Τερηδονική δραστηριότητα και εμφάνιση επιλεγμένων μικροβίων στη στοματική κοιλότητα παιδιών που διαμένουν στην Ελλάδα ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 «ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΟΔΟΝΤΙΑΤΡΙΚΗΣ» ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΟΡΘΟΔΟΝΤΙΚΗ ΚΑΙ ΠΕΡΙΟΔΟΝΤΟΛΟΓΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ: ΠΑΙΔΟΔΟΝΤΙΑΤΡΙΚΗ Τερηδονική δραστηριότητα και εμφάνιση επιλεγμένων μικροβίων στη στοματική κοιλότητα παιδιών που διαμένουν στην Ελλάδα ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΦΡΑΓΚΟΥ ΟΔΟΝΤΙΑΤΡΟΣ Επιβλέπων: Σωτήριος Κάλφας, Καθηγητής Εγκρίθηκε από την τριμελή επιτροπή αξιολόγησης την Σωτήριος Κάλφας, Καθηγητής, επιβλέπων Νικόλαος Κοτσάνος, Καθηγητής, μέλος Δήμητρα Σακελλάρη, Αναπληρώτρια καθηγήτρια, μέλος ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, Νοέμβριος, 2015 i

2 Η παρούσα μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία εκπονήθηκε στο πλαίσιο των απαιτήσεων του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Οδοντιατρική». Η έγκρισή της δεν υποδηλώνει απαραιτήτως και την αποδοχή των απόψεων του συγγραφέα εκ μέρους του Τμήματος Οδοντιατρικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Α.Π.Θ. (Νόμος 5343/32, άρθρο 202 παρ. 2 και Νόμος 1268/82, άρθρο 50 παρ. 8). ii

3 ΑRISTOTLE UNIVERSITY of THESSALONIKI FACULTY of HEALTH SCIENCES SCHOOL of DENTISTRY POSTGRADUATE PROGRAM «DENTISTRY» DESIPLINARY: Orthodontics and Periodontology DEPARTMENT: Paediatric Dentistry Correlation between caries activity and counts of selected microbes in oral samples from Greek children POSTGRADUATE THESIS Styliani Fragkou DENTIST Supervisor: Sotirios Kalfas, Professor THESSALONIKI, November, 2015 iii

4 H Φράγκου Στυλιανή, γνωρίζοντας τις συνέπειες της λογοκλοπής, δηλώνω υπεύθυνα ότι η παρούσα εργασία με τίτλο «Τερηδονική δραστηριότητα και εμφάνιση επιλεγμένων μικροβίων στη στοματική κοιλότητα παιδιών που διαμένουν στην Ελλάδα», αποτελεί προϊόν αυστηρά προσωπικής εργασίας και όλες οι πηγές που έχω χρησιμοποιήσει έχουν δηλωθεί κατάλληλα στις βιβλιογραφικές παραπομπές και αναφορές. Τα σημεία όπου έχω χρησιμοποιήσει ιδέες, κείμενο ή/και πηγές άλλων συγγραφέων, αναφέρονται ευδιάκριτα στο κείμενο με την κατάλληλη παραπομπή, η δε σχετική αναφορά περιλαμβάνεται στο τμήμα των βιβλιογραφικών αναφορών με πλήρη περιγραφή. Η ΔΗΛΟΥΣΑ iv

5 Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέπων καθηγητή Κ. Κάλφα για την καθοδήγηση και έμπνευση που μου προσέφερε καθ όλη τη διάρκεια της παρούσης εργασίας. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους παιδοδοντιάτρους του Ιδρύματος Κοινωνικής Ασφάλισης της Θεσσαλονίκης κ. Βλάχου Ιωάννα και κ. Καραφέργια Ευτέρπη καθώς και τον καθηγητή κ. Κοτσάνο και όλα τα μέλη του εργαστηρίου Παιδοδοντιατρικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης για την πολύτιμη βοήθειά τους. v

6 Περίληψη Οι μικροοργανισμοί S. mutans, S. sobrinus και C. albicans έχουν σχετιστεί με την τερηδονική νόσο. Η γνώση της συχνότητας εμφάνισής τους καθώς και των παραγόντων που ενδέχεται να επηρεάζουν την αποίκισή τους, συνεισφέρει στην καλύτερη κατανόηση της τερηδονικής νόσου. Η παρούσα μελέτη εξετάζει την εμφάνιση των S. mutans, S. sobrinus και C. albicans σε δείγματα μικροβιακής πλάκας και σάλιου παιδιών που εμφανίζουν ή όχι τερηδονικές αλλοιώσεις. Δείγματα σάλιου και μικροβιακής πλάκας από 46 παιδιά ελεύθερα τερηδονικών αλλοιώσεων και 51 παιδιά με τερηδονικές αλλοιώσεις μελετήθηκαν για την εμφάνιση των S. mutans, S. Sobrinus και C. αlbicans. Για την ταυτοποίηση των μικροβίων χρησιμοποιήθηκαν επιλεγμένα μέσα καλλιέργειας, βιοχημικά τεστ, ειδικοί DNA ανιχνευτές και Dentocult SM strips. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, οι S. mutans, S. sobrinus και C. albicans απομονώθηκαν σε ποσοστά 66%, 11% και 18% αντίστοιχα. Τα παιδιά με τερηδονικές αλλοιώσεις εμφάνιζαν πιο συχνά και σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα τα συγκεκριμένα μικρόβια από τα παιδιά χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις. Έτσι, η παρούσα μελέτη καταλήγει στο συμπέρασμα ότι η τερηδονική δραστηριότητα σχετίζεται σημαντικά με την παρουσία και των τριών μικροβίων τόσο στην μικροβιακή πλάκα όσο και στο σάλιο. Λέξεις κλειδιά: mutans streptococci, C. albicans, Dentocult SM strip vi

7 Abstract S. mutans and S. sobrinus are strongly associated with dental caries. C. albicans has also been implicated in early childhood caries. Their mutual interaction and the factors influencing their colonization require further understanding for caries aetiology. The aim of the present study is to examine the occurrence of S. mutans, S. sobrinus and C. albicans in dental plaque and saliva from caries free and caries active Greek children. Saliva and dental plaque samples from 46 caries free and 51 caries active 3-13 year-old children were examined using selective media for the 3 microbes. Identification of isolated mutans streptococci (S. mutans and S. sobrinus) was performed with biochemical test and specific DNA probes. The salivary levels of mutans streptococci were additionally determined by a chair-side test (Dentocult SM strips). The isolation frequencies of S. mutans, S. sobrinus and C. albicans were 66%, 11%, 18% respectively. Caries active children harboured more often and at significantly higher numbers the specific microbes than caries free children. A similar pattern was observed with the Dentocult SM strip scores. No correlation was found between the presence of these microbes and the age or gender of the children. Caries activity was significantly related to the presence of all three microbes under study, both in dental plaque and saliva. Key words: mutans streptococci, C. albicans, Dentocult SM strip vii

8 Περιεχόμενα Εξώφυλλο. Εσώφυλλο.. i Εσώφυλλο στην αγγλική.iii Υπεύθυνη Δήλωση Λογοκλοπής....iv Ευχαριστίες v Περίληψη.....vi Περίληψη στην αγγλική..... vii Πίνακας Περιεχομένων.. viii Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Αποτελέσματα Συζήτηση Προτάσεις για μελλοντική έρευνα Βιβλιογραφία viii

9 Εισαγωγή Υπάρχουν τρεις ισχύουσες θεωρίες ως προς την αιτιολογία της τερηδονικής νόσου: η θεωρία της ειδικής πλάκας σύμφωνα με την οποία υπάρχουν λίγα και συγκεκριμένα μικροβιακά είδη όπως ο S. mutans και ο S. sobrinus τα οποία εμπλέκονται στην τερηδονική διαδικασία, η θεωρία της μη ειδικής πλάκας η οποία υποστηρίζει ότι η τερηδονική νόσος είναι το αποτέλεσμα της δραστηριότητας του συνόλου της μικροβιακής πλάκας και τέλος η οικολογική θεωρία της πλάκας με βάση την οποία η τερηδονική νόσος προκαλείται από μια διαταραχή στην ισορροπία της υπάρχουσας μικροβιακής χλωρίδας η οποία πυροδοτείται από αλλαγές στο περιβάλλον (Jorn και συν., 2008). Σύμφωνα με την τελευταία θεωρία, οι περιβαλλοντικές αλλαγές, όπως η συχνή κατανάλωση ζυμώσιμων υδατανθράκων, ευνοούν την ανάπτυξη και την κυριαρχία οξεάντοχων παθογόνων βακτηρίων ανάμεσα στα οποία είναι οι στρεπτόκοκκοι και οι λακτοβάκιλλοι (Marsh, 2003). Έτσι, η νόσος δεν έχει συγκεκριμένη μικροβιακή αιτιολογία, καθώς οποιοδήποτε είδος με παρόμοια χαρακτηριστικά μπορεί να προκαλέσει την νόσο. Στρεπτόκοκκοι Οι στρεπτόκοκκοι είναι Gram θετικά βακτήρια που ανήκουν στην οικογένεια των Streptococcaceae. Αυτοί οι οργανισμοί, όταν αναπτύσσονται σε κατάλληλα μέσα καλλιέργειας εμφανίζουν χαρακτηριστική μορφή αλυσίδας. Το τεστ καταλάσης που ανιχνεύει κυτοχρωματικά ένζυμα διαχωρίζει τους στρεπτοκόκκους (καταλάση αρνητικοί) από άλλα μέλη της οικογένειας των Micrococcaceae (καταλάση θετικοί). Οι στρεπτόκοκκοι είναι δυνητικά αναερόβιοι και πολλά στελέχη αναπτύσσονται καλύτερα παρουσία διοξειδίου του άνθρακα (CO2). 1

