Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών

Transcript

1 Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών Ο Coup-TF και τα προγονικά νευρικά κύτταρα στο έμβρυο του αχινού Paracentrotus lividus Παναγιώτης Τσίμπος Επιβλέπων Καθηγητής: Κωνσταντίνος Φλυτζάνης

2 Πρόλογος H συγκεκριμένη πτυχιακή εργασία αποτελεί τον επίλογο των μεταπτυχιακών σπουδών μου στον τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών και πραγματοποιήθηκε τη περίοδο Σεπτέμβριος 2015 Ιούλιος Για την ολοκλήρωση αυτής οφείλω να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου σε όσους με βοήθησαν με οποιονδήποτε τρόπο να περατώσω την πτυχιακή μου. Αρχικά, ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Αναπληρωτή Καθηγητή και Επιβλέποντα της παρούσας πτυχιακής εργασίας κ. Κωνσταντίνο Φλυτζάνη. Αποτέλεσε το κύριο κίνητρό μου και παράλληλα τη πηγή έμπνευσης μου, μέσα από τα προπτυχιακά μαθήματα του, καλλιεργώντας μου το ερέθισμα για τον τομέα της Αναπτυξιακής Βιολογίας. Επιπλέον, να τον ευχαριστήσω για το δικαίωμα που μου πρόσφερε ώστε να ενταχθώ στη δική του εργαστηριακή ομάδα με σκοπό την ολοκλήρωση της εργασίας μου. Τον ευχαριστώ θερμά για το αδιάκοπο ενδιαφέρον του, αψηφώντας τα ωράρια δίνοντας μου πολύτιμες συμβουλές, καθώς και για την ηθική υποστήριξη που μου πρόσφερε σε όλη διάρκεια του μεταπτυχιακού προγράμματος σπουδών. Επίσης, να ευχαριστήσω το καθηγητή κ. Παναγιώτη Κατσώρη και το καθηγητή κ. Ηλία Καζάνη που δέχτηκαν να συμπεριληφθούν στην εξεταστική μου επιτροπή και ήταν εκεί για να λύσουν την οποιαδήποτε απορεία και δυσκολία είχα. Σε αυτό το σημείο, να ευχαριστήσω και να αφιερώσω αυτήν την πτυχιακή εργασία στην οικογένεια μου και πιο συγκεκριμένα στους γονείς μου, οι οποία ήταν δίπλα μου σε κάθε ανησυχία μου και σε κάθε δυσκολία μου κατά την διάρκεια των σπουδών μου και μου παρείχαν την οικονομική και ψυχολογική υποστήριξη καθόλη τη διάρκεια των προπτυχιακών και μεταπτυχιακών σπουδών μου. Για όλους αυτούς που ήταν δίπλα μου και με βοήθησαν να γίνω αυτό που είμαι 1

3 Περιεχόμενα Περίληψη... 5 Abstract ) Εισαγωγή ) Ο αχινός Paracentrotus lividus ως πειραματικό μοντέλο ) Πρώιμη εμβρυογένεση στον αχινό ) Γονιμοποίηση και μηχανισμοί αποφυγής πολυσπερμίας ) Διαιρέσεις στο πρώιμο έμβρυο και ανάπτυξη του βλαστιδίου ) Καθορισμός εμβρυικών στοιβάδων cell fate specification ) Γαστριδίωση ) Γονιδιακά Ρυθμιστικά Δίκτυα στον αχινό ) Ρόλος των Γονιδιακών Ρυθμιστικών Δικτύων ) Σχεδιασμός των Γονιδιακών Ρυθμιστικών Δικτύων ) Γονιδιακά Ρυθμιστικά Δίκτυα του αχινού S.purpuratus ) Εμβρυική νευρογένεση στον αχινό ) Καθορισμός προσθιοπίσθιου άξονα και του πρόσθιου νευρο-εξωδέρματος ) Καθορισμός ραχιαιοκοιλιακού άξονα και της βλεφαριδωτής ζώνης ) Καθορισμός νευρικής ταυτότητας και Delta/Notch πλάγια αναστολή ) Ανάπτυξη νευρικού συστήματος στη προνύμφη του αχινού ) Σημαντικά νευρογενή γονίδια του αχινού ) Six ) FoxQ ) Fez ) SoxC ) Hbn ) Sip ) Η υπεροικογένεια των θυρεοειδών/στεροειδών πυρηνικών υποδοχέων ) Η υποοικογένεια των COUP-TFs ) Λειτουργία ) Ιστοειδική έκφραση στον αχινό ) Σημασία των COUP-TFs στους οργανισμούς ) Σκοπός ) Υλικά και μέθοδοι ) Εύρεση cdna αλληλουχιών ) Σχεδιασμός εκκινητών

4 3.3) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής με το PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver ) Ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5 % ) Καθαρισμός προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμερισμού με πρωτόκολλο QIAGEN ) Κλωνοποίηση προϊόντων PCR σε φορείς pgem-t easy Αντίδραση Λιγάσης ) Παρασκευή βακτηριακών δεκτικών κυττάρων DH10b με χλωριούχο ρουβίδιο (RbCl 2) ) Χημικός μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων ) Επιλογή ανασυνδυασμένων αποικιών (Blue-White Screening), μεταφορά αποικιών (streaking) και υγρές καλλιέργειες ) Απομόνωση πλασμιδιακού DNA (Mini Preps) με το πρωτόκολλο Machery-Nagel NucleoSpin Plasmid ) Πέψεις ελέγχου πλασμιδίων και αλληλούχιση ) Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης με M13 εκκινητές ) In vitro μεταγραφή ) Whole mount in situ υβριδοποίηση (WMISH) με RNA ιχνηθέτες σε κανονικά έμβρυα P.lividus ) Φθορίζουσα in situ υβριδοποίηση (FISH) με RNA ιχνηθέτες σε έμβρυα P.lividus μέσω τεχνολογίας TSA της Perkin Elmer Corporation ) Καλλιέργεια εμβρύων αχινού P.lividus ) Μονιμοποίηση καλλιέργειας εμβρύων αχινού P.lividus ) Μικροένεση σε γονιμοποιημένα ωάρια αχινού με αντινοηματικά νουκλεοτίδια morpholino ) Whole mount In situ υβριδοποίηση (WMISH) με RNA ιχνηθέτες σε έμβρυα P.lividus ενεμένα με morpholino αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια ) Ανοσοφθορισμός σε έμβρυα P.lividus ενεμένα με αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια morpholino για την καταστολή του PlCoup-TF ) Αποτελέσματα ) Κατασκευή cdna από ολικό RNA γαστριδίου ) Απομόνωση πλασμιδιακού DNA ) Πέψεις ελέγχου πλασμιδιακού DNA ) Πολλαπλασιασμός του DNA ενθέματος του πλασμιδιακού φορέα ) Κατασκευή RNA ιχνηθετών ) Αναπτυξιακό πρότυπο του SoxC ) Συνεντοπισμός του SoxC με γονίδια ρυθμιστές της νευρογένεσης ) Έκφραση του SoxC σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF ) Έκφραση του SoxC σε έμβρυα που έχουν κατασταλεί οι FoxQ2, Delta και Six

5 4.9) Έκφραση του Six3 σε έμβρυα που έχουν κατασταλεί o Coup-TF ) Δημιουργία σεροτονεργικών νευρώνων σε έμβρυο αχινού που έχει κατασταλεί ο Coup-TF ) Αναπτυξιακά πρότυπα έκφρασης γονιδίων διαφοροποίησης των σεροτονεργικών νευρώνων ) Έκφραση γονιδίων διαφοροποίησης σεροτονεργικών νευρώνων σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF ) Συζήτηση-Μελλοντικοί στόχοι ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Βιβλιογραφία

6 Περίληψη Η νευρογένεση είναι μία περίπλοκη αναπτυξιακή διαδικασία που έχει μελετηθεί σε πλειάδα οργανισμών. Στους αχινούς, τα ρυθμιστικά γονιδιακά δίκτυα (GRN) του στοματικού εξωδέρματος (ΟΕ) και του πρόσθιου νευροεξωδέρματος (ΑΝΕ), όπου λαμβάνει χώρα η εμβρυική νευρική ανάπτυξη, έχουν ξεκινήσει να αναλύονται πρόσφατα. Ο μεταγραφικός παράγοντας Coup-TF αποτελεί ορφανό μέλος της υπεροικογένειας των θυρεοειδών / στεροειδών υποδοχέων και αποτελεί παράγοντα απαραίτητο για τη νευρογένεση στον αχινό και όχι μόνο. Εκφράζεται στις περιοχές του στοματικού εξωδέρματος, της βλεφαριδωτής ζώνη και του πρόσθιου νευροεξωδέρματος, περιοχές όπου εκφράζονται σημαντικά νευρογενή γονίδια, όπως ο Six3, o FoxQ2 και ο SoxC. Στη παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκαν τα πρότυπα έκφρασης γονιδίων του νευρογενούς GRN, των SoxC, Six3, Hbn, Sip1 και Fez στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια του αχινού Paracentrotus lividus, καθώς και η επίδραση της καταστολής σημαντικών γονιδίων για την ανάπτυξη του εμβρυικού νευρικού συστήματος, των PlCoup-TF, PlSix3, PlDelta και PlFoxQ2, στο πρότυπο έκφρασης των γονιδίων αυτών. Με τη χρήση κλασσικών μεθόδων Μοριακής Βιολογίας, κατασκευάστηκαν ειδικοί RNA αντινοηματικούς ιχνηθέτες για τα mrna των υπό μελέτη γονιδίων, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης στα έμβρυα του πετραχινού με τη διαδικασία της in situ υβριδοποίησης. Έπειτα, για τη διευκρίνιση της θέσης των γονιδίων μέσα στο GRN, αλλά και τις αλληλεπιδράσεις των γονιδίων με τα PlCoup-TF, PlSix3, PlDelta και PlFoxQ2 στο νευρογενές γονιδιακό δίκτυο, πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις με τη χρήση των παραπάνω RNA ιχνηθετών σε έμβρυα στα οποία η έκφραση των PlCoup-TF, PlSix3, PlDelta και PlFoxQ2 έχει κατασταλεί με morpholino αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια. Τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων έδειξαν ότι το SoxC αποτελεί άριστο μάρτυρα προγονικών και μερικώς καθορισμένων νευρικών κυττάρων και η δράση του δεν εξαρτάται σημαντικά από κανένα από τα κατεσταλμένα μόρια. Επίσης, ο Coup-TF φαίνεται να έχει σημαντικό ρόλο στο καθορισμό των σεροτονεργικών νευρώνων, καθώς η καταστολή του οδηγεί σε απώλεια έκφρασης γονιδίων διαφοροποίησης των νευρώνων αυτών, καθώς σε συνδυασμό με αδημοσίευτα πειράματα του εργαστηρίου, η καταστολή οδηγεί σε μερική αλλαγή της ταυτότητας της κεντρικής περιοχής του ΑΝΕ προς στοματικό εξώδερμα που εκφράζει μερικά νευρογενή μόρια, π.χ. FoxQ2. 5

7 Abstract Neurogenesis is a complex developmental process that has been researched in a multitude of organisms. In sea urchins, the gene regulatory networks (GRN) of oral ectoderm (OE) and anterior neuroectoderm (ANE), where embryonic neural development takes place, have recently started to be analyzed. The Coup-TF transcription factor is an orphan member of the thyroid / steroid receptor superfamily and play a pivotal role in neurogenesis in the sea urchin embryo and not only in this process. It is expressed in the oral ectoderm, the ciliary band and the ANE, areas in which several neurogenic factors are express, such as Six3, FoxQ2 and SoxC. In this dissertation, the expression profiles of the genes SoxC, Six3, Hbn, Sip1 and Fez have been examined in the early embryonic stages of the sea urchin Paracentrotus lividus, as well as the changes in their expression profiles when master genes, PlCoup-TF, PlSix3, PlDelta and PlFoxQ2, that regulate the development of the embryonic nervous system, are knocked down. Using classic methods of Molecular Biology, RNA antisense probes have been developed, specific for the genes in interest, which have, then, been used for the analysis of the spatiotemporal expression profiles of these genes in sea urchin embryos by in situ hybridization. Moreover, for the positioning of the aforementioned genes in the neurogenic GRN, as well as their interactions with PlCoup-TF, PlSix3, PlDelta and PlFoxQ2, in situ hybridizations have been performed using the developed RNA probes in morpholino oligonucleotide injected embryos where PlCoup-TF, PlSix3, PlDelta and PlFoxQ2 have been knocked down. Results showed that SoxC is an excellent panneural marker for precursor and early specified neuronal cells and its expression is not dependent on neither of the knocked down factors. Additionally, Coup-TF seems to play a crucial role in the specification of the serotonergic neurons of the sea urchin embryo, as its downregulation leads to expression changes of genes important for the differentiation of these type of neurons. Finally, in conjunction with unpublished data from our lab, knocking down Coup-TF seems to lead to a change of fate of the central area of the ANE to an oral ectodermal state, but with some cells expressing neurogenic factors, such as FoxQ2. 6

8 1) Εισαγωγή 1.1) Ο αχινός Paracentrotus lividus ως πειραματικό μοντέλο Το πειραματικό μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε είναι ο Paracentrotus lividus, γνωστός ως πετραχινός (εικόνα 1). Το είδος αυτό απαντάται στη Μεσόγειο σε ρηχά νερά και πετρώδη υποστρώματα και τρέφεται με φύκη. Εικόνα 1: Ο Paracentrotus lividus (en.wikipedia.org/wiki/paracentrotus_lividus) Βασίλειο Συνομοταξία Ομοταξία Υφομοταξία Υπέρταξη Τάξη Οικογένεια Είδος Ζώα Εχινόδερμα Εχινοειδή Ενδοκυκλικά Εχινόμορφα Καμερόδοντα Echinidae Paracentrotus lividus Πίνακας 1: Συστηματική κατάταξη του Paracentrotus lividus 7

9 Χαρακτηριστικό αυτού του αχινού, όπως και όλων των εχινοδέρμων, είναι η χαρακτηριστική τους πεντακτινωτή συμμετρία, που προκύπτει δευτερογενώς, έπειτα από μία περίοδο αμφίπλευρης συμμετρίας στην πρώιμη οντογένεση. Το σώμα του είναι σφαιρικό, πεπλατυσμένο ραχαιοκοιλιακά, με ισχυρές, σκληρές άκανθες που κινούνται με μύες προσφυόμενους στη βάση τους και ενδιάμεσα αυτών, υπάρχουν οι βαδιστικοί ποδίσκοι και οι ποδολαβίδες. Κάτω από το περίβλημα, υπάρχουν σκελετικά στοιχεία, πλούσια σε ασβέστιο (ασβεστολιθικά πινακίδια). Κάποια άλλα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του αχινού είναι η έλλειψη κεφαλιού, η μασητική του συσκευή (λύχνος του Αριστοτέλη), το υδροφορικό του σύστημα και το ιδιαίτερα οργανωμένο νευρικό σύστημα (εικόνα 2) [1] Εικόνα 2: Τα ανατομικά χαρακτηριστικά του αχινού (Gilbert SF: Developmental Biology 8th ed) Ο αχινός αποτελεί ένα από τα πιο διαδεδομένα και σημαντικά ερευνητικά μοντέλα, κυρίως σε τομείς όπως της αναπτυξιακής βιολογίας, της μοριακής βιολογίας και περιβαλλοντικής βιολογίας γιατί χαρακτηρίζεται από πολλά πλεονεκτήματα. Ειδικά για τον αχινό P.lividus, υπάρχει σε αφθονία στις ελληνικές θάλασσες και η συλλογή του είναι εύκολη και προσβάσιμη σχεδόν, καθόλη τη διάρκεια του έτους. Σε μελέτες ανάπτυξης και εμβρυογένεσης, τα έμβρυα του αχινού αποτελούν εξαιρετικό πειραματικό υλικό, καθώς τα κύτταρα είναι διαφανή, προσφέροντας άμεση και εύκολη παρατήρηση των κυτταρικών διαιρέσεων και με χρήση χρωστικών, παρατηρείται απλά και με ακρίβεια η κυτταρική τύχη του κάθε κυττάρου σε ζωντανά έμβρυα. Επιπλέον, η 8

10 εμβρυική ανάπτυξη είναι σύντομη ( μία μέρα ως το στάδιο του βλαστιδίου και περίπου 48 ώρες μέχρι τον πλουτέα), η γονιμοποίηση μπορεί να γίνει εύκολα σε δεξαμενές και υάλινα δοχεία και σε αυτή τη διαδικασία βοηθάει και το μεγάλο πλήθος ωαρίων και σπερματοζωαρίων που παράγονται από τα θηλυκά και αρσενικά άτομα, αντίστοιχα. Έτσι, έχουμε αφθονία εμβρύων πειραματικού υλικού για βιοχημικά και μοριακά πειράματα που είναι εύκολα στο χειρισμό, δίνοντας τη δυνατότητα για διεξαγωγή πειραμάτων κυτταρικής τύχης κατασκευής χαρτών πεπρωμένου με απομάκρυνση ή μεταμόσχευση βλαστομεριδίων και άλλων κυτταρικών πληθυσμών. Τέλος, πραγματοποιούνται και πειράματα γονιδιακής έκφρασης, αφού η εισαγωγή γενετικού υλικού ή κατασταλτικών μορίων σε συγκεκριμένα κύτταρα γίνεται απλά με μικροενέσεις, δίνοντας την ευκαιρία να παρατηρηθούν τα αποτελέσματα της τροποποίησης της γονιδιακής έκφρασης και την εύρεση της αλληλεπίδρασης διαφόρων γονιδίων μεταξύ τους. 1.2) Πρώιμη εμβρυογένεση στον αχινό 1.2.1) Γονιμοποίηση και μηχανισμοί αποφυγής πολυσπερμίας Οι αχινοί είναι γονοχωριστικοί οργανισμοί με πέντε γονάδες, τοποθετημένες κυκλικά της αντιστοματικής περιοχής που διαφέρουν στο χρώμα ανάλογα το είδος και το φύλο. Η γονιμοποίηση είναι εξωτερική και οι γαμέτες απελευθερώνονται στο θαλάσσιο περιβάλλον κατά την αναπαραγωγική περίοδο. Τα ώριμα ωάρια του αχινού περιβάλλονται από ένα ζελατινώδες περίβλημα, απαραίτητο για την ενεργοποίηση του σπερματοζωαρίου κατά τη γονιμοποίηση και την αντίδραση του ακροσώματος. Εσωτερικά, κάτω από το περίβλημα, υπάρχει η λεκιθική μεμβράνη που καλύπτει την κυτταροπλασματική μεμβράνη του ωαρίου. Το ώριμο σπερματοζωάριο αποτελείται από την κεφαλή (περιέχει το γενετικό υλικό), που στο πρόσθιο τμήμα της περιέχει το ακρόσωμα, τμήμα πλούσιο σε πρωτεολυτικά ένζυμα, που πέπτουν τη λεκιθική μεμβράνη και σχηματίζεται το F- ακροσωμικό νημάτιο κατά την ακροσωμική αντίδραση. Επίσης, αποτελείται από τον αυχένα, το μέσο τμήμα (πλούσιο σε μιτοχόνδρια που παράγουν την απαραίτητη ενέργεια για την κίνηση) και την ουρά. Κατά τη γονιμοποίηση, το ωάριο έλκει, μέσω ουσιών που εκκρίνει, το σπερματοζωάριο μέσω χημειοτακτισμού. Στη συνέχεια, το ωάριο συντήκεται με το σπερματοζωάριο, με 9

11 το δεύτερο να διεισδύει το ζελατινώδες περίβλημα με τη βοήθεια των ακροσωμικών, πρωτεολυτικών ενζύμων (αντίδραση ακροσώματος) που εκκρίνει σε μορφή κυστιδίων. Το δεύτερο αποτέλεσμα της ακροσωμικής αντίδρασης είναι η είσοδος ιόντων ασβεστίου στο σημείο σύντηξης των μεμβρανών. Αυτή η είσοδος ιόντων, προκαλεί το πολυμερισμό ινιδίων ακτίνης και το σχηματισμό του F-ακροσωμικού νηματίου του σπερματοζωαρίου, το οποίο διασχίσει την λεκιθική μεμβράνη του ωαρίου. Ακολουθεί σύντηξη προπυρήνων των δύο γαμετών, σχηματισμός του ζυγωτού και έναρξη της πρώιμης εμβρυικής ανάπτυξης[2]. Για την αποφυγή πολυσπερμίας, το αχινός κατέχει δύο μηχανισμούς άμυνας κατά του φαινομένου αυτού, το ταχεία (fast block) και το βραδεία (slow block) απόκριση κατά της πολυσπερμίας. Η ταχεία απόκριση επιτυγχάνεται με την άμεση αλλαγή του δυναμικού ηρεμίας της μεμβράνης του ωαρίου (από -70 mv στα +20 mv) με το που πραγματοποιηθεί η σύντηξη με το σπερματοζωάριο. Αφού η πρώτη επαφή του σπερματοζωαρίου με το ωάριο γίνεται στο αρνητικό δυναμικό ηρεμίας, αυτή η τεράστια αλλαγή σε θετικό μεμβρανικό δυναμικό καθιστά αδύνατη τη σύντηξη άλλου σπερματοζωαρίου με το ωάριο. Ωστόσο, η μεμβράνη του ωαρίου παραμένει θετικά φορτισμένη για περίπου ένα λεπτό πριν επανέλθει στο δυναμικό ηρεμίας, γεγονός που επιτρέπει επιπλέον σπερματοζωάρια να το γονιμοποιήσουν. Για το λόγο αυτό, μετά το πρώτο λεπτό της γονιμοποίησης ξεκινά η βραδεία απόκριση κατά της πολυσπερμίας, που βασίζεται στην απελευθέρωση ενζυμικών κυστιδίων στην πλασματική μεμβράνη του ωαρίου (εικόνα 3). Εικόνα 3: Μηχανισμός βραδείας απόκρισης κατά της πολυσπερμίας ( 10

12 Με την είσοδο του σπέρματος, περίπου κυστίδια συντήκονται με την πλασματική μεμβράνη του ωαρίου και απελευθερώνουν τα περιεχόμενά τους στο χώρο μεταξύ της πλασματικής μεμβράνης και το ζελατινώδες περίβλημα. Οι πρώτες πρωτεΐνες που απελευθερώνονται με αυτή την εξωκυττάρωση είναι πρωτεάσες, που ξεχωρίζουν το ζελατινώδες περίβλημα από την πλασματική και πέπτουν τον υποδοχέα της bindin (πρωτεΐνη του ακροσώματος απαραίτητη για την αποφυγή διαειδικής γονιμοποίησης) και κάθε σπέρμα που έχει συνδεθεί με αυτή. Επιπλέον, από τα κυστίδια έχουν απελευθερωθεί και πρωτεΐνες που δημιουργούν ωσμωτική κλίση συγκέντρωσης που προκαλεί την είσοδο νερού στο χώρο μεταξύ των δύο χωρισμένων μεμβρανών. Αυτό το γεγονός έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό της μεμβράνης γονιμοποίησης που εκτοπίζει περίσσεια σπέρματος και δεν επιτρέπει την επαφή τους με το ωάριο.[2] 1.2.2) Διαιρέσεις στο πρώιμο έμβρυο και ανάπτυξη του βλαστιδίου Οι αχινοί παρουσιάζουν πρότυπο ακτινωτής ολοβλαστικής αυλάκωσης. Οι πρώτες δύο διαιρέσεις γίνονται κατά μήκος του ζωικού (πρόσθιου) φυτικού (οπίσθιου) πόλου και είναι κάθετες μεταξύ τους, ενώ η τρίτη διαίρεση είναι κάθετη στις πρώτες δύο. Οδηγεί στο σχηματισμό 8 ίδιων κυττάρων (βλαστομερίδια) και χωρίζει τον ζωικό από τον φυτικό πόλο. Η τέταρτη διαίρεση, όμως, είναι αρκετά διαφορετική από τις άλλες τρεις. Στο ζωικό πόλο, γίνεται μία συμμετρική διαίρεση κάθετη στο ισημερινό επίπεδο, που διαιρεί τα 4 βλαστομερίδια σε 8 ίδια κύτταρα, που αποκαλούνται μεσομερίδια. Στο φυτικό πόλο, τα 4 βλαστομερίδια διαιρούνται παράλληλα στο ισημερινό επίπεδο με μία ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση, οδηγώντας στο σχηματισμό 4 μεγάλων κυττάρων, που αποκαλούνται μακρομερίδια, και 4 μικρών κυττάρων, που αποκαλούνται μικρομερίδια. Έπειτα το στάδιο των 16 κυττάρων, η επόμενη αυλάκωση παράγει από τη διαίρεση των 8 μεσομεριδίων, δύο «ζωικές στοιβάδες» κυττάρων, τις an1 και an2, με τη δεύτερη ακριβώς κάτω από την πρώτη. Τα μακρομερίδια διαιρούνται κάθετα στον ισημερινό και έπειτα παράλληλα, σχηματίζοντας την veg1 στοιβάδα, κάτω από την an2, και την veg2 στοιβάδα, κάτω από τη veg1. Μετά ακολουθεί η ασύμμετρη διαίρεση των μικρομεριδίων, σχηματίζοντας τα μεγάλα και τα μικρά μικρομερίδια, με τη μικρή ομάδα κυττάρων κάτω από την μεγάλη. Όλες οι έκτες διαιρέσεις γίνονται στο ισημερινό επίπεδο, ενώ οι έβδομες στο μεσημβρινό, σχηματίζοντας το βλαστίδιο των 128 κυττάρων [2] 11

13 Εικόνα 4: Εμβρυογένεση του αχινού μέχρι το βλαστίδιο των 128 κυττάρων. Από τη τέταρτη διαίρεση και μετά πραγματοποιούνται ασύμμετρες κυτταρικές διαιρέσεις (Gilbert, Developmental Biology 6 th Edition) Το στάδιο του βλαστιδίου χαρακτηρίζεται από την ομοιόμορφη κατανομή των κυττάρων γύρω από μία κοιλότητα, το βλαστόκοιλο. Το έμβρυο αρχίζει να εκκρίνει ειδικά ένζυμα από τα κύτταρα του ζωικού πόλου, για να απελευθερωθεί από τη μεμβράνη γονιμοποίησης και να μετατραπεί σε ελεύθερο κολυμβητικό βλαστίδιο. Το μεσεγχυματικό προχωρημένο βλαστίδιο εκφράζει σε διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς γονίδια που παίζουν ρόλο στη κυτταρική τους τύχη και επίσης, παρατηρείται μία πάχυνση στα κύτταρα στη βάση του φυτικού πόλου, σχηματίζοντας έτσι τη φυτική πλάκα, μέρος από το οποίο ξεκινά το πολύ σημαντικό για την ανάπτυξη, στάδιο της γαστριδίωσης ) Καθορισμός εμβρυικών στοιβάδων cell fate specification Αξίζει να αναφερθεί ότι από το στάδιο των 60 κυττάρων ήδη, πολλά από τα κύτταρα του εμβρύου έχουν καθορισμένη μοίρα, κάτι όμως που δεν είναι απόλυτο, καθώς παρατηρούνται φαινόμενα μετάπτωσης μοίρας - transfating [3] (εικόνα 5). 12

14 Εικόνα 5 : Μετάπτωση μοίρας στο έμβρυο του αχινού. Αν τα μικρομερίδια ή τα πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα αφαιρεθούν, τα δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα αλλάζουν μοίρα και δίνουν σκελετικά στοιχεία στο πλουτέα.[3] Οι εξελικτικές δυνατότητες όλων των κυτταρικών τύπων στο πρώιμο έμβρυο του αχινού, καθώς και οι κυτταρικές τύχες των απογόνων των αρχικά σχηματιζόμενων κυτταρικών τύπων απεικονίζονται στους λεγόμενους χάρτες κυτταρικής τύχης (εικόνα 6). Φυσιολογικά, από τα κύτταρα του ζωικού πόλου (στοιβάδες an1 και an2) προκύπτει εξώδερμα και νευροεξώδερμα. Από τα κύτταρα του φυτικού πόλου, από αυτά της veg1 στοιβάδας προκύπτει είτε ενδόδερμα, είτε συμβάλλουν στο σχηματισμό του εξωδέρματος. Τα κύτταρα της veg2 στοιβάδας παράγουν απογόνους που μεταναστεύουν προς σχηματισμό ενδοδέρματος και μη σκελετογόνου μεσοδέρματος. Τα μεγάλα μικρομερίδια παράγουν τα πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα (primary mesenchyme cells ΠΜΚ) που οι απόγονοί τους δομούν το σκελετό της προνύμφης, ενώ τα μικρά μικρομερίδια σχηματίζουν τα γαμετικά κύτταρα της προνύμφης και τους κοιλωματικούς σάκους, εκ των οποίων ο ένας (ο αριστερός) παραμένει, ενώ ο άλλος (ο δεξιός) εκφυλίζεται. (Εικόνα 5). Στον αριστερό κοιλωματικό σάκο αναπτύσσεται, μεταμορφώνεται και εκκολάπτεται το ενήλικο άτομο του αχινού [2]. 13

