ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Μ.Π.Σ. ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ. Διδακτορική Διατριβή

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Μ.Π.Σ. ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ Διδακτορική Διατριβή Μελέτη των πλειοτροπικών δράσεων της απολιποπρωτεΐνης C3 με στόχο την ανάδειξη καινοτόμων φαρμακολογικών παρεμβάσεων που στοχεύουν στη λειτουργικότητα της HDL Βιολόγος, MSc Πάτρα 2017

2 Επιβλέπων Καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Τα μέλη της εξεταστικής επιτροπής: Βασιλική Γκρέκα-Σπηλιώτη Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Γεώργιος Σκρουμπής Επίκουρος Καθηγητής, Χειρουργική Κλινική, Τμήμα Ιατρικής, Σχολη Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Γεώργιος Σπυρούλιας Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Σχολη Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Αλέξανδρος Τσελέπης Καθηγητής, Τμήμα Χημείας, Σχολή Θετικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Ιωννίνων Νικόλαος Τσοπάνογλου Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Γεώργιος Παναγιωτακόπουλος Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Πατρών

3 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού \ Στις αδερφές μου Κατερίνα και Ειρήνη 3

4 Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών κατά την περίοδο στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Πρόκειται για τη μελέτη των πλειοτροπικών δράσεων της απολιποπρωτεΐνης C3 με στόχο την ανάδειξη καινοτόμων φαρμακολογικών παρεμβάσεων που στοχεύουν στη λειτουργικότητα της HDL Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου, κ. Κυριάκο Κυπραίο για την ευκαιρία που μου έδωσε να συνεχίσουμε την άψογη συνεργασία που ξεκινήσαμε κατά την διάρκεια των μεταπτυχιακών σπουδών μου και να εκπονήσω τη διδακτορική μου διατριβή στο εργαστήριό του. Τον ευχαριστώ για την καθοδήγηση, τις παρατηρήσεις και τις συμβουλές του κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, αλλά και για την εμψύχωση και την προτροπή να συνεχίσω να προσπαθώ όταν η απογοήτευση και η κούραση υπερτερούσαν του ενθουσιασμού και της «δίψας» για διερεύνηση νέων ιδεών. Ήταν εκεί όταν τον χρειαζόμουν και τον ευχαριστώ που όταν ήρθε η ώρα μου έδειξε το τέλος αυτής της διαδρομής και μου είπε να μην κοιτάξω πίσω και να εστιάσω μόνο στη γραμμή του τερματισμού. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω την καθηγήτρια κ. Βασιλική Γκρέκα-Σπηλιώτη, τον επίκουρο καθηγητή κ. Γεώργιο Σκρουμπή, τον καθηγητή κ. Γεώργιο Σπυρούλια, τον καθηγητή κ. Αλέξανδρο Τσελέπη, τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Νικόλαο Τσοπάνογλου και τον επίκουρο καθηγητή κ. Γεώργιο Παναγιωτακόπουλο που μου έκαναν την τιμή να συμμετάσχουν ως μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, αλλά και για τις πολύτιμες συμβουλές και διορθώσεις του παρόντος κειμένου. Ακόμη θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Dr. Anatol Kontush και τη Marie Lhomme του ICAN Analytics Facility (Lipidomics Core Lab) του ICAN (Institute of Cardiometabolism And Nutrition, Paris, France) για την πολύτιμη συνεισφορά τους στα πειράματα της λιπιδομικής, την διδακτορική φοιτήτρια του εργαστηρίου του κ. Γεώργιου Σπυρούλια, του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, Στέλλα Χασάπη για την μεταβολομική ανάλυση και τις πολύτιμες υποδείξεις και συμβουλές της ώστε να καταφέρω να κατανοήσω την χαοτική πληροφορία των δεδομένων της ανάλυσης, καθώς και τον Κωνσταντίνο Τέλλη, του τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, συνεργάτη του κ. Αλέξανδρου Τσελέπη, για την διεξαγωγή του πειράματος προσδιορισμού της ενζυμικής δραστικότηατα της Lp-pla2 και για την άψογη συνεργασία. Πολλοί ήταν εκείνοι που βοήθησαν στην πραγματοποίηση της παρούσας μελέτης είτε παρέχοντας την επιστημονική τους γνώση, είτε συμβάλλοντας στη δημιουργία ενός υπέροχου κλίματος εργασίας. Δεν θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω τα παιδιά της ομάδας του εργαστηρίου της

5 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Φαρμακολογίας, την Χριστίνα Καλογεροπούλου, την Κατερίνα Χατζίρη, την Έρη Πετροπούλου, που πια δεν είναι μέλος του εργαστηρίου αλλά ήταν παρούσα στα πρώτα μου βήματα, την Κατερίνα Κωνσταντίνου, την Ελένη Καραβία και κυρίως την Έφη Φίλου, που μου προσέφερε απλόχερα τη βοήθειά της σε μία πολύ κρίσιμη στιγμή της ανάπτυξης του αδενοϊού επαναφέροντας κυριολεκτικά στη ζωή τα κύτταρα. Αναγνωρίζω ότι χωρίς τη βοήθειά της η παρούσα μελέτη ενδεχομένως να μην είχε ολοκληρωθεί ακόμη. Ιδιαιτέρως θα ήθελα να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Ευα Ξεπαπαδάκη για την πρακτική της βοήθεια σε όλες τις θυσίες των πειραματόζωων αλλά και για τις ατέλειωτες ώρες συζήτησης των αποτελεσμάτων και των πειραμάτων. Η Εύα Ξεπαπαδάκη και η Χριστίνα Καλογεροπούλου δεν μπορούν να χαρακτηριστούν μόνο ως συνεργάτες. Η φιλία και η στήριξή τους, άλλοτε ψυχολογική και άλλοτε πρακτική ήταν απαραίτητες για την ολοκλήρωση της μελέτης που παρουσιάζεται στο παρόν σύγγραμμα. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στη φίλη και συγκάτοικό μου Σπυριδούλα Γιάκη για την στήριξη, την αμέριστη συμπαράσταση και την υπομονή της ιδιαίτερα κατά τους τελευταίους αυτούς μήνες, που η δική μου υπομονή έτεινε να εξαντληθεί. Την προσπάθειά μου αυτή την αφιερώνω στην οικογένειά μου και τους ευχαριστώ πάρα πολύ που πιστεύουν σε εμένα και με στηρίζουν με κάθε τρόπο και χωρίς δεύτερη σκέψη σε οποιοδήποτε βήμα αποφασίζω να κάνω. Είναι πάντα δίπλα μου και γι αυτό τους είμαι ευγνώμων. 5

6 Περίληψη Η απολιποπρωτεΐνη C3 (APOC3) συντίθεται στο ήπαρ και το έντερο και έχει μέγεθος 8,8 kda. Κατανέμεται κυρίως στις λιποπρωτεϊνες που χαρακτηρίζονται από υψηλή περιεκτικότητά σε απολιποπρωτεϊνη Β (APOΒ-λιποπρωτεΐνες), όπως τα χυλομικρά, η VLDL, η IDL και η LDL και περίπου το ήμισυ της APOC3 του πλάσματος σχετίζεται με την HDL. Αν και για χρόνια επικρατούσε η άποψη ότι η APOC3 σχετίζεται με την HDL λόγω απλής σύνδεσης με προϋπάρχοντα σωματίδια, πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η βιογένεση της HDL που περιέχει APOC3 (APOC3-HDL) απαιτεί τη μεσολάβηση του μεταφορέα Abca1. Επιπλέον, η APOC3-HDL συμβάλλει στην ομοιόσταση των τριγλυκεριδίων του πλάσματος, εμποδίζοντας την σύνδεση της APOC3 με τις πλούσιες σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεΐνες. Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι η APOC3-HDL παρουσιάζει επίσης θετική συσχέτιση με τον παθολογικά παχύσαρκο φαινότυπο. Σε μια κλινική μελέτη, που περιλάμβανε ασθενείς με νοσογόνο παχυσαρκία (ΒΜΙ>50), παρατηρήσαμε σημαντικά επίπεδα HDL σωματιδίων πλούσιων σε APOC3 στο πλάσμα των ασθενών αμέσως πριν από τη βαριατρική χειρουργική επέμβαση, ενώ έξι μήνες μετά τα σωματίδια της HDL αποτελούνταν κυρίως από ΑΡΟΑΙ, ενώ η APOC3 ήταν ελάχιστη. Οι μεταβολές του απολιποπρωτεϊνικού περιεχομένου της HDL συσχετίστηκαν με μεταβολές στην ενζυμική δραστικότητα της LCAT και της πρωτεΐνης μεταφοράς χοληστερόλης (CETP), καθώς και στην αντιοξειδωτική ικανότητα της HDL. Οι μέχρι τώρα μελέτες έχουν εστιάσει στον μοναδικό, ευρύτερα αποδεκτό, λειτουργικό ρόλο της APOC3 που αφορά στην αθηροσκλήρωση και πιο συγκεκριμένα στη ρύθμιση των επιπέδων των τριγλυκεριδίων του πλάσματος μέσω της αναστολής της δραστικότητας της Lpl και του καταβολισμού των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών. Με βάση αυτή τη λειτουργία, ολιγονουκλεοτίδια με αντινοηματική ακολουθία (ASO) που στοχεύουν στη αποσιώπηση της έκφραση της APOC3 βρίσκονται σήμερα σε κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία της υπερτριγλυκεριδαιμίας (HTG) και των σχετικών με αυτήν παθολογιών. Ωστόσο, ο ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστηριότητα του λιπώδους ιστού παραμένει άγνωστος. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη ερευνήσαμε τα άμεσα αποτελέσματα της έκφρασης της APOC3 στη δομή και τη λειτουργικόητα της HDL, καθώς και στη μεταβολική δραστηριότητα του λευκού (WAT) και του φαιού λιπώδους ιστού (BAT). Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν C57BL/6 ποντίκια, στα οποία χορηγήθηκε ανασυνδυασμένος αδενοϊός που εκφράζει την ανθρώπινη APOC3 (AdGFP-APOC3) ή αδενοϊός ελέγχου AdGFP και συλλέχθηκαν δείγματα αίματος και ιστού πέντε ημέρες μετά τη χορήγηση. Στη συνέχεια απομονώθηκε η HDL και αναλύθηκε για το απολιποπρωτεϊνικό και το λιπιδικό της περιεχόμενο, καθώς και για τη δομή και τη λειτουργικότητα των σωματιδίων της. Επιπλέον, έγινε

7 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού μεταβολομική ανάλυση του ορού με NMR και ανάλυση των επιπέδων των πρωτεϊνών Ucp1, Cytc και Cox4 στα μιτοχονδριακά κλάσματα που απομονώθηκαν από τους ιστούς ΒΑΤ και WAT, ως έμμεσοι δείκτες της μεταβολικής δραστηριότητάς τους. Συνδυασμένα, τα δεδομένα δείχνουν ότι η APOC3 μεταβάλλει το απολιποπρωτεϊνικό περιεχόμενο της HDL, το οποίο με τη σειρά του ρυθμίζει το λιπιδικό με αποτέλεσμα να προκαλούνται σημαντικές αλλαγές στη δομή και τη λειτουργικότητα της HDL. Εκτός όμως από την επίδραση της αυξημένης έκφρασης της APOC3 στην HDL, η απολιποπρωτεΐνη αυτή φάνηκε να παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του ενεργειακού μεταβολισμού, ενεργοποιώντας τη μεταβολική δραστηριότητα των μιτοχονδρίων του BAT. 7

8 Study of the pleiotropic effects of apolipoprotein C3 in order to highlight innovative pharmacological interventions aiming at the functionality of HDL Evangelia V. Zvintzou Abstract Apolipoprotein C3 (APOC3) is mainly synthesized in the liver and intestine and its size is 8.8 kda. It is predominantly distributed to lipoproteins characterized by high levels of apolipoprotein B (APOB-lipoproteins), such as chylomicrons, VLDL, IDL and LDL and approximately half of plasma APOC3 associates with HDL. Although there was a predominant view that APOC3 associates with HDL by simple binding to pre-existing particles, recent data support that biogenesis of APOC3- containing HDL (APOC3-HDL) requires Abca1. Moreover, APOC3-HDL contributes to plasma triglyceride homeostasis, by preventing APOC3 association with triglyceride-rich lipoproteins. Interestingly, APOC3-HDL also shows positive correlation with the morbidly obese phenotype. However, the roles of APOC3 in HDL functionality and adipose tissue metabolic activity remain unknown. In a clinical trial of morbidly obese subjects, we observed significant levels of APOC3-HDL particles in plasma immediately prior bariatric surgery, while six months after operation all HDL was mainly APOA1-HDL with only trace amounts of APOC3-HDL being present. This change in apolipoprotein content of HDL was associated with alterations in the antioxidant properties of HDL and plasma enzymatic activities of lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) and cholesterylester transfer protein (CETP). These clinical observations supported the interesting hypothesis that changes in APOC3 content of HDL associate with alterations in HDL particle functionality and overall body energy metabolism. To this date most of the studies have focused on the unique, broadly accepted, functional role of APOC3 in atherosclerosis, and more specifically in regulating plasma triglyceride levels by inhibiting Lpl activity and catabolism of triglyceride-rich lipoproteins. Based on this function, Apoc3 antisense oligonucelotides are currently in clinical trials for the treatment of hypertriglyceridemia. However, the roles of APOC3 in the function of HDL and metabolic activity of the adipose tissue remain unknown. Therefore, in the present study we investigated the direct effects of APOC3 expression on the structure and function of HDL, as well as on the metabolic activity of white (WAT) and brown adipose tissue (BAT). For this purpose C57BL/6 mice were infected with an adenovirus expressing human APOC3 or a control adenovirus AdGFP and five days post-infection blood and tissue samples were collected.

9 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού HDL was then isolated and analyzed for its apolipoprotein and lipid content as well as for the structure and functionality of its particles. In addition, serum metabolomic analysis was performed by NMR and purified mitochondria from BAT and WAT were analyzed for Ucp1, Cytc and Cox4 protein levels as an indirect measure of their metabolic activity. Combined, our data show that APOC3 alters the apolipoprotein content of HDL, which in turn modulates its lipidome, resulting in significant changes in the structure and functionality of HDL. Apart from the effect of APOC3 on HDL, this apolipoprotein has a major effect on energy metabolism by activating the metabolic activity selectively in BAT. 9

10 Περιεχόμενα Πρόλογος... 4 Περίληψη... 6 Abstract... 8 Ευρετήριο συντμήσεων Εισαγωγή Λιποπρωτεΐνες Χυλομικρά Λιποπρωτεΐνη πολύ χαμηλής πυκνότητας Λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας Λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) Λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας Ένζυμα Λεκιθινοχοληστερολική ακυλοτρανσφεράση Σχετιζόμενη με λιποπρωτεΐνες φωσφολιπάση Α Λιπίδια Φωσφολιπίδια Σφιγγολιπίδια Στερόλες Εστέρες χοληστερόλης Τριγλυκερίδια Απολιποπρωτεϊνες Απολιποπρωτεΐνη Α Απολιποπρωτεΐνη Α Απολιποπρωτεΐνη Ε Απολιποπρωτεΐνη C Απολιποπρωτεΐνη C Απολιποπρωτεΐνη C Παχυσαρκία Λιπώδης ιστός... 35

11 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Σκοπός Μέθοδοι Χειρισμός πειραματόζωων Πειραματόζωα Λήψη αίματος από την ουραία φλέβα Ενδοφλέβια χορήγηση οδενοϊού Ευθανασία και απομόνωση ιστών, πλάσματος και ορού Κυτταροκαλλιέργειες Καλλιέργεια τριπλών φλασκών Κατασκευή ανασυνδυασμένου αδενοϊού που εκφράζει την ανθρώπινη απολιποπρω-τεΐνη C Κατασκευή του ανασυνδυασμένου φορέα έκφρασης padtrackcmv-c3g που φέρει το ανθρώπινο APOC3 γονίδιο Ανασυνδυασμός του του padtrackcmv-c3g με το padeasy-1 σε BJ5183 βακτηριακά κύτταρα Αποµόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας µε τη μέθοδο της αλκαλικής λύσης (Mini Prep) Μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων DH5a με τη μέθοδο του θερμικού σοκ Επιλογή βακτηριακής αποικίας που περιέχει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Αποµόνωση πλασμιδιακού DNA μεγάλης κλίμακας µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης (Maxi Prep) Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA με φυγοκέντρηση ισορροπίας σε βαθμίδωση CsCl - βρωμιούχου αιθιδίου Παροδική διαμόλυνση ευκαρυωτικών HEK293 κυττάρων με λιποδιαμόλυνση (Lipofection) Μόλυνση τριπλών φλασκών και συλλογή των κυττάρων Απομόνωση και καθαρισμός αδενοϊού Τιτλοδότηση αδενοϊού με καταμέτρηση πλακών Βιοχημικές αναλύσεις Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών πλάσματος και ορού με υπερφυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας KBr

12 3.2 Διαπίδυση λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης Προσδιορισμός επιπέδων ελεύθερης χοληστερόλης Προσδιορισμός επιπέδων φωσφολιπιδίων Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων Προσδιορισμός επιπέδων γλυκόζης Προσδιορισμός επιπέδων ολικής πρωτεΐνης (Lowry) Μέτρηση ενζυμικής δραστικότητας στο πλάσμα του αίματος Προσδιορισμός του αντιοξειδωτικού δυναμικού της HDL Μοριακές αναλύσεις Απομόνωση ολικού RNA από ήπαρ Απομόνωση μιτοχονδρίων από λευκό και φαιό λιπώδη ιστό Ανάλυση απολιποπρωτεϊνών με αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και ανοσοαποτύπωση Western (Western Blot) Ανάλυση των σωματιδίων της HDL με τη μέθοδο TEM (Transmission Electron Microscopy) Ανάλυση των σωματιδίων της HDL με μη-αποδιατακτική δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real Time PCR) Λιπιδομική ανάλυση των σωματιδίων της HDL με τη μέθοδο HILIC LC/MS/MS Μεταβολομική ανάλυση του ορού του αίματος με τη μέθοδο NMR Προσδιορισμός της ικανότητας αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης της HDL Προσδιορισμός της δράσης της HDL στη φλεγμονώδη απόκριση Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Επιβεβαίωση της έκφρασης της ανθρώπινης απολιποπρωτεΐνης C3 στο πλάσμα των C57BL/6 ποντικιών μετά από ενδοφλέβια χορήγηση του αδενοϊού AdGFP-APOC Απολιποπρωτεϊνική και λιπιδική σύσταση της HDL Ανάλυση των λιπιδίων του πλάσματος και των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων της HDL Η APOC3 προκαλεί μεταβολές στην απολιποπρωτεϊνική σύσταση της HDL APOC3 προκαλεί μεταβολές στο λιπιδίωμα της HDL... 84

13 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού 2.4 Οι μεταβολές στο λιπιδίωμα της HDL σχετίζονται με μεταβολές στην ενζυμική δραστικότητα του πλάσματος Επίδραση της αυξημένης έκφρασης της APOC3 στη δομή των σωματιδίων της HDL Ανάλυση των σωματιδίων της HDL με ηλεκτρονική μικροσκοπία και μη αποδιατακτική δυσδιάστατη ηλεκτροφόρηση Η αυξημένη έκφραση της APOC3 επηρεάζει τη λειτουργικότητα της HDL Αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL Ικανότητα αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης της HDL Επίδραση της HDL στη φλεγμονή Η APOC3 προκαλεί μεταβολές στον ενεργειακό μεταβολισμό Ανάλυση των μεταβολιτών του ορού του αίματος Προσδιορισμός της μιτοχονδριακής λειτουργίας στον φαιό και στον λευκό λιπώδη ιστό 94 Συζήτηση Βιβλιογραφικές αναφορές Brief biographical note Publications

14 Ευρετήριο συντμήσεων Abca1 mouse ATP-binding cassette transporter member 1 Abcg1 mouse ATP-binding cassette sub-family G member 1 Ad adenovirus GFP green fluorescence protein AdGFP recombinant attenuated control adenovirus expressing the green fluorescent protein AdGFP-APOC3 recombinant attenuated adenovirus expressing the human APOC3 protein and the GFP under the independent control of two separate CMV promoters Apoa1 mouse apolipoprotein AI Apoa2 mouse apolipoprotein AII Apoc1 mouse apolipoprotein CI Apoc2 mouse apolipoprotein CII Apoc3 mouse apolipoprotein CIII APOC3 human apolipoprotein CIII Apoe mouse apolipoprotein E BAT brown adipose tissue CAD coronary artery disease Cer d18:0 Ceramide d18:0 Cer d18:1 Ceramide d18:1 Cer d18:2 Ceramide d18:2 CETP human cholesteryl ester transfer protein CHD coronary heart disease Cox4 mouse cytochrome c oxidase subunit 4 Cytc mouse cytochrome c El mouse endothelial lipase HDL high density lipoprotein HDL-C high density lipoprotein cholesterol IDL intermediate density lipoprotein Hl mouse hepatic lipase Lcat mouse lecithin cholesterol acyltransferase

15 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού LDL LPC Lpl low density lipoprotein Lysophosphatidylcholine mouse Lipoprotein Lipase Lp-pla2 Lipoprotein-associated phospholipase A2 LPS Lipopolysaccharide NMR Nuclear magnetic resonance PA Phosphatidic acid PAF Platelet activating factor PC Phosphatidylcholine PE Phosphatidylethanolamine pfu plaque-forming unit PG Phosphatidylglycerol PI Phosphatidylinositol Pltp Phospholipid transfer protein PS Phosphatidylserine SM Sphingomyelin Srb1 Scavenger receptor class B type I SREBP sterol response element binding protein TG triglycerides TNFa Tumor Necrosis Factor alpha UCF density gradient ultracentrifugation Ucp1 mouse uncoupling protein 1 VLDL very low density lipoprotein WAT white adipose tissue 15

16 Εισαγωγή

17 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού 1 Λιποπρωτεΐνες Η μεταφορά ελεύθερης χοληστερόλης (FC), εστέρων χοληστερόλης (CE), τριγλυκεριδίων (TG), φωσφολιπιδίων (PL) και άλλων λιπιδίων στην κυκλοφορία γίνεται μέσω ειδικών υδατοδιαλυτών συμπλεγμάτων, που ονομάζονται λιποπρωτεΐνες. Οι λιποπρωτεΐνες του πλάσματος απαντώνται είτε σε σφαιρική είτε σε δισκοειδή μορφή. Τα σφαιρικά σωματίδια αποτελούνται από έναν πυρήνα που περιέχει εστέρες χοληστερόλης και τριγλυκερίδια και ένα εξωτερικό περίβλημα που σχηματίζεται από ελεύθερη χοληστερόλη, φωσφολιπίδια και πρωτεΐνες, τις απολιποπρωτεΐνες. Τα δισκοειδή σωματίδια είναι διαμορφωμένα σε δύο στρώσεις και αποτελούνται κυρίως από πολικά λιπίδια και πρωτεΐνες (4). Οι λιποπρωτεΐνες του πλάσματος έχουν παραδοσιακά ταξινομηθεί σε πέντε κύριες κατηγορίες ανάλογα με την πυκνότητά τους, τα χυλομικρά (CM), τις λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL), τις λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL), τις λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) και τις υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) (2). 1.1 Χυλομικρά Τα χυλομικρά (CM) είναι μακρομοριακά σύμπλοκα με πυκνότητα μικρότερη από 0,95 g/ml, με σύσταση κατά 98-99% λιπιδιακή (κυρίως τριγλυκερίδια και μικρή ποσότητα χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων) και κατά 1-2% πρωτεϊνική. Η κύρια απολιποπρωτεΐνη των CM είναι η Apob-100 που σχηματίζει ένα σφαιρικό κέλυφος, η εξωτερική επιφάνεια του οποίου είναι υδρόφιλη. Άλλες απολιποπρωτεΐνες που απαντώνται στα CM είναι η Αpοe, η Αpοa4 και Αpoc2. Τα CM συντίθενται στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα και εκκρίνονται στην λεμφική κυκλοφορία, μεταφέροντας τα διατροφικά λιπίδια από το έντερο στην συστηματική κυκλοφορία και τους περιφερειακούς ιστούς. Στην κυκλοφορία, ο καταβολισμός τους γίνεται από την λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL) η οποία προσδένεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων. Περαιτέρω καταβολισμός των CM γίνεται από την ηπατική λιπάση (Hl) και τα παραγόμενα κατάλοιπα δεσμεύονται από την Apoe και απομακρύνονται από την κυκλοφορία μέσω του υποδοχέα LDL (2). 1.2 Λιποπρωτεΐνη πολύ χαμηλής πυκνότητας Η λιποπρωτεΐνη πολύ χαμηλής πυκνότητας (VLDL) χαρακτηρίζεται από μεγάλα σωματίδια με πυκνότητα μεταξύ 0,95-1,006 g/ml και σύσταση κατά 85-90% λιπιδιακή και κατά 10-15% πρωτεϊνική. Τα βασικότερα λιπίδια που εντοπίζονται στην VLDL είναι τα τριγλυκερίδια, τα φωσφολιπίδια και η χοληστερόλη (ελεύθερη και εστεροποιημένη), με τα πρώτα να αποτελούν το μεγαλυτερο τμήμα (45-17

18 65%) του λιπιδιακού περιεχομένου της VLDL. Οι κύριες απολιποπρωτεΐνες της VLDL είναι η Apob, η Apoe, η Apoc1, η Apoc2 και η Apoc3. Η VLDL συντίθεται στο ήπαρ και εκκρίνεται για να βοηθήσει στην κατανομή των λιπιδίων στους περιφερειακούς ιστούς. Επομένως, η σύνθεση και η έκκρισή της εξαρτώνται από τις ανάγκες των περιφερικών ιστών για λιπίδια (2). 1.3 Λιποπρωτεΐνες ενδιάμεσης πυκνότητας Η λιποπρωτεΐνη ενδιάμεσης πυκνότητας (IDL) είναι προϊόν του καταβολισμού της VLDL και είναι πρόδρομη της λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας. Η πυκνότητά της κυμαίνεται μεταξύ 1,006-1,019 g/ml, μία αύξηση που οφείλεται στην υδρόλυση των τριγλυκεριδίων της VLDL, από την LpL και συνεπώς της αύξησης της συγκέντρωσης των εστέρων χοληστερόλης στα σωματίδιά της. Κύριος ρόλος της IDL είναι είτε η μεταφορά λιπιδίων στο ήπαρ και σε άλλους περιφερειακούς ιστούς, είτε η μετατροπή της σε λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας με περαιτέρω υδρόλυση τριγλυκεριδίων από την LpL (2). 1.4 Λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) Η λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας (LDL) είναι προϊόν του καταβολισμού της IDL και είναι ο κύριος φορέας χοληστερόλης στο αίμα. Η πυκνότητα της κυμαίνεται από 1,019-1,063 g/ml, και η σύστασή της είναι κατά 75% λιπιδιακή (κυρίως εστεροποιημένη χοληστερόλη και τριγλυκερίδια) και κατά 25% πρωτεϊνική. Οι βασικές απολιποπρωτεΐνες που απαντώνται στα σωμάτια της LDL είναι η Apob-100 και η Apoe και σε μικρότερο βαθμό, οι Apoc1, Apoc2 και Apoc3. Ο κύριος ρόλος της LDL είναι η μεταφορά της χοληστερόλης από το ήπαρ στα κύτταρα των περιφερικών ιστών για την εξυπηρέτηση των βιοσυνθετικών αναγκών τους καθώς και η σύνθεση των στεροειδών ορμονών (2). 1.5 Λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας Η λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας (HDL) είναι πλούσια σε απολιποπρωτεΐνες και τα σωματίδιά της έχουν μέσο μέγεθος 8-10 nm και πυκνότητα 1,063-1,21 g/ml (5). Η σύστασή της είναι κατά 45-55% λιπιδιακή και κατά 45-55% πρωτεϊνική. Τα βασικά λιπίδια της HDL είναι τα φωσφολιπίδια, η εστεροποιημένη χοληστερόλη, η ελεύθερη χοληστερόλη και τα τριγλυκερίδια, με τα πρώτα να αποτελούν το μεγαλύτερο τμήμα (26-32%) του λιπιδιακού περιεχομένου της. Ανάλογα με την περιεκτικότητά τους σε λιπίδια, τα HDL σωματίδια είναι σφαιρικά ή δισκοειδή.

