιµοποίηση ενδεδειγµένων τρόπων καθαρισµού και στεγνώµατος των κυψελίδων. Οι Erickson και Surles 106, συνιστούν την ακόλουθη πορεία καθαρισµού της εξωτερικής επιφάνειας των κυψελίδων: πριν από τη µέτρηση, οι επιφάνειες της κυψελίδας πρέπει να καθαρίζονται µε ένα ειδικό χαρτί για φακούς (lens paper), το οποίο να είναι διαβρεγµένο µε µεθανόλη φασµατοσκοπικής καθαρότητας. Το χαρτί συγκρατείται µε αιµοστατική λαβίδα και µετά το σκούπισµα, η µεθανόλη αφήνεται να εξατµισθεί πάνω στην επιφάνεια αφήνοντάς την ελεύθερη από ρύπους. Οι συγγραφείς έδειξαν ότι η µέθοδος αυτή είναι κατά πολύ ανώτερη από το συνηθισµένο σκούπισµα των κυψελίδων µε ξηρό χαρτί φακών, το οποίο προφανώς αφήνει χνούδι και σκόνη στην επιφάνειά τους.

142 5.17 ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΧΕΣΗΣ ΜΕΤΑΞΥ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΚΑΙ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ Αφού καθορισθούν οι άριστες συνθήκες εργασίας, θα πρέπει να κατασκευασθεί µια καµπύλη αναφοράς µε πρότυπα διαλύµατα γνωστών συγκεντρώσεων, που περιβάλλουν τις αναµενόµενες συγκεντρώσεις των άγνωστων δειγµάτων. Σε πολύ σπάνιες περιπτώσεις, µπορούµε να υποθέσουµε ότι η απορρόφηση υπακούει στο νόµο του Beer και να χρησιµοποιήσουµε µόνο ένα πρότυπο για τον υπολογισµό του συντελεστή γραµµοµοριακής απορροφητικότητας. Οι αναλυτικοί υπολογισµοί δεν πρέπει ποτέ να βασίζονται σε τιµές γραµµοµοριακής απορροφητικότητας από τη βιβλιογραφία. Στην ιδανική περίπτωση, τα πρότυπα βαθµονόµησης θα πρέπει να προσεγγίζουν τα πραγµατικά δείγµατα, όχι µόνο ως προς τη συγκέντρωση της προσδιοριζόµενης ουσίας, αλλά και ως προς τις συγκεντρώσεις των υπολοίπων συστατικών του δείγµατος, ώστε να ελαχιστοποιείται το αναλυτικό σφάλµα από την επίδρασή τους στη µετρούµενη απορρόφηση. Για παράδειγµα, η απορρόφηση των έγχρωµων συµπλόκων πολλών µετάλλων µειώνεται σε διαφορετικό βαθµό παρουσία θειικών ή φωσφορικών ιόντων, τα οποία έχουν την τάση να σχηµατίζουν µε πολλά µέταλλα άχρωµα σύµπλοκα. Έτσι, η χρωµογόνος αντίδραση συµπληρώνεται σε µικρότερο ποσοστό και η απορρόφηση µειώνεται. Η επίδραση των παραπάνω ιόντων µπορεί συχνά να αντιµετωπισθεί µε την εισαγωγή τους στα πρότυπα σε συγκεντρώσεις, όσο το δυνατόν πλησιέστερα προς εκείνες των πραγµατικών δειγµάτων ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΓΜΑΤΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Η συνολική απορρόφηση ενός διαλύµατος, σε δεδοµένο µήκος κύµατος, ισούται µε το άθροισµα των απορροφήσεων των επιµέρους συστατικών του (A ολική = Α 1 + Α Α n = ε 1 bc 1 + ε 2 bc ε n bc n ). Η σχέση αυτή καθιστά εφικτό τον ποσοτικό προσδιορισµό των συστατικών ενός µίγµατος, ακόµα και εάν τα φάσµατά τους επικαλύπτονται. Για παράδειγµα, τα φάσµατα των ουσιών Μ και Ν που φαίνονται στο Σχήµα Να σηµειωθεί ότι δεν υπάρχει κανένα µήκος κύµατος στο οποίο η απορρόφηση οφείλεται µόνο στη µία ουσία. Έτσι, ο προσδιορισµός του Μ και του Ν είναι αδύνατος µε µία µόνο µέτρηση. Εποµένως, οι απορροφήσεις του µίγµατος στα δύο διαφορετικά µήκη κύµατος λ και λ αποδίδονται από τις εξισώσεις: Α = ε Μ bc Μ + ε Ν bc N (σε µήκος κύµατος λ ) Α = ε Μ bc Μ + ε Ν bc N (σε µήκος κύµατος λ )

143 Σχήµα 5.18: Φάσµα απορρόφησης ενός µίγµατος δύο συστατικών. Τα βέλτιστα µήκη κύµατος λ και λ για τον προσδιορισµό των δύο ουσιών υποδεικνύονται µε κάθετες διακεκοµµένες γραµµές. ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ UV-Vis Η φασµατοφωτοµετρία παραγώγων υπεριώδους-ορατού είναι µία αναλυτική τεχνική µεγάλης χρησιµότητας για τη λήψη ποιοτικών και ποσοτικών πληροφοριών από φάσµατα µίγµατος ουσιών των οποίων οι κορυφές αλληλεπικαλύπτονται. Ο όρος φασµατοφωτοµετρία παραγώγων αφορά την τεχνική υπολογισµού και σχεδιασµού κάποιας από τις µαθηµατικές παραγώγους ενός φάσµατος απορρόφησης. Η παραγώγιση δίνει τη δυνατότητα να παρατηρούνται και να περιγράφονται αδρές διαφορές µεταξύ οµοίων φασµάτων, καθώς και να διακρίνονται στενές κορυφές έναντι ευρύτερων κορυφών παρεµπόδισης. Η χρήση της τεχνικής της παραγώγισης των φασµατικών κορυφών οριοθετείται στις αρχές της δεκαετίας του 50 από τους Hammond και Price, Tannenbauer και Morrison. Το 1955 οι Giese και French ανέπτυξαν µία τεχνική πρώτης παραγώγου για τη µελέτη χρωστικών ουσιών στη φυτική φωτοχηµεία. Ένα χρόνο αργότερα, οι Collier και Singleton χρησιµοποίησαν φάσµατα παραγώγων δεύτερης ή και υψηλότερης τάξεως στη φασµατοφωτοµετρία υπερύθρου (IR). Η χρησιµοποίηση των παραγώγων επεκτάθηκε και στον τοµέα της φαρµακευτικής

144 ανάλυσης, όπου ακολούθησαν εργασίες βασισµένες στη λήψη της δεύτερης ή υψηλότερης τάξεως παραγώγου των φασµάτων απορρόφησης υπεριώδους-ορατού. Η τεχνική αυτή έγινε αποδεκτή διστακτικά, λόγω του ακριβού εργαστηριακού εξοπλισµού και του αρχικού περιορισµού µέχρι την πρώτη παράγωγο, αν και είχε αποδεδειγµένα αποτελέσµατα στην επίλυση σηµαντικών αναλυτικών προβληµάτων. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια, η εισαγωγή της ηλεκτρονικής διαφόρισης µε µικροϋπολογιστές ενσωµατωµένους στα φασµατοφωτόµετρα κατέστησε εύκολο τον υπολογισµό της πρώτης, δεύτερης και υψηλότερης τάξεως παραγώγων ενός φάσµατος σε συνάρτηση µε το µήκος κύµατος και αύξησε ραγδαία τις εφαρµογές της φασµατοφωτοµετρίας παραγώγων. Η τεχνική της παραγώγισης έχει εφαρµοσθεί και σε άλλους τοµείς της ανάλυσης, όπως στη φασµατοσκοπία υπερύθρου (IR), στη φλογοφασµατοφωτοµετρία εκποµπής και απορρόφησης, τη φθορισµοµετρία, στην αέριο χρωµατογραφία, στη φασµατοσκοπία NMR και στις ποτενσιοµετρικές ογκοµετρήσεις. 6.2 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΦΑΣΜΑΤΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ ΥΠΕΡΙΩ ΟΥΣ-ΟΡΑΤΟΥ Τα φάσµατα παραγώγων UV-Vis λαµβάνονται µε παραγώγιση του φάσµατος µηδενικής τάξης σε συνάρτηση µε το µήκος κύµατος λ. Με τον τρόπο αυτό µπορούν να ληφθούν παράγωγοι πρώτης, δεύτερης ή υψηλότερης τάξης: Α = f(λ) da/dλ = f'(λ) d 2 A/dλ 2 = f''(λ) d n A/dλ n = f n (λ) Ένα φάσµα απορρόφησης, το οποίο ονοµάζεται επίσης αναλυτικό φάσµα, µπορεί να περιγραφεί µε προσεγγιστικούς τύπους, όπως οι εξισώσεις κατά Gauss ή κατά Lorenz ή η κατανοµή κατά Gauchy. Σύµφωνα µε τον Gauss, η απορρόφηση Α του φάσµατος σε µήκος κύµατος λ δίνεται από τον τύπο: Αλ = Α max e όπου Α max είναι η µέγιστη απορρόφηση και C είναι µία σταθερά. Η επίδραση της παραγώγισης σε µία κορυφή κατά Gauss φαίνεται παραστατικά στο Σχήµα 6.2. Η πρώτη παράγωγος µίας αναλυτικής καµπύλης απορρόφησης είναι η γραφική παράσταση της κλίσης da/dλ σε συνάρτηση µε το µήκος κύµατος λ και χαρακτηρίζεται από ένα µέγιστο και ένα ελάχιστο που αντιστοιχούν στα δύο κατοπτρικά σηµεία του κανονικού Cλ 2

