ΚΕΦΑΛΑΙΟ 16. Ο Κυτταρικός Κύκλος. Μέρος Ι

Transcript

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 16 Ο Κυτταρικός Κύκλος Μέρος Ι

2 ΓΕΝΙΚΑ Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός είναι βασικό χαρακτηριστικό της διαιώνισης του είδους και η ικανότητα αυτο-αναπαραγωγής αποτελεί θεμελιώδες κυτταρικό γνώρισμα -Οι οργανισμοί διαιωνίζονται με Κυτταρική Διαίρεση και : α. για ένα μονοκύτταρο οργανισμό απαιτείται μόνο μία διαίρεση, ενώ β. για ένα πολυκύτταρο οργανισμό απαιτούνται πολλοί κύκλοι διαιρέσεων - Μετά από κυτταρική διαίρεση προκύπτουν 2 πανομοιότυπα θυγατρικά κύτταρα - Τα θυγατρικά κύτταρα αυξάνονται σε μέγεθος και αριθμό σχηματίζοντας ένα πληθυσμό * Τα βακτήρια σχηματίζουν αποικίες εκατομμυρίων κυττάρων σε λίγες ώρες (πολλαπλασιάζονται κάθε ~20 min) ** Τα ανθρώπινα κύτταρα προκύπτουν από επαναλαμβανόμενους κύκλους διαίρεσης του γονιμοποιημένου ωαρίου σε μεγάλο χρονικό διάστημα

3 - Τα θυγατρικά κύτταρα για να έχουν πανομοιότυπο γονιδίωμα με τα μητρικά, πρέπει η Kυτταρική Διαίρεση να: 1. ρυθμίζεται αυστηρά 2. συντονίζεται με την κυτταρική αύξηση & την αντιγραφή του DNA -Ο κυτταρικός κύκλος όλων των ευκαρυωτών ρυθμίζεται από: α. πρωτεϊνικές κινάσες, συντηρημένες από τους ζυμομύκητες μέχρι τα θηλαστικά β. & αυξητικούς παράγοντες στους ανώτερους ευκαρυώτες -Η ελαττωματική ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου συνδέεται με τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

4 Ο Κυτταρικός Κύκλος, ως ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΔΙΕΡΓΑΣΙΕΣ Ο κυτταρικός κύκλος χαρακτηρίζεται από τις 4 συντονισμένες διεργασίες της: α. κυτταρικής αύξησης (σε μέγεθος) β. αντιγραφής του DNA γ. κατανομής των διπλασιασμένων χρωμοσωμάτων στα θυγατρικά κύτταρα, & δ. κυτταρικής διαίρεσης 1. Στα βακτήρια η κυτταρική αύξηση & αντιγραφή DNA γίνονται στο μεγαλύτερο διάστημα του κυτταρικού κύκλου. Τα διπλασιασμένα χρωμοσώματα, συνδεδεμένα με την κυτταροπλασματική μεμβράνη, κατανέμονται μαζί της στα θυγατρικά κύτταρα 2. Στους ευκαρυώτες ο κυτταρικός κύκλος είναι πολύπλοκος: 2α. διακρίνεται σε τέσσερις συγκεκριμμένες φάσεις 2β. η κυτταρική αύξηση είναι μία συνεχής διαδικασία 2γ. η σύνθεση DNA γίνεται σε μία μόνο φάση 2δ. η κατανομή των διπλασιασμένων χρωμοσωμάτων στα θυγατρικά κύτταρα γίνεται με πολύπλοκο μηχανισμό πριν την κυτταρική διαίρεση 2ε. ελέγχεται από ένα συντηρημένο ρυθμιστικό μηχανισμό

5 Οι Φάσεις του Κυτταρικού Κύκλου - Ι - Γενικά, το ευκαρυωτικό κύτταρο διαιρείται κάθε 24 ώρες και οι περίοδοι του κυτταρικού κύκλου είναι: η μίτωση και η μεσόφαση 1. Η Μίτωση ή πυρηνική διαίρεση είναι ο διαχωρισμός των θυγατρικών χρωμοσωμάτων που οδηγεί σε κυτταρική διαίρεση ή κυτταροκίνηση 2. Η Μεσόφαση είναι το χρονικό μεσοδιάστημα μεταξύ δύο κυτταρικών διαιρέσεων -Η μίτωση & κυτταροκίνηση διαρκούν ~ 1 ώρα, ενώ η μεσόφαση αποτελεί το 95% της συνολικής διάρκειας του κύκλου ΤΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ της ΜΕΣΟΦΑΣΗΣ 1. τα χρωμοσώματα αποσυμπυκνώνονται (από την προηγούμενη Μίτωση) 2. διεξάγεται η κυτταρική αύξηση (σε όγκο) 3. γίνεται η αντιγραφή του DNA 4. το κύτταρο προετοιμάζεται για την επόμενη διαίρεση 5. τα διαιρούμενα κύτταρα αυξάνουν σε μέγεθος, ίσο με το αρχικό

