ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΤΗΣ CARVEDILOL ΖΩΓΡΑΦΟΣ ΣΩΤΗΡΙΟΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΟΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΤΗΣ CARVEDILOL ΖΩΓΡΑΦΟΣ ΣΩΤΗΡΙΟΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΚΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Για την απο κτηση Μεταπτυχιακου Διπλω ματος Ειδι κευσης στην Βιομηχανικη Φαρμακευτικη - Φαρμακευτικη Ανάλυση ΠΑΤΡΑ 2016

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΟΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΤΗΣ CARVEDILOL ΖΩΓΡΑΦΟΣ ΣΩΤΗΡΙΟΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΗΧΑΝΙΚΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Για την απο κτηση Μεταπτυχιακου Διπλω ματος Ειδι κευσης στην Βιομηχανικη Φαρμακευτικη - Φαρμακευτικη Ανάλυση ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Π. ΚΛΕΠΕΤΣΑΝΗΣ Επι κουρος Καθηγητη ς - Επιβλε πων Χ. ΚΟΝΤΟΓΙΑΝΝΗΣ Καθηγητη ς Μ. ΟΡΚΟΥΛΑ Επι κουρη Καθηγη τρια

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρου σα ερευνητικη διπλωματικη εργασι α εκπονη θηκε στα πλαι σια του Μεταπτυχιακου Διπλω ματος Ειδι κευσης στην Βιομηχανικη Φαρμακευτικη Φαρμακευτικη Ανα λυση κατα τα ε τη στο Εργαστη ριο Φυσικοφαρμακευτικη ς του Τμη ματος Φαρμακευτικη ς του Πανεπιστημι ου Πατρω ν υπο την επι βλεψη του Επι κουρου Καθηγητη κ. Παυ λου Κλεπετσα νη, τον οποι ο θε λω να ευχαριστη σω θερμο τατα για την α ψογη συνεργασι α μας, την καθοδη γηση καθω ς και την πολυ τιμη υποστη ριξη, κατανο ηση και βοη θεια που μου παρει χε, το σο στο επι πεδο της διπλωματικη ς εργασι ας ο σο και στη συγγραφη της παρου σας εργασι ας. Ευχαριστω θερμα τα με λη της Συμβουλευτικη ς Επιτροπη ς μου, Καθηγητη κ. Χρι στο Κοντογια ννη και την Επι κουρη Καθηγη τρια κ. Μαλβι να Όρκουλα. Ευχαριστω θερμα το Ινστιτου το Επιστημω ν Χημικη ς Μηχανικη ς (ΙΕΧΜΗ/ΙΤΕ) για την χρη ση του εξοπλισμου για τον χαρακτηρισμο των στερεω ν (Ηλεκτρονικο Μικροσκο πιο Σα ρωσης, Διαφορικο Θερμιδο μετρο Σα ρωσης και Περι θλαση Ακτι νων- Χ) και ιδιαι τερα τον Δρακο πουλο Βασι λειο, Διευθυντη Εφαρμογω ν για την λη ψη των φωτογραφιω ν στο ηλεκτρονικο μικροσκο πιο σα ρωσης καθω ς και για μικροκατασκευε ς στο Μηχανουργει ο και το Ηλεκτροτεχνει ο. Επι σης θε λω να ευχαριστη σω και τον κ. Νικο λαο Μπουρο πουλο, Αναπληρωτη Καθηγητη του Τμη ματος Επιστη μης των Υλικω ν του Πανεπιστημι ου Πατρω ν για την χρη ση του οργα νου της υπε ρυθρης φασματοσκοπι ας αποσβενυμε νης ολικη ς ανακλαστικο τητας.

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 1 ABSTRACT 4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7 Α. ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ 8 1. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ 8 2. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ 9 3. ΔΟΜΗ ΦΥΣΙΚΕΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΕΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ (MODIFIED CYCLODEXTRINS) ΜΕΘΥΛΙΩΜΕΝΕΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ ΥΔΡΟΞΥΑΛΚΥΛΙΩΜΕΝΕΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ ΙΟΝΙΚΕΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΜΕ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ ΣΤΑΘΕΡΑ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΕΓΚΛΕΙΣΗΣ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑΣ ΦΑΣΕΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΕΓΚΛΕΙΣΗΣ ΜΕ ΣΤΟΙΧΕΙΟΜΕΤΡΙΑ 1: ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΣΤΑΤΙΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΥΔΡΟΦΟΒΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΔΕΣΜΟΙ ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ ΑΠΕΛΕΥΘΕΡΩΣΗ ΜΟΡΙΩΝ ΥΔΑΤΟΣ ΠΛΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΕΝΘΑΛΠΙΑ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΦΟΡΤΙΣΗΣ-ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ (Charge-transfer interaction) ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΣΤΕΡΕΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΜΕ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ 5.1. ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΑΤΑΒΥΘΙΣΗΣ ( COPRECIPITATION) ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΠΑΣΤΑΣ Ή ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΛΕΙΟΤΡΙΒΗΣΗΣ ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΛΥΟΦΙΛΟΠΟΙΗΣΗΣ (FREEZE DRYING) ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΞΗΡΑΝΣΗΣ ΤΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΘΟΔΟΣ ΞΗΡΟΥ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΕΓΚΛΕΙΣΗΣ 39 36

5 6.1. ΠΕΡΙΘΛΑΣΗ ΤΩΝ ΑΚΤΙΝΩΝ-Χ ΘΕΡΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΘΕΡΜΟΣΤΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΘΕΡΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΘΕΡΜΙΔΟΜΕΤΡΙΑ ΣΑΡΩΣΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΣΑΡΩΣΗΣ (Scanning Electron Microscopy) ΥΠΕΡΥΘΡΗ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΑΠΟΣΒΕΝΥΜΕΝΗΣ ΟΛΙΚΗΣ ΑΝΑΚΛΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ (FTIR-ATR) 7. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΣΤΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΑΥΞΗΣΗ ΤΗΣ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑΣ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΤΗ ΒΙΟΔΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΤΗΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΤΩΝ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΜΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΠΤΗΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ ΚΑΛΥΨΗ ΤΗΣ ΔΥΣΑΡΕΣΤΗΣ ΓΕΥΣΗΣ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ (TASTE MASKING) ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ΑΣΥΜΒΑΤΟΤΗΤΑΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΤΟΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΔΥΣΔΙΑΛΥΤΩΝ ΣΤΟ ΝΕΡΟ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΟΛΙΚΗ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ 64 Β. CARVEDILOL 66 ΣΚΟΠΟΣ 68 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ, ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΥΛΙΚΑ/ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΣΥΣΚΕΥΕΣ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ 73

6 1.3 ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ CARVEDILOL ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΣΤΕΡΕΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ CARVEDILOL ΜΕ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ 75 Α. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΜΕΙΓΜΑΤΩΝ (PHYSICAL MIXTURES) 75 B. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΛΕΙΟΤΡΙΒΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ (KNEADING OR PASTE METHOD) 76 Γ. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΛΥΟΦΙΛΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ (FREEZED DRYING) 76 Δ. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΣΤΕΡΕΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ ΣΥΓΚΑΤΑΒΥΘΙΣΗΣ (CO-PRECIPITATION OR CO-EVAPORATION) ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΕΡΕΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΜΕ CARVEDILOL 77 Α.1 Διαφορικη θερμιδομετρι α σα ρωσης (DSC) 77 Α.2 Περι θλαση ακτι νων-χ (ΧRD) 78 Α.3 Ηλεκτρονικη μικροσκοπι α σα ρωσης (SEM) 78 Α.4 Φασματοσκοπι α πυρηνικου μαγνητικου συντονισμου (ΝΜR) 79 Α.5 Υπε ρυθρη Φασματοσκοπι α Αποσβενυμε νης Ολικη ς Ανακλαστικο τητας (FTIR-ATR) 1.5 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ CARVEDILOL ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΗΣ / ΕΠΙΦΑΝΕΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΤΑΘΕΡΑΣ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ 82 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 84 Α. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΣΤΕΡΕΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ Διαφορικη Θερμιδομετρι α Σα ρωσης (DSC) Περι θλαση ακτι νων-χ (XRD) Υπε ρυθρη Φασματοσκοπι α Αποσβενυμε νης Ολικη ς Ανακλαστικο τητας (FTIR-ATR) Ηλεκτρονικη Μικροσκοπι α Σα ρωσης (SEM) Φασματοσκοπι α πυρηνικου μαγνητικου συντονισμου (NMR) 98 Β. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ CARVEDILOL ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ph ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΤΗΣ CARVEDILOL ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΤΗΣ CARVEDILOL ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΣΤΑΘΕΡΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΣΤΑΘΕΡΩΝ 113

7 2.3 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΚΑΙ ΕΚΔΟΧΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΤΗΣ CARVEDILOL 115 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 121 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 123

8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι κυκλοδεξτρίνες είναι κυκλικοί ολιγοσακχαρίτες αποτελούμενοι από μόρια α-d-γλυκοπυρανόζης (6, 7 και 8 μόρια για τις α-, β- και γ- κυκλοδεξτρίνες αντίστοιχα). Οι κυκλοδεξτρίνες δεν έχουν απόλυτα κυλινδρικό σχήμα αλλά μοιάζουν περισσότερο με κόλουρο κώνο έχοντας ένα στενότερο και ένα ευρύτερο άνοιγμα εξαιτίας στερεοχημικών περιορισμών. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την δημιουργία μιας υδρόφιλης εξωτερικής επιφάνειας και μιας υδρόφοβης εσωτερικής κοιλότητας. Στην εσωτερική κοιλότητα μπορούν να εισέλθουν, μερικά ή ολικά, υδρόφοβα μόρια τα οποία αλληλεπιδρούν με τα μόρια της κυκλοδεξτρίνης μέσω ασθενών διαμοριακών αλληλεπιδράσεων και σχηματίζουν σύμπλοκα έγκλεισης. Ο σχηματισμός συμπλόκων έγκλεισης βιοδραστικών ενώσεων με κυκλοδεξτρίνες έχει σημαντική συνεισφορά στην μορφοποίηση των βιοδραστικών ενώσεων σε διάφορες φαρμακοτεχνικές μορφές αφού αυξάνει την διαλυτότητα δυσδιάλυτων στο νερό βιοδραστικών ενώσεων, βελτιώνει την βιοδιαθεσιμότητά τους, αυξάνει την σταθερότητά τους, βελτιώνει τις οργανοληπτικές ιδιότητες των και μειώνει σημαντικά τυχόν παρενέργειές των. Η Carvedilol είναι μια βιοδραστική ένωση που χρησιμοποιείται για την μείωση της αρτηριακής πίεσης και στην θεραπεία της καρδιακής ανεπάρκειας. Πρόκειται για μια δυσδιάλυτη στο νερό βιοδραστική ένωση με αποτέλεσμα να δημιουργούνται προβλήματα κατά την μορφοποίηση της σε φαρμακοτεχνικές μορφές καθώς και κατά την αποδέσμευση της στον ανθρώπινο οργανισμό μετά την χορήγηση της. Είναι ασθενής μονόξινη βάση με συνέπεια η διαλυτότητά του να μειώνεται με την αύξηση του ph. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της φύσης και της συγκέντρωσης κυκλοδεξτρινών (β-cd, Crysmeb, HP-β-CD και HP-γ-CD) στην διαλυτότητα της Carvedilol. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες διαλυτότητας της Carvedilol σε υδατικά διαλύματα παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων των β- CD, Crysmeb, HP-β-CD και HP-γ-CD σε θερμοκρασίες 20, 25, 30 και 35 C σε διαλύματα 20mM ανθρακικού νατρίου με ph=10.5. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση επιφανειοδραστικών ενώσεων (SDS, CTAB, Tween 20, Tween 80, Solutol HS15) και εκδόχων (PEG400, PEG4000, PEG20000, Transcutol, Propylene Glycol) στην διαλυτότητα της Carvedilol. Επίσης, προσδιορίσθηκε η μέθοδος παρασκευής ενώσεων έγκλεισης της Carvedilol με τις παραπάνω κυκλοδεξτρίνες χρησιμοποιώντας κατάλληλες τεχνικές χαρακτηρισμού των παρασκευαζομένων στερεών. Παρασκευάσθηκαν στερεά μίγματα της Carvedilol με τις κυκλοδεξτρίνες (β-cd, Crysmeb, HP-β-CD και HP-γ-CD) χρησιμοποιώντας διαφορετικές τεχνικές (απλή ανάμιξη με ξηρή λειοτρίβηση, υγρή λειοτρίβηση με τον σχηματισμό πάστας, συγκαταβύθιση και λυοφιλοποίηση). Για την μελέτη των στερεών μιγμάτων και την πιστοποίηση του σχηματισμού 1

9 συμπλόκων έγκλεισης μεταξύ της Carvedilol και των υπό μελέτη κυκλοδεξτρινών χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές α) Περίθλαση Ακτίνων-Χ, β) Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης, γ) Υπέρυθρη Φασματοσκοπία αποσβενυμένης ολικής ανακλαστικότητας και δ) Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης. Επίσης μελετήθηκε η στερεοχημεία των σχηματιζόμενων συμπλόκων της Carvedilol με τις υπό μελέτη κυκλοδεξτρίνες με την τεχνική του Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR). Από την μελέτη των ισοθέρμων διαλυτότητας διαπιστώθηκε ότι: α) η διαλυτότητα της Carvedilol αυξάνει με την συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης σε όλες τις θερμοκρασίες για όλες τις κυκλοδεξτρίνες που μελετήθηκαν και β) οι ισόθερμοι διαλυτότητας είναι της μορφής AL στην οποία όλα τα σχηματιζόμενα σύμπλοκα είναι ευδιάλυτα και έχουν στοιχειομετρία ίση με 1:1. Η HP-γ-CD παρουσίασε την μεγαλύτερη συμπλεκτική ικανότητα σε σύγκριση με τις άλλες κυκλοδεξτρίνες. Με βάση την συμπλεκτική ικανότητά τους, οι κυκλοδεξτρίνες μπορούν να ταξινομηθούν με την ακόλουθη σειρά: HP-γ-CD > HP-β-CD > Crysmeb > β-cd Η αύξηση της θερμοκρασίας δεν επηρέασε την μορφή των ισοθέρμων διαλυτότητας και την ταξινόμηση των κυκλοδεξτρινών με βάση την συμπλεκτική ικανότητα. Από την κλίση των ισοθέρμων διαλυτότητας προσδιορίσθηκαν οι σταθερές σχηματισμού των συμπλόκων έγκλεισης της Carvedilol με τις υπό μελέτη κυκλοδεξτρίνες. Η διαφοροποίηση της συμπλεκτικής ικανότητας των β-cd, Crysmeb, HP-β-CD και HP-γ-CD μπορεί να αποδοθεί α) στο διαφορετικό μέγεθος της υδρόφοβης κοιλότητας και β) στην διαφορετική υδροφοβικότητα των υποκατεστημένων κυκλοδεξτρινών. Από την μεταβολή των σταθερών σχηματισμού των συμπλόκων με την θερμοκρασίας υπολογίσθηκε η μεταβολή της ενθαλπίας (ΔΗ) και η μεταβολή της εντροπίας (ΔS) για τον σχηματισμό των συμπλόκων έγκλεισης. Για όλες τις κυκλοδεξτρίνες υπολογίσθηκε θετική μεταβολή της ενθαλπίας και θετική αλλά μικρή μεταβολή της εντροπίας. Ο συνδυασμός θετικής μεταβολής της φαινόμενης ενθαλπίας σχηματισμού και μικρής θετικής τιμής της μεταβολής της φαινόμενης εντροπίας σχηματισμού δείχνει την ύπαρξη υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στο μόριο της Carvedilol και των παραπάνω κυκλοδεξτρινών για τον σχηματισμό συμπλόκων έγκλεισης. Οι επιφανειοδραστικές ενώσεις CTAB, Tween20, Tween 80, SDS και Solutol HS15 αύξησαν σε διαφορετικό βαθμό την διαλυτότητα της Carvedilol. Η διαφοροποίηση στην επίδραση οφείλεται κυρίως στα χαρακτηριστικά των επιφανειοδραστικών ενώσεων (φορτίο, μέγεθος μορίου) καθώς και στο μέγεθος και την δομή των σχηματιζόμενων μικυλλίων. Η σειρά κατάταξης των επιφανειοδραστικών ενώσεων με βάση την αύξηση διαλυτότητας της Carvedilol είναι η ακόλουθη: 2

10 Tween 20 > Tween 80 > CTAB > SDS, Solutol HS15 Τα έκδοχα, PEG400, PEG4000, PEG20000, Transcutol και Propylene Glycol, αύξησαν σε μικρότερο βαθμό την διαλυτότητα της Carvedilol σε σύγκριση με τις επιφανειοδραστικές ενώσεις ενώ μπορούν να ταξινομηθούν με την ακόλουθη σειρά με βάση την αύξηση της διαλυτότητας της Carvedilol: PEG4000 > PEG20000 > PEG400 > Transcutol >> Propylene Glycol Οι τεχνικές της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης και περίθλασης ακτίνων-χ είναι οι καταλληλότερες για την μελέτη και τον χαρακτηρισμό των στερεών συμπλόκων της Carvedilol με τις κυκλοδεξτρίνες. Συγκεκριμένα, η απουσία της ισχυρής ενδόθερμης κορυφής που αντιστοιχεί στο σημείο τήξεως της Carvedilol στο θερμογράφημα του στερεού μίγματος που παρασκευάσθηκαν με την μέθοδο της συγκαταβύθισης αποτελεί σαφή ένδειξη για τον σχηματισμό συμπλόκων έγκλεισης της Carvedilol με τις κυκλοδεξτρίνες. Ανάλογα, στα φάσματα περίθλασης ακτίνων-x η απουσία των χαρακτηριστικών κορυφών της Carvedilol στο μίγμα που παρασκευάσθηκε με την μέθοδο της συγκαταβύθισης αποτελεί μια επιπλέον ένδειξη για τον σχηματισμό συμπλόκων ενώσεων μεταξύ της Carvedilol και των υπό μελέτη κυκλοδεξτρινών. Η αλληλεπίδραση Carvedilol με τις κυκλοδεξτρίνης επιβεβαιώθηκε και με την τεχνική της υπέρυθρης φασματοσκοπίας. Επίσης με την ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωση μελετήθηκε η μορφολογία των μιγμάτων που παρασκευάσθηκαν. Από την μελέτη των φασμάτων NMR των διαλυμάτων που περιείχαν σε διάφορες αναλογίες Carvedilol και τις υπό μελέτη κυκλοδεξτρίνες προσδιορίσθηκε η στερεοχημεία των σχηματιζόμενων συμπλόκων. Διαπιστώθηκε ότι το μόριο της Carvedilol α) δεν εισέρχεται ολόκληρο στην υδρόφοβη κοιλότητα των κυκλοδεξτρινών αλλά τμήμα του και β) εισέρχεται με την ομάδα της 2- methoxyphenoxy. 3

11 ABSTRACT Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides composed of a-d-glucopyranose units (6, 7 and 8 molecules for a-, b-, and c- cyclodextrins). Because of stereochemical restrictions, cyclodextrins do not have absolutely a cylindrical shape but they resemble a truncated cone. As a result of their characteristic structure is the formation of a hydrophilic external surface and a hydrophobic internal cavity. Partly or wholly hydrophobic molecules can enter the internal cavity and interact with the cyclodextrin molecules through weak intermolecular interactions, thus forming inclusion complexes. The inclusion complex formation of bioactive compounds improves the solubility of poorly soluble drugs, their bioavailability, enhances their stability and reduces considerably the side effects after administration. Carvedilol is a beta blocker used for treating mild to severe congestive heart failure, left ventricular dysfunction following heart attack and for treating high blood pressure. It is a water sparingly soluble bioactive compound, which results in problems on its pharmaceutical formulations. It is a weak base, as such its solubility decreases with ph increase. In this study, the influence of the nature and concentration of (β-cd, Crysmeb, HP-β- CD and HP-γ-CD) on the solubility of the bioactive compound Carvedilol was studied. Solubility studies in aqueous solutions of Carvedilol with the cyclodextrins were performed in 20, 25, 30 and 35 C in 20mM Sodium Carbonate solutions at ph=10.5. The study of solubility isotherms showed that: a) solubility of Carvedilol increases with the concentration of cyclodextrins at all temperatures studied, for all the cyclodextrins studied and b) solubility isotherms have a graphical representation of the AL type, which shows that all formed complexes are water soluble with 1:1 stoichiometry. HP-γ-CD exhibited the greatest complexive ability at all tested temperatures. Based on the complexation ability, the cyclodextrins under discussion can be classified in the following order: HP-γ-CD > HP-β-CD > Crysmeb > β-cd The temperature increase did not affect the solubility isotherms and the above classification in comlexation efficiency. The inclusion complex formation constants were determined from the gradient of the solubility isotherms. The differentiation of the complexation ability of cyclodextrins can be attributed a) to the different size of the hydrophobic cavity and b) to the different hydrophobicity of the substituted cyclodextrins. The enthalpy change (ΔH) and the entropy change (ΔS) during complex formation were calculated from the change of the complexation constants with the increase of the temperature. For all tested cyclodextrins positive enthalpy change and positive 4

12 but small entropy change were found, which indicate the existence of hydrophobic interactions between the Carvedilol molecule and the cyclodextrins, when forming inclusion complexes. Carvedilol solid mixtures with the β-cd, Crysmeb, HP-β-CD and HP-γ-CD were prepared by using different techniques (physical mixture, kneading, coprecipitation, freeze drying) in order to determine the technique or the techniques that lead to the formation of inclusion complex. For the study of solid mixtures and the assessment of inclusion complex formation between the Carvedilol and the cyclodextrins under investigation the following techniques were used: a) X-Ray Diffraction (XRD) b) Differential Scanning Calorimetry (DSC), c) Fourier Transform Attenuated Total Reflectance (FTIR-ATR) and d) Scanning Electron Microscopy (SEM). Furthermore, the stereochemistry of the formed inclusion complexes of Carvedilol with the specific cyclodextrins was also assessed using the technique of Nuclear Magnetic Resonance (NMR). The techniques of DSC and XRD are the most appropriate for the investigation and characterization of solid complexes of Carvedilol with cyclodextrins. Particularly, the absence of the strong endothermic peak, which corresponds to the melting point of carvedilol in the DSC thermograph of the solid mixture, which was prepared by the coprecipitation method, constitutes a clear indication of the inclusion complex formation of Carvedilol with the cyclodextrins. Accordingly, in the XRD spectra the absence of the characteristic peaks of Carvedilol in the mixture prepared by the coprecipitation method comprises an additional indication for the formation of inclusion complexes between Carvedilol and the cyclodextrins under investigation. The method leading up to the formation of inclusion complexes is coprecipitation method from methanol in a Carvedilol /Cyclodextrin ratio of 1:1. The stereochemistry of the formed inclusion compounds was assessed through the spectra received by the application of NMR on solutions, which contained Carvedilol and the specific cyclodextrins in different ratios. In particular, it was determined that the Carvedilol, when forming the inclusion complex, does not enter the cavity as a whole, but only in part. Specifically, Carvedilol enters the cyclodextrine hydrophobe cavity with the 2-methoxyphenoxy group. In addition, the effect of surfactants (CTAB, Tween20, Tween 80, SDS and Solutol HS15) and common excipients (PEG400, PEG4000, PEG20000, Transcutol, Propylene Glycol) on Carvedilol solubility was studied. Based on the solubilization efficiency, the tested surfactants can be classified in the following order: Tween 20 > Tween 80 > CTAB > SDS, Solutol HS15 5

13 The differentiation of the solubilization efficiency of tested surfactants can be attributed a) to the specific characteristics of surfactants and b) to the size and structure of micelles. The solubilization efficiency of tested excipients was significantly lower in comparison with surfactants. 6

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7

15 Α. ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ 1. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Η πρώτη επιστημονική εργασία στην οποία αναφέρεται η παρατήρηση μερικών άγνωστων κρυσταλλικών ενώσεων στη ζύμωση του αμύλου δημοσιεύθηκε το Δεκαπέντε χρόνια αργότερα ο Αυστριακός μικροβιολόγος Franz Schardinger, μελετώντας τους μικροοργανισμούς που προκαλούν την αλλοίωση των τροφίμων, απομόνωσε ένα μικροοργανισμό (Bacillus macerans) ο οποίος παρήγαγε δύο διακριτές κρυσταλλικές ενώσεις σε καλλιέργειες που περιείχαν άμυλο. Επειδή οι ιδιότητές τους ήταν παρόμοιες με εκείνες των ήδη γνωστών προϊόντων αποικοδόμησης του αμύλου, των δεξτρινών, ονόμασε τις ουσίες αυτές α- και β- δεξτρίνη. Οι Villers (1891) και Schardinger (1911) ανακάλυψαν την α- και β- δεξτρίνη αντίστοιχα, ενώ η χημική δομή των παρέμενε άγνωστη μέχρι το 1936, όταν προσδιορίσθηκε από τον Freudenberg και τους συνεργάτες του. Στις αρχές της δεύτερης περιόδου ο Freudenberg και οι συνεργάτες του, βασιζόμενοι σε δικά τους πειράματα αλλά και στις παρατηρήσεις των Karrer και Miekeley κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι δεξτρίνες του Schardinger αποτελούνται από μονάδες μαλτόζης και περιέχουν μόνο α-(1-4)-γλυκοζιτικούς δεσμούς και υπέθεσαν την κυκλική δομή των κρυσταλλικών δεξτρινών. Την διετία απομονώθηκε η γ-κυκλοδεξτρίνη και προσδιορίσθηκε η δομή της. Στις αρχές της δεκαετίας του 50, οι ομάδες των Freunch και Cramer εργάσθηκαν εντατικά στην ενζυμική παραγωγή κυκλοδεξτρινών, στην απομόνωση των καθαρών συστατικών και στον προσδιορισμό των χημικών και φυσικών ιδιοτήτων τους. Η ομάδα του French ανακάλυψε ότι υπάρχουν κυκλοδεξτρίνες μεγαλύτερου μεγέθους, ενώ η ομάδα του Cramer ασχολήθηκε με την ικανότητα των κυκλοδεξτρινών να σχηματίζουν σύμπλοκα. Το πρώτο σημαντικό άρθρο για τις κυκλοδεξτρίνες δημοσιεύτηκε το 1953 απο τον Freunch και ακολούθησαν οι μονογραφίες των Thoma και Stewart το 1965 και του Caesar το Όμως μια λανθασμένη δημοσίευση του Freunch σχετικά με την τοξικότητα των κυκλοδεξτρινών στον άνθρωπο αποθάρρυνε πολλούς επιστήμονες από την παρασκευή προϊόντων με κυκλοδεξτρίνη για ανθρώπινη χρήση. Μέχρι το τέλος της δεκαετίας του 60 είχε διευκρινιστεί τόσο η παρασκευή των κυκλοδεξτρινών στο εργαστήριο, όσο και οι φυσικές και χημικές ιδιότητες αυτών αλλά και οι ιδιότητες σχηματισμού συμπλόκων. Μετά από μια σειρά τοξικολογικών μελετών που απέδειξαν την ασφάλεια των κυκλοδεξτρινών για θεραπευτική χρήση στον άνθρωπο, οι δημοσιεύσεις παρουσίασαν σημαντική αύξηση. Σύμφωνα με τα δεδομένα της CycloLab, ο συνολικός αριθμός των δημοσιεύσεων σήμερα ξεπερνάει τις και ο μέσος αριθμός τους ανά ημέρα αυξήθηκε από 2,2 το 1990 σε 8 το [Szejtli (2004, Loftsson (2007)] 8

16 Σχήμα Θ1: Ο αριθμός των δημοσιεύσεων που σχετίζονται με τις κυκλοδεξτρίνες από το 1998 έως σήμερα. Το πρώτο παγκόσμιο συνέδριο κυκλοδεξτρινών έγινε το 1981 και από τότε μέχρι σήμερα επαναλαμβάνεται κάθε δύο χρόνια. Το τελευταίο συνέδριο, 17 ο στη σειρά, έγινε στο Saarbrücken (Germany) το Επίσης, το κόστος παραγωγής των κυκλοδεξτρινών έχει μειωθεί σημαντικά. Ενδεικτικά, αναφέρεται ότι το Kg β-cd κόστιζε 2000 $, ενώ σήμερα το κόστος έχει μειωθεί μόλις μερικά $. 2. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ Η παραγωγή των κυκλοδεξτρινών είναι μία σχετικά απλή διεργασία η οποία περιλαμβάνει την κατεργασία του αμύλου με μία σειρά ενζύμων. Το βασικότερα των ενζύμων αυτών είναι η γλυκοσυλο-τρανσφεράση των κυκλοδεξτρινών (CGTase) η οποία παράγεται από μικροοργανισμούς, όπως είναι ο Bacillus macerans, η Klebsiella oxytaca και o Bacillus circulans. Σήμερα, με τη βοήθεια της γενετικής μηχανικής έχουν παραχθεί μία σειρά ενζύμων τα οποία χρησιμοποιούνται για την βιομηχανική παραγωγή των κυκλοδεξτρινών. Το πρώτο στάδιο στη παραγωγή των κυκλοδεξτρινών είναι η ρευστοποίηση του αμύλου είτε με θέρμανση είτε με προσθήκη της α-αμυλάσης. Στη συνέχεια, προστίθεται η CGTάση. Η CGTάση μπορεί να συνθέσει όλους τους τύπους των φυσικών κυκλοδεξτρινών, επομένως το προϊόν της ενζυμικής μετατροπής είναι ένα μείγμα α-, β- και γ-κυκλοδεξτρίνης σε αναλογία που εξαρτάται από το ένζυμο που χρησιμοποιείται κάθε CGΤάση έχει τη δική της χαρακτηριστική αναλογία. Ο διαχωρισμός των τριών βασικών φυσικών κυκλοδεξτρινών στηρίζεται στη διαφορετική υδατοδιαλυτότητα των μορίων τους. Συγκεκριμένα, η β-κυκλοδεξτρίνη έχει πολύ μικρή υδατοδιαλυτότητα (18,5 g/l) και μπορεί να ανακτηθεί εύκολα με κρυστάλλωση, ενώ οι περισσότερο διαλυτές α-cd και γ-cd (145 και 232 g/l αντίστοιχα) διαχωρίζονται με τη βοήθεια χρωματογραφικών τεχνικών. 9

17 Επίσης, κατά τη διάρκεια της ενζυμικής μετατροπής μπορεί να προστεθεί ένας «παράγοντας συμπλοκοποίησης» ώστε να σχηματιστεί σύμπλοκο με την επιθυμητή κυκλοδεξτρίνη, το οποίο στη συνέχεια καταβυθίζεται. Ο σχηματισμός του συμπλόκου κατευθύνει την μετατροπή του αμύλου προς τη κατεύθυνση της σύνθεσης της επιθυμητής κυκλοδεξτρίνης, αυξάνοντας έτσι την περιεκτικότητα της κυκλοδεξτρίνης αυτής στο τελικό μείγμα. Στο τελικό στάδιο η κυκλοδεξτρίνη ανακτάται με φυγοκέντρηση και διαχωρίζεται από τον «παράγοντα συμπλοκοποίησης». Οι κυριότεροι παράγοντες που χρησιμοποιούνται είναι το τολουένιο, η ακετόνη και η 1- δεκανόλη. Η προσθήκη τολουενίου κατευθύνει τη μετατροπή προς το σχηματισμό β- CD, η προσθήκη 1-δεκανόλης προς α-cd και η κυκλοεξαδεκανόλη προς γ-cd. H τελική καθαρότητα των προϊόντων είναι της τάξης του 99% [Biwer et al (2002), Szerman (2007), Sjejtli (1998)]. 3. ΔΟΜΗ Οι κυκλοδεξτρίνες είναι κυκλικοί ολικοσακχαρίτες αποτελούμενοι από μόρια α-d-γλυκοπυρανόζης που συνδέονται με α-1-4 γλυκοζιτικούς δεσμούς. Το σχήμα τους δεν είναι κυλινδρικό αλλά προσομοιάζει το σχήμα κόλουρου κώνου που οφείλεται στην έλλειψη ελεύθερης περιστροφής των δεσμών που συνδέουν τις μονάδες γλυκοπυρανόζης. Το χαρακτηριστικό σχήμα των κυκλοδεξτρινών απεικονίζεται στο Σχήμα 2. Κάθε μονάδα γλυκοπυρανόζης έχει 3 υδροξυλομάδες. Δύο από αυτές είναι δευτερεύουσες και εντοπίζονται στους άνθρακες 2 και 3 και μία είναι πρωτεύουσα στον άνθρακα στην θέση C-6. Οι υδροξυλομάδες αυτές καθιστούν υδρόφιλη την εξωτερική επιφάνεια των κυκλοδεξτρινών και είναι υπεύθυνες για την μεγάλη διαλυτότητά τους στο νερό. Οι πρωτεύουσες υδροξυλομάδες εντοπίζονται στο στενό άκρο του κώνου, ενώ οι δευτερεύουσες στο ευρύτερο άκρο. Το εσωτερικό των κυκλοδεξτρινών είναι υδρόφοβο, λόγω της παρουσίας των αιθερικών οξυγόνων στο Ο-4 και των υδρογόνων που είναι προσαρτημένα στους άνθρακες C-3 και C-5, με αποτέλεσμα να δημιουργείται μια κοιλότητα για τον εγκλωβισμό υδρόφοβων μορίων [Loftsson (2005), Szejtli (1998), Saenger et al (1998)]. Η β-κυκλοδεξτρίνη έχει μικρότερη διαλυτότητα στο νερό σε σύγκριση με τις α- και γ- κυκλοδεξτρίνες λόγω σχηματισμού ενδομοριακού δεσμού υδογόνου ανάμεσα στα υδροξύλια που βρίσκονται στην εξωτερική πλευρά τους. Ο σχηματισμός αυτών των ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου μειώνει τις αλληλεπιδράσεις των υδροξυλίων με τα μόρια του νερού με αποτέλεσμα την μειωμένη διαλυτότητα της β-κυκλοδεξτρίνης σε υδατικά μέσα. 10

18 Σχήμα Θ2: Η διαμόρφωση των μονάδων γλυκοπυρανόζης έχει σαν αποτέλεσμα η εξωτερική επιφάνεια των κυκλοδεξτρινών να είναι υδρόφιλη και η εσωτερική υδρόφοβη. Σχήμα Θ3 : Η χημική δομή και η δομή του κόλουρου κώνου της α-κυκλοδεξτρίνης 3.1 ΦΥΣΙΚΕΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ Οι πιο γνωστές φυσικές κυκλοδεξτρίνες είναι οι α-, β-, γ- κυκλοδεξτρίνη. Η α- κυκλοδεξτρίνη αποτελείται από 6 μόρια γλυκοπυρανόζης, η β-κυκλοδεξτρίνη από 7 και η γ-κυκλοδεξτρίνη από 8, όπως απεικονίζονται στο Σχήμα Θ4. Πίνακας ΘΠ1: Τα βασικά χαρακτηριστικά της α-, β- και γ- κυκλοδεξτρίνης. α-cd β-cd γ-cd Αριθμός μονάδων γλυκοπυρανόζης Μοριακό βάρος Διαλυτότητα στο νερό (g/100 ml) 14,5 1,85 23,2 Διάμετρος κεντρικής κοιλότητα (Å) 4,7-5,3 6,0 6,5 7,5 8,3 Ύψος του κώνου (Å) 7,9 ± 0,1 7,9 ± 0,1 7,9 ± 0,1 Διάμετρος εξωτερικής περιφέρειας (Å) 14,6 ± 0,4 15,4 ± 0,4 17,5 ± 0,4 11