10 Ταξινόμηση στρεπτοκόκκων Α. Με βάση την αιμόλυση (1903) Η πρώτη προσπάθεια ταξινόμησης των στρεπτοκόκκων έγινε πιθανόν το 1903 από τον Shottmuller ο οποίος χρησιμοποίησε αιματούχο άγαρ για να κατηγοριοποιήσει του στρεπτοκόκκους με βάση την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε αιματούχο άγαρ προβάτου και να εμφανίζουν είτε α- ατελή, β-πλήρη, ή γ-μη αιμόλυση καθώς παράγουν αιμολυσίνη η οποία λύει τα ερυθρά κύτταρα του αίματος. α-αιμόλυση ατελή και μερική: Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι S. pneumoniae, S. viridans και χαρακτηρίζονται από την αιμόλυση σιδήρου στα ερυθρά αιμοσφαίρια και εμφανίζεται με πράσινο σκούρο χρώμα στο αιματούχο άγαρ. Ο S. mutans αποτελεί το % των mutans streptococci (MS) που απομονώνονται από τον άνθρωπο. Η ομάδα MS αποτελεί μέρος των viridans streptococci, μια ομάδα α-ή μη-αιμολυτικών στρεπτοκόκκων που αποτελεί τμήμα της φυσιολογικής στοματοφαρυγγικής και ουρογεννητικής χλωρίδας. Άλλοι στρεπτόκοκκοι της ομάδας viridans είναι οι S. sanguis, S. parasanguis, S. gordonii, S. mitis, S. oralis, S. crista, S. vestibularis και S. salivarius (Renschler, 2006). γ-μη αιμόλυση: Οι στρεπτόκοκκοι αυτής της ομάδας δεν προκαλούν αιμόλυση και περιλαμβάνουν τους εντερόκοκκους (εικόνα 1). 2

11 Εικόνα 1. Ταξινόμηση α ή μη αιμολυτικών στρεπτοκόκκων (Facklam 2002) Είδη ή ομάδες Αντιγόνα S. pneumoniae pn S. equines (S. bovis) D S. gallolyticus (S. bovis I) D S. pasteurianus (S. bovis II.2) D S. infantarius (S. bovis II/1) D (v) S. lutetiensis D (v) S. suis b Type 1-35 (R,S,T) Στρεπτόκοκκοι Viridans Άλλοι στρεπτόκκοι και γένη A,C,G,F Άγνωστα β-αιμόλυση ή πλήρη: Οι στρεπτόκοκκοι που ανήκουν σε αυτήν την κατηγορία προκαλούν πλήρη διάλυση των ερυθρών αιμοσφαιρίων γι αυτό και στο αιματούχο άγαρ εμφανίζονται ως μεγάλες καθαρές περιοχές από ερυθρά οι οποίες περιβάλλονται από αποικίες μικροβίων. Σε αυτήν την κατηγορία ανήκουν οι στρεπτόκοκκοι των ομάδων A-V σύμφωνα με την ταξινόμηση κατά Lancefield που θα περιγράψουμε παρακάτω (εικόνα 2) (Facklam 2002). 3

12 Εικόνα 2. Ταξινόμηση των β-αιμολυτικών στρεπτοκόκκων (Facklam 2002) Είδη Ομάδα κατά Lancefield S. pyogenes A S. agalactiae B S. dysgalactiae subsp. dysgalactiae b subsp. equisimilis c C A, C, G, L S. equi subsp. equi subsp. zooepidemicus C C S. canis c G S. anginosus (group) d A, C, G, F, Καμία S. constellatus subsp. pharyngis C S. porcinus E, P, U, V, Καμία S. iniae Καμία S. phocae C, F S. didelphis Καμία B. Ταξινόμηση κατά Lancefield για τον β-αιμολυτικό στρεπτόκοκκο (1933) Το στρεπτοκοκκικό κυτταρικό τοίχωμα, όπως και σε άλλα Gram-θετικά βακτήρια, αποτελείται κατά κύριο λόγο από πεπτιδογλυκάνη. Μια ποικιλία από υδατάνθρακες, τειχοϊκό οξύ, λιποπρωτείνες και επιφανειακά αντιγόνα 4

13 είναι ενσωματωμένα στο κυτταρικό τοίχωμα. Ομαδοποιούνται οροτυπικά με βάση των υδατανθρακικών αντιγόνων που υπάρχουν στην επιφάνειά τους. Η ομαδοποίηση κατά Lancefield για τον β-αιμολυτικό στρεπτόκοκκο καθιερώθηκε το 1933 από την Rebecca Lancefield. Αυτό το σύστημα ομαδοποιεί του στρεπτοκόκκους σε A,B,C,F και G (με βάση τους πολυσακχαρίτες του κυτταρικού τοιχώματος) ή ομάδα D και είδη Enterococcus (με βάση το λιποτειχοϊκό οξύ του κυτταρικού τοιχώματος). Η ομάδα των mutans streptococci ανευρίσκονται στην οδοντική μικροβιακή πλάκα, μεταβολίζουν την μαννιτόλη και τη σορβιτόλη, παράγουν εξωκυττάριες γλουκάνες από σουκρόζη και έχουν τερηδονογόνο δράση. Σύμφωνα με την ταξινόμηση αυτή οι στρεπτόκοκκοι ταξινομούνται στις παρακάτω ομάδες: Ομάδες Α: S. pyogenes, B: S. agalactiae, C: S. equi, D: Enterococci και S. bovis, F: S. anginosus, G: S. dysgalactiae και S. canis (Facklam 2002). Γ. Με βάση τον ορότυπο (1970) Με βάση τις διαφορές στην σύνθεσή τους και στις συνδέσεις των πολυσακχαριτών του κυτταρικού τοιχώματος οι mutans streptococci ταξινομούνται σε οκτώ ορότυπους (a,b,c,d και e) οι οποίο περιγράφηκαν από τον Bratthal το 1970 και δύο επιπλέον οι f,g οι οποίοι περιγράφηκαν από τον Perch το Αυτοί είναι οι παρακάτω : S. mutans (ορότυποι c,e,f), S. sobrinus (ορότυποι d/g), S. downei (ορότυπος h), S. criceti (ορότυπος a), S. ratti (ορότυπος b), S. ferus (ορότυπος c), S. macacae (ορότυπος c). Ανάμεσα σε αυτούς ο S. mutans είναι γνωστός ως κύριος αιτιολογικός βακτηριακός παράγοντας της τερηδονικής νόσου ενώ περιστασιακά έχει απομονωθεί από το αίμα ατόμων με λοιμώδη ενδοκαρδίτιδα (Beighton και συν., 1981). Η ταξινόμηση του S. mutans στους ορότυπους c,e και f βασίζεται στη διαφορετική χημική σύνθεση των ειδικών για τους ορότυπους πολυσακχαρίτες οι οποίοι αποτελούνται από μια 5

14 βασική αλυσίδα ραμνόζης και πλευρικές αλυσίδες γλυκόζης. Έχει αναφερθεί ότι σχεδόν το 70-80% των S. mutans στη στοματική κοιλότητα ανήκουν στον ορότυπο c, ακολουθεί ο e (20%) και λιγότερο συχνός οf (λιγότερο από 5%) (Nakano και συν., 2010). Όσον αφορά τη σχέση ανάμεσα στους ορότυπους των mutans streptococci και τον τύπο των τερηδονικών αλλοιώσεων, παλιότερες μελέτες έχουν δείξει ότι οι ορότυποι d, g σχετίζονται κατά προτίμηση με τερηδονικές αλλοιώσεις στις λείες παρειακές επιφάνειες ενώ οι ορότυποι c,e,f, με τερηδονικές αλλοιώσεις οπών και σχισμών (Masuda και συν., 1979). Πρόσφατα ορίστηκε ένας επιπλέον ορότυπος του S. mutans ο ορότυπος k, ο οποίος χαρακτηρίζεται από δραστική μείωση στην ποσότητα των πλευρικών αλυσίδων γλυκόζης στους πολυσακχαρίτες του κυτταρικού τοιχώματος. Μια βασική ιδιότητα αυτού του οροτύπου είναι η μειωμένη τερηδονογόνος ικανότητα χάρη στις μεταβολές διαφόρων πρωτεϊνικών αντιγόνων της κυτταρικής επιφάνειας. Αντιθέτως, έχει την ικανότητα να επιβιώνει στο αίμα για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα συγκριτικά με τους άλλους οροτύπους λόγω της μειωμένης αντιγονικότητας και της μειωμένης ευαισθησίας στη φαγοκυττάρωση (Nakano και συν., 2004, Nakano και συν., 2010). Για το λόγο αυτό θεωρείται ότι ο ορότυπος k του S. mutans πιθανόν να σχετίζεται με την ανάπτυξη καρδιαγγειακών παθήσεων (Nakano και συν., 2010). Σχετικά με την ταυτόχρονη παρουσία περισσότερου του ενός οροτύπου παλαιότερες μελέτες έχουν δείξει ότι η αύξηση του αριθμού των S. mutans συνοδευόταν από την αυξημένη συχνότητα απομόνωσης περισσότερων του ενός οροτύπου S. mutans (Masuda και συν., 1979). Πιο πρόσφατες μελέτες καταλήγουν ότι παιδιά με μικτή παρουσία πολλαπλών οροτύπων φαίνεται να έχουν μεγαλύτερη τερηδονική εμπειρία από αυτά στα οποία απομονώθηκε ένας μόνο ορότυπος (Shibata και συν., 2003). Δ. Με βάση την ενζυματική δραστηριότητα σε βιότυπους (1974) 6