6 Οι Φάσεις του Κυτταρικού Κύκλου - ΙΙ - Οι κυτταρικός κύκλος του ευκαρυωτικού κυττάρου διαιρείται σε 4 χρονικές φάσεις: κυτταρική αύξηση & σύνθεση πρωτείνών διαίρεση Πυρήνα & Κυτταροκίνηση Μ: αντιστοιχεί στην μίτωση & κυτταροκίνηση αύξηση βιομάζας G1: διάστημα μεταξύ μίτωσης & έναρξης αντιγραφής DNA (S) S: διάστημα σύνθεσης/αντιγραφής του DNA σύνθεση DNA G2: διάστημα προετοιμασίας για μίτωση * Η κυτταρική αύξηση αρχίζει από το τέλος της Μ και συνεχίζει μέχρι το τέλος της G2

7 Η ΧΡΟΝΙΚΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ Η διάρκεια των φάσεων διαφέρει ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου: 1. Στο ανθρώπινο κύτταρο διάρκειας κύκλου 24 ωρών, οι φάσεις διαρκούν: G1: 11 ώρες, S: 8 ώρες, G2: 4 ώρες & M: ~ 1 ώρα 2. Στο σακχαρομύκητα ο κύκλος διαρκεί: ~ 90 λεπτά 3. Στην εμβρυογένεση, μετά την γονιμοποίηση του ωαρίου ο κύκλος διαρκεί 30 λεπτά 3α. ο κύκλος έχει σύντομες εναλλασόμενες φάσεις Μ & S, χωρίς G1 & G2 3β. παράγονται μικρά θυγατρικά κύτταρα, λόγω έλλειψης κυτταρικής αύξησης

8 4. τα νευρικά κύτταρα, στα ενήλικα θηλαστικά, παύουν να διαιρούνται 5. Τα κύτταρα της επιδερμίδας ή του ήπατος πολλαπλασιάζονται κατά περίπτωση για αντικατάσταση μετά από τραύμα ή κυτταρικό θάνατο Η ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΦΑΣΕΩΝ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ: Βασικά εργαλεία 1. Φωτονικό Μικροσκόπιο: π.χ: παρατήρηση μιτωτικών κυττάρων-στάδια μίτωσης 2. Βιοχημικά κριτήρια: για τις φάσεις G1, S & G2/M (έκφραση σηματοδοτικών πρωτεϊνών) 3. Μέτρηση της ποσότητας DNA σε διαφορετικές φάσεις με Κυτταρομετρία Ροής (FACS) Η ΤΕΧΝΙΚΗ 3α. Σήμανση DNA κυττάρων με φθοριόχρωμα 3β. Μέτρηση έντασης φθορισμού κάθε κυττάρου με FACS (FACS: Fluoresence-Activated Cell Sorting) - ποσότητα DNA, 2η: μη-διπλασιασμένα κύτταρα στη G1 - ποσότητα DNA, 4η: διπλασιασμένα κύτταρα στην G2/M (log) *Τα κύτταρα στην S έχουν ποσότητα DNA μεταξύ 2η και 4η

9 Η ΡΥΘΜΙΣΗ του Κυτταρικού Κύκλου: από Κυτταρική Αύξηση & Εξωκυτταρικά σήματα -Ο κυτταρικός κύκλος ρυθμίζεται από εξωτερικά & εσωτερικά σήματα για τον απαραίτητο συντονισμό των διεργασιών της κυτταρικής αύξησης, αντιγραφής DNA & μίτωσης -Η ρύθμιση των φάσεων γίνεται από σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου 1. Η ρύθμιση στο Saccharomyces cerevisiae με εκβλάστηση ο όγκος του αυξάνεται αργότερα G2 S 2ΧDNA & εκβλάστηση -Ένα κρίσιμο σημείο ελέγχου είναι το START προς στο τέλος της G1, (απόφαση διπλ/σμού) -Η διέλευση από το START επιτρέπει τις άλλες φάσεις, αλλά ελέγχεται από 3 παράγοντες -Οι παράγοντες σύζευξης δρούν ανασταλτικά (αντι πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα συζεύγνυνται) -Τα θυγατρικά κύτταρα δεν πολλαπλασιάζονται: χωρίς τροφή & το απαραίτητο μέγεθος -Τα θυγατρικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται με εκβλάστηση

10 2. Ο Πολλαπλασιασμός των ΖΩΪΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ -Ο κύκλος τους ρυθμίζεται προς στο τέλος της G1, στο ΣΗΜΕΙΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ -Σε αντίθεση με τους ζυμομύκητες, ο κύκλος ρυθμίζεται/επάγεται κυρίως από εξωκυτταρικούς ΑΥΞΗΤΙΚΟΥΣ παράγοντες και όχι από την διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών 1. Μετά την διέλευση του περιοριστικού σημείου: 1.α το κύτταρο «δεσμεύεται» να εισέλθει στην S φάση 1.β. δεν απαιτείται πλέον ο αυξητικός παράγοντας Στα ΖΩΪΚΑ κύτταρα 2. Με μη διαθέσιμο αυξητικό παράγοντα: 2α. ο κύκλος σταματά στο σημείο περιορισμού 2β. η στάση αυτή ονομάζεται φάση Go 2γ. τα κύτταρα Go είναι μεταβολικά ενεργά αλλά με μειωμένο ρυθμό 2δ. η Go μπορεί να διαρκέσει για πολύ χρόνο ε. τα κύτταρα της Go πολλαπλασιάζονται μετά από διέγερση με αυξητικούς παράγοντες π.χ: οι ινοβλάστες δέρματος πολλαπλασιάζονται από PDGF, για επούλωση τραύματος *PDGF, Platelet-Derived Growth Factor: αναπτυξιακός παράγοντας από πήξη αιμοπεταλίων

