Αλγόριθμοι για την ταυτοποίηση των αερόβιων Gram-θετικών κόκκων

Transcript

1 Αλγόριθμοι για την ταυτοποίηση των αερόβιων Gram-θετικών κόκκων Μαρία Ορφανίδου Βιοπαθολόγος Επιμελήτρια Β Μικροβιολογικό εργαστήριο Γ.Ν.Α. «Γ. Γεννηματάς» ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ METEKΠAIΔΕΥΤΙΚΩΝ ΜΑΘΗΜΑΤΩΝ ΕΛΛΗΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΕΤΑΙΡΕΙΑΣ

2 Ταυτοποίηση των βακτηρίων Ο προσδιορισμός ενός ελάχιστου αριθμού ιδιοτήτων, ώστε να τοποθετήσουμε μια άγνωστη καλλιέργεια στην κατάλληλη θέση του συστήματος ταξινόμησης και να την αναγνωρίσουμε Kayser FH, Ιατρική Μικροβιολογία, 1995

3 Ταυτοποίηση των βακτηρίων 3 ομάδες ιδιοτήτων: Μορφολογικά χαρακτηριστικά Gram χρώση [Gram (-), Gram (+)] Μορφή (κόκκος, ραβδίο, σπείρα) Μέγεθος Διάταξη Έλυτρο (ναι, όχι) Σπόροι Kayser FH, Ιατρική Μικροβιολογία, 1995

4 Ταυτοποίηση των βακτηρίων 3 ομάδες ιδιοτήτων: Μορφολογικά χαρακτηριστικά Gram χρώση Φυσιολογικά [Gram (-), Gram χαρακτηριστικά (+)] Μορφή (κόκκος, Αφορούν ραβδίο, παραγωγή σπείρα) ενζύμων Μέγεθος Διαπιστώνονται με διαφοροποιητικά υλικά (μεταβολή της τιμής του ph αλλαγή Διάταξη χρώματος) Έλυτρο (ναι, όχι) Έτοιμα ταυτοποιητικά συστήματα εμπορίου Σπόροι Kayser FH, Ιατρική Μικροβιολογία, 1995

5 Ταυτοποίηση των βακτηρίων 3 ομάδες ιδιοτήτων: Μορφολογικά χαρακτηριστικά Gram χρώση Φυσιολογικά [Gram (-), Gram χαρακτηριστικά (+)] Μορφή (κόκκος, Αφορούν ραβδίο, Χημικά παραγωγή σπείρα) χαρακτηριστικά ενζύμων Μέγεθος Διαπιστώνονται Δομή τουμεdna διαφοροποιητικά υλικά (μεταβολή της τιμής του ph αλλαγή Διάταξη χρώματος) Δομή της μουρεΐνης του κυτταρικού Έλυτρο (ναι, όχι) τοιχώματος Έτοιμα ταυτοποιητικά συστήματα εμπορίου Σπόροι Δομή των αντιγόνων ανιχνεύονται με αντισώματα (π.χ. πολυσακχαρίτες του κυτταρικού τοιχώματος ή της κάψας) Kayser FH, Ιατρική Μικροβιολογία, 1995

6 Αλγόριθμοι για την ταυτοποίηση των αερόβιων Gram-θετικών κόκκων

7 ΒΗΜΑ 1: Μορφολογία αποικιών

8 Μορφολογία αποικιών

9 Μορφολογία αποικιών Μικρόβια Αιματούχο άγαρ MacConkey Νο2 άγαρ Staphylococcus aureus Μεγάλες, χρυσές, β- αιμολυτικές Μεγάλες, χρυσές CNS Μεγάλες, άσπρες Μεγάλες, ροζ Streptococci viridans Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Μικρές, α-αιμολυτικές (πράσινη αιμόλυση) Μικρές, β-αιμολυτικές (διαυγής κυκλική ζώνη αιμόλυσης) Μικρές, με κεντρική κοίλανση, α-αιμολυτικές Δεν αναπτύσσονται Δεν αναπτύσσονται Δεν αναπτύσσονται Enterococci Μικρές, μερικές β- αιμολυτικές Μικρές, μπορντώ Αρσένη Α, Καλλιέργειες μικροβίων, 1994

