Χρωμοσωμική κοχεζίνη: σύνδεση της γήρανσης με τους μηχανισμούς απόκρισης σε βλάβες του DNA σε ωοκύτταρα θηλαστικών

Transcript

1 ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ 2014 Χρωμοσωμική κοχεζίνη: σύνδεση της γήρανσης με τους μηχανισμούς απόκρισης σε βλάβες του DNA σε ωοκύτταρα θηλαστικών Επιστημονικά Υπεύθυνος: Πέτρος Μαραγκός Επίκουρος Καθηγητής Αναπτυξιακής Βιολογίας Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Μέλος Ομάδας: Rolf Jessberger Professor and Director, Institute of Physiological Chemistry Dresden University of Technology, Germany Δεκέμβριος 2014

2 Περίληψη Στις μέρες μας, η αυξανόμενη τάση της γυναίκας να αναβάλλει την τεκνοποιία, έχει οδηγήσει σε αύξηση της υπογονιμότητας, της εμφάνισης εγκυμοσυνών με χρωμοσωμικές ανωμαλίες και της αναζήτησης θεραπειών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Η προχωρημένη αναπαραγωγική ηλικία της μητέρας αποτελεί αποδεδειγμένα τον κύριο παράγοντα κινδύνου εμφάνισης γενομικής αστάθειας. Βασικές αιτίες της εμφάνισης χρωμοσωμικών ανωμαλιών ενδέχεται να αποτελούν η ελλιπής αντιμετώπιση βλαβών του γενετικού υλικού των ωοκυττάρων ή η απώλεια του συμπλόκου της κοχεζίνης [1-6]. Με την μελέτη μας διαπιστώνουμε ότι τα νεαρά ωοκύτταρα θηλαστικών αναπτύσσουν ισχυρούς μηχανισμούς αντιμετώπισης βλαβών του DNA στη φάση-μ της Μείωσης Ι που εξαρτώνται από το μηχανισμό ελέγχου της ατράκτου αλλά και από άλλους σημαντικούς παράγοντες του κυτταρικού κύκλου όπως οι Chk1/2 και Mos/MAPK. Tα γερασμένα ωοκύτταρα δεν εμφανίζουν ισχυρή απόκριση σε βλάβες του DNA κατά τη διάρκεια της Μείωσης Ι. Η μελέτη πειραματόζωων που χρησιμοποιούνται ως μοντέλα για τη μελέτη του ρόλου της μειωτικής κοχεζίνης μας έδειξε πως η απουσία κοχεζίνης δεν είναι υπεύθυνη για την υπολειτουργία των μηχανισμών ελέγχου στα γερασμένα ωοκύτταρα. Αντίθετα, διαπιστώνουμε πως ο βασικός λόγος αδυναμίας των γερασμένων ωοκυττάρων να αντιμετωπίσουν βλάβες του DNA είναι, πρωτίστως, η περιορισμένη ενεργοποίηση του μηχανισμού ελέγχου της ατράκτου. Περίληψη στα Αγγλικά The increasing tendency of modern women to postpone childbearing has led to an increase in infertility, the development of pregnancies with chromosomal abnormalities and the pursuit for assisted reproductive treatments. Advanced maternal reproductive age has proven the main risk factor for genomic instability. Major causes of the occurrence of chromosomal abnormalities may be the inefficient response to DNA damage in oocytes or the loss of the cohesin complex. Through this work we find that young oocytes establish a strong response to DNA damage in the first meiotic M-phase. This response is dependent on the activation of the spindle assembly checkpoint but also other important cell cycle regulators such as Chk1/2 and Mos/MAPK. Αged oocytes do not show a strong response to DNA damage during meiosis I. The study of mouse models where meiotic cohesion is lost, show that loss of chromosome cohesion is not responsible for the absence of meiotic M-phase checkpoints. On the contrary, we find that reduced spindle assembly checkpoint activity is the primary cause for the inability of aged oocytes to respond to DNA damage.