11 3. Η ρύθμιση του πολλαπλασιασμού του Schizosaccharomyces pombe: με διχοτόμηση -Αναπαράγεται με διχοτόμηση στην G1 (όχι εκβλάστηση όπως στο S. cerevisiae) -Αποτελεί παράδειγμα Ρύθμισης κυρίως στην G2 και όχι στην G1 -Σε αντίθεση με τον S. cerevisiae, ρυθμίζεται στο σημείο μετάβασης από G2 σε Μ που ελέγχεται από: α. το κυτταρικό μέγεθος & β. τη διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών Μέγεθος στη G2 διχοτόμηση G2 Μ G1 **διχοτόμηση *Η ρύθμιση γίνεται στη G2 Τα στάδια μίτωσης/κυτταροκίνησης πυρήνας -Στα θηλαστικά ο έλεγχος στην G2 γίνεται στα ωοκύτταρα που παραμένουν στην G2, μέχρι και δεκαετίες. H μετάβασή των στη Μ γίνεται μετά από ορμονική διέγερση ΣΥΝΟΛΙΚΑ: ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός ελέγχεται από εξωκυτταρικά σήματα από την G1 στην S & από το μέγεθος στην G2/M (S. pombe)

12 Τα ΣΗΜΕΙΑ ΕΛΕΓΧΟΥ του Κυτταρικού Κύκλου Τα στάδια του κύκλου: πρέπει να είναι συντονισμένα αλλά και ολοκληρωμένα πρίν την Μίτωση Ο συντονισμός των φάσεων γίνεται από δύο (2) σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που: εμποδίζουν την είσοδο στην επόμενη φάση, πρίν την ολοκλήρωση της προηγούμενης ΤΑ 2 ΣΗΜΕΙΑ ΕΛΕΓΧΟΥ είναι: 1. Τα σημεία ελέγχου βλαβών DNA: - Είναι αισθητήρες βλαβών DNA ή ατελούς αντιγραφής που καθυστερούν το κύκλο για επιδιορθώσεις α. στην G1: επιδιορθώσεις οποιαδήποτε βλάβης DNA β. στην S: έλεγχος ακεραιότητας & ποιότητας DNA (π.χ: αταίριαστες νουκλεοτιδικές βάσεις) γ. στην G2: όταν το DNA δεν έχει πλήρως αντιγραφεί ή δεν είναι πλήρως επιδιορθωμένο

13 2. Το σημείο συγκρότησης της ατράκτου: -Συναντάται πρίν το τέλος της Μ -Ελέγχει τη στοίχιση όλων των χρωμοσωμάτων στην μιτωτική άτρακτο -Η αποτυχία στοίχισης προκαλεί στάση της μίτωσης στην μετάφαση πρίν το διαχωρισμό -Εξασφαλίζει η διανομή μιας πλήρους σειράς χρωμοσωμάτων στα θυγατρικά κύτταρα

14 Ο ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ DNA: μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο - I Παράδειγμα αντιγραφής στο S. cerevisiae - Οι αυτόνομες αλληλουχίες αντιγραφής (ARSs) είναι σημεία έναρξης της αντιγραφής - Κάθε στοιχείο ARS έχει μία συναινετική αλληλουχία, την ACS, και τα στοιχεία Β1, Β2 & Β3 -Το σύμπλοκο αναγνώρισης της θέσης έναρξης της αντιγραφής (ORC) προσδένεται στο ACS/Β1 - Tο ORC στρατολογεί επιπρόσθετες πρωτεΐνες, όπως και την DNA ελικάση MCM ARS *ACS: ARS Consensus Sequence Συναινετική Ακολουθία *MCM: Mini-Chromosome Maintenance helicase

15 Ο ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ DNA: μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο - IΙ Στα κύτταρα των θηλαστικών - Εκτός των Σημείων Ελέγχου: η αντιγραφή DNA πρέπει να γίνεται μία μόνο φορά / 1 κύκλο - Ειδικοί ρυθμιστικοί μηχανισμοί: εμποδίζουν τη επανέναρξη της αντιγραφής πριν τη μίτωση θέση έναρξης αντιγραφής η MCM προσδένεται μόνο στη G1 Ο μηχανισμός ελέγχου της αντιγραφής: α. στην ORC προσδένονται: MCM ελικάσες μαζί με παράγοντες «αδειοδότησης» της αντιγραφής β. οι MCM ελικάσες προσδένονται μόνο στην G1 γ. η έναρξη αντιγραφής γίνεται από τη DNA πολυμεράση - οι MCM απομακρύνονται & συνδέονται μόνο στην επόμενη G1 δ. οι MCM εκτοπίζονται από θέσεις της αντιγραφής οδηγώντας σε αδυναμία επανέναρξης της αντιγραφής ζ. νέα πρόσδεση MCM, παρεμποδίζεται από κινάσες

