ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

Transcript

1 ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Δρ. Νικόλας Φωκιαλάκης Επίκουρος Καθηγητής Τομέα Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων

2 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Μέθοδοι διαχωρισμού των συστατικών ενός μείγματος με βάση την διαφορετική τους κατανομή μεταξύ δύο φάσεων, μιας σταθερής (stationary phase) και μιας κινητής (mobile phase)

3 Κατηγορίες χρωματογραφίας: κριτήριο η φύση των φάσεων 1. Αέριου υγρού (GC, GLC) 2. Υγρού - υγρού (LLC) 3. Υγρού στερεού ( LC) 4. Αέριου στερεού 5.Υπερκρίσιμου-στερεού

4 Κατηγορίες χρωματογραφίας: κριτήριο ο μηχανισμός διαχωρισμού 1. Προσρόφησης (Si gel, Al2O3) (κανονική & αντίστροφη) 2. Κατανομής (κανονική & αντίστροφη) 3. Ιοντοανταλαγής 4. Μοριακού αποκλεισμού 5. Συγγένειας

5 Κατηγορίες χρωματογραφίας: κριτήριο η στατική φάση 1. Χρωματογραφία σε χαρτί (PC) 2. Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) 3. Χρωματογραφία στήλης (CC)

6 Κατηγορίες χρωματογραφίας: κριτήριο η στατική φάση Κατηγορίες χρωματογραφίας: κριτήριο ο σκοπός του διαχωρισμού 1. Ανιούσα 2. Κατιούσα 3. Οριζόντια 1. Αναλυτική χρωματογραφία 2. Παρασκευαστική χρωματογραφία

7 Χρωματογραφία επί χάρτου Στατική φάση : Η2Ο + κυτταρίνη Μηχανισμός : κατανομή μεταξύ δύο υγρών φάσεων Rf = Συντελεστής συγκράτησης ή επιβράδυνσης Rf= απόσταση που διάνυσε η ουσία Απόσταση που διάνυσε το μέτωπο του διαλύτη

8 Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας TLC Μηχανισμός: Προσρόφηση + κατανομής Αντιδραστήρια εμφάνισης : Αντιδραστήριο Dragendorff (αλκαλοειδή) Vanillin + H2SO4 (γενικό) ΚΑΝΟΝΙΚΗ ΦΑΣΗ Στερεή φάση : διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) οξείδιο του αλουμινίου (alumina -ph) Κινητή φάση : οργανικοί διαλύτες ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΦΑΣΗ Στερεή φάση : C18 διοξείδιο του πυριτίου ( C18 silica gel) Κινητή φάση : Η2Ο + οργανικοί διαλύτες ( MeOH, ACN )

9

10

11

12 TLC

13 COOH HO O HO O CH 2 Cl 2 / MeOH: 96/4 COOH OH OH O OMe HO OMe OMe O CH 3 MeO O OH COOH OH HO OH OH COOMe COOH HO O COOMe COOH OMe OH OH OH O OH OMe OMe OH OH

14 Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας TLC Πλεονεκτήματα Πολύ ευαίσθητη Εύκολη παραλαβή των ουσιών Δυνατότητα ποσοτικής ανάλυσης Γρήγορη Μπορεί να ψεκαστεί Κατάλληλη για λιπόφιλες και λιπόφοβες ενώσεις Χαμηλού κόστους

15 Παρασκευαστική χρωματογραφία scale up μεθόδου προθέρμανση της TLC διάλυση μίγματος σε μικρό όγκο διαλύτη σωστή τοποθέτηση δείγματος δυνατότητα πολλαπλής ανάπτυξη ψεκασμός μόνο στην άκρη απόξυση προϊόντος εκχύλιση προϊόντος

16 Centrifugal Preparative Thin Layer chromatography (CPTLC) Πλεονεκτήματα Δυνατότητα αλλαγής διαλύτη Μεγαλύτερες ποσότητες (1-2 g) Γρήγορη

