ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΟΠΩΡΟΚΗΠΕΥΤΙΚΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΟΠΩΡΟΚΗΠΕΥΤΙΚΩΝ ΑΛΕΞΑΝ ΡΟΣ ΠΑΠΑΧΡΙΣΤΟΦΟΡΟΥ Πτυχιούχος Γεωπόνος Η ΑΜΥΝΤΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΤΗΣ ΚΥΠΡΙΑΚΗΣ ΜΕΛΙΣΣΑΣ Apis mellifera cypria ΑΠΕΝΑΝΤΙ ΣΤΗ ΣΦΗΚΑ Vespa orientalis Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 ΑΛΕΞΑΝ ΡΟΣ ΠΑΠΑΧΡΙΣΤΟΦΟΡΟΥ Η ΑΜΥΝΤΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΤΗΣ ΚΥΠΡΙΑΚΗΣ ΜΕΛΙΣΣΑΣ Apis mellifera cypria ΑΠΕΝΑΝΤΙ ΣΤΗ ΣΦΗΚΑ Vespa orientalis Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στη Γεωπονική Σχολή Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Ειδίκευσης Επιστήμης Οπωροκηπευτικών Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: 1 Απριλίου 2008 Εξεταστική Επιτροπή Καθηγητής Ανδρέας Θρασυβούλου, Επιβλέπων Καθηγητής Γεώργιος Θεοφιλίδης, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Αν. Καθ. Πασχάλης Χαριζάνης, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγήτρια ήμητρα Προφήτου-Αθανασιάδου, Εξεταστής Καθηγητής Βύρων Κατσόγιαννος, Εξεταστής Καθηγήτρια Ματθίλδη Σαββοπούλου-Σουλτάνη, Εξεταστής Αν. Καθηγητής Νικόλαος Παπαδόπουλος, Εξεταστής ii

3 Στους: Ελένη, Χριστάκη, Γιώτα και Ιάσονα iii

4 Αλέξανδρος Παπαχριστοφόρου Α.Π.Θ. Η ΑΜΥΝΤΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΤΗΣ ΚΥΠΡΙΑΚΗΣ ΜΕΛΙΣΣΑΣ Apis mellifera cypria ΑΠΕΝΑΝΤΙ ΣΤΗ ΣΦΗΚΑ Vespa orientalis ISBN «Η έγκριση της παρούσης ιδακτορικής ιατριβής από τη Σχολή Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν.5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2) iv

5 Πρόλογος Κατά τη διάρκεια κάποιων αρχικών μελετών και παρατηρήσεων σε μελίσσια στην Κύπρο τον Ιούνιο του 2004, υπήρξαν ενδείξεις πως οι μέλισσες που αντιμετώπιζαν επιθέσεις από την ανατολίτικη σφήκα Vespa orientalis, εκδήλωναν μία ξεχωριστή και ενδιαφέρουσα αμυντική συμπεριφορά. Ερευνητές από το Εργαστήριο Εξέλιξης, Γονιδιώματος και ιαφοροποίησης των Ειδών (L.E.G.S.) του Εθνικού Κέντρου Επιστημονικών Ερευνών της Γαλλίας (C.N.R.S.), με τους οποίους είχα την τύχη να συνεργαστώ και στο παρελθόν, εκτίμησαν πως η μελέτη τη συμπεριφοράς (αλλά και του γονιδιώματος) της κυπριακής μέλισσας Apis mellifera cypria θα ήταν μία έρευνα που θα παρουσίαζε ιδιαίτερο επιστημονικό ενδιαφέρον και ζήτησαν τη συνεργασία μου για την κατάρτιση ενός προγράμματος διακρατικής συνεργασίας μεταξύ Γαλλίας και Κύπρου. Με τη βοήθεια του Ινστιτούτου Γεωργικών Ερευνών της Κύπρου, εγκρίθηκε ένα διετές πρόγραμμα που χρηματοδοτήθηκε μερικώς από το Ίδρυμα Προώθησης Έρευνας της Κύπρου και το Γαλλικό ίδρυμα υποτροφιών Egide. Η χρηματοδότηση μέσω του προγράμματος, επέτρεψε την πραγματοποίηση ταξιδιών στην Κύπρο και τη Γαλλία, και αποτέλεσε την αρχή της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Πέρα από το ενδιαφέρον και την πρωτοτυπία που παρουσίαζε το συγκεκριμένο θέμα, στην επιλογή του συνέβαλε και ο ιδιαίτερος δεσμός με τον τόπο καταγωγής μου, την Κύπρο, ενδιαίτημα της κυπριακής μέλισσας, μίας αυτόχθονης φυλής η οποία ελάχιστα έχει μελετηθεί. θα ήθελα να μνημονεύσω και να ευχαριστήσω προσωπικά αρκετά άτομα, τα οποία σε μικρό ή μεγάλο βαθμό, βοήθησαν στο να καταφέρω να πραγματοποιήσω την ερευνά και τη συγγραφή της παρούσας εργασίας: Πρώτα και κύρια θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα της εργασίας, καθηγητή Μελισσοκομίας κ. Ανδρέα Θρασυβούλου, που εδώ και 10 χρόνια υπήρξε αστείρευτη πηγή γνώσης και παροχή βοήθειας, η οποία ξεκίνησε με την πρώτη επαφή και γνωριμία μου με τον κόσμο της μέλισσας και ολοκληρώθηκε με την επίβλεψη της διδακτορικής διατριβής. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής για την επίβλεψη και τις χρήσιμες υποδείξεις, τους καθηγητές κ. Πασχάλη Χαριζάνη και κ. Γεώργιο Θεοφιλίδη. Ειδικά οι γνώσεις του κ. Θεοφιλίδη στο πειραματικό κομμάτι μέρους του διδακτορικού, υπήρξε πολύτιμη. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την κ. Γεωργία Ζαφειρίδου από το Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων του τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. για τη βοήθεια κατά τη διάρκεια των v

6 εργαστηριακών πειραμάτων και τον κ. Ιωάννη Ιωαννίδη και κ. Νίκο Σεραφίδη του Ινστιτούτου Γεωργικών Ερευνών της Κύπρου, για την παροχή εξοπλισμού και την συμβολή τους στην κατάρτιση του προγράμματος διακρατικής συνεργασίας Γαλλίας-Κύπρου. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την κ. Ελευθερία Φελεκίδου, για την έμμεση αλλά σημαντική συμβολή της κατά τη διάρκεια της συγγραφής του διδακτορικού. Επίσης, θερμές ευχαριστίες στον κ. Γεώργιο Γεροντάκη για τη ποικιλόμορφη και σημαντικότατη στήριξή του και την ιδιαίτερη φιλία του. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στους δύο Κύπριους μελισσοκόμους τον κ. Γιαννάκη Βαρνάβα και τον κ. Γεώργιο Καλλένο (και γενικότερα στην Παγκύπρια Ομοσπονδία Μελισσοκόμων) για την αμέριστη βοήθεια μέσω της παραχώρησης των μελισσοκομείων τους για την πραγματοποίηση των πειραμάτων. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω τον κ. Εμμανουήλ Φιλίππου για τη συνεργασία στη φωτογράφηση των πειραμάτων, τους κ.κ. Jérôme Truiller και Μax Watkins της Vita-Europe Ltd για την συνεργασία και τη στήριξή τους τα τελευταία έξι χρόνια, τον κ. Jérôme Sueur του Εθνικού Μουσείου Φυσικής Ιστορίας της Γαλλίας για τη βοήθεια στην ανάλυση των ήχων των μελισσών, τον κ. Lionel Garnery του Εργαστηρίου Εξέλιξης, Γονιδιώματος και ιαφοροποίησης των Ειδών (L.E.G.S.) του Εθνικού Κέντρου Επιστημονικών Ερευνών της Γαλλίας (C.N.R.S.), για την εκπαίδευση και τη βοήθεια κατά την ανάλυση του γενετικού υλικού των κυπριακών μελισσών και τον καθηγητή κ. Jacob Ishay, ειδικό στην ανατομία, μορφολογία και βιολογία της Vespa orientalis, για την επικοινωνία και τις χρήσιμες συμβουλές του. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα δύο άτομα που συνέβαλαν περισσότερο από κάθε άλλο στην πραγματοποίηση της διδακτορικής μου διατριβής: Πρόκειται για τους ερευνητές και φίλους του Εργαστηρίου Εξέλιξης, Γονιδιώματος και ιαφοροποίησης των Ειδών (L.E.G.S.) του Εθνικού Κέντρου Επιστημονικών Ερευνών της Γαλλίας (C.N.R.S.), την κ. Agnès Rortais και τον κ. Gérard Arnold. Χωρίς τη δικιά τους πολύτιμη συνεργασία, βοήθεια και συμπαράσταση, η μελέτη της αμυντικής συμπεριφοράς της κυπριακής μέλισσας Apis mellifera cypria απέναντι στη σφήκα Vespa orientalis, δε θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί. vi

7 Συντμήσεις bp: base pair(s). Μονάδα μέτρησης γονιδιώματος που βασίζεται στον αριθμό των ζευγών βάσεων του DNA Hz: Hertz. Μονάδα μέτρησης της συχνότητας. Εκφράζεται ως ο λόγος των κύκλων/δευτερόλεπτο Log: Λογάριθμος P: pixel. Εικονοστοιχείο (Σύντμηση για picture element) rpm: Κύκλοι ανά λεπτό (rounds per minute) t: χρόνος vii

8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος Συντμήσεις. Περιεχόμενα... Περίληψη Summary iv vi vii ix xi Γενική Εισαγωγή. 1 Κυπριακή μέλισσα: Μελέτη της ετήσιας ανάπτυξης του μελισσιού και του γονιδιώματος... 3 Μεθοδολογία. 4 Παρακολούθηση της ετήσιας ανάπτυξης κυπριακών μελισσιών... 4 Ανάλυση DNA Κυπριακών μελισσών. 4 Αποτελέσματα-συζήτηση... 9 Παρακολούθηση της ετήσιας ανάπτυξης κυπριακών μελισσιών Ανάλυση DNA Κυπριακών μελισσών. 15 Συμπεριφορά των μελισσιών κατά την αντιμετώπιση επιτιθέμενης σφήκας 21 Μεθοδολογία Προσομοίωση επιθέσεων με παγιδευμένες σφήκες-κίνηση αμυνομένων μελισσών Προσδιορισμός του ρόλου των φραγμάτων πρόπολης στις εισόδους των κυψελών, στην εκδήλωση αμυντικής συμπεριφοράς Προσομοίωση επιθέσεων με μοντέλα σφηκών Παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της αμυντικής συμπεριφοράς.. 29 Αποτελέσματα-συζήτηση Προσομοίωση επιθέσεων με παγιδευμένες σφήκες-κίνηση αμυνομένων μελισσών Προσδιορισμός του ρόλου των φραγμάτων πρόπολης στις εισόδους των κυψελών, στην εκδήλωση αμυντικής συμπεριφοράς Παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της αμυντικής συμπεριφοράς Προσομοίωση επιθέσεων με μοντέλα σφηκών. 56 Η θανάτωση της σφήκας-πρόκληση ασφυξίας στον εισβολέα Μεθοδολογία Προσδιορισμός της θερμοκρασίας στον πυρήνα της σφαίρας viii

9 Χρόνος θανάτωσης των σφηκών στη θερμοκρασία της σφαίρας Προσδιορισμός του ανώτατου ορίου θνησιμότητας. 63 Μελέτη της συμπεριφοράς των εργατριών που σχηματίζουν τη σφαίρα.. 63 Χρόνος θανάτωσης των σφηκών σε ατμόσφαιρα 20% CO Μελέτη της μορφολογίας των αναπνευστικών στιγμάτων της σφήκας. 64 Προσομοίωση της συμπεριφοράς των μελισσών στο εργαστήριο-μελέτη του αναπνευστικού ρυθμού της σφήκας.. ιερεύνηση του χρόνου θανάτωσης της σφήκας με τους κοιλιακού τεργίτες ανοικτούς Αποτελέσματα-Συζήτηση 69 Προσδιορισμός της θερμοκρασίας στον πυρήνα της σφαίρας Χρόνος θανάτωσης των σφηκών στη θερμοκρασία της σφαίρας. 69 Προσδιορισμός του ανώτατου ορίου θνησιμότητας. 70 Μελέτη της συμπεριφοράς των εργατριών που σχηματίζουν τη σφαίρα.. 70 Χρόνος θανάτωσης των σφηκών σε ατμόσφαιρα 20% CO Μελέτη της μορφολογίας των αναπνευστικών στιγμάτων της σφήκας. 74 Προσομοίωση της συμπεριφοράς των μελισσών στο εργαστήριο-μελέτη του αναπνευστικού ρυθμού της σφήκας.. ιερεύνηση του χρόνου θανάτωσης της σφήκας με τους κοιλιακού τεργίτες ανοικτούς Ήχος Αμυνομένων μελισσών. 83 Μεθοδολογία Καταγραφή των ήχων σε μορφή MP3 85 Καταγραφή των ήχων σε μορφή WAV Τεχνητή αναπαραγωγή των ήχων και μελέτη της επίδρασης στη συμπεριφορά των μελισσών.. 88 Αποτελέσματα-Συζήτηση Καταγραφή των ήχων σε μορφή MP3 89 Καταγραφή των ήχων σε μορφή WAV Τεχνητή αναπαραγωγή των ήχων και μελέτη της επίδρασης στη συμπεριφορά των μελισσών Γενικά συμπεράσματα.. 98 Βιβλιογραφία Παράρτημα ix

10 Περίληψη Η μέλισσα της Κύπρου Apis mellifera cypria παρουσιάζει ιδιαίτερα χαρακτηριστικά κατά την άμυνά της απέναντι στον κύριο εχθρό της, τη σφήκα Vespa orientalis. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η συμπεριφορά της κυπριακής μέλισσας κατά τη διάρκεια φυσικών και τεχνητών επιθέσεων σφηκών. Αρχικά πραγματοποιήθηκαν γενετικοί έλεγχοι και καταγράφηκε η ετήσια ανάπτυξη των κυπριακών μελισσιών. Η ανάλυση μιτοχονδριακού και μικρο-δορυφορικού DNA έδειξε ότι ο πληθυσμός της κυπριακής μέλισσας παραμένει ομοιογενής και αντιπροσωπευτικός στο μεγαλύτερο μέρος του νησιού. Η ετήσια ανάπτυξη είναι επίσης χαρακτηριστική (μέγιστο το Μάιο και ελάχιστο τον Αύγουστο) και διαφέρει από άλλες φυλές της Apis mellifera. Στη συνέχεια, αναλύθηκε ο τρόπος που αμύνεται το κάθε μελίσσι κατά την επίθεση της σφήκας, ο τρόπος θανάτωσης των επιτιθέμενων σφηκών από τις μέλισσες και ο ήχος που παράγουν οι αμυνόμενες εργάτριες. Η ανάλυση του τρόπου που αμύνεται το κάθε μελίσσι έδειξε πως υπάρχουν δύο διακριτές και αντίθετες μορφές άμυνας. Κατά την προσέγγιση της επιτιθέμενης σφήκας, οι εργάτριες κάποιων μελισσιών απέφευγαν τη σύγκρουση με τον εισβολέα οπισθοχωρώντας προς το εσωτερικό της κυψέλης. Αντίθετα, ένα άλλο μέρος των μελισσιών παρουσίαζε μία συμπεριφορά επίθεσης : Οι μέλισσες κινούνταν προς τη σφήκα και συμπλέκονταν μαζικά σε περίπτωση που αυτή προσπαθούσε να πιάσει κάποια μέλισσα. Βρέθηκε πως οι δύο μορφές συμπεριφοράς σχετίζονται με τη μορφή των φραγμάτων πρόπολης που δημιουργούν οι μέλισσες στην είσοδο κάθε μελισσιού. Η ανάλυση του τρόπου με τον οποίο οι μέλισσες θανατώνουν μία σφήκα, έδειξε πως χρησιμοποιούν έναν άγνωστο μέχρι τώρα μηχανισμό: Κουβαριάζουν τη σφήκα σε μία σφαίρα x

11 μελισσών και μέσω της ακινητοποίησης των κοιλιακών της άρθρων, παρεμποδίζουν την λειτουργία του αναπνευστικού συστήματος, προκαλώντας της μ αυτόν τον τρόπο ασφυξία. Κατά τις επιθέσεις των σφηκών, παραγόταν από τις αμυνόμενες μέλισσες ένας χαρακτηριστικός, οξύς ήχος. Καταγράφηκε ένας μεγάλος αριθμός ήχων οι οποίοι αναλύθηκαν με τη χρήση κατάλληλων λογισμικών. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως, τόσο οι κυρίαρχες συχνότητές τους όσο και το εύρος των αρμονικών από τις οποίες αποτελούνται, είναι ιδιαίτερα ψηλές και βρίσκονται εκτός του φάσματος αντίστοιχων συχνοτήτων που έχουν καταγραφεί σε άλλες φυλές της δυτικής μέλισσας αλλά και σε άλλα είδη κοινωνικών μελισσών. Tα πιο πάνω αποτελέσματα καταδεικνύουν πως η ιδιαίτερη αμυντική συμπεριφορά της κυπριακής μέλισσας διαφέρει σε σημαντικό βαθμό σε σχέση με άλλες φυλές μελισσών. xi

12 Summary In the present work, several characteristics of the Cyprian honeybee Apis mellifera cypria were examined, with particular emphasis on its defensive behaviour during natural or simulated attacks by its main enemy, the oriental hornet. Firstly, genetic analyses using mitochondrial and microsatellite DNA were performed and showed that in a large part of the island, the Cyprus honeybee population is genetically homogeneous. Regarding the growth of colonies over the year, the maximum growth was observed in May and the minimum in August, and this characteristic pattern differs from that of other subspecies. Next, the defensive behaviour of individual colonies against hornets, the way honeybees kill invading hornets and the sound produced by defending workers, were investigated in detail. Analysis of data collected, showed two different patens of defensive behaviour by individual colonies. When attacking hornets approached the hive, defending workers in certain colonies avoided confrontation with the enemy and retreated inside the hive, while in other colonies, defending honeybees moved towards the hornet and massively attacked it if it tried to catch and kill a honeybee. It was observed, that the two types of defensive behaviour were related to the form of propolis barrier erected at the entrance of the hive. An up to now unknown mechanism by which Cyprus honeybees kill an attacking hornet was revealed after careful examination and analysis of data collected: 50 to 250 workers, cluster around the hornet forming a ball and by immobilizing the abdominal segments, they block the respiratory process causing asphyxiation. xii

13 Defending honeybees produced a very sharp sound (hissing) when attacked by hornets. This sound was recorded in numerous cases and analysed using appropriate software. The results showed that both the dominant frequencies and the amplitude of constituting harmonics were extremely high and beyond the spectrum of respective frequencies recorded for other western honeybee subspecies or for other species of social bees. Collectively, the above results showed the special defensive behaviour of the Cyprus honeybee, a behaviour which is quite different from other subspecies. xiii

14 ΓΕΝΙΚΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά τις τελευταίες δεκαετίες, υπάρχει ένα αυξημένο ερευνητικό ενδιαφέρον για είδη και κυρίως, για φυλές μελισσών που ενδημούν σε ιδιαίτερα περιβάλλοντα, όπως νησιά τα οποία βρίσκονται σε σχετική γεωγραφική απομόνωση. Ιδιαίτερα οι μέλισσες που βρίσκονται σε νησιά της Μεσογείου, όπως η Κρήτη, η Σικελία, η Μάλτα, η Κορσική και οι Βαλεαρίδες, έχουν γίνει αντικείμενο μελέτης τόσο ως προς τη μορφολογία και τη γενετική σύστασή τους όσο και προς τη βιολογία και τη συμπεριφορά τους (Ruttner, 1980; Badino et al., 1985; Sheppard et al., 1997; De la Rúa et al., 2001; De la Rúa et al., 2003). Εξαίρεση αποτελεί η κυπριακή μέλισσα Apis mellifera cypria (Pollman, 1879), μία φυλή μελισσών η οποία δεν έχει μελετηθεί παρά ελάχιστα. Αποσπασματικές αναφορές μπορούν να βρεθούν σε διάφορα συγγράμματα (Butler, 1954; Morse, 1978; Adams, 1983; Ruttner et al., 1978; Ruttner, 1988; Bouga et al., 2005). Όλες οι πιο πάνω εργασίες δεν αφορούν αποκλειστικά στην κυπριακή μέλισσα αλλά αφορούν γενικότερα στη μορφολογία και στη γενετική όλων των ευρωπαϊκών φυλών ή δεν αναφέρουν καν αποτελέσματα έρευνας αλλά κυρίως αποτελέσματα παρατηρήσεων. Παρά τις ολιγάριθμες αναφορές, ιδιαίτερη σημασία δίνεται στην αμυντική συμπεριφορά που εκδηλώνει η κυπριακή μελίσσα απέναντι στη σφήκα Vespa orientalis (Butler, 1954; Morse, 1978). Αναφέρονται παρατηρήσεις για τη δημιουργία του φαινόμενου της κουρτίνας (curtain phenomenon) μπροστά στις εισόδους των μελισσιών καθώς και για την παραγωγή ενός πολύ ιδιάζοντος σφυρικτού ήχου (very peculiar hissing sound) που παράγεται από τις εργάτριες όταν αυτές αντιμετωπίζουν τη V. orientalis. Η V.orientalis (ανατολίτικη σφήκα) αποτελεί τον κύριο εχθρό της κυπριακής μέλισσας. Πρόκειται για ένα μεγαλόσωμο, σαρκοφάγο έντομο το οποίο διαθέτει ισχυρά σαγόνια και πολύ σκληρό εξωσκελετό που λειτουργεί ως θωράκιση. Η περιοχή εξάπλωσης της συγκεκριμένης σφήκας περιλαμβάνει μερικές από τις θερμότερες και ξηρότερες περιοχές του πλανήτη (Archer, 1998). Οι συνθήκες που επικρατούν στην Κύπρο, επιτρέπουν τη διαβίωση της V.orientalis στο νησί και ευνοούν την ανάπτυξη μεγάλων πληθυσμών, κυρίως κατά το καλοκαίρι και τους φθινοπωρινούς μήνες. Ιδιαίτερα κατά την περίοδο μεταξύ του Ιουλίου και του Οκτωβρίου, τα μελίσσια αποτελούν την κύρια πηγή τροφής για τις σφήκες λόγω της ύπαρξης πρωτεϊνών (μέλισσες) που απαιτούνται για την εκτροφή του γόνου το καλοκαίρι και υδατανθράκων (μέλι) που απαιτούνται το φθινόπωρο, πριν τη διάλυση των κοινωνιών των σφηκών και τη διαχείμαση των βασιλισσών τους. Η μελέτη της αμυντικής συμπεριφοράς των μελισσών ενάντια στις σφήκες είναι ένα πεδίο έρευνας στο οποίο αποδίδεται ιδιαίτερη σημασία τα τελευταία χρόνια, όπως και κάθε 1

15 μελισσοκομικός εχθρός ή ασθένεια, γεγονός που οφείλεται και στο γενικότερο ενδιαφέρον και την προσοχή που δείχνει η επιστημονική κοινότητα στη μέλισσα, έχοντας αναγνωρίσει το σημαντικότατο ρόλο της στην επικονίαση, στη βιοπικοιλότητα και στη διατήρηση της περιβαλλοντολογικής ισορροπίας του πλανήτη. Η αντιμετώπιση των σφηκών και κυρίως των ειδών Vespa από τις μέλισσες, απαιτεί ξεχωριστή άμυνα, η οποία εκδηλώνεται με εξειδικευμένες τεχνικές, μιας και είναι αδύνατη η χρήση του κυριότερου αμυντικού όπλου, του μηχανισμού του κεντριού. Η πρόσφατη εισαγωγή της ασιατικής σφήκας (Vespa velutina) στη νότια Γαλλία (Villemant et al., 2006), έχει δημιουργήσει έντονο προβληματισμό και συναγερμό στους σχετικούς επιστήμονες. Η Ασιατική σφήκα βρήκε συνθήκες που της επιτρέπουν να αναπτυχθεί στα Μεσογειακά παράλια της Γαλλίας αλλά ταυτόχρονα βρήκε και ένα θήραμα, τη ντόπια μέλισσα, η οποία αδυνατεί να αντιμετωπίσει το νέο εισβολέα, λόγω του ότι δεν είχε το χρόνο να προσαρμοστεί μέσα από αιώνες συνεξέλιξης στην ίδια γεωγραφική περιοχή. Ως αποτέλεσμα, εκατοντάδες μελίσσια καταστράφηκαν κατά τα πρώτα δύο χρόνια της εισβολής της ασιατικής σφήκας στη Γαλλία. Αντίστοιχη εισαγωγή αναφέρθηκε πριν ελάχιστους μήνες στο Μεξικό, όπου σε μία τουριστική περιοχή, εντοπίστηκε η ανατολίτικη σφήκα, V. orientalis (Dvorak, 2006), προκαλώντας την έντονη ανησυχία τόσο για τη μελισσοκομία όσο και για τη διατάραξη της οικολογικής ισορροπίας στην περιοχή. Πιθανότατα, στο μέλλον οι φυλές της δυτικής μέλισσας Apis mellifera θα αντιμετωπίσουν την εισβολή σφηκών τις οποίες μέχρι σήμερα δεν γνώριζαν. Για παράδειγμα, η αύξηση της θερμοκρασίας σε παγκόσμιο επίπεδο, θα μπορούσε να προκαλέσει τον εποικισμό βορειότερων περιοχών της Ελλάδας από τη σφήκα V. orientalis, η οποία για την ώρα απαντάται στα νησιά του νοτίου και κεντρικού Αιγαίου, στην Πελοπόννησο και στη Στερεά Ελλάδα. Η μελέτη της αμυντικής συμπεριφοράς των μελισσών στις περιοχές που αυτές συνυπάρχουν με τους εχθρούς τους και συνεξελίσσονται, αλληλεπιδρώντας μέσω της σχέσης θηρευτή-θηράματος, θα μπορούσε να προσφέρει πολύτιμα στοιχεία στις γνώσεις μας και να βοηθήσει στην εφαρμογή χειρισμών που θα ελαχιστοποιούσαν τις ζημιές σε ενδεχόμενη εισβολή. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε αρχικά η ανάπτυξη των κυπριακών μελισσιών στη διάρκεια του έτους και η γενετική σύσταση των κυπριακών μελισσιών. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η αμυντική συμπεριφορά απέναντι στις επιθέσεις των σφηκών και το πώς εκδηλώνεται αυτή η συμπεριφορά σε σχέση με την εποχή και τη μαζικότητα των επιθέσεων. Μελετήθηκαν επίσης κάποιες ιδιαιτερότητες που παρουσιάζει η συγκεκριμένη αμυντική συμπεριφορά, όπως ο τρόπος θανάτωσης των σφηκών κατά τη συμπλοκή με αμυνόμενες μέλισσες και η ακουστική επικοινωνία κατά την άμυνα. 2

16 ΚΥΠΡΙΑΚΗ ΜΕΛΙΣΣΑ: ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΤΗΣΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΜΕΛΙΣΣΙΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η κυπριακή μέλισσα Apis mellifera cypria είναι μία φυλή που δεν έχει μελετηθεί εκτενώς. Πέρα από τις περιγραφές του Brother Adams (Adams, 1983), και τις κλασσικές μελέτες του Ruttner (Ruttner et al., 1978; Ruttner, 1988), ελάχιστα άρθρα ή επιστημονικές εργασίες έχουν δημοσιευθεί σε σχέση με τη βιολογία και τη συμπεριφορά της κυπριακής μέλισσας. Ο βιολογικός κύκλος των κυπριακών μελισσιών και η ανάπτυξή τους στη διάρκεια του έτους, είναι χαρακτηριστικά για τα οποία δεν υπάρχουν επίσης στοιχεία από έρευνες ή καταγραφές. Τέτοια στοιχεία θα ήταν χρήσιμα για την κατανόηση πολλών ιδιαιτεροτήτων της κυπριακής φυλής μελισσών, συμπεριλαμβανομένης και της αμυντικής συμπεριφοράς, με δεδομένο το γεγονός ότι η A.m. cypria ενδημεί σε ένα ιδιαίτερο, θερμοξηρικό περιβάλλον το οποίο χαρακτηρίζεται αντίστοιχα από ιδιαίτερη μελισσοκομική χλωρίδα. Ομοίως, η γενετική δομή της κυπριακής μέλισσας δεν έχει μελετηθεί παρά σε ελάχιστες εργασίες (Bouga et al., 2005). Τα τελευταία χρόνια το DNA των διαφορετικών φυλών μελισσών, αποτελεί αντικείμενο ανάλυσης, μέσω της χρήση μοριακών δεικτών, με κυριότερους το μιτοχονδριακό DNA (mt-dna) και το μικροδορυφορικό DNA (ms-dna). Τα μιτοχόνδρια είναι μικρά κυλινδρικά ενδοκυτταρικά οργανίδια, τα οποία επιτελούν το ρόλο ενεργειακής πηγής για το κύτταρο. ιαθέτουν δικό τους DNA και το DNA αυτό μεταβιβάζεται από τις μητέρες στους απογόνους τους. Στους αρσενικούς απογόνους η αλυσίδα σταματά. Η ανάλυση του mt-dna, τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιείται ευρύτατα στη μέλισσα και κυρίως στη φυλογενετική των μελισσών, έχοντας προσφέρει στην κατανόηση της προέλευσης των διαφορετικών ειδών και στο διαχωρισμό των διαφορετικών φυλών των ειδών, κυρίως της ευρωπαϊκής μέλισσας Apis mellifera. Επιπλέον, έχει βοηθήσει στην επαλήθευση της κατάταξης των ευρωπαϊκών φυλών μελισσών, βάσει των μορφομετρικών χαρακτηριστικών τους. Ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος δείκτης στις αναλύσεις DNA στις μέλισσες είναι η παραλλακτικότητα που παρουσιάζεται στη διαγονιδιακή περιοχή ανάμεσα στα γονίδια COI και COII του μιτοχονδριακού DNA, όπως φάνηκε από την αλληλούχιση ή την περιοριστική ανάλυση (Cornuet et al., 1991; Garnery et al., 1992; 1993; 1998a; Franck et al., 1998). Το μικροδορυφορικό DNA ή ms-dna, αποτελείται από βραχείες διαδοχικά επαναλαμβανόμενες νουκλεοτιδικές αλληλουχίες και βρίσκεται διασκορπισμένο σε όλο το γονιδίωμα των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών. Ιδιαίτερα στις μέλισσες, 3

