ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΗΣ mrna ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ ΚΑΛΛΙΚΡΕΪΝΗΣ- 13 (KLK13) ΜΕ ΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ΑΔΕΝΟΚΑΡΚΙΝΩΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΧΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΟΥΔΑΚΗΣ Χειρουργός ΑΘΗΝΑ, ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2016

2

3 Στο Γιάννη και την Αφροδίτη για το χρόνο που τους στέρησα

4

5 Ημερομηνία αίτησης διδακτορικής διατριβής και ορισμού 3μελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής : Ημερομηνία ορισμού 3μελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής: Μέλη Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής: Παπαδόπουλος Ιορδάνης, Καθηγητής Χειρουργικής Ε.Κ.Π.Α. (Επιβλέπων) Σκορίλας Ανδρέας, Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας Ε.Κ.Π.Α. Σαφιολέας Μιχαήλ, Καθηγητής Χειρουργικής Ε.Κ.Π.Α. Ημερομηνία ορισμού θέματος διδακτορικής διατριβής: Ημερομηνία κατάθεσης διδακτορικής διατριβής: Πρόεδρος Ιατρικής Σχολής Ε.Κ.Π.Α.: Σφηκάκης Πέτρος, Καθηγητής Παθολογίας Μέλη Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής: Παπαδόπουλος Ιορδάνης, Καθηγητής Χειρουργικής Ε.Κ.Π.Α. (Επιβλέπων) Σκορίλας Ανδρέας, Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας Ε.Κ.Π.Α. Σαφιολέας Μιχαήλ, Καθηγητής Χειρουργικής Ε.Κ.Π.Α. Μουτσάτσου-Λαδικού Παρασκευή, Καθηγήτρια Κλινικής Βιοχημείας Ε.Κ.Π.Α. Στεργιόπουλος Σπυρίδων, Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Ε.Κ.Π.Α. Δανιάς Νικόλαος, Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Ε.Κ.Π.Α. Βασιλείου Παντελεήμων, Επίκουρος Καθηγητής Χειρουργικής Ε.Κ.Π.Α. Βαθμός διδακτορικής διατριβής: ΆΡΙΣΤΑ i

6 Η έγκριση διδακτορικής διατριβής από τη Σχολή Θετικών Επιστημών δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα (Άρθρο 202, Παρ. 2, Ν. 5343/32). ii

7 Όρκος του Ιπποκράτη Ὄμνυμι Ἀπόλλωνα ἰητρὸν, καὶ Ἀσκληπιὸν, καὶ Ὑγείαν, καὶ Πανάκειαν, καὶ θεοὺς πάντας τε καὶ πάσας, ἵστορας ποιεύμενος, ἐπιτελέα ποιήσειν κατὰ δύναμιν καὶ κρίσιν ἐμὴν ὅρκον τόνδε καὶ ξυγγραφὴν τήνδε. Ἡγήσασθαι μὲν τὸν διδάξαντά με τὴν τέχνην ταύτην ἴσα γενέτῃσιν ἐμοῖσι, καὶ βίου κοινώσασθαι, καὶ χρεῶν χρηίζοντι μετάδοσιν ποιήσασθαι, καὶ γένος τὸ ἐξ ωὐτέου ἀδελφοῖς ἴσον ἐπικρινέειν ἄῤῥεσι, καὶ διδάξειν τὴν τέχνην ταύτην, ἢν χρηίζωσι μανθάνειν, ἄνευ μισθοῦ καὶ ξυγγραφῆς, παραγγελίης τε καὶ ἀκροήσιος καὶ τῆς λοιπῆς ἁπάσης μαθήσιος μετάδοσιν ποιήσασθαι υἱοῖσί τε ἐμοῖσι, καὶ τοῖσι τοῦ ἐμὲ διδάξαντος, καὶ μαθηταῖσι συγγεγραμμένοισί τε καὶ ὡρκισμένοις νόμῳ ἰητρικῷ, ἄλλῳ δὲ οὐδενί. Διαιτήμασί τε χρήσομαι ἐπ' ὠφελείῃ καμνόντων κατὰ δύναμιν καὶ κρίσιν ἐμὴν, ἐπὶ δηλήσει δὲ καὶ ἀδικίῃ εἴρξειν. Οὐ δώσω δὲ οὐδὲ φάρμακον οὐδενὶ αἰτηθεὶς θανάσιμον, οὐδὲ ὑφηγήσομαι ξυμβουλίην τοιήνδε. Ὁμοίως δὲ οὐδὲ γυναικὶ πεσσὸν φθόριον δώσω. Ἁγνῶς δὲ καὶ ὁσίως διατηρήσω βίον τὸν ἐμὸν καὶ τέχνην τὴν ἐμήν. Οὐ τεμέω δὲ οὐδὲ μὴν λιθιῶντας, ἐκχωρήσω δὲ ἐργάτῃσιν ἀνδράσι πρήξιος τῆσδε. Ἐς οἰκίας δὲ ὁκόσας ἂν ἐσίω, ἐσελεύσομαι ἐπ' ὠφελείῃ καμνόντων, ἐκτὸς ἐὼν πάσης ἀδικίης ἑκουσίης καὶ φθορίης, τῆς τε ἄλλης καὶ ἀφροδισίων ἔργων ἐπί τε γυναικείων σωμάτων καὶ ἀνδρῴων, ἐλευθέρων τε καὶ δούλων. Ἃ δ' ἂν ἐν θεραπείῃ ἢ ἴδω, ἢ ἀκούσω, ἢ καὶ ἄνευ θεραπηίης κατὰ βίον ἀνθρώπων, ἃ μὴ χρή ποτε ἐκλαλέεσθαι ἔξω, σιγήσομαι, ἄῤῥητα ἡγεύμενος εἶναι τὰ τοιαῦτα. Ὅρκον μὲν οὖν μοι τόνδε ἐπιτελέα ποιέοντι, καὶ μὴ ξυγχέοντι, εἴη ἐπαύρασθαι καὶ βίου καὶ τέχνης δοξαζομένῳ παρὰ πᾶσιν ἀνθρώποις ἐς τὸν αἰεὶ χρόνον. παραβαίνοντι δὲ καὶ ἐπιορκοῦντι, τἀναντία τουτέων. iii

8 Όρκος του Ιπποκράτη - απόδοση στα νέα ελληνικά Ορκίζομαι στο θεό Απόλλωνα τον ιατρό και στο θεό Ασκληπιό και στην Υγεία και στην Πανάκεια και επικαλούμενος τη μαρτυρία όλων των θεών, ότι θα εκτελέσω κατά τη δύναμη και την κρίση μου τον όρκο αυτόν και τη συμφωνία αυτή. Να θεωρώ τον διδάσκαλό μου της ιατρικής τέχνης ίσο με τους γονείς μου και την κοινωνό του βίου μου. Και όταν χρειάζεται χρήματα να μοιράζομαι μαζί του τα δικά μου. Να θεωρώ την οικογένειά του αδέλφια μου και να τους διδάσκω αυτήν την τέχνη αν θέλουν να την μάθουν χωρίς δίδακτρα ή άλλη συμφωνία. Να μεταδίδω τους κανόνες ηθικής, την προφορική διδασκαλία και όλες τις άλλες ιατρικές γνώσεις στους γιους μου, στους γιους του δασκάλου μου και στους εγγεγραμμένους μαθητές που πήραν τον ιατρικό όρκο, αλλά σε κανέναν άλλο. Θα χρησιμοποιώ τη θεραπεία για να βοηθήσω τους ασθενείς κατά τη δύναμη και την κρίση μου, αλλά ποτέ για να βλάψω ή να αδικήσω. Ούτε θα δίνω θανατηφόρο φάρμακο σε κάποιον που θα μου το ζητήσει, ούτε θα του κάνω μια τέτοια υπόδειξη. Παρομοίως, δεν θα εμπιστευτώ σε έγκυο μέσο που προκαλεί έκτρωση. Θα διατηρώ αγνή και άσπιλη και τη ζωή και την τέχνη μου. Δεν θα χρησιμοποιώ νυστέρι ούτε σε αυτούς που πάσχουν από λιθίαση, αλλά θα παραχωρώ την εργασία αυτή στους ειδικούς της τέχνης. Σε όσα σπίτια πηγαίνω, θα μπαίνω για να βοηθήσω τους ασθενείς και θα απέχω από οποιαδήποτε εσκεμμένη βλάβη και φθορά, και ιδίως από γενετήσιες πράξεις με άνδρες και γυναίκες, ελεύθερους και δούλους. Και όσα τυχόν βλέπω ή ακούω κατά τη διάρκεια της θεραπείας ή και πέρα από τις επαγγελματικές μου ασχολίες στην καθημερινή μου ζωή, αυτά που δεν πρέπει να μαθευτούν παραέξω δεν θα τα κοινοποιώ, θεωρώντας τα θέματα αυτά μυστικά. Αν τηρώ τον όρκο αυτό και δεν τον παραβώ, ας χαίρω πάντοτε υπολήψεως ανάμεσα στους ανθρώπους για τη ζωή και για την τέχνη μου. Αν όμως τον παραβώ και επιορκήσω, ας πάθω τα αντίθετα. iv

9 ΚΩΝΣΤΑΝΤΟΥΔΑΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΣΥΝΟΠΤΙΚΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ Γεννηθείς στο Ηράκλειο Κρήτης το Αποφοίτηση από το 5ο Γενικό Λύκειο Ηρακλείου το 1990 και εισαγωγή στην Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Κρήτης με Πανελλήνιες Εξετάσεις (3ος σε σειρά κατάταξης). Κατά τη διάρκεια φοίτησης στη Σχολή, η κλινική άσκηση στην Παθολογία έγινε στην Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Louis Pasteur στο Στρασβούργο (Παν/κό Νοσοκομείο Hautepierre) μέσω του προγράμματος Erasmus (υποτροφία από το ΙΚΥ) και η κλινική άσκηση στη Μαιευτική-Γυναικολογία έγινε στην Ιατρική σχολή του ΕΚΠΑ (Νοσοκομείο Αλεξάνδρα ). Ορκωμοσία και λήψη πτυχίου το Υπηρεσία υπαίθρου στο Π Ι Πρασσών (ΚΥ Αγ Φωτεινής Αμαρίου, νομός Ρεθύμνης) την περίοδο Στρατιωτική θητεία στις Ειδικές Δυνάμεις του ΕΣ Έναρξη ειδικότητας Γενικής Χειρουργικής στο Γ Ν Ν Αγίου Νικολάου Κρήτης το Συνέχιση στο ΠαΓΝΗ μέχρι τον 4ο/2003. Ακολούθησε 1 έτος βασικής έρευνας στην Ιατρική Σχολή του Παν/μίου Κρήτης και συνέχιση της ειδικότητας στο ΠΓΝ ΑΤΤΙΚΟΝ (Δ Παν/κή Χειρουργική Κλινική) από τον 4ο/2004. Λήξη του χρόνου ειδίκευσης τον 4ο/2008 και παραμονή ως υπεράριθμος μέχρι τέλος 8ου/2008. Εξετάσεις ειδικότητας τον 2ο/2009 επιτυχώς. Παραμονή ως επιστημονικός συνεργάτης στη Δ Χειρουργική Κλινική στο ΠΓΝ ΑΤΤΙΚΟΝ έως τον 12ο/2009 και εργασία σχετικά με τη διδακτορική διατριβή. Επικουρικός Επιμελητής Β στο Γ Ν Δυτικής Αττικής Η Αγία Βαρβάρα από τον 2ο/2010 έως τον 2ο/2011. Επιστημονικός συνεργάτης στη Δ Χειρουργική Κλινική στο ΠΓΝ ΑΤΤΙΚΟΝ το 2011 και εργασία σχετικά με τη διδακτορική διατριβή. Κατά τα έτη συμμετοχή στο Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών στην Ιατρική Σχολή του Παν/μίου Θράκης στη Χειρουργική Ήπατος-Χοληφόρων- Παγκρέατος. Το 2012 εργασία σε θέση εκπαιδευόμενου εθελοντή για 3 μήνες στο Trauma & Emergency Surgery Unit στο Chris Hani Baragwanath Academic Hospital στο Johannesburg (South Africa) με υποτροφία από την ΕΧΕ. Εν συνεχεία, προετοιμασία v

10 και συμμετοχή στις εξετάσεις του Εθνικού Συμβουλίου Υγείας Νοτίου Αφρικής (HPCSA) τον 10ο/2012 επιτυχώς. Κατά το έτος 2013 εργασία σχετικά με τη διδακτορική διατριβή και συμμετοχή σε χειρουργικές επεμβάσεις ως βοηθός στον ιδιωτικό τομέα (Αθήνα). Τον Μάιο 2014 μετάβαση στο Johannesburg και έναρξη εργασίας στο Trauma & Emergency Surgery Unit στο Chris Hani Baragwanath Academic Hospital από τον 6ο/2014 έως και τον 10ο/2015. Από τον 2ο/2016 έως τον 4ο/2016 θέση Clinical Fellow στο Τμήμα Γενικής και Λαπαροσκοπικής Χειρουργικής στο Royal Surrey County Hospital (Guildford). Από τον 5ο/2016 έως σήμερα εργασία σε θέση Επικουρικού Επιμελητή Β στη Χειρουργική Κλινική του Γ Ν Ναυπλίου. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην Επείγουσα Χειρουργική και στο Τραύμα, στη Χειρουργική Ήπατος-Χοληφόρων-Παγκρέατος και στη Λαπαροσκοπική Χειρουργική. vi

11 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε κατά το χρονικό διάστημα Ιούλιος Σεπτέμβριος 2016 στη Δ Χειρουργική Κλινική του ΕΚΠΑ και στον Τομέα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογίας του ΕΚΠΑ, με επιστημονικούς υπεύθυνους τον Καθηγητή Χειρουργικής Ιορδάνη Παπαδόπουλο και τον Καθηγητή Μοριακής Βιολογίας Ανδρέα Σκορίλα. Θέλω κατ αρχήν να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον επιβλέποντα της παρούσας διδακτορικής διατριβής, Καθηγητή Χειρουργικής Ιορδάνη Παπαδόπουλο, για την ευκαιρία που μου έδωσε, την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και για τη συνεχή επιστημονική καθοδήγηση. Του είμαι ευγνώμων για τη αμέριστη συμπαράσταση και υποστήριξη και για το ειλικρινές ενδιαφέρον. Θερμές ευχαριστίες επίσης θέλω να εκφράσω στον Καθηγητή Κλινικής Βιοχημείας Ανδρέα Σκορίλα, τόσο για τη συμμετοχή του στην Τριμελή Συμβουλευτική Επιτροπή, όσο και για τη δυνατότητα που μου έδωσε να πραγματοποιηθούν τα πειράματα στο Εργαστήριο Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας. Ειλικρινά τον ευχαριστώ για τις εύστοχες υποδείξεις στις εκθέσεις προόδου και για τη στατιστική επεξεργασία των δεδομένων. Ευχαριστώ επίσης τον Καθηγητή Χειρουργικής Μιχαήλ Σαφιολέα για τη συμμετοχή του στην Τριμελή Συμβουλευτική Επιτροπή και για το ενδιαφέρον του ως Διευθυντής της Δ Χειρουργικής Κλινικής στο ΠΓΝ ΑΤΤΙΚΟΝ να μου δώσει την ευκαιρία να πραγματοποιήσω τη συγκεκριμένη έρευνα. Θέλω επίσης να ευχαριστήσω ολόθερμα τη Δρα Φλώρου Δήμητρα στο Εργαστήριο Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας για την άψογη συνεργασία, τη συμβολή της στην επεξεργασία των ιστικών δειγμάτων και την πραγματοποίηση των πειραμάτων, χωρίς την οποία θα ήταν αδύνατη η ολοκλήρωση της διδακτορικής διατριβής. Την ευχαριστώ επίσης για την επιστημονική βοήθεια, την καθοδήγηση και τις πολύτιμες συμβουλές σε ό,τι αφορά την όλη διαδικασία των πειραμάτων PCR στο Εργαστήριο. Θα ήταν παράλειψη να μην εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες στην Καθηγήτρια Βιοχημείας Αναστασία Μουτσάτσου-Λαδικού και στους Επίκουρους Καθηγητές Χειρουργικής και δάσκαλούς μου κατά τη διάρκεια της vii

12 ειδικότητάς μου στο ΠΓΝ ΑΤΤΙΚΟΝ Σπύρο Στεργιόπουλο, Νίκο Δανιά και Παντελή Βασιλείου για την τιμή που μου έκαναν να συμμετέχουν στην Επταμελή Εξεταστική Επιτροπή. Τελειώνοντας θέλω να ευχαριστήσω ξανά τον Καθηγητή Ιορδάνη Παπαδόπουλο και τους Επίκουρους Καθηγητές Σπύρο Στεργιόπουλο, Νίκο Δανιά και Παντελή Βασιλείου, για όλα όσα με δίδαξαν κατά την ειδίκευσή μου στη Γενική Χειρουργική, τα οποία αποδεικνύονται όλο και πιο πολύτιμα με την πάροδο του χρόνου. viii

13 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η γονιδιακή βάση της διαδικασίας της καρκινογένεσης, έχει μελετηθεί περισσότερο ή λιγότερο ανάλογα με τον τύπο της νεοπλασίας. Για παράδειγμα στον καρκίνο του παχέος εντέρου, έχει διερευνηθεί σε μεγάλη έκταση η διαδικασία της καρκινογένεσης και το χρονικό διάστημα που απαιτείται μέχρι την εμφάνιση του όγκου (γονίδια p52, οικογένεια Bcl κλπ). Σχετικά με τον καρκίνο του προστάτη, η γένεσή του δεν είναι γνωστή σε τέτοια έκταση, αλλά έχει βρεθεί ένα πρωτεϊνικό μόριο, το PSA (το οποίο είναι μία καλλικρεΐνη), που αποτελεί αξιόπιστο βιολογικό δείκτη για το συγκεκριμένο καρκίνο. Η έρευνα για την καρκινογένεση σε όλα τα είδη των νεοπλασιών, αποφέρει συνεχώς νέα δεδομένα. Σε ό,τι αφορά τον καρκίνο του στομάχου, έχει προκύψει αξιοσημείωτη πρόοδος τις τελευταίες δεκαετίες όσο οι έρευνες εξελίσσονται. Νέα στοιχεία για το γονιδιακό υπόβαθρο και την καλύτερη κατανόηση των αιτιών, το ρόλο του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού, την πιθανή διαφορετική συμπεριφορά του καρκίνου ανάλογα με την ανατομική εντόπιση, τη διασπορά και τη δυνατότητα πρωιμότερης διάγνωσης, αποτελούν βήματα προόδου και μπορούν να συμβάλλουν σε καλύτερη πρόγνωση. Η λεμφαγγειακή διασπορά συνεχίζει να αποτελεί έναν από τους κυριότερους προγνωστικούς παράγοντες και να καθορίζει τη σταδιοποίηση και τις θεραπευτικές επιλογές. Η χειρουργική αντιμετώπιση του γαστρικού καρκίνου έχει εν πολλοίς τυποποιηθεί και υπάρχουν πρωτόκολλα συμπληρωματικών θεραπειών. Υπάρχουν εντούτοις ακόμη σημεία αντιπαράθεσης που χρήζουν περαιτέρω έρευνας, ώστε να υπάρξει βελτίωση της πρόγνωσης. Η διαδικασία της κακοήθους εξαλλαγής στο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου έχει μελετηθεί αρκετά και έχουν βρεθεί διάφορα γονίδια που εμπλέκονται σ αυτήν (c-met, k-sam, c-erbb2, p53, APC, HER2/NEU, CDH1 KLK6, KLK10 και άλλα), ορισμένα από αυτά με αποδεδειγμένη κλινική σημασία. Οι μέχρι σήμερα μελέτες δεν έχουν καταλήξει στην εφαρμογή μιας γονιδιακής έκφρασης ή ενός πρωτεϊνικού παραγώγου γονιδίου που να μπορέσουν να αποτελέσουν δείκτη πρώιμης διάγνωσης ή/και προγνωστικής αξίας στο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου. Υπάρχει ως εκ τούτου η ανάγκη ix

14 ανεύρεσης ενός βιολογικού δείκτη στον γαστρικό καρκίνο, που να μπορεί να εφαρμοστεί στην κλινική πράξη. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι να συμβάλλει προς αυτήν την κατεύθυνση, μελετώντας την mrna έκφραση στο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου ενός από τα γονίδια της οικογένειας των καλλικρεϊνών και συγκεκριμένα του KLK13. x

15 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. Γενικό μέρος. 1 Κεφάλαιο 1 Στόμαχος Εμβρυολογία Ανατομία Ιστολογία Στοιχεία Φυσιολογίας. 44 Κεφάλαιο 2 Αδενοκαρκίνωμα στομάχου Επιδημιολογία Αίτια - Παράγοντες κινδύνου Γενετικό υπόβαθρο Μορφολογική & Ιστολογική ταξινόμηση Κλινική εικόνα Εργαστηριακός/Παρακλινικός έλεγχος Σταδιοποίηση.. 77 Πρώιμος γαστρικός καρκίνος 91 Καρκίνος Καρδιοοισοφαγικής Συμβολής Αντιμετώπιση.. 94 Χειρουργική.. 94 Επικουρική/Νεο-Επικουρική Πρόγνωση Παρηγορική Θεραπεία Παρακολούθηση. 98 Σελ Κεφάλαιο 3 Καλλικρεΐνες Γενικά Καλλικρεΐνες και ανθρώπινες ασθένειες Οι καλλικρεΐνες ειδικά 109 Β. Ειδικό μέρος. 119 Κεφάλαιο 1 Ασθενείς και Μέθοδοι Σκοπός Ασθενείς Συλλογή και φύλαξη ιστών και δειγμάτων αίματος Νουκλεϊκά οξέα - Διαδικασίες Απομόνωσης RNA, Σύνθεσης και Ενίσχυσης cdna Κυτταρική σειρά AGS Ομογενοποίηση κυττάρων AGS και ιστικών δειγμάτων Απομόνωση RNA Ποσοτικός προσδιορισμός και Ποιοτική ανάλυση xi

16 του ολικού RNA Προσδιορισμός της συγκέντρωσης και εκτίμηση της καθαρότητας Ποιοτικός έλεγχος σε πήκτωμα αγαρόζης Παρασκευή cdna με αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής Γενικά Περιγραφή της μεθόδου Ενίσχυση cdnas συγκεκριμένων αλληλουχιών Ποιοτική PCR Γενικά Μέθοδος α) Σχεδιασμός και χαρακτηριστικά των εκκινητών της Συμβατικής PCR 151 β) Συνθήκες συμβατικής PCR για τα γονίδια GAPDH και KLK γ) Ποιοτική ανάλυση των προϊόντων της PCR σε πήκτωμα αγαρόζης Μεθοδολογία της ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο Γενικά α) Σχεδιασμός και ιδιότητες των εκκινητών της qreal-time PCR β) Χημικά συστήματα ανίχνευσης γ) Βασικές αρχές της μεθόδου qreal-time PCR. 163 δ) Ανάλυση και έλεγχος των προϊόντων της qreal-time PCR Ειδικά α) Παράγοντες για το σχεδιασμό των ειδικών εκκινητών β) Ιδιότητες εκκινητών για τα γονίδια GAPDH και KLK γ) Συνθήκες ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο. 172 δ) Σχετική ποσοτικοποίηση της KLK13 έκφρασης με τη μέθοδο 2 -ΔΔCt Στατιστική ανάλυση 177 Κεφάλαιο 2 Αποτελέσματα 180 Κεφάλαιο 3 Συζήτηση Συμπέρασμα 194 Περίληψη. 199 Summary. 203 Βιβλιογραφία. 207 Παράρτημα 1 Έγκριση Επιτροπής Βιοηθικής Δεοντολογίας 219 Παράρτημα 2 Έντυπο Συναίνεσης Ασθενούς 222 Παράρτημα 3 Δημοσίευση xii

17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1

18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΣΤΟΜΑΧΟΣ 1.1 ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑ Ο στόμαχος, όπως και ο οισοφάγος και το εγγύς 12δάκτυλο, προέρχονται από το εμβρυικό (αρχέγονο) πρόσθιο έντερο (foregut). Από το αρχέγονο έντερο προέρχονται επίσης το ήπαρ με τα χοληφόρα και το πάγκρεας, καθώς και ο φάρυγγας με την τραχεία. Ο στόμαχος ξεκινά ως μία διάταση στο σωληνώδες εμβρυικό πρόσθιο έντερo κατά την 4η εβδομάδα της κύησης στο επίπεδο Α3-Α5 αυχενικών σπονδύλων (Εικόνες 1.1 & 1.2Α). Στο τέλος της 7ης εβδομάδας κατέρχεται στο επίπεδο των Θ5-Θ10, εξαιτίας της ανάπτυξης άλλων εμβρυικών οντοτήτων κεφαλικά. Με την πλήρη ανάπτυξή του, ο στόμαχος παίρνει την τελική του θέση στο επίπεδο μεταξύ Θ10 και Ο3 σπονδύλων. Εικόνα 1.1 Ανάπτυξη του στομάχου (4η εβδομάδα), πρόσθιο και οπίσθιο μεσεντέριο (Πηγή: 2

19 Πιθανότατα συμβαίνει μία περιστροφή κατά 90 0 ωρολογιακά γύρω από τον επιμήκη άξονα του στομάχου, ωθώντας το οπίσθιο μεσογάστριο προς τα αριστερά (Εικόνες 1.2Β & 1.3). Στη φάση αυτή γίνεται και η διαμόρφωση του επιπλοϊκού θυλάκου. Είναι λόγω της περιστροφής αυτής που η τοπογραφική ανατομία των πνευμονογαστρικών νεύρων αλλάζει και έτσι το αριστερό στέλεχος νευρώνει το πρόσθιο, ενώ το δεξιό νευρώνει το οπίσθιο τοίχωμα του στομάχου (Εικόνα 1.3). [1] Εικόνα 1.2 Ανάπτυξη του στομάχου. Α 3η-4η εβδομάδα. Β 5η εβδομάδα, αρχή περιστροφής του στομάχου. (Πηγή: m=isch&tbo=u&source=univ&sa=x&sqi=2&ved=0ahukewie6rzngc7lahxgqzokhc1odk8q saqigq#imgrc=_ ) 3

20 Η περιστροφή γύρω από τον προσθιοπίσθιο άξονα, αλλάζει τη θέση της καρδίας και του πυθμένα του στομάχου, καθώς και εκείνη του πυλωρού και της γαστροδωδεκαδακτυλικής συμβολής. Ως αποτέλεσμα των δύο αυτών περιστροφών, η αρχική οπίσθια μέση γραμμή του στομάχου γίνεται το μείζον τόξο και η πρόσθια μέση γραμμή αποτελεί το έλασσον τόξο (Εικόνα 1.3). Εικόνα 1.3 Περιστροφές του στομάχου. A-C Λοξές μετωπιαίες όψεις. C περιστροφή κατά τον επιμήκη άξονα. D Μετωπιαία όψη, περιστροφή κατά τον προσθιοπίσθιο άξονα. Το οπίσθιο τοίχωμα του στομάχου αναπτύσσεται κατά την 4η-5η εβδομάδα και σχηματίζεται το μείζον τόξο. (Πηγή: Μόνο το κρανιακό άκρο του κοιλιακού (πρόσθιου) μεσεντερίου του στομάχου παραμένει στον ενήλικα, με το πρόσθιο τμήμα αυτού να αποτελεί το δρεπανοειδή σύνδεσμο (Εικόνα 1). Το οπίσθιο γίνεται ο ηπατογαστρικός και ο ηπατοδωδεκαδακτυλικός σύνδεσμος, δηλαδή το έλασσον επίπλουν. Η αποφραχθείσα αριστερή ομφαλική φλέβα αποτελεί το στρογγύλο σύνδεσμο, 4

21 που είναι το ελεύθερο άκρο του δρεπανοειδούς συνδέσμου. Το οπίσθιο μεσεντέριο του στομάχου δίνει γένεση σε τρεις ανατομικές δομές: το γαστροκολικό, το γαστροσπληνικό και το γαστροφρενικό σύνδεσμο [2]. Μέχρι τον όγδοο μήνα, το έλασσον τόξο αναπτύσσεται με πιο αργό ρυθμό απ ότι το μείζον τόξο, με αποτέλεσμα η κυρτότητά του να παίρνει την τελική της μορφή και ο πυθμένας του στομάχου να αυξάνεται σε μέγεθος. Το εγγύς τμήμα του στομάχου μετατοπίζεται προς τα αριστερά αποτελώντας το μόνιμο πυθμένα και το περιφερικό μετακινείται προς τα δεξιά, σχηματίζοντας τον πυλωρό. Μερικοί συγγραφείς δε θεωρούν ότι συμβαίνουν οι περιγραφείσες περιστροφικές αλλαγές στη θέση του στομάχου και πιστεύουν ότι επιτελούνται εσωτερικές αυξητικές αλλαγές και στα δύο τόξα και ότι δεν υπάρχουν ενδείξεις περιστροφής του οργάνου [3]. Ο μυικός χιτώνας αναπτύσσεται μεταξύ της 8ης και της 14ης εβδομάδας. Οι πρώτοι αδενικοί θύλακες εμφανίζονται στο έλασσον τόξο μεταξύ 6ης και 9ης εβδομάδας και από την 10η βρίσκονται σε όλο το στόμαχο. Κατά τη γέννηση υπάρχουν περίπου αδένες. Τα τοιχωματικά κύτταρα αναγνωρίζονται γύρω στην 11η εβδομάδα και τα chief κύτταρα στη 12η. Την ίδια περίοδο εμφανίζονται και τα βλεννώδη κύτταρα, ενώ η πεψίνη βρίσκεται κατά το 2ο μισό του 6ου μήνα [1]. 5

22 1.2 ΑΝΑΤΟΜΙΑ 1.2Α ΤΟΠΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΑ Ο στόμαχος είναι από τα πλέον κινητά ενδοκοιλιακά όργανα. Η θέση του εξαρτάται από πολλούς παράγοντες, όπως η θέση του ατόμου, η πληρότητα του στομάχου, η πληρότητα του εντέρου, ο τόνος του κοιλιακού τοιχώματος. Τα μόνα σημεία όπου το στομάχι είναι σταθερό, είναι αφενός η γαστροοισοφαγική συμβολή, η οποία βρίσκεται αριστερά της μέσης γραμμής, όπισθεν του 7ου πλευρικού χόνδρου, στο ύψος του Θ10 σπονδύλου, αφετέρου το τμήμα της 1ης μοίρας του δωδεκαδακτύλου που έχει πρόσθιο και οπίσθιο μεσεντέριο. Προσθίως ο στόμαχος βρίσκεται σε επαφή με το ήπαρ, το διάφραγμα και το πρόσθιο κοιλιακό τοίχωμα. Η οπίσθια επιφάνεια του στομάχου εφάπτεται (όταν το άτομο βρίσκεται σε ύπτια θέση), με το διάφραγμα, το σπλήνα, τον αριστερό νεφρό και επινεφρίδιο, το πάγκρεας, το εγκάρσιο μεσόκολο και τη σπληνική καμπή του παχέος εντέρου (Εικόνα 1.4). Η θέση και η έκταση της επαφής του στομάχου με τις προηγουμένως περιγραφείσες ανατομικές δομές, ποικίλλει ανάλογα με το άτομο. Η εγγύτητα του στομάχου με τα αναφερθέντα όργανα, η κοινή με αυτά αιμάτωση και σύστημα λεμφαγγείων, καθορίζουν κανόνες για την αποφυγή επιπλοκών στη χειρουργική του στομάχου. Για παράδειγμα, η φλεγμονώδης διεργασία πεπτικού έλκους μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα τη σύμφυση του οπισθίου τοιχώματος του στομάχου με το εγκάρσιο μεσόκολο, γεγονός που θα κάνει το διαχωρισμό των δύο αυτών ανατομικών δομών αρκετά δυσχερή, με ενδεχόμενο τραυματισμό στα μέσα κολικά αγγεία. Άλλο παράδειγμα είναι ο τραυματισμός του σπληνός λόγω ρήξης της κάψας κατά τους χειρισμούς του στομάχου. Στον προχωρημένο καρκίνο του στομάχου συμβαίνει διήθηση των γειτονικών οργάνων κατά συνέχεια ιστού. Συχνότερα διηθημένα όργανα είναι το παχύ έντερο, το πάγκρεας, το ήπαρ, η χοληδόχος κύστη, ο σπλήνας, το δωδεκαδάκτυλο και η εγγύς νήστιδα. Άλλες διηθήσεις έχουν αναφερθεί στο αριστερό ημιδιάφραγμα, στον αριστερό νεφρό και επινεφρίδιο και στο δρεπανοειδή σύνδεσμο. Ο στόμαχος μπορεί επίσης να διηθηθεί από καρκίνο που εξορμάται από άλλα όργανα, όπως το πάγκρεας και το παχύ έντερο. 6

23 Εικόνα 1.4 Ανατομικές σχέσεις του στομάχου με τα γειτονικά όργανα (Πηγή: Ο στόμαχος καλύπτεται σχεδόν εξ ολοκλήρου από περιτόναιο, εκτός από: α) μικρό μέρος της οπίσθιας επιφάνειας της καρδίας, το οποίο εφάπτεται πάνω στο αριστερό σκέλος του διαφράγματος και μπορεί εύκολα να διαχωριστεί από αυτό με το δάχτυλο του χειρουργού (το αριστερό επινεφρίδιο και η αριστερή γαστρική αρτηρία και φλέβα βρίσκονται κοντά στο σημείο αυτό) και β) την οπίσθια επιφάνεια που αντιστοιχεί στο άπω τμήμα του πυλωρού και στο εγγύς τμήμα της 1ης μοίρας του δωδεκαδακτύλου. Δεν υπάρχει επίσης κάλυψη με περιτόναιο κατά μήκος του μείζονος και του ελάσσονος τόξου. 7

24 Ο ηπατογαστρικός σύνδεσμος είναι το εγγύς τμήμα του ελάσσονος επιπλόου και εκτείνεται από την ηπατική πύλη έως το έλασσον τόξο και προς τα άνω ως μεσεντέριο του κοιλιακού οισοφάγου (Εικόνα 1.5). Περιέχει την αριστερή γαστρική αρτηρία και φλέβα, τον ηπατικό κλάδο από το πρόσθιο πνευμονογαστρικό, τους πρόσθιους και οπίσθιους γαστρικούς κλάδους των των πνευμονογαστρικών (νεύρα του Latarjet) καθώς και λεμφαγγεία και λεμφαδένες. Στο 25% των ατόμων συναντάται έκτοπη αριστερή ηπατική αρτηρία στο εγγύς τμήμα του ηπατογαστρικού συνδέσμου. Προς τα δεξιά βρίσκεται η κοινή ηπατική αρτηρία και κλάδοι της δεξιάς γαστρικής αρτηρίας και φλέβας. Εικόνα 1.5 Πτυχές του περιτοναίου και σύνδεσμοι του στομάχου (Πηγή: Ο ηπατοδωδεκαδακτυλικός σύνδεσμος είναι το δεξιότερο τμήμα του ελάσσονος επιπλόου και εκτείνεται από το ήπαρ προς τα αρχικά 2,5 εκατοστά του δωδεκαδακτύλου (Εικόνα 1.5). Το ελέυθερο άκρο του περικλείει την 8

25 ηπατική τριάδα (ιδίως ηπατική αρτηρία, εξωηπατικός χοληφόρος πόρος και πυλαία φλέβα) μαζί με λεμφαδένες. Έκτοπη δεξιά ηπατική αρτηρία μπορεί να βρίσκεται στον ηπατοδωδεκαδακτυλικό σύνδεσμο, εκφυόμενη στο 18-20% από την άνω μεσεντέριο αρτηρία. Έχει αναφερθεί ότι μόνο στο 9% των ατόμων συναντάται φυσιολογική ανατομία των αρτηριών στο έλασσον επίπλουν (Εικόνα 1.6) [4]. Εικόνα 1.6 Συχνότητα ανατομικών παραλλαγών στο έλασσον επίπλουν NORM: Φυσιολογική Ανατομία, AGAS: Επικουρική αριστερή γαστρική αρτ CALOT: Δεξιά ηπατική αρτ διασταυρούμενη προσθίως του χοληδόχου πόρου ή καθόλου, LIG: Αρτηρία στο όριο του ηπατοδωδεκαδακτυλικού συνδέσμου, AHA: Έκτοπες ηπατικές αρτηρίες (Πηγή: Ο γαστροκολικός σύνδεσμος (Εικόνα 1.8) αποτελεί τμήμα του μείζονος επιπλόου. Εκτείνεται από το μείζον τόξο του στομάχου και την 1η μοίρα του δωδεκαδακτύλου προς το εγκάρσιο κόλο, στο οποίο και συμφύεται. Προς τα αριστερά συνεχίζει ως γαστροσπληνικός σύνδεσμος. Περιέχει την αριστερή και δεξιά γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία και φλέβα Ο γαστροσπληνικός σύνδεσμος είναι διπλού στρώματος, συμφύεται στο μείζον τόξο του στομάχου και συνέχεται με τον γαστροφρενικό σύνδεσμο (Εικόνα 1.5). Στο άνω μέρος του βρίσκονται οι βραχείες γαστρικές αρτηρίες 9

26 και φλέβες, καθώς και λεμφαδένες. Στο κατώτερο τμήμα του, η αριστερή γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία και φλέβα, τελικοί κλάδοι της σπληνικής αρτηρίας και λεμφαδένες. Ο γαστροφρενικός σύνδεσμος (Εικόνα 1.5), είναι συνέχεια του ηπατογαστρικού από τα αριστερά. Στο κατώτερο τμήμα του βρίσκονται βραχείες γαστρικές αρτηρίες και φλέβες καθώς και λεμφαδένες. Το άνω τμήμα είναι ανάγγειο και αποτελεί σημείο δια μέσω του οποίου μπορεί με ασφάλεια να δημιουργήσει δίοδο ο χειρουργός με το δάχτυλο και να περάσει ένα penrose ή κάτι ανάλογο γύρω από την καρδία. Με τον τρόπο αυτό μπορεί να έλξει τον οισοφάγο προς τα κάτω αν χρειαστεί (πχ σε περίπτωση διενέργειας βαγοτομής). Ο οισοφάγος συμφύεται με το διάφραγμα στο οισοφαγικό τρήμα με τον ελαστικό αλλά ισχυρό φρενοοισοφαγικό σύνδεσμο. Ο υπεζωκός και το περιτόναιο εξασφαλίζουν ότι η σύμφυση αυτή είναι αεροστεγής (Εικόνα 1.7). Οι ίνες του συνδέσμου ξεκινούν από την ενδοκοιλιακή περιτονία του διαφράγματος και ένα τμήμα τους διέρχεται του οισοφαγικού τρήματος και εισέρχεται στο μυικό χιτώνα του οισοφάγου σε απόσταση 1-2 εκατοστά άνωθεν του τρήματος. Ένα δεύτερο τμήμα των ινών της περιτονίας πορεύεται προς τα κάτω και εισέρχεται στον ενδοκοιλιακό οισοφάγο. Οι ίνες του συνδέσμου, επιτρέπουν μία κίνηση του οισοφάγου κατά τον κάθετο άξονα περίπου 2 εκατοστών. Ο φρενοοισοφαγικός σύνδεσμος ουσιαστικά υφίσταται στα νεογέννητα και στα παιδιά, ενώ με το χρόνο εκφύλιζεται και σταδιακά εμφανίζεται λίπος μεταξύ των εναπομεινασών ινών. Κατά τη μέση ηλικία ο σύνδεσμος έχει χάσει αρκετή από την αρχική συνοχή του και η σύμφυση του οισοφάγου στο τρήμα είναι λιγότερο στέρεη. 10

27 Εικόνα 1.7 Η Γαστροοισοφαγική συμβολή σε στεφανιαία τομή (Πηγή: Μείζον επίπλουν Από χειρουργικής πλευράς, το μείζον επίπλουν μπορεί να διαιρεθεί σε δύο μέρη: το άνω, που αποτελεί το γαστροκολικό σύνδεσμο και το κατώτερο, που ουσιαστικά είναι το ιδίως μείζον επίπλουν. Σχηματίζεται από 4 πέταλα περιτοναίου, δύο πρόσθια και δύο οπίσθια, που συνήθως συνενώνονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (Εικόνα 1.8). 11

28 Εικόνα 1.8 Δημιουργία του μείζονος επιπλόου Α: σχηματισμός του επιπλοϊκού θυλάκου, Β: 1η συνένωση του οπισθίου τοιχώματος του επιπλοϊκού θυλάκου με το εγκάρσιο μεσόκολο, C-D: 2η συνένωση του προσθίου και του οπισθίου τοιχώματος του επιπλοϊκού θυλάκου και σχηματισμός του μείζονος επιπλόου (Πηγή: Ο γαστροκολικός σύνδεσμος σχηματίζεται από τα δύο πρόσθια πέταλα και αποτελεί την καλύτερη δίοδο προς τον ελάσσονα επιπλοϊκό θύλακο. Η συνένωση του οπισθίου πετάλου με το εγκάρσιο κόλο και το μεσόκολο σχηματίζει το εγκάρσιο μεσόκολο, το οποίο ως εκ τούτου αποτελείται από 4 πέταλα. 12

29 Προσοχή χρειάζεται στην περίπτωση που ο γαστροκολικός σύνδεσμος συνέχεται με το εγκάρσιο μεσόκολο, οπότε υπάρχει συνένωση των 6 πετάλων του περιτοναίου και αυξημένος κίνδυνος επιπλοκής από τα μέσα κολικά αγγεία ή τους κλάδους τους, καθώς και από άλλα αγγεία του επιπλόου. Το μείζον επίπλουν παίζει ρόλο στην άμυνα του οργανισμού, έχοντας προστατευτική λειτουργία έναντι φλεγμονωδών διεργασιών. Επιπλέον αποτελεί ανατομική δομή όπου εναποτίθενται καρκινικές μεταστάσεις, όπως για παράδειγμα στον ωοθηκικό καρκίνο. Η αιμάτωση του επιπλόου (Εικόνα 1.9), προέρχεται από τη δεξιά (κλάδος της γαστροδωδεκαδακτυλικής) και από την αριστερή (κλάδος της σπληνικής) γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία, οι οποίες αναστομώνονται στο μείζον τόξο του στομάχου. Από τις αρτηρίες αυτές εκφύονται ο αριστερός και δεξιός επιπλοϊκός κλάδος, που σχηματίζουν το τόξο του Barkow στο οπίσθιο στρώμα του επιπλόου. Το τόξο ενισχύεται από τους πρόσθιους επιπλοϊκούς κλάδους που εκφύονται από τις γαστροεπιπλοϊκές αρτηρίες, καθώς και από τους αντίστοιχους οπίσθιους κλάδους οι οποίοι προέρχονται από την κάτω παγκρεατική αρτηρία. Η διατήρηση της αιμάτωσης του επιπλόου κατά τη διάρκεια μιας επέμβασης, εξασφαλίζεται με τη διατήρηση του τόξου του Barkow. Αυτό επιτυγχάνεται με τη διαφύλαξη του αριστερού και δεξιού επιπλοϊκού κλάδου κατά την κινητοποίηση του επιπλόου (οι πρόσθιοι και οι γαστρικοί κλάδοι μπορούν να απολινωθούν, όπως επίσης και η δεξιά γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία περιφερικότερα της έκφυσης του δεξιού επιπλοϊκού κλαδου). 13

30 Εικόνα 1.9 Αρτηριακή αιμάτωση μείζονος επιπλόου (Πηγή: 1.2Β ΑΝΑΤΟΜΙΑ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΧΟΥ 1) Μέρη του στομάχου - Μορφολογία Ο στόμαχος έχει δύο ευδιάκριτα όρια, το μείζον και το έλασσον τόξο και χωρίζεται αδρά σε πέντε μέρη: την καρδία, τον πυθμένα, το σώμα, το άντρο και τον πυλωρό (Εικόνα 1.10). Ως πυλωρός εννοείται στα περισσότερα συγγράμματα το πυλωρικό κανάλι και ο πυλωρικός σφιγκτήρας. Ωστόσο, τα μόνα ορατά οδηγά σημεία στην κλινική πράξη είναι το μείζον και το έλασσον τόξο, η γαστροοισοφαγική και η γαστροδωδεκαδακτυλική συμβολή και η προπυλωρική φλέβα του Mayo όταν υπάρχει. 14

31 Εικόνα 1.10 Τα μέρη του στομάχου (Πηγή: +anatomy&biw=1280&bih=671&source=lnms&tbm=isch&sa=x&ved=0ahukewju6lmg8m3l AhVpAZoKHRX8D58Q_AUIBigB) Από χειρουργικής πλευράς, ο στόμαχος μπορεί να διακριθεί στην εγγύς και στην άπω γαστρική μονάδα. Η πρώτη περιλαμβάνει το οισοφαγικό τρήμα, τον κατώτερο οισοφάγο και το εγγύς τμήμα του στομάχου (πυθμένας και σώμα). Η δεύτερη αποτελείται από το άντρο και τον πυλωρό, μαζί με την 1η μοίρα του δωδεκαδακτύλου. Εγγύς γαστρική μονάδα Ο ενδοκοιλιακός οισοφάγος έχει μήκος από 0,5 έως 2,5 εκατοστά και βρίσκεται στο επίπεδο του 11ου με 12ου θωρακικού σπονδύλου. Η πρόσθια επιφάνειά του σχετίζεται με τον αριστερό λοβό του ήπατος, η οπίσθια με το δεξιό σκέλος του διαφράγματος και την αορτή, η δεξιά με τον κερκοφόρο λοβό του ήπατος και η αριστερή με τον πυθμένα του στομάχου. Στην καρδιοοισοφαγική συμβολή δεν υπάρχει αληθής ανατομικός σφιγκτήρας, παρά μόνο πάχυνση του κυκλοτερούς χιτώνα του οισοφάγου που φυσιολογικά βρίσκεται σε σύσπαση. Η φυσιολογική πίεση του κατώτερου οισοφαγικού σφιγκτήρα κυμαίνεται από 14,5 έως 34 mmhg. 15

32 Οι ανατομικές σχέσεις της εγγύς γαστρικής μονάδας έχουν ως εξής: -το έλασσον τόξο, η γαστροοισοφαγική συμβολή και ο κοιλιακός οισοφάγος συμφύονται με τον ηπατογαστρικό σύνδεσμο -το μείζον τόξο συμφύεται με το ανώτερο τμήμα του μείζονος επιπλόου (γαστροκολικός σύνδεσμος) και με τον γαστροσπληνικό σύνδεσμο -οπισθίως σχετίζεται με τον ελάσσονα επιπλοϊκό θύλακο, την αορτή και την κοιλιακή αρτηρία με τους κλάδους αυτής, καθώς και το κοιλιακό γάγγλιο και το ομώνυμο πλέγμα -προσθίως σχετίζεται με το πρόσθιο κοιλιακό τοίχωμα και τον αριστερό λοβό του ήπατος Η σημαντικότερη ανατομική σχέση είναι με την αριστερή γαστρική αρτηρία, η οποία μπορεί να απολινωθεί στην έκφυσή της και να αφαιρεθούν οι λεμφαδένες αυτής, καθώς και της κοιλιακής αρτηρίας. Άπω γαστρική μονάδα Το όριο μεταξύ σώματος και άντρου δεν είναι διακριτό και δύσκολα αναγνωρίζεται. Η περιγραφόμενη γωνιώδης εντομή στο έλασσον τόξο δεν είναι σταθερό εύρημα και συνήθως δεν αναγνωρίζεται στο χειρουργείο αλλά προσδιορίζεται αδρά. Ένα οδηγό σημείο είναι οι τελικοί γαστρικοί κλάδοι του πρόσθιου πνευμονογαστρικού (crow s foot). Το άντρο εκτιμάται ότι αρχίζει 3-4 εκατοστά κεντρικότερα των κλάδων αυτών, ή 8-10 εκατοστά κεντρικότερα του πυλωρού. Μεταξύ του άντρου και του πυλωρού δεν υπάρχει σαφές εξωτερικό όριο, ενώ μεταξύ πυλωρού και δωδεκαδακτύλου η μετάπτωση είναι εμφανής λόγω της διαφοράς μεταξύ του πυλωρικού σφιγκτήρα που είναι παχύς και του τοιχώματος του δωδεκαδακτύλου που είναι λεπτό. Τα πρώτα 2,5 εκατοστά του δωδεκαδακτύλου που συμπεριλαμβάνονται στην άπω γαστρική μονάδα, διατηρούν το κοιλιακό και ραχιαίο μεσεντέριο, δηλαδή αντίστοιχα τον ηπατοδωδεκαδακτυλικό (άπω τμήμα του ελάσσονος επιπλόου) και το άπω τμήμα του γαστροκολικού συνδέσμου (μείζον επίπλουν). Ως εκ τούτου, το τμήμα αυτό μπορεί να κινητοποιηθεί μαζί με το άντρο και τον πυλωρό και δικαίως αποτελεί μαζί με τα μέρη αυτά, τμήμα της άπω γαστρικής μονάδας. Σε ύπτια θέση, το τμήμα αυτό του δωδεκαδακτύλου βρίσκεται στο επίπεδο μεταξύ του 1ου και του 4ου οσφυικού σπονδύλου. Οι ανατομικές σχέσεις της άπω γαστρικής μονάδας έχουν ως εξής: 16

33 -το έλασσον τόξο που αντιστοιχεί στο άντρο, στον πυλωρό και στα πρώτα 2,5 εκατοστά του 12δακτύλου, συμφύεται με τον ηπατογαστρικό και τον ηπατοδωδεκαδακτυλικό σύνδεσμο -το αντίστοιχο τμήμα του μείζονος τόξου, συμφύεται με το γαστροκολικό σύνδεσμο -οπισθίως σχετίζεται με τον ελάσσονα επιπλοϊκό θύλακο, το εγκάρσιο μεσόκολο, την κεφαλή και τον αυχένα του παγκρέατος, την αορτή και την κοιλιακή αρτηρία με τους κλάδους της, το κοιλιακό γάγγλιο και πλέγμα, την ηπατική τριάδα και τη γαστροδωδεκαδακτυλική αρτηρία -προσθίως, με το πρόσθιο κοιλιακό τοίχωμα, τον αριστερό και δεξιό λοβό του ήπατος και το εγκάρσιο μεσόκολο Το τοίχωμα του στομάχου αποτελείται από τον ορογόνο με τον υπορογόνιο, το μυικό χιτώνα, τον υποβλεννογόνιο και το βλεννογόνο (Εικόνα 1.11). Τα χαρακτηριστικά τους περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω στο υποκεφάλαιο της ιστολογίας. Εικόνα 1.11 Τοίχωμα του στομάχου Πηγή:( o=u&source=univ&sa=x&ved=0ahukewiz3dq1rtdlahwbe5okhzbjcleqsaqigq) 17

34 2) Αιμάτωση του στομάχου 1. Αρτηρίες Ο στόμαχος είναι ένα από τα καλύτερα αιματούμενα όργανα. Αιματώνεται από πολλές αρτηρίες και στο τοίχωμά του βρίσκεται πλούσιο αναστομωτικό δίκτυο. Όλοι οι μικροί κλάδοι των αρτηριών που αγγειώνουν το στόμαχο, διαπερνούν το μυικό χιτώνα και τροφοδοτούν το υποβλεννογόνιο δίκτυο. Είναι αυτό το δίκτυο που ουσιαστικά αναστομώνει τις εξωγαστρικές αρτηρίες μεταξύ τους. Έτσι, ο στόμαχος μπορεί να παραμείνει βιώσιμος ακόμη και αν απολινωθούν όλες εκτός μίας από τις αρτηρίες του, αλλά, αντίθετα, δύσκολα θα ελεγχθεί η αιμορραγία από πεπτικό έλκος με εξω-γαστρική απολίνωση αρτηρίας. Παρακάτω αναφέρονται και περιγράφονται οι αρτηρίες που αιματώνουν το στόμαχο, οι οποίες προέρχονται από την κοιλιακή αρτηρία, καθώς και οι κλάδοι αυτών (Εικόνα 1.12): Εικόνα 1.12 Η αρτηριακή παροχή του στομάχου (Πηγή: my&biw=1280&bih=671&source=lnms&tbm=isch&sa=x&ved=0ahukewju6lmg8m3lahvpa ZoKHRX8D58Q_AUIBigB#tbm=isch&q=arterial+supply+of+the+stomach+skandalakis%27+s urgical+anatomy) 18

35 Αριστερή γαστρική αρτηρία ανιόν κλάδος (δίνει οισοφαγικούς κλάδους) κατιόν κλάδος (δίνει γαστρικούς κλάδους) Κοινή ηπατική αρτηρία δεξιά γαστρική αρτ. γαστροδωδεκαδακτυλική αρτ. πρόσθια άνω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική οπίσθια δωδεκαδακτυλική οπίσθια άνω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική άνω δωδεκαδακτυλική δεξιά γαστροεπιπλοϊκή Σπληνική αρτηρία οπίσθιες γαστρικές βραχείες γαστρικές αριστερή γαστροεπιπλοϊκή Η αριστερή γαστρική αρτηρία αποτελεί κλάδο της κοιλιακής αρτηρίας στο 90% των ατόμων. Μπορεί όμως να είναι κλάδος της σπληνικής (4%), της αορτής (3%) ή της κοινής ηπατικής (2%). Έχει πορεία ανιούσα και προς τα αριστερά οπισθοπεριτοναϊκά, προς το εγγύς 1/3 του ελάσσονος τόξου του στομάχου. Στο σημείο αυτό, παρέχει οισοφαγικούς κλάδους στο 95% των περιπτώσεων και ένα καρδιοοισοφαγικό κλάδο που αιματώνει τον κοιλιακό οισοφάγο, την καρδία και τον πυθμένα. Όχι σπάνια διακλαδίζεται σε πρόσθιο και οπίσθιο κλάδο προτού φτάσει στο έλασσον τόξο και στην περίπτωση αυτή συνηθέστερα ο καρδιοοισοφαγικός κλάδος εκφύεται από τον πρόσθιο κλάδο. Μετά την έκφυση του καρδιοοισοφαγικού κλάδου, η αριστερή γαστρική πορεύεται δεξιά προς τα κάτω, κατά μήκος του ελάσσονος τόξου. Κατά την πορεία της επί του τόξου, διαιρείται σε πρόσθιο και οπίσθιο κλάδο, για την αιμάτωση του προσθίου και οπισθίου τοιχώματος του στομάχου αντίστοιχα. Ο πρόσθιος κλάδος δίνει πολλούς μικρότερους που σχηματίζουν το αγγειακό crow s foot (του Payne), όμοιο με το αντίστοιχο του πρόσθιου νεύρου του Latarjet και τελειώνει 4-6 εκ πριν από τον πυλωρό και 1 εκ κάτωθεν του 19

