Η HDL ως καινοτόμος φαρμακολογικός στόχος: Διδάγματα από μελέτες έκθεσης πειραματόζωων σε χαμηλή θερμοκρασία.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Μ.Π.Σ. ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Η HDL ως καινοτόμος φαρμακολογικός στόχος: Διδάγματα από μελέτες έκθεσης πειραματόζωων σε χαμηλή θερμοκρασία. Ξεπαπαδάκη Α. Ευστρατία Βιολόγος Επιβλέπων καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Καθηγητής Φαρμακολογίας Πάτρα 2014

2 Επιβλέπων Καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Καθηγητής Φαρμακολογίας Τμήματος Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής: Κυριάκος Η. Κυπραίος, Καθηγητής, Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Διονύσιος Παπαχρήστου, Επίκουρος Καθηγητής, Εργαστήριο Ανατομίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Ιωάννης Χαμπαίος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Κλινικής Παθολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών 2

3 Πρόλογος Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών κατά την περίοδο στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της ενεργοποίησης του φαιού λιπώδους ιστού, μέσω έκθεσης πειραματικών μοντέλων ποντικών σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας, καθώς και του εγκλιματισμού τους στις παραπάνω συνθήκες, στο λιπιδαιμικό προφίλ τους και τις ιδιότητες της HDL. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Κυπραίο Κυριάκο, που μου έδωσε την ευκαιρία να ενταχθώ στην ερευνητική του ομάδα και μέσα από την αμέριστη καθοδήγησή και υπομονή του, κατηύθυνε την επιστημονική και τεχνική μου ανάπτυξη. Διδάσκοντάς με ακούραστα και μέσα από την εύστοχη κριτική και το αμείωτο ενδιαφέρον, μου μετέδωσε τον ενθουσιασμό του για την έρευνα και την επιστήμη. Επίσης θα ήθελα να τον ευχαριστήσω γιατί πάντα έδειχνε πίστη στις δυνάμεις μου, ακόμα και σε στιγμές που την έχανα εγώ. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Αν. Καθηγητή κ. Χαμπαίο Ιωάννη και τον Επικ. Καθηγητή κ. Παπαχρήστου Διονύσιο, που με τίμησαν με την συμμετοχή τους στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Ευχαριστώ επίσης τα μέλη του εργαστηρίου Φαρμακολογίας για το ευχάριστο κλίμα και την συμπαράστασή τους. Ιδιαίτερα την Ζβίντζου Ευαγγελία για την βοήθεια, τις συμβουλές που μου προσέφερε στην διεκπεραίωση της εργασίας αυτής, καθώς και για την αστείρευτη υπομονή και κατανόηση της στο το πρόσωπό μου όπως επίσης και για την αδιάκοπη ψυχολογική συμπαράσταση. Δεν θα μπορούσα να παραλείψω την κ. Κωνσταντίνου Κατερίνα, η οποία πίστεψε σε μένα και με κάθε δυνατό τρόπο μου μετέδιδε συνεχώς γνώσεις και αισιοδοξία. Τέλος ευχαριστώ τον πατέρα μου Αντώνη, μητέρα μου Ρηγάκη Μαρία, αδερφή μου Φλωρεντία και την αδελφική μου φίλη Μάκρα Χρυσάνθη, που όλα αυτά τα χρόνια με στηρίζουν, ο καθένας με τον δικό του ξεχωριστό τρόπο, σε κάθε απόφασή μου και κάθε βήμα μου, μεγάλο ή μικρό. Η δουλειά αυτή είναι αφιερωμένη σε αυτούς. 3

4 Περίληψη Πρόσφατα δεδομένα σε πειραματικά μοντέλα ζώων αλλά και σε ασθενείς καταδεικνύουν την σημαντικότητα της «ποιότητας» της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL), σε σχέση με την ποσότητά της, στην προστασία από τη στεφανιαία νόσο. Τα κύρια χαρακτηριστικά της HDL τα οποία καθορίζουν την «ποιότητά» της, είναι η ανάστροφη μεταφορά χοληστερόλης, οι αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητές της καθώς επίσης και η ικανότητά της να προάγει την παραγωγή ΝΟ στο αρτηριακό επιθήλιο και να ρυθμίζει την ομοιόσταση της γλυκόζης αίματος. Στην συγκεκριμένη ερευνητική εργασία μελετάμε την επίδραση που έχει η ενεργοποίηση του φαιού λιπώδους ιστού, μέσω της έκθεσης φυσιολογικών πειραματικών μοντέλων μυών, σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας, στο λιπιδαιμικό προφίλ, καθώς και στην λειτουργικότητα της HDL. Είναι γνωστό είναι ότι η ενεργοποίηση του φαιού λιπώδους ιστού, λόγω έκθεσης πειραματόζωων σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας, οδηγεί σε θερμογένεση, κάθαρση των τριγλυκεριδίων από το αίμα παχύσαρκων ποντικών, μείωση του βάρους τους, έλεγχο του καταβολισμού των λιποπρωτεϊνών και ομαλοποίηση της ανοχής τους στην γλυκόζη. Έτσι θελήσαμε να επεκτείνουμε την μελέτη μας, στον ενδεχόμενο ρόλο του εγκλιματισμού των πειραματόζωων μετά από μακρόχρονη έκθεσή τους στο ψύχος στους παραπάνω παράγοντες. Για την επίτευξη των πειραματικών μας στόχων δημιουργήθηκαν τρεις ομάδες C57BL/6 μυών εκ των οποίων η μια εκτέθηκε σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας για 2 εβδομάδες (βραχύχρονη έκθεση στο ψύχος), η άλλη ομάδα για 12 εβδομάδες (μακρόχρονη έκθεση στο ψύχος), ενώ η τρίτη αποτέλεσε την ομάδα ελέγχου. Στις δύο ομάδες μυών έγιναν κινητικές μελέτες έκκρισης και κάθαρσης τριγλυκεριδίων. Επίσης απομονώθηκαν από το πλάσμα του αίματος, τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα στα οποία έγιναν αναλύσεις για τον έλεγχο της ποσότητας και της ποιότητας της HDL. Τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν την επαγωγή θερμογένεσης από τον φαιό λιπώδη ιστό και στις δύο πειραματικές ομάδες, με αυτή να είναι πιο έντονη κατά την βραχύχρονη έκθεση στο ψύχος. Παρόλο που η κατανάλωση τροφής στις ομάδες που εκτέθηκαν στο ψύχος αυξήθηκε, το σωματικό τους βάρος παρέμεινε το ίδιο, μιας και η περίσσεια διατροφικών λιπιδίων χρησιμοποιούνταν από τον φαιό λιπώδη ιστό για την παραγωγή θερμότητας παρά για αποθήκευσή τους στον λευκό λιπώδη ιστό. Η εντερική απορρόφηση τριγλυκεριδίων αυξήθηκε σε σχέση με την ομάδα ελέγχου καθώς πιθανά ο οργανισμός χρειαζόταν τα λιπίδια για θερμογένεση, ενώ η ηπατική έκκριση τριγλυκεριδίων μειώθηκε. Η ολική χοληστερόλη των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων, στις πειραματικές ομάδες, έτεινε να βρίσκεται συγκεντρωμένη στα πιο ώριμα κλάσματα, ιδιαίτερα έπειτα από μακρόχρονη έκθεση 4

5 στο πειραματικό περιβάλλον. Επιπλέον η HDL την 12 η εβδομάδα, παρουσίασε καλύτερη αντιοξειδωτική δράση καθώς και διατήρησε αμιγή την ικανότητα να επιτελεί εκροή χοληστερόλης από τα κύτταρα. Τα ευρήματά μας οδηγούν σε δύο ενδιαφέρουσες ανακαλύψεις: 1) Η βραχεία έκθεση στο ψύχος έχει μεγαλύτερη επίδραση στη θερμογένεση και την παραγωγή ATP, απ ότι η μακρά έκθεση. 2) Η μακρά έκθεση στο ψύχος οδηγεί σε πιο λειτουργική HDL σε σχέση με την ομάδα βραχείας έκθεσης. Κατά συνέπεια τα αποτελέσματα μας αυτά, καταδεικνύουν εγκλιματισμό των πειραματόζωων στο ψύχος, ο οποίος συνοδεύεται από ποιοτικότερη και πιο λειτουργική HDL. 5

6 HDL as a novel pharmacological target: Lessons from cold exposure experiments. Efstratia A. Xepapadaki Abstract Recent data indicate the significance of HDL quality in atherosclerosis, rather than HDL cholesterol levels in plasma, suggesting that composition as well as functionality of HDL particle, imparts the atheroprotective property of HDL. The main atheroprotective property of HDL is cholesterol efflux in addition to anti-inflammatory and antioxidant properties. HDL has also the ability to promote NO production in the arterial lining and to regulate blood glucose levels. In this study we intend to examine whether brown adipose tissue activation, through low environmental temperature, affects lipid profile and functionality of HDL in C57BL/6 mice. Previous studies have shown that BAT is activated in animals which have been exposed to low temperature environment, resulting in thermogenesis, blood triglycerides clearance, weight reduction, control of lipoproteins catabolism and normalization of glucose tolerance. Thus we intended to study the possible role of acclimatization after long-term exposure to cold temperature regarding the above factors. Therefore we formed three groups of C57BL/6 mice, one of which was exposed to 4 o C environment for 2 weeks (short-term exposure), the other one for 12 weeks (long-term exposure) and the last one at 28 o C environment (control group). Kinetic studies of triglyceride secretion and clearance where performed, to all groups of animals. Analyses regarding HDL quantity and quality, where performed in lipoprotein fractions isolated from plasma. Our data demonstrate the induction of thermogenesis in BAT in both experimental groups, which appeared to be more intense during the short-term exposure. Although food consumption, in groups exposed to cold, was increased, body weight did not change, as BAT used the excess dietary lipids in order to produce heat rather than storing them in white adipose tissue. Intestinal absorption of triglycerides was increased compared to the control group, possibly because lipids are needed due thermogenesis. Total cholesterol in HDL fractions, tended to be concentrated in more mature fragments, especially after long-term exposure. In addition HDL, during long-term exposure, showed to have more effective antioxidant potential and cholesterol efflux, compared to the group exposed to cold temperature for 2 weeks. 6

7 Our observations lead to two interesting findings: 1) Short-term exposure to cold has greater effect on thermogenesis and ATP production rather than long-term exposure. 2) After long-term exposure to cold, HDL appears to be more functional compared to the short-term exposure group. Therefore our results indicate acclimation of the animals to low temperature environment, followed by a qualitative HDL. 7

8 Περιεχόμενα Πρόλογος... 3 Περίληψη... 4 Abstract... 6 Περιεχόμενα... 8 Ευρετήριο συντμήσεων Εισαγωγή Το μεταβολικό σύνδρομο Κριτήρια διάγνωσης μεταβολικού συνδρόμου Παθογένεια του μεταβολικού συνδρόμου Παχυσαρκία Λιπώδης Ιστός Χαρακτηριστικά Λευκού και Φαιού λιπώδους ιστού Θερμογένεση και η ρύθμισή της Μηχανισμός Θερμογένεσης στον Φαιό λιπώδη ιστό Διαζευκτική πρωτεΐνη 1 (Uncoupling protein 1 - UCP1) Ενεργοποίηση του Φαιού λιπώδους ιστού Ο Φαιός λιπώδης ιστός ως πιθανό μέσο θεραπείας της παχυσαρκίας Λιποπρωτεΐνες Χυλομικρά Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL) Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Απολιποπρωτεΐνες Απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-i) Ένζυμα

9 6. Υποδοχείς Μεταφορείς Υποδοχέας εκκαθαριστής τάξης Β τύπου Ι (Scavenger Receptor class B member 1 - SR-B1) ATP-Binding Cassette Transporter Protein A1 (ABCA1) Μονοπάτια μεταβολισμού λιποπρωτεϊνών Μεταβολικό μονοπάτι των χυλομικρών Μεταβολικό μονοπάτι των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας Μεταβολικό μονοπάτι της HDL Οι λειτουργίες της HDL Η αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Η αντιοξειδωτική δράση της HDL Επιπλέον λειτουργίες της HDL HDL : Ποσότητα ή Ποιότητα Σκοπός της μελέτης Υλικά και Μέθοδοι Πειραματόζωα: Χειρισμοί και πειραματικές διαδικασίες Ομάδες μελέτης Λήψη αίματος από την ουραία φλέβα των πειραματόζωων Μέτρηση σωματικού βάρους μυών Μέτρησης ημερήσιας κατανάλωσης τροφής των ποντικών Μέτρηση της ταχύτητας ηπατικής έκκρισης VLDL τριγλυκεριδίων Μέτρηση της ταχύτητας ολικής (εντερικής και ηπατικής) παροχής τριγλυκεριδίων στο αίμα και υπολογισμός της εντερικής έκκρισης τριγλυκεριδίων Θυσίες και λήψη ιστών από τα πειραματόζωα Αναλύσεις στο πλάσμα των πειραματόζωων Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στο πλάσμα Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας

10 Διαπίδυση στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Αναλύσεις στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα του πλάσματος Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Ανάλυση απολιποπρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Βlot) Αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL Αναλύσεις στους ιστούς Απομόνωση RNA από ηπατικό ιστό Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real Time PCR) Ομογενοποίηση Φαιού λιπώδους ιστού και απομόνωση μιτοχονδρίων Αποτελέσματα Μετρήσεις κατανάλωση τροφής, σωματικού βάρους και λιπιδίων Ενεργοποίηση Φαιού λιπώδους ιστού (UCP1 και CYC) Ρυθμός εντερικής και ηπατικής έκκρισης τριγλυκεριδίων Χαρακτηρισμός λιποπρωτεϊνών Κατανομή ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Κατανομή της απολιποπρωτεϊνης Α-Ι στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Ηπατική έκφραση γονιδίων Λειτουργικότητα της HDL Αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL Εκροή χοληστερόλης (Cholesterol Efflux) Συζήτηση Βιβλιογραφία

11 Ευρετήριο συντμήσεων 4-AAP 4-αμινοαντιπυρίνη ABCA1 ATP-binding cassette transporter A1 ACAT AκυλοCoA: χοληστερολακυλοτρανσφεράση ADP Διφωσφορική Αδενοσίνη (Adenosine Diiphosphate) ApoA-I Απολιποπρωτεΐνη A-I ApoA-II Απολιποπρωτεΐνη A-II ApoB-48 Απολιποπρωτεΐνη B-48 ApoC Απολιποπρωτεΐνη C ApoE Απολιποπρωτεΐνη Ε APS Υπερθειϊκό αμμώνιο Ammonium Persulfate ATP Τριφωσφορική Αδενοσίνη (Adenosine Triphosphate) BAT Φαιός Λιπώδης Ιστός (Brown Adipose Tissue) BDNF Brain-derived neurotrophic factor BMI Δείκτης Μάζας Σώματος (Body Mass Index) camp Κυκλική Μονοφωσφορική Αδενοσίνη(Cyclic adenosine monophosphate) CE Εστεράση της χοληστερόλης CETP Cholesteryl Ester Transfer Protein CO Οξειδάση της χοληστερόλης CYC Κυτόχρωμα c (Cytochrome c) DAP Φωσφορική διυδρόξυακετόνη ddh2o Δις-απεσταγμένο νερό DEPC Diethyl pyrocarbonate DHR Διϋδροροδαμίνη 123 DRP1 Dynamin Related Protein EDTA Αιθυλενο-διαμινο-τετρα-οξικό οξύ (Ethylene-diamino-tetra-acetic acid) EL Ενδοθηλιακή Λιπάση (Endothelial Lipase) ESPA Νατριικη Ν-αιθυλο-Ν-(3-θειοπροπυλο)-m-ανισιδίνη FADH2 Φλαβινο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο (Flavin adenine dinucleotide) FBS Εμβρυικός Βόειος Ορός (Fetal Bovine Serum) G-1-P 1-φωσφορική γλυκερόλη GK κιναση γλυκερολης GPO Οξειδάση της φωσφορικής γλυκερόλης HDL Λιποπρωτεΐνη Υψηλής Πυκνότητας (High Density Lipoprotein) HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N -2-ethanesulfonic acid HL Ηπατική Λιπάση (Hepatic Lipase) IDL Λιποπρωτεΐνη Ενδιάμεσης Πυκνότητας (Intermediate Density Lipoprotein) kda kilodalton, μονάδα μέτρησης μεγέθους πρωτεϊνών LCAT Λεκιθινο-Χοληστερολική Ακυλοτρανσφεράση (Lecithin-Cholesterol Acyltransferase) LDL Λιποπρωτεΐνη Χαμηλής Πυκνότητας (Low Density Lipoprotein) Lpl Λιποπρωτεϊνική Λιπάση (Lipoprotein Lipase) 11

12 MTTP Πρωτεΐνη Μικροσωμιακής Μεταφοράς Τριγλυκεριδίων (Microsomal Triglyceride Transfer Protein) Myf5 Myogenic Factor 5 NADH Νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο(Nicotinamide adenine dinucleotide) NEA Non-essential amino acids PBS Φωσφορικό Ρυθμιστικό Διάλυμα Άλατος (Phosphate Buffer Saline) Pen- Strep Penicillin Streptomycin PLTP Phospholipid Transfer Protein POD Υπεροξειδάση rpm Στροφές ανά λεπτό (Revolutions per minute) RPS18 Ριβοσωμική Πρωτεΐνη S18 (Ribosomal Protein S18) RT-PCR Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου SDS Δωδέκυλοθειϊκό Νάτριο (Sodium Dodecyl Sulfate) SR-B1 Υποδοχέας Εκκαθαριστής Τάξης Β, Τύπου 1 (Scavenger Receptor, Class B, Type 1) TEMED N,N, N,N - Tetramethylethylenediamine UCP1 Διαζευκτική Πρωτεΐνη 1 (Uncoupling protein 1) VLDL Λιποπρωτεΐνη Πολύ Χαμηλής Πυκνότητας (Very Low Density Lipoprotein) WAT Λευκός λιπώδης Ιστός (White Adipose Tissue) 12

13 Εισαγωγή 1. Το μεταβολικό σύνδρομο Το μεταβολικό σύνδρομο είναι ένα σύνολο αλληλένδετων παραγόντων κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων και διαβήτη τύπου ΙΙ. Αυτοί είναι: η δυσλιπιδαιμία (αυξημένα τριγλυκερίδια σε συνδυασμό με μειωμένη HDL χοληστερόλη), η αυξημένη αρτηριακή πίεση, η διαταραγμένη ανοχή στη γλυκόζη, η υπερινσουλιναιμία και η κεντρική παχυσαρκία (1). Τα τελευταία χρόνια ο επιπολασμός του μεταβολικού συνδρόμου έχει αυξηθεί σημαντικά εξαιτίας κυρίως του σύγχρονου τρόπου ζωής, των διατροφικών συνηθειών και της έλλειψης φυσικής άσκησης. Συγκεκριμένα, ένας στους τέσσερις ενήλικες εμφανίζει μεταβολικό σύνδρομο, με το 78% των ανδρών και το 74% των γυναικών στην Ελλάδα να το αγνοούν (2). 1.1 Κριτήρια διάγνωσης μεταβολικού συνδρόμου Το 2009, δημοσιεύθηκε στην επιθεώρηση Circulation ένα κείμενο σχετικά με τα διαγνωστικά κριτήρια του μεταβολικού συνδρόμου, όπως αυτά προέκυψαν από την επιστημονική συνάντηση εκπροσώπων διαφόρων διεθνών οργανισμών υγείας όπως: International Diabetes Federation (IDF), National Heart, Lung, and Blood Institute (NΙΗ), World Heart Federation, International Atherosclerosis Society, American Heart Association (AHA) και International Association for the Study of Obesity (3). Τα κριτήρια που ορίστηκαν είναι τα πέντε παρακάτω, από τα οποία απαιτούνται τουλάχιστον τρία για να γίνει η διάγνωση: 1. Περίμετρος μέσης: Άνδρες > 102cm, Γυναίκες > 88cm 2. Τριγλυκερίδια 150mg/dl (ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση αυξημένων επιπέδων τριγλυκεριδίων). 3. HDL: Άνδρες < 40mg/dl, Γυναίκες < 50mg/dl (ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση ελαττωμένων επιπέδων HDL). 4. Γλυκόζη νηστείας 100mg/dl (ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση των αυξημένων επιπέδων γλυκόζης). 5. Συστολική Αρτηριακή Πίεση (ΣΑΠ) 130mmHg ή Διαστολική Αρτηριακή Πίεση (ΔΑΠ) 85mmHg (ή λήψη φαρμάκων για την αντιμετώπιση αυξημένης ΣΑΠ ή ΔΑΠ). Tα τελευταία χρόνια έχουν αναφερθεί και άλλες διαταραχές που σχετίζονται με το μεταβολικό σύνδρομο, όπως το λιπώδες ήπαρ, η υπνική άπνοια, το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών, η αυξημένη πηκτικότητα του αίματος και η οστεοπόρωση. 13

