Μελέτη της φλεγμονώδους αντίδρασης, μετά από χορήγηση LPS, σε διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών των μεταβολικών μονοπατιών των VLDL και HDL

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Μ.Π.Σ. ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Μελέτη της φλεγμονώδους αντίδρασης, μετά από χορήγηση LPS, σε διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών των μεταβολικών μονοπατιών των VLDL και HDL Θεοδωρόπουλος Βασίλης Βιολόγος Επιβλέπων καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Καθηγητής Φαρμακολογίας Πάτρα 2016

2 Επιβλέπων Καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Καθηγητής Φαρμακολογίας Τμήματος Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής: Κυριάκος Η. Κυπραίος, Καθηγητής, Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Νικόλαος Τσοπάνογλου, Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Γενικής Φαρμακολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Γεώργιος Παναγιωτακόπουλος, Επίκουρος Καθηγητής, Εργαστήριο Γενικής Φαρμακολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών 2

3 Πρόλογος Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών κατά την περίοδο στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών «Βιοϊατρικές Επιστήμες». Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε πως η ωρίμανση της HDL μέσω της δράσης του ενζύμου, LCAT καθώς και η τροποποίηση της απολιποπρωτεϊνικής σύστασή της, επηρεάζουν την αντιφλεγμονώδη δράση της. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Κυπραίο Κυριάκο, που μου έδωσε την ευκαιρία να ενταχθώ στην ερευνητική του ομάδα και μέσα από την αμέριστη καθοδήγησή και υπομονή του, κατηύθυνε την επιστημονική και τεχνική μου ανάπτυξη. Διδάσκοντάς με ακούραστα και μέσα από την εύστοχη κριτική και το αμείωτο ενδιαφέρον, μου μετέδωσε τον ενθουσιασμό του για την έρευνα και την επιστήμη. Επίσης θα ήθελα να τον ευχαριστήσω γιατί πάντα έδειχνε πίστη στις δυνάμεις μου, ακόμα και σε στιγμές που την έχανα εγώ. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Αν. Καθηγητή κ. Τσοπάνογλου Νικόλαο και τον Επικ. Καθηγητή κ. Παναγιωτακόπουλο Γεώργιο, που με τίμησαν με την συμμετοχή τους στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Η βοήθεια μερικών ανθρώπων στο εργαστήριο ήταν εξαιρετικά σημαντική για μένα και γι αυτό ως ελάχιστη ένδειξη εκτίμησης θα ήθελα να ευχαριστήσω την Έρη Πετροπούλου, που ουσιαστικά υπήρξε η δασκάλα μου στο εργαστήριο κατά τη διάρκεια της εξαιρετικής μας συνεργασίας. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα παιδιά του εργαστηρίου για την προθυμία τους να βοηθήσουν και για το άριστο κλίμα το οποίο υπήρχε στο εργαστήριο, κάνοντας την καθημερινότητα μας πιο ευχάριστη. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου για όλη την ηθική και όχι μόνο στήριξη καθ όλη τη διάρκεια της ζωής μου και τους φίλους μου για την αμέριστη συμπαράσταση. Σας ευχαριστώ όλους 3

4 Περίληψη Μια από τις πιο σημαντικές ιδιότητες της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL) είναι η αντιφλεγμονώδης δράσης της. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της συσχέτισης της φλεγμονώδους απόκρισης που επάγεται από το LPS με τη δομή και τη σύνθεση της HDL. Έτσι στη συγκεκριμένη εργασία μελετήσαμε πως η ωρίμανση της HDL μέσω της δράσης του ενζύμου LCAT καθώς και η τροποποίηση της απολιποπρωτεϊνικής σύστασή της, επηρεάζουν την αντιφλεγμονώδη δράση της. Συγκεκριμένα, έγινε σύγκριση της φλεγμονώδους απόκρισης μεταξύ ποντικιών που δεν εκφράζουν την LCAT (Lcat -/- ), ποντικιών που δεν εκφράζουν την ApoA-I (ApoA-I -/- ) και ποντικιών αγρίου τύπου (WT). Τα ApoA-I -/- ποντίκια στερούνται της κλασικής HDL και έχουν αυξημένη απόκριση στο LPS, ενώ στα Lcat -/- δεν υπάρχει η ώριμη σφαιρική μορφή της HDL. Τα WT ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου. Μοριακές μελέτες για την απολιποπρωτεϊνική σύσταση της HDL έδειξαν ότι η βασική πρωτεΐνη της HDL των Lcat -/- ποντικιών είναι η ApoE, ενώ η HDL των ApoA-I -/- ποντικιών αποτελείται κυρίως από ApoE και σε λιγότερο βαθμό από ApoA-II. Επίσης, σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν και στη λιπιδική σύσταση της HDL μεταξύ των τριών ομάδων. Όπως περιμέναμε, η επαγόμενη από το LPS (100 μg/kg βάρους σώματος) απόκριση κυτταροκινών τόσο των Lcat -/- όσο και των ΑροΑ-Ι -/- ποντικιών ήταν σημαντικά ενισχυμένη σε σύγκριση με τα WT ποντίκια. In vitro πειράματα σε κυτταρική σειρά μακροφάγων (RAW 264.7) έδειξαν ότι η HDL των Lcat -/- ποντικιών, είχε μειωμένη ικανότητα να εξουδετερώνει την επαγόμενη από το LPS παραγωγή TNFα. Σε συνέχεια των παραπάνω προχωρήσαμε σε χορήγηση του αδενοϊού AdLCAT στα Lcat -/- ποντίκια. Η έκφραση της LCAT οδήγησε σε επαναφορά του λιπιδικού προφίλ στα επίπεδα των WT ποντικιών. Αυτή η επαναφορά του φαινοτύπου οδήγησε τα Lcat -/- ποντίκια, στα οποία χορηγήθηκε ο αδενοϊός AdLCAT, να παρουσιάσουν σημαντική μείωση στα επίπεδα του TNFα μετά από μόλυνση με LPS, σε αντίθεση με τα ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε ο αδενοϊός ελέγχου AdGFP, τα οποία διατήρησαν αυξημένα επίπεδα TNFα. Φαίνεται, λοιπόν, ότι η ανώριμη δισκοειδής HDL, που οφείλεται στην έλλειψη του ενζύμου LCAT, αδυνατεί να εξουδετερώσει το LPS, με αποτέλεσμα να παρατηρείται αύξηση της LPS-επαγόμενης φλεγμονώδους απόκρισης. Τέλος πραγματοποιήθηκαν in vitro πειράματα σε ποντίκια με ανεπάρκεια τόσο στην απολιποπρωτεΐνη Α-Ι όσο και στην απολιποπρωτεΐνη Ε (ApoA-I -/- xapoe -/- ) στα οποία έγινε επανεισαγωγή με την χρήση αδενοϊού είτε της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι είτε της απολιποπρωτεΐνης Ε. Η ομάδα στην οποία χορηγήθηκε η ApoE (ApoE-HDL) παρουσίασε σημαντική μείωση στα επίπεδα του TNFα μετά από μόλυνση με LPS, υποδηλώνοντας ότι η σφαιρική ApoE-HDL έχει αντιφλεγμονώδη δράση. Αντίθετα, η επαγόμενη από LPS απόκριση κυτταροκινών στην ομάδα που πήρε τον ApoA- I αδενοϊό (ApoA-I-HDL) παρουσιάζεται αρκετά ενισχυμένη, υποδηλώνοντας πως η ApoA-I- HDL, απουσία της ApoE, έχει μειωμένη αντιφλεγμονώδη δράση. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν πως η αντιφλεγμονώδης δράση της HDL και του ορού γενικότερα, απαιτεί ισορροπία έκφρασης τόσο της ApoE όσο και της ApoA-I. Η δημιουργία ανασυνδυασμένων μορφών της HDL, προκειμένου να είναι επιτυχείς ως αντιφλεγμονώδης θεραπεία, θα πρέπει να λαμβάνει υπόψιν αυτή τη λειτουργική ισορροπία ApoA-I και ApoE. 4

5 Abstract One of the most important functional properties of high density lipoprotein (HDL) is its antiinflammatory action. The purpose of this study was to investigate the correlation of the inflammatory response induced by LPS with the geometry and composition of HDL. So in this study, we investigated how the maturation of HDL and modification of apolipoprotein composition by LCAT enzymatic activity, affect the anti-inflammatory activity of HDL. Specifically, a comparison was made between the inflammatory response of mice deficient in LCAT (Lcat -/- ), mice deficient in ApoA-I (ApoA-I -/- ) and wild-type (WT) mice. ApoA-I -/- mice lack the classical HDL and display a pronounced response to LPS, while Lcat -/- mice lack the mature form of HDL. WT mice were used as controls. Molecular studies for the characterization of apolipoprotein composition of HDL, showed that LCAT-deficient HDL is primarily composed of ApoE, while HDL from ApoA-I -/- mice is highly enriched in ApoE and ApoA-II. In addition, significant differences were observed in the lipid composition of HDL between the three groups. As expected, LPS-induced (100 μg/kg body weight) cytokine response in both Lcat -/- and ApoA-I -/- mice was markedly enhanced compared to WT mice. In vitro experiments in a macrophage cell line (RAW 264.7) showed that HDL of Lcat -/- mice had a decreased ability to neutralize LPS-induced production of TNFα. Next we proceeded to administer an LCAT-expressing adenovirus (AdLCAT) in Lcat -/- mice. The expression of LCAT led to restoration of the lipid profile in the levels observed in WT mice. Consequently, AdLCAT-treated Lcat -/- mice presented significant decrease in TNFα levels when stimulated with LPS, compared to the Lcat -/- group treated with the control adenovirus AdGFP. It appears that the immature discoidal HDL cannot neutralize LPS, resulting in an increase of the LPS-induced inflammatory response. Finally, we performed in vitro experiments using ApoA-I- and ApoE-double deficient (ApoA-I -/- ApoE -/- ) mice infected with either ApoA-I- or ApoE- expressing adenoviruses. Specifically, HDL isolated from the mouse group infected with ApoE-expressing adenovirus (ApoE-HDL) showed a significant reduction in the levels of TNFα after LPS-infection, suggesting that spherical ApoE-HDL exhibits significant anti-inflammatory action. In contrast, HDL isolated from mice infected with ApoA-I-expressing adenovirus showed attenuated capacity to neutralize LPS-induced cytokine response, suggesting that in the absence of ApoE, ApoA-I-HDL has attenuated anti-inflammatory potential. In conclusion, our results show that the antinflammatory activity in HDL and serum in general, requires a balanced expression of both ApoE and ApoA-I. The creation of recombinant forms of HDL as novel pharmacological agents against LPS-induced inflammation and sepsis, in order to be successful, should take into consideration this functional interrelation between ApoA-I and ApoE. 5

6 Περιεχόμενα Πρόλογος. 3 Περίληψη 4 Abstract...5 Περιεχόμενα 6 Ευρετήριο συντμήσεων..9 Εισαγωγή Λιποπρωτεΐνες Χυλομικρά Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL) Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Μεταβολικά μονοπάτια λιποπρωτεϊνών Το Μεταβολικό μονοπάτι των χυλομικρών Το μεταβολικό μονοπάτι των VLDL-IDL-LDL Το μεταβολικό μονοπάτι των HDL Πρωτεϊνική σύσταση της HDL Κυριότερες απολιποπρωτεΐνες Ένζυμα Υποδοχείς-Μεταφορείς Υποδοχέας εκκαθαριστής τάξης Β τύπου Ι (SR-B1) ATP-Binding Cassette Transporter Protein A1 (ABCA1) Λειτουργία της HDL Φυσική ανοσία Επιθηλιακός φραγμός

7 6.2 Ενεργοποίηση του συμπληρώματος Αναγνώριση συντηρημένων χαρακτηριστικών των παθογόνων Ενδοτοξίνες Δομή του λιποπολυσακχαρίτη (LPS) Μηχανισμός δράσης Toll-like υποδοχείς (TLRs) HDL και φλεγμονή.. 25 Σκοπός της μελέτης.. 27 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματόζωα: Χειρισμοί και πειραματικές διαδικασίες Μέτρηση σωματικού βάρους των ποντικών Λήψη αίματος από την ουρά ποντικών Ενδοφλέβιες ενέσεις Κυτταροκαλλιέργειες Απόψυξη κυττάρων Splitting Ψύξη κυττάρων Ανάπτυξη ανασυνδυασμένων αδενοϊών Καλλιέργεια τριπλών φλασκών Επιμόλυνση τριπλών φλασκών με τους αδενοϊούς Συλλογή των μολυσμένων με τους ιούς κυττάρων HEK Καθαρισμός των αδενοϊών Τιτλοδότηση αδενοϊών με φασματοφωτομέτρηση Βιοχημικές αναλύσεις Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας Διαπίδυση στα κλάσματα του πλάσματος Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης Προσδιορισμός επιπέδων ελεύθερης χοληστερόλης

8 11.5 Προσδιορισμός επιπέδων φωσφολιπιδίων Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων Προσδιορισμός επιπέδων των πρωτεϊνών Μοριακές αναλύσεις Προσδιορισμός επιπέδων του TNFa με ELISA Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Βlot) In vivo LPS stimulation In vitro LPS stimulation Αποτελέσματα Η έλλειψη της LCAT ενισχύει την επαγόμενη από τον LPS φλεγμονώδη απόκριση in vivo και in vitro Χαρακτηρισμός της απολιποπρωτεϊνικής σύστασης της HDL των WT, ApoA-I -/- και Lcat -/- πειραματόζωων Μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης της HDL των WT, ApoA-I -/- και Lcat -/- πειραματόζωων Μελέτη της απολιποπρωτεϊνικής σύστασης της HDL των WT, ApoA-I -/- και Lcat -/- πειραματόζωων συναρτήση με το χρόνο έκθεσης στον LPS Επανέκφραση του ενζύμου LCAT μειώνει την επαγόμενη από το LPS φλεγμονή στα Lcat -/- ποντίκια in vivo Η αντιφλεγμονώδης δράση της HDL οφείλεται σε μια συνεργατική δράση της ApoA-I με την ApoE Υπερέκφραση της ApoC-III οδηγεί σε επαγωγή της φλεγμονώδους απόκρισης 60 Συζήτηση.. 62 Βιβλιογραφία

9 Ευρετήριο συντμήσεων ABCA1 ABCG1 Ad AdApoA-I AdApoC-III AdApoE AdLCAT AdGFP Apo ApoA-I ApoA-I -/- ATP-binding cassette transporter A1 ATP-binding cassette transporter G1 Αδενοϊός Αδενοϊός που εκφράζει την ApoA-I Αδενοϊός που εκφράζει την ApoC-III Αδενοϊός που εκφράζει την ApoE Αδενοϊός που εκφράζει την LCAT Αδενοϊός που εκφράζει τον GFP Απολιποπρωτεΐνη Απολιποπρωτεΐνη Α-Ι ApoA-I deficient ApoA-IxApoE -/- ApoA-IxApoE deficient ApoA-II ApoC-III ApoE BSA CETP CM ddh2o EDTA EL ELISA FC FBS GFP Απολιποπρωτεΐνη Α-ΙΙ Απολιποπρωτεΐνη C-III Απολιποπρωτεΐνη E Bovine Serum Albumin Cholesteryl Ester Transfer Protein Χυλομικρά Δις-απεσταγμένο νερό Αιθυλενο-διαμινο-τετρα-οξικό οξύ (Ethylene-diamino-tetra-acetic acid) Ενδοθηλιακή Λιπάση (Endothelial Lipase) Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay Ελεύθερη χοληστερόλη Εμβρυικός Βόειος Ορός (Fetal Bovine Serum) Green Fluorescent Protein 9

