Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΞΥ-ΤΕΛΙΚΗΣ ΕΠΕΚΤΑΣΗΣ ΤΗΣ ΕΠΙΚΡΑΤΕΙΑΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΣΤΟ DNA ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ COUP-TF

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΚΑΡΒΟΞΥ-ΤΕΛΙΚΗΣ ΕΠΕΚΤΑΣΗΣ ΤΗΣ ΕΠΙΚΡΑΤΕΙΑΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΣΤΟ DNA ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ COUP-TF ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Ζήνων Ζήνωνος ΑΜ: 409 Πάτρα, Ιούλιος 2009

2 Εικόνα στο εξώφυλλο: Ένα σύμπλοκο του μοτίβου δάκτυλοι ψευδαργύρου με το DNA

3

4 ΑΝΤΙ ΠΡΟΛΟΓΟΥ Η παρούσα Μεταπτυχιακή Διατριβή διεξήχθη στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας κατά την περίοδο με επιβλέπων τον Αναπληρωτή Καθηγητή κύριο Φλυτζάνη Κωνσταντίνο. Η διεκπεραίωση της εργασίας αυτής έχει ιδιαίτερη σημασία για μένα διότι σηματοδοτεί το τέλος των σπουδών μου στην Ελλάδα. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά κάποιους ανθρώπους-παράγοντες που με βοήθησαν με τον ένα ή τον άλλο τρόπο, ώστε να φέρω εις πέρας το δύσκολο έργο που μου ανατέθηκε και να βρίσκομαι σήμερα στην ευχάριστη θέση να παρουσιάζω τη δουλειά μου. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στο Κοινωφελές Ίδρυμα Αλέξανδρος Σ. Ωνάσης για την υποτροφία που μου παρείχε κατά την περίοδο Η χρηματοδότηση αυτή αξιοποιήθηκε με τον καλύτερο δυνατό τρόπο και αυτό αποδεικνύεται με τη δουλεία που παρουσιάζεται μέσα από την παρούσα Μεταπτυχιακή Διατριβή. Ευχαριστώ πολύ τον Αναπληρωτή Καθηγητή κύριο Κατσώρη Παναγιώτη που δέχτηκε με ευχαρίστηση να είναι μέλος της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής μου. Θερμές ευχαριστίες οφείλω επίσης στον Καθηγητή κύριο Αναστάσιο Μίτζα που με υποστήριξε σε περιόδους ορόσημα για την μελλοντική μου πορεία. Ακόμα, οφείλω να ομολογήσω ότι οι συζητήσεις μαζί του ήταν ιδιαίτερα εποικοδομητικές και με βοήθησαν να ξεπεράσω αρκετά από τα προβλήματα που παρουσιάστηκαν κατά τη διάρκεια των πειραμάτων μου. Ευχαριστώ τις υποψήφιες διδάκτορες Βίκυ και Χρυσαυγή από το εργαστήριο Βιοχημείας της Ιατρικής Σχολής οι οποίες με βοήθησαν στα πειράματα που απαιτούσαν την χρήση του phosphorimager. Ευχαριστώ θερμά το υποψήφιο διδάκτορα Γιάννη Τσιρώνη, ένα πανέξυπνο επιστήμονα και αυθεντικό άνθρωπο, ο οποίος πάντοτε έβρισκε τον τρόπο να με ωθεί να ξεπερνώ τα όποια εμπόδια παρουσιάζονταν στον δρόμο μου. Δεν θα μπορούσα φυσικά να μην ευχαριστήσω ολόψυχα τους ακούραστους υπηρέτες της ζωής μου, τους δυο μου γονείς και τη φίλη μου Κυριακή. Φρόντιζαν πάντοτε, να μην στερηθώ απολύτως τίποτα, αντιμετώπισαν τις γκρίνιες και τις στεναχώριες μου με υπομονή, ενώ παράλληλα η αγάπη και η ψυχολογική υποστήριξη που μου παρείχαν μου έδινε δύναμη να συνεχίσω αφοσιωμένος στο έργο μου. Άφησα τελευταίο έναν άνθρωπο ξεχωριστό, έναν άριστο διδάσκαλο, έναν άνθρωπο που χρήζει σεβασμό από όλους, έναν άνθρωπο αξιαγάπητο. Και αυτός δεν είναι άλλος από τον Αναπληρωτή Καθηγητή κύριο Φλυτζάνη Κωνσταντίνο. Πραγματικός στηλοβάτης στο πλευρό μου πάντοτε με υποστήριζε και μου έδειχνε το σωστό δρόμο. Οι συμβουλές του πάντοτε έπιαναν τόπο στις τελικές μου αποφάσεις. ΣΑΣ ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΟΛΟΥΣ I

5 Στους Ανδρέα, Γιώργο, Κυριακή και Μαρία Πάτρα, Ιούλιος 2009 II

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ. 1 (A) ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Α.1) Ο Paracentrotus lividus.4 (A.1.1) ΑΝΑΤΟΜΙA KAI ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ...4 (A.1.2) ΤΑ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΑ ΣΤΑΔΙΑ ΤΟΥ ΑΧΙΝΟΥ...6 (A.1.3) Ο ΑΧΙΝΟΣ ΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ.12 (Α.2) Η ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ / ΘΥΡΕΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ.. 13 (Α.3) Η ΥΠΟΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ COUP-TFS..15 (Α.3.1) Η ΠΡΩΤΕΙΝΗ COUP-TF.15 (Α.3.2) ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ COUP-TF..17 (Α.3.3) H ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ COUP-TF..19 (Α.3.4) COUP-TF ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ. 20 (Α.3.5) O COUP-TF ΣΤΟΝ ΑΧΙΝΟ S.purpuratus. 23 (Α.3.6) COUP-TF ΣΤΟΝ ΑΧΙΝΟ Paracentrotus lividus..27 (Β) ΣΚΟΠΟΣ..31 (Γ) ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...34 (Γ.1) ΚΑΤΕΥΘΥΝΟΜΕΝΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΣΗ 34 (Γ.1.1) INVERT PCR (Γ.1.2) ΠΕΨΗ ΜΕ TO ΕΝΖΥΜΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ DpnI..37 (Γ.1.3) ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ (Γ.1.4) ΣΤΕΡΕΗ ΚΑΛΙΕΡΓΕΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ L Broth..38 (Γ.1.5)ΥΓΡΗ ΚΑΛΙΕΡΓΕΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ L Broth.39 (Γ.2) ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΟΥ ΜΙΚΡΗΣ ΚΛΙΜΑΚΑΣ (minipreps) 40 (Γ.3) ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΟΥ ΜΕΣΗΣ ΚΛΙΜΑΚΑΣ (midipreps)..41 III

7 (Γ.4) ΠΕΨΗ ΜΕ ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ NcοΙ.42 (Γ.5)ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ DNA ΣΕ ΜΗ ΑΠΟΔΙΑΤΑΚΤΙΚΟ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ.. 43 (Γ.6) ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΤΩΝ ΚΛΩΝΩΝ ΠΟΥ ΕΠΙΛΕΧΘΗΚΑΝ...45 (Γ.7) ΠΕΨΗ ΜΕ ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ HindIII..45 (Γ.8)ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ DNA ME ΦΑΙΝΟΛΗ-ΧΛΩΡΟΦΟΡΜΙΟ ΚΑΙ ΚΟΛΩΝΑ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ (Γ.9) in vitro ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ..47 (Γ.9.1) Promega...47 (Γ.9.2) mmessage mmachine kit (T7) Ambion..48 (Γ.10) ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ RNA ΣΕ ΑΠΟΔΙΑΤΑΚΤΙΚΟ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ..49 (Γ.11)ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ RNA ME ΦΑΙΝΟΛΗ-ΧΛΩΡΟΦΟΡΜΙΟ ΚΑΙ KOΛΩΝΑ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ (Γ.12) in vitro ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ (Γ.12.1) ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ. 51 (Γ ) Wheat Germ Extract (Promega) (Γ ) Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega) 52 (Γ.12.2) ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΜΗ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (Γ ) Wheat Germ Extract (Promega) (Γ ) Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega) 53 (Γ ) Flexi Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega).. 54 (Γ.12.3) in vitro co-translation με το Wheat Germ Extract (Promega) 54 (Γ.13) ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ SDS-PAGE 55 (Γ.14) Ξήρανση και Αυτοραδιογραφία.. 57 (Γ.15) Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)...58 (Γ.15.1) ΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΤΜΗΜΑΤΩΝ ΣΕ ΔΙΚΛΩΝΟ...58 (Γ.15.2) ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΚΙΝΑΣΗΣ ΚΑΙ ΣΗΜΑΝΣΗ ΜΕ 32 P...59 (Γ.15.3) ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΠΗΚΤΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 60 (Γ.15.4) ANAΛΥΣΗ ΜΕ PHOSPHORIMAGER 62 (Γ.16) ΕΝΕΣΕΙΣ RNA ΣΕ ΕΜΒΡΥΑ ΑΧΙΝΟΥ.. 63 IV

8 (Γ.16.1) ΣΥΛΛΟΓΗ ΓΑΜΕΤΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΑΥΓΩΝ ΑΧΙΝΟΥ ΓΙΑ ΕΝΕΣΕΙΣ 63 (Γ.16.2) ΤΟΠΟΘΕΤΗΣΗ ΤΩΝ ΑΥΓΩΝ ΣΕ PETRI ΚΑΙ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ (Γ.16.3) ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ RNAs ΚΑΙ ΕΝΕΣΕΙΣ (Δ) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Δ.1) ΠΕΨΕΙΣ ΜΕ NcoI.67 (Δ.2) ΠΕΨΕΙΣ ΜΕ HindIII..70 (Δ.3) in vitro ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ...70 (Δ.4) ΑΝΑΛΥΣΗ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΑ ΣΕΣΗΜΑΣΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ SDS- PAGE..71 (Δ.5) EMSA.72 (Δ.5.1) ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΩΝ ΟΜΟΔΙΜΕΡΩΝ.72 (Δ.5.2) ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΩΝ ΕΤΕΡΟΔΙΜΕΡΩΝ. 73 (Δ.5.3)ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΩΝ ΕΤΕΡΟΔΙΜΕΡΩΝ ΜΕ PHOSPORIMAGER. 74 (Δ.6) ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ ΕΝΕΜΕΝΩΝ ΕΜΒΡΥΩΝ (E) ΣΥΖΗΤΗΣΗ...78 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ. 86 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ V

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Oι COUP-TFs (Chicken Ovalvumin Upstream Promoter Transcription Factrors) είναι ορφανοί πυρηνικοί υποδοχείς που ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων στεροειδών/θυρεοειδών ορμονών. Εμφανίζουν μεγάλη ομολογία σε όλα τα μετάζωα και εκφράζονται κατά προτίμηση στο νευρικό σύστημα. Εκτός της συντηρημένης αλληλουχίας τους, επίσης συντηρημένες είναι και οι θέσεις των εσoνίων στους διάφορους οργανισμούς ενώ, μέχρι πρόσφατα, δεν είχε παρατηρηθεί εναλλακτικό μάτισμα. Ωστόσο έχουμε δείξει ότι στα εχινόδερμα, υπάρχουν δύο μετάγραφα, αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος ενός μικρού εξονίου 63 bps. Τα δύο mrnas παράγουν δύο πρωτεΐνες, η μεγαλύτερη εκ των οποίων περιέχει 21 επιπρόσθετα αμινοξέα στην κάρβοξυ-τελική επέκταση της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). Πειράματα EMSA έδειξαν ότι η μικρή ισομορφή του COUP-TF, ως ομοδιμερές, προσδένεται με διαφoρετική συγγένεια σε όλα τα στοιχεία απόκρισης που εξετάστηκαν. Η μεγάλη ισομορφή εν αντιθέσει, δεν προσδένεται αποτελεσματικά σε κανένα από αυτά τα στοιχεία απόκρισης, ούτε ως ομοδιμερές ούτε ως ετεροδιμερές με τη μικρή ισομορφή. Επίσης, πειράματα ανοσοφθορισμού, έχουν δείξει ότι σε έμβρυα αχινού στο στάδιο των 16 κυττάρων, η μεγάλη πρωτεΐνη εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ για τη μικρή πρωτεΐνη είναι γνωστή η παρουσία της στον πυρήνα. Ο σκοπός της εργασίας αυτής είναι η μελέτη του ρόλου της ένθεσης των 21 αμινοξέων στην μεγάλη ισομορφή, όσον αφορά στην κυτταρική διαμερισματοποίηση και στη συγγένεια πρόσδεσης στο DNA. Στην ένθεση αυτή υπάρχουν δύο προλίνες και τρείς θρεονίνες. Η προλίνη γενικότερα βρίσκεται σε σημεία όπου μία πρωτεΐνη κάμπτεται. Η υπόθεσή μας είναι ότι οι προλίνες αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο στη στερεοδιαμόρφωση της πρωτεΐνης, που με τη σειρά της είναι υπεύθυνη για τις αλλαγές που παρατηρούνται στη μεγάλη ισομορφή, ως προς την συγγένεια πρόσδεσης στο DNA και την κυτταρική διαμερισματοποίηση, σε σχέση με την μικρή. Επίσης η θρεονίνη είναι ένα αμινοξύ που μπορεί να δεκτεί φωσφορυλίωση. Γεγονότα φωσφορυλίωσης και αποφοσφωρυλίωσης μπορεί να επηρεάζουν την ικανότητα πρόσδεσης και την κυτταρική διαμερισματοποίηση του υποδοχέα. 1

10 Για να ελεχθούν οι υποθέσεις αυτές, μεταλλάχθηκαν οι δύο προλίνες και οι τρεις θρεονίνες της μεγάλης ισομορφής σε αλανίνες, παράχθηκαν in vitro οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες και προσδιορίστηκε η συγγένεια πρόσδεσης τους στο DNA με πειράματα EMSA. Οι ίδιες μεταλλάξεις πραγματοποιήθηκαν και σε ένα κατασκεύασμα το οποίο κωδικοποιεί για τη χιμαιρική πρωτεΐνη που αποτελείται από τη μεγάλη ισομορφή και τη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη. Τα in vitro παραχθέντα RNAs ενέθηκαν σε έμβρυα αχινού ώστε να μελετηθεί η ενδοκυτταρική κατανομή της μεγάλης COUP-TF ισομορφής. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι δύο προλίνες δεν φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο όσον αφορά την πρόσδεση της μεγάλης COUP-TF ισομορφής ως ομοδιμερές. Εντούτοις οι δύο αυτές προλίνες φαίνεται να επηρεάζουν την πρόσδεση της μεγάλης ισομορφής COUP-TF ως ετεροδιμερές με τρόπο ώστε να την ενισχύει. 2

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 3

12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (A) ΕΙΣΑΓΩΓΗ (Α.1) Ο Paracentrotus lividus (A.1.1) ΑΝΑΤΟΜΙA KAI ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Ο Paracentrotus lividus, είναι ο κοινός πετρoαχινός (Εικόνα 1). Από συστηματική σκοπιά κατατάσσεται στα εχινόδερμα. Η αναλυτική συστηματική του υποδεικνύεται στον Πίνακα 1. Το είδος αυτό απαντάται ευρύτατα στη Μεσόγειο, σε ρηχά νερά και τρέφεται με φωτόφιλα φύκη. Όπως όλα τα εχινόδερμα, έτσι και ο P. lividus χαρακτηρίζεται από πεντακτινωτή συμμετρία, η οποία προκύπτει δευτερογενώς μετά από μια περίοδο αμφίπλευρης συμμετρίας, κατά την πρώιμη οντογένεση. Το σώμα είναι σφαιρικό, πεπλατυσμένο στους δύο πόλους και φέρει ισχυρές άκανθες, μεταξύ Εικόνα 1. Ο Paracentrotus lividus των οποίων υπάρχουν οι βαδιστικοί ποδίσκοι και οι ποδολαβίδες. Η κίνηση των άκανθων επιτυγχάνεται με μύες προσφυόμενους στη βάση τους. Βασίλειο Φύλο Ομοταξία Τάξη Οικογένεια Γένος Είδος Animalia Echinodermata Echinoidea Echinoida Echinidea Paracentrotus Paracentrotus lividus (Παρακεντρωτός ο μολυβδόχρωμος) Πίνακας 1. Η συστηματική κατάταξη του Paracentrotus lividus (Lamark 1816) 4

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κάτω από το εξωδερμικό περίβλημα υπάρχει ο ενδοδερμικός σκελετός που αποτελείται από τα ασβεστολιθικά πινακίδια. Η διάμετρος του σώματος μπορεί να φτάσει μέχρι και τα 9-10 εκ. χωρίς τις άκανθες. Οι άκανθες είναι οξύληκτες, φτάνουν τα 3 εκ. σε μήκος και κινούνται με τη βοήθεια μυών (Hickman et al., 2001). Όπως και στα άλλα μέλη της συνομοταξίας των εχινοδέρμων δεν παρατηρείται κεφαλοποίηση. Υπάρχει ωστόσο ένας στοματικός-αντιστοματικός άξονας. Στην Εικόνα 2Α φαίνεται η εσωτερική δομή του αχινού. Στο κέντρο της στοματικής επιφάνειας διακρίνεται το στόμα, ενώ στην αντιστοματική περιοχή, η έδρα. Χαρακτηριστική είναι επίσης, η μασητική συσκευή των εχινοειδών από την οποία ξεκινά το πεπτικό σύστημα. Η μασητική συσκευή, η οποία είναι γνωστή και ως λύχνος του Αριστοτέλη (Εικόνα 2Β), εκτείνεται ως το φάρυγγα και αποτελείται από τα δόντια και τις γνάθους. Τα πέντε μακριά κυρτά δόντια εκφύονται από τις πέντε γνάθους και προεξέχουν από το στόμα. Οι γνάθοι συνδέονται μεταξύ τους με τη βοήθεια μικρών σκελετικών τεμαχίων από ανθρακικό ασβέστιο που ονομάζονται επιφύσεις. Η κίνηση των γνάθων επιτυγχάνεται με τη βοήθεια προσαγωγών και Α Β Εικόνα 2. Α.Τα ανατομικά χαρακτηριστικά του αχινού. Β.Ο λύχνος του Αριστοτέλη απαγωγών μασητήρων μυών. Συνέχεια της μασητικής συσκευής αποτελεί ο οισοφάγος, ο διευρυμένος στόμαχος και το σωληνοειδές περιελιγμένο έντερο που καταλήγει στην έδρα. Ο σίφωνας είναι τυφλός σωλήνας που εκφύεται από τον οισοφάγο και ενώνεται με το πρόσθιο τμήμα του τελικού εντέρου. Χρησιμεύει για την απομάκρυνση της περίσσειας του θαλασσινού νερού που εισέρχεται στη στοματική κοιλότητα με την τροφή. Στο κοίλωμα του αχινού περιφέρονται τα κοιλωματικά κύτταρα με φαγοκυτταρική δράση και ικανότητα επούλωσης των τραυμάτων. 5

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το υδροφορικό σύστημα του αχινού που ξεκινά από τη μητροπόρα πλάκα και οδηγεί το νερό στον περιοισοφαγικό υδροφορικό κλοιό. Το νερό μέσα από ένα σύστημα τυφλών σωλήνων και υδροφόρων αγωγών καταλήγει σε σωληνοειδείς τυφλούς βαδιστικούς ποδίσκους οι οποίοι εξέρχονται από τους πόρους των βαδιστικών πινακιδίων και προβάλλουν στην εξωτερική επιφάνεια. Οι βαδιστικοί ποδίσκοι διατείνονται από το περιεχόμενο νερό και προκαλούν την κίνηση του ζώου με τη βοήθεια και ζευγών μυών. Το νευρικό σύστημα του αχινού αποτελείται από τον περιοισοφαγικό νευρικό κλοιό, από τον οποίο εκφύονται πέντε πλευρικά νευρικά στελέχη. Διαθέτει επίσης βράγχια τα οποία βρίσκονται συμμετρικά γύρω από το περίστομα ενώ το αιμοφόρο (κυκλοφορικό) του σύστημα αποτελείται από ένα στενό αιμοφόρο αγγείο παράλληλο προς τον πετρώδη σωλήνα, που καλείται αξονικό όργανο (Hickman et al., 2001). (A.1.2) ΤΑ ΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΑ ΣΤΑΔΙΑ ΤΟΥ ΑΧΙΝΟΥ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ Ο αχινός είναι γονοχωριστικός οργανισμός και φέρει πέντε γονάδες που διατάσσονται ακτινωτά ως προς τον στοματικό-αντιστοματικό άξονα. Παρατηρείται διαφορά ως προς το χρώμα των γονάδων και συγκεκριμένα οι αρσενικές είναι υποκίτρινες ενώ οι θηλυκές είναι πορτοκαλί (Εικόνα 3). Οι αχινοί ελευθερώνουν τους γαμέτες τους στο θαλάσσιο περιβάλλον από τους πόρους των γεννητικών πινακιδίων και έτσι επιτυγχάνεται εξωτερική γονιμοποίηση. Α Β Εικόνα 3. Α:Οι αρσενικές γονάδες που είναι υποκίτρινες. Β: Οι θηλυκές γονάδες με χρώμα πορτοκαλί 6

