Διδακτορική Διατριβή

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Πατρών Τμήμα Χημείας Διδακτορική Διατριβή Σχεδιασμός, σύνθεση και αξιολόγηση αναλόγων των ανοσοκυρίαρχων επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης που εμπλέκονται στη σκλήρυνση κατά πλάκας Ανθούλα Ταπεινού Χημικός Πάτρα 2016

2

3 University of Patras Department of Chemistry PhD Thesis Design, synthesis and evaluation of analogues of myelin proteins immunodominant epitopes implicated in multiple sclerosis Anthoula Tapeinou Chemist Patras 2016

4

5 Επιβλέπων: Θεόδωρος Τσέλιος Αναπληρωτής Καθηγητής Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή: Θεόδωρος Τσέλιος Ιωάννης Ματσούκας Αλέξιος Βλάμης Αναπληρωτής Καθηγητής Καθηγητής Επίκουρος Καθηγητής Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή: Θεόδωρος Τσέλιος Ιωάννης Ματσούκας Αλέξιος Βλάμης Φωτεινή Λάμαρη Δημήτριος Γάτος Γεράσιμος Τσιβγούλης Γεώργιος Παναγιωτακόπουλος Αναπληρωτής Καθηγητής Καθηγητής Επίκουρος Καθηγητής Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Αναπληρωτής Καθηγητής Επίκουρος Καθηγητής Επίκουρος Καθηγητής Supervisor: Theodore Tselios Associate Professor Dissertation Committee: Theodore Tselios John Matsoukas Alexios Vlamis Associate Professor Professor Assistant Professor Examination Committee: Theodore Tselios John Matsoukas Alexios Vlamis Fotini Lamari Dimitrios Gatos Gerasimos Tsivgoulis George Panagiotakopoulos Associate Professor Professor Assistant Professor Associate Professor Associate Professor Assistant Professor Assistant Professor v Σ ε λ ί δ α

6 vi Σ ε λ ί δ α

7 Περίληψη Το αντικείμενο της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη νέων ενώσεων, αναλόγων των ανοσοκυρίαρχων επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης, που εμπλέκονται στη Σκλήρυνση Κατά πλάκας (ΣΚΠ). Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν δύο διαφορετικές στρατηγικές, που πιθανώς θα μπορούσαν να αποτελέσουν βάση για την ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων στην αντιμετώπιση της ασθένειας. Για το σκοπό αυτό συντέθηκαν πεπτιδικά ανάλογα με βάση τους ανοσοκυρίαρχους επιτόπους MOG και MBP Η πρώτη προσέγγιση στοχεύει στην ανάπτυξη ανοχής του ανοσοποιητικού συστήματος μέσω των δενδριτικών κυττάρων, με τη χρήση πεπτιδικών αναλόγων συζευγμένων με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη (πολυμανόζη). Τα συντιθέμενα ανάλογα χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα τοξικολογικής, in vivo και in vitro αξιολόγησης. Πραγματοποιήθηκε σύζευξη πεπτιδικών αναλόγων στη μαννάνη μέσω μιας γέφυρας [KG] 5. Αναπτύχθηκε μία μέθοδος ηλεκτροφόρησης (SDS-PAGE) για τον έλεγχο των συζευγμάτων, καθώς και για τον προσδιορισμό βέλτιστων συνθηκών σύζευξης. Επίσης πραγματοποιήθηκε μελέτη σταθερότητας του συζεύγματος Mannan oxidized -[KG] 5 MOG 35-55(Pro 42 ). Η δεύτερη προσέγγιση, περιλαμβάνει το σχεδιασμό τη σύνθεση και την αξιολόγηση ενός συζεύγματος που αποτελείται από τον επίτοπο MBP και τροποποιημένη ανθρακινόνη. Η σύζευξη πραγματοποιήθηκε μέσω μια γέφυρας (Ahx) 6 και δισουλφιδικού δεσμού, με στόχο να επιτευχθεί επιλεκτική ανοσοκαταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος. Το συντιθέμενο ανάλογο αξιολογήθηκε για την ανασοκατασταλτική του δράση στην ανθρώπινη καρκινική σειρά Jurkat. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν μελέτες ανοσοφθορισμού για τον εντοπισμό του στο κύτταρο και για τον ρόλο του δισουλφιδικού δεσμού σε συνδυασμό με τη δράση της αναγωγάσης της θειορεδοξίνης. Διαπιστώθηκε επιπλέον, η ικανότητα πρόσδεσης του συζεύγματος με την πρωτεΐνη HLA II DRΒ1-1501, η οποία έγινε προσπάθεια να εκφραστεί και να απομονωθεί από την κυτταρική σειρά HEK293, μέσω τεχνικής ανασυνδυασμένου DNA. Προέκταση της μελέτης αυτής είναι η ενσωμάτωση του συζεύγματος σε HLA II ειδικά-τετραμερή τα οποία θα χρησιμοποιηθούν για in vivo και in vitro αξιολόγηση. Τα εγκεφαλιτογόνα Τ κύτταρα, δύναται να αναγνωρίσουν το πεπτιδικό ανάλογο το οποίο θα βρίσκεται σε τετραμερές, με αποτέλεσμα την προσέγγιση σε αυτά της vii Σ ε λ ί δ α

8 ανοσοκατασταλτικής ένωσης που θα μπορούσε να τα οδηγήσει σε επιλεκτική ανοσοκαταστολή. Λέξεις Κλειδιά: Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ), Μυελινική Γλυκοπρωτεΐνη των Ολιγοδενδριτών (MOG), Βασική πρωτεΐνη της μυελίνης (MBP), μαννάνη, Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας/Αντιγόνα Ανθρώπινων Λευκοκυττάρων (MHC/HLA), μιτοξανδρόνη, τετραμερές. viii Σ ε λ ί δ α

9 Summary In this thesis the development of new compounds, analogues of myelin proteins immunodominant epitopes implicated in Multiple Sclerosis (MS) is reported. Two different strategies were studied, that could potentially serve as a basis for developing new approaches to addressing the disease. Peptide analogues based on the immunodominant epitopes MOG and MBP were synthesized. The first approach involves the tolerance of the immune system by dendritic cells, using peptide analogues conjugated to mannan polysaccharide (polymanose). The synthesized analogues were used in toxicological, in vivo and in vitro evaluation. The conjugation between the peptide and mannan was achieved using the decapeptide [KG] 5 as a bridge. A methodology, based on SDS-PAGE was developed for the confirmation of conjugates and the determination of optimal coupling conditions. In addition, stability studies of Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Pro 42 ) was performed. The second approach involves the design synthesis and evaluation of a conjugate consisting of the MBP epitope and a modified anthraquinone molecule. The coupling was performed via an (Ahx) 6 bridge and a disulfide bond, in order to achieve selective immunosuppression of the immune system. The synthesized analogue evaluated for its immunosuppressive activity on human cancer cell line Jurkat. Immunofluorescence studies were performed, to define its localization into cell and the role of the disulfide bond in combination with the action of thioredoxin reductase. The binding affinity of conjugate to HLA II DRΒ protein was certified. Moreover, the protein was attempted to be expressed and isolated from the cell line HEK293, by recombinant DNA technique. A further study is the merger of conjugation to specific II HLA-tetramers, to be used for in vivo and in vitro experiments. The encephalitogenic T cells will hopefully recognize the peptide analogue merged in the tetramer, follow-on the approach of the immunosuppressive compound to these cells and may be lead them to apoptosis. Keywords: Multiple Sclerosis (MS), Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG), Myelin Basic Protein (MBP), mannan, Major Histocompatibility Complex/Human Leukocyte Antigen (MHC/HLA), mitoxandrone, tetramer. ix Σ ε λ ί δ α

10 x Σ ε λ ί δ α

11 Πρόλογος Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στον Τομέα Οργανικής Χημείας, Βιοχημείας και Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών, υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή Θεόδωρου Τσέλιου, κατά το χρονικό διάστημα Οκτώβριος 2012 έως Φεβρουάριος Το μέρος της διατριβής που αφορά την αξιολόγηση συντιθέμενων αναλόγων καθώς και την έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα, εκπονήθηκε στο εργαστήριο Κλινικής Ογκολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Τα πειράματα binding affinity πραγματοποιήθηκαν στο Rigshospitalet, Institut for Inflammationsforskning στο Πανεπιστήμιο της Κοπεγχάγης στη Δανία, από τον Καθηγητή Bjarke και την ομάδα του. Η φασματομετρία μάζας (MALDI) της πρωτεΐνης που εκφράστηκε, πραγματοποιήθηκε στο Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών (ΙΙΒΕΑΑ). Σημαντική υπήρξε η βοήθεια του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας (National Institute of Health, NIH) στο NIH Tetramer Core Facility (TCF), στο Πανεπιστήμιο Emory στην Αμερική, για την προσφορά των HEK293 κυττάρων και την αποδοχή της ανάπτυξης των τετραμερών. Κατά τη διάρκεια της διατριβής πολλοί ήταν αυτοί που με βοήθησαν άμεσα ή/και έμμεσα, μου συμπαραστάθηκαν στις δύσκολες στιγμές άλλα και συνέβαλαν καθοριστικά στην εκπόνησή της. Για το λόγο αυτό θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου. Πρώτα απ όλα θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα μου Αναπληρωτή Καθηγητή Θεόδωρο Τσέλιο, για την αμέριστη εμπιστοσύνη που μου έδειξε όλα αυτά τα χρόνια. Η συνεχής βοήθεια και καθοδήγησή του, από την ανάθεση του θέματος μέχρι και την ολοκλήρωσή της διατριβής, υπήρξε πολύτιμη. Οι ιδέες, η ερευνητική κατάρτιση και οι εύστοχες παρατηρήσεις του καθόρισαν την επιστημονική μου σκέψη. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή Αλέξιο Βλάμη, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για τις γνώσεις που μου μετέδωσε, τις πολύτιμες συμβουλές του και την άρτια συνεργασία που είχαμε. Ευχαριστώ τον Καθηγητή Ιωάννη Ματσούκα, μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, για τη συνεργασία μας όλα τα χρόνια στο Πανεπιστήμιο Πατρών και στην Eldrug ΑΕ. Ευχαριστώ θερμά, την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Φωτεινή Λάμαρη, τον Αναπληρωτή Καθηγητή Δημήτριο Γάτο, τον Επίκουρο Καθηγητή Γεράσιμο Τσιβγούλη και τον xi Σ ε λ ί δ α

12 Επίκουρο Καθηγητή Γεώργιο Παναγιωτακόπουλο, για την τιμή που μου έκαναν να αποτελέσουν μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τις μεταδιδακτορικές ερευνήτριες, Μαρία Ελένη Ανδρούτσου και Ευσταθία Γιαννοπούλου για την άψογη συνεργασία, τη μετάδοση γνώσεων, τις χρήσιμες συμβουλές και πάνω απ όλα τη φιλία και την ηθική υποστήριξη, τα οποία με βοήθησαν να φέρω εις πέρας τη διδακτορική μου διατριβή. Ευχαριστώ επίσης, τη Μεταδιδάκτορα Carmen Simal Fernandez για τη συμβολή και τη βοήθεια της στην οργανική σύνθεση. Ένα μεγάλο ευχαριστώ σε όλα τα μέλη του εργαστηρίου Οργανικής και Πεπτιδικής Χημείας, για τη συνεργασία μας αλλά και για τις ωραίες στιγμές που περάσαμε εντός και εκτός εργαστηρίου. Επίσης, ευχαριστώ όλα τα μέλη του εργαστηρίου Κλινικής Ογκολογίας για τη συνεργασία, την κατανόηση και τη βοήθεια τους. Ένα ξεχωριστό ευχαριστώ στο Νίκο για την ηθική υποστήριξη και την κατανόηση του όλα αυτά τα χρόνια. Τέλος, ευχαριστώ από καρδιάς τα αδέρφια μου Γιώργο και Ζήνα για τη διαρκή παρουσία τους σε κάθε βήμα της ζωής μου και τους γονείς μου Κώστα και Μαρία, για όλα όσα μου πρόσφεραν και θυσίασαν σε όλη την πορεία μου μέχρι σήμερα. Ανθή Ταπεινού xii Σ ε λ ί δ α

13 Στη μητέρα μου, Μαρία

14 xiv Σ ε λ ί δ α

15 Περιεχόμενα Περίληψη Summary Πρόλογος Συντομογραφίες vii ix xi xix 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1.Α ΘΕΩΡΙΑ 3 1.Α 1 ΣΚΛΗΡΥΝΣΗ ΚΑΤΑ ΠΛΑΚΑΣ 3 1.Α 1.1 Βιοχημική Σύσταση της Μυελίνης 4 1.Α 1.2 Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis - ΕΑΕ) 5 1.Α 1.3 Παθογένεση της ΣΚΠ 5 1.Α 1.4 Η ΣΚΠ και το σύστημα HLA (MHC) 8 1.Α 1.5 Υπάρχουσες Θεραπείες 10 1.Α 2 ΜΑΝΝΑΝΗ 13 1.Α 2.1 Σύζευξη πεπτιδίων με μαννάνη στην οξειδωμένη και ανηγμένη της μορφή 15 1.Α 3 ΑΝΘΡΑΚΙΝΟΝΗ 17 1.Α 3.1 Μιτοξανδρόνη και ΣΚΠ 17 1.Α 3.2 Σχέση δομής-δραστικότητας παραγώγων ανθρακινόνης 18 1.Α 4 ΠΕΠΤΙΔΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ 20 1.Α 4.1 Μέθοδοι σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού 20 1.Α 4.2 Πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) 21 1.Α Το στερεό υπόστρωμα 25 1.Β ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ - ΣΤΟΧΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 31 ΣΥΣΚΕΥΕΣ-ΌΡΓΑΝΑ-ΥΛΙΚΑ 33 2.A ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ 39 2.A 1 ΓΕΝΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ ΣΕ ΣΤΕΡΕΑ ΦΑΣΗ 39 2.A 2 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΣΕ ΣΤΕΡΕΗ ΦΑΣΗ ΕΠΙ ΤΗΣ CLTR-CL ΡΗΤΙΝΗΣ ΚΑΤΑ ΣΤΑΔΙΑ (STEP BY STEP) 42 2.A 2.1 Σύζευξη του αναλόγου (Ahx) 6 MBP (2) με SPDP [Succinimidyl 3-(2- Pyridyldithio)Propionate] 44 2.B ΣΥΖΕΥΞΗ ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΣΕ ΜΑΝΝΑΝΗ 46 2.B 1 ΈΛΕΓΧΟΣ ΣΥΖΕΥΞΗΣ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ-ΜΑΝΝΑΝΗΣ ΜΕ TRICINE SDS-PAGE 47 2.B 2 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΑΛΔΕΫΔΟΜΑΔΩΝ ΣΤΗ ΜΑΝΝΑΝΗ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ 50 xv Σ ε λ ί δ α

16 2.Γ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΑΝΘΡΑΚΙΝΟΝΗ-(AHX) 6 MBP (7) ΚΑΙ ΑΠΟΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΤΟΥ ΔΡΑΣΗΣ 53 2.Γ 1 ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΑΝΑΛΟΓΟΥ Γ 1.1 Σύνθεση των αναλόγων 1,4-δις-(4-αµινο-βουτυλαµινο)-ανθρακινόνη (4) και 1- (αµινο-βουτυλαµινο)-4-υδροξυ-ανθρακινόνη (5) 53 2.Γ 1.2 Σύνθεση του αναλόγου Γ 1.3 Σύζευξη του αναλόγου 6 με το SPDP-(Ahx) 6 MBP (3) 57 2.Γ 2 ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ 59 2.Γ 2.1 Διαδικασία ανακαλλιέργειας των κυττάρων προσκόλλησης HEK Γ 2.2 Διαδικασία ανακαλλιέργειας (split) των κυττάρων εναιωρήματος Jurkat 60 2.Γ 2.3 Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο NEUBAUER 61 2.Γ 3 ΈΛΕΓΧΟΣ ΠΙΘΑΝΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΕΝΔΙΑΜΕΣΟΥ ΑΝΑΛΟΓΟΥ 5 ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ HEK Γ 3.1 Έλεγχος φθορισμού 62 2.Γ 3.2 Έλεγχος επίδρασης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό - MTT cell proliferation assay 63 2.Γ 4 ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΟΤΙΜΗΣΗ ΤΟΥ ΑΝΑΛΟΓΟΥ 7 ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ JURKAT 64 2.Γ 4.1 Εντοπισμός στο κύτταρο του υπό έλεγχο αναλόγου Ανοσοφθορισμός 64 2.Γ 4.2 Προσδιορισμός ελευθέρων σουλφυδρυλομάδων σε υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας Μέθοδος DTNB (Ellman's Reagent) 66 2.Γ 4.3 Προσδιορισμός της απόπτωσης των κυττάρων μέσω ανίχνευσης της αποπτωτικής πρωτεΐνης BCL2 - Aνοσοαποτύπωση (Western Blot Analysis) 67 2.Δ ΈΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΜΕΡΙΚΟΣ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ HLA II DRB ΑΠΟ ΚΥΤΤΑΡΑ HEK Δ 1 ΣΥΛΛΟΓΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ HLA II DRB ΑΠΟ ΤΟ ΥΠΕΡΚΕΙΜΕΝΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ HEK Δ 2 ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ HLA II DRB Δ 2.1 Μεταλλοχηλική (Ni 2+ ) χρωματογραφία 72 2.Δ 2.2 Κατόπιν κατακρήμνισης με θειικό αμμώνιο 73 2.Δ 2.3 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης 74 2.Δ 3 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΚΛΑΣΜΑΤΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ HLA II DRB ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 77 3.A ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ 79 3.Α 1 ΣΥΝΤΙΘΕΜΕΝΑ ΠΕΠΤΙΔΙΚΑ ΑΝΑΛΟΓΑ 79 3.Β ΣΥΖΕΥΞΗ ΠΕΠΤΙΔΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΜΕ ΜΑΝΝΑΝΗ 88 3.Β 1 ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ MANNAN-[KG] 5 MOG (PRO 42 ) 93 3.Β 1.1 Έλεγχος με tricine SDS-PAGE 93 3.Β 1.2 Ανίχνευση ελεύθερων αλδεϋδομάδων με tricine SDS-PAGE/PAS stain και χρωματομετρία 98 3.Β 1.3 Έλεγχος σταθερότητας 99 3.Β 2 ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ MANNAN-[KG] N MBP (TYR 91 ) Γ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ, ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΟΥ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΑΝΘΡΑΚΙΝΟΝΗΣ- (AHX) 6 MBP xvi Σ ε λ ί δ α

17 3.Γ 1 ΣΥΛΛΟΓΙΣΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΟΥ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΑΝΘΡΑΚΙΝΟΝΗΣ- (AHX) 6 MBP ΓΙΑ ΠΙΘΑΝΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ Γ 2 ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ ΑΝΑΛΟΓΟΥ ΑΝΘΡΑΚΙΝΟΝΗΣ ΜΕ ΤΟ ΠΕΠΤΙΔΙΟ (AHX) 6 MBP Γ 2.1 Σύνθεση των αναλόγων 4 και 5 της ανθρακινόνης Γ 2.2 Σύνθεση του αναλόγου 6 της ανθρακινόνης Γ 2.3 Σύνθεση του αναλόγου 7 της ανθρακινόνης Γ 3 ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ Γ 3.1 Μελέτη του ενδιάμεσου αναλόγου 5 στα κύτταρα HEK Γ Έλεγχος φθορισμού Γ Έλεγχος επίδρασης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό - MTT cell proliferation assay Γ 3.2 Μελέτη του αναλόγου 7 στα κύτταρα Jurkat Γ Ποιοτική ανάλυση με ανοσοφθορισμό για τον εντοπισμό του αναλόγου 7 στο κύτταρο Γ Προσδιορισμός ελευθέρων σουλφυδρυλομάδων σε υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας Μέθοδος DTNB (Ellman's Reagent) Γ Προσδιορισμός της απόπτωσης των κυττάρων μέσω ανίχνευσης της αποπτωτικής πρωτεΐνης BCL2 - Aνοσοαποτύπωση (Western Blot Analysis) Δ ΈΚΦΡΑΣΗ ΚΑΙ ΜΕΡΙΚΟΣ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ HLA II DRB Δ 1 ΜΕΤΑΛΛΟΧΗΛΙΚΗ (NI 2+ ) ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ Δ 2 ΚΑΤΟΠΙΝ ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗΣ ΜΕ ΘΕΙΙΚΟ ΑΜΜΩΝΙΟ Δ 3 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΔΙΗΘΗΣΗΣ Ε ΣΥΓΓΕΝΕΙΑ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ HLA II ΜΕ ΤΟ ΑΝΑΛΟΓΟ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 135 Α. ΣΥΖΕΥΓΜΑ ΜΑΝΝΑΝΗΣ-ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ 137 Β. ΣΥΖΕΥΓΜΑ ΑΝΘΡΑΚΙΝΟΝΗΣ-ΠΕΠΤΙΔΙΟΥ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 157 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ 163 xvii Σ ε λ ί δ α

18 xviii Σ ε λ ί δ α

19 Συντομογραφίες Οι συντμήσεις που χρησιμοποιούνται στην παρούσα διατριβή έχουν προταθεί από την Επιτροπή Βιοχημικής Ονοματολογίας της διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC) [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomeclature (JCBN)], (JCBN 1965; JCBN 1970; JCBN 1984). Σύντμηση AA ACN AcOH Ahx Ala APC APS Arg Asn Asp AΕΦ Bcl Boc BSA BuOH CDCl 3 CLTR-Cl Cys DCC DCM DCs DIC DIMAC DMAP DIPEA DMF d 6 -DMSO DMSO DNPH DTNB DTT Ονομασία αμινοξύ ακετονιτρίλιο οξικό οξύ αμινοεξανοϊκό οξύ αλανίνη αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο υπερθειϊκό αμμώνιο αργινίνη ασπαραγίνη ασπαραγινικό οξύ αιματοεγκεφαλικός φραγμός Β κυτταρικό λέμφωμα tert-βουτυλοξυκαρβονυλομάδα βόεια λευκωματίνη ορού βουτανόλη δευτεριωμένο χλωροφόρμιο χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνη κυστεΐνη Ν,Ν'-δικυκλοεξυλοκαρβοδιιµίδιο διχλωρομεθάνιο δενδριτικά κύτταρα Ν,Ν'-διισοπροπυλοκαρβιδιιµίδιο Ν,Ν-διμεθυλακεταμίδιο 4-διµεθυλαµινοπυριδίνη N,N-διισοπροπυλαιθυλαμίνη διμεθυλοφορμαμίδιο δευτεριωμένο διμεθυλοσουλφοξείδιο διμεθυλοσουλφοξείδιο 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνη 5,5'-διθειοδις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ) διθειοθρεϊτόλη xix Σ ε λ ί δ α

20 EAE EDT EDTA EndoH ESI-MS Et 2 O EtOH FBS FGF Fmoc Gln Glu Gly (G) His HLA HOAt HOBt HRP IFN IL Ile iproh K KCN KΝΣ Leu LPPS Lys MAG MBP MeOH Met MHC Mmt MOG MR MRI MS/ΣΚΠ Mtt MTT NaDOC πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα 1, 2-αιθανοδιθειόλη αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ ενδογλυκοζιδάση H φασματομετρία μάζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό διαιθυλαιθέρας αιθανόλη βόειος εμβρυικός ορός παράγοντας ανάπτυξης ινοβλαστών 9-φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα γλουταμίνη γλουταμινικό οξύ γλυκίνη ιστιδίνη αντιγόνο ανθρώπινων λευκοκυττάρων 1-υδροξυ-7-αζαβενζοτριαζόλιο 1- υδροξυβενζοτριαζόλιο υπεροξειδάση ιντερφερόνη ιντερλευκίνη ισολευκίνη ισοπροπανόλη λυσίνη κυανιούχο κάλιο κεντρικό νευρικό σύστημα λευκίνη πεπτιδική σύνθεση σε υγρή φάση λυσίνη μυελινοσύνδετη γλυκοπρωτεΐνη ολιγοδενδριτών βασική πρωτεΐνη της μυελίνης μεθανόλη μεθειονίνη μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας 4-μεθοξυ-τριτυλομάδα μυελινική γλυκοπρωτεΐνη των ολιγοδενδριτών υποδοχέας μανόζης απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού/μαγνητική τομογραφία σκλήρυνση κατά πλάκας 4-μεθυλο-τριτυλομάδα 3-(4,5-διμεθυλο-2-θειαζολυλο)-2, 5-διφαινυλ-2Η-τετραζόλιο δεοξυχολικο νάτριο xx Σ ε λ ί δ α

21 PAS Pbf PBS Phe PhOH PLP Pmc Pro PVDF RP-HPLC SDS SDS-PAGE Ser SPDP SPPS TBS TCA TCR TEMED TES TFA TFE TGA THF Thr TLC TMS TNB TNF T R Tris Trp Trx TrxR Tyr UV Val χρώση υπεριωδικού οξέος πενταφθοροφαινυλεστέρας αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών φαινυλαλανίνη φαινόλη πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη της μυελίνης 2,2,5,7,8-πενταµεθυλοχροµαν-6-σουλφονυλοµάδα προλίνη φθοριούχο πολυβινυλιδένιο υγρή χρωματογραφία υψηλής επίδοσης ανάστροφης φάσης δωδεκυλο-θειικό νάτριο ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου σερίνη ηλεκτραμιδυλο 3-(2-πυριδυλοδιθειο)προπιονικό οξύ πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση ρυθμιστικό διάλυμα άλατος τρις(υδροξυμεθυλο)αμινομεθάνιου τριχλωροξικό οξύ υποδοχέας Τ κυττάρου Ν,Ν,N,N -τετραμεθυλο 1,2-διαμινοαιθάνιο τριαιθυλοπυρίτιο τριφθοροξικό οξύ τριφθοροαιθανόλη θειογλυκολικό οξύ τετραϋδροφουράνιο θρεονίνη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας τετραµεθυλοπυρίτιο 2-νιτρο-5-θειοβενζοϊκό οξύ παράγοντας νέκρωσης όγκων χρόνος έκλουσης τρις(υδροξυμεθυλο)αμινομεθάνιο τρυπτοφάνη θειορεδοξίνη αναγωγάση της θειορεδοξίνης τυροσίνη υπεριώδης ακτινοβολία βαλίνη xxi Σ ε λ ί δ α

22 xxii Σ ε λ ί δ α

23 1. Εισαγωγή

24

25 Εισαγωγή 1.Α Θεωρία 1.Α 1 Σκλήρυνση κατά Πλάκας Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος, του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), αυτοάνοσης αρχής, η οποία οφείλεται στην καταστροφή της μυελίνης των νευραξόνων. Η μυελίνη είναι µια μονωτική λιποπρωτεΐνη που περιβάλλει τους περισσότερους νευράξονες και βοηθά στη μετάδοση των νευρικών ώσεων (ερεθισμάτων). Αν η μυελίνη είναι κατεστραμμένη, το νευρικό ερέθισμα από τους νευρώνες είτε διακόπτεται είτε φτάνει µε κάποια καθυστέρηση, ανάλογα µε το βαθμό καταστροφής της, οπότε παρατηρούνται νευρολογικές διαταραχές, όπως δυσκολία στη βάδιση, παράλυση, προβλήματα στην όραση κ.ά. Η ΣΚΠ χαρακτηρίζεται από την πολλαπλότητα των συμπτωμάτων της, τη διακύμανση της σοβαρότητας και της διάρκειας τους καθώς και την απρόβλεπτη πορεία και εξέλιξη της, η οποία είναι πλήρως εξατομικευμένη (Compston and Coles 2008). Η ιστορία της ΣΚΠ ξεκινάει από τον 14 ο αιώνα όπου έχουμε τις πρώτες ιστορικές αναφορές ενώ η έρευνα για τον καθορισμό της παθοφυσιολογίας της συνεχίζεται έως σήμερα. Πρόκειται για μία πολυδιάστατη ασθένεια κατά την οποία τόσο γενετικοί όσο και περιβαλλοντικοί αλλά και ανοσολογικοί παράγοντες, οι οποίοι θα περιγραφούν παρακάτω, έχουν στοχοποιηθεί πως επάγουν τα κλινικά συμπτώματα της ασθένειας (σχήμα 1). Σχήμα 1: Βασικοί εμπλεκόμενοι παράγοντες στην εκδήλωση της ΣΚΠ (Bardi 2011). 3 Σ ε λ ί δ α

26 Εισαγωγή 1.Α 1.1 Βιοχημική Σύσταση της Μυελίνης Ένα από τα βιοχημικά χαρακτηριστικά που διακρίνουν τη μυελίνη από άλλες βιολογικές μεμβράνες είναι η υψηλή αναλογία του λιπιδίου ως προς την πρωτεΐνη. Τα λιπίδια αποτελούν το % της συνολικής σύστασης της μυελίνης, ενώ οι πρωτεΐνες το %. Η περιεκτικότητα λιπιδίου αποτελείται από τρία στοιχεία, χοληστερόλη, φωσφολιπίδια και γλυκολιπίδια σε αναλογία 2:2:1. Οι κύριες πρωτεΐνες που αποτελούν την μυελίνη είναι η πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη της μυελίνης (Proteolipid Protein, PLP) η οποία αποτελεί το 50% των συνολικών πρωτεϊνών και παρέχει αυξημένη σταθερότητα, και η βασική πρωτεΐνη της μυελίνης (Myelin Basic protein, MBP) η οποία είναι βασικό συστατικό του περιβλήματος της μυελίνης και αποτελεί το 30-40% των πρωτεϊνών της μυελίνης. Επίσης, ποσοτικά ελάσσονες πρωτεΐνες της μυελίνης είναι η μυελινο-σύνδετη γλυκοπρωτεΐνη ολιγοδενδριτών (Myelin associated Glycoprotein, MAG) η οποία είναι ο κυρίαρχος μεσολαβητής των αξονικών νευρογλοιακών συνάψεων και παίζει ουσιαστικό ρόλο στην έναρξη της μυελινοποίησης αποτελώντας το 1% της μυελίνης, και η μυελινική πρωτεΐνη ολιγοδενδριτών (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, MOG) η οποία βρίσκεται στην επιφάνεια του περιβλήματος της μυελίνης και αποτελεί μόνο το % των συνολικών πρωτεϊνών της μυελίνης (σχήμα 2). Σε μικρότερο ποσοστό, είναι οι θερμοπληκτικές πρωτεΐνες (heat shock), η αβ κρυσταλλίνη (ελάσσονα heat shock πρωτεΐνη), η GFAP πρωτεΐνη (Glial fibrillary acidic protein), και η S-100b πρωτεΐνη. Σχήμα 2: Πιθανά αυτοαντιγόνα μυελίνης. Οι πρωτεΐνες του ελύτρου της μυελίνης είναι πιθανοί στόχοι της ανοσοαπόκρισης στη ΣΚΠ, καθώς έχουν αναγνωριστεί ως αντιγόνα που προκαλούν την ασθένεια στο πειραματικό μοντέλο αυτοάνοσης εγκεφαλομυελίτιδας (ΕΑΕ). Προσαρμοσμένο από (Hemmer et al. 2002). 4 Σ ε λ ί δ α

27 Εισαγωγή 1.Α 1.2 Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis - ΕΑΕ) Η πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (ΕΑΕ) περιγράφηκε για πρώτη φορά πριν από 80 χρόνια (Rivers and Schwentker 1935) και είναι το πιο δημοφιλές και ευρέως χρησιμοποιούμενο ζωικό μοντέλο της ΣΚΠ. Ο όρος εγκεφαλομυελίτιδα αναφέρεται σε φλεγμονώδη πάθηση του εγκεφάλου. Η ευαισθητοποίηση σε αντιγόνα μυελίνης στην ΕΑΕ τυπικά συμβαίνει μέσω της χρήσης ανοσοενισχυτικού, που περιέχει συνήθως βακτηριακά συστατικά ικανά να ενεργοποιήσουν το ανοσοποιητικό σύστημα (Libbey and Fujinami 2011). Ενεργή ΕΑΕ προκαλείται από ανοσοποίηση με ιστό του ΚΝΣ ή από πεπτίδια της μυελίνης όπως της MOG και ΜΒΡ. Αντίθετα, η παθητική ΕΑΕ μπορεί να επαχθεί σε ζώα δέκτες με μεταφορά ειδικών για τη μυελίνη CD4 + Τ κυττάρων που παράγονται σε ζώα δότες από ενεργητική ανοσοποίηση (Stromnes and Goverman 2006; Stromnes and Goverman 2006). Η παθολογία των βλαβών ποικίλει σε διαφορετικά στελέχη ζώων (Lassmann et al. 1983; Gran et al. 2002). Για παράδειγμα, σε C57BL/6 ποντικούς, η ανοσοποίηση με MOG μπορεί να επάγει μονοφασική ή χρόνια μορφή της ΕΑΕ (O'Neill et al. 2006), σε SJL/J ποντικούς η ανοσοποίηση με PLP οδηγεί σε υποτροπιάζουσα-διαλείπουσα ασθένεια (Vanderlugt et al. 2000) και σε αρουραίους Lewis, η ενεργητική και παθητική ΕΑΕ που επάγεται με ΜΒΡ ή μεταφορά ΜΒΡ-ειδικών Τ κυττάρων παράγει σοβαρή φλεγμονή του ΚΝΣ με μικρή ή καθόλου απομυελίνωση (Meeson et al. 1994). H ΕΑΕ μιμείται πολλές από τις κλινικές και ανοσολογικές πτυχές της ΣΚΠ αλλά δεν είναι σε θέση να αναπαράγει όλο το φάσμα της ανθρώπινης ασθένειας. Μέχρι στιγμής, ένα μοντέλο για την πρωτογενή προοδευτική πορεία της νόσου εξακολουθεί να απουσιάζει ενώ επαγωγή της ΕΑΕ οδηγεί σε εκτεταμένη βλάβη ιστών και όχι σε πρωτογενή απομυελίνωση. Παρ όλα αυτά, τα δεδομένα από μελέτες ΕΑΕ εξακολουθούν να παρέχουν τα πιο σημαντικά στοιχεία για την ΣΚΠ ως αυτοάνοση ασθένεια η οποία οδηγεί σε απομυελίνωση, γλοίωση και αξονική βλάβη. 1.Α 1.3 Παθογένεση της ΣΚΠ Στη ΣΚΠ η ισορροπία μεταξύ του ανοσολογικού συστήματος και του οργανισμού διαταράσσεται και το πρώτο αναγνωρίζει λανθασμένα, πεπτιδικά τμήματα της μυελίνης ως ξένα (αυτοαντιγόνα). Μελέτες σε ασθενείς με ΣΚΠ καθώς και σε μοντέλα της ασθένειας σε ζώα, έχουν οδηγήσει σε ένα προτεινόμενο μηχανισμό της παθογένειας της 5 Σ ε λ ί δ α

28 Εισαγωγή νόσου και αφορά στην ενεργοποίηση πληθυσμού κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στο περιφερικό αίμα, συμπεριλαμβανομένων αυτοαντιδρώντων, ειδικών για πρωτεΐνες της μυελίνης, Τ κυττάρων έναντι αυτοαντιγόνων. Η ανοσολογική απόκριση ξεκινάει στην περιφέρεια (Steinman 1995; Wucherpfennig et al. 1997) όταν ένα μυελινικό αντιγόνο εκφράζεται στην επιφάνεια ενός αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου (APC) από το Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας (Major Histocompatibility Complex, MHC ή Human Leukocyte Antigen, HLA για τον άνθρωπο). Ο υποδοχέας των Τ κυττάρων (TCR), είναι σε θέση να αναγνωρίσει το πεπτίδιο/αντιγόνο ως σύμπλοκο με το MHC, με αποτέλεσμα τη δημιουργία του τριμοριακού συμπλόκου μεταξύ του TCR, του αντιγόνου (πεπτίδιο) και της ιστοσυμβατής πρωτεΐνης, MHC (σχήμα 3) (Hennecke and Wiley 2001). Με τη δημιουργία του τριμοριακού συμπλόκου, ενεργοποιούνται τα Τ βοηθητικά κύτταρα (Thelper, Th) τα οποία ανάλογα με τις κυτταροκίνες που εκκρίνουν επάγουν Th1 ή Th2 ανοσολογική απόκριση, ενεργοποιώντας τα Τ κυτταροτοξικά κύτταρα (T-cytotoxic, Tc) ή προάγοντας την πορεία παραγωγής αντισωμάτων (Β κύτταρα) αντίστοιχα, με τελικό στόχο την καταστροφή του αντιγόνου. Σχήμα 3: Σχηματισμός τριμοριακού συμπλόκου, προσαρμοσμένο από (Mayer 2014). Επίσης, υπάρχει επαγωγή έκφρασης μορίων προσκόλλησης στα επιθηλιακά κύτταρα με αποτέλεσμα τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα να δεσμεύονται στα μόρια προσκόλλησης να διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό (ΑΕΦ) και τελικά να μετακινούνται στο ΚΝΣ (Wekerle et al. 1986; Noseworthy 1999). Στο ΚΝΣ τα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα 6 Σ ε λ ί δ α