10 HDL HIHS HL IDL kda LBP LCAT Lcat -/- LPS LDL PAMPs PBS Pen-Strep PL rpm SDS Λιποπρωτεΐνη Υψηλής Πυκνότητας Heat Inactivated Horse Serum Ηπατική Λιπάση (Hepatic Lipase) Λιποπρωτεΐνη Ενδιάμεσης Πυκνότητας kilodalton, μονάδα μέτρησης μεγέθους πρωτεϊνών Lipopolysaccharide-Binding Protein Λεκιθινο-Χοληστερολική Ακυλοτρανσφεράση Lcat deficient Λιποπολυσακχαρίτης Λιποπρωτεΐνη Χαμηλής Πυκνότητας Pathogen-Associated Microbial Patterns Φωσφορικό Ρυθμιστικό Διάλυμα Άλατος (Phosphate Buffer Saline) Penicillin Streptomycin Φωσφολιπίδια Στροφές ανά λεπτό (Revolutions per minute) Δωδέκυλοθειϊκό Νάτριο (Sodium Dodecyl Sulfate) SR-BI Υποδοχέας Εκκαθαριστής Τάξης Β, Τύπου 1 TEMED TG ΤΜΒ TNFα TLR- VLDL WT N,N, N,N - Tetramethylethylenediamine Τριγλυκερίδια 3,3,5,5 -Tetra-methyl-benzidine Tumor Necrosis Factor alpha Toll-like υποδοχείς Λιποπρωτεΐνη Πολύ Χαμηλής Πυκνότητας Wild-type 10

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 11

12 1. Λιποπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες είναι υδατοδιαλυτά σφαιρικά συμπλέγματα που αποτελούνται από λιπίδια (χοληστερόλη, τριγλυκερίδια, φωσφολιπίδια) και πρωτεΐνες, τις απολιποπρωτεΐνες. Στο εσωτερικό των λιποπρωτεϊνών βρίσκεται ο πυρήνας, ο οποίος αποτελείται από λιπίδια, τριγλυκερίδια και εστεροποιημένη χοληστερόλη. Ο πυρήνας περιβάλλεται από ελεύθερη χοληστερόλη και από ένα στρώμα φωσφολιπιδίων, με τα λιπόφιλα άκρα διατεταγμένα προς τον πυρήνα και τα υδρόφιλα άκρα προς το πλάσμα. Οι απολιποπρωτεΐνες βρίσκονται στο εξωτερικό τμήμα των λιποπρωτεϊνών (1). Η βασική λειτουργία των λιποπρωτεϊνών είναι η μεταφορά της χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων και των φωσφολιπιδίων στην κυκλοφορία. Οι απολιποπρωτεΐνες δρούν επίσης και σαν τροποποιητές της δράσης των ενζύμων του πλάσματος ή σαν σύνδεσμοι για υποδοχείς κυττάρων, κάνοντας το ρόλο τους στο μεταβολισμό των λιπιδίων πολύ σημαντικό (1). Οι λιποπρωτεΐνες, σύμφωνα με την πυκνότητά τους, διακρίνονται σε 5 μεγάλες κατηγορίες: χυλομικρά, λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL), λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL), λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) και λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (HDL). Οι μεγαλύτερες σε μέγεθος που είναι τα χυλομικρά (CM) και οι πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) είναι πλούσιες σε τριγλυκερίδια ενώ οι μικρότερες όπως οι χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) και οι υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) είναι πλούσιες σε εστεροποιημένη χοληστερόλη (1). 1.1 Χυλομικρά Τα χυλομικρά είναι μακρομοριακά σύμπλοκα με πυκνότητα μικρότερη από 0,95 g/ml και περιέχουν 98-99,5% λιπίδια (κυρίως τριγλυκερίδια και μικρές ποσότητες χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων) και 0,5-2% πρωτεΐνες. Η κύρια απολιποπρωτεΐνη των χυλομικρών είναι η ApoB- 48, η οποία σχηματίζει ένα σφαιρικό κέλυφος, η εξωτερική επιφάνεια του οποίου είναι υδρόφιλη. Άλλες απολιποπρωτεΐνη που συναντάμε στα χυλομικρά είναι η ApoE, ApoA-IV και ApoC-II. Τα χυλομικρά παράγονται στο έντερο και εκκρίνονται στην λεμφική κυκλοφορία, με αποτέλεσμα τα διατροφικά λιπίδια να μεταφέρονται από το έντερο στους περιφερικούς ιστούς. Στην κυκλοφορία τα χυλομικρά μεταβολίζονται μερικώς από την λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL), η οποία βρίσκεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών και ακολούθως καταβολίζονται από την ηπατική λιπάση (HL). Τα υπολείμματα των χυλομικρών προσλαμβάνουν ApoE και εν συνεχεία απομακρύνονται από την κυκλοφορία μέσω των υποδοχέων της LDL (LDLr) (1). 12

13 1.2 Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Οι πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες είναι μεγάλα σωμάτια με πυκνότητα που κυμαίνεται από 0,95 έως 1,006 g/ml και μέγεθος 40-70nm. Περιέχουν % λιπίδια και 10-15% πρωτεΐνες. Συγκεκριμένα περιέχουν 45-65% τριγλυκερίδια, 15-20% φωσφολιπίδια και 20-30% χοληστερόλη (ελεύθερη και εστεροποιημένη). Οι απολιποπρωτεΐνες που συναντάμε στις VLDL είναι οι ApoB- 100, ApoE, ApoC-I, ApoC-II και ApoC-III. Η σύνθεση των VLDL πραγματοποιείται στο ήπαρ, στη συνέχεια εκκρίνονται και συμμετέχουν στην διανομή των λιπιδίων στους περιφερικούς ιστούς. Έτσι, η σύνθεση και η έκκρισή τους εξαρτάται από τις ανάγκες των περιφερικών ιστών σε λιπίδια (1). 1.3 Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL) Οι ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες προκύπτουν από τον μεταβολισμό των VLDL και αποτελούν πρόδρομες μορφές των LDL. Η λιποπρωτεϊνική λιπάση υδρολύει τα τριγλυκερίδια των VLDL με αποτέλεσμα τα σωμάτια των VLDL να γίνονται πλούσια σε εστέρες χοληστερόλης. Η πυκνότητα των IDL κυμαίνεται από 1,006-1,019 g/ml και το μέγεθός τους από 27,5-30 nm. Η συγκέντρωσή τους στο πλάσμα είναι χαμηλή και ο ρόλος τους είναι είτε να μεταφέρουν τα λιπίδια στο ήπαρ και σε άλλους περιφερικούς ιστούς για περαιτέρω επεξεργασία είτε να μετατρέπονται σε λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) με την αφαίρεση περισσότερων τριγλυκεριδίων (1). 1.4 Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Οι χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες προκύπτουν από τον καταβολισμό των IDL και αποτελούν τον κύριο φορέα χοληστερόλης στο αίμα. Η πυκνότητά τους κυμαίνεται από 1,019-1,063 g/ml και το μέγεθός τους από 22,5-27,5 nm. Περιέχουν 75% λιπίδια (κυρίως εστεροποιημένη χοληστερόλη και τριγλυκερίδια) και 25% πρωτεΐνες. Το σωμάτιο της LDL περιέχει ένα μοναδικό αντίγραφο της ApoB-100 με μοριακό βάρος 550 kda, το οποίο αναγνωρίζεται από τα κύτταρα-στόχους. Άλλη μια σημαντική απολιποπρωτεΐνη της LDL είναι η ApoE. Σε μικρότερο βαθμό απαντώνται οι απολιποπρωτεΐνες ApoC-I, ApoC-II και ApoC-III. Κύριος ρόλος των LDL είναι η μεταφορά χοληστερόλης από το ήπαρ στα κύτταρα των περιφερικών ιστών για την εξυπηρέτηση των βιοσυνθετικών αναγκών τους και όπως επίσης και για την σύνθεση στεροειδών ορμονών (1). 13

14 1.5 Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Οι υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες έχουν μέγεθος 8-10 nm και πυκνότητα 1,063-0,21 g/ml. Το σχήμα τους μπορεί να είναι είτε σφαιρικό είτε δισκοειδές. Η ώριμη σφαιρική HDL περιέχει 45-55% πρωτεΐνες, 26-32% φωσφολιπίδια, 15-20% εστεροποιημένη χοληστερόλη, 3-5% ελεύθερη χοληστερόλη, και περίπου 5% τριγλυκερίδια (2). Η κύρια απολιποπρωτεΐνη της HDL είναι η ApoA-I (70%), ενώ σε χαμηλότερα ποσοστά παρατηρούνται οι ApoA-II (20%) και άλλες απολιποπρωτεΐνες, όπως η ApoE (10%) (3). Ο κύριος ρόλος της HDL είναι η μεταφορά χοληστερόλης από τους περιφερικούς ιστούς στο ήπαρ (ανάστροφη μεταφορά χοληστερόλης) (2) (εικόνα 1). Εικόνα 1: τυπική δομή ενός HDL σωματιδίου Η HDL χωρίζεται με βάσει τις ποσοτικές και ποιοτικές διαφορές των λιπιδίων και των πρωτεϊνών σε διαφορετικά κλάσματα, τα οποία διαφέρουν στο σχήμα, στην πυκνότητα, στο μέγεθος και στο φορτίο. Με υπερφυγοκέντρηση διακρίνονται δύο κλάσματα της HDL: οι HDL2 με πυκνότητα 1,063 1,125 g/ml και οι HDL3 με πυκνότητα 1,125 1,210 g/ml (4). Στη συνέχεια, τα σωματίδια της HDL διαχωρίζονται με βάση το μέγεθός τους, με ηλεκτροφόρηση διαβάθμισης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες (5). Η HDL2 υποδιαιρείται σε δύο υποπληθυσμούς: HDL2a (1,1 1,125 g/ml) και HDL2b (1,063 1,1 g/ml). Με παρόμοιο τρόπο η HDL3 υποδιαιρείται σε τρεις υποπληθυσμούς: HDL3a (1,125 1,147 g/ml), HDL3b (1,147 1,167 g/ml) και HDL3c (1,167 1,21 g/ml). 14

15 Οι πρόδρομες μορφές της HDL στερούνται του κεντρικού πυρήνα και έχουν προ-β ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Τα προ-β HDL σωματίδια είναι είτε δισκοειδή σύμπλοκα της ApoA-I με φωσφολιπίδια και ελεύθερη χοληστερόλη είτε μονομοριακή απολιπιδιωμένη ApoA-I. Ένα ποσοστό 5-15% της ApoA-I στο ανθρώπινο πλάσμα σχετίζεται με σωματίδια που παρουσιάζουν προ-β ηλεκτροφορητική κινητικότητα (6). Με ηλεκτροφόρηση σε τζελ πολυακρυλαμιδίου, οι προ-β μορφές μπορούν να διαχωριστούν σε προ-β-1, προ-β-2 και προ-β-3. Υπάρχουν επίσης σωματίδια της HDL με μοναδική απολιποπρωτεΐνη την ApoE ή την ApoA-IV με γ ή προ-β κινητικότητα. Τα ώριμα σφαιρικά σωματίδια τα οποία και αποτελούν την πλειοψηφία των HDL στο πλάσμα, παρουσιάζουν α ηλεκτροφορητική κινητικότητα και διακρίνονται σε α-1, α-2, α-3 και α-4 (7). Ένας μικρότερος υποπληθυσμός των α-hdl αποτελείται από μεγάλα σφαιρικά σωματίδια που περιέχουν ApoE και φωσφολιπίδια. 2. Μεταβολικά μονοπάτια λιποπρωτεϊνών 2.1 Το Μεταβολικό μονοπάτι των χυλομικρών Η βιοσύνθεση των χυλομικρών πραγματοποιείται στο έντερο. Τα λίπη που απορροφώνται από τις τροφές (λιπαρά οξέα, μονογλυκερίδια, ελεύθερη χοληστερόλη και λυσολεκιθίνη) μετατρέπονται σε φωσφολιπίδια, τριγλυκερίδια και εστεροποιημένη χοληστερόλη, τα οποία συνδέονται με την ApoΒ-48 μέσω της δράσης του ενζύμου MTTP (microsomal triglycerides transfer protein) σχηματίζοντας τα χυλομικρά. Τα πρωτοεκκρινόμενα χυλομικρά περιέχουν και τις ApoΕ και ApoC-II (8). Αφού συντεθούν εκκρίνονται από τα εντερικά κύτταρα και εισέρχονται στην κυκλοφορία, όπου έχουν χρόνο ημιζωής λίγων λεπτών. Η ApoC-II αποτελεί συνένζυμο για την λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL) και έτσι τα χυλομικρά που την περιέχουν υδρολύονται στο ενδοθήλιο των τριχοειδών αγγείων (9). Στην διαδικασία αυτή σημαντικό ρόλο παίζει και η GPIHBP1 (glycosylphosphatidylinositol-anchored high density lipoprotein binding protein 1) που βρίσκεται στο ενδοθήλιο των τριχοειδών αγγείων και αποτελεί μια πλατφόρμα που δεσμεύει ταυτόχρονα την LpL και τα χυλομικρά (10). Από την υδρόλυση των χυλομικρών προκύπτουν τα υπολείμματα χυλομικρών τα οποία έχουν χάσει το 90% των τριγλυκεριδίων, λιπαρά οξέα και μονογλυκερίδια τα οποία είτε χρησιμοποιούνται από διάφορους ιστούς ως ενέργεια είτε εστεροποιούνται και αποθηκεύονται ως τριγλυκερίδια (8). Στη συνέχεια τα υπολείμματα χυλομικρών προσλαμβάνουν ApoE από την κυκλοφορία και εν συνεχεία δεσμεύονται από τους υποδοχείς του ήπατος μέσω της ApoE, υδρολύονται από την ηπατική λιπάση (ΗL) και την LpL και εισέρχονται στα ηπατικά κύτταρα με ενδοκυττάρωση μέσω του LDLr όπου και αποσυντίθενται σε αμινοξέα και σε λιπίδια (εικόνα 2). 15

16 ΕΕΡΥ Εικόνα 2: το μεταβολικό μονοπάτι των χυλομικρών 2.2 Το μεταβολικό μονοπάτι των VLDL-IDL-LDL Η βιογένεση των VLDL πραγματοποιείται στο ήπαρ, όπου η MTTP μεταφέρει ηπατικά τριγλυκερίδια στην ApoB-100, η οποία και αποτελεί το κύριο πρωτεϊνικό συστατικό τους. Στη συνέχεια, προσλαμβάνουν ApoE και ApoC-ΙΙ, καθώς και χοληστερόλη και εστέρες χοληστερόλης. Έπειτα, εκκρίνονται από το ήπαρ και εισέρχονται στην κυκλοφορία και καθώς έρχονται σε επαφή με το τοίχωμα των τριχοειδών, ενεργοποιούν την LpL μέσω της ApoC-ΙΙ κατά τρόπο ανάλογο με αυτόν που περιγράφηκε παραπάνω για τα χυλομικρά. Η LpL υδρολύει τις VLDL και απελευθερώνονται ελεύθερα λιπαρά οξέα και μονογλυκερίδια που είτε προσλαμβάνονται από τα λιπώδη ή μυϊκά κύτταρα για καύση είτε αποθηκευόνται. Τα νέα μόρια που προκύπτουν από την υδρόλυση των VLDL ονομάζονται λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL) και αποτελούν τα VLDL υπολείμματα. Οι IDL διαθέτουν δύο εναλλακτικά μονοπάτια: είτε καταβολίζονται περαιτέρω σε LDL είτε απομακρύνονται από το πλάσμα μέσω της πρόσληψής τους από το ήπαρ (εικόνα 3) (11,12). Εικόνα 3: το μεταβολικό μονοπάτι των VLDL-IDL-LDL 16

