ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Ο μεταγραφικός παράγοντας Coup-TF και το γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο στο νευρικό σύστημα του αχινού Paracentrotus lividus ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Γεωργία Γούβη Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, Ιούλιος

2 Επιβλέπων καθηγητής Φλυτζάνης Κωνσταντίνος (Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών) Μέλη τριμελούς εξεταστικής επιτροπής Φλυτζάνης Κωνσταντίνος Καζάνης Ηλίας (Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών) Μίντζας Αναστάσιος (Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών)

3 Πρόλογος Η διπλωματική αυτή εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη του καθηγητή κ.κωνσταντίνου Φλυτζάνη. Θα ήθελα να εκφράσω τη βαθειά ευγνωμοσύνη μου στον επιβλέποντα καθηγητή μου κ.κωνσταντίνο Φλυτζάνη για την αμέριστη στήριξη που μου πρόσφερε καθόλο το διάστημα της γνωριμίας και συνεργασίας μας. Δημιουργώντας πάντα ένα ευχάριστο και φιλικό περιβάλλον εργασίας, με παρακινούσε να αποκτήσω δικό μου τρόπο σκέψης και να παίρνω πρωτοβουλίες. Και πάνω από όλα με έμαθε να σκέφτομαι με επιστημονικό τρόπο. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τους καθηγητές τις τριμελούς μου επιτροπής κ.η. καζάνη και κ.α.μίντζα οι οποίοι με καθοδήγησαν καθόλη τη διάρκεια των σπουδών μου με υπομονή ανοχή και ειλικρινές ενδιαφέρον. Πολλές από καρδιάς ευχαριστίες στον διδακτορικό φοιτητή Ιωάννη Τσιρώνη, ο οποίος ήταν πάντα πρόθυμος να με καθοδηγήσει και να λύσει πολλές απορίες μου. Ακομη, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά όλα τα μέλη του εργαστηρίου για τη βοήθεια και τις συμβουλές τους. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την προπτυχιακή φοιτήτρια Άννα Μαθιουδάκη η οποία ήταν το δεξί μου χέρι στο εργαστήριο, όπως και την Ειρήνη Τσική, Ανδριάνα Ματζαφού και Μιχάλη Γκουβέλη. Τέλος θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στις φίλες και συναδέλφους Άρτεμις, Ανδριάνα και Δανάη που αποτελούν την αντίστοιχη οικογένεια μου στο εργαστήριο. Τον Περικλή, και τον Παναγιώτη για την αμέριστη στήριξή τους, και φυσικά την οικογένεια μου που είναι πάντα διπλα μου και με στηρίζει σε κάθε βήμα. Ευχαριστώ πολύ όλους! 3

4 Περίληψη Ο Coup TF (Nr2F1), αποτελεί ένα μέλος της υπέρ-οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων και χαρακτηρίζεται ως ορφανός υποδοχέας. Είναι απαραίτητος παράγοντας στην νευρογένεση του εμβρύου του αχινού, όπως και όλων των μεταζώων. Εκφράζεται στο στοματικό εξώδερμα [ventral ή oral ectoderm (OE)] του εμβρύου, το οποίο περιλαμβάνει δύο κύριες νευρογενείς περιοχές την βλεφαριδωτή ζώνη [ciliary band (CB)], και το πρόσθιο νευροεξώδερμα [anterior neural ectoderm (ANE)]. Χωροειδικά και χρονοειδικά πρότυπα έκφρασης των ρυθμιστικών γονιδίων απαιτούνται για την δημιουργία ενός ρυθμιστικού δικτύου, gene regulatory network (GRN). Στην παρούσα μελέτη διερευνάται το πρότυπο έκφρασης των γονιδίων του ANE και του στοματικού εξωδέρματος όπως Six3, Fez, Ets4, Not, Sip1, Foxq2 και Gsc στην πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη, με την χρήση qpcr και in situ υβριδοποίησης (WMISH). Επιπροσθέτως μελετάται το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου SynB που χρησιμοποιείται ως μάρτυρας νευρικών κυττάρων. Το υπάρχων υπόδειγμα ρυθμιστικού δικτύου για το στοματικό εξώδερμα του εμβρύου του αχινού, το οποίο εμπεριέχει τo λιγότερο μελετημένo GRN-υπoδίκτυο του ΑΝΕ, δεν περιλαμβάνει το γονίδιο Coup-TF. Στόχος μας είναι να αναγνωρίσουμε τις ρυθμιστικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ του Coup-TF και τον προαναφερθέντων γονιδίων, ώστε να τοποθετηθεί ο Coup-TF μέσα στο υποδίκτυο του ANE του εμβρυικού GRN. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε μια σειρά πειραμάτων με έμβρυα που είχαν ενεθεί με ειδικά αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια (morpholino) έναντι του μεταγράφου του Coup-TF, τα οποία δίνουν σαν αποτέλεσμα ακραίο φαινότυπο και απώλεια του ενδογενούς Coup-TF mrna μετά από WMISH. Επίσης, αυτός ο φαινότυπος ακολουθείται από την έλλειψη των σεροτονεργικών νευρώνων και την απαλοιφή ή εκτοπική έκφραση αρκετών σημαντικών γονιδίων στην νευρογένεση του ANE και της CB. Τέλος παρουσιάζεται ένα προσωρινό υποδίκτυο στο οποίο φαίνονται οι ειδικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ του Coup-TF και άλλων ρυθμιστικών γονιδίων στο πρόσθιο νευροεξώδερμα..

5 Abstract Coup TF (Nr2F1), an orphan member of the nuclear receptor super family, is an essential factor in neurogenesis of all metazoans as well as sea urchin embryos. Coup- TF is expressed in the oral ectoderm (OE) of the embryo, which includes the two major neurogenic territories, the ciliary band (CB) and the anterior neural ectoderm (ANE). The temporal and spatial expression patterns of regulatory genes are required for building a gene regulatory network (GRN). In this study we analyzed the expression profile throughout early development of ANE and OE genes such as Six3, Fez, Ets4, Sip1, FoxQ2, Not, SynB and Gsc, by qpcr and whole mount in situ hybridization (WMISH). The current OE-GRN model for the sea urchin embryo, which includes the least studied GRN-subgroup of the anterior neural ectoderm, does not encompass Coup-TF. We aim to identify the regulatory interactions between Coup-TF and the aforementioned genes in order to place Coup-TF within the ANE sub-circuit of the embryonic GRN. Thus, we performed a series of experiments with specific anti-coup-tf morpholino injected embryos that result in severe phenotype and loss of endogenous Coup-TF mrna as judged by WMISH. Such repression of Coup-TF in developing sea urchin embryos, results in the absence of serotonergic neurons and diminishing or ectopic expression of a number of key neurogenic genes of the ANE and CB. A provisional GRN that indicates the specific interactions between Coup-TF and other neural ectoderm regulatory genes will be presented. 5

6 Συντομογραφίες Pl: Paracentrotus lividus PFA: Paraformaldyide ASW: Artficiial Sea Water Sp: Strongylocentrotus purpuratus TAE: tris/acetate/edta RT: Room Temprature O/V: Over Night ANE: Anterior Neuro Ectoderm OE: Oral Ectoderm NSM: Non Skeletogenic Mesoderm CBE: Cillary Band Ectoderm A/v: Animal Vegetal PMC: Primary Mesenchyme Cells APD: Animal pole domain PABA: Para amino Benzoil acid MFSW: Millipore Filter sea water

7 Πίνακας περιεχομένων Πρόλογος... 3 Περίληψη... 4 Abstract... 5 Συντομογραφίες... 6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο αχινός ως πειραματικό υλικό Γενικά χαρακτηριστικά Πλεονεκτήματα χρήσης του αχινού ως πειραματικό υλικό Η Εμβρυογένεση στον αχινό Γονιμοποίηση Πρώιμη ανάπτυξη ως το στάδιο του βλαστιδίου Καθορισμός της αναπτυξιακής τύχης των κυττάρων, cell fate determination Γαστριδίωση Ο παράγοντας Coup-TF Γενικά Δομή Δράση Δράση ως καταστολέας μέσω τεσσάρων μηχανισμών Δράση ως ενεργοποιητής μέσω τριών μηχανισμών Φυσιολογικός Ρόλος και σημασία των Coup-TF στους οργανισμούς Ιστοειδική έκφραση του Coup-TF στον αχινό Τα ρυθμιστικά γονιδιακά δίκτυα GRNs Αρχές σχεδίασης ρυθμιστικών γονιδιακών δικτύων Ρόλος των αναπτυξιακών ρυθμιστικών γονιδιακών δικτύων GRNs στον αχινό Καθορισμός του νευρικού συστήματος στον αχινό Καθορισμός νευρογενών περιοχών Πρόσθιο νευροεξώδερμα, περιοχή του ANE Περιοχή της Βλεφαριδωτής ζώνης CBE Ο καθορισμός και η οργάνωση του νευρικού συστήματος του εμβρύου του αχινού σε 4 στάδια

8 Διαφοροποιημένο νευρικό σύστημα στην προνύμφη του αχινού Ο μεταγραφικός παράγοντας Six Ο μεταγραφικός παράγοντας FoxQ Ο μεταγραφικός παράγοντας Fez Ο μεταγραφικός παράγοντας Ets Ο μεταγραφικός παράγοντας Not O μεταγραφικός παράγοντας Sip O μεταγραφικός παράγοντας Gsc Το γονίδιο της Synaptotagmin B ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματόζωα Απομόνωση CDNA Κλωνοποίηση του απομονωμένου cdna Αντίδραση λιγάσης Παρασκευή δεκτικών κυττάρων: Κατασκευή τρυβλίων θρεπτικού Μετασχηματισμός δεκτικών κυττάρων Blue-white screening Μεταφορά αποικιών (streaking) και δημιουργία υγρών καλλιεργειών Απομόνωση μικρής κλίμακας πλασμιδιακού DNA από βακτήρια mini-preps Πέψη με ένζυμα περιορισμού Φωτομέτρηση Αλληλούχιση In situ υβριδοποιήση Παρασκευή ιχνηθετών In situ υβριδοποίηση Fluorescence in situ hybridization Ένεση αντινοηματικών morpholinos σε αυγά αχινού Μονιμοποίηση εμβρύων ελέγχου και ενεμμένων εμβρύων με morpholinos Απομόνωση RNA Δημιουργία CDNA Πραγματικού χρόνου PCR (QPCR) Real-time polymerase chain reaction ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ελαττωματική ανάπτυξη του νευρικού συστήματος μετά από αποσιώπηση του Coup-TF 95 Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη... 95

9 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου SynB και δημιουργία ιστοειδικού προτύπου έκφρασης Ανίχνευση της έκφραση του γονιδίου SynB σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Coup-TF μετά την καταστολή του Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Coup-TF Ανίχνευση έκφρασης Coup-TF σε έμβρυα που έχει κατασταλεί Η αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Six Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Six Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Six3 και δημιουργία ιστοειδικού προτύπου έκφρασής του Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Six3 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου Six3 στον αχινό Paracentrotus lividus Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Six3 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF 108 Ανίχνευση της έκφρασης του Coup-TF σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Six Η αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Fez Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Fez και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Fez στο πρόσθιο νευροεξώδερμα Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Fez σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου Fez στον αχινό Paracentrotus lividus Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Fez σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF. 115 Αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Ets Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίουets4 και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου ets4 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου Ets4 στον αχινό Paracentrotus lividus Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Ets4 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί o Coup-TF 121 Αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο FoxQ Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου FoxQ2 και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του

10 Ανίχνευση της έκφρασης του FoxQ2 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου FoxQ2 στον αχινό Paracentrotus lividus Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του FoxQ2 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Not Παρασκευή αντινοηματικού και νοηματικού ιχνηθέτη Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Not και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Not σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου Not στον αχινό Paracentrotus lividus Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Not σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF. 133 Η αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Sip1/Zeb Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Sip1/Zeb2 και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Sip1/Zeb2 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου sip1 στον αχινό Paracentrotus lividus Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Sip1 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF 139 Η αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Gsc Παρασκευή νοηματικού αντινοηματικού ιχνηθέτη Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου gsc και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου gsc σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου gsc στον αχινό Paracentrotus lividus Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Gsc σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF. 146 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Κλώνοι Εκκινητές για QPCR Εκκινητές για κλωνοποίηση γονιδίων ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

11 11

12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

13 Ο αχινός ως πειραματικό υλικό Γενικά χαρακτηριστικά Ο αχινός αποτελεί ένα από τα πιο κοινά πειραματόζωα που χρησιμοποιείται σε εργαστήρια βιολογίας για τη μελέτη ποικίλων μηχανισμών και προβλημάτων που αφορούν την ανάπτυξη των οργανισμών. Το πειραματικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε στην συγκεκριμένη διπλωματική εργασία είναι ο Paracentrotus lividus, ο κοινός πετραχινός. Το είδος αυτό απαντάται ευρύτατα στη Μεσόγειο σε ρηχά νερά και τρέφεται με φωτόφιλα φύκη. Όπως όλα τα εχινόδερμα έτσι και ο P.lividus φέρει το πιο ξεχωριστό χαρακτηριστικό, την πεντακτινωτή συμμετρία, η οποία προκύπτει δευτερογενώς μετά από μια περίοδο αμφίπλευρης συμμετρίας (Barnes R.D. Zoology) Εικόνα 1: O αχινός Paracentrotus lividus The Marine Life Information Network Πλεονεκτήματα χρήσης του αχινού ως πειραματικό υλικό Η εκτενής χρήση του αχινού οφείλεται σε μια ποικιλία πλεονεκτημάτων. Ο αχινός φέρει ένα σύνολο χαρακτηριστικών που διευκολύνουν την έρευνα. Καταρχήν, η πληθώρα των ατόμων που είναι διαθέσιμα, όπως ο Paracentrotus lividus που αφθονεί 13

14 στις ελληνικές θάλασσες, δημιουργεί τις προϋποθέσεις για εύκολη συλλογή και χρήση. Επίσης, η απλή διαδικασία της εμβρυογένεσης και το γεγονός ότι τα εμβρυϊκά κύτταρα είναι διαφανή, επιτρέπει την άμεση παρατήρηση των κυτταρικών διαιρέσεων και κινήσεων σε ολόκληρο το έμβρυο και την προνύμφη και το χαρακτηρισμό των αναπτυξιακών γεγονότων του αχινού, καθώς και την παρατήρηση των αποτελεσμάτων σε ζωντανά έμβρυα. Ένα άλλο πολύ σημαντικό πλεονέκτημα είναι ο σύντομος χρόνος ανάπτυξης, ο οποίος μέχρι το στάδιο του βλαστιδίου διαρκεί μόνο μια μέρα, ενώ μέχρι τον ώριμο πλουτέα αντιστοιχεί σε δυο περίπου μέρες. Ακόμη, ο μεγάλος αριθμός εμβρύων με συγχρονισμένη ανάπτυξη παρέχει πλούσιο υλικό για βιοχημικούς και μοριακούς χαρακτηρισμούς. Τα έμβρυα του αχινού είναι εύκολα στο χειρισμό, γεγονός που δίνει στους ερευνητές τη δυνατότητα πραγματοποίησης πειραμάτων που περιλαμβάνουν απομάκρυνση ή μεταμόσχευση βλαστομεριδίων, διχοτόμηση ολόκληρων εμβρύων, καθώς και ευκολία στη γονιδιακή μεταφορά, με μικροένεση γενετικού υλικού. Ταυτόχρονα λόγω της φυλογενετικής του θέσης (δευτεροστόμιο και κοντά φυλογενετικά στην ομάδα των Χορδωτών) δίνει τη δυνατότητα παροχής σημαντικών πληροφοριών κυρίως για μοριακά μονοπάτια και γεγονότα που συνέβησαν κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Επιπλέον, το πλήρως αλληλουχημένο γονιδίωμα του αχινού Strongylocentrotus purpuratus που δημοσιεύτηκε το Νοέμβριο του 2006 (Sea Urchin Genome Sequencing et al., 2006) δίνει τη δυνατότητα εύκολης και ταχείας αναζήτησης και μελέτης νέων γονιδίων. Ακόμα ένα πολύ σημαντικό πλεονέκτημα αποτελεί η απλότητα του γονιδιώματος του αχινού όπου εξυπηρετεί την σύγκριση και τον προσδιορισμό των συντηρημένων γονιδίων και τον αλληλεπιδράσεων τους. Εικόνα 2: Μικροένεση σε έμβρυο αχινού,

15 Η Εμβρυογένεση στον αχινό Ο αχινός αποτελεί εξαιρετικά σημαντικό οργανισμό μελέτης των τρόπων με τους οποίους τα γονίδια διαμορφώνουν το έμβρυο. Γονιμοποίηση Ο αχινός είναι γονοχωριστικός οργανισμός και φέρει πέντε γονάδες που διατάσσονται ακτινωτά ως προς τον στοματικό-αντιστοματικό άξονα. Παρατηρείται διαφορά ως προς το χρώμα των γονάδων και συγκεκριμένα οι αρσενικές είναι υποκίτρινες ενώ οι θηλυκές είναι πορτοκαλί. Οι αχινοί ελευθερώνουν τους γαμέτες τους στο θαλάσσιο περιβάλλον από τους πόρους των γεννητικών πιδακιδίων που ονομάζονται γονοπόροι και έτσι επιτυγχάνεται εξωτερική γονιμοποίηση. Το ώριμο ωάριο του αχινού περιβάλλεται από ένα παχύ βλεννώδες- ζελατινώδες περίβλημα (gel coat) που χρησιμεύει για την ενεργοποίηση του σπερματοζωαρίου κατά την γονιμοποίηση. Παράγοντες σε αυτό το βλεννώδες περίβλημα προκαλούν την αντίδραση του ακροσώματος στο σπερματοζωάριο και είναι ειδικοί για κάθε είδος. Το ώριμο σπερματοζωάριο φέρει στο πρόσθιο άκρο της κεφαλής του, το ακρόσωμα. Το ακρόσωμα περιέχει πρωτεολυτικά ένζυμα που πέπτουν τη λεκιθική μεμβράνη και στον αχινό σχηματίζει το ακροσωμικό νημάτιο με τη διαδικασία της αντίδρασης του ακροσώματος(εικόνα 3). Εικόνα 3: Παράδειγμα γονιμοποίησης στον αχινό. 15

16 Κατά τη διάρκεια της γονιμοποίησης, το ωάριο συντήκεται με το σπερματοζωάριο, αφού το δεύτερο διασχίσει το ζελατινώδες περίβλημα με τη βοήθεια των ακροσωμικών ενζύμων. Στη συνέχεια συντήκονται οι προπυρήνες ωαρίου και σπερματοζωαρίου με αποτέλεσμα τον σχηματισμό του ζυγωτού κάτι το οποίο σηματοδοτεί την έναρξη των αυλακώσεων(gilbert 2003). Ο αχινός παρουσιάζει ακτινωτή ολοβλαστική αυλάκωση. Τα επίπεδα τόσο της πρώτης όσο και της δεύτερης διαίρεσης είναι παράλληλα προς το μεσημβρινό επίπεδο, περνούν από το ζωικό-φυτικό πόλο και είναι κάθετα μεταξύ τους. Η τρίτη διαίρεση γίνεται στο ισημερινό επίπεδο, είναι κάθετη στις δύο πρώτες και διαχωρίζει τα το ζωικό και φυτικό «ημισφαίριο». Εντούτοις, η τέταρτη αυλάκωση είναι αρκετά διαφορετική από τις προηγούμενες τρείς.(εικόνα 4) Πρώιμη ανάπτυξη ως το στάδιο του βλαστιδίου Τα τέσσερα κύτταρα στο ζωικό ημισφαίριο διαιρούνται στο μεσημβρινό επίπεδο, σε οκτώ ίσα βλαστομερίδια. Τα κύτταρα αυτά καλούνται μεσομερίδια. Τα κύτταρα στη φυτική στοιβάδα διαιρούνται στο ισημερινό επίπεδο, όμως η διαίρεση είναι άνιση και έτσι παράγονται τέσσερα μεγάλα κύτταρα, τα μακρομερίδια και τέσσερα μικρότερα τα μικρομερίδια. Καθώς το έμβρυο των 16-κυττάρων αυλακώνεται, τα οκτώ μεσομερίδια διαιρούνται για να σχηματίσουν δύο «ζωικές στοιβάδες» την an1 και an2, όπου η πρώτη επικάθεται στην δεύτερη. Τα μακρομερίδια διαιρούνται στο ισημερινό επίπεδο σχηματίζοντας μια στοιβάδα (veg1) κάτω από την an2 και άλλη μία κάτω από την veg1, την veg2(εικόνα 4). Λίγο αργότερα διαιρούνται και τα μικρομερίδια παράγοντας μία μικρή «συστάδα» κάτω από την μεγαλύτερη. Όλα τα επίπεδα της έκτης διαίρεσης γίνονται στο ισημερινό επίπεδο ενώ της έβδομης στο μεσημβρινό, σχηματίζοντας το βλαστίδιο των 128-κυττάρων. Το στάδιο του βλαστιδίου στην εμβρυική ανάπτυξη του αχινού, ξεκινά από την στιγμή που το έμβρυο φτάνει τα 128 κύτταρα.(εικόνα 4). Εδώ τα κύτταρα σχηματίζουν μια κοίλη σφαίρα και διατάσσονται περιμετρικά της κεντρικής κοιλότητας η οποία καλείται βλαστόκοιλος. Τη στιγμή αυτή όλα τα κύτταρα έχουν το ίδιο μέγεθος, δεδομένου ότι τα μικρομερίδια έχουν ελαττώσει σαφώς τον ρυθμό διαίρεσης τους σε σχέση με τα μεσομερίδια και μακρομερίδια. Το κάθε κύτταρο βρίσκεται σε επαφή με το πρωτεϊνούχο υγρό του βλαστόκοιλου, στην εσωτερική του πλευρά και με την

17 στοιβάδα της υαλίνης στην εξωτερική του. Σε αυτή τη χρονική στιγμή αναπτύσσονται στενές συνδέσεις μεταξύ των κυττάρων κάτι που έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός ενιαίου επιθηλιακού στρώματος το οποίο περιβάλλει το βλαστόκοιλο Καθώς τα κύτταρα συνεχίζουν να διαιρούνται, το πάχος της περιφέρειας του βλαστιδίου γίνεται όσο το πάχος ενός κυττάρου, και συνεχίζει να λεπταίνει καθώς το βλαστίδιο επεκτείνεται. Αυτό επιτυγχάνεται με την προσκόλληση των βλαστομεριδίων στην επιφάνεια της υαλίνης και με την εισροή νερού που φουσκώνει το βλαστόκοιλο. Αυτές οι γρήγορες κυτταρικές αυλακώσεις διαρκούν για 9-10 κυτταρικές διαιρέσεις(gilbert 2003). Εικόνα 4:Η ανάπτυξη του αχινού μέχρι το βλαστίδιο των 128 κυττάρων. Χαρακτηριστικό είναι ότι από την τέταρτη διαίρεση και μετά παρατηρούνται ασύμμετρες διαιρέσεις Μετά την περίοδο αυτή το έμβρυο μεταπίπτει στο στάδιο του μέσου-βλαστιδίου (midblastula) όπου οι συγχρονισμένες διαιρέσεις σταματούν, νέα γονίδια εκφράζονται και πολλά μη μιτωτικά κύτταρα αναπτύσσουν βλεφαρίδες στην εξωτερική τους επιφάνεια. Το βλεφαριδωτό βλαστίδιο ξεκινά να περιστρέφεται μέσα στην μεμβράνη γονιμοποίησης. Σύντομα αρχίζουν να διακρίνονται διαφορές στα κύτταρα. 17

18 Τα κύτταρα του φυτικού πόλου αρχίζουν να παχαίνουν, σχηματίζοντας τη φυτική πλάκα. Επίσης τα κύτταρα του ζωικού ημισφαιρίου εκκρίνουν ένα ένζυμο που πέπτει την μεμβράνη γονιμοποίησης. Εικόνα 5: Α: Τα βλαστομερίδια διατάσσονται περιμετρικά για να σχηματίσουν το βλαστόκοιλο. Β: Ανάπτυξη στενώνσυνδέσμων μεταξύ των κυττάρων και σχηματισμόςενός ενιαίου επιθηλίου. Γ: Τα κύτταρα του φυτικού πόλου, αυξάνονται σε όγκο για να σχηματίσουν τη φυτική πλάκα Καθορισμός της αναπτυξιακής τύχης των κυττάρων, cell fate determination. Ο χάρτης της τύχης των κυττάρων στο έμβρυο του αχινού, σχηματίστηκε αρχικά με παρατηρήσεις όσον αφορά σε τι εξελίσσονταν οι απόγονοι των κυτταρικών στοιβάδων. Πιο σύγχρονες μελέτες έχουν διασαφηνίσει αυτούς τους χάρτες, μέσω παρατήρησης ξεχωριστών κυττάρων, ενεμμένων με φθορίζουσες χρωστικές. Αυτές οι έρευνες έδειξαν ότι μέχρι το στάδιο των 60 κυττάρων, η τύχη των περισσοτέρων εμβρυικών κυττάρων έχει καθοριστεί, όμως τα κύτταρα δεν έχουν δεσμευτεί μη αντιστρεπτά. Με άλλα λόγια, συγκεκριμένα βλαστομερίδια παράγουν τους ίδιους κυτταρικούς τύπους σε διαφορετικά έμβρυα, όμως αυτά τα κύτταρα παραμένουν πολυδύναμα και μπορούν να σχηματίσουν άλλους κυτταρικούς τύπους, αν τοποθετηθούν πειραματικά σε άλλα μέρη του εμβρύου. Ένας χάρτης της τύχης των κυττάρων φαίνεται στην (εικόνα 5).Τα κύτταρα του ζωικού ημισφαιρίου δίνουν το εξώδερμα, την επιδερμίδα της προνύμφης καθώς και τους νευρώνες της. Η στοιβάδα veg1 μπορεί να παράγει κύτταρα που μπορούν να εισέλθουν τόσο σε εξωδερμικά όσο και ενδοδερμικά όργανα. Η στοιβάδα veg2 μπορεί να δώσει κύτταρα τριών διαφορετικών δομών: ενδόδερμα, κοιλωματικές δομές και δευτερογενές μεσέγχυμα (ανοσοκύτταρα, κύτταρα που παράγουν χρωστικές και μυοκύτταρα). Η πρώτη στοιβάδα των μικρομεριδίων παράγει πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα που θα δομήσουν το σκελετό της προνύμφης, ενώ

19 η δεύτερη στοιβάδα των μικρομεριδίων (μικρά μικρομερίδια) συνεισφέρει στο κοιλωματικές δομές και τη γαμετική σειρά (Gilbert, 2003). Φαίνεται ότι ο καθορισμός της κυτταρικής τύχης, στον αχινό, εμπλέκει ένα καταρράκτη ο οποίος ξεκινά από τα μικρομερίδια. Έχει τεθεί επί τάπητος η υπόθεση ότι το σινιάλο από τα μικρομερίδια επάγει μέτα-μεταφραστικές τροποποιήσεις σε κάποιους παράγοντες στην στοιβάδα veg2. Ομοίως, το σινιάλο από την στοιβάδα veg2 πιθανότατα τροποποιεί κάποιες πρωτεΐνες στην στοιβάδα veg1. Με αυτό τον τρόπο οι διαφορετικές στοιβάδες δεσμεύονται για διαφορετική αναπτυξιακή τύχη(davidson, 1989; Davidson et al., 1998)( Gilbert, 2003). Εικόνα 6: Α: Το έμβρυο των 60 κυττάρων καθώς και η αναπτυξιακή τύχη των κυττάρων. Β: Ενδεικτικός χάρτης αναπτυξιακής τύχης( Gilbert 2003). 19