3 Εισαγωγή Εγκυμοσύνες εμβρύων με χρωμοσωμικές ανωμαλίες μπορούν να προκαλέσουν σοβαρά προβλήματα στην υγεία της μητέρας, αποβολή του εμβρύου και χρόνια στειρότητα, ενώ εκείνες που καταλήγουν σε γεννήσεις προκαλούν πολύ σοβαρές αναπτυξιακές δυσλειτουργίες στο έμβρυο. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες στα έμβρυα κατά κανόνα προέρχονται από προβλήματα στο ωοκύτταρο και η συχνότητα αυτών των σφαλμάτων αυξάνεται με την ηλικία του ωοκυττάρου [7]. Χαρακτηριστικά, η πιθανότητα εμφάνισης τρισωμικής εγκυμοσύνης αυξάνεται από μόνο 2% για μία γυναίκα 20 ετών σε περίπου 35% στα 40 έτη [1]. Μία βασική αιτία του προβλήματος φαίνεται πως αποτελεί ο μη σωστός διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων κατά τη μείωση [1]. Η αύξηση της συχνότητας εμφάνισης χρωμοσωμικών ανωμαλιών με την ηλικία στα θηλαστικά, σχετίζεται με την επί μακρόν ακινητοποίηση των ωοκυττάρων στην πρόφαση της μείωσης. Τα ωοκύτταρα εισέρχονται στην πρόφαση της μείωσης κατά την εμβρυική ανάπτυξη και παραμένουν ακινητοποιημένα μέχρι τη στιγμή της ωορρηξίας που στον άνθρωπο μπορεί να συμβεί και ύστερα από 50 έτη ζωής. Συνεπώς, το ωοκύτταρο είναι ένα κύτταρο που γερνάει, γεγονός που προκαλεί προβλήματα στη λειτουργία του με την πάροδο του χρόνου. Βασική αιτία της δυσλειτουργίας της μείωσης στα ωοκύτταρα μεγάλης ηλικίας έχει θεωρηθεί πως είναι η απώλεια της κοχεζίνης. Η κοχεζίνη είναι το πρωτεϊνικό σύμπλοκο που συγκρατεί ενωμένα τα χρωμοσώματα μέχρι την ανάφαση της μείωσης και της μίτωσης [8]. Ο ρόλος της είναι διττός: α) συγκράτηση μητρικού και θυγατρικού χρωμοσώματος κατά τη φάση διπλασιασμού του DNA με σκοπό την πιστή αντιγραφή του DNA, β) σύνδεση (cohesion) των χρωμοσωμάτων με στόχο την αποφυγή του πρόωρου διαχωρισμού τους. Απουσία της κοχεζίνης προκαλεί σοβαρές δυσλειτουργίες. Ωοκύτταρα ποντικών όπου απουσιάζει ο παράγοντας κοχεζίνης Smc1β παρουσιάζουν αυξημένη χρωμοσωμική αστάθεια και ανευπλοειδία [9]. Επίσης, σε ωοκύτταρα ηλικιωμένων ποντικών απουσιάζει η κοχεζίνη Rec8 γεγονός που ενδέχεται να εξηγεί την ηλικιακά-εξαρτώμενη ανευπλοειδία [3,4]. Συνεπώς, η ηλικιακά-εξαρτώμενη γενομική αστάθεια ενδέχεται να σχετίζεται με τη δυσλειτουργία της κοχεζίνης. Εκτός της ηλικίας, ένας άλλος γνωστός παράγοντας πρόκλησης γενομικής αστάθειας και χρωμοσωμικών ανωμαλιών είναι η βλάβη του DNA [5,6,10]. Προκειμένου τα κύτταρα να αντιμετωπίσουν προσβολές του DNA αναπτύσσουν μηχανισμούς ελέγχου που εμποδίζουν τη λειτουργία και τον πολλαπλασιασμό σε κύτταρα με βλάβη μέχρι την επιδιόρθωση της. Σε πρόσφατες εργασίες μας όμως, διαπιστώνουμε πως τα ωοκύτταρα δεν διαθέτουν το μηχανισμό ελέγχου της φάσης G2/προφασης [2]. Το γεγονός αυτό καθιστά τους μηχανισμούς ελέγχου της φάσης-μ της μείωσης Ι ιδιαίτερα σημαντικούς για την αντιμετώπιση βλαβών στα ωοκύτταρα. Μία γνωστή συσχέτιση κοχεζίνης και βλαβών του DNA προκύπτει από το γεγονός πως η κοχεζίνη συμμετέχει στην επιδιόρθωση του DNA μετά από βλάβη. Σωματικά κύτταρα όπου απουσιάζουν παράγοντες που συγκροτούν την κοχεζίνη αδυνατούν να επιδιορθώσουν βλάβες στο DNA τους [11,12]. Η αδυναμία επιδιόρθωσης οδηγεί στην ισχυροποίηση των μηχανισμών ελέγχου βλαβών του DNA της μεσόφασης και τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου, πριν την είσοδο στη μίτωση, ώστε η βλάβη να μη μεταφερθεί στα θυγατρικά κύτταρα. Αποτελεί, επομένως, σημαντικό ερώτημα αν η ηλικιακά-εξαρτώμενη έλλειψη κοχεζίνης στα ωοκύτταρα εμποδίζει τη λειτουργία