17 2.3 Το μεταβολικό μονοπάτι των HDL Το πρώτο βήμα της βιογένεσης της HDL είναι η έκκριση της μη λιπιδιομένης ApoA-I από το ήπαρ και από το έντερο. Η εκκρινόμενη μη λιπιδιομένη ApoA-I, και σε λιγότερο βαθμό η ApoE και ApoA-IV, αλληλεπιδρούν με τον υποδοχέα ABCA1. Η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί στην μεταφορά φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης στην ApoA-I. Έτσι σχηματίζονται τα πρόδρομα σωμάτια, preβ-1 HDL. Στη συνέχεια τα preβ-1 HDL σωματίδια μετατρέπονται σε preβ-2 HDL και preβ-3 HDL σωματίδια τα οποία έχουν δισκοειδές σχήμα. Στην δισκοειδή HDL δρα το ένζυμο LCAT που εστεροποιεί την ελεύθερη χοληστερόλη, η οποία εισέρχεται στον πυρήνα των δισκοειδών σωματιδίων, μετατρέποντάς τα σε σφαιρικά. Έτσι, σχηματίζονται τα ώριμα α-hdl σωματίδια, τα οποία διακρίνονται σε HDL2 και HDL3 (εικόνα 4 ) (13). Εικόνα 4: το μεταβολικό μονοπάτι των HDL Τα λιπίδια και οι πρωτεΐνες της HDL απομακρύνονται από την κυκλοφορία με δύο μηχανισμούς: Πρώτον, την εκλεκτική απομάκρυνση των λιπιδίων μέσω του υποδοχέα SR-BI. Ο υποδοχέας αυτός εκφράζεται στα ηπατικά κύτταρα και στους στεροειδοπαραγωγικούς ιστούς (επινεφρίδια, ωοθήκες, όρχεις). Συνδέεται με την HDL μέσω της ApoA-I, ApoA-II αλλά και άλλων απολιποπρωτεϊνών, προσλαμβάνει τους εστέρες χοληστερόλης και τους μεταφέρει ενδοκυττάρια, χωρίς να ενδοκυτταρώνει το σωματίδιο της HDL, το οποίο επιστρέφει στην κυκλοφορία. Και δεύτερον, με την απομάκρυνση όλου του σωματιδίου μέσω των υποδοχέων της ApoE ή της ApoA- I στα κύτταρα του ήπατος (14). 17

18 3. Πρωτεϊνική σύσταση της HDL 3.1 Κυριότερες απολιποπρωτεΐνες ApoA-I Η ApoΑ-Ι αποτελεί περίπου το 70% της πρωτεΐνης της HDL. Εκκρίνεται από το ήπαρ (70%) και από το έντερο (30%), έχει μοριακό βάρος 28 kda και αποτελείται από 223 αμινοξέα, τα οποία οργανώνονται σε επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες 22 και 11 αμινοξέων σε μορφή αμφιπαθών α-ελίκων. Όταν η χοληστερόλη στα δισκοειδή σωματίδια εστεροποιείται, η HDL αποκτά σφαιρικό σχήμα και η δομή της ApoA-I αλλάζει έτσι ώστε να προσαρμοστεί στην σφαιρική επιφάνεια (15). Η ApoA-I είναι ο κύριος ενεργοποιητής του ενζύμου λεκιθινοχοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (LCAT), το οποίο είναι υπεύθυνο για την εστεροποίηση της χοληστερόλης στο μόριο της HDL και επίσης είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση των λιποπρωτεϊνών της HDL με τον υποδοχέα SR-BI (16). Τέλος, έχει αποδειχθεί ότι η αθηροπροστατευτική, αντιφλεγμονώδη και αντιοξειδωτική δράση της ApoA-I οφείλεται στον σημαντικό της ρόλο στην ανάστροφη μεταφορά της χοληστερόλης και στην ικανότητα της να αφαιρεί οξειδωμένα φωσφολιπίδια από την οξειδωμένη LDL (17). ApoA-II Η ApoA-II αποτελεί περίπου το 25% της πρωτεΐνης της HDL. Αποτελείται από δύο πανομοιότυπες πολυπεπτιδικές αλυσίδες 77 αμινοξέων η κάθε μια, οι οποίες ενώνονται με έναν δισουλφυδικό δεσμό. Η κάθε πολυπεπτιδική αλυσίδα έχει μοριακό βάρος 8,7 kda (18). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι στα δισκοειδή σωματίδια της HDL η ApoA-II υιοθετεί έναν belt-like προσανατολισμό, παρόμοιο με αυτόν των ApoA-I και ApoE. Ο ρόλος της ApoA-II στην λειτουργία της HDL παραμένει μέχρι σήμερα άγνωστος (19). ApoE Η ApoΕ αποτελείται από 299 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος 34,5 kda. Παράγεται κυρίως στο ήπαρ και σε άλλους ιστούς, όπως ο εγκέφαλος και ο λιπώδης ιστός (20). Η ApoE αποτελεί προσδέτη για διάφορους υποδοχείς, όπως τον υποδοχέα 2 της ApoE (ApoER2) και τον VLDLr (21,22). Πρόσφατα έχει δειχθεί ότι η ApoE προωθεί την de novo βιοσύνθεση της HDL, με την συμμετοχή της LCAT και του ABCA1, ανεξάρτητα από την ApoA-I (23). Η ApoE αποτελεί επίσης συμπαράγοντα της LCAT σε in vitro μελέτες, καθώς προωθεί, την επαγόμενη από τον ABCA1, ανάστροφη μεταφορά χοληστερόλης (24). ApoC-I Η ApoC-I είναι μια μικρή σε μέγεθος απολιποπρωτεΐνη με μοριακό βάρος 6,6 kda, η οποία αλληλεπιδρά τόσο με την HDL όσο και με την VLDL. Η ApoC-I εμπλέκεται στην ενεργοποίηση του ενζύμου LCAT καθώς και στην απενεργοποίηση της λιποπρωτεϊνικής και ηπατικής λιπάσης (20). 18

19 ApoC-II Η ApoC-II ενεργοποιεί διάφορες λιπάσες τριακυλογλυκερόλης και αλληλεπιδρά με HDL και VLDL σωμάτια (19). ApoC-III Η ApoC-III αποτελείται από 79 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος 8,7 kda (25). Σε υψηλές συγκεντρώσεις, η ApoC-III αναστέλλει την δράση της λιποπρωτεϊνικής και ηπατικής λιπάσης και μειώνει την πρόσληψη των χυλομικρών από τα ηπατικά κύτταρα. Πρόσφατα έχει δειχθεί ότι η ApoC-III είναι ικανή να προωθεί και την de novo βιογέννεση της HDL, ανεξάρτητα από την παρουσία της ApoA-I, με την συμμετοχή του ABCA1 (26). 3.2 Ένζυμα Ηπατική λιπάση (HL) Η ηπατική λιπάση είναι μια γλυκοπρωτεΐνη, η οποία συντίθεται στο ήπαρ (27). Υδρολύει τις μονοκυλογλυκερόλες, διακυλογλυκερόλες και τα φωσφολιπίδια των IDL και HDL, οδηγώντας στην δημιουργία μικρότερων HDL σωματιδίων, τα οποία προσδένονται με μεγαλύτερη ευκολία στον υποδοχέα SR-BI, προωθώντας έτσι την αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης. Ελάττωση της λειτουργικότητας της HL οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων και των φωσφολιπιδίων στα HDL και IDL σωματίδια (28). Ενδοθηλιακή λιπάση (EL) Η ενδοθηλιακή λιπάση παράγεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα μακροφάγα, στο ήπαρ, στους πνεύμονες, στα νεφρά, στους όρχεις και στον πλακούντα (29). Υπερέκφραση της EL οδηγεί σε μείωση των επιπέδων της HDL-C και ApoA-I στο πλάσμα. Αντιθέτως, αδρανοποίηση της EL στα ποντίκια οδηγεί σε μείωση της κάθαρσης της HDL και σε αύξηση των επιπέδων της HDL-C και ApoA-I στο πλάσμα (30). Λεκιθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (LCAT) Η LCAT είναι μια γλυκοπρωτεΐνη με μοριακό βάρος 49 kda. Παράγεται κυρίως στο ήπαρ και μεταφέρεται στην κυκλοφορία συνδεδεμένη με την HDL (31). Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην διαδικασία ωρίμανσης της HDL διότι εστεροποεί την ελεύθερη χοληστερόλη που βρίσκεται στην επιφάνεια των σωματιδίων της HDL και έτσι η δισκοειδής HDL μετατρέπεται σε ώριμη, σφαιρική HDL. Στην συνέχεια, η εστεροποιημένη χοληστερόλη συσσωρεύεται στον πυρήνα των σωματιδίων με αποτέλεσμα η HDL να μπορεί να προσλαμβάνει ακόμα περισσότερη ελεύθερη χοληστερόλη από τις μεμβράνες των κυττάρων. Συνεπώς η LCAT διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης (32). 19

20 4. Υποδοχείς Μεταφορείς 4.1 Υποδοχέας εκκαθαριστής τάξης Β τύπου Ι (Scavenger Receptor class B member 1 - SR-B1) Ο υποδοχέας εκκαθαριστής τάξης Β τύπου 1 (SR-B1) είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 80 kda, η οποία διαπερνά την κυτταροπλασματική μεμβράνη δύο φορές με το καρβοξυτελικό και το αμινοτελικό άκρο της να βρίσκονται ενδοκυτταρικά (33). Εκφράζεται στα ηπατικά κύτταρα, στους στεροειδοπαραγωγικούς ιστούς (επινεφρίδια, ωοθήκες, όρχεις) και λιγότερο στα κύτταρα της καρδιάς (34). Μεσολαβεί στην εκλεκτική μεταφορά εστέρων χοληστερόλης από την HDL, προς το εσωτερικό των κύτταρων, χωρίς την αποδόμηση του σωματιδίου, ενώ προωθεί και την αντίστροφη μεταφορά εστεροποιημένη χοληστερόλης από τους ιστούς προς την HDL (35). 4.2 ATP-Binding Cassette Transporter Protein A1 (ABCA1) Ο μεταφορέας ATP-Binding Cassette A1 (ABCA1) είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 253 kda, με το καρβοξυτελικό και το αμινοτελικό άκρο της να βρίσκονται ενδοκυτταρικά και εκφράζεται κυρίως στα ηπατικά κύτταρα και τα μακροφάγα (36). Επάγει την εκροή λιπιδίων (φωσφολιπίδια και χοληστερόλη) από τα κύτταρα προς την μη λιπιδιωμένη ApoA-I με αποτέλεσμα να σχηματίζονται τα δισκοειδή σωμάτια της HDL (αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης). Οι ABCA1 κινούνται επάνω στη μεμβράνη των κυττάρων και δεσμεύουν φωσφολιπίδια και χοληστερόλη. Όταν κορεστούν, σχηματίζουν διμερή και είναι πλέον έτοιμοι να αλληλεπιδράσουν με την ApoA-I και να μεταφέρουν τα λιπίδια χρησιμοποιώντας ATP σαν πηγή ενέργειας (37,38). Λόγω της συμμετοχής του μεταφορέα αυτού στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, έχει προκαλέσει το ενδιαφέρον ως πιθανό αθηροπροστατευτικό φαρμακολογικό στόχο. Μάλιστα μελέτες έδειξαν πως πειραματόζωα που υπερεκφράζουν τον ABCA1, είχαν υψηλά επίπεδα HDL και ApoA-I και σημαντικά μειωμένη εμφάνιση αθηρωματικών πλακών (39). 5. Λειτουργία της HDL Οι μεταβολές στον μεταβολισμό των λιπιδίων και των λιποπρωτεϊνών, όπως επίσης και η φλεγμονή οδηγούν στη δημιουργία αθηρωματικής πλάκας, η οποία χαρακτηρίζεται από τη συσσώρευση μεγάλων ποσοτήτων χοληστερόλης και μακροφάγων στο τοίχωμα των αρτηριών. Η αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης (RCT) μπορεί να εξουδετερώσει τις παθογενείς καταστάσεις που οδηγούν στον σχηματισμό και την ανάπτυξη του αθηρώματος, προωθώντας την μεταφορά 20

21 της περίσσειας χοληστερόλης, μέσω της HDL, από τις αρτηρίες στο ήπαρ, όπου και καταβολίζεται με την συμμετοχή των ABCA1 και SR-BI (40). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η HDL παρέχει άμεση ή έμμεση προστασία από την οξείδωση της LDL. Πιο συγκεκριμένα, σύμφωνα με in vitro μελέτες η ApoA-I καθιστά την LDL ανθεκτική στην οξείδωση με την βοήθεια της λιποξυγενάσης, ενός ενζύμου που συμμετέχει στην οξείδωση των λιπαρών οξέων (41). Επιπλέον, η παρουσία αντιοξειδωτικών ενζύμων στην HDL, όπως η παραοξονάση (PON), φαίνεται ότι αποτρέπει την βιοσύνθεση οξειδομένης LDL (42). Η HDL παίζει επίσης πολύ σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης μεταξύ VLDL και τριγλυκεριδίων. Ποιο συγκεκριμένα, ο σχηματισμός HDL πλούσιας σε ApoC-III εμποδίζει την επαγόμενη από την C-III υπερτριγλυκεριδεμία (43). Η HDL δρα σαν μαγνήτης και δεσμεύει την ApoC-III, εμποδίζοντας έτσι την υπερβολική συσσώρευσή της στα VLDL σωματίδια και την δημιουργία αθηρωμάτωσης. Η παρατήρηση αυτή, λόγω της συσχέτισης των επιπέδων της ApoC- III στο πλάσμα με τον δείκτη μάζας σώματος, μπορεί να εξηγεί την υπερτριγλυκεριδεμία και τα χαμηλά επίπεδα της HDL που παρατηρούνται σε παχύσαρκους ασθενείς με μεταβολικό σύνδρομο (44). Η ApoA-I εισέρχεται στα κύτταρα, όπου έχει τη δυνατότητα να ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση AMPK επηρεάζοντας τον μεταβολισμό της γλυκόζης. Η ενεργοποίηση της AMPK οδηγεί σε αύξηση της απορρόφησης της γλυκόζης από τα σκελετικά μυϊκά κύτταρα και σε μείωση της γλυκονεογένεσης στο ήπαρ. Μέσω αυτού του μηχανισμού η ApoA-I ρυθμίζει την ομοιόσταση της γλυκόζης και βελτιώνει την αντίσταση των περιφερικών ιστών στην ινσουλίνη. Για το λόγο αυτό, η HDL έχει προστατευτική δράση έναντι του διαβήτη τύπου 2 μειώνοντας τις πιθανότητες εκδήλωσης καρδιαγγειακών νοσημάτων που σχετίζονται με τον διαβήτη και βελτιώνοντας παράλληλα την αντίσταση στην ινσουλίνη (45). 6. Φυσική ανοσία Καθημερινά, ο οργανισμός μας έρχεται σε επαφή με εκατομμύρια παθογόνων μικροοργανισμών. Σημαντικό ρόλο καταπολέμηση των μολύνσεων διαδραματίζει η επίκτητη ανοσία, καθώς έχει την ικανότητα να δημιουργεί ανοσολογική μνήμη μετά από μια αρχική έκθεση σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο, με αποτέλεσμα η αντίδραση του οργανισμού σε επόμενες εκθέσεις στο συγκεκριμένο παθογόνο να είναι άμεση και ενισχυμένη. Κατά την πρώτη έκθεση σε ένα νέο παθογόνο η επίκτητη ανοσία εξελίσσεται με αργό ρυθμό. Αντιθέτως, ένα και μόνο βακτήριο, με χρόνο διπλασιασμού 1 ώρα, μπορεί να παράγει πάνω από 20 εκατομμύρια αντίγραφα την μέρα. Για τον λόγο αυτόν, η φυσική ανοσία παίζει πολύ σημαντικό ρόλο κατά τις πρώτες ώρες και μέρες έκθεσης σε ένα νέο παθογόνο. Η φυσική ανοσία, σε αντίθεση με την επίκτητη, δεν είναι ειδική έναντι ενός συγκεκριμένου αντιγόνου και για τον λόγο αυτόν υπάρχουν διάφορες πρωτεΐνες και κύτταρα που αναγνωρίζουν συγκεκριμένα στοιχεία πάνω στους παθογόνους μικροοργανισμούς, ενεργοποιούνται άμεσα και βοηθάνε έτσι στην καταπολέμηση της μόλυνσης (46). 21

