ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΚΑΙ ΖΩΩΝ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΚΑΙ ΖΩΩΝ Μηχανισμοί νευροπροστασίας στο μοντέλο ντοπαμινεργικής απονεύρωσης μυός weaver μετά από τη συγχορήγηση του νευροστεροειδούς ΒΝΝ-50 και της Ν-ακετυλοκυστεΐνης. ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Παναγιωτακοπούλου Βασιλική Βιολόγος Πάτρα, Φεβρουάριος 2014

2 ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΕΓΚΡΙΣΗ ΜΕ ΥΠΟΓΡΑΦΕΣ Τα μέλη της Τριμελούς Εξαταστικής Επιτροπής Ματσώκης Νικόλαος Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Γεωργίου Χρήστος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Παναγόπουλος Νικόλαος Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Ο επιβλέπων καθηγητής Ματσώκης Νικόλαος Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών 1

3 Ευχαριστίες Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών και συγκεκριμένα στα εργαστήρια Φυσιολογίας Ανθρώπου και Ζώων (Τομέας Βιολογίας Ζώων) και Βιοχημείας (Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης), κατά το χρονικό διάστημα Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους συνέβαλαν με οποιονδήποτε τρόπο στην εκπόνηση αυτής της εργασίας. Πρώτο, τον αναπληρωτή καθηγητή, κ. Νικόλαο Ματσώκη, για την πολύτιμη ευκαιρία που μου προσέφερε αναλαμβάνοντας την επίβλεψη της παρούσας εργασίας, για την ουσιαστική επαφή μας και το ειλικρινές ενδιαφέρον του. Ακόμη, τα μέλη της εξεταστικής επιτροπής. Τον καθηγητή κ. Χρήστο Γεωργίου, για τη διάθεση του εργαστηρίου και τη συνεισφορά του στην ολοκλήρωση της εργασίας και τον λέκτορα, κ. Νίκο Παναγόπουλο, για τις πολύτιμες συμβουλές και την έμπρακτη βοήθειά του στο πειραματικό της μέρος. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στην καθηγήτρια του Τμήματος Ιατρικής, κ. Φεβρωνία Αγγελάτου, για την ανεκτίμητη συμβολή και τις πάντοτε εύστοχες παρατηρήσεις της. Ευχαριστώ τα υπόλοιπα μέλη της ερευνητικής ομάδας, το μεταδιδακτορικό ερευνητή, κ. Κώστα Μποτσάκη και την υποψήφια διδάκτορα, κ. Θεοδώρα Μούρτζη, για την άψογη συνεργασία μας όλο το προηγούμενο διάστημα. Ακόμη, τον υποψήφιο διδάκτορα, κ. Δημήτρη Ζησιμόπουλο, για την πολύτιμη συνεισφορά του στο πειραματικό μέρος της εργασίας. Τέλος, θέλω να εκφράσω την απεριόριστη ευγνωμοσύνη μου στους δικούς μου ανθρώπους, τους γονείς μου, Γιάννα και Γιώργο, και τον αδερφό μου, Αντρέα, για την αγάπη τους και τη συνεχή στήριξη που μου προσφέρουν όλα αυτά τα χρόνια. Στο Γιάννη, που στέκεται πάντα δίπλα μου. 2

4 Περίληψη Η νόσος του Parkinson χαρακτηρίζεται από τη βαθμιαία, εκλεκτική νευροεκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μελαινοραβδωτής οδού. Η μειωμένη δραστηριοποίηση των ντοπαμινεργικών υποδοχέων που προκαλείται από την ανεπάρκεια ντοπαμίνης τροποποιεί τη λειτουργία των βασικών γαγγλίων και αναστέλλει τα κινητικά συστήματα. Ιδανικό πειραματικό μοντέλο αποτελεί το μοντέλο weaver, το οποίο εμφανίζει το ίδιο μοτίβο νευροεκφύλισης με τους παρκινσονικούς ασθενείς καθώς και περισσότερη από 70% μείωση της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα. Το γεγονός πως δεν υπάρχει σήμερα αποτελεσματική θεραπεία που να σταματά ή να αναστρέφει την εξέλιξη της νόσου, δημιουργεί την ανάγκη ανακάλυψης ενός φαρμακευτικού σχήματος το οποίο θα έχει νευροπροστατευτική δράση και θα περιορίζει τις παρενέργειες. Προηγούμενα αποτελέσματα της ομάδας μας δείχνουν σημαντική επιβίωση των ντοπαμινεργικών κυττάρων στο μοντέλο weaver μετά από χρόνια χορήγηση του ενδογενούς νευροστεροειδούς DHEAS, του χημικού αναλόγου του ΒΝΝ-50 (το οποίο δε μεταβολίζεται σε οιστρογόνα) και του φαρμακευτικού συνδυασμού του ΒΝΝ-50 με τη Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC), με το τελευταίο να επαναφέρει πλήρως τον αριθμό των κυττάρων στη μέλαινα ουσία. Στην παρούσα εργασία θελήσαμε να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς μέσω των οποίων επιτυγχάνεται η νευροπροστασία που προκαλεί η συγχορήγηση του συνδυασμού BNN-50/ΝAC. Για το σκοπό αυτό, αξιολογήσαμε την αντιαποπτωτική, καθώς και την αντιοξειδωτική δράση του σχήματος BNN-50/NAC. Οι δύο δείκτες επιλέχθηκαν λαμβάνοντας υπόψιν τον κεντρικό ρόλο του αποπτωτικού θανάτου στη διαδικασία της νευροεκφύλισης, καθώς και το ρόλο του οξειδωτικού στρες στην παθογένεια της νόσου. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν πλειοτροπική δράση του φαρμακευτικού συνδυασμού BNN-50/NAC, η οποία εκφράζεται μέσω της ισχυρής αντιαποπτωτικής και αντιοξειδωτικής του δράσης. 3

5 Πίνακας Περιεχομένων Περίληψη... 3 Ευρετήριο Εικόνων... 6 Ευρετήριο Πινάκων... 7 Ευρετήριο Γραφημάτων... 7 Θεωρητικό μέρος 8 1. Το κύκλωμα των βασικών γαγγλίων Ανατομική οργάνωση Λειτουργική οργάνωση Η νόσος του Parkinson Επιδημιολογία Παθοφυσιολογία Τροποποίηση της λειτουργίας των βασικών γαγγλίων Σωμάτια Lewy Συμπτώματα Διάγνωση Θεραπεία Γενετική Πειραματικά μοντέλα μελέτης της νόσου του Parkinson Χημικά επαγόμενα μοντέλα Γενετικά μοντέλα Το μοντέλο weaver Κυτταρικός θάνατος Μορφές κυτταρικού θανάτου Η απόπτωση στο νευρικό σύστημα Πρωτεΐνες ρυθμιστές της απόπτωσης Η απόπτωση στη νόσο του Parkinson Οξειδωτικό στρες Ελεύθερες ρίζες

6 5.2 Οξειδωτικές βλάβες στα βιομόρια Μηχανισμοί αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού Το οξειδωτικό στρες στη νόσο του Parkinson Νευροστεροειδή Σύνθεση, μεταβολισμός και μηχανισμός δράσης Τα ενδογενή νευροστεροειδή DHEA και DHEAS Νευροπροστατευτική δράση των DHEA και DHEAS Άλλες δράσεις των DHEA και DHEAS Το συνθετικό νευροστεροειδές BNN Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) Μεταβολισμός Μηχανισμοί δράσης Δράση της NAC σε μοντέλα νευροεκφύλισης Σκοπός της εργασίας Πειραματικό μέρος Υλικά και Μέθοδοι Πειραματόζωα Απομόνωση εγκεφαλικών περιοχών μυών Προσδιορισμός των επιπέδων των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες Αποτελέσματα Σύγκριση των επιπέδων των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax, καθώς και του λόγου τους στο μεσεγκέφαλο φυσιολογικών και ομοζυγωτικών weaver μυών πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Σύγκριση των επιπέδων της ελεύθερης, της πρωτεϊνικής και της συνολικής MDA στο μεσεγκέφαλο φυσιολογικών και ομοζυγωτικών weaver μυών πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Συζήτηση Βιβλιογραφία

7 Ευρετήριο Εικόνων Εικόνα 1: Το κύκλωμα των βασικών γαγγλίων... 9 Εικόνα 2: Λειτουργική οργάνωση του κυκλώματος των βασικών γαγγλίων Εικόνα 3: Συχνότητα εμφάνισης της νόσου με την αύξηση της ηλικίας Εικόνα 4: Τροποποίηση της λειτουργίας των βασικών γαγγλίων στη νόσο του Parkinson Εικόνα 5: Σωμάτια Lewy Εικόνα 6: Προϊόντα των γονιδίων που σχετίζονται με τη νόσο του Parkinson, τα οποία επηρεάζουν τη μιτοχονδριακή λειτουργία και αυξάνουν το οξειδωτικό στρες Εικόνα 7: Ιοντικός δίαυλος GIRK. Διακρίνονται οι καρβοξυτελικές και αμινοτελικές περιοχές και οι περιοχές Μ1 και Μ2 που σχηματίζουν τον πόρο Εικόνα 8: Εξαφάνιση των μεσοδακτύλιων πτυχών με απόπτωση στο πόδι όρνιθας Εικόνα 9: Ρύθμιση της απόπτωσης από πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl Εικόνα 10: Δραστικές μορφές οξυγόνου Εικόνα 11: Στάδια υπεροξείδωσης λιπιδίων Εικόνα 12: Αντίδραση αναγωγής του μοριακού οξυγόνου σε νερό Εικόνα 13: Βιοσύνθεση των νευροστεροειδών από χοληστερόλη Εικόνα 14: Διακύμανση της συγκέντρωσης DHEAS στην κυκλοφορία στην διάρκεια ζωής του ανθρώπου Εικόνα 15: Χημική δομή της NAC Εικόνα 16: Φωτογραφία από οπτικό μικροσκόπιο, στεφανιαίας τομής εγκεφάλου μυός, ηλικίας 21 ημερών σε μεγέθυνση 20x Εικόνα 17: Σχηματική απεικόνιση της συνεχούς νευροπροστατευτικής δράσης των οιστρογόνων μέσω της δ;eσμευσης ριζών υδροξυλίου Εικόνα 18: Χημική δομή 17β-οιστραδιόλης και ΒΝΝ

8 Ευρετήριο Πινάκων Πίνακας 1: Σύγκριση των επιπέδων της πρωτεΐνης Bcl-2 σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Πίνακας 2: Σύγκριση των επιπέδων της πρωτεΐνης Bax σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Πίνακας 3: Σύγκριση του λόγου Bcl-2/bax σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Πίνακας 4: Σύγκριση των επιπέδων της frmda σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Πίνακας 5: Σύγκριση των επιπέδων της prmda σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Πίνακας 6: Σύγκριση των επιπέδων της ολικής MDA σε (+/+) και (wv/wv) ποντικούς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Ευρετήριο Γραφημάτων Γράφημα 1: Ιστογραμμική απεικόνιση και εικόνες από ενδεικτικά φιλμ ανοσοαποτύπωσης με τη μέθοδο Western blotting των επιπέδων της πρωτεΐνης Bcl-2 σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Γράφημα 2: Ιστογραμμική απεικόνιση και εικόνες από ενδεικτικά φιλμ ανοσοαποτύπωσης με τη μέθοδο Western blotting των επιπέδων της πρωτεΐνης Bax σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Γράφημα 3: Ιστογραμμική απεικόνιση και εικόνες από ενδεικτικά φιλμ ανοσοαποτύπωσης με τη μέθοδο Western blotting του λόγου Bcl-2/bax σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Γράφημα 4: Ιστογραμμική απεικόνιση και εικόνες από ενδεικτικά φιλμ ανοσοαποτύπωσης με τη μέθοδο Western blotting των επιπέδων της frmda σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Γράφημα 5: Ιστογραμμική απεικόνιση και εικόνες από ενδεικτικά φιλμ ανοσοαποτύπωσης με τη μέθοδο Western blotting των επιπέδων της prmda σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Γράφημα 6: Ιστογραμμική απεικόνιση και εικόνες από ενδεικτικά φιλμ ανοσοαποτύπωσης με τη μέθοδο Western blotting των επιπέδων της ολικής MDA σε (+/+) και (wv/wv) ποντικούς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC

9 Θεωρητικό μέρος 8

10 1. Το κύκλωμα των βασικών γαγγλίων Τα βασικά γάγγλια (εικ.1) είναι μια ομάδα από πυρήνες του εγκεφάλου που εντοπίζονται σε σημαντικό βάθος σε σχέση με τον εγκεφαλικό φλοιό και διασυνδέονται με αυτόν, το θάλαμο και το εγκεφαλικό στέλεχος. Εκτείνονται στον τελεγκέφαλο, το διεγκέφαλο και το μεσεγκέφαλο. Συγκεκριμένα, πρόκειται για τους εξής πέντε πυρήνες: (1) κερκοφόρος πυρήνας, (2) κέλυφος του φακοειδούς πυρήνα, (3) ωχρά σφαίρα, (4) υποθαλάμιος πυρήνας και (5) μέλαινα ουσία (Albin et al., 1989). Εικόνα 1: Το κύκλωμα των βασικών γαγγλίων (πηγή: Τα βασικά γάγγλια λειτουργούν σε στενή συνεργασία με τον εγκεφαλικό φλοιό και το φλοιονωτιαίο σύστημα. Επεξεργάζονται τα προσαγωγά σήματα που δέχονται από το φλοιό και τα επιστρέφουν σε αυτόν. Βρίσκονται σε στρατηγική θέση για να ασκούν επιρροή στην κινητική συμπεριφορά, το συναίσθημα, τη μάθηση και τις γνωστικές διεργασίες. Βλάβες στους βασικούς πυρήνες μειώνουν την ικανότητα έναρξης εκούσιων κινήσεων και προκαλούν διαταραχές που χαρακτηρίζονται από ακούσιες κινήσεις όπως ο τρόμος και η δυσκαμψία της νόσου του Parkinson και οι ανεξέλεγκτες κινήσεις των μελών στην χορεία του Huntington. Ακόμη τα βασικά γάγγλια φαίνεται ότι ασκούν ρυθμιστικό έλεγχο και σε σπλαχνικές λειτουργίες αφού βλάβη του ραβδωτού σώματος ακολουθείται από γενικευμένη έκπτωση της αισθητικότητας (Yinn et al., 2006). 9

11 1.1 Ανατομική οργάνωση Πιο αναλυτικά, ο κερκοφόρος πυρήνας (caudate nucleus, CN) και το κέλυφος (putamen, PUT) αναπτύσσονται από την ίδια περιοχή του πρόσθιου εγκεφάλου, αποτελούνται από τα ίδια είδη κυττάρων σε όλη την έκτασή τους και συνενώνονται στο πρόσθιο τμήμα τους. Μαζί αποτελούν το ραβδωτό σώμα (striatum, STR), το οποίο λειτουργικά αποτελεί το ανώτερο, σε υποφλοιώδες επίπεδο, τελεγκεφαλικό κέντρο σύνθεσης κινητικών, συναισθηματικών και γνωστικών λειτουργιών. Το ραβδωτό σώμα μπορεί να διαιρεθεί λειτουργικά με βάση τους ντοπαμινεργικούς υποδοχείς που εκφράζονται σε δύο τμήματα αυτού: το τμήμα που κυριαρχούν οι υποδοχείς τύπου D1, ονομάζεται D1-ραβδωτό και αντίστοιχα το τμήμα που κυριαρχούν οι υποδοχείς τύπου D2, D2-ραβδωτό. Η ωχρά σφαίρα (globus pallidus, GP) προέρχεται από το διάμεσο εγκέφαλο και διαιρείται σε εξωτερική μοίρα (external, GPe) και εσωτερική μοίρα (internal, GPi) με την παρεμβολή ενός μυελώδους πετάλου. Εντοπίζεται μεταξύ του κελύφους, εξωτερικά, και της έσω κάψας, εσωτερικά. Το κέλυφος και η ωχρά σφαίρα αναφέρονται πολλές φορές μαζί ως φακοειδής πυρήνας (lenticular nucleus), λόγω του σφηνοειδούς σχήματος που έχουν ως σύνολο. Η έσω μοίρα της ωχράς σφαίρας (GPi) είναι ένας πυρήνας εξόδου των βασικών γαγγλίων. Το δενδριτικό πεδίο των νευρώνων της GPi χαρακτηρίζεται από μεγάλο μέγεθος και κατεύθυνση εγκάρσια στους εισερχόμενους από το ραβδωτό σώμα άξονες, γεγονός που τους παρέχει τη δυνατότητα να λαμβάνουν μεγάλο πλήθος συγκλινουσών προβολών (Parent & Hazrati, 1995). Ο υποθαλάμιος πυρήνας (subthalamic nucleus, STN) βρίσκεται κάτω από το θάλαμο, στο όριο μεταξύ θαλάμου και μέσου εγκεφάλου. Μαζί με το ραβδωτό αποτελούν τα βασικά στοιχεία εισόδου των βασικών γαγγλίων. Η μέλαινα ουσία (substantia nigra, SN) παρεμβάλλεται και διαχωρίζει τη βάση από την καλύπτρα των εγκεφαλικών σκελών του μέσου εγκεφάλου. Διαιρείται σε δύο μοίρες, τη δικτυωτή μοίρα (pars reticulata SNr), η οποία μοιάζει ιστολογικά με την ωχρά σφαίρα και το χρώμα της είναι ωχρό, και τη συμπαγή μοίρα (pars compacta SNc), η οποία είναι κυτταροβριθής και περιέχει κυρίως ντοπαμινεργικούς νευρώνες και μεγάλες ποσότητες μελανίνης, γι αυτό το χρώμα της είναι μελανό (Nakano et al., 2000). 10

12 1.2 Λειτουργική οργάνωση Οι βασικοί πυρήνες εισόδου των βασικών γαγγλίων είναι το ραβδωτό σώμα και ο υποθαλάμιος πυρήνας. Το ραβδωτό σώμα δέχεται διεγερτικές νευρικές ίνες από το μέσο κεντρικό πυρήνα του θαλάμου και γλουταμινεργικές προβολές από το φλοιό των εγκεφαλικών ημισφαιρίων, ο οποίος προβάλλει και στον υποθαλάμιο πυρήνα. Μια άλλη σημαντική είσοδος στο ραβδωτό σώμα προέρχεται από τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας. Τέλος, το ραβδωτό σώμα δέχεται νοραδρενεργική νεύρωση από τον υπομέλανα τόπο και σεροτονινεργική είσοδο από το ραχιαίο πυρήνα καθώς και από τον ουραίο πυρήνα της ραφής (Blandini et al., 2000). Τους πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων αποτελούν η έσω μοίρα της ωχράς σφαίρας και η δικτυωτή μοίρα της μέλαινας ουσίας (Hikosaka et al, 2000). Οι απαγωγοί ίνες αυτών των πυρήνων καταλήγουν στον φλοιό μέσω του θαλάμου. Σχηματίζεται, συνεπώς, ένα κλειστό κύκλωμα μεταξύ του φλοιού, των βασικών γαγγλίων και του θαλάμου (Parent & Hazrati, 1995). Η πολυπλοκότητα της λειτουργικής οργάνωσης του κυκλώματος αυξάνεται σημαντικά από το γεγονός ότι τα βασικά γάγγλια εμφανίζουν εκτεταμένες διασυνδέσεις και μεταξύ τους. Οι διασυνδέσεις αυτές εμφανίζουν τοπογραφική οργάνωση. Ανάμεσα στα μοντέλα που έχουν προταθεί, το επικρατέστερο είναι αυτό που προβλέπει την ύπαρξη δύο βασικών κυκλωμάτων ελέγχου των βασικών γαγγλίων, το άμεσο (direct pathway) και το έμμεσο (indirect pathway). Τα δύο μονοπάτια προέρχονται από διαφορετικά υποσύνολα νευρώνων του ραβδωτού σώματος και στο μοντέλο αυτό παραμένουν λειτουργικά διαχωρισμένα. Το μοντέλο άμεσης και έμμεσης οδού έχει αποδειχθεί χρήσιμο για την κατανόηση των υπερ- και υποκινητικών συμπτωμάτων στις νόσους Huntington και Parkinson αντίστοιχα (Albin et al., 1989; Bar-Gad & Bergman, 2001), (εικ.2). Το ραβδωτό σώμα λαμβάνει διεγερτικές νευρικές ίνες από τον εγκεφαλικό φλοιό και προβάλλει άμεσα και έμμεσα στους πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων. Το άμεσο μονοπάτι αποτελείται από μια μονοσυναπτική GABAεργική προβολή από τους νευρώνες εξόδου του ραβδωτού σώματος (οι οποίοι λειτουργούν με υποδοχείς ντοπαμίνης D1) στην δικτυωτή μοίρα της μέλαινας ουσίας και την έσω μοίρα της ωχράς σφαίρας. Το έμμεσο μονοπάτι είναι πολυσυναπτικό και αποτελείται από την GABAεργική προβολή των νευρώνων εξόδου του ραβδωτού σώματος (οι οποίοι λειτουργούν με υποδοχείς ντοπαμίνης 11