17 HPTLC HPTLC TLC Layer of Sorbent 100µm 250µm High due to smaller Efficiency particle size generated Less Separations 3-5 cm cm Analysis Time Solid support Development chamber Sample spotting Scanning Shorter migration distance and the analysis time is greatly reduced Wide choice of stationary phases like silica gel for normal phase and C8, C18 for reversed phase modes New type that require less amount of mobile phase Auto sampler Use of UV/ Visible/ Fluorescence scanner scans the entire chromatogram qualitatively and quantitatively and the scanner is an advanced type of densitometer Slower Silica gel, Alumina & Kiesulguhr More amount Manual spotting Not possible

18 HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) Περιλαμβάνει τη χρήση της υψηλής απόδοσης προσρόφησης στρώματων(π.χ. σίλικα τζελ με εκλεπτυσμένα ομοιόμορφα σωματίδια, περίπου 5μm σε διάμετρο), και υιοθέτει οργανολογια για τη ανάπτυξη θαλάμων. Η τεχνική HPTLC εφαρμόζεται σε ποιοτικούς και ποσοτικούς διαχωρισμούς ενώσεων σε μείγματα D.H. Shewiyo, HPTLC methods to assay active ingredients in pharmaceutical formulations: A review of the method development and validation steps, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, σελ ,

19 Οργανολογία Συσκευή επίστρωσης πλάκας Ράφια ξήρανσης

20 Θερμαντής πλακών Κόφτης πλακών

21 Συσκευή τοποθέτησης δείγματος

22 Θάλαμος ανάπτυξης Συσκευή βύθισης

23 Συσκευή ανίχνευσης Συσκευή παραγωγοποίησης

24 Πυκνόμετρο σάρωσης

25 Χρωματογραφικό Σύστημα Στατική Φάση: Silica-gel (Si02) (καθαρό ή τροποποιημένο), Αλουμίνα, Γη-Διατόμων, Κυτταρίνη, Πολυαμίδια Κινητή Φάση: Διαιθυλαιθέρας, Αιθανόλη, Τετραϋδροφουράνιο, Οξικό οξύ, Διχλωρομεθάνιο, Διοξάνιο, Τολουόλιο, Χλωροφόρμιο D.H. Shewiyo, HPTLC methods to assay active ingredients in pharmaceutical formulations: A review of the method development and validation steps, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, σελ ,

26 Οπτικοποίηση Αποτελεσμάτων Εμποτισμός πλάκας με δείκτες φθορισμού με μήκος κύματος διέγερσης 254nm και 366nm[1] Ακτινοβόληση πλάκας με UV ή πράσινο χρώμα[1] μπλε Για τις ενώσεις που δεν παρουσιάζουν UVvis ιδιότητες απορρόφησης, διεξάγεται χημική παραγωγοποίηση [1] D.H. Shewiyo, HPTLC methods to assay active ingredients in pharmaceutical formulations: A review of the method development and validation steps, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, σελ ,

27 Πρόκειται για μια μέθοδο: Που χρησιμοποιείται στον διαχωρισμό των συστατικών μειγμάτων στην αναλυτική χημεία και στη βιοχημεία με σκοπό τον εντοπισμό, την ποσοτικοποίηση ή τον καθαρισμό μεμονομένων συστατικών των μειγμάτων Αναλυτική και ποσοτική Με υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια Με εύκολη απεικόνιση των διαχωρισμένων συστατικών Mr. Sagar Kishor savale, HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY [HPLC] Presentation, Department of Pharmacy (Pharmaceutics), διαφάνειες 6-10,