22 6.1 Επιθηλιακός φραγμός Το δέρμα, το ρινικό και στοματικό επιθήλιο, καθώς και το επιθήλιο των πνευμόνων αποτελούν φραγμό μεταξύ του εξωτερικού περιβάλλοντος και του εσωτερικού του οργανισμού. Το βλεννογόνο στρώμα, που καλύπτει όλες τις εσωτερικές επιφάνειες του επιθηλίου, αποτελείται από μουκίνη και άλλες γλυκοπρωτεΐνες, οι οποίες εμποδίζουν την είσοδο των παθογόνων μικροοργανισμών. Επίσης περιέχει διάφορες ουσίες, η οποίες καταστρέφουν τους μικροοργανισμούς ή εμποδίζουν την ανάπτυξή τους (46,47). 6.2 Ενεργοποίηση του συμπληρώματος Το συμπλήρωμα αποτελείται περίπου από 20 πρωτεΐνες, οι οποίες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και προκαλούν μια σειρά φλεγμονωδών αποκρίσεων που βοηθούν στην καταπολέμηση της λοίμωξης. Οι πρωτεΐνες αυτές βρίσκονται στην κυκλοφορία του αίματος και στην εξωκυττάρια ύλη και οι περισσότερες είναι ανενεργές μέχρι την έναρξη της λοίμωξης. Για να διασφαλιστεί ότι η δράση του συμπληρώματος δεν επηρεάζει τα κύτταρα του ξενιστή, οι πρωτεΐνες αδρανοποιούνται αμέσως μόλις ολοκληρώσουν το έργο τους (46). 6.3 Αναγνώριση συντηρημένων χαρακτηριστικών των παθογόνων Όταν ένας παθογόνος μικροοργανισμός περάσει τον επιθηλιακό φραγμό, το ανοσοποιητικό σύστημα είναι αυτό που πρέπει να τον αναγνωρίσει και να τον καταστρέψει, χωρίς να βλάψει τον ξενιστή. Το σύστημα της φυσικής ανοσίας αναγνωρίζει συγκεκριμένους τύπους μορίων που είναι κοινά μεταξύ των μικροοργανισμών και απουσιάζουν από τον ξενιστή. Τα μόρια αυτά προκαλούν φλεγμονώδεις αποκρίσεις και φαγοκυττάρωση από κύτταρα, όπως τα ουδετερόφιλα και τα μακροφάγα (46). Υπάρχουν διάφοροι τύποι τέτοιων μορίων. Το πρώτο αμινοξύ που χρησιμοποιούν οι προκαρυωτικοί οργανισμοί, σε αντίθεση με του ευκαρυωτικούς, στην μετάφραση του DNA είναι η φορμυλιωμένη μεθειονίνη. Κατά συνέπεια, τα πεπτίδια που περιέχουν φορμυλιωμένη μεθειονίνη στο Ν-τελικό άκρο γίνονται αντιληπτά από τον ξενιστή ως συστατικά των παθογόνων μικροοργανισμών. Επιπλέον, η εξωτερική επιφάνεια αρκετών μικροοργανισμών αποτελείται από μόρια, τα οποία απουσιάζουν από τον ξενιστή και δρουν ως ανοσοδιεγερτικά. Η πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος και τα μαστίγια των βακτηρίων, ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS) των Gram-αρνητικών βακτηρίων και τα τεϊχοϊκά οξέα των Gram-θετικών βακτηρίων είναι ορισμένα από αυτά τα ανοσοδιεγερτικά μόρια. Ακόμα, ανοσολογική απόκριση προκαλείται και από ορισμένες αλληλουχίες στο βακτηριακό DNA (46,47). 22

23 Οι πολυάριθμες κατηγορίες ανοσοδιεγερτικών μορίων συχνά βρίσκονται στην επιφάνεια των μικροοργανισμών σε επαναλαμβανόμενα μοτίβα, τα οποία αναγνωρίζονται από διάφορους τύπους υποδοχέων του ξενιστή, που ονομάζονται υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRC, pattern recognition receptors). Η οικογένεια των υποδοχέων αυτών αποτελείται από υποδοχείς που βρίσκονται στην κυκλοφορία (σύστημα συμπληρώματος) και από υποδοχείς που βρίσκονται στην επιφάνεια κυττάρων του ξενιστή ( μέλη της οικογένειας των Toll-like υποδοχέων) (46,47) Ενδοτοξίνες Οι ενδοτοξίνες είναι δομικά συστατικά της εξωτερικής μεμβράνης του κυτταρικού τοιχώματος των Gram-αρνητικών βακτηρίων. Ο όρος «ενδοτοξίνη» αναφέρεται στο σύμπλοκο λιποπολυσακχαρίτη που βρίσκεται στην εξωτερική μεμβράνη των Gram-αρνητικών βακτηρίων, όπως Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas, Shigella, Haemophilus influenzae, Vibrio cholerae και Bordetella pertussis (48) Δομή του λιποπολυσακχαρίτη (LPS) Ο LPS αποτελείται από τρία συστατικά: το λιπίδιο Α, τον πολυσακχαρίτη R και τον πολυσακχαρίτη Ο (48,49). Το λιπίδιο Α αποτελείται από ένα διμερές φωσφορυλιωμένης Ν- ακετυλογλυκοζαμίνης (NAG) με 6 ή 7 κορεσμένα λιπαρά οξέα. Μεταξύ των Gram-αρνητικών βακτηρίων το λιπίδιο Α είναι εξαιρετικά συντηρημένο. Το Λιπίδιο Α μεσολαβεί τις κύριες φυσιολογικές δράσεις του LPS και διεγείρει το ανοσοποιητικό σύστημα των θηλαστικών (48,49). Ο πολυσακχαρίτης R βρίσκεται στην θέση 6 της φωσφορυλιωμένης Ν- ακετυλογλυκοζαμίνης και αποτελείται από μια μικρή αλυσίδα σακχάρων. Ο πολυσακχαρίτης R είναι κοινός σε όλα τα βακτήρια. Ο πολυσακχαρίτης Ο είναι προσκολλημένος στον πολυσακχαρίτης R και αποτελείται από επαναλαμβανόμενες ομάδες 3-5 σακχάρων (εικόνα 5) (48,49). 23

24 Εικόνα 5: σχηματική αναπαράσταση του LPS Μηχανισμός δράσης Ο μηχανισμός δράσης του LPS είναι αρκετά πολύπλοκος. Αρχικά, ο LPS δεσμεύεται στην LBP (lipid binding protein), η οποία είναι πρωτεΐνη του ορού, που τον παρουσιάζει στο CD14 στην επιφάνεια των κυττάρων. Ο CD14 μεταφέρει τον LPS στο MD2, ο οποίος συνδέεται με το TLR4. Οι CD14 και TLR4 βρίσκονται σε διάφορα είδη κυττάρων, όπως τα μονοκύτταρα, μακροφάγα, δενδρητικά και ενδοθηλιακα κύτταρα. Η μεταφορά του LPS στον TLR4 οδηγεί στον ομοδιμερισμό του, με αποτέλεσμα να ξεκινάει ένα σηματοδοτικό μονοπάτι που οδηγεί στην παραγωγή προφλεγμονώδων κυττοκινών και νιτρικού οξέος (εικόνα 6) (48). Εικόνα 6: μηχανισμός δράσης του LPS 24

25 6.4 Toll-like υποδοχείς (TLRs) Οι toll-like υποδοχείς είναι διαμεμβρανικές γλυκοπρωτεΐνες τύπου Ι και αποτελούνται από δύο χαρακτηριστικές περιοχές. Η πρώτη είναι μια εξωκυττάρια, πλούσια σε λευκίνη επανάληψη (LRR) και η δεύτερη βρίσκεται στο εσωτερικό του κυττάρου και είναι ένας υποδοχέας toll/interleukin-1 (TIR) (50). Οι TLRs αναγνωρίζουν συντηρημένα δομικά μοτίβα που ονομάζονται PAMPs (pathogen-associated microbial patterns), τα οποία εκφράζονται συγκεκριμένα από τους μικροοργανισμούς, ή άλλα ενδογενή μόρια που ονομάζονται DAMPs (danger-associated molecular patterns), τα οποία εκκρίνονται από τα νεκρά κύτταρα. Τα PAMPs περιλαμβάνουν διάφορα συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων, όπως πεπτιδογλυκάνες, λιποπεπτίδια και λιποπολυσακχαρίτη, όπως επίσης και το βακτηριακό DNA. Τα DAMPs περιλαμβάνουν ενδοκυττάριες πρωτεΐνες, όπως οι πρωτεΐνες heat shock καθώς επίσης και μέρη πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ύλης (51). Η ενεργοποίηση των TLRs πυροδοτεί καταρράκτες σηματοδότησης που οδηγούν στη διέγερση διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων, όπως ο AP-1, NF-Kb και IRFs. Η σηματοδότηση αυτή οδηγεί σε μια ποικιλία κυτταρικών διαδικασιών, όπως η παραγωγή ιντερφερόνης, προφλεγμονώδων κυτταροκινών και παραγόντων που οδηγούν στην παθητική ανοσία (51). 7. HDL και φλεγμονή Η σήψη είναι η κύρια αιτία θανάτου σε ασθενής στα νοσοκομεία. Η μεγάλη θνησιμότητα που παρατηρείται οφείλεται στη δράση του LPS, το οποίο είναι συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος των Gram-αρνητικών βακτηρίων (52). Ο LPS όσο βρίσκεται στην μεμβράνη δεν είναι τοξικός, όταν όμως τα βακτήρια λύονται, ο LPS απελευθερώνεται στην κυκλοφορία και προκαλεί φλεγμονώδη αντίδραση. Ποιο ειδικά, το λιπίδιο Α, που αποτελεί δομικό συστατικό του LPS, προκαλεί μία ισχυρή φλεγμονώδη απόκριση λόγο της παραγωγή προφλεγμονώδων κυτταροκινών, όπως ο παράγοντας νέκρωσης όγκων α (TNFa), ιντερλευκίνη 1β (IL-1β) και ιντερλευκίνη 6 (IL-6), κυρίως από τα μακροφάγα και τα μονοκύτταρα αλλά και από τα ουδετερόφιλα (53,54). Υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί με τους οποίους η HDL προστατεύει έναντι της σήψης. Η HDL, όπως και άλλες λιποπρωτεΐνες, έχει την ικανότητα να προσδένεται στο LPS και με αυτόν τον τρόπο να το εξουδετερώνει (52,55). Ποντίκια που δεν εκφράζουν την ApoA-I παρουσιάζουν μειωμένη ικανότητα εξουδετέρωσης του LPS, σε σύγκριση με φυσιολογικά ποντίκια (56). Επιπλέον, υπερέκφραση της ApoA-I σε ποντίκια με σήψη, οδηγεί σε αύξηση του ποσοστού επιβίωσης, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι αύξηση των επιπέδων HDL ίσως έχει προστατευτικό ρόλο (57). Εκτός από το ρόλο της στην εξουδετέρωση του LPS, η HDL συμμετέχει επίσης στην διαδικασία κάθαρσης του LPS μέσω του SR-BI, ενός υποδοχέα της HDL (58). Αυτό γίνεται γιατί σχεδόν όλο 25

26 το LPS της κυκλοφορίας βρίσκεται σε σύμπλοκο με την HDL (59). Χορήγηση rhdl (reconstituted HDL) αναστέλει, την επαγώμενη από το LPS, παραγωγή κυτταροκινών από ολικό αίμα in vitro. Επιπλέον, ενδοφλέβια χορήγηση rhdl σε υγιή άτομα πριν την έναρξη της ενδοτοξιναιμίας, οδηγεί σε σημαντική μείωση των συμπτωμάτων και της παραγωγής κυτταροκινών (60). Η ApoA-I διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στις αντιφλεγμονώδεις δράσεις της HDL καθώς μπορεί να αδρανοποιήσει το LPS (61). Επίσης η ApoA-I εμποδίζει την, επαγόμενη από το LPS, παραγωγή κυτταροκινών από τα ανθρώπινα μονοκύτταρα καθώς επίσης μειώνει και τα επίπεδα του TNFa μετά την χορήγηση LPS σε αρουραίους, αυξάνοντας έτσι τα ποσοστά επιβίωσής τους (62,63). Επίσης η ApoA-I μπορεί να αναστέλει την πρόσδεση του LPS στα μακροφάγα, εμποδίζοντας έτσι την παραγωγή κυτταροκινών που συνδέονται με την ανάπτυξη και εξέλιξη της σήψης (64). 26

27 ΣΚΟΠΟΣ 27

28 H σήψη προκαλεί εκατομμύρια θανάτους παγκοσμίως κάθε χρόνο και αποτελεί σημαντική αιτία θανάτου για ασθενείς στα νοσοκομεία. Τα περιστατικά της σήψης εκτιμάται ότι είναι περίπου 18 εκατομμύρια παγκοσμίως. Στις Ηνωμένες Πολιτείες πάνω από θάνατοι κάθε χρόνο οφείλονται στη σήψη. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει κάποια αποτελεσματική θεραπεία. Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν πως η HDL αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή τόσο της έμφυτης όσο και της παθητικής ανοσίας και μπορεί να έχει προστατευτική δράση έναντι της σήψης λόγω των αντιοξειδωτικών, αντιφλεγμονωδών και αντιθρομβωτικών ιδιοτήτων της. Σημαντικό ρόλο στην προστασία που ασκεί η HDL έναντι της σήψης διαδραματίζει η ApoA-I, η οποία μπορεί να εξουδετερώνει τις βακτηριακές τοξίνες, να προστατεύει τα τοιχώματα των αιμοφόρων αγγείων από τη βλάβες και να αποτρέπει βλάβες στους ιστούς μέσω των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων της. Μέχρι σήμερα έχουν προταθεί και εξεταστεί ένας μεγάλος αριθμός από θεραπείες, οι οποίες βασίζονται στην HDL, όπως η χορήγηση ανασυνδιασμένης HDL ή πεπτιδίων που μιμούνται την ApoA-I. Παρά το γεγονός ότι υπήρξαν κάποια ελπιδοφόρα πρώτα αποτελέσματα, καμία από αυτές τις προσεγγίσεις δεν αποδείχθηκε αποτελεσματική σε κλινικές μελέτες. Ο λόγος μπορεί να είναι το γεγονός ότι η HDL αποτελεί ένα εξαιρετικά πολύπλοκο λιποπρωτεϊνικό σωματίδιο, με πολλούς υποπληθυσμούς, που διαφέρουν σε μέγεθος, σχήμα, λιπιδική και πρωτεϊνική σύσταση. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνήσει την πιθανή συσχέτιση μεταξύ της δομής και της σύνθεσης της HDL και των αντιφλεγμονωδών λειτουργιών της στην επαγόμενη από το LPS φλεγμονή. Έτσι στη συγκεκριμένη εργασία μελετήσαμε πως η ωρίμανση της HDL μέσω της δράσης του ενζύμου LCAT καθώς και η τροποποίηση της απολιποπρωτεϊνικής σύστασή της, επηρεάζουν την αντιφλεγμονώδη δράση της. 28

29 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 29

30 8. Πειραματόζωα: Χειρισμοί και πειραματικές διαδικασίες Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 4 πειραματικά μοντέλα ποντικών: ποντίκια με έλλειψη του ενζύμου λεκιθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (LCAT -/- ), ποντίκια με έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι (apoa-i -/- ), ποντίκια με έλλειψη τόσο της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι όσο και της απολιποπρωτεΐνης Ε (ApoA-I -/- x ApoE -/- ), καθώς επίσης και φυσιολογικά ποντίκια που εξέφραζαν το πλήρες γονιδίωμα, τα C57BL/6. Η προμήθεια των πειραματόζωων έγινε από την εταιρεία Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, ενώ τα LCAT-/- ήταν μια ευγενική προσφορά της κυρίας Silvia Santamarina-Fojo από το NIH. Στα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν αρσενικά ποντίκια ηλικίας εβδομάδων. Οι πειραματικές μελέτες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης, τη συνθήκη του Ελσίνκι και το πρωτόκολλο προστασίας και ορθής μεταχείρισης των ζώων το οποίο έχει λάβει την έγκριση της επιτροπής πειραματόζωων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών και της κτηνιατρικής υπηρεσίας της περιφέρειας δυτικής Ελλάδος. 8.1 Μέτρηση σωματικού βάρους των ποντικών Υλικά Ειδικές θήκες παγίδευσης ποντικών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) Ηλεκτρονικός ζυγός (Mettler precision microscale, Τολέδο, Ισπανία) Πειραματική πορεία Οι μύες τοποθετήθηκαν στις ειδικές παγίδες και ζυγίστηκαν. Ο ζυγός είχε μηδενιστεί αρχικά με το βάρος των ειδικών παγίδων ώστε να δοθεί το καθαρό σωματικό βάρος των ποντικών 8.2 Λήψη αίματος από την ουρά ποντικών Υλικά Ειδικές θήκες παγίδευσης ποντικών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) Ειδικά τριχοειδή σωληνάκια λήψης αίματος (Microvette for capillary blood collection, CB 300, Sarstedt, D Numbrecht, Germany) 30