15 Μια επιπλέον ταξινόμηση σε βιοτύπους από Ι-V πραγματοποιήθηκε από του Shklair και Keenτο 1974 με βάση τον μεταβολισμό μαννιτόλης, σορβιτόλης, ραφινόζης και μελιβιόζης καθώς και την παραγωγή αμμωνίας από αργινίνη όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα 3 (Beighton και συν., 1981). Εικόνα 3. Ταξινόμηση σε βιοτύπους Ι-VI με βάση την παραγωγή οξέος από συγκεκριμένα σάκχαρα (Shklairκαι Keene, 1974) Παραγωγή οξέος από τα παρακάτω Βιότυπος Ορότυπος Μαννιτόλη Σορβιτόλη Ραφφινόζη Μελιβιόζη Παραγωγή NH 3 από αργινίνη Ανάπτυξη σε βακιτρακίνη Ι c, e, f ΙΙ b ΙΙΙ a ΙV d,g,sl-1 + +/ V e VI h Ε. Με βάση την αλληλουχία DNA σε γονότυπους (1974) Το 1974 ο Coykendall ταξινόμησε τους S. mutans σε τέσσερις ομάδες με βάση την αλληλουχία DNA-γουανίνη/κυτοσίνη και ομόλογων αλυσίδων DNA όπως παρακάτω. 7

16 1. Mutans mol% αντιστοιχεί στον ορότυπο c 2. Rattus mol% με ικανότητα παραγωγής αμμωνίας από αργινίνη και αντιστοιχεί στον ορότυπο b 3. Cricetus 42-44% mol% με μη ικανότητας ανάπτυξης σε αερόβιες συνθήκες και αντιστοιχεί στον ορότυπο a 4. Sobrinus 44-46% mol% με μη ικανότητα μεταβολισμού ραφινόζης και αντιστοιχεί στον ορότυπο d (Coykendall, 1974) ΣΤ. Μοριακή ταξινόμηση με βάση την 16 SrDNA αλληλουχία (1995) Οι στρεπτόκοκκοι έχουν διαχωριστεί σε έξι ομάδες με βάση την 16 Sr DNA αλληλουχία. Αυτές είναι οι: Bovis, Mitis, Mutans, Pyogenic, Anginosus και Salivarius. Τα πιο σημαντικά παθογόνα S. pneumonia και S. pyogenes ανήκουν στις ομάδες Mitis και Pyogenic αντίστοιχα ενώ ο τερηδονογόνος Streptococcus mutans ανήκει στην ομάδα των Mutans (Kawamura και συν., 1995). S. mutans Ο S. mutans απομονώθηκε για πρώτη φορά από μια τερηδονική αλλοίωση το 1924 από τον Clark. O μικροοργανισμός πήρε το όνομά του από την οβάλ mutant=μεταλλαγμένη μορφή του στην χρώση κατά Gram σε αντίθεση με τη τυπική στρογγυλή μορφή των στρεπτοκόκκων. Ο S. mutans είναι τυπικά α-ή μη αιμολυτικός στο αιματούχο άγαρ. Όταν αναπτύσσεται σε άγαρ που περιέχει σουκρόζη οι αποικίες είναι λευκές (ή περιστασιακά κίτρινες) αδρές και υπερυψωμένες από την επιφάνεια του άγαρ. Στο αιματούχο άγαρ, οι αποικίες του S. mutans είναι λευκές ή γκρι, κυκλικές ή ακανόνιστου σχήματος, μμ σε διάμετρο και μερικές φορές είναι προσκολλημένες στην επιφάνεια του άγαρ. Τα βιοχημικά χαρακτηριστικά του S. mutans περιλαμβάνουν ενζυματική δραστηριότητα α-d-γλυκοσιδάσης, β-d-γλυκοσιδάσης και β-d-γαλακτοσιδάσης,παραγωγή 8

17 οξέος από αμυγδαλίνη, αρβουτίνη, κελλοβιόζη, ινουλίνη, μαννιτόλη, Ν- ακετυλοζαμίνη, ραφινόζη, σαλικίνη, σορβιτόλη, σουκρόζη, τριαλόζη, λακτόζη και μελιβιόζη. Τα κύτταρα των S.mutans μπορεί να είναι σφαιρικά, οβάλ ή επιμηκυμένα. Οι οργανισμοί συχνά εμφανίζονται σε ζεύγη ή σε μικρού ή μετρίου μήκους αλυσίδες. Μακρού μήκους αλυσίδες στρεπτοκόκκων μπορούν να προκύψουν μετά από ανάπτυξη σε εμπλουτισμένο μέσο καλλιέργειας. Η συχνότητα εμφάνισής του κυμαίνεται στην Βόρεια Αμερική από 83-96% σε ενήλικες και από 74-97% σε παιδιά. Η μητέρα του παιδιού θεωρείται η πιο σημαντική πηγή μόλυνσης του παιδιού και τα περισσότερα παιδιά αποικίζονται από το βακτήριο κατά τη διάρκεια ανατολής των νεογιλών δοντιών (8 μηνών-3 ετών). Από τη στιγμή που θα αποικίσει τη στοματική κοιλότητα μπορεί να βρεθεί στο σάλιο, τη γλώσσα, το στοματικό βλεννογόνο, τις επιφάνειες των δοντιών και τις ορθοδοντικές συσκευές. Αποτελεί τον κυριότερο αιτιολογικό παράγοντα της τερηδονικής νόσου και διαθέτει ποικίλους επιθετικούς μηχανισμούς που του επιτρέπουν να αποικίζει την οδοντική πλάκα και να παράγει αλλά και να αντέχει μια ποικιλία οξέων. Μηχανισμοί προσκόλλησης του S. mutans 1. Προσκόλληση εξαρτώμενη από σουκρόζη Ο S. mutans διαθέτει 3 πρωτείνες γλυκοσυλοτρανσφεράσες (GTFs) με ενζυματική δραστηριότητα και ικανότητα να διασπούν τη σουκρόζη σε γλυκόζη και φρουκτόζη. Η παραγόμενη γλυκόζη ομαδοποιείται σε ένα αναπτυσσόμενο πολυμερές γλουκάνης. Έτσι, αυτού του τύπου η προσκόλληση του S. mutans στηρίζεται στη σύνδεση του S. mutans επενδυμένου με γλουκάνη στο σιαλικό υμένιο, ή μέσω της σύνδεσής του στη γλουκάνη που υπάρχει ήδη στην οδοντική πλάκα. Αυτή η γλουκάνη 9

18 μπορεί να σχηματίζεται από GTFs που απελευθερώνονται μέσα στο σιαλικό υμένιο οι οποίες προηγουμένως ήταν προσκολλημένες στον S. mutans ή σε άλλους στρεπτοκόκκους. 2. Προσκόλληση μη εξαρτώμενη από σουκρόζη Ο S. mutans έχει επίσης την ικανότητα να προσκολλάται απουσία σουκρόζης μέσω επιφανειακών αδεσινών όπως είναι το αντιγόνο Ι/ΙΙ. Οι πρωτείνες της οικογένειας των αντιγόνων Ι/ΙΙ διαθέτουν δομικές ομοιότητες, αλλά παρουσιάζουν μια ποικιλία στη λειτουργικότητά τους σχετικά με την ικανότητα να συνδέονται στο σιαλικό υμένιο και σε άλλα βακτήρια της πλάκας. Οξεογενετικότητα και οξεαντοχή Ο S. mutans διαθέτει ένα πλήρες γλυκολυτικό μονοπάτι και μπορεί να παράγει γαλακτικό, μυρμηκικό, οξικό οξύ και αιθανόλη ως προϊόντα του μεταβολισμού. Όταν η γλυκόζη απουσιάζει, το γαλακτικό οξύ αποτελεί το τελικό προϊόν. Ο μεταβολισμός οδηγεί σε δημιουργία όξινου περιβάλλοντος, απασβεστίωση της αδαμαντίνης και επακόλουθη δημιουργία τερηδονικών κοιλοτήτων. Συγκριτικά με άλλους στρεπτοκόκκους, ο S. mutans παράγει μεγαλύτερη ποσότητα γαλακτικού οξέος και η πτώση του ph του περιβάλλοντος οδηγεί σε οικολογικές αλλαγές στην οδοντική πλάκα, συμπεριλαμβανομένης μια αύξησης της ποσότητας των S. mutans και άλλων οξεάντοχων ειδών. Αυτή η αλλαγή στη μικροβιακή χλωρίδα προκαλεί μια πτώση του ph της πλάκας μεγαλύτερης από την υγιή πλάκα σε συνθήκες μεταβολισμού υδατανθράκων και παρατείνει την ανάκτηση ενός ουδέτερου ph ενώ παράλληλα με την πτώση του ph η δραστηριότητα του S. mutans αυξάνεται (Renschler,2006). 10

