Μοριακή Ανάλυση Φυτών

Transcript

1 Μοριακή Ανάλυση Φυτών Μοριακοί Δείκτες Αριστοτέλης Χ. Παπαγεωργίου Εργαστήριο Δασικής Γενετικής / ΔΠΘ

2 Γενετική ποικιλομορφία Είναι η βάση της εξέλιξης Προϋπόθεση προσαρμογής σε νέα περιβάλλοντα Το μέρος της ποικιλότητας που κληρονομείται Η μελέτη της είναι σημαντική για τη γενετική και τη βιοτεχνολογία Περιγραφή γενετικών διαφορών μεταξύ οργανισμών Περιγραφή ή σήμανση συγκεκριμένων γονιδίων Ταυτοποίηση ποικιλιών και γενοτύπων Σύγκριση πληθυσμών άγριων φυτών Μέτρηση εξελικτικών παραμέτρων Μετανάστευση Αναπαραγωγή Παρακολούθηση προγραμμάτων βελτίωσης

3 Στο εργαστήριο Θέλουμε να δούμε τη γενετική ποικιλότητα Χρειαζόμαστε χαρακτηριστικά όπου ο φαινότυπος να φανερώνει το γενότυπο απλό πρότυπο κληρονόμησης ανεξαρτησία από το περιβάλλον Επίσης θέλουμε συγκυριαρχία να μην κοστίζει να εμφανίζεται πολυμορφισμός Ακόμα θα θέλαμε: να βλέπουμε πολυμορφισμό που να ξέρουμε τι σημαίνει Να έχουμε αντιπροσωπευτική εικόνα του γενώματος τα γονίδια που βλέπουμε να σχετίζονται με την προσαρμογή τα γονίδια που βλέπουμε να ελέγχουν σημαντικούς χαρακτήρες Πολλά θέλουμε...

4 Χαρακτηριστικά που βλέπουμε Στο πεδίο (φύση, χωράφι, κλπ.) χαρακτηριστικά που έχουν νόημα για την πράξη επίδραση από το περιβάλλον και πολλαπλά γονίδια Στο εργαστήριο μοριακοί δείκτες συνήθως τμήματα DNA 100% γενετικές διαφορές Δεν ξέρουμε πάντα τι σημαίνουν οι πολυμορφισμοί Όλα αυτά πλέον αλλάζουν (βλ. Γενωμική)

5 Μοριακοί δείκτες Δείκτες που βασίζονται στη Μοριακή Βιολογία Επίπεδο DNA ή ενζύμων (συνήθως) Βασικές κατηγορίες Ισοένζυμα Μήκος τμημάτων DNA Αλληλουχίες τμημάτων των γενωμάτων (ή ολόκληρων)

6 Ηλεκτροφόρηση

7 Ηλεκτροφόρηση

8 Ισοένζυμα A B heterozygous A A B B homozygous allele B allele A Zymogram +

9 PCR Σήμερα οι δείκτες DNA βασίζονται στην PCR Διαδικασία πολλαπλασιασμού (πολυμερισμού) συγκεκριμένων τμημάτων DNA Βασίζεται πάνω στην εναλλαγή των θερμοκρασιών Παράγει εκατομμύρια αντίτυπα από ένα αρχικό τμήμα DNA

10 Διαδικασία PCR

11 Συσκευή PCR

12 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες Random Amplified Polymorphic DNA RAPD PCR Ηλεκτροφόρηση

13 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες Random Amplified Polymorphic DNA RAPD

14 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες

15 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)

16 Ένζυμα περιορισμού

17 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες Amplified Fragments Length Polymorphism

18 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες AFLP

19 Ηλεκτροφόρηση στηλών

20 Αποτελέσματα AFLP

21 Ουδέτεροι κυρίαρχοι δείκτες Παράγουν μια σειρά δυαδικών αποτελεσμάτων (0/1) Στοχεύουν τυχαία σημεία στο γένωμα Αντιπροσωπευτικότητα Εύκολοι στη χρήση και σχετικά οικονομικοί δείκτες Ιδανικοί δείκτες αν δεν γνωρίζουμε στοιχεία του γενώματος από πριν Δεν είναι εύκολα επαναλήψιμοι και απαιτούν σύγκριση όλων των δειγμάτων σε μία αντίδραση Είναι κυρίαρχοι δείκτες και απαιτούν τη χρήση θεωρητικών μοντέλων για την περιγραφή της ποικιλότητας Ιδανικοί για ταυτοποίηση γενοτύπων.

22 Ανάλυση στοχευμένων τμημάτων DNA Δείκτες που εξετάζουν τον πολυμορφισμό σε συγκεκριμένα τμήματα του DNA Χρειάζεται να σχεδιαστούν πάνω σε γνωστές αλληλουχίες και συχνά είναι εξειδικευμένοι για συγκεκριμένα είδη γένη Το πρώτο στάδιο της ανάλυσης είναι πάντα ο πολυμερισμός ενός συγκεκριμένου τεμαχίου DNA με PCR Στη συνέχεια εξετάζεται η ποικιλότητα ανάμεσα στα δείγματα της ανάλυσης Με χώνευση ενζύμων περιορισμού και σύγκριση μήκους τεμαχίων Με σύγκριση του μήκους των τεμαχίων Με αλληλούχιση των τεμαχίων

23 PCR RFLP Πολυμερισμός συγκεκριμένου τεμαχίου DNA Χώνευση με ένζυμα περιορισμού που στοχεύουν σε σημείο πολυμορφισμού (SNP) Ηλεκτροφόρηση και διαχωρισμός τεμαχίων DNA με διαφορετικό μήκος

24 Μικροδορυφόροι SSR Συχνές μεταλλάξεις, προκαλούν μεγάλο πολυμορφισμό στον αριθμό των επαναλαμβανόμενων μοτίβων

25 SSR δείκτες

26 SSR δείκτες

27 SSR δείκτες

28 Αλληλούχιση μικροδορυφόρων

29 Αλληλούχιση μικροδορυφόρων

30 Πολυμορφισμοί σε μία θέση (SNP)

31 Αλληλούχιση τεμαχίων DNA (sequencing) Αλληλούχιση κατά Sanger Απόκτηση τεμαχίου και πολυμερισμός με PCR Απόκτηση πλήρους αλληλουχίας του τεμαχίου και σύγκριση μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων Εντοπισμός SNPs

32 Συσκευή αλληλούχισης Sanger

33 Εντοπισμός SNP σε αλληλουχίες

34 Εντοπισμός πιθανού indel

35 Πολυμορφισμός σε επίπεδο DNA

36 Δίκτυο απλοτύπων cpdna

37 Γενωμική (genomics) Μελέτη αλληλουχιών συγκεκριμένων γονιδίων που γνωρίζουμε τη λειτουργία τους Πολυμορφισμός Έρευνα προσαρμογών Σημαντική εφαρμογή σε επιστήμες υγείας και αγροτικής παραγωγής βιοτεχνολογίας