31 Εικόνα 7: Ειδικά τριχοειδή σωληνάκια λήψης αίματος. Πειραματική πορεία Για την λήψη του αίματος, τα ποντίκια ακινητοποιήθηκαν στις ειδικές θήκες και με ένα νυστέρι έγινε μια μικρή τομή στο άκρο της ουράς. Η καλύτερη αιμοληψία για την συλλογή της απαραίτητης ποσότητας αίματος (περίπου μl) εξασφαλιζόταν με μαλάξεις στην ουρά των ποντικών. Μετά την λήψη, ακολούθησε καυτηριασμός της ουράς των ποντικών για να αποφευχθεί περαιτέρω αιμορραγία. Για τη συλλογή του αίματος χρησιμοποιήθηκαν ειδικά τριχοειδή σωληνάκια CB300 που περιείχαν EDTA ως αντιπηκτικό παράγοντα (εικόνα 7). Το αίμα αμέσως μετά τη λήψη ανακινούνταν ελαφρώς για να αναμιχθεί με το EDTA και διατηρούνταν σε πάγο ώσπου να φυγοκεντρηθεί στα 1.500g για 10 λεπτά στους 4 o C και να απομονωθεί το πλάσμα 8.3 Ενδοφλέβιες ενέσεις Υλικά Σύριγγες ινσουλίνης Λάμπα με υπέρυθρο φως Ειδικές θήκες παγίδευσης ποντικών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) Αιθανόλη 70% 1 αποστειρωμένο PBS Βαμβάκι 31

32 Πειραματική πορεία Πέντε λεπτά πριν από τις ενέσεις, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν κάτω από μια λάμπα με υπέρυθρο φως για να εξασφαλιστεί η διαστολή των αιμοφόρων αγγείων. Τα ποντίκια ακινητοποιήθηκαν στις ειδικές παγίδες και η ουρά καθαρίστηκε με ένα βαμβάκι εμποτισμένο με αιθανόλη 70%. Στη συνέχεια η βελόνα της σύριγγας εισήχθη παράλληλα σε μια από τις δύο πλευρικές φλέβες της ουράς διεισδύοντας 2-4 mm μέσα στον αυλό, ενώ το άνοιγμα της βελόνας ήταν στραμμένο προς τα πάνω (εικόνα 8). Όταν η ενδοφλέβια χορήγηση τελείωσε, το σημείο της ένεσης πιέστηκε σταθερά με ένα βαμβάκι εμποτισμένο με PBS 1 για την πρόληψη της αντίστροφης ροής του χορηγούμενου διαλύματος ή του αίματος. Εικόνα 8: Ενδοφλέβια ένεση στην πλευρική φλέβα της ουράς ενός ποντικού χρησιμοποιώντας μια σύριγγα ινσουλίνης 9. Κυτταροκαλλιέργειες Στις in vitro μελέτες χρησιμοποιήθηκε μια συγκεκριμένη κυτταρική σειρά μακροφάγων, η RAW Επιπλέον, για την ανάπτυξη των αδενοϊών χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά HEK 293 (ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα). Η επιλογή τους οφείλεται στο γεγονός ότι διαμολύνονται πολύ εύκολα με το γονιδίωμα των αδενοϊών και είναι ιδιαίτερα παραγωγικά στην ανάπτυξη νέων ιών. Πιο συγκεκριμένα, τα HEK 293 έχουν την ιδιότητα να σχηματίζουν πολυστοιβάδες και για τον λόγο αυτόν χρησιμοποιούνται για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων αδενοϊού. Όλοι οι χειρισμοί των κυττάρων έγιναν σε θάλαμο νηματικής ροής που έχει αποστειρωθεί με υπεριώδη ακτινοβολία, διάλυμα SDS 1%, και διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70%. Η ανάπτυξη των αδενοϊών γίνεται σε ειδικά σχεδιασμένο δωμάτιο κυτταροκαλλιεργειών το οποίο πληρεί τους κανονισμούς ασφαλείας. 32

33 9.1 Απόψυξη κυττάρων Υλικά Υδατόλουτρο 37 ο C Falcon των 15ml Φυγόκεντρος Φλάσκες καλλιέργειας Τ-25 DMEM (+4.5 g/l D-glucose + pyruvate; Gibco) Fetal Bovine Serum (FBS; Biochrom) Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep; Biochrom) Non-essential amino acids (NEAA; BioChrom) Πειραματική πορεία Για την απόψυξη κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν οι φλάσκες καλλιέργειας T-25. Επιλέχθηκε το κρυοφυαλίδιο με την επιθυμητή σειρά κυττάρων και μεταφέρθηκε από τους -80 ºC, όπου βρισκόταν αποθηκευμένο, σε υδατόλουτρο 37 ºC. Μετά την ταχεία απόψυξη, το περιεχόμενο του κρυοφυαλιδίου (1 ml) αποχύθηκε σε ένα falcon των 15 ml, το οποίο περιείχε 10 ml θρεπτικό υλικό DMEM (πίνακας 1). Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα rpm. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το υπερκείμενο, τα κύτταρα επαναδιαλύθηκαν σε 5 ml DMEM, το οποίο πρώτα είχε ζεσταθεί στους 37 o C, και μεταφέρθηκαν σε φλάσκες καλλιέργειας T-25. Οι φλάσκες τοποθετήθηκαν στον επωαστή (5% CO2, 37 o C). Πίνακας 1: προετοιμασία του θρεπτικού υλικού Συστατικά Ποσότητα Τελική συγκέντρωση High glucose DMEM 440 ml - FBS 50 ml 10% Pen/Strep 5 ml 1% NEAA 5 ml 1% 9.2 Splitting Υλικά Υδατόλουτρο 37οC Cell scrapers (Greiner Bio-one) Φλάσκες καλλιέργειας Τ-75 DMEM medium 33

34 Πειραματική πορεία Όταν η πληρότητα των κυττάρων στην φλάσκα πλησίαζε ένα ποσοστό 90 με 100%, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS 1 και ξύστηκαν από τον πάτο της φλάσκας. Στη συνέχεια, επαναδιαλύθηκαν σε 3 ml θρεπτικό υλικό και μεταφέρθηκαν σε μια νέα φλάσκα T-75, η οποία περιείχε 12 ml θρεπτικό υλικό. Τέλος οι φλάσκες τοποθετήθηκαν στον επωαστή (5% CO2, 37oC). 9.3 Ψύξη κυττάρων Υλικά Υδατόλουτρο 37 ο C Cell scrapers Cryovials DMEM medium Υγρό άζωτο Πειραματική πορεία Όταν η πληρότητα των κυττάρων στην φλάσκα πλησίασε το 100%, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS 1 και ξύστηκαν από τον πάτο της φλάσκας. Στη συνέχεια τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε falcon των 15 ml και φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα rpm. Απομακρύνθηκε το υπερκείμενο και τα κύτταρα επαναδιαλύθηκαν με 5 ml διάλυμα 20% FBS. Στη συνέχεια προστέθηκαν αργά και στάγδην 5 ml διαλύματος 20% FBS-20% DMSO, διότι η αντίδραση που προκύπτει είναι εξώθερμη και η απότομη ανάμειξη μπορεί να αυξήσει τη θερμοκρασία του θρεπτικού, με κίνδυνο την καταστροφή των κυττάρων. Το μίγμα αναδεύθηκε με πιπέτα και διανεμήθηκε σε κρυοφιαλίδια, τα οποία τοποθετήθηκαν στους -80 ο C. 10. Ανάπτυξη ανασυνδυασμένων αδενοϊών Ύστερα από την μόλυνση κυττάρων ΗΕΚ 293 σε τριπλές φλάσκες, οι ανασυνδυασμένοι αδενοϊοί καθαρίστηκαν με δύο συνεχόμενες υπερφυγοκεντρήσεις με διαβάθμιση πυκνότητας CsCl. Στη συνέχεια ακολούθησε διαπίδυση και τιτλοδότηση, όπου οι τίτλοι που προέκυψαν ήταν της τάξης του pfu/ml. Η μονάδα μέτρησης pfu (Plaque-forming unit) είναι ένα μέτρο του αριθμού των σωματιδίων του αδενοϊού που μπορεί να σχηματίσει πλάκες ανά μονάδα όγκου. 34

35 10.1 Καλλιέργεια τριπλών φλασκών Υλικά HEK 293 Τριπλές φλάσκες DMEM medium Heat inactivated horse serum (Donor horse serum; Biosera) DMEM 2% HIHS Πειραματική πορεία Στις τριπλές φλάσκες προστέθηκαν 90 ml θρεπτικό υλικό DMEM 10% FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν ώσπου να μεγαλώσουν για 4 ημέρες και όταν η πληρότητα των τριπλών φλασκών έφτασε στο 100%, το θρεπτικό υλικό αντικαταστάθηκε από DMEM με θερμικά απενεργοποιημένο ορό αλόγου (Heat Inactivated Horse Serum - HIHS) (πίνακας 2) Πίνακας 2: Συστατικά θρεπτικού υλικού DMEM 2% HIHS Θρεπτικό υλικό DMEM 2% HIHS Αντιδραστήρια Ποσότητες Τελική συγκέντρωση High glucose DMEM 480 ml - HIHS 10 ml 2% NEAA 5 ml 1% Pen-Strep 5 ml 1% Ο ορός του αλόγου υπέστη θερμική απενεργοποίηση στους 65 ºC και ύστερα από φιλτράρισμα, διαμοιράστηκε σε σωλήνες των 50 ml και φυλάχθηκε στους -20 ºC 10.2 Επιμόλυνση τριπλών φλασκών με τους αδενοϊούς Υλικά HEK 293 Φλάσκες T-175 DMEM 2% HIHS Αδενοϊός 35

36 Πειραματική πορεία Αρχικά, η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HEK 293 μέσα σε φλάσκες Τ-175. Χρησιμοποιήθηκαν δυο φλάσκες Τ-175 που ήταν πλήρεις με κύτταρα, στις οποίες προστέθηκαν 25 ml θρεπτικού υλικού DMEM 2% HIHS καθώς και 10 μl από το stock του αδενοϊού. Το στάδιο αυτό απαιτείται, ώστε ο ιός που βρισκόταν φυλαγμένος σε βαθειά κατάψυξη στους -80 ο C, να επανακτήσει την μολυσματικότητά του και να είναι απόλυτα λειτουργικός. Για τη μαζική παραγωγή του ανασυνδυασμένου αδενοϊού, χρησιμοποιήθηκαν οχτώ τριπλές φλάσκες. Συνολικά χρειάστηκαν 720 ml θρεπτικού υλικού DMEM 2% HIHS. Σε αυτή την ποσότητα προστέθηκαν 5 ml μολυσματικού υλικού που προήλθαν από τις φλάσκες Τ-175 και κατόπιν το μίγμα αυτό ισομοιράστηκε στις οκτώ φλάσκες. Ακολούθησε αναμονή 2-3 ημερών, ώστε να παραχθούν μεγάλες ποσότητες αδενοϊού. Η φάση συλλογής του υλικού εκτιμήθηκε με βάση την έναρξη της κηλιδωτής αποκόλλησης των κυττάρων καθώς και την παρατήρηση φθορισμού των κυττάρων λόγω της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP), που παράγεται από το γενετικό υλικό του ανασυνδυασμένου αδενοϊού. Στόχος ήταν η απομόνωση ακέραιων κυττάρων ΗΕΚ 293 που περιείχαν μεγάλες ποσότητες αδενοϊού στο κυτταρόπλασμα τους. Με απλή ανακίνηση των φλασκών τα μολυσμένα κύτταρα αποκολλώνται Συλλογή των μολυσμένων με τους ιούς κυττάρων HEK 293 Υλικά Falcon των 50 ml DMEM χωρίς ορό Πειραματική πορεία Μετά την συλλογή του μολυσματικού υλικού των τριπλών φλασκών σε σωλήνες των 50 ml, ακολούθησε φυγοκέντρηση δέκα λεπτών στις 1500 rpm. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε με πιπέτα κρατώντας το ίζημα το οποίο περιείχε τους ιούς εγκλωβισμένους μέσα στα κύτταρα. Τέλος, το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 2 ml θρεπτικού υλικού DMDM χωρίς ορό (πίνακας 3). Στο σημείο αυτό το κυτταρικό ίζημα μπορεί να διατηρηθεί στους -80 ο C, ώστε να συνεχιστεί η απομόνωση του ιού σε μελλοντικό χρόνο. Πίνακας 3: Συστατικά θρεπτικού υλικού DMEM χωρίς ορό Θρεπτικό υλικό DMEM χωρίς ορό Αντιδραστήρια Ποσότητες Τελική συγκέντρωση High glucose DMEM 490 ml - Pen/Strep 5 ml 1% NEAA 5 ml 1% 36

37 10.4 Καθαρισμός των αδενοϊών Υλικά Διαυγή σωληνάρια φυγοκέντρησης (Ultra-Clear Centrifuge Tubes, Beckman, USA) Ειδικά σωληνάρια (Quick Seal tubes, Beckman) Κασέτα διαπίδυσης (Slide-A Lyzer Dialysis Cassette 10,000, 5,503,741, Pierce, USA) Κρυοφιαλίδια (CRYO.S, E10090FD, Greiner Bio-One, Germany) Υπερφυγόκεντρος (Beckman, L8-70M Ultracentrifuge) Κεφαλή υπερφυγοκέντρου SW-41 και Ti-75 Χλωριούχο Νάτριο, NaCl (S1679, Sigma-Aldrich, USA) Όξινο Φωσφορικό Δινάτριο, Na2HPO4 (S-5136, Sigma, USA) Χλωριούχο Κάλιο, KCl (P5405, Sigma, USA) Χλωριούχο Ασβέστιο, CaCl2 (C-3881, Sigma, USA) Χλωριούχο Μαγνήσιο, MgCl2 (63063 Fluka, Sigma-Aldrich, USA) Διένυδρο Μονόξινο Ορθοφωσφορικό Νάτριο, Na2HPO4.2H2O (# , Merck, Germany) Δισόξινο Φωσφορικό Κάλιο, KH2PO4 (P0662, Sigma-Aldrich, USA) Σουκρόζη (Sucrose, S0389-1Kg, Sigma, USA) 1M Tris (AB , American Bioanalytica, USA) 0.5M EDTA ph 8 (AB , American Bioanalytica, USA) Χλωριούχο Καίσιο, CsCl ( , Gibco BRL, France) Διαλύματα Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν καταγράφονται στο πίνακα 4. Το ph διαλύματος TD 10Χ και του ρυθμιστικού διαλύματος αλάτων (Salt buffer) 10Χ ρυθμίστηκε στο 7.8. Το ρυθμιστικό διάλυμα TD 1Χ παρασκευάστηκε με αραίωση του TD 10Χ σε αναλογία 1:10.Το Sucrose buffer 10Χ προέκυψε από την προσθήκη 1kg σουκρόζης σε 2 L dd H2O. Όλα τα διαλύματα διηθήθηκαν με φίλτρο και αποθηκεύτηκαν στους 4 ο C. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε το θρεπτικό υλικό DMEM 2% HIHS και το ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA 1X (Πίνακας 5). Το διάλυμα διηθήθηκε από φίλτρο 0,22 μm και αποστειρώθηκε σε αυτόκαυστο θερμοκρασίας 121 O C για 20 λεπτά. Πίνακας 4: Συστατικά διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για τον καθαρισμό των αδενοϊών. Συστατικά NaCl Tris-HCl [ph 7.4] Na2HPO4 KCl ddh2o TD 10X Τελική συγκέντρωση 1.37 M 250 mm 7.3 mm 50 mm 37