36 ελάσσονος τόξου, όπου εισέρχεται στο μυικό χιτώνα. Μετά τους δύο αυτούς κλάδους, η αριστερή γαστρική αρτηρία συνεχίζει να πορεύεται επί του ελάσσονος τόξου μέχρι τη γωνιώδη εντομή όπου αναστομώνεται με τη δεξιά γαστρική. Έκτοπη αριστερή ηπατική αρτηρία από την αριστερή γαστρική, απαντάται στο 30% των ατόμων. Λόγω των πλούσιων αναστομώσεων μεταξύ των οισοφαγικών κλάδων, των κλάδων της κάτω φρενικής και εκείνων από την αριστερή γαστρική, μπορεί να υπάρξει σοβαρή παλίνδρομη αιμορραγία από την οπίσθια πλευρά του οισοφάγου. Η δεξιά γαστρική αρτηρία είναι ένας μικρός κλάδος που εκφύεται συνήθως από την κοινή ηπατική αρτηρία, αλλά περιγράφεται επίσης έκφυσή της από την αριστερή ή την ιδίως ηπατική αρτηρία. Δίνει υπερπυλωρικούς κλάδους (πρόσθιους και οπίσθιους) που αναστομώνονται με υποπυλωρικούς κλάδους και με την άνω δωδεκαδακτυλική αρτηρία, αιματώνοντας το άντρο, τον πυλωρό και τα αρχικά 2,5 εκ της 1ης μοίρας του 12δακτύλου. Εν συνεχεία πορεύεται επί του ελάσσονος τόξου για 4-6 εκ και αναστομώνεται με την αριστερή γαστρική. Σε περίπου 13% των ατόμων, η άνω δωδεκαδακτυλική εκφύεται από τη δεξιά γαστρική αντί της γαστροδωδεκαδακτυλικής αρτηρίας. Η γαστροδωδεκαδακτυλική αρτηρία είναι ένας από τους δύο τελικούς κλάδους της κοινής ηπατικής. Λίγο μετά την έκφυσή της από την κοινή ηπατική, δίνει την άνω δωδεκαδακτυλική, την οπίσθια δωδεκαδακτυλική και την οπίσθια άνω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική αρτηρία. Εν συνεχεία κατέρχεται μεταξύ της 1ης μοίρας του 12δακτύλου και της κεφαλής του παγκρέατος και καταλήγει διαιρούμενη στη δεξιά γαστροεπιπλοϊκή και στην πρόσθια άνω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική. Η δεξιά γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία, αφού δώσει υποπυλωρικό κλάδο, συνεχίζει κατά μήκος του μείζονος τόξου εντός του γαστροκολικού συνδέσμου, δίνοντας 8-10 κλάδους στο τοίχωμα του στομάχου. Ορισμένες φορές, η δεξιά γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία εκφύεται από την άνω μεσεντέριο ή από την πρόσθια άνω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική αρτηρία. Στο 75% των ατόμων η δεξιά γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία αναστομώνεται με την αριστερή γαστροεπιπλοϊκή. Οι γαστρικοί κλάδοι της αναστομώνονται εκτενώς με αντίστοιχους κλάδους από την αριστερή γαστρική. Άλλοι κλάδοι της είναι ο 20

37 δεξιός επιπλοϊκός και οι πρόσθιοι επιπλοϊκοί προς το μείζον επίπλουν. Για τη βιωσιμότητα του μείζονος επιπλόου κατά τη διάρκεια επέμβασης, πρέπει να διατηρείται η δεξιά γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία, διαιρώντας είτε τους γαστρικούς κλάδους, είτε την πρόσθια επιπλοϊκή, είτε τέλος την ίδια τη δεξιά γαστροεπιπλοϊκή περιφερικότερα της έκφυσης της δεξιάς επιπλοϊκής αρτηρίας. Η αριστερή γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία εκφύεται είτε από τη σπληνική, είτε από έναν από τους τελικούς της κλάδους, συνήθως εκείνον του κάτω πόλου του σπλήνα. Είναι ο μεγαλύτερος κλάδος της σπληνικής αρτηρίας. Πορεύεται εντός του γαστροσπληνικού συνδέσμου κατά μήκος του μείζονος τόξου μέχρι τη μεσότητα αυτού και δίνει σχετικά μακρείς κλάδους στο εγγύς τμήμα του τόξου. Άλλοι κλάδοι της είναι ο αριστερός επιπλοϊκός (που μαζί με τον δεξιό επιπλοϊκό από τη δεξιά γαστροεπιπλοϊκή σχηματίζουν το τόξο του Barkow) και οι πρόσθιοι επιπλοϊκοί. Οι βραχείες γαστρικές αρτηρίες είναι από 5 έως 7 και εκφύονται από τους τελικούς κλάδους της σπληνικής αρτηρίας και από την αριστερή γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία. Προσοχή χρειάζεται στις περιπτώσεις που φαίνεται ότι προέρχονται από το παρέγχυμα του σπλήνα κοντά στην πύλη, όπου στην πραγματικότητα εκφύονται από τους τελικούς σπληνικούς κλάδους μέσα στο σπλήνα. Οι βραχείες γαστρικές αγγειώνουν τον πυθμένα και το ανώτερο τμήμα του σώματος του στομάχου. Μερικές είναι πολύ βραχείες και χρειάζεται προσοχή κατά την απολίνωσή τους σε περίπτωση σπληνεκτομής. Ο ενταφιασμός του τμήματος του μείζονος τόξου που απολινώθηκαν οι βραχείες γαστρικές είναι ένα ασφαλές μέτρο ώστε να αποφευχθεί πιθανή νέκρωση και διάτρηση. Η οπίσθια (ή ραχιαία) γαστρική αρτηρία, μπορεί να προέρχεται από το εγγύς, το μέσο ή το άπω τμήμα της σπληνικής αρτηρίας. Έχει ανιούσα πορεία, οπισθίως του στομάχου και αγγειώνει τον τελικό οισοφάγο, την καρδία και τον πυθμένα. Απολίνωσή της μπορεί να προκαλέσει εστιακές νεκρώσεις στην αιματούμενη από αυτήν περιοχή. 21

38 Στοιχεία σχετικά με την αγγείωση του στομάχου που χρήζουν προσοχής στην κλινική πράξη: -το υποβλεννογόνιο αρτηριακό δίκτυο τροφοδοτεί εξ ολοκλήρου το τοίχωμα του στομάχου εκτός της περιοχής του ελάσσονος τόξου. Η περιοχή αγγειούται από μικρούς κλάδους κατευθείαν από την αριστερή και δεξιά γαστρική αρτηρία. Εκτομή τμήματος του ελάσσονος τόξου χρήζει ενταφιασμού της πρωτογενούς συρραφής προς αποφυγή διάτρησης λόγω νέκρωσης. Το ίδιο ισχύει και για το μείζον τόξο, στην περίπτωση που απολινωθούν τα βραχέα γαστρικά αγγεία -στην περίπτωση αιμορραγούντος δωδεκαδακτυλικού έλκους, το υπεύθυνο αγγείο είναι η γαστροδωδεκαδακτυλική αρτηρία ή κλάδος της, η οπίσθια άνω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική. Λόγω των αναστομώσεων με τις κάτω παγκρεατοδωδεκαδακτυλικές αρτηρίες, δεν έχει νόημα να απολινώσουμε τα προαναφερθέντα υπεύθυνα αγγεία. -η γαστροδωδεκαδακτυλική αρτηρία είναι άριστο οδηγό σημείο ώστε να μην προκαλέσουμε κάκωση στον πόρο του Santorini -η έκτοπη ή η επικουρική αριστερή ηπατική αρτηρία από την αριστερή γαστρική δεν πρέπει να απολινούται, διότι μπορεί να είναι το μόνο αγγείο αρτηριακής παροχής στον αριστερό ηπατικό λοβό 2. Φλέβες Η αριστερή γαστρική (ή στεφανιαία) φλέβα σχηματίζεται από τη συνένωση της αριστερής και δεξιάς γαστρικής φλέβας κατά μήκος του ελάσσονος τόξου (Εικόνα 1.13). Ονομάστηκε έτσι επειδή με τη συνένωση των δύο γαστρικών φλεβών σχηματίζεται ένα είδους στεφάνης. Επειδή όμως η αριστερή γαστρική φλέβα είναι κατά πολύ μεγαλύτερη της δεξιάς, προς χάριν απλότητας συνήθως αναφέρεται ως στεφανιαία φλέβα. Ξεκινάει από τη μεσότητα του ελάσσονος τόξου και έχοντας ανιούσα πορεία φτάνει μέχρι 2-3 εκ από το κατώτερο όριο του οισοφαγικού τρήματος, όπου δέχεται οισοφαγικούς κλάδους. Από το σημείο αυτό, είτε πορεύεται προς τα κάτω και λοξώς δεξιά, εκβάλλοντας στην πυλαία, είτε προς τα πίσω και κάτω εκβάλλοντας στη σπληνική φλέβα. Συνηθέστερα εκβάλλει στην πυλαία φλέβα (67-83%). Προσοχή χρειάζεται σε περίπτωση αιμορραγίας από κλάδους της αριστερής 22

39 γαστρικής φλέβας, διότι είναι μεγάλη λόγω των αναστομώσεων μεταξύ της αριστερής γαστρικής, των οισοφαγικών και των ημιάζυγων φλεβών. Η μικρή δεξιά γαστρική φλέβα πορεύεται μαζί με τη δεξιά γαστρική αρτηρία στο περιφερικό τμήμα του ελάσσονος τόξου από αριστερά προς τα δεξιά και εκβάλλει στην πυλαία φλέβα. Η προπυλωρική φλέβα του Mayo, στην περίπτωση που υπάρχει, εκβάλλει στη δεξιά γαστρική φλέβα και αποτελεί οδηγό σημείο για την γαστροδωδεκαδακτυλική συμβολή. Η δεξιά γαστροεπιπλοϊκή φλέβα συνοδεύει τη δεξιά γαστροεπιπλοϊκή αρτηρία. Δέχεται την πρόσθια άνω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική και κλάδο από τη μέση κολική φλέβα προσθίως της κεφαλής του παγκρέατος και έχει στενή σχέση με την αγκιστροειδή απόφυση του παγκρέατος. Στις περισσότερες περιπτώσεις εκβάλλει στην άνω μεσεντέριο φλέβα. Εικόνα 1.13 Φλεβική αποχέτευση του στομάχου (Πηγή: +anatomy&biw=1280&bih=671&source=lnms&tbm=isch&sa=x&ved=0ahukewju6lmg8m3l AhVpAZoKHRX8D58Q_AUIBigB) 23

40 Η αριστερή γαστροεπιπλοϊκή φλέβα εκβάλλει είτε στη σπληνική, είτε σε έναν από τους τελικούς της κλάδους, συνηθέστερα στον κάτω. Η απολίνωσή της πρέπει να γίνεται όσο το δυνατόν εγγύτερα στην πύλη του σπλήνα. Η αριστερή κάτω φρενική φλέβα εκβάλλει είτε στην αριστερή άνω νεφρική, είτε στην κάτω κοίλη, είτε και στις δύο. Στην πρώτη περίπτωση δεν προσεγγίζει τη γαστροοισοφαγική συμβολή. Στις περιπτώσεις που εκβάλλει μερικώς εξ ολοκλήρου στην κάτω κοίλη, η πορεία της είναι προσθίως του οισοφαγικού τρήματος και χρειάζεται προσοχή διότι είναι πολύ πιθανό να γίνει κάκωση κατά τη διάρκεια επεμβάσεων στην περιοχή αυτή. Οι βραχείες γαστρικές φλέβες αποχετεύουν μερικώς την εγγύς γαστρική μονάδα. Πορεύονται εντός του γαστροσπληνικού συνδέσμου και στην πλειοψηφία τους εκβάλλουν στη σπληνική φλέβα ή σε κάποιον από τους κλάδους της. Οι βραχείες γαστρικές χρήζουν ιδιαίτερης προσοχής στην απολίνωσή τους διότι εύκολα εισέλκονται και μαζί με την αριστερή γαστροεπιπλοϊκή φλέβα μπορεί να είναι υπεύθυνες για μετεγχειρητική αιμορραγία. Για το λόγο αυτό συνιστάται ενδεχόμενος ενταφιασμός του αντίστοιχου τμήματος του μείζονος τόξου. Η εκβολή της κάτω μεσεντερίου, της αριστερής και της δεξιάς γαστρικής, ποικίλει και για το λόγο αυτό έχει προταθεί ο παρακάτω κανόνας με το ποσοστό για κάθε περίπτωση στρογγυλοποιημένο στο 30% [5]. Η κάτω μεσεντέριος φλέβα, εκβάλλει είτε στη σπληνική, είτε στην άνω μεσεντέριο, είτε στη συμβολή τους, σε ποσοστό 30% για κάθε περίπτωση. Η δεξιά γαστρική φλέβα εισέρχεται είτε στο άνω, είτε στο κάτω τμήμα της πυλαίας, είτε στη συμβολή σπληνικής και άνω μεσεντερίου, σε ποσοστό 30% για κάθε περίπτωση. Η αριστερή γαστρική φλέβα εκβάλλει είτε στο άνω, είτε στο κάτω τμήμα της πυλαίας, είτε στη σπληνική, σε ποσοστό 30% για κάθε περίπτωση. Το πιο σημαντικό σημείο παράπλευρης κυκλοφορίας των γαστρικών φλεβών, εντοπίζεται στον κοιλιακό οισοφάγο (Εικόνα 1.13). Στο σημείο αυτό, η αριστερή γαστρική φλέβα (πυλαίο σύστημα), επικοινωνεί με τις αζύγους φλέβες (σύστημα κάτω κοίλης) και στην περίπτωση πυλαίας υπέρτασης δημιουργούνται οι κιρσοί του οισοφάγου. 24

41 Απόφραξη της σπληνικής φλέβας έχει ως αποτέλεσμα εμφανείς κιρσοειδείς διευρύνσεις των φλεβών της εγγύς γαστρικής μονάδας (βραχείες γαστρικές, αριστερή γαστροεπιπλοϊκή). Είναι δυνατό επίσης να διαταθεί και η δεξιά γαστροεπιπλοϊκή, οι εσωτερικές παράπλευρες φλέβες του στομάχου, ακόμη και να εμφανιστούν κιρσοί δωδεκαδακτύλου. 3) Λεμφική αποχέτευση του στομάχου Σχετικά με τη λεμφική αποχέτευση του στομάχου, έχει περιγραφεί από τον Coller* το 1941 ένα σύστημα τεσσάρων ζωνών, το οποίο υιοθετήθηκε από τους περισσότερους συγγραφείς [6]. -Ζώνη Ι (κάτω γαστρική - κάτω ήμισυ και δεξιά 2/3 του σώματος και κάτω ήμισυ του πυλωρού): λεμφαδένες δεξιάς γαστροεπιπλοϊκής και γαστροδωδεκαδακτυλικής προς εκείνους της κοινής ηπατικής και εν συνεχεία της κοιλιακής αρτηρίας -Ζώνη ΙΙ (σπληνική - πυθμένας και αριστερό 1/3 του σώματος): λεμφαδένες αριστερής γαστροεπιπλοϊκής και βραχέων γαστρικών προς τους παγκρεατοσπληνικούς και εκείνους της σπληνικής και εν συνεχεία της κοιλιακής αρτηρίας Ζώνη ΙΙΙ (άνω γαστρική - άνω ήμισυ προσθίου και οπισθίου τοιχώματος): λεμφαδένες αριστερής γαστρικής προς εκείνους της κοιλιακής αρτηρίας -Ζώνη ΙV (ηπατική - άνω ήμισυ του πυλωρού): λεμφαδένες δεξιάς γαστρικής προς εκείνους της κοιλιακής αρτηρίας Η διαίρεση όμως αυτή είναι παραπλανητική, διότι όπως απεδείχθη αργότερα, οι λεμφαγγειακές μεταστάσεις δεν περιορίζονται μόνο στους λεμφαδένες που αποχετεύουν μία συγκεκριμένη ζώνη. Πράγματι, έγχυση χρωστικής είτε στη μεσότητα του προσθίου τοιχώματος στο σώμα του στομάχου, είτε στον πυλωρό, δείχνει διασπορά στους λεμφαδένες αμφότερων των τόξων [7]. Πάντως, το μεγαλύτερο ποσοστό της λεμφικής αποχέτευσης του στομάχου, καταλήγει στους λεμφαδένες της κοιλιακής αρτηρίας [8]. Έχουν επίσης περιγραφεί τέσσερεις ομάδες λεμφαδένων, ανάλογα με τα αγγεία που ακολουθούν, σύστημα που είναι όμοιο με εκείνο των τεσσάρων ζωνών λεμφικής αποχέτευσης του στομάχου που είχε περιγραφεί από τον Coller [9]. 25

42 Είναι πάντως εξαιρετικά δύσκολο να οριστούν συγκεκριμένες ομάδες λεμφαδένων που δέχονται τη λέμφο από συγκεκριμένες περιοχές του στομάχου. Ως εκ τούτου, από πλευράς χειρουργικής ανατομίας διακρίνονται οι κάτωθι ομάδες λεμφαδένων του στομάχου (Εικόνα 1.14): -παρακαρδιακοί λεμφαδένες -λεμφαδένες αριστερής γαστρικής -λεμφαδένες κοιλιακής αρτηρίας -υπερπυλωρικοί λεμφαδένες -υποπυλωρικοί λεμφαδένες -λεμφαδένες δεξιάς γαστροεπιπλοϊκής αρτηρίας -παγκρεατοσπληνικοί λεμφαδένες (στην πορεία της αριστερής γαστροεπιπλοϊκής) -λεμφαδένες άνω 3μορίου μείζονος τόξου (βραχέων γαστρικών) Εικόνα 1.14 Ομάδες λεμφαδένων του στομάχου (Πηγή: 26

43 4) Νεύρωση του στομάχου Παρασυμπαθητκό σύστημα Τα δύο πνευμονογαστρικά νεύρα, αριστερό και δεξιό, κατέρχονται παράλληλα με τον οισοφάγο και συμβάλλουν σε ένα εξωτερικό οισοφαγικό νευρικό πλέγμα μεταξύ του διχασμού της τραχείας και του διαφράγματος. Από το πλέγμα αυτό σχηματίζονται δύο πνευμονογαστρικά στελέχη, το πρόσθιο και το οπίσθιο, τα οποία περνούν δια του οισοφαγικού τρήματος και εντός της κοιλίας το καθένα διχάζεται σε δύο τμήματα (Εικόνα 1.15). Εικόνα 1.15 Οι ανατομικές δομές των πνευμονογαστρικών νεύρων στο θώρακα και στην κοιλία (Πηγή: 27

44 Από το πρόσθιο στέλεχος, το ηπατικό τμήμα πορεύεται προς τα δεξιά στο έλασσον επίπλουν και διακλαδίζεται προτού εισέλθει στο ήπαρ. Ένας κλάδος έχει κατιούσα πορεία προς τον πυλωρό (ενίοτε και στην 1η μοίρα του 12δακτύλου). Το δεύτερο τμήμα (πρόσθιο γαστρικό), πορεύεται κατά μήκος του ελάσσονος τόξου και δίνει κλάδους στο πρόσθιο τοίχωμα του στομάχου. Το οπίσθιο στέλεχος δίνει το κοιλιακό τμήμα και το οπίσθιο γαστρικό. Το κοιλιακό τμήμα περνάει από το κοιλιακό πλέγμα και το οπίσθιο γαστρικό δίνει κλάδους στο οπίσθιο τοίχωμα του στομάχου. Η γνώση της ανατομικής διάταξης των πνευμονογαστρικών νεύρων στο οισοφαγικό τρήμα και περιφερικότερα αυτού, είναι πολύ σημαντική για την πραγματοποίηση επεμβάσεων στην περιοχή. Στο οισοφαγικό τρήμα και αμέσως κάτω από αυτό, αναγνωρίζονται δύο ανατομικά στοιχεία, το πρόσθιο και το οπίσθιο πνευμονογαστρικό στέλεχος, σε ποσοστό 88%. Στις υπόλοιπες περιπτώσεις η διαίρεση σε τμήματα έχει γίνει κεντρικότερα του οισοφαγικού τρήματος. Συνήθως αμφότερα τα στελέχη βρίσκονται στα δεξιά της μέσης γραμμής. Η κατανομή στο στόμαχο έχει ως εξής (Εικόνα 1.16): Ο κύριος κλάδος του πρόσθιου γαστρικού τμήματος σχηματίζει το πρόσθιο νεύρο του Latarjet, το οποίο βρίσκεται συνήθως σε απόσταση 0,5 με 1 εκ από το έλασσον τόξο. Στα περισσότερα άτομα ανιχνεύεται μέχρι τη γωνιώδη εντομή, αλλά έχει μπορεί να φτάσει μέχρι την 1η μοίρα του 12δακτύλου. Δίνει από 2 μέχρι 12 κλάδους στο τοίχωμα του στομάχου. Έχουν αναφερθεί πολλές παραλλαγές αυτής της κλασσικής ανατομικής περιγραφής. Ενδεικτικά αναφέρονται η παρουσία διπλού νεύρου του Latarjet, η ύπαρξη αντί του κυρίως νεύρου πολλών γαστρικών κλάδων κατευθείαν από το πρόσθιο πνευμονογαστρικό στέλεχος, η ύπαρξη μικρών γαστρικών κλάδων προς την καρδία και τον πυθμένα με σύγχρονη παρουσία του νεύρου του Latarjet και η περίπτωση το ηπατικό τμήμα να σχηματίζεται από πολλαπλά νεύρα. Όχι πάντοτε, το νεύρο του Latarjet τελειώνει διακλαδιζόμενο στο σχηματισμό crow s foot που έχει χρησιμοποιηθεί από τον Payne για να περιγράψει τη μορφή που σχηματίζει το τελικό τμήμα της αριστερής γαστρικής αρτηρίας στο ίδιο σημείο. Το ηπατικό τμήμα του προσθίου στελέχους ξεκινά συνήθως στο επίπεδο του κοιλιακού οισοφάγου και πορεύεται στην ανάγγειο περιοχή του 28

45 ηπατογαστρικού συνδέσμου. Συχνά έχει τη μορφή πολλών κλάδων παράλληλων μεταξύ τους. Το οπίσθιο γαστρικό τμήμα του οπισθίου στελέχους σχηματίζει στα περισσότερα άτομα το οπίσθιο νεύρο του Latarjet. Συνηθέστερα τελειώνει ψηλότερα στο έλασσον τόξο και δίνει λιγότερους γαστρικούς κλάδους απ ότι το πρόσθιο. Εικόνα 1.16 Η κλασσική κατανομή των κλάδων των πνευμονογαστρικών νεύρων στο στόμαχο (Πηγή: +anatomy&biw=1280&bih=671&source=lnms&tbm=isch&sa=x&ved=0ahukewju6lmg8m3l AhVpAZoKHRX8D58Q_AUIBigB) Το κοιλιακό τμήμα του οπισθίου στελέχους είναι το μεγαλύτερο από τα τέσσερα τμήματα. Βρίσκεται μεταξύ του στομάχου και του παγκρέατος, είναι πάντα μονό και κατευθύνεται στο κοιλιακό πλέγμα. Ακολουθεί είτε την αριστερή γαστρική αρτηρία, είτε το δεξί σκέλος του διαφράγματος, είτε βρίσκεται σε μία ενδιάμεση θέση στο τρίγωνο που σχηματίζεται από από την αρτηρία, το σκέλος και το δεξί όριο του στομάχου. 29

46 Παρασυμπαθητικές ίνες συνδέουν το στόμαχο με το εγκεφαλικό στέλεχος, οι περισσότερες από τις οποίες είναι κεντρομόλες (προσαγωγές) που μεταφέρουν πληροφορίες στον εγκέφαλο. Συμπαθητικό σύστημα Οι βασικές δομές της συμπαθητικής νεύρωσης του στομάχου είναι οι συμπαθητικές άλυσοι, τα θωρακικά σπλαχνικά νεύρα που περιέχουν προσαγωγές και απαγωγές ίνες και τα κοιλιακά γάγγλια. Απαγωγές ίνες Τα θωρακικά σπλαχνικά νεύρα σχηματίζονται κυρίως από προγαγγλιακές ίνες που προέρχονται από τη διάμεση στήλη του νωτιαίου μυελού των επιπέδων Θ5-Θ10. Οι ίνες αυτές καταλήγουν στα κοιλιακά γάγγλια όπου συνάπτονται με τα γαγγλιακά κύτταρα. Οι μεταγαγγλιακές ίνες από τα κοιλιακά γάγγλια πηγαίνουν στο στόμαχο και στο 12δάκτυλο ακολουθώντας τα αιμοφόρα αγγεία. Προσαγωγές ίνες Προσαγωγές ίνες για την αίσθηση του πόνου από τα όργανα που αιματώνονται από την κοιλιακή αρτηρία, περνούν μέσω του κοιλιακού πλέγματος και των θωρακικών σπλαχνικών νεύρων στις συμπαθητικές αλύσους. Καταλήγουν στα νωτιαία νεύρα στα επίπεδα Θ5-Θ10. Τα κυτταρικά σώματα αυτών των ινών βρίσκονται στα γάγγλια των οπισθίων ριζών στα επίπεδα αυτά. Υπάρχει επομένως σύνδεση του στομάχου με το Νωτιαίο Μυελό μέσω μονοπατιών του συμπαθητικού νευρικού συστήματος (συμπαθητικοί νευρώνες και γάγγλια οπισθίων ριζών). Το συμπαθητικό νευρικό σύστημα (αδρενεργικό), καταστέλλει την έκκριση του γαστρικού οξέος και της πεψίνης, καθώς επίσης και την κινητικότητα. Το παρασυμπαθητικό (χολινεργικό), μέσω του πνευμονογαστρικού νεύρου αναστέλλει την κινητικότητα του άντρου, ενώ το υποβλεννογόνιο πλέγμα του Meissner μαζί με το μυεντερικό πλέγμα του Auerbach συμμετέχουν στην κανονική κινητικότητα του άντρου. 30

47 1.3 ΙΣΤΟΛΟΓΙΑ Όπως έχει ήδη αναφερθεί στην ανατομική περιγραφή, ο στόμαχος καλύπτεται σχεδόν εξ ολοκλήρου από περιτόναιο (εκτός από πολύ μικρές περιοχές στην οπίσθια επιφάνεια της καρδίας και του περιφερικού τμήματος του πυλωρού μαζί με το εγγύς 12δάκτυλο καθώς και κατά μήκος των δύο τόξων). Το περιτόναιο αποτελεί τον εξωτερικό χιτώνα του στομάχου που είναι ο ορογόνος. Κάτω από τον ορογόνο και τον υπορογόνιο, βρίσκεται ο παχύς εξωτερικός μυικός χιτώνας που αποτελείται από 3 στοιβάδες λείων μυικών ινών (Εικόνα 1.17). Η έξω επιμήκης στοιβάδα, η οποία βρίσκεται κυρίως κατά μήκος των δύο τόξων και αποτελεί συνέχεια της εξωτερικής λείας μυικής στοιβάδας του οισοφάγου. Η μέση μυική στοιβάδα, είναι κυκλοτερής και είναι το μόνο ολοκληρωμένο μυικό στρώμα του τοιχώματος του στομάχου. Γίνεται σταδιακά παχύτερη στον πυλωρό και λειτουργεί ως αληθής ανατομικός σφιγκτήρας. Η μέση μυική στοιβάδα είναι συνέχεια της κυκλοτερούς στοιβάδας του οισοφάγου. Η έσω λοξή μυική στοιβάδα βρίσκεται ως επί το πλείστον στο σώμα και είναι περισσότερο ανεπτυγμένη στο καρδιακό στόμιο. Ανάμεσα στις στοιβάδες του εξωτερικού μυικού χιτώνα, βρίσκεται το μυεντερικό πλέγμα του Auerbach, ένα πλούσιο πλέγμα από αυτόνομα νεύρα και γάγγλια (Εικόνα 1.11). Ο υποβλεννογόνιος χιτώνας (Εικόνες 1.11 και 1.18) βρίσκεται μεταξύ του εξωτερικού μυικού χιτώνα και του βλεννογόνου και αποτελείται από συνδετικό ιστό πλούσιο σε κολλαγόνο. Είναι ο ισχυρότερος χιτώνας του τοιχώματος του στομάχου. Περιέχει πλούσιο αναστομωτικό αγγειακό και λεμφαγγειακό δίκτυο, καθώς και το πλέγμα αυτόνομων νεύρων του Meissner [10]. Παρέχει αιμάτωση σε όλο το γαστρικό βλεννογόνο εκτός από το μέρος που αντιστοιχεί στο έλασσον τόξο (αιμάτωση από την αριστερή και δεξιά γαστρική αρτηρία) [11]. 31

48 Εικόνα 1.17 Στοιβάδες του εξωτερικού μυικού χιτώνα του στομάχου (Πηγή: my&biw=1280&bih=671&source=lnms&tbm=isch&sa=x&ved=0ahukewju6lmg8m3lahvpa ZoKHRX8D58Q_AUIBigB) Ο βλεννογόνος του στομάχου αποτελείται από το επιθήλιο, το χόριο και το βλεννογόνιο μυικό χιτώνα (Εικόνες 1.11, 1.18 και 1.19). Ο τελευταίος βρίσκεται σε επαφή με τον υποβλεννογόνιο και πιθανότατα είναι υπεύθυνος για το σχηματισμό των πτυχών (rugae) του γαστρικού βλεννογόνου (Εικόνες 1.17 και 1.20), χάρη στις οποίες αυξάνεται κατά πολύ η επιφάνεια του επιθηλίου. Αποτελεί επίσης το όριο με βάση το οποίο τα γαστρικό καρκίνωμα θα χαρακτηριστεί διηθητικό ή μη διηθητικό. Το χόριο αντιπροσωπεύει ένα λεπτό στρώμα συνδετικού ιστού και περιέχει τριχοειδή αγγεία, λεμφαγγεία και νεύρα, απαραίτητα για το επιθήλιο [10]. Στο χόριο υπάρχουν ινοβλάστες, ιστιοκύτταρα, λίγα πλασματοκύτταρα και λεμφοκύτταρα (κυρίως Β-λεμφοκύτταρα), ενώ σπάνια συναντώνται πολυμορφοπύρηνα και μαστοκύτταρα. 32

49 Εικόνα 1.18 Χιτώνες τοιχώματος στομάχου (χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης) (Πηγή: o=u&source=univ&sa=x&ved=0ahukewiz3dq1rtdlahwbe5okhzbjcleqsaqigq) Εικόνα 1.19 Βλεννογόνος στομάχου (χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης x10) LP: χόριο (lamina propria), MM: βλεννογόνιος μυικός χιτώνας (muscularis mucosa) (Πηγή: o=u&source=univ&sa=x&ved=0ahukewiz3dq1rtdlahwbe5okhzbjcleqsaqigq) 33

50 Εικόνα 1.20 Πτυχές του γαστρικού βλεννογόνου (Rugae) (Πηγή: QIGg&biw=1366&bih=657) Το μονόστοιβο επιθήλιο σχηματίζεται από διάφορα κύτταρα, ανάλογα με την ανατομική περιοχή του στομάχου. Συνολικά, υπάρχουν τα βλεννοπαραγωγά, τα κύρια (πεπτικά ή ενζυμοπαραγωγά), τα τοιχωματικά (οξεοπαραγωγά) και τα εντεροενδοκρινικά κύτταρα. Συνολικά διακρίνουμε τρεις διαφορετικές ιστολογικές ζώνες στο γαστρικό βλεννογόνο, την επιπολής, την αυχενική και την εν τω βάθει (Εικόνα 1.21), οι οποίες έχουν διαφορετική μορφολογία ανάλογα με το ανατομικό τμήμα του στομάχου (Εικόνα 1.22). Εκτός από τις λειτουργίες που απορρέουν από τους διαφορετικούς τύπους κυττάρων, ο βλεννογόνος λειτουργεί και ως φραγμός, εμποδίζοντας τα ιόντα υδρογόνου και τα βακτήρια από το να προκαλέσουν βλάβη στον ίδιο. Σε αυτό συμμετέχουν η κορυφαία κυτταρική μεμβράνη, το κυτταρόπλασμα και η βασική μεμβράνη. Η μικροκυκλοφορία παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην πρόληψη βλάβης στο βλεννογόνο. 34

51 Εικόνα 1.21 Ιστολογικές ζώνες γαστρικού βλεννογόνου ανάλογα με την ανατομική περιοχή του στομάχου: (Α) καρδία, (Β) πυθμένας-σώμα, (Γ) πυλωρός (Πηγή: QIGg&biw=1366&bih=657) Μορφολογία βλεννογόνου ανάλογα με το ανατομικό τμήμα του στομάχου Ο κατώτερος οισοφάγος έχει πολύστοιβο πλακώδες επιθήλιο, με βλεννοπαραγωγά κύτταρα στο κοιλιακό τμήμα του (Εικόνες 1.7 και 1.23). Λίγοι βλεννοπαραγωγοί αδένες υπάρχουν στο χόριο και ονομάζονται καρδιακοί αδένες, λόγω της ομοιότητάς τους με εκείνους στο καρδιακό τμήμα του στομάχου. Οι αδένες αυτοί δεν παράγουν αρκετή βλέννη ώστε να προστατεύει από την παλινδρόμηση του όξινου περιεχομένου του στομάχου. Ιστολογικά, το επιθήλιο της συμβολής (junctional epithelium) μεταξύ του οισοφάγου και του στομάχου αποτελείται από ένα ακανόνιστο όριο 35

52 πολύστοιβου πλακώδους και απλού κυλινδρικού επιθηλίου. Η συμβολή αυτή βρίσκεται ένα εκατοστό περίπου κεντρικότερα από την εξωτερική γαστροοισοφαγική συμβολή. Η ακριβής εντόπιση πάντως της μεταβατικής γραμμής είναι πολύ δύσκολη διότι ο υποβλεννογόνιος είναι τόσο χαλαρός που ο βλεννογόνος κινείται αρκετά επί του μυικού χιτώνα και προβάλλει στο στόμαχο σε κάθε καταποτική κίνηση (Εικόνα 1.7). Εικόνα 1.22 Μορφολογία του γαστρικού βλεννογόνου ανάλογα με την ανατομική περιοχή (καρδία, σώμα, πυλωρός) (Πηγή: QIGg&biw=1366&bih=657) 36

53 Εικόνα 1.23 Τύποι επιθηλίου Καρδιο-Οισοφαγικής Συμβολής (Πηγή: o=u&source=univ&sa=x&ved=0ahukewiz3dq1rtdlahwbe5okhzbjcleqsaqigq#tbm=isc h&q=stomach+anatomy+skandalakis%27+surgical+anatomy) Στην καρδία του στομάχου (Εικόνες 1.21Α και 1.22), απαντώνται απλά κυλινδρικά κύτταρα. Τα γαστρικά βοθρία έχουν μικρό μήκος και υπάρχουν μικροί σωληνωτοί βλεννοπαραγωγοί αδένες, απλοί και διακλαδούμενοι, που περιέχουν μικρό αριθμό οξεοπαραγωγών τοιχωματικών κυττάρων. Εν αντιθέσει με το σώμα του στομάχου, οι αδένες είναι κυρίως βλεννοπαραγωγοί. Στον πυθμένα και στο σώμα του στομάχου (Εικόνα 1.24), βρίσκονται τα τοιχωματικά (οξεοπαραγωγά) κύτταρα, τα κύρια (πεπτικά ή ενζυμοπαραγωγά) κύτταρα και τα εντεροενδοκρινικά κύτταρα. Το χόριο βρίθει από διακλαδούμενους σωληνωτούς αδένες (Εικόνες 1.21Β και 1.22), των οποίων ο αυχένας και η βάση περιέχουν τοιχωματικά, κύρια και 37

54 εντεροενδοκρινικά κύτταρα (Εικόνα 1.25). Τα γαστρικά βοθρία εδώ έχουν μεγαλύτερο μήκος. Εικόνα 1.24 Ιστολογική εικόνα βλεννογόνου σώματος του στομάχου (χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης). Διακρίνονται τα βλεννοπαραγωγά κύτταρα που βρίσκονται στην επιπολής ζώνη του βλεννογόνου (προς τον αυλό) (Πηγή: QIGg&biw=1366&bih=657) 38

55 Εικόνα 1.25 Κύτταρα γαστρικού αδένα στο σώμα του στομάχου Gastric pit: Γαστρικό βοθρίο Foveolar cell: Βλεννοπαραγωγό κύτταρο επιφανείας Mucous neck cell: Βλεννοπαραγωγό κύτταρο αυχενικής ζώνης γαστρ βοθρίου Parietal cell: Τοιχωματικό (οξεοπαραγωγό) κύτταρο Peptic cell: Κύριο (ενζυμοπαραγωγό) κύτταρο Endocrine cell: Εντεροενδοκρινικό κύτταρο (Πηγή: QIGg&biw=1366&bih=657) Το κυτταρόπλασμα των τοιχωματικών κυττάρων (Εικόνα 1.26), είναι πλούσιο σε μιτοχόνδρια, κάτι που είναι ενδεικτικό των υψηλών απαιτήσεων σε ενέργεια που έχει η παραγωγή γαστρικού οξέος. Τα τοιχωματικά κύτταρα παράγουν επίσης τον ενδογενή παράγοντα που είναι απαραίτητος για την απορρόφηση της βιταμίνης Β 12, κάτι που είναι σημαντικό για να μην αναπτυχθεί κακοήθης 39

56 αναιμία. Τέλος, τα τοιχωματικά κύτταρα παράγουν ισταμίνη, που διεγείρει την παραγωγή οξέος. Τα πεπτικά κύτταρα (Εικόνα 1.26), περιέχουν το ανενεργό ένζυμο πεψινογόνο και επίσης παράγουν τα ένζυμα πεψίνη και λιπάση. Όταν το πεψινογόνο ελευθερώνεται στο όξινο περιβάλλον του στομάχου, μετατρέπεται στην ενεργό πρωτεολυτική πεψίνη. Εικόνα 1.26 Σώμα στομάχου. PC (Parietal Cell): Τοιχωματικό (οξεοπαραγωγό) κύτταρο CC (Chief Cell): Κύριο (πεπτικό ή ενζυμοπαραγωγό) κύτταρο (Πηγή: QIGg&biw=1366&bih=657) Τα εντεροενδοκρινικά κύτταρα (Εικόνες 1.25, 1.27 και 1.28), παράγουν σεροτονίνη και ενδορφίνη που δρουν όχι μόνο ως ορμόνες του γαστρεντερικού, αλλά και ως νευρο-διαβιβαστές προς στο ΚΝΣ όταν εισέρχονται στην κυκλοφορία. Έτσι, σε συνεργασία με τα ενδογενή νευρικά πλέγματα του στομάχου, οι ορμόνες αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της κινητικότητας του πεπτικού και στη δραστηριότητα των τοπικών αυτόνομων αντανακλαστικών. Από τα κύτταρα αυτά μπορεί να προέλθουν 40

57 νευροενδοκρινείς όγκοι, από τους οποίους είναι δυνατό να παραχθεί μεγάλη ποσότητα σεροτονίνης, που είναι υπεύθυνη για τη συμπτωματολογία της πάθησης (σύνδρομο καρκινοειδούς - flushing, κοιλιακά άλγη, διάρροιες). Εικόνα 1.27 Εντεροενδοκρινικά κύτταρα στην εν τω βάθει ζώνη των αδένων του σώματος του στομάχου Εικόνα 1.28 Εντεροενδοκρινικά κύτταρα με ανοσοϊστοχημική χρώση χρωμογρανίνης (Πηγή: QIGg&biw=1366&bih=657) (Πηγή: QIGg&biw=1366&bih=65 41

58 Το πυλωρικό άντρο (Εικόνα 1.29), περιέχει τα κύτταρα G που εκκρίνουν γαστρίνη (Εικόνα 1.30) και βλεννοπαραγωγά κύτταρα. Πολύ λίγα τοιχωματικά κύτταρα υπάρχουν στο εγγύς άντρο, αλλά όχι στο προπυλωρικό τμήμα του. Ο βλεννογόνος του άντρου διακρίνεται ξεκάθαρα από εκείνον του σώματος του στομάχου όντας περισσότερο επίπεδος, χωρίς πτυχές. Οι αδένες εδώ έχουν περισσότερες διακλαδώσεις και επαλείφονται στο άκρο τους με τα βλεννοπαραγωγά επιθηλιακά κύτταρα, που εκτείνονται μέχρι των αυχένα των αδένων. Τα κύτταρα των πυλωρικών αδένων παράγουν βλέννη και μεγάλες ποσότητες λυσοζύμης. Ορισμένα κύτταρα που παράγουν γαστρίνη, ονομάζονται C κύτταρα. Η γαστρίνη διεγείρει την παραγωγή οξέος από τα τοιχωματικά κύτταρα. Άλλα εντεροενδοκρινικά κύτταρα (κύτταρα D), απελευθερώνουν σωματοστατίνη, που αναστέλλει την απελευθέρωση άλλων ορμονών, συμπεριλαμβανομένης και της γαστρίνης. Εικόνα 1.29 Ιστολογική εικόνα πυλωρικού άντρου (χρώση αιματοξυλίνηςηωσίνης) (Πηγή: QIGg&biw=1366&bih=657) 42

59 Εικόνα 1.30 Εντεροενδοκρινή κύτταρα πυλωρικού άντρου με ανοσοϊστοχημική χρώση γαστρίνης (Πηγή: QIGg&biw=1366&bih=657) Το εγγύς δωδεκαδάκτυλο περιέχει τους αδένες του Brunner που παράγουν αλκαλική βλέννη. Το υψηλό αλκαλικό ph (8,1-9,3) δρα προστατευτικά στο βλεννογόνο του 12δακτύλου έναντι του γαστρικού οξέος και επίσης ρυθμίζει το ph του εντερικού περιεχομένου σε επίπεδο κατάλληλο για τη δράση των παγκρεατικών ενζύμων. 43

60 1.4 ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ, ΑΝΑΜΙΞΗ, ΠΕΨΗ και ΠΡΟΩΘΗΣΗ ΤΡΟΦΗΣ Η κύρια λειτουργία του στομάχου είναι να προετοιμάζει την τροφή που έχει καταποθεί προς πέψη και απορρόφηση, ενώ προωθείται προς το λεπτό έντερο. Η αρχική περίοδος της πέψης απαιτεί τα στερεά συστατικά του γεύματος να αποθηκευτούν για κάποιες ώρες, ενώ υποβάλλονται σε μείωση του μεγέθους τους και σε διάσπαση στα βασικά μεταβολικά συστατικά τους. Ο εγγύς στόμαχος (πυθμένας και σώμα) δέχεται και αποθηκεύει προσωρινά την τροφή ως γαστρικό περιεχόμενο. Στο τμήμα αυτό βρίσκονται τα τοιχωματικά κύτταρα που εκκρίνουν το γαστρικό οξύ και τον ενδογενή παράγοντα, όπως και τα κύτταρα που παράγουν πεψινογόνο ομάδας Ι. Η μεγαλύτερη συγκέντρωση των οξυπαραγωγών κυττάρων παρατηρείται στο σώμα και ακολουθεί το έλασσον τόξο και ο πυθμένας. Η χαλάρωση του εγγύς τμήματος του στομάχου προ της λήψης της τροφής, είναι εκείνη που του δίνει τη δυνατότητα να λειτουργήσει ως αποθηκευτικό όργανο. Η χαλάρωση αυτή δίνει τη δυνατότητα στα υγρά να περάσουν το στομάχι κατά μήκος του ελάσσονος τόξου, ενώ η στερεά τροφή παραμένει στο μείζον τόξο προς τον πυθμένα. Εν αντιθέσει με τα υγρά, η προώθηση της στερεάς τροφής διευκολύνεται από το άντρο, το οποίο προωθεί το στερεό περιεχόμενο στον πυλωρό και δια μέσω αυτού. Ο άπω στόμαχος (άντρο και πυλωρός) αναμιγνύει και προωθεί το γαστρικό περιεχόμενο. Εδώ βρίσκονται επίσης οι πυλωρικοί αδένες που παράγουν γαστρίνη και σωματοστατίνη Το άντρο και ο πυλωρός λειτουργούν σε συνδυασμό, επιτρέποντας την είσοδο συστατικών της τροφής στο 12δάκτυλο και επιστρέφοντας προς το εγγύς τμήμα του στομάχου το περιεχόμενο που δεν είναι ακόμη κατάλληλο για να προωθηθεί. Επιπλέον της λειτουργίας του ως αποθηκευτικό όργανο, ο στόμαχος συμμετέχει και στην πέψη των προσλαμβανόμενων τροφών. Η πεπτική διαδικασία μεταβολίζει την τροφή σε λίπη, πρωτεΐνες και υδατάνθρακες μέσω της διάσπασης των κυτταρικών τοιχωμάτων. Παρόλο που το 12δάκτυλο και το 44

61 εγγύς λεπτό έντερο είναι κυρίως υπεύθυνα για την πέψη της τροφής, το στομάχι διευκολύνει αρκετά την όλη διαδικασία. Η λειτουργία του στομάχου βρίσκεται υπό νευρικό και ορμονικό έλεγχο. Τα δύο αυτά συστήματα δρουν συνεργικά, ώστε να παρέχουν πρόσθετη ρύθμιση. Ορμονικοί μεσολαβητές της γαστρικής λειτουργίας είναι συνήθως πεπτίδια ή αμίνες που αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα-στόχους με έναν από τους τρεις τρόπους: ενδοκρινικό, παρακρινικό και νευροκρινικό. Τα ενδοκρινικά κύτταρα απελευθερώνουν πεπτίδια στην κυκλοφορία, τα οποία καταλήγουν στα κύτταρα-στόχους και επιτελούν τις ορμονικές λειτουργίες. Αντίθετα, τα παρακρινικά κύτταρα απελευθερώνουν τα πεπτίδιά τους τοπικά, τα οποία μέσω διάχυσης στο διάμεσο χώρο καταλήγουν στα κύτταραστόχους. Τέλος, οι νευροκρινικοί μεσολαβητές απελευθερώνονται από τις απολήξεις των νεύρων, διαχέονται στη σύναψη και προσδένονται σε υποδοχείς στο κύτταρο-στόχο που βρίσκεται στο άλλο άκρο της σύναψης. Αξίζει να σημειωθεί, πως ορισμένα πεπτίδια όπως η σωματοστατίνη, μπορούν να δράσουν τόσο ως ενδοκρινικοί, όσο και ως παρακρινικοί μεσολαβητές για τη γαστρική λειτουργία, αναλόγως των συνθηκών. ΓΑΣΤΡΙΚΑ ΠΕΠΤΙΔΙΑ 1) Γαστρίνη Όπως έχει ήδη αναφερθεί στο κεφάλαιο της ιστολογίας, η γαστρίνη παράγεται από τα κύτταρα G που βρίσκονται στο άντρο του στομάχου. Η απελευθέρωσή της διεγείρεται από τα συστατικά της τροφής και ειδικότερα από τα προϊόντα πέψης των πρωτεϊνών. Αντιθέτως, η παρουσία οξέος ενδοαυλικά αναστέλλει την έκκρισή της. Η σωματοστατίνη έχει παρακρινική δράση στα κύτταρα G και λειτουργεί ανασταλτικά στην απελευθέρωση της γαστρίνης. Στο άντρο, η απελευθέρωση της σωματοστατίνης και της γαστρίνης συνδέονται λειτουργικά και υπάρχει αμοιβαία αντίστροφη σχέση μεταξύ τους. Η γαστρίνη είναι ο κύριος ορμονικός ρυθμιστής της γαστρικής φάσης της έκκρισης του οξέος που ακολουθεί ένα γεύμα. Παρόλο που τα οξεοπαραγωγά (τοιχωματικά) κύτταρα διαθέτουν υποδοχείς γαστρίνης και παρά το ότι η εξωγενής χορήγησή της προκαλεί την έκκριση γαστρικού οξέος, το 45

62 πιθανότερο είναι ότι η ισταμίνη που παράγεται από τα εντεροχρωμαφινικά ομοιάζοντα κύτταρα (EnteroChroamaffin-Like (ECL) cells), είναι ο κύριος μεσολαβητής για τη λειτουργία αυτή. Έτσι, οι ανταγωνιστές των H2 υποδοχέων της ισταμίνης. Έχει διαπιστωθεί ότι η γαστρίνη προστατεύει το στόμαχο από ενδοαυλικούς ερεθιστικούς παράγοντες. Φαίνεται λοιπόν ότι παίζει κάποιο ρόλο στην άμυνα του γαστρικού βλεννογόνου. Έχει επίσης σημαντικά τροφικά αποτελέσματα στα τοιχωματικά και στα ECL κύτταρα του στομάχου. Έτσι, παρατεταμένη υπεργαστριναιμία οποιασδήποτε αιτιολογίας, οδηγεί σε υπερπλασία του βλεννογόνου και σε αύξηση του αριθμού των ECL κυττάρων και σε μερικές περιπτώσεις σχετίζεται με καρκινοειδείς όγκους του στομάχου. 2) Σωματοστατίνη Η σωματοστατίνη παράγεται από τα νευροενδοκρινικά D κύτταρα, που βρίσκονται διάχυτα τόσο στον πυθμένα, όσο και στο άντρο. Οι κυτταροπλασματικές προσεκβολές των D κυττάρων έχουν άμεση επαφή με τα τοιχωματικά και τα G κύτταρα, όπου πιθανότατα εξασκούν τις λειτουργίες τους με παρακρινική δράση στην έκκριση του γαστρικού οξέος και στην απελευθέρωση της γαστρίνης. Η σωματοστατίνη μπορεί να αναστείλει άμεσα την έκκριση οξέος από τα τοιχωματικά κύτταρα, αλλά και έμμεσα, μέσω αναστολής της απελευθέρωσης της γαστρίνης και περιορισμού της απελευθέρωσης της ισταμίνης από τα ECL κύτταρα. Το κύριο ερέθισμα για την έκκριση της σωματοστατίνης είναι η οξύτητα του άντρου, ενώ η ακετυλοχολίνη από τις ίνες του πνευμονογαστρικού, αναστέλλει την απελευθέρωσή της. 3) Ισταμίνη Η Ισταμίνη παίζει κυρίαρχο ρόλο στη διέγερση των τοιχωματικών (οξεοπαραγωγών) κυττάρων. Για παράδειγμα η χορήγηση ανταγωνιστών των Η2 υποδοχέων, σχεδόν καταργεί την έκκριση γαστρικού οξέος που διεγείρεται από τη γαστρίνη και την ακετυλοχολίνη. Τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η ισταμίνη είναι ένας απαραίτητος ενδιάμεσος παράγοντας για την έκκριση του γαστρικού οξέος. Η ισταμίνη αποθηκεύεται σε κοκκία στα ECL (Entero- Chromaffin Like) κύτταρα καθώς και στα μαστοκύτταρα. Η απελευθέρωσή της 46

63 διεγείρεται από τη γαστρίνη, την ακετυλοχολίνη και την επινεφρίνη κατόπιν αλληλεπίδρασης συνδέτη-υποδοχέα στα ECL κύτταρα. Εν αντιθέσει, η σωματοστατίνη αναστέλλει τη διεγειρόμενη από τη γαστρίνη απελευθέρωση ισταμίνης, μέσω αλληλεπίδρασης με τους υποδοχείς σωματοστατίνης που βρίσκονται στα ECL κύτταρα. Φαίνεται λοιπόν ότι τα κύτταρα αυτά, παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην ενεργοποίηση των τοιχωματικών (οξεοπαραγωγών) κυττάρων, που περιλαμβάνει τόσο διεγερτικά, όσο και ανασταλτικά ερεθίσματα που ελέγχουν την απελευθέρωση της ισταμίνης και ως εκ τούτου την έκκριση του οξέος. 4) Πεπτίδιο απελευθέρωσης γαστρίνης (Gastrin-Releasing Peptide) Το πεπτίδιο αυτό βρίσκεται κυρίως στα τελικά άκρα των νεύρων στα τμήματα του στομάχου όπου παράγεται το οξύ και η γαστρίνη και εντοπίζεται στον κυκλοτερή μυικό χιτώνα. Στο βλεννογόνο του άντρου, το πεπτίδιο συνδέεται σε υποδοχείς των G και D κυττάρων και διεγείρει αντίστοιχα την απελευθέρωση της γαστρίνης της σωματοστατίνης. Απομακρύνεται τάχιστα από την κυκλοφορία από μία ενδοπεπτιδάση και έχει χρόνο ημίσειας ζωής 1.4 λεπτά. Έχει βρεθεί ότι η εξωγενής περιφερική χορήγηση του πεπτιδίου διεγείρει την έκκριση γαστρικού οξέος. Αντίθετα, η εξωγενής κεντρική χορήγησή του στις κοιλίες, αναστέλλει την έκκριση του οξέος. Η ανασταλτική οδός φαίνεται ότι λειτουργεί μέσω του συμπαθητικού νευρικού συστήματος, δεν επηρεάζεται από βαγοτομή και δεν υπάρχει χυμικός μεσολαβητής. 5) Γρελίνη (Ghrelin) Η Γρελίνη είναι πεπτίδιο 28 αμινοξέων, το οποίο παράγεται από τα ενδοκρινικά κύτταρα του οξεοπαραγωγού τμήματος του γαστρικού βλεννογόνου. Σημαντικά μικρότερες ποσότητες προέρχονται από το έντερο, το πάγκρεας και άλλα όργανα. Για παράδειγμα, η αφαίρεση του οξεοπαραγωγού τμήματος του στομάχου, έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της κυκλοφορούσας γαστρίνης κατά 80%. Η Γρελίνη φαίνεται ότι βρίσκεται υπό ενδοκρινικό μια μεταβολικό έλεγχο, πιθανότατα παίζει κύριο ρόλο στη νευροενδοκρινική και μεταβολική απάντηση στις αλλαγές της διατροφικής κατάστασης και μπορεί να είναι κύρια αναβολική ορμόνη. Προκαλεί την απελευθέρωση της αυξητικής ορμόνης μέσω της 47