15 Εικόνα 6: Χάρτης πεπρωμένου του εμβρύου του αχινού στο στάδιο των 60 κυττάρων με την τύχη κάθε κυτταρικής ομάδας προς σχηματισμό των τριών βλαστικών δερμάτων (Gilbert, Developmental Biology 6 th Edition) 1.2.4) Γαστριδίωση Το στάδιο του μεσεγχυματικού βλαστιδίου ακολουθεί το στάδιο της γαστριδίωσης, μίας διαδικασίας που οδηγεί στο σχηματισμό του αρχεντέρου και κατ επέκταση του στόματος, έδρας και εντερικού σωλήνα στο πλουτέα. Το βλαστίδιο βρίσκεται κλεισμένο ακόμα στη μεμβράνη γονιμοποίησης, η οποία πέπτεται από πρωτεολυτικά ένζυμα που παράγονται από το βλαστίδιο. Έτσι, το βλαστίδιο εκκολάπτεται και αρχίζει να σχηματίζεται η φυτική πλάκα, μία πεπλατυσμένη περιοχή στο φυτικό πόλο του βλαστιδίου. Από το κέντρο της φυτικής πλάκας, κύτταρα ξεκινάνε να διεισδύουν προς το βλαστόκοιλο, να επιμηκύνονται και να αναπτύσσουν φυλλοπόδια στην εσωτερική της επιφάνεια, χάνοντας επαφή με τα γειτονικά τους κύτταρα και δίνοντας τα πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα (ΠΜΚ). Τα ΠΜΚ αποκαλούνται και σκελετογόνο μεσέγχυμα και είναι αυτά τα κύτταρα υπεύθυνα για το σχηματισμό του σκελετού της κολυμβητικής προνύμφης. Με τη βοήθεια των φυλλοποδίων τους, εγκαθίστανται πλαγιοκοιλιακά του βλαστόκοιλου και δημιουργούν συγκύτια, τα οποία παράγουν πρωτεΐνες δέσμευσης του ασβεστίου, με σκοπό το 14

16 σχηματισμό των σκελετικών ράβδων ασβεστίου, που θα δώσουν τα σκελετικά στοιχεία του πλουτέα. Μετά τη μετανάστευση των ΠΜΚ, τα υπόλοιπα κύτταρα της φυτικής πλάκας περνούν σημαντικές μορφογενετικές αλλαγές. Με τη διαδικασία της συγκλίνουσας επέκτασης, τη δέσμευση νερού από τις πρωτεογλυκάνες του στρώματος υαλίνης (εξωτερικά του βλαστόκοιλου) και τις συσφίξεις των ινών ακτίνης στη βάση των κυττάρων, τα μη σκελετογόνα κύτταρα της φυτικής πλάκας αρχίζουν να καλύπτουν το κενό που άφησαν στη φυτική πλάκα τα ΠΜΚ και σχηματίζουν μία εγκόλπωση που αρχικά σταματά στο ¼ με ½ του εσωτερικού του βλαστόκοιλου και ονομάζεται αρχέντερο. Αφού τα εχινόδερμα είναι δευτεροστόμια, το σημείο αυτής της εγκόλπωσης είναι η μελλοντική έδρα και ονομάζεται βλαστοπόρος. Η μοίρα των κυττάρων που απαρτίζουν το αρχέντερο είναι καθορισμένη πλέον (ενδόδερμικά κύτταρα) και τα τμήματα του αρχεντέρου από το ζωικό προς το φυτικό πόλο, είναι το πρόσθιο έντερο, το μεσέντερο και το οπίσθιο έντερο, αντίστοιχα. Μετά μία περίοδο παύσης, το αρχέντερο επιμηκύνεται και στην κορυφή του βρίσκονται τα δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα, τα οποία εκτείνουν φιλοπόδια με σκοπό να έρθουν σε επαφή με το εξώδερμα και να κατευθύνουν την ανάπτυξη του αρχεντέρου εκεί. Τέλος, στα στάδια του όψιμου γαστριδίου και του πρίσματος, όταν το αρχέντερο φτάσει στο ζωικό πόλο και έρθει σε επαφή με το εξώδερμα, σχηματίζεται στο σημείο εκείνο το στόμα (Εικόνα 7). Τελευταίο στάδιο της πρώιμης ανάπτυξης του εμβρύου του αχινού είναι αυτό του πλουτέα, προνύμφης κωνοειδούς σχήματος, με 4 βραχίονες και όλος αυτός ο σχηματισμός υποστηρίζεται από ασβεστολιθικές ράβδους που σχηματίστηκαν από τα ΠΜΚ. Ο πλουτέας είναι ένας πλαγκτονικός ετερότροφος οργανισμός, από τον οποίο με τη διαδικασία της μεταμόρφωσης, προκύπτει το νεαρό άτομο. 15

17 Εικόνα 7: Σχηματική απεικόνιση των σταδίων από την έναρξη της γαστριδίωσης μέχρι το στάδιο του πλουτέα. Α:ζυγωτό, Β:βλαστίδιο με φυτική πλάκα, C:βλαστίδιο με τα ΠΜΚ στο βλαστόκοιλό του, D:όψιμο γαστρίδιο όπου διακρίνονται τα ΠΜΚ, το αρχέντερο και τα δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα με τα φυλλοπόδια τους, E και F: πλουτέας με διαφοροποιημένα βλαστικά δέρματα και σκελετικές ράδβους (Gilbert, Developmental Biology 6 th Edition) 1.3) Γονιδιακά Ρυθμιστικά Δίκτυα στον αχινό Τα ρυθμιστικά γονιδιακά δίκτυα (Gene Regulatory Networks GRNs) αποτελούν μία διαγραμματική απεικόνιση των σχέσεων μεταξύ γονιδιακών ρυθμιστικών αλληλουχιών που λαμβάνουν καθοριστικό ρόλο στην εμβρυική ανάπτυξη του ζώου [4]. Οι αλληλουχίες αυτές απαρτίζονται από γονίδια που κωδικοποιούν σηματοδοτικά μόρια και μεταγραφικούς παράγοντες που καθοδηγούν την ανάπτυξη του εκάστοτε οργανισμού μέσω των μεταξύ τους αλληλεπιδράσεων και αυτές οι σχέσεις επεξηγούνται πλήρως μέσω των GRNs με τοπική και χρονική ακρίβεια [5] ) Ρόλος των Γονιδιακών Ρυθμιστικών Δικτύων Όπως αναφέρθηκε, ρόλος των GRNs είναι η απεικόνιση και επεξήγηση των σχέσεων και αλληλεπιδράσεων σηματοδοτικών μορίων, μεταγραφικών παραγόντων και άλλων σημαντικών ρυθμιστικών αλληλουχιών στην ανάπτυξη του οργανισμού. Η αρχιτεκτονική των GRNs προσδιορίζεται από cis ρυθμιστικές αλληλουχίες των ενισχυτών που ελέγχουν το κάθε ένα γονίδιο του ρυθμιστικού δικτύου. Αυτές οι αλληλουχίες DNA εμπεριέχουν πολλαπλά στοιχεία αναγνώρισης και πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων και αυτών που καλούνται ως απόρροια σηματοδοτικών μονοπατιών [4]. Οι cis ρυθμιστικές αλληλουχίες ορίζουν πως μηνύματα και σήματα στο σύστημα προσδιορίζουν την έκφραση των γονιδίων και πως αυτά τα σήματα δρουν με συνεργατικό και με χρονοιστοειδικό τρόπο [6]. Τα GRNs, λοιπόν, καθιστούν χάρτες όλων των γονιδιακών αλληλεπιδράσεων, αυτών που καθορίζουν την μορφολογία και την αναπτυξιακή τύχη των κυττάρων κατά τα πρώιμα εμβρυικά στάδια, δίνοντας μία ξεκάθαρη εικόνα για τη ροή της διαδικασίας της ανάπτυξης (εικόνα 8) 16

18 Εικόνα 8: Ενδομεσοδερμικό GRN του αχινού S.purpuratus [7] 1.3.2) Σχεδιασμός των Γονιδιακών Ρυθμιστικών Δικτύων Ο σχεδιασμός των GRNs βασίζεται στην απεικόνιση της αιτιότητας της αναπτυξιακής διαδικασίας. Τα δίκτυα επεξηγούν πως ρυθμιστικές αλληλουχίες εμπεριέχουν την πληροφορία για τη κωδικοποίηση της έκφρασης ομάδας γονιδίων που στη συνέχεια, καθορίζει πολύπλοκα μοτίβα ανάπτυξης και διαφορετικά, χαρακτηριστικά εμβρυικά στάδια [8]. Για την επίλυση των GRNs κρίνεται απαραίτητη η ταυτοποίηση των γονιδίων του δικτύου, που και πότε εκφράζονται, ποια cis ρυθμιστικά στοιχεία τα ρυθμίζουν και ποιες πληροφορίες εμπεριέχουν, ποια τα αποτελέσματα της στοχευμένης αποσιώπησης αυτών των γονιδίων και χρήση υπολογιστικής δύναμης για την ανάλυση των αποτελεσμάτων [4]. Απαριθμούνται 4 βασικές αρχές για το σχεδιασμό ενός ορθού και αντιπροσωπευτικού γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου [8]: Τα GRNs σαν ένα σύστημα λογικής επεξεργασίας. Κάθε ρυθμιστικό στοιχείο που περιέχεται στο γονιδίωμα δέχεται πολλαπλά και ξεχωριστά μηνύματα, τα οποία επεξεργάζεται με τρόπους που αντιπροσωπεύονται μαθηματικά σαν συνδυασμοί λογικών λειτουργειών ( και, διακόπτης ή ). 17

19 Αιτιότητα στο ρυθμιστικό γονιδίωμα. Οι λόγοι για τους οποίους τα γονίδια εκφράζονται με χρονοιστοειδικό τρόπο, όταν και όπου πρέπει σε κάθε εμβρυικό στάδιο. Για την αποσαφήνιση αυτών των ρυθμιστικών λειτουργειών, χρησιμοποιούνται πειράματα διαταραχής της γονιδιακής έκφρασης (perturbation) και μέτρηση των αλλαγών στην λειτουργεία των γονιδίων στόχων. Υποδομή του δικτύου. Τα GRNs είναι ανομοιογενείς συνθέσεις πολλών ειδών υποκυκλωμάτων, που το καθένα έχει μία ξεχωριστή λειτουργεία. Αυτή η αρχή είναι σημαντική, επειδή αποτελεί το συνδετικό κρίκο των αρχών σχεδίασης των GRNs. Ανασχεδιασμός των γονιδιακών συστημάτων ελέγχου. Για να πραγματοποιηθεί αυτός ο ανασχεδιασμός των πιο δυναμικών, βιολογικών συστημάτων, τόσο σε νοητικό, όσο και σε πρακτικό επίπεδο, απαιτείται η εμπεριστατωμένη κατανόηση της ροής της αιτιότητας σε ένα γενομικά κωδικοποιημένο GRN. Αυτή η κατανόηση έρχεται μέσω συνδυασμού της θεωρίας και του πειραματισμού, της μοριακής βιολογίας και των υπολογιστικών μέσων ) Γονιδιακά Ρυθμιστικά Δίκτυα του αχινού S.purpuratus Ο αχινός έχει αποτελέσει ένα πολύ ισχυρό εργαλείο στην κατανόηση της λειτουργείας των GRNs. Μέσα σε 48 ώρες, όπου φτάνει στο στάδιο της ώριμης κολυμβητικής προνύμφης, του πλουτέα, απαιτεί στενό έλεγχο και ρύθμιση της ανάπτυξης του, με σκοπό το καθορισμό των εμβρυικών του ιστών. Μετά την αλληλούχιση του γονιδιώματος του αχινού, έχει πραγματοποιηθεί σημαντική έρευνα πάνω στο ενδομεσοδερμικό ρυθμιστικό δίκτυο του αχινού S.purpuratus, καθώς και στην κατανόηση της δομής των ρυθμιστικών δικτύων του ενδοδέρματος, του μεσοδέρματος και του εξωδέρματος, με το υποδίκτυο του νευροεξωδέρματος να αποτελεί το λιγότερο μελετημένο από όλα ως και σήμερα (εικόνα 9) [9]. 18

20 Εικόνα 9: Το στοματικό εξωδερμικό GRN του S.purpuratus με τα υποδίκτυα του. Στα δεξιά, απεικονίζεται το GRN του πρόσθιου νευροεξωδέρματος, που αποτελεί το λιγότερο μελετημένο από όλα τα γονιδιακά δίκτυα στον αχινό (grns.biotapestry.org/specto/) 1.4) Εμβρυική νευρογένεση στον αχινό Ένα από τα πιο ενδιαφέροντα, και ταυτόχρονα δυσκολότερα, ερωτήματα να απαντηθούν είναι το πώς ένας οργανισμός αναπτύσσει το νευρικό του σύστημα. Εξωδερμικά κύτταρα περνάνε μία διαδικασία ελέγχου και διαφοροποίησης μέσω μηνυμάτων που δέχονται τόσο από το περιβάλλον τους, όσο και από γειτονικά κύτταρα και ξεκινάνε να εκφράζουν νευρογενείς πρωτεΐνες [10]. Τα κύτταρα αυτά εκτείνουν άξονες ως απόκριση σε αυτά τα ερεθίσματα, διαμορφώνοντας ένα πολύπλοκο σχηματισμό, το νευρικό σύστημα, έτοιμο να ανταποκριθεί σε αλλαγές του περιβάλλοντος. Η έρευνα της νευρογένεσης στον αχινό μέχρι πριν μερικά χρόνια είχε περιοριστεί σε νευροανατομικό επίπεδο. Όμως, η ανακάλυψη νέων σηματοδοτικών μονοπατιών και μεταγραφικών παραγόντων που φαίνεται να επηρεάζουν τη διαδικασία αυτή στο έμβρυο του αχινού, καθώς και οι ομοιότητες των μονοπατιών αυτών με άλλα μετάζωα, κατέστησαν τον αχινό ως ένα ικανό και πρακτικό μοντέλο έρευνα της εμβρυικής νευρογένεσης [10]. Ο αχινός αποτελεί ένα χαρακτηριστικό αντιπρόσωπο των δευτεροστόμιων οργανισμών, ο οποίος καθορίζει την πολικότητά του και τη μοίρα των εμβρυικών του 19

21 ιστών μέσω δύο αξόνων, του προσθοπίσθιου (anteroposterior axis AP) και του ραχιαιοκοιλιακού (dorsoventral axis DV). Όπως θα αναφερθεί με περισσότερη λεπτομέρεια στη συνέχεια, αυτοί οι άξονες σχηματίζονται με τη βοήθεια Wnt και TGFβ σηματοδοτικών μονοπατιών, τα οποία αλληλεπιδρούν και αυτές οι σηματοδοτήσεις και οι αλληλεπιδράσεις τους, είναι υπεύθυνες για το σχηματισμό των 2 εμβρυικών, νευρογενών περιοχών του αχινού, το πρόσθιο νευροεξώδερμα (anterior neuroectoderm ANE) και της βλεφαριδωτής ζώνης (ciliary band CB), υποπεριοχές του κοιλιακού ή στοματικού εξωδέρματος (vental/oral ectoderm) [10-12]. Ωστόσο, αξίζει να αναφερθεί εδώ ότι πολλοί υποθέτουν ότι η προκαθορισμένη κατάσταση (pre-signaling default state) των κυττάρων του εξωδέρματος του αχινού, αλλά και όλων των μεταζώων, είναι η νευρογενής [11]. Η καθορισμένη αυτή μοίρα των κυττάρων καταστέλλεται μέσω σηματοδοτήσεων, όπως Wnt, TGFβ και Delta/Notch πλάγια αναστολή, όπου ωθούνται σε μία διαφοροποιημένη, μη νευρογενή κατάσταση και ταυτότητα, δημιουργώντας έτσι τους εμβρυικούς, εξωδερμικούς ιστούς του στοματικού και αντιστοματικού εξωδέρματος. Στον αχινό ειδικότερα, αυτή η νευρογενής, καθορισμένη περιοχή που αντιτίθεται στα σηματοδοτικά μηνύματα διαφοροποίησης σε μη νευρογενές εξώδερμα, είναι το ΑΝΕ ) Καθορισμός προσθιοπίσθιου άξονα και του πρόσθιου νευροεξωδέρματος Ο περιορισμός και η δημιουργία του ΑΝΕ, της μίας νευρογενούς περιοχής του εμβρύου του αχινού, ταυτίζεται και συνδέεται με το καθορισμό του ΑP άξονα πολικότητας του εμβρύου. Σε αυτή τη διαδικασία, είναι πολύ σημαντική η δράση Wnt σηματοδοτήσεων, και ειδικότερα, της Wnt/β-κατενίνης, ενός συντηρημένου, αρχαίου μηχανισμού για το καθορισμό της προσθιοπίσθιας πολικότητας σε σχεδόν όλα τα μετάζωα [13]. Στον αχινό, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η προκαθορισμένη κατάσταση είναι νευρογενής και επικρατεί σε όλο το έμβρυο, από τα πρώτα αναπτυξιακά στάδια. Η β- κατενίνη ανιχνεύεται από το στάδιο των 16 κυττάρων μέχρι των 32 κυττάρων, στο πυρήνα των κυττάρων του οπίσθιου μέρους του εμβρύου και καταστέλλει αυτή τη νευρογενή μοίρα σε αυτή την επικράτεια του εμβρύου. Στη συνέχεια, διαμορφώνεται μία κλίση συγκέντρωσης β-κατενίνης από το οπίσθιο προς το πρόσθιο μέρος, που είναι 20

22 απαραίτητη και αναγκαία για δύο αναπτυξιακά γεγονότα : 1) την ενεργοποίηση του γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου του ενδομεσοδέρματος στο οπίσθιο μέρος του εμβρύου και 2) τη καταστολή της νευρικής, προκαθορισμένης μοίρας στη περιοχή αυτή. Έτσι, δημιουργείται μία ασυμμετρία στο έμβρυο, με το οπίσθιο μέρος να αποτελεί το φυτικό πόλο του εμβρύου και το πρόσθιο μέρος, το ζωικό πόλο [13]. Στη ζωική πλευρά, λοιπόν, του εμβρύου περιορίζεται η νευρογενής περιοχή μέσω ανταγωνισμού με τη σηματοδότηση Wnt/β-κατενίνης, όπου θα σχηματιστεί η περιοχή του ΑΝΕ. Ήδη από το στάδιο των 32 κυττάρων, η ρυθμιστική κατάσταση εξειδίκευσης του ΑΝΕ έχει ενεργοποιηθεί, με την έκφραση ειδικών, κορυφαίων γονιδίων (master genes), όπως το Six3, Fez και FoxQ2, που είναι υπεύθυνα όχι μόνο για την εξειδίκευση και σχηματισμό της περιοχής του ΑΝΕ, αλλά και την προστασία του από σήματα διαφοροποίησης Wnt, κανονικών και μη, σηματοδοτήσεων [13] (εικόνα 10). Εικόνα 10: Καθορισμός του ΑΝΕ μέσω νευρογενών, ρυθμιστικών παραγόντων και ανταγωνισμού με τη σηματοδότηση Wnt/β-κατενίνης [13] Ωστόσο, η σηματοδότηση Wnt/β-κατενίνη (κανονικό Wnt μονοπάτι) δεν έχει ανιχνευτεί ποτέ στο ζωικό πόλο του εμβρύου, το οποίο σημαίνει ότι ο περιορισμός της περιοχής του ΑΝΕ συμβαίνει μέσω σηματοδοτήσεων καθοδικά του κανονικού Wnt 21

23 μονοπατιού [13]. Το δεύτερο στάδιο περιορισμού του ΑΝΕ ξεκινάει με την ενεργοποίηση της παραγωγής 2 Wnt προσδεμάτων, των Wnt1 και Wnt8, από τη β- κατενίνη του φυτικού πόλου και έχει τεθεί σε λειτουργία μέχρι το στάδιο των 60 κυττάρων. Αυτά τα προσδέματα συνδέονται με τον υποδοχέα Fzl 5/8, ο οποίος ενεργοποιεί το μη-κανονικό Wnt/JNK σηματοδοτικό μονοπάτι. Ο Fzl 5/8 είναι σημαντικός τόσο για τη καταστολή της νευρογενής μοίρας στο φυτικό πόλο, όσο και για το περιορισμό της περιοχής του ΑΝΕ, μέσω ανταγωνισμού της JNK κινάσης με ρυθμιστικά μόρια του ΑΝΕ (εικόνα 11). Εικόνα 11: Δράση μη-κανονικού Wnt/JNK σηματοδοτικού μονοπατιού στο περιορισμό της περιοχής του ΑΝΕ Ως ρυθμιστικό μέσο ελέγχου για τη διατήρηση της περιοχής του ΑΝΕ και την αποτροπή του περιορισμού του σε μεγάλη έκταση, δρα ο υποδοχέας Fzl 1/2/7 και η μηκανονική σηματοδότηση Wnt/pPKC [13]. Η σηματοδότηση αυτή δρα παράλληλα με τις άλλες δύο Wnt σηματοδοτήσεις και είναι υπεύθυνη για τη καταστολή της δράσης της JNK κινάσης και της β-κατενίνης, διατηρώντας έτσι την επικράτεια του ΑΝΕ (εικόνα 12). 22

24 Εικόνα 12: Δράση του μη-κανονικού μονοπατιού Wnt/pPKC για τη προστασία του ΑΝΕ από σήματα περιορισμού της επικράτειάς του Μέχρι το στάδιο του μεσεγχυματικού βλαστιδίου, η επικράτεια του ΑΝΕ έχει εγκαθιδρυθεί πλήρως, προστατεύεται από Wnt σηματοδοτικά μονοπάτια και το ρυθμιστικό γονιδιακό δίκτυο της έχει τεθεί σε λειτουργία [13] (εικόνα 13). Ωστόσο, ακόμα στη περιοχή αυτή ανιχνεύονται μόρια του υποδοχέα Fzl 5/8, που φυσιολογικά, περιορίζει την περιοχή του ΑΝΕ. Μέσω ενός μηχανισμού, όπου εμπλέκεται θετικά ο Fzl 5/8, ενεργοποιείται η έκφραση του Dkk1, ενός Wnt ανταγωνιστή στη περιοχή του ΑΝΕ, ο οποίος καταστέλλει τη δράση της Wnt/JNK σηματοδότησης, προστατεύοντας το ΑΝΕ από τα σήματα αυτά (εικόνα 14). Εικόνα 13: Ο καθορισμός του ΑΝΕ ξεκινάει από το στάδιο των 32 κυττάρων και ολοκληρώνεται έως το μεσεγχυματικό βλαστίδιο. Με πορτοκαλί χρώμα απεικονίζονται οι Wnt σηματοδοτήσεις και με μπλε η επικράτεια του ΑΝΕ 23

25 Εικόνα 14: Η δράση του Dkk1 στη προστασία της επικράτειας του ΑΝΕ από σήματα της σηματοδότησης Wnt/JNK 1.4.2) Καθορισμός ραχιαιοκοιλιακού άξονα και της βλεφαριδωτής ζώνης Η ζυγωτική έκφραση του Nodal, ένα μέλος της υπεροικογένειας των TGFβ παραγόντων, είναι απαραίτητη και ικανή να καθορίσει το σχηματισμό του στοματικού εξωδέρματος και τη κυτταρική μοίρα κατά μήκος του ραχιαιοκοιλιακού άξονα (DV axis) [14]. Σε προχωρημένο στάδιο κυτταρικών διαιρέσεων, μία οξειδοαναγωγική κλίση (redox gradient) προκαλεί την δράση του p38 σηματοδοτικού μονοπατιού, το οποίο είναι υπεύθυνο για την έκφραση του Nodal στη περιοχή του μελλοντικού στοματικού/ κοιλιακού εξωδέρματος. Αξίζει να αναφερθεί εδώ ότι, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι πιθανά ο μητρικός παράγοντας Panda είναι αναγκαίος για την ενεργοποίηση του Nodal και το καθορισμό του DV άξονα [15]. Το αποτέλεσμα αυτών των γεγονότων είναι, ο Nodal να εκκινήσει τη λειτουργία του γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου μεταγραφικών παραγόντων και σηματοδοτικών μορίων που θα καθορίσουν τη περιοχή του στοματικού εξωδέρματος. Ωστόσο, εκτός της δράσης του αυτής, η περιοχή έκφρασης του Nodal μπορεί να θεωρηθεί και ως οργανωτής (organizer-like), αφού πέρα της θετικής ανατροφοδότησης της έκφρασής του, ενεργοποιεί και την έκφραση 3 γονιδίωνκλειδιών: των bmp2/4, chordin και lefty, γονιδίων απαραίτητων για το καθορισμό της 24

26 κυτταρικής μοίρας κατά μήκος του DV άξονα και του αντιστοματικού εξωδέρματος [14, 16, 17]. Ο παράγοντας Lefty δρα ως ανταγωνιστής του Nodal και εκφράζεται σε μεγαλύτερη έκταση από αυτόν, περιορίζοντας τη δράση του στην περιοχή του στοματικού εξωδέρματος αποκλειστικά. Από την άλλη μεριά, ενώ το mrna του bmp2/4 γονιδίου εντοπίζεται στη στοματική περιοχή, η πρωτεΐνη διαχέεται σε μεγάλη απόσταση και εγκαθίσταται στην αντιδιαμετρική περιοχή του DV άξονα. Έτσι, δημιουργείται η ασυμμετρία κατά μήκος του DV άξονα και ο BMP2/4 είναι υπεύθυνος για την ενεργοποίηση ενός γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου που θα καθορίσει τη περιοχή του αντιστοματικού/ραχιαίου εξωδέρματος. Το περιορισμό της δράσης της BMP2/4 σηματοδότησης στη περιοχή αυτή, αναλαμβάνει ο παράγοντας Chordin που εκφράζεται στο στοματικό εξώδερμα και δεν επιτρέπει μόρια BMP2/4 να δράσουν στη κοιλιακή περιοχή του εμβρύου [12, 18] (εικόνα 14). Μερικές ώρες μετά το καθορισμό του DV άξονα και της Nodal/BMP 2/4 σηματοδότησης, σχηματίζεται μία επικράτεια στο στοματικό εξώδερμα, πάχους 3-4 σειρών κυττάρων που εντοπίζεται μεταξύ και χωρίζει τις περιοχές του στοματικού και αντιστοματικού εξωδέρματος. Αυτή η περιοχή ονομάζεται βλεφαριδωτή ζώνη (ciliary band-cb) (εικόνα) και αποτελεί τη δεύτερη νευρογενή περιοχή του εμβρύου του αχινού[12, 18]. Ως περιοχή σχηματισμού νευρικών κυττάρων, η CB προστατεύεται από τα σήματα της Nodal/BMP σηματοδότησης που έχει σκοπό να της προδώσει μία μη νευρική, εξωδερμική κυτταρική μοίρα. Το παράδοξο αυτού του μηχανισμού προστασίας είναι ότι η CB προστατεύεται από μόρια της Nodal/BMP σηματοδότησης, και συγκεκριμένα τα Lefty και Chordin, τους αναστολείς του Nodal και BMP2/4, αντίστοιχα. Εκτός αυτής της προστασίας, αυτά τα μόρια είναι υπεύθυνα για την έναρξη της λειτουργίας του CB GRN, όπου το πιο ιστοειδικό γονίδιο - μάρτυρας του είναι το Hnf6, γονίδιο που η έκφραση του σημαίνει και καθορισμός της βλεφαριδωτής ζώνης. Οι αλληλεπιδράσεις αυτών των παραγόντων και σηματοδοτήσεων, καθορίζει και τη γεωμετρία, αλλά και τη θέση δημιουργίας των προγονικών και διαφοροποιημένων νευρικών κυττάρων στη περιοχή αυτή [18, 19] (εικόνα 14). 25

27 Εικόνα 14: Η Nodal/BMP 2/4 σηματοδότηση και ο καθορισμός του ραχιαιοκοιλιακού άξονα και των περιοχών του στοματικού εξωδέρματος (κίτρινο),, αντιστοματικού εξωδέρματος(γαλανό) και βλεφαριδωτής ζώνης (πράσινο) 1.4.3) Καθορισμός νευρικής ταυτότητας και Delta/Notch πλάγια αναστολή Πολύπλοκοι μηχανισμοί ελέγχουν τον καθορισμό και την ωρίμανση του νευρικού συστήματος. Σε κάποιους οργανισμούς, η νευρική μοίρα υπάρχει σε όλο το εξώδερμα και από εκεί προκύπτουν νευρικά προγονικά (precursor) κύτταρα, ενώ σε άλλους συγκεκριμένες επικράτειες του εξωδέρματος έχουν νευρογενείς δυνατότητες, καθορίζονται μέσω σηματοδότησεις και από εκεί, γεννιούνται και μεταναστεύουν νευρικά βλαστικά κύτταρα [20]. Ένα πολύ σημαντικό γεγονός κατά τη νευρογένεση είναι οι ασύμμετρες διαιρέσεις που ορίζουν το σημείο ωρίμανσης ενός νευρικού προγονικού κυττάρου (neural progenitor) σε προνευρώνα (neural precursor) με πλήρως καθορισμένη νευρική μοίρα [21, 22]. Επίσης, σε αυτό το μηχανισμό, πολλές φορές λειτουργεί 26