4 μηχανισμών ελέγχου και επιδιορθωτικών μηχανισμών επιτρέποντας σε ωοκύτταρα με βλάβη στο DNA να εισέλθουν στη φάση της μειωτικής διαίρεσης. Ο τρόπος να αντιμετωπιστεί μελλοντικά το πρόβλημα της ηλικιακά-εξαρτώμενης γενομικής αστάθειας των ωοκυττάρων είναι, πρωτίστως, να αναγνωρίσουμε τους μηχανισμούς που το προκαλούν και την αλληλεπίδρασή τους. Από τα παραπάνω γίνεται αντιληπτό πως δύο βασικοί συντελεστές ηλικιακά-εξαρτώμενης γενομικής αστάθειας στα ωοκύτταρα ενδέχεται να είναι η διατήρηση βλαβών του DNA και η απώλεια κοχεζίνης. Έχει, επομένως, μεγάλη σημασία για την εξακρίβωση των αιτιών αύξησης της εμφάνισης γενομικής αστάθειας με την ηλικία, να μελετηθεί που οφείλεται η παρουσία βλαβών στο DNA των γερασμένων ωοκυττάρων και αν η ηλικιακά-εξαρτώμενη απουσία παραγόντων του κυτταρικού κύκλου και των μηχανισμών απόκρισης σε βλάβες του DNA μπορεί να είναι υπεύθυνη για την κατάσταση αυτή, οδηγώντας σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες στο έμβρυο. Με την παρούσα μελέτη επιδιώξαμε να εξακριβώσουμε τους μηχανισμούς που αναπτύσσονται ως απόκριση σε βλάβες του DNA στα ωοκύτταρα και τη σχέση αναπαραγωγικής ηλικίας με τη λειτουργία των μηχανισμών απόκρισης σε βλάβες του DNA στα ωοκύτταρα. Συγκεκριμένα η μελέτη μας κινήθηκε σε τέσσερις άξονες: α) την εξέταση των μηχανισμών ελέγχου βλαβών του DNA στη Μείωση Ι. β) την αναγνώριση των λόγων που οδηγούν στην απουσία ισχυρών μηχανισμών ελέγχου στα γερασμένα ωοκύτταρα. γ) τη διαπίστωση του ρόλου της κοχεζίνης στην ηλικιακά-εξαρτώμενη απουσία μηχανισμών ελέγχου στα ωοκύτταρα. δ) τη μελέτη του αν η μεγάλη αναπαραγωγική ηλικία και η έλλειψη κοχεζίνης προκαλούν δυσλειτουργία των μηχανισμών επιδιόρθωσης βλαβών του DNA στα ωοκύτταρα.

5 Μεθοδολογία Συλλογή και καλλιέργεια ωοκυττάρων Ωοκύτταρα στη φάση της πρόφασης συλλέχθηκαν από ποντίκια CD1 ηλικίας ημερών ή άνω των 50 εβδομάδων ώρες μετά τη χορήγηση της αναπαραγωγικής ορμόνης FSH. Τα ωοκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε σταγόνες θρεπτικών μέσων καλυπτόμενες από λάδι: σε θρεπτικό μέσο Μ2 για εργασίες εκτός επωαστικού κλιβάνου και σε θρεπτικό μέσο Μ16 για καλλιέργεια εντός κλιβάνου σε θερμοκρασία 37 ο C σε ατμόσφαιρα 5% CO 2. Η βλάβη του DNA έχει τη μορφή διπλών θραύσεων στην αλυσίδα του DNA και επάγεται από Ετοποσίδιο (Etoposide, 100μg/ml, 1h) κατά τη φάση της πρόφασης [2,14]. Μικροχειρισμός ωοκυττάρων Για την αποσιώπηση πρωτεϊνικών παραγόντων εντός των ωοκυττάρων έγινε χρήση morpholinos (MO) και αντιμορφών. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν φθορίζουσες πρωτεΐνες. Για το σκοπό αυτό έγινε μικρο-έγχυση ολιγονουκλεοτιδίων ΜΟ ή crna εντός των ωοκυττάρων ενώ βρίσκονταν στη φάση της πρόφασης σε θρεπτικό μέσο Μ2. Το ωοκύτταρο δεσμεύεται με μικροπιπέττα στήριξης και το υλικό έγχυσης εισέρχεται εντός του ωοκυττάρου μέσω μικροπιπέττας έγχυσης. Η ποσότητα έγχυσης αποτελεί περίπου το 5% του όγκου του ωοκυττάρου. Απεικονιστικά πειράματα Η διαπίστωση της θραύσης και της επιδιόρθωσής του DNA έγινε με την ανίχνευση της ιστόνης γη2αχ [15]. Πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκοπία για την παρατήρηση βλαβών του DNA, της μορφής της ατράκτου και της συμπεριφοράς των παραγόντων που συμμετέχουν στο μηχανισμό ελέγχου της ατράκτου. Πραγματοποιήθηκαν επίσης απεικονιστικά πειράματα ζωντανών ωοκυττάρων με χρήση φθορίζοντων δεικτών όπου διαπιστώνεται η φυσιολογική ή μη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Μοντέλα πειραματόζωων Στα πλαίσια της συγκεκριμένης μελέτης εξετάσαμε τη συμπεριφορά ωοκυττάρων knock-out μοντέλων ποντικών από τους οποίους απουσιάζουν συγκεκριμένοι παράγοντες που συγκροτούν την κοχεζίνη, όπως Smc1β, Rec8, Smc1α και Stag3 [8,9,13]. Στα παραπάνω πειραματόζωα έγινε προσπάθεια να μελετηθεί αν, κάτω από συνθήκες βλάβης του DNA, αντίθετα με τα φυσιολογικά ζώα, δεν ενεργοποιείται ο μηχανισμός ελέγχου της μειωτικής διαίρεσης και δε γίνεται επιδιόρθωση της βλάβης, επιτρέποντας σε ωοκύτταρα με βλάβη να εισέρχονται στην εμβρυική ανάπτυξη.