17 χρησιμοποιείται ευρύτατα ως ένας αξιόπιστος μοριακός δείκτης για τη διάκριση ατόμων ανάμεσα στον ίδιο πληθυσμό, λόγω του υψηλού πολυμορφισμού που παρουσιάζει το μικροδορυφορικό DNA τους (Estoup et al., 1993; Estoup et al., 1995; Garnery et al., 1998b; Solignac et al., 2003). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν κυπριακά μελίσσια στη διάρκεια ενός έτους με στόχο να καταγραφεί η ανάπτυξή τους και να συσχετιστεί, στη συνέχεια, με τις διάφορες εκδηλώσεις της αμυντικής συμπεριφοράς της κυπριακής μέλισσας. Μελετήθηκε επίσης η γενετική δομή πληθυσμών από διαφορετικές περιοχές του νησιού για να βρεθεί το κατά πόσο η κυπριακή μέλισσα διατηρείται ως διακριτή φυλή και για να επιλεγούν τα αντιπροσωπευτικότερα μελίσσια (βάσει του DNA) για τη μελέτη της αμυντικής συμπεριφοράς απέναντι στις σφήκες. ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Παρακολούθηση της ετήσιας ανάπτυξης κυπριακών μελισσιών Ένα μελισσοκομείο 10 μελισσιών, χωρίστηκε σε 2 ομάδες των 5. Τα μισά μελίσσια παρέμειναν στην περιοχή της Άλασσας ενώ τα υπόλοιπα μεταφέρθηκαν στην περιοχή του Αμιάντου. Η επιλογή του Αμιάντου ως χώρου τοποθέτησης του δεύτερου μελισσοκομείου επιλέχθηκε βάσει δύο ιδιαιτεροτήτων: α) ύπαρξη τροφής και ιδιαίτερα γύρης, που μπορεί να στηρίξει την επιβίωση του μελισσιού ολόκληρο το χρόνο και β) απουσία σφηκών σχεδόν καθ όλη τη διάρκεια του έτους λόγω του υψομέτρου (1100m). Η ανάπτυξη των μελισσιών καταγραφόταν με επισκέψεις δύο φορές το μήνα. Σημειώνονταν τα πλαίσια που κάλυπτε ο πληθυσμός του κάθε μελισσιού και τα πλαίσια του γόνου. Οι μετρήσεις του γόνου και του πληθυσμού, χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία της χαρακτηριστικής καμπύλης ανάπτυξης των κυπριακών μελισσιών, στη διάρκεια του έτους. Οι μελισσοκομικοί χειρισμοί περιορίστηκαν μόνο στη φροντίδα με στόχο την αποτροπή της σμηνουργίας των 10 μελισσών (προσθήκη άφθονου χώρου, τους μήνες Μάρτιο-Μάιο, μέθοδος Demaree, χρήση βασιλικών διαφραγμάτων κτλ). Επίσης, τα μελίσσια δε δέχθηκαν καμίας μορφής τροφοδοσία ή άλλη ενίσχυση. Ανάλυση DNA Κυπριακών μελισσών ειγματοληψία για ανάλυση DNA μελισσών Συνολικά, για την ανάλυση του DNA της κυπριακής μέλισσας, συλλέχθηκαν 268 εργάτριες από 6 περιοχές του νησιού, από το 2001 μέχρι και το 2005: Φλάσσου (2001), Αλάμπρα 4

18 (2003), Κατύδατα (2003), Κερύνεια (2003), Άλασσα (2003) και Τρούλλοι (2005). Οι περιοχές της δειγματοληψίας φαίνονται στην εικόνα 4. Για την ανάλυση του DNA, η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε με τη λήψη μίας εργάτριας από την κάθε κυψέλη. Από κάθε περιοχή λήφθηκαν 50 εργάτριες, αριθμός που θεωρείται αντιπροσωπευτικός για να χαρακτηρίσει τον πληθυσμό μίας περιοχής, ο οποίος ορίζεται ως ο αριθμός περίπου 50 μελισσιών από την ίδια περιοχή (Nei, 1987). Από την περιοχή των Τρούλλων, συλλέχθηκαν εργάτριες από 18 μελίσσια, όσα ήταν και τα μελίσσια του συγκεκριμένου μελισσοκομείου. Παρά το μικρό μέγεθός του, το συγκεκριμένο μελισσοκομείο επιλέχθηκε για δειγματοληψία λόγω του ότι αποτελείται από παραδοσιακές κυψέλες (τζιβέρκια) σε ένα σχετικά απομονωμένο μοναστήρι, όπου η μελισσοκομία ασκείται παραδοσιακά και δεν γίνεται κανένας βελτιωτικός χειρισμός, όπως βασιλοτροφία ή εισαγωγή ξένων βασιλισσών. Η κάθε εργάτρια τοποθετήθηκε σε σωλήνα eppendorf 2mL που περιείχε απόλυτη αλκοόλη και το κάθε δείγμα αριθμήθηκε. Πριν την έναρξη της διαδικασίας εξαγωγής του DNA, οι εργάτριες απομακρύνθηκαν από την αλκοόλη και αφέθηκαν να στεγνώσουν για 1-2 ώρες. Στη συνέχεια, αποσπάστηκε ο κάθε θώρακας και το υπόλοιπο σώμα της εργάτριας τοποθετήθηκε και πάλι στην αλκοόλη για φύλαξη. Εξαγωγή DNA από μέλισσες Η εξαγωγή πραγματοποιήθηκε βάσει του πρωτοκόλλου από Kocher et al (1989) με τροποποιήσεις που περιγράφονται από Garnery et al (1993) και μετατροπές που περιγράφονται στο παρόν κεφάλαιο, στις εγκαταστάσεις του Εργαστηρίου Εξέλιξης, Γονιδιώματος και ιαφοροποίησης των Ειδών (L.E.G.S.) του Εθνικού Κέντρου Επιστημονικών Ερευνών της Γαλλίας (C.N.R.S.). Οι θώρακες από τις μέλισσες συνθλίφτηκαν ξεχωριστά, μέσα σε σωλήνα eppendorf 2mL, με τη χρήση συσκευής Retch MM 301 (automatic grinder). Η χρήση της συγκεκριμένης συσκευής παρείχε τη δυνατότητα ταυτόχρονης σύνθλιψης 40 μελισσών σε χρόνο 5 λεπτών. Σε κάθε σωλήνα προστέθηκαν 750μL διαλύματος Wilson (extraction buffer) και 40μl πρωτεϊνάσης Κ (10mg/mL) για να αποσυντεθούν οι πρωτεΐνες. Οι σωλήνες αναδεύτηκαν με τη χρήση συσκευής Vortex και τοποθετήθηκαν σε υδατόλουτρο (Lauda A112T) στους 50 ο C για 2 ώρες. 5

19 Στη συνέχεια, για να απομακρυνθούν τα μεγάλα θραύσματα (εξωσκελετός), πραγματοποιήθηκε μία πρώτη φυγοκέντριση για 10 λεπτά σε 600rpm και σε θερμοκρασία 4 ο C. Το υπερκείμενο στρώμα απομονώθηκε και τοποθετήθηκε σε σωλήνες eppendorf των 1,5mL. Προστέθηκαν 750μL φαινόλης και οι σωλήνες αναδεύτηκαν, με το χέρι, για περίπου 4 λεπτά. Ακολούθησε φυγοκέντριση για 20 λεπτά, σε 12000rpm, στους 4 ο C. Από το υπερκείμενο στρώμα λήφθηκαν 600μL υγρού και τοποθετήθηκαν σε νέους σωλήνες eppendorf των 1,5mL. Προστέθηκαν 600μL Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol (25/24/1) και αναδεύτηκαν, με το χέρι, για περίπου 2 λεπτά. Ακολούθησε φυγοκέντριση για 20 λεπτά, σε 12000rpm, στους 4 ο C. Από το νέο υπερκείμενο στρώμα λήφθηκαν 450μL υγρού και τοποθετήθηκαν σε νέους σωλήνες eppendorf των 1,5mL. Προστέθηκαν 450μL Chloroform-Isoamyl (24/1) και αναδεύτηκαν, με το χέρι, για περίπου 2 με 3 λεπτά. Ακολούθησε φυγοκέντριση για 10 λεπτά, σε 12000rpm, στους 4 ο C. Από το υπερκείμενο στρώμα λήφθηκαν 400μL υγρού και τοποθετήθηκαν σε νέους σωλήνες eppendorf των 1,5mL. Στη συνέχεια προστέθηκαν 40μL sodioum acetate (3M, ph5,5) και 800μL απόλυτης αιθανόλης (στους -20 ο C). Οι σωλήνες αναδεύτηκαν, με το χέρι, για περίπου 1 λεπτό και τοποθετήθηκαν για περίπου 16 ώρες, στους 20 ο C, για να πραγματοποιηθεί καθίζηση του DNA. Ακολούθησε φυγοκέντριση για 30 λεπτά, σε 12000rpm, στους 4 ο C. Η τελευταία αυτή φυγοκέντριση επιτρέπει στην ταμπλέτα του DNA να καθιζάνει στον πυθμένα του σωλήνα και να είναι ορατή με το μάτι. Οι σωλήνες που περιείχαν την καθαρή ταμπλέτα του DNA, αναστράφηκαν για να απομακρυνθεί η αλκοόλη ενώ το DNA παρέμεινε προσκολλημένο στα τοιχώματα του σωλήνα. Αφού εξατμίσθηκε όλη η απόλυτη αλκοόλη (40-60 λεπτά), η ταμπλέτα ξεπλύθηκε με προσθήκη 800μL αιθανόλης 70%. Ακολούθησε φυγοκέντριση για 20 λεπτά σε rpm στους 4 ο C. Απομακρύνθηκε και πάλι το υπερκείμενο υγρό με αναστροφή του σωλήνα και το παρασκεύασμα αφέθηκε να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου, για λεπτά. Τέλος, προστέθηκαν 200μL αποστειρωμένου νερού και το διάλυμα αφέθηκε να ηρεμήσει σε θερμοκρασία δωματίου, για μία ώρα και στους 4 ο C, για περίπου 16 ώρες, για να διαλυθεί το DNA. Ακολούθησε ανάδευση με τη συσκευή Vortex και φυγοκέντριση για 1 λεπτό στις 3000rpm. Το DNA ήταν έτοιμο για ενίσχυση με τη συσκευή PCR (DNA amplifications). 6

20 ιαδικασία PCR για το μιτοχονδριακό DNA Η περιοχή του μιτοχονδριακού-dna που περιλαμβάνει την διαγονιδιακή περιοχή COI-COII, το γονίδιο trna leu (για τη σύνθεση του αμινοξέος της λευκίνης) και το 5 άκρο της υπομονάδας του γονιδίου COII, ενισχύθηκαν μέσω της διαδικασίας της PCR, με τη χρήση των εκκινητών (primers) E2 (5 GGCAGAATAAGTGCATTG-3 ) και Η2 (5 - CAATATCATTGATGACC-3 ) όπως περιγράφεται από Garnery et al (1991; 1993). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε 5μL διαλύματος που περιείχε 25 pmoles από κάθε primer, 25 nmoles από κάθε dntps, 0,6 μονάδες Promega Taq Polymerase, 2mM MgCl 2 και 1μL διαλύματος από το DNA που είχε εξαχθεί. Μετά από ένα πρώτο στάδιο αποδιάταξης (3 λεπτά στους 92 ο C), οι σωλήνες αντίδρασης υποβλήθηκαν σε 30 κύκλους (1 λεπτό στους 92 ο C, 1,5 λεπτά στους 47 ο C και 2 λεπτά στους 63 ο C) και διατηρήθηκαν στους 15 ο C μετά από ένα τελευταίο στάδιο επιμήκυνσης (5 λεπτά στους 63 ο C), με τη χρήση συσκευής PCR (T1 Thermocycler Biometra). Εκτίμηση μεγέθους του παρασκευάσματος PCR Για να προσδιορισθεί η κατηγορία μεγέθους των ενισχυμένων τμημάτων, αν δηλαδή ανήκουν στους τύπους Q ( bp), PQ (1200bp), PQQ (1400bp) ή PQQQ (1600bp) (Garnery et al., 1991), ένα πρώτο μέρος (1μL) από το παρασκεύασμα του PCR προστέθηκε σε 4μL διαλύματος παύσης (Bromophenol blue σε διάλυμα σουκρόζης 40%). Το μείγμα φορτώθηκε σε gel αγαρόζης 1,4% και ακολούθησε ηλεκτροφόρηση για 45 λεπτά, στα 100 Volt (Runone electrophoresis system). Το DNA έγινε ορατό μετά από στερέωση με ETB (Ethidium bromide) για 5 λεπτά σε σύστημα Gel logic 100E (Sciencetec). Η εικόνα του gel καταγράφηκε και φυλάχθηκε σε υπολογιστή σε μορφή.tif αρχείου, η οποία επιτρέπει την απευθείας εκτύπωση. Προσδιορισμός απλότυπου Τα 24μL του εναπομείναντος παρασκευάσματος PCR, επεξεργάσθηκαν με την προσθήκη μείγματος που περιείχε 8,5μl αποστειρωμένου νερού, 1μL M-Buffer και 0,5μl ενζύμου DraI (Roche Applied Science). Η επεξεργασία πραγματοποιήθηκε σε υδατόλουτρο στους 37 ο C για 8 ώρες. Για να προσδιοριστεί ο απλότυπος κάθε μελισσιού, 25μL και 5μL από το επεξεργασμένο παρασκεύασμα φορτώθηκαν, αντίστοιχα, σε gel ακριλαμίδης 10% και 5% (συσκευή System 7

21 Penguine Owl). Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε για 220 λεπτά στα 250 Volt (Power Supply PS304 minipac). Η εμφάνιση των gel πραγματοποιήθηκε σε συσκευή UV ακτινοβολίας με την ίδια διαδικασία που αναφέρθηκε και στην εκτίμηση μεγέθους του παρασκευάσματος PCR. Ανάλυση μικροδορυφορικού DNA μελισσών To DNA από τις δειγματοληψίες μελισσών, ενισχύθηκε με την τεχνική της PCR, με χρήση διαλύματος 10μL, το οποίο περιείχε τους εκκινητές (πίνακας 1) που επιτρέπουν την αναγνώριση 14 διαφορετικών μικροδορυφορικών θέσεων: Α7, Α8, Α28, Α88, Α113, Β124 (Estoup et al., 1995), Α43, Αp33, Αp36, Αρ43, Αp55, Αp66, Αp81 και Β24 (Solignac et al., 2003), με τη συσκευή αλληλουχίας ABIPRISM-310 (BioApplied System). Η θερμοκρασία αποδιάταξης ορίστηκε στους 55 ο C και η συγκέντρωση MgCl 2 στο 1,2mM. Πίνακας 1. Η αλληλουχία βάσεων των 14 εκκινητών (primers) που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση του μικροδορυφορικού DNA της κυπριακής μέλισσας και την σύγκριση με 17 διαφορετικούς πληθυσμούς της Apis mellifera. Κωδικός Εκκινητές (primers) Α7 5 -GTTAGTGCCCTCCTCTTGC-3 5 -CCCTTCCTCTTTCATCTTCC-3 Α8 5 -CGAAGGTAAGGTAAATGGAAC-3 5 -GGCGGTTAAAGTTCTGG-3 Α28 5 -GAAGAGCGTTGGTTGCAGG-3 5 -GCCGTTCATGGTTACCACG-3 Α43 5 -CACCGAAACAAGATGCAAG-3 5 -CCGCTCATTAAGATATCCG 3 Α88 5 -CGAATTAACCGATTTGTCG-3 5 -GATCGCAATTATTGAAGGAG-3 Α CTCGAATCGTGGCGTCC-3 5 -CCTGTATTTTGCAACCTCGC-3 Αp33 5 -TTTCTTTTTGTGGACAGCG-3 5 -AAATATGGCGAAACGTGTG-3 Αp36 5 -CTACGCGCTTACAGGGCA-3 5 -GCCGAAATTCAACGCTCA-3 Αρ43 5 -GGCGTGCACAGCTTATTCC-3 5 -CGAAGGTGGTTTCAGGCC-3 Αp55 5 -GATCACTTCGTTTCAACCGT-3 5 -CATTCGGTATGGTACGACCT-3 Αp66 5 -TTGCATTCGGTCTCCAGC-3 5 -ACTTGCCGCGGTATCTGA-3 Αp81 5 -GGATCGTCGAGGCGTTGA-3 5 -GAAAAGTATTCCGCCGAGCA-3 Β24 5 -CACAAGTTCCAACAATGC-3 5 -CACATTGAGGATGAGCG-3 Β GCAACAGGTCGGGTTAGAG-3 5 -CAGGATAGGGTAGGTAAGCAG-3 Για τη σύγκριση των μικροδορυφορικών ακολουθιών χρησιμοποιήθηκαν 14 πληθυσμοίμάρτυρες, από τη βάση δεδομένων του Εργαστηρίου Εξέλιξης, Γονιδιώματος και 8

22 ιαφοροποίησης των Ειδών (L.E.G.S.) του Εθνικού Κέντρου Επιστημονικών Ερευνών της Γαλλίας (C.N.R.S.). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν δύο πληθυσμοί από τη Γαλλία (Sabre, Ouessant) και ανά ένας από το Βέλγιο (Hainaut), την Αρμενία (Erevan), την Τουρκία (Mugla), την Ελλάδα (Χαλκιδική), τη Σλοβενία, την Ιταλία (Forli), την Αλγερία (Chlef), το Μαρόκο (Al Hoceima), τη Γουινέα (Nimba) και την Υεμένη (Yemenon). Οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των πληθυσμών προέκυψαν από το λογισμικό πρόγραμμα TREEMAKER, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Cavalli-Sforza & Edwards (1967). Οι τιμές αυτοδυναμίας υπολογίστηκαν από το συγκεκριμένο λογισμικό με περισσότερες από 2000 επαναλήψεις ελέγχου (Hedges, 1992). Το λογισμικό πρόγραμμα GENEPOP v.3.1. (Raymond and Rousset, 1995), χρησιμοποιήθηκε για την κατηγοριοποίηση των κυπριακών μελισσιών, σε σχέση με τις μέλισσες-μάρτυρες. Η PCA (Principal Coordinate Analysis) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού προγράμματος NUEES v.0.8. (Langella, 2001) για να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των πληθυσμών και να δώσει μία εικόνα κατάταξης βάσει του διαχωρισμού τους. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Παρακολούθηση της ετήσιας ανάπτυξης κυπριακών μελισσιών Τα αποτελέσματα από τις καταγραφές της ανάπτυξης των μελισσιών στην Άλασσα και στον Αμίαντο, παρουσιάζονται στους πίνακες 2-5. Οι χαρακτηριστικές καμπύλες ανάπτυξης των μελισσιών (μέσοι όροι πληθυσμού και γόνου) στις δύο αυτές περιοχές της Κύπρου, παρουσιάζονται στις εικόνες 1 και 2. 9

23 Πίνακας 2. Καταγραφή της ανάπτυξης του πληθυσμού 5 μελισσιών (Α1-Α5) στην περιοχή της Άλασσας (αριθμός πλαισίων με μέλισσες) A1 A2 A3 A4 A5 Μέσος Τυπική Όρος απόκλιση Ιαν ,8 1,48 Ιαν ,6 1,81 Φεβ ,8 2,86 Φεβ ,6 2,88 Μαρ ,6 2,88 Μαρ ,2 2,86 Απρ ,0 2,70 Απρ ,6 3,36 Μάι ,4 1,22 Μάι ,2 3,56 Ιουν ,8 3,63 Ιουν ,0 3,24 Ιουλ ,2 2,86 Ιουλ ,6 3,96 Αυγ ,2 3,27 Αυγ ,8 2,95 Σεπ ,2 2,16 Σεπ ,6 2,19 Οκτ ,8 1,92 Οκτ ,4 1,14 Νοε ,0 1,22 Νοε ,2 1,48 εκ ,0 1,87 εκ ,0 1,87 Πίνακας 3. Καταγραφή της ανάπτυξης του γόνου 5 μελισσιών (Α1-Α5) στην περιοχή της Άλασσας (αριθμός πλαισίων γόνου) A1 A2 A3 A4 A5 Μέσος Τυπική Όρος απόκλιση Ιαν ,4 0,89 Ιαν , ,7 0,81 Φεβ ,6 1,14 Φεβ ,8 1,48 Μαρ ,2 1,64 Μαρ ,2 1,64 Απρ ,2 1,64 Απρ ,8 1,48 Μάι ,8 1,48 Μάι ,0 1,22 Ιουν ,0 0,70 Ιουν ,0 0,70 Ιουλ ,2 0,83 Ιουλ ,6 0,54 Αυγ ,6 0,54 Αυγ ,5 0 0,5 0 0,4 0,57 Σεπ ,5 0 0,5 0 0,4 0,57 Σεπ ,5 0,7 0,50 Οκτ ,5 0,7 0,50 Οκτ , ,3 0,57 Νοε , ,5 0,50 Νοε ,8 0,44 εκ ,4 0,54 εκ ,2 0,86 10

24 Πίνακας 4. Καταγραφή της ανάπτυξης του πληθυσμού 5 μελισσιών (Β1-Β5) στην περιοχή του Αμιάντου (αριθμός πλαισίων με μέλισσες) Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Μέσος Τυπική Όρος απόκλιση Ιαν ,0 0,70 Ιαν , ,9 0,50 Φεβ ,6 0,89 Φεβ ,0 0,70 Μαρ ,4 1,14 Μαρ ,2 1,09 Απρ ,8 2,37 Απρ ,2 2,95 Μάι ,8 2,95 Μάι ,4 2,96 Ιουν ,2 3,34 Ιουν ,2 3,70 Ιουλ ,6 3,05 Ιουλ ,2 3,58 Αυγ ,4 1,14 Αυγ ,8 1,09 Σεπ ,2 1,09 Σεπ ,0 1,41 Οκτ ,4 1,14 Οκτ ,4 1,14 Νοε ,6 1,14 Νοε ,0 0,70 εκ ,6 0,89 εκ ,0 0,70 Πίνακας 5. Καταγραφή της ανάπτυξης του γόνου 5 μελισσιών (Β1-Β5) στην περιοχή του Αμιάντου (αριθμός πλαισίων γόνου) Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Μέσος Τυπική Όρος απόκλιση Ιαν-01 0, ,1 0,22 Ιαν ,5 0 0,5 1 0,6 0,57 Φεβ , ,7 0,67 Φεβ ,0 0,70 Μαρ ,2 1,09 Μαρ ,6 1,34 Απρ ,8 1,78 Απρ ,6 1,94 Μάι ,6 1,51 Μάι ,8 1,92 Ιουν ,6 1,51 Ιουν ,6 1,51 Ιουλ ,2 1,09 Ιουλ ,0 0,70 Αυγ ,6 0,89 Αυγ , ,1 0,54 Σεπ ,0 0,70 Σεπ ,0 0,70 Οκτ ,0 0,70 Οκτ ,2 0,83 Νοε ,2 0,83 Νοε , ,3 0,67 εκ ,4 0,54 εκ

25 20 Aνάπτυξη μελισσιών (Άλασσα) Αριθμός πλαισίων Πληθυσμός Γόνος Ιαν-01 Ιαν-15 Φεβ-01 Φεβ-15 Μαρ-01 Μαρ-15 Απρ-01 Απρ-15 Μάι 01 Μάι 15 Ιουν-01 Ιουν-15 Ιουλ-01 Ιουλ-15 Αυγ-01 Αυγ-15 Σεπ-01 Σεπ-15 Οκτ-01 Οκτ-15 Νοε-01 Νοε-15 εκ-01 εκ-15 Εικόνα 1. Η ανάπτυξη του πληθυσμού και του γόνου 5 μελισσιών (μέσοι όροι) στην περιοχή της Άλασσας, κατά τη διάρκεια ενός έτους 20 Ανάπτυξη μελισσιών (Αμίαντος) Αριθμός πλαισίων Πληθυσμός Γόνος 2 0 Ιαν-01 Ιαν-15 Φεβ-01 Φεβ-15 Μαρ-01 Μαρ-15 Απρ-01 Απρ-15 Μάι 01 Μάι 15 Ιουν-01 Ιουν-15 Ιουλ-01 Ιουλ-15 Αυγ-01 Αυγ-15 Σεπ-01 Σεπ-15 Οκτ-01 Οκτ-15 Νοε-01 Νοε-15 εκ-01 εκ-15 Εικόνα 2. Η ανάπτυξη του πληθυσμού και του γόνου 5 μελισσιών (μέσοι όροι) στην περιοχή του Αμιάντου, κατά τη διάρκεια ενός έτους Οι καμπύλες ανάπτυξης των κυπριακών μελισσιών παρουσίασαν τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: -Μέγιστη ανάπτυξη του πληθυσμού και του γόνου τους μήνες Μάιο-Ιούνιο. 12

26 -Συνεχόμενη μείωση του πληθυσμού και κυρίως του γόνου, η οποία ξεκίνησε από τα τέλη Ιουνίου και διήρκεσε μέχρι τα τέλη Σεπτεμβρίου, λόγω των πολύ ψηλών θερμοκρασιών, οι οποίες μετά την ολοκλήρωση της ανθοφορίας του θυμαριού, σηματοδοτούν μία περίοδο παντελούς απουσίας ανθισμένων μελισσοκομικών φυτών. Ιδιαίτερα στην περίπτωση των μελισσιών που βρίσκονταν στην Άλασσα και στερούνταν τροφής ενώ παράλληλα δέχονταν τις επιθέσεις των σφηκών, ο γόνος απουσίασε εντελώς από κάποια μελίσσια και ο πληθυσμός τους μειώθηκε στο ελάχιστο. Το συγκεκριμένο στάδιο στην καμπύλη ανάπτυξης του πληθυσμού και του γόνου, ομοιάζει με το κρίσιμο στάδιο στην ανάπτυξη άλλων ευρωπαϊκών φυλών μελισσών, το οποίο όμως παρατηρείται στο τέλος του χειμώνα και στις αρχές της Άνοιξης (εικόνα 3). Σύμφωνα με μαρτυρίες μελισσοκόμων από όλο το νησί, τη συγκεκριμένη αυτή περίοδο χάνονται τα περισσότερα μελίσσια. Στα μελίσσια της περιοχής του Αμιάντου, αν και ο γόνος μειώθηκε αρκετά κατά τα μέσα του Αυγούστου, δεν παρουσιάστηκε απουσία γόνου. Τα αποτελέσματα αυτά, είναι σε συμφωνία με την πρώτη δημοσιευμένη ερευνητική εργασία που αφορά στην ανάπτυξη του γόνου της A.m. cypria (Nolan, 1928). Στη συγκεκριμένη εργασία αναφέρεται ότι το μέγιστο μέγεθος του γόνου παρουσιάζεται τον Ιούνιο και το ελάχιστο το Σεπτέμβριο. εν αναφέρεται η απόλυτη απουσία γόνου κατά τους καλοκαιρινούς μήνες, γεγονός που δεν προκαλεί έκπληξη αν ληφθούν υπόψη οι διαφορετικές κλιματικές συνθήκες που επικρατούσαν πριν 80 χρόνια (χαμηλότερες θερμοκρασίες), γεγονός που θα επέτρεπε την άνθηση γυρεοδοτικών και νεκταροδοτικών φυτών ακόμη και κατά τους καλοκαιρινούς μήνες. Επιπλέον, δεν αναφέρεται η ανάπτυξη του μελισσιού και του γόνου κατά τους χειμερινούς μήνες, λόγω του ότι οι καταγραφές ξεκινούσαν το Μάρτιο και ολοκληρώνονταν τον Οκτώβριο. 13

27 Εικόνα 3. Υποθετικές καμπύλες ανάπτυξης πληθυσμού και γόνου κατά τη διάρκεια του έτους, σε μελίσσια της Apis mellifera macedonica (από Θρασυβούλου, 1996) -Παρατηρήθηκε μία δεύτερη, μικρή κορυφή ανάπτυξης τόσο του γόνου όσο και του πληθυσμού, μεταξύ Νοεμβρίου και εκεμβρίου. Αυτό οφείλεται τόσο στην ελαχιστοποίηση των επιθέσεων των σφηκών και στην αποχώρηση των μελισσοφάγων όσο και στην άνθιση γυρεοδοτικών και νεκταροδοτικών φυτών (χαρουπιά, ακονιζιά). Οι θερμοκρασίες που δεν κινούνται ποτέ σε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα (κυρίως στις πεδινές περιοχές), ευνοούν επίσης τη δεύτερη αυτή περίοδο ανάπτυξης του μελισσιού. -Στην περιοχή της Άλασσας, όλα σχεδόν τα μελίσσια διατήρησαν γόνο καθ όλη τη διάρκεια του χειμώνα. Αντιθέτως, λόγω των χαμηλότερων θερμοκρασιών που επικρατούν στον Αμίαντο, τα περισσότερα μελίσσια πέρασαν μία μικρή περίοδο (15-30 ημερών) χωρίς καθόλου γόνο. -Οι καμπύλες ανάπτυξης των δύο μελισσοκομείων παρουσιάζουν παρόμοια μορφή. -Η δύναμη των μελισσιών και στα δύο μελισσοκομεία ήταν σχετικά μικρότερη από την αντίστοιχη δύναμη των κυπριακών μελισσιών λόγω του ότι δεν δέχθηκαν καμία ενίσχυση και δε μετακινήθηκαν. Η εικόνα αυτή όμως είναι αντιπροσωπευτικότερη του ρυθμού ανάπτυξης των μελισσιών στη φύση. Ιδιαίτερα τα αποτελέσματα των καταγραφών του μελισσοκομείου της Άλασσας, μπορούν να δώσουν με μεγαλύτερη αξιοπιστία τις επιπτώσεις που έχει η 14

28 επίδραση περιβαλλοντικών συνθηκών και θηρευτών στην ετήσια ανάπτυξη των κυπριακών μελισσιών. Ανάλυση DNA Κυπριακών μελισσών Όλα τα αποτελέσματα από τις αναλύσεις του DNA παρουσιάζονται στους πίνακες στο Παράρτημα. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση του μιτοχονδριακού DNA έδειξαν πως όλοι οι κυπριακοί πληθυσμοί εξαιρουμένου ενός (Κερύνεια), παρουσιάζουν ένα μοναδικό απλότυπο (Εικόνα 4). Αυτός ο απλότυπος, ο C1, είναι ο πιο συνηθισμένος των C lineage. O πληθυσμός της Κερύνειας εμφανίζει τέσσερεις διαφορετικούς απλότυπους, τους C1, C6, C2 και M7. Ο απλότυπος C6 ξεχωρίζει από τον απλότυπο C1 κατά ένα νουκλεοτίδιο όπως φαίνεται στην εικόνα 6 από την ηλεκτροφόρηση σε πηχτή πολυακριλαμίδης (40bp για τον C1 και 41bp για τον C2). Στην ίδια εικόνα φαίνεται και η διαφορά κατά ένα νουκλεοτίδιο ανάμεσα στους απλότυπους C6 και C1 (64bp για τον C1 και 65bp για τον C6). Οι απλότυποι C2 και M7 είναι χαρακτηριστικοί των ιταλικών μελισσών (Apis mellifera ligustica) ενώ ο απλότυπος C6 είναι χαρακτηριστικός τουρκικών μελισσών (Apis mellifera anatoliaca). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι μελίσσια (ή βασίλισσες) που ανήκουν στη φυλή A.m.ligustica αλλά και στην A.m. anatoliaca, έχουν εισαχθεί στο βόρειο τμήμα της Κύπρου, στο οποίο ο έλεγχος από τις αρμόδιες υπηρεσίες της Κυπριακής ημοκρατίας είναι πρακτικά αδύνατος λόγω της τουρκικής κατοχής. Το δενδρόγραμμα (εικόνα 5), που βασίζεται στην ανάλυση του μικροδορυφορικού DNA, δείχνει ότι οι πληθυσμοί της Κύπρου, εκτός από αυτόν της Κερύνειας, ομαδοποιούνται και διαχωρίζονται από τους υπόλοιπους πληθυσμούς. Ο πληθυσμός της Κερύνειας τοποθετείται ανάμεσα στους πληθυσμούς της Μέσης Ανατολής (Λίβανος-Συρία) και της Αρμενίας- Τουρκίας. ιαχωρίζεται όμως απ αυτούς με τιμές αυτοδυναμίας 57% και 70%, αντίστοιχα. Οι Κυπριακοί πληθυσμοί εντοπίζονται πάνω στον κλάδο της O lineage μαζί με τους πληθυσμούς από το Λίβανο και τη Συρία αλλά διαχωρίζονται από αυτούς με υψηλές τιμές αυτοδυναμίας (100%). 15

29 Εικόνα 4. Γενετική ποικιλότητα κυπριακών μελισσών βάσει δεικτών mt-dna Εικόνα 5. ενδρόγραμμα γεωγραφικής εγγύτητας, με τις τιμές αυτοδυναμίας ανάμεσα σε 6 πληθυσμούς της Κύπρου (μαύρο χρώμα), 3 πληθυσμούς της M (κόκκινο χρώμα), 3 πληθυσμούς της C (μπλε χρώμα), 4 πληθυσμούς της O (πορτοκαλί και ροζ χρώμα) και 4 πληθυσμούς της A (πράσινο χρώμα) γραμμής 16

