Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών στίς Βασικές Ιατρικές Επιστήμες. Κατεύθυνση : «Νευροεπιστήμες». Γιώργος Τρομπούκης ΑΜ:2078 Διπλωματική Εργασία ΘΕΜΑ: «Συγκριτική in vitro νευροφυσιολογική μελέτη της πλάγιας και μέσης διατιτραίνουσας οδού,στην οδοντωτή έλικα διαφραγματικού και κροταφικού ιππόκαμπου επίμυος.»

2 Η Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Γεώργιος Κωστόπουλος,Προεδρεύων καθηγήτης Φυσιολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Κωνσταντίνος Παπαθεοδωρόπουλος, αναπληρωτής καθηγητής Φυσιολογίας/Νευροφυσιολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Γεωργία Βουκελάτου, Επίκουρος καθηγήτρια Φυσιολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Η παρούσα πειραματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυσιολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Παν/μιου Πατρών υπό την επίβλεψη του κ. Κων/νου Παπαθεοδωρόπουλου, αναπληρωτή καθηγητή Φυσιολογίας/Νευροφυσιολογίας. 2

3 Σε όσους θεωρούν ότι ο Άνθρωπος είναι σκοπός και όχι μέσο. 3

4 EΙΣΑΓΩΓΗ Ανατομικά στοιχεία. Εικόνα 1: Ιπποκάμπειος σχηματισμός: Γενική ανατομία (Netters Atlas of Human Neurosciense, David L. Felten, Ralph F. Josephowicz, 2003, p. 289) Α. Ανατομία Ανθρώπινού Ιππόκαμπού. Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός συνίσταται από την οδοντωτή έλικα, τον ιππόκαμπο καθ εαυτό (CA περιοχές) και τη σκάφη (Subiculum). Αυτές οι δομές είναι στενά διασυνδεόμενες με τον συναφή ενδορινικό φλοιό (Εικ. 1). Ο ιππόκαμπος είναι μία δομή που ομοιάζει με τον θαλάσσιο ιππόκαμπο στο σχήμα και βρίσκεται στο μεσαίο τμήμα του πρόσθιου κροταφικού λοβού.διογκώνεται προς πλευρικά μισά στο κροταφικό κέρας της πλάγιας κοιλίας. Ο ιππόκαμπος διαιρείται σε διάφορες ζώνες πυραμιδικών κυττάρων, τις CA περιοχές (CA 1, CA 2, CA 3, CA 4 ). Τα κοκκιώδη κύτταρα βρίσκονται στην οδοντωτή έλικα. Ο ιππόκαμπος και η οδοντωτή έλικα είναι φλοιϊκές περιοχές, τριζωνικές. Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός έχει εκτεταμένες ενδοσυνδέσεις με φλοιϊκες περιοχές και με τον επιχείλιο προσθεγκέφαλο. Σχετίζονται δε με τη δημιουργία της βραχύχρονης μνήμης, όπως η προσωρινή αποθήκευση της (μνημονικός διακομιστής) σε συνεργασία και με εκτεταμένα μέρη του νεοφλοιού. Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός έχει ένα εσωτερικό κύκλωμα (Εικ.2) διασυνδεόμενο με τον ενδορινικό φλοιό. Πυραμιδικοί νευρώνες του ενδορινικού φλοιού στέλνουν νευράξονες στα κοκκιώδη κύτταρα (δενδρίτες) της οδοντωτής έλικας. Αυτά στέλνουν νευρικές ίνες (mossy fibers) που συνάπτονται στην CA 3 περιοχή με τους δενδρίτες των εκεί πυραμιδικών κυττάρων. Οι νευρικές ίνες των πυραμιδικών κυττάρων της CA 3 με την σειρά τους Εικόνα 2: Νευρωνικές συνδέσεις στον ιπποκάμπειο σχηματισμό (Netters Atlas of Human Neurosciense, David συνάπτονται με πυραμιδικούς L. Felten, Ralph F. Josephowicz, 2003, p. 290) δενδρίτες της CA 1 (Schaffer colaterals) και της CA 2. Οι CA1 πυραμιδικού νευρώνες φθάνουν και συνάπτονται με 4

5 τα νευρικά κύτταρα της σκάφης.η σκάφη στέλνει με την σειρά της νευράξονες στον ενδορινικό φλοιό. Βλέπουμε ολοφάνερα ένα κλειστό κυκλικό κύκλωμα. Υπερκείμενες στο κύκλωμα αυτό βρίσκονται και πλήθος συνδέσεων με σχετιζόμενες περιοχές του νεοφλοιού και άλλες δομές του επιχείλιου προσθεγκεφάλου. Επίσης, νευρώνες της CA1 και CA3, καθώς και νευρώνες προερχόμενοι από το Subiculum στέλνουν άξονες ως απαγωγές προεκβολές. Τέλος, η σκάφη προβάλλει στην αμυγδαλή και σε τμήματα του κροταφικού λοβού. Εικόνα 3: Σημαίνουσες προσαγωγές και απαγωγές συνδέσεις του ιπποκάμπου σχηματισμού (Netters Atlas of Human Neurosciense, David L. Felten, Ralph F. Josephowicz, 2003, p. 291) Πυραμιδικοί νευρώνες της σκάφης και της CA1 και CA3 προβάλλουν στην φυγόκεντρη ψαλίδα.η σκάφη προβάλλει στον υποθαλαμικό πυρήνα και στον θαλαμικό πυρήνα διαμέσου του οπισθίου συνδέσμου της ψαλίδας(εικ. 3). Οι CA1 και CA3 πυραμιδικοί νευρώνες στέλνουν νευράξονες στον κεφαλικό πυρήνα, στους επικλινείς πυρήνες, την προοπτικη και πρόσθια υποθαλαμική περιοχή της τοξοειδούς δεσμίδας και σε σχετιζόμενες περιοχές του μετωπιαίου λοβού(εικ. 3). Προσαγωγές χολινεργικές ίνες από τον κεφαλικό πυρήνα διασυνδέουν την ψαλίδα ώστε να υποστηρίξει την οδοντωτή έλικα και τις CA ιπποκάμπειες περιοχές. Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός δέχεται μαζικές εισόδους νευραξόνων από τον αισθητικό φλοιό, τον πολυαισθητηριακό φλοιό, τον προμετωπιαίο φλοιό, το νησιδικό φλοιό, τον αμυγδαλοειδή πυρήνα και τον οσφρητικό βολβό διαμέσου των προεκβολών του ενδορινικού φλοιού(εικ. 3). Ο ενδορινικός φλοιός είναι απολύτως ενοποιημένος με το εσωτερικό κύκλωμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού. 5

6 1. Ανατομία Ιππόκαμπου Επίμυος Γενικά Εικόνα 4: Βασικά νευρωνικά συστήματα του ιπποκάμπειου σχηματισμού στον εγκέφαλο επίμυος όπως αποδόθηκαν οι όψεις του εγκεφάλου σε τομογραφία MRI (A) ο εγκέφαλος από αριστερά επάνω (Β) ο εγκέφαλος από επάνω (C) ο εγκέφαλος από μπροστά (D) ο εγκέφαλος από αριστερά κάτω.η ταινία του ραχιαίου ιππόκαμπου είναι μωβ, η ραχιαία ψαλίδα κίτρινη και η fimbria (τοξοειδείς ίνες) κόκκινη. Η προταινιακή ψαλίδα έχει χρώμα μπεζ, η ταινία του κοιλιακού ιππόκαμπου μπλε και η μεταταινιακή ψαλίδα πράσινη. (The Hippocampus Book, Peter Andersen, Richard Morris, David Amaral, Tim Bliss & John O Keefe, 2007, Figure 3-4.) 6

7 Εικόνα 5:Απόδοση της μαγνητικής απεικόνισης του εγκαφάλου επίμυος που δείχνει τη θέση του ιππόκαμπου (κυρίως ιππόκαμπος, οδοντωτή έλικα και Subiculum - σκάφη) με κόκκινο χρώμα και του ενδορινικού φλοιού με πράσινο (The Hippocampus Book, Peter Andersen, Richard Morris, David Amaral, Tim Bliss & John O Keefe, 2007, Figure 3-4.) Ανατομία της Οδοντωτής Έλικας του ιππόκαμπου του Επίμυος Γενικά: Η οδοντωτή έλικα είναι μία φλοιϊκή περιοχή που αποτελεί αναπόσπαστο τμήμα του γενικότερου ανατομικού και λειτουργικού σχηματισμού, που ονομάζεται ιπποκάμπειος σχηματισμός. Η βασική οργανωτική δομή των βασικών κυτταρικών στοιβάδων της, σε συνδυασμό με τη στοιβαδική κατανομή των νευρικών οδών που εισέρχονται σε αυτή έχει εναθαρρύνει τη χρήση της σαν ένα μοντέλο για πολλές όψεις της μοντέρνας Νευροφυσιολογίας. Έτσι από τα μοναδικά γνωρίσματα του ιπποκάμπειου σχηματισμού είναι ότι πολλές από τις συνδέσεις του είναι μονής κατεύθυνσης Παρομοίως, ο ενδορινικός 7

8 φλοιός παρέχει το μεγαλύτερο μέρος των νευρικών του προβολών προς την οδοντωτή έλικα μέσω ινών που καλούνται διατιτραίνουσα οδός. Όμως η οδοντωτή έλικα, dentate gyrus (DG) δεν επιστρέφει νευρικές συνδέσεις προς τον ενδορινικό φλοιό, endorhinal cortex (EG) Αφού λοιπόν ο ενδορινικός φλοιός είναι η πηγή των περισσότερων φλοιϊκών πληροφοριών προς τον ιππόκαμπο προκειμένου αυτός να τροφοδοτηθεί με τις απαραίτητες πληροφορίες που χρειάζεται για τις λειτουργίες του και επιπλέον η οδοντωτή έλικα αποτελεί τον τερματικό σταθμό των νευρικών προβολών από τον ενδορινικό φλοιό προς τον ιππόκαμπο, είναι λογικό να καταλήξουμε στο συμπέρασμα πως η οδοντωτή έλικα είναι το μέρος όπου γίνονται τα πρώτα βήματα για το σχηματισμό της προσωρινής (episodic) μνήμης Επιπλέον η μοναδική νευροανατομία της οδοντωτής έλικας της αποδίδει έναν ειδικό ρόλο στην προαγωγή των πληροφοριών από τον ενδορινικό φλοιό προς την CA 3 περιοχή του ιππόκαμπου. Είναι χρήσιμο να κάνουμε μία ανασκόπηση του νευρωνικού κυκλώματος του ιππόκαμπου για να γίνει κατανοητός ο κομβικός ρόλος της οδοντωτής έλικας νευροανατομικά και νευροφυσιολογικά. 8