145 φάσµατος. Στο λ max του κανονικού φάσµατος η πρώτη παράγωγος διέρχεται από το µηδέν (zero crossing point). Σχήµα 6.2: Φάσµατα απορρόφησης µηδενικής, πρώτης, δεύτερης, τρίτης και τέταρτης τάξης παραγώγου µίας καµπύλης κατά Gauss. Το βασικότερο χαρακτηριστικό της δεύτερης παραγώγου µίας αναλυτικής καµπύλης απορρόφησης είναι η παρουσία ενός ελαχίστου που αντιστοιχεί στο λ max του κανονικού φάσµατος. Στα δύο κατοπτρικά σηµεία εξάλλου του αρχικού φάσµατος αντιστοιχούν δύο µέγιστα της δεύτερης παραγώγου (λοβοί).

146 Τα σχήµατα των παραγώγων υψηλότερης τάξης γίνονται περισσότερο πολύπλοκα µε την αύξηση της τάξης παραγώγισης, αφού αυξάνεται ο αριθµός των λοβών. Παρουσιάζουν ωστόσο αρκετά χρήσιµα χαρακτηριστικά γνωρίσµατα. Η χαρακτηριστική µορφή της τρίτης παραγώγου, µιας απλής αναλυτικής κορυφής, είναι ένα µέγιστο που ακολουθείται από ένα ελάχιστο, ενώ το σηµείο µηδενισµού της συµπίπτει µε το λ max του κανονικού φάσµατος. Η τέταρτη παράγωγος έχει ως χαρακτηριστικό γνώρισµα ένα µέγιστο στο σηµείο του λ max του κανονικού φάσµατος και δύο δορυφορικά ελάχιστα (λοβοί) που αντιστοιχούν στα δύο κατοπτρικά σηµεία του αρχικού φάσµατος. 6.3 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ 1. Προσδιορισµός του λ max Το µήκος κύµατος στο οποίο µηδενίζεται η πρώτη παράγωγος ανταποκρίνεται στο λ max του βασικού φάσµατος. Έτσι η λήψη της πρώτης παραγώγου των φασµάτων παραγώγισης είναι ιδιαίτερα χρήσιµη για τον ακριβή προσδιορισµό του λ max, ειδικά στην περίπτωση ουσιών που εµφανίζουν πλατιές ζώνες απορρόφησης. Αυτό το πλεονέκτηµα των φασµάτων παραγώγων είναι σηµαντικό για την ποιοτική ανάλυση διαφόρων ουσιών, αφού από τη θέση του λ max µπορεί να προβλεφθεί η ύπαρξη διαφόρων χρωµοφόρων οµάδων στο µόριο τους. 2. Ενίσχυση της διαχωριστικότητας (enhanced resolution) Η ανάπτυξη της τεχνικής των παραγώγων βασίζεται στο γεγονός, ότι οι φασµατοφωτοµετρικές τεχνικές είναι εύχρηστες, γρήγορες, µε χαµηλό κόστος σε σχέση µε άλλες αναλυτικές µεθόδους. Γιατί είναι γνωστό, πως στις παραγώγους των φασµάτων οι αµυδρές διαφορές που παρατηρούνται στα κυρίως φάσµατα (φάσµατα µηδενικής τάξης) καθίστανται πολύ πιο έντονες. Επιπρόσθετα, η παραγώγιση συντελεί στο να διακρίνονται στενές ταινίες απορρόφησης, έναντι των ευρύτερων ταινιών παρεµπόδισης που συνήθως προέρχονται από τα έκδοχα. Πιο συγκεκριµένα, τα φάσµατα απορρόφησης υπεριώδους-ορατού συνήθως αποτελούνται από πλατιές ζώνες απορρόφησης, που συχνά αλληλεπικαλύπτονται σε µεγάλο βαθµό. Βασικό χαρακτηριστικό της παραγώγισης των φασµάτων απορρόφησης, είναι το εύρος της κεντρικής κορυφής σε φάσµατα παραγώγου να ελαττώνεται, όσο αυξάνεται η τάξη της παραγώγισης. Αποτέλεσµα εποµένως της παραγώγισης των φασµάτων είναι η ενίσχυση της διαχωριστικότητας των φασµατικών ζωνών (αύξηση του αριθµού των λεπτοµερειών), που καθιστά δυνατή τη λήψη περισσότερων πληροφοριών στη διευκρίνιση της δοµής µιας ενώσεως. Έτσι, τα φάσµατα παραγώγων είναι χαρακτηριστικότερα για την κάθε ουσία σε σχέση µε τα

147 φάσµατα µηδενικής τάξεως παραγώγου και µπορούν να χρησιµεύσουν για το διαχωρισµό αλληλεπικαλυπτόµενων κορυφών. 3. Αύξηση της διαφοράς (discrimination) των µικρότερων φασµατικών λεπτοµερειών Η παραγώγιση των φασµάτων απορρόφησης αυξάνει τις διαφορές µεταξύ των φασµάτων, αποκαλύπτοντας έτσι µικρές αλλαγές στην κλίση που είναι δύσκολο να παρατηρηθούν στην άµεση φασµατοφωτοµετρία. Η αύξηση των διαφορών των µικρότερων φασµατικών λεπτοµερειών αυξάνει µε αύξηση της τάξης της παραγώγου. 4. Εκλεκτική αφαίρεση (selective subtraction) Αν και το φάσµα παραγώγου είναι πιο χαρακτηριστικό από το βασικό φάσµα, είναι γεγονός ότι µε την παραγώγιση των φασµάτων απορρόφησης, οι ουσιαστικές πληροφορίες των δεδοµένων, ελαττώνονται. Είναι φανερό ότι κατά τη διάρκεια της παραγώγισης χάνονται πολύπλοκες µορφές δεδοµένων. Ωστόσο, αυτό το µειονέκτηµα της παραγώγισης των φασµάτων απορρόφησης, µπορεί να χρησιµοποιηθεί πλεονεκτικά σε ορισµένες αναλυτικές εφαρµογές. 6.4 Ο ΛΟΓΟΣ ΣΗΜΑΤΟΣ-ΠΡΟΣ-ΘΟΡΥΒΟ Κάθε αποτέλεσµα αναλυτικής µέτρησης αποτελείται από δύο συνιστώσες. Η µία συνιστώσα είναι το σήµα, το οποίο αποτελεί το φορέα της πληροφορίας για τον αναλύτη του οποίου ο προσδιορισµός ενδιαφέρει τον αναλυτικό-φαρµακοποιό. Η δεύτερη συνιστώσα είναι ο θόρυβος, ο οποίος αποτελείται από εξωγενείς πληροφορίες που είναι ανεπιθύµητες, εφόσον υποβαθµίζουν την ακρίβεια και την επαναληψιµότητα ενός προσδιορισµού. Ο θόρυβος καθορίζει το κατώτερο όριο ανιχνεύσιµης ποσότητας αναλύτη. Στις περισσότερες µετρήσεις η µέση ισχύς του θορύβου (noise, N) είναι σταθερή και ανεξάρτητη της τιµής του σήµατος (signal, S). Εποµένως, η επίδραση του θορύβου στο σχετικό σφάλµα µιας µέτρησης γίνεται εντονότερη, όσο ελαττώνεται το µέγεθος της µετρούµενης ποσότητας. Συνεπώς, ο λόγος σήµατος-προς-θόρυβο (signal-to-noise, S/N) αποτελεί χρησιµότερο µέγεθος αξιολόγησης της ποιότητας µιας αναλυτικής µεθόδου ή της απόδοσης ενός οργάνου από ότι ο ίδιος ο θόρυβος. Για ένα σήµα, ως τιµή του θορύβου ορίζεται η τυπική απόκλιση s ενός αριθµού µετρήσεων της ισχύος του σήµατος. Το σήµα παρέχεται ως µέση τιµή x των µετρήσεων αυτών. Εποµένως, ο λόγος S/N παρέχεται από τη σχέση: S = N µέση τιµή τυπική απόκλιση x = s