13 D2) στους νευρώνες της έξω μοίρας της ωχράς σφαίρας, ακολουθούμενη από την ανασταλτική προβολή αυτών προς τους διεγερτικούς νευρώνες του υποθαλάμιου πυρήνα. Οι νευρώνες του υποθαλάμιου πυρήνα συνάπτονται στους ανασταλτικούς νευρώνες των πυρήνων εξόδου των βασικών γαγγλίων (Goldberg, 2003), (εικ.2). Εικόνα 2: Λειτουργική οργάνωση του κυκλώματος των βασικών γαγγλίων (πηγή: Blumenfeld, 2010). Συνολικά, οι πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων αναστέλλονται από την άμεση προβολή του ραβδωτού σώματος και διεγείρονται από την έμμεση προβολή, ενώ οι ίδιοι προβάλλουν ανασταλτικά στο θάλαμο. Άρα στο σύνολο του το άμεσο κύκλωμα προκαλεί διεγερτικό αποτέλεσμα, ενώ το έμμεσο κύκλωμα προκαλεί ανασταλτικό αποτέλεσμα (Heimer et al., 1995). Και στα δύο μονοπάτια κύριος νευροδιαβιβαστής είναι η ντοπαμίνη, η οποία διεγείρει την άμεση οδό (μέσω D1 υποδοχέων) και αναστέλλει την έμμεση οδό (μέσω D2 υποδοχέων). 12

14 2. Η νόσος του Parkinson 2.1 Επιδημιολογία Η νόσος του Parkinson προσβάλλει περίπου 200 στα άτομα παγκοσμίως. Η συχνότητα της νόσου αυξάνεται με την ηλικία (εικ.3) και ενώ μέχρι την ηλικία των 40 ετών δεν ξεπερνά το 4/ , προσβάλλει το 3% του πληθυσμού άνω των 65 ετών, γεγονός που την καθιστά τη δεύτερη πιο συχνή νευροεκφυλιστική διαταραχή μετά τη νόσο του Alzheimer. Η μέση ηλικία Εικόνα 3: Συχνότητα εμφάνισης της νόσου με την αύξηση της ηλικίας (πηγή: Van Den Eeden et al. 2003). διάγνωσης της νόσου είναι τα 70 χρόνια (Ross et al., 2000). 2.2 Παθοφυσιολογία Η παθοφυσιολογία της νόσου συνίσταται σε δύο κύρια χαρακτηριστικά: α. την εκλεκτική νευροεκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μελαινοραβδωτής οδού, με αποτέλεσμα την απορρύθμιση του συντονιστικού ρόλου του εξωπυραμιδικού συστήματος επί των κινήσεων, και β. την ύπαρξη των σωματίων Lewy, τα οποία είναι κυτταροπλασματικά έγκλειστα πρωτεϊνών, κατά κύριο λόγο α-συνουκλεΐνης, που ανιχνεύονται στους προσβεβλημένους νευρώνες. Είναι χαρακτηριστικά της νόσου, δεν αποτελούν όμως επαρκές διαγνωστικό κριτήριο καθώς ανιχνεύονται και σε άλλες ασθένειες (Papachroni et al., 2003). 2.3 Τροποποίηση της λειτουργίας των βασικών γαγγλίων Η απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας τροποποιεί τη φυσιολογική λειτουργία του κυκλώματος των βασικών γαγγλίων. Η ανεπάρκεια ντοπαμίνης οδηγεί σε μειωμένη δραστηριοποίηση των ντοπαμινεργικών υποδοχέων, η οποία έχει ως 13

15 αποτέλεσμα την μειωμένη αναστολή των νευρώνων της έμμεσης οδού και την μειωμένη διέγερση των νευρώνων της άμεσης οδού. Μειωμένη αναστολή των νευρώνων της έμμεσης οδού οδηγεί σε μαζική αναστολή των νευρώνων της έξω μοίρας της ωχράς σφαίρας, μειωμένη αναστολή του υποθαλάμιου πυρήνα και αυξημένη διέγερση της έσω μοίρας της ωχράς σφαίρας και της δικτυωτής μοίρας της μέλαινας ουσίας, ενώ η μειωμένη ενεργοποίηση της άμεσης οδού προκαλεί μείωση της ανασταλτικής επίδρασης στους πυρήνες εξόδου των βασικών γαγγλίων (εικ.4). Το καθαρό αποτέλεσμα είναι μια μαζική ενεργοποίηση των πυρήνων εξόδου των βασικών γαγγλίων, οι οποίοι με τη σειρά τους αναστέλλουν τα κινητικά συστήματα, οδηγώντας στα κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου του Parkinson (Obeso et al., 2000). Εικόνα 4: Τροποποίηση της λειτουργίας των βασικών γαγγλίων στη νόσο του Parkinson (πηγή: Smith et al., 2011). 2.4 Σωμάτια Lewy Το 1912 πρώτος ο Friedrich H. Lewy, μελετώντας εγκεφάλους ασθενών με τρομώδη παράλυση, περιέγραψε στη διάμεση φαιά ουσία τα ηωσινόφιλα κυτταροπλασματικά έγκλειστα που πήραν το όνομά του (Holdorff, 2002). Τα σωμάτια αυτά (Lewy bodies, LBs) αποτελούν σήμερα παθοφυσιολογικό χαρακτηριστικό της νόσου του Parkinson και της «άνοιας με σωμάτια Lewy» (DLB). 14

16 Η βιοχημική τους σύσταση δεν είναι πλήρως γνωστή. Αποτελούνται κυρίως από α- συνουκλεΐνη, μια προσυναπτική πρωτεΐνη η οποία είναι μεταλλαγμένη σε κάποιες οικογενείς μορφές της νόσου του Parkinson, συζευγμένη με ουβικιτίνη (Spillantini et al., 1997). Στο εσωτερικό των σωματίων Lewy η α-συνουκλεΐνη εμφανίζεται κυρίως πολυμερισμένη, δηλαδή με τη μορφή ινιδίων. Αξιοσημείωτο είναι ότι τα ινίδια αυτά μοιάζουν τόσο μορφολογικά, όσο και ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες με τα ινίδια β-αμυλοειδούς της νόσου Alzheimer (Agorogiannis et al., 2006) (εικ.5). Εικόνα 5: Σωμάτια Lewy (πηγή: Μια άλλη μορφή κυτταρικών εγκλείστων που έχει αναγνωριστεί στη νόσο του Parkinson, είναι αυτή των νευριτών Lewy (Lewy neurites, LNs). Πρόκειται για διακριτά συσσωματώματα πρωτεϊνών που εδράζονται στους δενδρίτες, τα οποία έχουν τη μορφή άξονα ή νηματίου και συχνά διακλαδίζονται. Όλοι οι προσβεβλημένοι νευρώνες στη νόσο του Parkinson φέρουν σώματα και νευρίτες Lewy, και μάλιστα κάποιοι από αυτούς επιβιώνουν για μεγάλο διάστημα παρουσία τους. Ωστόσο θεωρείται πως παύουν να είναι λειτουργικοί πολύ πριν το θάνατό τους (Braak et al., 2004). Η παρουσία συσσωρεύσεων συγκεκριμένων πρωτεϊνών υπό την μορφή ινιδίων αποτελεί κοινό παθογενετικό μηχανισμό των νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Μάλιστα, μεταλλάξεις των γονιδίων που κωδικοοιούν αυτές τις πρωτεΐνες συχνά ενοχοποιούνται για τις κληρονομικές μορφές των αντίστοιχων νοσημάτων (Agorogiannis et al., 2004). 15

17 2.5 Συμπτώματα Τα παρκινσονικά συμπτώματα μπορούν να ελεγχθούν τα πρώτα χρόνια θεραπείας, ωστόσο περίπου το 50% των ασθενών εμφανίζει σημαντικές επιπλοκές μετά από 5 χρόνια και χρειάζεται συχνά ειδική βοήθεια ή/και περίθαλψη σε ίδρυμα. Υπάρχει μια «τετράδα κύριων συμπτωμάτων» τα οποία χρησιμοποιούνται και ως αρχικά κριτήρια για τη διάγνωση της νόσου. Αφορούν όλα στην εκούσια και ακούσια κινητική λειτουργία και συνήθως ξεκινούν από τη μια πλευρά του σώματος. Τα συμπτώματα είναι ήπια στην αρχή και γίνονται πιο έντονα καθώς εξελίσσεται η νόσος. 1. Τρόμος: πρόκειται για ασύμμετρο τρόμο ηρεμίας, που εμφανίζεται κυρίως στα δάκτυλα, στα άνω και κάτω άκρα, στη σιαγόνα και αργότερα σε ολόκληρο το κεφάλι. 2. Δυσκαμψία στα άκρα και τον κορμό, η οποία μπορεί να αυξηθεί κατά τη διάρκεια της κίνησης. Η δυσκαμψία μπορεί δευτερογενώς να επιφέρει μυϊκούς πόνους. 3. Βραδυκινησία: αφορά αφενός στη δυσκολία έναρξης, αφετέρου στην επιβράδυνση της εκούσιας κίνησης. Ιδιαίτερες μορφές βραδυκινησίας συνιστούν η υπομιμία, η υποφωνία, η σιελόρροια, η ελάττωση της αιώρησης του άνω άκρου κατά τη βάδιση, η δυσκολία στην έναρξη της βάδισης και το χαρακτηριστικό βάδισμα με μικρά, συρόμενα βήματα (βάδισμα των παρκινσονικών). 4. Αστάθεια, η οποία προκαλείται λόγω των μειωμένων αντανακλαστικών που καθιστούν δύσκολο τον έλεγχο της στάσης του σώματος και την διατήρηση της ισορροπίας. Δευτερογενώς, εμφανίζονται μη κινητικά συμπτώματα, η συχνότητα των οποίων διαφέρει σημαντικά και για το λόγο αυτό δε μπορούν να αξιοποιηθούν ως διαγνωστικά κριτήρια. Διαταραχή του αυτόνομου νευρικού συστήματος, η οποία δημιουργεί χαρακτηριστικά συμπτώματα, όπως δυσκοιλιότητα, ορθοστατική υπόταση, ναυτία, δυσανεξία στο θερμό και το κρύο, συχνουρία, υπεριδρωσία. Διαταραχές του ύπνου (98% των ασθενών παρουσιάζει υπέρμετρη ημερήσια υπνηλία και αϋπνία πρώιμης αφύπνισης). Αρκετά χρόνια πριν από τη διάγνωση, οι ασθενείς μπορεί να παρουσιάσουν μία διαταραχή του ύπνου που αποκαλείται σύνδρομο RBD (REM Behavioral Disorder). Σε 16

18 αυτό, ο ύπνος είναι ανήσυχος και με πολύ «ζωντανά» όνειρα και έντονες κινήσεις, που ενίοτε οδηγούν και σε τραυματισμούς. Σύνδρομο ανήσυχων άκρων (Restless Legs Syndrome, RLS) που χαρακτηρίζεται από αισθητικά συμπτώματα όπως δυσαισθησίες, και ακατανίκητη τάση κίνησης των μελών, ιδίως των κάτω άκρων, τα οποία επιδεινώνονται όταν οι ασθενείς αναπαύονται. Αισθητικές διαταραχές: Οι πόνοι και οι παραισθησίες συνήθως δεν αναγνωρίζονται ως παρκινσονικά συμπτώματα, αφού οι αρχικές διαγνώσεις παραπέμπουν σε παθήσεις του μυοσκελετικού ή σε ψυχιατρικά νοσήματα αντίστοιχα. Ένα χαρακτηριστικό σύμπτωμα, που μάλιστα αξιολογείται ως προκλινικό σύμπτωμα της νόσου είναι η υποσμία έως και ανοσμία. Διαταραχές νοητικών λειτουργιών: χαρακτηριστικά προσβάλλονται η προσοχή και οι οπτικοχωρικές λειτουργίες, ενώ 20-30% των παρκινσονικών εμφανίζει άνοια, συνήθως μετά την παρέλευση της πρώτης δεκαετίας της νόσου (Chaudhuri et al., 2006). 2.6 Διάγνωση Λόγω της κλινικής ετερογένειας της νόσου, η διάγνωση γίνεται κυρίως βάσει του ιστορικού του κάθε ασθενή. Σε κάθε περίπτωση, βασικό κριτήριο αποτελεί η εμφάνιση ενός ή περισσότερων συμπτωμάτων από αυτά που συγκαταλέγονται στην «τετράδα κύριων συμπτωμάτων», όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. Το χαρακτηριστικό που αξιολογείται μεμονωμένα με μεγαλύτερη ασφάλεια είναι ο τρόμος ηρεμίας, παρόλο που υπάρχει ένα αξιοσημείωτο ποσοστό των ασθενών που δεν τον παρουσιάζει (Savitt et al., 2006). Η διάγνωση του Parkinson διακρίνεται σε 3 επίπεδα: την δυνατή, την πιθανή και την οριστική. Τα κριτήρια φαίνονται στον επόμενο πίνακα (Chakor et al., 2011): Συμπτώματα Διάγνωση 1. Τρόμος ηρεμίας Δυνατή: τουλάχιστον 2 από τα 2. Βραδυκινησία συμπτώματα Ακαμψία Πιθανή: ένα από τα συμπτώματα 1 ή 2 4. Αστάθεια (μεμονωμένο) 5. Κυρτή στάση του κορμού Οριστική: τουλάχιστον 2 συμπτώματα, 6. Πάγωμα (ακινησία) εκ των οποίων το ένα το 1 ή το 2 17

19 Η κλίμακα UPDRS (Unified Parkinson s Disease Rating Scale) είναι μια περισσότερο σύνθετη κλίμακα, η οποία χρησιμοποιείται σήμερα, και περιλαμβάνει στα κριτήρια της την εγκεφαλική λειτουργία, τη συμπεριφορά, τη διάθεση και τις καθημερινές δραστηριότητες του ασθενή (Martinez Martin et al., 1994). 2.7 Θεραπεία Οι υπάρχουσες θεραπείες για τη νόσο του Parkinson στοχεύουν πρωτίστως στην αποκατάσταση των επιπέδων της ντοπαμίνης στη μέλαινα ουσία και, δευτερευόντως, στον ανταγωνισμό της διεγερτικής δράσης των χολινεργικών νευρώνων. Οι θεραπείες αυτές ελέγχουν προσωρινά τα συμπτώματα και διατηρούν για κάποια χρόνια ικανοποιητική λειτουργική κινητικότητα, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής των ασθενών και μειώνοντας το δείκτη θνησιμότητας. Ωστόσο, δε σταματούν ούτε αναστρέφουν τη νευρωνική εκφύλιση, με αποτέλεσμα προοδευτικά η θεραπευτική ανταπόκριση να τείνει να ελαττωθεί και, τελικά, να εκλείψει. Ο καθορισμός του θεραπευτικού σχήματος είναι συνάρτηση διαφόρων παραγόντων, όπως το στάδιο της νόσου, η ηλικία, η ανοχή και, κυρίως, η ανταπόκριση του ασθενούς σε αυτό. Γίνεται, κατά κανόνα, προσπάθεια ιδίως νεότεροι ασθενείς να μην τεθούν εξ αρχής υπό αγωγή με L-DOPA, καθώς σχετίζεται με αυξημένη πιθανότητα κινητικών επιπλοκών στο μέλλον ως αποτέλεσμα της τοξικότητας της ντοπαμίνης. Σε ηλικιωμένους, αρχικού σταδίου ασθενείς, συνηθίζεται ως θεραπεία πρώτης γραμμής. Ωστόσο, σε κάθε περίπτωση η χρήση της υπαγορεύεται από την ίδια την εξέλιξη της νόσου και θεωρείται δεδομένη στην όψιμη νόσο. Η λεβοντόπα (L-DOPA) χρησιμοποιείται ως θεραπεία υποκατάστασης. Είναι άμεσος μεταβολικός πρόδρομος της ντοπαμίνης, διέρχεται τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό μέσω του μεμβρανικού μεταφορέα των αρωματικών αμινοξέων και αποκαρβοξυλιώνεται σε ντοπαμίνη στο ΚΝΣ από την αποκαρβοξυλάση των αρωματικών αμινοξέων (AAD). Είναι αποτελεσματική στην άμβλυνση του τρόμου, της αστάθειας και της βραδυκινησίας ιδιαίτερα στα πρώτα στάδια της νόσου όπου το μελαινοραβδωτό σύστημα διατηρεί κάποια ικανότητα να αποθηκεύει και να απελευθερώνει ντοπαμίνη και, έτσι, η θετική επίδραση του φαρμάκου ξεπερνά τον περιορισμένο χρόνο ημιζωής του. Η μετατροπή της L-DOPA σε ντοπαμίνη στην περιφέρεια προκαλεί ανεπιθύμητες ενέργειες που περιλαμβάνουν ορθοστατική υπόταση, ταχυκαρδία, έκτακτες κοιλιακές συστολές, ανορεξία, ναυτία και έμετο, στα οποία συνήθως αναπτύσσεται σύντομα ανοχή. 18

20 Κανόνα στην κλινική πράξη αποτελεί η συγχορήγηση L-DOPA με περιφερικούς αναστολείς της AAD, όπως η καρβιντόπα και η βενζοτροπίνη, η οποία επιτρέπει τη μείωση της χορηγούμενης δόσης της κατά 75%. Ο μειωμένος περιφερικός μεταβολισμός της L-DOPA αυξάνει τη διαθεσιμότητά της στο ΚΝΣ και μειώνει σημαντικά τις περιφερικές παρενέργειες της. Άλλες σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες είναι οι ψυχικές διαταραχές που σχετίζονται με αυξημένη δράση της ντοπαμίνης στο ΚΝΣ και οι δυσκινησίες που εμφανίζονται ως και στο 80% των ασθενών που βρίσκονται σε μακροχρόνια αγωγή και μπορούν να περιλαμβάνουν χορεία, βαλλισμό, δυστονία και tics. Συνήθης είναι η εναλλαγή περιόδων έκδηλης ακινησίας ή δυσκινησίας και περιόδων βελτιωμένης κινητικότητας (φαινόμενο on-off ) που οφείλεται στα φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά της ουσίας, όπως και η αντίδραση ακινησίας του τέλους της δόσης (φαινόμενο wearing off ). Οι καταστάσεις αυτές συνοδεύουν τη μακροπρόθεσμη θεραπεία και προδηλώνουν την απώλεια της θεραπευτικής ανταπόκρισης. Η απώλεια της αποτελεσματικότητας της αγωγής εμφανίζεται στο βαθμό που δεν επαρκούν οι εναπομείναντες λειτουργικοί ντοπαμινεργικοί νευρώνες για τη μετατροπή της L-DOPA σε ντοπαμίνη (Rang, 2007). Στην αντιμετώπιση της νόσου χρησιμοποιούνται τα παρακάτω φάρμακα είτε ως μονοθεραπείες προκειμένου να καθυστερήσει η μετάβαση στην L-DOPA είτε, σε όψιμα στάδια της νόσου, σε σχήματα που τη συμπεριλαμβάνουν: Η σελεγιλίνη και ρασαγιλίνη είναι εκλεκτικοί αναστολείς της μονοαμεινοξειδάσης (ΜΑΟ) τύπου Β και συγκρίνονται ως πολύ λιγότερο αποτελεσματικοί της λεβοντόπα. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μονοθεραπεία σε αρχικά στάδια ήπιας νόσου, ή να συνδυαστούν με αυτή, παρατείνοντας τη διάρκεια δράσης της και μειώνοντας τις κινητικές διακυμάνσεις όταν υπάρχουν. Η εντακαπόνη και η τολκαπόνη είναι αναστολείς της κατεχολ-ο-μεθυλτρανσφεράσης (COMT), ένζυμο που ευθύνεται για τη μετατροπή της ντοπαμίνης σε 3-Ομεθυλτρανσφεράση, η οποία επιπλέον ανταγωνίζεται την L-DOPA για την είσοδό της στο ΚΝΣ. Η οδός αυτή ενδυναμώνεται όταν αναστέλλεται η ΜΑΟ. Τα φάρμακα αυτής της κατηγορίας, μειώνοντας το μεταβολισμό της ντοπαμίνης από την COMT, αυξάνουν την κεντρική διαθεσιμότητά της και, σε συνδυασμό με την L-DOPA, είναι χρήσιμα στους ασθενείς που έχουν αναπτύξει διακυμάνσεις ανταπόκρισης. Η εντακαπόνη προτιμάται της 19