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το ώριμο ωάριο του αχινού περιβάλλεται από ένα παχύ βλεννώδεςζελατινώδες περίβλημα (gel coat) που χρησιμεύει για την ενεργοποίηση του σπερματοζωαρίου κατά την γονιμοποίηση. Παράγοντες σε αυτό το βλεννώδες περίβλημα προκαλούν την αντίδραση του ακροσώματος στο σπερματοζωάριο και είναι ειδικοί για κάθε είδος. Στην εσωτερική πλευρά αυτού του περιβλήματος βρίσκεται η λεκιθική μεμβράνη που καλύπτει την κυτταρική μεμβράνη. Το ώριμο σπερματοζωάριο, το οποίο αποτελείται από την κεφαλή, τον αυχένα, το μέσο τμήμα και την ουρά, φέρει στο πρόσθιο άκρο της κεφαλής του, το ακρόσωμα. Το ακρόσωμα περιέχει πρωτεολυτικά ένζυμα που πέπτουν τη λεκιθική μεμβράνη και στον αχινό σχηματίζει το ακροσωμικό νημάτιο με τη διαδικασία της αντίδρασης του ακροσώματος. Σε αντίθεση με τα σπερματοζωάρια των θηλαστικών που χρησιμοποιούν θρεπτικά συστατικά από το θηλυκό αναπαραγωγικό σύστημα ως πηγή ενέργειας για την κίνησή τους, τα σπερματοζωάρια του αχινού κολυμπούν στη θάλασσα και επομένως διαθέτουν ενδογενείς ενεργειακούς πόρους όπως φωσφολιπίδια ή τριγλυκερίδια τα οποία παράχθηκαν κατά τη σπερματογένεση και αποθηκεύτηκαν. Κατά τη διάρκεια της γονιμοποίησης, το ωάριο συντήκεται με το σπερματοζωάριο, αφού το δεύτερο διασχίσει το ζελατινώδες περίβλημα με τη βοήθεια των ακροσωμικών ενζύμων. Στη συνέχεια συντήκονται οι προπυρήνες ωαρίου και σπερματοζωαρίου με αποτέλεσμα τον σχηματισμό του ζυγωτού κάτι το οποίο σηματοδοτεί την έναρξη των αυλακώσεων (Ζάγκρης, 2005). Ο αχινός παρουσιάζει ακτινωτή ολοβλαστική αυλάκωση. Τα επίπεδα τόσο της πρώτης όσο και της δεύτερης διαίρεσης είναι παράλληλα προς το μεσημβρινό επίπεδο, παιρνούν από το ζωικό-φυτικό πόλο και είναι κάθετα μεταξύ τους. Η τρίτη διαίρεση γίνεται στο ισημερινό επίπεδο, είναι κάθετη στις δύο πρώτες και διαχωρίζει τα το ζωικό και φυτικό «ημισφαίριο». Εντούτοις, η τέταρτη αυλάκωση είναι αρκετά διαφορετική από τις προηγούμενες τρείς (Εικόνα 4). ΠΡΩΙΜΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΧΡΙ ΤΟ ΣΤΑΔΙΟ ΤΟΥ ΒΛΑΣΤΙΔΙΟΥ Τα τέσσερα κύτταρα στο ζωικό ημισφαίριο διαιρούνται στο ισημερινό επίπεδο, σε οκτώ ίσα βλαστομερίδια. Τα κύτταρα αυτά καλούνται μεσομερίδια. Τα κύτταρα στη φυτική στοιβάδα διαιρούνται επίσης στο ισημερινό επίπεδο, όμως η διαίρεση 7

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ είναι άνιση και έτσι παράγονται τέσσερα μεγάλα κύτταρα, τα μακρομερίδια και τέσσερα μικρότερα τα μικρομερίδια. Καθώς το έμβρυο των 16-κυττάρων αυλακώνεται, τα οκτώ μεσομερίδια διαιρούνται για να σχηματίσουν δύο «ζωικές στοιβάδες» την an1 και an2, όπου η πρώτη επικάθεται στην δεύτερη. Τα μακρομερίδια διαιρούνται στο ισημερινό επίπεδο σχηματίζοντας μια στοιβάδα (veg1) κάτω από την an2 και άλλη μία κάτω από την veg1, την veg2. Λίγο Εικόνα 4. Η ανάπτυξη του αχινού μέχρι το βλαστίδιο των 128 κυττάρων. Χαρακτηριστικό είναι ότι από την τέταρτη διαίρεση και μετά παρατηρούνται ασύμμετρες διαιρέσεις. Για περισσότερες λεπτομέρειες βλέπε κείμενο. αργότερα διαιρούνται και τα μικρομερίδια παράγοντας μία μικρή «συστάδα» κάτω από την μεγαλύτερη. Όλα τα επίπεδα της έκτης διαίρεσης γίνονται στο ισημερινό επίπεδο ενώ της έβδομης στο μεσημβρινό, σχηματίζοντας το βλαστίδιο των 128 κυττάρων. Το στάδιο του βλαστιδίου στην εμβρυική ανάπτυξη του αχινού, ξεκινά από την στιγμή που το έμβρυο φτάνει τα 128 κύτταρα. Εδώ τα κύτταρα σχηματίζουν μια κοίλη σφαίρα και διατάσσονται περιμετρικά της κεντρικής κοιλότητας η οποία καλείται βλαστόκοιλο (Εικόνα 5Α). Τη στιγμή αυτή όλα τα κύτταρα έχουν το ίδιο μέγεθος, δεδομένου ότι τα μικρομερίδια έχουν ελαττώσει σαφώς τον ρυθμό διαίρεσης τους σε σχέση με τα μεσομερίδια και μακρομερίδια. Το κάθε κύτταρο βρίσκεται σε επαφή με το πρωτεϊνούχο υγρό του βλαστόκοιλου, στην εσωτερική 8

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ του πλευρά και με την στοιβάδα της υαλίνης στην εξωτερική του. Σε αυτή τη χρονική στιγμή αναπτύσσονται στενές συνδέσεις μεταξύ των κυττάρων κάτι που έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός ενιαίου επιθηλιακού στρώματος το οποίο περιβάλλει το βλαστόκοιλο (Εικόνα 5Β). Α Β Γ Εικόνα 5. Α: Τα βλαστομερίδια διατάσσονται περιμετρικά για να σχηματίσουν το βλαστόκοιλο. Β: Ανάπτυξη στενών συνδέσμων μεταξύ των κυττάρων και σχηματισμός ενός ενιαίου επιθηλίου. Γ: Τα κύτταρα του φυτικού πόλου, αυξάνονται σε όγκο για να σχηματίσουν τη φυτική πλάκα Καθώς τα κύτταρα συνεχίζουν να διαιρούνται, το πάχος της περιφέρειας του βλαστιδίου γίνεται όσο το πάχος ενός κυττάρου, και συνεχίζει να λεπταίνει καθώς το βλαστίδιο επεκτείνεται. Αυτό επιτυγχάνεται με την προσκόλληση των βλαστομεριδίων στην επιφάνεια της υαλίνης και με την εισροή νερού που φουσκώνει το βλαστόκοιλο. Αυτές οι γρήγορες κυτταρικές αυλακώσεις διαρκούν για 9-10 κυτταρικές διαιρέσεις. Μετά την περίοδο αυτή το έμβρυο μεταπίπτει στο στάδιο του μέσου-βλαστιδίου (mid-blastula) όπου οι συγχρονισμένες διαιρέσεις σταματούν, νέα γονίδια εκφράζονται και πολλά μη μιτωτικά κύτταρα αναπτύσσουν βλεφαρίδες στην εξωτερική τους επιφάνεια. Το βλεφαριδωτό βλαστίδιο ξεκινά να περιστρέφεται μέσα στην μεμβράνη γονιμοποίησης. Σύντομα αρχίζουν να διακρίνονται διαφορές στα κύτταρα. Τα κύτταρα του φυτικού πόλου αρχίζουν να παχαίνουν, σχηματίζοντας τη φυτική πλάκα. Επίσης τα κύτταρα του ζωικού ημισφαιρίου εκκρίνουν ένα ένζυμο που πέπτει την μεμβράνη γονιμοποίησης. ΚΑΘΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΤΥΧΗΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (cell fate determination) Ο χάρτης της τύχης των κυττάρων στο έμβρυο του αχινού, σχηματίστηκε αρχικά με παρατηρήσεις όσον αφορά σε τι εξελίσσονταν οι απόγονοι των κυτταρικών στοιβάδων. Πιο σύγχρονες μελέτες έχουν διασαφηνίσει αυτούς τους χάρτες, μέσω παρατήρησης ξεχωριστών κυττάρων, ενεμένων με φθορίζουσες 9

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ χρωστικές. Αυτές οι έρευνες έδειξαν ότι μέχρι το στάδιο των 60 κυττάρων, η τύχη των περισσοτέρων εμβρυικών κυττάρων έχει καθοριστεί, όμως τα κύτταρα δεν έχουν δεσμευτεί μη αντιστρεπτά. Με άλλα λόγια, συγκεκριμένα βλαστομερίδια παράγουν τους ίδιους κυτταρικούς τύπους σε διαφορετικά έμβρυα, όμως αυτά τα κύτταρα παραμένουν πολυδύναμα και μπορούν να σχηματίσουν άλλους κυτταρικούς τύπους, αν τοποθετηθούν πειραματικά σε άλλα μέρη του εμβρύου. Ένας χάρτης της τύχης των κυττάρων φαίνεται στην Εικόνα 6. Τα κύτταρα του ζωικού ημισφαιρίου δίνουν το εξώδερμα, την επιδερμίδα της προνύμφης καθώς και τους νευρώνες της. Η Εικόνα 6. Α: Το έμβρυο των 60 κυττάρων καθώς και η στοιβάδα veg 1 μπορεί να αναπτυξιακή τύχη των κυττάρων. Β: Ενδεικτικός χάρτης αναπτυξιακής τύχης. παράγει κύτταρα που μπορούν να εισέλθουν τόσο σε εξωδερμικά όσο και ενδοδερμικά όργανα. Η στοιβάδα veg 2 μπορεί να δώσει κύτταρα τριών διαφορετικών δομών: ενδόδερμα, κοίλωμα και δευτερογενές μεσέγχυμα (ανοσοκύτταρα, κύτταρα που παράγουν χρωστικές και μυοκύτταρα. Η πρώτη στοιβάδα των μικρομεριδίων παράγει πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα που θα δομήσουν το σκελετό της προνύμφης, ενώ η δεύτερη στοιβάδα των μικρομεριδίων συνεισφέρει στο κοίλωμα (Gilbert, 2000) Φαίνεται ότι ο καθορισμός της κυτταρικής τύχης, στον αχινό, εμπλέκει ένα καταρράκτη ο οποίος ξεκινά από τα μικρομερίδια. Έχει τεθεί επί τάπητος η υπόθεση ότι το σινιάλο από τα μικρομερίδια επάγει μέτα-μεταφραστικές τροποποιήσεις σε κάποιους παράγοντες στην στοιβάδα veg 2. Ομοίως, το σινιάλο από την στοιβάδα veg 2 πιθανότατα τροποποιεί κάποιες πρωτεΐνες στην στοιβάδα 10

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ veg 2. Με αυτό τον τρόπο οι διαφορετικές στοιβάδες δεσμεύονται για διαφορετική αναπτυξιακή τύχη (Davidson, 1989; Davidson et al., 1998; Gilbert, 2000). ΓΑΣΤΡΙΔΙΩΣΗ Το ώριμο βλαστίδιο αποτελείται από μία μόνο στοιβάδα από περίπου 1000 κύτταρα τα οποία σχηματίζουν μία κοίλη μπάλα, λίγο πεπλατυσμένη στο φυτικό πόλο. Τα βλαστομερίδια, που προέκυψαν από διαφορετικές περιοχές του ζυγωτού έχουν διαφορετικό μέγεθος και ιδιότητες (Εικόνα 7). Λίγο μετά την «εκκόλαψη» του Εικόνα 7. Τα αναπτυξιακά στάδια του αχινού μέχρι και τον πλουτέα. Α:Το ζυγωτό. Β:Βλαστίδιο. Γ.Έναρξη γαστριδίωσης, με χαρακτηριστική την έναρξη της παρουσίας των πρωτογενών μεσεγχυματικών κυττάρων. Δ: Η εγκόλπωση του αρχεντέρου και η εμφάνιση των σκελετογόνων ράβδων. Ε: Το αρχέντερο φτάνει στο πλαγιοκοιλιακό τοίχωμα του βλαστόκοιλου όπου θα σχηματιστεί το στόμα. ΣΤ: Ο πλουτέας. βλαστιδίου από την μεμβράνη γονιμοποίησης, σχηματίζεται η φυτική πλάκα. Στο κέντρο αυτής της πλάκας μια ομάδα μικρών κυττάρων αρχίζει να αλλάζει σε μορφολογία. Επιμηκύνονται και αναπτύσσουν φυλλοπόδια στην εσωτερική τους επιφάνεια. Έπειτα αποκολλώνται από την επιθηλιακή μονοστοιβάδα και εισβάλλουν στο βλαστόκοιλο. Τα κύτταρα αυτά καλούνται πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα (Εικόνα 7Γ-Δ). Θα σχηματίσουν το σκελετό της προνύμφης γι αυτό κάποιες φορές καλούνται και σκελετογόνο μεσέγχυμα. Αρχικά τα κύτταρα αυτά φαίνεται να κινούνται τυχαία κατά μήκος της εσωτερικής επιφάνειας του βλαστόκοιλου, χρησιμοποιώντας τα φυλλοπόδια. Ωστόσο, τελικά εντοπίζονται στην πλαγιοκοιλιακή περιοχή του βλαστοκοίλου. Εκεί συντήκονται μεταξύ τους σε ένα συγκύτιο το οποίο θα συμμετάσχει στο σχηματισμό του σκελετού της προνύμφης. Καθώς όμως τα πρωτογενή 11

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μεσεγχυματικά κύτταρα απομακρύνονται από την φυτική περιοχή του βλαστόκοιλου, συμβαίνουν σημαντικές αλλαγές στα κύτταρα που παραμένουν στη φυτική πλάκα. Αυτά τα κύτταρα παραμένουν συνδεδεμένα το ένα με το άλλο καθώς και στην επιφάνεια της υαλίνης και κινούνται για να καλύψουν τα κενά που αφήνουν τα πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα. Περεταίρω, η φυτική πλάκα κάμπτεται προς το εσωτερικό και εγκολπώνεται (Εικόνα 7Δ). μέχρι το ¼ έως ½ του βλαστόκοιλου. Μετά η εγκόλπωση ξαφνικά σταματά. Η εγκολπωμένη περιοχή καλείται αρχέντερο ενώ το άνοιγμα του αρχεντέρου στο φυτικό πόλο καλείται βλαστοπόρος. Στο στάδιο που τα κύτταρα του σκελετογόνου μεσεγχύματος αρχίζουν να εισβάλλουν στο βλαστόκοιλο, η τύχη των κυττάρων της φυτικής πλάκας έχει ήδη καθοριστεί. Τα ενδοδερμικά κύτταρα που είναι γειτονικά στα μεσεγχυματικά κύτταρα που προέκυψαν από τα μικρομερίδια, θα γίνουν πρόσθιο έντερο, μεταναστεύοντας βαθιά μέσα στο βλαστόκοιλο. Η επόμενη στοιβάδα ενδοδερμικών κυττάρων θα γίνει μεσέντερο ενώ η τελευταία ομάδα ενδοδερμικών κυττάρων που εγκολπώνεται θα σχηματίσει το τελικό έντερο και την έδρα. Μετά από μια μικρή περίοδο παύσης της εγκόλπωσης τα δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα «τραβούν» το αρχέντερο πιο βαθιά στο βλαστόκοιλο μέχρι να συναντήσει το τοίχωμα (Εικόνα 7Ε). Στο σημείο αυτό θα σχηματιστεί το στόμα της προνύμφης (Gilbert, 2000). (A.1.3) Ο ΑΧΙΝΟΣ ΩΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ. Ο αχινός αποτελεί ένα από τα πιο κοινά πειραματόζωα και έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για μελέτες ποικίλων κλασικών αναπτυξιακών προβλημάτων, συμπεριλαμβανομένων των μηχανισμών της γονιμοποίησης και της ενεργοποίησης των ωαρίων, της αυλάκωσης, της γαστριδίωσης και της ρύθμισης της διαφοροποίησης στο πρώιμο έμβρυο. Αυτό οφείλεται στην πληθώρα των ατόμων που είναι διαθέσιμα (ειδικά ο P. lividus χρησιμοποιήθηκε γιατί αφθονεί στις ελληνικές θάλασσες και η συλλογή του είναι μία εύκολη διαδικασία), στην απλή διαδικασία της εμβρυογένεσης και στο γεγονός ότι τα εμβρυϊκά κύτταρα είναι διαφανή επιτρέποντας άμεση παρατήρηση των κυτταρικών διαιρέσεων και κινήσεων σε ολόκληρο το έμβρυο και την προνύμφη (Ammons et al., 1999; Arnone et al., 1997). Αυτό αποτέλεσε ως τώρα σπουδαίο πλεονέκτημα στο χαρακτηρισμό των αναπτυξιακών 12

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ γεγονότων του αχινού καθώς και στη διεξαγωγή πειραμάτων και την παρατήρηση των αποτελεσμάτων σε ζωντανά έμβρυα. Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα είναι ο σύντομος χρόνος ανάπτυξης, που έως το στάδιο του βλαστιδίου απαιτεί μόλις μια ημέρα ενώ για τον ώριμο πλουτέα αρκούν δύο περίπου ημέρες. Επίσης η αφθονία των αυγών του αχινού παρέχει πλούσιο υλικό για βιοχημικούς και μοριακούς χαρακτηρισμούς και επιτρέπει τη διεξαγωγή πειραμάτων με μεγάλο αριθμό εμβρύων με συγχρονισμένη ανάπτυξη. Τα έμβρυα του αχινού είναι εύκολα στο χειρισμό, γεγονός που δίνει στους ερευνητές τη δυνατότητα πραγματοποίησης πειραμάτων που περιλαμβάνουν απομάκρυνση ή μεταμόσχευση βλαστομεριδίων, απομόνωση βλαστικών στοιβάδων ή και διχοτόμηση ολόκληρων εμβρύων. Σημαντική είναι επίσης η ευκολία της γονιδιακής μεταφοράς, καθώς η εισαγωγή γενετικού υλικού είναι πιο εύκολη από ότι σε άλλους οργανισμούς (Bogarad et al., 1998). (Α.2) Η ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ / ΘΥΡΕΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ Οι υποδοχείς στεροειδών ορμονών είναι πρωτεΐνες που απαντώνται στο κυτταρόπλασμα ή τον πυρήνα ευκαρυωτικών κυττάρων, προσδένονται στο DNA και ρυθμίζουν την μεταγραφή γονιδίων, μετά από τη σύνδεσή τους με τη κατάλληλη ορμόνη. Η υπεροικογένεια αυτή περιλαμβάνει τους κλασικούς υποδοχείς στεροειδών ορμονών (ανδρογόνων, οιστρογόνων, γλυκοκορτικοειδών, μεταλλοκορτικοειδών και προγεστερόνης), υποδοχείς θυρεοειδών ορμονών, βιταμίνης D, ρετινοειδών κ.ά. Όλοι οι παραπάνω υποδοχείς παρουσιάζουν σημαντικές δομικές και λειτουργικές ομοιότητες, κάτι το οποίο υποδηλώνει την κοινή τους προέλευση και οδηγεί στην κατάταξή τους σε μία υπεροικογένεια. Τα μέλη της οικογένειας μοιράζονται μια κοινή δομή. Υπάρχουν πέντε διακριτές περιοχές (domains) (Εικόνα 8). Στο Ν-τελικό άκρο η Α/Β domain είναι ελάχιστα συντηρημένη και ποικίλλει σε μέγεθος. Φέρει μια subdomain την AF-1 η οποία είναι υπεύθυνη για την ιδιοστατική ενεργοποίηση του υποδοχέα σε απουσία του προσδέματος (Mangelsdorf et al., 1995). Η C domain είναι η περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DNA Binding Domain - DBD) και η πιο συντηρημένη περιοχή μεταξύ των μελών της υπεροικογένειας πράγμα που μπορεί να μεταφραστεί ως κοινή ανάγκη για πρόσδεση στο DNA. Η DBD αποτελείται 13