14 1.2 Παθογένεια του μεταβολικού συνδρόμου Όπως γίνεται αντιληπτό η εμφάνιση του μεταβολικού συνδρόμου είναι σύνθετη και βασίζεται σε διάφορους παράγοντες που εξαρτώνται από τον γονότυπο καθώς και το περιβάλλον. Τέτοιοι είναι για παράδειγμα η γενετική προδιάθεση και η καθιστική ζωή συνδυασμένη με διαταραχές στο ενεργειακό ισοζύγιο (κατανάλωση τροφής πλούσια σε λιπίδια, γλυκόζη κ.α.). Η παχυσαρκία κεντρικού τύπου εμφανίζεται, από κάποιες μελέτες, σαν η βασική αιτία του μεταβολικού συνδρόμου (4) (5) (6), ενώ άλλες ορίζουν σαν βασικό αίτιο την αντίσταση στην ινσουλίνη (7). Επίσης, μέσα στις πιθανές αιτίες συμπεριλαμβάνονται και άλλοι παράγοντες όπως είναι η έλλειψη φυσικής δραστηριότητας (8), το γήρας (9) και η ορμονική ανισορροπία (10). 1.3 Παχυσαρκία Η παχυσαρκία, μια από τις βασικές διαταραχές του μεταβολικού συνδρόμου, αποτελεί τα τελευταία χρόνια στις αναπτυγμένες κυρίως χώρες, πολύ σοβαρό κοινωνικό πρόβλημα και ζήτημα υγείας. Περισσότερο από το 30% του ενήλικου πληθυσμού είναι παχύσαρκο, ενώ τα ποσοστά σε παιδιά και εφήβους τείνουν να γίνουν ανησυχητικά (11) (12) (13). Μάλιστα ήδη από την δεκαετία του 1990 ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας αναγνώρισε την παχυσαρκία ως παγκόσμια επιδημία (14). Επηρεάζεται από περιβαλλοντικούς, γενετικούς, μεταβολικούς καθώς και ψυχολογικούς παράγοντες. Χαρακτηρίζεται από υπερβολική συσσώρευση λίπους στον οργανισμό και οι κύριες αιτίες εμφάνισής της είναι η αυξημένη ενεργειακή πρόσληψη σε σχέση με την ενεργειακή κατανάλωση και η έλλειψη φυσικής άσκησης. Όταν η πρόσληψη θερμίδων είναι μεγαλύτερη από την κατανάλωσή τους, τότε ο οργανισμός αποθηκεύει την περίσσεια ενέργεια σαν λίπος. Η πιο κοινή μέθοδος για τη διάγνωση της παχυσαρκίας είναι ο προσδιορισμός του Δείκτη Μάζας Σώματος (Body Mass Index, ΒΜΙ), που ορίζεται ως το πηλίκο του σωματικού βάρους (kg) προς το τετράγωνο του ύψους (m), (kg/m 2 ). Ένα άτομο χαρακτηρίζεται ανάλογα με τις τιμές του Δείκτη Μάζας Σώματός του (15), ως: Φυσιολογικό: 18,5-24,9 Υπέρβαρο: 25-29,9 Παχύσαρκο 1 ου βαθμού: 30-34,9 Παχύσαρκο 2 ου βαθμού: 35-39,9 Παχύσαρκο 3 ου βαθμού: >40 14

15 Με το BMI προσδιορίζεται η ποσότητα και όχι η κατανομή του λίπους στο σώμα, με αποτέλεσμα πολλές φορές να είναι παραπλανητικό κυρίως για άτομα με αυξημένη μυϊκή μάζα. Για τον προσδιορισμό της κατανομής του λίπους στο σώμα, χρησιμοποιείται ο Δείκτης Κεντρικής Παχυσαρκίας (Waist to Hip Ratio), που ορίζεται ως το πηλίκο της περιμέτρου της μέσης (cm) προς την περίμετρο των ισχύων (cm). Ανάλογα με την τιμή του Δείκτη Κεντρικής Παχυσαρκίας προβλέπεται ο κίνδυνος ανάπτυξης κάποιων από τις παθήσεις που σχετίζονται με την παχυσαρκία ως εξής: μικρός κίνδυνος: <0,88 μέσος κίνδυνος: 0,88-0,95 υψηλός κίνδυνος: 0,96-1 πολύ υψηλός κίνδυνος για την υγεία: >1 Η παχυσαρκία περιλαμβάνει δύο τύπους την κεντρική παχυσαρκία, με αυξημένη κατανομή λίπους στο άνω τμήμα του σώματος, και την περιφερική παχυσαρκία, με εναπόθεση λίπους στους μηρούς και στους γλουτούς. Τα άτομα που εμφανίζουν κεντρική παχυσαρκία διατρέχουν κίνδυνο εμφάνισης διαταραχών του μεταβολικού συνδρόμου, ενώ τα άτομα που εμφανίζουν περιφερική παχυσαρκία τείνουν να είναι λιγότερο ευάλωτα σε τέτοιου είδους παθήσεις. Για την αντιμετώπιση της παχυσαρκίας συνιστάται κυρίως η αύξηση της σωματικής άσκησης σε συνδυασμό με δίαιτα λίγων θερμίδων καθώς και η χορήγηση φαρμακευτικής αγωγής (16). 2. Λιπώδης Ιστός Ο λιπώδης ιστός είναι ένα πολύ σημαντικό όργανο καθώς, εκτός από αποθηκευτικό ρόλο, είναι ένας μεταβολικά ενεργός ιστός που συμμετέχει σε πολλές λειτουργίες του οργανισμού. Υπάρχουν τρεις τύποι λιπώδους ιστού. Ο λευκός λιπώδης ιστός (White Adipose Tissue WAT), με αποθηκευτικό, κυρίως, ρόλο, ο φαιός λιπώδης ιστός (Brown Adipose Tissue BAT), ο οποίος παράγει θερμότητα μέσω της καύσης λιπιδίων και ο μπεζ λιπώδης ιστός (Brite Adipose Tissue), ο οποίος παρουσιάζει θερμογενετική ικανότητα όπως ο φαιός, αλλά εντοπίζεται σε σημεία όπου εμφανίζεται ο λευκός. Λόγω της ύπαρξης των δύο τελευταίων τύπων λιπώδους ιστού καταφέρνουν τα θηλαστικά, στα οποία εντοπίζεται, να επιβιώνουν σε συνθήκες χαμηλών θερμοκρασιών. 15

16 2.1 Χαρακτηριστικά Λευκού και Φαιού λιπώδους ιστού Εκτός από λειτουργικές, έχουν επίσης εμφανείς μορφολογικές και αναπτυξιακές διαφορές (Πίνακας 1). Συγκεκριμένα τα λευκά λιποκύτταρα είναι σφαιρικά και περιέχουν ένα μοναδικό κυτταροπλασματικό σταγονίδιο, όπου αποθηκεύονται τα λιπίδια και καταλαμβάνει το 90% του όγκου του κυττάρου. Το φαιό λιποκύτταρο από την άλλη είναι μικρότερο σε μέγεθος, πολυγωνικό με στρογγυλό πυρήνα και περιέχει πολυάριθμα μικρά λιποσταγονίδια και μεγάλο αριθμό μιτοχονδρίων (Εικόνα 1). Το WAT είναι έδρα σημαντικών μεταβολικών διεργασιών, εμφανίζει ενδοκρινική δράση (εκκρίνει την ορμόνη λεπτίνη), μεταβολίζει ορμόνες και τροποποιεί την έκκριση άλλων ενδοκρινών αδένων (17). Τα κύτταρα του BAT προέρχονται από τα μεσεγχυματικά κύτταρα του μεσοδέρματος κατά την εμβρυογένεση, έχουν κοινή προέλευση με τα μυϊκά κύτταρα και είναι θετικά, στο μεταγραφικό παράγοντα Myogenic Factor 5 (Myf5). Στη συνέχεια, με τη επίδραση διαφόρων παραγόντων (BMP7, PRDM16, c/ebpβ, PPARγ και PGC-1α) εξελίσσονται σε φαιά λιποκύτταρα (18) (19). Αντίθετα τα λευκά λιποκύτταρα προέρχονται από προγονικά κύτταρα αρνητικά στον Myf5. Χαρακτηριστική πρωτεΐνη του ΒΑΤ είναι η διαζευκτική πρωτεΐνη 1 (Uncoupling protein 1 UCP1) (Παράγραφος 2.2.2), η οποία εμπλέκεται στην παραγωγή θερμότητας μέσω αποσύζευξης της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης από την αναπνοή και κατά συνέπεια την παραγωγή ΑΤΡ. Τέλος ο φαιός λιπώδης ιστός εντοπίζεται κυρίως σε έμβρυα και νεογνά, και μειώνεται σύντομα μετά την γέννηση (18). Έτσι μέχρι πρόσφατα θεωρούνταν ότι είναι απών σε ενήλικα άτομα. Πρόσφατες μελέτες φανέρωσαν την παρουσία φαιού λιπώδους ιστού σε ενήλικες, ο οποίος ενεργοποιείται σε χαμηλές θερμοκρασίες και σχετίζεται με το βάρος του σώματος (20) (21) (22) (23) (Εικόνα 2). Εικόνα 1: Λευκό (αριστερά) και Φαιό (δεξιά)λιποκύτταρο. Μ-Μιτοχόνδριο, Π- Πυρήνας, ΛΣ-Λιποσταγονίδιο 16

17 Πίνακας 1: Χαρακτηριστικά Λευκού και Φαιού λιπώδους ιστού Λευκός λιπώδης ιστός (WAT) Φαιός λιπώδης ιστός (BAT) Εντόπιση Υποδόρια, Σπλαχνικά Αυχένας, Θώρακας, Ράχη Λειτουργία Αποθήκευση ενέργειας Θερμογένεση Χαρακτηριστικά Ενδοκρινική δράση (Λεπτίνη) Έκφραση πρωτεΐνης UCP1 Σύσταση κυττάρου Διογκωμένο λιποσταγονίδιο Πολλά μικρά λιποσταγονίδια Πολλά μιτοχόνδρια Εμβρυϊκή προέλευση Myf5 αρνητικά προγονικά κύτταρα Myf5 θετικά προγονικά κύτταρα Εικόνα 2: Εντόπιση BAT και WAT στα νεογνά και ενήλικα άτομα. Πηγή εικόνας: Gesta S et al. Cell (2007) 17

18 2.2 Θερμογένεση και η ρύθμισή της Η θερμογένεση είναι ο μηχανισμός μέσω του οποίου ο οργανισμός παράγει θερμότητα. Υπάρχουν δύο τύποι θερμογένεσης ανάλογα με την προέλευση της θερμότητας που παράγεται (Εικόνα 3). Η θερμογένεση λόγω σωματικής άσκησης (exercise associated thermogenesis) όπου η θερμότητα εκλύεται από τα μυϊκά κύτταρα και η θερμο - ρυθμιστική θερμογένεση (thermo - regulatory thermogenesis) που στόχο έχει την διατήρηση της θερμοκρασίας του οργανισμού σε φυσιολογικά επίπεδα και διαχωρίζεται σε δύο είδη. Στο ένα είδος η θερμότητα παράγεται λόγω ρίγους των σκελετικών μυών (shivering thermogenesis), ενώ στο άλλο παράγεται από τον φαιό λιπώδη ιστό (non-shivering thermogenesis) όταν αυτός ενεργοποιείται λόγω: 1) χαμηλής θερμοκρασίας περιβάλλοντος (cold induced), 2) σε καταστάσεις που είναι απαραίτητη η άμυνα του οργανισμού απέναντι σε ξενιστές (fever induced) και γεύματος (diet induced) (24). Shivering Μηχανισμός Θερμογένεσης στον Φαιό λιπώδη ιστό Θερμορυθμιστική Θερμογένεση non-shivering Σωματική άσκηση Θερμοκρασία περιβάλλοντος Κατανάλωση γέυματος Άμυνα Εικόνα 3: Διαγραμματική απεικόνιση των διαφόρων τύπων θερμογένεσης. 3) έπειτα από την κατανάλωση Η κύρια λειτουργία που επιτελείται για την παραγωγή ενέργειας, με την μορφή ATP, σε έναν οργανισμό είναι η οξειδωτική φωσφορυλίωση που λαμβάνει χώρα στα μιτοχόνδρια των κυττάρων. Αναλυτικότερα, μέσω της καύσης των τριών κατηγοριών ενεργειακών υποστρωμάτων (υδατάνθρακες, λιπίδια, πρωτεΐνες) παράγεται ακετυλο-συνενζύμο Α. Αυτό εισέρχεται στον κύκλο του κιτρικού οξέος (κύκλος του Krebs) και παράγονται ηλεκτρόνια (e - ) με την μορφή NADH και FADH2 μέσα στην μιτοχονδριακή μήτρα. Στην συνέχεια μέσω της αναπνευστικής αλυσίδας τα NADH και FADH2 οξειδώνονται και τα e - περνούν μέσω του κυτοχρώματος c (CYC) στο σύμπλοκο IV της αναπνευστικής αλυσίδας - οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COX4) και από κει στο μοριακό οξυγόνο. Η ροή αυτή των e - οδηγεί στην άντληση πρωτονίων έξω από την μιτοχονδριακή μήτρα και κατ επέκταση στην δημιουργία βαθμίδωσης συγκέντρωσης πρωτονίων γύρω από την εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη. Η βαθμίδωση αυτή οδηγεί με την σειρά της σε βαθμίδωση του ph και του ηλεκτρικού δυναμικού. Στην συνέχεια μέσω της συνθάσης του ΑΤΡ (σύμπλοκο V της αναπνευστικής αλυσίδας) τα πρωτόνια ρέουν προς την 18

19 μιτοχονδριακή μήτρα βάσει της ηλεκτροχημικής βαθμίδωσης. Η συνθάση του ATP χρησιμοποιεί την ενέργεια από την ροή αυτή των πρωτονίων για την φωσφορυλίωση του ADP προς ΑΤΡ (25) (26) (27). Οι διεργασίες της οξείδωσης των NADH και FADH2 (αναπνευστική αλυσίδα) και η φωσφορυλίωση του ADP προς ΑΤΡ είναι συζευγμένες και μαζί αποτελούν την οξειδωτική φωσφορυλίωση. Η σύνθεση του ATP είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με την δημιουργία βαθμίδωσης συγκέντρωσης πρωτονίων, που με την σειρά της προκύπτει από την οξείδωση των NAD και FADH2. Στα μιτοχόνδρια του BAT εκφράζεται η διαζευκτική πρωτεΐνη 1 (UCP1) η οποία προκαλεί την αποσύζευξη των δύο διεργασιών αυτών και μετακινεί τα πρωτόνια αντίθετα προς το ηλεκτροχημικό δυναμικό που έχει δημιουργηθεί. Τα πρωτόνια δεν εισέρχονται μέσω της ΑΤΡ συνθάσης στην μιτοχονδριακή μήτρα προς παραγωγή ATP και έτσι αντί να παράγεται ενέργεια, παράγεται θερμότητα, όποτε αυτό είναι αναγκαίο (28) (29). (Εικόνα 4). Γίνεται φανερό βάσει των παραπάνω διεργασιών ότι η πρωτεΐνη UCP1 αποτελεί δείκτη των επιπέδων θερμογένεσης στον φαιό λιπώδη ιστό, ενώ η CYC δείκτη των επιπέδων οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Εικόνα 4: Σύγκριση της σύνθεσης ATP στα κύτταρα οποιουδήποτε ιστού με την παραγωγή θερμότητας στο φαιό λιποκύτταρο. ΑΑ-Αναπνευστική αλυσίδα, V- ΑΤΡ συνθάση, Η+ -πρωτόνια Διαζευκτική πρωτεΐνη 1 (Uncoupling protein 1 - UCP1) Υπάρχουν συνολικά πέντε διαζευκτικές πρωτεΐνες των μιτοχονδρίων οι οποίες βρίσκονται στην εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη. Αυτές είναι οι UCP 1, 2, 3, 4, και 5. Έχουν παρόμοια δομή αλλά διαφέρουν ως προς την κατανομή τους στους διάφορους ιστούς. Συγκεκριμένα η UCP1 εντοπίζεται στον φαιό και μπεζ λιπώδη ιστό, η UCP2 εντοπίζεται σε πλήθος άλλων ιστών, η UCP3 κυρίως στους σκελετικού μύες και οι UCP4 και 5 στον εγκέφαλο (30). Η ανθρώπινη UCP1 είναι διμερής πρωτεΐνη μεγέθους 33kDa και κωδικοποιείται από το τέταρτο χρωμόσωμα. Το αμινοτελικό και το καρβοξυλιτελικό πρωτεϊνικό άκρο της, βρίσκονται στο διαμεμβρανικό διάστημα του μιτοχονδρίου και 6 περιοχές του μορίου της διαπερνούν την εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη, από τις οποίες οι 3 χρησιμοποιούνται για τη μεταφορά των πρωτονίων (30). Είναι υπεύθυνη για την αποσύζευξη της αναπνευστικής αλυσίδας από την 19

20 οξειδωτική φωσφορυλίωση με αποτέλεσμα να παράγεται θερμότητα αντί ATP στα μιτοχόνδρια του BAT, όταν αυτό είναι απαραίτητο. Η μεταγραφή του γονιδίου της UCP1 και κατ επέκταση η ενεργοποίηση του BAT, συμβαίνει ως απάντηση στην χαμηλή θερμοκρασία του περιβάλλοντος, μέσω διαφόρων μηχανισμών Ενεργοποίηση του Φαιού λιπώδους ιστού Πολλές μελέτες έχουν γίνει για να διευκρινιστούν οι μηχανισμοί μέσω των οποίων ενεργοποιείται ο φαιός λιπώδης ιστός. Είναι πλέον φανερό ότι σε αυτήν συμμετέχουν πολλά όργανα, μέσω της απελευθέρωσης διαφόρων σημάτων. Το συμπαθητικό νευρικό σύστημα φαίνεται παρόλα αυτά να κατέχει τον κύριο ρόλο. Αρχικά οι περιφερικοί και κεντρικοί θερμοϋποδοχείς αντιλαμβάνονται την θερμοκρασία του περιβάλλοντος και ενεργοποιούν το Κεντρικό Νευρικό Σύστημα, το οποίο με την σειρά του ενεργοποιεί το Συμπαθητικό. Αποτέλεσμα είναι η έκκριση νορεπινεφρίνης, για την οποία υπάρχουν υποδοχείς στο ΒΑΤ ( β3-αδρενεργικοί υποδοχείς) (31). Με την αλληλεπίδραση της νορεπινεφρίνης και των υποδοχέων της, ενεργοποιούνται δεύτερα μηνύματα όπως το camp, Ca + κ.α. και έτσι ξεκινά ένας καταρράκτης γεγονότων. Το camp ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση A (PKA), και αυτή με την σειρά της φωσφορυλιώνει την περιλιπίνη, μια πρωτεΐνη που στην μη φωσφορυλιωμένη της μορφή καλύπτει τα λιποσταγονίδια των λιποκυττάρων προστατεύοντας τα τριγλυκερίδια από την λιπόλυση (32), ενώ όταν φωσφορυλιωθεί, αυτά εκτίθενται και καταβολίζονται. Ενεργοποιείται έτσι η λιπόλυση και δημιουργούνται ελευθέρα λιπαρά οξέα που με την σειρά τους ενεργοποιούν την UCP1 και αποτελούν «καύσιμη ύλη» για την παραγωγή θερμότητας (19) (26) (33). Επιπλέον έχει βρεθεί ότι η PKΑ φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη DRP1 (Dynamin Related Protein) η οποία επάγει την διαίρεση των μιτοχονδρίων (34). Αυξανόμενου του αριθμού των μιτοχονδρίων, αυξάνεται η ευαισθησία στα ελεύθερα λιπαρά οξέα που δημιουργούνται από την λιπόλυση και επάγεται περισσότερο η UCP1 (35). (Εικόνα 5). Με την αδρενεργική ενεργοποίηση επίσης αλλάζει η ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων και μάλιστα μελέτες έδειξαν ότι ενεργοποιούνται γονίδια κυτταρικής διαφοροποίησης και πολλαπλασιασμού με αποτέλεσμα να αυξάνεται ο αριθμός των κυττάρων του ιστού σε οργανισμούς που έχουν εκτεθεί στο ψύχος, για καλύτερη απόκριση (19) (26) (33). Άλλα όργανα που έχει βρεθεί ότι συμμετέχουν στον έλεγχο της ενεργοποίησης του BAT, είναι ο θυρεοειδής αδένας μέσω της ορμόνης Τ3 (36), το πάγκρεας μέσω της ινσουλίνης (37), ο εγκέφαλος μέσω του παράγοντα BDNF (38) και άλλα. 20

21 Εικόνα 5: Αδρενεργική ενεργοποίηση του φαιού λιπώδους ιστού ως απόκριση στην χαμηλή θερμοκρασία περιβάλλοντος. ΒΑΤ-Φαιός λιπώδης ιστός, ΚΝΣ-Κεντρικό νευρικό σύστημα, ΣΝΣ- Συμπαθητικό νευρικό σύστημα, ΝΕ-Νορεπινεφρίνη, ΑΔ-Αδρενεργικός υποδοχέας, PKA-Πρωτεϊνική κινάση Α, PLIN-Περιλιπίνη, DRP1-Dynamin related protein, FFA-Ελευθέρα λιπαρά οξέα, UCP1- Διαζευκτική πρωτεΐνη 1, BDNF-Brain-derived neurotrophic factor, T3-Τριϊωδοθυρονίνη. 2.3 Ο Φαιός λιπώδης ιστός ως πιθανό μέσο θεραπείας της παχυσαρκίας Γίνεται φανερό ότι ο φαιός λιπώδης ιστός, είναι ιδιαίτερα ενεργός μεταβολικά. Κύριες πηγές «καυσίμων» του είναι τα τριγλυκερίδια και η γλυκόζη, γεγονός που τον καθιστά υποψήφιο στόχο για την αντιμετώπιση της παχυσαρκίας καθώς και της βελτίωσης των υψηλών επιπέδων τριγλυκεριδίων και γλυκόζης στο αίμα. Άλλωστε είναι γνωστό ότι το ΒΑΤ ενεργοποιείται ως απάντηση στην κατανάλωση περίσσειας θερμίδων, με στόχο την διατήρηση του βάρους του σώματος (Diet induced thermogenesis) (28) (39). Υπάρχει πληθώρα δεδομένων από μελέτες σε τρωκτικά που αποδεικνύουν ότι το BAT ενεργοποιεί τον μεταβολισμό in vivo (40). Πρόσφατες έρευνες φανέρωσαν την ύπαρξη ενεργού BAT σε ενήλικες και την συσχέτισή του με την θερμοκρασία του περιβάλλοντος και του βάρους του σώματος, όπως έχει ήδη αναφερθεί (Παράγραφος 2.1) (18). Συγκεκριμένα μελέτες σε ανθρώπους έχουν συσχετίσει την μειωμένη θερμογένεση με την τάση για ανάπτυξη 21