28 Σύγκριση στην ανάλυση και ποσοτικοποίηση φυσικών προϊόντων HPTLC Ταυτόχρονη ανάλυση πολλαπλών δειγμάτων [1] HPLC Ανάλυση ενός δείγματος κάθε φορά[1] Απαιτεί λιγότερο χρόνο [2] Απαιτεί περισσότερο χρόνο [2] Καλής ποιότητας χρωματογραφικό αποτύπωμα[1] Χαμηλότερη ισχύς διαχωρισμού[2] Χρωματογραφία 2 διαστάσεων (πλάκα, στροφή 90 ο ) [3] Μέτριας ποιότητας χρωματογραφικό αποτύπωμα[1] Μεγαλύτερη ισχύς διαχωρισμού[2] Χρωματογραφία 1 διάσταση (στήλη) [3] [1] Marcello Nicoletti, HPTLC fingerprint: a modern approach for the analytical determination of Botanicals, Revista Brasileira de Farmacognosia-Brazilian Journal of Pharmacognosy, σελ , [2]Gertrud E. Morlocka, High-performance thin-layer chromatography analysis of steviol glycosides in Stevia formulations and sugar-free food products, and benchmarking with (ultra) high-performance liquid chromatography, Journal of Chromatography, σελ , [3]D.H. Shewiyo, HPTLC methods to assay active ingredients in pharmaceutical formulations: A review of the method development and validation steps, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, σελ ,

29

30

31

32

33

34

35

36

37 Βιοαυτογραφικές Μέθοδοι με HPTLC Βιοαυτογραφία είναι η επίπεδη χρωματογραφική ανάλυση συνδυασμένη με μέθοδο βιολογικής ανίχνευσης Απλή, ταχεία και φθηνή μέθοδος για χημική και βιολογική διαλογή πολύπλοκων φυτικών εκχυλισμάτων, με επακόλουθη βιολογική δοκιμασία Εφαρμογή τόσο σε εξελιγμένα εργαστήρια, όσο και σε μικρά ερευνητικά εργαστήρια που έχουν ελάχιστη πρόσβαση σε εξελιγμένο εξοπλισμό Το 1946, Goodall και Levi χρησιμοποίησαν χρωματογραφία χάρτου (PC) με επακόλουθη βιοαυτογραφία για πρώτη φορά για την εκτίμηση της καθαρότητας της πενικιλίνης Σε γενικές γραμμές, μπορούν να χρησιμοποιηθούν επίπεδες χρωματογραφίες, δηλ. TLC και PC, για βιοαυτογραφία, αλλά η μέθοδος ανίχνευσης μπορεί να βελτιωθεί με την εφαρμογή προηγμένων χρωματογραφικών μέσων, δηλ. με HPTLC και OPLC. Saikat Dewanjee, Bioautography and its scope in thefield of natural product chemistry, Journal of Pharmaceutical Analysis, σελ ,

38 Οι κυριότερες εφαρμογές της βιοαυτογραφίας είναι: Η ταχεία διαλογή ενός μεγάλου αριθμού δειγμάτων για έλεγχο της βιοδραστικότητάς τους, δηλαδή, της αντιβακτηριακής, αντιμυκητιακής, αντιοξειδωτικής,κλπ δράσης τους, και Η στοχευμένη απομόνωση δραστικών ενώσεων από διάφορα μείγματα Saikat Dewanjee, Bioautography and its scope in thefield of natural product chemistry, Journal of Pharmaceutical Analysis, σελ. 76,

39

40 Overpressured layer chromatography (OPLC) Δυνατότητα έκλουσης των προϊόντων Flow rate: 10 ml/min Pressure : max 40 bar

41 Χρωματογραφία έκλουσης Συντελεστής κατανομής Κ= CS/CM Παράγοντας χωρητικότητας Κ = Vr-V0 V0

42 Χρωματογραφία έκλουσης

43 Προσρόφηση Δυνάμεις που ενεργούν Ιονικές (Ηλεκτροστατικές δυνάμεις) Διπόλου διπόλου Διπόλου - επαγόμενου διπόλου Δυνάμεις London Συνδυασμός όλων αυτών

44

45 Νεκρός όγκος στήλης Το χρονικό διάστημα που απαιτείται ώστε ένα μη συγκρατούμενο μόριο να διανύσει το μήκος της στήλης (V0)