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ από ένα υψηλά συντηρημένο πυρήνα (core) με δύο δάκτυλους ψευδαργύρου και από ένα τμήμα περίπου αμινοξέων το οποίο καλείται Καρβόξυ-Τελική Επέκταση (Carboxy-Terminal Extension - CTE) της DBD (Melvin et al., 2004; Roemer et al., 2008). O εμπλοκή της CTE στην λειτουργία του υποδοχέα συζητείται εκτενώς στο μέρος ΣΥΖΗΤΗΣΗ. H DBD είναι υπεύθυνη για την αναγνώριση στοιχείων απόκρισης στο DNA. Εντός της C domain υπάρχει επίσης ένα site το οποίο φαίνεται να εμπλέκεται στον διμερισμό του υποδοχέα ενώ είναι αξιοσημείωτο ότι οι υποδοχείς λειτουργούν σχεδόν αποκλειστικά ως διμερή. Εικόνα 8. Η δομή των υποδοχέων στεροειδών θυρεοειδών ορμονών. Για λεπτομέρειες βλέπε κείμενο Τα μοτίβα των δακτύλων ψευδαργύρου της DBD περιοχής έχουν την εξής αλληλουχία: Cys-X 2 -Cys-X 13 -Cys-X 2 -Cys ή για συντομία C 2 C 2 μιας και η θέση πρόσδεσης του ψευδαργύρου δημιουργείται από τέσσερις κυστείνες (Εικόνα 8). Όσα αμινοξέα βρίσκονται στο δεξιό τμήμα του πρώτου δάκτυλου καθορίζουν την αλληλουχία στόχο ενώ όσα βρίσκονται στο αριστερό τμήμα του δεύτερου δάκτυλου καθορίζουν την απόσταση ανάμεσα στις θέσεις πρόσδεσης που αναγνωρίζονται από 14

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κάθε υπομονάδα του διμερούς. Οι υποδοχείς λειτουργούν σχεδόν αποκλειστικά ως διμερή. Πειράματα «ανταλλαγής ειδικότητας πρόσδεσης» απέδειξαν άμεσα ότι ο πρώτος δάκτυλος προσδένεται στο DNA. Όταν ο δάκτυλος του υποδοχέα των οιστρογόνων απαλείφθηκε και αντικαταστάθηκε από την αντίστοιχη αλληλουχία του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών, η νέα πρωτεΐνη αναγνώριζε την αλληλουχία GRE (το συνηθισμένο στόχο του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών) αντί για την ERE (το συνηθισμένο στόχο του υποδοχέα των οιστρογόνων). Επομένως αυτή η περιοχή ορίζει την ειδικότητα αναγνώρισης του DNA (Lewin, 2004). Η περιοχή D είναι η λιγότερο συντηρημένη και φαίνεται να προσδίδει στην πρωτεΐνη ευκαμψία και μεταβλητότητα αναφορικά με τη διαμόρφωσή της στο χώρο. Η D λειτουργεί ως γέφυρα για την περιοχή E που βρίσκεται στο C-τελικό άκρο. Η περιοχή Ε είναι αρκετά συντηρημένη και είναι η περιοχή πρόσδεσης του προσδέματος (Ligand Binding Domain-LBD) Στην Ε domain υπάρχει επίσης μια subdomain η AF-2 η οποία συνεισφέρει στο διμερισμό του υποδοχέα. Όσον αφορά την F domain δεν της έχει αποδοθεί κάποια λειτουργία μέχρι στιγμής.(mangelsdorf et al., 1995). (Α.3) Η ΥΠΟΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΤΩΝ COUP-TFS: (Α.3.1) Η ΠΡΩΤΕΙΝΗ COUP-TF Οι COUP-TFs είναι μεταγραφικοί παράγοντες που ανήκουν στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων των στεροειδών και θυρεοειδών ορμονών. Μέχρι τώρα δεν έχει βρεθεί κάποιο ειδικό πρόσδεμα (ligand) και γι αυτό χαρακτηρίζονται ως ορφανοί. O πρώτος COUP-TF απομονώθηκε από πυρηνικό εκχύλισμα κυττάρων HeLa και ορίστηκε σαν ο ανθρώπινος COUP-TFI (hcoup-tfi) (Bagchi et al., 1987; Wang et al., 1987). Αργότερα απομονώθηκε και ο hcoup-tfii από μια cdna βιβλιοθήκη κυττάρων HeLa μέσω της ομολογίας που παρουσιάζει με τον hcoup-tf (Wang et al., 1989). Το γονίδιο COUP-TF αποτελείται σε όλους τους μέχρι σήμερα μελετημένους οργανισμούς από τρία εξόνια, ενώ τα δύο εσόνια διακόπτουν τη κωδική περιοχή σε συντηρημένες θέσεις. Ωστόσο όπως συζητείται πιο κάτω, ο αχινός Paracentrotus lividus, διαφοροποιείται από αυτό το μοντέλο καθώς το γονίδιο αποτελείται από τέσσερα εξόνια (αδημοσίευτα αποτελέσματα από 15

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ το εργαστήριό μας). Βιοχημικές μελέτες υποδεικνύουν ότι οι COUP-TFs εντοπίζονται κυρίως ως διμερή. To πρώτο στοιχείο απόκρισης στο οποίο βρέθηκε να δένει ο COUP-TF (ως ομοδιμερές) είναι μια ρυθμιστική περιοχή του υποκινητή του γονιδίου της ωαλβουμίνης στην όρνιθα (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter), το λεγόμενο στοιχείο COUP, το οποίο φαίνεται να είναι πολύ σημαντικό για την μεταγραφή του γονιδίου της ωαλβουμίνης (Pastorcic et al., 1986; Sagami et al., 1986). Αυτή είναι και η προέλευση της ονομασίας των εν λόγω μεταγραφικών παραγόντων. Ο COUP-TF επάγει την έκφραση του εν λόγω γονιδίου. Πιο συγκεκριμένα, ο COUP-TF βρέθηκε να δένει ως ομοδιμερές, στην αλληλουχία GTGTCA A AGGTCA η οποία αποτελεί ατελή ευθεία επανάληψη της αλληλουχίας AGGTCΑ με απόσταση ενός νουκλεοτιδίου μεταξύ των ημιθέσεων (DR1). Τα δύο κατάλοιπα γουανίνης που βρίσκονται σε κάθε επανάληψη είναι πολύ σημαντικά για την πρόσδεση του COUP- TF. Ωστόσο, οι COUP-TFs μπορούν και προσδένονται σε ατελείς ευθείες επαναλήψεις της παραπάνω αλληλουχίας με διάφορες αποστάσεις μεταξύ των ημιθέσεων, από 0 ως 11 nt. Για παράδειγμα, δένουν σε μια ατελή ευθεία επανάληψη GGGTCA με απόσταση έξι νουκλεοτιδίων μεταξύ των ημιθέσεων στον υποκινητή της ινσουλίνης ΙΙ στον αρουραίο. Η σχετική συγγένεια πρόσδεσης εξαρτάται από την απόσταση μεταξύ των ημιθέσεων και αυξάνεται όσο η απόσταση μεταξύ των ημιθέσεων μειώνεται, ενώ τη μεγαλύτερη συγγένεια φαίνεται να έχει το στοιχείο DR1. Οι COUP-TFs προσδένονται και σε παλίνδρομες επαναλήψεις της παραπάνω αλληλουχίας, αλλά με μικρότερη συγγένεια πρόσδεσης. Η ικανότητά τους να προσδένονται σε ευθείες ή παλίνδρομες επαναλήψεις καθώς και σε ποικιλία αποστάσεων φαίνεται να επιτυγχάνεται μέσω πολλών εναλλακτικών στερεοδιαμορφώσεων (Cooney et al., 1992; Kliewer et al., 1992; Tsai and Tsai, 1997). Οι COUP-TFs παρουσιάζουν σημαντική ομολογία με άλλα γονίδια-μέλη της ίδιας υπεροικογένειας (Εικόνα 9Α). Σε σχέση με τους υπόλοιπους υποδοχείς της υπεροικογένειας ο πιο συγγενικός είναι ο RAR2 στη συνέχεια η οικογένεια των υποδοχέων Retinoid X Receptors (RXR) και ακολούθως οι HNF4 και TLX (Tsai and Tsai, 1997). 16

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ακόμη πιο σημαντική ομολογία έχουν οι COUP-TFs που έχουν απομονωθεί από τους διαφόρους οργανισμούς μεταξύ τους, με αποτέλεσμα να αποτελούν Α Β Εικόνα 9. Α: To εξελικτικό δέντρο των υποδοχέων στεροειδών/θυρεοειδών ορμονών στα σπονδυλωτά Β: Η ομολογία των DBDs και LBDs μεταξύ των COUP-TFs από διάφορους οργανισμούς. διακριτή υποοικογένεια (Εικόνα 9Β). Η εξαιρετική ομολογία των περιοχών DBDs καθώς και των θεωρούμενων LBDs υποδηλώνει ότι οι περιοχές αυτές είναι απαραίτητες για τη βιολογική λειτουργία των COUP-TFs. Επίσης, η πολύ μικρή απόκλιση των LBDs μεταξύ των διαφόρων οργανισμών αποτελεί ένδειξη της ύπαρξης ενός πιθανού προσδέματος (Tsai and Tsai, 1997). (Α.3.2) ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ COUP-TF Ο COUP-TF δρα ως μεταγραφικός παράγοντας που επηρεάζει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων και η δράση αυτή είναι κυρίως κατασταλτική. Αν και πρωτοπεριγράφηκε ως ενεργοποιητής του γονιδίου της ωαλβουμίνης στην όρνιθα, τις περισσότερες φορές δρα καταστέλλοντας τη μεταγραφή γονιδίων που επάγουν άλλοι πυρηνικοί υποδοχείς ορμονών, όπως ο υποδοχέας του ρετινοϊκού οξέως RAR, της θυρεοειδούς ορμόνης TR, της βιταμίνης D VDR, του περοξισώματος PPAR και ο πυρηνικός παράγοντας 4 των κυττάρων του ήπατος HNF4 (Cooney et al., 1992; 17

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ladias et al., 1992; Leng et al., 1996). Έχουν περιγραφεί αρκετοί τρόποι μέσω των οποίων ο COUP-TF ασκεί τη δράση του (Εικόνα 10) (Cooney et al., 1993; Park et al., 2003; Tsai and Tsai, 1997) (Ι) ΣΑΝ ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΑΣ (1)Ανταγωνισμός για την πρόσδεση στα στοιχεία απόκρισης Οι COUP-TFs καταστέλλουν την ενεργοποίηση γονιδίων που κανονικά επάγονται από τους πυρηνικούς υποδοχείς VDR, TR, RAR, RXR, PPAR και HNF-4 μέσω ανταγωνισμού για την κατάληψη των θέσεων πρόσδεσης στο DNA. Εικόνα 10. Μηχανισμοί δράσης Μπορούν και σχηματίζουν ομοδιμερή και του COUP-TF ως καταστολέας. Α: Ανταγωνισμός για την ετεροδιμερή που δένουν σε μια πληθώρα πρόσδεση Β: Ανταγωνισμός για στοιχείων απόκρισης που υπό διαφορετικές διμερισμό με τον RXR. Γ: συνθήκες αναγνωρίζονται από υποδοχείς όπως Ενεργός καταστολή Δ: Transκαταστολή. VDR, TR, RAR, RXR, PPAR, HNF-4 και επάγουν τη μεταγραφή. (2)Ανταγωνισμός για διμερισμό με τον RXR. Ο RXR ετεροδιμερίζεται με πολλούς πυρηνικούς υποδοχείς όπως οι RAR, TR, VDR, ΡPΑR. Τα ομοδιμερή των πυρηνικών αυτών υποδοχέων προσδένονται στις αλληλουχίες στόχους τους με αρκετά χαμηλή συγγένεια ενώ μετά από τον ετεροδιμερισμό τους με τον RXR πετυχαίνουν πολύ υψηλότερη συγγένεια. Ο COUP- TF συναγωνίζεται με τους άλλους υποδοχείς της οικογένειας για τη δημιουργία ετεροδιμερούς με τον μεταγραφικό παράγοντα RXR. Έτσι περιορίζει τον ετεροδιμερισμό του RXR με τους άλλους μεταγραφικούς παράγοντες και ως εκ τούτου και την ενεργοποιητική τους δράση. (3)Ενεργός καταστολή. Ο COUP-TF προσδένοντας στο στοιχείο απόκρισής του καταστέλλει άμεσα τα γονίδια στόχους μέσω άμεσης ή έμμεσης αλληλεπίδρασης με τους γειτονικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Πιθανόν, η καταστολή να επιτυγχάνεται μέσω του μηχανισμού απακετυλίωσης των ιστονών 18

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (4) Trans- καταστολή Πραγματοποιούν trans-καταστολή όπου δεν προσδένεται άμεσα στο στοιχείο απόκρισης αλλά παρεμβάλλεται μεταξύ της LBD ενός άλλου πυρηνικού ορμονικού υποδοχέα που βρίσκεται προσδεδεμένος στο DNA και των γενικών μεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή, αποτρέποντας την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων. Δρα δηλαδή σαν συγκαταστολέας. (ΙI)ΣΑΝ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗΣ Οι COUP-TFs μπορούν να δράσουν και ως ενεργοποιητές της μεταγραφής. Έχουν περιγραφεί τρείς μηχανισμοί (Park et al., 2003): (1) Άμεσα προσδένεται στο στοιχείο απόκρισης και ενεργοποιεί τη μεταγραφή. Με αυτό τον τρόπο δρα ο COUP- TFII όταν επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου CYP7A. (2) Προσδένεται σε ένα ρυθμιστικό στοιχείο και έμμεσα μέσω άλλων μεταγραφικών παραγόντων επηρεάζει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων (π.χ. PEPCK). (3) Επάγει τη μεταγραφή μέσω αλληλεπίδρασης αφενός με άλλον μεταγραφικό παράγοντα όπως π.χ. ο Sp1 ο οποίος προσδένεται στο στοιχείο απόκρισής του στο DNA και αφετέρου με το γενικό μεταγραφικό παράγοντα TFIIB (π.χ. NFGI) (Ing et al., 1992). Η επαγωγή της μεταγραφής των γονιδίων στόχων συχνά επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπίδρασης του COUP-TF με άλλους συνενεργοποιητές. Η αλληλεπίδραση πραγματοποιείται στην καρβόξυ-τελική περιοχή και πιο συγκεκριμένα στην LBD (Pipaon et al., 1999). (Α.3.3) H ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ COUP-TF Σε αντίθεση με τα ρόλο και τη λειτουργία της πρωτεΐνης COUP-TF, για τα οποίο υπάρχει αρκετά μεγάλος όγκος πληροφορίας, λίγα είναι γνωστά για τη ρύθμιση του γονιδίου. Μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία τρία μόρια τα οποία επηρεάζουν τη ρύθμιση Εικόνα 11. Μοριακοί μηχανισμοί δράσης του COUP-TF ως ενεργοποιητής. Α: Άμεση ενεργοποίηση μέσω πρόσδεσής του στο στοιχείο απόκρισης. Β: Έμμεση ενεργοποίηση μέσω δράσης ως βοηθητικός παράγοντας. Γ: Ενεργοποίηση μέσω αλληλεπίδρασής στο με πρωτεΐνη που προσδένει DNA 19

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ του γονιδίου: το Sonic Hedgehog, οι μεταγραφικοί παράγοντες Ets και το ρετινοϊκό οξύ (Εικόνα 11). Ο παράγοντας Sonic Hedgehog είναι μια πρωτεΐνη η οποία εκκρίνεται από τη νωτοχορδή και απαιτείται για την επαγωγή της υποβλάστης, των κινητικών νευρώνων και άλλων κεντρικών δομών (Chiang et al., 1996; Roelink et al., 1994). Στον υποκινητή του COUP-TFII στον ποντικό έχει βρεθεί ένα στοιχείο απόκρισης για ένα μεταγραφικό παράγοντα (διαφορετικός από τον Gli) ο οποίος ανήκει και αυτός στο μονοπάτι σηματοδότησης του Sonic Hedgehog. Φαίνεται ότι το Sonic Hedgehog επάγει τη μεταγωγή σήματος η οποία καταλήγει στην αποφωσφορυλίωση ενός μεταγραφικού παράγοντα απαραίτητου για την ενεργοποίηση της μεταγραφής του γονιδίου COUP-TFII (Krishnan et al., 1997a; Krishnan et al., 1997b). Οι παράγοντες Ets συγκροτούν μια μεγάλη ομάδα παραγόντων και όλοι φέρουν την ίδια περιοχή με την οποία προσδένονται στα στοιχεία απόκρισής τους (Wasylyk et al., 1993). Συγκεκριμένα προσδένονται ως μονομερή στην αλληλουχία GGAA/T. και ενεργοποιούν τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων. Πολλοί από τους παράγοντες, όπως ο Ets-1 και 2, αλληλεπιδρούν με άλλους συνενεργοποιητές και επάγουν τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων (Wasylyk et al., 1990). Στον ποντικό έχει βρεθεί μια ομάδα στοιχείων απόκρισης των Ets στον υποκινητή του γονιδίου COUP- TFI.Φαίνεται ότι ο παράγοντας Ets-1 στρατολογεί μια πληθώρα συνενεργοποιητών και μαζί επάγουν τη μεταγραφή του γονιδίου COUP-TFI (Salas et al., 2002). Στο Xenopus, το ρετινοϊκό οξύ φαίνεται να ρυθμίζει την έκφραση των COUP- TF-Α και COUP-TF-Β και μάλιστα με αντίθετο τρόπο. Ενισχύει την έκφραση του xcoup-tf-a στο στάδιο 13 μέχρι και το στάδιο του νευριδίου, ενώ η έκφραση του xcoup-t-b αναστέλλεται στα ίδια αναπτυξιακά στάδια. Αργότερα, τα επίπεδα έκφρασης και των δυο γονιδίων επιστρέφουν στα κανονικά (van der Wees et al., 1996). Επιπλέον παρατηρήθηκε in vitro επαγωγή της μεταγραφής των γονιδίων COUP-TFI και ΙΙ μετά από προσθήκη ρετινοειδών σε καρκινικά κύτταρα P19 (Qiu et al., 1996). (Α.3.4) COUP-TF ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Οι πυρηνικοί υποδοχείς παίζουν κεντρικό ρόλο στην διαφοροποίηση, την ανάπτυξη, τη μεταβολική ρύθμιση και την ομοιόσταση και αυτό φαίνεται από τις λειτουργίες που ρυθμίζουν σε κάθε οργανισμό καθώς και τις επιπτώσεις σε 20

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ περίπτωση μεταλλάξεων των γονιδίων. Έως τώρα οι COUP-TFs έχουν απομονωθεί και μελετηθεί σε αρκετούς οργανισμούς, από τα πρώτα μετάζωα μέχρι τον άνθρωπο. Έτσι, σήμερα γνωρίζουμε ότι ο άνθρωπος έχει δύο τέτοια γονίδια (hcoup-tf I, II), η όρνιθα ένα (ccoup-tfii), ο Xenopus τρία (xcoup-tf I, II/Β, III/Α), η Drosophila ένα (seven up [svp]), το zebrafish τρία (svp[44], svp[46], svp[40]), το ποντίκι δύο (mcoup-tf I, II), το hamster, ο αρουραίος ο C.elegans και ο αχινός Strongylocentrotus purpuratus, ένα (hmcoup-tf I, rcoup-tf I, unc-55 και SpCOUP-TF αντίστοιχα) Στο zebrafish μετάγραφα του svp[44] ανιχνεύονται για πρώτη φορά σε έμβρυα ωρών. Στον προσθεγκέφαλο εμβρύων 13 ωρών εκφράζεται στο πρόσθιο μισό του μεσεγκεφάλου και στο οπίσθιο μέρος του διεγκεφάλου. Στον μελλοντικό ρομβεγκέφαλο εμφανίζεται σαν μία ράβδωση στην πρόσθια περιοχή, η οποία αντιπροσωπεύει τα πρόδρομα ρομβομερίδια. Επίσης, ανιχνεύεται στο ενδιάμεσο μεσόδερμα, οπίσθια του πρώτου σωμίτη. Παρόμοια, ο svp[40], εκφράζεται από το στάδιο των 10 ωρών και στις 12 ώρες εκφράζεται στο όριο διεγκεφάλουρομβεγκεφάλου και μόλις οπίσθια των οπτικών κυστιδίων, καθώς και στα έξι πρώτα ρομβομερίδια. Ο svp[46], εκφράζεται στα μέρη που θα καθοριστούν ως διεγκέφαλος, μεσεγκέφαλος, ρομβεγκέφαλος και στο πρόσθιο μέρος του νωτιαίου μυελού στο στάδιο των 11 ωρών. Ακόμα, εκφράζεται στο παραξονικό μεσόδερμα σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια (Fjose et al., 1995). Στο Xenopus το πρότυπο έκφρασης είναι παρόμοιο με αυτό στο zebrafish. Μειωμένη έκφραση του xcoup-tf Ι επηρεάζει την πρώιμη ανάπτυξη. Εκτοπική έκφραση σε έμβρυα των 4-κυττάρων στο ραχιαίο μισό, αλλά όχι στο κοιλιακό, οδηγεί σε απώλεια ματιών, σιελογόνων αδένων και κακό σχηματισμό των δομών του εγκεφάλου (van der Wees et al., 1996). Στον ποντικό, όπως έχει ήδη αναφερθεί, υπάρχουν δυο γονίδια COUP-TF τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του κεντρικού νευρικού συστήματος αλλά και στην οργανογένεση. Παρόλο που τα πρότυπα έκφρασης των δύο COUP- TFs αλληλεπικαλύπτονται, είναι αρκετά διακριτά μεταξύ τους. Ο COUP-TF I εκφράζεται στον εγκεφαλικό φλοιό και ρυθμίζει τη φυσιολογική ανάπτυξη και διαφοροποίηση των νευρικών κυττάρων κατά την εμβρυογένεση. Εκφράζεται, επίσης, στο μεσόδερμα και επηρεάζει τη διαφοροποίηση των οστών κατά την ανάπτυξη. Άτομα με μεταλλαγμένο COUP-TF I πεθαίνουν κάποια χρονική στιγμή 21