29 Εισαγωγή συνεχίζουν να εκκρίνουν φλεγμονώδης κυτταροκίνες οι οποίες δρουν στα μικρογλοιακά κύτταρα και τα μετατρέπουν σε αντιγονοπαρουσιαστικά που εκφράζουν στην επιφάνειά τους μυελινικά αντιγόνα. Ταυτόχρονα, άλλα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, όπως Β κύτταρα και μακροφάγα επίσης εισέρχονται στο ΚΝΣ μέσω του ΑΕΦ, με αποτέλεσμα την ενίσχυση της ανοσολογικής απόκρισης έναντι της μυελίνης (Hohlfeld 1997; Miller and Galboiz 2002). Τα Β κύτταρα παράγουν αντισώματα που προσδένονται στη μυελίνη, ενώ παράλληλα τα μακροφάγα επιτίθενται στη μυελίνη, είτε απευθείας με φαγοκυττάρωση είτε με έκκριση TNF-α και άλλων φλεγμονωδών κυτταροκινών. Αποτέλεσμα όλων αυτών είναι η δημιουργία φλεγμονωδών περιοχών (πλάκες), καταστροφή της μυελίνης, κακή μεταφορά μηνύματος και δημιουργία παθοφυσιολογικών συμπτωμάτων (σχήμα 4) (Steinman and Zamvil 2003). Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες πιθανώς προκαλούν την μετακίνηση των ενεργοποιημένων Τ-κυττάρων και των απομυελινωτικών αντισωμάτων από την συστηματική κυκλοφορία στο ΚΝΣ, μέσω πάντα του ΑΕΦ. Εκεί, τοπικοί παράγοντες, όπως ιογενείς λοιμώξεις και μεταβολικά αίτια, προκαλούν την έκφραση ενδοθηλιακών μορίων που ευνοούν την είσοδο των Τ-κυττάρων στο ΚΝΣ. Σχήμα 4: Αυτοανοσία και απομυελίνωση στη ΣΚΠ. Έναρξη της ανοσολογικής απόκρισης στην περιφέρεια, διαπίδυση του ΑΕΦ και ενεργοποίηση κυττάρων στο ΚΝΣ (Steinman and Zamvil 2003). 7 Σ ε λ ί δ α

30 Εισαγωγή Εγκεφαλιτογόνα Τ κύτταρα που είναι υπεύθυνα για τη ΣΚΠ μπορούν επίσης να διεγερθούν από μικρόβια, βακτήρια ή ιούς μέσω του σχηματισμού του τριμοριακού συμπλόκου (ιογενής θεωρία). Οι ομοιότητες μεταξύ επιτόπων πρωτεϊνών, των μολυσματικών παθογόνων και των αυτοαντιγόνων οδηγούν σε ενεργοποίηση και πολλαπλασιασμό της ανοσολογικής απόκρισης έναντι του ιδίου ιστού, φαινόμενο γνωστό ως μοριακή μίμηση. Χαρακτηριστικά παραδείγματα είναι η ομολογία της αλληλουχίας μεταξύ της γλυκοπρωτεΐνης Ε2 του ιού λύσσας και του 1-10 επιτόπου της πρωτεΐνης MOG (Duvanel et al., 2001) καθώς και του επιτόπου της πρωτεΐνης ΜΒΡ στις οποίες επίσης εμφανίζονται αλληλουχίες τεσσάρων με έξι αμινοξέων όμοιες με τμήματα των πρωτεϊνών που υπάρχουν στον ιό της ιλαράς, της ηπατίτιδας Β, στον ιό της γρίπης, στον αδενοϊό (adenovirus), στον ιό Epstein-Barr, στον ιό του έρπητα 6 (HHV-6) και στον ιό papilloma (HPV) (Wucherpfennig and Strominger 1995; Soldan et al. 1997). Συνεπώς, μια ανοσολογική απόκριση σε έναν ιό ή μικρόβιο μπορεί να είναι αρκετή να σηματοδοτήσει μια υποτροπή ή να ξεκινήσει την ασθένεια (Gautam et al. 1992). Η νόσος έχει συνδεθεί και με το σύστημα HLA. Λεπτομερής ανάλυση στοιχείων από μελέτες συγγενών με ΣΚΠ στοιχειοθετούν ενδείξεις ότι η ΣΚΠ εξαρτάται τουλάχιστον από δυο γονίδια και πιθανόν από περισσότερα. Παρόλο που δεν είναι ξεκάθαρη η σχέση μεταξύ των γονιδίων HLA και της ΣΚΠ, φαίνεται ότι ο παράγοντας του HLA τάξης II παίζει ρόλο στον καθορισμό προδιάθεσης της νόσου. Πιθανοί παράγοντες κινδύνου για την πάθηση που έχουν ενοχοποιηθεί και βρίσκονται υπό διερεύνηση είναι επίσης η εποχή του χρόνου, η έκθεση σε οργανικούς διαλύτες, μέταλλα όπως Hg και Pb, οι εμβολιασμοί, η έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία, το κάπνισμα καθώς και διαιτιτικοί ή/ και αγχογόνοι παράγοντες. 1.Α 1.4 Η ΣΚΠ και το σύστημα HLA (MHC) Η ΣΚΠ είναι μία νόσος με πολυπαραγοντική αιτιοπαθογένεια. Το υποκείμενο γενετικό υπόβαθρο φαίνεται να διαδραματίζει ρόλο, όπως έχει επανειλημμένα διαπιστωθεί από επιδημιολογικές μελέτες και μελέτες διδύμων. Οι μελέτες του ακριβούς τρόπου επέκτασης της νόσου, εμπλέκουν κυρίως πολυμορφισμούς μορίων του MHC, γονιδιακούς τόπους εκτός ΜΗC σε μικρότερο βαθμό, αλλά και πιθανές επιδράσεις από επιγενετικές μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις (Artemiadis and Anagnostouli 2010). Οι πολυμορφισμοί των μορίων του MHC (HLA) είναι εκείνοι που φέρουν αδιαμφισβήτητα 8 Σ ε λ ί δ α

31 Εισαγωγή τη βασική ευθύνη για την αύξηση του γενετικού φορτίου της νόσου. Μεταξύ των διαφόρων HLA, συγκεκριμένοι πολυμορφισμοί των τάξης ΙΙ και συγκεκριμένα το αλλήλιο HLA DRB έχουν δείξει σαφή συσχέτιση με αυξημένο κίνδυνο για ανάπτυξη ΣΚΠ και στον ελληνικό πληθυσμό (Bozikas et al. 2003). Έτεροι απλότυποι, μη σχετιζόμενοι με το εν λόγω αλλήλιο, όπως οι DR3 και DR4, έχουν επίσης αναφερθεί ως αιτιολογικά σχετιζόμενοι με τον κίνδυνο εμφάνισης της νόσου, και μάλιστα σε μελέτες ασθενών με παιδική ή οικογενή ΣΚΠ (Anagnostouli et al. 2014). Σχήμα 5: Η πρωτεΐνη HLA II κωδικοποιείται στο χρωμόσωμα 6, είναι μία διαμεμβρανική ετεροδιμερής πρωτεΐνη μοριακού βάρους 60 kda, η οποία αποτελείται από την α πεπτιδική αλυσίδα με μοριακό βάρος 32 kda και από τη β αλυσίδα με μοριακό βάρος 28 kda.οι αλυσίδες α και β είναι δομικά ομόλογες (Arimilli et al. 1999; Ladiabetes 2011; Winslow 2012). 9 Σ ε λ ί δ α

32 Εισαγωγή 1.Α 1.5 Υπάρχουσες Θεραπείες Αν και δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία για την καταπολέμηση της νόσου, υπάρχουν διάφορα θεραπευτικά σχήματα που στοχεύουν στην ανάρρωση των ασθενών έπειτα από κάποια υποτροπή, την πρόληψη αυτών των υποτροπών καθώς και την πρόληψη της αναπηρίας. Ποικίλουν ως προς την ασφάλεια και αποτελεσματικότητά τους, έτσι οι ασθενείς που πάσχουν από ΣΚΠ αντιμετωπίζουν αρκετούς περιορισμούς. Η ανεπαρκής αποτελεσματικότητα, οι περιορισμοί χρήσης φαρμάκων σε ομάδες ασθενών, οι παρενέργειες, η πιθανή ανάπτυξη ανοσογονικότητας σε κάποιους ασθενείς, καθώς και οι συχνές παρεντερικές χορηγήσεις κάποιων φαρμάκων στα υπάρχοντα θεραπευτικά σχήματα, αποτελούν εμπόδια για τη βέλτιστη θεραπεία συμπεριλαμβανομένης και της συμμόρφωσης του ασθενούς με τη θεραπεία (Minagar 2013). Οι κύριες θεραπευτικές αγωγές που χρησιμοποιούνται σήμερα παρουσιάζονται στο σχήμα 6 και περιγράφονται παρακάτω. Ιντερφερόνες: έχουν αναγνωριστεί δύο τύποι, ο τύπος I όπου ανήκουν οι ιντερφερόνες α και β (IFN-α, IFN-β) και ο τύπος II όπου ανήκει η ιντερφερόνη γ. Η IFN-β είναι αυτή που χρησιμοποιείται στη ΣΚΠ και μειώνει τον αριθμό των υποτροπών, τον μέσο όγκο των βλαβών που απεικονίζονται στις MRI (Magnetic Resonance Imaging) καθώς και το ρυθμό επιδείνωσης της αναπηρίας. Η IFN-β-1b (Betaferon, Extavia), η IFN-β-1α (Avonex) και η IFN-b-1α (Rebif), συνίσταται σε ασθενείς με την υποτροπιάζουσα μορφή της νόσου καθώς και σε όσους παρουσιάζουν ταχεία επιδείνωση (Kappos et al. 2006; Kappos et al. 2006). Μονοκλωνικό αντίσωμα, Natalizumab (Tysabri): δεσμεύεται σ ένα μόριο προσκόλλησης, την α 4 -ιντεγκρίνη, στην επιφάνεια ενεργοποιημένων Τ κυττάρων και άλλων λεμφοκυττάρων. Με αυτό τον τρόπο αναστέλλεται η μετανάστευσή τους στα σημεία φλεγμονής διαμέσου του ΑΕΦ. Ενδείκνυται σε ασθενείς που παρά τη θεραπεία τους με IFN παρουσιάζουν υψηλή δραστικότητα της νόσου με συχνές υποτροπές ή/και ταχεία εξέλιξη της νόσου (Polman et al. 2006). Glatiramer acetate (Copaxone): οξικό άλας μίγματος συνθετικών πολυπεπτιδίων που περιλαμβάνει τα αμινοξέα L-Ala, L-Glu, L-Lys, L-Tyr (Neuhaus et al., 2007). Μειώνει τον αριθμό των υποτροπών και καθυστερεί την εξέλιξη της νόσου. 10 Σ ε λ ί δ α

33 Εισαγωγή Προσομοιάζει τη μυελινική πρωτεΐνη και είναι ανταγωνιστής του επιτόπου της MBP για τον υποδοχέα των Τ-κυττάρων, ενώ προκαλεί αλλαγή της ανοσολογικής απόκρισης από Th1 σε Th2 (Weber et al. 2007). Μιτοξανδρόνη (Novantrone, Genefandrone, Mitoxan): αντινεοπλασματικό με πιθανή ανοσοκατασταλτική δράση. Επιβραδύνει την εξέλιξη της νευρολογικής ανικανότητας και μειώνει τη συχνότητα των υποτροπών. Η χρήση του περιορίζεται σε ταχέως εξελισσόμενη νόσο που δεν ανταποκρίνεται σε άλλες θεραπείες, καθώς χαρακτηρίζεται από καρδιοτοξικότητα (Zipoli et al. 2008). Φινγκολιμόδη (Gilenya): ανοσορυθμιστικό φάρμακο προερχόμενο από τον ISP- 1 μεταβολίτη του μύκητα Isaria Sinclair. Αποτελεί δομικό ανάλογο της σφιγγοσίνης και υφίσταται φωσφορυλίωση στο κύτταρο από την κινάση της σφιγγοσίνης. Δρα απομονώνοντας τα λεμφοκύτταρα στους λεμφαδένες εμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο την είσοδο τους στο ΚΝΣ (Pelletier and Hafler 2012). Φουμαρικός διμεθυλεστέρας (Tecfidera): από του στόματος θεραπεία πρώτης γραμμής, με αντιφλεγμονώδης και νευροπροστατευτική δράση. Παρότι ο ακριβής μηχανισμός δράσης του δεν έχει ακόμα γίνει πλήρως κατανοητός, έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιεί το μονοπάτι Nrf2, παρέχοντας τη δυνατότητα στα κύτταρα του οργανισμού να αμύνονται έναντι στην φλεγμονή και το οξειδωτικό στρες. Έχει αποδειχθεί ότι μειώνει τις υποτροπές και τις εστίες του εγκεφάλου και καθυστερεί την εξέλιξη της αναπηρίας, παρουσιάζοντας παράλληλα ευνοϊκή εικόνα ασφάλειας και ανοχής (Hutchinson et al. 2013). 11 Σ ε λ ί δ α

34 Εισαγωγή Σχήμα 6: Χαρακτηριστικό διάγραμμα αποτελεσματικότητας των υπαρχουσών θεραπειών συναρτήσει της ασφάλειας τους. Οι δραστικές ουσίες με την έντονη γραφή έχουν πάρει έγκριση από τον FDA (Hauser et al. 2013). Στην αγορά υπάρχουν ευρείας επιλογής θεραπευτικά σχήματα, με γνωστά τα δεδομένα ασφάλειας και αποτελεσματικότητας τους (σχήμα 6). Ωστόσο, δεν υπάρχουν επαρκείς πληροφορίες σχετικά με τη μακροπρόθεσμη δραστικότητα, τη συγκριτική αποτελεσματικότητα και την εξατομικευμένη αναλογία ρίσκου/οφέλους. Οι τρέχουσες θεραπείες προκαλούν μη ειδική ανοσοκαταστολή και συνοδεύονται από ανεπιθύμητες παρενέργειες, όπως αυξημένη ευαισθησία σε μολυσματικούς παράγοντες και ιούς. Είναι απολύτως απαραίτητο οι νέες θεραπείες που πρόκειται να αναπτυχθούν να έχουν στοχευμένη, εξατομικευμένη και νευροπροστατευτική δράση. Ο κατάλογος των σε εξέλιξη μορίων ή αυτών που πρόσφατα ολοκλήρωσαν τις κλινικές δοκιμές για την ΣΚΠ (National Multiple Sclerosis Society, περιλαμβάνει σήμερα πάνω από 150 μόρια. Επιπλέον, πολλοί δυνητικά ελπιδοφόροι νέοι παράγοντες διερευνούνται σε προκλινικές μελέτες. 12 Σ ε λ ί δ α

35 Εισαγωγή 1.Α 2 Μαννάνη Η μαννάνη (mannan) είναι ένας πολυσακχαρίτης D-μανόζης και αποτελεί το κυριότερο συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος της ζύμης Saccharomyces cerevisiae. Η μαννάνη συνδέεται με διάφορες ποσότητες πρωτεΐνης και φωσφορικών ομάδων και μπορεί να περιέχει μικρά ποσά από Ν-ακετυλο-D-γλυκοζαμίνη και άλλα σάκχαρα. Τα περισσότερα είδη μαννάνης αποτελούνται από μια κύρια αλυσίδα, όπου μόρια D- μανόζης ενώνονται με α (1 6) γλυκοζιτικούς δεσμούς, και πλευρικές αλυσίδες, όπου μόρια D-μανόζης ενώνονται με α (1 2) και α (1 3) γλυκοζιτικούς δεσμούς (Cawley and Ballou 1972). Οι δομές των πλευρικών αλυσίδων είναι χαρακτηριστικές για τα διάφορα είδη μαννάνης (σχήμα 7). OH CH 2 OH O OH OH OH M M M M M M M M M A H HO HO OH H H OH O H OH H B 1 M 3 1 M 2 M 1 1 M 1 4 Μ=μανόζη Σχήμα 7: (Α) Δομή α-d-μανόζης, (Β) Μαννάνη προερχόμενη από Saccharomyces cerevisiae (Cawley and Ballou 1972). Η μανόζη, όπως και η μαννάνη, εκφράζεται σε πολλούς παθογόνους μικροοργανισμούς (βακτήρια, ζύμη) και ο υποδοχέας της εμπλέκεται στο μηχανισμό καταστροφής αυτών των κυττάρων (Taylor et al. 1990). Ο υποδοχέας μανόζης (mannose receptor, MR) εκφράζεται στα μακροφάγα, στα ηπατικά κύτταρα, στα ανώριμα δενδριτικά κύτταρα (dendritic cells, DCs) (σχήμα 8) αλλά και σε κάποια εγκεφαλικά κύτταρα, σε αστροκύτταρα και μικρόγλοια, δρώντας ενδοκυττάρια (Stahl and Ezekowitz 1998; Burudi et al. 1999). Ο MR μεσολαβεί στην ενδοκυττάρωση, φαγοκυττάρωση και πυνοκυττάρωση αντιγόνων που περιέχουν μανόζη, φρουκτόζη, Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη και γλυκόζη (Shepherd et al. 1981; Largent et al. 1984). Επίσης, παίζει ρόλο στην αναγνώριση και 13 Σ ε λ ί δ α

36 Εισαγωγή μεταφορά των αντιγόνων που περιέχουν οξειδωμένη ή ανηγμένη μανόζη σε μόρια MHC. Πεπτίδια ή πρωτεΐνες που δρουν ως αντιγόνα και είναι συνδεδεμένα με μόρια μανόζης, αυξάνουν τη δραστικότητα αντιγονοπαρουσίασης των μορίων MHC τάξης ΙΙ από 100 έως φορές (Apostolopoulos et al. 2000; Apostolopoulos et al. 2000). Μετά την ενδοκυττάρωση του υποδοχέα, τα αντιγόνα μεταφέρονται σε μόρια MHC τάξης ΙΙ, αναγνωρίζονται από τα Τ λεμφοκύτταρα και ξεκινάει η ανοσολογική απόκριση (Apostolopoulos et al. 1995; Sallusto et al. 1995). Σχήμα 8: Οι υποδοχείς των μακροφάγων και των δενδριτικών κυττάρων οι οποίοι σχετίζονται με την αναγνώριση παθογόνων μικροοργανισμών διεγείροντας την παραγωγή των κυτταροκινών (Perez-Garcia et al. 2011). 14 Σ ε λ ί δ α

37 Εισαγωγή 1.Α 2.1 Σύζευξη πεπτιδίων με μαννάνη στην οξειδωμένη και ανηγμένη της μορφή Το μόριο της μανόζης περιέχει cis-διόλη όπου εύκολα διασπάται οξειδωτικά ο δεσμός C-C και δημιουργείται βάση shiff με αμινομάδες, όπως της Lys. Αρχικά γίνεται διάσπαση του δεσμού C-C στις cis-διόλες, οι οποίες αντιδρούν πιο γρήγορα από τις trans, λόγω ευκολίας στον σχηματισμό του κυκλικού ενδιάμεσου. H αντίδραση πραγματοποιείται με χρήση υπεριωδικού νατρίου (NaIO 4 ) σε ph 4-7. H H C C cis διόλη OH OH NaIO 4 H H C C O O OH +7 O Na I O OH -NaIO 3 -H 2 O H H H C C O O H Στη συνέχεια οι αμινομάδες (της Lys) αντιδρούν με τις αλδεϋδομάδες, αρχικά δίνοντας α- αμινοαλκοόλες ή καρβινολαμίνες. Οι καρβινολαμίνες αφυδατώνονται αμέσως προς ιμίνες ή βάσεις Schiff. Η αναγωγή των αλδεϋδομάδων σε αλκοόλες και των βάσεων Schiff σε αμίνες γίνεται με κατεργασία με υδρίδιο βορίου-νατρίου (NaBH 4 ). OH R NH 2 R' CHO R NH C R' H καρβινολαμίνη -H 2 O R NaBH 4 N C H R' ιμίνη R H N H 2 C R' 15 Σ ε λ ί δ α

38 Εισαγωγή CH 2 OH CH 2 OH O O OH OH OH OH Μαννάνη (Πολυμανόζη) n Οξείδωση της cis-διόλης με ΝαΙΟ 4 ph=6.0 OH H O O OH H Αλδεΰδη n H 2 N NH 2 COOH Πεπτιδικά ανάλογα Σχηματισμός βάσης Schiff ph=9.0 NH 2 CH 2 OH O OH Πεπτιδικά ανάλογα N H O H OH Οξειδωμένη μορφή Μαννάνης n Αναγωγή αλδεϋδομάδων/διπλών δεσμών με ΝαΒΗ 4 CH 2 OH O OH Πεπτιδικά ανάλογα H NH H HO H OH H Ανηγμένη μορφή Μαννάνης n Σχήμα 9: Συνθετική πορεία της σύζευξης πεπτιδικών αναλόγων με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη (πολυμανόζη) στην οξειδωμένη και ανηγμένη μορφή της μέσω δημιουργίας βάσεων Schiff. 16 Σ ε λ ί δ α

39 Εισαγωγή 1.Α 3 Ανθρακινόνη Η ανθρακινόνη είναι ένας αρωµατικός πολυκυκλικός υδρογονάνθρακας µε μοριακό τύπο C 14 H 8 O 2. Υπάρχουν διάφορα ισομερή, με το πιο σημαντικό παράγωγο κινόνης του ανθρακενίου την 9,10-ανθρακινόνη (IUPAC: 9,10-διοξο ανθρακένιο) η οποία αποτελεί τη μητρική ένωση μιας μεγάλης κατηγορίας των βαφών και χρωστικών. Παρασκευάζεται εμπορικά με οξείδωση ανθρακενίου με χρωμικό οξύ, με συμπύκνωση βενζολίου και φθαλικό ανυδρίτη (Friedel-Crafts) ακολουθούμενη από αφυδάτωση για κυκλοποίηση ή με αντίδραση Diels-Alder. Παράγωγα της 9,10-ανθρακινόνης έχουν χρησιμοποιηθεί και στην ιατρική ως καθαρτικά, ανθελονοσιακά, αντινεοπλασματικά αλλά και ως χρωστικές DNA στην κυτταρομετρία ροής και μικροσκόπιο φθορισμού. Η πιο γνωστή ανθρακινόνη είναι η μιτοξανδρόνη (σχήμα 10), η οποία έχει αντινεοπλασματική δράση και χρησιμοποιείται ευρέως στη θεραπεία του καρκίνου όπως στον καρκίνο του μαστού και στη λευχαιμία (Holmes et al. 1984; Thomas and Archimbaud 1997), ενώ τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιείται και στη ΣΚΠ (Fox 2006). OH O HN H N OH OH O HN N H OH Σχήμα 10: Δομή της μιτοξανδρόνης. 1.Α 3.1 Μιτοξανδρόνη και ΣΚΠ Η χρήση της μιτοξανδρόνης στην ΣΚΠ είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα λόγω του ρόλου της στη θεραπεία σε διάφορα στάδια της νόσου. Αποτελεί θεραπεία πρώτης γραμμής για κακοήθεις μορφές της ΣΚΠ αλλά και φάρμακο δεύτερης γραμμής στην υποτροπιάζουσα-διαλείπουσα ή δευτερογενή προϊούσα πολλαπλή σκλήρυνση καθυστερώντας την εξέλιξη της νόσου και αυξάνοντας το διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ των υποτροπών. Η δράση της είναι ανοσοκατασταλτική, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των μακροφάγων, των Τ και των Β κυττάρων (με πιο έντονη 17 Σ ε λ ί δ α

40 Εισαγωγή επίδραση στα Τh κύτταρα) και στην επιλεκτική μείωση της έκκρισης κυτταροκινών όπως της IFN-γ και IL-10 (Morrissey et al. 2005). Στο μηχανισμό δράσης της μιτοξανδρόνης εμπλέκεται το DNA. Ο δακτύλιος της ανθρακινόνης στη δομή της μιτοξανδρόνης, είναι αυτός που παρεμβάλλεται μεταξύ των ζευγών βάσεων του DNA και οι αζωτούχες πλευρικές αλυσίδες προσδένονται στις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες του DNA (Krishnamoorthy et al. 1986). Η δέσμευση της μιτοξανδρόνης στο DNA προκαλεί συμπύκνωση του DNA και εμποδίζει την αντιγραφή του καθώς και την RNA μεταγραφή (Nishio and Uyeki 1983). Επίσης αναστέλλει την τοποϊσομεράση ΙΙ, ένα ένζυμο που είναι υπεύθυνο για την εκτύλιξη και την επιδιόρθωση του κατεστραμμένου DNA και αυτό οδηγεί σε μονά και διπλά σπασίματα κλώνου (Capranico et al. 1993). 1.Α 3.2 Σχέση δομής-δραστικότητας παραγώγων ανθρακινόνης Εκτός από τη μιτοξανδρόνη έχουν γίνει μελέτες σύνθεσης και βιολογικής αξιολόγησης και άλλων παραγώγων ανθρακινόνης. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων από διάφορα ανάλογα οδήγησε σε κάποια συμπεράσματα σχετικά µε το ρόλο που παίζουν κάποια δομικά χαρακτηριστικά του µορίου στη δράση του (Robert et al. 1978; Johnson et al. 1979; Zee-Cheng et al. 1979): Οι υδροξυλοµάδες στις θέσεις 1 και 4 του δακτυλίου ενισχύουν τη δράση του ενώ υδροξυλίωση στις θέσεις 1 και 2 έχει μικρή επίδραση. Η παρουσία των δύο πλευρικών αλυσίδων µε βασικό χαρακτήρα, δεν φαίνεται να είναι ουσιαστική για τη δράση του µορίου. Μερικά παράγωγα µε µία αλυσίδα αντί δύο, µε ένα υδρογόνο ή µια αµινοµάδα στη θέση της πλευρικής αλυσίδας διατηρούν σημαντική δραστικότητα. Ουσίες µε πλευρικές αλυσίδες βασικού χαρακτήρα στις θέσεις 5 και 1 αντί των θέσεων 5 και 8, είναι ανενεργές. Τα άζωτα στις θέσεις 5 και 8 δε μπορούν να αντικατασταθούν από άτομα οξυγόνου. Το άτομο αζώτου των πλευρικών αλυσίδων είναι μεγάλης σημασίας, δε μπορεί να αντικατασταθεί από θείο, οξυγόνο ή µεθυλενοµάδα. 18 Σ ε λ ί δ α

41 Εισαγωγή Η απόσταση μεταξύ των δύο ατόμων αζώτου της πλευρικής αλυσίδας είναι σημαντική, καθώς μειώνοντας ή αυξάνοντας τον αριθμό των µεθυλενοµάδων αλλάζει η δραστικότητα. Το άτομο αζώτου της πλευρικής αλυσίδας πρέπει να είναι πλήρως βασικό. Πυριδυλο-, Ν-αρυλο, Ν- ακυλο- παράγωγα είναι αδρανή. Στερεοχημική παρεμπόδιση του αζώτου της πλευρικής αλυσίδας από την αύξηση του μεγέθους της, μειώνει ή εκμηδενίζει τη δράση. Νουκλεόφιλη υποκατάσταση µε 3-µεθυλο, 3-καρβοξυλο ή 2,3-διχλωρο ομάδες δίνει αδρανείς ουσίες. 6,7-διΰδρο παράγωγα έχουν συγκρίσιμη δράση µε τα αντίστοιχα αρωματικά παράγωγα, αλλά είναι λιγότερο αποτελεσματικά. Φαίνεται ότι αυτές οι ουσίες in vivo μερικώς οξειδώνονται. Παρόλο που φαίνεται ότι η πιο αποτελεσματική επιλογή για αντικαρκινική δράση είναι η NH(CH 2 ) 2 NH(CH 2 ) 2 -OH ως πλευρική αλυσίδα, έχει βρεθεί ότι η σύνδεσή της σε άλλα αρωματικά συστήματα δεν έχει οδηγήσει σε δραστικές ουσίες. 19 Σ ε λ ί δ α

42 Εισαγωγή 1.Α 4 Πεπτιδική Σύνθεση Η πεπτιδική σύνθεση μπορεί να πραγματοποιηθεί τόσο σε υγρή (LPPS) όσο και σε στερεή φάση (SPPS). Η σύνθεση πεπτιδίων σε υγρή φάση είναι μία χρονοβόρα και επίπονη τεχνική και δεν χρησιμοποιείται συχνά. Η ανάπτυξη της μεθόδου σύνθεσης πεπτιδίων επί στερεάς φάσης αποτελεί την κύρια μέθοδο σύνθεσης πεπτιδίων τα τελευταία χρόνια λόγω των δυνατοτήτων της μεθόδου στην ταχύτητα της σύνθεσης, στην απλότητα των χειρισμών αλλά και στην απόδοση των αντιδράσεων. 1.Α 4.1 Μέθοδοι σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού Η δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού και η ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο διαφορετικούς τρόπους, σταδιακή ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας (step by step) και σύνθεση μέσω συμπύκνωσης πεπτιδικών κλασμάτων (fragment or segment condensation). Ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού είναι ενδόθερμη αντίδραση και κατά συνέπεια απαιτείται υψηλή θερμοκρασία για να πραγματοποιηθεί. Ωστόσο οι υψηλές θερμοκρασίες έχουν αρνητικές επιδράσεις σε κάθε πεπτιδικό μόριο, συνεπώς είναι απαραίτητη η ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας. Η επιλογή των αντιδραστηρίων ενεργοποίησης γίνεται µε βάση την ταχύτητα σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού, την απόδοση, την απουσία παράπλευρων αντιδράσεων και την αποφυγή της ρακεµίωσης. Οι πιο γνωστές μέθοδοι σύζευξης που χρησιμοποιούνται είναι η μέθοδος των καρβοδιιμιδίων και η μέθοδος σύζευξης με φωσφωνιακά και ουρονιακά παράγωγα. Στη μέθοδο των καρβοδιιμιδίων στην SPPS το κύριο αντιδραστήριο ενεργοποίησης είναι το Ν,Ν'- διισοπροπυλοκαρβιδιιµίδιο (DIC) (Sheehan and Hess 1955). Μειονέκτημα της χρήσης του αποτελεί ο σχηματισμός της ουρίας, παραπροϊόν όμως που είναι διαλυτό και παραμένει στο διάλυμα οπότε και διαχωρίζεται από το επιθυμητό προϊόν. Το DIC συνήθως χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με το αντιδραστήριο 1- υδροξυβενζοτριαζόλιο (HOBt) για τη μείωση της ρακεμίωσης (Konig and Geiger 1970). Επίσης έχει προταθεί η χρήση του 1-υδροξυ-7-αζαβενζοτριαζολίου (HOAt) ως πρόσθετο αντιδραστήριο σύζευξης που οδηγεί σε υψηλότερες αποδόσεις και χαμηλότερα επίπεδα ρακεμίωσης (Carpino 1993). 20 Σ ε λ ί δ α

43 Εισαγωγή 1.Α 4.2 Πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση (Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS) Η SPPS περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1963 από τον Robert Bruce Merfield. Είχε την ιδέα να συνδέσει την καρβοξυλοµάδα του πρώτου αµινοξέος της πεπτιδικής αλυσίδας σε ένα στερεό πολυμερές υπόστρωμα, µέσω οµοιοπολικού δεσμού. Η επιμήκυνση της αλυσίδας πραγματοποιείται με επαναλαμβανόμενες διαδικασίες επιλεκτικής απομάκρυνσης προστατευτικής ομάδας και σύζευξης (σχήμα 11). Oι δραστικές ομάδες των αμινοξέων οι οποίες δε συμμετέχουν στη συνθετική πορεία, πρέπει να είναι προστατευμένες ώστε να μην οδηγήσουν στο σχηματισμό παραπροϊόντων. Οι πλύσεις του πολυμερούς σε κάθε κύκλο είναι απαραίτητες, ώστε να απομακρυνθούν, με κατάλληλους διαλύτες, οι περίσσειες αντιδραστηρίων και τυχόν παραπροϊόντα. Στο τέλος της σύνθεσης, το πεπτίδιο αποδεσμεύεται από τη ρητίνη, ακολουθεί απομάκρυνση των προστατευτικών ομάδων και τελικά ο καθαρισμός και η ταυτοποίηση του πεπτιδίου. R 1 R 1 HOOC NH N PG i NH NPG ii R 1 R 2 O N C H Peptide Bond NH N PG iii R 1 NH 2 HOOC R 2 NH N PG iv R 1 R 2 R 3 R 1 R 2 R 3 N H O C N H O C N H v HOOC N H O C N H O C N H vi Solid Substrate (Resin) N PG Amino Protecting Group R 1 R 2 R 3 Protecting Groups HOOC N H O C N H O C N H Σχήμα 11: Αρχή πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεή φάση. Η επιμήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας πραγματοποιείται από το C προς το Ν τελικό άκρο (Tapeinou et al. 2015). 21 Σ ε λ ί δ α

44 Εισαγωγή Η προστασία των πλάγιων δραστικών ομάδων των αμινοξέων είναι απαραίτητη για την αποφυγή παράπλευρων αντιδράσεων κατά τη διάρκεια σύνθεσης του πεπτιδίου (πίνακας 1). Η σταθερότητα της προστατευτικής ομάδας θεωρείται σημαντική ώστε να αποφεύγεται η δημιουργία διμερών ή ολιγομερών από μόρια του εκάστοτε προς σύζευξη αμινοξέος. Επιπλέον, η α-άμινο προστατευτική ομάδα πρέπει να απομακρύνεται εύκολα για την πλήρη και συνεχή επιμήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας (Zervas and Theodoropoulos 1956; ΜcKay and Albertson 1957; Carpino and Han 1970; Carpino and Han 1972). Η μέθοδος προστασίας της αμινομάδας των αμινοξέων συνδυάζεται με συγκεκριμένο τύπο πλάγιων προστατευτικών ομάδων και συγκεκριμένο τύπο ρητινών. Δύο είναι οι τύποι Ν α -προστατευτικών ομάδων που ξεχωρίζουν. Η Boc/Bzl μέθοδος, η οποία περιλαμβάνει όξινη απομάκρυνση Boc Ν α -προστατευτικής ομάδας, και η Fmoc/tBu μέθοδος, η οποία περιλαμβάνει βασική απομάκρυνση Ν α - προστατευτικής ομάδας. Ευρύτερα χρησιμοποιούμενη μέθοδος είναι η δεύτερη, με προσωρινή προστατευτική ομάδα την 9-φλουρενυλομεθοξυ-καρβονυλομάδα (Fmoc) (Carpino and Han 1970). Η απομάκρυνση της Fmoc ομάδας γίνεται με διάλυμα 20-50% πιπεριδίνης σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF). Σε αντίθεση µε την Boc/Bzl μέθοδο, η Fmoc/tBu μέθοδος χαρακτηρίζεται από τη δυνατότητα σύνθεσης προστατευμένων πεπτιδικών τμημάτων τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν περαιτέρω για κυκλοποίηση ή fragment condensation, καθώς χρησιμοποιούνται ηπιότερες συνθήκες για την απομάκρυνση τόσο του πεπτιδίου από τη ρητίνη (TFE/DCM) όσο και των πλάγιων προστατευτικών ομάδων (TFA). Σχήμα 12: Fmoc/tBu μέθοδος. Προσαρμοσμένο από (Cudic and Fields 2008). 22 Σ ε λ ί δ α

45 Εισαγωγή Πίνακας 1: Μερικές από τις πιο σημαντικές πλάγιες προστατευτικές ομάδες που χρησιμοποιούνται στην πεπτιδική σύνθεση µε βάση την Fmoc/tBu μεθοδολογία. Δραστική ομάδα Χημικός τύπος Συνθήκες απόσπασης Βιβλιογραφία 50% v/v TFA σε DCM, 1h TFA-ανισόλη (9:1), 30min TFA-ανισόλη-EDT-EMS (95:3:1:1), 1.5h (Ramage and Green 1987) (Ramage et al. 1991) Arg 2,2,5,7,8- πενταμεθυλοχρομαν-6- σουλφονυλο-ομάδα (Pmc) 2,2,4,6,7-πενταμεθυλο- διυδρο-βενζοφουραν-5- σουλφονυλο-ομάδα (Pbf) 95% v/v TFA, 30min (Carpino et al. 1993) 90% v/v TFA, 30min (Callahan et al. 1963) Tert-βουτυλομάδα (tbu) Ser, Thr, Tyr 1-5% v/v TFA σε DCM, 2- (Barlos et al. 1991; 5min Barlos et al. 1998) Τριτυλομάδα, R 1 = H (Trt) Asp, Glu Tert-βουτυλομάδα (tbu) 90% v/v TFA, 30min (Schwyzer and Dietrich 1961) 23 Σ ε λ ί δ α