22 παχυσαρκίας. Επίσης μειωμένη ενεργότητα του BAT σχετίζεται με την ανάπτυξη παχυσαρκίας, ενώ αυξημένη ενεργότητα οδηγεί σε προστασία από αυτήν (41) (42). Προκύπτει το εξής ερώτημα: Μπορεί ο φαιός λιπώδης ιστός να ενεργοποιείται περιοδικά ή μόνιμα στον άνθρωπο με στόχο την ενεργοποίηση του μεταβολισμού, την αυξημένη θερμιδική κατανάλωση και κατ επέκταση τον έλεγχο του βάρους του σώματος; Σε πειραματόζωα αυτό έχει ήδη επιτευχθεί με την ενεργοποίηση θερμο-ρυθμιστικής θερμογένεσης ως απάντηση στην έκθεση σε ψυχρό περιβάλλον ή μέσω β3-αδρενεργικών αγωνιστών. Άλλος τρόπος θα μπορούσε να είναι η ενεργοποίηση του BAT με την βοήθεια φαρμακευτικών παρασκευασμάτων, γεγονός που απαιτεί όμως την περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών ενεργοποίησής του. 3. Λιποπρωτεΐνες Οι λιποπρωτεΐνες είναι υδατοδιαλυτά σφαιρικά συμπλέγματα αποτελούμενα από λιπίδια (χοληστερόλη, τριγλυκερίδια, φωσφολιπίδια) και πρωτεΐνες (απολιποπρωτεΐνες Α, Β, C, E, J, M και a). Η σφαιρική δομή των λιποπρωτεϊνών περιλαμβάνει έναν κεντρικό πυρήνα και ένα εξωτερικό περίβλημα περιφερειακά. O πυρήνας αποτελείται από λιπίδια, εστεροποιημένη χοληστερόλη και τριγλυκερίδια. Περιβάλλεται από ελεύθερη χοληστερόλη και ένα στρώμα φωσφολιπιδίων διατεταγμένα έτσι ώστε τα λιπόφιλα άκρα να βρίσκονται προς τον πυρήνα και τα υδρόφιλα άκρα προς το πλάσμα. Στο εξωτερικό περίβλημα των λιποπρωτεϊνών υπάρχουν οι απολιποπρωτεΐνες οι οποίες, προς τον πυρήνα των λιποπρωτεϊνών, διαθέτουν ένα άκρο πλούσιο σε μη πολικά αμινοξέα και ένα άλλο άκρο πλούσιο σε πολικά αμινοξέα που βρίσκεται σε επαφή με το υδατικό περιβάλλον (Εικόνα 6). Εικόνα 6: Γραφική αναπαράσταση της δομής και της σύστασης των λιποπρωτεϊνών. Η βασική λειτουργία των λιποπρωτεϊνών είναι η μεταφορά των λιπιδίων και η ανταλλαγή τους μεταξύ των ιστών. Συγκεκριμένα μεταφέρονται τριγλυκερίδια, που αποτελούν την κύρια πηγή ενέργειας του λιπώδους και μυϊκού ιστού και χοληστερόλη που αποτελεί δομικό συστατικό των κυτταρικών μεμβρανών και χρησιμοποιείται επίσης για την βιοσύνθεση των στεροειδών ορμονών και χολικών αλάτων. Μεταφέρουν επίσης φωσφολιπίδια και άλλα λιποδιαλυτά μόρια, όπως είναι οι βιταμίνες και ορισμένες φαρμακευτικές ουσίες. Οι απολιποπρωτεΐνες δρουν σαν τροποποιητές της δράσης των ενζύμων του πλάσματος ή σαν σύνδεσμοι για τους υποδοχείς των κυττάρων κάνοντας το ρόλο τους στο μεταβολισμό των λιπιδίων πολύ σημαντικό. 22

23 Οι λιποπρωτεΐνες διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μέγεθος και την πυκνότητά τους, χαρακτηριστικά που εξαρτώνται από την σύστασή τους σε απολιποπρωτεΐνες και λιπίδια. Συγκεκριμένα υπάρχουν πέντε γενικές κατηγορίες λιποπρωτεϊνών. Οι μεγαλύτερες σε μέγεθος είναι τα χυλομικρά (CM) και οι πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL), οι οποίες είναι πλούσιες σε τριγλυκερίδια. Οι μικρότερες σε μέγεθος όπως οι χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) και οι υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) είναι πλούσιες σε εστεροποιημένη χοληστερόλη. Σύμφωνα με την πυκνότητα τους και ξεκινώντας από αυτές με την χαμηλότερη πυκνότητα, οι λιποπρωτεΐνες ταξινομούνται ως εξής: χυλομικρά, λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL), λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL), λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) και λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (HDL). (43) 3.1 Χυλομικρά Τα χυλομικρά είναι μεγαλομοριακά συμπλέγματα με πυκνότητα μικρότερη από 0,95 g/ml και περιέχουν 98-99,5% λιπίδια (κυρίως τριγλυκερίδια και μικρή ποσότητα χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων) και 0,5-2 % πρωτεΐνες. Κύρια απολιποπρωτεΐνη χυλομικρών στον άνθρωπο είναι η apoβ-48, μια μεγάλη πρωτεΐνη (240kDa), που σχηματίζει ένα αμφίφυλο σφαιρικό κέλυφος, η εξωτερική επιφάνεια του οποίου είναι υδρόφιλη (στους μύες τα χυλομικρά περιέχουν και apob-100). Άλλες απολιποπρωτεΐνες που συναντώνται είναι η apoe, η apoa-iv και η apoc-ii. Τα χυλομικρά συντίθενται στα επιθηλιακά κύτταρα του εντερικού σωλήνα και εκκρίνονται στην λεμφική κυκλοφορία, έτσι μεταφέρονται τα διατροφικά λιπίδια από το έντερο, στην συστηματική κυκλοφορία και από κει στους περιφερικούς ιστούς. Στην κυκλοφορία μεταβολίζονται μερικώς από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL), που βρίσκεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών και ακολούθως καταβολίζονται από την ηπατική λιπάση (HL) σε υπολείμματα χυλομικρών τα οποία προσλαμβάνουν apoe και εν συνεχεία απομακρύνονται από την κυκλοφορία μέσω των υποδοχέων της LDL (LDLr). (43) 3.2 Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Οι πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες είναι μεγάλα σωμάτια με πυκνότητα μεταξύ 0,95-1,006 g/ml και περιέχουν 85-90% λιπίδια και 10-15% πρωτεΐνες. Το μέγεθός τους κυμαίνεται από Angstrom. Η λιπιδική τους σύσταση περιλαμβάνει 45-65% τριγλυκερίδια, 15-20% φωσφολιπίδια και 20-30% χοληστερόλη (ελεύθερη και εστεροποιημένη). Οι απολιποπρωτεΐνες που συναντώνται στις VLDL είναι οι apob, apoe, apoc-i, apoc-ii και apoc-iii. Οι VLDL συντίθενται στο ήπαρ από όπου εκκρίνονται με σκοπό την διανομή λιπιδίων 23

24 στους περιφερικούς ιστούς. Ως εκ τούτου η σύνθεση και η έκκρισή τους εξαρτώνται από τις ανάγκες των περιφερικών ιστών, για λιπίδια. (43) 3.3 Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL) Από τον καταβολισμό των VLDL λιποπρωτεϊνών προκύπτουν οι λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL) οι οποίες αποτελούν πρόδρομες μορφές των LDL. Η LpL υδρολύει τα τριγλυκερίδια που υπάρχουν στα VLDL σωμάτια με αποτέλεσμα να προκύπτουν σωμάτια πλούσια σε εστέρες χοληστερόλης και κατ επέκταση μεγαλύτερης πυκνότητας. Συγκεκριμένα η πυκνότητά των IDL είναι μεταξύ 1,006-1,019 g/ml. Φυσιολογικά βρίσκονται σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση και το μέγεθος τους κυμαίνεται στα Angstrom. Βασικός ρόλος των IDL είναι είτε η μεταφορά λιπιδίων στο ήπαρ και σε άλλους περιφερικούς ιστούς για περαιτέρω επεξεργασία, είτε η μετατροπή τους σε LDL λιποπρωτεΐνες μέσω υδρόλυσης περισσότερων τριγλυκεριδίων. (43) 3.4 Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Οι λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας προκύπτουν από τον καταβολισμό των IDL και αποτελούν τον κύριο φορέα χοληστερόλης στο αίμα. Η πυκνότητα τους είναι g/ml, περιέχουν 75% λιπίδια (κυρίως εστεροποιημένη χοληστερόλη και ελάχιστα τριγλυκερίδια) και 25% πρωτεΐνες και το μέγεθος τους κυμαίνεται από Angstrom. Το σωμάτιο των LDL περιέχει ένα μοναδικό αντίγραφο της απολιποπρωτεΐνης Β-100 (apob-100) με μοριακό βάρος 550kDa, το οποίο αναγνωρίζεται από τα κύτταρα-στόχους. Σε μικρότερο βαθμό απαντώνται οι απολιποπρωτεΐνες apoc-i, apoc-ii και apoc-iii. Βασικός ρόλος των LDL είναι η μεταφορά χοληστερόλης από το ήπαρ στα κύτταρα των περιφερικών ιστών για την εξυπηρέτηση των βιοσυνθετικών αναγκών τους καθώς επίσης και την σύνθεση στεροειδών ορμονών. (43) 3.5 Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Οι λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (HDL) έχουν πυκνότητα 1,063-1,21 g/ml και το μέγεθος τους είναι Angstrom (44). Αποτελούνται από 50% πρωτεΐνες και διαχωρίζονται σε διάφορους υποπληθυσμούς, ανάλογα με το λιπιδικό, πρωτεϊνικό τους περιεχόμενο και το στάδιο βιογένεσής τους (45). Υπάρχουν τα HDL πρόδρομα σωματίδια preβ-1, preβ-2 και preβ-3 που περιέχουν apoa-i σε συνδυασμό με τις σφιγγομυελίνες και φωσφατιδυλοχολίνες, έχουν δισκοειδές σχήμα και χαρακτηρίζονται ως «ανώριμα σωματίδια HDL». Στα δισκοειδή σωματίδια, δρα το ένζυμο LCAT 24

25 που εστεροποιεί την ελεύθερη χοληστερόλη, μετατρέποντάς τα σε σφαιρικά. Έτσι, σχηματίζονται τα ώριμα α-hdl σωματίδια, τα οποία διακρίνονται σε HDL2 και HDL3. Η ώριμη σφαιρική HDL περιέχει 45-55% πρωτεΐνες, 26-32% φωσφολιπίδια, 15-20% εστεροποιημένη χοληστερόλη, 3-5% ελεύθερη χοληστερόλη, και περίπου 5% τριγλυκερίδια. H κύρια πρωτεΐνη που συναντάται στις λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας είναι η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-i). Αυτή αποτελεί το πρώτο βήμα για τη βιοσύνθεση των λιποπρωτεϊνών υψηλής πυκνότητας (44). Δευτερεύουσες πρωτεΐνες που συναντώνται στην HDL είναι οι: apoa-ii, ApoCI, ApoCII, ApoCIII και ApoE. Κατά μέσο όρο η ανθρώπινη HDL περιέχει περίπου 70% (κατά βάρος) apoa-i, 20% apoα-ιι και 10% άλλες απολιποπρωτεΐνες (46). 4. Απολιποπρωτεΐνες Όπως προαναφέρθηκε, βασικό συστατικό των λιποπρωτεϊνών, πέρα από τα λιπίδια, αποτελούν οι πρωτεΐνες που ονομάζονται απολιποπρωτεΐνες. Οι κυριότερες κατηγορίες είναι οι A, B, C, E και α, ενώ πρόσφατα έχουν χαρακτηριστεί οι Μ και οι J. Το μέγεθός τους ποικίλει και εκτείνεται σε ένα φάσμα μεταξύ 6kDa (apoc-i) έως και 500kDa (apob, apoα). Οι βασικές τους λειτουργίες είναι: δεσμεύουν λιπίδια και τα μεταφέρουν διαμέσου της κυκλοφορίας, αναγνωρίζουν ειδικούς υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης και δρουν σαν ενεργοποιητές ή αναστολείς των ενζύμων που συμμετέχουν στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών. 4.1 Απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-i) Η apoa-i είναι πρωτεΐνη 30,6kDa, η οποία συντίθεται και εκκρίνεται από το ήπαρ και το έντερο. Αποτελεί δομικό συστατικό της HDL, και διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην βιογένεση και τη λειτουργία. Κατά την έκκρισή της, είναι ελεύθερη από λιπίδια και αλληλεπιδρά με τον διαμεμβρανικό μεταφορέα ATP-Binding Cassette A1 (ABCA1), γεγονός που προωθεί την αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων από τα κύτταρα, στην apoa-i (47). Έτσι δημιουργείται ένα σύμπλοκο λιπιδίων και apoa-i (λιπιδιωμένη apoa-i), το οποίο αποτελεί το πρόδρομο σωματίδιο της HDL. Η λιπιδιωμένη apoa-i πυροδοτεί την ενεργοποίηση του ενζύμου λεκιθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (LCAT) που είναι υπεύθυνο για την εστεροποίηση της χοληστερόλης στο μόριο της HDL. Επίσης αλληλεπιδρά με τον διαμεμβρανικό υποδοχέα Scavenger Receptor 25

26 class B member 1 (SR-B1), γεγονός που οδηγεί στην εκλεκτική μεταφορά εστέρων χοληστερόλης από την HDL στα κύτταρα (43) (48). 5. Ένζυμα Οι λιποπρωτεΐνες που βρίσκονται στο πλάσμα υφίστανται συνεχώς χημικές και δομικές αλλαγές, που οφείλονται σε αλληλεπιδράσεις που συμβαίνουν είτε μεταξύ τους είτε με διάφορα κύτταρα όπως για παράδειγμα τα ενδοθηλιακά. Στις αλληλεπιδράσεις αυτές σημαντικό ρόλο παίζουν τα ένζυμα, που είτε μεταφέρονται συνδεδεμένα στα σωματίδια των λιποπρωτεϊνών είτε βρίσκονται στη μεμβράνη των κυττάρων με τα οποία αλληλεπιδρούν (49). Τα σημαντικότερα ένζυμα που συμμετέχουν στον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών είναι: η λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL) η ηπατική λιπάση (HL) η ενδοθηλιακή λιπάση (EL) η ακυλοcoa: χοληστερολακυλοτρανσφεράση (ACAT) η λεκιθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (LCAT) 6. Υποδοχείς Μεταφορείς 6.1 Υποδοχέας εκκαθαριστής τάξης Β τύπου Ι (Scavenger Receptor class B member 1 - SR-B1) Ο υποδοχέας εκκαθαριστής τάξης Β τύπου 1 (SR-B1) είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη 80kDa, η οποία διαπερνά την κυτταροπλασματική μεμβράνη δύο φορές με το καρβοξυτελικό και το αμινοτελικό άκρο της να βρίσκονται ενδοκυτταρικά (50). Εκφράζεται στα ηπατικά κύτταρα, στους στεροειδοπαραγωγικούς ιστούς (επινεφρίδια, ωοθήκες, όρχεις) και λιγότερο στα κύτταρα της καρδιάς (51). Μεσολαβεί στην εκλεκτική μεταφορά εστέρων χοληστερόλης από την HDL, προς το εσωτερικό των κύτταρων, χωρίς την αποδόμηση του σωματιδίου, ενώ προωθεί και την αντίστροφη μεταφορά εστεροποιημένη χοληστερόλης από τους ιστούς προς την HDL (52). Η κατεύθυνση της κίνησης προσδιορίζεται πιθανώς από την βαθμίδωση συγκέντρωσης, ενώ θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι δύο αυτές διεργασίες πιθανότατα διαμεσολαβούνται από διαφορετικούς μηχανισμούς. 26

27 6.2 ATP-Binding Cassette Transporter Protein A1 (ABCA1) Ο μεταφορέας ATP-Binding Cassette A1 (ABCA1) είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη 253kDa, με το καρβοξυτελικό και το αμινοτελικό άκρο της να βρίσκονται ενδοκυτταρικά και εκφράζεται κυρίως στα ηπατικά κύτταρα και τα μακροφάγα (53). Επάγει την εκροή λιπιδίων (φωσφολιπίδια και χοληστερόλη) από τα κύτταρα προς την απολιπιδιωμένη apoa-1 με αποτέλεσμα να σχηματίζονται τα δισκοειδή σωμάτια της HDL (αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης). Οι ABCA1 κινούνται επάνω στη μεμβράνη των κυττάρων και δεσμεύουν φωσφολιπίδια και χοληστερόλη. Όταν κορεστούν, σχηματίζουν διμερή και είναι πλέον έτοιμοι να αλληλεπιδράσουν με την apoa-i (54) και να μεταφέρουν τα λιπίδια χρησιμοποιώντας ATP σαν πηγή ενέργειας (55). Λόγω της συμμετοχής του μεταφορέα αυτού στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, έχει προκαλέσει το ενδιαφέρον ως πιθανό αθηροπροστατευτικό μέσο. Μάλιστα μελέτες σε πειραματόζωα που υπερεκφράζουν τον ABCA1, έδειξαν ότι είχαν υψηλά επίπεδα HDL και apoa- I και σημαντικά μειωμένη εμφάνιση αθηρωματικών πλακών (56). 7. Μονοπάτια μεταβολισμού λιποπρωτεϊνών 7.1 Μεταβολικό μονοπάτι των χυλομικρών Τα χυλομικρά είναι οι λιποπρωτεΐνες που σχηματίζονται στο έντερο από τα διατροφικώς προσλαμβανόμενα λιπίδια, με στόχο να τα μεταφέρουν από το σημείο αυτό στους διάφορους ιστούς. Τα διατροφικά λίπη (λιπαρά οξέα, μονογλυκερίδια, λυσολεκιθίνη και ελεύθερη χοληστερόλη) μετατρέπονται σε τριγλυκερίδια, φωσφολιπίδια και εστεροποιημένη χοληστερόλη και συνδέονται με την apob-48 με την βοήθεια του ενζύμου μικροσωμικής πρωτεΐνης μεταφοράς τριγλυκεριδίων (microsomal triglycerides transfer protein, MTTP), με την apoe και την apoc-iι, σχηματίζοντας τα χυλομικρά (57). Αυτά εισέρχονται στο λεμφικό σύστημα και από κει στην κυκλοφορία μέσω του θωρακικού πόρου. Η apoc-ii αποτελεί συνένζυμο για την λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL), η οποία υδρολύει τα τριγλυκερίδια των χυλομικρών στο ενδοθήλιο των τριχοειδών αγγείων (58) και επιτρέπει με τον τρόπο αυτό στα διάφορα όργανα να προσλάβουν διατροφικά λιπίδια. Τα προϊόντα της υδρόλυσης είναι τα υπολείμματα χυλομικρών, τα οποία έχουν χάσει το 90% των τριγλυκεριδίων. Από την υδρόλυση απελευθερώνονται λιπαρά οξέα και μονογλυκερίδια τα οποία είτε χρησιμοποιούνται από διάφορους ιστούς ως ενέργεια είτε εστεροποιούνται και αποθηκεύονται 27

28 στο WAT ως τριγλυκερίδια (57). Τα υπολείμματα χυλομικρών απομακρύνονται από το ήπαρ μέσω των υποδοχέων που αναγνωρίζουν την apoe και καταβολίζονται περαιτέρω από την ΗL και την LpL. 7.2 Μεταβολικό μονοπάτι των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας Οι VLDL λιποπρωτεΐνες συντίθενται στο ήπαρ από τα τριγλυκερίδια που προέρχονται από τον μεταβολισμό των υδατανθρακών και της ελεύθερης χοληστερόλης. Ο ρόλος τους είναι η μεταφορά των τριγλυκεριδίων από το ήπαρ στους περιφερικούς ιστούς και κυρίως στο λιπώδη και μυϊκό και η μεταφορά της χοληστερόλης μέσω των LDL σωματιδίων που σχηματίζονται στη συνέχεια (59). Αρχικά, η ΜΤΤΡ μεταφέρει ηπατικά τριγλυκερίδια στην νεοσυντιθέμενη apob-100, η οποία αποτελεί το κύριο πρωτεϊνικό συστατικό των VLDL. Στη συνέχεια, προσλαμβάνονται apoe και apoc-ιι, καθώς και χοληστερόλη και εστέρες χοληστερόλης. Όμοια με τον μηχανισμό υδρόλυσης των χυλομικρών, οι VLDL έρχονται σε επαφή με το τοίχωμα των τριχοειδών, ενεργοποιούν την LpL μέσω της apoc-ιι και αυτή υδρολύει τα τριγλυκερίδια, απελευθερώνοντας ελεύθερα λιπαρά οξέα. Αυτά προσλαμβάνονται από τον λιπώδη ή τον μυϊκό ιστό, είτε για καύσεις είτε για αποθήκευση. Τα υπολείμματα των VLDL που προκύπτουν από την υδρόλυσή τους, ονομάζονται λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL) (60). Οι IDL στην συνέχεια, είτε καταβολίζονται περαιτέρω με την βοήθεια της HL σε LDL, είτε απομακρύνονται από την κυκλοφορία στο ήπαρ. (Εικόνα 7). Εικόνα 7: Σχηματική αναπαράσταση του μεταβολισμού των VLDL, IDL και LDL. TGs-Τριγλυκερίδια, CE-Εστεροποιημένη χοληστερόλη, Β-100-apoB-100, Ε-apoE, C-II-apoC-II. 7.3 Μεταβολικό μονοπάτι της HDL Αρχικά εκκρίνονται από το ήπαρ και το έντερο οι μη λιπιδιωμένες apoa-i και apoa-ii, αυτές ενώνονται με τις υπάρχουσες λιποπρωτεΐνες ή με αυτές που υφίστανται υδρόλυση και 28