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κοντά στη γέννηση από λιμοκτονία και αφυδάτωση, γιατί παρουσιάζουν ανωμαλία στη μορφογένεση του ένατου κρανιακού γαγγλίου (γλωσσοφαρυγγικό) και νεύρου. Αυτό έχει σαν συνέπεια να σχηματίζονται λιγότεροι νευρώνες και ανώμαλες νευρικές προεκβολές προς τον μεσεγκέφαλο. Στα μεταλλαγμένα άτομα το γάγγλιο ΙΧ εμφανίζεται ως απομονωμένη μάζα νευρώνων χωρίς συνδέσεις με το γάγγλιο Χ. Ο COUP-TF Ι συμμετέχει επίσης στη διαφοροποίηση των οστών(park et al., 2003; Qiu et al., 1997). Ο COUP-TF II, όπως και ο COUP-TF Ι, εκφράζεται στον εγκέφαλο και επηρεάζει ιδιαίτερα την αγγειογένεση και την ανάπτυξη της καρδιάς. Μεταλλάξεις του COUP-TF ΙΙ προκαλούν συνήθως το θάνατο σε πρώιμο εμβρυϊκό στάδιο (κοντά στη δέκατη εμβρυική μέρα) και τα άτομα φαίνεται να αντιμετωπίζουν σοβαρές καρδιακές και αγγειακές ανωμαλίες. Ο φλεβώδης κόλπος είναι αρκετά μικρότερος και δύσμορφος και οι κύριες φλέβες υπό κατάρρευση. Ο mcoup-tfii εκφράζεται επίσης στους σιελογόνους αδένες, τους πνεύμονες, τον οισοφάγο, τον στόμαχο, τον μεσόνεφρο, τον προστάτη και το πάγκρεας (Cooney et al., 2001; Qiu et al., 1995). Στην όρνιθα, υπάρχουν τρία μετάγραφα του γονιδίου COUP-TF με διαφορετικά μήκη, που πιθανότατα προέρχονται από εναλλακτικό μάτισμα. Ο ccoup-tf ΙΙ παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των κινητικών νευρώνων. Τα επίπεδα του mrna ποικίλλουν κατά την ανάπτυξη: είναι σχετικά χαμηλά κατά τη γαστριδίωση, νευριδίωση και πρώιμη σωμιτογένεση (στάδια 4-8), αλλά από τα στάδια 8-9 και μετά τα επίπεδα έκφρασης σταδιακά αυξάνονται και φτάνουν το μέγιστο στα στάδια Το γονίδιο εκφράζεται στις ραχιαίες ρίζες των γαγγλίων, στα κρανιακά αισθητικά γάγγλια και σε όλα τα παράγωγα του διάμεσου μεσοδέρματος, όπως μεσόνεφρος, μεσεντέρια, εντερικό τοίχωμα αλλά και σε άλλες περιοχές του νευρικού συστήματος (προσθεγκέφαλος, μεσεγκέφαλος, οπισθεγκέφαλος)(cooney et al., 2001; Lutz et al., 1994). Στη Drosophila το ομόλογο COUP-TF γονίδιο, svp (seven up), παίζει ρόλο στον καθορισμό των φωτουποδοχέων, την ανάπτυξη των λιπαρών σωμάτων, των νεφρών και των μαλπιγγιανών σωληναρίων. Συγκεκριμένα, εκφράζεται στα κύτταρα φωτουποδοχέων που θα γίνουν τύπου R1, R3, R4 και R6 και τα εμποδίζει να γίνουν τύπου R7. Το svp γονίδιο όταν απουσιάζει οδηγεί τα κύτταρα αυτά να λάβουν φαινότυπο μικρών ομματιδίων όμοιων με τα R7. Το svp είναι το γονίδιο που οδηγεί τα R1, R3, R4, R6 στην σωστή αναπτυξιακή τύχη. Έλλειψή του οδηγεί τα R3, R4 σε 22

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ τύπου R7 και τα R1, R6 σε ένα αβέβαιου τύπου μικρού μεγέθους φωτουποδοχέα. Η δράση του svp επιτυγχάνεται κυρίως μέσω ετεροδιμερισμού του με το usp (ultraspiracle) που είναι το ομόλογο του RXR και το οποίο κανονικά ενεργοποιεί τον υποδοχέα της εκδυσόνης (Hiromi et al., 1993; Hoshizaki, 1994; Kerber et al., 1998; Mlodzik et al., 1990). Στο C.elegans το ομόλογο γονίδιο είναι το unc-55 και μεταλλάξεις του έχουν σαν αποτέλεσμα οι κοιλιακοί κινητικοί νευρώνες να αποκτήσουν συναπτικό πρότυπο ραχιαίων κινητικών νευρώνων με συνέπεια έναν ασύμμετρο τρόπο κίνησης όταν τα ζώα αυτά κατευθύνονται προς τα πίσω (Shan et al., 2005; Zhou and Walthall, 1998). Πρόσφατα έχει αναδειχθεί και ο ρόλος του unc-55 στην συμπεριφορά των αρσενικών ως προς το ζευγάρωμα (Shan and Walthall, 2008). (Α.3.5) O COUP-TF ΣΤΟΝ ΑΧΙΝΟ S.purpuratus Ένα ομόλογο της οικογένειας των COUP-TFs είναι το γονίδιο SpCOUP-TF, που έχει απομονωθεί από τον αχινό Strongylocentrotus purpuratus. Το γονίδιο αυτό εμφανίζει μεγάλη ομοιότητα αλληλουχίας με το γονίδιο COUP-TF σε ασπόνδυλα και σπονδυλωτά. Έτσι, μεταξύ του ανθρώπινου COUP-TFΙ και του SpCOUP-TF υπάρχει 96% ομολογία στα αμινοξέα της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD) και 92% στην περιοχή πρόσδεσης της ορμόνης (LBD) (Chan et al., 1992). Το γονίδιο SpCOUP-TF εκφράζεται κατά τα η διάρκεια της ωογένεσης και τα μετάγραφά Εικόνα 12. Ανίχνευση του του παραμένουν στο ωάριο ως μητρικό mrna. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 12. Το μητρικό μητρικού mrna του SpCOUP-TF A: στο ωοκύτταρο και Β: στο γονιμοποιημένο ωάριο με in situ mrna εντοπίζεται στη μια πλευρά του υβριδοποίηση. ωοκυττάρου προς τη περιοχή του φλοιού. Το ίδιο συμβαίνει και στο αυγό, δηλαδή το mrna συγκεντρώνεται προς τη μια πλευρά του (Vlahou et al., 1996). 23

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά την αυλάκωση και ξεκινώντας από το στάδιο των δύο κυττάρων, το mrna του SpCOUP-TF συγκεντρώνεται κυρίως στο ένα από τα δύο βλαστομερίδια σε γωνία 90 ο ως προς το επίπεδο αυλάκωσης (Εικόνα 13Ζ). Κατά τη δεύτερη αυλάκωση ανιχνεύεται σε δύο από τα τέσσερα βλαστομερίδια (Εικόνα 13Η). Μετά από δύο ακόμη διαιρέσεις το έμβρυο βρίσκεται στο στάδιο των 16 κυττάρων και το mrna πλέον ανιχνεύεται στα 4 από τα 8 μεσομερίδια, σε 2 από τα 4 μακρομερίδια ενώ ανιχνεύεται λιγότερο στα μικρομερίδια (Εικόνα 13Ι). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 13Α-Ε στο είδος Lytechinus variegatus το COUP-TF mrna ανιχνεύεται σε διαφορετικά σημεία, σχετικά με τα επίπεδα αυλάκωσης από ότι το mrna του S.purpuratus. Συγκεκριμένα στο στάδιο των 2 Εικόνα 13. Ανίχνευση του mrna του COUP-TF σε πρώιμα αναπτυξιακά στάδια στα είδη Lytechinus variegatus A-E και Strongylocentrotus purpuratus ΣΤ-Ι με in situ υβριδοποίηση βλαστομεριδίων, η μεγαλύτερη συγκέντρωση του COUP-TF mrna ανιχνεύεται στο ένα από τα δύο κύτταρα σε γωνία 45 ο ως προς το πρώτο επίπεδο αυλάκωσης Εικόνα 13Β. Μετά τη δεύτερη αυλάκωση, μεγάλη ποσότητα mrna ανιχνεύεται στο ένα από τα τέσσερα βλαστομερίδια, μεμιρκότερο ποσοστό να ανιχνεύεται στα δύο γειτονικά του (Εικόνα 13Γ). Στα δύο αυτά είδη η θέση του στοματικού /αντιστοματικού άξονα του εμβρύου διαφέρει ως προς το πρώτο επίπεδο αυλάκωσης κατά 45 ο. Ο εντοπισμός του mrna COUP-TF στα έμβρυα των δύο αυτών ειδών αχινού δείχνει ότι είναι πολύ πιθανόν να είναι άμεσα συνηφασμένος με τη θέση του στοματικού/αντιστοματικού άξονα του εμβρύου (Vlahou et al., 1996). 24

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στο στάδιο του βλαστιδίου, το SpCOUP-TF mrna εντοπίζεται αποκλειστικά στα εξωδερμικά κύτταρα ση μια πλευρά του τοιχώματος του βλαστόκοιλου, την υποτιθέμενη στοματική περιοχή (Εικόνα 14Α). Στο στάδιο αυτό το ανιχνεύσιμο mrna, πιθανόν να είναι λιγότερο μητρικής και περισσότερο ζυγωτικής προέλευσης. Από το στάδιο του γαστριδίου και μετά όλα τα μετάγραφα του COUP-TF θεωρούνται ζυγωτικής προέλευσης και ανιχνεύονται στο στοματικό εξώδερμα (Εικόνα 14Β). Στο στάδιο του πλουτέα, το SpCOUP-TF mrna εντοπίζεται καθαρά στα στοματικό εξώδερμα και στη βλεφαριδωτή ζώνη(εικόνα 14Γ) (Vlahou et al., 1996). Μελέτες που αφορούν την ενδοκυτταρική διαμερισματοποίηση του υποδοχέα στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια, απέδειξαν ότι η μητρική πρωτεΐνη ανιχνεύεται στο κυτταρόπλασμα και στον πυρηνίσκο του ωοκυττάρου και στο κυτταρόπλασμα στο ώριμο αγονιμοποίητο ωάριο (Εικόνα 15Α,Β). Μετά τη γονιμοποίηση το μεγαλύτερο μέρος της πρωτεΐνης μεταναστεύει από το κυτταρόπλασμα στους πυρήνες. Κατά τη μεσόφαση, στο στάδιο των δύο κυττάρων, η πρωτεΐνη COUP-TF ανιχνεύεται στην Εικόνα 14. Ανίχνευση με in situ υβριδοποίηση του COUP-TF mrna στο Α: βλαστίδιο Β: γαστρίδιο Γ: πλουτέας. Δ-Ζ: controls. oe:oral ectoderm, cb: ciliated band, ae: aboral ectoderm περιφέρεια του πυρήνα (Εικόνα 15C), όπου παραμένει και σε επόμενα αναπτυξιακά στάδια με ένα μικρό ποσοστό της να ανιχνεύεται και στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 15D,E). 25

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ωστόσο, κατά τη μιτωτική διαίρεση των χρωμοσωμάτων η πρωτεΐνη COUP- TF βρίσκεται συνδεδεμένη με τη συμπυκνωμένη χρωματίνη. Άρα η πρωτεΐνη COUP- Εικόνα 15. Ανίχνευση του COUP-TF με ανοσοφθορισμό σε ωοκύτταρα, αυγά και βλαστομερίδια που βρίσκονται στη μεσόφαση. Για λεπτομέρειες βλέπε κείμενο Εικόνα 16. Ανίχνευση του COUP-TF με ανοσοφθορισμό σε πρώιμα εμβρυικά κύτταρα που βρίσκονται σε μίτωση. Για λεπτομέρειες βλέπε κείμενο TF πηγαινοέρχεται μεταξύ της πυρηνικής περιφέρειας και των χρωμοσωμάτων κατά τον κυτταρικό κύκλο. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 16A-C, στο στάδιο των 2, 4, και 16 κυττάρων ο COUP-TF ανιχνεύεται στα χρωμοσώματα. Στο στάδιο των 16 κυττάρων όμως, τα μικρομερίδια βρίσκονται ακόμη στη φάση της μεσόφασης, οπότε ο COUP ανιχνεύεται στην περιφέρεια του πυρήνα σε αυτά (Εικόνα 16C). Ωστόσο, όταν και τα μικρομερίδια ξεκινούν τη μίτωση ο SpCOUP-TF ανιχνεύεται πλέον στα συμπυκνωμένα χρωμοσώματα (Εικόνα 16D). Προχωρώντας στο στάδιο των 60 κυττάρων, ο SpCOUP-TF ανιχνεύεται σε κάποια κύτταρα στην πυρηνική περιφέρεια ενώ σε άλλα στη συμπυκνωμένη χρωματίνη ακολουθώντας τις χαρακτηριστικές μετακινήσεις του κατά τον κυτταρικό κύκλο (Εικόνα 16E) (Vlahou and Flytzanis, 2000). Ο μεταγραφικός παράγοντας SpCOUP-TF πρωτοεντοπίστηκε σε πυρηνικό εκχύλισμα εμβρύων αχινού και φάνηκε ότι σχημάτιζε in vitro συγκεκριμένα 26

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ συμπλέγματα με ένα στοιχείο απόκρισης ορμονών. Αυτό το στοιχείο βρέθηκε στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της ακτίνης CyIIIb και ονομάζεται C1R (AGGTCA GC GGGTCA). To CyIIIb κωδικοποιεί μία ακτίνη κυτταροσκελετικού τύπου η οποία εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Η συσσώρευση του mrna της ακτίνης CyIIIb ρυθμίζεται στο επίπεδο της μεταγραφής και πρωτοπαρατηρείται 10 ώρες μετά τη γονιμοποίηση και αυξάνει μέχρι το στάδιο του πλουτέα. Το γονίδιο της ακτίνης εκφράζεται ειδικά στο αντιστοματικό εξώδερμα (Flytzanis et al., 1989). Το γεγονός αυτό ίσως υπονοεί ότι ο COUP-TF προσδένεται στον υποκινητή του εν λόγω γονιδίου και καταστέλλει την έκφρασή του στο στοματικό εξώδερμα (Xu et al., 1996) (Α.3.6) COUP-TF ΣΤΟΝ ΑΧΙΝΟ Paracentrotus lividus O αχινός Paracentrotus lividus, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, διαφοροποιείται από αυτό το μοντέλο δομής του γονιδίου COUP-TF καθώς το γονίδιο αποτελείται από τέσσερα εξόνια (αδημοσίευτα αποτελέσματα από το εργαστήριό μας) αντί για τρία. To επιπλέον εξόνιο (εξόνιο ΙΙ) κωδικοποιεί ένα πεπτίδιο 21 αμινοξέων το οποίο εντίθεται στην C περιοχή και συγκεκριμένα στην κάρβοξυ-τελική επέκταση (CTE) της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD) (Εικόνα 19) Εικόνα 19. Η δομή του γονιδίου και της πρωτεΐνης COUP-TF στον αχινό Paracentrotus lividus. Το επιπλέον εξόνιο (ΙΙ) κωδικοποιεί ένα πεπτίδιο 21αα που εντοπίζεται στην C περιοχή και συγκεκριμένα στην κάβοξυτελική επέκταση (CTE) της περιοχής πρόσδεσης στο DNA (DBD). DBD: DNA Binding Domain, CTE: Carboxy Terminal Extension, LBD: Ligand Binding Domain 27

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Απομονώθηκαν λοιπόν δύο cdna κλώνοι για τον PlCOUP-TF. H ανάλυση της πρωτοδιάταξης των δύο αυτών κλώνων έδειξε ότι περιλαμβάνουν ένα ανοικτό αναγνωστικό πλαίσιο 1410 και 1473 νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν αντίστοιχα μια μικρή πρωτεϊνική αλληλουχία 470 νουκλεοτιδίων και μια μεγάλη 491 αμινοξέων αντίστοιχα. Οι πρωτεΐνες αυτές έδειξαν πολύ μεγάλη ομολογία με τις πρωτεϊνικές αλληλουχίες γνωστών μελών της υποοικογένειας COUP-TF υποδοχέων και επίσης περιελάμβαναν και τις πέντε χαρακτηριστικές περιοχές της υπεροικογένειας των υποδοχέων στεροειδών/θυρεοειδών ορμονών. Στην συνέχεια αποκαλύφθηκε ότι o COUP-TF βρίσκεται σε δύο ισομορφές, οι οποίες προκύπτουν μέσω εναλλακτικού ματίσματος κατά το οποίο αφαιρείται ένα το εξόνιο ΙΙ. Το εναλλακτικό μάτισμα αυτό συναντάται για πρώτη φορά και δεν έχει περιγραφεί σε άλλο οργανισμό μέχρι στιγμής. Χρησιμοποιώντας τις in vitro συντιθέμενες ισομορφές του PlCOUP-TF και σχεδιάζοντας σειρά στοιχείων απόκρισης με βάση το μοτίβο του στοιχείου C1R στον υποκινητή του γονιδίου CyIIIb του αχινού, επιχειρήθηκε να αναλυθεί η ικανότητα πρόσδεσης των δύο ισομορφών. Σχεδιάστηκε μια σειρά από REs βασισμένη στην ευθεία επανάληψη του GGTCA σε αποστάσεις 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 και 11 nt (N0, N1, N2, N3, N4, N5, N7, N9, N11 αντίστοιχα). Παράλληλα, σχεδιάστηκε μια σειρά βασισμένη στην παλινδρομική επανάληψη του βασικού μοτίβου σε αποστάσεις 0 και 3 nt (P0 και P3 αντίστοιχα). Τέλος χρησιμοποιήθηκε και το στοιχείο 432 (5 -UTR του PlCOUP-TF) αλλά και μια half site (H, GGTCA). Όπως προέκυψε από πειράματα EMSA (η μέθοδος αναλύεται εκτενώς στο μέρος Υλικά και μέθοδοι), οι in vitro συντιθέμενες πρωτεΐνες διαφοροποιούνται ως προς το πρότυπο πρόσδεσης τους στο DNA. Συγκεκριμένα για την μικρή ισομορφή, παρατηρείται πρόσδεση σε όλα τα στοιχεία απόκρισης που χρησιμοποιήθηκαν με ποσοστό από 2,3% έως 51,8%. Η μικρή ισομορφή εμφανίζει μεγαλύτερη πρόσδεση σε ευθείες επαναλήψεις (C1R, N3, N2) από ότι σε παλίνδρομες επαναλήψεις, ενώ για κάποια παλίνδρομα το ποσοστό πρόσδεσης είναι αρκετά ψηλό (P0 31,8%). O COUP-TF μπορεί να δένει σε half-sites (Η) με εμφανώς μειωμένα ποσοστά (2,3%) συγκριτικά με τα υπόλοιπα στοιχεία, ενώ είναι χαρακτηριστικό ότι δένει αποτελεσματικά και στο στοιχείο 432 (σε ποσοστό 30,1%) παρέχοντας ισχυρές ενδείξεις για φαινόμενα αυτορρύθμισης του γονιδίου PlCOUP-TF. Για κάποια στοιχεία, η πρόσδεση είναι μικρότερη (Ν11, Ν7, Ν0). Ακόμη και γι αυτά τα στοιχεία 28