64 ενεργοποίησης του υποδοχέα 1a της αυξητικής ορμόνης. Μελέτες έχουν δείξει ότι η εξωγενής χορήγηση γρελίνης προκαλεί δοσοεξαρτώμενη διέγερση απελευθέρωσης της αυξητικής ορμόνης. Άλλες πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η γρελίνη εμπλέκεται στην ομοιόσταση της γλυκόζης, μια και η εξωγενής χορήγησή της μειώνει την έκκριση της ινσουλίνης. Έχει βρεθεί επίσης ότι η χορήγηση γρελίνης αυξάνει την όρεξη και την πρόσληψη τροφής. Σε ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε γαστρική παράκαμψη, διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα γρελίνης είναι κατά 77% χαμηλότερα σε σχέση με τους αντίστοιχους παχύσαρκους μάρτυρες, εύρημα το οποίο δεν παρατηρείται μετά άλλες βαριατρικές επεμβάσεις. Παρ ότι ο μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για την καταστολή των επιπέδων γρελίνης μετά την επέμβαση γαστρικής παράκαμψης δεν είναι γνωστός, τα παραπάνω δεδομένα υποδεικνύουν ότι η γρελίνη ίσως είναι υπεύθυνη για την κανονική ροή των συστατικών της τροφής διά του στομάχου. Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι η γρελίνη οδηγεί προς τη γλυκόλυση και όχι προς την οξείδωση των λιπαρών οξέων, γεγονός που ευνοεί την εναπόθεση λίπους. Φαίνεται ότι η έκκριση της γρελίνης διεγείρεται στις περιπτώσεις αρνητικού ισοζυγίου ενέργειας και καταστέλλεται όταν υπάρχει θετικό ενεργειακό ισοζύγιο. Παρ όλο που ο ακριβής ρόλος της στο μεταβολισμό της ενέργειας χρειάζεται να αποσαφηνιστεί, ίσως η γρελίνη να έχει κάποιο ρόλο στη θεραπεία και στην πρόληψη της παχυσαρκίας. ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΓΑΣΤΡΙΚΗΣ ΕΚΚΡΙΣΗΣ 1) ΓΑΣΤΡΙΚΟ ΟΞΥ Η έκκριση του γαστρικού οξέος από τα τοιχωματικά κύτταρα ρυθμίζεται από τρία τοπικά ερεθίσματα: την ακετυλοχολίνη, τη γαστρίνη και την ισταμίνη. Τα τρία αυτά πεπτίδια είναι υπεύθυνα τόσο για τη βασική, όσο και για την έκκριση γαστρικού οξέος κατόπιν διέγερσης. Η ακετυλοχολίνη είναι ο κύριος νευροδιαβιβαστής που ρυθμίζει την έκκριση του γαστρικού οξέος και απελευθερώνεται από το πνευμονογαστρικό και από τα κύτταρα των παρασυμπαθητικών γαγγλίων. Ίνες του πνευμονογαστρικού 48

65 νευρώνουν όχι μόνο τα τοιχωματικά κύτταρα, αλλά και τα G και ECL κύτταρα και ρυθμίζεται με τον τρόπο αυτό η απελευθέρωση των πεπτιδίων τους. Η γαστρίνη έχει ορμονική επίδραση στα τοιχωματικά κύτταρα και προκαλεί την απελευθέρωση της ισταμίνης. Η ισταμίνη απελευθερώνεται από τα ECL κύτταρα και έχει παρακρινική επίδραση στα τοιχωματικά κύτταρα παίζοντας κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της έκκρισης οξέος από αυτά. Η σωματοστατίνη ασκεί ανασταλτική δράση στην έκκριση του γαστρικού οξέος. Η απελευθέρωσή της από τα D κύτταρα του άντρου προκαλείται από την παρουσία οξέος ενδοαυλικά, σε ph 3 ή μικρότερο. Αναστέλλει την έκκριση γαστρίνης μέσω παρακρινικών επιδράσεων και τροποποιεί την απελευθέρωση της ισταμίνης. Σε μερικούς ασθενείς με πεπτικό έλκος, αυτή η αρνητική ανάδρομη απάντηση είναι ανεπαρκής. Από τα παραπάνω βλέπουμε ότι η έκκριση οξέος από τα τοιχωματικά κύτταρα, εξαρτάται από τη συγκεντρωτική επίδραση θετικών και αρνητικών ερεθισμάτων. Βασική έκκριση γαστρικού οξέος Επί απουσίας τροφής, υπάρχει πάντα ένα βασικό επίπεδο έκκρισης οξέος, το οποίο κυμαίνεται αδρά στο 10% του μέγιστου επιπέδου έκκρισης. Η βασική έκκριση παρουσιάζει επίσης κιρκάδιο ρυθμό, με την ποσότητα της νυκτερινής έκκρισης να είναι μεγαλύτερη της ημερήσιας. Υπό κανονικές συνθήκες, εκκρίνεται 1 έως 5 mmol υδροχλωρικού οξέος/ώρα, ποσότητα που μειώνεται κατά 75% έως 90% μετά βαγοτομή ή χορήγηση ατροπίνης. Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι η ακετυλοχολίνη παίζει σημαντικό ρόλο στη βασική έκκριση του γαστρικού οξέος. Παρ όλ αυτά, ο αποκλεισμός των Η2 υποδοχέων μειώνει την έκκριση του οξέος κατά 90%, υποδεικνύοντας ότι η ισταμίνη παίζει έναν επίσης σημαντικό ενδιάμεσο ρόλο στην όλη διαδικασία. Φαίνεται λοιπόν ότι η βασική γαστρική έκκριση οξέος εξαρτάται από συνδυασμό χολινεργικής και ισταμινεργικής συμμετοχής. 49

66 Έκκριση γαστρικού οξέος κατόπιν διέγερσης Η λήψη τροφής είναι το φυσιολογικό ερέθισμα για την έκκριση γαστρικού οξέος. Έχουν περιγραφεί τρεις φάσεις της έκκρισης οξέος ως απάντηση στη λήψη γεύματος: η κεφαλική, η γαστρική και η εντερική. Οι φάσεις αυτές αλληλοσυσχετίζονται και συμβαίνουν συγχρόνως και όχι διαδοχικά. 1. Κεφαλική φάση Η κεφαλική φάση ξεκινάει με τη θέα, την όσφρηση, τη σκέψη ή τη γεύση της τροφής, ερεθίσματα που διεγείρουν κέντρα στο φλοιό και στον υποθάλαμο. Οι ακριβείς μηχανισμοί μέσω των οποίων οι αισθήσεις διεγείρουν την έκκριση οξέος παραμένει να διερευνηθούν. Επικρατεί η υπόθεση πως αρκετά κέντρα διεγείρονται στον εγκέφαλο, τα οποία μεταδίδουν σήματα στο στομάχι μέσω των πνευμονογαστρικών νεύρων. Αυτά με τη σειρά τους απελευθερώνουν ακετυλοχολίνη, η οποία ενεργοποιεί τους μουσκαρινικούς υποδοχείς που βρίσκονται στα κύτταρα-στόχους. Η ακετυλοχολίνη προκαλεί άμεσα την αύξηση της έκκρισης του οξέος από τα τοιχωματικά κύτταρα και μπορεί είτε να αναστείλει, είτε να διεγείρει την απελευθέρωση γαστρίνης, με τελικό αποτέλεσμα μία ήπια αύξηση στα επίπεδά της. Παρ όλο που η ένταση της έκκρισης γαστρικού οξέος στην κεφαλική φάση είναι μεγαλύτερη από την αντίστοιχη στις άλλες φάσεις, έχει βραχύτερη διάρκεια. Έτσι, η ποσότητα γαστρικού οξέος που παράγεται στη φάση αυτή, είναι το 20% με 30% του συνολικού όγκου που παράγεται ως απάντηση σε ένα γεύμα. 2. Γαστρική φάση Η γαστρική φάση έκκρισης του οξέος ξεκινά όταν η τροφή εισέρχεται στον αυλό του στομάχου. Τα προϊόντα της πέψης της τροφής αλληλεπιδρούν με τις μικρολάχνες των κυττάρων G του άντρου, διεγείροντας έτσι την απελευθέρωση γαστρίνης. Η τροφή διεγείρει επίσης την έκκριση οξέος μέσω πρόκλησης μηχανικής διάτασης του στομάχου. Με τη γαστρική διάταση ενεργοποιούνται οι τασεοϋποδοχείς που ενεργοποιούν με τη σειρά τους το μακρό αντανακλαστικό τόξο του πνευμονογαστρικού. Το τόξο αυτό ό καταργείται με την εγγύς βαγοτομή και είναι εν μέρει ανεξάρτητο από τις αλλαγές στα επίπεδα γαστρίνης στον ορό. Παρ όλ αυτά, η διάταση του 50

67 άντρου προκαλεί επίσης απελευθέρωση γαστρίνης (πυλωρο-οξυπαραγωγό αντανακλαστικό). Κατά τη γαστρική φάση, η μηχανική διάταση του στομάχου είναι υπεύθυνη για το 30% - 40% της μέγιστης έκκρισης οξέος ως απόκρισης στη λήψη γεύματος, με το υπόλοιπο ποσοστό παραγωγής οξέος να οφείλεται στην απελευθέρωση γαστρίνης. Ολόκληρη η γαστρική φάση είναι υπεύθυνη για το 60% με 70% της προκαλούμενης από τη λήψη τροφής παραγωγής οξέος, για το λόγο ότι διαρκεί έως ότου κενωθεί ο στόμαχος. 3. Εντερική φάση Η εντερική φάση της γαστρικής έκκρισης παραμένει ελλιπώς κατανοητή, αλλά φαίνεται ότι ξεκινά με την είσοδο του χυμού στο λεπτό έντερο. Ακολουθεί την κένωση του στομάχου και διαρκεί όσο τα συστατικά της τροφής παραμένουν στο εγγύς λεπτό έντερο. Είναι υπεύθυνη για το 10% της έκκρισης οξέος ως απάντησης στη λήψη γεύματος και δε φαίνεται να οφείλεται στην έκκριση γαστρίνης. Φαίνεται ότι ένα ορμονικό πεπτίδιο (εντερο-οξυντίνη) που απελευθερώνεται από το βλεννογόνο του λεπτού εντέρου, είναι υπεύθυνο για την εντερική φάση της έκκρισης γαστρικού οξέος. Σημασία του γαστρικού οξέος Το γαστρικό οξύ παίζει σημαντικό ρόλο στην πέψη της τροφής. Η παρουσία του είναι απαραίτητη για τη μετατροπή του πεψινογόνου σε πεψίνη, η οποία είναι υπεύθυνη για την υδρόλυση των πρωτεϊνών σε πολυπεπτίδια. Το γαστρικό οξύ προκαλεί επίσης την απελευθέρωση της εκκριματίνης (secretin) από το 12δάκτυλο, που με τη σειρά της προκαλεί την έκκριση διττανθρακικών από το πάγκρεας. Επιπλέον, το γαστρικό οξύ περιορίζει τον αποικισμό του ανώτερου πεπτικού με βακτήρια. Αποικισμός του στομάχου και του 12δακτύλου είναι γνωστό ότι συμβαίνει σε ασθενείς με αχλωρυδρία ή σε όσους λαμβάνουν χρονίως αντιεκκριτικούς παράγοντες. Η αλκαλοποίηση του γαστρικού περιβάλλοντος ελαττώνει τη βακτηριοκτόνο επίδραση του οξέος, δημιουργώντας ευνοϊκές συνθήκες για υπερανάπτυξη μοκροβίων. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα παθογόνα που είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη νοσοκομειακής πνευμονίας, που αποτελεί την κύρια λοίμωξη σε ασθενείς με Σύνδρομο Ανεπάρκειας Πολλαπλών Οργάνων στις Μονάδες Εντατικής Θεραπείας, συχνά 51

68 ανευρίσκονται στο γαστρικό υγρό και φαίνεται ότι αποικίζουν προσωρινά το στόμαχο πριν από την ανάπτυξη πνευμονίας [10]. 2) ΓΑΣΤΡΙΚΟΣ ΧΥΜΟΣ Ο γαστρικός χυμός είναι το αποτέλεσμα της έκκρισης από τα τοιχωματικά, τα κύρια και τα βλεννώδη κύτταρα, μαζί με τη σίελο και το υγρό που παλινδρομεί από το 12δάκτυλο. Η περιεκτικότητα σε ηλεκτρολύτες ποικίλλει ανάλογα με το ρυθμό της γαστρικής έκκρισης. Τα τοιχωματικά κύτταρα εκκρίνουν ισότονο με το πλάσμα διάλυμα ηλεκτρολυτών, που έχει περιεκτικότητα 160mmol/L. Το ph του διαλύματος αυτού είναι 0.8. Η χαμηλότερη τιμή ενδοαυλικού ph στο στομάχι είναι το 2, που οφείλεται στην επιπλέον γαστρική έκκριση που περιέχει Na, K και διττανθρακικά. 3) ΕΝΔΟΓΕΝΗΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ Ο ενδογενής παράγοντας είναι μία βλεννοπρωτεΐνη dalton, που εκκρίνεται από τα τοιχωματικά κύτταρα και είναι απαραίτητος για την απορρόφηση της βιταμίνης Β12 από τον τελικό ειλεό. Η έκκρισή του γίνεται παράλληλα με εκείνη του γαστρικού οξέος, αν και δεν είναι απαραίτητο οι δύο αυτές λειτουργίες να συνδέονται μεταξύ τους (για παράδειγμα οι αναστολείς αντλίας πρωτονίων δεν αναστέλλουν την έκκριση του ενδογενούς παράγοντα). Ανεπάρκεια του ενδογενούς παράγοντα αναπτύσσεται στην κακοήθη αναιμία και στους ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε ολική γαστρεκτομή. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις χρειάζεται χορήγηση βιταμίνης Β12. 4) ΠΕΨΙΝΟΓΟΝΟ Τα πεψινογόνα είναι πρωτεολυτικά προένζυμα με ΜΒ και εκκρίνονται από τους αδένες του γαστρικού και 12δακτυλικού βλεννογόνου και διακρίνονται σε δύο ομάδες. Τα πεψινογόνα ομάδας 1 εκκρίνονται από τα κύρια (ενζυμοπαραγωγά) κύτταρα καθώς και από τα βλεννοπαραγωγά κύτταρα της αυχενικής μοίρας των αδένων που βρίσκονται στο οξεοπαραγωγό τμήμα του στομάχου. Τα πεψινογόνα ομάδας 2 παράγονται από τα επιφανειακά επιθηλιακά κύτταρα του οξεοπαραγωγού τμήματος του 52

69 στομάχου καθώς και από το άντρο και το εγγύς 12δάκτυλο. Συνεπώς, τα πεψινογόνα ομάδας 1 εκκρίνονται από τους ίδιους αδένες που εκκρίνουν το γαστρικό οξύ, ενώ εκείνα της ομάδας 2 εκκρίνονται από τον οξεοπαραγωγό βλεννογόνο και από εκείνον που παράγει γαστρίνη. Παρουσία οξέος, αμφότερα τα είδη πεψινογόνου μετατρέπονται σε πεψίνη, η οποία αδρανοποιείται σε ph μεγαλύτερο του 5. 5) ΒΛΕΝΝΗ και ΔΙΤΤΑΝΘΡΑΚΙΚΑ Η βλέννη συνδυάζεται με τα διττανθρακικά και αδρανοποιούν το γαστρικό οξύ στην επιφάνεια του γαστρικού βλεννογόνου. Η έκκρισή τους γίνεται από τα βλεννοπαραγωγά κύτταρα της επιφάνειας και της αυχενικής μοίρας των αδένων που βρίσκονται στο οξεοπαραγωγό τμήμα και στο άντρο του στομάχου. Η βλέννη βρίσκεται σε μία συνεχή ροή, διότι παράγεται συνεχώς από τα κύτταρα του βλεννογόνου, ενώ διαλύεται από την πεψίνη στον αυλό του στομάχου. Παρέχει μηχανικό φραγμό, προστατεύοντας το γαστρικό βλεννογόνο. Η παραγωγή της προκαλείται μέσω του πνευμονογαστρικού, χολινεργικών αγωνιστών, προσταγλανδινών και ορισμένων βακτηριακών τοξινών. Τα αντιχολινεργικά και τα ΜΣΑΦ αναστέλλουν την έκκρισή της. Το H. pylori παράγει διάφορες πρωτεάσες και λιπάσες, που διασπούν τη βλέννη και εμποδίζουν την προστατευτική δράση της. Στο οξεοπαραγωγό τμήμα του στομάχου, η έκκριση των διττανθρακικών είναι μία ενεργής διαδικασία, ενώ στο άντρο συμβαίνει τόσο ενεργής, όσο και παθητική έκκριση. Η έκταση της έκκρισης των διττανθρακικών είναι σημαντικά μικρότερη εκείνης του γαστρικού οξέος. Το ενδοαυλκό ph είναι 2, ενώ το ph στην επιφάνεια του επιθηλίου είναι 7. Η διαφορά αυτή οφείλεται στο στρώμα νερού που εμπεριέχεται στη βλέννη, καθώς και στη συνεχή έκκριση διττανθρακικών από τα επιθηλιακά κύτταρα επιφανείας. 53

70 ΚΙΝΗΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΧΟΥ Η κινητικότητα του στομάχου ρυθμίζεται από εξωγενείς και ενδογενείς νευρικούς μηχανισμούς, αλλά υπόκειται επίσης σε μυικό έλεγχο. Ο εξωγενής νευρικός έλεγχος ασκείται μέσω του παρασυμπαθητικού (πνευμονογαστρικά) και του συμπαθητικού νευρικού συστήματος. Ο ενδογενής έλεγχος περιλαμβάνει το σύστημα του μυεντερικού πλέγματος. Τα κύτταρα του Cajal που βρίσκονται στο μείζον τόξο στη μεσότητα του σώματος, είναι ο γαστρικός βηματοδότης. Η γαστρική κινητικότητα αρχίζει με την εκπόλωση των κυττάρων αυτών και παράγονται αρχικά βραδέα κύματα (3 κύκλοι/λεπτό) με κυκλοτερή και προωθητική κατεύθυνση. Επιπλέον των βραδέων αυτών κυμάτων, τα λεία μυικά κύτταρα του στομάχου παράγουν και ενεργά δυναμικά, τα οποία παράγουν αληθείς μυικές συσπάσεις. Κατά τη φάση νηστείας, η ηλεκτρική δραστηριότητα του στομάχου αποτελείται τόσο από βραδέα κύματα, όσο και από ενεργά δυναμικά, τα οποία ονομάζονται Μυοηλεκτρικό Μεταναστευτικό Σύμπλεγμα (ΜΜΣ). Κάθε τέτοιος κύκλος διαρκεί λεπτά και αποτελείται από 4 φάσεις. Το αποτέλεσμα είναι η κένωση του στομάχου από το περιεχόμενο κατά τη φάση νηστείας. Μετά τη λήψη γεύματος, επέρχεται μείωση του τόνου ηρεμίας στον εγγύς στόμαχο και στον πυθμένα, αντανακλαστικό το οποίο σχετίζεται με το πνευμονογαστρικό νεύρο. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η προσωρινή αποθήκευση της τροφής. Επιπρόσθετα, ο στόμαχος είναι υπεύθυνος για την ανάμειξη και το άλεσμα της τροφής, το οποίο επιτυγχάνεται με επαναλαμβανόμενες συσπάσεις του μεσαίου τμήματος και του άντρου. Η τροφή έτσι προωθείται προς τον πυλωρό που αρχικά είναι κλειστός, με αποτέλεσμα να παλινδρομεί και να διασπάται σταδιακά. Η κένωση του στομάχου ρυθμίζεται από τη συνεργασία νευρικών και ορμονικών μεσολαβητών. Διάφοροι παράγοντες όπως το άγχος, ο φόβος, η κατάθλιψη, η άσκηση, αλλά και η θερμοκρασία η χημική σύσταση και οι μηχανικές ιδιότητες της τροφής, επηρεάζουν την κινητικότητα και την κένωση του στομάχου. Τα υγρά σε σχέση με τα στερεά, καθώς και οι υδατάνθρακες σε σχέση με το λίπος, προωθούνται γρηγορότερα. Αυξημένη συγκέντρωση ή οξύτητα των υγρών, προκαλεί καθυστέρηση στην κένωση. Ομοίως, ζεστά και κρύα υγρά, προωθούνται με πιο αργό ρυθμό απ ότι εκείνα που βρίσκονται σε 54

71 θερμοκρασία δωματίου. Πεπτίδια που αναστέλλουν την κένωση του στομάχου είναι η χολοκυστοκινίνη, η γλουκαγόνη, το αγγειοκινητικό εντερικό πεπτίδιο (VIP) και το γαστρικό ανασταλτικό πολυπεπτίδιο. Ωσμοϋποδοχείς και phυποδοχείς στο εγγύς λεπτό έντερο φαίνεται ότι συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της αναστολής της γαστρικής κένωσης. Οι κυριότερες διαταραχές της γαστρικής κινητικότητας που απαντώνται στην κλινική πράξη είναι η δυσκινησία μετά βαγοτομή, η καθυστερημένη γαστρική κένωση στους διαβητικούς ασθενείς και η κινητική δυσλειτουργία στις περιπτώσεις λοίμωξης με H. pylori. ΒΛΕΝΝΟΓΟΝΙΚΟΣ ΦΡΑΓΜΟΣ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΧΟΥ Η λειτουργία του φραγμού εξαρτάται από έναν αριθμό φυσιολογικών και ανατομικών παραγόντων. Τέτοιοι είναι οι κυτταρικές μεμβράνες, οι μεσοκυττάριες ενώσεις, η διαδικασία κυτταρικής αναγέννησης, οι ενδογενείς προσταγλανδίνες, αυξητικοί παράγοντες, η έκκριση βλέννης, η έκκριση διττανθρακικών, το αρτηριακό ph, και η αιματική ροή. Για παράδειγμα, το πεπτικό έλκος οφείλεται στην αυξημένη παρουσία επιθετικών παραγόντων, στη μείωση των αναφερθέντων προστατευτικών παραγόντων ή και στα δύο. Επιθετικοί (επιβλαβείς) παράγοντες για το γαστρικό βλεννογόνο είναι το υδροχλωρικό οξύ, οι πεψίνες, το αλκοόλ, το κάπνισμα, η παλινδρόμηση χολής απ το 12δάκτυλο, η ισχαιμία, τα ΜΣΑΦ, η υποξία, και το H. pylori [10]. 55

72 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 - ΑΔΕΝΟΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΣΤΟΜΑΧΟΥ 2.1 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Τις τελευταίες δεκαετίες, ο καρκίνος του στομάχου βρίσκεται στην 9 η - 10 η θέση ως αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ, σε σχέση με την 1η θέση που κατείχε παλαιότερα [12]. Παγκοσμίως όμως συνεχίζει να αποτελεί μία από τις κυριότερες αιτίες θανάτου από καρκίνο [12]. Πιο συγκεκριμένα, ο καρκίνος του στομάχου βρίσκεται στην 3η θέση σε συχνότητα εμφάνισης, αλλά και ως αιτία θανάτου, στους άντρες στις αναπτυσσόμενες χώρες και την 4η θέση στις οικονομικά αναπτυγμένες χώρες. Στις γυναίκες κατέχει την 4η και 9η θέση αντίστοιχα [13]. Περισσότερο από το 70% των νέων περιπτώσεων και θανάτων συμβαίνουν στις αναπτυσσόμενες χώρες. Τα υψηλότερα ποσοστά παρατηρούνται στην Ανατολική Ασία, την Ανατολική Ευρώπη και τη Νότιο Αμερική, ενώ τα χαμηλότερα στη Βόρειο Αμερική και στις περισσότερες περιοχές της Αφρικής (Εικόνα 2.1) [13] Στην Ευρώπη έχουν καταγραφεί νέες περιπτώσεις ετησίως, ενώ στις ΗΠΑ η επίπτωση είναι χαμηλότερη με τη θνητότητα να βρίσκεται στους 5,2 θανάτους ανά σε σχέση με τους 90 θανάτους ανά στην Ιαπωνία. Οι διακυμάνσεις κατά περιοχή αντικατοπτρίζουν μερικώς διαφορές στον τρόπο διατροφής και στην επίπτωση του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού [14]. Η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του στομάχου έχει μειωθεί στις περισσότερες γεωγραφικές περιοχές παγκοσμίως τα τελευταία 50 χρόνια [15, 16]. 56

73 Εικόνα 2.1 Επίπτωση Ca στομάχου ανά φύλο και γεωγραφική περιοχή (εναρμονισμένη με την ηλικία) (Πηγή: Jemal, A., et al., Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, (2): p. 78) Σημαντική συμβολή σε αυτό είχε η βελτίωση της διατροφής με την ευρεία διάδοση της συντήρησης τροφίμων σε ψυγεία, τη μεγαλύτερη διαθεσιμότητα φρέσκων φρούτων και λαχανικών και τη μείωση της κατανάλωσης παστών και συντηρημένων τροφών. Άλλοι παράγοντες είναι η αυξημένη αντιμετώπιση της λοίμωξης από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού και η μείωση της συχνότητας του καπνίσματος σε ορισμένες από τις αναπτυγμένες χώρες [16]. 57

74 Στην Ιαπωνία η θνητότητα έχει μειωθεί λόγω της εφαρμογής του screening με φωτοφλουορογραφία, κάτι που ίσως έχει συμβάλλει και στην παραμένουσα υψηλή συχνότητα της πάθησης στη χώρα [17]. Μία παρατήρηση κατά τις τελευταίες δύο δεκαετίες, είναι η αύξηση της συχνότητας εμφάνισης του καρκίνου στον εγγύς στόμαχο και στην καρδία, ενώ η επίπτωση των περιφερικών όγκων μειώνεται. Το γεγονός αυτό ίσως οφείλεται στην αυξημένη κατανάλωση αλκοόλ και στο κάπνισμα [18]. Φυσικά υπάρχει αύξηση της επίπτωσης του γαστρικού καρκίνου με την ηλικία, ως αποτέλεσμα της γήρανσης του πληθυσμού, σε συνδυασμό βέβαια με έναν τρόπο ζωής που προδιαθέτει στην εμφάνιση καρκίνου (κάπνισμα, πολύ λίγη ή καθόλου φυσική δραστηριότητα κλπ) [13, 19]. Εντυπωσιακή βελτίωση στην πρόγνωση παρατηρείται στην Ιαπωνία και στην Κορέα, όπου το 40% των καρκίνων ανιχνεύεται εγκαίρως χάρη στα προγράμματα ελέγχου (screening programs) [20]. 58

75 2.2 ΑΙΤΙΑ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ Οι μελέτες που υπάρχουν σχετικά με την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου υποδηλώνουν ότι η γενετική προδιάθεση, η λοίμωξη με ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού και η διατροφή, παίρνουν μέρος σε μία περίπλοκη αλληλεπίδραση. Σε ό,τι αφορά τους κλασσικούς παράγοντες κινδύνου όπως το κάπνισμα και το αλκοόλ, υπάρχουν μελέτες που δεν έχουν επιβεβαιώσει το ρόλο τους στην ανάπτυξη του γαστρικού καρκίνου [20]. Επιδημιολογικές έρευνες συσχετίζουν τον καρκίνο του στομάχου με περιβαλλοντικούς και διατροφικούς παράγοντες. Μελέτες σε πληθυσμούς που έχουν μεταναστεύσει από περιοχές με υψηλή επίπτωση σε άλλες με χαμηλή, δείχνουν ότι η περιβαλλοντική επίδραση όπως επίσης πολιτισμικοί ή/και γενετικοί παράγοντες επηρεάζουν την προδιάθεση για καρκίνο του στομάχου. Για παράδειγμα, ο κίνδυνος ανάπτυξης γαστρικού καρκίνου σε άτομα που μετοίκησαν από την Ιαπωνία, παρέμεινε ο ίδιος παρά το ότι υιοθετήθηκε Δυτικός τρόπος ζωής. Οι απόγονοί τους αντιθέτως που μεγάλωσαν με διαφορετικές περιβαλλοντικές επιδράσεις, είχαν σημαντικά μικρότερο κίνδυνο εμφάνισης της πάθησης [21]. Ο ρόλος της διατροφής σε σχέση με την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου έχει διερευνηθεί εκτενώς. Οι περισσότερες μελέτες συσχετίζουν τη δίαιτα χαμηλή σε ζωική πρωτεΐνη και λιπαρά, υψηλή σε σύνθετους υδατάνθρακες, το παστό κρέας και ψάρι και τα υψηλά επίπεδα νιτρωδών με αυξημένο κίνδυνο για ανάπτυξη του καρκίνου. Η μακρόχρονη λήψη νιτρωδών με τα αποξηραμένα, καπνιστά και παστά τρόφιμα συνεισφέρει προς την κατεύθυνση αυτή. Συγκεκριμένα, τα νιτρώδη μετατρέπονται από τα βακτήρια σε νιτρικά, τα οποία είναι καρκινογόνα. Τέτοια βακτήρια υπάρχουν σε μερικώς αλλοιωμένα τρόφιμα, κάτι που είναι σύνηθες στα χαμηλά κοινωνικοοικονομικά στρώματα παγκοσμίως. Αντιθέτως, η κατανάλωση ωμών λαχανικών, εσπεριδοειδών και τροφών με υψηλή περιεκτικότητα σε ίνες, σχετίζεται με χαμηλότερο κίνδυνο για καρκίνο στομάχου. Το ασκορβικό οξύ και το β- καροτένιο που υπάρχουν στα φρούτα και στα λαχανικά, δρουν ως αντιοξειδωτικά. Επιπλέον, το ασκορβικό οξύ προλαμβάνει τη μετατροπή των νιτρωδών σε νιτρικά [21]. 59

76 Άτομα που λαμβάνουν ασπιρίνη ή άλλα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα, φαίνεται ότι έχουν χαμηλότερο κίνδυνο ανάπτυξης εξω-καρδιακού γαστρικού αδενοκρκινώματος σε σχέση με όσους δεν έχουν λάβει καθόλου, αν και το κατά πόσο υπάρχει αιτιώδης σχέση δεν είναι ξεκάθαρο [20]. Άλλοι παράγοντες που σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του στομάχου είναι η κοινωνικοοικονομική κατάσταση, το κάπνισμα, το άρρεν φύλο και η λοίμωξη με ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού (H. pylori). To H. pylori ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά από τους Marshal και Warren το 1983 και από τότε συσχετίστηκε με το πεπτικό έλκος [22]. Η μετάδοση γίνεται από άτομο σε άτομο από τη γαστρεντερική οδό (στόματος-κοπράνων). Ο επιπολασμός είναι υψηλότερος στην Ασία και στην Ανατολική Ευρώπη και χαμηλότερος στη Δυτική και Βόρεια Ευρώπη και Βόρεια Αμερική. Μία από τις σχετικές μελέτες έδειξε ότι το 89% των ιστολογικών τομών από ασθενείς με γαστρικό αδενοκαρκίνωμα εντερικού τύπου, είχαν ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού στο φυσιολογικό βλεννογόνο, σε σχέση με το 32% στο διαχύτου τύπου καρκίνωμα. Η ορολογική ανάλυση με ανίχνευση αντισωμάτων έδειξε συσχέτιση του H pylori και με τους δύο ιστολογικούς τύπους [20]. Η παρουσία IgG αντισωμάτων έναντι του ελικοβακτηριδίου σε ένα πληθυσμό, σχετίζεται με την επίπτωση του γαστρικού καρκίνου και τη θνητότητα. Διαφορετικά στελέχη του βακτηριδίου αυτού έχουν ως αποτέλεσμα διαφορετικά επίπεδα ανοσιακής απόκρισης. Για παράδειγμα, λοίμωξη από το caga στέλεχος, προκαλεί περισσότερη φλεγμονή του βλεννογόνου απ ότι τα στελέχη αρνητικά για caga και ενέχει μεγαλύτερο κίνδυνο για ανάπτυξη καρκίνου [23]. Επιπλέον, γενετικοί παράγοντες παίζουν ενδεχομένως ρόλο για το ποια άτομα με λοίμωξη από το ελικοβακτηρίδιο θα αναπτύξουν τελικά καρκίνο στομάχου. Για παράδειγμα, ο πολυμορφισμός της ομάδας γονιδίων Interleukin-1 (τα οποία προάγουν την παραγωγή της ιντερλευκίνης-1β), σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο για υποχλωρυδρία εξαιτίας του ελικοβακτηριδίου και κατά συνέπεια για εμφάνιση καρκίνου [24]. Η ιντερλευκίνη-1β είναι ισχυρός αναστολέας της έκκρισης γαστρικού οξέος. Άτομα λοιπόν που έχουν γενετικό υπόβαθρο για υποχλωρυδρία μαζί με παρουσία λοίμωξης από ελικοβακτηρίδιο πυλωρού στο οικογενειακό 60

77 περβάλλον και συγχρόνως οικογενειακό ιστορικό καρκίνου στομάχου, έχουν αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης κακοήθειας στο στόμαχο. Μία άλλη παρατήρηση είναι ότι οι ασθενείς που έχουν έλκος 12δακτύλου και H pylori γαστρίτιδα κυρίως στο άντρο και πολύ μικρότερου βαθμού στο σώμα, έχουν φυσιολογική ή και αυξημένη παραγωγή οξέος και μπορεί να αναπτύξουν πολύ σπάνια καρκίνο στομάχου. Αντίθετα, άτομα με εκτεταμένη γαστρίτιδα στο σώμα, αναπτύσσουν υποχλωρυδρία και ατροφία του βλεννογόνου [25]. Η προσκόλληση του H pylori στο γαστρικό βλεννογόνο γίνεται μέσω ειδικών συγκολλητινών του βακτηριδίου και των αντίστοιχων υποδοχέων στα κύτταρα του βλεννογόνου. Για παράδειγμα το αντιγόνο ομάδας αίματος Lewis b, μεσολαβεί για την προσκόλληση του H pylori στο βλεννογόνο. Όπου δεν εκφράζεται το Lewis b αντιγόνο, το ελικοβακτηρίδιο δεν μπορεί να συνδεθεί [26]. Το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού ενοχοποιείται επίσης για το ότι επιδρά αρνητικά στη βιοδιαθεσιμότητα της βιταμίνης C, γεγονός που μαζί με τη μειωμένη απορρόφησή της που συμβαίνει σε όσα άτομα είναι θετικά για H pylori, συμβάλλει στη μείωση της συγκέντρωσης της βιταμίνης C στο πλάσμα. Η χαμηλή συγκέντρωση βιταμίνης C σε άτομα με λοίμωξη από H pylori, μπορεί να αποτελεί αιτιολογικό παράγοντα για τον καρκίνο του στομάχου, όπως συμβαίνει και με άλλες παθήσεις που σχετίζονται με ανεπάρκεια αντιοξειδωτικών παραγόντων [27]. Ασθενείς με κακοήθη αναιμία έχουν επίσης αυξημένο κίνδυνο να αναπτύξουν γαστρικό καρκίνο. Η κακοήθης αναιμία είναι μία αυτοάνοση γαστρίτις και αυξάνει τον κίνδυνο για καρκίνο όπως συμβαίνει και με άλλους τύπους χρόνιας φλεγμονής. Η αχλωρυδρία είναι το κύριο χαρακτηριστικό αυτής της πάθησης, διότι η αυτοάνοση αντίδραση καταστρέφει τα κύρια και τα τοιχωματικά κύτταρα. Ο βλεννογόνος γίνεται ατροφικός και αναπτύσσεται εντερική μετάπλαση. Ο σχετικός κίνδυνος για έναν ασθενή με κακοήθη αναιμία να αναπτύξει καρκίνο στομάχου είναι 2,1 με 5,6 [21]. Οι γαστρικοί πολύποδες είναι μία κατάσταση που επίσης συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο στομάχου. Ο συχνότερος ιστολογικός τύπος είναι οι υπερπλαστικοί πολύποδες, οι οποίοι είναι καλοήθεις. Παρ όλ αυτά, η παρουσία τους σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο για κακοήθεια διότι αναπτύσσονται σε καταστάσεις με εγκατεστημένη γαστρίτιδα, η οποία όπως 61

78 προαναφέρθηκε είναι από μόνη της παράγοντας κινδύνου για γαστρικό καρκίνωμα. Οι αδενωματώδεις πολύποδες έχουν ξεχωριστό κίνδυνο ανάπτυξης καρκινώματος εντός τους. Είναι συχνή η ατυπία του βλεννογόνου και έχει παρατηρηθεί πορεία προς τη δυσπλασία και καρκίνωμα. Ο κίνδυνος ανάπτυξης καρκινώματος είναι 10-20% και αυξάνει ανάλογα με το μέγεθος του πολύποδα. Η ενδοσκοπική αφαίρεση ενδείκνυται σε μισχωτούς πολύποδες και είναι αρκετή αν ο πολύποδας εξαιρεθεί εξ ολοκλήρου και αν δεν υπάρχουν εστίες διηθητικού καρκίνου στην ιστολογική εξέταση. Αν ο πολύποδας είναι μεγαλύτερος από 2εκ, έχει ευρεία βάση, ή αποδειχθεί εστία διηθητικού καρκινώματος, τίθεται η ένδειξη της χειρουργικής εκτομής [21]. 62

79 2.3 ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχουν γενετικές αλλαγές που είναι υπεύθυνες για την ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου. Έχουν διαπιστωθεί αλλαγές σε συγκεκριμένα γονίδια που έχουν σημαντικούς ρόλους σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες όπως η προσκόλληση των κυττάρων μεταξύ τους, η μετάδοση μηνυμάτων, η διαφοροποίηση, η επιδιόρθωση του DNA και άλλων [28]. Αρκετές γενετικές αλλαγές έχουν ταυτοποιηθεί που σχετίζονται με το αδενοκαρκίνωμα του στομάχου. Οι αλλαγές αυτές μπορούν να ταξινομηθούν ως εξής: - ενεργοποίηση ογκογονιδίων - αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων - μείωση της κυτταρικής προσκόλλησης - επανενεργοποίηση τελομεράσης - παρουσία μικροδορυφορικής αστάθειας. Το πρωτο-ογκογονίδιο c-met είναι ο υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα των ηπατοκυττάρων και συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο του στομάχου, όπως συμβαίνει και με τα ογκογονίδια k-sam και c-erbb2. Η αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων p53 και p16 έχει βρεθεί σε αμφότερους τους ιστολογικούς τύπους γαστρικού καρκίνου (εντερικό και διάχυτο). Μεταλλάξεις στο γονίδιο της αδενωματώδους πολυποδίασης του κόλου (APC), συνήθως απαντώνται πιο συχνά στον εντερικού τύπου καρκίνο. Περιορισμός ή απώλεια του μορίου E-cadherin μπορεί να ανιχνευτεί στο 50% περίπου των διαχύτου τύπου καρκίνων [29]. Μικροδορυφορική αστάθεια μπορεί να βρεθεί στο 20% με 30% των γαστρικών καρκίνων εντερικού τύπου. Οι μικροδορυφόροι είναι τμήματα DNA στα οποία μία βραχεία αλληλουχία (1 έως 5 νουκλεοτίδια), επαναλαμβάνεται αρκετές φορές. Η μικροδορυφορική αστάθεια αντανακλά απόκτηση ή απώλεια των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών σε μικροδορυφορικό αλλήλιο γενετικού κυττάρου, που υποδηλώνει την κλωνική ανάπτυξη που είναι τυπική για νεοπλασία [21]. 63

80 Η απορρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των κυττάρων του στομάχου, μπορεί να προκληθούν από οποιαδήποτε από τις γνωστές γενετικές αλλαγές. Τέτοιες γονιδιακές αλλαγές έχουν αναφερθεί για αμφότερους τους ιστολογικούς τύπους καρκίνου του στομάχου. Παρ όλ αυτά, ο συνδυασμός των μοριακών αλλαγών διαφέρει μεταξύ του εντερικού και του διαχύτου τύπου καρκίνου, κάτι που υποδηλώνει ότι ίσως έχουν ξεχωριστά γενετικά μονοπάτια. Απενεργοποίηση εξαιτίας απώλειας ετεροζυγωτίας ή/και μετάλλαξης των p53, APC και DCC έχει αναφερθεί για τον καρκίνο του στομάχου. Τέτοιες αλλαγές στο p53 έχουν ανιχνευθεί στο 30% περίπου των γαστρικών καρκίνων, στο 30% των αδενωμάτων και στο 10% εντερικής μετάπλασης. Μέχρι και στο 60% των εντερικού τύπου καρκινωμάτων και στο 25% των αδενωμάτων υπάρχει μετάλλαξη ή/και απώλεια ετεροζυγωτίας στο APC. Οι αλλαγές αυτές είναι σπάνιες στα διαχύτου τύπου, αλλά μπορεί να σχετίζονται με καρκινώματα που έχουν τα κύτταρα δίκην σφραγιστήρος δακτυλίου (signetring). Το προϊόν του APC γονιδίου συνδέεται με την πολλαπλών λειτουργιών πρωτεΐνη β-κατενίνη (β-catenin), της οποίας η ενδοκυττάρια συγκέντρωση ρυθμίζεται και διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα. Σε περιπτώσεις αλλαγών στο APC ή μεταλλάξεων στη β-κατενίνη, η ποσότητα της β-κατενίνης αυξάνεται. Η β-κατενίνη μετατίθεται στον πυρήνα του κυττάρου μετά αλληλεπίδραση με τον παράγοντα μεταγραφής LEF-1. Από τον πυρήνα ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση. Οι μεταλλάξεις της β-κατενίνης έχουν ανιχνευτεί στον εντερικού τύπου καρκίνο, αλλά απουσιάζουν στον διαχύτου τύπου. Η e-cadherin, είναι ένα διακυτταρικό μόριο προσκόλλησης των κυττάρων και παίζει μαζί με τη β-catenin σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της δομικής ακεραιότητας του επιθηλίου. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, στο 50% των διαχύτου τύπου καρκίνων έχουν ανιχνευτεί μεταλλάξεις της e-cadherin. Η απόλυτη συσχέτιση μεταξύ μετάλλαξης ενός συγκεκριμένου γονιδίου και ενός ιστολογικού τύπου καρκίνου, παρατηρείται για πρώτη φορά με την e-cadherin και τον διαχύτου τύπου γαστρικό καρκίνο. Χάρη στην ειδικότητά της για το διαχύτου τύπου καρκίνωμα, η μεταλλαγμένη e-cadherin είναι πολύ καλός βιολογικός δείκτης για τη διάγνωση της πάθησης, καθώς επίσης και ελκυστικός στόχος για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις. 64

81 Το c-met πρωτοογκογονίδιο κωδικοποιεί για τον ηπατοκυτταρικό αυξητικό παράγοντα (HGF), ο οποίος υπερπαράγεται κυρίως στον καρκίνο διαχύτου τύπου. Η ενίσχυση του c-met συνδέεται με το στάδιο (λεμφαδενικές μεταστάσεις) και την πρόγνωση. Εκφράζεται σε καρκινικές σειρές και σε ιστικά δείγματα από καρκίνο διαχύτου τύπου, αλλά όχι στον υγιή γαστρικό βλεννογόνο. Το K-sam είναι μέλος της οικογένειας των υποδοχέων αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών και ενισχύεται κατά προτίμηση σε καρκίνους διαχύτου τύπου. Συχνά, η ενίσχυση του K-sam παρατηρείται ανεξάρτητα από την ενίσχυση του c-met. Το ογκογονίδιο c-erbb2 είναι μία γλυκοπρωτεΐνη με δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης και συχνά υπερεκφράζεται στο γαστρικό καρκίνωμα. Γονίδια που ρυθμίζουν τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο μπορεί να συνεισφέρουν στην ανάπτυξη του καρκίνου στο στόμαχο. Απώλεια της ετεροζυγωτίας στο bcl-2 γονιδιακό τόπο (αναστολέας απόπτωσης που εντοπίζεται στην εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων), σχετίζεται με καρκίνο εντερικού τύπου. Έκφραση του αντιγόνου SC-1 (υποδοχέας απόπτωσης), ανιχνεύεται κατά προτίμηση στον διαχύτου τύπου καρκίνο. Ο κυτταρικός κύκλος ελέγχεται από θετικούς και αρνητικούς ρυθμιστές. Γενετικές αλλαγές και παθολογική έκφραση των διαφόρων κυκλινών και των εξαρτώμενων από τις κυκλίνες κινασών (Cyclin Dependent Kinases), αλλά και των αναστολέων τους, παίζουν ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου του στομάχου. Ενίσχυση της cyclin E στο 10% και 20% των καρκίνων διαχύτου και εντερικού τύπου αντίστοιχα. Υπερέκφραση των αυξητικών παραγόντων EGF (Epidermal Growth Factor), TGF-α (Transforming Growth Factor alpha) καθώς και του υποδοχέα του EGF, σχετίζεται με κακοήθεια και είναι ενδεικτική χειρότερης πρόγνωσης στους ασθενείς με καρκίνο στομάχου. Έκφραση του VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), σχετίζεται με λεμφαδενικές και ηπατικές μεταστάσεις. Πρωτεάσες σχετιζόμενες με τον όγκο και οι αναστολείς αυτών, παίζουν κεντρικό ρόλο στην επέκταση και στη μετάσταση του όγκου. Έχουν αναφερθεί θετικές συσχετίσεις των ιστομορφολογικών στοιχείων και των upa και PAI-1. Αυξημένα επίπεδα της πρωτεάσης upa και του αναστολέα της έχει αποδειχθεί ότι σχετίζονται με πτωχή πρόγνωση. Σε μονοπαραγοντική ανάλυση, τα 65

82 επίπεδα αμφοτέρων των παραγόντων βρέθηκε ότι σχετίζονται με την επιβίωση. Σε πολυπαραγοντική ανάλυση, ο αναστολέας PAI-1 βρέθηκε ότι είναι ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας. Τα δύο αυτά μόρια είναι ενδεικτικά βραχύτερης επιβίωσης και μπορούν να αποτελέσουν προγνωστικούς παράγοντες. Επιπρόσθετα, η upa μπορεί να είναι μελλοντικός στόχος νέων θεραπευτικών επιλογών [28]. Είναι γνωστό ότι οι διατροφικές συνήθειες και οι περιβαλλοντικοί παράγοντες, ειδικά η λοίμωξη με H pylori, θεωρούνται οι κύριοι παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη γαστρικού καρκινώματος. Παρ όλ αυτά, υπάρχουν ολοένα αυξανόμενα στοιχεία ότι η γενετική προδιάθεση παίζει ρόλο, σε ένα υποσύνολο ασθενών με καρκίνο του στομάχου. Ορισμένες παραλλαγές στην αλληλουχία του DNA σε άτομα με λοίμωξη από H pylori, φαίνεται ότι σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο του στομάχου, αποδεικνύοντας έτσι συσχέτιση περιβαλλοντικών με γενετικούς παράγοντες. Συγκεκριμένα, όπως έχει αναφερθεί και στο κεφάλαιο 2.2, έχει βρεθεί τα τελευταία χρόνια συσχέτιση του πολυμορφισμού του DNA στην περιοχή του γονιδίου για την ιντερλευκίνη-1, με την αντίδραση στο H pylori, που οδηγεί σε υποχλωρυδρία, ατροφία στο σώμα του στομάχου και αυξημένο κίνδυνο για γαστρικό καρκίνο. Πιστεύεται ότι οι πολυμορφισμοί αυτοί προάγουν την παραγωγή ιντερλευκίνης-1β, η οποία είναι μία προφλεγμονώδης κυτοκίνη που αναστέλλει την έκκριση γαστρικού οξέος, έχοντας ως συνέπεια υποχλωρυδρία και γαστρική ατροφία, που αποτελούν πιθανές προκαρκινωματώδεις καταστάσεις. Επιπλέον, ο καρκίνος του στομάχου παρατηρείται συχνότερα σε συνδυασμό με κληρονομικά σύνδρομα καρκίνου, που χαρακτηρίζονται από την παρουσία καρκινωμάτων σε άλλα όργανα. Παρακάτω αναφέρονται τα κληρονομικά αυτά σύνδρομα. Οικογενές διάχυτο γαστρικό καρκίνωμα Μεταλλάξεις του γονιδίου της E-cadherin (CDH1) στα γενετικά κύτταρα έχουν περιγραφεί ως η αιτία σε μοριακό επίπεδο για τον οικογενή γαστρικό καρκίνο σε τρεις οικογένειες της φυλής Maori. Κατόπιν αυτού, έχει περιγραφεί και σε άλλες οικογένειες με περιπτώσεις καρκίνου στομάχου διαφόρων εθνικοτήτων. Η E-cadherin είναι ένα, εξαρτώμενο από ασβέστιο, μόριο 66

83 διακυτταρικής προσκόλλησης, η ακέραια λειτουργία του οποίου είναι κρίσιμη για τη δημιουργία και τη διατήρηση της πολικότητας των κυττάρων καθώς και της δομικής τους ακεραιότητας. Σωματικές μεταλλάξεις στο γονίδιο αυτό έχουν επίσης βρεθεί συχνά σε διαχύτου τύπου καρκίνο αλλά και σε λοβιακό καρκίνωμα του μαστού, ενώ μεταλλάξεις στα γενετικά κύτταρα έχουν βρεθεί επιπλέον σε καρκίνο προστάτη και παχέος εντέρου. Η διεισδυτικότητα της νόσου έχει υπολογιστεί στο 70% περίπου, με μέσο όρο ηλικίας εμφάνισης τα 38 έτη. Έχουν αναπτυχθεί κατευθυντήριες οδηγίες από το Διεθνή Σύνδεσμο για τον Καρκίνο του Στομάχου, σε ό,τι αφορά τη γενετική συμβουλευτική και τον έλεγχο για μεταλλάξεις της E-cadherin στα γενετικά κύτταρα. Σύμφωνα με τις οδηγίες αυτές, συνιστάται γενετικός έλεγχος ασθενών με διαχύτου τύπου καρκίνο στομάχου οι οποίοι έχουν: α) τουλάχιστον ένα μέλος στην οικογένεια που να έχει την πάθηση και να έχει διαγνωστεί πριν από την ηλικία των 50 ετών ή β) δύο μέλη της οικογένειας με την πάθηση χωρίς περιορισμό στην ηλικία. Καρκίνος στομάχου σε συνδυασμό με κληρονομικά σύνδρομα νεοπλασιών Ο καρκίνος του στομάχου παρατηρείται συχνότερα όταν υπάρχουν κληρονομικά σύνδρομα νεοπλασιών, τα οποία χαρακτηρίζονται κυρίως από την εμφάνιση καρκινωμάτων σε άλλα όργανα. 1. HNPCC / Lynch Syndrome Το σύνδρομο μη πολυποδιασικού καρκίνου παχέος εντέρου-ορθού, κληρονομείται βάσει αυτοσωματικού επικρατούς γονιδίου και χαρακτηρίζεται κυρίως από οικογενή εμφάνιση καρκίνου παχέος εντέρου-ορθού. Εντούτοις, εξωεντερικά καρκινώματα όπως ενδομητρίου, ουρητήρων, στομάχου και 12δακτύλου παρατηρούνται αρκετά συχνότερα στα άτομα των οικογενειών αυτών. Η μοριακή αιτία του συνδρόμου είναι οι γενετικές μεταλλάξεις σε γονίδια του συστήματος επιδιόρθωσης της DNA ασυμβατότητας και παρατηρούνται συχνότερα στα hmlh1 και hmsh2. Οι όγκοι στους ασθενείς αυτούς παρουσιάζουν υψηλού βαθμού μικροδορυφορική αστάθεια (οι μικροδορυφόροι είναι βραχείες, επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες διασκορπισμένες σε όλο το γονιδίωμα). Εκτεταμένη σωματική μετάλλαξη των αλληλουχιών αυτών εξαιτίας απώλειας ή απόκτησης μιας ή περισσοτέρων 67

84 επαναλαμβανόμενων μονάδων ονομάζεται μικροδορυφορική αστάθεια (MicroSatellite Instability). Η MSI είναι το αποτέλεσμα πολλών λαθών αντιγραφής τα οποία φυσιολογικά διορθώνονται από ένα ακέραιο σύστημα επιδιόρθωσης ασυμβατότητας DNA. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης κακοήθειας, συμβαίνει συνήθως παύση της λειτουργίας του συστήματος επιδιόρθωσης ασυμβατότητας που οδηγεί σε υψηλού βαθμού Μικρο- Δορυφορική Αστάθεια (ΜΔΑ) στους HNPCC όγκους. Εντούτοις, η ΜΔΑ στα καρκινώματα του στομάχου σε ασθενείς με θετικό οικογενειακό ιστορικό για γαστρικό καρκίνο, σπάνια σχετίζεται με γενετικές μεταλλάξεις στα γονίδια hmlh1 και hmsh2. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι υπάρχουν και άλλοι παράγοντες που συνεισφέρουν στην κληρονομικότητα του καρκινώματος του στομάχου. 2. Οικογενής αδενωματώδης πολυποδίαση του εντέρου (FAP) Παρά την εμφάνιση πολλαπλών πολυπόδων στο παχύ έντερο, οι ασθενείς με το σύνδρομο αυτό συχνά αναπτύσσουν πολύποδες και στο στομάχι, οι οποίοι μπορεί να σχετίζονται με αδενοκαρκίνωμα. Αιτία του συνδρόμου είναι οι γενετικές μεταλλάξεις στο γονίδιο APC στο χρωμόσωμα 5q Σύνδρομο Li-Fraumeni Πρόκειται για ένα κληρονομικό σύνδρομο και οφείλεται σε γενετικές μεταλλάξεις στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53. Διάφοροι τύποι καρκίνων εμφανίζονται στα πλαίσια αυτού του συνδρόμου. Οι καρκίνοι του πεπτικού αποτελούν το 7% των νεοπλασμάτων του συνδρόμου Li-Fraumeni. Από αυτά, το καρκίνωμα του στομάχου κατέχει ποσοστό 57% (συχνότερο από εκείνο του παχέος εντέρου που βρίσκεται στο 31%). 4. Σύνδρομο Peutz-Jeghers Πρόκειται για μία σπάνια πάθηση που κληρονομείται κατά τον αυτοσωματικό επικρατούντα χαρακτήρα και περιλαμβάνει αμαρτωματώδεις πολύποδες πεπτικού, βλεννογονο-δερματική εναπόθεση χρωστικής στα χείλη, στο στοματικό βλεννογόνο και στα δάχτυλα. [21] 68