19 Κυκλοδεξτρίνες με λιγότερες από 6 μονάδες γλυκοπυρανόζης δεν μπορεί να υπάρξουν λόγω των στερεοχημικών περιορισμών [Szejtli (1996)]. Επίσης έχουν απομονωθεί κυκλοδεξτρίνες με περισσότερες από 8 μονάδες γλυκοπυρανόζης αλλά δεν έχουν σημαντικό ενδιαφέρον λόγω της πολύ μικρής ικανότητας των να σχηματίζουν σύμπλοκα με βιοδραστικές ενώσεις. Σχήμα Θ4: Η χημική δομή της α-, β- και γ- κυκλοδεξτρίνης. 3.2 ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΕΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ (MODIFIED CYCLODEXTRINS) Ο αριθμός των τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών που έχουν παραχθεί και μελετηθεί είναι μεγάλος. Οι τροποποιημένες κυκλοδεχτρίνες παράγονται με την αντίδραση χημικών μορίων με τις υδροξυλομάδες των κυκλοδεξτρινών. Οι υδροξυλομάδες στον C-6 έχουν την μεγαλύτερη ικανότητα αντίδρασης, ενώ οι υδροξυλομάδες στον C-3 έχουν την μικρότερη. Παρόλα αυτά μεταβάλλοντας τις συνθήκες της αντίδρασης, όπως το ph, την θερμοκρασία και τα αντιδρασήρια, μπορούμε να κατευθύνουμε την αντίδραση προς μία συγκεκριμένη πορεία και να πετύχουμε την εκλεκτική υποκατάσταση μίας συγκεκριμένης ομάδας. Κάθε μονάδα γλυκοπυρανόζης έχει 3 ελεύθερες υδροξυλομάδες, επομένως η α-κυκλοδεξτρίνη 12

20 έχει 18 ελεύθερες υδροξυλομάδες που μπορούν να υποκατασταθούν, η β- κυκλοδξτρίνη έχει 21 και η γ-κυκλοδεξτρίνη έχει 24. Έτσι, με την υποκατάσταση του ατόμου υδρογόνου ή της υδροξυλομάδας από διάφορες ομάδες όπως άλκυλο-, υδροξυάλκυλο, καρβοξυλοάλκυλο-, άμινο-, θείο- γλυκόσυλο-, αλλά και άλλες ομάδες, μπορούν να παραχθούν μια σειρά από παράγωγα με χημικές αντιδράσεις [Jicsinszky et al (1996), Loftsson & Brewster (1996)]. Επειδή κατά την παραγωγή των τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών παράγονται διάφορα παράγωγα και ισομερή, η ονοματολογία πρέπει να είναι σαφής και να περιλαμβάνει τουλάχιστον την πρόδρομη κυκλοδεξτρίνη και τον τύπο και τον αριθμό των υποκαταστατών. Οι υποκαταστάτες συνήθως δηλώνονται με μία συντόμευση, πριν την αρχική κυκλοδεξτρίνη. Στη συντόμευση αυτή όμως μπορεί να φανεί και η ακριβής θέση του υποκαταστάτη, αν αυτό χρειαστεί. Για παράδειγμα, η υδροξυλομάδα του υδροξυπρόπυλο υποκαταστάτη μπορεί να βρίσκεται σε ένα από τους τρεις άνθρακες της προπυλικής αλυσίδας. Έτσι, αν έχει ενωθεί με τον C-2, το παράγωγο θα συμβολίζεται ως HP-β-CD. Όταν θέλουμε να συμβολίσουμε τον αριθμό των υποκαταστατών που συνδέονται με την πρόδρομη κυκλοδεξτρίνη, ο αριθμός ακολουθεί τον υποκαταστάτη. Έτσι η HP4-β-CD υποδηλώνει μία β- κυκλοδεξτρίνη με 4 υδροξυπρόπυλο ομάδες. Ο αριθμός αυτός ονομάζεται μοριακός βαθμός υποκατάστασης (molar degree of substitution, MS) και εκφράζει το μέσο αριθμό αλκυλομάδων στο δακτύλιο της κυκλοδεξτρίνης. Βέβαια στο παράδειγμα της ΗP4-β-CD τέσσερις υδρόξυ-πρόπυλο υποκαταστάτες μπορεί να έχουν συνδεθεί σε τέσσερις διαφορετικές υδροξυλομάδες γύρω από το δακτύλιο της β- κυκλοδεξτρίνης ή μία μόνο υδροξυλομάδα μπορεί να έχει υποκατασταθεί από μία αλυσίδα με τέσσερις υδροξυ-πρόπυλο ομάδες. Ένας άλλος όρος που χρησιμοποιείται είναι ο βαθμός υποκατάστασης (degree of substitution, DS) που εκφράζει το μέσο αριθμό των υποκατεστημένων υδροξυλομάδων των μονάδων γλυκοπυρανόζης και μπορεί να πάρει τιμές από 0 έως 3. Οι βασικές τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες που χρησιμοποιούνται ως έκδοχα στις φαρμακομορφές είναι όλες παράγωγα της β-κυκλοδεξτρίνης: 1. Τυχαία μεθυλιωμένα παράγωγα με μέσο MS 14 (Μ14-β-CD). 2. Δύο διαφορετικά υδροξυπρόπυλο παράγωγα, το ένα με μέσο μοριακό βαθμό υποκατάστασης 3 ((2ΗP)3-β-CD) και το άλλο με μέσο μοριακό βαθμό υποκατάστασης 7 ((2ΗP)7-β-CD). 3. Σουλφο-βούτυλο αιθερικά παράγωγα με μέσο MS 7 (SBE7-β-CD). 4. Γλυκόσυλο και μαλτόσυλο κυκλοδεξτρίνες, οι οποίες περιέχουν μόνο μόρια γλυκόζης (G1-β-CD) ή μαλτοσακχαρίτες όπως η μαλτόζη (G2-β-CD) συνδεδεμένα απευθείας με α-(1 6) γλυκοζιτικό δεσμό στο μόριο της κυκλοδεξτρίνης [Mosher και Thompson]. Ο συντελεστής κατανομής των κυκλοδεξτρινών στο σύστημα οκτανόλης/νερού προσδιορίσθηκαν στους 25 C. Οι πραγματικές τιμές θα 13

21 εξαρτηθούν από το μοριακό βαθμό υποκατάστασης (MS) καθώς και τη θέση των υποκαταστατών. [Loftsson, Brewster (2010]). Σχήμα Θ5. Αντιδράσεις σχηματισμού τροποιημένων κυκλοδεξτρινών της β- κυκλοδεξτρίνης Η παραγωγή τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών έχει σαν στόχο: 1. Να αυξήσει την υδατοδιαλυτότηα των κυκλοδεξτρινών και των συμπλόκων τους: Οι φυσικές κυκλοδεξτρίνες έχουν μικρή διαλυτότητα στο νερό. Η β- κυκλοδξτρίνη έχει τη μικρότερη υδατοδιαλυτότητα λόγω της περισσότερο άκαμπτης δομής της που οφείλεται στους δεσμούς υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ της υδροξυλομάδας του C-2 μιας μονάδας γλυκοπυρανόζης και της υδροξυλομάδας του C-3 της γειτονικής ομάδας, σχηματίζοντας επτά ενδομοριακούς δεσμούς υδρογόνου που εμποδίζουν την αλληλεπίδραση της κυκλοδεξτρίνης με το διαλύτη. Αυτή η «ζώνη δεσμών υδρογόνου» δεν είναι πλήρης στις υπόλοιπες φυσικές κυκλοδεξτρίνες και γι αυτο ευνοείται η αλληλεπίδραση αυτών με τα μόρια του νερού. 2. Να βελτιώσει τη σύνδεση-αλληλεπίδραση των εγκλωβιζόμενων μορίων με τις κυκλοδεξτρίνες. 3. Να εκλύσει συγκεκριμένες καταλυτικές ομάδες στη θέση σύνδεσης. 4. Να σχηματίσει αδιάλυτες δομές που περιέχουν κυκλοδεξτρίνες, όπως τα πολυμερή, σε στόχο την εφαρμογή τους στη χρωματογραφία [Szejtli (2004)]. 14

22 Πίνακας ΘΠ2: Χαρακτηριστικά τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών που χρησιμοποιούνται σε εμπορικά φαρμακευτικά προϊόντα ή που διερευνώνται ως φαρμακευτικά έκδοχα. Cyclodextrin Trade name and manufacturer MS MW (Da) Solubility (mg/ml) LogKo/w a 2-Hydroxypropyl-αcyclodextrin (HP-α-CD) 2-Hydroxypropyl-βcyclodextrin (HP-β-CD) (Hydroxypropylbetadex, Ph.Eur.) Sulfobutylether-βcyclodextrin Na (SBEβCD) Randomly methylated β- cyclodextrin (RM-β-CD) Maltosyl-β-cyclodextrin (Me-β-CD) 2-Hydroxypropyl-γcyclodextrin (HP-γ-CD) Cavasol W6 HP (Wacker, Germany) Cavasol W7 HP (Wacker, Germany) Kleptose HPB (Roquette, France) Captisol (CyDex Pharmaceuticals, USA) Cavasol W7 M (Wacker, Germany) Kleptose Crysmeb (Roquette, France) (Ensuiko Sugar Refining Co., Japan) Cavasol W8 HP (Wacker, Germany) >500 < > > >500 < > >500 < >600 < ΜΕΘΥΛΙΩΜΕΝΕΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ Η προσθήκη του μέθυλο-υποκαταστάτη στις υδροξυλομάδες των κυκλοδεξτρινών αυξάνει σημαντικά την υδατοδιαλυτότητα της τροποποιημένης κυκλοδεξτρίνης σε σχέση με αυτή της αρχικής. Η υδατοδιαλυτότητα αυξάνεται όσο 15

23 αυξάνεται ο αριθμός των υποκαταστατών έως ότου τα 2/3 των υδροξυλομάδων να υποκατασταθούν και μειώνεται όσο οι υποκαταστάτες αυξάνονται περαιτέρω. Έτσι, οι κυκλοδεξτρίνες που περιέχουν 14 μεθόξυ-ομάδες έχουν την μεγαλύτερη διαλυτότητα, ενώ οι κυκλοδεξτρίνες με 21 μεθόξυ-ομάδες παρουσιάζουν τη μικρότερη διαλυτότητα, η οποία όμως είναι σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή της μη μεθυλιωμένης κυκλοδεξτρίνης [ Szejtli (1992), Szente and Szejtli (1999)]. Οι πιο γνωστές εμπορικά μεθυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες είναι οι : DM14-β-CD [επτάκις (2,6-δι-ο-μεθυλο)-β-κυκλοδεκτρίνη] (DIMEB) και η 2,3,6-ΤΜ21-β-CD [επτάκις (2,3,6-τρι-ο-μεθυλο)-β-κυκλοδεξτρίνη] (TRIMEB), των οποίων η διαλυτότητα στο νερό είναι 57g/100ml και 31g/100ml αντίστοιχα, σε σχέση με 1,8g/100ml που είναι η υδατοδιαλυτότα της β-κυκλοδεξτρίνης. Επίσης, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και μίγμα τυχαία μεθυλιωμένων β-κυκλοδεξτρινών. Βρέθηκε ότι η Μ14-β-CD αύξησε τη διαλυτότητα 26 βιοδραστικών ενώσεων σε σχέση με την β-cd και ο βαθμός της αύξησης ήταν 80% σε σχέση με τη καθαρή 2,6-DM-β-CD. Πίνακας ΘΠ3: Παραδείγματα της αύξησης της διαλυτότητας βιοδραστικών ενώσεων σε υδατικά διαλύματα 10g/100ml μετά από συμπλοκοποίηση με τη DIMEB ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΗ ΕΝΩΣΗ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΣΤΟ ΝΕΡΟ mg/ml (S 1 ) ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΣΕ ΔΙΑΛΥΜΑ DIMEB mg/ml (S 2 ) S 2 / S 1 π-αμινο βενζοϊκό οξύ 4, π-υδροξυ βενζοϊκό οξύ 5, ναφθόλη 0, ναφθόλη 0,62 12,5 20 τολουένιο 0,44 9,6 22 υδροκορτιζόνη 0, διγοξίνη 0,27 22,2 81 μεθυλοτεστοστερόνη 0,071 13,7 193 προγεστερόνη 0, Η μεθυλίωση όμως αυξάνει και την ικανότητα συμπλοκοποίησης των κυκλοδεξτρινών καθώς η υποκατάσταση των υδροξυλομάδων στις θέσεις 2 και 6 αυξάνει την υδροφοβικότητα της εσωτερικής κοιλότητας. Η σταθερά συμπλοκοποίησης της 2,6-DM14-β-CD με πολλές βιοδραστικές ενώσεις είναι κατά μέσο όρο 5 φορές μεγαλύτερη από αυτή της β-cd. Παρόλα αυτά, η μεθυλίωση των υδροξυλομάδων στη θέση 3 μειώνει σημαντικά την ικανότητα συμπλοκοποίησης της κυκλοδεξτρίνης [Szejtli (1992)]. 16

24 Σχήμα Θ6: Χημική δομή της επτάκις (2,6-δι-ο-μεθυλο)-β-κυκλοδεκτρίνη (DIMEB). 3.4 ΥΔΡΟΞΥΑΛΚΥΛΙΩΜΕΝΕΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ Οι υδροξυαλκυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες παράγονται μετά από κατεργασία των κυκλοδεξτρινών με οξείδια των αλκυλενίων και υποκατάσταση των ελεύθερων υδροξυλομάδων στις θέσεις C-2, C-3 και C-6 κάθε μονάδας γλυκοπυρανόζης. Το DS στις υδροξυαλκυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες επηρεάζει τόσο την ικανότητά τους να σχηματίζουν σύμπλοκα όσο και τη διαλυτότητά τους. Το πιο γνωστό παράγωγο είναι η (2HP)-β-CD η οποία παρασκευάζεται μετά από κατεργασία της β-cd με οξείδιο του προπυλενίου και είναι γνωστή με τα εμπορικά ονόματα Molecusol TM και Encapsin TM. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα τόσο στις πρωτεύουσες όσο και στις δευτερεύουσες υδροξυλομάδες και παράγεται ένα μίγμα απο ισομορφές της (2HP)-β-CD που οδηγεί σε ένα προϊόν που είναι άμορφο, μη κρυσταλλικό που έχει μεγάλη διαλυτότητα στο νερό και έχει 27 φορές μεγαλύτερη διαλυτότητα σε σύγκριση με την β-cd. Η ευρεία χρησιμοποίηση της ΗP-β-CD σε φαρμακομορφές τόσο σε ανθρώπους όσο και σε ζώα οφείλεται στην ικανότητά της να σχηματίζει σταθερά σύμπλοκα με πάρα πολλές βιοδραστικές ενώσεις, στην ασφάλειά της τόσο για παρεντερική όσο και για per os χορήγηση και στην ιδιότητά της να σχηματίζει διαλυτά σύμπλοκα τύπου AL [(Szejtli (1992), Szente and Szejtli (1999), Szejtli (2004)]. 3.5 ΙΟΝΙΚΕΣ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ Οι ιονικές κυκλοδεξτρίνες παράγονται μετά από υποκατάσταση των υδροξυλομάδων των κυκλοδεξτρινών με υποκαταστάτες που ιονίζονται εύκολα. Η ικανότητα συμπλοκοποίησης των παραγομένων κυκλοδεξτρινών επηρεάζεται από το ph του διαλύματος, τον βαθμό υποκατάστασης και τις ιονίζουσες ομάδες με αποτέλεσμα στερικά και ηλεκτρονιακά φαινόμενα να επηρεάζουν την ικανότητα αυτή. 17

25 Οι ιονικές κυκλοδεξτρίνες διακρίνονται σε ανιονικές και κατιονικές. Τα κυριώτερα παράγωγα των ανιονικών κυκλοδεξτρινών είναι τα σουλφαλκυλαιθερο παράγωγα: Η σουλφοπροπυλοαιθυλο-β-cd (SPΕ-β-CD) και η σουλφοβουτυλο-αιθυλοβ-cd (SBE-β-CD) παράγονται μετά από αντίδραση της β-cd σε αλκαλικό υδατικό διάλυμα με propane-sultone και butane-sultone αντίστοιχα. Τα ευρύτερα παραγόμενα παράγωγα της SBE-β-CD είναι άμορφα, έχουν μεγάλη υδατοδιαλυτότητα (>50mg/ml) και έχουν αποδειχθεί ασφαλή ακόμη και για οφθαλμική χρήση. H SBE7-β-CD χρησιμοποιείται σε κλινικά πειράματα για παρεντερική χορήγηση φαρμάκων και είναι γνωστή με το εμπορικό όνομα Captisol TM[Mosher και Thompson, Stella and Rajewski (1997), Szente and Szejtli (1999), Okimoto και συνεργάτες (1996), Hirayama και συνεργάτες (1999)]. Πίνακας ΘΠ4: Η γενική δομή των κυκλοδεξτρινών και των κυριοτέρων παραγώγων τους με φαρμακευτικό ενδιαφέρον [Stella and Rajewski, (1997)]. Κυκλοδεξτρίνη Συντομογραφία R n α-κυκλοδεξτρίνη α-cd Η 4 β-κυκλοδεξτρίνη β- CD Η 5 γ-κυκλοδεξτρίνη γ- CD Η 6 6-ο-γλυκόσυλ-β-κυκλοδεξτρίνη G-β-CD Γλυκόσυλ- ή Η 5 6-ο-μαλτόσυλ-β-κυκλοδεξτρίνη M-β-CD Μαλτόσυλ- ή Η 5 Διμεθυλιωμένη-β-κυκλοδεξτρίνη DM-β-CD CH 3 ή H 5 Τριμεθυλιωμένη-β-κυκλοδεξτρίνη TM-β-CD CH 3 ή H 5 Τυχαίως μεθυλ-β-κυκλοδεξτρίνη RM-β-CD CH 3 ή H 5 2-Υδρόξυπροπυλ-β-κυκλοδεξτρίνη HP-β-CD CH 2 CHOHCH 3 ή H 5 Υδροξυβουτένυλ-β-κυκλοδεξτρίνη Hben-β-CD CH 2 CHOHCHCH 2 ή H 5 Σουλφοβουτυλαίθερ-β-κυκλοδεξτρίνη SBE-β-CD (CH 2 ) 4 SO 3 Na ή H 5 * Τα παράγωγα μπορούν να έχουν διαφορετικό DS της 2,3 ή 6 θέσης της γλυκοπυρανόζης 18

26 4. ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΜΕ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ Η βασικότερη ιδιότητα των κυκλοδεξτρινών είναι η ικανότητά τους να εγκλωβίζουν στην υδρόφοβη κοιλότητά τους είτε ολόκληρα μόρια υδρόφοβων βιοδραστικών ενώσεων είτε υδρόφοβα τμήματα των ενώσεων αυτών, σε υδατικά διαλύματα [Loftsson T., et al (2005]. Σχήμα Θ7: Σχηματική απεικόνιση του σχηματισμού συμπλόκου έγκλεισης βιοδραστικής ένωσης/κυκλοδεξτρίνης (σύμπλοκο σαλικυλικού οξέος : β- κυκλοδεξτρίνης). Τα σύμπλοκα που σχηματίζονται ονομάζονται σύμπλοκα έγκλεισης καθώς σε αυτά δεν σχηματίζονται πραγματικοί χημικοί δεσμοί μεταξύ των μορίων. Η σταθερότητα των συμπλόκων αυτών οφείλεται σε: 1. Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, 2. Δυνάμεις Van der Waals, 3. Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, 4. Δεσμούς υδρογόνου και 5. Στην απομάκρυνση μορίων νερού πλούσιων σε ενθαλπία από την υδρόφοβη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης. 4.1 ΣΤΑΘΕΡΑ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΕΓΚΛΕΙΣΗΣ Η σταθερά συμπλοκοποίησης ή σταθερά σχηματισμού συμπλόκου είναι μια σταθερά που προσδιορίζεται πειραματικά μετρώντας τη μεταβολή μιας φυσικοχημικής ιδιότητας (διαλυτότητα, απορρόφηση) του βιοδραστικού μορίου με αλλαγές της συγκέντρωσης του φαρμάκου ή/και της κυκλοδεξτρίνης. Η τιμή της σταθεράς αυτής, με μονάδα το M -1, αποτελεί μέτρο της ικανότητας συμπλοκοποίησης των διαφόρων κυκλοδεξτρινών. Για απλούστευση, το S θα συμβολίζει το εγκλωβιζόμενο μόριο (guest molecule) και το L θα συμβολίζει τον ξενιστή (host 19

27 molecule), δηλαδή την κυκλοδεξτρίνη. Έτσι, ο σχηματισμός ενός συμπλόκου έγκλεισης περιγράφεται από τη γενική εξίσωση: ms + nl S m L n (1) όπου m και n είναι ο αριθμός των μορίων της δραστικής ουσίας και της κυκλοδεξτρίνης, αντίστοιχα. Η σταθερά ισορροπίας δίνεται από την σχέση: K = [S m L n ] [S] m [L] n (2) Η στοιχειομετρική αναλογία των συμπλόκων που σχηματίζονται διαφέρει και εξαρτάται από το τύπο της κυκλοδεξτρίνης και από το μέγεθος και τις φυσικοχημικές ιδιότητες της βιοδραστικής ένωσης. Η απλούστερη και συχνότερα απαντούμενη στοιχειομετρική αναλογία είναι ίση με 1:1, οπότε το σύμπλοκο συμβολίζεται S:L. S + L SL (3) K 1:1 = [SL] (4) [S][L] Όταν όμως η κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης είναι αρκετά μεγάλη δύο μόρια βιοδραστικής ένωσης μπορούν να εγκλωβιστούν, οπότε σχηματίζεται σύμπλοκο με στοιχειομετρία 2:1 (S 2 L) σπανιώτερη περίπτωση. S + SL S 2 L (5) K 2:1 = [S 2L] (6) [S][SL] Αντίστοιχα, αν το μόριο της βιοδραστική ένωσης είναι πολύ μεγάλο και κατά προτίμηση γραμμικό (itraconazole, linoleic acid) τότε απαιτούνται περισσότερα από ένα μόρια κυκλοδεξτρίνης για να το εγκλωβίσουν οπότε σχηματίζονται σύμπλοκα μεγαλύτερης τάξης ως προς την κυκλοδεξτρίνη (1:2 για το SL 2, 1:3 για το SL 3 ) εκτός από το σύμπλοκο με στοιχειομετρία 1:1. SL + L SL 2 όπου η σταθερά δίνεται από την σχέση K 1:2 = [SL 2] [SL][L] (7) ή S + L 2 SL 2 για την ολική σταθερά σχηματισμού K 1:2 = [SL 2] [S][L 2 ] (8) 4.2 ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑΣ ΦΑΣΕΩΝ Η περισσότερο χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό της σταθεράς συμπλοκοποίησης και της στοιχειομετρίας του συμπλόκου είναι η μελέτη της διαλυτότητας φάσεων [Higuchi and Connors (1965)]. Είναι η απλούστερη τεχνική και περιλαμβάνει αρχικά την προσθήκη σταθερής ποσότητας βιοδραστικής ουσίας (Substrate) σε μία σειρά από περιέκτες (vials) ανάλογα με την φυσιολογική διαλυτότητα της. Σε κάθε περιέκτη προστίθεται σταθερός όγκος υδατικού διαλύματος προοδευτικά αυξανόμενης συγκέντρωσης σε κυκλοδεξτρίνη (Ligand). Οι περιέκτες σφραγίζονται και αναδεύονται σε σταθερή θερμοκρασία 20

28 μέχρι να αποκατασταθεί ισορροπία. Στη συνέχεια, τα αιωρήματα διηθούνται για την απομάκρυνση του στερεού και τα διηθήματα αναλύονται και προσδιορίζεται η ολική συγκέντρωση του υποστρώματος ανεξάρτητα από την μοριακή κατάστασή του χρησιμοποιώντας κατάλληλη αναλυτική τεχνική. Ακολούθως κατασκευάζεται ένα διάγραμμα φάσεως ή ισόθερμος διαλυτότητας με τη γραφική παράσταση της ολικής συγκέντρωσης του υποστρώματος [S] ως προς τη συγκέντρωση του υποκαταστάτη που προστέθηκε στο σύστημα [Connors (1987)]. Σημαντικό μεονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι ο μεγάλος χρόνος για την αποκατάσταση της ισορροπίας (από 3 μέχρι 10 ημέρες) γιαυτό απαιτούνται προκαταρκτικά πειράματα για τον προσδιορισμό του (λήψη δειγμάτων έως ότου η συγκέντρωση της βιοδραστικής ουσίας να παραμένει σταθερή). Τα διαγράμματα φάσεως διακρίνονται σε δύο γενικούς τύπους: 1. Στα διαγράμματα τύπου Α, τα οποία χαρακτηρίζονται α) από το σχηματισμό ευδιάλυτων συμπλόκων μεταξύ κυκλοδεξτρίνης και βιοδραστικής ένωσης και β) από την συνεχή αύξηση της διαλυτότητας της βιοδραστικής ένωσης όσο αυξάνεται η συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης. Τα διαγράμματα τύπου Α διακρίνονται σε 3 επιμέρους κατηγορίες: Α) Α L type: στα διαγράμματα αυτά το σύμπλοκο εμφανίζει πρώτης τάξης σχέση με τη συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης και πρώτης ή μεγαλύτερης τάξης σχέση με τη συγκέντρωση της βιοδραστικής ένωσης (SL, S 2 L, S 3 L, S m L). Το διάγραμμα αυτό παριστά μια γραμμική σχέση ανάμεσα στη συγκέντρωση του υποκαταστάτη και τη συνολική συγκέντρωση της βιοδραστικής ουσίας στο διάλυμα. Β) Α p type: στα διαγράμματα αυτά εμφανίζεται θετική απόκλιση από τη γραμμική σχέση και το σχηματιζόμενο σύμπλοκο εμφανίζει πρώτης τάξης σχέση με τη συγκέντρωση της βιοδραστικής ουσίας και δεύτερης ή μεγαλύτερης τάξης σχέση με τη κυκλοδεξτρίνη (SL 2, SL 3, SL n ). Γ) Α N type: στα διαγράμματα αυτά εμφανίζεται αρνητική απόκλιση από τη γραμμική σχέση. Η αρνητική απόκλιση από την γραμμική σχέση οφείλεται είτε στην συσσωμάτωση των μορίων της κυκλοδεξτρίνης είτε σε αλλαγές στις ιδιότητες του διαλύτη. 21

29 Σχήμα Θ8: Γραφική απεικόνιση των διαφόρων τύπων ισοθέρμων διαλυτότητας κατά Higuchi και Connors. 2. Στα διαγράμματα τύπου Β, τα οποία χαρακτηρίζονται από το σχηματισμό συμπλόκων περιορισμένης διαλυτότητας. Τα σύμπλοκα αυτά καταβυθίζονται όταν η συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης ξεπεράσει μία ορισμένη τιμή. Τα δυσδιάλυτα αυτά σύμπλοκα έχουν ενδιαφέρον σε συστήματα βραδείας αποδέσμευσης βιοδραστικών ενώσεων. Στην ισόθερμο Β s το τμήμα xy υποδεικνύει το σχηματισμό ενός ευδιάλυτου συμπλόκου που αυξάνει τη συγκέντρωση της βιοδραστικής ουσίας και είναι παρόμοιο με τα διαγράμματα τύπου Α. Στο σημείο y όμως, η ευθεία οριζόντια γραμμή υποδεικνύει ότι παρά το σχηματισμό συμπλόκου, η συνολική συγκέντρωση της διαλυτοποιημένης βιοδραστικής ουσίας παραμένει σταθερή, επομένως το σύμπλοκο που σχηματίζεται καταβυθίζεται αφού το διάλυμα είναι κορεσμένο ως προς αυτό. Στο τελευταίο τμήμα της ισοθέρμου παρατηρείται απότομη μείωση της συγκέντρωσης της διαλυτοποιημένης βιοδραστικής ουσίας λόγω του σχηματισμού δυσδιάλυτων συμπλόκων ανώτερης τάξεως με τα μόρια της κυκλοδεξτρίνης. Η ισόθερμος ΒI είναι παρόμοια με τη BS με τη διαφορά ότι το σύμπλοκο που σχηματίζεται είναι περισσότερο δυσδιάλυτο σε σχέση με το σύμπλοκο στην περίπτωση της ισοθέρμου BS και δεν παρατηρείται αύξηση της διαλυτότητας της βιοδραστικής ουσίας με την συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης [Connors (1987)]. 22

30 4.2.1 ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΕΓΚΛΕΙΣΗΣ ΜΕ ΣΤΟΙΧΕΙΟΜΕΤΡΙΑ 1:1 Οι βασικοί στόχοι των διαγραμμάτων φάσεων είναι ο προσδιορισμός α) της στοιχειομετρίας και β) των σταθερών σχηματισμού των σχηματιζόμενων συμπλόκων. Έστω ότι έχουμε το σχηματισμό ενός συμπλόκου με στοιχειομετρία 1:1. Οι ολικές ποσότητες υποστρώματος (S) και υποκαταστάτη (L) (εξισώσεις ισοζυγίων μάζας) είναι: [S] t = [S] f + [S] b (9) [L] t = [L] f + [L] b [L] f = [L] t - [L] b (10) όπου [S] t και [L] t συμβολίζεται η συνολική, [S] f και [L] f η ελεύθερη και [S] b και [L] b η δεσμευμένη ποσότητα της βιοδραστικής ουσίας και της κυκλοδεξτρίνης, αντίστοιχα. Επειδή όμως η ελεύθερη ποσότητα του υποστρώματος είναι ίση με την υδατοδιαλυτότητα (S 0 ) αυτού, η σχέση [S] t = [S] f + [S] b (9) λαμβάνει την μορφή: [S] t = S 0 + [S] b (11) Θεωρώντας ότι το σύμπλοκο που σχηματίζεται έχει στοιχειομετρία 1:1 συνεπάγεται ότι η συγκέντρωση της δεσμευμένης βιοδραστικής ουσίας θα ισούται με τη συγκέντρωση της δεσμευμένης κυκλοδεξτρίνης και εκείνη με τη σειρά της θα ισούται με τη συγκέντρωση του συμπλόκου που σχηματίζεται. Δηλαδή: [S] b = [L] b = [SL] (12) Με βάση την αντίδραση S + L SL η σταθερά συμπλοκοποίησης θα ισούται με: Κ 1:1 = [SL] / [S] f [L] f Κ 1:1 = [SL] / S 0 [L] f (13) Από τις σχέσεις (10) ([L] t = [L] f + [L] b [L] f = [L] t - [L] b [S]t = S0 + [S] b (11) Κ1: 1 = [SL] / [S] f [L] f Κ1 :1 = [SL] / S0 [L] f (13) συνεπάγεται ότι: K 1:1 = [SL] S 0 ([L t] [L b ]) K 1:1 = [SL] S 0 ([L t ] [SL]) (14) Λύνοντας ως προς [SL] έχουμε: [SL] = K 1:1 S 0 [L t ] 1+K 1:1 S 0 (15) Επομένως, η γραφική παράσταση της συγκέντρωσης της διαλυτοποιημένης βιοδραστικής ουσίας έναντι της συνολικής συγκέντρωσης της κυκλοδεξτρίνης, δηλαδή η ισόθερμος διαλυτότητας, δίνει μια ευθεία γραμμή που τέμνει τον άξονα y 23

31 στο σημείο S0. Από την κλίση της ευθείας μπορεί εύκολα να υπολογιστεί η σταθερά K 1:1 καθώς: Κλίση = K 1:1[S 0 ] K 1:1 [S 0 ]+1 (16) Σύμφωνα με την παραπάνω σχέση η τιμή της κλίσης είναι πάντα μικρότερη της μονάδας. Η σταθερά Κ1:1 από την κλίση και την διαλυτότητα της βιοδραστικής ένωσης απουσία κυκλοδεξτρίνης με την ακόλουθη εξίσωση : K 1:1 = κλίση S 0 (1 κλίση) (17) Συγκέντρωση Βιοδραστικής Ένωσης / Μ S 0 Αύξηση κλίσης αύξηση σταθερότητας Κλίση ~ σταθερότητα συμπλόκου Συγκέντρωση Κυκλοδεξτρίνης / Μ Σχήμα Θ9: Ισόθερμος διαλυτότητας δυσδιάλυτης βιοδραστικής ένωσης που σχηματίζει σύμπλοκο με κυκλοδεξτρίνη με στοιχειομετρία 1:1. Η τιμή της Κ1:1 είναι συνήθως μεταξύ 50 και 2000 Μ -1 και η μέση τιμή για την α-, β-, γ- κυκλοδεξτρίνη είναι 129, 490 και 355 Μ -1 αντίστοιχα. Αυτή όμως η σχέση ισχύει μόνο όταν η κλίση είναι μικρότερη της μονάδας. Και αυτό γιατί τα διαγράμματα ΑL είναι αυτά στα οποία το σύμπλοκο εμφανίζει πρώτης τάξης σχέση με τη συγκέντρωση του υποκαταστάτη και πρώτης ή μεγαλύτερης τάξης σχέση με τη συγκέντρωση του υποστρώματος (SL, S 2 L, S 3 L, S m L). Η κλίση στο διάγραμμα της ισοθέρμου διαλυτότητας σχετίζεται άμεσα με την σταθερότητα του σχηματιζόμενου συμπλόκου βιοδραστικής ένωσης κυκλοδεξτρίνης. Αύξηση της κλίσης έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της σταθερότητας του σχηματιζόμενου συμπλόκου και της αντίστοιχης σταθεράς σχηματισμού Κ1:1. Στο Σχήμα Θ, απεικονίζονται οι ισόθερμοι διαλυτότητας για μια βιοδραστική ένωση παρουσία τριών διαφορετικών κυκλοδεξτρινών. Η ισόθερμος διαλυτότητας της βιοδραστικής ένωσης παρουσία της κυκλοδεξτρίνης Γ έχει την μεγαλύτερη κλίση και κατά συνέπεια το σχηματιζόμενο σύμπλοκο έχει την μεγαλύτερη σταθερότητα και την μεγαλύτερη σταθερά 24