19 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Η βασική απολιποπρωτεΐνη της HDL είναι η Apoa1, η οποία είναι απαραίτητη για την βιοσύνθεσή της και αποτελεί περίπου το 70% του πρωτεϊνικού περιεχομένου της. Σε μικρότερο βαθμό η HDL απαρτίζεται από τις Apoa2, Apoe, Apoc3 και Apoc1 (6;7). Κύριος ρόλος της HDL είναι η μεταφορά της χοληστερόλης από τους περιφερικούς ιστούς στο ήπαρ, μια διαδικασία που είναι γνωστή ως αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης. Το διαφορετικό λιπιδιακό και πρωτεϊνικό περιεχόμενο προσδίδει μεγάλη Εικόνα 1. Δομή και σύσταση του σφαιρικού HDL σωματιδίου (1). ετερογένεια στα σωματίδια της HDL, μεταβάλλοντας τις δομικές, χημικές και βιολογικές τους ιδιότητες (2) Ταξινόμηση των HDL σωματιδίων Η HDL μπορεί να χαρακτηριστεί ως μίγμα λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων, τα οποία εμφανίζουν μεγάλη ετερογένεια που οφείλεται σε διαφορές στο σχήμα, στην πυκνότητα και στο μέγεθός τους. Η βασική ταξινόμηση των HDL σωματιδίων γίνεται με βάση το σχήμα τους και επομένως με τον βαθμό ωρίμανσής τους, σε δισκοειδή και σφαιρικά. H ταξινόμηση των HDL σωματιδίων με βάση την πυκνότητα γίνεται σε δύο κατηγορίες: - HDL2, με πυκνότητα 1,063 έως 1,120 g/ml - HDL3, με πυκνότητα 1,120 έως 1,210 g/ml, Η πυκνότητα (περιεκτικότητα σε τριγλυκερίδια και εστέρες χοληστερόλης) των HDL σωματιδίων έχει αντίστροφη συσχέτιση με το μέγεθός τους. Εικόνα 2. Τα ετερογενή σωματίδια της HDL. Έτσι με βάση το μέγεθος και το φορτίο τα HDL σωματίδια ταξινομούνται σε: - pre-β (pre-β1, pre-β2 και pre-β3) - α (α1, α2 και α3) - pre-α (pre-α1, pre-α2 και pre-α3), που εμφανίζουν αυξανόμενη κινητικότητα και μικρότερο μέγεθος αντίστοιχα (8). 19

20 1.5.2 Το μεταβολικό μονοπάτι της HDL Βιοσύνθεση Η βιοσύνθεση της HDL είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει πολλές μεμβρανικές πρωτεΐνες και πρωτεΐνες του πλάσματος (9). Λόγω της εξαιρετικά δυναμικής φύσης της, η Apoa1 εμπλέκεται στις κύριες οδούς του μεταβολισμού της HDL. Η Apoa1 συντίθεται κυρίως από το ήπαρ και, σε μικρότερο βαθμό, από το λεπτό έντερο και εκκρίνεται ως συστατικό των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών (TRL). Στην κυκλοφορία, η πρωτεΐνη μεταφοράς φωσφολιπιδίων (Pltp) προωθεί τη μεταφορά επιφανειακών συστατικών (φωσφολιπιδίων, ελεύθερης χοληστερόλης και απολιποπρωτεϊνών) από τις TRL στην HDL. Ο ρυθμιστικός ρόλος της Pltp επιτυγχάνεται μέσω δύο κύριων λειτουργιών, της μεταφοράς φωσφολιπιδίων και της ικανότητας να ρυθμίζει το μέγεθος και τη σύνθεση της HDL. Τα ηπατοκύτταρα μπορούν να εκκρίνουν Apoa1 σε μη-λιπιδιωμένη μορφή. Η μηλιπιδιωμένη Apoa1 προσλαμβάνει φωσφολιπίδια και χοληστερόλη μέσω της αλληλεπίδρασης με τον μεταφορέα Abca1, για να σχηματίσει τα preβ HDL σωματίδια. Εικόνα 3. Το μεταβολικό μονοπάτι της HDL. Μόλις τα σωματίδια αυτά σχηματιστούν, εισέρχονται στην κυκλοφορία και αποτελούν το κατάλληλο υπόστρωμα για την δράση της λεκιθινο-χοληστερολικής ακυλοτρανσφεράσης (Lcat), η οποία μετατρέπει τη φωσφατιδυλοχολίνη (λεκιθίνη) και τη χοληστερόλη σε λυσοφωσφατιδυλοχολίνη (λυσολεκιθίνη) και εστέρες χοληστερόλης αντίστοιχα με δράση που εξαρτάται από την Apoa1. Οι

21 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού εστέρες χοληστερόλης που παράγονται από την Lcat είναι περισσότερο υδρόφοβοι από την ελεύθερη χοληστερόλη και έτσι μεταναστεύουν στον πυρήνα της λιποπρωτεΐνης με αποτέλεσμα τη μετατροπή των δισκοειδών preβ HDL σε ώριμα, σφαιρικά, α HDL σωματίδια τα οποία διακρίνονται σε HDL2 και HDL3. Τα HDL3 σωματίδια συγκεντρώνουν την περίσσεια εστεροποιημένης χοληστερόλης και μεταπίπτουν σε HDL2 που έχουν μεγαλύτερο μέγεθος. Έτσι η Lcat έχει κεντρικό ρόλο στον μεταβολισμό της HDL και στη ρύθμιση των επιπέδων της στο πλάσμα. Η εστεροποίηση της χοληστερόλης στο πλάσμα από την Lcat είναι επίσης απαραίτητη για τον καταβολισμό της στο ήπαρ, μέσω του υποδοχέα Srb1, ώστε τα α HDL σωματίδια να επιστρέψουν στην κυκλοφορία προκειμένου να συλλέξουν περισσότερα λιπίδια από τους περιφερικούς ιστούς. Τα ώριμα, μεγάλα α HDL σωματίδια μπορούν να μετατραπούν ξανά σε preβ HDL μέσω της δράσης της Pltp και της ενδοθηλιακής (El) και ηπατικής λιπάσης (Hl), που υδρολύουν τα τριγλυκερίδια και τα φωσφολιπίδια της HDL. Ο χρόνος ημιζωής των preβ HDL του πλάσματος είναι σύντομος, καθώς γίνεται ταχεία απομάκρυνσή τους μέσω των νεφρών, ενώ τα ώριμα α HDL σωμάτια παραμένουν περισσότερο στην κυκλοφορία μεταφέροντας τα λιπίδια για καταβολισμό στο ήπαρ (2) Καταβολισμός Οι κύριες οδοί καταβολισμού των πρωτεϊνικών συστατικών της HDL είναι το ήπαρ και οι νεφροί. Οι νεφροί φιλτράρουν τις μη-λιπιδιωμένες απολιποπρωτεΐνες, οι οποίες μπορούν να επαναρροφηθούν μέσω των υποδοχέων κουμπουλίνης στα εγγύς σωληνάρια των νεφρών. Όταν η επαναρρόφηση είναι μειωμένη, οι υδρόφιλες απολιποπρωτεΐνες μπορούν να εκκριθούν στα ούρα. Ο σπειραματικός διηθητικός φραγμός αποτρέπει την πρόσβαση των ώριμων HDL σωματιδίων στα εγγύς σωληνάρια. Στο ήπαρ τα HDL σωματίδια πακετάρονται σε ενδοσωμικά διαμερίσματα και μπορούν να μεταφερθούν μέσα σε λυσοσώματα ώστε να αποικοδομηθούν εξ ολοκλήρου, ενώ μια μικρή ποσότητα μπορεί να εκκριθεί εκ νέου στην κυκλοφορία (2) Ιδιότητες της HDL Μέχρι πρόσφατα τα επίπεδα της HDL χοληστερόλης (HDL-C) στο πλάσμα ήταν ο βασικός δείκτης κινδύνου εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων. Καθώς οι μελέτες πάνω στην HDL προχωρούν και εμβαθύνουν, γίνεται σαφές ότι εκτός από την ποσότητα, η ποιότητα, δηλαδή η δομή και η λειτουργικότητα της HDL παίζει επίσης πολύ σημαντικό ρόλο στην αθηροπροστατευτική ικανότητά της. Οι κύριες ιδιότητες της HDL είναι η αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, η 21

22 αντιοξειδωτική και η αντιφλεγμονώδης δράση της. Σημαντικός είναι επίσης ο ρόλος της HDL στη βιοσύνθεση των οιστρογόνων, στην κατανομή των απολιποπρωτεϊνών του πλάσματος και στην ομοιόσταση της γλυκόζης (10) Αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης Μία από τις πιο σημαντικές ιδιότητες της HDL είναι η απομάκρυνση της περίσσειας χοληστερόλης από τα περιφερικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων εντός του αρτηριακού τοιχώματος και η μεταφορά της στο ήπαρ για καταβολισμό, μία διαδικασία που ονομάζεται αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης. Το μονοπάτι αυτό χαρακτηρίζεται ως μία αντιαθηρογόνος διαδικασία, που προλαμβάνει την συσσώρευση χοληστερόλης στα αρτηριακά τοιχώματα, την αποσταθεροποίηση των αθηρωματικών πλακών και την εμφάνιση οξέων καρδιαγγειακών επεισοδίων. Η εκροή χοληστερόλης από τα κύτταρα είναι το πρώτο βήμα στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης και έγκειται στην ανταλλαγή της μη εστεροποιημένης χοληστερόλης ανάμεσα στα κύτταρα και στους εξωκυττάριους αποδέκτες. Τα διάφορα HDL σωματίδια έχουν διαφορετική αποτελεσματικότητα στην εκροή της χοληστερόλης από τα κύτταρα. Όλα τα είδη HDL σωματιδίων του πλάσματος, συμπεριλαμβανομένων των ώριμων α HDL σωματιδίων και των δισκοειδών preβ HDL, είναι αποδοτικά στην εκροή χοληστερόλης μέσω του υποδοχέα Abcg1, ενώ ο Srb1 υποδοχέας προωθεί την εκροή της χοληστερόλης μόνο στα ώριμα α HDL σωματίδια. Η χοληστερόλη που συσσωρεύεται στην HDL μετατρέπεται σε εστέρες χοληστερόλης στο πλάσμα, από την Lcat, οι οποίοι μετακινούνται στον πυρήνα της, οδηγώντας στην προοδευτική μεγέθυνση των σωματιδίων. Τελικά οι εστέρες χοληστερόλης της HDL προσλαμβάνονται από τον υποδοχέα Srb1 και οδηγούνται στο ήπαρ για καταβολισμό (2) Αντιοξειδωτική δράση Εκτός από την αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, η HDL έχει την ικανότητα να αναστέλλει την οξείδωση της LDL περιορίζοντας το οξειδωτικό στρες και συμβάλλοντας στην πρόληψη σχηματισμού αθηρωματικών πλακών στα αρτηριακά τοιχώματα. Η αντιοξειδωτική ικανότητα της HDL έχει άμεση συσχέτιση με το ενζυμικό, λιπιδιακό και πρωτεϊνικό της περιεχόμενο, και ιδιαίτερα με την παραοξονάση 1 (Pon1) και την Apoa1. Ειδικότερα, η Pon1 είναι εκείνη που προσδίδει στην HDL τις αντιοξειδωτικές της ιδιότητες και είναι υπεύθυνη για τον κύριο μηχανισμό που αναστέλλει την οξείδωση τόσο της LDL όσο και της ίδιας της HDL. In vitro, η Pon1 εξουδετερώνει το υπεροξείδιο του υδρογόνου και τα υπεροξειδωμένα λιπίδια που βρίσκονται είτε ελεύθερα είτε στις αθηρωματικές πλάκες ή στην ελάχιστα οξειδωμένη

23 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού LDL (11;12). Τα υπεροξείδια των λιπιδίων αναστέλλουν την αντιοξειδωτική δραστικότητα της Pon1, πιθανώς μέσω αλληλεπιδράσεων με μια θειική ομάδα του ενζύμου (13). Μια σημαντική συνέπεια αυτού του φαινομένου είναι ότι εάν η HDL είναι οξειδωμένη θα υπάρξει αντίστοιχη μείωση της δραστικότητας της παραοξονάσης και, συνεπώς, μείωση της προστατευτικής αντιοξειδωτικής δραστικότητας του ενζύμου στην LDL (14) Αντιφλεγμονώδης δράση Πρόσφατες μελέτες υπογραμμίζουν πρόσθετους αθηροπροστατευτικούς ρόλους της HDL πέρα από την αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης και την αντιοξειδωτική δράση. Με την προώθηση της εκροής ελεύθερης χοληστερόλης από τα κύτταρα, η HDL και οι κύριες απολιποπρωτείνες της (Apoa1, Apoa2 και Αpoe) μειώνουν την ελεύθερη χοληστερόλη της πλασματικής μεμβράνης και το περιεχόμενο των λιπιδιακών σχεδιών σε ανοσοποιητικά και αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα, καταστέλλοντας τα σηματοδοτικά μονοπάτια της φλεγμονώδους απόκρισης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η HDL και η Apoa1 μειώνουν επίσης τη φλεγμονώδη σηματοδότηση ανεξάρτητα από την εκροή ελεύθερης χοληστερόλης από τα κύτταρα. Επιπλέον, το λιπιδιακό και πρωτεϊνικό περιεχόμενο της HDL παρέχει προστασία έναντι παρασιτικής και βακτηριακής μόλυνσης, ενδοθηλιακής βλάβης και τοξικότητας (15). 23

24 2 Ένζυμα Τα βασικότερα ένζυμα που συμμετέχουν στα μεταβολικά μονοπάτια των λιποπρωτεϊνών βρίσκονται είτε στη μεμβράνη των κυττάρων με τα οποία αλληλεπιδρούν οι πρωτεΐνες είτε μεταφέρονται συνδεδεμένα στις λιποπρωτεϊνές (16). Τα σημαντικότερα ένζυμα είναι: η λεκιθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (Lcat). η σχετιζόμενη με λιποπρωτεΐνες φωσφολιπάση Α2 (Lp-pla2)/ακετυλο-υδρολάση του παράγοντα ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (Paf-ah) η λιποπρωτεϊνική λιπάση (Lpl) η ηπατική λιπάση (Hl) και η ενδοθηλιακή λιπάση (El) 2.1 Λεκιθινοχοληστερολική ακυλοτρανσφεράση Η λεκιθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (Lcat) είναι μια γλυκοπρωτεΐνη με μοριακό βάρος 49 kda. Η βιοσύνθεσή της γίνεται στο ήπαρ και, σε μικρότερο βαθμό, στον εγκέφαλο και στους όρχεις. Οι βασικές δράσεις της Lcat είναι η υδρόλυση της φωσφατιδυλοχολίνης προς λυσοφωσφατιδυλοχολίνη και η εστεροποίηση της ελεύθερης χοληστερόλης των λιποπρωτεϊνών και κυρίως της HDL, αφού περίπου το 75% της δραστικότητας του Εικόνα 4. Σχηματική αναπαράσταση του μηχανισμού δράσης της LCAT. ενζύμου στο πλάσμα σχετίζεται με αυτήν. Συγκεκριμένα για την HDL η αντίδραση της εστεροποίησης είναι απαραίτητη για την μετατροπή των πρώιμων δισκοειδών σωματιδίων σε ώριμα σφαιρικά. Η αντίδραση εστεροποίησης της χοληστερόλης από την Lcat γίνεται σε δύο στάδια. Μετά τη σύνδεσή της στην επιφάνεια της HDL, η Lcat διασπά το λιπαρό οξύ της sn-2 θέσης της φωσφατιδυλοχολίνης και το μεταφέρει στη Ser181. Στη συνέχεια, το λιπαρό οξύ μετεστεροποιείται στην 3-β-υδροξυλομάδα στον Α-δακτύλιο της χοληστερόλης. Το τελικό αποτέλεσμα της αντίδρασης είναι ο σχηματισμός λυσοφωσφατιδυλοχολίνης και εστέρων χοληστερόλης. Επειδή οι εστέρες

25 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού χοληστερόλης είναι πιο υδρόφοβοι από την ελεύθερη χοληστερόλη, μεταναστεύουν στον πυρήνα των λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων. Εκτός από την HDL, η Lcat είναι ικανή να συνδέεται και να παράγει εστέρες χοληστερόλης στην LDL και σε άλλες λιποπρωτεΐνες που περιέχουν Apob (Apobλιποπρωτεΐνες) (17). 2.2 Σχετιζόμενη με λιποπρωτεΐνες φωσφολιπάση Α2 Η σχετιζόμενη με λιποπρωτεΐνες φωσφολιπάση a2 (Lp-pla2), που είναι επίσης γνωστή ως ακετυλο-υδρολάση του παράγοντα ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (Paf-ah) είναι ένα μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών της φωσφολιπάσης a2. Συντίθεται στον εγκέφαλο, στον λευκό λιπώδη ιστό και στον πλακούντα (18). Στο πλάσμα η Lp-pla2 κυκλοφορεί συνδεδεμένη με σωματίδια LDL (κυρίως μικρά σε μέγεθος και πυκνά) και HDL, και με την λιποπρωτεΐνη (α) (19). Κύριος ρόλος της Lp-pla2 είναι ο καταβολισμός των οξειδωμένων φωσφολιπιδίων (OxPL). Έχοντας ενεργότητα φωσφολιπάσης a2 ανεξάρτητη από Ca 2+ καταλύει την υδρόλυση του εστερικού δεσμού στη θέση sn-2 του παράγοντα ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (Paf) και των OxPL. Τα OxPL υδρολύονται με τη δράση της Lp-pla2 σε οξειδωμένα ελεύθερα λιπαρά οξέα (OxFFA) και λυσοφωσφατιδυλοχολίνη (LPC), παράγωγα τα οποία χαρακτηρίζονται ως προαθηρογόνα και προφλεγμονώδη (19). 25

26 3 Λιπίδια Παρά την υψηλή συγκέντρωση πολλαπλών δομικών και λειτουργικών πρωτεϊνών στα σωματίδια της HDL, το μισό περίπου της συνολικής μάζας της HDL αποτελείται από λιπίδια. Για πολλά χρόνια, το λιπιδιακό περιεχόμενο της HDL χαρακτηρίζονταν από την ύπαρξη κυρίως των φωσφολιπιδίων, των ελεύθερων στερολών (κυρίως της χοληστερόλης), των εστέρων χοληστερόλης και των τριγλυκεριδίων. Συγκεκριμένα, η χοληστερόλη είναι το πιο χαρακτηριστικό συστατικό του λιπιδιακού περιεχομένου της HDL. Ωστόσο, δεν είναι η χοληστερόλη, αλλά τα φωσφολιπίδια που κυριαρχούν ποσοτικά στην HDL, και μαζί με τη σφιγγομυελίνη, αποτελούν το 40-60% των συνολικών λιπιδίων, ενώ οι εστέρες χοληστερόλης καταλαμβάνουν το 30-40%, τα τριγλυκερίδια το 5-12% και η ελεύθερη χοληστερόλη το 5-10% του συνολικού λιπιδιακού περιεχομένου της (20). 3.1 Φωσφολιπίδια Τα φωσφολιπίδια αντιπροσωπεύουν περίπου το ήμισυ όλων των λιπιδίων της HDL και είναι αυτά που σχηματίζουν την επιφανειακή λιπιδιακή μονοστιβάδα της HDL. Κύρια κατηγορία των φωσφολιπιδίων της HDL είναι η φωσφατιδυλοχολίνη (PC), ενώ σε μικρότερες, αλλά σημαντικές ποσότητες ( 1% των συνολικών HDL λιπιδίων), συναντώνται η λυσοφωσφατιδυλοχολίνη (LPC), η φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (ΡΕ), η φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (ΡΙ) και τα πλασμαλογόνα (21). Η μικρότερη κατηγορία των φωσφολιπιδίων της HDL (<1% των συνολικών HDL λιπιδίων) αντιπροσωπεύεται από τη φωσφατιδυλογλυκερόλη (PG), τη φωσφατιδυλοσερίνη (PS), το φωσφατιδικό οξύ (PA) και την καρδιολιπίνη (22;23). Οι ΡΙ, PS, PG και το ΡΑ είναι αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια που επηρεάζουν σημαντικά το καθαρό επιφανειακό φορτίο της HDL, ρυθμίζοντας έτσι τις αλληλεπιδράσεις της με λιπάσες, πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων, την εξωκυτταρική μήτρα και άλλα πρωτεϊνικά συστατικά (22;24;25). 3.2 Σφιγγολιπίδια Τρεις είναι οι βασικές κατηγορίες των σφιγγολιπιδίων της HDL, η σφιγκομυελίνη (SM), τα κεραμίδια και τα λυσοσφιγγολιπίδια, με την πρώτη να αντιπροσωπεύει την κύρια κατηγορία σφιγγολιπιδίων (5-10% των συνολικών HDL λιπιδίων). Η περιεκτικότητα του HDL σωματιδίου σε SΜ αποτελεί έναν κρίσιμο παράγοντα για τον προσδιορισμό της επιφανειακής πίεσης των λιπιδιακών μεμβρανών και των λιποπρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης της HDL, ενισχύοντας την ακαμψία τους και επηρεάζοντας έτσι τη δραστηριότητα των ενσωματωμένων πρωτεϊνών (26;27). Επιπλέον, τα

27 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού κεραμίδια έχουν βασικό ρόλο ως μόρια σηματοδότησης, καθώς εμπλέκονται στις διαδικασίες κυτταρικής επιβίωσης, ανάπτυξης και διαφοροποίησης (20). 3.3 Στερόλες Η βασική στερόλη της HDL είναι η χοληστερόλη, η οποία αντιπροσωπεύοντας το 5-10% των συνολικών λιπιδίων της, κάνει φανερό τον ρόλο της HDL στη μεταφορά της χοληστερόλης μέσω της κυκλοφορίας. Άλλες στερόλες παρούσες, σε πολύ μικρότερες ποσότητες, στην HDL είναι η οξυστερόλη, τα οιστρογόνα (σε μεγάλο βαθμό παρόντα ως εστέρες) και οι φυτοστερόλες. Μαζί με τα φωσφολιπίδια, οι στερόλες εντοπίζονται στην επιφανειακή λιπιδιακή μονοστιβάδα των σωματιδίων της HDL και συμβάλλουν στη ρύθμιση της ρευστότητάς της (20). 3.4 Εστέρες χοληστερόλης Οι εστέρες χοληστερόλης αποτελούν το 30-40% των HDL λιπιδίων και σχηματίζονται σε μεγάλο βαθμό (έως 80%) στην HDL του πλάσματος ως αποτέλεσμα της αντίδρασης εστεροποίησης της χοληστερόλης, που καταλύεται από την Lcat. Επειδή οι εστέρες χοληστερόλης είναι εξαιρετικά υδρόφοβοι, η αντίδραση εστεροποίησης μετατοπίζει την εστεροποιημένη χοληστερόλη από την λιπιδιακή μονοστοιβάδα της επιφανείας στον λιπιδιακό πυρήνα της HDL. Στη συνέχεια, στον άνθρωπο, οι εστέρες χοληστερόλης μπορούν να ανταλλαχθούν με τριγλυκερίδια των APOBλιποπρωτεϊνών μέσω της πρωτεΐνης μεταφοράς εστέρων χοληστερόλης (CETP) (20). 3.5 Τριγλυκερίδια Τα τριγλυκερίδια της HDL αποτελούν το 5-12% των συνολικών λιπιδίων της και προέρχονται από πλούσιες σε τριγλυκερίδια APOB-λιποπρωτεΐνες, κυρίως VLDL, ως αποτέλεσμα της ανταλλαγής με εστέρες χοληστερόλης μέσω της CETP. Όπως και οι εστέρες χοληστερόλης, τα τριγλυκερίδια είναι εξαιρετικά υδρόφοβα και βρίσκονται στον λιπιδιακό πυρήνα της HDL, βοηθώντας στην διατήρηση μιας ρευστότερης κατάστασης του πυρήνα (20). 27

28 4 Απολιποπρωτεϊνες Οι απολιποπρωτεΐνες συνιστούν το βασικό πρωτεϊνικό περιεχόμενο των λιποπρωτεϊνών. Η σύνθεση και η έκκρισή τους γίνεται κυρίως από το ήπαρ και σε μικρότερο βαθμό από το λεπτό έντερο και βασικός τους ρόλος είναι να συμβάλλουν στον μεταβολισμό των λιπιδίων είτε μεταφέροντάς τα στην κυκλοφορία, είτε μέσω της σύνδεσής τους με ειδικούς υποδοχείς, είτε δρώντας ως καταστολείς ή ενεργοποιητές των ενζύμων. Οι κυριότερες κατηγορίες είναι οι A, B, C και E, ενώ πρόσφατα έχουν χαρακτηριστεί οι Μ και οι J (28;29). 4.1 Απολιποπρωτεΐνη Α1 Η απολιποπρωτεΐνη Α1 (Apoa1) είναι η κύρια δομική και λειτουργική πρωτεΐνη της HDL, με μοριακό βάρος 29 kda, και αντιπροσωπεύει περίπου το 70% της ολικής πρωτεΐνης της HDL. Οι κύριοι ιστοί για τη σύνθεση και την έκκρισή της είναι το ήπαρ και το λεπτό έντερο (10). Κύριος ρόλος της Apoa1 είναι ο σχηματισμός της HDL, μέσω της σύνδεσής της με φωσφολιπίδια και ελεύθερη χοληστερόλη και της ενεργοποίηση της Lcat. Η Apoa1 έχει την ικανότητα να αλληλοεπιδρά με κυτταρικούς υποδοχείς, γεγονός που της προσδίδει σημαντικό ρόλο στην αντίστροφη μεταφορά της χοληστερόλης. Μελέτες έχουν δείξει ότι η αθηροπροστατευτική, αντιφλεγμονώδης και αντιοξειδωτική δράση της HDL οφείλεται επίσης σε μεγάλο βαθμό στην Apoa1 και συγκεκριμένα στην ικανότητά της να αφαιρεί οξειδωμένα φωσφολιπίδια από την οξειδωμένη LDL (30). Η Apoa1 κινείται ελεύθερα μεταξύ των σωματιδίων των λιποπρωτεϊνών και βρίσκεται επίσης στα χυλομικρά και στις VLDL (10). 4.2 Απολιποπρωτεΐνη Α2 Η απολιποπρωτεΐνη Α2 (Apoa2) είναι η δεύτερη βασική απολιποπρωτεΐνη της HDL, με μοριακό βάρος 8,7 kda και αντιπροσωπεύει περίπου 15-20% της ολικής πρωτεΐνης της HDL. Η Apoa2 συντίθεται κυρίως στο ήπαρ αλλά και στο έντερο, και είναι πιο υδρόφοβη από την Apoa1. Βασικός ρόλος της είναι να διατηρεί αυξημένα τα επίπεδα της HDL-C, αναστέλλοντας την δράση της Hl όπως έχει δειχθεί σε πειράματα με ποντίκια που δεν εκφράζουν την Apoa2 και την Hl (double knockout) (10).