30 Εικόνα 6. Αποτελέσματα από ηλεκτροφόρηση δείγματος 50 μελισσιών από την Κερύνεια, σε πηκτή πολυακριλαμίδης. Ξεχωρίζουν τέσσερεις διαφορετικοί απλότυποι: C1 (26), C2 (13), C6 (9) και M7 (2). 17

31 Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν και με την ανάλυση PCA (εικόνες 7 και 8). Στη συγκεκριμένη ανάλυση, ο άξονας 1 αντιπροσωπεύει το 39,07% της συνολικής παραλλακτικότητας. Οι προβολές των κυπριακών πληθυσμών σ αυτόν τον άξονα, δείχνουν τη συγγένειά τους με πληθυσμούς που ανήκουν στην O-lineage (Αρμενία, Τουρκία). Ο άξονας 2 αντιπροσωπεύει το 54,38% της συνολικής παραλλακτικότητας. Οι προβολές των κυπριακών πληθυσμών σ αυτόν τον άξονα (τόσο στην εικόνα 7 όσο και στην εικόνα 8), δείχνουν το διαχωρισμό τους από τους πληθυσμόυς της O-lineage, παρά τη συγγένεια του πληθυσμού της Κερύνειας μ αυτούς τους πληθυσμούς (εικόνα 7). Τέλος, ο άξονας 3, αντιπροσωπεύει το 14,3% της συνολικής παραλλακτικότητας. Οι προβολές των κυπριακών πληθυσμών σ αυτόν τον άξονα, δείχνουν τη διαφοροποίησή τους από τους πληθυσμούς που ανήκουν στην O-lineage και τη μεγάλη απόσταση που τους χωρίζει από τους πληθυσμούς της C-lineage. Μοναδική εξαίρεση αποτελεί και πάλι ο πληθυσμός της Κερύνειας, ο οποίος πλησιάζει τους πληθυσμούς της O-lineage. Εικόνα 7. Αποτελέσματα της ανάλυσης PCA για τη σύγκριση των κυπριακών πληθυσμών μελισσιών με τους υπόλοιπους 14 πληθυσμούς-μάρτυρες της Apis mellifera. Άξονας 1 (axe_1)=31,07% της συνολικής παραλλακτικότητας. Άξονας 2 (axe_2)=54,38% της συνολικής παραλλακτικότητας. 18

32 Όπως και με τα αποτελέσματα από το μιτοχονδριακό DNA, έτσι και με τα αποτελέσματα του μικροδορυφορικού DNA, ο πληθυσμός της Κερύνειας φαίνεται ότι διαχωρίζεται από τους άλλους πληθυσμούς της Κύπρου και είναι συγγενικά πιο κοντά στους πληθυσμούς της Αρμενίας και της Τουρκίας ή βρίσκεται ανάμεσα στους πληθυσμούς της Μέσης Ανατολής και της C lineage. Εικόνα 8. Αποτελέσματα της ανάλυσης PCA για τη σύγκριση των κυπριακών πληθυσμών μελισσιών με τους υπόλοιπους 14 πληθυσμούς-μάρτυρες της Apis mellifera. Άξονας 2 (axe_2)=54,38% της συνολικής παραλλακτικότητας. Άξονας 3 (axe_3)=14,3% της συνολικής παραλλακτικότητας. Στη συνέχεια, παρατίθενται δύο επιπλέον συμπεράσματα που μπορούν να εξαχθούν από τις αναλύσεις των δειγμάτων του 2004 (Κατύδατα, Αλάμπρα, Άλασσα), τα οποία θα μπορούσαν να αποτελέσουν αντικείμενο μελλοντικής έρευνας: Το πρώτο είναι πως όσο εγγύτερα βρίσκεται η κάθε περιοχή στην πράσινη γραμμή, τόσο πλησιάζουν τα αποτελέσματα από τις αναλύσεις του μικροδορυφορικού DNA τα αποτελέσματα των πληθυσμών άλλων περιοχών, γεγονός που οφείλεται ενδεχομένως σε υβριδισμό. Το δεύτερο είναι πως, αν και έχουν εξακριβωθεί εισαγωγές ξένων βασιλισσών στις νότιες περιοχές του νησιού, σε 19

33 περιοχές κοντά στα μελισσοκομεία που πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες και αναλύσεις, δεν εντοπίστηκε υβριδισμός και δε βρέθηκαν μελίσσια με μιτοχονδριακό DNA που να μην ανταποκρίνεται στον απλότυπο C1. Το γεγονός αυτό μπορεί να αποτελεί μία πρώτη ένδειξη πως μελίσσια που δημιουργούνται από μη ντόπιες βασίλισσες, πιθανότατα, δεν μπορούν να προσαρμοστούν και να επιβιώσουν στις ιδιαίτερες συνθήκες της Κύπρου. Απαιτείται όμως μελλοντική έρευνα για να προσδιοριστεί ο αριθμός των βασιλισσών που έχουν εισαχθεί στην Κύπρο καθώς, αν ο συγκεκριμένος αριθμός είναι μικρός η επίπτωση στη γενετική δομή της κυπριακής μέλισσας θα είναι εκ των πραγμάτων αμελητέα και πιθανότατα, δύσκολα ανιχνεύσιμη. Χρησιμοποιώντας αυτούς τους δύο μοριακούς δείκτες (mt-dna και ms-dna), είναι δυνατό να χαρακτηρίσουμε πληθυσμούς από την Κύπρο που φέρουν το διπλό πρότυπο, δηλαδή C απλότυπων μιτοχονδριακού DNA και πυρηνικό DNA όμοιο με αυτό των πληθυσμών της Μέσης Ανατολής, συνδυασμός που δεν έχει μέχρι σήμερα αναφερθεί. Σύμφωνα με την ιδιαιτερότητα που εμφανίζουν οι κυπριακοί πληθυσμοί σε επίπεδο DNA, φαίνεται ότι η κυπριακή μέλισσα A.m. cypria διατηρείται ακόμη στην Κύπρο και καλύπτει το μεγαλύτερο μέρος του νησιού. Οι πληθυσμοί που παρουσιάζονται ως οι πλέον αντιπροσωπευτικοί της κυπριακής μέλισσας εντοπίζονται στην περιοχή της Φλάσσου, των Τρούλλων και της Άλασσας. Τα μελισσοκομεία της Φλάσσου και των Τρούλλων δεν επιλέχθηκαν για τα πειράματα που ακολούθησαν, το πρώτο λόγω του χρόνου που είχε περάσει από τη δειγματοληψία (3 έτη) και το δεύτερο, λόγω του μεγέθους του μελισσοκομείου (μόνο 18 μελίσσια). Για τη μελέτη της αμυντικής συμπεριφοράς απέναντι στις σφήκες, επιλέχθηκε το μελισσοκομείο στην Άλασσα λόγω της γενετικής του σύστασης, του μεγέθους του και της ευκολότερης πρόσβασης σ αυτό. 20

34 Η ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΤΩΝ ΜΕΛΙΣΣΙΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΕΠΙΤΙΘΕΜΕΝΗΣ ΣΦΗΚΑΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η εφαρμογή συντονισμένης και μαζικής, αμυντικής συμπεριφοράς από τις εργάτριες ενός μελισσιού, είναι ζωτικής σημασίας για την επιβίωσή της κοινωνίας τους και την προφύλαξη του πληθυσμού, του γόνου και των αποθεμάτων τροφής από επιτιθέμενους εχθρούς (Breed et al., 2004). Αν και η μορφή που παίρνει η εκδήλωση της άμυνας εξαρτάται από το είδος του εισβολέα αλλά και το είδος της μέλισσας, σε γενικές γραμμές η αλληλουχία των γεγονότων που προσδιορίζουν την αμυντική συμπεριφορά του μελισσιού είναι οι ακόλουθες: Σε πρώτη φάση, μία μεμονωμένη μέλισσα ή μερικές μεμονωμένες μέλισσες αντιλαμβάνονται ένα δυνητικό εχθρό. Θα ακολουθήσει ο προσανατολισμός και η παρακολούθηση του πιθανού εχθρού που εντοπίστηκε και όταν καταστεί δυνατόν (κατάλληλη απόσταση για οπτική επαφή, έκκριση οσμών που αντιλαμβάνονται οι μέλισσες), θα επιχειρηθεί για πρώτη φορά η διάκριση ή ταυτοποίηση του εισβολέα. Αν η ταυτοποίηση δείξει την ύπαρξη εχθρού, τότε οι μέλισσες που τον εντόπισαν (συνήθως οι φρουροί της κυψέλης) θα προχωρήσουν σε ενέργειες που έχουν ως στόχο το συναγερμό για να επιστρατεύσουν μεγαλύτερο αριθμό εργατριών που θα συμμετάσχουν στην αντιμετώπιση του εισβολέα. Σε αρκετές περιπτώσεις, όταν συνήθως το μέγεθος και η φύση του εχθρού το επιτρέπει, οι φρουροί που τον εντόπισαν, μπορεί να τον προσεγγίσουν. Η προσέγγιση αυτή, οδηγεί συνήθως στο επόμενο στάδιο που είναι μία δευτερογενής ταυτοποίηση, η οποία θα επιβεβαιώσει το είδος του εισβολέα και θα τον σημάνει ως απειλή, με αποτέλεσμα να δεχτεί την επίθεση από τις αμυνόμενες μέλισσες. Σε κάθε ένα από τα πιο πάνω στάδια που περιγράφηκαν, υπάρχει πάντα το ενδεχόμενο διακοπής της σειράς των ενεργειών και απεμπλοκής, είτε γιατί ο εισβολέας αποχωρεί είτε γιατί αντιμετωπίζεται αποτελεσματικά σε κάποιο από τα στάδια πριν το τελικό της επίθεσης. Γενικά, όλες οι φρουροί (Breed et al., 1992; Stabentheiner et al., 2002; Arechavaleta- Velasco, et al., 2003a, Arechavaleta-Velasco et al., 2003b) αλλά και οι εργάτριες που επιστρατεύονται από τις φρουρούς για να συμμετάσχουν στην άμυνα (Breed et al., 1990), ακολουθούν την πιο πάνω αλληλουχία που παρουσιάζεται σχηματικά στην εικόνα 9. Αν και η αλληλουχία αυτή έχει μελετηθεί στην ευρωπαϊκή μέλισσα, πιθανότατα δεν διαφέρει ανάμεσα σε άλλα είδη κοινωνικών μελισσών (Breed et al., 2004). 21

35 Αυτό που παρουσιάζει συχνά ποικιλομορφία ανάμεσα στα διαφορετικά είδη των κοινωνικών μελισσών, είναι η κορύφωση της αμυντικής συμπεριφοράς στο στάδιο που οι αμυνόμενες μέλισσες έρχονται σε επαφή με τον επιτιθέμενο εχθρό ή στη φάση που εφαρμόζουν αποτρεπτικές τεχνικές με στόχο την αποθάρρυνση του επίδοξου εισβολέα. Εικόνα 9. Η σταδιακή εκδήλωση αμυντικής συμπεριφοράς της Apis mellifera κατά την επίθεση ενός εχθρού (από Breed et al. 2004) Για να αντιμετωπίσουν αποτελεσματικά τον εισβολέα, στις περισσότερες περιπτώσεις οι μέλισσες χρησιμοποιούν τα σαγόνια τους και κυρίως, το μηχανισμό του κεντριού και του δηλητηρίου, αν και η ένταση της χρήσης αυτών των αμυντικών μηχανισμών διαφέρει από είδος σε είδος αλλά και από φυλή σε φυλή του ίδιου είδους (Breed et al., 2004). Έτσι, ενώ οι φρουροί της ευρωπαϊκής φυλής Apis mellifera πετούν προς τον εισβολέα για να τον εκδιώξουν, να τον δαγκώσουν ή τον κεντρίσουν, οι Ασιατικές μέλισσες Apis cerana υποχωρούν προς το εσωτερικό της κυψέλης μέσω μιας μικρής και καλά φρουρούμενης εισόδου και επιτίθενται για να κεντρίσουν μόνο μετά από επίμονη και παρατεταμένη ενόχληση. Αντιθέτως, οι γιγαντόσωμες μέλισσες Apis dorsata οι οποίες καλύπτουν τις μη- 22

36 προστατευμένες κηρήθρες τους με μία κουρτίνα μελισσών, αντιδρούν με μεγάλη επιθετικότητα και επιφέρουν πολλαπλά κεντρίσματα τον εχθρό, τον οποίο καταδιώκουν σε μεγάλη απόσταση (Seleey et al., 1982). Πέρα από τα κεντρίσματα, οι μέλισσες έχουν αναπτύξει κάποιους διαφορετικούς και αξιοθαύμαστους μηχανισμούς αντιμετώπισης των εχθρών τους. Για παράδειγμα, εργάτριες της Apis mellifera και της Apis cerana, εκτοξεύουν ριπές αέρα και απομακρύνουν μυρμήγκια που πλησιάζουν τις εισόδους των κυψελών τους (Spangler και Taber, 1970; Seleey et al., 1982) ενώ για να αντιμετωπίσουν τον ίδιο εχθρό, οι μικρόσωμες μέλισσες Apis florea καλύπτουν με κολλώδεις ουσίες τον κορμό και όλα τα κλαδιά που θα μπορούσαν να αποτελέσουν γέφυρα προς την κυψέλη, με αποτέλεσμα τα μυρμήγκια να μην μπορούν να περάσουν και να παγιδεύονται (Seeley et al., 1982; Duangphakdee et al., 2005). Ακόμη και είδη μελισσών που δεν διαθέτουν κεντρί, μπορούν να αντιμετωπίσουν έναν εισβολέα. Για παράδειγμα, οι μέλισσες Trigona corvina επιτίθενται κατά εκατοντάδες στον εισβολέα δαγκώνοντάς τον (Roubik, 1992) ενώ οι μέλισσες Oxytrigona mellicolor, καθώς δαγκώνουν τον εχθρό, εκκρίνουν μία καυστική ουσία, το μυρμηκικό οξύ από αδένες του κεφαλιού (Roubik at al., 1987). Ιδιαίτεροι μηχανισμοί εμπλέκονται στην αντιμετώπιση διαφόρων ειδών σφηκών από τα διαφορετικά είδη μελισσών. Κατά τον εντοπισμό και την προσέγγιση μίας σφήκας στην κυψέλη, παράγεται από μέλισσες Apis mellifera (Butler, 1974), Apis florea (Pirk et al., 2002), και Apis dorsata (Kastberger et al., 1998) ένας χαρακτηριστικός, οξύς ήχος (hissing) ο οποίος συνοδεύεται συνήθως με το φαινόμενο της μαρμαρυγής (shimmering), κατά το οποίο οι αμυνόμενες μέλισσες στην είσοδο της κυψέλης κινούν συντονισμένα τα φτερά και τις κοιλιές τους, δημιουργώντας ένα φαινόμενο κυματισμού το οποίο αποτρέπει την προσέγγιση των σφηκών (Butler, 1954; Seleey et al., 1982). Αν οι στρατηγικές αποτροπής δεν αποδώσουν και οι μέλισσες εμπλακούν με την επιτιθέμενη σφήκα, το κεντρί συνήθως αποδεικνύεται αναποτελεσματικό στο να διαπεράσει τον σκληρό εξωσκελετό μεγαλόσωμων σφηκών. Έτσι, οι ασιατικές μέλισσες Apis cerana που αντιμετωπίζουν μεγαλόσωμες σφήκες όπως τη Vespa simillima και τη Vespa mandarinia (Ono et al., 1987; Ono et al., 1995) αλλά και οι μέλισσες Apis nuluensis που αντιμετωπίζουν τη σφήκα Vespa multimaculata (Koeniger et al., 1996), επιστρατεύουν ένα μεγάλο αριθμό εργατριών που επιτίθενται ταχύτατα και κουβαριάζουν τη σφήκα σε μία σφαίρα μελισσών. Στη συνέχεια, θανατώνουν τον παγιδευμένο εισβολέα ανεβάζοντας τη θερμοκρασία στον πυρήνα της σφαίρας πάνω από το θερμοκρασιακό ανώτατο όριο θνησιμότητας (upper lethal thermal point) της σφήκας, προκαλώντας της μ αυτό τον τρόπο θερμοπληξία. 23

37 Η κυπριακή μέλισσα Apis mellifera cypria αντιμετωπίζει με μαζική άμυνα τη σφήκα Vespa orientalis, οι επιθέσεις της οποίας την καθιστούν τον πιο επικίνδυνο εχθρό της, κυρίως κατά το τέλος του καλοκαιριού και τους δύο πρώτους μήνες του φθινοπώρου. Οι βιβλιογραφικές πηγές που περιγράφουν αυτή την αμυντική συμπεριφορά είναι περιορισμένες (Butler, 1954; Morse, 1978; Adam, 1983) και βασίζονται ουσιαστικά σε απλές παρατηρήσεις μεμονωμένων φαινομένων και όχι σε πειραματικά δεδομένα. Στο παρών κεφάλαιο περιγράφονται πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε μελίσσια της κυπριακής μέλισσας με στόχο να καταγραφεί και να αναλυθεί λεπτομερώς η συμπεριφορά της κατά τις διαφορετικές φάσεις της επίθεσης από σφήκες (πριν την επίθεση, κατά την προσέγγιση και κατά τη συμπλοκή). ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Υλικά Για τη σύλληψη σφηκών και την προσομοίωση επιθέσεων στα μελίσσια, χρησιμοποιήθηκε εντομολογική απόχη, εντομολογικός κλωβός, φορητή φιάλη CO 2 και λεπτό νάιλον νήμα. Για την παρακολούθηση και την καταγραφή της συμπεριφοράς των μελισσιών κατά τις φάσεις της επίθεσης μίας σφήκας ή μοντέλων σφηκών, χρησιμοποιήθηκαν ψηφιακές κάμερες Sony και Panasonic, ενώ για τη φωτογράφηση των εισόδων των κυψελών και των φραγμάτων πρόπολης, χρησιμοποιήθηκαν ψηφιακές φωτογραφικές μηχανές Kodak P mp και Kodak CX mp. Για την επεξεργασία των ταινιών από τις καταγραφές, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό επεξεργασίας εικόνας και βίντεο Pinnacle Liquid Edition V6 ενώ για την πραγματοποίηση μετρήσεων και αναλύσεων στις εικόνες, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό ανάλυσης εικόνας ImageJ. Για τη μελέτη επί μέρους στοιχείων της αμυντικής συμπεριφοράς, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα πήλινα μοντέλα σφηκών διαφορετικών χρωμάτων και μεγεθών. Όλα τα πειράματα μελέτης της συμπεριφοράς πραγματοποιήθηκαν σε 30 μελίσσια στην περιοχή της Άλασσας, τα οποία επιλέχθηκαν βάσει του ιστορικού τους (καμία εισαγωγή βασιλισσών, καμία εφαρμογή μεθόδων επιλογής και βελτίωσης από το μελισσοκόμο) και των αποτελεσμάτων ανάλυσης μιτοχονδριακού και μικροδορυφορικού DNA. 24

38 Μέθοδοι Προσομοίωση επιθέσεων με παγιδευμένες σφήκες - Κίνηση αμυνομένων μελισσών Με σκοπό να καταγραφεί η αμυντική συμπεριφορά των μελισσών απέναντι στις επιτιθέμενες σφήκες και να βρεθούν συγκρίσιμα μεγέθη (πέρα από την περιγραφή της καταγραφής σε συνάρτηση με το χρόνο), παγιδεύτηκαν σφήκες με την ακόλουθη διαδικασία: Με εντομολογική απόχη πιάνονταν σφήκες από την περιοχή του μελισσοκομείου. Ακολουθούσε νάρκωσή τους με τη χρήση διοξειδίου του άνθρακα για 3 δευτερόλεπτα. Οι αναισθητοποιημένες σφήκες δένονταν από το μίσχο με λεπτό νάιλον νήμα, μήκους περίπου εκατοστών. Η επίδραση του διοξειδίου του άνθρακα διαρκούσε για περίπου δύο λεπτά και στη συνέχεια, οι σφήκες άρχιζαν να επανέρχονται από τη νάρκωση. Σε χρόνο λεπτών μετά την πλήρη επαναφορά τους, οι σφήκες μπορούσαν να πετάξουν και να κινηθούν με άνεση, στην περιορισμένη όμως ακτίνα των 10 περίπου εκατοστών. Οι σφήκες αυτές, πλησίαζαν την κυψέλη και η συμπεριφορά των μελισσών καταγραφόταν με ψηφιακή κάμερα, τοποθετημένη σταθερά, σε απόσταση 30 εκατοστών από τη σανίδα πτήσης. Η όλη καταγραφή είχε διάρκεια 5-5,5 λεπτά ανά επίθεση. Στα 30 πρώτα δευτερόλεπτα η σφήκα παρέμενε σε απόσταση 10 εκατοστών από τη σανίδα πτήσης (χωρίς προσέγγιση και επαφή με τις μέλισσες) και καταγραφόταν μόνο η δραστηριότητα των φρουρών και η συχνότητα πτήσης των συλλεκτριών. Στη συνέχεια, η σφήκα πλησίαζε σε απόσταση που της επέτρεπε να πετάξει, να προσγειωθεί στη σανίδα πτήσης και να εμπλακεί με τις αμυνόμενες μέλισσες. Όλες οι ταινίες από τις καταγραφές, μετατράπηκαν σε εικόνες με τη χρήση του λογισμικού προγράμματος (Pinnacle Liquid Edition V6) και η κάθε εικόνα αναλύθηκε με τη χρήση του λογισμικού προγράμματος ImageJ. Αν και σε αντίστοιχα πειράματα ανάλυσης δεδομένων από εικόνες οπτικογραφήσεων χρησιμοποιείται μία εικόνα ανά 30 δευτερόλεπτα (Collins et al., 1982), για μεγαλύτερη ακρίβεια, κατά την παρούσα εργασία, αναλύθηκε μία εικόνα ανά 15 δευτερόλεπτα. Η ανάλυση των εικόνων αποσκοπούσε στο α) να υπολογίσει τον αριθμό των μελισσών που εμπλέκονται στην οργανωμένη, μαζική άμυνα κατά την επίθεση της σφήκας, β) να προσδιορίσει τον τρόπο άμυνας-κίνησης των φρουρών, την ύπαρξη ή απουσία κεντρισμάτων, το φαινόμενο της μαρμαρυγής κτλ. Με τη χρήση του ImageJ, κατέστη εφικτό να μετρηθεί ο ακριβής αριθμός των εργατριών σε κάθε εικόνα (μία προς μία) ή να υπολογιστεί με βάση το εμβαδόν που κάλυπταν στη σανίδα πτήσης και τη χρήση κατάλληλης μετατροπής (μέλισσες/εμβαδόν) με τη χρήση του ImageJ (εικόνα 10). Το λογισμικό χρησιμοποιούσε γνωστές και σταθερές αποστάσεις, όπως το μήκος a και το πλάτος b στη σανίδα πτήσης, για να υπολογίσει το εμβαδόν που κάλυπταν οι εργάτριες σε όλα τα στάδια της οπτικογράφησης. 25

39 Σε κάθε πείραμα και σε κάθε επανάληψη, χρησιμοποιήθηκε νέα σφήκα για να αποκλειστεί το ενδεχόμενο αλλοίωσης της συμπεριφοράς, είτε λόγω φερομονών σήμανσης και επιθετικότητας που θα υπήρχαν στο σώμα σφήκας, είτε λόγω πιθανού τραυματισμού ή καταπόνησης της παγιδευμένης σφήκας που είχε ήδη εμπλακεί με μέλισσες. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε 10 διαφορετικά μελίσσια με στόχο να καταγραφεί και να αναλυθεί η αμυντική συμπεριφορά του κάθε μελισσιού. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν σε τέσσερεις διαφορετικές περιόδους: Οκτώβριος 2004, Νοέμβριος 2004, Απρίλιος 2005 και Σεπτέμβριος Κατά τα πειράματα του Οκτωβρίου και Νοεμβρίου 2004, χρησιμοποιήθηκαν τα ίδια μελίσσια, γεγονός που επέτρεψε να μελετηθεί η συμπεριφορά τους σε δύο περιόδους με διαφορετικές συνθήκες (δύναμη μελισσιών, συχνότητα επιθέσεων σφηκών, καιρικές συνθήκες). Εικόνα 10. Χρήση του ImageJ για υπολογισμό των μελισσών που καλύπτουν τη σανίδα πτήσης. Σημαδεύονται γνωστές αποστάσεις (μήκος a και πλάτος b της σανίδας πτήσης), οι οποίες χρησιμοποιούνται ως σταθερές από το λογισμικό ImageJ, για τον υπολογισμό του αριθμού των μελισσών που βρίσκονται στη σανίδα πτήσης κατά τις επιθέσεις των σφηκών 26

40 Προσδιορισμός του ρόλου των φραγμάτων πρόπολης στις εισόδους των κυψελών, στην εκδήλωση αμυντικής συμπεριφοράς Όλες οι είσοδοι των μελισσιών που παρατηρήθηκαν στα πειράματα το Σεπτέμβριο του 2005, φωτογραφήθηκαν με ψηφιακή φωτογραφική KodakCX mp. Η φωτογράφηση πραγματοποιήθηκε ημέρα που στο μελισσοκομείο έπνεαν ισχυροί άνεμοι και η θερμοκρασία ήταν σχετικά χαμηλή για να μην υπάρχουν μέλισσες στις εισόδους. Με τη χρήση του λογισμικού ImageJ μετρήθηκε ο αριθμός και το εμβαδόν του κάθε ανοίγματος. Για υπολογιστεί το αν οι σφήκες μπορούν να περάσουν μέσω του κάθε ανοίγματος στα φράγματα πρόπολης, μετρήθηκε η μεγαλύτερη διάμετρος από 25 σφήκες που συλλέχθηκαν στο μελισσοκομείο. Ως μεγαλύτερη διάμετρος θεωρήθηκε η μεγαλύτερη απόσταση του θώρακα (ως του πιο ογκώδους μέρους του σώματος της σφήκας) που μπορούσε να μετρηθεί με διαστημόμετρο διατομής. Υπολογίστηκε η επιφάνεια που καλύπτει θεωρητικά η κάθετη τομή στο σώμα των σφηκών, με στόχο να βρεθεί το ποσοστό επιτυχούς διείσδυσης του μέσου όρου των σφηκών από τα ανοίγματα πρόπολης στην είσοδο της κάθε κυψέλης. Για να εξεταστεί αν ό τρόπος κατασκευής των φραγμάτων πρόπολης και των ανοιγμάτων τους από τις μέλισσες είναι τυχαίος ή όχι, τα φράγματα από 18 εισόδους κυψελών καταστράφηκαν ολοσχερώς το εκέμβριο του Πριν την καταστροφή, φωτογραφήθηκαν όλες οι είσοδοι των κυψελών και προσδιορίστηκε η μορφή της συμπεριφοράς του κάθε μελισσιού, το αν δηλαδή οι αμυνόμενες μέλισσες επιτίθενται στις σφήκες ή αν υποχωρούν πίσω από τα φράγματα πρόπολης. Η ανακατασκευή των φραγμάτων από τις μέλισσες, παρακολουθήθηκε επί ένα έτος. Τους μήνες Μάρτιο, Μάιο, Ιούλιο, Αύγουστο, Σεπτέμβριο και Οκτώβριο του 2006, όλες οι είσοδοι των κυψελών φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκε η επιφάνεια και ο αριθμός των ανοιγμάτων πρόπολης μέσω του λογισμικού ImageJ, με στόχο να συγκριθεί η μορφή των αρχικών φραγμάτων ( εκέμβριος 2005) με την τελική μορφή των φραγμάτων μετά την ανακατασκευή (Οκτώβριος 2006). Το πείραμα συμπληρώθηκε με τα 8 από τα αρχικά 18 μελίσσια, λόγω κλοπής των υπολοίπων. Προσομοίωση επιθέσεων με μοντέλα σφηκών Κατασκευάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα πήλινα μοντέλα (εικόνα 11). Ένα μεγέθους 2,5cm (μικρότερο μέγεθος από τις πραγματικές σφήκες) και τρία μεγέθους 3,5cm (ίδιο μέγεθος με τις πραγματικές σφήκες). Το κάθε μοντέλο έφερε διαφορετικούς χρωματισμούς: 1. κίτρινο, 2. λευκό με την κίτρινη χαρακτηριστική περιοχή της κοιλιάς (3 ο και 27

41 4 ο άρθρο), καφέ και κίτρινο (όμοιο με πραγματική σφήκα) και μαύρο με την κίτρινη χαρακτηριστική περιοχή της κοιλιάς. Τα μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν με τον ίδιο ακριβώς τρόπο που χρησιμοποιήθηκαν οι πραγματικές σφήκες στα πειράματα προσομοίωσης. Οι ταινίες από τα πειράματα με τις προσεγγίσεις των μοντέλων σφηκών μετατράπηκαν σε εικόνες και επεξεργάστηκαν με το σύστημα ImageJ. Στο πρώτο πείραμα, τα 4 μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν σε προσομοίωση επίθεσης σε 5 μελίσσια. Η οπτικογράφηση των τεχνητών επιθέσεων διαρκούσε 1 λεπτό από την προσέγγιση της σφήκας ενώ πριν την προσέγγιση, η φυσιολογική δραστηριότητα των μελισσών καταγράφηκε για 10 δευτερόλεπτα. Η κάθε ταινία μετατράπηκε σε 7 εικόνες (1 εικόνα/10 δευτερόλεπτα). Η ανάλυση των εικόνων είχε ως στόχο: α) να βρεθεί η επίδραση των οπτικών ερεθισμάτων στην εκδήλωση της αμυντικής συμπεριφοράς των μελισσιών και να καταγραφεί η κίνηση των αμυνομένων εργατριών κατά τη διάρκεια της τεχνητής επίθεσης, β) τον προσδιορισμό του αριθμού των μελισσών που επιτέθηκαν σε κάθε μοντέλο καθώς και το σημείο στο σώμα του μοντέλου που δέχθηκε την κάθε επίθεση, γ) τη χρονική σειρά με την οποία το σώμα του μοντέλου δέχθηκε την κάθε επίθεση (σημείο επίθεσης της 1 ης, 2 ης, 3 ης κτλ μέλισσας που επιτέθηκε). Στο δεύτερο πείραμα έγινε προσομοίωση επίθεσης μαύρων και λευκών μοντέλων σφηκών σε τρία μελίσσια. Πραγματοποιήθηκαν δέκα επαναλήψεις κάθε μοντέλου με εναλλαγή. Η ανάλυση των ταινιών έγινε όπως και στο πρώτο πείραμα με μόνη διαφορά πως η κάθε ταινία μετατράπηκε σε 11 εικόνες (1 εικόνα/6 δευτερόλεπτα), με στόχο να βρεθεί το αν η εκδήλωση της μορφής της αμυντικής συμπεριφοράς παραμένει σταθερή στο χρόνο. 28

42 Εικόνα 11. Μοντέλα σφηκών κατά την προσομοίωση επιθέσεων σε μελίσσια (εικόνες από οπτικογράφηση) Παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της αμυντικής συμπεριφοράς Για να προσδιοριστεί το αν μία από τις δύο διαφορετικές μορφές συμπεριφοράς είναι αποτελεσματικότερη από την άλλη, μελετήθηκε ένα μελισσοκομείο στην περιοχή της Βάσσας, το οποίο δέχθηκε μαζική επίθεση από σφήκες τον Οκτώβριο του Τόσο τα μελίσσια που καταστράφηκαν από τις σφήκες όσο και αυτά που επιβίωσαν, φωτογραφήθηκαν για να συγκριθεί η κατασκευή των φραγμάτων πρόπολης που κάλυπταν τις εισόδους τους. Επίσης, για να μελετηθεί το πώς συμπεριφέρονται μελίσσια που παρουσιάζουν διαφορετική συμπεριφορά όταν βρεθούν σε κυψέλες με φράγματα πρόπολης αντίθετης μορφής από τα δικά τους, μεταγγίστηκαν 2 μελίσσια από κυψέλες που είχαν μικρά ανοίγματα πρόπολης σε κυψέλες με μεγάλα ανοίγματα και αντιστρόφως. Καταγράφηκε η συμπεριφορά των μελισσιών και η αποτελεσματικότητά τους στο να αντιμετωπίσουν τις επιτιθέμενες σφήκες. 29