85 2.4 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΗ ΚΑΙ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Το γαστρικό αδενοκαρκίνωμα αποτελεί το 95% του συνόλου των κακοήθων νεοπλασμάτων του στομάχου, ενώ στο υπόλοιπο 5% περιέχονται το καρκίνωμα εκ πλακωδών κυττάρων, το αδενοακάνθωμα, οι καρκινοειδείς όγκοι, οι στρωματικοί όγκοι (GISTs) και το λέμφωμα. Από τις πολλές παθολογοανατομικές κατατάξεις που έχουν προταθεί για τον καρκίνο του στομάχου, έχει επικρατήσει εκείνη του Borrmann, η οποία περιγράφηκε το 1926 και παραμένει χρήσιμη μέχρι σήμερα για την περιγραφή των ενδοσκοπικών μακροσκοπικών ευρημάτων. Το σύστημα του Borrmann διακρίνει το γαστρικό αδενοκαρκίνωμα σε 5 τύπους, ανάλογα με τη μακροσκοπική εικόνα της βλάβης (Εικόνα 2.2). Πλαστική Λινίτις είναι ο όρος που περιγράφει τον τύπο 4 όταν περιλαμβάνει ολόκληρο τον στόμαχο. Εικόνα 2.2 Ταξινόμηση κατά Borrmann (I:Πολυποειδής ή Προβάλων τύπος, II:Ελκωτικός με επηρμένα όρια, III:Ελκωτικός με διήθηση του του τοιχώματος, IV:Διάχυτη διήθηση του τοιχώματος, V: Τύπος που δεν εμπίπτει στις προηγούμενες κατηγορίες) (Πηγή: 69

86 Η αρχική ιστολογική ταξινόμηση έχει περιγραφεί από τον Borders το 1942 σύμφωνα με το βαθμό κυτταρικής διαφοροποίησης και ανεξάρτητα από τη μορφολογία. Ο βαθμός διαφοροποίησης κυμαίνεται από grade I (καλώς διαφοροποιημένο), μέχρι grade IV (αναπλαστικό). [21] Η πλέον χρήσιμη και ευρέως χρησιμοποιούμενη κατάταξη είναι εκείνη κατά Lauren από το 1965, σύμφωνα με την οποία το γαστρικό αδενοκαρκίνωμα διακρίνεται σε εντερικού και διαχύτου τύπου με βάση την ιστολογική εικόνα [30]. Οι συγκεκριμένοι τύποι καρκίνου χαρακτηρίζονται από διαφορετική επιδημιολογία, ιστοπαθολογία, παθογένεση και πρόγνωση. Ο καρκίνος εντερικού τύπου εμφανίζεται συνήθως στο έδαφος προκαρκινωματώδους κατάστασης όπως η γαστρική ατροφία ή η εντερική μετάπλαση. Είναι συνηθέστερος στο άρρεν φύλο και η συχνότητα εμφάνισης αυξάνεται με την ηλικία. Είναι καλά διαφοροποιημένος τύπος με τάση να σχηματίζει αδενικούς σχηματισμούς και δίνει συνήθως αιματογενείς μεταστάσεις. Είναι ο επικρατέστερος ιστολογικός τύπος στις περιοχές όπου υπάρχει αυξημένη επίπτωση καρκίνου του στομάχου, γεγονός που σημαίνει ότι ίσως υπάρχει περιβαλλοντική επίδραση και αιτιολογία. [21] Οι Correa και συν έχουν προτείνει ένα μοντέλο παθογένεσης του εντερικού τύπου καρκίνου από γαστρίτιδα σε καρκίνωμα, σε διάστημα μερικών δεκαετιών [31]. Ένα ενδιάμεσο στάδιο σε αυτό το μοντέλο είναι η εντερική μετάπλαση, η οποία ορίζεται ως η αντικατάσταση του γαστρικού βλεννογόνου με επιθήλιο όμοιο με εκείνο του λεπτού εντέρου. Η αντικατάσταση αυτή επέρχεται από τα αρχέγονα κύτταρα του στομάχου, τα οποία παρεκκλίνουν από το εξειδικευμένο μονοπάτι ανάπτυξης γαστρικών κυττάρων προς την κατεύθυνση επιθηλίου λεπτού εντέρου λόγω παρατεταμένου ερεθισμού του γαστρικού βλεννογόνου, συνηθέστερα από λοίμωξη H pylori. Η εντερική μετάπλαση διακρίνεται σε πλήρη (τύπος Ι) και σε ατελή (τύπος ΙΙ και ΙΙΙ). Οι διαφορές μεταξύ των τύπων βασίζονται στις μορφές έκφρασης της Mucin Core Protein (MUC), καθώς και στα είδη των κυττάρων. Ο τύπος Ι χαρακτηρίζεται από την παρουσία απορροφητικών κυττάρων, κυττάρων Paneth και βλεννοπαραγωγών κυττάρων που παράγουν σιαλοβλεννίνες. Στους ατελείς τύπους παρατηρούνται κυλινδρικά και βλεννοπαραγωγά 70

87 κύτταρα που εκκρίνουν σιαλοβλεννίνες, θειοβλεννίνες ή και τις δύο. Η πιθανότητα εξέλιξης από την εντερική μετάπλαση στον καρκίνο είναι υψηλότερη στον τύπο ΙΙΙ απ ότι στον τύπο Ι. Έχει περιγραφεί ευρύ φάσμα μοριακών αλλαγών στην εντερική μετάπλαση που μπορεί να επηρεάσουν την εξέλιξη σε καρκίνο. Αυτές περιλαμβάνουν την υπερέκφραση της κυκλοοξυγενάσης-2 και της κυκλίνης D2, μεταλλάξεις του p53, μικροδορυφορική αστάθεια, μειωμένη έκφραση του p27 και αλλαγές στους μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι CDX 1 και 2. Είναι ξεκάθαρο ότι η εντερική μετάπλαση αποτελεί παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη αδενοκαρκινώματος του στομάχου. Παρ όλ αυτά, δε θα αναπτύξουν όλοι οι ασθενείς με εντερική μετάπλαση, καρκίνο του στομάχου. Εν αντιθέσει με τον εντερικό τύπο, ο διάχυτος τύπος γαστρικού αδενοκαρκινώματος έχει πτωχή διαφοροποίηση, δεν έχει αδενικούς σχηματισμούς και χαρακτηρίζεται από τα κύτταρα δίκην σφραγιστήρος δακτυλίου (signet ring cells). Αποτελείται από μικρές ομάδες μικρών ομοιόμορφων κυττάρων, έχει την τάση να επεκτείνεται υποβλεννογονίως, έχει λιγότερη φλεγμονώδη διήθηση και μεθίσταται νωρίς. Επεκτείνεται συνήθως κατά συνέχεια ιστών (διατοιχωματικά) και μέσω λεμφαγγειακής διήθησης. Οι ενδοπεριτοναϊκές μεταστάσεις είναι συχνές και γενικά η πρόγνωση είναι λιγότερο ευνοϊκή στο συγκεκριμένο ιστολογικό τύπο. Ο διάχυτος τύπος δεν αναπτύσσεται σε έδαφος προϋπάρχουσας γαστρίτιδας, είναι συχνότερος σε γυναίκες και προσβάλλει ελαφρώς νεότερες ηλικιακές ομάδες. Σχετίζεται με την ομάδα αίματος Α και παρουσιάζει οικογενή επίπτωση, στοιχεία που υποδεικνύουν γενετικά αίτια (Πίνακας 2.1). Το 1990, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας πρότεινε ένα άλλο σύστημα ταξινόμησης για τον καρκίνο του στομάχου, βασιζόμενο σε μορφολογικά κριτήρια. Σύμφωνα με αυτό, ο γαστρικός καρκίνος διακρίνεται σε 5 κύριες κατηγορίες: το αδενοκαρκίνωμα, το αδενοπλακώδες, το πλακώδες, το αδιαφοροποίητο και το αταξινόμητο καρκίνωμα. Το αδενοκαρκίνωμα διαιρείται περαιτέρω σε 4 τύπους σύμφωνα με την ιστολογική εικόνα: θηλώδες, σωληνώδες, βλεννώδες και signet ring. Κάθε ένας από τους τύπους αυτούς, υποδιαιρείται σύμφωνα με το βαθμό διαφοροποίησης. Παρ όλο που η ταξινόμηση κατά WHO χρησιμοποιείται ευρέως, δεν προσφέρει ουσιαστικά στη διαχείριση και αντιμετώπιση ασθενών. Επιπλέον, υπάρχει σημαντικός 71

88 αριθμός καρκίνων στομάχου που δεν μπορούν να συμπεριληφθούν στις συγκεκριμένες κατηγορίες. Πίνακας 2.1 Συγκριτική περιγραφή του εντερικού και του διαχύτου τύπου γαστρικού αδενοκαρκινώματος Εντερικός τύπος Διάχυτος τύπος Σποραδικός Οικογενής Γαστρική ατροφία, Εντερική μετάπλαση Α Ομάδα αίματος Άντρες > Γυναίκες Γυναίκες > Άντρες Αύξηση συχνότητας με την ηλικία Νεότερες ηλικιακές ομάδες Υψηλότερης διαφοροποίησης, αδενικοί σχηματισμοί Χαμηλής διαφοροποίησης, κύτταρα δίκην σφραγιστήρος δακτυλίου Αιματογενής διασπορά Διατοιχωματική & Λεμφαγγειακή διασπορά Μικροδορυφορική αστάθεια Μειωμένη E-cadherin Μεταλλάξεις του APC Αδρανοποίηση p53, p16 Αδρανοποίηση p53, p16 Υπάρχουν περιορισμένες ενδείξεις ότι κάθε ένα από τα προαναφερθέντα συστήματα ταξινόμησης συνεισφέρουν επιπλέον στα προγνωστικά δεδομένα του συστήματος ΤΝΜ της American Joint Cancer Commission (βλ Κεφάλαιο Σταδιοποίηση). 72

89 2.5 ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ Ο καρκίνος του στομάχου έχει αμβληχρή ή καθόλου συμπτωματολογία στα πρώιμα στάδια της νόσου. Οι ασθενείς συχνά αδιαφορούν για μία πρώιμη, ασαφή επιγαστρική δυσφορία ή για τυχόν δυσπεπτικά ενοχλήματα, συμπτώματα που συχνά αποδίδονται λανθασμένα σε γαστρίτιδα και οδηγούν σε συμπτωματική θεραπεία για 6 με 12 μήνες προτού γίνει σύσταση για διαγνωστική εξέταση. Η επιγαστραλγία είναι όμοια με εκείνη που προκαλείται από καλόηθες έλκος και μπορεί ακόμη να μιμηθεί στηθαγχικό άλγος. Συνηθέστερα βέβαια, ο πόνος είναι συνεχής, χωρίς αντανάκλαση και δεν υφίεται με τη λήψη τροφής. Σε προχωρημένα στάδια εμφανίζονται ανορεξία, κόπωση/αδυναμία, έμετοι, απώλεια βάρους. Τα συμπτώματα συχνά αντανακλούν την ανατομική περιοχή όπου βρίσκεται ο όγκος. Όγκοι στον εγγύς στόμαχο που περιλαμβάνουν τη γαστροοισοφαγική συμβολή, συχνά εμφανίζονται με δυσφαγία, ενώ εκείνοι στην άπω γαστρική μονάδα παρουσιάζουν συμπτωματολογία απόφραξης της γαστρικής εξόδου. Η διάχυτη διήθηση του τοιχώματος του στομάχου, όπως στην πλαστική λινίτιδα, οδηγεί σε μειωμένη διατασιμότητα και αίσθημα πρώιμου κορεσμού. Κλινικά σημαντική αιμορραγία δεν είναι συχνή, αλλά περίπου 15% των ασθενών μπορεί να παρουσιάσουν αιματέμεση και ένα 40% είναι αναιμικοί. Μεγάλοι όγκοι μπορούν να διαβρώσουν το γαστρικό τοίχωμα και να επεκταθούν στο εγκάρσιο κόλον, προκαλώντας συμπτωματολογία απόφραξης παχέος εντέρου. Τα φυσικά σημεία εμφανίζονται αργά στην πορεία της νόσου και συνηθέστερα σχετίζονται με τοπικά προχωρημένη ή μεταστατική νόσο. Μπορεί να υπάρχει ψηλαφητή μάζα στο επιγάστριο, ψηλαφητός υπερκλείδιος (Virchow s) ή περιομφαλικός (Sister Mary Joseph s) λεμφαδένας, περιτοναϊκές μεταστάσεις ψηλαφητές με δακτυλική εξέταση (Blummer s shelf) ή ψηλαφητή μάζα ωοθήκης (όγκος Krukenberg). Με την εξέλιξη της νόσου, οι ασθενείς μπορεί να αναπτύξουν ηπατομεγαλία λόγω μεταστάσεων, ίκτερο, ασκίτη και καχεξία. [21] 73

90 2.6 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ / ΠΑΡΑΚΛΙΝΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Στις περιπτώσεις που τίθεται η υποψία καρκίνου του στομάχου με βάση το ιστορικό και τα κλινικά ευρήματα, η διαγνωστική μέθοδος εκλογής είναι η γαστροσκόπηση. Παρ όλο που η μέθοδος απεικόνισης ανώτερου πεπτικού με βάριο διπλής αντίθεσης έχει καλύτερη σχέση κόστους προς όφελος με 90% διαγνωστική ακρίβεια, η αδυναμία της να διακρίνει καλοήθη από κακοήθη έλκη, δεν την καθιστά προτιμητέα έναντι της γαστροσκόπησης. Κατά την ενδοσκόπηση, λαμβάνονται 7 ή και περισσότερα δείγματα για βιοψία γύρω από τον κρατήρα του έλκους, ώστε να διευκολύνουν την ιστολογική διάγνωση. Δείγμα μέσα από τον κρατήρα του έλκους μπορεί να δείξει μόνο νεκρωτικό υλικό. Όταν λαμβάνονται πολλαπλά δείγματα για βιοψία, η διαγνωστική ακρίβεια της εξέτασης αγγίζει το 98%. Η πρόσθετη λήψη υλικού με βούρτσα για κυτταρολογική εξέταση (brush cytology), μπορεί να αυξήσει ακόμη περισσότερο τη διαγνωστική ακρίβεια της εξέτασης. Με την ενδοσκόπηση, περιγράφεται επίσης το μέγεθος, η θέση και η μορφολογία του όγκου, καθώς και άλλες ανωμαλίες του βλεννογόνου. Σε επιλεγμένους ασθενείς με προχωρημένη νόσο, η ενδοσκόπηση ανώτερου πεπτικού μπορεί να παράσχει παρηγορητική θεραπεία μέσω καταστροφής μέρους του όγκου με laser, διαστολής και τοποθέτησης stent. Το ενδοσκοπικό υπερηχοτομογράφημα (EUS) χρησιμοποιείται σε ορισμένα κέντρα συμπληρωματικά για τη σταδιοποίηση της νόσου, παρ όλο που δεν περιλαμβάνεται στις κατευθυντήριες οδηγίες του National Comprehensive Cancer Network. Με το EUS μπορεί να εκτιμηθεί η έκταση της διήθησης του τοιχώματος του στομάχου και να εκτιμηθούν οι επιχώριοι λεμφαδένες. Παρ όλ αυτά με το EUS δεν μπορεί να διακριθεί ο όγκος από την ίνωση και έτσι δεν είναι η εξέταση εκλογής για την εκτίμηση της ανταπόκρισης του όγκου στη θεραπεία. Συνολικά η ακρίβεια στη σταδιοποίηση της νόσου είναι περίπου 75%. Για Τ2 βλάβες, η εκτίμηση του σταδίου του όγκου με EUS είναι μόνο 38%, αλλά είναι καλύτερη για τους Τ1 και Τ3 όγκους, με ποσοστά 80% και 90% αντίστοιχα. Συνολικά, η ακρίβεια στην εκτίμηση του σταδίου των λεμφαδένων είναι 77% και παρ όλο που μπορεί να βελτιωθεί με βιοψία δια λεπτής βελόνης, η τεχνική δεν εφαρμόζεται ευρέως λόγω τεχνικών απαιτήσεων. Γενικά, η χρήση του EUS στην εκτίμηση 74

91 και διερεύνηση του καρκίνου του στομάχου, περιορίζεται στα κέντρα αναφοράς. Όταν γίνει επιβεβαίωση της διάγνωσης, ακολουθεί περαιτέρω έλεγχος που περιλαμβάνει γενική αίματος, έλεγχο πήξης και βιοχημικό έλεγχο που περιλαμβάνει και ηπατικά ένζυμα. Επιπλέον, απεικόνιση με ακτινογραφία θώρακος και υπολογιστική τομογραφία κοιλίας. Σε γυναίκες ασθενείς συνιστάται επίσης υπολογιστική τομογραφία ή υπερηχοτομογράφημα πυέλου. Υπολογιστική τομογραφία θώρακος είναι χρήσιμη όταν ο καρκίνος εντοπίζεται στον εγγύς στόμαχο. Με την τομογραφία ελέγχεται η παρουσία μεταστάσεων καθώς και κακοήθους ασκίτη. Δεν μπορεί όμως να ανιχνευθεί πρώιμος γαστρικός καρκίνος, ούτε μικρές (<5mm) ηπατικές ή περιτοναϊκές μεταστάσεις. Σχετικά με τις λεμφαδενικές μεταστάσεις, η αναφερόμενη ακρίβεια της υπολογιστικής τομογραφίας για σταδιοποίηση, κυμαίνεται από 25% έως 86%. Λόγω της περιορισμένης δυνατότητας της αξονικής τομογραφίας και άλλων μεθόδων απεικόνισης στην ανίχνευση μεταστάσεων μεγέθους μικρότερου των 5mm στο ήπαρ ή στο περιτόναιο, το επόμενο βήμα στην εκτίμηση των ασθενών με τοπικο-περιοχική νόσο, είναι η λαπαροσκόπηση. Με τη λαπαροσκόπηση μπορεί να ανιχνευθεί μεταστατική νόσος στο 23% με 37% των ασθενών που φάνηκε ότι έχουν δυνητικά εξαιρέσιμη νόσο στον έλεγχο με Αξονική Τομογραφία. Ενδείξεις για διενέργεια λαπαροσκόπησης σταδιοποίησης αποτελούν η ανεύρεση λεμφαδενοπάθειας στην Αξονική Τομογραφία, ο καρκίνος καρδιοοισοφαγικής συμβολής και η διάχυτη διήθηση του στομάχου [32, 33]. Το λαπαροσκοπικό υπερηχοτομογράφημα μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία της λαπαροσκόπησης ως μεθόδου σταδιοποίησης. Η κυτταρολογική ανάλυση του περιτοναϊκού υγρού ή του υγρού από περιτοναϊκή πλύση, μπορεί να αναδείξει την παρουσία ελεύθερων καρκινικών κυττάρων, καταδεικνύοντας έτσι τους ασθενείς που έχουν μη ανιχνεύσιμη καρκινωμάτωση. Οι ασθενείς αυτοί έχουν πτωχή πρόγνωση, όμοια με εκείνη των ασθενών με μακροσκοπική νόσο σταδίου IV. Παρ όλ αυτά, μπορεί να υπάρξουν ψευδώς θετικά αποτελέσματα, ενώ υπάρχουν μελέτες που δεν επιβεβαιώνουν την προγνωστική σημασία των θετικών ευρημάτων. Γίνεται έρευνα για πιο ευαίσθητες μεθόδους ανίχνευσης ελεύθερων καρκινικών 75

92 κυττάρων στην περιτοναϊκή κοιλότητα, όπως η ανοσοϊστοχημεία και η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (rt-pcr) για την ανίχνευση του Καρκινοεμβρυικού αντιγόνου (CEA) σε επίπεδο mrna. [21] 76

93 2.7 ΣΤΑΔΙΟΠΟΙΗΣΗ Πολλά συστήματα σταδιοποίησης έχουν προταθεί για το αδενοκαρκίνωμα του στομάχου. Το σύστημα που εφαρμόζεται σήμερα παγκοσμίως είναι το TNM της American Joint Committee on Cancer (AJCC). Το TNM (Tumor, Nodes, Metastasis) βασίζεται στο βάθος διήθησης του πρωτοπαθούς όγκου στο τοίχωμα του στομάχου, στον αριθμό των διηθημένων λεμφαδένων και στην παρουσία ή όχι απομακρυσμένων μεταστάσεων. Με βάση το σύστημα TNM ορίζονται στάδια, κάθε ένα από τα οποία έχει διαφορετική πρόγνωση. Η σταδιοποίηση των όγκων στους ασθενείς της μελέτης έγινε σύμφωνα με την 6 η έκδοση του συστήματος TNM (Πίνακας 2.2), διότι αυτή ήταν σε χρήση κατά το μεγαλύτερο μέρος της περιόδου διάγνωσης, αντιμετώπισης και παρακολούθησης των ασθενών. Αναλυτικά, η 6 η έκδοση της σταδιοποίησης κατά TNM περιγράφεται Παρακάτω [34]: TNM 6η Έκδοση Τ ΤX T0 Tis T1 T2 T2a T2b T3 Δε δύναται να εκτιμηθεί Χωρίς ένδειξη πρωτοπαθούς όγκου Καρκίνωμα in situ: ενδοεπιθηλιακός όγκος χωρίς διήθηση του χορίου Ο όγκος διηθεί το χόριο ή τον υποβλεννογόνιο Διήθηση του μυικού χιτώνα ή του υπορογόνιου Διήθηση του μυικού χιτώνα Διήθηση του υπορογόνιου περιλαμβάνονται επίσης οι όγκοι που εκτείνονται στο γαστροκολικό ή στο γαστροηπατικό σύνδεσμο, ή στο μείζον ή έλασσον επίπλουν, χωρίς διάτρηση του σπλαχνικού περιτοναίου που καλύπτει τις δομές αυτές Ο όγκος διηθεί τον ορογόνο (σπλαχνικό περιτόναιο) χωρίς διήθηση των γειτονικών δομών 77

94 T4 Διήθηση των γειτονικών δομών (σπλήνας, εγκάρσιο κόλον, ήπαρ, διάφραγμα, πάγκρεας, κοιλιακό τοίχωμα, επινεφρίδιο, νεφρός, λεπτό έντερο, οπισθοπεριτόναιο) (Εικόνα 2.3) Εικόνα 2.3 Απεικόνιση του Τ στο σύστημα TNM (Πηγή: TNM Atlas, 5 th edition. 2004, Springer: Germany. p. 87, 90) 78

95 Μία σημαντική αναθεώρηση αυτού του συστήματος σταδιοποίησης για τον καρκίνο του στομάχου έγινε το 1997, όταν ο καθορισμός της κατάστασης των λεμφαδένων άρχισε να γίνεται με βάση τον αριθμό των διηθημένων λεμφαδένων αντί της εντόπισης των θετικών λεμφαδένων που ίσχυε προηγουμένως. Αυτό που ισχύει σήμερα, είναι ότι πρέπει να αξιολογούνται προς σταδιοποίηση, κατ ελάχιστον 15 λεμφαδένες. Έτσι, το pn1 αντιστοιχεί σε 1 έως 6 θετικούς λεμφαδένες, το pn2 σε 7 με 15 και το pn3 σε περισσότερους από 15 θετικούς λεμφαδένες. Ν NX Επιχώριοι λεμφαδένες δεν μπορούν να εκτιμηθούν N0 Χωρίς διήθηση επιχώριων λεμφαδένων N1 Μετάσταση σε 1-6 επιχώριους λεμφαδένες Ν2 Μετάσταση σε 7-15 επιχώριους λεμφαδένες Ν3 Μετάσταση σε περισσότερους από 15 λεμφαδένες (Εικόνες 2.4 & 2.5) Εικόνα 2.4 Επιχώριοι λεμφαδένες (σύστημα TNM) (Πηγή: TNM Atlas, 5 th edition. 2004, Springer: Germany. p. 92) 79

96 Εικόνα 2.5 Επιχώριοι λεμφαδένες (σύστημα TNM) (Πηγή: TNM Atlas, 5 th edition. 2004, Springer: Germany. p ) 80

97 Μ ΜX M0 M1 Απομακρυσμένες μεταστάσεις δεν μπορούν να εκτιμηθούν Χωρίς απομακρυσμένες μεταστάσεις Απομακρυσμένες μεταστάσεις, διηθημένοι λεμφαδένες άνωθεν του διαφράγματος, οπισθοπαγκρεατικοί, μεσεντέριοι, παραορτικοί Πίνακας 2.2 Σταδιοποίηση κατά ΤΝΜ (6η Έκδοση) Στάδιο 0 Tis N0 M0 Στάδιο ΙΑ T1 N0 M0 Στάδιο ΙΒ T1 N1 M0 T2a/b N0 M0 Στάδιο ΙΙ T1 N2 M0 T2a/b N1 M0 T3 N0 M0 Στάδιο ΙΙΙΑ T2a/b N2 M0 T3 N1 M0 T4 N0 M0 Στάδιο ΙΙΙΒ T3 N2 M0 Στάδιο IV T4 N1-3 Μ0 T1-3 N3 M0 Κάθε Τ Κάθε Ν Μ1 81

98 Το 2009 κυκλοφόρησε η 7η έκδοση του συστήματος ΤΝΜ (Πίνακας 2.3), στην οποία υπήρχαν αλλαγές για αρκετούς καρκίνους μεταξύ των οποίων και για το γαστρικό καρκίνο [35]. Οι αλλαγές που υπάρχουν στην 7η έκδοση συνοψίζονται στα παρακάτω: 1. Οι όγκοι που εξορμούν από τη γαστροοισοφαγική συμβολή και οι όγκοι που εξορμούν από το στόμαχο μέχρι 5εκ από τη ΓΟΣ και επεκτείνονται πέρα απ αυτήν, σταδιοποιούνται με βάση το ΤΝΜ σύστημα για το αδενοκαρκίνωμα του οισοφάγου. Οι όγκοι στομάχου αλλά και εκείνοι που εξορμούν 5εκ από την ΚΟΣ χωρίς όμως να εκτείνονται σε αυτήν, ταξινομούνται και σταδιοποιούνται σύμφωνα με το σύστημα για τον καρκίνο του στομάχου. 2. Οι κατηγορίες του Τ τροποποιήθηκαν ώστε να εναρμονιστούν με τις αντίστοιχες για τον οισοφάγο, το λεπτό και το παχύ έντερο 3. Οι Τ1 βλάβες υποδιαιρέθηκαν σε T1a και T2b 4. Το Τ2 ορίζεται ως ο όγκος που διηθεί το μυικό χιτώνα 5. Το Τ3 ορίζεται ως ο όγκος που διηθεί τον υπορογόνιο συνδετικό ιστό 6. Το Τ4 ορίζει τον όγκο που διηθεί τον ορογόνο (σπλαχνικό περιτόναιο) ή τα παρακείμενα όργανα 7. Οι κατηγορίες του Ν έχουν τροποποιηθεί ως εξής: Ν1 1-2, Ν2 3-6 και Ν3 7 ή περισσότεροι θετικοί λεμφαδένες 8. Η θετική κυτταρολογική εξέταση περιτοναϊκού υγρού ταξινομείται ως Μ1 9. Τα στάδια έχουν αλλάξει επίσης TNM 7η Έκδοση Τ ΤX T0 Tis T1 T1a T1b Δε δύναται να εκτιμηθεί Χωρίς ένδειξη πρωτοπαθούς όγκου Καρκίνωμα in situ: ενδοεπιθηλιακός όγκος χωρίς διήθηση του χορίου Ο όγκος διηθεί το χόριο, το βλεννογόνιο μυικό χιτώνα ή τον υποβλεννογόνιο Διήθηση του χορίου ή του βλεννογόνιου μυικού χιτώνα Διήθηση του υποβλεννογόνιου 82

99 T2 T3 T4 T4a T4b Διήθηση του μυικού χιτώνα Ο όγκος διηθεί τον υπορογόνιο συνδετικό ιστό χωρίς διήθηση του σπλαχνικού περιτοναίου ή των γειτονικών δομών Οι T3 όγκοι περιλαμβάνουν επίσης όσους εκτείνονται στο γαστροκολικό ή στο γαστροηπατικό σύνδεσμο, ή στο μείζον ή έλασσον επίπλουν, χωρίς διάτρηση του σπλαχνικού περιτοναίου που καλύπτει τις δομές αυτές Διήθηση του ορογόνου (σπλαχνικό περιτόναιο) ή των γειτονικών δομών Διήθηση του ορογόνου Διήθηση γειτονικών οργάνων (σπλήνας, εγκάρσιο κόλον, ήπαρ, διάφραγμα, πάγκρεας, κοιλιακό τοίχωμα, επινεφρίδιο, νεφρός, λεπτό έντερο, οπισθοπεριτόναιο) Ν NX N0 N1 Ν2 Ν3a N3b Επιχώριοι λεμφαδένες δεν μπορούν να εκτιμηθούν Χωρίς διήθηση επιχώριων λεμφαδένων Μετάσταση σε 1-2 επιχώριους λεμφαδένες Μετάσταση σε 3-6 επιχώριους λεμφαδένες Μετάσταση σε 7-15 λεμφαδένες Μετάσταση σε 16 ή περισσότερους λεμφαδένες Μ M0 M1 Χωρίς απομακρυσμένες μεταστάσεις Απομακρυσμένες μεταστάσεις, ανεύρεση καρκινικών κυττάρων στην περιτοναϊκή κοιλότητα (θετική κυτταρολογική εξέταση), διηθημένοι λεμφαδένες άνωθεν του διαφράγματος, οπισθοπαγκρεατικοί, μεσεντέριοι, παραορτικοί 83

100 Πίνακας 2.3 Σταδιοποίηση κατά ΤΝΜ (7η Έκδοση) Στάδιο 0 Tis N0 M0 Στάδιο ΙΑ T1 N0 M0 Στάδιο ΙΒ T2 N0 M0 T1 N1 M0 Στάδιο ΙΙΑ T3 N0 M0 T2 N1 M0 T1 N2 M0 Στάδιο ΙΙΒ T4a N0 M0 T3 N1 M0 T2 N2 M0 T1 N3 M0 Στάδιο ΙΙΙΑ T4a N1 M0 T3 N2 M0 T2 N3 M0 Στάδιο ΙΙΙΒ T4b N0 / N1 M0 T4a N2 M0 T3 N3 M0 Στάδιο ΙΙΙC T4b N2 / N3 M0 T4a N3 M0 Στάδιο IV Κάθε Τ Κάθε Ν Μ1 84

101 Σε κάποιες μελέτες αναφέρεται ότι η εντόπιση του πρωτοπαθούς όγκου είναι ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την επιβίωση (ο καρκίνος στην καρδία του στομάχου έχει χειρότερη πρόγνωση σε σχέση με τους περιφερικούς όγκους. Παρ όλ αυτά, το τρέχον AJCC σύστημα σταδιοποίησης δε συμπεριλαμβάνει τέτοια πληροφορία. Η κατάσταση του όγκου μετά την αφαίρεση περιγράφεται με το R, το οποίο αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 1994 από τον Hermanek. Ως R0 περιγράφεται αφαιρεθείς όγκος με μικροσκοπικά υγιή (αρνητικά) όρια. Αυτό σημαίνει ότι δεν υπάρχει εναπομείνας ιστός μικροσκοπικώς διηθημένος. Ως R1 περιγράφεται η αφαίρεση του όγκου σε μακροσκοπικώς υγιή όρια, αλλά σε μικροσκοπικό επίπεδο τα όρια είναι διηθημένα (θετικά). Η R2 εξαίρεση σημαίνει μακροσκοπικώς υπολειπόμενη νόσος. Επειδή η επιβίωση σχετίζεται άμεσα με την έκταση της αφαίρεσης, μερικοί συγγραφείς περιλαμβάνουν το R ως συμπληρωματικό στοιχείο στη σταδιοποίηση κατά TNM. Μακρόχρονη επιβίωση επιτυγχάνεται μόνο μετά R0 εκτομή. Αυτό συνεπάγεται ότι πρέπει να γίνεται προσπάθεια να αποφεύγονται οι R1 και R2 εκτομές. Η γνώση των παλαιότερων συστημάτων σταδιοποίησης καθώς και του Ιαπωνικού συστήματος, είναι σημαντική για την κατανόηση των λεμφαδενεκτομών στον καρκίνο του στομάχου. Στην προηγούμενη έκδοση της Union Internationale Contre le Cancer (UICC) για το σύστημα TNM, το N οριζόταν από την εντόπιση των διηθημένων λεμφαδένων σε σχέση με την πρωτοπαθή εστία. Το 1982 η UICC και η AJCC όρισαν το pn1 ως την παρουσία λεμφαδένα μέχρι 3εκ από την πρωτοπαθή εστία. Στο pn2 έχουμε λεμφαδένες σε απόσταση μεγαλύτερη των 3εκ από την πρωτοπαθή εστία, ή λεμφαδενικές μεταστάσεις κατά μήκος των κυρίων αγγείων. Το σύστημα σταδιοποίησης της Ιαπωνικής ταξινόμησης για το γαστρικό καρκίνωμα (Japanese Classification for Gastric Carcinoma), έχει αναλυτικότερη περιγραφική ταξινόμηση για τον επιφανειακό τύπο της μακροσκοπικής κατηγοριοποίησης (Εικόνα 2.6). Παρέχει επίσης περαιτέρω ταξινόμηση με βάση τον όγκο στρώματος που καταλαμβάνει το καρκινώμα, τη μορφή διήθησης (παρουσία ή όχι διακριτού ορίου με τους γύρω ιστούς) και το βαθμό διήθησης λεμφαγγείων και φλεβών. [21, 36] 85

102 Εικόνα 2.6 Περιγραφική ταξινόμηση του επίπεδου καρκινώματος σύμφωνα με την Japanese Classification for Gastric Carcinoma Type 0 Superficial, flat Type 0-I Protruding Type 0-II Superficial Type 0-IIa Sup. Elevated Type 0-IIb Sup. Flat Type 0-IIc Sup. depressed Type 0-III Excavated (Πηγή: Japanese classification of gastric carcinoma: 3rd English edition. Gastric Cancer, (2): p. 103) Σε ό,τι αφορά τη λεμφαδενική διασπορά, περιγράφονται δεκαέξι διακριτές ανατομικές περιοχές λεμφαδένων (Εικόνα 2.7), με σύσταση για αφαίρεση λεμφαδενικών ομάδων ανάλογα με την εντόπιση της πρωτοπαθούς εστίας. Οι σταθμοί αυτοί λεμφαδένων έχουν αρίθμηση και ταξινομούνται περαιτέρω σε ομάδες που αντιστοιχούν στις ανατομικές περιοχές του στομάχου και των γειτονικών δομών και επιτρέπουν την πιθανότητα να ανιχνευθούν μεταστάσεις (Πίνακας 2.4). Η παρουσία μεταστάσεων σε κάθε ομάδα λεμφαδένων 86

103 καθορίζει σε ποια κατηγορία Ν θα ταξινομηθεί η νόσος (για παράδειγμα θετικοί λεμφαδένες στην ομάδα 1 χωρίς μετάσταση στις πιο απομακρυσμένες ομάδες ταξινομείται ως Ν1). Κατά το χειρουργείο, συνιστάται η αφαίρεση 16 τουλάχιστον λεμφαδένων, για να προσδιοριστεί με ακρίβεια το Ν. Εικόνα 2.7 Σταθμοί λεμφαδένων σύμφωνα με την Japanese Classification for Gastric Carcinoma (Πηγή: 87

104 Πίνακας 2.4 Σταθμοί Λεμφαδένων και Ομαδοποίηση ανάλογα με την πρωτοπαθή εστία (Japanese Classification for Gastric Carcinoma) Εντόπιση 1/παθούς όγκου Αριθμός ομάδας λεμφαδένων Περιγραφή ανατομικής εντόπισης Άνω 3/μόριο Μέσο 3/μόριο Κάτω 3/μόριο 1 ΔΕ παρακαρδιακοί (περιλαμβάνονται οι λεμφαδένες κατά μήκος του ανιόντος κλάδου της ΑΡ γαστρικής αρτ) Ομάδα 1 Ομάδα 1 Ομάδα 2 2 3a ΑΡ παρακαρδιακοί (περιλαμβάνονται οι λεμφαδένες του καρδιοοισοφαγικού κλάδου της ΑΡ φρενικής αρτ) Λεμφαδένες ελάσσονος τόξου κατά μήκος των κλάδων της ΑΡ γαστρικής αρτ Ομάδα 1 Ομάδα 3 Μ Ομάδα 1 Ομάδα 1 Ομάδα 1 3b 4sa 4sb Λεμφαδένες ελάσσονος τόξου κατά μήκος του 2 ου κλάδου και του περιφερικού τμήματος της ΔΕ γαστρικής αρτ Λεμφαδένες μείζονος τόξου ΑΡ κατά μήκος των βραχέων γαστρικών αρτ Λεμφαδένες μείζονος τόξου ΑΡ κατά μήκος της ΑΡ γαστροεπιπλοϊκής αρτ Ομάδα 1 Ομάδα 1 Ομάδα 1 Ομάδα 1 Ομάδα 3 Μ Ομάδα 1 Ομάδα 1 Ομάδα 3 4d Λεμφαδένες μείζονος τόξου ΔΕ κατά μήκος του 2 ου κλάδου και του περιφερικού τμήματος της ΔΕ γαστροεπιπλοϊκής αρτ Ομάδα 2 Ομάδα 1 Ομάδα 1 5 Υπερπυλωρικοί λεμφαδένες κατά μήκος του 1 ου κλάδου και του εγγύς τμήματος της ΔΕ γαστρικής αρτ Ομάδα 3 Ομάδα 1 Ομάδα 1 6 Υποπυλωρικοί λεμφαδένες κατά μήκος του 1 ου κλάδου και του εγγύς τμήματος της ΔΕ γαστροεπιπλοϊκής αρτ μέχρι τη συμβολή της ΔΕ γαστροεπιπλοϊκής με την πρόσθια άνω παγκρεατοδωδεκαδακτυλική φλέβα Ομάδα 3 Ομάδα 1 Ομάδα 1 88

105 7 8a 8p Λεμφαδένες κατά μήκος του στελέχους της ΑΡ γαστρικής αρτ μεταξύ της έκφυσής της και της έκφυσης του ανιόντος κλάδου της Πρόσθιοι - άνω λεμφαδένες κατά μήκος της κοινής ηπατική αρτ Οπίσθιοι λεμφαδένες κατά μήκος της κοινής ηπατικής αρτ Ομάδα 2 Ομάδα 2 Ομάδα 2 Ομάδα 2 Ομάδα 2 Ομάδα 2 Ομάδα 3 Ομάδα 3 Ομάδα 3 9 Λεμφαδένες κοιλιακής αρτ Ομάδα 2 Ομάδα 2 Ομάδα 2 10 Λεμφαδένες πύλης σπληνός, σπληνικής αρτ περιφερικά της ουράς του παγκρέατος, εκφύσεων των βραχέων γαστρικών αρτ, ΑΡ γαστροεπιπλοϊκής αρτ εγγύς του 1 ου γαστρικού κλάδου Ομάδα 2 Ομάδα 3 Μ 11p 11d Λεμφαδένες εγγύς τμήματος σπληνικής αρτ (στο εγγύς μισό της απόστασης μεταξύ της έκφυσής της και του άκρου της ουράς του παγκρέατος) Λεμφαδένες άπω τμήματος σπληνικής αρτ (στο περιφερικό μισό της απόστασης μεταξύ της έκφυσής της και του άκρου της ουράς του παγκρέατος) Ομάδα 2 Ομάδα 2 Ομάδα 2 Ομάδα 2 Ομάδα 3 M 12a Λεμφαδένες ηπατοδωδεκαδακτυλικού συνδέσμου κατά μήκος της ιδίως ηπατικής αρτ στο ουραίο μισό της απόστασης μεταξύ της συμβολής των ηπατικών πόρων και του άνω ορίου του παγκρέατος 12b Λεμφαδένες ηπατοδωδεκαδακτυλικού συνδέσμου κατά μήκος του χοληδόχου πόρου στο ουραίο μισό της απόστασης μεταξύ της συμβολής των ηπατικών πόρων και του άνω ορίου του παγκρέατος 12p Λεμφαδένες ηπατοδωδεκαδακτυλικού συνδέσμου κατά μήκος της πυλαίας φλέβας στο ουραίο μισό της απόστασης Ομάδα 3 Ομάδα 2 Ομάδα 2 Ομάδα 3 Ομάδα 3 Ομάδα 3 Ομάδα 3 Ομάδα 3 Ομάδα 3 89

106 μεταξύ της συμβολής των ηπατικών πόρων και του άνω ορίου του παγκρέατος 13 Λεμφαδένες οπίσθιας επιφάνειας κεφαλής παγκρέατος κεφαλικά του φύματος του Vater 14v Λεμφαδένες κατά μήκος της άνω μεσεντερίου φλέβας 15 Λεμφαδένες κατά μήκος των μέσων κολικών αγγείων 16a1 Παραορτικοί λεμφαδένες στο αορτικό τρήμα M Ομάδα 3 Ομάδα 3 M Ομάδα 3 Ομάδα 2 M M M Ομάδα 3 M M 16a2 16b1 16b2 Παραορτικοί λεμφαδένες μεταξύ του άνω ορίου της έκφυσης της κοιλιακής αρτ και του κάτω ορίου της ΑΡ νεφρικής φλέβας Παραορτικοί λεμφαδένες μεταξύ του κάτω ορίου της ΑΡ νεφρικής φλέβας και του άνω ορίου της έκφυσης της κάτω μεσεντερίου αρτ Παραορτικοί λεμφαδένες μεταξύ του άνω ορίου της έκφυσης της κάτω μεσεντερίου αρτ και του διχασμού της αορτής M Ομάδα 3 Ομάδα 3 M Ομάδα 3 Ομάδα 3 M M M 17 Λεμφαδένες πρόσθιας επιφάνειας κεφαλής παγκρέατος 18 Λεμφαδένες κατά μήκος του κάτω χείλους του σώματος του παγκρέατος 19 Υποδιαφραγματικοί λεμφαδένες κατά μήκος της φρενικής αρτ 20 Παραοισοφαγικοί λεμφαδένες στο οισοφαγικό τρήμα 11 0 Παραοισοφαγικοί λεμφαδένες στον κατώτερο θώρακα 90

107 11 1 Λεμφαδένες άνωθεν του διαφράγματος μη σχετιζόμενοι με τον οισοφάγο 11 2 Λεμφαδένες οπισθίου μεσοθωρακίου μη σχετιζόμενοι με τον οισοφάγο και το οισοφαγικό τρήμα Οι λεμφαδενικές ομάδες 1 έως 12 και 14v ορίζονται ως περιοχικοί γαστρικοί λεμφαδένες. Μετάσταση σε οποιαδήποτε άλλη ομάδα ταξινομείται ως Μ1. Μεταστάσεις σε δομές εκτός των λεμφαδενικών ομάδων, όπως και οι περιτοναϊκές μεταστάσεις, ορίζονται ως Μ1 νόσος. ΠΡΩΙΜΟΣ ΓΑΣΤΡΙΚΟΣ ΚΑΡΚΙΝΟΣ Ο πρώιμος γαστρικός καρκίνος έχει περιγραφεί από το 1962 ως το αδενοκαρκίνωμα που περιορίζεται στο βλεννογόνο ή τον υποβλεννογόνιο, ανεξάρτητα από τη συμμετοχή ή όχι των λεμφαδένων [37]. Το πρώιμο αυτό στάδιο της νόσου έχει πολύ καλή πρόγνωση μετά τη χειρουργική εξαίρεση, με αναφορές για ποσοστά 5ετούς επιβίωσης πάνω από 90% [38]. Η πλειοψηφία των ασθενών αναφέρουν συμπτώματα όμοια με εκείνα καλοήθους πεπτικού έλκους. Από μία προοπτική μελέτη, έχει εκτιμηθεί ότι το πρώιμο γαστρικό καρκίνωμα εξελίσσεται σε προχωρημένο καρκίνο σε ένα μέσο διάστημα 37 μηνών [39]. Απομακρυσμένες μεταστάσεις από πρώιμο γαστρικό καρκίνο είναι εξαιρετικά σπάνιες, όπως και οι περιτοναϊκές εμφυτεύσεις, διότι η καρκινική βλάβη είναι εξ ολοκλήρου περιορισμένη στο τοίχωμα του στομάχου. Η μοναδική πιθανή οδός μετάστασης είναι μέσω των λεμφαγγείων. Η συχνότητα και η έκταση των λεμφαδενικών μεταστάσεων από πρώιμο γαστρικό καρκίνωμα, έχουν άμεση συσχέτιση με το βάθος διήθησης του όγκου. Οι βλάβες που περιορίζονται στο βλεννογόνο πολύ σπάνια μεθίστανται (3% ή λιγότερο), ενώ ένα 20% εκείνων που διηθούν τον υποβλεννογόνιο θα δώσουν μεταστάσεις στους επιχώριους λεμφαδένες. Το ποσοστό αυτό πλησιάζει το 50% στις περιπτώσεις Τ2 όγκων 91

108 [40]. Πρόσφατες μελέτες με ανοσοϊστοχημεία, έχουν δείξει υψηλότερη συχνότητα μικρομεταστάσεων, η κλινική και προγνωστική σημασία των οποίων χρήζουν περαιτέρω αποσαφήνισης [41]. Σχετικά με την υποτροπή στον πρώιμο γαστρικό καρκίνο, είναι συχνότερη στις περιπτώσεις των όγκων που διηθούν τον υποβλεννογόνιο και έχουν θετικούς λεμφαδένες. Οι ηπατικές και άλλες αιματογενείς μεταστάσεις είναι ο κύριος τρόπος υποτροπής. ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΓΑΣΤΡΟΟΙΣΟΦΑΓΙΚΗΣ ΣΥΜΒΟΛΗΣ Ο καρκίνος της καρδιοοισοφαγικής συμβολής (ΚΟΣ) προέρχεται είτε από το μεταπλαστικό επιθήλιο του οισοφάγου, είτε από το γαστρικό επιθήλιο και έτσι μπορεί να διαφέρει στις βιολογικές του ιδιότητες. Η εντόπισή του έχει ως αποτέλεσμα η λεμφική του αποχέτευση να γίνεται είτε προς τους ενδοθωρακικούς, είτε προς τους ανώτερους κοιλιακούς λεφαδένες. Με τα δεδομένα αυτά ο Siewert πρότεινε μία νέα κατάταξη για τον καρκίνο της ΚΟΣ το 1987, η οποία έγινε αποδεκτή από τη Σύνοδο για το Αδενοκαρκίνωμα της Καρδιοοισοφαγικής Συμβολής της Διεθνούς Ένωσης για τον Γαστρικό Καρκίνο (International Gastric Cancer Association Consensus Conference on Adenocarcinoma of the Esophagogastric Junction) [42-44]. Η κατάταξη αυτή βασίζεται στα ανατομικά/τοπογραφικά χαρακτηριστικά του όγκου που εντοπίζεται στην ΚΟΣ και περιλαμβάνει όλους τους όγκους που βρίσκονται στα 5εκ από την ΚΟΣ. Είναι εφαρμόσιμη στην καθημερινή κλινική πράξη και διευκολύνει τον καθορισμό της χειρουργικής αντιμετώπισης. Διακρίνονται 3 τύποι καρκίνου ανάλογα με την εντόπιση του κέντρου του όγκου. Όγκοι που εντοπίζονται περισσότερο από 1εκ άνωθεν της ΚΟΣ ορίζονται ως τύπου Ι (καρκίνος του άπω οισοφάγου). Όγκοι που εντοπίζονται μεταξύ 1εκ κεντρικά και 2εκ περιφερικά της ΚΟΣ ταξινομούνται ως τύπου ΙΙ (αληθές καρκίνωμα της καρδίας), ενώ εκείνοι που βρίσκονται περισσότερο από 2εκ περιφερικά της ΚΟΣ, ταξινομούνται ως τύπου ΙΙΙ (υποκαρδιακό γαστρικό καρκίνωμα) (Εικόνα). 92

109 Η Καρδιοοισοφαγική Συμβολή ορίζεται ως η συμβολή πλακώδους και κυλινδρικού επιθηλίου, ή στην περίπτωση που ο οισοφάγος έχει κυλινδρικό επιθήλιο, από το εγγύς όριο των γαστρικών πτυχών [44]. Η 7 η έκδοση του συστήματος TNM για την ταξινόμηση των κακοήθων όγκων, περιλαμβάνει νέα κατάταξη για τα γαστροοισοφαγικά καρκινώματα. Σύμφωνα με αυτή, οι όγκοι των οποίων το επίκεντρο βρίσκεται στα 5εκ από την ΚΟΣ και επεκτείνονται στον οισοφάγο, ταξινομούνται και σταδιοποιούνται σύμφωνα με το σχήμα για τον καρκίνο του οισοφάγου. Όλοι οι άλλοι όγκοι των οποίων το επίκεντρο βρίσκεται στο στόμαχο σε απόσταση μεγαλύτερη των 5εκ από την ΚΟΣ, καθώς και οι όγκοι που βρίσκονται εντός 5εκ από την ΚΟΣ χωρίς επέκταση στον οισοφάγο, σταδιοποιούνται σύμφωνα με το σχήμα για τον γαστρικό καρκίνο. 93

110 2.8 ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ Η ιδανική χειρουργική αντιμετώπιση του γαστρικού καρκίνου πρέπει να γίνεται σύμφωνα με την εντόπιση και την έκταση της νόσου. Η έκταση της εκτομής καθορίζεται έτσι ώστε να επιτυγχάνονται χειρουργικά όρια ελεύθερα μικροσκοπικής νόσου. Επειδή ο καρκίνος του στομάχου χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη ενδοτοιχωματική επέκταση, είναι απαραίτητο να επιτυγχάνεται όριο εκτομής τουλάχιστον 6εκ από τον όγκο, ώστε να υπάρχει μικρό ποσοστό υποτροπής στην αναστόμωση. Η ενδεδειγμένη χειρουργική επέμβαση σχεδιάζεται με βάση την εντόπιση του όγκου και τον τρόπο επέκτασης. Όγκοι που βρίσκονται στην καρδία και στον εγγύς στόμαχο αποτελούν το 35% - 50% των γαστρικών αδενοκαρκινωμάτων. Γενικά οι όγκοι αυτοί είναι περισσότερο προχωρημένοι κατά την ανεύρεσή τους, σε σχέση με εκείνους στον περιφερικό στόμαχο. Για τους εγγύς όγκους, η ενδεδειγμένη επέμβαση είναι είτε η ολική, είτε η κεντρική γαστρεκτομή. Παρ όλο που δεν υπάρχει ένδειξη ότι η μία εγχείρηση υπερτερεί της άλλης για την αφαίρεση του όγκου, υπάρχουν αρκετές ενδείξεις ότι η κεντρική γαστρεκτομή έχει υψηλότερα ποσοστά νοσηρότητας και θνησιμότητας σε σχέση με την ολική. Έχει αναφερθεί υψηλότερη συχνότητα σ dumping, καυσαλγίας και ανορεξίας στους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε κεντρική γαστρεκτομή σε σχέση με εκείνους στους οποίους έγινε περιφερική ή ολική γαστρεκτομή [45]. Στη Νορβηγική μελέτη για τον καρκίνο του στομάχου (Norwegian Stomach Cancer Trial), τα ποσοστά νοσηρότητας και θνησιμότητας μετά κεντρική γαστρεκτομή ήταν 52% και 16% αντίστοιχα, συγκρινόμενα με 38% και 8% μετά ολική γαστρεκτομή. Με βάση το παραπάνω συμπεραίνεται ότι η ολική γαστρεκτομή πρέπει να θεωρείται η επέμβαση εκλογής για τους όγκους στον εγγύς στόμαχο. Οι όγκοι του περιφερικού στομάχου αποτελούν το 35% των γαστρικών καρκίνων. Σχετικά με το ποια είναι η ενδεδειγμένη επέμβαση για τους όγκους αυτούς, πρόσφατες μελέτες δεν έχουν δείξει διαφορά στην 5ετή επιβίωση μεταξύ των ασθενών που υπεβλήθησαν σε δυνητικά θεραπευτική υφολική έναντι ολικής γαστρεκτομής. Η υφολική γαστρεκτομή είναι κατάλληλη σε ασθενείς όπου μπορεί επιτευχθεί αρνητικό όριο εκτομής. Απόσταση 6εκ από 94