32 σχηματισμού. Επίσης για την ίδια συγκέντρωση κυκλοδεξτρίνης, η κυκλοδεξτρίνη Γ παρουσιάζει την μεγαλύτερη διαλυτοποιητική ικανότητα, S3 (εστιγμένη γραμμή) σε σύγκριση με την κυκλοδεξτρίνη Β (διαλυτοποιητική ικανότητα, S2) και την κυκλοδεξτρίνη Α (διαλυτοποιητική ικανότητα, S1). Συγκέντρωση βιοδραστικής ένωσης / Μ S 0 S 3 S 2 S 1 Κυκλοδεξτρίνη Γ Κυκλοδεξτρίνη Β Κυκλοδεξτρίνη Α Συγκέντρωση Κυκλοδεξτρίνης / Μ Σχήμα Θ10: Ισόθερμοι διαλυτότητας δυσδιάλυτης βιοδραστικής ένωσης που σχηματίζει σύμπλοκα με κυκλοδεξτρίνες με στοιχειομετρία 1:1. Συγκέντρωση βιοδραστικής ένωσης/ Μ T 3 > T 2 > T 1 S 0 (T 3 ) S 0 (T 2 ) S 0 (T 1 ) T 3 T 2 T 1 S 0 (T 3 ) > S 0 (T 2 ) > S 0 (T 1 ) Συγκέντρωση Κυκλοδεξτρίνης / Μ Σχήμα Θ11: Επίδραση της θερμοκρασίας στην ισόθερμο διαλυτότητας δυσδιάλυτης βιοδραστικής ένωσης που σχηματίζει σύμπλοκα με κυκλοδεξτρίνη με στοιχειομετρία 1:1 Έτσι, αν η αντίδραση έχει τη μορφή : ms + L S m L (18) 25

33 τότε με κατάλληλη τροποποίηση των ισοζυγίων μάζας για την ολική βιοδραστική ένωση και την ολική κυκλοδεξτρίνη έχουμε τις εξισώσεις: [L] f = [L] t - [S m L] (19) [S m L] = ([S] t [S] 0 ) / m (20) και τελικά προκύπτει ότι: [S t ] = mks 0 m L t 1+KS 0 m + S 0 (21) Επομένως, η γραφική παράσταση του S t ως προς L t για το σχηματισμό ενός διαλυτού συμπλόκου S m L δίνει ευθεία γραμμή (διάγραμμα τύπου Α L ) που τέμνει τον άξονα y στο σημείο S 0 και η κλίση της δίνεται από τη σχέση: κλίση = mks 0 m 1+KS 0 m (22) Για παράδειγμα στην περίπτωση σχηματισμού συμπλόκου με στοιχειομετρία 2:1 η κλίση δίνεται από την σχέση: Slope = 2S 0K 2:1 S 0 2 K 2:1 +1 όπου Κ 2:1 είναι η σταθερά συμπλοκοποίησης του συμπλόκου. Στην περίπτωση αυτή η κλίση του διαγράμματος φάσεως είναι πάντα μικρότερη από την τιμή δύο. Όταν η σχέση ανάμεσα στη συγκέντρωση της διαλυμένης βιοδραστικής ουσίας και τη συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης δεν είναι γραμμική σχηματίζεται σύμπλοκο υψηλότερης τάξης. Πιο συχνά εμφανίζεται σύμπλοκο με στοιχειομετρία 1:2, δηλαδή ένα σύμπλοκο δεύτερης τάξης ως προς την κυκλοδεξτρίνη, όπου ένα μόριο βιοδραστικής ουσίας δεσμεύεται από δύο μόρια κυκλοδεξτρίνης. Ο σχηματισμός του συμπλόκου γίνεται σε δύο στάδια, με βάση τις αντιδράσεις: S + L SL και SL + L SL 2 Οι σταθερές συμπλοκοποίησης των επιμέρους συμπλόκων [SL] και [SL 2 ] συμβολίζονται Κ 1:1 και Κ 1:2, αντίστοιχα και δίνονται από τη σχέσεις: K 1:1 = [SL] [S][L] και K 1:2 = [SL 2] [SL][L] Σημειώνεται ότι εάν η σταθερά Κ 1:2 δίνεται ως ολική σταθερά σχηματισμού δηλαδή ως Κ 1:2 =[SL 2 ]/[S][L] 2 τότε σε αυτή τη περίπτωση η τιμή της διαφέρει. Με βάση τα ισοζύγια μάζας για την βιοδραστική ένωση και την κυκλοδεξτρίνη έχουμε: [S] t = S 0 + [SL] + [SL 2 ] (24) (23) [L t ] = [L f ] + [SL] + 2[SL] 2 (25) 26

34 Από τις παραπάνω εκφράσεις των σταθερών το ισοζύγιο μάζας για την ολική βιοδραστική ένωση λαμβάνει την μορφή : [S t ] = [S 0 ] + K 1:1 [S 0 ] [L f ] + K 1:1 K 1:2 [S 0 ] [L f ] 2 (26) Ανάλογα το ισοζύγιο μάζας για την ολική κυκλοδεξτρίνη έχει την μορφή : [L t ] = [L f ] + K 1:1 [S 0 ] [L f ] + 2 K 1:1 K 1:2 [S 0 ] [L f ] 2 (27) και λύνοντας την δευτεροβάθμια εξίσωση ως προς την συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης έχουμε: L = b+(b2 +al t ) 1/2 2a (28) όπου α = 2Κ 1:1 K 1:2 S 0 και b = 1 + K 1:1 S 0 Η τιμή της Κ 1:2 είναι συνήθως 10 έως 500 Μ -1 και σημαντικά μικρότερη από την τιμή της Κ 1:1. Αντίστοιχα, αν το σύμπλοκο που σχηματίζεται είναι τρίτου βαθμού ως προς την κυκλοδεξτρίνη η ολική συγκέντρωση της βιοδραστικής ουσίας και της κυκλοδεξτρίνης δίνονται από τις σχέσεις: [S t ] = [S 0 ](1 + K 1:1 [L f ] + K 1:1 K 1:2 [L f ] 2 + K 1:1 K 1:2 K 1:3 [L f ] 3 ) [L t ] = [L f ] + [S 0 ]K 1:1 [L f ] + 2[S 0 ]K 1:1 K 1:2 [L f ] 2 + 3[S 0 ]K 1:1 K 1:2 K 1:3 [L f ] 3 όπου Κ 1:3 η σταθερά συμπλοκοποίησης του συμπλόκου SL 3 Στην περίπτωση τώρα που το διάγραμμα διαλυτότητας φάσεων παρουσιάζει θετική απόκλιση από τη γραμμική σχέση (ισόθερμος τύπου Α p ) και σχηματίζονται σύμπλοκα βιοδραστικής ένωσης-κυκλοδεξτρίνης με στοιχειομετρία 1:1 και 1:2, οι σταθερές συμπλοκοποίησης Κ 1:1 και K 1:2 μπορούν να υπολογιστούν με βάση το μαθηματικό πρότυπο του Iga [Iga et al (1998)], σύμφωνα με το οποίο οι εξισώσεις που προκύπτουν από τα ισοζύγια μάζας για την ολική βιοδραστική ένωση και την ολική κυκλοδεξτρίνη έχουν την ακόλουθη μορφή: και Seq S0 = [SL] + [SL2] = K1:1 S0 [L](1 + K1:2[L]) (29) Leq = [L] + [SL] + 2[SL2] = [L] (1 + K1:1 S0 (1 + K1:2 [L])) (30) Από τις σχέσεις Seq S0 = [SL] + [SL2] = K1:1 S0[L](1 + K1:2[L]) και συνεπάγεται ότι: Leq = [L] + [SL] + 2[SL2] = [L] (1 + K1:1 S0 (1 + K1:2 [L])) L = Q 1 K 1:1 S 0 (31) όπου ο όρος ισούται με Q = L t 2(S eq S 0 ). Με αντικατάσταση της εξίσωσης Lt = 2(Seq S0) στην εξίσωση Seq S0 = [SL] + [SL2] = K1:1 S0[L](1 + K1:2[L]) προκύπτει ότι: 27

35 η οποία οδηγεί στη γραμμική σχέση: y=a+bq S eq S 0 = QK 1+K 1:2 [Q] 1:1S 0 1 K 1:1 S 0 (32) 1 K 1:1 S 0 όπου: y = S eq S 0, a = K 1:1S 0 και b = ak 1:2. Q 1 K 1:1 S 0 1 K 1:1 S 0 Επομένως, η γραφική παράσταση του y έναντι του Q δίνει ευθεία γραμμή, από τη κλίση της οποίας και την τεταγμένη επί την αρχή μπορούμε εύκολα να υπολογίσουμε τις σταθερές συμπλοκοποίησης: K 1:1 = a S 0 (1+a) (33) και K 1:2 = b(1 K 1:1S 0 ) a (34) Τα διαλυμένα μόρια της δραστικής ουσίας μπορεί να σχηματίσουν υδατοδιαλυτά διμερή, τριμερή και άλλα πολυμερή συσσωματώματα, καθώς και να συσχετισθούν με άλλα έκδοχα που είναι παρόντα στο διάλυμα. Αρκετά συχνά, μόνο τα μόρια της δραστικής ουσίας σχηματίζουν σύμπλοκα με τα διαλυμένα μόρια της κυκλοδεξτρίνης και όχι τα πολυμερή [Brewster and Loftsson, (2007)]. Υπό αυτές τις συνθήκες, το σημείο τομής του άξονα y δεν είναι ίσο με το S0, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε αρκεντικά σημαντικό σφάλμα κατά τον υπολογισμό της K 1:1. Μία διαφορετική και πιο ακριβής μέθοδος για τον υπολογισμό της επίδρασης της κυκλοδεξτρίνης στην υδατοδιαλυτότητα της δραστικής ουσίας είναι ο υπολογισμός της σταθεράς CE (δηλαδή του λόγου της συγκέντρωσης της συμπλοκοποιημένης κυκλοδεξτρίνης προς τη συγκέντρωση της ελεύθερης). Η CE μπορεί να υπολογιστεί από το διάγραμμα φάσης διαλυτότητας της δραστικής ουσίας, είναι ανεξάρτητη και από το S0 και από το σημείο τομής του άξονα του y και είναι πιο αξιόπιστη κατά την μελέτη της επιρροής των διαφόρων φαρμακετικών εκδόχων στη διαλυτότητα της δραστικής ουσίας [Loftsson and Brewster, (2010), Kurkov and Loftsson (2013)]. Για αντιδράσεις στοιχειομετρίας 1:1 η CE υπολογίζεται ως εξής: CE = [SL] [L] = S 0K 1:1 = 4.3 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΣΗΣ κλίση 1 κλίση Ο εγκλωβισμός ενός τμήματος ή ολόκληρης της βιοδραστικής ουσίας στην υδρόφοβη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης σχετίζεται με μία σειρά φαινομένων - αλληλεπιδράσεων. Οι μελέτες που έχουν γίνει στον τομέα αυτό έχουν οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι ο σχηματισμός των συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών περιλαμβάνει φαινόμενα όπως οι: Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις Αλληλεπιδράσεις Van der Waals (35) 28

36 Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις Δεσμοί υδρογόνου Απελευθέρωση μορίων ύδατος πλούσιων σε ενθαλπία Αλληλεπίδραση μεταφοράς φορτίου (charge transfer). Η σημασία που έχουν οι παραπάνω καλούμενες και ασθενείς διαμοριακές δυνάμεις στο σχηματισμό των συμπλόκων επηρεάζεται από το εγκλωβιζόμενο μόριο, την κυκλοδεξτρίνη και το διαλύτη και στις περισσότερες των περιπτώσεων περισσότερες από μία δυνάμεις συμμετέχουν στη συμπλοκοποίηση. Πρέπει όμως εδώ να σημειωθεί ότι αναφερόμαστε μόνο στις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στο μόριο της βιοδραστικής ουσίας και την επιφάνεια της υδρόφοβης κοιλότητας της κυκλοδεξτρίνης και όχι στις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στη βιοδραστική ουσία και τις ομάδες των υποκαταστατών στις τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες [Szejtli (1996), Connors (1997)]. Παρακάτω δίνεται λεπτομερέστερη περιγραφή αυτών των αλληλεπιδράσεων ΗΛΕΚΤΡΟΣΤΑΤΙΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ Αλληλεπιδράσεις Van der Waals Οι δεσμοί Van der Waals είναι μία μη ειδική δύναμη και δημιουργούνται όταν δύο άτομα βρεθούν σε απόσταση 3 έως 4 Å μεταξύ τους. Παρά το γεγονός ότι είναι ασθενέστεροι και λιγότερο εξειδικευμένοι από ότι οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις και οι δεσμοί υδρογόνου, δεν είναι λιγότερο σημαντικοί για το σχηματισμό των συμπλόκων έγκλεισης. Οι αλληλεπιδράσεις van der Waals δημιουργούνται από την αλλαγή της κατανομής του ηλεκτρονικού φορτίου γύρω από τα άτομα με το χρόνο (παροδικά δίπολα). Σε μία δεδομένη στιγμή, η κατανομή του φορτίου δεν είναι απολύτως συμμετρική. Αυτή η ασύμμετρη κατανομή ηλεκτρονικών φορτίων γύρω από ένα άτομο, ενθαρρύνει μια παρόμοια ασυμμετρία στην κατανομή ηλεκτρονίων γύρω από τα γειτονικά του άτομα (δίπολα εξ επαγωγής). Η συνεπαγόμενη έλξη μεταξύ ενός ζεύγους ατόμων αυξάνει καθώς αυτά πλησιάζουν μέχρι να φτάσουν στην απόσταση επαφής Van der Waals. Σε αποστάσεις μικρότερες από αυτή αναπτύσσονται πολύ ισχυρές απωστικές δυνάμεις, επειδή τα εξωτερικά νέφη των ηλεκτρονίων αλληλεπικαλύπτονται. Οι απωστικές αυτές δυνάμεις ονομάζονται δυνάμεις London, ενώ εμπλέκονται και οι αλληλεπιδράσεις διπόλου-διπόλου και διπόλων εξ επαγωγής. Ο όρος αλληλεπιδράσεις Van der Waals περιλαμβάνει τις δυνάμεις διπόλου-διπόλου, τις δυνάμεις London και τις δυνάμεις διπόλου-διπόλου εξ επαγωγής. Η απόσταση μεταξύ ατόμων οξυγόνου και άνθρακα είναι για παράδειγμα 3.4 Å και αυτό γιατί αποτελεί το άθροισμα 1.4 και 2 Å των ακτίνων επαφής των ατόμων Ο και C. 29

37 Η ενέργεια του δεσμού Van der Waals για ένα ζεύγος ατόμων είναι περίπου 1Kcal/mol, επομένως σημαντικά ασθενέστερη από ότι ενός δεσμού υδρογόνου ή ενός ηλεκτροστατικού δεσμού που κυμαίνεται από 3 έως 7Kcal/mol. Επομένως, ένας μόνο δεσμός Van der Waals έχει πολύ μικρή σημασία, ειδικά όταν η απόσταση ενός ζεύγους ατόμων γίνεται έστω κατά 1 Å μεγαλύτερη από την απόσταση επαφής τους. Αντιθέτως, οι δυνάμεις αυτές γίνονται σημαντικές όταν μεγάλος αριθμός ατόμων ενός μορίου μπορεί να πλησιάσει ταυτόχρονα πολλά άτομα ενός άλλου μορίου. Αυτό είναι δυνατόν να συμβεί μόνο όταν το σχήμα των μορίων ταιριάζει. Με άλλα λόγια, η αποτελεσματικότητα των δεσμών Van der Waals εξαρτάται από την συμπληρωματικότητα των μορίων στο χώρο. Έτσι, παρόλο που δεν υπάρχει καθόλου εξειδίκευση σε ένα μόνο δεσμό Van der Waals, η εξειδίκευση προκύπτει από από την ευκαιρία να δημιουργηθούν πολλοί δεσμοί Van der Waals συγχρόνως στο εσωτερικό της κοιλότητας της κυκλοδεξτρίνης [Szejtli (1996), Connors (1997), Liu and Guo (2002)] ΥΔΡΟΦΟΒΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ Με τον όρο υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις περιγράφουμε την τάση των υδρόφοβων μορίων ή των υδρόφοβων τμημάτων των μορίων να αποφεύγουν το νερό επειδή αυτά δεν μπορούν να προσαρμοσθούν στη χαρακτηριστική δομή του νερού με τους δεσμούς υδρογόνου. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα μεγάλα υδρόφοβα μόρια να συζεύγνυνται μεταξύ τους, στη προσπάθειά τους να αποφύγουν τα μόρια του νερού, και να σχηματίζουν δομές παρόμοιες με αυτές των μικυλλίων, με τα μη πολικά τμήματα σε επαφή στις εσωτερικές περιοχές των μικυλλίων αυτών από όπου έχουν απομακρυνθεί τα μόρια του νερού, ενώ αντίστοιχα τα πολικά τους τμήματα προεξέχουν προς την επιφάνεια του μικυλλίου αλληλεπιδρώντας με τα μόρια του νερού. Η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί σε θετική μεταβολή της ενθαλπίας και της εντροπίας του συστήματος και η μεταβολή αυτή θεωρήθηκε ως ένδειξη της ύπαρξης υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Μάλιστα, η αύξηση της εντροπίας είναι σημαντικά μεγαλύτερη με αποτέλεσμα το φαινόμενο να ελέγχεται ουσιαστικά από την μεταβολή της. Αρχικά, το γεγονός ότι κατά το σχηματισμό των συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών η μεταβολή των δύο θερμοδυναμικών παραμέτρων είναι αρνητική οδήγησε στο λανθασμένο συμπέρασμα ότι η συνεισφορά των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων κατά τη συμπλοκοποίηση είναι πολύ μικρή. Στη συνέχεια όμως αποδείχθηκε ότι οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις παίζουν ουσιαστικό ρόλο στη συμπλοκοποίηση και ότι η θετική αύξηση της εντροπίας και της ενθαλπίας υπερκαλύπτονται από τις αρνητικές αλλαγές που οφείλονταν στην απελευθέρωση μορίων πλούσιων σε ενθαλπία και στις αλληλεπιδράσεις Van der Waals. Η μοναδική όμως πηγή αύξησης της εντροπίας είναι η υδρόφοβος αλληλεπίδραση [Connors (1997), Liu and Guo (2002), [Loftsoon & Brewster (1996)]. 30

38 4.3.3 ΔΕΣΜΟΙ ΥΔΡΟΓΟΝΟΥ Οι διαμοριακές ελκτικές δυνάμεις για ορισμένες υδρογονούχες ενώσεις είναι ασυνήθιστα ισχυρές. Οι ελκτικές αυτές δυνάμεις εμφανίζονται σε υδρογονούχες ενώσεις, στις οποίες το υδρογόνο είναι ομοιοπολικά ενωμένο με ένα ισχυρά ηλεκτραρνητικό και μικρό σε μέγεθος άτομο Υ- όπως το οξυγόνο, το άζωτο, το χλώριο και το φθόριο. Σ αυτές τις ενώσεις τα ηλεκτρόνια του δεσμού Υ-Η έλκονται τόσο ισχυρά από το στοιχείο Υ, ώστε στο άτομο Η εμφανίζεται ένα σημαντικό θετικό φορτίο δ+. Στην ουσία, το άτομο Η, απογυμνωμένο από τη θωράκιση των ηλεκτρονίων του δεσμού δεν διαφέρει πολύ από ένα πρωτόνιο. Το άτομο Η ενός μορίου Υ-Η και ένα ελεύθερο ζεύγος ηλεκτρονίων του ηλεκτραρνητικού ατόμου Υ ενός γειτονικού μορίου έλκονται αμοιβαία σχηματίζοντας αυτό που ονομάζουμε δεσμό ή γέφυρα υδρογόνου. Η ενέργεια των δεσμών κυμαίνεται από 3 έως 7 Kcal/mol. Οι δεσμοί υδρογόνου είναι ισχυρότεροι από τους δεσμούς Van der Waals, αλλά πολύ ασθενέστεροι απ ότι οι ομοιοπολικοί δεσμοί. Το μήκος ενός δεσμού υδρογόνου κυμαίνεται μεταξύ αυτού του ομοιοπολικού δεσμού και ενός δεσμού Van der Waals. Οι δεσμοί υδρογόνου παίζουν σημαντικό ρόλο στη συμπλοκοποίηση των κυκλοδεξτρινών σε υδατικά διαλύματα και εμφανίζονται κυρίως στη πρωτογενή Ο(6)-Η ομάδα των κυκλοδεξτρινών και πιο σπάνια στα δευτερογενή Ο(2) και Ο(3) άτομα ενώ έχουν βρεθεί και δεσμοί C-H O, C-H N και C-H π μεταξύ της επιφάνειας της εσωτερικής κοιλότητας και του βιοδραστικού μορίου, με ενέργεια που κυμαίνεται μεταξύ 0.7 και 1.1Kcal/mol [Liu and Guo (2002)] ΑΠΕΛΕΥΘΕΡΩΣΗ ΜΟΡΙΩΝ ΥΔΑΤΟΣ ΠΛΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΕΝΘΑΛΠΙΑ Επειδή η κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης είναι μη πολική, τα μόρια του νερού που βρίσκονται στο εσωτερικό της κυκλοδεξτρίνης δεν μπορούν να σχηματίσουν τον ίδιο αριθμό δεσμών υδρογόνου με τα μόρια που περιβάλλουν τη κυκλοδεξτρίνη, με αποτέλεσμα τα πρώτα να έχουν υψηλότερη ενέργεια και να καλούνται μόρια ύδατος πλούσια σε ενθαλπία. Η απελευθέρωση των μορίων αυτών από την κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης προκειμένου να αυξήσουν τον αριθμό των δεσμών υδρογόνου με τα μόρια του περιβάλλοντος διαλύτη και η παράλληλη αντικατάστασή τους από τα εγκλωβιζόμενα μόρια, που είναι λιγότερο πολικά από το νερό, θεωρείται μία από τις κινητήριες δυνάμεις του σχηματισμού συμπλόκων έγκλεισης και συνοδεύεται από αρνητική μεταβολή της ενθαλπίας του συστήματος [Liu and Guo (2002)]. 31

39 4.3.5 ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΦΟΡΤΙΣΗΣ-ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ (Charge-transfer interaction) Η σημασία της αλληλεπίδρασης φόρτισης-μεταφοράς στο σχηματισμό συμπλόκων έγκλεισης ανακαλύφθηκε πρόσφατα στη προσπάθεια των μελετητών να δώσουν απάντηση σε μια σειρά από ερωτήματα, που έρχονταν στην επιφάνεια λαμβάνοντας υπόψην μόνο τις παραπάνω κινητήριες δυνάμεις, όπως αυτά που προέκυπταν κατά την συμπλοκοποίηση της β-κυκλοδεξτρίνης με το βενζοϊκό οξύ και το νιτροβενζένιο. Θεωρητικά, με βάση τις φυσικοχημικές ιδιότητες των δύο φαρμάκων και δεχόμενοι μόνο τις παραπάνω δυνάμεις, το σύμπλοκο α-cd: νιτροβενζένιο έπρεπε να είναι πιο σταθερό σε σχέση με το σύμπλοκο α-cd: βενζοϊκό οξύ. Παρόλα αυτά, πειραματικά προσδιορίσθηκε το αντίθετο. Κατά το σχηματισμό των συμπλόκων έγκλεισης, η αλληλεπίδραση φόρτωσης-μεταφοράς προέρχεται από τη συμπλοκή των συμπληρωμένων τροχιακών ΗΟΜΟ (Highest Occupied Molecular Orbital) - του ενός συστατικού και των άδειων τροχιακών LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital) του άλλου. Ουσιαστικά, έχουμε ένα σύμπλοκο ηλεκτρονίου δότη-ηλεκτρονίου δέκτη που χαρακτηρίζεται από ηλεκτρονιακές μεταπτώσεις σε μια διεγερμένη κατάσταση. Στην κατάσταση αυτή έχουμε μερική μεταφορά (transfer) ηλεκτρονιακής φόρτισης (charge) από το δότη στο δέκτη. Στην περίπτωση της α-κυκλοδεξτρίνης, βρέθηκε ότι στις ενώσεις έγκλεισης η α-cd είναι πάντα αρνητικά φορτισμένη, με αποτέλεσμα οι αλληλεπιδράσεις φόρτισης-μεταφοράς να συμμετέχουν στη συμπλοκοποίηση. Η α-κυκλοδεξτρίνη είναι ένα οξύ κατά Lewis που δέχεται ηλεκτρόνια, ενώ ο υποκαταστάτης δρά ως βάση κατά Lewis προσφέροντας ηλεκτρόνια. Έτσι, η ενέργεια της φόρτισηςμεταφοράς εξαρτάται από την αλληλεπίδραση του HOMO του υποκαταστάτη και του LUMO της κυκλοδεξτρίνης. Όσο μεγαλύτερο είναι το ΗΟΜΟ του υποκαταστάτη τόσο μεγαλύτερη είναι και η ενέργεια της αλληλεπίδρασης. Επομένως, το ελαφρά υψηλότερο ΗΟΜΟ του βενζοϊκού οξέος δικαιολογεί τη μεγαλύτερη σταθερότητα του συμπλόκου α-cd: βενζοϊκό οξύ σε σχέση με το σύμπλοκο α-cd:νιτροβενζένιο. Τέλος, πρέπει να σημειωθεί ότι η σύγκριση της αλληλεπίδρασης φόρτισηςμεταφοράς είναι χρήσιμη μόνο όταν τα μόρια των υποκαταστατών είναι ισοηλεκτρονιακά. Σε αντίθετη περίπτωση άλλες δυνάμεις, όπως οι δυνάμεις διπόλου - διπόλου και άλλα στερικά φαινόμενα καθορίζουν τη σταθερότητα του συμπλόκου [Liu και συνεργάτες (2000)]. 4.4 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ Ο προσδιορισμός της σταθεράς σχηματισμού συμπλόκων διαφόρων μορίων με τις κυκλοδεξτρίνες σε διάφορες θερμοκρασίες είναι ιδιαίτερης σημασίας για την κατανόηση και την εκτίμηση των δυνάμεων που εμπλέκονται στο σχηματισμό των 32

40 συμπλόκων έγκλεισης. Οι θερμοδυναμικές ποσότητες που λαμβάνονται για την συμπλοκοποίηση είναι αποτέλεσμα των σταθμισμένων συνεισφορών των διαφόρων αλληλεπιδράσεων-δυνάμεων. Επιπρόσθετα, η σταθερά συμπλοκοποίησης είναι ένα μέτρο για την σταθερότητα του σχηματιζόμενου συμπλόκου και επομένως συνδέει την μεταβολή της ενθαλπίας και την μεταβολή της εντροπίας με τη μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας του συστήματος. Επομένως, μια επισταμένη μελέτη της συμπεριφοράς των συμπλόκων έγκλεισης θα πρέπει να περιλαμβάνει τον προσδιορισμό της μεταβολής της ενθαλπίας και τη μεταβολή της εντροπίας της αντίδρασης επιπρόσθετα στον υπολογισμό της σταθεράς συμπλοκοποίησης [Rekharsky & Inoue (1998), Connors (1997), Omari και συνεργάτες (2006)], Lofsson (1998)]. Η σχέση που συνδέει τη σταθερά συμπλοκοποίησης, τη μεταβολή της ενθαλπίας και τη θερμοκρασία είναι η εξίσωση van t Hoff : lnk = ΔΗ 0 αντ R 1 T + ΔS0 R όπου η γραφική παράσταση του lnk ως της 1/T δίνει ευθεία γραμμή με κλίση ίση με ΔG 0 αντ R και τεταγμένη επί την αρχή ίση με ΔS0 R (36). Έτσι, μπορούν εύκολα να υπολογιστούν οι μεταβολές της εντροπίας και της ενθαλπίας. Όταν η σταθερά συμπλοκοίησης είναι γνωστή σε δύο θερμοκρασίες μπορεί να χρησιμοποιηθεί η εξίσωση: ln K 2 K 1 = ΔH0 R ( 1 T 1 1 T 2 ) (37) Ενώ το ΔΗ και το ΔG δεν μεταβάλονται σημαντικά όταν αυξάνεται η θερμοκρασία, δεν συμβαίνει το ίδιο με τον όρο ΤΔS, ο οποίος σε υψηλές θερμοκρασίες γίνεται καθοριστικός παράγοντας της τιμής του ΔG. Οι μεταβολές της εντροπίας, ΔS, και της ενθαλπίας, ΔH, μάς δίνουν πληροφορίες για το είδος των αλληλεπιδράσεων που συμμετέχουν στο σχηματισμό του συμπλόκου έγκλεισης. Ο σχηματισμός συμπλόκου έγκλεισης στις περισσότερες περιπτώσεις συνοδεύεται από σχετικά μεγάλη μεταβολή της ενθαλπίας, ΔΗ, ενώ η μεταβολή της εντροπίας, ΔS, μπορεί να είναι είτε θετική είτε αρνητική. Επίσης, ο σχηματισμός του συμπλόκου έγκλεισης είναι σε μεγάλο βαθμό ανεξάρτητος των ιδιοτήτων του μορίου-ξενιστή (στην περίπτωση αυτή των βιοδραστικών ενώσεων). Οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις συνοδεύονται από σχετικά μικρή θετική τιμή της ενθαλπίας, ΔΗ και μεγάλη θετική τιμή της εντροπίας, ΔS, γι αυτό και οι κλασικές υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που ευνοούνται από την μεταβολή της εντροπίας θεωρούμε ότι δεν λαμβάνουν μέρος στην συμπλοκοποίηση διότι αυτή ευνοείται κύρια από την μεταβολή της ενθαλπίας. Επιπλέον, σειρά μορίων-ξενιστή παρουσιάζουν την τάση για γραμμική σχέση ανάμεσα στην μεταβολή της εντροπίας και στην μεταβολή της ενθαλπίας όπου η αύξηση της ενθαλπίας συνδέεται με 33

41 λιγότερο αρνητικές τιμές της εντροπίας. Αυτό το φαινόμενο, ονομάζεται αντιστάθμιση και συχνά συνδέεται με το νερό και ενεργεί ως κινητήρια δύναμη στον σχηματισμό συμπλόκου έγκλεισης. Η σημαντικότερη κινητήρια δύναμη για τον σχηματισμό των συμπλόκων έγκλεισης μπορεί να θεωρηθεί η απελευθέρωση των μορίων νερού υψηλής ενθαλπίας που βρίσκονται στην υδρόφοβη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης. Τα μόρια του νερού που βρίσκονται στην υδρόφοβη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης δεν μπορούν να σχηματίσουν το σύνολο των δεσμών υδρογόνου που έχουν την δυνατότητα να σχηματίσουν γιαυτό θεωρούνται υψηλής ενθαλπίας. Η ενέργεια του συστήματος μειώνεται όταν αυτά τα μόρια του νερού αντικαθίστανται στην υδρόφοβη κοιλότητα από το μόριο που εισέρχεται και το οποίο είναι λιγότερο πολικό σε σύγκριση με το νερό. Άλλοι μηχανισμοί οι οποίοι συμμετέχουν στον σχηματισμό των συμπλόκων έγκλεισης έχουν ταυτοποιηθεί στην περίπτωση της α- CD. Συγκεκριμένα, η μείωση των τάσεων του δακτυλίου περιλαμβάνεται σε αυτή την κατηγορία. Ενυδατωμένα μόρια της α-cd συνδέονται με εσωτερικούς δεσμούς υδρογόνου με τα μόρια νερού στην υδρόφοβη κοιλότητα προκαλώντας διαταραχές στην κυκλική δομή της κυκλοδεξτρίνης. Η απομάκρυνση των μορίων νερού της υδρόφοβης κοιλότητας οδηγεί στην καταστροφή των δεσμών υδρογόνου με αποτέλεσμα να μειώνονται σημαντικά οι τάσεις στον δακτύλιο και κατά συνέπεια η ενθαλπία. Επιπλέον οι μη-κλασσικές υδρόφοβες επιδράσεις μπορούν να ληφθούν υπόψη προκειμένου να εξηγηθεί ο σχηματισμός συγπλόκων έγκλεισης. Αυτές οι επιδράσεις αποτελούν την συνισταμένη των επιμέρους αλληλεπιδράσεων που είναι α) οι κλασσικές υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις (χαρακτηρίζονται από την μεγάλη θετική τιμή της μεταβολής της ενθαλπίας, ΔΗ) και β) τις αλληλεπιδράσεις Van der Waals (χαρακτηρίζονται από την αρνητική τιμή της μεταβολής της ενθαλπίας, ΔΗ, και την αρνητική τιμή της μεταβολής της εντροπίας, ΔS) που ενεργούν από κοινού στο σύστημα. Όπως αναφέρεται στη βιβλιογραφία [Julian C., (2008)], η διαφοροποίηση των μεταβολών ΔΗ και ΔS ερευνήθηκε με την βοήθεια adamantanecarboxylates ως μόρια-ξενιστές. Στην περίπτωση της α-cd, τα πειραματικά δεδομένα έδειξαν μικρές μεταβολές στις τιμές των ΔΗ και ΔS με μικρές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα μόρια-ξενιστές και την μικρή κοιλότητα. Στην περίπτωση της β-cd, τα μόρια-ξενιστές εισέρχονται βαθιά στην υδρόφοβη κοιλότητα σχηματίζοντας σταθερά σύμπλοκα, οπότε παρατηρήθηκε μεγάλη αρνητική τιμή για την μεταβολή της ενθαλπίας, ΔΗ, και σχεδόν μηδενική τιμή για την μεταβολή της εντροπίας, ΔS. Τέλος, στην περίπτωση της γ-cd, η συμπλοκοποίηση των μορίων-ξενιστών έδειξε σχεδόν μηδενικές τιμές για την μεταβολή της ενθαλπίας, ΔΗ, και μεγάλες θετικές τιμές για την μεταβολή της εντροπίας, ΔS, που αποτελεί απόδειξη για την δράση κλασσικών υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Το μέγεθος της κοιλότητας της γ-cd είναι αρκετά μεγάλο 34

42 προκειμένου να έχουν σημαντική συνεισφορά οι αλληλεπιδράσεις Van der Waals. Τα παραπάνω δείχνουν ότι δεν είναι σχετικά απλή διαδικασία ο προσδιορισμός των επιμέρους δυνάμεων που συνιστούν την κινητήρια δύναμη για τον σχηματισμό συμπλόκων έγκλεισης. Παρότι η απελευθέρωση-απομάκρυνση των μορίων νερού υψηλής ενθαλπίας που βρίσκονται στην υδρόφοβη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης έχει σημαντική συνεισφορά στην κινητήρια δύναμη για τον σχηματισμό των συμπλόκων και άλλες δυνάμεις μπορούν να συνεισφέρουν, όπως : Α) αλληλεπιδράσεις Van der Waals, Β) δεσμοί υδρογόνου, Γ) υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, Δ) μείωση των τάσεων στην κυκλική δομή της κυκλοδεξτρίνης και Ε) μεταβολές στις αλληλεπιδράσεις διαλύτη-κυκλοδεξτρίνης. 35