148 Να σηµειωθεί ότι ο λόγος σήµατος-προς-θόρυβο x /s ισούται προς το αντίστροφο της σχετικής τυπικής απόκλισης RSD της οµάδας µετρήσεων, δηλαδή είναι: S = N 1 RSD 6.5 ΠΗΓΕΣ ΘΟΡΥΒΟΥ ΣΤΗΝ ΕΝΟΡΓΑΝΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Οι φαρµακευτικές αναλύσεις υπόκεινται σε δύο τύπους θορύβου: τον χηµικό και τον οργανολογικό θόρυβο. Ο χηµικός θόρυβος προκύπτει από µια ποικιλία ανεξέλεγκτων µεταβλητών, που επιδρούν στη χηµεία του υπό ανάλυση συστήµατος. Παραδείγµατα αποτελούν µη ανιχνεύσιµες µεταβολές θερµοκρασίας ή πίεσης που επηρεάζουν τη θέση των χηµικών ισορροπιών, διακυµάνσεις στη σχετική υγρασία που µπορεί να επιδρούν στην περιεκτικότητα υγρασίας στα δείγµατα, δονήσεις που µπορεί να οδηγούν σε διαστρωµατώσεις κονιοποιηµένων δειγµάτων, µεταβολές στην ένταση φωτός που επηρεάζουν φωτοευαίσθητα υλικά και ατµοί στον εργαστηριακό χώρο που επηρεάζουν δείγµατα και αντιδραστήρια. Ο οργανολογικός θόρυβος συνδέεται µε κάθε τµήµα ενός οργάνου, δηλαδή µε την πηγή σήµατος, µε τον µεταλλάκτη εισόδου, όλες τις µονάδες επεξεργασίας σήµατος, ακόµη και µε τον µεταλλάκτη εξόδου (µονάδα ανάγνωσης). Επιπλέον, ο θόρυβος κάθε µονάδας οργάνου µπορεί να αποτελείται από διάφορους τύπους θορύβων και να προέρχεται από διάφορες πηγές. Εποµένως ο θόρυβος που τελικά παρατηρείται είναι ένα σύνθετο µίγµα διαφορετικών τύπων θορύβου, το οποίο δεν µπορεί να χαρακτηριστεί πλήρως. Είναι δυνατή η αναγνώριση ορισµένων τύπων θορύβου: (1) ο θερµικός θόρυβος ή θόρυβος Johnson, (2) ο θόρυβος βολής, (3) ο θόρυβος Flicker (ή 1/f) και (4) ο περιβαλλοντικός θόρυβος. 6.6 ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΟΥ ΛΟΓΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ-ΠΡΟΣ-ΘΟΡΥΒΟ Σε πολλές περιπτώσεις εργαστηριακών µετρήσεων δεν χρειάζεται ιδιαίτερη προσπάθεια για να διατηρηθεί ο λόγος σήµατος-προς-θόρυβο σε αποδεκτά επίπεδα. Παραδείγµατα αποτελούν οι ζυγίσεις, που χρειάζονται κατά την πορεία µιας χηµικής σύνθεσης ή η χρωµατική σύγκριση για τον προσδιορισµό της περιεκτικότητας σε χλώριο του νερού µιας πισίνας. Και στα δύο παραδείγµατα το σήµα είναι µεγάλο σε σχέση µε το θόρυβο και οι απαιτήσεις επαναληψιµότητας και ακρίβειας είναι περιορισµένες. Όσο αυξάνει όµως η ανάγκη ευαισθησίας και ακρίβειας, ο λόγος του σήµατος-προς-θόρυβο καθίσταται ο παράγοντας που περιορίζει την επαναληψιµότητα µιας µέτρησης.

149 Υπάρχουν πολλές µέθοδοι υλισµικού (hardware) και λογισµικού (software) για τη βελτίωση του λόγου σήµατος-προς-θόρυβο µιας ενόργανης τεχνικής. Μείωση του θορύβου µέσω υλισµικού πραγµατοποιείται µε ενσωµάτωση στον σχεδιασµό ενός οργάνου στοιχείων όπως: φίλτρα, τεµαχιστές, θωρακίσεις, διαµορφωτές και σύγχρονοι ανιχνευτές. Τα µέσα αυτά αφαιρούν ή περιορίζουν τον θόρυβο χωρίς να επιδρούν σηµαντικά στο αναλυτικό σήµα. Οι µέθοδοι λογισµικού βασίζονται σε διάφορους υπολογιστικούς αλγορίθµους, µε τους οποίους επιτυγχάνεται η ανάληψη του σήµατος από θορυβώδη δεδοµένα. Για να πραγµατοποιηθεί η επεξεργασία ενός σήµατος µε µεθόδους λογισµικού απαιτείται ένα ελάχιστο λογισµικό: η µετατροπή του σήµατος εξόδου της µονάδας από την αναλογική στην ψηφιακή µορφή. Στις πιο συνηθισµένες περιπτώσεις, τα δεδοµένα συλλέγονται µε ένα υπολογιστή εφοδιασµένο µε µια µονάδα συλλογής δεδοµένων. Στην περίπτωση αυτή τα σήµατα απαλλάσσονται από το θόρυβο µε το λογισµικό του υπολογιστή συλλογής δεδοµένων ή άλλου κατάλληλα δικτυωµένου υπολογιστή. Λόγω της ευρύτατης χρήσης των µικροεπεξεργαστών και των µικροϋπολογιστών πολλές από τις µονάδες βελτίωσης του λόγου σήµατος-προς-θόρυβο, έχουν πλέον αντικατασταθεί ή συνδυάζονται µε προγράµµατα υπολογιστών. Μεταξύ των προγραµµάτων αυτών υπάρχουν ρουτίνες υπολογισµού µέσων τιµών (µέσες µορφές σηµάτων-boxcar- ή µέσα σύνολα), ψηφιακού φιλτραρίσµατος σηµάτων, µετασχηµατισµών Fourier, εξοµάλυνσης (πολυωνυµική εξοµάλυνση ελάχιστων τετραγώνων) και τεχνικών συσχέτισης (correlation methods). Τα προγράµµατα αυτά µπορούν να εφαρµοσθούν σε µη περιοδικές ή ακανόνιστες κυµατοµορφές, όπως είναι ένα φάσµα απορρόφησης, σε σήµατα που δεν διαθέτουν σήµα συγχρονισµού ή κάποια κυµατοµορφή αναφοράς, όπως επίσης και σε περιοδικά σήµατα. 6.7 ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΙ ΕΞΟΜΑΛΥΝΣΗΣ ΣΗΜΑΤΩΝ α. Θεωρία Βελτίωση του λόγου σήµατος-προς-θόρυβο (signal-to-noise ratio, SNR ή S/N) µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε τεχνικές υλισµικού (hardware) ή λογισµικού (software). Η ευρύτατη χρήση προσωπικών υπολογιστών στη χηµική οργανολογία και η ευελιξία προγραµµατισµού που προσφέρουν, καθιστούν ιδιαίτερα ελκυστικές τις µεθόδους λογισµικού για εξοµάλυνση (ή φιλτράρισµα) σηµάτων. Στη συνέχεια παρουσιάζονται µερικοί από τους πλέον χρησιµοποιούµενους αλγόριθµους εξοµάλυνσης 123.