9 Εικόνα 6(A,B,C): Ανατομία εγκάρσιας τομής ενδορινικού φλοιού και ιπποκάμπειου σχηματισμού.( Progress in Brain Research, H.E. Scharfman, CHAPTER 1, The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies), 2007 Elsevier B.V, p.5.) A)Φαίνονται οι νευρικές προεκβολές των νευρώνων από τον ενδορινικό φλοιό και συγκεκριμένα της ΙΙ στοιβάδας του πρός την μοριακή στοιβάδα (ml) molecular layer της οδοντωτής έλικας και το stratum lacunosum-moleculare (η βοθριώδης μοριακή στοιβάδα) της CA 3 περιοχής του ιππόκαμπου. Μέρος της διατιτραίνουσας οδού από τη στοιβάδα ΙΙΙ του ενδορινικού φλοιού φτάνει και καταλήγει στην CA 1 περιοχή και τη σκάφη.τα κοκκώδη κύτταρα granule cells 9

10 της οδοντωτής έλικας έχουν νευράξονες που αποτελούν τις mossy fibers(2) που καταλήγουν τόσο στην πολυμορφική στοιβάδα(pl, polymorphic layer) της οδοντωτής έλικας, όσο και στο stratum lucidum (διαυγής στοιβάδα) της CA 3 περιοχής. Η CA 3 περιοχή με την σειρά της ενεργοποιεί τις παράπλευρες ίνες του Schaffer(3) των οποίων οι νευράξονες καταλήγουν στην CA 1 περιοχή. Τέλος, πυραμιδικοί νευράξονες κυτταρων της CA 1 περιοχής καταλήγουν στον ενδορινικό φλοιό (βαθύτερες στοιβάδες) και τη σκάφη, η οποία επίσης δίνει ίνες προς το ενδορινικό φλοιό (Β) Η οδοντωτή έλικα χωρίζεται στην (ml,molecular layer) μοριακή στοιβάδα,την (gcl, granule cell layer) στοιβάδα των κοκκωδών κύτταρων,και την (polymorphic layer, pl) πολυμορφική στοιβάδα. Η μοριακή στοιβάδα έχει τρείς υποστοιβάδες που διαχωρίζονται από τις καταγωγές των νευρικών προεκβολών πρός αυτήν. Ο ιππόκαμπος χωρίζεται στις περιοχές CA 1, CA 2 και CA 3.Ειδικά για την CA 3 μπορούμε να πούμε ότι η κατανομή των υποστοιβάδων της από το εσωτερικό της ιπποκάμπειας τομής προς το εξωτερικό,έχει ως εξής: 1) stratum lacunosum-moleculare (βοθριώδης-μοριακή στοιβάδα) 2) stratum radiatum (ακτινωτή στοιβάδα) 3) stratum lusidum (διαυγής στοιβάδα) 4) pyramidal cell layer (στοιβάδα πυραμιδικών κυττάρων) 5) stratum oriens (στοιβάδα των πολύμορφων κυττάρων), και 6) η λευκή ουσία του alveus Οι περιοχές CA 1, CA 2 έχουν τις ίδιες στοιβάδες εκτός από την stratum lusidum. Το υπόλοιπο ανατομικό κομμάτι του ιπποκάμπειου σχηματισμού είναι η σκάφη- Subiculum (Sub), presubiculum(pre), parasubiculum (Para) και το συναφές του (EC) endorhinal cortex (C) Εδώ φαίνεται η υπερπυραμιδική πλευρά της οδοντωτής έλικας (suprapyramidal) και η infrapyramidal (υποπυραμιδικό πέταλο) καθώς και η ενδιάμεση παρυφή (crest).πρέπει να πούμε ότι το σχήμα της οδοντωτής έλικας, διαφέρει στον ραχιαίο (dorsal) και τον κοιλιακό (ventral) ιππόκαμπο. Στον ραχιαίο έχει σχήμα V ενώ στον κοιλιακό σχήμα U. 10

11 Κύριοι τύποι κυττάρων της οδοντωτής έλικας 1. Τα κοκκώδη κύτταρα (granule cells) Εικόνα 7: Το καθένα από τα κοκκώδη κύτταρα (gcl ) σχηματίζει ένα παράπλευρο πλέγμα που δίνει 200 περίπου συνάψεις μέσα στην πολυμορφική στοιβάδα (pl). Οι περισσότερες από αυτές τις συνάψεις είναι με ανασταλτικούς ενδονευρώνες. ( Progress in Brain Research, H.E. Scharfman, CHAPTER 1, The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies), 2007 Elsevier B.V, p.8.) Τα σώματα των κοκκωδών κυττάρων είναι τοποθετημένα πολύ στενά μεταξύ τους και πολλές φορές δίχως τη μεσολάβηση νευρογλοίας. Το σχήμα τους (Εικ. 7) περιλαμβάνει το κωνικής μορφής δενδριτικό δένδρο των στριφογυριστών ακραίων δενδριτών, των οποίων οι κλάδοι αφού διασχίσουν τη μοριακή στοιβάδα φτάνουν στο άκρο της έως την ιπποκάμπεια σχισμή (στην υπερπυραμιδική πλευρά) ή στην κοιλιακή επιφάνεια (στην υποπυραμιδική πλευρά). 11

12 Κατά μέσο όρο για την υπερπυραμιδική περιοχή το μήκος των δενδριτικών δένδρων των κυττάρων αυτών είναι περίπου 3500 μm, ενώ στην υποπυραμιδική περίπου 2600 μm. Η περιστροφή των δενδριτών στα κοκκώδη κύτταρα της υπερπυραμιδικής περιοχής είναι της τάξης των 1,6 περιστροφών ανά μm, δηλαδή συνολικά περίπου 5600 περιστροφές ανά κύτταρο, ενώ για την υποπυραμιδική περιοχή 1,3 περιστροφές ανά μm, δηλαδή συνολικά 3640 περίπου περιστροφές ανά κύτταρο. Ο συνολικός αριθμός των κοκκωδών κυττάρων στην οδοντωτή έλικα ενός αρουραίου είναι περίπου 1, κύτταρα, φαίνεται δε πως υπάρχει ένας σταθερός αριθμός των κυττάρων αυτών κατά τη διάρκεια της ενήλικης ζωής του αρουραίου, κάτι που υποδεικνύει μια σταθερή κατάσταση επανατροφοδότησης, παρά μια τάση συνεχούς επαύξησης για τα κοκκώδη κύτταρα. Εικόνα 8: Άλλη μια χαρακτηριστική εικόνα για τα κοκκώδη κύτταρα (granule cells). Οι δενδρίτες ξεκινούν από την επάκρια επιφάνεια των κυτταρικών σωμάτων και ο άξονας εκφύεται από τη βασική επιφάνεια των σωμάτων. Οι στριφογυριστοί δενδρίτες εκτεινονται διαμέσου και πέρα από τη μοριακή στοιβάδα, φτάνοντας στην ιπποκάμπεια σχισμή, ενώ ο άξονας διακλαδίζεται μέσα στην πολυμορφική στοιβάδα δημιουργώντας εκεί συνάψεις. ( Progress in Brain Research, H.E. Scharfman, CHAPTER 1, The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies), 2007 Elsevier B.V, p.9.) 12

13 Άλλο σημαντικό είδος κυττάρων της οδοντωτής έλικας είναι τα καλαθοειδή πυραμιδικά κύτταρα (Pyramidal Basket Cells, PBC). Εικόνα 9: Τα σώματα των καλαθοειδών (pbc) κυττάρων τοποθετούνται στι σύνολο μεταξύ της (gcl) στοιβάδας των σωμάτων των κοκκωδών κυττάρων και της πολυμορφικής στοιβάδας (pl). Παράπλευρες ίνες του άξονα συνδέονται με τα σώματα των κοκκωδών κυττάρων. ( Progress in Brain Research, H.E. Scharfman, CHAPTER 1, The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies), 2007 Elsevier B.V, p.12.) 13

14 Εικόνα 10: Επίσης εικόνα καλαθοειδούς κυττάρου όπου στο (Α) υποδεικνύεται ο νευράξονας με το βέλος. Εικόνα με τη βοήθεια ενδοκυτταρικής ένεσης με νευροβιοτίνη. ( Progress in Brain Research, H.E. Scharfman, CHAPTER 1, The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies), 2007 Elsevier B.V, p.12.) Το όνομα καλαθοειδές προκύπτει από το ότι ο άξονας των κυττάρων αυτών δημιουργεί περικυτταρικό πλέγμα σαν ένα καλάθι (Εικ. 9) που περικλείει τα σώματα των κοκκωδών κυττάρων και συνάπτεται με αυτά. Τα καλαθοειδή κύτταρα της οδοντωτής έλικας, καθώς και τα καλαθοειδή κύτταρα με διαφορετική καταγωγή δημιουργούν ένα πλέγμα νευρικό, το οποίο δίνει απολήξεις που είναι : GABAεργικές, σχηματικά συμμετρικές, ανασταλτικές που τοποθετούνται πρωταρχικά στα κυτταρικά σώματα και τους εγγύτερους δενδριτικούς κορμούς των ακραίων δενδριτών των. Επομένως συνοψίζοντας, η μοριακή στοιβάδα αποτελείται από : α) δενδρίτες των κοκκωδών κυττάρων, β) δενδριτικές και κυρίως αξονικές προεκβολές των κυττάρων της πολυμορφικής στοιβάδας (mossy cells), γ) νευρώνες των καλαθοειδών κυττάρων και δ) αξονικές προεκβολές και αξονικούς τερματικούς βραχίονες του ενδορινικού φλοιού. Επίσης υπάρχουν τα ε) MOPP κύτταρα ( molecular layer - perforant path - associated cell), δηλαδή κύτταρα της μοριακής στοιβάδας που σχετίζονται με την διατιτραίνουσα οδό, που έχουνε πολυπολικά ή τριγωνικά σώματα και δίνουνε άξονες 14