46 Εισαγωγή Δραστική ομάδα Χημικός τύπος Συνθήκες απόσπασης Βιβλιογραφία 90% v/v TFA, 30-60min (Sieber and Riniker 1991) Asn, Gln Τριτυλομάδα (Trt) 50% v/v TFA σε DCM, (Sieber and Riniker His 30min 1987) 90% v/v TFA, min (Hiskey et al. 1966) Τριτυλομάδα (Trt) Cys 0.5% v/v TFA σε DCM- TES (95:5), min (Barlos et al. 1996) 4-μεθοξυ-τριτυλομάδα (Mmt) 3% v/v TFA, 5-10 min 90% v/v TFA, 1h Trp tert-βουτυλοξυκαρβονυλομάδα (Boc) ακολουθούμενη από 1% aq. TFA, 1-2h (White 1992) Lys tert-βουτυλοξυκαρβονυλομάδα (Boc) 4-μεθυλο-τριτυλομάδα (Mtt) 90% v/v TFA, 30min (Chang et al. 1980) 1% v/v TFA σε DCM, 30min (Aletras et al. 1995) AcOH-TFE-DCM (1:2:7), 1h 24 Σ ε λ ί δ α

47 Εισαγωγή 1.Α Το στερεό υπόστρωμα H ανάπτυξη της πεπτιδικής αλυσίδας σε οποιοδήποτε στερεό υπόστρωμα προϋποθέτει τη σύνδεση του C τελικού αμινοξέος με αυτό. Η σύνδεση πραγματοποιείται σε συγκεκριμένα κέντρα του πολυμερούς τα οποία έχουν τροποποιηθεί χημικά με την εισαγωγή μιας χαρακτηριστικής ομάδας-συνδέτη (linker). Κατάλληλο στερεό υπόστρωμα θεωρείται εκείνο το οποίο έχει μηχανική αντοχή και σταθερότητα, καλή διόγκωση στους διαλύτες που χρησιμοποιούνται κατά τη σύνθεση, δομή η οποία να επιτρέπει ταχεία και χωρίς στερεοχημικούς περιορισμούς αλληλεπίδραση μεταξύ του πεπτιδίου και των διαφόρων αντιδραστηρίων και δυνατότητα διαχωρισμού του στερεού υποστρώματος από την υγρή φάση σε κάθε στάδιο της αντίδρασης. Σήμερα υπάρχει μια τεράστια ποικιλία από ρητίνες με μεγάλο εύρος ιδιοτήτων και εφαρμογών. Κάποιες από τις πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες ρητίνες είναι η Wang (Wang 1973), η CLTR-Cl (Barlos et al. 1989; Barlos et al. 1989; Bollhagen et al. 1994), η Sasrin (Mergler et al. 1988) και η NovaSyn TGA (Terracciano et al. 2005). Μία από τις πιο σημαντικές ρητίνες είναι η 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνη (CLTR-Cl), η οποία είναι ιδανική για τη σύνθεση τόσο ελεύθερων όσο και προστατευμένων πεπτιδίων με μεγάλη απόδοση και υψηλή καθαρότητα των τελικών προϊόντων (Barlos et al. 1989; Barlos et al. 1989). Cl πολυμερές υπόστρωμα Cl χλωροτρίτυλο ομάδα Σχήμα 13: Δομή της 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνης. 25 Σ ε λ ί δ α

48 26 Σ ε λ ί δ α

49 Εισαγωγή 1.Β Βιβλιογραφική Ανασκόπηση - Στόχος Εργασίας Η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ) είναι μια πολυπαραγοντικής αιτιολογίας, αυτοάνοση και νευροεκφυλιστική νόσος του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) (Goldenberg 2012; Luessi et al. 2012). Το Μείζον Σύμπλεγμα Ιστοσυμβατότητας (MHC/HLA) και οι πολυμορφισμοί του αποτελούν τον κύριο γενετικό παράγοντα που επηρεάζει την ΣΚΠ, την παθοφυσιολογία, την πρόγνωση, την διάγνωση, αλλά και την θεραπευτική προσέγγιση της νόσου. Η συσχέτιση με το αλλήλιο HLA II DRB (Irizar et al. 2012) και οι αλληλεπιδράσεις του με περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η βιταμίνη D (Ramagopalan et al. 2009) ή ο ιός EBV (Anagnostouli et al. 2014), θεωρείται πλέον βεβαιωμένη. Η ΣΚΠ περιλαμβάνει την ανεξέλεγκτη επίθεση των ελύτρων της μυελίνης του ΚΝΣ από το ίδιο το ανοσοποιητικό σύστημα του ασθενούς, το οποίο παύει να διακρίνει σωστά μεταξύ δικών του και ξένων αντιγόνων με αποτέλεσμα να ενεργοποιείται μια φλεγμονώδης Τh1 ανοσολογική αντίδραση η οποία τελικά οδηγεί στην καταστροφή της μυελίνης και στην εμφάνιση της νόσου (Frohman et al. 2006). Η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος πραγματοποιείται μέσω της δημιουργίας του τριμοριακού συμπλόκου TCR (υποδοχές Τ κυττάρου) - Αντιγόνο (πεπτίδιο) - ΗLA (σύστημα ιστοσυμβατότητας) η οποία οδηγεί αρχικά στην ενεργοποίηση των βοηθητικών Τ κυττάρων (Anderton et al. 2001; Hemmer et al. 2006). Αυτοαντιγόνα στη ΣΚΠ θεωρούνται πεπτιδικά τμήματα (12-18 αμινοξέων) των πρωτεϊνών της μυελίνης όπως η MBP και η MOG (Lutterotti et al. 2013). Παρά την μεγάλη πρόοδο που έχει επιτευχθεί, από τη δεκαετία του 1990 με την ανακάλυψη ειδικών φαρμάκων, η ίαση της νόσου παραμένει ανεπίτευκτη. Μέχρι σήμερα εφαρμόζονται θεραπευτικά πρωτόκολλα που επάγουν κυρίως ανοσορύθμιση, αλλά είναι μόνο εν μέρει αποτελεσματικά και συσχετίζονται με παρενέργειες (Minagar 2013). Για το λόγο αυτό, είναι απαραίτητες στοχευμένες θεραπείες έναντι των κυττάρων που εμπλέκονται στην παθογένεια της νόσου και επαγωγή ανοχής στα Τ- λεμφοκύτταρα που είναι ειδικά για συγκεκριμένα αυτοναντιγόνα. Πολλές σύγχρονες προσεγγίσεις για τη θεραπεία της ΣΚΠ βασίζονται στην έρευνα με βάση τα πεπτίδια, συμβάλλοντας σημαντικά στην κατανόηση της ασθένειας, στον χαρακτηρισμό των μοριακών μηχανισμών, με στόχο την ανάπτυξη νέων μορίων για θεραπεία (Alcaro and Papini 2006). Την τελευταία δεκαετία, υπάρχει ένα αυξημένο ενδιαφέρον στα πεπτίδια, καθώς αναγνωρίζονται ως εξαιρετικά εκλεκτικά, αποτελεσματικά και ταυτόχρονα σχετικά ασφαλή, στην φαρμακευτική έρευνα και ανάπτυξη και περίπου Σ ε λ ί δ α

50 Εισαγωγή θεραπευτικά πεπτίδια επί του παρόντος αξιολογούνται σε διάφορες κλινικές δοκιμές, (Fosgerau and Hoffmann 2015). Κατά την εκπόνηση της διατριβής έγινε προσπάθεια, με βάση την κατανόηση της παθοφυσιολογίας της ΣΚΠ, όπως έχει περιγραφεί στη βιβλιογραφία, να ελεγχθεί η ανοσολογική επίθεση στη μυελίνη. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν ορθολογικά και συντέθηκαν πεπτιδικά ανάλογα με βάση τους ανοσοκυρίαρχους επιτόπους των πρωτεϊνών της μυελίνης MBP και MOG. Στην παρούσα διατριβή, σχεδιάστηκαν και μελετήθηκαν δύο διαφορετικές ανοσοθεραπευτικές στρατηγικές, που πιθανώς θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην αντιμετώπιση της ασθένειας. Η πρώτη προσέγγιση περιλαμβάνει τη χρήση πεπτιδικών αναλόγων συζευγμένων με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη, με στόχο την ανοχή του ανοσοποιητικού συστήματος μέσω των δενδριτικών κυττάρων (DCs) (κυτταρική ανοχή στα CD4 + λεμφοκύτταρα). Τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα όπως τα DCs είναι σημαντικά για τη δημιουργία ανοσοαποκρίσεων έναντι ξένων αντιγόνων, καθώς και τη διατήρηση της ανοχής έναντι αυτοαντιγόνων στην περιφέρεια (Meuth et al. 2012). Στις αυτοάνοσες νόσους, όπως η ΣΚΠ, η περιφερική ανοχή χάνεται. Πεπτιδικά μυελινικά αντιγόνα του ΚΝΣ έχουν τη δυνατότητα να επαναφέρουν περιφερική ανοχή όταν στοχεύουν τον υποδοχέα μανόζης (MR) που υπάρχει στα DCs και στα μακροφάγα, με σύζευξη με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη (Steinman 2008). Το σύστημα μαννάνης-mr επάγει ισχυρή και πολύ δραστική αντιγονοπαρουσίαση των αντιγόνων και έχει χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση ανοσοαποκρίσεων έναντι κυττάρων όγκου, με ενθαρρυντικά αποτελέσματα σε κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙΙ σε ασθενείς με καρκίνο (Apostolopoulos et al. 2006). Στα πλαίσια αυτής της μελέτης πραγματοποιήθηκε σύζευξη πεπτιδίων, των ανοσοκυρίαρχων επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης με τη μαννάνη, ανάπτυξη μεθοδολογίας για τον έλεγχο των συζευγμάτων καθώς και έλεγχος σταθερότητας του συζεύγματος. Ακολούθησε ανοσολογική και βιολογική αξιολόγηση των συντιθέμενων αναλόγων με ενθαρρυντικά αποτελέσματα (Day et al. 2015; Tseveleki et al. 2015). Πεπτιδικά ανάλογα συζεύχθηκαν με μαννάνη στην οξειδωμένη και ανηγμένη μορφή του πολυσακχαρίτη μέσω μιας γέφυρας σύνδεσης, του δεκαπεπτιδίου [KG] 5. Η σύζευξη των πεπτιδίων πραγματοποιείται μέσω δημιουργίας βάσεων Schiff, όπου οι αλδεΰδες της οξειδωμένης μορφής του πολυσακχαρίτη αντιδρούν με τις αμινομάδες του καταλοίπου της λυσίνης, που υπάρχει στη γέφυρα [KG] 5. Για τον έλεγχο πραγματοποίησης της σύζευξης αναπτύχθηκε μεθοδολογία βασισμένη στην SDS- PAGE, η οποία επίσης χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω μελέτη του συζεύγματος, όπως 28 Σ ε λ ί δ α

51 Εισαγωγή ο βέλτιστος χρόνος πραγματοποίησης της σύζευξης και ο αριθμός των [KG] n στη γέφυρας σύζευξης. Ταυτόχρονα υπολογίστηκε το όριο ανίχνευσης ελεύθερου πεπτιδίου που μπορούμε να πετύχουμε με τη συγκεκριμένη μέθοδο ενώ έγινε προσδιορισμός και των ελεύθερων αλδεϋδομάδων στη μαννάνη (Tapeinou et al. 2015). Τέλος, μελετήθηκε η σταθερότητα του συζεύγματος σε χρονικό διάστημα διάρκειας δύο χρόνων σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες. Η δεύτερη στρατηγική που διερευνήθηκε, περιλαμβάνει μία προσέγγιση κατά την οποία γίνεται χρήση πεπτιδικών αναλόγων συζευγμένων με ανοσοκατασταλτικές ενώσεις (ανάλογα ανθρακινόνης/μιτοξανδρόνης) για επιλεκτική ανοσοκαταστολή και καταστροφή των εγκεφαλιτογόνων Τ κυττάρων που εμπλέκονται στην εμφάνιση της ΣΚΠ. Η μιτοξανδρόνη ως ισχυρό ανοσοκατασταλτικό έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως στη ΣΚΠ και ενδείκνυται για μείωση της νευρολογικής αναπηρίας και της συχνότητα των υποτροπών σε ασθενείς σε διάφορα στάδια της νόσου (Fox 2006). Η δράση της είναι ανοσοκατασταλτική κυρίως στα Τh κύτταρα, μειώνοντας επιλεκτικά την έκκριση κυτταροκινών όπως της IFN-γ και IL-10, καθώς αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των μακροφάγων και των Β κυττάρων (Morrissey et al. 2005). Η μιτοξανδρόνη είναι παράγωγο ανθρακινόνης, ο δακτύλιος της οποίας παρεμβάλλεται μεταξύ των ζευγών βάσεων του DNA αναστέλλοντας την αντιγραφή του με συνέπεια τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Krishnamoorthy et al. 1986). Στα πλαίσια της διατριβής, πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός, σύνθεση και αξιολόγηση ενός αναλόγου ανθρακινόνης με βάση τη μιτοξανδρόνη συζευγμένο με τον επίτοπο της MBP. Συνδέτης χρησιμοποιήθηκε ένα εξαπεπτίδιο αποτελούμενο από αμινοεξανοϊκό οξύ (Yu et al. 2011), ενώ η σύζευξη πραγματοποιήθηκε μέσω δισουλφιδικού δεσμού. Το συντιθέμενο ανάλογο αξιολογήθηκε για την ανασοκατασταλτική του δράση στην ανθρώπινη καρκινική σειρά αίματος Jurkat. Τα Jurkat είναι Τ λεμφοκύτταρα και επιλέχθηκαν διότι η ΣΚΠ ανήκει στις ρυθμιζόμενες από Τ κύτταρα αυτοάνοσες νόσους. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες ανοσοφθορισμού για τον εντοπισμό του αναλόγου στο κύτταρο και για τον ρόλο του δισουλφιδικού δεσμού σε συνδυασμό με τη δράση της αναγωγάσης της θειορεδοξίνης. Επίσης, το ανάλογο μελετήθηκε ως προς την ικανότητα πρόσδεσης του με την πρωτεΐνη HLA II και συγκεκριμένα με τα αλλήλια DRB και DRB (Quandt et al. 2012). Το IC 50 του αναλόγου υπολογίστηκε ενώ χρησιμοποιήθηκε πεπτίδιο αναφοράς ο ανοσοκυρίαρχος επίτοπος MBP (Bielekova et al. 2000). Η πρωτεΐνη εκφράστηκε από την κυτταρική σειρά HEK293 μέσω τεχνικής ανασυνδυασμένου DNA (Majera et al. 2012). Το ανάλογο δύναται να χρησιμοποιηθεί 29 Σ ε λ ί δ α

52 Εισαγωγή στη συνέχεια για την ενσωμάτωση του στην τετραμερή μορφή της HLA II DRB πρωτεΐνης (Bischof et al. 2004). Απώτερος στόχος της μελέτης είναι το τετραμερές που θα αναπτυχθεί να χρησιμοποιηθεί σε in vivo και in vitro πειράματα για την επιλεκτική καταστροφή των εγκεφαλιτογόνων Τ κυττάρων τα οποία έχουν ενεργοποιηθεί από τον ανοσοκυρίαρχο MBP επίτοπο (Constantin et al. 2002; Greene et al. 2008). Η επιλογή της τετραμερούς μορφής της πρωτεΐνης έγινε καθώς είναι γνωστό ότι ο TCR μπορεί να αναγνωρίσει αντιγόνα (πεπτιδίου-hla) στην επιφάνεια αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου ή την τετραμερή μορφή της πρωτεΐνης (Novak et al. 2001; Nepom et al. 2002). 30 Σ ε λ ί δ α

53 2. Πειραματικό Μέρος

54

55 Πειραματικό μέρος Συσκευές-Όργανα-Υλικά Για τη σύνθεση των πεπτιδικών αναλόγων χρησιμοποιήθηκαν πλαστικές σύριγγες με πορώδη ηθμό G2 στο κάτω μέρος και στρόφιγγα που μπορούσε να συνδεθεί με αντλία κενού (phenomenex vaccum pump). Η CLTR-Cl ρητίνη καθώς και τα προστατευμένα αμινοξέα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από την εταιρεία Chemical and Biopharmaceutical Laboratories of Patras. Η παρακολούθηση στις πορείες της πεπτιδικής σύνθεσης πραγματοποιήθηκε με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) και test Kaiser. Πλάκες TLC (Merck) με silica gel 60 και δείκτη φθορισμού F 254 (0.2 mm) επιστρωμένη σε φύλλα αλουμινίου χρησιμοποιήθηκαν για TLC. Το συστήματα των διαλυτών που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη των χρωματογραφημάτων είναι ACN/H 2 O (2:1 v/v). Η εμφάνιση των κηλίδων πραγματοποιήθηκε με UV ακτινοβολία και ψεκασμό με διάλυμα νινυδρίνης (0.3 gr νινυδρίνης, 100 ml n-buoh και 3 ml AcOH) στους o C. Τα αντιδραστήρια Kaiser έχουν τη σύσταση: Kaiser 1: 500 mg νινιδρίνη σε 10 ml EtOH Kaiser 2: 80 gr PhOΗ σε 20 ml EtOH Kaiser 3: 2 ml 0.001M KCN σε 98 ml πυριδίνης Για τον έλεγχο της καθαρότητας των συντιθέμενων αναλόγων χρησιμοποιήθηκε υγρή χρωματογραφία υψηλής επίδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) της εταιρείας Agilent Technologies, 1260 Afinity, Quaternary Pump VL, με λειτουργικό σύστημα Microsoft Windows 7 και ανιχνευτή Agilent 1260 DAD VL (Photodiode Array Detector, υπεριώδους με συστοιχία διόδων). Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν η Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 ( mm) με διάμετρο σωματιδίων 3.5 μm. Τα χρωματογραφήματα ελήφθησαν με χρήση διαλυμάτων έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης (gradient) και ταχύτητα ροής 1 ml/min. Οι διαλύτες έκλουσης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν (Α) διάλυμα TFA σε H 2 O 0.08 % (v/v) και (Β) διάλυμα TFA σε ACN 0.08 % (v/v). Ο τελικός καθαρισμός των συντιθέμενων αναλόγων έγινε με ημιπαρασκευαστικό HPLC της εταιρίας Waters (600 controller) με λειτουργικό σύστημα millennium 2.1 και 33 Σ ε λ ί δ α

56 Πειραματικό μέρος ανιχνευτή Waters 996 (Diode Array didector, υπεριώδους με συστοιχία διόδων). Η στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν η Nucleosil RP-18 (250x10 mm) με διάμετρο σωματιδίων 7 μm ενώ η ταχύτητα ροής ήταν 3 ml/min. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε HPLC της εταιρείας Waters (Delta Drep Controller) με λειτουργικό σύστημα Empower και ανιχνευτή Waters 2996 (Photodiode Array Detector, υπεριώδους με συστοιχία διόδων). Η παρασκευαστική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν η μbondapaktm C18 (30x300 mm) με διάμετρο σωματιδίων 10 μm ενώ η ταχύτητα ροής ήταν 9 ml/min. Για την ταυτοποίηση των αναλόγων χρησιμοποιήθηκε φασματομετρία μάζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό (Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI- MS) με συσκευή Electrospray Platform LC της εταιρίας Waters και με λειτουργικό σύστημα MassLynx V4.1. Οι συμπυκνώσεις των διαλυμάτων έγιναν υπό ελαττωμένη πίεση, σε υδρόλουτρο θερμοκρασίας o C, σε συσκευή Buchi (Rotavapor R-200). Η λυοφιλοποίηση των προϊόντων έγινε με το σύστημα Freezone 4.5 της Labconco. Τα φάσματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού ελήφθησαν στα MHz σε φασµατόµετρο Bruker Avance 400 DPX. Ουσία αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το τετραµεθυλοπυρίτιο (TMS) και διαλύτες οι CDCl 3 και d 6 -DMSO. Για την μέτρηση της απορρόφησης UV/Vis χρησιμοποιήθηκε συσκευή Varian Cary 4000 µε ρυθµό σάρωσης 0.2 nm/min και εύρος σάρωσης µήκους κύµατος nm. Ο πολυσακχαρίτης (μαννάνη) που χρησιμοποιήθηκε ήταν της Sigma Aldrich (Mannan from Saccharomyces cerevisiae Sodium content 1.6% Phosphorus content 0.6%). Για τον καθαρισμό του, χρησιμοποιήθηκαν στήλες χρωματογραφίας PD-10, Sephadex TM G- 25M της εταιρίας Healthcare. Για τον καθαρισμό της HLA DR2 πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε στήλη νικελίου, Ni Sepharose TM 6 Fast Flow της εταιρίας GE Healthcare. Για την ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιήθηκε η συσκευή Mini-PROTEAN Tetra Cell της Biorad με τροφοδοτικό PowerPac Basic power supply. Οι δείκτες μοριακών βαρών (markers) που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό πεπτιδίου ήταν οι SDS-PAGE standards, Prestained Broad Range και Unstained 34 Σ ε λ ί δ α

57 Πειραματικό μέρος Polypeptide της εταιρίας BioRad, ενώ για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών o PageRuler Plus Prestained Protein Ladder της εταιρείας ThermoScientific. Όλες οι ποσοτικοποιήσεις στις πηκτές και στην ανάλυση κατά Western έγιναν με το πρόγραμμα ImageJ. Η κυτταρική σειρά που χρησιμοποιήθηκε για τα βιολογικά πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, ήταν η ανθρώπινη καρκινική σειρά Τ λεμφοκυττάρων Jurkat, την οποία ευγενώς μας παρείχε το Εργαστήριο Κλινικής Ογκολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Για την έκφραση της HLA DR2 πρωτεΐνης η καρκινική κυτταρική σειρά που χρησιμοποιήθηκε ήταν η επιθηλιακή εμβρυική νεφρική σειρά HEK293, η οποία ήταν ευγενική χορηγία από την εταιρεία NIH Tetramer Core Facility, USA. Τα κύτταρα ήταν τροποποιημένα (ανασυνδυασμένο DNA) καθώς περιείχαν πλασμίδιο που ενεργοποιούσε την έκφραση της επιθυμητής πρωτεΐνης. Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε επωαστικό θάλαμο (Thermo, Msc- Advance, Heracell 150 Thermo, Germany) με συνθήκες 37 ο C, ατμόσφαιρα 5% CO 2 και απόλυτη υγρασία. Τα θρεπτικά μέσα καθώς και τα συμπληρώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την κάθε κυτταρική σειρά περιγράφονται στον πίνακα Σ ε λ ί δ α

58 Πειραματικό μέρος Πίνακας 2: Χρησιμοποιούμενα θρεπτικά μέσα με τα αντίστοιχα συμπληρώματα στην καλλιέργεια των κυττάτων. Κύτταρα Θρεπτικό μέσο Συμπληρώματα Αντιβιοτικά 2 mm L-γλουταμίνη 4.5 gr/l γλυκόζη 1 mm πυροσταφυλικό 100 μg/ml πενικιλλίνη G/ RPMI 1640 νάτριο στρεπτομυκίνη, Jurkat 1 mm διτανθακικό νάτριο 0.01 mg/ml ινσουλίνη 2.5 μg/ml αμφοτερικίνη, 50 μg/ml γενταμικίνη 10 % βόειος εμβρυικός ορός (FBS) RPMI (χωρίς ερυθρό της φαινόλης) 2 mm L-glutamine 100 μg/ml πενικιλλίνη G/ 10 % βόειος εμβρυικός στρεπτομυκίνη, ορός (FBS) 2.5 μg/ml αμφοτερικίνη 2 mm L-γλουταμίνη 100 μg/ml πενικιλλίνη G/ HEK293 DMEM 10 % βόειος εμβρυικός ορός (FBS) στρεπτομυκίνη, 2.5 μg/ml αμφοτερικίνη, 50 μg/ml γενταμικίνη Για τη λύση των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε συσκευή υπερήχων MSE. Για τον ανοσοφθορισμό χρησιμοποιήθηκε ανάστροφο μικροσκόπιο, confocal Axiovert 40CFL, AxioCam ERc, Zeiss Germany, ενώ για τα πειράματα φθορισμού το ανάστροφο μικροσκόπιο με φθορισμό Nikon (Eclipse TE 2000). Για τη δοκιμή ελεύθερων θειολομάδων χρησιμοποιήθηκε φασματόμετρο Jasco V-630 Bio spectrophotometer. 36 Σ ε λ ί δ α

59 Πειραματικό μέρος Άλλα όργανα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: i. Πεχάμετρο ΗΑΝΝΑ, ΗΙ 2210 ΗΙ 2211 ii. Πιπέτες ακριβείας από την εταιρεία Gilson iii. Αναλυτικός ζυγός, KERN iv. Συσκευή Υπερκάθαρου νερού Millipore Simplicity system v. Φυγόκεντρος labofuge 400R Heraeus, Thermo Τέλος, τα διάφορα αντιδραστήρια καθώς και οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν τόσο στη σύνθεση όσο και για τα βιολογικά πειράματα προέρχονταν από τις εταιρείες Merck, Sigma Aldrich, Fluka, Acros, Fischer Chemical, BioRad, Piece, Biochrom, Invitrogen, Biosera, ThermoScientific, SantaCruze Blotechnology και CellSignalling. Τα εμπορικά φαρμακευτικά σκευάσματα Novatrone-Mitoxandrone HCl (MEDA Pharmaceuticals AE) και Platosin-CisPlatin (Pharmachemie BV) που χρησιμοποιήθηκαν ως ενώσεις αναφοράς ευγενώς τα παρείχε το Εργαστήριο Κλινικής Ογκολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. 37 Σ ε λ ί δ α

60 38 Σ ε λ ί δ α

61 Πειραματικό μέρος 2.A Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων 2.A 1 Γενική πορεία σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεά φάση Εστεροποίηση Ν α -Fmoc αμινοξέων στην CLTR-Cl Η ρητίνη (1.5 mmol/gr ρητίνης) διογκώνεται σε DCM (7 ml/gr) υπό ελαφρά ανάδευση για 5 min. Στη συνέχεια προστίθεται DIPEA (4.5 mmol/gr ρητίνης). Μετά από ~1 min προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα Ν α -Fmoc αµινοξέος (1.5 mmol/gr ρητίνης) που έχει διαλυθεί στον ελάχιστο όγκο DCM ή/και DMF. Το μίγμα τοποθετείται σε μαγνητικό αναδευτήρα όπου και παραμένει για 2 h σε θερμοκρασία δωματίου. Η ρητίνη διηθείται και πλένεται με διάλυμα DCM/MeOH/DIPEA (80:15:5) (3x10 ml/gr ρητίνης) για 5 min/πλύση. Τέλος, γίνονται πλύσεις με DMF (3x10 ml/gr ρητίνης), i-proh (3x10 ml/gr ρητίνης) και MeOH (2x10 ml/gr ρητίνης). Ακολουθεί απομάκρυνση της Ν α -Fmoc ομάδας του αµινοξέος Αντιπροσωπευτικά, η υποκατάσταση της ρητίνης που χρησιμοποιήθηκε ήταν 0.6 mmol/gr ρητίνης (Barlos et al. 1991). Απομάκρυνση της Ν α -Fmoc ομάδας του αµινοξέος Η ρητίνη πλένεται με διάλυμα 25% πιπεριδίνης σε DMF (1x10 ml/gr ρητίνης για 5 min, 1x10 ml/gr ρητίνης για 15 min και 1x10 ml/gr ρητίνης για 10min). Έπειτα πλένεται με DMF (4x10 ml/gr ρητίνης) και i-proh (3x10 ml/gr ρητίνης). Για τον έλεγχος της απομάκρυνσης της Ν α -Fmoc ομάδας του αµινοξέος χρησιμοποιείται το Kaiser test και η χρωματογραφία TLC. Μέθοδος σύζευξης με DIC/HOBt Διαλύεται η απαιτούμενη ποσότητα Fmoc-αµινοξέος στην ελάχιστη ποσότητα DIMAC, mmol Fmoc-ΑΑ-OH=2.5x (υποκατάσταση ρητίνης) x (μάζα ρητίνης). Στη συνέχεια προστίθεται στη ρητίνη, μαζί με το διάλυμα του Fmoc-αμινοξέος, HOBt [mmol HOBt=3.7 x (υποκατάσταση ρητίνης) x (μάζα ρητίνης)] και DIC [mmol DIC=2.35 x (υποκατάσταση ρητίνης) x (μάζα ρητίνης)]. Μετά το τέλος της σύζευξης η ρητίνη διηθείται και πλένεται με DMF (4x10 ml/gr ρητίνης) και i-proh (3x10 ml/gr ρητίνης). Ο έλεγχος της σύζευξης γίνεται με Kaiser test και χρωματογραφία TLC. 39 Σ ε λ ί δ α

62 Πειραματικό μέρος Έλεγχος της συνθετικής πορείας με test Kaiser Μεταφέρεται σε δοκιμαστικό σωλήνα 2-3 mg πεπτιδίου-ρητίνης και προστίθονται δύο σταγόνες από το κάθε αντιδραστήριο Kaiser που αναφέρθηκε παραπάνω. Το μίγμα θερμαίνεται για 5 min σε θερμοθάλαμο στους o C. Το χρώμα του διαλύματος και των κόκκων της ρητίνης πρέπει να είναι κίτρινο για τον έλεγχο της αντίδρασης σύζευξης και σκούρο καφέ-μπλε αν η αντίδραση σύζευξης δεν έχει ολοκληρωθεί, όπου και ακολουθεί επανασύζευξη με τις μισές ποσότητες. Αντίθετα, για τον έλεγχο της απομάκρυνση της Fmoc-ομάδας το χρώμα του διαλύματος και των κόκκων της ρητίνης πρέπει να είναι σκούρο καφέ-μπλε. Ακολουθεί χρωματογραφία TLC, όπως περιγράφεται παρακάτω, για περαιτέρω έλεγχο. Έλεγχος της συνθετικής πορείας με TLC (χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας) Μεταφέρονται 1-2 mg πεπτιδίου-ρητίνης σε δοκιμαστικό σωλήνα και στη συνέχεια προστίθενται DCM/TFE (7:3 v/v) ώστε να απομακρυνθεί το πεπτίδιο από τη ρητίνη. Μετά από 5 min τοποθετείται κηλίδα από το διάλυμα σε πλάκα χρωματογραφίας και αναπτύσσεται σε κατάλληλο σύστημα διαλυτών. Απομάκρυνση πεπτιδίου από τη CLTR-Cl ρητίνη και ολική αποπροστασία Μετά την ολοκλήρωση της επιθυμητής πεπτιδικής αλυσίδας, ακολουθεί η απομάκρυνση του πεπτιδίου από τη ρητίνη. Για το σκοπό αυτό, μεταφέρεται σε σφαιρική φιάλη το πεπτίδιο-ρητίνη, προστίθεται το διάλυμα διάσπασης DCM/TFE (7/3, v/v) (10 ml/gr πεπτιδίου-ρητίνης) και παραμένει υπό ανάδευση για 2 h σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια η ρητίνη διαχωρίζεται από το διάλυμα µε διήθηση και το διήθηµα συμπυκνώνεται υπό ελαττωμένη πίεση. Το πεπτίδιο καταβυθίζεται συνήθως µε προσθήκη ψυχρού Et 2 O ή H 2 O στο ελαιώδες υπόλειμμα. Το λαμβανόμενο στερεό διηθείται και ξηραίνεται υπό κενό πάνω από P 2 O 5. Για την ολική αποπροστασία μεταφέρεται το προστατευμένο πεπτίδιο σε σφαιρική φιάλη, προστίθεται διάλυμα TFA σε DCM μαζί με δεσμευτές κατιόντων (scavengers) (10 ml/gr προστατευμένου πεπτιδίου) και παραμένει υπό ανάδευση για 4-5 h σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί συμπύκνωση υπό ελαττωμένη πίεση και προστίθεται ψυχρός Et 2 Ο, ώστε να καταβυθιστεί το πεπτίδιο. Ακολουθεί διήθηση υπό κενό και τέλος το προϊόν τοποθετείται σε ξηραντήρα, όπου ξηραίνεται υπό κενό πάνω 40 Σ ε λ ί δ α

63 Πειραματικό μέρος από P 2 O 5. Η σύσταση του διαλύματος TFA/DCM και η χρήση των δεσμευτών κατιόντων (scavengers) εξαρτάται από τον τύπο των πλάγιων προστατευτικών ομάδων. 41 Σ ε λ ί δ α

64 Πειραματικό μέρος 2.A 2 Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων σε στερεή φάση επί της CLTR-Cl ρητίνης κατά στάδια (step by step) Σύνθεση των: 1. (KG) 5 MOG (Pro 42 ) H-Lys-(Gly-Lys) 4 -Gly-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Pro 42 -Pro-Phe-Ser-Arg-Val- Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys-OH 2. (Ahx) 6 MBP H-Ahx-(Ahx) 5 -Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg- OH Αρχικά πραγματοποιήθηκε η εστεροποίηση 1.5 mmol Fmoc-Lys Boc -OH (0.70 gr), και Fmoc-Arg Pbf -OH (0.97 gr) σε 1 gr CLTR-Cl ρητίνη για τα ανάλογα 1 και 2 αντίστοιχα. Στη συνέχεια η Fmoc-ομάδα απομακρύνθηκε με διάλυμα πιπεριδίνης σε DMF και ακολούθησε η σύνθεση των πεπτιδίων σύμφωνα με την πορεία σύνθεσης που έχει περιγραφεί. Ο έλεγχος σύζευξης και απομάκρυνσης της Fmoc-ομάδας γίνεται με Kaiser test και χρωματογραφία TLC. Μετά την ολοκλήρωση της πεπτιδικής αλυσίδας ελήφθησαν: gr (KG) 5 MOG (Pro 42 ) protected CLTR H-Lys Boc -(Gly-Lys Boc ) 4 -Gly-Met-Glu tbu -Val-Gly-Trp-Tyr tbu -Arg Pbf -Pro 42 -Pro-Phe- Ser-Arg Pbf -Val-Val-His Trt -Leu-TyrtBu-Arg Pbf -Asn-Gly-Lys Boc -CLTR gr (Ahx) 6 MBP protected CLTR H-Ahx-(Ahx) 5 -Glu tbu -Asn-Pro-Val-Val-His Trt -Phe-Phe-Lys Boc -Asn-Ile-Val-Thr tbu - Pro-Arg Pbf -CLTR Ακολούθησε απομάκρυνση των πεπτιδίων από τη ρητίνη µε χρήση διαλύματος DCM/TFE (7/3, v/v) για 2 h σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε διήθηση της ρητίνης, συμπύκνωση των διηθηµάτων υπό ελαττωμένη πίεση και καταβύθιση των πεπτιδίων µε Et 2 O. Για το ανάλογο 1 η διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε 1 gr ρητίνης πεπτιδίου, ενώ για το ανάλογο 2 σε 50 mg. Ελήφθησαν: 42 Σ ε λ ί δ α

65 Πειραματικό μέρος gr (KG) 5 MOG (Pro 42 ) protected 2. H-Lys Boc -(Gly-Lys Boc ) 4 -Gly-Met-Glu tbu -Val-Gly-Trp-Tyr tbu -Arg Pbf -Pro 42 -Pro- Phe-Ser-Arg Pbf -Val-Val-His Trt -Leu-TyrtBu-Arg Pbf -Asn-Gly-Lys Boc -OH mg (Ahx) 6 MBP protected 4. H-Ahx-(Ahx) 5 -Glu tbu -Asn-Pro-Val-Val-His Trt -Phe-Phe-Lys Boc -Asn-Ile-Val- Thr tbu -Pro-Arg Pbf -OH H απομάκρυνση των tbu, Pbf, Boc και Trt ομάδων από τα προστατευμένα πεπτίδια έγινε µε κατεργασία µε διάλυμα 94% TFA, 2.5% ανισόλη, 2.5% TES και 2-3 σταγόνες Η 2 Ο, για 5 h (ανάλογο 1) και 3 h (ανάλογο 2) σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν ακολούθησε συμπύκνωση του διηθήµατος υπό ελαττωμένη πίεση και καταβύθιση του πεπτιδίου µε Et 2 O. Ελήφθησαν: gr (KG) 5 MOG (Pro 42 ) H-Lys-(Gly-Lys) 4 -Gly-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Pro 42 -Pro-Phe-Ser-Arg-Val- Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys-OH mg (Ahx) 6 MBP H-Ahx-(Ahx) 5 -Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg- OH Ο καθαρισµός των πεπτιδίων έγινε µε ηµιπαρασκευαστικό RP-HPLC (διαλύτης έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης 10% ACN σε 45 min 60% ACN). Ελήφθησαν: gr (KG) 5 MOG (Pro 42 ) mg (Ahx) 6 MBP Σ ε λ ί δ α