28 συμπληρωματικά και η Delta/Notch πλάγια σηματοδότηση (lateral inhibition), που έχει ως στόχο τη διαφοροποίηση των νευρικών κυττάρων από γειτονικά κύτταρα εξωδερμικής, μη-νευρογενούς μοίρας [23]. Κύτταρα που εκφράζουν στην επιφάνεια της κυτταρικής τους μεμβράνης τον υποδοχέα Notch, ενεργοποιούνται όταν συνδεθεί το πρόσδεμα Delta, που βρίσκεται αγκυροβολημένο στην επιφάνεια γειτονικών κυττάρων. Αυτή η αλληλεπίδραση εκκινεί την τροποποίηση του ενδοκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα Notch (NICD), το οποίο μαζί με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες και συνενεργοποιητές, εισέρχεται στο πυρήνα του κυττάρου και καταστέλλει την έκφραση γονιδίων νευρικής διαφοροποίησης. Αυτή η δυναμική σχέση μεταξύ γειτονικών κυττάρων, δημιουργεί ένα μηχανισμό θετικής ανατροφοδότησης, όπου προωθεί τη δημιουργία μικρών διαφορών στη γονιδιακή έκφραση των γειτονικών κυττάρων, οδηγώντας στο καθορισμό 2 διαφορετικών κυτταρικών μοιρών. Τελικώς, τα κύτταρα τα οποία εκφράζουν ισχυρά το Delta οδηγούνται προς μία νευρική ταυτότητα, ενώ τα γειτονικά, Notch-θετικά κύτταρα οδηγούνται σε καταστολή της νευρικής ταυτότητας και τη διαφοροποίησή τους σε εξωδερμικά κύτταρα [23] (εικόνα 15). Εικόνα 15: Ο μηχανισμός πλάγιας αναστολής, η αλληλεπίδραση γειτονικών κυττάρων και η δημιουργία μωσαϊκού νευρογενών και μη, εξωδερμικών κυττάρων [23] 27

29 Αυτός ο μηχανισμός πρωτοανιχνεύτηκε στη Drosophila και το Zebrafish, και έπειτα συμπληρωματικών ερευνών έχει επιβεβαιωθεί ότι η σηματοδότηση αυτή λαμβάνει χώρα στη πλειονότητα των μεταζώων, συμπεριλαμβανομένου και του αχινού, καθώς ορίζει τη ταυτότητα των νευρικών προγονικών κυττάρων και την ισορροπία του αριθμού τους σε σχέση με γειτονικά εξωδερμικά κύτταρα[20] ) Ανάπτυξη νευρικού συστήματος στη προνύμφη του αχινού Η ανάπτυξη του νευρικού συστήματος της προνύμφης του αχινού ξεκινά από το στάδιο του μεσεγχυματικού βλαστιδίου, όπου εμφανίζονται 2 ομάδες νευρικών προγονικών κυττάρων, η μία στη περιοχή του ΑΝΕ (Animal Pole Neural Progenitors) και η άλλη κοντά στο φυτικό πόλο του εμβρύου (Postoral Neural Progenitors). Οι ομάδες αυτές παραμένουν και συνεχίζουν να διατηρούν τη προγονική τους ταυτότητα μέχρι και το στάδιο του γαστριδίου, όπου θεωρείται το στάδιο εκκίνησης του προγράμματος διαφοροποίησης και ωρίμανσης των προγονικών κυττάρων σε προνευρώνες (neural progenitors to neural precursors) [10, 20]. Τα GRNs του ΑΝΕ και της βλεφαριδωτής ζώνης, καθώς και οι αλληλεπιδράσεις τους με τα στοματικά και αντιστοματικά GRNs, οδηγούν στη δημιουργία ενός πρώιμου νευρικού συστήματος μέχρι το στάδιο του πρίσματος. Στη περιοχή του ΑΝΕ έχει ξεκινήσει η διαφοροποίηση 4-6 κυττάρων ξεχωριστών σε σχέση με τα υπόλοιπα προνευρικά κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης. Τα προνευρικά κύτταρα κοντά στο φυτικό πόλο πολλαπλασιάζονται σε αριθμό με ταχείς διαιρέσεις, αναπτύσσουν νευράξονες και δημιουργούν τις πρώτες συνάψεις, νευρώνοντας τη περιοχή της βλεφαριδωτής ζώνης και του αρχεντέρου. Διαχωρίζονται σε 2 κατηγορίες, στους προνευρώνες της οπίσθιας μοίρας (Postoral Neural Precursors) και στους γαγγλιακούς προνευρώνες της βλεφαριδωτής ζώνης (Lateral Ganglion Neural Precursors). Το τέλος της νευρογένεσης έρχεται στο στάδιο του πλουτέα, όπου έχει δημιουργηθεί ένα πλήρως λειτουργικό και πολύπλοκο νευρικό σύστημα που περιλαμβάνει ένα ακραίο γάγγλιο στο κορυφαίο όργανο (Apical Organ-ΑΡ), αναπτυξιακό προϊόν του ΑΝΕ και μία ομάδα περιφερειακών νευρώνων και γαγγλίων που νευρώνουν τη βλεφαριδωτή ζώνη και το πεπτικό σωλήνα, στη περιοχή του φάρυγγα. Οι νευρώνες στο ΑΡ ονομάζονται σεροτονεργικοί νευρώνες, είναι τοποθετημένοι προς τη ραχιαία μεριά του οργάνου, εκφράζουν σεροτονίνη και το ένζυμο υδροξυλάση της τρυπτοφάνης (TPH), απαραίτητο για την βιοσύνθεση 28

30 σεροτονίνης και είναι υπεύθυνοι για τη κίνηση και την αίσθηση βλεφαρίδων σε μυϊκά κύτταρα του στόματος του πλουτέα, βοηθώντας στη σύλληψη τροφής [10]. Το νευρικό δίκτυο των νευρώνων της βλεφαριδωτής ζώνης, των πλευρικών γαγγλίων και των περιφαρυγγικών νευρώνων βοηθούν στο συντονισμό των βλεφαρίδων για τη κίνηση του ζώου και την είσοδο και κίνηση της τροφής στον οισοφάγο, αντίστοιχα (εικόνα 16). Εικόνα 16: Διαγραμματική απεικόνιση των σταδίων της νευρογένεσης στο έμβρυο του αχινού [20] 1.5) Σημαντικά νευρογενή γονίδια του αχινού 1.5.1) Six3 Στην ανάπτυξη όλων των νευρώνων, σημαντικό ρόλο παίζει ο μεταγραφικός παράγοντας Six3, που μαζί με το FoxQ2, είναι οι πρώτοι παράγοντες που ενεργοποιούνται στη περιοχή του ΑΝΕ και θέτουν σε λειτουργία το GRN της επικράτειας αυτής [24]. Η έκφραση του ξεκινά σε προχωρημένο αριθμό διαιρέσεων, κατά το στάδιο του πρώιμου βλαστιδίου, όπου και παρατηρείται mrna στην ευρύτερη περιοχή του ζωικού πόλου. Μέχρι το στάδιο του μεσεγχυματικού βλαστιδίου, όμως, η έκφρασή του περιορίζεται σε 2 δακτυλίους, έναν στην περιοχή του ΑΝΕ και ο άλλος στο ενδομεσόδερμα. Κατά τη γαστριδίωση, το γονίδιο εκφράζεται σε δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα, διάσπαρτα στο βλαστόκοιλο και στη κορυφή του αρχεντέρου και σε νευρικά κύτταρα στις περιοχές του ΑΝΕ και του στοματικού εξωδέρματος. Τέλος, στο στάδιο του πλουτέα, η έκφραση του Six3 εντοπίζεται στη περιοχή του 29

31 κορυφαίου οργάνου, σε περιφαρυγγικούς νευρώνες του εντέρου και σε διάσπαρτα νευρικά κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης (εικόνα 17) [24]. Εικόνα 17: Αναπτυξιακό πρότυπο του Six3 στα στάδια του πρώιμου (Α), εκκολαπτόμενου (Β) και μεσεγχυματικού βλαστιδίου (C-Η), όψιμου γαστριδίου (Ι,J) και πλουτέα (K) [24] Η σημαντικότητα του Six3 στη νευρογένεση του εμβρύου του αχινού φάνηκε όταν έγινε καταστολή του γονιδίου (εικόνα 18), όπου είχε σαν αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση έως απώλεια του αριθμού των νευρώνων στο έμβρυο και ένα παχύτερο ΑΝΕ, πιθανώς με ταυτότητα μη νευρογενούς εξωδέρματος [24] 30

32 Εικόνα 18: (Α,Β) Έμβρυα 3 ημερών,ενεμένα με δύο διαφορετικά Six3 morpholinos, που δίνουν ισχυρό φαινότυπο με πλήρη απώλεια νευρικών κυττάρων και πιο ασθενή φαινότυπο με μείωση του αριθμού των νευρώνων, αντίστοιχα. (C) Έμβρυο ελέγχου 3 ημερών με φυσιολογικό αριθμό και θέση σεροτονεργικών (Serotonin) νευρώνων και νευρώνων της βλεφαριδωτής ζώνης (1e11) [24] Επίσης, ο Six3 είναι υπεύθυνος για τη σωστή ανάπτυξη των ορίων της περιοχής του ΑΝΕ, καθώς ανταγωνίζεται ανασταλτικά σήματα του κανονικού Wnt μονοπατιού [18, 24] που έχουν σκοπό να προάγουν μη νευρογενή, εξωδερμική ταυτότητα (εικόνα 19). 31

33 Εικόνα 19: Ανταγωνισμός Wnt κανονικής σηματοδότησης και Six3 καθορίζει τα όρια της επικράτειας του ΑΝΕ [18] Συμπερασματικά, ο Six3 είναι ένας καθοριστικός παράγοντας για το σχηματισμό του ΑΝΕ και το καθορισμό της κυτταρικής τύχης των νευρικών κυττάρων, αλλά όχι για την πορεία διαφοροποίησής τους, καθώς σε αυτή επάγονται και παίζουν ρόλο διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια και μεταγραφικοί παράγοντες των GRN του ΑΝΕ και της βλεφαριδωτής ζώνης [11, 20] ) FoxQ2 Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, ο FoxQ2 είναι από τους πρώτους παράγοντες που ενεργοποιούνται στο ΑΝΕ και παίζουν ρόλο στο καθορισμό της περιοχής αυτής και των ορίων της, καθώς αποσιώπησή του οδηγεί σε απώλεια του ΑΝΕ [25]. Ωστόσο με την εύρεση του αναπτυξιακού μοτίβου αυτού του παράγοντα, άλλαξε ο τρόπο θεώρησης του ΑΝΕ (εικόνα 20). Η έκφραση του ξεκινά από το στάδιο των 32 κυττάρων σε όλο το ζωικό πόλο του εμβρύου και στη συνέχεια λόγω των σηματοδοτικών γεγονότων που λαμβάνουν χώρα στον ΑV άξονα, μετά το στάδιο του βλαστιδίου και μέχρι το στάδιο του πλουτέα, περιορίζεται ιστοειδικά στη περιοχή του ΑΝΕ [25]. Εικόνα 20: Αναπτυξιακό πρότυπο του FoxQ2 από το στάδιο των 32 κυττάρων μέχρι και του πλουτέα. Η έκφραση του γονιδίου φαίνεται συγκριτικά με την έκφραση γονιδίων μαρτύρων του ενδομεσοδέρματος (Delta z13) και του στοματικού εξωδέρματος (Nodal)[25] 32

34 Όταν έγινε σύγκριση της έκφρασης του FoxQ2 με του Six3, αυτό που παρατηρήθηκε ήταν ότι το FoxQ2 εκφράζεται πολύ ειδικά στη κεντρική περιοχή του ΑΝΕ, ενώ το Six3 εκφράζεται σε δακτύλιο γύρω από τη κεντρική περιοχή του ΑΝΕ (εικόνα 21). Επομένως, το συμπέρασμα αυτού του αποτελέσματος ήταν ότι το ΑΝΕ αποτελείται από δύο υποεπικράτειες, το κεντρικό ΑΝΕ (central ANE) και την εξωτερική περιοχή του ΑΝΕ (Border ANE) [11, 25]. Εικόνα 21: Διαγραμματική απεικόνιση των διαφορετικών περιοχών έκφρασης του FoxQ2 και του Six3 στο πρόσθιο νευροεξώδερμα [25] Ο ρόλος του FoxQ2 είναι καθοριστικός τόσο για το καθορισμό των στοματικών ορίων της περιοχής του ΑΝΕ, όσο και για το καθορισμό της θέσης των σεροτονεργικών νευρώνων στο ΑΝΕ [11, 26]. Το FoxQ2 ανταγωνίζεται την Nodal/BMP 2/4 σηματοδότηση, η οποία προσπαθεί να προάγει μία μη νευρογενή, εξωδερμική μοίρα στη περιοχή του ΑΝΕ, καταστέλλοντας τη δράση του Nodal στη περιοχή του πρόσθιου νευροεξωδέρματος. Από την άλλη, η δράση του FoxQ2 στη περιοχή του στοματικού εξωδέρματος, καταστέλλεται από το Nodal, δημιουργώντας έτσι μία δυναμική σχέση μεταξύ αυτών των μορίων που δημιουργεί τα στοματικά όρια του ΑΝΕ (εικόνα 22) [27]. 33

35 Εικόνα 22: Αλληλεπίδραση του FoxQ2 με τα μονοπάτια καθορισμού των AV και DV αξόνων, δρώντας ως ένα μόριο αλληλεπίδρασης τους και ταυτόχρονα, καθορισμού της περιοχής του ΑΝΕ [27] Τέλος, το FoxQ2 καταστέλλει τη δημιουργία σεροτονεργικών νευρώνων στη κεντρική περιοχή του ΑΝΕ, προσανατολίζοντας τη θέση τους προς το ραχιαίο τμήμα των ορίων του ΑΝΕ, όπου και τελικώς εντοπίζονται από το στάδιο του πρίσματος και μετά [11], μέσω μηχανισμού που συμπεριλαμβάνει το Nodal/BMP 2/4 σηματοδοτικό μονοπάτι, το μη κανονικό Wnt/JNK μονοπάτι και το γονίδιο διαφοροποίησης σεροτονεργικών νευρώνων Hbn (περισσότερα στη παράγραφο 1.5.5) ) Fez Ο μεταγραφικός παράγοντας Fez είναι μέλος του ρυθμιστικού γονιδιακού δικτύου του ΑΝΕ και η έκφραση του επάγεται από το FoxQ2, παράγοντας απαραίτητος για το καθορισμό της περιοχής, όπως αναφέρθηκε παραπάνω [28]. Η έκφραση του είναι ζυγωτική και ξεκινά από το στάδιο του εκκολαπτόμενου βλαστιδίου, όπου και ανιχνεύεται στην ευρύτερη περιοχή του ΑΝΕ μέχρι και το στάδιο του πρώιμου 34

36 γαστριδίου. Από το όψιμο γαστρίδιο και μετά, η έκφραση του γίνεται ειδικότερη, και μάλιστα ισχυρά εντοπισμένη σε μεμονωμένα κύτταρα του ΑΝΕ (εικόνα 23). Εικόνα 23: Αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης του Fez σε έμβρυα του αχινού S.purpuratus (Α) Πρώιμο βλαστίδιο, (Β) Μεσεγχυματικό βλαστίδιο, (C) Πρώιμο γαστρίδιο (D) Όψιμο γαστρίδιο, (Ε) Πρίσμα, (F) Πλουτέας [28] Με πειράματα διπλής φθορίζουσας in situ υβριδοποίησης για το Fez και το FoxQ2, συνοδευόμενα με χρήση αντισώματος κατά της σεροτονίνης, διαπιστώθηκε ότι από το όψιμο γαστρίδιο και μετά, η έκφραση του Fez δεν είναι εξαρτώμενη, ούτε αλληλεπικαλυπτόμενη με του FoxQ2 και τα Fez θετικά κύτταρα αποτελούν σεροτονεργικούς προνευρώνες και νευρώνες (εικόνα 24) [28]. 35

37 Εικόνα 24: Μοτίβο έκφρασης του Fez (μωβ) σε σχέση με το FoxQ2 (πράσινο) από το στάδιο του εκκολαπτόμενου βλαστιδίου μέχρι και του πρίσματος (G-K ). Στα παράθυρα L-L φαίνεται ο συνεντοπισμός του Fez με το ένζυμο Τph, απαραίτητο για παραγωγή σεροτονίνης [28] Τέλος, ο Fez αποτελεί καθοριστικό μόριο για τη ρύθμιση του μεγέθους του ΑΝΕ μέσω ανταγωνισμού με τη BMP 2/4 πρωτεΐνη στο αντιστοματικό εξώδερμα (εικόνα 25) [28]. Ο FoxQ2 εμφανίζεται πριν το στάδιο του εκκολαπτόμενου βλαστιδίου και πριν την BMP σηματοδότηση και έχει στόχο την ενεργοποίηση του ANE GRN μαζί με το Six3. Από την άλλη, μέσω της Nodal/BMP σηματοδότησης, η BMP 2/4 πρωτεΐνη μετακινείται στη ραχιαία περιοχή του εμβρύου και ενεργοποιεί το αντιστοματικό GRN, καταστέλλοντας τη νευρογενή δράση του FoxQ2 στη περιοχή αυτή. Από το στάδιο του εκκολαπτόμενου βλαστιδίου, η ενεργοποίηση του Fez από το FoxQ2 στη περιοχή του ΑΝΕ, του επιτρέπει όταν φτάσει στα απαραίτητα επίπεδα έκφρασης, να καταστείλει τη 36

38 μη νευρογενή δράση του BMP 2/4 στα ραχιαία όρια της εξωτερικής περιοχής του ΑΝΕ, δρώντας έτσι ως αρνητικός ρυθμιστής της έκφρασης του BMP 2/4 στο ΑΝΕ και καθοριστής των ορίων της περιοχής αυτής. Εικόνα 25: Μοντέλο καθορισμού του μεγέθους του ΑΝΕ μέσω ανταγωνισμού FoxQ2, Fez και BMP 2/4 σηματοδότησης [28] 1.5.4) SoxC Ο μεταγραφικός παράγοντας SoxC, ομόλογο του Sox11 των θηλαστικών, αποτελεί έναν ζυγωτικό παράγοντα, ο οποίος εκφράζεται νωρίς κατά την εμβρυογένεση και παίζει σημαντικό ρόλο στο έμμεσο καθορισμό, ρύθμιση και διαφοροποίηση των νευρικών προγονικών κυττάρων σε ώριμους νευρώνες [20, 29]. Η έκφραση του ξεκινά λίγο μετά την εκκόλαψη του βλαστιδίου και σημειώνεται σε κύτταρα της φυτικής πλάκας και του μελλοντικού πρόσθιου νευροεξωδέρματος, ενώ από το στάδιο του γαστριδίου και έπειτα, η έκφραση του στο φυτικό πόλο εξαλείφεται και εκφράζεται σε κύτταρα του στοματικού εξωδέρματος, της βλεφαριδωτής ζώνης, του πρόσθιου εντέρου και του ΑΝΕ (εικόνα 26). 37

39 Εικόνα 26: (Α,Β) Έκφραση του SoxC στα στάδια του εκκολαπτόμενου βλαστιδίου και του γαστριδίου, (G-I ) Συνεντοπισμός του SoxC με κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης, θετικά στο γονίδιο μάρτυρα της CB, Hnf6 [29] Τα κύτταρα αυτά αναγνωρίστηκαν ότι αποτελούν προγονικά νευρικά κύτταρα, καθώς η έκφραση του SoxC σε αυτά, μειώνεται σημαντικά υπό καταστολή του Six3 και συνεντοπίζεται σε κύτταρα θετικά σε Delta (μάρτυρας προγονικών νευρικών κυττάρων) (εικόνα 27). Ωστόσο, παρόλο που ο SoxC παρουσιάστηκε ως απαραίτητος παράγοντας της πρώιμης νευρογένεσης στο έμβρυο του αχινού, δεν αποτελεί τμήμα του μηχανισμού διαφοροποίησης των νευρώνων στη τελική τους ταυτότητα, καθώς δεν συνεκφράζεται με μόρια μάρτυρες διαφοροποιημένων νευρικών κυττάρων (π.χ. συναπτοταγμίνη και σεροτονίνη) [20] 38

40 Εικόνα 27: (C) Εξάλειψη της έκφρασης του SoxC σε έμβρυα όπου έχει κατασταλεί ο Six3, (D-E) Συνεντοπισμός Delta-SoxC σε νευρικά προγονικά κύτταρα, (F) Έμβρυα μεγαλωμένα σε DAPT αναστολέα του μονοπατιού Delta/Notch, οδηγεί σε μεγάλο αριθμό προγονικών νευρικών κυττάρων (SoxC θετικά) [29] Η έρευνα των Wei et. al [29] υπέδειξε ένα πρώιμο, νευρογενετικό μονοπάτι ωρίμανσης και διαφοροποίησης των προγονικών νευρικών κυττάρων (εικόνα 28). Το Six3 εμπλέκεται σε, μέχρι στιγμής, άγνωστο σηματοδοτικό μηχανισμό και ενεργοποιεί την έκφραση του SoxC στα νευρικά προγονικά κύτταρα, διάσπαρτα σε νευρογενείς περιοχές του εμβρύου. Τα SoxC θετικά κύτταρα διαιρούνται και η πλειονότητα αυτών, συνεκφράζουν Delta και είναι δεκτικά στο μηχανισμό Πλάγιας Αναστολής. Το SoxC απαιτείται για την ανάπτυξη τόσο των σεροτονεργικών νευρώνων (SynB και Tph), όσο και των μη σεροτονεργικών (SynB) και ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου Brn1/2/4, που με τη σειρά του ενεργοποιεί έμμεσα την έκφραση του SynB στους μη σεροτονεργικούς νευρώνες και του Z167 και Tph στους σεροτονεργικούς νευρώνες. Έτσι, γίνεται φανερό ότι το SoxC αποτελεί έναν παράγοντα κλειδί για το καθορισμό της κυτταρικής ταυτότητας των προγονικών νευρικών κυττάρων και θέτει σε κίνηση το μηχανισμό διαφοροποίησης και ωρίμανσης τους, χωρίς να εκφράζεται στα ώριμα νευρικά κύτταρα [29]. Εικόνα 28: Νευρογενές μονοπάτι καθορισμού και διαφοροποίησης των προγονικών νευρικών κυττάρων [29] 39

41 1.5.5) Hbn Ο μεταγραφικός παράγοντας Hbn ανήκει στην οικογένεια γονιδίων homeobrain-like (hbnl), που πρωτοαναγνωρίστηκε στη Drosophila και έπειτα, σε άλλους οργανισμούς συμπεριλαμβανομένου και του αχινού [30]. Είναι ένας παράγοντας που εκφράζεται αποκλειστικά στην περιοχή του ΑΝΕ με χαρακτηριστικό μοτίβο (εικόνα 29). Αρχικά, στο στάδιο του πρώιμου βλαστιδίου, η έκφραση του εντοπίζεται στην ευρύτερη περιοχή του ΑΝΕ και συνεντοπίζεται με το FoxQ2. Στη συνέχεια της ανάπτυξης, όμως, και μέχρι το στάδιο του όψιμου γαστριδίου, η έκφραση του Hbn απαλείφεται από τη κοιλιακή πλευρά και κεντρική περιοχή του ΑΝΕ και περιορίζεται στη ραχιαία πλευρά των εξωτερικών ορίων του ΑΝΕ, την περιοχή δημιουργίας των σεροτονεργικών νευρώνων και δεν συνεντοπίζεται πλέον με το FoxQ2 [11]. Εικόνα 29: (Α-F) Αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης του Hbn από το στάδιο του πρώιμου βλαστιδίου μέχρι το στάδιο του πρώιμου πλουτέα σε έμβρυα του αχινού H.pulcherrimus, (G-K ) Σύγκριση της έκφρασης του Hbn σε σχέση με του FoxQ2, όπου παρατηρείται ο συνεντοπισμός τους στη περιοχή του ΑΝΕ στις 12 ώρες και έπειτα, η χαρακτηριστική μετατόπιση της έκφρασης του Hbn προς τη ραχιαία πλευρά των ορίων του ΑΝΕ, όπου συνεντοπίζεται με το Tph, ένζυμο σύνθεσης της σεροτονίνης των σεροτονεργικών νευρώνων [11] Από πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης του Hbn σε έμβρυα αχινού, διαπιστώθηκε ότι η καταστολή του γονιδίου επιφέρει έλλειψη τόσο της έκφρασης 40

42 γονιδίων τελικής διαφοροποίησης των σεροτονεργικών νευρώνων, όπως τα Fez, Sip1 και Tph, όσο και απώλεια δημιουργίας σεροτονεργικών νευρώνων εξολοκλήρου, υποδεικνύοντας τη σημαντικότητα του ρόλου του Hbn στην ανάπτυξη των σερονεργικών νευρώνων στο ΑΝΕ (εικόνα 30) [11]. Εικόνα 30: (L-O) Καταστολή του Hbn επιφέρει απώλεια σεροτονεργικών νευρώνων στο έμβρυο του αχινού, (P-Q) Καταστολή του κανονικού μονοπατιού Wnt με Δcad επιφέρει επέκταση του ΑΝΕ και δημιουργία σεροτονεργικών νευρώνων χωρίς συγκεκριμένη θέση. Ακόμα και σε τέτοια κατάσταση του εμβρύου, καταστολή του Hbn δεν επιτρέπει τη δημιουργία νευρώνων, (R-W) Καταστολή του Hbn επιφέρει απώλεια έκφρασης γονιδίων διαφοροποίησης των σεροτονεργικών νευρώνων Tph, sip1/zfhx, fez [11] Πρόσφατη δημοσίευση έδειξε ένα μηχανισμό καθορισμού της δομής των υποπεριοχών του ΑΝΕ και της θέσης των σεροτονεργικών νευρώνων (εικόνα 31) [11], όπου συμμετέχουν τα γονίδια FoxQ2 και Hbn και οι σηματοδοτήσεις Nodal/BMP και Wnt/β-κατενίνη. Όσον αφορά την έκφραση του FoxQ2, σε περιοχές εκτός του ΑΝΕ, καταστέλλεται από κανονική σηματοδότηση cwnt που ρυθμίζεται από τα Wnt7/LRP6, που διαρκεί από τα στάδια του βλαστιδίου μέχρι του γαστριδίου. Το Nodal καταστέλλει την έκφραση του από τη κοιλιακή πλευρά. Οι σεροτονεργικοί νευρώνες αρχίζουν να σχηματίζονται στη πλαγιοραχιαία περιοχή των ορίων του ΑΝΕ, περιοχή που δεν εκφράζει FoxQ2, αλλά Hbn. Η έκφραση του Hbn περιορίζεται στη πλαγιοραχιαία περιοχή του ΑΝΕ και έχει τη μορφή πετάλου μέσω καταστολής από το Nodal και μη κανονική Wnt6/JNK σηματοδότηση, ενώ δέχεται θετικά σήματα διατήρησης (positive 41

43 maintainance) από το BMP 2/4 του ραχιαίου εξωδέρματος. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις, λοιπόν, καθορίζουν όχι μόνο την θέση δημιουργίας των σεροτονεργικών νευρώνων στα πλαγιοραχιαία όρια του ΑΝΕ, αλλά και το περιορισμό της δημιουργίας τους μόνο στη περιοχή αυτή, καθώς όπως έχει αναφερθεί, η προκαθορισμένη μοίρα (default state) του εμβρύου είναι νευρογενής και τέτοιες σηματοδοτήσεις περιορίζουν αυτή τη κατάσταση σε μία περιορισμένη περιοχή [11]. Εικόνα 31: Σχεδιαγραμματική απεικόνιση του μηχανισμού καθορισμού της θέσης δημιουργίας των σεροτονεργικών νευρώνων στη πλαγιοραχιαία περιοχή των ορίων του ΑΝΕ [11] 1.5.6) Sip1 Ο μεταγραφικός παράγοντας Sip1 (Z81/Zfhx) ανήκει στην οικογένεια γονιδίων Homeobox και αποτελεί ρυθμιστή της διαφοροποίησης των σεροτονεργικών νευρώνων [31]. Δεν αποτελεί μητρικό παράγοντα και η έκφρασή του ξεκινά από το στάδιο του εκκολαπτόμενου βλαστιδίου, σε όλη την έκταση του εμβρύου, εκτός της φυτικής πλάκας. Με την εκκόλαψη, η έκφραση του περιορίζεται σε κύτταρα του ενδομεσοδέρματος του μεσεγχυματικού βλαστιδίου. Με τη γαστριδίωση, έκφραση εμφανίζεται και σε κύτταρα του οπίσθιου εξωδέρματος, εκεί που σχηματίζονται τα 42

44 οπίσθια γάγγλια και στην περιοχή του ΑΝΕ. Μέχρι το στάδιο του πρίσματος, δίνοντας έμφαση στην περιοχή του ΑΝΕ, η έκφραση του Sip1 μετατοπίζεται προς τη ραχιαία περιοχή των ορίων του ΑΝΕ, δηλαδή στη περιοχή δημιουργίας σεροτονεργικών νευρώνων και σε κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης. Τέλος, στο στάδιο του πλουτέα, η έκφραση παραμένει στη βλεφαριδωτή ζώνη και σε εξωδερμικά κύτταρα, αλλά η έκφραση στη περιοχή του κορυφαίου οργάνου (εξελικτικό προϊόν του ΑΝΕ) εξαλείφεται (εικόνα 32) [31]. Εικόνα 32: Αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης του Sip1 σε έμβρυα του αχινού Η.pulcherrimus (10-72 ωρών). FoxA μάρτυρας ενδομεσοδερμικών κυττάρων, DAPI φθορίζουσα χρωστική που σημάνει πυρήνες [31] Ο Sip1 συμμετέχει στη διαφοροποίηση των σεροτονεργικών προγονικών νευρώνων σε ώριμους σεροτονεργικούς νευρώνες, αλλά δεν εκφράζεται σε αυτούς, κάτι που φαίνεται τόσο από το αναπτυξιακό του πρότυπο, όσο και από την απώλεια συνεντοπισμού του Tph με το Sip1 στο στάδιο του πλουτέα. Αντίθετα, ο Sip1 είναι απαραίτητος για την ενεργοποίηση της έκφρασης του Tph και τη παραγωγή σεροτονίνης, αλλά απουσιάζει από τα τελικά στάδια διαφοροποίησης των νευρώνων. 43