29 δεσμεύουν φωσφολιπίδια και χοληστερόλη που εκρέουν από τα κύτταρα μέσω των υποδοχέων ABCA1 (61) (62). Με τον τρόπο αυτό σχηματίζονται HDL πρόδρομα σωματίδια (preβ-1 HDL) που περιέχουν apoa-i σε συνδυασμό με τις σφιγγομυελίνες και τις φωσφατιδυλοχολίνες. Αυτά στην συνέχεια, μέσω μοριακών διαδικασιών που δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως, μετατρέπονται σε preβ-2 HDL και preβ-3 HDL σωματίδια, με δισκοειδές σχήμα (63) (64). Στην δισκοειδή HDL δρα το ένζυμο LCAT που εστεροποιεί την ελεύθερη χοληστερόλη, η οποία εισέρχεται στον πυρήνα των δισκοειδών σωματιδίων, μετατρέποντάς τα σε σφαιρικά. Έτσι, σχηματίζονται τα ώριμα α-hdl σωματίδια, τα οποία διακρίνονται σε HDL2 και HDL3. Τα HDL3 μόρια συγκεντρώνουν εστεροποιημένη χοληστερόλη και μεταπίπτουν σε HDL2 μόρια που έχουν μεγαλύτερο μέγεθος. Αυτά εν συνεχεία ανταλλάσουν τη χοληστερόλη με τριγλυκερίδια και φωσφολιπίδια μέσω της δράσης της CETP (Cholesteryl Ester Transfer Protein) και PLTP (Phospholipid Transfer Protein), τα οποία υδρολύονται από την ηπατική λιπάση (HL) δίνοντας μικρότερα μόρια HDL (63). Υπάρχουν δύο εναλλακτικοί μηχανισμοί καταβολισμού της HDL (63): Γίνεται εκλεκτική απομάκρυνση των λιπιδίων από το σωμάτιο της HDL, μέσω του υποδοχέα SR-B1. Αυτός συνδέεται με την HDL μέσω των apoa-i και apoa-ii, προσλαμβάνει τους εστέρες χοληστερόλης και τους μεταφέρει ενδοκυττάρια για αποικοδόμηση. Η διεργασία αυτή λαμβάνει χώρα χωρίς να αποδομείται το σωματίδιο, το οποίο επιστρέφει στην κυκλοφορία για να ξεκινήσει ένας νέος κύκλος συλλογής λιπιδίων από τους ιστούς. Γίνεται αποικοδόμησή ολόκληρου του σωματιδίου της HDL στα κύτταρα του ήπατος, μέσω των SR-B1 υποδοχέων. Ένας άλλος μηχανισμός που συμβάλλει στην απομάκρυνση της χοληστερόλης από τα ώριμα σωματίδια της HDL, με αποτέλεσμα την μείωση του μεγέθους τους και του λιπιδικού τους φορτίου, είναι η αλληλεπίδραση της HDL με την CETP (65). Εξαιτίας αυτής της αλληλεπίδρασης ανταλλάσσονται εστέρες χοληστερόλης της HDL με τριγλυκερίδια των χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (χυλομικρά, VLDL, LDL, IDL). Τα τρωκτικά δεν εκφράζουν την CETP διαφοροποιώντας έτσι την φυσιολογία τους ως προς τον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών. Τα VLDL και LDL απομακρύνονται στο ήπαρ, μέσω του υποδοχέα της LDL (LDLr). Η ενδοθηλιακή λιπάση και η ηπατική λιπάση, υδρολύουν τα τριγλυκερίδια της HDL σε ελεύθερα λιπαρά οξέα, τα οποία προσλαμβάνονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα ηπατοκύτταρα, Έτσι μειώνεται το μέγεθος και το λιπιδικό της φορτίο και δημιουργούνται νέα πρόδρομα σωματίδια HDL που μπορούν πλέον να συνεχίσουν να προσλαμβάνουν λιπίδια από τους ιστούς. (Εικόνα 8). 29

30 Εικόνα 8: Σχηματική αναπαράσταση του μεταβολισμού της HDL. PL-Φωσφολιπίδια, FC-Ελεύθερη χοληστερόλη, CE-Εστεροποιημένη χοληστερόλη, TGs-Τριγλυκερίδια. 8. Οι λειτουργίες της HDL Μέχρι πρόσφατα τα επίπεδα της HDL στο πλάσμα, αποτελούσαν κύριο δείκτη κινδύνου εμφάνισης στεφανιαίας νόσου και αθηροπροστασίας. Καθώς η έρευνα σχετικά με την HDL προχωράει, γίνεται όλο και πιο φανερό ότι πέρα από την ποσότητα, σπουδαίο ρόλο διαδραματίζει και η λειτουργικότητά της. Όλο και περισσότερες μελέτες τα τελευταία χρόνια επικεντρώνονται στις λειτουργίες της HDL και την συσχέτισή τους με την αθηροπροστασία, όμως λόγω του ότι οι περισσότερες μελέτες γίνονται σε πειραματόζωα ή κυτταροκαλλιέργειες, είναι δύσκολο να προσδιοριστεί ποια από τις λειτουργίες της HDL έχει μεγαλύτερη κλινική σημασία (66). Οι κύριες ιδιότητες της HDL που έχουν μελετηθεί εκτενώς είναι: Η αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, η αντιοξειδωτική της δράση, η αντιφλεγμονώδης δράση, η παρουσία οιστρογόνων, η ρυθμιστική της δράση στην κατανομή των απολιποπρωτεϊνών στο πλάσμα και ο ρόλος της στην ομοιόσταση της γλυκόζης. 8.1 Η αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Κλινικές και επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει αντίστροφη συσχέτιση ανάμεσα στα επίπεδα της HDL και στον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακής νόσου και αθηροσκλήρωσης (63). Η συσχέτιση αυτή οφείλεται στην ικανότητα της HDL να μεταφέρει την χοληστερόλη από τους περιφερικούς ιστούς στο ήπαρ για καταβολισμό (αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης). Διακοπή της διεργασία αυτής οδηγεί στην εναπόθεση χοληστερόλης στο αγγειακό τοίχωμα και συμβάλλει στην ανάπτυξη αθηρωμάτωσης (67). 30

31 Η αντίστροφη μεταφορά της χοληστερόλης ξεκινά με την μεταφορά της ελεύθερης χοληστερόλης από τους περιφερικούς ιστούς στις πρόδρομες μορφές της HDL μέσω του ABCA1 (Παράγραφος 6.2), στην συνέχεια εστεροποίησή της με την βοήθεια της LCAT, ανταλλαγή αυτών των εστέρων με τριγλυκερίδια των VLDL, IDL, LDL και χυλομικρών με τη δράση της CETP και τέλος καταβολισμός της HDL χοληστερόλης στο ήπαρ (Παράγραφος 7.3). 8.2 Η αντιοξειδωτική δράση της HDL Ο σχηματισμός αθηρωματικών πλακών οφείλεται ως έναν βαθμό στην παρουσία οξειδωμένης LDL στο αρτηριακό τοίχωμα. Η HDL έχει την ιδιότητα να αναστέλλει την οξείδωση της LDL μέσω διαφόρων μηχανισμών. Τα οξειδωμένα φωσφολιπιδία της LDL, έχουν την ικανότητα να διεγείρουν την παραγωγή κυτταροκινών και συμβάλουν στην προσκόλληση μονοπύρηνων στην επιφάνεια του ενδοθηλίου, οδηγώντας στην δημιουργία αθηρωματικής πλάκας (68). Ειδικότερα η παρουσία των apoa-i και apoa-ιι στην HDL, στις αλληλουχίες των οποίων εντοπίζονται μεθειονίνες, έχει ως αποτέλεσμα την μείωση των υπεροξειδίων των φωσφολιπιδίων αλλά και των εστέρων χοληστερόλης που σχηματίζονται κατά την οξείδωση των LDL σωματιδίων. Η ΗDL, επιπλέον, περιέχει αντιοξειδωτικά μόρια που δεσμεύουν τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και αποτρέπουν την οξείδωση της LDL. Συγκεκριμένα η παραοξονάση (ΡΟΝ), η οποία μεταφέρεται από την apoa-i, καταλύει τον καταβολισμό των οξειδωμένων φωσφολιπιδίων της LDL (69) με αποτέλεσμα να παρεμποδίζεται η δημιουργία αθηρωματικών πλακών. 8.3 Επιπλέον λειτουργίες της HDL Αντιφλεγμονώδης δράση: Η προσκόλληση των μονοκυττάρων στο αγγειακό επιθήλιο αποτελεί το έναυσμα της δημιουργίας αθηρωματικών πλακών. Η προσκόλληση γίνεται με την βοήθεια μορίων κυτταρικής προσκόλλησης η επαγωγή των οποίων, υποκινείται από προφλεγμονώδεις διεργασίες (70). Η αντιφλεγμονώδης δράση της HDL έγκειται στην ικανότητά της να αναστέλλει την έκφραση των μορίων κυτταρικής προσκόλλησης (71). Παρουσία Οιστρογόνων: Το ένζυμο LCAT, το οποίο εστεροποιεί τη χοληστερόλη και τη μεταφέρει μεταξύ των λιποπρωτεϊνών, ρυθμίζει και την εστεροποίηση και την μεταφορά της οιστραδιόλης (44) (72). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η σχετιζόμενη με την HDL οιστραδιόλη αυξάνει την αθηροπροστατευτική δράση της HDL διεγείροντας τη δράση της συνθετάσης του οξειδίου του αζώτου (enos) και αυξάνοντας έτσι τη βιοδιαθεσιμότητα του NO (73). 31

32 Ρυθμιστική δράση στην κατανομή των απολιποπρωτεϊνών: Η HDL επίσης αποτελεί κεντρικό ρυθμιστή της κατανομής των απολιποπρωτεϊνών (πέρα από την apob) στις διάφορες λιποπρωτεΐνες του πλάσματος και κυρίως των VLDL, με συνέπεια να μπορεί να επηρεάζει τη δράση της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (LPL) και να ρυθμίζει τα επίπεδα τριγλυκεριδίων του πλάσματος (74). Ρόλος στην ομοιόσταση της γλυκόζης: Η απολιποπρωτεΐνη A-I εισέρχεται στα κύτταρα, όπου έχει τη δυνατότητα να ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση AMPK επηρεάζοντας τον μεταβολισμό της γλυκόζης. Η ενεργοποίηση της AMPK οδηγεί σε αύξηση της απορρόφησης της γλυκόζης από τα σκελετικά μυϊκά κύτταρα και σε μείωση της γλυκονεογένεσης στο ήπαρ. Μέσω αυτού του μηχανισμού η apoa-i ρυθμίζει την ομοιόσταση της γλυκόζης και βελτιώνει την αντίσταση των περιφερικών ιστών στην ινσουλίνη. Για το λόγο αυτό, η HDL έχει προστατευτική δράση έναντι του διαβήτη τύπου 2 μειώνοντας τις πιθανότητες εκδήλωσης καρδιαγγειακών νοσημάτων που σχετίζονται με τον διαβήτη και βελτιώνοντας παράλληλα την αντίσταση στην ινσουλίνη (75). 9. HDL : Ποσότητα ή Ποιότητα Γενικά είναι αποδεκτό ότι η LDL και η HDL έχουν αντίστροφη συσχέτιση με τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων, με την ποσότητα της πρώτης να είναι ανάλογη του κινδύνου και την ποσότητα της δεύτερης, αντιστρόφως ανάλογη (76). Τα αυξημένα επίπεδα HDL στο πλάσμα έχουν συσχετιστεί, με τον πιο αργό ρυθμό σχηματισμού της αθηροσκληρωτικής βλάβης και με τη σταθεροποίηση των ασταθών αθηρωματικών πλακών. Έτσι πολλές έρευνες επικεντρώθηκαν στην προσαρμογή της ποσότητας της HDL και LDL με διάφορα φαρμακευτικά παρασκευάσματα, με σκοπό τον έλεγχο του κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακών. Πρόσφατες όμως μελέτες φανερώνουν ότι η συσχέτιση ποσότητας HDL - κινδύνου, είναι πιο πολύπλοκη. Συγκεκριμένα βρέθηκε ότι η αύξηση της ποσότητας της HDL μέσω SNPs που σχετίζονται με το μεταβολικό της μονοπάτι, για παράδειγμα, δεν μείωσε τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων (77). Επίσης έχουν βρεθεί αυξημένα επίπεδα της HDL στο πλάσμα λόγω μειωμένου καταβολισμού της, πράγμα το οποίο προκύπτει από την παρεμπόδισης της ροής της HDL από τα λιπίδια των περιφερικών ιστών στο ήπαρ. Τα αυξημένα, όμως, αυτά επίπεδα δεν φαίνεται να λειτουργούν πάντα αθηροπροστατευτικά (78). Ένας παράγοντας που φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία από αθηρωματικές νόσους, είναι η λειτουργικότητα και η κατανομή των διαφόρων υποπληθυσμών της HDL. Όπως έχει αναφερθεί ήδη, τα σωματίδια της HDL διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθος, την πυκνότητα και την πρωτεϊνική σύσταση σε υποπληθυσμούς. Τα σωματίδια των 32

33 υποπληθυσμών αυτών διαφέρουν επίσης ως προς τα ένζυμα που μεταφέρουν και με τα οποία αλληλεπιδρούν και κατά συνέπεια ως προς την αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη κ.α. δράσεις τους. Συγκεκριμένα έχει βρεθεί ότι στα ώριμα σωματίδια HDL3 (a-hdl) τα ένζυμα αυτά είναι ιδιαίτερα αυξημένα (79) (80). Αυτές καθώς και άλλες έρευνες παρέχουν ολοένα και περισσότερα στοιχεία που φανερώνουν ότι η λειτουργικότητα της HDL έγκειται στην κατανομή των υποπληθυσμών της. Πιστεύεται ότι αυτοί θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες του κίνδυνου εμφάνισης καρδιαγγειακών. Συνέπεια όλων αυτών, είναι τα τελευταία χρόνια να γίνεται λόγος για την «ποιότητα» έναντι της ποσότητας της HDL, ως πιθανός θεραπευτικός στόχος για αθηρωματικές νόσους. 33

34 Σκοπός της μελέτης Ο Παγκόσμιος οργανισμός υγείας χαρακτήρισε τα τελευταία χρόνια την παχυσαρκία ως την νέα παγκόσμια επιδημία του 21 ο αιώνα. Στις ΗΠΑ, υπολογίζεται ότι το 60% των ατόμων άνω των 20 ετών είναι υπέρβαρο. Ιδιαίτερα επίφοβη είναι η ραγδαία αύξηση του επιπολασμού σε παιδιά και εφήβους σε ανεπτυγμένες καθώς και αναπτυσσόμενες χώρες. Εξίσου αποθαρρυντικά είναι τα δεδομένα για την Ελλάδα. Ένας στους τέσσερις Έλληνες (περισσότερο από το 30% του πληθυσμού) είναι υπέρβαρος και η αναλογία αυτή αναμένεται μέσα στα επόμενα χρόνια να αυξηθεί δραματικά. Ανησυχητικό είναι το γεγονός ότι η παχυσαρκία συνοδεύεται και από άλλες διαταραχές όπως η δυσλιπιδαιμία, αθηρωμάτωση, υπέρταση, διαβήτης τύπου ΙΙ, αναπνευστικά και ψυχολογικά προβλήματα. Αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακής νόσου μιας και εμφανίζονται αυξημένα επίπεδα τριγλυκεριδίων και γλυκόζης στο αίμα καθώς και αυξημένη αρτηριακή πίεση. Έτσι λοιπόν γίνεται ιδιαίτερη προσπάθεια να βρεθούν κατάλληλοι φαρμακευτικοί στόχοι για να αντιμετωπιστεί επιτυχώς η παχυσαρκία. Ως τέτοιος είχε θεωρηθεί από την δεκαετία του 1970 ο φαιός λιπώδης ιστός, όταν αποκαλύφθηκε η ικανότητά του να παράγει θερμότητα χρησιμοποιώντας ως καύσιμη ύλη λιπίδια (θερμο-ρυθμιστική θερμογένεση) (81) (82). Έτσι έγιναν προσπάθειες δημιουργίας φαρμακευτικών παρασκευασμάτων για την προώθηση της θερμογένεσης. Αποσύρθηκαν λόγω ελλιπών στοιχείων για την ύπαρξη φαιού λιπώδους ιστού σε ενήλικα άτομα. Πρόσφατες μελέτες απέδειξαν την ύπαρξή του σε ενήλικες και ο φαιός λιπώδης ιστός βρέθηκε ξανά στο επίκεντρο της προσοχής. Στην συγκεκριμένη μελέτη επιδιώκουμε να διερευνήσουμε τις πιθανές επιπτώσεις που έχει η επαγόμενη από έκθεση στο ψύχος θερμογένεση στο λιπιδαιμικό προφίλ καθώς και στην «ποιότητα» της HDL, σε φυσιολογικά πειραματόζωα που εκτέθηκαν σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας, σε μια προσπάθεια να αξιολογήσουμε τον εν δυνάμει αντιαθηρωματικό ρόλο του φαιού λιπώδους ιστού. Επιπλέον θελήσαμε να επεκτείνουμε την μελέτη μας και στον ενδεχόμενο ρόλο του εγκλιματισμού των πειραματόζωων μετά από μακρόχρονη έκθεσή τους στο ψύχος στους παραπάνω παράγοντες. 34

35 Υλικά και Μέθοδοι 10. Πειραματόζωα: Χειρισμοί και πειραματικές διαδικασίες Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν πειραματικά μοντέλα μυών του γένους C57BL/6, τα οποία εκφράζουν το πλήρες γονιδίωμα και κατ επέκταση τον φυσιολογικό φαινότυπο. Η προμήθεια των πειραματόζωων έγινε από την εταιρεία Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine, Ομάδες μελέτης Η πειραματική πορεία χωρίστηκε σε δύο μελέτες διαφορετικής χρονικής διάρκειας (Εικόνα 9). Στην μία χρησιμοποιήθηκαν 4 αρσενικοί μύες ηλικίας εβδομάδων, οι οποίοι εκτέθηκαν σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας (4 o C) (83) για χρονικό διάστημα 2 εβδομάδων (βραχύχρονη έκθεση στο κρύο). Στην άλλη χρησιμοποιήθηκαν 15 αρσενικοί μύες ηλικίας εβδομάδων, οι οποίοι χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Η μία ομάδα περιλάμβανε 10 πειραματόζωα, τα οποία εκτέθηκαν σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας (4 o C) για χρονικό διάστημα 12 εβδομάδων (μακρόχρονη έκθεση στο κρύο) και αποτέλεσε την πειραματική ομάδα, ενώ η άλλη ομάδα περιλάμβανε 5 πειραματόζωα και αποτέλεσε την ομάδα ελέγχου. Και οι τρεις ομάδες τρέφονταν καθ όλη την διάρκεια της μελέτης με τυπική δίαιτα (Standard chow diet 1324 TPF, Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG) και τα πειραματόζωα φυλάσσονταν ανά πέντε ή τέσσερα σε κάθε κλωβό. Μελέτη 12 εβδομάδών 10 μύες (4 ο C) 5 μύες (28 ο C) Από όλες τις ομάδες μυών που δημιουργήθηκαν λήφθηκε αίμα από την ουραία φλέβα (όπως περιγράφεται στην παράγραφο 10.2) πριν την έναρξη της μελέτης (μηδενική εβδομάδα), το οποίο χρησιμοποιήθηκε για αναλύσεις της βασικής κατάστασης των ζώων. Μελέτη 2 εβδομάδων 4 μύες (4 ο C) Εικόνα 9: Σχηματική απεικόνιση ομάδων πειραματόζωων 10.2 Λήψη αίματος από την ουραία φλέβα των πειραματόζωων Υλικά Ειδικές θήκες παγίδευσης μυών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) 35

36 Ειδικά τριχοειδή σωληνάκια λήψης αίματος (Microvette for capillary blood collection, CB 300, Sarstedt, D Numbrecht, Germany) Πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml (Reaction Tubes, , Greiner Bio-One) Πειραματική πορεία Πριν από κάθε λήψη αίματος απομακρύνθηκε η τροφή από τους κλωβούς, στους οποίους φυλάσσονταν οι μύες, για 16 ώρες. Για την λήψη του αίματος, τα πειραματόζωα ακινητοποιήθηκαν στις ειδικές θήκες και με ένα νυστέρι έγινε μια μικρή τομή στο άκρο της ουράς, από όπου με μαλάξεις συλλέχθηκαν περίπου 30-50μl αίμα. Για τη συλλογή του αίματος χρησιμοποιήθηκαν ειδικά τριχοειδή σωληνάκια CB 300 που περιέχουν EDTA ως αντιπηκτικό παράγοντα. Το αίμα αμέσως μετά τη λήψη ανακινήθηκε ελαφρώς για να αναμιχθεί με το EDTA και διατηρήθηκε σε πάγο ώσπου να φυγοκεντρηθεί στα 1.500g για 10 λεπτά στους 4 o C και να απομονωθεί το πλάσμα (υπόλευκο υγρό - Εικόνα 10). Το πλάσμα συλλέχθηκε σε πλαστικά σωληνάκια 1,5ml και φυλάχθηκε στους -20 ο C για περεταίρω αναλύσεις. Το σημείο όπου έγινε η τομή στην ουρά των πειραματόζωων καυτηριάστηκε αμέσως μετά την λήψη του αίματος ώστε να διακοπεί η αιμορραγία. Υλικά 10.3 Μέτρηση σωματικού βάρους μυών Ειδικές θήκες παγίδευσης ποντικών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) Ηλεκτρονικός ζυγός (Mettler precision microscale, Τολέδο, Ισπανία) Πειραματική πορεία Ύστερα από 16 ώρες νηστείας, οι μύες τοποθετήθηκαν στις ειδικές παγίδες και ζυγίστηκαν. Ο ζυγός είχε μηδενιστεί αρχικά με το βάρος των ειδικών παγίδων ώστε να δοθεί το καθαρό σωματικό βάρος των ποντικών. Υλικά 10.4 Μέτρησης ημερήσιας κατανάλωσης τροφής των ποντικών Ηλεκτρονικός ζυγός (Mettler precision microscale, Τολέδο, Ισπανία) Τυπική Δίαιτα (Standard chow diet 1324 TPF, Altromin Spezialfutter GmbH & Co.KG) Πειραματική πορεία Εικόνα 10: Τριχοειδή σωληνάκια λήψης αίματος 36