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (μεγάλες αποστάσεις μεταξύ των ημιθέσεων ή μηδενικές) όπως και για τα υπόλοιπα, η πρόσδεση είναι ειδική όπως αποκαλύφθηκε με την χρήση ειδικού ανταγωνιστή. Η λειτουργική κατάσταση της μικρής PICOUP-TF είναι αυτή του σταθερού διμερούς. Η μικρή πρωτεΐνη PICOUP-TF προσδένεται σε όλα τα στοιχεία απόκρισης με τη μορφή ενός και μόνο διμερούς που διαθέτει δομική ευελιξία. Τα αποτελέσματα της EMSA ανάλυσης δεν εμφάνισαν ανάλογο πρότυπο πρόσδεσης για την μεγάλη ισομορφή (Κοζάου, 2006). Παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον το γεγονός ότι για τη μεγάλη PICOUP-TF πρωτεΐνη δεν παρατηρήθηκε αποτελεσματικό δέσιμο σε κανένα από τα στοιχεία απόκρισης που μελετήθηκαν (παρατηρούμενα ποσοστά πρόσδεσης από 0 έως 0,2%). Είναι επίσης πολύ σημαντικό ότι σε πειράματα ετεροδιμερισμού της μικρής με την μεγάλη ισομορφή, παρατηρήθηκε δοσοεξαρτώμενη μείωση του ποσοστού πρόσδεσης σε σχέση με το ομοδιμερές της μικρής ισομορφής. Η παρατηρούμενη μείωση επιβεβαιώνει τον σχηματισμό ετεροδιμερών, τα οποία δεν δύνανται να προσδεθούν στο DNA. Το γεγονός αυτό οδηγεί στην σκέψη για τον πιθανό ρόλο της μεγάλης πρωτεΐνης σαν φυσικού αρνητικού ρυθμιστή της μικρής. Ωστόσο κάτι τέτοιo δεν έχει ακόμα αποδειχθεί. Επίσης, πειράματα ανοσοφθορισμού, έχουν δείξει ότι σε έμβρυα αχινού στο στάδιο των 16 κυττάρων, η μεγάλη πρωτεΐνη εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα 20), ενώ για τη μικρή πρωτεΐνη είναι γνωστή η παρουσία της στον πυρήνα (Εικόνα 15 και 16). Εικόνα 20. Ανοσοφθορισμός στο στάδιο των 16 κυττάρων με τη χρήση αντισώματος έναντι της ένθεσης των 21 αμινοξέων. Χαρακτηριστική είναι η απουσία φθορισμού από τον πυρήνα κάτι που σημαίνει κυτταροπλασματική δαμερισματοποίηση της μεγάλης ισομορφής PlCOUP-TF 29

38 ΣΚΟΠΟΣ 30

39 ΣΚΟΠΟΣ (Β) ΣΚΟΠΟΣ Ο σκοπός της εργασίας αυτής είναι η μελέτη του ρόλου της ένθεσης των 21 αμινοξέων στην μεγάλη ισομορφή, όσον αφορά στην κυτταρική διαμερισματοποίηση και στη συγγένεια πρόσδεσης στο DNA. Στην ένθεση αυτή υπάρχουν δύο προλίνες και τρείς θρεονίνες(εικόνα 21Α). Η προλίνη γενικότερα βρίσκεται σε σημεία όπου μία πρωτεΐνη κάμπτεται. Η υπόθεσή μας είναι ότι οι προλίνες αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο στη στερεοδιαμόρφωση της πρωτεΐνης, που με τη σειρά της είναι υπεύθυνη για τις αλλαγές που παρατηρούνται στην μεγάλη ισομορφή, ως προς την συγγένεια πρόσδεσης στο DNA και την κυτταρική διαμερισματοποίηση, σε σχέση με Α. B. Εικόνα 21. Α: Τα 21 αμινοξέα της ένθεσης στην CTE. Με κόκκινο χρώμα φαίνονται οι 2 προλίνες, με πράσινο οι τρεις αλανίνες. Υποδεικνύεται επίσης η ακριβής τους θέση στην πρωτεϊνική αλληλουχία B:Τα χαρακτηρίστηκα των αμινοξέων προλίνη θρεονίνη και αλανίνη 31

40 ΣΚΟΠΟΣ την μικρή. Επίσης η θρεονίνη είναι ένα αμινοξύ που μπορεί να δεκτεί φωσφορυλίωση. Γεγονότα φωσφορυλίωσης και αποφωσφορυλίωσης μπορεί να επηρεάζουν την ικανότητα πρόσδεσης και την κυτταρική διαμερισματοποίηση του υποδοχέα. Για να ελεχθούν οι υποθέσεις αυτές, μεταλλάχθηκαν οι δύο προλίνες και οι τρεις θρεονίνες της μεγάλης ισομορφής σε αλανίνες, παράχθηκαν in vitro οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες και προσδιορίστηκε η συγγένεια πρόσδεσης τους στο DNA με πειράματα EMSA.. Το αμινοξύ αλανίνη προτιμήθηκε, έτσι ώστε να διαταραχθεί η κάμψη ή η πιθανή φωσφορυλίωση στα σημεία όπου υπάρχει προλίνη και θρεονίνη αντίστοιχα χωρίς όμως να προσδοθεί κάποιο άλλο ειδικό χαρακτηριστικό όπως φορτίο ή υδροφοβικότητα (Εικόνα 21Β). Οι ίδιες μεταλλάξεις πραγματοποιήθηκαν και σε ένα κατασκεύασμα το οποίο κωδικοποιεί για τη χιμαιρική πρωτεΐνη που αποτελείται από τη μεγάλη ισομορφή και τη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Τα in vitro παραχθέντα RNAs ενέθηκαν σε έμβρυα αχινού ώστε να μελετηθεί η ενδοκυτταρική κατανομή της μεγάλης COUP-TF ισομορφής. Τα πειράματα με τις θρεονίνες βρίσκονται ακόμα στο στάδιο δημιουργίας των μεταλλάξεων 32

41 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 33

42 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ) ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ.1) ΚΑΤΕΥΘΥΝΟΜΕΝΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΓΕΝΕΣΗ Για την κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση χρησιμοποιήθηκε το Quik Change Lightning Site-Directed Mutagenesis kit της Stratagene. Αρχικά σχεδιάζονται οι primers που φέρουν την επιθυμητή μετάλλαξη και οι οποίοι υβριδοποιούνται σε πλήρως συμπληρωματικές θέσεις στις δύο αλυσίδες του DNA (Εικόνα 21) και πραγματοποιείται μια invert PCR. Τα προϊόντα της PCR είναι κυκλικά μόρια DNA τα οποία φέρουν εγκοπές σε διαφορετικές θέσεις στις συμπληρωματικές αλυσίδες. Σ αυτά προστίθεται το ένζυμο DpnI προκειμένου να κατακερματιστεί το αρχικό DNA υπόστρωμα και Εικόνα 21. Συνοπτικά η πορεία του Quik Change Lightning Site-Directed Mutagenesis kit. Α:invert ακολουθεί μετασχηματισμός. PCR, B: Πέψη με DpnI, Γ:Μετασχηματισμός. Τόσο το cdna της COUP-TF μικρής (COUP-TF S.I) και της μεγάλης ισομορφής (COUP-TF L.I) (1410 και 1473 bp αντίστοιχα) όσο και τα αντίστοιχα που είναι fused me GFP (2527bp και 2464bp αντίστοιχα) βρίσκονται κλωνοποιημένα στον φορέα PCRII σε κύτταρα DH10B. (Γ.1.1) INVERT PCR Για τις αντιδράσεις PCR και τη δημιουργία των μεταλλάξεων χρησιμοποιήθηκαν οι πιο κάτω primers 34

43 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Ala F A 5 -GCTTGTCCCTCGGTTGCGAGGTTTAGCTGG-3 Ala R A 5 -CCAGCTAAACCTCGCAACCGAGGGACAAGC-3 Ala F B 5 -GCTGGAGGTCCCATGCGTGATTGGTTACCG-3 Ala R B 5 -CGGTAACCAATCACGCATGGGACCTCCAGC-3 Primer 1 st Thr F 5 -GAGAAGGCAGAAACGCGGTAACCAATCACC-3 Primer 1 st Thr R 5 -GGTGATTGGTTAACCGCGTTTCTGCCTTCTC-3 Primer 2 nd Thr F 5 -GGCAGAAACACGGTAGCCAATCACCCATGG-3 Primer 2 nd Thr R 5 -CCATGGGTGATTGGCTACCGTGTTTCTGCC-3 Primer 3 rd Thr F 5 -CAGCTAAACCTCCCAGCCGAGGGACAAGCT-3 Primer 3 rd Thr R 5 -AGCTTGTCCCTCGGCTGGGAGGTTTAGCTG-3 Με πράσινο χρώμα είναι τα νουκλεοτίδια που μεταλλάσσονται. Για τα κατασκευάσματα COUP-TF και COUP-TF GFP χρησιμοποιήθηκαν οι primers AlaFB και AlaRB και σαν υπόστρωμα το COUP-TF Large Isoform και COUP-TF Large Isoform GFP αντίστοιχα. Για τα κατασκευάσματα COUP-TF και COUP-TF GFP χρησιμοποιήθηκαν οι primers AlaFΑ και AlaRΑ και σαν υπόστρωμα το COUP-TF Large Isoform και COUP-TF Large Isoform GFP αντίστοιχα. Για τo κατασκεύασμα COUP-TF / χρησιμοποιήθηκαν οι primers AlaFB και AlaRB και σαν υπόστρωμα COUP-TF. Για το κατασκεύασμα COUP-TF / GFP χρησιμοποιήθηκαν οι primers AlaFA και AlaRA και σαν υπόστρωμα COUP-TF GFP. Όσον αφορά τις μεταλλαγές των θρεονινών σε αλανίνες έχουν γίνει μόνο τα COUP-TF Τ211A,, COUP-TF Τ213A και COUP-TF Τ225A και τα αντίστοιχα με GFP χωρίς να έχουν προχωρήσει τα πειράματα. Για τα κατασκευάσματα COUP-TF Τ211A και COUP-TF Τ211A GFP χρησιμοποιήθηκαν οι primers Primer 1 st Thr F και Primer 1 st Thr R και σαν υπόστρωμα το COUP-TF Large Isoform και COUP-TF Large Isoform GFP αντίστοιχα. 35

44 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Για τα κατασκευάσματα COUP-TF Τ213A και COUP-TF Τ213A GFP χρησιμοποιήθηκαν οι primers Primer 2 nd Thr F και Primer 2 nd Thr F και σαν υπόστρωμα το COUP-TF Large Isoform και COUP-TF Large Isoform GFP αντίστοιχα. Για τα κατασκευάσματα COUP-TF Τ225A και COUP-TF Τ225A GFP χρησιμοποιήθηκαν οι primers Primer 3 rd Thr F και Primer 3rd Thr F και σαν υπόστρωμα το COUP-TF Large Isoform και COUP-TF Large Isoform GFP αντίστοιχα. Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική πορεία: 1. Σε σωληνάκι PCR προστίθενται τα ακόλουθα: 5λ 10Χ Reaction Buffer 25λ DNA υπόστρωμα (1 ng/λ)(βλέπε παραπάνω) 1,26λ Forward Primer (βλέπε παραπάνω) (10pmoles/λ) 1,26λ Reverse Primer (βλέπε παραπάνω) (10pmoles/λ) 1λ dntp mix 1,5λ Quik solution reagent 13,48λ ddh 2 O 1λ Quik Change Lightning Enzyme 2. Ακολουθεί η αντίδραση PCR με τα εξής χαρακτηριστικά: Για τα κατασκευάσματα χωρίς GFP o C για 2 min o C για 20 s o C για 10s o C για 2min και 45s 5. Go to 2 X o C για 5min 7. END 36

45 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Για τα κατασκευάσματα με GFP o C για 2 min o C για 20 s o C για 10s o C για 3min και 15s 5. Go to 2 X o C για 5min 7. END (Γ.1.2) ΠΕΨΗ ΜΕ TO ΕΝΖΥΜΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ DpnI Μετά την PCR στο διάλυμα υπάρχουν 3 είδη κυκλικών μορίων DNA: (Α) Μόρια που και οι δύο αλυσίδες είναι νεοσυντιθέμενες, (Β) Μόρια που μόνο η μία αλυσίδα είναι νεοσυντιθέμενη και (Γ) Μόρια που και οι δύο αλυσίδες είναι μητρικής προέλευσης. Δεδομένου ότι τα κύτταρα από τα οποία απομονώθηκε το αρχικό υπόστρωμα DNA (DH10B και X-10 Gold ultracompetent cells) φέρουν σύστημα μεθυλίωσης τελικά στο διάλυμα υπάρχει μη μεθυλιωμένο, ημιμεθυλιωμένο και μη μεθυλιωμένο DNA αντίστοιχα. Το DpnI είναι μια ενδονουκλεάση η οποία αναγνωρίζει την αλληλουχία 5 -Gm 6 ATC-3 και επομένως κατακερματίζει ειδικά το μεθυλιωμένο και ημιμεθυλιωμένο DNA. Όταν προστίθεται στα προϊόντα της PCR δρα προσβάλλοντας το μεθυλιωμένο και ημιμεθυλιωμένο DNA. Τελικά απομένει μόνο το μη μεθυλιωμένο DNA το οποίο είναι αυτό που φέρει την επιθυμητή μετάλλαξη και στις δύο αλυσίδες. Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική πορεία: 3. Με το πέρας της PCR προστίθενται στο σωληνάκι 2λ Dpn I 4. Επώαση στους 37 ο C για 5 min 37

46 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ.1.3) ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική πορεία: 5. Σε σωληνάκι προπυλενίου των 14ml με στρογγυλό πάτο που βρίσκεται στον πάγο μεταφέρονται 45λ X10 GOLD ultra competent cells 6. Στο σωλήνα προστίθενται 2λ β-μερκαπτοθανόλης και ακολουθεί επώαση για 2min στον πάγο 7. Στο σωλήνα προστίθενται 2λ DNA από το στάδιο Επώαση για 30min στον πάγο 9. Επώαση για 30s στους 42 ο C 10. Επώαση για 2min στον πάγο. 11. Προσθήκη στο σωλήνα 0,5ml προθερμασμένου στους 42 o C θρεπτικού NZY + (10g NZ amine, 5g yeast extract, 5g NaCl, 12,5ml MgSO 4 1M, 12,5ml MgCl 2 1M, 10ml glucose 2M, ddh 2 O μέχρι τελικού όγκου 1L) 12. Τοποθέτηση του σωλήνα στον rotor για ανάδευση στις rpm στους 37 ο C για 1h. (Γ.1.4) ΣΤΕΡΕΗ ΚΑΛΙΕΡΓΕΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ L Broth Υλικά-Διαλύματα: Bactotryptone Yeast Extract NaCl Agar Ampicillin (100mg/ml) ddh 2 O Πειραματική Πορεία: 1. Σε ποτήρι ζέσεως ζυγίζω 8g 5g Bactotryptone, 2,5g Yeast Extract, 5g NaCl και προσθέτω 400ml ddh 2 O.. 38

47 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2. Κάλυψη με αλουμινόχαρτο και τοποθέτηση σε μαγνητικό αναδευτήρα μέχρι την πλήρη διάλυση 3. Μεταφορά του θρεπτικού σε ογκομετρικό κύλινδρο και συμπλήρωση με ddh 2 O μέχρι τελικού όγκου 500ml. 4. Μεταφορά του θρεπτικού σε κωνική φιάλη και προσθήκη agar ώστε η τελική περιεκτικότητα να είναι 1%. 5. Υγρή αποστείρωση στο αυτόκαυστο (20min,T=121 ο C,P=1,1atm) 6. Αφήνω το θρεπτικό να κρυώσει μέχρι να γίνεται ανεκτό στο μάγουλο και τότε προστίθεται Ampicillin σε τελική συγκέντρωση 100μg/ml. 7. Μοιράζω το θρεπτικό στα τρυβλία, περίπου 30ml σε κάθε τρυβλίο και το αφήνουμε το θρεπτικό να πήξει 8. Επώαση στους 37 ο C overnight για να είμαστε σίγουροι ότι το θρεπτικό δεν έχει μολυνθεί 9. Με την βοήθεια πιπέτας Pasteur στρώνουμε στο στερεό θρεπτικό μέσο τα 50λ από τα κύτταρα που προέρχονται από μετασχηματισμό 10. Επώαση στους 37 ο C overnight 11. Επιλογή αποικιών και επίστρωση σε νέα τρυβλία με στερεό θρεπτικό μέσο με τρόπο ώστε να αναπτυχθούν μοναδικές αποικίες. 12. Επώαση στους 37 ο C overnight (Γ.1.5)ΥΓΡΗ ΚΑΛΙΕΡΓΕΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ L Broth Υλικά-Διαλύματα: Bactotryptone Yeast Extract NaCl Ampicillin (100mg/ml) ddh 2 O 39

48 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματική Πορεία: 1. Σε ποτήρι ζέσεως ζυγίζω 5g Bactotryptone, 2,5g Yeast Extract, 5g NaCl και προσθέτω 400ml ddh 2 O. 2. Κάλυψη με αλουμινόχαρτο και τοποθέτηση σε μαγνητικό αναδευτήρα μέχρι την πλήρη διάλυση 3. Μεταφορά του θρεπτικού σε ογκομετρικό κύλινδρο και συμπλήρωση με ddh 2 O μέχρι τελικού όγκου 500ml. 4. Μεταφορά του θρεπτικού σε κωνική φιάλη 5. Υγρή αποστείρωση στο αυτόκαυστο (20min,T=121 ο C,P=1,1atm) 6. Μοιράζω 3-5ml θρεπτικού σε σωλήνες Falcon των 50ml ή 15ml 7. Προσθέτω Ampicillin σε τελική συγκέντρωση 100μg/ml 8. Επιλέγω μοναδικές αποικίες από την στερεή καλλιέργεια και εμβολιάζω τους σωλήνες με το υγρό θρεπτικό (1 αποικία σε κάθε σωλήνα) (Γ.2) ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΟΥ ΜΙΚΡΗΣ ΚΛΙΜΑΚΑΣ (minipreps) Προκειμένου να ελεγχθούν τα κατασκευάσματα που μετασχηματίστηκαν στα δεκτικά κύτταρα, απομονώθηκαν πλασμιδιακά DNAs με τη χρήση των αντιδραστηρίων της εταιρείας Macherey Nagel (Nucleospin Plasmid) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται. Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική Πορεία: 1. Μετά από φυγοκέντρηση της υγρής καλλιέργειας (5, 10000g, 00C), ακολουθεί επαναιώρηση του ιζήματος των βακτηρίων με τη χρήση 250 λ Buffer Α1 (Cell Resuspension Solution) 2. Προσθήκη 250 λ Buffer Α2 (Cell Lysis Solution)και ήπια ανάδευση, ώστε να γίνει λύση των βακτηρίων. 3. Διατήρηση για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Προσθήκη 300 λ Buffer Α3 (Neutralization Solution) και ήπια ανάδευση. 5. Φυγοκέντρηση για 10 min σε 17000g σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Το υπερκείμενο μεταφέρεται στην κολωνίτσα του Kit. 7. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1min σε 11000g σε θερμοκρασία δωματίου. 8. Προσθήκη 500λ προθερμασμένου στους 50 ο C ΑW Buffer. 9. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1min σε 11000g σε θερμοκρασία δωματίου 40