43 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Προσομοίωση επιθέσεων με παγιδευμένες σφήκες-κίνηση αμυνομένων μελισσών Άνοιξη Από τα πειράματα με τις παγιδευμένες σφήκες που πραγματοποιήθηκαν σε 10 μελίσσια την άνοιξη (Μάιος 2005), η κίνηση των αμυνόμενων μελισσών παρουσιάζεται στην εικόνα 12. Οι καμπύλες στις γραφικές παραστάσεις παρουσιάζουν την κίνηση των αμυνομένων μελισσών, εκφρασμένες σε αριθμό εργατριών στη σανίδα πτήσης, στο χρόνο. Την άνοιξη, όταν μία σφήκα πλησιάζει την κυψέλη, οι μέλισσες εκδηλώνουν μία μη συντονισμένη και μη μαζική αμυντική συμπεριφορά. Αρχικά, ελάχιστες φρουροί που βρίσκονται στην είσοδο του μελισσιού επιτίθενται εν πτήσει στη σφήκα που πλησιάζει. Όσο αυξάνεται ο χρόνος της τεχνητής επίθεσης, τόσο αυξάνεται και ο αριθμός των μελισσών που πετάνε και επιτίθενται στη σφήκα, σε μια προσπάθεια να την εκδιώξουν, συνήθως χωρίς να την κεντρίζουν. Τα κεντρίσματα των μελισσών είναι περισσότερα από το φθινόπωρο και η επιθετικότητά τους μαζικοποιείται την εποχή αυτή. Σε μερικές περιπτώσεις, οι επιτιθέμενες μέλισσες πλησιάζουν τις 100. Τα μελίσσια παρουσιάζουν όμοια συμπεριφορά και ως προς την κίνηση των αμυνομένων μελισσών στη μονάδα του χρόνου. Φθινόπωρο Περιγραφή Πριν την έναρξη της προσέγγισης της σφήκας, τα μελίσσια παρουσιάζουν συνήθως δύο εικόνες: Στη μία ομάδα μελισσιών (Α), μικρό ή μεγάλο μέρος της σανίδας πτήσης είναι καλυμμένο με αριθμό φρουρών. Σε μερικές περιπτώσεις, η κάλυψη μπορεί να φτάσει ή και να ξεπεράσει τα 2/3 της σανίδας πτήσης (εικόνα 13). Στην άλλη ομάδα (Β), ελάχιστοι φρουροί βρίσκονται στη σανίδα πτήσης. Αριθμός φρουρών βρίσκεται στην είσοδο του μελισσιού, παραταγμένος ανάμεσα στα ανοίγματα που αφήνει η πρόπολη με την οποία το μελίσσι φράσει μικρό ή μεγάλο μέρος της εισόδου (εικόνα 14). 30

44 100 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) 100 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) 100 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) 100 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) 100 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) Εικόνα 12. Καμπύλες συμπεριφοράς 10 μελισσιών. Παρουσιάζεται ο αριθμός μελισσών που επιτίθενται στη σφήκα σε συνάρτηση με το χρόνο (Άνοιξη 2005) 31

45 Εικόνα 13. Πλήθος φρουρών στη σανίδα πτήσης (ομάδα Α) Εικόνα 14. Ελάχιστοι φρουροί στη σανίδα πτήσης (ομάδα Β) ιακρίνεται το μικρόφωνο για την καταγραφή ήχων Κατά την προσέγγιση της σφήκας, η πρώτη συνήθως αντίδραση που παρουσιάζουν οι παραταγμένες μέλισσες στη σανίδα πτήσης, είναι το φαινόμενο της μαρμαρυγής (shimmering). Η κουρτίνα που δημιουργούν μπροστά από την είσοδο και η λάμψη που παράγει η κίνηση των φτερών τους, δρα πολλές φορές αποτρεπτικά και κρατάει σε μικρή απόσταση τις σφήκες. Αν, παρά τη μαρμαρυγή, η σφήκα προσεγγίσει τη σανίδα πτήσης, παρατηρούνται δύο διαφορετικές μορφές αντίδρασης: Στην πρώτη περίπτωση, οι φρουροί στη σανίδα πτήσης αυξάνονται ταχύτατα και οι μέλισσες ακολουθούν κινούμενες τη φορά κίνησης της σφήκας. Στη δεύτερη περίπτωση, οι φρουροί που βρίσκονται στη είσοδο υποχωρούν προς το 32

46 εσωτερικό της κυψέλης και συνωστίζονται στην είσοδο, μπροστά ή πίσω από τα φράγματα πρόπολης. εν υπάρχει κατ ανάγκη συσχέτιση ανάμεσα στις ομάδες Α και Β και στις δύο συμπεριφορές που ακολουθούν. ηλαδή, η αρχική εικόνα πριν την εμφάνιση της σφήκας δεν παίζει πάντα ρόλο στο πως συμπεριφέρεται το μελίσσι μόλις αντιληφθεί τη σφήκα. Για παράδειγμα, όπως φαίνεται και από τις καμπύλες στις γραφικές παραστάσεις στις εικόνες 17 και 18, σε κάποια μελίσσια των οποίων οι σανίδες πτήσης καλύπτονται από μεγάλο αριθμό μελισσών, η εμφάνιση της σφήκας μπορεί να προκαλέσει τη γρήγορη υποχώρησή τους προς το εσωτερικό της κυψέλης (μελίσσι 8) ενώ σε κάποια άλλα μπορεί να προκαλέσει ταχύτατη αύξηση των μελισσών που βρίσκονται στη σανίδα πτήσης (μελίσσι 1 και 6). Ένα αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό όλων των μελισσιών κατά την προσέγγιση της σφήκας είναι πως, ανεξάρτητα της μορφής της αμυντικής συμπεριφοράς την οποία εκδηλώνουν, δεν παρατηρείται καμία πτήση μελισσών προς τον εισβολέα. Οι αμυνόμενες μέλισσες δηλαδή δεν εγκαταλείπουν τη σανίδα πτήσης. Κατά τη συμπλοκή με τις σφήκες, στα μελίσσια που παρουσιάζουν τη μορφή συμπεριφοράς Α, οι μέλισσες προσπαθούν να κυκλώσουν τη σφήκα και να την παγιδέψουν σε μία σφαίρα εργατριών. Πρόκειται για το φαινόμενο balling (εικόνες 15 και 16), το οποίο εκτυλίσσεται είτε στη σανίδα πτήσης είτε στην είσοδο της κυψέλης. Χαρακτηριστική είναι η σειρά με την οποία οι αμυνόμενες μέλισσες έρχονται σε επαφή με τη σφήκα. Συνήθως η πρώτη εργάτρια επιτίθεται ή πέφτει θύμα στα σαγόνια της σφήκας, ενώ οι εργάτριες που την ακολουθούν επιτίθενται σχεδόν πάντα, πρώτα στην κοιλιά, στη συνέχεια στο θώρακα και τέλος προσπαθούν να καλύψουν το κεφάλι. Παρατηρήθηκε σε πάρα πολλές περιπτώσεις, εργάτριες να δαγκώνουν τα φτερά και τα πόδια της σφήκας και να προσπαθούν να την σύρουν στο εσωτερικό της κυψέλης, γεγονός που επιτεύχθηκε στα μελίσσια 4 και 6 (εικόνα 17) ενώ σε άλλα μελίσσια (1, 2, 4 και 5) της ίδιας ομάδας (Α) η σφαίρα δημιουργήθηκε στη σανίδα πτήσης. εν παρατηρήθηκε προσπάθεια από τις μέλισσες να κεντρίσουν τη σφήκα. Στις περισσότερες περιπτώσεις κατά τη συμπλοκή, ακουγόταν ένας διαπεραστικός ήχος (hissing) από τις αμυνόμενες μέλισσες. Ο συγκεκριμένος ήχος καταγράφηκε, απομονώθηκε, (από τους υπόλοιπους ήχους της ηχογράφησης) και αναπαράχθηκε ψηφιακά, ενώ αναλύθηκαν οι συχνότητες στις οποίες εκπέμπεται (βλ. κεφάλαιο ήχος αμυνομένων μελισσών ). 33

47 Εικόνα 15. ημιουργία σφαίρας γύρω από τη σφήκα στη σανίδα πτήσης Εικόνα 16. Οι εργάτριες παραμένουν γύρω από τη σφήκα ακόμη και όταν αυτή απομακρύνεται Μετρήσεις Οι μετρήσεις του αριθμού των μελισσών που αντιμετωπίζουν επιτιθέμενη σφήκα, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν σε εικόνες με συχνότητα 1 εικόνα/15 δευτερόλεπτα, έδωσαν χαρακτηριστικές καμπύλες που δείχνουν την συμπεριφορά των αμυνομένων μελισσών. Η 34

48 ανάλυση των εικόνων από τρεις επαναλήψεις (Οκτώβριος 2004, Νοέμβριος 2004, Σεπτέμβριος 2005), πραγματοποιήθηκε σε ταινίες από 10 μελίσσια ανά πείραμα. Τα αποτελέσματα έδωσαν τις χαρακτηριστικές καμπύλες ανά μελίσσι που παρουσιάζονται στις εικόνες 17-18,20-21 και Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Μελίσσι Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Μελίσσι Χρόνος (seconds) Μελίσσι Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Μελίσσι Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Εικόνα 17. Καμπύλες συμπεριφοράς σε 7 από τα 10 μελίσσια. Παρουσιάζεται ο αριθμός μελισσών που επιτίθενται στη σφήκα σε συνάρτηση με το χρόνο. Όλα τα μελίσσια αυτής της ομάδας (Α) αντιμετωπίζουν τη σφήκα εκτός κυψέλης (Οκτώβριος 2004) 35

49 450 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Μελίσσι Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Εικόνα 18. Καμπύλες συμπεριφοράς σε 3 από τα 10 μελίσσια. Παρουσιάζεται ο αριθμός μελισσών που επιτίθενται στη σφήκα σε συνάρτηση με το χρόνο. Όλα τα μελίσσια αυτής της ομάδας (Β) δεν αντιμετωπίζουν τη σφήκα εκτός κυψέλης και υποχωρούν προς το εσωτερικό (Οκτώβριος 2004) 450 Οκτώβριος Αριθμός μελισσών Υποχώρηση Επ ίθεση Χρόνος (seconds) Εικόνα 19. Μέσος όρος του αριθμού μελισσών στο χρόνο που αντιμετωπίζουν τη σφήκα στις δύο διαφορετικές ομάδες συμπεριφοράς 36

50 Πίνακας 6. Μέσος όρος μελισσών που αμύνονται στη σανίδα πτήσης, ανά 15 δευτερόλεπτα, ανάμεσα στις δύο ομάδες συμπεριφοράς τον Οκτώβριο του 2004 Χρόνος (sec) Υποχώρηση (αριθμός μελισσών) Επίθεση (αριθμός μελισσών) ,00 214, ,00 221, ,00 257, ,67 262, ,67 260, ,67 249, ,33 238, ,33 259, ,67 242, ,67 240, ,67 210, ,67 220, ,33 232, ,67 215, ,67 217, ,00 227, ,67 242, ,33 237, ,00 189, ,67 230, ,00 247,43 n Μέσος όρος 47,36 a 234,06 b Τυπ. Σφάλμα 5,849 4,171 Στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στους μέσους όρους σημειώνονται με διαφορετικό γράμμα (a,b) σύμφωνα με το Students t-κριτήριο Οι μέσοι όροι των εργατριών που βρίσκονται στη σανίδα πτήσης και αντιμετωπίζουν τη σφήκα (στη μονάδα του χρόνου) από τα 10 μελίσσια των πειραμάτων του Οκτωβρίου 2004, παρουσιάζονται συγκεντρωτικά στην εικόνα 19. Η σύγκριση των μέσων όρων μελισσών στη μονάδα του χρόνου (πίνακας 6), έδειξε πως υπάρχουν σημαντικές διαφορές και οι δύο μορφές συμπεριφοράς διακρίνονται σαφέστατα (ttest, P<0,0001). 37

51 200 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) 200 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) 200 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) Εικόνα 20. Καμπύλες συμπεριφοράς σε 6 από τα 10 μελίσσια. Παρουσιάζεται ο αριθμός μελισσών που επιτίθενται στη σφήκα σε συνάρτηση με το χρόνο. Όλα τα μελίσσια αυτής της ομάδας (Α) αντιμετωπίζουν τη σφήκα εκτός κυψέλης (Νοέμβριος 2004) Οι μέσοι όροι των εργατριών που βρίσκονται στη σανίδα πτήσης και αντιμετωπίζουν τη σφήκα (στη μονάδα του χρόνου) από τα 10 μελίσσια των πειραμάτων του Νοεμβρίου 2004, παρουσιάζονται συγκεντρωτικά στην εικόνα 22. Η σύγκριση των μέσων όρων μελισσών στη μονάδα του χρόνου έδειξε πως τον Νοέμβριο, όπως και τον Οκτώβριο, υπήρχαν σημαντικές διαφορές (πίνακας 7) και οι δύο μορφές συμπεριφοράς, διακρίνονται σαφέστατα (P<0,0001). 38

52 200 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) 200 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) Εικόνα 21. Καμπύλες συμπεριφοράς σε 4 από τα 10 μελίσσια. Παρουσιάζεται ο αριθμός μελισσών που επιτίθενται στη σφήκα σε συνάρτηση με το χρόνο. Όλα τα μελίσσια αυτής της ομάδας (Β) δεν αντιμετωπίζουν τη σφήκα εκτός κυψέλης και υποχωρούν προς το εσωτερικό (Νοέμβριος 2004) 160 Νοέμβριος Αριθμός μελισσών Υποχώρηση Επίθεση Χρόνος (seconds) Εικόνα 22. Μέσος όρος του αριθμού μελισσών στο χρόνο που αντιμετωπίζουν τη σφήκα στις δύο διαφορετικές ομάδες συμπεριφοράς 39

53 Πίνακας 7. Μέσος όρος μελισσών που αμύνονται στη σανίδα πτήσης, ανά 15 δευτερόλεπτα, ανάμεσα στις δύο ομάδες συμπεριφοράς το Νοέμβριο του 2004 Χρόνος (sec) Υποχώρηση (αριθμός μελισσών) Επίθεση (αριθμός μελισσών) -30 1,5 13, , , ,75 16, , ,75 12, ,25 11, ,5 15, , ,75 28, ,75 30, ,25 36, ,5 48, ,25 54, ,75 57, ,75 63, ,5 74,67 n Μέσος όρος 2,779 a 30,628 b Τυπ. Σφάλμα 0,3725 5,146 Στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στους μέσους όρους σημειώνονται με διαφορετικό γράμμα (a,b) σύμφωνα με το Students t-κριτήριο Οι μέσοι όροι των εργατριών που βρίσκονται στη σανίδα πτήσης και αντιμετωπίζουν τη σφήκα (στη μονάδα του χρόνου) από τα 10 μελίσσια των πειραμάτων του Σεπτεμβρίου 2005, παρουσιάζονται συγκεντρωτικά στην εικόνα 25. Η σύγκριση των μέσων όρων μελισσών στη μονάδα του χρόνου, έδειξε πως το Σεπτέμβριο του 2005, όπως και τον Οκτώβριο και το Νοέμβριο του 2004, υπήρχαν σημαντικές διαφορές (πίνακας 8) και οι δύο μορφές συμπεριφοράς, διακρίνονται σαφέστατα (P<0,0002). Τα αποτελέσματα των γραφικών παραστάσεων στις εικόνες και 20-21, προέρχονται από τα ίδια μελίσσια (2004) με ένα μήνα διαφορά ανάμεσα στις μετρήσεις. Τα αποτελέσματα στις εικόνες 23-24, αναφέρονται σε διαφορετικά μελίσσια από εκείνα των πρώτων δύο πειραμάτων. 40

54 100 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) Μελίσσι 13 Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) Μελίσσι Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Εικόνα 23. Καμπύλες συμπεριφοράς για 5 από τα 10 μελίσσια. Παρουσιάζεται ο αριθμός μελισσών που επιτίθενται στη σφήκα σε συνάρτηση με το χρόνο. Όλα τα μελίσσια αυτής της ομάδας (Α) αντιμετωπίζουν τη σφήκα εκτός κυψέλης (Σεπτέμβριος 2005) 41

55 100 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) 100 Μελίσσι Μελίσσι Αριθμός μελισσών Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Χρόνος (seconds) Μελίσσι Αριθμός μελισσών Χρόνος (seconds) Εικόνα 24. Καμπύλες συμπεριφοράς για 5 από τα 10 μελίσσια. Παρουσιάζεται ο αριθμός μελισσών που επιτίθενται στη σφήκα σε συνάρτηση με το χρόνο. Όλα τα μελίσσια αυτής της ομάδας (Β) δεν αντιμετωπίζουν τη σφήκα εκτός κυψέλης και υποχωρούν προς το εσωτερικό (Σεπτέμβριος 2005) 42

56 100 Σεπτέμβριος 2005 Αριθμός μελισσών Υποχώρηση Επίθεση Χρόνος (seconds) Εικόνα 25. Μέσος όρος του αριθμού μελισσών στο χρόνο που αντιμετωπίζουν τη σφήκα στις δύο διαφορετικές ομάδες συμπεριφοράς Πίνακας 8. Μέσος όρος μελισσών που αμύνονται στη σανίδα πτήσης, ανά 15 δευτερόλεπτα, ανάμεσα στις δύο ομάδες συμπεριφοράς το Σεπτέμβριο του 2005 Χρόνος (sec) Υποχώρηση (αριθμός μελισσών) Επίθεση (αριθμός μελισσών) ,4 0,6 30 0, ,2 9,4 60 3, ,8 26,4 90 8,2 28, ,6 27, ,4 29, ,4 29, ,8 28, ,6 34, ,6 35, ,4 37,2 N Μέσος όρος 3,165 a 20,047 b Τυπ. Σφάλμα 0,7585 3,398 Στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στους μέσους όρους σημειώνονται με διαφορετικό γράμμα (a,b) σύμφωνα με το Students t-κριτήριο -Από τις καμπύλες και τις συγκρίσεις στους πίνακες 6, 7 και 8, φάνηκε καθαρά ότι υπάρχουν δύο διακριτές και αντίθετες μορφές αμυντικής συμπεριφοράς, Α και Β, οι οποίες ακολουθούν δύο διαφορετικές στρατηγικές : Τα μελίσσια της ομάδας Α πραγματοποιούν επίθεση προς τη σφήκα όταν αυτή προσεγγίσει τη σανίδα πτήσης και προσπαθήσει να αρπάξει κάποια 43

57 μέλισσα. Η επίθεση είναι ταχύτατη, ο αριθμός των μελισσών που συμπλέκονται αυξάνεται με γρήγορους ρυθμούς και συνήθως το τελικό αποτέλεσμα είναι η δημιουργία σφαίρας, είτε πάνω στη σανίδα πτήσεως είτε μέσα στην κυψέλη, όπου οι εργάτριες παρασέρνουν τη σφήκα. Αντιθέτως, οι μέλισσες στα μελίσσια της ομάδας Β πραγματοποιούν υποχώρηση προς την είσοδο της κυψέλης. Συνωστίζονται ανάμεσα στα περάσματα της πρόπολης που φράσσουν σε μεγάλο βαθμό την είσοδο. Προσπαθούν να αποκρούσουν τη σφήκα όταν αυτή επιχειρεί είτε να αρπάξει κάποια μέλισσα, είτε να εισέλθει στην κυψέλη. Σε ελάχιστες περιπτώσεις, οι μέλισσες παγιδεύουν τη σφήκα ανάμεσα στα φράγματα πρόπολης και δημιουργούν σφαίρα σε εκείνα τα σημεία. -Η αρχική εικόνα του μελισσιού δεν φαίνεται να παίζει ρόλο στο ποια από τις δύο μορφές άμυνας θα εκδηλώσει το κάθε μελίσσι. Χαρακτηριστικά παραδείγματα φαίνονται στις εικόνες 17 και 18, στις καμπύλες των μελισσιών 1 και 8 αντίστοιχα. Ενώ η σανίδα πτήσης στο μελίσσι 1 ήταν ουσιαστικά κενή, μέσα σε περίπου 60 δευτερόλεπτα, πάνω από 300 εργάτριες βγήκαν και επιτέθηκαν στη σφήκα που είχε προσεγγίσει. Αντίθετα, στο μελίσσι 8, ο πληθυσμός των μελισσών που υπήρχε στη σανίδα πτήσης και ξεπερνούσε τις 150, άρχισε να υποχωρεί σταδιακά προς το εσωτερικό της κυψέλης, με αποτέλεσμα να μην υπάρχουν περισσότερες από 50 εργάτριες στο τέλος της καταμέτρησης. -Ο αριθμός των μελισσών που συμμετείχαν στην άμυνα του μελισσιού είναι διαφορετικός ανάμεσα στις τρεις επεμβάσεις (Οκτώβριος 2004, Νοέμβριος 2004, Σεπτέμβριος 2005). Αυτό φαίνεται να οφείλεται τόσο σε ενδογενείς όσο και σε εξωγενείς παράγοντες. Στους ενδογενείς παράγοντες, κύριο ρόλο φαίνεται να παίζει η δύναμη του μελισσιού και η παρουσία ή όχι βασίλισσας και γόνου. Στα 9 από τα 10 μελίσσια που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα του Οκτωβρίου και Νοεμβρίου 2005, παρουσιάστηκε η ίδια μορφή συμπεριφοράς. ιαφορετικός ήταν μόνο ο αριθμός εργατριών που μπορούσαν να διαθέσουν για την άμυνα ενάντια στις σφήκες μιας και ο πληθυσμός τους είχε μειωθεί σχεδόν κατά το ήμισυ ανάμεσα στους δύο μήνες. Έτσι, ενώ τα μελίσσια της ομάδας Α μπορούσαν τον Οκτώβριο να διαθέσουν ένα μεγάλο αριθμό εργατριών και να σχηματίσουν ταχύτατα μια συμπαγή σφαίρα γύρω από της σφήκα (είτε στην σανίδα πτήσης είτε μέσα στην κυψέλη), αδυνατούσαν να το πετύχουν τόσο αποτελεσματικά το Νοέμβριο. Αν και τέσσερα μελίσσια (1, 4, 6 και 7) κατάφεραν να σχηματίσουν σφαίρα γύρω από τη σφήκα, χρειάστηκε κατά μέσο όρο υπερδιπλάσιος χρόνος για το σχηματισμό της (Οκτώβριος 60 δευτερόλεπτα, n=6, Νοέμβριος 168,75 δευτερόλεπτα, n=4). Σε κάθε περίπτωση όμως, είχαν την τάση να δημιουργήσουν τη σφαίρα και να αντιμετωπίσουν την επιτιθέμενη σφήκα εκτός κυψέλης, σε αντίθεση με τα μελίσσια της ομάδας Β που πάντα υποχωρούσαν προς το εσωτερικό και απέφευγαν τη συμπλοκή με τη 44

58 σφήκα. Η απουσία βασίλισσας και γόνου, φαίνεται πως επίσης επηρεάζει καθοριστικά την αμυντική συμπεριφορά του μελισσιού. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι το μελίσσι 5. Τον Οκτώβριο παρουσίαζε συμπεριφορά που το κατέτασσε στην ομάδα Α. Στα πειράματα του Νοεμβρίου όμως, η συμπεριφορά του φαινομενικά έμοιαζε με τη συμπεριφορά των μελισσών της ομάδας Β, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα μελίσσια των οποίων η συμπεριφορά δεν μεταβλήθηκε στο χρόνο. Όταν επιθεωρήθηκε το μελίσσι, βρέθηκε πως η βασίλισσα είχε χαθεί και δεν αντικαταστάθηκε. εν υπήρχε γόνος και είχαν παρουσιαστεί τα πρώτα αυγά από αρρενοτόκες εργάτριες. Ως αποτέλεσμα, ελάχιστες έως καμία εργάτρια δεν συμμετείχε στην άμυνα του μελισσιού και δεν συμπλεκόταν με τη σφήκα. Η συμπεριφορά αυτή εντοπίστηκε και σε άλλα 7 μελίσσια που επίσης ήταν ορφανά και στερούνταν γόνου, στην περιοχή του Πρωταρά κατά τις πρώτες παρατηρήσεις για επιλογή μελισσοκομείων για τα πειράματα τον Οκτώβριο του 2004, καθώς και σε δύο μελίσσια, τα οποία είχαν επίσης χάσει τη βασίλισσα και δεν μπόρεσαν να την αντικαταστήσουν, στην περιοχή της Άλασσας, το Σεπτέμβριο του Στους εξωγενείς παράγοντες που επιδρούν στη διαφοροποίηση της συμπεριφοράς, πέρα από τις κλιματικές συνθήκες που επηρεάζουν έμμεσα τη δύναμη του μελισσιού (θερμοκρασίες, χρόνος άνθησης, διαθέσιμη τροφή κτλ), σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζει η παρουσία ενός δεύτερου, κοινού θηρευτή που επηρεάζει τόσο τις μέλισσες όσο και τις σφήκες. Κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων το Σεπτέμβριο του 2005, σε ολόκληρη την Κύπρο, ήταν έντονη η παρουσία μεγάλων πληθυσμών μελισσοφάγων Merops apiaster. Οι συχνές πτήσεις τους πάνω από το μελισσοκομείο, περιόριζαν σε μεγάλο βαθμό, τόσο την πτήση των μελισσών και των σφηκών όσο και την παρουσία των φρουρών στις σανίδες πτήσης. Τα πιο πάνω όμως δεν έχουν ιδιαίτερη βαρύτητα μιας και αντικείμενο μελέτης είναι κυρίως η μορφή της συμπεριφοράς που παρουσιάζει το κάθε μελίσσι και όχι το πλήθος των μελισσών που συμμετέχει στην εκδήλωση αυτής της συμπεριφοράς. -Οι καμπύλες των εικόνων 17-18, και 23-24, δεν παρουσιάζουν απλά τον αριθμό των μελισσών που συμμετέχουν στην άμυνα αλλά δείχνουν το πώς συμπεριφέρεται το κάθε μελίσσι σε συνάρτηση με το χρόνο που εξελίσσεται η επίθεση. Σε αντίθεση με τα μελίσσια στις ομάδες που παρουσιάζουν τη συμπεριφορά της υποχώρησης όπου οι καμπύλες δείχνουν απλά τη σταδιακή μείωση των εργατριών στη σανίδα πτήσης όσο περνάει ο χρόνος, η μελέτη των καμπύλων της ομάδας των μελισσιών της επιθετικής μορφής συμπεριφοράς, παρουσιάζει αρκετές ιδιαιτερότητες. Χαρακτηριστικά παραδείγματα, στις καμπύλες των εικόνων 17 και 18 με τις γραφικές παραστάσεις των μελισσιών κατά τον Οκτώβριο. Τον Οκτώβριο οι επιθέσεις των μελισσοφάγων έχουν σταματήσει και ο πληθυσμός των μελισσιών αρχίζει να παρουσιάζει μία 45

59 ανάκαμψη, πριν ξαναρχίσει να μειώνεται το Νοέμβριο. Οι πληθυσμοί των σφηκών βρίσκονται σε μέγιστα επίπεδα και οι επιθέσεις στα μελίσσια είναι συνεχόμενες. Σε όλα τα μελίσσια της πρώτης ομάδας, οι μέλισσες κινήθηκαν ταχύτατα μόλις η παγιδευμένη σφήκα προσγειώθηκε πάνω στη σανίδα πτήσης και ξεκίνησε η συμπλοκή. Σε σύντομο χρόνο άρχισαν τη δημιουργία σφαίρας γύρω από τον εισβολέα. Μοναδική εξαίρεση το μελίσσι 5. Στο συγκεκριμένο μελίσσι, η σφήκα πετούσε μακριά από τις μέλισσες που προσπαθούσαν να την παγιδεύσουν και απέφευγε την εμπλοκή. Σε όλα τα μελίσσια, ο αριθμός των εργατριών στη σανίδα πτήσης αυξήθηκε άμεσα μετά την εμφάνιση της σφήκας (χρόνος -30 έως +15 δευτερόλεπτα). Στη συνέχεια, ο αριθμός των μελισσών σε αρκετές καμπύλες φαίνεται να μειώνεται, με χαρακτηριστικές περιπτώσεις των μελισσιών 2, 4 και 6. Η εξήγηση βρίσκεται στη δημιουργία της σφαίρας. Στα τρία αυτά μελίσσια, μετά τον ταχύτατο σχηματισμό της σφαίρας πριν τη συμπλήρωση των 30 πρώτων δευτερολέπτων από την έναρξη της συμπλοκής, οι υπόλοιπες εργάτριες φαίνεται να μην ασχολούνται πλέον με την αντιμετώπιση του εισβολέα και επιστρέφουν προς το εσωτερικό της κυψέλης. Στο μελίσσι 6 μάλιστα, μετά τα πρώτα 45 δευτερόλεπτα, οι εργάτριες παρασέρνουν τη σφήκα στο εσωτερικό της κυψέλης και η σφαίρα παραμένει εκεί μέχρι το τέλος της οπτικογράφησης. Κάτι αντίστοιχο συνέβη κατ αρχή και στο μελίσσι 4, το οποίο παρέσυρε τη σφήκα στο εσωτερικό της κυψέλης μέσα σε 45 δευτερόλεπτα. Αμέσως ο αριθμός των μελισσών μειώθηκε σε λιγότερες από τις μισές. Στα 75 δευτερόλεπτα όμως, η σφήκα κατάφερε να ξεφύγει και να βγει εκτός της εισόδου. Οι εργάτριες ακολούθησαν εκτός κυψέλης και ξαναεπιτέθηκαν στη σφήκα, γεγονός που φαίνεται από την κορυφή της καμπύλης στα 105 δευτερόλεπτα. Κατάφεραν να ξανακυκλώσουν τη σφήκα και να την παρασύρουν στο εσωτερικό της κυψέλης στα 120 δευτερόλεπτα. Στα 135 δευτερόλεπτα όμως, η σφήκα κατάφερε να ξεφύγει ξανά και να βγει στη σανίδα πτήσης. Οι αμυνόμενες μέλισσες την ακολουθούν εκ νέου και οι αριθμοί τους στην καμπύλη άρχισαν να αυξάνονται και πάλι, σχεδόν με σταθερό ρυθμό, μέχρι περίπου τα 225 δευτερόλεπτα που η σφαίρα δημιουργήθηκε και σταθεροποιήθηκε στη σανίδα πτήσης. Αντίθετα, τα μελίσσια της δεύτερης ομάδας, παρουσίαζαν δύο κύρια χαρακτηριστικά: Οι αμυνόμενες μέλισσες απέφευγαν να συγκρουστούν με τη σφήκα και ο αριθμός τους μειωνόταν σταθερά καθώς υποχωρούσαν ταχύτατα προς το εσωτερικό της κυψέλης. Τα φράγματα πρόπολης που έφραζαν σε μεγάλο ποσοστό τις εισόδους, φάνηκε να λειτουργούν ως μία δεύτερη γραμμή άμυνας μιας και οι εργάτριες παρέμεναν ανάμεσα στα ανοίγματα αυτών των φραγμάτων και προσπαθούσαν να εμποδίσουν σε εκείνα τα σημεία τη σφήκα από το να εισέλθει στο εσωτερικό της κυψέλης. 46