6 Αποτελέσματα Σε προηγούμενες μελέτες μας διαπιστώσαμε πως η πρόκληση διπλών θραύσεων του DNA των ωοκυττάρων κατά την φάση της πρόφασης δεν ενεργοποιεί την ανάπτυξη μηχανισμού ελέγχου αντίστοιχο με αυτόν των σωματικών κυττάρων της φάσης G2. Αντίθετα, τα ωοκύτταρα με τη βλάβη εισέρχονται στη μείωση Ι με την ίδια δυναμική που εισέρχονται και τα ωοκύτταρα χωρίς τη βλάβη. Επομένως, πιθανοί μηχανισμοί που αναπτύσσονται στη φάση-μ της μείωσης αποτελούν το μοναδικό εμπόδιο αντιμετώπισης της βλάβης πρωτού καταλήξει στο έμβρυο. Καθώς η δυσλειτουργία των μηχανισμών αυτών ενδέχεται να προκαλεί την αυξημένη γενομική αστάθεια στα γερασμένα ωοκύτταρα, ήταν σημαντικό να διερευνήσουμε την ύπαρξή τους και το ρόλο τους λεπτομερώς. Για το λόγο αυτό μελετήσαμε πως συμπεριφέρονται ωοκύτταρα με διπλές θραύσεις του DNA στη φάση-μ της μείωσης Ι. Διαπιστώσαμε πως, αντίθετα με τα φυσιολογικά ωοκύτταρα, τα ωοκύτταρα με βλάβη ακινητοποιούνται στη μείωση Ι. Περίπου 80% των φυσιολογικών ωοκυττάρων (control) ολοκληρώνουν τη μείωση Ι και αποβάλουν το πρώτο πολικό σωμάτιο (% Pb1) ενώ λιγότερο από 20% των ωοκυττάρων με βλάβη (ετοποσίδιο) ολοκληρώνει την πρώτη μείωση (Εικόνα 1A). Επιβεβαιώσαμε ότι τα κύτταρα που ακινητοποιούνται στη μείωση Ι διαθέτουν βλάβες καθώς ανιχνεύσαμε σε αυτά την ιστόνη γη2αχ (Εικόνα 1Β). Στη συνέχεια εξετάσαμε αν η ακινητοποίηση πραγματοποιείται πριν τη μετάφαση και την ενεργοποίηση του μηχανισμού αποδόμησης της κυκλίνης Β και της Securin. Οι δύο αυτοί παράγοντες πρέπει να αποδομηθούν προκειμένου να αποδεσμευθούν οι πρωτεάσες (σεπαράση) που καταστρέφουν την κοχεζίνη των χρωμοσωμάτων ωστε να διαχωριστούν τα χρωμοσώματα κατά την ανάφαση. Για το λόγο αυτό εισάγαμε στα ωοκύτταρα μια φθορίζουμε μορφή της Geminin (Geminin-GFP) που διαθέτει την ίδια κινητική με την κυκλίνη Β αλλά δεν επηρεάζει τις διαδικασίες ης φάσης-μ. Διαπιστώνουμε ότι στα κύτταρα που έχουν υποβληθεί σε Ετοποσίδιο δεν ενεργοποιείται ο μηχανισμός καταστροφής (Εικόνα 1C). Επομένως τα ωοκύτταρα αυτά βρίσκονται στην προμετάφαση. Στη συνέχεια εξετάσαμε αν η κατάσταση της ατράκτου επιβάλει την ακινητοποίηση. Ο λόγος της ακινητοποίησης δεν είναι η απουσία ή κάποια δυσμορφία της πρώτης μειωτικής ατράκτου μικροσωληνίσκων (tubulin) καθώς τόσο τα φυσιολογικά όσο και τα ωοκύτταρα με βλάβη διαθέτουν πλήρως σχηματισμένες ατράκτους 6 ώρες μετά τη διάσπαση του ωοκυτταρικού πυρηνικού φακέλου (GVBD) (Εικόνα 1D). Διαπιστώσαμε όμως πως τα χρωμοσώματα δεν είναι ευθυγραμμισμένα στον ισημερινό της ατράκτου αλλά εμφανίζουν μορφή συσσωματώματος (Εικόνα 1D). Η απουσία ευθυγράμμισης των χρωμοσωμάτων λογικά θα προκαλούσε την ενεργοποίηση του μηχανισμού ελέγχου της ατράκτου (ΜΕΑ). Ο ΜΕΑ είναι ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών όπως οι Mad2, Bub1, BubR1 και Mps1 το οποίο σχηματίζεται στους κινητοχώρους των χρωμοσωμάτων όταν αυτά δεν είναι ευθυγραμμισμένα στην μειωτική ή μιτωτική άτρακτο. Μόνο όταν ευθυγραμμιστούν τα χρωμοσώματα αποσιωπάται ο μηχανισμός αυτός και απελευθερώνεται η λιγάση που δρομολογεί την καταστροφή της κυκλίνης Β. Στα ωοκύτταρα με βλάβη του DNA διαπιστώνουμε πως ισχυροποιείται ο ΜΕΑ και πως διατηρείται ενεργός σε όλη τη διάρκεια της μείωσης Ι. Μέσω ανοσοφθοριμού και