21 τολκαπόνης, καθώς η τελευταία ενέχεται σε ηπατοτοξικότητα και απαιτεί τακτικό έλεγχο της ηπατικής λειτουργίας. Η ροπινιρόλη, η πραμιπεξόλη ή η ροτιγοτρίνη είναι άμεσα δρώντες ντοπαμινεργικοί αγωνιστές οι οποίοι εμφανίζουν μικρότερη πιθανότητα εμφάνισης όψιμων κινητικών επιπλοκών, αλλά μεγαλύτερη συχνότητα πρόκλησης σύγχυσης, παραισθήσεων και ψευδαισθήσεων από την L-DOPA. Έτσι, έχουν σημαντικό ρόλο ως θεραπεία πρώτης εκλογής σε αρχικά στάδια της νόσου και χρησιμοποιούνται ιδιαίτερα σε νεαρούς ασθενείς χωρίς έκπτωση της νοητικής λειτουργίας. Η κλινική χρήση των παλαιοτέρων φαρμάκων αυτής της κατηγορίας, των εργοταμινικών παραγώγων, βρωμοκρυπτίνη και περγολίδη, έχει περιοριστεί από τις δυνητικά σοβαρές ανεπιθύμητές ενέργειές τους. Η απομορφίνη είναι επίσης ένας ισχυρός ντοπαμινεργικός αγωνιστής που χορηγείται σε όψιμα στάδια ως «θεραπεία διάσωσης» για την αντιμετώπιση των δυσκινησιών και των κινητικών διακυμάνσεων που επιμένουν σε κάθε άλλη θεραπεία. Η αμανταδίνη, ένα αντιϊκό φάρμακο που τυχαία ανακαλύφθηκε ότι έχει και αντιπαρκινσονική δράση, φαίνεται να αυξάνει την απελευθέρωση ντοπαμίνης στο ραβδωτό, έχει αντιχολινεργικές δράσεις και, ακόμη, αναστέλλει τους NMDA υποδοχείς γλουταμικού οξέος (Factor, 2008). Είναι λιγότερο ισχυρή από τη L-DOPA και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μονοθεραπεία σε αρχικά στάδια της νόσου ή ως συμπληρωματική προσθήκη στο σχήμα της L-DOPA σε ασθενείς που έχουν αναπτύξει διακυμάνσεις στην ανταπόκριση και δυσκινησίες. Η προπρανολόλη και άλλοι αποκλειστές των β-αδρενεργικών υποδοχέων. Τα φάρμακα αυτά είναι αποτελεσματικά στην αντιμετώπιση μόνο του τρόμου και χρησιμοποιούνται στο πρώιμο στάδιο, ιδιαίτερα όταν προεξάρχον σύμπτωμα είναι ο τρόμος θέσης (Harvey, 1998). Τέλος, ο εν τω βάθει εγκεφαλικός ερεθισμός (deep brain stimulation) χρησιμοποιείται σε κάποιους ασθενείς σε προχωρημένο στάδιο της νόσου. Περιλαμβάνει την εμφύτευση ενός ηλεκτροδίου στην έσω μοίρα της ωχράς σφαίρας ή στον υποθαλάμιο πυρήνα και την παροχή ερεθισμάτων υψηλής συχνότητας μέσω μιας γεννήτριας παλμών που εμφυτεύεται στον ασθενή. Αυτό το είδος θεραπείας προτιμάται για ασθενείς μικρής ηλικίας και με καλή συνολική κατάσταση υγείας (Chakor et al., 2011). 20

22 2.8 Γενετική Η σποραδική μορφή της ασθένειας είναι η συχνότερα εμφανιζόμενη, ωστόσο έχουν αναγνωριστεί συγκεκριμένα γονίδια τα οποία είναι υπεύθυνα για την οικογενή μορφή και είναι μεταλλαγμένα στο 5-10% των ασθενών με κλινική εικόνα παρκινσονικού. Υπάρχουν επίσης ενδείξεις πως τα ίδια γονίδια παίζουν κάποιο ρόλο ακόμα και στην σποραδική μορφή της νόσου (Xiromerisiou et al., 2010). Η βιοχημική λειτουργία αυτών των γονιδίων μπορεί να πυροδοτήσει διαφορετικά παθογενετικά μονοπάτια, όπως το οξειδωτικό στρες, τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία ή τη μειωμένη ενεργότητα των κινασών που οδηγούν στη νόσο του Parkinson. Μέχρι σήμερα αρκετά γονίδια έχουν επιβεβαιωμένα συσχετιστεί με τη νόσο του Parkinson, ενώ αρκετοί ακόμη γενετικοί τόποι θεωρούνται ύποπτοι και εξετάζονται. PARK-1 (α-συνουκλεΐνη) Η α-συνουκλεΐνη είναι μια μικρή (140 αμινοξέα), υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη, η οποία όπως ήδη αναφέραμε αποτελεί το κύριο συστατικό των σωματίων Lewy. Η πρωτεΐνη φέρει έναν αριθμό όξινων αμινοξέων στο καρβοξυτελικό της άκρο και επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες 11 αμινοξέων στο αμινοτελικό της άκρο (Davidson et al, 1998). Τις πρώτες εβδομάδες της εμβρυϊκής ζωής εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα των νευρικών κυττάρων και σταδιακά μεταφέρεται προς την προσυναπτική περιοχή, στην οποία ανιχνεύεται στα υπόλοιπα στάδια της ανάπτυξης. Αν και ο φυσιολογικός ρόλος των συνουκλεϊνών δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως, υπάρχουν ενδείξεις ότι εμπλέκονται στην κυτταρική επικοινωνία. Πειράματα σε ποντικούς έδειξαν ότι μίγμα α- και β- συνουκλεΐνης ανέστειλε την ενεργότητα της φωσφολιπάσης D2, δρώντας στις κινάσες που συζεύγνεινται με G-πρωτεΐνες, ρυθμίζοντας με αυτό τον τρόπο την έκκριση της ντοπαμίνης (Jenco et al., 1998). Έχουν ταυτοποιηθεί τουλάχιστον 3 μεταλλάξεις με λάθος νόημα (Α53Τ, Α30Ρ, Ε46Κ) καθώς και πολλαπλασιασμοί του γονιδίου της φυσιολογικής πρωτεΐνης. Η μετάλλαξη Α53Τ έχει αποδειχθεί πως αυξάνει την τάση της πρωτεΐνης να σχηματίζει ινίδια, έναντι της μονομερούς μορφής της (Foltynie et al., 2002). Η τοξικότητα σε αυτή την περίπτωση οφείλεται στην απελευθέρωση ντοπαμίνης από τα συναπτικά κυστίδια λόγω της διάτρησης της μεμβράνης τους από τα ινίδια α-συνουκλεΐνης. Αυτή η διαπίστωση αποτελεί και μια πιθανή εξήγηση για την εκλεκτική τοξικότητα της α- συνουκλεΐνης στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες της μέλαινας ουσίας (Xiromerisiou et al., 2010). 21

23 PARK-2 (parkin) Το γονίδιο parkin κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 465 αμινοξέων, με δράση λιγάσης της ουβικιτίνης, η οποία χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα μια Ο-γλυκοζυλιωμένη μορφή της α- συνουκλεΐνης. Εμφανίζει ομολογία με την ουβικιτίνη στο αμινοτελικό άκρο της και φέρει ένα μοτίβο RING στο καρβοξυτελικό άκρο της. Μεταλλάξεις στο γονίδιο parkin προκαλούν την υποτελή αυτοσωμική νεανική μορφή της νόσου του Parkinson. Το γονίδιο περιέχει 12 εξώνια, εκ των οποίων τα πέντε (εξώνια 3-7) απουσιάζουν στους ασθενείς (Kitada et al., 1998), ενώ έχουν ταυτοποιηθεί και μεταλλάξεις τόσο με λάθος νόημα όσο και χωρίς νόημα. Η κλινική εικόνα δεν διαφέρει στους τρεις τύπους μεταλλάξεων. Η συχνότητα των μεταλλάξεων στο γονίδιο parkin μειώνεται σημαντικά με την αύξηση της ηλικίας εμφάνισης της νόσου (Lücking et al., 2000). PARK-5 (γονίδιο UCH-L1) Η πρωτεΐνη UCH-L1 (ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1) είναι ένα ένζυμο το οποίο εμπλέκεται στην αποδέσμευση της ουβικιτίνης από τις πρωτεΐνες στις οποίες έχει συνδεθεί προκειμένου να τις οδηγήσει στα πρωτεασώματα για αποικοδόμηση. Δυσλειτουργία αυτού του ενζύμου μπλοκάρει το μονοπάτι αποικοδόμησης των πρωτεϊνών του κυττάρου. Έχει ως τώρα αναγνωριστεί μια επικρατής μετάλλαξη με λάθος νόημα στο γονίδιο UCH-L1 (Liu et al., 2002). PARK-6 (γονίδιο PINK1) To γονίδιο PINK1 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 581 αμινοξέων (PTEN-induced putative kinase) η οποία εμφανίζει υψηλή ομολογία με τις κινάσες σερίνης-θρεονίνης της οικογένειας ασβεστίου/καλμοδουλίνης. Εξετάστηκαν ασθενείς με πρώιμη έναρξη της νόσου του Parkinson και βρέθηκαν δέκα παθογόνες μεταλλάξεις στον γενετικό τόπο PARK-6 (Ibáñez et al., 2006). Η κλινική εικόνα των ασθενών με μεταλλαγμένη PINK1 πρωτεΐνη χαρακτηρίζεται από τυπικό παρκινσονικό φαινότυπο με ασύμμετρη έναρξη και αργή εξέλιξη (Valente et al., 2004). PARK-7 (γονίδιο DJ1) Το γονίδιο DJ1 κωδικοποιεί μία ομοδιμερή πρωτεΐνη που εκφράζεται σε πολλούς ιστούς και στον εγκέφαλο, κι έδραζεται στα μιτοχόνδρια. Έντεκα διαφορετικές μεταλλάξεις του γονιδίου αυτού (ελλείμματα και μεταλλάξεις με λάθος νόημα) βρέθηκαν να ενέχονται σε μία μορφή υπολειπόμενης κληρονομικής μορφής της νόσου του Parkinson. 22

24 Δεν έχει διευκρινιστεί ο ακριβής λειτουργικός ρόλος της πρωτεΐνης DJ1, φαίνεται όμως να έχει προστατευτική δράση έναντι του οξειδωτικού stress. Μεταλλάξεις που οδηγούν σε απώλεια της λειτουργικότητας της πρωτεΐνης, προκαλούν νευροεκφύλιση (Bonifati et. al., 2003). Νεότερα δεδομένα δείχνουν πως η DJ1 είναι μια ισχυρή μεταλλοδεσμευτική πρωτεΐνη, η οποία ενισχύει τους προστατευτικούς μηχανισμούς του κυττάρου έναντι της τοξικότητας που προκαλείται από τα μέταλλα, κυρίως το κάδμιο (Bjοrkblom, 2013). Στην ίδια εργασία επιβεβαιώνεται ότι η παρουσία ντοπαμίνης ενισχύει την μεταλλοκαταλυόμενη οξείδωση των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνων σε in vivo πειράματα σε κυτταροκαλλιέργειες. Το εύρημα αυτό ίσως είναι σημαντικό για την συμπλήρωση του παζλ της αιτιολογίας της νόσου. Εικόνα 6: Προϊόντα των γονιδίων που σχετίζονται με τη νόσο του Parkinson, τα οποία επηρεάζουν τη μιτοχονδριακή λειτουργία και αυξάνουν το οξειδωτικό στρες (πηγή: Henchcliffe & Beal, 2008). Οι Lill et al. παρουσίασαν 12 ακόμη γενετικούς τόπους (BST1, CCDC62/HIP1R, DGKQ/GAK, GBA, ITGA8, LRRK2, MAPT, MCCC1/LAMP3, PARK16, SNCA, STK39, SYT11/RAB25) που έδειξαν να σχετίζονται με την πιθανότητα εκδήλωσης της νόσου του Parkinson, είτε αυξορυθμιστικά, είτε μειορυθμιστικά (Lill et al., 2012). Στην ίδια εργασία προτείνονται γενετικοί τόποι που εμφανίζονται μεταλλαγμένοι μόνο σε ασθενείς συγκεκριμένων εθνικοτήτων (συγκεκριμένα σε Καυκάσιους και Ασιάτες), δεν έχουν ωστόσο ακόμη δημοσιευτεί τα ερευνητικά αποτελέσματα. 23

25 3. Πειραματικά μοντέλα μελέτης της νόσου του Parkinson Προκειμένου να μελετηθούν οι παθογενετικοί μηχανισμοί της νόσου, η πιθανή τοξικότητα ουσιών ή άλλων παραγόντων, ο τρόπος δράσης και η αποτελεσματικότητα των φαρμακευτικών σκευασμάτων που δοκιμάζονται πειραματικά χρησιμοποιείται ένας αριθμός πειραματικών μοντέλων. Στην περίπτωση της νόσου του Parkinson, παρά το γεγονός ότι δεν υπάρχει αντίστοιχη ζωονόσος, γίνεται χρήση ορισμένων μοντέλων που προσεγγίζουν σε κάποιο βαθμό την παθογένεια της νόσου. Τα μοντέλα αυτά διακρίνονται σε γενετικά και σε χημικά επαγόμενα (Gerlach & Riederer, 1996). 3.1 Χημικά επαγόμενα μοντέλα Παράγοντες οι οποίοι διακόπτουν τη λειτουργία ή καταστρέφουν πλήρως το κατεχολαμινεργικό σύστημα χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη παρκινσονικών μοντέλων. Τέτοιοι παράγοντες είναι η μεθαμφεταμίνη, η 6-υδροξυντοπαμίνη (6-OHDA) και η 1-μεθυλο- 4-φαινυλ-1,2,3,6-τετραυδροπυριδίνη (MPTP), οι οποίοι εξετάζονται πιο αναλυτικά στην συνέχεια (Betarbet et al., 2002). Το μοντέλο της μεθαμφεταμίνης στηρίζεται στην παρατήρηση ότι τα παράγωγα των αμφεταμινών, χορηγούμενα σε πειραματόζωα, προκαλούν σημαντική μείωση της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα και της ενεργότητας της υδροξυλάσης της τυροσίνης (Harvey et al, 2000). Η νευροτοξικότητα της μεθαμφεταμίνης εκφράζεται με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Στη μέλαινα ουσία, η έκθεση σε μεθαμφεταμίνη προκαλεί απώλεια των ντοπαμινεργικών κυττάρων και των τελικών απολήξεων της μελαινοραβδωτής οδού, σε ποσοστό 25% (Granado et al., 2013). Η 6-υδροξυντοπαμίνη είναι νευροτοξίνη ειδική για τις κατεχολαμίνες, η οποία επίσης προκαλεί μείωση των επιπέδων της ντοπαμίνης και μείωση της υδροξυλάσης της τυροσίνης (Shimohama et al., 2003). Έχουν δημιουργηθεί διαφορετικά μοντέλα για την μελέτη της νόσου στα επιμέρους στάδιά της. Όταν η τοξίνη ενεθεί στην αρχή της μελαινοραβδωτής οδού παρουσιάζεται εκτεταμένη μείωση της ντοπαμίνης που προσεγγίζει την κλινική εικόνα της προχωρημένης μορφής της νόσου. Αντίθετα, η ένεση της ουσίας κοντά στις τελικές απολήξεις δημιουργεί ένα μοντέλο καταλληλότερο για τη μελέτη της νευροπροστασίας των υπό εξέταση χορηγούμενων φαρμάκων, καθώς υπάρχει μικρότερης έκτασης και πιο αργής εξέλιξης μείωση της ντοπαμίνης (Deumens et al., 2002). 24

26 Η MPTP είναι χημική ουσία που ανιχνεύεται σε νοθευμένα παρασκευάσματα ηρωίνης. Το μοντέλο MPTP είναι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο μοντέλο της νόσου για δύο κύριους λόγους: προκαλεί εκλεκτική καταστροφή των ντοπαμινεργικών νευρώνων και όταν χορηγηθεί σε ανθρώπους προκαλεί συμπτώματα όμοια με της ιδιοπαθούς νόσου του Parkinson (Smeyne & Lewis, 2005). Η χορήγηση MPTP σε πειραματόζωα προκαλεί εκφύλιση των ντοπαμινεργικών απολήξεων στο ραβδωτό σώμα και δημιουργία συσσωματωμάτων α- συνουκλεΐνης (όχι όμως στην ινιδιακή της μορφή). Μελετώντας το μηχανισμό δράσης της ουσίας διαπιστώθηκε ότι το MPTP δεν είναι τοξικό, αλλά το μεταβολικό του παράγωγο MPP + είναι αυτό που εισέρχεται στα νευρικά κύτταρα με τη βοήθεια του μεταφορέα της ντοπαμίνης και εμπλέκεται στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων στα μιτοχόνδρια και στη μεταφορά μονοαμινών μέσω των πλασματικών μεμβρανών. Και οι δύο παραπάνω διαδικασίες σχετίζονται με την επιβίωση των κυττάρων (Przedborski & Lewis, 1997; Schober, 2004). Ακόμη, έχει βρεθεί ότι δομικά παρόμοιες με το MPTP χημικές ουσίες που περιέχονται στα φυτοφάρμακα, όπως το paraquat και η ροτενόνη, όταν χορηγούνται συστηματικά, προκαλούν στα πειραματόζωα τα κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου του Parkinson. Ο πιθανός μηχανισμός είναι μέσω οξειδωτικών βλαβών (Betarbet et al., 2002). 3.2 Γενετικά μοντέλα Τα γενετικά μοντέλα που χρησιμοποιούνται για την μελέτη της νόσου του Parkinson είναι είτε διαγονιδιακά ζώα τα οποία υπερεκφράζουν το γονίδιο της α-συνουκλεΐνης, τα οποία κυρίως χρησιμοποιούνται για την μελέτη του ρόλου της πρωτεΐνης αυτής στην ντοπαμινεργική νευροεκφύλιση (Betarbet et al., 2002), είτε γενετικά τροποποιημένα ζώα τα οποία φέρουν μεταλλάξεις στα γονίδια που θεωρούνται υπεύθυνα για την κληρονομική μορφή της νόσου. Για παράδειγμα, ποντίκια στα οποία έχει απενεργοποιηθεί το γονίδιο PINK1 (PINK1 -/- ) παρουσιάζουν έντονη μείωση της μιτοχονδριακής αναπνοής στο ραβδωτό σώμα καθώς και μειωμένη απελευθέρωση ντοπαμίνης (Kitada et al, 2009). Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο weaver, ένα από τα πρώτα ζωικά μοντέλα που χρησιμοποιήθηκαν για την μελέτη των νευροεκφυλιστικών ασθενειών και το μοναδικό γενετικό προοδευτικής νευροεκφύλισης που συμβαίνει ενδογενώς. Tο μοντέλο weaver παρουσιάζεται πιο αναλυτικά αμέσως παρακάτω. 25

27 3.3 Το μοντέλο weaver Η μετάλλαξη weaver έχει αναγνωριστεί στον ποντικό ως μια αυτοσωμική, ατελώς επικρατής μετάλλαξη με λάθος νόημα στο γονίδιο Girk2 που εντοπίζεται στο 16 ο χρωμόσωμα και κωδικοποιεί την GIRK2 υπομονάδα της οικογένειας των GIRK διαύλων (G-protein Inward Rectifying K + channels) (Surmeier et al., 1996) Οι GIRK δίαυλοι Από τους πέντε GIRK διαύλους που έχουν αναγνωριστεί ως τώρα, οι GIRK1, -2 και -3 εκφράζονται στην παρεγκεφαλίδα, ενώ μόνο ο GIRK2 εκφράζεται και στη μέλαινα ουσία. Οι GIRK υπομονάδες συγκροτούν ετεροτετραμερή, διαμεμβρανικά σύμπλοκα που φέρουν από δύο έως τέσσερις διαφορετικές υπομονάδες, τα οποία αποτελούν μετασυναπτικά κανάλια ιόντων καλίου που συζεύγνυνται με G-πρωτεΐνες. Όπως φαίνονται στην εικόνα 7, οι αμινοξικές και οι καρβοξυτελικές περιοχές των υπομονάδων GIRK είναι ενδοκυτταρικές, ενώ οι υψηλά συντηρημένες περιοχές Μ1, Μ2 και η περιεχόμενη σε αυτές Η5 περιοχή δημιουργούν τον πόρο του διαύλου και είναι υπεύθυνες για την εκλεκτικότητά προς το K + (Hille, 2001) Η μετάλλαξη weaver Η μετάλλαξη weaver έχει ως αποτέλεσμα την αντικατάσταση μιας γλυκίνης από σερίνη στην θέση 156, η οποία εντοπίζεται στο εσωτερικό του πόρου. Συνέπεια της μετάλλαξης είναι η απώλεια της εκλεκτικότητας των διαύλων για τα Κ + (Patil et al., 1995), η αυξημένη εισροή Na + και η συνεχής εκπόλωση του κυττάρου. Τα κύτταρα χάνουν την ικανότητα απόκρισης σε νευροδιαβιβαστές που ενεργούν μέσω εισροής καλίου στο νευρικό κύτταρο, και ενεργοποιούνται συνεχώς και μη-επιλεκτικά (διεγερσιτοξικότητα). Οι ομοζυγώτες για τη μετάλλαξη εμφανίζουν εκλεκτική εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας και των κοκκιωδών παρεγκεφαλιδικών κυττάρων, καθώς και πολύ μεγάλη μείωση (>70%) των επιπέδων της ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα (Graybiel et al., 1990). Η νευροεκφύλιση είναι πιο δραματική τις πρώτες τρεις εβδομάδες 26 Εικόνα 7: Ιοντικός δίαυλος GIRK. Διακρίνονται οι καρβοξυτελικές και αμινοτελικές περιοχές και οι περιοχές Μ1 και Μ2 που σχηματίζουν τον πόρο.