37 Αρχικά μετρήθηκε και τοποθετήθηκε σε κάθε κλωβό μια ποσότητα τροφής ίση με 30gr. Στη συνέχεια, κάθε 24 ώρες για μια περίοδο εφτά ημερών ζυγιζόταν η τροφή που απέμεινε στον κλωβό και αφαιρώντας την τιμή αυτή από αυτή της προηγούμενης ημέρας, προσδιορίστηκε η ημερήσια κατανάλωση της τροφής σε κάθε κλωβό. Η ημερήσια κατανάλωση τροφής ανά πειραματόζωο προσδιορίστηκε με την διαίρεση της ημερήσιας κατανάλωσης τροφής ανά κλωβό με το πλήθος των μυών που φυλάσσονταν στον κάθε κλωβό. Η μέση κατανάλωση τροφής ανά ζώο ήταν ο μέσος όρος για την διάρκεια των εφτά ημερών εκφρασμένη ως μέση κατανάλωση τροφής ± S.E.M Μέτρηση της ταχύτητας ηπατικής έκκρισης VLDL τριγλυκεριδίων Αρχή της μεθόδου Προκειμένου να προσδιοριστεί η ταχύτητα της ηπατικής έκκρισης των VLDL τριγλυκεριδίων στα πειραματόζωα, χορηγήθηκε ενδοφλέβια ένας αναστολέας του καταβολισμού των λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε τριγλυκερίδια, το Triton-WR1339 (84). Ο αναστολέας αυτός που είναι απορρυπαντικό, έχει την ικανότητα να συνδέεται με τα τριγλυκερίδια του πλάσματος μειώνοντας την ταχύτητα υδρόλυσης τους από την λιποπρωτεϊνική λιπάση και έτσι παρεμβαίνει στην πρόσληψη τους από το ήπαρ (85). Συνεπώς τα επίπεδα τριγλυκεριδίων στο αίμα των πειραματόζωων μετά την χορήγηση του αναστολέα, αποτελούν μέτρο της ηπατικής έκκρισης VLDL σωματιδίων. Μετρώντας τα επίπεδα τριγλυκεριδίων σε τακτά χρονικά διαστήματα δημιουργείται γραφική παράσταση της ποσότητας των τριγλυκεριδίων σε συνάρτηση με τον χρόνο, η κλίση της οποίας αποτελεί την ταχύτητα ηπατικής έκκρισης VLDL τριγλυκεριδίων εκφρασμένη σε mg λιπιδίων /dl πλάσματος /min. (Εικόνα 11). Εικόνα 11: Σχηματική αναπαράσταση της χορήγησης Triton-WR1339 και αιμοληψίας σε τακτά χρονικά διαστήματα για τον προσδιορισμό της ταχύτητας ηπατικής έκκρισηςvldl σωματιδίων Υλικά Υλικά 37

38 Ειδικές θήκες παγίδευσης ποντικών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) Ειδικά σωληνάρια λήψης αίματος (Microvette for capillary blood collection, CB 300, Sarstedt, D Numbrecht, Germany) Χλωριούχο νάτριο (Sodium Cloride, K , Merck, Germany) Triton-WR1339 (T-8761, Sigma, USA) Σύριγγες ινσουλίνης (Insulin Syringe, , Becton Dickinson, USA) Πειραματική πορεία Αρχικά παρασκευάστηκε ένα διάλυμα 15% (w/v) Triton-WR1339 σε 0.9% NaCl. Τα πειραματόζωα τέθηκαν σε 16 ώρες νηστεία πριν την έναρξη της πειραματικής διαδικασίας. Στην συνέχεια ακινητοποιήθηκαν στις ειδικές θήκες και χορηγήθηκε μέσω της ουραίας φλέβας δόση του διαλύματος που αντιστοιχεί σε 500mg απορρυπαντικού / kg σωματικού βάρους (84μl διαλύματος / 25g ποντικού). Αμέσως μετά την χορήγηση του διαλύματος συλλέχθηκε αίμα από την ουραία φλέβα (όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 10.2), το οποίο αποτέλεσε την χρονική στιγμή μηδέν και έπειτα στα 20, 40, 60 και 90 λεπτά. Τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων προσδιορίστηκαν στο πλάσμα του αίματος για κάθε χρονικό σημείο, όπως περιγράφεται παρακάτω (Παράγραφος 11.1) Μέτρηση της ταχύτητας ολικής (εντερικής και ηπατικής) Αρχή της μεθόδου παροχής τριγλυκεριδίων στο αίμα και υπολογισμός της εντερικής έκκρισης τριγλυκεριδίων Σκοπός είναι να υπολογιστεί α) η ταχύτητα ολικής παροχής των τριγλυκεριδίων στο αίμα και β) η εντερική απορρόφηση των διατροφικών τριγλυκεριδίων. Για τον προσδιορισμό της ταχύτητας ολικής παροχής τριγλυκεριδίων στο αίμα, πειραματόζωα τίθενται σε 16 ώρες νηστεία και στη συνέχεια χορηγείται από του στόματος 300μl ελαιόλαδο που είναι πλούσιο σε τριγλυκεριδία. Η χορήγηση του ελαιολάδου γίνεται με ειδική βελόνα που διαθέτει στρογγυλή άκρη ώστε κατά την εισαγωγή της στον οισοφάγο του ζώου να αποφευχθεί τυχόν τραυματισμός (Εικόνα 12). Εικόνα 12: Ειδική βελόνα για per os χορήγηση υγρών σε μύες 38

39 Μια ώρα μετά, χορηγείται Triton-WR1339 ώστε να ανασταλεί ο καταβολισμός των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών. Από τις αναλύσεις των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα του αίματος δίνεται η εικόνα των τριγλυκεριδίων που εκκρίνονται από το έντερο και από το ήπαρ, δηλαδή το μέγεθος της ολικής ταχύτητας. Στη συνέχεια, αφαιρώντας την ταχύτητα της ηπατικής έκκρισης (Παράγραφος 10.5) από την ταχύτητα ολικής παροχής προσδιορίζεται και η ταχύτητα εντερικής απορρόφησης τριγλυκεριδίων. (Εικόνα 13). Εικόνα 13: Σχηματική αναπαράσταση της χορήγησης ελαιόλαδου και του αναστολέα Triton-WR1339. Αιμοληψία σε τακτά χρονικά διαστήματα για τον προσδιορισμό της ταχύτητας ολικής παροχής τριγλυκεριδίων στο αίμα. Υλικά Ειδικές θήκες παγίδευσης ποντικών (Mouse Restrainer adult mice & neonate rats, IITC.84, Campden Instruments Ltd., UK) Ειδική βελόνα για per os χορήγηση υγρών σε μύες (Sterile Gavage Feeding Needles, # , Miltenyi Biotec, Germany) Ελαιόλαδο Triton-WR1339 (T-8761, Sigma, USA) Σύριγγες ινσουλίνης (Insulin Syringe, , Becton Dickinson, USA) Πειραματική πορεία Τα πειραματόζωα τέθηκαν σε νηστεία 16 ωρών και στην συνέχεια χορηγήθηκε per os 300μl ελαιόλαδου. Έπειτα από μία ώρα χορηγήθηκε ενδοφλέβια διάλυμα 15% (w/v) Triton-WR1339 σε 0,9% NaCl σε δόση που αντιστοιχεί σε 500 mg απορρυπαντικού / kg σωματικού βάρους και έγινε λήψη αίματος στα 1, 30, 60, 90, 120 και 150 λεπτά, μετά την ένεση. Η συγκέντρωση τριγλυκεριδίων στο δείγμα αίματος που λήφθηκε στο πρώτο λεπτό χρησιμοποιήθηκε σαν τιμή αναφοράς. Κατόπιν, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα τριγλυκεριδίων στο πλάσμα (Παράγραφος 11.1). Η γραφική παράσταση της συγκέντρωσης τριγλυκεριδίων σε συνάρτηση με το χρόνο μετά την χορήγηση του Triton-WR1339 αποτελεί μια ευθεία γραμμή, η κλίση της οποίας εκφράζει 39

40 την ταχύτητα ολικής παροχής τριγλυκεριδίων στο αίμα εκφρασμένη σε mg λιπιδίων / dl πλάσματος / min Θυσίες και λήψη ιστών από τα πειραματόζωα Υλικά Ισοφλουράνιο (AEranne Isoflurane, USP, NDC , Baxter, USA) Σωληνάκια συλλογής αίματος (Microtubes for pediatric blood collection CB1000, Sarstedt, D Numbrecht, Germany) 70% αιθανόλη (Ethanol, K , Merck, Germany) (70ml αιθανόλης 100% + 30 ml ddh2o) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Υγρό άζωτο Πλαστικά σωληνάκια 1.5 ml (Reaction Tubes, , Greiner Bio-One) Πειραματική πορεία Τα πειραματόζωα νήστεψαν για 16 ώρες και εν συνεχεία αναισθητοποιήθηκαν σε δοχείο που κλείνει ερμητικά και στο οποίο περιέχεται βαμβάκι εμποτισμένο με ισοφλουράνιο. Στη συνέχεια, αφαιρέθηκε ο οφθαλμός με λαβίδα και λήφθηκε αίμα μέσω του περικογχικού φλεβικού κόλπου (περίπου μl) σε ειδικά σωληνάκια που περιείχαν EDTA αντιπηκτικό. Το αίμα φυλάχθηκε σε πάγο έως την στιγμή της απομόνωσης του πλάσματος με φυγοκέντρηση στα 1.500g για 10 λεπτά στους 4 o C. Το πλάσμα συλλέχθηκε σε πλαστικά σωληνάκια και φυλάχθηκε στους -20 ο C για περαιτέρω αναλύσεις. Έπειτα, τα ναρκωμένα πειραματόζωα υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αυχενική μετατόπιση. Το ζώο τοποθετήθηκε με την ραχιαία πλευρά προς τα πάνω σε χειρουργικό τραπέζι. Η περιοχή αποστειρώθηκε με διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70% και έγινε μια τομή, με αποστειρωμένο χειρουργικό ψαλίδι, στο μέσω της ραχιαίας περιοχής έως τον αυχένα ώστε να αποκαλυφθεί ο φαιός λιπώδης ιστός. Αυτός απομονώθηκε αποκόβοντάς τον από τους συνδέσμους που το συγκρατούν, ξεπλύθηκε σε τρυβλίο με διάλυμα PBS 1x, τοποθετήθηκε σε πλαστικά σωληνάκια, ψύχθηκε άμεσα σε υγρό άζωτο και φυλάχθηκε στους -80 o C για μελλοντική χρήση. Στην συνέχεια το ζώο τοποθετήθηκε με την κοιλιακή πλευρά προς τα πάνω, η οποία αποστειρώθηκε με διάλυμα αιθυλικής αλκοόλης 70% και στην συνέχεια ανοίχθηκε με αποστειρωμένο χειρουργικό ψαλίδι. Με νυστέρι σκίστηκε το περιτόναιο και αφαιρέθηκε το ήπαρ, αποκόβοντάς το από τα αγγεία και τους συνδέσμους που το συγκρατούν. Ξεπλύθηκε σε τρυβλίο με διάλυμα PBS 1x και κόπηκε σε μικρότερα τμήματα, τα οποία τοποθετήθηκαν σε 40

41 πλαστικά σωληνάκια, ψύχθηκαν άμεσα σε υγρό άζωτο και τοποθετήθηκαν στους -80 o C για μελλοντική χρήση. 11. Αναλύσεις στο πλάσμα των πειραματόζωων Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως απομονώθηκε πλάσμα από το αίμα των πειραματόζωων κατά την έναρξη της μελέτης (πλάσμα βασικής κατάστασης), κατά την διάρκεια διαφόρων πειραματικών διαδικασιών (παράγραφοι 10.5 και 10.6) και στο τέλος της μελέτης όταν θυσιάστηκαν οι μύες. Στα δείγματα αυτά λάβαν μέρος βιοχημικές και μοριακές αναλύσεις όπως αυτές που περιγράφονται στην συνέχεια Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στο πλάσμα Αρχή της μεθόδου Ο προσδιορισμός των επιπέδων των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα έγινε με το Serum Triglyceride Determination Kit (Sigma, TR 0100). Το kit αυτό μας δίνει την δυνατότητα να προσδιορίσουμε τα επίπεδα γλυκερόλης, πραγματικών τριγλυκεριδίων και ολικών τριγλυκεριδίων σε πλάσμα ή ορό. Τα τριγλυκερίδια, οι εστέρες λιπαρών οξέων και η γλυκερόλη είναι υδρόφοβα μόρια και η κυκλοφορία τους στο πλάσμα είναι εφικτή μόνο όταν προσδένονται με τις απολιποπρωτεΐνες. Για τον προσδιορισμό τους είναι απαραίτητη η υδρόλυση των τριγλυκεριδίων σε γλυκερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα και στη συνέχεια η ενζυματική μέτρηση της γλυκερόλης. Η διαδικασία περιλαμβάνει την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL). Στη συνέχεια η γλυκερόλη φωσφορυλιώνεται από το ATP με τη βοήθεια της κινάσης της γλυκερόλης (GK) σε 1-φωσφορική γλυκερόλη (G-1-P) και οξειδώνεται σε φωσφορική διυδρόξυακετόνη (DAP) με τη βοήθεια της οξειδάσης της φωσφορικής γλυκερόλης (GPO) με ταυτόχρονη απελευθέρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η2Ο2). Glyserol + ATP G-1-P + O 2 GK GPO G-1-P + ADP DAP + H 2 O 2 41

42 Τέλος καταλύεται η σύνδεση του Η2Ο2 με την 4-αμινοαντιπυρίνη (4-AAP) και την νατριϊκή Ν- αιθυλο-ν-(3-θειοπροπυλο)-m-ανισιδίνη (ESPA) από την υπεροξειδάση (POD) και παράγεται η χρωστική κινονιμίνη, της οποίας η απορρόφηση μετράται στα 540nm. H 2 O AAP + ESPA POD Quinoneimine dye + H 2 O Υλικά Serum Triglyceride Determination Kit (Sigma, TR 0100, Missouri USA) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελιών (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Πειραματική πορεία Αρχικά, προετοιμάστηκαν τα πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης μέσω διαδοχικών αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος με PBS 1x. Συγκεκριμένα παρασκευάστηκαν έξι αραιώσεις από το πρότυπο διάλυμα συγκέντρωσης S. Οι S/2, S/4, S/8, S/16, S/32 και S/64. Στα πρώτα κελιά των δύο τελευταίων σειρών της μικροπλάκας φορτώθηκαν 7,5μl τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό PBS 1x ph 7,4 και στα υπόλοιπα κελιά από 7,5μl πρότυπων διαλυμάτων ξεκινώντας από το πιο αραιό (S/64) και καταλήγοντας στο πιο πυκνό (S). (Εικόνα 14). Στα υπόλοιπα πηγαδάκια προστέθηκαν 7,5μl από τα δείγματά μας τα οποία είχουμε αραιώσει με PBS 1x σε μια αναλογία 1:3, στο πλάσμα βασικής κατάστασης και της ομάδας ελέγχου, ενώ δεν είχει γίνει καμιά αραίωση στο πλάσμα των μυών που εκτέθηκαν στην χαμηλή θερμοκρασία. Εικόνα 14: Μικροπλάκα 96 κελιών όπου προσδιορίστηκαν τα επίπεδα τριγλυκεριδίων του πλάσματος Με την πολυπιπέτα προστέθηκαν 100μl από το αντιδραστήριο Α και η μικροπλάκα τοποθετήθηκε στην μηχανή ανάδευσης για 10 λεπτά. Φωτομετρήσαμε με το ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 540nm και προσθέσαμε 30μl από το αντιδραστήριο Β. Τοποθετήσαμε την πλάκα στην μηχανή ανάδευσης για 45 λεπτά και φωτομετρήσαμε ξανά με το ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 540nm. Η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων στα άγνωστα δείγματα 42

43 προκύπτει από την απορρόφηση τους με βάση την πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται από τις απορροφήσεις των αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος. Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε αφαιρώντας από τη δεύτερη μέτρηση, η οποία περιλαμβάνει την ολική γλυκερόλη (ελεύθερη γλυκερόλη του πλάσματος συν αυτή που αποδεσμεύτηκε από τα τριγλυκερίδια), την πρώτη που αφορά στην ελεύθερη γλυκερόλη που κυκλοφορεί στο αίμα. Η τιμή που παίρνουμε αντιστοιχεί στα επίπεδα των τριγλυκεριδίων εκφρασμένα σε mg λιπιδίων / dl πλάσματος Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα Αρχή της μεθόδου Ο προσδιορισμός των επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα έγινε με την χρήση του Infinity Cholesterol Liquid Stable Reagent. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι η υδρόλυση των εστέρων χοληστερόλης με την εστεράση της χοληστερόλης (CE) σε χοληστερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα. Cholesterol Esters CE Cholesterol + Fatty Acids Στη συνέχεια οξειδώνεται η απελευθερώνεται Η2Ο2. χοληστερόλη με την οξειδάση της χοληστερόλης (CO) και Cholesterol + O CO 2 Cholest-4-en-3-one + H 2 O 2 Τέλος, το Η2Ο2 αντιδρά με το υδροξυ-βενζοϊκό οξύ και την 4-αμινοαντιπυρίνη μέσω της υπεροξειδάσης (POD) σχηματίζοντας τη χρωστική κυνομιμίνη, που απορροφά φως και βάσει αυτής της απορρόφησης και συγκριτικά με την απορρόφηση των προτύπων γίνεται ο υπολογισμός της συγκέντρωσης των δειγμάτων. 2H 2 O 2 + HBA + 4-AAP POD Quinoneimine dye + 4H 2 O Υλικά Infinity Cholesterol Liquid Stable Reagent (TR , Thermo Electron, Melbourne, Australia) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελλίων (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) 43

44 Πειραματική πορεία Αρχικά, προετοιμάστηκαν τα πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης μέσω διαδοχικών αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος με PBS 1x. Συγκεκριμένα παρασκευάστηκαν έξι αραιώσεις από το πρότυπο διάλυμα συγκέντρωσης S. Οι S/2, S/4, S/8, S/16, S/32 και S/64. Στα πρώτα κελιά των δύο τελευταίων σειρών της μικροπλάκας φορτώθηκαν 7,5μl τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό PBS 1x, ph 7,4 και στα υπόλοιπα κελιά από 7,5μl πρότυπων διαλυμάτων ξεκινώντας από το πιο αραιό (S/64) και καταλήγοντας στο πιο πυκνό (S). Στα υπόλοιπα πηγαδάκια προστέθηκαν 7,5μl από τα δείγματά μας τα οποία έχουμε αραιώσει με PBS 1x σε μια αναλογία 1:3, στο πλάσμα βασικής κατάστασης και της ομάδας ελέγχου, ενώ δεν είχε γίνει καμιά αραίωση στο πλάσμα των μυών που εκτέθηκαν στην χαμηλή θερμοκρασία. Με την πολυπιπέτα προσθέσαμε 200μl του αντιδραστηρίου Infinity και τοποθετήσαμε την μικροπλάκα σε μηχανή ανάδευσης για 45 λεπτά. Τέλος, φωτομετρήσαμε στο ειδικό φασματοφωτόμετρο στα 490nm. Η συγκέντρωση της χοληστερόλης στα άγνωστα δείγματα προκύπτει από την απορρόφηση της με βάση την πρότυπη καμπύλη που δημιουργείται από τις απορροφήσεις των αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας Αρχή της μεθόδου Οι λιποπρωτεΐνες διαφέρουν μεταξύ τους ως προς το μέγεθος και την πυκνότητά τους, χαρακτηριστικά που εξαρτώνται από την σύστασή τους σε απολιποπρωτεΐνες και λιπίδια, όπως έχει ήδη αναφερθεί (Ενότητα 3). Με την μέθοδο της υπερφυγοκέντρησης διαβαθμισμένης πυκνότητας επιτυγχάνεται η επίπλευσή τους σε διαφορετικές πυκνότητες αλατούχου διαλύματος (86). Συνήθως για την κλασματοποίηση των λιποπρωτεϊνών του ανθρώπινου πλάσματος χρησιμοποιείται διάλυμα βρωμιούχου καλίου (ΚΒr). Στα διάφορα κλάσματα που συλλέγονται μετά την υπερφυγοκέντρηση, αρχικά απομονώνονται τα χυλομικρά με πυκνότητα <0,95 g/ml και οι VLDL με 0,94-1,006 g/ml. Οι λιποπρωτεΐνες IDL και LDL βρίσκονται στα κλάσματα με πυκνότητα 1,019-1,063 g/ml IDL και τις LDL και τέλος οι ΗDL στα κλάσματα με πυκνότητα 1,063-1,21 g/ml. Σε πυκνότητες άνω του 1,21 g/ml εντοπίζονται οι μη λιπιδιωμένες πρωτεΐνες του πλάσματος. Ο υπολογισμός της μάζας του KBr που απαιτείται για την επιθυμητή πυκνότητα στην οποία θα επιπλεύσει το κάθε κλάσμα λιποπρωτεϊνών γίνεται με τη βοήθεια του εξής τύπου: 44