7 συνεστιακής μικροσκοπίας διακρίνουμε πιο έντονο εντοπισμό των παραγόντων Mad2 και Bub1 στους κινητοχώρους (CREST) των ωοκυττάρων που έχουν επωαστεί με Ετοποσίδιο σε σχέση με τα φυσιολογικά (control) (Εκονα 2Α, 2Β). Για να εξετάσουμε την αναγκαιότητα του ΜΕΑ για την επιβολή ακινητοποίησης στη φάση- Μ παρουσία βλάβης του DNA απομακρύναμε ή απενεργοποιήσαμε παράγοντες που συγκροτούν το μηχανισμό. Απομακρύναμε τον Mad2 με χρήση ειδικών ΜΟ, απενεργοποιήσαμε τον Bub1 μέσω χρήσης αντιμορφών (dominant-negative, dn) και τον Mps1 μέσω του ειδικού αναστολέα του ΑΖ3146 (Mps1i). Και στις τρεις περιπτώσεις διαπιστώνουμε πως η απενεργοποίηση του ΜΕΑ επιτρέπει την ολοκλήρωση της μείωσης Ι (% Pb1) (Εικονα 2C). Ο παράγοντας Mps1 είναι ιδιαίτερα σημαντικός για την εγκαθίδρυση του ΜΕΑ καθώς η απουσία του εμποδίσει τη συσσώρευση στους κινητοχώρους άλλων ΜΕΑ παραγόντων (Εικόνα 2D- Nabti et al., 2014). Συνεπώς, ο ΜΕΑ είναι αναγκαίος για την ακινητοποίηση των ωοκυτταρων με βλάβη του DNA στη φάση-μ της μείωσης. Στη συνέχεια εξετάσαμε αν υπάρχουν και άλλοι παράγοντες του κυτταρικού κύκλου που να ενισχύουν το μηχανισμό ελέγχου της μειωτικής φάσης-μ μετά από βλάβη του DNA. Εξετάσαμε, επομένως, το ρόλο των παραγόντων ΑΤΜ, Chk1 και Chk2. Οι παράγοντες αυτοί συμμετέχουν στους μηχανισμούς ελέγχου βλάβης του DNA στη μεσόφαση αλλά έχει διαπιστωθεί η παρουσία τους και κατά τη φυσιολογική μίτωση σε θέσεις της ατράκτου. Απενεργοποιήσαμε τους παράγοντες ΑΤΜ και Chk1/Chk2 με τους ειδικούς αναστολείς KU55933 (ATMi) και AZD7762 (Chk1/2i) αντίστοιχα. Διαπιστώσαμε πως ενώ η αναστολή του ΑΤΜ δεν επηρεάζει την ακινητοποίηση στη φάση-μ, η απενεργοποίηση των Chk1 και Chk2 επιτρέπει την ολοκλήρωση της μείωσης Ι παρουσία βλάβης στο DNA (Εικόνα 3Α). Επομένως, οι κινάσες του μεσοφασικού ελέγχου βλαβών στο DNA, Chk1 και Chk2, συμμετέχουν στο μηχανισμό ελέγχου βλαβών στο DNA στη μείωση Ι των ωοκυττάρων. Ένα σηματοδοτικό μονοπάτι που παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μείωσης στα ωοκύτταρα είναι το μονοπάτι Μοs/MAPK. Μέχρι τώρα γνωρίζαμε για τον κυτταροστατικό του ρόλο στη μείωση ΙΙ. Στα πλαίσια της μελέτης μας εξετάσαμε αν το μονοπάτι αυτό μπορεί να επιδράσει κυτταροστατικά και στη μείωση Ι. Για το λόγο αυτό απενεργοποιήσαμε την κινάση ΜΑΡΚ με τον αναστολέα UO126 (MAPKi) και διακόψαμε την έκφραση του Mos με ειδικά ΜΟ. Διαπιστώσαμε πως αναστολή του μονοπατιού Μοs/MAPK εμποδίζει την ανάπτυξη του μηχανισμού ελέγχου (Εικόνα 3Β). Ενδεχομένως, το γεγονός αυτό να οφείλεται στην ενεργοποιητική δράση της ΜΑΡΚ επί του Mps1. Επομένως, το σηματοδοτικό μονοπάτι Μοs/MAPK δρα κυτταροστατικά στα ωοκύτταρα που εμφανίζουν βλάβη του DNA στη μείωση Ι. Καθώς τα γερασμένα ωοκύτταρα είναι γνωστό πως είναι επιρρεπή σε ανευπλοειδίες, ενδιαφερθήκαμε να εξετάσουμε αν τα ηλικιωμένα ωοκύτταρα είναι επιρρεπή και στη συσσώρευση βλαβών του DNA. Μελετήσαμε αρχικά αν η βλάβη του DNA γίνεται αντιληπτή από το μηχανισμό ελέγχου βλαβών του DNA στη μείωση Ι. Διαπιστώσαμε πως τα γερασμένα (aged) ωοκύτταρα εξέρχονται της μείωσης Ι παρουσία βλάβης του DNA σε ποσοστό περίπου 60% ενώ τα νεαρά (young) ωοκύτταρα σε ποσοστό μόλις 15% (Εικόνα 4Α). Αυτό το γεγονός δείχνει πως τα γερασμένα ωοκύτταρα δε διαθέτουν ευαίσθητους μηχανισμούς ελέγχου βλαβών του DNA στη φάση-μ της μείωσης Ι και μπορούν να εισέλθουν στη δεύτερη μειωτική διαίρεση παρουσία βλάβης.