29 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού 4.3 Απολιποπρωτεΐνη Ε Η απολιποπρωτεΐνη E (Apoe) είναι μία επίσης βασική δομική και λειτουργική πρωτεΐνη της HDL, παρόλο που βρίσκεται σε χαμηλότερη συγκέντρωσή στα σωματίδια της HDL σε σύγκριση με την Apoa1 (2). Η Apoe είναι μια γλυκοπρωτεΐνη 34.5 kda που συντίθεται κυρίως στο ήπαρ και σε άλλους ιστούς όπως ο εγκέφαλος και ο λιπώδης ιστός. Η Apoe είναι προσδέτης του υποδοχέα Αpoe2 (Αpoer2), της σχετιζόμενης με LDLr πρωτεΐνης 1 (Lrp1), του VLDL υποδοχέα και άλλων λιποπρωτεϊνικών υποδοχέων (10). Κύριος ρόλος της είναι η απομάκρυνση των αθηρογόνων λιποπρωτεϊνικών υπολειμμάτων από την κυκλοφορία του αίματος προσφέροντας έτσι προστασία από την αθηρωματική νόσο (31). Κατά την κάθαρση των πλούσιων σε χοληστερόλη και τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνικών υπολειμμάτων, η λιπιδιωμένη Apoe αναγνωρίζεται από τους υποδοχείς των LDL, VLDL καθώς και από τον Lrp1 και έτσι πραγματοποιείται η απομάκρυνσή τους από την κυκλοφορία (32-35). Το μεγαλύτερο μέρος της Apoe του πλάσματος κυκλοφορεί μεταφερόμενο από τις πλούσιες σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεΐνες, όπου χρησιμεύει ως προσδέτης για τους υποδοχείς Apob/Apoe και εξασφαλίζει τη δέσμευση των λιποπρωτεϊνών στις γλυκοζαμινογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας. Μία πρόσφατη μελέτη αναφέρει ότι η Apoe είναι ικανή να προάγει την de novo βιογένεση σωματιδίων τύπου HDL με τη συμμετοχή των Abca1 και Lcat ανεξάρτητα από την Apoα1 (6). 4.4 Απολιποπρωτεΐνη C1 Η απολιποπρωτεΐνη C1 (Apoc1) είναι η μικρότερη απολιποπρωτεΐνη της HDL, με μοριακό βάρος 6,6 kda. Η Apoc1 έχει ισχυρό θετικό φορτίο και έτσι δεσμεύει τα ελεύθερα λιπαρά οξέα και ρυθμίζει τις δραστικότητες αρκετών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στο μεταβολισμό της HDL. Έτσι, η Apoc1 εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της Lcat και στην αναστολή της Lpl, της Hl και της CETP (10). 4.5 Απολιποπρωτεΐνη C2 Η απολιποπρωτεΐνη C2 (Apoc2) έχει μέγεθος 8.8 kda και εκκρίνεται στο πλάσμα όπου αποτελεί συστατικό των VLDL και των χυλομικρών. Η Apoc2 είναι σημαντικός ενεργοποιητής της Lpl, η οποία υδρολύει τα τριγλυκερίδια και έτσι παρέχει ελεύθερα λιπαρά οξέα για τα κύτταρα. Ωστόσο, έχει δειχθεί ότι σε υψηλές συγκεντρώσεις η Apoc2 μπορεί να δράσει ως αναστολέας της Lpl (10). Παρόμοια με την Apoc3, η Apoc2 αναστέλλει τη δράση της Lcat, πιθανώς μέσω της εκτόπιση των απολιποπρωτεϊνών που δρουν ως ενεργοποιητές της Lcat, όπως η Apoa1, από την επιφάνεια των λιποπρωτεϊνών (36). 29

30 4.6 Απολιποπρωτεΐνη C3 Η απολιποπρωτεΐνη C3 (Apoc3) συντίθεται στο ήπαρ και σε μικρότερες ποσότητες στο έντερο, ως ένα πεπτίδιο 99 αμινοξέων. Μετά την απομάκρυνση ενός πεπτιδίου 20 αμινοξέων στο ενδοπλασματικό δίκτυο, η ώριμη μορφή της Apoc3 αποτελείται από 79 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος 8,8 kda (37;38). H Apoc3 κατανέμεται στις λιποπρωτεϊνες που χαρακτηρίζονται από υψηλή περιεκτικότητά σε απολιποπρωτεϊνη Β (Apob-λιποπρωτεΐνες), όπως τα χυλομικρά, η VLDL, η IDL και η LDL. Περίπου το ήμισυ της Apoc3 του πλάσματος σχετίζεται με την HDL και πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι η πρόσδεσή της στην HDL προαπαιτεί την ύπαρξη λειτουργικού Abca1, όμοια με την Apoa1. Έτσι η Apoc3 έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά με τον Abca1 ώστε να προάγει την βιογένεση σωματιδίων που προσομοιάζουν σε εκείνα της HDL (39). Σε κατάσταση νηστείας, η Apoc3 σχετίζεται κυρίως με την HDL, ενώ σε κατάσταση φυσιολογικής πρόσβασης σε τροφή η Apoc3 ανακατανέμεται επιλεκτικά σε σωματίδια χυλομικρών και VLDL. Σε ασθενείς με φυσιολογικά επίπεδα τριγλυκεριδίων του αίματος, περίπου τα μισά έως τα δύο τρίτα των σωματιδίων VLDL και IDL περιέχουν APOC3. Αντίθετα, η Apoc3 περιέχεται μόνο στο 10% των LDL σωματιδίων (38) Ρόλος στον μεταβολισμό των τριγλυκεριδίων Η Apoc3 παίζει σημαντικό ρόλο στον μεταβολισμό των τριγλυκεριδίων του πλάσματος. Πολυάριθμες επιδημιολογικές μελέτες και μελέτες σε πειραματόζωα έχουν δείξει ότι υπάρχει άμεση συσχέτιση των επιπέδων της Apoc3 στο πλάσμα με τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων του πλάσματος και αντίστροφη συσχέτιση με τον ρυθμό κάθαρσης των μεταγευματικών τριγλυκεριδίων (40-47). Επιπλέον, πολλές in vitro μελέτες έχουν προτείνει έναν ρόλο της Apoc3 στον καταβολισμό των πλούσιων σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεϊνών (TRLs) (48-56). Οι APOΒ-λιποπρωτεΐνες που περιέχουν APOC3 είναι πλούσιες σε τριγλυκερίδια και εστέρες χοληστερόλης και είναι σημαντικά αυξημένες σε ασθενείς που πάσχουν από υπερτριγλύκεριδαιμία (HTG). Οι συγκεντρώσεις της APOC3 στο πλάσμα και στις APOΒ-λιποπρωτεΐνες εμφανίζουν τυχαία συσχέτιση με τη συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων του πλάσματος (57). Η Apoc3 προάγει την HTG μέσω διαφόρων μηχανισμών. Αρχικά η Apoc3 αναστέλλει τη δράση της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (Lpl) και με αυτόν τον τρόπο διαταράσσει την λιπόλυση των TRLs (58). Σε μελέτες που έγιναν αποκλειστικά σε υπερτριγλυκεριδαιμικούς ασθενείς, αποδείχθηκε ότι η APOC3 είναι ένας από τους πιο ειδικούς αναστολείς της LPL (59). Το 1992 ο McConathy και οι συνεργάτες του χρησιμοποίησαν συνθετικά πολυπεπτιδικά θραύσματα της APOC3 και παρατήρησαν ότι κυρίως υπεύθυνη για την αναστολή της LPL είναι η Ν-τελική περιοχή της APOC3 (60). Ένας

31 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού δεύτερος μηχανισμός είναι η παρέμβαση της APOC3 στην πρόσδεση της απολιποπρωτεΐνης Β ή της απολιποπρωτεΐνης Ε στους ηπατικούς υποδοχείς, οδηγώντας σε καθυστερημένο καταβολισμό των υπολειμμάτων των TRLs (58). Όπως έχει δειχθεί σε προηγούμενες μελέτες, η APOC3 καταργεί πλήρως την διαμεσολαβούμενη από την APOB σύνδεση των λιποπρωτεϊνών με τον LDL υποδοχέα. Έχει προταθεί ότι ο τρόπος με τον οποίο η APOC3 αναστέλλει τη σύνδεση των λιποπρωτεϊνών στους υποδοχείς, είναι καλύπτοντας την περιοχή πρόσδεσης της APOB στον υποδοχέα (49;50) Ρόλος στη δραστικότητα των ενζύμων Εκτός από τη δράση της ως αναστολέας της Lpl, έχει αποδειχθεί ότι η Apoc3 μπορεί να δράσει σε πολλά άλλα ένζυμα που εμπλέκονται στον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών. Υψηλές συγκεντρώσεις Apoc3 μπορούν να αναστείλουν τη δράση της Hl, in vitro (61). H Apoc3 φαίνεται επίσης να επηρεάζει και τη δράση του ενζύμου Lcat, λειτουργώντας ως αναστολέας. Η δράση της αυτή φαίνεται να επιτυγχάνεται πιθανώς με εκτόπιση των απολιποπρωτεϊνών που δρουν ως ενεργοποιητές της Lcat, όπως η Apoa1, από την επιφάνεια των λιποπρωτεϊνών (36). Επιπλέον, η Apoc3 δρα ως ενεργοποιητής της Lp-pla2. Αποτελέσματα από in vitro πειράματα και ζωικά μοντέλα έδειξαν ότι η Apoc3 θα μπορούσε να αυξήσει την έκφραση της Lp-pla2 μέσω των μονοπατιών MAPK και NF-kB με τρόπο που εξαρτάται από τη δόση και το χρόνο και συνεπώς να προκαλέσει φλεγμονή (62). Πολύ λίγες πληροφορίες είναι διαθέσιμες για την επίδραση της APOC3 στη δραστικότητα του ενζύμου CETP. Προκαταρκτικές μελέτες των Sparks και Pritchard αποδεικνύουν ότι χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένα σωματίδια HDL, η APOC3 διεγείρει τη δράση της CETP (63) Ρόλος στην καρδιαγγειακή νόσο Η APOC3 και οι λιποπρωτεΐνες που φέρουν την APOC3 δρουν, όχι μόνο ως βασικοί ρυθμιστές στον μεταβολισμό των τριγλυκεριδίων, αλλά και ως ανεξάρτητοι δείκτες πρόγνωσης για τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιαγγειακής νόσου (CVD) (64;65). Αποτελέσματα από κλινικές μελέτες δείχνουν την άμεση συσχέτιση της APOC3 με την CVD. Σε μία μελέτη που αφορούσε 5ετή παρακολούθηση ασθενών με αγγειογραφικά αποδεδειγμένη CVD βρέθηκε ότι η συγκέντρωση της APOC3 στον ορό ( 10,5 mg/dl) αντιπροσωπεύει ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου συνολικής και καρδιαγγειακής θνησιμότητας (66). Εκτός αυτού, η ανάλυση των αποτελεσμάτων αυτής της μελέτης αποκάλυψε μια ανεξάρτητη συσχέτιση μεταξύ των αυξημένων επιπέδων APOC3 και της αυξημένης παραγωγής θρομβίνης (66). Επιπλέον, μια άλλη αναδρομική μελέτη που περιλάμβανε 933 ασθενείς που 31

32 συμμετείχαν στη μελέτη «Verona heart Study» έδειξε ότι η αυξημένη συγκέντρωση της APOC3 στο πλάσμα σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο φλεβικής θρόμβωσης, ακόμη και μετά τη ρύθμιση άλλων παραγόντων κινδύνου (67). Η HDL έχει αναφερθεί ότι έχει αθηροπροστατευτικές ιδιότητες, οι οποίες μπορούν να μεταβληθούν εξαιτίας παθολογικών διαταραχών, οδηγώντας στην δημιουργία δυσλειτουργικής HDL, η οποία με τη σειρά της συμβάλλει στην εμφάνιση ενός μεγάλου αριθμού διαταραχών και ιδιαίτερα της CVD. Στοιχεία που έχουν προκύψει από πολλές μελέτες υποδεικνύουν ότι η APOC3 σχετίζεται με τη δυσλειτουργία της HDL. Μία προοπτική μελέτη ελέγχου περιπτώσεων έδειξε ότι η HDL που περιέχει APOC3 και η HDL που δεν περιέχει APOC3 έχουν αντίθετη συσχέτιση με τον κίνδυνο εμφάνισης CVD (68) ενώ όπως έδειξε και μία συγκριτική μελέτη ελέγχου περιπτώσεων, τα επίπεδα APOC3 της HDL είναι σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς με CVD, σε σχέση με εκείνα που παρατηρούνται σε υγιή άτομα, αποδεικνύοντας ότι η APOC3 της HDL είναι ένας ανεξάρτητος δείκτης πρόβλεψης της CVD (69). Σε μία άλλη μελέτη, απομονώθηκε HDL από υγιή άτομα και από ασθενείς που λάμβαναν θεραπεία για στεφανιαία αρτηριακή νόσο (CAD). Η HDL που απομονώθηκε από ασθενείς με CAD είχε σημαντικά περισσότερη APOC3 και εμφάνισε αλλοιωμένη ενεργοποίηση της ενδοθηλιακής απόπτωσης σε σχέση με την HDL των υγιών ατόμων. Η προεπώαση της HDL με ένα αντίσωμα κατά της APOC3 παρεμπόδισε αυτά τα αποτελέσματα (70). Εκτός, όμως, από τα επίπεδα της APOC3 στην HDL σημαντικό ρόλο στον κίνδυνο εμφάνισης CVD παίζει και η APOC3 που περιέχεται στις VLDL και LDL λιποπρωτεΐνες. Μια προοπτική ανθρωποκεντρική μελέτη αναφέρει ότι ο κίνδυνος για θανατηφόρο και μη θανατηφόρο έμφραγμα του μυοκαρδίου είναι σημαντικά αυξημένος σε ασθενείς με αυξημένο κλάσμα VLDL ή LDL που περιέχει APOC3 (71). Ακόμη, στην μελέτη «ChinShan Community Cardiovascular Cohort» στην Ταϊβάν, η αναλογία APOC3 της HDL προς APOC3 της VLDL θεωρήθηκε ως ένας πιο αξιόπιστος δείκτης για την πρόβλεψη της CVD (72). Μία άλλη μελέτη που περιλάμβανε νέους σε ηλικία ( 35 ετών) ασυμπτωματικούς ασθενείς, που επιβίωσαν έπειτα από οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου, έδειξε την ύπαρξη δυσλειτουργικής HDL που συνοδευόταν από αυξημένο κλάσμα APOC3/APOA1 (73). Τα δεδομένα από όλες τις παραπάνω μελέτες υποδεικνύουν ότι η παρουσία ή η απουσία αυξημένης APOC3 στα σωματίδια της HDL μπορεί να μετατρέψει την αθηροπροστατευτική δράση της HDL σε προαθηρογόνο, ενώ τα επίπεδα της APOC3 στις LDL και VLDL μπορούν να καθορίσουν τον βαθμό της αθηρογένεσης. Τα επίπεδα της APOC3 στα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια μπορούν να εξηγήσουν γιατί τα φάρμακα που στοχεύουν στην αύξηση των επιπέδων της HDL στο πλάσμα, δεν είχαν επιτυχία στη μείωση του κινδύνου της CVD, επειδή στην πραγματικότητα υπάρχει μια ετερογενής ομάδα λιποπρωτεϊνών που περιέχουν APOC3, τα επίπεδα της οποίας είναι εκείνα που καθορίζουν τον κίνδυνο εμφάνισης CVD (74).

33 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού H APOC3 ως φαρμακολογικός στόχος Παρόλο που υπάρχει μια ποικιλία φαρμάκων που μειώνουν τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων (στατίνες, νιασίνη, φιβράτες και ω-3 λιπαρά οξέα), η APOC3 είναι ένας ελκυστικός φαρμακολογικός στόχος λόγω της σχέσης της με τη φλεγμονή, τη λειτουργία της HDL, τη λειτουργία των παγκρεατικών β-κυττάρων και τον κίνδυνο εμφάνισης CVD. Βάσει αυτών των σημαντικών λειτουργιών της APOC3, ολιγονουκλεοτίδια με αντινοηματική ακολουθία (ASO) που στοχεύουν στη αποσιώπηση της έκφραση της APOC3 βρίσκονται σήμερα σε κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία της HTG και των σχετικών με αυτήν παθολογιών (75). Η χρήση των ολιγονουκλεοτιδίων κατάφερε να προκαλέσει μείωση των επιπέδων της APOC3 και των τριγλυκεριδίων στον ορό του αίματος και παρουσίασε καλή ανοχή σε διάφορα προκλινικά μοντέλα, συμπεριλαμβανομένων διαγονιδιακών ποντικιών, αρουραίων και μη ανθρώπινων πρωτευόντων (75). Στην φάση Ι της κλινική δοκιμής σε υγιείς ανθρώπινους εθελοντές, η χορήγηση APOC3-ASO (volanesorsen, πρώην: ISIS-APOCIIIRx) προκάλεσε μια έντονη, εξαρτώμενη από τη δόση και το χρόνο, μείωση της APOC3 και των τριγλυκεριδίων χωρίς αξιοσημείωτες ανεπιθύμητες ενέργειες (75). Η φάση ΙΙ της κλινικής δοκιμής αξιολόγησε τις φαρμακοδυναμικές επιδράσεις του volanesorsen σε ενήλικες ασθενείς με σοβαρή ή μη ελεγχόμενη HTG (76). Όταν το volanesorsen χορηγήθηκε ως απλός παράγοντας, η APOC3 στο πλάσμα μειώθηκε στις λιποπρωτεΐνες που περιέχουν APOB και APOAI καθώς και στη λιποπρωτεΐνη (α) ομοιόμορφα με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (77). Τα τριγλυκερίδια μειώθηκαν σύμφωνα με την APOC3, ενώ η HDL-C παρουσίασε μια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση. Παρόμοιες αλλαγές εμφανίστηκαν όταν χορηγήθηκε volanesorsen ως πρόσθετο στη σταθερή θεραπεία με φιβράτη. Δεν εντοπίστηκαν σοβαρά προβλήματα ασφάλειας που σχετίζονται με τη θεραπεία (77). Εκτός από την αξιολόγηση του φαρμάκου σε ασθενείς με HTG, μέχρι το τέλος του 2018 το volanesorsen θα βρίσκεται σε φάση ΙΙ κλινικής δοκιμής ώστε να ελεγχθεί για την αποτελεσματικότητα, την ασφάλεια και την ανεκτικότητά του σε άτομα με μερική λιποδυστροφία (78). Τα εμφανή κλινικά οφέλη που προκάλεσε το volanesorsen παρουσιάστηκαν όχι μόνο σε ασθενείς με ΗΤG αλλά και σε ασθενείς με σύνδρομο οικογενούς χυλομικροναιμίας (FCS). Σε ασθενείς με FCS, η απουσία της LPL προκαλεί ανεπαρκή απομάκρυνση των TRLs και οδηγεί σε χυλομικροναιμία (TG>880 mg/dl). Η αγωγή με volanesorsen παρουσίασε σημαντική αποτελεσματικότητα στη μείωση των τριγλυκεριδίων (>500 mg/dl) ανεξάρτητα από την LPL (79). Η βραχυπρόθεσμη αποτελεσματικότητα και η προφανής ασφάλεια του volanesorsen έδωσε τη δυνατότητα για μια περαιτέρω μακροπρόθεσμη αξιολόγηση. Ήδη μία κλινική δοκιμή φάσης ΙΙΙ, η APPROACH (δοκιμή του volanesorsen σε ασθενείς με σύνδρομο οικογενούς χυλομικροναιμίας, 33

34 NCT ), έχει ολοκληρωθεί, ενώ τα αποτελέσματα της μελέτης δεν έχουν επισήμως ανακοινωθεί (78). Οι κλινικές δοκιμές φάσης ΙΙΙ που βρίσκονται σε εξέλιξη για το volanesorsen περιλαμβάνουν τις παρακάτω: - Approach Open Label Study (δοκιμή του volanesorsen σε ασθενείς με σύνδρομο οικογενούς χυλομικροναιμίας) - COMPASS (δοκιμή του volanesorsen σε ασθενείς με υπερτριγλυκεριδαιμία, NCT ) - BROADEN (δοκιμή του volanesorsen σε ασθενείς με μερική λιποδυστροφία, NCT ) (78). Εκτός από την πολλά υποσχόμενη θεραπεία με APOC3-ASO, τα νανοσωματίδια ζεολίθου, των οποίων το αρνητικό φορτίο βοηθά την ηλεκτροστατική αλληλεπίδρασή τους με τα θετικά φορτισμένα υπολείμματα αμινοξέων της APOC3, δεσμεύουν επιλεκτικά την APOC3 του πλάσματος και μπορούν να αποτελέσουν μια πιθανή μελλοντική θεραπεία για τη μείωση της APOC3 στο πλάσμα (80) Ρόλος στην παχυσαρκία Η εμφάνιση της APOC3 στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα και κυρίως στην HDL έχει συνδεθεί, μέσα από αρκετές μελέτες, και με την παχυσαρκία. Συγκεκριμένα, σε μια συγκριτική μελέτη, που περιλάμβανε παχύσαρκους ασθενείς και άτομα με φυσιολογικό βάρος, βρέθηκε ότι στα παχύσαρκα άτομα τα HDL σωματίδια περιείχαν αυξημένες ποσότητες APOC3 σε σχέση με τα άτομα που είχαν φυσιολογικό βάρος, με τη συγκέντρωση της APOC3 να είναι 1,5-2 φορές υψηλότερη (81). Σε συμφωνία με τη μελέτη αυτή, σε μια κλινική δοκιμή που περιλάμβανε ασθενείς με παθολογική παχυσαρκία που υποβλήθηκαν σε βαριατρική χειρουργική επέμβαση, παρατηρήθηκαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα HDL σωματιδίων πλούσιων σε APOC3 στο πλάσμα των ασθενών αμέσως πριν από την επέμβαση, ενώ έξι μήνες μετά την επέμβαση όλη η HDL περιείχε κυρίως APOA1, ενώ μόνο ίχνη της APOC3 ήταν ανιχνεύσιμα (82). Το 2005 μία μελέτη που έγινε σε ποντίκια που δεν εξέφραζαν την Apoc3 (apoc3 -/- ) έδειξε ότι η απουσία της Apoc3, του φυσικού αναστολέα της Lpl, ενισχύει την πρόσληψη λιπαρών οξέων από τα τριγλυκερίδια του πλάσματος στον λιπώδη ιστό, γεγονός που οδηγεί σε υψηλότερη ευαισθησία στην διατροφικά επαγόμενη παχυσαρκία ακολουθούμενη από σοβαρή ανάπτυξη αντίστασης στην ινσουλίνη. Ως εκ τούτου, η APOC3 είναι ένας πιθανός στόχος για τη θεραπεία της παχυσαρκίας και της αντίστασης στην ινσουλίνη και ταυτόχρονα για την πρόληψη καρδιαγγειακού κινδύνου (83).

35 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού 5 Παχυσαρκία Η παχυσαρκία χαρακτηρίζεται ως πολυπαραγοντική νόσος λόγω της άμεσης συσχέτισής της με πολλές διαταραχές του μεταβολικού συνδρόμου, όπως ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2, η υπέρταση, η δυσλιπιδαιμία, η υπερχοληστερολαιμία και η στεφανιαία νόσος. Η βασικότερη αιτία εμφάνισης της παχυσαρκίας είναι ο συνδυασμός της υπερβολικής κατανάλωσης τροφής και της έλλειψης σωματικής δραστηριότητας (84;85), ενώ ελάχιστες είναι οι περιπτώσεις στις οποίες τα αίτια οφείλονται σε γενετικές ή ψυχιατρικές παθήσεις (86). Οι αυξανόμενοι ρυθμοί παχυσαρκίας σε κοινωνικό επίπεδο φαίνεται να οφείλονται σε μια εύκολα προσβάσιμη, φθηνή και εύγευστη διατροφή (87) σε συνδυασμό με τον σύγχρονο «καθιστικό» τρόπο ζωής (88). Η παχυσαρκία διακρίνεται σε δύο τύπους, την κεντρική παχυσαρκία, που χαρακτηρίζεται από αυξημένη εναπόθεση λιπώδους ιστού ενδοκοιλιακά και την περιφερική παχυσαρκία, στην οποία συσσώρευση λιπώδους ιστού εντοπίζεται κυρίως στους μηρούς και στους γλουτούς. Η εμφάνιση της κεντρικής παχυσαρκίας είναι εκείνη που σχετίζεται με διαταραχές του μεταβολικού συνδρόμου, όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, ενώ η εμφάνιση της περιφερικής παχυσαρκίας φαίνεται να σχετίζεται με προστασία του ατόμου από τέτοιου είδους παθήσεις (84;85). 5.1 Λιπώδης ιστός Ο λιπώδης ιστός είναι ένας χαλαρός συνδετικός ιστός ο οποίος ανάλογα με το είδος των λιποκυττάρων ταξινομείται σε δύο κύριους τύπους, τον λευκό λιπώδη ιστό και τον φαιό λιπώδη ιστό. Ο λευκός λιπώδης ιστός θεωρείται ότι είναι υπεύθυνος για την αποθήκευση ενέργειας μέσω της Εικόνα 5. Λευκό και φαιό λιποκύτταρο και οι δύο όψεις του μπες λιποκυττάρου (3). συσσώρευσης μεγάλων λιπιδιακών σταγονιδίων, αν και πλέον αναγνωρίζεται και ως ενδοκρινικό όργανο (89). Ο φαιός λιπώδης ιστός χαρακτηρίζεται από πολυάριθμα σταγονίδια λιπιδίων και ευρεία παρουσία μιτοχονδρίων, κύριος ρόλος των οποίων είναι να παράγουν θερμότητα μέσω του μηχανισμού της θερμογένεσης (90;91). 35

36 Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια, έχει περιγραφεί ένας νέος τύπος λιπώδους ιστού που είναι γνωστός ως Μπεζ ή BRITE. Η διαδικασία παραγωγής των μπεζ λιποκυττάρων ονομάζεται «καφεποίηση» (του λευκού λιπώδους ιστού) και γίνεται στις τοπικές αποθήκες του λευκού λιπώδους ιστού (92-95). Τα μπεζ λιποκύτταρα εκφράζουν θερμογενείς δείκτες και εμφανίζουν ανατομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά τα οποία είναι ενδιάμεσα εκείνων των λευκών και φαιών λιποκυττάρων, που τους επιτρέπουν να έχουν θερμογενετική ικανότητα (96) Λευκός λιπώδης ιστός Ο λευκός λιπώδης ιστός (WAT) είναι το κύριο λιπώδες όργανο στους ενήλικες και είναι η κύρια αποθήκη ενέργειας του οργανισμού με τη μορφή τριγλυκεριδίων. Η ανάπτυξη του WAT ξεκινάει στο μεσόδερμα κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής περιόδου (97). Ενώ μέχρι πρόσφατα ήταν γνωστό ότι τα λευκά λιποκύτταρα προέρχονται από πρόδρομα κύτταρα που δεν εκφράζουν τον μυογενή παράγοντα 5 (Myf5-αρνητικά) (98-100), το 2014, ο Guertin και η ομάδα του ανακάλυψαν μία διαφορετική προέλευση των λευκών λιποκυττάρων από διαφορετικές αποθήκες WAT. Έδειξαν ότι τα λευκά λιποκύτταρα από την οπίσθια υποδόρια, τη μεσεντερική και την περιγοναδική σπλαγχνική κοιλότητα είναι όλα Myf5-αρνητικά, ενώ εκείνα από την πρόσθια υποδόρια και την οπισθοπεριτοναϊκή σπλαχνική κοιλότητα είναι σχεδόν όλα Myf5-θετικά (101). Το WAT είναι ευρέως κατανεμημένο σε όλο το σώμα, αλλά το πιο καλά εντοπισμένο απόθεμά του είναι ο σπλαχνικός λευκός λιπώδης ιστός, που περιβάλλει κυρίως τα εσωτερικά όργανα (102). Μορφολογικά, ένα λευκό λιποκύτταρο είναι ένα μονοκύτταρο που περιέχει ένα μεγάλο λιπιδιακό σταγονίδιο που ωθεί τον πυρήνα κοντά στην πλασματική μεμβράνη. Τα μιτοχόνδρια εντοπίζονται κυρίως στο παχύτερο τμήμα του κυτταροπλασματικού χείλους κοντά στον πυρήνα. Όποτε οι απαιτήσεις παραγωγής ενέργειας είναι αυξημένες, λιπαρά οξέα απελευθερώνονται από το WAT με λιπόλυση. Αυτή η διαδικασία ξεκινάει με τη σύνδεση της νορεπινεφρίνης στους β3- αδρενεργικούς υποδοχείς των λευκών λιποκυττάρων, που οδηγεί στη δημιουργία camp. Ο δεύτερος μηνύτορας camp ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση Α, η οποία διεγείρει την ορμονο-ευαίσθητη λιπάση απελευθερώνοντας ελεύθερα λιπαρά οξέα από τα τριγλυκερίδια των λιπιδιακών σταγονιδίων. Εκτός από αποθήκη ενέργειας, το WAT είναι επίσης ένα ενδοκρινικό όργανο που εκκρίνει ορμόνες, όπως λεπτίνη, αδιπονεκτίνη, αγγειοτασίνη, TNFa, και ιντερλευκίνη 6, και έχει σημαντικό ρόλο στη μεταβολική και αγγειακή ομοιόσταση και στις φλεγμονώδεις διεργασίες (102).

37 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Φαιός λιπώδης ιστός Ο φαιός λιπώδης ιστός (BAT) είναι ένας ειδικός τύπος λιπώδους οργάνου που βρίσκεται σχεδόν σε όλα τα θηλαστικά, συμπεριλαμβανομένων ποντικών και ανθρώπων (103). Το BAT αναπτύσσεται νωρίτερα από το WAT κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης (90;104;105). Τα φαιά λιποκύτταρα προκύπτουν από το κεντρικό δερμομυοτόμιο κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης και μοιράζονται την προέλευσή τους με κύτταρα σκελετικών μυών, δερματικά κύτταρα και έναν υποπληθυσμό λευκών λιποκυττάρων ( ). Παρόλο που ο Myf5 αναφέρθηκε αρχικά ως ειδικός δείκτης για τα πρόδρομα κύτταρα από τα οποία προέρχονται τα φαιά λιποκύτταρα και τα μυϊκά κύτταρα (108), πρόσφατες μελέτες σε ποντίκια έδειξαν ότι από τα Myf5-θετικά πρόδρομα κύτταρα προέρχονται επίσης και λευκά λιποκύτταρα, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, γεγονός που δείχνει ότι ο Myf5 είναι μάλλον ένας δείκτης για την κυτταρική θέση, παρά για τον κυτταρικό τύπο (101). Η κατανομή του BAT περιορίζεται κυρίως υπερκλείδια, αυχενικά και παρασπονδυλικά (103;109). Σε σύγκριση με τα ώριμα λευκά, τα φαιά λιποκύτταρα είναι μικρότερα και περιέχουν πολλά μικρότερα σταγονίδια λιπιδίων και περισσότερα μιτοχόνδρια, τα οποία ποικίλουν σε μέγεθος και σχήμα και αποτελούν βασικό λόγο για το χρώμα του ΒΑΤ. Σε περιπτώσεις που απαιτείται παραγωγή θερμότητας γίνεται ενεργοποίηση του BAT, μέσω της λιπόλυσης, όπως περιγράφηκε πιο πάνω. Το ενεργοποιημένο ΒΑΤ καταναλώνει λιπίδια και γλυκόζη, οδηγώντας στην παραγωγή θερμότητας εις βάρος της παραγωγής ενέργειας με μια διαδικασία γνωστή ως θερμογένεση μη εξαρτώμενη από ρίγη (non-shivering thermogenesis, NST). H NST εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη διαζευκτική πρωτεΐνη 1 (Uncoupling Protein 1, UCP1), μια πρωτεΐνη χαρακτηριστική του φαιού λιπώδους ιστού. Η UCP1, είναι υπεύθυνη για την αποσύζευξη της αναπνευστικής αλυσίδας από την οξειδωτική φωσφορυλίωση με αποτέλεσμα να απελευθερώνεται ενέργεια με τη μορφή θερμότητας έναντι ATP στα μιτοχόνδρια (110;111) Παραγωγή ενέργειας και θερμογένεση Ο κύριος μηχανισμός παραγωγής ενέργειας, με τη μορφή ATP, είναι η οξειδωτική φωσφορυλίωση που γίνεται στην εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων. Το μεγαλύτερο μέρος της ελεύθερης ενέργειας που απελευθερώνεται κατά την οξείδωση της γλυκόζης προς CO2 διατηρείται στα συνένζυμα NADH και FADH2 που παράγονται κατά τη διάρκεια της γλυκόλυσης και του κύκλου του κιτρικού οξέος. Κατά την αναπνοή, ηλεκτρόνια απελευθερώνονται από τα NADH και FADH2 και μεταφέρονται μέσω του κυτοχρώματος C (CytC) στο σύμπλοκο IV (οξειδάση του κυτοχρώματος C, COX4) της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Ταυτόχρονα με τη μεταφορά των ηλεκτρονίων κατά 37

38 μήκος της αλυσίδας, μεταφέρονται και πρωτόνια στον διαμεμβρανικό χώρο, με αποτέλεσμα την δημιουργία βαθμίδωσης συγκέντρωσης πρωτονίων γύρω από την εσωτερική μεμβράνη του μιτοχονδρίου. Στη συνέχεια τα πρωτόνια επιστρέφουν μέσω της ATP συνθάσης, λόγω της διαφοράς ηλεκτροχημικού δυναμικού, στο εσωτερικό της μιτοχονδριακής μήτρας. Η ροή τεσσάρων πρωτονίων μέσω της ATP συνθάσης οδηγεί στην φωσφορυλίωση του ADP και στην παραγωγή ενός μορίου ATP (112). Στα μιτοχόνδρια του BAT, η UCP1 είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη που μειώνει τη βαθμίδωση συγκέντρωσης πρωτονίων, που προκαλείται κατά τη μεταφορά των ηλεκτρονίων, μέσω της αύξησης της διαπερατότητας της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης, επιτρέποντας στα πρωτόνια που έχουν αντληθεί στον διαμεμβρανικό χώρο να επιστρέψουν, μέσω αυτής, στη μιτοχονδριακή μήτρα. Η ροή των πρωτονίων μέσω της UCP1 οδηγεί στην παραγωγή θερμότητας, προκαλώντας αποσύζευξη της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης από την αναπνευστική αλυσίδα επιτρέποντας την ταχεία οξείδωση του υποστρώματος με χαμηλό ρυθμό παραγωγής ΑΤΡ (113;114). Εικόνα 6. Οι διεργασίες παραγωγής ενέργειας και θερμογένεσης που επιτυγχάνονται μέσω σύζευξης και αποσύζευξης της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης από την αναπνευστική αλυσίδα, αντίστοιχα.