45 Υλικά Βρωμιούχο Κάλιο (KBr, P , Fisher Scientific, New Jersey) 1,21 g/ml KBr (16.4g KBr σε 50 ml ddh2o) 1,063 g/ml KBr (4.61g KBr σε 50 ml ddh2o) 1,019 g/ml KBr (1.365g KBr σε 50 ml ddh2o) Ψυχόμενη υπερφυγόκεντρος (Beckman) Κεφαλή υπερφυγοκέντρου SW40 Σωλήνες διαβάθμισης (Ultra-Clear Centrifuge Tubes, Beckman, USA) SW60 ultracentrifugation rotor buckets (Beckman) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Πειραματική πορεία Το δείγμα του πλάσματος πρέπει να έχει πυκνότητα 1,23 g/ml και τελικό όγκο 400μl οπότε προστέθηκε στο δείγμα 0,145g KBr και εν συνεχεία τοποθετήθηκε πρώτο μέσα στο σωλήνα διαβάθμισης. Έπειτα προστέθηκαν όλα τα διαλύματα του KBr, ξεκινώντας από το πιο πυκνό και καταλήγοντας στο πιο αραιό, πολύ αργά με πιπέτα ώστε τα διαλύματα να μην αναμιχθούν και να σχηματιστεί μια διακριτή επιφάνεια (διεπιφάνεια) μεταξύ των διαλυμάτων διαφορετικής πυκνότητας. Συγκεκριμένα, προστέθηκαν 0.8ml διαλύματος KBr (1,21 g/ml) και στη συνέχεια 2ml KBr (1,063 g/ml). Έπειτα, προστέθηκε 0,4ml KBr (1.019 g/ml) και τέλος 0,4ml PBS 1x ph 7,4 (Εικόνα 15). Οι σωλήνες ισοζυγίστηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στους 15 o C στις g για 20 ώρες. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, συλλέχθηκαν σε σωληνάκια, δέκα κλάσματα των 400μl με πιπέτα προσεκτικά ώστε να μην αναμιχθούν τα κλάσματα. Από το κάθε κλάσμα τέλος θα πρέπει να απομακρυνθεί το KBr ώστε να μπορέσουν να γίνουν οι απαραίτητες για την μελέτη βιοχημικές αναλύσεις. Ο καθαρισμός των κλασμάτων γίνεται με την μέθοδο της διαπίδυσης όπως περιγράφεται παρακάτω στην παράγραφο

46 Εικόνα 15: Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας κλασματοποίησης λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας Διαπίδυση στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό μικρών μορίων από μεγάλα μακρομόρια διαμέσου μεμβράνης εκλεκτικής διαπερατότητας. Βρίσκει κυρίως εφαρμογή στον διαχωρισμό μορίων από διαλύματα τα οποία περιέχουν μεγάλη συγκέντρωση αλάτων. Το διάλυμα που πρόκειται να υποστεί διαπίδυση, τοποθετείται σε σωλήνα ο οποίος σφραγίζεται με την ειδική μεμβράνη διαπίδυσης και βυθίζεται σε δοχείο με ρυθμιστικό διάλυμα ή ddh2o. Τα άλατα έρχονται σε ισορροπία μεταξύ των δύο πλευρών της μεμβράνη και διευκολύνεται η μετακίνησή τους. Οι μεμβράνες που χρησιμοποιούνται είναι ειδικά κατασκευασμένες ώστε οι πόροι που διαθέτουν να εμποδίζουν την μετακίνηση μορίων που υπερβαίνουν κάποιο συγκεκριμένο μοριακό βάρος και να επιτρέπουν μόνο την μετακίνηση των αλάτων. Υλικά Μεμβράνη διαπύδησης με μοριακό βάρος αποκλεισμού τα 10κDa (Dialysis Membrane, , Medicell International LtD, neolab, London, England) Σωληνάκια (Fisherbrand Disposable Culture Tubes, , Fisher Scientific, USA) Καπάκια (Fisher brand, Tainer Top Safety, Fisher Scientific, USA) Μαγνητικός αναδευτήρας (Chimarec 2, Thermolyne) Δις-απεσταγμένο νερό (ddh2o) Αέριο Άζωτο 46

47 Paraffin film (Parafilm, Pechiney Plastic Packaging Company, USA) Πειραματική πορεία Τα σωληνάκια που συλλέχθηκαν μετά την υπερφυγοκέντρηση, σκεπάστηκαν με την μεμβράνη διαπίδυσης και κλείστηκαν με τα καπάκια tainer top safety. Πριν χρησιμοποιηθεί η μεμβράνη, τοποθετήθηκε σε διάλυμα EDTA σε ddh2o που έβραζε ώστε να απομακρυνθεί η λιπαρή ουσία με την οποία είναι επεξεργασμένη. Τα σωληνάκια βυθίστηκαν με τα καπάκια προς τα κάτω σε ένα ποτήρι ζέσεως που περιείχε ddh2o και τοποθετήθηκαν στους 4 o C πάνω σε μαγνητικό αναδευτήρα για 24 ώρες, ενώ σε τακτά χρονικά διαστήματα το ddh2o ανανεωνόταν. Τέλος, τα κλάσματα μεταφέρθηκαν σε σωληνάκια 1,5ml. Τα κλάσματα, τοποθετούνται για περίπου ένα λεπτό κάτω από συνεχή ροή αέριου αζώτου, ώστε να απομακρυνθεί το οξυγόνο, στην συνέχεια σφραγίζονται με parafilm και αποθηκεύονται στους -20 ο C. O λόγος για τον οποίο απομακρύνεται το οξυγόνο, είναι ότι στα κλάσματα θα γίνουν αναλύσεις της αντιοξειδωτικής ικανότητας της HDL, όπως θα αναφερθεί παρακάτω, ως εκ τούτου η HDL δεν θα πρέπει να έρχεται σε επαφή με οξυγόνο μέχρι να γίνουν οι αναλύσεις. 12. Αναλύσεις στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα του πλάσματος 12.1 Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Υλικά Infinity Cholesterol Liquid Stable Reagent (TR , Thermo Electron, Melbourne, Australia) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Μικροπλάκες 96 κελλίων (microwell plate, Thermo Fisher Scientific Nunc, Denmark) Φωτόμετρο (Microplate Reader, BIO-RAD Model 680) Συσκευή ξήρανσης (Speed-vac, Savant) Πειραματική πορεία Ο προσδιορισμός των επιπέδων της ολικής χοληστερόλης στα κλάσματα των λιποπρωτεϊνών έγινε, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Η διαφορά είναι ότι στην μικροπλάκα φορτώθηκαν 20μl από τα πρότυπα διαλύματα και 20μl δείγματος συμπυκνωμένο 2 φορές. 47

48 Συγκεκριμένα 40μl από το κάθε κλάσμα μεταφέρθηκαν σε σωληνάκια 1,5ml και φορτώθηκαν στο Speed-vac. Μόλις τα δείγματα ξηράνθηκαν, επαναδιαλύθηκε το ίζημα σε 20μl PBS 1x ph 7,4. Σε αυτά τα 20μl προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ολικής χοληστερόλης Ανάλυση απολιποπρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Αρχή της μεθόδου Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών, βάσει του μοριακού τους βάρους, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου σταθερής τάσης. Συγκεκριμένα οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες αποδιατάσσονται με την προσθήκη του απορρυπαντικού SDS, το οποίο σχηματίζει σύμπλοκα με τις πρωτεΐνες και καλύπτει την επιφάνειά τους με μόρια SDS, προσδίδοντάς τους ένα ισχυρά αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο. Επίσης, προστίθεται ένας αναγωγικός παράγοντας (2 μερκαπτοαιθανόλη ή DTT diothreitol) για τη διάσπαση των δισουλφιδικών δεσμών (S-S). Κάτω από αυτές τις συνθήκες οι πρωτεΐνες μεταναστεύουν με ταχύτητα ανάλογη του μοριακού τους βάρους. Το μοριακό βάρος μιας πρωτεΐνης υπολογίζεται σε σχέση με την ηλεκτροφορητική μετανάστευση πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους. Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου σχηματίζονται με πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου με το αντιδραστήριο διασταύρωσης Ν,Ν μεθυλένο-δισ-ακρυλαμίδιο. Ο πολυμερισμός καταλύεται από το υπερθειϊκό αμμώνιο (APS), που προκαλεί την δημιουργία ελευθέρων ριζών, και τον καταλύτη N,N τετραμεθυλ-ενο-αιθυλ-ενο-διαμίνη (TEMED), που καταλύει την μετάδοση ελευθέρων ριζών στο σύστημα. Η πυκνότητα της πηκτής εξαρτάται από το μέγεθος των πρωτεϊνών που θέλουμε να διαχωρίσουμε (87). Η πηκτή αποτελείται από δύο τμήματα, την πηκτή διαχωρισμού (separating gel), που διαχωρίζει τις πρωτεΐνες, και την πηκτή επιστοίβαξης (stacking gel), όπου γίνεται η εναπόθεση των δειγμάτων, ώστε όλες οι πρωτεΐνες να ξεκινήσουν από το ίδιο σημείο και να αυξηθεί η διακριτική ικανότητα διαχωρισμού (Εικόνα 16). 48

49 Εικόνα 16: Γραφική απεικόνιση της πορείας της SDS-page. 1) Αποδιάταξη των πρωτεϊνών με τη χρήση του αποδιατακτικού παράγοντα SDS. 2) Φόρτωση του μίγματος των λιποπρωτεϊνών στο πήκτωμα και εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος. Οι πρωτεΐνες μετακινούνται προς το θετικό πόλο. 3) Ακινητοποίηση των διαχωρισθέντων ζωνών, ώστε να είναι δυνατή η οπτικοποίηση τους. Υλικά Συσκευή κατακόρυφης ηλεκτροφόρησης (Biorad) και τροφοδοτικό σταθερής έντασης (E-C, Apparatus Corporation) Glass Plates (Spacer Plates with 1.5 mm spacer, , Bio-Rad, USA) Glass Plates (Short Plates, , Bio-Rad, USA) 20% (w/v) Sodium Dodecyl Sulfate (SDS, ART. NR , Carl Roth GmbH) (20g SDS + 80 ml ddh2o) Tris-HCl 1.5 M ph 8,8 Tris-HCl 1.5 M ph 6,8 30% (w/v) ακρυλαμίδιο / 0.8% (w/v) δις-ακρυλαμίδιο (75g high grade acrylamide + 2g bis-acrylamide + ddh2o μέχρι τα 250ml) 20% (w/v) Υπερθειϊκό αμμώνιο (Ammonium Persulfate, APS, BP , Fisher Scientific, USA) (20 g APS ml ddh2o) N,N, N,N - Tetramethylethylenediamine (TEMED, T7024, Sigma-Aldrich, USA) 10X Running Buffer (30 g Tris g Glycine + 10 g SDS + ddh2o μέχρι το 1L) 1X Running Buffer (50 ml 10X Running Buffer ml ddh2o) 49

50 Διάλυμα φόρτωσης δειγμάτων (Sample loading buffer) (50 mm Tris.Cl ph mm Dithiothreitol + 2% SDS + 0.1% Bromophenol Blue + 10% Glycerol) Prestained Protein Marker, Broad Range (#P7708S, Biolabs, New England) Ισοπροπανόλη (2-Propanol, , Panreac Quimica Sau, Barcelona, Spain) Συσκευή ξήρανσης (Speed-vac, Savant) Πειραματική πορεία Η πηκτή διαχωρισμού και η πηκτή επιστοίβαξης προετοιμάστηκαν σε δύο σωλήνες falcon των 50ml, όπως φαίνεται στον Πίνακας 2. Το TEMED προστέθηκε τελευταίο εφόσον με την προσθήκη του ξεκινά ο πολυμερισμός. Πίνακας 2: Συστατικά των πηκτών επιστοίβαξης και διαχωρισμού Πηκτή Διαχωρισμού 12% Πηκτή επιστοίβαξης 5% Ακρυλαμίδιο / δις-ακρυλαμίδιο (12ml) ddh2o (9,8ml) Tris-HCl ph8,8 (7,6ml) SDS 10% (300μl) APS 10% (300μl) TEMED (12μl) Ακρυλαμίδιο / δις-ακρυλαμίδιο (1,660ml) ddh2o (6,8ml) Tris-HCl ph6,8 (1,260ml) SDS 10% (100μl) APS 10% (100μl) TEMED (10μl) Η πηκτή διαχωρισμού προστέθηκε ανάμεσα στις δύο γυάλινες πλάκες και απομακρύνθηκαν τυχόν φυσαλίδες με την προσθήκη ισοπροπανόλης. Μόλις πολυμερίστηκε η πηκτή διαχωρισμού αφαιρέθηκε η ισοπροπανόλη με διηθητικό χαρτί και προστέθηκε η πηκτή επιστοίβαξης μαζί με μια οδοντωτή μήτρα με 15 εσοχές, που σχηματίζουν τα κελιά για το φόρτωμα των δειγμάτων. Στην συνέχεια οι πλάκες με τις πηκτές μεταφέρθηκαν στη συσκευή ηλεκτροφόρησης στην οποία τοποθετήθηκε το ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης 1x Running Buffer. Ακολούθηκε η προετοιμασία των δειγμάτων ως εξής: Σε σωληνάκια 1,5ml προστέθηκαν 100μl δέιγματος από το κάθε κλάσμα και μεταφέρθηκαν στο Speed-vac έως ότου ξηρανθούν. Στην συνέχεια επαναδιαλύθηκε το ίζημα σε 20μl ddh2o και προστέθηκαν 5μl Sample Loading Buffer. Προκειμένου να αποδιαταχθούν τα μόρια των πρωτεϊνών, τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε συσκευή θέρμανσης στους 100 o C για 4 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν για λιγότερο από 1 λεπτό σε μέγιστη ταχύτητα (spindown). 50

51 Τέλος φορτώθηκαν τα δείγματα στην συσκευή ηλεκτροφόρησης ξεκινώντας με 5μl από τον μάρτυρα στο πρώτο κελάκι και στην συνέχεια τα δείγματα. Η ηλεκτροφόρηση έγινε στα 100 Volt για περίπου 90 λεπτά. Για τον εντοπισμό των πρωτεϊνικών ζωνών προχωράμε σε ανοσοαποτύπωση κατά Western όπως περιγράφεται ακολούθως Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western Βlot) Αρχή της μεθόδου Η τεχνική περιλαμβάνει την μεταφορά πρωτεϊνών από την πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη PVDF με την εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος (87). Οι πρωτεΐνες δεσμεύονται πάνω στη μεμβράνη μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, αλλά διατηρούν τις αντιγονικές τους ιδιότητες. Έτσι μπορούν να αναγνωριστούν από τα αντισώματα. Χρησιμοποιείται ένα αντίσωμα το οποίο αναγνωρίζει την πρωτεΐνη, και ένα δεύτερο που αναγνωρίζει μία περιοχή του πρώτου. Στο δεύτερο αντίσωμα επίσης, βρίσκεται ομοιοπολικά συνδεδεμένο το ένζυμο της υπεροξειδάσης, το οποίο όταν αντιδράσει με το υπεροξείδιο του υδρογόνου, προκαλεί χημειοφωταύγεια. Έτσι εμφανίζεται φωτεινό σήμα στο σημείο όπου βρίσκεται η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Υλικά 10Χ Transfer Buffer (10.1g Tris Base + 72 g Glycine + ddh20 μέχρι τα 500 ml) 1X Transfer Buffer (50 ml 10X Transfer Buffer ml ddh2o) Συσκευή και κασέτα μεταφοράς Μεμβράνη μεταφοράς (Porablot PVDF membrane, REF , Macherey-Nagel, Germany) Μεθανόλη (Methanol for analysis, I557009, Merck, Germany) Διηθητικό χαρτί (Whatmann) 5% Blotting milk (10 g Blotting grade blocker-non-fat dry milk, Biorad σε 200 ml PBS 1x) Πρωτοταγές αντίσωμα για την ανίχνευση της apoa-i (αραίωση: 1:1000, 5ml blotting milk 5% + 5μl). Polyclonal Antibody to ApoA-I (N-term) Rabbit IgG (Acris antibodies, cat # AP23390PU- N) Δευτεροταγές αντίσωμα (αραίωση: 1:4000, 8 ml blotting milk 5% + 2 μl αντισώματος) Goat anti-rabbit IgG, (Santa Cruz Biotechnology Inc.) Washing buffer (5 ml NP-40 IGEPAL, Sigma σε1 L PBS 1x) Κασέτα εμφάνισης του φιλμ 51

52 ECL (10 ml Luminol 1.25 mm ph μl p-coumaric acid 68 mm + 30 μl hydrogen peroxide 3%) Developer (P7042-1GA, Sigma-Aldrich, USA) Διάλυμα Developer (828 ml Developer L ddh2o) Fixer (P7167-1GA, Sigma-Aldrich, USA) Διάλυμα Fixer (828 ml Fixer L ddh2o) Kodak film 13cm x 18cm (Biomax Xar Film) Πειραματική πορεία Α. Μεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή πολυακρυλαμιδίου στη μεμβράνη PVDF Η μεμβράνη PVDF αρχικά ενεργοποιήθηκε με εμβάπτιση σε μεθανόλη. Έπειτα σε ένα δοχείο που περιέχει 1x Transfer Buffer τοποθετήθηκαν στην κασέτα μεταφοράς, με κατεύθυνση από την κάθοδο προς την άνοδο, τα ακόλουθα : Σφουγγαράκι - τρία κομμάτια διηθητικού χαρτιού - Πηκτή - Μεμβράνη PVDF - τρία κομμάτια διηθητικού χαρτιού Σφουγγαράκι (Εικόνα 17). Αφαιρέθηκαν τυχόν φυσαλίδες και η κασέτα μεταφοράς τοποθετήθηκε στην ειδική συσκευή, η οποία περιείχει ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς 1x. Εφαρμόστηκε ηλεκτρικό ρεύμα σταθερής έντασης 30 Volt για 24 ώρες στους 4 o C. Σφουγγαράκια Διηθητικά χαρτιά Gel _ + Μεμβράνη Gel Κασέτα Μεμβράνη PVDF Εικόνα 17: Μεταφορά πρωτεϊνικού δείγματος από την πηκτή στη μεμβράνη PVDF Β. Ανοσοαποτύπωση Η μεμβράνη PVDF που πλέον περιείχει τις πρωτεΐνες επωάστηκε σε 5ml blotting milk 5% για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου πάνω σε μηχάνημα ήπιας ανάδευσης. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το blotting milk και η μεμβράνη επωάστηκε υπό ανάδευση με 5ml πρωτοταγούς αντισώματος (αραίωση 1:1000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησαν τρείς πλύσεις της μεμβράνης με 100ml washing buffer για 15 λεπτά υπό ανάδευση. Προστέθηκε το δευτεροταγές αντίσωμα (αραίωση 1:4000) και η μεμβράνη επωάστηκε υπο ανάδευση για 1 ώρα 52

53 σε θερμοκρασία δωματίου (Εικόνα 18). Τέλος, ακολούθησαν τρείς πλύσεις με washing buffe rγια 15 λεπτά και η μεμβράνη τοποθετήθηκε σε διάλυμα PBS 1x, ώσπου να γίνει η αυτοραδιογραφία όπως περιγράφεται παρακάτω. Γ. Αυτοραδιογραφία Η μέθοδος της αυτοραδιογραφίας βασίζεται στην χημική αντίδραση των οπτικών φωτονίων με τους κόκκους αλογονούχου Ag του φιλμ. Τα οπτικά φωτόνια μετατρέπουν τα ιόντα αργύρου σε μεταλλικό άργυρο. Κατά την εμφάνιση του φιλμ, οι κόκκοι αλογονούχου αργύρου που δεν αντέδρασαν απομακρύνονται, ενώ ο μεταλλικός άργυρος μαυρίζει στα σημεία αλληλεπίδρασης με την ακτινοβολία. Μέσα σε σκοτεινό θάλαμο, η μεμβράνη επωάστηκε για 1 λεπτό σε διάλυμα ΕCL που περιείχε υπεροξείδιο του υδρογόνου. Στην συνέχεια τοποθετήθηκε στην κασέτα εμφάνισης ανάμεσα σε δύο πλαστικές διαφάνειες, επάνω από τις διαφάνειες τοποθετήθηκε το φιλμ και έκλεισε η κασέτα εμφάνισης. Το κάθε φιλμ έμεινε στην κασέτα 1-4 λεπτά και στη συνέχεια βυθίστηκε σε διάλυμα developer (περίπου 1 λεπτό), ξεπλύθηκε σε νερό και βυθίστηκε σε διάλυμα fixer μέχρι να γίνει διαυγές και να μονιμοποιηθεί. Δευτεροταγές αντίσωμα HRP + ECL Χημειοφωταύγεια Πρωτοταγές αντίσωμα Μεμβράνη Πρωτεΐνη Εικόνα 18: Επώαση με blotting milk και αντισώματα (πρωτοταγές και δευτεροταγές) Αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Αρχή της μεθόδου Η παρακάτω μέθοδος στόχο έχει την ποσοτικοποίηση του ποσοστού ανάστροφης μεταφοράς χοληστερόλης, από κύτταρα που βρίσκονται σε καλλιέργεια (88). Συγκεκριμένα μετράται η ικανότητα των κυττάρων να απελευθερώνουν την περίσσεια ενδοκυττάριας 53

54 ραδιοσημασμένης χοληστερόλης, παρουσία της HDL του πλάσματος των πειραματόζωων. Επομένως προσδιορίζεται η ικανότητα της apoa-ι, που κυκλοφορεί στο πλάσμα, να αλληλεπιδρά με τον μεταφορέα ABCA1 των κυττάρων και να προκαλείται εκροή λιπιδίων (φωσφολιπίδια και χοληστερόλη) από τα κύτταρα προς την HDL (Παράγραφος 6.2 και 8.1). Υλικά για τον προσδιορισμό της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης από την HDL Κυτταρική σειρά HTB-13 (ATCC) (4-14 C) χοληστερόλη, S.A. 50mCi/mmol (American Radiolabeled Chemicals Inc.) Καθαρή ανθρώπινη Απολιποπρωτεϊνη Α-Ι (Millipore) Θρεπτικό μέσο Leibovitz s L-15 (Biochrome AG) Εμβρυϊκός Βόειος Ορός (Fetal Bovine Serum - FBS) (Biochrom AG) NEA Non essential aminoacids (Biochrome AG) L-Glutamine (Biochrome AG) Penicillin / Streptomycin (Pen-Strep) (Biochrome AG) Trypsin / EDTA Solution (Biochrome AG) Triton X-100 (MP Biomedicals, LLC) NaOH (Sigma) NaCl (Sigma) Διάλυμα PBS 1x ph 7,4 Πιάτο καλλιέργειας 12 κελιών (12-well plate) (Greiner bio-one, CELLSTAR) Πλαστικά φιαλίδια μέτρησης ραδιενέργειας 20ml (Sigma) Επωαστής 37 o C (Thermo Scientific) Μετρητης σπινθηρισμού υγρών β-ακτινοβολίας (LS 6500 Multi-Purpose, Scintillation Counter, Beckman) Υγρό σπινθηρισμού (Scintillation liquid) (Quicksafe A, Zinsser Analytic, Germany) Ξέστρο κυττάρων (Cell scraper) (Sigma) Διαλύματα: Πίνακας 3: Σύσταση Θρεπτικού μέσου με ορό (Complete medium) και Θρεπτικού μέσου χωρίς ορό (Serum free medium) 54