20 Γαστριδίωση Το ώριμο βλαστίδιο αποτελείται από μία μόνο στοιβάδα από περίπου 1000 κύτταρα τα οποία σχηματίζουν μία κοίλη μπάλα, λίγο πεπλατυσμένη στο φυτικό πόλο. Τα βλαστομερίδια, που προέκυψαν από διαφορετικές περιοχές του ζυγωτού έχουν διαφορετικό μέγεθος και ιδιότητες εικόνα Λίγο μετά την «εκκόλαψη» του βλαστιδίου από την μεμβράνη γονιμοποίησης, σχηματίζεται η φυτική πλάκα. Στο κέντρο αυτής της πλάκας μια ομάδα μικρών κυττάρων αρχίζει να αλλάζει σε μορφολογία. Επιμηκύνονται και αναπτύσσουν φυλλοπόδια στην εσωτερική τους επιφάνεια. Έπειτα αποκολλώνται από την επιθηλιακή μονοστοιβάδα και εισβάλλουν στο βλαστόκοιλο. Τα κύτταρα αυτά καλούνται πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα εικόνα Θα σχηματίσουν το σκελετό της προνύμφης γι αυτό κάποιες φορές καλούνται και σκελετογόνο μεσέγχυμα. Αρχικά τα κύτταρα αυτά φαίνεται να κινούνται τυχαία κατά μήκος της εσωτερικής επιφάνειας του βλαστόκοιλου, χρησιμοποιώντας τα φυλλοπόδια. Ωστόσο, τελικά εντοπίζονται στην πλαγιοκοιλιακή περιοχή του βλαστοκοίλου. Εκεί συντήκονται μεταξύ τους σε ένα συγκύτιο το οποίο θα συμμετάσχει στο σχηματισμό του σκελετού της προνύμφης. Καθώς όμως τα πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα απομακρύνονται από την φυτική περιοχή του βλαστόκοιλου, συμβαίνουν σημαντικές αλλαγές στα κύτταρα που παραμένουν στη φυτική πλάκα. Αυτά τα κύτταρα παραμένουν συνδεδεμένα το ένα με το άλλο καθώς και στην επιφάνεια της υαλίνης και κινούνται για να καλύψουν τα κενά που αφήνουν τα πρωτογενή μεσεγχυματικά κύτταρα. Περεταίρω, η φυτική πλάκα κάμπτεται προς το εσωτερικό και εγκολπώνεται (εικόνα 6). μέχρι το ¼ έως ½ του βλαστόκοιλου. Μετά η εγκόλπωση ξαφνικά σταματά. Η εγκολπωμένη περιοχή καλείται αρχέντερο ενώ το άνοιγμα του αρχεντέρου στο φυτικό πόλο καλείται βλαστοπόρος. Στο στάδιο που τα κύτταρα του σκελετογόνου μεσεγχύματος αρχίζουν να εισβάλλουν στο βλαστόκοιλο, η τύχη των κυττάρων της φυτικής πλάκας έχει ήδη καθοριστεί. Τα ενδοδερμικά κύτταρα που είναι γειτονικά στα μεσεγχυματικά κύτταρα που προέκυψαν από τα μικρομερίδια, θα γίνουν πρόσθιο έντερο, μεταναστεύοντας βαθιά μέσα στο βλαστόκοιλο. Η επόμενη στοιβάδα ενδοδερμικών κυττάρων θα γίνει μεσέντερο ενώ η τελευταία ομάδα ενδοδερμικών κυττάρων που εγκολπώνεται θα σχηματίσει το τελικό έντερο και την έδρα. Μετά από μια μικρή περίοδο παύσης της εγκόλπωσης τα δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα «τραβούν» το αρχέντερο πιο

21 βαθιά στο βλαστόκοιλο μέχρι να συναντήσει το τοίχωμα (εικόνα 7). Στο σημείο αυτό θα σχηματιστεί το στόμα της προνύμφης (Gilbert, 2003). Εικόνα 7:Τα αναπτυξιακά στάδια του αχινού μέχρι και τον πλουτέα. Α:Το ζυγωτό. Β:Βλαστίδιο. Γ.Έναρξη γαστριδίωσης, με χαρακτηριστική την έναρξη της παρουσίας των πρωτογενών μεσεγχυματικών κυττάρων. Δ: Η εγκόλπωση του αρχεντέρου και η εμφάνιση των σκελετογόνων ράβδων. Ε: Το αρχέντερο φτάνει στο πλαγιοκοιλιακό τοίχωμα του βλαστόκοιλου όπου θα σχηματιστεί το στόμα. ΣΤ: Ο πλουτέας. Ο παράγοντας Coup-TF Γενικά Ο COUP-TF (Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factor) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας ο οποίος ανήκει στην υποοικογένεια των πυρηνικών ορφανών υποδοχέων δεδομένου ότι δεν έχει βρεθεί μέχρι στιγμής κάποιο πρόσδεμα να δένει σ αυτόν. Πήρε το όνομά του από το στοιχείο COUP (στοιχείο απόκρισης του DNA) στον υποκινητή του γονιδίου της ωαλβουμίνης της όρνιθας(wang et al., 1987). Η αρχική απομόνωσή του έγινε από κύτταρα HeLa ως ομοδιμερή που είναι ικανά να προσδένονται σ αυτό το στοιχείο. Το στοιχείο αυτό είναι μια ατελής ευθεία επανάληψη της αλληλουχίας AGGTCA (απόσταση ενός νουκλεοτιδίου μεταξύ των επαναλήψεων, DR1). Οι COUP-TFs έχουν μελετηθεί και εντοπιστεί σε μια μεγάλη ποικιλία οργανισμών, γεγονός που επιβεβαιώνει τη βαθιά φυλογενετική συντηρητικότητά τους. Από τον άνθρωπο μέχρι το βάτραχο και τον αχινό οι COUP-TFs φαίνεται να εμπλέκονται σε μια ποικιλία λειτουργιών και ρυθμίσεων. Στον άνθρωπο έχουν βρεθεί 21

22 δύο τέτοια γονίδια (hcoup-tf I, II)(Pereira et al., 2000), στο βάτραχο Xenopus laevis τρία (XCOUP-TFI, II/B, III/A)(van der Wees et al., 1996), στη Drosophila ένα, το seven up (SVP)(Hiromi et al., 1993), στην όρνιθα ένα (ccoup-tfii)(lutz et al., 1994), στον ποντικό δύο (m COUP-TFI, II)(Park et al., 2003), στο χάμστερ και τον αρουραίο από ένα (hmcoup-tfi και rcoup-tfi αντιστοίχως), στο ψάρι zebrafish τρία(jayakumar et al., 1995) (svp 44, svp 46, svp 40) και στον αχινό S.purpuratus ένα (SpCOUPTF). Οι περιοχές πρόσδεσης στο DNA (DBDs) των COUP-TFs παρουσιάζουν ομολογία αμινοξέων της τάξεως του 94%. Δομή Όπως έχει αναφερθεί πιο πάνω ο Coup-TF ανήκει στην υπεροικογένεια των στεροειδών θυρεοειδών ορμονών ή όπως ονομάζονται σήμερα πυρηνικοί υποδοχείς. Οι υποδοχείς στεροειδών ορμονών είναι πρωτεΐνες που απαντώνται στο κυτταρόπλασμα ή τον πυρήνα ευκαρυωτικών κυττάρων, προσδένονται στο DNA και ρυθμίζουν την μεταγραφή γονιδίων, μετά από τη σύνδεσή τους με τη κατάλληλη ορμόνη. Τα μέλη της οικογένειας μοιράζονται μια κοινή δομή. Εικόνα 8: Η δομή των υποδοχέων στεροειδών θυροειδών ορμονών Υπάρχουν πέντε διακριτές περιοχές (domains) (Εικόνα 8). Στο Ν-τελικό άκρο η Α/Β domain είναι ελάχιστα συντηρημένη και ποικίλλει σε μέγεθος. Φέρει μια subdomain την AF-1 η οποία είναι υπεύθυνη για την ιδιοστατική ενεργοποίηση του υποδοχέα σε απουσία του προσδέματος (Mangelsdorf et al., 1995).

23 Η C domain είναι η περιοχή πρόσδεσης στο DNA (DNA Binding Domain - DBD) και η πιο συντηρημένη περιοχή μεταξύ των μελών της υπεροικογένειας πράγμα που μπορεί να μεταφραστεί ως κοινή ανάγκη για πρόσδεση στο DNA. Η DBD αποτελείται από ένα υψηλά συντηρημένο πυρήνα (core) με δύο δάκτυλους ψευδαργύρου και από ένα τμήμα περίπου αμινοξέων το οποίο καλείται Καρβόξυ-Τελική Επέκταση (Carboxy-Terminal Extension - CTE) της DBD(Melvin et al., 2004; Roemer et al., 2008) H DBD είναι υπεύθυνη για την αναγνώριση στοιχείων απόκρισης στο DNA. Εντός της C domain υπάρχει επίσης ένα site το οποίο φαίνεται να εμπλέκεται στον διμερισμό του υποδοχέα ενώ είναι αξιοσημείωτο ότι οι υποδοχείς λειτουργούν σχεδόν αποκλειστικά ως διμερή. Τα μοτίβα των δακτύλων ψευδαργύρου της DBD περιοχής έχουν την εξής αλληλουχία: Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys ή για συντομία C2C2 μιας και η θέση πρόσδεσης του ψευδαργύρου δημιουργείται από τέσσερις κυστείνες (Εικόνα 9). Όσα αμινοξέα βρίσκονται στο δεξιό τμήμα του πρώτου δάκτυλου καθορίζουν την αλληλουχία στόχο ενώ όσα βρίσκονται στο αριστερό τμήμα του δεύτερου δάκτυλου καθορίζουν την απόσταση ανάμεσα στις θέσεις πρόσδεσης που αναγνωρίζονται από κάθε υπομονάδα του διμερούς. Οι υποδοχείς λειτουργούν σχεδόν αποκλειστικά ως διμερή. Πειράματα «ανταλλαγής ειδικότητας πρόσδεσης» απέδειξαν άμεσα ότι ο πρώτος δάκτυλος προσδένεται στο DNA. Όταν ο δάκτυλος του υποδοχέα των οιστρογόνων απαλείφθηκε και αντικαταστάθηκε από την αντίστοιχη αλληλουχία του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών, η νέα πρωτεΐνη αναγνώριζε την αλληλουχία GRE (το συνηθισμένο στόχο του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών) αντί για την ERE (το συνηθισμένο στόχο του υποδοχέα των οιστρογόνων). Επομένως αυτή η περιοχή ορίζει την ειδικότητα αναγνώρισης του DNA (Lewin, 2004). Η περιοχή D είναι η 23

24 λιγότερο συντηρημένη και φαίνεται να προσδίδει στην πρωτεΐνη ευκαμψία και μεταβλητότητα αναφορικά με τη διαμόρφωσή της στο χώρο. Η D λειτουργεί ως γέφυρα για την περιοχή E που βρίσκεται στο C-τελικό άκρο. Η περιοχή Ε είναι αρκετά συντηρημένη και είναι η περιοχή πρόσδεσης του προσδέματος (Ligand Binding Domain-LBD) Στην Ε domain υπάρχει επίσης μια subdomain η AF-2 η οποία συνεισφέρει στο διμερισμό του υποδοχέα. Όσον αφορά την F domain δεν της έχει αποδοθεί κάποια λειτουργία μέχρι στιγμής(mangelsdorf et al., 1995). Δράση Ο COUP-TF δρα ως μεταγραφικός παράγοντας επηρεάζοντας τη μεταγραφή πολλών γονιδίων και η δράση του είναι κυρίως κατασταλτική. Αν και έγινε γνωστή η δράση του ως ενεργοποιητής του γονιδίου της ωαλβουμίνης στην όρνιθα, τις περισσότερες φορές δρα καταστέλλοντας τη μεταγραφή γονιδίων που επάγουν άλλοι πυρηνικοί υποδοχείς ορμονών, όπως ο υποδοχέας του ρετινοϊκού οξέως RAR ή της θυρεοειδούς ορμόνης TR(Cooney et al., 1992) (Ladias et al., 1992) (Leng et al., 1996). Bιοχημικές μελέτες αποδεικνύουν ότι οι Coup-TFs σχηματίζουν διμερή και προσδένονται με μεγάλη συγγένεια στο στοιχείο απόκρισης του Coup-TF που είναι η ευθεία επανάλληψη GTGTCAAAGGTCA. Ωστόσο, έχουν την ικανότητα να προσδένονται και σε άλλες ευθείες επαναλλήψεις του προτύπου ΑGGTCA που απέχουν μεταξύ τους από 0 έως και 12 νουκλεοτίδια. Ο Coup-TF δρα μέσω αρκετών τρόπων οι οποίοι περιγράφονται αναλυτικά πιο κάτω. (Εικόνα 10) (Cooney et al., 1993; Park et al., 2003; Tsai and Tsai, 1997) Δράση ως καταστολέας μέσω τεσσάρων μηχανισμών Μέσω ανταγωνισμού για την πρόσδεση του στα στοιχεία απόκρισης: Οι COUP-TFs καταστέλλουν την ενεργοποίηση γονιδίων που κανονικά επάγονται από τους πυρηνικούς υποδοχείς VDR, TR, RAR, RXR, PPAR και HNF-4 μέσω ανταγωνισμού για την κατάληψη των θέσεων πρόσδεσης στο DNA. Μπορούν και σχηματίζουν ομοδιμερή και ετεροδιμερή που δένουν σε μια πληθώρα στοιχείων απόκρισης που υπό διαφορετικές συνθήκες αναγνωρίζονται από υποδοχείς όπως VDR, TR, RAR, RXR, PPAR, HNF-4 και επάγουν τη μεταγραφή. Μέσω ανταγωνισμού για τον διμερισμό με τον RXR. Ο RXR ετεροδιμερίζεται με πολλούς πυρηνικούς υποδοχείς όπως οι RAR, TR, VDR, ΡPΑR. Τα

25 ομοδιμερή των πυρηνικών αυτών υποδοχέων προσδένονται στις αλληλουχίες στόχους τους με αρκετά χαμηλή συγγένεια ενώ μετά από τον ετεροδιμερισμό τους με τον RXR πετυχαίνουν πολύ υψηλότερη συγγένεια. Ο COUP-TF συναγωνίζεται με τους άλλους υποδοχείς της οικογένειας για τη δημιουργία ετεροδιμερούς με τον μεταγραφικό παράγοντα RXR. Έτσι περιορίζει τον ετεροδιμερισμό του RXR με τους άλλους μεταγραφικούς παράγοντες και ως εκ τούτου και την ενεργοποιητική τους δράση. Μέσω ενεργού καταστολής. Ο COUP-TF προσδένοντας στο στοιχείο απόκρισής του καταστέλλει άμεσα τα γονίδια στόχους μέσω άμεσης ή έμμεσης αλληλεπίδρασης με τους γειτονικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Πιθανόν, η καταστολή να επιτυγχάνεται μέσω του μηχανισμού απακετυλίωσης των ιστονών. Μέσω Trans- καταστολής. Πραγματοποιούν trans-καταστολή όπου δεν προσδένεται άμεσα στο στοιχείο απόκρισης αλλά παρεμβάλλεται μεταξύ της LBD ενός άλλου πυρηνικού ορμονικού υποδοχέα που βρίσκεται προσδεδεμένος στο DNA και των γενικών μεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή, αποτρέποντας την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων. Δρα δηλαδή σαν συγκαταστολέας. Εικόνα9: από πάνω προς τα κάτω ορίζουμε, ανταγωνισμό για την πρόσδεση στο στοιχείο απόκρισης,ανταγωνισμός για το διμερισμό με το RXR, ενεργος καταστολή, trans καταστολή. Δράση ως ενεργοποιητής μέσω τριών μηχανισμών Άμεση πρόσδεση στο στοιχείο απόκρισης και ενεργοποίηση της μεταγραφής. 25

26 Προσδένεται σε ένα ρυθμιστικό στοιχείο και έμμεσα μέσω άλλων μεταγραφικών παραγόντων επηρεάζει τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων Επάγει τη μεταγραφή μέσω αλληλεπίδρασης αφενός με άλλον μεταγραφικό παράγοντα ο οποίος προσδένεται στο στοιχείο απόκρισής του στο DNA και αφετέρου με ένα γενικό μεταγραφικό παράγοντα. Η επαγωγή της μεταγραφής των γονιδίων στόχων συχνά επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπίδρασης του COUP- TF με άλλους συνενεργοποιητές. Η αλληλεπίδραση πραγματοποιείται στην καρβόξυ-τελική περιοχή και πιο συγκεκριμένα στην LBD (Pipaon et al., 1999). Εικόνα 10: Μοριακοί μηχανισμοί δράσης του Coup-TF ως ενεργοποιητή Φυσιολογικός Ρόλος και σημασία των Coup-TF στους οργανισμούς Τα πρότυπα έκφρασης των COUP-TFs κατά την εμβρυική ανάπτυξη των σπονδυλωτών και των ασπονδύλων δείχνουν ότι εκφράζονται κυρίως σε περιορισμένες περιοχές του κεντρικού νευρικού συστήματος και σχετίζονται με τη ρύθμιση πολλών διαδικασιών ζωτικής σημασίας, όπως η νευρογένεση, η οργανογένεση, ο καθορισμός της αναπτυξιακής τύχης των κυττάρων και η μεταβολική ομοιόσταση (Park et al., 2003). Yπάρχουν δεδομένα ότι οι COUP-TFs πιθανώς είναι σημαντικοί για την τμηματοποίηση των νευρομεριδίων του

27 διεγκεφάλου, των ρομβομεριδίων του οπισθεγκεφάλου, καθώς και για την ανάπτυξη του οφθαλμού. Επίσης, οι βιοχημικές και in vitro μελέτες δείχνουν ότι οι COUP-TFs δρουν ως αρνητικοί ρυθμιστές των σηματοδοτικών μονοπατιών του ρετινοϊκού οξέος και των θυρεοειδικών ορμονών. Έχει διαπιστωθεί ότι οι ίδιοι οι COUP-TFs είναι στόχοι του μονοπατιού σηματοδότησης του ρετινοϊκού οξέoς(tsai and Tsai, 1997). Εκτός των άλλων, είναι υπεύθυνοι για τη ρύθμιση της δραστηριότητας διαφόρων γονιδίων σε πολλούς ιστούς. Σε αυτά περιλαμβάνονται οι υποκινητές των γονιδίων διαφόρων απολιποπρωτεϊνών που λαμβάνουν μέρος στη μεταφορά των λιπαρών οξέων στο αίμα, ενζύμων που λαμβάνουν μέρος στη β-οξείδωση, καθώς και ενζύμων που εμπλέκονται στη σύνθεση των λιπαρών οξέων. Όσον αφορά στη ρύθμιση γονιδίων, ξεχωρίζουν το γονίδιο της ακτίνης CyIIIb στον αχινό, το γονίδιο της απολιποπρωτεϊνών A1, Β και CIII στον άνθρωπο, το γονίδιο της ωοαλβουμίνης και της απολιποπρωτεΐνης VLDLII στην όρνιθα. Οι COUP-TFs εμπλέκονται στην αναστολή της μεταγραφής των RAR, TR, VDR, PPAR και HNF4, όπως αναφέρθηκε και ανωτέρω (Pereira et al., 2000). Επίσης, είναι απαραίτητοι για τη σωστή ανάπτυξη της καρδιάς και των αγγείων στον ποντικό(pereira et al., 1999). Έχει δειχθεί ότι υπάρχει μια δυναμική ισορροπία μεταξύ των ορφανών υποδοχέων nur77 και COUP-TF, μέσω ετεροδιμερισμού τους, η οποία είναι κρίσιμης σημασίας για την ανταπόκριση ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα στο ρετινοϊκό οξύ. Συμπερασματικά, η εμπλοκή των COUP-TFs στη ρύθμιση τόσο σημαντικών διαδικασιών, καθιστά απαραίτητη την παρουσία τους στους διάφορους οργανισμούς και υποδεικνύει τη σημαντικότητά τους για τη ζωή και την ανάπτυξη των μεταζώων. Ιστοειδική έκφραση του Coup-TF στον αχινό Η ιστοειδική έκφραση του παράγοντα COUP-TF στον αχινό P.lividus είναι γνωστή από παλαιότερα πειράματα του εργαστηρίου και φαίνεται στην εικόνα 12. Ο συγκεκριμένος παράγοντας εκφράζεται διάχυτα στο αυγό αποδεικνύοντας την παρουσία μητρικού mrna. Συνεχίζει να εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα στο επόμενο στάδιο των 16 κυττάρων ενώ ο περιορισμός της έκφρασης σε συγκεκριμένους ιστούς αρχίζει από το στάδιο του βλαστιδίου. Εκεί ανιχνεύεται έκφραση στη μισή φυτική πλάκα και στο εξώδερμα. Στο γαστρίδιο η έκφραση περιορίζεται επίσης στο μισό έμβρυο και συγκεκριμένα στο μελλοντικό στοματικό εξώδερμα. Στον πρώιμο 27

28 πλουτέα ο COUP-TF εκφράζεται αποκλειστικά στο στοματικό εξώδερμα και συγκεκριμένα στη βλεφαριδωτή ζώνη καθώς και στην έδρα και στην κορυφή του αρχεντέρου. Στο στάδιο του ώριμου πλουτέα η έκφραση εντοπίζεται στη βλεφαριδωτή ζώνη και στην έδρα του εμβρύου (Kalampoki and Flytzanis, 2014). Αντινοηµατικό Νοηµατικό Αυγό 16 κύτταρα Φυτ. Πλ. Βλαστίδιο Γαστρίδιο Στόµα Βλ. Έδρα ζώνη Πλουτέας 32 h Βλ. ζώνη Πλουτέας 45h Εικόνα 11: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Coup-TF (Kalampoki and Flytzanis, 2014)

29 Τα ρυθμιστικά γονιδιακά δίκτυα GRNs Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει πολλές έρευνες με σκοπό την δημιουργία δικτύων για την επεξήγηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των γονίδιων κατά την ανάπτυξη(davidson and Levine, 2008). Συγκεκριμένα, έχουν αναπτυχθεί μαθηματικά μοντέλα μέσω των οποίων έχουν δημιουργηθεί τα ρυθμιστικά γονιαδιακά δίκτυα (GRNs)(Bolouri and Davidson, 2002b; Ribeiro and Lloyd-Price, 2007), διαλευκανθεί η πολυπλοκότητα της γονιδιακής ρύθμισης. 29 για να Τα ρυθμιστικά γονιδιακά δίκτυα (GRNs) συσχετίζουν τις γονιδιωματικές ρυθμιστικές αλληλουχίες με την διαδικασία της ανάπτυξης. Ένα ρυθμιστικό γονιδιακό δίκτυο περιλαμβάνει ρυθμιστικά γονίδια τα οποία κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες και μόρια σηματοδότησης και κυρίως καθιστούν σαφείς τις πληροφορίες για την χωρική και χρονική έκφραση των ρυθμιστικών γονιδίων που εγκλείονται στις cis ρυθμιστικές περιοχές τους(bolouri and Davidson, 2003; Li and Davidson, 2009). Αυτά είναι κομμάτια DNA αλληλουχιών τα οποία περιέχουν πολύτιμα στοιχεία αναγνώρισης και πρόσδεσης για τους μεταγραφικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που αποκρίνονται σε μονοπάτια μεταγωγής σημάτων(bolouri and Davidson, 2002a). Τα cis ρυθμιστικά μόρια καθορίζουν την εξαγωγή των πληροφοριών που είναι απαραίτητες για τα γονίδια που υπηρετούν. Τον τόπο το χρόνο και τον ρυθμό της έκφρασης τους καθορίζουν η εισροή πληροφοριών, που παρέχονται από τους μεταγραφικούς παράγοντες της εκάστοτε κυτταρικής ρυθμιστικής κατάστασης. Στα αναπτυξιακά ρυθμιστικά δίκτυα η εξαγωγές πληροφοριών των ρυθμιστικών γονιδίων τροφοδοτούν κυρίως τις cis- ρυθμιστικές περιοχές, ελέγχοντας άλλα ρυθμιστικά γονίδια, εκτός της περιμέτρου του GRN όπου οι δεσμοί οδηγούν σε γονίδια υπεύθυνα για την ανάπτυξη αλλά και την δομή και μορφογένεση του εμβρύου. Συνήθως τα ρυθμιστικά γονιδιακά δίκτυα περιλαμβάνουν περίπλοκους δεσμούς όπως δεσμούς ανατροφοδότησης, ενεργοποίησης, καταστολής αλλά και διασταύρωση ρυθμιστικών βρόχων(li and Davidson, 2009). Αναλύοντας ένα αναπτυξιακό ρυθμιστικό δίκτυο, για την δόμηση του απαιτείται η γνώση των μεταγραφικών παραγόντων και των μορίων σηματοδότησης που εμπλέκονται στο σύστημα όταν και όπου τα γονίδια εκφράζονται, και το πιο σημαντικό πως αυτά αλληλεπιδρούν μεταξύ τους.

30 Αρχές σχεδίασης ρυθμιστικών γονιδιακών δικτύων Για να γίνει κατανοητό το πώς δομείται ένα ρυθμιστικό γονιδιακό δίκτυο, θα πρέπει να καθοριστεί το πώς κάθε ρυθμιστικό γονίδιο, που εμπλέκεται ειδικά σε μια αναπτυξιακή διαδικασία, συνδέεται στο δίκτυο. Οι πληροφορίες οι οποίες είναι απαραίτητες και οδηγούν στην κατανόηση της επίλυσης των GRNs είναι οι ακόλουθες(oliveri and Davidson, 2004) : Η ταυτοποίηση των γονιδίων που εμπεριέχονται στο δίκτυο Ακριβείς ενδείξεις για το που και πότε εκφράζονται τα γονίδια Στοιχεία σχετικά με τις cis- ρυθμιστικές περιοχές και τις πληροφορίες που δίνουν Αποτελέσματα μετά από μελέτη μέσω διαταραχής των γονιδίων Υπολογιστική ανάλυση Με αυτόν τον τρόπο συγκεντρώνονται 4 αρχές που αφορούν τα γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα(davidson and Levin, 2005). 1. Το ρυθμιστικό γονιδίωμα ως σύστημα λογικής επεξεργασίας. Κάθε ρυθμιστικό μόριο που περιέχεται στο γονιδίωμα δέχεται πολλαπλές εισροές πληροφοριών, και τα επεξεργάζεται με τρόπους που μπορούν να παρασταθούν μαθηματικά ως συνδυασμοί των λογικών λειτουργιών «και», «διακόπτης», «ή». 2. Αιτιότητα στο ρυθμιστικό γονιδίωμα. Οι λόγοι για τους οποίους εκφράζονται τα γονίδια χωρικά και χρονικά κατά ένα εμβρυικό αναπτυξιακό στάδιο. 3. Υποδομή του δικτύου. Τα ρυθμιστικά γονιδιακά δίκτυα είναι ανομοιογενής συνθέσεις από διάφορων ειδών υποκυκλώματα(oliveri and Davidson, 2007), όπου το καθένα εκτελεί ένα συγκεκριμένο είδος λειτουργίας. Η έννοια αυτή είναι πολύ σημαντική αφού αποτελεί το κλειδί για την δικτύωση των αρχών σχεδίασης. 4. Ανασχεδιασμός των γονιδιωματικών συστημάτων ελέγχου. Για να επανασχεδιαστούν τα πιο δυναμικά βιολογικά συχτήματα ελέγχου και σε θεωρητικό αλλά και σε πρακτικό επίπεδο είναι απαραίτητο να κατανόηθεί διεξοδικά η ροή της αιτιότητας ενός γονιδιακού ρυθμιστικού δίκτυου το οποίο κωδικοποιείται μέσα στο γονιδίωμα.

31 Εικόνα 12 : Υπόδειγμα δημιουργίας απλού γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου Ρόλος των αναπτυξιακών ρυθμιστικών γονιδιακών δικτύων Τα αναπτυξιακά γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα δημιουργήθηκαν για να διαλευκάνουν την διαδικασία της ανάπτυξης μέσω της μελέτης του γονιδιώματος. Η μορφοποίηση των εμβρύων αλλά και ο καθορισμός της αναπτυξιακής τύχης των κυττάρων είναι αποτέλεσμα συντονισμένης δράσης πολλών εκατοντάδων γονιδίων. Ο μηχανισμός δράσης τους βασίζεται στη χωρική και χρονική έκφραση μεταγραφικών παραγόντων αναγνωρίζοντας cis- ρυθμιστικές περιοχές. Αυτές οι ρυθμιστικές μονάδες ρυθμίζονται από έναν ή πολλούς μεταγραφικούς παράγοντες καθιστώντας ένα σύμπλεγμα αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους. Τα ρυθμιστικά γονιδιακά δίκτυα απεικονίζουν σαν χάρτες όλες τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των εκάστοτε γονιδίων δημιουργώντας μια ξεκάθαρη και μοντελοποιημένη εικόνα για την ροή της διαδικασίας της ανάπτυξης. GRNs στον αχινό Το έμβρυο του αχινού έχει δειχτεί μία κατάλληλη επιλογή ως υλικό για την μελέτη και ανάλυση των GRNs. Ο αχινός διαμορφώνει την ενήλικη μορφή του από το στάδιο της λάρβας που ξεκινάει και τρέφεται, οπότε η διαδικασία της εμβρυογένεσης απαιτεί ένα γονιδιακό ρυθμιστικό δίκτυο για τον καθορισμό και την διαφοροποίηση των ιστών. Για πολλά χρόνια διεξαγόταν μεγάλης κλίμακας έρευνα πάνω στο εμβρυονικό ενδομεσοδερμικό GRN στον αχινό Strongylocentrotus purpuratus(oliveri et al., 2002). Τα τελευταία χρόνια έχουν καταστεί υπό μελέτη και οι τρείς στιβάδες του εμβρύου για την δημιουργία δικτύων που ελέγχουν τον καθορισμό και την διαφοροποίηση τους. Παρόλα αυτά, τα αντίστοιχα υποδίκτυα του εξωδέρματος (Su, 31

32 2009)και συγκεκριμένα του νευρονικού ρυθμιστικού δικτύου δεν είναι αρκετά μελετημένα ως σήμερα (εικόνα 13). Εικόνα 13: Υπόδειγμα ρυθμιστικού γονιδιακού δικτύου στον αχινό Strongylocentrotus purpuratus για το ενδομεσόδερμα. Εικόνα 14: Παράδειγμα γονιδιακού ρυθμιστικού δικτύου στον αχινό Strongylocentrotus purpuratus για το εξώδερμα.