39 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Σκοπός 39

40 Η HDL είναι μία από τις λιποπρωτεΐνες του πλάσματος που εδώ και πολλά χρόνια προσελκύει το ενδιαφέρον της βιοϊατρικής επιστημονικής κοινότητας, κυρίως λόγω του σημαντικού ρόλου της στην προστασία έναντι της αθηροματικής νόσου (115). Η αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της HDL-χοληστερόλης (HDL-C) και του κινδύνου εμφάνισης στεφανιαίας καρδιοπάθειας (CHD) (10; ) έδειξε ότι υψηλά επίπεδα HDL-C στο πλάσμα προστατεύουν από την ανάπτυξη αθηροματικών πλακών. Ως αποτέλεσμα, η συντριπτική πλειοψηφία των μελετών επικεντρώθηκε στην κατανόηση του ρόλου της HDL-C στην ανθρώπινη παθολογία. Ωστόσο, πιο πρόσφατα δεδομένα από μελέτες σε πειραματικά μοντέλα ποντικιών και κλινικές δοκιμές έδειξαν ότι η λειτουργικότητα των σωματιδίων της HDL, όπως αυτή καθορίζεται από το απολιποπρωτεϊνικό και το λιπιδιακό της περιεχόμενο, είναι πολύ πιο σημαντική για την αθηροπροστασία από ότι τα επίπεδα της HDL-C (10). Tα πιο πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το απολιποπρωτεϊνικό περιεχόμενο της HDL είναι εκείνο που καθορίζει το λιπιδιακό περιεχόμενό της και ο συνδυασμός των δύο ρυθμίζει τη λειτουργικότητα των σωματιδίων της HDL (119), υποδηλώνοντας ότι η κατανόηση του απολιποπρωτεϊνικού περιεχομένου της HDL και των παραγόντων που το επηρεάζουν είναι καθοριστικής σημασίας για την επιτυχή βελτίωση της λειτουργικότητας της HDL. Σε μια κλινική δοκιμή, που ολοκληρώθηκε το 2014 και περιλάμβανε ασθενείς με υπερνοσογόνο παχυσαρκία (ΒΜΙ>50), παρατηρήσαμε σημαντικά επίπεδα HDL σωματιδίων πλούσιων σε APOC3 στο πλάσμα των ασθενών αμέσως πριν από τη βαριατρική χειρουργική επέμβαση, ενώ έξι μήνες μετά τα σωματίδια της HDL αποτελούνταν κυρίως από ΑΡΟΑΙ, ενώ η APOC3 ήταν ελάχιστη (82). Οι μεταβολές του απολιποπρωτεϊνικού περιεχομένου της HDL συσχετίστηκαν με μεταβολές στην ενζυμική δραστικότητα της LCAT και της πρωτεΐνης μεταφοράς χοληστερίνης (CETP), καθώς και στην αντιοξειδωτική ιδιότητα της HDL (82). Αυτές οι κλινικές παρατηρήσεις οδήγησαν στην υπόθεση ότι οι μεταβολές στην περιεκτικότητα της HDL σε APOC3 σχετίζονται με μεταβολές στη λειτουργικότητα των σωματιδίων της HDL, αλλά και με μεταβολές στο συνολικό ενεργειακό μεταβολισμό του οργανισμού. Προκειμένου να εξεταστεί αυτή η υπόθεση, στην παρούσα μελέτη κατασκευάστηκε αδενοϊός που εκφράζει την ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη C3 (AdGFP-APOC3) και χορηγήθηκε σε C57BL/6 ποντίκια, τα οποία εκφράζουν το πλήρες γονιδίωμα, ώστε να επιτευχθούν αυξημένα επίπεδα APOC3 παρόμοια με εκείνα που είχαν ανιχνευθεί προεγχειρητικά στους παχύσαρκους ασθενείς (82). Στη συνέχεια ακολούθησαν μοριακές και βιοχημικές μελέτες, ώστε να διερευνηθούν οι επιδράσεις της αυξημένης έκφρασης της APOC3 στη δομή και στη λειτουργικότητα της HDL. Δεδομένου ότι προηγουμένως παρατηρήθηκε συσχέτιση της APOC3-HDL με τον παθολογικά παχύσαρκο φαινότυπο (82), μελετήθηκε, επίσης, η επίδραση των αυξημένων επιπέδων της APOC3 του πλάσματος στη μιτοχονδριακή δραστηριότητα του λευκού (WAT) και του φαιού (ΒΑΤ) λιπώδους ιστού.

41 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Μέθοδοι 41

42 1 Χειρισμός πειραματόζωων 1.1 Πειραματόζωα Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 40 άγριου τύπου (WT) C57BL/6 ποντίκια, που εκφράζουν το πλήρες γονιδίωμα. Τα ποντίκια ήταν ηλικίας εβδομάδων και χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες μελέτης. Στην πρώτη ομάδα (17 ποντίκια) χορηγήθηκαν 2x10 9 pfu από τον αδενοϊό ελέγχου AdGFP, στη δεύτερη (6 ποντίκια) και στην τρίτη ομάδα (17 ποντίκια) χορηγήθηκαν 5x10 8 και 2x10 9 pfu, αντίστοιχα, από τον αδενοϊό AdGFP-APOC3 που εκφράζει την ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη C3. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, σε κάθε κλουβί διατηρήθηκαν μέχρι πέντε ποντίκια και τους επιτράπηκε απεριόριστη πρόσβαση σε δίαιτα Chow (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG) και σε νερό υπό έναν 12-ωρο κύκλο φωτός/σκότους. Όλες οι μελέτες σε ζώα διέπονται υπό τις κατευθυντήριες γραμμές της ΕΕ όπως περιγράφονται στο Πρωτόκολλο για την Προστασία και την Πρόνοια των Ζώων και διεξάγονται σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Επίσης, εγκρίνονται από την αρμόδια επιτροπή του Κέντρου Εργαστηριακών Ζώων της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών και της Κτηνιατρικής Αρχής του Νομού Δυτικής Ελλάδας. Στα πειράματά μας ελήφθησαν υπόψη τα 3R (μείωση, βελτίωση, αντικατάσταση) και ελαχιστοποιήσαμε τον αριθμό των πειραματόζωων στο απαραίτητο ελάχιστο. 1.2 Λήψη αίματος από την ουραία φλέβα Την ημέρα της ενδοφλέβιας χορήγησης του αδενοϊού, τα ποντίκια, μετά από 4-ωρη νηστεία υποβλήθηκαν σε δειγματοληψία αίματος από την ουραία φλέβα. Για να επιταχυνθεί η δειγματοληψία αίματος και έτσι να μειωθεί το στρες των ζώων, οι κλωβοί των ποντικών τοποθετήθηκαν κάτω από έναν υπέρυθρο λαμπτήρα για 5 λεπτά, μια διαδικασία που αυξάνει τη ροή του αίματος και τη διαστολή των αγγείων Στη συνέχεια, κάθε ποντίκι τοποθετήθηκε σε ειδική παγίδα και η άκρη της ουράς κόπηκε χρησιμοποιώντας ένα νυστέρι (λεπίδας ν. 10). Το αίμα συλλέχθηκε με μασάζ της ουράς σε σωληνάκια τριχοειδούς που περιείχαν EDTA. Στο τέλος της δειγματοληψίας αίματος η ουρά καυτηριάστηκε για να αποφευχθεί περιττή απώλεια αίματος. Το αίμα αναμίχθηκε πλήρως με το EDTA του σωλήνα και φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα rpm. Τέλος το πλάσμα απομονώθηκε και μεταφέρθηκε σε ένα σωληνάκι τύπου eppendorf και αποθηκεύτηκε στους -20 για μελλοντικές αναλύσεις.

43 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού 1.3 Ενδοφλέβια χορήγηση οδενοϊού Πέντε λεπτά πριν από τις ενδοφλέβιες ενέσεις, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν κάτω από έναν υπέρυθρο λαμπτήρα για να εξασφαλιστεί η διαστολή των αιμοφόρων αγγείων. Τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε ειδικές παγίδες και η ουρά ξεπλύθηκε με ένα βαμβάκι εμποτισμένο σε 70% αιθανόλη. Στη συνέχεια, η βελόνα από μία σύριγγα ινσουλίνης εισήχθη παράλληλα σε μία από τις δύο πλευρικές φλέβες της ουράς διεισδύοντας 2-4 mm μέσα στον αυλό ενώ η λοξότμηση της βελόνας διατηρήθηκε προς τα πάνω. Προκειμένου να Εικόνα 7. Ενδοφλέβια ένεση. αποφευχθεί η αιμοδυναμική καταπόνηση, ο όγκος του ενέσιμου διαλύματος διατηρήθηκε σε 0,2 ml. Στα ποντίκια κάθε ομάδας χορηγήθηκαν οι δόσεις των αδενοϊών όπως περιγράφονται στην παράγραφο 1.1 διαλυμένες σε αποστειρωμένο 1x PBS. Όταν ολοκληρώθηκε η ενδοφλέβια χορήγηση, το σημείο εισαγωγής της βελόνας πιέστηκε σταθερά με ένα βαμβάκι εμποτισμένο σε αποστειρωμένο 1x PBS για να αποτραπεί η επαναρροή του χορηγούμενου διαλύματος και/ή του αίματος. 1.4 Ευθανασία και απομόνωση ιστών, πλάσματος και ορού Την πέμπτη ημέρα μετά την ενδοφλέβια χορήγηση του αδενοϊού, τα ποντίκια υπέστησαν ευθανασία και απομονώθηκαν αίμα και ιστοί για περαιτέρω ανάλυση. Η προσέγγισή μας για την ευθανασία ήταν αναισθησία ακολουθούμενη από εξάρθρωση αυχενικών σπονδύλων (αυχενική μετατόπιση). Για την αναισθησία, κάθε ποντίκι τοποθετήθηκε ξεχωριστά σε κουτί που περιείχε βαμβάκι εμποτισμένο με διαιθυλαιθέρα. Το κουτί που χρησιμοποιήθηκε για την αναισθησία ήταν αρκετά μεγάλο ώστε να επιτρέπει την ελεύθερη κυκλοφορία των ζώων. Με την αναισθητοποίηση του ζώου, γινόταν αφαίρεση του ενός οφθαλμού και συλλογή αίματος ( μl) από το οπισθοτροχιακό πλέγμα σε σωλήνάκια που περιείχαν EDTA (για απομόνωση πλάσματος) ή σε απλά αποστειρωμένα σωληνάκια τύπου eppendorf (για απομόνωση ορού). Για την απομόνωση πλάσματος το αίμα φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα rpm, ενώ για την απομόνωση ορού το αίμα επωάστηκε σε υδατόλουτρο των 37 για 15 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα rpm. Το πλάσμα και ο ορός συλλέχθηκαν σε σωληνάκια τύπου eppendorf και αποθηκεύτηκαν στους -20. Μετά από την αυχενική μετατόπιση, συλλέχθηκαν ιστοί (BAT, WAT και ήπαρ), οι οποίοι αφού ξεπλύθηκαν σε τρυβλίο με αποστειρωμένο διάλυμα 1x PBS τοποθετήθηκαν σε σωληνάκια τύπου eppendorf και αποθηκεύτηκαν στους -80 για μελλοντικές αναλύσεις. 43

44 1.5 Κυτταροκαλλιέργειες Όλοι οι χειρισμοί των κυττάρων έγιναν σε θάλαμο ελασματοειδούς ροής ο οποίος είχε αποστειρωθεί με υπεριώδη ακτινοβολία, διάλυμα 1% SDS και 70% αιθανόλη. Η κυτταρική σειρά που χρησιμοποιήθηκε στα in vitro πειράματα ήταν η RAW (μακροφάγα κύτταρα ποντικού), ενώ για την κατασκευή και την τιτλοδότηση των ανασυνδυασμένων αδενοϊών AdGFP και AdGFP-ΑPOC3 χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές HEK293 (ανθρώπινα εμβρυονικά νεφρικά κύτταρα) και 911 (ανθρώπινοι εμβρυονικοί ρετινοβλάστες), αντίστοιχα, από την American Type Culture Collection (ATCC, University Boulevard Manassas, VA USA). Τα κύτταρα αποψύχθηκαν σε υδατόλουτρο 37 C και αμέσως μεταφέρθηκαν σε σωλήνα τύπου falcon των 15 ml που περιείχε 10 ml θερμού μέσου καλλιέργειας DMEM (Πίνακας 1). Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στα rpm και στη συνέχεια, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 5 ml θερμού μέσου καλλιέργειας DMEM και μεταφέρθηκαν σε μια φλάσκα καλλιέργειας Τ25. Οι φλάσκες καλλιέργειας διατηρήθηκαν σε θάλαμο επώασης με παροχή 5% CO2, και θερμοκρασία 37 C. Πίνακας 1. Θρεπτικό μέσο καλλιέργειας DMEM Θρεπτικό μέσο 440 ml DMEM καλλιέργειας (4.5 g/l D- DMEM glucose) 50 ml FBS 5 ml Pen/Strep 5 ml NEAA Όταν τα κύτταρα κάλυπταν σχεδόν ολόκληρη την επιφάνεια του πυθμένα της φλάσκας καλλιέργειας (80-90%), ακολούθησαν δύο πλύσεις με αποστειρωμένο διάλυμα 1x PBS και ξύσιμο των κυττάρων από τον πυθμένα. Στη συνέχεια τα κύτταρα επαναδιαλύθηκαν σε 10 ml μέσου καλλιέργειας DMEM και χωρίστηκαν σε φλάσκες Τ75 ή Τ175, ανάλογα με το στάδιο της διαδικασίας, που περιείχαν 7-10 ml και ml θερμού μέσου καλλιέργειας, αντίστοιχα. Οι φλάσκες καλλιέργειας τοποθετήθηκαν σε θάλαμο επώασης με παροχή 5% CO2, και θερμοκρασία 37 C. Ο διαχωρισμός των κυττάρων γινόταν κάθε δύο με τρεις ημέρες, ανάλογα με την ταχύτητα πολλαπλασιασμού τους. 1.6 Καλλιέργεια τριπλών φλασκών Για την παραγωγή ικανής ποσότητας αδενοϊού απαιτείται μεγάλος αριθμός HEK293 κυττάρων, που επιτυγχάνεται με την καλλιέργεια τριπλών φλασκών. Για καλλιέργεια 8-10 τριπλών φλασκών απαιτούνται 6-8 φλάσκες Τ175. Τα κύτταρα στις Τ175 φλάσκες ξύθηκαν από τον πυθμένα

45 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού και επαναιωρήθηκαν σε 25 ml θερμού μέσου καλλιέργειας DMEM ανά φλάσκα. Στα επαναιωρήματα των κυττάρων προστέθηκαν 720 ml φρέσκου θερμού μέσου καλλιέργειας DMEM και το μίγμα διαμοιράστηκε εξίσου στις τριπλές φλάσκες (περίπου 110 ml/τριπλή φλάσκα). Οι φλάσκες καλλιέργειας τοποθετήθηκαν σε θάλαμο επώασης με παροχή 5% CO2, και θερμοκρασία 37 C. 2 Κατασκευή ανασυνδυασμένου αδενοϊού που εκφράζει την ανθρώπινη απολιποπρω-τεΐνη C3 2.1 Κατασκευή του ανασυνδυασμένου φορέα έκφρασης padtrackcmv-c3g που φέρει το ανθρώπινο APOC3 γονίδιο Για την κατασκευή του ανασυνδυασμένου φορέα έκφρασης padtrackcmv-c3g, αρχικά, ένα τμήμα 4,1 kb (PstI-PstI) που περιείχε ολόκληρο το APOC3 γονίδιο κλωνοποιήθηκε στο puc9 πλασμίδιο ώστε να προκύψει ο puc9-c3g ανασυνδυασμένος φορέας. Στη συνέχεια το 3,35 kb NaeI- PstI τμήμα που περιείχε ολόκληρη την αλληλουχία κωδικοποίησης του APOC3 απομονώθηκε και καθαρίστηκε από πήκτωμα αγαρόζης και τα προεξέχοντα 3 άκρα κόπηκαν με χρήση της T4 DNA πολυμεράσης. Μετά την ένωση του τμήματος με XhoI συνδέτες, το μίγμα κλωνοποιήθηκε στη θέση XhoI του Bluescript(+) φορέα, για τη δημιουργία του Blue-C3g ώστε να γίνει επιλογή του τμήματος που περιείχε τους XhoI συνδέτες. Στη συνέχεια το 3,35 kb τμήμα απομονώθηκε και καθαρίστηκε από πήκτωμα αγαρόζης και συνδέθηκε στη θέση XhoI του φορέα pbmt3x, ώστε να προκύψει o pbmt3x- C3g. Το XhoI-XhoI τμήμα του pbmt3x-c3g που περιείχε ολόκληρη την αλληλουχία του APOC3 γονιδίου, κλωνοποιήθηκε στον pbluescript φορέα και προέκυψαν οι pbluescript-c3g-sense και pbluescript-c3g-antisense. Ο έλεγχος για τη αντινοηματική αλληλουχία έγινε με sequencing. Στον pbluescript-c3g-antisense φορέα το 5 άκρο του APOC3 γονιδίου πλαισιώνεται από μία μοναδική θέση περιορισμού KpnI και το 3 άκρο από μία μοναδική θέση περιορισμού XbaI του pbluescript φορέα. Η κλωνοποίηση του KpnI-XbaI τμήματος του pbluescript-c3g-antisense στις KpnI και XbaI θέσεις του padtrackcmv φορέα, οδήγησε στην κατασκευή του padtrackcmv-c3g φορέα, στον οποίο η γενομική αλληλουχία του APOC3 βρίσκεται υπό τον έλεγχο του προαγωγέα CMV. Η νοηματική αλληλουχία του γενομικού DNA του APOC3 γονιδίου επιβεβαιώθηκε με sequencing. 45

46 Εικόνα 8. Σχηματική απεικόνιση της κατασκευής του padtrackcmv-c3g φορέα. 2.2 Ανασυνδυασμός του του padtrackcmv-c3g με το padeasy-1 σε BJ5183 βακτηριακά κύτταρα Μετά την επιβεβαίωση ότι ο φορέας padtrackcmv-c3g περιέχει τη γονιδιωματική αλληλουχία που κωδικοποιεί την απολιποπρωτεΐνη C3, έγινε πέψη του φορέα με το PmeI ώστε να γίνει ευθυγράμμιση του (ο φορέας φέρει μία μοναδική θέση περιορισμού PmeI). Στη συνέχεια ο φορέας ηλεκτροφορήθηκε σε πήκτωμα αγαρόζης 0,75% w/v, εφαρμόζοντας τάση Volt, ώστε να επιβεβαιωθεί η ευθυγράμμισή του. Το επόμενο βήμα της διαδικασίας περιλάμβανε την απομόνωση του ευθυγραμμισμένου φορέα padtrackcmv-c3g από το πήκτωμα της αγαρόζης, όπως περιγράφεται παρακάτω.

47 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από πήκτωμα αγαρόζης Για την απομόνωση του padtrackcmv-c3g φορέα από το πήκτωμα αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος έκλουσης σε μεμβράνη διαπίδυσης με εφαρμογή ηλεκτρικής τάσης (Electroelution into dialysis bags) (120). Η μέθοδος της έκλουσης του DNA σε μεμβράνη διαπίδυσης με εφαρμογή ηλεκτρικής τάσης χρησιμοποιείται για απομόνωση μεγάλων τμημάτων DNA (με μέγεθος μεγαλύτερο από 5 kb) από πήκτωμα αγαρόζης. Η μέθοδος βασίζεται στην εφαρμογή ηλεκτρικής τάσης 4-5 V/cm για 2-3 ώρες ώστε να γίνει έκλουση του DNA από το πήκτωμα της αγαρόζης στο εσωτερικό τοίχωμα της μεμβράνης του σωλήνα διαπίδυσης ο οποίος περιέχει την απαραίτητη ποσότητα 1x ΤΑΕ που χρειάζεται ώστε να το τμήμα του πηκτώματος που περιέχει το DNA να καλύπτεται πλήρως από το διάλυμα. Στη συνέχεια με εφαρμογή αντίστροφης πολικότητας, για ένα λεπτό, το DNA απελευθερώθηκε από τα τοιχώματα στο εσωτερικό του σωλήνα, από όπου μεταφέρθηκε με μία μικροπιπέτα σε ένα σωληνάκι τύπου eppendorf. Μετά τη συλλογή του το DNA καθαρίστηκε με τη μέθοδο των οργανικών διαλυμάτων (121) Ηλεκτροδιάτρηση (Electroporation) Η ηλεκτροδιάτρηση είναι μια μέθοδος διαμόλυνσης που χρησιμοποιεί έναν ηλεκτρικό παλμό για να δημιουργήσει προσωρινούς πόρους σε κυτταρικές μεμβράνες μέσω των οποίων ουσίες όπως τα νουκλεϊκά οξέα μπορούν να διέλθουν μέσα στα κύτταρα. Είναι μια πολύ αποτελεσματική στρατηγική για την εισαγωγή ξένων νουκλεϊκών οξέων σε πολλούς τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των βακτηριακών και των ευκαρυωτικών κυττάρων (122). Η διαδικασία της ηλεκτροδιάτρησης ήταν η εξής: το ευθυγραμμισμένο DNA του φορέα padtrackcmv-c3g, ο φορέας padeasy-1 και τα βακτηριακά κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μία κυβέτα (0,1 cm gap, brown cap, Biorad), ενώ στη Mock αντίδραση δεν συμπεριλήφθηκαν οι δύο φορείς και χρησιμοποιώντας έναν MicroPulser electroporator (Biorad) εφαρμόστηκε τάση Volt για ms. Η εφαρμογή της τάσης διαταράσσει τη φωσφολιπιδιακή διπλοστοιβάδα της μεμβράνης και έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό προσωρινών πόρων. Το ηλεκτρικό δυναμικό κατά μήκος της κυτταρικής μεμβράνης αυξάνεται ταυτοχρόνως επιτρέποντας στα φορτισμένα μόρια όπως το DNA να οδηγούνται κατά μήκος της μεμβράνης μέσω των πόρων με τρόπο παρόμοιο με την ηλεκτροφόρηση (122). Στη συνέχεια οι αντιδράσεις μεταφέρθηκαν από τις κυβέτες σε σωλήνες τύπου falcon των 15 ml που περιείχαν 580 μl θρεπτικό μέσο S.O.C. (Cat# , Invitrogen ), ώστε να επιτευχθεί 47

48 μεγαλύτερη αποδοτικότητα της διαμόλυνσης των βακτηριακών κυττάρων και επωάστηκαν σε θερμοκρασία 37 C υπό ανάδευση στα 240 rpm για μιάμιση ώρα. Μετά την επώαση κάθε αντίδραση στρώθηκε σε πιάτα άγαρ/καναμικίνης (1:1000 καναμικίνη σε LB άγαρ), τα οποία επωάστηκαν στους 37 C, Ο/Ν. Για κάθε αντίδραση ετοιμάστηκαν τρία τρυβλία που περιείχαν 100 μl, 200 μl και 300 μl από την αντίδραση αντίστοιχα. 2.3 Αποµόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας µε τη μέθοδο της αλκαλικής λύσης (Mini Prep) Μετά το πέρας της επώασης παρατηρήθηκε ότι στα πιάτα της Mock αντίδρασης δεν αναπτύχθηκαν αποικίες, όπως ήταν αναμενόμενο, αφού το γονίδιο ανθεκτικότητας στην καναμικίνη βρίσκεται στον πλασμιδιακό φορέα padtrack-cmv. Από τα άλλα πιάτα επιλέχθηκαν οι πιο μικρές αποικίες, καθώς στις πιο μικρές είναι πιο πιθανό να έχει γίνει ο ανασυνδυασμός του padtrackcmv- C3g με τον padeasy-1, με ένα κίτρινο τιπ και μεταφέρθηκαν μαζί με το τιπ σε σωλήνες τύπου falcon των 15 ml που περιείχαν 5 ml LB broth (1:1000 καναμικίνη). Οι αποικίες επωάστηκαν σε θερμοκρασία 37 C υπό ανάδευση στα 240 rpm, Ο/Ν. Την επόμενη μέρα οι καλλιέργεις φυγοκεντρήθηκαν και τα βακτήρια ξεπλύθηκαν και επαναδιαλύθηκαν σε 1 ml αποστειρωμένου διαλύματος 1x TE. Ένα τμήμα των καλλιεργειών (300 μl) κρατήθηκε, ώστε να γίνουν τα stock γλυκερόλης για εκείνες που θα ήταν θετικές για τον ανασυνδυασμό. Μετά τη δεύτερη φυγοκέντρηση τα βακτήρια επαναδιαλύθηκαν σε 200 μl διαλύματος S1, το οποίο προκαλεί μείωση της ωσμωτικότητας και αφαίρεση H2O από τα κύτταρα και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Στη συνέχεια προστέθηκαν 400 μl διαλύματος S2, το οποίο λύει τα βακτήρια και ακολούθησε επώαση για 20 λεπτά στον πάγο. Τέλος προστέθηκαν 300 μl διαλύματος S3, το οποίο καταβυθίζει το γενομικό DNA, έγινε επώαση για 3 λεπτά στον πάγο και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα rpm για 10 λεπτά. Πίνακας 2. Διαύματα για Mini και Maxi Preps. Διάλυμα 1 (S1) Διάλυμα 2 (S2) Διάλυμα 3 (S3) Glucose 50 mm NaOH O,2 N Potassium acetate 3 M Tris-HCl (ph 8.0) 25 mm 1% SDS Glacial acetic acid 5 M EDTA (ph 8.0) 10 mm Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε καινούριο σωληνάκι τύπου eppendorf και προστέθηκαν 5 μl RNAse A. Ακολούθησε επώαση σε υδατόλουτρο 37 C για 15 λεπτά. Στη συνέχεια προστέθηκε ίσος