150 β. Κινούµενη µέση τιµή Η απλούστερη τεχνική εξοµάλυνσης σηµάτων που αποτελούνται από ισοαπέχοντα σηµεία είναι η κινούµενη µέση τιµή (moving average). Από µια αλληλουχία ακατέργαστων δεδοµένων (raw data) [y 1, y 2,..., y N ] µπορεί να δηµιουργηθεί µια αντίστοιχη αλληλουχία εξοµαλυµένων δεδοµένων (smoothed data). Το εξοµαλυµένο (smoothed) σηµείο (y k ) s αποτελεί τη µέση τιµή περιττού αριθµού 2n+1 (n=1, 2, 3,..) διαδοχικών σηµείων ακατέργαστων δεδοµένων y k-n, y 1k-n+1,..., y k-1, y k, y k+1,..., y k+n-1, y 1k+n, δηλαδή θα είναι Ο περιττός αριθµός 2n+1 συχνά ονοµάζεται εύρος φίλτρου (filter width). Όσο µεγαλύτερο είναι το εύρος του φίλτρου, τόσο πιο έντονη είναι η εξοµάλυνση. Η διαδικασία φαίνεται στο παρακάτω "ζωντανό" σχήµα:

151 Smoothed Data Στο παράδειγµα αυτό το εύρος φίλτρου είναι 5. Υπολογίζεται η µέση τιµή των 5 πρώτων ακατέργαστων σηµείων (µαύρα τετραγωνάκια) και η µέση τιµή τους (πράσινο τετραγωνάκι) αποτελεί το εξοµαλυµένο σηµείο µε δείκτη 3. Το κόκκινο ορθογώνιο (κινούµενο "παράθυρο"), που περικλείει την εκάστοτε οµάδα 5 σηµείων, κινείται µια θέση δεξιά και η µέση τιµή της νέας οµάδας σηµείων αποτελεί το εξοµαλυµένο σηµείο µε δείκτη 4 κ.ο.κ. Η διαδικασία αυτή ονοµάζεται µη αντισταθµισµένη εξοµάλυνση 5 σηµείων (5-point unweighted smooth). Ο SNR µπορεί να βελτιωθεί ακόµη περισσότερο µε πολλαπλά περάσµατα του φίλτρου (εξοµάλυνση στα ήδη εξοµαλυµένα σηµεία) ή µε αύξηση του εύρους φίλτρου. Είναι προφανές ότι µε κάθε πέρασµα του φίλτρου χάνονται τα πρώτα n και τα τελευταία n σηµεία. Τα αποτελέσµατα της τεχνικής αυτής είναι εντυπωσιακά και συγχρόνως παραπλανητικά, λόγω του υπερβολικού φιλτραρίσµατος του θορύβου. Στην πραγµατικότητα χάνεται ή αλλοιώνεται πληροφορία, επειδή δίνεται υπερβολικό στατιστικό βάρος σε σηµεία αρκετά µακριά από το κεντρικό σηµείο. γ. Αλγόριθµος Savitzky-Golay Μια πολύ καλύτερη τακτική από το να λαµβάνεται απλά η µέση τιµή των σηµείων είναι να πραγµατοποιείται προσαρµογή ελαχίστων τετραγώνων σε µια µικρή οµάδα διαδοχικών σηµείων και να αντικαθίσταται το κεντρικό σηµείο της οµάδας από τη θεωρητική τιµή που παρέχεται από το προκύπτον πολυώνυµο. Οι Savitzky και Golay (βλέπε A. Savitzky and M. J. E. Golay, Anal. Chem., 1964, 36, 1627) έδειξαν ότι µπορεί να υπολογισθεί µια οµάδα ακέραιων αριθµών (A -n, A -(n-1)..., A n-1, A n ) που µπορούν να χρησιµεύσουν ως συντελεστές στατιστικού βάρους κατά τη διαδικασία εξοµάλυνσης. Η χρήση αυτών των συγκεκριµένων συντελεστών στατιστικού βάρους, που αναφέρονται και ως ακέραιοι συνέλιξης (convolution integers), αποδεικνύεται ότι παρέχει αποτελέσµατα ισοδύναµα µε εκείνα της προσαρµογής σε πολυώνυµο που προαναφέρθηκε. Η µέθοδος των Savitzky-Golay από υπολογιστική άποψη είναι πιο αποτελεσµατική, απλούστερη

152 και ταχύτατη σε σχέση µε τις διαδοχικές πολυωνυµικές προσαρµογές κατά οµάδες σηµείων. Εποµένως, το εξοµαλυµένο σηµείο (y k ) s µε τον αλγόριθµο των Savitzky-Golay θα παρέχεται απλά από την ακόλουθη εξίσωση: Μπορούν να χρησιµοποιηθούν αρκετές οµάδες ακεραίων συνέλιξης ανάλογα µε το ζητούµενο εύρος φίλτρου ως και τον βαθµό του πολυωνύµου που προσαρµόζεται στα δεδοµένα. Τυπικές οµάδες ακεραίων "δευτεροβάθµιας εξοµάλυνσης" δίνονται στον επόµενο πίνακα: Εύρος φίλτρου (2n+1) i Με κατάλληλες οµάδες ακεραίων συνέλιξης, µπορούν να ληφθούν απ' ευθείας οι παράγωγοι 1ης, 2ης,... κλπ τάξης του σήµατος και έτσι, ο αλγόριθµος των Savitzky-Golay είναι κατάλληλος για τον απ' ευθείας υπολογισµό των παραγώγων θορυβωδών σηµάτων συνιστώµενων από διακριτά και ισοαπέχοντα σηµεία. Η εξοµάλυνση µε τον αλγόριθµο των Savitzky-Golay δεν είναι τόσο έντονη, όσο και εκείνη της κινούµενης µέσης τιµής, αλλά και η απώλεια ή αλλοίωση της πληροφορίας είναι

153 περιορισµένη. Θα πρέπει να τονισθεί ότι και οι δύο αλγόριθµοι είναι "απωλεστικοί", δηλαδή όχι µόνο δεν προσθέτουν επιπλέον πληροφορία, αλλά αντίθετα συµβάλλουν στην απώλεια πληροφορίας από το αρχικό σήµα. Θα µπορούσε κανείς να δεχθεί ότι περισσότερο χρησιµεύουν για να κάνουν το αρχικό σήµα πιο "εµφανίσιµο". δ. Σύνολα µέσων τιµών Στη µέθοδο των συνόλων µέσων τιµών (ensemble average) συλλέγονται τα σήµατα ως διαδοχικές οµάδες δεδοµένων και αθροίζονται σηµείο προς σηµείο (δηλαδή το i-σηµείο της µίας µε το i-σηµείο της άλλης κ.ο.κ.). Εποµένως, προαπαιτούµενο για την εφαρµογή της µεθόδου αυτής είναι η δυνατότητα πολλαπλής αναπαραγωγής του σήµατος, αντίθετα µε τις προηγούµενες µεθόδους που "λειτουργούν" σε µία και µόνη οµάδα δεδοµένων. Τυπική εφαρµογή των συνόλων µέσων τιµών πραγµατοποιείται στις φασµατοσκοπίες NMR και FT-IR, όπου το τελικό φάσµα ουσιαστικά είναι το µέσο φάσµα χιλιάδων επιµέρους φασµάτων. Αυτός είναι και ο µόνος τρόπος για να ληφθεί ένα τελικό σήµα, όταν στην περίπτωση µιας απλής µέτρησης (ή σάρωσης) το λαµβανόµενο σήµα είναι "πνιγµένο" σε τόσο θόρυβο, που ουσιαστικά εξαφανίζει την οποιαδήποτε χρήσιµη πληροφορία. Η δραστικότητα της µεθόδου οφείλεται βέβαια στη συνεχή ροή νέας πληροφορίας. Επαναλαµβανόµενες προσθέσεις θορυβωδών σηµάτων σηµείο-προς-σηµείο έχουν ως αποτέλεσµα να αναδεικνύονται τα συστηµατικά χαρακτηριστικά τους, ενώ µειώνεται σταδιακά ο τυχαίος θόρυβος ο οποίος έχει µηδενική µέση τιµή. Εάν (SNR) o είναι ο αρχικός λόγος σήµατος-προς-θόρυβο, ο τελικός λόγος (SNR) f µετά από N επαναλήψεις (ή σαρώσεις) παρέχεται από τη σχέση: Έτσι, αν το µέσο σήµα αποτελεί αποτέλεσµα άθροισης σηµείο-προς-σηµείο 100 (ή 10000) επιµέρους σηµάτων, το επίπεδο θορύβου µειώνεται κατά 10 (ή 100) φορές. 6.8 ΜΕΤΡΑ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ Κατά τη διεξαγωγή οποιασδήποτε µετρήσεως οποιουδήποτε µεγέθους, υπεισέρχονται αναπόφευκτα σφάλµατα και εποµένως τα αποτελέσµατα χαρακτηρίζονται από ένα βαθµό

154 αβεβαιότητας, που µπορεί µεν να περιορισθεί σε µία αποδεκτή στάθµη, όχι όµως και να µηδενισθεί. Ο έµπειρος αναλυτής πρέπει να καθορίζει από πριν τα όρια της απαιτούµενης αξιοπιστίας των αποτελεσµάτων, ώστε να µην σπαταλάτε χρόνος για επίτευξη ακρίβειας µεγαλύτερης της απαιτούµενης. 6.9 ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΟΡΙΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΕΩΣ Η ελάχιστη συγκέντρωση ή ποσότητα ενός συστατικού δείγµατος, που µπορεί να ανιχνευτεί αξιόπιστα µε µια αναλυτική µέθοδο, ονοµάζεται όριο ανιχνεύσεως της µεθόδου. Σχεδόν σε κάθε αναλυτική µέθοδο, µια απόκριση ή σήµα µπορεί να µετρηθεί, ακόµα και όταν απουσιάζει το µετρούµενο συστατικό (εννοείται ότι όλα τα άλλα αντιδραστήρια και οι συνθήκες είναι ακριβώς τα ίδια). Το ελάχιστο όριο ανιχνεύσεως υπολογίζεται σύµφωνα µε τους παρακάτω τύπους: LOD = 3.3 S y / x / m και LOQ = 10 S y / x / m όπου S y / x, είναι η σταθερή απόκλιση του υπολοίπου ( residual standard deviation ) και m είναι η κλίση της καµπύλης αναφοράς της µορφής y = α x + β που χαράχθηκε µε τη µέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων.