49 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 10. Προσθήκη 600λ διαλύματος με αιθανόλη (Buffer A4) στο φίλτρο για ξέπλυμα. 11. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1min σε 11000g σε θερμοκρασία δωματίου. 12. Αφαιρούμε το διάλυμα ξεπλύματος και ξαναφυγοκεντρούμε για 2 min σε 13000rpm σε θερμοκρασία δωματίου, προκειμένου το DNA που έχει προσδεθεί στο φίλτρο να στεγνώσει. 13. Το φιλτράκι τοποθετείται σε καθαρό eppendorf και προστίθενται 100 λ Buffer ΑΕ, ώστε να γίνει η έκλουση του DNA από το φίλτρο. 14. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 min σε 11000g σε θερμοκρασία δωματίου. Τελικά, το πλασμιδιακό DNA έχει συλλεχθεί στο eppendorf (VΤΕΛ=100λ). Έπειτα από κατάλληλη αραίωση (1:100) προσδιορίζεται η συγκέντρωση του διαλύματος σε νουκλεϊκά οξέα μέσω φωτομέτρησης. Η φωτομέτρηση γίνεται στα 260nm (οπτική απορρόφηση νουκλεϊκών οξέων) και στα 280nm (οπτική απορρόφηση πρωτεϊνών). Ο λόγος των οπτικών απορροφήσεων O.D.260/O.D.280 πρέπει να είναι μεγαλύτερος του 1,8 για να θεωρηθεί το DNA πολύ καθαρό. Η συγκέντρωση του DNA υπολογίζεται αν λάβει κανείς υπόψη του ότι 1 O.D.260 α= 50μg\ml DNA (Γ.3) ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΟΥ ΜΕΣΗΣ ΚΛΙΜΑΚΑΣ (midipreps) Από της minipreps δεν απομονώθηκε μεγάλη ποσότητα DNA (ιδιαίτερα για το COUP-TF Large Isoform) γι αυτό και έγινε και απομόνωση πλασμιδίου μέσης κλίμακας χρησιμοποιώντας το Plasmid DNA Purificaion NucleoBond PC 100 της εταιρείας Macherey-Nagel Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική Πορεία: 1. Εμβολιάζεται 30ml LB θρεπτικό μέσο που βρίσκεται σε κωνική φιάλη και αφήνεται να αναδεύεται overnight στους 37 ο C. 2. Η καλλιέργεια μεταφέρεται σε σωληνάκι Falcon των 50ml. 3. Φυγοκέντρηση για 15min σε 6000g στους 4 ο C και αφαίρεση του θρεπτικού. 4. Επαναιώρηση με 4ml Buffer S1. 5. Προσθήκη 4ml Buffer S2 και ήπια ανάδευση. 6. Επώαση για 2-3min σε RT. 7. Προσθήκη 4ml παγωμένου Buffer S3 και ήπια ανάδευση. 8. Επώαση για 5min στον πάγο 41

50 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 9. Τοποθετούνται 2,5ml Buffer N2 στην κολώνα και αφήνεται να αδειάσει με την βαρύτητα. 10. Το κυτταρόλυμα από το στάδιο 7 φιλτράρεται με την χρήση πτυχωτού διηθητικού χαρτιού και χωνιού. 11. Το καθαρό κυτταρόλυμα συλλέγεται και φορτώνεται στην κολώνα από το στάδιο 9. Η κολώνα αφήνεται να αδειάσει με την βαρύτητα. Το διήθημα πετιέται. 12. Στην κολώνα προστίθενται 10ml Βuffer Ν3 και αφήνεται να αδειάσει με την βαρύτητα. Το διήθημα πετιέται. 13. Στην κολώνα προστίθενται 5ml Βuffer Ν5 και αφήνεται να αδειάσει με την βαρύτητα. 14. Στο διήθημα προστίθενται 3,5ml isopropanol. 15. Φυγοκέντρηση για 30min σε 15000g στους 4 o C και απομακρύνεται το υπερκείμενο. 16. Στο ίζημα προστίθενται 2ml 70%EtOH. 17. Φυγοκέντρηση για 10min σε 15000g στους o C και απομακρύνεται το υπερκείμενο. 18. Το ίζημα αφήνεται να στεγνώσει και επαναδιαλυτοποιείται σε 1ml ddh 2 O (Γ.4) ΠΕΨΗ ΜΕ ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ NcοΙ Η πέψη με το ένζυμο περιορισμού NcoI γίνεται προκειμένου να ελεχθεί το μέγεθος των πλασμιδίων που έχουν μετασχηματιστεί και μετέπειτα απομονωθεί. Περεταίρω κατά την μετάλλαξη χάνεται μία θέση περιορισμού για το NcoI και συνεπώς η πέψη αυτή είναι ένας καλός δείκτης για το ότι έχει γίνει αυτή η μετάλλαξη. Υλικά-Διαλύματα: mq H 2 O NcoI (20u/λ) (ΝΕΒ) 10X Buffer 3 (NEB) Πλασμιδιακό DNA (COUP-TF Large Isoform, COUP-TF, COUP-TF, COUP-TF P214A/, COUP-TF Small Isoform GFP, COUP- TF Large Isoform GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF P214A/ GFP) 42

51 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ DNA ladder 1kb (NEB) Πειραματική Πορεία: Σε σωληνάκι eppendorf προστίθενται: 1. 2λ 10X Buffer λ NcoI (20u/λ) 3. 0,5 μg πλασμιδιακού DNA 4. mq H2O μέχρι τελικό όγκο 20λ Ακολουθεί επώαση για 2h στους 37 ο C και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. (Γ.5)ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ DNA ΣΕ ΜΗ ΑΠΟΔΙΑΤΑΚΤΙΚΟ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι η πιο κλασική μέθοδος για τον διαχωρισμό και την απομόνωση τμημάτων DNA. Από τους στενούς πόρους του πηκτώματος διέρχονται ευκολότερα τα μικρότερου μήκους θραύσματα DNA, με αποτέλεσμα, στον ίδιο χρόνο, να μετατοπίζονται σε μεγαλύτερη απόσταση από τα μεγαλύτερα. Όσο πιο μακριά από το σημείο έναρξης βρίσκεται η ζώνη, τόσο πιο μικρά τα κομμάτια που τη συγκροτούν. Τα θραύσματα αυτά μπορούν να γίνουν εύκολα ορατά μετά από χρώση του πηκτώματος με βρωμιούχο αιθίδιο, μία χρωστική που παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων του DNA και κάτω από υπεριώδες φως φθορίζει. Η αγαρόζη είναι ένα γραμμικό πολυμερές το οποίο παράγεται από εκχυλίσματα θαλάσσιων φυκιών. Όταν το πήκτωμα στερεοποιηθεί στην πλαστική μήτρα, τοποθετείται μέσα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης και εφαρμόζεται ηλεκτρικό πεδίο στα άκρα του πηκτώματος. Το DNA σε ουδέτερο ph είναι αρνητικά φορτισμένο και μεταναστεύει προς τον θετικό πόλο, ενώ το κατιόν του αιθιδίου κινείται ανάποδα, και έτσι το DNA κατά τη μετανάστευσή του κατά μήκος του πηκτώματος δεσμεύει αιθίδιο και το συμπαρασύρει μαζί του. Μαζί με το δείγμα τρέχουμε και τον μάρτυρα (ladder), που περιέχει κομμάτια DNA γνωστού μεγέθους και μας επιτρέπει να υπολογίσουμε το μέγεθος των θραυσμάτων του δείγματός μας. 43

52 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Προκειμένου να διαχωριστούν τα τμήματα του DNA που έχουν προκύψει από τις πέψεις με ένζυμα περιορισμού ακολουθείται η τεχνική της ηλεκτροφόρησης. Η ανάλυση έγινε σε πήκτωμα 1% αγαρόζης σε 0,5Χ ΤΒΕ. Υλικά-Διαλύματα: ddh 2 O Αγαρόζη ΤΒΕ 5Χ (για 1L: 54g Tris-Base, 27,5g Boric Acid, 20ml 0,5M EDTA ph 8.0) EtBr 10mg/ml Gel Loading Dye 6X (σε Η 2 Ο: 0,25% bromophenol blue, 0,25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll [Type 400 Pharmacia]) 1kb ladder (NEB) Πλασμιδιακό DNA από πέψεις Πειραματική Πορεία: (Εικόνα 22) 1. Ζυγίζονται 0,3g αγαρόζης και τοποθετούνται σε κωνική φιάλη των 100ml 2. Προστίθενται στην κωνική 30ml ΤΒΕ 0,5Χ 3. H κωνική τοποθετείται σε φούρνο μικροκυμάτων μέχρι να διαλυθεί πλήρως η αγαρόζη. 4. Στο διάλυμα προστίθενται 2λ EtBr 10mg/ml 5. Το διάλυμα τοποθετείται στην πλαστική μήτρα. Στην μήτρα επίσης τοποθετείται και το κτενάκι που θα δημιουργήσει τα πηγαδάκια Εικόνα 23. Η πορεία για 6. Όταν το διάλυμα γίνει πλέον πήκτωμα το κτενάκι αφαιρείται και μήτρα τοποθετείται διεξαγωγή ηλεκτροφορησης DNA σε πήκτωμα αγαρόζης. στη συσκευή ηλεκτροφόρησης την οποία γεμίζουμε με TBE 0,5X 7. Τα προς ανάλυση δείγματα αναμιγνύονται με την Gel Loading Dye φορτώνονται (όπως και ο ladder) και ηλεκτροφορούνται. 8. Το πήκτωμα ηλεκτροφορείται στα 80V. 44

53 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ.6) ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΤΩΝ ΚΛΩΝΩΝ ΠΟΥ ΕΠΙΛΕΧΘΗΚΑΝ Επιλέχθηκαν 2 κλώνοι από κάθε κατασκεύασμα και στάλθηκαν για αλληλούχιση στο VBC (Vienna BioCentre στην Αυστρία) (Γ.7) ΠΕΨΗ ΜΕ ΤΟ ΕΝΖΥΜΟ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ HindIII Η πέψη με το ένζυμο περιορισμού HindIII γίνεται προκειμένου να γίνουν γραμμικά τα πλασμίδια και να είναι δυνατή η in vitro μεταγραφή του cdna του ενδιαφέροντος μας. Υλικά-Διαλύματα: mq H 2 O HindIII (20u/λ) (ΝΕΒ) 10X Buffer 2 (NEB) Πλασμιδιακό DNA (COUP-TF Small Isoform, COUP-TF Large Isoform, COUP-TF, COUP-TF, COUP-TF P214A/, COUP-TF Small Isoform GFP, COUP-TF Large Isoform GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF P214A/ GFP) DNA ladder 1kb (NEB) Πειραματική Πορεία: Σε σωληνάκι eppendorf προστίθενται: 1. 10λ 10X Buffer λ HindIII (20u/λ) μg πλασμιδιακού DNA 4. mq H2O μέχρι τελικό όγκο 100λ Ακολουθεί επώαση για 3h στους 37 ο C και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 45

54 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ.8)ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ DNA ME ΦΑΙΝΟΛΗ-ΧΛΩΡΟΦΟΡΜΙΟ ΚΑΙ ΚΟΛΩΝΑ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ Με τη μέθοδο αυτή απομακρύνονται οι πρωτεΐνες και άλλα λιπόφιλα μόρια έτσι ώστε στο διάλυμα να παραμένουν τα νουκλεϊκά οξέα καθώς και υδατοδιαλυτές ενώσεις. Η προσθήκη φαινόλης, ενός οργανικού διαλύτη, στο διάλυμα έχει ως αποτέλεσμα την διαλυτοποίηση ενώσεων που φέρουν υδρόφοβες ομάδες καθώς και τη μεταφορά τους στην οργανική φάση. Ο ρόλος του χλωροφορμίου από την άλλη είναι να διαχωρίσει καλά την υδατική από την οργανική φάση απομακρύνοντας οποιαδήποτε κατάλοιπα της φαινόλης που πιθανόν να υπάρχουν στην υδατική φάση και μεταφέροντάς τα στην οργανική. Επίσης η παρουσία της Ισοαμυλικής αλκοόλη μειώνει την παρουσία γαλακτώματος και τον αφρισμό. Ακολουθεί κατακρήμνιση του DNA με τη χρήση αιθανόλης και κατάλληλου μονοσθενούς ιόντος. Υλικά-Διαλύματα: Nuclease free Η 2 Ο Water Saturated Phenol ph 6,5 Chloroform Chloroform:Isoamyl Alcohol (CIA) 24:1 Διάλυμα NaOAc 3M ph 5,2 100% EtOH 70% EtOH Mini Quick Spin Columns (Roche ) Πειραματική πορεία: 1. Φέρνουμε τον τελικό όγκο του δείγματος σε 150λ με Nuclease free Η 2 Ο 2. Προστίθενται 150λ Phenol. Καλό VORTEX 3. Προστίθενται 150λ Chloroform. Καλό VORTEX 4. Φυγοκέντρηση 10min full speed 5. Προσεκτική μεταφορά του υπερκειμένου σε άλλο σωληνάκι. 6. Προσθήκη 150λ CIA. Καλό VORTEX 7. Φυγοκέντρηση 5min fullspeed. 46

55 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 8. Προσεκτική μεταφορά του υπερκειμένου σε άλλο σωληνάκι. 9. Επανάληψη των σταδίων 6,7,8 10. Ογκομέτρηση του δείγματος και προσθήκη διπλάσιου όγκου 100% EtOH και CH 3 COONa σε τελική συγκέντρωση 0,3Μ 11. Overnight επώαση στους -20 ο C 12. Φυγοκέντρηση για 30min full speed στους 4 o C 13. Αφαιρείται το υπερκείμενο και προστίθενται 200λ 70% EtOH. VORTEX 14. Αφαιρείται το υπερκείμενο και το DNA επαναδιαλυτοποιείται σε 50λ Nuclease Free H 2 O 15. Παίρνουμε μια κολωνίτσα και αφού την ανακινήσουμε καλά φυγοκεντρούμε στα 1000g για 1min 16. Φορτώνουμε το δείγμα στην κολώνα και φυγοκεντρούμε για 4min 1000g. 17. Έπειτα από κατάλληλη αραίωση (1:100) προσδιορίζεται η συγκέντρωση του διαλύματος σε νουκλεικά οξέα μέσω φωτομέτρησης. Η φωτομέτρηση γίνεται στα 260nm (οπτική απορρόφηση νουκλεικών οξέων) και στα 280nm (οπτική απορρόφηση πρωτεϊνών). Ο λόγος των οπτικών απορροφήσεων O.D.260/O.D.280 πρέπει να είναι μεγαλύτερος του 1,8 για να θεωρηθεί το DNA πολύ καθαρό. Η συγκέντρωση του DNA υπολογίζεται αν λάβει κανείς υπόψη του ότι 1 O.D.260 nm= 50μg/ml DNA (Γ.9) in vitro ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Για την in vitro μεταγραφή χρησιμοποιήθηκαν 2 διαφορετικά σετ διαλυμάτων από δύο διαφορετικές εταιρείες. Το kit της Ambion δούλεψε με πολύ καλύτερη απόδοση σε σχέση με της Promega: (Γ.9.1) Promega Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική Πορεία 1. Σε σωλήνάκι eppendorf προστίθενται τα ακόλουθα: 20λ Transcription Optimized Buffer 5x 10λ DTT (100mM) 2,5λ RNasin Ribonuclease Inhibitor (40u/λ) 47

56 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 20λ rntp mix (2,5mM each) 5μg γραμμικό DNA υπόστρωμα(coup-tf Small Isoform, COUP-TF Large Isoform, COUP-TF, COUP-TF, COUP-TF P214A/, COUP-TF Small Isoform GFP, COUP-TF Large Isoform GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF P214A/ GFP) 2λ Τ7 RNA Polymerase (40u/λ) Nuclease free Η 2 Ο μέχρι τελικό όγκο 50λ 2. Η αντίδραση επωάζεται για 2h στους 37 o C. 3. Προσθήκη 3λ RQ1 RNAse-free DNAse (1u/λ) και επώαση για 15min στους 37 ο C 4. Προσθήκη 10λ stop solution και επώαση στους 65 o C για 10min. (Γ.9.2) mmessage mmachine kit (T7) Ambion Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική Πορεία 1. Σε σωληνάκι eppendorf προστίθενται(είναι σημαντική η σειρά): Nuclease free water μέχρι τελικού όγκου 20λ 10λ 2X NTP/CAP 2λ 10Χ Reaction Buffer 1μg γραμμικό DNA υπόστρωμα(coup-tf Small Isoform, COUP-TF Large Isoform, COUP-TF, COUP-TF, COUP-TF P214A/, COUP-TF Small Isoform GFP, COUP-TF Large Isoform GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF P214A/ GFP) 2λ Enzyme mix. 2. Η αντίδραση επωάζεται για 2h στους 37 o C 3. Προσθήκη 1λ Turbo DNase (2u/λ) Αξίζει να σημειωθεί ότι, όταν η αντίδραση στήθηκε με διπλάσιες ποσότητες η απόδοση ήταν αρκετά καλύτερη. 48

57 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ.10) ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ RNA ΣΕ ΑΠΟΔΙΑΤΑΚΤΙΚΟ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ To RNA προτιμάται να αποδιατάσσεται πριν ηλεκτροφορηθεί προκειμένου να διαταραχθούν οι όποιες δευτεροταγείς δομές που πιθανόν να επηρεάζουν την ηλεκτροφορητική του κινητικότητα. Γι αυτό πριν ηλεκτροφορηθούν τα RNA δείγματα αναμιγνύονται με το Sample Coctail το οποίο περιέχει φορμαμίδιο, ένα αντιδραστήριο το οποίο προσβάλλει της δευτεροταγείς δομές του RNA. Στο πήκτωμα προστίθεται φορμαλδεύδη η οποία δρα ως μονιμοποιητικό. Παράλληλα με τα δείγματα ηλεκτροφορείται και total RNA σαν μάρτυρας αφού η μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα τρέχει στα 5kb ενώ η μικρή στα 2kb. Υλικά-Διαλύματα: Agarose Formaldehyde Nuclease free και dd H 2 O Διάλυμα 10Χ MOPS (0,2M MOPS, 0,005M NaOAc, 0,001M EDTA) ph 7.0 Sample Coctail 2X (300λ formamide, 100λ formaldehyde, 60λ MOPS 10X, 36λ ΕtBr 1mg/ml, 64λ Nuclease free H 2 O) Gel Loading Dye 6X (σε Η 2 Ο: 25% bromophenol blue, 0,25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll [Type 400 Pharmacia]) Πειραματική Πορεία: 1. Ζυγίζονται 0,75g agarose και μεταφέρονται σε κωνική φιάλη όπου υπάρχουν 100ml ddh 2 O 2. H κωνική φιάλη τοποθετείται στον φούρνο μικροκυμάτων μέχρι να διαλυθεί η αγαρόζη. 3. Ακολούθως όταν κρυώσει λίγο το διάλυμα προστίθενται 7,5ml 10X MOPS και 14,4ml formaldehyde. 4. Το διάλυμα τοποθετείται στην μήτρα για να πήξει ενώ παράλληλα τοποθετείται το κτενάκι. Όταν πήξει τότε η μήτρα με το πήκτωμα τοποθετείται στην συσκευή ηλεκτροφόρησης στην οποία υπάρχει MOPS 1X. 49

58 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 5. Για την προετοιμασία των δειγμάτων, σε σωληνάκι eppendorf προστίθεται 1 μg RNA. Ο όγκος τον δειγμάτων εξισορροπείται με προσθήκη Nuclease free Η 2 Ο. 6. Προστίθεται ίσος όγκος Sample Coctail 2X. 7. Το διάλυμα θερμαίνεται στους 65 o C για 5 min 8. Ακολούθως προστίθεται Gel Loading Dye 6X και τα δείγματα φορτώνονται. 9. Το πήκτωμα ηλεκτροφορείται στα 35V (Γ.11)ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ RNA ME ΦΑΙΝΟΛΗ-ΧΛΩΡΟΦΟΡΜΙΟ ΚΑΙ KOΛΩΝΑ ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΓΗΣ Υλικά-Διαλύματα: Nuclease free Η 2 Ο Water Saturated Phenol ph 6,5 Chloroform Chloroform:Isoamyl Alcohol 24:1 LiCl 7,5M 100% EtOH 70% EtOH Mini Quick Spin Columns (Roche ) Πειραματική πορεία: 1. Φέρνουμε τον τελικό όγκο του δείγματος σε 150λ με Nuclease free Η 2 Ο 2. Προστίθενται 150λ Phenol. Καλό VORTEX 3. Προστίθενται 150λ Chloroform. Καλό VORTEX 4. Φυγοκέντρηση 10min full speed 5. Προσεκτική μεταφορά του υπερκειμένου σε άλλο σωληνάκι. 6. Προσθήκη 150λ CIA. Καλό VORTEX 7. Φυγοκέντρηση 5min fullspeed. 8. Προσεκτική μεταφορά του υπερκειμένου σε άλλο σωληνάκι. 9. Επανάληψη των σταδίων 6,7,8 50