33 Καθορισμός του νευρικού συστήματος στον αχινό Η οργάνωση του νευρικού συστήματος προέρχεται από το ζωικό πόλο του εμβρύου. Στα σπονδυλωτά και στις μύγες υπάρχει ένα κεντρικό νευρικό σύστημα, ενώ ένα πιο πρωτόγονο και διάχυτο νευρικό σύστημα είναι χαρακτηριστικό των ατόμων με ακτινωτή συμμετρία, όπως ο αχινός. Σήματα από τον TGFβ καθοδηγούν το νευρικό σύστημα κατά μήκος της ραχιαίας πλευράς στα σπονδυλωτά ενώ κατά μήκος της κοιλιακής πλευράς στις μύγες. Αυτό υποδηλώνει την ύπαρξη ενός κοινού μηχανισμού δημιουργίας του κεντρικού νευρικού συστήματος και στον πρόγονό τους. Ο αχινός ο οποίος αποτελεί βασικό αντιπρόσωπο των δευτερόστομων οργανισμών καθορίζει την πολικότητά του με τον καθορισμό δύο αξόνων AP και DV. Δημιουργεί δύο κύριες νευρογενείς περιοχές που είναι αποτέλεσμα διαφοροποίησης αλλά και εξειδίκευσης προγονικών κυττάρων του εξωδέρματος, το πρόσθιο νευροεξώδερμα ANE και την περιοχή της βλεφαριδωτής ζώνης CBE. Στον καθορισμό και εξειδίκευση των δύο αυτών δευτερογενών περιοχών σημετέχουν πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια και μεταγραφικοί παράγοντες. Οι πιο σημαντικές διαδικασίες που επηρεάζουν και καθορίζουν τις νευρογενείς περιοχές είναι ο καθορισμός του εμπροσθιοπίσθιου και ραχιαιοκοιλικού άξονα του εμβρύου στον αχινό. Κατά την εξέλιξη της διαδικασίας καθορισμού των αξόνων υπάρχουν σήματα υπεύθυνα για την δημιουργία νεύρων που οργανώνονται σε περιορισμένες περιοχές του εξωδέρματος, όπως αντίστοιχα συμβαίνει και στην περίπτωση δημιουργίας ενός κεντρικού νευρικού συστήματος. Καθορισμός νευρογενών περιοχών Πρόσθιο νευροεξώδερμα, περιοχή του ANE Ο καθορισμός και ο περιορισμός της νευρογενούς ρυθμιστικής περιοχής του πρόσθιου εξωδέρματος από την περιοχή του ζωικού πόλου αποτελεί την εναρκτήριο διαδικασία για την δημιουργία του ANE. Χρονικά η διαδικασία αυτή συμβαίνει με τα γεγονότα καθορισμού του εμπροσθιοπίσθιου άξονα του αχινού ο οποίος μελετάτε ανεξάρτητα από τον ραχιαιοκοιλιακό καθορισμό αφού συμβαίνει νωρίτερα. 33

34 Εικόνα 15 : Διάγραμμα που απεικονίζει την κατανομή των ρυθμιστικών παραγόντων κατά την διάρκεια του περιορισμού του ΑΝΕ στον αχινό και του πρόσθιου εγκεφάλου στα σπονδυλωτά. Στα πρώτα αναπτυξιακά στάδια στο έμβρυο του αχινού υπάρχει μια ρυθμιστική κατάσταση παρόμοια με αυτή του ANE η οποία επικρατεί σε όλο το έμβρυο. Έπειτα, περιορίζεται αυτή η ρυθμιστική κατάσταση μόνο στην πρόσθιο περιοχή του εμβρύου κατά το στάδιο των 16 κυττάρων με την καταστολή των ρυθμιστικών γονιδίων του ΑΝΕ από το κανονικό μονοπάτι της Wnt/β-catenin σηματοδότησης στο οπίσθιο μέρος του εμβρύου. Η Wnt/β-catenin σηματοδότηση δεν επιτρέπει στα οπίσθια βλαστομερίδια να εξειδικευτούν σε κύτταρα του ΑΝΕ.(Range et al., 2013) Στο στάδιο των 32 κυττάρων συγκεκριμένα ξεκινούν να εκφράζονται ειδικά γονίδια για την εξειδίκευση της περιοχής του ANE,(Six3, FoxQ2, Fez). Εν συνεχεία, μέσω του μονοπατιού της Wnt/β-catenin εκκρίνονται προσδέματα Wnt1 και Wnt8 τα οποία προσδένονται σε υποδοχείς Fzl 5/8. Προσδεδεμένα πλέον μέσω του μονοπατιού της JNK κινάσης περιορίζουν καταστέλλοντας ακόμα περισσότερο την ρυθμιστική κατάσταση της περιοχής του ΑΝΕ προς την πρόσθια περιοχή του εμβρύου.

35 Εικόνα 16 : σχηματική απεικόνιση των σταδίων περιορισμού του ANE Παράλληλα λειτουργεί και ένα άλλο μονοπάτι σηματοδότησης ανταγωνιστικά στο Fzl5/8 που αναφέρθηκε πιο πάνω με σκοπό την διατήρηση και εξειδίκευση της ρυθμιστικής κατάστασης του ΑΝΕ(Range et al., 2013). Αυτό το μονοπάτι ενεργοποιείται από άλλα Wnt σήματα και χρησιμοποιεί ιόντα ασβεστίου και την κινάση PKC, σηματοδότηση Fzl2/7. Εικόνα 17:A: Wnt μονοπάτι σηματοδότησης στον αχινό, Β: μοντέλο τριών βημάτων για τον περιορισμό του ΑΝΕ Τέλος ενργοποιείται μέσω της Wnt σηματοδότησης ένας ανταγωνιστής των Wnt προσδεμάτων ο Dkk1 στα εμπρόδθια κύτταρα του εξωδέρματος εγκαθιδρύοντας την ρυθμιστική κατάσταση του ΑΝΕ σε εκείνη την περιοχή(range, 2014). Στο στάδιο πλέον του μεσεγχυματικού βλαστιδίου η περιοχή του ANE έχει περιοριστεί και 35

36 καθοριστεί και αποτελεί μια ρυθμιστική περιοχή του εμπρόσθιου άκρου του εμβρύου με εμφανή όρια. Εικόνα 18: Διάγραμμα απεικόνισης του μοντέλου περιορισμού του ΑΝΕ Περιοχή της Βλεφαριδωτής ζώνης CBE Όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω η περιοχή της βλεφαριδωτής ζώνης αποτελεί την δεύτερη νευρογενή περιοχή του εμβρύου στον αχινό. Μετά την έναρξη της διαδικασίας περιορισμού του ANE η περιοχή του υπόλοιπου ενδοδέρματος υποστηρίζει την συντήρηση και εξειδίκευση μιας ρυθμιστικής νευρογενους περιοχής ως οπίσθιο εξώδερμα με την μορφή 4 κυττάρων που δομούν την βλεφαριδωτή ζώνη. Εικόνα 19: Σχεδιαγραμματική απεικόνιση της τοποθέτησης του στοματικού και αντιστοματικού εξωδέρματος και ο περιορισμός της βλεφαριδωτής ζώνης CBE από τους Nodal, BMP2/4, Chordin και Lefty. Ο περιορισμός αυτής της περιοχής χρονικά συμβαίνει κατά τον καθορισμό του στοματικού- αντιστοματικού άξονα του εμβρύου ή όπως είναι ευρέως γνωστο τον καθορισμο του ραχιαιοκοιλιακού άξονα. Για την έναρξη της δημιουργίας του

37 δευτερου άξονα του εμβρύου απαραίτητη είναι η έκφραση του σηματοδοτικού μόρίου Nodal.(Angerer et al., 2011) Εικόνα 20: Σχεδιαγραμματική απεικόνιση της WNt εξαρτώμενης απελευθέρωσης του Nodal Το Nodal εκφράζεται στην ραχιαία πλευρά, (στοματική), και ενεργοποιείται από την διαβαθμισμένη οξειδοαναγωγή λόγω της κλίσης της κατανομής των μιτοχονδρίων μεταξύ ραχιαίου και κοιλιακού εξωδέρματος. Λόγω αυτής της διαβάθμισης η κινάση p38 η οποία είναι ευαίσθητη στην οξειδοαναγωγή βρίσκεται φωσφωρυλιωμένη στην ραχιαία πλευρά του εμβρύου και ενεργοποιεί το Nodal με τους μητρικούς παράγοντες SoxB1 και Univin. Ένα ακόμα σημείο ελέγχου για το Nodal αποτελεί το ειδικό γονίδιο FoxQ2 το οποίο δρα κατασταλτικά ως προς το Nodal σε όλο το εξώδερμα. Μετά τον καθορισμό του ANE το γονίδιο FoxQ2 αναστέλλεται αφήνοντας το Nodal να εκφραστεί στο υπόλοιπο εξώδερμα ενεργοποιώντας γονίδια ειδικά για τον καθορισμό του ραχαιοκοιλιακού άξονα.(angerer et al., 2011) Η βλεφαριδωτή ζώνη είναι αποτέλεσμα αλληλεπιδράσεων μεταξύ των γονιδίων Nodal, BMP2/4, Chordin και Lefty, τα οποία διαχέονται από την κοιλιακή πλευρά προς την ραχιαία. Το Nodal προσδένεται στο μελλοντικό στοματικό εξώδερμα ενώ το BMP2/4 προσδένεται στο μελλοντικό αντιστοματικό εξώδερμα. Το Nodal περιορίζεται στο στοματικό εξώδερμα μέσω της διάχυσης του Lefty ενώ αντίστοιχα για το BMP2/4 από την Chordin. Στις περιοχές όπου έχουμε δράση του Nodal και BMP2/4 περιορισμένα από τα Lefty και Chordin, διατηρείται η ρυθμιστική κατάσταση που δομεί τη βλεφαριδωτή ζώνη κατά το στάδιο του μεσεγχυματικού βλαστιδίου. 37

38 Ο καθορισμός και η οργάνωση του νευρικού συστήματος του εμβρύου του αχινού σε 4 στάδια Συμπερασματικά, μπορούμε να συνοψίσουμε την διαδικασία δημιουργίας των δύο νευρογενών περιοχών στο έμβρυο του αχινού σε τέσσερα στάδια(angerer et al., 2011). Σε πρώτο στάδιο, υπάρχει μια ρυθμιστική κατάσταση αντίστοιχη με αυτή που επικρατεί στο ΑΝΕ σε όλο το έμβρυο μέχρι και τα πρώτα στάδια των διαιρέσεων. Σε δεύτερο στάδιο, το οποίο συμβαίνει κατά την διάρκεια του πρώιμου βλαστιδίου αυτή η πρότερη ρυθμιστική κατάσταση εξαλείφεται μέσω του κανονικού Wntεξαρτώμενου μονοπατιού και των σημάτων του, από όλο το οπίσθιο νευροέξωδερμα αποκαλύπτοντας μόνο μία βλεφαριδωτή ζώνη που μοιάζει με νευροεξώδερμα και περιέχει προγονικά νευρικά κύτταρα. Το πρόσθιο νευροεξώδερμα έχει πλέον αρχίσει να περιορίζεται. Στο τρίτο στάδιο, το οποίο χρονίκά βρίσκεται στο στάδιο πρώιμου γαστριδίου, μεσεγχυματικού βλαστιδίου, κομβικά σήματα από το Nodal και BMP2/4 μετατρέπουν το ραχιαίο και κοιλιακό εξώδερμα σε μη νευρικό εξώδερμα εκτός από τις περιοχές του πρόσθιου νευροεξωδέρματος και της βλεφαριδωτής ζώνης, οι οποίες προστατεύονται από αυτά τα σήματα. Κατά το τέταρτο και τελικό στάδιο τα προγονικά κύτταρα των νευρογενών περιοχών διαφοροποιούνται. Εικόνα 21: Μοντέλο τεσσάρων σταδίων για τον περιορισμό των δύο κύριων νευρονικών περιοχών στον αχινό, ΑΝΕ και CBE.

39 Διαφοροποιημένο νευρικό σύστημα στην προνύμφη του αχινού Στο τέλος της εμβρυογένεσης το νευρικό σύστημα του σταδίου πρώιμου πλουτέα στον αχινό συμπεριλαμβάνει ένα ακραίο γάγγλιο στην κορυφιαία πλάκα (animal plate) στο πρόσθιο (ζωικό) πόλο, ένα σετ από 40 με 50 περιφερικά νεύρα, τα περισσότερα διαφοροποιημένα ή προσαρμοσμένα στην βλεφαριδωτή ζώνη, και μερικά νεύρα στο περιφαρυγγικό ενδόδερμα(burke et al., 2014; Wei et al., 2016). Η κορυφιαία πλάκα αναπτύσσεται σε μια περιορισμένη ρυθμιστική περιοχή περιοχής του ζωικού πόλου (APD) το οποίο καλύπτει περίπου το 15% του ζωικού πόλου του βλαστιδίου. Τα πρότυπα της γονιδιακής έκφρασης στην APD περιοχή αποτελούν ένα αυξανόμενο σύμπλεγμα σημάτων κατά το στάδιο της λάρβας, προνύμφης. Επιπλέον, το ακραίο γάγγλιο δημιουργεί την ακραία τούφα από βλεφαρίδες και πολλά διαφορετικά σύνολα κυττάρων που χαρακτηρίζονται από την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων με νευρογενείς λειτουργίες σε άλλους οργανισμούς. Τα πρώτα από αυτά φαίνεται να είναι 2 με 6 νευρώνες στο οπίσθιο όριο του AP, οι οποίοι εκφράζουν σεροτονίνη και υδροξυλάση της τρυπτοφάνης (Tph) ένα ένζυμο στο μονοπάτι βιοσύνθεσης της σεροτονίνηε. Οι περιφερικοί νευρώνες στέλνουν προεξοχές κατά μήκος της βλεφαριδωτής ζώνης στην κορυφιαία πλάκα και στο ραχιαίο εξώδερμα. (Garner et al., 2016)Το ακραίο γάγγλιο έχει αισθητήριες και αφομοιωτικές ιδιότητες,καθώς και οι νευρώνες της βλεφαριδωτής ζώνης έχουν αισθητήριες λειτουργίες, μαζί συντονίζουν την κίνηση των βλεφαρίδων. της Εικόνα 22:(Garner et al., 2016) Διάγραμμα των σταδίων της νευρογένεσης στον αχινό 39

40 Ο μεταγραφικός παράγοντας Six3 Η ανάπτυξη όλων των νευρώνων φαίνεται να εξαρτάται από την λειτουργία του μεταγραφικού παράγοντα Six3(Wei et al., 2016). Αποτελεί ένα από τα πρώτα γονίδια που ενεργοποιούνται μετά την γονιμοποίηση και εκφράζονται στην περιοχή APD κατά το στάδιο του βλαστιδίου. Αυτός ο παράγοντας είναι τόσο απαραίτητος όσο και αναγκαίος για την ανάπτυξη όλων των νεύρων, για τα ανταγωνιστικά σήματα που επάγουν την διαφοροποίηση των νευρικών κυττάρων και για την έκφραση μιας πληθώρας ρυθμιστικών γονιδίων που εκφράζονται επίσης στην περιοχή APD(Wei et al., 2009a). Επιπλέον, η μη σωστή έκφραση του Six3 συμβάλλει στη διαμόρφωση σχεδόν όλων των κυττάρων του εμβρύου στο APD πρότυπο. Συνεπώς, το Six3 έχει θέση κοντά ή στην κορυφή του GRN που ελέγχει την τύχη της διαφοροποίησης των κυττάρων στην APD περιοχή και οι Six3- εξαρτώμενες υποπεριοχές της APD δείχνουν ότι αυτή η περιοχή έχει λειτουργία ως κέντρο διαμόρφωσης. Εικόνα 23: Εμβρυα χωρίς νευρώνες και με λεπτισμένο επιθήλιο μετά από αποσιώπηση του Six3, A,B ενεμμένα με MASO Six3 έμβρυα,c έμβρυα ελέγχου(wei et al., 2009b) Ο Six3 είναι ένας από τους παράγοντες που μελετήθηκε σε κανονικά και σε έμβρυα όπου τα όρια του ζωικού πόλου έχουν επεκταθεί, και βρέθηκε να είναι υπεύθυνος για την διαφοροποίηση όλων των νευρώνων(wei et al., 2009b). Η έκφραση του ξεκινάει

41 κατά τα στάδια των προχωρημένων διαιρέσεων προωθώντας και περιβάλλοντας τις νευρογενείς περιοχές του εμβρύου. το γεγονός ότι η έκφρασή του δεν περιορίζεται μόνο στα προγονικά νευρικά κύτταρα δείχνει ότι ο Six3 εμπλέκεται στην εγκαθίδρυση των νευροεξωδερμικών περιοχών αλλά δεν εμπλέκεται άμεσα, αλλά έμμεσα στην προαγωγή της τελικής διαφοροποίησης των νευρικών κυττάρων. Αναλυτικότερα, ο Six3 εκφράζεται στον ζωικό ημισφαίριο κατά το στάδιο των προχωρημένων διαιρέσεων στηνapd περιοχή, από το στάδιο του hatching βλαστιδίου και έπειτα η έκφρασή του περιορίζεται σε δύο δακτυλίους έναν κοντά στην περιφέρεια της APD και έναν στο ενδομεσόδερμα στο στάδιο του μεσεγχυματικού βλαστιδίου. Κατά την γαστριδίωση ο Six3 εκφράζεται σε μερικά δευτερογενή μεσεγχυματικά κύτταρα που διαχέονται μέσα από το βλαστόκοιλο και στην κορυφή του αρχεντέρου, όπως επίσης και στα κύτταρα του ζωικού πόλου και του στοματικού εξωδέρματος(howard-ashby et al., 2006). Στο στάδιο του πλουτέα το RNA του Six3 ανιχνεύεται σε δύο ομάδες κυττάρων περιφερικά του στόματος και της βλεφαριδωτής ζώνης. Εικόνα 24: In situ υβριδοπίηση για το γονίδιο Six3 κατά τα στάδια της ανάπτυξης.(wei et al., 2009b) Υπάρχουν τρεις άλλοι παράγοντες οι οποίοι βρίσκονται καθοδικά του Six3 και ρυθμίζονται από αυτόν. Ο SoxC και ο Brn1/2/4 έχουν λειτουργία ειδική για την διαφοροποίηση όλων των νευρώνων, ενώ ο παράγοντας Z167 καθορίζει το σημείο 41

42 διαχωρισμού στο οποίο διαφοροποιούνται οι σεροτονεργικοί νευρώνες(wei et al., 2016). Εικόνα 25: Σχηματική απεικόνιση μέσω επίδρασης Six3 διαφοροποίηση νευρικών κυττάρων Συμπερασματικά, ο μεταγραφικός παράγοντας Six3: Είναι απαραίτητος για την αναπτυξιακή τύχη των νευρικών κυττάρων Συντονίζει την διαφοροποίηση των νευρικών κυττάρων έμμεσα ρυθμίζοντας άλλους μεταγραφικούς προάγοντες Η μη σωστή έκφρασή του οδηγεί τα περισσότερα κύτταρα του εμβρύου προς την APD ρυθμιστική κατάσταση. Δρα ανταγωνιστικά με τα σήματα του Wnt κανονικού μονοπατιού Η έλλειψη του οδηγεί σε παντελή εξάλειψη των νευρώνων Είναι απαραίτητος για την διαφοροποίηση των μη- νευρικών κυττάρων παράγοντας μακριές ειδικες βλεφαρίδες.

43 Εικόνα 26: Διάγραμματική απεικόνιση της διανομής των APD τύπου κυττάρων σε κανονικά και σε SIX3 misexressed έμβρυα(wei et al., 2009b). Ο μεταγραφικός παράγοντας FoxQ2 Ο μεταγραφικός παράγοντας FoxQ2 είναι ένα από τα πρώτα ρυθμιστικά γονίδια του ΑΝΕ που εκφράζονται στο εν δυνάμει εξώδερμα στα έμβρυα του αχινού και δρα ως συντονιστής της διαφοροπίησης της περιοχής του ΑΝΕ(Range and Wei, 2016). O FoxQ2 εκφράζεται γύρω από την κεντρική περιοχή του ΑΝΕ(Li et al., 2014), στο στάδιο των 32 με 60 κυττάρων υπάρχει έκφραση σε όλο το πρόσθιο μισό ενώ σε πιο προχωρημένα στάδια περιορίζεται σε μια κεντρική περιοχή γύρω από τον ζωικό πόλο(ανε). Επιπλέον, είναι απαραίτητος για την διαφοροποίηση των σεροτονεργικών νευρώνων και δρα ως συντονιστής της διαφοροποίησης των κυττάρων που θα δώσουν την ακριαία τούφα από βλεφαρίδες στην κεντρική υποπεριοχή του ΑΝΕ(Yaguchi et al., 2012). Εικόνα 27: Έκφραση ιστοειδική του μεταγραφικού παραάγοντα FoxQ2 (Yaguchi et al., 2008) 43

44 Εικόνα 28 H περιοχή του ΑΝΕ είναι διαχωρισμένη σε δύο ομόκεντρες περιοχές(range and Wei, 2016) Όταν το ΑΝΕ ξεκινά να εγκαθιδρύεται από το πρόσθιο άκρο του εμβρύου ο FoxQ2 εγκαθιδρύει το πιο πρόσθιο μέρος της περιοχής του ΑΝΕ, διαχωρίζοντας το ΑΝΕ σε δύο ομοκεντρικές περιοχές κατά την έναρξη της γαστριδίωσης. Επίσης, ενεργοποιεί ένα κέντρο σημάτων στο πιο πρόσθιο κομμάτι του ΑΝΕ το οποίο εκκρίνει τους Wnt διαμορφωτές SFR1/5 και DKK3, οι οποίοι δουλεύουν μαζί στο Fzl5/8-JNK μηχανισμό διαμορφώνοντας όλη την περιοχή του ΑΝΕ στο σωστό μέγεθος. Εικόνα 29: Ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα FoxQ2 στον καθορισμό του ραχιαιοκοιλιακού άξονα(yaguchi et al., 2008)

45 Πιο συγκεκριμένα, εκτός από τον ρόλο που κατέχει στον προσδιορισμό του ραχιαιοκοιλιακού άξονα στο έμβρυο του αχινού μέσω της καταστολής του Nodal κατά την κανονική Wnt σηματοδότηση, ορίζει και τα όρια εξωτερικά και εσωτερικά του APD που θα διαμορφώσει το ΑΝΕ, υποστηρίζοντας την κυτταρική διαφοροποίηση. Τέλος, η αποσιώπηση του οδηγεί σε επέκταση του ΑΝΕ. Συνοψίζοντας, ο μεταγραφικός παράγοντας FoxQ2: Έχει κυρίαρχη θέση στον μηχανισμό σχηματισμού του ραχιαιοκοιλιακού άξονα του εμβρύου του αχινού Δρα μέσω ενεργοποίησης άλλων παραγόντων που εμπλέκονται στον Fzl5/8- JNK μηχανισμό Οριοθετεί εσωτερικά και εξωτερικά την περιοχή του ΑΝΕ Η έλλειψη του οδηγεί σε επέκταση των ορίων του ΑΝΕ Είναι απαραίτητος για την διαφοροποίηση των σεροτονεργικών νευρώνων Είναι υπεύθυνος για την διαφοροποίηση των κυττάρων της ακριαίας τούφας βλεφαρίδων Ενεργοποιεί τον Fez Εικόνα 30: Απεικόνιση ενός εκτεταμένου μοντέλου περιορισμού του ΑΝΕ(Range and Wei, 2016) 45

46 Ο μεταγραφικός παράγοντας Fez Η μελλοντική ζωική πλάκα όπως και η βλεφαριδωτή ζώνη του νευροεξωδέρματος επιβάλλεται να κατέχει έναν πολύ ισχυρό μηχανισμό ώστε να ανταγωνίζεται τα εξίσου ισχυρά σήματα του Nodal και BMp2/4, για την διατήρηση του μεγάθους τους κατά την διάρκεια των εμβρυικών σταδίων. Στην ζωική πλάκα ο μεταφραφικός παράγοντας FoxQ2 επάγει την παραγωγή ενός ενδοκυτταρικού μεταφραφικού παράγοντα τον Fez( Forbrain embryonic zing finger) στο στάδιο του βλαστιδίου. Ο μεταγραφικός παράγοντας Fez εξασθενεί ειδικά τα BMP σήματα διατηρώντας και εγκαθιδρύοντας τα όρια του πρόσθιου νευροεξωδέρματος στο έμβρυο του αχινού(yaguchi et al., 2011). Εικόνα 31: Μοντέλο σήματα(yaguchi et al., 2011). λειτουργίας του μεταγραφικού παράγοντα Fez έναντι στα ισχυρά BMP Ο μεταγραφικός παράγοντας Fez αρχίζει να εκφράζεται από το στάδιο του hatching βλαστιδίου. Έπειτα, μέχρι το στάδιο του πρώιμου γαστριδίου εκφράζεται σε ολόκληρη την ζωική πλάκα. Όταν φτάσει στο mid-γαστρίδιο η ολική έκφραση του

47 εξασθενεί και αντικαθίσταται από πιο ισχυρά σε μερικά μόνο κύτταρα μέσα στην ζωική πλάκα. Εικόνα 32: Απεικόνιση του ιστοειδικού προτύπου του μεταγραφικού παράγοντα Fez(Yaguchi et al., 2011). Όπως προαναφέρθηκε ο Fez ρυθμίζει το μέγεθος της ζωικής πλάκας και η έλλειψη του οδηγεί σε λιγότερα κύτταρα σεροτονεργικών νευρώνων ή μικρότερη περιοχή έκφρασης των σεροτονεργικών νευρώνων(yaguchi et al., 2012). Επάγει λοιπόν μια σημαντική μείωση της λειτουργίας του BMP2/4 στις εξωτερικές περιοχές της ζωικής πλάκας στο πρώιμο έμβρυο εκεί που θα αναπτυχθούν όλοι οι σεροτονεργικοί νευρώνες. Τέλος εκφράζεται στα κύτταρα των σεροτονεργικών νευρώνων. Εικόνα 33: Μοντέλο των ρυθμιστικών μηχανισμών που ελέγχουν την διαφοροποίηση των σεροτονεργικών νευρώνων(yaguchi et al., 2012). Συμπερασματικά, ο μεταγραφικός παράγοντας Fez: Ρυθμίζει το μέγεθος της ζωικής πλάκας 47

48 Προστατεύει την οπίσθια πλευρά του ΑΝΕ στο σημείο όπου θα δημιουργηθούν οι σεροτονεργικοί νευρώνες. Αποτελεί έναν μάρτυρα για την ύπαρξη σεροτονεργικών νευρώνων Η έλλειψή του δίνει μικρότερη περιοχή ανάπτυξης των σεροτονεργικών νευρώνων ή λιγότερους σεροτονεργικούς νευρώνες Ο μεταγραφικός παράγοντας Ets4 Ο μεταγραφικός παράγοντας Ets4 είναι ένας μητρικός παράγοντας του οποίου τα μετάγραφα εντοπίζονται σε όλο το αυγό αλλά και σε όλο το έμβρυο κατά τις πρώτες διαιρέσεις του. Αυτός εξαφανίζει το μητρικό του mrna μεταξύ των 64 κυττάρων και 12 ωρών μετά την γονιμοποίηση, και αντικαθίσταται με μετάγραφα ζυγωτικής προέλευσης περιοριζόμενα μόνο στα μη φυτικά κύτταρα περίπου από το στάδιο της 6 ης διαίρεσης. Επιπλέον, η πρωτεΐνη του φαίνεται να είναι λειτουργική μόνο στα μη φυτικά κύτταρα. Αποτελεί ένα κομμάτι της ρύθμισης του καθορισμού της ταυτότητας των κυττάρων σε φυτικά και ζωικά, δηλαδή την πολικότητα του Α/V άξονα(wei et al., 1999). Αναλυτικότερα, ο Ets4 μεταγραφικός παράγοντας βρίσκεται σε όλο το μελλοντικό εξώδερμα στις 18 ώρες όμως η έκφρασή ου εξαλείφεται από το στοματικό εξώδερμα και από περιορίζεται μόνο το αντιστοματικό εξώδερμα με εξάπλωση σε περιοχές συμπληρωματικές αυτών που εκφράζουν γονίδια του στοματικού εξωωδερματος(li et al., 2013). Εικόνα 34 Απεικόνιση της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Ets4(Li et al., 2013) Το γονίδιο ets4 αποτελεί ένα παράδειγμα από ένα σετ γονιδίων που κωδικοποιούνται από τους μεταγραφικούς παράγοντες οι οποίοι λειτουργούν διατηρώντας και εγκαθιδρύοντας ένα πρώιμο μοτίβο γονιδιακής έκφρασης του ζωικού πόλου στο 80 με 90% του εμβρύου του αχινού. Τα γονίδια στόχοι από αυτό το σετ ρυθμιστών