43 5. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΣΤΕΡΕΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΜΕ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ Για την παρασκευή των συμπλόκων κυκλοδεξτρινών με βιοδραστικές ενώσεις χρησιμοποιούνται διάφορες μέθοδοι, οι βασικότερες των οποίων είναι: λυοφιλοποίηση (freeze drying) συγκαταβύθιση (coprecipitation) λειοτρίβηση (paste method) ξήρανση εκνεφωμένου διαλύματος (spray drying). Η παρουσία του νερού είναι σημαντική για το σχηματισμό του συμπλόκου αφενός γιατί είναι η κινητήρια δύναμη της υδρόφοβης αλληλεπίδρασης μεταξύ του υποκαταστάτη και της υδρόφοβης εσωτερικής κοιλότητας της κυκλοδεξτρίνης και αφετέρου γιατί αποτελεί μέσο διάλυσης τόσο για το εγκλωβιζόμενο μόριο όσο και για την κυκλοδεξτρίνη. Σε μερικές περιπτώσεις, το νερό είναι απαραίτητο για να διατηρηθεί η ακεραιότητα του συμπλόκου καθώς μπορεί να δημιουργήσει μία γέφυρα μεταξύ των υδροξυλομάδων γειτονικών μορίων κυκλοδεξτρίνης με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός είδους κλωβού που θα βοηθήσει στον εγκλωβισμό της βιοδραστικής ένωσης στο σύμπλοκο. Η επιλογή της κατάλληλης κάθε φορά μεθόδου για την παρασκευή των συμπλόκων έγκλεισης πρέπει να στηρίζεται σε δύο βασικές παραμέτρους: 1. στη βιοδραστική ένωση που θέλουμε να δεσμευθεί στην κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης και 2. στο διαθέσιμο εργαστηριακό εξοπλισμό Παράγοντες όπως η θερμοκρασία, η ποσότητα του ύδατος, ο χρόνος ανάμιξης και οι συνθήκες ξήρανσης πρέπει να βελτιστοποιούνται σε σχέση με το διαθέσιμο εξοπλισμό, τη βιοδραστική ουσία και τη κυκλοδεξτρίνη [Hedges (1998)] ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΣΥΓΚΑΤΑΒΥΘΙΣΗΣ ( COPRECIPITATION) Η μέθοδος της συγκαταβύθισης είναι η περισσότερο χρησιμοποιούμενη εργαστηριακή μέθοδος για την παρασκευή συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών με βιοδραστικές ενώσεις. Η βιοδραστική ένωση διαλύεται σε κατάλληλο οργανικό διαλύτη (διαιθυλαιθέρα, χλωροφόρμιο, μεθανόλη κ.α.) και προστίθεται υπό ανάμιξη σε υδατικό διάλυμα κυκλοδεξτρίνης. Με την ψύξη του διαλύματος έχουμε τον σχηματισμό κρυστάλλων των συμπλόκων έγκλεισης. Οι σχηματιζόμενοι κρύσταλλοι εκπλένονται με διαιθυλαιθέρα ή κάποιον άλλον οργανικό διαλύτη και στη συνέχεια ξηραίνονται στους 50 C και κονιοποιούνται σε λεπτόκοκκο διαμερισμένο στερεό. Στην περίπτωση της β-κυκλοδεξτρίνης λόγω της μειωμένης υδατοδιαλυτότητάς της, το διάλυμα θερμαίνεται στους 60 C για να διαλυθεί η κυκλοδεξτρίνη πριν την προσθήκη της βιοδραστικής ουσίας. Στη συνέχεια, το 36

44 διάλυμα ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου καθώς προστίθεται ο υποκαταστάτης υπό ανάμιξη και το σύμπλοκο έγκλεισης καταβυθίζεται [Loftsson (1999)]. Η μέθοδος της συγκαταβύθισης είναι κυρίως εργαστηριακή μέθοδος. Τα μεγάλα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι τα εξής: a) Η εφαρμογή της είναι απλή και ο εξοπλισμός που απαιτείται χαμηλού κόστους, b) Ο σχηματισμός του συμπλόκου γίνεται εύκολα αντιληπτός λόγω της καταβύθισής του. Το μεγάλο μειονέκτημα της μεθόδου είναι οι μεγάλες ποσότητες νερού που απαιτούνται με αποτέλεσμα να μην εφαρμόζεται η μέθοδος στη βιομηχανικής κλίμακας παραγωγή των συμπλόκων [Hedges (1998)]. 5.2 ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΠΑΣΤΑΣ Ή ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΛΕΙΟΤΡΙΒΗΣΗΣ Κατά την παρασκευή συμπλόκων έγκλεισης με τη μέθοδο της λειοτρίβησης η βιοδραστική ένωση προστίθεται σταδιακά σε ένα υδατικό εναιώρημα % (κ.β.) της κυκλοδεξτρίνης και ακολουθεί λειοτρίβηση για καθορισμένο χρονικό διάστημα σε ιγδίο, μέχρι το σχηματισμό μιας πάστας η οποία αφήνεται να ξηρανθεί πλήρως. Το πλεονέκτημα της μεθόδου είναι η διαλυτοποίηση βιοδραστικών μορίων σε χαμηλή υδατοδιαλυτότητα καθώς γίνεται αργή διαλυτοποίηση της ένωσης με το σχηματισμό των συμπλόκων έγκλεισης. Η μέθοδος της πάστας χρησιμοποιείται για τη παραγωγή συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών σε βιομηχανική κλίμακα, σε αντίθεση με τη μέθοδο της συγκαταβύθισης. Ο χρόνος της ανάμιξης εξαρτάται από τον υποκαταστάτη, τη ποσότητα του νερού και το μύλο που χρησιμοποιείται και προσδιορίζεται πειραματικά συγκρίνοντας τις ιδιότητες του συμπλόκου που παράγεται με τις ιδιότητες του συμπλόκου που παράγεται με τη μέθοδο της συγκαταβύθισης [Hedges (1998)]. 5.3 ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΛΥΟΦΙΛΟΠΟΙΗΣΗΣ (FREEZE DRYING) Λυοφιλοποίηση είναι η μέθοδος ξήρανσης κατά την οποία η υγρασία που περιέχεται σε ένα υλικό μετατρέπεται σε πάγο (στερεό) τοποθετώντας το υλικό είτε σε υγρό άζωτο (ταχεία ψύξη) είτε σε καταψύκτη (σχετικά αργή ψύξη) και στην συνέχεια τοποθετείται σε υψηλό κενό (που δημιουργείται με την βοήθεια κατάλληλης αντλίας) όπου ο πάγος απομακρύνεται. Η μέθοδος στηρίζεται στο φαινόμενο της εξάχνωσης κατά το οποίο το νερό περνά από την στερεά κατάσταση (πάγος) απ ευθείας στην αέριο (υδρατμός) παρακάμπτοντας την υγρή κατάσταση. Περισσότερες λεπτομέρειες μπορύν να εξαχθούν από το διάγραμμα φάσεων του νερού και συγκεκριμένα από την καμπύλη εξάχνωσης. Κατά τη παρασκευή συμπλόκων έγκλεισης με τη μέθοδο της λυοφιλοποίησης προστίθεται κατάλληλη ποσότητα βιοδραστικής ένωσης σε 37

45 υδατικό διάλυμα κυκλοδεξτρίνης και αφήνεται υπό ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου έως ότου ολοκληρωθεί η συμπλοκοποίηση και αποκατασταθεί ισορροπία μεταξύ της αδιάλυτης και της διαλυτοποιημένης βιοδραστικής ένωσης (συμπλοκοποιημένης και μη-συμπλοκοποιημένης). Στη συνέχεια, το παραγόμενο διάλυμα λυοφιλοποιείται και σε ορισμένες περιπτώσεις το στερεό υπόλειμμα εκπλένεται με διαιθυλαιθέρα για να απομακρυνθεί τυχόν σημαντική περίσσεια της βιοδραστικής ένωσης που έχει διλαυτοποιηθεί και ξηραίνεται υπό κενό. 5.4 ΜΕΘΟΔΟΣ ΤΗΣ ΞΗΡΑΝΣΗΣ ΤΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ Κατά τη διαδικασία της ξήρανσης των συμπλόκων έγκλεισης είναι επιθυμητή η όσο το δυνατόν ταχύτερη απομάκρυνση του νερού ιδιαίτερα. Η παρουσία ακόμα και μιας πολύ μικρής ποσότητας νερού έχει σαν αποτέλεσμα την αποκατάσταση ισορροπίας μεταξύ της αδιάλυτης και της διαλυτοποιημένης βιοδραστικής ένωσης και την διάσπαση μικρής ποσότητας του συμπλόκου οδηγώντας σε απελευθέρωση της εγκλωβισμένης βιοδραστικής ένωσης. Στη περίπτωση θερμοανθεκτικών βιοδραστικών ενώσεων η απώλεια του υποκαταστάτη με την εξάτμιση του νερού θα είναι μεγάλη και επομένως η ποσότητα του νερού το οποίο ευνοεί τη διαλυτοποίηση της βιοδραστικής ένωσης πρέπει να είναι όσο το δυνατόν μικρότερη. Η ξήρανση των συμπλόκων γίνεται σε ξηραντήρες δίσκων, κινούμενου στρώματος, ρευστοποιηθέντος στρώματος και ψεκασμού. Οι ιδιότητες της βιοδραστικής ένωσης και του συμπλόκου που σχηματίζεται επηρεάζουν την επιλογή του ξηραντήρα. Έτσι, όταν η βιοδραστική ένωση είναι θερμοανθεκτική χρησιμοποιείται ξηραντήρας ψεκασμού (spray dryer) όπου το διάλυμα ψεκάζεται αφού θερμανθεί. Με το ψεκασμό το διάλυμα διασπείρεται σε μικροσταγόνες οι οποίες αποβάλλουν τον διαλύτη σε επαφή με το θερμό ρεύμα αέρα και το υπολλειπόμενο στερεό μετατρέπεται σε μικρά τεμαχίδια. Τα μεγαλύτερα από αυτά πέφτουν στο πυθμένα του θαλάμου ξήρανσης, ενώ τα μικρότερα παρασύρονται από το ρεύμα αέρα και συλλέγονται σε ξεχωριστό δοχείο [Hedges (1998)] ΜΕΘΟΔΟΣ ΞΗΡΟΥ ΜΙΓΜΑΤΟΣ Η μέθοδος του ξηρού μίγματος εφαρμόζεται όταν η βιοδραστική ένωση είναι ευαίσθητη στην υδρόλυση και επομένως πρέπει να απουσιάζει το νερό κατά τη διαδικασία παρασκευής του συμπλόκου έγκλεισης. Έτσι, η βιοδραστική ένωση και η κυκλοδεξτρίνη προστίθενται σε δονούμενο μύλο υπό θέρμανση και αφήνονται για ανάμιξη. Το σημαντικό μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι ο χρόνος ανάμιξης μπορεί να διαρκέσει από μερικά λεπτά έως και ώρες [Hedges (1998)]. 38

46 6. ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΕΓΚΛΕΙΣΗΣ 6.1. ΠΕΡΙΘΛΑΣΗ ΤΩΝ ΑΚΤΙΝΩΝ-Χ Οι ακτίνες-χ είναι ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία μικρού μήκους κύματος που παράγεται μετά από την επιβράδυνση ηλεκτρονίων υψηλής ενέργειας ή κατά τις ηλεκτρονιακές μεταπτώσεις στις εσωτερικές στοιβάδες των ατόμων. Η περιοχή μηκών κύματος των ακτίνων-χ είναι 10-5 έως 100 Å, αν και η συνήθης φασματομετρία ακτίνων Χ περιορίζεται στην περιοχή 0,1 έως 25 Å (1 Å = 0,1 nm = m). Η περίθλαση των ακτίνων-χ είναι μία από τις βασικότερες μεθόδους προσδιορισμού των συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών με ενώσεις που βρίσκονται σε λεπτά διαμερισμένη κόνι και μικροκρυσταλλική κατάσταση. Οι κρύσταλλοι αποτελούνται από τρισδιάστατες δομές με χαρακτηριστικές περιοδικότητες, που καλούνται περίοδοι ταυτότητας, κατά μήκος κάθε κρυσταλλογραφικού άξονα. Το συνεχές φάσμα από μια πηγή ηλεκτρονιακής δέσμης παράγεται από συγκρούσεις μεταξύ των ηλεκτρονίων της δέσμης και των τρισδιάστατων δομών των κρυστάλλων. Σε κάθε σύγκρουση ηλεκτρονίου, τούτο επιβραδύνεται και παράγεται ένα φωτόνιο με ενέργεια ακτίνων-χ. Η ενέργεια του φωτονίου είναι ίση με τη διαφορά της κινητικής ενέργειας του ηλεκτρονίου πριν και μετά τη πρόσκρουση στο στόχο. Όπως και σε άλλους τύπους ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας, η αλληλεπίδραση μεταξύ του ηλεκτρονικού διανύσματος της ακτινοβολίας και των ηλεκτρονίων της ύλης, μέσω της οποίας διέρχεται, προκαλεί σκέδαση. Όταν οι ακτίνες-χ σκεδάζονται στο οργανωμένο περιβάλλον του κρυστάλλου, συμβαίνει συμβολή (ενισχυτική ή καταστρεπτική) των σκεδαζόμενων ακτίνων, επειδή οι αποστάσεις μεταξύ των κέντρων σκέδασης είναι του ίδιου μεγέθους με το μήκος κύματος της ακτινοβολίας. Αποτέλεσμα αυτού του τύπου σκέδασης είναι η περίθλαση της ακτινοβολίας. Ο William L. Bragg έδειξε ότι οι ακτίνες-x συμπεριφέρονται σαν δημιουργοί της απεικόνισης της κρυσταλλικής δομής, όταν αυτές περιθλώνται σε έναν κρύσταλλο. Όταν μία δέσμη ακτίνων-χ προσκρούει στην επιφάνεια ενός κρυστάλλου με κάποια γωνία θ, ένα τμήμα της σκεδάζεται από το επιφανειακό στρώμα των ατόμων. Το μη σκεδαζόμενο τμήμα της δέσμης εισέρχεται στο δεύτερο στρώμα των ατόμων όπου και πάλι ένα τμήμα σκεδάζεται και το υπόλοιπο εισέρχεται στο τρίτο στρώμα (Σχήμα Θ). Το αθροιστικό αποτέλεσμα της σκέδασης αυτής από τα χωροθετημένα κέντρα του κρυστάλλου είναι η περίθλαση της δέσμης, όπως περίπου συμβαίνει κατά την πρόσπτωση ορατής ακτινοβολίας σε ένα περιθλαστικό φράγμα. Οι προϋποθέσεις για περίθλαση των ακτίνων Χ είναι: 1. Οι αποστάσεις μεταξύ των στρωμάτων των ατόμων πρέπει να είναι περίπου ίδιες με το μήκος κύματος της ακτινοβολίας. 39

47 2. Τα κέντρα σκέδασης πρέπει να κατανέμονται στο χώρο με υψηλή κανονικότητα. Σχήμα Θ12: Περίθλαση των ακτίνων-χ από έναν κρύσταλλο. Όπως φαίνεται στο 3 η στενή δέσμη της ακτινοβολίας προσπίπει στην επιφάνεια του κρυστάλλου με γωνία θ. Η σκέδαση είναι το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης της ακτινοβολίας με τα άτομα στα σημεία Ο, P και R. Εάν ισχύει ότι: AP + PC = nλ (38) όπου n είναι ένας ακέραιος, η σκεδαζόμενη ακτινοβολία θα βρίσκεται σε φάση στα σημεία ΟCD και ο κρύσταλλος θα φαίνεται ότι ανακλά την ακτινοβολία-χ. Ισχύει όμως η σχέση : AP = PC = d sinθ (39) όπου d είναι η απόσταση μεταξύ των επιπέδων (στρωμάτων) του κρυστάλλου. Έτσι, η συνθήκη για ενισχυτική συμβολή της δέσμης για τη γωνία θ δίνεται από τη σχέση: nλ = 2dsinθ (40) Η εξίσωση nλ = 2dsinθ (40) είναι γνωστή ως εξίσωση του Bragg. Πρέπει να σημειωθεί ότι οι ακτίνες Χ εμφανίζονται σαν να ανακλώνται από τον κρύσταλλο, μόνο όταν η γωνία πρόσπτωσης ικανοποιεί τη σχέση: sinθ = nλ/2d (41) Σε κάθε άλλη γωνία η συμβολή είναι καταστρεπτική. 40

48 Σχήμα Θ13: Σχηματική απεικόνιση της περίθλασης των ακτίνων Χ από ένα κρύσταλλο. Ακτινοβολώντας ένα απλό κρύσταλλο με μονοχρωματική ακτινοβολία, οι ακτίνες-χ δεν παράγουν περιθλώμενες ακτίνες και έτσι δεν θα υπάρχουν πληροφορίες για τη κρυσταλλική δομή του κρυστάλλου. Αυτό μπορεί να ξεπεραστεί μεταβάλλοντας συνεχώς το μήκος κύματος ή τη γωνία θ ώστε να ικανοποιήσουν το νόμο του Bragg. Πρακτικά αυτό γίνεται : 1. Μεταβάλλοντας το μήκος κύματος των ακτίνων Χ 2. Περιστρέφοντας το κρύσταλλο 3. Χρησιμοποιώντας κόνη ή πολυκρυσταλλικό δείγμα. Ένα περιθλασόμετρο ακτίνων-χ αποτελείται από τα παρακάτω: 1. Πηγή ακτίνων-χ 2. Φίλτρα ακτίνων-χ 3. Μονοχρωμάτορας Στην περίθλαση των ακτίνων-χ πρέπει να παραχθεί δέσμη ακτίνων-χ με περιορισμένο εύρος περιοχής τιμών μήκους κύματος. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται φίλτρα και μονοχρωμάτορες. Ο μονοχρωμάτορας αποτελείται από ένα ζεύγος κατευθυντήρων δέσμης και ένα στοιχείο διασποράς. Το στοιχείο αυτό είναι ένας μονοκρύσταλλος προσαρμοσμένος σε ένα γωνιόμετρο ή μια περιστροφική τράπεζα, που επιτρέπει τη μεταβολή και την ακριβή μέτρηση ή ρύθμιση της γωνίας θ, μεταξύ της μετωπικής επιφάνειας του κρυστάλλου και της εισερχόμενης δέσμης. Για αναλυτικές μελέτες περίθλασης, το κρυσταλλικό δείγμα λειοτριβείται μέχρις ότου μετατραπεί σε λεπτή διαμερισμένη κόνι. Στην κατάσταση αυτή οι απειράριθμοι μικροκρυσταλλίτες προσανατολίζονται προς κάθε δυνατή κατεύθυνση. Έτσι, όταν μια δέσμη ακτίνων-χ διέλθει μέσω του υλικού, αναμένεται ότι ένας σημαντικός αριθμός σωματιδίων θα είναι προσανατολισμένα έτσι, ώστε να ικανοποιούν τη συνθήκη Bragg, για ανάκλαση από κάθε δυνατή απόσταση μεταξύ των κρυσταλλικών επιπέδων (στρωμάτων). Τα δείγματα τοποθετούνται σε 41

49 λεπτότοιχους τριχοειδείς σωληνίσκους από ύαλο ή οξική κυτταρίνη (σελλοφάνη). Εναλλακτικά, το δείγμα μπορεί να αναμιχθεί με κατάλληλο μη κρυσταλλικό συνδετικό υλικό και να αποκτήσει το κατάλληλο σχήμα με χύτευση. Η ταυτοποίηση μιας ουσίας από το φάσμα περίθλασης σκόνης βασίζεται στον προσδιορισμό της θέσης της γραμμής (σε μονάδες θ ή 2θ) και της έντασής της. Η γωνία περίθλασης 2θ προσδιορίζεται από την απόσταση μεταξύ καθορισμένων σειρών επιπέδων. Η απόσταση d υπολογίζεται μέσω της εξίσωσης Bragg από το γνωστό μήκος κύματος της πηγής και τη μετρούμενη γωνία. Οι εντάσεις των γραμμών εξαρτώνται από τον αριθμό και το είδος των ατομικών ανακλαστικών κέντρων σε κάθε σειρά επιπέδων του κρυσταλλικού πλέγματος. Η εφαρμογή της περίθλασης των ακτίνων Χ στο προσδιορισμό των συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών με βιοδραστικές ουσίες στηρίζεται στην αντιπαράθεση του φάσματος περίθλασης του συμπλόκου με αυτά των συστατικών του. Η πιθανή εξαφάνιση ή τροποποίηση των χαρακτηριστικών κορυφών των συστατικών του συμπλόκου στο φάσμα περίθλασης του συμπλόκου που υποθέτουμε ότι δημιουργείται ή/και η εμφάνιση νέων κορυφών ως αποτέλεσμα της συμπλοκοποίησης αποτελούν σαφείς ενδείξεις για το σχηματισμό του συμπλόκου έγκλεισης. Στη περίπτωση που το εγκλωβιζόμενο στη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης μόριο δεν είναι υπό μορφή κόνεως ή μικροκρυσταλλικής κατάστασης αλλά σε υγρή κατάσταση, αρκεί το φάσμα του πιθανολογούμενου συμπλόκου να είναι διαφορετικό από αυτό της μη συμπλοκοποιημένης κυκλοδεξτρίνης για να διαπιστωθεί η δημιουργία ενός νέου κρυσταλλικού πλέγματος. Η παραπάνω μέθοδος είναι πολύ χρήσιμη για την ανάλυση μεγάλου αριθμού συμπλόκων καθώς και για τον προσδιορισμό της κρυσταλλικής και μοριακής δομής συμπλόκων με κυκλοδεξτρίνες [Bruni et al (1999), Morin N. et al (2000), Bayomi et al (2002), Erden and Celebi, (1988), Zornoza et al (1998), Ahmed et al (1998), Mura et al (2002), Sicard-Roselli et al (2001)]. 6.2 ΘΕΡΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Η θερμική ανάλυση περιλαμβάνει μια ομάδα τεχνικών με τις οποίες μετρείται κάποια φυσική ιδιότητα μιας ένωσης ή των προϊόντων αντίδρασής της ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, όταν η τελευταία μεταβάλλεται κατά ένα προγραμματισμένο τρόπο. Οι θερμικές μέθοδοι διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τις μετρούμενες παραμέτρους και τον τρόπο προγραμματισμού της θερμοκρασίας. Η εφαρμογή των θερμικών μεθόδων για την ανάλυση συμπλόκων κυκλοδεξτρινών έχει δύο περιορισμούς: 42

50 α. Η εγκλωβιζόμενη στο εσωτερικό της κυκλοδεξτρίνης βιοδραστική ένωση πρέπει να έχει σημείο τήξεως μικρότερο από την θερμοκρασία της θερμικής αποικοδόμησης των κυκλοδεξτρινών β. Όταν η βιοδραστική ένωση είναι πτητική το σημείο τήξεώς της πρέπει να κυμαίνεται στα όρια C ΘΕΡΜΟΣΤΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Σε μια θερμοσταθμική ανάλυση (thermogravimetry, TG) καταγράφεται συνεχώς η μάζα του δείγματος σε μια ελεγχόμενη ατμόσφαιρα, ως συνάρτηση της θερμοκρασίας ή του χρόνου, καθώς η θερμοκρασία του δείγματος αυξάνει (συνήθως γραμμικά με το χρόνο). Το διάγραμμα της μάζας ή του ποσοστού της μάζας ως συνάρτηση του χρόνου ονομάζεται θερμογράφημα (thermogram) ή καμπύλη θερμικής διάσπασης (thermal decomposition curve) ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΘΕΡΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Στη διαφορική θερμική ανάλυση (differential thermal analysis, DTA) μετρείται η διαφορά στη θερμοκρασία μεταξύ μιας ένωσης και ενός υλικού αναφοράς ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, όταν η ουσία και το υλικό αναφοράς υπόκειται σε προγραμματισμένη μεταβολή θερμοκρασίας. Συνήθως, το πρόγραμμα αυτό περιλαμβάνει θέρμανση του δείγματος και του υλικού αναφοράς έτσι ώστε η θερμοκρασία του δείγματος T S να αυξάνει γραμμικά με τον χρόνο. Στη συνέχεια καταγράφεται η διαφορά Τ μεταξύ της θερμοκρασίας του δείγματος και του υλικού αναφοράς Τ r (Τ = T r T S ) και σχεδιάζεται η γραφική παράσταση ως προς τη θερμοκρασία του δείγματος, ώστε να προκύψει ένα διαφορικό θερμογράφημα, όπως αυτό του παρακάτω γραφήματος. 43

51 Σχήμα Θ14: Σχηματικό διάγραμμα διαφορικού θερμογραφήματος που δείχνει τους τύπους των μεταβολών που υφίστανται τα πολυμερικά υλικά ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΘΕΡΜΙΔΟΜΕΤΡΙΑ ΣΑΡΩΣΗΣ Η διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (differential scanning calorimetry) είναι μια θερμική τεχνική, στην οποία μετρείται η διαφορά ροής θερμότητας προς μία ένωση-δείγμα και προς μία ένωση αναφοράς, ως συνάρτηση της θερμοκρασίας του δείγματος, όταν οι δύο ενώσεις υπόκεινται σε ένα ελεγχόμενο πρόγραμμα θερμοκρασίας. Σήμερα, η διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης είναι η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη θερμική τεχνική για την ανάλυση συμπλόκων κυκλοδεξτρίνης και στηρίζεται στην απεικόνιση της διαφορετικής συμπεριφοράς ενός συμπλόκου έγκλεισης σε σχέση με ένα φυσικό μίγμα των συστατικών του [Veiga et al (1996), Lin et al (1991), Lu et al (1999), Amdidouche et al (1989), Mura et al (2002)]. Η βασική διαφορά μεταξύ της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης και της διαφορικής θερμικής ανάλυσης είναι, ότι η πρώτη αποτελεί μια θερμιδομετρική μέθοδο, στην οποία μετρούνται διαφορές στην ενέργεια. Αντίθετα, στη διαφορική θερμική ανάλυση καταγράφονται διαφορές στη θερμοκρασία. Ο προγραμματισμός για τις μεταβολές της θερμοκρασίας για τις δύο μεθόδους είναι ο ίδιος. Στο παραπάνω σχήμα, παρουσιάζεται ένα εξιδανικευμένο θερμογράφημα στο οποίο εμφανίζονται ένα ελάχιστο και ένα μέγιστο σαν κορυφές. Το μέγιστο είναι αποτέλεσμα εξώθερμων διεργασιών στις οποίες παράγεται θερμότητα από το δείγμα, οπότε αυξάνεται η θερμοκρασία του. Το ελάχιστο, το οποίο ονομάζεται τήξη, είναι αποτέλεσμα ενδόθερμης διεργασίας, κατά την οποία απορροφάται θερμότητα από το δείγμα. 44

52 Οι κορυφές στη διαφορική θερμική ανάλυση οφείλονται τόσο σε φυσικές μεταβολές όσο και σε χημικές αντιδράσεις, που προκαλούν οι μεταβολές της θερμοκρασίας του δείγματος. Φυσικές ενδόθερμες διεργασίες είναι η τήξη, η εξάτμιση, η εξάχνωση, η απορρόφηση, η εκρόφηση, η αποσύνθεση, η αναγωγή, η αποδιαλύτωση και η υαλώδης μετάπτωση. Εξώθερμες διεργασίες είναι συνήθως η προσρόφηση και η κρυστάλλωση. Οι χημικές αντιδράσεις μπορούν επίσης να είναι ενδόθερμες ή εξώθερμες. Ενδόθερμες αντιδράσεις είναι η αφυδάτωση, η αναγωγή σε ατμόσφαιρα αερίου και η διάσπαση. Εξώθερμες αντιδράσεις είναι η οξείδωση παρουσία αέρα ή οξυγόνου, ο πολυμερισμός και οι καταλυτικές αντιδράσεις. Στη καμπύλη DSC του παραπάνω σχήματος δεν εμφανίζεται κορυφή οξείδωσης σε αντίθεση με την καμπύλη DTA γιατί το πείραμα πραγματοποιήθηκε σε ατμόσφαιρα αζώτου. Έτσι, η εμφάνιση της ισχυρής ενδόθερμης κορυφής που αντιστοιχεί στο σημείο τήξεως της βιοδραστικής ουσίας στο θερμογράφημα ενός φυσικού μίγματος κυκλοδεξτρίνης και βιοδραστικής ουσίας και η παράλληλη εξαφάνισή της στο θερμογράφημα του συμπλόκου αποτελεί σαφή ένδειξη για το σχηματισμό του συμπλόκου έγκλεισης. Η εμφάνιση της ενδόθερμης κορυφής που αντιστοιχεί στο σημείο τήξης της χοληστερόλης (148 C) (α) και της ενδόθερμης κορυφής που αντιστοιχεί στην αφυδάτωση της methyl-β-cyclodextrin (β) (μεταξύ 50 και 120 C) στο θερμογράφημα του φυσικού μίγματος methyl-β-cyclodextrin και βιοδραστικής ένωσης και η παράλληλη εξαφάνισή τους από το θερμογράφημα του συμπλόκου που παρασκευάστηκε με τη μέθοδο της συγκαταβύθισης αποτελούν σαφή ένδειξη για το σχηματισμό του συμπλόκου έγκλεισης. Για όλα τα πειράματα της DSC είναι σημαντικό να αναφέρονται επακριβώς η θερμοκρασία έναρξης του φαινομένου (Τ onset ), η προέκταση (extrapolation) του Τ onset (Τ exp ), η θερμοκρασία λήξης του φαινομένου (Τ offset ) και ο ρυθμός σάρωσης (scanning rate). Σημείο τήξης: Τα κρυσταλλικά υλικά υφίστανται μία πρώτης τάξης μετάπτωση τήξης από την οργανωμένη στερεά κατάσταση στην ανοργάνωτη υγρή κατάσταση. Το DSC παρέχει ακριβείς θερμοκρασίες τήξης, πράγμα το οποίο αδυνατεί να κάνει ορισμένες φορές η παραδοσιακή μέθοδος προσδιορισμού του σημείου τήξης. Η τήξη είναι μία ενδόθερμη μετάβαση κατά την οποία το δείγμα προσλαμβάνει μια ποσότητα ενέργειας. Για μικρά ή 100 % κρυσταλλικά μόρια η κορυφή είναι ιδιαίτερα οξεία και η θερμοκρασία τήξης είναι η θερμοκρασία στη κορυφή (Τm). Η επιφάνεια κάτω από τη καμπύλη αντιπροσωπεύει το σύνολο της θερμότητας που απορροφάται κατά τη διαδικασία της τήξης. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για λήψη δεδομένων στη διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης είναι δύο ειδών. Στην DSC αντιστάθμισης ισχύος (power compensated DSC) το δείγμα και το υλικό αναφοράς θερμαίνονται με ξεχωριστές 45

53 πηγές θέρμανσης, ώστε οι θερμοκρασίες τους να διατηρούνται ίδιες, ενώ συγχρόνως αυξάνουν ή μειώνονται γραμμικά. Στην DSC ροής θερμότητας (heat flux) μετρείται η διαφορά των ροών θερμότητας προς το δείγμα και προς την ουσία αναφοράς, καθώς αυξάνει ή μειώνεται γραμμικά η θερμοκρασία του δείγματος. Από τα θερμογραφήματα των στερεών κυκλοδεξτρινών προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα: Α. Στις φυσικές κυκλοδεξτρίνες τα περισσότερα μόρια ύδατος απελευθερώνονται σε θερμοκρασίες μικρότερες των 100 C. Εξαίρεση αποτελούν οι α- και γ- κυκλοδεξτρίνες στις οποίες βρέθηκαν ισχυρά συνδεδεμένα μόρια ύδατος που απελευθερώνονται σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 100 C. Β. Όσο αυξάνεται η συμμετρία του δακτυλίου της κυκλοδεξτρίνης τόσο αυξάνεται και η θερμοκρασία που απαιτείται για την αποικοδόμησή του. Έτσι, στη περίπτωση της β-cd η θερμοκρασία αποικοδόμησης είναι πολύ μικρότερη σε σχέση με τις υπόλοιπες φυσικές κυκλοδεξτρίνες λόγω του λιγότερο συμμετρικού δακτυλίου της. Γ. Η θερμική αποικοδόμηση των τροποποιημένων κυκλοδεξτρινών εμφανίζεται με μεγαλύτερες θερμοκρασίες λόγω του σαφώς μικρότερου περιεχομένου ύδατος. 6.3 ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΠΥΡΗΝΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy ) Η φασματοσκοπία Μαγνητικού Πυρηνικού Συντονισμού βασίζεται στη μέτρηση της απορρόφησης ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας στην περιοχή των ραδιοσυχνοτήτων, από περίπου 4 έως 900 MHz. Σε αντίθεση με την απορρόφηση υπεριώδους, ορατής και υπέρυθρης ακτινοβολίας στη διαδικασία της απορρόφησης μετέχουν οι πυρήνες των ατόμων και όχι τα ηλεκτρόνια και για τη δημιουργία των πυρηνικών ενεργειακών καταστάσεων, που απαιτούνται για να υπάρξει απορρόφηση, είναι απαραίτητη η τοποθέτηση του αναλυτή εντός ισχυρού μαγνητικού πεδίου. Οι πρώτοι που εφάρμοσαν τη τεχνική αυτή για τη μελέτη των συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών ήταν οι Thakkar και Demarco και έκτοτε η ΝΜR χρησιμοποιείται ευρύτατα τόσο για την ανάλυση και το χαρακτηρισμό όσο και για το προσδιορισμό της σταθεράς συμπλοκοποίησης ενός βιοδραστικού μορίου με τις κυκλοδεξτρίνες [Ventura και συνεργάτες (2005), Omari και συνεργάτες (2006), Αrancibia και συνεργάτες (2000), Loukas (1997), Puglisi και συνεργάτες (1996)]. Η τεχνική βασίζεται στο γεγονός ότι όταν ένα μόριο μιας βιοδραστικής ουσίας εγκλωβίζεται στο εσωτερικό της κοιλότητας της κυκλοδεξτρίνης, τα άτομα υδρογόνου που βρίσκονται στο εσωτερικό της κοιλότητας, δηλαδή τα C 3 -H και C 5 -H, θωρακίζονται σημαντικά από το εγκλωβιζόμενο μόριο και εμφανίζουν φάσματα με μετατόπιση των κορυφών προς υψηλότερα επίπεδα (upfield shift), ενώ αντίθετα τα 46

