Αρχές PCR και υβριδισμού. Ιωσήφ Παπαπαρασκευάς Βιοπαθολόγος, Λέκτορας ΕΚΠΑ Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή Αθηνών

Transcript

1 Αρχές PCR και υβριδισμού Ιωσήφ Παπαπαρασκευάς Βιοπαθολόγος, Λέκτορας ΕΚΠΑ Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή Αθηνών

2 Ιστορικά στοιχεία Πρώτη αναφορά in vitro ενζυματικής αντίδρασης για την κατασκευή νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Kleppe et al, J Mol Biol, 1971 Πρώτη αναλυτική παρουσίαση της τεχνικής της PCR Saiki and Mullis, Science, 1985 Πρώτες άμεσες εφαρμογές της τεχνικής Saiki and Mullis, Science, 1987 Mullis and Faloona, Methods Enzymol, 1987 Mullis, Sci Amer, 1990 Σήμερα η PCR πλέον έχει αυτοματοποιηθεί και εισαχθεί στην καθημερινή ιατρική διαγνωστική πρακτική

3 ομή της παρουσίασης Περιγραφή της τεχνικής της PCR Περιγραφή της ηλεκτροφόρησης του DNA Συζήτηση ορισμένων βασικών παραμέτρων που επηρεάζουν το αποτέλεσμα της αντίδρασης Η επιλογή του DNA στόχου (αναλυτική ευαισθησία) Η επιλογή και επεξεργασία του κλινικού δείγματος (διαγνωστική ευαισθησία) Η αξία του θετικού ή αρνητικού αποτελέσματος (θετική - αρνητική προγνωστική αξία) Η οπτικοποίηση του αποτελέσματος (αναλυτική ευαισθησία) Τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα (επιμόλυνση) Τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα (αναστολή)

4 ιαδικασία της PCR Περιγραφή της τεχνικής της PCR Περιγραφή της ηλεκτροφόρησης των προϊόντων

5 Αναλυτική ευαισθησία της μεθόδου Η αναλυτική ευαισθησία της μεθόδου, δηλ. το όριο της ποσότητας του DNA (ή της ποσότητας των βακτηριακών κυττάρων) που απαιτείται για να είναι θετική η αντίδραση, εξαρτάται από: Αριθμός των σταδίων (ενός σταδίου ή εμφωλεάζουσα) Ύπαρξη και ποσότητα του DNA στόχου στα στελέχη Οπτικοποίηση αποτελέσματος (αγαρόζη, ιχνηθέτης, Real Time)

6 ιάγνωση της φυματίωσης Αναλυτική ευαισθησία μεθόδων Ευαισθησία οξεάντοχης χρώσης: ~ βακτήρια/ml Ευαισθησία καλλιέργειας: βακτήρια/ml Ευαισθησία PCR ποικίλει

7 Αναλυτική ευαισθησία μεθόδου Η επιλογή στόχου με πολλαπλά αντίγραφα M. tuberculosis complex: ~ 5-20 αντίγραφα IS6110 Όμως έως 5% στελεχών M. tuberculosis :0-4αντίγραφα Έως 5% ασθενών με φυματίωση κ/α (+) και PCR (-) Αλλά και στους λοιπούς 95% η αναλυτική ευαισθησία ποικίλει σε μεγάλο βαθμό, ανάλογα με τον αριθμό των αντιγράφων του DNA στόχου στο στέλεχος

8 Αναλυτική ευαισθησία μεθόδου Η μέθοδος ανίχνευσης του αποτελέσματος Συμβατική PCR ενός σταδίου με ανίχνευση των προϊόντων: Οπτικά σε gel αγαρόζης Αύξηση της αναλυτικής ευαισθησίας Οπτικά με υβριδισμό και σημασμένο ιχνηθέτη Φωτομετρικά με ELISA Ραδιομετρικά Συμβατική PCR δύο σταδίων (nested) με ανίχνευση των προϊόντων: Οπτικά σε gel αγαρόζης Οπτικά με υβριδισμό και σημασμένο ιχνηθέτη Φωτομετρικά με ELISA Ραδιομετρικά Real-Time PCR με ανίχνευση των προϊόντων φωτομετρικά (CCD camera) με σημασμένο ιχνηθέτη (TaqMan probe ή molecular beacon)