16 ΡΥΘΜΙΣΤΕΣ ΠΡΟΟΔΟΥ του Κυτταρικού Κύκλου Α Β Μείωση Ι Στάση Μείωση Ι Στάση Χωρίς Προγεστερόνη Μείωση ΙΙ Μείωση ΙΙ -Η γνώση μηχανισμών ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου προήλθε από μοντέλα όπως: ζυμομύκητες, αχινούς, βάτραχους & θηλαστικά -Βρέθηκε ότι ο κυτταρικός κύκλος όλων των ευκαρυωτών ρυθμίζεται από μία συντηρημένη ομάδα ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ Η ανακάλυψη των πρωτεϊνικών κινασών έγινε με τρείς πειραματικές προσεγγίσεις: Η πρώτη προσέγγιση Α. Ήταν γνωστό ότι τα ωοκύτταρα βατράχου παραμένουν στη G2 & η δράση της προγεστερόνης, τα «ωθεί» στην φάση Μ της Μείωσης ΙΙ Β. Η ένεση κυτταροπλάσματος από ορμονικά διεγερμένα ωοκύτταρα σε ωοκύτταρα G2 προκαλεί την μετάβαση τους από G2 στη φάση Μ - Άρα, υπάρχει ένας κυτταροπλασματικός παράγοντας προώθησης ωρίμανσης του ωοκυττάρου ή MPF (Maturation Promoting Factor) -Η δράση του MPF βρέθηκε και σε σωματικά κύτταρα. Άρα είναι ένας γενικός ρυθμιστής της μετάβασης από G2 προς M

17 Η δεύτερη προσέγγιση -Η προσέγγιση αυτή έγινε στο σακχαρομύκητα S. cerevisiae -Βρέθηκαν θερμοευαίσθητα / μεταλλαγμένα στελέχη με ελαττωματική πρόοδο του κύκλου -Ονομάσθηκαν μεταλλάγματα cdc (cell division cycle mutants) της κυτταρικής διαίρεσης -Η ανάπτυξή τους σταματούσε σε συγκεκριμένα σημεία του κυτταρικού κύκλου -Στο σημαντικό μετάλλαγμα cdc28, ο κύκλος σταματούσε στο σημείο ελέγχου START *απώλεια ενεργότητας της πρωτεϊνης cdc28 Ολοκλήρωση κύκλου Στάση κύκλου Το πείραμα υπέδειξε ότι η πρωτεϊνη cdc28, είναι απαραίτητη για διέλευση από το START

18 - ΑΝΑΛΟΓΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΜΑΤΑ, βρέθηκαν και στο Σχιζοσακχαρομύκητα S. pombe με σημαντικό εκείνο του cdc2 - Ο κυτταρικός κύκλος κυττάρων με μεταλλαγή cdc2 είχε στάση: α. στην G1 (διχοτόμηση) & β. από G2 προς Μ (κύριο ρυθμιστικό σημείο στον κύκλο του) Μετά από σύγκριση βρέθηκε ότι: -Τα γονίδια cdc28 και cdc2 είναι ομόλογα λειτουργικά γονίδια: το cdc28, για διέλευση από το START και το cdc2, για διχοτόμηση στην G1 -Ανάλυση των γονιδίων cdc28 και cdc2, απέδειξε την κωδικοποίηση μίας πρωτεϊνικής Κινάσης που αποτέλεσε την ΠΡΩΤΗ ΕΝΔΕΙΞΗ του ρόλου της φωσφορυλίωσης στη ρύθμιση του κύκλου - Σήμερα η πρωτεϊνη του cdc28 ή cdc2, είναι γνωστή ως Cdk1 (cyclin-dependent kinase 1): είναι συντηρημένη σε όλους τους ευκαρυώτες και είναι ΡΥΘΜΙΣΤΗΣ του κυτταρικού κύκλου

19 Η τρίτη προσέγγιση - Έγινε με μελέτη της πρωτεϊνοσύνθεσης σε πρώϊμα έμβρυα αχινών - Μετά τη γονιμοποίηση: τα πρώϊμα έμβρυα αχινών κάνουν μία σειρά γρήγορων διαιρέσεων ενώ η χρήση καταστολέων Πρωτεϊνοσύνθεσης ΑΝΑΣΤΕΛΛΕΙ την είσοδο στην φάση Μ -Άρα, ο παράγοντας MPF είναι πρωτεϊνικής φύσεως. Έτσι, ταυτοποιήθηκαν δύο πρωτεϊνες με χαρακτήρα περιοδικότητας που ονομάσθηκαν Κυκλίνες: η Κυκλίνη Α & η Κυκλίνη Β - Αυτές συσσωρεύονταν στη μεσόφαση και αποικοδομούνταν ταχύτατα στο τέλος της μίτωσης Συσσώρευση & Αποικοδόμηση κυκλινών Συσσώρευση κυκλινών & Κυτταρική διαίρεση - Στα συνδεόμενα αυτά γεγονότα: υποστηρίχθηκε ότι δρούν ως ΕΠΑΓΩΓΕΙΣ της ΜΙΤΩΣΗΣ & η περιοδικότητά τους ρυθμίζει την είσοδο/έξοδο από την φάση Μ * MΙΚΡΟΕΝΕΣΗ κυκλίνης Α (αντι Προγεστερόνης) σε ωοκύτταρα βατράχου «ώθησε» τη μετάβαση από G2 σε Μ