60 Η δύναμη των μελισσιών δε φάνηκε να παίζει ρόλο στο πια μορφή αμυντικής συμπεριφοράς θα εκδηλωθεί, μιας και τα μελίσσια ήταν σχετικά ισοδύναμα σε πληθυσμό και γόνο. Συγκεκριμένα, το ελαφρώς δυνατότερο μελίσσι ήταν το μελίσσι 8 (ένα πλαίσιο περισσότερο πληθυσμού σε σχέση με όλα τα υπόλοιπα), το οποίο παρουσίαζε ένα σχετικά μικρό αριθμό μελισσών στη σανίδα πτήσης ο οποίος μειώθηκε σταθερά κατά τη διάρκεια της επίθεσης (Ομάδα Β). Από τα πιο πάνω, τίθενται δύο ερωτήματα: Που μπορεί να οφείλεται η εκδήλωση διαφορετικής συμπεριφοράς ανάμεσα στα μελίσσια του ίδιου μελισσοκομείου και ποια από της δύο στρατηγικές είναι πιο αποτελεσματική; Για να απαντηθεί το πρώτο ερώτημα, μελετήθηκε η σχέση της συμπεριφοράς με τη μορφολογία των φραγμάτων πρόπολης που οι μέλισσες αποθέτουν στην είσοδο της κυψέλης. Σε σχέση με το δεύτερο ερώτημα, μελετήθηκε η μορφολογία των φραγμάτων πρόπολης στα μελίσσια ενός μελισσοκομείου (περιοχή Βάσσας) που δέχθηκε μία μαζική επίθεση ενός πολύ μεγάλου αριθμού σφηκών το Σεπτέμβριο του 2007, που είχε ως αποτέλεσμα να χαθεί ένα πολύ μεγάλο ποσοστό αυτών των μελισσιών (περίπου 65%) και οι κυψέλες τους να καταληφθούν από σφήκες. Προσδιορισμός του ρόλου των φραγμάτων πρόπολης στις εισόδους των κυψελών, στην εκδήλωση αμυντικής συμπεριφοράς Από την παρατήρηση των εισόδων των κυψελών που συμμετείχαν στα πειράματα, φάνηκε οπτικά πως υπήρχαν διαφοροποιήσεις στο μέγεθος των εισόδων που άφηναν οι κατασκευές των μελισσών από πρόπολη. Κάποια μελίσσια διέθεταν μεγάλα ανοίγματα ενώ κάποια άλλα είχαν φραγμένη σχεδόν όλη την επιφάνεια της εισόδου, αφήνοντας μικροσκοπικά ανοίγματα για να περνάνε οι συλλέκτριες. Από τις φωτογραφίες όλων των εισόδων φάνηκε ότι τα μελίσσια που υποχωρούν προς το εσωτερικό της κυψέλης (ομάδα Β) είχαν φραγμένο σχεδόν το σύνολο της εισόδου με πρόπολη, αφήνοντας μόνο ανοίγματα μικρής διατομής (εικόνα 26). Αντιθέτως, στα μελίσσια της ομάδας Α υπήρχαν πολύ μεγαλύτερα ανοίγματα στα φράγματα πρόπολης της εισόδου (εικόνα 27). Οι μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν στις φωτογραφίες από τις εισόδους των κυψελών με τη χρήση του ImageJ, έδωσαν τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στον πίνακα 9. 47

61 Εικόνα 26. Ανοίγματα μικρής διατομής σε είσοδο κυψέλης (Σεπτέμβρης 2005) Εικόνα 27. Ανοίγματα μεγάλης διατομής σε είσοδο κυψέλης (Σεπτέμβρης 2005) Από την ανάλυση των ταινιών με τη συμπεριφορά των μελισσών κατά τις φυσικές ή τεχνητές επιθέσεις των σφηκών, φάνηκε πως ανάμεσα στις δύο ομάδες μελισσιών παρουσιάζονταν μορφολογικές διαφορές στις κατασκευές από πρόπολη που έφραζαν τις εισόδους τους. Οι μετρήσεις που ακολούθησαν έδειξαν πως τα μελίσσια που υποχωρούν προς το εσωτερικό της κυψέλης έχουν φραγμένο σχεδόν το σύνολο της εισόδου με πρόπολη αφήνοντας μόνο ανοίγματα μικρής διατομής από τα οποία η σφήκα πιθανότατα δυσκολεύεται να περάσει, 48

62 ιδιαίτερα όταν αυτά φράσσονται από τα σώματα των 1-2 φρουρών. Αντιθέτως, στα μελίσσια της ομάδας στα οποία παρατηρείται έξοδος εργατριών που επιτίθεται στις σφήκες, υπάρχουν πολύ μεγαλύτερα ανοίγματα στα φράγματα πρόπολης της εισόδου (πίνακας 9). Για να επιβεβαιωθεί το κατά πόσο η κατασκευή των φραγμάτων πρόπολης επηρεάζει τη δυνατότητα των σφηκών να εισέλθουν στα μελίσσια, μετρήθηκαν οι διαστάσεις του σώματος 25 σφηκών (μέγιστη διάμετρος και επιφάνεια μέγιστης διατομής). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον πίνακα 14 ενώ στον πίνακα 15, συγκρίνεται το μέγεθος των σφηκών με τη διατομή του κάθε ανοίγματος στα φράγματα πρόπολης, με στόχο να υπολογιστεί το ποσοστό των ανοιγμάτων μέσω των οποίων η σφήκα μπορεί να εισέλθει στο εσωτερικό της κυψέλης. Πίνακας 9. Εμβαδόν ανοιγμάτων (cm 2 ) στα φράγματα πρόπολης των πειραματικών μελισσιών (Σεπτέμβριος 2005) Αριθμός Μελίσσια που επιτίθενται Μελίσσια που υποχωρούν ανογμάτων ,19 0,81 0,78 1,85 4,52 0,33 0,47 0,71 0,48 0,30 2 1,69 0,43 0,23 2,75 0,74 0,34 0,11 0,21 0,41 0,30 3 0,72 3,37 0,35 5,80 0,14 0,44 0,16 0,06 0,60 0,15 4 1,72 1,90 0,46 5,62 0,28 0,22 0,45 0,37 0,37 0,11 5 2,85 3,55 0,48 12,81 1,55 0,30 1,12 0,14 0,77 0,35 6 1,22 1,03 0,52 1,08 0,46 1,37 1,02 0,54 0,43 7 2,39 2,03 1,49 0,67 0,94 0,63 0,44 0,41 0,36 8 0,81 2,87 1,10 1,02 0,79 0,75 0,40 0,42 0,23 9 0,72 2,08 0,52 0,85 7,33 0,43 0,10 0,31 0, ,31 1,47 0,84 0,61 0,40 0,36 0,32 0, ,87 1,08 1,00 1,55 0,22 0,08 0,70 0, ,61 0,42 0,25 0,48 0,37 0, ,53 1,31 0, ,31 0, , ,41 Εμβαδόν (σύνολο) 16,53 20,66 10,43 28,84 15,34 11,19 7,73 4,43 5,74 5,89 Μέσος όρος 18,33 a 6,99 b Τυπ. απόκλ. 6,90 2,62 Στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στους μέσους όρους σημειώνονται με διαφορετικό γράμμα (a,b) σύμφωνα με t-κριτήριο (μετά από τη διόρθωση Welch) Όπως φαίνεται στα αποτελέσματα του πίνακα 10, το μέγεθος του σώματος των σφηκών παρουσιάζει μεγάλη ομοιομορφία με μέση επιφάνεια τα 0,5476cm 2 (τυπικό σφάλμα 0,068) και μέση διάμετρο τα 0,2947cm (τυπικό σφάλμα 0,003). Με βάση αυτή την ομοιομορφία, μπορεί να υπολογιστεί με ακρίβεια το ποσοστό επιτυχούς διείσδυσης των σφηκών στην κάθε κυψέλη (πίνακας 11), γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα πως: τα μελίσσια της ομάδας των οποίων οι μέλισσες κινούνταν από το εσωτερικό προς τη σανίδα πτήσης και επιτίθονταν στις σφήκες, παρουσίαζαν ένα ποσοστό επιτυχίας διείσδυσης με μέσο όρο 49

63 56,04% ενώ τα μελίσσια της ομάδας των οποίων οι μέλισσες υποχωρούσαν προς το εσωτερικό της κυψέλης κατά την επίθεση μίας σφήκας, παρουσίαζαν ένα ποσοστό επιτυχίας διείσδυσης με μέσο όρο 10,30% (εικόνα 28). Πίνακας 10. Μέγεθος σφηκών που συλλέχθηκαν στο μελισσοκομείο Σφήκες (n=25) ιάμετρος cm Επιφάνεια cm 2 Μέσος Όρος 0,2947 a (s.e. 0,003) 0,5476 b (s.e. 0,068) Ελάχιστο 0,2546 0,407 Μέγιστο 0,34 0,7259 Στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στους μέσους όρους σημειώνονται με διαφορετικό γράμμα (a,b) Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων από τους πίνακες 9 και 11, έδειξε πως: α) υπάρχουν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στο συνολικό εμβαδόν των ανοιγμάτων που αφήνουν οι μέλισσες στα φράγματα πρόπολης στις δύο ομάδες συμπεριφοράς (P=0,184), β) υπάρχουν σημαντικές διαφορές στο ποσοστό επιτυχούς διείσδυσης των σφηκών ανάμεσα στα μελίσσια της ομάδας που παρουσιάζουν υποχώρηση των αμυνομένων μελισσών προς το εσωτερικό της κυψέλης και στα μελίσσια που παρουσιάζουν έξοδο των αμυνομένων μελισσών και επίθεση στις σφήκες (P=0,0193). Πίνακας 11. Σύγκριση επιφάνειας των ανοιγμάτων στα φράγματα πρόπολης και μέσου όρου της επιφάνειας των σφηκών Συμπεριφορά Μελίσσια που επιτίθενται Μελίσσια που υποχωρούν Κυψέλη Ανοίγματα Αριθμός και ποσοστό ανοιγμάτων από τα οποία μπορεί να περάσει σφήκα Ποσοστό % ανοιγμάτων από τα οποία μπορεί να περάσει σφήκα ,5 54, ,1 22, ,2 50

64 Εικόνα 28. Σύγκριση των δύο ομάδων μελισσιών που παρουσιάζουν διαφορετική μορφή αμυντικής συμπεριφοράς με το ποσοστό επιτυχούς διείσδυσης των σφηκών από τα ανοίγματα πρόπολης στις εισόδους τους. Από όλα τα πιο πάνω αποτελέσματα, αποδεικνύεται πως οι στρατηγικές της υποχώρησης και της επίθεσης δεν σχετίζονται με το αν κάποιο μελίσσι είναι πιο επιθετικό από κάποιο άλλο αλλά με το αν η κατασκευή των φραγμάτων πρόπολης επιτρέπει στις μέλισσες να αμυνθούν εκμεταλλευόμενες την πολύ μικρή διατομή των ανοιγμάτων τους, (υποχωρώντας πίσω από τα ανοίγματα) ή αν η μεγάλη διατομή των ανοιγμάτων (γεγονός που επιτρέπει την εύκολη είσοδο των σφηκών στο εσωτερικό της κυψέλης), προκαλεί την έξοδο των μελισσών με σκοπό να αντιμετωπίσουν τον εισβολέα εκτός κυψέλης. Η στρατηγική της υποχώρησης και της άμυνας πίσω από τα μικρά ανοίγματα των φραγμάτων πρόπολης, παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον αφού δεν περιγράφεται και δεν αναλύεται στη βιβλιογραφία που αφορά στις μέλισσες. Για να προσδιοριστεί αν η μορφή κατασκευής των φραγμάτων οφείλεται σε γενετικούς παράγοντες ή είναι τυχαία, τα φράγματα πρόπολης καταστράφηκαν και φωτογραφήθηκε η ανακατασκευή τους στο χρόνο. Η σύνοψη των αποτελεσμάτων των από την ανάλυση των φωτογραφιών, παρουσιάζεται στον πίνακα 12. Πριν την καταστροφή των φραγμάτων μελετήθηκε, μέσω των πειραμάτων προσομοίωσης, η αμυντική συμπεριφορά του κάθε μελισσιού με στόχο να βρεθεί σε ποιά από τις δύο 51

65 διαφορετικές μορφές άμυνας ανήκει. Από τα οκτώ μελίσσια που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, έξι παρουσίασαν την επιθετική μορφή συμπεριφοράς (21-26) ενώ δύο παρουσίασαν τη συμπεριφορά της υποχώρησης (27 και 28). Όλη η πρόπολη απομακρύνθηκε το εκέμβριο του 2005 σε μία εποχή που τα μελίσσια δεν δέχονται επίθεση από κανένα εχθρό. Η ανακατασκευή τους υπήρξε περιορισμένη μέχρι περίπου τις αρχές Ιουλίου του 2006, περίοδο κατά την οποία άρχισε να αυξάνει η επιθετικότητα των σφηκών στα μελίσσια και ταυτόχρονα να αυξάνεται και ο ρυθμός ανακατασκευής των φραγμάτων, κυρίως στα δύο μελίσσια που παρουσίαζαν τη συμπεριφορά της υποχώρησης. Η κορύφωση της επιθετικότητας των σφηκών που παρουσιάζεται τον Οκτώβριο, συμπίπτει με την ολοκλήρωση της ανακατασκευής των φραγμάτων στα μελίσσια που μελετήθηκαν. Η μορφή τους ήταν τελική και παρέμεινε έτσι μέχρι το τέλος του έτους. Πίνακας 12. Αριθμός ανοιγμάτων, συνολικό εμβαδόν ανοιγμάτων και ποσοστό ανοιγμάτων από τα οποία μπορεί να περάσει μία σφήκα, πριν την καταστροφή των φραγμάτων πρόπολης ( εκέμβριος 2005) και μετά τη συμπλήρωση της ανακατασκευής τους (Οκτώβριος 2006). α/α κυψέλης εμβαδόν ανοιγμάτων ανοίγματα διαπερατά αριθμός ανοιγμάτων cm 2 στη σφήκα εκ Οκτ. εκ Οκτ. εκ Οκτ ,04 43,01 50% 100% ,76 56,14 57,14% 100% επίθεση ,72 58,06 92,3% 100% ,45 42,18 71,42% 100% ,83 48,34 100% 100% ,69 32,42 76,47% 80% υποχώρηση ,57 5,44 28,57% 25% ,13 4,76 80% 0% Από την παρατήρηση και την ανάλυση των εικόνων με το λογισμικό ImageJ, φαίνεται πως η ανακατασκευή των φραγμάτων ανταποκρίνεται στη μορφή αμυντικής συμπεριφοράς, δηλαδή μικρά ανοίγματα στα μελίσσια που υποχωρούν προς το εσωτερικό και μεγάλα στα μελίσσια που επιτίθενται στη σφήκα εκτός κυψέλης. Επίσης, ένα πολύ ενδιαφέρον στοιχείο είναι το ότι τα μελίσσια που επιτίθενται στις σφήκες, κατά την ανακατασκευή των φραγμάτων, άφησαν πολύ μεγαλύτερη επιφάνεια της εισόδου ακάλυπτη σε σχέση με τα αρχικά φράγματα (εικόνα 29). Στον πίνακα 12 φαίνεται πως τα μελίσσια άφησαν ένα πολύ μεγάλο ποσοστό της εισόδου ακάλυπτο γεγονός που θεωρητικά επιτρέπει σε κάθε επιτιθέμενη σφήκα να εισέλθει στο εσωτερικό της κυψέλης. Ουσιαστικά, δεν υπάρχει καμία έμμεση προστασία στο μελίσσι και το γεγονός πως οι εργάτριες επιλέγουν να μην χτίσουν τα φράγματα της πρόπολης δείχνει πως η μοναδική τους αμυντική επιλογή είναι η ενεργητική αντιμετώπιση των σφηκών στη σανίδα πτήσης. 52

66 Αντίστοιχα, όλα τα μελίσσια που υποχωρούν προς το εσωτερικό, ανακατασκεύασαν τα φράγματα αφήνοντας ακόμη μικρότερα ανοίγματα σε σχέση με τα αρχικά, γεγονός που επέτρεπε ακόμη μικρότερο ποσοστό επιτυχούς διείσδυσης στις σφήκες (εικόνα 30). Όπως φαίνεται στην εικόνα 30 αλλά και στα αποτελέσματα του πίνακα 12, τα μελίσσια 27 και 28 ξανακτίζουν τα φράγματα με πανομοιότυπο τρόπο, αφήνοντας σχεδόν τον ίδιο αριθμό ανοιγμάτων. Το ποσοστό επιτυχούς διείσδυσης της σφήκας μειώνεται στο μελίσσι 27 από το 28,57% στο 25%. Στο μελίσσι 28, αν και ο αριθμός των ανοιγμάτων παραμένει ο ίδιος, φαίνεται πως το ποσοστό επιτυχούς διείσδυσης μηδενίζεται ενώ αρχικά φαίνεται να είναι 80%. Το αρχικό αυτό ποσοστό όμως, δεν ανταποκρίνεται με ακρίβεια στο πόσο εύκολα μπορούν να εισέλθουν οι σφήκες στην κυψέλη μιας και τα ανοίγματα είναι οριακά μεγαλύτερα από τη μέση διατομή μίας σφήκας και η παρουσία μίας και μόνο μέλισσας σε κάθε άνοιγμα, μπορεί να εμποδίσει εύκολα τη σφήκα από το να εισέλθει στο εσωτερικό. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων από την καταστροφή και την ανάλυση της ανακατασκευής των φραγμάτων πρόπολης στο χρόνο, δείχνουν πως η μορφή που δίνουν οι κυπριακές μέλισσες στα φράγματα των εισόδων των κυψελών τους αλλά και η μορφή της αμυντικής συμπεριφοράς που επιδεικνύουν, δεν είναι τυχαία αλλά βασίζεται πιθανότατα σε γενετικά αίτια. Το ερώτημα όμως για το ποια από τις δύο μορφές συμπεριφοράς είναι η πιο αποτελεσματική, είναι δύσκολο να απαντηθεί. Παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της αμυντικής συμπεριφοράς Σε ένα μελισσοκομείο που δέχθηκε μαζική επίθεση από σφήκες, 14 από τα 22 μελίσσια καταστράφηκαν και καταλήφθηκαν. Από τα 8 μελίσσια που επιβίωσαν, τα 6 είχαν μεγάλα ανοίγματα στα φράγματα πρόπολης και αντιμετώπιζαν τις σφήκες στη σανίδα πτήσης. Όμως, δεν μπορεί να υποστηριχθεί με σιγουριά πως αυτή η συμπεριφορά είναι πιο αποτελεσματική γιατί τα υπόλοιπα 2 μελίσσια που επιβίωσαν των μαζικών επιθέσεων, είχαν τα μικρότερα ανοίγματα στα φράγματα πρόπολης και από τα 22 μελίσσια του μελισσοκομείου, από τα οποία οι σφήκες δεν μπορούσαν να περάσουν στο εσωτερικό της κυψέλης. Από 14 μελίσσια που καταστράφηκαν, 9 έφεραν μικρά ανοίγματα στα φράγματα πρόπολης και 5 έφεραν μεγάλα. 53

67 α. εκέμβριος 2005 β. Μάρτιος 2006 γ. Ιούλιος 2006 δ. Αύγουστος 2006 ε. Οκτώβριος 2006 Εικόνα 29. Ανακατασκευή των φραγμάτων πρόπολης μέσα στο χρόνο, σε μελίσσι που παρουσιάζει την επιθετική μορφή αμυντικής συμπεριφοράς. Στα φράγματα παραμένουν πολύ μεγάλα ανοίγματα τα οποία όσο περνάει ο χρόνος, γίνονται ακόμη μεγαλύτερα και στο τέλος, η πρόπολη απομακρύνεται σχεδόν ολοκληρωτικά Όταν 2 μελίσσια που είχαν καλυμμένες τις εισόδους με πρόπολη και υποχωρούσαν προς το εσωτερικό (αμυντική συμπεριφορά) μεταγγίστηκαν σε κυψέλες με μεγάλα ανοίγματα πρόπολης κατά τη διάρκεια μαζικών επιθέσεων σφηκών (τέλος Οκτωβρίου 2005), δεν κατάφεραν να αμυνθούν αποτελεσματικά και οι κυψέλες τους καταλήφθηκαν σε 5 και 14 μέρες, αντίστοιχα. Ο αντίστοιχος έλεγχος, η μετάγγιση δηλαδή δύο επιθετικών μελισσιών σε κυψέλες με μικρά ανοίγματα στα φράγματα πρόπολης, δεν οδήγησε στην καταστροφή των μελισσιών από τις σφήκες. Οι εργάτριες συνέχισαν να βγαίνουν εκτός εισόδου και να αντιμετωπίζουν τις σφήκες. Μέσα σε διάστημα 6 ημερών οι μέλισσες των δύο μελισσιών είχαν μεγαλώσει ελαφρώς την επιφάνεια των ανοιγμάτων, μετακινώντας μέρος της πρόπολης που τα αποτελούσε. 54

68 Από τα πιο πάνω αποτελέσματα, φαίνεται πως οι μέλισσες που επιτίθενται στις σφήκες εκτός κυψέλης, μπορούν να αμυνθούν καλύτερα, αν και αυτό δεν είναι κανόνας και δεν επιβεβαιώνεται πάντα. Η σύγκριση των δύο διαφορετικών μεθόδων συμπεριφοράς θα μπορούσε να αποτελέσει πεδίο μελλοντικής έρευνας, πάντα σε συνάρτηση με την αποδοτικότητα και άλλα ποιοτικά χαρακτηριστικά των μελισσιών που εμπλέκονται σ αυτές. α. εκέμβριος 2005 β. Μάρτιος 2006 γ. Ιούλιος 2006 δ. Αύγουστος 2006 ε. Οκτώβριος 2006 Εικόνα 30. Ανακατασκευή των φραγμάτων πρόπολης μέσα στο χρόνο, σε μελίσσι που παρουσιάζει τη συμπεριφορά υποχώρησης. Η ανακατασκευή των φραγμάτων ακολουθεί τη μορφή που αυτά είχαν πριν την καταστροφή τους, με μικρά μόνο ανοίγματα. Η ανακατασκευή ολοκληρώνεται τον Οκτώβριο του 2006 και η τελική μορφή έχει φράγματα με ανοίγματα μικρότερης διατομής από την αρχική μορφή το εκέμβριο του Προσομοίωση επιθέσεων με μοντέλα σφηκών 55

69 Πέρα από τα πειράματα με τις ζωντανές, παγιδευμένες σφήκες, χρησιμοποιήθηκαν μοντέλα σφηκών σε προσομοιώσεις επιθέσεων στα μελίσσια. Από την ανάλυση των οπτικογραφήσεων, φάνηκε πως οι εργάτριες αντιδρούν αρχικά στην προσέγγιση του μοντέλου με τον ίδιο τρόπο που αντιδρούν στις πραγματικές σφήκες, κυρίως όταν τα μεγέθη και τα χρώματα είναι όμοια με αυτά των πραγματικών σφηκών (πίνακες 28, 29 και 30- Παράρτημα). Μετά την πρώτη όμως επαφή με το μοντέλο, παύουν να αντιδρούν και το εγκαταλείπουν. Η σύγκριση των διαφορετικών τύπων μοντέλων έδειξε πως οι μέλισσες αντιδρούν εντονότερα και επιτίθενται ή απλά παρακολουθούν την κίνηση των μοντέλων που μοιάζουν στις πραγματικές σφήκες (πίνακας 26-Παράρτημα). Οι εργάτριες όλων των μελισσιών δεν παρουσίασαν ιδιαίτερη αμυντική συμπεριφορά απέναντι στο μοντέλο που δεν έφερε τους χαρακτηριστικούς κίτρινους δακτύλιους στην κοιλιά και ήταν μικρότερη από μία πραγματική σφήκα. Οι επιθέσεις στο χρόνο διέφεραν σημαντικά από τις επιθέσεις στα άλλα τρία μοντέλα (πίνακας 27-Παράρτημα). Τις περισσότερες επιθέσεις και την πιο έντονη εκδήλωση αμυντικής συμπεριφοράς, δέχτηκε το μοντέλο που έφερε τους φυσικούς χρωματισμούς και το μοντέλο με μαύρο χρώμα και τους χαρακτηριστικούς κίτρινους δακτύλιους, ενώ αρκετές επιθέσεις δέχθηκε και το λευκό μοντέλο με τους κίτρινους δακτύλιους. εν υπήρχαν διαφορές ανάμεσα στις επιθέσεις στο μαύρο και το καφέ μοντέλο καθώς επίσης ανάμεσα στο λευκό και το καφέ μοντέλο. Οι επιθέσεις που δέχθηκε το μαύρο μοντέλο ήταν περισσότερες και διέφεραν σημαντικά από το λευκό μοντέλο (πίνακας 27-Παράρτημα). Τα μελίσσια που ανήκαν στις δύο διαφορετικές μορφές συμπεριφοράς, συμπεριφέρθηκαν ανάλογα και στα πειράματα με τα μοντέλα σφηκών. Τα μελίσσια που υποχωρούσαν πίσω από τα φράγματα πρόπολης, αντέδρασαν με τον ίδιο τρόπο και στα μοντέλα. Ελάχιστες εργάτριες ήρθαν σε επαφή με τη σφήκα μόνο όταν αυτή αφέθηκε πάνω στη σανίδα πτήσης, σε επαφή με τα φράγματα πρόπολης (πίνακας 28-Παράρτημα). Τα μελίσσια της ομάδας που επιτίθεται και αντιμετωπίζει τη σφήκα εκτός κυψέλης, αντέδρασαν στην προσέγγιση με τον ίδιο τρόπο, μέχρι τη στιγμή που οι πρώτες εργάτριες ήρθαν σε επαφή με το μοντέλο (πίνακες 29 και 30-Παράρτημα). Υπήρχαν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στο μελίσσι 29 (υποχώρηση) και στα μελίσσια 30 και 31 (επίθεση) ενώ δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στα μελίσσια 30 και 31 (πίνακας 31-Παράρτημα). Χαρακτηριστικό φαινόμενο είναι επίσης το ότι οι αμυνόμενες μέλισσες επιτίθενται πρώτα στην κοιλιά της σφήκας (πίνακες 26, 28, 29 και 30-Παράρτημα). Η ανάλυση των εικόνων και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε πως ο αριθμός των εργατριών που επιτίθενται στην κοιλιά των σφηκών-μοντέλων είναι μεγαλύτερος και διαφέρει σημαντικά από 56

70 τον αριθμό των εργατριών που επιτίθενται στο θώρακα ή στο κεφάλι (πίνακας 32- Παράρτημα). Ακόμη και όταν γίνει άθροιση των εργατριών που επιτίθενται στο θώρακα και στο κεφάλι (για να αποκλειστεί ο παράγοντας του διαφορετικού μεγέθους) και το άθροισμά τους συγκριθεί με τις εργάτριες που επιτίθενται στην κοιλιά των σφηκών-μοντέλων, οι δεύτερες είναι και πάλι περισσότερες, με σημαντική διαφορά. Επίσης, η ανάλυση των εικόνων και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε πως οι πρώτες δύο μέλισσες επιτίθενται στην κοιλιά των μοντέλων και όχι στο κεφάλι ή και στο θώρακα. Τα πιο πάνω στοιχεία, χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα για τον προσδιορισμό του τρόπου με τον οποίο οι εργάτριες θανατώνουν μία σφήκα όταν καταφέρουν να την παγιδεύσουν σε σφαίρα (βλέπε κεφάλαιο Η θανάτωση της σφήκας-πρόκληση ασφυξίας στον εισβολέα ). Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων με τα μοντέλα σφηκών μπορούμε να συμπεράνουμε πως οι μέλισσες που αμύνονται στις επιθέσεις των σφηκών αναγνωρίζουν με ακρίβεια το μέγεθος και το χρώμα των σφηκών. Το στάδιο δηλαδή που αντιστοιχεί στη διάκρισηταυτοποίηση του εχθρού (εικόνα 9), οφείλεται σε οπτικά ερεθίσματα. Φαίνεται πως οι μέλισσες μπορούν να διακρίνουν στον εισβολέα που προσεγγίζει το μελίσσι, πέρα από το χρώμα και το σχήμα, λεπτομέρειες όπως την ύπαρξη των κίτρινων τεργιτών και στερνιτών ανάμεσα στο υπόλοιπο καφέ σώμα της σφήκας. Αυτό μπορεί να αιτιολογηθεί αν ληφθεί υπόψη η πολύ ανεπτυγμένη όραση των μελισσών (Giourfa et al., 1995; Lunau και Maier, 1995) που τους επιτρέπει να διακρίνουν ανάμεσα σε σύνθετες οπτικές δομές και μοτίβα (Maddess et al., 1999). Το γεγονός πως μετά την πρώτη επαφή με το μοντέλο οι εργάτριες παύουν να ασχολούνται μαζί του, μη εκλαμβάνοντάς το ως απειλή, δείχνει πως το στάδιο που αντιστοιχεί στη δευτερογενή αντίληψη και διάκριση ή ταυτοποίηση οφείλεται σε χημικά ερεθίσματα, όπως για παράδειγμα την έκκριση φερομονών από τις σφήκες, τις οποίες όμως οι μέλισσες και κατά κύριο λόγο οι φρουροί, μπορούν να αναγνωρίσουν ως εχθρικές (Ono et al., 1995; Wood και Ratnieks, 2004). Από το σύνολο των πειραμάτων για τη μελέτη της αμυντικής συμπεριφοράς της κυπριακής μέλισσας, φαίνεται πως η αντιμετώπιση του εισβολέα, όταν εφαρμόζεται η επιθετική μορφή συμπεριφοράς, μοιάζει με τη συμπεριφορά που εκδηλώνουν κυρίως οι ασιατικές μέλισσες όταν αντιμετωπίζουν διάφορα είδη σφηκών. Χαρακτηριστικά όπως η μαρμαρυγή, η αποφυγή της πτήσης προς τη σφήκα, η μη χρήση του κεντριού και η δημιουργία σφαίρας γύρω από τον εισβολέα, αποτελούν τον κανόνα σε όλα τα είδη μελισσών (Apis mellifera, Apis dorsata, Apis florea, Apis cerana) που αντιμετωπίζουν τη σφήκα εκτός κυψέλης. Αντιθέτως, η συμπεριφορά των μελισσιών που υποχωρούν προς το εσωτερικό, αποφεύγοντας κάθε 57

71 συμπλοκή με τη σφήκα και καλύπτοντας το μεγαλύτερο μέρος της επιφάνειας της εισόδου με πρόπολη, αποτελεί μορφή συμπεριφοράς που δεν έχει αναφερθεί σε άλλα είδη ή φυλές μελισσών. Το φαινόμενο των εργατριών που όταν απειλούνται από ένα δυνητικό εχθρό υποχωρούν προς το εσωτερικό της κυψέλης, έχει αναφερθεί μόνο στην περίπτωση των μελισσών Apis cerana στην Ταϊλάνδη, οι οποίες επίσης αποφεύγουν τη σύγκρουση με κάποιον εχθρό που πλησιάζει την κυψέλη τους και επιστρέφουν στο εσωτερικό μέσω μίας μικρής και καλά κρυμμένης εισόδου. Όταν όμως ο εχθρός επιμένει, οι εργάτριες βγαίνουν από την κυψέλη και αντιμετωπίζουν τον εισβολέα κεντρίζοντάς τον (Seleey et al., 1982), κάτι που δεν συμβαίνει στην περίπτωση των κυπριακών μελισσών. Χρησιμοποιώντας τη σχηματική παράσταση (εικόνα 9) της σταδιακής εκδήλωσης αμυντικής συμπεριφοράς κατά την επίθεση ενός εχθρού (Breed et al. 2004), η συμπεριφορά υποχώρησης των κυπριακών μελισσιών θα μπορούσε να περιγραφεί ως ακολούθως: Μετά την προσέγγιση του εισβολέα και κατά τα στάδια της δευτερογενούς αντίληψης και διάκρισης ή απειλής, τα μελίσσια που ανήκουν σ αυτή τη μορφή συμπεριφοράς υποχωρούν και καλύπτονται πίσω από τα φράγματα πρόπολης. Η απεμπλοκή μπορεί να γίνει και στις τρεις αυτές φάσεις και συνήθως συμβαίνει στις περιπτώσεις που η σφήκα δεν μπορεί να εισέλθει από κανένα άνοιγμα των φραγμάτων, οπότε και ο εισβολέας αποχωρεί για να επιτεθεί σε γειτονικές κυψέλες. 58