28 μετά τη γέννηση, χρονικό διάστημα στο οποίο χάνεται το 50% των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας (Liss et al., 1999). Ο κυτταρικός θάνατος στους weaver φαίνεται πως εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Πιο συγκεκριμένα, τα κοκκιώδη παρεγκεφαλιδικά κύτταρα υφίστανται απόπτωση, ενώ μηαποπτωτικός θάνατος παρουσιάζεται στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες. Ο θάνατος άλλων τύπων κυττάρων, όπως τα Purkinje, είναι πιθανόν δευτερογενές αποτέλεσμα της απώλειας των κοκκιωδών κυττάρων. Όπως συμβαίνει και στο νευροεκφυλιστικό μοτίβο του Parkinson, στο μοντέλο weaver οι ντοπαμινεργικοί υποπληθυσμοί επηρεάζονται σε διαφορετικό βαθμό (Graybiel et al., 1900) Η παρεγκεφαλίδα των μυών weaver Η παρεγκεφαλίδα των weaver χαρακτηρίζεται από σημαντική ελάττωση του μεγέθους της (ατροφία) και από μείωση του αριθμού των κοκκιωδών κυττάρων. Η αιτία της αποκοκκίωσης είναι το γεγονός ότι οι κοκκιώδεις νευρώνες δεν μεταναστεύουν επιτυχώς κατά την ανάπτυξη με αποτέλεσμα να υφίστανται απόπτωση εκτοπικά, στην έξω κοκκιώδη στιβάδα (Hatten et al., 1986). Οι τύποι κυττάρων που χαρακτηρίζουν την παρεγκεφαλίδα των θηλαστικών (Purkinje, κοκκιώδη, αστεροειδή, καλαθοειδή και Golgi) είναι όλοι παρόντες στους ομοζυγώτες weaver, μειωμένοι όμως σε αριθμό και χωρίς την χαρακτηριστική γραμμωτή διάταξη (Sotelo, 1975). Στο επίπεδο του εμβρύου, μελετήθηκε η ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας και βρέθηκε χρονική καθυστέρηση στην αυλάκωση των ομοζυγωτών και μικρότερη καθυστέρηση στους ετεροζυγώτες (Bayer et al., 1996). Στην παρεγκεφαλίδα των weaver, εκτός από τα κοκκιώδη κύτταρα, δομικές ανωμαλίες παρουσιάζουν και τα κύτταρα της γλοίας (κύτταρα Bergmann), τα οποία είναι σημαντικά περισσότερα σε αριθμό και μεγαλύτερα σε μέγεθος (υπερτροφία). Αρχικά, οι ερευνητές πίστευαν πως η εκφύλιση των κοκκιωδών κυττάρων είναι δευτερογενής επίπτωση της αδυναμίας αλληλεπίδρασής τους με τα γλοία κύτταρα (Smeyne & Goldowitz, 1989). Μελέτες σε κυτταροκαλλιέργειες έδειξαν πως κοκκιώδη +/+ κύτταρα ήταν σε θέση να μεταναστεύουν επάνω σε υπόστρωμα τόσο +/+, όσο και wv/wv γλοίων κυττάρων. Αντίθετα κοκκιώδη wv/wv κύτταρα, δεν μετανάστευσαν επιτυχώς ανεξάρτητα από τον γενότυπο των γλοίων κυττάρων (Hatten et al., 1986). 27

29 4. Κυτταρικός θάνατος 4.1 Μορφές κυτταρικού θανάτου Ο κυτταρικός θάνατος διακρίνεται με βάση τα ιστολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά του σε δύο μορφές, τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (Programmed Cell Death, PCD) και τη νέκρωση. Ο νεκρωτικός κυτταρικός θάνατος (νέκρωση) επάγεται από εξωτερικούς παράγοντες (π.χ. μετά από τραυματισμό του ιστού, ισχαιμία ή/και επίδραση τοξικών παραγόντων) και προκαλεί φλεγμονώδη απόκριση. Είναι μη ρυθμιζόμενη γενετικά (παθητική) διαδικασία που προσβάλλει ομάδες κυττάρων κι έχει συγκεκριμένα μορφολογικά χαρακτηριστικά που συνίστανται σε διαταραχές στην κυτταρική μεμβράνη που επιτρέπουν την ανεξέλεγκτη εισροή ιόντων και H 2O στο κύτταρο προκαλώντας την διόγκωσή του (απώλεια ιοντικής ισορροπίας), αποδιοργάνωση του πυρήνα, των μιτοχονδρίων και του ενδοπλασματικού δικτύου, σχηματισμό κενοτοπίων στο κυτταρόπλασμα. Η έννοια του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, εισήχθη πρώτη φορά σε μελέτες αναπτυξιακής βιολογίας για να περιγράψει τον θάνατο των κυττάρων σε μια περιοχή του εμβρύου σύμφωνα με ένα συγκεκριμένο χρονοδιάγραμμα, προκειμένου να γίνει σωστά η ανάπτυξη του εμβρύου και η διαφοροποίηση των οργάνων (εικ.8). Εικόνα 8: Εξαφάνιση των μεσοδακτύλιων πτυχών με απόπτωση στο πόδι όρνιθας (πηγή: Majno & Joris, 1995). Οι δύο κύριες μορφές του προγραμματισμένου κυτταρικόυ θανάτου είναι η απόπτωση και η αυτοφαγία, με την πρώτη να τείνει να θεωρηθεί συχνά συνώνυμη του όρου, πιθανώς λόγω της πολύ μεγαλύτερης συχνότητας εμφάνισης της. 28

30 Η αυτοφαγία είναι ο κύριος ρυθμιζόμενος μηχανισμός του κυττάρου για την αποδόμηση των γηρασμένων πρωτεϊνών και των οργανιδίων. Πρόκειται για μια μηαναστρέψιμη διαδικασία αυτο-κανιβαλισμού, μέσω ενός λυσοσωματικού μονοπατιού αποδόμησης (Levine, 2005). Η απόπτωση είναι θεμελιώδης, φυσιολογική διαδικασία, η οποία υπεισέρχεται τόσο στη μορφογένεση των εμβρυικών ιστών όσο και στη διατήρηση της ομοιόστασης των ώριμων οργάνων. Χαρακτηρίζεται από συρρίκνωση του κυττάρου (μείωση του όγκου του κυτταροπλάσματος), απόσυρση των ψευδοποδίων και των μικρολαχνών, συμπύκνωση της χρωματίνης και διαχωρισμό της σε σαφείς διακριτές μάζες οι οποίες εφάπτονται επί της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης. Η κυτταρική μεμβράνη παραμένει ακέραια μέχρι τα τελικά στάδια της διαδικασίας, όμως στην κυτταρική επιφάνεια σχηματίζονται φυσαλίδες (budding). Τα αποπτωτικά σωματίδια που περιβάλλουν το κύτταρο φέρουν είτε πυρηνικό, είτε κυτταροπλασματικό υλικό (Tatton & Olanow, 1999). Σε αντίθεση με τη νέκρωση, η απόπτωση απαιτεί την κατανάλωση ενέργειας για την ελεγχόμενη φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών σωματιδίων και την αποφυγή φλεγμονής. 4.2 Η απόπτωση στο νευρικό σύστημα Η σπουδαιότητα της απόπτωσης έγκειται στη ρύθμιση του αριθμού και του είδους των κυττάρων που θα επιβιώσουν κατά την ανάπτυξη του κεντρικού και του περιφερικού νευρικού συστήματος. Ένα παράδειγμα αποτελεί η ανάπτυξη του εγκεφαλικού φλοιού όπου η απόπτωση αρχίζει τη 10η εμβρυϊκή ημέρα και στην 14η εμβρυϊκή ημέρα το 70% των φλοιϊκών κυττάρων έχουν πεθάνει ενώ στη 18η ημέρα μόνο το 50% των κυττάρων είναι αποπτωτικά. Στον ώριμο εγκέφαλο λίγα κύτταρα είναι αποπτωτικά. Αυτό συμβαίνει κυρίως στις ζώνες των διαιρούμενων κυττάρων και όχι στα μεταμιτωτικά κύτταρα. Ακόμη, ο αριθμός των κυττάρων Schwann ελέγχεται με απόπτωση και η επιβίωσή τους εξαρτάται από τα σήματα επιβίωσης μεταξύ των οποίων είναι οι νευράξονες. 4.3 Πρωτεΐνες ρυθμιστές της απόπτωσης Κασπάσες Οι κασπάσες είναι τα ένζυμα που παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην διαδικασία της απόπτωσης. Πρόκειται για πρωτεάσες που φέρουν το αμινοξύ κυστεΐνη στο ενεργό τους κέντρο και κόβουν τα υποστρώματα τους μετά από κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος, ρυθμίζοντας την ενεργότητά 29

31 τους θετικά ή αρνητικά. Υπάρχουν στο κυτταρόπλασμα ως ανενεργά προένζυμα (προκασπάσες) και διακρίνονται σε εναρκτήριες και εκτελεστικές. Οι εναρκτήριες ενεργοποιούν μέσω πρωτεόλυσης τις εκτελεστικές κασπάσες κι αυτές με τη σειρά τους πρωτεολύουν εκλεκτικά άλλες πυρηνικές και κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες. Διεγείρεται, δηλαδή, ένας πρωτεολυτικός καταρράκτης ο οποίος τελεικά θα οδηγήσει στον θάνατο (Μαρμάρας, 2005). Οι κυτταρικοί στόχοι των κασπασών είναι μόρια που παίρνουν μέρος σε επόμενα στάδια της διαδικασίας της απόπτωσης: ρυθμιστές της απόπτωσης, μόρια κυτταρικής προσκόλλησης, δομικές πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού και του πυρήνα, πρωτεΐνες που σχετίζονται με την σύνθεση, την επιδιόρθωση ή τον κατακερματισμό του DNA, μεμβρανικοί υποδοχείς κ.α. Οικογένεια Bcl-2 Κύριο ρόλο στη διαδικασία ρύθμισης της ενεργοποίησης των κασπασών διαδραματίζουν τα μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών Bcl-2 (εικ.9). Η υπεροικογένεια Bcl-2 απαριθμεί περισσότερα από είκοσι πρωτεϊνικά μέλη, τα οποία συμμετέχουν είτε επαγωγικά, είτε ανασταλτικά στον κυτταρικό θάνατο ρυθμίζοντας την διαβατότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης (Shimizu et al., 1999). Με αυτό τον τρόπο παρεμποδίζουν ή επάγουν την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C και των άλλων μιτοχονδριακών παραγόντων που επάγουν την απόπτωση (Μαρμάρας, 2005). Εικόνα 9: Ρύθμιση της απόπτωσης από πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2 (πηγή: journals.prous.com). Mεταξύ των μελών της οικογένειας Bcl-2 υπάρχει ομολογία στην αλληλουχία των αμινοξέων και παρουσιάζουν μέχρι και τέσσερις μικρές σε μήκος συντηρημένες περιοχές: οι περιοχές BH1, BH2, BH3 και ΒΗ4 (Bcl-2 homology domains). Η αντιαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 είναι μια μικρή πρωτεΐνη μεγέθους 25kDa, η οποία εδράζεται στην εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων. Είναι το πρώτο μέλος που ταυτοποιήθηκε, και για πρώτη φορά βρέθηκε στο ανθρώπινο λέμφωμα Β κυτταρικής σειράς (Β-cell leukemia). Η υπερέκφρασή της φαίνεται ότι εμπλέκεται στην ανθεκτικότητα των καρκινικών κυττάρων στον αποπτωτικό θάνατο (Krishna et al., 2011). 30

32 Η πρωτεΐνη Bcl-2 αλληλεπιδρά με την προαποπτωτική πρωτεΐνη Bax (Bcl-2 associated x protein), η οποία ανήκει στην ίδια οικογένεια. Οι δύο πρωτεΐνες σχηματίζουν ετεροδιμερή και η αναλογία Bcl-2/Bax είναι αυτή που καθορίζει την επιβίωση των κυττάρων ύστερα από ένα αποπτωτικό ερέθισμα. Είναι γνωστό πως τα προ-αποπτωτικά μέλη της Bcl-2 οικογένειας, Bax και Bak, τα οποία φυσιολογικά εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα, μετατοπίζονται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, ολιγομερίζονται και στη συνέχεια εισέρχονται στη μεμβράνη και δημιουργούν ένα δίαυλο ο οποίος διευκολύνει την απελευθέρωση κυτοχρώματος C (Suzuki et al., 2000). Αντίθετα, η πρωτεΐνη Bcl-2 και τα υπόλοιπα αντιαποπτωτικά μέλη της Bcl-2 οικογένειας δρουν έμμεσα: προσδένονται ειδικά στην ενεργοποιημένη διαμόρφωση του Bax, κι εμποδίζουν την ένθεση του Bax στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη (Perez & White, 2000). Οικογένεια ΙΑΡ Είναι πρωτεΐνες που δεσμεύονται στις προκασπάσες και τις κασπάσες, παρεμποδίζοντας την ενεργοποίησή τους και κατά την συνέπεια την απόπτωση (Μαρμάρας, 2005). 4.4 Η απόπτωση στη νόσο του Parkinson Η απόπτωση στα νευρικά κύτταρα μπορεί να συμβεί ως απόκριση σε διάφορα ερεθίσματα, πολλά από τα οποία σχετίζονται με την παθογένεση των νευροεκφυλιστικών ασθενειών στον άνθρωπο. Για παράδειγμα, η απόπτωση μπορεί να προκληθεί από έκθεση σε διεγερτικά αμινοξέα, στην τοξίνη MPTP (και τον μεταβολίτη της MPP + ), αναστολείς του μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι, προοξειδωτικά μόρια καθώς και από υπερέκφραση του μεταλλαγμένου γονιδίου της υπεροξειδικής δισμουτάσης (Tatton & Olanow, 1999). Υπάρχουν πολλές εργασίες που αναφέρουν αποπτωτικά χαρακτηριστικά σε μεταθανάτια εξέταση εγκεφάλων παρκινσονικών ασθενών. Γενικά, το σημείο-κλειδί στην αναγνώριση των χαρακτηριστικών αυτών, είναι ο κατακερματισμός του πυρηνικού DNA σε τμήματα ποικίλου μήκους, από ενδονουκλεάσες οι οποίες ενεργοποιούνται στα τελικά στάδια της απόπτωσης. Η πέψη αυτή είναι ανιχνεύσιμη με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα (δημιουργία χαρακτηριστικού ladder-pattern), η οποία όμως απαιτεί δείγμα από μεγάλο αριθμό νευρικών κυττάρων τα οποία εισέρχονται στο αποπτωτικό στάδιο συγχρονισμένα ή παραμένουν σε αυτό για μεγάλο χρονικό διάστημα. Δεδομένου ότι τίποτα από τα παραπάνω δεν συμβαίνει στη νόσο του Parkinson, απαιτείται μια διαφορετική τεχνική εξακρίβωσης της ύπαρξης ή μη, 31

33 αποπτωτικών χαρακτηριστικών (Olanow & Tatton, 1999). Μια συχνά χρησιμοποιούμενη σήμερα τεχνική είναι η TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)- mediated dutp Nick End Labeling) η οποία στηρίζεται στην ενσωμάτωση βιοτινυλιωμένης dutp στα 3 -άκρα θραυσμάτων DNA και στην επακόλουθη ανοσοϊστοχημική ανίχνευσή τους. Οι τεχνικές ISEL (In Situ End Labeling) και ISTN (In Situ Nick Translation) χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των μεταγραφικά ενεργών θέσεων στα χρωμοσώματα και στο κατακερματισμένο DNA. Σε μελέτη του μεσεγκεφάλου 11 παρκινσονικών ασθενών με την τεχνική ISEL, οι οκτώ από αυτούς εμφάνισαν έντονη πυρηνική χρώση, ενδεικτική της ύπαρξης κυττάρων στο στάδιο της απόπτωσης (Mochizuki et al., 1996). Με ηλεκτρονική μικροσκοπία ελέγχθηκε μεταθανάτια ο εγκέφαλος τριών ασθενών και το ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων ανερχόταν στο 6%, δηλαδή 6 φορές υψηλότερο από το ποσοστό που απαντάται φυσιολογικά στο νευρικό σύστημα. Παρατηρήθηκαν τα τυπικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένης της συμπυκνωμένης χρωματίνης καθώς και αποπτωτικά σωματίδια εγκολπωμένα σε γλοία κύτταρα. Στην ίδια εργασία βρέθηκαν και ντοπαμινεργικά κύτταρα με νεκρωτικά χαρακτηριστικά, υποδεικνύοντας πως η απόπτωση δεν είναι η μοναδική μορφή κυτταρικού θανάτου στη νόσο του Parkinson (Anglade et al., 1997). Παρόμοια αποτελέσματα δημοσιεύτηκαν σε μια ακόμη μελέτη, η οποία συνδύασε τις δύο παραπάνω τεχνικές (Tatton et al., 1998). Εκτός από τον εγκέφαλο των ασθενών με Parkinson μελετήθηκε και η πιθανή μεταβολή της ρύθμισης της απόπτωσης συνολικά στα κύτταρα του οργανισμού. Συγκεκριμένα εξέταση των λεμφοκυττάρων έδειξε σημαντικά αυξημένη δραστηριότητα της κασπάσης-3, και σαφή αρνητικό συσχετισμό των επιπέδων της πρωτεΐνης Bcl-2 με τη διάρκεια της ασθένειας (Blandini et al., 2004). 32

34 5. Οξειδωτικό στρες Η ύπαρξη δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS, Reactive Oxygen Species), γνωστών και ως προ-οξειδωτικά (pro-oxidants), είναι φυσιολογική ιδιότητα των αερόβιων οργανισμών. Ο σταθερός ρυθμός σχηματισμού των προοξειδωτικών εξισορροπείται από έναν παρόμοιο ρυθμό κατανάλωσής τους από τα αντιοξειδωτικά (anti-oxidants) με ενζυμικό ή μη ενζυμικό τρόπο (Sies, 1991). Το οξειδωτικό στρες (oxidative stress) προκύπτει από την ανισορροπία μεταξύ της παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου και της αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού, προς όφελος της πρώτης (Betteridge, 2000). Πρόκειται για μια πολυπαραγοντική κατάσταση που απαντάται στους οργανισμούς και αποτελεί ένα σύνολο αντιδράσεων με τελικό αποτέλεσμα τις οξειδώσεις μέσω των οποίων καταστρέφονται ή τροποποιούνται τα βιολογικά μόρια. 5.1 Ελεύθερες ρίζες Πρωταρχικό ρόλο στην δημιουργία οξειδωτικού στρες παίζουν οι ελεύθερες ρίζες (free radicals), πολύ δραστικά μόρια, λόγω του ενός ή περισσότερων ασύζευκτων ηλεκτρονίων που περιέχουν σε κάποια από τις εξωτερικές στιβάδες τους, με μικρή διάρκεια ζωής. Οι ελεύθερες ρίζες προκύπτουν είτε από αντιδράσεις οξειδοαναγωγής, είτε από ομολυτική διάσπαση ενός ομοιοπολικού δεσμού. Σε υψηλές συγκεντρώσεις οι δραστικές μορφές οξυγόνου προκαλούν βλάβες στα βιομόρια. Κυρίως η ρίζα υδροξυλίου (OH ) η οποία είναι η πιο ισχυρή, αντιδρά ακαριαία με τα λιπίδια των μεμβρανών, με το DNA, τις πρωτεΐνες και τις λιποπρωτεΐνες με Εικόνα 10: Δραστικές μορφές οξυγόνου (πηγή: αποτελέσματα καταστροφικά για το κύτταρο (Yiannakopoulou, 2009). 33

35 5.2 Οξειδωτικές βλάβες στα βιομόρια Όταν μια ρίζα αντιδράσει με ένα βιολογικό μόριο, τότε παράγεται μια δευτερογενής ρίζα, η οποία είναι είτε ασθενής (π.χ. ένα αντιοξειδωτικό μόριο), είτε ισχυρή. Στην δεύτερη περίπτωση προκαλούνται αλυσιδωτές αντιδράσεις που συχνά έχουν ως αποτέλεσμα την ολική καταστροφή του βιολογικού υλικού και οι οποίες μπορούν να σταματήσουν με δύο τρόπους: Α + Β ΑΒ Α + Q A + Q (μη δραστική ρίζα) Ο πρώτος τρόπος, δηλαδή η αντίδραση δύο ριζών προς σχηματισμό ενός ομοιοπολικού δεσμού είναι πρακτικά αδύνατος γιατί η συγκέντρωση των ριζών είναι πολύ χαμηλή, αφού αντιδρούν αμέσως. Ο δεύτερος τρόπος αποτελεί τον κύριο μηχανισμό αντιμετώπισης τον ελεύθερων ριζών στα κύτταρα και το μόριο Q είναι συνήθως η βιταμίνη C ή η βιταμίνη Ε. Πρωτεΐνες Για να μπορέσουν οι ROS να δράσουν στις πρωτεΐνες θα πρέπει να υπάρχουν αμινοξέα ευάλωτα στις δραστικές αυτές ρίζες. Τα αμινοξέα Met, Cys, Trp, Tyr, Phe και His είναι αυτά που προσβάλλονται πιο εύκολα, λόγω της αυξημένης δραστικότητας των θειούχων ή ακόρεστων ομάδων τους με τις ελεύθερες ρίζες. Η δράση των ROS εξαρτάται επίσης από την σημασία των αμινοξέων αυτών στη διαμόρφωση και τη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών καθώς και από την ικανότητα των πρωτεϊνών να επιδιορθώνουν εγκαίρως τις βλάβες που προκύπτουν. Η πιο συνηθισμένη τροποποίηση είναι η καρβονυλίωση, η οποία μπορεί να έχει πολλαπλές επιδράσεις στη φυσιολογική λετουργία του κυττάρου. DNA Οι οξειδωτικές βλάβες στο DNA περιλαμβάνουν βλάβες στο πυρηνικό και μιτοχονδριακό DNA. Αφορούν εγκοπές στη μία έλικα του DNA ή θραύσεις και στις δύο αλυσίδες του DNA. Επίσης, οι ελεύθερες ρίζες επιφέρουν χημικές τροποποιήσεις στις πουρίνες και τις πυριμιδίνες. Για παράδειγμα, η 8-υδροξυδεοξυγουανοσίνη είναι ένα από τα περίπου είκοσι γνωστά προϊόντα οξειδωτικής βλάβης και βρέθηκε σε αυξημένη συγκέντρωση σε μιτοχόνδρια τα οποία επωάστηκαν με προοξειδωτικούς παράγοντες (Richter at al., 1988). 34