15 που συνάπτονται και επηρεάζουν με τα πλέγματά τους τα 2/3 της εξωτερικής πλευράς της μοριακής στοιβάδας. Και τα στ) τα κύτταρα που μοιάζουν με πολύφωτα ή λεγόμενα και αξονο αξονικά (axono-axonic cells) και βρίσκονται σε συνάφεια εσωτερικά της στοιβάδας σωμάτων κοκκωδών κυττάρων, προς την μοριακή στοιβάδα. Στα κύτταρα αυτά οι άξονές τους κατηφορίζουν από τη μοριακή στοιβάδα προς τη στοιβάδα των κοκκωδών κυττάρων παράλληλα και τερματίζουν συναπτόμενα με τα σώματα των κοκκωδών κυττάρων στην περιοχή που αρχίζει ο νευράξονας (περίπου εκφυτικός κώνος). Τα κύτταρα αυτά είναι GABA- εργικά ανασταλτικά και υποβοηθούν τον ανασταλτικό έλεγχο των κοκκωδών κυττάρων. Eικόνα 11. Τα long-spined cells, των οποίων τα σώματα και οιδενδρίτες βρίσκονται στην πολυμορφική στοιβάδα.( Progress in Brain Research, H.E. Scharfman, CHAPTER 1, The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies), 2007 Elsevier B.V, p.16.) Τέλος, μπορούμε να αναφερθούμε και στα long - spined cells (μακρυάκανθα)της πολυμορφικής στοιβάδας (Εικ. 11) των οποίων οι δενδριτικές άκανθες είναι ιδιαίτερα μακριές και μαζί με τα σώματα βρίσκονται στην πολυμορφική στοιβάδα. Οι νευράξονες τους δίνουν GABA- εργικές τερματικές συνδέσεις με τα 15

16 σώματα των granule cells, και εκτείνονται έως μέσα στη μοριακή στοιβάδα, την οποία μπορεί να διασχίζουν κιόλας. Επιπλέον συμπέρασμα: GABA - εργικές ανασταλτικές συνδέσεις των κοκκωδών κυττάρων από: α)αξονο-αξονικά κύτταρα, β) long - spined cells (HIPP-δηλαδή κύτταρα του hilus(πολυμορφική στοιβάδα) σχετιζόμενα με την διατιτραίνουσα) και γ) καλαθοειδή πυραμιδικά κύτταρα. Το τελευταίο είδος κυττάρου, αλλά όχι λιγότερο σημαντικό που θα αναφερθεί είναι μια ομάδα κυττάρων της πολυμορφικής στοιβάδας τα mossy cells (Εικ. 12). Εικόνα 12 : Ο άξονας του mossy cell δημιουργεί ένα πλέγμα στην πολυμορφική στοιβάδα και επίσης μια ομόπλευρη - σύστοιχη προβολή στην εσώτερη μοριακή στοιβάδα γνωστή ως συνδυαστική οδός. Ο κυρίως άξονας, επίσης, προβάλλει αντίπλευρα πρός την εσώτερη μοριακή στοιβάδα δημιουργώντας την συνδεσμική οδό. Η ομόπλευρη προβολή αυξάνει σε πυκνότητα, όσο απομακρυνόμαστε από το σώμα από το οποίο εκφύεται ο άξονας. Επίσης βλέπουμε στη δεύτερη εικόνα ένα κλασσικό κύτταρο mossy: χαρακτηριστικά ακανθώδη εκφύματα και δενδριτικά δένδρα, με τα ακανθώδη εκφύματα να είναι εγγύτερα στο σώμα. Οι δενδρίτες εκτείνονται σε όλη την πολυμορφική στοιβάδα αλλά μερικά μπορεί να εισέρχονται στην στοιβάδα σωμάτων κοκκωδών κυττάρων και την μορική στοιβάδα (ml). ( Progress in Brain Research, H.E. Scharfman, CHAPTER 1, The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies), 2007 Elsevier B.V, p.13.) 16

17 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Σκοπός της εργασίας.ο σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης υπήρξε η εύρεση τυχόν διαφορών,ως προς τα προσυναπτικά και μετασυναπτικά δυναμικά,μεταξύ ραχιαίου και κοιλιακού ιππόκαμπου στον επίμυ,μετά απο ερεθισμό της πλάγιας και μεσαίας διατιτραίνουσας οδού. Α. ΕΞΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΤΟΜΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ 1. Πειραματόζωα Στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκαν 35 επίμυες Wistar. Τα ζώα διατηρούνταν στο ζωοτροφείο της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών σε σταθερό περιβάλλον ο C και 24ώρου κύκλου φωτός (12 ώρες φως / 12 ώρες σκοτάδι). Τα ζώα προέρχονται από την αποικία που αναπτύχθηκε στο ζωοτροφείο με βάση ζεύγη που αγοράστηκαν από το ίδρυμα Charles River (Ιταλία). 2. Γενικά στοιχεία για την εξαγωγή και διατήρηση των τομών Τα ζώα παραλαμβάνονταν από τον πειραματιστή σε κλωβό από το ζωοτροφείο και μεταφέρονταν στο εργαστήριο της φυσιολογίας. Εκεί αφήνονταν για λίγο να ηρεμήσουν από την ενόχληση της μεταφοράς. Κατόπιν τοποθετούνταν σε ένα διαφανές κουτί με χαρτί εμποτισμένου με διαιθυλαιθέρα όπου αναισθητοποιούνταν. Λίγο πριν το 4 ο στάδιο αναισθησίας, δηλαδή τον θάνατο, στους τελευταίους παλμούς που γίνονταν αντιληπτοί από την θωρακική κίνηση, το ζώο τοποθετούνταν σε λαιμητόμο όπου και αποκεφαλιζόταν. Κατόπιν, το κεφάλι μεταφερόταν ταχύτατα στον πειραματικό χώρο όπου το κρανίο ανοιγόταν και αφαιρούνταν ο εγκέφαλος. Ο εγκέφαλος, στην συνέχεια, μεταφερόταν μέσα σε κρύο (2-4 ο C) Τ.Ε.Ν.Υ. (Τεχνητό ΕγκεφαλοΝωτιαίο Υγρό) και με κατάλληλη τεχνική αφαιρούνταν με μικροχειρουργείο άθικτοι οι δύο ιππόκαμποι, ένας από κάθε ημισφαίριο. Το άνοιγμα του κρανίου γινόταν με τρεις τομές: 1 κατά μήκος της οβελιαίας γραμμής και 2 κατά μήκος των έσω καρωτίδων. Η εξαγωγή του ιπποκάμπου γινόταν με αρχική αφαίρεση του μετωπιαίου λοβού με τομή στο ύψος του βρεγματικού τρήματος και της παρεγκεφαλίδας. Επίσης γινόταν και χωρισμός των ημισφαιρίων. Έτσι για το κάθε ημισφαίριο εξαγόταν ο ιπποκάμπος, μετά από προσεκτική απομάκρυνση των τρημάτων του διεγκεφάλου και κοπή της ψαλίδας (Εικ.13 α ). Εικόνα 13: Εξαγωγή και τεμαχισμός ιπποκάμπου.(in vitro ηλεκτροφυσιολογική μελέτη της νευρωνικής διεγερσιμότητας και των αλλαγών της με την ηλικία.κώστας Παπαθεοδωρόπουλος, Διδακτορική διατριβή, 1996, σελ.19). 17

18 Έπειτα μεταφερόταν στην μικροτόμο όπου τεμαχιζόταν σε εγκάρσιες τομές πάχους 550μm(Εικ.13 β,γ ). Οι τομές αυτές μεταφέρονταν μία προς μία, αμέσως μετά την κοπή τους, σε υδατόλουτρο, μία ειδική πειραματική διάταξη όπου διατηρούνται οι τομές κατά την διάρκεια του πειράματος. Η γωνία τομής ήταν κάθετη προς τον επιμήκη άξονα σχεδόν για το σύνολο των πειραμάτων και οι τομές μεταφέρονταν με μικρό πινέλο στο υδατόλουτρο(εικ.14). Στο υδατόλουτρο, τα δείγματα διαβρέχονταν και οξυγονώνονταν σε όλη τη διάρκεια του πειράματος από το Τ.Ε.Ν.Υ. Από κάθε ιππόκαμπο εξάγονταν 8-10 τομές περίπου, μισές ραχιαίου ιπποκάμπου (DORSAL) και μισές κοιλιακού (VENTRAL). Η επιβιωσιμότητα των τομών, με τη μέθοδο αυτή, έφτανε τις ώρες σε κάποια πειράματα, στον οποίο χρόνο ο νευρικός ιστός διατηρούσε όχι μόνο την οπτική (ανατομική) ακεραιότητα του αλλά και τις φυσιολογικές του ιδιότητες, εντός αποδεκτών ορίων. Η τεχνική των τομών του εγκεφάλου αναπτύχθηκε την δεκαετία του 50 από τον Henry McIlwain, ενώ στην ηλεκτροφυσιολογία, η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε από τους Yamamoto και McIlwain το Σημαντικό χαρακτηριστικό των τομών ιπποκάμπου είναι η διατήρηση ενός μεγάλου αριθμού νευρώνων αλλά και των μεταξύ τους συνδέσεων, στην κατά μήκος παράλληλη διάταξη ενός βασικού εσωτερικού κυκλώματος. Στις τομές του ιπποκάμπου μπορεί κανείς να ερεθίσεις άθικτες νευρικές οδούς και να καταγράψει τα προσυναπτικά και μετασυναπτικά αποτελέσματα. Πλεονεκτήματα σχετικά με τα in vivo πειράματα 1. Διατήρηση συναπτικών συνδέσεων ενός πλήρους νευρωνικού κυκλώματος 2. Μηχανική σταθερότητα για πολύωρες καταγραφές 3. Δυνατότητα ελέγχου της χημικής σύστασης του μικροπεριβάλλοντος των νευρώνων, του ph, της θ ο C και της παροχής Ο Έλλειψη αναισθητικών ουσιών 5. Ακρίβεια στην τοποθέτηση των ηλεκτροδίων με οπτικό έλεγχο 6. Παρόμοιες πολλές τομές μπορούν να εξαχθούν από τον ίδιο ιππόκαμπο 7. Ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας και πειραματόζωων 8. Ευκολία προσέγγισης και ταυτοποίησης των νεύρων 9. Ευκολία προετοιμασίας παρασκευάσματος 10. Δυνατότητα μεγάλης επαναληψιμότητας της διαδικασίας,αφού δεν αλλάζει η φυσιολογία των νευρώνων με την επίδραση των προκλητών δυναμικών. Μειονεκτήματα 1. Όχι συνδέσεις με άλλες περιοχές 2. Όχι ρυθμιστικοί παράγοντες της κυκλοφορίας 18 Εικόνα 14: Υδατόλουτρο.(In vitro ηλεκτροφυσιολογική μελέτη της νευρωνικής διεγερσιμότητας και των αλλαγών της με την ηλικία.κώστας Παπαθεοδωρόπουλος, Διδακτορική διατριβή, 1996, σελ.21).