45 Επίσης, ο Sip1 συνεντοπίζεται στα προγονικά νευρικά κύτταρα με το Delta στο στάδιο του γαστριδίου και η έκφραση του στη κοιλιακή περιοχή του ΑΝΕ, καταστέλλεται έμμεσα από το Nodal. Η καταστολή του Sip1 με σκοπό την αποφυγή δημιουργίας περίσσειας σεροτονεργικών νευρώνων γίνεται τόσο με μηχανισμό Delta/Notch πλάγιας αναστολής, όσο και με αυτορυθμιστικό μηχανισμό (εικόνα 33) [31]. Εικόνα 33: Σύντομη απεικόνιση μερικών από των μηχανισμών καθορισμού και διαφοροποίησης των σεροτονεργικών νευρώνων, καθώς και ρύθμισης του Sip1/Z81/Zfhx στο πρώιμο έμβρυο του αχινού H.pulcherrimus [31] 1.6) Η υπεροικογένεια των θυρεοειδών/στεροειδών πυρηνικών υποδοχέων Οι υποδοχείς στεροειδών ορμονών είναι πρωτεΐνες του κυτταροπλάσματος που βρίσκονται σε ανενεργή κατάσταση και η δράση τους ενεργοποιείται μετά την πρόσδεση, στην επικράτεια ενεργοποίησης του υποδοχέα, του κατάλληλου μικρομοριακού προσδέτη ορμόνη [32]. Έπειτα, η πρωτεΐνη μεταφέρεται στο πυρήνα των κυττάρων, όπου και λειτουργεί σαν μεταγραφικός παράγοντας για τη ρύθμιση της έκφρασης διαφόρων γονιδίων, είτε ενεργοποιώντας, είτε καταστέλλοντας τη δράση τους. Η υπεροικογένεια αυτή περιλαμβάνει τους υποδοχείς στεροειδών ορμονών (ανδρογόνων, οιστρογόνων, γλυκοκορτικοειδών κ.α.), υποδοχείς θυρεοειδών ορμονών, βιταμίνης D, ρετινοειδών κ.α. 44

46 Εικόνα 34: Τρόπος σηματοδότησης και λειτουργίας των υποδοχέων στεροειδών ορμονών (http//: Όλοι οι υποδοχείς αυτής της υπεροικογένειας έχουν μία κοινή, χαρακτηριστική δομή (εικόνα 35) [32, 33]: Το αμινοτελικό τους άκρο είναι η περιοχή Α/Β και ονομάζεται ρυθμιστής. Είναι η ελάχιστα συντηρημένη περιοχή στον υποδοχέα, ποικίλει σε αλληλουχία και μέγεθος και έχει λειτουργία ανεξάρτητης ενεργοποίησης (AF-1). Περιέχουν αλληλουχίες απαραίτητες για την μεταγραφή των ρυθμιζόμενων γονιδίων. Η περιοχή C είναι η περιοχή πρόσδεσης του υποδοχέα στην κατάλληλη αλληλουχία στοιχείο απόκρισης στο DNA (DNA Binding Domain - DBD). Είναι η πιο συντηρημένη περιοχή στον υποδοχέα και αποτελείται από δύο μοτίβα δακτύλων ψευδαργύρου. Είναι απαραίτητη τόσο για την αναγνώριση των κατάλληλων ειδικών αλληλουχιών στο DNA, όσο και για τον διμερισμό του υποδοχέα. Τα μοτίβα των δακτύλων ψευδαργύρου της DBD περιοχής έχουν την αλληλουχία Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys (εικόνα 18). Ο κάθε δάκτυλος στο αμινοξυτελικό άκρο του σχηματίζει β-πτυχωτή επιφάνεια και στο καρβοξυτελικό, μία α-έλικα. Ο πρώτος δάκτυλος αναγνωρίζει την περιοχή πρόσδεσης αλληλουχία στο DNA, ενώ ο δεύτερος αναλαμβάνει το διμερισμό των υποδοχέων. Η δομή αυτή εισέρχεται στη μεγάλη αύλακα του DNA και η 45

47 ειδική αναγνώριση των βάσεων του στοιχείου απόκρισης εξαρτάται από τα δύο αμινοξέα μεταξύ των κυστεΐνων. Οι υποδοχείς λειτουργούν σχεδόν αποκλειστικά ως διμερή και τα στοιχεία απόκρισης περιλαμβάνουν δύο φορές μικρές αλληλουχίες, είτε ομόρροπες (αναγνωρίζονται από ετεροδιμερή υποδοχέων), είτε παλίνδρομες (αναγνωρίζονται από ομοδιμερή υποδοχέων). Αυτός ο τρόπος διάταξης των αλληλουχιών ταιριάζει απόλυτα με το διμερικό χαρακτήρα των υποδοχέων. Εικόνα 35: Α: Δομή υποδοχέα στεροειδών/θυρεοειδών ορμονών, B: Δομή μοτίβου δακτύλων ψευδαργύρου, C: Διμερισμός και πρόσδεση σε κατάλληλα παλίνδρομα στοιχεία απόκρισης του DNA ( 46

48 Η περιοχή D (hinge) προσδίδει στην πρωτεΐνη ευκαμψία και μεταβλητότητα στην δομή της στο χώρο, ενώ φαίνεται να περιέχει και πληροφορίες για την πυρηνική διαμερισματοποίηση. Η περιοχή E/F στο καρβοξυτελικό άκρο του υποδοχέα παρουσιάζει μεγάλη ποικιλομορφία μεταξύ των πυρηνικών υποδοχέων, καθώς φέρει την περιοχή σύνδεσης του προσδέτη (Ligand Binding Domain LBD) που θα ενεργοποιήσει τον υποδοχέα, μία AF-2 περιοχή που συνδράμει στην ενεργοποίηση του υποδοχέα, την περιοχή διμερισμού και μία περιοχή που σχετίζεται με την εγκατάσταση και τον εντοπισμό του υποδοχέα στο πυρήνα ως μεταγραφικός παράγοντας πλέον. 1.7) Η υποοικογένεια των COUP-TFs Οι COUP-TFs είναι μεταγραφικοί παράγοντες της υπεροικογένειας των υποδοχέων στεροειδών/θυρεοειδών ορμονών με τη χαρακτηριστική δομή που περιγράφηκε στην παράγραφο 1.6, αλλά επειδή μέχρι τώρα δεν έχει βρεθεί το ειδικό πρόσδεμα που τους ενεργοποιεί, χαρακτηρίζονται ως ορφανοί υποδοχείς. [34] Ο πρώτος COUP-TF που αναγνωρίστηκε ήταν στην όρνιθα και προσδένεται σε μία ανοδική ρυθμιστική περιοχή του υποκινητή της ωοαλβουμίνης (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter), απ όπου πήρε και την ονομασία του (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor COUP-TF) FA Pereira, Y Qiu, MJ Tsai and SY Tsai [34]. Συγκεκριμένα, o COUP-TF βρέθηκε να δένει στην αλληλουχία GTGTCA A AGGTCA, η οποία είναι μία ατελής ευθεία επανάληψη της αλληλουχίας AGGTCA με απόσταση ενός νουκλεοτιδίου μεταξύ ημιθέσεων (DR1). Παρόλα αυτά, οι COUP-TFs προσδένονται και σε ατελείς ευθείες επαναλήψεις που οι αποστάσεις των ημιθέσεων ποικίλουν από 0-11 νουκλεοτίδια. Η ικανότητα πρόσδεσής τους σε ευθείες ή και παλίνδρομες επαναλήψεις και η διαφορετικές αποστάσεις μεταξύ των ημιθέσεων, εξαρτώνται από τις διάφορες εναλλακτικές στερεοδομές του παράγοντα[35] ) Λειτουργία O COUP-TF δρα ως μεταγραφικός παράγοντας, σημαντικός για την ρύθμιση της έκφρασης πολλών γονιδίων και η δράση του είναι κυρίως κατασταλτική, αν και στην όρνιθα αναγνωρίστηκε ως ενεργοποιητής του γονιδίου της ωοαλβουμίνη. Η 47

49 κατασταλτική του δράση οφείλεται στο ενεργό κέντρο καταστολής τους στην καρβοξυτελική περιοχή της επικράτειας σύνδεσης του προσδέτη[36, 37]. Ως καταστολέας (εικόνα 36) Ανταγωνισμός για την πρόσδεση στα στοιχεία απόκρισης: Οι COUP- TFS καταστέλλουν την ενεργοποίηση γονιδίων που επάγονται από τους πυρηνικούς υποδοχείς VDR, TR, RAR, RXR, PPAR, HNF-4 μέσω ανταγωνισμού με την θέση πρόσδεσης στο DNA. Ανταγωνισμός για διμερισμό με τον RXR: Ο RXR ετεροδιμερίζεται με πολλούς πυρηνικούς υποδοχείς ( RAR, TR, VDR, PPAR), που ενώ αυτοί μπορούν να δράσουν ως ομοδιμερή, έχουν χαμηλότερη συγγένεια με τις αλληλουχίες στόχους σε σχέση με τη μορφή ετεροδιμερών με τον RXR. O COUP-TF ανταγωνίζεται με τους υποδοχείς της οικογένειας για την δημιουργία ετεροδιμερών με τον RXR, περιορίζοντας την ενεργοποιητική τους δράση. Ενεργός καταστολή: Οι COUP-TFs μέσω πρόσδεσης στο κατάλληλο στοιχείο απόκρισης, μπορούν να καταστείλλουν μέσω άμεσης ή έμμεσης αλληλεπίδρασης με τους γειτονικούς μεταγραφικούς παράγοντες την μεταγραφή γονιδίων, αφού έχουν κατασταλτικό ενεργό κέντρο στην LBD επικράτεια. Η καταστολή αυτού του τύπου εξαρτάται από την θέση του στοιχείου απόκρισης, που μπορεί να είναι καθοδικά ή ανοδικά του +1 της μεταγραφής. Trans-καταστολή: Αυτού του τύπου η καταστολή πραγματοποιείται όταν ο COUP-TF δεν προσδένεται άμεσα στο στοιχείο απόκρισης, αλλά στην LBD ενός άλλου πυρηνικού υποδοχέα, αποτρέποντας έτσι την ενεργοποίηση αυτού του υποδοχέα, αφού η επικράτεια σύνδεσης του προσδέτη δεν είναι ελεύθερη για τη δέσμευση του προσδέτη. Δηλαδή, εδώ ο COUP-TF δρα σαν συγκαταστολέας. 48

50 Εικόνα 36: Τρόποι λειτουργίας του COUP-TF σαν καταστολέας. Α: Ανταγωνισμός για την πρόσδεση, Β: Ανταγωνισμός για το διμερισμό με RXR, Γ: Ενεργός καταστολή, Δ: Trans-καταστολή Ως ενεργοποιητής Αν και η κύρια δράση του COUP-TF είναι σαν καταστολέας, έχουν παρατηρηθεί φαινόμενα όπου επάγει την μεταγραφή διαφόρων γονιδίων στόχων, αλλά αυτό είναι σπάνιο, είτε περιορίζεται σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους και έχει μικρή σημαντικότητα[36]. Έχουν περιγραφεί τρεις μηχανισμοί ενεργοποιητικής δράσης (εικόνα 37): Α) Πρόσδεση στο στοιχείο απόκρισης και ενεργοποίηση της μεταγραφής του γονιδίου CYP7A, Β) Πρόσδεση σε ρυθμιστικό στοιχείο μεταγραφικό παράγοντα και έμμεσα επηρεάζει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων (π.χ PEPCK) και Γ) Επαγωγή της μεταγραφής του γονιδίου NGFI-A μέσω αλληλεπίδρασης, αφενός με άλλον μεταγραφικό παράγοντα (π.χ Sp1) που προσδένεται στο στοιχείο απόκρισης στο DNA και αφετέρου, με συνενεργοποιητικό σύμπλοκο (π.χ SRC-1). 49

51 Εικόνα 37: Τρόποι δράσης του COUP-TF ως ενεργοποιητής. Α) Άμεση ενεργοποίηση μέσω αλληλεπίδρασης με στοιχείο απόκρισης, Β) Έμμεση ενεργοποίηση μέσω αλληλεπίδρασης με μεταγραφικό παράγοντα σαν συνενεργοποιητής, Γ) Ενεργοποίηση μέσω αλληλεπίδρασης με άλλο μεταγραφικό παράγοντα που προσδένεται στο DNA Όσον αφορά τη ρύθμιση των COUP-TFs, οι γνωστότεροι μηχανισμοί είναι : 1) Ρύθμιση των xcoup-tf1 και xcoup-tf2 από το ρετινοϊκό οξύ στον Xenopus[38], όπου το ρετινοϊκό επάγει την έκφραση του xcoup-tfι και αναστέλλει την έκφραση του xcoup-tfιι σε απαραίτητα αναπτυξιακά στάδια. 2) Ρύθμιση του ccoup-tf από το Sonic Hedgehog (Shh)[39], μεταγραφικού παράγοντα που παράγεται από τη νωτοχορδή και διαφοροποιεί και καθορίζει διάφορους κυτταρικούς τύπους, όπου μία φωσφατάση επάγει μέσω μηχανισμού αποφωσφορυλίωσης την αυξημένη πρόσδεση του Shh στον κατάλληλο υποκινητή του ccoup-tf, επάγοντας την έκφρασή του. 3) Ρύθμιση του COUP-TF από τους Ets παράγοντες[40], όπου στο γονίδιο του mcoup- TFΙ υπάρχουν τρία στοιχεία απόκρισης για τους ETS μεταγραφικούς παράγοντες, που έχουν μία επικράτεια πρόσδεσης στο DNA που λέγεται ETS, και κυρίως ο Ets1, ενεργοποιούν τον mcoup-tfι μετά την πρόσδεσή τους ) Ιστοειδική έκφραση στον αχινό Όσον αφορά τον αχινό, που αποτελεί και το πειραματικό μας μοντέλο, έχουν γίνει πειράματα, τόσο στον Strongylocentrotus purpuratus, όσο και στον Paracentrotus lividus. Ομόλογο του COUP-TF στον S.purpuratus είναι το SpCOUP-TF, που έχει μεγάλη ομολογία με τον hcoup-tf ( 96% ομολογία στο DBD και 92% ομολογία στο 50

52 LBD [41, 42]. O SpCOUP-TF μεταγραφικός παράγοντας εντοπίστηκε σε πυρηνικό εκχύλισμα αχινού και προσδεδεμένος στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της ακτίνης CyIIIb, που ονομάζεται C1R και έχει μεγάλη ομολογία με το στοιχείο απόκρισης της ωοαλβουμίνης στην όρνιθα [41]. Το γονίδιο του SpCOUP-TF εκφράζεται κατά την ωογένεση με τη μορφή μητρικής προέλευσης mrna και εντοπίζεται προς τη μία πλευρά τόσο του αυγού, όσο και του ωοκυττάρου [42] (εικόνα 38). Εικόνα 38: Περιοχές εντοπισμού του μητρικού SpCOUP-TF mrna. A: Ωοκύτταρο, Β: Αυγό C-E: controls Κατά την αυλάκωση και στο στάδιο των δύο κυττάρων, το mrna ανιχνεύεται στα δύο βλαστομερίδια, κατά το στάδιο των τεσσάρων κυττάρων, ανιχνεύεται σε δύο από τα τέσσερα βλαστομερίδια και στο στάδιο των 16 κυττάρων, το mrna ανιχνεύεται σε 4 από τα 8 βλαστομερίδια, σε 2 από τα 4 μακρομερίδια και ελάχιστα στα μικρομερίδια [42] (εικόνα 39). Τα δύο είδη αχινού στην εικόνα παρουσιάζουν το mrna του COUP- TF σε διαφορετικές περιοχές και θέσεις και πιθανώς σχετίζεται με τη θέση του στοματικού/αντιστοματικού άξονα του εμβρύου. Εικόνα 39: Ανίχνευση του COUP-TF σε στάδια αυγού 16 κυττάρων σε L.variegatus (A-E) και S.purpuratus (F-J) 51

53 Στο στάδιο του βλαστιδίου, το SpCOUP-TF mrna εντοπίζεται αποκλειστικά στο εξώδερμα στη μία μεριά του βλαστόκοιλου, την στοματική και είναι περισσότερο ζυγωτικό, παρά μητρικό. Από το στάδιο του γαστριδίου και μετά, όλα τα μετάγραφα του SpCOUP-TF είναι ζυγωτικής προέλευσης και ανιχνεύονται στο στοματικό εξώδερμα. Στο στάδιο του πλουτέα, το mrna εντοπίζεται σε εξωδερμικά κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης και στην έδρα [42] (εικόνα 40). Εικόνα 40: Εντοπισμός του SpCOUP-TF mrna στα στάδια του βλαστιδίου (Α), γαστριδίου (Β), πλουτέα (C). E-H: controls Το πρότυπο του S.purpuratus είναι ίδιο με το αυτό το PlCoup-TF [41] (εικόνα 41), το οποίο πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριό μας. Εικόνα 41: Αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης του PlCoup-TF σε εμβρυικά στάδια του αυγού (Ε), των 16 κυττάρων (16c), βλαστιδίου (Β), γαστριδίου (G), πρίσματος (Ρ) και πλουτέα (Pl) [43]. 52

54 O PlCoup-TF αποτελεί μητρικό παράγοντα, καθώς εκφράζεται στο στάδιο του αυγού και των 16 κυττάρων σε όλα τα κύτταρα του εμβρύου. Στη συνέχεια, στο στάδιο του βλαστιδίου, η έκφραση περιορίζεται στη μεριά του στοματικού εξωδέρματος, όπου και παραμένει. Από το στάδιο του γαστριδίου μέχρι και το στάδιο του πρίσματος, όπου το mrna είναι ζυγωτικής προέλευσης, ο PlCoup-TF εκφράζεται σε κύτταρα του στοματικού εξωδέρματος, του αρχεντέρου, της βλεφαριδωτής ζώνης και του πρόσθιου νευροεξωδέρματος. Τέλος, στο στάδιο του πλουτέα, παρατηρείται έκφραση στις περιοχές του κορυφαίου οργάνου, της βλεφαριδωτής ζώνης και της έδρας του πεπτικού σωλήνα. Συμπληρωματικά, τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν με τον αχινό P.lividus στο εργαστήριό μας [43], έδειξαν ότι ο υποδοχέας COUP-TF στον P.lividus διαφέρει και έχει δύο ισομορφές, προϊόντα εναλλακτικού ματίσματος, με αποτέλεσμα την εισαγωγή ενός επιπλέον εξωνίου. Αυτό το εξώνιο κωδικοποιεί ένα πεπτίδιο 21 αμινοξέων που εντοπίζεται στην καρβοξυτελική περιοχή CTE της DBD περιοχής (εικόνα 42). Εικόνα 42: Δομή του PlCOUP-TF. Φαίνονται οι χαρακτηριστικές περιοχές του γονιδίου του πυρηνικού υποδοχέα, καθώς και το μήκος των αμινοξέων που κωδικοποιεί το κάθε τμήμα του γονιδίου. Με κόκκινο συμβολίζεται το επιπλέον εξώνιο που κωδικοποιεί το πεπτίδιο των 21 αμινοξέων. 53

55 Έτσι εντοπίζονται δύο κλώνοι cdna του PlCOUP-TF, ο ένας μήκους 1410 νουκλεοτιδίων, που κωδικοποιεί τη μικρή ισομορφή της πρωτεΐνης (470 αμινοξέα) και ο άλλος μήκους 1473 νουκλεοτιδίων, που κωδικοποιεί τη μεγάλη ισομορφή του υποδοχέα (491 αμινοξέα). Από πειράματα που ακολούθησαν είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι η μεγάλη ισομορφή της PlCOUP-TF πρωτεΐνης φαίνεται να μην προσδένεται σαν ομοδιμερές, αποτελεσματικά στα στοιχεία απόκρισης μόνη της, ενώ η μικρή ισομορφή του υποδοχέα προσδένεται αποτελεσματικά στα στοιχεία απόκρισης σαν ομοδιμερές και σαν ετεροδιμερές με την μεγάλη ισομορφή. Στη τελευταία περίπτωση μάλιστα, εμφανίζεται δοσοεξαρτώμενη μείωση του ποσοστού πρόσδεσης του ετεροδιμερούς σε σχέση με το ομοδιμερές ) Σημασία των COUP-TFs στους οργανισμούς Ο COUP-TF ορφανός υποδοχέας ή ομόλογα αυτού παρατηρούνται σε πλήθος έμβιων οργανισμών, όπως το zebrafish (svp 40,44,46)[44], το Xenopus (xcoup-tfi και ΙΙ)[38], το ποντικό (mcoup-tfi και ΙΙ)[39], την όρνιθα (ccoup-tfi, II και III)[45], τη Drosophila (svp)[46], το C.elegans (unc-55)[47] και τον άνθρωπο (hcoup- TFI kai II)[48, 49], όπου παίζoυν σημαντικό ρόλο σε διαδικασίες [36] όπως: Νευρογένεση: Από τον αχινό μέχρι και τα ποντίκια, ο COUP-TF παίζει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση του νευρικού συστήματος. Στα ποντίκια, η υπερέκφραση του COUP-TFI προκαλεί την έλλειψη αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου μεταξύ των νευριτών και των κυττάρων του υποστρώματος, ενώ η καταστολή του επηρεάζει την αξονική ανάπτυξη των νευρικών σωμάτων και των γαγγλίων. Υπάρχουν δεδομένα ότι ο COUP-TF I είναι σημαντικός για τη τμηματοποίηση διαφόρων εγκεφαλικών περιοχών, όπως ο διεγκέφαλος και ο οπίσθιος εγκέφαλος, καθώς και για την ανάπτυξη του οφθαλμού, αφού οι COUP-TFs είναι στόχοι του μονοπατιού των ρετινοϊκών οξέων [50]. Οργανογένεση: Τα ρετινοϊκά είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν την έκφραση των Hox γονιδίων, σημαντικά για το καθορισμό του σχεδίου του σώματος και της οστικής μορφογένεσης και ο COUP-TF I θεωρείται ότι ανταγωνίζεται τη δράση του ρετινοϊκού, ερευνήθηκε η επίδραση του στην διαδικασία της δημιουργίας 54

56 οστικού ιστού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε ποντίκια χωρίς κανένα αλληλόμορφο για τον COUP-TFI (null), επηρεάζεται σημαντικά ο σχηματισμός των οστών [51]. Αγγειογένεση: Σε ποντίκια, μελετήθηκε ο ρόλος του COUP-TFII και βρέθηκε ότι είναι εξαιρετικά σημαντικός για την εμβρυογένεση και, πιο συγκεκριμένα, για την αγγειογένεση στο έμβρυο. Ερευνήθηκε ο φαινότυπος των εμβρύων χωρίς COUP-TFII μετά από ζευγάρωμα ετεροζυγωτών με μετάλλαξη στο γονίδιο του COUP-TFII και βρέθηκε ότι ο φαινότυπος Null (COUP-TFII -/-) είναι θνησιγόνος. Από την εμβρυική μέρα 9.5, οι ομοζυγώτες παρουσίασαν εκτεταμένη αιμορραγία σε αιμοφόρα αγγεία του εγκεφάλου και της καρδιάς και μέχρι την εμβρυική μέρα είχαν όλα πεθαίνει [52]. Συμπερασματικά, η εμπλοκή των COUP-TFs στη ρύθμιση τόσο σημαντικών διαδικασιών, καθιστά απαραίτητη την παρουσία τους στους διάφορους οργανισμούς και υποδεικνύει τη σημαντικότητά τους για τη ζωή και την ανάπτυξη των μεταζώων. 2) Σκοπός Σκοπός της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας είναι η ενσωμάτωση του μεταγραφικού παράγοντα PlCoup-TF στο νευρογενές γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο και η διευκρίνιση του ρόλου του στη πρώιμη εμβρυική νευρογένεση του αχινού. Επίσης, επιδιώκεται ο καθορισμός της θέσης στο νευρογενές γονιδιακό δίκτυο των σημαντικών γονιδίων για την εμβρυική νευρογένεση PlSoxC, PlHbn, PlFez, PlSip1 και η διευκρίνιση των πιθανών αλληλεπίδρασεών τους με κύριους παράγοντες της νευρογένεσης όπως ο PlCoup-TF, ο PlSix3, ο PlFoxQ2 και ο PlDelta. 3) Υλικά και μέθοδοι 3.1) Εύρεση cdna αλληλουχιών Ομόλογες αλληλουχίες cdna για τα υπό μελέτη γονίδια για τον αχινό P.lividus βρέθηκαν χρησιμ οποιώντας τη μέθοδο BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Αρχικά, πραγματοποιείται in silico αναζήτηση για τις ήδη δημοσιευμένες αλληλουχίες των συγκεκριμένων γονιδίων στον αχινό S.purpuratus, στη βάση 55

57 δεδομένων EchinoBase ( Έπειτα, οι αλληλουχίες αυτές χρησιμοποιούνται για αναζήτηση των ομόλογων γονιδίων στη βάση δεδομένων του P.lividus, Octopus ( με τη μέθοδο BLAST. 3.2) Σχεδιασμός εκκινητών Χρησιμοποιώντας τις αλληλουχίες γονιδίων που πήραμε από τη βάση δεδομένων Octopus, σχεδιάσαμε τους κατάλληλους εκκινητές με το πρόγραμμα Primer3Plus ( Το πρόγραμμα μάς δίνει την δυνατότητα να τροποποιήσουμε τους παράγοντες και τις παραμέτρους (π.χ Tm, βέλτιστη θερμοκρασία, μέγεθος αλληλουχίας των εκκινητών κ.ά.) που επηρεάζουν την αλληλουχία και λειτουργία των εκκινητών και το πρόγραμμα στο τέλος, μας δίνει διάφορους συνδυασμούς ζευγάρια εκκινητών, διαλέγοντας αυτούς που μας εξυπηρετούν καλύτερα. Για κάθε γονίδιο επιλέχθηκαν τρία ζεύγη εκκινητών, μήκους νουκλεοτιδίων και με βέλτιστη θερμοκρασία λειτουργίας o C. Οι αλληλουχίες των εκκινητών αναγράφονται στο Παράρτημα. 3.3) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής με το PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver2 Με τη μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR), χρησιμοποιούμε ως υπόστρωμα ολικό RNA από το αναπτυξιακό στάδιο, όπου το εκάστοτε γονίδιο ξέρουμε βιβλιογραφικά ότι εκφράζεται περισσότερο. Με τα κατάλληλα ζεύγη εκκινητών που κατασκευάσαμε, μπορούμε να πάρουμε cdna, συμπληρωματικό του RNA, για το κάθε γονίδιο. Επίσης, οι RT-PCR πραγματοποιήθηκαν με διαφορετικές θερμοκρασίες (Gradient) στο στάδιο υβριδοποίησης των εκκινητών (βήμα 4), με σκοπό να επιλεγεί το ζεύγος εκκινητών που λειτουργεί καλύτερα και μας δίνει ειδικότερο νουκλεοτιδικό προϊόν στο τέλος της αντίδρασης. 56

58 Υλικά Ολικό RNA από στάδιο γαστριδίου (C=70 ngr/ul) 1,5 μl Ρυθμιστικό Διάλυμα 2x 12,5 μl Ανοδικός Εκκινητής (10 mm) 1 μl Καθοδικός εκκινητής (10mM) 1 μl Ενζυμικό μείγμα 1 μl dh20 up to 25 μl (8,5 μl) Το πρόγραμμα PCR που ακολουθήθηκε για όλα τα παραπάνω πειράματα ήταν το εξής: Βήμα 1: 30 λεπτά στους 50 ο C Βήμα 2: 2 λεπτά στους 94 o C Βήμα 3: 30 δευτερόλεπτα στους 94 ο C Βήμα 4: 30 δευτερόλεπτα στους ο C (Μετά τη Gradient, επιλέγεται μία θερμοκρασία για τη βέλτιστη λειτουργία του συγκεκριμένου ζεύγος εκκινητών) Βήμα 5: 2 λεπτά στους 72 ο C Βήμα 6: πήγαινε στο βήμα 3 x 34 φορές Βήμα 7: 3 λεπτά στους 72 ο C Βήμα 8: Τέλος 57