66 Πειραματικό μέρος 2.A 2.1 Σύζευξη του αναλόγου (Ahx) 6 MBP (2) με SPDP [Succinimidyl 3-(2- Pyridyldithio)Propionate] Μετά την ολοκλήρωση της πεπτιδικής αλυσίδας του αναλόγου 2 στη ρητίνη, ακολούθησε η σύζευξη του SPDP στο ελεύθερο άμινο τελικό άκρο του Ahx. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε στερεή φάση με την προσθήκη του SPDP στην ελάχιστη ποσότητα DIMAC. O O N S S O N SPDP O H-(Ahx) 6 MBP protected - CLTR 2h O N S S N H (Ahx) 6 MBP protected - CLTR 3 Ένωση Μοριακό Βάρος (g/mol) Ποσότητα mmol H-(Ahx) 6 MBP protected CLTR mg 0.15 (0.5 mmol/gr ρητίνης) SPDP mg 0.15 Μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης ακολούθησε απομάκρυνση του πεπτιδικού αναλόγου 3 από τη ρητίνη µε χρήση διαλύματος DCM/TFE (7/3, v/v) για 2 h σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησε διήθηση της ρητίνης, συμπύκνωση του διηθήματος υπό ελαττωμένη πίεση και καταβύθιση του πεπτιδίου µε Et 2 O. Ελήφθησαν: protected 0.18 gr SPDP-(Ahx) 6 MBP SPDP-Ahx-(Ahx) 5 -Glu(tBu)-Asn-Pro-Val-Val-His(Trt)-Phe-Phe-Lys(Boc)-Asn-Ile- Val-Thr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-OH 44 Σ ε λ ί δ α

67 Πειραματικό μέρος H απομάκρυνση των tbu, Pbf, Boc και Trt ομάδων από τo προστατευμένo πεπτίδιo έγινε µε κατεργασία µε διάλυμα 94% TFA, 2.5% ανισόλη, 2.5% TES και 2-3 σταγόνες Η 2 Ο, για 5 h σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησε συμπύκνωση του διηθήµατος υπό ελαττωμένη πίεση και καταβύθιση του πεπτιδίου µε Et 2 O. Ελήφθησαν: 0.11 gr SPDP-(Ahx) 6 MBP SPDP-Ahx-(Ahx) 5 -Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg- ΟΗ Ο καθαρισµός του πεπτιδικού αναλόγου έγινε µε ηµιπαρασκευαστικό RP-HPLC (διαλύτης έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης 30% ACN σε 45 min 70% ACN). Ελήφθησαν: 0.07 gr SPDP-(Ahx) 6 MBP Σ ε λ ί δ α

68 Πειραματικό μέρος 2.B Σύζευξη πεπτιδικών αναλόγων σε μαννάνη Πειραματική Πορεία 1. Οξειδωτική διάσπαση της μαννάνης μεταξύ των C 2 -C 3 των μορίων μανόζης. i. 14 mg μαννάνης διαλύονται σε 1 ml ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (0.1 M, ph 6), διάλυμα Α. ii gr NaIO 4 διαλύονται σε 10 ml ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (0.1 Μ, ph 6), διάλυμα Β. iii. Στο διάλυμα Α προστίθονται 100 μl διαλύματος Β και προκύπτει το διάλυμα Γ. iv. Το διάλυμα Γ αφήνεται για 1 h στους 4 ο C και έπειτα προστίθενται 10 μl αιθανοδιόλη για 30 min στους 4 ο C. 2. Καθαρισμός μαννάνης, μετά την οξειδωτική διάσπαση, με χρήση PD-10 στηλών (χρωματογραφία μοριακής διήθησης) i. Αφαιρείται το καπάκι της στήλης και αφήνεται το διάλυμα αποθήκευσης να εξέλθει από τη στήλη. ii. Η στήλη σταθεροποιείται με 0.1 M ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών pη 9. Τέσσερις επαναλήψεις από 5 ml ρυθμιστικού διαλύματος. iii. iv. 1 ml δείγματος οξειδωμένης μαννάνης φορτώνεται στη στήλη και αφήνεται να εξέλθει από τη στήλη. Φορτώνονται 1.5 ml από το ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών ph 9 και αφήνονται να εξέλθουν από τη στήλη. v. Τοποθετείται γυάλινο φιαλίδιο κάτω από τη στήλη. vi. Φορτώνονται 2 ml από το ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών ph 9 και συλλέγονται στο γυάλινο φιαλίδιο. Τα 2 ml περιέχουν την καθαρή οξειδωμένη μαννάνη. 46 Σ ε λ ί δ α

69 Πειραματικό μέρος 3. Σύζευξη πεπτιδίου με την οξειδωμένη μαννάνη Στα 2 ml διαλύματος καθαρής οξειδωμένης μαννάνης προστίθεται 1 mg πεπτιδίου. Το διάλυμα παραμένει για ~48 h, ανακινώντας σε τακτά χρονικά διαστήματα, σε σκοτάδι και σε θερμοκρασία δωματίου. Προκύπτει σύζευγμα με συγκέντρωση πεπτιδίου 0.5 mg/ml. Το σύζευγμα μαννάνης-πεπτιδίου αποθηκεύεται στους -20 ο C. 4. Αναγωγή μαννάνης Στα 2 ml διαλύματος καθαρής οξειδωμένης μαννάνης ή συζεύγματος οξειδωμένης μαννάνης-πεπτιδίου προστίθονται 2 mg NaBH 4 και το διάλυμα αφήνεται για 3 h σε θερμοκρασία δωματίου έτσι ώστε να πραγματοποιηθεί η αντίδραση. Πίνακας 3: Ρυθμιστικά διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη συνθετική πορεία. Ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών 0.1 M ph 9 Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 0.1 M ph gr Na 2 CO 3 σε 100 ml H 2 O (A) 1.68 gr NaHCO 3 σε 100 ml H 2 O (B) 96 ml (B) + 8 ml (A) + αραίωση με Η 2 Ο σε τελικό όγκο 500 ml 6.9 gr NaH 2 PO 4 H 2 O σε 450 ml H 2 O + NaOH 1 M έως ph 6 2.B 1 Έλεγχος συζεύξης πεπτιδίων-μαννάνης με tricine SDS-PAGE Για τον έλεγχο της σύζευξης των πεπτιδικών αναλόγων με τη μαννάνη, μέσω του δεκαπεπτιδίου (KG) 5, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, tricine SDS PAGE). Χρησιμοποιήθηκαν επίπεδα πήγματα με περιεκτικότητα σε ακρυλαμίδιο 16.5% για το πήκτωμα διαχωρισμού και 3.5% για το πήκτωμα πακεταρίσματος. Ο πολυμερισμός του ακρυλαμιδίου έγινε με την προσθήκη TEMED και APS. Η παρασκευή των πηκτωμάτων καθώς οι αναλογίες που χρησιμοποιήθηκαν αναφέρονται στους πίνακες 4 και 5. Το ρυθμιστικό διάλυμα ανόδου και καθόδου περιείχε 100 mm Tris, 100 mm tricine, 0.1% SDS, ph 8.3 και χρησιμοποιήθηκε στην ηλεκτροφόρηση σε αραίωση 1x. Ο χρωματισμός της πηκτής για την αποτύπωση του πεπτιδικού αναλόγου μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, πραγματοποιήθηκε με βαφή χρώσης Coomassie Brilliant Blue G- 47 Σ ε λ ί δ α

70 Πειραματικό μέρος 250 ή χρώση νιτρικού αργύρου (silver stain) (Rabilloud 1990; Georgiou et al. 2008), ενώ για την αποτύπωση της μαννάνης με βαφή Periodic acid-schiff reagent stain (PAS) (Doerner and White 1990; Heelan et al. 1991). Πειραματική διαδικασία επεξεργασίας δειγμάτων Σε κάθε υπό ανάλυση δείγμα προστίθεται tricine sample buffer σε αναλογία όγκου 1:1. Ακολούθησε θέρμανση στους 100 C για 5 min, έτσι ώστε να πραγματοποιηθεί αποδιάταξη, και φυγοκέντρηση για 1min. Τα δείγματα φορτώθηκαν στην πηκτή, 15 μl από τα δείγματα ελέγχου και 5 μl από τους δείκτες μοριακών βαρών στις θέσεις τοποθέτησης δείγματος και εφαρμόστηκε σταθερή τάση 120 V μέχρι την είσοδο των δειγμάτων στην πηκτή διαχωρισμού οπότε και η τάση αυξήθηκε σε 150 V και παρέμεινε σταθερή μέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε στους 4 ο C και ο μέσος χρόνος της ήταν ~100 min. Οι δείκτες μοριακών βαρών που χρησιμοποιήθηκαν είναι οι broad range και polypeptide. Χρώση και αποχρωματισμός της πηκτής Coomassie Brilliant Blue Με το πέρας της ηλεκτροφόρησης, η πηκτή εμβαπτίστηκε για 30 min σε διάλυμα 0.1% Coomassie Brilliant Blue σε 50% MeOH και 10% CH 3 COOH. Ο αποχρωματισμός επιτεύχθηκε με εμβάπτιση στο διάλυμα αποχρωματισμού για 30 min, που ακολουθείται από ολονύχτια εμβάπτιση σε υπερκάθαρο νερό (Grintzalis et al. 2009). 48 Σ ε λ ί δ α

71 Πειραματικό μέρος Silver Stain Με το πέρας της ηλεκτροφόρησης, η πηκτή εμβαπτίστηκε για 30 min σε 50% MeOH, έπειτα για 30 min σε απιονισμένο H 2 O και τέλος για 30 min σε 0.1% AgNO 3. Ακολουθούν δύο γρήγορες πλύσεις με απιονισμένο H 2 O και τέλος η πηκτή εμβαπτίζεται σε διάλυμα χρωματισμού 3% Na 2 CO 3 και 40% HCHO 1:2000. Periodic acid - Schiff reagent stain (PAS) Με το πέρας της ηλεκτροφόρησης, η πηκτή εμβαπτίστηκε για 30 min, απουσία φωτός, σε διάλυμα αντιδραστηρίου Schiff (Schiff s reagent solution). Ο αποχρωματισμός επιτεύχθηκε μόνο με εμβάπτιση σε υπερκάθαρο νερό, απουσία φωτός, έως ότου να εμφανιστούν οι ζώνες. H CH 2 OH O H OH CH 2 OH O H OH OH H OH H OH H HN CHSO 3 H OH HO 3 SHCNH Periodic Acid OH CH 2 OH O H C H O H O H OH NH 2 * Η χρώση της μαννάνης πραγματοποιήθηκε μόνο με διάλυμα Schiff το οποίο είναι το δεύτερο βήμα στην γενική πορεία της βαφής PAS καθώς η μαννάνη έχει ήδη οξειδωθεί, αντίδραση με NaIO 4, στη συνθετική πορεία που ακολουθείται για την παρασκευή των δειγμάτων. 49 Σ ε λ ί δ α

72 Πειραματικό μέρος Πίνακας 4: Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν στην SDS-PAGE από την εταιρεία BioRad. Tricine Sample Buffer Running Buffer 10x 4x Lower Tris Buffer 4x Upper Tris Buffer 200 mm Tris HCl ph 6.8, 2% SDS, 40% γλυκερόλη, 0.04% Coomassie, 2% μερκάπτοαιθανόλη 100 mm Tris, 100 mm Tricine, 0.1% SDS, ph 8.3 Resolving Gel Buffer, 1.5 M Tris-HCl, ph 8.8 Stacking Gel Buffer, 0.5M Tris-HCl, ph 6.8 Πίνακας 5: Ποσότητες αντιδραστηρίων για την παρασκευή πηκτωμάτων. Αντιδραστήρια Πήκτωμα διαχωρισμού 16.5% Πήκτωμα πακεταρίσματος 3.5% Υπερκάθαρο Η 2 Ο 1.95 ml 1.84 ml 30% Διάλυμα Ακρυλαμιδίου 5.5 ml 0.35 ml 4x Lower Tris Buffer 3 ml - 4x Upper Tris Buffer ml 10% APS 80 μl 15 μl TEMED 8 μl 5 μl 2.B 2 Ανίχνευση ελεύθερων αλδεϋδομάδων στη μαννάνη με χρωματομετρία Η σύζευξη πεπτιδίων με μαννάνη, αξιολογήθηκε επίσης με μέθοδο που βασίζεται στην αντίδραση των αλδεϋδών με 2,4 δινιτροφαινυλυδραζίνη (DNPH) προς σχηματισμό του σταθερότερου παραγώγου 2,4-δινιτροφαινυλυδραζόνης, το οποίο απορροφά στα 405 nm (Apostolopoulos et al. 2000). R O 2 N R O 2 N O H 2 N N NO 2 N N NO 2 H 2 O H H H H κίτρινο παράγωγο 50 Σ ε λ ί δ α

73 Πειραματικό μέρος Τα διάφορα δείγματα μαννάνης (0.7 ml ή ~5.25 mg/ml) αναμίχθηκαν με 0.5 ml διάλυμα mm DNPH (0.68 mg DNPH διαλύθηκαν σε 5% θειϊκό οξύ, 33% αιθανόλη και 62% νερό) και αφέθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 h. Ακολούθησε καθαρισμός με PD-10 στήλες (χρωματογραφία μοριακής διήθησης) και συλλέχθηκε το κίτρινο κλάσμα που περιέχει το προϊόν Ο καθαρισμός πραγματοποιήθηκε για να απομακρυνθεί η περίσσεια του DNPH. Η διαδικασία καθαρισμού έχει περιγραφεί στην ενότητα 2.Β. Η απορρόφηση των προϊόντων μετρήθηκε στα 405 nm. 51 Σ ε λ ί δ α

74 52 Σ ε λ ί δ α

75 Πειραματικό μέρος 2.Γ Σύνθεση του συζεύγματος ανθρακινόνη-(ahx) 6 MBP (7) και αποτίμηση της βιολογικής του δράσης 2.Γ 1 Σύνθεση του αναλόγου 7 2.Γ 1.1 Σύνθεση των αναλόγων 1,4-δις-(4-αµινο-βουτυλαµινο)-ανθρακινόνη (4) και 1-(αµινο-βουτυλαµινο)-4-υδροξυ-ανθρακινόνη (5) O OH + H 2 N H N Boc 1. EtOH, 3h, 50 o C, Ar 2. [O] 24h O OH O HN H N Boc O HN H N Boc + O 4a NH N H Boc O 5a OH TFA/DCM, 2h CF 3 COO CF 3 COO O HN NH 3 O HN NH 3 + O NH CF 3 COO NH 3 O OH 4 5 Σχήμα 14: Συνθετική πορεία των αναλόγων 4 και 5 (Murdock et al. 1979). 53 Σ ε λ ί δ α

76 Πειραματικό μέρος Ένωση Μοριακό Πυκνότητα Ποσότητα mmol Βάρος (g/mol) (gr/ml) 2,3-διϋδρο-1,4-διυδροξυανθρακινόνη (λευκοκουινιζαρίνη) gr 12 Boc-βουτυλενοδιαμίνη ml 24 (2 eq) Σε δίλαιμη σφαιρική φιάλη υπό μαγνητική ανάδευση μεταφέρονται 70 ml EtOH και παράλληλα μεταβιβάζεται Ar (bubbling) για 10 min. Ακολουθεί διάλυση της Bocβουτυλενοδιαμίνης στην EtOH και αφήνεται για 15 min ακόμα. Έπειτα προστίθεται η λευκοκουινιζαρίνη και η αντίδραση αφήνεται στους 50 o C για 3 h (υπό αδρανή ατμόσφαιρα, Ar). Μετά το τέλος της αντίδρασης, το διάλυμα αφήνεται για 24 h υπό ανάδευση με air bubbling προκειμένου να πραγματοποιηθεί αρωματοποίηση του δακτυλίου (οξείδωση). Ακολούθησε συμπύκνωση υπό ελαττωμένη πίεση, καταβύθιση του προϊόντος με πετρελαϊκό αιθέρα και απομόνωση του με διήθηση υπό κενό. Ελήφθησαν 2 gr μίγματος δύο προϊόντων, του δι-υποκατεστημένου αναλόγου 4a και του μονο-υποκατεστημένου αναλόγου 5a. Η πορεία της αντίδρασης ελέγχθηκε με αναλυτικό RP-HPLC (διαλύτης έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης 60% ACN σε 30 min 100% ACN). Η ταυτοποίηση τους έγινε με ESI-MS και 1 H-NMR (d 6 -DMSO). Ακολούθησε απομάκρυνση της Boc-ομάδας με διάλυμα TFA/DCM, 1:1 για 2 h. Τα προϊόντα διαχωρίστηκαν με παρασκευαστικό RP-HPLC (διαλύτης έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης 10% ACN σε 43 min 70% ACN). Ο έλεγχος της καθαρότητας του προϊόντος 5 έγινε με αναλυτικό RP-HPLC (διαλύτης έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης 10% ACN σε 15 min 100% ACN) και η ταυτοποίηση του πραγματοποιήθηκε με ESI-MS και 1 H-NMR (d 6 -DMSO). Απόδοση: 37.1 % 54 Σ ε λ ί δ α

77 Πειραματικό μέρος 2.Γ 1.2 Σύνθεση του αναλόγου 6 CF 3 COO O HN NH 3 O + HO S Trt DMAP/DCC 24h O OH (5) O HN H N S Trt O TFA/DCM/TES 94 : 3 : 3 4h O OH 6a O HN H N SH O O OH 6 Σχήμα 15: Συνθετική πορεία του αναλόγου 6. Ένωση Μοριακό Βάρος (g/mol) Ποσότητα mmol 1-(αµινο-βουτυλαµινο)-4- υδροξυ-ανθρακινόνη (5) mg 0.81 Trt-TGA mg 1.1 (1.3 eq) DMAP mg 1 (1.2 eq) DCC mg 1.22 (1.5 eq) 55 Σ ε λ ί δ α

78 Πειραματικό μέρος Σε σφαιρική φιάλη υπό μαγνητική ανάδευση μεταφέρονται 370 mg Trt-TGA και διαλύθηκαν σε 10 ml DCM. Στη συνέχεια προστίθενται 122 mg DMAP και 50 mg 1- (αµινο-βουτυλαµινο)-4-υδροξυ-ανθρακινόνη (5) διαλυμένη στην ελάχιστη ποσότητα DCM. Η σφαιρική φιάλη τοποθετήθηκε σε παγόλουτρο και προστέθηκαν 252 mg DCC. Μετά από 5 min η αντίδραση αφέθηκε σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 24 h. Ακολούθησε συμπύκνωση και ξήρανση σε ξηραντήρα (P 2 O 5 ). Η έλεγχος καθαρότητας και η ταυτοποίηση του αναλόγου 6a έγινε με αναλυτικό RP-HPLC, ESI-MS και 1 H- NMR (CDCl 3 ). Ακολούθησε απομάκρυνση της Trt ομάδας με διάλυμα TFA/DCM/TES, 94:3:3 για 4 h. Ο καθαρισμός του προϊόντος 6 έγινε με παρασκευαστικό RP-HPLC (διαλύτης έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης 50% ACN σε 43 min 80% ACN). Ο έλεγχος της καθαρότητας έγινε με αναλυτικό RP-HPLC (διαλύτης έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης 10% ACN σε 15 min 100% ACN) και η ταυτοποίηση του πραγματοποιήθηκε με ESI-MS, 1 H-NMR (CDCl 3 ), 13 C-NMR (CDCl 3 ). Απόδοση: 64.2 % 56 Σ ε λ ί δ α

79 Πειραματικό μέρος 2.Γ 1.3 Σύζευξη του αναλόγου 6 με το SPDP-(Ahx) 6 MBP (3) O NH NH SH O O + N S S NH (Ahx) 6 MBP O OH 6 DMSO, DIPEA 6h O NH O HN S S NH O (Ahx) 6 MBP O OH Σχήμα 16: Συνθετική πορεία του προϊόντος 7. Ένωση Μοριακό Βάρος (g/mol) Ποσότητα mmol SPDP-(Ahx) 6 MBP (3) mg Ανάλογο mg (1.2 eq) DIPEA μl (1.4 eq) Σε σφαιρική φιάλη υπό ανάδευση μεταφέρονται 35 mg του αναλόγου 3 και 6 mg του αναλόγου 6. Προστίθονται 0.3 ml DMSO και 3.2 μl DIPEA. Η αντίδραση αφήνεται για 6 h σε RT. Η πορεία της αντίδρασης ελέγχθηκε με αναλυτικό RP-HPLC (διαλύτης έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης 10% ACN σε 15 min 100% ACN). Ακολούθησε συμπύκνωση και ξήρανση του προϊόντος σε ξηραντήρα (P 2 O 5 ). Ο καθαρισμός του προϊόντος 7 έγινε με ημιπαρασκευαστικό RP-HPLC (διαλύτης έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης 30% ACN σε 45 min 70% ACN). Ο έλεγχος της καθαρότητας έγινε με αναλυτικό RP-HPLC (διαλύτης έκλουσης μεταβαλλόμενης σύστασης 10% ACN σε 15 min 100% ACN) και η ταυτοποίηση του πραγματοποιήθηκε με ESI-MS. Απόδοση: 31.6 % 57 Σ ε λ ί δ α

80 58 Σ ε λ ί δ α

81 Πειραματικό μέρος 2.Γ 2 Βιολογικά Πειράματα 2.Γ 2.1 Διαδικασία ανακαλλιέργειας των κυττάρων προσκόλλησης HEK Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο, στο πλαστικό μέσο στο οποίο βρίσκονται προσκολλημένα (φλάσκα). Η εικόνα των κυττάρων είναι ενδεικτική της κατάστασης στην οποία βρίσκονται. Κύτταρα τα οποία είναι προσκολλημένα στην φλάσκα θεωρούνται υγιή ενώ επιπλέοντα κύτταρα στο θρεπτικό μέσο είναι κατά πάσα πιθανότητα νεκρά. Η ανακαλλιέργεια γίνεται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει κατά 80-90% την επιφάνεια της φλάσκας στο οποίο καλλιεργούνται. 2. Μεταφορά της φλάσκας με τα κύτταρα σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. 3. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 4. Πλύσιμο των κυττάρων δύο φορές με PBS. Με τη διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς της τρυψίνης. * Τα κύτταρα δεν πρέπει να μένουν για μεγάλο χρονικό διάστημα χωρίς θρεπτικό μέσο ή PBS, αφού είναι ιδιαίτερα ευπαθή κατά την επαφή τους με τον αέρα. Επιπλέον, και ο χρόνος παραμονής των κυττάρων στο PBS (το οποίο δεν περιέχει ιόντα Ca 2+ ) δεν πρέπει να είναι μεγάλος, γιατί παρατηρείται απώλεια της επαφής τους με το υπόστρωμα. 5. Προσθήκη κατάλληλης ποσότητας τρυψίνης. 6. Παρατήρηση της αποκόλλησης των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα δεν πρέπει να μένουν για πολύ ώρα στην τρυψίνη, ο συνιστώμενος χρόνος κατά μέσο όρο είναι τα 7 min και μπορεί να παραταθεί έως και τα 15 min. 7. Αμέσως μόλις παρατηρηθεί η αποκόλληση των κυττάρων, αναστέλλεται η τρυψίνη με την προσθήκη διπλάσιας ποσότητας πλήρους θρεπτικού μέσου (που περιέχει 10% ορό) σε σύγκριση με την ποσότητα της τρυψίνης που προστέθηκε. 8. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωλήνα των 15 ml. 9. Φυγοκέντρηση για 4 min στα 1600 rpm σε θερμοκρασία δωματίου (25 ο C). 59 Σ ε λ ί δ α

82 Πειραματικό μέρος 10. Αφαίρεση του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur. 11. Επαναιώρηση των κυττάρων σε PBS για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα τρυψίνης. 12. Φυγοκέντρηση για 4 min στα 1600 rpm σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Απομάκρυνση του υπερκειμένου και καλή επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων, έπειτα από προσθήκη πλήρους θρεπτικού, μέχρις ότου να μην υπάρχουν συσσωματώματα. Η ποσότητα του θρεπτικού μέσου εξαρτάται από το μέγεθος του ιζήματος των κυττάρων. 14. Προσθήκη 10 μl από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική υποδοχή του αιματοκυτταρομέτρου. 15. Υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 16. Για κάθε ανακαλλιέργεια χρησιμοποιούνται κύτταρα ανά ml θρεπτικού μέσου, εκτός από τις περιπτώσεις που τα κύτταρα θα χρησιμοποιηθούν σε ειδικά πειράματα. 17. Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρούνται σε επωαστή με συνθήκες απόλυτης υγρασίας στους 37 ο C και σε ατμόσφαιρα με 5% CO 2. 2.Γ 2.2 Διαδικασία ανακαλλιέργειας (split) των κυττάρων εναιωρήματος Jurkat 1. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο, στο πλαστικό μέσο στο οποίο βρίσκονται αιωρούμενα (φλάσκα). Η ανακαλλιέργεια γίνεται όταν το εναιώρημα των κυττάρων είναι αρκετά πυκνό και το θρεπτικό μέσο από πορτοκαλί αρχίζει να γίνεται κίτρινο. Συνήθως ο διαχωρισμός των κυττάρων γίνεται ανά 3-4 ημέρες. 2. Μεταφορά της φλάσκας με τα κύτταρα σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. 3. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με σιφώνιο και μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωλήνα των 15 ml. 4. Φυγοκέντρηση για 4 min στα 1600 rpm στους 25 ο C. 60 Σ ε λ ί δ α

83 Πειραματικό μέρος 5. Απομάκρυνση του υπερκειμένου του κυτταρικού εκχυλίσματος και καλή επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων, έπειτα από προσθήκη πλήρους θρεπτικού, μέχρις ότου να μην υπάρχουν συσσωματώματα. Η ποσότητα του θρεπτικού μέσου εξαρτάται από το μέγεθος του ιζήματος των κυττάρων. 6. Προσθήκη 10 μl από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική υποδοχή του αιματοκυτταρομέτρου. 7. Υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 8. Για κάθε ανακαλλιέργεια χρησιμοποιούνται κύτταρα ανά ml θρεπτικού μέσου, εκτός από τις περιπτώσεις που τα κύτταρα θα χρησιμοποιηθούν σε ειδικά πειράματα. 9. Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρούνται σε επωαστή με συνθήκες απόλυτης υγρασίας στους 37 ο C και σε ατμόσφαιρα με 5% CO 2. 2.Γ 2.3 Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο NEUBAUER Είναι η πιο απλή, άμεση και οικονομική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιμοκυτταρόμετρο είναι μια τροποποιημένη αντικειμενοφόρος πλάκα που έχει δυο κατάλληλα επεξεργασμένες, γυαλισμένες επιφάνειες. Κάθε μια από αυτές έχει ένα τετραγωνισμένο πλέγμα, το οποίο αποτελείται από 9 αρχικά τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (εμβαδόν 1 mm 2 ). Κάθε τετράγωνο ορίζεται από τρεις παράλληλες και πολύ κοντινές γραμμές (των οποίων η μεταξύ τους απόσταση είναι 2.5 μm), που χρησιμεύουν για τον καθορισμό του αν τα κύτταρα θα θεωρηθούν ότι βρίσκονται μέσα ή έξω από το πλέγμα. Επίσης, κάθε ένα από τα αρχικά τετράγωνα, έχει επιπλέον διαβαθμίσεις για να διευκολύνεται η μέτρηση των κυττάρων. Το επίπεδο του πλέγματος βρίσκεται 0.1 mm χαμηλότερα από δυο «ράχες» στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης γυαλισμένης επιφάνειας και των σημείων όπου στηρίζεται η καλυπτρίδα. Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρημα και με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. 61 Σ ε λ ί δ α

84 Πειραματικό μέρος 1.0mm Πρώτοτετράγωνο περιοχή βάθος όγκος =μετρήσιμα = μημετρήσιμα Σχήμα 17: Αιμοκυτταρόμετρο Neubauer: Παρουσιάζεται σχηματικά και ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0.1 mm 3 (1.0 mm 2 x 0.1 mm) ή 1 x 10-4 ml. Έτσι, η συγκέντρωση των κυττάρων στο αρχικό εναιώρημα (σε κύτταρα/ml) είναι: μέτρηση στο ένα τετράγωνο x * Μέτρηση με αιμοκυτταρόμετρο: 10 μl εναιωρήματος κυττάρων προστίθεται σε κάθε σταυρό του αιμοκυτταρόμετρου, ανάμεσα στο αιμοκυτταρόμετρο και την καλυπτρίδα. Στη συνέχεια, μετράμε τα κύτταρα που βρίσκονται στα 25 κεντρικά τετράγωνα. Με βάση τον αριθμό των κυττάρων προχωράμε στους υπολογισμούς ανάλογα με το πείραμα που θέλουμε. 2.Γ 3 Έλεγχος πιθανού βιολογικού αποτελέσματος του ενδιάμεσου αναλόγου 5 στα κύτταρα HEK293 2.Γ 3.1 Έλεγχος φθορισμού Οι ανθρακινόνες ανήκουν στην κατηγορία των αυτοφθορίζουσων ουσιών δίνοντας την δυνατότητα χρήσης μικροσκοπίου φθορισμού για την ανίχνευσή τους στο κύτταρο. Τα ανάλογα ανθρακινόνης που μελετήθηκαν απορροφούν στο πράσινο ( nm) και εκπέμπουν στο κόκκινο ( nm). Πειραματική πορεία 1. Μετά από ανακαλλιέργεια των κυττάρων, τοποθετείται κατάλληλη ποσότητα από το εναιώρημα των κυττάρων σε μικροπλακίδιο (plate) με 48 μικροκυψελίδες (wells) (40 x 10 3 κυττ./250 μl/well). 62 Σ ε λ ί δ α

85 Πειραματικό μέρος 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες σε απόλυτη υγρασία στους 37 ο C σε ατμόσφαιρα 5% CO Προσθήκη του υπό μελέτη αναλόγου 5 σε συγκεντρώσεις 100 nm, 1 μμ, 5 μμ και 10 μμ και εκ νέου επώαση σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, 30 min και 60 min. 4. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο φθορισμού. 2.Γ 3.2 Έλεγχος επίδρασης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό - MTT cell proliferation assay Η μέθοδος MTT βασίζεται στη μετατροπή των αλάτων τετραζολίου σε μη διαλυτά παράγωγα φορμαζάνης. Το κίτρινου χρώματος άλας τετραζολίου (MTT) που οξειδώνεται από τις αφυδρογονάσεις των μιτοχονδρίων των ζωντανών κυττάρων και παράγονται πορφυρού χρώματος κρύσταλλοι φορμαζάνης, οι οποίοι συσσωρεύονται στα μιτοχόνδρια του κυττάρου. Η οξείδωση του MTT πραγματοποιείται μόνο όταν τα μιτοχονδριακά ένζυμα είναι μεταβολικώς ενεργά και συνεπώς η παραγωγή κρυστάλλων φορμαζάνης είναι απευθείας ανάλογη του αριθμού βιώσιμων κυττάρων (Mosmann 1983). S N N N Br N N MTT Mitochondrial Reductuse S N H N N N N Formazan Πειραματική πορεία 1. Μετά από ανακαλλιέργεια των κυττάρων, τοποθετείται κατάλληλη ποσότητα από το εναιώρημα των κυττάρων σε 48 wells plate (250 μl/well, cells/well). 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες σε απόλυτη υγρασία στους 37 ο C σε ατμόσφαιρα 5% CO Προσθήκη του υπό μελέτη αναλόγου 5 σε συγκεντρώσεις 1, 10, 25, 100 μμ και εκ νέου επώαση για 48 h. 4. Προσθήκη 1/10 του όγκου του θρεπτικού μέσου (50 μl) από το διάλυμα ΜTT 10x /well (5 mg MTT/ ml PBS). 5. Επώαση για 2 ώρες σε απόλυτη υγρασία, στους 37 ο C σε ατμόσφαιρα 5% CO Σ ε λ ί δ α

86 Πειραματικό μέρος 6. Αφαίρεση του θρεπτικού μέσου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 7. Ακολουθούν δύο πλύσεις με PBS. 8. Προσθήκη 100 μl οξινισμένης ισοπροπανόλης /well. Ήπια ανακίνηση, έτσι ώστε να μην υπάρχουν κρύσταλλοι φορμαζάνης οι οποίοι δεν έχουν διαλυθεί και πιθανόν να επηρεάσουν τη φωτομέτρηση. 9. Μεταφορά σε ELISA 96 wells plate και φωτομέτρηση στα 570 nm χρησιμοποιώντας φωτόμετρο για ELISA. 10. Από τις απορροφήσεις, υπολογίζεται ο αριθμός των κυττάρων με βάση την πρότυπη καμπύλη που έχει κατασκευαστεί, σύμφωνα με το αντίστοιχο πρωτόκολλο. 2.Γ 4 Βιολογική αποτίμηση του αναλόγου 7 στα κύτταρα Jurkat 2.Γ 4.1 Εντοπισμός στο κύτταρο του υπό έλεγχο αναλόγου Ανοσοφθορισμός Επώαση του αναλόγου 7 στα κύτταρα και παρατήρηση τους στο συνεστιακό μικροσκόπιο μετά από μονιμοποίηση, δίνει τη δυνατότητα ελέγχου εντοπισμού του αναλόγου στο κυτταρόπλασμα ή στον πυρήνα του κυττάρου (Edward 2009). Τα ανάλογα ανθρακινόνης που μελετήθηκαν απορροφούν στο πράσινο ( nm) και εκπέμπουν στο κόκκινο ( nm). Επώαση κυττάρων με το προς έλεγχο ανάλογο 7 και συλλογή δειγμάτων 1. Μετά από ανακαλλιέργεια των κυττάρων, τοποθετείται κατάλληλη ποσότητα από το εναιώρημα των κυττάρων σε 48 wells plate (250 μl/ well, cells/well). 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες σε απόλυτη υγρασία στους 37 ο C σε ατμόσφαιρα 5% CO Προσθήκη του υπό μελέτη αναλόγου 7 σε συγκέντρωση 2 μμ με παρουσία και μη του αναστολέα σισπλατίνη (30 μμ) και εκ νέου επώαση σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, 10 min, 20 min και 30 min. 4. Συλλογή του εναιωρήματος των κυττάρων, φυγοκέντρηση για 4 min στα 1600 rpm στους 25 o C. 64 Σ ε λ ί δ α

87 Πειραματικό μέρος 5. Διαχωρισμός του κυτταρικού ιζήματος από το υπερκείμενο κυτταρικού εκχυλίσματος. 6. Τα κυτταρικά ιζήματα μπορούν να φυλαχθούν στους -20 ή -80 o C μέχρι την ανάλυση τους. Πειραματική πορεία ανοσοφθορισμού 1. Ξεπάγωμα των κυττάρων εφόσον είχαν καταψυχθεί. 2. Τα κύτταρα διαλύονται σε PBS και τοποθετούνται σε ειδική αντικειμενοφόρο πλάκα. 3. Γίνονται 2 πλύσεις των κυττάρων με PBS για 5 min. 4. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων με διάλυμα 1% p-φορμαλδεϋδης για 15 min πλύση με PBS για 5 min. 6. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων με PBS και χρώση πυρήνων hoechst 1:2000 για 2 min στους 25 o C απουσία φωτός. 7. Γίνεται 1 πλύση με απιονισμένο H 2 O και απαλό σκούπισμα. 8. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων με κατάλληλο υγρό έγκλεισης κυττάρων (διάλυμα στερέωσης) για 40 min στους 25 o C απουσία φωτός. Η αντικειμενοφόρος πλάκα καλύπτεται με καλυπτίδρα. 9. Οι πλάκες είναι έτοιμες για παρατήρηση των κυττάρων σε μικροσκόπιο ή να φυλαχθούν στο ψυγείο. * Όλα τα στάδια γίνονται με απαλές κινήσεις για να μην ξεκολλήσουν τα κύτταρα. Πίνακας 6: Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν για τον ανοσοφθορισμό. 1% p-φορμαλδεΰδης Αραίωση από π. διάλυμα p-φορμαλδεΰδης Διάλυμα στερέωσης Mowiol 4-88 σε διάλυμα γλυκερόλης και 0.2 Μ Tris ph Σ ε λ ί δ α

88 Πειραματικό μέρος 2.Γ 4.2 Προσδιορισμός ελευθέρων σουλφυδρυλομάδων σε υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας Μέθοδος DTNB (Ellman's Reagent) Η μέθοδος DTNB (5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)) χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των ελεύθερων σουλφυδρυλομάδων σε διάφορα βιολογικά δείγματα (Ellman 1959). O NO 2 NO 2 NO 2 R SH OH S S OH R S S OH SH OH NO 2 DTNB O O TNB O Επώαση κυττάρων με το προς έλεγχο ανάλογο (3) και συλλογή δειγμάτων 1. Μετά από ανακαλλιέργεια των κυττάρων, τοποθετείται κατάλληλη ποσότητα από το εναιώρημα των κυττάρων σε 48 wells plate (390 μl/ well). 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες σε απόλυτη υγρασία στους 37 ο C σε ατμόσφαιρα 5% CO Προσθήκη του υπό μελέτη αναλόγου σε συγκέντρωση 250 μμ με παρουσία και μη του αναστολέα σισπλατίνη (30 μμ) και εκ νέου επώαση σε διαφορετικές χρονικές στιγμές, 10 min, 20 min και 30 min. 4. Συλλογή του εναιωρήματος των κυττάρων, φυγοκέντρηση για 4 min στα 1600 rpm στους 25 o C. 5. Διαχωρισμός του υπερκείμενου κυτταρικού εκχυλίσματος από το ίζημα. DTNB assay 1. Σε ένα φιαλίδιο προσθέτουμε 50 μl υπερκείμενο κυτταρικού εκχυλίσματος, 200 μl διαλύματος 200 mm Tris-6 M guanidine HCl ph 8.0 και 8 μl διαλύματος DTNB (25 mg/ml σε αιθανόλη). 2. Μεταφέρουμε το παραπάνω διάλυμα (τελικός όγκος 258 μl) από κάθε φιαλίδιο σε κατάλληλη κυψελίδα και μετράμε την απορρόφηση στα 412 nm (ε 412 (TNB): 13.6 /mm). 66 Σ ε λ ί δ α