19 3. Επιπτώσεις από την διαδικασία απομόνωσης των τομών (ανοξικά φαινόμενα κυρίως) 4. Απουσία συνήθως αυθόρμητης δραστηριότητας λόγω έλλειψης πολλών προσαγωγών διεγερτικών ινών. 3. Διαλύματα Σε όλες τις φάσεις χειρισμού του, ο ιστός βρισκόταν σε περιβάλλον τεχνητού εγκεφαλονωτιαίου υγρού (Τ.Ε.Ν.Υ.) σύστασης (σε mm): 124 NaCl, 26 NaHCO 3, 4 KCl, 2 MgSO4, 2 CaCl,1.25 KH2PO4, 10 γλυκόζη και ph , κορεσμένο με οξυγόνο (30 λεπτά οξυγόνωση με αέριο μίγμα συστάσεως 95% Ο 2 και 5% CO 2 σε θερμοκρασία 7 ο C). B. ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΕΣ ΚΑΤΑΓΡΑΦΕΣ ΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΠΕΔΙΟΥ ΣΕ ΤΟΜΕΣ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ 1. ΓΕΝΙΚΑ Στην εργασία αυτή πραγματοποιήθηκαν εξωκυττάριες καταγραφές προκλητών συναπτικών δυναμικών και δυναμικών ενέργειας προερχόμενων από ένα πληθυσμό νευρώνων. Μέσω συγκεκριμένων μετρήσεων των καταγραφών των δυναμικών αυτών ποσοτικοποιήθηκαν διάφορες παράμετροι της συναπτικής και νευρωνικής φυσιολογίας. Οι εξωκυττάριες καταγραφές παρουσιάζουν ορισμένα πλεονεκτήματα συγκριτικά με τις ενδοκυττάριες όπως είναι α) η ευκολία στην πραγματοποίηση τους και β) η δυνατότητα επαναληψιμότητας που προσφέρουν. Επίσης, γ) σταθερές εξωκυττάριες καταγραφές είναι δυνατόν να διαρκέσουν επί μακρόν, κάτι σχεδόν αδύνατο για μία ενδοκυττάρια καταγραφή και δ) επιτρέπουν τον πειραματικό έλεγχο σχετικά μεγάλου αριθμού τομών σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα διευκολύνοντας τις στατιστικές συγκρίσεις στις ποσοτικές μελέτες. Επιπλέον, οι προκλητές απαντήσεις πεδίου αντιπροσωπεύουν αθροισμένα δυναμικά από μεγάλο πληθυσμό νευρώνων και έτσι αποκλείεται η επιπρόσθετη διακύμανση μετρήσεων που συνοδεύει τις ενδοκυττάριες καταγραφές, τόσο μεταξύ νευρώνων της ίδιας τομής όσο και διαφορετικών τομών. Στις ενδοκυττάριες καταγραφές αναμφισβήτητα υφίστανται τα επακόλουθα της επέμβασης στον νευρώνα, κάτι που δεν συμβαίνει με τις εξωκυττάριες. Τέλος, ανάλογα με το ερώτημα της έρευνας, η πειραματική προσέγγιση απαιτεί τη χρησιμοποίηση εξωκυττάριων καταγραφών όπως για παράδειγμα στις περιπτώσεις που αναφέρονται στη συμπεριφορά ενός πληθυσμού νευρώνων που συμμετέχουν σε συγκεκριμένο κύκλωμα ή όταν διερευνάται η κατανομή και το είδος των συναπτικών επιδράσεων στο χώρο. Για παράδειγμα, η διεγερσιμότητα που είναι φαινόμενο «όλο ή ουδέν» στο επίπεδο του ενός κυττάρου, μπορεί να μελετηθεί διαβαθμιζόμενη ως εκατοστιαία αναλογία των νευρώνων που εκφορτίζουν με δεδομένη είσοδο στην εξωκυττάρια καταγραφή. Η καταγραφόμενη κυματομορφή των εξωκυττάριων δυναμικών εξαρτάται από την συγκεκριμένη θέση του ηλεκτρόδιου καταγραφής, έτσι απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στην ακριβή τοποθέτηση του στη τομή, ιδίως όταν η μελέτη αφορά τη 19

20 σύγκριση ποσοτικών μετρήσεων. Εδώ θα πρέπει να αναφερθεί ότι η πρόκληση συναπτικών απαντήσεων με ερεθισμό μεγάλου αριθμού προσαγωγών ινών και ενεργοποίηση συνάψεων που χρησιμοποιείται ευρέως στην πειραματική νευροφυσιολογία, δεν είναι γνωστό κατά πόσο και σε ποιο βαθμό συμβαίνει στις φυσικές συνθήκες λειτουργίας των νευρωνικών κυκλωμάτων. 2. ΘΕΩΡΗΤΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΠΕΔΙΟΥ Όταν ένας νευρώνας ενεργοποιηθεί συναπτικά στην περιοχή των απώτερων δενδριτών του, ο νευροδιαβιβαστής που απελευθερώνεται από τις προσυναπτικές απολήξεις προκαλεί το άνοιγμα ιοντικών καναλιών της μετασυναπτικής μεμβράνης των δενδριτών και την είσοδο θετικού ιοντικού ρεύματος στον ενδοκυττάριο χώρο, προκαλώντας εκπόλωση της μεμβράνης (και καθιστώντας έτσι το ενδοκυττάριο δυναμικό στην περιοχή αυτή των απώτερων δενδριτών πιο θετικό από ότι σε άλλα σημεία της μεμβράνης). Σαν συνέπεια, το ρεύμα διατρέχει τον ενδοκυττάριο χώρο από το σημείο αυτό του υψηλού δυναμικού προς άλλα απομακρυσμένα σημεία χαμηλότερου δυναμικού (στην περίπτωση αυτή το σώμα του νευρώνα), και καθώς πρέπει να κλείσει το κύκλωμα μεταξύ ενδοκυττάριου και εξωκυττάριου χώρου, εξέρχεται του νευρώνα από τα απομακρυσμένα σημεία του σώματος για να ακολουθήσει αντίθετη πορεία στο εξωκυττάριο μέσο. Το σημείο εισόδου του ρεύματος στο νευρώνα (στην πιο πάνω περίπτωση στους δενδρίτες) το ονομάζουμε καταβόθρα ρεύματος (current sink) ενώ το σημείο εξόδου στον εξωκυττάριο χώρο (στην περίπτωση πιο πάνω από το νευρωνικό σώμα) το ονομάζουμε πηγή ρεύματος (current source). Τα ιοντικά ρεύματα ρέουν με κατεύθυνση από τις πηγές (+) προς τις καταβόθρες (-), δημιουργώντας στιγμιαίες διαφορές δυναμικού, τα δυναμικά πεδίου. Στις περιοχές των καταβοθρών καταγράφονται αρνητικά δυναμικά ενώ στις περιοχές της πηγής θετικά, σχηματίζοντας ηλεκτροστατικά δίπολα. Στην περίπτωση που τέτοια δίπολα (νευρώνες) είναι διευθετημένα σε σειρά παράλληλη, όπως συμβαίνει στον ιππόκαμπο, τότε η άθροιση των εξωκυττάριων δυναμικών από ένα μεγάλο πληθυσμό νευρώνων δημιουργεί σχετικά μεγάλα δυναμικά πεδίου που μπορούν έτσι να καταγραφούν εξωκυττάρια. Το δυναμικό πεδίου που καταγράφεται σε ένα σημείο εξαρτάται από το γραμμικό άθροισμα των δυναμικών καθεμιάς των πηγών και καταβοθρών του ρεύματος, αναλόγως βέβαια της απόστασης τους από το σημείο που κάνουμε την καταγραφή και από την αγωγιμότητα του εξωκυττάριου μέσου. 3.ΔΥΝΑΜΙΚΑ ΠΕΔΙΟΥ ΣΤΗΝ ΟΔΟΝΤΩΤΗ ΕΛΙΚΑ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΥ Ο ηλεκτρικός ερεθισμός στην περιοχή των δενδριτικών αποφυάδων της μοριακής στοιβάδας προκαλεί συναπτική εκπόλωση των δενδριτών. Στο σημείο αυτό η εκπόλωση θα καταγραφεί εξωκυττάρια ως μία αρνητική απόκλιση του δυναμικού που αποτελεί το άθροισμα των δενδριτικών εκπολώσεων ενός πληθυσμού νευρώνων 20