19 Τα παραπάνω χαρακτηριστικά βοηθούν τους S. mutans να επιβιώνουν ακόμα και σε ένα μη φιλικό περιβάλλον κάτω από συνθήκες με ή χωρίς παρουσία σακχάρων όπως για παράδειγμα κατά τη διάρκεια περιόδων φτωχής κατανάλωσης σακχάρων (ανάμεσα στα γεύματα) μέχρι περιόδους αυξημένης κατανάλωσης. Τα παράγωγα του μεταβολισμού των σακχάρων, τα οξέα, απελευθερώνονται από τα βακτηριακά κύτταρα στην μικροβιακή πλάκα. Έτσι, ο S. mutans αποτελεί το πιο συχνό βακτήριο της ομάδας mutans streptococci στον άνθρωπο και έχει την υψηλότερη εμφάνιση καθιστώντας τον το πιο επιθετικό οδοντοπαθογόνο στην αιτιολογία της τερηδονικής νόσου. S. sobrinus To είδος S. sobrinus περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Coykendall (1983) για στρεπτόκοκκους τύπου mutans, οι οποίοι έφεραν αντιγόνα της ομάδας d ή g. Θεωρείται αιτιολογικός παράγοντας της τερηδονικής νόσου στον άνθρωπο μαζί με τον S. mutans. Τα κύτταρά του έχουν διάμετρο 0.5 μm και σχηματίζουν μακρές αλυσίδες ή εμφανίζονται σε ζεύγη. Τα στελέχη είναι κυρίως μη αιμολυτικά σε αιματούχο άγαρ με κάποια στελέχη να παράγουν α-αιμόλυση. Σε άγαρ πλούσιο σε σουκρόζη οι αποικίες είναι αδρές, υπερυψωμένες, σχεδόν 1χιλ διάμετρο και περιβάλλονται από υγρό που περιέχει γλουκάνη. Τα στελέχη του S. sobrinus ανήκουν σε ορότυπους d,g βάση των πολυσακχαριτών της επιφάνειας (Holzapfel και Wood, 2012). Η συχνότητα εμφάνισης του S. sobrinus κυμαίνεται από % (Ko hler και συν., 1995,Franco EF και συν., 2007, Fujiwara και συν., 1991) ενώ έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία και σημαντικά υψηλότερα ποσοστά εμφάνισης (Okada και συν., 2005). Μύκητες του γένους Candida 11

20 Οι μικροοργανισμοί που ανήκουν στο είδος Candida είναι μικροί (4-6μm), οβάλ, με λεπτό τοίχωμα ζυμομύκητες που πολλαπλασιάζονται με εκβλαστήσεις. Το γένος Candida αποτελείται από 200 είδη με κοινό χαρακτηριστικό την απουσία κύκλου αναπαραγωγής. Μόνο συγκεκριμένα είδη προκαλούν νόσο στον άνθρωπο. Αυτά είναι Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida kefyr, Candida guillier-mondii, Candida lusitaniae, Candida stellatoide και Candida dubliniensis. C.albicans Η μορφή της Candida σε καλλιέργεια σε άγαρ είναι λείες, κρεμώδεις, λευκές και γυαλιστερές αποικίες. Η Candida albicans παραμένει ο κύριος παθογόνος μύκητας στον άνθρωπο και η πιο συχνή αιτία μυκητιασικής μόλυνσης σε βλεννογόνο (Anaisse και συν., 2009). Παρόλο που η Candida επιβιώνει με δυσκολία σε ξηρές επιφάνειες μπορεί να παραμείνει ζωντανή για κάποιο χρονικό διάστημα σε υγρές επιφάνειες. Για παράδειγμα μπορεί να απομονωθεί από οδοντόβουρτσες ατόμων που εμφανίζουν Candida στο στόμα, και επιβιώνει σε κρέμες χεριών, καλλυντικά και ρούχα. Συχνά αποικίζει την ανθρώπινη επιδερμίδα κυρίως σε περιοχές του δέρματος με αυξημένη υγρασία όπως ανάμεσα στα δάκτυλα των χεριών και των ποδιών, αλλά η γαστρεντερική οδός θεωρείται το σημαντικότερο ρεζερβουάρ. Παρόλο που ένα σημαντικό ποσοστό του πληθυσμού εμφανίζει ανιχνεύσιμα μεγέθη του μύκητα στο στόμα, λίγοι μόνο από αυτούς νοσούν από στοματική καντιντίαση. Έχουν απομονωθεί πολλά είδη μυκήτων από τη στοματική κοιλότητα με την πλειονότητα αυτών να ανήκουν στο είδος Candida και ειδικά C. albicans. Πρέπει εδώ να επισημάνουμε ότι η απομόνωση της C. albicans από τη στοματική κοιλότητα, σε απουσία αλλοιώσεων, δεν αποτελεί ένδειξη καντιντίασης. Τα αναφερόμενα ποσοστά εμφάνισης στην στοματική κοιλότητα κυμαίνονται 12

21 από 15-75% με βάση τον πληθυσμό και την ευαισθησία της τεχνικής απομόνωσης. Παράγοντες του ξενιστή που βρέθηκαν ότι σχετίζονται με αυξημένα επίπεδαcandida στη στοματική κοιλότητα περιλαμβάνουν τον μειωμένο ρυθμό ροής σάλιου, χαμηλό ph σάλιου, κάπνισμα, και αυξημένα επίπεδα γλυκόζης στο σάλιο (Cannon και συν., 1995). Μέθοδοι ανίχνευσης και ταυτοποίησης των υπό διερεύνηση μικροβίων 1. Βιοχημικές δοκιμασίες Στην δεκαετία του 1970 δύο βιοχημικά σχήματα για την ταυτοποίηση των στρεπτοκόκκων viridans δημοσιεύτηκαν και στην συνέχεια ακολουθήθηκαν ευρέως. Το σχήμα των Colman και Williams αναγνώριζε πέντε είδη των στρεπτοκόκκων viridans τα οποία απομονώνονταν κυρίως από το στόμα (S. mutans, S. milleri, S. sanguis, S. salivarius, S. mitior) και καθιερώθηκε η χρήση του κυρίως στα Ευρωπαϊκά ερευνητικά εργαστήρια. Το δεύτερο σχήμα του Facklam χρησιμοποιήθηκε κυρίως στις ΗΠΑ και διέφερε ως προς την ανάθεση στελεχών τα οποία ταξινομούνταν με βάση τους Colman και Williams ως S. sanguis και S. mitior σε S. sanguis Ι και S. sanguis II ή S. mitis και επιπλέον διαχωρίζοντας τα στελέχη του S. milleri σε S. anginosus-constellatus και S. MG-intermedius. Οι παραπάνω διαφορές οδήγησαν σε σημαντική σύγχυση στην βιβλιογραφία. Η διαδικασία των ενζυμικών τεστ και δοκιμασιών ζύμωσης περιλαμβάνει την παραγωγή οξέος από αμυγδαλίνη, αρβουτίνη, ινουλίνη, λακτόση, μαννιτόλη, μελιβιόζη, Ν-ακέτυλογλυκοζαμίνη, ραφινόζη και σορβιτόλη, υδρόλυση της αισκουλίνης, σχηματισμό αμμωνίας από αρφινίνη και ουρία και παραγωγή υπεροξειδίου του υδρογόνου. Η αντίδραση ζύμωσης των υδατανθράκων καθορίζεται με ένα βασικό μέσο το οποίο συντίθεται από Purple Broth Base 24g και Thioglygollate μέσο χωρίς δεξτρόζη 12g με την προσθήκη υδατανθράκων σε συγκέντρωση 0.5% w/v πριν την αποστείρωση. Τα βακτήρια αναπτύσσονται για 48 ώρες σε 4ml του 13

22 ζωμού Todd-Hewitt και στη συνέχεια ενοφθαλμίζονται σε αυτά τα τεστ. Στη συνέχεια επωάζονται σε αναερόβιες συνθήκες για 24ώρες και καταγράφουμε τα αποτελέσματα (Beighton και συν 1991). Στην εικόνα 4 φαίνεται το σχήμα που προτείνεται για τα είδη των viridians streptococci συμπεριλαμβανομένου των S. mutans (L), S. sobrinus (M) (Beighton και συν., 1991). Εικόνα 4. Σχήμα για την ταυτοποίηση των viridans streptococci από Beighton D και συν A1,A2 και Α3, S. sanguis βιότυποι 1,2 και 3; B, S. parasanguis; C, S. gordonii; D, ομάδα φουντωτών ινιδίων ; E, S. oralis; F, S. mitis; G, S. vestibularis; H, S. salivarius; I, S. intermedius; J, S. constellatus; K, S. anginosus; L, S. mutans; M, S. sobrinus. +,>85% των στελεχών θετικά; d,15-85% των στελεχών θετικά; -, <15% των στελεχών θετικά. 14

23 Εϊδη στρεπτοκόκκων Ενζυμική δραστηριότητα Α1 Α2 Α3 B C D E F G H I J K L M β-d-φουκοσιδάση - + d d d β-ν-ακετυλογαλακ-δάση d σιαλιδάση d α-l-φουκοσιδάση d β-ν-ακετυλογλυκοσιδάση - d α-γλυκοσιδάση d d d β-γλυκοσιδάση d + d d d d α-αραβινοσιδάση d Παραγωγή οξέος από αμυγδαλίνη d d d d d ινουλίνη d d d d - d μαννιτόλη Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη d d + - ραφφινόζη d - - d + - d - - d + - Υδρόλυση από: αργινίνη d