9 Συμβατική PCR με οπτικοποίηση σε gel αγαρόζης Πρωτόκολλο ενός σταδίου Εκκινητές για το IS6110 Aναλυτική ευαισθησία 180 fg DNA ~ 40 βακτηριακά κύτταρα Ποσοτική Real-Time PCR Πρωτόκολλο ενός σταδίου Εκκινητές και molecular beacon για το IS6110 Aναλυτική ευαισθησία 45 fg DNA ~ 10 βακτηριακά κύτταρα Papaparaskevas et al, J Clin Microbiol, 2008

10 ιάγνωση φυματίωσης Συμβατική μικροβιολογία Οξεάντοχη χρώση Ziehl-Neelsen Χρώση Ροδαμίνης Αουραμίνης Mycobacterium tuberculosis Καλλιέργεια σε Lowenstein-Jensen 24 ημέρες, 36 ο C, 5% CO 2 Αρχείο Εργαστηρίου Μικροβιολογίας ΓΝΑ Λαϊκό

11 Η επιλογή του κλινικού δείγματος Η συσχέτιση μεταξύ της αναλυτικής ευαισθησίας και της διαγνωστικής ευαισθησίας (ικανότητας της αντίδρασης να δίνει θετικό αποτέλεσμα στα θετικά δείγματα) Η κλινική σημαντικότητα του θετικού αποτελέσματος

12 Η πιθανότητα του αρνητικού αποτελέσματος σε δείγματα με χαμηλή συγκέντρωση στόχου Κανόνας του Poison για την ομοιογενή κατανομή του στόχου στο διάλυμα του κλινικού δείγματος P N =C N /Nxe c Σε ένα διάλυμα δείγματος 1 ml (1.000 μl) με χαμηλό αριθμό βακτηριακού φορτίου, η πιθανότητα 100 τυχαία μl του δείγματος να έχουν την ίδια ακριβώς συγκέντρωση στόχου με 100 άλλα τυχαία μl είναι εξαιρετικά μικρή Χαμηλή ευαισθησία και επαναληψιμότητα Greenfield and White, Mayo Foundation, 1993

13 Η πιθανότητα του αρνητικού αποτελέσματος σε δείγματα με χαμηλή συγκέντρωση στόχου Greenfield and White, Mayo Foundation, 1993

14 Βελτιστοποίηση της τεχνικής σε δείγματα με χαμηλή συγκέντρωση στόχου Εμπλουτισμός του δείγματος κατά την διάρκεια της κατεργασίας Φυγοκέντρηση Απομάκρυνση περιττών στοιχείων Κατεργασία μεγαλύτερης ποσότητας δείγματος Λήψη πολλαπλών δειγμάτων

15 Βελτιστοποίηση της τεχνικής σε δείγματα με χαμηλή συγκέντρωση στόχου Αύξηση της ποσότητας του δείγματος για κατεργασία αύξηση της τελικής συγκέντρωσης του ευκαρυωτικού DNA (Αιματηρά πτύελα: 14 μg ευκαρυωτικό DNA/ml πτυέλων) Χρυσή τομή μεταξύ αύξησης της ποσότητας του δείγματος και εξαφάνισης του DNA στόχου μέσα σε τεράστιες ποσότητες ευκαρυωτικού DNA (Αύξηση της πιθανότητας μη ειδικών υβριδισμών απώλεια ευαισθησίας) Greenfield and White, Mayo Foundation, 1993

16 Η επιλογή του κλινικού δείγματος ιάγνωση C. pneumoniae Το κλινικό δείγμα μπορεί να είναι πτύελα, BAL,φαρυγγικό έκπλυμα, κλπ. Το κλινικό δείγμα (ανάλογα με τον τρόπο λήψης) μπορεί να έχει ποικίλου βαθμού φυσιολογική χλωρίδα Ποια είναι η κλινική σημαντικότητα του θετικού αποτελέσματος; Το θετικό αποτέλεσμα της μεθόδου σημαίνει ότι ανευρέθηκε το αίτιο της λοίμωξης;