21 κοκκωδών κυττάρων και καλείται διεγερτικό μετασυναπτικό δυναμικό πεδίου (E.P.S.P.: Excitatory Post-Synaptic Potential). Προκειμένου να κλείσει το κύκλωμα από το δημιουργούμενο ρεύμα θα πρέπει να εξέλθει από άλλο σημείο του νευρώνα όπου καταγράφεται ως μία θετική απόκλιση του δυναμικού που αποτελεί κατοπτρικό είδωλο του δυναμικού που καταγράφεται στους δενδρίτες. Όταν η συναπτική εκδήλωση υπερβεί ένα συγκεκριμένο όριο (ουδό) προκαλεί την διέγερση των νευρώνων με τη δημιουργία δυναμικών ενέργειας στην περιοχή του σώματος (εκφυτικό κωνο) που η άθροιση τους από πληθυσμό νευρώνων καταγράφεται ως μία αρνητική απόκλιση (καταβόθρα ρεύματος) που επικάθεται στην κυματομορφή του διεγερτικού μετασυναπτικού δυναμικού και καλείται πληθυσμιακό δυναμικό ενέργειας (PS). Τα σώματα στην συγκεκριμένη περίπτωση είναι τα σώματα των κοκκωδών κυττάρων και είναι σφαιρικά και όχι πυραμιδοειδή όπως τα σώματα των πυραμιδικών κυττάρων. Αποτελούν δε ξεχωριστή στοιβάδα στην εσωτερική μοίρα της μοριακής στοιβάδας που λέγεται κοκκώδης στοιβάδα (g.c.l. granule cell layer). Στην δενδριτική περιοχή το δυναμικό ενέργειας καταγράφεται ως θετική απόκλιση του δυναμικού (αλλά μικρότερου μεγέθους από αυτό που καταγράφεται στο σώμα). 4.ΠΡΟΚΛΗΣΗ, ΚΑΤΑΓΡΑΦΗ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ 1) Ηλεκτρόδια ερεθισμού Τα ηλεκτρόδια ερεθισμού αποτελούνται από διπλά χαλύβδινα σύρματα διαμέτρου 20μm το καθένα και με μεταξύ τους απόσταση 100μm σχηματίζοντας ζεύγος για διπολικό ερεθισμό. Στην άκρη τους που προορίζεται για ερεθισμό παραμένουν ελεύθερα μόνωσης και με παράλληλη μεταξύ τους διευθέτηση. Δύο σημεία επελέγησαν για ερεθισμό: α) στην εξωτερική πλευρά της μοριακής στοιβάδας (outer molecular layer) που αντιστοιχεί στην πλάγια διατιτραίνουσα οδό (lateral perforant path). β) στην μεσαία στοιβάδα της μοριακής στοιβάδας (medial molecular layer) που θεωρείται ότι αντιστοιχεί στην μέση διατιτραίνουσα οδό (medial perforant path). Και στις δύο περιπτώσεις πρόκειται για ορθόδρομο ερεθισμό, αφού και η εξωτερική και η μέση μοριακή στοιβάδα αποτελούνται από δενδριτικές αποφυάδες των κοκκωδών κυττάρων πάνω στην οποία συνάπτονται οι απολήξεις των ινών της διατιτραίνουσας οδού. Όταν ερεθίζεται η εξωτερική, καταγράφεται σε αυτή φυσιολογικά EPSP αρνητικό και Fv (προσυναπτικό πληθυσμιακό δυναμικό, fiber volley),στην μέση μοριακή στοιβάδα καταγράφεται ανεστραμμένο το EPSP, δηλαδή θετικό, αφού αποτελεί την πηγή του εκπολωτικού ρεύματος που δημιουργείται στην εξωτερική, και στην g.c.l. (granule cell layer) καταγράφεται EPSP θετικό, και PS αφού έχουμε από τον εκφυτικό κώνο των σωμάτων της g.c.l. δημιουργία δυναμικού ενέργειας. 21

22 Όταν ερεθίζεται η μέση μοριακή στοιβάδα έχουμε εκεί αρνητικό EPSP και Fv και στην εξωτερική θετικό EPSP, ενώ στην g.c.l. θετικό EPSP και PS. Εικόνα 15: Ενδεικτική ταυτόχρονη τριπλή καταγραφή. 2) Ηλεκτρόδια καταγραφής. Είναι ηλεκτρόδια ίνας άνθρακα μικρής διαμέτρου (7-8 μm) τα οποία παρουσιάζουν τα εξής πλεονεκτήματα σε σχέση με τα ηλεκτρόδια από γυάλινες μικροπιπέτες: α)μεγάλη ανθεκτικότητα και ευρεία δυνατότητα χρησιμοποίησης τους σε πολλά πειράματα β)σταθερή αντίσταση κατά τη διάρκεια του πειράματος και από πείραμα σε πείραμα. Αυτό είναι πολύ σημαντικό ειδικά σε περιπτώσεις όπου χαρακτηριστικά του βιολογικού σήματος εξαρτώνται από την αντίσταση του ηλεκτροδίου καταγραφής. γ)χαμηλή απόκριση θορύβου δ)μικρότερη εν δυνάμει βλάβη του ιστού λόγω της ευκαμπτότητας τους ε)οπτικά ευκολότερη τοποθέτηση σε σταθερό βάθος από τομή σε τομή στ)χαμηλό κόστος Η ποιότητα των καταγραφών με τα ηλεκτρόδια αυτά είναι συγκρίσιμη με αυτή των ηλεκτροδίων βολφραμίου τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για εξωκυττάριες καταγραφές. Επιπλέον όμως, οι ίνες άνθρακα παρουσιάζουν μεγαλύτερες ευαισθησίες σε αλλαγές του D.C. ενώ με το βολφράμιο αποκλείονται οι μικρές συχνότητες (λειτουργεί ως high-pass φίλτρο). Η τοποθέτηση των ηλεκτροδίων ίνας άνθρακα πραγματοποιείται με οπτικό έλεγχο με τη βοήθεια στερεομικροσκοπίου. 22

23 5.ΠΡOΚΛΗΣΗ, ΚΑΤΑΓΡΑΦΗ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΗΜΑΤΟΣ Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε μονωμένο ηλεκτρομαγνητικά δωμάτιο πειραμάτων του εργαστηρίου ηλεκτροφυσιολογίας, του τομέα φυσιολογίας της Ιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών (με παράθυρα επενδυμένα από σύρματα κλωβού Faraday). Οι συχνότερες παρεμβολές στην καταγραφή του βιολογικού σήματος προέρχονται από ηλεκτρικές συσκευές και καλώδια υψηλής τάσης. Για την πρόκληση των βιολογικών απαντήσεων χρησιμοποιήθηκαν ηλεκτρικοί παλμοί μέσω μονάδων ηλεκτρικών συσσωρευτών (μπαταρίες) ελεγχόμενης τάσης και διάρκειας παλμών. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης, ειδικές μονάδες για την σταθεροποίηση του ρεύματος ερεθισμού (stimulus isolution units) ανεξάρτητα από την αντίσταση του ηλεκτροδίου ερεθισμού (η οποία μπορεί να ποικίλλει). Για τον ορθόδρομο ερεθισμό συνήθως χρησιμοποιήθηκαν ζεύγη παλμών με χρονική διαφορά μεταξύ των ερεθισμών ίση με 40msec (ερεθισμός με ζευγη παλμων pair-pulse stimulation) και με ένταση από 20 έως 320 μa (και για τους 2 παλμούς χρησιμοποιήθηκε ίδια ένταση). Το βιολογικό σήμα που προερχόταν από ερεθισμό (προκλητή απάντηση), άγονταν μέσω του ηλεκτροδίου καταγραφής σε ενισχυτή όπου ενισχυόταν 100 φορές. Στη συνέχεια προωθούταν σε φίλτρα απομόνωσης συχνοτήτων για την απομάκρυνση των πολύ διαφορετικών του βιολογικού σήματος συχνοτήτων και τη βελτίωση του λόγου σήμα/θόρυβος (βελτίωση καθαρότητας καταγραφόμενων κυματομορφών). Το φάσμα συχνοτήτων που χρησιμοποιούνταν για τη δέσμευση του σήματος ήταν συνήθως μεταξύ 5kHz και 5Hz. Μετά το φιλτράρισμα, το σήμα περνούσε από ενισχυτή όπου τροποποιούνταν με ένα συντελεστή 0,5 έως 2. Από τον ενισχυτή, το σήμα άγονταν σε 3 όργανα: α) σε παλμογράφο σε ψηφιακή μορφή, β) σε ηχείο για ακουστικό έλεγχο και γ) στον υπολογιστή όπου γινόταν η αποθήκευση του με παραμέτρους που ρυθμιζόταν από το λογισμικό πρόγραμμα Signal. Στον σκληρό δίσκο (μνήμη ROM) του υπολογιστή καταγραφόταν και αποθηκευόταν για την περαιτέρω ανάλυση του. Η συνολική διαδικασία μεταξύ ερεθισμού και τελικής καταγραφής του βιολογικού σήματος συντονιζόταν από ειδική συσκευή προγραμματισμού (προγραμματισμός Digitimer). 23