59 3.4) Ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5 % Η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων των RT-PCR γίνεται με σκοπό να δούμε, υπό μορφή ζωνών σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5 % διαλυμένο σε TAE 1x, εάν πήραμε την επιθυμητή ζώνη προϊόν, δηλαδή το cdna του εκάστοτε γονιδίου που μελετάμε. Το cdna αναλύεται στο πήκτωμα, λόγω του αρνητικού του φορτίου από τις πλευρικές αλυσίδες των αζωτούχων βάσεων, από τον (-) πόλο της συσκευής ηλεκτροφόρησης προς τον θετικό (+). Λόγω του διαφορετικού βάρους και μεγέθους των προϊόντων της αντίδρασης, αυτά αναλύονται με διαφορετική ταχύτητα μέσα από τους πόρους του πηκτώματος, άρα σταματάνε σε διαφορετικά σημεία κατά μήκος του πηκτώματος, κάτι που εξηγεί και τις διαφορετικές ζώνες (πιο κοντά στον θετικό πόλο οι μικρού μήκους και ΜΒ νουκλεοτιδικές αλυσίδες και πιο κοντά στον αρνητικό πόλο οι μεγαλύτερου μήκους και ΜΒ αλυσίδες). Εμείς, ξέροντας το αναμενόμενο μήκος του DNA του γονιδίου που μελετάμε, με τη χρήση ενός μάρτυρα ζωνών (χρησιμοποιήσαμε τον μάρτυρα 1 Κb της New England Biolabs) μπορούμε να συγκρίνουμε και να δούμε αν πήραμε το επιθυμητό προϊόν ή όχι. Εικόνα 43: Μία συσκευή ηλεκτροφόρησης με τα βασικά γνωρίσματά της Από το stock 50 Χ ΤΑΕ, αραιώνουμε σε dh20 για να φτιάξουμε ΤΑΕ 1Χ, το οποίο θα χρησιμοποιηθεί τόσο ως buffer για την συσκευή ηλεκτροφόρησης, όσο και για διαλύτη μέσα στον οποίο θα προστεθεί η σκόνη αγαρόζης και θα βραστεί μέχρι να διαλυθεί πλήρως. Έπειτα, προσθέτουμε 2-3 μl βρωμιούχο αιθίδιο (ΕtBr) μέσα στο υγρό ακόμα gel, το οποίο μας βοηθάει να δούμε τις ζώνες στο gel, καθώς όταν εκτεθεί σε UV, φθορίζει με πορτοκαλί χρώμα. Tα δείγματα DNA και ο μάρτυρας προστίθενται στα 58

60 πηγαδάκια του gel, μαζί με dh2o και χρωστική φόρτωσης, η οποία βοηθάει τόσο στο να βλέπουμε πώς προχωράνε τα δείγματα κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης, με σκοπό να υπολογίζουμε πότε πρέπει να σταματήσουμε την ηλεκτροφότηση, όσο και να βοηθά τα δείγματα να βυθιστούν στα πηγαδάκια, χωρίς κίνδυνο να διαχυθούν στα διπλανά πηγαδάκια ή έξω από αυτά. H ηλεκτροφόρηση γίνεται στα 90 μv για λεπτά. 3.5) Καθαρισμός προϊόντων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμερισμού με πρωτόκολλο QIAGEN Τα DNA των γονιδίων που πάρθηκαν από τις RT PCR, καθαρίστηκαν από προσμίξεις και πρωτεΐνες, πέρα των ιστονών, ακολουθώντας το προτόκολλο PCR- Clean up της QIAGEN. Στις κολώνες QIAquick, προστέθηκαν τα DNA συν RB buffer ίσο με πέντε φορές τον όγκο του DNA και στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε φυγοκέντριση στα rpm για δευτερόλεπτα για πρόσδεση του DNA στη κολώνα. Έπειτα, προστέθηκαν 750 μl PE Buffer με αιθανόλη και πραγματοποιήθηκε φυγοκέντριση στα rpm για δευτερόλεπτα με σκοπό το ξέπλυμα της στήλης. Ακολούθησε ξηρή φυγοκέντιση στα rpm για άλλα δευτερόλεπτα για απομάκρυνση καταλύπων. Τέλος, για την απομόνωση του DNA από τη κολώνα, προστέθηκαν 50 μl Elution Buffer, επώαση για 1-2 λεπτά και φυγοκέντριση στα rpm για 60 δευτερόλεπτα. Για το προσδιορισμό των συγκεντρώσεων των απομονωμένων τμημάτων DNA, πραγματοποιήθηκε φωτομέτριση σε Nanodrop, χρησιμοποιώντας για τυφλό το Elution Buffer του πρωτοκόλλου. 59

61 3.6) Κλωνοποίηση προϊόντων PCR σε φορείς pgem-t easy Αντίδραση Λιγάσης Χρησιμοποιώντας τον πλασμιδιακό φορέα pgem-t easy σε αναλογία με τα DNAs που πήραμε από τις PCR 1 προς 3, μπορέσαμε να κατασκευάσουμε ανασυνδυασμένα πλασμίδια με τα γονίδια που επιθυμούμε, με σκοπό να τα κλωνοποιήσουμε σε βακτηριακές καλλιέργειες. Για την αντίδραση λιγάσης, δεν απαιτείται να πέψουμε με ένζυμα περιορισμού για να έχουν κοινά άκρα τα πλασμίδια με τα DNAs με σκοπό να ενωθούν, καθώς τα προϊόντα της RT-PCR έχουν στα άκρα τους από μία βάση αδενίνης (Α), και υβριδοποιούνται λόγω συμπληρωματικότητας με το πλασμίδιο, αφού αυτό φέρει μία βάση θυμίνης (T) στο κάθε άκρο του (εικόνα 44). Η ποσότητα του DNA που προσθέτουμε για κάθε αντίδραση λιγάσης υπολογίζεται με το τύπο (ngr του φορέα Χ το μέγεθος σε kb του ενθέματος Χ 3) / το μέγεθος σε kb του φορέα που αναγράφεται στο πρωτόκολλο του kit της Promega. Υλικά 2Χ Ρυθμιστικό Διάλυμα, T4 DNA Λιγάση 5 μl pgem-t easy φορέας (50 ngr) 1 μl PCR Προϊόν Χ μl Τ4 DNA Λιγάση (3U/ μl) 1 μl dh2o up to 10 μl Αφήνουμε την αντίδραση όλη την νύχτα σε υδατόλουτρο στους 16 ο C 60

62 Εικόνα 44: Αντίδραση λιγάσης Κλωνοποίηση DNA ενθέματος μέσα σε πλασμίδιο 3.7) Παρασκευή βακτηριακών δεκτικών κυττάρων DH10b με χλωριούχο ρουβίδιο (RbCl 2 ) Όλοι οι χειρισμοί γίνονται υπό άσηπτες συνθήκες και όλα τα υλικά είναι αποστειρωμένα. Οι συνταγές για όλα τα διαλύματα βρίσκονται στο Παράρτημα. Πορεία Από απόθεμα βακτηριακού στελέχου E.coli σε γλυκερόλη (-70 ο C) με αποστειρωμένο μικροβιολογικό κρίκο, μεταφέρουμε ποσότητα κυττάρων σε τρυβλίο με θρεπτικό SOB και άγαρ και απλώνουμε έτσι ώστε να μεγαλώσουν μοναδικές αποικίες. Μετά από επώαση ολονυκτίς στους 37 ο C, διαλέγουμε μία μοναδική αποικία, την οποία μεταφέρουμε σε 5 ml θρεπτικού Psi που περιέχεται σε σωληνάριο τύπου falcon των 50 ml. Ακολουθεί ολονύκτια επώαση στους 37 ο C υπό ανάδευση. Την επόμενη μέρα, εμβολιάζουμε με 1 ml από την υγρή καλλιέργεια, 100 ml θερμασμένου υγρού θρεπτικού Psi σε κωνική φιάλη των 250 ml (1% v/v) και επωάζουμε στους 37 ο C υπό ανάδευση. Μετά από μία ώρα και ανά τακτά χρονικά διαστήματα, ελέγχουμε την πρόοδο της καλλιέργειας φωτομετρώντας την οπτική απορρόφηση (OD) στα 550 nm. Όταν η OD550 = 0,48 (λογαρυθμική φάση της ανάπτυξης), σταματάμε την καλλιέργεια, τοποθετώντας την στο πάγο για 15 λεπτά (από δω και πέρα, πάντα τα κύτταρα στο πάγο). Μοιράζουμε την καλλιέργεια σε δύο παγωμένα σωληνάρια τύπου Falcon των 50 ml και πραγματοποιείται φυγοκέντριση σε ψυχώμενη φυγόκεντρο στους 4 ο C στις 1000 στροφές ανά λεπτό (rpm) για 15 λεπτά. Τοποθετούμε τα σωληνάρια στο πάγο, απομακρύνουμε υπερκείμενο υγρό και προσθέτουμε 20 ml παγωμένου TfbI. Επαναιωρούμε ήπια τα κύτταρα και τα αφήνουμε 15 λεπτά στο πάγο. Πραγματοποείται δεύτερη φυγοκέντριση σε ψυχώμενη φυγόκεντρο στους 4 ο C στις 1000 στροφές ανά λεπτό (rpm) για 15 λεπτά. Τοποθετούμε τα σωληνάρια στο πάγο, απομακρύνουμε υπερκείμενο υγρό και προσθέτουμε 2 ml παγωμένου TfbIΙ. Επαναιωρούμε ήπια τα κύτταρα και τα αφήνουμε 15 λεπτά στο πάγο. 61

63 Διατηρώντας τα σωληνάρια στο πάγο και κάτω από άσηπτες συνθήκες, μοιράζουμε γρήγορα τα κύτταρα σε κλάσματα των 50 μl σε παγωμένα σωληνάρια τύπου Eppendorf των 1,5 ml. Όταν μεταφερθεί το κλάσμα στο σωληνάριο, αυτό παγώνεται ακαριαία σε υγρό άζωτο και όλα τα κλάσματα μεταφέρονται στους -80 ο C. 3.8) Χημικός μετασχηματισμός βακτηριακών κυττάρων Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια με τα υπό μελέτη ενθέματα, εισέρχονται σε δεκτικά κύτταρα βακτηρίων (DH10b), που μεγαλώνουν σε τρυβλία Petri, που περιέχουν θρεπτικό LB και αντιβιοτικό Amp 1/1000, και δίνουν αποικίες, που θα απομονωθούν και θα χρησιμοποιηθούν για να μας δώσουν το υπόστρωμα γονίδιο, πάνω στο οποίο θα κάνουμε τα επόμενα πειράματα. Περίπου 2-3 ώρες πριν εμβολιάσουμε τα βακτήρια στα Petri, επιστρώνουμε το καθένα, με τη βοήθεια υάλινης λυγισμένης βελόνας Pasteur και κοντά σε φλόγα, με 40 μl Χ-gal (20 mgr/ml) και 4 μl IPTG (200 mgr/ml) και τα μεταφέρουμε στον επωαστικό (37 ο C). Στη συνέχεια, από τους -80 ο C, μεταφέρουμε τα δεκτικά κύτταρα στο πάγο και αφήνονται να ξεπαγώσουν. Χρησιμοποιώντας ένα κλάσμα δεκτικών για κάθε αντίδραση λιγάσης, προσθέτουμε 4 μl από την αντίδραση λιγάσης (ο όγκος της αντίδρασης λιγάσης δεν πρέπει να ξεπερνά το 1/10 του όγκου των δεκτικών βακτηρίων) και τα επωάζουμε για 40 λεπτά στο πάγο. Μετά τα 40 λεπτά, προκαλούμε θερμικό σοκ (heat shock) στα δεκτικά κύτταρα, μεταφέροντάς τα σε υδατόλουτρο στους 42 ο C για 90 δευτερόλεπτα και αμέσως μετά στον πάγο για 2-3 λεπτά. Μεταφέρουμε το σύνολο των δεκτικών κυττάρων σε σωληνάρια καλλιέργειας των 5ml με καπάκι που περιέχουν 1 ml θρεπτικό LB και τα επωάζουμε για μιάμιση ώρα με δύο ώρες σε υδατόλουτρο στους 37 ο C, αναδεύοντάς τα ήπια κάθε 15 λεπτά. Όταν περάσει ο απαιτούμενος χρόνος, επιστρώνουμε τα τρυβλία Petri που είχαμε ετοιμάσει με τα δεκτικά, με τη βοήθεια λυγισμένης υάλινης βελόνας τύπου Pasteur και κοντά σε φλόγα. Χρησιμοποιούμε 2 τρυβλία Petri για κάθε μετασχηματισμό, όπου στο ένα απλώνουμε 50 μl και στο άλλο 200 μl δεκτικών κυττάρων. Τέλος, τοποθετούμε τα τρυβλία στον επωαστικό θάλαμο, όλη τη νύχτα στους 37 ο C για να αναπτυχθούν μοναδικές αποικίες. 62

64 3.9) Επιλογή ανασυνδυασμένων αποικιών (Blue-White Screening), μεταφορά αποικιών (streaking) και υγρές καλλιέργειες Σε νέα Petri που έχουν θρεπτικό LB και Amp, τα χωρίζουμε σε ανάλογα τμήματα και τα αριθμούμε (π.χ. 1-8 αν επιλέξαμε 8 αποικίες). Από τα τρυβλία που επωάστηκαν όλο το βράδυ για σχηματισμό αποικιών, παρατηρούμε πόσες άσπρες αποικίες έχουμε. Επιλέγουμε τις άσπρες αποικίες, γιατί αυτές δεν εκφράζουν το γονίδιο b-gal, λόγω του ότι το επιθυμητό ένθεμα εισάγεται στο πολυσυνδέτη LacZ. Το X-gal (άχρωμο συνθετικό ανάλογο της λακτόζης) που έχει προστεθεί στα τρυβλία, κάνει το χρώμα των αποικίων με τα πλασμίδια που δεν έχουν λάβει ένθεμα μπλε, αφού εκφράζουν το γονίδιο αναφορά b-gal, παράγουν το ένζυμο β-γαλακτοζιδάση που διασπά το X-gal, δίνοντας ως προϊόν μία χημική ένωση με έντονο μπλε χρώμα. Χρησιμοποιώντας αποστειρωμένους βακτηριακούς κρίκους μίας χρήσης, μεταφέρουμε μοναδικές άσπρες αποικίες από το ένα τρυβλίο στο άλλο και τις απλώνουμε στο εκάστοτε αριθμημένο κομμάτι ( ένα από τα οκτώ στο κάθε τρυβλίο Petri) με streaking (εικόνα 45), κοντά σε φλόγα. Εικόνα 45: Μεταφορά άσπρων αποικιών - steaking Ταυτόχρονα, σε άσηπτες συνθήκες, ετοιμάζουμε υγρές καλλιέργειες για κάθε αποικία σε σωληνάρια τύπου falcon των 50 ml που περιέχουν 3 ml θρεπτικού και 3 μl Amp. Τον κρίκο που χρησιμοποιούσαμε κάθε φορά για να μεταφέρουμε την κάθε μοναδική, αριθμημένη αποικία στα νέα τρυβλία, τον εμβαπτίζουμε σε συγκεκριμένο, αντίστοιχα αριθμημένο σωληνάριο, κοντά σε φλόγα. Συνολικά, έχουμε για κάθε υπό μελέτη μοναδική αποικία και μία υγρή καλλιέργεια. Τέλος, μεταφέρουμε τις υγρές καλλιέργειες στον αναδευτήρα στους 37 ο C και τα νέα τρυβλία στον επωαστικό στους 37 ο C για ολονύκτια επώαση. 63

65 3.10) Απομόνωση πλασμιδιακού DNA (Mini Preps) με το πρωτόκολλο Machery-Nagel NucleoSpin Plasmid Από τις υγρές καλλιέργειες που επωάσαμε, και εφόσον έχουν αναπτυχθεί βακτήρια σε αυτές (φαίνεται από τη θολερότητα), προχωράμε σε απομόνωση μικρής κλίμακας των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων, ακολουθώντας το πρωτόκολλο Machery-Nagel NucleoSpin Plasmid για απομόνωση high copy plasmid DNA : Απομόνωση των βακτηριακών κυττάρων: Χρησιμοποιούμε 3ml από κάθε υγρή καλλιέργεια και τα μεταφέρουμε σε σωληνάρια τύπου Εppendorf των 1,5 ml, αριθμημένα κατάλληλα και φυγοκεντρούμε για 30 δευτερόλεπτα στα x g. Έπειτα, απομακρύνουμε όσο περισσότερο υπερκείμενο γίνεται. Λύση των βακτηριακών κυττάρων: Προσθέτουμε 250 μl Ρυθμιστικού Διαλύματος A1 και επαναιωρούμε τα κύτταρα με πιπέτα ή vortex, προσέχοντας να μην υπάρχουν μάζες κυττάρων (cell clumps) μετά την επαναιώρηση. Προσθέτουμε 250 μl Ρυθμιστικού Διαλύματος A2 (λύει τα κύτταρα) και αναδεύουμε ελαφρά, αναστρέφοντας τα σωληνάκια 6-8 φορές. Δεν χρησιμοποιούμε vortex, γιατί μπορεί να τεμαχιστεί το γενομικό DNA και δεν αφήνουμε τα δείγματα με το A2 πάνω από 5 λεπτά. Τέλος, προσθέτουμε 300 μl από το Ρυθμιστικό Διάλυμα A3, που απενεργοποιεί το Α2, ανακατεύοντας πάλι όπως πριν. Διευκρίνιση του λύματος: Φυγοκεντρούμε τα δείγματα για 10 λεπτά στα x g, για να κατακριμνήσουμε πρωτεΐνες, γονιδιωματικό DNA και κυτταρικά υπολείμματα. Δέσιμο του πλασμιδιακού DNA: Μεταφέρουμε 750 μl από την υπερκείμενη φάση σε μία κολώνα χρωματογραφίας NucleoSpin Plasmid/Plasmid (NoLid) Column και φυγοκεντρούμε για 1 λεπτό στα x g. Απομακρύνουμε το υγρό που πέρασε μέσα από την κολώνα. Στέγνωμα της μεμβράνης της στήλης: Φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα x g και απομάκρυνση του υγρού που πέρασε μέσα από τη κολώνα. Συλλογή του πλασμιδιακού DNA: Μεταφέρουμε την κολώνα μέσα σε σωληνάριο τύπου Εppendorf και προσθέτουμε στην κολώνα 50 μl Ρυθμιστικού Διαλύματος AE (διάλυμα που προκαλεί την αποδέσμευση του πλασμιδιακού 64

66 DNA από την κολώνα) και αφήνουμε για επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό. Φυγοκεντρούμε για 1 λεπτό στα x g και το δείγμα που συλλέγεται μέσα στο σωληνάριο είναι το ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό DNA με το ένθεμα που επιθυμούμε. Στη συνέχεια, φωτομετρούμε τα δείγματα σε φασματοφωτομετρητή μικρών ποσοτήτων (Νanodrop) για να προσδιοριστούν οι συγκεντρώσεις και οι καθαρότητα των δειγμάτων. 3.11) Πέψεις ελέγχου πλασμιδίων και αλληλούχιση Τα πλασμιδιακά DNA με τα ενθέματα που απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν από τις βακτηριακές καλλιέργειες, για να βεβαιωθούμε ότι περιέχουν τα γονίδια που επιθυμούμε, υπέστησαν πέψη με το ένζυμο περιορισμού EcoRI, καθώς το πλασμίδιο pgem-t Easy περιέχει θέσεις περιορισμού για την EcoRI που περικλείουν το ένθεμα. Για να βρεθεί και η φορά με την οποία αυτά ενσωματώθηκαν, πέψαμε με κατάλληλα ένζυμα περιορισμού. Η επιλογή των συγκεκριμένων για κάθε ένθεμα ενζύμων περιορισμού έγινε με το κριτήριο ότι υπάρχει μόνο μία θέση περιορισμού για κάθε ένζυμο, εσωτερικά του ενθέματος και άλλη μία θέση περιορισμού στον πολυσυνδέτη του πλασμιδιακού φορέα pgem-t Εasy. Επομένως, ανάλογα με το που θα πέψουν, θα δούμε χαρακτηριστικές ζώνες με διαφορετικά μήκη βάσεων στο πήκτωμα ηλεκτροφόρησης. Έτσι, θα καταλάβουμε αν στο πλασμίδιο είχε ενσωματωθεί το DNA με το 3 άκρο του είτε κοντά στην αλληλουχία του υποκινητή της Τ7 RNA πολυμεράσης, είτε κοντά στον υποκινητή της Sp6 RNA πολυμεράσης. Με αυτό τον τρόπο, θα μπορέσουμε να επιλέξουμε την κατάλληλη RNA πολυμεράση για τη κατασκευή αντινοηματικών RNA ιχνηθετών με την διαδικασία της in vitro μεταγραφής. Η ποσότητα πλασμιδιακού DNA που προσθέσαμε από το κάθε δείγμα για την αντίδραση είναι ίση με 5 μl. Υλικά DNA 5 μl 65

67 Ρυθμιστικό Διάλυμα 10x 1 μl Ένζυμο Περιορισμού 0,5 μl dh2o μέχρι 10 μl για την κάθε αντίδραση Τα προϊόντα των πέψεων ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% με ΤΑΕ 1Χ. Τα επιλεγμένα ανασυνδυασμένα πλασμίδια με βάση τα αποτελέσματα των πέψεων περιορισμού, στάλθηκαν για αλληλούχιση στην Vbc Biotechnologies για να βεβαιωθούμε ότι περιέχουν τα κατάλληλα ενθέματα. 3.12) Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης με M13 εκκινητές Ο πλασμιδιακός φορέας pgem-t Εasy έχει κάποιες χαρακτηριστικές αλληλουχίες που μας επιτρέπουν να πολλαπλασιάσουμε και να απομονώσουμε από το πλασμίδιο το υπόστρωμα DNA, πάνω στο οποίο θα πραγματοποιήσουμε in vitro μεταγραφή για την κατασκευή RNA ιχνηθετών (probes). Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) γίνεται με εκκινητές του M13 φάγου, που η περιοχή πρόσδεσής τους βρίσκεται εκτός της αλληλουχίας του ενθέματος (Μ13 ανοδική αλληλουχία δέσμευσης = bp, M13 καθοδική αλληλουχία δέσμευσης= bp). Υλικά DNA (1ngr/μl) 1 μl M13 ανοδικός εκκινητής (0,3 mm) 0,5 μl από 15 μμ Stock M13 καθοδικός εκκινητής (0,3 mm) 0,5 μl από 15 μμ Stock Ρυθμιστικό Διάλυμα 1x 2,5 μl από 10x Stock dntps (200 μm) 0,5 μl από 10 mm Stock Taq πολυμεράση (5U/ μl) 0,3 μl 66

68 Mg 2+ (2,5 mm) 1 μl από 25 mm Stock dh2o μέχρι 25 μl τελικός όγκος κάθε αντίδρασης Το πρόγραμμα PCR που ακολουθήθηκε για όλα τα παραπάνω πειράματα ήταν το εξής: Βήμα 1: 30 λεπτά στους 50 ο C Βήμα 2: 2 λεπτά στους 94 o C Βήμα 3: 30 δευτερόλεπτα στους 94 ο C Βήμα 4: 30 δευτερόλεπτα στους 58 ο C Βήμα 5: 2 λεπτά στους 72 ο C Βήμα 6: πήγαινε στο βήμα 3 x 29 φορές Βήμα 7: 3 λεπτά στους 72 ο C Βήμα 8: Τέλος Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5 % με ΤΑΕ 1x, καθαρισμός των δειγμάτων και φωτομέτρηση για έυρεση των συγκεντρώσεων και της καθαρότητας των προϊόντων σε nanodrop. 3.13) Δημιουργία stock βακτηρίων σε cryovials Από την αποικία που περιέχει το αλληλουχημένο πλασμίδιο με το ένθεμα DNA που επιθυμούμε, πραγματοποιούμε ανακαλλιέργεια σε τρυβλίο Petri με θρεπτικό και Amp και απλώνουμε με streaking. Επωάζουμε τα τρυβλία όλη τη νύχτα στους 37 ο C. Tην επόμενη μέρα, σε σωληνάριο τύπου falcon με 3ml θρεπτικού LB και Amp, μεταφέρουμε με αποστειρωμένο κρίκο μίας χρήσης, μοναδική αποικία και φτιάχνουμε υγρή καλλιέργεια που αφήνουμε ολονυκτίς στον αναδευτήρα για επώαση στους 37 ο C. 67

69 Εικόνα 46: Μέθοδος streaking για ανάπτυξη μοναδικών αποικιών Μετά από μία μέρα, σε σωληνάριο cryovial των 2 ml μεταφέρουμε 250 μl από την υγρή καλλιέργεια και 750 μl γλυκερόλης 50% και το αποθηκεύουμε για μελλοντική χρήση (stock) στους -80 ο C. 3.14) In vitro μεταγραφή Με υποστρώματα τα προϊόντα της PCR με Μ13 εκκινητές, ακολούθησε in vitro μεταγραφή με σκοπό την παρασκευή αντινοηματικών RNA ιχνηθετών, ειδικών για κάθε υπό μελέτη γονίδιο, που θα χρησιμοποιηθούν για τις in situ υβριδοποιήσεις. Ο υποκινητής της RNA πολυμεράσης που θα χρησιμοποιήσουμε στην αντίδραση είναι είτε ο Τ7 ( bp), είτε ο SP6 ( bp), αναλόγως τη φορά με την οποία έχει ενσωματωθεί το ένθεμα. Η φορά προσδιορίστηκε με τις πέψεις ελέγχου και την αλληλούχιση για το κάθε DNA. Οι ιχνηθέτες, εκτός από κανονικά νουκλεοτίδια, περιέχουν και σημασμένα UTPs με το φυτικό προϊόν διγοξιγενίνη (dig-utps) που μπορούν να ανιχνευτούν από ειδικό αντίσωμα αντί της διγοξιγενίνης (anti-dig) κατά την in situ υβριδοποίηση. H διγοξιγενίνη επιλέγεται ως μέσο ιχνηθέτησης του RNA λόγω του ότι αποτελεί φυτικό προΐόν, άρα αποφεύγεται έτσι η περίπτωση μη ειδικής σύνδεσης του αντισώματος με άλλον επίτοπο. Επίσης, χρησιμοποιούμε αναστολείς RNAασών που αποτρέπουν τις RNAασες από το να καταστρέψουν τους ιχνηθέτες μας και όλη η διαδικασία γίνεται σε συνθήκες και υλικά καθαρά από RNAασες. 68

70 Υλικά DNA (1 μgr/ 20 μl) Χ μl Μείγμα νουκλεοτιδίων (10x) 2 μl 10 mm GTPs 4 μl από 100 mm stock 10 mm CTPs 4 μl από 100 mm stock 10 mm ATPs 4 μl από 100 mm stock 6,5 mm UTPs 2,6 μl από 100 mm stock Ρυθμιστικό Διάλυμα 10x 2 μl RNA πολυμεράση 2 μl Dig UTPs (10x) 2 μl Αναστολέας RNAασών 0,5 μl Ελεύθερο από νουκλεάσες H2O μέχρι 25 μl τελικός όγκος αντίδρασης Βάζουμε τις αντιδράσεις για 2-3 ώρες στους 37 ο C και μετά προσθέτουμε 2 μl DNAάση (καταστρέφει τα υπολείμματα DNA) και αφήνουμε τα δείγματα για 20 λεπτά στους 37 ο C. Έπειτα, μεταφέρουμε τις αντιδράσεις σε υδατόλουτρο ρυθμισμένο στους 75 ο C για 3 λεπτά για απενεργοποίηση της DNAάσης και τέλος, μεταφέρουμε το RNA σε πάγο μέχρι καθαρισμού του με κολώνες Sephadex με μέγεθος κόκκων G-50. Οι κολώνες φυγοκεντρούνται κενές για 1 λεπτό στα 1000 g για απομάκρυνση περίσσειας εγκλωβισμένου στους κόκκους νερού. Προσθέτουμε τα RNA στις κολώνες Sephadex και φυγοκεντρούμε για 2 λεπτά στα 1000g. Έπειτα, παίρνουμε το έκλουσμα - RNA ιχνηθέτη, και το φωτομετρούμε στο nanodrop για προσδιορισμό της συγκέντρωσης και της καθαρότητας του RNA. 69