72 Η ΘΑΝΑΤΩΣΗ ΤΗΣ ΣΦΗΚΑΣ-ΠΡΟΚΛΗΣΗ ΑΣΦΥΞΙΑΣ ΣΤΟΝ ΕΙΣΒΟΛΕΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μέσω της μαζικής αμυντικής συμπεριφοράς, οι μέλισσες μπορούν να θανατώνουν τους εχθρούς που απειλούν το ενδιαίτημά τους. Στο ευρύ κοινό είναι γνωστή η χρήση του μηχανισμού του κεντριού ως κύριο μέσο άμυνας κατά των εισβολέων. Η αντιμετώπιση και θανάτωση επιτιθέμενων μελισσών (πχ λεηλάτριες) ή σφηκών όμοιων σε μέγεθος με τις μέλισσες, καταλήγει συνήθως στη θανάτωση του εισβολέα με τη χρήση του κεντριού. Το κεντρί είναι αποτελεσματικό και για τη θανάτωση εχθρών που υπερτερούν σε μέγεθος όπως τρωκτικά και θηλαστικά. Ακόμη και ο άνθρωπος μπορεί να πέσει θύμα του μηχανισμού του κεντριού, είτε μέσω της εκδήλωσης αλλεργίας είτε μέσω ενός μεγάλου αριθμού κεντρισμάτων. Σχεδόν πάντα, η χρήση του μηχανισμού του κεντριού είναι μαζική όταν απειλείται η κυψέλη, με την εμπλοκή ενός μεγάλου αριθμού εργατριών που μπορεί να φτάσει το 10% του συνολικού πληθυσμού ενός μελισσιού στις φυλές της δυτικής μέλισσας (Breed, 1991; Cunard and Breed, 1998) ενώ στις αφρικανοποιημένες μέλισσες (Africanized honey bees), οι εργάτριες που μπορεί να επιτεθούν για να κεντρίσουν ταυτόχρονα έναν εχθρό μπορεί να φτάσουν και το 50% του συνολικού πληθυσμού (Díaz-Sánchez et al., 1998; Schumacher et al., 1995). Το κέντρισμα όμως δεν αποτελεί τη μοναδική τεχνική θανάτωσης ενός εχθρού. Η στρατηγική για τη θανάτωση ενός εισβολέα που θα εφαρμόσουν οι αμυνόμενες εργάτριες, ποικίλει ανάλογα με το είδος ή τη φυλή στην οποία ανήκουν οι ίδιες αλλά και ανάλογα με το μέγεθος του εχθρού και τις ιδιαιτερότητες που παρουσιάζει (Seeley, 1985). Στις περιπτώσεις όπου το κεντρί δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά, κυρίως λόγω της δυσκολίας του να διαπεράσει την θωράκιση ενός εχθρού, όπως είναι ο σκληρός εξωσκελετός μεγαλόσωμων σφηκών, τότε οι μέλισσες χρησιμοποιούν άλλους, αξιοθαύμαστους συνήθως μηχανισμούς. Για παράδειγμα, όταν οι μέλισσες A.m. capensis και A.m. scutellata αντιμετωπίζουν τον μικρότερο συγκριτικά με τις ίδιες εχθρό, Aethina tumida (μικρό σκαθάρι της κυψέλης), προσπαθούν να το θανατώσουν παγιδεύοντάς το σε συγκεκριμένα σημεία του πυθμένα της κυψέλης και περιορίζοντάς το σε κελιά πρόπολης (Neumann et al., 2001; Ellis et al., 2002). Εξαιρετικό ενδιαφέρον παρουσιάζει και η περίπτωση της δημιουργίας σφαίρας εργατριών (balling) γύρω από έναν εισβολέα, ο οποίος στη συνέχεια θα βρεθεί νεκρός χωρίς να φέρει κεντρίσματα ή άλλα εμφανή συμπτώματα, που να καταδεικνύουν τον τρόπο με τον οποίο οι 59

73 μέλισσες κατάφεραν να τον θανατώσουν. Αν και η σφαίρα εργατριών έχει περιγραφεί και μελετηθεί κυρίως στην περίπτωση των μελισσών που αντιμετωπίζουν τη γιγαντόσωμη σφήκα Vespa mandarinia, εντούτοις δεν διαφέρει μορφολογικά από το γνωστό στους μελισσοκόμους κουβάριασμα μίας ξένης βασίλισσας που εισάγεται σε ένα μελίσσι (Butler, 1954; Yadava and Smith 1971; Robinson, 1984), φαινόμενο που περιγράφηκε για πρώτη φορά τον 18 ο αιώνα (Huber, 1792). Η ξένη βασίλισσα που αναγνωρίζεται από την οσμή της, παγιδεύεται σε μία συμπαγή σφαίρα που αποτελείται από 50 ή και περισσότερες εργάτριες. Μετά τη διάλυση της σφαίρας, η βασίλισσα βρίσκεται πολλές φορές νεκρή. Σε αρκετές περιπτώσεις το σώμα της μπορεί να μη φέρει σημάδια κακοποίησης αλλά σε ένα μεγάλο ποσοστό, στις νεκρές βασίλισσες έχουν βρεθεί δαγκώματα και κεντρίσματα (Walton and Smith, 1969). Αυτό αποτελεί και τη διαφορά με τη σφαίρα που δημιουργείται κατά το κουβάριασμα της V. mandarinia κυρίως όταν αυτή επιτίθεται σε μελίσσια της Ιαπωνικής μέλισας, Apis cerana japonica. Τι ακριβώς συμβαίνει στην πιο πάνω περίπτωση; Η V. mandarinia είναι η μεγαλύτερη σφήκα του γένους Vespa και στις περιοχές που ενδημεί, και κύρια την Ιαπωνία, αποτελεί ένα σημαντικότατο εχθρό των μελισσών (Matsuura and Sakagami, 1973). Οι αναφορές περιγράφουν, πως ένας μικρός αριθμός σφηκών μπορεί να καταστρέψει ένα μελίσσι αποτελούμενο από μέλισσες μέσα σε λίγες ώρες. Αφού εξοντώσουν όλες τις ενήλικες μέλισσες, περνούν σε μία φάση κατοχής της κυψέλης, μεταφέροντας σταδιακά το γόνο του μελισσιού στη δικιά τους φωλιά για να ταΐσουν τους αναπτυσσόμενους απογόνους τους. Παρά την υπεροπλία που προσδίδουν στη σφήκα τα χαρακτηριστικά της (ισχυρός εξωσκελετός που δεν μπορεί να διαπεράσει το κεντρί της μέλισσας, βάρος σώματος φορές το βάρος τις μέλισσας, ισχυρά σαγόνια) έχει παρατηρηθεί πως οι απώλειες μελισσιών της ενδημικής μέλισσας A. cerana japonica είναι εξαιρετικά μικρές σε σχέση με τις απώλειες μελισσιών της ευρωπαϊκής μέλισσας A. mellifera (που έχουν εισαχθεί εδώ και κάποια χρόνια στη Ιαπωνία), γεγονός που θέτει ένα ερωτηματικό για τους λόγους αυτής της διαφοράς. Η εξήγηση που δόθηκε, έκανε γνωστό ένα νέο αμυντικό μηχανισμό που χρησιμοποιούν οι μέλισσες όταν αντιμετωπίζουν έναν ισχυρό εχθρό. Σε πειράματα προσομοίωσης επιθέσεων που πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση παγιδευμένων σφηκών Vespa simillima xanthoptera, μετρήθηκε η θερμοκρασία που αναπτυσσόταν στον πυρήνα των σφαιρών που δημιουργούσαν εργάτριες από μελίσσια της A. mellifera και της A. cerana (Ono et al, 1987). Βρέθηκε πως στις σφαίρες της A. cerana η θερμοκρασία ήταν ψηλότερη από τις σφαίρες της A. mellifera (46,1 o C και 42,8 o C, αντίστοιχα). Η διάρκεια της σφαίρας στην Ιαπωνική μέλισσα ήταν γύρω στα 20 λεπτά ενώ στην ευρωπαϊκή ξεπερνούσε κατά μέσο όρο τα 60 λεπτά. Η θερμοκρασία της σφαίρας της 60

74 Ιαπωνικής μέλισσας μπορούσε να θανατώσει τη σφήκα αφού ξεπερνούσε το θερμοκρασιακό ανώτατο όριο θνησιμότητάς της (thermal upper lethal level) που βρίσκεται στους 46 o C. Αντιθέτως, οι ευρωπαϊκές μέλισσες, μη μπορώντας να θανατώσουν με θερμοπληξία την παγιδευμένη σφήκα, προσπαθούσαν να τη θανατώσουν με τη χρήση του κεντριού τους. Παρόμοια αποτελέσματα έδωσαν και μεταγενέστερα πειράματα κατά την αντιμετώπιση της σφήκας V. mandarinia από την Ιαπωνική μέλισσα (Ono et al, 1995). Οι σφήκες βρίσκονταν νεκρές μέσα στις σφαίρες που σχημάτιζαν περισσότερες από 500 εργάτριες χωρίς ίχνος κεντρίσματος. Η θερμοκρασία υπολογιζόταν με τη χρήση θερμικής κάμερας και η μέση τιμή της (47 o C) ξεπερνούσε το θερμοκρασιακό ανώτατο όριο θνησιμότητας της V. mandarinia (45 o C). Ο χρόνος που χρειάζονταν οι μέλισσες για τη θανάτωση της σφήκας ήταν κατά μέσο όρο 20 λεπτά. Ο όρος Heat-Balling (σφαίρα θερμότητας) καθιερώθηκε μετά από τις πιο πάνω εργασίες και επιβεβαιώθηκε και από πρόσφατα πειράματα (Ken et al, 2005) που αφορούσαν στη σύγκριση της αντιμετώπισης της σφήκας Vespa velutina από τις μέλισσες Apis mellifera ligustica και Apis cerana indica. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως το αίτιο που προκαλούσε το θάνατο των σφηκών από τις μέλισσες A. cerana indica ήταν, για μια ακόμη φορά, η θερμοπληξία. Και οι τρεις πιο πάνω εργασίες καταδεικνύουν μια υπεροχή των ενδημικών μελισσών στην αποτελεσματικότητα αντιμετώπισης των επίσης ενδημικών σφηκών, γεγονός που οφείλεται σε μία εξελικτική διαδικασία και προσαρμοστικότητα της σχέσης θηράματος-θηρευτή, αποτέλεσμα του οποίου είναι ο ειδικευμένος τρόπος θανάτωσης του δεύτερου μέσω της θερμοπληξίας. Η παρατήρηση της συμπεριφοράς της Κυπριακής μέλισσας στις περιπτώσεις που οι αμυνόμενες εργάτριες κατάφερναν να παγιδέψουν μία επιτιθέμενη σφήκα Vespa orientalis σε σφαίρα έδειχνε, από τις πρώτες οπτικές παρατηρήσεις και καταγραφές, να είναι μία έκφραση του φαινομένου της θερμοπληξίας. Με την έναρξη μίας συμπλοκής, οι εργάτριες περικύκλωναν ταχύτατα τη σφήκα, την ακινητοποιούσαν σε μία συμπαγή σφαίρα και ανέβαζαν τη θερμοκρασία, όπως φάνηκε από παρατηρήσεις. Η σφήκα βρισκόταν νεκρή μετά τη διάλυση της σφαίρας από τις εργάτριες και δεν έφερε κεντρίσματα. Πραγματοποιήθηκε μια σειρά διαφορετικών πειραμάτων, στο μελισσοκομείο και στο εργαστήριο, με στόχο να μελετηθεί αν οι Κυπριακές μέλισσες μπορούσαν να θανατώσουν τις σφήκες με τη χρήση της θερμοπληξίας ή αν ο θάνατος του εισβολέα προερχόταν από κάποιο άλλο αίτιο. 61

75 Μεθοδολογία Υλικά Για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας στις σφαίρες των παγιδευμένων σφηκών χρησιμοποιήθηκαν ψηφιακά θερμόμετρα τύπου Comark DT20 και PlantScan PST-300 με προσαρμοσμένους μικρο-αισθητήρες 3mm. Το θερμοκρασιακό ανώτατο όριο θνησιμότητας σφηκών και μελισσών προσδιορίσθηκε με τη χρήση θερμοθαλάμου J.P.Selecta και θερμοθαλάμου ελεγχόμενης ατμόσφαιρας, με δυνατότητα αύξησης της περιεκτικότητας σε CO 2 έως 20%, τύπου J.P.Selecta-Incubator CO Για την καταγραφή του αναπνευστικού ρυθμού των σφηκών χρησιμοποιήθηκαν: Ισομετρικός μεταγωγέας δύναμης (isometric force displacement transducer) Grass 103-Grass Company. Παλμογράφος (A/D converter, KPCI-3102, Keithley Instruments Inc). Μη τοξική πλαστελίνη, μείγμα κεριού και κολωφονίου-gum Resin, Fluka, Hanover Germany (για την καθήλωση των σφηκών σε τριβλία Petri). Λογισμικά προγράμματα: TestPoint, CorelDraw v12, Adobe Photoshop v7.0, Pinnacle Liquid Edition v6. Για την ανάλυση της συμπεριφοράς των εργατριών κατά το σχηματισμό της σφαίρας, χρησιμοποιήθηκαν πήλινα μοντέλα σφηκών σε διάφορα μεγέθη και με ποικίλους χρωματισμούς. Για να κρατηθούν ανοικτά τα αναπνευστικά στίγματα και να ακινητοποιηθούν οι κοιλιακοί τεργίτες των σφηκών χρησιμοποιήθηκαν πλαστικά κυλινδρικά τεμάχια διαμέτρου 0.6mm και μήκους 3mm, 2.5mm και 2mm. Όλα τα πειράματα οπτικογραφήθηκαν με ψηφιακή κάμερα Sony DCR-HC24 και φωτογραφήθηκαν με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή Kodak CX7525 5Mp. Οι ταινίες από τις οπτικογραφήσεις και οι φωτογραφίες, επεξεργάστηκαν και αναλύθηκαν με τα λογισμικά Pinnacle Liquid Edition V6 και ImageJ v1.37 αντίστοιχα. Για τις συγκρίσεις ανάμεσα στους μέσους όρους χρησιμοποιήθηκε το Students t-test μέσω του στατιστικού πακέτου GraphPad Instat v3.5. Μέθοδοι Προσδιορισμός της θερμοκρασίας στον πυρήνα της σφαίρας Για να μετρηθεί η θερμοκρασία που αναπτύσσεται μέσα στη σφαίρα στην οποία παγιδεύουν οι εργάτριες τη σφήκα, προσαρμόστηκε στο θώρακα 20 παγιδευμένων σφηκών μικροαισθητήρας θερμοκρασίας, ο οποίος μέσω ενός λεπτού καλωδίου κατέληγε στο 62

76 ηλεκτρονικό θερμόμετρο ακριβείας. Οι σφήκες τοποθετήθηκαν στην είσοδο 10 διαφορετικών μελισσιών και καταγράφηκε η θερμοκρασία που αναπτύχθηκε στη σφαίρα που σχημάτισαν οι μέλισσες καθώς και ο χρόνος διάρκειας του φαινομένου. Η απομάκρυνση όλων των εργατριών και η διάλυση της σφαίρας σηματοδοτούσε σε κάθε περίπτωση τη λήξη της καταγραφής. Χρόνος θανάτωσης των σφηκών στη θερμοκρασία της σφαίρας Για να μελετηθεί το αν η θερμοκρασία που αναπτύσσεται στη σφαίρα και η διάρκειά της επαρκούν για τη θανάτωση των σφηκών, 30 σφήκες συλλέχθηκαν στο μελισσοκομείο, τοποθετήθηκαν σε ξεχωριστά κλουβιά η κάθε μία και μεταφέρθηκαν αμέσως στο θερμοθάλαμο J.P.Selecta του οποίου η θερμοκρασία είχε ρυθμιστεί στους 44 ο C. Καταγράφηκε ο χρόνος θανάτωσης της κάθε σφήκας στη συγκεκριμένη θερμοκρασία. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στα εργαστήρια μικροβιολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικών Υπηρεσιών του Υπουργείου Γεωργίας, Φυσικών Πόρων και Περιβάλλοντος, στη Λευκωσία. Προσδιορισμός του ανώτατου ορίου θνησιμότητας Για να προσδιοριστεί το ανώτατο όριο θνησιμότητας μελισσών και σφηκών, 30 μέλισσες και 30 σφήκες μεταφέρθηκαν στο θερμοθάλαμο σε ξεχωριστά κλουβιά. Η αρχική θερμοκρασία των 44 ο C αυξανόταν κατά 1 ο C ανά 20 λεπτά, όπως προτείνεται από Ken et al (2005), και για κάθε αύξηση της θερμοκρασίας καταγραφόταν ο αριθμός των νεκρών ατόμων. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στα εργαστήρια μικροβιολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικών Υπηρεσιών του Υπουργείου Γεωργίας, Φυσικών Πόρων και Περιβάλλοντος, στη Λευκωσία. Μελέτη της συμπεριφοράς των εργατριών που σχηματίζουν τη σφαίρα Για να μελετηθεί η διαδικασία παγίδευσης μιας επιτιθέμενης σφήκας και να αιτιολογηθεί ο μηχανισμός που οδηγεί στη θανάτωσή της, δύο διαφορετικά πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο μελισσοκομείο στην περιοχή της Άλασσας, στην επαρχία Λεμεσού. Κατά το πρώτο πείραμα, χρησιμοποιήθηκαν πήλινα μοντέλα σφηκών. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε κατά την προσομοίωση των επιθέσεων των μοντέλων στα μελίσσια ήταν όμοια με αυτή που ακολουθήθηκε στα πειράματα με την προσομοίωση επιθέσεως με παγιδευμένες σφήκες στο κεφάλαιο Συμπεριφορά των μελισσών κατά την αντιμετώπιση επιτιθέμενης σφήκας, που περιγράφεται στην παρούσα εργασία. Οι επιθέσεις των πήλινων μοντέλων οπτικογραφήθηκαν και μετατράπηκαν σε εικόνες (12 ανά δευτερόλεπτο), με τη χρήση του λογισμικού Pinnacle Liquid Edition v6. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε το 63

77 πρόγραμμα ανάλυσης εικόνας ImageJ v1.37 για να υπολογιστούν ο αριθμός των μελισσών που επιτέθηκαν και ήρθαν σε επαφή με τη σφήκα-μοντέλο και συγκεκριμένα, το σημείο του σώματος στο οποίο επιτέθηκαν (κεφάλι, θώρακας ή κοιλιά). Κατά το δεύτερο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν 4 μελίσσια και 20 παγιδευμένες σφήκες. Τα μελίσσια επιλέχθηκαν έτσι ώστε να είναι περίπου ισοδύναμα και να παρουσιάζουν την ίδια μορφή συμπεριφοράς ενάντια στις επιτιθέμενες σφήκες. Σε κάθε μελίσσι, παρουσιάζονταν διαδοχικά 5 σφήκες. Μετά τη σταθεροποίηση της σφαίρας γύρω από την πρώτη σφήκα, αυτή απομακρυνόταν προσεχτικά από την είσοδο του μελισσιού και κλεινόταν σε ένα κλουβί μαζί με τις εργάτριες που την είχαν κουβαριάσει. Στη συνέχεια, πλησίαζε την είσοδο του μελισσιού η δεύτερη σφήκα και επαναλαμβανόταν η όλη διαδικασία. Μετά από 4 διαδοχικές απομακρύνσεις ο αριθμός των εργατριών που επιτίθονταν στη σφήκα είχε μειωθεί τόσο πολύ (15-20 εργάτριες), που δεν ήταν σε θέση να κουβαριάσουν ολόκληρη τη σφήκα. Οπτικογραφήθηκε και μελετήθηκε η συμπεριφορά αυτών των εργατριών σε σχέση με το μέρος του σώματος της σφήκας στο οποίο επιτίθονταν. Χρόνος θανάτωσης των σφηκών σε ατμόσφαιρα 20% CO 2 Για να μελετηθεί το αν η αύξηση της συγκέντρωσης CO 2 έχει επίδραση στο χρόνο θανάτωσης, σφήκες που είχαν συλλεχθεί στο μελισσοκομείο, τοποθετήθηκαν σε θερμοθάλαμο J.P.Selecta-Incubator CO ελεγχόμενης ατμόσφαιρας, στον οποίο η θερμοκρασία ρυθμίστηκε στους 44 ο C και η σχέση αέρα/διοξειδίου του άνθρακα ρυθμίστηκε στο 8:2 (ατμόσφαιρα CO 2 20%). Καταγράφηκε ο χρόνος θανάτου 16 σφηκών στις συγκεκριμένες συνθήκες. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στα εργαστήρια μικροβιολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικών Υπηρεσιών του Υπουργείου Γεωργίας, Φυσικών Πόρων και Περιβάλλοντος, στη Λευκωσία. Μελέτη της μορφολογίας των αναπνευστικών στιγμάτων της σφήκας Για να μελετηθούν οι ιδιαιτερότητες που παρουσιάζει το αναπνευστικό σύστημα της σφήκας V. orientalis και ιδιαίτερα η μορφολογία των αναπνευστικών στιγμάτων της κοιλιάς, απομονώθηκαν από 5 σφήκες, με ειδικά ψαλίδια ανατομίας, τα κομμάτια του εξωσκελετού που φέρουν τα 5 ορατά ζεύγη των αναπνευστικών στιγμάτων (3 στο θώρακα και 2 στην κοιλιά) και τα 5 μη ορατά κοιλιακά στίγματα (καλυμμένα κάτω από την προέκταση των μπροστινών τεργιτών). Τα αναπνευστικά στίγματα φωτογραφήθηκαν με τη χρήση ψηφιακής φωτογραφικής OLYMPUS CAMEDIA C2000Z προσαρμοσμένη σε μικροσκόπιο OLYMPUS BX40. Η επιφάνειά τους μετρήθηκε με τη χρήση του λογισμικού OLYMPUS DP-Soft Version

78 Λόγω της σημασίας της κίνησης της κοιλιάς στην αναπνοή της σφήκας (Weis-Fogh, 1967) υπολογίστηκε το μήκος της κοιλιάς 10 σφηκών που συλλέχθηκαν στο μελισσοκομείο, τόσο κατά το μέγιστο (έκταση) όσο και κατά ελάχιστο μήκος της (σύμπτυξη). Για τον υπολογισμό, οι σφήκες προσηλώθηκαν σε χιλιομετρικό χαρτί και οπτικογραφήθηκε η κίνηση της κοιλιάς τους. Στη συνέχεια, οι ταινίες μετατράπηκαν σε εικόνες με την χρήση του λογισμικού Pinnacle Liquid Edition V6 και αναλύθηκαν με το λογισμικό ImageJ v1.37. Για να επιβεβαιωθούν οι μετρήσεις, οι σφήκες θανατώθηκαν και οι κοιλιές τους αποκόπηκαν. Στη συνέχεια το μήκος τους μετρήθηκε με διαστημόμετρο ακριβείας (Mauf_ST). Πέρα από το μήκος της κοιλιάς, μετρήθηκε και το άνοιγμα που δημιουργείται από το ανασήκωμα των τεσσάρων τελευταίων κοιλιακών τεργιτών κατά τις αναπνευστικές κινήσεις. Προσομοίωση της συμπεριφοράς των μελισσών στο εργαστήριο - Μελέτη του αναπνευστικού ρυθμού της σφήκας Για να μελετηθεί ο τρόπος με τον οποίο οι σφήκες θανατώνονται από τις μέλισσες μέσα στη σφαίρα και να ερευνηθεί το αν η ασφυξία μπορεί να είναι το αίτιο του θανάτου, μία σειρά πειραμάτων προσομοίωσης πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων του Τμήματος Βιολογίας, Α.Π.Θ. Κύριος στόχος ήταν η καταγραφή του φυσιολογικού αναπνευστικού ρυθμού της σφήκας και το πώς αυτός μεταβάλλεται σε συνθήκες παρόμοιες με το κουβάριασμα των εργατριών. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε είναι μία παραλλαγή της μεθόδου που περιγράφεται από Zafeiridou and Theophilidis (2006). Από σφήκες που είχαν συλλεχθεί στο μελισσοκομείο στην Κύπρο, αποκόπηκαν τα φτερά και στη συνέχεια προσηλώθηκαν σε τριβλία, πάνω σε ένα στρώμα μη τοξικής πλαστελίνης με τη χρήση ενός χλιαρού μείγματος κεριού και κολοφωνίου (εικόνα 31). Εικόνα 31. Πειραματική διάταξη για την καταγραφή του αναπνευστικού ρυθμού της σφήκας Vespa orientalis 65

79 Η προσήλωση έγινε με την νωτιαία πλευρά του εντόμου προς τα πάνω έτσι ώστε να μπορεί να γίνει καταγραφή του αναπνευστικού ρυθμού από τους τεργίτες. Για να αποτραπεί κάθε κίνηση πλην της κίνησης των κοιλιακών άρθρων, και τα έξι πόδια προσηλώθηκαν επίσης με το μείγμα κεριού-κολοφωνίου. Ένας μεταγωγέας αγκιστρώθηκε στο άκρο του 3 ου κοιλιακού τεργίτη για να καταγράψει την κίνηση του εξωσκελετού της σφήκας η οποία παράγεται από τη σύσπαση των αναπνευστικών μυών (εικόνα 32). Πρέπει να σημειωθεί πως η αρίθμηση των άρθρων τις κοιλιάς στις σφήκες αρχίζει από τον αριθμό 2 εφόσον το 1 ο κοιλιακό άρθρο στα υμενόπτερα είναι ενσωματωμένο στο θώρακα. Εικόνα 32. Τρόπος σταδιακής ακινητοποίησης των κοιλιακών άρθρων στη σφήκα. ΜΕΤ: Μεταγωγέας αγκιστρωμένος στην άκρη του 3 ου κοιλιακού τεργίτη. 1, 2 και 3: Σημεία διαδοχικής κάλυψης με στρώμα κεριού Οι καταγραφές που πραγματοποιήθηκαν ήταν οι ακόλουθες: α) Καταγραφή 20 λεπτών του φυσιολογικού αναπνευστικού ρυθμού (μάρτυρας). β) Ακινητοποίηση του 6 ου και 7 ου κοιλιακού τεργίτη με ένα λεπτό στρώμα κεριού (εικόνα 32, θέση 1). γ) Ακινητοποίηση του 4 ου και 5 ου κοιλιακού τεργίτη. δ) Κάλυψη των αναπνευστικών στιγμάτων του 2 ου κοιλιακού τεργίτη και των θωρακικών αναπνευστικών στιγμάτων. Ανάμεσα στην κάθε κάλυψη, μεσολαβούσε καταγραφή 15 λεπτών. Για να επιβεβαιωθεί πως η καταγραφή οφειλόταν αποκλειστικά στην 66

80 αναπνοή και όχι σε οποιαδήποτε άλλη κίνηση, εφαρμόστηκε CO 2 για 20 λεπτά και καταγράφηκε ο αναπνευστικός ρυθμός πριν, κατά και μετά την εφαρμογή. Το σήμα του μεταγωγέα που αποθηκευόταν σε υπολογιστή με τη χρήση του λογισμικού TestPoint είχε υποστεί ψηφιοποίηση στα 256 δείγματα ανά δευτερόλεπτο μέσω του A/C μετατροπέα KPCI ιερεύνηση του χρόνου θανάτωσης της σφήκας με τους κοιλιακούς τεργίτες ανοικτούς Για να ερευνηθεί το αν η παρεμπόδιση του κλεισίματος των κοιλιακών τεργιτών από τις μέλισσες επηρεάζει ή όχι το χρόνο θανάτωσης της σφήκας μέσα στη σφαίρα, χρησιμοποιήθηκαν 20 σφήκες που συλλέχθηκαν στο μελισσοκομείο. Αμέσως μετά τη σύλληψή τους, αναισθητοποιήθηκαν με τη χρήση CO 2 για 3 δευτερόλεπτα. Κατά τη διάρκεια της αναισθητοποίησης, κυλινδρικά κομμάτια πλαστικού τοποθετήθηκαν κάτω από τον 3 ο, 4 ο και 5 ο κοιλιακό τεργίτη, διαμέτρου 0.6mm και μήκους 3mm, 2,5mm και 2mm αντίστοιχα (εικόνα 33α, 33β και 33γ), με τέτοιο τρόπο ώστε να κρατούν ανοικτές τις εισόδους των αναπνευστικών στιγμάτων που βρίσκονται κρυμμένα κάτω από τον τεργίτη που προηγείται (εικόνα 34). Σκοπός των πλαστικών ήταν να εμποδίζουν τις μέλισσες να κρατήσουν ακινητοποιημένα τα κοιλιακά άρθρα σταματώντας έτσι έμμεσα τις συσπάσεις των αναπνευστικών μυών, με αποτέλεσμα τη δραματική μείωση ή και την παύση του αναπνευστικού ρυθμού. Μετά την πλήρη επαναφορά των σφηκών (περίπου 20 λεπτά) αυτές παγιδεύονταν, προσαρμοζόταν μικρο-αισθητήρας ψηφιακού θερμομέτρου ακριβείας στο θώρακά τους και παρουσιάζονταν στις εισόδους των μελισσιών. Η μεταβολή της θερμοκρασίας και η διάρκεια της σφαίρας καταγραφόταν μέχρι το θάνατο της σφήκας. Η συμπεριφορά των σφηκών στις οποίες είχαν τοποθετηθεί τα πλαστικά έδειχναν να μην επηρεάζεται. Οι σφήκες μπορούσαν να κινηθούν και να πετάξουν ελεύθερα, να επιτεθούν στα μελίσσια και να επιστρέψουν στη φωλιά τους. Το συμπέρασμα αυτό εξάγεται από τέσσερις σφήκες που ελευθερώθηκαν μετά την τοποθέτηση των πλαστικών, δύο μπροστά από τη σανίδα πτήσης και δύο μακριά από το μελισσοκομείο. Παρόλα αυτά, για να αποκλειστεί κάθε ενδεχόμενο αλλοίωσης της συμπεριφοράς κυρίως στον αναπνευστικό ρυθμό, πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις πριν και μετά την τοποθέτηση των πλαστικών με την ίδια μεθοδολογία που περιγράφεται στην προσομοίωση της συμπεριφοράς των μελισσών στο εργαστήριο-μελέτη του αναπνευστικού ρυθμού της σφήκας. 67

81 Εικόνα 33. α και β: Εισαγωγή πλαστικών κυλίνδρων κάτω από τους κοιλιακούς τεργίτες της σφήκας. γ: Αναισθητοποιημένη σφήκα με τρία πλαστικά κάτω από τον 3 ο, 4 ο και 5 ο κοιλιακό τεργίτη Εικόνα 34. Σφήκα που φέρει 3 πλαστικά στους κοιλιακούς τεργίτες (διακρίνονται ανασηκωμένοι) έχοντας συνέλθει εντελώς από την αναισθητοποίηση 68