10 S. pyogenes S. pneumoniae S. pneumoniae Streptococcus viridans

11 S. aureus S. epidermidis Micrococcus Enterococcus

12 S. aureus S. epidermidis Micrococcus Enterococcus

13 ΒΗΜΑ 2: Gram χρώση

14 Gram χρώση

15 S. pneumoniae Staphylococcus spp Streptococcus spp Micrococcus spp Enterococcus spp

16 ΒΗΜΑ 3: ΚΑΤΑΛΑΣΗ

17 ΚΑΤΑΛΑΣΗ - +

18 ΚΑΤΑΛΑΣΗ + - Staphylococcus Micrococcus [Rothia (Stomatococcus)] Alloicoccus Streptococcus Enterococcus Aerococcus Gemella Pediococcus Leuconostoc Lactococcus

19 Καταλάση (+) Ανάπτυξη σε NaCl 6,5% ναι όχι Bacitracin 0,04 U Rothia E A A Furazolidone 100μg E Micrococcus Koneman, 2006 Staphylococcus Micrococcus Staphylococcus

20 ΚΑΤΑΛΑΣΗ + Υποχρεωτικά αερόβια + - Τροποποιημένη οξειδάση NaCl 6.5% + - Micrococcus Alloiococcus + - Staphylococcus Rothia mucilaginosa Τροποποιημένη οξειδάση: Διαθέσιμη στο εμπόριο (Remel, Microdase Test Disk) Δίσκοι από διηθητικό χαρτί, εμποτισμένοι με αντιδραστήριο οξειδάσης (tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride) σε DMSO (dimethyl sulfoxide) Koneman, 2006 Murray, 2002

21 Mannitol άγαρ Εκλεκτικό υλικό με μαννιτόλη NaCl6.5% -ερυθρό της φαινόλης Ζύμωση της μαννιτόλης Όχι ζύμωση της μαννιτόλης S. aureus S. epidermidis

22 Κοαγκουλάση (Coagulase) Είναι μία πρωτεΐνη που βοηθά στη μετατροπή του ινωδογόνου σε ινώδες Χρησιμοποιείται για τη διαφοροδιάγνωση του S. aureus από τους CNS Δύο μορφές: (α) Συνδεδεμένη (clumbing factor) με το κυτταρικό τοίχωμα (β) Ελεύθερη Μέθοδοι ελέγχου της κοαγκουλάσης (α) Δοκιμασία σε σωληνάριο ελεύθερη κοαγκουλάση (β) Δοκιμασία επί πλακός συνδεδεμένη κοαγκουλάση (γ) Συγκολλητινοαντίδραση σωματιδίων latex πρωτεΐνη Α S. aureus Koneman, 2006

23 Κοαγκουλάση (Coagulase) Είναι μία πρωτεΐνη που βοηθά στη μετατροπή του ινωδογόνου σε ινώδες Χρησιμοποιείται για τη διαφοροδιάγνωση του S. aureus από τους CNS Δύο μορφές: Πλάσμα να προέρχεται από σωληνάριο με EDTA (α) Συνδεδεμένη (clumbing factor) Κιτρικούχο με το κυτταρικό αντιπηκτικό τοίχωμα δεν πρέπει να χρησιμοποιείται (β) Ελεύθερη Οργανισμοί που χρησιμοποιούν τα κιτρικά, και έχουν λανθασμένα θεωρηθεί ως σταφυλόκοκκοι, μπορεί να δώσουν + αντίδραση (εντερόκοκκοι) Μέθοδοι ελέγχου της κοαγκουλάσης (α) Δοκιμασία σε σωληνάριο ελεύθερη κοαγκουλάση (β) Δοκιμασία επί πλακός συνδεδεμένη κοαγκουλάση (γ) Συγκολλητινοαντίδραση σωματιδίων latex πρωτεΐνη Α S. aureus Koneman, 2006