111 τον όγκο υγιούς μακροσκοπικά ιστού, επιβεβαιωμένο με ταχεία βιοψία, είναι το προτεινόμενο όριο στις περιπτώσεις που διενεργείται υφολική γαστρεκτομή. Η έκταση του λεμφαδενικού καθαρισμού στη χειρουργική αντιμετώπιση του καρκίνου του στομάχου έχει αποτελέσει αντικείμενο πολλών μελετών και συζητήσεων. Οι διαφορετικοί τύποι λεμφαδενεκτομής έχουν καλύτερα περιγραφεί από τους Ιάπωνες. Οι κατηγορίες λεμφαδενικού καθαρισμού (D) ανάλογα με την εντόπιση της πρωτοπαθούς εστίας, βασίζονται στις ομάδες λεμφαδένων σύμφωνα με την Ιαπωνική Ταξινόμηση για το Γαστρικό Καρκίνωμα (Japanese Classification of Gastric Carcinoma) (Πίνακας 2.4). Ως D1 λεμφαδενικός καθαρισμός περιγράφεται η αφαίρεση της λεμφαδενικής ομάδας 1 για την αντίστοιχη πρωτοπαθή εστία. Η D2 λεμφαδενεκτομή αναφέρεται στην αφαίρεση των λεμφαδενικών ομάδων 1 και 2. Τέλος, η D3 είναι η D2 με επιπλέον την αφαίρεση των παρα-αορτικών λεμφαδένων. Για την πραγματοποίηση πλήρους αφαίρεσης των ομάδων 10 και 11, η πρακτική στην Ιαπωνία είναι να γίνεται σπληνεκτομή και μερική παγκρεατεκτομή. Η τακτική αυτή δεν ακολουθείται στις Δυτικές χώρες, εκτός των περιπτώσεων όπου ο σπλήνας ή το πάγκρεας διηθούνται με απευθείας επέκταση ενός Τ4 όγκου κατά συνέχεια ιστού. Πολυπαραγοντική ανάλυση στη μελέτη από τη Δανία για τον καρκίνο του στομάχου (Dutch trial), στην οποία έγινε σύγκριση μεταξύ της D1 και D2 λεμφαδενεκτομής, έδειξε ότι η σπληνεκτομή εμπεριέχει υψηλό κίνδυνο για επιπλοκές και ενδονοσοκομειακή θνητότητα [46]. Κάθε εκτεταμένη εκτομή συνοδεύεται από αύξηση της νοσηρότητας και της θνητότητας, χωρίς αντίστοιχη βελτίωση στην επιβίωση. Ως εκ τούτου, η συναφαίρεση γειτονικών οργάνων όπως ο σπλήνας, το πάγκρεας ή το εγκάρσιο κόλον, πρέπει να πραγματοποιείται μόνο για την επίτευξη R0 εκτομής. Ο εκτεταμένος D2 λεμφαδενικός καθαρισμός εφαρμόζεται ως ρουτίνα στην Ιαπωνία και μελέτες αρκετά χρόνια πριν έχουν δείξει ότι έχει ως αποτέλεσμα βελτίωση στην επιβίωση σε σχέση με την D1 λεμφαδενεκτομή (5ετής επιβίωση 39% και 18% αντίστοιχα) [47]. Παρ όλ αυτά, ελεγχόμενες τυχαιοποιημένες μελέτες από τη Δύση, δεν έδειξαν υπεροχή της D2 έναντι της D1 λεμφαδενεκτομής σε ό,τι αφορά την 95

112 επιβίωση. Η μελέτη από τη Μ Βρετανία (British trial), έδειξε αύξηση της μετεγχειρητικής νοσηρότητας (28% για την D1 και 46% για την D2) και θνητότητας (6.5% στην D1 και 13% στην D2) στην ομάδα ασθενών με D2 λεμφαδενικό καθαρισμό, χωρίς στατιστικώς σημαντική διαφορά στην 5ετή επιβίωση (35% στην D1 και 32% στην D2) [48]. Ομοίως, στη μελέτη από τη Δανία (Dutch trial), παρατηρήθηκε αυξημένη νοσηρότητα (25% στην D1 και 43% στην D2) και θνητότητα (6.5% στην D1 και 13% στην D2) στο σκέλος της εκτεταμένης λεμφαδενεκτομής, χωρίς όφελος στην επιβίωση [49]. Σύμφωνα με τις οδηγίες του National Comprehensive Cancer Network (NCCN), στις ΗΠΑ συνιστάται ως ελάχιστος λεμφαδενικός καθαρισμός η D1 λεμφαδενεκτομή, με ελάχιστο αριθμό λεμφαδένων στο παρασκεύασμα για εκτίμηση τους ΕΠΙΚΟΥΡΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ (Adjuvant Therapy) & ΝΕΟ-ΕΠΙΚΟΥΡΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ (Neo-adjuvant Therapy) Η μελέτη που άλλαξε τα δεδομένα της θεραπείας στον καρκίνο του στομάχου ήταν η Southwest Cancer Oncology Group trial, όπου εφαρμόστηκαν και εκτιμήθηκαν δύο κύκλοι 5-FU και Leucovorin, τους οποίους ακολούθησε σύγχρονη χημειο-ακτινοθεραπεία χρησιμοποιώντας ως βοηθήματα τους ίδιους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Ο μέσος χρόνος επιβίωσης για την ομάδα των ασθενών που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση μόνο, ήταν 27 μήνες, ενώ για την ομάδα εκείνων που υποβλήθηκαν σε συμπληρωματική χημειο-ακτινοθεραπεία, ήταν 36 μήνες (p=0.005). Τα ποσοστά 3ετούς επιβίωσης ήταν 41% στην ομάδα χειρουργικής επέμβασης και 50% στην ομάδα συμπληρωματκής χημειο-ακτινοθεραπείας (p=0.005). Τα δεδομένα αυτά υποστήριξαν την εφαρμογή μετεγχειρητικής χημειο-ακτινοθεραπείας στην αντιμετώπιση των ασθενών με εξαιρέσιμο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου. Ακολούθως, μία ελεγχόμενη τυχαιοποιημένη μελέτη από τη Μ Βρετανία (MAGIC trial), έδειξε βελτίωση στη συνολική επιβίωση και στο διάστημα ελεύθερο νόσου στους ασθενείς που αντιμετωπίστηκαν με προεγχειρητική ή μετεγχειρητική χημειοθεραπεία (Epirubicin, cis-platin και 5-FU). Η συνολική 5ετής επιβίωση ήταν 23% στην 96

113 ομάδα ελέγχου, ενώ στην ομάδα που χορηγήθηκε χημειοθεραπεία, ήταν 39% (p=0.009). Πολλά υποσχόμενη έχει αποδειχθεί ότι είναι και η νέο-επικουρική θεραπεία. Μελέτες έχουν δείξει αποδεκτές τοξικότητες, με εφικτή την ολοκλήρωση της προκαθορισμένης θεραπείας από τους ασθενείς, οι οποίοι υποβάλλονται στη συνέχεια σε R0 εκτομές. Σύμφωνα με τις οδηγίες του NCCN, στους ασθενείς με Τ3 και Τ4 όγκους ή όγκους με θετικούς λεμφαδένες, συνιστάται νέο-επικουρική χημειο-ακτινοθεραπεία με σχήμα βασισμένο στην 5-FU και ακολούθως πλήρης χειρουργική εξαίρεση. Επιπρόσθετα, ασθενείς με μικροσκοπικά θετικά όρια εκτομής, πρέπει να λαμβάνουν συμπληρωματική θεραπεία. [21] 2.9 ΠΡΟΓΝΩΣΗ Η συνολική 5ετής επιβίωση που ακολουθεί μετά τη διάγνωση καρκίνου του στομάχου, είναι 10% με 21%. Ασθενείς που υποβάλλονται σε δυνητικά θεραπευτική χειρουργική επέμβαση έχουν καλύτερη πρόγνωση, με ποσοστά 5ετούς επιβίωσης που κυμαίνονται μεταξύ 24% και 57%. Τα ποσοστά υποτροπής μετά γαστρεκτομή παραμένουν υψηλά και κυμαίνονται από 40% έως 80%. Η πλειοψηφία των υποτροπών συμβαίνει εντός των πρώτων 3 ετών. Το ποσοστό τοπικο-περιοχικής υποτροπής κυμαίνεται από 38% έως 45% και οι περιτοναϊκές εμφυτεύσεις ανευρίσκονται στο 54% των ασθενών. Μεμονωμένες απομακρυσμένες μεταστάσεις δεν είναι συνήθεις, διότι οι περισσότεροι ασθενείς με δευτεροπαθείς εντοπίσεις έχουν και τοπικο-περιοχική υποτροπή. Η συνηθέστερη εντόπιση τοπικής υποτροπής είναι η αναστόμωση στο γαστρικό κολόβωμα, η ανατομική περιοχή του στομάχου και οι επιχώριοι λεμφαδένες. Αιματογενής διασπορά γίνεται στο ήπαρ, στους πνεύμονες και στα οστά. [21] 97

114 2.10 ΠΑΡΗΓΟΡΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ Περίπου το 20% με 30% των ασθενών με καρκίνο του στομάχου διαγιγνώσκονται με νόσο σταδίου IV, γεγονός που σημαίνει ότι στις περιπτώσεις αυτές θα πρέπει να εφαρμόζονται μέθοδοι παρηγορικής φροντίδας. Ο σκοπός είναι η ανακούφιση από τα συμπτώματα με την ελάχιστη δυνατή νοσηρότητα. Η χειρουργική παρέμβαση σε προχωρημένο καρκίνο στομάχου περιλαμβάνει είτε εκτομή, είτε παράκαμψη χωρίς εκτομή, με ενδεχόμενο συνδυασμό ενδοσκοπικής παρέμβασης ή/και χρήσης ραδιοσυχνοτήτων. Στις περιπτώσεις περιτοναϊκής νόσου, ηπατικών μεταστάσεων, διάχυτης λεμφαδενικής διασποράς ή ασκίτη, η αντμετώπιση αιμορραγίας ή γαστρικής απόφραξης είναι προτιμότερο να γίνεται χωρίς χειρουργική παρέμβαση, αν αυτό είναι εφικτό. Μη επεμβατικές τεχνικές είναι η ενδοσκοπική διαστολή με ή χωρίς χρήση stent και η χρήση laser για αποκατάσταση της βατότητας. Ασθενείς που υποβάλλονται σε τοποθέτηση stent, καθίστανται συνήθως ικανοί να ανεχτούν στερεές τροφές και ενδεχομένως να μη χρειαστούν περαιτέρω παρεμβάσεις. [21] 2.11 ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ Υποτροπή στον καρκίνο του στομάχου συμβαίνει συνήθως τα 3 πρώτα χρόνια από την εκτομή, ο παρακλινικός έλεγχος πρέπει να γίνεται πιο συχνά τα πρώτα χρόνια. Η παρακολούθηση πρέπει να περιλαμβάνει πλήρες ιστορικό και κλινική εξέταση κάθε 4 μήνες για 1 έτος, κατόπιν κάθε 6 μήνες για 2 έτη και στη συνέχεια σε ετήσια βάση. Ο παρακλινικός έλεγχος περιλαμβάνει γενική αίματος, βιοχημικό έλεγχο ηπατικής λειτουργίας, α/α θώρακος και ΥΤ κοιλίας και πυέλου. Ενδοσκόπηση σε ετήσια βάση θα πρέπει να γίνεται στους ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε υφολική γαστρεκτομή [21]. 98

115 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 - ΚΑΛΛΙΚΡΕΪΝΕΣ 3.1 ΓΕΝΙΚΑ Ανθρώπινες ιστικές καλλικρεΐνες Ο όρος καλλικρεΐνη (ετυμολογικά προερχόμενος από την ελληνική λέξη για το πάγκρεας), αποδόθηκε, από τους Kraut, Frey και Werle, το 1930 [50, 51]. Αυτοί εντόπισαν για πρώτη φορά στο πάγκρεας σε μεγάλη συγκέντρωση, μία ουσία που είχε περιγραφεί ως υποτασιογόνος. Ο Werle και οι συνεργάτες του αναγνώρισαν την καλλικρεΐνη ως ένα πρωτεολυτικό ένζυμο, και την ονόμασαν καλλικρεΐνη 1 (KLK1), επτά χρόνια μετά. Ο ορισμός του ονόματος βασίστηκε στο γνώρισμα των καλλικρεϊνών να μπορούν να απελευθερώνουν κινίνες (αγγειοδραστικά πεπτίδια) από το κινινογόνο. Η ανθρώπινη KLK1 επιδρά σε ένα ηπατικό κινινογόνο, με στόχο την απελευθέρωση λυσυλβραδυκινίνης (ή αλλιώς καλλιδίνης). Η λυσυλβραδυκινίνη συμμετέχει στον έλεγχο της πίεσης του αίματος, της ηλεκτρολυτικής ισορροπίας, της φλεγμονώδους απόκρισης, αλλά και σε άλλες φυσιολογικές διαδικασίες. Η KLK1, επιπρόσθετα, έχει τη δυνατότητα πέψης διαφορετικού τύπου υποστρωμάτων. Η οικογένεια γονιδίων των ανθρώπινων ιστικών καλλικρεϊνών είναι η μεγαλύτερη συνεχόμενη γονιδιακά οικογένεια πρωτεασών στο ανθρώπινο γονιδίωμα και εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 19 (Εικόνα 3.1). Συγκεκριμένα, πρόκειται για σερινοπρωτεάσες, που είναι πρωτεάσες που δρουν μέσω ενός μοναδικού ενεργοποιημένου κατάλοιπου σερίνης στη θέση πρόσδεσης του υποστρώματος, αλληλεπιδρώντας μη αντιστρεπτά με διισοπροπυλφθοροφωσφορικό (DFP) προς τον σχηματισμό ενός φωσφορικού εστέρα (Εικόνα 3.1). Καλλικρεΐνες έχουν ανιχνευτεί σε πολλούς ιστούς και έχουν επίσης απομονωθεί από βιολογικά υγρά [52]. Έως τα μέσα της δεκαετίας του 90 πιστευόταν πως η οικογένεια των καλλικρεϊνών αποτελείτο από τρία μέλη με τα αντίστοιχά τους γονίδια. Αυτά τα τρία ένζυμα που αναγνωρίσθηκαν πρώτα είναι τα εξής: η καλλικρεΐνη 1 (KLK1), η καλλικρεΐνη 2 (KLK2) και η καλλικρεΐνη 3 (KLK3 ή PSA, prostatespecific antigen) [53]. Από τα τρία αυτά μέλη με τον κλασικό ορισμό συμφωνεί μόνο η καλλικρεΐνη 1. Αργότερα, το 1995, κλωνοποιήθηκαν δύο νέα μέλη της οικογένειας των 99

116 ανθρώπινων καλλικρεϊνών. Αυτές οι νέες καλλικρεΐνες 6 και 10 ονομάστηκαν πρωτεάση Μ [54] και NES1 [55], αντίστοιχα. Οι καλλικρεΐνες εκφράζονται σε ένα ευρύ φάσμα ιστών και εμπλέκονται σε μια σειρά φυσιολογικών λειτουργιών, όπως η φυσική απολέπιση του δέρματος, η υγροποίηση του σπέρματος, η νευρική πλαστικότητα και η ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης. Ο γενετικός τόπος της οικογένειας κωδικοποιεί και τα 15 μέλη της, εκ των οποίων τα 13 έχουν αναφερθεί ως πιθανοί βιοδείκτες για πολλές περιπτώσεις καρκινωμάτων, αλλά και άλλων μη-νεοπλασματικών ασθενειών. Πολλές είναι οι αιτίες που δικαιολογούν την αναγκαιότητα της μελέτης των πρωτεασών ως καρκινικούς βιοδείκτες. Πολλά από τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα των καρκινικών κυττάρων, όπως ο ανώμαλος κυτταρικός πολλαπλασιασμός ή η εισβολή σε γειτονικούς ιστούς και η μετάσταση μέσω αποδόμησης των εξωκυττάριων συστατικών, θα μπορούσε να αποδοθεί στις διαδικασίες πρωτεόλυσης [56]. Η πρωτεολυτική δραστηριότητα των καλλικρεϊνών θεωρείται ότι εμπλέκεται σε πλειάδα ενζυμικών καταρρακτών. Σημειώνεται ότι στο κείμενο με το όνομα KLK θα αναφέρεται το πρωτεϊνικό παράγωγο, ενώ με πλάγια γράμματα θα αναφέρεται το όνομα του αντίστοιχου γονιδίου. Λειτουργίες και ενζυμική δράση των καλλικρεϊνών Οι καλλικρεΐνες εμπλέκονται σε διάφορες φυσιολογικές διεργασίες, οι οποίες κυμαίνονται από το επίπεδο της κυτταρικής ομοιόστασης έως αυτό του ανασχηματισμού του ιστού. Η KLK1 πιστεύεται ότι διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο σε ένα μεγάλο αριθμό διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένου της ρύθμισης της αρτηριακής πίεσης, της ομαλής σύσπασης των μυών, του χημειοτακτισμού των ουδετερόφιλων και της επαγωγής του πόνου, μέσω σηματοδοτικού μονοπατιού κινίνης, ενώ μπορεί να λειτουργήσει ανεξάρτητα από το σηματοδοτικό μονοπάτι κινίνης, για παράδειγμα, μέσω αλληλεπίδρασης με αυξητικούς παράγοντες. Οι KLK2, KLK3, KLK5 και KLK11 εμπλέκονται σε πρωτεολυτικούς καταρράκτες στο σπερματικό πλάσμα. Αυτά τα ένζυμα είναι κρίσιμα για την υγροποίηση του σπέρματος, μέσω μιας επεξεργασίας με τη μεσολάβηση των σεμενογελινών I και II [57]. 100

117 Εικόνα 3.1 a. Η οικογένεια των Καλλικρεϊνών b. Η γονιδιακή τους εντόπιση και η ενεργοποίηση των προ-προενζύμων (Πηγή: Επιπλέον, η KLK5 έχει εντοπισθεί ως μέρος του πρωτεολυτικού καταρράκτη της διαδικασίας απολέπισης του δέρματος, με τη μεσολάβηση των καθελικιδινών [58, 59]. Με βάση το πρότυπο έκφρασης, την αναγνώριση του υποστρώματος και τη λειτουργία ορθόλογων πρωτεϊνών, έχουν προταθεί πιθανές λειτουργίες για τις 101

118 υπόλοιπες καλλικρεΐνες. Για παράδειγμα, η KLK4 πιστεύεται ότι εμπλέκεται στην επεξεργασία αδαμαντινογένεσης [60]. Οι KLK6, KLK10 και KLK13 εμπλέκονται στην ενεργοποίηση πολλών προορμονών στις νήσους Langerhans του παγκρέατος, ενώ οι KLK6 και KLK8 παίζουν ρόλο στις διαδικασίες μυελίνωσης και συναπτογένεσης στο κεντρικό νευρικό σύστημα [61]. Κάθε πρωτεΐνη της οικογένειας των ανθρώπινων ιστικών καλλικρεϊνών, εκφράζεται ως μία μονή αλυσίδα με δραστικότητα πρωτεάσης σερίνης, η οποία περιλαμβάνει ένα σήμα οδηγό το οποίο αποκόπτεται από το Ν-τελικό άκρο της πρωτεΐνης πριν από την έκκριση. Η παραγωγή των καλλικρεϊνών, λοιπόν, γίνεται υπό την ανενεργή μορφή προ-προενζύμου (Εικόνα 3.1). Στη συνέχεια, όλα τα καλλικρεϊνικά προένζυμα, εκτός από την KLK4, ενεργοποιούνται μετά από πέψη του καρβοξυτελικού άκρου μίας συγκεκριμένης αργινίνης ή λυσίνης, κάτι που υποδεικνύει ότι στην ενεργοποίηση παίζουν ρόλο ένζυμα με δραστικότητα τρυψίνης [62, 63]. Για μερικά καλλικρεϊνικά πρωτεϊνικά μόρια έχει αποδειχθεί ότι έχουν την ικανότητα να αυτοενεργοποιούνται, δεδομένου ότι είναι ένζυμα ανάλογα τρυψίνης [64, 65]. Οι ώριμες, πια, καλλικρεΐνες περιέχουν μία συντηρημένη καταλυτική τριάδα, η οποία αποτελείται από ένα κατάλοιπο ιστιδίνης, ένα κατάλοιπο ασπαρτικού οξέος και μία σερίνη (H-D-S) (Εικόνα 3.1). Η αναδίπλωση των πρωτεϊνών πιστεύεται πως επιτυγχάνεται, εν μέρει, μέσω πέντε ή έξι δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ καταλοίπων κυστεΐνης [66]. Ως υποομάδα της μεγάλης οικογένειας των σερινοπρωτεασών, οι καλλικρεΐνες υδρολύουν τα υποστρώματα που αποτελούν στόχους τους, μέσω μίας επίθεσης, η οποία κατευθύνεται από τα ενεργά κατάλοιπα σερίνης. Τύποι υποστρωμάτων, που έχουν καταγραφεί, είναι αγγειοενεργά πεπτίδια, αυξητικοί παράγοντες, ορμόνες κ.α. Η πλειονότητα των καλλικρεϊνικών ενζύμων, όπως αναφέρθηκε, παρουσιάζουν ειδικότητα υποστρώματος ανάλογη τρυψίνης, ενώ οι KLK3, KLK7 και KLK9 παρουσιάζουν ειδικότητα υποστρώματος ανάλογη χυμοθρυψίνης. Δοκιμές in vitro υποδεικνύουν ότι τα πρωτεϊνικά μόρια KLK10, ΚLK11 και KLK14 εμφανίζουν διφορούμενη ειδικότητα [67, 68]. 102

119 Λόγω του γεγονότος, ότι οι πρωτεάσες, συνήθως, συντίθενται ως ανενεργά προένζυμα, χρειάζονται περιορισμένη ειδική πρωτεόλυση για να ενεργοποιηθούν. Οι καλλικρεΐνες, ως πρωτεάσες, ενεργοποιούνται, τουλάχιστον εν μέρει ως μέρος πρωτεολυτικών καταρρακτών, με πολλά επι μέρους σηματοδοτικά μονοπάτια. Προς αυτήν την κατεύθυνση δείχνει και το γεγονός της ταυτόχρονης έκφρασης πολλαπλών καλλικρεϊνών σε συγκεκριμένους ιστούς, η ταυτόχρονη επαγωγή ή καταστολή γονιδίων κατά τα διαδοχικά καρκινικά στάδια καθώς και το εύρημα πως ορισμένες καλλικρεϊνικές πρωτεΐνες έχουν τη δυνατότητα να ενεργοποιήσουν άλλες που βρίσκονται υπό τη μορφή προενζύμου. Είναι γνωστό ότι οι καλλικρεΐνες 1, 2 και 12 απελευθερώνουν κινίνες, όπως η βραδυκινίνη και η καλλιδίνη, από το κινινογόνο. Οι κινίνες, με τη σειρά τους, δρουν ως μεσάζοντες μεταφέροντας σήματα έχοντας πολλούς στόχους. Επιπλέον, πρωτείνες που μπορούν να ενεργοποιηθούν από καλλικρείνες στο πλαίσιο ενός πρωτεολυτικού καταρράκτη είναι οι τύποι υποδοχέων που ενεργοποιούνται από πρωτεάσες (protease-activated receptors: PARs), συνδέονται με G- πρωτεΐνες και ενεργοποιούνται μέσω αποκοπής του αμινοτελικού τους άκρου [69] Εξέλιξη της οικογένειας των καλλικρεϊνικών γονιδίων Πληθώρα φυλογενετικών αναλύσεων έχουν εκπονηθεί με επίκεντρο κάθε μία από τις 15 καλλικρεΐνες. Οι κλασικές καλλικρεΐνες (KLK1-KLK3) αποτελούν μια διακριτή μονοφυλετική ομάδα και διαχωρίζονται από τις νεότερες (KLK4-KLK15) [70]. Οι κλασικές καλλικρεΐνες εμφανίζουν βαθμό ομολογίας μεταξύ τους σχεδόν 80%, ενώ μεταξύ όλων ο βαθμός ομολογίας περιορίζεται σε ένα ποσοστό της τάξης του 30-50%. Αναφέρεται ότι ενώ ο πρωτεϊνικός πυρήνας όλων των γνωστών δομικά καλλικρεϊνών είναι κοινός, οι παρατηρούμενες διαφοροποιήσεις που λαμβάνουν χώρα στα εκτεθειμένα πρωτεϊνικά τμήματα είναι εξαιρετικά συντηρημένες. Κάποια συμπεράσματα που θα μπορούσαν, ενδεχομένως, να εξαχθούν, είναι ότι οι νέες καλλικρεΐνες έχουν αποκλίνει εξελικτικά από τον κοινό πρόγονο 65 με 85 εκατομμύρια χρόνια πριν, όταν και χρονολογείται ο διαχωρισμός των τρωκτικών από τα πρωτεύοντα και επίσης ότι είτε οι κλασσικές καλλικρεΐνες 103

120 έχουν αποκλίνει από τις «νέες», είτε οι δυο ομάδες είναι μονοφυλετικές με κοινό εξελικτικό πρόγονο. Τα περισσότερα φυλογενετικά δέντρα συγκλίνουν στο γεγονός ότι οι καλλικρεΐνες μπορούν να διαιρεθούν σε πέντε κύριους κλάδους. Συγκεκριμένα, οι καλλικρεΐνες KLK1, KLK2 και KLK3 ομαδοποιούνται σε έναν κλάδο, οι KLK9, KLK11, KLK15 στον δεύτερο, οι KLK6, KLK13 και KLK14 στον τρίτο, οι KLK8, KLK10 και KLK12 στον τέταρτο και οι KLK4, KLK5 και KLK7 στον πέμπτο. Η γονιδιακή οικογένεια των ανθρώπινων καλλικρεϊνών Οι διαφορετικές αμινοξικές αλληλουχίες που μεταφράζονται από τα διαφορετικά γονίδια που ανήκουν στην οικογένεια των καλλικρεϊνών, εμφανίζουν χαρακτηριστική ομοιότητα, η οποία αντιστοιχεί και σε ομοιότητα στη δομή των γονιδίων [71]. Όλα τα γονίδια της οικογένειας εντοπίζονται στη χρωμοσωματική περιοχή 19q13.4 (Εικόνα 3.1) [72]. Μέσω του Προγράμματος Προσδιορισμού του Ανθρωπίνου Γονιδιώματος (Human Genome Project, HGP) και με εργαλείο όλες τις πρωτοποριακές μεθόδους ανάλυσης αλληλουχιών γενετικού υλικού της βιοπληροφορικής, κατέστη δυνατός ο εντοπισμός του γενετικού τόπου όπου φαίνεται να βρίσκονται τα γονίδια της οικογένειας των ανθρώπινων καλλικρεϊνών. Ο γενετικός τόπος που χαρτογραφήθηκε εντοπίστηκε, όπως αναφέρθηκε, στη χρωμοσωματική περιοχή 19q13.4 και περιέχει 15 γονίδια διευθετημένα στη σειρά σε μία περιοχή περίπου 300 kb, χωρίς παρεμβολή άλλων γονιδίων. Το μήκος των γονιδίων είναι σχετικά μικρό, ποικίλοντας από 4 έως 10 kb [73]. Τα γονίδια που γειτνιάζουν της περιοχής που χαρτογραφούνται τα γονίδια της οικογένειας των καλλικρεϊνων δεν παρουσιάζουν καμία δομική ή λειτουργική σχέση με τις ανθρώπινες καλλικρεΐνες. Το 2003 ταυτοποιήθηκε ένα ψευδογονίδιο, το οποίο φαίνεται να παρεμβάλλεται στις καλλικρεϊνικές γονιδιακές αλληλουχίες [74]. Οι τρεις κλασικές καλλικρεΐνες KLK1, KLK3, και KLK2 εντοπίζονται μαζί εντός μίας περιοχής 60 kb, όπως έχει περιγραφεί από τον Riegman [75], τον Richards [76] και τους συνεργάτες τους. Ένα γονίδιο, το KLK15, εντοπίστηκε αργότερα κατά τη χαρτογράφηση ανάμεσα στα γονίδια KLK1 και KLK2 [77]. 104

121 Τα υπόλοιπα γονίδια των καλλικρεϊνών βρίσκονται τοποθετημένα στη σειρά μετά το πέρας αυτής της περιοχής. Τα γονίδια της οικογένειας των ανθρώπινων καλλικρεϊνών εμφανίζουν 40-80% ομολογία στην πολυνουκλεοτιδική και αμινοξική τους αλληλουχία και μοιράζονται ορισμένες κοινές ιδιότητες, οι οποίες τα χαρακτηρίζουν. Αυτές έχουν ως εξής [78]: 1. Όλα τα γονίδια κωδικοποιούν για πρωτεΐνες με δράση θρυψίνης ή χυμοθρυψίνης 2. Όλα τα γονίδια αποτελούνται από πέντε κωδικά εξώνια 3. Τα εξώνια είναι παρόμοια σε μέγεθος με τα εσώνια 4. Όλα τα γονίδια κωδικοποιούν για ένζυμα με συντηρημένη καταλυτική περιοχή. Πρόκειται, συγκεκριμένα, για μία καταλυτική τριάδα ιστιδίνηςασπαραγινικού οξέος-σερίνης (His-Asp-Ser). Η His βρίσκεται πάντα στο τέλος του δεύτερου εξωνίου, το Asp στη μέση του τρίτου και η Ser στην αρχή του πέμπτου 5. Πολλά από τα γονίδια ρυθμίζονται από τη δράση στεροειδών ορμονών. 105

122 3.2 ΚΑΛΛΙΚΡΕΪΝΕΣ και ΑΝΘΡΩΠΙΝΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ Για μια σειρά παθολογικών καταστάσεων, οι οποίες μπορεί να συσχετίζονται με τον καρκίνο, αλλά και με άλλες ασθένειες, υπεύθυνη ειναι η μη ελεγχόμενη πρωτεόλυση. Η τελευταία είναι πιθανό να οφείλεται σε υπερέκφραση ή υπερενεργοποίηση καλλικρεϊνών. Καλλικρεΐνες και καρκίνος Αρκετές καλλικρεΐνες ενέχονται στη ρύθμιση της ανάπτυξης όγκου, κυρίως μέσω τροποποίησης του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα IGF, αλλά και των πρωτεϊνών που προσδένονται σε αυτόν (IGF Binding Proteins: IGFBPs). Εναλλακτικά, οι καλλικρεΐνες μπορεί να ενεργοποιούν αρκετούς ογκοαυξητικούς παράγοντες TGF (TGFs: Tumor Growth Factors), μέσω των μονοπατιών πρωτεασών σερίνης και υποδοχέων που ενεργοποιούνται από πρωτεάσες σερίνης upa upar και ίσως μέσω μονοπατιών υποδοχέων που ενεργοποιούνται από πρωτεάσες PAR. Πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι πιθανώς υπάρχει μια συνεργατική επίδραση των καλλικρεϊνών στην ανάπτυξη όγκου. Αντιθέτως, ορισμένες καλλικρεΐνες φαίνεται να λειτουργούν ως κατασταλτικοί παράγοντες στην ανάπτυξη όγκου. Η KLK3, για παράδειγμα, φέρεται να καταστέλει την ανάπτυξη όγκου μέσω ενεργοποίησης του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού TGF (TGF: Transforming Growth Factor) στον καρκίνο του προστάτη [79]. Παρά το μοτίβο της συσχετιστικής έκφρασης και τα δεδομένα από κυτταροκαλλιέργειες, οι ανασταλτικές επιδράσεις αυτών των καλλικρεϊνών παραμένουν αμφιλεγόμενες. Οι καλλικρεΐνες ενδέχεται να προωθούν την αγγειογένεση, άμεσα ή έμμεσα, μέσω των μονοπατιών καλλικρεΐνης κινίνης και των μονοπατιών upa/upar. Η ενεργοποίηση του συστήματος καλλικρεΐνης κινίνης έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση ενεργών πεπτιδίων κινίνης. Η ενεργή κινίνη επάγει την αγγειογένεση μέσω ενεργοποίησης των μονοπατιών camp και VEGF και μέσω καταστολής άλλων μονοπατιών. Από την άλλη, αρκετές καλλικρεΐνες, για παράδειγμα η 3, η 6 και η 13, έχουν αποδειχθεί να ειναι αντιαγγειογενετικές. Αυτές φέρονται να αποτρέπουν την αγγειογένεση, κυρίως 106

123 μέσω κλασματοποίησης του πλασμινογόνου σε συστατικά που ομοιάζουν την αγγειοστατίνη [80]. Τα καρκινικά κύτταρα για να δημιουργήσουν μετάσταση θα πρέπει να διεισδύσουν στους γύρω ιστούς και να έχουν πρόσβαση στο κυκλοφορικό σύστημα. H μη σωστά ρυθμισμένη έκφραση των καλλικρεϊνών ή/και η ενεργοποίησή τους ενέχεται σε διάφορα σημαντικά βήματα της διείσδυσης του όγκου. Για παράδειγμα, οι καλλικρεΐνες ενέχονται στην αποδόμηση και ανασύσταση του εξωκυττάριου στρώματος, βήμα αναγκαίο για τη διείσδυση του όγκου. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα θα πρέπει να αλλάξουν μόνιμα από στατικά επιθηλιακά κύτταρα σε μεταναστευτικά μεσεγχυματικά κύτταρα για να μπορέσουν να διεσδύσουν. Σημαντικές ερευνητικές δουλειές στο παρελθόν έδειξαν ότι οι καλλικρεΐνες 3 και 4 ενέχονται στη μετατροπή από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό ιστό, σε προστατικά καρκινικά κύτταρα [81, 82]. Επιπρόσθετα δεδομένα δείχνουν τον ρόλο αρκετών καλλικρεϊνών στη διείσδυση καρκινικών κυττάρων στα οστά, μέσω μιας οστεοβλαστικής διαδικασίας μετάστασης [83]. Καλλικρεΐνες και μη νεοπλασματικές παθολογικές καταστάσεις Οι καλλικρεΐνες ενέχονται σε διάφορες φυσιολογικές διαδικασίες στο ΚΝΣ, και με αυτόν τον τρόπο μπορεί να ενέχονται σε μια σειρά νευροαποδομητικών διαταραχών [84]. Επίπρόσθετα, το προφίλ έκφρασης των καλλικρεϊνών 6, 7 και 10 έχει δειχθεί ότι ειναι τροποποιημένο σε ασθενείς με νευροεκφυλιστικές νόσους, όπως το Alzheimer (AD) [85] και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως διαγνωστικοί δείκτες. Τέλος, η λανθασμένη σηματοδότηση καλλικρεΐνης-κινίνης μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο σε μια σειρά παθολογικών διαδικασιών όπως η φλεγμονή, η υπέρταση, και παθήσεις των νεφρών. Θεραπευτικές εφαρμογές των ανθρώπινων καλλικρεϊνών Όπως τονίσθηκε και παραπάνω στην ανάλυση της φυσιολογικής και παθολογικής λειτουργίας των ανθρώπινων ιστικών καλλικρεϊνών, οι τελευταίες μπορούν να χρησιμεύσουν ως βιοδείκτες. Μέχρι σήμερα στην κλινική πρακτική, το γονίδιο KLK3/PSA είναι αυτό που παρουσιάζει το μεγαλύτερο ενδιαφέρον ως ένας πολύτιμος διαγνωστικός καρκινικός δείκτης για τη 107

124 διάγνωση και την παρακολούθηση του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, με την πρόσφατη ανάπτυξη ευαίσθητων ανοσολογικών μεθόδων, έχει δειχθεί ότι και άλλες καλικρεΐνες μπορούν να χρησιμεύσουν ως επιπρόσθετοι ή εναλλακτικοί προγνωστικοί ή διαγνωστικοί δείκτες. Μελέτες έχουν δείξει ότι πολλές καλλικρεΐνες μπορούν να αποτελέσουν δείκτες για έναν μεγάλο αριθμό καρκινωμάτων, όπως και για πληθώρα μη νεοπλασματικών ασθενειών. Μέχρι στιγμής, 13 μέλη της οικογένειας έχουν μελετηθεί αρκετά, ώστε να έχουν προταθεί για αυτά πιθανοί ρόλοι ως βιοδείκτες [86]. Δεδομένης της ευρύτητας του φάσματος των καλλικρεϊνικών λειτουργιών, αυτή η ενζυμική οικογένεια θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει μία ομάδα πολλά υποσχόμενων νέων στόχων για θεραπευτικές προσεγγίσεις. Για παράδειγμα, με βάση τα δομικά χαρακτηριστικά των μη ειδικών ενδογενών σερπινών, έχουν κατασκευασθεί ειδικοί συνθετικοί αναστολείς της KLK2 και KLK14 [87, 88]. Επιπρόσθετα, η υψηλής ανάλυσης σάρωση γενομικών βιβλιοθηκών και πρωτεϊνικών βάσεων δεδομένων που λαμβάνει χώρα, έχει ως σκοπό την αναγνώριση νέων στοιχείων που συσχετίζονται με την καλλικρεϊνική έκφραση ή λειτουργία. Τέλος, δεδομένης της ιστικής ειδικότητας ορισμένων καλλικρεϊνών, ιδιαίτερα όσον αφορά την KLK3, πολλές εναλλακτικές θεραπευτικές προσεγγίσεις έχουν προταθεί σχετικά με το σημείο στόχο. Για παράδειγμα, τα κυτταροτοξικά φάρμακα τα οποία είναι συζευγμένα με πεπτιδικούς φορείς ειδικούς για την καλλικρεΐνη 3, έχουν σχεδιαστεί ως προφάρμακα για στόχευση του όγκου στον καρκίνο του προστάτη. Επιπλέον, αρκετές κυτταρομειωτικές στρατηγικές γονιδιακής θεραπείας έχουν σχεδιαστεί, ώστε να παρέχουν ένα εξωγενές γονίδιο «αυτοκτονίας» μέσω ειδικών στοιχείων μεταγραφικής ρύθμισης που συνδέεται με το KLK3. Τέλος, έχει προταθεί ένας αριθμός προσεγγίσεων ανοσοτροποποιητικής θεραπείας, κυρίως για την τόνωση της ειδικής στην KLK3 απόκριση των Τ λεμφοκυττάρων, προκειμένου να αυξηθεί η ανοσολογική απόκριση έναντι καρκινικών κυττάρων του προστάτη. 108

125 3.3 ΟΙ ΚΑΛΛΙΚΡΕΪΝΕΣ ΕΙΔΙΚΑ Το γονίδιο KLK1, το οποίο κωδικοποιεί για την παγκρεατική/νεφρική καλλικρεΐνη (KLK1), ήταν ένα από τα πρώτα καλλικρεϊνικά γονίδια που ανακαλύφθηκαν, μαζί με τα γονίδια KLK2 και KLK3, κατά τη δεκαετία του Η ανθρώπινη ιστική καλλικρεΐνη KLK1 και η πρωτεολυτική της λειτουργία ανακαλύφθηκαν τη δεκαετία του Ο φυσιολογικός ρόλος της KLK1 περιλαμβάνει μια ποικιλία από λειτουργίες που κυμαίνονται από τη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης και της μυοσύσπασης έως την επεξεργασία των αυξητικών παραγόντων. Η καλλικρεΐνη 2 είναι μία πεπτιδάση, η οποία αποτελεί προϊόν του ανθρώπινου γονιδίου KLK2. Πρόκειται για μια πρωτεάση, η οποία είναι κατά το 80% αλληλουχικά ομόλογη με το ειδικό προστατικό αντιγόνο PSA, δηλαδή την KLK3 [89]. Η KLK2 συμβάλλει στην κανονική φυσιολογία του προστάτη από την υδρόλυση των πρωτεϊνών σεμινογελίνη Ι και ΙΙ και φιμπρονεκτίνη της σπερματοδόχου κύστης. Αυτό οδηγεί στην φυσιολογικά ενισχυμένη κινητικότητα του σπέρματος. Εντούτοις, η KLΚ2 διαδραματίζει, επίσης, σημαντικό ρόλο σε παθολογικές καταστάσεις του αδένα, καθώς μπορεί να ενεργοποιήσει τον ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης u- PA, μία πρωτεάση, που σχετίζεται ισχυρά με τον μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Η KLK2 είναι ο δεύτερος πιο καθιερωμένος καλλικρεϊνικός βιοδείκτης του καρκίνου του προστάτη. Τα αυξημένα επίπεδα KLK2 και το χαμηλό ποσοστό του λόγου ελεύθερου PSA προς ολικό PSA (fpsa/tpsa) σχετίζονται με ταχέως αναπτυσσόμενες κακοήθειες του προστάτη και μπορoύν, επίσης, να προβλέψουν βιοχημική υποτροπή μετά την τοπική θεραπεία, η οποία αποτελεί αδιαμφισβήτητη ένδειξη υποτροπής του καρκίνου του προστάτη [90, 91]. Ο όρος βιοχημική υποτροπή ορίζεται ως αύξηση των επιπέδων PSA στο αίμα των ασθενών με καρκίνο του προστάτη μετά από χειρουργική επέμβαση ή θεραπεία με ακτινοβολία, γεγονός που υποδηλώνει κακή πρόγνωση. Πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση απέδειξε ότι η χρήση του λόγου KLK2 προς ελεύθερο PSA (KLK2/fPSA) θα μπορούσε να αυξήσει την ειδικότητα στη διάκριση περιπτώσεων καρκίνου του προστάτη από τις περιπτώσεις 109

126 καλοήθους υπερτροφίας του προστάτη σε άτομα που ανήκουν σε γκρίζα ζώνη PSA (4-10 ng /ml) [92]. Συνεπώς, η εκτίμηση των επιπέδων KLK2 σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη μπορεί να αποδειχθεί ένα πολύτιμο εργαλείο για τη μελλοντική κλινική πρακτική, το οποίο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των κλινικών ερευνών και για την επιλογή κατάλληλης θεραπευτικής προσέγγισης. Ωστόσο, η προσέγγιση αυτή χρησιμοποιείται κυρίως σε ερευνητικό επίπεδο, ενώ η καλλικρεΐνη 3 (KLK3/PSA), παραμένει η μόνη εγκεκριμένη καλλικρεΐνη για χρήση στην κλινική πρακτική, ως βιοδείκτης του καρκίνου του προστάτη. Το γονίδιο KLK3 κωδικοποιεί για το ευρέως αναγνωρίσιμο ειδικό προστατικό αντιγόνο PSA, που είναι ο πλέον αποδεκτός και ευρέως χρησιμοποιούμενος βιοδείκτης του καρκίνου του προστάτη. Οι μετρήσεις ελέυθερου και συνολικού PSA στον ορό, όπως αναφέρθηκε, χρησιμοποιούνται τόσο στη βιοψία και στη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη, όσο και στην παρακολούθηση και πρόγνωση των πιθανών υποτροπών της νόσου [93, 94]. Το PSA, όπως και η KLK2, σχετίζεται με την υγροποίηση του σπέρματος στον φυσιολογικό προστάτη, πρωτεολύοντας τη σεμινογελίνη Ι και ΙΙ, τη φιμπρονεκτίνη και τη λαμινίνη. Ωστόσο, η λειτουργία του PSA μπορεί, επιπρόσθετα, να προκαλέσει ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων στον προστάτη και να προωθήσει τη μετάσταση, μέσω της ενεργοποίησης ή/και της διάσπασης ενός ευρέους φάσματος υποστρωμάτων. Το KLK3 είναι ένα γονίδιο που υπόκειται σε χαρακτηριστική ρύθμιση από στεροειδείς ορμόνες και εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά στον αδένα του προστάτη. Εκφράζεται επίσης σε πλειάδα ιστών στις γυναίκες, ιδιαίτερα σε εκείνους που ρυθμίζονται από στεροειδείς ορμόνες. Μία από τις πρώτες αναφορές, σχετικά με τις καλλικρεΐνες, σε περιπτώσεις καρκίνου πλην του καρκίνου του προστάτη, σχετιζόταν με τη μέτρηση των επιπέδων KLK3 σε ιστικά δείγματα καρκίνου του μαστού. Τοσυγκεκριμένο εύρημα αποκάλυψε ότι το PSA θα μπορούσε να θεωρηθεί ως ένας ανεξάρτητος, εύχρηστος προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του μαστού. Γυναίκες με θετικούς σε PSA όγκους στο μαστό χαίρουν μεγαλύτερης πιθανότητας για μακρά 110

127 ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) και συνολικότερο χρόνο επιβίωσης (OS) απ ότι εκείνες των οποίων οι κακοήθεις ιστοί ήταν αρνητικοί σε PSA [95]. Το γονίδιο KLK4 (αλλιώς γνωστό ως KLK-L1), που κωδικοποιεί για μία επιπλέον ανδρογονο-ρυθμιζόμενη πρωτεάση, ταυτοποιήθηκε το Η έκφραση του περιορίζεται στον αυλό και το βασικό επιθήλιο του προστάτη, όπου διασπά το προ-psa και προκαλεί υγροποίηση του σπέρματος [96]. Πολλές αναφορές δείχνουν ότι το KLK4 υπερεκφράζεται σημαντικά στον καρκίνο του προστάτη, σε σύγκριση με την έκφρασή του στο καλόηθες επιθήλιό του [97]. Πιστεύεται, ότι η πρωτεάση KLK4 δεν εμπλέκεται άμεσα μόνο στη διάδοση και στην ανάπτυξη των όγκων των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [81], αλλά και στη μεταστατική ανάπτυξή τους στα οστά [98]. Τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του mrna του KLK4 συσχετίζονται με πιο επιθετικές μορφές καρκίνου του προστάτη [99] και του παχέος εντέρου [100]. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη με ασθενείς με καρκίνο του μαστού, η οποία πραγματοποιήθηκε το 2009, ανέφερε ότι τα επίπεδα του KLK4 mrna συσχετίσθηκαν με προχωρημένο βαθμό και πιο επιθετική συμπεριφορά του όγκου, καθώς και με μειωμένη χρώση των υποδοχέων της προγεστερόνης και κακή πρόγνωση [101]. Το ίδιο μοτίβο έκφρασης του mrna είχε επίσης παρατηρηθεί σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών [102]. Το γονίδιο KLK5 και η αντίστοιχη πρωτεΐνη KLK5, εναλλακτικά ονομαζόμενη KLK-L2, εκφράζεται σε ιδιαίτερα υψηλά επίπεδα, τόσο όσο αφορά το mrna όσο και την πρωτεΐνη, στο δέρμα, στον μαστό, στις ωοθήκες, στους όρχεις και στους σιελογόνους αδένες. Η KLK5 προτείνεται πως, μαζί με άλλες πρωτεάσες, έχει την ικανότητα να αποδομεί μεσοκυττάριες δομές, όπως τα δεσμοσωμάτια, να μειώνει την κυτταρική συνοχή και να διευκολύνει την απολέπιση κατά τα τελικά στάδια του επιδερμικού κύκλου, όπως και την κερατινοποίηση. Επιπροσθέτως, η KLK5 είναι σε θέση να διασπά μόρια του εξωκυττάριου στρώματος (κολλαγόνο I-IV, φιμπρονεκτίνη και λαμινίνη) και μόρια κυτταρικής συνοχής (ινωδογόνο και βιτρονεκτίνη). Κατά συνέπεια, το ένζυμο αυτό μπορεί να συμβάλει στην εισβολή του καρκίνου, τη μετάσταση και την αγγειογένεση [103]. Το 2002, μελέτη με ιστικά δείγματα καρκίνου του μαστού, έπειτα από ποσοτικοποίηση των επιπέδων mrna του KLK5, έδειξε μέσω μονοπαραγοντικής και πολυπαραγοντικής ανάλυσης ό τι η αυξημένη έκφραση του KLK5 συσχετίζεται με μικρό διάστημα ελευθέρας νόσου (DFS) 111

128 και ολικής επιβίωσης (OS) [104]. Το 2009, μια ανεξάρτητη μελέτη επιβεβαίωσε ότι η έκφραση του KLK5 κυμαίνεται σε υψηλότερα του φυσιολογικού επίπεδα σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού, αρνητικές για τον υποδοχέα οιστρογόνων (ER). Εντούτοις, η ίδια μελέτη ανέφερε ότι το γονίδιο υποεκφράζεται σε μεταστατικούς όγκους του μαστού. Επιπλέον, δεν αναφέρθηκε συσχέτιση μεταξύ του καθεστώτος έκφρασης της KLK5 και της κλινικής έκβασης των ασθενών [105]. Υψηλά επίπεδα mrna του γονιδίου KLK5 βρέθηκε, αντιθέτως, να συσχετίζονται σημαντικά με πιο προχωρημένες μορφές επιθηλιακών κακοηθειών στις ωοθήκες [106]. Από την άλλη, ανεξάρτητες μελέτες πάνω στον καρκίνο του προστάτη, απέδειξαν ότι υψηλότερα επίπεδα mrna του KLK5 ανιχνεύονται συχνότερα σε ασθενείς με όγκους λιγότερο προχωρημένου σταδίου [107, 108]. Ευνοϊκή πρόγνωση δίνει το ιστικό μοτίβο έκφρασης της ΚLK5 στην περίπτωση του καρκίνου των όρχεων [109], ενώ δυσμενή πρόγνωση δίνει στον καρκίνο του παχέος εντέρου [110]. Η καλλικρεϊνική πεπτιδάση KLK6 ανακαλύφθηκε κατά τη διάρκεια προσπαθειών ανίχνευσης και ταυτοποίησης σερινοπρωτεασών με ασυνήθιστα υψηλά επίπεδα έκφρασης σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών [111]. Η σημαντική συσχέτιση της υψηλής συγκέντρωσης της KLK6 με ωοθηκικούς όγκους επιθετικού φαινότυπου και κακή κλινική έκβαση έχει επιβεβαιωθεί σε μια σειρά από πειραματικές εργασίες με χρήση δειγμάτων ορού και ιστού [112, 113]. Επιπρόσθετα, η KLK6 διαθέτει προγνωστική σημασία, τόσο για τον καρκίνο του παχέος εντέρου [114], όσο και για τον γαστρικό καρκίνο [115]. Σε αυτές τις περιπτώσεις καρκίνου, τα υψηλά επίπεδα mrna έχουν συσχετιστεί με την διήθηση του όγκου, τη μετάσταση και, γενικότερα, τα προχωρημένα καρκινικά στάδια. Πρόσφατα ερευνητικά δεδομένα έχουν συσχετίσει την KLK6 με την εξαρτώμενη από τo ογκογονίδιο KRAS μετανάστευση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου [116]. Τα μοτίβα έκφρασης της KLK6 θα μπορούσαν να αποτελέσουν δυσμενείς προγνωστικούς βιοδείκτες και στις περιπτώσεις του μημικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα [117], του ορώδους θηλώδους καρκίνου της μήτρας [118], του πορογενούς αδενοκαρκινώματος του παγκρέατος [119] και του νεφροκυτταρικού καρκινώματος [120]. Μελέτες που ακολούθησαν, υπέδειξαν σημαντικούς φυσιολογικούς ρόλους της πρωτεΐνης 112

129 στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ), και συσχέτισαν την καταστολή της έκφρασης του γονιδίου με νευροεκφυλιστικές παθήσεις, όπως η νόσος Parkinson [121] και η νόσος Alzheimer [122]. Επίσης, πολύ ενδιαφέρουσες είναι ερευνητικές δουλειές που ενέπλεξαν την KLK6 με την πρωτεόλυση της μυελίνης, και συνεπώς, με νόσους, όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας [123]. Σήμερα γνωρίζουμε, ότι η καλλικρεΐνη 6 είναι ένα ένζυμο τύπου θρυψίνης που μπορεί να διασπά με υδρόλυση λαμινίνη, φιμπρονεκτίνη, κολλαγόνο Ι-IV, καθώς και άλλα βασικά συστατικά του εξωκυττάριου στρώματος και της βασικής μεμβράνης, in vitro. Επίσης, πιστεύεται πως διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προώθηση της αποκόλλησης των E-καδερινών, ενθαρρύνοντας, έτσι, τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και τη μετάσταση [124]. Εντούτοις, στην περίπτωση του καρκίνου του μαστού, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η KLK6 συμμετέχει στην αναστολή της καρκινικής διήθησης από το επιθήλιο στο μεσέγχυμα και συγκρατεί τη διαδικασία εξέλιξης των όγκων [125]. Το γονίδιο KLK7, είναι ένα από τα λίγα μέλη της οικογένειας των καλλικρεϊνών με σαφώς καθορισμένη φυσιολογική λειτουργία. Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί για το χυμοτρυπτικό ένζυμο της ανθρώπινης κεράτινης στιβάδας HSCCE (Human Stratum Corneum Chymotryptic Enzyme) [126], το οποίο παράγεται από τα κερατινοκύτταρα της επιδερμίδας. Εκεί διαδραματίζει σημαντικό ρόλο, μαζί με άλλα μέλη της οικογένειας των καλλικρεϊνικών γονιδίων, στην απολέπιση της κεράτινης στοιβάδας και στην διαδικασία κυτταρικής απόπτωσης στην επιφάνεια του δέρματος [127]. Εκτός από το δέρμα, η καλλικρεΐνη 7 εντοπίζεται στο ΚΝΣ, στα νεφρά, στον μαστικό αδένα, στον θύμο αδένα και στους σιελογόνους αδένες. Υψηλά επίπεδα του mrna του KLK7 έχουν σε αρκετές περιπτώσεις συνδεθεί με μικρότερη χρονική περίοδο επιβίωσης ασθενών με καρκίνο του μαστού [128]. Επιπλέον, η υπερέκφραση του KLK7 σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, έχει συσχετισθεί σημαντικά με όγκους προχωρημένου σταδίου [129]. Στον καρκίνο του παγκρέατος παρατηρείται ενισχυμένη δραστηριότητα πρωτεάσης της KLK7 [130], το γονίδιο KLK7 εκφράζεται συχνότερα σε υψηλά επίπεδα σε πλακώδη κύτταρα του καρκίνου του τραχήλου [131] και, τέλος, το 2009 υψηλά επίπεδα mrna του γονιδίου συνδέθηκαν με περισσότερο επιθετικούς όγκους στον καρκίνο του παχέος εντέρου [132]. 113