20 Τα αποτελέσματα των 3 προσεγγίσεων αποκάλυψαν τη δομή & τη ρύθμιση του MPF: Α. Η δομή του MPF καταλυτική - Ο συντηρημένος ρυθμιστής του κυτταρικού κύκλου MPF αποτελείται από 2 μονάδες: την Cdk1 & Κυκλίνη Β -H Cdk1 είναι η καταλυτική υπομονάδα (κινάση) ενώ η κυκλίνη Β είναι η ρυθμιστική υπομονάδα ρυθμιστική Β. Ο MPF ρυθμίζεται με φωσφορυλίωση / αποφωσφορυλίωση της Cdk1 1. Η κυκλίνη Β συντίθεται και σχηματίζει σύμπλοκο με την Cdk1 στην φάση G2 2. Στο σύμπλοκο, η Cdk1 φωσφορυλιώνεται σε 2 θέσεις: α. στην θρεονίνη 161, για ενεργότητα κινάσης & β. στη τυροσίνη 15, για καταστολή ενεργότητας, που οδηγεί σε συσσώρευση ανενεργών συμπλόκων Cdk1/κυκλίνης Β σε όλη την G2 3. Η ενεργοποίηση του συμπλόκου γίνεται με αποφωσφορυλίωση: της θρεονίνης 14 & της τυροσίνης 15, από την φωσφατάση Cdc25

21 4. Η ενεργοποιημένη Cdk1: 4α. φωσφορυλιώνει πρωτεϊνες στόχους για έναρξη της φάσης Μ 4β. πυροδοτεί την αποικοδόμηση της κυκλίνης Β 5. Η αποικοδόμηση της κυκλίνης Β: απενεργοποιεί την Cdk1 & οδηγεί σε: έξοδο από τη Μ, κυτταροκίνηση και επιστροφή στη Μεσόφαση Ο ρόλος των 3 θέσεων φωσφορυλίωσης της Cdk1 2. η φωσφορυλίωση της Tyr15 & Thr14: καταστέλλει την ενεργότητα της Cdk1 & συσσωρεύει τo σύμπλοκο στη G2 * (στα σπονδυλωτά) (φωσφατάση Cdc25) G2 1. ανενεργό σύμπλοκο (από Wee1) 3. ενεργοποίηση συμπλόκου (φωσφορυλίωση μόνο στη Thr161) ΤΕΛΟΣ ΜΙΤΩΣΗΣ 4. Φωσφορυλίωση πρωτεϊνών της Μ *για ανακύκλωση δράσης * Η Cdk1 είναι πάντα παρούσα στο κυτταρικό κύκλο

22 Μέρος ΙΙ

23 Οικογένειες Κυκλινών & κυκλινοεξαρτώμενων κινασών - Ι -Η γνώση της δομής & λειτουργίας του MPF (Cdk1/κυκλίνης Β) αποτέλεσε την αρχή κατανόησης και άλλων σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου -Βρέθηκε ότι η Cdk1 και η κυκλίνη Β ανήκουν σε οικογένειες συγγενικών πρωτεϊνών και μέλη τους ρυθμίζουν διαφορετικά σημεία του κύκλου Στο σακχαρομύκητα S. cerevisiae - Η διέλευση από το START ελέγχεται από την Cdk1 σε σύμπλοκο με τις κυκλίνες της G1: Cln1, 2 & 3 - Σύμπλοκα της Cdk1 με κυκλίνες τύπου Β: α. Clb 5 & 6 ρυθμίζουν την είσοδο στη S /G2, ενώ β. με τις μιτωτικές Clb 1, 2, 3 & 4 την είσοδο στη M *Μία ΜΟΝΟ κινάση (cdk1) συνδέεται με ποικιλία κυκλινών * Η διαφορική σύνδεση της Cdk1 με ανάλογη κυκλίνη καθορίζει τα ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ φωσφορυλίωσης για κάθε φάση του κύκλου

24 Οικογένειες Κυκλινών & κυκλινοεξαρτώμενων κινασών- ΙΙ Στο Ζωϊκό κύτταρο -Σε αντίθεση με το σακχαρομύκητα, o κύκλος ρυθμίζεται από: α. διαφορετικές κυκλίνες & β. μία ποικιλία κινασών, παρόμοιων με την Cdk1 τις ΚΥΚΛΙΝΟ - ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΕΣ ΚΙΝΑΣΕΣ (Cdk-dependent kinases) -Μέλη των Cdk κάνουν σύμπλοκα, με συγκεκριμένες κυκλίνες, που είναι απαραίτητα για κάθε φάση του κύκλου: 1. Το σημείο περιορισμού της G1: ελέγχεται από τις Cdk4, Cdk6 με κυκλίνες τύπου D 2. Τα σύμπλοκα Cdk2/κυκλίνης Ε δρούν αργότερα στην G1 για μετάβαση από τη G1 προς S 3. Τα σύμπλοκα Cdk2/κυκλίνης Α δρούν για την πρόοδο της S (σύνθεση DNA) 4. Τo σύμπλοκo Cdk1/κυκλίνης Α ρυθμίζει τη μετάβαση στην G2, ενώ 5. Τo σύμπλοκo Cdk1/κυκλίνης Β ρυθμίζει τη μετάβαση από στην G2, στην Μ