24 2. Καλλιέργεια σε εκλεκτικά μέσα MSB μέσο καλλιέργειας Πολλά διαφορετικά μέσα καλλιέργειας έχουν χρησιμοποιηθεί για την μελέτη του S. mutans με τα πιο συχνά να είναι το mitis-salivarius bacitracin agar (MSB), το trypicase yeast-extract-cysteine-sucrose-bacitracin agar (TYCSB) και το glucosesucrose-potassium tellurite-bacitractin agar (GSTB). Στην εργασία του ο Dasanayake και οι συνεργάτες του συγκρίνουν το MSB και το GSTB άγαρ με στόχο να εντοπίσουν την κατάλληλη μέθοδο εκτίμησης των mutans streptococci για επιδημιολογικές μελέτες. Καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι το MSB φαίνεται να είναι πιο ευαίσθητο ως μέσο καλλιέργειας καθώς το GSTB μέσο απέτυχε στην ανίχνευση των mutans streptococci σχεδόν στο 50% των ατόμων στους οποίους οι mutans streptococci ανιχνεύτηκαν με το MSB άγαρ (Dasanayake και συν., 1995). MS-SOB μέσο καλλιέργειας Αντιπροσωπευτικά στελέχη των S. mutans και S. sobrinus εμφανίζουν διαφορές στην ευαισθησία τους σε μέλη της ομάδας μονοβακτάμης των β- λακταμικών αντιβιοτικών: Ο S. sobrinus είναι λιγότερο ευαίσθητος από τον S. mutans. Οι ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις της αζτρεονάμης (AZT) και καρουμονάμης, οι οποίες ανήκουν και οι δύο σε αυτήν την ομάδα είναι 2,000 μg/ml για τον S. sobrinus και 125 μg/ml για τον S. mutans. Επιπλέον προσθήκη φωσφομυκίνης, βακιτρακίνης και χλωριούχου νατρίου στο MSB άγαρ εμπλουτισμένο με ΑΖΤ οδηγεί σε αναστολή της ανάπτυξης των S. mutans και άλλων στρεπτοκόκκων του στόματος πλην των S. sobrinus. Για τον λόγο αυτό χρησιμοποιείται ως εκλεκτικό μέσο καλλιέργειας των S. sobrinus (MS-SOB μέσο) (Hirasawa Μ &TakadaK 2002). CHROMagar Candida μέσο καλλιέργειας Το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο μέσο για την απομόνωση της Candida και άλλων μυκήτων από κλινικά δείγματα είναι το Sabouraud glucose άγαρ, ένα μέσο γενικής χρήσης το οποίο επιτρέπει την ανάπτυξη 16

25 των πιο παθογόνων μυκήτων. Παρόλα αυτά καθώς το συγκεκριμένο άγαρ δεν αποτελεί ειδικό μέσο, αποικίες διαφόρων παθογόνων ζυμομυκήτων οι οποίες αναπτύσσονται στο συγκεκριμένο άγαρ δεν μπορούν εύκολα να διακριθούν μεταξύ τους. Καθώς η C. albicans αποτελεί το πιο συχνό είδος μύκητα που απομονώνεται από τα κλινικά δείγματα, έχουν γίνει προσπάθειες σχεδιασμού μέσων καλλιέργειας τα οποία στοχεύουν στην διαφοροποίηση των C. albicans από τους άλλους αναπτυσσόμενους μύκητες με βάση το χρώμα των αποικιών. Ανάμεσα σε αυτά τα μέσα είναι και το μέσο CHROMagar Candida το οποίο χρησιμοποιείται για την απομόνωση και την αρχική ταυτοποίηση των C. albicans, C. krusei, C. tropicalis και την διαφοροποίηση αυτών των ειδών από άλλους μύκητες με βάση την έντονη αντίθεση στα χρώματα των αποικιών. Το συγκεκριμένο μέσο επιτρέπει την ανίχνευση ακόμα και σε δείγματα που περιέχουν μια μίξη από διαφόρων ειδών μυκήτες. Μετά από 48 ώρες επώασης στους 37 C είναι δυνατή η διάκριση των αποικιών με βάση το χρώμα τους. Τα στελέχη της C. albicans εμφανίζουν χρώμα αποικιών κίτρινο-πράσινο / μπλεπράσινο στο CHROMagar. Αυτό το πράσινο χρώμα είναι ιδιαίτερα χαρακτηριστικό για αυτές τις αποικίες και η ευαισθησία και ειδικότητα μια πράσινης αποικίας για αναγνώριση της C. albicans υπολογίζεται στο 100% (Odds FC, Bernaerts R 1994). Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης τους οι Odds και Bernaerts υποστηρίζουν ότι δεν είναι απαραίτητα επιπλέον τεστ ταυτοποίησης της C. albicans χάρη στην χαρακτηριστική και μοναδική εμφάνισή τους στο συγκεκριμένο μέσο καλλιέργειας (Εικόνα 5). Εικόνα 5. Αποικίες τεσσάρων διαφορετικών ειδών Candida μετά από επώαση στο CHROMagar Candida για 48 ώρες στους 37 C. Παρατηρούμε τα παρακάτω είδη: τέσσερις αποικίες C. albicans πράσινες, δύο αποικίες C. 17

26 glabrata ροζ, δύο C. tropicalis μπλε-μωβ και δύο μεγάλες, ελαφρώς ροζ και αδρές C. krusei ( Odds FC, Bernaerts R 1994). 3. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Πολλοί ερευνητές χρησιμοποίησαν την μέθοδο της «αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης» (PCR analysis) για την ανίχνευση των mutans streptococci. Δείγματα σάλιου ή μικροβιακής πλάκας έχουν χρησιμοποιηθεί ως κλινικά δείγματα. Ο Oho και οι συνεργάτες του αναφέρουν ότι η οδοντική πλάκα μπορεί να μην είναι το επιθυμητό δείγμα στις επιδημιολογικές μελέτες εξαιτίας της δυσκολίας στη συλλογή της και διεξήγαγαν μια μελέτη με στόχο την γρήγορη ανίχνευση S. mutans και S. sobrinus από το σάλιο με την μέθοδο PCR. Για τον διαχωρισμό ανάμεσα στα δύο αυτά βακτήρια βασίστηκαν στον παρακάτω συλλογισμό. Ο S. mutans παράγει τρεις τύπους γλυκοσυλοτρανσφερασών (GTF-I, GTF-SI, GTF-S) και το gtfb γονίδιο κωδικοποιεί την GTF-I η οποία κυρίως συμμετέχει στη 18

27 σύνθεση αδιάλυτης στο νερό γλουκάνης από σουκρόζη. Ο S. sobrinus διαθέτει τέσσερις τύπους γλυκοσυλοτρανσφερασών (GTF-I, GTF-S,GTF-SA, GTF-SB) και το gtfi γονίδιο κωδικοποιεί την GTF-I η οποία συνθέτει την γλουκάνη. Τα γονίδια gtfb και gtfi είναι κατάλληλα για τον σχεδιασμό εκκινητών καθώς και τα δύο εκφράζουν σημαντικούς επιθετικούς παράγοντες των τερηδονογόνων βακτηρίων και έχουν νουκλεοτιδική αλληλουχία ειδική για κάθε είδος. Στην παραπάνω μελέτη οι PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν για τις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των S. mutans gtfb και S. sobrinus gtfi γονιδίων και από τα αποτελέσματα καταμέτρησης των αποικιών των mutans streptococci στα δείγματα σάλιου κατηγοριοποίησαν τον τερηδονικό κίνδυνο σε τέσσερα επίπεδα: χαμηλό, , , >10 5. Η μελέτη καταλήγει στην επιβεβαίωση της ευαισθησίας της τεχνικής PCR και την αποτελεσματικότητά της στην εκτίμηση του τερηδονικού κινδύνου του ατόμου (Oho και συν., 2000). 4. Ταινίες Dentocult Sm H μέθοδος Strip mutans περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Jensen και Bratthal το 1989 και περιλαμβάνει τα παρακάτω βήματα: Μια πλαστική σπάτουλα, με αδρή την μια της επιφάνεια ώστε να διευκολύνει την προσκόλληση των μικροβίων, επαλείφεται πάνω στην επιφάνεια της γλώσσας για περίπου 10 επαναλήψεις και στη συνέχεια απομακρύνεται από το στόμα με τα χείλη του ατόμου κλειστά. Οι σπάτουλες μεταφέρονται άμεσα σε φιαλίδια των 6ml που περιέχουν εκλεκτικό μέσο ανάπτυξης και επωάζονται στους 37 C για 48 ώρες. Το μέσο περιέχει σουκρόζη ώστε να προάγει την προσκόλληση των στρεπτοκόκκων στην ταινία. Η βακιτρακίνη η οποία προστίθεται πριν τη χρήση αποτελεί τη βάση για την εκλεκτική ανάπτυξη των στρεπτοκόκκων. Μετά την επώαση οι πλαστικές σπάτουλες απομακρύνονται από το ζωμό καλλιέργειας και αφήνονται να στεγνώσουν σε θερμοκρασία δωματίου. Στην συνέχεια πραγματοποιείται καταμέτρηση 19