24 Εικόνα 16: Διαγραμματική απεικόνιση της διαδικασίας πρόκλησης, καταγραφής, ενίσχυσης και ανάλυσης του βιολογικού σήματος.(in vitro ηλεκτροφυσιολογική μελέτη της νευρωνικής διεγερσιμότητας και των αλλαγών της με την ηλικία.κώστας Παπαθεοδωρόπουλος, Διδακτορική διατριβή, 1996, σελ.29). 6. ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΠΕΔΙΟΥ Τα είδη των δυναμικών πεδίου που κατεγράφησαν στις τομές του ιπποκάμπου ήταν τα εξής: 1.Πληθυσμιακό δυναμικό ενέργειας προσυναπτικών αξόνων Fiber volley, Fv Καταγράφεται στην περιοχή των δενδριτών ως μία αρνητική απόκλιση του δυναμικού, πολύ μικρότερης καθυστέρησης από αυτή των EPSP και PS. (Στην μοριακή στοιβάδα στο πολύ μεγαλύτερο μέρος των καταγραφών έχουμε Fv και στους 2 παλμούς της pair-pulse αλλά και στις 2 στοιβάδες του πιθανού ερεθισμού δηλαδή και στην εξωτερική αλλά και στην μέση. Οπότε όταν ερεθίζουμε στην εξωτερική έχουμε Fv τόσο στην εξωτερική όσο και στην μέση, όπου και αν καταγράφουμε είτε εξωτερική, είτε μέση. Όταν δε ερεθίζουμε στην μέση έχουμε Fv και στην εξωτερική και στην μέση, όπου και αν καταγράφουμε, δηλαδή είτε εξωτερική είτε μέση). To Fv οφείλεται στα αθροισμένα δυναμικά ενέργειας των διεγειρόμενων προσυναπτικών αξόνων αποτελώντας έτσι μέτρο της προσυναπτικής διέγερσης. Ακολουθεί σε μέγεθος την ένταση ερεθισμού, αφού εντονότερος ερεθισμός προκαλεί τη διέγερση περισσότερων ινών. Υπολογίζεται ότι η απόσταση της αρνητικής αιχμής 24

25 από την οριζόντια ευθεία που ορίζει το επίπεδο του δυναμικού πριν τον ερεθισμό / ύψος Fv, mv. 2. Διεγερτικό μετασυναπτικό δυναμικό πεδίου field Exitatory Post-Synaptic Potential ή fepsp ή EPSP To EPSP καταγράφεται τόσο της εξωτερικής μοριακής στοιβάδας όσο και στην g.c.l. των σωμάτων των κοκκωδών κυττάρων. Καθ ότι συναπτικό δυναμικό, το EPSP είναι ένα βραδύ κύμα από msec (αν και σπάνια φτάνει την μέγιστη χρονική διάρκεια των 40 msec) και αποτελεί ένδειξη της μετασυναπτικής ενεργοποίησης. Υπολογίζεται δε ως η μέγιστη κλίση (slope) της ανερχόμενης φάσης του (αρνητική στην μοριακή στοιβάδα στο σημείο διέγερσης και θετική στην άλλη στοιβάδα της μοριακής στοιβάδας και στην g.c.l.). Γενικά: κλίση του EPSP, mv/msec. Στα αποτελέσματα η κλίση του EPSP θα αναφέρεται πάντα συμβατικά με θετικό πρόσημο. Ο υπολογισμός του EPSP με την κλίση του συνίσταται στις περιπτώσεις που είτε αυτό διακόπτεται από την αποτύπωση του PS, όπως συμβαίνει κατά καιρό στην g.c.l., είτε όταν το Fv δεν είναι αρκετά μεγάλο για να εμποδίζει την καταγραφή του EPSP. Οι ιδιαιτερότητες των καταγραφών μας εμπίπτουν, σε αυτές τις συνθήκες, στην οδοντωτή έλικα. 3. Ορθόδρομο πληθυσμιακό δυναμικό ενέργειας Population spike, PS Το ορθόδρομο εκλυόμενο PS αποτελεί μία καθυστερημένη, σε σχέση με το EPSP, σύντομη αλλαγή του δυναμικού, διάρκειας 2-3 msec και καταγράφεται τυπικά στην g.c.l. (granule cell layer). Μπορεί δε να υπάρξει καταγραφή του PS και στην μέση μοριακή στοιβάδα, αλλά αυτό συμβαίνει μάλλον σπάνια, και για πολύ λιγότερο από τους μισούς ερεθισμούς μιας ομάδας input output. Αποτελεί μία μέτρηση του αριθμού των συναπτικά διεγειρόμενων νευρώνων αλλά και μέτρο του συγχρονισμού της διέγερσης τους. Το PS υπολογίζεται ως η απόσταση μεταξύ της αρνητικής αιχμής και του μεσοδιαστήματος των δύο θετικών κορυφών ύψος του PS, mv. 7. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΕΡΕΘΙΣΜΟΥ Στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των συναρτήσεων εισόδου εξόδου (input output) ταυτόχρονα με την σύζευξη παλμών. 1)Συναρτήσεις εισόδου εξόδου (input output) Μεταβάλλοντας το μέγεθος του πειραματικού ερεθισμού (το μέγεθος του ρεύματος που ερεθίζουμε δηλαδή με το ηλεκτρόδιο ερεθισμού) μεταβάλλεται και το μέγεθος της καταγραφόμενης βιολογικής απάντησης, τόσο σχετικά με τα προσυναπτικά στοιχεία (Fv δηλαδή) όσο σχετικά και με τα μετασυναπτικά στοιχεία (EPSP, PS). Όλες οι προκύπτουσες σχέσεις μεταξύ του της έντασης του ερεθισμού και της βιολογικής απάντησης της προσυναπτικής διέγερσης και μετασυναπτικής απάντησης καθώς και μεταξύ δενδριτικής εκπόλωσης και νευρωνικής πυροδότησης μπορούν να περιγραφούν διαγραμματικά, δείχνοντας ξεχωριστή συμπεριφορά. 25

26 Παραδείγματος χάριν, η σχέση μεταξύ προσυναπτικής διέγερσης και μετασυναπτικής δενδριτικής εκπόλωσης (δηλαδή μεταξύ Fv και EPSP) είναι σχεδόν γραμμική. Εδώ πρέπει να πούμε πως χρησιμοποιούμε το EPSP1 και το Fv του πρώτου παλμού. Επίσης, η σχέση μεταξύ δενδριτικής εκπόλωσης και νευρωνικής πυροδότησης (δηλαδή EPSP και PS) είναι μία σιγμοειδής καμπύλη, η οποία μπορεί να αποδοθεί μαθηματικά με εξαιρετική επιτυχία από συγκεκριμένη εξίσωση (Kostopoulos kai Psaropoulou, 1990, η εξίσωση αυτή δεν χρησιμοποιήθηκε εδώ). Η μελέτη της διεγερσιμότητας των στοιβάδων πλάγιας και μέση διατιτραίνουσα οδός έγινε με τη μελέτη συναρτήσεων εισόδου εξόδου, που βασίζονται στη σχέση μεταξύ προσυναπτικής διέγερσης και μετασυναπτικής απόκρισης: α) Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιούμε τη συνάρτηση EPSP-slope (κλίση) / Ι (ρεύμα) που είναι συνάρτηση της συναπτικής αποτελεσματικότητας. Αποτελεί την συνάρτηση μεταξύ του μεταβαλλόμενου ρεύματος ερεθισμού και συναπτικής εκπόλωσης (EPSP). Η γραμμικότητα της συνάρτησης αυτής υποδηλώνει την ευθεία αναλογία μεταξύ προσυναπτικής διέγερσης και δενδριτικής εκπόλωσης. β) Επίσης, χρησιμοποιούμε τη συνάρτηση διεγερσιμότητας PS-ύψος/Ι. Αυτή είναι μία σιγμοειδής καμπύλη που υποδηλώνει την κανονική κατανομή των νευρώνων ως προς τη διεγερσιμότητα τους. Έτσι, σε μικρές εντάσεις ερεθισμού μόνο οι πιο διεγέρσιμοι νευρώνες (σχετικά μικρός αριθμός) φτάνουν στον ουδό διέγερσης και πυροδοτούν δυναμικό ενέργειας. Οι περισσότεροι νευρώνες διεγείρονται σε ενδιάμεσες εντάσεις ερεθισμού (λόγω ουδού) και η συνάρτηση στην περιοχή αυτή του ρεύματος έχει μεγάλη κλίση. Σε μεγαλύτερες εντάσεις ερεθισμού μικραίνει ο αριθμός των λιγότερο διεγέρσιμων νευρώνων, αλλά δεν παύουν να υπάρχουν κάποιοι πολύ λίγοι, οπότε η καμπύλη (συνάρτηση) τείνει να γίνει ασυμπτωτικά να γίνει κάθετη στον άξονα του PS. γ) Τέλος, χρησιμοποιούμε τη συνάρτηση EPSP% / I δηλαδή [(EPSP 2 EPSP 1 ) / EPSP 1 ] / I η οποία είναι η επί τοις εκατό μεταβολή της διευκόλυνσης ή καταστολής,που όπως εξηγούμε είναι η ενίσχυση με συζευξη παλμου ή η καταστολή με σύζευξη παλμού. 26

27 2. Σύζευξη παλμών Όπως ειπώθηκε, οι συναρτήσεις εισόδου εξόδου δίνονται ταυτόχρονα και με σύζευξη παλμών, δηλαδή κάθε φορά που το ηλεκτρόδιο ερεθισμού ερεθίζει το κύκλωμα το κάνει με συγκεκριμένη ένταση αλλά 2 φορές (paired-pulse stimulation, διέγερση με συζευξη παλμου). Στην συγκεκριμένη σειρά πειραμάτων οι δύο αυτοί παλμοί δίνονται με χρονική διαφορά 40msec. Αυτό το χρονικό διάστημα ονομάζεται μεσοπαλμικό διάστημα. Είναι προφανές ότι στην περίπτωση μας υπάρχει μόνο ένα μεσοπαλμικό διάστημα. Με την σύζευξη παλμών στην input output μπορούμε να διερευνήσουμε το αποτέλεσμα που ο πρώτος παλμός επιφέρει στην απάντηση που εκλύεται με τον δεύτερο παλμό. Εάν το αποτέλεσμα είναι κατασταλτικό τότε έχουμε καταστολή με συζευξη παλμου (paird-pulse depression, ppd, καταστολή). Ενώ αν το αποτέλεσμα είναι ενισχυτικό τότε έχουμε ενίσχυση με συζευξη παλμου (paird-pulse facilitation, ppf, διευκόλυνση). Το συγκεκριμένο έχει μεγάλη σημασία στην εργασία αυτή γιατί αποτελεί το σημαντικότερο από τα νευροφυσιολογικά κριτήρια βάση του οποίου μπορούμε να αποφανθούμε για το κατά πόσο ερεθίζουμε την πλάγια ή τη μέση διατιτραίνουσα οδό. Αυτό συμβαίνει γιατί ερεθισμός της πλάγιας διατιτραίνουσας οδού (πλάγιας διατιτραίνουσας οδού) οδηγεί σε διευκόλυνση με σύζευξη παλμών, ενώ το αντίθετο συμβαίνει όταν ερεθίζεται η μέση διατιτραίνουσα οδός και καταγράφεται καταστολή με συζευξη παλμου (καταστολή). Άρα, η διερεύνηση του αποτελέσματος του πρώτου παλμού στο δεύτερο (διευκόλυνση και καταστολή, και ποσοτικά) εξαρτάται από τις θέσεις που δίνονται οι ερεθισμοί στην τομή. 27