8 Στη συνέχεια εξετάσαμε πιθανούς λόγους στους οποίους θα μπορούσε να οφείλεται η έλλειψη απόκρισης σε βλάβες στη μείωση Ι στα γερασμένα ωοκύτταρα. Μέσω ανοσοφθορισμού και σε συνδυασμό με συνεστιακή μικροσκοπία, διαπιστώσαμε πως πολλοί παράγοντες που συμμετέχουν ή εξαρτώνται από το ΜΕΑ παρουσιάζουν μειωμένη τοποθέτηση στους κινητοχώρους των γερασμένων ωοκυτταρων της μείωσης Ι σε σχέση με τη μείωση Ι των νεαρών ωοκυττάρων (Εικόνα 4Β, 4C). Εκτός από τον Mad2 που δεν εμφανίζει ιδιαίτερες διαφορές, οι παράγοντες Bub1 και BubR1 εμφανίζονται στους κινητοχώρους σε χαμηλότερα επίπεδα στα ηλικιωμένα ωοκύτταρα. Το ίδιο συμβαίνει και στα επίπεδα της κινάσης Plk1 που η παρουσία της στους κινητοχώρους εξαρτάται από τον ΜΕΑ. Δε διαπιστώθηκαν διαφορές στα επίπεδα του Mos μεταξύ νεαρών και ηλικιωμένων ζώων. Από τα αποτελέσματα αυτά οδηγούμαστε στο συμπέρασμα πως η απουσία ισχυρής απόκρισης σε βλάβες στη μειωτική φάση-μ των γερασμένων ωοκυττάρων οφείλεται στη δυσλειτουργία του ΜΕΑ. Μήπως, όμως και η περιορισμένη παρουσία της κοχεζίνης στα χρωμοσώματα περιορίζει την ευαισθησία των μηχανισμών ελέγχου των γερασμένων ωοκυττάρων; Για να εξετάσουμε αυτό το ερώτημα χρησιμοποιήσαμε μοντέλα πειραματόζωων όπου λείπουν παράγοντες που συμμετέχουν στη συγκρότηση της κοχεζίνης (knockout- KO). Εξετάσαμε τέσσερα τέτοια μοντέλα (Rec8 KO, Smc1α KO, Smc1β KO Stag3 KO) με την απαίτηση τουλάχιστον ένα να μας δώσει το απαραίτητο υλικό που χρειαζόμαστε για τα πειράματά μας. Οι ωοθήκες των ΚΟ για τους παράγοντες Rec8, Smc1α και Stag3 δε διέθεταν ωοκύτταρα. Ο πιθανός λόγος αυτού του φαινομένου είναι η σημαντική συμβολή της κοχεζίνης στις διεργασίες του μειωτικού ομόλογου ανασυνδυασμού. Απουσία κοχεζίνης ο ανασυνδυασμός ενδέχεται να είναι προβληματικός ενεργοποιώντας το μηχανισμό ελέγχου του μειωτικού ανασυνδυασμού που οδηγεί σε απόπτωση. Το φαινόμενο φαίνεται να είναι πιο ήπιο στα Smc1β KO ποντίκια με αποτέλεσμα να μπορέσουμε να συλλέξουμε ωοκύτταρα για τις ανάγκες της μελέτης. Όμως οι αριθμοί των ωοκυττάρων ήταν χαμηλότεροι από εκείνους των φυσιολογικών ζώων (wild type-wt) και περιορίζονταν μόνο σε ποντίκια μέχρι τριών μηνών. Τα μεγαλύτερα σε ηλικία ζώα ήταν στείρα λόγω απουσίας ωοκυττάρων. Στα Smc1β KO ποντίκια διαπιστώσαμε πως δεν ολοκληρώνεται η μείωση Ι στα ίδια ποσοστά με τα φυσιολογικά ζώα (Εικόνα 5Α). Επιπλέον, η διάρκεια της φάσης-μ της μείωσης I είναι μεγαλύτερη (Εικόνα 5Β). Δημιουργείται έτσι η εντύπωση πως απουσία κοχεζίνης, ακόμα και όταν δεν υφίσταται βλάβη του DNA, ενεργοποιείται μηχανισμός ακινητοποίησης των ωοκυττάρων στη φάση Μ της μείωσης. Το φαινόμενο αυτό δεν παρατηρείται στα ηλικιωμένα ωοκύτταρα όπου τα επίπεδα ολοκλήρωσης της μείωσης Ι είναι όμοια με εκείνα των νεαρών ωοκυττάρων (Εικόνα 4Α). Για το λόγο αυτό εξετάσαμε την ενεργοποίηση του ΜΕΑ στα Smc1β KO ωοκύτταρα. Διαπιστώσαμε πως παράγοντες όπως ο Mad2 δείχνουν πιο έντονη παρουσία στους κινητοχώρους των KO σε σχέση με τα WT φυσιολογικά ζώα (Εικόνα 5C). Το γεγονός αυτό ενδεχομένως να οφείλεται στο ότι απουσία κοχεζίνης τα χρωμοσώματα δεν είναι απολύτως ενωμένα και δεν μπορούν να τοποθετηθούν σωστά στη μειωτική άτρακτο με συνέπεια την ενεργοποίηση του ΜΕΑ. Η ενεργοποίηση του μηχανισμού ακινητοποίησης είναι πιο έντονη όταν στα Smc1β KO ωοκύτταρα προκαλούμε βλάβη του DNA με Ετοποσίδιο. Κατά συνέπεια, ενώ περίπου 80% των φυσιολογικών ωοκυττάρων ολοκληρώνουν τη μείωση Ι, μόλις 30% των ΚΟ παρουσία βλάβης εξέρχονται της μείωσης Ι (Εικόνα 5Α). Τα αποτελέσματα αυτά μας