28 ή εκτίμηση του αριθμού των αποικιών των mutans streptococci και τα αποτελέσματα κατατάσσονται σε 4 ομάδες: 0 CFU, 1-10 CFU, και 100 CFUs. Στην μελέτη τους οι Jensen και Bratthal βρήκαν σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στα αποτελέσματα αυτής της μεθόδου με την καλλιέργεια σε κατάλληλα μέσα ενώ παράλληλα εμφανίζει πολλά πλεονεκτήματα. Σε αυτά συμπεριλαμβάνονται η ευκολία της τεχνικής, η μακρά διάρκεια ζωής και αποθήκευσης, η ευκολία στην ανάγνωση των αποτελεσμάτων πάνω στην ταινία καθώς και η δυνατότητα απομόνωσης συγκεκριμένων αποικιών για επιπλέον ταυτοποίηση εφόσον κριθεί απαραίτητο (Jensen και Bratthal, 1989). Παρόλα τα πλεονεκτήματα της παραπάνω μεθόδου παρατηρήθηκε ότι περιστασιακά παρατηρούνταν αποχρωματισμός του ζωμού και των αποικιών των mutans streptococci στις πλαστικές ταινίες, καθιστώντας την ερμηνεία των αποτελεσμάτων δύσκολη (El- Nadeef και συν., 1992). Ο El-Nadeef και οι συνεργάτες τους καταλήγουν ότι ενώ η φυσιολογική στοματική χλωρίδα δεν είναι πιθανόν να παρεμβαίνει γενικά στην μέθοδο Strip mutans, περιστασιακά παροδική στοματική χλωρίδα όπως οι εντερόκοκκοι και συγκεκριμένα εντερικά βακτήρια, είναι πιθανό να αλλοιώνουν το μπλε χρώμα και να καθιστούν δύσκολη τη διάκριση των mutans streptococci. Τέτοιες μικροβιακές ομάδες μπορούν να βρεθούν στο σάλιο ατόμων με ανοσοκαταστολή και ανοσοανεπάρκεια όπως και σε πληθυσμούς με μειωμένη υγιεινή σώματος ή περιοχές με μολυσμένα πόσιμα νερά. Στην συγκεκριμένη μελέτη αναφέρονται και τρόποι βελτίωσης των αποτελεσμάτων της μεθόδου strip mutans όπως η περαιτέρω εξέταση των αποικιών πάνω στις ταινίες με μεγεθυντικό φακό και η προσεκτική χρήση των ταινιών ώστε να αποφεύγεται οποιαδήποτε επαφή αυτών με το δέρμα του προσώπου του ασθενή κατά την τοποθέτηση ή αφαίρεσή τους (El-Nadeef και συν., 1992). 20

29 Σχέση μικροβίων με την τερηδονική νόσο Η συσχέτιση ανάμεσα στους στρεπτοκόκκους και την συχνότητα και τον επιπολασμό της τερηδονικής νόσου έχει τεκμηριωθεί σε πολλές μελέτες (Sekiκαι συν., 2003, Zoitopoulos και συν.,1996, Ko hler και συν.,1987).ο S. mutans εμφανίζεται πιο συχνά από τον S. sobrinus στην οδοντική πλάκα και πολλές μελέτες επιβεβαιώνουν τη σχέση του με την τερηδονική εμπειρία και βαρύτητα (Fabiola Galbiatti de Carvalho και συν., 2006). Η παρουσία του S. sobrinus έχει σχετιστεί με αυξημένη τερηδονική εμπειρία ενώ πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι παιδιά που έφεραν και τα δύο είδη μικροβίων (S. mutans και S. sobrinus) εμφάνιζαν μεγαλύτερη τερηδονική εμπειρία, τερηδονική συχνότητα και συνολικό πληθυσμό mutans streptococci από τα παιδιά που είχαν μόνο S. mutans (Ko hler και συν., 1995, Okada και συν., 2005, Fujiwara και συν.,1991). H Candida albicans διαθέτει επίσης αυξημένη οξεογενετική και τερηδονογόνα δράση και αποτελέσματα προηγούμενων μελετών υποστηρίζουν ότι υπάρχει σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στην παρουσία C. albicans και στην τερηδόνα βρεφικής και νηπιακής ηλικίας (Fabiola Calbiatti de Carvalho και συν., 2006). Ανάμεσα στους παράγοντες που φαίνονται να επηρεάζουν την παρουσία των mutans streptococci είναι η ηλικία, οι διατροφικές συνήθειες και η εθνικότητα (Zoitopoulos και συν.,1996, Parisotto και συν.,2010, Marsh και συν.,2003). Με την αύξηση της ηλικίας η συχνότητα αποίκισης των mutans streptococci αυξάνεται σύμφωνα με κάποιους ερευνητές ενώ άλλοι δεν συμφωνούν με τον παραπάνω ισχυρισμό (Zoitopoulos και συν., 1996, Gizaniκαι συν.,2009). Η συχνότητα της C. albicans βρέθηκε επίσης να ποικίλει με την ηλικία και την γεωγραφική προέλευση (Rozkiewicz και συν.,2006). Η συχνότητα εμφάνισης των S. mutans και S. Sobrinus εμφανίζει μεγάλες διακυμάνσεις στη βιβλιογραφία καθώς έχει καταγραφεί ακόμα και η εμφάνιση των S. mutans, S. sobrinus και L. acidophilus σχεδόν σε όλο τον 21

30 υπό μελέτη πληθυσμό με τον S. sobrinus να εμφανίζεται με μεγαλύτερη συχνότητα από τον S. mutans (Gizani και συν., 2009). Εκτός από την παρουσία και τα μέσα επίπεδα των mutans streptococci στα στοματικά δείγματα, επιπλέον παράγοντες όπως η διάρκεια αποίκισης του σάλιου από mutans streptococci καθώς και η δυνατότητα των S. mutans να σχηματίζουν βιουμένιο φαίνεται να σχετίζονται με την τερηδονική εμπειρία (Zickert και συν., 1983, Giacaman και συν., 2010). Σκοπός της μελέτης Λόγω της ποικιλομορφίας των αποτελεσμάτων που εμφανίζονται στη βιβλιογραφία και στοχεύοντας στην αποσαφήνιση της συχνότητας εμφάνισης των S. mutans, S. sobrinus και C. albicans διεξήγαμε την παρούσα μελέτη, η οποία έχει ως στόχο να εξετάσει την εμφάνιση των προαναφερθέντων τριών μικροβίων στην οδοντική πλάκα και το σάλιο παιδιών με ή χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις, που διαμένουν στην Ελλάδα. Υλικά και μέθοδοι Συμμετέχοντες Παιδιά ηλικίας 3-13 ετών, που επισκέφθηκαν το παιδοδοντιατρικό τμήμα του Ιδρύματος Κοινωνικής Ασφάλισης (ΙΚΑ κέντρου και Νεάπολης Θεσσαλονίκης) και την μεταπτυχιακή κλινική της Παιδοδοντιατρικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κατά τη διάρκεια της περιόδου συμμετείχαν στην μελέτη. Μόνο συνεργάσιμα παιδιά τα οποία δεν είχαν κάνει χρήση αντιβιοτικών τους τελευταίους 3 μήνες συμμετείχαν στη μελέτη. Τα παιδιά εξετάστηκαν κλινικά για την παρουσία τερηδονικών αλλοιώσεων σε οδοντιατρική έδρα με τεχνητό φως και κάτοπτρο. Στις περιπτώσεις στις οποίες οι όμορες επιφάνειες δεν ήταν ορατές ώστε να 22

31 τεθεί η διάγνωση ύπαρξης ή μη τερηδονικής αλλοίωσης γινόταν λήψη ακτινογραφιών τύπου bite-wings χρησιμοποιώντας ψηφιακή ακτινογραφία. Η τερηδονική εμπειρία των παιδιών εκφράστηκε με τον δείκτη τερηδόνας dmft/dmft. Τα παιδιά χωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες με βάση την κλινική και ακτινογραφική εκτίμηση της παρουσίας τερηδονικών αλλοιώσεων σε: παιδιά ελεύθερα τερηδονικών αλλοιώσεων (caries-free group, dmft/dmft=0) και παιδιά με τερηδονικές αλλοιώσεις (caries-active group, ds/ds 1). Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Οδοντιατρικού Τμήματος του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη (κηδεμόνες των παιδιών) υπέγραψαν έντυπο συγκατάθεσης για τη συμμετοχή στη μελέτη. Διαδικασία συλλογής σάλιου και μικροβιακής πλάκας Η οδοντική πλάκα συλλέχθηκε από την παρειακή και μασητική επιφάνεια όλων των δοντιών χρησιμοποιώντας πλαστικά βουρτσάκια τύπου microbrush (MICROBRUSH INTERNATIONAL) και μεταφέρθηκε μέσα σε δοχεία που περιείχαν 1ml αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού με 0.05 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS), ph 7.0. Έτσι, δύο δείγματα μικροβιακής πλάκας, ένα από όλες τις παρειακές επιφάνειες για την ανίχνευση των S. mutans, S. sobrinus και της C. albicans και ένα από όλες τις μασητικές για την ανίχνευση μόνο των S. mutans, S. sobrinus, συλλέχθηκαν από κάθε παιδί. Επιπλέον, συλλέχθηκαν δείγματα σάλιου διέγερσης για την ανίχνευση των S. mutans, S. sobrinus και της C. albicans. Η διέγερση της σιαλικής έκκρισης πραγματοποιήθηκε μετά από μάσηση με τσίχλα ξυλιτόλης για 5 λεπτά. Όλα τα δείγματα που προορίζονταν για μικροβιολογική ανάλυση 23