55 Complete medium Serum free medium Συστατικά διαλύματος Συγκέντρωση (Ποσότητα) Συγκέντρωση (Ποσότητα) Leibovitz s L-15 (500ml) (500ml) FBS 10% (50ml) - NEA 1% (5ml) 1% (5ml) L-glutamine 1% (5ml) 1% (5ml) Pen-Strep 1% (5ml) 1% (5ml) Πίνακας 4: Σύσταση Διαλύματος σήμανσης (Labeling medium). Labeling medium Συστατικά διαλύματος Complete medium Συγκέντρωση (Ποσότητα / κελί) (1ml) (4-14 C) χοληστερόλη, 50mCi/mmol 1 (1μl) Πίνακας 5: Σύσταση Διαλύματος efflux (Efflux solution). Efflux solution Συστατικά διαλύματος Serum free medium Πλάσμα αίματος πειραματόζωων Συγκέντρωση (Ποσότητα / κελί) (250μl) 2% (5μl) Πίνακας 6: Σύσταση Διαλύματος λύσης κυττάρων. Διάλυμα λύσης κυττάρων Συστατικά διαλύματος PBS 1x NaOH NaCl Συγκέντρωση (Ποσότητα) (1.000ml) 0,2M (8g) 0,15M (8,76μl) Πειραματική Πορεία Καλλιέργεια Κυττάρων Για τον προσδιορισμό της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης, χρησιμοποιήθηκαν ΗΤΒ- 13 κύτταρα, τα οποία ισομοιράστηκαν στα κελιά ενός πιάτου 12 κελιών (12-well plate), έπειτα από τρυψινοποίηση και ανακαλλιέργειά τους. Χρησιμοποιήθηκαν φλάσκες Τ-75 και όταν η πληρότητα των κυττάρων πλησίαζε το 90 με 100%, τα κύτταρα ανακαλλιεργήθηκαν. Αρχικά απομακρύνθηκε από τις φλάσκες το θρεπτικό υλικό (10% FBS, 1% ΝΕΑ, 1% pen-strep, 1% L-glutamine σε Leibovitz s L-15). Ακολούθησαν 55

56 δύο πλύσεις με PBS 1x ώστε να απομακρυνθεί ο αναστολέας της τρυψίνης, που περιέχεται στα φυσικά συστατικά του ορού FBS. Έπειτα προστέθηκε 1ml διάλυμα τρυψίνης 1x (Trypsin-EDTA 10x σε PBS 1x). Οι φλάσκες τοποθετήθηκαν στον επωαστήρα για 5 λεπτά, ώστε το ένζυμο τρυψίνη να ενεργοποιηθεί και να υδρολύσει τις πρωτεΐνες του υποστρώματος των κυττάρων προκειμένου να αποκολληθούν από την επιφάνεια καθώς και μεταξύ τους. Αμέσως μετά, ακολούθησε προσθήκη θρεπτικού υλικού ώστε να ανασταλεί η δράση του ενζύμου. Σε όρθια θέση της φλάσκας και με τη βοήθεια πιπέτας το θρεπτικό μέσο που περιείχε τα αποκολλημένα κύτταρα αναρροφήθηκε και εκχύθηκε αρκετές φορές, ώστε να διαλυθούν τα συσσωματώματα των κυττάρων. Τέλος, το περιεχόμενο κάθε φλάσκας μοιράστηκε σε δύο νέες φλάσκες Τ-75, συμπληρώθηκε επιπλέον θρεπτικό υλικό στην κάθε μια από αυτές και τοποθετήθηκαν εκ νέου στον επωαστήρα. Όταν συμπληρώθηκε ο απαραίτητος αριθμός κυττάρων, τότε αυτά μοιράστηκαν στα κελιά του πιάτου, για να ξεκινήσει η πειραματική πορεία προσδιορισμού της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης. Προσδιορισμός αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης από την HDL Αρχικά τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πιάτο 12 κελιών (12-well plate) με complete medium και μεταφέρθηκαν σε επωαστή (37 o C) ώσπου η πληρότητά τους να είναι 80-90%. Στην συνέχεια το θρεπτικό μέσο αντικαταστάθηκε με labeling comple medium (1ml / κελί) και τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες. Μετά το πέρας των 48 ωρών έγινε απόχυση του θρεπτικού μέσου και τα κελιά πλύθηκαν τρεις φορές με αποστειρωμένο διάλυμα PBS 1x. Προστέθηκαν 500μl serum free medium / κελί και το πιάτο μεταφέρθηκε στον επωαστή για 18 ώρες. Ακολούθησαν τρεις πλύσεις με PBS 1x και προστέθηκαν 250μl efflux solution / κελί. Σαν αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν κελιά που περιείχαν 250μl serum free medium, ενώ θετικό μάρτυρα αποτέλεσαν κελιά με serum free medium τα οποία περιείχαν καθαρή ανθρώπινη apoa-i σε συγκέντρωση 1,68mg πρωτεΐνης /ml. Στην συνέχεια έγινε δειγματοληψία (50μl) από κάθε κελί, σε χρονικό διάστημα 30 λεπτών, 2 και 6 ωρών, από την προσθήκη του efflux solution. Το κάθε δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις g για 5 λεπτά και συλλέχθηκαν 40μl από το υπερκείμενο. Έπειτα προστέθηκαν 330μl διαλύματος λύσης κυττάρων σε κάθε κελί και έγινε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν από την επιφάνεια των κελιών με τη χρήση ξέστρου κυττάρων και συλλέχθηκαν 100μl / κελί. Κάθε ένα από τα δείγματα των 30 λεπτών, 2 και 6 ωρών (40μl) καθώς και τα 100μl που συλλέχθηκαν μετά την λύση των κυττάρων, μεταφέρθηκαν σε πλαστικά φιαλίδια μέτρησης 56

57 ραδιενέργειας, τα οποία περιείχαν 10ml υγρό σπινθηρισμού. Η ποσότητα της ραδιοσημασμένης χοληστερόλης μετρήθηκε σε μετρητή σπινθηρισμού υγρών β-ακτινοβολίας. Το ποσοστό της ανάστροφης μεταφοράς χοληστερόλης υπολογίστηκε με βάση την ποσότητα της χοληστερόλης που μεταφέρθηκε από τα κύτταρα στην HDL. Η αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης υπολογίστηκε βάσει του τύπου: Sample efflux Α / (A+B) *100% Blank efflux Γ / (Γ+Δ) *100% % Final Cholesterol Efflux % Sample efflux - % Blank efflux Όπου: Α = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν στο θρεπτικό μέσο κάθε δείγματος (30min, 2h και 6h) * την αραίωση του δείγματος στο υγρό σπινθηρισμού. Β = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν από την λύση των κυττάρων * την αραίωση του δείγματος λύσης κυττάρων, στο υγρό σπινθηρισμού. Γ = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν στο θρεπτικό μέσο κάθε αρνητικού μάρτυρα (30min, 2h και 6h) * την αραίωση του δείγματος στο υγρό σπινθηρισμού. Δ = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν από την λύση των κυττάρων του αρνητικού μάρτυρα * την αραίωση του δείγματος λύσης κυττάρων, στο υγρό σπινθηρισμού Αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL Αρχή της μεθόδου Η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα της διϋδροροδαμίνης 123 (DHR) να οξειδώνεται, με γραμμικό ρυθμό μεταξύ 10 και 50 λεπτών της ώρας, όταν έρχεται σε επαφή με τον ατμοσφαιρικό αέρα (89). Με την οξείδωση μετατρέπεται στο φθορίζον προϊόν (ροδαμίνη 123), του οποίου ο φθορισμός αυξάνει με τον ρυθμό της οξείδωσης (Εικόνα 19). Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η ταχύτητα οξείδωσης της DHR επηρεάζεται από τις ιδιότητες της HDL (Παράγραφος 8.2), τα δείγματα HDL ελέγχθηκαν για την επίδραση τους στο ρυθμό οξείδωσης DHR. Εικόνα 19: Μετατροπή της μη φθορίζουσας διϋδροροδαμίνης 123 σε φθορίζουσα ροδαμίνη 123 μετά από οξείδωση. 57

58 Υλικά Διϋδροροδαμίνη 123 (DHR) 50 mm σε DMSO, (Cayman Chemical) HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N -2-ethanesulfonic acid), (Sigma) NaCl (Sigma) HBS buffer (διαλύουμε 5,2 g HEPES και 8,766 g NaCl σε ddh2o μέχρι ο όγκος να είναι 1L) ddh2o Μικροπλάκα 96 κελιών (polypropylene, flat bottom, black, Fisher Scientific) VICTOR3 Multilabel Plate Readers (Perkin Elmer) Πειραματική Πορεία Αρχικά η DHR αραιώθηκε 1000 φορές (1:1000) σε HBS για την παρασκευή 50 μm working solution. Δείγμα πλάσματος των πειραματόζωων και από τις τρεις ομάδες ενώθηκε, ώστε να προκύψουν τρεις δεξαμενές πλάσματος. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν, όπως περιγράφεται στην παράγραφο 11.3 και υπέστησαν διαπίδυση, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Έπειτα προετοιμάστηκαν τα δείγματα (λιποπρωτεϊνικά κλάσματα της HDL) ως εξής: Τα κλάσματα 5-8 της HDL ενώθηκαν και προσδιορίστηκε στο τελικό δείγμα η ποσότητα της HDL χοληστερόλης (Παράγραφος 12.1). Τα δείγματα διατηρήθηκαν σε ατμόσφαιρα αζώτου. Σε μικροπλάκα 96 κελιών φορτώθηκε σε κάθε κελί ανάλογη ποσότητα δείγματος ώστε η τελική ποσότητα της HDL χοληστερόλης να είναι 5μg / κελί. Το κάθε δείγμα φορτώθηκε τέσσερις φορές και στην συνέχεια προστέθηκε διάλυμα HBS έως τελικό όγκο 150μl / κελί. Στη συνέχεια προστέθηκαν 25µl 50µM DHR με τελική συγκέντρωση της DHR 7µM. Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα κελιά, στα οποία προστέθηκε μόνο 150μl HBS και 25μl DHR. Αμέσως μετά την προσθήκη της DHR, η μικροπλάκα προστατεύθηκε από το φως και τοποθετήθηκε στο μηχάνημα μέτρησης φθορισμού. Ο φθορισμός μετρήθηκε στα 10 λεπτά αφότου προστέθηκε η DHR στα δείγματα και στα 60 λεπτά. Τα φίλτρα που χρησιμοποιήθηκαν είναι στα 485/538nm διέγερση/εκπομπή. Το οξειδωτικό δυναμικό της HDL υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος των τιμών των τεσσάρων κελιών για κάθε δείγμα, εκφρασμένο σε μονάδες φθορισμού ανά λεπτό (FU minute -1 ) και επί τοις εκατό του φθορισμού που μετρήθηκε από τα κελιά που περιείχαν μονάχα την DHR. 58

59 13. Αναλύσεις στους ιστούς 13.1 Απομόνωση RNA από ηπατικό ιστό Υλικά Trizol Reagent ( , Invitrogen, USA) Ισοπροπανόλη (2-Propanol, , Panreac Quimica Sau, Barcelona, Spain) Χλωροφόρμιο (Chloroform, K , Merck, Germany) DEPC (Diethyl pyrocarbonate, , MP Biomedicals, LLC, France) DEPC treated H2O (0.1% v/v) (1ml DEPC + 1L ddh20) 70 % Αιθανόλη (Ethanol, K , Merck, Germany) σε DEPC treated H2O Mini-bead beater Quawell Q5000 Πλαστικά σωληνάκια 1.5ml (Reaction Tubes, , Greiner Bio-One) Πλαστικά σωληνάκια ομογενοποίησης 2ml με βιδωτό καπάκι (Microcentrifuge tubes with hang-on screw lid, CK65.1, Roth) Πειραματική πορεία Για την απομόνωση του RNA από το ήπαρ ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: Ένα κομμάτι ιστού (περίπου 30mg ήπατος) τοποθετήθηκε σε ειδικό σωληνάκι ομογενοποίησης με βιδωτό καπάκι. Προστέθηκε 1ml αντιδραστηρίου Trizol και τοποθετήθηκε στον ομογενοποιητή Mini-bead beater για 1 λεπτό στη μέγιστη ταχύτητα. Μετά την ανάδευση, τα σωληνάκια με το περιεχόμενο τους παρέμειναν στον πάγο για τουλάχιστον 1 λεπτό και στη συνέχεια προστέθηκαν 100μl χλωροφόρμιο. Το μίγμα ανακινήθηκε στο vortex για 30 δευτερόλεπτα και έπειτα φυγοκεντρήθηκε στα g στους 4 o C για 15 λεπτά. Έπειτα 500μl από το υπερκείμενο μεταφέρθηκαν σε νέο σωληνάκι 1.5ml, προστέθηκαν 500μl ισοπροπανόλης και φυγοκεντρήθηκε και πάλι στα g στους 4 o C για 15 λεπτά. Έγινε απόχυση του υπερκειμένου και πλύση του ιζήματος με 1ml 70% αιθανόλης. Το δείγμα παρέμεινε στον πάγο για 20 λεπτά ώσπου να στεγνώσει. Τέλος, το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 200μl DEPC H2O και φωτομετρήθηκε σε νανοφωτόμετρο Quawell Q5000 ώστε να βρεθεί η συγκέντρωση του RNA η οποία υπολογίζεται βάσει του τύπου: C (γ/λ)= OD260 * 10 59

60 13.2 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real Time PCR) Αρχή της μεθόδου Τα επίπεδα του mrna των γονιδίων που σχετίζονται με την βιογένεση των HDL σωματιδίων (apoa-i η οποία εκκρίνεται από το ήπαρ), με την αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης (ABCA1) καθώς και με την πρόσληψη λιπιδίων από το ήπαρ (SR-B1), ελέγχθηκαν με τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (RT-PCR). Το γονίδιο που εκφράζει την ριβοσωμική πρωτεΐνη S18 (RPS18) χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο ελέγχου. Η τεχνική της RT-PCR βασίζεται σε αυτήν της συμβατικής PCR, με τη διαφορά ότι στην δέυτερη τα αποτελέσματα συλλέγονται με ανάλυση του τελικού προϊόντος μετά από διαχωρισμό σε πήκτωμα αγαρόζης, ενώ στην RT-PCR η διαδικασία ενισχύσεως του τελικού προϊόντος καταγράφεται σε πραγματικό χρόνο με τη χρήση τεχνικών φθορισμού (90). Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR polymerase chain reaction) είναι μία τεχνική με την βοήθεια της οποίας πολλαπλασιάζεται συγκεκριμένη αλληλουχία DNA. Μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος με γνωστή αλληλουχία μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέχρι και 2 n φορές (όπου n είναι ο αριθμός των κύκλων της PCR). Η γνώση της αλληλουχίας είναι απαραίτητη για το σχεδιασμό των εκκινητών (συνθετικών DNA ολιγονουκλεοτιδίων το καθένα συμπληρωματικό με μία από τις αλυσίδες του δίκλωνου DNA). Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιούνται ως εκκινητές (primers) πρέπει να δεσμεύονται σε αλληλουχίες που εντοπίζονται στα αντίθετα άκρα της DNA αλληλουχίας που πρόκειται να ενισχυθεί. Ένας πλήρης κύκλος μιας PCR αντίδρασης περιλαμβάνει τρία στάδια: 1) Αποδιάταξη του DNA (denaturation), που πραγματοποιείται σε θερμοκρασίες μεγαλύτερες των 90 C. 2) Πρόσδεση των εκκινητών στο DNA (annealing), όπου οι εκκινητές σε περίσσεια προσδένονται με υβριδισμό στις συμπληρωματικές αλληλουχίες του DNA με ψύξη του δείγματος στους C. 3) Επιμήκυνση των εκκινητών (extension) από μία θερμοάντοχη πολυμεράση, παρουσία των τεσσάρων νουκλεοτιδίων, με επώαση στους 72 C. Το μηχάνημα RT-PCR που χρησιμοποιήθηκε για την διεξαγωγή των πειραμάτων είναι το Rotor-Gene RG-3000 της εταιρείας CORBETT Research. Το μηχάνημα αυτό αποτελείται από ένα θερμικό κυκλοποιητή, ένα φθοριόμετρο για την ανίχνευση του φθορισμού κατά την διάρκεια της φάσης των κύκλων και έναν υπολογιστή που συγκεντρώνει τα δεδομένα φθορισμού, τα 60

61 οποία εμφανίζονται στην οθόνη με τη μορφή γραφημάτων μέσω ειδικού λογισμικού (Rotor gene, έκδοση 6 για Windows). Για την ανίχνευση των επιπέδων του mrna των προαναφερθέντων γονιδίων χρησιμοποιήθηκε το προτυπώμενο kit της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου SYBR Green Real-Time One-Step RT-PCR kit της εταιρείας Qiagen. Χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο kit, η μεταγραφή του RNA σε cdna γίνεται σε ένα βήμα, μειώνοντας έτσι τις απώλειες που θα μπορούσαν να υπάρξουν από ένα επιπλέον βήμα (reverse transcription). Η πορεία βασίζεται στις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρείας που περιγράφονται στο ένθετο φυλλάδιο που συνοδεύει το προϊόν. Υλικά Rotor-gene SYBR Green Real-Time One-Step RT-PCR kit (Qiagen, Valencia, CA ) Rotor-Gene RG-3000 cycler by CORBETT, Research (Mortlake, Sydney, Australia) Εκκινητές που σχεδιάστηκαν από την Lab Supplies EPE (Athens, Greece) Πίνακας 7: Αλληλουχία των βάσεων των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για τα γονίδια ABCA1, apoa-i και SR-B1. Εκκινητής Forward Εκκινητής Reverse ABCA1 CCC AGA GCA AAA AGC GAC TC GGT CAT CAT CAC TTT GGT CCT TG ApoA-I GGA GCT GCA AGG GAG ACT GT TGC GCA GAG AGT CTA CGT GTG T SR-B1 GTG CTG CTG GGG CTT GGA GG CAC TGG TGG GCT GTC CGC TG Πίνακας 8: Συστατικά της αντίδρασης RT-PCR. Συγκέντρωση Ποσότητα (μl) ανά 10 μl διαλυμάτων stock αντίδρασης Ρυθμιστικό διάλυμα της RT- PCR 2x 12.5 μl Probes 10x 2.5 μl Εκκινητές 10x 2.5 μl Taq DNA πολυμεράση 5 U/μl 0.25 μl cdna ( μg) 2.5 μl Αποστειρωμένο ddh2o 4.75 μl Πειραματική πορεία Συνοπτικά, για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν δύο αντιδράσεις. Η πρώτη παρουσία ειδικών εκκινητών για το κάθε γονίδιο που μελετήθηκε (Πίνακας 7) και η δεύτερη με ειδικούς εκκινητές για το γονίδιο ελέγχου RPS18. Κάθε αντίδραση πραγματοποιήθηκε στα ειδικά για RT- 61

62 PCR φιαλίδια, χωρητικότητας 0.1ml. Τα αντιδραστήρια ανακινήθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν σύντομα και προστέθηκαν στο φιαλίδιο, όπως αναφέρονται στον Πίνακας 8. Οι κύκλοι που χρησιμοποιήθηκαν για τις αντιδράσεις συγκεντρώνονται στον Πίνακας 9. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ειδικού λογισμικού του μηχανήματος της RT-PCR (Rotorgene software version 6 for windows). PCR προϊόν ApoA-I, ABCA1, SR- B1, RPS18 Αριθμός Κύκλων Πίνακας 9: Κύκλοι αντιδράσεων της RT-PCR. Αποδιάταξη Υβριδισμός Επιμήκυνση Τελική Επιμήκυνση o C 10 sec 60 o C 30 sec 72 o C 30 sec 72 o C 10 min 13.3 Ομογενοποίηση Φαιού λιπώδους ιστού και απομόνωση μιτοχονδρίων Για τον προσδιορισμό των επιπέδων των πρωτεϊνών UCP1 και CYC στα μιτοχόνδρια του Φαιού λιπώδους ιστού, αναγκαία ήταν η ομογενοποίηση του ιστού και η απομόνωση των μιτοχονδρίων. Υλικά Πρωτοταγές αντίσωμα για την ανίχνευση των UCP1 και CYC (αραίωση: 1:1000, 5ml blotting milk 5% + 5μl). Polyclonal Antibody to UCP1 Rabbit IgG (GeneTex #GTX10983) Polyclonal Antibody to Cytochrome c (CYC) Rabbit IgG (Cell signaling #4272) Δευτεροταγές αντίσωμα (αραίωση: 1:4000, 8 ml blotting milk 5% + 2 μl αντισώματος) Goat anti-rabbit IgG, (Santa Cruz Biotechnology Inc.) Sodium deoxycholate (Alfa Aesar) EDTA (Sigma) NaCl (Merck) Triton X-100 (Sigma) Διαλύματα: Πίνακας 10: Σύσταση Διαλύματος ομογενοποίησης Συστατικά διαλύματος Διάλυμα Ομογενοποίησης Σακχαρόζη 0.32 M 62