28 Υπερπυραμιδικό Πέταλο 1 α β 2 3 α β Υποπυραμιδικό Πέταλο Εικόνα 17. Εικόνα Πειραματικής Τοπογραφίας, τριπλής ταυτόχρονης καταγραφής, στη διατιτραίνουσα οδό (performant path) του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Στα σημεία α και β, βρίσκονται οι θέσεις των ηλεκτροδίων ερεθισμού( ), δηλαδή στην πλάγια και μέση διατιτραίνουσα οδό, αντίστοιχα, τόσο στο υπερπυραμιδικό όσο και στο υποπυραμιδικό πέταλο. Στα σημεία 1, 2 και 3, βρίσκονται οι θέσεις των ηλεκτροδίων καταγραφής( ), δηλαδή στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα,μέση μοριακή στοιβάδα και στοιβάδα σωμάτων των κοκκωδών κυττάρων, αντίστοιχα, τόσο στο υπερπυραμιδικό όσο και στο υποπυραμιδικό πέταλο. Κατά τη διάρκεια του πειράματος, η πολικότητα των ηλεκτροδίων ερεθισμού μεταβάλλονταν, προκειμένου να βρεθεί η κατάλληλη πολικότητα για τη βέλτιστη πρόκληση απάντησης. Όμως κατά τη διάρκεια μιας συνάρτησης εισόδου-εξόδου,η πολικότητα παρέμενε αυστηρά σταθερή. Υπήρξαν επίσης περιπτώσεις, όπου η καταγραφή σε συγκεκριμένη θέση της ίδιας τομής, έγινε και με τις δύο πολικότητες του ηλεκτροδίου ερεθισμού. 28

29 Αποτελέσματα Α. Συγκεντρωτικός πίνακας Supra/outer Supra/medial Infra/outer Infra/medial PPF PPD PPF PPD PPF PPD PPF PPD D 56/62 11/62 9/21 16/21 10/16 10/16 4/18 16/18 V 46/52 12/52 13/33 26/33 15/25 15/25 8/26 20/26 Γενικά Σχόλια 1) Συνολικά στο πείραμά μας χρησιμοποιήθηκαν όπως έχει αναφερθεί 35 επίμυες Wistar. 2) Από κάθε ζώο εξήχθησαν επιτυχώς και οι 2 ιπποκάμπειοι σχηματισμοί. 3) Από καθένα από τους ιππόκαμπους εξήχθησαν σε κάθε πείραμα,κατά μέσο όρο 10 τομές (5 κοιλιακού και 5 ραχιαίου ιππόκαμπου). 4) Συνολικά διερευνήθηκαν ηλεκτροφυσιολογικά περί τις 700 τομές (Δηλαδή διεγέρθηκαν από τα ηλεκτρόδια ερεθισμού και αξιολογήθηκαν οι προ- και μετασυναπτικές τους απαντήσεις από τα ηλεκτρόδια καταγραφής,ώστε να επιλεχθούν τα βέλτιστα σημεία πρός καταγραφή). 5) Από τις τομές αυτές τελικά χρησιμοποιήθηκαν οι καταγραφές από 65 ραχιαίες και 75 κοιλιακές τομές ιππόκαμπου.(140 τομές συνολικά) 6) Έγιναν 244 καταγραφές(168 στούς δενδρίτες των κοκκωδών και 76 στα σώματα) στο υπερπυραμιδικό (suprapyramidal) πέταλο της οδοντωτής έλικας και 235 (85 στούς δενδρίτες και 150 στα σώματα των κοκκωδών) στο υποπυραμιδικό (infrapyramidal) πέταλο. 7) Οι καταγραφές τόσο στο υπερπυραμιδικό πέταλο όσο και στο υποπυραμιδικό πέταλο εμπεριείχαν απαντήσεις από ερεθισμούς της εξωτερικής (outer) και της ενδιάμεσης (medial) υποστοιβάδας της μοριακής στοιβάδας (ml, molecular layer) της οδοντωτής έλικας. Σχόλια σχετικά με τον συγκεντρωτικό πίνακα 1) Στην υπερπυραμιδική στοιβάδα του ραχιαίου ιππόκαμπου και ερεθίζοντας την εξωτερική μοριακή στοιβάδα,έγιναν καταγραφές σε 62 τομες από τις οποίες τα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν σε 56 από αυτές το φαινόμενο της ενίσχυσης με συζευξη παλμου (διευκόλυνση), δηλαδή το μετασυναπτικό διεγερτικό δυναμικό (EPSP) ήταν μεγαλύτερης έντασης (σε mv) όταν προκαλούνταν από τον δεύτερο παλμό, από εκείνο που προκαλούνταν από τον 29

30 πρώτο, και σε 11 καταγραφές εμφανιζόταν το φαινόμενο της καταστολής με σύζευξη παλμού (καταστολή, pair pulse depression). Όπως περιγράψαμε στην μεθοδολογία για κάθε ερεθισμό είτε στην εξωτερική είτε στην μέση μοριακή στοιβάδα εφαρμόζαμε τριπλή καταγραφή(σε κάποιες περιπτώσεις) δηλαδή είχαμε 1 ηλεκτρόδιο στην εξωτερική, 1 στην μέση και 1 στην στοιβάδα των σωμάτων κοκκωδών κυττάρων gcl (granule cell layer).ενώ στίς περισσότερες περιπτώσεις οι καταγραφές ήταν μονές,δηλαδή υπήρχε μόνον ένα ηλεκτρόδιο καταγραφής είτε στην εξωτερική,είτε στην ενδιάμεση υπόστοιβάδα της μοριακής σοτοιβάδας,είτε στην στοιβάδα των σωμάτων των κοκκωδών κυττάρων. Όταν υπάρχει ερεθισμός στην εξωτερική αναμένεται η αναστροφή του EPSP της εξωτερικής σε θετικό στην μέση και στην στοιβάδα σωμάτων κοκκωδών κυττάρων Πρέπει επίσης να προσθέσουμε ότι στην στοιβάδα σωμάτων κοκκωδών κυττάρων πάντα καταγράφηκε θετικό το EPSP και αρνητικό το δυναμικό ενεργείας (PS). 2) Στην στοιβάδα εξωτερική του υπερπυραμιδικού πέταλου του κοιλιακού ιππόκαμπου,έχουμε διευκόλυνση σε 46 στις 52, και καταστολή μόνον σε 12 από τις 52 τομές. 3) Ερεθισμό στην μέση υποστοιβάδα του υπερπυραμιδικού πετάλου της μοριακής στοιβάδας έχουμε για τον ραχιαίο ιππόκαμπο σε 21 τομές. Φυσιολογικά, ο ερεθισμός στην μέση προκαλεί καταστολή με συζευξη παλμου (καταστολή, paird-pulse depression) όταν καταγράφουμε στην εξωτερική και στην μέση.αυτό συνέβη σε 16 στις 21 καταγραφές ενώ σε 9 στίς 21 είχαμε διευκόλυνση. 4) Στον κοιλιακό ιππόκαμπο με ερεθισμό στο υπερπυραμιδικό πέταλο στην ενδιάμεση υποστοιβάδα της μοριακής στοιβάδας (33 τομές), έχουμε διευκόλυνση σε 13 περιπτώσεις ενώ καταστολή σε 26 στις 33 περιπτώσεις. 5) α)με ερεθισμό του υποπυραμιδικού πετάλου (infrapyramidal blade) στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα έχουμε: α) Για τον ραχιαίο (dorsal) ιππόκαμπο (16 τομές συνολικά), διευκόλυνση σε 10 στις 16 τομές και καταστολή επίσης σε 10 στις 16 τομές (κάτι που είναι παράδοξο γιατί ο ερεθισμός στην εξωτερική πρέπει να παράγει διευκόλυνση κυρίως). β) Με ερεθισμό στο υποπυραμιδικό πέταλο της εξωτερικής μοριακής στοιβάδας έχουμε για τον κοιλιακό (ventral) ιππόκαμπο τα εξής: καταστολή σε15 στις 25 τομές και διευκόλυνση σε 15 στις 25 τομές επίσης,κάτι που επίσης είναι 30

31 παράδοξο όπως και στον ραχιαίο ιππόκαμπο αφού ερεθισμός στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα πρέπει να παράγει διευκόλυνση. γ) Βλέπουμε ότι για ερεθισμό στο υποπυραμιδικό πέταλο εξωτερική μοριακή στοιβάδα παίρνουμε σε ορισμένες τομές και για τον κοιλιακό και για τον ραχιαίο ιππόκαμπο μικτές καταγραφές, δηλαδή όχι μόνον διευκόλυνση ή καταστολή, αλλά στις περισσότερες τομές και τα δύο αποτελέσματα. Μάλιστα είναι δυνατόν, κάτι που δεν φαίνεται στον συγκεκριμένο πίνακα, κατά τη διάρκεια μιας συνάρτησης εισόδου εξόδου (input output) να έχουμε κατά τη διάρκεια αύξησης της έντασης ερεθισμού, μεταβολή του ανά παλμό αποτελέσματος και από διευκόλυνση να αλλάξει σε καταστολή και το αντίστροφο. 6) Ερεθίζοντας την μέση στοιβάδα του υποπυραμιδικού πετάλου έχουμε: α) Στον ραχιαίο (dorsal) ιππόκαμπο, σε 4 στις 18 τομές εμφανίζεταί το φαινόμενο της διευκόλυνσης και σε 16 στις 18 το φαινόμενο της καταστολής, που είναι αναμενόμενα αποτελέσματα για ερεθισμό στην ενδιάμεση υποστοιβάδα της μοριακής στοιβάδας. β) Στον κοιλιακό (ventral) ιππόκαμπο,διευκόλυνση έχουμε σε 8 στις 26 τομές, και καταστολή σε 20 στις 26 καταγραφές,αναλογία αναμενόμενη δηλαδή. Ακολουθούν ορισμένες ενδεικτικές ταυτόχρονες τριπλές καταγραφές όπου φαίνονται, στο λογισμικό πρόγραμμα Signal, οι κυματομορφές των προσυναπτικών και μετασυναπτικών δυναμικών πεδίου, μετά από επίδοση παλμών με συναρτήσεις εισόδου-εξόδου και σύζευξη παλμών. (Με κόκκινο βέλος σημειώνεται η στοιβάδα ερεθισμού). 31