32 μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο και ξεκίνησε η καλλιέργεια τους μέσα σε 4 ώρες. Μικροβιολογική ανάλυση Τα δείγματα σάλιου και οδοντικής πλάκας αναμείχθηκαν μηχανικά για 30 και αραιώθηκαν σταδιακά με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα. Για τη δημιουργία κατάλληλων αραιώσεων, 0.05 ml του ρυθμιστικού διαλύματος προστέθηκαν στα μέσα καλλιέργειας MS-MUTV, MS-SOB, και CHROM-agar για την εκλεκτική ανάπτυξη των S. mutans, S. sobrinus και C. albicans αντίστοιχα (Takada και συν., 2005, Hirasawa και συν., 2002, Odds και συν.,1994), καθώς και σε Brucella Agar (Difco TM ) για τον υπολογισμό του συνολικού αριθμού των δυνητικά αναερόβιων μικροβίων. Όλα τα τρυβλία επωάστηκαν στους 37 ο C για 2-3 ημέρες σε συνθήκες αέρα που περιείχε 5%CO 2. Βάση της μορφολογίας των αποικιών υπολογίστηκαν οι αριθμοί των S. mutans, S. sobrinus και C. albicans που αναπτύχθηκαν στα αντίστοιχα μέσα καλλιέργειας. Αντιπροσωπευτικές αποικίες των S. mutans, S. sobrinus απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν με τεστ όπως χρώση κατά Gram, τεστ καταλάσης, παραγωγή οξέος από αμυγδαλίνη, Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη, ινουλίνη, μαννιτόλη, ραφινόζη, σορβιτόλη και υδρόλυση με αργινίνη (Beighton και συν., 1991). Επιπλέον πραγματοποιήθηκε γενετική ταυτοποίηση των απομονωμένων στελεχών με την τεχνική PCR και τη χρήση ειδικών ζευγαριών οροτύπων ως εκκινητές (Εικόνα 6 και 7) όπως έχουν περιγραφεί και από προηγούμενες μελέτες (Oho και συν., 2000, Shibata και συν., 2003). 24

33 Εικόνα 6. Εικόνα χρωματισμένου gel με βρωμιούχο αιθύδιο των γενετικών προϊόντων που διαχωρίζονται με την ηλεκτροφόρηση (ενισχυμένα με τη μέθοδο PCR) τα οποία χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση των mutans streptococci. Τα γονίδια στόχοι των εκκινητών για τον S. mutans και S. sobrinus ήταν το gtfb (μέγεθος: 517 bp) και το gtfi (μέγεθος: 712 bp), αντίστοιχα. 25

34 Εικόνα 7. Εικόνα χρωματισμένου gel με βρωμιούχο αιθύδιο των γενετικών προϊόντων που διαχωρίζονται με την ηλεκτροφόρηση (ενισχυμένα με τη μέθοδο PCR) τα οποία χρησιμοποιούνται για ανίχνευση των οροτύπων των S. mutans. Το γονίδιο στόχος του εκκινητή ήταν το ειδικό για τους ορότυπους rgp (rhamnose-glucose polysaccharide) γονίδιο. Τα μεγέθη των προϊόντων για τους οροτύπους c, e, και f είναι 727, 517, και 316 bp αντίστοιχα. Τα σιαλικά επίπεδα των mutans streptococci υπολογίστηκαν επίσης χρησιμοποιώντας τη διαγνωστική δοκιμασία για χρήση στο ιατρείο Dentocult SM strip (Orion Diagnostica, Espoo, Finland ). Σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών, μετά τη διέγερση έκκρισης του σάλιου με τη μάσηση τσίχλας η ταινία πιέζεται στην επιφάνεια της γλώσσας του ασθενή. Στη συνέχεια, η ταινία τοποθετείται στο φιαλίδιο με το κατάλληλο μέσο καλλιέργειας και τα φιαλίδια επωάζονται στους o C για 48 ώρες με τα καπάκια ελαφρώς ανοικτά. Τέλος, καταγράφουμε τα αποτελέσματα σε μια κλίμακα

35 Στατιστική ανάλυση Τα αποτελέσματα εμφανίζονται με τη μορφή απόλυτων ή σχετικών συχνοτήτων (%), μέσες τιμές, διάμεσοι ± τυπική απόκλιση (SD) και συσχετίσεις (Spearman s rho). Οι συγκρίσεις ανάμεσα στα ποσοστά (%) έγιναν με το χ 2 τεστ. Για τη σύγκριση της κατανομής σχετικά με την κεντρική τους τάση (μέση τιμή και διάμεσος) χρησιμοποιήθηκε το τεστ Mann Whitney. Σε όλα τα μη παραμετρικά στατιστικά τεστ τα παρατηρούμενα επίπεδα σημαντικότητας (P value) υπολογίστηκαν είτε με τη μέθοδο υπολογισμού Monte-Carlo (χρησιμοποιώντας κύκλους επαναδειγματοληψίας) ή με την μέθοδο Exact test. Αυτές οι μέθοδοι επιτρέπουν τη διεξαγωγή ασφαλών επαγωγικών συμπερασμάτων ακόμα και σε περιπτώσεις όπου οι απαιτούμενες μεθοδολογικές προϋποθέσεις των αντίστοιχων τεστ (πχ μεγάλα δείγματα, ανεξάρτητες μετρήσεις, συμμετρικές κατανομές, απουσία έντονων ακραίων τιμών) δεν συναντώνται (Mehta & Patel, 1996). Σε όλα τα τεστ υπόθεσης που χρησιμοποιήθηκαν το επίπεδο σημαντικότητας είχε προκαθοριστεί στο P=0.05. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS ν.15.0 (SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA) εμπλουτισμένο με την ενότητα Exact test (για Monte-Carlo και Exact method). Αποτελέσματα Συνολικά εξετάστηκαν 97 παιδιά, 56 αγόρια και 41 κορίτσια, χωρισμένα σε δύο ομάδες, με τερηδονικές αλλοιώσεις (n=51) και ελεύθερα τερηδονικών αλλοιώσεων (n=46). Τα χαρακτηριστικά των δύο ομάδων περιγράφονται στον πίνακα Ι. 27

36 Δείγματα μικροβιακής πλάκας συλλέχθηκαν από όλους τους συμμετέχοντες, παρόλα αυτά η συλλογή του σάλιου ήταν δυνατή μόνο για 63 παιδιά (34 αγόρια και 29 κορίτσια). Συγκεκριμένα, σε 16 παιδιά από την ομάδα χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις (μέση ηλικία ± μήνες) και σε 18 από την ομάδα με τερηδονικές αλλοιώσεις (μέση ηλικία ± 28.5 μήνες) δεν ήταν δυνατό να πραγματοποιηθεί συλλογή σάλιου με την προαναφερθείσα τεχνική. Τα αποτελέσματα των βιοχημικών τεστ και της γενετικής ταυτοποίησης παρουσιάζονται στον πίνακα ΙΙ. Μόνο αυτές οι αποικίες που παρουσίαζαν βιοχημικά και γενετικά προφίλ τα οποία ταίριαζαν στον S. mutans και S.sobrinus συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση που ακολούθησε. Οι πιο συχνοί ορότυποι που παρατηρήθηκαν στην παρούσα μελέτη για τον S. mutans ήταν για τον ορότυπο c (87%), e (12%) και f (7%). Σε λίγες περιπτώσεις περισσότεροι από ένας ορότυπος απομονώθηκε. Τα ποσοστά απομόνωσης των C. albicans, S. mutans και S. sobrinus, συνολικά αλλά και σε σχέση με την προέλευση τους από τα δείγματα πλάκας ή σάλιου, παρουσιάζονται στον πίνακα ΙΙΙ. Συνολικά, ο S. mutans ανιχνεύθηκε στο 66% των παιδιών, ο S. sobrinus στο 11% και η C. albicans στο 18%. Στην ομάδα χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις 19 από τα 30 παιδιά ήταν ελεύθερα και από τα τρία μικρόβια τόσο στα δείγματα πλάκας όσο και σάλιου ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για την ομάδα με τερηδονικές αλλοιώσεις ήταν 3 από τα 33 παιδιά. Το ποσοστό των παιδιών που είχαν τα συγκεκριμένα μικρόβια ήταν σημαντικά χαμηλότερο στην ομάδα παιδιών χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις συγκριτικά με την ομάδα με τερηδονικές αλλοιώσεις (σε όλα τα Chi-Square tests P<0.05). Η C. albicans δεν ανιχνεύθηκε ποτέ μόνη παρά μόνο σε ένα δείγμα παρειακής πλάκας ενώ ο S. sobrinus δεν βρέθηκε καθόλου στο σάλιο ή την πλάκα παιδιών της ομάδας χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις. 28

37 Οι μέσες τιμές των συγκεκριμένων μικροβίων στο σάλιο και την πλάκα παρουσιάζονται στον πίνακα ΙV. Οι συσχετίσεις που παρατηρήθηκαν ανάμεσα στην τερηδονική δραστηριότητα και τον μικροβιακό πληθυσμό στα δείγματα παρουσιάζονται στον πίνακα V. Σημαντικά χαμηλότερες μέσες τιμές και των τριών μικροβίων παρατηρήθηκαν στο σάλιο των παιδιών χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις συγκριτικά με την ομάδα με τερηδονικές αλλοιώσεις. 29

38 Πίνακας Ι. Χαρακτηριστικά των υπό μελέτη ομάδων Χαρακτηριστικά Ομάδα χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις Ομάδα με τερηδονικές αλλοιώσεις Συνολικός αριθμός παιδιών Αγόρια Κορίτσια Εθνικότητα Ελληνική Άλλη 6 14 Ηλικία σε μήνες Διάμεσος ± Τυπική απόκλιση 95.3 ± ± 25.7 Μέση τιμή 90 (40-157) 108 (45-162) (ελαχ-μεγ) Τερηδονικό προφίλ dmft/dmft dt/dt mt/mt 0 0 ft/ft