24 Κοαγκουλάση Είδος Δοκιμασία σε σωληνάριο Δοκιμασία επί πλακός S. aureus + + S. schleiferi ssp coagulans S. schleiferi ssp schleiferi S. lugdunensis - (+) S. intermedius* + d S. hyicus* d + S. delphini* + - *: σπάνια σε κλινικά δείγματα, d: 11-89% τωνστελεχώνθετικά, (+): αργή θετική αντίδραση National Standard Methods, 2010

25 Κοαγκουλάση Δοκιμασία σε σωληνάριο Δοκιμασία επί πλακός Συγκολλητινοαντίδραση σωματιδίων latex

26 Δοκιμασία δεοξυριβονουκλεάσης (DNASE) Ένζυμο που παράγεται από τον S. aureus και υδρολύει το DNA (-) (+) S. epidermidis S. aureus Koneman, 2006

27 Είδος Novobiocin Polymyxin S. aureus E A S. epidermidis E A S. saprophyticus A E S. haemolyticus E E S. warneri E E S. hominis ssp hominis S. hominis ssp novobiosepticus E A E NA S. lugdunensis E E/A S. schleiferi E E S. cohnii A E S. intermedius E E S. sciuri A E Koneman, 2006

28 - Xylose ODC + S. lugdunensis CoNS + - S. xylosus Sucrose + + Trehalose Trehalose + - S. cohnii S. capitis + Phosphatase - Maltose Lactose + Fructose S. capitis - S. haemolyticus Maltose - Urease S. simulans + + S. epidermidis - Nitrate - + S. capitis Urease + Urease + - S. hominis S. saprophyticus Koneman, 2006 Novobiocin S. simulans S. capitis Nitrate Mannose S. hominis S. haemolyticus - S. cohnii

29 Συμπερασματικά για την ταυτοποίηση των Staphylococci Κλινικό δείγμα Αρχική απομόνωση σε θρεπτικά υλικά Ματ, κρεμώδεις, άσπρες, κίτρινες ή πορτοκαλί αποικίες σε αιματούχο άγαρ Gram χρώση: gram (+) κόκκοι Αρνητική: άλλα βακτήρια Καταλάση Θετική Θετική: Micrococcus spp Τροποποιημένη οξειδάση Αρνητική: Staphylococcus spp Clumping factor, DNAse Κογκουλάση σε σωληνάριο: Αρνητική πιθανόν CoNS National Standard Methods, 2010 Aρνητική Θετική Κογκουλάση σε σωληνάριο: θετική πιθανόν S. aureus

30 ΚΑΤΑΛΑΣΗ + - Staphylococcus Micrococcus [Rothia (Stomatococcus)] Alloicoccus Streptococcus Enterococcus Aerococcus Gemella Pediococcus Leuconostoc Lactococcus

31 Αιμόλυση σε αιματούχο άγαρ β-αιμόλυση πλήρης S. pyogenes α-αιμόλυση μερική Streptococcus viridans γ-αιμόλυση απουσία αιμόλυσης Enterococcus spp Murray, 2002

32 Αιμόλυση σε αιματούχο άγαρ β-αιμόλυση πλήρης S. pyogenes α-αιμόλυση μερική Streptococcus viridans γ-αιμόλυση απουσία αιμόλυσης Enterococcus spp Murray, 2002

33 Καταλάση (-) Μορφολογία στη Gram χρώση Σε αλυσίδες Streptococcus Enterococcus Abiotrophia Granulicatella Leuconostoc Weisella Vagococcus Globicatella Dolosicoccus Eremococcus Lactococcus Σε τετράδες/ομάδες Aerococcus Helcococcus Pediococcus Tetragenococcus [Gemella] Dolosigranulum Διπλόκοκκοι/ λογχοειδείς S. pneumoniae Koneman, 2006