25 Η ιδιαιτερότητα της κινάσης Cdk1 -Η μελέτη των Cdk / κυκλινών αποκάλυψε ένα υψηλό επίπεδο λειτουργικής πλαστικότητας Σε γενετικά μεταλλαγμένα ποντίκια: 1. Διαφορετικές κυκλίνες ή Cdk, μπορούν να αναπληρώσουν άλλες κυκλίνες ή Cdk 2. Κύτταρα που στερούνταν όλων των Cdk της μεσόφασης (Cdk2, Cdk4 & Cdk6) μπορούν να πολλαπλασιάζονται 3. Απουσία των άλλων Cdk, η Cdk1 προσδένεται με όλες τις κυκλίνες & ρυθμίζει όλα τα στάδια του κύκλου 4. ΑΝΤΙΘΕΤΑ, ποντίκια χωρίς Cdk1 δεν μπορούν να αναπτυχθούν ΑΡΑ, η Cdk1: Α. είναι η μόνη απαραίτητη Cdk στα κύτταρα των θηλαστικών & Β. μπορεί να αντικαταστήσει όλες τις άλλες Cdk όταν απουσιάζουν

26 Η ΡΥΘΜΙΣΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ της Cdk1 - Ι -Κατά την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου η Cdk1 ρυθμίζεται με 4 μηχανισμούς: 1 ος ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ Αφορά τη σύνδεση της με κυκλίνες & ρυθμίζεται από τη σύνθεση & αποικοδόμηση κυκλινών 2 ος ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ Ενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης μιας συντηρημένης θρεονίνης στη θέση 161 * η φωσφορυλίωση γiνεται από το ένζυμο CAK (Cdk-Activating Kinase) από την CAK

27 Η ΡΥΘΜΙΣΗ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ της Cdk1 - ΙΙ 3 ος ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ -Βασίζεται στη φωσφορυλίωση τυροσινών κοντά στο αμινοτελικό άκρο *η φωσφορυλίωση γίνεται από την κινάση Wee1, που όμως προκαλεί ΚΑΤΑΣΤΟΛΗ -Οι Cdk1 και Cdk2 καταστέλλονται από φωσφορυλίωση της τυροσίνης 15 & θρεονίνης 14 που στη συνέχεια ενεργοποιούνται με αποφωσφορυλίωση από φωσφατάσες της οικογένειας Cdc25 CKI: Cdk Inhibitors από την κινάση Wee1 4 ος ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ -Η δραστικότητά τους ρυθμίζεται επίσης μετά από σύνδεση με αναστολείς των Cdk (CKI)

28 2 ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΕΣ ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ Cdk ευθύνονται για την ρύθμιση ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ Cdk Οι οικογένειες ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ των Cdk 1 η -Μέλη της Ink4 προσδένονται ειδικά & ΜΟΝΟ στις Cdk4 & Cdk6 και καταστέλλουν την G1

29 -Σε ΑΝΤΙΘΕΣΗ: οι Cip/Kip προσδένονται ταυτόχρονα σε κυκλίνες αλλά & Cdk και καταστέλλουν την ενεργότητα κινάσης των συμπλόκων Cdk/κυκλίνης 2 η Οι Cip/Kip επιδρούν στα σύμπλοκα με διαφορετικό τρόπο, π.χ: Α. δευκολύνουν το σχηματισμό συμπλόκων Cdk4 & Cdk6 με την κυκλίνη D και δεν καταστέλλουν αλλά διεγείρουν την ενεργότητα των Cdk4 & Cdk6 Β. σε ωρισμένες συνθήκες: η επίδρασή τους σε σύμπλοκα Cdk1/κυκλίνης Β, αντί καταστολής, επάγει την μετάβαση από την G2 σε Μ Γ. έχουν κατασταλτική επίδραση σε σύμπλοκα Cdk2 με την κυκλίνη Ε ή Α που σταματά τον κύκλο στις φάσεις G1 ή S, αντίστοιχα -ΕΠΟΜΕΝΩΣ: οι πρωτεϊνες Ink4 και Cip/Kip αποτελούν μέλη μηχανισμού για τον έλεγχο της ενεργότητας των Cdk

30 Αυξητικοί Παράγοντες & η Ρύθμιση των Cdk στην ΦΑΣΗ G1 - Ο πολλαπλασιασμός των Ζωϊκών κυττάρων: ρυθμίζεται και από εξωτερικούς αυξητικούς παράγοντες για την διέλευση από το ΣΗΜΕΙΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ, στο τέλος της G1 - Απουσία αυξητικών παραγόντων, εισέρχονται στην κατάσταση ηρεμίας Go & επανέρχονται στο κυτταρικό κύκλο μετά από διέγερση με ΑΥΞΗΤΙΚΟΥΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Οι αυξητικοί παράγοντες δρούν διεγείροντας ενδογενή σηματοδοτικά μονοπάτια ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου Οι κυκλίνες D δρούν στη πρόοδο του κύκλου μέσω αυξητικών παραγόντων: Η κυκλίνη D1 1. Συντίθεται μέσω του μονοπατιού Ras/Raf/MEK/ERK αλλά αποικοδομείται με την απομάκρυνση αυξητικών παραγόντων 2. Σχηματίζει σύμπλοκα με τις Cdk4 ή Cdk6 στη G1, που προωθούν την διέλευση από το σημείο περιορισμού, στη S (σύμπλοκα) 3. Με απομάκρυνση αυξητικών παραγόντων πρίν το σημείο περιορισμού, τα κύτταρα δεν εισέρχονται στην S αλλά στη Go ΣΥΝΟΛΙΚΑ: η σύνθεση ή αποικοδόμηση της κυκλίνης D1 συνδέει τη ρύθμιση του κύκλου με αυξητικούς παράγοντες