49 συμπεριλαμβάνουν το ένζυμο το οποίο ευθύνεται για την hatching διαδικασία στο έμβρυο και μία πρωτεάση με μορφογενετικές ιδιότητες(wardle et al., 1999). Επιπλέον, ο μεταγραφικός παράγοντας Ets4 δρα κατασταλτικα. Επιλεκτικά, αποτρέπει την μεταγραφή γονιδίων ειδικών για το στοματικό εξώδερμα. Τα γονίδια αυτά είναι τα foxg,gsc και bra τα οποία οδηγούν σε εξειδίκευση το στοματικό εξώδερμα. Το χρονικό σημείο που εξαλείφεται από το στοματικό εξώδερμα η έκφραση του ταυτίζεται με αυτήν της εξάπλωσης της Nodal σηματοδότησης όπου ενεργοποιείται ένας άλλος μεταγραφικός παράγοντας ο Not και καταστέλει τον Ets4 στο στοματικό εξώδερμα. Συμπερασματικά ο μεταγραφικός παράγοντας Ets4: Αποτελεί κομμάτι του μηχανιομού ρύθμισης του A/V άξονα Είναι μητρικός μεταγραφικός παράγοντας Εκφράζεται εξωδερμικά στο αντιστοματικό εξώδερμα Καταστέλλει τα γονίδια gsc, bra, foxg Καταστέλλεται από τον μεταγραφικό παράγοντα Not και έναν άγνωστο ακόμα R-oral στο στοματικό εξώδερμα Επιτρέπει την δημιουργία δομών στο στοματικό εξώδερμα όπως η βλεφαριδωτή ζώνη Ο μεταγραφικός παράγοντας Not Τα όρια μεταξύ του ζωικής προέλευσης στοματικού εξωδέρματος και της βλεφαριδωτής ζώνης καθορίζονται μέσω της κατασταλτικής λειτουργίας σε συγκεκριμένες περιοχές των γονιδίων not και gsc. O μεταγραφικός παράγοντας Not καταστέλλει σε πρώιμο στάδιο γονίδια ειδικά για την εξειδίκευση του πλευρικού εξωδέρματος. Επιπλέον, συμβάλλει στον καθορισμό του στοματικού αντιστοματικού άξονα, και μπλοκάρει τα γονίδια ets4 και sip1 στο στοματικό 49

50 εξώδερμα. Στο έμβρυο του αχινού μετά τις 12 ώρες ο μεταγραφικός παράγοντας Not, ενώ δεν αποτελεί άμεσο στόχο της Wnt σηματοδότησης συμβάλλει ειδικά στην αποτροπή της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα FoxQ2 σε όλο το ισημερινό επίπεδο(li et al., 2014) και οριοθετεί την περιοχή του εκτείνεται ο FoxQ2 στην κορυφή του εμβρύου(materna et al., 2013). Εικόνα 35: απεικόνηση έκφρασης του FoxQ2 σε εμβρυα ελεγχου και ενεμμένα με MASO Not(Li et al., 2014). Η έκφρασή του περιορίζεται κοντά στην κορυφή κεντρικά και στην Veg1 περιοχή του στοματικού εξωδέρματος στις 15 ώρες από την γονιμοποίηση. Κατασταλτικά σήματα από το not αποσιωπά πολλά γονίδια ειδικά για την ρυθμιστική περιοχή του πλευρικού στοματικού εξωδέρματος στην μέση του στοματικού εξωδέρματος, αφήνοντας τα να εκφραστούν στα όρια του πλευρικού στοματικού εξωδέρματος (Li et al., 2012). Τέλος, το not είναι το πρώτο γονίδιο που εκφράζεται στο στοματικό τεταρτημόριο του μη σκελετογόνου μεσοδέρματος (NSM), και απαιτείται για τα κανονικά επίπεδα έκφρασης των NSM γονιδίων στο στοματικό εξώδερμα. Αποτελεί άμεσο γονίδιο στόχο της Nodal σηματοδότησης, και η έκφραση του είναι ανεπηρέαστη από την αλληλεπίδραση κατά την Delta/Notch σηματοδότηση(materna et al., 2013). Καταστέλλει το γονίδιο gsc(li et al., 2012).

51 Εικόνα 36: Απεικόνιση της έκφρασης του γονιδίου not Συμπερασματικά, ο μεταγραφικός παράγοντας Not: Παίζει σημαντικό ρόλο στην στον καθορισμό των ορίων του στοματικού εξωδέρματος και της βλαφαριδωτής ζώνης Είναι γονίδιο στόχος της Nodal σηματοδότησης Είναι απαραίτητο γονίδιο για την έκφραση των NSM γονιδίων Καταστέλει τον Ets4 και Gsc Συμβάλλει στην στοματική αντιστοματική διαμόρφωση του εξωδέρματος Περιορίζει τον FoxQ2 O μεταγραφικός παράγοντας Sip1 O μεταγραφικός παράγοντας Sip1 ανήκει στην οικογένεια των Homebox γονιδίων, είναι ένας καταστολέας ο οποίος αποτρέπει την μεταγραφή των γονιδίων που είναι ειδικά για το εξώδερμα μέχρι η έκφρασή του να εξαλειφθεί εντελώς από το στοματικό εξώδερμα σαν αποτέλεσμα της έμμεσης δράσης ης Nodal σηματοδότησης(li et al., 2013). Επιλεκτικά, καταστέλλει την έκφραση γονιδίων κλειδιά για το στοματικό εξώδερμα όπως gsc, foxg και bra. Έχει παροδική ζυγωτική έκφραση στην στοματική και αντιστοματική περιοχή στις 9 με 12 ώρες μετά την γονιμοποίηση. Στις 15 ώρες εξαλείφεται από το στοματικό εξώδερμα. Μέχρι το στάδιο του μεσεγχυματικού βλαστιδίου μοιράζεται ένα συμπληρωματικό μοτίβο έκφρασης αντίστοιχο με αυτό που επικρατεί στα γονίδια του στοματικού εξωδέρματος. Μετά τις 15 ώρες η έκφρασή του περιορίζεται σε συγκεκριμένο αριθμό προγονικών νευρικών κυττάρων που θα δώσουν τους σεροτονεργικούς νευρώνες(yaguchi et al., 2012). Επιπρόσθετα, 51

52 μετάγραφα του Sip1 ενεργοποιούνται στο αντιστοματικό μεσόδερμα ξεκινώντας από το στάδιο του μεσεγχυματικού βλαστιδίου. Εικόνα 37: Απεικόνιση της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Sip1(Li et al., 2013) O Sip1 μπλοκάρεται από έναν άγνωστο καταστολέα στο στοματικό εξώδερμα, περιορίζει χρονικά και χωρικά την έκφραση του foxg και αποσιωπείται στο αντιστοματικό εξώδερμα(li et al., 2013). Έχουν βρεθεί δύο ενεργές cis ρυθμιστικές περιοχές για το sip1, το οποίο έχει την ιδιότητα της αυτοκαταστολής(nam et al., 2010). Αναλυτικότερα, στο πρώιμο βλαστίδιο ο Sip1 εκφράζεται στα 2/3 του εμβρύου του αχινού και κυρίως στο πρόδρομο εξώδερμα χωρισμένο από το ζωικό ημισφαίριο(saudemont et al., 2010). Στις 18 ώρες μετά την γονιμοποίηση εξαλείφεται από το φυτικό μισό αλλά ξεκινά να επανφανίζεται ακραία. Μετά τη γαστριδίωση η αλλάγη στην έκφραση ολοκληρώνεται με το sip1 να είναι ενεργό μόνο στο ακραίο εξώδερμα. Η έκφρασή του πέφτει ακριβώς πριν την PMC μετανάστευση των κυττάρων(howard-ashby et al., 2006). Συμπερασματικά ο μεταγραφικός παράγοντας Sip1: Εκφράζεται ζυγωτικά περιοριζόμενος στα προγονικά κύτταρα των σεροτονεργικών νευρώνων στα προχωρημένα στάδια ανάπτυξης Καταστέλλει την έκφραση των γονιδίων gsc, foxg, bra Δρα ως καταστολέας για πολλά γονίδια στο αντιστοματικό εξώδερμα Αυτόκαταστέλλεται Επηρρεάζεται έμμεσα από την Nodal σηματοδότηση

53 Καταστέλλεται από έναν άγνωστο ακόμη καταστολέα στο στοματικό εξώδερμα O μεταγραφικός παράγοντας Gsc Ο μεταγραφικός παράγοντας Gsc είναι μέλος της οικογένειας homeobox και δρα ως καταστολέας. Είναι άμεσα και έμμεσα γονίδιο στόχος στο Nodal μονοπάτι και εκτελεί ρόλο κλειδί εξαλείφοντας και επιτρέποντας την έκφραση γονίδιων στο στοματικό εξώδερμα και την βλεφαριδωτή ζώνη. Καθορίζει τα όρια του στοματικού εξωδέρματος και της βλεφαριδωτής ζώνης συνεργατικά με τον μεταγραφικό παράγοντα Not που έχει και αυτός κατασταλτική δράση(li et al., 2013). Επιπλέον, καταστέλλεται από τον Ets4 και Sip1, παίζει εξίσου σημαντικό ρόλο στην διαφοροποίηση των κυττάρων χρονικά κατά την διαμόρφωση του δευτερογενή άξονα στα έμβρυα του αχινού(angerer et al., 2011), και είναι ένας καταστολέας που ανταγωνίζεται για την τύχη των κυττάρων στην αντιστοματική περιοχή και προάγει την εξειδίκευση των κυττάρων προς στοματικό εξώδερμα. Επιπρόσθετα, η παρουσία του είναι αναγκαία για την φυσιολογικά διαδικασία της γαστριδίωσης και την διαδοχική διαφοροποίηση του ενδοδέματος και των χρωμογόνων κυττάρων που είναι παράγωγα των δευτερογενών μεσεγχυματικών κυττάρων. Απαιτείται και για την φυσιολογική διαμόρφωση του αρχεντέρου(angerer et al., 2001). Κατέχει σημαντική θέση κατευθύνοντας το μοντέλο στην διαφοροποίηση των κυττάρων γύρω από τον ζωικής προέλευσης στοματικό άξονα. Η περιορισμένη γύρω από το στοματικό εξώδερμα εκφρασής του απαιτείται για να καταστείλει γονίδια που προάγουν τα κύτταρα να αποκτήσουν αντιστοματική ταυτότητα. 53

54 Εικόνα 38: Έμβρυα με αποσιώπηση του Gsc που δεν δημιουργούν έντερο (Angerer et al., 2001) Η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Gsc είναι σθεναρά μητρική και πιο ισχυρά ζυγωτική. Εκτείνεται σε όλο το κεντρικό και υποθετικό κοιλιακό εξώδερμα μέχρι το στάδιο του μεσεγχυματικού βλαστιδίου και έπειτα βαθμιαία αποκλείεται από το υποθετικό στομόδεο και περιφερικά του στομόδεου κατά το στάδιο του πλουτέα. Επιπλέον, εκφράζεται στο ενδόδερμα στο αρχέντερο. Συμπερασματικά ο μεταγραφικός παράγοντας Gsc: Δρα ως καταστολέας καθοδικά του μονοπατιού της β-κατενίνης στα έμβρυα του αχινού Είναι απαραίτητος παράγοντας για την γαστριδίωση και την δημιουργία του αρχεντέρου Είναι απαραίτητος για την διαφοροποίηση των κυττάρων του στοματικού εξωδέρματος και την εγκαθίδρυση της στοματικής αντιστοματικής πολικότητας Αποτελεί γονίδιο στόχο στην Nodal σηματοδότηση και καταστέλλεται από τον Not Καθορίζει τα όρια μεταξύ στοματικού εξωδέρματος και βλεφαριδωτής ζώνης

55 Το γονίδιο της Synaptotagmin B Οι συναπτοταγμίνες ανήκουν σε μία πρωτεϊνική οικογένεια αισθητήρων συγκέντρωσης ασβεστίου στα άκρα των αξόνων των προσυναπτικών κυττάρων και ρόλος τους είναι η απελευθέρωση του νευροδιαβιβαστή. Είναι αγκυροβολημένες στα προσυναπτικά κυστίδια και έχουν μια N-τελική επικράτεια και δύο διαδοχικές C2 επικράτειες (C2A και C2B), οι οποίες συνδέονται με φωσφολιπίδια παρουσία ασβεστίου. Η συγχώνευση των μεμβρανών τίθεται σε ενέργεια μέσω της συγχώνευσης των C2 επικρατειών με την μεμβράνη-στόχο, σε συνεργασία με το σύμπλεγμα SNARE(απαραίτητο και για την ενδοκυττάρια μεταφορά κυστιδίων αλλά και για την απελευθέρωση αυτών) (Burke et al., 2006a). Υπάρχουν 17 ισομορφές Synaptotagmin στον άνθρωπο και στα τρωκτικά, οι οποίες εμφανίζονται κυρίως στον νευρικό ιστό (κάποιες ισομορφές εμφανίζονται εκτός αυτού). Οι ισομορφές 1 και 2 είναι απαραίτητες για τη γρήγορη και συγχρονισμένη απελευθέρωση του νευροδιαβιβαστή. Άλλες μπορούν να ρυθμίζουν βραδύτερη και ασύγχρονη απελευθέρωση του νευροδιαβιβαστή. Κάποιες ισομορφές (8, 12-16) στερούνται της ικανότητας σύνδεσης με ασβέστιο και έτσι ο ρόλος τους είναι άγνωστος Λόγω της εμφάνισής τους στον νευρικό ιστό χρησιμοποιούνται ως πανερωνικοί μάρτυρες. Στον αχινό χρησιμοποιείται ευρέως σε έρευνες πάνω σε γονίδια που επάγουν την νευρογένεση. 55

56 ΣΚΟΠΟΣ

57 Στην παρούσα μελέτη σκοπός είναι η διερεύνηση του προτύπου έκφρασης των γονιδίων six3, foxq2, gsc, ets4, fez, not, sip1, synb του ΑΝΕ και του στοματικού εξωδέρματος στην πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη και η αναγνώριση των ρυθμιστικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ του Coup-TF και των παραπάνω γονιδίων. Το ήδη υπάρχον υπόδειγμα ρυθμιστικού δικτύου ( GRN ) για το στοματικό εξώδερμα του εμβρύου του αχινού εμπεριέχει το GRN υπο-δίκτυο του ΑΝΕ το οποίο είναι ελάχιστα μελετημένο και δεν εμπεριέχει τον COUP-TF. Απώτερος σκοπός είναι η δημιουργία ενός υπόδικτύου για το ΑΝΕ του εμβρύου του αχινού Paracentrotus lividus με κεντρικό παράγοντα τον Coup-TF. Η επιλογή των υπό μελέτη γονιδίων six3, foxq2, fez, not, gsc, sip1, ets4, synb έγινε με βάση την συσχέτισή τους με κάποιον τρόπο (ρύθμιση ή διαφοροποίηση) με το υποδίκτυο και την ρυθμιστική κατάσταση που ελέγχει τη δημιουργία των νευρογενών περιοχών. Επιπλέον, κριτήριο αποτελεί η άμεση ή έμμεση συμμετοχή τους στον καθορισμό των νευρογενών περιοχών, στην διαφοροποίηση και λειτουργία του νευρικού ιστού ή στην καθιέρωση μίας ρυθμιστικής κατάστασης που θα είναι απαραίτητη για την πραγματοποίηση της νευρογένεσης. Επίσης, κύριο κριτήριο αποτελεί η χωροχρονική έκφρασή τους η οποία είναι στις ίδιες περιοχές έκφρασης με αυτές του Coup-TF στην εκάστοτε χρονική στιγμή. 57

58 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

59 Πειραματόζωα Αχινός Paracentrotus lividus Το πειραματικό υλικό για την διεξαγωγή όλων των πειραμάτων προσλαμβάνεται από τον αχινό που χρησιμοποιείται στο εργαστήριο μας και ανήκει στο είδος Paracentrotus lividus, ο οποίος συλλέγεται από τις περιοχές του Ρίου και Βραχναιϊκων Αχαΐας. Τα άτομα συντηρούνται στους 13 Ο C σε ειδικά διαμορφωμένο ενυδρείο έως ένα μήνα. Συλλογή γαμετών Τα ενήλικα άτομα δεν διακρίνονται σε αρσενικά και θηλυκά σύμφωνα με την εξωτερική τους εμφάνιση. Η επιλογή γίνεται τυχαία και εν συνεχεία πραγματοποιείται ένεση στην περιστοματική τους περιοχή με 1 ml 5M KCl. Με αυτό τον τρόπο προκαλείται σύσπαση του μυοεπιθηλίου του τοιχώματος των γονάδων και πρόκληση ωορρηξίας εκσπερμάτωσης. Ακολουθεί ανακίνηση των αχινών και τοποθέτησή τους με την στοματική περιοχή προς τα κάτω. Μέσα σε λίγα λεπτά εμφανίζονται γαμέτες στην περιοχή της έδρας. Ο διαχωρισμός των θηλυκών αρσενικών ατόμων γίνεται βάσει του χρώματος των γαμετών, θηλυκοί γαμέτες κόκκινοι, αρσενικοί γαμέτες λευκοί. Τα αυγά συλλέγονται σε ποτήρι ζέσεως των 75ml με διπλά φιλτραρισμένο θαλασσινό νερό (MFSW). Τα θηλυκά τοποθετούνται με τέτοιον τρόπο ώστε η περιοχή της έδρας και του γονόπορου να βυθίζεται λίγο πιο κάτω από την επιφάνεια του νερού. Τα αυγά λόγω βαρύτητας καθιζάνουν στον πάτο του ποτηριού, ακολούθως γίνεται αλλαγή του νερού πάλι έως τα 75ml αναδεύοντας ταυτόχρονα τα αυγά. Τα γυαλικά έχουν καθαριστεί μόνο με απιονισμένο νερό καθώς τα απορρυπαντικά επηρεάζουν την φυσιολογική ανάπτυξη των εμβρύων. Μετά την αλλαγή του νερού, τα αυγά φιλτράρονται μέσω μιας χειρουργικής γάζας όπου απομακρύνονται σκελετικά υπολείμματα. Η υαλώδης μεμβράνη καταστρέφεται με την προσθήκη 5 σταγόνων 0,5M κιτρικού οξέος, μετρημένου με πιπέτα Pasteur, ακολουθεί αναδεύση για 1 λεπτό.η επαναφορά του ph σε φυσιολογικά επίπεδα δηλαδη να είναι ξανά κατάλληλο για να πραγματοποιηθεί η γονιμοποίηση γίνεται με την προσθήκη 18 σταγόνων 0,5M Tris-HCl ph 8,3. Επιπλέον, επαναλαμβάνεται το φιλτράρισμα με γάζα ώστε να απομακρυνθεί τελείως το ζελατινώδες περίβλημα. 59

60 Τέλος, η συλλογή του σπέρματος γίνεται από την περιοχή του γονοπόρου με πιπέτα Pasteur και διατηρείται σε Eppendorf μέσα σε πάγο. Πριν την γονιμοποίηση γίνεται αραίωση σπέρματος σε διπλά φιλτραρισμένο θαλασσινό νερό (MFSW) σε αντιστοιχία μιας σταγόνας σπέρματος σε 4ml νερού. Καλλιέργεια εμβρύων Οι καλλιέργειες εμβρύων που χρησιμοποιούνται έχουν όγκο 500ml- 1L και χρησιμοποιούνται για πειράματα in situ υβριδοποίησης και απομόνωσης ολικού RNA από διάφορα αναπτυξιακά στάδια. Τα ωάρια και τα σπερματοζωάρια συλλέγονται με την πιο πάνω διαδικασία και γονιμοποιούνται τεχνητά. Η γονιμοποίηση γίνεται παρουσία PABA (πάρα αμινο- βενζοϊκό οξύ) 10mM ph 8,1-8,3 προκειμένου να παραμείνει μαλακή η μεμβράνη γονιμοποίησης. Τα ωάρια μεταφέρονται σε 200ml διαλύματος PABA γονιμοποιούνται προσθέτοντας 1ml αραιωμένου σπέρματος με την αναλογία αραίωσης που αναφέρθηκε παραπάνω. Τα ήδη πια γονιμοποιημένα αυγά αναδεύονται σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Στην συνέχεια μέσω διήθησης της καλλιέργειας σε μεμβράνη mitex με πόρους διαμέτρου 50μ αφαιρείται η μεμβράνη γονιμοποίησης. Έπειτα προστίθενται 300ml MFSW και η καλλιέργεια μεταφέται στους 18 ο C υπό ανάδευση. Διαλύματα PABA 10mM ph 8,1-8,3 Σε τελικό όγκο 200ml PABA : 0,28 g MFSW : 200ml Η πεχαμέτρηση γίνεται με Tris-HCl. Μονιμοποίηση εμβρύων Μονιμοποιήθηκαν τα εξής εμβρυϊκά στάδια: 1. Αυγό (0 ώρες) κύτταρα (4 ώρες) 3. Βλαστίδιο (10 ώρες) 4. Γαστρίδιο (24 ώρες) 5. Πρίσμα (30 ώρες) 6. Πλουτέας (42 ώρες), με μηδενική ώρα την στιγμή της γονιμοποίησης. και

61 Τα έμβρυα από κάθε στάδιο συλλέγονται από την καλλιέργεια σε Falcon των 15ml και αφήνονται να καθιζάνουν στον πάγο. Στην συνέχεια απομακρύνεται το υπερκείμενο κ προστίθεται διάλυμα PFA 8% όγκο ίσου με τον όγκο του ιζήματος. Τα έμβρυα αναδεύονται σε θερμοκρασία δωματίου για 1h σε αναδευτήρα με ταυτόχρονη αλλαγή θέσεως κάθε 15 λεπτά. Κατόπιν, ξεπλένονται μια φορά με ASW (αφού έχει αφαιρεθεί όλη η ποσότητα από το PFA, προσθέτω αντίστοιχη ποσότητα ASW), και 3 φορές με 100% μεθανόλη. Τέλος αποθηκεύονται στους - 20 ο C. Διαλύματα ASW - Artificial Sea Water Σε τελικό όγκο 1L: 28.3g NaCl 0.77g KCl 5.41g MgCl2.6H 2 O 3.42g MgSO4 ή 7.13g MgSO4.7H 2 O 0.2g NaHCO3 1.56g CaCl2 dihydrate (το προσθέτουμε τελευταίο) PFA 8% : Σε τελικό όγκο 50 ml: PFA : 4g ASW: Ως τα 50ml Επώαση στους 65 ο C μέχρι να γίνει διαυγές Επώαση στους 25 ο C μέχρι να κρυώσει Προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος EPPS ph 8.0 (τελική συγκέντρωση, 20mM) EPPS: Σε τελικό όγκο 50ml: 12.61g EPPS Προσθήκη H 2 O ως τον όγκο των 50ml Για την χρήση εμβρυϊκών σταδίων για απομόνωση ολικού RNA,επιλέγονται ξανά τα ίδια αναπτυξιακά στάδια που αναφέρονται πιο πάνω. Τα εμβρυϊκά στάδια συλλέγονται σε Falcon των 15ml από καλλιέργεια εμβρύων. Έπειτα φυγοκεντρούνται για 7 λεπτά σε full speed σε φυγόκεντρο σε ψυχρό θάλαμο. Εν συνεχεία, 61

62 απομακρύνεται το υπερκείμενο διάλυμα και ψύχονται σε υγρό άζωτο. Τέλος, μεταφέρονται και φυλάσσονται σε καταψύκτη στους -80 ο C. Απομόνωση CDNA Για να διεξαχθούν τα πειράματα χρησιμοποιήθηκε απομονωμένο CDNA των υπό μελέτη παραγόντων. Για αυτό το σκοπό πραγματοποιήθηκαν οι εξής διαδικασίες: 1. Σχεδιασμός εκκινητών 2. RT-PCR 3. Ηλεκτροφόρηση DNA 4. Καθαρισμός προϊόντος RT-PCR (PCR Clean up) Σχεδιασμός εκκινητών Ο σχεδιασμός των εκκινητών πραγματοποιείται για να απομονωθεί το επιθυμητό CDNA. Αρχικά, αναζητείται in silico η αλληλουχία του επιθυμητού γονιδίου στην SpΒase του Strongylocentrotus purpuratus. Έπειτα, εναποθέτονται αυτές οι αλληλουχίες στην βάση δεδομένων που αντιστοιχεί στον Paracentrotus lividus, βάση Octopus. Εν συνεχεία, γίνεται blast σε νουκλεοτιδικό επίπεδο με σκοπό την εύρεση των αντίστοιχων mrnas του Paracentrotus lividus. Με αυτόν τον τρόπο σχεδιάζεται ένα ζεύγος εκκινητών forward και reverse,με την βοήθεια του προγράμματος primer blast, το οποίο δύναται να πολλαπλασιάσει όλοκληρη την κωδική περιοχή του εκάστοτε γονιδίου. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν δίνονται στον πίνακα 1. Το κάθε ζεύγος εκκινητών χρησιμοποιείται στη συνέχεια σε αντιδράσεις RT-PCR προκειμένου να απομονωθεί το αντίστοιχο cdna. RT-PCR Τα cdnas παρήχθησαν με RT-PCR χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια της εταιρίας TAKARA (PrimeScript One Step RT-PCR kit) και τα ζεύγη εκκινητών που παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Ως υπόστρωμα έχουμε ολικό RNA από το αναπτυξιακό στάδιο στο οποίο βιβλιογραφικά εκφράζεται περισσότερο ή σε μεγαλύτερη έκταση το κάθε γονίδιο. Η αντίδραση της RT-PCR πραγματοποιήθηκε αρχικά σε τέσσερις διαφορετικές θερμοκρασίες (gradient RT-PCR) κάθε φορά με σκοπό την εύρεση της βέλτιστης θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών. Από

63 την στιγμή που προσδιορίζεται η βέλτιστη θερμοκρασία οποιαδήποτε RT-PCR ακολουθεί γίνεται σε μια θερμοκρασία (αλλάζει το βήμα 4 στο πρόγραμμα). Η αντίδραση σε τελικό όγκο 25μl είναι η εξής: Ολικό RNA γαστριδίου(70ng/μl): 1,5 μl Buffer 2x : 12.5μl Enzyme mix : 1 μl Εκκινητής Forward : 0.75 μl Εκκινητής Reverse : 0.75 μl H 2 O (RNAse free) : 8.5 μl Το πρόγραμμα που ακολουθήθηκε είναι το εξής: Βήμα 1: 50 o C για 30 Βήμα 2: 94 o C για 2 Βήμα 3: 94 o C για 20 Βήμα 4: o C για 20 Βήμα 5: 72 o C για 3 Βήμα 6: επιστροφή στο βήμα 3 για 35 κύκλους Βήμα 7: 72 o C για 10 Βήμα 8: Τέλος Ηλεκτροφόρηση DNA Τα μόρια DNA αναλύθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης σε συγκέντρωση 1%. Τα νουκλεϊνικά οξέα διαχωρίζονται μέσα στο πήκτωμα αγαρόζης εφαρμόζοντας ηλεκτρικό πεδίο τάσης 80 έως 100V. Τα μικρότερα μόρια κινούνται περισσότερο γιατί διαπερνούν πιο εύκολα από τους πόρους του πηκτώματος. Τα νουκλεϊκά οξέα, μετακινούνται από αρνητικά προς θετικά ηλεκτρόδια, λόγω στο φυσικά-φερόμενο αρνητικό τους φορτίο. Οι ζώνες του DNA καθίστανται ορατές μετά από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV) λόγω της παρουσίας βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr) εντός του πηκτώματος. Ως διάλυμα ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται διάλυμα ΤΑΕ (Tris/Acetate/EDTA) 1Χ, ενώ ως μάρτυρας ο 1Kb ladder της εταιρίας NEB ή ο 100bp ladder. 63

64 Διαλύματα Πήκτωμα αγαρόζης 1% : 0,7gr αγαρόζη 70 ml TAE buffer 1X Το διάλυμα θερμαίνεται μέχρι να γίνει διαυγές και έπειτα προστίθεται σε αυτό 1,5μl βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr) 10mg/ml. Χρωστική δειγμάτων DNA 6X: Σε τελικό όγκο 50ml : Φικόλη 25% : 40ml (20%) Μπλε της Βρωμοφαινόλης 2.5%: 5ml (0.25%) Κυανούν του ξυλενίου 2.5%: 5ml (0.25%) EDTA 0.5M ph:8.0: 1ml (10mM) Διάλυμα ηλεκτροφόρησης ΤΑΕ 1Χ: Σε τελικό όγκο 1L: ddh 2 O 980ml 50X TAE 20ml 50Χ ΤΑΕ Σε τελικό όγκο 1L: 242g Tris 100ml από 0,5Μ EDTA ph 8 Προσθέτω οξικό οξύ μέχρι ν α φτάσει το ph στο 8 και έπειτα ογκομετρώ και προσθέτω όσο ddh 2 O χρειάζεται για να φτάσει σε τελικό όγκο 1L. Καθαρισμός προϊόντος RT-PCR (PCR Clean-up): Χρησιμοποιείται το πρωτόκολλο της εταιρίας QIAGEN (QIAquick PCR Purification Kit) για προιόντα μεγέθους από 100bp μέχρι 10Kb. Διαδικασία : Προσθήκη 5Χ του όγκου των προϊόντων της PCR, RB buffer. Μεταφορά του περιεχομένου σε κολώνες QIAquick και φυγοκέντρηση για 30s-60s. Προσθήκη 750μl PE buffer με αιθανόλη (ξέπλυμα της στήλης) και φυγοκέντρηση για 30s-60s. Ξηρή φυγοκέντρηση για 60 sec.