34 Μορφολογία αποικιών Μικρόβια Αιματούχο άγαρ MacConkey Νο2 άγαρ Staphylococcus aureus Μεγάλες, χρυσές, β- αιμολυτικές Μεγάλες, χρυσές CNS Μεγάλες, άσπρες Μεγάλες, ροζ Streptococci viridans Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Μικρές, α-αιμολυτικές (πράσινη αιμόλυση) Μικρές, β-αιμολυτικές (διαυγής κυκλική ζώνη αιμόλυσης) Μικρές, με κεντρική κοίλανση, α-αιμολυτικές Δεν αναπτύσσονται Δεν αναπτύσσονται Δεν αναπτύσσονται Enterococci Μικρές, μερικές β- αιμολυτικές Μικρές, μπορντώ Αρσένη Α, Καλλιέργειες μικροβίων, 1994

35 Gram: σε τετράδες/ομάδες Είδος Αιμόλυση PYR Vanco NaCl 6.5% 10 C 45 C Aerococcus α V E Pediococcus α - A V - + Gemella α, γ + E Gram: σε αλυσίδες Είδος Αιμόλυση PYR Vanco NaCl 6.5% 10 C 45 C Steptococcus α, β, γ - Ε V - V Enterococcus α, γ + Ε/Α Leuconostoc α, γ - Α V + + Koneman, 2006

36 Ταξινόμηση των Streptococcus Διαχωρισμός κατά Lancefield σε ομάδες βάσει του πολυσακχαριδικού αντιγόνου ή του λιποτειχοϊκού οξέος του κυτταρικού τοιχώματος (A, B, C, D, F, G) S. pyogenes β-αιμολυτικός ομάδα Α S. agalactiae β-αιμολυτικός ομάδα Β S. dysgalactiae α-αιμολυτικός ομάδα C Enterococci & S. bovis ομάδα D

37 Streptococcus ομάδος Α A SXT A Οι στρεπτόκοκκοι ομάδος C & G είναιευαίσθητοιστηνcotrimoxazole, ενώ οι στρεπτόκοκκοι ομάδος A& Β είναι ανθεκτικοί Οποιαδήποτε ζώνη αναστολής γύρω από το δισκίο θεωρείται θετική Ευαισθησία στη Bacitracin 0.04 U Οι β-αιμολυτικοί GΑS είναι ευαίσθητοι στη Bacitracin 0.04 U Οποιαδήποτε ζώνη αναστολής γύρω από το δισκίο θεωρείται θετική ~10% των GCS & GGS και ~5% της GBS είναι ευαίσθητοι Koneman, 2006

38 Δοκιμασία CAMP (CAMP test) Ταυτοποίηση GΒS Χρησιμοποιείται στέλεχος S. aureus που παράγει β-αιμολυσίνη Οι GΒS παράγουν μία πρωτεΐνη (CAMP factor) που αντιδρά με την αιμολυσίνη του S. aureus διεύρυνση της ζώνης αιμόλυσης δίκην τόξου Koneman, 2006

39 Υδρόλυση ιππουρικού νατρίου (+) Δοκιμασία εσκουλίνης Streptococcus ομάδος Β Δοκιμασία αμινοπεπτιδάσης της λευκίνης (LAP test) (+): όλοι οι στρεπτόκοκκοι & εντερόκοκκοι (+) Enterococcus Streptococcus ομάδος D Δοκιμασία πυρρολιδονυλ-αριλαμιδάσης (PYR test) (+): στρεπτόκοκκοι ομάδος Α & εντερόκοκκοι Koneman, 2006

40 S. pneumoniae Ευαισθησία στην Optochin (OPT) Οι πνευμονιόκοκκοι είναι ευαίσθητοι στην OPT Πρέπει να μετριέται η διάμετρος αναστολής Ε: >= 14mm < 14mm συμπληρωματικές εξετάσεις Μερικοί πρασινίζοντες στρεπτόκοκκοι & αερόκοκκοι εμφανίζουνμικρήζώνηαναστολής Διαλυτότητα χολής Το δεσοξυχολικό που χρησιμοποιείται ενεργοποιεί τα αυτολυτικά ένζυμα (+): S. pneumoniae