63 EDTA 100mM ph7,4 Tris-HCl 1M ph7,4 1mM 10mM Πίνακας 11: Σύσταση διαλύματος RIPA Συστατικά διαλύματος Διάλυμα RIPA NaCl Tris-HCl 1M ph7,4 150mM 50mM Sodium deoxycholate 0.5% SDS 0.1% EDTA 100mM ph7,4 1mM Triton X % Protease Inhibitor 1:1000 Phosphatase Inhibitor 1:1000 Πειραματική διαδικασία Αρχικά οι ιστοί που απομονώθηκαν ζυγίστηκαν και τοποθετήθηκαν σε γυάλινο ομογενοποιητή με teflon έμβολο σωληνάκι με 5ml διαλύματος ομογενοποίησης / gr ιστού. Η ομογενοποίηση πραγματοποιήθηκε μηχανικά στους 4 ο C, σε ταχύτητα 750 rpm. Έπειτα τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 1.000g για 5 λεπτά στους 4 o C και συλλέχθηκε το υπερκείμενο, στο οποίο βρίσκονταν τα μιτοχόνδρια. Αυτό φυγοκεντρήθηκε εκ νέου στα g για 10 λεπτά στους 4 o C και αποχύθηκε το υπερκείμενο (κυτταρόπλασμα) ενώ το ίζημα (μιτοχόνδρια) επαναδιαλύθηκε σε 1ml διάλυμα ομογενοποίησης. Ακολούθησαν τρεις πλύσεις με διάλυμα ομογενοποίησης, μέσω φυγοκέντρησης στα g για 10 λεπτά στους 4 o C. Το τελικό ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 500μl διαλύματος ομογενοποίησης και φυλάχθηκε στους -80 o C για περαιτέρω αναλύσεις. Για να γίνει η προετοιμασία του προϊόντος λύσης των μιτοχονδρίων, τα παραπάνω δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 13,000g για 10 λεπτά στους 4 o C, αποχύθηκε το υπερκείμενο διάλυμα ομογενοποίησης και το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 300μl διαλύματος RIPA. Στο σημείο αυτό έγινε προσδιορισμός της ολικής πρωτεΐνης των μιτοχονδρίων με την μέθοδο Lowry (91), έτσι ώστε να φορτωθούν ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από κάθε δείγμα (2,5μg) κατά την ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) (Παράγραφος 12.2). Τέλος ακολούθησε ανοσοαποτύπωση κατά Western όπως περιγράφεται στην παράγραφο

64 Αποτελέσματα 14. Μετρήσεις κατανάλωση τροφής, σωματικού βάρους και λιπιδίων Κατά την έναρξη της πειραματικής μελέτης και προτού εκτεθούν σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας οι δύο από τις τρεις ομάδες πειραματόζωων (Εικόνα 9), έγινε χαρακτηρισμός της βασικής κατάστασής τους. Συγκεκριμένα μετρήθηκε η ποσότητα τροφής που κατανάλωναν κατά μέσο όρο την ημέρα για μια περίοδο 7 ημερών, το σωματικό τους βάρος, καθώς επίσης και τα επίπεδα τριγλυκεριδίων και ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα του αίματος, όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι. Όμοιος χαρακτηρισμός της κατάστασής τους έγινε και στο τέλος της μελέτης, έπειτα από την έκθεση στο περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας. Στην ομάδα ελέγχου την μηδενική εβδομάδα τα πειραματόζωα κατανάλωναν 3,8 ± 0,07 gr/ημέρα/πειραματόζωο, και την 12 η εβδομάδα 4,0 ± 0,1 gr/ημέρα/πειραματόζωο (p>0,05). Αντίστοιχα τα πειραματόζωα που εκτέθηκαν σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας για 12 εβδομάδες κατανάλωναν 5,3 ± 0,1 gr/ημέρα/πειραματόζωο την μηδενική εβδομάδα, ενώ την 12 η εβδομάδα η κατανάλωση τροφής αυξήθηκε σημαντικά, στα 7,0 ± 0,3 gr/ημέρα/πειραματόζωο (p<0,01). (Εικόνα 20 Α) Οι ομάδες μελέτης είχαν στην μηδενική εβδομάδα παρόμοιο σωματικό βάρος. Συγκεκριμένα τα πειραματόζωα της ομάδας ελέγχου ζύγιζαν κατά μέσο όρο 19,4 ± 1,6 gr και αυτά της πειραματικής ομάδας 21,8 ± 0,5 gr (p>0,05). Την 12 η εβδομάδα οι δύο ομάδες μελέτης συνέχισαν να μην παρουσιάζουν αλλαγές στο σωματικό βάρος των πειραματόζωων, παρόλο που αυτά που εκτέθηκαν σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας είχαν αυξήσει σημαντικά την κατανάλωση τροφής όπως προαναφέρθηκε. Συγκεκριμένα τα σωματικά βάρη ήταν για την ομάδα ελέγχου 25,6 ± 0,8 gr και για την πειραματική ομάδα 24,1 ± 0,8gr (p>0,05). (Εικόνα 20 Β) Παρατηρήθηκε επίσης σημαντική μείωση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων και της ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα των πειραματόζωων που εκτέθηκαν στο πειραματικό περιβάλλον για 2 και 12 εβδομάδες, παρόλη την αυξημένη κατανάλωση τροφής. Συγκεκριμένα η πειραματική ομάδα που εκτέθηκε στους 4 o C για 2 εβδομάδες, είχε την 2 η εβδομάδα έκθεσης 24,4 ± 6,4 mg τριγλυκεριδίων/ dl πλάσμα αίματος, επίπεδα σημαντικά χαμηλότερα σε σχέση με την ομάδα μακρόχρονης έκθεσης στο ψύχος (80,4 ± 9,7 mg/dl) (p<0,01). Και οι δύο πειραματικές ομάδες είχαν σημαντικά πιο χαμηλά επίπεδα τριγλυκεριδίων σε σχέση με την βασική κατάσταση (215,9 ± 14,1 mg/dl) όπως επίσης και συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου (217,2 ± 13,8 mg/dl). (Εικόνα 20 C). 64

65 Τα επίπεδα ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα του αίματος των πειραματικών ομάδων δεν παρουσίασαν σημαντικές αλλαγές. Συγκεκριμένα κατά την 2 η εβδομάδα έκθεσης στο ψύχος η ολική χοληστερόλη ήταν 44,4± 3,6 mg/dl και την 12 η εβδομάδα 57,2 ± 5,1 mg/dl έναντι της ομάδας ελέγχου που ήταν 63,9± 3,7 mg/dl (Εικόνα 20 D). Εικόνα 20: Χαρακτηρισμός των ομάδων μελέτης την μηδενική εβδομάδα σε σύγκριση με την έκθεση σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας για 12 εβδομάδες και 2 εβδομάδες. Μέσος όρος κατανάλωσης τροφής ανά μέρα ανά πειραματόζωο (Α). Μέσος όρος βάρους σώματος (Β). Επίπεδα τριγλυκεριδίων (C) και ολικής χοληστερόλης (D) στο πλάσμα του αίματος. 15. Ενεργοποίηση Φαιού λιπώδους ιστού (UCP1 και CYC) Με σκοπό να επιβεβαιώσουμε την ενεργοποίηση ή όχι του μηχανισμού θερμογένεσης στις ομάδες που εκτέθηκαν στο ψύχος, προχωρήσαμε στον προσδιορισμό του επιπέδου έκφρασης της πρωτεΐνης CYC και UCP1 στο BAT των τριών ομάδων μελέτης. Τα επίπεδα των δύο αυτών πρωτεϊνών είναι αντιπροσωπευτικά της πραγματοποίησης οξειδωτικής φωσφορυλίωσης ή θερμογένεσης, αντίστοιχα. Ο προσδιορισμός των επιπέδων των πρωτεϊνών έγινε με την μέθοδο SDS-PAGE και Western Blot, όπως περιγράφεται στις παραγράφους 12.2 και Οι εικόνες που προέκυψαν ποσοτικοποιήθηκαν με το πρόγραμμα επεξεργασίας εικόνας ImageJ, με μέτρηση της έντασης κάθε ζώνης του φιλμ αυτοραδιογραφίας. Όπως ήταν αναμενόμενο στην ομάδα ελέγχου δεν εντοπίστηκε η πρωτεΐνη UCP1 καθώς η ομάδα ελέγχου διατηρήθηκε σε θερμο-ουδέτερο περιβάλλον. Την 2 η εβδομάδα έκθεσης στο 65

66 περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας παρουσιάζεται η UCP1 και άρα πραγματοποιείται θερμογένεση. Προς έκπληξή μας, τα επίπεδα της UCP1 είναι σημαντικά πιο μειωμένα κατά την 12 η εβδομάδα. Συγκεκριμένα τα επίπεδα της πρωτεΐνης κατά την μακρόχρονη έκθεση είναι 29,03 ± 7,8 % (p<0,001) των επιπέδων της 2 ης εβδομάδας (Εικόνα 21). Ομοίως για την CYC, παρατηρήθηκε ότι στην βραχύχρονη έκθεση στο ψύχος τα επίπεδα της πρωτεΐνης ήταν κατά μέσο όρο 2,9 ± 0,18 φορές αυξημένα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, ενώ την 12 η εβδομάδα πέφτουν περίπου στο μισό (0,45 ± 0,1) των βασικών επιπέδων έκφρασης (Εικόνα 21). Εικόνα 21: (Α) Επίπεδα πρωτεϊνών UCP1 και CYC στον Φαιό λιπώδη ιστό τρων τριών ομάδων μελέτης, όπως αναλύθηκαν με την τεχνική Western Blot. (Β) Ημιποσοτική ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης UCP1. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης την 12 η εβδομάδα, εκφράζονται ως % των επιπέδων της UCP1 κατά την 2 η εβδομάδα έκθεσης στο ψύχος. (C) ) Ημιποσοτική ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης CYC. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης στις δύο πειραματικές ομάδες εκφράζονται ως % των επιπέδων της ομάδας ελέγχου. 16. Ρυθμός εντερικής και ηπατικής έκκρισης τριγλυκεριδίων Προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της χαμηλής θερμοκρασίας στην κινητική των τι τριγλυκεριδίων, έγινε μέτρηση του ρυθμού της ηπατικής και εντερικής έκκρισης τριγλυκεριδίων όπως περιγράφεται στις παραγράφους 10.5 και

67 Παρατηρήθηκε ότι η ομάδα που εκτέθηκε στους 4 o C, την 12 η εβδομάδα παρουσίασε σημαντικά μειωμένη έκκριση ηπατικών τριγλυκεριδίων σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Συγκεκριμένα η ταχύτητα έκκρισης ηπατικών τριγλυκεριδίων στην πειραματική ομάδα ήταν 2,2 ± 0,3 mg τριγλυκεριδίων / dl πλάσματος / min έναντι της ομάδας ελέγχου που ήταν 6,8 ± 1,4 mg/dl/min (p<0,001). (Εικόνα 22 Α). Όμοια η ταχύτητα ολικής παροχής τριγλυκεριδίων από ήπαρ και έντερο βρέθηκε μειωμένη, 11,8 ± 0,6 mg/dl/min, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου που ήταν 14,0 ± 1,7 mg/dl/min. (Εικόνα 22 Β). Τέλος αφαιρώντας την ταχύτητα ηπατικής έκκρισης τριγλυκεριδίων από την ταχύτητα ολικής παροχής τριγλυκεριδίων, η ταχύτητα εντερικής έκκρισης τριγλυκεριδίων βρέθηκε ότι ήταν κατά μέσο όρο 9,5 ± 0,5 mg/dl/min στην πειραματική ομάδα, ενώ στην ομάδα ελέγχου ήταν 7,2 ± 0,9 mg/dl/min (p<0,05). Εικόνα 22: (A) Ταχύτητα ηπατικής και (Β) ολικής (ηπατικής και εντερικής) έκκρισης τριγλυκεριδίων στην πειραματική ομάδα και ομάδα ελέγχου την 12 η εβδομάδα της μελέτης. 17. Χαρακτηρισμός λιποπρωτεϊνών 17.1 Κατανομή ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Για τον προσδιορισμό της επίδρασης του ψύχους στην κατανομή της χοληστερόλης στα διάφορα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα, ενώσαμε πλάσμα των πειραματόζωων της κάθε ομάδας και προχωρήσαμε σε κλασματοποίηση με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας και διαπίδυση των κλασμάτων όπως περιγράφεται στις παραγράφους 11.3 και Τέλος έγινε προσδιορισμός των επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο κάθε λιποπρωτεϊνικό κλάσμα όπως περιγράφεται στην παράγραφο

68 Η κατανομή της ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα έδειξε να επηρεάζεται από την έκθεση των πειραματόζωων στο ψύχος. Συγκεκριμένα φάνηκε ότι με την έκθεση σε χαμηλή θερμοκρασία για 2 εβδομάδες, υπάρχει αύξηση των ώριμων σωματιδίων της HDL χοληστερόλης (κλάσματα 7 και 8) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, όπου η ολική χοληστερόλη ήταν κατανεμημένη στα πιο ανώριμα κλάσματα της ΗDL (κλάσματα 5 και 6). Μάλιστα κατά την 12 η εβδομάδα έκθεσης φαίνεται η κατανομή αυτή να επηρεάζεται ακόμα περισσότερο με τάση προς την ίδια κατεύθυνση (Εικόνα 23). Εικόνα 23: Κατανομή ολικής χοληστερόλης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα των ομάδων μελέτης 17.2 Κατανομή της απολιποπρωτεϊνης Α-Ι στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα Εφόσον παρατηρήθηκε ότι στις πειραματικές ομάδες η κατανομή της ολικής χοληστερόλης του πλάσματος αλλάζει, με την τάση να συσσωρεύεται στα ώριμα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα της HDL, θελήσαμε να χαρακτηρίσουμε τα κλάσματα αυτά και ως προς την πρωτεϊνική τους σύσταση. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η κατανομή των απολιποπρωτεϊνών Α-Ι, με την μέθοδο SDS-PAGE και Western Blot, όπως περιγράφεται στις παραγράφους 12.2 και Οι εικόνες που προέκυψαν ποσοτικοποιήθηκαν με το πρόγραμμα επεξεργασίας εικόνας ImageJ. Η ποσοτικοποίηση έγινε με μέτρηση της έντασης κάθε ζώνης του φιλμ αυτοραδιογραφίας. Η ανάλυση αυτή έδειξε ότι η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι συγκεντρώνεται επίσης στα ώριμα σωματίδια της HDL (κλάσματα 7-9) (Εικόνα 24 Α,Β), όπως συμβαίνει και με την ολική χοληστερόλη των κλασμάτων αυτών (Εικόνα 23). Από την ποσοτικοποίηση των ζωνών μάλιστα φάνηκε ότι η ολική apoa-i αυξάνεται σημαντικά στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα των πειραματόζωων που εκτέθηκαν στο ψύχος για 12 εβδομάδες (196,8 ± 0,1 %, p<0,01), ενώ έχει μειωθεί στο 63,0 ± 1,1 % σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, κατά την βραχύχρονη έκθεση στους 4 o C (Εικόνα 24 C). 68

69 Εικόνα 24: (A) Κατανομή της απολιποπρωτεϊνης A-Ι στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα των τριών ομάδων μελέτης. Δείγμα πλάσματος από κάθε ομάδας φυγοκεντρήθηκε σε διαβάθμιση πυκνότητας KBr. Τα κλάσματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και Western blot. (Β) Ημιποσοτική ανάλυση των επιπέδων της απολιποπρωτεϊνης A-Ι στα κλάσματα της HDL. Η κάθε τιμή εκφράζει το % της ολικής πρωτεΐνης apoa-i. (C) Επίπεδα ολικής πρωτεΐνης apoa-i ως % της ομάδας ελέγχου. 18. Ηπατική έκφραση γονιδίων Η μεταβολή στην κατανομή της ολικής χοληστερόλης στις πειραματικές ομάδες σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (Εικόνα 23) καθώς επίσης και της apoa-i (Εικόνα 24) μας ώθησε στο να ελέγξουμε τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης αυτής στο ήπαρ, μιας και αποτελεί δομικό συστατικό της HDL, και διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην βιογένεση και λειτουργία αυτής. Μετρήθηκε το mrna της apoa-i με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (RT-PCR) και παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης στην πειραματική ομάδα που εκτέθηκε στους 4 ο C για 12 εβδομάδες ήταν σημαντικά μειωμένα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (p 0.01) (Εικόνα 25). Επίσης θελήσαμε να ελέγξουμε την έκφραση του υποδοχέα SR-B1 και του μεταφορέα ABCA1, ώστε να σχηματίσουμε μια εικόνα για τα επίπεδα της αντίστροφης μεταφοράς 69

70 χοληστερόλης καθώς και την κάθαρση των λιπιδίων από το ήπαρ. Παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης και των δύο αυτών πρωτεϊνών στην πειραματική ομάδα που εκτέθηκε στους 4 ο C για 12 εβδομάδες ήταν σημαντικά μειωμένα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (p<0,001 για τον ABCA1 και p<0,01 για τον SR-B1 ) (Εικόνα 25). Fold Change in gene expression ** *** ** 28 o C 4 o C 12 weeks 0.0 ApoA-Ι ABCA1 Εικόνα 25: Έκφραση του mrna των γονιδίων ApoA-I, ABCA1 και SRB1 στα ήπατα των πειραματόζωων της ομάδας ελέγχου και της πειραματικής ομάδας μακρόχρονης έκθεσης σε περιβάλλον χαμηλής θερμοκρασίας. SR-B1 19. Λειτουργικότητα της HDL Η τάση να συσσωρεύονται στα πιο ώριμα σωματίδια της HDL,ολική χοληστερόλη και ApoA-Ι, έπειτα από έκθεση των πειραματόζωων στους 4 ο C, μας ώθησε να εξετάσουμε το κατά πόσο επηρεάζεται η λειτουργικότητα της HDL. Για να εξετάσουμε αυτή την υπόθεση, εστιάσαμε σε δύο σημαντικές δράσεις της HDL, την αντιοξειδωτική και την αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL Για τον προσδιορισμό του αντιοξειδωτικού δυναμικού της HDL, ακολουθήθηκε η μέθοδος όπως περιγράφεται στην παράγραφο Όπως φαίνεται στην Εικόνα 26 Α, οι τρεις ομάδες ξεκίνησαν στα 10 min μην έχοντας σημαντικές διαφορές ως προς τα επίπεδα φθορισμού της DHR, εκφρασμένα ως επί τοις εκατό του φθορισμού που μετρήθηκε στα κελία όπου προστέθηκε DHR χωρίς HDL (περίπου 75-90% του φθορισμού p>0,05 και για τις τρεις ομάδες). Με τη πάροδο του χρόνου όμως, μετρώντας τον φθορισμό της DHR στα κελιά που προστέθηκε HDL από κάθε μια από τις δύο πειραματικές ομάδες και της ομάδα ελέγχου παρατηρήθηκε το εξής: Στην ομάδα ελέγχου ο φθορισμός στα 60 min και στα 10min παρέμεινε στα ίδια επίπεδα σε σχέση με την οξείδωση της DHR (περίπου 85,3% στα 10min και 84,7% στα 60 min - p>0,05) γεγονός λογικό μιας και στα κελιά αυτά είχε προστεθεί HDL χοληστερόλη, η οποία παρουσιάζει 70

71 αντιοξειδωτική δράση. Συνεπώς απετράπη η περαιτέρω οξείδωση της DHR και ο φθορισμός δεν αυξήθηκε. Στις δύο πειραματικές ομάδες όμως φάνηκε ότι ο φθορισμός ήταν σημαντικά μειωμένος στα 60min σε σχέση με τα 10 min. Συγκεκριμένα στην ομάδα που εκτέθηκε στο πειραματικό περιβάλλον για 2 εβδομάδες ο φθορισμός στα 10 min ήταν 90% ενώ στα 60min ήταν 74,3% του φθορισμού της DHR χωρίς HDL (p<0,05). Στην ομάδα που εκτέθηκε στου 4 o C για 12 εβδομάδες ο φθορισμός στα 10min ήταν 74,7% και στα 60min ήταν 70,6% (p<0,01). Σε σχέση με την ομάδα ελέγχουν, η πειραματική ομάδα της βραχύχρονης έκθεσης δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές στα 60min (p>0,05), αντίθετα με την ομάδα της μακρόχρονης έκθεσης (p<0,05). Τέλος σημαντικές διαφορές στα 60 min δεν φάνηκαν ούτε μεταξύ των δύο πειραματικών ομάδων Εκροή χοληστερόλης (Cholesterol Efflux) Θελήσαμε επίσης να εκτιμήσουμε την ικανότητα της HDL να πραγματοποιεί αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, σε συνδυασμό με την παρατήρηση της μειωμένης έκφρασης του μεταφορέα λιπιδίων ABCA1 (Εικόνα 25). Ακολουθήθηκε η μέθοδος όπως περιγράφεται στην παράγραφο Φάνηκε ότι και στις τρεις ομάδες της μελέτης συμβαίνει εκροή χοληστερόλης από τα κύτταρα (Εικόνα 26 Β). Με την πάροδο του χρόνου η ραδιενεργή χοληστερόλη που μετρήθηκε στο θρεπτικό μέσο, αυξήθηκε στα κελία που προστέθηκε πλάσμα των ομάδων. Γεγονός που δείχνει ότι η HDL στο πλάσμα των ομάδων που εκτέθηκαν στο ψύχος, διατηρεί αμιγή την ικανότητά της να επιτελεί εκροή χοληστερόλης από τα κύτταρα. Εικόνα 26: (Α) Αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL στην ομάδα ελέγχου και στις πειραματικές ομάδες που εκτέθηκαν στους 4 ο C για 12 ή 2 εβδομάδες. Μέτρηση της οξείδωσης της DHR αφότου προστέθηκε στα δείγματα των ομάδων (5μg χοληστερόλης/ανά δείγμα) στα 10 και 60 min και εκφρασμένη σε % της οξείδωσης της DHR χωρίς την προσθήκη HDL χοληστερόλης. (Β) Εκτίμηση της ικανότητα ς της HDL να πραγματοποιεί αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης. Ακολουθήθηκε η μέθοδος όπως περιγράφεται στην παράγραφο (Παράγραφος 12.4). 71