65 Προσθήκη 50μl ΕΒ buffer (elution buffer) για έκλουση των προσδεδεμένων στη μεμβράνη μορίων DNA, επώαση για δύο λεπτά και φυγοκέντρηση για 60 Sec. Όλες οι φυγοκεντρήσεις γίνονται σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και στις rpm. Κλωνοποίηση του απομονωμένου cdna Η κλωνοποίηση των απομονωμένων cdnas περιλαμβάνει τα εξής στάδια: Αντίδραση λιγάσης Παρασκευή δεκτικών κυττάρων Κατασκευή τρυβλίων θρεπτικού Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηρίων Blue-white screening για επιλογή μετασχηματισμένων βακτηρίων Μεταφορά αποικιών streaking και δημιουργία υγρών καλλιεργειών Απομόνωση πλασμιδιακού DNA Πέψη με ένζυμα περιορισμού Φωτομέτρηση Αλληλούχιση Αντίδραση λιγάσης Χρησιμοποιείται ο φορέας PGEM-T Easy (Promega) και η αντίδραση που πραγματοποιείται είναι η εξής: Σε τελικό όγκο 10μl : H 2 O: 2 μl Επώαση στους 18oC για ώρες PCR προϊόν (~50ng) : 2Χ Buffer (Promega) : 1 μl 5 μl pgem-t Easy (50ng/μl) :1 μl T4 DNA Λιγάση (3u/μl) : 1 μl Ο συγκεκριμένος φορέας φέρει τους υποκινητές Sp6 και Τ7 εκατέρωθεν της θέσης ένθεσης. Λόγω των θέσεων δίνει τη δυνατότητα παραγωγής τόσο νοηματικού όσο και αντινοηματικού RNA ανάλογα με τη φορά εισαγωγής του 65

66 ενθέματος και τη χρήση της κατάλληλης πολυμεράσης. Επίσης, περιέχει αρκετές αλληλουχίες αναγνώρισης από ένζυμα περιορισμού. Αλληλουχίατου πολυσυνδέτη του πλασμιδίου pgem-teasy, όπου φαίνεται η θέση του ενθέματος και η θέση των δύο υποκινητών χάρτης του πλασμιδίου pgem-t Easy Παρασκευή δεκτικών κυττάρων: Δημιουργία δεκτικών κυττάρων με χρήση χλωριούχου ρουβιδίου (RbCl 2 ) Πορεία

67 1. Το τριβλίο SOB-άγαρ εμβολιάζεται με Ε.coli στέλεχος από stock γλυκερόλης (-70 ο C) και επωάζεται στους 37 ο C για όλη τη νύχτα. 2. Από το τρυβλίο αυτό λαμβάνεται μοναδική αποικία με την οποία εμβολιάζονται 5ml υγρού θρεπτικού μέσου καιεπωάζονται στους 37 ο C για όλη νύχτα σε περιοδική ανάδευση. 3. Από το προηγούμενο βήμα λαμβάνεται 1ml καλλιέργειας με το οποίο εμβολιάζονται 100ml υγρού θρεπτικού μέσου Psi. Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C με ανάδευση μ.εχρι η απορρόφηση της καλλιέργειας να γίνει OD 550nm =0,5. 4. Η καλλιέργεια μεταφέρεται κάτω από άσηπτες συνθήκες σε κατάλληλο πλαστικό σωλήνα και ψύχεται για περίπου 15 λεπτά σε πάγο. 5. Τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις 4000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ο C και αφού απορριφθεί το υπερκείμενο, ο σωλήνας αναστρέφεται για ένα λεπτό ώστε να απομακρυνθούν και τα τελευταία υπολείμματα θρεπτικού υλικού. 6. Τα κύτταρα επαναιωρούνται με ήπια ανάδευση σε 0,4 όγκους διαλύματος Tfb1 ( θερμοκρασίας 4 ο C ) και διατηρούνται στον πάγο για 15 λεπτά. 7. Τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις 4000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ο C το υπερκείμενο απορρίπτεται και ο σωλήνας αφήνεται ανεστραμμένος για περίπου 1 λεπτό ώστε να στεγνώσει πλήρως. 8. Τα κύτταρα επαναιωρούνται με ήπια αν αδευση σε 0,04 όγκους διαλύματος Tfb2 (θερμοκρασίας 4 ο C ) και διατηρούνται στον πάγο για 15 λεπτά. 9. Τα κύτταρα μοιράζονται σε κλάσματα των 100μl σε παγωμένα σωληνάκια eppendorf, τα οποία στη συνέχεια ψύχονται σε υγρό άζωτο και φυλάσσονται στους -70 ο C. Η όλη διαδικασία πραγματοποιείται σε άσηπτες συνθήκες ( δουλεύουμε ανάμεσα σε δύο λύχνους). Διαλύματα Psi θρεπτικό υλικό: Σε τελικό όγκο 500ml: Bacto-tryptone: 10g Bacto-yeast extract : 2.5g MgSO 4 : 2.5g 67

68 Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με ΚOH στο 7,6 και στη συνέχεια αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. SOB θρεπτικό υλικό : (2.0% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 10mM Sodium chloride, 2.5mM Potassium chloride και 10mM Magnesium chloride) Σε τελικό όγκο 100ml: Bacto-tryptone: 2g Bacto-yeast extract: 0.5g NaCl: 0.05g Αφού διαλυθούν τα υλικά προσθέτουμε 1ml διαλύματος KCl 250mM και γίνεται εξισορρόπηση σε ph 7.0 με NaOH 10M. ακολουθεί αποστείρωση στο αυτόκαυστο και στη συνέχεια προσθέτουμε 0,5ml αποστειρωμένου διαλύματος MgCl 2M. Tfb1 διάλυμα: Σε τελικό όγκο 100ml : CH 3 COOK: 0.29g RbCl 2 : 1.21g CaCl 2 : 0.15g MnCl 2 : 1g Glycerol: 15ml Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με αραιό CH3COOH στο 5,8 και στη συνέχεια το διάλυμα αποστειρώνεται με διήθηση σε φίλτρο 0,45μm. Tfb 2 διάλυμα: Σε τελικό όγκο 100ml : MOPS: 0.21g CaCl 2 : 1.1g RbCl 2 : 0.121g Glycerol: 15ml Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με αραιό NaOH στο 6,5 και στην συνέχεια το διάλυμα αποστειρώνεται με διήθηση σε φίλτρο 0,45μm. Κατασκευή τρυβλίων θρεπτικού Για να κατασκευαστούν τρυβλία με θρεπτικό χρησιμοποιείται υγρό L Broth στο οποίο προστίθεται 15g άγαρ στο λίτρο και έπειτα μπαίνει στο αυτόκαυστο. Εν

69 συνεχεία, το υγρό αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι να φτάσει σε θερμοκρασία χειρισμού και προστίθενται 500μl Amp. Έπειτα, μοιράζεται σε τρυβλία, σε αποστειρομένο από λύχνο περιβάλλον. Αφήνουμε το υγρό να πήξει σε RT 15 με 18 ώρες. Πριν την επίστρωση των καλλιεργειών, προστίθεται 4μl IPTG και 40μl X- gal. Διαλύματα: L Broth Σε τελικό όγκο 1L : Bacto-Tryptone: 10g Yeast extract: 5g NaCl: 5g Προσθέτω ddh 2 O μέχρι να φτάσει στο 1L.Ρυθμίζω το ph με NaOH στο 7,5. IPTG (Isopropylthio-β-D-galactoside) Σε τελικό όγκο 10ml: IPTG: 2g ddh 2 O: 10ml Το διάλυμα αποστειρώνεται με διήθηση σε φίλτρο 0,22μm. X-gal (Bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-galactoside) Συντίθεται stock με συγκέντρωση 20mg/ml διαλύοντας X-gal σε dimethylformamide. Το παρόν διάλυμα συντηρείται στους -20 ο C τυλιγμένο με αλουμινόχαρτο για να προστατευτεί από το φως. Μετασχηματισμός δεκτικών κυττάρων Πορεία Σε 50 μl δεκτικών κυττάρων, (ξεπαγωμένα από τους -70 ο C σε πάγο για 5 ) προστίθενται 4μl από την αντίδραση λιγάσης και αναμιγνύονται ελαφρώς.το δείγμα διατηρείται σε πάγο για 40. Στη συνέχεια, μεταφέρεται στους 42 ο C (θερμικό σοκ) για ακριβώς 90. Κατόπιν, τοποθετείται στον πάγο για 5. Έπειτα, το διάλυμα μεταφέρεται σε σωλήνα 5ml που περιέχει προθερμασμένο στους 37 ο C, θρεπτικό υλικό LB και αφήνεται για 1h στο υδατόλουτρο στους 37 ο C. Κατά τη διάρκεια αυτή αναδεύεται κάθε 15. Τέλος, 69

70 επιστρώνεται σε τρυβλία που περιέχουν LB, Χ-Gal και αμπικιλλίνη και επωάζεται στους 37 ο C για όλη τη νύχτα. Blue-white screening. Με αυτόν τον τρόπο γίνεται η επιλογή των μετασχηματισμένων βακτηρίων, τα οποία έχουν λάβει τον ανασυνδυασμένο πλασμιδιακό φορέα. Διακρίνουμε σε δύο κατηγορίες: Βακτήρια τα οποία έχουν λάβει μη ανασυνδυασμένο πλασμίδιο(χωρίς το επιθυμητό ένθεμα) αναπτύσσουν αποικίες μπλέ χρώματος καθώς εκφράζουν την υπομονάδα lacz, η οποία λείπει από τα βακτήρια, δίνοντας προϊόν μπλε χρώματος. Βακτήρια τα οποία έχουν λάβει ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, δεν εκφράζουν lacz υπομονάδα και γι αυτό οι αποικίες τους είναι λευκές. Αυτές είναι και οι αποικίες οι οποίες επιλέγονται καθώς περιέχουν το ζητούμενο ένθεμα. Μεταφορά αποικιών (streaking) και δημιουργία υγρών καλλιεργειών. Μετά την επιλογή καλλιεργειών, αυτές θα αναπτυχθούν και σε στερεό αλλά και σε υγρό θρεπτικό υλικό. Από τις καλλιέργειες υγρού θρεπτικού υλικού θα γίνει η απομόνωση του πλασμιδίου σε επόμενο στάδιο. Για τις καλλιέργειες σε στερεό θρεπτικό υλικό χρησιμοποιείται τρυβλίo το οποίο έχει κατασκευαστεί όπως παραπάνω (L-broth, Amp) χωρίς όμως να έχει επιστρωθεί με Xgal. Για τις καλλιέργειες σε υγρό θρεπτικό υλικό χρησιμοποιούνται αποστειρωμένα falcon των 50ml τα οποία περιέχουν 3ml θρεπτικού υλικού L-broth και 3μl Amp (100μg/ml). Η μεταφορά γίνεται με τη χρήση αποστειρωμένου κρίκου δίπλα σε φλόγα και τα βακτήρια επωάζονται στους 37 ο C στον επωαστικό θάλαμο με ανάδευση όλη νύκτα.

71 Απομόνωση μικρής κλίμακας πλασμιδιακού DNA από βακτήρια minipreps Η απομόνωση πλασμιδίων από τα βακτήρια πραγματοποιείται με την χρήση του kit Nucleospin plasmid της εταιρείας Macherey-Nagel. Πορεία 1. Μεταφορά 1,5ml από κάθε υγρή καλλιέργεια σε σωλήνες eppendorf. 2. Φυγοκέντρηση για 2 στις g και απομάκρυνση υπερκείμενου. 3. Προσθήκη 250μl διαλύματος Α1 (επαναιώρηση κυττάρων). 4. Προσθήκη 250μl διαλύματος Α2 (βασικό ph για λύση των κυττάρων) σε θερμοκρασία δωματίου (RT). 6. Προσθήκη 300μl διαλύματος Α3 (οξύ εξουδετέρωση, δημιουργείται ίζημα από πρωτεΐνες και βακτηριακό DNA). 7. Φυγοκέντρηση για 7 στις g. 8. Μεταφορά υπερκείμενου σε κολώνες. 9. Φυγοκέντρηση για 1 στις g. 10. Αφαίρεση του υγρού κάθε κολώνας. 11. Προσθήκη 500μl διαλύματος AW (καθαρισμός). 12. Φυγοκέντρηση 1 στις g. 13. Απομάκρυνση υγρού κολώνας. 14. Προσθήκη διαλύματος Α4 (με αιθανόλη, απομακρύνει άλατα και συγκρατεί το DNA). 15. Φυγοκέντρηση 1 στις g. 16. Αφαίρεση υγρού κολώνας. 17. Φυγοκέντρηση ξανά για 2 στις g. 18. Μεταφορά των φίλτρων σε καινούρια eppendorfs. 19. Προσθήκη 100μl διαλύματος ΑΕ. 20. Επώαση 2-5 σε RT. 21. Φυγοκέντρηση 1 στις g. 22. Απομάκρυνση φίλτρου και φύλαξη του διαλύματος Σε περιπτώσεις που η συγκέντρωση του απομονωμένου DNA δεν ήταν ικανοποιητική πραγματοποιούνται μεγαλύτερες καλλιέργειες και η απομόμωση των πλασμιδίων γίνεται χρησιμοποιώντας παρόμοιο πρωτόκολλο της ίδιας εταιρείας (Xtra Midi Prep). 71

72 Πέψη με ένζυμα περιορισμού Οι αντιδράσεις πέψης του DNA περιέχουν τα ένζυμα περιορισμού και τα αντίστοιχα ρυθμιστικά διαλύματα από την εταιρεία NEB σε αναλογία 10units ενζύμου περιορισμού για κάθε 0.5μg DNA. Συγκεκριμένα, για την πέψη ελέγχου με EcoRI η αντίδραση σε τελικό όγκο 20μl είναι η εξής: H 2 O : DNA (0.1μg/μl) : 10X buffer : 5μl 2μl EcoRI (20u/μl) : 0,5μl Το αποτέλεσμα ελέγχεται με ηλεκτροφόρηση του DNA. 12,5μl Φωτομέτρηση Για να γίνει ποσοτικός και ποιοτικός προσδιορισμός του πλασμιδιακού DNA τα δείγματα φωτομετρούνται αφού πρώτα υποστούν αραίωση 1:50 σε mq H 2 O. Η φωτομέτρηση πραγματοποιείται στα 260 και 280nm. Αρχικά, γίνεται μηδενισμός του φωτόμετρου με mq H 2 O. Ο λόγος των οπτικών πυκνοτήτων O.D.260\O.D.280 πρέπει να είναι μεγαλύτερος του 1,8 για να θεωρηθεί το DNA πολύ καθαρό (για RNA είναι 2.0). Η συγκέντρωση του DNA υπολογίζεται αν λάβει κανείς υπ όψιν του ότι 1 O.D.260 nm ισοδυναμεί με 50μg\ml DNA (για το RNA είναι 40μg\ml DNA). Αλληλούχιση Προκειμένου να γίνει η νουκλεοτιδική ανάλυση των διάφορων κλώνων στέλνονται για sequencing, αφού έχουν επέλθει από PCR με M13 εκκινητές. In situ υβριδοποιήση H in situ υβριδοποίηση έχει στόχο τον ποιοτικό και ιστοειδικό εντοπισμό του πρότυπου έκφρασης ενός γονιδίου στο έμβρυο, από το στάδιο του αγονιμοποιήτου αυγού ως το στάδιο του πλουτέα. Αυτό επιτυγχάνεται με προετοιμασία σημασμένων αντινοηματικών RNA ανιχνευτών που δημιουργούνται μετά από πέψη και in vitro μεταγραφή των πλασμιδιακών DNA που φέρουν το εκάστοτε cdna. Η διαδικασίες που είναι απαραίτητες αναφέρονται αναλυτικά παρακάτω.

73 Παρασκευή ιχνηθετών Οι ιχνηθέτες που χρησιμοποιούνται παρασκευάζονται αφού πολλαπλασιαστούν τα επιθυμητά κλωνοποιημένα cdnas με αντίδραση PCR και in vitro μεταγραφή. Η αντίδραση PCR που πραγματοποιήθηκε έγινε με αντιδραστήρια της εταιρίας NEB. Το DNA που χρησιμοποιώ έχει συγκέντρωση από 1 εως 3 ng/μl, και οι εκκινητές είναι οι Μ13 Forward και Reverse. Σε τελικό όγκο αντίδρασης 25μl: DNA (1ng/μl) : Buffer 10X : MgCl2 (25mM) : dntps (10mM) : 1,5 μl 2,5 μl 1 μl 0,5 μl Εκκινητής (forward, 15μΜ) :0,5 μl Εκκινητής (reverse, 15μΜ) : 0,5 μl Taq πολυμεράση( 5u/μl ): 0,5 μl H 2 O : 18 μl Το πρόγραμμα που ακολουθήθηκε είναι το εξής : Βήμα 1o : 94 ο C για 2 Βήμα 2o : 94 ο C για 30 Βήμα 3o : 58 ο C για 30 Βήμα 4o : 72 ο C για 1,15 Βήμα 5o : Επιστροφή στο βήμα 2 για 35 φορές Βήμα 6o: 72 ο C για 5 Βήμα 7ο : τέλος Ακολουθεί καθαρισμός προϊόντος PCR clean-up System της εταιρίας Promega Διαδικασία πρωτοκόλλου της εταιρίας Promega : 1. Μεταφέρεται το προϊόν της PCR σε ένα καθαρό αποστειρωμένο eppendorf και προστίθεται ίσος όγκος από το διάλυμα Membrane Binding Solution. 2. Μεταφέρεται το εμπλουτισμένο προϊόν μέσα σε κολώνα και αφήνεται για ένα λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm για 1, αφαιρείται το διάλυμα που έχει περάσει. 73

74 4. Προστίθενται 700 μl διαλύματος Membrane Wash Solution και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1, πετάω ότι έχει περάσει μέσα στο tube. 5. Προστίθενται άλλα 500μl από το ίδιο διάλυμα και ακολουθεί φυγοκέντρηση για Αδειάζετε ότι έχει περάσει και ακολουθεί ξηρή φυγοκέντρηση για Μεταφέρεται η κολώνα σε νέο eppendorf προστίθενται 30μl H 2 O και αφήνεται για 1 σε RT, ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1. Όλες οι φυγοκεντρήσεις γίνονται στις rpm ή στα 16000g. Στη συνέχεια πραγματοποιείται in vitro μεταγραφή με τη χρήση των RNA πολυμερασών Τ7 και Sp6. Γνωρίζοντας την κατεύθυνση εισαγωγής των cdna ενθεμάτων στον πλασμιδιακό φορέα, από την επεξεργασία των αποτελεσμάτων της αλληλούχισης, προβλέπεται και η σύνθεση των νοηματικών (sense) και αντινοηματικών (anti-sense) RNAs από την κάθε πολυμεράση. Για την παρασκευή των ιχνηθετών χρησιμοποιείται σημασμένo UTP με διγοξιγενίνη. Η σήμανση των ιχνηθετών πραγματοποιήθηκε με αντιδραστήρια της εταιρίας Roche εκτός από τον αναστολέα RNAσης που ανήκει στην εταιρεία Promega και η αντίδραση που πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 20μl είναι η εξής: Αντίδραση σε τελικό όγκο 20μl: Γραμμικό DNA (1μg): 10μl Νουκλεοτίδια (ATP, CTP, GTP, 10mM): 2μl 6.5 mm DIG-11-UTP + 3.5mM UTP: 2μl 10X transcription buffer: 2μl Sp6 ή T7 πολυμεράση: 2μl RNAse inhibitor: 0.5μl DEP H 2 O: 1.5μl Η αντίδραση επωάζεται στους 37 ο C για 2 ώρες. Μετά το πέρας των 2 ωρών, προστίθενται στην αντίδραση 2μl DNAse (RNase-free, Roche) προκειμένου να αποικοδομηθεί το DNA και αφήνεται για 20 στους 37 ο C. Στη συνέχεια, το παραγόμενο RNA εισέρχεται σε κολώνα Sephadex G-50 και καθαρίζεται με φυγοκέντρηση για 2 στα 1000g. Μετά από ογκομέτρηση του δείγματος τα δείγματα φωτομετρούνται στα 260 και 280nm και αναλύονται σε πήκτωμα αγαρόζης.

75 Κολώνα Sephadex G-50 Ζυγίζονται 5g Sephadex G-50 (Sigma) και συμπληρώνονται με mqh 2 O ως τα 50ml. Προστίθενται 50μl DEP και το διάλυμα αποστειρώνεται. Για τη δημιουργία των κολωνών, σφαιρίδια Sephadex από τον πάτο του δοχείου μεταφέρονται με πιπέτα Pasteur σε μικρά φίλτρα (Μicrospin της Pharmacia Biotech) και αφού πακεταριστεί το υλικό στην κολώνα, φυγοκεντρούνται στα 1000g για 1. In situ υβριδοποίηση Η in situ υβριδοποίηση είναι μια τεχνική η οποία επιτρέπει την ανίχνευση συγκεκριμένων αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων σε διατηρημένα χρωμοσώματα, κύτταρα ή τομές ιστών. Η μέθοδος αυτή, σε συνδυασμό με ανοσοϊστοχημικές τεχνικές, μπορεί να παρέχει πληροφορίες για την ενεργότητα συγκεκριμένων γονιδίων στο επίπεδο του DΝΑ και του mrνα. Υπάρχουν δύο τύποι μεθόδων in situ υβριδοποίησης χωρίς χρήση ραδιοσημασμένων ανιχνευτών, η άμεση και η έμμεση. Σημειώνεται ότι και στις δύο περιπτώσεις το μόριο-χημική ένωση που χρησιμοποιείται για τη σήμανση του ανιχνευτή δεν πρέπει να συμμετέχει στην αντίδραση υβριδοποίησης (είτε διευκολύνοντας, είτε εμποδίζοντάς την) ούτε να επηρεάζει τη σταθερότητα του προκύπτοντος υβριδίου. Εδώ χρησιμοποιείται έμμεση υβριδοποίηση με RΝΑ-RΝΑ in situ υβριδοποίηση για την οποία χρησιμοποιούνται ιχνηθέτες σημασμένοι με διγοξιγενίνη. Για να δημιουργηθούν οι ανιχνευτές αυτοί όπως αναφέρθηκε, επιτελείται in vitro μεταγραφή ενός τμήματος του γονιδίου (του οποίου αναζητείται το πρότυπο έκφρασης). Το τμήμα αυτό είναι συμπληρωματικό του ενδογενούς mrνα. Στην αντίδραση της μεταγραφής εκτός από τα UTPs προστίθενται και UTPs τα οποία είναι συνδεδεμένα με ένα μόριο διγοξιγενίνης. Αφού κατασκευαστεί ο ιχνηθέτης, τοποθετείται στο διάλυμα υβριδοποίησης με τα κύτταρα και μένει να αντιδράσει-υβριδοποιηθεί με τα ενδογενή mrnas των κυττάρων. Μετά την πάροδο του χρονικού διαστήματος που απαιτείται για να επιτευχθεί η υβριδοποίηση, τα κύτταρα υφίστανται πλύσεις ώστε να απομακρυνθεί η περίσσεια του ιχνηθέτη που δεν υβριδοποιήθηκε. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων με αντισώματα τα οποία αναγνωρίζουν ειδικά τη διγοξιγενίνη. Τα αντισώματα αυτά είναι συνδεδεμένα με ένα ένζυμο όπως είναι η αλκαλική φωσφατάση. Στη συνέχεια της πειραματικής πορείας τα κύτταρα υφίστανται πλύσεις ώστε να απομακρυνθεί η 75

76 περίσσεια του αντισώματος που δεν δεσμεύτηκε, ενώ ακολουθεί προσθήκη των υποστρωμάτων του ενζύμου. Τα υποστρώματα αυτά αντιδρούν με το ένζυμο με αποτέλεσμα να προκύπτει σκουρόχρωμη χρωστική. Πρέπει να αναφερθεί ότι ο χρωματισμός (το σήμα) θα εντοπίζεται μόνο στα σημεία του κυττάρου όπου υπάρχουν αντισώματα, τα οποία με τη σειρά τους βρίσκονται μόνο όπου υπάρχει διγοξιγενίνη. Στο πρώτο στάδιο της υβριδοποίησης τα δείγματα και οι ιχνηθέτες είναι ευαίσθητα στη δράση των RNAσών και για το λόγο αυτό χρησιμοποιούνται ρύγχοι και σωληνάκια επεξεργασμένα με DEP. Επιπλέον, η διαδικασία γίνεται σε σωλήνες eppendorf και κατά την αφαίρεση των διαλυμάτων φροντίζουμε ο όγκος του εναπομείναντος διαλύματος να καλύπτει τα έμβρυα για την προστασία των εμβρύων και την αποφυγή συσσωμάτωσης τους. Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε είναι τροποποιημένο από την Cyndi Bradham και τα αναπτυξιακά στάδια του P.lividus στα οποία πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα είναι 1) Αυγό, 2) 16-κύτταρα, 3)Μεσεγχυματικό Βλαστίδιο, 4) Γαστρίδιο, 5) Πρίσμα, 6) Πλουτέας. σχηματική απεικόνιση των γεγονότων κατά την πειραματική διαδικασία της in situ υβριδοποίησης Διαδικασία :

77 1. Συλλέγεται από όλα τα στάδια ποσότητα μονιμοποιημένων σε MeOH εμβρύων (~100μl) και τα έμβρυα αφήνονται να καθιζάνουν. Ακολουθεί επαναιώρηση των εμβρύων στο ρυθμιστικό διάλυμα PBST αντικαθιστώντας τη μισή ποσότητα MeOH του υπερκειμένου με ίσο όγκο PBST. 2. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται άλλη μία φορά. Στα βήματα που ακολουθούν τα έμβρυα ξεπλένονται πλέον με αντικατάσταση όχι της μισής αλλά όλης της ποσότητας του εκάστοτε διαλύματος και επαναιώρησή τους στο επόμενο διάλυμα. 3. Αφαίρεση 100λ διαλύματος και προσθήκη 100λ διαλύματος PBST. 4. Αφαίρεση 100λ διαλύματος και προσθήκη 100λ διαλύματος PBST. 5. Αφαίρεση 100λ διαλύματος και προσθήκη 100λ διαλύματος PBST. 6. Αφαίρεση 100λ διαλύματος PBST και προσθήκη 100λ διαλύματος υβριδοποίησης. 7. Αφαίρεση 100λ διαλύματος υβριδοποίησης και προσθήκη 100λ διαλύματος υβριδοποίησης. 8. Επώαση για 3h στους 65 ο C (προϋβριδοποίηση). 9. Αφαίρεση 100λ διαλύματος υβριδοποίησης και προσθήκη 100λ διαλύματος υβριδοποίησης με ιχνηθέτη (0,3ng/μl). 10. Επώαση στους 65 ο C για 72 h (υβριδοποίηση) Τα RNAs που δεν υβριδοποιήθηκαν μετά το στάδιο της επώασης, απομακρύνονται στα επόμενα ξεπλύματα των εμβρύων που ακολουθούν χρησιμοποιώντας αλάτι SSCT. Το διάλυμα SSC που χρησιμοποιείται σε αυτά τα βήματα έχει ph 7.0. Τα ξεπλύματα γίνονται στους 65 ο C και κάθε διάλυμα που χρησιμοποιείται έχει προηγουμένως προθερμανθεί για 15 στους 65 ο C. Η διαδικασία πλέον δεν απαιτεί τη χρήση ρυγχών ειδικών για RNA. 11. Αφαίρεση 100λ διαλύματος υβριδοποίησης και προσθήκη 100λ διαλύματος υβριδοποίησης. Επώαση στους 65 ο C για Αφαίρεση 100λ διαλύματος υβριδοποίησης και προσθήκη 100λ διαλύματος υβριδοποίησης. Επώαση στους 65 ο C για Αφαίρεση 100λ διαλύματος υβριδοποίησης και προσθήκη 100λ διαλύματος υβριδοποίησης/2χ SSCT (50/50). Επώαση στους 65 ο C για

78 14. Αφαίρεση 100λ διαλύματος και προσθήκη 100λ διαλύματος 2Χ SSCT. Επώαση στους 65 ο C για Αφαίρεση 100λ διαλύματος και προσθήκη 100λ διαλύματος 0,2X SSCT. Επώαση στους 65 ο C για Αφαίρεση 100λ διαλύματος 0,2X SSCT και προσθήκη 100λ διαλύματος 0,1X SSCT. Επώαση στους 65 ο C για Επανάληψη του βήματος Αφαίρεση 100λ διαλύματος 0,1X SSCT και προσθήκη 100λ διαλύματος TBST. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για Επανάληψη του βήματος Επανάληψη του βήματος Αφαίρεση 100λ διαλύματος TBST και προσθήκη 100λ διαλύματος BLOCK. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 h. 22. Αφαίρεση 100λ διαλύματος BLOCK και προσθήκη 100λ διαλύματος αντισώματος. Επώαση στους 4 ο C για h. Στα επόμενα στάδια γίνεται επαγωγή της χρωστικής BM Purple 23. Αφαίρεση 100λ διαλύματος αντισώματος και προσθήκη 100λ διαλύματος TBST. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για Αφαίρεση 100λ διαλύματος TBST και προσθήκη 100λ διαλύματος TBST. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για Επανάληψη του βήματος 24, 4 φορές. 26. Αφαίρεση 100λ διαλύματος TBST και προσθήκη 100λ διαλύματος AP Buffer. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για Αφαίρεση 100λ διαλύματος AP Buffer και προσθήκη 100λ διαλύματος AP Buffer. Επώαση σεθερμοκρασία δωματίου για Αφαίρεση 100λ διαλύματος AP Buffer και προσθήκη 100λ διαλύματος AP (με levamisole και 20% Tween-20). Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για Αφαίρεση 100λ διαλύματος AP (με levamisole και 20% Tween-20) και προσθήκη 100λ χρωστικής. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι μέχρι να δράσει η χρωστική.