54 άτομα υδρογόνου που βρίσκονται στην εξωτερική επιφάνεια (C 2 -H, C 4 -H και C 6 -H) παραμένουν ανεπηρέαστα ή εμφανίζουν πολύ μικρή μετατόπιση προς υψηλότερα επίπεδα. Τα άτομα υδρογόνου του μορίου της βιοδραστικής ουσίας παρουσίαζουν αντίστοιχα μια μετατόπιση σε χαμηλότερα επίπεδα. (downfield shift) [Schneider και συνεργάτες (1998), Connors (1997), Ficarra et al, (2002)]. Στο σχήμα 24 απεικονίζονται τα 1 Η-ΝΜR φάσματα της HP-β-CD σε d6-dmso και με εσωτερικό πρότυπο TMS. Ένταση TMS Χημική Μετατόπιση / ppm Σχήμα Θ15. 1 Η-ΝΜR φάσματα της HP-β-CD σε d6-dmso και με εσωτερικό πρότυπο TMS (Trimethylsilane) ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ Το πρώτο βήμα στην ανάλυση είναι να προσδιοριστεί ο σχηματισμός ή μη του συμπλόκου έγκλεισης. Για το σκοπό αυτό συγκρίνουμε το 1 Η-ΝΜR της υπό μελέτη βιοδραστικής ένωσης απουσία και παρουσία κυκλοδεξτρίνης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις της. Συγκρίνοντας τα δύο φάσματα παρατηρούνται σημαντικές χημικές μετατοπίσεις δ των πρωτονίων της β-κυκλοδεξτρίνης. Οι πιο σημαντικές μεταβολές παρατηρούνται στα πρωτόνια H-3 και H-5 γεγονός που αποδεικνύει τη θωράκιση των πρωτονίων αυτών από το εγκλωβιζόμενο μόριο. Επίσης, το γεγονός οτι Δδ(Η-3) > Δδ(Η-6) υποδηλώνει ότι η θωράκιση γίνεται προς αυτή την κατεύθυνση, δηλαδή από το Η-3 προς το Η-5. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν μία λίγο ή πολύ ολοκληρωτική δέσμευση του μορίου της βιοδραστικής ένωσης στη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης μέσα από το μεγάλο άνοιγμα του κώνου. Τέλος, η μετατόπιση των κορυφών των εξωτερικών πρωτονίων Η-1, Η-2 και Η-4 προς υψηλότερα επίπεδα υποδηλώνει και μια αλληλεπίδραση του μορίου με την εξωτερική επιφάνεια της κυκλοδεξτρίνης μέσω του τμήματος της βιοδραστικής ένωσης που βρίσκεται στο χείλος του κόλουρου κώνου. 47

55 Risp/MeβCD 1:9 1:6 Ένταση 1:3 H21 H22 H24 Risperidone 8,2 8,0 7,8 7,6 7,4 7,2 7,0 Χημική Μετατόπιση / ppm Σχήμα Θ16: Φάσματα NMR μιγμάτων Risperidone και Methyl-β-Cyclodextrin σε διαφορετικές μοριακές αναλογίες. Το δεύτερο βήμα είναι η επιβεβαίωση του σχηματισμού του συμπλόκου. Για το σκοπό αυτό μελετάται η χημική μετατόπιση των πρωτονίων της βιοδραστικής ένωσης. Η μετατόπιση των κορυφών των πρωτονίων σε υψηλότερα, από τα αρχικά, επίπεδα πιστοποιεί την αλληλεπίδραση υποστρώματος υποκαταστάτη. 6.4 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΣΑΡΩΣΗΣ (Scanning Electron Microscopy) Τα τελευταία χρόνια η ανάπτυξη της Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης μάς δίνει χρήσιμες πληροφορίες για τα σύμπλοκα έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών. Η μέθοδος στηρίζεται στη χρήση των ιδιοτήτων των ηλεκτρονίων καθώς αυτά οπισθοσκεδάζονται από ένα σώμα ή διέρχονται μέσα από αυτό [Marques και συνεργάτες (2002), Orienti και συνεργάτες (1999), Jansen και συνεργάτες (1990)]. Η υπεροχή του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σε σχέση με το οπτικό στηρίζεται στο ότι η ελάχιστη λεπτομέρεια που μπορεί να διακριθεί με ένα οπτικό μικροσκόπιο είναι περίπου 200 nm, όριο το οποίο θέτει η κυματική φύση του ορατού φωτός και το ελάχιστο μήκος κύματός του. Αντιθέτως, ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο εκμεταλλεύεται την κυματική φύση των ηλεκτρονίων σε μήκη κύματος πολύ μικρότερα, με αποτέλεσμα η μέγιστη ανάλυση να είναι της τάξης των 0,1 nm. 48

56 Σχήμα Θ17: Σύγκριση της διακριτικής ικανότητας των οπτικών και ηλεκτρονικών μικροσκοπίων. Σε ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης, καθώς το δείγμα σαρώνεται, το παραγόμενο σήμα μετατρέπεται σε εικόνα με τη βοήθεια οθόνης καθοδικού σωλήνα καθώς αυτή σαρώνεται με τον ίδιο ρυθμό με το δείγμα. Η μεγέθυνση ορίζεται ως το εμβαδό της οθόνης προς το εμβαδό της περιοχής όπου σαρώνεται. Ένα τυπικό SEM αποτελείται από τα εξής: Α) πυροβόλο ηλεκτρονίων, που παράγει μια έντονη δέσμη ηλεκτρονίων η οποία εστιάζεται πάνω σε ένα μικρό σημείο στο εξεταζόμενο δείγμαστόχο. Β) σύστημα ανίχνευσης ηλεκτρονίων καθώς και μια μονάδα απεικόνισης και Γ) σύστημα κενού. Καθώς η εξερχόμενη από το πολυβόλο δέσμη δεν είναι παράλληλη, ένα μαγνητικό πεδίο αναλαμβάνει να εστιάσει τη δέσμη ακριβώς πάνω στο τελικό διάφραγμα. Το μαγνητικό πεδίο χαρακτηρίζεται από κυλινδρική συμμετρία και δημιουργείται από δύο κατάλληλα διατεταγμένα ζεύγη μαγνητικών πόλων, τα οποία αναγκάζουν τα ηλεκτρόνια να διαγράψουν μία ελικοειδή τροχιά. Η μονάδα ανίχνευσης καταγράφει τον αριθμό των ηλεκτρονίων τα οποία προσπίπτουν σε αυτή και έχει τέτοια θέση ώστε μόνο ηλεκτρόνια από το δείγμα να ανιχνεύονται. Η σάρωση του δείγματος και η σάρωση της οθόνης γίνονται συγχρονισμένα καθώς χρησιμοποιούν το ίδιο σήμα, σήμα το οποίο παράγεται από κοινή πηγή, τη γεννήτρια σάρωσης (scan generator). Δύο ζεύγη πλακών δημιουργούν δύο μεταβαλλόμενα κάθετα μεταξύ τους και παράλληλα στην επιφάνεια ηλεκτρικά πεδία, με τρόπο που ορίζει η γεννήτρια σάρωσης. Κατ αυτό το τρόπο επιτυγχάνεται η εστίαση της δέσμης σε κάθε σημείο του δείγματος. Επειδή όμως λαμβάνει χώρα ένα πλήθος διαφορετικής φύσης αλληλεπιδράσεων, καθώς η δέσμη προσπίπτει στο δείγμα, παράγονται δευτερεύοντα ηλεκτρόνια που είναι λίγα σε αριθμό και επομένως χρειάζεται ενίσχυση του ανάλογου σήματος. Επιπλέον, επειδή οι διευθύνσεις όπου παράγονται είναι τυχαίες πρέπει με κάποιο τρόπο να συλλεχθούν. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται μία πλάκα υψηλού θετικού δυναμικού όπου έλκει τα δευτερεύοντα ηλεκτρόνια. Κατά την πρόσπτωσή τους σε αυτή παράγονται φωτόνια. Τα φωτόνια αυτά προσπίπτουν στην πλάκα Ε και παράγονται ηλεκτρόνια. Με διαδοχικά τέτοια βήματα επιτυγχάνεται ενίσχυση του σήματος. Λιγότερα είναι τα οπισθοσκευαζόμενα ηλεκτρόνια τα οποία έχουν ενέργεια ίση με αυτή της αρχικής δέσμης. Σε αντίθεση με τα δευτερεύοντα μπορούν να 49

57 δώσουν πληροφορίες για τη δομή της επιφάνειας καθώς περιέχουν την πληροφορία της διεύθυνσης απ όπου προήλθαν και δεν υπάρχει ανάγκη για ενίσχυση του ήδη ισχυρού σήματος. Οι ακτίνες-χ τέλος, έχοντας ενέργειες χαρακτηριστικές των ατομικών ειδών ανιχνεύονται δίνοντας πληροφορίες για τη χημική σύσταση του δείγματος. Η εφαρμογή της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης στον προσδιορισμό των συμπλόκων έγκλεισης των κυκλοδεξτρινών που βρίσκονται σε στερεή κατάσταση στηρίζεται στην αντιπαράθεση των κρυστάλλων της βιοδραστικής ουσίας και της κυκλοδεξτρίνης με τους κρυστάλλους του πιθανολογούμενου συμπλόκου. Η τυχόν διαφοροποίηση της δομής των κρυστάλλων του συμπλόκου από αυτή των συστατικών του, αποτελεί σαφή ένδειξη για το σχηματισμό του συμπλόκου έγκλεισης Υπέρυθρη Φασματοσκοπία Αποσβενυμένης Ολικής Ανακλαστικότητας (FTIR-ATR) Ο συνηθέστερος τρόπος συλλογής φασμάτων IR είναι με τη διάταξη της διαπερατότητας. Ωστόσο μόνο ορισμένα υλικά είναι αρκετά διαφανή και λεπτά ώστε να επιτρέπουν την διέλευση της δέσμης υπερύθρου και τη συλλογή αξιόπιστου φάσματος. Εναλλακτικά, προβαίνουμε στην αραίωση του δείγματος με βρωμιούχο κάλιο (KBr) και την παρασκευή δείγματος σε μορφή δισκίου (πελέτας). Η διαδικασία ενέχει σοβαρά μειονεκτήματα όπως το ότι δεν εφαρμόζεται σε υδατογενή δείγματα λόγω της υγροσκοπικότητας του KBr και δεν εφαρμόζεται σε κηρώδεις ουσίες επειδή αυτές δεν μπορούν να λειοτριβηθούν. Επίσης, είναι χρονοβόρα και είναι δυνατόν να προκαλέσει υδρόλυση ή ιονεναλλαγή του δείγματος και δεν είναι επαναλήψιμη καθώς το δείγμα δεν είναι ανακτήσιμο μετά την μέτρηση. Η ιδανική μέτρηση του φάσματος υπερύθρου πρέπει να μην απαιτεί προετοιμασία του δείγματος, να εφαρμόζεται εξ ίσου σε στερεά, κόνεις και υγρά, να είναι επαναλήψιμη και μη καταστροφική για το δείγμα. Η κατ εξοχήν μέθοδος συλλογής φασμάτων που συνδυάζει όλα τα παραπάνω πλεονεκτήματα είναι γνωστή ως Αποσβενύμενη Ολική Ανακλαστικότητα (Attenuated Total Reflectance, ATR). Συνοπτικά, το δείγμα έρχεται σε επαφή με κρύσταλλο υψηλού δείκτη διάθλασης, περατό στο υπέρυθρο, μέσα από τον οποίο διέρχεται η οπτική δέσμη υπό γωνία ολικής ανάκλασης. Η δέσμη δημιουργεί ένα στάσιμο κύμα στην μεσεπιφάνεια κρυστάλλου δείγματος το οποίο συλλέγει το φάσμα του υλικού από ένα εξαιρετικά μικρό «βάθος διείσδυσης» της τάξης των λίγων μικρών. Δείγματα σε μορφή σκόνης ή υμένια συγκρατούνται σε επαφή με τον κρύσταλλο με την βοήθεια ειδικής πρέσας η οποία ασκεί πίεση περίπου 75 psi όπως απεικονίζεται στο παρακάτω Σχήμα. 50

58 Σχήμα Θ18. Ενδεικτική τομή διάταξης ΑΤR. Τυπικά, τα φάσματα που συλλέγονται με την τεχνική ATR απαιτούν χρόνο συλλογής λιγότερο από 1 λεπτό και μηδενικό χρόνο προετοιμασίας. Είναι συνεπώς δυνατή η συλλογή μεγάλου αριθμού φασμάτων με ασφάλεια, ταχύτητα και υψηλή επαναληψιμότητα. Μαθηματική προσέγγιση Η προσπίπτουσα δέσμη ανακλάται ολικά στην μεσεπιφάνεια (Σχήμα 17), δηλαδή η γωνία πρόσπτωσης θ είναι μεγαλύτερη από την χαρακτηριστική γωνία θc (critical angle), για την οποία ισχύει: sin θ c = n 2 n 1 (5.1) όπου n2 ο δείκτης διάθλασης του δείγματος και n1 ο δείκτης διάθλασης του κρυστάλλου. Το βάθος διείσδυσης (penetration depth), dp, ορίζεται ως εκείνο στο οποίο η ένταση της ακτινοβολίας υπερύθρου ελαττώνεται στο Io/e (όπου Ιο είναι ή ένταση της ακτινοβολίας στην μεσεπιφάνεια κρυστάλλου/δείγματος και e είναι η βάση των νεπέρειων λογαρίθμων ίση με 2,718). Το βάθος διείσδυσης συναρτήσει των δεικτών διάθλασης n1 και n2, της γωνίας πρόσπτωσης θ και του μήκους κύματος της ακτινοβολίας στον αέρα λο, δίδεται από τη σχέση: λ ο d p = 2πn 1 sin 2 θ ( n 2 n 1 ) 2 (5.2) Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι οι παράγοντες που επηρεάζουν μία ανάλυση με τη μέθοδο ATR είναι: το μήκος κύματος της ακτινοβολίας λ, ο δείκτης διάθλασης τoυ δείγματος n2 και του κρυστάλλου n1, η γωνία πρόσπτωσης της ακτινοβολίας θ, το βάθος διείσδυσης dp και η επαφή δείγματος με τον κρύσταλλο. I ev = I o e z dp (5.3) Όπου Ιev η ένταση του αποσβενόμενου κύματος, z είναι η κανονική απόσταση προς την οπτική μεσεπιφάνεια, και Ιo είναι η ένταση όταν z=0. Η ένταση του εξασθενημένου κύματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του δείγματος. 51

59 Σχήμα Θ19. Πρόσπτωση ακτινοβολίας και δημιουργία αποσβενόμενου κύματος στο δείγμα. Η τεχνική ATR είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την απόκτηση IR φασμάτων, δύσκολων δειγμάτων τα οποία δεν μπορούν εύκολα να εξετασθούν με την κανονική μέθοδο. Τα κυριότερα πλεονεκτήματα της τεχνικής ATR που είναι η δυνατότητα μη καταστροφικής ανάλυσης υμενίων με σχετικά μεγάλο πάχος, ή με πολύ υψηλούς συντελεστές μοριακής απορροφητικότητας και η δυνατότητα ανάλυσης πολυστρωματικών δειγμάτων. Η ευαισθησία της τεχνικής ATR αυξάνει σημαντικά με αύξηση του αριθμού εσωτερικών ανακλάσεων, Ν>1. Αυτό επιτυγχάνεται με χρήση μεγαλύτερου κρυστάλλου με σχήμα τραπεζίου ή παραλλεπιπέδου. Σε αυτή την περίπτωση, το φαινόμενο βάθος διείσδυσης (effective penetration depth) ισούται με Νdp και η ποιότητα του σήματος ενισχύεται σημαντικά. Η παραλλαγή της απλής ανάκλασης εφαρμόζεται μέσω φακοειδών κρυστάλλων σε μικρά δείγματα ή σε αυτά με πορώδεις ή ανώμαλες επιφάνειες τα οποία δεν θα εφάπτονταν αποτελεσματικά στους συνηθισμένους πρισματικούς κρυστάλλους. Τα φάσματα της τεχνικής FT-ATR είναι πανομοιότυπα με αυτά της FT-IR ως προς τη θέση απορρόφησης αλλά διαφέρουν στις σχετικές εντάσεις των δεσμών. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό στερεού, μπορούμε να πούμε ότι η τεχνική της φασματομετρίας ATR, είναι μία αξιόπιστη μέθοδος, λαμβάνοντας όμως υπόψη όλες τις παραμέτρους που μπορούν να επηρεάσουν το αποτέλεσμα, όπως η γωνία πρόσπτωσης, η καλή επαφή δείγματος και κρυστάλλου, καθώς και το είδος του κρυστάλλου. Τα βασικά τμήματα του φασματομέτρου υπερύθρου αποτελούν η πηγή υπέρυθρης ακτινοβολίας, ο μονοχρωμάτορας που διαχωρίζει την ακτινοβολία στα επιμέρους μήκη κύματος, ο ανιχνευτής που συλλέγει την ακτινοβολία που δεν απορροφήθηκε από το δείγμα και ο φωτοπολλαπλασιαστής ο οποίος μετατρέπει την ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία σε ηλεκτρικό σήμα. Το φασματοφωτόμετρο Αποσβενύμενης Ολικής Ανακλαστικότητας που χρησιμοποιήθηκε στο χαρακτηρισμό των CPCs στην παρούσα εργασία, ήταν το FTIR (Excalibur της Digilab) στο οποίο είχε προσαρμοστεί ανεξάρτητα διάταξη ATR (Pike Magic) με περιοχή σάρωσης από 450 cm -1 έως 4000 cm -1, το οποίο βρίσκεται στο Τμήμα Επιστήμης των Υλικών. 52

60 7. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΣΤΗ ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ 7.1 ΑΥΞΗΣΗ ΤΗΣ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑΣ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Μία από τις βασικότερες εφαρμογές των κυκλοδεξτρινών στη Φαρμακευτική είναι η χρήση τους για την αύξηση της υδατοδιαλυτότητας διαφόρων βιοδραστικών μορίων σχηματίζοντας ενώσεις έγκλεισης. Η αύξηση της υδατοδιαλυτότητας των βιοδραστικών ενώσεων εκφράζεται με το συντελεστή διαλυτοποίησης που ισούται με το λόγο της διαλυτότητας της βιοδραστικής ένωσης παρουσία συγκεκριμένης συγκέντρωσης κυκλοδεξτρίνης προς τη διαλυτότητα της βιοδραστικής ένωσης απουσία κυκλοδεξτρίνης. Ανάμεσα στις εμπορικά διαθέσιμες κυκλοδεξτρίνες οι μεθυλιωμένες κυκλοδεξτρίνες με χαμηλή μοριακή υποκατάσταση φαίνεται να είναι οι καλύτεροι διαλυτοποιητές. Επίσης, η SBE-β-CD φαίνεται να είναι ένας άριστος διαλυτοποιητής για πολλές βιοδραστικές ενώσεις και είναι περισσότερο αποτελεσματική από τη β-cd όχι όμως και από την DM-β-CD. Πίνακας ΘΠ5: Παραδείγματα βιοδραστικών ενώσεων των οποίων η διαλυτότητα αυξάνει μετά τη συμπλοκοποίηση τους με κυκλοδεξτρίνες. β-cd α-cd γ-cd ΗP-β-CD DM-β-CD SBE-β-CD RM-β-CD CD Τυχαία μεθυλιωμένη άμορφη β-cd ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΗ ΕΝΩΣΗ Λοραζεπάμη, Ιτρακοναζόλη, Ιβουπροφένη, Πιροξικάμη, Γκριζεοφουλβίνη, Πραζικουαντέλη Πραζικουαντέλη Πραζικουαντέλη, Ομεπραζόλη, Διγοξίνη Καρβαμαζεπίνη, Φαινυτοϊνη, Ιτρακοναζόλη, Γκριζεοφουλβίνη, ETH-615 Ναπροξένη Δεναζόλη, Σπιρονολακτόνη ETH-615 Ναπροξένη Η προσθήκη πολυμερών σε διαλύματα κυκλοδεξτρινών μπορεί να βελτιώσει σημαντικά την ικανότητα διαλυτοποίησης των βιοδραστικών μορίων. Έτσι, η προσθήκη διαφόρων ρεολογικών παραγόντων, με βασικότερο τα υδατοδιαλυτά παράγωγα της κυτταρίνης, έχει σαν αποτέλεσμα τον σχηματισμό συμπλόκων με τις κυκλοδεξτρίνες και τη μεταβολή των φυσικοχημικών τους ιδιοτήτων. Σε υδατικά διαλύματα υδατοδιαλυτών πολυμερών παρουσιάζεται αύξηση της ικανότητας διαλυτοποίησης των κυκλοδεξτρινών σε διάφορες υδρόφοβες βιοδραστικές ενώσεις αυξάνοντας την φαινόμενη σταθερά συμπλοκοποίησης των συμπλόκων 53

61 βιοδραστικών ενώσεων-κυκλοδεξτρίνης [Challa et al (2005), Loftsson and Brewster (1996)]. 7.2 ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ Οι κυκλοδεξτρίνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να αυξήσουν τη σταθερότητα βιοδραστικών μορίων. Όταν ένα μόριο υποκαταστάτης δεσμευθεί στο εσωτερικό της κοιλότητας της κυκλοδεξτρίνης παρεμποδίζει την είσοδο άλλων μορίων την ίδια στιγμή, παρά το γεγονός ότι το τέλος της κοιλότητας είναι ανοιχτό. Αυτό οφείλεται σε φαινόμενα στερεοχημικής (steric) παρεμπόδισης που εμποδίζουν την προσέγγιση των μορίων στο τμήμα του μορίου που «εκτείθεται». Με αυτό το τρόπο εμποδίζεται η αντίδραση και η αλληλεπίδραση του μορίου με τα άλλα μόρια με αποτέλεσμα τη σταθεροποίησή του. Η πενικιλλίνη G σταθεροποιείται σε υδατικό διάλυμα που περιέχει chloroacetate buffer παρουσία της ΗP-β-CD. Η τιμή της αποικοδόμησης είναι περίπου 9 φορές μικρότερη για το σύμπλοκο σε σχέση με τη τιμή της αποικοδόμησης για την ελεύθερη βιοδραστική ένωση. Η ενέργεια ενεργοποίησης για την αντίδραση αποικοδόμησης είναι η ίδια και στις δύο περιπτώσεις όμως η εντροπία της ενεργοποίησης είναι μειωμένη γεγονός που υποδηλώνει ότι η στερεοχημική παρεμπόδιση έκανε την προσέγγιση του καταλυτικού πρωτονίου πιο δύσκολη. Οι κυκλοδεξτρίνες μπορούν να βελτιώσουν τη σταθερότητα διαφόρων ασταθών βιοδραστικών ενώσεων απέναντι στην υδρόλυση, την αφυδάτωση, την οξείδωση και την φωτοαποικοδόμηση. Αυτό επιτυγχάνεται είτε απομονώνοντας την βιοδραστική ένωση από ένα πιθανό δραστικό περιβάλλον είτε εμποδίζοντας την αποικοδόμησή της μετά την απορρόφησή της. Σε μοριακό επίπεδο, οι κυκλοδεξτρίνες φαίνεται να εγκλωβίζουν τα ασταθή μόρια με τη συμπλοκοποίηση και να προστατεύουν έτσι τις βιοδραστικές ουσίες από τις διάφορες διαδικασίες αποικοδόμησης. Η SBE-β-CD παρουσιάζει τη μεγαλύτερη ικανότητα αύξησης της σταθερότητας βιοδραστικών μορίων σε σχέση με τις υπόλοιπες κυκλοδεξτρίνες. Η ικανότητα σταθεροποίησης των κυκλοδεξτρινών εξαρτάται κυρίως από τη φύση τους και την επίδραση των δραστικών ομάδων αυτών στην σταθερότητα της βιοδραστικής ένωσης και στη φύση της κυκλοδεξτρίνης. Τόσο η καταλυτική ικανότητα της νιτρομάδας όσο και η ικανότητα σταθεροποίησης των κυανιούχων ομάδων στη φωτοαποικοδόμηση των 1,4 διυδρο-πυριμιδικών αναλόγων μειώνεται μετά από συμπλοκοποίηση με κυκλοδεξτρίνες. Επίσης, οι κυκλοδεξτρίνες αυξάνουν την σταθερότητα της τριμεπραζίνης και της προμεθαζίνης στο φως. Εφόσον η υδρόλυση των βιοδραστικών μορίων που έχουν «ενκαψακιωθεί» στις κυκλοδεξτρίνες είναι σαφώς μειωμένη σε σχέση με την υδρόλυση των ελεύθερων βιοδραστικών μορίων η σταθερότητα του συμπλόκου βιοδραστικής ένωσης/κυκλοδεξτρίνης (π.χ. η τιμή της σταθεράς συμπλοκοποίησης) παίζει σημαντικό ρόλο στο προσδιορισμό της έκτασης της προστασίας. Για παράδειγμα, 54

62 μικρές συγκεντρώσεις της HP-β-CD (1% ή λιγότερο) προστατεύουν τη ταξόλη σε πολύ μικρότερο βαθμό απ ότι υψηλότερες συγκεντρώσεις της κυκλοδεξτρίνης. Πίνακας ΘΠ6: Επίδραση των κυκλοδεξτρινών στη σταθερότητα των βιοδραστικών ενώσεων. Επίδραση Βιοδραστική ένωση Κυκλοδεξτρίνη της φωτοσταθερότητας της θερμικής σταθερότητας σε υγρή κατάσταση της σταθερότητας απέναντι στον ενδομοριακό σχηματισμό δακτυλίων σε υγρή κατάσταση της σταθερότητας στην όξινη υδρόλυση και φωτοαποικοδόμηση της σταθερότητας απέναντι στην υδρόλυση Προμεθαζίνη DY-9760e Δικλοφενάκη Κουιναρίλη Δοξορουβικίνη Διγοξίνη Πακλιταξέλη Γανκικλοβίρη ΗP-β-CD, DM-β-CD SBE-β-CD β-cd β-cd, ΗP-β-CD ΗP-β-CD, HP-γ-CD γ-cd γ-cd, HP-γ-CD, HP-β-CD ΗP-β-CD Σε διαλύματα κυκλοδεξτρίνης ο ρυθμός αποικοδόμησης για μία χημικά ασταθή βιοδραστική ένωση που σχηματίζει ένα σύμπλοκο 1:1 θα είναι ο σταθμικός μέσος του ρυθμού αποικοδόμησης της ελεύθερης και της συμπλοκοποιημένης βιοδραστικής ένωσης. Σε αντιδράσεις πρώτης ή ψευδοπρώτης τάξεως η ικανότητα σταθεροποίησης εξαρτάται από τρεις παράγοντες: 1. την συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης 2. την σταθερά συμπλοκοποίησης του συμπλόκου 3. την σταθερά αποικοδόμησης της βιοδραστικής ένωσης μέσα στη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης (ΚC) Οι τρεις αυτοί παράγοντες μπορούν να προσδιορισθούν με βάση την παρακάτω εξίσωση: Κ obs = (k o + k c K C [CD] / (1 + K C [CD] (42) όπου k0 είναι η σταθερά αποικοδόμησης της βιοδραστικής ένωσης απουσία κυκλοδεξτρίνης, Κ obs είναι η σταθερά αποικοδόμησης της βιοδραστικής ένωσης παρουσία κυκλοδεξτρίνης, kc είναι η σταθερά αποικοδόμησης της βιοδραστικής ένωσης που έχει συμπλοκοποιηθεί με τη κυκλοδεξτρίνη, kc είναι η σταθερά σχηματισμού του συμπλόκου και [CD] είναι η συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης. 55

63 Σχήμα Θ20: Απλό πρότυπο που απεικονίζει την επίδραση της σταθεράς συμπλοκοποίησης στην χημική αποικοδόμηση των βιοδραστικών ενώσεων. Σε άλλες μελέτες πάντως οι τιμές των σταθερών kc και KC προσδιορίζονται από τη γραμμική προσαρμογή της εξίσωσης: 1/(Κ 0 Κ obs ) = 1/ (K o K c ) + 1/K 1:1 (K o K c ) 1/[CD]. Παρόλα αυτά, επειδή η μη γραμμική μέθοδος είναι λιγότερο ευαίσθητη στα πειραματικά λάθη σε σχέση με τη γραμμική, δίνει πιο ακριβή αποτελέσματα: K obs = k 0 (1 [D CD] D t = K C[CD] 1 + K C [CD] K C[CD] 1 + K C [CD] ) + k C ( K C[CD] 1 + K C [CD] ) = k 0 + k c K C [CD] 1 + K C [CD] Τόσο η Kc όσο και η kc μπορούν να υπολογιστούν από τη μη γραμμική προσαρμογή των δεδομένων [Challa et al (2005), Loftsson and Brewster (1996), Loftsson (1998)]. 7.3 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΤΗ ΒΙΟΔΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Οι κυκλοδεξτρίνες αυξάνουν τη βιοδιαθεσιμότητα δυσδιάλυτων βιοδραστικών ενώσεων αυξάνοντας τη διαλυτότητα ή/και τη διαπερατότητα των βιοδραστικών ενώσεων από τις βιολογικές μεμβράνες. Οι κυκλοδεξτρίνες είναι σχετικά μεγάλα μόρια οι περισσότερες έχουν μοριακό βάρος μεταξύ 1000 και 1600 και κάτω από φυσιολογικές συνθήκες διαπερνούν πολύ δύσκολα τις βιολογικές μεμβράνες. Παρόλα αυτά, οι κυκλοδεξτρίνες αυξάνουν τη διαπερατότητα δυσδιάλυτων, υδρόφοβων βιοδραστικών ενώσεων κάνοντας την βιοδραστική ένωση διαθέσιμη στην επιφάνεια των διαφόρων βιολογικών φραγμών όπως το δέρμα, η βλεννώδης μεμβράνη, ο κερατοειδής χιτώνας, απ όπου εισέρχεται μέσα στη μεμβράνη χωρίς να διασπάσει τα λιπιδικά στρώματα αυτής. Σε αυτές τις περιπτώσεις είναι σημαντικό να χρησιμοποιούμε καθορισμένη ποσότητα 56

64 κυκλοδεξτρίνης αρκετή για να διαλυθεί η βιοδραστική ένωση σε υδατικό διάλυμα και όχι περίσσεια γιατί μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της βιοδιαθεσιμότητας. Σε μικρές συγκεντρώσεις RM-β-CD, όπου η υδροκορτιζόνη είναι σε εναιώρηση, η αύξηση της συγκέντρωσης της κυκλοδεξτρίνης είχε σαν αποτέλεσμα την αύξηση της ροής της βιοδραστικής ένωσης. Αντίθετα, σε υψηλές συγκεντρώσεις κυκλοδεξτρίνης, όπου η βιοδραστική ένωση ήταν σε διάλυση, η αύξηση της συγκέντρωσης είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση της ροής της [Loftsson και συνεργάτες (1997)]. Σχήμα Θ21: Πρότυπο για την αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας από τις κυκλοδεξτρίνες. Έχει βρεθεί ότι η προσθήκη πολυμερών μπορεί να αυξήσει ακόμα περισσότερο τη διαπερατότητα των βιοδραστικών μορίων σε υδατικά διαλύματα κυκλοδεξτρίνης. Για παράδειγμα, η καρβόξυμέθυλο- κυτταρίνη (CMC) αυξάνει τη βιοδιαθεσιμότητα της τρικλοσάνης σε οδοντόπαστες που περιέχουν β- κυκλοδεξτρίνη, σχηματίζοντας ένα σύμπλοκο βιοδραστικής ένωσης/κυκλοδεξτρίνης/cmc με βελτιωμένες ιδιότητες. Στην περίπτωση των υδατοδιαλυτών βιοδραστικών ενώσεων, οι κυκλοδεξτρίνες αυξάνουν τη διαπερατότητα τους με άμεση δράση στις βλεννώδεις μεμβράνες και αύξηση της απορρόφησης ή/και τη βιοδιαθεσιμότητάς τους. Η διαλυτοποίηση συγκεκριμένων μεμβρανικών λιπιδίων των ανθρώπινων ερυθροκυττάρων μέσω της συμπλοκοποίησής τους με κυκλοδεξτρίνες και η ικανότητά τους να διαταράσουν την ακεραιότητα της μεμβράνης φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στην απορρόφηση και τοξικότητα των βιοδραστικών ενώσεων. Πιστεύεται οτι οι κυκλοδεξτρίνες, λόγω της ικανότητάς τους να απομακρύνουν τη χοληστερόλη, μπορούν να αυξήσουν τη ρευστότητα των μεμβρανών και να επηρεάσουν την αναδίπλωσή τους με αποτέλεσμα τη λύση του κυττάρου. Από την άλλη μεριά, η απομάκρυνση των φωσφολιπιδίων από τις κυκλοδεξτρίνες, ιδιαίτερα της φωσφατιδυλοχολίνης και της σφιγγομυελίνης, από την εξωτερική επιφάνεια της μεβρανικής διπλοστιβάδας προκαλεί ανισορροπία της μεβράνης. Με τον ίδιο μηχανισμό οι κυκλοδεξτρίνες προκαλούν λύση φυσιολογικών μεμβρανών που περιέχουν λεκιθίνη και χοληστερόλη. 57

65 Η αύξηση της σταθερότητας ασταθών βιοδραστικών ενώσεων από τις κυκλοδεξτρίνες, η ικανότητά τους να μειώνουν τον ερεθισμό που προκαλούν οι βιοδραστικές ενώσεις και η αύξηση του χρόνου παραμονής τους στο στάδιο της απορρόφησης στην ρινική, οπτική, ορθική και διαδερμική χορήγηση είναι μερικοί ακόμα παράγοντες που συνεισφέρουν στην αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας των βιοδραστικών ενώσεων από τις κυκλοδεξτρίνες. Για παράδειγμα, η α-κυκλοδεξτρίνη αυξάνει τη βιοδιαθεσιμότητα της μορφίνης μετά από ορθική χορήγηση, παρεμποδίζοντας την μετακίνηση της βιοδραστικής ένωσης σε περιοχές που θα υφίστατο μεταβολισμό πρώτης διόδου [Challa et al (2005), Loftsson and Brewster (1996), Loftsson (1998), Loftsson et al (2002)]. Σχήμα Θ22: Η αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας (αύξηση της AUC) μιας βιοδραστικής ένωσης μετά από συμπλοκοποίηση με κυκλοδεξτρίνες. 7.4 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΤΗΝ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΤΩΝ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Οι κυκλοδεξτρίνες χρησιμοποιούνται για να μειώσουν την τοπική ερεθιστική δράση ορισμένων βιοδραστικών ενώσεων. Η αυξημένη αποτελεσματικότητα των βιοδραστικών ενώσεων που οφείλεται στην αύξηση της διαλυτότητάς τους μετά τη συμπλοκοποίηση με τις κυκλοδεξτρίνες, οδηγεί στη μείωση της ερεθιστικότητάς του κάνοντάς το θεραπευτικά αποτελεσματικό σε χαμηλότερες δόσεις. Για παράδειγμα, η β-κυκλοδεξτρίνη αυξάνει την αντιιϊκή δράση της ακυκλοβίρης στον ανθρώπινο αδενομεγαλοϊό και η επακόλουθη αύξηση της δράσης της βιοδραστικής ένωσης μειώνει την ερεθιστικότητά του [Nicolazzi et al (2002)]. Επίσης, η συμπλοκοποίηση της φαινυτοΐνης με τη HP-β-CD είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση του ερεθισμού των ιστών σε επίμυες σε σχέση με τον ερεθισμό που προκαλεί η ενέσιμη χορήγηση της βιοδραστικής ένωσης. Σε μοριακό επίπεδο, η ενκαψακίωση της βιοδραστικής ένωσης στο μόριο της κυκλοδεξτρίνης εμποδίζει την απευθείας επαφή του με τις βιολογικές μεμβράνες και έτσι μειώνει τις παρενέργειές του και το τοπικό ερεθισμό των ιστών χωρίς 58