155 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΜΕΘΟ ΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟ- ΝΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΡΑΣΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Η φασµατοφωτοµετρία Υπεριώδους (UV-Vis) κατατάσσεται µεταξύ των κυριότερων ενόργανων τεχνικών ανάλυσης (οπτικές τεχνικές), οι οποίες βασίζονται στην αλληλεπίδραση της ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας και της ύλης. Οι εφαρµογές της στη Φαρµακευτική Ανάλυση είναι απεριόριστες, λόγω των πολλών πλεονεκτηµάτων που προσφέρει, έναντι των κλασσικών τεχνικών. Τα κυριότερα πλεονεκτήµατα είναι: α) η µεγάλη ακρίβεια και ευαισθησία, β) η µικρή ποσότητα της ουσίας που χρειάζεται για τη µέτρηση, γ) η δυνατότητα αυτοµατοποίησης ολόκληρης της ανάλυσης και δ) ο µικρός χρόνος µέτρησης. Στο παρόν κεφάλαιο θα αναπτυχθεί η µέθοδος «Παραγώγισης Φασµατικών Λόγων» (Derivative Ratio) µε σκοπό τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισµό της ανταζολίνης που συνυπάρχει µε τη ναφαζολίνη και το συντηρητικό χλωριούχο βενζεθόνιο (benzethonium) στο εµπορικό σκεύασµα Zincfrin. Πιο συγκεκριµένα, θα ελεγχθεί η αξιοπιστία της µεθόδου σε πρότυπα µικτά δείγµατα αρχικά των δύο δραστικών: ανταζολίνη-ναφαζολίνη και εν συνεχεία των τριών: ανταζολίνηναφαζολίνη-βενζεθόνιο. Τέλος, θα µελετηθεί η εφαρµογή της µεθόδου στο εµπορικό σκεύασµα Zincfrin. 7.2 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Για τις λήψεις των φασµάτων χρησιµοποιήθηκε ένα φασµατοφωτόµετρο Shimadzu UV- Vis διπλής δέσµης, τύπου UV-2501 PC µε πηγή εκποµπής της ακτινοβολίας λάµπα 50 Watt αλογόνου και δευτερίου. Οι ιδανικές συνθήκες λειτουργίας για τις φασµατοφωτοµετρικές µετρήσεις ήταν: Ταχύτητα σάρωσης: 210 nm/min, Εύρος σχισµής µονοχρωµάτορα: 1,0 nm και ιάστηµα δειγµατοληψίας: 0,1 nm.

156 Το όλο σύστηµα ήταν συνδεδεµένο µε έναν υπολογιστή τύπου Pentium 3, εξοπλισµένο µε το πρόγραµµα «UV- PC Personal Spectroscopy Software». Στα φάσµατα εφαρµόστηκε η διαδικασία της εξοµάλυνσης θορύβου (smoothing), µε 17 πειραµατικά σηµεία και dλ (Delta Wavelength) = 4 nm. Ακολούθησε διαίρεση των φασµάτων χρησιµοποιώντας τον κατάλληλο διαιρέτη για κάθε ουσία και τέλος έγινε παραγώγισή τους. Η παράγωγος πρώτης τάξης, D 1, έγινε µε dλ = 4 nm και scaling factor = 1 (σε κάποια περίπτωση µε τον double divisor, ο scaling factor ήταν διαφορετικός) για τη ναφαζολίνη και την ανταζολίνη κατά τον προσδιορισµό τους στο κολλύριο Zincfrin ΜΕΛΕΤΗ ΙΑΛΥΤΩΝ Όλα τα αντιδραστήρια και οι οργανικοί διαλύτες που χρησιµοποιήθηκαν ήταν υψηλής καθαρότητας και κατάλληλα για αναλυτικούς σκοπούς. Η επιλογή του κατάλληλου διαλύτη σαν διαλυτικό µέσο των ουσιών ναφαζολίνη, ανταζολίνη και χλωριούχου βενζεθονίου (benzethonium) έγινε κατόπιν µελέτης σταθερότητας αυτών για τρεις συνεχόµενες ηµέρες, σε τέσσερις διαφορετικούς διαλύτες: 0,1Μ HCl, 0,1M NaOH, MeOH και H 2 O. Σαν καταλληλότερος διαλύτης για τις παραπάνω προσδιοριζόµενες ουσίες θεωρήθηκε η µεθανόλη, διότι έχει µεγάλη διαλυτική ικανότητα και διατηρεί σταθερά τα δείγµατα των προσδιοριζόµενων ουσιών. Η επιλογή της µεθανόλης, ως του καταλληλότερου διαλύτη για τη συγκεκριµένη πειραµατική εργασία, πραγµατοποιήθηκε µέσω της στατιστικής επεξεργασίας µε τη µέθοδο ανάλυσης διακύµανσης δύο παραγόντων µε αλληλεπίδραση (2-way ANOVA with interaction) για στάθµη εµπιστοσύνης 99%, σε σειρά δειγµάτων των δραστικών ουσιών ναφαζολίνης µε C naph = 14,60 µg/ml και ανταζολίνης µε C anta = 5,20 µg/ml. Πιο συγκεκριµένα, µελετήθηκε η ακρίβεια και η επαναληψιµότητα της µεθόδου µέσω της απορρόφησης στο λ max γνωστής συγκέντρωσης των παραπάνω δραστικών ουσιών κατά τη διάρκεια της ίδιας ηµέρας (within day), αλλά και σε τρεις διαφορετικές ηµέρες µέσα στο µήνα (between day), επί τη βάσει του λόγου των διακυµάνσεων (Variance Ratio-VR), σύµφωνα µε τη σχέση: VR = MS MS between Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων είναι αυτά που παρουσιάζονται στους Πίνακες 1 και 2. within Πίνακας 1: Απορροφήσεις δειγµάτων ναφαζολίνης και ανταζολίνης στο λ max κατά τη διάρκεια της ίδιας ηµέρας (within day), αλλά και σε τρεις διαφορετικές ηµέρες µέσα στο µήνα (between day).

157 ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗ µε C=14,60 µg/ml ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗ µε C=5,20 µg/ml 1η µέρα 2η µέρα 3η µέρα 1η µέρα 2η µέρα 3η µέρα MeOH MeOH MeOH MeOH MeOH MeOH 0,329 0,333 0,327 0,117 0,119 0,114 0,331 0,329 0,330 0,118 0,121 0,115 0,328 0,332 0,328 0,121 0,122 0,115 0,329 0,331 0,324 0,113 0,114 0,112 H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O 0,321 0,313 0,314 0,093 0,105 0,107 0,319 0,316 0,313 0,090 0,107 0,110 0,320 0,315 0,315 0,095 0,13 0,108 0,324 0,308 0,314 0,094 0,105 0, M HCl 0.1 M HCl 0.1 M HCl 0.1 M HCl 0.1 M HCl 0.1 M HCl 0,321 0,319 0,314 0,092 0,107 0,101 0,323 0,324 0,317 0,095 0,104 0,101 0,319 0,318 0,313 0,091 0,108 0,102 0,321 0,315 0,312 0,090 0,109 0, M NaOH 0.1 M NaOH 0.1 M NaOH 0.1 M NaOH 0.1 M NaOH 0.1 M NaOH 0,311 0,304 0,310 0,114 0,109 0,113 0,315 0,299 0,316 0,112 0,109 0,116 0,310 0,308 0,308 0,116 0,110 0,113 0,314 0,305 0,306 0,114 0,108 0,110 Πίνακας 2: Ανάλυση διακύµανσης κατά δύο παράγοντες (δ.ο. ναφαζολίνη). ΑΝΑΛΥΣΗ ΙΑΚΥΜΑΝΣΗΣ Προέλευση SS διακύµανσης βαθµοί ελευθερίας MS F τιµή-p κριτήριο F είγµα 0, , , ,36165E-18 4, Στήλες 0, , , ,19528E-05 5, Αλληλεπίδραση 0, ,90833E-05 5, , , Μεταξύ 0, ,36806E-06 Σύνολο 0,