79 Ακολουθεί η διακοπή της διαδικασίας χρώσης 30. Αφαίρεση 100λ χρωστικής και προσθήκη 100λ διαλύματος TBST (με 50mM EDTA). Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για Αφαίρεση 100λ διαλύματος και προσθήκη 100λ διαλύματος TBST (με 50mM EDTA). Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για Επανάληψη του βήματος Αφαίρεση 100λ διαλύματος TBST (με 50mM EDTA) και προσθήκη 100λ διαλύματος TBST. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για Επανάληψη του βήματος Αφαίρεση 100λ διαλύματος TBST και προσθήκη 100λ διαλύματος γλυκερόλης σε PBS,( η γλυκερόλη είναι σε συγκέντρωση >50%). 36. Παρατήρηση σε μικροσκόπιο, φωτογράφηση και φύλαξη στο ψυγείο (4 ο C). Διαλύματα 10x PBS Σε τελικό όγκο 100ml: 1,44gr Na 2 HPO 4 O,24gr KH 2 PO 4 9grNaCl Πεχαμέτρηση στο ph 7,4. 20x SSC ph 5 Σε τελικό όγκο 100ml: 17,53gr NaCl 8,82gr Sodium Citrate Πεχαμέτρηση στο ph 5. 20% TWEEN-20: Αραίωση 1:5 σε DEP H 2 O, 100% Tween-20 79

80 1X PBST: Αραίωση 1:10, 10Χ PBS και 1:200, 20% Tween-20 σε DEP H2O Σε τελικό όγκο 50ml: 5ml 10x PBS 250μl 20% Tween-20 44,75ml DEP H 2 O Hybe Buffer : 50% Formamide 5Χ SSC pη 5 50 μg/ml yeast trna 50 μg/ml heparin 0,1 % Tween-20 20Χ SSC ph 7 Σε τελικό όγκο 100ml: 17,53gr NaCl 8,82gr Sodium Citrate Πεχαμέτρηση στο ph 7. 2X SSCT : Αραίωση 1:10, 20Χ SSC και 1:200, 20% Tween-20 σε DEP H2O. Σε τελικό όγκο 2ml: 200μl 20Χ SSC ph 7 10μl 20% Tween μl DEP H 2 O 0,2X SSCT: Αραίωση 1:100, 20Χ SSC και 1:200, 20% Tween-20 σε DEP H2O. Σε τελικό όγκο 2ml: 20μl 20Χ SSC ph 7 10μl 20% Tween μl DEP H 2 O 0,1X SSCT: Αραίωση 1:200 20Χ SSC και 1:200 20% tween-20 σε DEP H 2 O.

81 Σε τελικό όγκο 2ml: 10μl 20Χ SSC ph 7 10μl 20% Tween μl DEP H 2 O Διάλυμα 50/50 Σε τελικό όγκο 2ml: 1000μl διάλυμα υβριδοποίησης 1000μl 2X SSCT 10Χ TBS Σε τελικό όγκο 100ml: 6,1 gr Tris-Cl 8,8gr NaCl Πεχαμέτρηση στο ph 7,5. 1X TBST: Αραίωση 1:10, 10Χ TBS και 1:200, 20% Tween-20 σε DEP H2O. Σε τελικό όγκο 50ml: 5ml 10x TBS 250μl 20% Tween20 44,75ml DEP H 2 O Διάλυμα BLOCK Σε τελικό όγκο 3210μl : 3ml TBST 60μl sheep serum 150μl 100ng/μl BSA Αραίωση DIG αντισώματος Η αραίωση του αντισώματος γίνεται (1:2000) σε διάλυμα blocking 1500μl BLOCK 0,75μl DIG αντισώματος. 81

82 AP Buffer Σε τελικό όγκο 50ml: 5ml 1M Tris-HCl ph 9.5 1ml 5M NaCl 2.5ml 1M MgCl2 41.5ml H 2 O TBST/EDTA Σε τελικό όγκο 10ml: 9ml TBST 1ml 0,5M EDTA ph 8.0 Διάλυμα AP BUFFER (Levamisole, Tween-20) 5.2ml AP Buffer 26μl Levamisole 26μl 20% Tween-20 Διάλυμα Γλυκερόλης/PBS Σε τελικό όγκο 1ml: 500μl Γλυκερόλη 100% 100μl PBS 10X 400μl Η 2 Ο Διάλυμα χρωστικής Σε τελικό όγκο 1ml: 100μl dimethyl formamide (10%) 100μl Tris HCl ph 9,5 (0,1M) 50μl MgCl2 (50mM) 20μl NaCl (0,1M)

83 1μl Levamisole (1mM) 4,5μl 100mg/ml NBT 3,5μl 50mg/ml BCIP 721μl H 2 O Δράση διαλυμάτων PBST: Ενυδάτωση εμβρύων. Δημιουργία ιδανικών συνθηκών για τα κύτταρα εφόσον είναι ισοτονικό προς αυτά και δεν τα σπάει ούτε τα συρρικνώνει. TWEEN-20: Ήπιο απορρυπαντικό για την εμπόδιση δημιουργίας συσσωματωμάτων των πρωτεϊνών Διαλυμα υβριδοποίησης: 1. Μείωση της θερμοκρασίας τήξης (Tm) με τη χρήση φορμαμιδίου, επομένως μείωση της θερμοκρασίας υβριδοποίησης η οποία εάν ήταν υψηλή θα κατέστρεφε τους ιστούς. 2. Προστασία του RNA από τη δράση των RNA νουκλεασών, εφόσον καταστέλλεται η δράση τους στο φορμαμίδιο. 3. Ειδική αντίδραση του ιχνηθέτη με το επιθυμητό RNA και μείωση του background διότι το trna του διαλύματος υβριδοποίησης προσδένεται σε όλες τις μη ειδικές θέσεις. 4. Διατήρηση του ph και δημιουργία συνθηκών υβριδοποίησης, διότι περιέχει αλάτι που είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη διαδικασία της υβριδοποίησης (20Χ SSC). 5. Βελτίωση των συνθηκών αντίδρασης με τη χρήση της heparine. Fluorescence in situ hybridization Η φθορίζουσα in situ υβριδοποίηση ( FISH) είναι μία τεχνική που βασίζεται στις μεθόδους in situ υβριδοποίησης και χρησιμοποιεί αντί για ραδιενεργό σήμα ή χρωμογενετικό δίνει σήμα με την μορφή φθορισμού. Αυτή η μέθοδος είναι μια 83

84 έμμεση τεχνική ανίχνευσης χρησιμοποιώντας νουκλεικά οξέα, και βασίζεται στην συμπληρωματικότητα μεταξύ ανιχνευτή και αλληλουχίας στόχου στην οποία υβριδοποιείται με πολύ ισχυρούς δεσμούς. Η ανίχνευση του σήματος γίνεται με μικροσκοπία φθορισμού ή συνεστιακή μικροσκοπία. Επιπλέον, αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο για τον καθορισμό των χωροχρονικών προτύπων γονιδιακής έκφρασης. Η συγκεκριμένη in situ υβριδοποίηση χρησιμοποιεί ενίσχυση σήματος φθορισμού μέσω μιας τεχνολογίας που ονομάζεται TSA ( Tyramide Signal Amplification) της εταιρίας Perkin Elmer. Συγκεκριμένα, αφού γίνει σήμανση με DNP, και επώαση αντισώματος με προδεδεμένη υπεροξειδάση δημιουργούνται ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που αντιδρούν με τα τιραμίδια δίνοντας ελεύθερες ρίζες τυραμιδίου οι οποίες δημιουργούν ομοιοπολικούς δεσμούς με κατάλοιπα τυροσίνης κοντά στην υπεροξειδάση ( πάνω στην υπεροξειδάση και το αντίσωμα). Οι μη δεσμευμένες ελεύθερες ρίζες τυραμιδίου αντιδρούν μεταξύ τους σχηματίζοντας διμερή και απομακρύνονται με εκπλύσεις. Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε είναι το Lab practical sea urchin/starfish WMISH Protocol Protocol contributed by Carmen Andrikou, Rossella Annunziata & M. Ina Arnone Διαδικασία : DNP labeling: το probe για την σήμανση με DNP που χρησιμοποιείται είναι έτοιμο από την εταιρία MIRUS. Σε τελικό όγκο 20μl :

85 2μg RNA Nuclease free H 2 O Αποδιάταξη του RNA στους 70 ο C για 5 Προσθήκη 10x Mirus labeling Buffer A: 2μl Label DNP reagent: 2μl Επώαση στους 37 ο C για 2h Καθαρισμός προιόντος μέσω κολώνας G50 δύο φορές. Υβριδοποίηση 1. Συλλέγεται από όλα τα στάδια ποσότητα μονιμοποιημένων σε MeOH εμβρύων (~100μl) και τα έμβρυα αφήνονται να καθιζάνουν. 2. Ακολουθούν 5 εκπλύσεις των εμβρύων με 100μl MOPS Buffer, επώαση σε RT για 15 σε κάθε πλύση. 3. Αφαίρεση 100μl MOPS Buffer και προσθήκη 100μl Buffer υβριδοποίησης, επώαση στους 50 ο C για 1:30h. 4. Αφαίρεση 100μl Buffer υβριδοποίησης και προσθήκη 100μl Buffer υβριδοποίησης, επώαση στους 50 ο C για 1:30h. 5. Αφαίρεση 100μl Buffer υβριδοποίησης και προσθήκη 100μl ιχνηθέτη σε συγκέντρωση 0,3ng/μl, επώαση στους 50 ο C για 5 μέρες. Εκπλύσεις από την περίσσεια του ιχνηθέτη 6. Αφαίρεση 100μl του ιχνηθέτη και προσθήκη 100μl Post Hybe Buffer, επώαση στους 5 ο C για 1:30 h. 7. Αφαίρεση 100μl Post Hybe Buffer και προσθήκη 100μl Post Hybe Buffer, επώαση στους 50 ο C για 1:30 h. 8. Ακολουθούν 5 εκπλύσεις με 100μl MOPS Buffer, επώαση σε RT για 15 σε κάθε πλύση. Blocking και επώαση με αντίσωμα 9. Αφαίρεση 100μl MOPS Buffer και προσθήκη 100μl Perking Elmer Blocking reagent, επώαση σε RT για Αφαίρεση 100μl Perkin Elmer Blocking reagent και προσθήκη αντισώματος με αραίωση 1/1000, επώαση για O/N στους 4 ο C. 85

86 Εκπλύσεις από την περίσσεια αντισώματος 11. Ακολουθούν 5 εκπλύσεις με 100μl MOPS Buffer, επώαση σε RT για 15 σε κάθε πλύση. 12. Αφαίρεση 100μl MOPS Buffer και προσθήκη 100μl amplification diluents,επώαση σε RT για Αφαίρεση 100μl amplification diluents και προσθήκη Cy3 ή Cy5 amplification reagent, επώαση σε RT για 15 στο σκοτάδι. 14. Ακολουθούν 5 εκπλύσεις με MOPS Buffer, επώαση σε RT για 15 στο σκοτάδι μετά από κάθε πλύση. Παρατήρηση σε Confocal μικροσκόπιο 15. Αφαίρεση 100μl MOPS Buffer και προσθήκη σε αραίωση 1/1000 DAPI, επώαση σε RT για 15 στο σκοτάδι. 16. Αφαίρεση 100μl DAPI και προσθήκη 75% γλυκερόλη. Διαλύματα MOPS Buffer: Σε τελικό όγκο 50ml: 0.1M MOPS ph:7 0.5M NaCl 0.1% Tween -20 H 2 O mq-dep Buffer υβριδοποίησης: Σε τελικό όγκο 10ml: 70% formamide 0.1M MOPS ph:7 0.5M NaCl 0.1% Tween-20 1mg/ml BSA H 2 O mq-dep 50μg/ml Yeast trna Post Hybe Buffer

87 Σε τελικό όγκο 10ml : 70% formamide 0.1M MOPS ph:7 0.5 NaCl 0.1 Tween -20 1mg/ml BSA H 2 O mq-dep Ένεση αντινοηματικών morpholinos σε αυγά αχινού Με την διαδικασία ενέσεων ειδικών αντινοηματικων morpholinos σε αγονιμοποίητα έμβρυα αχινού πραγματοποιείται καταστολή της έκφρασης των υπό μελέτη παραγόντων. Με αυτόν τον τρόπο μελετάται η αλληλεπίδραση τω ν υπό μελέτη γονιδίων με τους κατασταλμένους παράγοντες. Μετά την ένεση με τις ειδικές αλληλουχίες αντινοηματικες ως προς το mrna των υπό μελέτη παραγόντων πραγματοποιείται γονιμοποίηση των αυγών και αναπτύσσονται σε ειδικό ψυγείο στους 18 ο C για 22 με 28h. Ακολουθεί διαδικασία συλλογής εμβρύων και μονιμοποίησης τους. Τα αποτελέσματα από την καταστολή της έκφρασης των παραγόντων μελετώνται μέσω in situ υβριδοποίησης σε 96 Well plates, και συγκρίνονται με μη ενεμμένα έμβρυα ελέγχου. 87

88 Τρόπος λειτουργίας Morpholino. Μονιμοποίηση εμβρύων ελέγχου και ενεμμένων εμβρύων με morpholinos. Διαδικασία 1. Έχουν συλλεχθεί έμβρυα σε πολύ μικρό όγκο θαλασσινού νερού μέσα σε πηγαδάκια της 96well plate. 2. Προσθήκη 400μl διαλύματος Fixative 1, επώαση σε RT για 1h. 3. Αφαίρεση 400μl μονιμοποιητικού διαλύματος και προσθήκη 400μl MOPS Buffer, επώαση σε RT για Ακολουθούν άλλες 2 εκπλύσεις με 400μl MOPS buffer, επώαση 15 σε RT μετά από κάθε πλύση. 5. Αφαίρεση 400μl MOPS Buffer και προσθήκη 200μl 75% Ethanol 6. Αποθήκευση στους -20 ο C για τουλάχιστον 1h πριν την χρήση τους για in situ υβριδοποίηση. Διαλύματα Fixative 1: Σε τελικό όγκο 15ml: 4% paraformaldehyde 0.1M MOPS ph:7 0.5 NaCl H 2 O mq-dep Το διάλυμα χωρίζεται σε aliquots και συντηρείται στους -20 ο C. Απομόνωση RNA Κατά την διαδικασία αυτή χρησιμοποιήθηκε το Kit της εταιρίας QIAGEN RNeasy Micro Kit. Διαδικασία 1. Συλλογή εμβρύων σε πολύ μικρό όγκο θαλασσινού νερού σε ένα σωληνάριο τύπου eppendorf 1,5ml στον πάγο. 2. Φυγοκέντρηση για 10 σε full speed σε ψυχόμενη φυγόκεντρο στους 4 ο C. 3. Αφαίρεση όλου του νερού με μεγάλη προσοχή. 4. Προσθήκη 350μl RTL Buffer

89 5. Vortex για να επιτευχθεί λύση των κυττάρων. 6. Προσθήκη ενός όγκου 70% αιθανόλη, πολύ καλή ανακίνηση με πιπέτα. 7. Μεταφορά του δείγματος σε μια RNeasy Min Elute κολώνα τοποθετημένη σε ένα 2ml tube. Φυγοκέντρηση για 15. Απορρίπτουμε από το tube ότι πέρασε. 8. Προσθήκη 350μl RW1 Buffer. Φυγοκέντρηση για 15. Απορρίπτουμε από το tube ότι πέρασε. 9. Προσθήκη 80μl DNase σε RDD buffer στο κέντρο της κολώνας και επωάζω σε RT για Προσθήκη 350μl RW1 Buffer. Φυγοκέντρηση για 15. Απορρίπτουμε το tube. 11. Μεταφορά της κολώνας σε καινούριο 2ml tube. Προσθήκη 500μl RPE Buffer. Φυγοκέντρηση για 15. Απορρίπτουμε από το tube ότι πέρασε. 12. Προσθήκη 500μl 80% αιθανόλη. Φυγοκέντρηση για 2. Απορρίπτουμε το tube. 13. Μεταφορά της κολώνας σε νέο 2ml tube. Ξηρή φυγοκέντρηση σε full speed για 5. Απορρίπτουμε το tube. 14. Μεταφορά της κολώνας σε καθαρό σωληνάριο τύπου eppendorf. Προσθήκη 14μl RNase free H2O. φυγοκέντρηση σε fyll speed για 1. Απορρίπτουμε την κολώνα, και συλλέγουμε το RNA στο σωληνάριο. Δημιουργία CDNA Κατά την διαδικασία δημιουργίας CDNA χρησιμοποιήθηκε το Kit της εταιρίας TAKARA (Perfect Real Time). Διαδικασία Σε τελικό όγκο 10μl: 5X Prime Script Buffer : 2μl Επωάζουμε ως εξής: Βήμα 1 ο :37 ο C για 15 Βήμα 2 ο : 85 ο C για 5 Prime Script RT Enzyme Mix1: 0.5μl Oligo dt Primer (50μΜ) :0.5μl Random 6 mers (100 μμ) : 0.5μl Total RNA: 500ng/10μl RNase Free dh2o : ως τον όγκο των 10μl στην αντίδραση. 89

90 Βήμα 3 ο : Τέλος Αποθηκεύεται στους -20 ο C. Πραγματικού χρόνου PCR (QPCR) Real-time polymerase chain reaction Η Real time PCR είναι μία τεχνική που βασίζεται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Σε αντίθεση με την απλή PCR στην qpcr παραγόμενου DNA η ποσότητα του μετριέται μετά το τέλος κάθε κύκλου μέσω φθορίζουσων χρωστικών οι οποίες αυξάνουν την απόδοση του φθορισμού (σήμα ) σε κάθε παραγόμενο μόριο. Τα δεδομένα συλλέγονται κατά την εκθετική φάση απόδοσης της αντίδρασης. Ο αναφερόμενος φθορισμός που χρησιμοποιείται περιλαμβάνει δίκλωνα μόρια DNA συνδεδεμένα με χρωστικές ουσίες ή μόρια χρωστικών συνδεδεμένα με τους εκκινητές της PCR ή ανιχνευτες που υβριδοποιούνται με τα προιόντα της PCR κατά την διάρκεια του πολλαπλασιασμού/ ενίσχυσης. Η μεταβολή του φθορισμού κατά την διάρκεια της αντίδρασης μετριέται με ένα όργανο που έχει την ικανότητα να συνδυάζει τον θερμικό κυκλοποιητή και την ανίχνευση φθορισμού. Η πραγματικού χρόνου PCR δίνει διαγράμματα συνδυάζοντας την μέτρηση του φθορισμού με τους κύκλους της PCR δημιουργεί μια καμπύλη που έχει συσσωρέυσει τον φθορισμό από όλη την αντίδραση.

91 Όλες οι αντιδράσεις qprc πραγματοποιήθηκαν με αντιδραστήρια της εταιρίας KAPA BIOSYSTEMS. Σε τελικό όγκο 10μl: Primer Forward: 0.2μl Primer Reverce: 0.2μl c-dna: (2.5ng/μl από το αρχικό RNA): 2μl Mix2X: 5μl H 2 O: 2,6μl 91

92 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

93 Όπως αναφέρεται και στο σκοπό επιλέχθηκαν γονίδια στα οποία θα μελετηθούν οι αλληλεπιδράσεις τους με τον Coup-TF. Μελετώντας τα βιβλιογραφικά δεδομένα παρατηρήθηκε ότι η έκφραση τους είναι στις ίδιες περιοχές έκφρασης του Coup-TF τόσο στο πρόσθιο νευροεξώδερμα (ΑΝΕ) όσο και στο στοματικό εξώδερμα (ΟΕ) και στη βλεφαριδωτή ζώνη (CB). Χρήσιμο εργαλείο φάνηκε το γονιδιακό δίκτυο του αχινού Strongylocentrotus Purpuratus από το εργαστήριο του Eric H.Davidson στο οποίο αναφέρονται αναλυτικά οι αλληλεπιδράσεις όλων των γονιδίων που μετέχουν στην δημιουργία των παραπάνω ιστών. Όπως φαίνεται και στις παρακάτω εικόνες τα γονίδια gsc, ets4, fez, sip1, not, six3, foxq2 εκφράζονται αλληλεπιδρώντας με άλλα γονίδια δίνοντας ενεργοποιητικά ή κατασταλτικά σήματα μέσα στο δίκτυο. Εικόνα 39: GRN του εξωδέρματος του αχινού Strongylocentrotus purpuratus από το εργαστήριο του Eric H.Davidson, με κόκκινους κύκλους συμβολίζονται τα γονίδια τα οποία έχουν τεθεί υπό μελέτη στην παρούσα εργασία. 93

94 Εικόνα 40:GNR της στοματικής περιοχής του ζωικού πόλου του αχινού Strongylocentrotus purpuratus,eric H.Davidson lab, με κόκκινους κύκλους συμβολίζονται τα γονίδια που μελετώνται στην παρούσα εργασία.

95 Ελαττωματική ανάπτυξη του νευρικού συστήματος μετά από αποσιώπηση του Coup-TF Το γονίδιο synb αποτελεί έναν πανευρωνικό μάρτυρα. Χρήση της SynB έγινε για να εκτιμήσουμε το αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων του Coup-TF με παράγοντες οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για την δημιουργία του νευρικού συστήματος του αχινού. Πραγματοποιήθηκαν fluorescence in situ υβριδοποιήσεις για τον εντοπισμό και καθορισμό των νευρώνων μέσω της έκφρασης του γονιδίου synb. Η ανίχνευση της έκφρασης της SynB έγινε με FISH σε σειρά εμβρύων από το αυγό ως το στάδιο του πλουτέα. Μελετήθηκε επίσης, η έκφραση της SynB μετά από καταστολή του Coup- TF σε έμβρυα 28 ωρών μετά την γονιμοποίηση. Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Επιλέχθηκαν κατάλληλοι εκκινητές για την απομόνωση όλης της κωδικής περιοχής του γονιδίου στον PL, των οποίων η αλληλουχία βρίσκεται στο παράρτημα. Η διαδικασία με την οποία πραγματοποιήθηκε αναφέρεται αναλυτικά στα υλικά και μεθόδους. Το μέγεθος του προϊόντος ήταν 1274 bp και πραγματοποιήθηκε RT-PCR με ολικό RNA για την απομόνωση του. Είχαν επιλεχθεί δύο ζευγάρια εκκινητών τα χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του επιθυμητού cdna. Τα προϊόντα μετά την RT-PCR ηλεκτροφορήθηκαν (εικόνα 41) και έδιναν και τα δύο ζευγάρια εκκινητών το επιθυμητό αποτέλεσμα. Επιλέχθηκε το προιόν της ζώνης 1. Εικόνα 41; Ηλεκτροφόρηση RT-PCR προϊόντος,μ ; μάρτυρας 1Κb,1,2 : προιόντα με δυο διαφορετικά ζευγάρια εκκινητών Το προϊόν της ζώνης 1 ενθέθηκε σε φορέα και συλλέχτηκε από μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Ηλεκτροφορήθηκαν 9 κλώνοι για να διαπιστώσουμε εάν είχαμε το επιθυμητό αποτέλεσμα (εικόνα 43). Επιλέχθηκαν οι κατάλληλοι κλώνοι με βάση 95

96 τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης (εικόνα 43) που στάλθηκαν για αλληλούχιση. Εικόνα 42: Ηλεκτροφόρηση κλώνων μετά από πέψη με EcoR1, M:μάρτυρας 1Κb, 1,2,3.: αριθμοί κλώνων. Επιλέχθηκε συγκεκριμένα ο κλώνος 9, του οποίου η αλληλουχία βρίσκεται στο παράρτημα, και ακολούθησε PCR σε δύο αντιδράσεις(εικόνα 43), και in vitro μεταγραφή (εικόνα 43) για την δημιουργία αντινοηματικού και νοηματικού ιχνηθέτη με χρήση sp6 πολυμεράσης. Εικόνα 43: Αριστερά :Ηλεκτροφόρηση PCR προιόντος με Μ13 εκκινητές. Μ: μάρτυρας 1Kb,1,2: δύο αντιδράσεις. Δεξία εικόνα:ηλεκτροφόρηση προιόντων μετά από in vitro μεταγραφή, Μ: ολικό RNA,S: νοηματικός ιχνηθέτης,α: αντινοηματικός ιχνηθέτης

97 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου SynB και δημιουργία ιστοειδικού προτύπου έκφρασης. Πραγματοποιήθηκαν Fluorescence in situ υβρισοποιήσεις για να ανιχνευθεί η έκφραση της SynB σε όλα τα πρώιμα και όψιμα αναπτυξιακά στάδια του αχινού Pl, με χρήση του αντινοηματικού ιχνηθέτη (εικόνα 44). Εικόνα 44: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του γονιδίου SynB στον αχινό Paracentrotus lividus, Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, BL: βλαστίδιο, G: γαστρίδιο, PR: πρίσμα, PL:πλουτέας Η έκφραση του γονιδίου SynB χαρτογραφεί την ύπαρξη νευρικών ή προγονικών νευρικών κυττάρων(εικόνα44). Στα πρώτα εμβρυικά στάδια μέχρι και το στάδιο του βλαστιδίου δεν υπάρχει έκφραση του γονιδίου synb. Στα επόμενα στάδια φαίνεται να ενεργοποιείται η έκφραση της SynB, Στο στάδιο του γαστριδίου η έκφραση εντοπίζεται στα κύτταρα που αποτελούν τα προγονικά κύτταρα των νευρικών κυττάρων. Σε πιο ώριμα γαστρίδια έχουμε έκφραση και στα κύτταρα του ANE που θα δημιουργήσουν τους σεροτονεργικούς νευρώνες. Στο επόμενο στάδιο του πρίσματος ανιχνεύεται έκφραση στα προγονικά νευρικά κύτταρα της βλεφαριδωτής ζώνης, στα προγονικά πλευρικά νευρικά γάγγλια και στα κύτταρα των σεροτονεργικών νευρωνων. 97

98 Στο στάδιο του πλουτέα ανιχνεύεται έκφραση γύρω από το στόμα στην βλεφαριδωτή ζώνη αλλά και στα πλευρικά γάγγλια και τους σεροτονεργικούς νευρώνες (εικόνα 45). Εικόνα 45: απεικόνιση ιστοειδικής έκφρασης του γονιδίου SynB σε πλουτείς. 48h μετά την γονιμοποίηση,. Σε διαφορετικές θέσεις, με κόκκινο απεικονίζονται τα κύτταρα τα οποία εκφράζουν SynB, με μπλε απεικονίζονται φθορίζοντες πυρήνες με DAPI.