46 Χρόνος κατακράτησης Retention time Ο χρόνος που χρειάζεται για να διατρέξει ένα συστατικό το μήκος της στήλης tr Προσαρμοσμένος χρόνος κατακράτησης tr W: εύρος κορυφής

47 Θεωρία πλακών Martin & Synge (1940) Nobel prize 1952 n = 16 (tr / W) 2 n = L / H L= ύψος στήλης Η = ύψος ισοδύναμο με μία θεωρητική πλάκα

48 Εξίσωση Van Deemter

49

50 Διαχωριστική ικανότητα - Resolution Μέτρο διαχωρισμού δύο ουσιών R = 2 (trb tra) WA + WB

51 Βελτίωση διαχωριστικής ικανότητας Αύξηση του ΔtR Αύξηση του μήκους της στήλης Ελάττωση του πλάτους της κορυφής έκλουσης ( W) Χρήση πιο ομοιόμορφου υλικού πλήρωσης Πιο πυκνό πακετάρισμα στήλης Πιο λεπτό υλικό πλήρωσης Αύξηση ταχύτητας ροής Ελάττωση ποσότητας δείγματος Ελάττωση διαμέτρου στήλης Αύξηση του εμβαδού επαφής των 2 φάσεων

52

53 Παράγοντας ασυμμετρίας ( Asymmetry factor) AF=b/a

54 Υλικά πλήρωσης ΚΑΝΟΝΙΚΗ ΦΑΣΗ Στερεή φάση : διοξείδιο του πυριτίου (silica gel) οξείδιο του αλουμινίου (alumina -ph) πολυστυρένιο Κινητή φάση : οργανικοί διαλύτες ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΦΑΣΗ Στερεή φάση : C18 διοξείδιο του πυριτίου ( C18 silica gel) Κινητή φάση : Η2Ο + οργανικοί διαλύτες ( MeOH, ACN )

55 Διαδικασίες στην χρωματογραφία Πακετάρισμα στήλης (στερεό ή υγρό) Προσθήκη δείγματος Ανάπτυξη χρωματογραφίας (ισοκρατική ή βαθμιδωτή) Εφαρμογή κενού (VLC) ή πίεσης ή απλός με την βαρύτητα

56 Flash chromatography or Column chromatography Up to 2 bar

57 Medium Pressure Liquid Chromatography (MPLC) Pressure : 20 Bar

58 Medium Pressure Liquid Chromatography (MPLC)

59 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

60 UPLC or UHPLC

61 Χρωματογραφικές τεχνικές 1943 Martin & Synge

62 HPLC vs UPLC

63 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) υλικό πληρώσεως στήλης λεπτότατου διαμερισμού υψηλή σφαιρική κανονικότητα Μεγάλη ομοιομορφία και πυκνότητα πλήρωσης στήλης Η υγρή φάση να είναι σε μορφή λεπτότατου υμένα, χωρίς λιμνάζοντες χώρους

64 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Πληρωτικά υλικά 1. Μικροπωρόδη σωματίδια (5-10 μm) 2. Μακροπορώδη σωματίδια (> 60 μm) 3. Υμενοειδή σωματίδια (35-45 μm) Αναλυτική Παρασκευαστική bar

65

66

67 ph

68 Method development Επιλογή στατικής φάσης Επιλογή κινητής φάσης Επιλογή προγράμματος μεταβολής των διαλυτών (gradient) Επιλογή ανιχνευτή

69 Σύγκριση χρωματογραφικών τεχνικών

70 Σύγκριση χρωματογραφικών τεχνικών

71

72

73

74

75 FPLC : Fast Protein Liquid Chromatography

76 FPLC : Fast Protein Liquid Chromatography

77 Supercritical fluid chromatography Είναι χρωματογραφική τεχνική κανονικής ή αντίστροφης φάσης κατάλληλη για διαχωρισμό ευαίσθητων προϊόντων Στατική φάση ότι και στην HPLC Κινητή φάση: CO2, CO2 +EtOH