66 σημαντική μείωση των θεραπευτικών του ιδιοτήτων. Τέλος, η συμπλοκοποίηση των βιοδραστικών ενώσεων που προορίζονται για οπτική χρήση, με τις κυκλοδεξτρίνες, μειώνει τον ερεθισμό που προκαλούν οι ενώσεις αυτές στον κερατοειδή χιτώνα περιορίζοντας τη συγκέντρωση της ελεύθερης βιοδραστικής ένωσης σε μη ερεθιστικά επίπεδα [Challa et al (2005), Loftsson and Brewster (1996), Loftsson (1998)]. 7.5 ΜΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΠΤΗΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Η συμπλοκοποίηση των κυκλοδεξτρινών με πτητικές βιοδραστικές ενώσεις μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να μειωθούν ή να εξαλειφθούν τελείως οι απώλειες από την εξάτμισή τους. Για παράδειγμα, η μενθόλη μπορεί να συμπλοκοποιηθεί με τη β-κυκλοδεξτρίνη για το σχηματισμό ενός άοσμου συμπλόκου. Στους 100 C, η ποσότητα της μενθόλης στο σύμπλοκο είναι πολύ κοντά στη θεωρητική συγκέντρωση αυτής, ενώ η ελεύθερη μενθόλη στις ίδιες συνθήκες θέρμανσης θα είχε εξατμιστεί τελείως. Η μέθοδος αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί επίσης σε αιθέρια έλαια και σε βελτιωτικά γεύσης φυτικής προέλευσης [Hegdes (1998)]. 7.6 ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΤΩΝ ΧΗΜΙΚΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Η εφαρμογή των κυκλοδεξτρινών για τη κατεύθυνση των χημικών αντιδράσεων βασίζεται στο γεγονός ότι όταν ένας υποκαταστάτης συμπλοκοποιείται με μία κυκλοδεξτρίνη, ένα τμήμα του μορίου βρίσκεται στο εσωτερικό της κοιλότητας και δεν μπορεί να αλληλεπιδράσει με άλλα μόρια - σε αντίθεση με το υπόλοιπο τμήμα του μορίου που προεξέχει από την κοιλότητα και μπορεί να αλληλεπιδράσει. Οι υδροξυλομάδες ή άλλες ομάδες που έχουν υποκαταστήσει τις υδροξυλομάδες που βρίσκονται στο εξωτερικό της κοιλότητας εμποδίζουν ορισμένες αντιδράσεις να συμβούν εύκολα λόγω φαινομένων στερεοχημικής παρεμπόδισης. Η αλληλεπίδραση όμως των πλευρικών ομάδων του υποκαταστάτη με τις ομάδες αυτές επηρεάζει την δραστικότητα του μορίου και ανάλογα με τις πλευρικές ομάδες μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη κατάλυση χημικών αντιδράσεων προς μία ορισμένη κατεύθυνση [Hedges (1998)]. 7.7 ΚΑΛΥΨΗ ΤΗΣ ΔΥΣΑΡΕΣΤΗΣ ΓΕΥΣΗΣ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΙΩΝ (TASTE MASKING) Οι κυκλοδεξτρίνες χρησιμοποιούνται για την κάλυψη της τυχόν δυσάρεστης γεύσης των βιοδραστικών μορίων - ή ορισμένων λειτουργικών ομάδων των μορίων αυτών - που χρησιμοποιούνται σε φαρμακομορφές που χορηγούνται από το στόμα. Η δυσάρεστη αυτή γεύση, που καθιστά ανεπιθύμητη τη λήψη των σκευασμάτων αυτών από τους ασθενείς, μπορεί να μειωθεί ή ακόμα και να εξαλειφθεί τελείως μετά τη συμπλοκοποίηση με τις κυκλοδεξτρίνες καθώς η δέσμευση των βιοδραστικών ενώσεων στη υδρόφοβη κοιλότητα των κυκλοδεξτρινών εμποδίζει τη δέσμευσή τους από τους γευστικούς κάλυκες [Hedges (1998), Nagai & Ueda (1996)]. 59

67 7.8 ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ΑΣΥΜΒΑΤΟΤΗΤΑΣ Κατά τη παρασκευή διαφόρων φαρμακομορφών μπορεί να εμφανιστούν προβλήματα ασυμβατότητας τόσο μεταξύ των βιοδραστικά ενεργών ουσιών όσο και μεταξύ των εκδόχων που χρησιμοποιούνται κατά την μορφοποίηση της φαρμακομορφής. Η συμπλοκοποίηση των ενώσεων, που εμφανίζουν πρόβλημα ασυμβατότητας, στο εσωτερικό της κοιλότητας των κυκλοδεξτρινών προστατεύει τις ενώσεις αυτές, επιτρέπει την ανάμιξη και τη μορφοποίησή τους στο τελικό προϊόν και σταθεροποιεί τη φαρμακομορφή, εμποδίζοντας την αλληλεπίδρασή τους με τα υπόλοιπα συστατικά αυτής [Hedges (1998)]. 7.9 ΧΟΡΗΓΗΣΗ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΑΠΟ ΤΟΥ ΣΤΟΜΑΤΟΣ Η εφαρμογή των κυκλοδεξτρινών στην χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων per os περιλαμβάνει τη βελτίωση της βιοδιαθεσιμότητας των ενώσεων αυτών, αύξηση του ρυθμού και της έκτασης της διαλυτότητας ή/και της σταθερότητάς τους στη θέση απορρόφησης (γαστρεντερικό σύστημα), μείωση του ερεθισμού που προκαλεί η βιοδραστική ένωση και κάλυψη της δυσάρεστης γεύσης. Επίσης, οι κυκλοδεξτρίνες αυξάνουν την διαπερατότητα της βιοδραστικής ένωσης από τους βλεννογόνους λόγω αύξησης της διαθεσιμότητας της ελεύθερης βιοδραστικής ουσίας στην επιφάνεια απορρόφησης. Η επιλογή της κυκλοδεξτρίνης για την συμπλοκοποίηση σε per os χορήγηση σχετίζεται άμεσα με την ασφάλεια, το κόστος και την αποτελεσματικότητα της συμπλοκοποίησης. Οι HP-β-CDs φαίνεται να έχουν τα πιο ασφαλή χαρακτηριστικά όμως ακόμα δεν υπάρχουν δεδομένα για την ασφάλεια των μεθυλιωμένων κυκλοδεξτρινών. Παρόλα αυτά όλες οι κυκλοδεξτρίνες μπορούν να θεωρηθούν πρακτικά μη τοξικές για per os χορήγηση λόγω της ελλιπούς απορρόφησής τους από το γαστροοισοφαγικό σωλήνα και επομένως η ασφάλειά τους σχετίζεται με τη δόση της βιοδραστικής ένωσης που χρησιμοποιείται στο σύμπλοκο και την LD 50 της κυκλοδεξτρίνης. Η απορρόφηση της βιοδραστικής ένωσης από τα δισκία άμεσης αποδέσμευσης στο γαστρεντερικό σύστημα περιλαμβάνει μία σειρά από στάδια όπως η διαλυτοποίηση της βιοδραστικής ένωσης στα γαστροοισοφαγικά υγρά, η διείσδυση στα επιθηλιακά κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου και η διαπέραση των βιολογικών μεμβρανών από τα μόρια της βιοδραστικής ένωσης είτε με μηχανισμό παθητικής διάχυσης είτε με ενεργητική μεταφορά [Challa et al (2005), Loftsson and Brewster (1996), Mosher and Thompson (2002), Rajewski R. and Stella V. (1996)]. Οι βιοδραστικές ενώσεις μπορούν να χωριστούν σε τρείς κατηγορίες ανάλογα με την υδατοδιαλυτότητά τους και την ικανότητά τους να διαπερνούν τις βιολογικές μεμβράνες [Loftsson (2005)]. Μια βιοδραστική ένωση θεωρείται ότι έχει μεγάλη διαλυτότητα όταν η υψηλότερη δόση της διαλύεται σε ποσότητα νερού μικρότερη από 250 ml σε μία περιοχή ph και έχει μεγάλη διαπερατότητα 60

68 όταν το ποσοστό της ένωσης που απορροφάται είναι μεγαλύτερο του 90% της χορηγηθείσας δόσης (σε διάλυμα). Στην κατηγορία I ανήκουν οι βιοδραστικές ενώσεις που διαλύονται εύκολα στο νερό και η βιοδιαθεσιμότητά τους είναι μεγαλύτερη από 90%. Οι ενώσεις αυτές παρουσιάζουν ικανοποιητική λιποφιλικότητα και έτσι διεισδύουν εύκολα και διαπερνούν το βλεννογόνο του ΓΕΣ. Οι υδρόφιλες κυκλοδεξτρίνες, επομένως, δεν αυξάνουν την βιοδιαθεσιμότητα αυτών των βιοδραστικών ενώσεων. Παρόλα αυτά, οι κυκλοδεξτρίνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να μειώσουν το τοπικό ερεθισμό που προκαλεί η βιοδραστική ένωση ή να αυξήσουν το ρυθμό διαλυτοποίησής της. Οι βιοδραστικές ενώσεις της κατηγορίας II έχουν μικρή υδατοδιαλυτότητα με αποτέλεσμα την περιορισμένη απορρόφησή τους. Παρόλα αυτά, όταν διαλυθούν διαπερνούν εύκολα τις βιολογικές μεμβράνες με αποτέλεσμα να έχουν βιοδιαθεσιμότητα μεγαλύτερη του 90%. Έτσι, τα υδατοδιαλυτά σύμπλοκα των βιοδραστικών αυτών ενώσεων με τις κυκλοδεξτρίνες θα βελτιώσουν τη διείσδυσή τους στον εντερικό βλεννογόνο και θα βελτιώσουν τη βιοδιαθεσιμότητά τους. Οι βιοδραστικές ενώσεις της κατηγορίας III είναι υδατοδιαλυτές αλλά δεν διαπερνούν εύκολα τις βιολογικές μεμβράνες (π.χ. λόγω του μεγέθους τους). Επομένως, ο σχηματισμός ενός υδρόφιλου συμπλόκου βιοδραστικής ένωσηςκυκλοδεξτρίνης δεν θα αυξήσει τη βιοδιαθεσιμότητά τους αλλά θα βελτιώσει την ικανότητά τους να διεισδύουν στον εντερικό βλεννογόνο από τα γαστρενερικά υγρά. Τέλος, οι βιοδραστικές ενώσεις της κατηγορίας IV δεν είναι υδατοδιαλυτές και δεν διαπερνούν εύκολα τις βιολογικές μεμβράνες με αποτέλεσμα οι κυκλοδεξτρίνες να μην μπορούν να αυξήσουν τη βιοδιαθεσιμότητά τους. Οι κυκλοδεξτρίνες μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για να μειώσουν την ρινική τοξικότητα άλλων enhancers χωρίς να επηρεάζουν την απορρόφησή τους [Merkus et al (1999), Challa (2005), Rajewski R. and Stella V. (1996)]. 8. ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΣΤΗΝ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑ ΔΥΣΔΙΑΛΥΤΩΝ ΣΤΟ ΝΕΡΟ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Η διαλυτοποίηση δυσδιάλυτων στο νερό βιοδραστικών ενώσεων σε μικύλλια επιφανειοδραστικών ενώσεων αποτελεί μία εναλλακτική μέθοδο για την διαλυτοποίηση των σε υδατικά διαλύματα. Μία σημαντική ιδιότητα των επιφανειοδραστικών ενώσεων είναι ο σχηματισμός συσσωματωμάτων κολλοειδών διαστάσεων τα οποία είναι γνωστά ως μικύλλια. Τα μικύλλια έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην φαρμακευτική μορφοποίηση λόγω της ικανότητας των να αυξάνουν την διαλυτότητα βιοδραστικών ενώσεων δυσδιάλυτων στο νερό [Mall S. et al., 1996]. Τα μικύλλια είναι γνωστό ότι έχουν μη ομοιόμορφη κατανομή των μορίων του νερού στην δομή των, συγκεκριμένα η συγκέντρωση του νερού μειώνεται από την επιφάνεια προς τον πυρήνα του ο οποίος είναι εξαιρετικά 61

69 υδρόφοβος. Κατά συνέπεια, η κατανομή του διαλυτοποιημένου μορίου στην δομή του μικυλλίου θα εξαρτάται από την πολικότητα του : τα μη-πολικά μόρια θα διαλυτοποιούνται κύρια στον πυρήνα του μικυλλίου ενώ ενώσεις με ενδιάμεση πολικότητα θα κατανέμονται ανάμεσα στα μόρια της επιφανειοδραστικής ένωσης σε θέσεις ανάλογης πολικότητας. Εντούτοις, αριθμός συστημάτων μεταφοράς και στόχευσης βιοδραστικών ενώσεων έχει μέχρι σήμερα μελετηθεί στην προσπάθεια ελαχιστοποίησης της αποικοδόμησης και απώλειας βιοδραστικών ενώσεων, στην πρόληψη ανεπιθύμητων παρενεργειών και στην αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας. Η χρήση των μικυλλίων επιφανειοδραστικών ενώσεων ως φορείς βιοδραστικών ενώσεων παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα συγκρινόμενη με άλλα συστήματα όπως διαλυτά πολυμερή και λιποσώματα. Τα μικυλλιακά συστήματα μπορούν να διαλυτοποιήσουν δυσδιάλυτες στο νερό βιοδραστικές ενώσεις και να αυξήσουν την βιοδιαθεσιμότητά τους, μπορούν να παραμείνουν για αρκετό διάστημα στην κυκλοφορία προλαμβάνοντας συσσώρευση της βιοδραστικής ένωσης στην περιοχή του στόχου και το μέγεθος των επιτρέπει να συσσωρεύονται σε περιοχές με μη επαρκή αγγειακή δόμηση. Τα μικύλλια είναι ασταθείς δομές που σχηματίζονται από τα μονομερή των επιφανειοδραστικών ενώσεων μέσω ασθενών διαμοριακών αλληλεπιδράσεων. Το σχήμα των μπορεί να είναι σφαιρικό, κυλινδρικό ή επίπεδο (δίσκοι ή διπλοστοιβάδες). Το σχήμα και το μέγεθος των μικυλλίων εξαρτάται από την χημική δομή των επιφανειοδραστικών ενώσεων, καθώς και από τις συνθήκες σχηματισμού των όπως η θερμοκρασία, η ολική συγκέντρωση της επιφανειοδραστικής ένωσης, η σύσταση των επιφανειοδραστικών (στην περίπτωση μίγματος επιφανειδραστικών ενώσεων), η ιοντική ισχύ και το ph. Ειδικότερα, ανάλογα με τον τύπο του επιφανειοδραστικού και τις συνθήκες του διαλύματος, σφαιρικά μικύλλια μπορούν αυξανόμενα σε μία διάσταση να μετατραπούν σε κυλινδρικά μικύλλλια ή σε δύο διαστάσεις σε διπλοστοιβαδικά ή δισκοειδή μικύλλια. Η ανάπτυξη των μικυλλίων ελέγχεται κατά κύριο λόγο από τις κεφαλές των επιφανειοδραστικών ενώσεων, αφού η μονοδιάσταστη ή δισδιάστατη ανάπτυξη των προϋποθέτει διευθέτηση σε κοντινές θέσεις των κεφαλών ώστε να μειωθεί η διαθέσιμη επιφάνεια ανά μόριο επιφανειοδραστικού στην επιφάνεια του μικυλλίου και κατά συνέπεια και η καμπυλότητά του. Η διαλυτοποίηση μιας βιοδραστικής ένωσης από μία επιφανειοδραστική ένωση μπορεί να εκτιμηθεί με δύο παραμέτρους: α) την μοριακή διαλυτοποιητική ικανότητα, χ, και β) τον συντελεστή κατανομής μικυλλίου-νερού. Η μοριακή διαλυτοποιητική ικανότητα ορίζεται ως ο αριθμός των moles της βιοδραστικής ένωσης που μπορεί να διαλυτοποιηθεί από ένα mol μικυλλίων της επιφανειοδραστικής ένωσης, χαρακτηρίζει την ικανότητα του επιφανειοδραστικού να διαλυτοποιεί την ένωση και δίνεται από την εξίσωση: 62

70 χ S C tot surf 63 - SW - cmc όπου Stot είναι η ολική διαλυτότητα της βιοδραστικής ένωσης, SW είναι η διαλυτότητα της βιοδραστικής ένωσης στο νερό, Csurf είναι η μοριακή συγκέντρωση της επιφανειοδραστικής ένωσης και cmc είναι η συγκέντρωση στο κρίσιμο σημείο μικυλλιοποίησης. Ο συντελεστής κατανομής μικυλλίου-νερού είναι ο λόγος της συγκέντρωσης της βιοδραστικής ένωσης στο μικύλλιο προς την συγκέντρωση της βιοδραστικής ένωσης στο νερό και δίνεται από την σχέση: Stot - S P S Ο συνδυασμός των παραπάνω εξισώσεων οδηγεί στην συσχέτιση των δύο παραμέτρων στην ακόλουθη εξίσωση: W W W χ Csurf - cmc P S Όσο μικρότερη είναι η τιμή του cmc τόσο σταθερότερα είναι τα μικύλλια. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό από φαρμακοτεχνικής πλευράς διότι κατά την αραίωση με μεγάλη ποσότητα βιολογικών υγρών, τα μικύλλια επιφανειοδραστικών ενώσεων με μικρή τιμή cmc θα εξακολουθούν να υπάρχουν ενώ μικύλλια επιφανειοδραστικών ενώσεων με μεγάλες τιμές cmc μπορούν να διασπασθούν σε μονομερή με αποτέλεσμα η περιεχόμενη βιοδραστική ένωση να αποβληθεί ως αδιάλυτη στο βιολογικό υγρό. Η ολική ποσότητα της βιοδραστικής ένωσης που διαλυτοποιείται σε μικύλλιο μπορεί να διακριθεί κατά προσέγγιση α) στο προσροφημένο κλάσμα το οποίο εντοπίζεται κύρια στην διεπιφάνεια μικυλλίου-νερού και β) στο διαλυτοποιημένο κλάσμα που εντοπίζεται στον υδρογονανθρακικό πυρήνα. Όταν λαμβάνει χώρα προσρόφηση στην διεπιφάνεια μικυλλίου-νερού, τότε η διαλυτοποιητική ικανότητα αυξάνει περισσότερο από την αντίστοιχη προβλεπόμενη του υδρογονανθρακικού πυρήνα. Σε αρκετές μελέτες, αναφέρεται ότι η διαλυτότητα ελαφρά πολικών ενώσεων και αρωματικών ενώσεων είναι σημαντικά μεγαλύτερη από την διαλυτότητα αλειφατικών ενώσεων με τον ίδιο μοριακό όγκο παρότι οι αλειφατικές ενώσεις είναι περισσότερο συμβατές ενώσεις με τον αλειφατικό υδρογονανθρακικό πυρήνα του μικυλλίου [Mukerjee P. et al., 1978]. Η ποσότητα της βιοδραστικής ένωσης που διαλυτοποιείται στα μικύλλια επιφανειοδραστικής ένωσης εξαρτάται από αρκετούς παράγοντες όπως: η χημική δομή της επιφανειοδραστικής ένωσης, η χημική δομή της βιοδραστικής ένωσης, η θερμοκρασία, το ph, η ιοντική ισχύς, κ.ά.. Μη ιονικές επιφανειοδραστικές ενώσεις παρουσιάζουν μεγαλύτερη διαλυτοποιητική ικανότητα για υδρόφοβες βιοδραστικές ενώσεις συγκρινόμενες με ιονικές επιφανειοδραστικές ενώσεις. Για πολικές βιοδραστικές ενώσεις είναι

71 περισσότερο περίπλοκο να εξαχθεί γενική σχέση ανάμεσα στον βαθμό διαλυτοποίησης και την χημική δομή της επιφανειοδραστικής ένωσης, αφού η διαλυτοποίηση των λαμβάνει χώρα τόσο στον υδρογονανθρακικό πυρήνα όσο και στην επιφάνεια των μικυλλίων. Εντούτοις σε ορισμένες περιπτώσεις βιοδραστικώn ενώσεων, όπως αναφέρεται στην βιβλιογραφία για την βιοδραστική ένωση β- Arteether [Krishna and Flanagan, 1989], ιονικές επιφανειοδραστικές ενώσεις έχουν μεγαλύτερη διαλυτοποιητική ικανότητα συγκρινόμενες με μη-ιονικές επιφανειοδραστικές ενώσεις. Σχετικά με την επίδραση της δομής της βιοδραστικής ένωσης, στερεές κρυσταλλικές βιοδραστικές ενώσεις γενικά παρουσιάζουν μικρότερη διαλυτότητα στα μικύλλια συγκρινόμενες με υγρές βιοδραστικές ενώσεις παρόμοιας δομής. Για πολικές βιοδραστικές ενώσεις, το βάθος διείσδυσης στα μικύλλια εξαρτάται από την δομή τους. 8.1 Ολική διαλυτότητα Η ολική διαλυτότητα ενός ασθενούς οξέος ή μιας ασθενούς βάσης σε ρυθμιστικά που περιέχουν επιφανειοδραστικά έχει αναφερθεί στην βιβλιογραφία (Rippie et al., 1964; Yalkowsky, 1999). Για μια ασθενή μονόξινη βιοδραστική ένωση, η ολική του διαλυτότητα ctotal μπορεί να εκφραστεί σαν το άθροισμα των τιμών διαλυτότητας των επιμέρους μορφών της: c ολική c HA c A c [HA] μικυλλίου c [A ] μικυλλίου Αντικαθιστώντας τους όρους cα -, c[ηα]μικυλλίου, c[α - ]μικυλλίου εξισώσεις (1)-(3) λαμβάνουμε την εξίσωση (6): στην εξίσωση (5) με τις c total Ka Ka 1 k * k ** c [H ] [H ] όπου k* και k** είναι οι σταθερές ισορροπίας για μικυλλιακή διαλυτότητα της αδιάστατης και της ιονισμένης βιοδραστικής ένωσης. Έχει παρατηρηθεί ότι η τιμή του cηα, δηλαδή η εσωτερική διαλυτότητα της αδιάστατης βιοδραστικής ένωσης, είναι σταθερή για όλα τα πειράματα εξ αιτίας περίσσειας ΗΑστερεού στο σύστημα. Επομένως, ένας αδιάστατος αριθμός διαλυτότητας, csp (ίσος με το λόγο ctotal/cηα), χρησιμοποιείται για να περιγράψει το εύρος της ισχύος διαλυτοποίησης. Επιπλέον, η εξίσωση (6) μπορεί να μετασχηματιστεί στις εξισώσεις (7) και (8) οι οποίες σαφώς δείχνουν πώς η cολική αλλάζει σύμφωνα με το ph και το επιφανειοδραστικό, αντίστοιχα. Η εξίσωση (7) αποτελείται από δύο μέρη, καθένα από τα οποία περιλαμβάνει και τον ελεύθερο διαλύτη και την συγκέντρωση της βιοδραστικής ένωσης που είναι διαλυμένη στα μικύλλια και αντίστοιχα αναπαριστά την διαλυτότητα της αδιάστατης μορφής της βιοδραστικής ένωσης στον όρο (1+ k*cm) και την διαλυτότητα του ιονισμένου φαρμάκου στον όρο (1 + k**cm)(ka/[h + ]). m c HA 64

72 Η διαλυτότητα της ιονισμένης μορφής της βιοδραστικής ένωσης παρά της αδιάσταστης μορφής της, είναι ο παράγοντας που επηρεάζεται από την επίδραση του ph. Για δεδομένη συγκέντρωση επιφανειοδραστικού cm, η εξίσωση (7) υποδηλώνει ότι η ολική διαλυτότητα του ΗΑ αυξάνει αντιστρόφως ανάλογα με την [Η + ] και συνεπώς εκφράζει μία θετική λογαριθμική-γραμμική σχέση με το ph. Επιπλέον, η εξίσωση (7) φανερώνει επίσης, ότι μεγαλύτερες τιμές της cm οδηγούν σε μεγαλύτερη ευαισθησία της ολικής διαλυτότητας σε συνάρτηση με αλλαγές του ph. Αυτό οφείλεται πρωταρχικά στην συνεισφορά της ιονισμένης βιοδραστικής ένωσης που έχει διαλυθεί στο μικύλλιο, το οποίο εκφράζεται Δctotal = cηα(1+k**cm)ka[δ(1/[η + ])]. Για δεδομένη [Η + ] ή ph, η εξίσωση (8) δείχνει ότι η csp αυξάνει γραμμικά με την μικυλλιακή συγκέντρωση cm. Βεβαίως, αυτή η γραμμική σχέση περιγράφεται καλά χρησιμοποιώντας μια σταθερή τεταγμένη επί την αρχή 1+(Ka/[H + ]) και μια σταθερή κλίση k*+k**(ka/[h + ]). Η τιμή της τεταγμένης επί την αρχή καθορίζεται από το ph του διαλύματος. Συγκριτικά, η κλίση καθορίζεται όχι μόνο από το ph αλλά και από τις σταθερές ενσωμάτωσης της βιοδραστικής ένωσης στα μικύλλια. Για μία βιοδραστική ένωση που είναι ασθενές οξύ, μια υψηλότερη τιμή του ph θα οδηγούσε σε μειωμένη τιμή [Η + ], και συνεπώς σε αύξηση της ισχύος διαλυτότητας csp: c SP c c total HA Ka Ka 1 k * k ** c [H ] [H ] m 65

73 Β. CARVEDILOL Η Carvedilol είναι βιοδραστική ένωση η οποία χορηγείται για την αντιμετώπιση παθήσεων του κυκλοφοριακού συστήματος. Η Carvedilol παρουσιάζει τριπλή φαρμακολογική δράση: α) αγγειοδιασταλτική δράση, β) αντιοξειδωτικές ιδιότητες και γ) είναι μη-εκλεκτικός β-ανταγωνιστής. Συγκεκριμένα μειώνει την περιφερειακή αντίσταση με εκλεκτικό αποκλεισμό των α1-υποδοχέων και καταστέλλει το σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνης με μη εκλεκτικό β-ανταγωνισμό (β1- και β2- υποδοχείς). Ανήκει στην τρίτη γενεά των β-ανταγωνιστών. Η Carvedilol αν και αποτελεί αποτελεσματική αντιυπερτασική βιοδραστική ένωση χρησιμοποιείται κυρίως για την θεραπεία της καρδιακής ανεπάρκειας. Η χρήση της Carvedilol έχει δείξει ότι μειώνεται η νοσηρότητα και η θνησιμότητα που συνδέονται με την καρδιακή ανεπάρκεια. Στο Σχήμα Θ22 απεικονίζεται η μοριακή δομή της Carvedilol καθώς και οι ομάδες στις οποίες οφείλονται οι παραπάνω ιδιότητες. Η αντιοξειδωτική δράση της Carvedilol οφείλεται στην ομάδα της καρβαζόλης, η δράση της ως α1-ανταγωνιστής οφείλεται στην μεθόξυφαινυλενομάδα και σε τμήμα της αλειφατικής αλυσίδας ενώ η δράση της ως β- ανταγωνιστής οφείλεται σε μέρος της ομάδας της καρβαζόλης και σε τμήμα της αλειφατικής αλυσίδας. Η Carvedilol μεταβολίζεται κύρια στο σηκώτι με μεταβολισμό πρώτης διέλευσης με αποτέλεσμα η μέγιστη βιοδιαθεσιμότητα της να φθάνει μόλις το 23% της χορηγούμενης δόσης. Δεσμεύεται σε ποσοστό 95% από τις πρωτεϊνες στο πλάσμα, ενώ η δέσμευση αυτή δεν επηρεάζεται αξιοσημείωτα σε περίπτωση ηπατικών ασθενειών. Ο μέσος χρόνος ημιζωής σε υπερτασικούς ασθενείς είναι 6-8 ώρες. Το χημικό όνομα της Carvedilol είναι (±)-[3-(9H-carbazol-4-yloxy)-2- hydroxypropyl][2-(2-methoxyphenoxy)ethyl]amine. Είναι λευκή κρυσταλλική άοσμη κόνις. Ο χημικός της τύπος είναι C24H26N2O4 και έχει μοριακό βάρος g/mol. Η Carvedilol είναι ασθενής μονόξινη βάση, η διαλυτότητας της μειώνεται με την αύξηση του ph υδατικής φάσης ενώ σε ph μικρότερο του 3 η διαλυτότητα της μειώνεται αντί να αυξάνεται λόγω σχηματισμού εσωτερικού άλατος περιορισμένης διαλυτότητας. Έχει πολύ μεγάλη διαλυτότητα στο DMSO (Dimethylsulfoxide), είναι 66

74 διαλυτή στο μεθυλοχλωρίδιο και στην μεθανόλη, είναι ελάχιστα διαλυτή στην εμπορική αιθανόλη (95%) και πρακτικά αδιάλυτη στο νερό, στο γαστρικό υγρό (ph = 1.1) και στα εντερικά υγρά (ph 7.5). Εχει ταξινομηθεί ως δραστική ένωση κατηγορίας ΙΙ από το Biopharmaceuticals Classification System (BCS). Υπάρχουν τουλάχιστον πέντε πολυμορφικές φάσεις της Carvedilol εκ των οποίων η φάση ΙΙ είναι η συνηθέστερα απαντώμενη. Το pka της Carvedilol είναι ίσο με 7.8 ενώ ο συντελεστής κατανομής ταξινομεί την Carvedilol στις λιπόφιλες ενώσεις. Συγκεκριμένα ο λογάριθμος του πειραματικού συντελεστή κατανομής είναι ίσος με 4.19, ενώ ο αντίστοιχος συντελεστής που υπολογίζεται θεωρητικά είναι ίσος με 3.42 (ChemAxon). Το σημείο τήξεως της Carvedilol είναι στους C. Η Carvedilol έχει ασύμμετρο άτομο άνθρακα (σημειώνεται στο Σχήμα Θ23 με αστερίσκο) με αποτέλεσμα να απαντάται ως ρακεμικό μίγμα. Σχήμα Θ23: Χημική δομή της Carvedilol και αντιστοίχιση των φαρμακολογικών δράσεων της σε τμήματα του μορίου της. 67

75 ΣΚΟΠΟΣ Η χρήση των κυκλοδεξτρινών στη βιομηχανική φαρμακευτική και συγκεκριμένα στην φαρμακευτική μορφοποίηση έχει παρουσιάσει σημαντική αύξηση τα τελευταία χρόνια. Η συμπλοκοποίηση των βιοδραστικών ενώσεων με τις κυκλοδεξτρίνες χρησιμοποιείται κύρια για: Α) την αύξηση της διαλυτότητας, Β) την βελτίωση της σταθερότητας, Γ) την βελτίωση της βιοδιαθεσιμότητας των βιοδραστικών ενώσεων Δ) την αλλαγή των οργανοληπτικών ιδιοτήτων τους και Δ) την μείωση των παρενεργειών τους. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση των κυκλοδεξτρινών στην υδατοδιαλυτότητα της Carvedilol της οποίας η φαρμακολογική δράση παρουσιάζεται εκτενώς παραπάνω. Η Carvedilol παρουσιάζει προβλήματα υδατοδιαλυτότητας σε διαφορετικό βαθμό σε όλη την περιοχή φυσιολογικών τιμών ph που απαντώνται στον γαστρεντερικό σωλήνα. Στην βιβλιογραφία αναφέρονται πολλές προσπάθειες για να ξεπερασθούν τα προβλήματα στην διαλυτότητα της Carvedilol, όπως α) η χρήση στερεών διασπορών που βασίζονται σε υδατοδιαλυτά πολυμερή (Yuvaraja et al, 2014 & Tapas et al, 2012), β) η χρήση μικρογαλακτωμάτων (Sanjula et al, 2009), γ) η χρήση αυτο-γαλακτωματοποιούμενων (self emulsifying) και αυτο-μικρογαλακτωματοποιούμενων (self microemulsifying) συστημάτων (Wei et al, 2005 & Salimi et al, 2014) και δ) η χρήση μικροσωματιδίων carboxylate carbon (Zhang et al, 2013). Επίσης έχουν γίνει μελέτες της επίδρασης των κυκλοδεξτρινών στην αύξηση της διαλυτότητας της Carvedilol. Η παρασκευή μιγμάτων της Carvedilol με την β-cd με τις τεχνικές της φυσικής ανάμιξης, της υγρής λειοτρίβηνσης και της συγκαταβύθισης (Sharman & Jain, 2013) και ο χαρακτηρισμός των έδειξε ότι η μέθοδος της συγκαταβύθισης είναι η περισσότερο αποτελεσματική για την ενώσεων έγκλεισης. Επίσης με την μέθοδο της λυοφιλοποίησης (Pamudji et al, 2014) παρασκευάσθηκαν ενώσεις έγκλεισης με στοιχειομετρία 1:3 ως προς την κυκλοδεξτρίνη. Η διαλυτόποίηση της Cravedilol έχει μελετηθεί (Loftsson et al, 2008) σε συνδυασμό σχηματισμού άλατος παρουσία κυκλοδεξτρινών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η 68

76 προσθήκη οξικού οξέος σε ph μικρότερο του 5 αύξησε σημαντικά την διαλυτότητα της Carvedilol. Επίσης έχει μελετηθεί η επίδραση της methyl-β-cyclodextrin στην διαλυτότητα και στην ταχύτητα διαλυτοποίησης της Carvedilol (Hirlekar & Kadam, 2009). Η συμπλοκοποίηση της Carvedilol με την της methyl-β-cyclodextrin έδειξε σημαντική αύξηση της διαλυτότητας της. Μελέτη του σχηματισμού ένωσης έγκλεισης της Carvedilol με την β-cyclodextrin με την μέθοδο του φθορισμού (Wei et al. 2004) έδειξε σημαντική αύξηση της διαλυτότητας ενώ προσδιορίσθηκε ο σχηματισμός της ένωσης έγκλεισης με στοιχειομετρία 1:2 και η σταθερά σχηματισμού ίση με 8,5x10 5 M -2. Επίσης μελετήθηκε η αύξηση της διαλυτότητας μέσω του σχηματισμού τριαδικών συμπλόκων με κιτρικό οξύ και β-cyclodextrin σε μοριακή αναλογία 1:2:2 (Pokharkar et al, 2009). Η αύξηση της διαλυτότητας της Carvedilol βρέθηκε 110 φορές μεγαλύτερη παρουσία του κιτρικού οξέος. Η μελέτη της επίδρασης του ph παρουσία της Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin έδειξε ότι η μέγιστη διαλυτότητα επιτεύχθηκε σε ph = 7.4 (Shewale et al, 2008). Ακόμη η τιμή της σταθεράς συμπλοκοποίησης με την Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin προσδιορίσθηκε ίση με 4.19x10 4 M -1, ενώ από το διάγραμμα διαλυτότητας βρέθηκε ότι το σχηματιζόμενο σύμπλοκο έχει στοιχειομετρία 1:1. Σε άλλη μελέτη (Bhutani et al, 2007) η σταθερά συμπλοκοποίησης βρέθηκε ίση με 582,78 M -1. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε ο σχηματισμός συμπλόκων έγκλεισης της Carvedilol με κυκλοδεξτρίνες τόσο σε στερεή κατάσταση όσο και σε υδατικά διαλύματα με διαφορετικούς τρόπους παρασκευής και στοιχειομετρικές αναλογίες και στη συνέχεια μελετήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν τα σύμπλοκα αυτά. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι να μελετηθεί και να επιτευχθεί πιθανή βελτίωση των ιδιοτήτων της Carvedilol μέσω της συμπλοκοποίησης με τις εξεταζόμενες κυκλοδεξτρίνες καθώς και να εντοπισθούν οι παράγοντες που ευνοούν το σχηματισμό των συμπλόκων. Από την βιβλιογραφική έρευνα διαπιστώθηκε ότι δεν έχει γίνει μελέτη της επίδρασης της θερμοκρασίας στην συμπλοκοποίηση της Carvedilol με κυκλοδεξτρίνες και κατά συνέπεια προσδιορισμός των θερμοδυναμικών παραμέτρων οι οποίες σχετίζονται με τις δυνάμεις που ευνοούν τον σχηματισμό των αντίστοιχων συμπλόκων έγκλεισης. Επίσης σε μελέτες επίδρασης της συγκέντρωσης και της φύσης των κυκλοδεξτρινών στην διαλυτότητα 69