59 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 10. Ογκομέτρηση του δείγματος και προσθήκη διπλάσιου όγκου 100% EtOH και LiCl σε τελική συγκέντρωση 0,375Μ 11. Overnight επώαση στους -20 ο C 12. Φυγοκέντρηση για 30min full speed στους 4 o C 13. Αφαιρείται το υπερκείμενο και προστίθενται 200λ 70% EtOH. VORTEX 14. Αφαιρείται το υπερκείμενο και το RNA επαναδιαλυτοποιείται σε 50λ Nuclease Free H 2 O 15. Παίρνουμε μια κολωνίτσα και αφού την ανακινήσουμε καλά φυγοκεντρούμε στα 1000g για 1min 16. Φορτώνουμε το δείγμα στην κολώνα και φυγοκεντρούμε για 4min 1000g. 17. Έπειτα από κατάλληλη αραίωση (1:100) προσδιορίζεται η συγκέντρωση του διαλύματος σε νουκλεικά οξέα μέσω φωτομέτρησης. Η φωτομέτρηση γίνεται στα 260nm (οπτική απορρόφηση νουκλεικών οξέων) και στα 280nm (οπτική απορρόφηση πρωτεϊνών). Ο λόγος των οπτικών απορροφήσεων O.D.260/O.D.280 πρέπει να είναι μεγαλύτερος του 1,9 για να θεωρηθεί το RNA πολύ καθαρό. Η συγκέντρωση του RNA υπολογίζεται αν λάβει κανείς υπόψη του ότι 1 O.D.260 nm= 40μg/ml RNA (Γ.12) in vitro ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ (Γ.12.1) ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Σε όλες τις αντιδράσεις αρχικά προστίθεται το νερό και το RNA στο eppendorf και ακολουθεί επώαση για 3min στους 65 ο C. Τα σωληνάκια μετά τοποθετούνται αμέσως στον πάγο για να προστεθούν τα υπόλοιπα αντιδραστήρια. Η θέρμανση καταστρέφει τις όποιες δευτεροταγής δομές με αποτέλεσμα να αυξάνεται η απόδοση της μετάφρασης. Επίσης το σύστημα μετάφρασης (Wheat Germ Extract, Rabbit Reticulocyte και Flexi Rabbit Reticulocyte) βγαίνει από τους -80 o C αμέσως πριν χρησιμοποιηθεί και ξεπαγώνετε γρήγορα με τα χέρια. Σε όλες τα kit γίνεται πάντα και μια αντίδραση που δεν προστίθεται RNA (ο όγκος αποκαθίσταται με νερό) και η οποία χρησιμοποιείται σαν control 51

60 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ ) Wheat Germ Extract (Promega) Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική Πορεία: 1. Σε σωληνάκι eppendorf προστίθενται (είναι σημαντική η σειρά): Nuclease Free Water μέχρι τελικό όγκο 50λ 1μg RNA(COUP-TF Small Isoform, COUP-TF Large Isoform, COUP- TF, COUP-TF, COUP-TF P214A/, COUP-TF Small Isoform GFP, COUP-TF Large Isoform GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF P214A/ GFP) 4λ Amino Acid Mixture Minus Methionine (1mM) 2λ Potassium Acetate (1M) 1λ RNasin Ribonuclease Inhibitor (40u/λ) 2,5λ [ 35 S]-Methionine (1175Ci/mmol, 10mCi/ml) 25λ Wheat Germ Extract 2. Ακολουθεί επώαση στους 25 ο C για 2h (Γ ) Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega) Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική Πορεία: 1. Σε σωληνάκι eppendorf προστίθενται (είναι σημαντική η σειρά): Nuclease Free Water μέχρι τελικό όγκο 50λ 2μg RNA(COUP-TF Small Isoform, COUP-TF Large Isoform, COUP- TF, COUP-TF, COUP-TF P214A/, COUP-TF Small Isoform GFP, COUP-TF Large Isoform GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF GFP, COUP-TF P214A/ GFP) 2λ Amino Acid Mixture Minus Methionine (1mM) 1λ RNasin Ribonuclease Inhibitor (40u/λ) 4λ [ 35 S]-Methionine (1175Ci/mmol, 10mCi/ml) 35λ Rabbit Reticulocyte Lysate 2. Επώαση για 1,5h στους 30 ο C 52

61 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ.12.2) ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΜΗ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ (Γ ) Wheat Germ Extract (Promega) Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική Πορεία: 1. Σε σωληνάκι eppendorf προστίθενται (είναι σημαντική η σειρά): Nuclease Free Water μέχρι τελικό όγκο 50λ 1μg RNA(COUP-TF Small Isoform, COUP-TF Large Isoform, COUP- TF, COUP-TF, COUP-TF P214A/) 2λ Amino Acid Mixture Minus Methionine (1mM) 2λ Amino Acid Mixture Minus Leucine (1mM) 2λ Potassium Acetate (1M) 1λ RNasin Ribonuclease Inhibitor (40u/λ) 25λ Wheat Germ Extract 2. Ακολουθεί επώαση στους 25 ο C για 2h (Γ ) Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega) Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική Πορεία: 1. Σε σωληνάκι eppendorf προστίθενται (είναι σημαντική η σειρά): Nuclease Free Water μέχρι τελικό όγκο 50λ 2μg RNA(COUP-TF Small Isoform, COUP-TF Large Isoform, COUP- TF, COUP-TF, COUP-TF P214A/) 2λ Amino Acid Mixture Minus Methionine (1mM) 2λ Amino Acid Mixture Minus Leucine (1mM) 1λ RNasin Ribonuclease Inhibitor (40u/λ) 35λ Rabbit Reticulocyte Lysate 2. Επώαση για 1,5h στους 30 ο C 53

62 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ ) Flexi Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega) Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική Πορεία: 1. Σε σωληνάκι eppendorf προστίθενται (είναι σημαντική η σειρά): Nuclease Free Water μέχρι τελικό όγκο 50λ 1μg RNA(COUP-TF Small Isoform, COUP-TF Large Isoform, COUP- TF, COUP-TF, COUP-TF P214A/) 1,4λ Potassium Chloride 1λ Amino Acid Mixture Minus Methionine (1mM) 1λ Amino Acid Mixture Minus Leucine (1mM) 1λ RNasin Ribonuclease Inhibitor (40u/λ) 33λ Flexi Rabbit Reticulocyte Lysate Επώαση για 1,5h στους 30 ο C (Γ.12.3) in vitro co-translation με το Wheat Germ Extract (Promega) Σκοπός της co-translation είναι ο αποδοτικότερος ετεροδιμερισμός των πρωτεΐνών που συμμεταφράζονται. Έγινε συμμετάφραση χρησιμοποιώντας αναλογίες RNA COUP-TF Small Isoform : COUP-TF Large Isoform 1:1, 1:2, 1:5, 1:10 προκειμένου να υπάρχει σταδιακά αυξανόμενη ποσότητα της πρωτεΐνης COUP-TF Large Isoform. Το ίδιο πείραμα έγινε χρησιμοποιώντας RNA / αντί για COUP-TF Large Isoform Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική Πορεία: 1. Σε σωληνάκι eppendorf προστίθενται (είναι σημαντική η σειρά): Nuclease Free Water μέχρι τελικό όγκο 25λ 0,5μg RNA (COUP-TF Small Isoform), 0,5/1/2,5/5μg RNA (COUP-TF Large Isoform, COUP-TF P214A/) 2λ Amino Acid Mixture Minus Methionine (1mM) 2λ Amino Acid Mixture Minus Leucine (1mM) 1λ Potassium Acetate (1M) 0,5λ RNasin Ribonuclease Inhibitor (40u/λ) 25λ Wheat Germ Extract 2. Ακολουθεί επώαση στους 25 ο C για 2h 54

63 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ.13) ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ SDS-PAGE Το ακρυλαμίδιο έχει τη δυνατότητα να παράγει τρισδιάστατα πολυμερή δίκτυα σε συγκεντρώσεις από 3 έως 30% αυτού. Το πήκτωμα είναι αποτέλεσμα βινυλπολυμερισμού του μονομερούς ακρυλαμιδίου και σχηματισμού πολυακρυλαμιδίου. Σ αυτές ενσωματώνονται μόρια bis ακρυλαμιδίου τα οποία συνδέουν εγκάρσια δύο διαφορετικές αλυσίδες δημιουργώντας πλέγμα. Ο πολυμερισμός του πολυακρυλαμιδίου επιτυγχάνεται μέσω της τετραμεθυλοδιαμίνης (TEMED) για την δράση της οποίας είναι απαραίτητα υπερθειϊκά ιόντα(s 2 O -2 3 ) τα οποία παρέχονται από το υπερθειϊκό αμμώνιο (AP). Τα υπερθειϊκά ιόντα ενεργοποιούν το TEMED προκαλώντας το σχηματισμό ελευθέρων ριζών, οι οποίες με τη σειρά τους καταλύουν την αντίδραση πολυμερισμού του ακρυλαμιδίου. Η συγκέντρωση του ακρυλαμιδίου καθορίζει το μέσο μήκος της αλυσίδας του πολυμερούς, ενώ η αναλογία του ακρυλαμιδίου προς bis ακρυλαμίδιο καθορίζει την απόσταση μεταξύ των γεφυρών και συνεπώς το μέγεθος των πόρων. Σε αντίθεση με τις περισσότερες μεθόδους ηλεκτροφόρησης στην SDS-PAGE χρησιμοποιούνται δύο πηκτώματα (gel): το upper ή αλλιώς stacking gel και το lower ή αλλιώς resolving gel. To stacking είναι πιο αραιό (5% Acrylamide) σε σχέση με το resolving (10% Acrylamide) και εδώ γίνεται το πακετάρισμα των δειγμάτων, ενώ στο resolving γίνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών ανάλογα με το μέγεθος τους. Πρώτα φτιάχνεται και φορτώνεται στη συσκευή το lower gel, καλύπτεται με νερό μέχρι να πήξει (δεδομένου ότι απουσία οξυγόνου επέρχεται πήξη γρηγορότερα), ακολούθως αφαιρείται το νερό και φορτώνεται το upper gel. Η ανάλυση των πρωτεϊνών έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS, DTT). Το SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) είναι ένα ιοντικό απορρυπαντικό το οποίο δεσμεύεται στις πρωτεΐνες με σταθερή αναλογία βάρους (1,4gr SDS ανά gr πρωτεΐνης). Η επιπλέον χρήση αναγωγικών παραγόντων, όπως είναι η διθειοθρεϊτόλη (DTT) έχει ως αποτέλεσμα την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών των πρωτεϊνών. Η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται με θέρμανση των πρωτεϊνικών δειγμάτων για 3 λεπτά στους 100 o C, παρουσία όλων των παραπάνω αποδιατακτικών παραγόντων. Εξαιτίας του SDS, οι πρωτεΐνες που περιέχονται στα δείγματα έχουν φορτιστεί αρνητικά και είναι δυνατή η κίνησή τους όταν βρεθούν εντός ηλεκτρικού 55

64 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ πεδίου. Η ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα είναι συνάρτηση του μοριακού τους βάρους. Υλικά-Διαλύματα: dh 2 O Tris ΗCl 1,5M ph 8,8 Tris ΗCl 0,5M ph 6,8 Διάλυμα Acrylamide:bis-acrylamide 30:1 SDS 10% AP 20% TEMED Running Buffer 5X (30g Tris, 144g γλυκίνη, 5g SDS και ddh20 μέχρι τελικού όγκου 1lt) Loading Buffer 2X (2,5ml 0,5M Tris-HCl ph 6.8, 0,5g SDS, 2ml γλυκερόλη, bromophenol blue 0,5%, και ddh 2 O μέχρι 10ml. Επίσης πριν χρησιμοποιηθεί προστίθεται DTT σε τελική συγκέντρωση 0,2Μ) Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175kDa) (ΝΕΒ) ραδιενεργά σεσημασμένες πρωτεΐνης (μέρος Γ.12.1) Πειραματική Πορεία: Παρασκευή του πηκτώματος ηλεκτροφόρησης: 1. Η γυάλινη μήτρα ξεπλένεται καλά με ddh 2 O και 70% EtOH και στήνεται. 2. Σε μικρό ποτήρι ζέσεως παρασκευάζεται αρχικά το resolving (lower) gel: 2,95ml ddh 2 O 2,5ml Acrylamide:bis-acrylamide 30:1 1,9ml Tris 1,5M ph 8,8 75λ SDS 10% 75λ AP 20% 3λ TEMED 3. Το διάλυμα αποχύνεται στην γυάλινη μήτρα και καλύπτεται με ddh 2 O. 4. Σε 40min περίπου το πήκτωμα έχει πήξει και αφαιρείται το νερό. 56

65 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 5. Σε μικρό ποτήρι ζέσεως παρασκευάζεται το stacking (upper) gel: 1,7ml ddh 2 O 415λ Acrylamide:bis-acrylamide 30:1 315λ Tris 0,5M ph 6,8 25λ SDS 10% 25λ AP 20% 2λ TEMED 6. Το διάλυμα αποχύνεται στην γυάλινη μήτρα και τοποθετείται το κτενάκι. 7. Σε 25min περίπου αφαιρείται το κτενάκι και η μήτρα τοποθετείται στην συσκευή ηλεκτροφόρησης η οποία περιέχει 1Χ Running Buffer. Με λωρίδες χαρτιού Wattman ή με ένα μακρύρυγχο tip καθαρίζονται τα πηγαδάκια από το ακρυλαμίδιο. Προετοιμασία δειγμάτων: 1. Σε σωληνάκι eppendorf τοποθετούνται: 10λ ddh 2 O 5λ ραδιενεργά σεσημασμένης πρωτεΐνης 15λ Loading Buffer 2X (μαζί με DTT) 2. Βρασμός για 3min 3. Φυγοκέντρηση για 5min fullspeed. 4. Τα δείγματα φορτώνονται 5. Το πήκτωμα ηλεκτροφορείται στα 15mA. (Γ.14) Ξήρανση και Αυτοραδιογραφία Το πήκτωμα μεταφέρεται σε χαρτί Wattman και καλύπτεται με διαφανή μεμβράνη. Το Wattman μαζί με το πήκτωμα τοποθετείται στο speed vac όπου ξηραίνεται για 1h στους 60 o C υπό κενό. Το αποξηραμένο πήκτωμα στο σκοτεινό θάλαμο τοποθετείται σε κασετίνα αυτοραδιογραφίας και εφαρμόζεται φωτογραφικό φιλμ. Η κασετίνα κλείνεται και τοποθετείται στους -80 ο C overnight. 57

66 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ.15) Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) Πρόκειται για μέθοδο ανίχνευσης αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνικών παραγόντων και νουκλεοτιδικών αλληλουχιών. Αρχή της μεθόδου είναι η παρατήρηση ότι σύμπλοκα πρωτεϊνών-νουκλεοτιδικών αλληλουχιών μεταναστεύουν πιο αργά σε μη αποδιατακτικά πηκτώματα αγαρόζης ή πολυακρυλαμιδίου, σε σύγκριση με τα ελεύθερα μόρια νουκλεοτιδικών αλληλουχιών. Χρησιμοποιείται ευρύτατα για τον εντοπισμό ειδικών αλληλεπιδράσεων μεταγραφικών παραγόντων με στοιχεία απόκρισης στο DNA. Το χρησιμοποιούμενο DNA σημαίνεται ραδιενεργά με 32 P προκειμένου να αμαυρώσει το φίλμ στις θέσεις μετανάστευσης του DNA και του συμπλόκου πρωτεΐνης-dna μετά από ηλεκτροφόρηση και αυτοραδιογραφία. Ένα από τα πλεονεκτήματα της τεχνικής αυτής είναι η ικανότητα να αναλύει σύμπλοκα διαφορετικής στοιχειομετρίας ή διαμόρφωσης. Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα για πάρα πολλές εφαρμογές είναι ότι η πηγή της DNA-binding πρωτεΐνης μπορεί να είναι ένας πρωτογενής μεταγραφικός παράγοντας ή ολόκληρο κυτταρικό εκχύλισμα και όχι καθαρισμένο υλικό. Η ικανότητα να αναλυθούν τα σύμπλοκα DNA-πρωτεϊνών εξαρτάται σε ένα μεγάλο βαθμό από την ισχύ της σύνδεσης και συνεπώς από την σταθερότητα του συμπλόκου. Μη ειδικοί ανταγωνιστές όπως poly(di/dc) και poly(da/dt) χρησιμοποιούνται στις αντιδράσεις σύνδεσης προκειμένου να περιοριστεί το δέσιμο μη ειδικών πρωτεϊνών στο ραδιενεργά σεσημασμένο DNA στόχο. Αυτά τα ανταγωνιστικά πολυμερή παρέχουν μια περίσσεια μη ειδικών θέσεων για την μη ειδική πρόσδεση πρωτεϊνών σε DNA. Εκτός από τα poly(di/dc) και poly(da/dt), μια ειδική μη σεσημασμένη αλληλουχία ειδικού ανταγωνιστή προστίθεται στο διάλυμα της αντίδρασης. Προσθήκη περίσσειας (200x) της αλληλουχίας DNA που μελετούμε αλλά μη σεσημασμένης, είναι ικανή να εξουδετερώσει αποτελεσματικά το σήμα που θα δώσει το σύμπλοκο πρωτεΐνης-σεσημασμένου DNA πιστοποιώντας ταυτόχρονα την ειδικότητα της πρόσδεσης της πρωτεΐνης στο DNA. (Γ.15.1) ΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΜΟΝΟΚΛΩΝΩΝ ΤΜΗΜΑΤΩΝ ΣΕ ΔΙΚΛΩΝΟ Στα πειράματα EMSA χρησιμοποιήθηκε το στοιχείο απόκρισης C1R. Παραγγέλθηκαν τα μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδα: 58

67 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ C1R F 5 -AAACATTTGACCCGCTGACCTTTCGCTA-3 C1R R 3 -TTTGTAAACTGGGCGACTGGAAAGCGAT-5 Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική πορεία: 1. Βράζουμε τα C1R F και C1R R για 1min 2. Σε σωληνάκι eppendorf προσθέτω τα ακόλουθα: 10λ C1R F (1μg/λ) 10λ C1R R (1μg/λ) 4λ SSC 20X 16λ H 2 O 3. Επώαση στο υδατόλουτρο 60 o C για 20min. 4. Σβήνουμε το υδατόλουτρο και αφήνουμε τη θερμοκρασία να πέσει στους 35 o C 5. Τελικά έχω δίκλωνο C1R σε συγκέντρωση 250ng/λ ή 13pmoles/λ (Γ.15.2) ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΚΙΝΑΣΗΣ ΚΑΙ ΣΗΜΑΝΣΗ ΜΕ 32 P Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική πορεία: 1. Σε ένα σωληνάκι eppendorf κάνω μία αραίωση του δίκλωνου C1R ώστε να γίνει 2,5pmoles/λ (1λ C1R 13pmoles/λ +2λ mqh 2 O) 2. Σε σωληνάκι eppendorf προσθέτω τα εξής με την παρακάτω σειρά: 5λ mqh 2 O 2λ C1R (2,5pmoles/λ) 1λ T4 polynucleodtide kinase Reaction Buffer 5x 1λ 32 P-γ-ΑΤP 1λ T4 polynocleodtide kinase (10u/λ) (ΝΕΒ) 3. Επώαση για 1h στους 37 ο C. 4. Προσθέτω στο σωληνάκι eppendorf 40λ mqh 2 O 5. Παίρνω 1λ από το δείγμα και το μεταφέρω σε σωλήνα σπινθηριστή που περιέχει 1-2ml υγρό σπινθηρισμού 6. Παίρνουμε μια κολωνίτσα Mini Quick Spin Columns (Roche ) 59

68 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ και αφού την ανακινήσουμε καλά φυγοκεντρούμε στα 1000g για 1min 7. Τα υπόλοιπα 49λ του δείγματος φορτώνονται στην κολώνα 8. Ογκομετρώ το δείγμα με πιπέτα. 9. Παίρνω 1λ από το δείγμα και το μεταφέρω σε σωλήνα σπινθηριστή που περιέχει 1-2ml υγρό σπινθηρισμού 10. Μέτρηση της ραδιενέργειας (σταδίου 5 και 9) με την βοήθεια σπινθηριστή. (Γ.15.3) ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΠΗΚΤΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Υλικά-Διαλύματα: ΤΒΕ 5Χ Διάλυμα Acrylamide:bis-acrylamide 30:0,6 ΑP 20% TEMED 5x binding buffer: (90mM Hepes ph=7.9, 455mM KCl, 4,5mM DTT, 25mM MgCl2, 40% Glycerol) 6x Loading Dye: 0,25% bromophenol blue, 0,25% Xylene cyanοl σε ddh 2 O ddh 2 O C1R ραδιενεργό counts/λ C1R κρύο 200Χ σε σχέση με το ραδιενεργό (specific competitor [sc200x]) in vitro συντιθίσες πρωτεΐνες (από μέρη Γ.12.2 και Γ.12.3) poly(di dc) και poly(da dt) σε συγκέντρωση 0,5μg/μl το καθένα Πειραματική Πορεία: Παρασκευή του πηκτώματος ηλεκτροφόρησης: 1. Η γυάλινη μήτρα ξεπλένεται καλά με ddh 2 O και 70% EtOH και στήνεται. 2. Σε σωλήνα falcon 50ml προστίθενται τα ακόλουθα: 27ml ddh 2 O 4,5ml ΤΒΕ 5Χ 13,5ml Διάλυμα Acrylamide:bis-acrylamide 30:0,6 300λ ΑP 20% 15λ TEMED 3. Το διάλυμα αποχύνεται στην γυάλινη μήτρα και τοποθετείται το κτενάκι. 60

