ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΑΡΘΡΙΚΟΥ ΧΟΝ ΡΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΥΠΟΧΟΝ ΡΙΝΟΥ ΟΣΤΟΥ ΣΕ ΟΣΤΕΟΑΡΘΡΙΤΙΚΕΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΕΣ ΚΕΦΑΛΕΣ ΜΗΡΙΑΙΟΥ ΟΣΤΟΥ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN

Transcript

1 ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΑΡΘΡΙΚΟΥ ΧΟΝ ΡΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΥΠΟΧΟΝ ΡΙΝΟΥ ΟΣΤΟΥ ΣΕ ΟΣΤΕΟΑΡΘΡΙΤΙΚΕΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΕΣ ΚΕΦΑΛΕΣ ΜΗΡΙΑΙΟΥ ΟΣΤΟΥ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN Μάρθα Ζ. Βαρδάκη 1, ιονύσιος Ι. Παπαχρήστου 2, Παναγιώτης Μέγας 3, Σοφία Παντελιού 4, Χρίστος Γ. Κοντογιάννης 1,5 και Μαλβίνα Γ. Όρκουλα 1,* 1 Τµήµα Φαρµακευτικής, Πανεπιστήµιο Πατρών 2 Τµήµα Ανατοµίας-Ιστολογίας-Εµβρυολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήµιο Πατρών και Τµήµα Παθολογίας, Πανεπιστήµιο του Pittsburgh, Ιατρική Σχολή, Pittsburgh, PA, ΗΠΑ 3 Τµήµα Ορθοπαιδικής Χειρουργικής, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήµιο Πατρών 4 Τµήµα Μηχανολόγων Μηχανικών και Αεροναυπηγών, Πανεπιστήµιο Πατρών 5 ΕΙΧΗΜΥΘ/ΙΤΕ, Πάτρα malbie@upatras.gr, τηλ: , fax: Εισαγωγή Η Οστεοαρθρίτιδα είναι µια συχνά εµφανιζόµενη ασθένεια στις µεγάλες ηλικίες, µε µεγάλο αντίκτυπο στην ποιότητα ζωής του ασθενούς. Χαρακτηριστικό της είναι η προοδευτική καταστροφή του αρθρικού χόνδρου, το οποίο έχει σαν επακόλουθο τη δυσκολία στη λειτουργία της άρθρωσης, στην κίνηση, έντονο πόνο, και τελικά αναπηρία [1]. Ο οστίτης ιστός είναι ένα σύµπλεγµα ινών κολλαγόνου τύπου Ι µε ανόργανο υλικό, ένα µη-στοιχειοµετρικό ανάλογο του υδροξυαπατίτη, το οποίο προσδίδει στον ιστό σκληρότητα και αντοχή σε θραύση. Ο χόνδρος αποτελείται κυρίως από κολλαγόνο τύπου ΙΙ χωρίς ανόργανη προσθήκη και ο ρόλος του είναι να απορροφά κραδασµούς και στις αρθρώσεις προστατεύοντας το υποχόνδρινο οστό από µηχανική καταπόνηση. Η κατάσταση του χόνδρου εκτιµάται µε κλινική εξέταση, µελέτες απεικόνισης και ιστοπαθολογικές αναλύσεις. Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκε η Φασµατοσκοπία Raman για τη µελέτη ανθρώπινων οστεαρθριτικών κεφαλών µηριαίου οστού σαν µια πιθανά συµπληρωµατική τεχνική, καθώς δίνει πληροφορίες για την περιεκτικότητα των συστατικών των ιστών. 2. Μεθοδολογία είγµατα Για τη µελέτη χρησιµοποιήθηκε ανθρώπινη οστεοαρθριτική κεφαλή µηριαίου οστού. Η οστεοαρθρίτιδα τεκµηριώθηκε τόσο µε µακροσκοπική και όσο και µε ιστοπαθολογική ανάλυση µε τη χρώση ηωσίνης-αιµατοξυλίνης. Αµέσως µετά την επέµβαση, µια λεπτή τοµή, παράλληλη στο διαµήκη άξονα, αφαιρέθηκε από την κεφαλή, µε αδαµάντινο τροχό (Φωτογραφία 1). Η τοµή εµβαπτίσθηκε σε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (Phosphate Buffer Saline - PBS) και διατηρήθηκε σε θερµοκρασία -20ºC µέχρι τη χρήση της. Πριν τη συλλογή των φασµάτων, η τοµή ήρθε σε θερµοκρασία περιβάλλοντος και διατηρήθηκε ενυδατωµένη ρίχνοντας σε τακτά χρονικά διαστήµατα ρυθµιστικό διάλυµα [2]. Οργανολογία Raman Για τη µελέτη χρησιµοποιήθηκε σύστηµα micro-raman (invia Raman microscope, Renishaw). Για τη λήψη των φασµάτων χρησιµοποιήθηκε αντικειµενικός