17 Η επιλογή του κλινικού δείγματος ιάγνωση C. pneumoniae Ποιο είναι το βέλτιστο κλινικό δείγμα? Κατάλληλα κατά Bartlet πτύελα ή βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα Συνηθέστερα χρησιμοποιούμενο δείγμα Πτωχό σε ευκαρυωτικά κύτταρα χαμηλότερη ευαισθησία Εξασφαλίζει κλινική σημαντικότητα υψηλότερη ειδικότητα και προγνωστική αξία Φαρυγγικό επίχρισμα ή φαρυγγικό έκπλυμα Σπανιότερα χρησιμοποιούμενο δείγμα Πλούσιο σε ευκαρυωτικά κύτταρα υψηλότερη ευαισθησία εν εξασφαλίζει κλινική σημαντικότητα χαμηλότερη ειδικότητα και προγνωστική αξία

18 Η επιλογή του κλινικού δείγματος ιάγνωση C. pneumoniae Το θετικό δείγμα εξασφαλίζει την διάγνωση? Σε δείγματα κατώτερου αναπνευστικού συνήθως ναι Σε δείγματα ανώτερου αναπνευστικού??? Έως 10% αποικισμός στοματοφάρυγγα από C. pneumoniae, ιδίως σε ΧΑΠ (persistent carriers, chronic infections) SF Dowell et al, Clin Infect Dis, 2001

19 Η επιλογή του κλινικού δείγματος Η PCR διαχωρίζει δυσκολότερα, σε σχέση με την καλλιέργεια, το πραγματικό παθογόνο από την χλωρίδα ή την επιμόλυνση. SF Dowell et al, Clin Infect Dis, 2001

20 Κλινικά δείγματα για PCR Ολικό αίμα ή λευκοκύτταρα (προτιμότερο EDTA από ηπαρίνη) Όταν ο μικροοργανισμός είναι ενδοκυττάριος Ορός ή πλάσμα Όταν ο μικροοργανισμός είναι εξωκυττάριος Πτύελα, ούρα, ΕΝΥ, βιολογικά υγρά Κόπρανα (τα πλέον δύσκολα δείγματα)

21 Μέθοδοι λήψης του DNA Αδρές μέθοδοι καταστροφής του κυττάρου Βρασμός Γυάλινα σφαιρίδια Μέθοδοι διαχωρισμού και εκχύλισης DNA Φαινόλη-Χλωροφόρμιο Χαοτροπικές ενώσεις (γουανιδίνη Μέθοδος Boom) Μαγνητικά σφαιρίδια Στήλες με ηθμό Αυτοματοποίηση

22 Μέθοδοι λήψης του DNA Αδρές μέθοδοι καταστροφής του κυττάρου ιάλυμα από συγκρίματα κυτταροπλάσματος και κυτταρικού τοιχώματος, DNA (διπλόκλωνο, μονόκλωνο και θραύσματα), πρωτεΐνες κλπ. Αδρή, φθηνή μέθοδος, με χαμηλό ποιοτικά αποτέλεσμα Μέθοδοι διαχωρισμού και εκχύλισης DNA Καθαρό DNA που μπορεί να φυλαχθεί για μεγάλο χρονικό διάστημα Πιο ακριβή μέθοδος, με υψηλής ποιότητας παραγόμενο DNA

23 Το ψευδώς θετικό αποτέλεσμα Μη ειδικός υβριδισμός Μη προτυποποιημένο πρωτόκολλο Μέθοδος λήψης του DNA Μεγάλη συγκέντρωση ευκαρυωτικού DNA Θετικό - αμφιλεγόμενο Μη ειδικό Επιμόλυνση με προϊόντα πολλαπλασιασμού Κακή εργαστηριακή πρακτική. Τελικά προϊόντα που βρίσκονται σε μεγάλη συγκέντρωση στο περιβάλλον του εργαστηρίου επιμολύνουν τα αρχικά στάδια εκχύλισης DNA και προετοιμασίας του χημικού μίγματος Ψευδώς θετικό δυνατό σήμα