158 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ Οµάδες Πλήθος Άθροισµα Μέσος όρος ιακύµανση MeOH 4 1,317 0, ,58333E-06 H 2 O 4 1,284 0,321 4,66667E M HCl 4 1,284 0,321 2,66667E M NaOH 4 1,25 0,3125 5,66667E ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΜΕΤΡΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΟΥΣΙΩΝ Κατά τη λήψη φασµάτων µηδενικής και πρώτης τάξης παραγώγου των ουσιών ναφαζολίνης, ανταζολίνης και χλωριούχου βενζεθονίου στην περιοχή nm, διαπιστώνεται σηµαντική αλληλοεπικάλυψη του φάσµατος της µιας δραστικής ουσίας ως προς τα φάσµατα των άλλων δύο ουσιών (Σχήµα 7.3), χωρίς να υπάρχουν εµφανή σηµεία µηδενισµού αυτών, ώστε να είναι δυνατή η ποσοτικοποίησή τους. ZINCFRIN Naphazoline Antazoline Benzethonium Zinc Sulfate Σχήµα 7.3: Φάσµα απορρόφησης µηδενικής τάξης ανταζολίνης 52,00µg/mL, ναφαζολίνης 14,60µg/mL, βενζεθονίου 21,06µg/mL και µίγµατος αυτών στο κολλύριο Zincfrin.

159 Προκειµένου να βρεθεί λύση στο συγκεκριµένο πρόβληµα, εφαρµόστηκε αρχικά η τεχνική «Derivative Ratio» για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό της ανταζολίνης µε τη ναφαζολίνη σε διπλά µίγµατα ή φαρµακευτικά σκευάσµατα στα οποία ενδεχοµένως να συνυπάρχουν. Ακολούθως η ίδια µέθοδος σε συνδυασµό µε τις τεχνικές «Zero-Crossing» και «Double Divisor» εφαρµόστηκαν για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό των τριών δραστικών και στο εµπορικό σκεύασµα Zincfrin. 7.4 ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΕΞΟΜΑΛΥΝΣΗΣ ΘΟΡΥΒΟΥ ΣΤΑ ΦΑΣΜΑΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ Όπως έχει ήδη αναφερθεί στη θεωρία της εξοµάλυνσης (smoothing) για τα φάσµατα παραγώγων, η ελάττωση του ύψους της κορυφής που προκαλείται κατά την εφαρµογή αυτής της διαδικασίας, δεν δηµιουργεί κάποιο συστηµατικό σφάλµα, εντούτοις η έντονη εξοµάλυνση είναι ανεπιθύµητη, διότι αφ ενός αυξάνει το εύρος των κορυφών και έτσι ελαττώνει τη διαχωριστικότητα των φασµατικών ζωνών και αφ ετέρου, συχνά η προκαλούµενη από την εξοµάλυνση εξασθένηση του σήµατος του υποστρώµατος είναι µικρότερη από την εξασθένηση της µετρούµενης κορυφής, µε αποτέλεσµα να ελαττώνεται ο λόγος του σήµατος προς το υπόστρωµα (Signal to Background Ratio). Από τα παραπάνω συµπεραίνουµε ότι η έντονη εξοµάλυνση αποβαίνει συχνά σε βάρος της λεπτής υφής του φάσµατος, αναιρώντας έτσι πολλά από τα πλεονεκτήµατα της φασµατοφωτοµετρίας παραγώγων. Η αντιστάθµιση εποµένως, µεταξύ της βελτίωσης του SNR και της εξασθένισης του ύψους της κορυφής, θα πρέπει να λαµβάνεται σοβαρά υπόψη. Στην περίπτωση των ουσιών ναφαζολίνη και ανταζολίνη, µελετήθηκε η επίδραση της εξοµάλυνσης θορύβου σε φάσµατα προτύπων δειγµάτων, µεταβάλλοντας το dλ σταδιακά ή απευθείας κατά την παραγώγιση, σύµφωνα µε την ακόλουθη διαδικασία. Το φάσµα της πρώτης παράγωγου προτύπου δείγµατος ανταζολίνης (C = 52,00 µg/ml) που προκύπτει απ ευθείας από το φάσµα µηδενικής τάξης της και χωρίς καµία επεξεργασία (εξοµάλυνση dλ=1) παρουσιάζεται στο Σχήµα (Antazoline 1). Στη συνέχεια, στο ίδιο πρότυπο δείγµα µηδενικής τάξης εφαρµόστηκε η διαδικασία της εξοµάλυνσης θορύβου (smoothing) σε δύο στάδια µε dλ (Delta Wavelength) = 4 nm, ώστε το συνολικό να είναι dλ = 8 nm, όπως φαίνεται στο Σχήµα (Antazoline 2). Τέλος, η ίδια διαδικασία της εξοµάλυνσης θορύβου εφαρµόστηκε σε ένα στάδιο, ταυτόχρονα µε την παραγώγιση για dλ = 8 nm (Antazoline 3). Όλες οι παραπάνω ενέργειες, επεξεργασίας φάσµατος απορρόφησης του προτύπου διαλύµατος ανταζολίνης, πραγµατοποιήθηκαν και για το αντίστοιχο πρότυπο διάλυµα

160 ναφαζολίνης µε C = 14,60 µg/ml Σχήµα 7.4.2, έτσι όπως απεικονίζονται στα παρακάτω σχήµατα: Antazoline 2 Antazoline 3 Antazoline 1 Σχήµα 7.4.1:Φάσµατα απορρόφησης πρώτης τάξης παραγώγου προτύπου διαλύµατος ανταζολίνης ( C=52,00 µg/ml) µε διαφορετικά dλ. Naphazoline 3 Naphazoline 2 Naphazoline 1 Σχήµα 7.4.2:Φάσµατα απορρόφησης πρώτης τάξης παραγώγου προτύπου διαλύµατος ναφαζολίνης ( C=14,60 µg/ml) µε διαφορετικά dλ.

161 Naphazoline 3 Naphazoline 2 Naphazoline 1 Σχήµα 7.4.3: Φάσµατα απορρόφησης πρώτης τάξης παραγώγου προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης ( C=14,60 µg/ml) µε διαφορετικά dλ. Όπως διακρίνεται στα παραπάνω σχήµατα, η επίδραση της εξοµάλυνσης θορύβου στα φάσµατα πρώτης παραγώγου των ουσιών ναφαζολίνη και ανταζολίνη, είναι σηµαντική και µάλιστα είναι τόσο πιο έντονη, όσο πιο απότοµα µεταβάλλεται το dλ. Επειδή όµως η βέλτιστη φασµατική επεξεργασία είναι η εξοµάλυνση εκείνη, σύµφωνα µε την οποία το τελικό φάσµα που προκύπτει, να είναι όσο το δυνατόν ταυτόσηµο µε το πραγµατικό αλλά εξοµαλυµένο, σαν ιδανικότερη θεωρήθηκε η περίπτωση εξοµάλυνσης δύο σταδίων µε dλ = ΜΕΘΟ ΟΣ «ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΛΟΓΩΝ» (DERIVATIVE RATIO) Η τεχνική «Παραγώγισης Φασµατικών Λόγων» βασίζεται στην εφαρµογή του νόµου του Beer για µίγµα δύο ουσιών (Χ, Ψ), σύµφωνα µε τον οποίο έχουµε την εξίσωση: Α λi = α χ,λi C χ + β ψ,λi C ψ (1) όπου Α λi είναι η απορρόφηση του µίγµατος σε µήκος κύµατος λ i και α χ,λi, β ψ,λi είναι η απορροφητικότηττα (absorptivity) των Χ και Ψ αντίστοιχα. ιαιρώντας κατά µέλη την εξίσωση (1) µε τον όρο α χ,λi C ο χ (C ο χ = γνωστή συγκέντρωση προτύπου δείγµατος) και παραγωγίζοντας το αποτέλεσµα, προκύπτει η εξίσωση:

162 Α λ α λ i ψ, λι ψ 0 = 0 x, λ i C x λ α x, λι C x Η εξίσωση (2) αποτελεί τη θεµελιώδη µαθηµατική εξίσωση για την ανάλυση διπλού µίγµατος ουσιών, η οποία επιτρέπει τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης καθενός από τα συστατικά του δείγµατος στο διάλυµα, χωρίς την παρεµβολή του άλλου. Αναλυτικότερα, διαπιστώνεται ότι τα αποτελέσµατα προσδιορισµού µεµονωµένης της µίας ουσίας δεν επηρεάζονται από την παρουσία της άλλης στο µικτό δείγµα (λόγω απαλοιφής του όρου της στην εξίσωση Beer µετά την παραγώγιση, εξίσωση 2) και έτσι µπορούν να προσδιοριστούν από τις αντίστοιχες καµπύλες αναφοράς τους. Η µέθοδος «Derivative Ratio» (Παραγώγιση Φασµατικών Λόγων) εφαρµόστηκε πρώτα σε καθαρά πρότυπα δείγµατα των προσδιοριζόµενων ουσιών, ώστε να χαραχθούν οι καµπύλες αναφοράς τους και στη συνέχεια η αξιοπιστία της µεθόδου ελέγχθηκε µε τη βοήθεια µιας σειράς µεικτών δειγµάτων ανταζολίνης-ναφαζολίνης γνωστής συγκέντρωσης. Αναλυτικότερα, στα φάσµατά τους εφαρµόστηκε η ίδια διαδικασία πρώτα για τον προσδιορισµό της ανταζολίνης, χρησιµοποιώντας ως διαιρέτη τη ναφαζολίνη και το αντίστροφο. β C (2) 7.6 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ-ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟ Ο «ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΛΟΓΩΝ» Έχοντας καθορίσει σαν κατάλληλο διαλυτικό µέσο για τον προσδιορισµό των ουσιών ανταζολίνης-ναφαζολίνης τη µεθανόλη, παρασκευάσθηκαν πρότυπα διαλύµατα, ώστε να µελετηθούν µε φασµατοφωτοµετρία υπεριώδους Η παρασκευή των προτύπων διαλυµάτων έγινε ως εξής: Ζυγίσθηκε ακριβής ποσότητα φωσφορικής ανταζολίνης 0,0130g και αραιώθηκε µε µεθανόλη σε ογκοµετρική φιάλη των 100 ml. Κατόπιν καταλλήλων αραιώσεων προέκυψαν πρότυπα διαλύµατα συγκέντρωσης: 8,32 / 10,40 / 12,48 / 14,56 / 16,64 / 18,72 και 52,00 µg/ml. Κατά τον ίδιο τρόπο ζυγίσθηκε ακριβής ποσότητα υδροχλωρικής ναφαζολίνης 0,0365g και αραιώθηκε µε µεθανόλη σε ογκοµετρική φιάλη των 100 ml. Κατόπιν καταλλήλων αραιώσεων προέκυψαν πρότυπα διαλύµατα συγκέντρωσης: 0,584 / 1,168 / 1,752 / 2,336 / 2,92 / 3,504 και 14,60 µg/ml. Ορισµένη ποσότητα ( 1mL) από κάθε πρότυπο διάλυµα, µεταφέρθηκε µε προσοχή σε κυψελίδα χαλαζία και τοποθετήθηκε στους ειδικούς υποδοχείς του φασµατοφωτοµέτρου.

163 Σχήµα 7.6.1: Φάσµατα απορρόφησης µηδενικής τάξης προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης, µε dλ = 4. Οι µετρήσεις για τα πρότυπα διαλύµατα ανταζολίνης και ναφαζολίνης (Σχήµατα και 7.6.2), πραγµατοποιήθηκαν υπό τις ακόλουθες συνθήκες: Ταχύτητα σάρωσης: 210 nm/min, Εύρος σχισµής µονοχρωµάτορα: 1,0 nm και ιάστηµα δειγµατοληψίας: 0,1 nm. Σχήµα 7.6.2: Φάσµατα απορρόφησης µηδενικής τάξης προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης, µε dλ = 4.

164 Προκειµένου να εφαρµοστεί και πειραµατικά η τεχνική «Derivative Ratio», ώστε να χαραχθούν οι καµπύλες αναφοράς, έγινε διαίρεση και παραγώγιση των φασµάτων των προτύπων διαλυµάτων της κάθε ουσίας χωριστά, σύµφωνα µε τα ακόλουθα: I. Φάσµατα δειγµάτων ανταζολίνης (Σχήµα 7.6.4) διαιρέθηκαν µε φάσµα δείγµατος ναφαζολίνης συγκέντρωσης C = 2,336 µg/ml (divisor) (Σχήµα 7.6.3) και στη συνέχεια παραγωγίσθηκαν. II. Φάσµατα δειγµάτων ναφαζολίνης (Σχήµα 7.6.5) διαιρέθηκαν µε φάσµα δείγµατος ανταζολίνης συγκέντρωσης C = 14,56 µg/ml (divisor) (Σχήµα 7.6.3) και στη συνέχεια παραγωγίσθηκαν. Σχήµα : Α) Ο διαιρέτης (divisor) της ανταζολίνης είναι το φάσµα ναφαζολίνης ( ) µε C = 2,336 µg/ml, Β) Ο διαιρέτης (divisor) της ναφαζολίνης είναι το φάσµα ανταζολίνης ( ) µε C = 14,56 µg/ml. Τα φάσµατα των προτύπων διαλυµάτων, που προέκυψαν κατόπιν των διαιρέσεων, παρουσιάζονται παραστατικά στα ακόλουθα σχήµατα:

165 Σχήµα 7.6.4: Φάσµατα προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης συγκεντρώσεων 8,32 / 10,40 / 12,48 / 14,56 / 16,64 / 18,72 και 52,00 µg/ml, κατόπιν διαίρεσης µε φάσµα ναφαζολίνης µε C = 2,336 µg/ml, µε dλ = 4 nm. Σχήµα : Φάσµατα προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης συγκεντρώσεων 0,584 / 1,168 / 1,752 / 2,336 / 2,92 / 3,504 και 14,60 µg/ml, κατόπιν διαίρεσης µε φάσµα ανταζολίνης µε C = 14,56 µg/ml, µε dλ = 4 nm. Τέλος, εφαρµόστηκε η διαδικασία παραγώγισης των διαιρεµένων φασµάτων µε scaling factor = 1 και dλ = 4. Τα φάσµατα που προέκυψαν απεικονίζονται στα ακόλουθα σχήµατα:

166 240.6 nm nm Σχήµα 7.6.6: Φάσµατα 1 ης παραγώγου προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης συγκεντρώσεων 8,32 / 10,40 / 12,48 / 14,56 / 16,64 / 18,72 και 52,00 µg/ml, κατόπιν διαίρεσης και παραγώγισης, µε scaling factor = 1 και dλ = 4 nm nm nm nm Σχήµα 7.6.7: Φάσµατα 1 ης παραγώγου προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης συγκεντρώσεων 0,584 / 1,168 / 1,752 / 2,336 / 2,92 / 3,504 και 14,60 µg/ml, κατόπιν διαίρεσης και παραγώγισης, µε scaling factor = 1 και dλ = 4 nm. Οι συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης και ναφαζολίνης, που χρησιµοποιήθηκαν για τη χάραξη καµπύλων αναφοράς, καθώς και οι αντίστοιχες απορροφήσεις τους σε συγκεκριµένα µήκη κύµατος για την πρώτη παράγωγο, παρουσιάζονται ακολούθως:

167 Πίνακας 7.6.1: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης και οι αντίστοιχες απορροφήσεις τους σε συγκεκριµένα µήκη κύµατος. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Απορροφήσεις Υ Α/Α Ανταζολίνη λ = 240,6 nm λ = 253,7 nm 1 8,32 0,8017 0, ,40 0,9846 1, ,48 1,1917 1, ,56 1,3364 1, ,64 1,5559 1, ,72 1,7722 1, ,00 4,9877 5,2861 Πίνακας 7.6.2: Χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις για την παρασκευή προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης και οι αντίστοιχες απορροφήσεις τους σε συγκεκριµένα µήκη κύµατος. Συγκεντρώσεις Χ (µg/ml) Απορροφήσεις Υ Α/Α Ναφαζολίνη λ = 225,5 nm λ = 283,2 nm λ = 294,6 nm 1 0,584 0,9185 0,2333 0, ,168 1,8443 0,4862 0, ,752 2,7683 0,7438 0, ,336 3,6185 0,9593 0, ,920 4,5919 1,2579 1, ,504 5,4410 1,4553 1, ,60 21,4161 6,0758 5,6825 Εφαρµόζοντας την εξίσωση (2) για τον προσδιορισµό του ζεύγους ανταζολίνης ναφαζολίνης και χρησιµοποιώντας κάθε φορά τον κατάλληλο διαιρέτη (divisor), χαράχτηκαν καµπύλες αναφοράς γραµµικής παλινδρόµησης µε τη µέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων (Σχήµατα ), όπου παρείχαν γραφικά σε διάγραµµα ορθογωνίων συντεταγµένων την