130 Το γονίδιο KLK8 κλωνοποιήθηκε το 1998 και βρέθηκε να εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στον ανθρώπινο εγκέφαλο και το δέρμα [133]. Η ανάλυση της έκφρασης του mrna του KLK8 σε ωοθηκικά καρκινώματα δείχνει ότι οι κλασικές ισομορφές του mrna σχετίζονται με διαφορετικά στάδια του όγκου και ότι, επίσης, υψηλά επίπεδα έκφρασης συνδέονται με χαμηλότερη πιθανότητα εμφάνισης της νόσου [134]. Η αξιολόγηση της KLK8 ως ευνοϊκού προγνωστικού δείκτη στον καρκίνο των ωοθηκών έχει επιβεβαιωθεί με εκτίμηση των επιπέδων πρωτεΐνης σε ιστικά δείγματα των όγκων αυτών, όπως και σε δείγματα ορού, με εφαρμογή μεθόδων, όπως η in situ ανάλυση της πρωτεΐνης, η ανοσοϊστοχημεία και η ELISA [135]. Τα επίπεδα του mrna του γονιδίου, επίσης, συνδέονται με την ευνοϊκή κλινική έκβαση σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Ο φαινομενικά ευνοϊκός χαρακτήρας του προγνωστικού χαρακτήρα της KLK8 στις προαναφερθείσες κακοήθειες μπορεί να εξηγηθεί, εν μέρει, από το γεγονός ότι η υπερέκφραση του γονιδίου αυτού σε καρκινικά κύτταρα μειώνει την ικανότητα εισβολής των κυττάρων αυτών, καθώς εμποδίζει τη δέσμευση της φιμπρονεκτίνης στην ιντεγκρίνη [136]. Η καλλικρεϊνική πεπτιδάση 9, ανήκει στα προσφάτως κλωνοποιημένα μέλη της οικογένειας [137]. Η KLK9 εκφράζεται κυρίως στο δέρμα, στους μαστούς, στο πάγκρεας και στο κεντρικό νευρικό σύστημα [138]. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης του mrna του KLK9, το 2003, αποκάλυψε ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης σχετίζονται με όγκους πρώτων σταδίων στον μαστό, καθώς και με μεγάλη περίοδο επιβίωσης των ασθενών, θέτοντας, έτσι, τις βάσεις για την αναγνώριση της KLK9 ως ενός ακόμα πολύτιμου προγνωστικού παράγοντα για τον καρκίνο του μαστού [139]. Ίδια συμπεράσματα μπορούν να εξαχθούν για την περίπτωση του καρκίνου των ωοθηκών [140]. Το γονίδιο KLK10, κλωνοποιήθηκε, αρχικά, το 1996 ως ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, το οποίο είχε υποστεί απώλεια έκφρασης σε περιπτώσεις καρκίνου του μαστού [55]. Οι μηχανισμοί που υπόκεινται στην ογκοκατασταλτική λειτουργία της KLK10 και των φυσιολογικών του υποστρωμάτων δεν έχουν ακόμη, πλήρως, περιγραφεί. Η ανάλυση της έκφρασης του mrna του KLK10, με υβριδισμό in situ σε ιστούς μαστού έδειξε ότι, ενώ όλα τα φυσιολογικά δείγματα βρέθηκαν θετικά στην έκφραση της 114

131 KLK10, στην πλειοψηφία των καρκινωμάτων παρατηρήθηκε πλήρης έλλειψη έκφρασης του γονιδίου KLK10 [141]. Αυτή η απώλεια έκφρασης πιστεύεται ότι οφείλεται σε μεθυλίωση στο τρίτο εξώνιο του γονιδίου. Η αποσιώπηση του γονιδίου KLK10, λόγω της μεθυλίωσης του τρίτου εξωνίου του, φαίνεται πως απενεργοποιεί τις ογκοκατασταλτικές του ιδιότητες και μπορεί να συμβάλει στην εμφάνιση μειωμένου προσδόκιμου ζωής [142]. Άλλες μελέτες έχουν δείξει τη συσχέτιση των υψηλών πρωτεϊνικών επιπέδων της KLK10 στον ορό ασθενών με πιο επιθετικά στάδια καρκίνου των ωοθηκών και με μικρότερη προσδοκόμενη περίοδο επιβίωσης. Η δυσμενής προγνωστική ικανότητα της KLK10 μπορεί, επίσης, να αφορά τις περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου και του γαστρικού καρκίνου, όπου τα αυξημένα επίπεδα mrna συνδέονται με την εισβολή του όγκου και τα προχωρημένα κλινικά στάδια αυτών των ασθενειών [143]. Υπάρχει σήμερα η άποψη, ότι η KLK10 θα μπορούσε να αποτελέσει ως ένας νέος προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, κάτι που, ωστόσο, χρήζει περαιτέρω έρευνας. Το γονίδιο KLK11, έχει αναφερθεί να εκφράζεται σε πολλούς ανθρώπινους ιστούς, συμπεριλαμβανομένου του δέρματος, του στομάχου, του προστάτη και των ωοθηκών [144]. Στοιχεία υπάρχουν και για τον ρόλο του KLK11 στον καρκίνο του προστάτη, όπου τα χαμηλότερα επίπεδα του mrna του γονιδίου σχετίζονται με όγκους προχωρημένου σταδίου και λιγότερο διαφοροποιημένες κακοήθειες, αποκαλύπτοντας τον ευνοϊκό προγνωστικό ρόλο του γονιδίου στον καρκίνο του προστάτη. Αντίθετα, τα επίπεδα της πρωτεΐνης KLK11 σε καρκίνωμα του ορθού, βρέθηκαν να συνδέονται ισχυρά με επιθετικούς όγκους και με μειωμένο προσδόκιμο επιβίωσης για τους ασθενείς. Το γονίδιο KLK12 εκφράζεται σε μια ποικιλία ιστών, συμπεριλαμβανομένου των σιελογόνων αδένων, του στομάχου, της μήτρας, των πνευμόνων, του θύμου αδένα, του προστάτη, του παχέος εντέρου, του εγκεφάλου, του μαστού, του θυρεοειδούς και της τραχείας [145]. Τα επίπεδα πρωτεΐνης KLK12 εμφανίζονται μειωμένα σε ασθενείς που πάσχουν από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, σε σύγκριση με τη φυσιολογικά ιστικά δείγματα [146]. Εντούτοις, η προγνωστική ικανότητα του εν λόγω μέλους της οικογένειας των καλλικρεϊνών δεν έχει ακόμη διερευνηθεί σε οποιουδήποτε τύπου κακοήθεια. 115

132 Το γονίδιο KLK13 (εναλλακτικά KLK-L4), είναι ένα προσφάτως αναγνωρισμένο μέλος της οικογένειας γονιδίων των ανθρώπινων καλλικρεϊνών [147]. Η υπερέκφραση του mrna του γονιδίου σε ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του μαστού σχετίζεται με στατιστικά σημαντική αύξηση του προσδόκιμου επιβίωσης. Το ευνοϊκό αποτέλεσμα που προμηνύει η έκφραση του θα μπορούσε να δικαιολογηθεί από ερευνητικά δεδομένα, τα οποία υποδεικνύουν ότι η καλλικρεΐνη 13 θα μπορούσε να διασπά ειδικά το ανθρώπινο πλασμινογόνο προς θραύσματα που προσομοιάζουν τη δράση της αγγειοστατίνης και έτσι να προωθεί αντιαγγειογενετική δράση [148]. Όσον αφορά τον καρκίνο των ωοθηκών, οι ασθενείς που είναι θετικές στην KLK13 είναι πιο πιθανό να βρίσκονται σε πρώιμο στάδιο της νόσου και υψηλότερο προσδόκιμο επιβίωσης. Τα δεδομένα αυτά εισάγουν την προγνωστική χρησιμότητα της ιστικής KLK13 ως ανεξάρτητο δείκτη ευνοϊκής πρόγνωσης σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Η πρόταση αυτή ενισχύεται περαιτέρω από το γεγονός ότι KLK13 βρίσκεται να κατέχει μια σημαντική προγνωστική αξία για τη θετική ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία (μεγαλύτερη από οποιαδήποτε άλλη κλινική μεταβλητή που χρησιμοποιείται σε πολυπαραγοντική ανάλυση) [149]. Σε αντίθεση με τα προηγούμενα, μια πρόσφατη μελέτη αναφέρει ότι ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και αυξημένα επίπεδα mrna του KLK13 έχουν περισσότερες πιθανότητες να παρουσιάσουν υποτροπή της νόσου. Επιπρόσθετα στα προαναφερθέντα στοιχεία, έχει αποδειχθεί ότι η KLK13 μπορεί να διασπάσει στοιχεία του εξωκυττάριου στρώματος, δηλαδή το κολλαγόνο Ι-ΙΙΙ, τη φιμπρονεκτίνη και τη λαμινίνη, και θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στη μετάσταση των όγκων των ωοθηκών [150]. Η δυσμενής προγνωστική ικανότητα του KLK13 είναι σαφής στον καρκίνο του πνεύμονα. Επιπλέον, οι ασθενείς με υψηλά επίπεδα έκφρασης του KLK13 σε πρωτεϊνικό επίπεδο χαρακτηρίζονται από βραχύτερο προσδόκιμο επιβίωσης [151]. Η μέχρι πρότινως γνωστή ως KLK-L6, KLK14 είναι ένα από τα νεότερα μέλη της οικογένειας των καλλικρεϊνών και εκφράζεται κυρίως στο αδενικό επιθήλιο του μαστού και του προστάτη και στην επιδερμίδα του δέρματος, όπου, μαζί με άλλες καλλικρεΐνες, πιστεύεται ότι διαδραματίζει καίριο ρόλο στην απολέπιση του δέρματος [152]. Πιστεύεται ότι η KLK14 υλοποιεί τις φυσιολογικές της λειτουργίες μέσω της διάσπασης συστατικών του 116

133 εξωκυττάριου στρώματος [153]. Η KLK14 έχει αναγνωριστεί ως ανεξάρτητος δείκτης δυσμενούς πρόγνωσης του καρκίνου του μαστού λόγω του γεγονότος ότι οι ασθενείς με όγκους του μαστού θετικούς σε mrna του γονιδίου είναι πιο πιθανό να βρίσκονται σε προχωρημένο στάδιο της νόσου και παρουσιάζουν αυξημένο κίνδυνο υποτροπής και θανάτου [154]. Επιπλέον, το KLK14 υπερεκφράζεται και στον καρκίνο του προστάτη [155]. Μια άλλη κακοήθεια όπου η KLK14 φαίνεται να αποκτά δυσμενή προγνωστική αξία είναι ο καρκίνος του πνεύμονα. Όσον αφορά τα επίπεδα έκφρασης του KLK14, αυτά φαίνεται να σχετίζονται με το μέγεθος του όγκου. Ο συχνά αναφερόμενος δυσμενής προγνωστικός χαρακτήρας της KLK14, σε πολλές διαφορετικές κακοήθειες του ανθρώπου, θα μπορούσε να τεκμηριωθεί από το γεγονός ότι η KLK14, μέσω της δραστηριότητάς της ως πρωτεάση σερίνης, είναι σε θέση να διασπάσει συστατικά του εξωκυττάριου στρώματος in vitro, τα οποία μπορούν να προωθήσουν την εισβολή των κυττάρων του όγκου και των μεταστάσεων in vivo. Το KLK15 ανακαλύφθηκε και κλωνοποιήθηκε πιο πρόσφατα από όλα τα μέλη της οικογένειας καλλικρεϊνικών γονιδίων [77]. Αυτό εξηγεί γιατί ονομάστηκε καλλικρείνη 15, παρά το γεγονός ότι χαρτογραφείται μεταξύ των γονιδίων KLK1 και KLK3/PSA. Τα επίπεδα του mrna του γονιδίου αυτού έχουν αναφερθεί να είναι υψηλά σε καρκινικές περιοχές του αδένα του προστάτη, σε σύγκριση με τις αντίστοιχες μη καρκινικές περιοχές. Επιπλέον, αυτή η υπερέκφραση φαίνεται να σχετίζεται με όγκους όψιμων σταδίων στον προστάτη (pt3/t4), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα επίπεδα έκφρασης είναι δείκτης δυσμενούς πρόγνωσης της νόσου [156]. Ο πιθανός φυσιολογικός ρόλος που έχει αποδοθεί στο γονίδιο είναι η ενεργοποίηση μέσω διάσπασης του προ-psa. Έτσι, έχει προταθεί ότι η KLK15 λαμβάνει μέρος σε πρωτεολυτικούς καταράκτες που συμμετέχει το PSA, οι οποίοι ρυθμίζουν την υγροποίηση του σπέρματος στον φυσιολογικό αδένα του προστάτη. Εντούτοις, η υπερέκφραση του KLK15 σε κακοήθεις όγκους του αδένα θα μπορούσε να σημαίνει υπερενεργοποίηση του PSA, κάτι που με τη σειρά του μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της φυσιολογικής ιστικής αρχιτεκτονικής του προστάτη, σε χάλαση της δομής του εξωκυττάριου στρώματος, σε εισβολή του όγκου και μετάσταση [157]. Το mrna του γονιδίου ανιχνεύεται συχνότερα σε υψηλά επίπεδα σε δείγματα καρκίνου των ωοθηκών σε σύγκριση με τα 117

134 φυσιολογικά ωοθηκικά δείγματα. Το KLK15 θα μπορούσε να αποτελέσει έναν ανεξάρτητο δείκτη δυσμενούς πρόγνωσης στον καρκίνο των ωοθηκών [158]. Αντίθετα, και ομοίως με το KLK3, η έκφραση του KLK15 φαίνεται να αποτελεί ανεξάρτητο βιοδείκτη ευνοϊκής πρόγνωσης στον καρκίνο του μαστού [159]. 118

135 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 119

136 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 - ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1.1 ΣΚΟΠΟΣ Η πρώιμη διάγνωση του καρκίνου του στομάχου -όπως όλων των κακοήθων νεοπλασιών- έχει ως γνωστόν τη μεγαλύτερη σημασία για την εξέλιξη της νόσου και άρα για την πρόγνωση της/του ασθενούς. Η όσο γίνεται αμεσότερη χειρουργική αντιμετώπιση μπορεί να οδηγήσει σε μακρά επιβίωση ή ακόμα και στην ίαση, στην περίπτωση του πρώιμου γαστρικού καρκίνου. Η διαγνωστική διαδικασία ξεκινά με ενδοσκοπικό έλεγχο που γίνεται είτε βάσει κλινικής συμπτωματολογίας, είτε στο πλαίσιο ελέγχου του πληθυσμού (screening test) ή ατόμων με υψηλό κίνδυνο για ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου. Ακολούθως, η διάγνωση τίθεται με την ιστολογική εξέταση των βιοψιών που έχουν ληφθεί κατά την ενδοσκόπηση. Μέχρι σήμερα δεν έχει τεκμηριωθεί κάποια απλούστερη εξέταση που να χρησιμοποιηθεί ως screening test και να μπορεί να θέσει τη διάγνωση ή έστω να θέσει την υποψία για την ύπαρξη της νόσου, ώστε να ακολουθήσει περεταίρω έλεγχος με τη γαστροσκόπηση και βιοψίες. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι η μέτρηση του PSA στον καρκίνο του προστάτη. Ο έλεγχος του πληθυσμού με γαστροσκόπηση είναι και δαπανηρός, αλλά και η ίδια η εξέταση δεν είναι απλή όσο μία αιμοληψία. Ως εκ τούτου, ο ασθενής θα οδηγηθεί να υποβληθεί σε αυτήν, όταν θα αναπτύξει κάποια συμπτωματολογία. Γαστροσκόπηση ως screening test εφαρμόζεται μόνο σε ορισμένες χώρες όπου υπάρχει υψηλή επίπτωση της νόσου (πχ Ιαπωνία), οπότε η σχέση κόστους/οφέλους είναι υπέρ του δεύτερου. Υπάρχει λοιπόν η ανάγκη ανεύρεσης ενός βιολογικού δείκτη με βάση την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης στον γαστρικό καρκίνο, που να μπορεί να εφαρμοστεί στην κλινική πράξη. Προκειμένου η μέτρηση ενός δείκτη να είναι κλινικά εφαρμόσιμη, θα πρέπει να μην είναι δαπανηρή και να έχει επαναληψιμότητα. Η παράμετρος αυτή θα πρέπει να μπορεί είτε μόνη της, είτε σε συνδυασμό με άλλα στοιχεία (κλινικά / εργαστηριακά), να θέτει την υποψία ύπαρξης της νόσου, ή ιδανικότερα την ίδια τη διάγνωση. Η διαδικασία της κακοήθους εξαλλαγής στο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου έχει μελετηθεί μέχρι σήμερα σε μεγάλο βαθμό και έχουν βρεθεί διάφορα γονίδια που εμπλέκονται σ αυτήν (c-met, k-sam, c-erbb2, p53, APC, HER2/NEU, CDH1 120

137 KLK6, KLK10 και άλλα), ορισμένα από αυτά με αποδεδειγμένη κλινική σημασία. Οι μέχρι σήμερα μελέτες δεν έχουν καταλήξει στην εφαρμογή μιας γονιδιακής έκφρασης ή ενός πρωτεϊνικού παραγώγου γονιδίου που να μπορέσουν να αποτελέσουν δείκτη πρώιμης διάγνωσης ή/και προγνωστικής αξίας στο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου, αλλά η έρευνα συνεχίζεται προς αυτήν την κατεύθυνση. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της mrna έκφρασης της κλασσικής μορφής του γονιδίου KLK13 με συμβατική και ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο, σε υγιείς και καρκινικούς ιστούς ασθενών με διαγνωσθέν αδενοκαρκίνωμα στομάχου. Το συγκεκριμένο γονίδιο είναι μέλος της οικογένειας των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις σχετιζόμενες με τις καλλικρεΐνες πεπτιδάσες. Αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων της οικογένειας αυτής, έχουν βρεθεί ότι συμβαίνουν σε διάφορους τύπους καρκίνων. Ως εκ τούτου, μπορούν να έχουν ρόλο στη διάγνωση και πρόγνωση του καρκίνου και μπορούν να αποτελέσουν βιολογικούς δείκτες με πιθανή κλινική εφαρμογή μελλοντικά. Η συμμετοχή του KLK13 γονιδίου έχει ήδη αποδειχθεί στους καρκίνους του μαστού, των ωοθηκών και των όρχεων. Στο πλαίσιο αυτό, μελετήθηκε η έκφρασή του στο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου και έγινε συσχέτιση τόσο με τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών όσο και με τα παθολογοανατομικά στοιχεία των όγκων, προκειμένου να διερευνηθεί η προγνωστική του σημασία στον τύπο αυτό του καρκίνου. Σύμφωνα με αναδρομή που έγινε στη βιβλιογραφία, δεν έχει μελετηθεί μέχρι σήμερα η έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου στο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου. 121

138 1.2 ΑΣΘΕΝΕΙΣ Υλικό της ερευνητικής μελέτης απετέλεσαν 95 συνολικά ιστολογικά δείγματα, 52 καρκινικού και 43 φυσιολογικού ιστού. Τα συγκεκριμένα δείγματα συλέχθηκαν από ασθενείς που νοσηλεύτηκαν στη Δ Χειρουργική Κλινική του Πανεπιστημίου Αθηνών στο ΠΓΝ ΑΤΤΙΚΟΝ, από το 2000 έως τον Ιανουάριο του 2009, λόγω ιστολογικά διαπιστωμένου αδενοκαρκινώματος του στομάχου, για το οποίο και υπεβλήθησαν σε χειρουργική επέμβαση. Συνολικά, κατά τα 9 έτη που αναφέρθηκαν, 116 ασθενείς νοσηλεύτηκαν και χειρουργήθηκαν στην Κλινική για διαγνωσθέν Ca στομάχου. Ιστικά δείγματα ελήφθησαν από 56 ασθενείς, 38 άνδρες και 18 γυναίκες, με μέση τιμή ηλικίας τα 64.9 έτη (εύρος έτη) (Πίνακας 1.1). Η επιλογή ασθενών προκειμένου να εισαχθούν στη μελέτη, γινόταν βάσει των εξής κριτιρίων: α) ιστολογικά επιβεβαιωμένη διάγνωση γαστρικού αδενοκαρκινώματος β) το αδενοκαρκίνωμα να είναι σε μη χειρουργημένο στόμαχο και όχι σε γαστρικό κολόβωμα συνεπεία προηγηθείσας επέμβασης γ) το μέγεθος του όγκου έπρεπε να είναι μεγαλύτερο του ενός εκατοστού, ώστε να μην καταστρέφεται το παρασκεύασμα πριν από την παθολογοανατομική εξέταση, με τη λήψη των ιστοτεμαχίων για τους σκοπούς της μελέτης. Πέραν των κριτηρίων που προαναφέρθηκαν, υπήρξε και ένας αριθμός ασθενών που δεν συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, λόγω αδυναμίας λήψης δειγμάτων κυρίως εξαιτίας φόρτου εργασίας. Η μελέτη έχει λάβει έγκριση από την Επιτροπή Βιοηθικής Δεοντολογίας του Νοσοκομείου (Παράρτημα 1) και όλοι οι ασθενείς έχουν δώσει γραπτή συναίνεση (Παράρτημα 2). 122

139 Πίνακας 1.1 Ασθενείς και βασικά χαρακτηριστικά των όγκων Ασθενείς Φύλο Άντρες 38 Γυναίκες 18 Μέση Ηλικία 64.9 (εύρος έτη) Ημέρες νοσηλείας 7 60 ημέρες (διάμεση τιμή: 16ημ) Εντόπιση Άνω 3/μόριο Μέσο 3/μόριο Κάτω 3/μόριο ΚΟΣ Ολόκληρο Χωρίς στοιχεία n=13 (23.21%) n=9 (16.07%) n=26 (46.43%) n=2 (3.57%) n=2 (3.57%) n=4 (7.14%) Μέγεθος όγκου 5-18 εκ Παθολογοανατομική ταξινόμηση κατά Borrmann Τύπος I Τύπος II Τύπος III Τύπος IV Τύπος V (προβάλων ή (ελκωτικός με (επιφ εξαπλ με (επιφ εξαπλ (μεικτός) πολυποειδής) υπεγερμένα όρια) εξέλκωση) επίπεδος/ επηρμένος) n=9 (16.07%) n=2 (3.57%) n=35 (62.50%) n=5 (8.93%) n=5 (8.93%) Ιστολογικός τύπος (κατά Lauren) Εντερικός Διάχυτος Μικτός Χωρίς στοιχεία n=23 (41%) n=22 (39.28%) n=6 (10.71%) n=5 (8.93%) I n=1 (1.78%) Βαθμός διαφοροποίησης (Grade) II III n=16 (28.57%) n=29 (51.78%) Χωρίς στοιχεία n=10 (17.85%) R 0 n=42 (75%) Υπολειπόμενος όγκος R 1 R 2 n=4 (7.14%) n=4 (7.14%) Χωρίς στοιχεία n=5 (8.92%) Η διάγνωση της νόσου έγινε βάσει της κλασσικής προσέγγισης που ακολουθεί η Ιατρική Επιστήμη. Το ιστορικό και η συμπτωματολογία, σε συνδυασμό με τα τυχόν ευρήματα της κλινικής εξέτασης, οδηγούσαν στον παρακλινικό έλεγχο, που βασίστηκε κυρίως στην ενδοσκόπηση του ανώτερου πεπτικού και στην απεικονιστική διερεύνηση (συνήθως με υπολογιστική και σπανιότερα με μαγνητική τομογραφία). Όλα τα δεδομένα από το ιστορικό, τη συμπτωματολογία, την κλινική εξέταση, καθώς και τα ευρήματα από τη 123

140 γαστροσκόπηση και την τομογραφία, καταγραφόταν στο έντυπο του πρωτοκόλλου, στο οποίο θα γίνει λεπτομερής αναφορά παρακάτω. Η τελική διάγνωση της νόσου και η ταυτοποίηση του όγκου, ετέθησαν με την ιστολογική εξέταση των ιστοτεμαχίων που είχαν ληφθεί από την βλεννογονική βλάβη. Μετά την επιβεβαίωση της διάγνωσης, ο ασθενής προσερχόταν για αντιμετώπιση. Κανένας από τους ασθενείς δεν είχε λάβει προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Μετά την είσοδο των ασθενών στο νοσοκομείο για χειρουργκή αντιμετώπιση, συμπληρωνόταν η φόρμα του πρωτοκόλλου καταγραφής, που περιλάμβανε τις ακόλουθες πληροφορίες: 1) Δημογραφικά στοιχεία 2) Στοιχεία νοσηλείας (ημερομηνίες εισόδου εξόδου - χειρουργικής επέμβασης, διάρκεια νοσηλείας) 3) Παρουσία ή μη αρχικών συμπτωμάτων, τα οποία αποτέλεσαν την αφορμή ώστε να αρχίσει η διερεύνηση που οδήγησε στην τελική διάγνωση της νόσου (επιγαστραλγία, δυσφορία, αίσθημα βάρους, μετεωρισμός, δυσπεψία, δυσφαγία, ανορεξία, αδυναμίακαταβολή, απώλεια βάρους, διάτρηση-περιτονίτις) 4) Χρονική διάρκεια συμπτωμάτων 5) Κλινική σημειολογία (ψηλαφητή μάζα, ψηλαφητό ήπαρ, παρουσία ασκίτη) 6) Τυχόν ευρήματα από τον εργαστηριακό έλεγχο (πχ αναιμία) 7) Προδιαθεσικοί παράγοντες παράγοντες κινδύνου [ιστορικό παρουσίας H Pylori, χρήση ανταγωνιστών Η2 υποδοχέων ή/και αναστολέων αντλίας πρωτονίων, διατροφικές συνήθειες, κάπνισμα, ομάδα αίματος, παρουσία γαστρικών πολυπόδων, ατροφική γαστρίτις, εντερική μετάπλαση, δυσπλασία, οικογενειακό ιστορικό γαστρικού καρκίνου διαχύτου τύπου, Οικογενούς Αδενοματώδους Πολυποδίασης (FAP), Κληρονομικού Μη Πολυποδιασικού Καρκίνου Παχέος Εντέρου (HNPCC), σ. Peutz- Jeghers] 8) Συνοδές νόσοι από τα άλλα συστήματα που αυξάνουν τη νοσηρότητα (κατηγορία κατά ASA και NYHA) Παθολογικό Ιστορικό (καταγραφή παθήσεων) 9) Κατάσταση θρέψης (Βάρος, Ύψος, BMI, απώλεια βάρους) 10) Ανοσοποιητικό Σύστημα (συνυπάρχουσα αυτοάνοση νόσος, προηγηθείσα χρήση ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων, κυτταροτοξικών παραγόντων, κορτικοστεροειδών ή ακτινοβολίας) 11) Κοινωνικό Ιστορικό Συνήθειες (κάπνισμα, κατανάλωση αλκοόλ ή άλλων ουσιών) 124

141 12) Πληροφορίες προεγχειρητικής ετοιμασίας του ασθενούς (προφυλακτική -ή όχιχρήση αντιβιοτικών, προετοιμασία -ή όχι- εντέρου, τοποθέτηση -ή όχι- κεντρικού φλεβοκαθετήρα κ.α.) 13) Χαρακτηρισμός της χειρουργικής επέμβασης με βάση του αν είναι επείγουσα ή προγραμματισμένη 14) Περιγραφή του είδους της επέμβασης (περιφερική/υφολική/ολική/κεντρική γαστρεκτομή, με ή χωρίς θωρακοτομή, με ή χωρίς συναφαίρεση γειτονικού οργάνου, έκταση λεμφαδενεκτομής, τοποθέτηση ή όχι παροχετεύσεων) 15) Κατάταξη κατά TNM, παρουσία ή όχι υπολειπόμενης νόσου, Σταδιοποίηση 16) Ιστολογική ταυτοποίηση του όγκου, Βαθμός διαφοροποίησης, Ταξινόμηση κατά Borrmann, Ταξινόμηση κατά Lauren, Άλλα ιστολογικά χαρακτηριστικά (περινευρική διήθηση, διήθηση λεμφαγγείων/φλεβών, νέκρωση όγκου) 17) Καρκινικοί δείκτες (προεγχειρητικά μετεγχειρητικά) 18) Στοιχεία βραχύχρονης έκβασης 18α) Νοσηρότητα (παρουσία ή όχι μετεγχειρητικών επιπλοκών και περιγραφή τους, διενέργεια ή μη επανεπέμβασης, νοσηλεία ή όχι σε ΜΕΘ, αιτία εισαγωγής σε ΜΕΘ, παρουσία Συνδρόμου Συστηματικής Φλεγμονώδους Αντίδρασης / Σήψης / Σηπτικής Καταπληξίας / Συνδρόμου Έκπτωσης Οργάνων Πολλών Συστημάτων) 18β) Ημερομηνία και αιτία θανάτου 19) Συμπληρωματική θεραπεία σύμφωνα με την απόφαση του Ογκολογικού Συμβουλίου (Ακτινοθεραπεία / Χημειοθεραπεία / Επανεπέμβαση) 20) Παρακολούθηση (Ημερομηνίες κλινικής εξέτασης, αποτελεσμάτων καρκινικών δεικτών, απεικονιστικών μεθόδων, γαστροσκόπησης, παρουσίας τοπικής / συστηματικής υποτροπής της νόσου) 21) Ημερομηνία και αιτία θανάτου (αν οφείλεται ή όχι στη νόσο) 22) Διάστημα ελεύθερο νόσου, Επιβίωση Στους ασθενείς γινόταν λήψη φλεβικού αίματος προεγχειρητικά, συνήθως την ημέρα της εισαγωγής στην Κλινική. Ο εργαστηριακός έλεγχος ήταν ο συνήθης και περιλάμβανε γενική αίματος, τις εξής βιοχημικές παραμέτρους στον ορό του αίματος: Κάλιο (K), Νάτριο (Na), Ουρία (Ur), Κρεατινίνη (Cr), Γλυκόζη (Gluc), Τρανσαμινάσες (SGOT, SGPT), Αλκαλική Φωσφατάση (ALP), γgt, χολερυθρίνη άμεση-έμμεση, αμυλάση, Γαλακτική Δεϋδρογονάση (LDH), Ολική πρωτεΐνη, αλβουμίνη, Ασβέστιο (Ca) καθώς και καρκινικούς δείκτες: CEA, AFP, Ca19-9, Ca125, Ca

142 Κατά την αιμοληψία γινόταν λήψη ενός επιπλέον φιαλιδίου γενικής αίματος και ενός φιαλιδίου βιοχημικού ελέγχου, τα οποία φυλάχτηκαν ως παρακαταθήκη για μελλοντική έρευνα. Παρακάτω (ενότητα 1.3), περιγράφεται η διαδικασία συλλογής και φύλαξης των δειγμάτων αυτών. Το είδος της χειρουργικής επέμβασης καθορίστηκε με βάση την εντόπιση και την επέκταση του όγκου, στοιχεία τα οποία καταγράφηκαν στο πρακτικό του χειρουργείου. Διενεργήθηκαν 17 υφολικές, 34 ολικές και 2 κεντρικές γαστρεκτομές ανάλογα με την εντόπιση και την επέκταση του όγκου, με ή χωρίς θωρακοτομή (Πίνακας 1.2). Σε ορισμένες περιπτώσεις κρίθηκε απαραίτητη η συναφαίρεση γειτονικού/ών οργάνου/ων για λόγους ριζικότητας της επέμβασης (Πίνακας 1.2). Κατά τη διάρκεια του χειρουργείου και αμέσως μετά την αφαίρεση του παρασκευάσματος (στόμαχος-επιχώριοι λεμφαδένες με ή χωρίς γειτονικά όργανα), έγινε η λήψη των ιστοτεμαχίων τόσο από την περιοχή του όγκου, όσο και από περιοχή με φυσιολογικό βλεννογόνο. Η όλη διαδικασία περιγράφεται στην επόμενη ενότητα (1.3). Πίνακας 1.2 Είδη επεμβάσεων Επέμβαση γαστρεκτομής Ολική Υφολική Ολική με Κεντρική με Χωρίς αναφορά Θωρακοτομή Θωρακοτομή n=30 n=17 n=4 n=2 n=3 Συναφαίρεση γειτονικού οργάνου Σπληνεκτομή Κολεκτομή Σπληνεκτομή και Περιφ Σπληνεκτομή και Κολεκτομή Παγκρεατεκτομή n=5 n=1 n=3 n=1 126

143 Στα πλαίσια της μετεγχειρητικής παρακολούθησης των ασθενών, γινόταν αιμοληψίες για τις απαραίτητες εξετάσεις καθώς και απεικονιστικός έλεγχος σε περίπτωση επιδείνωσης της κατάστασης του ασθενούς και υποψίας μετεγχειρητικής επιπλοκής, η οποία και καταγραφόταν. Στον Πίνακα 1.3 αναφέρονται το είδος και ο αριθμός των επιπλοκών των ασθενών της μελέτης, τα ποσοστά των οποίων είναι παρόμοια με εκείνα άλλων μελετών από τη διεθνή βιβλιογραφία [ ]. Πίνακας 1.3 Μετεγχειρητικές Επιπλοκές Είδος επιπλοκής αριθμός - ποσοστό Διαφυγή 12δακτύλου 2 (3.57%) Διαφυγή αναστόμωσης 1 (1.78%) Παγκρεατικό συρίγγιο 2 (3.57%) Διάσπαση τραύματος / Εκσπλάχνωση 2 (3.57%) Διαπύηση τραύματος 4 (7.14%) Εισρόφηση - Πνευμονίτις 1 (1.78%) Ατελεκτασία Εμπύρετο 3 (5.35%) Πνευμονία 2 (3.57%) Ίκτερος 1 (1.78%) Ουρολοίμωξη 1 (1.78%) Θρομβοφλεβίτιδα 1 (1.78%) Αναπνευστική ανεπάρκεια 1 (1.78%) Ανεξάρτητα από τα παραπάνω, κατά την 1 η μετεγχειρητική εβδομάδα, λαμβανόταν δείγμα αίματος για τη μέτρηση των επιπέδων των καρκινικών δεικτών μετά την αφαίρεση του όγκου. Στην παθολογοανατομική έκθεση γινόταν περιγραφή του όγκου (εντόπιση, μέγεθος, μορφολογία), καθώς και μακροσκοπική (κατά Borrmann) και ιστολογική ταξινόμηση (κατά Lauren, βαθμός διαφοροποίησης και άλλα ιστολογικά χαρακτηριστικά όπως αγγειακή ή περινευρική διήθηση, παρουσία νέκρωσης). Όσα από τα παραπάνω χαρακτηριστικά είχαν περιγραφεί στις παθολογοανατομικές εκθέσεις και ως εκ τούτου υπήρχαν δεδομένα για τους ασθενείς, απεικονίζονται στον Πίνακα

144 Σε ό,τι αφορά την εντόπιση, η πλειονότητα των όγκων (46.43%), ήταν στο κάτω 3/μόριο του στομάχου και ακολουθούσαν οι όγκοι του άνω και εκείνοι του μέσου 3/μορίου με ποσοστά 23.21% και 16.07% αντίστοιχα. Σε δύο ασθενείς ο όγκος εντοπιζόταν στην καρδιοοισοφαγική συμβολή και σε άλλους δύο καταλάμβανε ολόκληρο το στομάχι (πλαστική λινίτις) (Πίνακας 1.1). Η ταξινόμηση κατά Borrmann έδειξε ότι ο πιο συχνός μορφολογικός τύπος στους ασθενείς της μελέτης ήταν ο επιφανειακά εξαπλούμενος με εξέλκωση (τύπος ΙΙΙ), με ποσοστό 62.50%. Ακολουθούσε ο προβάλων ή πολυποειδής (τύπος Ι) με ποσοστό 16.07%, με τους τύπους ΙV, V και II να έπονται, με ποσοστά 8.93% οι δύο πρώτοι και 3.57% ο τρίτος (Πίνακας 1.1). Σε ό,τι αφορά τον ιστολογικό τύπο κατά Lauren, τα ποσοστά ήταν παρόμοια για τον εντερικό και τον διάχυτο τύπο (41% και 39.28% αντίστοιχα), ενώ ο μικτός τύπος παρατηρήθηκε στο 10.71% των περιπτώσεων. Τέλος, σύμφωνα με το βαθμό διαφοροποίησης (Grade), η πλειονότητα των ασθενών είχαν χαμηλής και μέσης διαφοροποίησης όγκους (51.78% και 28.57% αντίστοιχα) (Πίνακας 1.1). Το γεγονός αυτό καταδεικνύει ότι οι περισσότεροι ασθενείς της μελέτης δεν είχαν όγκους καλής διαφοροποίησης, στοιχείο που αποτελεί δυσμενή προγνωστικό παράγοντα. Καθορίστηκε επίσης η παρουσία ή μη, υπολειπόμενης νόσου (R - Residual Tumour) (Πίνακας 1.1), καθώς και η σχέση του R με το μέγεθος του όγκου και με το T (Πίνακας 1.4). Υπολειπόμενος όγκος (μακροσκοπικός ή μικροσκοπικός) παρατηρήθηκε στο 14.28% των ασθενών (Πίνακας 1.1) και ειδικότερα μόνο στους ασθενείς με όγκους Τ3 και Τ4. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1.4, το 50% των Τ4 όγκων είχαν υπολειπόμενη νόσο ενώ το αντίστοιχο ποσοστό για τους Τ3 όγκους ήταν 7.4%. Σε ό,τι αφορά το μέγεθος του όγκου, R(+) παρατηρήθηκε στο 23.33% των όγκων μεγαλύτερων από 3εκ, ενώ περίπτωση υπολειπόμενης νόσου παρατηρήθηκε σε έναν όγκο μεγέθους 3εκ (ποσοστό 5%). Σύμφωνα με το follow-up, οι ασθενείς με υπολειπόμενο όγκο R1 ή R2 απεβίωσαν σε λιγότερο από 12 μήνες. Εκείνοι με R0 είχαν επιβίωση από 6 έως 50 μήνες, ενώ υπάρχουν ασθενείς πρώιμου σταδίου που έχουν ξεπεράσει την πενταετή επιβίωση (Πίνακας 1.5). 128

145 Πίνακας 1.4 Σχέση του R (Residual tumour) με το Τ και το μέγεθος του όγκου Τ R(+) [R1 + R2] T4 (n=12) 6 (50%) T3 (n=27) 2 (7.4%) Μέγεθος >3εκ (n=30) 7 (23.33%) <=3εκ (n=20) 1 (5%) Με βάση την παθολογοανατομική έκθεση, έγινε και η τελική σταδιοποίηση κατά ΤΝΜ (ptnm). Επιπλέον, έγινε αντιστοίχιση κάθε σταδίου με την πενταετή επιβίωση, το διάστημα ελεύθερο νόσου και τη συνολική επιβίωση (Πίνακας 1.5). Σημειώνεται ότι έχει χρησιμοποιηθεί η 6 η έκδοση του ΤΝΜ, μια και ολόκληρος ο αριθμός των περιστατικών είχε καταγραφεί με βάση αυτή. Η 7 η έκδοση που ισχύει σήμερα, έχει σημαντικές διαφορές σε ό,τι αφορά τον καρκίνο οισοφάγου και στόμαχου [ ], αλλά εκδόθηκε το 2009 και δεν υιοθετήθηκε άμεσα στην καθημερινή πρακτική. Περιγραφή των διαφορών μεταξύ των παραπάνω εκδόσεων της ΤΝΜ ταξινόμησης, γίνεται στην ενότητα που αφορά στη σταδιοποίηση του αδενοκαρκινώματος του στομάχου (ενότητα 2.7 του κεφαλαίου 2 στο Γενικό Μέρος της παρούσας μελέτης). Σύμφωνα με τη σταδιοποίηση των ασθενών της μελέτης (Πίνακας 1.5), παρατηρείται ότι στην πλειονότητά τους η διάγνωση και κατά συνέπεια και η αντιμετώπιση έγιναν σε προχωρημένα στάδια (κατά σειρά φθίνουσας συχνότητας στα IIIΑ, IV και II), γεγονός που εξηγεί την όχι τόσο μακρά επιβίωση που κατεγράφη. 129

146 Πίνακας 1.5 Σταδιοποίηση και Επιβίωση Στάδιο (κατά ΤΝΜ) 5ετής επιβίωση Διάστημα Ελεύθερο Νόσου (μήνες) Συνολική επιβίωση (μήνες) I A (n=2) 100% (1/1) I B (n=2) 100% (1/1) II (n=9) 20% (1/5) III A (n=22) III B (n=1) IV (n=16) Άνευ στοιχείων: 4 Όλες οι παραπάνω πληροφορίες για κάθε ασθενή, συμπεριλήφθηκαν στη φόρμα καταγραφής που αναφέρθηκε προηγουμένως και καταχωρήθηκαν σε μία βάση δεδομένων, η οποία αργότερα συμπληρωνόταν με στοιχεία της συμπληρωματικής θεραπείας (ακτινοθεραπεία χημειοθεραπεία) καθώς και με πληροφορίες από την παρακολούθηση (follow-up) των ασθενών. Αυτή η βάση δεδομένων ήταν αργότερα διαθέσιμη για στατιστική ανάλυση. Η παρακολούθηση (follow-up) γινόταν κάθε 4 μήνες τον 1 ο χρόνο, κάθε 6 μήνες τον 2 ο και 3 ο χρόνο και ακολούθως σε ετήσια βάση, μέχρι και 102 μήνες για ορισμένους ασθενείς. Περιλάμβανε, εκτός του ιστορικού και της κλινικής εξέτασης, εργαστηριακό έλεγχο με εξετάσεις αίματος (γενική αίματος, βιοχημικό έλεγχο ηπατικής λειτουργίας, καρκινικούς δείκτες), καθώς και με απεικονιστικές εξετάσεις (ακτινογραφία θώρακος, υπολογιστική τομογραφία κοιλίας-πυέλου). Ενδοσκοπικός έλεγχος γινόταν σε ετήσια βάση στους ασθενείς εκείνους που είχαν υποβληθεί σε μερική/υφολική γαστρεκτομή. Ο αλγόριθμος παρακολούθησης ασθενών με χειρουργηθέν γαστρικό αδενοκαρκίνωμα απεικονίζεται στο Σχήμα 1.1. Σε περίπτωση εμφάνισης συμπτωμάτων προ του προγραμματισμένου επανελέγχου, διενεργείτο επιπλέον έλεγχος εκτός πρωτοκόλλου. Επί διαπίστωσης υποτροπής, καταγραφόταν η ημερομηνία δίαγνωσης και το είδος (εάν είναι τοπική, απομακρυσμένη ή και τα δύο). Υπολογίστηκε έτσι το διάστημα ελεύθερο νόσου (Disease Free Survival - DFS). Η θεραπευτική επιλογή επί υποτροπής, εξαρτάτο από τη γενική κατάσταση του ασθενούς (κλινική εικόνα, συνοσηρότητα, κατάταξη κατά ASA), καθώς και από το είδος της υποτροπής 130

147 (τοπική, μονήρης μετάσταση ή πολλαπλές, καρκινωμάτωση περιτοναίου). Η αντιμετώπιση συνίστατο συνηθέστερα είτε σε ελάχιστα παρεμβατική πράξη (τοποθέτηση stent σε στένωση αυλού, διαδερμικό RF για μεμονωμένες μεταστάσεις), είτε σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και σπανιότερα σε χειρουργική επέμβαση. Στην περίπτωση θανάτου του ασθενούς, καταγραφόταν η ημερομηνία, η αιτία θανάτου (εάν σχετίζεται με τη νόσο ή όχι) και η συνολική επιβίωση (Overall Survival - OS). 131

148 Σχήμα 1.1 στομάχου Αλγόριθμος παρακολούθησης ασθενών με χειρουργηθέν Ca 132

149 1.3 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΚΑΙ ΦΥΛΑΞΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΑΙΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΙΣΤΟΤΕΜΑΧΙΩΝ Διαδικασία λήψης και φύλαξης δειγμάτων αίματος Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, κατά την αιμοληψία στην εισαγωγή του ασθενούς έγινε λήψη ενός επιπλέον φιαλιδίου γενικής αίματος και ενός φιαλιδίου βιοχημικού ελέγχου, τα οποία και φυλάχτηκαν για μελλοντική έρευνα. Τα φιαλίδια γενικής αίματος (ολικό αίμα), καταψύχθηκαν στους -80 ο C, ενώ εκείνα του βιοχημικού ελέγχου, φυγοκεντρήθηκαν ώστε να γίνει διαχωρισμός του ορού από τα έμμορφα συστατικά προτού φυλαχθούν. Το κάθε φιαλίδιο φυγοκεντρήθηκε στις 4000 στροφές/λεπτό για 7 λεπτά και ακολούθως έγινε λήψη του υπερκείμενου ορού. Ο ορός τοποθετήθηκε σε κρυοφιαλίδιο, το οποίο φυλάχθηκε μαζί με το σωληνάριο που περιείχε το εναπομείναν ίζημα στους -80 ο C. Διαδικασία λήψης και φύλαξης ιστικών δειγμάτων Κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης και μετά την εκτομή του στομάχου, γινόταν επιμήκης διάνοιξη αυτού και επιμελής έκπλυση του βλεννογόνου ώστε να απομακρυνθεί το γαστρικό υγρό και τυχόν υπολλείμματα τροφής. Εν συνεχεία, λαμβανόταν δύο ιστοτεμάχια από τη καρκινική βλάβη και δύο ιστοτεμάχια από φυσιολογικό βλεννογόνο, μακριά από τον όγκο. Η λήψη των τεμαχίων φυσιολογικού βλεννογόνου γινόταν τουλάχιστον 11εκ από τη βλάβη, ώστε να εξασφαλιστεί ότι δεν υπάρχει υποβλεννογόνια επέκταση του καρκινώματος [166]. Το μέγεθος των ιστοτεμαχίων ήταν μικρότερο των 10χιλ και διέφερε, αναλόγως του μεγέθους του όγκου. Σε μεγαλύτερους όγκους μπορεί να λαμβανόταν και τεμάχια μεγέθους 7-8χιλ, ενώ σε μικρότερους όγκους δεν ξεπερνούσαν τα 3χιλ, προκειμένου να μην αλλοιωθεί η καρκινική βλάβη. Όπως αναφέρθηκε και στην αρχή του κεφαλαίου για τα κριτήρια εισαγωγής ενός ασθενούς στη μελέτη, δε γινόταν λήψη ιστικού δείγματος από όγκους μικρότερους του 1εκ, ώστε να μένει ανέπαφος ο λιγοστός καρκινικός ιστός. Τα ιστοτεμάχια ξεπλενόταν με φυσιολογικό ορό και τοποθετούταν πάνω σε καθαρή και νωπή γάζα για 1-2 λεπτά, ώστε να αποστραγγιστεί η περίσσεια του ορού. 133

150 Το ένα ζεύγος ιστών (ένα τεμάχιο καρκινικού και ένα φυσιολογικού ιστού), τοποθετούταν σε κρυοφιαλίδια με βιδωτό πώμα, στα οποία προστίθεται RNA later. Κάθε ιστοτεμάχιο τοποθετούταν σε ένα φιαλίδιο, στο οποίο προστίθετο 1mL RNA later R [Ambion, USA], ούτως ώστε να γίνει αναστολή των RNασών πριν από τη λύση των κυττάρων. Με τον τρόπο αυτό ήταν αποτελεσματικότερη η απομόνωση των νουκλεϊκών οξέων (στην προκειμένη περίπτωση του mrna). Το δεύτερο ζεύγος ιστών τοποθετούταν σε κενά κρυοφιαλίδια (ομοίως ένα ιστοτεμάχιο σε κάθε φιαλίδιο), προκειμένου να χρησιμοποιηθούν για μετέπειτα προσδιορισμό ενζυμικής ενεργότητας (απομόνωση πρωτεϊνών). Στο κάθε φιαλίδιο αναγραφόταν το όνομα, η ημερομηνία και το είδος του ιστού, δηλαδή αν είναι καρκινικός (C) ή φυσιολογικός (N) και εν συνεχεία καταψύχονταν άμεσα στους -80 o C. 134

151 1.4 ΝΟΥΚΛΕΪΚΑ ΟΞΕΑ - ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ RNA, ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΚΑΙ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ cdna Τα ιστοτεμάχια που έχουν ληφθεί από τα χειρουργικά παρασκευάσματα, υπόκεινται αρχικά σε μία διαδικασία ομογενοποίησης, προκειμένου να ακολουθήσει η απομόνωση του ολικού RNA. Με τον τρόπο αυτό καθίσταται εφικτή η μοριακή μελέτη των γονιδίων-στόχων σε επίπεδο mrna, η οποία γίνεται με συμβατική PCR καθώς και με ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (Σχήμα 1.2). Για τα πειράματα της συμβατικής PCR είναι απαραίτητος ένας θετικός μάρτυρας, που να μπορεί να αποτελέσει και κατάλληλο βαθμονομητή στα πειράματα της ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε η ανθρώπινη κυτταρική σειρά AGS γαστρικού αδενοκαρκινώματος. Σχήμα 1.2 Διαδικασία απομόνωσης νουκλεϊκών οξέων (1) Ομογενοποίηση κυττάρων και ιστών, (2) Απομόνωση ολικού mrna, (3) Σύνθεση cdna, (4) Ενίσχυση DNA με συμβατική PCR, (5) Ενίσχυση DNA με ποσοτική PCR 135

152 1.4.1 Συνθήκες καλλιέργειας καρκινικών κυττάρων στομάχου AGS Τα κύτταρα AGS είναι ανθρώπινη κυτταρική σειρά γαστρικού αδενοκαρκινώματος [ATCC No. CRL-1739] και αποκτήθηκε χάρη στην ευγενική προσφορά της Dr Daniela Basso, Department of Laboratory Medicine, University of Padova, Ιταλίας. Η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, αρχικά απομονώθηκε μέσω βιοψίας από γαστρικό καρκίνωμα γυναίκας Καυκασίας φυλής, χωρίς να της έχει χορηγηθεί καμία προηγούμενη αγωγή με κυτταροστατικά σκευάσματα. Η κυτταρική σειρά AGS έχει καθιερωθεί ως ένα in vitro μοντέλο διερεύνησης του καρκίνου του στομάχου [167]. Τα AGS είναι κύτταρα επιθηλιακής προέλευσης και καθώς πολλαπλασιάζονται αναπτύσσουν μονοστοιβάδα. Όπως προκύπτει από τα παραπάνω, τα κύτταρα AGS ήταν η καταλληλότερη καρκινική σειρά για την παρούσα ερευνητική μελέτη, αφού αποτελούσε κατάλληλο θετικό μάρτυρα για τα πειράματα της συμβατικής PCR, αλλά και κατάλληλο βαθμονομητή για τα πειράματα ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο. Επιπλέον, επειδή τα κύτταρα αυτά αποτελούν ένα πολύτιμο in vitro μοντέλο για τη μελέτη του αδενοκαρκινώματος του στομάχου, η επιλογή τους συνέβαλε στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων μας σχετικά με την έκφραση του γονιδίου-στόχου KLK13 στο γαστρικό καρκίνο Θρεπτικό μέσο και διαλύματα 1) Θρεπτικό μέσο Τα κύτταρα AGS αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), που αποτελείτο από 0.3g/L L- γλουταμίνης, 0.85g/L NaHCO 3, 0.1g/L στρεπτομυκίνης, 100KU/L πενικιλλίνης και 10% (v/v) εμβρυϊκό ορό βοός (FBS) όλα προϊόντα της εταιρείας PAA (Pasching, Austria). Κάθε φορά που ετοιμαζόταν νέο θρεπτικό υλικό, 5mL αυτού, τοποθετούταν σε μικρή φιάλη (25cm 2 ) στον επωαστήρα στους 37 C, ώστε να ελεγχθεί ότι είναι στείρο μικροβίων. 2) Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) 0,01Μ, ph 7,4 Ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει: Na 2 HPO 4 2H 2 O 0,0081Μ, KH 2 PO 4 0,00176M, KCl 0,0027M και NaCl 0,137M [Sigma]. 136

153 3) Ρυθμιστικό διάλυμα κυτταρικής αποκόλλησης (θρυψίνης/edta), ph 7,4 Περιέχει 10mM PBS, 0,25% w/v θρυψίνης και 0,02% w/v EDTA [Cambrex]. 4) Διάλυμα κυτταρικής ψύξης-διατήρησης σε υγρό άζωτο Η μακροχρόνια διατήρηση των κυττάρων επιτυγχάνεται με τη χρήση 1mL μείγματος ψύξης που περιέχει 90% (v/v) εμβρυϊκό ορό βοός (FBS) και 10% (v/v) διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) [Applichem] Ανακαλλιέργεια γαστρικών καρκινικών κυττάρων Η ανακαλλιέργεια των κυττάρων AGS ελάμβανε χώρα κάθε φορά που αυτά κάλυπταν το 75-85% του πυθμένα της φιάλης καλλιέργειας, ώστε να διατηρούνται πάντα σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης για όλα τα μετέπειτα μοριακά πειράματα. Όλα τα χρησιμοποιούμενα πλαστικά υλικά ήταν αποστειρωμένα και όλα τα διαλύματα είχαν προθερμανθεί στους 37 C πριν από την εφαρμογή τους στα κύτταρα. Ο γενικότερος χειρισμός των συγκεκριμένων διαδικασιών απαιτούσε απόλυτα στείρες συνθήκες που διασφαλιζόταν στον ειδικό θάλαμο κάθετης νηματικής ροής (hood) [Invitro Manufacture Laboratory]. Η διαδικασία της ανακαλλιέργειας είχε ως εξής: -Αρχικά το παλαιό θρεπτικό υλικό απομακρυνόταν με αναρροφητή [Pipette Mate Pro, Nichiryo]. -Εν συνεχεία προστίθετο διάλυμα θρυψίνης/edta 0,8mL (για φιάλη 75cm2) ή 0,5mL (για φιάλη 25cm2), το οποίο απομακρυνόταν άμεσα. Η έκπλυση αυτή γινόταν ώστε να αφαιρεθούν ίχνη ορού που θα παρεμπόδιζαν τη δράση της θρυψίνης, καθώς και για να γίνει διαχωρισμός των νεκρών επιπλεόντων κυττάρων από τα ζωντανά προσκολλημένα. -Κατόπιν, προστίθετο εκ νέου 1,6mL (για φιάλη 75cm 2 ) ή 0,75mL (για φιάλη 25cm 2 ) από το ίδιο διάλυμα κυτταρικής αποκόλλησης, το οποίο παρέμενε να δράσει για 8-10min στους 37 C, μέχρι τα κύτταρα να αποκολληθούν πλήρως από τον πυθμένα της φιάλης. -Για να αδρανοποιηθεί η περαιτέρω δράση της θρυψίνης, προστίθετο 5mL φρέσκου θρεπτικού υλικού μέσα στη μεγάλη φιάλη (ή 2mL στη μικρή) και ακολούθως γινόταν συλλογή των αιωρούμενων κυττάρων κατόπιν διαδοχικών πλύσεων του πυθμένα και των παράπλευρων τοιχωμάτων της φιάλης. Η 137