36 Λιπίδια Τα λιπίδια, κύρια συστατικά των κυτταρικών μεμβρανών, αποτελούν τον βασικό στόχο των δραστικών μορφών οξυγόνου. Ιδιαίτερα ευάλωτα είναι τα υπολείμματα των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (polyunsaturated fatty acids, PUFAs). Η υπεροξείδωση λιπιδίων (εικ.11) ξεκινά με μια ρίζα να αντιδρά με ένα λιπαρό οξύ και να του αποσπά ένα άτομο υδρογόνου. Το άτομο άνθρακα από το οποίο αποσπάται το υδρογόνο αποτελεί τη γέφυρα ανάμεσα σε δύο διπλούς δεσμούς. Η ρίζα που δημιουργείται αναδιατάσσεται με ηλεκτρόνια από διπλανούς δεσμούς και παράγονται ανασυνδυασμένα διένια. Η ρίζα άνθρακα που σχηματίστηκε αντιδρά με ένα μόριο O 2 (το οποίο αντιδρά εύκολα με τις ελεύθερες ρίζες και υπάρχει σε υψηλές συγκεντρώσεις στο εσωτερικό των μεμβρανών) προς σχηματισμό μιας υπερόξυλρίζας (LOO ). Η τελευταία είναι πολύ δραστική και μπορεί να αποσπάσει ένα άτομο υδρογόνου από ένα γειτονικό μόριο λιπαρού Εικόνα 11: Στάδια υπεροξείδωσης λιπιδίων (Jairam et al., 2012). οξέος και να μετατραπεί σε υδρουπεροξείδιο (LOOH). Τα LOOH διασπώνται σε αλδεΰδες, οι οποίες αποτελούν και τα τελικά προϊόντα της υπεροξείδωσης λιπιδίων. Οι πιο σημαντικές είναι η μαλονική διαλδεΰδη (MDA), η οποία παραμένει στα κύτταρα των θηλαστικών και εμφανίζει μεταλλαξιγόνο δράση και η 4-υδροξυ-2-νονενάλη (ΗΝΕ), η οποία έχει πιο ήπια δράση και απορροφάται γρήγορα. μαλονική διαλδεΰδη (MDA) Αποτελεί τον πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη εκτίμησης της υπεροξείδωσης των βιολογικών υλικών. Ανάμεσα στις προτεινόμενες τεχνικές (π.χ. άμεση φασματοφωτομετρία, υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης), η αντίδραση με θειοβαρβιτουρικό οξύ προς σχηματισμό έγχρωμου προϊόντος είναι η πιο ταχεία, φτηνή κι ευαίσθητη τεχνική και αυτή που συνήθως χρησιμοποιείται εργαστηριακά (Velenzuela et al., 1991). 35

37 5.3 Μηχανισμοί αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού Οι οργανισμοί προκειμένου να αποτρέψουν την αλλαγή στην οξειδοαναγωγική ισορροπία και τις οξειδωτικές βλάβες, λόγω της συνεχούς έκθεσής τους στις ελεύθερες ρίζες έχουν αναπτύξει πλήθος αμυντικών μηχανισμών. Οι μηχανισμοί αυτοί αφορούν τόσο στην πρόληψη όσο και στην επιδιόρθωση των οξειδωτικών βλαβών και είναι φυσικοί, αντιοξειδωτικοί και ενζυμικοί μηχανισμοί (Valko et al., 2007). Ο πρώτος και πιο δραστικός μηχανισμός είναι η αποφυγή δημιουργίας ROS. Το 98% του μοριακού οξυγόνου ανάγεται σε νερό στο εσωτερικό των μιτοχονδρίων με την προσθήκη ενός ηλεκτρονίου σε κάθε στάδιο της αντίδρασης όπως φαίνεται στην εικόνα 12. Εικόνα 12: Αντίδραση αναγωγής του μοριακού οξυγόνου σε νερό (πηγή: Ωστόσο, κάποια μόρια οξυγόνου διαφεύγουν και σχηματίζουν δραστικές μορφές οξυγόνου. Σε αυτό το στάδιο χρειάζεται να ενεργοποιηθούν επόμενοι μηχανισμοί αντιοξειδωτικής άμυνας. Στην πρώτη γραμμή άμυνας βρίσκονται οι ενζυμικοί μηχανισμοί Ενζυμικοί αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί Υπεροξειδική δισμουτάση (SOD) Είναι ιδαίτερα ενεργό ένζυμο που απαντάται στους αερόβιους οργανισμούς σε δύο μορφές: την CuZn-SOD (κυτταροπλασματική και εξωκυτταρική μορφή) και την Mn-SOD (μιτοχονδριακή μορφή), οι οποίες εμφανίζουν ομολογία μόνο στο ενεργό τους κέντρο. Καταλύει την αντίδραση της δισμουτίωσης: 2O H + H 2O 2 + O 2 Καταλάση (CAT) Επίσης πολύ ενεργό ένζυμο το οποίο εδράζεται κυρίως στο ήπαρ και στα ερυθροκύτταρα, ενώ ενδοκυττάρια εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και στα υπεροξεισώματα. Στην ενεργή του μορφή αποτελείται από τέσσερις υπομονάδες, κάθε μια από τις οποίες φέρει στο ενεργό της κέντρο ένα μόριο αίμης. Καταλύει την αντίδραση: 2Η 2Ο 2 2Η 2Ο + Ο 2 36

38 Υπεροξειδάση της γλουταθειόνης (GPx) Το ένζυμο αυτό βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο ήπαρ και στα ερυθροκύτταρα, και σε μικρότερες στους μυς, τους πνεύμονες και τον εγκέφαλο. Αποτελείται από τέσσερις υπομονάδες, κάθε μια από τις οποίες φέρει στο ενεργό της κέντρο ένα άτομο σεληνίου. Δρα συνεργιστικά με το τριπεπτίδιο γλουταθειόνη (GSH), με υποστρώματα το υπεροξείδιο του υδογόνου ή άλλα οργανικά υδροϋπεροξείδια και καταλύει την αντίδραση: XOOH +2GSH XOH + Η 2Ο + GSSG (οξειδωμένη γλουταθειόνη). Έχει ανιχνευθεί ένα ακόμα είδος, η γλουταθειόνη S-τρανσφεράση (GST) το οποίο δεν απαιτεί ως συμπαράγοντα το σελήνιο και διαχειρίζεται μόνο τα υπόλοιπα υδροϋπεροξείδια και όχι το υπεροξείδιο του υδρογόνου Αντιοξειδωτικές ουσίες Πρόκειται για μικρομοριακές προστατευτικές ουσίες οι οποίες παίρνουν μέρος στην αλυσιδωτή αντίδραση και τη διακόπτουν. Αντιδρούν, δηλαδή, με μια ελεύθερη ρίζα, προς παραγωγή μιας σχετικά αδρανούς δευτερογενούς ρίζας, η οποία δε μπορεί να αντιδράσει με άλλα μόρια. Η αντίδραση αυτή προκαλεί οξείδωση του αντιοξειδωτικού, το οποίο πρέπει στη συνέχεια να αναγεννηθεί ή να αντικατασταθεί (Yiannakopoulou, 2009). Στις αντιοξειδωτικές ουσίες περιλαμβάνονται: το τριπεπτίδιο γλουταθειόνη (GSH), το οποίο αποτελεί υπόστρωμα του ενζύμου υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και ο βαθμός οξείδωσής του επηρεάζει την κυτταρική διαίρεση, την πρωτεϊνοσύνθεση, την ομοιόσταση του Ca ++ και την απελευθέρωση ορμονών και νευροδιαβιβαστών το ασκορβικό οξύ, το οποίο δρα απευθείας στις ελεύθερες ρίζες (ROS scavenger), διατηρεί τα μέταλλα στην ανηγμένη τους μορφή, επανανάγει τις αιμοπρωτεΐνες που περιέχουν σίδηρο και επαναγεννά την α-τοκοφερόλη από την οξειδωμένη μορφή της η α-τοκοφερόλη, ένας μη πολικός αντιοξειδωτής, ο οποίος προστατεύει τις μεμβράνες και τις λιποπρωτεΐνες από την οξειδωτική προσβολή. Το πρώτο προϊόν της αντίδρασης είναι η α-τοκοφερόξυ-ρίζα, η οποία επανανάγεται εύκολα, όμως η περαιτέρω οξείδωση της ουσίαςείναι μη αντιστρεπτή διαδικασία τα καροτενοειδή, πρόδρομα μόρια της βιταμίνης Α, τα οποία δρουν ως εκκαθαριστές του μονήρους οξυγόνου. Διοχετεύουν την ενέργεια από τα διεγερμένα μόρια στα καροτένια χωρίς τα ίδια να υφίστανται δομικές αλλαγές. 37

39 5.4 Το οξειδωτικό στρες στη νόσο του Parkinson Η παθογένεια της νόσου του Parkinson είναι πολυπαραγοντική, με δυο υποθέσεις να συγκεντρώνουν το κύριο ενδιαφέρον: η αύξηση του οξειδωτικού στρες και η τροποποίηση της μιτοχονδριακής δραστηριότητας. Μάλιστα η μια υπόθεση δε φαίνεται να αποκλείει την άλλη, αντίθετα ίσως δρουν συνεργιστικά (Bains & Shaw, 1997). Η οξειδωτική εικόνα του εγκεφάλου προσδιορίζεται σε πρώτο επίπεδο από τη μειωμένη ενεργότητα του συμπλόκου Ι της αναπνευστικής αλυσίδας των μιτοχονδρίων στη μέλαινα ουσία αλλά όχι και στις υπόλοιπες εγκεφαλικές περιοχές (Mizuno et al., 1989; Schapira et al., 1990). Η αναστολή του συμπλόκου Ι των μιτοχονδρίων έχει ως αποτέλεσμα τη διακοπή της μεταφοράς ηλεκτρονίων στην αναπνευστική αλυσίδα και τη διαταραχή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, με αποτέλεσμα τη μειωμένη παραγωγή ATP για το κύτταρο. Πολλά είναι τα πειραματικά δεδομένα που επιβεβαιώνουν την ύπαρξη αυξημένων επιπέδων οξειδωτικού στρες στους ασθενείς με Parkinson. Τα περισσότερα από αυτά προέρχονται από μεταθανάτια εξέταση του εγκεφάλου των ασθενών και από πειραματικά μοντέλα της νόσου. Τα επίπεδα της MDA στη μέλαινα ουσία (αλλά όχι στις άλλες εγκεφαλικές περιοχές) των ασθενών βρέθηκαν σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά άτομα (Dexter et al., 1989). Η ανηγμένη γλουταθειόνη είναι σημαντικά μειωμένη στον εγκέφαλο ασθενών με Parkinson (Halliwell, 2006; Jenner, 1993; Sian et al., 1994). Σε αυξημένη συγκέντρωση ανιχνεύονται η 4-υδροξυ-2-νονενάλη, τα υπεροξείδια των λιπιδίων καθώς και διάφορα προϊόντα οξειδωτικής βλάβης, όπως τα νουκλεοτίδια 8OHdG, 8OHG, τα πρωτεϊνικά καρβονύλια, η 3-νιτροτυροσίνη και η κυστεϊνυλντοπαμίνη (Halliwell, 2006). Οι περιβαλλοντικές τοξίνες που, όπως αναφέρθηκε και στο κεφάλαιο 3, αποτελούν παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση της νόσου του Parkinson (paraquat, ροτενόνη και MPTP) είναι αναστολείς του συμπλόκου Ι της αναπνευστικής αλυσίδας των μιτοχονδρίων. Πειράματα έχουν δείξει ακόμη, πως προκαλούν παραγωγή διάμεσων δραστικών ουσιών και αλκυλίωση ανηγμένων θειολών, καθώς και συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης (Ischiropoulos & Beckman, 2003). 38

40 Σε πιο προχωρημένα στάδια της νευροεκφύλισης στο μοντέλο MPTP, βρέθηκε σημαντικά αυξημένο ποσοστό ενεργοποίησης της μικρογλοίας. Το στοιχείο αυτό δείχνει την ύπαρξη νευροφλεγμονής ως αποτέλεσμα του οξειδωτικού στρες (Zhou ey al., 2008). Όπως φαίνεται παραπάνω, η μέλαινα ουσία παρουσιάζει αυξημένη ευαισθησία στο οξειδωτικό στρες, σε σύγκριση με τις υπόλοιπες εγκεφαλικές περιοχές. Αυτό συμβαίνει γιατί ο μεταβολισμός της ντοπαμίνης παράγει υπεροξειδικές ρίζες (Graham, 1978). Επίσης, η ντοπαμίνη έχει την τάση αυτοοξείδωσης προς παραγωγή νευρομελανίνης, μιας χρωστικής η οποία προσδίδει το χαρακτηριστικό μαύρο χρώμα στη μέλαινα ουσία και φυσιολογικά δρα ως scavenger ελεύθερων ριζών. Η αυτοοξείδωση της ντοπαμίνης περιλαμβάνει μια σειρά διαδοχικών οξειδωτικών αντιδράσεων, όπου παράγονται κινοειδή παράγωγα της ντοπαμίνης, τα οποία αποτελούν ισχυρούς νευροτοξικούς παράγοντες. Σε παθολογικές καταστάσεις, παράγεται μια δραστική μορφή οξυγόνου, η οποία ονομάζεται ημικινόνη της ντοπαμίνης. Η διαδικασία της αυτοοξείδωσης επάγεται από την παρουσία μεταβατικών μετάλλων, όπως ο δισθενής σίδηρος, ο οποίος στην μέλαινα ουσία ανιχνεύεται σε υψηλά επίπεδα (Jellinger et al., 1990). Εκτός από την επιτάχυνση της αυτοοξείδωσης της ντοπαμίνης, ο σίδηρος σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις, ξεφεύγει από τον έλεγχο της φερριτίνης και των άλλων πρωτεϊνών που τον δεσμεύουν, με αποτέλεσμα μέσω της αντίδρασης Fenton, να καταλύει τη μετατροπή του Η 2Ο 2 σε ρίζα υδροξυλίου, η οποία προσβάλλει το DNA και τα άλλα βιομόρια. Η διαδικασία αυτή συχνά εμπλέκει τη νευρομελανίνη. Τα επίπεδα του σιδήρου στη μέλαινα ουσία είναι ακόμα πιο αυξημένα στα προχωρημένα στάδια της νόσου (Jellinger et al., 1990). Η αυτοοξείδωση της ντοπαμίνης δε φαίνεται να συμβαίνει σε όλους τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες, αφού τα ποσά ενδοκυτταρικής νευρομελανίνης διαφέρουν σημαντικά ανάμεσα στους νευρώνες της μέλαινας ουσίας. Το ποσοστό νευροεκφύλισης στους παρκινσονικούς ασθενείς, δεν είναι ισότιμα κατανεμημένο στη μέλαινα ουσία, αλλά εντοπίζεται κυρίως στους πλούσιους σε νευρομελανίνη νευρώνες. Τα δυο παραπάνω στοιχεία στοχοποιούν τη διαδικασία της αυτοοξείδωσης της ντοπαμίνης ως εμπλεκόμενη στην παθογένεια της νόσου του Parkinson. 39

41 6. Νευροστεροειδή Η παρατήρηση ότι οι στεροειδείς ορμόνες βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις στον εγκέφαλο των ποντικών ανεξάρτητα από την παραγωγή τους από τους περιφερικούς ενδοκρινείς αδένες, άνοιξε τον δρόμο για την ανακάλυψη του βιοσυνθετικού μονοπατιού των στεροειδών ορμονών στα ολιγοδενδροκύτταρα του εγκεφάλου (Baulieu & Robel, 1990). Στα επόμενα χρόνια επιβεβαιώθηκε πως ο εγκέφαλος είναι ένας στεροειδογενετικός ιστός και εισήχθη ο όρος νευροστεροειδή, ο οποίος αναφέρεται σε αυτά τα στεροειδή τα οποία συντίθεται στο κεντρικό και το περιφερικό νευρικό σύστημα, είτε από χοληστερόλη είτε από άλλα -μεταφερόμενα μέσω της κυκλοφορίας- πρόδρομα μόρια των στεροειδών και διατηρούνται στο νευρικό σύστημα σε συγκεντρώσεις ανεξάρτητες από τον ρυθμό έκκρισής τους από στεροειδικούς αδένες (Plassart-Schiess & Baulieu, 2001). Στα νευροστεροειδή περιλαμβάνονται η πρεγνενολόνη (PREG) και η δεϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA), οι θειικοί τους εστέρες (PREGS και DHEAS), η προγεστερόνη (PROG) και μεταβολίτες, όπως το τετραϋδροπαράγωγο της προγεστερόνης, 3α,5α-τετραϋδροπρογεστερόνη (Baulieu, 1998). Εικόνα 13: Βιοσύνθεση των νευροστεροειδών από χοληστερόλη. 40

42 6.1 Σύνθεση, μεταβολισμός και μηχανισμός δράσης Η σύνθεση και ο μεταβολισμός των νευροστεροειδών γίνεται τόσο στα γλοία κύτταρα, όσο και στους νευρώνες (Plassart-Schiess & Baulieu, 2001). Τα γλοία κύτταρα θεωρούνται το κύριο σημείο σύνθεσης, ωστόσο έχει δειχθεί πως τα κύτταρα Purkinje, συνθέτουν ενεργά αρκετά νευροστεροειδή de novo από χοληστερόλη (Tsutsui et al., 2000). Η PREGS, ένα από τα νευροστεροειδή που συντίθενται από τα κύτταρα Purkinje φαίνεται πως εμπλέκεται σε σημαντικά παρεγκεφαλιδικά γεγονότα μέσω της ρύθμισης της νευροδιαβίβασης. Επίσης η προγεστερόνη (η οποία συντίθεται από τα ίδια κύτταρα κατά τη νεογνική ζωή) εμπλέκεται στην προαγωγή της ανάπτυξης των γλοίων και των νευρικών κυττάρων στην παρεγκεφαλίδα. Βιοσύνθεση και δράση νευροστεροειδών έχει βρεθεί και στα πυραμιδικά κύτταρα του ιπποκάμπου. Δεδομένου ότι και τα δύο αυτά είδη κυττάρων (παρεγκεφαλιδικά κύτταρα Purkinje και πυραμιδικά κύτταρα του ιπποκάμπου) παίζουν σημαντικό ρόλο στη μνήμη και τη μάθηση, υποδεικνύεται μια πιθανή φυσιολογική δράση των νευροστεροειδών (Tsutsui et al., 2000). Η έκφραση των στεροειδογενετικών ενζύμων ρυθμίζεται αναπτυξιακά: κάποια ένζυμα εκφράζονται μόνο κατά την διάρκεια της ανάπτυξης ενώ άλλα τόσο στην ανάπτυξη όσο και στην ενήλικη ζωή. Αυτά τα ένζυμα εκφράζονται στους νευρώνες και στα γλοία κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι τα δύο είδη κυττάρων δρουν συνεργιστικά για την παραγωγή λειτουργικών νευροστεροειδών (Compagnone & Mellon, 2000; Mellon & Griffin, 2002) Τα νευροστεροειδή δρουν αλλοστερικά στον υποδοχέα GABA A, στους NMDA και στους σ-υποδοχείς. (Baulieu, 1998). Στους GABA A υποδοχείς προκαλούν ταχεία μεταβολή στην διεγερσιμότητα του κεντρικού νευρικού συστήματος και η δράση τους μπορεί να είναι αγωνιστική ή ανταγωνιστική έναντι των υποδοχέων. Ένας υποδοχέας ειδικός για την προγεστερόνη (PROG-R) έχει εντοπιστεί στα γλοία κύτταρα του κεντρικού και του περιφερικού νευρικού συστήματος (Baulieu, 1998). Διάφορα νευροστεροειδή παίρνουν μέρος σε αυτοκρινικούς και παρακρινικούς μηχανισμούς. Ένας ακόμη μηχανισμός στεροειδικής δράσης είναι η δέσμευση της πρεγνενολόνης στην πρωτεΐνη MAP2 και η επακόλουθη αύξηση του πολυμερισμού της τουμπουλίνης. Αυτός ο μηχανισμός πιθανά παίρνει μέρος στην ρύθμιση της σύνθεσης των μικροσωληνίσκων και κατά συνέπεια στη νευρική πλαστικότητα και λειτουργία (Plassart- Schiess & Baulieu, 2001). 41