71 3.15) Whole mount in situ υβριδοποίηση (WMISH) με RNA ιχνηθέτες σε κανονικά έμβρυα P.lividus Με τη χρήση των ιχνηθετών που κατασκευάστηκαν από την in vitro μεταγραφή, πραγματοποιήσαμε in situ υβριδοποίησεις σε έμβρυα αχινού P.lividus διαφόρων εμβρυικών, αναπτυξιακών σταδίων (αυγό, 16 κυττάρων, όψιμο/μεσεγχυματικό βλαστίδιο, όψιμο γαστρίδιο, πρίσμα και πλουτέας) απομονωμένων από εργαστηριακές καλλιέργειες, καθώς και σε ενεμένα με συνθετικά αντινοηματικά morpholinos για τα γονίδια PlCoup-tf, PlSix3, PlFoxQ2 και PlDelta. Η μέθοδος της υβριδοποίησης σε ολόκληρα έμβρυα (whole mount) βασίζεται στη χρήση ιχνηθετημένων με dig-utps αντινοηματικών ιχνηθετών RNA, ειδικών για τον εντοπισμό, την αναγνώριση και την υβριδοποίηση λόγω συμπληρωματικότητας με συγκεκριμένα mrna μόρια, παραγόμενα στο τόπο τους (in situ) από τα υπό μελέτη γονίδια. Με αυτό τον τρόπο, μπορούμε να παρατηρήσουμε τα μοτίβα έκφρασης, λειτουργίας και οργάνωσης διαφόρων γονιδίων, καθώς με τη χρήση αντισώματος ειδικού για τα dig-utps (antidig) και μορίων χρωστικής, εντοπίζουμε τη θέση υβριδοποίησης των RNA ιχνηθετών με τα επιθυμητά mrnas, κατανοώντας την συμβολή του εκάστοτε γονιδίου, βλέποντας την έκφραση ή την απουσία έκφρασης του σε συγκεκριμένα κύτταρα του εμβρύου με χρονοιστοειδικό πρότυπο. Πρωτόκολλο WMISH του Minokawa 1. Μεταφορά μονημοποιημένων σε μεθανόλη εμβρύων διαφορετικών σταδίων σε σωληνάρια τύπου eppendorf (200 μl για κάθε σωληνάκι) των 1,5 ml και πλύση τους 3 φορές με 200 μl Διάλυμα MOPS σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για απομάκρυνση της μεθανόλης. Μία πλύση θεωρείται η προσθήκη και απομάκρυνση του εκάστοτε διαλύματος που χρησιμοποιούμε. Περιμένουμε 2-3 λεπτά για καθίζηση των εμβρύων και απομάκρυνση της υπερκείμενης μεθανόλης με χρήση πιπέτας και καθαρά από RNAάσες τιπάκια πιπετών. Αφαιρούμε όσο περισσότερο όγκο υπερκείμενου μπορούμε, χωρίς να χάνουμε έμβρυα και χωρίς να τα αφήνουμε τελείως στεγνά. Τα έμβρυα βρίσκονται σε τελικό όγκο διαλύματος MOPS = 200 μl 2. Προ-υβριδοποίηση: Αφαιρούμε όσο το δυνατόν περισσότερο όγκο από το διάλυμα MOPS επιτρέπεται από τα σωληνάκια και προσθέτουμε 200 μl 70

72 διάλυμα υβριδοποίησης (Hybe), προθερμανσμένο για 15 λεπτά στους 50 ο C. Τοποθετούμε τα δείγματα για 3 ώρες στους 50 ο C. Στη μιάμιση ώρα, πραγματοποιούμε αλλαγή στο Hybe. 3. Υβριδοποίηση: Για κάθε RNA ιχνηθέτη, χρησιμοποιούμε 6 σωληνάρια τύπου eppendorf, που το κάθε ένα περιέχει μονιμοποιημένα έμβρυα από προαναφερθέντα, διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια. Στη συνέχεια, αφαιρούμε όσο το δυνατόν περισσότερο Hybe γίνεται και προσθέτουμε σε κάθε σωληνάριο 100 μl του κατάλληλου, αραιωμένου σε Hybe, RNA ιχνηθέτη (οι ιχνηθέτες αραιώνονται σε τελική συγκέντρωση 0,1-0,5 ngr/μl). Υβριδοποίηση για 5-7 ημέρες στους 50 ο C. 4. Μετα-υβριδοποίηση: Έπειτα από 5-7 ημέρες, αφαιρούμε όσο το δυνατόν περισσότερο Hybe με RNA ιχνηθέτες μπορούμε και πλένουμε 5 φορές τα έμβρυα με 200 μl διαλύματος MOPS. Έπειτα, αφαιρούμε το διάλυμα MOPS και προσθέτουμε 200 μl διαλύματος μεταυβριδοποίησης (Post-Hybe) και μεταφέρουμε τα δείγματα στους 50 ο C για 3 ώρες, κάνοντας αλλαγές στο Post Hybe κάθε 1 ώρα. Τέλος, αφαιρούμε το Post Hybe και πραγματοποιούμε 3 πλύσεις με 200 μl διαλύματος MOPS τη φορά. 5. Μπλοκάρισμα: Αφαιρούμε όσο το δυνατόν περισσότερο διάλυμα MOPS μπορούμε και προσθέτουμε 200 μl διαλύματος παρεμπόδισης (Blocking) σε κάθε δείγμα και επωάζουμε για 1 ώρα σε RT. 6. Επώαση: Βγάζουμε από τα δείγματα το διάλυμα παρεμπόδισης και προσθέτουμε 1:1500 Anti-dig αραιωμένο σε διάλυμα παρεμπόδισης σε κάθε σωληνάριο με έμβρυα με σκοπό το αντίσωμα να ενωθεί με τους RNA ιχνηθέτες που είναι ιχνηθετημένοι με dig-utps. Επωάζουμε στο ψυγείο στους 4 ο C όλο το βράδυ. 7. Την επόμενη μέρα, αφαιρούμε όσο το δυνατόν περισσότερο από το αραιωμένο αντίσωμα και κάνουμε 5 πλύσεις με 200 μl διάλυμα MOPS, αφήνοντας 15 λεπτά ανάμεσα σε κάθε πλύση για καλή απομάκρυνση του αντισώματος, το οποίο μπορεί να αντιδράσει με την χρωστική στα επόμενα βήματα και να μας οδηγήσει σε λάθος παρατηρήσεις και αποτελέσματα (background false positive signal). 71

73 8. Απομακρύνουμε το Διάλυμα MOPS και πραγματοποιούμε 2 πλύσεις με 200 μl διάλυμα AP (ενεργοποιεί τη αλκαλική φωσφατάση του αντισώματος) και μετά άλλες 2 πλύσεις με 200 μl διαλύματος AP/ Levamisol/ Tween (απενεργοποιεί τις ενδογενείς φωσφατάσες του δείγματος). 9. Μετά την απομάκρυνση του διαλύματος, προσθέτουμε 200 μl διαλύματος χρώσης και περιμένουμε όσο χρειαστεί για να βάψουν ικανοποιητικά τα έμβρυα. Τοποθετούμε τα δείγματα σε σκοτεινό χώρο κατά τη χρώση και προσέχουμε να μην βάψουν για πάρα πολύ ώρα, καθώς τότε η χρώση δεν θα είναι ιστοειδική και αντιπροσωπευτική του μοτίβου έκφρασης του εκάστοτε υπό μελέτη γονιδίου. 10. Για να σταματήσουμε τη χρώση, πραγματοποιούμε 3 πλύσεις με 200 μl TBST/ EDTA και έπειτα, άλλες 2 πλύσεις με TBST. 11. Η παρατήρηση των εμβρύων γίνεται σε οπτικό μικροσκόπιο και τοποθετούμε 10 μl εμβρύων μαζί με 75% γλυκερόλη σε αντικειμενοφόρο πλάκα. 3.16) Φθορίζουσα in situ υβριδοποίηση (FISH) με RNA ιχνηθέτες σε έμβρυα P.lividus μέσω τεχνολογίας TSA της Perkin Elmer Corporation Σε περιπτώσεις όπου επιθυμούμε να παρατηρήσουμε την έκφραση ενός γονιδίου σε κυτταροπλασματικό και πυρηνικό επίπεδο, η in situ υβριδοποίηση με αλκαλική φωσφατάση δεν μπορεί να μας δώσει την επιθυμητή ανάλυση αποτελεσμάτων, καθώς με αυτήν μπορούμε να παρατηρήσουμε ικανοποιητικά το πρότυπο έκφρασης ενός γονιδίου σε επίπεδο ιστού. Επίσης, σε περίπτωση που επιθυμούμε να αναλύσουμε την ύπαρξη συνεντοπισμού 2 ή περισσότερων γονιδίων, η WMISH δεν αποτελεί ικανοποιητική τεχνική για να απαντήσει τέτοιου είδους ερωτήματα. Η φθορίζουσα in situ υβριδοποίηση (FISH) είναι ενός είδους υβριδοποίηση που δεν βασίζεται σε ενζυμικές, χρωμοφόρες αντιδράσεις, αλλά δίνει σήμα με τη μορφή φθορισμού. Η συγκεκριμένη παραλλαγή της in situ υβριδοποίησης βασίζεται στη τεχνολογία TSA (Tyramide Signal Amplification) της εταιρίας Perkin Elmer. Αρχικά, η παρασκευή RNA ιχνηθετών γίνεται με τον τρόπο του αναλύθηκε στη παράγραφο 72

74 3.13, αλλά η σήμανση εκτός από τη χρήση διγοξιγενίνης, γίνεται και με τη χρήση της 2-4 δινιτροφαινόλης (DNP), όπου εισάγεται μη ενζυμικά και πλευρικά στην αλυσίδα του μη σημανσμένου RNA που θα χρησιμοποιήσουμε ως ιχνηθέτη, με τη χρήση του Label IT Nucleid Acid kit της Mirus : Υλικά Μη σημανσμένο RNA (2 μgr/ 20 μl) Χ μl Ρυθμιστικό Διάλυμα 10x Mirus Labeling Buffer 2 μl DNP Label reagent 2 μl Ελεύθερο από νουκλεάσες H2O μέχρι 20 μl τελικός όγκος αντίδρασης Το μη σημανσμένο RNA μαζί με τη κατάλληλη ποσότητα νερού θερμαίνονται σε υδατόλουτρο των 70 ο C για 5 λεπτά με σκοπό την αποδιάταξη του RNA, καθώς οι δευτεροταγείς δομές που σχηματίζει μπορεί να μειώσουν το ποσοστό σήμανσης με το DNP. Στη συνέχεια, προστίθενται τα υπόλοιπα διαλύματα της αντίδρασης και επωάζονται στους 37 ο C για 2 ώρες. Έπειτα, το σημανσμένο με DNP RNA καθαρίζεται από προσμίξεις και κατάλοιπα της αντίδρασης σε κολώνα Sephadex G-50 2 φορές. Με αυτό τον τρόπο, μπορούμε να σημάνουμε 2 διαφορετικούς ιχνηθέτες με 2 διαφορετικές πλευρικές ομάδες και να πραγματοποιήσουμε διπλή φθορίζουσα υβριδοποίηση, ανιχνεύοντας την ύπαρξη συνεντοπισμού ή όχι 2 διαφορετικών γονιδίων σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους του εμβρύου του αχινού και σε ανάλυση πυρηνικού επιπέδου. Η ανίχνευση του σήματος, όπως αναφέρθηκε, βασίζεται στο φθορισμό που εκπέμπεται από φθοροχρώματα που βρίσκονται ενωμένα στα ειδικά αντισώματα έναντι των πλευρικών ομάδων (Dig και DNP) των RNA ιχνηθετών και το σήμα ενισχύεται με την αντίδραση ριζών υπεροξειδίου με μόρια τυραμιδίων (εικόνα 47). Συγκεκριμένα, οι σημανσμένοι με Dig ή DNP ιχνηθέτες υβριδοποιούνται λόγω συμπληρωματικότητας με τα mrnas των υπό μελέτη γονιδίων, σε συγκεκριμένες περιοχές του εμβρύου. Έπειτα, ακολουθεί προσθήκη ειδικών αντισωμάτων, Anti-Dig-POD και Anti-DNP- HRP που αναγνωρίζoυν ως επίτοπο τη διγοξιγενίνη και τη δινιτροφαινόλη, αντίστοιχα. Τα POD και ΗRP αναφέρονται στο ένζυμο που βρίσκεται ενωμένο στην Fc περιοχή 73

75 των αντισωμάτων, που αποτελούν δύο είδων υπεροξειδάσες (POD = peroxidase, HRP=horse radish peroxidase). Η υπεροξειδάση αποτελεί το ένζυμο, το οποίο είναι υπεύθυνο για την παραγωγή ελευθέρων ριζών τυραμιδίων. Οι τυραμίδες παρέχονται στο σύστημα και είναι προσδεδεμένες με υπεροξείδιο και ένα φθορόχρωμα (στο εργαστήριο χρησιμοποιούνται οι κυανίνες 3 και 5). Έτσι, οι υπεροξειδάσες των αντισωμάτων καταλύουν μέσω του υπεροξειδίου, τη δημιουργεία ελευθέρων ριζών τυραμιδίου, οι οποίες μέσω ομοιοπολικών δεσμών που σχηματίζουν με κατάλοιπα τυροσύνης που βρίσκονται κοντά στο ένζυμο της υπεροξειδάσης, σχηματίζουν σύμπλοκα γύρω από το αντίσωμα. Έτσι, το σύστημα αυτό δίνει την θέση των mrna των γονιδίων που μελετάμε, καθώς μπορούμε να διεγείρουμε τα φθοροχρώματα με φως κατάλληλου μήκους κύματος, αυτά να φθορίσουν και σε συνεστιακό μικροσκόπιο να παρατηρήσουμε όχι μόνο το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης των γονιδίων σε πυρηνικό επίπεδο, αλλά και να εντοπίσουμε πιθανό συνεντοπισμό 2 γονιδίων σε ένα κύτταρο. Εικόνα 47: Σύστημα TSA της Perkin Elmer Corporation για χρήση σε in situ υβριδοποίηση (TSA Amplification System Brochure perkinelmer.com) Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε για τη FISH είναι το Lab Practical Sea Urchin/Starfish WMISH Protocol contributed by Carmen Andrikou, Rossella Annunziata & M.Ina Arnone : 1. Μεταφορά μονημοποιημένων σε μεθανόλη εμβρύων διαφορετικών σταδίων σε σωληνάρια τύπου eppendorf (200 μl για κάθε σωληνάκι) των 1,5 ml και πλύση τους 3 φορές με 200 μl Διάλυμα MOPS σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 74

76 απομάκρυνση της μεθανόλης για 15 λεπτά το ξέπλυμα. Μία πλύση θεωρείται η προσθήκη και απομάκρυνση του εκάστοτε διαλύματος που χρησιμοποιούμε. Όλες οι πλύσεις με διάλυμα MOPS απαιτούν θερμοκρασία δωματίου και 15 λεπτά παραμονή μέχρι το επόμενο ξέπλυμα. Περιμένουμε 2-3 λεπτά για καθίζηση των εμβρύων και απομάκρυνση της υπερκείμενης μεθανόλης με χρήση πιπέτας και καθαρά από RNAάσες τιπάκια πιπετών. Αφαιρούμε όσο περισσότερο όγκο υπερκείμενου μπορούμε, χωρίς να χάνουμε έμβρυα και χωρίς να τα αφήνουμε τελείως στεγνά. Τα έμβρυα βρίσκονται σε τελικό όγκο διαλύματος MOPS = 200 μl 2. Προ-υβριδοποίηση: Αφαιρούμε όσο το δυνατόν περισσότερο όγκο από το διάλυμα MOPS επιτρέπεται από τα σωληνάκια και προσθέτουμε 200 μl διάλυμα υβριδοποίησης (Hybe), προθερμανσμένο για 15 λεπτά στους 50 ο C. Τοποθετούμε τα δείγματα για 3 ώρες στους 50 ο C. Στη μιάμιση ώρα, πραγματοποιούμε αλλαγή στο Hybe. 3. Υβριδοποίηση: Για κάθε RNA ιχνηθέτη, χρησιμοποιούμε σωληνάρια τύπου eppendorf, που το κάθε ένα περιέχει μονιμοποιημένα έμβρυα από συγκεκριμένα αναπτυξιακά στάδια. Στη συνέχεια, αφαιρούμε όσο το δυνατόν περισσότερο Hybe γίνεται και προσθέτουμε σε κάθε σωληνάριο 100 μl του κατάλληλου, αραιωμένου σε Hybe, RNA ιχνηθέτη (οι ιχνηθέτες αραιώνονται σε τελική συγκέντρωση 0,1-0,5 ngr/μl). Αν επιθυμούμε να πραγματοποιήσουμε διπλή υβριδοποίηση, τότε προσθέτουμε 100 μl Hybe που περιέχει αραιωμένους ιχνηθέτες σε ίση τελική συγκέντρωση 0,3 ngr/μl ο καθένας. Υβριδοποίηση για 5-7 ημέρες στους 50 ο C. 4. Μετα-υβριδοποίηση: Έπειτα από 5-7 ημέρες, αφαιρούμε όσο το δυνατόν περισσότερο Hybe με RNA ιχνηθέτες μπορούμε και πλένουμε 5 φορές τα έμβρυα με 200 μl διαλύματος MOPS. Έπειτα, αφαιρούμε το διάλυμα MOPS και προσθέτουμε 200 μl διαλύματος μεταυβριδοποίησης (Post-Hybe) και μεταφέρουμε τα δείγματα στους 50 ο C για 3 ώρες, κάνοντας αλλαγές στο Post Hybe κάθε 1 ώρα. Τέλος, αφαιρούμε το Post Hybe και πραγματοποιούμε 3 πλύσεις με 200 μl διαλύματος MOPS τη φορά. 5. Μπλοκάρισμα I: Αφαίρεση 200 μl διαλύματος MOPS και προσθήκη διαλύματος μπλοκαρίσματος Perkin Elmer (PEBR 0,5 % σκόνης PEBR σε 75

77 διάλυμα MOPS). Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Όσο περιμένουμε το μπλοκάρισμα, ετοιμάζουμε την αραίωση του αντισώματος σε διάλυμα μπλοκαρίσματος και το αφήνουμε να επωαστεί για 30 λεπτά. Έπειτα, αφαίρεση του PEBR και προσθήκη 200 μl 1/1500 αντισώματος Anti-Dig-POD και επώαση ολονυκτίς σε θερμοκρασία 4 ο C. 6. Χρώση I: Την επόμενη μέρα, ακολουθούν 5 ξεπλύματα με 200 μl διαλύματος MOPS και στη συνέχεια, προσθήκη 200 μl διαλύματος ενίσχυσης σήματος (Amplification Diluent) και επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Απομάκρυνση του διαλύματος ενίσχυσης και προσθήκη 200 μl κυανίνης 5 σε αραίωση 1/500 σε διάλυμα ενίσχυσης (από εδώ και πέρα, όλα τα βήματα πραγματοποιούνται σε σκοτάδι). Επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, απομάκρυνση της κυανίνης και πραγματοποίηση 5 ξεπλυμάτων με διάλυμα MOPS. Για μονή φθορίζουσα in situ υβριδοποίηση, η συνέχεια στο βήμα 9 - χρώση πυρήνων και παρατήρηση 7. Μπλοκάρισμα ΙΙ: Πλύση εμβρύων με 200μl 1% υπεροξειδίου για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για απενεργοποίηση της υπεροξειδάσης του πρώτου αντισώματος. Πραγματοποίηση 5 πλύσεων των 15 λεπτών με διάλυμα MOPS σε θερμοκρασία δωματίου. Αφαίρεση 200 μl διαλύματος MOPS και προσθήκη διαλύματος μπλοκαρίσματος Perkin Elmer (PEBR 0,5 % σκόνης PEBR σε διάλυμα MOPS). Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Όσο περιμένουμε το μπλοκάρισμα, ετοιμάζουμε την αραίωση του αντισώματος σε διάλυμα μπλοκαρίσματος και το αφήνουμε να επωαστεί για 30 λεπτά. Έπειτα, αφαίρεση του PEBR και προσθήκη 200 μl 1/1000 αντισώματος Anti-DNP-HRP και επώαση ολονυκτίς σε θερμοκρασία 4 ο C. 8. Χρώση ΙΙ: Την επόμενη μέρα, ακολουθούν 5 ξεπλύματα με 200 μl διαλύματος MOPS και στη συνέχεια, προσθήκη 200 μl διαλύματος ενίσχυσης σήματος (Amplification Diluent) και επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Απομάκρυνση του διαλύματος ενίσχυσης και προσθήκη 200 μl κυανίνης 3 σε αραίωση 1/500 σε διάλυμα ενίσχυσης. Επώαση για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, απομάκρυνση της κυανίνης και πραγματοποίηση 5 ξεπλυμάτων με διάλυμα MOPS. 76

78 9. Χρώση πυρήνων και παρατήρηση: Προσθήκη 200 μl διαλύματος χρωστικής DAPI (χρώση πυρήνων) σε αραίωση 1/1000 σε διάλυμα MOPS και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά. Απομάκρυνση της DAPI και προσθήκη 200μl 75% γλυκερόλης σε απιονισμένο νερό. Η παρατήρηση γίνεται σε αντικειμενοφόρους πλάκες με σταγόνα των 10 μl εμβρύων σε συνεστιακό μικροσκόπιο Leica Confocal Microscope TCS SP4, κάτω από φθορίζουσα ακτινοβολία και σε μεγέθυνση φακού από 20 Χ 40 Χ. 3.17) Καλλιέργεια εμβρύων αχινού P.lividus 1. Τα ωάρια και το σπέρμα απομονώνονται από θηλυκούς και αρσενικούς αντίστοιχα αχινούς P.lividus με τη βοήθεια βελόνας, όπου γίνεται ένεση περίπου 1ml διαλύματος 0,5M KCl στην περιστοματική κοιλότητα του αχινού, πλευρικά του λύχνου του Αριστοτέλη, με αποτέλεσμα την αλλαγή της ισορροπίας ιόντων Κ + /Να +, τη σύσπαση των γονάδων και την απελευθέρωση των γαμετών από έναν ή περισσότερους από τους πέντε γονοπόρους της αντιστοματικής περιοχής, αν το ζώο είναι ώριμο. Κάποια ζώα δίνουν περισσότερους γαμέτες αν κουνηθούν μετά την ένεση. Μπορεί να χρειαστεί και δεύτερη ένεση KCl. 2. Οι θηλυκοί αχινοί τοποθετούνται με την έδρα προς τα κάτω σε ποτήρι ζέσεως των 50ml που περιέχει θαλασσινό νερό, έτσι ώστε τα ωάρια να συλλέγονται στο ποτήρι. Το χρώμα των ωαρίων στο είδος P.lividus είναι ελαφρά πορτοκαλί έως κόκκινο. 3. Αφού τα ωάρια καθιζάνουν, το υπερκείμενο θαλασσινό νερό απορρίπτεται προσεκτικά και προστίθεται νέο. Ακολούθως τα ωάρια επαναιωρούνται και το διάλυμα διηθείται μέσω γάζας για την απομάκρυνση άχρηστων αντικειμένων, όπως σπασμένες άκανθοι και ποδίσκοι των αχινών. 4. Στη συνέχεια, τα ωάρια αραιώνονται με φιλτραρισμένο θαλασσινό νερό μέχρι τελικού όγκου 80ml. 5. Με τη βοήθεια βελόνας γίνεται ένεση διαλύματος 0,5M KCl στην περιστοματική κοιλότητα του ώριμου αρσενικού αχινού, με αποτέλεσμα τη σύσπαση των γονάδων και την απελευθέρωση σπέρματος. 77

79 6. Τα αρσενικά άτομα ακολούθως τοποθετούνται με την έδρα προς τα πάνω και το σπέρμα συλλέγεται σε σωληνάριο τύπου eppendorf άμεσα με τη βοήθεια πιπέτας pasteur και διατηρείται στον πάγο. Το αδιάλυτο σπέρμα (πυκνό σπέρμα), αν αποθηκευτεί στους 4 ο C μπορεί να χρησιμοποιηθεί ξανά για δύο με τρεις μέρες. 7. Η καλλιέργεια εμβρύων αχινού γίνεται σε γυάλινα κυλινδρικά δοχεία όγκου 4L σε φιλτραρισμένο θαλασσινό νερό, παρουσία μείγματος αντιβιοτικών (πενικιλίνηςστρεπτομυκίνης), υπό ανάδευση στους 18 C. Η ποσότητα των ωαρίων στην καλλιέργεια δε θα πρέπει να υπερβαίνει τα 2*10 7 /L. Από τη στιγμή που η επιθυμητή ποσότητα ωαρίων τοποθετηθεί στο δοχείο καλλιέργειας, μπορεί να γίνει η γονιμοποίηση με την προσθήκη μίας σταγόνας ξηρού σπέρματος ανά λίτρο καλλιέργειας, αφού πρώτα αραιωθεί σε 1ml θαλασσινού νερού. Μετά από 15 λεπτά, γίνεται έλεγχος αν έχει ολοκληρωθεί κανονικά η γονιμοποίηση, σε αντίθετη περίπτωση η καλλιέργεια απορρίπτεται. Συλλογή και απομάκρυνση δειγμάτων γίνεται σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα, στα οποία τα έμβρυα βρίσκονται στο αναπτυξιακό στάδιο που μας ενδιαφέρει. 3.18) Μονιμοποίηση καλλιέργειας εμβρύων αχινού P.lividus Η μονιμοποίηση των εμβρύων γίνεται, όπως αναφέρθηκε, σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα, στα οποία τα έμβρυα βρίσκονται σε συγκεκριμένα και χαρακτηριστικά αναπτυξιακά στάδια, τα οποία είναι με σειρά ανάπτυξης, το αυγό (0 ώρες μετά τη γονιμοποίηση hpf), το στάδιο των 16 κυττάρων (4 hpf), το μεσεγχυματικό βλαστίδιο (10 hpf), το γαστρίδιο (24 hpf), το πρίσμα (30 hpf) και ο πλουτέας (42 hpf). Η διαδικασία μονιμοποίησης είναι η εξής : Συλλογή εμβρύων από κάθε στάδιο ανάπτυξης σε σωληνάρια τύπου Falcon των 15 ml και αφήνονται να καθιζάνουν σε πάγο. Απομάκρυνση του υπερκείμενου νερού και προσθήκη παραφορμαλδεΰδης (PFA) 8% όγκου ίσου με τον όγκο του ιζήματος των εμβρύων. Ήπια ανάδευση των εμβρύων σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα σε αναδευτήρα με ταυτόχρονη αλλαγή θέσεως κάθε 15 λεπτά. Απομάκρυνση του PFA και ξέπλυμα των εμβρύων με ίσου όγκου σε σχέση με αυτό που αφαιρέθηκε, τεχνητού θαλασσινού νερού (ΑSW). 78

80 Απομάκρυνση του ΑSW και 3 φορές ξέπλυμα των εμβρύων με ίσου όγκου σε σχέση με αυτό που αφαιρέθηκε, 100% μεθαλόνης. Αποθήκευση των εμβρύων σε 100% μεθαλόνη σε καταψύχτη των -20 ο C 3.19) Μικροένεση σε γονιμοποιημένα ωάρια αχινού με αντινοηματικά νουκλεοτίδια morpholino Προετοιμασία τρυβλίων petri: Στα καπάκια από τρυβλία petri των 60mm, προστίθεται διάλυμα θειικής προταμίνης 2%, μέχρι να καλυφθεί ο πάτος. Μετά από ένα λεπτό, το διάλυμα απορρίπτεται και ξεπλένουμε καλά με δις-απεσταγμένο νερό με τη χρήση υδροβολέα. Με αυτόν τον τρόπο δημιουργείται στον πάτο ένα στρώμα θετικού φορτίου, το οποίο βοηθά στην ακινητοποίηση των ωαρίων. Τα καπάκια αφήνονται να στεγνώσουν στον αέρα ανάποδα. Προετοιμασία των βελονών για μικροένεση: Ένα τριχοειδές διατομής τύπου Ω τοποθετείται στο μηχάνημα επιμήκυνσης, επιλεγούμε το πρόγραμμα με τις επιθυμητές ρυθμίσεις και πιέζουμε το πλήκτρο εκκίνησης. Το αποτέλεσμα είναι η δημιουργία δύο βελονών. Σε αυτές τις βελόνες μεταφέρεται το υλικό - morpholino, το οποίο θέλουμε να εισάγουμε στα ωάρια, με τη χρήση λεπτών πιπετών Pasteur που έχουν επιμηκυνθεί σε φλόγα. Προετοιμασία του υλικού που πρόκειται να εισαχθεί στα ωάρια: Το υλικό που επιθυμούμε να εισάγουμε στα ωάρια, αραιώνεται στην επιθυμητή συγκέντρωση σε διάλυμα γλυκερόλης 30%. Στην συνέχεια, τοποθετείται σε φίλτρο (με πόρους 0,45μm), το οποίο είναι προσαρμοσμένο σε σωληνάριο 0,75ml και φυγοκεντρείται για 10 στα rpm. Απομάκρυνση του ζελατινώδους περιβλήματος των ωαρίων: Από τη στιγμή που ολοκληρωθεί η συλλογή των ωαρίων ενός θηλυκού ατόμου, ο όγκος του θαλασσινού νερού στο ποτήρι ζέσεως συμπληρώνεται έως τα 75ml και στη συνέχεια ακολουθεί προσθήκη τεσσάρων σταγόνων διαλύματος Κιτρικού οξέος 0,5M, ώστε να γίνει πτώση του ph του νερού, ήπια ανάδευση και μετά από ένα λεπτό γίνεται 79