49 Μ_1 kb padtrackcmv-c3g padgfp #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού όγκος (1:1) φαινόλης/χλωροφορμίου, ώστε να απομακρυνθούν οι πρωτεΐνες και έγινε φυγοκέντρηση στα rpm για 2 λεπτά. Στην υδατική φάση που μεταφέρθηκε σε νέο σωληνάκι προστέθηκε ίσος όγκος (1:1) χλωροφορμίου και έγινε φυγοκέντρηση στα rpm για 2 λεπτά. Η υδατική φάση μεταφέρθηκε σε νέο σωληνάκι και ακολούθησε καταβύθιση του πλασμιδιακού DNA σε 2V 100% αιθανόλη και 1/10 V οξικό νάτριο με φυγοκέντρηση στα rpm σε θερμοκρασία 4 C, για 30 λεπτά. Τέλος το πλαμιδιακό DNA επαναδιαλύθηκε σε 30 μl 1x TE και αποθηκεύτηκε στους -20 C για μελλοντική χρήση. Για να γίνει έλεγχος του ανασυνδυασμού, το DNA που απομονώθηκε από τις βακτηριακές καλλιέργειες, ηλεκτροφορήθηκε σε πήκτωμα αγαρόζης 0,75% w/v. Σαν μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ένας padgfp (θετικός) φορέας και ο padtrackcmv-c3g (αρνητικός). Εικόνα 9. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι αποικίες #2, 3, 4, 9, 10, 12, 13,14 περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Από τις παραπάνω αποικίες (Εικόνα 9) επιλέχθηκε η #14 για μετασχηματισμό. Οι υπόλοιπες θετικές αποικίες (300 μl) μεταφέρθηκαν σε σωληνάκια τύπου eppendorf όπου αναδεύτηκαν με 70 μl 100% αποστειρωμένη γλυκερόλη και αποθηκεύτηκαν στους -80 C. 2.4 Μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων DH5a με τη μέθοδο του θερμικού σοκ Τα βακτήρια Ε.coli που χρησιμοποιήθηκαν ανήκουν στο στέλεχος DH5a (competent cells) της εταιρείας Invitrogen. Η διαδικασία αυτή έχει σαν στόχο την πρόσληψη του ανασυνδυασμένου πλασμιδιακού φορέα από κατάλληλα επιδεκτικά βακτήρια, ώστε να γίνει πολλαπλασιασμός του πλασμιδιακού DNA μέσω της αντιγραφής και της βακτηριακής διάιρεσης. Η μέθοδος βασίζεται στο 49

50 Μ_1 kb padgfp #14_1 #14_2 #14_3 θερμικό σοκ των κυττάρων. Αρχικά προστέθηκε 1/10 του πλασμιδιακού DNA που απομονώθηκε από την αποικία #14, σε ένα σωλήνα τύπου falcon που περιείχε επιδεκτικά DH5a βακτήρια και έγινε ανάδευση. Ακολούθησε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά, ώστε το πλασμίδιο να έρθει σε επαφή με την βακτηριακή μεμβράνη και μεταφορά σε υδατόλουτρο των 37 C, όπου με επώαση 20 δευτερολέπτων το πλασμίδιο εισήλθε στο εσωτερικό των κυττάρων. Στη συνέχεια ο σωλήνας μεταφέρθηκε στον πάγο και ακολούθησε επώαση για 20 λεπτά. Με τον τρόπο αυτό το πλασμιδιακό DNA «φυλακίστηκε» στο εσωτερικό των κυττάρων. Μετά την επώαση προστέθηκαν 450 μl θρεπτικού μέσου S.O.C. και η αντίδραση επωάστηκε σε θερμοκρασία 37 C υπό ανάδευση στα 240 rpm για μία ώρα. Τέλος τα βακτήρια στρώθηκαν σε πιάτα καναμικίνης και επωάστηκαν σε θερμοκρασία 37 C, Ο/Ν. 2.5 Επιλογή βακτηριακής αποικίας που περιέχει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Την επόμενη μέρα επιλέχθηκαν τρεις αποικίες μεσαίου μεγέθους, όπως περιγράφεται στην παράγραφο 2.3 και μεταφέρθηκαν σε σωλήνες τύπου falcon των 15 ml που περιείχαν 5 ml LB broth (1:1000 καναμικίνη). Οι αποικίες επωάστηκαν σε θερμοκρασία 37 C υπό ανάδευση στα 240 rpm, Ο/Ν. Για να γίνει επιλογή της αποικίας που περιέχει το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο ακολούθησε Mini Prep, όπως περιγράφεται στην παράγραφο ml από κάθε καλλιέργεια ανακαλλιεργήθηκε σε 15 ml LB broth (1:1000 καναμικίνη) για 4 h στους 37 C υπό ανάδευση στα 240 rpm. Όπως έδειξε η ηλεκτροφόρηση του DNA σε πήκτωμα αγαρόζης και οι τρεις αποικίες περιέιχαν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (Εικόνα 10). Για κάθε μία από τις καλλιέργειες των αποικιών 300 μl μεταφέρθηκαν σε σωληνάκια τύπου eppendorf όπου αναδεύτηκαν με 70 μl 100% αποστειρωμένη γλυκερόλη και αποθηκεύτηκαν στους -80 C. Μία από τις καλλιέργειες επιλέχθηκε για ανακαλλιέργεια. Εικόνα 10. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι τρεις αποικίες περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. 2.6 Αποµόνωση πλασμιδιακού DNA μεγάλης κλίμακας µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης (Maxi Prep) Η βακτηριακή καλλιέργεια που επιλέχθηκε μεταφέρθηκε σε κωνική φιάλη που περιείχε 500 ml LB broth (1:1000 καναμικίνη) και επωάστηκε σε θερμοκρασία 37 C υπό ανάδευση στα 240 rpm, Ο/Ν. Την επόμενη μέρα η καλλιέργεια φυγοκεντρήθηκε στα rpm σε θερμοκρασία 4 C, για 10

51 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού λεπτά, ώστε να γίνει συλλογή των βακτηριακών κυττάρων. Στη συνέχεια, ακολούθησε προσθήκη των διαλυμάτων S1, S2 και S3 (βλ. παράγραφο 2.3) ως εξής: - 20 ml S1, για 15 λεπτά στον πάγο (επαναδιάλυση του ιζήματος) - 40 ml S2, για 20 λεπτά στον πάγο υπό ανάδευση - 30 ml S3, για 10 λεπτά στον πάγο σε ηρεμία Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα rpm σε θερμοκρασία 4 C, για 20 λεπτά, προσθήκη 60 ml ισοπροπανόλης στο υπερκέιμενο και φυγοκέντρηση εκ νέου με τις ίδιες συνθήκες, ώστε να επιτευχθεί η καθίζηση του πλάσμιδίου και του RNA. Το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 9 ml 1x ΤΕ και έγινε καταβύθιση του πλασμιδιακού DNA σε 2V αιθανόλη και 1/10 V οξικό νάτριο με φυγοκέντρηση στα rpm σε θερμοκρασία 4 C, για 30 λεπτά. Στη συνέχεια η πελέτα επαναδιαλύθηκε σε 2 ml 1x ΤΕ και μετά από επώαση σε 2 ml διαλύματος χλωριούχου λιθίου, για 10 λεπτά στον πάγο, φυγοκεντρήθηκε στα rpm σε θερμοκρασία 4 C, για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέο σωλήνα τύπου falcon των 15 ml και έπειτα από προσθήκη 40 μl RNAse A, επωάστηκε για 15 λεπτά σε θερμοκρασία 37 C. Ακολούθησε καταβύθιση των πρωτεϊνών σε ίσο όγκο (1:1) φαινόλης/χλωροφορμίου με φυγοκέντρηση στα rpm σε θερμοκρασία 4 C, για 10 λεπτά. Η υδατική φάση μεταφέρθηκε σε νέο σωλήνα τύπου falcon των 15 ml και ακολούθησε καταβύθιση του πλασμιδιακού DNA σε 2V 100% αιθανόλη και 1/10 V οξικό νάτριο με φυγοκέντρηση στα rpm σε θερμοκρασία 4 C, για 30 λεπτά. Τέλος το πλαμιδιακό DNA αποθηκεύτηκε, σε μορφή πελέτας στους -20 C μέχρι τον καθαρισμό του. 2.7 Καθαρισμός πλασμιδιακού DNA με φυγοκέντρηση ισορροπίας σε βαθμίδωση CsCl - βρωμιούχου αιθιδίου Προκειμένου να αποφευχθεί η επιμόλυνση του πλασμιδιακού DNA από το χρωμοσωμικό, ακολούθησε καθαρισμός του πλασμιδιακού DNA με φυγοκέντρηση ισορροπίας σε βαθμίδωση CsCl - βρωμιούχου αιθιδίου. Ο διαχωρισμός πλασμιδιακού και χρωμοσωμικού DNA με φυγοκέντρηση ισορροπίας σε βαθμίδωση CsCl - βρωμιούχου αιθιδίου εξαρτάται από την ποσότητα βρωμιούχου αιθιδίου που μπορεί να συνδεθεί με γραμμικά ή κλειστά κυκλικά μόρια DNA. Το βρωμιούχο αιθίδιο δεσμεύεται στο DNA παρεμβάλλοντας μεταξύ των βάσεων, προκαλώντας το ξετύλιγμα της διπλής έλικας. Αυτό οδηγεί σε αύξηση του μήκους των γραμμικών μορίων DNA και στην δημιουργία υπερ-ελικοειδών στροφών στα κλειστά κυκλικά πλασμιδιακά DNA. Η μέγιστη ποσότητα χρωστικής που μπορεί να συνδέεται με τα 51

52 κυκλικά μόρια είναι μικρότερη από ότι με τα γραμμικά. Η κυμαινόμενη πυκνότητα του συμπλόκου DNA-χρωστικής σχετίζεται αντιστρόφως ανάλογα με την ποσότητα χρωστικής που δεσμεύεται. Έτσι η κυμαινόμενη πυκνότητα του κλειστού κυκλικού συμπλόκου DNA-χρωστικής, όταν το σύμπλοκο είναι σε κορεσμό είναι μεγαλύτερη από εκείνη του γραμμικού συμπλόκου DNA-χρωστικής. Λόγω αυτής της διαφορικής σύνδεσης της χρωστικής, οι πυκνότητες των γραμμικών και των κλειστών κυκλικών μορίων DNA, σε κορεσμό βρωμιούχου αιθιδίου εμφανίζουν διαφορετική διαβάθμιση σε διάλυμα CsCl (123). Η πελέτα του πλασμιδιακού DNA επαναδιαλύθηκε σε 10 ml διαλύματος CsCl και μετά από προσθήκη 100 μl βρωμιούχου αιθιδίου μεταφέθηκε σε σωληνάκια φυγοκέντρησης (quick seal). Ο διαχωρισμός έγινε στα rpm σε θερμοκρασία 15 C, Ο/Ν. Την επόμενη μέρα η μπάντα του πλασμιδιακού DNA απομονώθηκε με τη χρήση μιας σύριγγας των 5 ml με βελόνα 18G, αφού πρώτα χρησιμοποιήθηκε μία βελόνα 18G για να σπάσει το κενό στο σωληνάκι. Το DNA μεταφέρθηκε σε έναν σωλήνα τύπου falcon των 15 ml και προστέθηκαν 5 ml υπέρκορου διαλύματος CsCl-ισοπροπανόλης, ώστε να απομακρυνθεί το βρωμιούχο αιθίδιο. Η διαδικασία επαναλήφθηκε τρεις φορές ώστε να γίνει ο καλύτερος δυνατός καθαρισμός. Και τις τρεις φορές μετά από ανάδευση (vortex) και ηρεμία απομακρύνθηκε η πάνω φάση. Η κάτω φάση που περιείχε το πλαμιδιακό DNA μεταφέρθηκε σε ένα σωλήνα τύπου falcon των 50 ml και έπειτα από προσθήκη 5V (του όγκου πριν τον καθαρισμό) ddh2o και 2V (του όγκου μετά την προσθήκη του ddh2o) 100% παγωμένης αιθανόλης, φυγοκεντρήθηκε στα rpm σε θερμοκρασία 4 C, για 30 λεπτά. Τέλος το πλασμιδιακό DNA επαναδιαλύθηκε σε 300 μl 1x ΤΕ και αποθηκεύτηκε στους -20 C μέχρι την λιποδιαμόλυνση των ευκαρυωτικών κυττάρων. Εικόνα 11. Σωληνάκια φυγοκέντρησης Quick Seal, Beckman 2.8 Παροδική διαμόλυνση ευκαρυωτικών HEK293 κυττάρων με λιποδιαμόλυνση (Lipofection) Το επόμενο βήμα της διαδικασίας κατασκευής του αδενοϊού που εκφράζει την απολιποπρωτεΐνη C3 (AdGFP-APOC3) ήταν η προετοιμασία του πλασμιδιακού DNA για τη διαμόλυνση ευκαρυωτικών HEK293 κυττάρων. Αρχικά έγινε πέψη του DNA με το ένζυμο περιορισμού PacI και μετά το τέλος της αντίδρασης προστέθηκε η κατάλληλη ποσότητα ddh2o ώστε ο όγκος να γίνει 100 μl. Ακολούθησε καταβύθιση του πλασμιδιακού DNA σε 2V 100% αιθανόλη και

53 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού 1/10 V οξικό νάτριο με φυγοκέντρηση στα rpm σε θερμοκρασία 4 C, για 10 λεπτά. Το DNA επαναδιαλύθηκε σε 50 μl 1x HBS και ήταν έτοιμο για τη διαμόλυνση. Η μέθοδος διαμόλυνσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν η λιποδιαμόλυνση, μια τεχνολογία που βασίζεται στο ότι τα θετικά φορτισμένα λιποσώματα σχηματίζουν συσσωματώματα με το αρνητικά φορτισμένο DNA. Τα προκύπτοντα συσσωματώματα φέρουν ένα θετικό καθαρό φορτίο με αποτέλεσμα να έλκονται από την αρνητικά πολωμένη κυτταρική μεμβράνη και εισέρχονται στα κύτταρα στόχους μέσω ενδοκυττάρωσης. Τα κύρια πλεονεκτήματα της λιποδιαμόλυνσης είναι η υψηλή αποτελεσματικότητά της, η ικανότητά της να μεταφέρει όλα τα είδη νουκλεϊκών οξέων σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών τύπων, η αναπαραγωγιμότητα και η χαμηλή τοξικότητα. Το αντιδραστήριο που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Dosper liposomal transfection reagent (Cat# ). Ετοιμάστηκαν δύο σωλήνες τύπου falcon των 15 ml ως εξής: μl 1x HBS + 10 μl DNA μl 1x HBS + 18 μl Dosper reagent Το περιεχόμενο του πρώτου σωλήνα προστέθηκε στάγδην στον δεύτερο και στη συνέχεια ακολούθησε επώαση για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ώστε να σχηματιστούν τα συσσωματώματα. Τέλος το μίγμα προστέθηκε στάγδην σε φλάσκες καλλιέργειας που περιείχαν HEK293 κύτταρα σε DMEM και οι φλάσκες καλλιέργειας τοποθετήθηκαν σε θάλαμο επώασης με παροχή 5% CO2 και θερμοκρασία 37 C, Ο/Ν. Την επόμενη τα κύτταρα πλύθηκαν με 1x PBS και η καλλιέργειά τους συνεχίστηκε με DMEM που περιείχε 2% HIHS (Heat Inactivated Horse Serum). Μετά από 2-3 ημέρες τα κύτταρα παρατηρήθηκαν σε μικροσκόπιο φθορισμού ώστε να εξακριβωθεί, μέσω του φθορισμού τους λόγω της έκφρασης της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP), η επιτυχής μόλυνσή τους. Έπειτα από διαδοχικές μολύνσεις φλασκών T75 και T175, υπήρχε αρκετή ποσότητα ιού ώστε να γίνει η μόλυνση των τριπλών φλασκών. 2.9 Μόλυνση τριπλών φλασκών και συλλογή των κυττάρων Για έναν τελικό αδενοϊικό τίτλο 2-5x10 10 pfu/ml, απαιτούνται 8-10 τριπλές φλάσκες και ml μέσου μόλυνσης (DMEM, 2% HIHS). Σε αυτή την ποσότητα μέσου προστέθηκαν 20 ml μολυσματικών κυττάρων από τις Τ175 φλάσκες και το μέσο μοιράστηκε εξίσου στις 10 τριπλές φλάσκες. Μετά από ώρες επώασης σε συνθήκες παροχής 5% CO2 και θερμοκρασία 37 C, παρήχθησαν μεγάλες ποσότητες αδενοϊού. Η συλλογή των κυττάρων έγινε όταν ο φθορισμός, που προκαλείται από την παραγωγή της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) εξαιτίας του 53

54 πολλαπλασιασμού του γενετικού υλικού του ανασυνδυασμένου αδενοϊού, ήταν στο μέγιστο και όταν παρατηρήθηκε η αποκόλλησή των κυττάρων από την επιφάνεια των φλασκών. Tα κύτταρα ΗΕΚ293 συλλέχθηκαν από τις τριπλές φλάσκες σε σωλήνες τύπου falcon των 50 ml και φυγοκεντρήθηκαν για 10 λεπτά στα rpm. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το ίζημα που περιείχε τον αδενοϊό επαναιωρήθηκε σε 2 ml DMEM και αποθηκεύτηκε στους -80 C μέχρι τον καθαρισμό του αδενοϊού Απομόνωση και καθαρισμός αδενοϊού Ο καθαρισμός του αδενοϊού ξεκίνησε με τη λύση των ΗΕΚ293 κυττάρων ακολουθώντας 3 κύκλους ψύξης στους -80 C και απόψυξης στους 37 C και φυγοκέντρηση στα rpm, σε θερμοκρασία 4 C, για 10 λεπτά, ώστε να γίνει απελευθέρωση του αδενοϊού στο υπερκείμενο. Στη συνέχεια 2 ml διαλύματος AV1 και 4 ml διαλύματος AV2 προστέθηκαν σε ένα διαυγές σωληνάκι φυγοκέντρησης, προσέχοντας να μην γίνει ανάμειξη των διαλυμάτων και να δημιουργηθούν δύο ζώνες. Το πλούσιο σε αδενοϊό εκχύλισμα από τα λυμένα ΗΕΚ293 κύτταρα προστέθηκε στην κορυφή του διαλύματος AV2 και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα rpm, σε θερμοκρασία 15 C, για 2 ώρες, ώστε να γίνει διαχωρισμόw του αδενοϊού από τα υπολείμματα των κυττάρων. Μετά την υπερφυγοκέντρηση σχηματίστηκε μια λευκή ζώνη μεταξύ των δύο διαλυμάτων, η οποία περιείχε το γενετικό υλικό τόσο του ιού όσο και των κυττάρων. Αυτή η ζώνη αναρροφήθηκε χρησιμοποιώντας μια σύριγγα των 5 ml και μία βελόνα 18G. Προκειμένου να γίνει ο καθαρισμός του αδενοϊού και να εξαλειφθεί η πιθανότητα επιμόλυνσης με το DNA των κυττάρων, η ζώνη μεταφέρθηκε σε ένα σωληνάκι φυγοκέντρησης (quick seal), το οποίο γέμισε με διάλυμα AV3 και φυγοκεντρήθηκε στα rpm, σε θερμοκρασία 15 C για ώρες. Την επόμενη μέρα είχαν σχηματιστεί δύο ζώνες, από τις οποίες η κατώτερη περιείχε τον αδενοϊό. Η ζώνη αναρροφήθηκε χρησιμοποιώντας μία σύριγγα των 5 ml και μια βελόνα 18G, αφού πρώτα χρησιμοποιήθηκε μία βελόνα 18G για να σπάσει το κενό στο σωληνάκι. Τέλος ο αδενοϊός μεταφέρθηκε σε κασέτα διαπίδυσης, που είχε ενυδατωθεί για 5 λεπτά σε διάλυμα 1x TD (Ca 2+ Mg 2+ ), και επωάστηκε σε ένα ποτήρι ζέσεως με διάλυμα 1x TD (Ca 2+ Mg 2+ ), υπό ανάδευση, σε θερμοκρασία 4 C. Το ρυθμιστικό διάλυμα 1x TD (Ca 2+ Mg 2+ ) δημιούργησε ένα υποτονικό περιβάλλον το οποίο επέτρεψε την απομάκρυνση του CsCl από την ημιπερατή μεμβράνη της κασέτας διαπίδυσης. Το διάλυμα 1x TD (Ca 2+ Mg 2+ ) ανανεώθηκε τουλάχιστον τρεις φορές και μετά από 16 ώρες αντικαταστάθηκε με ισοτονικό διάλυμα σακχαρόζης (1x Sucrose Buffer) για τρεις επιπλέον ώρες. Αμέσως μετά, ο αδενοϊός συλλέχθηκε από την κασέτας διαπίδυσης και ισομοιράστηκε

55 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού (100 μl/vial) σε σωληνάκια κατάλληλα για πολύ χαμηλές θερμοκρασίες (cryovials), τα οποία αποθηκεύτηκαν στους -80 C. Πίνακας 3. Διαλύματα για την φυγοκέντρηση. AV1 AV2 AV3 610 g CsCl 277 g CsCl 450 g CsCl έως 1000 ml TE, ph 8 έως 1000 ml TE, ph 8 έως 1000 ml TE, ph 8 Πίνακας 4. Διαλύματα για την διαπίδυση. 10x Sucrose Solution (50%) 10x Salt Buffer 1x Sucrose Buffer 250 g Sucrose 163,6 g NaCl 100 ml 10x Sucrose Solution έως 500 ml ddh2o 17,6 g Na2HPO4 100 ml 10x Salt Buffer αποστείρωση και αποθήκευση στους 4 4 g KH2PO4 έως 1000 ml ddh2o έως 2000 ml ddh2o αποθήκευση στους 4 ph 7.8, αποστείρωση και αποθήκευση στους 4 Πίνακας 5. Διαλύματα για την διαπίδυση. 10x TD 200x Ca 2+ /Mg 2+ 1x TD (Ca 2+ /Mg 2+ ) 80,1 g NaCl 13,2 g CaCl2 100 ml 10x TD 3,7 g KCl 10,2 g MgCl2 5 ml 200x Ca 2+ /Mg 2+ 1,3 g Na2HPO4 έως 500 ml ddh2o έως 1000 ml ddh2o 30,3 g Tris base αποστείρωση και αποθήκευση στους 4 αποθήκευση στους 4 έως 1000 ml ddh2o ph 7.8, αποστείρωση και αποθήκευση στους Τιτλοδότηση αδενοϊού με καταμέτρηση πλακών 55

56 Για την τιτλοδότηση των αδενοϊών AdGFP και AdGFP-APOC3 καλλιεργήθηκαν κύτταρα 911 και ισομοιράστηκαν σε 12 κελιά δύο πιάτων 6 κελιών, ένα για κάθε αδενοϊό. Όταν η πληρότητά τους ήταν 80-90%, έγιναν δύο πλύσεις με αποστειρωμένο διάλυμα 1x PBS και ακολούθησε η μόλυνση με τους αδενοϊούς. Από κάθε αδενοϊό χρησιμοποιήθηκαν 20 μl και έγιναν διαδοχικές αραιώσεις σε Serum Free Medium όπως φαίνεται στην εικόνα 12. Σε κάθε κελί προστέθηκαν 500 μl από την αντίστοιχη αραίωση, έγινε ανάδευση με κυκλικές κινήσεις και ακολούθησε επώαση στους 37 για 15 λεπτά. Τα κελιά αριθμήθηκαν ως εξής: -2, -4, -6, -8, -9, -10 όπου οι αριθμοί αυτοί υποδηλώνουν την τάξη του ιού στη συγκεκριμένη αραίωση (πχ. αν προκύψουν 5 πλάκες από το υλικό του σωλήνα με τον αριθμό 9, τότε ο ιός έχει μολυσματικότητα της τάξης των 5x10 9 pfu/ml). Κατά τη διάρκεια της επώασης ετοιμάστηκε το μίγμα επικάλυψης όπως φαίνεται στον πίνακα 6, σε θερμοκρασία 37. Πίνακας 6. Συστατικά μίγματος επικάλυψης. Μίγμα επικάλυψης 13 ml 2Χ F-15 5 ml HIHS 1 ml NEAA 1 ml L- Glut 20 ml 2X Agar Εικόνα 12. Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας τιτλοδότησης των αδενοϊών. Μετά το πέρας των 15 λεπτών της επώασης απομακρύνθηκε το μολυσματικό θρεπτικό μέσο και προστέθηκαν στάγδην 2 ml μίγματος επικάλυψης/κελί. Τα πιάτα έμειναν μέσα στην απενεργοποιημένη εστία για 3-5 λεπτά μέχρι να σταθεροποιηθεί το μίγμα και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε επωαστή 37 για περίπου δύο εβδομάδες. Κατά τη διάρκεια των δύο εβδομάδων τα πιάτα ελέγχονταν τακτικά σε μικροσκόπιο φθορισμού για την ύπαρξη πλακών. Τα κύτταρα που είχαν μολυνθεί από τον ιό είχαν μολύνει και τα

57 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού γειτονικά τους κύτταρα με αποτέλεσμα την εμφάνιση κενών περιοχών (νεκρά κύτταρα λόγω της μόλυνσης από τον αδενοϊό) μεταξύ του ομοιογενούς στρώματος των κυττάρων. Κάθε τέτοια κενή περιοχή μετρήθηκε ως μια πλάκα και ο συνολικός αριθμός των πλακών χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση της μολυσματικότητας του αδενοϊού όπως προαναφέρθηκε. 57

58 3 Βιοχημικές αναλύσεις 3.1 Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών πλάσματος και ορού με υπερφυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας KBr Οι λιποπρωτεΐνες του πλάσματος και του ορού διαχωρίζονται με βάση την πυκνότητά τους λόγω της διαφορετικής λιπιδικής και πρωτεϊνικής σύστασης, με υπερφυγοκέντρηση σε βαθμίδωση πυκνότητας βρωμιούχου καλίου (KBr). Τα δείγματα του πλάσματος των ποντικιών κάθε ομάδας αναμίχθηκαν σε ένα τελικό δείγμα (για κάθε ομάδα) όγκου 400 μl στο οποίο προστέθηκαν 0,145 g KBr ώστε η πυκνότητα να είναι 1,23 g/ml. Τα υπόλοιπα διαλύματα προστέθηκαν προσεκτικά από το πυκνότερο στο αραιότερο, ώστε να σχηματιστούν οι ζώνες της βαθμίδωσης πυκνότητας μεταξύ των διαλυμάτων, όπως φαίνεται στην εικόνα 13. Τα σωληνάκια ισοζυγίστηκαν με 1x PBS και φυγοκεντρήθηκαν στα rpm, σε θερμοκρασία 15, για ώρες. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, συλλέχθηκαν δέκα κλάσματα των 400 μl (Εικόνα 13) και υποβλήθηκαν σε διαπίδυση. Εικόνα 13. Σχηματική απεικόνιση της κλασματοποίησης των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος

59 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Πίνακας 7. Διαλύματα που χρησιμοποιούνται στην υπερφυγοκέντρηση του πλάσματος. Διάλυμα KBr 1 (S1) (1,21 g/ml) Διάλυμα KBr 2 (S2) (1,063 g/ml) Διάλυμα KBr 3 (S3) (1,019 g/ml) 16,4 g KBr 4,61 g KBr 1,365 g KBr έως 50 ml ddh2o έως 50 ml ddh2o έως 50 ml ddh2o Τα δείγματα του ορού των ποντικιών κάθε ομάδας αναμίχθηκαν σε ένα τελικό δείγμα (για κάθε ομάδα) όγκου 500 μl στο οποίο προστέθηκαν 0,41 g KBr και 13,3 μl 0.1 M EDTA.Na2. Στο μίγμα προστέθηκε η κατάλληλη ποσότητα S3 ώστε ο όγκος να γίνει 1,27 ml. Τα υπόλοιπα διαλύματα προστέθηκαν προσεκτικά από το πυκνότερο στο αραιότερο, ώστε να σχηματιστούν οι ζώνες της βαθμίδωσης πυκνότητας μεταξύ των διαλυμάτων, όπως φαίνεται στην εικόνα 14. Τα σωληνάκια ισοζυγίστηκαν με 1x PBS και φυγοκεντρήθηκαν στα rpm, σε θερμοκρασία 4, για ώρες. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, συλλέχθηκαν τέσσερα κλάσματα (Εικόνα 14) και υποβλήθηκαν σε διαπίδυση. Για να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα επιμόλυνσης των δειγμάτων από LPS κατά τη διάρκεια της απομόνωσης και της παρασκευής, όλα τα διαλύματα αποστειρώθηκαν σε υγρό αυτόκαυστο και όλα τα πλαστικά αποστειρώθηκαν με αιθανόλη 70% και αφέθηκαν να στεγνώσουν Ο/Ν σε θάλαμο ελασματοειδούς ροής εξοπλισμένο με υπεριώδες φως. Εικόνα 14. Σχηματική απεικόνιση της κλασματοποίησης των λιποπρωτεϊνών του ορού. 59

60 Πίνακας 8. Διαλύματα που χρησιμοποιούνται στην υπερφυγοκέντρηση του ορού. 0.1 M EDTA.Na2 Διάλυμα KBr 1 (S1) (1,063 g/ml) Διάλυμα KBr 2 (S2) (1,019 g/ml) Διάλυμα KBr 3 (S3) (1,0063 g/ml) 3,72 g EDTA.Na2 3 ml EDTA.Na2 0.1 M 3 ml EDTA.Na2 0.1 M 3 ml EDTA.Na2 0.1 M έως 100 ml ddh2o 5,71 g NaCl 5,71 g NaCl 5,71 g NaCl 40,13 g KBr 8,92 g KBr 0 g KBr έως 500 ml ddh2o έως 500 ml ddh2o έως 500 ml ddh2o ph 7.4, αποστείρωση και αποθήκευση στους 4 ph 7.4, αποστείρωση και αποθήκευση στους 4 ph 7.4, αποστείρωση και αποθήκευση στους Διαπίδυση λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων Η μέθοδος χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων από τα διαλύματα KBr. Τα κλάσματα που συλλέχθηκαν μετά την υπερφυγοκέντρηση, τοποθετήθηκαν σε γυάλινα σωληνάκια, τα οποία σφραγίστηκαν με ειδική μεμβράνη διαπίδυσης με όριο 10 kda (Medicell International LtD) και βυθίστηκαν σε ddh2o, ώστε τα μικρά διαλυτά μόρια να έρθουν σε ισορροπία μεταξύ των δύο πλευρών της μεμβράνης. Τα σωληνάκια βυθίστηκαν ανάστροφα σε ένα ποτήρι ζέσεως που περιείχε ddh2o και τοποθετήθηκαν στους 4 ο C πάνω σε μαγνητικό αναδευτήρα για 2 ώρες. Το διάλυμα ανανεώθηκε 2-3 φορές σε διάστημα 5 ωρών και τέλος αφέθηκε στους 4 ο C πάνω σε μαγνητικό αναδευτήρα για 24 ώρες. Τα κλάσματα μεταφέρθηκαν σε σωληνάκια τύπου eppendorf και αποθηκεύτηκαν στους -20 ο C. Για να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα επιμόλυνσης των δειγμάτων από LPS κατά τη διάρκεια της απομόνωσης και της παρασκευής, όλα τα διαλύματα αποστειρώθηκαν σε υγρό αυτόκαυστο και όλα τα πλαστικά αποστειρώθηκαν με αιθανόλη 70% και αφέθηκαν να στεγνώσουν Ο/Ν σε θάλαμο ελασματοειδούς ροής εξοπλισμένο με υπεριώδες φως. 3.3 Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης Ο προσδιορισμός των επιπέδων της ολικής χοληστερόλης έγινε με το Cholesterol FS Kit (Diasys Diagnostic Systems GmbH, Germany). Τα δείγματα γνωστής συγκέντρωσης (standards) και το πλάσμα (7,5 μl) ή τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα (20 μl) φορτώθηκαν σε πλάκες 96 κελιών και αναμίχθηκαν με 100 μl χρωμογόνου διαλύματος. Έπειτα από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, για 20 λεπτά, υπό ανάδευση στα 450 rpm, έγινε φωτομέτρηση στα 490 nm.