168 εξάρτηση των απορροφήσεων από τις συγκεντρώσεις των προτύπων διαλυµάτων των δραστικών ουσιών. 6 Καµπύλη Αναφ οράς Ανταζολίνης 5 Απορροφήσεις y = 0,096x - 0,0188 R 2 = 0, Συγκεντρώ σεις (µg/ml) Σχήµα 7.6.8: Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης σε συνάρτηση µε τις απορροφήσεις τους (Y) σε λ = 240,6 nm. 6 5 Καµπύλη Αναφοράς Ανταζολίνης Απορροφήσεις y = 0,102x - 0,0462 R 2 = 0, Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα 7.6.9: Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ανταζολίνης σε συνάρτηση µε τις απορροφήσεις τους (Y) σε λ = 253,7 nm.

169 Καµπύλη Αναφοράς Ναφαζολίνης Απορροφήσεις y = 0,4161x + 0,0041 R 2 = 0, Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα : Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε τις απορροφήσεις τους (Y) σε λ = 225,5 nm. 25 Καµπύλη Αναφοράς Ναφαζολίνης Απορροφήσεις y = 1,4599x + 0,1723 R 2 = 0, Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα : Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε τις απορροφήσεις τους (Y) σε λ = 283,2 nm.

170 Καµπύλη Αναφοράς Ναφαζολίνης Απορροφήσεις y = 0,3891x - 0,0051 R 2 = 0, Συγκεντρώσεις (µg/ml) Σχήµα : Καµπύλη αναφοράς των τιµών συγκέντρωσης (Χ) προτύπων διαλυµάτων ναφαζολίνης σε συνάρτηση µε τις απορροφήσεις τους (Y) σε λ = 294,6 nm. Τα χαρακτηριστικά των καµπύλων αναφοράς βάσει της τεχνικής «derivative ratio» των προσδιοριζόµενων ουσιών ανταζολίνης-ναφαζολίνης, στα διάφορα µήκη κύµατος που µελετήθηκαν, παρουσιάζονται στον Πίνακα που ακολουθεί: ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΑ ΠΑΛΙΝ ΡΟΜΗΣΗΣ ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗ ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗ Μήκος Κύµατος (nm) 240,6 nm 253,7 nm 225,5 nm 283,2 nm 294,6 nm Πολλαπλό r 0,9999 0,9998 0,9999 0,9999 0,9999 R 2 0,9998 0,9996 0,9997 0,9999 0,9999 Τυπικό Σφάλµα 0,0244 0,0331 0,1277 0,0191 0,0156 Τοµή -0,0188-0,0462 0,1723 0,0041-0,0051 Κλίση 0,096 0,102 1,4599 0,4161 0,3891

171 LOD(µg/mL) 0,839 1,071 0,289 0,151 0,132 LOQ(µg/mL) 2,544 3,248 0,876 0,458 0,400 Τα παραπάνω αποτελέσµατα επιβεβαιώνουν τη γραµµικότητα της σχέσης των τιµών συγκέντρωσης (Χ) και των απορροφήσεων (Υ) µε τη µέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. Η επεξεργασία των τιµών των µεταβλητών παρείχε τις εξισώσεις παλινδρόµησης του τύπου: Ανταζολίνη: για λ = 240,6 nm y = 0,096x - 0,0188 και R 2 = 0,9998 για λ = 253,7 nm y = 0,102x - 0,0462 και R 2 = 0,9996 Ναφαζολίνη: για λ = 225,5 nm y = 1,4599x + 0,1723 και R 2 = 0,9997 για λ = 283,2 nm y = 0,4161x + 0,0041 και R 2 = 0,9999 για λ = 294,6 nm y = 0,3891x - 0,0051 και R 2 = 0,9999 Για την εκτίµηση της ικανότητας προσαρµογής των εξισώσεων στα πειραµατικά δεδοµένα, χρησιµοποιήθηκε ως δείκτης η τιµή του συντελεστή συσχέτισης r. Όπως φαίνεται στις παραπάνω σχέσεις, η τιµή του R 2 πλησιάζει τη µονάδα και βρίσκεται µεταξύ των ορίων, 0,9996 < R 2 < 0, ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ Με σκοπό τη διερεύνηση των δυνατοτήτων και των περιορισµών της συγκεκριµένης τεχνικής «Derivative Ratio» παρασκευάσθηκε µια σειρά µικτών δειγµάτων των δύο δραστικών ναφαζολίνης-ανταζολίνης σε διάφορες συγκεντρώσεις και στη συνέχεια θεωρώντας τα σαν άγνωστα επαναπροσδιορίστηκαν. Συνεπώς προέκυψαν τα παρακάτω µικτά δείγµατα: ΜΙΚΤΟ ΕΙΓΜΑ C ΑΝΤΑΖΟΛΙΝΗΣ (µg/ml) 8,32 10,40 12,48 14,56 16,64 18,72 52,00 C ΝΑΦΑΖΟΛΙΝΗΣ (µg/ml) 0,584 1,168 1,752 2,336 2,92 3,504 14,60

172 Έτσι για τον ποσοτικό προσδιορισµό των δύο δραστικών ουσιών στα µικτά δείγµατα, επαναλήφθηκε η ίδια διαδικασία εξοµάλυνσης, διαίρεσης και παραγώγισης µε αυτή των προτύπων διαλυµάτων τους. Στα φάσµατα εφαρµόστηκε η διαδικασία της εξοµάλυνσης θορύβου (smoothing) µε dλ (Delta Wavelength) = 4 nm. Τα φάσµατα απορρόφησης του µικτού δείγµατος, µετά τη διαδικασία της εξοµάλυνσης, απεικονίζονται παρακάτω: Σχήµα 7.7.1: Φάσµατα απορρόφησης µηδενικής τάξης προτύπων µικτών δειγµάτων ανταζολίνης και ναφαζολίνης. Χρησιµοποιώντας κάθε φορά τον κατάλληλο διαιρέτη (divisor), τα φάσµατα του µικτού προτύπου δείγµατος διαιρέθηκαν και κατόπιν παραγωγίσθηκαν, σύµφωνα µε τα Σχήµατα και Αναλυτικότερα για τον προσδιορισµό της ανταζολίνης χρησιµοποιήθηκε ως διαιρέτης φάσµα της ναφαζολίνης, συγκέντρωσης C = 14,56 µg/ml (divisor) και η παραγώγιση έγινε µε scaling factor 1 και dλ = 4 nm. Αντίστοιχα, για τον προσδιορισµό της ναφαζολίνης χρησιµοποιήθηκε ως διαιρέτης φάσµα ανταζολίνης, συγκέντρωσης C = 2,336 µg/ml (divisor) και η παραγώγιση έγινε µε scaling factor = 1 και dλ = 4 nm.

173 Σχήµα 7.7.2: Φάσµατα απορρόφησης µηδενικής τάξης προτύπων µικτών δειγµάτων, κατόπιν διαίρεσης µε φάσµα ναφαζολίνης (C = 14,56 µg/ml, µε dλ = 4 nm), για τον προσδιορισµό δειγµάτων ανταζολίνης. Σχήµα 7.7.3: Φάσµατα 1 ης τάξης παραγώγου των διαιρεµένων προτύπων µικτών δειγµάτων µε scaling factor 1 και dλ = 4 nm, για τον προσδιορισµό ανταζολίνης.

174 Σχήµα 7.7.4: Φάσµατα απορρόφησης µηδενικής τάξης προτύπων µικτών δειγµάτων, κατόπιν διαίρεσης µε φάσµα ανταζολίνης (C = 2,336 µg/ml, µε dλ = 4 nm), για τον προσδιορισµό δειγµάτων ναφαζολίνης. Σχήµα 7.7.5: Φάσµατα 1 ης τάξης παραγώγου των διαιρεµένων προτύπων µικτών δειγµάτων µε scaling factor 1 και dλ = 4 nm, για τον προσδιορισµό ναφαζολίνης