41 S. pneumoniae Ευαισθησία στην Optochin (OPT) Οι πνευμονιόκοκκοι είναι ευαίσθητοι στην OPT Πρέπει να μετριέται η διάμετρος αναστολής Ε: >= 14mm < 14mm συμπληρωματικές εξετάσεις Μερικοί πρασινίζοντες στρεπτόκοκκοι & αερόκοκκοι εμφανίζουνμικρήζώνηαναστολής Διαλυτότητα χολής Το δεσοξυχολικό που χρησιμοποιείται ενεργοποιεί τα αυτολυτικά ένζυμα (+): S. pneumoniae

42 S. pneumoniae Ευαισθησία στην Optochin (OPT) Οι πνευμονιόκοκκοι είναι ευαίσθητοι στην OPT Πρέπει να μετριέται η διάμετρος αναστολής Ε: >= 14mm < 14mm συμπληρωματικές εξετάσεις Μερικοί πρασινίζοντες στρεπτόκοκκοι & αερόκοκκοι εμφανίζουνμικρήζώνηαναστολής Διαλυτότητα χολής Το δεσοξυχολικό που χρησιμοποιείται ενεργοποιεί τα αυτολυτικά ένζυμα (+): S. pneumoniae

43 Είδος Φαινοτυπικά κριτήρια για την ταυτοποίηση των κλινικώς σημαντικών Streptococci Αιμόλ υση Βα SXT CAMP HIP LAP PYR ESC NaCl 6.5% GAS β Ε A A - OPT Διαλυτό τητα χολής GBS β, γ A A V A - GC-F- GS Entero cocci β V E A - α,β,γ A A - V A - GDS α, γ A E A - Virida ns Pneu moco cci α, γ V E - V + - V - A - α V E E + Koneman, 2006

44 Φαινοτυπικά κριτήρια για την ταυτοποίηση των κλινικώς σημαντικών Enterococci Είδος ESC LAP PYR Κινητικότητα Χρωστική ΗΙΡ E. faecalis E. faecium E. casseliflavus E. gallinarum Koneman, 2006

45 Αντιβιόγραμμα Ανάπτυξη σε Mueller-Hinton Χωρίς προσθήκη αίματος Με προσθήκη αίματος Enterococci Enterococci Streptococci Αντοχή σε όλες τις κεφαλοσπορίνες και την κλινδαμυκίνη Enterococci

46 Αντιβιόγραμμα - Enterococci Penicillin Ampicillin Quinopristin/Dalfopristin A E A E A E E. faecium E. faecalis E. faecium E. faecalis Άλλο είδος

47 Μανιτόλη/Σορβιτόλη +/+ PYR +/- S. sobrinus -/- Υδρόλυση εσκουλίνης - + S. mutans S. uberis/ parauberis + Ραφινόζη + Διυδρολάση αργινίνης - Ινουλίνη + - S. salivarius S. vestibularis - Διυδρολάση αργινίνης S. oralis/ mitis - -/- S. sanguis bio 1 + Αμυγδαλίνη/β-D-φουκοσιδάση - Ινουλίνη/Ραφινόζη S. gordonii +/- -/+ -/- +/+ S. sanguis S. parasanguis S. crista S. sanguis bio 2 bio 3 Koneman, 2006

48 Συμπερασματικά για την ταυτοποίηση των Streptococci Κλινικό δείγμα Αρχική απομόνωση σε θρεπτικά υλικά Gram χρώση: gram (+) κόκκοι Καταλάση + Άλλο είδος α-αιμόλυση [Gemella] OPT γ-αιμόλυση [Gemella, Leuconostoc] - β-αιμόλυση Lancefield group E A Υποψία Enterococci A, B, C, D, F, G Αρνητική [Listeria] S. pneumoniae S. viridans ESC + Enterococci National Standard Methods, PYR - GDS

49 Τελική ταυτοποίηση Gram (+) αερόβιων κόκκων Έτοιμα ταυτοποιητικά συστήματα εμπορίου με τη χρήση ενζυμικών και βιοχημικών δοκιμασιών επί ειδικών υποστρωμάτων Αυτόματα Ημιαυτόματα Χειροκίνητα