9 δείχνουν πως η απουσία κοχεζίνης ενεργοποιεί τους μηχανισμούς ακινητοποίησης της φάσης-μ, όπως ο ΜΕΑ, και δεν τους αναστέλλει. Κατά συνέπεια, η έλλειψη κοχεζίνης δεν παίζει ρόλο στη μειωμένη ευαισθησία του μηχανισμού ελέγχου της μείωσης Ι στα γερασμένα ωοκύτταρα. Αφού διαπιστώσαμε πως τα γερασμένα ωοκύτταρα διαθέτουν δυσλειτουργικούς μηχανισμούς ελέγχου σε βλάβες του DNA στη φάση-μ της μείωσης, εξετάσαμε την αποτελεσματικότητα των μηχανισμών επιδιόρθωσης στα ωοκύτταρα αυτά. Δεδομένου πως η κοχεζίνη συμμετέχει στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης, αναμέναμε πως τα ηλικιωμένα ωοκύτταρα θα έδειχναν περιορισμένη επιδιορθωτική ικανότητα. Η μέθοδος που χρησιμοποιήσαμε ήταν η παρατήρηση της διατήρησης ή μη της παρουσίας της γη2αχ σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα μετά την πρόκληση βλάβης με Ετοποσίδιο (χρονικό σήμειο 0h: απομάκρυνση κυττάρων από το Ετοποσίδιο). Περιμένουμε πως σε κύτταρα που διαθέτουν ισχυρούς μηχανισμούς επιδιόρθωσης της βλάβης, η παρουσία της γη2αχ θα φθίνει με το χρόνο καθώς μειώνονται οι διπλές θραύσεις του DNA. Διαπιστώσαμε πως δεν υπάρχει διαφορά στα επίπεδα γη2αχ σε νεαρά και ηλικιωμένα ωοκύτταρα (Εικόνα 6Α). Συνεπώς, η απουσία κοχεζίνης δεν επηρεάζει την αποτελεσματικότητα των μηχανισμών επιδιόρθωσης στα ωοκύτταρα. Αυτό επιβεβαιώνεται και από τα αντίστοιχα πειράματα σε Smc1β KO ωοκύτταρα όπου η επιδιόρθωση βλαβών επαγόμενων από Ετοποσίδιο δεν παρουσιάζει διαφορετική αποτελεσματικότητα από εκείνη των φυσιολογικών WT (Εικόνα 6B).

10 Τελικά συμπεράσματα Στα θηλαστικά, τα κύτταρα βρίσκονται διαρκώς αντιμέτωπα με τον κίνδυνο αλλοιώσεων στο γενετικό τους υλικό. Αντίθετα με τα σωματικά κύτταρα, βλάβες στο DNA των γαμετικών κυττάρων μπορούν να οδηγήσουν στην εμφάνιση χρωμοσωμικών ανωμαλιών και κατά επέκταση σε υπογονιμότητα ή σε ανωμαλίες στο έμβρυο. Επιπλέον, βλάβες στα γαμετικά κύτταρα μπορούν να μεταδοθούν και να διατηρηθούν στις επόμενες γενιές και επομένως να επηρεάσουν την υγεία και τη βιωσιμότητα ολόκληρου του πληθυσμού. Είναι επομένως σημαντικό να εξακριβώσουμε πως αντιμετωπίζουν τα ωοκύτταρα βλάβες του DNA και κάτω από ποιες συνθήκες αυτοί οι μηχανισμοί αντιμετώπισης δυσλειτουργούν. Με τη μελέτη αυτή διαπιστώσαμε πως: 1. Τα ωοκύτταρα αποκρίνονται σε βλάβες του DNA με την ανάπτυξη μηχανισμών ελέγχου στη Μείωση Ι. 2. Η απόκριση σε βλάβες του DNA στα ωοκύτταρα εξαρτάται κυρίως από τη δράση του μηχανισμού ελέγχου της ατράκτου. 3. Τα γερασμένα ωοκύτταρα παρουσιάζουν περιορισμένη απόκριση σε βλάβες του DNA λόγω δυσλειτουργίας του μηχανισμού ελέγχου της ατράκτου. 4. Τα ωοκύτταρα διαθέτουν μηχανισμούς επιδιόρθωσης στην πρόφαση. 5. Η απουσία κοχεζίνης δεν επηρεάζει τη λειτουργία του μηχανισμού απόκρισης, ελέγχου και επιδιόρθωσης, των ωοκυττάρων. Με την εργασία αυτή αποκαλύπτουμε τις τακτικές με τις οποίες το ωοκύτταρο, το κύτταρο που οδηγεί στη δημιουργία ενός νέου οργανισμού, αντιμετωπίζει βλάβες του γενετικού του υλικού και τους μηχανισμούς που μπορεί να επιστρατεύσει για την προστασία του από γενετικές αλλοιώσεις. Τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής μας βοηθούν να κατανοήσουμε καλύτερα τις αιτίες γενετικών προβλημάτων και δυσκολιών γονιμότητας που εμφανίζονται στον άνθρωπο και σχετίζονται με την αναπαραγωγική ηλικία και τη βλάβη του γενετικού υλικού. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν με έμφαση τη σημασία της προστασίας απέναντι σε περιβαλλοντικούς και άλλους παράγοντες που δημιουργούν αλλοιώσεις του DNA οδηγώντας σε μειωμένη γονιμότητα και γεννητικές ανωμαλίες. Η παραπάνω μελέτη παρουσιάστηκε στο 65 ο Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας στη Θεσσαλονίκη. Το αποτέλεσμα που παρουσιάζεται στην Εικόνα 2D περιλαμβάνεται στη δημοσίευση: Dual-mode regulation by CDK1 and MAPK controls APC activity during meiosis I in mouse oocytes. Ibtissem Nabti, Marangos P, Kudo N and Carroll J. Journal of Cell Biology March; 204(6):