89 Πειραματικό μέρος 2.Γ 4.3 Προσδιορισμός της απόπτωσης των κυττάρων μέσω ανίχνευσης της αποπτωτικής πρωτεΐνης BCL2 - Aνοσοαποτύπωση (Western Blot Analysis) Η ανοσοαποτύπωση είναι μία μέθοδος ανίχνευσης συγκεκριμένων πρωτεϊνών ενός σύνθετου μίγματος, που συνδυάζει την υψηλή αναλυτική ικανότητα της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή, την ειδικότητα των αντισωμάτων και την ευαισθησία των ενζυματικών μεθόδων (Renner 1988). Επώαση κυττάρων με τα προς έλεγχο ανάλογα και συλλογή δειγμάτων 1. Μετά από ανακαλλιέργεια των κυττάρων, τοποθετείται κατάλληλη ποσότητα από το εναιώρημα των κυττάρων σε 6 wells plate (2 ml/ well). 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες σε απόλυτη υγρασία στους 37 ο C σε ατμόσφαιρα 5% CO Προσθήκη των υπό μελέτη αναλόγων σε συγκέντρωση 10 μμ και δείγμα αναφοράς το ανοσοκατασταλτικό φάρμακο Novantrone (Μιτοξανδρόνη, 10 μμ) και εκ νέου επώαση για 48 ώρες. 4. Συλλογή του εναιωρήματος των κυττάρων, φυγοκέντρηση για 4 min στα 1600 rpm στους 25 o C. 5. Απομάκρυνση του υπερκείμενου κυτταρικού εκχυλίσματος και πλύση του κυτταρικού ιζήματος (pellet) με PBS. 6. Συλλογή του εναιωρήματος των κυττάρων, φυγοκέντρηση για 4 min στα 1600 rpm στους 25 o C. 7. Διαχωρισμός του κυτταρικού ιζήματος από το υπερκείμενο κυτταρικού εκχυλίσματος. 8. Τα κυτταρικά ιζήματα μπορούν να φυλαχθούν στους -20 ή -80 o C μέχρι την ανάλυση τους. 67 Σ ε λ ί δ α

90 Πειραματικό μέρος Λύση κυττάρων 1. Ξεπάγωμα των κυττάρων εφόσον είχαν καταψυχθεί. 2. Προσθήκη σε κάθε ίζημα κυττάρων διάλυμα λύσης με αναστολείς πρωτεασών, 1: Πιπετάρισμα για επαναιώρηση του ιζήματος και ανακίνηση με vortex 3 φορές ανά 10 min. 4. Ακολουθεί κατεργασία των δειγμάτων με υπερήχους (sonication) και φυγοκέντρηση στα rpm για 15 min στους 4 o C. 5. Διαχωρισμός του υπερκειμένου κυτταρικού εκχυλίσματος από το ίζημα. * Όλη η διαδικασία λύσης των κυττάρων πραγματοποιείται σε πάγο. * Οι αναστολείς πρωτεασών προστίθενται λίγο πριν τη χρήση του lysis buffer και μετά τη προσθήκη τους το διάλυμα μπορεί να διατηρηθεί για 30min στους 4ºC. SDS-PAGE Οι ηλεκτροφορήσεις έγιναν σε αποδιατακτικές συνθήκες όπου οι προς ανάλυση ουσίες μετακινούνται με βάση το μοριακό βάρος. 1. Τα δείγματα αναμιγνύονται με κατάλληλη ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων 5x (loading buffer) ώστε η τελική συγκέντρωσή του να είναι 1x. Τα δείγματα θερμαίνονται στους 100 o C για 5 min και φυγοκέντρηση για 1 min. 2. Παρασκευή πηκτώματος σε μίγμα ακρυλαμιδίου (10% πήκτωμα διαχωρισμού, 3.5% πήκτωμα επιστοίβαξης) και ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων. Εφαρμόστηκε σταθερή τάση 100 V μέχρι την είσοδο των δειγμάτων στην πηκτή διαχωρισμού οπότε και η τάση αυξήθηκε σε 120 V και παρέμεινε σταθερή μέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε στους 25 ο C και ο μέσος χρόνος της ήταν 2 h. Ο δείκτης μοριακών βαρών που χρησιμοποιήθηκε είναι ο PageRuler Plus. 68 Σ ε λ ί δ α

91 Πειραματικό μέρος Πίνακας 7: Ποσότητες αντιδραστηρίων για την παρασκευή πηκτωμάτων. Αντιδραστήρια Πήκτωμα διαχωρισμού 10% Πήκτωμα επιστοίβαξης 3.5% Απιονισμένο H 2 O 3.41 ml 1.68 ml 30% ακρυλαμίδιο 3.34 ml 3.5 ml 1.5 M Tris ph ml M Tris ph μl 10% SDS 100 μl 100 μl 10% APS 80 μl 80 μl TEMED 8 μl 8 μl Ανοσοαποτύπωση Western Blot Analysis 1. Προετοιμασία μεμβράνης Immobilon-P PVDF (πολυβυνιλιδενοφθορίδιο). Η μεμβράνη είναι υδρόφοβη, επομένως για να καταστεί υδρόφιλη πρέπει προηγουμένως να διαβραχεί με μεθανόλη, να εκπλυθεί δύο φορές με απιονισμένο H 2 O και να διαβραχεί με το διάλυμα μεταφοράς (transfer buffer). 2. Η μεμβράνη και η πήκτη τοποθετούνται ανάμεσα σε τέσσερα διηθητικά χαρτιά Whatman 3 mm, τα οποία είχαν εμποτισθεί με transfer buffer και τοποθετούνται στη συσκευή μεταφοράς. 3. Η ηλεκτρομεταφορά πραγματοποιείται παρουσία διαλύματος μεταφοράς (transfer buffer) στα 350 ma για 50 min. 4. Μετά την ηλεκτρομεταφορά η μεμβράνη διαβρέχεται με TBS-Tween για 5 min. 5. Μπλοκάρισμα των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης της μεμβράνης με 5% αποβουτυρωμένο γάλα ή BSA σε TBS-Tween για 1h στους 25 o C. 6. Ακολουθούν 3 πλύσεις με TBS-Tween για 5 min. 7. Επώαση overnight με το 1 o αντίσωμα σε 3% αποβουτυρωμένο γάλα ή BSA σε TBS-Tween στους 4 o C. 8. Ακολουθούν 3 πλύσεις με TBS-Tween για 5 min. 69 Σ ε λ ί δ α

92 Πειραματικό μέρος 9. Επώαση με το 2 o αντίσωμα σε 3% αποβουτυρωμένο γάλα ή BSA σε TBS-Tween για 1 h στους 25 o C. 10. Ακολουθούν 3 πλύσεις με TBS-Tween για 5 min. 11. Ακολουθεί 1 πλύση με TBS για 5 min και απόχυση. 12. Προσθήκη αντιδραστηρίων χημειοφωταύγειας στο σκοτάδι και εμφάνιση φιλμ. Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από μεμβράνη PVDF - Stripping Η διαδικασία αυτή γίνεται όταν θέλουμε να αποδεσμεύσουμε από τη μεμβράνη PVDF ένα αντίσωμα προκειμένου να την επωάσουμε με κάποιο άλλο (αποδιατάσσονται όλοι οι φωσφορικοί, δισουλφιδικοί, εστερικοί ή άλλοι δεσμοί που τυχόν υπάρχουν) πλύσεις για 5 min με TBS-Tween. 2. Επώαση σε διάλυμα αποδέσμευσης για 30 min στους 25 o C πλύσεις για 5 min με TBS-Tween. 4. Μπλοκάρισμα για 1 h σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη ή 3% BSA σε TBS- Tween και διαδικασία για νέο αντίσωμα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: Anti - BCL-2, 1:1000 (1 ο Αντίσωμα), Anti - rabbit HRP, 1:5000 (2 ο Αντίσωμα) Anti - Actin, 1:1000 (1 ο Αντίσωμα), Anti - mouse HRP, 1:5000 (2 ο Αντίσωμα) 70 Σ ε λ ί δ α

93 Πειραματικό μέρος Πίνακας 8: Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν κατά την διαδικασία ανοσοαποτύπωσης. Διάλυμα λύσης ph 7.5 Loading buffer 5x Running Buffer 10x Transfer Buffer 10x TBS ph 7.6 TBS-Tween 20 ph 7.6 Διάλυμα αποδέσμευσης 50 mm Tris-HCl ph 7, 150 mm NaCl, 0,1 % SDS, 1 mm EDTA ph 8, 0.5 % NP-40, 0.5 % NaDOC, 1 mm NaF 0.03 M SDS, 0.05 M Tris, 10% w/v γλυκερόλη, 2% w/v μπλε της βρωμοφαινόλης 0.25 M Tris, 0,02 M SDS, 2 M γλυκίνη 0.05 M Tris, 1 mm SDS, 0.04 M γλυκίνη, 20% v/v απόλυτη MeOH 0.02 Μ Tris-base, 0.3 Μ NaCl, 0.38% v/v π. HCl 0.05% v/v Tween 20 σε TBS 62.5 mm Tris ph 6.8, 2% SDS, 178 μl μερκαπτοαιθανόλη σε 25 ml διαλύματος Ποσοτική εκτίμηση των ζωνών ηλεκτροφορητικής ανάλυσης πρωτεϊνών 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, τα πηκτώματα φωτογραφίζονται με τη χρήση διερχόμενου φωτός. 2. Οι φωτογραφίες σε ψηφιακή μορφή αναλύονται με λογισμικό εικόνας. Προκύπτει για κάθε ζώνη μία τιμή που αντιστοιχεί στην ποσότητα της πρωτεΐνης που συγκροτεί τη ζώνη που αναλύεται. 3. Η σύγκριση των τιμών που αντιστοιχούν στις ζώνες διαφορετικών διαδρομών της ίδιας ηλεκτροφόρησης προσδιορίζει την επί τοις εκατό αλλαγή. 4. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ομαλοποιημένα ως προς τα αντίστοιχα ποσά της πρωτεΐνης ακτίνης μετά τη διαδικασία της ανοσοαποτύπωσης. 71 Σ ε λ ί δ α

94 Πειραματικό μέρος 2.Δ Έκφραση και μερικός καθαρισμός της πρωτεΐνης HLA II DRB από κύτταρα HEK293 2.Δ 1 Συλλογή πρωτεΐνης HLA II DRB από το υπερκείμενο καλλιέργειας κυττάρων HEK293 Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης HLA II DRB έγινε σε κύτταρα HEK293, μετασχηματισμένα με κατάλληλο λεντοϊό (σταθερή ενσωμάτωση του γονιδίου στο χρωμοσωμικό DNA) ώστε να εκκρίνεται η πρωτεΐνη στο μέσο καλλιέργειας, με ενσωματωμένη αλληλουχία έξι ιστιδινών στο καρβοξυ τελικό της άκρο. 1. Αρχικά, κυτταρική καλλιέργεια με ~ κύτταρα ανά ml θρεπτικού μέσου, διατηρείται σε επωαστήρα με συνθήκες απόλυτης υγρασίας στους 37 ο C και σε ατμόσφαιρα με 5% CO Όταν τα καλλιεργούμενα κύτταρα καλύψουν το % την επιφάνεια της φλάσκας στο οποίο καλλιεργούνται, αφήνονται στον επωαστήρα για άλλες 7 ημέρες χωρίς καμία αλλαγή του θρεπτικού μέσου. 3. Την 7 η ημέρα καλλιέργειας συλλέγεται το υπερκείμενου του κυτταρικού εκχυλίσματος και φυλάσσεται στους -20 o C. 2.Δ 2 Μέθοδοι Καθαρισμού και ταυτοποίησης της πρωτεΐνης HLA II DRB Δ 2.1 Μεταλλοχηλική (Ni 2+ ) χρωματογραφία Αρχή: Πρωτεΐνες που περιέχουν στην αλληλουχία τους έξι συνεχόμενα κατάλοιπα ιστιδίνης, μπορούν να προσδεθούν με υψηλή συγγένεια σε στήλη νικελίου. Έκλουση των συνδεδεμένων πρωτεϊνών πραγματοποιείται με αυξανόμενη συγκέντρωση ιμιδαζολίου, το οποίο ανταγωνίζεται τα κατάλοιπα της ιστιδίνης των πρωτεϊνών για πρόσδεση στο Ni 2+ (Gaberc-Porekar and Menart 2001). Πειραματική πορεία 1. Χρησιμοποιήθηκε στήλη Ni Sepharose 6 Fast Flow, με μέγιστο όγκο ρητίνης 4 ml. (Η μέγιστη δεσμευτική ικανότητα της ρητίνης είναι 40 mg πρωτεΐνης/ ml ρητίνης). 72 Σ ε λ ί δ α

95 Πειραματικό μέρος 2. Η στήλη αρχικά εκλούεται με απιονισμένο H 2 O και έπειτα με ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm Hepes, 20 mm ιμιδαζόλη, 200 mm KCl, 0.1% Triton, ph Το υπερκείμενο των κυττάρων με την πρωτεΐνη καθίσταται 10 mm ιμιδαζόλη και χρωματογραφείται στη στήλη. 4. Ακολουθούν δύο πλύσεις (2x30 ml) με 20 mm Hepes, 20 mm ιμιδαζόλη, 200 mm KCl, 0.1% Triton, ph 7.5 και η πρωτεΐνη απομακρύνεται από τη στήλη με εκλούσεις αυξανομένων συγκεντρώσεων ιμιδαζόλης (50 mm, 100 mm, 150 mm, 200 mm, 500 mm, 2 M, 10 ml). 5. Μετά το πέρας της χρωματογραφίας, η στήλη καθαρίζεται με απιονισμένο H 2 O, 20% EtOH και φυλάσσεται στους 4 o C. 2.Δ 2.2 Κατόπιν κατακρήμνισης με θειικό αμμώνιο Αρχή: Αυξανόμενες συγκεντρώσεις (NH 4 ) 2 SO 4 μπορούν να προκαλέσουν κατακρήμνιση των πρωτεϊνών. Η εκλεκτική κατακρήμνιση διαφορετικών πρωτεϊνών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (NH 4 ) 2 SO 4 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον αρχικό χονδροειδή καθαρισμό ορισμένων πρωτεϊνών (Layer et al. 2000). Πειραματική πορεία 1. Σε έναν όγκο πρωτεϊνικού δείγματος προστίθεται στερεό (NH 4 ) 2 SO 4 ώστε να επιτευχθούν διαφορετικοί κορεσμοί, 10-90% (Duong-Ly and Gabelli 2014). 2. Ακολουθεί επώαση στους 25 o C για 5 min. 3. Τα δείγματα φυγοκεντρούνται στις rpm για 20 min στους 20 o C. 4. Ακολουθεί διαχωρισμός του ιζήματος από το υπερκείμενο. 5. Το ίζημα επαναδιαλυτοποιείται σε ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm Τris-HCl, 200 mμ KCl, 1 mm EDTA ph Η καθαρότητα του δείγματος εξετάζεται με SDS-PAGE. 73 Σ ε λ ί δ α

96 Πειραματικό μέρος 2.Δ 2.3 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Αρχή: Στη χρωματογραφία μοριακής διήθησης τα μόρια διαχωρίζονται ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι υπάρχει καλή ανάκτηση της βιολογικής δραστικότητας της πρωτεΐνης καθώς δεν υπάρχει καμία αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης με την ρητίνη ενώ μειονέκτημα της μεθόδου είναι η χαμηλή διαχωριστική ικανότητα γι αυτό και συνήθως χρησιμοποιείται στο τέλος της πορείας καθαρισμού (Bonner 2007). 1. Στήλη με τη ρητίνη Sephadex G (2 m x 2 cm 2 ) εξισορροπείται με ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm Τris-HCl, 200 mμ KCl, 1 mm EDTA, ph 8.0 στους 4 ºC. 2. Το δείγμα χρωματογραφείται στα 0.1 ml/min, συλλέγονται κλάσματα των 3 ml στους 4 ºC και γίνεται ανάλυση των κλασμάτων της χρωματογραφίας με SDS- PAGE. 3. Ακολουθεί έκπλυση της στήλης με απιονισμένο H 2 O με 0.02% νατραζίδιο και αποθήκευση στους 4 o C. 2.Δ 3 Ανάλυση των κλασμάτων για την ταυτοποίηση της HLA II DRB πρωτεΐνης Κατακρήμνιση πρωτεΐνης με TCA και ενζυμική κατεργασία με Endo H Με την τεχνική αυτή οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται και κατακρημνίζονται με μεταβολή του ph παρουσία TCA και NaDOC (Bensadoun and Weinstein 1976). Η ενδογλυκοζιδάση χρησιμοποιείται για την απογλυκοζιδίωση της HLA II DRB πρωτεΐνης. Πειραματική πορεία 1. Σε έναν όγκο πρωτεϊνικού δείγματος προστίθενται NaDOC και TCA ώστε η τελική συγκέντρωση να γίνει 125 μg/ml και 6 % αντίστοιχα. 2. Ακολουθεί επώαση στους 4 o C για 30 min. 3. Το δείγμα φυγοκεντρείται στις rpm για 30 min στους 4 o C. 74 Σ ε λ ί δ α

97 Πειραματικό μέρος 4. Διαχωρίζεται το ίζημα από το υπερκείμενο. 5. Το ίζημα εκπλύεται με μεθανόλη και φυγοκεντρείται στις rpm για 10 min. 6. Ακολουθεί αποξήρανση για τουλάχιστον 30 min. 7. Σε κάθε πρωτεϊνικό ίζημα (1-20 μg πρωτεΐνης) προστίθενται 1 μl ρυθμιστικού διαλύματος μετουσίωσης 10x (glycoprotein denaturing buffer), 2 μl ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης 10x (reaction buffer), 1-5 μl Εndo H ( μονάδες), και απιονισμένο H 2 O για τελικό όγκο διαλύματος 20 μl. 8. Ακολουθεί επώαση στους 37 o C για 24 h. Πίνακας 9: Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν στην ενζυμική κατεργασία (BioLabs). Glycoprotein Denaturing Buffer 5% SDS, 0.4 M DTT Reaction Buffer 0.5 M κιτρικό νάτριο ph 5.5 SDS-PAGE - Western Blot Analysis Τα πρωτεϊνικά δείγματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και χρώση της πηκτής με Coomassie Brilliant Blue καθώς επίσης και με ανοσοαποτύπωση Western. Οι τεχνικές ακολουθήθηκαν όπως έχει περιγραφεί στην ενότητα 2.Γ 4.3. Ο δείκτης μοριακών βαρών που χρησιμοποιήθηκε είναι ο PageRuler Plus. Στο στύπωμα Western τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα Anti 6xHis, 1:1000 (1 ο αντίσωμα) και Anti - mouse HRP, 1:3000 (2 ο αντίσωμα). Οι ζώνες στην πηκτή με θετική χρώση Coomassie Brilliant Blue και παραπλήσιο μοριακό βάρος με την πρωτεΐνη HLA II DRB στάλθηκαν για ταυτοποίηση με φασματομετρία μάζας (MALDI) στο Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών (ΙΙΒΕΑΑ). 75 Σ ε λ ί δ α

98 76 Σ ε λ ί δ α

99 3. Αποτελέσματα και Συζήτηση

100

101 Αποτελέσματα Συζήτηση 3.A Σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων 3.Α 1 Συντιθέμενα πεπτιδικά ανάλογα Κατά την εκπόνηση της παρούσας διατριβής συντέθηκαν τα πεπτιδικά ανάλογα του πίνακα 10, με βάση τους ανοσοκυρίαρχους επιτόπους των πρωτεϊνών της μυελίνης MOG και MBP. Πίνακας 10: Συντιθέμενα πεπτιδικά ανάλογα. Αλληλουχία H-Lys-(Gly-Lys) 4 -Gly-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr- Arg-Pro 42 -Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr- Arg-Asn-Gly-Lys-OH H-Ahx-(Ahx) 5 -Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe- Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-OH SPDP-Ahx-(Ahx) 5 -Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe- Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-OH Συμβολισμός Αριθμός αναλόγου (KG) 5 MOG (Pro 42 ) (1) (Ahx) 6 MBP (2) SPDP-(Ahx) 6 MBP (3) Παρακάτω περιγράφονται σχηματικά οι συνθετικές πορείες των αναλόγων 1 και 2, τα αναλυτικά RP-HPLC και τα αντίστοιχα ESI-MS των τελικών προϊόντων μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. 79 Σ ε λ ί δ α

102 Αποτελέσματα Συζήτηση Cl Cl 1.Fmoc-Lys(Boc)-OH / DIPEA 2. 25% piperidine/dmf H 2 N Lys(Boc) 25% piperidine/dmf Fmoc-AA-OH, HOBt/DIC H-Lys Boc -Gly-Lys Boc -Gly-Met-Glu tbu -Val-Gly-Trp Boc -Tyr tbu -Arg Pbf -Pro-Pro-Phe-Ser tbu -Arg Pbf -Val-Val-His Trt -Leu-Tyr tbu -Arg Pbf -Asn Trt -Gly-Lys Boc 4 DCM/TFE (7/3) H-Lys Boc -Gly-Lys Boc -Gly-Met-Glu tbu -Val-Gly-Trp Boc -Tyr tbu -Arg Pbf -Pro-Pro-Phe-Ser tbu -Arg Pbf -Val-Val-His Trt -Leu-Tyr tbu -Arg Pbf -Asn Trt -Gly-Lys Boc -OH 4 94% TFA in DCM, scavengers H-Lys-Gly-Lys-Gly-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg(Pbf)-Pro-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys-OH 4 1 Σχήμα 18: Συνθετική πορεία του αναλόγου 1. Οι αντιδράσεις σύζευξης και απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας ελέγχθηκαν με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) και test Kaiser. Μετά από αναλυτικό RP-HPLC και ESI-MS του πεπτιδίου 1 διαπιστώθηκε η οξείδωση του θειοαιθέρα της Met σε σουλφοξείδιο (σχήμα 19). Ακολούθησε καθαρισμός με ημιπαρασκευαστικό RP-HPLC για την παραλαβή του καθαρού πεπτιδίου το οποίο ταυτοποιήθηκε με ESI-MS (σχήμα 20). 80 Σ ε λ ί δ α

103 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 19: (A) Αναλυτικό RP-HPLC και (B) ESI-MS του οξειδωμένου αναλόγου 1. Συνθήκες: 10%(Β) σε 15min 100%(Β), ροή: 1mL/min, [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0.08% (v/v)] t R(1) =6.858 min, Καθαρότητα= 84.96% t R(οξειδ.) =6.741 min M (1)θεωρ. = , M (οξειδ.)θεωρ. = (Μ+2Η + )/2= , (Μ+3Η + )/3= , (Μ+4Η + )/4=884.79, (Μ+5Η + )/5= Σ ε λ ί δ α

104 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 20: Αναλυτικό RP-HPLC και ESI-MS του αναλόγου 1 μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. Συνθήκες: 10%(Β) σε 15min 100%(Β), ροή: 1mL/min, [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0.08% (v/v)] t R =7.013 min, καθαρότητα= 97.41% Μ θεωρ.= (Μ+2Η + )/2= , (Μ+3Η + )/3= , (Μ+4Η + )/4=880.78, (Μ+5Η + )/5=704.88, (Μ+6Η + )/6=587.52, (Μ+7Η + )/7= Σ ε λ ί δ α

105 Αποτελέσματα Συζήτηση Cl Cl 1.Fmoc-Arg Pbf -OH / DIPEA 2. 25% piperidine/dmf H 2 N Arg Pbf 25% piperidine/dmf Fmoc-AA-OH, HOBt/DIC H-Ahx-Ahx-Glu tbu -Asn-Pro-Val-Val-His Trt -Phe-Phe-Lys Boc -Asn-Ile-Val-Thr tbu -Pro-Arg Pbf 5 DCM/TFE (7/3) H-Ahx-Ahx-Glu tbu -Asn-Pro-Val-Val-His Trt -Phe-Phe-Lys Boc -Asn-Ile-Val-Thr tbu -Pro-Arg Pbf -OH 5 94% TFA in DCM, scavengers H-Ahx-Ahx-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-OH 5 2 Σχήμα 21: Συνθετική πορεία του αναλόγου 2. Οι αντιδράσεις σύζευξης και απομάκρυνσης της Fmoc ομάδας ελέγχθηκαν με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) και test Kaiser. 83 Σ ε λ ί δ α

106 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 22: Αναλυτικά RP-HPLC του αναλόγου 2, (Α) πριν και (Β) μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. Συνθήκες: 10%(Β) σε 15min 100%(Β), ροή: 1mL/min, [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0.08% (v/v)] t R =8.087 min, καθαρότητα= 82.98%, 99.98% (πριν και μετά τον καθαρισμό αντίστοιχα) Σχήμα 23: ESI-MS του αναλόγου 2 μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. Μ θεωρ.= (Μ+2Η + )/2= , (Μ+3Η + )/3=826.35, (Μ+4Η + )/4=620.02, (Μ+5Η + )/5= Σ ε λ ί δ α

107 Αποτελέσματα Συζήτηση Παρατηρήσεις: Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης του πεπτιδίου 1 στα αμινοξέα Asn, Tyr και Val καθώς και στο δεκαπεπτίδιο [KG] 5 εμφανίστηκαν ατελείς συζεύξεις. Το πρόβλημα αντιμετωπίστηκε με επαναλαμβανόμενες επανασυζεύξεις. Η μη επιτυχής σύζευξη πιθανώς να οφείλεται σε στερεοχημική παρεμπόδιση λόγω αναδίπλωσης της πεπτιδικής αλυσίδας. Επιπλέον, στο πεπτίδιο 1 εμφανίστηκε παραπροϊόν που οφείλεται στην οξειδωμένη μεθειονίνη δημιουργώντας προβλήματα στον καθαρισμό του, καθώς η οξείδωση της πραγματοποιείται σχετικά εύκολα. Κατά τη διάρκεια σύνθεσης του πεπτιδίου 2 δεν υπήρχαν ιδιαίτερα προβλήματα και ειδικότερα στα (Ahx) 6 δεν χρειάστηκε καμία επανασύζευξη. Όλες οι αντιδράσεις σύζευξης πραγματοποιήθηκαν με διαλύτη DIMAC, υψηλής καθαρότητας, ώστε να αποφευχθεί πιθανή απομάκρυνση της Fmoc ομάδας από ελεύθερες αμίνες λόγω της χρήσης DMF. Τέλος, όπως διαπιστώθηκε και από τα αναλυτικά RP-HPLC, τα τελικά συντιθέμενα πεπτίδια ήταν υψηλής καθαρότητας. 85 Σ ε λ ί δ α

108 Αποτελέσματα Συζήτηση Για την σύνθεση του πεπτιδικού αναλόγου 3, πραγματοποιήθηκε σύζευξη του SPDP στο ελεύθερο άμινο τελικό άκρο του Ahx του αναλόγου 2. Η σύζευξη πραγματοποιήθηκε σε στερεή φάση επί της CLTR-Cl, ενώ δεν ήταν αναγκαία η χρήση αντιδραστηρίων ενεργοποίησης καθώς η καρβοξυλομάδα του SPDP είναι ενεργοποιημένη. Διαλύτης σύζευξης χρησιμοποιήθηκε το DIMAC. Ο καθαρισμός του αναλόγου 3 πραγματοποιήθηκε με ημιπαρασκευαστικό RP-HPLC και η ταυτοποίησή του με ESI-MS. Παρατίθενται τα αναλυτικά RP-HPLC πριν και μετά τον καθαρισμό και το αντίστοιχο ESI-MS. Σχήμα 24: Αναλυτικά RP-HPLC του αναλόγου 3, (Α) πριν και (Β) μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. Συνθήκες: 10%(Β) σε 15min 100%(Β), ροή: 1mL/min, [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0.08% (v/v)] t R =8.972 min, καθαρότητα= 85.30%, 99.41% (πριν και μετά τον καθαρισμό αντίστοιχα). 86 Σ ε λ ί δ α

109 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 25: ESI-MS του αναλόγου 3 μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. Μ θεωρ.= (Μ+2Η + )/2= , (Μ+3Η + )/3=891.70, (Μ+4Η + )/4=669.02, (Μ+5Η + )/5= Παρατηρήσεις: Η σύζευξη του SPDP στο πεπτίδιο 2 πραγματοποιήθηκε χωρίς δυσκολία. Η αντίδραση σύζευξης ελέγθηκε και επιβεβαιώθηκε σε 2 h με test Kaiser. Το τελικό πεπτιδικό ανάλογο 3 είναι υψηλής καθαρότητας σύμφωνα με το αναλυτικό RP-HPLC (σχήμα 24). 87 Σ ε λ ί δ α

110 Αποτελέσματα Συζήτηση 3.Β Σύζευξη πεπτιδικών αναλόγων με μαννάνη Το πεπτίδιο [KG] 5 MOG (Pro 42 ) 1 συζεύχθηκε με τον πολυσακχαρίτη μαννάνη στην οξειδωμένη και ανηγμένη μορφή του. Η αμινοξική αλληλουχία [KG] 5 χρησιμοποιείται ως γέφυρα σύζευξης του πεπτιδίου με τη μαννάνη (σχήμα 26). Σχήμα 26: Σύζευγμα πεπτιδίου 1 με την (Α) ανηγμένη μαννάνη, (Β) οξειδωμένη μαννάνη. Για τη σύνθεση του συζεύγματος, αρχικά αντέδρασε η μαννάνη με υπεριωδικό νάτριο (NaIO 4 ) προκειμένου να ολοκληρωθεί η οξειδωτική διάσπαση των cis-διολών της μαννάνης σε πολυαλδεΰδη (σχήμα 27). Ο καθαρισμός της οξειδωμένης μαννάνης πραγματοποιήθηκε με χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε στήλες PD-10 και η ανάκτηση της μαννάνης υπολογίστηκε σε ~10.5 mg (αρχικά χρησιμοποιήθηκαν 14 mg). Στη συνέχεια, σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακινών ph 9 προστέθηκε το ανάλογο 1 για τη δημιουργία βάσεων Schiff ανάμεσα στις αμινομάδες της Lys και τις αλδεϋδομάδες της οξειδωμένης μαννάνης, σχήμα 27). Αναγωγή των αλδεϋδομάδων σε αλκοόλες και των βάσεων Schiff σε αμίνες με κατεργασία με υδρίδιο βορίου-νατρίου (NaBH 4 ) οδήγησε στην ανηγμένη μορφή της μαννάνης (σχήμα 27). Το προϊόν αποθηκεύεται στους -20 ο C. Για τον έλεγχο της σύζευξης πεπτιδίου-μαννάνης μέσω [KG] 5 πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, tricine SDS PAGE) με χρώση Coomassie Brilliant Blue ή χρώση αργύρου, ενώ για τον προσδιορισμό των ελεύθερων 88 Σ ε λ ί δ α

111 Αποτελέσματα Συζήτηση αλδεϋδομάδων πραγματοποιήθηκε tricine SDS PAGE με χρώση Periodic acid-schiff stain, PAS και χρωματομετρία (Tapeinou et al. 2015). Σχήμα 27: Συνθετική πορεία σύζευξης της μαννάνης με το πεπτίδιο [KG] 5 MOG (Pro 42 ) (1). Tο δεκαπεπτίδιο [KG] 5 χρησιμοποιήθηκε ως γέφυρα σύζευξης καθώς οι ελεύθερες αμινομάδες της λυσίνης μετέχουν στη δημιουργία βάσεων Schiff με τις αλδεΰδες της οξειδωμένης μορφής της μαννάνης (Tapeinou et al. 2015). Όπως αναφέρθηκε παραπάνω ο καθαρισμός της μαννάνης γίνεται με χρωματογραφία μοριακής διήθησης με στήλες PD-10. Πρόκειται για στήλες Sephadex G-25 για την αφαίρεση αλάτων και μικρών µορίων από διάλυμα μακρομορίων. Ουσίες με μοριακό βάρος μεγαλύτερο από Da εκλούονται σε όγκο V 0. Τα μικρότερα µόρια µε µοριακό βάρος κάτω από Da, θα εκλούονται μετά τα μακρομόρια µε µια σειρά αντίστροφη µε το μέγεθος τους. Ένα από τα πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι ότι τα μακρομόρια εκλούονται χωρίς αραίωση. Παρακάτω φαίνεται σχηματικά η απομάκρυνση άλατος από ένα πρωτεϊνικό διάλυμα (σχήμα 28). Με βάση το παρακάτω 89 Σ ε λ ί δ α

112 Αποτελέσματα Συζήτηση διάγραμμα, πραγματοποιήθηκε ο καθαρισμός της οξειδωμένης μαννάνης, όπως έχει περιγραφεί στην ενότητα 2.Β, ενώ τα αντίστοιχα κλάσματα που συλλέχθηκαν ήταν μεταξύ 2.5 και 4.5 ml. Σχήμα 28: Απομάκρυνση του NaCl από διάλυμα αλβουμίνης με στήλη PD-10. Η αλβουμίνη εκλούεται σε κλάσματα όγκου μεταξύ 2.5 και 6 ml (όπως υποδεικνύεται από τα βέλη). Σύμφωνα με τη σύζευξη του πεπτιδίου 1 με μαννάνη, πραγματοποιήθηκε σύζευξη και άλλων πεπτιδικών αναλόγων, επιτόπων των πρωτεϊνών της μυελίνης (πίνακα 11) προκειμένου να γίνει εκτίμηση της in vivo και in vitro βιολογικής τους δράση. Τα in vivo πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο Ινστιτούτο Παστέρ από την ερευνητική ομάδα της Dr Lesley Probert. Τα in vitro πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο αιματολογίας της Ιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη της Καθηγήτριας Αθανασίας Μουζάκη. Επίσης, in vivo και in vitro βιολογική αξιολόγηση συντιθέμενων αναλόγων πραγματοποιούνται από την Καθηγήτρια Βάσω Αποστολοπούλου στο Ινστιτούτο Burnet στην Μελβούρνη, Αυστραλία. Επιπλέον, για το ανάλογο Mannan oxidized - [KG] 5 MOG (Pro 42 ) πραγματοποιήθηκαν μελέτες τοξικότητας, από την εταιρία ICP Firefly Pty Ltd στην Αυστραλία, σε outbred Ινδικά χοιρίδια και inbred C57BL/6. 90 Σ ε λ ί δ α

113 Αποτελέσματα Συζήτηση Πίνακας 11: Συντιθέμενα ανάλογα μυελίνης στα οποία πραγματοποιήθηκε βιολογική αξιολόγηση. Ο συμβολισμός (Ser 42 ) ή (Pro 42 ) αναφέρεται στη MOG πρωτεΐνη των αρουραίων ή του ανθρώπου αντίστοιχα. α/α Συντιθέμενα ανάλογα Βιολογική αξιολόγηση 1 MOG (Ser 42 ) Πρόκληση ΕΑΕ σε C57BL/6 ποντίκια 2 Mannan oxidized - [KG] 5 OVA OVA Mannan oxidized 5 Mannan reduced 6 Mannan oxidized - [KG] 5 MOG (Ser 42 ) 7 Mannan reduced - [KG] 5 MOG (Ser 42 ) 8 Mannan oxidized - [KG] 5 MOG (Pro 42 ) 9 Mannan reduced - [KG] 5 MOG (Pro 42 ) i. in vivo πρόκληση/αναστολή ΕΑΕ Σχεδιασμός ανοσοθεραπειών που προάγουν ανοχή στα CD4+ και CD8+ T κύτταρα στην ΕΑΕ σε ποντίκια SJL/J, C57BL/6 και αρουραίους Lewis. Έλεγχος έκκρισης κυτταροκινών, ρυθμιστικών κυττάρων (T regs ), ιστοπαθολογική μελέτη-απομυελίνωση (Day et al. 2015; Tseveleki et al. 2015). 10 Mannan oxidized - [KG] 5 MBP Mannan reduced - [KG] 5 MBP Mannan oxidized - [KG] 5 MBP (Tyr 91 ) 13 Mannan reduced - [KG] 5 MBP (Tyr 91 ) 14 Mannan oxidized - [KG] 5 MBP (Ala 91 ) 15 Mannan reduced - [KG] 5 MBP (Ala 91 ) 16 Mannan oxidized - [KG] 5 MBP ii. in vitro αξιολόγηση σε αίματα ασθενών με ΣΚΠ Αξιολόγηση της συχνότητας και δραστηριότητας των Τ ρυθμιστικών κυττάρων (Tregs) σε ασθενείς με ΣΚΠ. Έλεγχος έκκρισης κυτταροκινών, ανάπτυξη αντιγονοειδικών δενδριτικών κυττάρων (DCs). 17 Mannan reduced - [KG] 5 MBP Mannan oxidized - [KG] 5 PLP Mannan oxidized - [KG] 5 PLP Mannan oxidized 21 Mannan reduced 22 Mannan oxidized - [KG] 5 MOG (Ser 42 ) 23 MOG (Pro 42 ) 24 MOG (Ser 42 ) in vivo αξιολόγηση σε διαγονιδιακά πειραματόζωα που εκφράζουν το HLA-DR2 (humanized mice): DRA-0101/DRB MBP MBP PLP Σ ε λ ί δ α