24 Το ψευδώς θετικό αποτέλεσμα Η εργαστηριακή πρακτική Εξαιρετικά μεγάλη σημασία η σωστή εργονομία και η αυστηρή αλληλουχία των βημάτων της πρακτικής Προετοιμασία του χημικού μίγματος (καθαρό δωμάτιο) Προσθήκη DNA (δωμάτιο προσθήκης DNA) Αντίδραση PCR (δωμάτιο PCR) Ηλεκτροφόρηση προϊόντος PCR (δωμάτιο PCR) Η εκχύλιση του DNA ιδανικά θα πρέπει να γίνεται σε τέταρτο χώρο Η αλληλουχία των βημάτων αυστηρά προς μια κατεύθυνση Συχνή χρήση UV ακτινοβολίας και διαλύματος χλωρίου

25 Η απενεργοποίηση του προϊόντος πολ/σμού Χρήση UNG+dUTP αφορά τη συγκεκριμένη αντίδραση κάθε φορά UV ακτινοβολία ή/και διάλυμα χλωρίου αφορά το περιβάλλον Persing and Chimino, Mayo Foundation, 1993

26 Η απενεργοποίηση του προϊόντος πολ/σμού Χρήση UNG και dutp Αρχή της μεθόδου: χρήση του ενζύμου UNG (uracil-nglycosilase) ένζυμο επισκευής του DNA που υδρολύει τον δεσμό του dutp και αντικαθιστά την ουρακίλη που σποραδικά μπορεί in vivo να ενσωματώνεται στο διπλόκλωνο DNA. Ta νουκλεοτίδια: datp, dctp, dgtp, dttp (A-T, C-G) Συνεχής χρήση dutp αντί για dttp Τα προϊόντα πολ/σμού έχουν νουκλεοτιδική αλληλουχία με dutp Στην αντίδραση της PCR προσθήκη UNG υδρόλυση τμημάτων DNA με dutp (επιμολύνοντα amplicons), αλλά όχι τμημάτων DNA με dttp (DNA στόχος) Μειονέκτημα: Ελάττωση της ευαισθησίας της αντίδρασης Greenfield and White, Mayo Foundation, 1993

27 Το ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα Μικρή συγκέντρωση στόχου, κάτωαπότοόριοτηςαναλυτικής ευαισθησίας Αναστολή της ενζυματικής αντίδρασης

28 Το ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα Αναστολή της αντίδρασης Φυσικές ουσίες Αιμίνη Πολυσακχαρίτες Χημικά αντιδραστήρια Ηπαρίνη, EDTA, SDS Χαοτροπικά μόρια (guanidinium HCl)

29 Το ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα Αναστολή της αντίδρασης Κλινικά δείγματα που πιθανά περιέχουν αναστολείς Αίμα και αιματηρά βιολογικά υγρά Ούρα Πτύελα

30 Το ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα Αναστολή της αντίδρασης Έλεγχος αναστολής Επανάληψη της αντίδρασης του συγκεκριμένου δείγματος μετά από προσθήκη μικρής ποσότητας DNA απότοθετικόcontrol Εάν το αποτέλεσμα εξακολουθεί να είναι αρνητικό, τότε ισχυρή πιθανότητα αναστολής Βασική παράμετρος για την αναστολή η μέθοδος εκχύλισης DNA Στις μεθόδους εκχύλισης του DNA με στήλες με ηθμό ή με μαγνητικά σφαιρίδια, μικρότερη η πιθανότητα. Οι αναστολείς κατακρατούνται από τον ηθμό.

31 Αντί συμπερασμάτων Η PCR και οι άλλες τεχνικές της μοριακής μικροβιολογίας έχουν πλέον καθιερωθεί στο κλινικό εργαστήριο Όμως υπάρχουν όρια στην εφαρμογή τους και κανόνες που πρέπει να γίνονται σεβαστοί εν φαίνεται στο άμεσο μέλλον συμβατικές τεχνικές, όπως η καλλιέργεια και η δοκιμασία ευαισθησίας, να μπορέσουν να αντικατασταθούν πλήρως από μοριακές τεχνικές Το πιθανότερο είναι ότι η συμβατική και η μοριακή μικροβιολογία θα δρουν συμπληρωματικά η μια της άλλης για μεγάλο χρονικό διάστημα ακόμη

32 Ευχαριστώ για την προσοχή σας