99 Ανίχνευση της έκφραση του γονιδίου SynB σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Μετά από καταστολή του Coup-TF με χρήση Morpholino σε έμβρυα, πραγματοποιήθηκαν Fluorescence in situ υβριδοποιήσεις, σε έμβρυα 28 ωρών μετά την γονιμοποίηση, με αντινοηματικό ιχνηθέτη SynB. Εικόνα 46:FISH με SynB αντινοηματικό ιχνηθέτη.από πάνω προς τα κάτωέμβρυα ελέγχου 28h μετά την γονιμοποίηση. Κάτω δεξιά και αριστερά : ΜASO Coup-TF έμβρυα. Με μπλε απεικονίζονται οι φθορίζοντες πυρήνες των εμβρύων με Dapi. Με κόκκινο χρώμα, φθορίζει η έκφραση της SynB. Από τα αποτελέσματα της in situ υβριδοποίησης φαίνεται ότι το γονίδιο synb δεν εκφράζεται στα ενεμμένα με MASO Coup-TF έμβρυα. Είναι πολύ πιθανό να υπάρχει έκφραση η οποία είναι ασθενής και δεν μπορεί να ανιχνευτεί, ή να μην διαφοροποιούνται νευρικά κύτταρα στα έμβρυα. 99

100 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Coup-TF μετά την καταστολή του. Από προηγούμενα πειράματα είναι γνωστό το ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του μεταφραφικού παράγοντα Coup-TF (εικόνα 47), από το στάδιο του ωαρίου ως το στάδιο του πλουτέα {Kalampoki and Flytzanis, 2014}όπως και το ποσοτικό πρότυπο έκφρασης του στα ίδια στάδια. Εικόνα 47: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης Coup-TF{Kalampoki, 2014 #1639} Ο Coup-TF είναι μητρικός παράγοντας εκφράζεται δηλαδή από το στάδιο του αυγού. Από το στάδιο του βλαστιδιού, ανιχνεύουμε την ζυγωτική έκφραση του mrna του Coup TF. Στο στάδιο του γαστριδίου, αλλά και στα στάδια του πρίσματος και του πλουτέα, φαίνεται η ειδική έκφραση του στο στοματικό εξώδερμα και στις περιοχές του πρόσθιου νευροεξωδέρματος και της βλεφαριδωτής ζώνης. Ο κλώνος του γονιδίου Coup-TF που χρησιμοποιήθηκε παρασκευάστηκε από τον Ιωάννη Τσιρώνη. Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Coup-TF Για την παρασκευή καινούργιου αντινοηματικού ιχνηθέτη πραγματοποιήθηκε PCR σε δύο ίδιες αντιδράσεις και ηλεκτροφόρηση των προιόντων (εικόνα 48), in vitro μεταφραφή (εικόνα 48) και σήμανση με DNP και διγοξιγενίνη. Εικόνα 48: A Ηλεκτροφόρηση προιόντων PCR με Μ13 εκκινητές, Μ μάρτυρας 1Kb,1,2 προιόντα PCR,B Ηλεκτροφόρηση προιόντος μετά από in vitro μεταγραφή, 1 ολικό RNA,2 προιόν

101 Ανίχνευση έκφρασης Coup-TF σε έμβρυα που έχει κατασταλεί Για να ανιχνευθεί η έκφραση του Coup-TF όταν αυτός καταστέλλεται πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις σε έμβρυα ελέγχου και Coup-TF MASO έμβρυα, με χρήση αντινοηματικού ιχνηθέτη Coup-TF(εικόνα 49). Εικόνα 49:WMISH σε έμβρυα 24h μετά την γονιμοποίηση, με αντινοηματικό ιχνηθέτη Coup-TF. Α: έμβρυα ελέγχου, L: lateral view, V: vegetal view, Β: Έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF 0.125mM Ο μεταγραφικός παράγοντας Coup-TF είναι ένας μητρικός παράγοντας ο οποίος όπως έχει αναφερθεί συμβάλλει στην κανονική ανάπτυξη του εμβρύου του αχινού. Η έλλειψη του οδηγεί σε θάνατο, αλλά και η αποσιώπηση του δημιουργεί πολλές αναπτυξιακές ανωμαλίες στα έμβρυα είτε μορφολογικές, είτε προκαλώντας καθυστερημένη ανάπτυξη. Αξίζει να σημειωθεί ότι ανιχνεύεται mrna του γονιδίου Coup-TF στα Morphants Coup-TF. Αυτό συμβαίνει διότι μετά την ένεση με το Morpholino δεν καταστρέφεται το mrna αλλά μπλοκάρεται η μετάφραση του. Η διαφορετική μορφολογία αλλά και η καθυστερημένη ανάπτυξη του εμβρύου ήταν εμφανείς. Τα έμβρυα ενώ βρίσκονταν χρονικά (24h) στο στάδιο του γαστριδίου μορφολογικά έδιναν φαινότυπο μεταξύ σταδίων βλαστιδίου- γαστριδίου. Πολλά ενεμμένα έμβρυα έδιναν πιο extreme φαινότυπο, ο οποίος δεν αντιστοιχούσε στην οικεία διαμόρφωση των εμβρύων του αχινού. Σε όλες τις in situ υβριδοποιήσεις που 101

102 χρησιμοποιήθηκαν έμβρυα ενεμμένα με Morpholino Coup-TF η μορφολογία τους ήταν παρόμοια με αυτή που μόλις περιγράφηκε. Η αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Six3 Για να μελετηθεί η αλληλεπίδραση του Coup-TF με το six3 γονίδιο, πραγματοποιήθηκαν, δημιουργία ποσοτικού και αναπτυξιακού προτύπου έκφρασης του γονιδίου six3. Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Six3 Ο κλώνος του γονιδίου Six3 που χρησιμοποιήθηκε έχει απομονωθεί από την Μπάρου Βίκυ. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε ο κλώνος 3. Πραγματοποιήθηκε PCR με Μ13 εκκινητές και ηλεκτροφόρηση του δείγματος για την πιστοποίηση της επιθυμητής ζώνης(εικόνα 50). Ακολούθησε διαδικασία καθαρισμού του προϊόντος και in vitro μεταγραφή με Sp6 RNA polymerase για την δημιουργία Diq-ιχνηθέτη. Εικόνα 50: Ηλεκτροφόρηση PCR προιόντος με Μ13 εκκινητές. Μ: μάρτυρας 1Kb

103 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Six3 και δημιουργία ιστοειδικού προτύπου έκφρασής του Για να μελετήσουμε το γονίδιο six3 αναγκαία ήταν η επιβεβαίωση της έκφρασής του σε περιοχές που εκφράζεται και ο Coup-TF. Αυτό επιτεύχθηκε με την δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου six3 σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια για τον αχινό Pl με αντινοηματικό ιχνηθέτη Six3 (εικόνα 51). Εικόνα 51: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Six3, Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, BL: βλαστίδιο, G: γαστρίδιο, PR: πρίσμα, PL: πλουτέας. Ο μεταφραφικός παράγοντας Six3 δεν εμφάνισε μητρική έκφραση, επιβεβαιώνοντας και βιβλιογραφικά δεδομένα{garner, 2016 #1664}. Η έκφραση του ξεκινά στο στάδιο του βλαστιδίου (εικόνα 51), κυρίως στο εκτεταμμένο πρόσθιο νευροεξώδερμα αφήνοντας ένα κενό στο κέντρο του όπου εκφράζονται άλλα σημαντικά γονίδια όπως θα δούμε παρακάτω. Στο γαστρίδιο φαίνεται και η έκφρασή του στο έντερο αλλά και στο πρόσθιο νευροεξώδερμα. Στα στάδια του πρίσματος και 103

104 πλουτέα φαίνεται η έκφραση στους διαφοροποιημένους ιστούς που προήλθαν από το πρόσθιο νευροεξώδερμα, ( apical organ). Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Six3 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να ανιχνευθεί η έκφραση του six3 γονιδίου σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF πραγματοποιήθηκαν in situ υβρισοποιήσεις σε έμβρυα, 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, ελέγχου και ενεμμένα με Coup-TF MASO. O αντινοηματικός ιχνηθέτης που χρησιμοποιήθηκε είναι ο Six3 ( εικόνα 52). Εικόνα 52: WMISH με αντινοηματικό ιχνηθέτη Six3.CTRL: Έμβρυο ελέγχου 24 h μετά από τη γονιμοποίηση,maso Coup-TF: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF 0.125mM 24h. 1,2.αριθμός διαφορετικών πειραμάτων. Ο μεταγραφικός παράγοντας Six3, όπως φαίνεται στην (εικόνα 52)στα πειράματα 1,3,4 και 5 βρέθηκε να επηρεάζεται αρνητικά από την καταστολή του Coup-TF, η

105 οποία οδηγεί σε μείωση ή και καταστολή της έκφρασής του. Τα έμβρυα τα οποία δεν έχουν ακραίο φαινότυπο δείχνουν να εκφράζουν το γονίδιο six3 όπως τα έβρυα ελέγχου. Ενώ, η έκφραση του six3 στα έμβρυα τα οποία έχουν τον χαρακτηριστικό ακραίο φαινότυπο που δημιουργείται από την έλλειψη του Coup-TF, διαφέρουν από τα έμβρυα ελέγχου. Το γονίδιο six3 φαίνεται να ανιχνεύεται σε πολύ μικρότερη περιοχή ή και καθόλου στα Morphants Coup-TF σε σχέση με τα έμβρυα ελέγχου. 105

106 Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου Six3 στον αχινό Paracentrotus lividus Απομονώθηκε RNA και δημιουργήθηκε cdna από τρεις διαφορετικές σειρές εμβρύων από το στάδιο του αυγού ως το στάδιο του πλουτέα. Πραγματοποιήθηκαν qpcr και τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με χρήση δύο γονιδίων αναφοράς, το γονίδιο 18s και ubicitin (εικόνα 53) Εικόνα 53: Γράφημα ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Six3 μετά από qpcr. Six3A :cdna από την Α βιολογική σειρά εμβρύων. Six3B : cdna από την Β σειρά εμβρύων.six3c: cdna από την C σειρά εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση με το γονίδιο αναφοράς 18s, με κόκκινο απεικονίζεται αντιστοίχως κανονικοποιημένη η έκφραση με το γονίδιο αναφοράς ουμπικιτίνη, με πράσινο χρώμα απεικονίζεται κανονικοποιημένη έκφραση και με τα δύο γονίδια αναφοράς.

107 Με τα αποτελέσματα των qpcrs και από τις τρεις σειρές εμβρύων (εικόνα 54), γίνεται ποσοτική ανάλυση με τυπικό σφάλμα ( εικόνα 55). 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0-0,01-0,02 Six3 egg 16c E.B L.G Pr Pl 2^-ΔCt Εικόνα 54: Γράφημα σχετικής ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Six3 και με τις τρεις βιολογικές σειρές εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση και με τα δύο γονίδια αναφοράς με την μέθοδο 2^- ΔCt. Το γονίδιο Six3 δεν φαίνεται να εκφράζεται στα πρώτα εμβρυικά στάδια αλλά να παρουσιάζει ενεργοποίηση της έκφρασης του από το στάδιο του πολύ πρώιμου βλαστιδίου. Δίνει το μέγιστο της έκφρασης του στο στάδιο του πλουτέα. Αυτό συνάδει με τα βιβλιογραφικά δεδομένα αφού αποτελεί μόριο κλειδί για την δημιουργία του νευρικού συστήματος στον αχινό{garner, 2016 #1664}. 107

108 Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Six3 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να διερευνηθεί αν επηρεάζεται ποσοτικά η έκφραση του γονιδίου six3 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, απομονώθηκε RNA από έμβρυα ελέγχου 24 ωρών μετα τη γονιμοποίηση και από MASO Coup-TF έμβρυα 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση. Έγινε σύνθεση των αντίστοιχων cdnas και πραγματοποιήθηκε qpcr με κατάλληλους εκκινητές για το γονίδιο six3 (εικόνα55). 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 ctrl Six3 maso Six3 Εικόνα 55: Γράφημα απεικόνισης του ποσοστού έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Six3 σε έμβρυα 24 h ελέγχου και ενεμμένων με MASO Coup-TF 0.125mM μετά από κανονικοποίηση με 2 γονίδια αναφοράς, ctrl: έμβρυα ελέγχου, maso: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF Όπως φαίνεται στην εικόνα 56 η έκφραση του γονιδίου six3 μειώνεται πάνω από 80% στα ενεμμένα έμβρυα. Το παραπάνω αποτέλεσμα συμφωνεί με την ιστοειδική προσέγγιση που έχει αναλυθεί πιο πάνω (εικόνα 53).

109 Ανίχνευση της έκφρασης του Coup-TF σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Six3 Για να ανιχνευθεί η έκφραση του Coup-TF σε έμβρυα που έχει κατασταλεί το γονίδιο six3, πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις με αντινοηματικό ιχνηθέτη Coup-TF σε έμβρυα ελέγχου και MASO Six3 έμβρυα (εικόνα 57). Εικόνα 56:WMISH με αντινοηματικό ιχνηθέτη Coup-TF. CTRL: Έμβρυο ελέγχου 24 h μετά τη γονιμοποίηση. MASO Six3: έμβρυα ενεμμένα με MASO Six3 02mM 24h μετά τη γονιμοποίηση, 1,2 αριθμός διαφορετικών πειραμάτων, L : lateral view, V: vegetal view Τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων δείχνουν ότι το γονίδιο six3 δεν επηρεάζει τον Coup-TF. Στο πείραμα 2 της εικόνας 56 φαίνεται η έκφραση του Coup- TF να μην διαφοροποιείται στα Morhants Six3. Στο πείραμα 1 αντιστοίχως, έχουμε έκφραση του Coup-TF σε όλη την περιοχή του εμβρύου, το οποίο πιθανόν οφείλεται σε τεχνικό σφάλμα. Η αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Fez Ο κλώνος που χρησιμοποιήθηκε για το γονίδιο Fez κατασκευάστηκε από τον Κάτσανο Δημήτρη. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε ο κλώνος νούμερο 8. Πραγματοποιήθηκε PCR με τους M13 εκκινητές, καθαρισμός του προϊόντος και in vitro μεταγραφή με την Sp6 polymerase για την δημιουργία του αντινοηματικού ιχνηθέτη 109

110 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Fez και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Για να μελετήσουμε το γονίδιο fez αναγκαία ήταν η επιβεβαίωση της έκφρασής του στις νευρογενενείς περιοχές που εκφράζεται και ο Coup-TF. Αυτό επιτεύχθηκε με την δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου fez σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια για τον αχινό Pl με αντινοηματικό ιχνηθέτη Fez (εικόνα57). Εικόνα 57: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Fez, Egg: στάδιο αυγού, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, BL: στάδιο βλαστιδίου, G: γαστρίδιο, PR:πρίσμα, PL: πλουτέας. Το γονίδιο Fez αρχίζει να εκφράζεται στο στάδιο του βλαστιδίου και στο στάδιο του γαστριδίου όπου επεκτείνεται σε μεγάλο μέρος του εμβρύου στον ζωικό πόλο. Στο στάδιο του πρίσματος η έκφρασή του περιορίζεται προς το κέντρο του πρόσθιου νευροεξωδέρματος ενώ στο στάδιο του πλουτέα εκφράζεται στο apical organ όπως φαίνεται και στην εικόνα 57,

111 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Fez στο πρόσθιο νευροεξώδερμα. Πραγματοποιήθηκε Fluorescence In situ υβριδοποίηση με αντινοηματικό ιχνηθέτη Fez. Έγινε ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου στα κύτταρα του πρόσθιου νευροεξώδερματος. Τα κύτταρα αυτά είναι τα κύτταρα που δίνουν τους σεροτονεργικούς νευρώνες(εικόνα 58). Εικόνα 58: Απεικόνιση της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Fez μετά από φθορίζουσα in situ υβριδοποίηση, V:vegetal view, L:lateral view. Με μπλε χρώμα απεικονίζονται οι πυρήνες με Dapi ενώ με πράσινο χρώμα απεικονίζεται η έκφραση του Fez στα κύτταρα του ΑΝΕ 111

112 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Fez σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να ανιχνευθεί η έκφραση του γονιδίου fez σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, πραγματοποιήθηκαν in situ υβρισοποιήσεις σε έμβρυα, 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, ελέγχου και ενεμμένα με Coup-TF MASO. O αντινοηματικός ιχνηθέτης που χρησιμοποιήθηκε είναι ο Fez ( εικόνα 59). Εικόνα 59: CTRL: Έμβρυο ελέγχου 24 h μετά από υβριδοποίηση με αντινοηματικό ιχνηθέτη Fez,MASO Coup-TF: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF 0.125mM 24h μετά από υβριδοποίηση με αντινοηματικό ιχνηθέτη Fez, 12,3 αριθμός διαφορετικών πειραμάτων. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων (εικόνα 60) δείχνουν ότι η έκφραση του γονιδίου fez δεν καταστέλλεται από τον Coup-TF. Η έκφραση του γονιδίου fez στα Coup-TF Morphants φαίνεται να είναι διάχυτη και όχι οργανωμένη όπως φαίνεται στα κύτταρα των εμβρύων ελέγχου. Πιθανή εξήγηση αποτελεί η ύπαρξη μιας αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο παραγόντων. Ο Coup TF δεν καταστέλλει τον Fez, αλλά φαίνεται πως η καταστολή του Coup-TF επάγει την έκφρασή του Fez σε μικρότερη περιοχή.

113 Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου Fez στον αχινό Paracentrotus lividus Απομονώθηκε RNA και δημιουργήθηκε cdna από τρεις διαφορετικές σειρές εμβρύων από το στάδιο του αυγού ως το στάδιο του πλουτέα. Πραγματοποιήθηκαν qpcr και τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με χρήση δύο γονιδίων αναφοράς, το γονίδιο 18s και ubicitin (εικόνα 60) Εικόνα 60:Γράφημα ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Fez μετά από qpcr FezA: cdna από την Α βιολογική σειρά εμβρύων FezB: cdna με β βιολογική σειρά εμβρύων.fezc:cdna με την C βιολογική σειρά εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση με το γονίδιο αναφοράς 18s, με κόκκινο απεικονίζεται αντιστοίχως κανονικοποιημένη η έκφραση με το γονίδιο αναφοράς ουμπικιτίνη, με πράσινο χρώμα απεικονίζεται κανονικοποιημένη έκφραση και με τα δύο γονίδια αναφοράς 113

114 Με τα αποτελέσματα των qpcrs και από τις τρεις σειρές εμβρύων (εικόνα 60), γίνεται ποσοτική ανάλυση με τυπικό σφάλμα ( εικόνα 61). 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0-0,02-0,04 Fez egg 16c E.B L.G Pr Pl 2^-ΔCt Εικόνα 61: Γράφημα σχετικής ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Fez και με τις τρεις βιολογικές σειρές εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση και με τα δύο γονίδια αναφοράς με την μέθοδο 2^- ΔCt. Όπως φαίνεται στα παραπάνω διαγράμματα ο μεταγραφικός παράγοντας Fez δεν έχει μητρική έκφραση. Η ενεργοποίηση της έκφρασής του ξεκινά στο στάδιο του ώριμου βλαστιδίου/γαστριδίου. Το μέγιστο της έκφρασης του εμφανίζεται στο στάδιο του πλουτέα όπου έχουμε την πλήρη ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων που εκφράζεται.

115 Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Fez σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να διερευνηθεί αν επηρεάζεται ποσοτικά η έκφραση του γονιδίου fez σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, απομονώθηκε RNA από έμβρυα ελέγχου 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, και από MASO Coup-TF έμβρυα 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση. Έγινε σύνθεση των αντίστοιχων cdnas και πραγματοποιήθηκε qpcr με κατάλληλους εκκινητές για το γονίδιο fez (εικόνα62). 1,2 Fez 1 0,8 0,6 0,4 Fez 0,2 0 ctrl maso Εικόνα 62: Γράφημα απεικόνισης του ποσοστού έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Fez σε έμβρυα ελέγχου και ενεμμένων με MASO Coup-TF 0.125mM 24h, ctrl: έμβρυα ελέγχου, maso: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF Το γονίδιο fez φαίνεται να μειώνει την έκφραση στο μισό από τα αποτελέμστα της qpcr (εικόνα 62). Ιστοειδικά με την in situ υβριδοποίηση (εικόνα 60) δεν ήταν δυνατό να διακρίνουμε εμφανώς αυτή την διαφορά. Αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Ets4 Για να μελετηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ των παραγόντων Coup-TF και Ets4 πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις αλλά και qpcr. Ο κλώνος που 115

116 χρησιμοποιήθηκε για το γονίδιο ets4 κατασκευάστηκε από τον Κάτσανο Δημήτρη. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε ο κλώνος 1. Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Πραγματοποιήθηκαν PCR με Μ13 εκκινητές (εικόνα 63) και in vitro μεταγραφή με Sp6 polymerase για να παραχθεί ο αντινοηματικός ιχνηθέτης Ets4. Εικόνα 63: Ηλεκτροφόρηση PCR προιόντος με Μ13 εκκινητές. Μ: μάρτυρας 1Kb

117 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίουets4 και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Για να μελετήσουμε το γονίδιο ets4 αναγκαία ήταν η επιβεβαίωση της έκφρασής του στις περιοχές που εκφράζεται και ο Coup-TF. Αυτό επιτεύχθηκε με την δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου ets4 σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια για τον αχινό Pl με αντινοηματικό ιχνηθέτη ets4 (εικόνα64). Εικόνα 64: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Ets4, Egg: στάδιο αυγού, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, BL: στάδιο βλαστιδίου, G: στάδιο γαστριδίου, PR: στάδιο πρίσμα, PL: στάδιο πλουτέα Ο μεταγραφικός παράγοντας Ets4 είναι ένας μητρικός παράγοντας ο οποίος εκφράζεται από το στάδιο του αυγού έως και το στάδιο του πλουτεα. Η έκφραση του Ets4 στον αχινό Pl βρέθηκε να είναι διαφορετική με αυτή που αναφέρεται στην βιβλιογραφία ( αναφέρεται έκφραση του κυρίως στο αντιστοματικό εξώδερμα){wei, 1999 #1536} με πρότυπο έκφρασης κυρίως στο στοματικό εξώδερμα, στο πρόσθιο νευροεξώδερμα και στο έντερο. Όπως φαίνεται και στην εικόνα 64 από το στάδιο του 117

118 γαστριδίου παρατηρούμε έκφραση που περιορίζεται στο στοματικό εξώδερμα και στην περιοχή του πρόσθιου νευροεξωδέρματος. Στα επόμενα δύο στάδια φαίνεται η έκφραση σε ιστούς που είναι παράγωγα του OE αλλά και του ANE. Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου ets4 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να ανιχνευθεί η έκφραση του γονιδίου ets4 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, πραγματοποιήθηκαν in situ υβρισοποιήσεις σε έμβρυα, 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, ελέγχου και ενεμμένα με Coup-TF MASO. O αντινοηματικός ιχνηθέτης που χρησιμοποιήθηκε είναι ο Ets4 ( εικόνα 65). Εικόνα 65: CTRL: Έμβρυο ελέγχου 24 h μετά από υβριδοποίηση με αντινοηματικό ιχνηθέτη Ets4,MASO Coup-TF: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF 0.125mM 24h μετά από υβριδοποίηση με αντινοηματικό ιχνηθέτη Ets4, 12,3 αριθμός διαφορετικών πειραμάτων. Τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων, δείχνουν ότι το γονίδιο ets4 αλληλεπιδρά με τον Coup-TF. Αναλυτικότερα, η αποσιώπηση του Coup-TF προκαλεί φανερά μικρότερη σε έκταση έκφραση του γονιδίου του ets4 ή και καταστολή της έκφρασης του.

119 Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου Ets4 στον αχινό Paracentrotus lividus Για την δημιουργία του ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου Ets4 στον αχινό Paracentrotus lividus χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές σειρές cdnas από το στάδιο του αυγού ως το στάδιο του πλουτέα. Απομονώθηκε RNA και δημιουργήθηκε cdna από τις τρεις διαφορετικές σειρές εμβρύων. Πραγματοποιήθηκαν qpcrs και τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με χρήση δύο γονιδίων αναφοράς, το γονίδιο 18s και ubicitin (εικόνα 66). Εικόνα 66:Γράφημα ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Ets4 μετά από qpcr.ets4a:cdna από την Α βιολογική σειρά εμβρύων.ets4b:cdna με την Β βιολογική σειρά εμβρύων.ets4c:cdna από την C βιολογική σειρά εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση με το γονίδιο αναφοράς 18s, με κόκκινο απεικονίζεται αντιστοίχως κανονικοποιημένη η έκφραση με το γονίδιο αναφοράς ουμπικιτίνη, με πράσινο χρώμα απεικονίζεται κανονικοποιημένη έκφραση και με τα δύο γονίδια αναφοράς 119

120 Με τα αποτελέσματα των qpcrs και από τις τρεις σειρές εμβρύων (εικόνα 67), γίνεται ποσοτική ανάλυση με τυπικό σφάλμα ( εικόνα 68). 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0-0,05 Ets4 egg 16c E.B L.G Pr Pl 2^-ΔCt Εικόνα 67: Γράφημα σχετικής ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Ets4 και με τις τρεις βιολογικές σειρές εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση και με τα δύο γονίδια αναφοράς με την μέθοδο 2^- ΔCt Το ποσοτικό πρότυπο έκφρασης του παράγοντα Ets4 επαληθεύει και το ιστοειδικό πρότυπο του, όπου δείχνει πως ο συγκεκριμένος παρόντας είναι μητρικός με μέγιστο ποσοστό έκφρασης το στάδιο του αυγού. Μέσω των qprcs φαίνεται ότι το ενδογενές mrna υπερισχύει ποσοτικά του ζυγωτικού το οποίο φτάνει στο μέγιστο ποσοστό της έκφρασής του στο στάδιο του πλουτέα, λόγω της σημαντικότητας του Ets4 κατά τα πρώτα εμβρυικά στάδια για τον καθορισμό του ραχιαιοκοιλιακού άξονα{wei, 1999 #1536}.

121 Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Ets4 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί o Coup-TF Για να διερευνηθεί αν επηρεάζεται ποσοτικά η έκφραση του γονιδίου ets4 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, απομονώθηκε RNA από έμβρυα ελέγχου 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, και από MASO Coup-TF έμβρυα 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση. Έγινε σύνθεση των αντίστοιχων cdnas και πραγματοποιήθηκε qpcr με κατάλληλους εκκινητές για το γονίδιο ets4 (εικόνα 68) 1,2 Ets4 1 0,8 0,6 0,4 Ets4 0,2 0 ctrl maso Εικόνα 68: Γράφημα απεικόνισης του ποσοστού έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Ets4 σε έμβρυα ελέγχου και ενεμμένων με MASO Coup-TF 0.125mM 24h, ctrl: έμβρυα ελέγχου, maso: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της qpcr με χρήση cdnas από ενεμμένα έμβρυα η έκφραση του παράγοντα Ets4 μειώνεται κατά 55%. Το αποτέλεσμα επιβεβαιώνει το αποτέλεσμα της ιστοειδικής ανάλυσης για την αλληλεπίδραση των δύο παραγόντων. 121

122 Αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο FoxQ2 Για να μελετηθεί η αλληλεπίδραση του γονιδίου foxq2 με τον Coup-TF πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις και qprcs. Ο κλώνος του γονιδίου foxq2 που χρησιμοποιήθηκε παρασκευάστηκε από την Μπάρου Βίκυ. Συγκεκριμένα, έγινε χρήση του κλώνου 10. Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Πραγματοποιήθηκαν PCR με Μ13 εκκινητές και in vitro μεταγραφή με Τ7 polymerase. Εικόνα 69: Ηλεκτροφόρηση προιόντος μετά από in vitro μεταγραφή, Μ ολικό RNA,1 :προιόν

123 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου FoxQ2 και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Για να μελετήσουμε το γονίδιο foxq2 αναγκαία ήταν η επιβεβαίωση της έκφρασής του στις νευρογενείς περιοχές που εκφράζεται και ο Coup-TF. Αυτό επιτεύχθηκε με την δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου foxq2 σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια για τον αχινό Pl με αντινοηματικό ιχνηθέτη FoxQ2 (εικόνα70). Εικόνα 70: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα FoxQ2, Egg: στάδιο αυγού, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, BL: στάδιο βλαστιδίου, G: στάδιο γαστριδίου, PR: στάδιο πρίσμα, PL: στάδιο πλουτέα Ο μεταγραφικός παράγοντας FoxQ2 εκφράζεται από το στάδιο των 16 κυττάρων στον ζωικό πόλο. Έπειτα, κατά τα επόμενα στάδια περιορίζεται η έκφραση του στα κύτταρα που πρόσθιου νευροεξωδέρματος και συγκεκριμένα κεντρικά στην ευρύτερη περιοχή του ΑΝΕ, συμπληρώνοντας το κενό που αφήνει στο κεντρικό νευροεξώδερμα το γονίδιο six3 (εικόνα 50) Στο στάδιο του πλουτέα η έκφραση του βρίσκεται δίπλα στην περιοχή από όπου θα δημιουργηθούν οι σεροτονευργικοί 123

124 νευρώνες. Η έκφραση του είναι πολύ συγκεκριμένη και όπως αναφέρεται εισαγωγικά ο ρόλος του πολύ σημαντικός. Ανίχνευση της έκφρασης του FoxQ2 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να ανιχνευθεί η έκφραση του γονιδίου foxq2 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, πραγματοποιήθηκαν in situ υβρισοποιήσεις σε έμβρυα, 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, ελέγχου και ενεμμένα με Coup-TF MASO. O αντινοηματικός ιχνηθέτης που χρησιμοποιήθηκε είναι ο FoxQ2 ( εικόνα 71). Εικόνα 71:WMISH σε έμβρυα 24h μετά τη γονιμοποίηση, με χρήση αντινοηματικού ιχνηθέτη FoxQ2. CTRL: Έμβρυο ελέγχου,maso Coup-TF: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF 0.125mM. 1,2 αριθμός διαφορετικών πειραμάτων. V: vegetal view L: lateral view Τα αποτελέσματα των παραπάνω πειραμάτων (εικόνα72) δείχνουν πως το γονίδιο foxq2 από την αποσιώπηση του Coup-TF ούτε θετικά ούτε αρνητικά. Ιστοειδικά η έφραση του φαίνεται παρόμοια με αυτή στα έμβρυα ελέγχου. Παρόλο που η μορφολογία των ενεμμένων εμβρύων λόγω αποσιώπησης του Coup-TF αλλάζει δραματικά η έκφραση του υπό μελέτη παράγοντα δείχνει να είναι στα ίδια κύτταρα χωρίς ιδιαίτερη μεταβολή.