43 6.2 Τα ενδογενή νευροστεροειδή DHEA και DHEAS Εικόνα 14: Διακύμανση της συγκέντρωσης DHEAS στην κυκλοφορία στην διάρκεια ζωής του ανθρώπου (πηγή: Η δεϋδροεπιανδροστερόνη και ο θειικός της εστέρας είναι οι πιο άφθονες ορμόνες στην κυκλοφορία του αίματος, με συγκέντρωση φορές υψηλότερη από της τεστοστερόνης και φορές υψηλότερη από της οιστραδιόλης στον ενήλικο οργανισμό (Labrie et al., 2005). Τα επίπεδά τους στο αίμα είναι μέγιστα στο αναπτυσσόμενο έμβρυο και μειώνονται ραγδαία μετά τη γέννηση (εικ.14). Στην ηλικία των 6-7 ετών αρχίζουν να αυξάνονται πάλι (αδρεναρχή), επιτυγχάνουν μια μέγιστη συγκέντρωση στα έτη και σταδιακά μειώνονται κατά περίπου 2% κάθε χρόνο, μέχρι να φτάσουν το 10% αυτής της συγκέντρωσης στα 80 έτη (αδρενόπαυση). Μετά την ηλικία των 90 ετών δεν φαίνεται να υπάρχει καμία μεταβολή στα επίπεδα του DHEAS (Rogaeva et al., 2004). Ο χρόνος ημιζωής του DHEAS είναι 7-10 ώρες, ενώ του DHEA μόνο λεπτά, κατά συνέπεια η πρώτη μορφή συναντάται σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στην κυκλοφορία. Ωστόσο in vitro μελέτες έχουν δείξει πως το DHEA είναι η μορφή που είναι κυρίως υπεύθυνη για τις φυσιολογικές λειτουργίες. Περίπου η μισή ποσότητα DHEA του οργανισμού παράγεται στον φλοιό των επινεφριδίων, ενώ το υπόλοιπο στις γονάδες, τον λιπώδη ιστό και μια σημαντική ποσότητα στον εγκέφαλο. Στον εγκέφαλο τα κύτταρα που παράγουν DHEA είναι κυρίως τα αστροκύτταρα και σε πολύ μικρότερο βαθμό οι νευρώνες (Zwain & Yen, 1999). Οι άντρες εμφανίζουν 10-30% μεγαλύτερες συγκεντρώσεις DHEAS, στις γυναίκες όμως είναι υψηλότερη η ενεργότητα σουλφατάσης και ο λόγος DHEA/DHEAS. Οι διαφορές ανάμεσα στα φύλα μειώνονται σημαντικά από το 50 ο έτος της ηλικίας. Ο λόγος DHEA/DHEAS επηρεάζεται και από περιβαλλοντικούς παράγοντες όπως το κάπνισμα, η χρήση αλκοόλ, η παχυσαρκία και οι χρόνιες παθήσεις (Mobbs, 2004). 42

44 Η σημαντική μείωση της συγκέντρωσης των DHEA και DHEAS με την αύξηση της ηλικίας έχει γεννήσει την υπόθεση πως οι ουσίες αυτές παίζουν κάποιο ρόλο στην γήρανση κι επίσης έχουν προταθεί ως δείκτες γήρανσης. Υπάρχουν μάλιστα στοιχεία πως στην ηλικία των 90 ετών, όσο αυξάνεται η συγκέντρωση του DHEAS στην κυκλοφορία, τόσο πιο υγιής παρουσιάζεται συνολικά η εικόνα του οργανισμού (Rogaeva et al., 2004). 6.3 Νευροπροστατευτική δράση των DHEA και DHEAS Τα ενδογενή νευροστεροειδή, κυρίως το DHEA, επιδεικνύουν σημαντικές νευροπροστατευτικές και νευρογενετικές ιδιότητες τόσο in vitro όσο και in vivo, σε ζωικά μοντέλα. Υποδόρια χορήγηση DHEA σε ενήλικους αρσενικούς αρουραίους καθ όλη τη διάρκεια της ζωής, αύξησε τη νευρογένεση στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου κι επίσης ανταγωνίστηκε την ανασταλτική δράση της κορτικοστερόνης (Karishma & Herbert, 2002). Η χορήγηση DHEAS μπορεί να προλάβει ή να μειώσει τη νευροτοξική δράση στον ιππόκαμπο του NMDA τόσο in vivo όσο και in vitro, καθώς και των AMPA και καϊνικού οξέος in vitro. Δεδομένου ότι η απελευθέρωση γλουταμικού έχει δειχθεί ότι σχετίζεται με τη νευρωνική βλάβη που ακολουθεί την παρεγκεφαλιδική ισχαιμία, τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν την υπόθεση ότι τα μειωμένα επίπεδα DHEA (λόγω αυξημένης ηλικίας ή παθολογικής κατάστασης) στον ανθρώπινο εγκέφαλο αυξάνουν την πιθανότητα εμφάνισης τέτοιας βλάβης (Kimonides et al., 1998) 6.4 Άλλες δράσεις των DHEA και DHEAS Τα DHEA, DHEAS, καθώς και η αλλοπρεγνανολόνη (Allo) προστάτευσαν την κυτταρική σειρά PC12 (περιλαμβάνει κύτταρα από φαιοχρωμοκύττωμα αρουραίου) από επαγόμενη από στέρηση ορού απόπτωση. Τα παραπάνω αποτελέσματα ήταν χρονο- και δοσοεξαρτώμενα. Επίσης συγκρινόμενες με την αντιαποπτωτική δράση των υπόλοιπων στεροειδών ορμονών, οι 3 ουσίες αποδείχθηκαν σημαντικά πιο αποτελεσματικές. Στην προεπιβιωτική δράση των DHEAS και Allo, αποδεδειγμένα εμπλέκεται η αντιαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2, και μάλιστα ο ρόλος της είναι απαραίτητος αφού η προσθήκη Bcl-2 αντινοηματικών ολιγονουκλεοτιδίων αναιρούσε τα προηγούμενα αποτελέσματα (Charalampopoulos et al., 2004). Το DHEA βρέθηκε να μειώνει σημαντικά τους δείκτες οξειδωτικού στρες σε κύτταρα του ιπποκάμπου που προέρχονταν από ασθενείς με Alzheimer (Bastianetto et al., 1999), ενώ 43

45 τα ενδογενή επίπεδα DHEA σε ασθενείς με νόσο Alzheimer εμφανίζονται μειωμένα (Näsman et al., 1991; Sunderland et al., 1989). Η από του στόματος υποκατάσταση του DHEA μπορεί να προλάβει ή ακόμη και να αναστρέψει καταστάσεις που συνδέονται με τη γήρανση. Μελέτες έχουν δείξει ευεργετικές επιδράσεις του DHEA, που περιλαμβάνουν αντινεοπλασματική δράση, επίδραση στον διαβήτη, βελτίωση του λιπιδικού προφίλ και προστασία έναντι της ανάπτυξης αθηροσκλήρωσης. Έχει δειχθεί η αντιστρόφως ανάλογη σχέση των επιπέδων DHEAS στην κυκλοφορία με την εμφάνιση καρδιαγγειακών νοσημάτων και θνησιμότητας στους άντρες. Προτείνεται μάλιστα πως η συγκέντρωση DHEA μπορεί να αποτελέσει δείκτη πρόγνωσης ισχαιμικού καρδιακού επεισοδίου (Barrett-Connor et al., 1986; Feldman et al., 2001). Τα ίδια αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν εν μέρει μόνο σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, στις οποίες χαμηλές συγκεντρώσεις DHEA αυξάνουν τον καρδιαγγειακό κίνδυνο, δεν έχουν όμως επίδραση στο ποσοστό θνησιμότητας (Barrett-Connor et al., 1995; Mazat et al., 2001; Shufelt et al., 2010). Τα επίπεδα του DHEAS σχετίζονται άμεσα και αντίστροφα με την κλινικά διαγνωσμένη κατάθλιψη σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (Barrett-Connor et al., 1999). Χορήγηση DHEAS σε γυναίκες με μείζονα κατάθλιψη είχε σημαντικά αντικαταθλιπτικά αποτελέσματα (Wolkowitz et al., 1999) καθώς και βελτίωση της μνήμης και των γνωστικών λειτουργιών, όταν η χορήγηση έγινε μακροχρόνια χωρίς διακοπή (Gurnell & Chatterjee, 2001; Wolkowitz et al., 1997). Υπάρχουν ωστόσο και δεδομένα που κάνουν λόγο για τοξική δράση του DHEA όταν αυτό χορηγηθεί σε μεγάλες συγκεντρώσεις. Για παράδειγμα ηπατοτοξική δράση και δυσλειτουργία των ηπατικών μιτοχονδρίων έχει αναφερθεί (Mayer & Forstner, 2004). Σε άλλη εργασία βρέθηκε ότι υψηλές συγκεντρώσεις DHEA καταστέλλουν το σύμπλοκο I της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας και είναι νευροτοξικά τόσο in vitro, όσο και in vivo (Safiulina et al., 2006). 6.5 Το συνθετικό νευροστεροειδές BNN-50 Τα ενδογενή νευροστεροειδή DHEA και DHEAS έχουν επιβεβαιωμένη νευροπροστατευτική δράση. Όμως οι ουσίες αυτές στο ανθρώπινο σώμα μεταβολίζονται σε οιστρογόνα, ανδρογόνα ή προγεστερινοειδή, τα οποία προκαλούν σημαντικές ενδοκρινικές 44

46 παρενέργειες με κυριότερη την δημιουργία νεοπλασιών. Το γεγονός αυτό περιορίζει πολύ την δυνατότητα κλινικής του χρήσης. Για το λόγο αυτό, η επιστημονική ομάδα της κ. Καλογεροπούλου (Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Κρήτης) προχώρησε στη σύνθεση χημικά τροποποιημένων αναλόγων του DHEA (στη θέση του 3 ου και 17 ου άνθρακα του μορίου), με σκοπό την αύξηση της αντιαποπτωτικής και νευροπροστατευτικής τους δράσης και την αναστολή της ικανότητας μετατροπής τους σε οιστρογόνα ή ανδρογόνα (Calogeropoulou et al., 2009). Εξετάστηκε η αντιαποπτωτική ικανότητα των αναλόγων σε κύτταρα PC12 μετά από αποστέρηση ορού. Τα πιο αποτελεσματικά ανάλογα ήταν 3 σπιρο-εποξικά ανάλογα, το 17βspiro[5-androstene-17,20-oxiran]-3β-ol (ΒΝΝ20 ή BNN50), το (20S)-3β,21-dihydroxy-17β,20- epoxy-5-pregnene (ΒΝΝ23), και το (20R)-3β,21-dihydroxy-17R,20-epoxy-5-pregnene (ΒΝΝ27) (Calogeropoulou et al., 2009). Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκε το ανάλογο BNN-50, συγχορηγούμενο με τη N-ακετυλοκυστεΐνη. 45

47 7. Ν-ακετυλοκυστεΐνη (NAC) Η Ν-ακετυλοκυστεΐνη (εικ.15) αποτελεί την ακετυλιωμένη μορφή του αμινοξέος L- κυστεΐνη. Ο χημικός της τύπος είναι C 5H 9NO 3S και το μοριακό της βάρος ίσο με 163,19. Είναι πρόδρομο μόριο για την παραγωγή του μορίου της γλουταθειόνης (GSH). Εικόνα 15: Χημική δομή της NAC Για πρώτη φορά το 1963, βρέθηκε πως η NAC μπορούσε να δράσει ως βλεννολυτικό. Λόγω της μεγάλης σημασίας αυτής της ιδιότητας για τις χρόνιες πνευμονοπάθειες, γρήγορα βρήκε κλινική εφαρμογή και από τότε ξεκίνησε εκτεταμένη μελέτη της. Τα χρόνια που ακολούθησαν διαπιστώθηκε πως αποτελεί ένα πολύ αποτελεσματικό πρόδρομο μόριο, κι επίσης διεγείρει, τη σύνθεση της γλουταθειόνης (Weiss et al., 1996). 7.1 Μεταβολισμός Η NAC απορροφάται γρήγορα μετα από χορήγηση από το στόμα και η μέγιστη συγκέντρωση στο αίμα παρατηρείται μετά από περίπου μια ώρα. Μεταβολίζεται ταχύτατα και σε μεγάλο βαθμό στο εντερικό τοίχωμα και στο ήπαρ. Ένα από τα κύρια μονοπάτια του μεταβολισμού της NAC είναι η μετατροπή της σε L-κυστεΐνη και τελικά η ενσωμάτωση της κυστεΐνης σε γλουταθειόνη. Η χορήγηση NAC έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει τα επίπεδα γλουταθειόνης σε πειραματόζωα αλλά και στον άνθρωπο, ενώ το ίδιο δε συμβαίνει με την χορήγηση L-κυστεΐνης. Αυτό εξηγείται από το γεγονός ότι η L-κυστεΐνη γρήγορα οξειδώνεται σε L-κυστίνη, ένα αδιάλυτο δισουλφίδιο. Η μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα της NAC πηγάζει από την τάση των μορίων L-κυστεΐνης που προήλθαν από τον μεταβολισμό του NAC να ενσωματώνονται στη γλουταθειόνη, παρά να ακολουθούν άλλα μεταβολικά μονοπάτια (Bridgeman, 1991). 46

48 7.2 Μηχανισμοί δράσης Οι περισσότερες από τις ευεργετικές δράσεις της NAC πηγάζουν είτε από την ικανότητά της να μειώνει τον μεταβολισμό της L-κυστεΐνης και κυστίνη, είτε από το γεγονός ότι αποτελεί πηγή σουλφυδριλικών ομάδων (SH) και κατά συνέπεια διεγείρει την παραγωγή γλουταθειόνης, ενισχύει την δραστικότητα της S-μεταφοράσης της γλουταθειόνης, προάγει την αποτοξίνωση και δρα απευθείας ως εκκαθαριστής στις ενεργές ρίζες οξυγόνου (free radical scavenger). Υπάρχουν στοιχεία πως τόσο in vitro όσο και in vivo η παρουσία της NAC ενισχύει τη βιοσύνθεση της GSH. Σε πειράματα κυτταροκαλλιέργειας, η NAC προώθησε την επαναπρόσληψη κυστίνης από το μέσο της καλλιέργειας για την κυτταρική βιοσύνθεση της GSH (Issels et al., 1988). Άλλα πειραματικά δεδομένα προτείνουν ότι η NAC ασκεί προστατευτική δραση έναντι της προκληθείσας από το paraquat τοξικότητας σε κύτταρα αρουραίου, αυξάνοντας τη βιοσύνθεση της GSH και μειώνοντας την προκαλούμενη από τη νευροτοξίνη εξάντλησή της (Hoffer et al., 1996). Σε πειράματα σε αρουραίους αποφράχθηκε ο χοληδόχος πόρος. Η παρουσία της NAC αναίρεσε τα αποτελέσματα του επαγόμενου οξειδωτικού στρες, εμπόδισε τη μείωση της συγκέντρωσης της GSH, συνέβαλε στη διατήρηση της ρευστότητας των μεμβρανών και των δραστηριοτήτων της καταλάσης, της μιτοχονδριακής δισμουτάσης του σουπεροξειδίου (SOD) και των διαφορετικών μορφών της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GPx) σε αρουραίους (Pastor et al., 1997). Μια σημαντική φαρμακευτική χρήση της Ν-ακετυλοκυστεΐνης είναι ως αντίδοτο έναντι της παρακεταμόλης ουσία που μεταβολίζεται μερικώς σε NAPQI, το οποία εξαντλεί τα ενδοκυττάρια αποθέματα της γλουταθειόνης (Harvey et al., 1998). 7.3 Δράση της NAC σε μοντέλα νευροεκφύλισης Δεδομένης της δράσης της NAC ως αντιοξειδωτικό, θεωρείται πιθανό να μπορεί να φανεί χρήσιμο στη νευροπροστατευτική θεραπεία της νόσου του Parkinson, αφού το οξειδωτικό στρες αποτελεί μέρος της παθογένεσης της νόσου. Οι παρκινσονικοί ασθενείς εμφανίζουν χαμηλά επίπεδα GSH και GPx και η NAC όπως αναφέρθηκε παραπάνω αυξάνει την κυτταρική διαθεσιμότητα της γλουταθειόνης. 47

49 Σε in vitro μελέτες, έχει δειχθεί ότι η NAC είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην προστασία των νευρικών κυττάρων έναντι του προκαλούμενου από το οξειδωτικό στρες αποπτωτικού θανάτου. Επίσης αυξάνει τη δραστηριότητα του μιτοχονδριακού συμπλόκου Ι (Banaclocha, 2001). Σε πιο πρόσφατη εργασία, η NAC προστάτευσε τα κοκκιώδη παρεγκεφαλιδικά κύτταρα από την απόπτωση που προκαλείται από το προϊόν της λιπιδικής υπεροξείδωσης, 4-ΗΝΕ (Arakawa, 2007). Η NAC έχει χρησιμοποιηθεί και ως νευροπροστατευτικός παράγοντας σε μοντέλα μελαινοραβδωτής νευροεκφύλισης. Σε αρχέγονες καλλιέργειες εμβρυϊκών μεσεγκεφαλικών κυττάρων αρουραίου σε συνθήκες προκαλούμενου από την έκθεση σε MPTP οξειδωτικού στρες, η προσθήκη της NAC οδήγησε σε σημαντική αύξηση της επιβίωσης των ντοπαμινεργικών κυττάρων (Colton et al., 1995). Παρατηρήθηκε σημαντική επιβίωση των ντοπαμινεργικών κυττάρων μυών που ενέθηκαν με ΜΡΤΡ όταν πριν και μετά την έκθεσή τους στην τοξική ουσία, έλαβαν ενέσεις NAC. Ανάλογα αποτελέσματα βρέθηκαν και σε καλλιέργειες ντοπαμινεργικών κυττάρων (Park et al., 2004). Η NAC προστάτευσε in vivo τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες του ραβδωτού σε πειραματόζωα στα οποία ενέθηκε η ουσία 6-υδροξυντοπαμίνης (Munoz et al., 2004). 48

50 Σκοπός της εργασίας Kάθε διαθέσιμη, μέχρι σήμερα, θεραπεία της νόσου του Parkinson αφορά στον έλεγχο των συμπτωμάτων, αλλά δεν υπάρχει καμία επιβεβαιωμένη νευροπροστατευτική αγωγή. Η λεβοντόπα, η οποία αποτελεί το φάρμακο εκλογής είναι πρόδρομο μόριο της ντοπαμίνης. Παρά το γεγονός ότι αποτελεί την πιο αποτελεσματική συμπτωματική θεραπεία για τη βραδυκινησία και τη δυσκαμψία, ο τρόμος ηρεμίας και τα προβλήματα ισορροπίας του σώματος δεν αντιμετωπίζονται με τη λεβοντόπα. Επίσης παρουσιάζει μεγάλο αριθμό σοβαρών παρενεργειών, οι οποίες είναι πιο ήπιες στα πρώτα στάδια χορήγησης, ενώ αργότερα οι ακούσιες κινήσεις και η ημερήσια διακύμανση των συμπτωμάτων είναι χαρακτηριστικές και βασανιστικές για τον ασθενή. Όπως συμπεραίνεται, μείζον ζήτημα αποτελεί η ανακάλυψη ενός φαρμακευτικού σχήματος το οποίο θα έχει νευροπροστατευτική δράση και θα περιορίζει τις παρενέργειες. Σε προηγούμενα πειράματα της ερευνητικής μας ομάδας διερευνήθηκε η πιθανή νευροπροστατευτική δράση των νευροστεροειδών DHEAS καθώς και του χημικού του ανάλογου BNN-50 (το οποίο όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή δεν μεταβολίζεται σε οιστρογόνα). Πράγματι, η in vivo χρόνια χορήγηση (Ρ1-Ρ21) των DHEA, BNN-50 και του συνδυασμού BNN-50 και NAC οδήγησε σε σημαντική επιβίωση των κυττάρων της μέλαινας ουσίας στο παρκινσονικό μοντέλο weaver. Πιο συγκεκριμένα, η χορήγηση DHEAS και BNN-50 οδήγησαν σε 85% αύξηση των ντοπαμινεργικών κυττάρων στη μέλαινα ουσία σε σύγκριση με ομοζυγωτικούς weaver μύες στου οποίους χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός. Η συγχορήγηση όμως του BNN-50 με τη N- ακετυλοκυστεΐνη, επανέφερε τον αριθμό των ντοπαμινεργικών κυττάρων στη μέλαινα ουσία στα φυσιολογικά επίπεδα (εικ.16). Επιπλέον η χορήγηση του BNN-50 καθώς και του συνδυασμού BNN-50 και NAC παρέχουν προστασία και στους τελικούς ντοπαμινεργικούς νευράξονες στο ραβδωτό σώμα, υποδεικνύοντας ότι διέσωσαν τις λειτουργικές ντοπαμινεργικές απολήξεις (Δ.Δ., Μποτσάκης, 2013) 49