114 Αποτελέσματα Συζήτηση α/α Συντιθέμενα ανάλογα Βιολογική αξιολόγηση 28 MOG [KG] 5 MOG (Pro 42 ) 30 MOG (Pro 42 ) 31 MOG (Ser 42 ) 32 Cyclic( ) PLP [Leu 144,Arg 147 ] 33 linear PLP FGFv variant Έλεγχος αντιγονικότητας: Αναγνώριση αντιγόνου από Τ κύτταρα HLA πιστοποιημένων ασθενών με ΣΚΠ. in vivo πρόκληση/αναστολή ΕΑΕ σε ποντίκια SJL/J σε συνδυασμό με τον παράγοντα ανάπτυξης, FGF. 92 Σ ε λ ί δ α

115 Αποτελέσματα Συζήτηση 3.Β 1 Μελέτη του συζεύγματος Mannan-[KG] 5 MOG (Pro 42 ) 3.Β 1.1 Έλεγχος με tricine SDS-PAGE Για τον έλεγχο των αντιδράσεων σύζευξης των πεπτιδίων με τη μαννάνη αναπτύχθηκε μεθοδολογία παρόμοια με την τυπική Laemmli ηλεκτροφόρηση (Laemmli 1970) όπου δίνεται η δυνατότητα προσδιορισμού πεπτιδίων με μοριακό βάρος μεγαλύτερο από 500 Da. Χρησιμοποιούνται επίπεδα πήγματα που αποτελούνται από το πήγμα διαχωρισμού και το πήγμα πακεταρίσματος. Έπειτα από αναλύσεις συζευγμάτων πεπτιδίου-μαννάνης με SDS PAGE και διάφορες αναλογίες περιεκτικότητας σε ακρυλαμίδιο του πήγματος διαχωρισμού βρέθηκε πως η καλύτερη εικόνα για την ανάλυση των συζευγμάτων απαντάται σε περιεκτικότητα 16.5%. Η παρασκευή των πηκτωμάτων καθώς και οι αναλογίες που χρησιμοποιήθηκαν έχουν περιγραφεί αναλυτικά στην ενότητα 2.Β 1. Η χρώση της πηκτής πραγματοποιείται με Coomassie Brilliant Blue ή silver stain για την ανίχνευση του ελεύθερου πεπτιδίου καθώς και του συζεύγματος μαννάνης-πεπτιδίου. Για κάθε περίπτωση, σε κάθε θέση δείγματος φορτώθηκαν 15 μl μαννάνης ή μαννάνηςπεπτιδίου ή πεπτιδίου σε ρυθμιστικό διάλυμα ph 9. Δεδομένου ότι η περιεκτικότητα πεπτιδίου στο διάλυμα σύζευξης είναι 0.5 mg/ml (1 mg πεπτιδίου/2 ml διαλύματος) και η ανάκτηση της μαννάνης υπολογίστηκε σε ~10.5 mg, οι ποσότητες που φορτώθηκαν αντιστοιχούν σε μg για τις διάφορες μορφές της μαννάνης και 7.5 μg για το πεπτίδιο, ανά θέση δείγματος. 93 Σ ε λ ί δ α

116 Αποτελέσματα Συζήτηση Στις πηκτές του σχήματος 29 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα μετά την ηλεκτροφορητική ανάλυση του πεπτιδίου 1, της μαννάνης (στις διάφορες μορφές) και των συζευγμάτων πεπτιδίου-μαννάνης. Σχήμα 29: Πηκτές μετά από SDS-PAGE με (Α) χρώση Coomassie Brilliant Blue, (Β) χρώση αργύρου. Διαδρομή 1: Mannan, Διαδρομή 2: Mannan oxidized, Διαδρομή 3: Mannan oxidized - [KG] 5 MOG (Pro 42 ), Διαδρομή 4: Mannan reduced, Διαδρομή 5: Mannan reduced -[KG] 5 MOG 35-55(Pro 42 ), Διαδρομή 6: [KG] 5 MOG (Pro 42 ). Στις δύο πηκτές του σχήματος 29 η οξειδωμένη μαννάνη δεν ανιχνεύεται. Η ζώνη με μοριακό βάρος kda αντιστοιχεί στο πεπτίδιο, ενώ το σύζευγμα της οξειδωμένης μαννάνης-πεπτιδίου εμφανίζεται σαν διάχυση μοριακού βάρους ~ kda. Η διάχυση στις ζώνες των συζευγμάτων (διαδρομές 3, 5) ενδεχομένως οφείλεται στην διαφοροποίηση της σύζευξης των πεπτιδίων που συζεύχθηκαν με τη μαννάνη καθώς ποικίλει ο αριθμός των μορίων μανόζης τόσο της κύριας αλυσίδας όσο και των πλευρικών αλυσίδων του πολυσακχαρίτη. Πρέπει να σημειωθεί ότι και στις δύο περιπτώσεις δεν υπάρχει ελεύθερο πεπτίδιο στο σύζευγμα, όπως διαπιστώθηκε από την απουσία της ζώνης των πεπτιδίων στις θέσεις όπου τοποθετήθηκαν τα συζεύγματα οξειδωμένης ή ανηγμένης μαννάνης-πεπτιδίου (διαδρομέ 3, 5). 94 Σ ε λ ί δ α

117 Αποτελέσματα Συζήτηση Επιπλέον, υπολογίστηκε η ποσότητα του ελεύθερου πεπτιδίου που θα μπορούσε να αποτυπωθεί εμφανώς μετά την ηλεκτροφόρηση (σχήμα 30). Το εύρος συγκέντρωσης του πεπτιδίου που ελέγθηκε ήταν 2.5x10-1 (3.75 μg) έως 12.5x10-4 mg/ml (18.75 ng). Σχήμα 30: Όριο ανίχνευσης του ελεύθερου πεπτιδίου με χρώση (Α) Coomassie Brilliant Blue (Β) χρώση αργύρου. Οι διαδρομές αντιστοιχούν στο πεπτίδιο σε διάφορες συγκεντρώσεις: Διαδρομή 1: 3.75 μg, Διαδρομή 2: μg, Διαδρομή 3: 0.75 μg, Διαδρομή 4: μg, Διαδρομή 5: μg, Διαδρομή 6: 75 ng, Διαδρομή 7: 37.5 ng, Διαδρομή 8: ng. Η μικρότερη ποσότητα πεπτιδίου που ανιχνεύθηκε στην πηκτή Α (διαδρομή 7) είναι 37.5 ng. Όπως έχει περιγραφεί, η συγκέντρωση του πεπτιδίου στην έναρξη της σύζευξης ήταν 0.5 mg/ml διαλύματος οξειδωμένης μαννάνης, ενώ ταυτόχρονα δεν ανιχνεύθηκε ελεύθερο πεπτίδιο στο σύζευγμα (σχήμα 29, διαδρομή 3). Δεδομένου ότι τα 37.5 ng πεπτιδίου που μπορούν να ανιχνευθούν αντιστοιχούν σε 0.015% τελικού διαλύματος συζεύγματος, τουλάχιστον 99.9% του πεπτιδίου μπορεί να επιβεβαιωθεί ότι έχει συζευχθεί με μαννάνη με SDS-PAGE και Coomassie Brilliant Blue. Ο έλεγχος ευαισθησίας της μεθόδου μελετήθηκε επίσης με χρώση νιτρικού αργύρου, η οποία θεωρείται γενικά πιο ευαίσθητη (0.25 ng/ θέση δείγματος) από την Coomassie Brilliant Blue (Morrissey 1981). Στην πηκτή Β παρατηρείται πως η μικρότερη ποσότητα πεπτιδίου που ανιχνεύθηκε είναι 75 ng (διαδρομή 6). Δεδομένου ότι το πείραμα επαναλήφθηκε αρκετές φορές, το αποτέλεσμα αντιπαραβάλλεται με το κατώτερο όριο με την Coomassie Brilliant Blue. Η χρώση αργύρου βασίζεται στην αναγωγική κατακρήμνιση του αργύρου επί μακρομορίων υπό αλκαλικές συνθήκες. Ενδεχομένως, η εναπόθεση του αργύρου να μειώθηκε στα μικρότερα πεπτίδια εξαιτίας 95 Σ ε λ ί δ α

118 Αποτελέσματα Συζήτηση του μεγέθους τους και της απλούστερης διαμόρφωσης τους, με αποτέλεσμα να μην είναι έντονος ο χρωματισμός τους. Η πορεία της αντίδρασης σύζευξης καθώς και ο έλεγχος ολοκλήρωσης της σύζευξης προκειμένου όλο το πεπτίδιο να έχει συζευχθεί στη μαννάνη, προσδιορίστηκε επίσης ως προς την αναλογία πεπτιδίου/μαννάνης και ως προς το χρόνο. Σε 14 mg αρχικής μαννάνης ή ~10.5 mg καθαρής οξειδωμένης μαννάνης σε διάλυμα ανθρακικών ph 9 προστέθηκε το πεπτίδιο 1 σε ποσότητα 3 mg, 2 mg, 1.5 mg και 1 mg. Ο έλεγχος στη μονάδα του χρόνου πραγματοποιήθηκε σε χρονικές στιγμές 5 h, 10 h, 24 h, 32 h και 48 h. Σχήμα 31: Πηκτή με χρώση Coomassie Brilliant Blue για τον έλεγχο του συζεύγματος Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Pro 42 ) ως προς την αναλογία πεπτιδίου και ως προς το χρόνο. Οι διαδρομές αντιστοιχούν στο σύζευγμα (Α) σε διαφορετικά mg πεπτιδίου, Διαδρομή 1: 1 mg, Διαδρομή 2: 1.5 mg, Διαδρομή 3: 2 mg, Διαδρομή 4: 3 mg, (Β) σε διάφορες χρονικές στιγμές, Διαδρομή 1: 5 h, Διαδρομή 2: 10 h, Διαδρομή 3: 24 h, Διαδρομή 4: 32, Διαδρομή 5: 48 h, Διαδρομή 6: 0 h. Όπως φαίνεται στην πηκτή Α, η αναλογία 14 mg μαννάνης/1 mg πεπτιδίου είναι η βέλτιστη κυρίως λόγω της στερεοχημικής παρεμπόδισης που δεν επιτρέπει στις συνθήκες του πειράματος τη σύζευξη μεγαλύτερης ποσότητας πεπτιδίου. Στις διαφορετικές περιπτώσεις όπου προστέθηκε περισσότερο από 1 mg πεπτιδίου (διαδρομές 2-4) παρατηρήθηκε ότι μία ποσότητα παραμένει ασύζευκτη και έτσι 96 Σ ε λ ί δ α

119 Αποτελέσματα Συζήτηση εμφανίζεται μια έντονη ζώνη στα 3.5 kda (MW 1 = ). Επιπλέον, παρατηρείται ότι η ένταση της χρώσης της ζώνης του πεπτιδίου είναι ανάλογη της ποσότητας που προστέθηκε αρχικά στη μαννάνη, άρα και της ποσότητας πεπτιδίου που έμεινε τελικά ασύζευκτο. Μετά από ποσοτικοποίηση των ζωνών προκύπτει για τη διαδρομή 2 δηλαδή τα 1.5 mg πεπτιδίου αντιστοιχούν σε ~24% αύξηση της έντασης της ζώνης ως προς τη διαδρομή 1 (1 mg). Η διαδρομή 3, δηλαδή τα 2 mg πεπτιδίου αντιστοιχούν σε ~42% αύξηση της έντασης της ζώνης ως προς τη διαδρομή 1 (1 mg) και τέλος η διαδρομή 4 δηλαδή τα 3 mg πεπτιδίου αντιστοιχούν σε ~220% αύξηση της έντασης της ζώνης ως προς τη διαδρομή 1 (1 mg). Στην πηκτή Β στη διαδρομή 6 δηλαδή σε χρόνο μηδέν από την έναρξη αντίδρασης της σύζευξης παρατηρείται ότι δεν εμφανίζεται διάχυση παρά μόνο η έντονη ζώνη στα 3.5 kda που αντιστοιχεί στο πεπτίδιο το οποίο δεν έχει ακόμα συζευχθεί με την μανάνη. Στους χρόνους t= 5 h, 10 h και 24 h (διαδρομές 1-3) εμφανίζεται το ασύζευκτο πεπτίδιο (3.5 kda) ενώ διακρίνεται και η διάχυση (~ kda) η οποία δείχνει ότι η διαδικασία της σύζευξης του πεπτιδίου με την μαννάνη βρίσκεται σε εξέλιξη. Μετά από 32 h (διαδρομή 4) παρατηρείται ότι έχει σχεδόν ολοκληρωθεί η διαδικασία της σύζευξης, ενώ η απουσία της ζώνης του πεπτιδίου μετά από 2 ημέρες σύζευξης (διαδρομή 5) αποδεικνύει ότι η σύζευξη έχει ολοκληρωθεί. Η ένταση της χρώσης της ζώνης του πεπτιδίου είναι ανάλογη της ποσότητας δεν έχει ακόμα συζευχθεί. Μετά από ποσοτικοποίηση των ζωνών προκύπτει για τη διαδρομή 1 δηλαδή μετά από 5 h σύζευξης ότι το ελεύθερο πεπτίδιο αντιστοιχεί στο ~34% του πεπτιδίου σε t=0 (διαδρομή 6). Μετά από 10 h σύζευξης (διαδρομή 2) το ελεύθερο πεπτίδιο αντιστοιχεί στο ~21% του πεπτιδίου σε t=0 (διαδρομή 6). Το ελεύθερο πεπτίδιο αντιστοιχεί στο ~13% και ~8% του πεπτιδίου σε t=0 (διαδρομή 6) μετά από 24 h (διαδρομή 3) και 32 h (διαδρομή 4) σύζευξης αντίστοιχα. Τέλος, στις 48 h σύζευξης (διαδρομή 5), δεν ανιχνεύεται ελεύθερο πεπτίδιο. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι μεταξύ 5-6 h η αντίδραση της σύζευξης έχει ολοκληρωθεί κατά ~50% ενώ χρειάζονται τουλάχιστον επιπλέον ~42 h για την ολοκλήρωση της αντίδρασης σύζευξης. 97 Σ ε λ ί δ α

120 Αποτελέσματα Συζήτηση 3.Β 1.2 Ανίχνευση ελεύθερων αλδεϋδομάδων με tricine SDS-PAGE/PAS stain και χρωματομετρία Στην παράγραφο αυτή περιγράφεται o προσδιορισμός των αλδεϋδομάδων της μαννάνης πριν και μετά τη σύζευξη με το πεπτίδιο. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκε tricine SDS-PAGE σε συνδυασμό με χρώση PAS, για την αποτύπωση της μαννάνης. Η συνήθης διαδικασία για την χρώση PAS των σακχάρων αρχίζει με οξείδωση τους και ακολουθείται από χρώση τους με το αντιδραστήριο Schiff. Για τον πολυσακχαρίτη μαννάνη η χρώση έγινε μόνο από το αντιδραστήριο Schiff καθώς η μαννάνη προηγουμένως οξειδώνεται με υπεριωδικό οξύ για την σύνθεση των συζευγμάτων (ενότητα 2.Β). Στην παρακάτω πηκτή αποτυπώνεται η μαννάνη, στα διάφορα δείγματα, υποδεικνύοντας την ύπαρξη ή μη ελεύθερων αλδεϋδομάδων. Σχήμα 32: Πηκτή με χρώση PAS. Διαδρομή 1: Mannan, Διαδρομή 2: Mannan oxidized, Διαδρομή 3: Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Pro 42 ), Διαδρομή 4: Mannan reduced, Διαδρομή 5: Mannan reduced - [KG] 5 MOG (Pro 42 ), Διαδρομή 6: [KG] 5 MOG (Pro 42 ). Θετική χρώση με PAS προκύπτει για την οξειδωμένη μαννάνη καθώς και το σύζευγμα οξειδωμένης μαννάνης-πεπτιδίου (διαδρομές 2, 3) τα οποία εμφανίζονται σαν διάχυση μοριακού βάρους ~ kda. Η διάχυση οφείλεται στην ετερογένεια της μαννάνης. Η θετική χρώση του συζεύγματος δείχνει ότι οι αλδεΰδες δεν εξαλείφονται μετά την σύζευξη του πεπτιδίου στην οξειδωμένη μαννάνη. Αντίθετα, η αρνητική χρώση στην 98 Σ ε λ ί δ α

121 Αποτελέσματα Συζήτηση ανηγμένη μαννάνη και στο σύζευγμα ανηγμένης μαννάνης-πεπτιδίου (διαδρομές 4, 5) δηλώνει την πλήρη αναγωγή των αλδεϋδών σε αλκοόλες μετά την κατεργασία με NaBH 4. Το πεπτίδιο (διαδρομή 6) όπως ήταν αναμενόμενο δεν εμφανίζεται. Για την επιβεβαίωση του αποτελέσματος της πηκτής, μετρήθηκαν επίσης οι αλλαγές των συνολικών καρβονυλίων με DNPH. Η μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση των αλδεϋδών με DNPH προς σχηματισμό του σταθερότερου παραγώγου 2,4- δινιτροφαινυλυδραζόνης, το οποίο απορροφά στα 405 nm (παράρτημα, πίνακας 14). Οι αλδεΰδες αυξήθηκαν μετά την οξείδωση της μαννάνης (Α 405 από ± σε ± 0.031), ενώ η σύζευξη της οξειδωμένης μαννάνης με το πεπτίδιο οδήγησε σε μικρή μείωση (Α ± 0.023). Η παρουσία αλδεϋδών στο σύζευγμα οξειδωμένης μαννάνης-πεπτιδίου αντανακλά την περίσσεια της μαννάνης που χρησιμοποιήθηκε. Η αναγωγή της μαννάνης και του συζεύγματος μαννάνης-πεπτιδίου από το NaBH 4 οδήγησε στην εξάλειψη της περίσσειας των αλδεΰδων (Α ± και ± αντίστοιχα) και πιθανώς στην μετατροπή τους σε αλκοόλες. Η απορρόφηση του πεπτιδίου είναι ασήμαντη (Α ± ). Η μέτρηση των αλδεϋδών συμφωνεί με την ποιοτική ανίχνευση τους από την πηκτή (tricine SDS-PAGE/PAS stain). 3.Β 1.3 Έλεγχος σταθερότητας Στο σύζευγμα Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Pro 42 ) πραγματοποιήθηκε μελέτη σταθερότητας με SDS-PAGE και χρώση Coomassie Brilliant Blue. Έτσι, ποσότητα του συζεύγματος τοποθετήθηκε σε φιαλίδια τα οποία χωρίστηκαν και φυλάχθηκαν σε σκοτάδι σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες, ο C (θερμοκρασία δωματίου), 4 ο C (ψυγείο) και -20 ο C (κατάψυξη). Τα δείγματα ελέγχθηκαν για την σταθερότητας τους στις τρεις θερμοκρασίες και σε χρόνο έως 2 χρόνια. Στις πηκτές τοποθετήθηκε και δείγμα πρόσφατα παρασκευασμένου συζεύγματος Mannan oxidized - [KG] 5 MOG (Pro 42 ) το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα αναφοράς (reference standard). 99 Σ ε λ ί δ α

122 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 33: Έλεγχος σταθερότητας του συζεύγματος στο χρόνο σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες. (Α) t= 2 ημέρες, (Β) t= 4 ημέρες, (Γ) t= 7 ημέρες, (Δ) t= 14 ημέρες, (Ε) t= 1 μήνας, (ΣΤ) t= 2 μήνες, (Ζ) t= 3 μήνες, (Η) t= 6 μήνες. Διαδρομή 1: δείγμα αναφοράς, Διαδρομή 2: Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Pro 42 ) -20 ο C, Διαδρομή 3: Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Pro 42 ) 4 ο C, Διαδρομή 4: Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Pro 42 ) 25 ο C, Διαδρομή 5: [KG] 5 MOG 35-55(Pro 42 ). (Θ) t= 9 μήνες, (Ι) t= 1 χρόνο, (Κ) t= 2 χρόνια. Διαδρομή 1: δείγμα αναφοράς, Διαδρομή 2: Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Pro 42 ) -20 ο C, Διαδρομή 3: Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Pro 42 ) 4 ο C, Διαδρομή 4: [KG] 5 MOG (Pro 42 ). Σε χρονική διάρκεια 3 μηνών από τη σύνθεση του συζεύγματος δεν παρατηρείται κάποια αλλαγή στην πηκτή σε καμία από τις τρεις θερμοκρασίες στις οποίες φυλάχθηκε το σύζευγμα (Πηκτές Α-Ζ). Στην πηκτή Η, η οποία αντιστοιχεί στους 6 μήνες, στο σύζευγμα το οποίο φυλάχθηκε στους o C (διαδρομή 4) παρατηρείται ότι δεν αποτυπώνεται το σύζευγμα. Επομένως το σύζευγμα δεν παραμένει σταθερό μετά από 6 μήνες σε θερμοκρασία δωματίου. Η καταστροφή του συζεύγματος πιθανώς να οφείλεται και σε αλλοίωση του πεπτιδίου καθώς δεν ανιχνεύεται η αντίστοιχη ζώνη στα 100 Σ ε λ ί δ α

123 Αποτελέσματα Συζήτηση 3.5 kda στην πηκτή. Στα πειράματα σταθερότητας μετά τον 6 ο μήνα τα δείγματα στους 25 o C δε χρησιμοποιούνται. Στις πηκτές Θ, Ι και Κ τα συζεύγματα στους 4 o C και -20 o C παραμένουν σταθερά έως και 2 χρόνια. 3.Β 2 Μελέτη του συζεύγματος Mannan-[KG] n MBP (Tyr 91 ) Στο σύζευγμα mannan oxidized -[KG] 5 MBP (Tyr 91 ) παρατηρήθηκε ότι από την έναρξη αλλά και μετά την πραγματοποίηση της αντίδρασης σύζευξης, το διάλυμα ήταν θολό και υπήρχαν αιωρούμενα σωματίδια. Για αυτό το λόγο, πραγματοποιήθηκε σύζευξη του πεπτιδίου σε μαννάνη μέσω μικρότερης γέφυρας [KG] n. Συγκεκριμένα, στη μαννάνη συζεύχθηκε το πεπτίδιο με n=1, 2, 3, 4. Όταν χρησιμοποιήθηκε το πεπτίδιο με n= 4 παρατηρήθηκε επίσης θολερότητα. Τα υπόλοιπα συζεύγματα ήταν διαυγή οπότε και ακολούθησε ο έλεγχος για επιβεβαίωση ή μη της σύζευξης τους στη μαννάνη. Στην πηκτή τοποθετήθηκε και σύζευγμα με n= 5 ως δείγμα αναφοράς. Τα αποτελέσματα της σύζευξης παρουσιάζονται στο σχήμα 34. Σχήμα 34: Πηκτή με χρώση Coomassie Brilliant Blue. Διαδρομή 1: [KG] 5 MBP (Tyr 91 ), Διαδρομή 2: Mannan oxidized -[KG] 5 MBP (Tyr 91 ), Διαδρομή 3: [KG] 3 MBP (Tyr 91 ), Διαδρομή 4: Mannan oxidized -[KG] 3 MBP (Tyr 91 ), Διαδρομή 5: [KG] 2 MBP (Tyr 91 ), Διαδρομή 6: Mannan oxidized -[KG] 2 MBP (Tyr 91 ), Διαδρομή 7: [KG] 1 MBP (Tyr 91 ), Διαδρομή 8: Mannan oxidized -[KG] 1 MBP (Tyr 91 ). 101 Σ ε λ ί δ α

124 Αποτελέσματα Συζήτηση Στα συζεύγματα με n= 1, 2, 3 (διαδρομές 8, 6 και 4) παρατηρείται ζώνη μοριακού βάρους ~3.0 kda υποδεικνύοντας ελεύθερο πεπτίδιο το οποίο δεν έχει συζευχθεί με τη μαννάνη. Ωστόσο, η πρόοδος της αντίδρασης σύζευξης φαίνεται καλύτερη όσο αυξάνεται ο αριθμός της γέφυρας. Η αντίδραση της σύζευξης αφέθηκε περαιτέρω έως και 4 ημέρες χωρίς να υπάρξει διαφορά στη σύζευξη. Μετά από ποσοτικοποίηση προκύπτει ότι στο σύζευγμα με n=1 (διαδρομή 8) το ελεύθερο πεπτίδιο που ανιχνεύεται αντιστοιχεί στο 84% του πεπτιδίου με n=1 (διαδρομή 7). Στο σύζευγμα με n=2 (διαδρομή 6) το ελεύθερο πεπτίδιο που ανιχνεύεται αντιστοιχεί στο 40% του πεπτιδίου με n=2 (διαδρομή 5). Τέλος, στο σύζευγμα με n=3 (διαδρομή 4) το ελεύθερο πεπτίδιο που ανιχνεύεται αντιστοιχεί στο 25% του πεπτιδίου με n=3 (διαδρομή 3). Από τα παραπάνω προκύπτει ότι μόνο το πεπτίδιο με n=5 συζευγνύεται επαρκώς με τη μαννάνη (διαδρομή 2). Για την αντιμετώπιση της θολερότητας, το σύζευγμα Mannan oxidized - [KG] 5 MBP (Tyr 91 ) πέρασε από φίλτρο 0.45 μm, οπότε και το διάλυμα προέκυψε διαυγές. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε έλεγχος του μετά από το φίλτρο δείχνοντας ότι το σύζευγμα έχει περάσει από το φίλτρο χωρίς να έχει επηρεαστεί. 102 Σ ε λ ί δ α

125 Αποτελέσματα Συζήτηση 3.Γ Σχεδιασμός, σύνθεση και αξιολόγηση του συζεύγματος ανθρακινόνης-(ahx) 6 MBP Γ 1 Συλλογιστική πορεία για την ανάπτυξη του συζεύγματος ανθρακινόνης- (Ahx) 6 MBP για πιθανή βιολογική δράση Οι ενώσεις τύπου ανθρακινόνης και ειδικά οι δι-υποκατεστημένες αμινοαλκυλαμινο ανθρακινόνες έχουν μελετηθεί ευρέως στη βιβλιογραφία για την αντινεοπλασματική τους δράση (Zee-Cheng et al. 1979; Zee-Cheng et al. 1987; Morley and Furlong 2006). Στην παρούσα διατριβή επιλέχτηκε η σύνθεση ενός αναλόγου της μιτοξανδρόνης (σχήμα 35), η οποία έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς ως ανοσοκατασταλτικό μόριο στη ΣΚΠ (Morrissey et al. 2005). Το πεπτίδιο που επιλέχθηκε να συντεθεί και να συζευχθεί με το ανάλογο μιτοξανδρόνης είναι ο ανοσοκυρίαρχος επίτοπος της μυελίνης MBP καθώς έχει δειχθεί ότι το σύμπλεγμα HLA II DR2-MBP αναγνωρίζεται από τον TCR των εγκεφαλιτογόνων κυττάρων που εμπλέκονται στη ΣΚΠ (Lang et al. 2002; Greene et al. 2008). Η χρήση του πεπτιδίου συζευγμένο με το ανάλογο μιτοξανδρόνης έχει απώτερο στόχο την επιλεκτική ανοσοκαταστολή και καταστροφή των εγκεφαλιτογόνων Τ κυττάρων τα οποία έχουν ενεργοποιηθεί από το πεπτίδιο MBP Για το σκοπό αυτό, επιλέχθηκε η σύζευξη του πεπτιδίου στο ανάλογο μιτοξανδρόνης μέσω δισουλφιδικού δεσμού και η χρήση ενός εξαπεπτιδίου αποτελούμενο από αμινοεξανοϊκό οξύ ως γέφυρα σύνδεσης (σχήμα 35). Σχήμα 35: Σχεδιασμός για τη σύνθεση του συζεύγματος ανθρακινόνης-πεπτιδίου. 103 Σ ε λ ί δ α

126 Αποτελέσματα Συζήτηση Οι θειορεδοξίνες (Trxs) είναι αντιοξειδωτικά ένζυμα και δρουν ως αναγωγάσες προστατεύοντας από οξειδωτική συνάθροιση (Collet and Messens 2010). H ισομεράση των πρωτεϊνικών δισουλφιδίων, είναι ένα ένζυμο της οικογένειας της θειορεδοξίνης, η οποία εκκρίνεται και εκφράζεται στην επιφάνεια των κυττάρων. Η λειτουργία του στην επιφάνεια των κυττάρων είναι η αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών (σχήμα 36) (Khan et al. 2011). Ο δισουλφιδικός δεσμός για τη σύζευξη της ανθρακινόνης με το πεπτίδιο επιλέχθηκε στοχεύοντας το σύστημα της θειορεδοξίνης. Συγκεκριμένα, το επιθυμητό αποτέλεσμα είναι μετά την αναγνώριση του αντιγόνου MBP από τον TCR, μέσω της δημιουργίας του τριμοριακού συμπλόκου, οι θειορεδοξίνες να δράσουν αναγωγικά στην συντιθέμενη ένωση προκειμένου να ελευθερωθεί το ανοσοκατασταλτικό μόριο (ανθρακινόνη) από τη μεγάλη μοριακού βάρους ουρά του (συνδέτης-πεπτίδιο) και να εισέλθει στο ενεργοποιημένο από το MBP Τ κύτταρο (σχήμα 37). Σχήμα 36: Σχηματική αναπαράσταση της ροής ηλεκτρονίων στην οποία η θειορεδοξίνη (Trx) ανάγει τις οξειδωμένες πρωτεΐνες με τα ηλεκτρόνια που προέρχονται από το NADPH μέσω της αναγωγάση της θειορεδοξίνης (TrxR) (Collet and Messens 2010). Ο συνδέτης (Ahx) 6 χρησιμοποιήθηκε για την επιμήκυνση της αλυσίδας ώστε να καλυφθεί η απόσταση μεταξύ του πεπτιδίου και της επιφάνειας του Τ κυττάρου, προκειμένου η ανθρακινόνη να πλησιάσει αρκετά στο κύτταρο και να εισέλθει μετά τη διάσπαση του δισουλφιδικού δεσμού (σχήμα 38). Η απόσταση του πεπτιδίου και της επιφάνειας του TCR υπολογίστηκε με το λογιστικό πρόγραμμα MOE στα ~40 Å (σχήμα 37). Το αμινοεξανοϊκό οξύ έχει μήκος 7 Å και έχει μεγάλη ευελιξία. Επιπλέον, πρόκειται για μη φυσικό αμινοξύ χωρίς πλάγιες δραστικές ομάδες αποφεύγοντας τυχόν αλληλεπίδραση τους. Στο σχήμα 38 περιγράφεται σχηματικά η συλλογιστική πορεία για το σχεδιασμό της συντιθέμενης ένωσης. 104 Σ ε λ ί δ α

127 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 37: Απόσταση από το Ν τελικό άκρο του πεπτιδίου MBP (πράσινο) από τον TCR (μπλε), με βάση την κρυσταλλική δομή. Σχήμα 38: Συλλογιστική πορεία για την ανάπτυξη του συζεύγματος ανθρακινόνης-πεπτιδίου για απελευθέρωση της ανθρακινόνης και πιθανή βιολογική δράση. 105 Σ ε λ ί δ α

128 Αποτελέσματα Συζήτηση Τέλος, με την προϋπόθεση ότι το συντιθέμενο ανάλογο έχει συγγένεια πρόσδεσης (binding affinity) με την HLA II DRB1-1501, θα πρέπει να εξασφαλιστεί η σταθερότητα του τριμοριακού συμπλόκου (αναγνώριση HLA DR2-MBP από τον TCR) ώστε να επιτευχθούν όλα τα παραπάνω, οδηγώντας στο επιθυμητό αποτέλεσμα. Η βιβλιογραφία αναφέρει πως η αλληλεπίδραση του TCR με το αντιγόνο έχει χαμηλή συγγένεια και μικρό χρόνο ζωής (Samuel and Hanke 2003; Massilamany et al. 2011). Με την τεχνολογία των τετραμερών θα μπορούσαμε να αυξήσουμε τη συγγένεια της αλληλεπίδρασης για τη δημιουργία του τριμοριακού συμπλόκου ανάμεσα στον TCRpeptide-HLA II tetramer (Mallone and Nepom 2004; O'Connor et al. 2007). Για τη δημιουργία του τετραμερούς, αρχικά η πρωτεΐνη HLA II DRB εκφράζεται σε ευκαρυωτικά κύτταρα (με την τεχνολογία cdna φτιάχνεται πλασμίδιο το οποίο κωδικοποιεί την πρωτεΐνη), απομονώνεται και καθαρίζεται. Έπειτα, εκμεταλλευόμενοι τον ισχυρό δεσμό μεταξύ της στρεπταβιδίνης με τέσσερις βιοτίνες, γίνεται βιοτυνιλίωση στη μία αλυσίδα της πρωτεΐνης προκειμένου να δημιουργήσουμε ένα τετραμερές HLA σε μία στρεπταβιδίνη, η οποία συνήθως επισημαίνεται με κάποια φθορίζουσα ουσία. (Kozono et al. 1994; Ramachandiran et al. 2007). Το εν λόγω τετραμερές δε θα επισημανθεί λόγω του φθορισμού του συντιθέμενου συζεύγματος (ενότητα 3.Γ ). Στο σχήμα που ακολουθεί (σχήμα 39) περιγράφεται σχηματικά η γενική συλλογιστική πορεία για το σχεδιασμό του συζεύγματος-hla II τετραμερούς για την επιλεκτική καταστροφή των εγκεφαλιτογόνων Τ κυττάρων τα οποία έχουν ενεργοποιηθεί από τον ανοσοκυρίαρχο MBP επίτοπο. Απώτερος στόχος είναι το τετραμερές που δύναται αναπτυχθεί, να χρησιμοποιηθεί σε in vivo και in vitro πειράματα. 106 Σ ε λ ί δ α

129 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 39: Συλλογιστική πορεία για τη σύνθεση του συζεύγματος ανθρακινόνης-πεπτιδίου για επιλεκτική ανοσοκαταστολή. 107 Σ ε λ ί δ α

130 Αποτελέσματα Συζήτηση 3.Γ 2 Σύνθεση του συζεύγματος αναλόγου ανθρακινόνης με το πεπτίδιο (Ahx) 6 MBP Η σύνθεση του συζεύγματος ανθρακινόνη-(ahx) 6 MBP περιλαμβάνει τη σύζευξη του πεπτιδικού αναλόγου 3 με το ανάλογο της ανθρακινόνης 6 (σχήμα 40). Το ανάλογο 6 λαμβάνεται ξεκινώντας από την εμπορικά διαθέσιμη λευκοκουινιζαρίνη (σχήμα 40). Παρακάτω περιγράφεται σχηματικά η πορείας σύνθεσης του τελικού προϊόντος 7. O OH O HN NH Boc O HN NH Boc 1. H 2 N 2. [O] NH Boc + O leucoquinizarin OH O NH NH Boc 4a O OH 5a TFA/DCM CF 3 COO CF 3 COOH O HN NH 3 O HN NH 2 + CF 3 COO O OH 5 O NH NH 3 DMAP/DCC HO O S Trt 4 O HN H N O SH TFA/DCM/TES O HN H N O S Trt OH 6 O OH 6a DMSO, DIPEA SPDP - (Ahx) 6 MBP O H N O HN S S N (Ahx) 6 MBP H O 7 O OH Σχήμα 40: Συνθετική πορεία του συζεύγματος αναλόγου ανθρακινόνης-(ahx) 6 MBP Σ ε λ ί δ α

131 Αποτελέσματα Συζήτηση 2.Γ 2.1 Σύνθεση των αναλόγων 4 και 5 της ανθρακινόνης Για τη σύνθεση των αναλόγων 4 και 5 αρχικά αντέδρασε η Boc-βουτυλενοδιαμίνη με την λευκοκουινιζαρίνη. Ακολούθησε οξείδωση από τον ατμοσφαιρικό αέρα (αρωματοποίηση δακτυλίου, σχήμα 43). Ελήφθησαν 2 προϊόντα, το δι-υποκατεστημένο ανάλογο 4a και το μονο-υποκατεστημένο ανάλογο 5a σε αναλογία 1:1. Η πορεία της αντίδρασης ελέγχθηκε με αναλυτικό RP-HPLC και η ταυτοποίηση των ενδιάμεσων προϊόντων έγινε με ESI-MS και 1 Η-NMR (παράρτημα, σχήμα 58). Ακολούθησε απομάκρυνση της Boc-ομάδας με διάλυμα TFA/DCM (50/50, v/v). Τα 4 και 5 διαχωρίστηκαν με παρασκευαστικό RP-HPLC και ταυτοποιήθηκαν με ESI-MS. Ο έλεγχος της καθαρότητας του αναλόγου 5 έγινε με 1 Η-NMR. Παρακάτω παρατίθενται τα αναλυτικά RP-HPLC και ESI-MS των 4 και 5 (σχήμα 41), καθώς και το αναλυτικό RP-HPLC και το 1 Η-NMR του αναλόγου 5 μετά από καθαρισμό (σχήμα 42). 109 Σ ε λ ί δ α