61 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Η αντίδραση ξεκινά με την υδρόλυση εστέρων χοληστερόλης από την εστεράση της χοληστερόλης σε χοληστερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα. Στη συνέχεια η χοληστερόλη οξειδώνεται από την οξειδάση της χοληστερόλης και απελευθερώνεται υπεροξείδιο του υδρογόνου. Τέλος, το υπεροξείδιο του υδρογόνου αντιδρά με το υδροξυ-βενζοϊκό οξύ και την 4-αμινοαντιπυρίνη μέσω της υπεροξειδάσης για να σχηματίσει τη χρωστική κινονεϊμίνη, η οποία απορροφά στα 490 nm. Με βάση αυτή την απορρόφηση, η συγκέντρωση των δειγμάτων υπολογίζεται από την πρότυπη καμπύλη των δειγμάτων γνωστής συγκέντρωσης. 3.4 Προσδιορισμός επιπέδων ελεύθερης χοληστερόλης Ο προσδιορισμός των επιπέδων της ελεύθερης (μη εστεροποιημένης) χοληστερόλης έγινε με το Free Cholesterol E Kit (Wako, Japan). Τα δείγματα γνωστής συγκέντρωσης (standards) και το πλάσμα (7,5 μl) ή τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα (20 μl) φορτώθηκαν σε πλάκες 96 κελιών και αναμίχθηκαν με 75 μl χρωμογόνου διαλύματος. Έπειτα από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, για 45 λεπτά, υπό ανάδευση στα 450 rpm, έγινε φωτομέτρηση στα 655 nm. Η μέθοδος βασίζεται στο ότι η ελεύθερη χοληστερόλη αντιδρά με την οξειδάση της χοληστερόλης και παράγει υπεροξείδιο του υδρογόνου το οποίο αντιδρά με την ένωση DAOS [Nethyl-N-(2-hydroxy-3sulfopropyl)-3,5-domethoxyaniline] και την 4-αμινοαντιπυρίνη παράγοντας μια μπλε χρωστική που απορροφά στα 655 nm. Με βάση αυτή την απορρόφηση, η συγκέντρωση των δειγμάτων υπολογίζεται από την πρότυπη καμπύλη των δειγμάτων γνωστής συγκέντρωσης. 3.5 Προσδιορισμός επιπέδων φωσφολιπιδίων Ο προσδιορισμός των επιπέδων των φωσφολιπιδίων έγινε με το Phospholipid C Kit (Wako, Japan). Τα δείγματα γνωστής συγκέντρωσης (standards) και το πλάσμα (7,5 μl) ή τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα (20 μl) φορτώθηκαν σε πλάκες 96 κελιών και αναμίχθηκαν με 75 μl χρωμογόνου διαλύματος. Έπειτα από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, για 45 λεπτά, υπό ανάδευση στα 450 rpm, έγινε φωτομέτρηση στα 490 nm. Η μέθοδος βασίζεται στην υδρόλυση των φωσφολιπιδίων από την φωσφολιπάση D, που οδηγεί στην παραγωγή χολίνης. Η χολίνη οξειδώνεται από την οξειδάση της χολίνης προς βεταΐνη και υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το παραγόμενο υπεροξείδιο του υδρογόνου ωθεί την ένωση DAOS και την 4-αμινοαντιπυρίνη σε μια ποσοτική οξειδωτική συμπύκνωση που καταλύεται από την υπεροξειδάση, παράγοντας μία κόκκινη χρωστική, η οποία απορροφά στα 490 nm. Με βάση αυτή την 61

62 απορρόφηση, η συγκέντρωση των δειγμάτων υπολογίζεται από την πρότυπη καμπύλη των δειγμάτων γνωστής συγκέντρωσης. 3.6 Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων Ο προσδιορισμός των επιπέδων των τριγλυκεριδίων έγινε με το Triglycerides FS Kit (Diasys Diagnostic Systems GmbH, Germany). Τα δείγματα γνωστής συγκέντρωσης (standards) και το πλάσμα (7,5 μl) ή τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα (20 μl) φορτώθηκαν σε πλάκες 96 κελιών και αναμίχθηκαν με 100 μl χρωμογόνου διαλύματος. Έπειτα από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, για 20 λεπτά, υπό ανάδευση στα 450 rpm, έγινε φωτομέτρηση στα 540 nm. Η αντίδραση ξεκινά με τη διάσπαση των τριγλυκεριδίων από τη λιποπρωτεϊνική λιπάση σε γλυκερόλη και λιπαρά οξέα. Η γλυκερόλη φωσφορυλιώνεται από το ATP μέσω της κινάσης της γλυκερόλης σε 3-φωσφορική γλυκερόλη, η οποία οξειδώνεται από την οξειδάση της φωσφορικής γλυκερόλης σε φωσφορική διϋδροξυακετόνη με ταυτόχρονη απελευθέρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου. Τέλος, το υπεροξείδιο του υδρογόνου αντιδρά με την 4-αμινοαντιπυρίνη και την 4- χλωροφαινόλη μέσω της υπεροξειδάσης για να σχηματίσει τη χρωστική κινονεϊμίνη, η οποία απορροφά στα 540nm. Με βάση αυτή την απορρόφηση, η συγκέντρωση των δειγμάτων υπολογίζεται από την πρότυπη καμπύλη των δειγμάτων γνωστής συγκέντρωσης. 3.7 Προσδιορισμός επιπέδων γλυκόζης Ο προσδιορισμός των επιπέδων της γλυκόζης έγινε με το Glucose GOD FS Kit (Diasys Diagnostic Systems GmbH, Germany). Τα δείγματα γνωστής συγκέντρωσης (standards) και ο ορός (7,5 μl) φορτώθηκαν σε πλάκες 96 κελιών και αναμίχθηκαν με 100 μl χρωμογόνου διαλύματος. Έπειτα από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, για 20 λεπτά, υπό ανάδευση στα 450 rpm, έγινε φωτομέτρηση στα 540 nm. Η αντίδραση ξεκινά με την οξείδωση της γλυκόζης από την οξειδάση της γλυκόζης (GOD) για τον σχηματισμό γλυκονικού οξέος και την ταυτόχρονη απελευθέρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου αντιδρά με την 4-αμινοαντιπυρίνη και την φαινόλη μέσω της υπεροξειδάσης για να σχηματίσει τη χρωστική κινονεϊμίνη, η οποία απορροφά στα 540nm. Με βάση αυτή την απορρόφηση, η συγκέντρωση των δειγμάτων υπολογίζεται από την πρότυπη καμπύλη των δειγμάτων γνωστής συγκέντρωσης. 3.8 Προσδιορισμός επιπέδων ολικής πρωτεΐνης (Lowry)

63 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Ο προσδιορισμός των επιπέδων της ολικής πρωτεΐνης στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα έγινε με το DC TM Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Τα δείγματα γνωστής συγκέντρωσης (standards) προετοιμάστηκαν με διαδοχικές αραιώσεις διαλύματος BSA (20 mg/ml). Τα standards και τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα (5 μl) φορτώθηκαν σε πλάκες 96 κελιών και αναμίχθηκαν με 25 μl χρωμογόνου αντιδραστηρίου A (20 μl S+1 ml A) και 200 μl χρωμογόνου αντιδραστηρίου B. Έπειτα από επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, για 15 λεπτά, υπό ανάδευση στα 450 rpm, έγινε φωτομέτρηση στα 750 nm. Η μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση της πρωτεΐνης με το αλκαλικό διάλυμα τρυγικού χαλκού και το αντιδραστήριο Folin. Η αντίδραση μεταξύ πρωτεΐνης και χαλκού σε ένα αλκαλικό μέσο και η επακόλουθη μείωση του αντιδραστηρίου Folin, με απώλεια 1, 2 ή 3 ατόμων οξυγόνου, από την κατεργασμένη με χαλκό πρωτεΐνη, οδηγούν στον σχηματισμό μίας κυανής χρωστικής που απορροφά στα 750 nm. Με βάση αυτή την απορρόφηση, η συγκέντρωση των δειγμάτων υπολογίζεται από την πρότυπη καμπύλη των δειγμάτων γνωστής συγκέντρωσης. 3.9 Μέτρηση ενζυμικής δραστικότητας στο πλάσμα του αίματος Προσδιορισμός της δραστικότητας του ενζύμου LCAT Η δραστικότητα του ενζύμου LCAT μετρήθηκε σε πλάσμα χρησιμοποιώντας το LCAT Activity Assay Fluorometric Kit, (cat# , Calbiochem, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το πλάσμα επωάζεται με ένα φθορίζον υπόστρωμα που εκπέμπει στα 470 nm. Με την επώαση, το υπόστρωμα υδρολύεται από την LCAT και απελευθερώνεται ένα μονομερές που εκπέμπει φθορισμό στα 390 nm. Η δραστικότητα της LCAT υπολογίζεται από τον λόγο εκπομπής του υδρολυμένου υποστρώματος προς την εκπομπή του μη υδρολυμένου υποστρώματος (390 nm/470 nm). Για κάθε δείγμα η αντίδραση προετοιμάστηκε όπως φαίνεται στον πίνακα 9. Πίνακας 9. Αντίδραση για τον προσδιορισμό της δραστικότητας της LCAT. 4 μl 0,5 μl LCAT 100 μl LCAT Assay Αντίδραση πλάσμα Substrate Buffer Επώαση για 4 ώρες σε θερμοκρασία 37 C Μετά το τέλος της επώασης, 50 μl της αντίδρασης αναμίχθηκαν με 150 μl Read Reagent Buffer και το μίγμα φορτώθηκε σε πιάτο 96 κελιών (polypropylene, black flat bottom). Ο φθορισμός μετρήθηκε σε μήκος κύματος διέγερσης 340 nm και μήκος κύματος εκπομπής 390 nm και 470 nm. 63

64 Πίνακας 10. Διαλύματα για τη μέτρηση της δραστικότητας της LCAT. LCAT Assay Buffer Read Reagent Reconstitution Buffer Read Reagent (RRRB) Buffer 8,766 g NaCl 8,766 g NaCl 148,25 μl RRRB 10 ml Tris-HCl (1M, ph 7.4) 10 ml Tris-HCl (1M, ph 7.4) 1,75 μl Read Reagent 270 μl 2-mercaptoethanol 2 ml EDTA (0,5M, ph 8) 2 ml EDTA (0,5M, ph 8) ph 7.4 ph 7.4 έως 1000 ml ddh2o έως 1000 ml ddh2o Προσδιορισμός της δραστικότητα του ενζύμου Lp-PLA2 Η δραστικότητα του ενζύμου Lp-PLA2 μετρήθηκε σε πλάσμα με μία τροποποιημένη μέθοδο καθίζησης με τριχλωροοξικό οξύ, χρησιμοποιώντας [ 3 H]-PAF (1-O-hexadecyl-2-[3H-acetyl]-snglycero-3-phosphocholine) (10 Ci/mmol; DuPont-New England Nuclear, Boston, MA), ως υπόστρωμα σε τελική συγκέντρωση 100 μμ (124). Εν συντομία, 50 μl αραιωμένου πλάσματος (1:25, ν/ν σε HEPES Buffer), χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή του ενζύμου και αναμίχθηκαν με HEPES Buffer σε τελικό όγκο 90 μl. Έπειτα από την προσθήκη φρέσκου υποστρώματος (2 mm [3Η]- PAF σε 2,5 mg/ml BSA), η αντίδραση πραγματοποιήθηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία 37 C. Ως τυφλό χρησιμοποιήθηκε HEPES Buffer που δεν περιείχε πλάσμα. Η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη 20 μl παγωμένου υδατικού διαλύματος αλβουμίνης (100 mg/ml BSA) και επώαση για 10 λεπτά σε θερμοκρασία 4 C. Στη συνέχεια προστέθηκαν 80 μl παγωμένου διαλύματος τριχλωροοξικού οξέος (20% TCA) και το μίγμα επωάστηκε για επιπλέον 30 λεπτά σε θερμοκρασία 4 C. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα g για 5 λεπτά σε θερμοκρασία 4 C και 100 μl υπερκείμενου μεταφέρθηκαν σε 2 ml υγρού σπινθηρισμού. Η ποσότητα του [ 3 Η] ιχνηθέτη προσδιορίστηκε σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού (Packard Tri-Card 2100). Η δραστικότητα του ενζύμου Lp-PLA2 εκφράστηκε ως nmol PAF/ml/min (124). Ο προσδιορισμός της δραστικότητας του ενζύμου Lp-PLA2 έγινε στο εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, Πίνακας 11. Διάλυμα για την αραίωση του πλάσματος. HEPES Buffer HEPES 4,2 mm NaCl 137 mm KCI 2,6 mm EDTA 2 mm ρη 7.4

65 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού 3.10 Προσδιορισμός του αντιοξειδωτικού δυναμικού της HDL Η αντιοξειδωτική δράση της HDL προσδιορίστηκε με μία τροποποιημένη διαδικασία της μεθόδου της διϋδροροδαμίνης 123 (125), η οποία βασίζεται στην ικανότητα της DHR 123 να οξειδώνεται προς το φθορίζον προϊόν ροδαμίνη 123. Η οξείδωση γίνεται με γραμμικό ρυθμό μεταξύ 10 και 60 λεπτών της ώρας, όταν η DHR 123 έρχεται σε επαφή με τον ατμοσφαιρικό αέρα, και μπορεί να αποτραπεί παρουσία λειτουργική HDL. Μετά την κλασματοποίηση και τη διαπίδυση των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος (βλ. παράγραφο 3.1 και 3.2), τα κλάσματα της HDL κάθε ομάδας αναμίχθηκαν σε ένα τελικό δείγμα (για κάθε ομάδα) και έγινε μέτρηση της ολικής χοληστερόλης. Τα δείγματα διατηρήθηκαν σε ατμόσφαιρα αζώτου. Για κάθε δείγμα η αντίδραση ετοιμάστηκε σε πιάτο 96 κελιών (polypropylene, black flat bottom) όπως φαίνεται στον πίνακα 12. Το αντιδραστήριο που χρησιμοποιήθηκε ήταν η DHR 123(cat# 85100, Cayman Chemical). Πίνακας 12. Αντίδραση για τον προσδιορισμό του αντιοξειδωτικού δυναμικού της HDL. Αντίδραση 5 μg HDL χοληστερόλης έως 150 µl HBS 25 µl DHR µm Ο φθορισμός μετρήθηκε στα 10 και στα 60 λεπτά μετά την έναρξη της αντίδρασης σε μήκος κύματος διέγερσης 485 nm και μήκος κύματος εκπομπής 538 nm. Ως «τυφλό» χρησιμοποιήθηκαν κελιά στα οποία δεν φορτώθηκε HDL χοληστερόλη. Το οξειδωτικό δυναμικό της HDL υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος της κλίσης του γραμμικού ρυθμού οξείδωσης της DHR 123 για κάθε δείγμα, εκφρασμένο σε μονάδες φθορισμού ανά λεπτό (FU/minute). Πίνακας 13. Διαλύματα για τον προσδιορισμό του αντιοξειδωτικού δυναμικού της HDL HBS DHR 123 stock solution DHR 123 working solution 5,2 g HEPES 1 mg DHR μl DHR 123 stock solution 8,766 g NaCl 60 μl DMSO 1000 μl HBS ph 7.4 έως 1000 ml ddh2o 65

66 4 Μοριακές αναλύσεις 4.1 Απομόνωση ολικού RNA από ήπαρ Για την απομόνωση ολικού RNA από το ήπαρ των ποντικιών ένα κομμάτι ιστού (περίπου 30 mg) από κάθε ζώο τοποθετήθηκε σε ειδικό σωληνάκι ομογενοποίησης με βιδωτό καπάκι που περιείχε 1 ml αντιδραστηρίου Trizol. Ο ιστός ομογενοποιήθηκε στον ομογενοποιητή Mini-bead beater για 1 λεπτό στη μέγιστη ταχύτητα. Ακολούθησε επώαση στον πάγο για 1 λεπτό και στη συνέχεια προστέθηκαν 100 μl χλωροφόρμιο. Το μίγμα ανακινήθηκε στο vortex για 30 δευτερόλεπτα και φυγοκεντρήθηκε στα rpm, σε θερμοκρασία 4 ο C, για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο (500 μl) μεταφέρθηκε σε νέο σωληνάκι τύπου eppendorf, προστέθηκε ίσος όγκος ισοπροπανόλης (1:1) και φυγοκεντρήθηκε στα rpm, σε θερμοκρασία 4 ο C, για 15 λεπτά. Το ίζημα ξεπλύθηκε με 70% παγωμένη αιθανόλη και παρέμεινε στον πάγο (με ανοιχτό καπάκι) για περίπου 1 ώρα μέσα σε θάλαμο ελασματοειδούς ροής μέχρι να στεγνώσει. Τέλος, το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 50 μl RNAse free H2O και φωτομετρήθηκε στο νανοφωτόμετρο Quawell Q5000 ώστε να βρεθεί η συγκέντρωση του RNA. Το RNA αποθηκεύτηκε στους -80 ο C. Όλα τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση του RNA ήταν RNAse free. 4.2 Απομόνωση μιτοχονδρίων από λευκό και φαιό λιπώδη ιστό Για την απομόνωση μιτοχονδρίων από τον λευκό και τον φαιό λιπώδη ιστό, ένα κομμάτι WAT (200 mg) και ένα κομμάτι BAT (50 mg) ομογενοποιήθηκαν μηχανικά σε 250 μl και 400 μl διαλύματος ομογενοποίησης, αντίστοιχα, στα 750 rpm. Καθ όλη τη διάρκεια της ομογενοποίησης, ιστοί και ομογενοποιήματα παρέμεναν στον πάγο. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 1000 rcf, σε θερμοκρασία 4 ο C, για 5 λεπτά, ώστε να απομακρυνθούν οι πυρήνες και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέο σωληνάκι τύπου eppendorf. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στα rcf, σε θερμοκρασία 4 έως 500 ml ddh2o, για 10 λεπτά, ώστε να απομακρυνθεί το κυτταρόπλασμα (υπερκείμενο). Ακολούθησαν τρεις πλύσεις του ιζήματος (μιτοχόνδρια) σε 500 μl διαλύματος ομογενοποίησης, με φυγοκέντρηση στα rcf, σε θερμοκρασία 4 ο C, για 10 λεπτά. Τέλος το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 15 μl (για WAT) και σε 50 μl (για BAT) διαλύματος RIPA, ώστε να γίνει λύση των μιτοχονδρίων. Τα μιτοχονδριακά κλάσματα υποβλήθηκαν σε δύο κύκλους πάγος (30 λεπτά) vortex και αποθηκεύτηκαν στους -80 ο C. Πριν την χρήση τους έγινε προσδιορισμός των επιπέδων της ολικής πρωτεΐνης όπως περιγράφεται στην παράγραφο 3.7.

67 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Πίνακας 14. Διαλύματα για την ομογενοποίηση των ιστών και την απομόνωση των μιτοχονδρίων. BAT Homogenization Buffer WAT Homogenization Buffer RIPA Buffer Sucrose 0,32 M Sucrose 0,25 M NaCl 150 mm EDTA 1 mm Tris HCl (ph 8) 5 mm Tris HCl (ph 7.4) 50 mm Tris HCl (ph 7.4) 10 mm έως 500 ml ddh2o 0,5% sodium deoxycholate έως 250 ml ddh2o ph 7.2, αποστείρωση και αποθήκευση στους 4 0,1% SDS ph 7.2, αποστείρωση και αποθήκευση στους 4 EDTA 1 mm 1% Triton X-100 έως 250 ml ddh2o αποστείρωση και αποθήκευση στους Ανάλυση απολιποπρωτεϊνών με αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και ανοσοαποτύπωση Western (Western Blot) Προκειμένου να προσδιοριστεί η απολιποπρωτεϊνική σύσταση των λιποπρωτεϊνών, μετά την κλασματοποίησή τους ακολούθησε ανάλυση με αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου και ανοσοαποτύπωση Western SDS-PAGE Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό αποδιατακτικές συνθήκες (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE ) είναι μια τεχνική διαχωρισμού των πρωτεϊνών μέσω πηκτής πολυακρυλαμιδίου βάσει του αρνητικού ηλεκτρικού τους φορτίου, που διαμορφώνεται εξαιτίας των συμπλόκων που σχηματίζουν με το απορρυπαντικό SDS. Επιπλέον η προσθήκη ενός αναγωγικού παράγοντα (2 μερκαπτοαιθανόλη ή DTT diothreitol) προκαλεί τη διάσπαση των δισουλφιδικών δεσμών (S-S) και κάτω από αυτές τις συνθήκες οι πρωτεΐνες μεταναστεύουν με βάση το μοριακό τους βάρος. Για την ηλεκτροφόρηση των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων, 100 μl από κάθε κλάσμα ξηράθηκαν στην συσκευή ξήρανσης (Speed-vac) και επαναδιαλύθηκαν σε 12 μl ddh2o και 4 μl Sample Loading Buffer. Ακολούθησε αποδιάταξη των πρωτεϊνών με θέρμανση στους 100 o C για 4 λεπτά και φυγοκέντρηση σε μέγιστη ταχύτητα για 20 δευτερόλεπτα. Για την ηλεκτροφόρηση των 67

68 μιτοχονδριακών κλασμάτων, κάθε δείγμα προετοιμάστηκε σύμφωνα με τη συγκέντρωση της ολικής πρωτεΐνης του. Για το WAT κάθε δείγμα περιείχε 15 μg ολικής πρωτεΐνης, ενώ για BAT κάθε δείγμα περιείχε 6 μg ολικής πρωτεΐνης. Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τον πίνακα 16 και μετά τη φόρτωση των δειγμάτων έγινε ηλεκτροφόρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα 1x Running Buffer στα 100 Volt για περίπου 90 λεπτά. Πίνακας 15. Διαλύματα απαραίτητα για την παρασκευή των πηκτών πολυακρυλαμιδίου. 10% SDS 1Μ Tris-HCl, ph Μ Tris-HCl, ph % Acrylamide 10% APS 10 g SDS 12,11 g Tris base 18,17 g Tris base 29 g Acrylamide 10 g APS έως 100 έως 100 ml έως 100 ml ddh2o έως 100 ml ddh2o 1 g bis-acrylamide ml ddh2o ddh2o Ρύθμιση του ph με Ρύθμιση του ph με 6N HCl 6N HCl έως 100 ml ddh2o Πίνακας 16. Πηκτές πολυακρυλαμιδίου. Συνταγή για 2 πηκτές. Πηκτή διαχωρισμού (12%) Πηκτή επιστοίβαξης (5%) 7,35 ml ddh2o 5,1 ml ddh2o 9 ml Acrylamide (30%) 1245 μl Acrylamide (30%) 5,7 ml Tris-HCl, ph μl Tris-HCl, ph μl SDS (10%) 75 μl SDS (10%) 225 μl APS (10%) 75 μl APS (10%) 9 μl TEMED 7,5 μl TEMED Πίνακας 17. Διαλύματα ηλεκτροφόρησης. 10x Running Buffer 1x Running Buffer 4x Sample Loading Buffer 30 g Tris base 100 ml Running Buffer 10x 1,5 ml Tris-HCl 1M, ph g Glycine έως 1000 ml ddh2o 3 ml DTT 1M 10 g SDS 0,6 g SDS έως 1000 ml ddh2o 0,03 g Bromophenol Blue 2,4 ml glycerol

69 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Western Blot Η τεχνική περιλαμβάνει την μεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή πολυακρυλαμιδίου σε μεμβράνη PVDF, όπου δεσμεύονται μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, αλλά διατηρούν τις αντιγονικές τους ιδιότητες. Η ανίχνευση των πρωτεϊνών γίνεται μέσω της αναγνώρισής τους από ειδικά αντισώματα, από τα οποία το πρώτο (πρωτοταγές) δεσμεύεται στην πρωτεΐνη, ενώ το δεύτερο (δευτεροταγές) αναγνωρίζει μία περιοχή του πρώτου. Το δευτεροταγές αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με το ένζυμο της υπεροξειδάσης, το οποίο μέσω αντίδρασης με το κατάλληλο υπόστρωμα προκαλεί χημειοφωταύγεια. Μετά την ηλεκτροφόρηση οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν στη μεμβράνη PVDF, με εφαρμογή σταθερής ηλεκτρικής τάσης 30 Volt για 24 ώρες στους 4 o C, μέσα σε διάλυμα 1x Transfer Buffer. Η μεμβράνη επωάστηκε σε 5% γάλα σε TBST για 1,5 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανάδευση και στη συνέχεια, αφού ξεπλύθηκε με TBST, ακολούθησε επώαση με το πρωτοταγές αντίσωμα. Για τα αντισώματα APOC3, Apoe, Apoc1 και Apoc2 η επώαση έγινε σε 5% γάλα σε TBST (αραίωση αντισώματος, 1:1000) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, υπό ανάδευση, ενώ για τα αντισώματα Apoc3, Apoa1, Apoa2, Ucp1, CytC και Cox4 η επώαση έγινε σε 5% BSA σε TBST (αραίωση αντισώματος, 1:1000) για 16 ώρες, σε θερμοκρασία 4 o C, υπό ανάδευση. Ακολούθησαν 4-5 πλύσεις της μεμβράνης με TBST, διάρκειας 15 λεπτών η κάθε μία και έγινε επώαση με το δευτεροταγές αντίσωμα σε TBST (αραίωση 1:4000) για 1,5 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το τέλος της επώασης έγιναν 4-5 πλύσεις και η μεμβράνη επωάστηκε για 1 λεπτό σε διάλυμα ΕCL (υπόστρωμα), σε σκοτεινό θάλαμο. Στη συνέχεια τοποθετήθηκε στην ειδική κασέτα και καλύφθηκε από ένα φιλμ. Η διάρκεια έκθεσης του φιλμ ήταν ανάλογη με το «σήμα» της κάθε πρωτεΐνης. Η ανάπτυξη του φιλμ έγινε σε διάλυμα Developer (Kodak) και η μονιμοποίησή του σε διάλυμα Fixer (Kodak). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: - Goat anti-human APOC3 (cat# K74140G, Meridian Life Science) - Goat anti-mouse Apoa2 (cat# K34001G, Meridian Life Science) - Goat anti-mouse Apoc1 (cat# K74110G, Meridian Life Science) - Goat anti-mouse Apoc2 (cat# K59600R, Meridian Life Science) - Rabbit anti-mouse Apoa1 (cat# AP23390PU-N, Acris) - Rabbit anti-mouse Apoc3 (cat# ab55984, Abcam and cat# PAB5869, Abnova) - Rabbit anti-mouse Apoe (cat# K23100R, Meridian Life Science) - Rabbit anti-mouse Cytc (cat# 4272, Cell Signaling) 69