51 Εικόνα 16: Φωτογραφία από οπτικό μικροσκόπιο, στεφανιαίας τομής εγκεφάλου μυός, ηλικίας 21 ημερών σε μεγέθυνση 20x. A. (+/+) saline, B. (wv/wv) saline, C. (wv/wv) BNN και D. (wv/wv) BNN&NAC. Φαίνεται η περιοχή ενδιαφέροντος, SNpc, που περιλαμβάνει κεχρωσμένα τα ντοπαμινεργικά κύτταρα και τις ντοπαμινεργικές ίνες (Μποτσάκης, 2013). Σε αυτή την εργασία, θεωρήσαμε σκόπιμο να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς μέσω των οποίων επιτυγχάνεται η νευροπροστατευτική δράση του φαρμακευτικού συνδυασμού του νευροστεροειδούς BNN-50 με τη Ν-ακετυλοκυστεΐνη. Για το σκοπό αυτό, εξετάσαμε την αντιαποπτωτική και αντιοξειδωτική δράση της συγχορήγησης των δύο ουσιών. Για να εξετάσουμε την αντιαποπτωτική δράση μελετήσαμε εάν ο συνδυασμός ΒΝΝ- 50/NAC επηρεάζει τα επίπεδα της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2 και της προαποπτωτικής πρωτεΐνης Βax σε ομοζυγώτες weaver μυς. Επίσης, εξετάσαμε το λόγο τους, Bcl-2/Bax, ο οποίος, δεδομένου πως οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν ετεροδιμεριζόμενες και η αναλογία τους είναι αυτή που καθορίζει αν ένα κύτταρο θα οδηγηθεί σε απόπτωση, θεωρείται δείκτης πιο αξιόπιστος από τις μεμονωμένες τιμές. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων των δύο πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Western blotting. Στη συνέχεια, εξετάσαμε εάν η μακροχρόνια χορήγηση του συνδυασμού BNN- 50/NAC μεταβάλλει τα επίπεδα του οξειδωτικού stress, μελετώντας τα επίπεδα της μαλονικής διαλδεΰδης, ως δείκτη υπεροξείδωσης λιπιδίων. Χρησιμοποιήσαμε μια νεα, ευαίσθητη τεχνική προσδιορισμού δεικτών υπεροξείδωσης λιπιδίων (Grintzalis et al., 2012). 50

52 Πειραματικό μέρος 51

53 8. Υλικά και Μέθοδοι 8.1 Πειραματόζωα Τα πειραματόζωα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή ήταν φυσιολογικοί (+/+) και ομοζυγωτικοί weaver (wv/wv) μύες οι οποίοι διατηρήθηκαν και αναπαράχθηκαν στο ζωοτροφείο του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Τα πειραματόζωα διατηρούνταν σε συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας και με κύκλο φωτός /σκότους 12 ωρών, ενώ είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε νερό και τροφή. Όλα τα ζώα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ηλικίας 21 ημερών (Ρ21). Οι πειραματικές ομάδες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: Control saline: (+/+) μύες στους οποίους χορηχήθηκε ενδοπεριτοναϊκά διάλυμα φυσιολογικού ορού (0,9% NaCl) Weaver saline: (wv/wv) μύες στους οποίους χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά διάλυμα φυσιολογικού ορού (0,9% NaCl) Control BNN-50 & NAC: (+/+) μύες στους οποίους συγχορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά το NAC σε συγκεντρώσεις 14,7 mg/kg βάρους σώματος και το BNN-50 σε διάλυμα φυσιολογικού ορού (0,9% NaCl) και 1% αλκοόλη σε συγκεντρώσεις 10 mg/kg βάρους σώματος και 1% ζελατίνη. Weaver BNN-50 & NAC: (wv/wv) μύες στους οποίους συγχορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά το ΝAC και το BNN-50, όπως παραπάνω. Η χορήγηση των ουσιών ήταν μακροχρόνια, από την 1 η ημέρα μετα τη γέννηση τους (postnatal day 1, P1) ως την 21 η ημέρα (postnatal day 21, P21). Οι ουσίες που χορηγήθηκαν ήταν: Ν-Acetyl-L-cysteine (NAC) της εταιρείας Sigma-Aldrich και 17.beta.- spiro-[5-androsten-17,2'-oxiran]-3.beta.ol (BNN-50) της εταιρείας BIONATURE E.A. 52

54 8.2 Απομόνωση εγκεφαλικών περιοχών μυών Τα ζώα θυσιάστηκαν με αυχενική μετατόπιση και ο εγκέφαλος τους τοποθετήθηκε πάνω σε γυάλινη επιφάνεια που ακουμπούσε σε πάγο, όπου απομονώθηκε η περιοχή του μεσεγκεφάλου. Οι ιστοί ψύχθηκαν άμεσα σε υγρό άζωτο και εν συνεχεία αποθηκεύτηκαν στους -80 ο C. Οι ιστοί οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των οξειδωτικών δεικτών, πριν την κατάψυξη, βυθίστηκαν σε 150 μl ρυθμιστικού διαλύματος 10 mm Na2PO4, 0,5 mm BHA (λιπιδικός αντιοξειδωτής ο οποίος προστίθεται για να περιοριστεί η αυτοοξείδωση του ιστού) και ph=7,2. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων των Bcl-2 και Bax θυσιάστηκαν: 6 control saline 6 weaver saline 6 control BNN-50 & NAC και 6 weaver BNN-50 & NAC. Για τον προσδιορισμό τον οξειδωτικών δεικτών θυσιάστηκαν: 4 control saline 4 weaver saline 4 control BNN-50 & NAC και 4 weaver BNN-50 & NAC. 53

55 8.3 Προσδιορισμός των επιπέδων των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax Μέθοδος Western blotting αρχή της μεθόδου Επιτρέπει την εκλεκτική ανίχνευση μιας πρωτεΐνης αντιγόνου, με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων που έχουν παρασκευαστεί γι αυτό. Η μέθοδος περιλαμβάνει την ηλεκτροφορητική ανάλυση ενός πρωτεϊνούχου διαλύματος σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, την ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνες και τέλος τη δέσμευση των ειδικών αντισωμάτων στο αντιγόνο. Μετά από την κάλυψη των κενών θέσεων της μεμβράνης (blocking) πραγματοποιείται επώαση της μεμβράνης με ειδικό έναντι του υπό μελέτη αντιγόνου αντίσωμα. Στη συνέχεια, η μεμβράνη επωάζεται με αντίσωμα που αναγνωρίζει την Fc περιοχή του πρώτου αντισώματος. Το δεύτερο αντίσωμα είναι σεσημασμένο είτε ενζυμικά είτε ραδιενεργά, οπότε είναι δυνατή η ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος μετά από την προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος Επεξεργασία ιστού: Ανά εγκεφαλική περιοχή προστίθενται 800 μl διαλύματος 1% SDS (η ποσότητα είναι εμπειρική και αντιστοιχεί σε όγκο περίπου 5x το βάρος του ιστού) και 8 μl αναστολείς πρωτεασών (10% του όγκου του διαλύματος 1% SDS). Το διάλυμα θερμαίνεται για 5 λεπτά στους 100 ο C (σε υδατόλουτρο) και αναδεύεται έντονα σε vortex. Τέλος ομογενοποιείται σε συσκευή υπερήχων για 40 δευτερόλεπτα υπό ψύξη. Διαλύματα: Sodium-dodecyl-sulfate (SDS): ισχυρό ανιονικό απορρυπαντικό, το οποίο δεσμεύεται με τις πρωτεΐνες με σταθερή αναλογία βάρους (1,4 gr SDS ανά gr πρωτεΐνης) με αποτέλεσμα την αποδιάταξη της τριτοταγούς και τεταρτοταγούς δομής τους. Επίσης προσδίδει αρνητικό φορτίο σε όλες τις πρωτεΐνες και κατά συνέπεια κατά την ηλεκτροφόρηση οι πρωτεΐνες κινούνται μόνο βάσει του μοριακού τους βάρους (ΜΒ). Αναστολείς πρωτεασών (Ρ.Ι.): προκειμένου να αποφευχθεί η αποικοδόμηση των πρωτεϊνών στο ομογενοποίημα. 54

56 Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών με την μέθοδο BCA Για την μέτρηση της ολικής πρωτεΐνης κάθε δείγματος, χρησιμοποιήθηκε το Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit. αρχή της μεθόδου Οι πρωτεΐνες αντιδρούν με ιόντα χαλκού (Cu +2 ) σε αλκαλικό περιβάλλον και το αποτέλεσμα της αντίδρασης είναι η αναγωγή των δισθενών ιόντων Cu +2 σε μονοσθενή ιόντα Cu +1. Στη συνέχεια αυτά αντιδρούν με δύο μόρια BCA και το προϊόν της αντίδρασης είναι η δημιουργία χρώματος. Η χρωματογόνος αυτή ένωση παρουσιάζει υψηλή οπτική απορρόφηση σε μήκος κύματος 562nm, η οποία εμφανίζει γραμμικότητα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης σε ένα ευρύ φάσμα από 20μg/ml έως και 2.000μg/ml. α. Κατασκευή πρότυπης καμπύλης γνωστών συγκεντρώσεων πρωτεΐνης οπτικής απορρόφησης (OD) στα 562 nm. Τα πρότυπα δείγματα κατασκευάστηκαν σύμφωνα με τον επόμενο πίνακα, από stock διάλυμα αλβουμίνης (BSA) 2000 μg/ml (όπως προτείνεται στο πρωτόκολλο του kit). Πρότυπο Διάλυμα πρωτεΐνης SDS 1% Τελική συγκέντρωση Α 125 μl από το stock BSA 375 μl 500 μg/ml Β 100 μl από το stock BSA 700 μl 250 μg/ml C 400 μl από το Β 400 μl 125 μg/ml D 300 μl από το C 450 μl 50 μg/ml E 400 μl από το D 400 μl 25 μg/ml F 100 μl από το E 400 μl 5 μg/ml Προετοιμασία τριών (3) σωλήνων eppendorf για κάθε πρότυπο διάλυμα, τα οποία περιέχουν: 2 μl πρότυπου διαλύματος, 48 μl 1% SDS και 1ml αντιδραστηρίου. (Το τελικό αντιδραστήριο φτιάχνεται με την ανάμιξη των αντιδραστηρίων Α και Β που περιέχονται στο kit σε αναλογία A:B ίση με 50:1). 55

57 Επώαση των σωλήνων στους 60 ο C για 30 λεπτά. Μέτρηση της οπτικής απορρόφησης σε μήκος κύματος 562 nm. Υπολογισμός του μέσου όρου της οπτικής απορρόφησης για κάθε δείγμα. Κατασκευή πρότυπης καμπύλης συγκέντρωσης - οπτικής απορρόφησης με την χρήση του προγράμματος Microsoft excel. β. Υπολογισμός της συγκέντρωσης πρωτεΐνης στα δείγματα μέσω της εξίσωσης της ευθείας ελάχιστων τετραγώνων της πρότυπης καμπύλης. Προετοιμασία τριών (3) σωλήνων eppendorf για κάθε δείγμα ιστού, τα οποία περιέχουν: 2 μl δείγματος, 48 μl 1% SDS και 1 ml αντιδραστηρίου. (Το αντιδραστήριο φτιάχνεται όπως αναφέρεται παραπάνω). Επώαση των σωλήνων στους 60 ο C για 30 λεπτά. Μέτρηση της οπτικής απορρόφησης σε μήκος κύματος 562 nm. Υπολογισμός του μέσου όρου της οπτικής απορρόφησης για κάθε δείγμα. Υπολογισμός της συγκέντρωσης πρωτεΐνης στα δείγματα μέσω της εξίσωσης της ευθείας ελάχιστων τετραγώνων της πρότυπης καμπύλης SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και μεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Παρασκευή πηκτώματος το οποίο έχει συγκέντρωση ακρυλαμιδίου 15% στο κατώτερο τμήμα του (separating gel) και 4% στο ανώτερο τμήμα του (stacking gel). Οι ουσίες και οι ποσότητες που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των πηκτωμάτων φαίνονται στον παρακάτω πίνακα: Συστατικά Separating gel 15% Stacking gel 4% ddh 2O 3,5 ml 4,6125 ml Tris-HCl 1,5M ph 8,8 3,75 ml 1,875 ml 20% SDS 75 μl 37,5 μl 30% Acrylamide- Bisacrylamide 7,5 μl 1005 μl 10% Ammonium persulfate 75 μl 37,5 μl TEMED 7,5 μl 7,5 μl 56

58 Φόρτωση δειγμάτων στα πηγαδάκια σε όγκο που να περιέχει 40 μg πρωτεΐνης (όπως υπολογίστηκε με την μέθοδο BCA). Σε ένα από τα πηγαδάκια φορτώνεται και ο προχρωσμένος πρωτεϊνικός μάρτυρας (ladder), ο οποίος μας επιτρέπει να επιβεβαιώσουμε ότι οι ζώνες που εμφανίζονται αντιστοιχούν στην πρωτεΐνη που ψάχνουμε (και όχι σε μη-ειδική δέσμευση). Ηλεκτροφόρηση με την συσκευή SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης (παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης) η οποία ρυθμίζεται αρχικά στα 80 mv και στην συνέχεια στα 120 mv όταν το μέτωπο περάσει στο τμήμα του separating gel. Μεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με χρήση συσκευής ηλεκτροφορητικής μεταφοράς (παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος μεταφοράς), σε πάγο και υπό ανάδευση. Η συσκευή ρυθμίζεται στα 400 W/120 mv για 90 λεπτά Blocking, επώαση αντισωμάτων και εμφάνιση Επώαση της μεμβράνης σε διάλυμα 5% γάλακτος σε TBS-Tween για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ξέπλυμα της μεμβράνης σε TBS-Tween και over night επώαση στους 4 ο C με διάλυμα αντισώματος rabbit anti-bcl2 σε 5% γάλα (συγκέντρωση αντισώματος 1:1000). Ξέπλυμα της μεμβράνης και 1 ώρα επώαση σε θερμοκρασία δωματίου σε διάλυμα αντισώματος goat anti-rabbit σε 5% γάλα (συγκέντρωση αντισώματος 1:2000). Ξέπλυμα της μεμβράνης και εφαρμογή διαλύματος ενισχυμένης φωταύγειας ECL για 1 λεπτό. Το ECL περιέχει Η 2Ο 2 και λουμινόλη, μια ουσία η οποία έχει την ιδιότητα όταν είναι ενεργειακά οξειδωμένη να μεταπίπτει σταδιακά σε πιο σταθερή ενεργειακά κατάσταση με ταυτόχρονη εκπομπή φωτονίων. Αποτελεί υπόστρωμα της υπεροξειδάσης HRP (horse-raddish peroxidase) με την οποία είναι σημασμένα τα δεύτερα αντισώματα. Εμφάνιση της μεμβράνης σε φιλμ λιθογραφίας με την χρήση ειδικής κασετίνας: το φιλμ επωάζεται για 3 λεπτά στο διάλυμα του developer, ξεπλένεται με απεσταγμένο νερό και επωάζεται για 3 ακόμη λεπτά στο διάλυμα του fixer. Το φιλμ ξεπλένεται και αφήνεται να στεγνώσει. Η διαδικασία της εμφάνισης γίνεται στον σκοτεινό θάλαμο του εργαστηρίου. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται για το αντίσωμα rabbit anti-bax με δεύτερο αντίσωμα το goat anti-rabbit καθώς και για το αντίσωμα mouse anti β-actin με δεύτερο αντίσωμα το goat anti-mouse (στην τελευταία περίπτωση, λόγω του έντονου σήματος, η συγκέντρωση του δεύτερου αντισώματος ήταν 1: και ο χρόνος έκθεσης 1 λεπτό). 57

59 Η β-actin χρησιμοποιείται ως πρωτεΐνη αναφοράς, διότι βρίσκεται σε μεγάλες ποσότητες σε όλους τους ιστούς και δεν επηρεάζεται από νευροεκφυλιστικές ασθένειες και την λήψη φαρμάκων. Κατά συνέπεια η διακύμανση στις τιμές της ακτίνης θεωρείται ανάλογη των ποσοτικών σφαλμάτων κατά την φόρτωση των δειγμάτων και χρησιμοποιείται για κανονικοποίηση των υπόλοιπων τιμών. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής: rabbit anti-βcl2 και rabbit anti-bax της εταιρείας Cell Signaling goat anti-rabbit της εταιρείας της εταιρείας Molecular Probes mouse anti-β-actin και goat anti-mouse της εταιρείας SantaCruz Biotechnologies. Το διάλυμα ECL που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate της εταιρείας Millipore). Τα διαλύματα εμφάνισης ήταν τα Professional HC-110 Developer και T-max Fixer της εταιρείας Kodak Εξαγωγή αποτελεσμάτων Τα φιλμ σαρώνονται με υψηλή ανάλυση (1200 dpi) και αποθηκεύονται ως εικόνα με διαβάθμιση του γκρι (grey scale). Στην συνέχεια γίνεται η μέτρηση της αμαύρωσης του φιλμ με το πρόγραμμα ImageJ στην περιοχή που επιλέγουμε, δηλαδή σε μια ζώνη κάθε φορά. Το εμβαδό της καμπύλης που προκύπτει είναι ενδεικτικό της ποσότητας της πρωτεΐνης στο δείγμα, δεδομένου ότι η δεσμευμένη στην πρωτεΐνη (μέσω πρώτου και δεύτερου αντισώματος) HRP είναι αυτή που προκάλεσε την αμαύρωση του φιλμ. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται για όλα τα φιλμ και οι τιμές που παίρνουμε για κάθε πρωτεΐνη διαιρούνται με την τιμή της ακτίνης για να είναι όλες οι τιμές συγκρίσιμες μεταξύ τους. Τελικά, οι τιμές που υπολογίζουμε για κάθε δείγμα είναι οι: Bcl-2/β-actin, Bax/β-actin και ο λόγος Bcl-2/Bax. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Η σύγκριση μεταξύ των ομάδων διενεργήθηκε με ανάλυση μεταβλητότητας επαναλαμβανόμενων μετρήσεων ANOVA, με post-hoc ανάλυση LSD. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο P<0.05. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του στατιστικού πακέτου SPSS ( SPSS Inc. 2011, έκδοση 20.0). 58

60 8.4 Προσδιορισμός δεικτών οξειδωτικού στρες Χρησιμοποιήθηκε μια ευαίσθητη τεχνική για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των κύριων λιπιδικών και πρωτεϊνικών παραγώγων της υπεροξείδωσης μετά από την αρχική κλασμάτωση του δείγματος. Η τεχνική επιτρέπει τον φθορισμομετρικό προσδιορισμό της ελεύθερης και της δεσμευμένης-με-πρωτεΐνες μαλονικής διαλδεΰδης (FrMDA και PrMDA) και τον φωτομετρικό προσδιορισμό των ολικών και των πρωτεϊνικών υδροϋπεροξειδίων (LOOH και PrOOH). (Grintzalis et al., 2012) Επεξεργασία ιστού Τα δείγματα τα οποία έχουν αποθηκευτεί σε αντιοξειδωτικό ρυθμιστικό διάλυμα, ξεπαγώνονται και ομογενοποιούνται με ομογενοποιητή teflon και στην συνέχεια φυγοκεντρούνται στις rpm για 10 λεπτά, στους 4 ο C. Λαμβάνεται το υπερκείμενο και η διαδικασία επαναλαμβάνεται μετά από προσθήκη ακόμη 150 μl ρυθμιστικού διαλύματος. Στο συνολικό υπερκείμενο προστίθεται ίση με αυτό ποσότητα διαλύματος χλωροφορμίουμεθανόλης (σε αναλογία 2:1) και ίση με το 15% αυτού ποσότητα τριχλωρικού οξέος (100% TCA). Μετά από 20 λεπτά παραμονή στον πάγο τα δείγματα φυγοκεντρούνται στις rpm για 10 λεπτά, στους 4 ο C. Μεταγγίζουμε τις 3 προκύπτουσες φάσεις σε διαφορετικά eppendorf για να χρησιμοποιηθούν ως εξής: Οργανική φάση (επάνω): για τον προσδιορισμό LOOH Πρωτεϊνική φάση (μεσαία): για τον προσδιορισμό prooh και prmda Υδατική φάση (κάτω): για τον προσδιορισμό frmda. 59

61 Φθορισμομετρικός προσδιορισμός της ελεύθερης MDA (frmda) αρχή της μεθόδου Η φθορισμομετρική μέθοδος προσδιορισμού της MDA (ελεύθερης και πρωτεϊνικής) αποτελεί μια τροποποίηση της TBA assay. Βασίζεται στην αντίδραση σε όξινες συνθήκες του θειοβαρβιτουρικού οξέος (thiobarbituric acid, TBA) με τη μαλονική διαλδεϋδη (malondialdehyde, MDA) προς δημιουργία ενός φθορίζοντος (ex/em 535/550 nm) συμπλόκου MDA-(TBA)2. Αναμειγνύονται 250 μl από την υδατική φάση με τα αντιδραστήρια όπως φαίνονται στον παρακάτω πίνακα: Διαλύματα (μl) Τυφλό Αντιδραστηρίων Τυφλό Δείγματος Δείγμα Υπερκείμενο ιστού 5% TCA Διάλυμα εκχύλισης ,1Μ BHA Διαλύτης TBA Αντιδραστήριο ΤΒΑ Επώαση για 20' στους 90 ο C Ισοβουτανόλη Μετά από έντονο vortex γίνεται φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις rpm για να διαχωριστούν οι φάσεις. Μεταγγίζεται η υπερκείμενη οργανική φάση (η φάση της ισοβουτανόλης) και μετράται ο φθορισμός (σε μονάδες FU) στα 535/550 nm (Ex/Em) έχοντας ρυθμίσει το φθορισμόμετρο σε κατάσταση χαμηλής ευαισθησίας. Από την τιμή του δείγματος αφαιρούνται οι τιμές του τυφλού των αντιδραστηρίων και του τυφλού δείγματος για να βρεθεί η καθαρή τιμή. Το τελικό αποτέλεσμα υπολογίζεται με βάση την πρότυπη καμπύλη και εκφράζεται ως ισοδύναμα nmoles MDA/mg ολικής πρωτεΐνης του ιστού. 60