132 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 41: (Α) Αναλυτικό RP-HPLC και (Β) ESI-MS των αναλόγων 4 και 5. Συνθήκες: 10%(Β) σε 30min 100%(Β), ροή: 1mL/min, [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0.08% (v/v)] t R (4)= min, t R (5)= min, Μ θεωρ. (4) = , Μ θεωρ. (5) = Σ ε λ ί δ α

133 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 42: Δεδομένα του αναλόγου 5 μετά από καθαρισμό. (Α) Αναλυτικό RP-HPLC. Συνθήκες: 10%(Β) σε 15min 100%(Β), ροή: 1mL/min, [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0.08% (v/v)], t R =9.408 min. (Β) 1 H-ΝΜR (400 ΜΗz, d 6 -DMSO): δ 1.70 (br m, 4 H, CH 2 ), 2.87 (br m, 2 H, CH2), 3.48 (q, 2 H, J = 5.8 Hz, CH 2 ), 7.39 (d, 1 H, J = 9.6 Hz, Ar), 7.55 (d, 1 H, J = 9.6 Hz, Ar), 7.73 (br s, 2 H, NH 2 ), 7.88 (dd, 1 H, J = 7.6, 7.2 Hz, Ar), 7.97 (dd, 1 H, J = 7.6, 7.2 Hz, Ar), 8.27 (d, 2 H, J = 7.6 Hz, Ar), (app t, 1 H, J = 5.2 Hz, NH), (s, 1 H, OH). Τα δύο ανάλογα, το δι-υποκατεστημένο 4a και το μονο-υποκατεστημένο 5a ελήφθησαν σε αναλογία 50/50. Η χαμηλή μετατροπή (50%) οφείλεται στην αναλογία των αντιδρώντων. Η Boc-βουτυλενοδιαμίνη ως προς την λευκοκουινιζαρίνη ήταν σε αναλογία 2:1 με αποτέλεσμα να ευνοηθεί η σύνθεση του αναλόγου 4a και τελικά να προκύψει η χαμηλή απόδοση (37.1%) ως προς το τελικό 111 Σ ε λ ί δ α

134 Αποτελέσματα Συζήτηση ανάλογο 5. Η αντίδραση με αναλογία 1:2 έδωσε σημαντικό καλύτερο αποτέλεσμα με τα δύο ανάλογα 4a και 5a να λαμβάνονται σε αναλογία 20/80 αντίστοιχα. Η αρωματοποίηση του δακτυλίου (οξείδωση) διαπιστώθηκε από τα φάσματα 1 H- NMR της αρχικής ένωσης, λευκοκουινιζαρίνη, και του αναλόγου 5a, όπου παρατηρείται μετατόπιση της κορυφής προς τα αριστερά (αρωματικά). Σχήμα 43: 1 H-ΝΜR (400 ΜΗz, d 6 -DMSO) (A) της λευκοκουινιζαρίνης, 3.11 (s, 4 H, CH 2 ), (m, 2 H, Ar), (m, 2 H, Ar), (s, 2 H, OH). (B) του αναλόγου 5a, δ 1.37 (s, 9 H, tbu), (m, 2 H, CH 2 ), (m, 2 H, CH 2 ), 2.98 (q, 2 H, J = 6.4 Hz, CH 2 ), 3.44 (q, 2 H, J = 6.4 Hz, CH 2 ), 6.87 (t, 1 H, J = 5.4 Hz, NH), 7.36 (d, 1 H, J = 9.8 Hz, Ar), 7.53 (d, 1 H, J = 9.8 Hz, Ar), (m, 2 H, Ar), 8.27 (dd, 2 H, J = 6.8, 6.4 Hz, Ar), (app t, 1 H, J = 4.4 Hz, NH), (br s, 1 H, OH). 112 Σ ε λ ί δ α

135 Αποτελέσματα Συζήτηση 2.Γ 2.2 Σύνθεση του αναλόγου 6 της ανθρακινόνης Για τη σύνθεση του αναλόγου 6 αντέδρασε η 1-(αµινοβουτυλαµινο)-4-υδροξυανθρακινόνη 5 με τριτυλο-θειοθειϊκό οξύ (Trt-TGA). Ο έλεγχος καθαρότητας και η ταυτοποίηση του αναλόγου 6a έγινε με αναλυτικό RP-HPLC, ESI-MS και 1 H-NMR (παράρτημα, σχήμα 59, 60). Δεν ακολούθησε περαιτέρω καθαρισμός του και στη συνέχεια απομακρύνθηκε η Trt ομάδα με διάλυμα TFA/DCM (94/3) και TES ως δεσμευτή κατιόντων. Ο καθαρισμός του αναλόγου 6 έγινε με παρασκευαστικό RP- HPLC. Ο έλεγχος της καθαρότητας έγινε με αναλυτικό RP-HPLC και η ταυτοποίηση του πραγματοποιήθηκε με ESI-MS και 1 H-NMR. Παρακάτω παρατίθενται το αναλυτικό RP-HPLC, ESI-MS του 6 (σχήμα 44), και 1 Η-NMR, 13 C-NMR (σχήμα 45), μετά από καθαρισμό. Σχήμα 44: (A) Αναλυτικό RP-HPLC και (B) ESI-MS του αναλόγου 6 μετά από καθαρισμό. Συνθήκες: 10%(Β) σε 15min 100%(Β), ροή: 1mL/min, [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0.08% (v/v)] t R = min, Μ θεωρ.= Σ ε λ ί δ α

136 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 45: (Α) 1 H-ΝΜR (400 ΜΗz, d6-cdcl 3 ) του αναλόγου 6 μετά από καθαρισμό, δ (m, 4 H, CH 2 ), (s, 1 H, SH), 3.32 (s, 2 H, CH 2 SH), (m, 4 H, CH 2 ), 7.07 (br s, 1 H, NH), (m, 3 H, NH, Ar), (m, 2 H, Ar), 8.30 (app t, 2 H, J = 7.2 Hz, Ar), (s, 1 H, OH). (Β) 13 C-NMR (100 ΜΗz, d6-cdcl 3 ) του αναλόγου 6 μετά από καθαρισμό (CH 2 ), 26.9 (CH 2 ), 28.1 (CH 2 SH), 39.7 (CH 2 NHBoc), 42.3 (CH 2 NHAr), (C Ar), (C Ar), 123.8, 126.4, 128.3, 129.1, 129.4, 132.6, 134.2, 135.2, (C Ar), (C Ar), (COCH 2 SH), (CO), (CO). 114 Σ ε λ ί δ α

137 Αποτελέσματα Συζήτηση 2.Γ 2.3 Σύνθεση του αναλόγου 7 της ανθρακινόνης Η σύζευξη του αναλόγου 6 της ανθρακινόνης με το ανάλογο SPDP-(Ahx) 6 MBP πραγματοποιήθηκε σε υγρή φάση. Ο καθαρισμός του προϊόντος 7 έγινε με ημιπαρασκευαστικό RP-HPLC και η ταυτοποίηση του πραγματοποιήθηκε με ESI-MS. Παρακάτω παρατίθενται το αναλυτικό RP-HPLC και ESI-MS του προϊόντος 7 (σχήμα 46), πριν και μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. 115 Σ ε λ ί δ α

138 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 46: Αναλυτικό RP-HPLC (Α) πριν και (Β) μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση, (Γ) ESI-MS του προϊόντος 7 μετά από καθαρισμό και λυοφιλοποίηση. Συνθήκες: 10%(Β) σε 15min 100%(Β), ροή: 1mL/min, [(B) διάλυμα TFA σε ACN 0.08% (v/v)] t R(Α) =9.948, t R(Β) =9.970 min, Μ θεωρ.= , (Μ+2Η + )/2= , (Μ+3Η + )/3=982.54, (Μ+4Η + )/4=737.16, (Μ+5Η + )/5= Στην αντίδραση αυτή παρατηρείται χαμηλή απόδοση του τελικού προϊόντος 7, 31.6%. Για τον λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε διερεύνηση ως προς τις διάφορες παραμέτρους της αντίδρασης, με βέλτιστες συνθήκες όμως αυτές που περιγράφονται στην πειραματική πορεία. Παρακάτω αναφέρονται οι τρόποι προσέγγισης για βελτιστοποίηση την απόδοσης. Διαλύτες Με τους διαλύτες DMF, ACN, DCM, και ακετόνη παρατηρήθηκαν προβλήματα διαλυτότητας είτε στην ανθρακινόνη είτε στο πεπτίδιο. Το THF οδήγησε πολύ χαμηλή απόδοση ~15%. H MeOH οδήγησε σε πολλά παραπροϊόντα ενώ τα καλύτερα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με EtOH και DMSO. Τελικά επιλέχθηκε το DMSO λόγω μεγαλύτερης απόδοσης και καθαρότερου HPLC. 116 Σ ε λ ί δ α

139 Αποτελέσματα Συζήτηση Αντιδραστήρια (αναλογία) Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε αναλογία 1.0, 1.2 και 1.3/1 αναλόγου 6 ανθρακινόνης/spdp-πεπτιδίου (ανάλογο 3). Η αναλογία 1.2/1 έδειξε τα καλύτερα αποτελέσματα ως προς τα εναπομείναντα αντιδρώντα. Χρόνος αντίδρασης Η αντίδραση ελέγθηκε με RP-HPLC σε 1, 3, 6 και 12 h. Σύμφωνα με τα χρωματογραφήματα, σε χρόνους 1, 3 και 12 h υπήρχαν κορυφές που δεν αντιστοιχούσαν στο προϊόν ή στα αντιδρώντα. Οι κορυφές αυτές πιθανώς να είναι ενδιάμεσο προϊόν, το διμερές της ανθρακινόνης ή κάποιο παραπροϊόν προερχόμενο από την ανθρακινόνη. Στις 6 h, παρατηρήθηκε η βέλτιστη εικόνα με κύρια κορυφή το επιθυμητό προϊόν. Θερμοκρασία Εξαιτίας του DMSO ως διαλύτη της αντίδρασης η αντίδραση θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί μόνο πάνω από το σημείο τήξης του, 19 C. Μεγαλύτερη θερμοκρασία δεν δοκιμάστηκε λόγω της αυξημένης πιθανότητας παραπροϊόντων. 117 Σ ε λ ί δ α

140 Αποτελέσματα Συζήτηση 3.Γ 3 Βιολογική αξιολόγηση 3.Γ 3.1 Μελέτη του ενδιάμεσου αναλόγου 5 στα κύτταρα HEK293 Το ανάλογο 5 είναι μία ενδιάμεση ένωση τύπου ανθρακινόνης στη συνθετική πορεία του προϊόντος 7, η οποία αξιολογήθηκε ως προς τον φθορισμό της και ως προς την επίδραση της στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό της καρκινικής σειράς HEK293. Συγκεκριμένα και όπως θα αναφερθούν στις ενότητες 3.Γ και 3.Γ μελετήθηκε η ιδιότητα της ανθρακινόνης ως αυτοφθορίζουσα ουσία ενώ προσδιορίστηκε και ο χρόνος που χρειάζεται προκειμένου η υπό μελέτη ένωση να εισέλθει στο κύτταρο. Επίσης, μελετήθηκε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός έπειτα από 48 h μετά από επεξεργασία των κυττάρων με το ανάλογο 5. Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο MTT ενώ προσδιορίστηκε το ήμισυ της συγκέντρωσης με την μέγιστη αναστολή (half maximal inhibitory concentration, IC 50 ). 3.Γ Έλεγχος φθορισμού Για τον έλεγχο αυτοφθορισμού του αναλόγου 5 χρησιμοποιήθηκε ανάστροφο μικροσκόπιο με φθορισμό. Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 10 μμ της υπό μελέτη ένωσης και έγινε παρατήρησή τους στο μικροσκόπιο 30 και 60 min μετά τη προσθήκη του στα κύτταρα. 118 Σ ε λ ί δ α

141 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 47: Παρατήρηση του φθορίζοντος αναλόγου 5 στα κύτταρα HEK293, σε χρονικές στιγμές 30 και 60 min. (A) μη επεξεργασμένα κύτταρα σε ορατή περιοχή, (Β) κύτταρα μετά από επεξεργασία με το ανάλογο 5 σε χρόνο t=0, (Γ) κύτταρα μετά από επεξεργασία με το ανάλογο 5 σε χρόνο t=30 min, κύτταρα μετά από επεξεργασία με το ανάλογο 5 σε χρόνο t=60 min. Χρησιμοποιήθηκε φακός 4x. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Στο σχήμα 47 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα του φθορισμού. Στην εικόνα Α φαίνονται τα κύτταρα στην ορατή περιοχή χωρίς να έχουν υποστεί επεξεργασία, και στις εικόνες Β, Γ και Δ τα κύτταρα μετά από επεξεργασία με το ανάλογο 5 σε χρονικές στιγμές 0, 30 και 60 min αντίστοιχα. Επιβεβαιώνεται ο αυτοφθορισμός του αναλόγου ανθρακινόνης καθώς υπάρχει φθορισμός στα κύτταρα στο κόκκινο ( nm). Παρατηρείται ότι στα 30 min η ανθρακινόνη έχει ήδη μπει στα κύτταρα και ο φθορισμός παραμένει σταθερός μέχρι και τα 60 min όπως φαίνεται από την εικόνα Δ. 3.Γ Έλεγχος επίδρασης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό - MTT cell proliferation assay Η μελέτη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο MTT όπως περιγράφηκε στην ενότητα 2.Γ 3.2. Στα κύτταρα HEK293 προστέθηκε το ανάλογο 5 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και 48 h μετά έγινε φωτομετρικός προσδιορισμός του αριθμού των κυττάρων. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν είναι 1, 10, 25 και 119 Σ ε λ ί δ α

142 O.D. Αποτελέσματα Συζήτηση 100 μμ. Η φωτομετρική ανάλυση έδειξε ότι το ανάλογο 5 σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερη του 10 μμ μείωσε τον πολλαπλασιασμό των HEK293 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, ενώ το IC 50 προσδιορίστηκε στα 9.4 μμ (σχήμα 48). 0,8 Ανάλογο 5 στα HEK κύτταρα IC 50 = 9.4 μm 0,6 0,4 0,2 0,0-0, LogC (μm) Σχήμα 48: Μελέτη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού έπειτα από 48 h μετά από επεξεργασία με το ανάλογο 5. Οι συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν είναι 1, 10, 25 και 100 μμ. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή της O.D. ± τυπικό σφάλμα και έχουν προκύψει από 3 ανεξάρτητα πειράματα. 3.Γ 3.2 Μελέτη του αναλόγου 7 στα κύτταρα Jurkat Το ανάλογο 7 είναι ένα σύζευγμα πεπτιδίου με μία τύπου ανθρακινόνης ένωση μέσω δισουλφιδικού δεσμού. Ο κορμός της ανθρακινόνης σχεδιάστηκε σύμφωνα με τη δομή της μιτοξανδρόνης η οποία χρησιμοποιείται στη θεραπεία της ΣΚΠ (Fox 2006) αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των μακροφάγων, των Τ και των Β κυττάρων ενώ συμβάλλει και στην επιλεκτική μείωση της έκκρισης κυτταροκινών όπως της IFN-γ και IL-10 (Morrissey et al. 2005). Στο μηχανισμό δράσης της μιτοξανδρόνης εμπλέκεται το πυρηνικό DNA (Krishnamoorthy et al. 1986). Το ανάλογο 7 αξιολογήθηκε ως προς τη βιολογική του δράση σε κύτταρα Jurkat, καθώς επίσης μελετήθηκε ο εντοπισμός του στα κύτταρα σε διάφορες χρονικές στιγμές μόνο του ή σε συνδυασμό με τη σισπλατίνη. Η σισπλατίνη είναι αναστολέας της αναγωγάσης της θειορεδοξίνης (Prast-Nielsen et al. 2010) και χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί ο ρόλος του δισουλφιδικού δεσμού στην 120 Σ ε λ ί δ α

143 Αποτελέσματα Συζήτηση επίδραση του αναλόγου 7 στα κύτταρα. Η ΣΚΠ ανήκει στις ρυθμιζόμενες από Τ κύτταρα αυτοάνοσες νόσους, για το λόγο αυτό η μελέτη πραγματοποιήθηκε στην ανθρώπινη καρκινική σειρά Τ λεμφοκυττάρων Jurkat. 3.Γ Ποιοτική ανάλυση με ανοσοφθορισμό για τον εντοπισμό του αναλόγου 7 στο κύτταρο Το ανάλογο 7 ως ανάλογο μιτοξανδρόνης, για να δράσει απαιτείται η είσοδος του στον πυρήνα του κυττάρου. Έπειτα από επεξεργασία των κυττάρων με την υπό μελέτη ένωση έγινε παρατήρηση τους στο μικροσκόπιο. Ο ανοσοφθορισμός δίνει τη δυνατότητα ελέγχου εντοπισμού ενός μορίου στο κυτταρόπλασμα ή στον πυρήνα του κυττάρου. Για τη σήμανση του πυρήνα χρησιμοποιήθηκε χρώση Hoechst (Latt et al. 1975). 121 Σ ε λ ί δ α

144 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 49: Ανοσοφθορισμός για την κυτταρική εντόπιση του αναλόγου 7, 10, 20 και 30 min μετά την προσθήκη του σε κύτταρα jurkat, παρουσία ή μη σισπλατίνης. Με κόκκινο παρατηρείται η ανθρακινόνη (ανάλογο 7) και με μπλε οι πυρήνες των κυττάρων. Ο φακός που χρησιμοποιήθηκε ήταν 63x με περαιτέρω μεγέθυνση 5x. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Σύμφωνα με το σχήμα 49, το ανάλογο 7 μετά από επώαση 10 min, εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Μετά το πέρας των 20 min φαίνεται να εισέρχεται στον πυρήνα και να παραμένει εκεί όπως φαίνεται μετά από επώαση στα 30 min. Σε μία δεύτερη σειρά πειραμάτων τα κύτταρα πριν επεξεργαστούν με το ανάλογο 7, είχαν επωαστεί με σισπλατίνη για 30 min. Το αποτέλεσμα δείχνει ότι η παρουσία σισπλατίνης απέτρεψε την είσοδο της ένωσης στα κύτταρα. Η σισπλατίνη, ως αναστολέας της αναγωγάσης της θειορεδοξίνης, εμποδίζει το ένζυμο να διασπάσει τον δισουλφιδικό δεσμό της ένωσης αποτρέποντας την είσοδο της στο κύτταρο. Έτσι, προτείνεται ότι στο κύτταρο 122 Σ ε λ ί δ α

145 -SH ομάδες/ 100 μg συνολικής πρωτεΐνης Αποτελέσματα Συζήτηση εισέρχεται το μέρος της ανθρακινόνης του αναλόγου 7 μέσω διάσπασης του δισουλφιδικού δεσμού. Στην επόμενη παράγραφο θα μελετηθεί η δράση του αναστολέα στα κύτταρα Jurkat με τη μέθοδο DTNB. 3.Γ Προσδιορισμός ελευθέρων σουλφυδρυλομάδων σε υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας Μέθοδος DTNB (Ellman's Reagent) Η ανίχνευση των ελευθέρων σουλφυδρυλομάδων πραγματοποιήθηκε προκειμένου να επιβεβαιωθεί η δράση της σισπλατίνης ως αναστολέας της αναγωγάσης της θειορεδοξίνης στα κύτταρα Jurkat τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση του αναλόγου 7. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε χρονικές στιγμές 10, 20, και 30 min μετά από επώαση των κυττάρων με το ανάλογο 3 απουσία και παρουσία του αναστολέα. Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκε το πεπτιδικό ανάλογο 3, λόγω προβλημάτων διαλυτότητας του αναλόγου 7 στις απαιτούμενες συγκεντρώσεις του πειράματος. Το πεπτιδικό ανάλογο 3 πρόκειται για το πεπτίδιο (Ahx) 6 MBP συζευγμένο με το SPDP στο οποίο υπάρχει δισουλφιδικός δεσμός. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο σχήμα 51 με τη μορφή διαγράμματος Κύτταρα Jurkat Μη επεξεργασμένα κύτταρα Ανάλογο 3 Ανάλογο 3 παρουσία σισπλατίνης Χρόνος (min) 30 Σχήμα 50: Γραφική παράσταση των SH ομάδων σε χρονικές στιγμές 10, 20, 30 min σε κύτταρα Jurkat: μη επεξεργασμένα (μαύρη γραμμή), παρουσία του αναλόγου 3 (κόκκινη γραμμή), παρουσία του πεπτιδίου με τον αναστολέα σισπλατίνη (μπλε γραμμή). Οι SH ομάδες εκφράζονται ως SH ομάδες/100 μg πρωτεΐνης ± τυπικό σφάλμα. Τα αποτελέσματα έχουν προκύψει από τρία ανεξάρτητα πειράματα. 123 Σ ε λ ί δ α

146 Αποτελέσματα Συζήτηση Σε χρόνο 10 min, στα Jurkat κύτταρα που δεν έχουν υποστεί καμία επεξεργασία, η συγκέντρωση των SH ομάδων είναι 8.3 μμ ±2.2 ενώ στα κύτταρα τα οποία έχουν υποστεί επεξεργασία με το ανάλογο 3 η συγκέντρωση των SH ομάδων αυξάνεται σε μμ ±9.1 (p= 0.005). Στα 20 min, στα Jurkat κύτταρα η συγκέντρωση των SH ομάδων παρουσία του αναλόγου 3 είναι 48.4 μμ ±3.6 ενώ όταν ίδια χρονική στιγμή η συγκέντρωση των SH ομάδων παρουσία και του αναλόγου 3 και του αναστολέα (σισπλατίνη) είναι 5.9 μμ ±0.9 (p= 0.007), περίπου δηλαδή όπως στα μη επεξεργασμένα κύτταρα (11.3 μμ ±1.2). Με βάση τα παραπάνω ο ρόλος του συστήματος της θειορεδοξίνης φαίνεται να παίζει ρόλο στην δράση των συντιθέμενων αναλόγων. 3.Γ Προσδιορισμός της απόπτωσης των κυττάρων μέσω ανίχνευσης της αποπτωτικής πρωτεΐνης BCL2 - Aνοσοαποτύπωση (Western Blot Analysis) Η BCL-2 είναι μια πρωτεΐνη kd που εντοπίζεται κυρίως στην εξωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων και έχει βρεθεί ότι συμβάλλει στη νεοπλασματική αύξηση, αναστέλλοντας την απόπτωση (Hockenbery et al. 1990). Έτσι, μειωμένη ανίχνευση της στα κύτταρα σηματοδοτεί απόπτωση. Σχήμα 51: (Α) Ανοσοαποτύπωση για ανίχνευση της πρωτεΐνης Bcl-2. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός μάρτυρας. Αντιπροσωπευτική εικόνα από 3 ανεξάρτητα πειράματα. Με τη χρήση ειδικού λογισμικού, οι εικόνες ποσοτικοποιήθηκαν δίνοντας το διάγραμμα (B) όπου φαίνεται η επίδραση του αναλόγου 7 στα επίπεδα της πρωτεΐνης Bcl-2 σε κύτταρα Jurkat. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως % αλλαγή ως προς τον μάρτυρα ± τυπικό σφάλμα. 124 Σ ε λ ί δ α

147 Αποτελέσματα Συζήτηση Κύτταρα Jurkat επωάστηκαν με τα ανάλογο 6, 7 και με μιτοξανδρόνη για 48 h. Ακολούθηκε λύση των κυττάρων και ανασοαποτύπωση για τον προσδιορισμό του επιπέδου της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2. Στο σχήμα 51 παρουσιάζονται τα αποτέλεσμα της ανάλυσης (Α) καθώς και η επί της εκατό μείωση της ως προς τα κύτταρα μάρτυρες (Β). Η μιτοξανδρόνη χρησιμοποιήθηκε ως ένωση αναφοράς γνωστή για την αποπτωτική της δράση (Bellosillo et al. 1998), προκαλώντας 50% μείωση των επιπέδων της Bcl-2. Το ανάλογο 6 πρόκειται για την ένωση τύπου μιτοξανδρόνης που συντέθηκε, η οποία φαίνεται να έχει επίδραση στα επίπεδα της Bcl-2 προκαλώντας μείωση 40%. Το υπό μελέτη ανάλογο 7 σύμφωνα με το διάγραμμα προκαλεί απόπτωση των κυττάρων καθώς μειώνει τα επίπεδα της Bcl-2 κατά 30%. 125 Σ ε λ ί δ α

148 Αποτελέσματα Συζήτηση 3.Δ Έκφραση και μερικός καθαρισμός της πρωτεΐνης HLA II DRB Σύμφωνα με τις οδηγίες του National Institute of Health Tetramer Core Facility, τα κύτταρα HEK293 έχουν μετασχηματιστεί με τον ιό Lentivirus ώστε να εκφράζουν συνεχώς την HLA II DRB1-1501, η οποία περιέχει μία αλληλουχία πολυϊστιδίνης (Naldini et al. 1996; Wurm 2004). H πρωτεΐνη εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο στο οποίο καλλιεργείται το οποίο συλλέγεται μετά από εφτά ημέρες επώασης των κυττάρων. 3.Δ 1 Μεταλλοχηλική (Ni 2+ ) χρωματογραφία Τα έξι ιστιδινικά κατάλοιπα που εμπεριέχονται στην HLA II DRB σχηματίζουν σταθερά σύμπλοκα με το Ni 2+ το οποίο είναι ακινητοποιημένο στη στήλη. Η έκλουση της HLA II DRB επιτυγχάνεται με την προσθήκη αυξημένης συγκέντρωσης ιμιδαζολίου 50 mm έως 2 M (Majera et al. 2012). Ακολουθεί ανάλυση των κλασμάτων για ταυτοποίηση της επιθυμητής πρωτεΐνης. Αρχικά, πραγματοποιείται ολική κατακρήμνιση πρωτεϊνών με TCA και NaDOC. Στη συνέχεια το κυτταρικό ίζημα επεξεργάζεται ενζυμικά με endoh για απογλυκοζιδίωση της πρωτεΐνης HLA II DRB Η απογλυκοζιδίωση της πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε σε περίπτωση στερεοχημικής παρεμπόδισης επιτόπου της πρωτεΐνης και για να ληφθεί η ζώνη της πρωτεΐνης εντοπισμένη στην πιθανότητα αποτύπωσης ως διάχυση. Μετά από ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων ακολούθησε χρώση της πηκτής με Coomassie Brilliant Blue καθώς και ανοσοαποτύπωση Western. Στην ανάλυση κατά Western η ταυτοποίηση πραγματοποιήθηκε με αντίσωμα για τα ιστιδινά κατάλοιπα της πρωτεΐνης (σχήμα 52), και οι ζώνες στην πηκτή με θετική χρώση Coomassie Brilliant Blue (σχήμα 53) και παραπλήσιο μοριακό βάρος με την πρωτεΐνη HLA II DRB στάλθηκαν για ταυτοποίηση με φασματομετρία μάζας (MALDI) στο ΙΙΒΕΑΑ. 126 Σ ε λ ί δ α

149 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 52: Ανοσοαποτύπωση για ανίχνευση της HLA II DRB πρωτεΐνης. (Α) Διαδρομή 1: έκλουσμα 50 mm ιμιδαζόλης, Διαδρομή 2: έκλουσμα 50 mm ιμιδαζόλης με ενζυμική κατεργασία, Διαδρομή 3: έκλουσμα 100 mm ιμιδαζόλης, Διαδρομή 4: έκλουσμα 100 mm ιμιδαζόλης με ενζυμική κατεργασία, Διαδρομή 5: έκλουσμα 150 mm ιμιδαζόλης, Διαδρομή 6: έκλουσμα 150 mm ιμιδαζόλης με ενζυμική κατεργασία. (Β) Διαδρομή 1: έκλουσμα 200 mm ιμιδαζόλης, Διαδρομή 2: έκλουσμα 200 mm ιμιδαζόλης με ενζυμική κατεργασία, Διαδρομή 3: έκλουσμα 500 mm ιμιδαζόλης, Διαδρομή 4: έκλουσμα 500 mm ιμιδαζόλης με ενζυμική κατεργασία, Διαδρομή 5: υπερκείμενο, Διαδρομή 6: υπερκείμενο με ενζυμική κατεργασία. Σχήμα 53: Πηκτή με χρώση Coomassie Brilliant Blue για ανίχνευση της HLA II DRB πρωτεΐνης. (Α) Διαδρομή 1: έκλουσμα 50 mm ιμιδαζόλης, Διαδρομή 2: έκλουσμα 50 mm ιμιδαζόλης με ενζυμική κατεργασία, Διαδρομή 3: έκλουσμα 100 mm ιμιδαζόλης, Διαδρομή 4: έκλουσμα 100 mm ιμιδαζόλης με ενζυμική κατεργασία, Διαδρομή 5: έκλουσμα 150 mm ιμιδαζόλης, Διαδρομή 6: έκλουσμα 150 mm ιμιδαζόλης με ενζυμική κατεργασία. (Β) Διαδρομή 1: έκλουσμα 200 mm ιμιδαζόλης, Διαδρομή 2: έκλουσμα 200 mm ιμιδαζόλης με ενζυμική κατεργασία, Διαδρομή 3: έκλουσμα 500 mm ιμιδαζόλης, Διαδρομή 4: έκλουσμα 500 mm ιμιδαζόλης με ενζυμική κατεργασία, Διαδρομή 5: υπερκείμενο, Διαδρομή 6: υπερκείμενο με ενζυμική κατεργασία. 127 Σ ε λ ί δ α

150 Αποτελέσματα Συζήτηση Από τα σχήματα 52 και 53 ανιχνεύονται οι ζώνες της επιθυμητής πρωτεΐνης στα ~34 kda στις διαδρομές 3-6, οι οποίες αντιστοιχούν στα κλάσματα 100 και 150 mm ιμιδαζόλης. Παρόλα αυτά παρατηρείται ότι ο καθαρισμός δεν πραγματοποιήθηκε πλήρως καθώς ανιχνεύονται και άλλες πρωτεΐνες (διαδρομές 3-6). Επίσης, παρατηρείται ότι τα δείγματα δεν επηρεάστηκαν από την γλυκοζιδάση H. Η EndoH είναι μία ανασυνδυασμένη γλυκοζιδάση η οποία διασπά μεγάλες αλληλουχίες μανόζης και ολιγοσακχαρίτες, από γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες. Επιλεκτικά κάποιες ζώνες της πηκτές (σχήμα 53, spots1-6) συλλέχθηκαν και στάλθηκαν για ταυτοποίηση στο ΙΒΒΕΑ, με φασματομετρία μάζας βιομορίων (MALDI). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα 12. Τα κλάσματα των 100 και 150 mm ιμιδαζόλης στα οποία και διαπιστώθηκε η πρωτεΐνη HLA II ενώθηκαν και ακολούθησε συμπύκνωση έως ~2 ml. Ακολούθησε περαιτέρω καθαρισμός του πρωτεϊνικού διαλύματος. Πίνακας 12: Φύλλο εργασίας του Microsoft Office Excel. Ταυτοποίηση HLA II. Δεδομένα από το ΙΒΕΕΑ. Title Accession Comment MS Coverage Protein MW Status pi-value ************ ************ ******** *********** ********** ******* ******* Zinc finger imprinted 3 OS=Homo sapiens GN=ZIM3 PE=2 SV=1 ZIM3_HUMAN Spot Uncertain 10.3 Erythroid differentiation-related factor 1 OS=Homo sapiens G EDRF1_HUMAN Spot Uncertain 5.9 Carbonic anhydrase 2 OS=Homo sapiens GN=CA2 PE=1 SV=2 CAH2_HUMAN Spot Identified 7 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-15 beta chain 2B1F_HUMAN Spot Identified 8.9 HLA class II histocompatibility antigen, DR alpha chain OS=H DRA_HUMAN Keratin, type I cytoskeletal 16 OS=Homo sapiens GN=KRT16 PE= K1C16_HUMAN Spot Identified 4.8 Keratin, type II cytoskeletal 1 OS=Homo sapiens GN=KRT1 PE=1 K2C1_HUMAN HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-15 beta chain 2B1F_HUMAN Spot Identified 8.9 HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-16 beta chain 2B1G_HUMAN Δ 2 Κατόπιν κατακρήμνισης με θειικό αμμώνιο Σε όγκο 0.1 ml του πρωτεϊνικού διαλύματος, από τον πρώτο καθαρισμό, προστίθεται σταδιακά (NH 4 ) 2 SO 4 για κατακρήμνιση των πρωτεϊνών. Τα δείγματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE (πηκτή 10 %) και χρώση της πηκτής με νιτρικό άργυρο (σχήμα 54). Σύμφωνα με το σχήμα 54 Α, οι πρωτεΐνες άρχισαν να κατακρημνίζονται από 30% (NH 4 ) 2 SO 4. Σε 50% και 75% φαίνεται να μην υπάρχουν πρωτεΐνες στο υπερκείμενο και η επιθυμητή πρωτεΐνη να ανιχνεύεται στο κυτταρικό ίζημα στα ~34 kda. Σε 50% φαίνεται να υπάρχει το καλύτερο αποτέλεσμα, παρόλα αυτά η επιθυμητή πρωτεΐνη συνυπάρχει στο κυτταρικό ίζημα με άλλες πρωτεΐνες μοριακού βάρους ~60 kda και ~26 kda. Ακολούθησε κατακρήμνιση με κορεσμό 50% στο πρωτεϊνικό διάλυμα (σχήμα 54 Β), απόχυση του κυτταρικού εκχυλίσματος και επαναδιάλυση του κυτταρικού 128 Σ ε λ ί δ α

151 Αποτελέσματα Συζήτηση ιζήματος με ρυθμιστικό διάλυμα 20 mm Τris-HCl, 200 mμ KCl, 1 mm EDTA, ph 8.0. Ακολούθησε περαιτέρω καθαρισμός του πρωτεϊνικού διαλύματος. Σχήμα 54: Κατακρήμνιση πρωτεϊνών με θειικό αμμώνιο. (Α) κατακρήμνιση σε κορεσμούς 10-90%. Διαδρομή 1: υπερκείμενο από 10% κορεσμό, Διαδρομή 2: ίζημα από 10% κορεσμό, Διαδρομή 3: υπερκείμενο από 20% κορεσμό, Διαδρομή 4: ίζημα από 20% κορεσμό, Διαδρομή 5: υπερκείμενο από 30% κορεσμό, Διαδρομή 6: ίζημα από 30% κορεσμό, Διαδρομή 7: υπερκείμενο από 40% κορεσμό, Διαδρομή 8: ίζημα από 40% κορεσμό, Διαδρομή 9: υπερκείμενο από 50% κορεσμό, Διαδρομή 10: ίζημα από 50% κορεσμό, Διαδρομή 11: υπερκείμενο από 75% κορεσμό, Διαδρομή 12: ίζημα από 75% κορεσμό, Διαδρομή 13: υπερκείμενο από 90% κορεσμό, Διαδρομή 14: ίζημα από 90% κορεσμό, (Β) κατακρήμνιση πρωτεϊνικού διαλύματος με 50% θειϊκό αμμώνιο. Διαδρομή 1: υπερκείμενο, Διαδρομή 3: ίζημα, Διαδρομή 5: πρωτεϊνικό διάλυμα αναφοράς. 3.Δ 3 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Στο τέλος του καθαρισμού πραγματοποιήθηκε στήλη μοριακής διήθησης με ροή έκλουσης 0.1 ml/min και συλλέγονται κλάσματα ανά 3 ml στους 4 ºC. Τα κλάσματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE (πηκτή 10 %) και χρώση της πηκτής με νιτρικό άργυρο (σχήμα 55). Η πρωτεΐνη αρχίζει να εκλούεται από τη στήλη μετά τα από 31 κλάσματα και ανιχνεύεται έως και το κλάσμα Σ ε λ ί δ α

152 Αποτελέσματα Συζήτηση Σχήμα 55: Πηκτή με χρώση αργύρου για ανίχνευση της HLA II DRB πρωτεΐνης. Στις διαδρομές 1-13 έχουν φορτωθεί τα κλάσματα αντίστοιχα. Η πρωτεΐνη ανιχνεύεται στα ~34 kda στα κλάσματα 31 έως 42 (διαδρομές 2-12). Πιο έντονη ζώνη παρατηρείται στα κλάσματα (διαδρομές 8-11). Διαπιστώνεται ότι η πρωτεΐνη σε κανένα από τα 4 κλάσματα δεν υπάρχει καθαρή καθώς ανιχνεύονται επίσης πρωτεΐνες μοριακού βάρους ~55 kda και ~26 kda. Από όλα τα παραπάνω προκύπτει ότι δεν επιτεύχθηκε διαχωρισμός της επιθυμητής πρωτεΐνης με τις τεχνικές που ακολουθήθηκαν. 130 Σ ε λ ί δ α