70 - Rabbit anti-mouse Ucp1 (cat# GTX10983, Acris) - Rabbit anti-mouse Cox4 (cat# 4844, Cell Signaling) - Rabbit anti-goat IgG-HRP (cat# sc-2768, Santa-Cruz) - Goat anti-rabbit IgG-HRP (cat#7074, Cell Signaling) Πίνακας 18. Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν στην Western Blot. 10x Transfer Βuffer 1x Transfer Βuffer 10x TBS TBST 10,1 g Tris base 100 ml 10x Τransfer buffer 60,57 g Tris base 100 ml 10x TBS 72 g Glycine 10 ml 10 % SDS 87,66 g NaCl 2 ml Tween-20 έως 500 ml ddh2o έως 1000 ml ddh2o ph 7.6, έως 1000 ml ddh2o έως 1000 ml ddh2o Πίνακας 19. Διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για την υπεροξειδάση ECL 10 ml διαλύματος Luminol 1.25 mm, ph μl p-coumaric acid 68 mm 30 μl 3% hydrogen peroxide 4.4 Ανάλυση των σωματιδίων της HDL με τη μέθοδο TEM (Transmission Electron Microscopy) Για την ανάλυση των σωματιδίων της HDL χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της αρνητικής χρώσης. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην προσρόφηση μορίων της χρωστικής μέσα και γύρω από τα σωμάτια, κι έτσι η πραγματική δομή τους σκιαγραφείται μετά τη σκέδαση των ηλεκτρονίων από το βαρύ μέταλλο με αποτέλεσμα η εικόνα που βλέπουμε να είναι αρνητική. Μετά την κλασματοποίηση των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος (βλ. παράγραφο 3.1) έγινε διαπίδυση (βλ. παράγραφο 3.2) των κλασμάτων της HDL σε 1x EM Buffer. Τα κλάσματα της HDL κάθε ομάδας αναμίχθηκαν σε ένα τελικό δείγμα (για κάθε ομάδα) όγκου 4 μl το οποίο εναποτέθηκε σε ένα μη φορτισμένο πλέγμα (300 mesh) χαλκού επικαλυμμένο με formvar/carbon και επωάστηκε για 10 δευτερόλεπτα, ώστε να γίνει απορρόφηση του δείγματος από το πλέγμα. Το πλέγμα στεγνώθηκε σε διηθητικό χαρτί και εφαρμόστηκαν 4 μl 1% Sodium Phosphotungstate. Ακολούθησε επώαση για 10 δευτερόλεπτα και το πλέγμα στεγνώθηκε σε διηθητικό χαρτί και αφέθηκε να ξηραθεί στον αέρα για 2 ώρες. Η απεικόνιση έγινε στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο τύπου JEM-2100 της εταιρείας JEOL στο Εργαστήριο Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας και Μικροανάλυσης (Ε.Η.Μ.Μ.) του Πανεπιστημίου Πατρών (

71 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Πίνακας 20. Διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση TEM. 1x EM Buffer 1% Sodium Phosphotungstate 9,3 g ammonium acetate 1 g sodium phosphotungstate 0,249 g ammonium carbonate 80 ml ddh2o και ανάδευση στο σκοτάδι, Ο/Ν 52 μl EDTA 0,5M Ρύθμιση του ph 7.4 με NaOH Ρύθμιση του ph 7.4 έως 100 ml ddh2o έως 1000 ml ddh2o Φιλτράρισμα (0,2 μm) 2 φορές πριν τη χρήση 4.5 Ανάλυση των σωματιδίων της HDL με μη-αποδιατακτική δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση Η τεχνική της μη-αποδιατακτικής δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης περιλαμβάνει το διαχωρισμό των πρωτεϊνών, σε πηκτή αγαρόζης, με βάση το ηλεκτρικό τους φορτίο (πρώτη διάσταση) και το διαχωρισμό των πρωτεϊνών, σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου διαβαθμισμένης πυκνότητας 4-20%, με βάση το μοριακό τους βάρος (δεύτερη διάσταση). Τα σωματίδια της HDL διαχωρίζονται με βάση το μέγεθός τους (8). Πίνακας 21. Διαλύματα δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης. Διάλυμα 1 ης διάστασης Διάλυμα 2 ης διάστασης 3,03 g Tris base 3 g Tris base 4,48 g Tricine 14,4 g glycine 0,92 g calcium lactate 200 ml methanol 0,5 g sodium azide 100 ml ddh ml ddh2o Πίνακας 22. Προετοιμασία δείγματος. 5 μl 2 μl Δείγμα πλάσμα Διάλυμα 1 ης διάστασης 2 μl 50% glycerol 1 μl 1% Bromophenol Blue Ετοιμάστηκε πηκτή αγαρόζης 0,75% σε 100 ml διαλύματος πρώτης διάστασης, στην οποία φορτώθηκαν τα δείγματα του πλάσματος των δύο ομάδων μελέτης. Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε διάλυμα 1 ης διάστασης, στα 80V για περίπου 90 λεπτά. Από την ηλεκτροφόρηση πρώτης διάστασης προέκυψαν δύο ζώνες. Η ηλεκτροφόρηση σταμάτησε, όταν η μία ζώνη ήταν στα 3 εκατοστά και η άλλη στα 5 εκατοστά από την βάση των πηγαδιών. Οι ζώνες κόπηκαν και τοποθετήθηκαν στο πάνω 71

72 μέρος της πηκτής πολυακρυλαμιδίου διαβαθμισμένης πυκνότητας 4-20% και σταθεροποιήθηκαν με αγαρόζη 0,75%. Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε διάλυμα 2 ης διάστασης, στα 80V για περίπου 90 λεπτά μέχρι οι ζώνες να φτάσουν στο κατώτερο σημείο της πηκτής. Τέλος ακολούθησε ανάλυση των σωματιδίων με Western Blot, όπως περιγράφεται στην παράγραφο 4.3.2, με χρήση των αντισωμάτων: - Goat anti-apoc3 (cat# K74140G, Meridian Life Science) - Rabbit anti-goat IgG-HRP (cat# sc-2768, Santa-Cruz) - Rabbit anti-apoa1 (cat# AP23390PU-N, Acris) - Goat anti-rabbit IgG-HRP (cat#7074, Cell Signaling) 4.6 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real Time PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια τεχνική για την ενίσχυση μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA. Ως εκκινητές χρησιμοποιούνται συνθετικά DNA ολιγονουκλεοτίδια συμπληρωματικά προς κάθε μια από τις αλυσίδες του δίκλωνου DNA. Ένας πλήρης κύκλος αντίδρασης PCR περιλαμβάνει τρία στάδια: 1. Αποδιάταξη του DNA (θερμοκρασία >90 C) 2. Σύνδεση των εκκινητών στο DNA εκμαγείο (θερμοκρασία C) 3. Επιμήκυνση των εκκινητών (θερμοκρασία 70 C) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real Time PCR) βασίζεται στη συμβατική τεχνική PCR, με τη διαφορά ότι το τελικό προϊόν της διαδικασίας ενίσχυσης αναγνωρίζεται σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας τεχνικές φθορισμού.η αντίστροφη μεταγραφή του RNA σε cdna πραγματοποιήθηκε με το PrimeScript TM RT kit (Takara Bio Inc) σύμφωνα με την αντίδραση του πίνακα 23, για 15 λεπτά στους 37 C. Πίνακας 23. Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής. Υλικά Ποσότητες (μl) #1. PrimeScript 2 #2. Reverse Transcriptase 0,5 #3. Oligo DT 0,5 #4. Random 6meres 0,5 RNA (100 ng/μl) 5 RNase-free H2O 1,5 Ολικός όγκος 10

73 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Η Real Time PCR για τα γονίδια apoa1, apoe, apoa2 και apoc1 πραγματοποιήθηκε με το KAPA SYBR FAST Universal qpcr kit (Kapa Biosystems), σύμφωνα με την αντίδραση του πίνακα 24. Η αντίδραση εκτελέστηκε σε MicroAmp 96-well reaction plate (Applied Biosystems) στο μηχάνημα StepOnePlus cycler (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, λαμβάνοντας υπόψιν τη θερμοκρασία των εκκινητών. Τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν σε σχέση με την έκφραση του γονιδίου αναφοράς RPS18. Πίνακας 24. Αντίδραση PCR. Υλικά Ποσότητες (μl) 2x SYBR green 5 Primer Mix (Forward + Reverse; 10 mm) 0,4 50x ROX High 0,2 cdna (10 ng/μl) 2 ddh2o 2,4 Ολικός όγκος 10 Πίνακας 25. Αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR (Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany). Εκκινητής Αλληλουχία (5-3 ) apoa1_f apoa1_r apoe_f apoe_r apoa2_f apoa2_r apoc1_f apoc1_r RPS18_F RPS18_R GGA GCT GCA AGG GAG ACT GT TGC GCA GAG AGT CTA CGT GTG T CTG ACA GGA TGC CTA GCC G CGC AGG TAA TCC CAG AAG C GCA GAC GGA CCG GAT ATG C GCT GCT CGT GTG TCT TCT CA TCC TGT CCT GAT TGT GGT CGT CCA AAG TGT TCC CAA ACT CCT T GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG 73

74 4.7 Λιπιδομική ανάλυση των σωματιδίων της HDL με τη μέθοδο HILIC LC/MS/MS H λιπιδομική ανάλυση των σωματιδίων της HDL έγινε με τη μέθοδο HILIC LC/MS/MS. Τα λιπίδια διαχωρίστηκαν σε μία στήλη Kinetex HILIC 150 x 2,1 mm, 2,6 μm (Phenomenex, CA, USA) με το σύστημα Prominence HPLC (Shimadzu). Η έκλουση ήταν εξαρτώμενη από την ομάδα πολικής κεφαλής των λιπιδίων. Τα λιπίδια ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας προγραμματισμένη παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων (smrm) σε ειδικά θραύσματα ομάδων πολικής κεφαλής χρησιμοποιώντας ένα QTrap 4000 (ΑΒ Sciex) και ποσοτικοποιήθηκαν με βάση 23 εσωτερικές πρότυπες (ISTD) και 37 καμπύλες βαθμονόμησης. Για να γίνει διόρθωση της ισοτοπικής συμβολή στα σήματα MRM, χρησιμοποιήθηκε η γλώσσα προγραμματισμού R. Η λιπιδομική ανάλυση και η επεξεργασία των δεδομένων έγινε στο ICAN Analytics Facility (Lipidomics Core Lab) του ICAN (Institute of Cardiometabolism And Nutrition, Paris, France), Μεταβολομική ανάλυση του ορού του αίματος με τη μέθοδο NMR Η ανάλυση των μεταβολιτών του ορού έγινε με τη μέθοδο του πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (Nuclear magnetic resonance, NMR), που βασίζεται στη φυσική ιδιότητα των πυρήνων των ατόμων να απορροφούν και επανεκπέμπουν ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία όταν βρίσκονται σε μαγνητικό πεδίο. Από κάθε δείγμα ορού, 200 μl αναμίχθηκαν με 60 μl D2O και 340 μl φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (1,5 Μ Na2HPΟ4 σε Η2Ο που περιείχε 4% NaN3 και 1 mm 4,4- dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid (DSS), ρη 7.4). Στη συνέχεια 550 μl του μίγματος μεταφέρθηκαν για ανάλυση σε έναν σωλήνα NMR 5 mm (Bruker BioSpin srl). Η μεταβολομική ανάλυση του ορού έγινε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NMR Bruker Avance III HD 700 MHz εξοπλισμένο με έναν TCI ανιχνευτή (κρυογονικής ψύξεως). Για κάθε δείγμα λήφθηκα τρία φάσματα 1 Η NMR εφαρμόζοντας τυποποιημένα πρωτόκολλα (NOESY, CPMG και J-resolved pulse sequences). Η ανάλυση PLS-DA (Partial Least Squares-Discriminant Analysis) εκτελέστηκε ώστε να πραγματοποιηθεί η μείωση των δεδομένων και η αναγνώριση προτύπων. Η ποιότητα του μοντέλου PLS-DA καθορίστηκε από την παράμετρο προσαρμογής (R 2 ) και την παράμετρο πρόβλεψης (Q 2 ) μετά από διαδικασία επικύρωσης που επαναλήφθηκε 10 φορές (cross validation). Η μονομεταβλητή ανάλυση διεξήχθη με υπολογισμό της σχετικής συγκέντρωσης μέσω της ενσωμάτωσης της περιοχής του σήματος, όλων των αναγνωρισμένων μεταβολιτών στα φάσματα που λήφθηκαν κατά την ανάλυση. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το TopSpin 3.6 (Bruker BioSpin srl). Η ταυτοποίηση των μεταβολιτών του ορού

75 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού έγινε με τη χρήση του λογισμικού Chenomx NMR (Profiler 8.1 Chenomx Inc., Canada), της δημόσιας βάσης δεδομένων (HMDB) και των δεδομένων της βιβλιογραφίας (126;127). Η μεταβολομική ανάλυση του ορού με τη μέθοδο NMR έγινε από την Ομάδα Βιομοριακής Προσομοίωσης & ΝΜR του εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, στο Τμήμα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, Προσδιορισμός της ικανότητας αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης της HDL Η ικανότητα αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης της HDL προσδιορίστηκε με τη χρήση μακροφάγων κυττάρων της σειράς RAW που εκφράζουν τους υποδοχείς Abca1, Abcg1 και Srb1. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και ισομοιράστηκαν στα κελιά ενός πιάτου 12 κελιών. Όταν η πληρότητά τους ήταν % το θρεπτικό μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με θρεπτικό μέσο σήμανσης (Labeling Medium), που περιείχε ραδιοσημασμένη χοληστερόλη ([4-14 C] χοληστερόλη, S.A. 50mCi/mmol, American Radiolabeled Chemicals Inc.) σε αναλογία 1 ml medium: 1 μl [4-14 C] χοληστερόλη/κελί. Ακολούθησε επώαση σε συνθήκες παροχής 5% CO2 και θερμοκρασία 37 C για 48 ώρες. Μετά το πέρας των 48 ωρών το θρεπτικό μέσο επισήμανσης απομακρύνθηκε και αφού έγιναν δύο πλύσεις με αποστειρωμένο διάλυμα 1x PBS, προστέθηκαν 500 μl Serum Free Medium/κελί και ακολούθησε επώαση σε συνθήκες παροχής 5% CO2 και θερμοκρασία 37 C για 18 ώρες. Την επόμενη μέρα έγιναν δύο πλύσεις με αποστειρωμένο διάλυμα 1x PBS και προστέθηκαν 250 μl Efflux Medium/κελί. Σαν αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν τρία κελιά που περιείχαν 250 μl Serum Free Medium. Πίνακας 26. Θρεπτικά μέσα καλλιέργειας. Θρεπτικό μέσο καλλιέργειας Serum Free Medium 440 ml DMEM (4,5 g/l D-glucose) 490 ml DMEM (4,5 g/l D-glucose) 50 ml FBS 5 ml Pen/Strep 5 ml Pen/Strep 5 ml NEAA 5 ml NEAA Η δειγματοληψία έγινε στις 2 και στις 6 ώρες μετά από την προσθήκη του Efflux Medium. Το κάθε δείγμα φυγοκεντρήθηκε στα rpm για 2 λεπτά και 40 μl από το υπερκείμενο μεταφέρθηκαν σε πλαστικά φιαλίδια μέτρησης ραδιενέργειας, το καθένα από τα οποία περιείχε 10 ml υγρού σπινθηρισμού. Στη συνέχεια τα κύτταρα λύθηκαν με προσθήκη 250 μl διαλύματος λύσης (0,2 M NaOH/0,15 M NaCl) και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Τα κύτταρα 75

76 αποκολλήθηκαν από την επιφάνεια των κελιών με τη χρήση ξέστρου κυττάρων και συλλέχθηκαν 80 μl/κελί, τα οποία μεταφέρθηκαν σε πλαστικά φιαλίδια μέτρησης ραδιενέργειας, το καθένα από τα οποία περιείχε 10ml υγρού σπινθηρισμού. Η ποσότητα της ραδιοσημασμένης χοληστερόλης μετρήθηκε σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού β-ακτινοβολίας. Το ποσοστό της ολικής ανάστροφης μεταφοράς χοληστερόλης υπολογίστηκε με βάση την ποσότητα της ραδιοσημασμένης χοληστερόλης που υπέστη εκροή από τα μακροφάγα κύτταρα λόγω της αλληλεπίδρασης της HDL με τους υποδοχείς Abca1, Abcg1 kai Srb1. Πίνακας 27. Διαλύματα που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης. Θρεπτικό μέσο σήμανσης (Labeling Medium) Θρεπτικό μέσο efflux (Efflux Medium) Διάλυμα λύσης των κυττάρων 1 ml Θρεπτικό μέσο καλλιέργειας 250 ml Serum Free Medium 0,24 g NaOH 1 μl [4-14 C] χοληστερόλη 5 μg HDL cholesterol 0,27 g NaCl έως 30 ml 1x PBS Υγρό Σπινθηρισμού 11 g 2,5- diphenyloxazole (PPO) 0,2 g 1,4-Di-[2-(5- phenyloxazolyl)]be nzene (POPOP) 1266 ml Toluene Επώαση Ο/Ν στο σκοτάδι 660 ml Triton X- 100 Η αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης υπολογίστηκε βάσει των τύπων: % Sample efflux = Α/(A+B)x100 % Blank efflux = Γ/(Γ+Δ)x100 % Total Cholesterol Efflux = % Sample efflux - % Blank efflux Όπου: Α = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν στο θρεπτικό μέσο κάθε δείγματος (2h και 6h) * την αραίωση του δείγματος στο υγρό σπινθηρισμού. Β = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν από την λύση των κυττάρων * την αραίωση του δείγματος λύσης κυττάρων, στο υγρό σπινθηρισμού.

77 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Γ = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν στο θρεπτικό μέσο κάθε αρνητικού μάρτυρα (2 h και 6 h) * την αραίωση του δείγματος στο υγρό σπινθηρισμού. Δ = Οι κρούσεις που μετρήθηκαν από την λύση των κυττάρων του αρνητικού μάρτυρα * την αραίωση του δείγματος λύσης κυττάρων, στο υγρό σπινθηρισμού. Στη συνέχεια υπολογίστηκε ο μέσος όρος της κλίσης του γραμμικού ρυθμού εκροής ραδιοσημασμένης χοληστερόλης και η ολική αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης της HDL των δύο ομάδων μελέτης εκφράστηκε ως % Cholesterol efflux per mg of HDL cholesterol Προσδιορισμός της δράσης της HDL στη φλεγμονώδη απόκριση In vitro διέγερση μακροφάγων κυττάρων με LPS Η in vitro διέγερση των μακροφάγων κυττάρων της σειράς RAW με LPS έγινε με καλλιέργεια των κυττάρων για ώρες σε θρεπτικό μέσο DMEM (10% FBS) και ακόλουθη επώαση με LPS (100 ng/ml) και 0,1% human serum albumin, με ή χωρίς την παρουσία ορού ή HDL, για 4 ώρες, σε συνθήκες παροχής 5% CO2, στους 37 ο C Προσδιορισμός των επιπέδων TNFa με ELISA Η ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) είναι μια βιοχημική μέθοδος, που χρησιμοποιείται κυρίως για την ανίχνευση ενός αντιγόνου ή ενός αντισώματος σε ένα δείγμα. Στην ELISA, μία άγνωστη ποσότητα αντιγόνου ακινητοποιείται στην επιφάνεια της μικροπλάκας και στη συνέχεια ένα ειδικό αντίσωμα απλώνεται επάνω στην επιφάνεια αυτή προκειμένου να δεσμεύσει το αντιγόνο. Το αντίσωμα αυτό συνδέεται με ένα ένζυμο το οποίο με την προσθήκη ενός υποστρώματος μπορεί να παράγει μια χρωμογόνο ένωση. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων του TNFa χρησιμοποιήθηκε η Sandwich ELISA, μία παραλλαγή της μεθόδου, στην οποία το πρώτο αντίσωμα, που είναι ειδικό για το αντιγόνο, ακινητοποιείται στην επιφάνεια της μικροπλάκας και μετά την προσθήκη του αντιγόνου ακολουθεί προσθήκη ενός δεύτερου αντισώματος, το οποίο είναι συνδεδεμένο με ένα ένζυμο που παράγει μια χρωμογόνο ένωση. Αρχικά, στη μικροπλάκα της ELISA προστέθηκαν 100 μl/κελί από το πρώτο αντίσωμα (Capture Antibody), η μικροπλάκα σφραγίστηκε και τοποθετήθηκε για επώαση στους 4 ο C για ώρες. Την επόμενη μέρα ακολούθησαν 5 πλύσεις των κελιών (200 μl/κελί Washing Buffer, πίνακας 28). Μετά τις πλύσεις προστέθηκαν με την πολυπιπέτα 200 μl/κελί 1X Assay Diluent, η μικροπλάκα σφραγίστηκε και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. 77

78 Πίνακας 28. Συστατικά του Washing Buffer και του Stop Solution Washing buffer (0,05% v/v Tween 20) Stop solution (2N H2SO4) 1000 ml 1x PBS 3 ml H2SO4 50 μl Tween 20 έως 1000 ml dd H2O Μετά το τέλος της επώασης ακολούθησαν 5 πλύσεις των κελιών. Στη συνέχεια, προετοιμάστηκαν τα πρότυπα διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης μέσω διαδοχικών αραιώσεων του διαλύματος Mouse TNFα με 1Χ Assay Diluent και φορτώθηκαν 100 μl από το καθένα στις δύο τελευταίες σειρές της μικροπλάκας. Στα πρώτα κελιά των σειρών αυτών προστέθηκε το τυφλό διάλυμα που είναι καθαρό 1Χ Assay Diluent. Στα υπόλοιπα πηγαδάκια προστέθηκαν 100 μl από κάθε άγνωστο δείγμα. Η μικροπλάκα σφραγίστηκε και τοποθετήθηκε για επώαση στους 4 ο C για ώρες. Την επόμενη μέρα ακολούθησαν 5 πλύσεις των κελιών. Μετά τις πλύσεις προστέθηκαν με την πολυπιπέτα 200 μl/κελί από το δεύτερο αντίσωμα (Detection Antibody) και η μικροπλάκα σφραγίστηκε και ακολούθησε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Στη συνέχεια ακουλούθησαν 5 πλύσεις των κελιών, προστέθηκαν 100 μl/κελί Avidin-HRP, η μικροπλάκα σφραγίστηκε και έγινε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Μετά το τέλος της επώασης ακολούθησαν 7 πλύσεις των κελιών, προστέθηκαν 100 μl/κελί Substrate Solution (TMB) και έγινε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Τέλος προστέθηκαν 50 μl/κελί Stop Solution για να σταματήσει η αντίδραση και ακολούθησε φωτομέτρηση στα 450 nm. Η συγκέντρωση του TNFa στα άγνωστα δείγματα προέκυψε από την απορρόφηση του με βάση την πρότυπη καμπύλη, που προέκυψε από τις απορροφήσεις των αραιώσεων του πρότυπου διαλύματος. 5 Στατιστική ανάλυση Όλα τα δεδομένα ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας τα τεστ Kolmogorov-Smirnov και Shapiro- Wilk και υποβλήθηκαν σε παραμετρικά (p> 0,1) ή μη παραμετρικά τεστ (p <0,1) σύμφωνα με την απόκλισή τους από την κανονικότητα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως Mean ± SEM. Όλες τα στατιστικά τεστ πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 6.

79 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού m Αποτελέσματα 79

80 1 Επιβεβαίωση της έκφρασης της ανθρώπινης απολιποπρωτεΐνης C3 στο πλάσμα των C57BL/6 ποντικιών μετά από ενδοφλέβια χορήγηση του αδενοϊού AdGFP-APOC3 Προκειμένου να παραχθούν HDL σωματίδια πλούσια σε APOC3 (APOC3-HDL), 23 ποντίκια C57BL/6 χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες και τους χορηγήθηκαν είτε 5x10 8 pfu είτε 2x10 9 pfu AdGFP- APOC3 ανασυνδυασμένου αδενοϊού, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 1 της ενότητας των μεθόδων. Για να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα εμφάνισης μη ειδικών επιδράσεων λόγω της ανοσολογικής απόκρισης στην ιική μόλυνση σε επακόλουθες αναλύσεις, μια επιπλέον ομάδα 17 C57BL/6 ποντικιών μολύνθηκε επίσης με 2x10 9 pfu AdGFP αδενοϊού ελέγχου. Η ανάλυση των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων του πλάσματος με Western Blot επιβεβαίωσε την έκφραση της ανθρώπινης APOC3 στα ποντίκια που μολύνθηκαν με τις δύο διαφορετικές δόσεις AdGFP-APOC3 (Εικόνα 15 F, G). Στα ποντίκια που μολύνθηκαν με 5x10 8 pfu AdGFP-APOC3 (AdGFP-APOC3_L), η APOC3 ανιχνεύθηκε μόνο στα κλάσματα της HDL και των IDL/VLDL (Εικόνα 15 F) ενώ στα ποντίκια που μολύνθηκαν με 2x10 9 pfu AdGFP-APOC3 (AdGFP-APOC3_H), η APOC3 ήταν κατανεμημένη σε όλα τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα (Εικόνα 15 G), εμφανίζοντας παρόμοια κατανομή με εκείνη των παχύσαρκων ασθενών (ΒΜΙ>50) πριν από τη βαριατρική χειρουργική επέμβαση (82). Όπως αναμενόταν, τα ποντίκια που μολύνθηκαν με τον αδενοϊό ελέγχου AdGFP δεν είχαν ανιχνεύσιμα επίπεδα ανθρώπινης APOC3 στο πλάσμα τους (Εικόνα 15 C). 2 Απολιποπρωτεϊνική και λιπιδική σύσταση της HDL 2.1 Ανάλυση των λιπιδίων του πλάσματος και των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων της HDL Η ανάλυση των λιπιδίων του πλάσματος των ποντικιών της ομάδας AdGFP-APOC3_H έδειξε ότι, πέντε ημέρες μετά τη μόλυνση, η αυξημένη έκφραση της APOC3 προκάλεσε σημαντική αύξηση των επιπέδων της ολικής χοληστερόλης και των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα, σε σύγκριση με τα επίπεδά τους πριν από τη μόλυνση (day 0) ή με τα επίπεδα των λιπιδίων του πλάσματος των ποντικιών της ομάδας ελέγχου AdGFP πέντε ημέρες μετά τη μόλυνση (Εικόνα 15 Α, Β). Αυτή η αύξηση συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση της χοληστερόλης και των τριγλυκεριδίων των χυλομικρών/vldl, της IDL και της LDL και με μια μετατόπιση της κατανομής της χοληστερόλης της HDL προς μεγαλύτερα και λιγότερο πυκνά σωματίδια (Εικόνα 15 D, E). Τα ποντίκια της ομάδας AdGFP-APOC3_H εμφάνισαν επίσης αυξημένα επίπεδα φωσφολιπιδίων και ελεύθερης χοληστερόλης στην HDL τους. Η ανάλυση των λιπιδίων του πλάσματος των ποντικιών της ομάδας AdGFP-APOC3_L έδειξε ότι σε αυτό το χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης, η APOC3 δεν είχε σημαντική επίδραση στην μεταβολή των επιπέδων χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων, αν και οδήγησε σε αύξηση

81 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού των επιπέδων των τριγλυκεριδίων του πλάσματος, λόγω συσσώρευσης των πλούσιων σε τριγλυκερίδια VLDL (Εικόνα 15 Α, Β, D, Ε). Η σχετική περιεκτικότητα σε λιπίδια της APOC3-HDL εκφρασμένη ως mg της ολικής HDL πρωτεΐνης ή % κατά βάρος του συνόλου των λιπιδίων της HDL παρουσιάζεται στον πίνακα 29. Εικόνα 15. Επίπεδα ολικής χοληστερόλης (Α) και τριγλυκεριδίων (Β) του πλάσματος και προφίλ της ολικής χοληστερόλης (D) και των τριγλυκεριδίων (Ε) των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων των C57BL/6 ποντικιών πέντε ημέρες μετά τη χορήγηση 2x10 9 pfu του αδενοϊού ελέγχου AdGFP ή 5x10 8 pfu (AdGFP-APOC3_L) και 2x10 9 pfu (AdGFP-APOC3_H) του ανασυνδυασμένου αδενοϊού που εκφράζει την ανθρώπινη APOC3 (AdGFP-APOC3). Western Blot ανάλυση (C, F, G) των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων που απομονώθηκαν από το πλάσμα των ποντικών της ομάδας ελέγχου (C), της ομάδας AdGFP-APOC3_L (F) και της ομάδας AdGFP- APOC3_H (G) πέντε ημέρες μετά την μόλυνση. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με two way ANOVA και παρουσιάζονται ως Mean ± SEM. CM, Χυλομικρά; HDL, λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας; IDL, λιποπρωτεΐνη ενδιάμεσης πυκνότητας; LDL, λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας; VLDL, λιποπρωτεΐνη πολύ χαμηλής πυκνότητας. * = ρ < 0,05, ** = ρ < 0,