11 Εικόνα 1: Τα ωοκύτταρα ακινητοποιούνται στη φάση-μ της μείωσης Ι ως απόκριση σε βλάβη του DNA.

12 Εικόνα 2: Ο μηχανισμός ελέγχου της ατράκτου είναι αναγκαίος για την απόκριση των ωοκυττάρων σε βλάβη του DNA στη μείωση Ι. D

13 Εικόνα 3: Οι κινάσες Chk1 και Chk2 και το σηματοδοτικό μονοπάτι Mos/MAPK συμμετέχουν στο μηχανισμό αντιμετώπισης βλάβης του DNA στη μείωση Ι των ωοκυττάρων.

14 Εικόνα 4: Τα γερασμένα ωοκύτταρα παρουσίαζουν περιορισμένη απόκριση σε βλάβες του DNA λόγω δυσλειτουργίας του μηχανισμού ελέγχου της ατράκτου.

15 Age d Young Εικόνα 5: Η απουσία κοχεζίνης ενισχύει τη λειτουργία του μηχανισμού ελέγχου των ωοκυττάρων. C Mad2 CREST DNA 5h post GVBD

16 Age d Youn g Εικόνα 6: Τα ωοκύτταρα διαθέτουν μηχανισμούς επιδιόρθωσης στην πρόφαση που δεν επηρεάζονται από την ηλικία του ωοκυττάρου και την απουσία κοχεζίνης. Α γη2αχ DNA γη2αχ DNA γη2αχ DNA 0h 2h 4h B

17 Ενδεικτική Βιβλιογραφία [1] Hassold, T., and Hunt, P. To err (meiotically) is human: The genesis of human aneuploidy. Nat. Rev. Genet , [2] Marangos P and Carroll J. Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage. Current Biology (11): [3] Chiang T, Duncan FE, Schindler K, Schultz RM, Lampson MA. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol (17): [4] Lister LM, Kouznetsova A, Hyslop LA, Kalleas D, Pace SL, Barel JC, Nathan A, Floros V, Adelfalk C, Watanabe Y, Jessberger R, Kirkwood TB, Höög C, Herbert M. Age-related meiotic segregation errorsin Mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesion and Sgo2. Curr Biol (17): [5] Jacquet P, Adriaens I, Buset J, Neefs M, Vankerkom J. Cytogenetic studies in mouse oocytes irradiated in vitro at different stages of maturation, by use of an early preantral follicle culture system. Mutat Res (2): [6] Tease C. X-ray-induced chromosome aberrations in dictyate oocytes of young and old female mice. Mutat Res (2): [7] Hassold, T., Hall, H., and Hunt, P. The origin of human aneuploidy: Where we have been, where we are going. Hum. Mol. Genet Spec No. 2, R203 R208. [8] Nasmyth K, Haering CH. Cohesin: its roles and mechanisms. Annu Rev Genet : [9] Revenkova E, Eijpe M, Heyting C, Hodges CA, Hunt PA, Liebe B, Scherthan H, Jessberger R. Cohesin SMC1 beta is required for meiotic chromosome dynamics, sister chromatid cohesion and DNA recombination. Nat Cell Biol (6): [10] Vitale, I., Galluzzi, L., Castedo, M., & Kroemer, G. Mitotic catastrophe: a mechanism for avoiding genomic instability. Nature reviews. Molecular cell biology (6), [11] Watrin E, Peters JM. The cohesin complex is required for the DNA damageinduced G2/M checkpoint in mammalian cells. EMBO J ;28(17): [12] Sjogren C, Strom L. S-phase and DNA damage activated establishment of sister chromatid cohesion--importance for DNA repair. Exp. Cell Res ;316(9): [13]Murdoch B, Owen N, Stevense M, Smith H, Nagaoka S, Hassold T, McKay M, Xu H, Fu J, Jessberger R, Hunt P. Altered cohesin gene dosage affects Mammalian meiotic chromosome structure and behavior. PLoS Genet (2)

18 [14] Wu CC, Li TK, Farh L, Lin LY, Lin TS, Yu YJ, et al. Structural basis of type II topoisomerase inhibition by the anticancer drug ετοποσίδιο. Science (6041): [15] Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM. DNA doublestranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem (10):