125 Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου FoxQ2 στον αχινό Paracentrotus lividus Για να επιβεβαιωθεί αλλά και να οριστεί το ποσοτικό πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα FoxQ2 πραγματοποιούνται qpcrs σε τρεις σειρές εμβρύων από το στάδιο του αυγού ως το στάδιο του πλουτέα. Απομονώθηκε RNA δημιουργήθηκε cdna από τις τρεις διαφορετικές σειρές εμβρύων. Πραγματοποιήθηκαν qpcrs και τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με χρήση δύο γονιδίων αναφοράς, το γονίδιο 18s και ubicitin (εικόνα 73). και Εικόνα 72:Γράφημα ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα FoxQ2 μετά από qpcr.foxq2a: cdna από την Α βιολογική σειρά εμβρύων.foxq2b:cdna με Β βιολογική σειρά εμβρύων.foxq2c: cdna με C βιολογική σειρά εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση με το γονίδιο αναφοράς 18s, με κόκκινο απεικονίζεται αντιστοίχως κανονικοποιημένη η έκφραση με το γονίδιο αναφοράς ουμπικιτίνη, με πράσινο χρώμα απεικονίζεται κανονικοποιημένη έκφραση και με τα δύο γονίδια αναφοράς 125

126 Με τα αποτελέσματα των qpcrs και από τις τρεις σειρές εμβρύων (εικόνα 73), γίνεται ποσοτική ανάλυση με τυπικό σφάλμα ( εικόνα74). 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0-0,02-0,04 FoxQ2 egg 16c E.B L.G Pr Pl 2^-ΔCt Εικόνα 73: Γράφημα σχετικής ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα FoxQ2 και με τις τρεις βιολογικές σειρές εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση και με τα δύο γονίδια αναφοράς με την μέθοδο 2^- ΔCt Το ποσοτικό πρότυπο έκφρασης του FoxQ2, επιβεβαιώνει το ιστοειδικό πρότυπο. Κατά το πρώιμο εμβρυικό στάδιο των 16 κυττάρων ξεκινά η ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου FoxQ2. To FoxQ2 γονίδιο φαίνεται να εκφράζεται σε όλα τα μετέπειτα στάδια με μέγιστη έκφραση στο στάδιο του βλαστιδίου. Η ύπαρξη του σε όλα τα στάδια που γνωρίζουμε από τα βιβλιογραφικά δεδομένα, πως συμβαίνει η διαδικασία του καθορισμού και διαφοροποίησης των νευρογενών περιοχών στο έμβρυο, υποδηλώνει την σημαντικότητα της έκφρασης του. Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του FoxQ2 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να διερευνηθεί αν επηρεάζεται ποσοτικά η έκφραση του γονιδίου foxq2 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, απομονώθηκε RNA από έμβρυα ελέγχου 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, και από MASO Coup-TF έμβρυα 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση. Έγινε σύνθεση των αντίστοιχων cdnas και πραγματοποιήθηκε qpcr με κατάλληλους εκκινητές για το γονίδιο foxq2 (εικόνα74).

127 1,4 FoxQ2 1,2 1 0,8 0,6 FoxQ2 0,4 0,2 0 ctrl maso Εικόνα 74: Γράφημα απεικόνισης του ποσοστού έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα FoxQ2 σε έμβρυα ελέγχου και ενεμμένων με MASO Coup-TF 0.125mM 24h, ctrl: έμβρυα ελέγχου, maso: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF Συμπερασματικά, η έκφραση του γονιδίου foxq2 δεν φαίνεται να μεταβάλλεται ούτε ποσοτικά αφού στα ενεμμένα έμβρυα το ποσοστό της έκφρασης του αυξάνεται περίπου στο 20%, αλλαγή που δεν θεωρούμε ως σημαντική αφού δεν ξεπερνά το 50% που έχουμε θέσει ως ελάχιστο όριο. Αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Not Για να μελετηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ των παραγόντων Coup-TF και Not πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις αλλά και qpcr. Παρασκευή αντινοηματικού και νοηματικού ιχνηθέτη Επιλέχθηκαν κατάλληλοι εκκινητές για την απομόνωση όλης της κωδικής περιοχής του γονιδίου στον PL, των οποίων η αλληλουχία βρίσκεται στο παράρτημα. Η διαδικασία με την οποία πραγματοποιήθηκε αναφέρεται αναλυτικά στα υλικά και μεθόδους. Εικόνα 75: Ηλεκτροφόρηση RT-PCR προϊόντος,μ ; μάρτυρας 1Κb 127

128 Το μέγεθος του προϊόντος ήταν 1302 bp και πραγματοποιήθηκε RT-PCR με ολικό RNA για την απομόνωση του (εικόνα 75). Ενθέθηκε σε φορέα και συλλέχτηκε από μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Εικόνα 76: Ηλεκτροφόρηση κλώνων μετά από πέψη με EcoR1, M:μάρτυρας 1Κb, 1,2,3.: αριθμοί κλώνων. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν οι κατάλληλοι κλώνοι με βάση τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης που στάλθηκαν για αλληλούχιση (κλώνοι 5 και 9) (εικόνα 76). Αφού επιλέχθηκε συγκεκριμένα ο κλώνος 9, του οποίου η αλληλουχία βρίσκεται στο παράρτημα, ακολούθησε in vitro μεταγραφή για την δημιουργία νοηματικού και αντινοηματικού ιχνηθέτη ( εικόνα 77). Εικόνα 77: Ηλεκτροφόρηση προιόντων μετά από in vitro μεταγραφή, Μ: ολικό RNA,S: νοηματικός ιχνηθέτης sp6 polymerase,α: αντινοηματικός ιχνηθέτης Τ7 πολυμεράση

129 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Not και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Για να μελετήσουμε το γονίδιο Not αναγκαία ήταν η επιβεβαίωση της έκφρασής του σε περιοχές που εκφράζεται και ο Coup-TF. Αυτό επιτεύχθηκε με την δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου not σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια για τον αχινό Pl με νοηματικό και αντινοηματικό ιχνηθέτη Not (εικόνα78). Εικόνα 78 Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Not A:,in situ υβριδοοίηση με νοηματικό ιχνηθέτη, Β: in situ υβριδοποίηση με αντινοηματικό ιχνηθέτη, Egg: στάδιο αυγού, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, BL: στάδιο βλαστιδίου, G: στάδιο γαστριδίου, PR: στάδιο πρίσμα, PL: στάδιο πλουτέα 129

130 Ο μεταγραφικός παράγοντας Not ξεκινά να εκφράζεται από το στάδιο του πρώιμου βλαστιδίου (εικόνα 78) σε όλη την περιοχή που θα δώσει το στοματικό εξώδερμα. Στο στάδιο του γαστριδίου και πρίσματος περιορίζεται η έκφρασή του στην κορυφή, κεντρικά και πλευρικά προς την αντιστοματική περιοχή του ΑΝΕ. Στο στάδιο του πλουτέα δεν φαίνεται να εκφράζεται. Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Not σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να ανιχνευθεί η έκφραση του γονιδίου not σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, πραγματοποιήθηκαν in situ υβρισοποιήσεις σε έμβρυα, 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, ελέγχου και ενεμμένα με Coup-TF MASO. O αντινοηματικός ιχνηθέτης που χρησιμοποιήθηκε είναι ο Not ( εικόνα 80). Εικόνα 79 :WMISH σε έμβρυα 24h μετά τη γονιμοποίηση, Χρήση αντινοηματικού ιχνηθέτη Not.CTRL: Έμβρυο ελέγχου,maso Coup-TF: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF 0.125mM, 1,2 αριθμός διαφορετικών πειραμάτων. L: lateral view Η έκφραση του γονιδίου not σύμφωνα με τα παραπάνω αποτελέσματα (εικόνα80), βρέθηκε πως δεν αλληλεπιδρά με τον Coup-TF εφόσον μετά την αποσιώπηση του τα έμβρυα δεν δίνουν διαφορετική έκφραση από τα έμβρυα ελέγχου. Αντιθέτως φαίνεται να είναι ιστοειδικά στις ίδιες περιοχές του εμβρύου όπως και τα μη ενεμμένα παρόλη την διαφορετική τους μορφολογία.

131 Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου Not στον αχινό Paracentrotus lividus Για να επιβεβαιωθεί το παραπάνω συμπέρασμα αλλά και για να οριστεί και το ποσοτικό πρότυπο έκφρασης του not γονιδίου πραγματοποιήθηκαν qpcrs σε τρεις βιολογικές σειρές εμβρύων από το στάδιο του αυγού ως το στάδιο του πλουτέα. Απομονώθηκε RNA και δημιουργήθηκε cdna από τις τρεις διαφορετικές σειρές εμβρύων. Πραγματοποιήθηκαν qpcrs και τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με χρήση δύο γονιδίων αναφοράς, το γονίδιο 18s και ubicitin (εικόνα80). Εικόνα 80: Γράφημα ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Not μετά από qpcr με cdna από την Α βιολογική σειρά εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση με το γονίδιο αναφοράς 18s, με κόκκινο απεικονίζεται αντιστοίχως κανονικοποιημένη η έκφραση με το γονίδιο αναφοράς ουμπικιτίνη, με πράσινο χρώμα απεικονίζεται κανονικοποιημένη έκφραση και με τα δύο γονίδια αναφοράς 131

132 Με τα αποτελέσματα των qpcrs και από τις τρεις σειρές εμβρύων (εικόνα 81), γίνεται ποσοτική ανάλυση με τυπικό σφάλμα ( εικόνα82). 0,02 Not 0,015 0,01 0, ,005 egg 16c E.B L.G Pr Pl 2^-ΔCt Εικόνα 81: Γράφημα σχετικής ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Not και με τις τρεις βιολογικές σειρές εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση και με τα δύο γονίδια αναφοράς με την μέθοδο 2^- ΔCt Σύμφωνα με το ποσοτικό πρότυπο έκφρασης του γονιδίου not, επιβεβαιώνεται και το ιστοειδικό πρότυπο. Κατά τα πρώιμα εμβρυικά στάδια δεν παρατηρείται έκφραση του γονιδίου. Στο στάδιο του πρώιμου βλαστιδίου αρχίζει να ενεργοποιείται η έκφρασή του και φτάνει στην μέγιστη έκφρασή του στο στάδιο του ώριμου γαστριδίου. Ανιχνεύεται mrna πρίσματος και πλουτέα. του γονιδίου not και στα όψιμα αναπτυξιακά στάδια, του

133 Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Not σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να διερευνηθεί αν επηρεάζεται ποσοτικά η έκφραση του γονιδίου not σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, απομονώθηκε RNA από έμβρυα ελέγχου 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, και από MASO Coup-TF έμβρυα 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση. Έγινε σύνθεση των αντίστοιχων cdnas και πραγματοποιήθηκε qpcr με κατάλληλους εκκινητές για το γονίδιο not (εικόνα82). 1,2 Not 1 0,8 0,6 0,4 Not 0,2 0 ctrl maso Εικόνα 82: Γράφημα απεικόνισης του ποσοστού έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Not σε έμβρυα ελέγχου και ενεμμένων με MASO Coup-TF 0.125mM 24h, ctrl: έμβρυα ελέγχου, maso: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF Από τα αποτελέσματα της qpcr, συμπεραίνουμε ότι η έκφραση του γονιδίου not δεν επηρεάζεται ποσοτικά σημαντικά από την αποσιώπηση του Coup-TF αφού η μείωση του ποσοστού έκφρασής του είναι 20%. Μια τέτοια μείωση δεν μπορεί να ανιχνευτεί φανερά με την μέθοδο της in situ υβριδοποίησης. Η μείωση 20% δεν ξεπερνά το όριο που έχουμε θέσει για να θεωρήσουμε σημαντική την ποσοτική αλλαγη στην έκφραση του γονιδίου. Η αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Sip1/Zeb2 Για να μελετηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ των παραγόντων Coup-TF και Sip1 πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις αλλά και qpcr 133

134 Παρασκευή αντινοηματικού ιχνηθέτη Επιλέχθηκαν κατάλληλοι εκκινητές για την απομόνωση όλης της κωδικής περιοχής του γονιδίου στον PL, των οποίων η αλληλουχία βρίσκεται στο παράρτημα. Η διαδικασία με την οποία πραγματοποιήθηκε αναφέρεται αναλυτικά στα υλικά και μεθόδους. Το μέγεθος του προϊόντος ήταν 3735 bp και πραγματοποιήθηκε RT-PCR με ολικό RNA για την απομόνωση του (εικόνα 84). Εικόνα 83: Ηλεκτροφόρηση RT-PCR προϊόντος,μ ; μάρτυρας 1Κb Ενθέθηκε σε φορέα και συλλέχτηκε από μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν οι κατάλληλοι κλώνοι με βάση τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης που στάλθηκαν για αλληλούχιση (κλώνοι 2 και 3) (εικόνα 84). Εικόνα 84: Ηλεκτροφόρηση κλώνων μετά από πέψη με EcoR1, M:μάρτυρας 1Κb, 1,2,3.: αριθμοί κλώνων.

135 Αφού επιλέχθηκε συγκεκριμένα ο κλώνος 3, του οποίου η αλληλουχία βρίσκεται στο παράρτημα, ακολούθησε in vitro μεταγραφή (εικόνα 85) για την δημιουργία αντινοηματικού ιχνηθέτη με χρήση sp6 πολυμεράσης. Εικόνα 85: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων μετά από in vitro μεταγραφή, Μ: ολικό RNA,Α: αντινοηματικός ιχνηθέτης Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Sip1/Zeb2 και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Για να μελετήσουμε το γονίδιο Sip1 αναγκαία ήταν η επιβεβαίωση της έκφρασής του σε περιοχές που εκφράζεται και ο Coup-TF. Αυτό επιτεύχθηκε με την δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου sip1 σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια για τον αχινό Pl με νοηματικό και αντινοηματικό ιχνηθέτη Sip1 (εικόνα86). Εικόνα 86: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Sip1, Egg: στάδιο αυγού, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, BL: στάδιο βλαστιδίου, G: στάδιο γαστριδίου, PR: στάδιο πρίσμα, PL: στάδιο πλουτέα 135

136 Η έκφραση του γονιδίου sip1 αρχίζει από το στάδιο του αυγού και εντοπίζεται και στο στάδιο των 16 κυττάρων. Στο στάδιο του βλαστιδίου εκφράζεται στην κορυφαία πλάκα και στο μελλοντικό στοματικό εξώδερμα. Στο αναπτυξιακό στάδιο του γαστριδίου η έκφραση του περιορίζεται στο στοματικό εξώδερμα, αρχέντερο και περιοχή του πρόσθιου νευροεξωδέρματος. Στα τελικά στάδια ανάπτυξης πρίσμα και πλουτέας η έκφραση είναι εμφανής στο έντερο και την περιοχή του ANE, apical Organ για τον πλουτέα. Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου Sip1/Zeb2 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να ανιχνευθεί η έκφραση του γονιδίου Sip1 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, πραγματοποιήθηκαν in situ υβρισοποιήσεις σε έμβρυα, 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, ελέγχου και ενεμμένα με Coup-TF MASO. O αντινοηματικός ιχνηθέτης που χρησιμοποιήθηκε είναι ο Sip1 ( εικόνα87) Εικόνα 87: WMISH σε έμβρυα 24h. Με χρήση αντινοηματικού ιχνηθέτη Sip1.:CTRL: Έμβρυο ελέγχου,maso Coup-TF: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF 0.125mM, 1,2 αριθμός διαφορετικών πειραμάτων. V: vegetal view L: lateral view Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των in situ υβριδοποιήσεων συμπεραίνουμε πως η έκφραση του Sip1 μετά την αποσιώπηση του Coup-TF φαίνεται να μην επηρεάζεται. Δεν εντοπίστηκε ούτε επέκταση αλλά ούτε και περιορισμός της έκφρασής του. Συγκρίνοντας, τα έμβρυα ελέγχου με τα Morphants Coup-TF εμφανίζεται μια ελαφριά ελάττωση στην έκφραση του γονιδίου sip1, όμως εάν συγκρίνουμε με το στάδιο του βλαστιδίου όπου φαίνονται να φτάνουν τα Coup-TF Morphants έμβρυα δεν παρατηρείται αλλαγή.

137 Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου sip1 στον αχινό Paracentrotus lividus Για να επιβεβαιωθεί το παραπάνω συμπέρασμα αλλά και για να οριστεί και το ποσοτικό πρότυπο έκφρασης του sip1 γονιδίου πραγματοποιήθηκαν qpcrs σε τρεις βιολογικές σειρές εμβρύων από το στάδιο του αυγού ως το στάδιο του πλουτέα. Απομονώθηκε RNA και δημιουργήθηκε cdna από τις τρεις διαφορετικές σειρές εμβρύων. Πραγματοποιήθηκαν qpcrs με κατάλληλους εκκινητές και τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με χρήση δύο γονιδίων αναφοράς, το γονίδιο 18s και ubicitin (εικόνα88). Εικόνα 88: Γράφημα ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Sip1 μετά από qpcr SipA: cdna από την Α βιολογική σειρά εμβρύων.sipb: cdna με την Β βιολογική σειρά εμβρύων. SipC: cdna με την C βιολογική σειρά εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση με το γονίδιο αναφοράς 18s, με κόκκινο απεικονίζεται αντιστοίχως κανονικοποιημένη η έκφραση με το γονίδιο αναφοράς ουμπικιτίνη, με πράσινο χρώμα απεικονίζεται κανονικοποιημένη έκφραση και με τα δύο γονίδια αναφοράς 137

138 Με τα αποτελέσματα των qpcrs και από τις τρεις σειρές εμβρύων (εικόνα 88), γίνεται ποσοτική ανάλυση με τυπικό σφάλμα ( εικόνα89). 0,014 0,012 0,01 0,008 0,006 0,004 0, ,002-0,004 Sip1 egg 16c E.B L.G Pr Pl 2^-ΔCt Εικόνα 89: Γράφημα σχετικής ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Sip1 και με τις τρεις βιολογικές σειρές εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση και με τα δύο γονίδια αναφοράς με την μέθοδο 2^- ΔCt Το ποσοτικό πρότυπο έκφρασης του Sip1, επιβεβαιώνει το ιστοειδικό πρότυπο. Κατά τα πρώιμα εμβρυικά στάδια η έκφραση βρίσκεται πολύ κοντά στο μηδέν. Στο στάδιο του πρώιμου βλαστιδίου η έκφραση του αυξάνεται κατά πολύ μέχρι να φτάσει στο στάδιο του πρίσματος όπου και έχει μέγιστη έκφραση, όπως φαίνεται και στο παραπάνω διάγραμμα(εικόνα 89). Κατά τα στάδια του πρίσματος και πλουτέα η έκφρασή του μειώνεται, και φτάνει περίπου στο ίδιο επίπεδο με αυτή στο βλαστίδιο.

139 Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του Sip1 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να διερευνηθεί αν επηρεάζεται ποσοτικά η έκφραση του γονιδίου sip1 σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, απομονώθηκε RNA από έμβρυα ελέγχου 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, και από MASO Coup-TF έμβρυα 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση. Έγινε σύνθεση των αντίστοιχων cdnas και πραγματοποιήθηκε qpcr με κατάλληλους εκκινητές για το γονίδιο sip1 (εικόνα90). 1,2 Zeb2/Sip1 1 0,8 0,6 0,4 Zeb2/Sip1 0,2 0 ctrl maso Εικόνα 90: Γράφημα απεικόνισης του ποσοστού έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Sip1 σε έμβρυα ελέγχου και ενεμμένων με MASO Coup-TF 0.125mM 24h, ctrl: έμβρυα ελέγχου, maso: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF Συμπερασματικά, ο Sip1 δεν φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά μετά την αποσιώπηση του Coup-TF, η μείωση της έκφρασής του αγγίζει το 30%, αλλαγή που δεν θεωρείται σημαντική. Η αλληλεπίδραση του Coup-TF με το γονίδιο Gsc Για να μελετηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ των παραγόντων Coup-TF και Gsc πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις αλλά και qpcr 139

140 Παρασκευή νοηματικού αντινοηματικού ιχνηθέτη Επιλέχθηκαν κατάλληλοι εκκινητές για την απομόνωση όλης της κωδικής περιοχής του γονιδίου στον PL, των οποίων η αλληλουχία βρίσκεται στο παράρτημα. Η διαδικασία με την οποία πραγματοποιήθηκε αναφέρεται αναλυτικά στα υλικά και μεθόδους. Το μέγεθος του προϊόντος ήταν 1017 bp και πραγματοποιήθηκε RT-PCR με ολικό RNA για την απομόνωση του (εικόνα91). Εικόνα 91: Ηλεκτροφόρηση RT-PCR προϊόντος,μ ; μάρτυρας 1Κb Ενθέθηκε σε φορέα και συλλέχτηκε από μετασχηματισμένα βακτηριακά κύτταρα. Επιλέχθηκαν οι κατάλληλοι κλώνοι με βάση τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης που στάλθηκαν για αλληλούχιση (κλώνοι 2 και 8)(εικόνα 92). Εικόνα 92: Ηλεκτροφόρηση κλώνων μετά από πέψη με EcoR1, M:μάρτυρας 1Κb, 2,8,9,11.: αριθμοί κλώνων. Αφού επιλέχθηκε συγκεκριμένα ο κλώνος 2, του οποίου η αλληλουχία βρίσκεται στο παράρτημα, ακολούθησε PCR με Μ13 εκκινητές και in vitro μεταγραφή (εικόνα 93) για την δημιουργία αντινοηματικού ιχνηθέτη με Τ7 πολυμεράση.

141 Εικόνα 93: Αριστερά :Ηλεκτροφόρηση PCR προιόντος με Μ13 εκκινητές. Μ: μάρτυρας 1Kb, Δεξιά εικόνα: Ηλεκτροφόρηση προιόντων μετά από in vitro μεταγραφή, Μ: ολικό RNA,S: νοηματικός ιχνηθέτης,α: αντινοηματικός ιχνηθέτης Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου gsc και δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του Για να μελετήσουμε το γονίδιο gsc αναγκαία ήταν η επιβεβαίωση της έκφρασής του σε περιοχές που εκφράζεται και ο Coup-TF. Αυτό επιτεύχθηκε με την δημιουργία του ιστοειδικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου gsc σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια για τον αχινό Pl με νοηματικό και αντινοηματικό ιχνηθέτη Gsc (εικόνα94). Εικόνα 94: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Gsc, νοηματικός ιχνηθέτης Gsc.Egg: στάδιο αυγού, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, BL: στάδιο βλαστιδίου, G: στάδιο γαστριδίου, PR: στάδιο πρίσμα, PL: στάδιο πλουτέα 141

142 Όπως αναφέραμε και πιο πάνω πραγματοποιήθηκαν in situ υβριδοποιήσεις και με αντινοηματικό ιχνηθέτη για να μελετήσουμε την έκφραση του γονιδίου gsc (εικόνα 95). Εικόνα 95: Ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Gsc, Egg: στάδιο αυγού, 16c: στάδιο 16 κυττάρων, BL: στάδιο βλαστιδίου, G: στάδιο γαστριδίου, PR: στάδιο πρίσμα, PL: στάδιο πλουτέα Ο μεταγραφικός παράγοντας Gsc εκφράζεται από το στάδιο του αυγού και των 16 κυττάρων. Στο στάδιο του βλαστιδίου η έκφραση του επεκτείνεται σε όλο το μελλοντικό στοματικό εξώδερμα αλλά και στην περιοχή του μεσοδέρματος που θα αναπτυχθεί το αρχέντερο. Ήδη από το επόμενο στάδιο, γαστρίδιο, η έκφραση του περιορίζεται σε όλο το στοματικό εξώδερμα αλλά και αρχέντερο. Αξιοσημείωτο είναι ότι το πρότυπο του σε αυτό το στάδιο είναι πολύ κοντά στο πρότυπο έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Coup-TF. Στα επόμενα στάδια η έκφραση του βρίσκεται στα παράγωγα του στοματικού εξωδέρματος,, βλεφαριδωτή ζώνη, και στο αρχέντερο.

143 Ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου gsc σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF Για να ανιχνευθεί η έκφραση του γονιδίου gsc σε έμβρυα που έχει κατασταλεί ο Coup-TF, πραγματοποιήθηκαν in situ υβρισοποιήσεις σε έμβρυα, 24 ωρών μετά τη γονιμοποίηση, ελέγχου και ενεμμένα με Coup-TF MASO. O αντινοηματικός ιχνηθέτης που χρησιμοποιήθηκε είναι ο gsc ( εικόνα 96). Εικόνα 96:WMISH σε έμβρυα 24 h μετά τη γονιμοποίηση. Χρήση αντινοηματικού ιχνηθέτη Gsc. CTRL: Έμβρυο ελέγχου,maso Coup-TF: έμβρυα ενεμμένα με MASO Coup-TF 0.125mM, 1,2,3 αριθμός διαφορετικών πειραμάτων. V: vegetal view L: lateral view Από τα αποτελέσματα των in situ υβριδοποιήσεων (εικόνα 96) συμπεραίνουμε ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Gsc φαίνεται να αλληλεπιδρά με τον Coup-TF. Αναλυτικότερα, φαίνεται να επεκτείνταιι η έκφραση του στα έμβρυα που έχει αποσιωπηθεί ο Coup-TF, δίνοντας έκφραση όχι μόνο στο στοματικό εξώδερμα αλλά και σε όλο το έμβρυο. 143

144 Δημιουργία ποσοτικού προτύπου έκφρασης του γονιδίου gsc στον αχινό Paracentrotus lividus Για να οριστεί το ποσοτικό πρότυπο έκφρασης του gsc γονιδίου πραγματοποιήθηκαν qpcrs σε τρεις βιολογικές σειρές εμβρύων από το στάδιο του αυγού ως το στάδιο του πλουτέα. Απομονώθηκε RNA και δημιουργήθηκε cdna από τις τρεις διαφορετικές σειρές εμβρύων. Πραγματοποιήθηκαν qpcrs με κατάλληλους εκκινητές και τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν με χρήση δύο γονιδίων αναφοράς, το γονίδιο 18s και ubicitin (εικόνα97). Εικόνα 97: Γράφημα ποσοτικής έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Gsc μετά από qpcr. GscA: cdna από την Α βιολογική σειρά εμβρύων. GscB: cdna με την Β βιολογική σειρά εμβρύων. GscC: cdna με την C βιολογική σειρά εμβρύων. Egg: αυγό, 16c: 16 κύτταρα, E.B: πρώιμο βλαστίδιο, L.G: ώριμο γαστρίδιο, Pr: πρίσμα, Pl: πλουτέας. Με μπλέ απεικονίζεται το ποσό της έκφρασης μετά από κανονικοποίηση με το γονίδιο αναφοράς 18s, με κόκκινο απεικονίζεται αντιστοίχως κανονικοποιημένη η έκφραση με το γονίδιο αναφοράς ουμπικιτίνη, με πράσινο χρώμα απεικονίζεται κανονικοποιημένη έκφραση και με τα δύο γονίδια αναφοράς