82 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Προσδιορισμός της θερμοκρασίας στον πυρήνα της σφαίρας Η διακύμανση της θερμοκρασίας παρουσίασε μεγάλη σταθερότητα ανάμεσα στα 20 μελίσσια που μελετήθηκαν. Μέσα σε ελάχιστα λεπτά (4-6), η θερμοκρασία έφτασε τους 44 ± 0,5 ο C και παρέμενε σ αυτό το επίπεδο για περίπου λεπτά. Η μέση διάρκεια της σφαίρας, ο χρόνος δηλαδή που χρειάζονταν οι μέλισσες για να θανατώσουν τη σφήκα, ήταν 57,85 λεπτά (n=20, s.d.=11,42) με ελάχιστο τα 41 και μέγιστο τα 78 λεπτά (πίνακας 13). Η θερμοκρασία αυτή είναι ψηλότερη από τις αναφορές για άλλες φυλές της ευρωπαϊκής μέλισσας (Ono et al, 1987; Ken et al, 2005), στις οποίες παρουσιάζεται η θερμοκρασία να φτάνει τους o C. Είναι όμως κατά 3 ο C χαμηλότερη από το μέσο όρο της θερμοκρασίας που αναπτύσσεται στις σφαίρες της A. cerana. Στη συνέχεια μελετήθηκε αν η θερμοκρασία αυτή είναι αρκετή για να προκαλέσει τη θερμοπληξία της σφήκας V. orientalis. Πίνακας 13. ιάρκεια σφαίρας σε 20 μελίσσια Μελίσσι Χρόνος (λεπτά) Μελίσσι Χρόνος (λεπτά) Μέσος όρος = 57,85 λεπτά, Εύρος = λεπτά Τυπική απόκλιση = 11,42, CV% = 19,74 Χρόνος θανάτωσης των σφηκών στη θερμοκρασία της σφαίρας Με δεδομένο πως η μέγιστη θερμοκρασία του πυρήνα της σφαίρας είναι οι 44 Ο C, ελέγχθηκε αν αυτή η θερμοκρασία μπορεί να αποβεί θανατηφόρα για τη σφήκα στο χρόνο που διαρκεί το κουβάριασμά της. Στο θερμοθάλαμο, ο μέσος όρος θανάτωσης των σφηκών στους 44 ο C ήταν τα 143,33 λεπτά (n=30, s.d.=33,56) με ελάχιστο τα 50 και μέγιστο τα 180 λεπτά (πίνακας 33, Παράρτημα), χρόνος σχεδόν τριπλάσιος από αυτόν που χρειάζονταν οι εργάτριες για να θανατώσουν τη σφήκα στη σφαίρα. Η αναντιστοιχία ανάμεσα στο χρόνο θανάτωσης σε φυσικές συνθήκες και στο χρόνο θανάτωσης στο θερμοθάλαμο, αποδεικνύει πως η θερμοπληξία δεν μπορεί να είναι το μοναδικό αίτιο θανάτου της σφήκας και πιθανότατα δεν αποτελεί καν το κύριο αίτιο. Αν και εκ πρώτης όψεως η αμυντική συμπεριφορά της A. mellifera cypria που θανατώνει τη σφήκα V. orientalis φαίνεται όμοια με 69

83 την περίπτωση της A. cerana και της V. mandarinia (ταχύτατη δημιουργία σφαίρας, αύξηση θερμοκρασίας), είναι φανερό πως στην περίπτωση της Κυπριακής μέλισσας εμπλέκεται ένας εντελώς διαφορετικός μηχανισμός. Προσδιορισμός του ανώτατου ορίου θνησιμότητας Για να επιβεβαιωθεί πως η θερμοκρασία που αναπτύσσεται στη σφαίρα δεν είναι αρκετή για να προκαλέσει το θάνατο της σφήκας προσδιορίστηκε το ανώτατο όριο θνησιμότητας της V. orientalis, καθώς και της κυπριακής μέλισσας (πίνακας 34, Παράρτημα). Τα αποτελέσματα έδειξαν πως το ανώτατο όριο θνησιμότητας της V. orientalis είναι εξαιρετικά ψηλό και φτάνει τους 50,6 C (n=30, s.d.=0,62). ε διαφέρει δε (t-test, P=0,5677) από αυτό της Κυπριακής μέλισσας που βρίσκεται στους 50.5 C (n=30, s.d.=0,11). Ανάμεσα στα καταγεγραμμένα ανώτατα θερμοκρασιακά όρια για άλλα είδη σφηκών η V. orientalis έχει το υψηλότερο, γεγονός που μπορεί να ερμηνευθεί αν παρατηρηθεί η γεωγραφική διασπορά αυτού του είδους. Η V. orientalis απαντάται στη λεκάνη της νοτιοανατολικής Μεσογείου, στα βορειοανατολικά παράλια της Αφρικής μέχρι και τις παρυφές της ερήμου Σαχάρα, σε όλη τη Μέση Ανατολή και την Αραβική Χερσόνησο, καθώς και στις χώρες του Περσικού κόλπου μέχρι και τη δυτική Ινδία (Darchen, 1964; Archer, 1998). Ζώντας ουσιαστικά σε μερικές από τις θερμότερες περιοχές του πλανήτη, ήταν αναμενόμενο να προσαρμοστεί στις ακραίες περιβαλλοντολογικές συνθήκες και να αυξήσει το θερμοκρασιακό ανώτατο όριο θνησιμότητας. Στην Κύπρο, συχνά οι μέγιστες ημερήσιες θερμοκρασίες ξεπερνούν τους ο C κατά τους καλοκαιρινούς μήνες. Ακόμη και στις θερμότερες ημέρες, έχει παρατηρηθεί ότι η δραστηριότητα των σφηκών συνεχίζεται με αμείωτο ρυθμό, χωρίς να επηρεάζεται από τη συνεχή, απ ευθείας έκθεσή τους στον ήλιο. Στη Σαουδική Αραβία, σφήκες V. orientalis εντοπίστηκαν να πετούν και να περπατούν στην άμμο σε θερμοκρασίες που ξεπερνούσαν τους 48 ο C (Ishay, προσωπική επικοινωνία). Τα αποτελέσματα από τα τρία πιο πάνω πειράματα, κατέδειξαν πως η θερμοπληξία πρέπει να αποκλειστεί ως το αίτιο θανάτωσης των σφηκών από τις Κυπριακές μέλισσες. Μελέτη της συμπεριφοράς των εργατριών που σχηματίζουν τη σφαίρα Από την προσομοίωση επιθέσεων σφηκών-μοντέλων, φάνηκε πως η πλειοψηφία των μελισσών που επιτίθονταν και έρχονταν σε επαφή με το πήλινο μοντέλο (ανεξάρτητα από το χρώμα), επέλεγαν την περιοχή της κοιλιάς (εικόνα 35), και ιδιαίτερα την περιοχή των κίτρινων δακτυλίων (4 ο και 5 ο κοιλιακό άρθρο). 70

84 Για τον υπολογισμό των αποτελεσμάτων θεωρήθηκε ως ενιαίο τμήμα το κεφάλι και ο θώρακας για να μην υπάρχει διαφορά στο μέγεθος σε σχέση με την κοιλιά. Από το σύνολο των 154 εργατριών που ήρθαν σε επαφή με τα μοντέλα κατά τις 60 επαναλήψεις, οι 92 επιτέθηκαν στην περιοχή της κοιλιάς (πίνακας 14). Εικόνα 35. Εργάτριες επιτίθενται στην περιοχή των κίτρινων δακτυλίων της κοιλιάς σε πορτοκαλί (α) και μαύρο (β) πήλινο μοντέλο σφήκας (εικόνες από οπτικογράφηση) Πίνακας 14. Συχνότητα επαφής των αμυνόμενων εργατριών ανά μέρος του σώματος των σφηκώνμοντέλων Μελίσσι Κεφάλι Θώρακας Κοιλιά Σύνολο Σύνολο Τα πιο πάνω αποτελέσματα, παρείχαν μια πρώτη ένδειξη πως οι μέλισσες στοχεύουν την περιοχή της κοιλιάς των σφηκών που καταφέρνουν να παγιδεύσουν. Λόγω του ταχύτατου σχηματισμού της σφαίρας και του μεγάλου αριθμού εργατριών που παίρνουν μέρος, είναι ιδιαίτερα δύσκολη η παρατήρηση του φαινομένου. Σε εποχές που υπάρχει περιορισμένη πτήση μελισσών και ελάχιστες φρουροί εκτός της εισόδου της κυψέλης (πχ μέσα με τέλη Σεπτεμβρίου όταν υπάρχει μεγάλος αριθμός μελισσοφάγων που επιτίθενται στα μελισσοκομεία), ένας ελάχιστος αριθμός μελισσών (2-10) μπορούσε να βγει και να επιτεθεί σε μία σφήκα που προσπαθούσε να εισέλθει στην κυψέλη. Οι αναλύσεις των ταινιών που κατέγραψαν αυτή την ιδιόμορφη δραστηριότητα, έδειξαν πως οι εργάτριες επιτίθονταν στην κοιλιά των σφηκών και προσπαθούσαν να γαντζωθούν στην περιοχή ανάμεσα σε δύο κοιλιακούς τεργίτες. Όταν απομακρύνθηκαν διαδοχικά οι εργάτριες που σχημάτιζαν τις σφαίρες σε τέσσερα μελίσσια, οι εναπομείνασες εργάτριες που επιχείρησαν να κουβαριάσουν τον εισβολέα, παρουσίαζαν την ίδια ακριβώς συμπεριφορά: Μη μπορώντας να καλύψουν 71

85 ολόκληρο το σώμα της σφήκας, κουβάριαζαν την κοιλιά της, αδιαφορώντας για το θώρακα και το κεφάλι (εικόνα 36). Εικόνα 36. Προσπάθεια για σχηματισμό σφαίρας γύρω από τη σφήκα. Λόγω του μικρού αριθμού τους, οι εργάτριες πάντα επιλέγουν να καλύψουν την κοιλιά του εισβολέα. ιακρίνεται το κεφάλι και μέρος από το θώρακα της σφήκας που παραμένουν εκτός (εικόνα από οπτικογράφηση) Η σημασία της κοιλιάς της V. orientalis είναι ξεχωριστή μιας και τόσο ο εξωσκελετός όσο και το εσωτερικό της αποτελεί ένα πολύπλοκο εργαλείο με ξεχωριστές ιδιότητες όπως έχει καταδείξει ο Ishay και οι συνεργάτες του σε πλήθος δημοσιεύσεων (Ishay and Litinetsky, 1996; Jongebloed et al., 1999; Ishay,1999; Ishay et al., 1999; Ishay et al., 2000). Μερικές από αυτές τις ιδιότητες είναι η ύπαρξη φωτοβολταϊκού συστήματος στους κίτρινους τεργίτες, το οποίο μπορεί να μετατρέπει την ηλιακή ακτινοβολία σε ενέργεια που χρησιμοποιεί η σφήκα κατά τη πτήση (Ishay, 2004), η θερμορύθμιση του οργανισμού της (Ishay and Pertsis, 2002) και η ισχυρή θωράκιση του εξωσκελετού (τόσο της κοιλιάς όσο και του υπόλοιπου σώματος), που μπορεί να αποτελείται σε αρκετά σημεία από 30 στρώσεις πάχους 45μm (Ishay et al, 2002). Οι στρώσεις αυτές αποτελούνται από χιτίνη (σκελετός) και στο ενδιάμεσο τους παρεμβάλλεται μία στρώση από διάφορα συστατικά, πρωτεϊνικής κυρίως φύσης (Ishay et al, 1998). Αυτή η θωράκιση, καθιστά τη χρήση του κεντριού της μέλισσας αναποτελεσματική απέναντι στη σφήκα, γεγονός που αποδεικνύεται από το ότι σε ένα σύνολο 130 σφαιρών που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία, βρέθηκαν μόνο τρία κεντριά 72

86 στο σώμα των παγιδευμένων σφηκών, στη μαλακή περιοχή ανάμεσα στο θώρακα και το κεφάλι ή στη μαλακή περιοχή κάτω ακριβώς από τα φτερά. Ίσως όμως η σπουδαιότητα της κοιλιάς για τη σφήκα να οφείλεται στο ότι αποτελεί το αναπνευστικό κέντρο του εντόμου. Στην κοιλιά βρίσκονται τα επτά από τα δέκα αναπνευστικά στίγματα της σφήκας. Από τα επτά ζεύγη, τα δύο είναι φανερά και βρίσκονται στους δύο πρώτους κοιλιακούς τεργίτες ενώ τα υπόλοιπα πέντε βρίσκονται ουσιαστικά κρυμμένα (εικόνα 37). Τα στίγματα αυτά μπορούν να χαρακτηριστούν ως εσωτερικά εφόσον βρίσκονται καλυμμένα από την πλάκα του προηγούμενου τεργίτη και ο αέρας φτάνει σ αυτά με τη συνεχή κίνηση (ανασήκωμα και έκταση) των τεργιτών Εικόνα 37. Η θέση των αναπνευστικών στιγμάτων της σφήκας V. orientalis. Τα στίγματα 6-10 (διακεκομμένο βέλος) είναι κρυμμένα κάτω από τον τεργίτη του προηγούμενου κοιλιακού άρθρου Στα έντομα, η κοιλιά πραγματοποιεί τακτικές και σχεδόν συνεχείς κινήσεις οι οποίες τροφοδοτούν με αέρα τα μεγαλύτερα τραχειακά αγγεία (Miller, 1960). Οι συσπάσεις των κοιλιακών μυών μειώνουν τον κοιλιακό όγκο, αυξάνουν την πίεση μέσα στην κοιλιακή κοιλότητα, και προκαλούν την εκροή του αέρα από ολόκληρο το τραχειακό σύστημα (φάση εκπνοής). Κατά τη διάρκεια της φάσης χαλάρωσης υπάρχει μια αύξηση στον όγκο της κοιλιάς που προκαλεί την ανάπτυξη μιας παθητικής, αρνητικής πίεσης στην κοιλιακή κοιλότητα και την εισροή του αέρα στο τραχειακό σύστημα (φάση εισπνοής). Οι αναπνευστικές κινήσεις 73

87 είναι ένα αποτέλεσμα των συγχρονισμένων κινήσεων των ομόλογων κοιλιακών μυών που παράγονται από την ενεργοποίηση μιας ομάδας κινητικών νευρώνων, οι οποίοι κατευθύνονται από την κεντρική αναπνευστική γεννήτρια (respiratory central pattern generator), ένα νευρικό δίκτυο άγνωστης θέσης στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (Marder and Bucher, 2001). Η επίθεση των μελισσών στην κοιλιά της σφήκας και η ολοκληρωτική κάλυψη του εντόμου, θα μπορούσε να αποτελεί ένα μηχανισμό για παρεμπόδιση της ανταλλαγής αερίων από τα αναπνευστικά στίγματα, για δημιουργία ενός φράγματος CO 2 γύρω από το σώμα της σφήκας ή για την παρεμπόδιση των αναπνευστικών κινήσεων της κοιλιάς, χωρίς φυσικά να αποκλείεται και ο συνδυασμός όλων των πιο πάνω. Σε κάθε περίπτωση, το αποτέλεσμα αυτής της διαδικασίας θα ήταν η θανάτωση της σφήκας με την πρόκληση ασφυξίας. Τα αποτελέσματα που ακολουθούν επιβεβαίωσαν την πιο πάνω υπόθεση. Χρόνος θανάτωσης των σφηκών σε ατμόσφαιρα 20% CO 2 Ο μέσος χρόνος θανάτωσης 16 σφηκών που τοποθετήθηκαν σε θερμοθάλαμο στους 44 ο C με περιεκτικότητα CO 2 20%, ήταν τα 108,75 λεπτά (n=16, s.d.=11,76) με ελάχιστο τα 95 και μέγιστο τα 120 λεπτά (πίνακας 35, Παράρτημα). Όμως, η θεωρία της δημιουργίας φράγματος CO 2 δεν μπορεί να εξηγήσει πλήρως και σε καμία περίπτωση δε θα μπορούσε να αποτελέσει το αίτιο θανάτωσής τους. Σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο όπου μετρήθηκε ο αναπνευστικός ρυθμός της σφήκας και ο τρόπος μεταβολής του σε ατμόσφαιρα κορεσμένη από CO 2, αποδείχθηκε ότι, αν και ο αναπνευστικός ρυθμός σταματούσε, η σφήκα μπορούσε να επανέλθει ακόμη και μετά από παραμονή για μία ώρα σ αυτές τις συνθήκες. Ο αναπνευστικός ρυθμός μετά από την πάροδο 20 λεπτών επανερχόταν στο φυσιολογικό επίπεδο δείχνοντας ουσιαστικά ότι η εφαρμογή του CO 2 μπορούσε να αναισθητοποιήσει τη σφήκα για μεγάλο χρονικό διάστημα αλλά όχι να τη θανατώσει. Μελέτη της μορφολογίας των αναπνευστικών στιγμάτων της σφήκας Το αναπνευστικό σύστημα της V. orientalis δεν έχει μελετηθεί μέχρι σήμερα και οι γνώσεις γι αυτό προέρχονται από τη μελέτη άλλων ειδών του γένους Vespa ή της οικογένειας Vespidae γενικότερα (Edwards, 1980; Ishay et al., 2004). Λόγω της σημασίας του αναπνευστικού συστήματος και ιδιαίτερα της μορφολογίας των κοιλιακών στιγμάτων και συνολικά της μορφολογίας της κοιλιάς της V. orientalis στην όλη διαδικασία της σφαίρας, μελετήθηκαν τα αναπνευστικά στίγματα και η κίνηση της κοιλιάς κατά την αναπνοή του εντόμου. 74

88 Τα αναπνευστικά στίγματα 5 σφηκών απομονώθηκαν και φωτογραφήθηκαν μέσω οπτικού μικροσκοπίου. Η επιφάνεια του κάθε αναπνευστικού στίγματος μετρήθηκε με τη χρήση του λογισμικού OLYMPUS DP-Soft Version 3.0. (εικόνα 38). Τα αποτελέσματα των μετρήσεων παρουσιάζονται στον πίνακα 15 και οι φωτογραφίες του κάθε στίγματος που βρίσκεται στο κάθε ένα από τα 7 κοιλιακά άρθρα, παρουσιάζονται στην εικόνα 39. Εικόνα 38. Μέτρηση της επιφάνειας αναπνευστικού στίγματος (Α) με τη χρήση του λογισμικού OLYMPUS DP-Soft Version 3.0. (Β). ιακρίνεται η τραχεία που καταλήγει στο στίγμα Πίνακας 15. Αποτελέσματα από τη μέτρηση του εμβαδού των 10 αναπνευστικών στιγμάτων (μm 2 ) από 5 σφήκες V. orientalis. Θ=Θωρακικό κ=κοιλιακό Μέσος Σφήκα 1 Σφήκα 2 Σφήκα 3 Σφήκα 4 Σφήκα 5 sd CV% όρος 1 ο θ 47126, , , , , ,0 618,7 1,31 2 ο θ 40323, , , , , , ,54 1 ο κ* 49599, , , , , , ,02 2 ο κ 22390, , , , , ,6 862,6 3,81 3 ο κ 19573, , , , , , ,84 4 ο κ 8246,2 9326,1 8193,4 8118,4 8144,1 8405,6 516,8 6,14 5 ο κ 8379,1 9377,5 8125,6 8291,8 8109,5 8456, ,23 6 ο κ 7970,1 8160,8 7893,8 7943,0 7901,6 7973, ,36 7 ο κ 7639,0 8666,4 7698,1 7638,1 7704,0 7869,1 446,7 5,67 8 ο κ 7302,2 7646,2 7226,7 7291,8 7118,4 7317, ,70 9 ο κ 7639, , , , , ,1 446,8 5,67 10 ο κ 7302, , ,7 7291, ,4 7317, ,07 *Το πρώτο κοιλιακό βρίσκεται στο θώρακα (προπόδιο) 75

89 Τα αποτελέσματα από τη μέτρηση της κοιλιάς 10 σφηκών κατά την έκταση και κατά τη σύμπτυξη (μέγιστο και ελάχιστο μήκος), παρουσιάζονται στον πίνακα 16. Από τα αποτελέσματα φαίνεται πως κατά τις αναπνευστικές κινήσεις, η κοιλιά μίας σφήκας μπορεί να εκταθεί κατά 17,18% (μέσος όρος). Πίνακας 16. Μέτρηση μήκους (cm) της κοιλιάς 10 σφηκών τόσο κατά τη σύμπτυξη (ελάχιστο μήκος όσο και κατά την έκταση (μέγιστο μήκος) Α/Α Ελάχιστο Μέγιστο ιαφορά Ποσοστό διαφοράς 1 1,22 1,50 0,28 18,66% 2 1,24 1,50 0,26 17,33% 3 1,30 1,60 0,30 18,75% 4 1,14 1,25 0,11 8,80% 5 1,40 1,66 0,26 15,66% 6 1,19 1,48 0,29 19,59% 7 1,25 1,50 0,25 16,66% 8 1,31 1,60 0,29 18,12% 9 1,20 1,48 0,28 18,91% 10 1,25 1,55 0,30 19,35% Μέσος όρος 1,25 1,51 0,26 17,18% Εύρος 1,14-1,40 1,25-1,66 0,11-0,30 8,80-19,59 sd 0,07 0,11 0,05 3,19 cv% 5,60 7,28 19,23 18,56 Η κίνηση της κοιλιάς της σφήκας όμως δεν γίνεται μόνο κατά μήκος. Παράλληλα με την κίνηση των άρθρων προς τα μπρος και πίσω, η κοιλιά καμπυλώνει προς τα κάτω με αποτέλεσμα να ανασηκώνονται ο τρίτος, τέταρτος, πέμπτος και έκτος κοιλιακός τεργίτης. Το άνοιγμα των τεργιτών από 10 σφήκες μετρήθηκε και τα αποτελέσματα έδειξαν πως ο τρίτος και τέταρτος κοιλιακός τεργίτης ανασηκώνονταν περισσότερο από τον πέμπτο και τον έκτο (πίνακας 17). Το άνοιγμα από το ανασήκωμα του τρίτου τεργίτη έφτανε σχεδόν το ένα χιλιοστό (μέσος όρος 0,915mm), του τέταρτου τα 0,6mm, του πέμπτου τα 0,2mm ενώ ο έκτος έμενε σχεδόν ακίνητος καθώς το άνοιγμα δεν ξεπερνούσε τα 0,065mm. Πίνακας 17. Μήκος (mm) του ανοίγματος των κοιλιακών τεργιτών (3 ο, 4 ο, 5 ο και 6 ο ) που δημιουργείται κατά το ανασήκωμά τους λόγω των αναπνευστικών κινήσεων Α/Α 3 ος τεργίτης 4 ος τεργίτης 5 ος τεργίτης 6 ος τεργίτης 1 1,00 0,70 0,25 0,10 2 0,95 0,65 0,20 0,10 3 0,75 0,40 0, ,80 0,50 0, ,20 0,75 0,25 0,15 6 0,90 0,55 0,20 0,10 7 0,95 0,65 0,20 0,10 8 0,85 0,55 0, ,95 0,65 0,20 0, ,80 0,50 0,15 0 Μέσος όρος 0,91 0,59 0,19 0,06 Εύρος 0,75-1,20 0,4-0,75 0,15-0,25 0-0,15 sd 0,12 0,10 0,03 0,05 cv% 13,18 16,94 15,78 83,33 76

90 Προσομοίωση της συμπεριφοράς των μελισσών στο εργαστήριο - Μελέτη του αναπνευστικού ρυθμού της σφήκας Οι ρυθμικές αναπνευστικές κινήσεις, που καταγράφηκαν από τους κοιλιακούς τεργίτες της σφήκας, παρουσιάζονται στην εικόνα 40Β. Το πλάτος της δύναμης που παράχθηκε από τις αναπνευστικές κινήσεις ήταν πολύ σταθερό. Κατά τα πρώτα 5 λεπτά της καταγραφής ήταν 5,69±1,62N (n=6), ενώ μετά από 2 ώρες συνεχόμενης καταγραφής ήταν 6,18±2,51N. Οι δύο τιμές δεν παρουσίαζαν στατιστικές διαφορές (t-test, P>0,05), γεγονός που αποδεικνύει πως ο αναπνευστικός ρυθμός δεν επηρεάστηκε από την πειραματική διαδικασία. Η συχνότητα των αναπνευστικών κινήσεων ήταν επίσης σταθερή. Κατά τα πρώτα 5 λεπτά της καταγραφής ήταν 3,1±0,6Hz (n=4) και 3,9±1,1Hz μετά από 2 ώρες συνεχόμενης καταγραφής. Οι δύο τιμές δεν παρουσίαζαν στατιστικές διαφορές (t-test, P>0,05). Το ότι η δραστηριότητα που καταγράφηκε σχετιζόταν άμεσα με την αναπνοή της σφήκας αποδεικνύεται από το γεγονός πως η έκθεση σε CO 2 (100%) περιόρισε εντελώς τις ρυθμικές κινήσεις μέσα σε δευτερόλεπτα. Με την κάλυψη του 6 ου και 7 ου κοιλιακού τεργίτη, το πλάτος των αναπνευστικών κινήσεων ελαττώθηκε στο 67,2±5,4% (n=4) του αρχικού (εικόνα 40Γ). Στη συνέχεια καλύφθηκαν τα δύο κίτρινα κοιλιακά άρθρα, το 4 ο και 5 ο, γεγονός που επέφερε μία δραστική μείωση του πλάτους του αναπνευστικού ρυθμού στο 12,7±1,8% (n=4) του αρχικού (σχήμα 40 ). Τέλος η κάλυψη των υπόλοιπων άρθρων της σφήκας (πλην του 3 ου κοιλιακού τεργίτη στον οποίο είχε αγκιστρωθεί ο μεταγωγέας) επέφερε μία περαιτέρω μείωση του πλάτους του αναπνευστικού ρυθμού κατά 3,2±1,8% (n=4) του αρχικού. Σε ξεχωριστό πείραμα, ακινητοποιήθηκαν όλα τα κοιλιακά άρθρα και καλύφθηκαν τα αναπνευστικά στίγματα του θώρακα. Παράλληλα η θερμοκρασία διατηρήθηκε στους 44 ο C. Μετά την πάροδο μίας ώρας, όλες οι σφήκες (n=4) βρέθηκαν νεκρές. 77

91 Εικόνα 39. Τα κοιλιακά αναπνευστικά στίγματα της V. orientalis. Α-Η: 2 ο -7 ο κοιλιακό στίγμα. Θ: Το πρώτο κοιλιακό στίγμα που βρίσκεται στο προπόδιο (το πρώτο άρθρο της κοιλιάς που έχει ενσωματωθεί στο θώρακα). Τα στίγματα Α και Β είναι ακάλυπτα ενώ τα στίγματα Γ-Η βρίσκονται καλυμμένα κάτω από την προέκταση του τεργίτη που προηγείται. Γίνονται ορατά μόνο κατά την πλήρη έκταση της κοιλιάς της σφήκας. 78

92 Εικόνα 40. Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας με τις διαδοχικές καλύψεις και τις αντίστοιχες καταγραφές. Α) Ακινητοποιημένη σφήκα σε τριβλίο Petri με το μεταγωγέα (ΜΕΤ) αγκιστρωμένο στον τρίτο κοιλιακό τεργίτη. Β) Φυσιολογικός αναπνευστικός ρυθμός (καμία κάλυψη). Γ) Αναπνευστικός ρυθμός μετά την ακινητοποίηση των κοιλιακών τεργιτών στη θέση 1. ) Αναπνευστικός ρυθμός μετά την ακινητοποίηση των κοιλιακών τεργιτών στη θέση 2. Ε) Μέρος της κοιλιάς σε έκταση με τους τεργίτες (Τ3, Τ4) ανασηκωμένους και το αναπνευστικό στίγμα (SP) ορατό. Ζ) Μέρος της κοιλιάς σε συρρίκνωση με τον τεργίτη Τ3 να καλύπτει το αναπνευστικό στίγμα (SP) 79

93 ιερεύνηση του χρόνου θανάτωσης της σφήκας με τους κοιλιακούς τεργίτες ανοικτούς Για να επιβεβαιωθεί πως η τοποθέτηση των πλαστικών κάτω από τους κοιλιακούς τεργίτες δεν επηρέασε το φυσιολογικό ρυθμό των σφηκών, πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις πριν και μετά την τοποθέτηση των πλαστικών, με τη μεθοδολογία που περιγράφεται στην προσομοίωση της συμπεριφοράς των μελισσών στο εργαστήριο-μελέτη του αναπνευστικού ρυθμού της σφήκας. Η σύγκριση των καταγραφών έδειξε πως υπήρξαν μικρές διαφορές αλλά αυτές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές. Ο μέσος όρος (n=4) της συχνότητας αντιστοιχούσε στο 98,89±12,14% του φυσιολογικού αναπνευστικού ρυθμού και το ύψος στο 94.02±21,27% του φυσιολογικού αναπνευστικού ρυθμού (P=0,92 και P=0,82 αντίστοιχα). Η επιλογή για την εισαγωγή των πλαστικών στους συγκεκριμένους τεργίτες (3 ο, 4 ο και 5 ο κοιλιακό τεργίτη) βασίστηκε στα αποτελέσματα των πειραμάτων προσομοίωσης στο εργαστήριο, μιας και ήταν ανέφικτο να κρατηθούν όλα τα αναπνευστικά στίγματα ανοικτά. Όταν πραγματοποιήθηκαν πειράματα προσομοίωσης επιθέσεων στα μελίσσια με τις 20 παγιδευμένες σφήκες που έφεραν τα πλαστικά στους κοιλιακούς τεργίτες και μετρήθηκε ο χρόνος θανάτωσης των σφηκών αυτών μέσα στη σφαίρα που δημιούργησαν οι μέλισσες γύρω τους, ο μέσος χρόνος θανάτωσης αυξήθηκε στα 124 λεπτά (n=20, s.d.=10,4), παρουσιάζοντας σημαντική διαφορά (P<0,001) από το χρόνο θανάτωσης σε φυσικές συνθήκες, ο οποίος ήταν τα 57,85 λεπτά (n=20, s.d.=11,42). Ελάχιστος χρόνος θανάτωσης ήταν τα 114 λεπτά και μέγιστος τα 143 λεπτά (πίνακας 36-Παράρτημα) ενώ η θερμοκρασία δεν παρουσίασε καμία διαφορά από τις σφαίρες υπό φυσιολογικές συνθήκες. Αν και ο χρόνος θανάτωσης στις σφήκες που έφεραν τα πλαστικά δεν έφτασε το χρόνο θανάτωσης των σφηκών στο θερμοθάλαμο, δηλαδή τα 143,33 λεπτά, οι μέσοι όροι τους δεν διέφεραν στατιστικά (P>0,05), γεγονός που αποδεικνύει πως η αποτροπή των μελισσών από το να ακινητοποιήσουν τους κοιλιακούς τεργίτες της σφήκας επηρεάζει το χρόνο θανάτωσης και δυσχεραίνει την πρόκληση της ασφυξίας. Αντίθετα, υπήρχαν σημαντικές διαφορές (P<0,001) ανάμεσα στο χρόνο θανάτωσης των σφηκών στις σφαίρες και στο χρόνο θανάτωσης των σφηκών στο θερμοθάλαμο (και στις δύο περιπτώσεις η θερμοκρασία ήταν 44 ο C). Τα αποτελέσματα των χρόνων θανάτωσης των σφηκών στις τρεις περιπτώσεις που μελετήθηκαν (στη σφαίρα, στο θερμοθάλαμο και στη σφαίρα μετά την προσθήκη των πλαστικών), παρουσιάζονται στον πίνακα 18 (αποτελέσματα από πίνακες 33, 35 και 36- Παράρτημα). 80