78 Χειρόμορφη χρωματογραφία Δυνατότητα διαχωρισμού στερεοϊσομερών Ειδική στατική φάση

79 Ανάπτυξη μεθοδολογίας για την απομόνωση 4 μορίων Επιλογή κατάλληλης στατικής φάσης (Chiral columns)

80 Χρωματογραφία Μοριακού αποκλεισμού Ο διαχωρισμός γίνεται με βάση το σχήμα και το μέγεθος των μορίων των αναλυόμενων ενώσεων. Τα μεγάλα μόρια εξέρχονται πρώτα από τη στήλη, ενώ τα μικρά μόρια, καθώς εισέρχονται στους πόρους των σωματιδίων της στατικής φάσης, καθυστερούν και βγαίνουν αργότερα.

81 Στατικές φάσεις πολυακρυλαμίδιο Πολυσακχαρίτες (Sephadex LH20)

82 Χρωματογραφία Συγγένειας

83 Διαχωρισμός με ιοντοανταλλαγή ανιονανταλλακτική κατιονανταλλακτική

84 Διαχωρισμός με ιοντοανταλλαγή Μ + + Χ + R - Χ + + Μ + R - (ανταλλαγή κατιόντος) Μ - + R + Χ - Χ - + R + Μ - (ανταλλαγή ανιόντος) Ανταλλακτική χωρητικότητα (exchange capacity)= ικανότητα συγκράτησης = ικανότητα της ρητίνης να συγκρατεί ανταλλάξιμα ιόντα.

85 Διαχωρισμός με ιοντοανταλλαγή Συντελεστής εκλεκτηκότητας (partition constant) ΚΜ = [Χ + ] [Μ + R - ] [Μ + ][Χ + R - ] Αριθμός διακλαδώσεων 8-10 Αντιστρεπτότητα Sephadex Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης. Οι κυριότερες παράμετροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι το αντίθετο ιόν της δραστικής ομάδας της στατικής φάσης, η ιονική ισχύς, το pη, η κινητή φάση και η θερμοκρασία.

86 Στατικές φάσεις Λιπόφιλες Ρητίνες πολυστυρενίου (XAD, DOWEX) ph 1-14 Υδρόφιλες πολυμερή πολυσακχαριτών Κινητές φάσεις Η2Ο ΜeOH ACN Buffer

87 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ

88

89 HPLC system

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΟΙΟΤΙΚΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ

101

102

103 Ποσοτικοί προσδιορισμοί 1. Μέθοδος της καμπύλης αναφοράς 2. Τεχνική του ενός σημείου 3. Μέθοδος της γνωστής προσθήκης

104 Μέθοδος της καμπύλης αναφοράς Για την αξιολόγηση της γραμμικότητας μιας μεθόδου κατασκευάζεται καμπύλη αναφοράς με αναλύσεις τουλάχιστον 5 διαφορετικών συγκεντρώσεων. Η συσχέτιση μεταξύ του μετρούμενου σήματος (απορρόφηση) και της συγκέντρωσης γίνεται με εφαρμογή γραμμικής ανάλυσης Λαμβάνεται έτσι η γραμμική εξίσωση της καμπύλης αναφοράς που είναι της μορφής Υ= α + β*c, Όπου α = τομή και β= κλίση

105

106

107 ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ Πιστοποίηση μεθόδου είναι η διαδικασία που εξασφαλίζει την αξιοπιστία μιας μεθόδου κατά την καθημερινή της χρήση. Με άλλα λόγια είναι η «γραπτή απόδειξη» ότι η μέθοδος κάνει πραγματικά αυτό που θα έπρεπε να κάνει[3] Τρείς Διεθνείς Οργανισμοί παρέχουν τις γενικές γραμμές Πιστοποιήσης. FDA (US Food and Drug Administration) USP (US Pharmacopeia) ICH (International Conference on Harmonization) Τα κοινά σημεία τους είναι και τα βασικότερα κριτήρια που εξετάζονται κατά την Πιστοποίηση. [3]