77 της Carvedilol δεν καθορίζονται οι συνθήκες του διαλύματος όπως το ph και η αλατότητα που αποτελούν σημαντικούς παράγοντες στην διαλυτότητα δυσδιαλύτων ενώσεων στο νερό. Στην παρούσα εργασία όλα τα πειράματα επίδρασης της συγκένρτωσης και της φύσης των κυκλοδεξτρινών έγιναν σε διάλυμα ανθρακικού νατρίου συγκέντρωσης 20 mm με ph = Σε αυτή την τιμή ph το μόριο της Carvedilol είναι πλήρως μη-ιονισμένο με αποτέλεσμα μόνο αφόρτιστα μόρια της να εισέρχονται στην υδρόφοβη κοιλότητα των κυκλοδεξτρινών. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση ορισμένων επιφανειοδραστικών ενώσεων και συχνά χρησιμοποιούμενων εκδόχων στην διαλυτότητα της Carvedilol στους 25 C σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) με ph = 7.4. Οι μελέτες της επίδρασης επιφανειοδραστικών ενώσεων στην διαλυτότητα της Carvedilol μέχρι σήμερα επικεντρώνονται κυρίως στην επίδραση της παρουσίας των στο μέσο αποδέσμευσης σε πειράματα αποδέσμευσης της από στερεές φαρμακοτεχνικές μορφές. 70

78 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 71

79 1.1. ΥΛΙΚΑ, ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΥΛΙΚΑ/ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Όλα τα αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν όπως ελήφθησαν χωρίς περαιτέρω επεξεργασία και ήταν αναλυτικού βαθμού καθαρότητας και σε όλες τις περιπτώσεις για την παρασκευή διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκε διπλά απεσταγμένο νερό. Η στερεή Carvedilol παραχωρήθηκε από την εταιρία Rafarm και χαρακτηρίσθηκε με τις τεχνικές περίθλασης ακτίνων-χ και διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης. Οι κυκλοδεξτρίνες, οι επιφανειοδραστικές ενώσεις και τα έκδοχα που μελετήθηκαν παρουσιάζονται στους Πίνακες ΠΜ1 και ΠΜ2. Πίνακας ΠΜ1: Οι κυκλοδεξτρίνες που που μελετήθηκαν για την αύξηση της διαλυτότητας της Carvedilol. ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΗ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΑ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ β-cyclodextrin β-cd Serva Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin HP-β-CD Aldrich Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin HP-γ-CD Aldrich Methyl-β-Cyclodextrin Crysmeb Roquette Πίνακας ΠΜ2. Επιφανειοδραστικές ενώσεις και έκδοχα που μελετήθηκαν για την αύξηση της διαλυτότητας της Carvedilol. ΕΝΩΣΗ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΑ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ Cetyltrimethylammonium bromide CTAB Sigma Sodium Dodecyl Sulfate SDS Serva Polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate Tween 20 Sigma Polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate Tween 80 Sigma Polyethylene glycol (15)-hydroxystearate Solutol HS15 BASF Polyethylene Glycol (ΜΒ = 400 g/mol) PEG400 Aldrich Polyethylene Glycol (ΜΒ = 4000 g/mol) PEG4000 Merck Polyethylene Glycol (ΜΒ = g/mol) PEG20000 Sigma 2-(2-Ethoxyethoxy)ethanol Transcutol Acros Organics Propylene Glycol - Fisher Chemicals 72

80 ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΣΥΣΚΕΥΕΣ Κατά την εκτέλεση του πειραματικού μέρους χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα όργανα και συσκευές: Φαρμακευτικός ζυγός ακριβείας : Μettler AE 166 Θερμοστατούμενο υδατόλουτρο με δυνατότητα ανακίνησης δειγμάτων (Memmert) Συσκευή περιστροφικής ανάδευσης: Vortex Labinco L 46 Πεχάμετρο : phmeter (Metrohm ph691) Φασματοφωτόμετρο υπεριώδους-ορατού (UV-VIS) : SHIMADZU UV-1205 Θερμιδόμετρο διαφορικής σάρωσης : Q100 της ΤΑ Instruments εξοπλισμένο με σύστημα ψύξης με υγρό άζωτο (Rheometrics Scientific Ltd) Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) : Zeiss Supra 35VP Φασματοφωτόμετρο NMR (Brüker NMR 400 MHz DPX Advance) Φασματοφωτόμετρο Υπέρυθρης Ακτινοβολίας αποσβενυμένης ολικής ανακλαστικότητας (FTIR (Excalibur της Digilab) - διάταξη ATR (Pike Magic)) Μαγνητικός αναδευτήρας : Hot plate stirrer SB (Stuart), Ξηραντήρας : Memmert, Συσκευή λυοφιλοποίησης (Labconco Freeze dryer 4,5 λίτρων) με αντλία κενού Edwards 5 δύο σταδίων, Λουτρό υπερήχων (Tuttnauer) και Συσκευές περίθλασης ακτίνων-χ (Siemens D5000 και Bruker D8 Advance) ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Α) Το πρότυπο διάλυμα Carvedilol με συγκέντρωση 50 ppm που χρησιμοποιήθηκε στον ποσοτικό προσδιορισμό της Carvedilol στα πειράματα διαλυτότητας παρασκευάσθηκε ως εξής : σε ογκομετρική φιάλη των 250 ml μεταφέρθηκαν επακριβώς ζυγισθέντα 12,5mg Carvedilol και 30 ml HCl 0,1Ν και προστέθηκε απεσταγμένο νερό μέχρι τη χαραγή. Ακολούθως το διάλυμα αναδεύθηκε για 12h προκειμένου να διαλυθεί πλήρως το στερεό. Το διάλυμα αποθηκεύθηκε σε σκιερό μέρος σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και διατηρείτο περίπου 1 μήνα. Ακολούθως παρασκευαζόταν νέο πρότυπο διάλυμα Carvedilol. Β) Τα υδατικά διαλύματα ΗCl (1N, 0.1N) και NaOH (1N, 0.1N) που χρησιμοποιήθηκαν για την ρύθμιση του ph των διαλυμάτων παρασκευάσθηκαν από την αραίωση αντίστοιχων πυκνών-προτύπων διαλυμάτων (Titrisol) σε ογκομετρική φιάλη των 1000 ml με αραίωση με απεσταγμένο νερό. Γ) Διάλυμα Ανθρακικού Νατρίου 0,2M. Για την παρασκευή 100ml διαλύματος Ανθρακικού Νατρίου 0,2M ζυγιζόταν 2,12g στερεού ανθρακικού νατρίου. Η διάλυση του στερεού και η αραίωση μέχρι τελικού όγκου έγινε με διπλά απεσταγμένο νερό. Το διάλυμα ανθρακικού νατρίου χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των διαλυμάτων κυκλοδεξτρίνης καθώς και των διαλυμάτων για τον προσδιορισμό της 73

81 διαλυτότητας απουσία και παρουσία κυκλοδεξτρινών (ισόθερμοι διαλυτότητας). Το διάλυμα παρασκευαζόταν κάθε φορά εκ νέου όταν επρόκειτο να χρησιμοποιηθεί λόγω της σταδιακής διάσπασης του με τον χρόνο. Δ) Ρυθμιστικό Διάλυμα Φωσφορικών (PBS, Phosphate Buffered Saline). Για την παρασκευή 1000ml διαλύματος PBS ζυγίσθηκαν 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.43g Na2HPO4 και 0.27g KH2PO4. Όλα τα στερεά μεταφέρθηκαν σε ογκομετρική φιάλη των 1000ml. Η διάλυση των αντιδραστηρίων και η αραίωση μέχρι τελικού όγκου έγινε με διπλά απεσταγμένο νερό. Το διάλυμα φυλασσόταν σε θερμοκρασία 4 C. E) Για την ρύθμιση του ph-meter χρησιμοποιήθηκαν πρότυπα ρυθμιστικά διαλύματα (NIST) με ph = (διάλυμα όξινων φθαλικών) και ph = (διάλυμα βορικών) στους 25 C. Τα πρότυπα ρυθμιστικά διαλύματα παρασκευάσθηκαν με διάλυση ορισμένης ποσότητας των αντίστοιχων στερεών σε ογκομετρική φιάλη των 1000ml. Συγκεκριμένα, για το ρυθμιστικό διάλυμα όξινων φθαλικών (ph = 4.008) ζυγίσθηκαν g όξινου φθαλικού καλίου (KHC8O4H4) και για το πρότυπο διάλυμα βορικών ζυγίσθηκαν 3.80 g βόρακα (Na2B4O7.10H2O). Το όξινο φθαλικό κάλιο πρέπει να τοποθετείται σε ξηραντήριο στους 110 C για 24h πριν χρησιμοποιηθεί, ενώ ο βόρακας χρησιμοποιείται ως έχει και σε καμία περίπτωση δεν τοποθετείται σε ξηραντήριο. Το πρότυπα ρυθμιστικά διαλύματα αποθηκεύθηκαν σε θερμοκρασία 4 C. 1.3 Ποσοτικός προσδιορισμός της Carvedilol Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της Carvedilol στην μελέτη της επίδρασης των κυκλοδεξτρινών και των επιφανειοδραστικών ενώσεων στην διαλυτότητά της καθώς και η περιεκτικότητα σε Carvedilol των στερεών μιγμάτων που παρασκευάσθηκαν με διάφορες τεχνικές έγινε με φασματοφωτομετρική μέθοδο. Όπως αναφέρεται στην βιβλιογραφία στο φάσμα υπεριώδους της Carvedilol υπάρχουν δύο μέγιστα στα 241 και 285nm αντίστοιχα σε όξινο περιβάλλον. Παρασκευάσθηκε σειρά διαλυμάτων με αυξανόμενη συγκέντρωση Carvedilol σε διάλυμα 0.1Ν HCl και μετρήθηκε η απορρόφησή τους και στα δύο μέγιστα απορρόφησης στα 241 και 285 nm αντίστοιχα. Με βάση τις τιμές της απορρόφησης κατασκευάσθηκαν πρότυπες καμπύλες αναφοράς (απορρόφηση έναντι συγκέντρωσης) και στα δύο μήκη κύματος οι οποίες απεικονίζονται στο Σχήμα E1. Οι μετρήσεις στα 241nm έδωσαν πολύ μεγαλύτερο συντελεστή μοριακής απορρόφησης σε σύγκριση με τις μετρήσεις στα 285nm αλλά με μικρότερη γραμμική περιοχή. Διαπιστώθηκε ότι ο νόμος Beer-Lambert (γραμμική σχέση απορρόφησης συγκέντρωσης) ισχύει για την περιοχή συγκεντρώσεων Carvedilol έως τα 25 ppm για μετρήσεις στα 285nm ενώ η αντίστοιχη γραμμική περιοχή για μετρήσεις στα 241nm είναι ως τα 10ppm. Με βάση τα παραπάνω οι μετρήσεις απορρόφησης έγιναν στα 241nm. 74

82 1,4 1,2 241nm Απορρόφηση 1,0 0,8 0,6 0,4 285nm 0,2 0, Συγκέντρωση Carvedilol / ppm Σχήμα Ε1. Πρότυπη καμπύλη απορρόφησης σε μήκος κύματος 241nm και 285nm της Carvedilol σε διάλυμα 0.1N HCl ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΣΤΕΡΕΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ CARVEDILOL ΜΕ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΕΣ Παρασκευάσθηκαν στερεά μίγματα με ισομοριακές αναλογίες Carvedilol και κυκλοδεξτρίνης. Μετά από κάθε μέθοδο παρασκευής, το στερεό που λαμβανόταν, υφίστατο ξηρή λειοτρίβηση προκειμένου να επιτευχθεί μείωση μεγέθους και περισσότερο ομοιόμορφη κατανομή του μεγέθους των σωματιδίων ώστε να τοποθετείται με ευκολία στους κατάλληλους υποδοχείς για περαιτέρω ανάλυση. Όλα τα στερεά μίγματα μετά την παρασκευή τους φυλάχθηκαν σε ξηραντήρα προστατευμένα από το φως σε αδιαφανείς περιέκτες. Η παρασκευή των στερεών μιγμάτων με διάφορες τεχνικές είχε ως σκοπό τον προσδιορισμό της συγκεκριμένης τεχνικής/-ών με τις οποίες σχηματίζεται σύμπλοκο έγκλεισης ανάμεσα στη Carvedilol και τις κυκλοδεξτρίνες που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία. Α. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΜΕΙΓΜΑΤΩΝ (PHYSICAL MIXTURES) Έγινε σταδιακή ανάμιξη επακριβώς ζυγισθέντων ισομοριακών ποσοτήτων κυκλοδεξτρίνης (0.5mmol) και Carvedilol (0.5mmol (205mg)) μέσα σε αχάτινο ιγδίο υπό συνεχή ξηρή λειοτρίβηση του μίγματος. Μετά την ανάμιξη των συστατικών του 75

83 μίγματος, το μίγμα λειοτριβήνθηκε τουλάχιστον πέντε φορές προκειμένου να επιτευχθεί πλήρης ομογενοποίηση του. Ακολούθως τα μίγματα, τοποθετήθηκαν σε υάλινους περιέκτες που έκλειναν ερμητικά με κατάλληλο πώμα και φυλάχθηκαν προστατευμένα από το φώς σε ξηραντήρα. B. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΛΕΙΟΤΡΙΒΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΜΙΓΜΑΤΩΝ (KNEADING OR PASTE METHOD) Ορισμένη ποσότητα κυκλοδεξτρίνης (0.5mmol) τοποθετήθηκε σε ιγδίο πορσελάνης, ακολούθως προστέθηκε μικρή ποσότητα υδατικού διαλύματος αιθυλικής αλκοόλης (αναλογία όγκων 1:1) και το περίπου υδαρές στερεό λειοτριβήθηκε έως ότου εξατμίσθηκε ο διαλύτης. Ακολούθως προστέθηκε μικρή ποσότητα Carvedilol, μερικές σταγόνες του παραπάνω διαλύματος και έγινε νέα λειοτρίβηση και το μίγμα αφέθηκε έως ότου εξατμίσθηκε ο διαλύτης. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε μέχρι να προστεθεί όλη η ποσότητα της Carvedilol (συνολικά 0.5mmol που αντιστοιχούν σε 205mg). Ακολούθησε νέα προσθήκη διαλύτη και νέα λειοτρίβηνση μέχρι να δημιουργηθεί λευκή παχύρρευστη μάζα. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε πέντε φορές για ολόκληρη την ποσότητα του μίγματος. Ακολούθησε ξηρή λειοτρίβηνση προκειμένου να διασπασθούν μικρά συσσωματώματα που σχηματίσθηκαν κατά την υγρή λειοτρίβηνση. Η ξηρή λειοτρίβηνση του μίγματος έγινε τρεις φορές. Τα μίγματα τοποθετήθηκαν για ξήρανση σε φούρνο στους 50 C για 24 ώρες, τοποθετήθηκαν σε υάλινους περιέκτες που έκλειναν ερμητικά με κατάλληλο πώμα και φυλάχθηκαν προστατευμένα από το φώς σε ξηραντήρα. Γ. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΛΥΟΦΙΛΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ (FREEZED DRYING) Σε υδατικό διάλυμα της κυκλοδεξτρίνης όγκου 5ml και συγκέντρωσης 100mM προστέθηκε ποσότητα στερεής Carvedilol ώστε τελικά να υπάρχει στερεή αδιάλυτη Carvedilol. Το παραχθέν εναιώρημα τοποθετήθηκε για 5 λεπτά σε λουτρό υπερήχων (η διαδικασία επαναλήφθηκε τρεις φορές με ενδιάμεσο χρόνο μισή ώρα) και αφέθηκε υπό συνεχή ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου, προστατευμένο από το φως, για 48 ώρες. Στο διάστημα των 48 ωρών τοποθετήθηκε για 5 λεπτά σε λουτρό υπερήχων ανά ορισμένα χρονικά διαστήματα. Ακολούθως, η στερεή Carvedilol που δεν διαλύθηκε απομακρύνθηκε με διήθηση διαμέσου ηθμού μεμβράνης (διάμετρος πόρων : 0.2μm). Το διήθημα λυοφιλοποιήθηκε μέχρι την πλήρη απομάκρυνση του ύδατος και την παραγωγή λευκού στερεού υπολείμματος το οποίο είχε την μορφολογία μικρού πάχους μεγάλου μεγέθους κρυστάλλων. Στη συνέχεια, λειοτριβήνθηκε μέχρι την παραγωγή λεπτόκοκκης κόνεως, τοποθετήθηκαν σε υάλινους περιέκτες που έκλειναν ερμητικά με κατάλληλο πώμα και φυλάχθηκαν προστατευμένο από το φώς σε ξηραντήρα. 76

84 Δ. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΣΤΕΡΕΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ ΣΥΓΚΑΤΑΒΥΘΙΣΗΣ (CO- PRECIPITATION OR CO-EVAPORATION ) Ίσοι όγκοι ισομοριακών διαλυμάτων Carvedilol και κυκλοδεξτρίνης σε μεθανόλη (50ml διαλύματος με συγκέντρωση 10mM το καθένα) αναμίχθηκαν σε σφαιρική φιάλη και αναδεύθηκαν για 48 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως το διάλυμα τοποθετήθηκε σε περιστρεφόμενο εξατμιστήρα (rotary evaporator). Εφαρμόσθηκε κενό με την βοήθεια κατάλληλης αντλίας κενού (αρχικά το εφαρμοζόμενο κενό ήταν στα 200 mbar και όταν μειώθηκε σημαντικά ο όγκος του υγρού το κενό αυξήθηκε στα mbar) ενώ ταυτόχρονα το διάλυμα θερμάνθηκε σε υδατόλουτρο στους 40 C μέχρι την πλήρη εξάτμιση του διαλύτη. Στη συνέχεια το στερεό τοποθετήθηκε σε ξηραντήρα μέχρι την επίτευξη σταθερού βάρους. Ακολούθως το στερεό απομακρύνθηκε από την υάλινη σφαιρική φιάλη με απόθεση με την βοήθεια κατάλληλα τροποποιημένης σπάτουλας, και λειοτριβήθηκε (ξηρή λειοτρίβηνση) σε αχάτινο ιγδίο μέχρι να δημιουργηθεί λεπτόκοκκο στερεό με περίπου ομοιόμορφο μέγεθος σωματιδίων. Η ξηρή λειοτρίβηνση ήταν απαραίτητη διότι το στερεό που ελήφθη από την εξάτμιση του διαλύτη αποτελείτο από διαφορετικού μεγέθους σωματίδια και υπήρχε μεγάλη δυσκολία στο χειρισμό του κατά την τοποθέτηση του στους κατάλληλους υποδοχείς των συσκευών για τον χαρακτηρισμό του. Η τεχνική της συγκαταβύθισης δεν χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή στερεών της Carvedilol με την β-cd, διότι η β-cd όπως και οι υπόλοιπες φυσικές κυκλοδεξτρίνες δεν διαλύονται σε καθαρές αλκοόλες όπως η απόλυτη αιθανόλη και μεθανόλη. Η χρήση της απόλυτης μεθανόλης και αιθανόλης είναι αναγκαία αφού διαλύεται σε ικανοποιητικό βαθμό η Carvedilol καθώς και οι τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες. Προκειμένου να διαλυτοποιηθεί η β-cd, χρησιμοποιήθηκαν μίγματα μεθανόλης-νερού και αιθανόλης-νερού 1:1 και 1:3 αλλά δεν διαλύθηκε πλήρως η Carvedilol σε αυτούς τους διαλύτες, οπότε και δεν παρασκευάσθηκαν τα αντίστοιχα στερεά για την β-cd με την μέθοδο της συγκαταβύθισης ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΣΤΕΡΕΩΝ ΜΙΓΜΑΤΩΝ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΩΝ ΜΕ ΤΗΝCARVEDILOL Α Χαρακτηρισμός των ιδιοτήτων των στερεών συμπλόκων Για τον χαρακτηρισμό των στερεών μιγμάτων της Carvedilol με τις κυκλοδεξτρίνες χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω τεχνικές ανάλυσης: Α.1 Διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC) Χρησιμοποιήθηκε το διαφορικής σάρωσης θερμιδόμετρο Q100 της εταιρίας TA Instruments, εξοπλισμένο με σύστημα ψύξης ελεγχόμενο με παροχή υγρού αζώτου. Τα δείγματα ζυγίστηκαν επακριβώς στην περιοχή βάρους : 4-8mg και τοποθετήθηκαν σε κατάλληλους αλουμινένιους περιέκτες όπου και κλείσθηκαν 77

85 ερμητικά με την βοήθεια κατάλληλης συσκευής. Ο ρυθμός θέρμανσης των δειγμάτων ήταν 10 C ανά λεπτό και η περιοχή των θερμοκρασιών που μελετήθηκε ήταν από 20 έως 150 C με παροχή αερίου αζώτου 25 ml/min για την δημιουργία αδρανούς ατμόσφαιρας στο κελίο μέτρησης. Εκτός από τα θερμογραφήματα των μιγμάτων που ελήφθησαν με την μέθοδο της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης, ελήφθησαν και τα θερμογραφήματα των καθαρών συστατικών που χρησιμοποιήθηκαν δηλαδή της Carvedilol και των κυκλοδεξτρινών που αναφέρονται στο Πίνακα Ε1. Η μέγιστη θερμοκρασία σάρωσης καθορίσθηκε στους 150 C διότι το σημείο τήξεως της καθαρής Carvedilol είναι στους C, ενώ σε θερμοκρασία πάνω από τους 250 C, το σύνολο των κυκλοδεξτρινών τήκεται με ταυτόχρονη διάσπαση των. Επίσης, πρέπει να σημειωθεί ότι η Methyl-β-Cyclodextrin έχει σημαντικά χαμηλότερο σημείο, σε σύγκριση με τις υπόλοιπες κυκλοδεξτρίνες διότι τήκεται με ταυτόχρονη διάσπαση της στους 180 C. Α.2 Περίθλαση ακτίνων-χ (ΧRD) Τα φάσματα περίθλασης ακτίνων-χ (ΧRD) ελήφθησαν στις συσκευές περίθλασης ακτίνων-χ α) Siemens D5000 και β) Bruker D8 Advance με τον ανιχνευτή LynxEye κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες: φίλτρο Ni, δυναμικό 40 kv, ένταση ρεύματος 30 ma, σταθερά χρόνου 2sec. Τα φάσματα ελήφθησαν στην περιοχή γωνιών 2Θ από 5 έως 50, το βήμα ήταν 0.02 και η ταχύτητα σάρωσης ήταν 1 /λεπτό. Εκτός από τα φάσματα των μιγμάτων που ελήφθησαν με την μέθοδο της περίθλασης ακτίνων-χ, ελήφθησαν και τα αντίστοιχα φάσματα των καθαρών συστατικών της Carvedilol και των κυκλοδεξτρινών που μελετήθηκαν. Για τα μίγματα που παρασκευάσθηκαν σε μικρές ποσότητες χρησιμοποιήθηκε ειδικός υποδοχέας με μηδενικό σήμα υποβάθρου (zero background holder) έτσι ώστε να μην εμφανίζονται πρόσθετες κορυφές που οφείλονται στο υλικό κατασκευής του υποδοχέα. Το πρόβλημα αυτό δεν εμφανίζεται στις περιπτώσεις όπου η ποσότητα του δείγματος είναι μεγάλη και το εμβαδό της διαθέσιμης επιφάνειας του δείγματος είναι αρκετά μεγαλύτερη από το εμβαδό της προσπίπτουσας στο δείγμα ακτινοβολίας-x. Α.3 Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) Για τη μορφολογική μελέτη των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης LEO Supra 35VP. Οι ηλεκτρονικές μικροφωτογραφίες ελήφθησαν σε δυναμικό 2.00kV και spot size 2.0. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε ειδικές κυλινδρικές θήκες από αλουμίνιο με κολλητική ταινία διπλής όψης και τα δοκίμια επικαλύφθησαν με ένα αγώγιμο στρώμα χρυσού, που έγινε με εναπόθεση του χρυσού υπό υψηλό κενό σε κατάλληλη συσκευή. Επιπλέον, ελήφθησαν προς σύγκριση ηλεκτρονικές μικροφωτογραφίες της καθαρής Carvedilol και των κυκλοδεξτρινών που μελετήθηκαν. 78

86 Α.4. Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (ΝΜR) Με την τεχνική αυτή μελετήθηκε η αλληλεπίδραση της Carvedilol με κυκλοδεξτρίνες σε διάλυμα και προσδιορίσθηκε η γεωμετρία του σχηματιζόμενου συμπλόκου. Όλα τα φάσματα 1 H-NMR ελήφθησαν με το φασματοφωτόμετρο Brüker NMR 400 MHz DPX Advance. Τα φάσματα των καθαρών συστατικών (Carvedilol, Crysmeb καθώς και των μιγμάτων Carvedilol/Crysmeb ελήφθησαν σε δευτεριωμένο οργανικό διαλύτη d6- DMSO με εσωτερικό πρότυπο αναφοράς TMS (trimethylsilane). Το εσωτερικό πρότυπο αναφοράς είναι απαραίτητο για τον επακριβή προσδιορισμό των χημικών μετατοπίσεων των κορυφών της Carvedilol και των κυκλοδεξτρινών. Παρασκευάσθηκαν μίγματα Carvedilol / Crysmeb με αναλογίες 1:1, 1:3 και 1:5. Η συγκέντρωση της Carvedilol σε όλα τα μίγματα ήταν ίση με 5mM, ενώ η συγκέντρωση της Crysmeb ήταν από 5 έως και 25mM. Η Carvedilol διαλύεται σχετικά εύκολα σε d6-dmso, ενώ έχει περιορισμένη διαλυτότητα σε D2O. Αντίθετα, οι κυκλοδεξτρίνες διαλύονται εύκολα και στο d6-dmso καθώς και στο D2O. Η παρουσία του d6-dmso δρα ανταγωνιστικά στον σχηματισμό συμπλόκου βιοδραστικών ενώσεων με κυκλοδεξτρίνες με συνέπεια να μειώνονται σε σημαντικό βαθμό οι χημικές μετατοπίσεις. Γιαυτό έγιναν μετρήσεις σε μεγαλύτερες αναλογίες κυκλοδεξτρίνης / Carvedilol προκειμένου να αυξηθεί το ποσοστό των μορίων της Carvedilol που σχηματίζουν σύμπλοκο έγκλεισης με την κυκλοδεξτρίνη. Με την τεχνική 1 H-NMR, γίνεται προσπάθεια να προσδιορισθεί ποιο τμήμα του μορίου της Carvedilol εισέρχεται στην υδρόφοβη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης. Δυστυχώς, η πλειονότητα των μορίων που συμπλοκοποιούνται με τις κυκλοδεξτρίνες έχουν μεγάλο μέγεθος και δεν μπορούν να εισέλθουν ολόκληρα στην υδρόφοβη κοιλότητα των κυκλοδεξτρινών. Από την άλλη πλευρά, είναι δυνατόν η μερική είσοδος των στην υδρόφοβη κοιλότητα των κυκλοδεξτρινών να οδηγήσει στον σχηματισμό ευδιάλυτου συμπλόκου και να αυξήσει έτσι την διαλυτότητα της δυσδιάλυτης βιοδραστικής ένωσης. Αυτό συμβαίνει και στη Carvedilol στην οποία λόγω δομής και μεγέθους δεν εισέρχεται ολόκληρο το μόριό της στην κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης αλλά τμήμα αυτού. Για την είσοδο του μορίου της Carvedilol στην υδρόφοβη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης υπάρχουν δύο προτεινόμενες διαμορφώσεις, οι οποίες και περιγράφονται παρακάτω στα αποτελέσματα, οπότε με την χρήση της τεχνικής 1 H-NMR και μέσω των χημικών μετατοπίσεων των αντίστοιχων πρωτονίων γίνεται προσπάθεια να προσδιορισθεί ποια από τις δύο αυτές διαμορφώσεις είναι η κυρίαρχη κατά τον σχηματισμό του συμπλόκου της Carvedilol με τις κυκλοδεξτρίνες. 79

87 Α.5. Υπέρυθρη Φασματοσκοπία αποσβενυμένης ολικής ανακλαστικότητας (FTIR-ATR) Τα μίγματα κυκλοδεξτρινών / Carvedilol χαρακτηρίσθηκαν με την βοήθεια φασματοφωτομέτρου Αποσβενυμένης Ολικής Ανακλαστικότητας. Το φασματοφωτόμετρο Αποσβενυμένης Ολικής Ανακλαστικότητας που χρησιμοποιήθηκε ήταν το FTIR (Excalibur της Digilab) στο οποίο είχε προσαρμοστεί ανεξάρτητη διάταξη ATR (Pike Magic) με περιοχή σάρωσης από 450 έως 4000 cm -1, το οποίο βρίσκεται στο Τμήμα Επιστήμης των Υλικών του Πανεπιστημίου Πατρών. Ο δειγματοφορέας ήταν κρύσταλλος Diamond/ZnSe ο οποίος είναι κατάλληλος για σκληρά δείγματα, όξινα και αλκαλικά υλικά. Επίσης ελήφθησαν τα φάσματα των κυκλοδεξτρινών και της Carvedilol προκειμένου να γίνει σύγκριση με τα φάσματα των μιγμάτων που παρασκευάσθηκαν ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΛΥΤΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ CARVEDILOL ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΚΥΚΛΟΔΕΞΤΡΙΝΗΣ / ΕΠΙΦΑΝΕΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Για τον προσδιορισμό της επίδρασης των κυκλοδεξτρινών στην υδατοδιαλυτότητα της Carvedilol χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Higuchi και Connors (Higuchi, 1965), σύμφωνα με την οποία περίσσεια στερεής Carvedilol προστίθεται σε υδατικά διαλύματα κυκλοδεξτρίνης με συγκεντρώσεις από 0 έως 25mM, εκτός από την β-κυκλοδεξτρίνη όπου η περιοχή συγκεντρώσεων των διαλυμάτων της ήταν από 0 έως 15mM εξαιτίας της μικρής διαλυτότητας της σε υδατικά διαλύματα. Σε όλες τις περιπτώσεις τα διαλύματα τοποθετήθηκαν σε επαρκώς κλεισμένα υάλινα φιαλίδια με βιδωτό πώμα και τα οποία ακολούθως ανακινήθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές έντονα με την βοήθεια συσκευής Vortex. Για την παρασκευή των διαλυμάτων κυκλοδεξτρίνης χρησιμοποιήθηκε μητρικό διάλυμα κυκλοδεξτρίνης σε αποσταγμένο νερό, οι αραιώσεις έγιναν με διάλυμα ανθρακικού νατρίου. Ακολούθησε η προσθήκη της στερεής Carvedilol, η ανακίνησή τους με την συσκευή Vortex και κατόπιν τοποθετήθηκαν στο θερμοστατούμενο υδατόλουτρο όπου αφέθηκαν για 3 ημέρες. Ανά ορισμένα χρονικά διαστήματα, τα αιωρήματα απομακρύνονταν από το υδατόλουτρο, ανακινούντο στην συσκευή vortex και τοποθετούνταν πάλι στο υδατόλουτρο. Τα αιωρήματα Carvedilol /κυκλοδεξτρίνης ήταν προστατευμένα σε όλη την διάρκεια της διαδικασίας από το φως. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τετραπλούν σε θερμοκρασία 20, 25, 30 και 35 C για κάθε κυκλοδεξτρίνη. Μετά το πέρας του χρόνου ανάδευσης τα εναιωρήματα διηθήθηκαν διαμέσου ηθμών διαμέτρου οπών 0.22 μm (Minisart NY15, Sartorius) που ήταν προσαρμοσμένοι σε σύστημα διήθησης (syringe filter) απομακρύνοντας με αυτόν τον τρόπο την ποσότητα της Carvedilol που δεν διαλυτοποιήθηκε. Η διήθηση έγινε 80