81 προσθήκη 18 σταγόνων διαλύματος Tris-Cl 0,5M ph 8,3 για την επαναφορά του ph στη φυσιολογική τιμή. Με αυτή τη διαδικασία, το ζελατινώδες μπορεί να απομακρυνθεί διηθώντας τα ωάρια σε γάζα. Μεταφορά και ακινητοποίηση των ωαρίων: Μεταφέρουμε ποσότητα των ωαρίων από το ποτήρι ζέσεως σε γυάλινο πλακίδιο παρατήρησης με κοίλωμα με τη χρήση πιπέτας Pasteur. Κάτω από το στερεοσκόπιο και με τη βοήθεια λεπτής πιπέτας Pasteur (που έχει επιμηκυνθεί σε φλόγα) αναρροφούμε με το στόμα ποσότητα ωαρίων και τα μεταφέρουμε στο καπάκι τρυβλίου petri (το οποίο έχει επωαστεί με θειική προταμίνη) που περιέχει δις-διηθημένο θαλασσινό νερό, σχηματίζοντας σειρές των ωαρίων στο κέντρο περίπου του πυθμένα. Τα ωάρια είναι έτοιμα για μικροένεση. Αυτή τη στιγμή, με τη βοήθεια πιπέτας Pasteur, δημιουργούμε μία χαραγή στον πυθμένα του τρυβλίου δίπλα και κατά μήκος της σειράς των ωαρίων. Πορεία των μικροενέσεων: Προσαρμόζουμε το τρυβλίο με τα ωάρια στην τράπεζα του ανεστραμμένου μικροσκοπίου. Στη συνέχεια προσαρμόζουμε τη βελόνα στην αρχή στο σύστημα υδραυλικής προώθησης και στη συνέχεια στον υδραυλικό βραχίονα του μικροχειριστή, με τέτοιο τρόπο ώστε να σχηματίζει γωνία περίπου 40 με τον πυθμένα του τρυβλίου. Με τη χρήση των αδρών κοχλιών του μικροχειριστή και τη βοήθεια των αδρών κοχλιών του μικροσκοπίου τοποθετούμε τη βελόνα στο επίπεδο των ωαρίων. Από το σημείο αυτό και στη συνέχεια όλοι οι χειρισμοί γίνονται με τους μικρομετρικούς κοχλίες του μικροσκοπίου και το μοχλό του μικροχειριστή. Μετακινούμε τη βελόνα έτσι ώστε να την ακουμπήσουμε προσεχτικά επάνω στη χαραγή που δημιουργήσαμε στον πυθμένα του τρυβλίου, κάτι που έχει ως αποτέλεσμα τη διάρρηξη του ρύγχους της και έναρξη της ροής του υλικού που είχαμε τοποθετήσει στο εσωτερικό της. Ρυθμίζουμε τη ροή στα επιθυμητά επίπεδα και είμαστε έτοιμοι για την διενέργεια των μικροενέσεων. Αμέσως, γονιμοποιούμε τα ωάρια με μερικές σταγόνες αραιού σπέρματος, ελέγχουμε αν έγινε κανονικά η γονιμοποίηση και προχωρούμε τις ενέσεις. Για να είναι επιτυχής μία ένεση θα πρέπει να μεταφερθεί στο εσωτερικό του ζυγωτού υλικό όγκου περίπου με το ένα τρίτου του όγκου του. Τα τρυβλία με τα ενεμένα ζυγωτά μεταφέρονται σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας στους 18 C. 80

82 3.20) Whole mount In situ υβριδοποίηση (WMISH) με RNA ιχνηθέτες σε έμβρυα P.lividus ενεμένα με morpholino αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια Για να προσδιοριστεί η επίδραση των PlCoup-tf, PlSix3, PlFoxQ2 και PlDelta στην έκφραση των SoxC, Six3, Hbn, Fez και Sip1 γονιδίων, πραγματοποιήθηκε WMISH με χρήση των RNA ιχνηθετών για τα γονίδια που μελετάμε, σε έμβρυα αχινού P.lividus ενεμένα με morpholino αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια, ειδικά για την καταστολή (knock down) των PlCoup-tf, PlSix3, PlFoxQ2 και PlDelta και σε κανονικά έμβρυα, που χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος (control) για το πείραμα. Τα ενεμένα έμβρυα με morpholinos ονομάζονται morphants και η διαδικασία με την οποία πραγματοποιήθηκαν η γονιμοποίηση και οι ενέσεις αναφέρεται στην παράγραφο 3.15 και Τα morpholino ολιγονουκλεοτίδια είναι σημαντικά εργαλεία της μοριακής βιολογίας, καθώς καθιστούν εύκολη την αποσιώπηση διαφόρων, συμπληρωματικών με αυτά, νουκλεοτιδικών αλληλουχιών, του μήκους περίπου 25 βάσεων και χωρίς να καταστρέφουν το DNA ή RNA με το οποίο συνδέονται. Τα ολιγομερή αποτελούνται από morpholino μονομερή που είναι χημικά μη ιονικά ανάλογα των νουκλεοτίδιων, διαφέροντας στη ραχοκοκαλιά (backbone) του μορίου σε σχέση με τα νουκλεοτίδια. Έχουν μεγάλο χρόνο ημιζωής, αφού δεν αναγνωρίζονται από τους ενδογενείς μηχανισμούς άμυνας του αχινού και επιτρέπουν την παραμονή και επίδρασή τους στο έμβρυο έως και 2 μέρες μέχρι να αρχίσει η αποικοδόμησή τους, χρόνος αρκετός για να παρατηρήσουμε την επίδραση των παραγόντων που καταστέλλουμε στο αναπτυξιακό πρότυπο του ζώου. 81

83 Εικόνα 48: Μηχανισμός δράσης και χημική δομή των morpholino ολιγονουκλεοτιδίων Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε είναι το ίδιο με της in situ υβριδοποίησης σε κανονικά, μη ενεμένα έμβρυα που περιγράφηκε αναλυτικά στη παράγραφο O αριθμός των εμβρύων που ενέθηκαν με morpholinos κυμάνθηκε από έμβρυα, τα οποία αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας 18 ο C για ώρες μετά την γονιμοποίηση. Ταυτόχρονα, αναπτύχθηκαν και έμβρυα ελέγχου, μη ενεμένα, για τον ίδιο αριθμό ωρών. Την επόμενη ημέρα, η συλλογή τους πραγματοποιήθηκε με την βοήθεια λεπτής, πάχους 3mm υάλινης πιπέτας Pasteur από τα τρυβλία Petri που αναπτύχθηκαν και τοποθετήθηκαν σε συγκεκριμένα, αριθμημένα πηγάδια (wells) ενός δίσκου 96 πηγαδιών (96 well plate),όπου και μονιμοποιήθηκαν με τον εξής τρόπο : Στα πηγάδια που περιέχουν περίπου μl εμβρύων σε θαλασσινό νερό, προστίθονται 300 μl Μονιμοποιητικού Ι και τα έμβρυα επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Στη συνέχεια, το μονιμοποιητικό απομακρύνεται με 3 πλύσεις των 15 λεπτών με 150 μl διάλυμα MOPS Τα έμβρυα, τέλος, αποθηκεύονται σε 200 μl 75% αιθανόλης στους -20 ο C μέχρι τη πραγματοποίηση της in situ υβριδοποίησης 3.21) Ανοσοφθορισμός σε έμβρυα P.lividus ενεμένα με αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια morpholino για την καταστολή του PlCoup-TF Για τον έλεγχο ύπαρξης συγκεκριμένων κυτταρικών τύπων, όπως οι σεροτονεργικοί νευρώνες, σε έμβρυα του αχινού, στα οποία έχει γίνει καταστολή του PlCoup-TF, πραγματοποιήθηκε έμμεσος ανοσοφθορισμός. Η τεχνική αυτή βασίζεται στην ειδικότητα των αντισωμάτων να αναγνωρίζουν ειδικούς για αυτά επιτόπους, όπως ένας υποδοχέας ή άλλου είδους μεμβρανική πρωτεΐνη. Με τη χρήση φθοροχρωμάτων που είναι συνδεδεμένα με τα αντισώματα, γίνεται ορατή η ιστοειδική κατανομή του επιτόπου στο δείγμα, όταν αυτό παρατηρηθεί σε μικροσκόπιο φθορισμού. 82

84 Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα της παρούσας μελέτης βασίζεται σε έμμεσο ανοσοφθορισμό του επιθυμητού δείγματος (εικόνα 49). Στο συγκεκριμένο είδος ανοσοφθορισμού, γίνεται η χρήση δύο αντισωμάτων, όπου το πρώτο είναι πολυκλωνικό και ειδικό για να αναγνωρίζει ως επίτοπο τη σεροτονίνη των νευρικών κυττάρων του πρόσθιου νευροεξωδέρματος, δένει σε αυτά, αλλά δεν είναι σημανσμένο με κάποιου είδους φθορίζων μόριο. Το δεύτερο αντίσωμα είναι πολυκλωνικό και ειδικό για την αναγνώριση της Fc περιοχής του πρώτου αντισώματος σαν επίτοπο και στη δικιά του Fc περιοχή φέρει μία είδους φθορίζουσα χρωστική, την Alexa 555. Έτσι, με παρατήρηση σε συνεστιακό μικροσκόπιο και με χρήση φωτός συγκεκριμένου μήκους κύματος για την διέγερση του φθοροχρώματος (555 nm), μπορούμε να αναλύσουμε την ύπαρξη ή όχι του επιθυμητού κυτταρικού τύπου στα δείγματά μας. Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα του έμμεσου ανοσοφθορισμού σε σχέση με τον άμεσο ανοσοφθορισμό, είναι ότι γύρω από κάθε πρώτο αντίσωμα συνδέονται πολλά δεύτερα αντισώματα, με αποτέλεσμα την ενίσχυση του σήματος κατά την παρατήρηση στο συνεστιακό μικροσκόπιο. Εικόνα 49: Άμεσος (αριστερά) και έμμεσος (δεξιά) ανοσοφθορισμός ( Τα έμβρυα ενέονται με morpholino για την καταστολή του PlCoup-TF, συλλέγονται και μονιμοποιούνται σε πηγάδια ενός δίσκου 96 πηγαδιών με τον τρόπο που περιγράφηκε στις παραγράφους 3.19 και Το πρωτόκολλο του ανοσοφθορισμού που ακολουθήθηκε είναι το εξής : 83

85 Απομάκρυνση 200 μl αιθανόλης από τα πηγάδια που περιέχουν τα μονιμοποιημένα έμβρυα και πραγματοποίηση 3 ξεπλυμάτων με 100 μl διαλύματος PBS 1x σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά η κάθε πλύση. Απομάκρυνση 100 μl διαλύματος PBS 1x και πραγματοποίηση 2 ξεπλυμάτων με 100 μl διαλύματος PBST σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά η κάθε πλύση. Μπλοκάρισμα και προσθήκη πρώτου αντισώματος: Αφαίρεση 100 μl διαλύματος PBST και προσθήκη 100μl διαλύματος μπλοκαρίσματος PBST με 4% ορό αίματος προβάτου (sheep serum). Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Όσο περιμένουμε το μπλοκάρισμα, ετοιμάζουμε την αραίωση του αντισώματος σε διάλυμα μπλοκαρίσματος και το αφήνουμε να επωαστεί για 30 λεπτά. Έπειτα, αφαίρεση του διαλύματος μπλοκαρίσματος και προσθήκη 100 μl 1/1000 πολυκλωνικού αντισώματος απομονωμένου από ορό αίματος κουνελιού Rabbit Anti-Serotonin και επώαση ολονυκτίς σε θερμοκρασία 4 ο C. Προσθήκη δεύτερου αντισώματος: Την επόμενη μέρα, γίνεται αφαίρεση 100μl του πρώτου αντισώματος και πραγματοποιούνται 5 ξεπλύματα με 100 μl διαλύματος PBST σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά για απομάκρυνση του μη συνδεδεμένου αντισώματος. Έπειτα, ακολουθεί αφαίρεση του διαλύματος PBST και προσθήκη 100 μl 1/500 πολυκλωνικού αντισώματος απομονωμένου από ορό αίματος μόσχου Goat AntiRabbit σημανσμένου με Alexa 555 φθορίζουσα χρωστική. Πραγματοποιείται επώαση για 2 ώρες και τριάντα λεπτά σε θάλαμο θερμοκρασίας 37 ο C. Από εδώ και πέρα, όλη η διαδικασία γίνεται σε σκοτάδι. Χρώση πυρήνων και παρατήρηση: Μετά το πέρας των δυόμιση ωρών, γίνεται αφαίρεση 100μl του δεύτερου αντισώματος και πραγματοποιούνται 5 ξεπλύματα με 100 μl διαλύματος PBST σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά για απομάκρυνση του μη συνδεδεμένου αντισώματος. Στη συνέχεια, γίνεται προσθήκη 100 μl διαλύματος χρωστικής DAPI (χρώση πυρήνων) σε αραίωση 1/1000 σε διάλυμα PBS 1x και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για λεπτά. Απομάκρυνση της DAPI και προσθήκη 100μl 75% γλυκερόλης σε απιονισμένο νερό. Η παρατήρηση γίνεται σε αντικειμενοφόρους πλάκες με σταγόνα των 10 μl εμβρύων σε συνεστιακό μικροσκόπιο Leica Confocal 84

86 Microscope TCS SP5, κάτω από φθορίζουσα ακτινοβολία και σε μεγέθυνση φακού από 20 Χ 40 Χ. 4) Αποτελέσματα 4.1) Κατασκευή cdna από ολικό RNA γαστριδίου Το προϊόν της RT-PCR, δηλαδή το DNA υπόστρωμα για το SoxC, ηλεκτροφορήθηκε σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5% με σκοπό να δούμε αν οι ζώνες που παίρνουμε για το DNA αντιστοιχούν με τo αναμενόμενo μήκoς αλληλουχίας που βρέθηκε από την αναζήτηση στις βάσεις δεδομένων. Τo μήκος αλληλουχιάς για το SoxC = 1136 bp Εικόνα 50: Tο πήκτωμα της ηλεκτροφόρησης του γονιδίου SoxC με χρήση 2 διαφορετικών ζευγών εκκινητών και αναγραφόμενο το μήκος των προϊόντων που παίρνουμε με κάθε διαφορετικό ζεύγος εκκινητών 85

87 Με τη χρήση των ζευγών εκκινητών F2-R2 και F10-R10, παίρνουμε το επιθυμητό και αναμενόμενο προϊόν, με παρόμοια μήκη, αλλά για την συνέχεια των πειραμάτων μας επιλέξαμε το προϊόν από το ζεύγος εκκινητών 2, καθώς ταυτίζεται απόλυτα στο θεωρητικό μήκος του SoxC στη βάση δεδομένων. Έπειτα, το DNA καθαρίστηκε με Qiagen PCR Clean up, φωτομετρήθηκε και η συγκέντρωση του βρέθηκε ίση με 148,74 ngr/μl ( A260/230 = 0,8, A260/280 = 2). 4.2) Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Έπειτα τη χρήση των προϊόντων των RT-PCR για αντίδραση λιγάσης και μετασχηματισμό δεκτικών βακτηριακών κυττάρων για τη δημιουργία πλήθους στερεών αποικιών, ακολούθησε καλλιέργεια υγρών αποικιών από τις αντίστοιχες στερεές αποικίες, με σκοπό την απομόνωση του πλασμιδιακού DNA που περιέχουν και επιλογή αυτών που θα περιέχουν ανασυνδυασμένο πλασμίδιο με το ένθεμα που επιθυμούμε. Τα απομονωμένα πλασμίδια από 7 αποικίες φωτομετρήθηκαν και τα αποτελέσματα αναγράφονται στο παρακάτω πίνακα: SoxC (ngr/μl) A260/280 A260/230 1) 74,87 1,96 1,49 2) 76,70 1,93 1,78 3) 572,24 1,93 1,80 4) 356,07 2 1,83 5) 518,24 1,93 1,82 6) 482,68 1,97 1,74 7) 583,06 1,94 1,81 86

88 4.3) Πέψεις ελέγχου πλασμιδιακού DNA Έπειτα τη πλασμιδιακή απομόνωση των φορέων που πιθανά, περιέχουν το ένθεμα που επιθυμούμε, πρέπει να σιγουρευτούμε ότι οι επιλεγμένες από εμάς αποικίες, περιέχουν τα ενθέματα που θέλουμε και με ποια φορά αυτά εισήχθησαν στον πλασμιδιακό φορέα. Με τη χρήση των κατάλληλων ενζύμων περιορισμού μπορούμε να επιτύχουμε τους παραπάνω στόχους και να εξάγουμε συμπεράσματα. Πέψεις ελέγχου με SalI Για να βεβαιωθούμε για την ειδικότητα του ενθέματος και ταυτόχρονα, να δούμε την φορά με την οποία το ένθεμα έχει ενσωματωθεί στο πλασμιδιακό φορέα, χρησιμοποιούμε το ένζυμο περιορισμού SalI για τo SoxC. Ο λόγος της επιλογής των συγκεκριμένων ενζύμων και των πέψεων ελέγχου αναφέρεται αναλυτικά στη παραγράφο

89 Εικόνα 51: Πέψεις ελέγχου στα επιλεγμένα πλασμιδιακά DNA του γονιδίου SoxC με χρήση του ενζύμου περιορισμού SalI. Από τις πέψεις ελέγχου και με τη βοήθεια των βάσεων δεδομένων και των χαρτών των περιορισμού και αλληλουχιών των υποκινητών Τ7 και Sp6, εξάγουμε τα εξής συμπεράσματα: Tα δείγματα SoxC 1,2,3,4 και 7 κόπηκαν είτε ατελώς, είτε τα τμήματα που πήραμε δεν συμφωνούν με τα αναμενόμενα από το χάρτη περιορισμού, κάτι που υποδεικνύει ότι, τα ενθέματα αυτά δεν αποτελούν το επιθυμητό SoxC DNA. Από την άλλη, στα δείγματα 5 και 7, το ένθεμα μπήκε με το 3 άκρο κοντά στον Sp6 υποκινητή, καθώς τα μήκη των τμημάτων που βλέπουμε στο πήκτωμα, συμφωνούν με τα αναμενόμενα από το χάρτη περιορισμού. Τελικά, τα δείγματα SoxC5 και SoxC7 επιλέχθηκαν για υποστρώματα της in vitro μεταγραφής για τη κατασκευή RNA ιχνηθετών για τις in situ υβριδοποιήσεις και στάλθηκαν για αλληλούχιση, όπου και επιβεβαιώθηκε η καταλληλότητα των επιλεγμένων DNA για υποστρώματα της in vitro μεταγραφής. 4.4) Πολλαπλασιασμός του DNA ενθέματος του πλασμιδιακού φορέα Με τη χρήση των Μ13 εκκινητών και με υπόστρωμα τα πλασμιδιακά DNA που επιλέξαμε από τις πέψεις ελέγχου, μπορούμε να πολλαπλασιάσουμε τα DNA ενθέματα, τα οποία θα γίνουν τα υποστρώματα για τις in vitro μεταγραφές. Η αναλυτική θεωρία της τεχνικής και τα υλικά με τις κατάλληλες ποσότητες και συγκεντρώσεις αναφέρονται στη παράγραφο Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης ήταν τα αναμενόμενα, καθώς μας έδωσε μία ζώνη στα 1336 bp και στις δύο αντιδράσεις του SoxC, στα αναμενόμενα μήκη βάσεων. H διαφορά στα μήκη των προϊόντων από την PCR σε σχέση με το μήκος του DNA από τις RT-PCR οφείλεται στο ότι οι M13 εκκινητές περικλείουν τους υποκινητές των Sp6 και T7 RNA πολυμερασών, άρα τα προϊόντα εκτός της δικιάς τους αλληλουχίας, περιέχουν και αλληλουχίες του πλασμιδιακού DNA. Έπειτα, ακολούθησε φωτομέτρηση των προϊόντων των αντιδράσεων για την εύρεση της συγκέντρωσης του κάθε δείγματος DNA με τα εξής 88

90 αποτελέσματα: Για το SoxC5 = 85,03 ngr/μl (A260/230 = 1,3) και για το SoxC7 = 74,40 ngr/μl (A260/230 = 0,95). Επιλέξαμε το SoxC5 DNA για υπόστρωμα στην in vitro μεταγραφή λόγω μεγαλύτερης συγκέντρωσης και καθαρότητας σε σχέση με το ) Κατασκευή RNA ιχνηθετών Ακολούθησε in vitro μεταγραφή των προϊόνντων των PCR με M13 εκκινητές για την κατασκευή ιχνηθετών για τις υβριδοποιήσεις και τα RNA προϊόντα αυτής, ηλεκτροφορήθηκαν σε αποδιατακτικό πήκτωμα αγαρόζης με MOPS. Ως μάρτυρας για τον ποιοτικό καθορισμό του μήκους των ζωνών χρησιμοποιείται ολικό RNA απομονωμένο από στάδιο γαστριδίου του αχινού bp Εικόνα 52: In vitro μεταγραφή με υπόστρωμα το SoxC5 DNA από την PCR με M13 εκκινητές Πάλι, η ηλεκτροφόρηση επιβεβαίωσε την ορθότητα των πειραμάτων μας, δίνοντας μας ζώνη για τo RNA προϊόν μας στα αναμενόμενα μήκη βάσεων από τις βάσεις δεδομένων. Το προϊόν στη συνέχεια, μετά από το καθαρισμό με Sephadex, 89

91 φωτομετρήθηκε για προσδιορισμό της συγκέντρωσής τους : SoxC RNA = 114,05 ngr/μl (A260/230 = 2,25) 4.6) Αναπτυξιακό πρότυπο του SoxC Οι in situ υβριδοποιήσεις που ακολουθούν, έγιναν σε έμβρυα αχινού P.lividus διαφόρων πρώιμων αναπτυξιακών σταδίων (αυγό, στάδιο 16 κυττάρων, μεσεγχυματικό βλαστίδιο, γαστρίδιο, πρίσμα και πλουτέα) με τη χρήση των RNA ιχνηθετών που κατασκευάστηκαν με την in vitro μεταγραφή, αλλά και ιχνηθετών που προυπήρχαν και είχαν δοκιμαστεί παλαιότερα. Τα έμβρυα τοποθετήθηκαν σε γλυκερόλη 75% και παρατηρήθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο, υπό 40Χ μεγέθυνση και οι φωτογραφίες πάρθηκαν με τη κάμερα SPOT. SoxC Εικόνα 53: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του SoxC. Από αριστερά προς τα δεξιά σε πλάγια πρόσοψη (l/v) φαίνονται χαρακτηριστικά εμβρυικά στάδια του αχινού Ε: αυγό, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, ΜΒ: Μεσεγχυματικό Βλαστίδιο, G: Γαστρίδιο, Pr: Πρίσμα, Pl: Πλουτέας Μέχρι το στάδιο των 16 κυττάρων, δεν παρατηρείται έκφραση του SoxC, το οποίο οφείλεται στο ότι δεν εντοπίζεται μητρικό mrna σε αυτά τα στάδια. Στο βλαστίδιο, βλέπουμε καθαρά ότι η ζυγωτική έκφραση του περιορίζεται στα κύτταρα της φυτικής πλάκας, σχηματίζοντας έναν δακτύλιο στο φυτικό πόλο του εμβρύου. Στο γαστρίδιο, παρατηρούμε ανακατανομή (turnover) της έκφρασης του SoxC, όπου η έκφραση του στη φυτική πλάκα αρχίζει να απαλείφεται και μετατοπίζεται προς τη ζωική μεριά του εμβρύου, όπου mrna ανιχνεύεται σε προγονικά νευρικά κύτταρα του στοματικού εξωδέρματος, του αρχεντέρου και των εξωτερικών ορίων του ΑΝΕ. Μέχρι το στάδιο του πρίσματος, το πρότυπο που ξεκίνησε να καθορίζεται στο στάδιο του γαστριδίου 90

92 έχει παγιωθεί και παρατηρείται μηδενική έκφραση του SoxC στη φυτική πλάκα. Στο πλουτέα, παρατηρούμε έκφραση του SoxC σε νευρικά κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης, του κορυφαίου οργάνου και γύρω από τη περιοχή του στόματος (FACE). 4.7) Συνεντοπισμός του SoxC με γονίδια ρυθμιστές της νευρογένεσης Γνωρίζοντας τόσο βιβλιογραφικά, όσο και με προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου μας, τη σημαντικότητα των γονιδίων Six3, FoxQ2 και Delta στη νευρογένεση του αχινού, κρίθηκε αναγκαίο να βρεθεί αν το SoxC συνεντοπίζεται με αυτά τα μόρια και αν όχι, ποια η σχετική θέση έκφρασής του σε σχέση με αυτά τα μόρια. Οι υβριδοποιήσεις που παρουσιάζονται παρακάτω έγιναν με τη βοήθεια της τεχνικής της διπλής φθορίζουσας in situ υβριδοποίησης που περιγράφεται στη παράγραγο Τα έμβρυα παρατηρήθηκαν ύστερα από τοποθέτηση σε σταγόνα διαλύματος 75% γλυκερόλης, σε συνεστιακό μικροσκόπιο, υπό 40Χ μεγέθυνση και οι φωτογραφίες πάρθηκαν ψηφιακά με το Leica AF software. SoxC Delta 91

93 Εικόνα 54: Συνεντοπισμός SoxC-Delta σε έμβρυα αχινού στο στάδιο του πρίσματος. Με μπλε χρώμα απεικονίζονται οι πυρήνες των κυττάρων, με κόκκινο το SoxC και με πράσινο το Delta. Στο πλαίσιο merged απεικονίζονται και τα 3 κανάλια μαζί Τα αποτελέσματα του παραπάνω πειράματος δείχνουν ξεκάθαρα το συνεντοπισμό (με κίτρινο χρώμα) των Delta και SoxC σε νευρικά προγονικά κύτταρα που εντοπίζονται διάσπαρτα στο αρχέντερο, στο στοματικό εξώδερμα και στα εξωτερικά όρια του ΑΝΕ. Γνωρίζουμε ότι τα κύτταρα αυτά αποτελούν προνευρώνες, καθώς το Delta αποτελεί σημαντικό μάρτυρα νευρικών κυττάρων που διαφοροποιούνται και εμπλέκεται στο μηχανισμό πλάγιας αναστολής κατά τη νευρογένεση. Επίσης, το αποτέλεσμα αυτό συμφωνεί με τη βιβλιογραφία που αναφέρει ότι SoxC Delta συνεντοπίζονται ισχυρά και είναι απαραίτητα μόρια για τη διαφοροποίηση των νευρώνων στο έμβρυο του αχινού. SoxC FoxQ2 Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε έλεγχος για το συνεντοπισμό του FoxQ2 με το SoxC, καθώς το SoxC εκφράζεται στην περιοχή του ΑΝΕ και ο μεταγραφικός παράγοντας FoxQ2 αποτελεί καθοριστικό μόριο του καθορισμού αυτής της περιοχής και της διαφοροποίησης και τοποθέτησης των σεροτονεργικών νευρώνων. 92

94 Εικόνα 55: Συνεντοπισμός SoxC-FoxQ2 σε έμβρυα αχινού στο στάδιο του γαστριδίου. Με μπλε χρώμα απεικονίζονται οι πυρήνες των κυττάρων, με κόκκινο το FoxQ2 και με πράσινο το SoxC. Στο πλαίσιο merged απεικονίζονται και τα 3 κανάλια μαζί Τα αποτελέσματα του παραπάνω πειράματος δείχνουν ότι δεν παρατηρείται συνεντοπισμός των δύο μορίων στη κεντρική περιοχή του ΑΝΕ, δηλαδή την χαρακτηριστική επικράτεια έκφρασης του FoxQ2. Αυτό σημαίνει ότι το SoxC δεν εκφράζεται στη περιοχή αυτή, αλλά μόνο στα εξωτερικά όρια του ΑΝΕ, πιθανά λόγω κατασταλτικών σημάτων από την κεντρική περιοχή του ΑΝΕ. SoxC Six3 Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε έλεγχος του συνεντοπισμού του SoxC με το Six3, γονίδιο με καθοριστικό ρόλο στη νευρογένεση του εμβρύου του αχινού και με επικράτειες έκφρασης που είναι κοινές με αυτές του SoxC. 93

95 Εικόνα 56: Συνεντοπισμός SoxC-Six3 σε έμβρυα αχινού στο στάδιο του γαστριδίου (πάνω μέρος εικόνας) και πλουτέα (κάτω μέρος εικόνας). Με μπλε χρώμα απεικονίζονται οι πυρήνες των κυττάρων, με κόκκινο το SoxC και με πράσινο το Six3. Στο πλαίσιο merged απεικονίζονται και τα 3 κανάλια μαζί 94

96 Τα αποτελέσματα του συγκεκριμένου πειράματος έδειξαν ότι, όσον αφορά το στάδιο του γαστριδίου, το SoxC και το Six3 δεν συνεντοπίζονται σε προγονικά νευρικά κύτταρα του στοματικού εξωδέρματος, του αρχεντέρου και των ορίων του ΑΝΕ, αλλά εκφράζονται το ένα κοντά στο άλλο, πιθανά σε γειτονικά κύτταρα σε αυτές τις νευρογενείς περιοχές. Το ίδιο παρατηρείται και στο στάδιο του πλουτέα, όπου δεν συνεντοπίζονται, αλλά εκφράζονται σε γειτονικά προγονικά νευρικά κύτταρα του κορυφαίου οργάνου, της βλεφαριδωτής ζώνης και του φάρυγγα. Ωστόσο, υπάρχουν και οι εξαιρέσεις σε αυτές τις παρατηρήσεις, όπου στο στάδιο του γαστριδίου παρατηρείται ισχυρός συνεντοπισμός των SoxC Six3 στα δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα (ΔΜΚ), αριστερά και δεξιά του αρχεντέρου και σε διάσπαρτα κύτταρα του αρχεντέρου. Επίσης, στο στάδιο του πλουτέα, συνεντοπισμός παρατηρείται σε διάσπαρτα κύτταρα στη περιοχή του κορυφαίου οργάνου και του φάρυγγα. Αυτές οι εξαιρέσεις, πιθανά, οφείλονται στο στάδιο διαφοροποίησης των κυττάρων, δηλαδή στο πόσο πρώιμα ή νωρίς στη διαφοροποίηση βρίσκονται. Για παράδειγμα, τα ΔΜΚ είναι πρόδρομα κύτταρα, τα οποία στη συνέχεια της ανάπτυξης δίνουν τους κοιλωματικούς σάκους του εμβρύου. Επομένως, αυτός ο συνεντοπισμός των δύο μορίων οφείλεται στο ότι, λόγω του πρώιμου της ανάπτυξης της κυτταρικής σειράς, δεν έχουν προλάβει τα μόρια να διαχωριστούν και το καθένα να εξυπηρετήσει το διαφορετικό του ρόλο. Το ίδιο, πιθανά, συμβαίνει και με τα διάσπαρτα κύτταρα στις περιοχές του αρχεντέρου και του κορυφαίου οργάνου, δηλαδή τα πρόδρομα νευρικά κύτταρα να είναι σε τόσο πρώιμο στάδιο που το πρόγραμμα διαφοροποίησής τους δεν είχε λάβει μέρος ακόμα. 4.8) Έκφραση του SoxC σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να αναλυθεί η έκφραση του γονιδίου SoxC σε έμβρυα όπου έχει κατασταλεί ο Coup-TF, πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις (n=3) με χρήση του ιχνηθέτη έναντι του SoxC, σε έμβρυα ενεμένα με morpholino έναντι του Coup-TF (mocoup), τα οποία ενέθηκαν (συγκέντρωση morpholino = 0,125 mm), συλλέχθηκαν στις 26 ώρες και μονιμοποιήθηκαν με τη διαδικασία που περιγράφηκε στην παράγραφο Τα έμβρυα τοποθετήθηκαν σε γλυκερόλη 75% και παρατηρήθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο, υπό 40Χ μεγέθυνση και οι φωτογραφίες πάρθηκαν με τη κάμερα SPOT. 95