31 Α. Η Κυκλίνη D1 & ΚΑΡΚΙΝΟΣ - Η σηματοδότηση της κυκλίνης D1 από αυξητικούς παράγοντες ρυθμίζει τη πρόοδο του κύκλου ενώ η απορρύθμισή της προκαλεί ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό, σε καρκινικά κύτταρα * Το ποσοστό ανθρώπινων καρκίνων με ελαττωματική ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, ΕΙΝΑΙ περίπου ίσο με το ποσοστό καρκίνων με ελαττωματική ΡΥΘΜΙΣΗ μονοπατιών σηματοδότησης 1. Μεταλλαγές στην έκφραση της κυκλίνης D1 εμπλέκονται σε πολλούς τύπους καρκίνου όπως: τα λεμφώματα & ο καρκίνος μαστού 2. Μεταλλαγές απενεργοποίησης των αναστολέων Ink4 (πρόσδεση σε Cdk4 & Cdk6) επίσης ανιχνεύονται σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα Β. Η κυκλίνη D συνδέεται με την ογκοκατασταλτική πρωτεϊνη του ρετινοβλαστώματος (Rb) Η πρωτεϊνη Rb: -Είναι ΠΡΩΤΕΪΝΗ-ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ φωσφορυλίωσης από σύμπλοκα Cdk4, 6/κυκλίνης D στη G1 -Ταυτοποιήθηκε αρχικά στο ρετινοβλάστωμα, σπάνιο κληρονομικό καρκίνο του οφθαλμού -Περαιτέρω μελέτες απέδειξαν την εμπλοκή της σε πολλούς άλλους τύπους καρκίνου

32 -Αποτελεί υπόδειγμα ογκοκατασταλτικού γονιδίου, δηλ.: η απενεργοποίησή του (μετάλλαξη) ΠΡΟΚΑΛΕΙ την ανάπτυξη όγκου -Σε αντίθεση με τις πρωτεϊνες των ογκογονιδίων Ras ή της κυκλίνης D που επάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, η Rb επιβραδύνει τον κυτταρικό κύκλο Ο μηχανισμός ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου από την Rb & τον μεταγραφικό παράγοντα E2F χωρίς φωσφορυλίωση με φωσφορυλίωση Η Rb 1. Στην Go ή την αρχή της G1: - προσδένεται στον E2F - ΚΑΤΑΣΤΕΛΛΕΙ τη μεταγραφή γονιδίων ρυθμιζόμενων από E2F ΕΠΟΜΕΝΩΣ η Rb είναι: 2. Μετά το περιοριστικό σημείο στη G1: -φωσφορυλιώνεται από σύμπλοκα Cdk4, 6/κυκλίνης D -αποδεσμεύεται από τον E2F - ο E2F ενεργοποιεί τη μεταγραφή γονιδίων-στόχων του κυτταρικού κύκλου, π.χ. κυκλίνη Ε Μοριακός Διακόπτης μετατροπής του E2F από καταστολέα σε ενεργοποιητή & η φωσφορυλίωσή της από Cdk4, 6/κυκλίνη D συνδέει τη γονιδιακή έκφραση με τη δράση μεταγραφικών παραγόντων

33 Γ. Η ρύθμιση ΕΙΣΟΔΟΥ στη φάση S: ο αναστολέας p27 & το σύμπλοκο Cdk2/κυκλίνης Ε - Ι Μετά τη φωσφορυλίωση της Rb: η διέλευση του περιοριστικού σημείου στη G1, η είσοδος στην S καθορίζεται από τη δράση E2F και την ενεργοποίηση του συμπλόκου Cdk2/κυκλίνης Ε Γ1. Γ1. Στη G 0 ή νωρίς στην G1: (αναίρεση καταστολής (μέσω φωσφορυλίωσης Rb / E2F) p27: π.χ. ουβικιτινίωση / αποδόμηση) -Η ενεργότητα του συμπλόκου Cdk2/κυκλίνης Ε καταστέλλεται από το αναστολέα p27 (της οικογένειας Cip/Kip) Η ΚΑΤΑΣΤΟΛΗ της Cdk2 από p27 ΑΝΑΙΡΕΙΤΑΙ: 1. από τις κινάσες PI3/Akt, που καταστέλλουν την έκφραση του p27 2. με αυξημένη σύνθεση της κυκλίνης D: που προκαλεί δέσμευση της p27 σε σύμπλοκα Cdk4,6/κυκλίνης D και όχι σε σύμπλοκα Cdk2/κυκλίνης Ε 3. όταν ενεργοποιηθεί η Cdk2: που φωσφορυλιώνει την p27 προκαλώντας ουβικιτινίωση/αποικοδόμησή της

34 Γ. Η ρύθμιση ΕΙΣΟΔΟΥ στη φάση S: ο αναστολέας p27 & το σύμπλοκο Cdk2/κυκλίνης Ε - ΙΙ Γ2. Στην κυρίως G1: 4. Η απομάκρυνση του p27 ενεργοποιεί τα σύμπλοκα Cdk2/κυκλίνης Ε Γ2. Απενεργοποίηση Rb 5. Η Cdk2 φωσφορυλιώνει & απενεργοποιεί πλήρως την Rb (επαγωγέας έκφρασης της κυκλίνης Ε) 6. Τα σύμπλοκα Cdk2/κυκλίνης Ε ενεργοποιούν τις MCM (Minichromosome maintance) ελικάσες για τη αποδιάταξη των αλυσίδων DNA στις θέσεις ΕΝΑΡΞΗΣ της ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ (ORC) 7. Αρχίζει η αντιγραφή από τις DNA πολυμεράσες & η πρόοδος του κύκλου στη ΦΑΣΗ S