2 φακός 20x. Η προσπίπτουσα ακτινοβολία είχε συχνότητα 785 nm και ισχύ 35 mw στον αντικειµενικό φακό. Κάθε φάσµα ήταν ο µέσος όρος δύο σαρώσεων στην περιοχή cm -1. Ο απαιτούµενος χρόνος για την καταγραφή κάθε φάσµατος ήταν 1.5 min. Η διακριτική ικανότητα του οργάνου ήταν 1.0 cm -1. Φωτογραφία 1. Φωτογραφία της τοµής της οστεοαρθριτικής κεφαλής µηριαίου οστού. Χαρτογράφηση δείγµατος Φάσµατα Raman συλλέχθηκαν από την επιφάνεια της τοµής. Η περιοχή µελέτης ήταν ο αρθρικός χόνδρος και το υποχόνδρινο οστό. Η τοµή τοποθετήθηκε κάθετα ως προς την προσπίπτουσα ακτινοβολία. Το ίχνος της ακτίνας πάνω στο δείγµα ήταν 100 µm. Η χαρτογράφηση έγινε µετακινώντας την µηχανοκίνητη τράπεζα του µικροσκοπίου και το δείγµα πάνω σε αυτή κατά βήµατα των 100 µm. Υγιείς (κοντά στο λαιµό) και οστεοαρθριτικές (στο κέντρο της κεφαλής) περιοχές, όπως εκτιµήθηκαν µε οπτική παρατήρηση, επιλέχθησαν για τη χαρτογράφηση. 3. Αποτελέσµατα - Συζήτηση Φάσµατα Raman αρθρικού χόνδρου και υποχόνδρινου οστού Χαρακτηριστικά φάσµατα Raman αρθρικού χόνδρου και υποχόνδρινου οστού όπως συλλέχθησαν από υγιή περιοχή της κεφαλής, παρατίθενται στο σχήµα 1. Στο φάσµα του υποχόνδρινου οστού, η παρουσία του ανόργανου συστατικού (βιοαπατίτη) πιστοποιείται από την παρουσία κορυφής στους 959 cm -1 που οφείλεται στα φωσφορικά και στους 1070 cm -1 που οφείλεται στα ανθρακικά ιόντα. Οι κορυφές αυτές δεν εµφανίζονται στο φάσµα του χόνδρου καθώς είναι ιστός χωρίς ανόργανο τµήµα. Οι κορυφές της προλίνης και της υδροξυπρολίνης στους 855, 875, 920 και 937 cm -1, εµφανίζονται και στα δύο φάσµατα στις ίδιες θέσεις. εν είναι χαρακτηριστικές της δευτεροταγούς δοµής του κολλαγόνου και δεν αναµένεται µετατόπιση. Ωστόσο, σηµαντικές διαφοροποιήσεις µεταξύ των δύο φασµάτων εντοπίζονται στην περιοχή του αµιδίου Ι ( cm -1 ) και ΙΙΙ ( cm -1 ) οι οποίες αντιπροσωπεύουν τη δευτεροταγή δοµή των δύο µακροµορίων. Η αναλογία µεταξύ των κορυφών 1246 και 1271 cm -1, χαρακτηριστικών κορυφών του αµιδίου ΙΙΙ του οστού, αναστρέφεται στο φάσµα του χόνδρου. Η παρατήρηση αυτή είναι σε συµφωνία µε τα όσα έχουν αναφερθεί από τους Dehring et. al. για τον αρθρικό χόνδρο επίµυων [3]. Επίσης, το αµίδιο Ι στο φάσµα του υποχόνδρινου οστού