38 Ρυθμιστικό διάλυμα Ca2+/Mg2+ (Ca2+/Mg2+ buffer) 200Χ CaCl M MgCl2 0.1 M TD 1Χ με Ca2+/Mg2+ dd H2O 70% v/v TD 10x 10% v/v Ca 2+ /Mg 2+ buffer 200x 0.5% v/v Ρυθμιστικό διάλυμα αλάτων (Salt buffer) 10Χ NaCl 1.4 M Na2HPO4.2H2O 49 mm KH2PO4 15 mm Ρυθμιστικό διάλυμα σουκρόζης (Sucrose buffer) 1Χ Salt buffer 10x 10% v/v Sucrose buffer 10x 10% v/v Πίνακας 8: Συστατικά ρυθμιστικού διαλύματος Tris-EDTA 1X. Συστατικά Ποσότητες Ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA 1X (TE buffer 1X) 1Μ Tris, ph ml 1 ml 0.5M EDTA ph 8 1 ml ddh2o 494 ml Τέλος, τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν στις υπερφυγοκεντρήσεις ήταν τα εξής: CsCl διάλυμα-1 (Adenovirus purification solution 1): 610 g/l σε 1X TE, ph 8.0 CsCl διάλυμα-2 (Adenovirus purification solution 2): 277 g/l σε 1X TE, ph 8.0 CsCl διάλυμα-3 (Adenovirus purification solution 3): 450 g/l σε 1X TE, ph 8.0 Πειραματική πορεία Αρχικά έγινε ψύξη των σωλήνων που περιείχαν τα κύτταρα με τους εγκλωβισμένους ιούς στους - 80 ο C και απόψυξη στους 37 ο C ούτως ώστε να λυθούν τα κύτταρα και να απελευθερωθεί ο ιός. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε τρεις φορές (κύκλοι ψύξης-απόψυξης/freeze-thaw cycles). Στη συνέχεια ακολούθησε φυγοκέντρηση 10 λεπτών, στους 4ºC και στις 4000 rpm για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα των κυττάρων και οι ιοί να παραμείνουν στο υπερκείμενο. Έπειτα ακολουθήθηκε η διαδικασία διαβάθμισης πυκνότητας όπως φαίνεται στην εικόνα 9, χρησιμοποιώντας δυο σωληνάκια. Στα ειδικά διαυγή σωληνάρια φυγοκέντρησης που εφαρμόζουν στην κεφαλή SW-41 της υπερφυγοκέντρου Beckman, προστέθηκαν αρχικά 2 ml διαλύματος CsCl- Solution 1 και στη συνέχεια 4 ml διαλύματος CsCl-Solution 2. Επειδή το διάλυμα 2 είναι ελαφρύτερο από το διάλυμα 1, η προσθήκη του δεύτερου διαλύματος έγινε με αργό ρυθμό, ώστε να μην αναμιχθεί με το πρώτο και να διατηρηθεί η βαθμίδωση πυκνότητας. 38

39 Στο τέλος προστέθηκε το πλούσιο σε αδενοϊό υπερκείμενο που συλλέχθηκε από τα μολυσμένα κύτταρα HEK 293 και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις 30,000 rpm στους 15 ο C για 2 ώρες. -Η διαδικασία της υπερφυγοκέντρησης γίνεται για να φιλτραριστούν μέσω της διαβάθμισης πυκνότητας οι αδενοϊοί από τα διάφορα υπολείμματα των κυττάρων. Μετά το τέλος της υπερφυγοκέντρησης, ο ιός σχηματίζει μια νεφελώδη λευκή ζώνη στη διαχωριστική επιφάνεια των δυο διαλυμάτων CsCl-. Έπειτα το υλικό που συλλέχθηκε, μεταφέρθηκε σε νέο ειδικό σωληνάριο (Quick Seal tubes), όπου προστέθηκε διάλυμα CsCl-Solution 3 (Adenovirus solution 3), το οποίο ξεχωρίζει το νεκρό από το ζωντανό ιό. Στη συνέχεια ακολούθησε φυγοκέντρηση με την κεφαλή Ti-75 στις 55,000 rpm στους 15 ο C για περίπου 16 ώρες. Εικόνα 9: Σχηματική αναπαράσταση ανάπτυξης και απομόνωσης αδενοϊών Μετά το πέρας της φυγοκέντρησης αναρροφήθηκε η κατώτερη νεφελώδης ζώνη που σχηματίστηκε.- Η ανώτερη ζώνη αποτελείται από άδεια ιϊκή κάψα, η οποία δεν πρέπει να αναμιχθεί με τα λειτουργικά και πλήρως μολυσματικά σωμάτια του αδενοϊού-. Ακολούθως, το υλικό μεταφέρθηκε στην κασέτα διαπίδυσης η οποία και τοποθετήθηκε σε δοχείο με το ρυθμιστικό διάλυμα 1X TD με Ca 2+ /Mg 2+ στους 4ºC υπό ανάδευση, ώστε να δημιουργηθεί υπότονο περιβάλλον ως προς το CsCl και να απομακρύνεται συνεχώς αυτό από την ημιπερατή μεμβράνη (εικόνα 10). Το διάλυμα αυτό ανανεώθηκε τουλάχιστον τρεις φορές και μετά από 16 ώρες αντικαταστάθηκε με το διάλυμα TD 1Χ με Ca 2+ /Mg 2+ με ισοτονικό διάλυμα σουκρόζης (sucrose buffer 1Χ) για τρείς επιπλέον ώρες. Αμέσως μετά, το περιεχόμενο της κασέτας συλλέχθηκε σε κρυοφυαλίδια, όπου στο καθένα προστέθηκαν 100μl αδενοϊού και φυλάχθηκαν στους 80 ºC. 39

40 Εικόνα 11: Σχηματική απεικόνιση της απομόνωσης αδενοϊών Τιτλοδότηση αδενοϊών με φασματοφωτομέτρηση Για την τιτλοδότηση του διαλύματος του αδενοϊού χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της φασματοφωτομέτρησης. Διαλύθηκαν 25 μl από το διάλυμα που προήλθε από τη διαπίδυση σε 475 μl sucrose buffer 1Χ και μετρήθηκε η οπτική απορρόφηση στα 260 nm. Η συγκέντρωση υπολογίζεται ως εξής: Σύνολο ιϊκών σωματιδίων = OD260 x 20 x 5 x 1011 Όπου το 20 αντιστοιχεί στην αραίωση του ιϊκού διαλύματος (Dilution factor) και 5 x 1011 είναι το πλήθος των ιϊκών σωματιδίων που αντιστοιχεί στην απορρόφηση OD260= 1. Μόνο 1% των σωματιδίων αυτών αντιστοιχεί σε μολυσματικό ιό άρα ο πραγματικός τίτλος του ιού είναι: Τίτλος ιού (σε pfu/ml) = (OD260 x 20 x 5 x 109) 11. Βιοχημικές αναλύσεις 11.1 Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας 40

41 Αρχή της μεθόδου Ο διαχωρισμός των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με την μέθοδο της υπερφυγοκέντρησης διαβαθμισμένης πυκνότητας βασίζεται στις διαφορές που εμφανίζουν οι λιποπρωτεΐνες ως προς την πυκνότητά τους λόγω διαφορετικού λιπιδικού και πρωτεϊνικού περιεχομένου. Έτσι επιτυγχάνεται η επίπλευσή τους σε διαφορετικές πυκνότητες αλατούχου διαλύματος. Στα διάφορα κλάσματα που συλλέγονται μετά την υπερφυγοκέντρηση, αρχικά απομονώνονται τα χυλομικρά με πυκνότητα <0.95 g/ml και οι VLDL με g/ml. Οι λιποπρωτεΐνες IDL και LDL βρίσκονται στα κλάσματα με πυκνότητα g/ml IDL και τις LDL και τέλος οι ΗDL στα κλάσματα με πυκνότητα g/ml. Σε πυκνότητες άνω του 1.21 g/ml εντοπίζονται οι μη λιπιδιωμένες πρωτεΐνες του πλάσματος. Ο υπολογισμός της μάζας του KBr που απαιτείται για την επιθυμητή πυκνότητα στην οποία θα επιπλεύσει το κάθε κλάσμα λιποπρωτεϊνών γίνεται με τη βοήθεια του εξής τύπου: Vτελ x ( d 1 ) 1 ( 0,298 * d ) Όπου Vτελ : ο τελικός όγκος του κλάσματος d : η πυκνότητα που πρέπει να έχει το πλάσμα Υλικά Βρωμιούχο Κάλιο (KBr, P , Fisher Scientific, New Jersey) 1.21 g/ml KBr (16.4g KBr σε 50 ml ddh2o) g/ml KBr (4.61g KBr σε 50 ml ddh2o) g/ml KBr (1.365g KBr σε 50 ml ddh2o) Ψυχώμενη υπερφυγόκεντρος (Beckman) Κεφαλή υπερφυγοκέντρου SW40 Σωλήνες διαβάθμισης (Ultra-Clear Centrifuge Tubes, Beckman, USA) SW40 ultracentrifugation rotor buckets (Beckman) 1X PBS ph 7.4 Πειραματική πορεία Το δείγμα του πλάσματος πρέπει να έχει πυκνότητα 1,23 g/ml και τελικό όγκο 400μl οπότε προστέθηκε στο δείγμα 0,145g KBr και εν συνεχεία τοποθετήθηκε πρώτο μέσα στο σωλήνα διαβάθμισης. Έπειτα προστέθηκαν όλα τα διαλύματα του KBr, ξεκινώντας από το πιο πυκνό και καταλήγοντας στο πιο αραιό, πολύ αργά με πιπέτα ώστε τα διαλύματα να μην αναμιχθούν και να 41

42 σχηματιστεί μια διακριτή επιφάνεια μεταξύ των διαλυμάτων διαφορετικής πυκνότητας. Συγκεκριμένα, προστέθηκαν 0.8 ml διαλύματος KBr (1,21 g/ml) και στη συνέχεια 2 ml KBr (1,063 g/ml). Έπειτα, προστέθηκε 0,4 ml KBr (1.019 g/ml) και τέλος 0,4 ml PBS 1x ph 7,4 (Εικόνα 12). Οι σωλήνες ισοζυγίστηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στους 15 ο C στις g για 20 ώρες. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, συλλέχθηκαν σε σωληνάκια, δέκα κλάσματα των 400μl με πιπέτα προσεκτικά ώστε να μην αναμιχθούν τα κλάσματα. Εικόνα 12: Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας κλασματοποίησης των λιποπρωτεϊνών. Για να ελαχιστοποιηθεί η μόλυνση με LPS των δειγμάτων, κατά τη διάρκεια της απομόνωσης όλα τα διαλύματα αποστειρώθηκαν στο αυτόκαυστο και όλα τα πλαστικά σκεύη που δεν μπορούσαμε να τα αποστειρώσουμε με αυτόν τον τρόπο, αποστειρώθηκαν με 70% αιθανόλη και τοποθετήθηκαν κάτω από απαγωγό εξοπλισμένο με υπεριώδες φως, όλη τη νύχτα Διαπίδυση στα κλάσματα του πλάσματος Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος της διαπίδυσης χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό μικρών μορίων από μεγάλα μακρομόρια διαμέσου μεμβράνης εκλεκτικής διαπερατότητας. Βρίσκει κυρίως εφαρμογή στον διαχωρισμό μορίων από διαλύματα τα οποία περιέχουν μεγάλη συγκέντρωση αλάτων. Το διάλυμα που πρόκειται να υποστεί διαπίδυση, τοποθετείται σε σωλήνα ο οποίος σφραγίζεται με την ειδική μεμβράνη διαπίδύσης και βυθίζεται σε δοχείο με συγκεκριμένο ρυθμιστικό διάλυμα. Τα μικρά διαλυτά μόρια έρχονται σε ισορροπία μεταξύ των δύο πλευρών της μεμβράνης. Η κίνηση των μικρών διαλυτών μορίων, ακολουθείται από κίνηση του διαλύτη προς την αντίθετη κατεύθυνση. Οι μεμβράνες που χρησιμοποιούνται είναι ειδικά κατασκευασμένες ώστε οι πόροι που διαθέτουν να εμποδίζουν την μετακίνηση μορίων που υπερβαίνουν κάποιο συγκεκριμένο μοριακό βάρος. Το 42

43 μέγεθος των πόρων της μεμβράνης θα πρέπει να είναι πολύ μικρότερο από το μακρομόριο που μας ενδιαφέρει. Υλικά Μεμβράνη διαπύδησης με μοριακό βάρος αποκλεισμού τα 10κDa (Dialysis Membrane, , Medicell International LtD, neolab, London, England) Σωληνάκια (Fisherbrand Disposable Culture Tubes, , Fisher Scientific, USA) Καπάκια (Fisher brand, Tainer Top Safety, Fisher Scientific, USA) Μαγνητικός αναδευτήρας (Chimarec 2, Thermolyne) Διάλυμα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (EM buffer) ph 7.4: (18,6 gr ammonium acetate + 4,98 gr ammonium carbonate μl 0,5 M EDTA ph 8.0 σε 1 lt dd H2O) Πειραματική πορεία Τα σωληνάκια που συλλέχθηκαν μετά την υπερφυγοκέντρηση, σκεπάστηκαν με την μεμβράνη διαπίδυσης και κλείστηκαν με τα καπάκια tainer top safety. Πριν χρησιμοποιηθεί η μεμβράνη, τοποθετήθηκε σε διάλυμα EDTA σε ddh2o που έβραζε ώστε να απομακρυνθεί η λιπαρή ουσία με την οποία είναι επεξεργασμένη. Τα σωληνάκια βυθίστηκαν με τα καπάκια προς τα κάτω σε ένα ποτήρι ζέσεως που περιείχε ddh2o και τοποθετήθηκαν στους 4 ο C πάνω σε μαγνητικό αναδευτήρα για 24 ώρες, ενώ σε τακτά χρονικά διαστήματα το ddh2o ανανεωνόταν. Τέλος, τα κλάσματα μεταφέρθηκαν σε σωληνάκια 1,5 ml. Τα κλάσματα, τοποθετήθηκαν για περίπου ένα λεπτό κάτω από συνεχή ροή αέριου αζώτου, ώστε να απομακρυνθεί το οξυγόνο, στην συνέχεια σφραγίστηκαν με parafilm και αποθηκεύτηκαν στους -20 ο C Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης Αρχή της μεθόδου Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι η υδρόλυση των εστέρων χοληστερόλης με την εστεράση της χοληστερόλης (CE) σε χοληστερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα. Cholesterol Esters CE Cholesterol + Fatty Acids Στη συνέχεια οξειδώνεται η χοληστερόλη με την οξειδάση της χοληστερόλης (CO) και απελευθερώνεται Η2Ο2. Cholesterol + O2 CO Cholest-4-en-3-one + H2O2 43