35 ΣΗΜΕΙΑ ΕΛΕΓΧΟΥ βλαβών στο DNA & Ρύθμιση της Στάσης του κύκλου -Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός ρυθμίζεται και από σήματα ελέγχου βλαβών του κυτταρικού κύκλου που συμβάλλουν στη διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος του κυττάρου - Τα σήματα ελέγχου βλαβών στο DNA: 1.Προκαλούν στάση του κύκλου στις φάσεις G1, S & G2 2. Εξασφαλίζουν αρκετό χρόνο για επιδιόρθωση των βλαβών πρίν συνεχισθεί η αντιγραφή & η κυτταρική διαίρεση * Η μη επιδιόρθωση των βλαβών DNA οδηγεί σε ποικίλες μεταλλάξεις -Η στάση του κύκλου προκαλείται από: 2 συγγενικές πρωτεϊνικές κινάσες τις: ATM & ATR που ενεργοποιούνται μετά από βλάβες στο DNA *ATM (Ataxia-Telangiectasia) *ATR (Ataxia-Telangiectasia and Rad3 related) - οι ATM & ATR ενεργοποιούν ένα σηματοδοτικό μονοπάτι που οδηγεί σε: α. κυτταρική στάση & ενεργοποίηση μηχανισμών επιδιόρθωσης βλαβών DNA ή β. σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο Οι ATM & ATR λειτουργούν στην ακεραιότητα του γονιδιώματος, ενώ οι μεταλλαγές τους ευθύνονται: 1. για την ασθένεια της Αταξίας Τελαγγειεκτασίας (ανωμαλίες Νευρικού & Ανοσοποιητικού) & 2. ανιχνεύονται σε υψηλής συχνότητας καρκίνους (γονιδιωματική αστάθεια)

36 Ο Βασικός μηχανισμός Στάσης του κυτταρικού κύκλου από βλάβες DNA - Οι ATM & ATR είναι συστατικά πρωτεϊνικών συμπλόκων που αναγνωρίζουν: α. βλάβες στο DNA & β. περιοχές που δεν έχει ολοκληρωθεί η αντιγραφή 1. Η ΑΤΜ αναγνωρίζει δίκλωνες ρήξεις DNA 2. Η ΑΤR αναγνωρίζει μονόκλωνες ή μη-πλήρως αντιγραμμένο DNA καταστολή Cdk2 ενεργοποίηση Chk1, 2 φωσφορυλίωση/ αποικοδόμηση των φωσφατασών Cdc25 καταστολή Cdk1 ΣΤΑΣΗ ΚΥΚΛΟΥ 3. Όταν ενεργοποιηθούν: φωσφορυλιώνουν & ενεργοποιούν τις ΚΙΝΑΣΕΣ ΣΗΜΕΙΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ Chk2 & Chk1 (Chk, Checkpoint kinases) 4. Οι Chk2 & Chk1 επάγουν την στάση του κύκλου: φωσφορυλιώνοντας & αποικοδομώντας τις φωσφατάσες Cdc25, που είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση των κινασών Cdk1 & Cdk2 (*αφαιρούν κατασταλτικές φωσφορυλιώσεις των) 5. Μη-ενεργοποίηση (καταστολή) των Cdk2 & Cdk1 προκαλεί στάση του κύκλου στην G1, S & G2 ΣΥΝΟΛΙΚΑ: οι βλάβες DNA μέσω των ΑΤΜ, ATR & Cdk2/Cdk1 σταματούν το κυτταρικό κύκλο

37 Ένας ΑΛΛΟΣ μηχανισμός στάσης του κυτταρικού κύκλου από βλάβες DNA & p53 Η Στάση του κύκλου στην G1 προκαλείται και από την πρωτεϊνη p53 που, στη μη-φωσφορυλιωμένη της μορφή αποικοδομείται γρήγορα Μετά από δίκλωνη βλάβη DNA, η p53: 1. φωσφορυλιώνεται από την ΑΤΜ και τη Chk2 (κινάση σημείου ελέγχου) 2. όταν φωσφορυλιωθεί σταθεροποιείται και αυξάνεται η συγκέντρωσή της, ως απόκριση σε βλάβες DNA 3. ως μεταγραφικός παράγοντας επάγει την έκφραση της πρωτεϊνης του αναστολέα p21, της οικογένειας Cip/Kip επαγωγή 4. η p21 αναστέλλει τα σύμπλοκα Cdk2/κυκλίνης Ε & 5. ο κυτταρικός κύκλος σταματά στην G1 p53 & Καρκινογένεση - Η μεταλλαγή του αποτρέπει στάση στη G1 ακόμα & σε βλάβες DNA - Οι βλάβες DNA μεταφέρονται σε θυγατρικά κύτταρα προκαλώντας αύξηση μεταλλαγών, γονιδιωματική αστάθεια και ανάπτυξη Καρκίνου - Είναι το πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο σε ανθρώπινους όγκους