94 Πίνακας 18. Σύγκριση χρόνου θανάτου σφηκών. Η θερμοκρασία τόσο στον πυρήνα της σφαίρας όσο και στο θερμοθάλαμο ήταν σταθερή (44 ο C) Σφήκες σε σφαίρα Σφήκες σε Σφήκες με πλαστικά σε θερμοθάλαμο σφαίρα n Εύρος Μέσος όρος 57,85 a 143,33 b 124 b Τυπική απόκλιση 11,42 33,56 10,43 Στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στους μέσους όρους σημειώνονται με διαφορετικό γράμμα (a,b). Ανάλυση: Kruskal-Wallis Test (μη παραμετρική ANOVA). Σύγκριση μέσων όρων με το κριτήριο Dunn Από τα αποτελέσματα όλων των πειραμάτων που παρουσιάζονται στο παρόν κεφάλαιο, αποδεικνύεται πως η κυπριακή μέλισσα έχει αναπτύξει έναν εξελιγμένο μηχανισμό για τη θανάτωση ενός σημαντικού και δύσκολου στην αντιμετώπιση εχθρού. Με δεδομένη τη δυσκολία χρήσης του κεντριού και της πρόκλησης θερμοπληξίας, η A. mellifera cypria καταφέρνει να προκαλέσει το θάνατο του εισβολέα με ασφυξία. Όπως και στην περίπτωση της ασιατικής μέλισσας, που αντιμετωπίζει τη γιγαντόσωμη σφήκα, η θερμοκρασία αυξάνεται αλλά η αύξησή της δεν είναι αρκετή για να προκαλέσει θερμοπληξία στη σφήκα V. orientalis. Όμως, η συγκεκριμένη αύξηση της θερμοκρασίας κατά 8-9 ο C, πιθανότατα να υποβοηθάει τη διαδικασία της ασφυξίας σε συνεργασία με την πρόκληση δυσλειτουργίας στο αναπνευστικό σύστημα της σφήκας που προκαλείται από το κουβάριασμα των μελισσών στη σφαίρα. Το αναπνευστικό σύστημα των εντόμων ρυθμίζει την εσωτερική πίεση του CO 2 μέσω των μεταβολών στο άνοιγμα των αναπνευστικών στιγμάτων και του εξαερισμού με τη μεταγωγή θερμότητας (Harrison, 2001) και λειτουργεί με τέτοιο τρόπο που όταν η εξωτερική θερμοκρασία μεταβάλλεται από τους 20 ο C στους 40 ο C (για παράδειγμα στην ακρίδα Melanoplus bivittatus), η συνολική συγκέντρωση του CO 2 και το ph μειώνονται (Harrison, 1988). Στις σφήκες, η παρεμπόδιση των κοιλιακών κινήσεων θα μπορούσε σταδιακά να οδηγήσει σε υποξία (hypoxia-μειωμένη συγκέντρωση Ο 2 ) και στη συνέχεια σε υπερκαπνία (hypercapnia-υπερβολική συγκέντρωση CO 2 στο αίμα των θηλαστικών και αντίστοιχα στην αιμόλεμφο των εντόμων), μιας και η αναπνοή των σφηκών βασίζεται αποκλειστικά στις αναπνευστικές κινήσεις της κοιλιάς (Weis-Fogh,1967). Σε συνθήκες υποξίας, ο ρυθμός έκλυσης CO 2 στα έντομα αυξάνει κατά περίπου 45%, προκαλώντας προοδευτική αύξηση του εξαερισμού με τη μεταγωγή θερμότητας (Greenlee and Harrison, 1998). Όμως, κατά την ακινητοποίηση της σφήκας μέσα σε μία σφαίρα εργατριών, η διαδικασία του εξαερισμού της κοιλιάς δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί φυσιολογικά. Κατά συνέπεια, η συγκέντρωση του CO 2 στην αιμόλεμφο αναμένεται να αυξηθεί πολύ πάνω από τα όρια σε φυσιολογικές συνθήκες. 81

95 Επιπλέον, η αύξηση της θερμοκρασίας στο εσωτερικό της σφαίρας (44 ο C) μπορεί να επηρεάσει έμμεσα τη συγκέντρωση του CO 2 στην αιμόλεμφο. Για να προκληθεί ψύξη μέσω της εξάτμισης, πραγματοποιείται αναρρόφηση (αναστροφή της ροής) περιεχομένων της κοιλίας που προκαλεί υπερβολική απώλεια νερού (Roberts and Harrison, 1999). Σε άλλα Υμενόπτερα (μέλισσες) όταν η θερμοκρασία του αέρα αυξάνεται από τους 33 ο C στους 45 ο C, η απώλεια θερμότητας μέσω της εξάτμισης αυξάνεται κατά 7 φορές σε σχέση με την απώλεια στους 21 ο C (Roberts and Harrison, 1999). Κατ αντίστοιχο τρόπο μπορεί κανείς να υποθέσει, πως όταν το αναπνευστικό σύστημα της σφήκας βρίσκεται ακινητοποιημένο λόγω της σφαίρας σε μία θερμοκρασία 44 ο C, η απώλεια νερού θα αυξήσει περεταίρω τη συγκέντρωση CO 2. Κατά συνέπεια, η ισορροπία Ο 2 και CO 2 θα ανατραπεί και η αύξηση του CO 2 σε βάρος του Ο 2 θα ακινητοποιήσει αρχικά και θα αναισθητοποιήσει σε λίγα λεπτά, στη συνέχεια, την παγιδευμένη σφήκα (το CO 2 χρησιμοποιείται ευρύτατα ως αναισθητικό εντόμων). Με την πάροδο του χρόνου, ο θάνατος του εισβολέα θα επέλθει καθώς η υποξία και η υπερκαπνία θα προκαλέσουν την οριστική κατάρρευση του εντόμου. Η ακινητοποίηση των κοιλιακών άρθρων της σφήκας και η στέρηση της δυνατότητας του παγιδευμένου εντόμου να τροφοδοτείται με οξυγόνο κατά τα πρώτα στάδια της συμπλοκής με τις μέλισσες, έχει επίσης συνέπειες στην πρόκληση του θανάτου από ασφυξία. Έχει αποδειχθεί πως σε συνθήκες έντονης δραστηριότητας, όπως για παράδειγμα η έντονη κίνηση κατά την πτήση, αυξάνουν σημαντικά οι ανάγκες ενός εντόμου σε οξυγόνο (Rascon and Harisson, 2005). Η δραστηριότητα των μελισσών κατά το σχηματισμό της σφαίρας έχει ως αποτέλεσμα τη στέρηση του οξυγόνου στη σφήκα, σε μία στιγμή (συμπλοκή με αρκετές δεκάδες μέλισσες) που το έχει απόλυτη ανάγκη. Η πρόκληση ασφυξίας ως μηχανισμός θανάτωσης δεν έχει μέχρι σήμερα αναφερθεί για κανένα κοινωνικό ή μη κοινωνικό έντομο. Ως έκφραση δε μαζικής και συντονισμένης αμυντικής συμπεριφοράς δεν έχει όμοιο παράδειγμα σε όλο το ζωικό βασίλειο. είχνει το πως η κυπριακή μέλισσα, μέσα από χιλιετίες προσαρμογής στις σκληρές περιβαλλοντολογικές συνθήκες της νήσου και συνεξέλιξης με τον κύριο εχθρό της, κατάφερε να εντοπίσει και να εκμεταλλευτεί αποτελεσματικά την αχίλλειο πτέρνα της V. orientalis. 82

96 ΗΧΟΣ ΑΜΥΝΟΜΕΝΩΝ ΜΕΛΙΣΣΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η μαζική αμυντική συμπεριφορά των μελισσών, που διασφαλίζει τη διαβίωση του πληθυσμού, του γόνου και των αποθεμάτων τροφής της κυψέλης, εκφράζεται με μερικές ιδιαίτερες εκδηλώσεις (Breed et al., 2004). Μερικές απ αυτές είναι τα μαζικά κεντρίσματα, το φαινόμενο της κουρτίνας ή παραπετάσματος μελισσών μπροστά στην είσοδο (curtain phenomenon) και το φαινόμενο της θερμοπληξίας. Κατά τη διάρκεια της μαζικής άμυνας απέναντι σε εχθρούς, έχει παρατηρηθεί και καταγραφεί σε αρκετά είδη κοινωνικών μελισσών, η παραγωγή διακριτών ήχων υψηλών συχνοτήτων, που διαφέρουν χαρακτηριστικά από το σύνολο των ήχων που παράγονται υπό κανονικές συνθήκες από τα μέλη της κυψέλης. Στους ήχους αυτούς έχουν δοθεί ονομασίες όπως βοή (buzzing), συριγμός (piping), ή σφύριγμα (hissing) (Butler, 1954; Seeley et al., 1982; Hrncir et al., 2006). Στις μέλισσες, συχνά το σφύριγμα (hissing) αναφέρεται και ως ιριδισμός (shimmering) λόγω της συγχρονισμένης κίνησης των φτερών των αμυνόμενων μελισσών που έχει παρατηρηθεί κατά την παραγωγή του ήχου στην Apis cerana (Schneider και Kloft, 1971; Koeniger και Fuchs, 1972; Fuchs και Koeniger, 1974), την A. florea (Seeley et al., 1982; Sen Sarma et al., 2002), την A. dorsata (Kastberger και Sharma, 2000), καθώς και σε μία φυλή της δυτικής μέλισσας, την A. mellifera ligustica (Ohtani και Kamada, 1980). Παρά τις αρκετές αναφορές που υπάρχουν για την παραγωγή ήχων κατά την άμυνα, το βιολογικό νόημα, ο λόγος δηλαδή της εκπομπής αυτών των ήχων, δεν έχει εξηγηθεί. Μερικοί ερευνητές, έχουν παρατηρήσει σημαντική μείωση του αριθμού των συλλεκτριών κατά τις επιθέσεις των σφηκών ενώ υπάρχει παράλληλη παραγωγή ήχων από τις αμυνόμενες μέλισσες (Koeniger και Fuchs, 1973; Sen Sarma et al., 2002, Ken et al., 2005, Tan et al., 2007). Έχει προταθεί η υπόθεση πως ο ήχος εξυπηρετεί σκοπούς επικοινωνίας με τη μορφή σινιάλου συναγερμού ανάμεσα στα μέλη της κυψέλης που αμύνονται. Στις μέλισσες, οι καταγραφές αυτών των ήχων έδειξαν πως έχουν ένα μεγάλο εύρος στο πλάτος εκπομπής και αποτελούνται από θεμελιώδεις συχνότητες (fundamental frequencies) ανάμεσα στα 0,3kHz και στα 0,7kHz, με αρμονικές συχνότητες που πολλές φορές ξεπερνούν τα 5kHz (Hrncir et al, 2006). Όμως, τα πιο πάνω στοιχεία προέρχονται από ένα περιορισμένο αριθμό καταγραφών (συνήθως 1-4 δείγματα) και από ένα ακόμη πιο μικρό αριθμό διαφορετικών μελισσιών (συνήθως 1-2). Ως επακόλουθο, είναι αδύνατη η σύγκριση των ήχων για να βρεθούν ενδεχόμενες ιδιαιτερότητες ανάμεσα στα μελίσσια μίας φυλής, ανάμεσα στις φυλές ενός 83

97 είδους ή ανάμεσα στα είδη. Επιπλέον, δεν είναι δυνατό να μελετηθούν τυχόν ομοιότητες ή διαφορές ανάμεσα σε διαφορετικές φυλές μελισσών που αντιμετωπίζουν τον ίδιο εχθρό, κάτι που πιθανότατα θα αποτελούσε ένδειξη προσαρμογής της αμυντικής συμπεριφοράς βάσει συνεξέλιξης της σχέσης θηράματος-θηρευτή σε ένα ιδιαίτερο περιβάλλον, όπως στην περίπτωση της Κυπριακής μέλισσας και της σφήκας Vespa orientalis. Η Κυπριακή μέλισσα παρουσιάζει μία αποτελεσματική αμυντική συμπεριφορά απέναντι στον κύριο εχθρό της τη σφήκα V. orientalis (Morse, 1978). Ανάμεσα στις εκδηλώσεις αυτής της συμπεριφοράς που έχουν αναφερθεί στο παρελθόν (όπως το κουβάριασμα της επιτιθέμενης σφήκας και ο ιριδισμός) εντύπωση προκαλεί η αναφορά του Butler (1954) για την παραγωγή ενός πολύ ιδιάζοντος σφυρικτού ήχου που παράγεται από τις εργάτριες όταν αυτές αντιμετωπίζουν τη V. orientalis. Όμως, ο συγκεκριμένος ήχος, ποτέ δεν καταγράφηκε και ποτέ δεν αναλύθηκε. Τόσο κατά την προσέγγιση της επιτιθέμενης σφήκας στην είσοδο του μελισσιού, όσο και κατά τη συμπλοκή σφηκών με αμυνόμενες μέλισσες, παρατηρήθηκε ότι παραγόταν ένας οξύς, χαρακτηριστικός ήχος. Ο ήχος αυτός, αν και έμοιαζε ελαφρώς με τον ήχο της ασύζευκτης βασίλισσας (queen piping), ήταν πολύ πιο έντονος και ιδιαίτερα ευκρινής για το ανθρώπινο αυτί. Στην παρούσα εργασία, πραγματοποιήθηκαν πειράματα με στόχο να καταγραφεί και να αναλυθεί ο ήχος καθώς και να εξηγηθεί ο πιθανός ρόλος του στην αμυντική συμπεριφορά των μελισσών απέναντι στις σφήκες. ιερευνήθηκε κατά πόσο η τεχνητή αναπαραγωγή του ήχου κατά την απουσία σφηκών, σχετίζεται με τη μείωση των συλλεκτριών, λειτουργεί δηλαδή ως μία μορφή συναγερμού ανάμεσα στις εργάτριες ενός μελισσιού. Χρησιμοποιήθηκε ένα μεγάλο δείγμα καταγραφών ανά μελίσσι και μελισσιών ανά μελισσοκομείο, με στόχο να είναι εφικτή η σύγκρισή τους μέσω στατιστικών μεθόδων ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Υλικά Για την καταγραφή του ήχου χρησιμοποιήθηκαν 2 τύποι μικροφώνων και καταγραφικών: 1. Μικρόφωνο ακριβείας τύπου Sony ECM DS70P με καταγραφικό τύπου Sony MZ-RH 910 για καταγραφή σε ψηφιακό αρχείο ήχου MP3 (MPEG-1 Audio Layer 2). 84

98 2. Μικρόφωνο ακριβείας τύπου Sennheiser ME64 με καταγραφικό τύπου Marantz PMD 670 για καταγραφή σε ψηφιακό αρχείο ήχου WAV (waveform audio format), υψηλής ευκρίνειας. Οι ήχοι που καταγράφηκαν, αναλύθηκαν με τα λογισμικά προγράμματα Avisoft (Specht, 2004), Cool Edit Pro v2 και Seewave v1.2 (Sueur et al., 2006). Για την αναπαραγωγή του ήχου, χρησιμοποιήθηκε φορητή συσκευή αναπαραγωγής ψηφιακού ήχου Sony SMT-EP505 με φορητά ηχεία Arowana DC889. Για την καταγραφή της συμπεριφοράς των μελισσών κατά την τεχνητή αναπαραγωγή του ήχου, χρησιμοποιήθηκε ψηφιακή βιντεοκάμερα τύπου Sony DCR-HC24 και για την ανάλυση των ταινιών χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό πρόγραμμα Pinnacle Liquid Edition v6. Για την επεξεργασία όλων των δεδομένων, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό στατιστικό πακέτο R software (R Development Core Team 2004). Μέθοδοι Καταγραφή των ήχων σε μορφή MP3 Το Νοέμβριο του 2004, έγινε μία πρώτη προσπάθεια για την ψηφιακή καταγραφή του ήχου σε 6 μελίσσια, κατά την προσομοίωση επιθέσεων με τη χρήση παγιδευμένων σφηκών. Οι καταγραφές πραγματοποιήθηκαν σε μελισσοκομείο στην Άλασσα. Ένα μικρόφωνο ακριβείας τύπου Sony ECM DS70P προσαρμόσθηκε στην είσοδο της κάθε κυψέλης (εικόνα 42). Ο ήχος μπορούσε να καταγραφεί στην ψηφιακή μορφή MP3 σε καταγραφικό τύπου Sony MZ- RH 910. Εικόνα 41. Προσαρμοσμένο μικρόφωνο τύπου Sony ECM DS70P στη είσοδο της κυψέλης για καταγραφή του ήχο των αμυνομένων μελισσών 85

99 Για την ανάλυση και την απεικόνιση του καταγεγραμμένου ήχου, χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Cool Edit Pro v2. Το συγκεκριμένο πρόγραμμα έχει την ικανότητα να παρουσιάζει μία απεικόνιση της φασματικής ανάλυσης του ήχου (εικόνα 42). Το λογισμικό, μπορεί επίσης να καθαρίσει τον ήχο που επιθυμούμε να απομονώσουμε από το θόρυβο, που συνυπάρχει στην κυματομορφή (ήχος φτερών μελισσών και σφηκών, θόρυβος από το περιβάλλον κτλ). Στη συνέχεια, το Cool Edit Pro v2 μπορεί να επεξεργαστεί την κυματομορφή και με τη χρήση του κατάλληλου αλγόριθμου, που στη συγκεκριμένη περίπτωση είναι ο αλγόριθμος Blackman-Harris, μετατρέπει τη συνάρτηση πλάτους ταλάντωσης στο χρόνο σε συνάρτηση του πλάτους ταλάντωσης-συχνότητας. Εικόνα 42. Επεξεργασία του ήχου με το λογισμικό Cool Edit Pro v2. Κυματομορφή (πράσινη/μαύρη γραμμή) και φασματική ανάλυση με μετατροπή της συνάρτησης πλάτους ταλάντωσης στο χρόνο, σε συνάρτηση του πλάτους ταλάντωσης και της συχνότητας (μπλε γράφημα) Καταγραφή των ήχων σε μορφή WAV Μετά την ανάλυση των ήχων MP3 της πρώτης καταγραφής, αποφασίστηκε να πραγματοποιηθούν νέες καταγραφές σε ψηφιακή μορφή WAV αρχείων, η οποία έχει την δυνατότητα να μη συμπιέζει τον ήχο και να καταγράφει με απόλυτη ευκρίνεια όλο το εύρος των αρμονικών. Για το σκοπό αυτό, ένα μικρόφωνο ακριβείας τύπου Sennheiser ME64 προσαρμόστηκε στην είσοδο κάθε κυψέλης και συνδέθηκε με καταγραφικό τύπου Marantz 86

100 PMD 670 (εικόνα 43). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τον Οκτώβριο του 2006 στα μελισσοκομεία της Άλασσας και του Αμιάντου. Από τα 16 μελίσσια που παρήγαγαν χαρακτηριστικούς ήχους, κατά την προσομοίωση επιθέσεων με τη χρήση παγιδευμένων σφηκών, επιλέχθηκαν για ανάλυση 9 μελίσσια που έδωσαν από 7-15 καθαρές καταγραφές. Έτσι, αναλύθηκε ένα σύνολο 93 καταγραφών. Εικόνα 43. Καταγραφικό τύπου Marantz PMD 670 για καταγραφή αρχείων ήχου τύπου WAV Κάθε ξεχωριστή καταγραφή ήχου, διάρκειας περίπου 2 δευτερολέπτων, αναλύθηκε με το λογισμικό Seewave v.1.2 (Sueur et al., 2006), μία βιβλιοθήκη ανάλυσης ήχων που δημιουργήθηκε σε γλώσσα R (R Core Team, 2004). Για την ανάλυση του ήχου, δημιουργήθηκε ένα φασματογράφημα, βασισμένο σε κυλιόμενους, βραχυπρόθεσμους μετασχηματισμούς (STFTs) με ένα παράθυρο Hamming διάρκειας 0,023 δευτερολέπτων (87,5% της επικάλυψης ανάμεσα στα επιτυχή παράθυρα ). Η διάρκεια του χαρακτηριστικού ήχου μετρήθηκε με ακρίβεια δευτερολέπτων και οι ιδιότητες των συχνοτήτων περιγράφηκαν με τον υπολογισμό 4096 σημείων με μετατροπή Fourier στο μέσο του σήματος (ακρίβεια συχνότητας της μετατροπής =11Hz). Το φάσμα συχνοτήτων που παρήχθη, επέτρεψε τον υπολογισμό της κυρίαρχης συχνότητας (δηλαδή της συχνότητας με την υψηλότερη ενέργεια) και δύο επιτυχών αρμονικών κορυφών f n και f n+1 οι οποίες στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της θεμελιώδους συχνότητας 87

101 f 0, (η συχνότητα με την συχνότερη επικάλυψη από το θόρυβο), ακολουθώντας τη σχέση f n + 1 f n = ( n + 1) f0 nf0 = f0. Η θεμελιώδης συχνότητα από τους ήχους του παρασκηνίου, που οφείλεται στην πτήση και το βόμβο (buzz) των μελισσών, υπολογίστηκε επίσης σε ένα άλλο φάσμα, πριν και αμέσως μετά το χαρακτηριστικό ήχο (hiss), έτσι ώστε να αποκλειστεί κάθε περίπτωση ανάμιξης των δύο ήχων (n=80). Ο μέσος όρος, η τυπική απόκλιση και η τιμή IQR (inter-quartile-range) υπολογίστηκαν για κάθε μεταβλητή και ο έλεγχος κανονικότητας Shapiro-Wilk εφαρμόστηκε αρχικά για την επιλογή των παραμετρικών και μη-παραμετρικών ελέγχων που πραγματοποιήθηκαν στη συνέχεια (one-way ANOVAs και Kruskal-Wallis). Για να προσδιοριστούν πιθανές διαφορές ανάμεσα στα μελίσσια, υπολογίστηκε ο λόγος CV w / CV b για κάθε μεταβλητή, όπου CV w είναι η παραλλακτικότητα εντός του μελισσιού και CV b η παραλλακτικότητα μεταξύ των μελισσιών (Scherrer, 1984). Η συχνότητα δειγματοληψίας για την ανάλυση ήταν τα 32KHz. Οι αναλύσεις των ήχων πραγματοποιήθηκαν στο Ινστιτούτο Βιολογίας των Ζώων και Κυτταρολογίας του Πανεπιστημίου του Orsay στο Παρίσι (Institut de Biologie Animale, Intégrative et Cellulaire-IBAIC-Université Paris-Sud à Orsay). Τεχνητή αναπαραγωγή των ήχων και μελέτη της επίδρασης τους στη συμπεριφορά των μελισσών Από τις καταγραφές του ήχου, απομονώθηκε και καθαρίστηκε από το θόρυβο χαρακτηριστική καταγραφή διάρκειας 2 δευτερολέπτων. Η καταγραφή αναπαράχθηκε ψηφιακά και καταγράφηκε σε ψηφιακό δίσκο σε τρεις μορφές: α) Επαναλαμβανόμενος φυσικός ήχος 2 δευτερολέπτων με κενά 2 δευτερολέπτων, συνολικής διάρκειας 5 λεπτών β) συνεχόμενος φυσικός ήχος 5 λεπτών γ) τεχνητός ήχος με μοναδική εκπομπή στη συχνότητα της κυρίαρχης αρμονικής (5420Hz) 5 λεπτών. Οι ήχοι αναπαράχθηκαν σε 10 μελίσσια στην Άλασσα με τη χρήση φορητής συσκευής αναπαραγωγής Sony SMT-EP505 και φορητά ηχεία Arowana DC889, τα οποία βρίσκονταν σε επαφή με τη σανίδα πτήσης. Σε κάθε μελίσσι, γινόταν Α) μία καταγραφή 5 λεπτών πριν την αναπαραγωγή των ήχων (μάρτυρας 1), Β) επαναλαμβανόμενος φυσικός ήχος 2 δευτερολέπτων με κενά 2 δευτερολέπτων, συνολικής διάρκειας 5 λεπτών, Γ) συνεχόμενος φυσικός ήχος 5 λεπτών και ) τεχνητός ήχος με μοναδική εκπομπή στη συχνότητα της κυρίαρχης αρμονικής (5420Hz), διάρκειας 5 λεπτών. Ανάμεσα στις εφαρμογές μεσολαβούσαν διαλύματα 15 λεπτών. Στο τέλος, γινόταν και μία δεύτερη καταγραφή Ε) 5 λεπτών χωρίς καμία αναπαραγωγή ήχου (μάρτυρας 2). Όλα τα 88

102 πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο μελισσοκομείο στην Άλασσα τον Απρίλιο του 2005, εποχή που δεν είχε ξεκινήσει η επίθεση των σφηκών στα μελισσοκομεία. Ψηφιακή βιντεοκάμερα που είχε προσαρμοστεί στην κορυφή της κυψέλης, κατέγραφε κάθετα την πτήση των μελισσών μπροστά από την είσοδο. Με τη βοήθεια του λογισμικού Pinnacle Liquid Edition v6, αναλύθηκαν οι οπτικογραφήσεις και μετρήθηκε ο αριθμός των συλλεκτριών που εγκατέλειπαν την κυψέλη. Οι αριθμοί των συλλεκτριών συγκρίθηκαν μεταξύ τους για να μελετηθεί το αν η παραγωγή του ήχου επηρεάζει την πτήση των συλλεκτριών. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Καταγραφή των ήχων σε μορφή MP3 Ο ήχος που καταγράφηκε ήταν συνεχόμενος και περιείχε αρμονικές σειρές με μερικούς συντονισμούς συχνότητας, κυρίως στην αρχή του σήματος (εικόνα 44). Η θεμελιώδης συχνότητα, η οποία καλύφθηκε από το θόρυβο και πιθανότατα φιλτραρίστηκε επίσης από το ηχείο, μπορεί να υπολογιστεί στη μέση του σήματος στα 482Hz (=f 0 ). Στην ίδια θέση, η κυρίαρχη συχνότητα καταγράφηκε στα 4,82kHz (=10*f 0 ). Πέρα από την κυρίαρχη συχνότητα των 4820Hz, το εύρος των αρμονικών (14-18) που αποτελούσαν τον χαρακτηριστικό ήχο ξεκινούσε από τα 1750Hz και έφτανε τα 10440Hz (εικόνα 45). Με τη χρήση του λογισμικού Cool Edit Pro v2 η κυματομορφή του ήχου απεικονίστηκε στην εικόνα 42 με πράσινο/μαύρο χρώμα και αποτελεί συνάρτηση του πλάτους ταλάντωσης στο χρόνο. Με τη χρήση του αλγόριθμου Blackman-Harris, μετατράπηκε η συνάρτηση πλάτους ταλάντωσης στο χρόνο σε συνάρτηση πλάτους ταλάντωσης-συχνότητας, που παρουσιάζεται ως μπλε γράφημα στην εικόνα 46. Αποτέλεσμα είναι να έχουμε πλέον μια απεικόνιση του φάσματος συχνοτήτων το οποίο μπορεί να οριστεί ως τα πλάτη ταλάντωσης κάθε μίας από τις αρμονικές που συνθέτουν το φυσικό ήχο. Από τα αποτελέσματα, φαίνεται πως η κυρίαρχη συχνότητα (4,8KHz) του χαρακτηριστικού ήχου καθώς και οι αρμονικές που τον αποτελούν (2-7,5KHz) κινούνται σε ιδιαίτερα ψηλές συχνότητες και υπερβαίνουν τις μέχρι σήμερα καταγραμμένες συχνότητες που έχουν ηχογραφηθεί σε μέλισσες της Apis mellifera αλλά και σε αντίστοιχες εκδηλώσεις αμυντικής συμπεριφοράς σε άλλα είδη μελισσών (Apis florea, Apis cerana και Apis dorsata). 89

103 Το γεγονός όμως πως κατά την πρώτη αυτή καταγραφή ο ήχος αποθηκεύτηκε ως αρχείο τύπου MP3 (εικόνα 46), επέβαλε την πραγματοποίηση νέων καταγραφών με χρήση εξοπλισμού υψηλής ευκρίνειας και αποθήκευση των ήχων σε αρχείο τύπου WAV. Εικόνα 44. Φασματογράφημα συχνοτήτων διάρκειας 2,1 δευτερολέπτων. ιακρίνονται οι αρμονικές του χαρακτηριστικού ήχου (hissing), οι αρμονικές του βόμβου (buzz), και ο ήχος που παράγεται από ένα διερχόμενο μελισσοφάγο Merops apiaster (bird) Εικόνα 45. Φασματική σύνθεση που υπολογίστηκε στο σημείο που έχει σημανθεί με διακεκομμένη γραμμή στην εικόνα 4. Η κυρίαρχη συχνότητα βρίσκεται στα 4820Hz. Αριστερά, περίπου στα 400 Hz διακρίνεται ο ήχος από το βόμβο των μελισσών (buzz). 90

104 Εικόνα 46. Το σύνολο των αρμονικών που απαρτίζουν τον ήχο κατά τη συμπλοκή μελισσών με σφήκες. Με κόκκινη σήμανση οι κυρίαρχες συχνότητες και με λευκή σήμανση οι δευτερεύουσες. Ανάλυση από καταγραφή ήχου σε αρχείο τύπου MP3 Καταγραφή των ήχων σε μορφή WAV Ένα σύνολο 93 ήχων καταγράφηκαν από 9 μελίσσια (μ.ο.=10,33 sd=2.6 εύρος=7-15 καταγραφές/μελίσσι). Στις περισσότερες περιπτώσεις, ο ήχος επαναλαμβανόταν αρκετές φορές, ανάλογα με τη διάρκεια και την ένταση της συμπλοκής. Η διάρκεια των ήχων ήταν κατά μέσο όρο 0,622 ± 0,708 δευτερόλεπτα (IQR=0,560, n=93) και αποτελούνταν από σειρές αρμονικών με μεγάλο εύρος συχνοτήτων (εικόνα 47). Η θεμελιώδης συχνότητα είχε μέσο όρο τα 499 ± 67Hz (IQR=125, n=93) και οι σειρές των αρμονικών περιλάμβαναν μέχρι συχνότητες. Το φάσμα των συχνοτήτων εκτεινόταν μέχρι τα 16-17kHz, με μέσο όρο τη 12 η ± 4 αρμονική (IQR=4, n=93) να αποτελεί την κυρίαρχη συχνότητα με μέσο όρο 5910 ± 1428Hz (IQR=2026, n=93) (εικόνες 48-49). Οι παλμικές καταγραφές των χαρακτηριστικών ήχων παρουσίασαν τη συνηθισμένη αλληλοδιαδοχή παλμών ενώ εκείνες του βόμβου παρουσίασαν μία ημιτονοειδή κυματομορφή (εικόνα 48). Οι ήχοι που καταγράφηκαν από τις κοντινές μέλισσες ήταν συνεχόμενοι και χωρίς διακυμάνσεις στη συχνότητα. Κυρίαρχη συχνότητα ήταν η θεμελιώδης συχνότητα με μέσο όρο τα 246 ± 24Hz (IQR=38, n=80), μία τιμή σημαντικά χαμηλότερη από την τιμή των χαρακτηριστικών ήχων κατά την άμυνα (ANOVA, df=1, F=1029,1, P=2,2x10-16 ). Έτσι, 91

105 φαίνεται ξεκάθαρα η διαφορετική μορφή των ήχων που παράγονται κατά την άμυνα, από τους συνηθισμένους ήχους που παράγονται σε ένα μελίσσι (εικόνα 48). Εικόνα 47. ύο καταγραφές ήχου αμυνόμενων μελισσών κατά την επίθεση σφήκας. (a) σύνθεση φάσματος (σχετικό εύρος σε σχέση με τη συχνότητα) που υπολογίστηκε στη θέση της κάθετης διακεκομμένης γραμμής στο (b). (b) φασματογράφημα (συχνότητα σε σχέση με το χρόνο και με το σχετικό εύρος σε decibel) και παλμική καταγραφή (σχετικό εύρος σε σχέση με το χρόνο). Η θεμελιώδης συχνότητα (f 0 ) βρίσκεται στα 0,47kHz και η κυρίαρχη συχνότητα (14 f 0 ) στα 6,60kHz. Αν και οι διαφορές που προσδιορίστηκαν μεταξύ των κυψελών (πίνακας 37-Παράρτημα) ήταν σημαντικές για όλες τις παραμέτρους (διάρκεια ήχου: P=9,67x10-3 ; κυρίαρχη συχνότητα ήχου: P=1,24x10-4 ; θεμελιώδης συχνότητα ήχου: P=1,5x10-7 ; θεμελιώδης συχνότητα βόμβου: 92