44 Τέλος, το Η2Ο2 αντιδρά με το υδροξυ-βενζοϊκό οξύ και την 4-αμινοαντιπυρίνη μέσω της υπεροξειδάσης (POD) σχηματίζοντας τη χρωστική κυνομιμίνη, που απορροφά φως και βάσει αυτής της απορρόφησης και συγκριτικά με την απορρόφηση των προτύπων γίνεται ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των δειγμάτων. 2H2O2 + HBA + 4-AAP POD Quinoneimine dye + 4H2O Υλικά Infinity Cholesterol Liquid Stable Reagent (TR , Thermo Electron, Melbourne, Australia) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελιών (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Πειραματική πορεία Αρχικά, προετοιμάστηκαν τα πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης μέσω διαδοχικών αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος με 1Χ PBS και φορτώθηκαν 7.5 μl από το καθένα στις δύο τελευταίες σειρές της μικροπλάκας. Στα πρώτα κελία των σειρών αυτών προστέθηκε το τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό 1Χ PBS ph 7.4. Στα υπόλοιπα πηγαδάκια προστέθηκαν 7.5 μl από τα δείγματά μας τα οποία είχαω αραιωθεί με 1Χ PBS σε μια αναλογία 1:5 (εικόνα 13). Με την πολυπιπέτα προστέθηκαν 200 μl του αντιδραστηρίου Infinity και η μικροπλάκα τοποθετήθηκε σε μηχανή ανάδευσης για 45 λεπτά. Τέλος, έγινε φωτομέτρηση στο ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 490nm. Η συγκέντρωση της χοληστερόλης στα άγνωστα δείγματα προκύπτει από την απορρόφηση της με βάση την πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται από τις απορροφήσεις των αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος. Εικόνα 13: Μικροπλάκα 96 κελιών για τη μέτρηση της ολικής χοληστερόλης του πλάσματος. 44

45 11.4 Προσδιορισμός επιπέδων ελεύθερης χοληστερόλης Υλικά Free Cholesterol E Kit (Wako,Japan) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελιών (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Πειραματική πορεία Για τον προσδιορισμό των επιπέδων της ελεύθερης χοληστερόλης ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία που περιγράφηκε στην παράγραφο 4.3. Το πρότυπο διάλυμα γνωστής συγκέντρωσης είναι το αντιδραστήριο Free Cholesterol E-Standard Solution, ενώ το χρωμογόνο διάλυμα είναι το αντιδραστήριο Free Cholesterol E-Color Reagent. Αφού φορτώθηκαν τα δείγματα, προστέθηκαν με την πολυπιπέτα 75 μl του αντιδραστηρίου Free Cholesterol E-Color Reagent και η μικροπλάκα τοποθετήθηκε σε μηχανή ανάδευσης για 45 λεπτά. Τέλος, έγινε φωτομέτρηση στο ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 655 nm Προσδιορισμός επιπέδων φωσφολιπιδίων Υλικά Phospholipid C Kit (Wako,Japan) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελιών (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Πειραματική πορεία Για τον προσδιορισμό των επιπέδων φωσφολιπιδίων ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία που περιγράφηκε στην παράγραφο 4.3. Το πρότυπο διάλυμα γνωστής συγκέντρωσης είναι το αντιδραστήριο Phospholipids C-Standard Solution, ενώ το χρωμογόνο διάλυμα είναι το αντιδραστήριο Phospholipids C-Color Reagent. Αφού φορτώθηκαν τα δείγματα, προστέθηκαν με την πολυπιπέτα 75 μl του αντιδραστηρίου Phospholipids C -Color Reagent και η μικροπλάκα τοποθετήθηκε σε μηχανή ανάδευσης για 45 λεπτά. Τέλος, έγινε φωτομέτρηση στο ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 490 nm. 45

46 11.6 Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων Υλικά Triglycerides FS Kit (Diasys Diagnostic Systems GmbH, Germany) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελιών (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Πειραματική πορεία Για τον προσδιορισμό των επιπέδων τριγλυκεριδίων ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία που περιγράφηκε στην παράγραφο 4.3. Αφού φορτώθηκαν τα δείγματα, προστέθηκαν με την πολυπιπέτα 75 μl του αντιδραστηρίου Triglycerides FS και η μικροπλάκα τοποθετήθηκε σε μηχανή ανάδευσης για 20 λεπτά. Τέλος, έγινε φωτομέτρηση στο ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 540 nm Προσδιορισμός επιπέδων των πρωτεϊνών Υλικά DCTM Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) Stock BSA solution (20 mg/ml) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελιών (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Πειραματικά πορεία Αρχικά, προετοιμάστηκαν τα πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης μέσω διαδοχικών αραιώσεων του διαλύματος Stock BSA με 1Χ PBS και στη συνέχεια φορτώθηκαν 5 μl από το καθένα στις δύο τελευταίες σειρές της μικροπλάλας. Στα πρώτα κελία των σειρών αυτών προστέθηκε το τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό 1Χ PBS ph 7.4. Στα υπόλοιπα πηγαδάκια προστέθηκαν 5 μl από τα δείγματά μας. Με την πολυπιπέτα προστέθηκαν 25 μl από το αντιδραστήριο chromogenic reagent A και 200 μl από το αντιδραστήριο chromogenic reagent B. Η μικροπλάκα τοποθετήθηκε σε μηχανή ανάδευσης για 15 λεπτά. Τέλος, έγινε φωτομέτρηση στο ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 540 nm. 46

47 12. Μοριακές αναλύσεις 12.1 Προσδιορισμός επιπέδων του TNFa με ELISA Αρχή της μεθόδου Η ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) είναι μια βιοχημική μέθοδος, που χρησιμοποιείται κυρίως για την ανίχνευση ενός αντιγόνου ή ενός αντισώματος σε ένα δείγμα. Στην ELISA, μία άγνωστη ποσότητα αντιγόνου ακινητοποιείται στην επιφάνεια της μικροπλάκας και στη συνέχεια ένα ειδικό αντίσωμα απλώνεται επάνω στην επιφάνεια αυτή προκειμένου να δεσμεύσει το αντιγόνο. Το αντίσωμα αυτό συνδέεται με ένα ένζυμο το οποίο με την προσθήκη ενός υποστρώματος μπορεί να παράγει μια χρωμογόνο ένωση. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε μία παραλλαγή της ELISA, την Sandwich ELISA (εικόνα 14). Στην παραλλαγή αυτή, το πρώτο αντίσωμα, που είναι ειδικό για το αντιγόνο, ακινητοποιείται στην επιφάνεια της μικροπλάκας. Στη συνέχεια προσθέτουμε το αντιγόνο, το οποίο προσδένεται στο αντίσωμα. Στο τέλος προσθέτουμε το δεύτερο αντίσωμα, το οποίο είναι συνδεδεμένο με ένα ένζυμο που παράγει μια χρωμογόνο ένωση. Στην παρούσα εργασία, πραγματοποιήσαμε ELISA για να προσδιορίσουμε τα επίπεδα του TNFa. Εικόνα 14: Σχηματική αναπαράσταση της sandwich ELISA Υλικά Mouse TNFα kit (ebioscience) Corning Costar 9018 or Nunc Maxisorp ELISA plates. Διηθητικό χαρτί (Whatmann) Πολυπιπέτα μl 47

48 Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Washing buffer Stop solution Πειραματική πορεία Αρχικά, στη μικροπλάκα της ELISA προστέθηκαν 100μl/κελί από το πρώτο αντίσωμα (capture antibody), η μικροπλάκα σφραγίστηκε και τη τοποθετήθηκε για επώαση στους 4 ο C για ώρες. Την επόμενη μέρα ακολούθησαν 5 πλύσεις των κελιών (200 μl/κελί washing buffer, πίνακας 9). Μετά τις πλύσεις προστέθηκαν με την πολυπιπέτα 200 μl 1X Assay Diluent σε κάθε κελί, η μικροπλάκα σφραγίστηκε και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά το τέλος της επώασης ακολούθησαν 5 πλύσεις των κελιών με washing buffer. Στη συνέχεια, προετοιμάστηκαν τα πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης μέσω διαδοχικών αραιώσεων του διαλύματος mouse TNFα με 1Χ Assay Diluent και φορτώθηκαν 100 μl από το καθένα στις δύο τελευταίες σειρές της μικροπλάλας. Στα πρώτα κελία των σειρών αυτών προστέθηκε το τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό 1Χ Assay Diluent. Στα υπόλοιπα πηγαδάκια προστέθηκαν 100 μl από τα δείγματά μας. Η μικροπλάκα σφραγίστηκε και τοποθετήθηκε για επώαση στους 4 ο C για ώρες. Την επόμενη μέρα ακολούθησαν 5 πλύσεις των κελιών. Μετά τις πλύσεις προστέθηκαν με την πολυπιπέτα 200 μl σε κάθε κελί από το δεύτερο αντίσωμα (Detection Antibody), η μικροπλάκα σφραγίστηκε έγινε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Στη συνέχεια ακουλούθησαν 5 πλύσεις των κελιών, προστέθηκαν 100 μl Avidin-HRP σε κάθε κελί, η μικροπλάκα σφραγίστηκε και έγινε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Μετά το τέλος της επώασης ακολούθησαν 7 πλύσεις των κελιών, προστέθηκαν 100 μl από το substrate solution (TMB) σε κάθε κελί και έγινε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Ύστερα προστέθηκαν 50 μl από το Stop Solution σε κάθε κελί για να σταματήσει η αντίδραση. Τέλος, έγινε φωτομέτρηση στο ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 450 nm και η συγκέντρωση του TNFa στα άγνωστα δείγματα προέκυψε από την απορρόφηση του με βάση την πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται από τις απορροφήσεις των αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος. Πίνακας 9: Συστατικά του washing buffer και του stop Solution Συστατικά Ποσότητες Washing buffer (0.05% v/v Tween 20) 1x PBS 1L Tween μl Stop solution (2N H2SO4) H2SO4 3 ml dd H2O Up to 1 L 48

49 12.2 Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Βlot) Αρχή της μεθόδου Η τεχνική περιλαμβάνει την μεταφορά πρωτεϊνών από την πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη PVDF με την εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος. Οι πρωτεΐνες δεσμεύονται πάνω στη μεμβράνη μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, αλλά διατηρούν τις αντιγονικές τους ιδιότητες. Έτσι μπορούν να αναγνωριστούν από τα αντισώματα. Χρησιμοποιείται ένα αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει την πρωτεΐνη, και ένα δεύτερο που αναγνωρίζει μία περιοχή του πρώτου. Στο δεύτερο αντίσωμα επίσης, βρίσκεται ομοιοπολικά συνδεδεμένο το ένζυμο της υπεροξειδάσης, το οποίο όταν αντιδράσει με το υπεροξείδιο του υδρογόνου, προκαλεί χημειοφωταύγεια. Έτσι εμφανίζεται φωτεινό σήμα στο σημείο όπου βρίσκεται η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Υλικά 1X Transfer Buffer Συσκευή και κασέτα μεταφοράς Μεμβράνη μεταφοράς (Porablot PVDF membrane, REF , Macherey-Nagel, Germany) Μεθανόλη (Methanol for analysis, I557009, Merck, Germany) Tris base (Applichem) Γλυκίνη (Fluka) Tween-20 (Chem-lab) Διηθητικό χαρτί (Whatmann) 5% Blotting milk Πρωτοταγές αντίσωμα (goat anti-mouse ApoA-I,ApoE και ApoA-II, Biodesign) Δευτεροταγές αντίσωμα Rabbit anti-goat IgG HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc) Washing buffer Κασέτα εμφάνισης του φιλμ ECL Developer (P7042-1GA, Sigma-Aldrich, USA) Fixer (P7167-1GA, Sigma-Aldrich, USA) Kodak film 13cm x 18cm (Biomax Xar Film) Πειραματική πορεία Η μεμβράνη PVDF αρχικά ενεργοποιήθηκε με εμβάπτιση σε μεθανόλη. Έπειτα σε ένα δοχείο που περιέχει 1x Transfer Buffer τοποθετήθηκαν στην κασέτα μεταφοράς, με κατεύθυνση από την κάθοδο προς την άνοδο, τα ακόλουθα : Σφουγγαράκι - τρία κομμάτια διηθητικού χαρτιού - Πηκτή - Μεμβράνη PVDF - τρία κομμάτια διηθητικού χαρτιού Σφουγγαράκι. Αφαιρέθηκαν τυχόν φυσαλίδες και η κασέτα μεταφοράς τοποθετήθηκε στην ειδική συσκευή, η οποία περιείχει ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1x. Εφαρμόστηκε ηλεκτρικό ρεύμα σταθερής έντασης 30 Volt για 24 ώρες στους 4 ο C. 49

50 Η μεμβράνη PVDF που πλέον περιείχει τις πρωτεΐνες επωάστηκε σε 5ml blotting milk 5% για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου πάνω σε μηχάνημα ήπιας ανάδευσης. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το blotting milk και η μεμβράνη επωάστηκε υπό ανάδευση με 5ml πρωτοταγούς αντισώματος (αραίωση 1:1000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησαν τρείς πλύσεις της μεμβράνης με 100ml washing buffer για 15 λεπτά υπό ανάδευση. Προστέθηκε το δευτεροταγές αντίσωμα (αραίωση 1:4000) και η μεμβράνη επωάστηκε υπο ανάδευση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, ακολούθησαν τρείς πλύσεις με washing buffer για 15 λεπτά και η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διάλυμα PBS 1x, ώσπου να γίνει η αυτοραδιογραφία όπως περιγράφεται παρακάτω. Η μέθοδος της αυτοραδιογραφίας βασίζεται στην χημική αντίδραση των οπτικών φωτονίων με τους κόκκους αλογονούχου Ag του φιλμ. Τα οπτικά φωτόνια μετατρέπουν τα ιόντα αργύρου σε μεταλλικό άργυρο. Κατά την εμφάνιση του φιλμ, οι κόκκοι αλογονούχου αργύρου που δεν αντέδρασαν απομακρύνονται, ενώ ο μεταλλικός άργυρος μαυρίζει στα σημεία αλληλεπίδρασης με την ακτινοβολία. Μέσα σε σκοτεινό θάλαμο, η μεμβράνη επωάστηκε για 1 λεπτό σε διάλυμα ΕCL που περιείχε υπεροξείδιο του υδρογόνου. Στην συνέχεια τοποθετήθηκε στην κασέτα εμφάνισης ανάμεσα σε δύο πλαστικές διαφάνειες, επάνω από τις διαφάνειες τοποθετήθηκε το φιλμ και έκλεισε η κασέτα εμφάνισης. Το κάθε φιλμ έμεινε στην κασέτα 1-4 λεπτά και στη συνέχεια βυθίστηκε σε διάλυμα developer (περίπου 1 λεπτό), ξεπλύθηκε σε νερό και βυθίστηκε σε διάλυμα fixer μέχρι να γίνει διαυγές και να μονιμοποιηθεί. Πίνακας 10: Προετοιμασία διαλυμάτων για την μεταφορά των πρωτεϊνών Συστατικά Tris base Glycine ddh2o 10x transfer buffer ddh2o Tris base NaCl ddh2o 10x TBS Tween-20 ddh2o 10x Transfer buffer 1x Transfer buffer 10x TBS buffer 1x TBST buffer Ποσότητες 10.1 g 72 g 500 ml 50 ml 450 ml g 58.4 g 900 ml 100 ml 1 ml Up to 1 L 50

51 Πίνακας 11: Προετοιμασία διαλυμάτων για την ανοσοαποτύπωση Συστατικά Blocking buffer Blotting milk 1x PBS Primary antibody (1:1000) Goat anti-mouse ApoA-I,ApoE ή ApoA-II 1x TBST Secondary antibody (1:4000) Rabbit anti-goat IgG HRP 1x TBST Ποσότητες 10 g 200 ml 5 μl 5 μl 2 μl 8 ml Πίνακας 12: Προετοιμασία διαλυμάτων για την αυτοραδιογραφία Συστατικά Luminol 1.25 mm ph 8.5 p-coumaric acid 68 mm hydrogen peroxide 3% Developer ddh2o Fixer ddh2o ECL solution Developer solution Fixer solution Ποσότητες 10 ml 10 μl 30 μl 218 ml Up to 1L 218 ml Up to 1L 13. In vivo LPS stimulation Οι μελέτες αυτές σχεδιάστηκαν για να μελετηθεί η επαγόμενη από το LPS, φλεγμονώδης απόκριση, των WT, Lcat -/-, ApoA-I -/-, ApoA-I/ApoE -/- ποντικών. Υλικά Σύριγγες ινσουλίνης Escherichia coli LPS 055:B5 (Sigma) EDTA-capillary tubes TNFα ELISA kits 51