108 Specificity Ειδικότητα Linearity Γραμμικότητα Accuracy Ορθότητα Μέτρησης Range Έυρος Τιμών Precision Ακρίβεια Μέτρησης Reproducibility Επαναληψιμότητα Detection Limit Οριο ανίχνευσης Quantification Limit Οριο ποσοτικοποίησης Stability Σταθερότητα Robustness Ρυθμιστικότητα ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗΣ

109 ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ (Specificity) Προσδιορισμός μόνο της ενδιαφερόμενης ουσίας (αναλύτης) Σύγκριση δ/των αναλύτη-μίγματος Έλεγχος καθαρότητας [2] ΑΚΡΙΒΕΙΑ (Accuracy) Εγγύτητα μετρούμενης-πραγματικής τιμής Τρόποι προσδιορισμού αληθινής τιμής : δ/τα αναφορας, spiked samples, πρότυπες προσθήκες, άλλη μέθοδος. [2] ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

110 ΓΡΑΜΜΙΚΟΤΗΤΑ (Linearity) Η παράμετρος που εξασφαλίζει οτι το εύρος των συγκεντρώσεων των προς ανάλυση δειγμάτων είναι τέτοια ωστε η απόκριση του αναλύτη να είναι γραμμικά ανάλογη της συγκέντρωσης του δείγματος. ΕΥΡΟΣ (Range) Το εύρος τιμών που μπορει να μετρήσει η μέθοδος μεσα στο οποίο εξασφαλίζεται η γραμμικότητα, η ορθότητα και η ακρίβεια των μετρήσεων. Η απόκλιση των μετρήσεων δεν θα πρέπει να δίνει RSD μεγαλύτερο του 3%[3] ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

111 ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΜΕΤΡΗΣΗΣ Η απόκλιση από την πραγματική τιμή πολλών μετρήσεων του ίδιου ομογενούς και σταθερού δείγματος. Διακρίνεται σε : ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΟΡΓΑΝΟΥ, ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΥ και ΔΙΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΚΡΙΒΕΙΑ (lab crossover). ΟΡΙΟ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ Η ελάχιστη συγκέντρωση-τιμή που μπορεί να ανιχνεύσει η μέθοδος πάνω από το επίπεδο του θορύβου. Τυπικά αναφέρεται ως το τριπλάσιο του επιπέδου του ΘΟΡΥΒΟΥ. ΟΡΙΟ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ Η ελάχιστη συγκέντρωση που μπορεί να ανιχνεύσει η μέθοδος με ΑΚΡΙΒΕΙΑ και ΟΡΘΟΤΗΤΑ. Απαραίτητο κριτήριο για ανίχνευση προσμίξεων.[3] ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

112 ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

113 ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ Γίνεται έλεγχος των αντιδραστηρίων, της κινητής φάσης, προτύπων και των δειγμάτων. Η σύσταση τους πρέπει να παραμένει αναλλοίωτη για τουλάχιστον 48h. Εξασφαλίζει την αξιοπιστία της μεθόδου σε περίπτωση βλάβης ή οποιασδήποτε καθυστέρησης. ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟΤΗΤΑ Η ικανότητα της μεθόδου να παραμένει αξιόπιστη και ανεπηρέαστη από, εντός συγκεκριμένων ορίων, αλλαγές στο ph και τη συσταση της κινητής φάσης, στη συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος, στη θερμοκρασία και τον όγκο του δείγματος.[3] ΑΝΑΛΥΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ

114 ΠΡΟ-ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ[3] Σχεδιασμός Συντήρηση Βαθμονόμηση Έλεγχος λειτουργίας ΣΤΟΧΟΣ ΜΕΘΟΔΟΥ[3] Α. ΕΠΙΠΕΔΟ I Ποσοτική ανάλυση Β. ΕΠΙΠΕΔΟ II Ποιοτική ανάλυση Ταυτοποίηση ΣΧΕΔΙΑΖΟΝΤΑΣ ΤΗΝ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ

115 Η Πιστοποίηση μιας μεθόδου θα πρέπει να γίνεται παράλληλα με την ανάπτυξη του πρωτοκόλλου της μεθόδου ώστε το τελικό αποτέλεσμα να είναι μία πιστοποιημένη μέθοδος έτοιμη προς εφαρμογή![3] Μια σε βάθος διαδικασία πιστοποίησης μπορεί να είναι αρκετά επίπονη αλλά μας γλυτώνει από περιττή σπατάλη χρόνου, κόπου και χρημάτων!![2] SOP (VALIDATION STANDARD ORGANIZATION PROCEDURE)

116 1. Identification, quantitation, and method validation for flavan-3-ols in fermented ready-to-drink teas from the Italian market using HPLC-UV/DAD and LC-MS/MS. (2009)[Chiara Cordero, ( Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco, Universita` degli Studi di Torino, Italy)Francesca Canale, ( Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco, Universita` degli Studi di Torino, Italy)Daniele Del Rio, (Dipartimento di Sanita` Pubblica, Universita` degli Studi di Parma, Italy)Carlo Bicchi, ( Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Farmaco, Universita` degli Studi di Torino, Italy)] J.Sep.Sci.2009, 32, J.Mark Green,A practical guide to Analytical Method Validation, Analytical Chemistry News and Features,May 1,1996, A 3. Ghulam A.Shabir, Validation of high-performance liquid chromatography methods for pharmaceutical analysis-understanding the differences and similarities between validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US Pharmacopeia and the International Conference on Harmonization, Journal of Chromatography A,987(2003) Bronner, W. E., Beecher, G. R., J. Chromatogr. A 1998, 805, CITAC/Eurachem Guide. Guide to Quality in Analytical Chemistry: An Aid to Accreditation, ICH International Conference on Harmonization. Quality Guidelines Q2(R1): Validation of Analytical Procedures :Text and Methodology, ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

117 Omics technologies Μια καινούρια προσέγγιση που απαντά σε ένα ευρύ πεδίο ερωτημάτων στην εφαρμοσμένη βιοεπιστήμη, χρησιμοποιώντας νέες μεθοδολογίες και εξελιγμένες αναλυτικές τεχνικές, με κύριο στόχο την ανεύρεση νέων βιοδεικτών

118 omics Στόχος της είναι να αναλύσει μηχανιστικά τη σχέση μεταξύ φαινοτυπικής διαφοροποίησης (π.χ. ανταπόκριση σε φάρμακα ή τροφές) και γονότυπου με τη χρήση υπολογιστικής βιολογίας και χημείας και βιοπληροφοριακών εργαλείων, που επιτρέπουν την ανάλυση και ερμηνεία του μεγάλου όγκου «omic-ων» δεδομένων Κύριες τεχνολογίες omics: η γενωμική, η πρωτεομική και η μεταβονομική

119 Γενομική (gen-omics) Μελετά τη δομή των γονιδίων, τις αλλαγές των αλληλουχιών των νουκλεοτιδίων, καθώς και τις μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης σε παθολογικές καταστάσεις Μελετά την έκφραση, τη δομή και τη λειτουργία των πρωτεϊνών σε οργανισμούς, αλλά και τις αλλαγές των επιπέδων τους σε παθολογικές καταστάσεις

120 Μεταβον(λ)ομική (metabon(l)-omics) Η omics προσέγγιση που αφορά στη μελέτη των χημικών διαδικασιών που αφορούν τους μεταβολίτες ενός βιολογικού συστήματος Συγκεκριμένα, είναι η συστηματική μελέτη των μοναδικών αποτυπωμάτων των χημικών ουσιών μεταβολιτών συγκεκριμένων κυτταρικών διεργασιών, ή αλλιώς, η μελέτη των μικρο-μοριακών τους προφίλ (μεταβόλομα)