3 εµφανίζει µέγιστο στους 1657 cm -1 (α-έλικα). Στο φάσµα του χόνδρου, όµως, το µέγιστο µετατοπίζεται στους 1668 cm Relative Intensity A Wavenumber (cm -1 ) B Σχήµα 1. Φάσµατα Raman υποχόνδρινου οστού (Α) και αρθρικού χόνδρου (Β). ιαφοροποίηση φασµάτων Raman Κολλαγόνου Ι και Κολλαγόνου ΙΙ Περαιτέρω µελέτη της περιοχής του αµιδίου Ι στα φάσµατα του υποχόνδρινου οστού και του αρθρικού χόνδρου έδειξε τη διαφοροποίηση µεταξύ κολλαγόνου Ι και ΙΙ, όπως αυτή αντικατοπτρίζεται στα φάσµατα τους. Με χρήση ειδικού λογισµικού (Peakfit v4.0, Jandel Scientific, San Rafael, CA) προσδιορίστηκαν και διαχωρίστηκαν οι κορυφές που συνυπάρχουν κάτω από την ευρεία µπάντα του αµιδίου Ι (σχήµατα 2, 3). Χαρτογράφηση της τοµής της κεφαλής µηριαίου οστού Φάσµατα που συλλέχθησαν από διαδοχικά σηµεία υγιούς περιοχής (όπως αυτή χαρακτηρίστηκε µε οπτική παρατήρηση) στην επιφάνεια της τοµής, έδειξαν την ύπαρξη, όπως άλλωστε ήταν αναµενόµενο, ενός διαχωριστικού ορίου µεταξύ του χόνδρου και του υποχόνδρινου οστού. Σάρωση της περιοχής µε κατεύθυνση προς το εσωτερικό της κεφαλής έδειξε ότι α) η ένταση της κορυφής του βιοαπατίτη στους 960 cm -1 αυξήθηκε απότοµα, β) ο λόγος των κορυφών 1246 και 1276 cm -1 αναστράφηκε και γ) το µέγιστο στην περιοχή του αµιδίου Ι µετατοπίσθηκε από τους 1668 στους 1657 cm -1. Αντίθετα, σε µια οστεοαρθριτική περιοχή, επειδή ακριβώς εισχωρεί ο χόνδρος στο εσωτερικό, η διαχωριστική γραµµή δεν υπάρχει, ενώ ακόµα και στην περίµετρο µπορεί να υπάρχει οστό εκεί που θα έπρεπε να υπάρχει χόνδρος. Η εικόνα αυτή απεικονίζεται πλήρως στα φάσµατα Raman όπου βλέπουµε τη συνύπαρξη των χαρακτηριστικών κορυφών των δύο τύπων κολλαγόνου κάτω από την ευρεία µπάντα του αµιδίου Ι (σχήµα 4).

4 Σχήµα 2. ιαχωρισµός κορυφών κάτω από την ευρεία µπάντα του αµιδίου Ι στο φάσµα του υποχόνδρινου οστού σε κεφαλή µηριαίου οστού. Οι κορυφές αυτές οφείλονται σε δονήσεις του κολλαγόνου τύπου Ι. Σχήµα 3. ιαχωρισµός κορυφών κάτω από την ευρεία µπάντα του αµιδίου Ι στο φάσµα του αρθρικού χόνδρου σε κεφαλή µηριαίου οστού. Οι κορυφές αυτές οφείλονται σε δονήσεις του κολλαγόνου τύπου ΙΙ.

5 Σχήµα 4. Συνύπαρξη των χαρακτηριστικών κορυφών κολλαγόνου Ι (1657 cm -1 ) και ΙΙ (1668 cm -1 ) κάτω από την ευρεία µπάντα του αµιδίου Ι στο φάσµα Raman οστεοαρθριτικής περιοχής της κεφαλής µηριαίου οστού. 4. Συµπεράσµατα Στην εργασία αυτή χρησιµοποιήθηκε η Φασµατοσκοπία Raman για τη µελέτη οστεοαρθριτικών ανθρώπινων κεφαλών µηριαίου οστού. Ταυτοποιήθηκαν οι δύο τύποι κολλαγόνου, Ι και ΙΙ, που κυριαρχούν στο υποχόνδρινο οστό και τον αρθρικό χόνδρο, αντίστοιχα. Η σαφής διαφοροποίηση των φασµάτων τους αποτελεί το εργαλείο µε το οποίο µπορεί να γίνει φασµατοσκοπική ταυτοποίηση του οστεαρθριτικού οστού. Χαρτογράφηση της κεφαλής υποδεικνύει ποιά περιοχή είναι υγιής, εφόσον διαχωρίζεται το στρώµα του χόνδρου από το οστό, και ποιά περιοχή είναι ασθενής όπου κολλαγόνο ΙΙ βρίσκεται να συνυπάρχει µε κολλαγόνο Ι καθώς ο οστεοαρθριτικός χόνδρος εισχωρεί στο υποχόνδρινο οστό. 5. Βιβλιογραφία 1. P. Creamer and M.C. Hochberg, «Osteoarthritis», Lancet, 350, , M. Raghavan, N.D. Sahar, R.H. Wilson, M.-A. Mycek, N. Pleshko, D.H. Kohn, M.D. Morris, Journal of Biomedical Optics, 15(3), 2010, K.A. Dehring, N.J. Crane, A.R. Smukler, J.B. Mchugh, B.J. Roessler and M.D. Morris «Identifying Chemical Changes in Subchondral Bone Taken from Murine Knee Joints Using Raman Spectroscopy», Applied Spectroscopy, 60(10), , Ευχαριστίες Η εργασία αυτή ενισχύθηκε οικονοµικά από το Πρόγραµµα Βασικής Έρευνας «Κ. Καραθεοδωρή», Επιτροπή Ερευνών, Πανεπιστήµιο Πατρών (Κωδικός: C.914).