154 φιάλη ελεγχόταν στο οπτικό μικροσκόπιο [Nova vision series] για τυχόν κυτταρικά υπολείμματα σημαντικού αριθμού -Το υγρό με τα κύτταρα τοποθετούταν σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης (falcon) και ακολουθούσε φυγοκέντρηση του κυτταρικού εναιωρήματος στα 1000g για 5min σε φυγόκεντρο [Hettich Universal II]. -Μετά τη φυγοκέντρηση απορριπτόταν το υπερκείμενο και το κυτταρικό ίζημα αραιωνόταν σε 5mL νέου θρεπτικού υλικού ώστε να καταμετρηθεί ο αριθμός των κυττάρων με αιμοκυττόμετρο [Neubauer, Hausser Scientific Company]. Η επιφάνεια της πλάκας του αιμοκυττομέτρου καθαριζόταν πρώτα με διάλυμα 70% (v/v) αιθυλικής αλκοόλης. Μετά το ξέπλυμα της περίσσειας της αλκοόλης με τρεχούμενο νερό και στέγνωμα του αιμοκυττομέτρου με μαλακό χαρτί προσέχοντας να μη χαραχθεί η ημι-αργυρή επιφάνειά του, τοποθετείτο σε αυτήν καλυπτρίδα. Μετά την αραίωση του ιζήματος των κυττάρων μέσα στο σωλήνα φυγοκέντρησης, λαμβανόταν 50μL από αυτό, τα οποία και αραιωνόταν 10 φορές σε PBS 1 και εν συνεχεία μία σταγόνα τους (ίση περίπου με 10μL) μεταφερόταν στο αιμοκυττόμετρο. Η μέτρηση των κυττάρων πραγματοποιούταν με αντικειμενικό φακό μεγέθυνσης 20 κατόπιν εστίασης με φακό 10. Γινόταν μέτρηση τεσσάρων τετραγώνων και ο αριθμός των κυττάρων υπολογιζόταν από το μέσο όρο των μετρήσεων και διαίρεσης αυτού με τον αριθμό των τετραγώνων. Το τελικό αποτέλεσμα πολλαπλασιαζόταν με τον αριθμό 10 4 για να προκύψει ο αριθμός των κυττάρων ανά ml (cells/ml) [168] και έπειτα επί 10 (λόγω της αραίωσης 1/10 των κυττάρων σε PBS 1 ). Σε περίπτωση απλής ανακαλλιέργειας, αρκούσε η αραίωση του ιζήματος σε όγκο ανάλογο με το 1/4 έως 1/8 της προηγούμενης φιάλης. Μετά την κατάλληλη αραίωση (υπολογισμένη μετά τη μέτρηση ή με την απλή εφαρμογή της αντίστοιχης αναλογίας), τα κύτταρα κατανεμήθηκαν ομοιόμορφα στο εσωτερικό της φιάλης έως τελικού όγκου 10mL ή 20mL. Ανάλογα με το σχεδιασμό των πειραμάτων, 3 με 4 νέες φιάλες δημιουργούταν σε κάθε ανακαλλιέργεια των κυττάρων AGS, 2-3 φορές την εβδομάδα. Μετά την τοποθέτησή τους στις φιάλες, τα κύτταρα αφηνόταν να κολλήσουν για 6h και κατόπιν να αναπτυχθούν σε επωαστήρα [Vwr International Sheldon Manufacturing, Inc] στους 37 C και σε 5% CO2. 138

155 Απόψυξη και ψύξη κυττάρων Τα κύτταρα φυλάσσονται μακροπρόθεσμα μέσα σε πλαστικά κρυοφιαλίδια σε μία διαρκώς ανανεώσιμη τράπεζα με υγρό άζωτο στους C. Για απόψυξη ενός αριθμού κυττάρων, λαμβανόταν ένα κρυοφιαλίδιο από τη δεξαμενή υγρού αζώτου και μεταφερόταν στους 37 C, έτσι ώστε να γίνεται απότομα το ξεπάγωμα των κυττάρων και να μην παθαίνουν βλάβη το περιεχόμενο και οι δομές τους. Εν συνεχεία ακολουθούταν οι παρακάτω διεργασίες, οι οποίες πραγματοποιούταν κάτω από αυστηρές συνθήκες ασηψίας στον αποστειρωμένο θάλαμο (hood), για την αποφυγή τυχόν επιμολύνσεων [169]: -Αρχικά, το περιεχόμενο του κρυοφιαλιδίου μεταφερόταν σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης, ο οποίος περιείχε 5mL εμβρυϊκό ορό βοός (FBS). Ακολουθούσε φυγοκέντρηση στα 1000g για 5min, ώστε να απομακρυνθεί το διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) από τα κύτταρα λόγω της αρνητικής επίδρασής του στην αύξησή τους. -Μία φιάλη με 10mL φρέσκου θρεπτικού υλικού τοποθετούταν σε σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας (37 C) και CO2 (5%), ώστε να έχει προσαρμοστεί το υλικό της σε ph περίπου 7.2 προτού να προστεθεί το περιεχόμενο του σωλήνα. -Μετά τη φυγοκέντρηση, αφαιρούταν 5mL από τη φιάλη, τα οποία χρησιμοποιούταν για την ανασύσταση του κυτταρικού ιζήματος. Το κυτταρικό εναιώρημα τοποθετούταν στη φιάλη καλλιέργειας ώστε να αρχίσει ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Σε ορισμένες περιπτώσεις που η μορφολογική εικόνα των αποψυχθέντων κυττάρων στο μικροσκόπιο δεν ήταν η επιθυμητή, προστίθετο 1mL FBS στα 10mL του συνολικού όγκου των κυττάρων της φιάλης, με σκοπό να διευκολυνθεί η αύξησή τους. -Μετά την παραπάνω διαδικασία, απαιτούταν τουλάχιστον 3 ανακαλλιέργειες (passaging) έως ότου τα κύτταρα επανακτήσουν το φυσιολογικό ρυθμό ανάπτυξής τους. Προκειμένου να διατηρείται και να ανανεώνεται η τράπεζα της κυτταρικής σειράς, γίνεται ανά διαστήματα ψύξη κυττάρων τα οποία λαμβάνονται από μια κυτταρική καλλιέργεια που βρίσκεται σε εκθετική φάση. Τα κύτταρα καταψύχονται βαθμιαία σε διάλυμα που περιέχει τον 139

156 κυτταροπροστατευτικό έναντι της ψύξης παράγοντα DMSO. Τα στάδια που ακολουθούνται είναι τα εξής: -Αρχικά λαμβάνεται το κυτταρικό εναιώρημα από την καλλιέργεια με τη χρήση του διαλύματος αποκόλλησης και κατόπιν με προσθήκη θρεπτικού υλικού, όπως αναφέρεται στην περιγραφή της ανακαλλιέργειας. -Εν συνεχεία γίνεται φυγοκέντρηση του εναιωρήματος, επαναδιάλυση του κυτταρικού ιζήματος σε νέο θρεπτικό υλικό και μέτρηση. -Μετά τη μέτρηση, τα κύτταρα επαναδιαλύονται σε συγκέντρωση κύτταρα/ml σε διάλυμα ψύξης ή, εμπειρικά, γίνεται ανασύσταση του περιεχομένου της φιάλης σε 1,5mL αυτού. -Τέλος, το κυτταρικό εναιώρημα μεταφέρεται σε πλαστικά κρυοφυαλίδια τα οποία τοποθετούνται σε ειδικά κουτιά από φελιζόλ. Τα κουτιά αυτά φυλάσσονται στους -80 C, ώστε να εξασφαλισθεί το πάγωμα των κυττάρων με αργό ρυθμό και να αποτραπεί έτσι η δημιουργία κρυστάλλων. -Τα κρυοφιαλίδια με τα κύτταρα παραμένουν σε βαθιά κατάψυξη το πολύ έως 3 εβδομάδες πριν από τη μακροπρόθεσμη αποθήκευσή τους σε υγρό άζωτο Ομογενοποίηση καρκινικών κυττάρων AGS και ιστικών δειγμάτων στομάχου Για την ομογενοποίηση κυττάρων και ιστών, απαραίτητη είναι η χρήση του διαλύματος ισοθειοκυανικής γουανιδίνης-φαινόλης (αντιδραστήριο TRI [Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX, USA]), με τη βοήθεια του οποίου καθίσταται μετέπειτα εφικτή η απομόνωση του ολικού RNA. Η διαγραμματική αναπαράσταση των βημάτων που ξεκινούν από την ομογενοποίηση των κυττάρων και των ιστών για να καταλήξουν στην ανάλυση της μοριακής μελέτης γονιδίων-στόχων σε επίπεδο mrna με συμβατική και με ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο, συνοψίζεται στο Σχήμα Ομογενοποίηση κυττάρων AGS Για να διαπιστωθεί κατά πόσο τα κύτταρα AGS αποτελούσαν θετικούς μάρτυρες της έκφρασης του υπό μελέτη γονιδίου KLK13, αρκούσε απλά η συλλογή κυττάρων προς ομογενοποίηση συνολικού αριθμού από τη 140

157 φιάλη των 20mL, παραλείποντας τη διαδικασία της μέτρησης. Ακολουθήθηκαν όλα τα στάδια της απλής ανακαλλιέργειας (βλέπε ) έως και την απόρριψη του υπερκειμένου μετά τη φυγοκέντρηση. Εν συνεχεία το κυτταρικό ίζημα επανασυστάθηκε και ομογενοποιήθηκε με την προσθήκη 1mL TRI [Ambion]. Μετά την ολοκλήρωση της ομογενοποίησης, το κυτταρικό ομογενοποίημα μεταφέρθηκε σε σωλήνα τύπου eppendorf οπότε και ακολούθησε έντονη ανατάραξη σε αναδευτήρα [Vortex, Velp Scientifica]. Για να εξασφαλισθεί η διάσπαση των νουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων, το ομογενοποίημα έμεινε σε ηρεμία για 5min σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και φυλάχθηκε στους -80 C έως την απομόνωση του ολικού RNA από αυτό Ομογενοποίηση ιστικών δειγμάτων στομάχου Τα τεμάχια ιστών επιβάλλεται να παραμένουν παγωμένα κατά τη διάρκεια της σύνθλιψής τους, προκειμένου να μην καταστραφεί το RNA τους. Το βάρος του κάθε ιστικού δείγματος προσδιορίζεται με ζυγό ακριβείας [FX- 300i, A&D Company Limited]. Στην περίπτωση που το βάρος του δείγματος ήταν μικρότερο ή ίσο με 80mg, χρησιμοποιήθηκε ολόκληρο, ενώ εάν ήταν μεγαλύτερο, γινόταν αποκοπή τμήματος αυτού μέχρι βάρους μικρότερου ή ίσου με 120mg. Εν συνεχεία ο ιστός τοποθετήθηκε σε παγωμένο κονιορτοποιητή [Biopulverizer, BioSpec Products Inc], κάτω από τον οποίο και συνεθλίβη. Για βάρος ιστού 10-20mg χρησιμοποιήθηκαν 200μL TRI, για 30-40mg ιστού χρησιμοποιήθηκαν 500μL TRI και για mg ιστού χρησιμοποιήθηκαν 1000μL TRI. Κατόπιν, με ανάδευση επιτεύχθηκε η πλήρης ομογενοποίηση του κάθε δείγματος, το οποίο μεταφέρθηκε σε αποστειρωμένο σωλήνα τύπου eppendorf. Ακολούθησε στάδιο επώασης για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) σε ηρεμία, για το διαχωρισμό των νουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων στα συστατικά τους. Τα ομογενοποιημένα δείγματα επανακαταψύχθηκαν στους -80 ο C μέχρι να συνεχιστεί η υπόλοιπη διαδικασία της απομόνωσης του ολικού RNA. 141

158 1.4.3 Απομόνωση του ολικού RNA από τα AGS κύτταρα και τους ιστούς Η εκχύλιση του ολικού RNA από τα κύτταρα AGS και τα ιστικά δείγματα στομάχου επιτεύχθηκε με τη χρήση των δύο συστατικών του αντιδραστηρίου TRI (της ισοθειοκυανικής γουανιδίνης και της φαινόλης) [Applied Biosystems/Ambion,Austin,TX,USA] σε συνδυασμό με χλωροφόρμιο [Sigma] και αιθυλική αλκοόλη [Merck]. Η προσθήκη του TRI στα προς ομογενοποίηση δείγματα συνέβαλε στην προστασία του RNA από τις ριβονουκλεάσες σε όλα τα στάδια της διαδικασίας απομόνωσης [170]. Αναλυτικότερα, μετά το ξεπάγωμα των ομογενοποιημένων κυτταρικών και ιστικών δειγμάτων, ακολούθησε προσθήκη 200μL χλωροφορμίου για κάθε 1ml αντιδραστηρίου TRI. Κατόπιν απότομης ανατάραξης για 15sec, τα δείγματα αφέθηκαν για 10min σε θερμοκρασία δωματίου (RT) σε ηρεμία, έτσι ώστε μετά την αποδιάταξη των πρωτεϊνών και των λιπιδίων και τον περιορισμό της διαλυτότητας του DNA στη φαινόλη, να καταστεί αποτελεσματικότερος ο διαχωρισμός της υδατικής από την οργανική φάση. Εν συνεχεία ακολούθησε φυγοκέντρηση [Spectrafuge, Labnet International Inc] στις 12000g για 15min στους 4 ο C, μετά την οποία προέκυψαν τρεις στιβάδες: μία ανώτερη διαυγής που αντιστοιχούσε στο RNA, μία ενδιάμεση και μία κατώτερη κόκκινη οργανική, στις οποίες περιέχονταν το DNA και οι πρωτεΐνες. Στο διαχωρισμό αυτόν, το ph παίζει ρυθμιστικό ρόλο. Έτσι, όταν κυμαινόταν μεταξύ 5 και 6, το DNA παρέμενε στη μεσόφαση και στην οργανική στοιβάδα, ενώ το RNA ήταν διαλυμένο στην ανώτερη υδατική [170]. Με ιδιαίτερη προσοχή μεταφέρθηκε η υπερκείμενη άχρωμη φάση του RNA σε καθαρό αποστειρωμένο σωληνάριο τύπου eppendorf, ενώ το αρχικό δείγμα με την ενδιάμεση και την οργανική φάση διατηρήθηκε στους -80 o C, με σκοπό να απομονωθούν αργότερα πρωτεΐνες. Στην υδατική φάση προστέθηκαν 500μL ισοπροπανόλης, (Ridel de Haen) ανά 1ml TRI και κατόπιν έντονης ανακίνησης για 5-10sec, ακολούθησε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 10min. Κατά την επόμενη φυγοκέντρηση στις 12000g για 8min στους 4 o C, το RNA κατακρημνίσθηκε ως ίζημα και με την προσθήκη 1ml αιθυλικής αλκοόλης 75% (ν/ν) σε DEPC-H 2 O [Applichem] για κάθε 1ml TRI, το ίζημα RNA ξεπλύθηκε από τυχόν άλατα. 142

159 Εν συνεχεία ακολούθησε μία τελευταία φυγοκέντρηση στις 12000g για 5min στους 4 o C μετά μία σύντομη ανάδευση του διαλύματος. Από το εκ νέου σχηματισθέν ίζημα του RNA απομακρύνθηκε το υπερκείμενο και το ίζημα αφέθηκε να στεγνώσει σε RT για 5-10min. Κατόπιν διαλύθηκε σε διάλυμα αποθήκευσης RNA (RSS) [Ambion], το οποίο περιείχε 1mM κιτρικού νατρίου σε ph 6.4. Ο όγκος του RSS που προστέθηκε (από 5 έως 30 μl για τους ιστούς και από 7 έως 35 μl για τα κύτταρα AGS), ήταν ανάλογος της ποσότητας του ιζήματος του RNA. Τέλος, το απομονωμένο ολικό RNA μεταφέρθηκε για φύλαξη στους -80 o C Ποσοτικός προσδιορισμός και ποιοτική ανάλυση του απομονωμένου ολικού RNA Η καθαρότητα και η συγκέντρωση του ολικού RNA προσδιορίστηκαν με φασματοφωτόμετρο [Ultraspec III, Pharmacia Biotech]. Συγκεκριμένα, ελήφθησαν οπτικές απορροφήσεις κάθε δείγματος στα 260nm (που είναι το μήκος κύματος απορρόφησης των αζωτούχων βάσεων των νουκλεϊκών οξέων) και στα 280nm (αντίστοιχο μήκος κύματος απορρόφησης των αρωματικών αμινοξέων των πρωτεϊνών). Η επιβεβαίωση της ακεραιότητάς έγινε με ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πήκτωμα αγαρόζης και την οπτικοποίηση των παραγομένων ζωνών κάτω από υπεριώδη φωτισμό. Σημεώνεται ότι πρόκειται για το ολικό RNA που έχει απομονωθεί, προτού ακολουθήσει η ενίσχυση των γονιδιακών αλληλουχιών (αναφοράς και στόχου). Πρέπει επίσης να αναφερθεί ότι ποσοτικός προσδιορισμός και ποιοτική ανάλυση έγιναν σε όλα τα κυτταρικά δείγματα και από τα ιστικά σε όσα υπήρχε επαρκής ποσότητα Προσδιορισμός της συγκέντρωσης και εκτίμηση της καθαρότητας του ολικού RNA (Ποσοτικός έλεγχος) Κάθε απομονωμένο ολικό RNA τοποθετήθηκε σε κυψελίδια χαλαζία [Hellma Analytics], αφού πρώτα αραιώθηκε 1/200 σε DEPC-H 2 Ο και ακολούθησαν οι μετρήσεις των οπτικών απορροφήσεων. Όταν ο λόγος (λ) της απορρόφησης στα 260 προς την απορρόφηση στα 280 (Abs260/Abs280) 143

160 κυμαινόταν μεταξύ , το απομονωμένο RNA ήταν καθαρό από τυχόν προσμίξεις με DNA και πρωτεΐνες. Στην περίπτωση λ<1.8 υπάρχει παρουσία πρωτεϊνών, ενώ όταν λ>2.2 υπάρχει υψηλή συγκέντρωση DNA. Έχοντας καταγράψει τις μετρήσεις των απορροφήσεων στα 260 και στα 280nm και κατόπιν 3 επαναλήψεων αυτών για κάθε δείγμα (κυττάρων ή ιστών), υπολογίστηκε η μέση τιμή τους. Ο μηδενισμός του φωτομέτρου έγινε με τη χρήση DEPC-H 2 Ο. Λαμβάνοντας υπ όψη την αραίωση κατά 200, ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του ολικού RNA έγινε με τη βοήθεια της μαθηματικής σχέσης: [RNA] μg/μl = μέση τιμή Abs260 x 200 x 0.04 (1) όπου 0.04μg/μL: 1 μονάδα οπτικής απορρόφησης στα 260nm αντιστοιχεί σε συγκέντρωση RNA 40μg/μL Ποιοτικός έλεγχος του ολικού RNA σε πήκτωμα αγαρόζης Η απόκτηση ενός δείγματος και η καθαρότητα του RNA, σηματοδοτούν το αρχικό βήμα κάθε διαδικασίας ποσοτικής Real Time-PCR (qrt-pcr). Η ποιότητα του εκμαγείου καθορίζει και την επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων από τα ακόλουθα πειράματα qrt-pcr. Πολλά δείγματα, ιδιαίτερα οι λήψεις τεμαχίων ανθρωπίνου ιστού, είναι μοναδικά και για το λόγο αυτό μία αποτυχημένη προετοιμασία των νουκλεϊκών οξέων σημαίνει ότι έχει χαθεί η ευκαιρία για καταγραφή δεδομένων από το συγκεκριμένο δείγμα [171]. Η μέτρηση της απορρόφησης στα 260nm ενδέχεται να υποδηλώνει την ύπαρξη ελεύθερων νουκλεοτιδίων χωρίς να διαπιστώνεται η ποιότητα του απομονωμένου RNA. Η επιβεβαίωση της ακεραιότητάς του γίνεται με την ηλεκτροφορητική ανάλυση του RNA των διαφόρων δειγμάτων σε πήκτωμα αγαρόζης και την οπτικοποίηση των παραγομένων ζωνών κάτω από υπεριώδη φωτισμό. Οι ζώνες αυτές, οι κυριότερες των οποίων είναι οι 28S και 18S rrna, αντικατοπτρίζουν την καλή ή μη ποιότητα του απομονωμένου 144

161 ολικού RNA, γεγονός που εξηγείται από την αφθονία (80% περίπου) με την οποία απαντάται το rrna μόριο στο ολικό RNA ενός ευκαρυωτικού κυττάρου. Η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης είναι ένας αντικειμενικός τρόπος εκτίμησης της ποιότητας του RNA. Είναι προφανές ότι οι διαφορές μεταξύ των δειγμάτων δεν έχουν καμία αξία αν οφείλονται στο ότι κάποιο δείγμα έχει αποδομημένο RNA. Επομένως, μετά την παρασκευή και πήξη του με ρυθμιστικό διάλυμα TBE 1x, ph 8, το πήκτωμα αγαρόζης [Bioron] 1.5% (w/v) εισήχθη στη συσκευή ηλεκτροφόρησης και καλύφθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα TBE 0.5x, ph 8. Το TBE αποτελείται από: M Tris EDTA [Applichem] Μ βορικό οξύ [Merck] και -0.01% (v/v) βρωμιούχο αιθίδιο [Sigma]. Το κάθε δείγμα, τελικού όγκου 6μL, ετοιμάστηκε ως εξής: αρχικά προστέθηκαν από 3μL διαλύματος χρώσης RNA (RNA 2x loading dye) [MBI Fermentas] που περιείχε 95% (v/v) φορμαμίδιο 0.025% (w/v) SDS, 0.025% (w/v) μπλε της βρωμοφαινόλης, 0.025% (w/v) κυανό του ξυλενίου, 0.025% (v/v) βρωμιούχου αιθιδίου και 0.5mM EDTA σε 3μL δείγματος (όγκος που αντιστοιχούσε σε 2μg RNA συμπληρωμένος με DEPC-H 2 Ο). Η συσκευή ηλεκτροφόρησης [Gel XL Ultra, Labnet International Inc] ρυθμίστηκε στα 50V για 35min σε θερμοκρασία δωματίου (RT), μετά το πέρας των οποίων το πήκτωμα φωτογραφήθηκε με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή [DC120 Zoom, Kodak] κάτω από τράπεζα UV Παρασκευή cdna με αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής Γενικά Το στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής είναι μείζονος σημασίας, γιατί η ποσότητα του παραγόμενου cdna από την αντίστροφη μεταγραφάση (Reverse Transcriptase Rtase) θα πρέπει να αντιπροσωπεύει με ακρίβεια την ποσότητα του RNA που χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο [172]. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction / RT-PCR), αποτελεί έως σήμερα 145

162 τη συνηθέστερη μέθοδο για τον χαρακτηρισμό της έκφρασης γονιδίων καθώς και για τη σύγκριση των επιπέδων έκφρασης mrna σε δείγματα από διαφορετικές ομάδες ιστών (καρκινικών και φυσιολογικών) [173]. Επιπλέον, η εφαρμογή της RT-PCR στη διεξαγωγή πειραμάτων σε πραγματικό χρόνο, την έχει καθιερώσει ως τη δημοφιλέστερη μέθοδο για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης mrna [174]. Οι αντίστροφες μεταγραφάσες (RTases) είναι ένζυμα που προέρχονται από ρετροϊούς, όπως ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) και της ηπατίτιδας C (HCV). Στο εργαστήριο, οι RTases χρησιμεύουν για τη μετατροπή του RNA σε συμπληρωματικό DNA (cdna), το οποίο μπορεί αργότερα να αποτελέσει εκμαγείο για πολλαπλούς σκοπούς, όπως στις εφαρμογές που βασίζονται στην PCR. Συνηθέστερα χρησιμοποιούνται οι αντίστροφες μεταγραφάσες AMV και M-MuLV, οι οποίες προέρχονται από τους ιούς Avian Myeloblastosis και Virus Moloney Murine Leukemia Virus αντίστοιχα [175]. Τόσο η AMV-RTase όσο και η M-MuLV-RTase, εκτός από 5' 3' πολυμεράσες, εμφανίζουν και δράση 3' 5' εξωνουκλεάσης (RNάσης- Η) κατά την οποία από το παραγόμενο RNA-cDNA υβρίδιο υδρολύεται το RNA και παραμένει αδέσμευτο το cdna [176]. Κατόπιν μπορεί να ακολουθήσει η ενίσχυσή του με συμβατική ή ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο. Η AMV-RTase μπορεί να επιτελέσει τη διαδικασία σύνθεσης με μήτρα είτε DNA είτε RNA και είναι αποτελεσματικότερη στη μεταγραφή μικρών τμημάτων mrna. Αντίθετα, η M-MuLV-RTase χρησιμοποιεί ως μήτρα μόνο RNA και αντιγράφει καλύτερα τα μεγαλύτερα τμήματα mrna. Η διαδικασία της RT-PCR (Σχήμα 1.3) ξεκινά με την προσθήκη μορίων εκκινητή στο μείγμα της αντίδρασης. Τα μόρια αυτά υβριδοποιούνται συμπληρωματικά με μόρια RNA. Οι εκκινητές εν συνεχεία επεκτείνονται με δεοξυριβονουκλεοτίδια απέναντι από τα αντίστοιχα ριβονουκλεοτίδια, χάρη στη δράση πολυμεράσης της RTase. Με τον τρόπο αυτό προκύπτει ένα σύμπλοκο mrna-cdna, μετά την υδρόλυση του οποίου (με RNάση-Η) παράγεται ένα μονόκλωνο μόριο cdna από το μόριο RNA που είχε χρησιμεύσει ως μήτρα. Υπό κατάλληλες συνθήκες αντίδρασης, η σχετική ποσότητα ενός μορίου cdna που συντίθεται, είναι ανάλογη με τη σχετική ποσότητα του εκμαγείου RNA [175] 146

163 Σχήμα 1.3 Σύνθεση cdna με αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής Ένα μόριο cdna μπορεί να δημιουργηθεί με τη χρήση τριών διαφορετικών τύπων εκκινητών: i) τα τυχαία εξαμερή, τα οποία υβριδοποιούνται μη ειδικά σε πολλαπλές θέσεις κατά μήκος κάθε RNA που χρησιμεύει ως εκμαγείο, παράγοντας έτσι περισσότερα του ενός μόρια cdna ανά αρχικό μόριο mrna [177] ii) τα ολιγονουκλεοτίδια δεοξυθυμιδίνης (oligo-dt) που είναι περισσότερο ειδικά από τα τυχαία εξαμερή και iii) οι ειδικοί για κάποιο γονίδιο-στόχο εκκινητές που συνθέτουν με μεγάλη ειδικότητα cdna παρά το ότι απαιτούνται ξεχωριστές αντιδράσεις υβριδοποίησης για κάθε στόχο [178]. 147

164 Στην τελευταία περίπτωση όμως δεν είναι δυνατό να επιστρέψουμε στο ίδιο δείγμα RNA και να ενισχύσουμε άλλους στόχους σε επόμενο στάδιο, ιδιαίτερα όταν είναι διαθέσιμες περιορισμένες ποσότητες RNA [171]. Η επιλογή της χρήσης των oligo-dt αποδεικνύεται η καταλληλότερη όταν στόχος είναι η ενίσχυση ορισμένων μορίων mrna από ένα περιορισμένο δείγμα RNA, μια και δεν μεταγράφεται rrna, όπως στην πλειοψηφία του cdna που συντίθεται από τα τυχαία εξαμερή. Τα oligo-dt ενδείκνυνται μόνο σε περιπτώσεις mrnas που διαθέτουν poly-a ουρά στο 3 άκρο τους, αφού συνδέονται με δεσμούς υδρογόνου με αυτή, συμβάλλοντας στη δημιουργία μορίων cdna από τα αντίστοιχα mrnas [171] Περιγραφή της μεθόδου Αφού ανευρέθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες της RT-PCR χρησιμοποιώντας ολικό RNA από διάφορα καρκινικά κύτταρα που υπήρχαν διαθέσιμα στο εργαστήριο, ακολούθησε η σύνθεση 20μL cdna από 1μg απομονωμένου ολικού RNA για το σύνολο των γαστρικών ιστικών δειγμάτων ή των AGS κυττάρων. Από τον τύπο (1) της συγκέντρωσης του RNA, υπολογίστηκε ο όγκος του RNA που αντιστοιχούσε σε ποσότητα 1μg σύμφωνα με τον παρακάτω τύπο: V RNA(μL) = ποσότητα (μg) ολικού RNA / [RNA] (μg/μl) (2) Αρχικά, σε φιαλίδιο PCR, τοποθετήθηκε δείγμα ολικού RNA, από τα ιστικά δείγματα ή από τα κύτταρα AGS, συνολικού όγκου 4μL σε DEPC-H 2 O και προστέθηκαν τα αντιδραστήρια, οι ποσότητες και οι συγκεντρώσεις των οποίων φαίνονται στον Πίνακα 1.6. Το διάλυμα αυτό αποτέλεσε και το μείγμα της αντίδρασης. Ο όγκος κάθε αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής ήταν 20μL. Ακολούθησε σύντομη φυγοκέντρηση [Spectrafuge, Labnet International Inc] και αμέσως τα 148

165 δείγματα τοποθετήθηκαν σε θερμικό κυκλοποιητή [MultiGene II Personal Thermal Cycler, Labnet International Inc] ώστε να εκτελεστούν οι αντιδράσεις της αντίστροφης μεταγραφής με τη χρήση του TaKaRa AMV RNA PCR-Kit αντίστροφης μεταγραφής (Takara, Otsu, Shiga, Japan). Πίνακας 1.6 Τα αντιδραστήρια, οι όγκοι και οι συγκεντρώσεις τους που αποτελούν το μείγμα της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής Αντιδραστήρια Cαρχ Όγκος (μl) Cτελ RNase-free dh 2 O MgCl 2 25 mm mm RT buffer 10x 1 x [10 mm Tris-HCL ph8.3, mm KCL] dntps (μείγμα) 10 mm mm Oligo-dT Adaptor εκκινητής 2.5 pmol/μl μm RNase αναστολέας 40 U/μL U/μL AMV RTase XL 5 U/μL U/μL RNA(1μg)+RNAase free dh 2 O Όγκος αντίδρασης 20.0 Οι παράμετροι των συνθηκών του πρωτοκόλλου της RT-PCR στο θερμικό κυκλοποιητή ήταν: i) 30 o C για 10min ώστε να υβριδοποιηθούν τα oligo-dt στην poly-a ουρά των μορίων mrna ii) 60 o C για 30min για τη δράση του πολυμερισμού της AMV-RTase iii) 99 o C για 5min για την απενεργοποίηση του ενζύμου iv) 5 o C για 5min για την απότομη ψύξη του cdna ώστε να διατηρηθεί προσωρινά Η φύλαξη όλων των μονόκλωνων cdnas έγινε στους -20 o C. 149

166 1.4.6 Ενίσχυση cdnas συγκεκριμένων αλληλουχιών με Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Γενικά Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης δημιουργήθηκε στις αρχές του 1980, όταν ο K. Mullis συνειδητοποίησε ότι ήταν εφικτό χρησιμοποιώντας ένα ζεύγος εκκινητών, να ενισχυθεί ένα τμήμα του DNA [179]. Πολλοί ερευνητές διαπίστωσαν ότι μετρώντας την ποσότητα του ενισχυμένου DNA σε κάθε κύκλο, θα μπορούσε η μέθοδος αυτή να καταστεί ποσοτική. Δέκα χρόνια αργότερα, αναπτύχθηκαν ειδικά σχεδιασμένα μηχανήματα, τα οποία συνδυάζοντας έναν θερμικό κυκλοποιητή με ένα οπτικό σύστημα, μπορούσαν να μετρήσουν ένα φθορίζον σήμα σε ένα δείγμα καθ όλη τη διάρκεια της ενίσχυσης [180]. Επειδή η συμβατική PCR αναλύει ένα προϊόν στο τέλος της αντίδρασης, δεν είναι ικανή να προσδιορίσει την αρχική ποσότητα των μορίων σε μία -ειδική για κάθε γονίδιο- αντίδραση. Αυτό οφείλεται στο ότι στο τέλος των κύκλων ενίσχυσης της PCR, η ποσότητα του ειδικού προϊόντος DNA εξαρτάται όχι μόνο από τον αριθμό των αντιγράφων-στόχων που υπήρχαν στο αρχικό δείγμα, αλλά και από τις τεχνικές μεταβολές που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια της αντίδρασης [181]. Η PCR εκμεταλλεύεται τη χρήση των DNA πολυμερασών για να ενισχύσει τμήματα του DNA χρησιμοποιώντας ειδικά ολιγονουκλεοτίδια για μια αλληλουχία-στόχο, τα οποία έχουν προστεθεί στην αντίδραση και δρουν ως εκκινητές. Το συνηθέστερο από τα ένζυμα αυτά είναι η Taq DNA πολυμεράση (από το θερμόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus). Δύο βασικές ικανότητές της την καθιστούν χρήσιμη για την PCR: 1) μπορεί να δημιουργήσει νέες αλυσίδες DNA με τη χρήση ενός εκμαγείου DNA και εκκινητών και 2) είναι θερμοανθεκτική, κάτι που είναι σημαντικό γιατί μετά κάθε κύκλο αντιγραφής, το δίκλωνο DNA (dsdna) θα πρέπει να αποδιαταχθεί πάλι σε υψηλή θερμοκρασία (95 ο C). Επομένως, μετά κάθε κύκλο PCR θα παραχθεί δύο φορές περισσότερο ειδικό dsdna εφ όσον η αντίδραση έχει τέλεια απόδοση. Στην πραγματικότητα όμως οι αποδόσεις των αντιδράσεων της PCR δεν είναι τέλειες, επειδή τα αντιδρώντα μόρια καταναλώνονται μετά πολλούς κύκλους και η αντίδραση φτάνει σε σταθερό επίπεδο (plateau). Επειδή η PCR μπορεί 150

167 να ενισχύσει επαρκώς μόνο μία ορισμένη ποσότητα DNA πριν από τη φάση σταθεροποίησης (plateau), δεν υπάρχει κανένας τρόπος αξιόπιστου υπολογισμού της ποσότητας του αρχικού μορίου DNA, αφού στη συμβατική PCR το προϊόν παράγεται μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας και δεν μπορεί να ποσοτικοποιηθεί [175] Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1.8 παρακάτω, εκτός από τη θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση, στο διάλυμα της αντίδρασης της PCR προστίθενται επίσης το μείγμα τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps), ένα ζεύγος χημικά συντεθιμένων εκκινητών, ρυθμιστικό διάλυμα κατάλληλου ph και ιοντικής ισχύος και συγκέντρωση χλωριούχου μαγνησίου. Η τελική συγκέντρωση των τεσσάρων dntps (datp, dttp, dgtp και dctp) που κυμαίνεται συνήθως μεταξύ μΜ, επιδρά (αν είναι υψηλότερη της βέλτιστης) στην πιστότητα της αντιγραφής από την Taq πολυμεράση επιτρέποντας την εισαγωγή λανθασμένων δεοξυριβονουκλεοτιδίων και επηρεάζει (σε χαμηλότερες τιμές της) την απόδοση της PCR. Η σύνδεση των Mg 2+ στοιχειομετρικά με τα dntps δημιουργεί διαλυτά σύμπλοκα, τα οποία ενσωματώνονται ευκολότερα στο προς ενίσχυση μόριο DNA. Τα ιόντα Mg 2+ ως συμπαράγοντας της DNA πολυμεράσης, παίζουν καθοριστικό ρόλο στην απόδοση της αντίδρασης PCR, μια και αυτή ελαττώνεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις τους. Σε αντίθετη περίπτωση παράγονται μη ειδικά προϊόντα εξαιτίας της σταθερής πρόσδεσης των εκκινητών σε μη συμπληρωματικές θέσεις [176, 182]. Πηγή για τα ιόντα μαγνησίου αποτελεί η προσθήκη MgCl 2 στο μείγμα της αντίδρασης Μέθοδος α) Σχεδιασμός και χαρακτηριστικά των εκκινητών της Συμβατικής PCR Προϋπόθεση για τον επιτυχημένο πολλαπλασιασμό τμήματος της αλληλουχίας-στόχου σε μια αντίδραση PCR, καθώς και για την εξάλειψη τυχόν μη ειδικών προϊόντων, αποτελεί ο σχεδιασμός δύο διαφορετικών μεταξύ τους εκκινητών. Οι εκκινητές αυτοί θα πρέπει να συνδέονται με απόλυτη συμπληρωματικότητα με τα άκρα του προς ενίσχυση τμήματος DNA. 151

168 Παράμετροι για το σχεδιασμό ειδικών εκκινητών Τα ζεύγη των κατάλληλων εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στη συγκεκριμένη εργασία, σχεδιάστηκαν με τη βοήθεια των λογιστικών προγραμμάτων Primer Premier 5.00 και Primer Output 3. Οι παράμετροι που ελήφθησαν υπ όψη και συμπεριλήφθηκαν στη διαδικασία αυτή συνοψίζονται στα εξής: 1) οι εκκινητές κυμάνθηκαν σε μήκος νουκλεοτίδια και σχεδιάστηκαν ώστε να υβριδοποιούνται στην περιοχή του ενδιαφέροντός μας 2) περιείχαν ποσοστό G+C βάσεων 40-60% και δόθηκε ιδιαίτερη προσοχή στην αποφυγή αλληλουχιών που θα μπορούσαν να δημιουργήσουν ενδογενείς δευτεροταγείς δομές (πχ φουρκέτες) 3) Τα 3 άκρα των δύο εκκινητών δεν ήταν συμπληρωματικά μεταξύ τους ώστε να μη συμβεί παραγωγή διμερών των εκκινητών 4) αποφεύχθηκε η παρουσία τριών G ή C νουκλεοτιδίων στη σειρά κοντά στο 3 άκρο κάθε εκκινητή, διότι αυτό θα είχε ως αποτέλεσμα τη μη ειδική σύνδεση του εκκινητή, αυξάνοντας τη σύνθεση ανεπιθύμητων προϊόντων της αντίδρασης 5) προτιμήθηκε η παρουσία ενός ή το πολύ δύο G ή C νουκλεοτιδίων στο 3 άκρο του εκκινητή, ώστε να αποτρέπονται οι μη ειδικές δεσμεύσεις, διότι οι τρεις δεσμοί υδρογόνου που σχηματίζει ένα ζεύγος GC, το σταθεροποιούν θερμοδυναμικά πάνω στην αλληλουχία-στόχο 6) οι δύο εκκινητές διέθεταν σχεδόν όμοιες (με διαφορά στα μεταξύ τους T m <2 o C) θερμοκρασίες τήξης, έτσι ώστε να υβριδοποιούνται ειδικά και οι δυο στην ίδια θερμοκρασία. Γενικά, η θερμοκρασία υβριδισμού της αντίδρασης εξαρτάται από τον εκκινητή εκείνο με τη χαμηλότερη T m. Για έναν εκκινητή έως 20 νουκλεοτιδια (nt), το T m του υπολογίζεται μαθηματικά από τον παρακάτω τύπο: T m = (No G+C) x 4 o C + (No A+T) x 2 o C (3) 152

169 όπου No ο αριθμός των αντίστοιχων βάσεων που περιέχονται στο σύνολο των 20 νουκλεοτιδίων (nt) του εκκινητή [176, 183]. Χαρακτηριστικά εκκινητών για το γονίδιο αναφοράς GAPDH και το γονίδιοστόχο KLK13 (κλασσική ισομορφή) Ο έλεγχος της απόδοσης της αντίστροφης μεταγραφής είναι πολύ σημαντικός και για το λόγο αυτό μια κοινή πρακτική είναι η χρησιμοποίηση ενός ή περισσοτέρων γονιδίων βασικών λειτουργιών, όπως η αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής γκυκεραλδεΰδης (GAPDH) για την κανονικοποίηση των επιπέδων έκφρασης άλλων γονιδίων [182, 184], στην προκειμένη περίπτωση του υπό μελέτη γονιδίου της καλλικρεΐνης 13 (KLK13). Με βάση τις αλληλουχίες mrna του γονιδίου GAPDH (2597) και της κλασσικής ισομορφής του γονιδίου KLK13 (AF135024) που είναι δημοσιευμένες σε βάσεις δεδομένων (NCBI), σχεδιάστηκε από ένα ζεύγος κατάλληλων εκκινητών της PCR για την επιλεκτική ενίσχυση τμήματος cdna του αντίστοιχου γονιδίου (Πίνακας 1.7). Πίνακας 1.7 Χαρακτηριστικά των εκκινητών της συμβατικής PCR για το γονίδιο GAPDH και την κλασσική μορφή του γονιδίου KLK13 Όνομα Εκκινητή GAPDH sense primer Αλληλουχίες 5 -CCA CAT CGC TCA GAC ACC AT-3 GAPDH anti-sense primer 5 -TGA CAA GCT TCC CGT TCT CA-3 Μέγεθος προϊόντος 240 bp KLK13 sense primer 5 -CAG CCC CCA GGT GAA TTA C-3 KLK13 anti-sense primer 5 -CAG GAG ACG ATG CCA TAC AGT-3 Μέγεθος προϊόντος 204 bp Για την αποφυγή επιμόλυνσης του προϊόντος της PCR από γενωμικό DNA, όλοι οι εκκινητές επιλέχτηκαν να σχεδιαστούν σε διαφορετικά εξώνια ώστε να παρεμβάλλεται τουλάχιστον ένα εσώνιο. Για παράδειγμα, ένα τμήμα cdna του μεταγράφου του γονιδίου GAPDH ενισχύθηκε με την υβριδοποίηση 153

170 ενός πρόσθιου εκκινητή σε τμήμα του δεύτερου εξωνίου (GAPDH ex2f) και ενός ανάστροφου σε τμήμα του τέταρτου εξωνίου (GAPDH ex4r). Ομοίως στην περίπτωση του KLK13. β) Συνθήκες συμβατικής PCR για τα γονίδια GAPDH και KLK13 σε γαστρικούς ιστούς και καρκινικά κύτταρα AGS Η ποιότητα του απομονωμένου ολικού RNA και κατ επέκταση του cdna που συντίθεται, ελέγχθηκε με αντίδραση PCR για το γονίδιο σταθερής έκφρασης GAPDH. Τα επονομαζόμενα γονίδια βασικών λειτουργιών εκφράζονται συνεχώς σε κύτταρα και ιστούς και επομένως έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί ως γονίδια ενδογενούς ελέγχου του RNA για ποιοτικές και ποσοτικές RT-PCR αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης [171]. Το γονίδιο GAPDH, κωδικοποιώντας το ένζυμο που καταλύει το σχηματισμό του 1,3- διφωσφογλυκερινικού οξέος από την 3-φωσφορική γλυκεραλδεΰδη, συμμετέχει στη βιοχημική πορεία της γλυκόλυσης αποτελώντας έτσι το κατεξοχήν γονίδιο αναφοράς [182]. Χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο cdna από τα AGS κύτταρα, πραγματοποιήθηκε αρχικά μια σειρά διερευνητικών αντιδράσεων που στόχευαν στην επιλογή των βέλτιστων συνθηκών της PCR για την ενίσχυση των cdnas του γονιδίου GAPDH και του υπό εξέταση γονιδίου KLK13. Εν συνεχεία, με το εξειδικευμένο ζεύγος εκκινητών (βλέπε α) για κάθε γονίδιο, οι βελτιστοποιημένες πλέον συνθήκες της αντίδρασης εφαρμόστηκαν στα cdnas του συνόλου των ιστολογικών δειγμάτων στομάχου για το γονίδιο GAPDH. Έγινε με τον τρόπο αυτό έμμεσος έλεγχος για όλα τα δείγματα της ποιότητας του RNA (εφόσον ενισχύθηκε το cdna σημαίνει ότι το RNA ήταν κατάλληλο) και έτσι καλύφθηκε το ότι δεν έγινε σε όλα τα δείγματα ποιοτικός έλεγχος σε αγαρόζη λόγω της μικρής τους ποσότητας όπως περιγράφηκε στην ενότητα Σε ό,τι αφορά το γονίδιο KLK13, έγινε PCR δειγματοληπτικά για την ενίσχυση του cdna, για να δούμε τη διαβάθμιση της έκφρασης του εν λόγω γονιδίου. Περιγραφή της μεθόδου Σε ένα σωληνάριο τύπου eppendorf ετοιμάστηκε το μείγμα κάθε αντίδρασης PCR, το οποίο περιείχε τα αντιδραστήρια με τη σειρά που 154

171 περιγράφονται παρακάτω (Πίνακας 1.8). Στο μείγμα αυτό προστέθηκαν στο τέλος και 1,2μL cdna από ιστολογικό δείγμα στομάχου ή 1μL cdna από καρκινικά κύτταρα, ώστε ο συνολικός του όγκος να είναι 50μL. Σε όλα τα πειράματα είχε συμπεριληφθεί και ένας αρνητικός μάρτυρας (NC), από τον οποίο απουσίαζε ο όγκος του cdna και στη θέση του προστέθηκε αντίστοιχος όγκος από DEPC-H2O [Applichem]. Μόλις η θερμοκρασία της πλάκας είχε φτάσει στους 95 C περίπου, το σύνολο των μικροφιαλιδίων εισήχθη στο θερμικό κυκλοποιητή [MultiGene II Personal Thermal Cycler, Labnet International Inc] για να επιτελεστεί η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Πίνακας 1.8 Αντιδραστήρια συμβατικής PCR για τα γονίδια GAPDH και KLK13 σε γαστρικούς ιστούς και καρκινική κυτταρική σειρά στομάχου Αντιδραστήρια Cαρχ Όγκος (μl) Cτελ DEPC-H 2 O (για τους ιστούς) ή (για τα κύτταρα) Colorless GoTaq Flexi buffer 5x x [50 mm Tris-HCl ph9.0, 50 mm ΝaCl] dntps (μείγμα) 10 mm mm από έκαστο MgCl 2 25mM mm Εκκινητής F 100 pmol/μl pmol/μl ή 1 μm Εκκινητής R 100 pmol/μl pmol/μl ή 1 μm GoTaq Flexi DNA 5 U/μL U/μL polymerase(promega) cdna ή DEPC-H 2 O 50 ng/μl 1.2 (για τους ιστούς) ή 1.0 (για τα κύτταρα) 1.2 ng/μl Συνολικός όγκος μείγματος

172 Στην περίπτωση των ιστολογικών δειγμάτων, τα στάδια του θερμικού πρωτοκόλλου της αντίδρασης PCR περιλάμβαναν: i) μία αρχική αποδιάταξη για 2min στους 95 C ii) 38 κύκλους (για το γονίδιο GAPDH) ή 39 κύκλους (για το γονίδιo στόχο) από τα επιμέρους στάδια: -αποδιάταξη για 30sec στους 95 C -υβριδισμός των εκκινητών για 30sec στους 60 C (για το γονίδιο GAPDH) ή στους 62 C (για τo γονίδιo στόχο ) -επιμήκυνση από την Taq πολυμεράση για 1min στους 72 C -τελική επέκταση στην ίδια θερμοκρασία για 5min. Σε ό,τι αφορά τα κύτταρα AGS, για την ενίσχυση του cdna των αντίστοιχων γονιδίων ακολουθήθηκαν τα ίδια προαναφερόμενα στάδια, αλλά οι κύκλοι επανάληψης αυτών ήταν 36 για το γονίδιο GAPDH και 39 για το KLK13. Μετά τη σύντομη διατήρησή τους στους 4 C, όλα τα προϊόντα της PCR μεταφέρθηκαν για φύλαξη στους -20 C. γ) Ποιοτική ανάλυση των προϊόντων της PCR μετά την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Η ανίχνευση των προϊόντων της PCR μέσω της ηλεκτροφόρησης, επιτυγχάνεται χάρη στην ικανότητα των δίκλωνων μορίων DNA να κινούνται με διαφορετική ταχύτητα μέσα στο πήκτωμα αγαρόζης, όταν εφαρμοστεί στο διάλυμα που το διαβρέχει ηλεκτρικό πεδίο. Τα μόρια DNA καθώς μετακινούνται από την κάθοδο (αρνητικό ηλεκτρόδιο) προς την άνοδο (θετικό ηλεκτρόδιο) με ρυθμό αντιστρόφως ανάλογο του δεκαδικού λογαρίθμου (log10) του μοριακού τους βάρους, διαχωρίζονται με βάση το μήκος της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας, τη διαμόρφωσή τους στο χώρο και την επί τοις εκατό (%) περιεκτικότητα της αγαρόζης στο πήκτωμα. Συνεπώς, τα προϊόντα DNA διαφορετικού μεγέθους εμφανίζονται στο πήκτωμα ως ξεχωριστές, διακριτές ζώνες, οι χαμηλότερες εκ των οποίων αντιστοιχούν σε μικρότερα μόρια, μια και αυτά μετακινούνται ταχύτερα μέσα στους πόρους του πηκτώματος και φτάνουν μακρύτερα από το σημείο φόρτωσής τους συγκριτικά με τα μεγαλομοριακά προϊόντα. Αυτά τα τελευταία, επειδή ακριβώς δυσχεραίνεται η κίνησή τους διαμέσου των πόρων του πλέγματος της 156

173 αγαρόζης, σχηματίζουν τις υψηλότερες ζώνες (πλησίον του σημείου φόρτωσης). Με την ενσωμάτωση μιας κοινής φθορίζουσας χρωστικής, γνωστής ως βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) στο πήκτωμα και την τοποθέτησή του σε τράπεζα υπεριώδους (UV) φωτός, οι συγκεκριμένες ζώνες μπορούν να γίνουν ορατές και να καταγραφεί η συσσώρευση του DNA με μία βιντεοκάμερα. Είναι γνωστό από το 1966, ότι το EtBr φθορίζει όταν παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων στα νουκλεϊκά οξέα [185]. Περιγραφή της μεθόδου Αρχικά γίνεται ανάμιξη 1.5 (w/v) αγαρόζης [Bioron] με TBE 1x, ph=8, το οποίο αποτελείτο από 0.089M Tris, 0.002M EDTA [Applichem] και 0.089M βορικό οξύ [Merck]. Ακολουθεί ομογενοποίηση του διαλύματος με ανάδευση και θέρμανση στους 120 o C και κατόπιν προσθήκη σε αυτό βρωμιούχου αιθιδίου (0.01% v/v) [Sigma]. Το διάλυμα τέλος αφέθηκε να πήξει σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 1h πριν από την εισαγωγή του πηκτώματος στη συσκευή της ηλεκτροφόρησης. Ο χρόνος πήξης εξαρτάται από την ποσοστιαία σε βάρος περιεκτικότητα του διαλύματος σε αγαρόζη (όσο πιο πυκνό είναι το διάλυμα, τόσο συντομότερο είναι αυτό το χρονικό διάστημα). Έγινε πλήρωση της συσκευής ηλεκτροφόρησης με ρυθμιστικό διάλυμα TBE 0.5x, ph=8, έτσι ώστε το πήκτωμα να διαβραχεί πλήρως για να μη στεγνώσει όσο γινόταν η προετοιμασία των δειγμάτων. Ποσότητα 15μL από κάθε προϊόν PCR αναμείχθηκε με 2μL διαλύματος χρώσης DNA (DNA 6x loading dye) που περιείχε (40% w/v) σουκρόζη και (0,25% w/v) μπλε βρωμοφαινόλη [186]. Παράλληλα, για τον προσδιορισμό του μεγέθους των προϊόντων της PCR, ετοιμάστηκε και ένας δείκτης γνωστών μοριακών βαρών DNA [Gene RulerTM, Fermentas] (μεγέθους έως 1Kb, διαβάθμισης ανά 100bp). Συγκεκριμένα, σε 4,5μL DEPC-H2O προστέθηκε 1μL διαλύματος χρώσης DNA και 0,5μL από το διάλυμα δείκτη μοριακών βαρών του DNA. Μόλις ολοκληρώθηκε η διαδικασία φόρτωσης, έλαβε χώρα η ηλεκτροφόρηση, σε συσκευή [Gel XL Ultra, Labnet International Inc], στα 100V σε RT για 35min ή 40min, ανάλογα με το μέγεθος κάθε αναμενόμενου προϊόντος της PCR. Τα αποτελέσματα εκτιμήθηκαν και οι μεταβολές των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων αναλύθηκαν μετά από εμφάνιση των ζωνών DNA κάτω από UV φως και τη 157

174 φωτογράφησή τους με ειδική ψηφιακή φωτογραφική μηχανή [DC120 Zoom, Kodak] Μεθοδολογία ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο (qreal-time PCR) Γενικά Η ανάπτυξη της ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο (quantitative Real-time PCR), αποτελεί μία πολλά υποσχόμενη καινοτομία στα πρωτόκολλα που ήδη εφαρμόζονται στη συμβατική RT-PCR. Η αντίδραση PCR σε πραγματικό χρόνο βασίζεται στο φαινόμενο του φθορισμού και αποτελεί μία από τις πιο ικανές μεθόδολογίες για την ανίχνευση του mrna [174]. Η Real-time PCR είναι μια πολύτιμη και αξιόπιστη μέθοδος, η οποία μπορεί να αναπαράγει επαναλήψιμα αποτελέσματα με βιολογική σημασία [171]. Οι παρακάτω παράγοντες έχουν συμβάλλει στη μετατροπή αυτής της τεχνολογίας σε ένα απαραίτητο ερευνητικό εργαλείο: α) ως πειραματική διαδικασία περιλαμβάνει την ενίσχυση και την ανάλυση γονιδίων χωρίς την ανάγκη χρήσης πηκτώματος, ραδιενέργειας ή περαιτέρω χειρισμού του προς ανάλυση δείγματος [187] β) ένα μεγάλο εύρος επιτρέπει την απευθείας σύγκριση μεταξύ των διαφορετικών RNAs γ) η χρήση των προτύπων καμπύλων επιτρέπει τη σύγκριση μεταξύ των πειραμάτων, ενώ τα γονίδια αναφοράς επιλύουν το θέμα της μεταβλητότητας των αρχικών ποσοτήτων των μορίων (τα οποία λειτουργούν ως εκμαγεία) καθώς και το θέμα τυχόν λάθους από το χειριστή δ) η μέθοδος αυτή επεκτείνει τη δυνατότητα της συμβατικής PCR ώστε να μπορεί να καταστεί και ποσοτική [188] Η Real-time PCR αναφέρεται στην ενίσχυση του cdna, μέσω της αντίδρασης PCR. Το όφελος της PCR σε πραγματικό χρόνο είναι ότι επιτρέπει στον ερευνητή να παρακολουθεί την αντίδραση τη στιγμή που αυτή πραγματοποιείται [175]. Μετά το πέρας της αντίδρασης μπορεί να προσδιορισθεί, κατόπιν ανάλυσης των αποτελεσμάτων, η αρχική ποσότητα μιας ειδικής αλληλουχίας DNA στο 158