121 Terms: Metabonomics (verses Metabolomics): The words 'Metabolomics' and 'Metabonomics' are often used interchangeably, though a consensus is beginning to develop as to the specific meaning of each. The goals of Metabolomics are to catalog and quantify the myriad small molecules found in biological fluids under different conditions. Metabonomics is the study of how the metabolic profile of a complex biological system changes in response to stresses like disease, toxic exposure, or dietary change Metabolites: low molecular weight molecules. Terminology

122 t[1] R2X[1] = 0, Plant metabolomics Raw material Sample preparation Extraction Localization of active ingredients Analysis Statistical techniques PCA data mining collection of data NMR/GC-MS/LC-MS triplet.m1 (PCA-X) t[comp. 1] Colored according to Obs ID (row m/z_row retention time) Var 1 Var n Obs 1 N 1 K 1 N n K n Obs k N k K 1 N kk n

123 Metabolomics Measure the metabolite profile gain mechanistic insight DSS DSS DSS DSS PKU statistical analysis classification normal MSU D Application of NMR spectroscopy combined with principal component analysis in detecting inborn errors of metabolism using blood spots. A INSPIRE 2011 metabonomic approach M.A. Constantinou, E. Papakonstantinou, M. Spraul, K. Shulpis, M.A. Koupparis, E. Mikros Analytica Chimica Acta, 511, , 2004

124 NMR based metabolomics

125 Application of Metabolomics for fungal identification and selection

126 PCA nmc_3 simca3.m1 (PCA-X) t[comp. 1]/t[Comp. 2] NMC57 novel scaffolds 20 NMC56 NMC55 10 NMC40 NMC45 t[2] 0 NMC25 NMC24 NMC26 NMC35 NMC42 NMC22 NMC13 NMC32 NMC21 NMC14 NMC15 NMC19 NMC18 NMC20 NMC28 NMC39 NMC34 NMC41 NMC31 NMC17 NMC16 NMC29 NMC38 NMC37 NMC36 NMC23 NMC33 NMC30 NMC52 NMC44 NMC43 NMC54 NMC50 NMC51 NMC48 NMC49 NMC46 NMC53 NMC47-10 NMC t[1] R2X[1] = 0, R2X[2] = 0, Ellipse: Hotelling T2 (0,95) SIMCA-P /7/2012 4:30:39 ìì

127 Human metabolome database HMDB Version 3.6 The Human Metabolome Database (HMDB) is a freely available electronic database containing detailed information about small molecule metabolites found in the human body. It is intended to be used for applications in metabolomics, clinical chemistry, biomarker discovery and general education. The database is designed to contain or link three kinds of data: 1) chemical data, 2) clinical data, and 3) molecular biology/biochemistry data. The database contains 41,815 metabolite entries including both water-soluble and lipid soluble metabolites as well as metabolites that would be regarded as either abundant (> 1 um) or relatively rare (< 1 nm). Additionally, 5,688 protein sequences are linked to these metabolite entries. Each MetaboCard entry contains more than 110 data fields with 2/3 of the information being devoted to chemical/clinical data and the other 1/3 devoted to enzymatic or biochemical data. Many data fields are hyperlinked to other databases (KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt, and GenBank) and a variety of structure and pathway viewing applets. The HMDB database supports extensive text, sequence, chemical structure and relational query searches. Four additional databases, DrugBank, T3DB, SMPDB and FooDB are also part of the HMDB suite of databases. DrugBank contains equivalent information on ~1600 drug and drug metabolites, T3DB contains information on 3100 common toxins and environmental pollutants, SMPDB contains pathway diagrams for 440 human metabolic and disease pathways, while FooDB contains equivalent information on ~28,000 food components and food additives.

128 The Scripps Center for Mass Spectrometry: Metabolomics Science Webpage The main focus of the Scripps Center for Mass Spectrometry is to provide a userfriendly websites for scientist in the field of Metabolomics. They provide general information on analytical tools, timelines of Metabolomics history, Metabolomic events held around the world, databases of metabolic systems, as well as bioinformatics software

129