32 Εικόνα

33 Εικόνα

34 Εικόνα

35 Εικόνα

36 Ιδιαιτερότητες της πειραματικής διαδικασίας που επηρέασαν τα αποτελέσματα. Τελικές παρατηρήσεις 1. Υπήρξε επίπονη προσπάθεια εντοπισμού των ιδιαιτεροτήτων της μελέτης της διατιτραίνουσας οδού, από την αλλαγή των γωνιών της εξαγωγής των τομών, μέχρι την εύρεση της βέλτιστης πολικότητας ερεθισμού που στην αρχή ακολουθούσε μια άγνωστη σε εμάς λογική (τελικά βρέθηκαν ανατομικά σημεία οδηγοί, όπως το αγγείο στο υπερπυραμιδικό πέταλο που εφάπτεται με την ιπποκάμπεια σχισμή). 2. Το EPSP που καταγράφεται στην οδοντωτή έλικα έχει μικρότερο μέγεθος τουλάχιστον σε σχέση με αυτά στην CA 1 περιοχή και η μέτρηση της slope ήταν πραγματικά δύσκολη. Η δυσκολία αναδεικνύεται ειδικά στην περίπτωση καταγραφής του EPSP που παράγεται από ερεθισμό της LPP ή MPP. 3. Τα δυναμικά ήταν ιδιαίτερα μικρά πολλές φορές, που είναι στοιχείο που προσδίδει πρόσθετες δυσκολίες τόσο στην εύρεση σημείων αξιόπιστης καταγραφής, όσο και στην μέτρηση των καταγραφών αυτών. 4. Το κορυφαίο όμως πρόβλημα υπήρξε η διαπλοκή των ινών της μέσης διατιτραίνουσας οδού προς τις ίνες της πλάγιας διατιτραίνουσας οδού. Όταν το φαινόμενο αυτό μεγάλωνε, μεγαλύτερη δηλαδή διασπορά των ινών της μέσης προς την πλάγια, φαίνεται πως αμβλυνόταν η διευκόλυνση φυσιολογικά αναμενόμενο αποτέλεσμα έως του σημείου ακόμη και αντιστροφής του φυσιολογικού αποτελέσματος και δημιουργίας καταστολής. Για αυτό και στους ερεθισμούς της μέσης PP είχαμε πιο αμιγή αποτελέσματα, αφού οι ίνες της πλάγιας μένουν στην υποστοιβάδα τους και δεν διαπλέκονται με την μέση. 5. Επιπλέον θα υπολογιστούν παράμετροι όπως μελέτη της βραχύχρονης πλαστικότητας με περαιτέρω μεθόδους όπως η FS (frequency stimulation) και περισσότερων μεσοπαλμικών διαστημάτων (ΜΠΔ). Επίσης μελέτη και της LTP (Long Term Potentiation) στην οδοντωτή έλικα. 36

37 Β. Ειδικά αποτελέσματα Ακολουθούν οι συναρτήσεις με τα μεγέθη τα οποία καταγράψαμε (EPSP, PS), τόσο σε σχέση μεταξύ τους, όσο κυρίως και με το ρεύμα μεταβάλλοντας την ισχύ του ερεθισμού (κυρίως κυμαινόμενο από 20 μα έως 320 μα), σε μια μεσαία κλίμακα έντασης ερεθισμού. Οι συναρτήσεις δίνονται ανά πέταλο (δηλαδή υπερπυραμιδικό πέταλο ή υποπυραμιδικό πέταλο), ανά υποστοιβάδα ερεθισμού (δηλαδή εξωτερική (1) ή μέση (2)) και ανά υποστοιβάδα καταγραφής (δηλαδή εξωτερική (1) ή μέση (2) ή στοιβάδα σωμάτων κοκκωδών κυττάρων (3). π.χ. υπερπυραμιδικό πέταλο_2_3: είναι ο τίτλος για τις συναρτήσεις των τιμών των μεγεθών, που καταγράφηκαν στην στοιβάδα σωμάτων κοκκωδών κυττάρων υποστοιβάδα όταν ερεθίζουμε την μέση μοριακή στοιβάδα του υπερπυραμιδικού πέταλου. Έχουμε λοιπόν: (1) Εικόνα 22. Υπερπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα. Περίπου ίση συναπτική αποτελεσματικότητα για κοιλιακό και ραχιαίο ιππόκαμπο σε όλους τους ερεθισμούς. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=44 Κοιλιακός: n=37),p > 0,05 37

38 Εικόνα 23. Υπερπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην εξωτερική στοιβάδα_καταγραφή στη στοιβάδα των σωμάτων των κοκκωδών κυττάρων.φανερά μεγαλύτερη διεγερσιμότητα για τον κοιλιακό ιππόκαμπο,σε όλο το εύρος των ερεθισμών. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=16 Κοιλιακός: n=32),p < 0,05 38

39 Εικόνα 24. Υπερπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα. Γενικά έχουμε διευκόλυνση σε ποσοστό 15-30% παρόμοια για κοιλιακό και ραχιαίο ιππόκαμπο. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=44 Κοιλιακός: n=37),p > 0,05 EPSP2 EPSP1 EPSP1. = x100 EPSP1 39

40 Εικόνα 25. Υπερπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην μέση μοριακή σοιβάδα.ίση συναπτική αποτελεσματικότητα στους δυό πόλους. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=18 Κοιλιακός: n=11),p > 0,05 40

41 Εικόνα 26. Υπερπυραμιδικό πέταλο_ερέθισμός στην εξωτερική_καταγραφή στη μέση μοριακή στοιβάδα.παρόμοια διευκόλυνση για ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο,της ταξεως του 15% περίπου. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=18 Κοιλιακός: n=11),p > 0,05 41

42 Εικόνα27. Υπερπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην ενδιάμεση μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην εξωτερική. 42

43 Εικόνα 28. Υπερπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην ενδιάμεση μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στη στοιβάδα των σωμάτων των κοκκωδών κυττάρων. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=7 Κοιλιακός: n=14),p > 0,05 43

44 Εικόνα 29. Υπερπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην ενδιάμεση μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην ενδιάμεση υποστοιβάδα της μοριακής στοιβάδας. 44

45 Εικόνα 30. Υπερπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στη μέση μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στη μέση μοριακή στοιβάδα.παρόμοια συναπτική αποτελεσματικότητα για τους δυό πόλους του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=19 Κοιλιακός: n=25),p > 0,05 45

46 Εικόνα 31. Υπερπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην ενδιάμεση στοιβάδα της μοριακής στοιβάδας_καταγραφή στην ενδιάμεση επίσης.καταστολή με σύζευξη παλμών από κοινού για ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο,σε ποσοστό 10-20%. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=19 Κοιλιακός: n=25),p > 0,05 46

47 Εικόνα 32. Υπoπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα.παρόμοια συναπτική αποτελεσματικότητα για κοιλιακό και ραχιαίο ιπποκαμπο. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=9 Κοιλιακός: n=11),p > 0,05 47

48 Εικόνα 33. Υποπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην στοιβάδα των σωμάτων των κοκκωδών κυττάρων.ίση διεγερσιμότητα για τους δυό πόλους του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=48 Κοιλιακός: n=30),p > 0,05 48

49 Εκόνα 34. Υποπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην εξωτερική. μοριακή στοιβάδα.μικτή εικόνα που περιλαμβάνει καταστολή και διευκόλυνση και στους δυό πόλους,αλλά με τιμές ως επι τώ πλείστον κοντά στο +/-10%. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=9 Κοιλιακός: n=11),p > 0,05 49

50 Εικόνα 35. Υποπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην εξωτερική διατιτραίνουσα οδό_καταγραφή στην ενδιάμεση μοριακή στοιβάδα.παρόμοια συναπτική αποτελεσματικότητα για ραχιαίο και κοιλιακό ιππόκαμπο. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=6 Κοιλιακός: n=12),p > 0,05 50

51 Εικόνα 36. Υποπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην ενδιάμεση μοριακή στοιβάδα. Σε μικρές εντάσεις ερεθισμού (εώς 100μΑ) έχουμε μικρή διευκόλυνση με σύζευξη παλμών για τον κοιλιακό ιππόκαμπο,ενώ για τον ραχιαίο (μικρή;) καταστολή,ενώ για μεγαλύτερους ερεθισμούς δεν φαίνεται καταστολή ή διευκόλυνση για κανένα από τους δύο πόλους. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=6 Κοιλιακός: n=12),p > 0,05 51

52 Εικόνα 37. Υποπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην ενδιάμεση μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα. 52

53 Εικόνα 38. Υποπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην ενδιάμεση μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην στοιβάδα των σωμάτων των κοκκωδών κυττάρων. Παρόμοια διεγερσιμότητα για κοιλιακό και ραχιαίο ιππόκαμπο. Mann-Whitney Test,(Ραχιαίος:n=34 Κοιλιακός: n=26),p > 0,05. 53

54 Εικόνα 39. Υποπυραμιδικό πέταλο_ερεθισμός στην ενδιάμεση μοριακή στοιβάδα_καταγραφή στην εξωτερική μοριακή στοιβάδα. 54