39 Πίνακας ΙΙ. Βιοχημικό και γενετικό προφίλ των βακτηριακών αποικιών που ταυτοποιήθηκαν αρχικά ως S. mutans και S. sobrinus και απομονώθηκαν από τα εκλεκτικά μέσα καλλιέργειας MS-MUTV και MS-SOB, αντίστοιχα. Αριθμός αλυσίδων (% του συνόλου) Χαρακτηριστικά S. mutans S. sobrinus Gram-θετικοί κόκκοι 157 (100) 23 (100) Αρνητικοί στην αντίδραση καταλάσης 0(0) 0(0) Παραγωγή οξέος από : Αμυγδαλίνη Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη Ινουλίνη Μαννιτόλη Ραφινόζη Σορβιτόλη 120 (76) 3 (13) 150 (96) 6 (26) 110 (70) 1 (4) 154 (98) 19 (83) 149 (95) 1 (4) 150 (96) 0 Υδρόλυση αργινίνης 2 (1) 0 gtfb amplification product (S. mutans) 144 (92) 1 (4) Ορότυπος c 125 (87) - Ορότυπος e 17 (12) - Ορότυπος f 10 (7) - gtfi amplification product (S. sobrinus) 2 (1) 19 (83) 31

40 Πίνακας III. Ποσοστά απομόνωσης των S. mutans, S. sobrinus, C. albicans και οι συνδυασμοί τους στο σάλιο και στην πλάκα ( μασητικά ή παρειακά ) από τα παιδιά με ή χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις. Η συχνότητα εμφάνισης των μικροβίων σε κάθε μία από τις εξεταζόμενες ομάδες στα παιδιά δίνεται με απόλυτους αριθμούς και με ποσοστά (μέσα στη παρένθεση). ND: not determined-δεν διερευνήθηκε η παρουσία. Μικρόβια Χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις Με τερηδονικές αλλοιώσεις Σάλιο Μικροβιακή πλάκα Σάλιο Μικροβιακή πλάκα N=30 N=46 N=33 N=51 Μασητική Παρειακή Μασητική Παρειακή S. mutans 8(26.7) 18(39.1) 19(41.3) 29(87.9) 44(86.3) 44(86.3) S. sobrinus 0(0) 0(0) 0(0) 7(21.2) 8(15.7) 9(17.6) C. albicans 2(6.7) ND 1(2.2) 11(33.3) ND 10(19.6) S. mutans + S. sobrinus 0(0) 0(0) 0(0) 7(21.2) 8(15.7) 7(13.7) S. mutans + C. albicans 2(6.7) ND 0(0) 11(33.3) ND 10(19.6) S. sobrinus + C. albicans 0(0) ND 0(0) 2(6.1) ND 1(2.0) S. mutans + S. sobrinus + C. albicans 0(0) ND 0(0) 2(6.1) ND 1(2.0) 32

41 Πίνακας IV. Αριθμοί των S. mutans, S. sobrinus, C. albicans στα δείγματα σάλιου (εκφρασμένα σε σχηματιζόμενες μονάδες αποικιών / ml σάλιου) και στα δείγματα από την μασητική και παρειακή πλάκα (σε ποσοστό του συνόλου των δυνητικά αναερόβιων μικροβίων) παιδιών με και χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις. Δίνεται η μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) και η διάμεσος [min-max]. DL: detection limitόριο ανίχνευσης (50 CFU/ml). ND: not determined-δεν διερευνήθηκε η παρουσία. Μικρόβια Χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις Με τερηδονικές αλλοιώσεις Σάλιο Μικροβιακή πλάκα (%) Σάλιο Μικροβιακή πλάκα(%) (CFU/ml) Μασητική Παρειακή (CFU/ml) Μασητική Παρειακή S. mutans Μέση τιμή ± τυπική απόκλιση 2.8 X 10 4 ±1.3 X ± 17 1 ± X 10 5 ± 5.4 X ± 42 3 ± 8 Διάμεσος <DL X [ελαχ-μεγ] [<DL-7 X 10 5 ] [<DL -100] [<DL -10] [<DL- [ ] [<DL-56] 2.5 X 10 6 ] S. sobrinus Μέση τιμή ± τυπική απόκλιση <DL <DL <DL 1.2 X 10 4 ± 4.4 X ± 8 1 ± 4 Διάμεσος <DL <DL <DL <DL 0.01 <DL [ελαχ-μεγ] <DL <DL <DL [<DL- [0-33] [<DL-27] 1.9 X 10 5 ] C. albicans Μέση τιμή ± τυπική απόκλιση 6.2 X 10 1 ± 6.4 X 10 1 ND 0.02 ± X 10 2 ± 3.3 X 10 2 ND 0.03 ± 0.1 Διάμεσος <DL <DL[<DL- <DL [ελαχ-μεγ] [<DL-4 X 10 2 ] [<DL-0.3] 1.7 X 10 3 ] [<DL-0.5] 33

42 Μικρόβια Χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις Με τερηδονικές αλλοιώσεις C. albicans Σάλιο Μικροβιακή πλάκα (%) Σάλιο Μικροβιακή πλάκα(%) (CFU/ml) Μασητική Παρειακή (CFU/ml) Μασητική Παρειακή Σύνολο δυνητικά αναερόβιων μικροβίων Μέση τιμή ± τυπική απόκλιση Διάμεσος [ελαχ-μεγ] ND 7 X 10 5 ± 2.3 X 10 6 ND 2.1 X 10 5 [5 X X 10 7 ] 2.9 X 10 6 ±6.5 X X 10 5 [2 X X 10 7 ] ND 1.6 X 10 6 ± 2.1 X X 10 6 ±8.9 X 10 6 ND 1.2 X 10 6 [1.5 X X 10 7 ] 1.5 X 10 6 [6 X X 10 7 ] (Συνέχεια Πίνακα IV) 34

43 Πίνακας V. Συσχετίσεις ανάμεσα σε τερηδονική δραστηριότητα και πληθυσμό μικροβίων σε διάφορα δείγματα.p: επίπεδο σημαντικότητας. Μικροβιακός πληθυσμός Δείγμα P Παρειακή μικροβιακή πλάκα S. mutans Μασητική μικροβιακή πλάκα <0.001 Σάλιο <0.001 Παρειακή μικροβιακή πλάκα S. sobrinus Μασητική μικροβιακή πλάκα Σάλιο C. albicans Δυνητικά αναερόβια μικρόβια Παρειακή μικροβιακή πλάκα Σάλιο Παρειακή μικροβιακή πλάκα Μασητική μικροβιακή πλάκα <0.001 Eπιπλέον, η τερηδονική δραστηριότητα σχετίστηκε σημαντικά με το σύνολο των δυνητικά αναερόβιων μικροβίων στην πλάκα (παρειακά ρ = 0.213, P = 0.037, μασητικά ρ = 0.459, P< 0.001) και τα αποτελέσματα του Dentocult. Σημαντικές συσχετίσεις βρέθηκαν επίσης ανάμεσα στα μέσα επίπεδα των S. mutans και C. albicans στο σάλιο (ρ = 0.496, P 0.001) και την παρειακή πλάκα (ρ = 0.217,P =0.03) καθώς και ανάμεσα στον S. mutans και S. sobrinus στην παρειακή πλάκα (ρ = 0.244, P =0.015). 35

44 Η παρουσία των μικροβίων δεν διέφερε σημαντικά είτε σε σχέση με το φύλο του παιδιού είτε με την ηλικία (προσχολική ηλικία 3-6 ετών σχολική ηλικία 6-13 ετών ) σε όλα τα χ 2 τεστ (P> 0.10)παρόλο που παρατηρήθηκε μια τάση για μικρότερη εμφάνιση των S. mutans και C. albicans στα δείγματα σάλιου στα παιδιά προσχολικής ηλικίας (διάγραμμα IΑ και IΒ). Διάγραμμα I. Συχνότητες απομόνωσης (σε ποσοστά των παιδιών που είναι θετικά στο μικρόβιο σε κάθε ομάδα) για S. mutans, S. sobrinus, C. albicans στο σάλιο και την πλάκα (μασητικά και παρειακά) σε σχέση με το φύλο (Α) και την ηλικία (Β) ND: not determined - δεν διερευνήθηκε η παρουσία. Σάλιο Παρειακή Μασητική Αγόρια Σάλιο Παρειακή Μασητική Κορίτσια Σάλιο Παρειακή Μασητική 3-5 ετών Σάλιο Παρειακή Μασητική 6-13 ετών 36

45 Τα αποτελέσματα από το chair-side test Dentocult Sm σε σχέση με την τερηδονική δραστηριότητα και βαρύτητα των παιδιών φαίνονται στο διάγραμμα II. Παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική διαφορά στα σκορ ανάμεσα στην ομάδα των παιδιών χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις και στην ομάδα με τερηδονικές αλλοιώσεις. Τα αποτελέσματα του Dentocult Sm strip συσχετίσθηκαν σημαντικά με την παρουσία ή απουσία τερηδονικών αλλοιώσεων (ρ = 0.374, Ρ = 0.003). Παρόλα αυτά δεν βρέθηκε συσχέτιση ανάμεσα στη βαρύτητα της τερηδονικής νόσου (αριθμός τερηδονισμένων δοντιών) και τα αποτελέσματα του Dentocult SM σε αυτήν την ομάδα (διάγραμμαii). Διάγραμμα II. Συσχέτιση ανάμεσα στον αριθμό των τερηδονισμένων δοντιών και τα αποτελέσματα Dentocult SM στα παιδιά με τερηδονικές αλλοιώσεις. Η κατανομή των δειγμάτων με βάση τα αποτελέσματα τόσο για τα παιδιά με και χωρίς τερηδονικές αλλοιώσεις φαίνεται στο ενσωματωμένο διάγραμμα 37