97 Εικόνα 57: In situ υβριδοποίηση για την έκφραση του SoxC σε έμβρυα ενεμένα με mocoup. Η κάθε σειρά εμβρύων αποτελεί μία βιολογική επανάληψη. Η πρώτη στήλη περιέχει control έμβρυα, μη ενεμένα και η δεύτερη και τρίτη στήλη περιέχουν ενεμένα έμβρυα. Όλα τα έμβρυα παρουσιάζονται σε πλάγια όψη (l/v). Σαν αρχική παρατήρηση των πειραμάτων είναι η ίδια η μορφολογία (φαινότυπος) των εμβρύων, όπου η καταστολή του Coup-TF έχει επιφέρει αδυναμία δημιουργίας του αρχεντέρου (ατελής γαστριδίωση) και ένα εξώδερμα με μεγαλύτερο πάχος επιθηλίου. Τα ενεμένα έμβρυα μοιάζουν με μεσεγχυματικά βλαστίδια στις 26 ώρες, ενώ τα έμβρυα ελέγχου έχουν προχωρήσει στο στάδιο του γαστριδίου με ένα πλήρως ανεπτυγμένο αρχέντερο. Επίσης, στο βλαστόκοιλο των ενεμένων εμβρύων παρατηρείται μεγάλος αριθμός μεσεγχυματικών κυττάρων. Όσον αφορά την επίδραση που έχει η καταστολή του Coup-TF στην έκφραση του SoxC, μπορούμε να δούμε ότι, όσον αφορά την περιοχή του ΑΝΕ, η οποία είναι νευρογενής και μας ενδιαφέρει ιδιαίτερα στη συγκεκριμένη εργασία, δεν παρατηρείται καμία αλλαγή στην έκφραση του SoxC. Η μόνη διαφορά που παρατηρείται μεταξύ εμβρύων ελέγχου και ενεμένων είναι στη φυτική πλάκα, όπου στα έμβρυα ελέγχου η έκφραση του SoxC έχει εξαφανιστεί, ενώ στα ενεμένα εκφράζεται ισχυρά. Πιθανά, αυτά οφείλεται στην έλλειψη γαστριδίωσης 96

98 στα ενεμένα έμβρυα, άρα και την παραμονή της έκφρασης του SoxC στη περιοχή της φυτικής πλάκας. Επομένως, μπορούμε να αναφέρουμε ότι η καταστολή του Coup-TF δεν επηρεάζει την έκφραση του SoxC στην περιοχή του πρόσθιου νευροεξωδέρματος. 4.9) Έκφραση του SoxC σε έμβρυα που έχουν κατασταλεί οι FoxQ2, Delta και Six3 Στη συνέχεια, κρίθηκε αναγκαία η μελέτη της πιθανής επίδρασης σημαντικών νευρογενών παραγόντων, όπως ο FoxQ2, ο Delta και ο Six3 στο μοτίβο έκφρασης του SoxC. Για να αναλυθεί η έκφραση του γονιδίου SoxC σε έμβρυα όπου έχει κατασταλεί ο FoxQ2, ο Delta και ο Six3, πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις (n=3) με χρήση του ιχνηθέτη έναντι του SoxC, σε έμβρυα ενεμένα με morpholino έναντι του FoxQ2 (mofoxq2), του Delta (modelta) και του Six3 (mosix3), τα οποία ενέθηκαν (συγκέντρωση morpholinos = 0,2 mm), συλλέχθηκαν στις ώρες και μονιμοποιήθηκαν με τη διαδικασία που περιγράφηκε στην παράγραφο Τα έμβρυα τοποθετήθηκαν σε γλυκερόλη 75% και παρατηρήθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο, υπό 40Χ μεγέθυνση και οι φωτογραφίες πάρθηκαν με τη κάμερα SPOT. Έκφραση του SoxC σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Delta 97

99 Εικόνα 58: In situ υβριδοποίηση για την έκφραση του SoxC σε έμβρυα ενεμένα με modelta. Η κάθε σειρά εμβρύων αποτελεί μία βιολογική επανάληψη. Η πρώτη στήλη περιέχει έμβρυα ελέγχου, μη ενεμένα και η δεύτερη στήλη περιέχει ενεμένα έμβρυα. Τα έμβρυα παρουσιάζονται σε πλάγια όψη (l/v) και όψη από τη φυτική πλευρά του εμβρύου (v/v). Η μορφολογία (φαινότυπος) των εμβρύων στις 24 ώρες, όπου έχει γίνει καταστολή του Delta φέρει, σε σχέση με τα έμβρυα ελέγχου, ένα υποανάπτυκτο αρχεντέρο (ατελής γαστριδίωση) και ένα μικρό σε έκταση βλαστόκοιλο. Τα αποτελέσματα σχετικά με την επίδραση που έχει η καταστολή του Delta στην έκφραση του SoxC, δείχνουν ότι δεν επιφέρεται άμεση αλλαγή στην έκφραση του SoxC, κάτι το οποίο ήταν και το αναμενόμενο. Ο Delta αποτελεί πρόσδεμα του υποδοχέα Notch και όχι μεταγραφικό παράγοντα, όπως είναι δηλαδή ο SoxC. Αυτά τα δύο μόρια συνεκφράζονται, όπως αποδείχτηκε παραπάνω, στα προγονικά νευρικά κύτταρα και ενώ o SoxC δρα στα κύτταρα αυτά, ο Delta εκκρίνεται από αυτά και αλληλοεπιδρά με γειτονικά κύτταρα που εκφράζουν Notch στην επιφάνεια τους και καταστέλλει τη νευρογένεση σε αυτά. Επομένως, αυτό το πείραμα ελέγχου επιβεβαίωσε ότι ενώ SoxC Delta συνεκφράζονται σε προγονικά νευρικά κύτταρα, δεν αλληλεπιδρούν και ο Delta δεν ρυθμίζει το ρόλο και τη δράση του SoxC. Ωστόσο, παρατηρείται μία αύξηση στον αριθμό των κυττάρων που εκφράζουν SoxC και αυτό οφείλεται στη μείωση δραστικότητας του μηχανισμού πλάγιας αναστολής. Αυτό το γεγονός, πιθανά, επιφέρει αύξηση του αριθμού των προγονικών νευρικών κυττάρων (SoxC θετικά) λόγω έλλειψης του μηχανισμού ρύθμισης του αριθμού που διαφοροποιούνται προς νευρικά κύτταρα. 98

100 Έκφραση του SoxC σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο FoxQ2 Εικόνα 59: In situ υβριδοποίηση για την έκφραση του SoxC σε έμβρυα ενεμένα με mofoxq2. Η κάθε σειρά εμβρύων αποτελεί μία βιολογική επανάληψη. Η πρώτη στήλη αποτελεί το αναπτυξιακό πρότυπο του FoxQ2. Η δεύτερη και Τρίτη στήλη αποτελούν το πείραμα υβριδοποίησης με SoxC ιχνηθέτη σε έμβρυα ενεμένα με mofoxq2. Η δεύτερη στήλη περιέχει έμβρυα ελέγχου, μη ενεμένα και η Τρίτη στήλη περιέχει ενεμένα έμβρυα. Τα έμβρυα παρουσιάζονται σε πλάγια όψη (l/v). Μορφολογικά, τα ενεμένα έμβρυα δεν παρουσιάζουν σημαντικές φαινοτυπικές αλλαγές σε σχέση με τα έμβρυα ελέγχου. Τα αποτελέσματα του συγκεκριμένου πειράματος δείχνουν ότι ο SoxC, στη περιοχή του ΑΝΕ, φαίνεται να εκφράζεται εκτοπικά στο κέντρο της επικράτειας, περιοχή που δεν εκφράζεται στα έμβρυα ελέγχου. Όπως φαίνεται και από το αναπτυξιακό πρότυπο της πρώτης στήλης, αυτή είναι η περιοχή που εκφράζεται αποκλειστικά ο FoxQ2, και πιθανά, καταστέλλει την έκφραση άλλων γονιδίων εκεί. Έτσι, στη περίπτωση που καταστείλαμε την έκφραση 99

101 του FoxQ2 στην κεντρική επικράτεια του ΑΝΕ, η έκφραση του SoxC δεν περιορίστηκε μόνο στα εξωτερικά όρια του ΑΝΕ, αλλά επεκτάθηκε σε όλη την περιοχή του ΑΝΕ. Επομένως, συμπεραίνουμε ότι ο FoxQ2 καταστέλλει την έκφραση του SoxC στην κεντρική επικράτεια του ΑΝΕ. Έκφραση του SoxC σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Six3 Εικόνα 60: In situ υβριδοποίηση για την έκφραση του SoxC σε έμβρυα ενεμένα με mosix3. Η κάθε σειρά εμβρύων αποτελεί μία βιολογική επανάληψη. Η πρώτη στήλη περιέχει έμβρυα ελέγχου, μη ενεμένα και η δεύτερη στήλη περιέχει ενεμένα έμβρυα. Τα έμβρυα παρουσιάζονται σε πλάγια όψη (l/v). Όπως αναφέρθηκε και στην εισαγωγή, ο Six3 αποτελεί καθοριστικό παράγοντα της νευρογένεσης στο έμβρυο του αχινού και ενεργοποιεί πλήθος παραγόντων διαφοροποίησης των νευρώνων. Ο SoxC αποτελεί σημαντικό παράγοντα διαφοροποίησης των προγονικών νευρικών κυττάρων, που βιβλιογραφικά, φαίνεται ότι εμπλέκεται σε σηματοδοτικό μονοπάτι που δέχεται σήματα ενεργοποίησης από το Six3. 100

102 Τα αποτελέσματα αυτού του πειράματος δείχνουν καθαρά ότι, η έκφραση του SoxC δεν επηρεάζεται από την καταστολή του Six3. Επομένως, η λειτουργία του SoxC στη διαφοροποίηση των προγονικών νευρικών κυττάρων είναι ανεξάρτητη ή εμπλέκεται σε διαφορετικό σηματοδοτικό μονοπάτι από αυτό του Six3. Ενδεχομένως, το SoxC να δέχεται ενεργοποιητικά σήματα από το Six3, αλλά η απομάκρυνση αυτών των σημάτων δεν είναι ικανή να μειώσει ή να απομακρύνει παντελώς τη δράση και έκφραση του SoxC. 4.9) Έκφραση του Six3 σε έμβρυα που έχουν κατασταλεί o Coup-TF Προηγούμενες εργασίες του εργαστηρίου έδειξαν ότι σε περίπτωση κατάστολής του Coup-TF, η έκφραση του Six3 μειώνεται μερικώς έως χάνεται πλήρως. Επειδή η σημαντικότητα του Six3 στη νευρογένεση είναι μεγάλη και φάνηκε ότι η λειτουργία του μπορεί να βασίζεται στη δράση του Coup-TF, η προηγούμενη δουλειά βασίστηκε σε αυτά τα δεδομένα. Ωστόσο, όσον αφορά το SoxC, τα αποτελέσματα δεν έδειξαν κάποια σύνδεση του παράγοντα με το Coup-TF ή το Six3. Γι αυτό το λόγο, προχωρήσαμε σε επανάληψη των πειραμάτων αποσιώπησης του Coup-TF και πραγματοποίηση in situ υβριδοποίησης με χρήση Six3 ιχνηθέτη με σκοπό τη βεβαίωση της πιστότητας των προηγούμενων αποτελεσμάτων. Η συγκέντρωση του morpholino έναντι στο Coup-TF = 0,125 mm. 101

103 Εικόνα 61: In situ υβριδοποίηση για την έκφραση του Six3 σε έμβρυα ενεμένα με mocoup. Η κάθε σειρά εμβρύων αποτελεί μία βιολογική επανάληψη. Η πρώτη στήλη περιέχει control έμβρυα, μη ενεμένα και η δεύτερη και τρίτη στήλη περιέχουν ενεμένα έμβρυα. Όλα τα έμβρυα παρουσιάζονται σε πλάγια όψη (l/v). Τα αποτελέσματα του πειράματος έδειξαν ότι η έκφραση του Six3 δεν επηρεάζεται από την αποσιώπηση του Coup-TF, σε αντίθεση με τα παλαιότερα αποτελέσματα. Ο Six3 συνεχίζει να εκφράζεται στις περιοχές της βλεφαριδωτής ζώνης, του αρχεντέρου και του στοματικού εξωδέρματος. Όπως αναφέρθηκε και στην εισαγωγή, ο Six3 εκφράζεται και στα εξωτερικά όρια του ΑΝΕ και όχι κεντρικά, στη περιοχή έκφρασης του FoxQ2. Σε αυτή τη κεντρική περιοχή του ΑΝΕ, εκφράζεται και ο Coup-TF. Φαίνεται πως στα ενεμένα με mocoup έμβρυα, ο Six3 εκφράζεται σ αυτή την κεντρική περιοχή και δεν σχηματίζει το χαρακτηριστικό δακτύλιο γύρω από αυτή την περιοχή, όπως συμβαίνει στα έμβρυα ελέγχου. Επομένως συμπεραίνουμε ότι η έκφραση του Six3 δεν επηρεάζεται από την αποσιώπηση του Coup-TF, παρά μόνο στη περιοχή του πρόσθιου εξωδέρματος, όπου εκφράζεται εκτοπικά και στη κεντρική του περιοχή. 4.10) Δημιουργία σεροτονεργικών νευρώνων σε έμβρυο αχινού που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Παλαιότερα πειράματα του εργαστηρίου είχαν υποδείξει ότι αποσιώπηση του Coup-TF οδηγεί σε αδυναμία σχηματισμού σεροτονεργικών νευρώνων στο έμβρυο του αχινού και αυτό αποτέλεσε μία πρώτη ένδειξη του ρόλου του παράγοντα αυτού στη νευρογένεση. Οι σεροτονεργικοί νευρώνες, όπως φαίνεται και στην εικόνα, στο στάδιο του πλουτέα, σχηματίζονται στη περιοχή του κορυφαίου οργάνου (εξελικτικό προϊόν του ΑΝΕ) και εντοπίστηκαν με τη χρήση της τεχνικής του ανοσοφθορισμού. Το πρώτο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν αντί της σεροτονίνης, το δεύτερο αντίσωμα περιείχε το φθορόχρωμα Alexa 555 και οι πυρήνες φαίνονται με τη βοήθεια της DAPI. Η φωτογραφία τραβήχτηκε σε συνεστιακό μικροσκόπιο, σε μεγέθυνση φακού 40Χ. Συμπληρωματικά, για επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων λοιπόν, πραγματοποιήθηκε 102

104 ανοσοφθορισμός σε έμβρυα ενεμένα με morpholino έναντι του Coup-TF (mocoup), τα οποία ενέθηκαν (συγκέντρωση morpholino = 0,125 mm), συλλέχθηκαν στις 48 ώρες και μονιμοποιήθηκαν με τη διαδικασία που περιγράφηκε στην παράγραφο Εικόνα 62: Ανοσοφθορισμός έναντι της σεροτονίνης σε έμβρυα του αχινού P.lividus στο στάδιο του πλουτέα. Η πάνω σειρά περιέχει έμβρυα ελέγχου και η κάτω σειρά περιέχει ενεμένα με mocoup έμβρυα, μονιμοποιημένα στις 48 ώρες. Με μπλε χρώμα απεικονίζονται οι πυρήνες των κυττάρων, με κόκκινο οι σεροτονεργικοί νευρώνες και merged αποτελεί εικόνα με τα δύο κανάλια μαζί Όσον αφορά τη μορφολογία, τα ενεμένα έμβρυα δεν μοιάζουν με πλουτείς, όπως τα έμβρυα ελέγχου, αλλά με πρώιμα πρίσματα. Στα έμβρυα ελέγχου, παρατηρούμε ισχυρό και ιστοειδικό φθορισμό από την Alexa 555 στη περιοχή του κορυφαίου οργάνου, στα κύτταρα των σεροτονεργικών νευρώνων. Συγκρίνοντας με τα έμβρυα ελέγχου, παρατηρούμε ότι στα έμβρυα όπου ο Coup-TF έχει κατασταλεί, δεν υπάρχει φθορισμός της Alexa 555 στη περιοχή του ΑΝΕ, δηλαδή δεν υπάρχουν σεροτονεργικοί νευρώνες. Επομένως, τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν ότι η αποσιώπηση του Coup-TF δεν επιτρέπει των σχηματισμό σεροτονεργικών νευρώνων στα πρώιμα εμβρυικά στάδια του αχινού. Σε συνδυασμό με τα υπόλοιπα αποτελέσματα, συνεχίσαμε γνωρίζοντας ότι ο Coup-TF λειτουργεί με μηχανισμό, στον οποίο δεν εμπλέκεται ο Six3 και ο ρόλος 103

105 του σχετικά με τη διαφοροποίηση των σεροτονεργικών νευρώνων έπρεπε να ερευνηθεί σε μοριακό επίπεδο. 4.11) Αναπτυξιακά πρότυπα έκφρασης γονιδίων διαφοροποίησης των σεροτονεργικών νευρώνων Στη συνέχεια, εξετάστηκε το μοτίβο έκφρασης σημαντικών παραγόντων διαφοροποίησης και ωρίμανσης των σεροτονεργικών νευρώνων, των Hbn, Fez και Sip1 σε έμβρυα του αχινού P.lividus. Οι in situ υβριδοποιήσεις που ακολουθούν, έγιναν σε έμβρυα πρώιμων αναπτυξιακών σταδίων (αυγό, στάδιο 16 κυττάρων, μεσεγχυματικό βλαστίδιο, γαστρίδιο, πρίσμα και πλουτέα) με τη χρήση των RNA ιχνηθετών με διγοξιγενίνη, που είχαν κατασκευαστεί από παλαιότερα μέλη του εργαστηρίου και ήταν πλήρως λειτουργικοί και δοκιμασμένοι. Οι συγκεντρώσεις των ιχνηθετών ήταν: Hbn = 27,76 ngr/μl, Fez = 34 ngr/μl και Sip1 = 125 ngr/μl. Τα έμβρυα τοποθετήθηκαν σε γλυκερόλη 75% και παρατηρήθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο, υπό 40Χ μεγέθυνση και οι φωτογραφίες πάρθηκαν με τη κάμερα SPOT. Hbn Εικόνα 63: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του Hbn. Από αριστερά προς τα δεξιά σε πλάγια πρόσοψη (l/v) φαίνονται χαρακτηριστικά εμβρυικά στάδια του αχινού Ε: αυγό, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, ΜΒ: Μεσεγχυματικό Βλαστίδιο, G: Γαστρίδιο, Pr: Πρίσμα, Pl: Πλουτέας Μέχρι το στάδιο των 16 κυττάρων, δεν παρατηρείται έκφραση του Hbn, το οποίο οφείλεται στο ότι δεν εντοπίζεται μητρικό mrna σε αυτά τα στάδια. Στο βλαστίδιο, βλέπουμε καθαρά ότι η ζυγωτική έκφραση του περιορίζεται στα κύτταρα της μελλοντικής περιοχής του ΑΝΕ, που τώρα αρχίζει να καθορίζεται από σηματοδοτικά μονοπάτια των ΑP και DV αξόνων. Στο γαστρίδιο, παρατηρούμε ότι η έκφραση του 104

106 Hbn αρχίζει να γίνεται πιο ιστοειδική, και μάλιστα να προσανατολίζεται από τη ραχιαία μεριά του ΑΝΕ, όπου σχηματίζονται οι σεροτονεργικοί νευρώνες. Μέχρι το στάδιο του πρίσματος, το πρότυπο που ξεκίνησε να καθορίζεται στο στάδιο του γαστριδίου έχει παγιωθεί και δεν υπάρχει καθόλου έκφραση του γονιδίου στην κεντρική περιοχή του ΑΝΕ (FoxQ2 θετική περιοχή) και στη κοιλιακή μεριά των εξωτερικών ορίων του ΑΝΕ. Στο πλουτέα, παρατηρούμε έκφραση του Hbn σε κύτταρα που περικλείουν αριστερά και δεξιά το κορυφαίο όργανο, σε μορφή πετάλου που εκτείνεται τρισδιάστατα στην πίσω μεριά του εμβρύου, όπως φαίνεται στην εικόνα, που αποτελεί στοματικό εξώδερμα. Fez Εικόνα 64: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του Fez. Από αριστερά προς τα δεξιά σε πλάγια πρόσοψη (l/v) φαίνονται χαρακτηριστικά εμβρυικά στάδια του αχινού Ε: αυγό, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, ΜΒ: Μεσεγχυματικό Βλαστίδιο, G: Γαστρίδιο, Pr: Πρίσμα, Pl: Πλουτέας Στο στάδιο του αυγού παρατηρείται μητρικό mrna, το οποίο αποικοδομείται μέχρι το στάδιο των 16 κυττάρων, όπου δεν παρατηρείται μητρική έκφραση του Fez. Στο βλαστίδιο, βλέπουμε καθαρά ότι η ζυγωτική έκφραση του περιορίζεται στα κύτταρα της μελλοντικής περιοχής του ΑΝΕ. Στο γαστρίδιο, παρατηρούμε ότι η έκφραση του Fez αρχίζει να γίνεται πιο ειδική και να προσανατολίζεται από τη ραχιαία μεριά του ΑΝΕ, όπου σχηματίζονται οι σεροτονεργικοί νευρώνες, αφήνοντας ένα εμφανές κενό στη κεντρική περιοχή του ΑΝΕ. Μέχρι το στάδιο του πρίσματος, το πρότυπο αυτό γίνεται ακόμα πιο ειδικό και ο Fez εκφράζεται σε 3 κύτταρα στη ραχιαία μεριά των ορίων του ΑΝΕ, που αποτελούν τους σεροτονεργικούς νευρώνες του εμβρύου. Μικρή έκφραση του Fez παρατηρείται και σε νευρικά κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης και στη βάση του αρχεντέρου. Στο πλουτέα, παρατηρούμε έκφραση του Fez σε 105

107 σεροτονερικά κύτταρα του κορυφαίου οργάνου, καθώς και σε κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης και του μεσαίου στομάχου. Sip1 Εικόνα 65: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του Sip1. Από αριστερά προς τα δεξιά σε πλάγια πρόσοψη (l/v) φαίνονται χαρακτηριστικά εμβρυικά στάδια του αχινού Ε: αυγό, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, ΜΒ: Μεσεγχυματικό Βλαστίδιο, G: Γαστρίδιο, Pr: Πρίσμα, Pl: Πλουτέας Μέχρι το στάδιο των 16 κυττάρων, δεν παρατηρείται έκφραση του Sip1, το οποίο οφείλεται στο ότι δεν εντοπίζεται μητρικό mrna σε αυτά τα στάδια. Στο βλαστίδιο, βλέπουμε ότι η ζυγωτική έκφραση του εντοπίζεται σε εκτενέστερη περιοχή του μελλοντικού στοματικού εξωδέρματος και στη φυτική πλάκα. Στο γαστρίδιο και στο πρίσμα, παρατηρούμε ότι η έκφραση του Sip1 αρχίζει να γίνεται πιο ιστοειδική, όπου εντοπίζεται στις περιοχές του στοματικού εξωδέρματος, στα μέσα του αρχεντέρου και γύρω από τη περιοχή του ΑΝΕ, στα ραχιαία του όρια. Στο πλουτέα, παρατηρούμε έκφραση του Sip1 σε κύτταρα του κορυφαίου οργάνου, στη βλεφαριδωτή ζώνη που διατρέχει τους στοματικούς βραχίονες του πλουτέα και στον οισοφάγο του εντερικού σωλήνα. 4.12) Έκφραση γονιδίων διαφοροποίησης σεροτονεργικών νευρώνων σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Καθώς, όπως αναφέραμε, η καταστολή του Coup-TF οδηγεί σε απώλεια σεροτονεργικών νευρώνων και η έκφρασή του επικαλύπτεται με αυτή των γονιδίων Fez, Hbn και Sip1, θέλουμε να μελετήσουμε την επίδραση αυτής της αποσιώπησης του Coup-TF στην έκφραση των γονιδίων αυτών, καθώς λαμβάνουν σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των σεροτονεργικών νευρώνων. Οι in situ υβριδοποιήσεις πραγματο- 106

108 ποιήθηκαν σε έμβρυα ενεμένα με morpholino έναντι του Coup-TF (mocoup), τα οποία ενέθηκαν (συγκέντρωση morpholino = 0,125 mm), συλλέχθηκαν στις 26 ώρες και μονιμοποιήθηκαν με τη διαδικασία που περιγράφηκε στην παράγραφο Τα έμβρυα τοποθετήθηκαν σε γλυκερόλη 75% και παρατηρήθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο, υπό 40Χ μεγέθυνση και οι φωτογραφίες πάρθηκαν με τη κάμερα SPOT. Hbn Εικόνα 66: In situ υβριδοποίηση για την έκφραση του Hbn σε έμβρυα ενεμένα με mocoup. Η κάθε σειρά εμβρύων αποτελεί μία βιολογική επανάληψη. Η πρώτη στήλη περιέχει control έμβρυα, μη ενεμένα και η δεύτερη και τρίτη στήλη περιέχουν ενεμένα έμβρυα. Όλα τα έμβρυα παρουσιάζονται σε πλάγια όψη (l/v). Τα αποτελέσματα του πειράματος αυτού δείχνουν ότι η αποσιώπηση του Coup-TF οδηγεί σε απώλεια έκφρασης του Hbn. Όπως και την σειρά παραπάνω, έτσι και εδώ, στα έμβρυα ελέγχου παρατηρούμε ισχυρά ιστοειδική έκφραση του Hbn στη περιοχή 107

109 των ραχιαίων ορίων του ΑΝΕ, κάτι το οποίο δεν παρατηρείται στα έμβρυα ενεμένα με mocoup. Σε αυτά, η έκφραση του Hbn εξαλείφεται παντελώς. Fez Εικόνα 67: In situ υβριδοποίηση για την έκφραση του Fez σε έμβρυα ενεμένα με mocoup. Η κάθε σειρά εμβρύων αποτελεί μία βιολογική επανάληψη. Η πρώτη στήλη περιέχει control έμβρυα, μη ενεμένα και η δεύτερη και τρίτη στήλη περιέχουν ενεμένα έμβρυα. Όλα τα έμβρυα παρουσιάζονται σε πλάγια όψη (l/v). Τα αποτελέσματα του πειράματος αυτού δείχνουν ότι η αποσιώπηση του Coup-TF οδηγεί σε απώλεια έκφρασης του Fez. Στα έμβρυα ελέγχου παρατηρούμε ισχυρά ιστοειδική έκφραση του Fez στη περιοχή του ΑΝΕ και πιο συγκεκριμένα, σε 2-3 κύτταρα που αποτελούν τους σεροτονεργικούς νευρώνες, κάτι το οποίο δεν παρατηρείται στα έμβρυα ενεμένα με mocoup. Σε αυτά, η έκφραση του Fez εξαλείφεται παντελώς. 108

110 Sip1 Εικόνα 68: In situ υβριδοποίηση για την έκφραση του Sip1 σε έμβρυα ενεμένα με mocoup. Η κάθε σειρά εμβρύων αποτελεί μία βιολογική επανάληψη. Η πρώτη στήλη περιέχει control έμβρυα, μη ενεμένα και η δεύτερη και τρίτη στήλη περιέχουν ενεμένα έμβρυα. Όλα τα έμβρυα παρουσιάζονται σε πλάγια όψη (l/v). Τα αποτελέσματα του πειράματος αυτού δείχνουν ότι η αποσιώπηση του Coup-TF οδηγεί σε επέκταση της έκφρασης του Sip1 σε όλη την έκταση των εμβρύων. Στα έμβρυα ελέγχου, παρατηρούμε ιστοειδική έκφραση του Sip1 στις περιοχές του στοματικού εξωδέρματος, του αρχεντέρου και του ΑΝΕ. Συγκρίνοντας αυτό το πρότυπο με αυτό των ενεμένων εμβρύων, η ιστοειδικότητα της έκφρασης έχει χαθεί και μετάγραφα του Sip1 εντοπίζονται σε όλο το έμβρυο. 109