175 δείγμα, η οποία αντανακλά το βαθμό της έκφρασης ενός συγκεκριμένου γονιδίου [189]. Η συγκεκριμένη μεθοδολογία χρησιμοποιείται συνηθέστερα για δύο λόγους: είτε ως κύριο ερευνητικό εργαλείο προσδιορισμού της γονιδιακής έκφρασης, είτε ως δευτερεύον εργαλείο επικύρωσης των αποτελεσμάτων από τις μικροσυστοιχίες του DNA. Εξαιτίας της ακρίβειας και της υψηλής ευαισθησίας της Real-time PCR, μπορούν να ανιχνευτούν και να εκτιμηθούν ακόμα και ελάχιστες αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων σε επίπεδο RNA [175]. Η ποσοτική Real-time PCR εφαρμόζεται και στην περίπτωση που επιθυμείται η ενίσχυση μικρών μορίων, όπως και σε αυτήν όπου οι αλληλουχίες-στόχοι διαφέρουν σε έναν μικρό αριθμό βάσεων κάτι που συμβαίνει, για παράδειγμα, στα micrornas (mirnas) [189]. α) Σχεδιασμός και ιδιότητες των εκκινητών της ποσοτικής Real-time PCR Κατά την οργάνωση ενός πειράματος ποσοτικής PCR, το πρώτο βήμα είναι η επιλογή ενός ζεύγους εκκινητών για την αντίδραση, προκειμένου να ενισχυθεί μόνο το επιθυμητό τμήμα DNA από τα υπό εξέταση γονίδιαστόχους. Ένα ζεύγος εκκινητών θεωρείται αποδεκτό, όταν είναι δυνατό να ανευρεθεί μία θερμοκρασία υβριδισμού στην οποία θα πραγματοποιείται ενίσχυση ενός μόνο ειδικού προϊόντος σε θετικούς μάρτυρες [180]. Ένα επόμενο βήμα προϋποθέτει ότι για να είναι ακριβής η ποσοτικοποίηση, απαιτούνται ζεύγη εκκινητών που να εξασφαλίζουν τη μέγιστη δυνατή απόδοση της ενίσχυσης. Οι επιλεγμένοι εκκινητές κρίνονται για την αποτελεσματικότητά τους με τη χρήση του χημικού συστήματος SYBR Green I και τη συνακόλουθη ανάλυση των προϊόντων με το σχηματισμό των καμπυλών τήξης [190]. β) Χημικά συστήματα ανίχνευσης στην qreal-time PCR Όπως προαναφέρθηκε, ο βασικός σκοπός της ποσοτικής Real-time PCR είναι να ενισχύσει με ακρίβεια σε ένα δείγμα, ειδικές αλληλουχίες ενός νουκλεϊκού οξέος, ακόμη και όταν αυτές απαντώνται σε έναν πολύ μικρό αριθμό αντιγράφων. Η παρακολούθηση της διαδικασίας ενίσχυσης μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας-στόχου, καθώς αυτή εξελίσσεται σε πραγματικό χρόνο, επιτυγχάνεται χάρη στα ειδικά χημικά συστήματα φθορισμού καθώς 159

176 και στην αυτοματοποιημένη οργανολογία της qreal-time PCR [175]. Έχουν αναφερθεί διάφοροι τύποι ανιχνευτών: οι ειδικοί και οι μη-ειδικοί ανιχνευτές [171]. Ειδικοί ανιχνευτές Στην πρώτη κατηγορία των ειδικών ανιχνευτών ανήκουν εκείνοι με δύο φθορίζουσες χρωστικές, όπως οι ανιχνευτές υδρόλυσης (Taqman probes), το ζεύγος ανιχνευτών υβριδισμού DNA (hybridization probes), οι μοριακοί φάροι (molecular beacons) και οι εκκινητές σκορπιοί (scorpion primers). Τα συστήματα αυτά αποτελούν παραδείγματα που βασίζονται στο φαινόμενο μεταφοράς ενέργειας συντονισμού με φθορισμό (FRET), όπου από ένα μόριο με διεγερμένα ηλεκτρόνια (το φθορισμοφόρο-δότη, reporter), μεταφέρεται ενέργεια σε ένα γειτονικό μόριο (αποδέκτη, quencher) όταν αυτά βρεθούν σε μία συγκεκριμένη απόσταση και το φάσμα εκπομπής του μορίου-δότη επικαλύπτεται με το φάσμα διέγερσης του μορίου-αποδέκτη. Όλες οι προαναφερόμενες χημικές χρωστικές ακολουθούν την ίδια αρχή: ένα φθορίζον σήμα καταγράφεται μόνο αν ο ειδικός στην προς ενίσχυση αλληλουχία ανιχνευτής, υβριδοποιείται συμπληρωματικά προς αυτή [171, 175]. Μη ειδικοί ανιχνευτές Η μη-ειδική ανίχνευση χρησιμοποιεί χρωστικές, όπως η SYBR Green I, οι οποίες προσδένονται σε κάθε δίκλωνο μόριο DNA που προκύπτει κατά την αντίδραση PCR και αυξάνουν τον εκπεμπόμενο φθορισμό [171]. Η SYBR Green I είναι μια χρωστική ασύμμετρης κυανιδίνης με δύο αρωματικά συστήματα που περιέχουν άζωτο, ένα από τα οποία είναι θετικά φορτισμένο (Σχήμα 1.4Α). Οι συγκεκριμένες χρωστικές δεν εκπέμπουν φθορισμό όταν βρίσκονται ελεύθερες στο διάλυμα της αντίδρασης, εξαιτίας δονήσεων και από τα δύο αρωματικά συστήματα. Οι δονήσεις αυτές μετατρέπουν την ενέργεια διέγερσης των ηλεκτρονίων σε θερμότητα που διαχέεται στον περιβάλλοντα διαλύτη. Από την άλλη, όταν οι χρωστικές αυτές προσδένονται στη μικρή αύλακα του δίκλωνου DNA (dsdna), έχουν την ικανότητα να φθορίζουν έντονα [191]. 160

177 Σχήμα 1.4 Χημικό σύστημα μη ειδικής ανίχνευσης στην Real-time PCR: Α] δομή ασύμμετρης κυανιδίνης της χρωστικής SYBR Green I Β] η SYBR Green I φθορίζει απορροφώντας σε μήκος κύματος 480nm και εκπέμποντας φως στα 520nm Γ] φθορισμός εκπέμπεται μόνο όταν ενώνεται με δίκλωνο DNA (οπότε και παράγει το ανάλογο σήμα) [346,361]. Η συγγένεια πρόσδεσης της SYBR Green I είναι περισσότερο από 100 φορές μεγαλύτερη από την αντίστοιχη του βρωμιούχου αιθιδίου. Καθώς διεγείρεται από μπλε φως σε μήκος κύματος 480nm, το φάσμα εκπομπής της SYBR Green I φτάνει σε ένα μέγιστο στα 520nm (Εικόνα 1.4Β). Ο εκπεμπόμενος φθορισμός της χρωστικής, είναι κατά 1000 φορές υψηλότερος όταν αυτή είναι προσδεμένη σε σύγκριση με όταν είναι ελεύθερη στο διάλυμα. Επομένως, όσο περισσότερη είναι η ποσότητα του dsdna στο μείγμα της αντίδρασης, τόσο ισχυρότερο είναι το φθορίζον σήμα από την SYBR Green I [175]. Κατά το στάδιο αποδιάταξης των δύο αλυσίδων DNA στην αρχή κάθε κύκλου της qreal-time PCR, απελευθερώνονται τα μόρια της χρωστικής τα οποία παράγουν πολύ χαμηλό σήμα φθορισμού, που αντιστοιχεί σε αυτό του υποβάθρου. Καθώς όμως υβριδοποιούνται οι 161

178 εκκινητές στην αλληλουχία-στόχο και επεκτείνονται οδηγώντας στη δημιουργία δίκλωνων προϊόντων PCR, αυξάνεται ο αριθμός των προσδεδεμένων στο νεοσυντιθέμενο DNA μορίων της χρωστικής. Ως αποτέλεσμα, παράγεται μεγαλύτερο φθορίζον σήμα που εξαρτάται από την ποσότητα του προϊόντος που προκύπτει σε κάθε κύκλο της αντίδρασης (Εικόνα 1.4Γ). Οι διαδικασίες που χρησιμοποιούν χρωστικές προσδεδεμένες στο DNA παρουσιάζουν δύο πλεονεκτήματα ως προς εκείνες που βασίζονται στους ειδικούς ανιχνευτές: (1) μπορούν να χρησιμοποιηθούν με οποιοδήποτε ζεύγος εκκινητών ειδικών για ένα στόχο, καθιστώντας την χρήση του λιγότερο ακριβή και (2) μπορούν να ενσωματωθούν επί μακρών σε καθιερωμένα πρωτόκολλα με τη χρήση ειδικών εκκινητών κάτω από βελτιστοποιημένες πειραματικές συνθήκες [171]. Συχνά διατυπώνεται ότι η μη-ειδική ανίχνευση κάθε δίκλωνου DNA με τη χρήση αυτών των χρωστικών αποτελεί μειονέκτημα για την ειδικότητα της qreal-time PCR αντίδρασης, γεγονός που δεν συμβαίνει όταν χρησιμοποιούνται ειδικοί για την αλληλουχία ιχνηθέτες. Κάτι τέτοιο όμως δεν είναι απόλυτα σωστό, γιατί τα προϊόντα που ενισχύονται μη-ειδικά αλλοιώνουν την απόδοση ενίσχυσης των ειδικών προϊόντων. Η ενίσχυση μηειδικών προϊόντων, όπως τα διμερή των εκκινητών, οδηγεί σε συστηματικό σφάλμα στην ποσοτικοποίηση ανεξάρτητα από την ανίχνευση ή μη των μηειδικών προϊόντων. Αυτό γιατί ο σχηματισμός διμερών των εκκινητών παρεμβαίνει στη δημιουργία των ειδικών προϊόντων εξαιτίας ανταγωνισμού μεταξύ τους και μπορεί να οδηγήσει σε εσφαλμένες διαπιστώσεις. Επομένως, για την ποσοτική ανάλυση, η συγκεκριμένη μεθοδολογία θα πρέπει να βελτιστοποιηθεί πρωτίστως ώστε να μην υπάρχουν μη-ειδικά προϊόντα [192]. Με την προϋπόθεση ότι πραγματοποιήθηκε προσεκτικός σχεδιασμός των εκκινητών και βελτιστοποιήθηκαν οι συνθήκες της αντίδρασης, η ανίχνευση με SYBR Green I είναι αρκετά ευαίσθητη ώστε να αναγνωρίσει ένα μόνο μόριο-στόχο στο μείγμα της αντίδρασης [192]. Ωστόσο, η επιβεβαίωση της ενίσχυσης με qreal-time PCR της επιθυμητής αλληλουχίας, γίνεται με ανάλυση της καμπύλης τήξης του προϊόντος για τον προσδιορισμό του σημείου τήξης (Tm), ελέγχοντας στην πράξη την παραγωγή τυχόν διμερών των εκκινητών. Σε περίπτωση εμφάνισης περισσοτέρων της μιας κορυφών, 162

179 διαπιστώνεται ότι έχουν ενισχυθεί περισσότερες της μίας αλληλουχιών και έτσι η ενίσχυση δεν ήταν ειδική για έναν μόνο DNA- στόχο. Οι καμπύλες τήξης αντιπροσωπεύουν την εξάρτηση του φθορισμού από τη θερμοκρασία. Καταγράφονται μετά την ολοκλήρωση της PCR και αποτελούν μοναδική ιδιότητα κάθε προϊόντος που βασίζεται στο μέγεθος και τη νουκλεοτιδική του σύσταση. Σε αυτή την ανάλυση η θερμοκρασία διαδοχικά αυξάνεται και ο φθορισμός μετριέται ως συνάρτηση της θερμοκρασίας. Καθώς αυξάνεται η θερμοκρασία, εξαιτίας της αυξημένης θερμικής κίνησης που επιτρέπει μεγαλύτερη ενδογενή περιστροφή στη προσδεδεμένη χρωστική, ελαττώνεται ο φθορισμός. Όταν όμως η θερμοκρασία φτάσει στην τιμή εκείνη κατά την οποία αποδιατάσσεται η διπλή έλικα του DNA, τότε η χρωστική απελευθερώνεται στο διάλυμα και τα επίπεδα του φθορισμού μειώνονται απότομα [191]. Αυτή η θερμοκρασία, αναφερόμενη ως Tm του προϊόντος, είναι εκείνη στην οποία συμβαίνει η πιο απότομη μείωση του σήματος και αντιστοιχεί στη μέγιστη τιμή κορυφής της πρώτης αρνητικής παραγώγου της καμπύλης τήξης [191, 192]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα μη-ειδικά προϊόντα έχουν διαφορετικά μεγέθη και επομένως οι Tm τους διαφέρουν από αυτή των ειδικών προϊόντων, ενώ τα προϊόντα από τα διμερή των εκκινητών είναι μικρότερα σε μέγεθος από το προϊόν-στόχο και έτσι τήκονται σε χαμηλότερη θερμοκρασία από αυτό. γ) Βασικές αρχές της μεθόδου qreal-time PCR Στην αντίδραση PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιείται η Taq πολυμεράση θερμής-έναρξης (hot start), ένα ένζυμο που είναι χημικά τροποποιημένο ώστε να είναι απενεργοποιημένο σε χαμηλή θερμοκρασία. Εξαιτίας της μεταβολής του ph σε υψηλή θερμοκρασία, η χημική τροποποίηση είναι ασταθής στους 95 C και το ένζυμο αυτό ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια των σταδίων αποδιάταξης της αντίδρασης PCR [180]. Η ποσοτική αντίδραση PCR διεξάγεται με εναλλαγές της θερμοκρασίας σε 3 διαδοχικά στάδια: α) υψηλή θερμοκρασία εφαρμόζεται για τον αποχωρισμό (τήξη) των δύο αλυσίδων του dsdna και την ενεργοποίηση του ενζύμου β) κατόπιν η θερμοκρασία ελαττώνεται για να επιτραπεί ο υβριδισμός των εκκινητών στο εκμαγείο και 163

180 γ) τελικά ρυθμίζεται γύρω στους 72 C, η οποία είναι η βέλτιστη για τη δράση της DNA πολυμεράσης και την επακόλουθη ενσωμάτωση των dntps (Σχήμα 1.5A). Συνοπτικά, το τυπικό πειραματικό πρωτόκολλο της qreal-time PCR περιλαμβάνει: μια αρχική αποδιάταξη (στους 95 C) και ένα στάδιο ενίσχυσης με επανάληψη των κύκλων αποδιάταξης / υβριδοποίησης / επιμήκυνσης [180, 191]. Παρότι η βέλτιστη θερμοκρασία για την Taq πολυμεράση είναι περίπου 72 C, και είναι αυτή που χρησιμοποιείται στα περισσότερα πρωτόκολλα 3 βημάτων PCR, υπάρχουν και άλλα όπου η επιμήκυνση επιτελείται στους 60 C [191]. Η ποσοτική PCR προσφέρει την ευκαιρία για παρατήρηση της κινητικής της ενίσχυσης μιας αντίδρασης PCR σε πραγματικό χρόνο, μέσω της συσσώρευσης και μέτρησης ειδικών φθοριζόντων σημάτων σε κάθε κύκλο [193]. Η ποσότητα του εκπεμπόμενου φθορισμού είναι ανάλογη της ποσότητας του σχηματιζόμενου προϊόντος, επιτρέποντας έτσι τον έλεγχο της αντίδρασης PCR. Κάθε δείγμα υφίσταται τέσσερα διαφορετικά κινητικά στάδια ενίσχυσης. Συγκεκριμένα, κατά τους αρχικούς κύκλους (φάση θορύβου) το σήμα είναι ασθενές και δε μπορεί να διαχωριστεί από το επίπεδο του υποβάθρου. Όσο το ποσό του προϊόντος συσσωρεύεται, αναπτύσσεται ένα σήμα φθορισμού που αρχικά αυξάνει εκθετικά (λογαριθμική φάση). Από εκεί και πέρα το σήμα φθίνει και επέρχεται κορεσμός αυτού, αποτέλεσμα της κατανάλωσης, κατά τη διάρκεια της αντίδρασης, κάποιων σημαντικών συστατικών, όπως οι εκκινητές, η χρωστική ή τα dntps. Επιπροσθέτως, ο αριθμός των μορίων της πολυμεράσης μπορεί να περιοριστεί, περίπτωση κατά την οποία η λογαριθμική ενίσχυση μετατρέπεται σε γραμμική (γραμμική φάση) για να καταλήξει στη φάση κορεσμού (plateau) (Σχήμα 1.5Β) [180, 191]. 164

181 Σχήμα 1.5 Απεικόνιση των κύκλων θερμοκρασίας (Α) και αναπαράσταση μιας τυπικής καμπύλης ενίσχυσης της qreal-time PCR (B) [361] Αξίζει να σημειωθεί ότι σε ένα τυπικό πείραμα Real-time PCR, όλες οι καμπύλες ενίσχυσης φτάνουν σε κορεσμό στο ίδιο επίπεδο. Συνεπώς, οι μετρήσεις PCR τελικού-σημείου δεν μας παρέχουν καμία πληροφορία σχετικά με τις αρχικές ποσότητες των μορίων-στόχων που βρίσκονται στα δείγματα, διακρίνουν μόνο το θετικό από το αρνητικό δείγμα [191]. Στο στάδιο της λογαριθμικής φάσης (log phase), η κινητική της PCR μπορεί να περιγραφεί με την ακόλουθη εξίσωση: Rn = Ro x (1+E) n (4) όπου Rn και Ro είναι ποσότητες του φθορίζοντος σήματος (σε αυθαίρετες μονάδες και ανάλογες με την ποσότητα του προϊόντος DNA) μετά από 0 (Ro) ή n (Rn) κύκλους, αντίστοιχα. Η απόδοση (Ε) της αντίδρασης είναι 0 Ε 1 σε μία βελτιστοποιημένη πειραματική δοκιμασία, όπου η Ε είναι κοντά στο 1 προτού η PCR φτάσει στη φάση plateau [184, 194]. Από την ανωτέρω σχέση, γίνεται εμφανές ότι η απόδοση της αντίδρασης παίζει πρωταρχικό ρόλο στη διαδικασία της ενίσχυσης. Εξαρτάται, μάλιστα, συχνά από το μήκος και την αλληλουχία του προς ενίσχυση DNA, το σχεδιασμό των εκκινητών, τις συγκεντρώσεις Mg 2+ και dntps στο ρυθμιστικό διάλυμα, τις θερμοκρασίες και τους χρόνους για κάθε βήμα ενός κύκλου της 165

182 PCR. Ακόμα και στην ίδια αντίδραση, η απόδοση μπορεί να αλλάξει κατά την πορεία της ενίσχυσης ως συνέπεια απώλειας της ενζυμικής ενεργότητας της πολυμεράσης, της συσσώρευσης των πυροφωσφορικών μορίων και της κατανάλωσης των αντιδραστηρίων. Η απόδοση προσεγγίζει το μηδέν, όσο η PCR πλησιάζει στη φάση plateau. Για τους λόγους αυτούς, είναι πολύ δύσκολο, αν όχι ακατόρθωτο, να ποσοτικοποιηθεί άμεσα το Ro μετρώντας το Rn μετά από κάποιους, προκαθορισμένου αριθμού, κύκλους της PCR. Η qreal-time PCR έρχεται να επιλύσει ορισμένους από αυτούς τους περιορισμούς, μια και εκτός από τους πρώτους λίγους κύκλους, όπου το προϊόν της PCR είναι ελάχιστο για να ποσοτικοποιηθεί, η απόδοση κάθε αντίδρασης μπορεί να υπολογιστεί με ακρίβεια [184] Ο εκπεμπόμενος φθορισμός των χρωστικών ανίχνευσης DNA (reporter dyes) καταγράφεται ανά κύκλο κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR. Για την ποσοτικοποίηση των νουκλεϊκών οξέων, ένα ορισμένο επίπεδο φθορισμού το οποίο είναι 10 φορές η τυπική απόκλιση του μέσου σήματος του εκπεμπόμενου φθορισμού αρχικών κύκλων (του θορύβου), χρησιμοποιείται για να ορίσει τον κύκλο κατωφλίου (Ct). Κάτω από ιδανικές συνθήκες, η αριθμητική τιμή του Ct είναι αντιστρόφως ανάλογη του λογαρίθμου της συγκέντρωσης (αριθμός αντιγράφων) του εκμαγείου-στόχου (δηλαδή του DNA) στην αντίδραση [355]. Δηλαδή, ο φθορισμός ελαττώνεται όσο πλησιάζουμε τη φάση plateau (όπου έχουμε το μεγαλύτερο αριθμό αντιγράφων) [184]. Συνεπώς, λιγότεροι κύκλοι ενίσχυσης απαιτούνται για την παραγωγή ενός αριθμού προϊόντων που περιέχουν περισσότερα αντίγραφα του γονιδίου - στόχου. Παρουσιάζοντας τα δεδομένα ως τιμές Ct, επιβεβαιώνει κανείς ότι η PCR βρίσκεται πάντα στην εκθετική φάση ενίσχυσης, ξεπερνώντας το πρόβλημα της φάσης πλατό της συμβατικής-pcr [184, 189]. Μάλιστα, το Ct αντιστοιχεί στο σημείο όπου η εκθετική καμπύλη ενίσχυσης διχοτομεί το σήμα κατωφλίου και εκφράζει το επίπεδο φθορισμού των αρχικών κύκλων (Σχήμα 1.5Β). Χρησιμοποιώντας οποιαδήποτε από τις χημικές χρωστικές, η αύξηση στον εκπεμπόμενο φθορισμό λαμβάνει χώρα κατά την πορεία της αντίδρασης και είναι μία άμεση συνέπεια της ενίσχυσης του στόχου κατά την PCR. Ένα ειδικό λογισμικό πρόγραμμα (Sequence Detection System, SDS) υπολογίζει το Rn σύμφωνα με την εξίσωση: 166

183 ΔRn = Rn + Rn - (5) όπου το Rn + είναι ο φθορισμός που εκπέμπει το προϊόν σε κάθε χρονικό σημείο και Rn - είναι ο φθορισμός εκπομπής στη φάση του θορύβου (baseline), δηλαδή η προηγούμενη σχέση αποκτά την εξής απλουστευμένη μορφή [365]: ΔRn = Rn baseline (6) Σε μια τυπική καμπύλη ενίσχυσης (Σχήμα 1.5Β), έχει επέλθει αριθμητική διόρθωση, αφαιρώντας την τιμή του φθορισμού του θορύβου (baseline) από όλες τις μετρούμενες τιμές φθορισμού του προϊόντος σε κάθε ξεχωριστό δείγμα [180]. Αυτές οι καμπύλες κατασκευάζονται από το ειδικό λογισμικό του προγράμματος του υπολογιστή, χρησιμοποιώντας τα δεδομένα της εκπομπής φθορισμού που συλλέγονται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR. Έτσι, οι τιμές Rn σχεδιάζονται ως προς τον αριθμό των κύκλων της αντίδρασης. Στους αρχικούς κύκλους της PCR, οι τιμές αυτές δεν ξεπερνούν το επίπεδο του θορύβου [195]. Σημειώνεται ότι το σήμα της χρωστικής ανίχνευσης (πχ της SYBR Green I), ομαλοποιείται χάρη σε μία παθητική χρωστική αναφοράς τη ROX. Η συγκεκριμένη χρωστική έχει ως ρόλο τη διόρθωση της διακύμανσης του φθορισμού, η οποία αποδίδεται σε διαφορές της συγκέντρωσης της χρωστικής ανίχνευσης μεταξύ των ταυτόχρονα επιτελούμενων διαφορετικών αντιδράσεων. Συνεπώς, η εξομαλυνθείσα τιμή φθορισμού (Rn) προκύπτει από το κλάσμα: 167

184 Rn = R (SYBR Green I) / R (ROX) (7) Με βάση τη μεταβλητότητα του θορύβου (baseline) που ρυθμίζεται αυτόματα από το πρόγραμμα μεταξύ 3-15 κύκλων ή εφόσον είναι απαραίτητο χειροκίνητα από τον χρήστη για κάθε ανεξάρτητο πείραμα, επιλέγεται ένα αυθαίρετο κατώφλι (threshold). Τέλος υπολογίζονται οι τιμές Ct καθορίζοντας το σημείο στο οποίο ο φθορισμός υπερβαίνει αυτό το επιλεγμένο όριο κατωφλίου [195] δ) Ανάλυση και έλεγχος των προϊόντων της ποσοτικής Real-time PCR Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τα πειράματα της ποσοτικής Real-time PCR, δύο διαφορετικές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν, η απόλυτη και η σχετική ποσοτικοποίηση [195]. Η απόλυτη ποσοτικοποίηση προσδιορίζει τον ακριβή αριθμό αντιγράφων μιας επιθυμητής αλληλουχίας σε ένα δεδομένο δείγμα, συσχετίζοντας συνήθως το σήμα της PCR με μια πρότυπη καμπύλη [175, 196]. Η δημιουργία της πρότυπης καμπύλης προϋποθέτει την ύπαρξη ενός δείγματος γνωστής ποσότητας αντιγράφων του υπό εξέταση γονιδίου, το οποίο μπορεί να αραιωθεί διαδοχικά. Μετρώντας την συγκέντρωση αυτών των προτύπων DNA ή RNA δειγμάτων φασματοφωτομετρικά στα 260nm, υπολογίζεται ο αριθμός των αντιγράφων χρησιμοποιώντας και το μοριακό βάρος του νουκλεϊκού οξέος [195]. Για την απόλυτη ποσοτικοποίησή τους, τα άγνωστα δείγματα συγκρίνονται με την πρότυπη καμπύλη. Η σχετική ποσοτικοποίηση περιγράφει την αλλαγή στην έκφραση ενός γονιδίου-στόχου ως προς ένα άλλο γονίδιο, το οποίο αναφέρεται ως γονίδιο αναφοράς (ομαλοποίηση ως προς το γονίδιο αναφοράς). Το δείγμα αναφοράς ονομάζεται βαθμονομητής (calibrator) [189, 196]. Μεταξύ των γονιδίων βασικών λειτουργιών που συνήθως δρουν επαρκώς ως γονίδια αναφοράς, συγκαταλέγονται τα γονίδια GAPDH, β-ακτίνη, β2- μικροσφαιρίνη και το rrna [368]. 168

185 Διάφορες μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί μέσα στα τελευταία χρόνια για την παρουσίαση των επιπέδων της σχετικής έκφρασης ενός γονιδίου. Μια εναλλακτική μέθοδος σχετικής ποσοτικοποίησης στην οποία χρησιμοποιούνται μαθηματικοί τύποι για τον υπολογισμό των επιπέδων σχετικής έκφρασης ενός υπό μελέτη γονιδίου, σε σύγκριση με ένα δείγμαβαθμονομητή, είναι η μέθοδος σύγκρισης των Ct (κύκλοι κατωφλίου - threshold cycles). Στη μέθοδο αυτή, η ποσότητα του γονιδίου στόχου ομαλοποιημένη ως προς το γονίδιο εσωτερικού ελέγχου και σε σχέση με την αντίστοιχη έκφραση στο βαθμονομητή, περιγράφεται με τη σχέση: 2 -ΔΔCt όπου: 2 -ΔΔCt -[ΔCt (δείγματος) - ΔCt (βαθμονομητή)] = 2 ΔCt (δείγματος) = Ct (γονιδίου στόχου δείγματος) - Ct (γονιδίου αναφοράς δείγματος) ΔCt (βαθμονομητή) = Ct (γονιδίου στόχου βαθμον) - Ct (γονιδίου αναφοράς βαθμον) Στην ουσία, το ΔΔCt είναι η διαφορά μεταξύ της μέσης τιμής ΔCt ενός δείγματος με τη μέση τιμή ΔCt για τον βαθμονομητή. Συνεπώς, η παραπάνω σχέση αναπαριστά την ομαλοποιημένη έκφραση του γονιδίου στόχου σε ένα δείγμα (κυτταρικό ή ιστικό), σε σχέση με την ομαλοποιημένη έκφραση στον βαθμονομητή. Εν συνεχεία, η ομαλοποιημένη ποσότητα (2 -ΔΔCt ) του γονιδίου στόχου πολλαπλασιάζεται με το λόγο [mrna αντίγραφα γονιδίου στόχου / mrna αντίγραφα γονιδίου αναφοράς] για το γονίδιο αυτό στο βαθμονομητή. Ο συγκεκριμένος λόγος αφορά στις σχετικές μονάδες έκφρασης (RQ units), που αντιστοιχούν υπό προϋποθέσεις σε mrna αντίγραφα γονιδίου στόχου / mrna αντίγραφα γονιδίου αναφοράς [195, 196]. Κατόπιν, ο λόγος αυτός πολλαπλασιάστηκε για κάθε ιστολογικό δείγμα με το 1000, οπότε προέκυψε ο λόγος [mrna αντίγραφα γονιδίου στόχου / 10 3 αντίγραφα γονιδίου αναφοράς]. Η μέθοδος αυτή δίνει συγκρίσιμα αποτελέσματα, ανεξάρτητα από τα επίπεδα mrna του γονιδίου στόχου στο βαθμονομητή. 169

186 Η εφαρμογή της μεθόδου 2 -ΔΔCt είναι εφικτή εφόσον οι αποδόσεις ενίσχυσης του γονιδίου στόχου και του γονιδίου αναφοράς είναι περίπου ίσες [195, 196]. Η απόδοση (Ε) της αντίδρασης PCR μπορεί να εκτιμηθεί από μία καμπύλη αναφοράς, η οποία βασίζεται σε σειριακές αραιώσεις, (με εύρος από 100-0,1ng cdna), ενός δείγματος θετικού για την επιθυμητή αλληλουχία (π.χ. του βαθμονομητή). Η απόδοση αυτή υπολογίζεται από τη σχέση: Ε = (10-1/s ) - 1 όπου s είναι η κλίση (slope) της καμπύλης. Ο σχεδιασμός της καμπύλης αυτής περιέχει τις τιμές Ct των αραιωμένων δειγμάτων στον άξονα y και στον άξονα x, το δεκαδικό λογάριθμο των συγκεντρώσεών τους, ή τον αριθμό των αντιγράφων του εκμαγείου ή ενός παράγοντα αραίωσης [191]. Μια θεωρητική απόδοση 1 (100%), θα έδινε τιμή κλίσης -3.32, γεγονός που θα σήμαινε διπλασιασμό των ειδικών προϊόντων για ένα γονίδιο από κύκλο σε κύκλο [194]. Είναι σημαντικό να είναι καλή η απόδοση της αντίδρασης PCR, ώστε να είναι περισσότερο επαναλήψιμα τα αποτελέσματα [180]. Ζεύγη εκκινητών για τα οποία δεν είναι δυνατή η εύρεση συνθηκών που να οδηγούν σε απόδοση μεγαλύτερη από 0.8 (80%), δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ακριβείς ποσοτικοποιήσεις. Μια άλλη ευαίσθητη μέθοδος για να εκτιμηθεί αν δύο γονίδια (στόχου και αναφοράς) έχουν την ίδια απόδοση, είναι με την παρατήρηση της διακύμανσης του ΔCt ως προς τις διαδοχικές αραιώσεις του υποστρώματος. Αν η απόλυτη τιμή της κλίσης της συγκεκριμένης καμπύλης (ΔCt ως προς τη μάζα του αραιωμένου cdna) είναι κοντά στο 0.1, τότε οι αποδόσεις των αντιδράσεων για τα δύο γονίδια είναι παρόμοιες και η μέθοδος 2 -ΔΔCt μπορεί να χρησιμεύσει στην ανάλυση των αποτελεσμάτων σχετικής ποσοτικοποίησης του γονιδίου-στόχου [196]. 170

187 Ειδικά Ο σχεδιασμός της ποσοτικής Real-Time PCR για την παρούσα μελέτη, έγινε όπως περιγράφεται στη συνέχεια. α) Παράγοντες για το σχεδιασμό των ειδικών εκκινητών Εφαρμόζοντας τα όσα προαναφέρθηκαν στην ενότητα 6 ( ) σχετικά με το σχεδιασμό των εκκινητών της συμβατικής-pcr, στην αντίστοιχη περίπτωση του σχεδιασμού των εκκινητών της qreal-time PCR συμπεριλήφθηκαν άλλες δύο παράμετροι. Αυτές ορίστηκαν αυστηρά από το λογισμικό πρόγραμμα Primer Express, το οποίο παρέχεται από την Applied Biosystems. Σε συνδυασμό με τη χρήση του Primer Premier 5.00, τα δύο αυτά προγράμματα αποτέλεσαν τη βάση για το σχεδιασμό διαφορετικών ζευγών ειδικών εκκινητών για τα γονίδια της παρούσας μελέτης. Συγκεκριμένα, οι επιπλέον παράγοντες αφορούσαν: (i) τη θερμοκρασία αποδιάταξης (Tm) των εκκινητών, η οποία θα έπρεπε να είναι μεταξύ C, ώστε να μπορούν οι εκκινητές να υβριδοποιούνται απολύτως, ειδικά στην αλληλουχία-στόχο κατά το στάδιο της επέκτασης της PCR (στάδιο που επιτελείται στους 60 C) ένα πλεονέκτημα αυτού του στενού εύρους είναι ότι οι συνθήκες ανά κύκλο θερμοκρασίας για την ενίσχυση στην PCR είναι ταυτόσημες για όλους τους στόχους και (ii) τα μεγέθη των προϊόντων θα έπρεπε να επιλέγονται όσο το δυνατόν μικρότερα, δηλαδή από 50 έως 150bp, μολονότι έχουν ενισχυθεί με καλή απόδοση προϊόντα μέχρι και 300bp [195]. β) Ιδιότητες εκκινητών για τα γονίδια GAPDH και KLK13 Για την επιλεκτική ενίσχυση τμημάτων cdna του γονιδίου της δεϋδρογονάσης της3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) (2597) και της κλασσικής ισομορφής του γονιδίου της πεπτιδάσης σχετιζόμενης με την καλλικρεΐνη 13 (KLK13) (AF135024), σχεδιάστηκαν δύο ζεύγη ειδικών εκκινητών (Πίνακας 1.9), σύμφωνα με στοιχεία δημοσιευμένα σε βάση δεδομένων (NCBI). Το ζεύγος εκκινητών για το GAPDH αποτελείτο από έναν ανοδικό εκκινητή (5 -ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3 ) και έναν καθοδικό εκκινητή (5 -GGG TCA TTG ATG GCA ACA ATA-3 ), που οδήγησαν σε ένα 171

188 προϊόν 107bp (ζευγών βάσεων). Για την κλασσική ισομορφή του KLK13, ο πρόσθιος εκκινητής προσδένεται με την αλληλουχία 5 -CAG CCC CCA GGT GAA TTA C-3 και ο ανάστροφος με την 5 -CAG GAG ACG ATG CCA TAC AGT-3, παράγοντας προϊόν 204bp. Πίνακας 1.9 Ιδιότητες των εκκινητών της ποσοτικής Real-time PCR για το γονίδιο GAPDH και την κλασσική μορφή του γονιδίου KLK13 Όνομα Εκκινητή GAPDH sense primer Αλληλουχίες 5 -ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3 GAPDH anti-sense primer 5 -GGG TCA TTG ATG GCA ACA ATA TC-3 Μέγεθος προϊόντος 107bp KLK13 sense primer 5 -CAG CCC CCA GGT GAA TTA C-3 KLK13 anti-sense primer 5 -CAG GAG ACG ATG CCA TAC AGT-3 Μέγεθος προϊόντος 204bp γ) Συνθήκες ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο για τα γονίδια GAPDH και KLK13 στους ιστούς στομάχου και στα AGS κύτταρα καρκινικής σειράς Όλες οι αντιδράσεις της ποσοτικής Real-time PCR στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του χημικού συστήματος ανίχνευσης SYBR Green I στο θερμικό κυκλοποιητή 7500 Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA), (ευγενική χορηγία του Ιδρύματος Μποδοσάκη). Η πολυμεράση θερμής-έναρξης η οποία χρησιμοποιήθηκε ήταν η AmpliTaq Gold Low DNA πολυμεράση. Τα αποτελέσματα από την ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου-στόχου ΚLΚ13 στα καρκινικά και στα φυσιολογικά ιστικά δείγματα στομάχου καθώς και στα κύτταρα AGS, αναλύθηκαν με το λογισμικό SDS v

189 Σχετικά με το γονίδιο GAPDH, είναι γνωστό ότι εκφράζεται σε σταθερά επίπεδα, τα οποία δεν μεταβάλλονται κάτω από πειραματικές συνθήκες [197]. Ως εκ τούτου, χρησίμευσε ως γονίδιο αναφοράς για τον υπολογισμό, στην PCR, της ποσότητας του RNA που προστέθηκε στις αντιδράσεις της αντίστροφης μεταγραφής [196]. Τα καρκινικά κύτταρα AGS γαστρικού αδενοκαρκινώματος, αποτέλεσαν το βαθμονομητή για όλες τις qreal-time PCR αντιδράσεις ενίσχυσης των προαναφερθέντων γονιδίων. Διερευνητικές αντιδράσεις έγιναν και στην ποσοτική PCR, όπως και σε όλες τις PCR με τη χρήση των AGS. Συγκεκριμένα, πριν από τη μελέτη, η επιβεβαίωση της μεθόδου έγινε με την κατασκευή προκαθορισμένων γραφικών παραστάσεων για το GAPDH και το KLK13 από AGS RNA για 8 διαφορετικές τιμές μάζας (από 100ng έως 0.5ng). Πραγματοποιήθηκε έτσι έλεγχος αποδοσης της αντίδρασης για δύο λόγους: α) επιβεβαιώθηκε αν η μέθοδος είναι αξιόπιστη για την ενίσχυση των γονιδίων και β) καθορίστηκε το min και max C T ώστε το κάθε δείγμα να συμπεριληφθεί ή όχι. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως ( β ), για την επιβεβαίωση της ειδικότητας των σχηματισθέντων προϊόντων κατόπιν ενίσχυσης τμήματος cdna των αντίστοιχων γονιδίων, ακολούθησε ανάλυση των προϊόντων αυτών με καμπύλες τήξης (Tm) για τον έλεγχο της παρουσίας τυχόν διμερώνεκκινητών ή μη-ειδικών προϊόντων. Καμπύλες τήξης: γίνονται μετά την PCR, με αποδιάταξη της διπλής έλικας σε υψηλή θερμοκρασία (αποτελεί επιπλέον βήμα μετά το πέρας της PCR). Περιγραφή της μεθόδου Η ενίσχυση με ποσοτική Real-Time PCR κάθε δείγματος (ιστολογικού ή κυτταρικού), έλαβε χώρα σε τριπλέτες μέσα στο πλακίδιο 96 θέσεων για καθένα από τα δύο γονίδια GAPDH και KLK13. Για την ορθή σύγκριση και συνακόλουθη επεξεργασία των αποτελεσμάτων, αναλύθηκε απαραίτητα σε κάθε πλακίδιο και το δείγμα-βαθμονομητής. Συγκεκριμένα, παρασκευάστηκε κοινό μείγμα για κάθε γονίδιο που περιείχε DEPC-H2O [Applichem], Power SYBR Green PCR Master Mix (2 ) [Applied Biosystems], το οποίο αποτελείτο από τη χρωστική SYBR Green I, την AmpliTaq Gold DNA πολυμεράση (Low 173

190 DNA,LD), ένα μείγμα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps), μία παθητική χρωστική αναφοράς (ROX), ένα ρυθμιστικό διάλυμα με MgCl 2 και το αντίστοιχο ζεύγος ανοδικού και καθοδικού εκκινητή. Ακολούθησε κατανομή ίσων ποσοτήτων από το μείγμα κάθε γονιδίου (20ng cdna από κάθε δείγμα), ώστε ο τελικός όγκος σε καθεμία από τις δύο αντίστοιχες θέσεις του πλακιδίου [MicroAmp Optical, Applied Biosystems] να είναι 10μL (Πίνακας 1.10). Προκειμένου να αποφευχθεί επιμόλυνση καθώς και εξάτμιση των δειγμάτων, το πλακίδιο σφραγίστηκε με αυτοκόλλητη μεμβράνη [Kisker] και εισήχθη στην ειδική θήκη του μηχανήματος της Real-Time PCR [ABI 7500 Real-Time PCR System, Applied Biosystems], ώστε να αρχίσει η αντίδραση της ποσοτικής Real-Time PCR. Πίνακας 1.10 Αντιδραστήρια ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο για τα γονίδια GAPDH και KLK13 σε ιστούς στομάχου Αντιδραστήρια Cαρχ Όγκος (μl) Cτελ DEPC-H 2 O Power SYBR Green PCR Master Mix 2x 5 1x Εκκινητής F για το GAPDH για το KLK nm 750 nm nm 75 nm Εκκινητής R για το GAPDH για το KLK nm 750 nm nm 75 nm cdna ή DEPC-H 2 O 20 ng/μl ng/μl Συνολικός όγκος δείγματος 10 Οι συνθήκες της αντίδρασης της qreal-time PCR περιελάμβαναν: (α) ένα στάδιο στους 95 C για 10min, το οποίο είναι προαπαιτούμενο για την αποδιάταξη και ενεργοποίηση της AmpliTaq Gold DNA πολυμεράσης (hot start), με σκοπό να αποτραπεί η λανθασμένη υβριδοποίηση των εκκινητών σε μη-επιθυμητά τμήματα του εκμαγείου και (β) 40 κύκλους της αντίδρασης, οι οποίοι αποτελούνται από ένα στάδιο αποδιάταξης στους 95 C για 15sec και ένα στάδιο υβριδοποίησης και επέκτασης των εκκινητών στους 60 C για 1min. 174

191 Μετά το πέρας της αντίδρασης PCR σε πραγματικό χρόνο, έγινε ανάλυση της καμπύλης τήξης και προσδιορισμός της Tm. Με τον τρόπο αυτό πιστοποιήθηκε η παρουσία των προϊόντων-στόχων της PCR και η απουσία διμερών εκκινητών ή μη-ειδικών προϊόντων. Με τη βοήθεια του λογισμικού προγράμματος SDS v [Applied Biosystems], ακολούθησε ο σχετικός ποσοτικός προσδιορισμός των προϊόντων της qreal-time PCR. δ) Σχετική ποσοτικοποίηση της έκφρασης της κλασσικής μορφής του γονιδίου KLK13 με τη μέθοδο 2 -ΔΔCt στους ιστούς στομάχου και στα καρκινικά κύτταρα AGS Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τα πειράματα της ποσοτικής Real-time PCR, χρησιμοποιήθηκε η μεθοδος της σχετικής ποσοτικοποίησης. Συγκεκριμένα ακολουθήθηκε η μέθοδος σύγκρισης των Ct (κύκλοι κατωφλίου - threshold cycles), στην οποία χρησιμοποιήθηκαν μαθηματικοί τύποι για τον υπολογισμό των επιπέδων σχετικής έκφρασης του υπό μελέτη γονιδίου (KLK13), σε σύγκριση με το δείγμα-βαθμονομητή (κύτταρα AGS). Η ποσότητα του γονιδίου στόχου (KLK13) ομαλοποιημένη ως προς το γονίδιο εσωτερικού ελέγχου (GAPDH) και σε σχέση με την αντίστοιχη έκφραση στο βαθμονομητή, υπολογίστηκε από τη σχέση: 2 -ΔΔCt όπου: 2 -ΔΔCt -[ΔCt (ιστικού δείγματος) - ΔCt (κυττάρων AGS)] = 2 ΔCt (δείγματος) = Ct (KLK13 δείγματος) - Ct (GAPDH δείγματος) ΔCt (AGS) = Ct (KLK13 AGS) - Ct (GAPDH AGS) Όπως έχει ήδη αναφερθεί, το ΔΔCt είναι στην ουσία η διαφορά μεταξύ της μέσης τιμής ΔCt στο ιστικό δείγμα με τη μέση τιμή ΔCt για τα κύτταρα AGS. Εν συνεχεία, η ομαλοποιημένη ποσότητα (2 -ΔΔCt ) του γονιδίου-στόχου KLK13, πολλαπλασιάστηκε με το λόγο [mrna αντίγραφα KLK13 / mrna αντίγραφα GAPDH] για το γονίδιο αυτό στα κύτταρα AGS. Ο υπολογισμός αυτός κατέστη 175

192 αναγκαίος ώστε τα αποτελέσματά μας, στα 80 ιστολογικά γαστρικά δείγματα, να είναι ανεξάρτητα από την έκφραση του γονιδίου KLK13 στα κύτταρα AGS (βαθμονομητής). Κατόπιν, ο λόγος αυτός πολλαπλασιάστηκε για κάθε ιστολογικό δείγμα με το 1000, οπότε προέκυψε ο λόγος [mrna αντίγραφα KLK13 / 10 3 αντίγραφα GAPDH]. 176

193 1.5 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Επειδή τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου KLK13 στους ασθενείς με καρκίνο του στομάχου δεν ακολουθούσαν κανονική κατανομή, η ανάλυση των διαφορών στα επίπεδα έκφρασης μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών ιστικών δειγμάτων, διεξήχθη με το μη παραμετρικό Mann-Whitney U test καθώς επίσης και με το Wilcoxon Sign test. Έτσι, οι τιμές για το γονίδιο KLK13 ταξινομήθηκαν σε δύο κατηγορίες (KLK13- θετικοί και KLK13-αρνητικοί ασθενείς), ανάλογα με το αν η έκφραση του γονιδίου σε κάθε δείγμα βρέθηκε μεγαλύτερη ή μικρότερη από το αντίστοιχο σημείο διάκρισης (cut-off point). Αναλύθηκαν επίσης οι όποιες συσχετίσεις της κάθε μιας εκ των δύο αυτών κατηγοριών, με άλλες ποιοτικές μεταβλητές χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Fisher s Exact test. Οι σχέσεις μεταξύ των διαφορετικών συνεχών μεταβλητών εκτιμήθηκαν με τον συντελεστή συσχέτισης Spearman. Η ικανότητα των μεταβλητών να προβλέψουν την υποτροπή ή το θάνατο μελετήθηκε με τη χρήση μονομεταβλητών και πολυμεταβλητών μοντέλων λογιστικής παλινδρόμησης. Προκειμένου να ταξινομήσουμε τους ασθενείς σε υψηλές και χαμηλές κατηγορίες, είναι συχνά πρακτικό να κατηγοριοποιούνται οι συνεχείς μεταβλητές. Υπάρχουν αρκετές μέθοδοι που προσδιορίζουν το σημείο διάκρισης (cut-off point), το οποίο μεγιστοποιεί τις διαφορές μεταξύ των ομάδων που μελετώνται. Για παράδειγμα, στην περίπτωση που χρησιμοποιείται η μέθοδος καθορισμού της διαμέσου στα βιολογικά δείγματα (διαδικασία βέλτιστης τιμής-p ), μπορεί να προκύψει μία σημαντική διακύμανση λαθών τύπου Ι. Ο αλγόριθμος X-Tile ο οποίος έχει αναπτυχθεί πρόσφατα, επιτρέπει τον καθορισμό ενός βέλτιστου σημείου διάκρισης (optimal cut-off point), διορθώνοντας τη χρήση της ελάχιστης τιμής-p (p-value) στη στατιστική ανάλυση [198]. Συνοπτικά, σε περίπτωση πολλών συγκρίσεων, η εύρεση της ελάχιστης τιμήςp που γίνεται με τη χρήση της δοκιμασίας log-rank, ενέχει τον κίνδυνο να παρουσιαστούν ψευδώς αυξημένες τιμές έως και 40%. Η διόρθωση που πραγματοποιείται, προσαρμόζεται κατάλληλα ώστε η τιμή-p να εμφανίζει ένα αληθώς υψηλό ποσοστό της τάξης του 5%. 177

194 Μια και το γονίδιο KLK13 δεν έχει ακόμα ευρέως μελετηθεί στον γαστρικό καρκίνο, δεν υπάρχουν καθιερωμένα σημεία διάκρισης (cut-off points) που να είναι διαθέσιμα για την έκφρασή του στον τύπο αυτό καρκίνου. Επομένως, για την κατηγοριοποίηση των επιπέδων έκφρασης του KLK13 χρησιμοποιήθηκε ο αλγόριθμος X-Tile για να δημιουργήσει το βέλτιστο cut-off point. Χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι στατιστικής διόρθωσης της χρήσης της ελάχιστης τιμής-p. Η πρώτη περιλάμβανε τον υπολογισμό της τιμής-p Monte Carlo για τη δημιουργία του βέλτιστου cut-off σημείου, με τη χρήση του X-Tile αλγορίθμου. Τιμές-p μικρότερες από 0.05 θεωρούνται ισχυρές και είναι απίθανο να αντιπροσωπεύουν λάθη τύπου Ι. Η δεύτερη μέθοδος περιλάμβανε τη διόρθωση της ελάχιστης τιμής-p κατά Miller-Siegmund [199]. Στην παρούσα μελέτη, το βέλτιστο cut-off point (σημείο διάκρισης) υπολογίστηκε σε 121c/Kc, το οποίο βρέθηκε να ισούται με το 65 ο εκατοστημόριο της έκφρασης mrna του γονιδίου KLK13 στο αδενοκαρκίνωμα του στομάχου. Με βάση τα παραπάνω, οι τιμές για το γονίδιο KLK13 ταξινομήθηκαν σε δύο κατηγορίες (KLK13-θετικοί και KLK13-αρνητικοί ασθενείς), ανάλογα με το αν η έκφραση του γονιδίου σε κάθε δείγμα βρέθηκε μεγαλύτερη ή μικρότερη από το αντίστοιχο cut-off point. Ακολούθως, αναλύθηκαν οι όποιες συσχετίσεις της κάθε μιας εκ των δύο αυτών κατηγοριών, με άλλες ποιοτικές μεταβλητές χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Fisher s Exact test. Η ανάλυση της επιβίωσης κατά Kaplan-Meier, οδήγησε στην κατασκευή καμπυλών επιβίωσης ελεύθερης νόσου (disease-free survival, DFS) και συνολικής επιβίωσης (overall survival, OS), οι διαφορές των οποίων συνεκτιμήθηκαν με το log-rank test. Επιπλέον, για να εκτιμηθεί η σχέση μεταξύ των υπό διερεύνηση προγνωστικών δεικτών και του σχετικού κινδύνου εμφάνισης υποτροπών ή θανάτου στους ασθενείς με καρκίνο στομάχου, αναπτύχθηκαν μοντέλα μονομεταβλητής και πολυμεταβλητής παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου κατά Cox. Η μονομεταβλητή ανάλυση δείχνει την ισχύ της σχέσης καθεμιάς από τις κλινικοπαθολογικές μεταβλητές ως προς το DFS ή το OS. Στην πολυμεταβλητή λογιστική ανάλυση, συμπεριλήφθηκαν μόνο ασθενείς για τους 178

195 οποίους υπήρχαν πλήρη ιατρικά δεδομένα σε ό,τι αφορά τις τιμές των μεταβλητών της ανάλυσης. 179

196 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 - ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.1 Έκφραση του γονίδιου αναφοράς GAPDH σε όλα τα δείγματα ιστών και του γονιδίου KLK13 σε κύτταρα καρκινικής σειράς και σε ιστολογικά δείγματα στομάχου Τα αρχικά ευρήματα της μελέτης, τα οποία ήταν και καθοριστικά για τη συνέχισή της, ήταν: 1) Αποδείχτηκε η έκφραση του γονίδιου αναφοράς GAPDH σε όλα τα δείγματα ιστών (Εικόνα 2.1Α), κάτι που αποτελούσε προϋπόθεση για την ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του προς μελέτη γονιδίου KLK13 2) Η μελέτη της έκφρασης του γονιδίου KLK13 με συμβατική PCR στην κυτταρική σειρά γαστρικού καρκίνου (AGS), έδειξε την παρουσία της κλασσικής μορφής του γονιδίου που αντιστοιχούσε σε προϊόν 204bp (Εικόνα 2.1Β). Ως εκ τούτου, η κυτταρική σειρά AGS μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως θετικός μάρτυρας και ως βαθμονομητής τόσο στην ποιοτική PCR, όσο και στην ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (Εικόνα 2.2). 3) Διαπιστώθηκε διαβαθμισμένη έκφραση του γονιδίου-στόχου KLK13 στους ιστούς ασθενών, τόσο στους φυσιολογικούς, όσο και στους καρκινικούς (Εικόνες 2.1Β, 2.2Α). 180

197 Εικόνα 2.1 Επίπεδα έκφρασης mrna των γονιδίων GAPDH (Α) και KLK13 (Β) σε ιστούς ασθενών και στα καρκινικά κύτταρα AGS Απεικονίζονται αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από 5 ζεύγη ιστών: φυσιολογικά δείγματα 1,3,5,7,9 και καρκινικά δείγματα 2,4,6,8,10 M: δείκτης Μοριακού Βάρους DNA, NC: Negative Control 181