153 Αποτελέσματα Συζήτηση 3.Ε Συγγένεια πρόσδεσης της πρωτεΐνης HLA II με το ανάλογο 7 Το σύζευγμα ανθρακινόνη-(ahx) 6 MBP (ανάλογο 7) μελετήθηκε ως προς την ικανότητα πρόσδεσης του με την πρωτεΐνη τάξης II και συγκεκριμένα με τα αλλήλια DRB και DRB (σχήμα 56). Πεπτίδια αναφοράς χρησιμοποιήθηκαν i) ο επίτοπος MBP (Gauthier et al. 1998) και ii) το πεπτίδιο (Ahx) 6 MBP (ανάλογο 2). Η μελέτη πρόσδεσης πραγματοποιήθηκε από τον Καθηγητή Bjarke και την ομάδα του στο Rigshospitalet, Institut for Inflammationsforskning στο Πανεπιστήμιο της Κοπεγχάγης. Σχήμα 56: Διάγραμμα συγγένειας πρόσδεσης με την πρωτεΐνη HLA II DRB Αντιπροσωπευτική εικόνα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Το ανάλογο 7 αντιστοιχεί στην πορτοκαλί γραμμή και αναφέρεται ως Analogue 1, το πεπτίδιο (Ahx) 6 MBP αντιστοιχεί στη μωβ γραμμή και αναφέρεται ως Control-Linker peptide και το πεπτίδιο MBP αντιστοιχεί στη γαλάζια γραμμή και αναφέρεται ως Control peptide. Τα αναφερόμενα ως Analogues 2, 3, 4 δεν αποτελούν μέρος της παρούσας διατριβής. 131 Σ ε λ ί δ α

154 Αποτελέσματα Συζήτηση 7 7 Σχήμα 57: Διάγραμμα συγγένειας πρόσδεσης με την πρωτεΐνη (Α) HLA II DRB και (Β) HLA II DRB Αντιπροσωπευτική εικόνα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Το ανάλογο 7 αντιστοιχεί στο τετράγωνο, το πεπτίδιο (Ahx) 6 MBP αντιστοιχεί στο τρίγωνο και το πεπτίδιο MBP αντιστοιχεί στον κύκλο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πειραμάτων πρόσδεσης για το ανάλογο 2, το οποίο περιέχει στο Ν τελικό άκρο του επίτοπο MBP έξι μόρια του μη πρωτεϊνικού αμινοξέος αμινοεξανοϊκού, δεν επηρεάζεται η πρόσδεση του στον HLA II DRB1-1501, ενώ μειώνεται η ικανότητα πρόσδεσης στο HLA II DRB κατά τέσσερις φορές. Η προσθήκη της ανθρακινόνης στο ανάλογο 2 μειώνει την ικανότητα πρόσδεσης με τον υποδοχέα HLA II DRB κατά 4.3 φορές, αλλά παραμένει σε ιδιαίτερα ικανοποιητικά επίπεδα. Αντίθετα, είναι σημαντική η μείωση της ικανότητας πρόσδεσης με τον υποδοχέα HLA II DRB (μείωση 33.3 φορές). Πίνακας 13: Τιμές IC 50 των πεπτιδίων για τα αλλήλια DRB και DRB Οι τιμές εκφράζονται σε nm. Ανάλογα DRB DRB Anthraquinone-(Ahx) 6 MBP (Ahx) 6 MBP MBP Τα αποτελέσματα πρόσδεσης του αναλόγου 7 με τον υποδοχέα HLA II DRB αποδεικνύουν ότι το ανάλογο δύναται να χρησιμοποιηθεί για ενσωμάτωση του στο τετραμερές της HLA II DRB πρωτεΐνης (Bischof et al. 2004; Mantzourani et al. 2005). Επίσης, θα πρέπει να τονιστεί ότι η προσθήκη στο Ν τελικό άκρο του επιτόπου MBP ενός εξαπεπτιδίου καθώς και ενός μορίου ανθρακινόνης συζευγμένο με 132 Σ ε λ ί δ α

155 Αποτελέσματα Συζήτηση δισουλφιδικό δεσμό δεν προκαλεί ιδιαίτερο πρόβλημα στην πρόσδεση του πεπτιδίου με την πρωτεΐνη HLA II DRB Αντίθετα, φαίνεται να επηρεάζει αρνητικά την πρόσδεση με την πρωτεΐνη HLA II DRB Τα αποτελέσματα των πειραμάτων πρόσδεσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν γενικότερα για το σχεδιασμό και άλλων αναλόγων τα οποία εκτός του επιτόπου MBP θα φέρουν ομάδες, πιθανώς λιπόφιλες, στο Ν τελικό τους άκρο, καθώς φαίνεται πως η προσθήκη αυτών των ομάδων δεν επηρεάζει τη δυνατότητα πρόσδεσης τους με την πρωτεΐνη HLA II DRB Σ ε λ ί δ α

156 134 Σ ε λ ί δ α

157 4. Συμπεράσματα

158

159 Συμπεράσματα Τα τελικά συμπεράσματα για τις δύο προσεγγίσεις που μελετήθηκαν και προκύπτουν από την συζήτηση των αποτελεσμάτων, αναφέρονται επιγραμματικά παρακάτω. Α. Σύζευγμα μαννάνης-πεπτιδίου Η σύζευξη του πολυσακχαρίτη μαννάνη (πολυμανόζη) με τους ανοσοκυρίαρχους επιτόπους της μυελίνης του πίνακα 11 πραγματοποιήθηκε με επιτυχία, σύμφωνα με το γενικό πρωτόκολλο που περιγράφηκε. Συγκεκριμένα, για πλήρη σύζευξη των αντιδρώντων χρησιμοποιείται 1 mg πεπτιδίου στα 2 ml καθαρής οξειδωμένης μαννάνης (~10.5 mg) και η αντίδραση πραγματοποιείται σε ~48 h ενώ έχει ολοκληρωθεί κατά 50% τις πρώτες 6 h (όπως πιστοποιήθηκε με SDS-PAGE). Η σύζευξη των πεπτιδίων στη μαννάνη πραγματοποιείται μέσω δημιουργίας βάσεων Schiff, όπου οι αλδεΰδες της οξειδωμένης μορφής του πολυσακχαρίτη αντιδρούν με τις αμινομάδες του καταλοίπου της λυσίνης, που υπάρχουν στη γέφυρα [KG] 5. Βρέθηκε ότι η γέφυρα [KG] 5 έχει το κατάλληλο μήκος για πλήρη σύζευξη του πεπτιδίου με τον πολυσακχαρίτη. Για τον έλεγχο του συζεύγματος η tricine SDS-PAGE αποδείχτηκε επιτυχής μέθοδος για την ανίχνευση του συζεύγματος, του ελεύθερου πεπτιδίου που πιθανώς να υπάρχει (Coomassie Brilliant Blue) και των ελεύθερων αλδεϋδομάδων στην μαννάνη (PAS). Η μείωση του αριθμού των αλδεϋδομάδων μετά την αντίδραση σύζευξης μετρήθηκε επίσης με χρωματομετρία μετά από αντίδραση με DNPH. Το όριο ανίχνευσης της αναπτυχθείσας SDS-PAGE με χρώση Coomassie Brilliant Blue είναι 37.5 ng πεπτιδίου, δηλαδή δύναται να προσδιοριστεί το ~99.9% του πεπτιδίου που έχει συζευχθεί με μαννάνη Στην παρούσα μελέτη, η χρώση αργύρου βρέθηκε να έχει μικρότερη ευαισθησία (75 ng) σε σχέση με την Coomassie Brilliant Blue. Η σταθερότητα του συζεύγματος Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Pro 42 ) μελετήθηκε σε χρονική διάρκεια δύο χρόνων στους 25, 4 και -20 o C. Σε χρονική διάρκεια έξι μηνών, το σύζευγμα το οποίο παρέμεινε στους 25 o C δεν παραμένει σταθερό. Τα συζεύγματα στους 4 o C και -20 o C παραμένουν σταθερά έως και δύο χρόνια. 137 Σ ε λ ί δ α

160 Συμπεράσματα Τα ανάλογα του πίνακα 11 αξιολογήθηκαν για την in vivo και in vitro βιολογική τους δράση. Συγκεκριμένα για το ανάλογο Mannan oxidized -[KG] 5 MOG (Ser 42 ) πραγματοποιήθηκε εκτενής βιολογική αξιολόγηση. Το εν λόγω ανάλογο ανέστειλε την εμφάνιση συμπτωμάτων της νόσου όταν χρησιμοποιήθηκε για θεραπευτική και προληπτική χορήγηση στο χρόνιο ΕΑΕ καθώς και σε HLA διαγονιδιακά ανθρωπόμορφα πειραματόζωα. Επιπλέον, για το ανάλογο Mannan oxidized - [KG] 5 MOG (Pro 42 ) πραγματοποιήθηκαν μελέτες τοξικότητας. Δεν παρατηρήθηκαν τοξικολογικά ευρήματα τα οποία να καθιστούν το ανάλογο επικίνδυνο για in vivo χορήγηση. Β. Σύζευγμα ανθρακινόνης-πεπτιδίου Η σύνθεση του συζεύγματος ανθρακινόνης-πεπτιδίου πραγματοποιήθηκε με επιτυχία. Η απόδοσης του τελικού προϊόντος κυμάνθηκε στο ~30%. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι η διαλυτότητα του συζεύγματος σε υδατικά διαλύματα μειώνεται σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες του 1 mm. Το σύζευγμα καθώς και η συντιθέμενη ανθρακινόνη, αποδείχτηκε πως έχουν αποπτωτική δράση στα κύτταρα Jurkat. Από τα πειράματα ανοσοφθορισμού, επιβεβαιώνεται ότι η ανθρακινόνη του συζεύγματος έχει δράση στο πυρήνα καθώς αρχικά εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων ενώ μετά από 20 min εισέρχεται στον πυρήνα. Ο ρόλος του συστήματος της θειορεδοξίνης φαίνεται να εμπλέκεται στην είσοδο της ανθρακινόνης του συζεύγματος στα κύτταρα, καθώς πιθανώς ανάγει τον δισουλφιδικό δεσμό ελευθερώνοντας την ανθρακινόνη. Η παρουσία της σισπλατίνης (αναστολέα της αναγωγάσης) αποτρέπει την είσοδο της ένωσης στα κύτταρα, πιθανώς εμποδίζοντας την αναγωγή του δισουλφιδικού δεσμού από το ένζυμο. Η μέτρηση των ελεύθερων θειολομάδων, παρουσία και απουσία σισπλατίνης, στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων επαληθεύει τον ρόλο που ενδεχομένως να έχει το σύστημα της θειορεδοξίνης στην δράση των συντιθέμενων αναλόγων καθώς απουσία αναστολέα παρατηρείται αύξηση των θειολομάδων. 138 Σ ε λ ί δ α

161 Συμπεράσματα Η έκφραση της πρωτεΐνης HLA II DRB πραγματοποιήθηκε με επιτυχία από τα κύτταρα HEK293 τα οποία είχαν τροποποιηθεί προκειμένου να υπερεκφράζουν την επιθυμητή πρωτεΐνη. Πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση της πρωτεΐνης αλλά δεν επιτεύχθηκε πλήρως ο καθαρισμός της. Η μελέτη συγγένειας πρόσδεσης του συζεύγματος με την HLA II DRB και HLA II DRB πραγματοποιήθηκε στο Rigshospitalet IIR. Το IC 50 του συζεύγματος στην πρωτεΐνη HLA II DRB προσδιορίστηκε στα 56 nm, καθώς το πεπτίδιο αναφοράς, MBP έχει IC 50 = 13 nm. Το αποτέλεσμα επιβεβαιώνει ότι είναι πιθανή η χρησιμοποίηση του αναλόγου 7 για ενσωμάτωση στο τετραμερές της πρωτεΐνης HLA II DRB Το σύζευγμα του πεπτιδίου με την ανθρακινόνη και τα τετραμερή που δύναται να αναπτυχθούν, θα χρησιμοποιηθούν σε in vivo και in vitro πειράματα. 139 Σ ε λ ί δ α

162 140 Σ ε λ ί δ α

163 5. Βιβλιογραφία

164

165 Βιβλιογραφία Alcaro, M. C. and A. M. Papini (2006). "Contribution of peptides to multiple sclerosis research." Biopolymers 84(4): Aletras, A. et al., (1995). "Preparation of the Very Acid-Sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-Oh - Application in the Synthesis of Side-Chain to Side-Chain Cyclic-Peptides and Oligolysine Cores Suitable for the Solid-Phase Assembly of Maps and Tasps." International Journal of Peptide and Protein Research 45(5): Anagnostouli, M. et al., (2014). "HLA-DRB1 15:01 and Epstein-Barr virus in a multiple sclerosis patient with psoriasis, nasopharyngeal and breast cancers. Lessons for possible hidden links for autoimmunity and cancer." J Neurol Sci 339(1-2): Anagnostouli, M. C. et al., (2014). "HLA-DRB1* Allele Frequencies in Pediatric, Adolescent and Adult-Onset Multiple Sclerosis Patients, in a Hellenic Sample. Evidence for New and Established Associations." J. Mult. Scler. 1(1): 1-8. Anderton, S. M. et al., (2001). "Negative selection during the peripheral immune response to antigen." J Exp Med 193(1): Apostolopoulos, V. et al., (2000). "Ex vivo targeting of the macrophage mannose receptor generates anti-tumor CTL responses." Vaccine 18(27): Apostolopoulos, V. et al., (2000). "Aldehyde-mannan antigen complexes target the MHC class I antigen-presentation pathway." Eur J Immunol 30(6): Apostolopoulos, V. et al., (1995). "Oxidative/reductive conjugation of mannan to antigen selects for T1 or T2 immune responses." Proc Natl Acad Sci U S A 92(22): Apostolopoulos, V. et al., (2006). "Pilot phase III immunotherapy study in early-stage breast cancer patients using oxidized mannan-muc1 [ISRCTN ]." Breast Cancer Res 8(3): R27. Arimilli, S. et al., (1999). "Peptide binding inhibits aggregation of soluble MHC class II in solution." IUBMB Life 48(5): Artemiadis, A. K. and M. C. Anagnostouli (2010). "Apoptosis of oligodendrocytes and posttranslational modifications of myelin basic protein in multiple sclerosis: possible role for the early stages of multiple sclerosis." Eur Neurol 63(2): Σ ε λ ί δ α

166 Βιβλιογραφία Bardi, J. (2011). "Major Genetic Study of Multiple Sclerosis Reveals DNA Hot Spots of Disease Susceptibility." from Barlos, K. et al., (1991). "2-Chlorotrityl chloride resin. Studies on anchoring of Fmoc-amino acids and peptide cleavage." Int J Pept Protein Res 37(6): Barlos, K. et al., (1996). "Synthesis of the very acid-sensitive Fmoc-Cys(Mmt)-OH and its application in solid-phase peptide synthesis." Int J Pept Protein Res 47(3): Barlos, K. et al., (1989). "Synthesis of Protected Peptide-Fragments Using Substituted Triphenylmethyl Resins." Tetrahedron Letters 30(30): Barlos, K. et al., (1989). "Esterification of Partially Protected Peptide-Fragments with Resins - Utilization of 2-Chlorotritylchloride for Synthesis of Leu-15-Gastrin-I." Tetrahedron Letters 30(30): Barlos, K. et al., (1998). "Fmoc/Trt-amino acids: comparison to Fmoc/tBu-amino acids in peptide synthesis." J Pept Res 51(3): Bellosillo, B. et al., (1998). "Mitoxantrone, a topoisomerase II inhibitor, induces apoptosis of B- chronic lymphocytic leukaemia cells." Br J Haematol 100(1): Bensadoun, A. and D. Weinstein (1976). "Assay of proteins in the presence of interfering materials." Anal Biochem 70(1): Bielekova, B. et al., (2000). "Encephalitogenic potential of the myelin basic protein peptide (amino acids 83-99) in multiple sclerosis: results of a phase II clinical trial with an altered peptide ligand." Nat Med 6(10): Bischof, F. et al., (2004). "Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers." J Immunol 172(5): Bollhagen, R. et al., (1994). "A New Reagent for the Cleavage of Fully Protected Peptides Synthesized on 2-Chlorotrityl Chloride Resin." Journal of the Chemical Society-Chemical Communications(22): Bonner, P. L. R. (2007). Protein purification. New York ; Abingdon, UK, Taylor & Francis. 144 Σ ε λ ί δ α

167 Βιβλιογραφία Bozikas, V. P. et al., (2003). "Familial bipolar disorder and multiple sclerosis: a threegeneration HLA family study." Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 27(5): Burudi, E. M. et al., (1999). "Identification and functional characterization of the mannose receptor in astrocytes." Glia 25(1): Callahan, F. M. et al., (1963). "The Tertiary Butyl Group as a Blocking Agent for Hydroxyl, Sulfhydryl and Amido Functions in Peptide Synthesis." J Am Chem Soc 85: Capranico, G. et al., (1993). "Similar sequence specificity of mitoxantrone and VM-26 stimulation of in vitro DNA cleavage by mammalian DNA topoisomerase II." Biochemistry 32(12): Carpino, L. A. (1993). "1-Hydroxy-7-Azabenzotriazole - an Efficient Peptide Coupling Additive." Journal of the American Chemical Society 115(10): Carpino, L. A. and G. Y. Han (1970). "9-Fluorenylmethoxycarbonyl Function, a New Base- Sensitive Amino-Protecting Group." J Am Chem Soc 92(19): 5748-&. Carpino, L. A. and G. Y. Han (1972). "9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group." Journal of Organic Chemistry 37(22): 3404-&. Carpino, L. A. et al., (1993). "The 2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-Sulfonyl Group (Pbf) as Arginine Side-Chain Protectant." Tetrahedron Letters 34(49): Cawley, T. N. and C. E. Ballou (1972). "Identification of two Saccharomyces cerevisiae cell wall mannan chemotypes." J Bacteriol 111(3): Chang, C. D. et al., (1980). "Preparation and Properties of N-Alpha-9- Fluorenylmethyloxycarbonylamino Acids Bearing Tert-Butyl Side-Chain Protection." International Journal of Peptide and Protein Research 15(1): Collet, J. F. and J. Messens (2010). "Structure, function, and mechanism of thioredoxin proteins." Antioxid Redox Signal 13(8): Compston, A. and A. Coles (2008). "Multiple sclerosis." Lancet 372(9648): Constantin, C. M. et al., (2002). "Major histocompatibility complex (MHC) tetramer technology: an evaluation." Biol Res Nurs 4(2): Cudic, M. and G. B. Fields (2008). Molecular Biomethods Handbook. 145 Σ ε λ ί δ α

168 Βιβλιογραφία Day, S. et al., (2015). "Mannosylated Linear and Cyclic Single Amino Acid Mutant Peptides Using a Small 10 Amino Acid Linker Constitute Promising Candidates Against Multiple Sclerosis." Front Immunol 6: 136. Doerner, K. C. and B. A. White (1990). "Detection of glycoproteins separated by nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis using the periodic acid-schiff stain." Anal Biochem 187(1): Duong-Ly, K. C. and S. B. Gabelli (2014). "Salting out of proteins using ammonium sulfate precipitation." Methods Enzymol 541: Edward, R. (2009). "Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells." Mol Cells 27(4): Ellman, G. L. (1959). "Tissue sulfhydryl groups." Arch Biochem Biophys 82(1): Fosgerau, K. and T. Hoffmann (2015). "Peptide therapeutics: current status and future directions." Drug Discov Today 20(1): Fox, E. J. (2006). "Management of worsening multiple sclerosis with mitoxantrone: a review." Clin Ther 28(4): Frohman, E. M. et al., (2006). "Multiple sclerosis--the plaque and its pathogenesis." N Engl J Med 354(9): Gaberc-Porekar, V. and V. Menart (2001). "Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography." J Biochem Biophys Methods 49(1-3): Gautam, A. M. et al., (1992). "A polyalanine peptide with only five native myelin basic protein residues induces autoimmune encephalomyelitis." J Exp Med 176(2): Gauthier, L. et al., (1998). "Expression and crystallization of the complex of HLA-DR2 (DRA, DRB1*1501) and an immunodominant peptide of human myelin basic protein." Proc Natl Acad Sci U S A 95(20): Georgiou, C. D. et al., (2008). "Mechanism of Coomassie brilliant blue G-250 binding to proteins: a hydrophobic assay for nanogram quantities of proteins." Anal Bioanal Chem 391(1): Goldenberg, M. M. (2012). "Multiple sclerosis review." P T 37(3): Σ ε λ ί δ α

169 Βιβλιογραφία Gran, B. et al., (2002). "IL-12p35-deficient mice are susceptible to experimental autoimmune encephalomyelitis: evidence for redundancy in the IL-12 system in the induction of central nervous system autoimmune demyelination." J Immunol 169(12): Greene, M. T. et al., (2008). "Differential induction of experimental autoimmune encephalomyelitis by myelin basic protein molecular mimics in mice humanized for HLA-DR2 and an MBP(85-99)-specific T cell receptor." J Autoimmun 31(4): Grintzalis, K. et al., (2009). "Protocol for the quantification of protein ng quantities by a Coomassie Brilliant Blue G-250-based hydrophobic assay." Protocol Exchange. Hauser, S. L. et al., (2013). "Multiple sclerosis: Prospects and promise." Ann Neurol 74(3): Heelan, B. T. et al., (1991). "Identification of a 200-kDa glycoprotein antigen of Saccharomyces cerevisiae." Immunol Lett 28(3): Hemmer, B. et al., (2002). "New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis." Nat Rev Neurosci 3(4): Hemmer, B. et al., (2006). "Immunopathogenesis and immunotherapy of multiple sclerosis." Nat Clin Pract Neurol 2(4): Hennecke, J. and D. C. Wiley (2001). "T cell receptor-mhc interactions up close." Cell 104(1): 1-4. Hiskey, R. G. et al., (1966). "Sulfur-Containing Polypeptides. II. Selective Removal of S- Protective Groups from Some L-Cysteinyl-L-cysteine Derivatives1, 2." J Org Chem 31: Hockenbery, D. et al., (1990). "Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death." Nature 348(6299): Hohlfeld, R. (1997). "Biotechnological agents for the immunotherapy of multiple sclerosis. Principles, problems and perspectives." Brain 120 ( Pt 5): Holmes, F. A. et al., (1984). "Mitoxantrone, cyclophosphamide, and 5-fluorouracil in the treatment of hormonally unresponsive metastatic breast cancer." Semin Oncol 11(3 Suppl 1): Σ ε λ ί δ α

170 Βιβλιογραφία Hutchinson, M. et al., (2013). "Clinical efficacy of BG-12 (dimethyl fumarate) in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis: subgroup analyses of the CONFIRM study." J Neurol 260(9): Irizar, H. et al., (2012). "HLA-DRB1*15:01 and multiple sclerosis: a female association?" Mult Scler 18(5): JCBN (1965). "IUPAC-iub Commission on Biochemical Nomenclature. Tentative rules. Nomenclature of quinones with isoprenoid side-chains." Biochim Biophys Acta 107(1): JCBN (1970). "IUPAC-IUB Combined Commission on Biochemical Nomenclature; Abbreviations and Symbols for Chemical Names of Special Interest in Biological Chemistry; Revised Tentative Rules (1965)." Arch Biochem Biophys 136(1): JCBN (1984). "IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides. Recommendations 1983." Eur J Biochem 138(1): Johnson, R. K. et al., (1979). "Experimental antitumor activity of aminoanthraquinones." Cancer Treat Rep 63(3): Kappos, L. et al., (2006). "Treatment with interferon beta-1b delays conversion to clinically definite and McDonald MS in patients with clinically isolated syndromes." Neurology 67(7): Kappos, L. et al., (2006). "Long-term subcutaneous interferon beta-1a therapy in patients with relapsing-remitting MS." Neurology 67(6): Khan, M. M. et al., (2011). "The potential of protein disulfide isomerase as a therapeutic drug target." Oncol Res 19(10-11): Konig, W. and R. Geiger (1970). "[A new method for synthesis of peptides: activation of the carboxyl group with dicyclohexylcarbodiimide using 1-hydroxybenzotriazoles as additives]." Chem Ber 103(3): Kozono, H. et al., (1994). "Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides." Nature 369(6476): Σ ε λ ί δ α

171 Βιβλιογραφία Krishnamoorthy, C. R. et al., (1986). "Stopped-flow kinetic analysis of the interaction of anthraquinone anticancer drugs with calf thymus DNA, poly[d(g-c)].poly[d(g-c)], and poly[d(a-t)].poly[d(a-t)]." Biochemistry 25(20): Ladiabetes. (2011). Laemmli, U. K. (1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature 227(5259): Lang, H. L. et al., (2002). "A functional and structural basis for TCR cross-reactivity in multiple sclerosis." Nat Immunol 3(10): Largent, B. L. et al., (1984). "Carbohydrate-specific adhesion of alveolar macrophages to mannose-derivatized surfaces." J Biol Chem 259(3): Lassmann, H. et al., (1983). "In vivo demyelinating activity of sera from animals with chronic experimental allergic encephalomyelitis. Antibody nature of the demyelinating factor and the role of complement." J Neurol Sci 59(1): Latt, S. A. et al., (1975). "Recent developments in the detection of deoxyribonucleic acid synthesis by Hoechst fluorescence." J Histochem Cytochem 23(7): Layer, A. et al., (2000). "Essensial guides for isolation/purification of immunoglobulins." Academic Press Appendix 1: Libbey, J. E. and R. S. Fujinami (2011). "Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines." Vaccine 29(17): Luessi, F. et al., (2012). "Neurodegeneration in multiple sclerosis: novel treatment strategies." Expert Rev Neurother 12(9): ; quiz Lutterotti, A. et al., (2013). "Antigen-specific tolerance by autologous myelin peptide-coupled cells: a phase 1 trial in multiple sclerosis." Sci Transl Med 5(188): 188ra175. Majera, D. et al., (2012). "Expression, purification and assembly of soluble multimeric MHC class II-invariant chain complexes." FEBS Lett 586(9): Mallone, R. and G. T. Nepom (2004). "MHC Class II tetramers and the pursuit of antigenspecific T cells: define, deviate, delete." Clin Immunol 110(3): Σ ε λ ί δ α

172 Βιβλιογραφία Mantzourani, E. D. et al., (2005). "Structural requirements for binding of myelin basic protein (MBP) peptides to MHC II: effects on immune regulation." Curr Med Chem 12(13): Massilamany, C. et al., (2011). "Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers." BMC Immunol 12: 40. Mayer, G. (2014). Microbiology and Immunology On-line. Response to Antigen: Processing and Presentation. U. S. o. Medicine. Meeson, A. P. et al., (1994). "The distribution of inflammatory demyelinated lesions in the central nervous system of rats with antibody-augmented demyelinating experimental allergic encephalomyelitis." Exp Neurol 129(2): Mergler, M. et al., (1988). "Peptide-Synthesis by a Combination of Solid-Phase and Solution Methods.2. Synthesis of Fully Protected Peptide-Fragments on 2-Methoxy-4-Alkoxy-Benzyl Alcohol Resin." Tetrahedron Letters 29(32): Meuth, S. G. et al., (2012). "Immune therapy of multiple sclerosis--future strategies." Curr Pharm Des 18(29): Miller, A. and Y. Galboiz (2002). "Multiple sclerosis: from basic immunopathology to immune intervention." Clin Neurol Neurosurg 104(3): Minagar, A. (2013). "Current and future therapies for multiple sclerosis." Scientifica (Cairo) 2013: Morley, J. O. and P. J. Furlong (2006). "Synthesis and calculated properties of some 1,4- bis(amino)anthracene-9,10-diones." Organic & Biomolecular Chemistry 4(21): Morrissey, J. H. (1981). "Silver stain for proteins in polyacrylamide gels: a modified procedure with enhanced uniform sensitivity." Anal Biochem 117(2): Morrissey, S. P. et al., (2005). "Mitoxantrone in the treatment of multiple sclerosis." Int MS J 12(3): Mosmann, T. (1983). "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays." J Immunol Methods 65(1-2): Murdock, K. C. et al., (1979). "Antitumor agents. 1. 1,4-Bis[(aminoalkyl)amino]-9,10- anthracenediones." J Med Chem 22(9): Σ ε λ ί δ α

173 Βιβλιογραφία Naldini, L. et al., (1996). "In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector." Science 272(5259): Nepom, G. T. et al., (2002). "HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells." Arthritis Rheum 46(1): Nishio, A. and E. M. Uyeki (1983). "Cellular uptake and inhibition of DNA synthesis by dihydroxyanthraquinone and two analogues." Cancer Res 43(5): Noseworthy, J. H. (1999). "Progress in determining the causes and treatment of multiple sclerosis." Nature 399(6738 Suppl): A Novak, E. J. et al., (2001). "Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens." J Immunol 166(11): O'Connor, K. C. et al., (2007). "Self-antigen tetramers discriminate between myelin autoantibodies to native or denatured protein." Nat Med 13(2): O'Neill, E. J. et al., (2006). "IL-10 is essential for disease protection following intranasal peptide administration in the C57BL/6 model of EAE." J Neuroimmunol 178(1-2): 1-8. Pelletier, D. and D. A. Hafler (2012). "Fingolimod for multiple sclerosis." N Engl J Med 366(4): Perez-Garcia, L. et al., (2011). "Role of Cell Wall Polysaccharides during Recognition of Candida albicans by the Innate Immune System." Glycobiol 1: 102. Polman, C. H. et al., (2006). "A randomized, placebo-controlled trial of natalizumab for relapsing multiple sclerosis." N Engl J Med 354(9): Prast-Nielsen, S. et al., (2010). "Noble metal targeting of thioredoxin reductase--covalent complexes with thioredoxin and thioredoxin-related protein of 14 kda triggered by cisplatin." Free Radic Biol Med 49(11): Quandt, J. A. et al., (2012). "Myelin Basic Protein-Specific TCR/HLA-DRB5*01:01 Transgenic Mice Support the Etiologic Role of DRB5*01:01 in Multiple Sclerosis." Journal of Immunology 189(6): Rabilloud, T. (1990). "Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis." Electrophoresis 11(10): Σ ε λ ί δ α

174 Βιβλιογραφία Ramachandiran, V. et al., (2007). "A robust method for production of MHC tetramers with small molecule fluorophores." J Immunol Methods 319(1-2): Ramage, R. and J. Green (1987). "Ng-2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-Sulfonyl-L-Arginine - a New Acid Labile Derivative for Peptide-Synthesis." Tetrahedron Letters 28(20): Ramage, R. et al., (1991). "An Acid Labile Arginine Derivative for Peptide-Synthesis - N(G)- 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-Sulfonyl-L-Arginine." Tetrahedron 47(32): Ramagopalan, S. V. et al., (2009). "Expression of the multiple sclerosis-associated MHC class II Allele HLA-DRB1*1501 is regulated by vitamin D." PLoS Genet 5(2): e Renner, S. W. (1988). "Immunoblotting and dot immunobinding. Emerging techniques in protein immunochemistry." Arch Pathol Lab Med 112(8): Rivers, T. M. and F. F. Schwentker (1935). "Encephalomyelitis Accompanied by Myelin Destruction Experimentally Produced in Monkeys." J Exp Med 61(5): Robert, K. Y. et al., (1978). "Antineoplastic agents. Structure-activity relationship study of bis(substituted aminoalkylamino)anthraquinones." J Med Chem 21(3): Sallusto, F. et al., (1995). "Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products." J Exp Med 182(2): Samuel, R. V. and T. Hanke (2003). "Construction of MHC class I-peptide tetrameric complexes for analysis of T-cell-mediated immune responses." Methods Mol Med 87: Schwyzer, R. and H. Dietrich (1961). "Helv Chim Acta." 44: Sheehan, J. C. and G. P. Hess (1955). "A new method of forming peptides bonds." J Am Chem Soc 77: Shepherd, V. L. et al., (1981). "L-Fucose-terminated glycoconjugates are recognized by pinocytosis receptors on macrophages." Proc Natl Acad Sci U S A 78(2): Sieber, P. and B. Riniker (1987). "Protection of Histidine in Peptide-Synthesis - a Reassessment of the Trityl Group." Tetrahedron Letters 28(48): Sieber, P. and B. Riniker (1991). "Protection of Carboxamide Functions by the Trityl Residue - Application to Peptide-Synthesis." Tetrahedron Letters 32(6): Σ ε λ ί δ α

175 Βιβλιογραφία Soldan, S. S. et al., (1997). "Association of human herpes virus 6 (HHV-6) with multiple sclerosis: increased IgM response to HHV-6 early antigen and detection of serum HHV-6 DNA." Nat Med 3(12): Stahl, P. D. and R. A. Ezekowitz (1998). "The mannose receptor is a pattern recognition receptor involved in host defense." Curr Opin Immunol 10(1): Steinman, L. (1995). "Multiple sclerosis. Presenting an odd autoantigen." Nature 375(6534): Steinman, L. and S. Zamvil (2003). "Transcriptional analysis of targets in multiple sclerosis." Nat Rev Immunol 3(6): Steinman, R. M. (2008). "Dendritic cells in vivo: a key target for a new vaccine science." Immunity 29(3): Stromnes, I. M. and J. M. Goverman (2006). "Active induction of experimental allergic encephalomyelitis." Nat Protoc 1(4): Stromnes, I. M. and J. M. Goverman (2006). "Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis." Nat Protoc 1(4): Tapeinou, A. et al., (2015). "Conjugation of a peptide to mannan and its confirmation by tricine sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis." Anal Biochem 485: Tapeinou, A. et al., (2015). "Review cyclic peptides on a merry-go-round; towards drug design." Biopolymers 104(5): Taylor, M. E. et al., (1990). "Primary structure of the mannose receptor contains multiple motifs resembling carbohydrate-recognition domains." J Biol Chem 265(21): Terracciano, S. et al., (2005). "Synthesis, solution structure, and bioactivity of six new simplified analogues of the natural cyclodepsipeptide jaspamide." Bioorganic & Medicinal Chemistry 13(17): Thomas, X. and E. Archimbaud (1997). "Mitoxantrone in the treatment of acute myelogenous leukemia: a review." Hematol Cell Ther 39(4): Tseveleki, V. et al., (2015). "Mannan-conjugated myelin peptides prime non-pathogenic Th1 and Th17 cells and ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis." Exp Neurol 267: Σ ε λ ί δ α

176 Βιβλιογραφία Vanderlugt, C. L. et al., (2000). "Pathologic role and temporal appearance of newly emerging autoepitopes in relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis." J Immunol 164(2): Wang, S. S. (1973). "p-alkoxybenzyl alcohol resin and p-alkoxybenzyloxycarbonylhydrazide resin for solid phase synthesis of protected peptide fragments." J Am Chem Soc 95(4): Weber, M. S. et al., (2007). "Mechanism of action of glatiramer acetate in treatment of multiple sclerosis." Neurotherapeutics 4(4): Wekerle, H. et al., (1986). "Antigen presentation in the peripheral nervous system: Schwann cells present endogenous myelin autoantigens to lymphocytes." Eur J Immunol 16(12): White, P. (1992). Peptides, Chemistry and Biology. Proceedings of the 12th American Peptide Symposium, Smith, J. A., Rivier, J. E., Eds.; ESCOM: Leiden. Winslow, T. (2012). "National Cancer Institute." from Wucherpfennig, K. W. et al., (1997). "Recognition of the immunodominant myelin basic protein peptide by autoantibodies and HLA-DR2-restricted T cell clones from multiple sclerosis patients. Identity of key contact residues in the B-cell and T-cell epitopes." J Clin Invest 100(5): Wucherpfennig, K. W. and J. L. Strominger (1995). "Molecular mimicry in T cell-mediated autoimmunity: viral peptides activate human T cell clones specific for myelin basic protein." Cell 80(5): Wurm, F. M. (2004). "Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells." Nat Biotechnol 22(11): Yu, G. S. et al., (2011). "Sequential Conjugation of 6-Aminohexanoic Acids and L-Arginines to Poly(amidoamine) Dendrimer to Modify Hydrophobicity and Flexibility of the Polymeric Gene Carrier." Bulletin of the Korean Chemical Society 32(2): Zee-Cheng, R. K. et al., (1987). "Structural modification study of mitoxantrone (DHAQ). Chloro-substituted mono- and bis[(aminoalkyl)amino]anthraquinones." J Med Chem 30(9): Σ ε λ ί δ α

177 Βιβλιογραφία Zee-Cheng, R. K. et al., (1979). "Structural modification study of bis(substituted aminoalkylamino)anthraquinones. An evaluation of the relationship of the [2-[(2- hydroxyethyl)amino]ethyl]amino side chain with antineoplastic activity." J Med Chem 22(5): Zervas, L. and D. Theodoropoulos (1956). "N-tritylamino Acids and Peptides. A new method of pepride synthesis." J Am Chem Soc 78: Zipoli, V. et al., (2008). "Intravenous mitoxantrone and cyclophosphamide as second-line therapy in multiple sclerosis: an open-label comparative study of efficacy and safety." J Neurol Sci 266(1-2): ΜcKay, F. C. and N. F. Albertson (1957). "New Amine-masking Groups for Peptide Synthesis." J Am Chem Soc 79: Σ ε λ ί δ α