82 Πίνακας 29. Λιπιδική σύσταση της HDL, που απομονώθηκε από το πλάσμα ποντικιών που μολύνθηκαν με τον AdGFP ή τον AdGFP-APOC3 αδενοϊό, εκφρασμένη σε mg λιπιδίων ανά mg ολικής πρωτεΐνης. Οι αριθμοί στις παρενθέσεις δηλώνουν την % κατά βάρος σχετική περιεκτικότητα σε λιπίδια της HDL εκφρασμένη ως mg της ολικής HDL πρωτεΐνης ή του συνόλου των λιπιδίων της HDL. Τα AdGFP-APOC3_L και AdGFP- APOC3_H αναφέρονται στις ομάδες των ποντικιών που μολύνθηκαν με 5x10 8 και 2x10 9 pfu AdGFP-APOC3, αντίστοιχα. AdGFP AdGFP-APOC3_L AdGFP-APOC3_H P Value AdGFP vs. AdGFP-APOC3_L AdGFP vs. AdGFP-APOC3_H AdGFP-APOC3_L vs. AdGFP-APOC3_H Free cholesterol/ mg of protein 0.10 ± (8.09 %) 0.23 ± 0.03 (13.68 %) 1.33 ± (19.7 %) Esterified cholesterol/ mg of protein 0.30 ± (24.1 %) 0.52 ± 0.09 (31.01 %) 0.31 ± 0.02 (4.56 %) Triglycerides/ mg of protein 0.02 ± (1.61 %) ± (0.95 %) 0.23 ± (3.38 %) Phospholipids/ mg of protein 0.81 ± (66.2 %) 0.92 ± (54.35 %) 4.88 ± (72.35 %) Total lipids/ mg of protein 1.22 ± ± ±

83 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού 2.2 Η APOC3 προκαλεί μεταβολές στην απολιποπρωτεϊνική σύσταση της HDL Η ανάλυση των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων του πλάσματος με Western Blot για την ανθρώπινη απολιποπρωτεΐνη APOC3 και για τις απολιποπρωτεΐνες του ποντικιού Apoa1, Apoa2 Apoe, Apoc1, Apoc2 και Apoc3, έδειξε ότι η έκφραση της APOC3 τόσο έπειτα από χορήγηση χαμηλής δόσης (5x10 8 pfu) όσο και μετά από χορήγηση υψηλής δόσης αδενοϊού (2x10 9 pfu), οδήγησε σε ποιοτικές και ποσοτικές μεταβολές της απολιποπρωτεϊνικής σύστασης της HDL και άλλων λιποπρωτεϊνικών κλάσεων. (Εικόνα 16 Α). Όπως φαίνεται και στην εικόνα 15, στα ποντίκια της ομάδας AdGFP-APOC3_H, η APOC3 ήταν κατανεμημένη σε όλες τις κλάσεις των λιποπρωτεϊνών. Αξίζει να σημειωθεί ότι η αυξημένη έκφραση της APOC3 οδήγησε σε σημαντική αύξηση της Apoc1 στις HDL, IDL, LDL και VLDL, ενώ ίχνη της Apoc2 παρατηρήθηκαν επίσης σε σχεδόν όλα τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα. Παρομοίως, τα υψηλά επίπεδα της APOC3 προκάλεσαν αύξηση των συνολικών επιπέδων της Apoe στο πλάσμα και οδήγησαν στο σχηματισμό LDL και μεγαλύτερων λιγότερο πυκνών HDL σωματιδίων πλούσιων σε Apoe. Από την άλλη, η υψηλή έκφραση της APOC3 προκάλεσε μια μέτρια μείωση στην Apoa1 της HDL, ενώ η Apoa2, που ήταν εμφανής στην HDL των AdGFP, δεν ήταν πλέον ανιχνεύσιμη (Εικόνα 16 Α). Μη ανιχνεύσιμα επίπεδα Apoa2 παρατηρήθηκαν επίσης και στα ποντίκια της ομάδας AdGFP-APOC3_L, αν και αυτά τα ποντίκια περιείχαν μόνο ίχνη της Apoc1 στην HDL τους, παρόμοια με τα ποντίκια της ομάδας ελέγχου AdGFP (Εικόνα 16 Α). Οι μεταβολές στην απολιποπρωτεϊνική σύσταση της HDL μετά την αυξημένη έκφραση της ανθρώπινης APOC3 δεν οφείλονταν σε μεταβολές στην έκφραση του mrna των απολιποπρωτεϊνών στο ήπαρ (Εικόνα 16 Β), υποδεικνύοντας ότι πιθανότατα οφείλονται σε τροποποιήσεις που προκαλούνται από την APOC3 στο σχηματισμό των λιποπρωτεϊνικών σωματιδίων και στον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος. Δεδομένου ότι η μόλυνση των ποντικιών με 2x10 9 pfu AdGFP-APOC3 οδήγησε στην κατανομή της APOC3 σε όλα τα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα και προκάλεσε αύξηση των επιπέδων της χοληστερόλης και των τριγλυκεριδίων στο πλάσμα, όπως είχε παρατηρηθεί και σε πολλούς ασθενείς με υπερνοσογόνο παχυσαρκία πριν από τη βαριατρική χειρουργική επέμβαση (82), σε όλα τα επακόλουθα πειράματα χρησιμοποιήθηκε αυτός ο τίτλος αδενοϊού για τις αναλύσεις. 83

84 Εικόνα 16. Κατανομή της ανθρώπινης APOC3 και των Apoa1, Apoa2, Apoe, Apoc1, Apoc2 και Apoc3 του ποντικιού στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα που απομονώθηκαν με UCF (Α). CM, Χυλομικρά; HDL, λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας; IDL, λιποπρωτεΐνη ενδιάμεσης πυκνότητας; LDL, λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας; VLDL, λιποπρωτεΐνη πολύ χαμηλής πυκνότητας. Το διάγραμμα Β δείχνει την σχετική έκφραση του mrna των ηπατικών γονιδίων apoa1, apoe, apoa2 και apoc1. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το Student's t-test και παρουσιάζονται ως Median, Min to Max. Τα AdGFP-APOC3_L και AdGFP- APOC3_Η αναφέρονται στις ομάδες των ποντικιών που μολύνθηκαν με 5x10 8 και 2x10 9 pfu AdGFP-APOC3, αντίστοιχα. 2.3 APOC3 προκαλεί μεταβολές στο λιπιδίωμα της HDL Η συγκριτική ανάλυση του λιπιδιώματος της APOC3-HDL της ομάδας AdGFP-APOC3_H και της HDL της ομάδας ελέγχου AdGFP, έδειξε σημαντικές διαφορές σε όλες τις κλάσεις των λιπιδίων (Εικόνα 17 Α-C), υποδηλώνοντας ότι η παρουσία αυξημένων επιπέδων της APOC3 οδηγεί σε πρόσληψη διαφόρων λιπιδίων στην HDL. Οι κλάσεις φωσφατιδυλοχολίνη (PC), φωσφατιδυλινοσιτόλη (ΡΙ), φωσφατιδικό οξύ (ΡΑ) και φωσφατιδυλογλυκερόλη (PG) ήταν μειωμένες στην APOC3-HDL. Αντιθέτως, οι κλάσεις λυσοφωσφατιδυλοχολίνη (LPC), φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (ΡΕ), λυσοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (LPE), φωσφατιδυλοσερίνη (PS) και οι υποκατηγορίες των κεραμιδίων d18: 0, d18: 1, d18: βρέθηκαν σημαντικά αυξημένες στην

85 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού APOC3-HDL. Η % περιεκτικότητα αυτών των λιπιδιακών κλάσεων στην APOC3-HDL και στην HDL της ομάδας ελέγχου καθώς και η % διαφορά μεταξύ τους φαίνονται στον πίνακα 30. Εικόνα 17. Λιπιδομικά δεδομένα που δείχνουν τις κύριες (Α) και δευτερεύουσες (Β) κατηγορίες λιπιδίων και τα είδη κεραμιδίου (C) εκφρασμένα ως mol % των συνολικών λιπιδίων της HDL. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το U Mann-Whitney test και παρουσιάζονται ως Mean ± SEM. PC, φωσφατιδυλοχολίνη; LPC, λυσοφωσφατιδυλοχολίνη; SM, Σφιγγομυελίνη; ΡΙ, Φωσφατιδυλινοσιτόλη; ΡΕ, Φωσφατιδυλαιθανολαμίνη; LPE, Λυσοφωσφατιδυλαιθανολαμίνη; PA, Φωσφατιδικό οξύ; PS, Φωσφατιδυλοσερίνη; PG, Φωσφατιδυλογλυκερόλη; Cer, Κεραμίδιο; Cer d18:0, Κεραμίδιο d18:0; Cer d18:1, Κεραμίδιο d18:1; Cer d18:2, Κεραμίδιο d18:2. * = ρ < 0,05. Τα διαγράμματα D και Ε παρουσιάζουν την ενζυμική δραστικότητα των Lcat και Lp-pla2 του πλάσματος, αντίστοιχα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το U Mann-Whitney test (D) και το Student's t-test (Ε) και παρουσιάζονται ως Mean ± SEM. *** = ρ < 0,001. Το AdGFP-APOC3_Η αναφέρεται στην ομάδα των ποντικιών που μολύνθηκαν με 2x10 9 pfu AdGFP-APOC Οι μεταβολές στο λιπιδίωμα της HDL σχετίζονται με μεταβολές στην ενζυμική δραστικότητα του πλάσματος Για να προσδιοριστεί εάν οι μεταβολές που παρατηρούνται στο λιπιδίωμα της APOC3-HDL σχετίζονται με μεταβολές στη δραστικότητα των ενζύμων Lcat και Lp-pla2, ακολούθησαν μελέτες για τον προσδιορισμό της δραστικότητας των δύο αυτών ενζύμων, όπως περιγράφεται στις παραγράφους και της ενότητας των μεθόδων. Όπως φαίνεται στην εικόνα 17 η αυξημένη έκφραση της APOC3 οδηγεί σε μειωμένη δραστικότητα της Lcat (Εικόνα 17 D), ενώ παρατηρείται αύξηση της 85

86 δραστικότητας της Lp-pla2 (Εικόνα 17 Ε), ευρήματα που συμφωνούν με προηγούμενες αναφορές από in vitro πειράματα (36;62). Πίνακας 30. Συγκριτική ανάλυση του λιπιδιώματος της HDL που απομονώθηκε από τα ποντίκια της ομάδας AdGFP-APOC3_H και της ομάδας ελέγχου AdGFP. Το AdGFP-APOC3_H αναφέρεται στην ομάδα των ποντικιών που μολύνθηκαν με 2x10 9 pfu AdGFP-APOC3. AdGFP AdGFP-APOC3_H Lipid Class Major Fatty acids moieties HDL Content (mol% of HDL Lipids) HDL Content (mol% of HDL Lipids) % difference between AdGFP and AdGFP-APOC3_H Phosphatidylcholine 34:1/34:2/36:2/36:3 /36:4/38: ± ± Lysophosphatidylcholine 16:0/18: ± ± Sphingomyelin 34:1/42: ± ± Phosphatidylinositol 36:2/38: ± ± Phosphatidylethanolamine 34:2/36:2/38: ± ± Lysophosphatidylethanolamine 18: ± ± Phosphatidic acid 34:2/36:2/38: ± ± Phosphatidylserine 36:1/40: ± ± Phosphatidylglycerol 34:1/36: ± ± Ceramide d18:0 16:0/24: ± ± Ceramide d18:1 16:0/22:0/24:0/24: ± ± Ceramide d18:2 24: ± ± Επίδραση της αυξημένης έκφρασης της APOC3 στη δομή των σωματιδίων της HDL Για να μελετήσουμε την επίδραση της αυξημένης έκφρασης της ανθρώπινης APOC3 στη γεωμετρία των HDL σωματιδίων και στην κατανομή των υποπληθυσμών τους, πραγματοποιήθηκε ποιοτική ανάλυση της HDL που απομονώθηκε από το πλάσμα των ομάδων AdGFP-APOC3_H και

87 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού AdGFP με χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (TEM) με αρνητική χρώση και ποιοτική ανάλυση του πλάσματος των δύο ομάδων με μη-αποδιατακτική δυσδιάστατη ηλεκτροφόρηση. 3.1 Ανάλυση των σωματιδίων της HDL με ηλεκτρονική μικροσκοπία και μη αποδιατακτική δυσδιάστατη ηλεκτροφόρηση Η αρνητική χρώση TEM επιβεβαίωσε την παρουσία κυρίως σφαιρικών HDL σωματιδίων στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα της HDL που απομονώθηκαν από το πλάσμα της ομάδας ελέγχου AdGFP (Εικόνα 18 Α). Ωστόσο, η ίδια ανάλυση στα λιποπρωτεϊνικά κλάσματα της HDL που απομονώθηκαν από το πλάσμα της ομάδας AdGFP-APOC3_H αποκάλυψε την παρουσία τόσο δισκοειδών όσο και σφαιρικών HDL σωματιδίων (Εικόνα 18 Β). Η διάμετρος των σωματιδίων της APOC3-HDL, υπολογίστηκε ότι ήταν 19,4 (16,6-20,9) nm και βρέθηκε σημαντικά μεγαλύτερη (ρ<0,0001) από τη διάμετρο των HDL σωματιδίων της ομάδας ελέγχου AdGFP που υπολογίστηκε ότι ήταν 10 (8,9-12,8) nm (Εικόνα 18 C). Η μη-αποδιατακτική δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση του πλάσματος επιβεβαίωσε ότι όλη η APOC3-HDL της ομάδας AdGFP-APOC3_H απαρτιζόταν από δισκοειδή preβ2 σωματίδια (Εικόνα 18 Ε). Όπως ήταν αναμενόμενο, δεν ανιχνεύθηκαν υποπληθυσμοί APOC3-HDL στο πλάσμα της ομάδας ελέγχου AdGFP (Εικόνα 18 D), σε συμφωνία με την έλλειψη της έκφρασης της ανθρώπινης APOC3 (Εικόνα 15 C). Επιπλέον, παρουσία της APOC3, ανιχνεύθηκαν μόνο σφαιρικά α2 και α3 HDL σωματίδια που περιείχαν Apoa1 (Εικόνα 18 G), ενώ απουσία της APOC3 (ομάδα ελέγχου AdGFP), τα HDL σωματίδια που περιείχαν Apoa1 ήταν preβ2, preα2, preα3, α1, α2 και α3 (Εικόνα 18 F). Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι στο πλάσμα των ποντικιών της ομάδας AdGFP-APOC3_H που περιείχε αυξημένα επίπεδα APOC3, η δισκοειδής HDL αποτελείται κυρίως από APOC3 ενώ η σφαιρική από Apoa1. 87

88 Εικόνα 18. Αντιπροσωπευτικές εικόνες των αναλύσεων ηλεκτρονικής μικροσκοπίας της HDL (Α, Β) και μη-αποδιατακτικής δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης του πλάσματος (D-G) των ποντικιών της ομάδας ελέγχου AdGFP (Α, D, F) και της ομάδας AdGFP-APOC3_H (Β, Ε, G). Το διάγραμμα C απεικονίζει μια ημιποσοτική ανάλυση της διαμέτρου των HDL σωματιδίων που φαίνονται στις εικόνες της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (Α, Β). Τα πλαίσια D και Ε δείχνουν HDL σωματίδια που περιέχουν APOC3 και τα πλαίσια F και G δείχνουν HDL σωματίδια που περιέχουν Apoa1. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το Student's t-test και παρουσιάζονται ως Median, Min to Max.* = ρ < 0,05. Το AdGFP-APOC3_Η αναφέρεται στην ομάδα των ποντικιών που μολύνθηκαν με 2x10 9 pfu AdGFP-APOC3. 4 Η αυξημένη έκφραση της APOC3 επηρεάζει τη λειτουργικότητα της HDL Δεδομένων των διακριτών δομικών διαφορών μεταξύ της APOC3-HDL και της HDL της ομάδας ελέγχου AdGFP, στη συνέχεια ακολούθησαν αναλύσεις που στόχο είχαν να διευκρινίσουν κατά πόσο αυτές οι δομικές διαφορές επηρεάζουν τη λειτουργικότητα της HDL. Ειδικότερα μελετήθηκε η αντιοξειδωτική δράση της HDL και η συνολική εκροή χοληστερόλης από μακροφάγα κύτταρα της σειράς RAW 264.7, καθώς και οι επιδράσεις της APOC3-HDL στη φλεγμονώδη απόκριση in vitro.

89 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού 4.1 Αντιοξειδωτικό δυναμικό της HDL Για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής δράσης της HDL, δείγματα HDL που απομονώθηκαν από τις δύο ομάδες μελέτης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μία τροποποιημένη διαδικασία της μεθόδου της διϋδροροδαμίνης 123 όπως περιγράφεται στην παράγραφο 3.10 της ενότητας των μεθόδων. Όπως φαίνεται στην εικόνα 19 Α, η APOC3-HDL εμφάνισε μια σημαντικά υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση (δηλ. μεγαλύτερη αναστολή της οξείδωσης του υποστρώματος) σε σύγκριση με την HDL της ομάδας ελέγχου AdGFP, η οποία επίσης προκάλεσε αναστολή της οξείδωσης του υποστρώματος, αλλά σε πολύ μικρότερο βαθμό. 4.2 Ικανότητα αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης της HDL Για να εκτιμηθεί η ικανότητα της APOC3-HDL και της HDL της ομάδας ελέγχου AdGFP να προκαλούν εκροή της χοληστερόλης από τα κύτταρα, πραγματοποιήθηκε μία ποσοτική ανάλυση ολική εκροής χοληστερόλης με χρήση των RAW μακροφάγων κυττάρων που εκφράζουν τους υποδοχείς Abca1, Abcg1 και Srb1. Όπως φαίνεται στην εικόνα 19 Β, η APOC3-HDL εμφάνισε μειωμένη ικανότητα εκροής χοληστερόλης από τα μακροφάγα κύτταρα που είχαν απορροφήσει ραδιοσημασμένη [4-14 C] χοληστερόλη. 4.3 Επίδραση της HDL στη φλεγμονή Για να συγκριθούν οι επιδράσεις της APOC3-HDL και της HDL της ομάδας ελέγχου AdGFP στη φλεγμονή, χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο της επαγόμενης από LPS φλεγμονής σε μακροφάγα κύτταρα RAW 264.7, όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 4.10 της ενότητας των μεθόδων. Απουσία LPS, η προσθήκη 100 μg/ml HDL από κάθε δείγμα (δηλ. APOC3-HDL και HDL της ομάδας ελέγχου AdGFP) δεν οδήγησε σε παραγωγή TNFa επιβεβαιώνοντας ότι τα δείγματα παρασκευάστηκαν κατάλληλα χωρίς επιμόλυνση από LPS. Όπως φαίνεται στην εικόνα 19 C, η διέγερση των μακροφάγων κυττάρων με LPS απουσία HDL είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική παραγωγή TNFa στο μέσο καλλιέργειας. Όταν η διέγερση των μακροφάγων κυττάρων με LPS διεξήχθη παρουσία APOC3-HDL, τα επίπεδα TNFa ήταν σημαντικά αυξημένα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα επίπεδα TNFa που μετρήθηκαν όταν η διέγερση με LPS έγινε παρουσία της HDL της ομάδας ελέγχου AdGFP, η οποία δεν έδειξε σημαντική προ- ή αντιφλεγμονώδη δράση. 89

90 Εικόνα 19. Αντιοξειδωτική δράση (Α) και ικανότητα αντίστροφης μεταφοράς χοληστερόλης (Β) της HDL που απομονώθηκε από τα ποντίκια της ομάδας AdGFP-APOC3_H και της ομάδας ελέγχου AdGFP. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το Student's t- test και παρουσιάζονται ως Mean ± SEM. Το διάγραμμα C δείχνει την επίδραση της APOC3-HDL στην επαγόμενη από LPS παραγωγή (100 ng/ml) TNFa σε καλλιέργειες μακροφάγων κυττάρων RAW Τα δεδομένα αναλύθηκαν με two-way ANOVA και παρουσιάζονται ως Mean ± SEM. * = ρ < 0,05. Το AdGFP-APOC3_Η αναφέρεται στην ομάδα των ποντικιών που μολύνθηκαν με 2x10 9 pfu AdGFP-APOC3.

91 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού 5 Η APOC3 προκαλεί μεταβολές στον ενεργειακό μεταβολισμό Η κλινική παρατήρηση ότι η APOC3-HDL παρουσιάζει μια θετική συσχέτιση με τον παθολογικά παχύσαρκο φαινότυπο (82) οδήγησε στην υπόθεση ότι η APOC3-HDL μπορεί να επηρεάζει τον ενεργειακό μεταβολισμό. 5.1 Ανάλυση των μεταβολιτών του ορού του αίματος Για να ερευνήσουμε αυτή την υπόθεση, στην επόμενη σειρά πειραμάτων μελετήσαμε κατά πόσο η αυξημένη έκφραση της APOC3 επηρεάζει τους μεταβολίτες του ορού του αίματος, που συνδέονται με τον ενεργειακό μεταβολισμό. Εν συντομία, χρησιμοποιήθηκαν τυπικά φάσματα CPMG των δειγμάτων ορού από ποντίκια των δύο ομάδων μελέτης, προκειμένου να αναγνωριστούν σήματα των μεταβολιτών χαμηλού μοριακού βάρους. Συνολικά εξετάστηκαν 21 δείγματα: 9 προερχόμενα από την ομάδα ελέγχου AdGFP και 12 από την ομάδα AdGFP-APOC3_H. Η ανάλυση και η αναγνώριση των τυπικών φασμάτων CPMG συνέβαλε σημαντικά στην ταυτοποίηση βασικών μεταβολιτών (μεταβολίτες κλειδιά), οι οποίοι είναι πολύτιμοι για την αύξηση της ακρίβειας ταξινόμησης που παρουσιάζεται παρακάτω. Τα αποτελέσματα της αυξημένης έκφρασης της APOC3 στα μεταβολικά προφίλ των δειγμάτων ορού αναλύθηκαν με PCA και PLS-DA. Η ομαδοποίηση της PLS-DA (Εικόνα 20 Β) έδειξε παρόμοια αλλά πιο έντονη διάκριση από εκείνη της PCA (ακρίβεια: 85,7%, R 2 : 84,1%, Q 2 : 46,5%). Για την ταυτοποίηση και ταξινόμηση των μεταβολιτών που αντιστοιχούν στη διακύμανση των μεταβολικών προφίλ μεταξύ των δειγμάτων AdGFP- APOC3_H και AdGFP, αξιολογήθηκαν οι μεταβλητές σημαντικότητας (VIP> 2.0) που προέκυψαν από το μοντέλο PLS-DA (Εικόνα 20 C). Συνολικά 38 μεταβολίτες ταυτοποιήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν (arbitrary units) από τα φάσματα CPMG της 1 Η NMR. Η χημική μετατόπιση και οι στατιστικώς σημαντικές μεταβολές της συγκέντρωσης των μεταβολιτών μεταξύ των δύο ομάδων παρουσιάζονται στον Πίνακα 31. Αυτή η ανάλυση έδειξε μειωμένα επίπεδα γλυκόζης στον ορό που επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με την ενζυμική μέθοδο που βασίζεται στην οξειδάση της γλυκόζης (GOD), όπως περιγράφεται στην παράγραφο 3.7 της ενότητας των μεθόδων (Εικόνα 20 Α, D). Επιπλέον, η μεταβολική ανάλυση έδειξε αυξημένα επίπεδα μεταβολιτών του κύκλου του κιτρικού οξέος και του κύκλου της ουρίας, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μείωση των επιπέδων της γλυκόζης οφείλεται στον αυξημένο μεταβολισμό της για παραγωγή ενέργειας. Συγκεκριμένα, η ορνιθίνη, το φορμικό οξύ, η αργινίνη, η βαλίνη, η φαινυλαλανίνη, η τυροσίνη, η σερίνη, η θρεονίνη και η λευκίνη βρέθηκαν σημαντικά αυξημένες στον ορό των ποντικιών της ομάδας AdGFP-APOC3_H (Εικόνα 20 Α, C). Στην εικόνα 21 αναπαρίστανται τα μεταβολικά μονοπάτια στα οποία εμπλέκονται οι μεταβολίτες που παρουσιάζονται στην εικόνα

92 Εικόνα 20. Μεταβολομική ανάλυση. (Α) Μεταβολίτες του ορού του αίμοτος που παρουσιάζουν στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων AdGFP_APOC3_H και AdGFP. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το Wilcoxon rank-sum test και παρουσιάζονται ως Mean ± SEM. * = ρ < 0,05. Το διάγραμμα Β παρουσιάζει μία πολυμεταβλητή ανάλυση των CPMG φασμάτων του ορού (αποτελέσματα γραφικών PLS-DA) των ποντικιών της ομάδας ελέγχου AdGFP (τετράγωνα) και της ομάδας AdGFP- APOC3_H (κύκλοι). Το διάγραμμα C δείχνει τις μεταβλητές σημαντικότητας (VIP) όπως προέκυψαν από την ανάλυση με το μοντέλο PLS-DA. Το διάγραμμα D δείχνει τα επίπεδα της γλυκόζης του ορού όπως προσδιορίστηκαν από την ενζυμική μέθοδο GOD. Το κόκκινο και το πράσινο δείχνουν αυξημένα και μειωμένα επίπεδα μεταβολιτών, αντίστοιχα. Το AdGFP-APOC3_Η αναφέρεται στην ομάδα των ποντικιών που μολύνθηκαν με 2x10 9 pfu AdGFP-APOC3.

93 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Εικόνα 21. Γραφική αναπαράσταση των μεταβολικών μονοπατιών στα οποία εμπλέκονται οι μεταβολίτες που παρουσιάζονται στην εικόνα 20. Ο χάρτης δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας βάση δεδομένων Kegg ( Το κόκκινο και το πράσινο δείχνουν αυξημένα και μειωμένα επίπεδα μεταβολιτών, αντίστοιχα. 93

94 Πίνακας 31. Μεταβολίτες του ορού του αίματος που εμφανίζουν στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των ποντικιών των ομάδων AdGFP και AdGFP-APOC3_H. Metabolites Chemical shift (δ) Type p-value Changes in AdGFP- APOC3 compared to AdGFP infected mice Glucose 3.40 d Formate 8.46 s Phenylalanine 7.44 m Tyrosine 7.20 d Threonine m Serine m Valine d Leucine d Arginine m Ornithine t Signal multiplicity: s, singlet; d, doublet; t, triplet; m, multiplet. 5.2 Προσδιορισμός της μιτοχονδριακής λειτουργίας στον φαιό και στον λευκό λιπώδη ιστό Προκειμένου να επιβεβαιωθούν τα δεδομένα της μεταβολομικής ανάλυσης που υποδηλώνουν ότι η αυξημένη έκφραση της APOC3 μπορεί να προάγει την ενεργειακή κατανάλωση και άρα να αυξάνει τις απαιτήσεις παραγωγής ενέργειας, ακολούθησε προσδιορισμός της μιτοχονδριακής λειτουργίας έπειτα από απομόνωση μιτοχονδρίων από το ΒΑΤ και το WAT των ποντικιών της ομάδας AdGFP-APOC3_H και της ομάδας ελέγχου AdGFP.

95 Ρόλος της APOC3 στη λειτουργικότητα της HDL και στη μεταβολική δραστικόητα του λιπώδους ιστού Ανάλυση των μιτοχονδριακών κλασμάτων του ΒΑΤ με Western Blot, έδειξε ότι η αυξημένη έκφραση της APOC3 προκαλεί σημαντική επαγωγή των επιπέδων του μιτοχονδριακού Cytc, υποδηλώνοντας αυξημένη οξειδωτική φωσφορυλίωση (Εικόνα 22 Α-C). Επιπλέον, φάνηκε ότι η οξειδωτική φωσφορυλίωση ήταν συζευγμένη με την αναπνοή για την παραγωγή ΑΤΡ, λόγω της μειωμένης έκφρασης της Ucp1 (σε σχέση με την Cox4) (Εικόνα 22 Α-C, G), επιβεβαιώνοντας τα δεδομένα της μεταβολομικής ανάλυσης. Εικόνα 22. Αντιπροσωπευτική Western Blot ανάλυση και ημιποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων του Cytc και της Ucp1 σε σχέση με την Cox4 στα μιτοχονδριακά κλάσματα του BAT (Α-C) και του WAT (D-F) που απομονώθηκαν από τα ποντίκια της ομάδας AdGFP-APOC3_H και της ομάδας ελέγχου AdGFP. Το διάγραμμα G δείχνει τη σχετική αναλογία Ucp1/Cytc στο BAT και στο WAT, αντίστοιχα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το Student's t-test και παρουσιάζονται ως Mean ± SEM. * = ρ < 0,05. Το AdGFP-APOC3_Η αναφέρεται στην ομάδα των ποντικιών που μολύνθηκαν με 2x10 9 pfu AdGFP-APOC3. Παρόμοια ανάλυση των μιτοχονδριακών κλασμάτων του WAT έδειξε ότι η αυξημένη έκφραση της APOC3 οδηγεί σε σημαντική μείωση των επιπέδων του μιτοχονδριακού Cytc, παρά την πολύ σημαντική επαγωγή της έκφρασης της Ucp1. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η οξειδωτική φωσφορυλίωση ήταν σημαντικά μειωμένη στο WAT των ποντικιών της ομάδας AdGFP-APOC3_H, πέντε ημέρες μετά τη χορήγηση του αδενοϊού AdGFP-APOC3 (Εικόνα 22 D-E, G). 95