52 Πειραματική πορεία Οι ApoE, ApoA-I and ApoA-II αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση κατά Western, στα κλάσματα της HDL, που απομονώθηκαν από τις πειραματικές μας ομάδες. Επίσης πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις των λιπιδίων και των πρωτεϊνών των HDL κλασμάτων, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 4. Στη συνέχεια χορηγήθηκαν στα ποντίκια Escherichia coli LPS 055:B5 με ενδοφλέβια ένεση, για να επιτευχθεί επαγωγή της φλεγμονώδους απόκρισης. Πριν την επαγωγή της φλεγμονής, καθώς και κατά την διάρκειά της, πάρθηκαν δείγματα αίματος από την ουρά, Στο πλάσμα που απομονώθηκε μετρήθηκαν τα επίπεδα του TNFa με ELISA, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 5.1. Επίσης στο πλάσμα αναλύθηκαν η ApoE και η ApoA-I, τόσο στην βασική κατάσταση όσο και κατά την διάρκεια της φλεγμονής. 14. In vitro LPS stimulation Υλικά Μικροπλάκες 96 κελιών RAW macrophage LPS Human serum albumin Θρεπτικό υλικό DMEM Ορός, λιποπρωτεΐνες από τις πειραματικές ομάδες Πειραματική πορεία Αρχικά, τα RAW κύτταρα καλλιεργήθηκαν για ώρες, στους 37 ο C, σε θρεπτικό υλικό DMEM. Την επόμενη μέρα, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS 1X και επωάστηκαν, για 4 ώρες στους 37 ο C, με LPS (100 ng/ml) και 0.1% human serum albumin, με ή χωρίς την παρουσία ορού ή HDL, σε διάφορες συγκεντρώσεις, που απομονώθηκαν από τις πειραματικές ομάδες ποντικών. Ως control, κύτταρα επωάστηκαν με 0.1% human serum albumin και ορό ή HDL, στις υψηλότερες συγκεντρώσεις. 52

53 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 53

54 15. Η έλλειψη της LCAT ενισχύει την επαγόμενη από τον LPS φλεγμονώδη απόκριση in vivo και in vitro 15.1 Χαρακτηρισμός της απολιποπρωτεϊνικής σύστασης της HDL των WT, ApoA-I -/- και Lcat -/- πειραματόζωων Αρχικά μελετήσαμε τις διαφορές στην πρωτεϊνική σύσταση της HDL που απομονώσαμε από τα WT, Lcat -/- και ApoA-I -/- ποντίκια. Έτσι πραγματοποιήσαμε western blot ανάλυση για τις τρείς κυριότερες απολιποπρωτεΐνες της HDL, την ApoA-I, ApoE και ApoA-II. Από το αποτέλεσμα της western παρατηρούμε ότι η HDL των WT ποντικών αποτελείται κυρίως από την ApoA-I, ενώ η HDL των Lcat -/- ποντικών αποτελείται από την ApoE. Η HDL των ApoA-I -/- ποντικών αποτελείται κυρίως από την ApoE και σε μικρότερο βαθμό από την ApoA-II (εικόνα 15). Εικόνα 15: Western blot ανάλυση για την ApoA-I (A), ApoE (B) και ApoA-II (C) σε κλάσματα HDL από WT (1-2), Lcat -/- (3-4) και ApoA-I -/- (5-6) ποντίκια. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε βιοχημικές αναλύσεις για να υπολογίσουμε τα επίπεδα της ολικής, ελεύθερης και εστεροποιημένης χοληστερόλης, των φωσφολιπιδίων, των τριγλυκεριδίων και της ολικής πρωτεΐνης, στα κλάσματα της HDL στις τρείς πειραματικές ομάδες ποντικών. Όπως παρατηρούμε στον πίνακα 13 τα Lcat -/- ποντίκια εμφανίζουν, στην HDL τους, πολύ χαμηλά επίπεδα ολικής και εστεροποιημένης χοληστερόλης, σε σύγκριση με τα WT ποντίκια. Επίσης η HDL των Lcat -/- ποντικών περιέχει λιγότερα φωσφολιπίδια και ολική πρωτεΐνη σε σχέση με τα WT ποντίκια. Στα ApoA-I -/- ποντίκια παρατηρούμε χαμηλότερα επίπεδα ολικής και 54

55 εστεροποιημένης χοληστερόλης και ολικής πρωτεΐνης σε σύγκριση με τα WT ποντίκια. Επίσης η HDL των ApoA-I -/- περιέχει περίπου την ίδια ποσότητα φωσφολιπιδίων σε σύγκριση με τα WT. Πίνακας 13: Λιπιδική σύσταση της HDL από WT, Lcat -/- και ApoA-I -/- ποντίκια WT HDL Lcat -/- HDL ApoA-I -/- HDL TC (mg/dl) ± ± ± 0.05 FC (mg/dl) 8.37 ± ± ± 0.11 CE (mg/dl) ± ± ± 0.04 PL (mg/dl) ± ± ± 0.08 TG (mg/dl) 1.44 ± ± ± 0.16 Protein (mg/ml) 1.58 ± ± ± Μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης της HDL των WT, ApoA-I -/- και Lcat -/- πειραματόζωων Για να μελετήσουμε τις πιθανές επιπτώσεις των ποιοτικών αλλαγών της HDL στις αντιφλεγμονώδης ιδιότητές της, εξετάσαμε το κατά πόσον η έλλειψη της LCAT και της ApoA-I επηρεάζουν την φλεγμονώδη απόκριση in vivo μετά από χορήγηση LPS. Η επίδραση του LPS στα Lcat -/- ποντίκια συγκρίθηκε με αυτή των ποντικιών με ανεπάρκεια στην ApoΑ-Ι, τα οποία στερούνται κλασικής HDL και είναι γνωστό ότι έχουν αυξημένη φλεγμονώδη απόκριση στο LPS, και με άγριου τύπου (WT) ποντίκια ελέγχου. Όπως αναμενόταν, η LPS-επαγόμενη (100 μg / kg βάρους σώματος) έκκριση TNFa τόσο των Lcat -/- όσο και των ΑροA-I -/- ποντικιών ήταν σημαντικά ενισχυμένη σε σύγκριση με τα WT ποντίκια (εικόνα 16). 55

56 A B Εικόνα 16: Επίπεδα του TNFa στο πλάσμα Lcat -/- (A) και ApoA-I -/- (Β) ποντικών μετά από χορήγηση LPS. * υποδηλώνει P<0.05, ** υποδηλώνει P<0.01 σε σύγκριση με τα WT Μελέτη της απολιποπρωτεϊνικής σύστασης της HDL των WT, ApoA-I -/- και Lcat -/- πειραματόζωων συναρτήση με το χρόνο έκθεσης στον LPS Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε western blot ανάλυση, σε πλάσμα που απομονώσαμε από τις τρείς πειραματικές ομάδες, για την ApoA-I και ApoE. Όσον αφορά την ApoA-I, μεγαλύτερη συγκέντρωση είχαν τα WT ποντίκια, τόσο πριν όσο και μετά την χορήγηση LPS. Στα Lcat -/- ποντίκια η συγκέντρωση ήταν εμφανώς μειωμένη, πριν και μετά την χορήγηση LPS, σε σχέση με τα WT. Όπως περιμέναμε, στα ApoA-I -/- παρατηρήσαμε παντελής έλλειψη της ApoA-I. Για την ApoE, τα Lcat -/- και ApoA-I -/- ποντίκια είχαν την μεγαλύτερη συγκέντρωση, τόσο πριν όσο και μετά την χορήγηση του LPS (εικόνα 17). Εικόνα 17: Western blot ανάλυση για την ApoA-I (A) και ApoE (B) σε πλάσμα από WT (1-4), Lcat -/- (5-8) και ApoA-I -/- (9-12), πριν και μετά την χορήγηση LPS. 56

57 Τέλος, επωάσαμε RAW μακροφάγα με LPS παρουσία ορού που απομονώσαμε από Lcat -/-, ApoA-I -/- και WT ποντίκια. Ο ορός από τα Lcat -/- ποντίκια, σε χαμηλές συγκεντρώσεις ( 0.1%), ενίσχυε την φλεγμονώδη απόκριση και μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις (10%) ήταν σε θέση να εξουδετερώσει την δράση του LPS (εικόνα 18Α). Παρόμοια μειωμένη εξουδετερωτική ικανότητα εμφάνισε και ο ορός από τα ApoA-I -/- ποντίκια (εικόνα 18Β). Όπως αναμενόταν, ο ορός από τα WT ποντίκια οδήγησε σε μια, εξαρτώμενη από τη δόση, μείωση της έκκρισης TNFa. A B Εικόνα 18: Έλλειψη του ενζύμου LCAT μειώνει την ικανότητα του ορού να αδρανοποιεί το LPS in vitro. RAW μακροφάγα επωάστηκαν για 4 ώρες με ή χωρίς LPS (100ng/ml), παρουσία συγκεκριμένων συγκεντρώσεων ορού από Lcat -/- (A) ή ApoA-I -/- (B) ποντίκια. # υποδηλώνει P<0.05, ## υποδηλώνει P<0.01 και ### υποδηλώνει P<0.001 σε σύγκριση με το LPS. * υποδηλώνει P<0.05, ** υποδηλώνει P<0.01 και *** υποδηλώνει P<0.001 σε σύγκριση με τα WT. 16. Επανέκφραση του ενζύμου LCAT μειώνει την επαγόμενη από το LPS φλεγμονή στα Lcat -/- ποντίκια in vivo Στη συνέχεια αυτό που θέλαμε να μελετήσουμε είναι το κατά πόσον η επανέκφραση της LCAT επανέφερε τον επαγόμενο από το LPS προ-φλεγμονώδη φαινότυπο των Lcat -/- ποντικών. Αρχικά επιβεβαιώσαμε ότι η μόλυνση με τον AdLCAT αδενοϊό επανέφερε το λιπιδικό προφίλ σε φυσιολογικά επίπεδα. Πράγματι, στα Lcat -/- ποντίκια που πήραν τον Lcat αδενοϊό, παρατηρήσαμε μια αύξηση κατά 50% των επιπέδων της ολικής χοληστερόλης του πλάσματος, καθώς και μία αύξηση 57% των επιπέδων της εστεροποιημένης χοληστερόλης (εικόνα 19). 57

58 Εικόνα 19: Επανέκφραση της LCAT επαναφέρει τα επίπεδα της ολικής (Α) και εστεροποιημένης (Β) χοληστερόλης στο πλάσμα. * υποδηλώνει P<0.05, ** υποδηλώνει P<0.01 και *** υποδηλώνει P<0.001 σε σύγκριση με τα WT. ### υποδηλώνει P<0.001 μεταξύ Lcat -/- και ApoΑ-Ι -/-. Στη συνέχεια χορηγήσαμε LPS στις τρεις πειραματικές ομάδες ποντικών και παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση των επιπέδων του TNFa στα Lcat -/- ποντίκια που πήραν τον Lcat αδενοϊό, σε σχέση με τα Lcat -/- ποντίκια που πήραν τον αδενοϊό ελέγχου που εκφράζει την GFP πρωτεΐνη (εικόνα 20). Plasma TNF (ng/ml) * # WT + AdGFP Lcat -/- + AdGFP Lcat -/- + AdLCAT * Time (min) Εικόνα 20: Επανέκφραση της LCAT στα Lcat -/- ποντίκια επανέφερε των προ-φλεγμονώδη φαινότυπο in vivo. Τα Lcat -/- ποντίκια μολύνθηκαν με 5x10 8 pfu είτε με AdGFP ή AdLCAT και τα WT ποντίκια μολύνθηκαν με 5x10 8 pfu AdGFP. Τρείς ημέρες μετά την μόλυνση, στα ποντίκια χορηγήθηκε LPS και μετρήθηκαν τα επίπεδα του TNFa στο πλάσμα. * υποδηλώνει P<0.05 vs Lcat που χορηγήθηκε AdLCAT και # υποδηλώνει P<0.05 vs WT που χορηγήθηκε AdGFP. 58

59 Επιπλέον πραγματοποιήσαμε western blot ανάλυση για την ApoA-I και ApoE, σε πλάσμα που απομονώσαμε από τα ποντίκια των τριών πειραματικών ομάδων. Πιο συγκεκριμένα, για την ApoA-I παρατηρήσαμε ότι την υψηλότερη συγκέντρωση είχε η ομάδα των WT ποντικών που πήρε τον GFP αδενοϊό, τόσο πριν όσο και μετά την χορήγηση του LPS. Η ομάδα των Lcat -/- ποντικών που πήρε των GFP αδενοϊό είχε πολύ χαμηλά επίπεδα της ApoA-I πριν και μετά την χορήγηση του LPS, ενώ στην ομάδα των Lcat -/- ποντικών που χορηγήσαμε τον LCAT αδενοϊό παρατηρήσαμε σημαντική αύξηση των επιπέδων της ApoA-I, πριν και μετά την χορήγηση του LPS (εικόνα 21Α). Όσον αφορά την ApoE, η ομάδα που εμφάνισε τα υψηλότερα επίπεδα είναι η Lcat -/- που πήρε τον GFP αδενοϊό, ενώ η ομάδα των Lcat -/- ποντικών που έλαβε τον AdLcat αδενοϊό, παρουσίασε τα χαμηλότερα επίπεδα ApoE πλάσματος (εικόνα 21Β). Εικόνα 21: Western blot ανάλυση για την ApoA-I (A) και ApoE (B) σε πλάσμα WT (1-4) και Lcat -/- (5-8) ποντικών που πήραν των GFP αδενοϊό και Lcat -/- (9-12) που πήραν τον LCAT αδενοϊό. 17. Η αντιφλεγμονώδης δράση της HDL οφείλεται σε μια συνεργατική δράση της ApoA-I με την ApoE Για να μελετήσουμε την αντιφλεγμονώδη δράση των ApoE και ApoA-I στην επαγόμενη από LPS φλεγμονή, πραγματοποιήσαμε in vitro πειράματα σε ποντίκια με ανεπάρκεια τόσο στην ApoΑ-Ι όσο και στην ApoΕ (ApoA-IxApoE -/- ) στα οποία έγινε επανεισαγωγή με την χρήση αδενοϊού είτε της ApoΑ-Ι είτε της ApoΕ. Η ομάδα στην οποία χορηγήθηκε η ApoE (ApoE HDL) παρουσίασε σημαντική μείωση στα επίπεδα του TNFα μετά τη μόλυνση με LPS, εμφανίζοντας έτσι αντιφλεγμονώδη δράση. Αντίθετα, η LPS-επαγόμενη απόκριση κυτταροκινών στην ομάδα που πήρε τον ApoA-I αδενοϊό (ApoA-I HDL) παρουσιάζεται αρκετά ενισχυμένη (εικόνα 22). 59

60 Εικόνα 22: Επίδραση της APOE3-HDL και της APOA-I-HDL στην επαγόμενη από LPS παραγωγή TNFa, σε RAW μακροφάγα, in vitro.h Control HDL απομονώθηκε από ApoA-IxApoE -/- στα οποία χορηγήθηκε AdGFP. 18. Υπερέκφραση της ApoC-III οδηγεί σε επαγωγή της φλεγμονώδους απόκρισης Δεδομένου ότι η έκφραση της ApoC-III διαταράσσει την ομοιοστασία των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος και έχει προαθηρωματική δράση, στο επόμενο σετ πειραμάτων μελετήσαμε την επίδραση της υπερέκφρασης της ApoC-III στην αντιφλεγμονώδη δράση της HDL. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήσαμε in vitro πειράματα σε WT ποντίκια, στα οποία έγινε εισαγωγή με τη χρήση αδενοϊού της ApoC-III. Η LPS-επαγόμενη απόκριση κυτταροκινών στην ομάδα που πήρε τον ApoC-III αδενοϊό παρουσιάζεται αρκετά ενισχυμένη σε σχέση με την ομάδα που πείρε τον GFP αδενοϊό (εικόνα 23). 60

61 Εικόνα 23: Επίδραση της υπερέκφρασης της ApoC-III στην επαγόμενη από το LPS παραγωγή TNFa σε RAW μακροφάγα, in vitro. ** υποδηλώνει P<0.01 και *** υποδηλώνει P<0.001 σε σύγκριση με τα C57BL/6. 61