88 μέσα σε υδατόλουτρο ώστε να διατηρείται σταθερή η θερμοκρασία που είχαν τα διαλύματα κατά την ανάδευση. Ακολούθως, σε 3ml του διηθήματος προστίθεται 1ml HCl 0,1Ν και προσδιορίζεται φασματοφωτομετρικά η συγκέντρωσή του σε Carvedilol με την βοήθεια κατάλληλης πρότυπης καμπύλης σε μήκος κύματος 240 nm (μέγιστη απορρόφηση Carvedilol σε 0.1Ν HCl). Στα πειράματα που έγιναν παρουσία κυκλοδεξτρινών, η απορρόφησή τους στο μήκος κύματος που έγιναν οι αναλύσεις ήταν αμελητέα για όλες τις κυκλοδεξτρίνες και σε όλες τις συγκεντρώσεις των διαλυμάτων τους με αποτέλεσμα να μην είναι απαραίτητη η διόρθωση της απορρόφησης. Αν η απορρόφηση του διαλύματος είναι πέραν της γραμμικής περιοχής τότε τα διαλύματα αραιώνονταν. Στην περίπτωση των πειραμάτων που έγιναν παρουσία επιφανειοδραστικών ενώσεων / εκδόχων προκειμένου να προσδιορισθεί η διαλυτότητα της Carvedilol παρασκευάσθηκε σειρά διαλυμάτων για κάθε επιφανειοδραστική ένωση / έκδοχο, το ph της υδατικής φάσης ρυθμίσθηκε με την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος PBS (ph = 7.4) ενώ για την παρασκευή των μητρικών διαλυμάτων των επιφανειοδραστικών ενώσεων / εκδόχων χρησιμοποιήθηκε επίσης ρυθμιστικό διάλυμα PBS. Σε κάθε σειρά διαλυμάτων προστέθηκε στερεή Carvedilol, ακολούθησε ανάδευση των διαλυμάτων με έντονη ανακίνηση με την βοήθεια vortex και τα διαλύματα αφέθηκαν στους 25 C σε υδατόλουτρο για τουλάχιστον 48h. Κατόπιν τα εναιωρήματα διηθήθηκαν διαμέσου ηθμών διαμέτρου οπών 0.22 μm (Minisart NY15, Sartorius) που ήταν προσαρμοσμένοι σε σύστημα διήθησης (syringe filter) απομακρύνοντας με αυτόν τον τρόπο την ποσότητα της Carvedilol που δεν διαλυτοποιήθηκε. Για τον ποσοστικό προσδιορισμό της Carvedilol έγινε κατάλληλη αραίωση ώστε η συγκέντρωση της επιφανειοδραστικής ένωσης να γίνει μικρότερη της κρίσιμης συγκέντρωσης μικυλλιοποίησης (CMC) και να διασπασθούν τα μικύλλια στα οποία έχει διαλυτοποιηθεί η Carvedilol και να απελευθερωθούν τα μόρια της στο διάλυμα. Επίσης, αφαιρέθηκε και η απορρόφηση των διαλυμάτων ίδιας συγκέντρωσης της επιφανειοδραστικής ένωσης / εκδόχων με αυτές που προέκυψαν από την αραίωση ώστε να μην ληφθεί στους υπολογισμούς η απορρόφηση που οφείλεται σε αυτές. Για την μελέτη της επίδρασης των επιφανειοδραστικών ενώσεων και των εκδόχων στην διαλυτότητα της Carvedilol τα πειράματα έγιναν δύο φορές για κάθε επιφανειοδραστική ένωση / έκδοχο. Επίσης προσδιορίσθηκε η διαλυτότητα της Carvedilol στην περιοχή τιμών ph από 3 έως και 12 με την χρήση κατάλληλων ρυθμιστικών διαλυμάτων. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν ρυθμιστικά διαλύματα κιτρικών / φωσφορικών στην περιοχή τιμών ph : 3 7.5, ρυθμιστικά διαλύματα φωσφορικών στην περιοχή τιμών ph : 8 10 και ρυθμιστικά διαλύματα ανθρακικών στην περιοχή τιμών ph : Προστέθηκε ορισμένη ποσότητα Carvedilol σε όγκο 5ml ρυθμιστικού διαλύματος έτσι ώστε να υπάρχει αδιάλυτη ποσότητα της, τα αιωρήματα αφέθηκαν για 48 ώρες σε θερμοστατούμενο υδατόλουτρο στους 25 C. Τα αιωρήματα 81

89 αναδεύονταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Ακολούθως έγινε μέτρηση του ph του αιωρήματος και τα αιωρήματα διηθήθηκαν διαμέσω ηθμού μεμβράνης. Προσδιορίσθηκε η ποσότητα της Carvedilol με φωτομέτρηση στα 241nm. Ο προσδιορισμός της διαλυτότητας έναντι του ph έγινε εις διπλούν. 1.6 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΣΤΑΘΕΡΑΣ ΣΥΜΠΛΟΚΟΠΟΙΗΣΗΣ Βασικός στόχος των διαγραμμάτων φάσεως είναι ο προσδιορισμός της στοιχειομετρίας και ο υπολογισμός των σταθερών συμπλοκοποίησης των σχηματιζόμενων συμπλόκων Carvedilol -κυκλοδεξτρίνης. Αν η στοιχειομετρία του συμπλόκου είναι 1:1 τότε ισχύει ότι: [S] T = K 1:1S 0 1+ K 1:1 S 0 [L] T + S 0 (Π-1) όπου ST είναι η ολική συγκέντρωση (συμπλοκοποιημένη και ελεύθερη) της Carvedilol στο διάλυμα γνωστής συγκέντρωσης κυκλοδεξτρίνης (προσδιορίζεται πειραματικά), S0 είναι η διαλυτότητα της Carvedilol απουσία κυκλοδεξτρίνης στο διάλυμα ανθρακικού νατρίου με ph = 10.5 και [L]T είναι η συνολική συγκέντρωση της κυκλοδεξτρίνης. Η παραπάνω εξίσωση είναι μια γραμμική συνάρτηση της ολικής διαλυτότητας του μορίου-ξενιστή SΤ έναντι της ολικής συγκέντρωσης του μορίουυποδοχέα [L]T, επομένως η Κ1:1 υπολογίζεται από την κλίση της ευθείας και η S0 από τα πειράματα προσδιορισμού της διαλυτότητας της βιοδραστικής ένωσης απουσία κυκλοδεξτρίνης σύμφωνα με τον τύπο (Higuchi, 1965): K 1:1 = κλίση S 0 (1 κλίση) (Π-2) Με την παραπάνω μέθοδο, υπολογίστηκε η σταθερά συμπλοκοποίησης για τα σχηματιζόμενα σύμπλοκα της Carvedilol με τις κυκλοδεξτρίνες που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία (β-cd, HP-β-CD, Crysmeb και HP-γ-CD). Η διαλυτότητα S0 είναι μία σημαντική παράμετρος για τον υπολογισμό των σταθερών συμπλοκοποίησης και προσδιορίσθηκε από τον μέσο όρο των συγκεντρώσεων της Carvedilol στα διαλύματα που δεν περιείχαν κυκλοδεξτρίνη. Κατά μέσο όρο η τιμή της διαλυτότητας S0 για κάθε θερμοκρασία είναι η μέση τιμή τουλάχιστον 20 μετρήσεων που ελήφθησαν σε διαφορετικές χρονικές στιγμές με πολύ ικανοποιητική επαναληψιμότητα. 1.7 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ Οι θερμοδυναμικές παράμετροι που εμπλέκονται στον σχηματισμό των συμπλόκων και υπολογίστηκαν στην παρούσα διπλωματική εργασία είναι α) η μεταβολή της ενθαλπίας (ΔΗ) και β) η μεταβολή της εντροπίας (ΔS). Όλα τα παραπάνω μεγέθη αναφέρονται ως φαινόμενα μεγέθη διότι δεν έχουν προσδιορισθεί σε μηδενική ιοντική ισχύ (πρότυπη κατάσταση). Συγκεκριμένα, η 82

90 ιοντική ισχύς δεν είναι μηδενική αλλά περίπου ίση με 0.16Μ εξαιτίας του ανθρακικού νατρίου που χρησιμοποιήθηκε για την ρύθμιση του ph της υδατικής φάσης. Για τον υπολογισμό της μεταβολής της ελεύθερης ενέργειας, ΔG, χρησιμοποιήθηκε η σχέση: ΔG = - RTlnKc (Π-3) όπου ΚC είναι η σταθερά συμπλοκοποίησης, Τ είναι η απόλυτη θερμοκρασία και R είναι η παγκόσμια σταθερά των αερίων. Με βάση τις τιμές για την ΚC στην περιοχή θερμοκρασιών που μελετήθηκε η συμπλοκοποίηση η μεταβολή της ενθαλπίας ΔΗ υπολογίστηκε από την παρακάτω τροποποιημένη εξίσωση Van t Hoff: logk c = ΔΗ 2.3R 1 T + ΔS R (Π-4) με την υπόθεση ότι η ΔΗ είναι σταθερή σε στενή περιοχή θερμοκρασιών ( C). Η περιοχή θερμοκρασιών που μελετήθηκε είχε εύρος 15 C οπότε και η μεταβολή της ενθαλπίας θεωρείται ότι παραμένει σταθερή. Η γραφική παράσταση της παραπάνω εξίσωσης είναι ευθεία και από την κλίση της υπολογίστηκε η ΔΗ ενώ η αντίστοιχη μεταβολή της εντροπίας προσδιoρίσθηκε από την τεταγμένη επί την αρχή (= ΔS/R) για κάθε κυκλοδεξτρίνη που μελετήθηκε. 83

91 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 84

92 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΣΤΕΡΕΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ Παρασκευάσθηκαν στερεά μίγματα Carvedilol με τις κυκλοδεξτρίνες β-cd, Crysmeb, HP-β-CD και HP-γ-CD με τις μεθόδους της υγρής λειοτρίβησης, της συγκαταβύθισης από κοινό διαλύτη και της λυοφιλοποίησης. Επίσης παρασκευάσθηκαν φυσικά μίγματα της Carvedilol με τις παραπάνω κυκλοδεξτρίνες. Όλα τα μίγματα χαρακτηρίσθηκαν με την χρήση αναλυτικών τεχνικών προκειμένου να προσδιορισθεί η μέθοδος ή οι μέθοδοι που οδηγούν στον σχηματισμό συμπλόκων έγκλεισης ανάμεσα στην Carvedilol και τις κυκλοδεξτρίνες β-cd, Crysmeb, HP-β-CD και HP-γ-CD. Για τον χαρακτηρισμό των στερεών μιγμάτων της Carvedilol και τις κυκλοδεξτρίνες β-cd, Crysmeb, HP-β-CD και HP-γ-CD χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές : Α) της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSC), Β) της Περίθλασης Ακτίνων-Χ (XRD), Γ) της Φασματοσκοπίας Υπερύθρου αποσβενυμένης ολικής ανακλαστικότητας (FTIR - ATR) και Δ) της Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Σάρωσης (SEM) Τα αποτελέσματα των αναλύσεων παρουσιάζονται αναλυτικά παρακάτω για κάθε τεχνική ξεχωριστά. Η Carvedilol εμφανίζεται σε διαφορετικές άνυδρες και ένυδρες κρυσταλλικές μορφές (πολυμορφισμός) όπως αναφέρεται στην βιβλιογραφία [Beattle K et al, 20XX]. Οι σημαντικότερες μορφές της Carvedilol καθώς α) οι σημαντικότερες κορυφές στα φάσματα περίθλασης ακτίνων-χ καθώς και β) οι σημαντικότερες ενδόθερμες κορυφές (που οφείλονται στο σημείο τήξης της μορφής, σε απώλεια νερού από ένυδρες μορφές και σε ενδιάμεσες μετατροπές των μορφών) στα θερμογραφήματα σάρωσης παρουσιάζονται στον Πίνακα Π1. Η κρυσταλλική μορφή-ι είναι η θερμοδυναμικά σταθερότερη μορφή, ενώ η κρυσταλλική μορφή-ιι συναντάται συνήθως και είναι η μορφή η οποία χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. Το φάσμα περίθλασης ακτίνων-χ και το θερμογράφημα σάρωσης για την μορφή-ιι παρουσιάζονται αναλυτικά σε κάθε τεχνική παρακάτω. 85

93 Πίνακας A1. Κρυσταλλικές φάσεις και δεδομένα περίθλασης ακτίνων-χ (XRD) και διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης (DSC) για την Carvedilol. Πολυμορφική φάση Form-I Κορυφές περίθλασης ακτίνων-χ (2θ) 9.5, 10.8, 12.0, 14.6, 19.6, 21.5, 22.3 Ενδόθερμες κορυφές από δεδομένα DSC C και C (τήξη Form-I) Form-II Form-III Form-IV (ημιένυδρη) Form-VI Form-IX (ημιένυδρη) 5.8, 11.6, 13.0, 13.6, 14.8, 15.2, 16.5, 17.0, 17.5, 18.4, 19.2, 20.3, 21.0, 21.4, 21.7, 22.9, 23.5, 24.3, 25.4, 26.2, 27.5, 28.1, 29.4, 31.4, 32.5, 34.2, 35.4, 38.2, , 9.3, 11.6, 13.2, 13.5, 14.2, 15.3, 15.8, 17.4, 18.4, 19.4, 20.6, 21.4, 22.0, 26.5, , 14.2, 15.7, 16.5, 17.7, 18.3, 19.2, 19.6, 21.7, 22.2, 23.9, 24.2, 24.9, 27.4, , 6.8, 10.9, 11.6, 12.9, 13.6, 16.8, 17.5, 17.9, 23.3, , 6.5, 11.4, 12.4, 13.6, 14.7, 16.9, 19.3, 19.6, C (έναρξη) και C (μέγιστο) (τήξη Form-II) C (κύρια κορυφή, τήξη) Α) C (έναρξη) και 104 C (μέγιστο) με απώλεια βάρους 2% λόγω του νερού Α) 73 C (μετατροπή σε Form-II) Β) 114 C (τήξη Form-II) Α) 80 C (μικρή, απώλεια νερού) Β) 99 C (κύρια) 3.1 Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης (DSC) Η κρυσταλλική μορφή ΙΙ της Carvedilol η οποία χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία έχει σημείο τήξεως στους 114 C περίπου όπως αναφέρεται στην βιβλιογραφία και το θερμογράφημα της απεικονίζεται στο Σχήμα A1. Όπως προέκυψε από την ανάλυση των πειραματικών δεδομένων στο Σχήμα A1, η έναρξη της τήξης της καθαρής Carvedilol Form-II προσδιορίσθηκε στους C, ενώ το μέγιστο της κορυφής προσδιορίσθηκε στους C. Τα θερμογραφήματα της Carvedilol και των κυκλοδεξτρινών που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία και των αντίστοιχων μιγμάτων τους που παρασκευάσθηκαν απεικονίζονται στα Σχήματα A2, A3 και A4. 86

94 -3-4 Θερμοκρασία έναρξης τήξης : ο C Heat Flow / (W.g -1 ) Εξώθερμη Ενδόθερμη Σημείο τήξης : ενδόθερμη κορυφή Θερμοκρασία / o C Σχήμα A1: Θερμογράφημα για την καθαρή Carvedilol. (f) (e) Heat flow W/g (d) (c) (b) (a) Θερμοκρασία / o C Σχήμα A2: Θερμογραφήματα για την Carvedilol (a), Crysmeb (b) και τα μίγματα τους φυσικό μίγμα (c), λειοτριβημένο μίγμα (d), μίγμα από συγκαταβύθιση (e) και λυοφιλοποιημένο μίγμα (f). 87

95 (f) (e) Heat Flow (W/g) (d) (c) (b) (a) Θερμοκρασία / o C Σχήμα A3: Θερμογραφήματα για την Carvedilol (a), HP-β-CD (b) και τα μίγματα τους: φυσικό μίγμα (c), λειοτριβημένο μίγμα (d), μίγμα από συγκαταβύθιση (e) και λυοφιλοποιημένο μίγμα (f). (f) (e) Heat flow (W/g) (d) (c) (b) (a) Θερμοκρασία / o C Σχήμα A4: Θερμογραφήματα για την Carvedilol (a), HP-γ-CD (b) και τα μίγματα τους: φυσικό μίγμα (c), λειοτριβημένο μίγμα (d), μίγμα από συγκαταβύθιση (e) και λυοφιλοποιημένο μίγμα (f). Στο Σχήμα ΣχήμαA2 απεικονίζονται τα θερμογραφήματα της καθαρής Carvedilol, της Crysmeb και των μιγμάτων τους που παρασκευάσθηκαν με απλή ανάμιξη (φυσικό μίγμα), με την μέθοδο της υγρής λειοτρίβησης (πάστας), με συγκαταβύθιση από κοινό διαλύτη και με λυοφιλοποίηση. Στο γράφημα αυτό, 88

96 παρατηρούμε ότι στα μίγματα που παρασκευάσθηκαν με απλή ανάμιξη και με την μέθοδο της υγρής λειοτρίβησης διακρίνεται η ενδόθερμη κορυφή της Carvedilol στους 114 C, που αντιστοιχεί στο σημείο τήξεως της καθαρής Carvedilol και αποτελεί ένδειξη για τον μη-σχηματισμό ένωσης έγκλεισης ανάμεσα στην Crysmeb και στην Carvedilol. Αντίθετα, στο μίγμα που παρασκευάσθηκε με την μέθοδο της συγκαταβύθισης δεν διακρίνεται η ενδόθερμη κορυφή που αντιστοιχεί στο σημείο τήξεως της Carvedilol και αποτελεί ένδειξη για τον σχηματισμό ένωσης έγκλεισης ανάμεσα στην Crysmeb και στην Carvedilol. Επίσης στο μίγμα που παρασκευάσθηκε με την μέθοδο της λυοφιλοποίησης δεν παρατηρήθηκε η ενδόθερμη κορυφή που αντιστοιχεί στο σημείο τήξεως της Carvedilol. Όμως η περιεκτικότητα της Carvedilol που προσδιορίσθηκε στο λυοφιλοποιημένο μίγμα ήταν 2% περίπου. Αυτό δείχνει ότι η μέθοδος της λυοφιλοποίησης έχει μικρή απόδοση στον σχηματισμό συμπλόκου ένωσης έγκλεισης ανάμεσα στην Carvedilol και την Crysmeb. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε όλα τα μίγματα η γραμμομοριακή αναλογία Crysmeb και Carvedilol εκτός από το λυοφιλοποιημένο μίγμα ήταν 1:1 ( 25.5% κ.β. Carvedilol). Ανάλογη εικόνα παρατηρήθηκε και στα στερεά μίγματα της Carvedilol με τις τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες HP-β-CD και HP-γ-CD που απεικονίζονται στα Σχήματα A3 και A4. Από την ανάλυση των θερμογραφημάτων διαπιστώθηκε ότι σύμπλοκα έγκλεισης ανάμεσα στην Carvedilol και όλες τις παραπάνω κυκλοδεξτρίνες παρασκευάσθηκαν μόνο με την μέθοδο της συγκαταβύθισης. Σε όλα τα στερεά που παρασκευάσθηκαν με την φυσική ανάμιξη των επιμέρους συστατικών και με την μέθοδο της υγρής λειοτρίβηνσης παρατηρήθηκε η ενδόθερμη κορυφή που αντιστοιχεί στο σημείο τήξεως της Carvedilol, ένδειξη για τον μη-σχηματισμό ένωσης έγκλεισης ανάμεσα στην Carvedilol και αυτές τις κυκλοδεξτρίνες. Επίσης η απόδοση σε σύμπλοκο έγκλεισης με την μέθοδο της λυοφιλοποίησης ήταν μικρή. Στην περίπτωση φυσικής κυκλοδεξτρίνης β-cd δεν παρασκευάσθηκε στερεό με την μέθοδο της συγκαταβύθισης αφού οι φυσικές κυκλοδεξτρίνες διαλύονται ελάχιστα σε απόλυτες αλκοόλες, ενώ σε υδατικά μίγματα τους με αλκοόλες η διαλυτότητα της Carvedilol είναι περιορισμένη. Στα στερεά που παρασκευάσθηκαν με τις άλλες δύο μεθόδους για την β-cd παρατηρήθηκε η ενδόθερμη κορυφή που αντιστοιχεί στο σημείο τήξεως της 89

97 Carvedilol, ένδειξη για τον μη-σχηματισμό ένωσης έγκλεισης ανάμεσα στην Carvedilol και στην β-cd. 3.2 Περίθλαση των ακτίνων-χ (XRD) Η κρυσταλλική μορφή της Carvedilol που χρησιμοποιήθηκε για όλα τα πειράματα της παρούσης εργασίας ήταν η Form-ΙI, της οποίας το αντίστοιχο φάσμα περίθλασης ακτίνων-χ απεικονίζεται στο Σχήμα A5. Οι κορυφές του φάσματος περίθλασης ακτίνων-χ συμπίπτουν με τις αντίστοιχες κορυφές της μορφής-ιι που δίνονται στην βιβλιογραφία και παρουσιάζονται στον Πίνακα Π1. Πρέπει να σημειωθεί ότι από τις κυκλοδεξτρίνες μόνο οι φυσικές κυκλοδεξτρίνες (α-, β- και γ-) είναι κρυσταλλικές. Στο Σχήμα A6, απεικονίζεται το φάσμα περίθλασης ακτίνων-χ για την β-κυκλοδεξτρίνη στο οποίο παρατηρούνται πολλές κορυφές. Αντίθετα οι τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες είναι στο σύνολο τους άμορφες. Στο Σχήμα A7 απεικονίζεται τα φάσματα περίθλασης ακτίνων-χ για την Crysmeb, HP-β-CD και HP-γ-CD στα οποία δεν υπάρχει καμία κορυφή ένδειλη του άμορφου χαρακτήρα των. Τα φάσματα περίθλασης ακτίνων-χ της Carvedilol και των κυκλοδεξτρινών που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία καθώς και των μιγμάτων που παρασκευάσθηκαν με τις τεχνικές που περιγράφονται στο πειραματικό μέρος παρουσιάζονται στα Σχήματα Α8, Α9 και Α10. Ένταση Σήματος Θ Σχήμα A5: Φάσμα περίθλασης ακτίνων-χ για την καθαρή Carvedilol Form-II. 90

98 Ένταση Σήματος Θ Σχήμα A6: Φάσμα περίθλασης ακτίνων-χ για την καθαρή β-κυκλοδεξτρίνη. Ένταση Σήματος HP-β-CD HP-γ-CD Crysmeb Θ Σχήμα A7: Φάσμα περίθλασης ακτίνων-χ για την Crysmeb, HP-β-CD και HP-γ-CD. 91

99 (f) (e) Ένταση Σήματος (d) (c) (b) Θ (a) Σχήμα A8: Φάσματα περίθλασης ακτίνων-χ για την Carvedilol (a), Crysmeb (b) και τα μίγματα τους φυσικό μίγμα (c), λειοτριβημένο μίγμα (d), μίγμα από συγκαταβύθιση (e) και λυοφιλοποιημένο μίγμα (f). (f) Ένταση Σήματος (e) (d) (c) (b) Θ (a) Σχήμα A9: Φάσματα περίθλασης ακτίνων-χ για την Carvedilol (a), HP-β-CD (b) και τα μίγματα τους φυσικό μίγμα (c), λειοτριβημένο μίγμα (d), μίγμα από συγκαταβύθιση (e) και λυοφιλοποιημένο μίγμα (f). 92

100 Στο Σχήμα A8 απεικονίζονται τα φάσματα περίθλασης ακτίνων-χ της καθαρής Carvedilol (καμπύλη a), της Crysmeb (καμπύλη b) και των μιγμάτων τους που παρασκευάσθηκαν με απλή ανάμιξη, με την μέθοδο της υγρής λειοτρίβηνσης, με συγκαταβύθιση των συστατικών και με λυοφιλοποίηση (καμπύλες c-f). Στο γράφημα αυτό, παρατηρούμε ότι στα μίγματα που παρασκευάσθηκαν με απλή ανάμιξη (καμπύλη c) και με την μέθοδο της υγρής λειοτρίβηνσης (καμπύλη d) διακρίνονται οι κύριες κορυφές της Carvedilol που αποτελεί ένδειξη για τον μησχηματισμό ένωσης έγκλεισης ανάμεσα στην Crysmeb και στην Carvedilol. Επίσης στα φάσματα περίθλασης ακτίνων-χ αυτών των μειγμάτων δεν διακρίνονται οι μικρότερες κορυφές λόγω αραίωσης με την κυκλοδεξτρίνη. Στο φάσμα του μίγματος που παρασκευάσθηκε με υγρή λειοτρίβηνση διακρίνονται ορισμένες επιπλέον κορυφές που πιθανότατα οφείλονται σε άλλη πολυμορφική φάση της Carvedilol η οποία σχηματίζεται. Στο μίγμα που παρασκευάσθηκε με την μέθοδο της συγκαταβύθισης (καμπύλη e) δεν παρατηρήθηκε καμία κορυφή της Carvedilol παρότι έχει την ίδια σύσταση με τα προηγούμενα μίγματα. Κατά συνέπεια η μέθοδος της συγκαταβύθισης οδηγεί στο σχηματισμό συμπλόκου έγκλεισης ανάμεσα στην Carvedilol και την Crysmeb. Επίσης, στο μίγμα που παρασκευάσθηκε με την μέθοδο της λυοφιλοποίησης (καμπύλη f) μόλις διακρίνονται οι κύριες κορυφές της Carvedilol αλλά και οι επιπλέον κορυφές που ανιχνεύθηκαν στο στερεό που παρασκευάσθηκε με την μέθοδο της λειοτρίβηνσης. Αυτό αποτελεί ένδειξη για τον μη-σχηματισμό ένωσης έγκλεισης ανάμεσα στην Crysmeb και στην Carvedilol με την μέθοδο της λυοφιλοποίησης. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε όλα τα μίγματα εκτός από το λυοφιλοποιημένο μίγμα η γραμμομοριακή αναλογία Crysmeb και Carvedilol ήταν 1:1 ( 25,5% κ.β.). Στο λυοφιλοποιημένο μίγμα η περιεκτικότητα σε Carvedilol ήταν περίπου 2%. Ανάλογη εικόνα παρατηρήθηκε και στα στερεά μίγματα της Carvedilol με τις τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες HP-β-CD και HP-γ-CD που απεικονίζονται στα Σχήματα A9 και A10. Στα Σχήματα A9 και A10, όπως και στο προηγούμενο, παρατηρούμε ότι στα μίγματα που παρασκευάσθηκαν με απλή ανάμιξη (καμπύλη c) και με την μέθοδο της υγρής λειοτρίβηνσης (καμπύλη d) διακρίνονται οι κύριες κορυφές της Carvedilol που αποτελεί ένδειξη για τον μη-σχηματισμό ένωσης 93

101 έγκλεισης ανάμεσα στις κυκλοδεξτρίνες HP-β-CD και HP-γ-CD και στην Carvedilol. Στο μίγμα που παρασκευάσθηκε με την μέθοδο της συγκαταβύθισης (καμπύλη e) παρουσιάζεται ανάλογη εικόνα όπως στην περίπτωση της Crysmeb. Έτσι και στις περιπτώσεις αυτές η μέθοδος της συγκαταβύθισης οδηγεί στον σχηματισμό ένωσης έγκλεισης. Αντίθετα, στο μίγμα που παρασκευάσθηκε με την μέθοδο της λυοφιλοποίησης (καμπύλη f) δεν διακρίνεται οι κύριες κορυφές και αποτελεί ένδειξη για τον σχηματισμό ένωσης έγκλεισης ανάμεσα στην Crysmeb και στην Carvedilol. Πρέπει να σημειωθεί ότι σε όλα τα μίγματα εκτός από το λυοφιλοποιημένο μίγμα η γραμμομοριακή αναλογία των κυκλοδεξτρινών HP-β-CD και HP-γ-CD και Carvedilol ήταν 1:1 ( 21,8 και 20,7% κ.β. αντίστοιχα). Στο λυοφιλοποιημένο μίγμα η περιεκτικότητα σε Carvedilol ήταν περίπου 1,8%. 3.3 Φασματοσκοπία Υπερύθρου Μετασχηματισμού Fourier Με την τεχνική της φασματοσκοπίας υπερύθρου μετασχηματισμού Fourier αποσβενυμένης ολικής ανακλαστικότητας (FTIR-ATR) προσπαθούμε να εντοπίσουμε τις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα τα μόρια της εγκλωβιζόμενης ένωσης και της κυκλοδεξτρίνης. Οι σημαντικότερες κορυφές απορρόφησης για την Carvedilol και την Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin παρουσιάζονται στούς Πίνακες A2 και A3 αντίστοιχα. Από τη σύγκριση των φασμάτων για τα μίγματα που παρασκευάσθηκαν και τα αντίστοιχα φάσματα των καθαρών συστατικών δεν παρατηρήθηκαν νέες κορυφές που αποτελεί ένδειξη για σχηματισμό νέων ομοιοπολικών ανάμεσα στα μόρια της Carvedilol και των κυκλοδεξτρινών που μελετήθηκαν. Συνεπώς οποιαδήποτε αλληλεπίδραση μπορεί να εντοπισθεί αφορά διαμοριακή αλληλεπίδραση ανάμεσα στα παραπάνω μόρια. Στο Σχήμα Α11 απεικονίζονται τα φάσματα FTIR-ATR που ελήφθησαν για τα μίγματα της Carvedilol με την HP-β-CD καθώς και τα φάσματα FTIR-ATR για την Carvedilol και την HP-β-CD. Από την εξέταση των φασμάτων διαπιστώθηκε αλληλεπίδραση ανάμεσα στα μόρια της Carvedilol και της HP-β-CD και συγκεκριμένα στο μίγμα που παρασκευάσθηκε με συγκαταβύθιση από κοινό διαλύτη. Η κορυφή της Carvedilol στα 3345cm -1 απουσιάζει στο μίγμα που παρασκευάσθηκε με συγκαταβύθιση ενώ παρατηρείται σε διαφορετικό βαθμό στο φυσικό μίγμα και στο μίγμα που παρασκευάσθηκε με λειοτρίβηνση. Αυτό δείχνει ότι ένα μέρος του μορίου της Carvedilol εισέρχεται στην 94

102 υδρόφοβη κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης με αποτέλεσμα να επηρεάζεται σημαντικά η αντίστοιχη δόνηση Ν-Η αλλά δεν είναι ξεκάθαρο με ποίο άτομο Ν της Carvedilol (Ν1 ή Ν2) αλληλεπιδρά η κυκλοδεξτρίνη. Πίνακας A2. Σημαντικότερες κορυφές απορρόφησης της Carvedilol στο φάσμα υπερύθρου Μήκος Κύματος / cm -1 Είδος δεσμού και δόνησης 3411 Δεσμός Ο-Η, δόνηση τάσης 3345 Δεσμός Ν-Η, δόνηση τάσης 2922, 2852 Αλειφατικοί δεσμοί C-H, δόνηση τάσης Δεσμοί C-H σε αρωματικό δακτύλιο, δόνηση τάσης, μικρής έντασης 1608, 1503, 1454 Δεσμοί C=C σε αρωματικό δακτύλιο, δόνηση τάσης 1591 Δεσμός Ν-Η, δόνηση κάμψης 1253 Δεσμός C-Ν σε αρωματικό δακτύλιο, δόνηση τάσης 1215 Δεσμός C-Ο, δόνηση τάσης Πίνακας A3. Σημαντικότερες κορυφές απορρόφησης της Hydroxypropyl-β- Cyclodextrin στο φάσμα υπερύθρου Μήκος Κύματος / cm -1 Είδος δεσμού και δόνησης 3411 Πρωτοταγείς και Δευτεροταγείς Δεσμοί Ο-Η, δόνηση τάσης 2926 Δεσμοί C-H σε ομάδες CH και CH2, δόνηση valence 1635 Δεσμοί Ο-Η στα μόρια του νερού*, δόνηση παραμόρφωσης 1414, 1378 Δεσμοί C-H σε πρωτοταγείς και δευτεροταγείς υδροξυλομάδες, δόνηση deformation 1156 Δεσμοί C-C, δόνηση τάσης 1082, 1035 Δεσμός C-O σε υδροξυλομάδες και αιθερομάδες, δόνηση valence Δεσμός C-Η, δόνηση παραμόρφωσης 95

103 (e) (d) % Διαπερατότητα (c) (b) (a) Κυματαριθμός / cm -1 Σχήμα A11: Φάσματα FTIR-ATR για την Carvedilol (a), HP-β-CD (b) και τα μίγματα τους φυσικό μίγμα (c), λειοτριβημένο μίγμα (d) και μίγμα από συγκαταβύθιση (e). 3.4 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) Επίσης τα στερεά μίγματα που παρασκευάσθηκαν με τις προαναφερθείσες τεχνικές μελετήθηκαν με την βοήθεια της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης. Οι φωτογραφίες των στερεών μειγμάτων της Carvedilol με την Crysmeb και των καθαρών συστατικών τους (Carvedilol και Crysmeb) που ελήφθησαν με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης παρουσιάζονται στα Σχήματα Α12 και Α13. Η μεγέθυνση κάθε εικόνας αναφέρεται στην αντίστοιχη παρένθεση. Σχήμα Α12: Εικόνες της Carvedilol (x243) και της Crysmeb (x636) που ελήφθησαν με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης. 96

104 Από τις εικόνες των καθαρών συστατικών που ελήφθησαν παρατηρούμε την μορφολογία των κρυστάλλων της Carvedilol καθώς και την μορφολογία των σφαιρικών σχηματισμών της Crysmeb. Στην εικόνα του φυσικού μίγματος παρατηρούμε τους κρυστάλλους της Carvedilol καθώς και την χαρακτηριστική μορφολογία της Crysmeb. Αυτό αποτελεί απόδειξη για τον μη σχηματισμό ένωσης έγκλεισης ανάμεσα στα δύο συστατικά κατά την απλή ανάμιξη τους. Στην εικόνα του λειοτριβημένου μίγματος παρατηρούμε τους κρυστάλλους της Carvedilol ενώ απουσιάζει η χαρακτηριστική μορφολογία της Crysmeb. Η απουσία της χαρακτηριστικής μορφολογίας των επιμέρους καθαρών συστατικών οφείλεται στην χρήση του διαλύτη (υδατικού διαλύματος αιθανόλης 50%) που προκάλεσε μερική διαλυτοποίηση της Carvedilol αλλά σχεδόν πλήρη διαλυτοποίηση της Crysmeb. Σε συνδυασμό με τις προηγούμενες τεχνικές η μορφολογία αυτή δεν αντιστοιχεί σε ένωση έγκλεισης ανάμεσα στην Carvedilol και την Crysmeb.Επίσης στα μίγματα που παρασκευάσθηκαν με τις τεχνικές της συγκαταβύθισης και της λυοφιλοποίησης παρατηρούμε μία τελείως διαφορετική μορφολογία που δεν μοιάζει με την μορφολογία κανενός από τα δύο επιμέρους συστατικά. Εντούτοις, μόνο στην περίπτωση των μιγμάτων που παρασκευάσθηκαν με την μέθοδο της συγκαταβύθισης σχηματίζεται ένωση έγκλεισης ανάμεσα στην Carvedilol και την Crysmeb με βάση τις τεχνικές DSC και XRD. Συμπερασματικά, η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης δεν μπορεί να δώσει ασφαλή συμπεράσματα από μόνη της για τον σχηματισμό ή όχι ένωσης έγκλεισης ανάμεσα στην Carvedilol και τις κυκλοδεξτρίνες αλλά σε συνδυασμό με άλλες αναλυτικές τεχνικές όπως DSC και XRD στην παρούσα περίπτωση. 97

105 A B Γ Δ Σχήμα Α13: Εικόνες των στερεών μιγμάτων της Carvedilol και της Crysmeb που ελήφθησαν με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης. Α : Φυσικό μίγμα (x106), Β: Λειοτριβημένο μίγμα (x238), Γ : Μίγμα από συγκαταβύθιση με στοιχειομετρική αναλογία 1:1 (x303) και Δ: Λυοφιλοποιημένο μίγμα (x293). 3.5 Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) Με την τεχνική NMR προσπαθούμε να εντοπίσουμε την γεωμετρία του σχηματιζόμενου συμπλόκου έγκλεισης και συγκεκριμένα ποία πλευρά του μορίου της Carvedilol εισέρχεται στην υδρόφοβη κοιλότητα των κυκλοδεξτρινών. Είναι γνωστό ότι το μόριο της Carvedilol δεν μπορεί να εισέλθει ολόκληρο στην κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης λόγω του μεγέθους του. Για να προσδιορίσουμε το τμήμα του μορίου της Carvedilol που εισέρχεται στην κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης πρέπει να συγκρίνουμε τις τιμές των χημικών μετατοπίσεων των πρωτονίων της Carvedilol 98