62 Αντιδραστήρια Διάλυμα TCA-HCl: Για 1.5 ml διαλύματος σύστασης 20% TCA, 2Ν HCl, αναμειγνύονται 1.25 ml 100% TCA και 2.5 ml πυκνό HCl. Διάλυμα ΤΒΑ: Διαλύονται 25 mg TBA (ΜΒ:144.1)/ml 0.2 Ν NaOH. Αντιδραστήριο TBA: Αναμειγνύονται σε αναλογία 1:1 διάλυμα TCA-HCl με διάλυμα ΤΒΑ. Το διάλυμα χρησιμοποιείται για τα δείγματα και τα τυφλά αντιδραστηρίων Φθορισμομετρικός προσδιορισμός της πρωτεϊνικής MDA (prmda) Το πρωτεϊνικό ίζημα (μεσαία φάση) διαλύεται σε 150 μl 0.1Ν NaOH. Μεταγγίζονται σε καθαρό eppendorf 80 μl από το διαλυμένο ίζημα και επωάζονται στους 60 ο C για 30 λεπτά ώστε να γίνει αλκαλική υδρόλυση των πρωτεϊνών και απελευθέρωση της MDA από τις πρωτεΐνες. Σε κάθε eppendorf συμπληρώνω ως τα 250 μl με0.1 NaOH και στη συνέχεια προστίθενται τα αντιδραστήρια σύμφωνα με τον πίνακα: Διαλύματα (μl) Τυφλό Αντιδραστηρίων Τυφλό Δείγματος Δείγμα Δείγμα σε 0.1 Ν NaOH Ν NaOH Μ BHA Διαλύτης TBA Αντιδραστήριο ΤΒΑ Επώαση για 20' στους 90 ο C Ισοβουτανόλη Μετά την προσθήκη της ισοβουτανόλης, ακολουθούνται τα βήματα όπως ακριβώς περιγράφονται στην παράγραφο και οι τιμές εκφράζονται επίσης ως ισοδύναμα nmoles MDA/mg ολικής πρωτεΐνης του ιστού. 61

63 Φωτομετρικός προσδιορισμός των οργανικών υδροϋπεροξειδίων (LOOH) αρχή της μεθόδου Ο φωτομετρικός προσδιορισμός των οργανικών υδροϋπεροξειδίων (μέθοδος FOX) βασίζεται στη χημική αντίδρασή τους με το δισθενή σίδηρο και την οξείδωσή του σε τρισθενή σίδηρο, ο οποίος προσβάλλει τη χρωστική xylenol orange που εμπεριέχεται στο αντιδραστήριο FOX και παράγεται έγχρωμο προϊόν που απορροφά στα 560 nm. Ενώνονται οι οργανικές φάσεις (όπως αναφέρεται στην παράγραφο ) από τουλάχιστον 2 ζώα της ίδιας κατηγορίας (pooling), και ο συνολικός όγκος εξατμίζεται στους 45 ο C για περίπου 2 ώρες. Προστίθενται 600 μl απόλυτης μεθανόλης, ακολουθεί έντονη ανάδευση και στην συνέχεια προσθήκη των αντιδραστηρίων όπως φαίνονται στον πίνακα: Διαλύματα (μl) Τυφλό Αντιδραστηρίων +Fe Δείγμα +Fe Τυφλό Αντιδραστηρίων Fe Δείγμα Fe Δείγμα σε 100% μεθανόλη % μεθανόλη Αντιδραστήριο FOX +Fe Αντιδραστήριο FOX Επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία και φωτομετρικός προσδιορισμός στα 560 nm. Η καθαρή τιμή του δείγματος υπολογίζεται από τον τύπο: (Δείγμα +Fe Τυφλό αντιδραστηρίων +Fe ) (Δείγμα Fe Τυφλό αντιδραστηρίων Fe ) Αντιδραστήρια Αντιδραστήριο FOX: Διαλύονται g xylenol orange σε 5ml ddh 2O και προστίθενται 70 μl πυκνό H 2SO 4. Ακολουθεί φυγοκέντρηση. Αντιδραστήριο FOX+Fe: Σε 1.5 ml αντιδραστηρίου FOX διαλύονται 2.3 mg Fe 2+. Ακολουθεί φυγοκέντρηση. 62

64 Φωτομετρικός προσδιορισμός των πρωτεϊνικών υδροϋπεροξειδίων (PrOOH) Τα υπόλοιπα του επαναδιαλυμένου πρωτεϊνικού ιζήματος, όπως αναφέρεται στην παράγραφο (η ποσότητα δηλαδή που δεν χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της prmda) μεταγγίζονται σε νέα eppendorf. Ενώνονται ανά 2 τουλάχιστον ζώα της ίδιας κατηγορίας (pooling) και η συνολική ποσότητα ογκομετρείται. Η αντίδραση FOX γίνεται σε χαμηλό ph, άρα πρέπει να εξουδετερώσουμε το NaOH. Η εξουδετέρωση γίνεται με την προσθήκη ποσότητας 10Ν HCl ίσης με το 1/100 του όγκου του δείγματος. Ο όγκος κάθε δείγματος συμπληρώνεται ως τα 285 μl με ddh 2O. Διαλύματα (μl) Τυφλό Αντιδραστηρίων +Fe Δείγμα +Fe Τυφλό Αντιδραστηρίων Fe Δείγμα Fe Δείγμα ddh 2O Αντιδραστήριο FOX +Fe Αντιδραστήριο FOX Επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία και φωτομετρικός προσδιορισμός στα 560 nm. Η καθαρή τιμή του δείγματος υπολογίζεται από τον τύπο: (Δείγμα +Fe Τυφλό αντιδραστηρίων +Fe ) (Δείγμα Fe Τυφλό αντιδραστηρίων Fe ) Μέτρηση της ολικής πρωτεΐνης των δειγμάτων Σε κάθε ένα από τα παραπάνω βήματα κρατήθηκαν 10 μl δείγματος για τον προσδιορισμό των επιπέδων ολικής πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα μετρήθηκε η πρωτεΐνη: στο φυγοκεντρημένο υπερκείμενο για την ποσοτικοποίηση των frmda και LOOH, στο διαλυτοποιημένο πρωτεϊνικό ίζημα για την ποσοτικοποίηση της prmda και στο εξουδετερωμένο με HCl διάλυμα του πρωτεϊνικού ιζήματος για την ποσοτικοποίηση των PrOOH. 63

65 Χρησιμοποιήθηκε μια υπερευαίσθητη τεχνική η οποία αποτελεί τροποποίηση της μεθόδου Bradford με ελάχιστο όριο ανίχνευσης τα 100 ng απόλυτης πρωτεΐνης (Georgiou et al., 2008). Η μέθοδος βασίζεται στην ηλεκτροστατικής φύσης αντίδραση των πρωτεϊνών με το αντιδραστήριο Coomassie Brilliant Blue G-250 η οποία ενισχύεται με την προσθήκη του υδρόφοβου αντιδραστηρίου TCA που προκαλεί την αύξηση του αριθμού των μορίων χρωστικής που προσδένονται ανά μόριο πρωτεΐνης. α. Κατασκευή πρότυπης καμπύλης γνωστών συγκεντρώσεων πρωτεΐνης- απορρόφησης (OD) στα 610 nm. Τα πρότυπα δείγματα πρωτεΐνης παρασκευάστηκαν από stock διάλυμα αλβουμίνης συγκέντρωσης 100 μg/ml σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Πρότυπο Stock BSA (μl) ddh 2O (μl) Τελική συγκέντρωση μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml μg/ml Προστίθενται τα αντιδραστήρια σύμφωνα με τον πίνακα: Διαλύματα (μl) Τυφλό Δείγματος Πρότυπο δείγμα γνωστής συγκέντρωσης Ομογενοποίημα - 50 ddh 2O 50 - Υδροφοβικό αντιδραστήριο CBB-TCA Επώαση για 5' σε θερμοκρασία δωματίου Σύντομη υπερήχηση (sonication) και μέτρηση απορρόφησης στα 610 nm 64

66 Κατασκευή πρότυπης καμπύλης συγκέντρωσης - οπτικής απορρόφησης με την χρήση του προγράμματος Microsoft excel. β. Υπολογισμός της συγκέντρωσης πρωτεΐνης στα δείγματα μέσω της εξίσωσης της ευθείας ελάχιστων τετραγώνων της πρότυπης καμπύλης. Προστίθενται τα αντιδραστήρια σύμφωνα με τον πίνακα: Διαλύματα (μl) Τυφλό Αντιδραστηρίων Δείγμα Ομογενοποίημα - 50 Ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης 50 - Υδροφοβικό αντιδραστήριο CBB-TCA Επώαση για 5' σε θερμοκρασία δωματίου Σύντομη υπερήχηση (sonication) και μέτρηση απορρόφησης στα 610 nm Συνήθως η αντίδραση πραγματοποιείται για διάφορες αραιώσεις του δείγματος, ώστε να επιβεβαιώνεται η τιμή στις διάφορες αναλογίες. Από την τιμή του δείγματος αφαιρείται η τιμή του τυφλού του αντιδραστηρίου και το τελικό αποτέλεσμα υπολογίζεται με βάση την πρότυπη καμπύλη και εκφράζεται συνήθως ως mg ολικής πρωτεΐνης (ισοδύναμα BSA)/ml ομογενοποιήματος. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Η σύγκριση μεταξύ των ομάδων διενεργήθηκε με ανάλυση μεταβλητότητας επαναλαμβανόμενων μετρήσεων ANOVA, με post-hoc ανάλυση LSD. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε στο P<0.05. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του στατιστικού πακέτου SPSS ( SPSS Inc. 2011, έκδοση 20.0). 65

67 9. Αποτελέσματα 9.1 Σύγκριση των επιπέδων των πρωτεϊνών Bcl-2 και Bax, καθώς και του λόγου τους στο μεσεγκέφαλο φυσιολογικών και ομοζυγωτικών weaver μυών πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Σύγκριση των επιπέδων της πρωτεΐνης Bcl-2 Εξετάσθηκαν οι μεσεγκέφαλοι 6 φυσιολογικών (+/+) και 6 ομοζυγωτικών weaver (wv/wv) μυών ηλικίας 21 ημερών, στους οποίους χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά διάλυμα φυσιολογικού ορού και ισάριθμων ζώων από την κάθε κατηγορία στα οποία χορηγήθηκε μακροχρόνια (P1-P21), ενδοπεριτοναϊκά, το φαρμακευτικό σχήμα BNN-50/NAC. Με τη μέθοδο Western Blotting προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-2, η οποία αποτελεί δείκτη της αποπτωτικής κατάστασης των μεσεγκεφαλικών κυττάρων. Η στατιστική επεξεργασία έγινε με τη δοκιμασία two-way anova, ακολουθούμενη από LSD, posthoc ανάλυση. Τα αποτελέσματα αναλύονται αμέσως παρακάτω και συνοψίζονται στον Πίνακα 1 και στο Γράφημα 1. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα τα επίπεδα της πρωτεΐνης Bcl-2 στο μεσεγκέφαλο ομοζυγωτικών weaver μυών είναι σημαντικά μειωμένα (κατά 49%) σε σύγκριση με τα φυσιολογικά ζώα (Πιν.1, Γραφ.1). Μακροχρόνια χορήγηση (Ρ1-Ρ21) του σχήματος BNN- 50/NAC προκάλεσε αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης Bcl-2 ίση με 185% σε ομοζυγώτες weaver. Έτσι η τιμή της πρωτεΐνης Bcl-2 όχι μόνο αποκαταστάθηκε στα επίπεδα των φυσιολογικών ζώων, αλλά τα υπερέβη σημαντικά κατά 44%. Στα φυσιολογικά ζώα, η μακροχρόνια χορήγηση του σχήματος BNN-50/NAC δεν προκάλεσε καμία μεταβολή των επιπέδων της πρωτεΐνης Bcl-2 (Πιν.1, Γραφ.1). Πίνακας 1: Σύγκριση των επιπέδων της πρωτεΐνης Bcl-2 σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με twoway anova ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. Πειραματική ομάδα (Ν=6) bcl-2 / β-actin * p<0,05 σε σύγκριση με τα control saline 0,466 ± 0,051 control BNN-50 / NAC 0,445 ± 0,040 weaver saline 0,236 ± 0,042** weaver BNN-50 / NAC 0,672 ± 0,095*, ### control saline ** p<0,01 σε σύγκριση με τα control saline ### p<0,001 σε σύγκριση με τα weaver saline 66

68 Γράφημα 1: Ιστογραμμική απεικόνιση και εικόνες από ενδεικτικά φιλμ ανοσοαποτύπωσης με τη μέθοδο Western blotting των επιπέδων της πρωτεΐνης Bcl-2 σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με two-way anova ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. 67

69 Σύγκριση των επιπέδων της πρωτεΐνης Bax Στη συνέχεια, με τη μέθοδο Western blotting, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της προαποπτωτικής πρωτεΐνης Bax στο μεσεγκέφαλο φυσιολογικών και ομοζυγωτικών weaver μυών που έλαβαν ενδοπεριτοναϊκά, είτε φυσιολογικό ορό, είτε το φαρμακευτικό σχήμα BNN- 50/NAC (Ρ1-Ρ21). Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η πρωτεΐνη Bax επίσης αξιολογείται ως δείκτης της αποπτωτικής κατάστασης των κυτταρων. Εξετάστηκαν 6 ζώα για καθεμία από τις τέσσερις κατηγορίες και η στατιστική επεξεργασία έγινε με τη δοκιμασία two-way anova, ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. Τα αποτελέσματα εκφρασμένα ως λόγος Bax/βακτίνη φαίνονται στον Πίνακα 2 και το Γράφημα 2. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα τα επίπεδα της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bax δε διαφέρουν σημαντικά ανάμεσα στους φυσιολογικούς και τους ομοζυγωτικούς weaver μυες (Πιν.2, Γραφ.2). Επίσης, η μακροχρόνια χοργηση του σχήματος BNN-50/NAC (Ρ1-Ρ21) στους ομοζυγώτες weaver μυς δεν προκάλεσε καμία αλλαγή στα επίπεδα της πρωτεΐνης Bax σε σύγκριση με τους ομοζυγώτες weaver που έλαβαν φυσιολογικό ορό. Ομοίως, όταν εξετάστηκαν τα επίπεδα της πρωτεΐνης σε φυσιολογικά ζώα που έλαβαν μακροσρόνια το σχήμα BNN- 50/NAC δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική μεταβολή σε σχέση με τα αντίστοιχα ζώα που έλαβαν ορό (Πιν.2, Γραφ.2). Πίνακας 2: Σύγκριση των επιπέδων της πρωτεΐνης Bax σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με twoway anova ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. Πειραματική ομάδα (N=6) bax/β-actin control saline 0,164 ± 0,009 control BNN-50 / NAC 0,170 ± 0,009 weaver saline 0,212 ± 0,033 weaver BNN-50 / ΝΑC 0,189 ± 0,037 Οι τιμές δεν εμφανίζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές 68

70 Γράφημα 2: Ιστογραμμική απεικόνιση NAC και εικόνες από ενδεικτικά φιλμ ανοσοαποτύπωσης με τη μέθοδο Western blotting των επιπέδων της πρωτεΐνης Bax σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 /. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με two-way anova ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. 69

71 Σύγκριση του λόγου Bcl-2/Bax Η ανεξάρτητη μελέτη των Bcl-2 και Bax δε θεωρείται αξιόπιστη όσον αφορά στην εξαγωγή συμπερασμάτων για τον τελικό προ ή αντι-αποπτωτικό μηχανισμό δράσης, αφού τα μόρια αυτά δε δρουν ανεξάρτητα. Η αλληλεπίδρασή τους είναι αυτή που καθορίζει εαν ένα κύτταρο θα οδηγηθεί σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο ή θα επιβιώσει (Oltval et al., 1993). Για το λόγο αυτό έγινε σύγκριση του λόγου Bcl-2/Bax. Η στατιστική επεξεργασία των τιμών έγινε με τη δοκιμασία two-way anova, ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. αποτελεσματα φαίνονται στον Πίνακα 3 και το Γράφημα 3. Τα Όπως φαίνεται (Πιν.3, Γραφ.3) ο λόγος Bcl-2/Bax στους ομοζυγώτες weaver ποντικούς που έλαβαν φυσιολογικό ορό είναι κατά 60% μειωμένος σε σύγκριση με τα φυσιολογικά ζώα. Σύγκριση του λόγου Bcl-2/Bax στο μεσεγκέφαλο ομοζυγωτικών weaver ποντικών στους οποίους χορηγήθηκε το φαρμακευτικό σχήμα BNN-50/NAC και ομοζυγωτικών weaver ποντικών στους οποίους χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός δείχνει εντυπωσιακή αύξηση, ίση με 218%. Η χορήγηση του σχήματος ΒΝΝ-50 /ΝΑC σε φυσιολογικούς μυς δεν προκάλεσε μεταβολή στο λόγο Bcl-2/bax σε σύγκριση με τα φυσιολογικά ζώα στα οποία χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός (Πιν.3, Γραφ.3). Οι τιμές του λόγου Bcl-2/Bax απεικονίζονται ιστογραμμικά (Γράφ.3), κι επίσης συνοψίζονται οι ενδεικτικές φωτογραφίες των φιλμ ανοσοαποτύπωσης για τις πρωτεΐνες Bcl- 2, Bax και β-actin, προς σύγκρισή τους. Πίνακας 3: Σύγκριση του λόγου Bcl-2/bax σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με two-way anova ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. Πειραματική ομάδα (N=6) bcl-2 / bax control saline 2,961 ± 0,494 control BNN-50 / NAC 2,618 ± 0,250 weaver saline 1,169 ± 0,047*** weaver BNN-50 / ΝΑC 3,714 ± 1,005 ### *** p<0,001 σε σύγκριση με τα control saline ### p<0,001 σε σύγκριση με τα weaver saline 70

72 Γράφημα 3: Ιστογραμμική απεικόνιση και εικόνες από ενδεικτικά φιλμ ανοσοαποτύπωσης με τη μέθοδο Western blotting του λόγου Bcl-2/bax σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με two-way anova ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. 71

73 9.2 Σύγκριση των επιπέδων της ελεύθερης, της πρωτεϊνικής και της συνολικής MDA στο μεσεγκέφαλο φυσιολογικών και ομοζυγωτικών weaver μυών πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC Σύγκριση των επιπέδων της ελεύθερης MDA (frmda) Μετρήθηκαν τα επίπεδα της ελεύθερης μαλονικής διαλδεΰδης στο μεσεγκέφαλο 4 φυσιολογικών και 4 ομοζυγωτικών weaver ποντικών ηλικίας 21 ημερών, στους οποίους συγχορηγήθηκαν μακροχρόνια (Ρ1-Ρ21), ενδοπεριτοναϊκά οι ουσίες BNN-50 και Ν- ακετυλοκυστεΐνη. Οι τιμές αυτές συγκρίνονται με τα αντίστοιχα επίπεδα της frmda στις ίδιες κατηγορίες πειραματοζώων τα οποία είχαν λάβει φυσιολογικό ορό. Η στατιστική επεξεργασία έγινε με τη δοκιμασία two-way anova, ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 4 και στο Γράφημα 4. Τα αποτελέσματα δείχνουν αυξημένα κατά 60% επιπέδα της ελεύθερης μαλονικής διαλδεΰδης στο μεσεγκέφαλο ομοζυγωτών weaver μυών σε σύγκριση με τα φυσιολογικά ζώα (Πιν.4, Γραφ.4). Η αυξημένη τιμή της ελεύθερης MDA δεν παρουσιάζει καμία μεταβολή μετά τη χορήγηση του σχήματος BNN-50/NAC στα (wv/wv) ζώα. Επίσης, τα φυσιολογικά ζώα στα οποία χορηγήθηκε BNN-50/NAC δεν παρουσιάζουν καμία μεταβολή σε σύγκριση με τα φυσιολογικά ζώα που έλαβαν φυσιολογικό ορό (Πιν.4, Γραφ.4). Πίνακας 4: Σύγκριση των επιπέδων της frmda σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με two-way anova ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. Πειραματική ομάδα (Ν=4) nmol frmda/mg πρωτεΐνης control saline 0,015 ± 0,002 control BNN-50 / NAC 0,011 ± 0,004 weaver saline 0,024 ± 0,002* * p<0,05 σε σύγκριση με τα control saline weaver BNN-50 / NAC 0,026 ± 0,008* 72

74 Γράφημα 4: Σύγκριση των επιπέδων της frmda σε (+/+) και (wv/wv) μυς πριν και μετά τη χορήγηση του φαρμακευτικού σχήματος BNN-50 / NAC. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με two-way anova ακολουθούμενη από LSD, post-hoc ανάλυση. 73