69 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 4. Σε 1h περίπου αφαιρείται το κτενάκι και η μήτρα τοποθετείται στην συσκευή ηλεκτροφόρησης η οποία περιέχει 0,5Χ TBE. Με λωρίδες χαρτιού Wattman ή με μία πιπέτα Pasteur (αποχύνεται με δύναμη 0,5Χ TBE στα πηγαδάκια) καθαρίζονται τα πηγαδάκια από το ακρυλαμίδιο 5. Ακολουθεί προηλεκτροφόρηση για 1h στα 10mA Προετοιμασία δειγμάτων: 1. Πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις σε τρεις διαφορετικούς όγκους αντίδρασης οι οποίοι δούλεψαν εξίσου καλά όπως φαίνεται παρακάτω (όλες οι αντιδράσεις στήνονται στον πάγο): 10λ 15λ 20λ ddh 2 O 4λ 7λ 8λ C1R 1λ 1λ 1λ poly(di dc) και 1λ 1λ 2λ poly(da dt) Binding Buffer 5X 2λ 3λ 4λ in vitro συντηθίσες πρωτεΐνες 2λ 3λ 5λ 20 min επώαση στον πάγο 6x Loading Dye 1λ 1λ 2λ Ένα παράδειγμα φαίνεται πιο αναλυτικά στην επόμενη σελίδα (αντίδραση στα 20λ) 61

70 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ddh 2 O 13λ 8λ 8λ 8λ 8λ 8λ 8λ 8λ C1R 1λ 1λ 1λ 1λ 1λ 1λ 1λ 1λ Sc 200x λ poly(di dc) και poly(da dt) 2λ 2λ 2λ 2λ 2λ 2λ 2λ 2λ Binding Buffer 5X 4λ 4λ 4λ 4λ 4λ 4λ 4λ 4λ Control - 5λ COUP-TF Small Isoform - 5λ 5λ COUP-TF Large Isoform λ COUP-TF λ - - COUP-TF λ - COUP-TF / λ 20 min επώαση στον πάγο Loading Dye 6x 2λ 2λ 2λ 2λ 2λ 2λ 2λ 2λ 2. Τα δείγματα φορτώνονται και ακολουθεί ηλεκτροφόρηση στα 10mA 3. Όταν τελειώσει η ηλεκτροφόρηση το πήκτωμα μεταφέρεται σε χαρτί Wattman, ακολουθεί ξήρανση στο speed vac (2h 60 o C) και αυτοραδιογραφία. (Γ.15.4) ANAΛΥΣΗ ΜΕ PHOSPHORIMAGER Πρόκειται για συσκευή ανάλυσης που δύναται να αντικαταστήσει τη χρήση film (αυτοραδιογραφία) σε πειράματα ανίχνευσης ραδιενεργών ουσιών. Τα πλεονεκτήματα από τη χρήση ενός PI αναλυτή (phosporimager screen) είναι αρχικά ότι πρόκειται για πιο ευαίσθητη τεχνική, απαιτεί λιγότερο χρόνο έκθεσης και δεν είναι αναλώσιμος. To αποξηραμένο πήκτωμα τοποθετείται σε μία κασετίνα έτσι ώστε να βρίσκεται αντιμέτωπο με την ειδική κασέτα του PI. Η κασέτα αυτή συνίστανται από εξαιρετικής ποιότητας κρυστάλλους BaFBr:Eu+2. Τα ραδιενεργά δείγματα διεγείρουν το επιστρωμένο υλικό και κινούμενα ηλεκτρόνια παγιδεύονται στις αποθήκες (storage phosphors) που έχουν τη δυνατότητα να συγκρατήσουν το παγιδευμένο σήμα για 62

71 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ κάποιες ώρες. Ένας σαρωτής ακολούθως " σαρώνει κασέτα με την εφαρμογή ενός λέιζερ ηλίου-νέου που εκπέμπει κόκκινο φως στα 633 nm. Τα φορτισμένα σύμπλοκα BaFBr- απορροφούν το κόκκινο φώς, τα παγιδευμένα ηλεκτρόνια απελευθερώνονται, το Eu+3 ανάγεται σε Eu+2* και καθώς το Eu+2* επανέρχεται στη θεμελιώδη του κατάσταση Eu+2 απελευθερώνει ενέργεια με τη μορφή μπλε φωτός. Το μπλέ φως οδηγείται στους φωτοπολλαπλασιαστές (Photomultiplier Tube -PMT) όπου ενισχύεται το σήμα και από εκεί στον ανιχνευτή. Η κασέτα μπορεί να αναγεννηθεί (επαναχρησιμοποιηθεί) μετά από έκθεση σε ισχυρό φως Τα ξηραμένα σε χαρτί Whatmann (3 mm) πηκτώματα των EMSA σκεπάζονται προσεκτικά με διάφανη μεμβράνη και τοποθετούνται στην ειδική κασετίνα του phosphorimager. Εκεί εκτέθηκαν όλη νύχτα και ακολούθως η κασέτας στην οποία τοποθετήθηκε στο σαρωτή του phosphorimager (Fuji Phosphorimager),) και από αυτήν και με το υπολογιστικό πρόγραμμα AIDA software έγινε μέτρηση του ποσοστού δεσίματος των χρησιμοποιούμενων in vitro παραγόμενων πρωτεϊνών στο ραδιενεργό σεσημασμένο στοιχείο C1R. Η διαδικασία της επεξεργασίας περιελάμβανε την επιμέλεια της σκαναρισμένης εικόνας του πηκτώματος με τα ραδιενεργά μόρια να εμφανίζονται με τη μορφή μαύρων ζωνών καθώς και την λήψη δεδομένων όσων αφορά την ένταση των ζωνών αυτών. (Γ.16) ΕΝΕΣΕΙΣ RNA ΣΕ ΕΜΒΡΥΑ ΑΧΙΝΟΥ (Γ.16.1) ΣΥΛΛΟΓΗ ΓΑΜΕΤΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΑΥΓΩΝ ΑΧΙΝΟΥ ΓΙΑ ΕΝΕΣΕΙΣ Χρησιμοποιήθηκαν αναπαραγωγικά ώριμοι αχινοί από τους οποίους έγινε η συλλογή των γαμετών Υλικά-Διαλύματα: Θαλασσινό νερό Διάλυμα KCl 0,5M Γάζα Διάλυμα κιτρικού οξέως 0,5Μ Διάλυμα Tris-HCl 0,5M ph=8,3 Φίλτρο nytex 60μm 63

72 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματική Πορεία: 1. Με τη βοήθεια βελόνας γίνεται ένεση διαλύματος 0,5M KCl στην περιστοματική περιοχή του αχινού, με αποτέλεσμα την αλλαγή της ιοντικής ισχύος, την σύσπαση των γονάδων και τελικά την απελευθέρωση των γαμετών. 2. Οι θηλυκοί αχινοί τοποθετούνται με την έδρα προς τα κάτω σε ποτήρι ζέσεως των 50ml που περιέχει θαλασσινό νερό, έτσι ώστε τα ωάρια να συλλέγονται στο ποτήρι. 3. Αφού τα ωάρια συγκεντρωθούν στον πάτο, ακολουθεί επαναιώρησή τους σε θαλασσινό νερό και διήθηση μέσω γάζας. 4. Τα ωάρια μεταφέρονται σε νέο ποτήρι ζέσεως των 50ml έτσι ώστε να είναι αιωρημένα σε 75ml θαλασσινό νερό. 5. Στην συνέχεια, προστίθενται 4 σταγόνες 0,5Μ κιτρικού οξέος ώστε το pη να φθάσει την τιμή 4,5 και ανακατεύονται τα ωάρια για 1min (η προσθήκη του κιτρικού οξέος έχει σαν αποτέλεσμα την αφαίρεση της ζελατινώδους μεμβράνης που περιβάλλει). 6. Ακολουθεί προσθήκη 18 σταγόνων 0,5Μ Tris HCl, pη=8,3 ώστε να εξουδετερωθεί το όξινο ph και το τελικό ph να αποκατασταθεί στην τιμή 8, στην οποία και λαμβάνει χώρα η γονιμοποίηση. 7. Τέλος, τα ωάρια διηθούνται από φίλτρο nytex 60μ ώστε να φύγει το gel coat. Η συλλογή του σπέρματος γίνεται με την βοήθεια πιπέτας Pasteur και μεταφέρεται σε eppendorf το οποίο διατηρείται στον πάγο. (Γ.16.2) ΤΟΠΟΘΕΤΗΣΗ ΤΩΝ ΑΥΓΩΝ ΣΕ PETRI ΚΑΙ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ Τα αυγά τοποθετούνται σε ειδικά μικρά τρυβλία petri που φέρουν επικολλημένη καλυπτρίδα και τα οποία είχαν προηγουμένως καλυφθεί με 2% protamine sulfate. Η protamine sulfate κολλάει μη ειδικά στα τοιχώματα του τρυβλίου ενώ με τα θετικά φορτία της αλληλεπιδρά με τα αρνητικά φορτία της επιφάνειας των αυγών και έτσι επιτυγχάνεται η ακινητοποίηση των αυγών στο τρυβλίο για την πραγματοποίηση των ενέσεων. Έπειτα τοποθετείται στο τρυβλίο με τα αυγά μία σταγόνα εμπειρικά αραιωμένου σπέρματος ώστε να πραγματοποιηθεί γονιμοποίηση. 64

73 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ (Γ.16.3) ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ RNAs ΚΑΙ ΕΝΕΣΕΙΣ Υλικά-Διαλύματα/Πειραματική πορεία: 1. Τα RNAs COUP-TF Small Isoform GFP, COUP-TF Large Isoform GFP και COUP-TF / GFP κατακρημνίζονται με LICl (βλέπε μέρος Γ.9 από στάδιο 10 και μετά) και επαναδιαλυτοποιούνται σε Nuclease Free H 2 O σε τελική συγκέντρωση 2μg/λ 2. Προστίθεται ίσος όγκος 60% glycerol RNase Free. 3. Τα RNA δείγματα φορτώνονται σε φιλτράκι Millex-HV και ακολουθεί φυγοκέντρηση 2min σε 10000g 4. Τα RNA δείγματα ενίονται με την χρήση micro-injector στα γονιμοποιημένα ωάρια. 5. Τα έμβρυα αφήνονται να αναπτυχθούν για 6-8 ώρες. 6. Παρατήρηση των εμβρύων σε μικροσκόπιο φθορισμού και συνεστιακό μικροσκόπιο ανάστροφης φάσης. 65

74 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 66

75 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Δ) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Δ.1) ΠΕΨΕΙΣ ΜΕ NcoI Η μετάλλαξη (τόσο στα κατασκευάσματα που φέρουν GFP όσο και σε αυτά που δεν φέρουν) μέσω αντικατάστασης της κυτοσίνης από γουανίνη έχει ως αποτέλεσμα να χάνεται μία θέση περιορισμού για το ένζυμο περιορισμού NcoI (Εικόνα 25). Έτσι μετά από πέψη με NcoI και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, για τα κατασκευάσματα COUP-TF Εικόνα 24. Πέψεις των κατασκευασμάτων με NcoI L.I και αναμένονται 3 ζώνες (3216bp, 1648bp και 589bp) για τα και / δύο (3805bp και 1649bp) για τα COUP-TF L.I GFP και GFP τέσσερις (3197bp, 1649bp, 999bp και 589bp) ενώ για τα GFP και / GFP τρεις (3197bp, 1649bp και 1589bp) (Εικόνα 24) 67

76 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εικόνα 25.Η μετάλλαξη μέσω αντικατάστασης της κυτοσίνης από γουανίνη έχει ως αποτέλεσμα να χάνεται μία θέση περιορισμού για το ένζυμο περιορισμού NcoI 68

77 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εικόνα 26. Οι μεταλλάξεις των θρεονινών σε αλανίνες. 69

78 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Δ.2) ΠΕΨΕΙΣ ΜΕ HindIII Μετά την παραλαβή των αλληλουχίσεων και την επιλογή των κλώνων που θα χρησιμοποιηθούν, τα πλασμίδια που απομονώθηκαν από τους κλώνους που επιλέχθηκαν έγιναν γραμμικά προκειμένου να είναι πιο αποδοτική η μεταγραφή (για τη θέση περιορισμού του Hind IIΙ βλέπε Εικόνα 25) Έτσι μετά από πέψη με ΗindIII και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης πάρθηκαν οι εξής ζώνες όπως αναμενόταν: COUP-TF S.I: 5391, COUP-TF L.I - /:5454bp, COUP-TF S.I GFP: 6371bp, COUP-TF L.I GFP- GFP / GFP:6463bp (Εικόνα 27) Εικόνα 27 Ανάλυση των γραμμικών πλασμιδίων, που αποτελούν τα προϊόντα πέψης με HindIII σε πήκτωμα αγαρόζης (Δ.3) in vitro ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Το mmessage mmachine kit (T7) της Ambion δούλεψε πολύ καλύτερα σε σχέση με το κιτ της Promega και γι αυτό και προτιμήθηκε. Μετά από in vitro μεταγραφή και ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα αγαρόζης πάρθηκαν οι εξής ζώνες οι οποίες και αναμένονταν με βάση το μέγεθος των cdnas υποστρωμάτων που βρίσκονταν κλωνοποιημένα στον φορέα pcrii: COUP-TF S.I: 1410Nts, COUP-TF L.I - /:1473Nts, COUP-TF S.I GFP: 70

79 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2464Nts, COUP-TF L.I GFP- GFP / GFP:2464Nts (Εικόνα 28). Εικόνα 28. Ανάλυση των in vitro παραχθέντων RNAs σε αποδιατακτικό πήκτωμα αγαρόζης (Δ.4) ΑΝΑΛΥΣΗ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΑ ΣΕΣΗΜΑΣΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ SDS-PAGE Οι in vitro παραχθέντες ραδιενεργά σεσημασμένες πρωτεΐνες από τα στάδια Γ και Γ αναλύθηκαν με SDS PAGE. Τα δύο κιτ δούλεψαν εξίσου καλά όμως με το Rabbit Reticulocyte Lysate System αντιμετωπίσαμε προβλήματα στα μετέπειτα πειράματα EMSA. Το μοριακό βάρος των πρωτεϊνών που φέρουν GFP έχει υπολογιστεί, με βάση την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα, στα 80kDa περίπου ενώ γι αυτές που δεν φέρουν GFP στα 58kDa περίπου (Εικόνα 29) Εικόνα 29. Ανάλυση των in vitro παραχθέντων ραδιενεργά σεσημασμένων πρωτεϊνών με SDS-PAGE 71

80 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Δ.5) EMSA (Δ.5.1) ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΩΝ ΟΜΟΔΙΜΕΡΩΝ Από τα πειράματα EMSA παρατηρείται ότι μόνο το ομοδιμερές COUP-TF S.I δύναται να προσδεθεί στο στοιχείο απόκρισης C1R (Εικόνα 30,lane 3). Αντιθέτως ούτε τα ομοδιμερή COUP-TF L.I ούτε αυτά που αφορούν τα μεταλλαγμένα στις προλίνες ομοδιμερή του υποδοχέα COUP-TF δύνανται να προσδεθούν στο C1R. Οι πρωτεΐνες που χρησιμοποιήθηκαν είναι αυτές που παράχθηκαν με το Wheat Germ Extract. Πειράματα έγιναν χρησιμοποιώντας και τις πρωτεΐνες που παράχθηκαν με το Rabbit Reticulocyte Lysate System (βλέπε Γ ) και με το Flexi Rabbit Reticulocyte Lysate System (βλέπε Γ ) χωρίς επιτυχία. Εικόνα 30: Πείραμα EMSA με τη χρήση ομοδιμερών 72

81 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Δ.5.2) ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΩΝ ΕΤΕΡΟΔΙΜΕΡΩΝ Στα πειράματα EMSA με την χρησιμοποίηση των ετεροδιμερών COUP-TF S.I: COUP-TF L.I ή / που προέκυψαν από co-translation (βλέπε Γ.12.3) φαίνεται καθαρά ότι όσο αυξάνεται η αναλογία COUP-TF L.I ή / : COUP-TF S.I τόσο μειώνεται και η πρόσδεση του ομοδιμερούς COUP-TF S.I στο στοιχείο απόκρισης C1R (Εικόνα 31). Σημειωτέον ότι η ποσότητα της COUP-TF S.I πρωτεΐνης παραμένει σταθερή αφού για τις co-translation χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις 0,5μg RNA. Εικόνα 31: Πείραμα EMSA με τη χρήση ετεροδιμερών 73

82 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ (Δ.5.3)ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΩΝ ΕΤΕΡΟΔΙΜΕΡΩΝ ΜΕ PHOSPHORIMAGER Προκειμένου να συγκριθεί το ποσοστό πρόσδεσης των ετεροδιμερών COUP- TF S.I : COUP-TF L.I και COUP-TF S.I : / στο C1R, τόσο μεταξύ τους όσο και με το ομοδιμερές του COUP-TF S.I έγινε ανάλυση των EMSA στο phosphorimager. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι όσο αυξάνεται η αναλογία COUP- TF L.I ή / : COUP-TF S.I τόσο μειώνεται και η πρόσδεση στο στοιχείο απόκρισης C1R. Περεταίρω δείχνουν ότι το ετεροδιμερές / : COUP-TF S.I παρουσιάζει μεγαλύτερο ποσό πρόσδεσης στο C1R σε σχέση με το COUP-TF L.I : COUP-TF S.I για όλες τις αναλογίες που χρησιμοποιήθηκαν (Εικόνα 32). Φαίνεται ότι τα ετεροδιμερή / : COUP-TF S.I και COUP-TF L.I : COUP-TF S.I ακολουθούν το ίδιο μοντέλο πρόσδεσης στο στοιχείο απόκρισης C1R, όμως με εμφανώς διαφορετικό πρότυπο(εικόνα 33). Εικόνα 32: Σύγκριση των ποσοστών πρόσδεσης των ετεροδιμερών και ομοδιμερών στο στοιχείο απόκρισης C1R 74

83 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Εικόνα 33.: Τα ετεροδιμερή COUP-TF L.I : COUP-TF S.I και: / : COUP-TF S.I ακολουθούν το ίδιο μοντέλο πρόσδεσης στο στοιχείο απόκρισης C1R, όμως με εμφανώς διαφορετικό πρότυπο. το ετεροδιμερές / : COUP-TF S.I παρουσιάζει μεγαλύτερο ποσό πρόσδεσης στο C1R σε σχέση με το COUP-TF L.I : COUP-TF S.I για όλες τις αναλογίες. Στον άξονα των χ υποδεικνύονται τα μg RNA COUP-TF L.I και / που χρησιμοποιήθηκαν για τις co-translation. H ποσότητα της COUP-TF S.I πρωτεΐνης παραμένει σταθερή αφού για τις co-translation χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις 0,5μg RNA. Yi:ποσοστό πρόσδεσης του ετεροδιμερούς COUP-TF L.I : COUP-TF S.I ή / : COUP-TF S.I. στο C1R Yo : ποσοστό πρόσδεσης του ομοδιμερούς COUP-TF S.I στο C1R (Δ.6) ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ ΕΝΕΜΕΝΩΝ ΕΜΒΡΥΩΝ Τα έμβρυα που ενέθηκαν στο στάδιο Γ.16 παρατηρήθηκαν σε απλό μικροσκόπιο φθορισμού καθώς και σε συνεστιακό μικροσκόπιο ανάστροφης φάσης. Δυστυχώς λόγω του μεγάλου ενδογενή φθορισμού των εμβρύων αλλά και λόγω της απουσίας ενός καλού control (π.χ του hcoup-tf) δεν μας επέτρεψε να βγάλουμε κάποια συμπεράσματα όσον αφορά την κατανομή των πρωτεΐνών που προκύπτουν από τα ενεμένα RNAs (Εικόνα 34). Επίσης η απουσία kozak αλληλουχίας από την 5 -UTR ίσως να μην επιτρέπει την αποδοτική μετάφραση των ενιόμενων RNAs 75

84 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ A B Εικόνα 34. Συνεστιακή μικροσκόπηση εμβρύων αχινού Paracentrotus lividus. A: Μη ενεμένα έμβρυα. Β: Έμβρυα που ενέθηκαν με COUP-TF S.I GFP RNA. 76